JP2024506711A - 最適化リンカー及びアンカー部分を介して生物学的に活性な分子に連結した細胞外ベシクル - Google Patents

最適化リンカー及びアンカー部分を介して生物学的に活性な分子に連結した細胞外ベシクル Download PDF

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Abstract

Figure 2024506711000001
本開示は、最適化リンカー及びアンカー部分を介して、細胞外ベシクルに共有結合により連結した生物学的に活性な分子を含む細胞外ベシクル（例えば、エクソソーム）に関し、これは、がん又は他の疾患の予防又は処置のための薬剤として有用である場合がある。細胞外ベシクルを産生するための方法及び疾患又は障害を処置するために細胞外ベシクルを使用するための方法も本明細書において提供される。
【選択図】 図１

Description

[001]本ＰＣＴ出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０２１年２月１７日に出願された米国特許仮出願第６３／１５０，５２３号の優先権の利益を主張する。
ＥＦＳ－ＷＥＢにより電子的に提出された配列表への言及
[002]本出願において提出された電子的に提出された配列表（名称：４０００．１２５ＰＣ０１＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、サイズ：７６６，３９９バイト；及び作成日：２０２２年２月１７日）の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
[003]本開示は、最適化リンカー及びアンカー部分を介して細胞外ベシクル（ＥＶ）、例えばエクソソームに連結した少なくとも１つの生物学的に活性な分子を含む、がん及び他の疾患の予防又は処置のための薬剤として有用であり得る細胞外ベシクル、例えばエクソソームを提供する。
[004]多くの生物活性化合物は、治療を目的とする強力な生物活性を有する。しかし、これらの化合物は、非標的器官において毒性を呈することが多い。非標的組織への曝露を制限するための１つの方法は、小分子を、治療用化合物を特定の細胞型に向けることができる抗体などの親和性に基づく試薬に化学的にコンジュゲートさせることであるが（Ｄｏｓｉｏ，Ｆら、Ｔｏｘｉｎｓ（Ｂａｓｅｌ） ３（７）：８４８～８８３（２０１１））、このアプローチは、抗体に結合することができる目的の化合物の分子数（典型的には、抗体当たり２～６個の分子）、及び非標的細胞に結合せずに、標的となる関連疾患／エフェクター細胞に特異的に結合する抗体の利用可能性／存在によって制限される。これらの２つの問題は、それぞれ効力の低下及びと全身毒性の増加によって抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の使用を制限する。したがって、特定の組織又は器官を選択的に標的とする一方で、同時に治療用化合物への全身曝露を全体的に制限することができる、ＡＤＣよりも高いペイロードを有する送達系が必要とされている。
[005]ＥＶ、例えばエクソソームは、細胞内伝達の重要なメディエーターである。ＥＶは、がんなどの多くの疾患の診断及び予後において重要なバイオマーカーでもある。薬物送達ビヒクルとして、ＥＶ、例えばエクソソームは、多くの治療分野における新しい治療モダリティーとして、従来の薬物送達方法（例えば、ペプチド免疫、ＤＮＡワクチン）よりも多くの利点をもたらす。しかしながら、その利点にもかかわらず、多くのＥＶ、例えばエクソソームの臨床的有効性は限られている。例えば、樹状細胞に由来するエクソソーム（ＤＥＸ）は、手術不能の非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を有する患者における第一選択化学療法後の維持免疫療法として、第ＩＩ相臨床試験で検討された。しかし、主要評価項目（化学療法中止の４か月後に無増悪生存（ＰＦＳ）を示す患者の少なくとも５０％）に達しなかったため、試験は終了した。Ｂｅｓｓｅ，Ｂ．ら、Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５（４）：ｅ１０７１００８（２０１５）。
[006]したがって、ＥＶに基づく技術の治療的使用及び他の適用をより良好に可能にするためには、新しい、より効果的な操作されたＥＶ、例えばエクソソームが必要である。
[007]本開示は、式［ＡＭ］－Ｌ１－［ＳＰ１］－Ｌ２－［ＳＰ２］－Ｌ３－［ＢＡＭ］（式１）（式中、［ＡＭ］は、アンカー部分であり；Ｌ１は、切断性又は非切断性の連結であり；Ｌ２及びＬ３は、任意選択の切断性又は非切断性の連結であり；ＳＰ１は、任意選択の第１のスペーサーであり；ＳＰ２は、任意選択の第２のスペーサーである）によるアンカー部分（ＡＭ）を介してＥＶに共有結合により連結した生物学的に活性な分子（ＢＡＭ）を含む細胞外ベシクル（ＥＶ）を提供する。
[008]一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、ステロール、脂質、ビタミン、ペプチド、又はこれらの組合せ及び任意選択でスペーサーを含む。一部の態様では、任意選択のスペーサーは、アルキルスペーサーである。一部の態様では、アルキルスペーサーは、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、又はＣ１５である。一部の態様では、アルキルスペーサーは、Ｃ６又はＣ８である。一部の態様では、任意選択のスペーサーは、グリコールスペーサーである。一部の態様では、グリコールスペーサーは、２（ジエチレングリコール）、３（トリエチレングリコール）、４（テトラエチレングリコール；ＴＥＧ）、５（ペンタエチレングリコール）、６（ヘキサエチレングリコール；ＨＥＧ）、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のグリコール単位を有する。一部の態様では、グリコールスペーサーは、テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）である。
[009]一部の態様では、ステロールは、コレステロール、エルゴステロール、７－デヒドロコレステロール、２４Ｓ－ヒドロキシコレステロール、ラノステロール、シクロアルテノール、フコステロール、サリンゴステロール、カンペステロール、β－シトステロール、シトスタノール、コプロスタノール、アベナステロール、及びスチグマステロールからなる群から選択される。一部の態様では、ステロールは、コレステロールである。一部の態様では、脂質は、脂肪酸である。一部の態様では、脂肪酸は、直鎖脂肪酸である。一部の態様では、脂肪酸は、直鎖脂肪酸、分岐脂肪酸、不飽和脂肪酸、モノ不飽和脂肪酸、ポリ不飽和脂肪酸、ヒドロキシ脂肪酸、ポリカルボン酸、又はこれらの任意の組合せである。一部の態様では、直鎖脂肪酸は、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、又はステアリン酸である。一部の態様では、直鎖脂肪酸は、パルミチン酸である。一部の態様では、ビタミンは、ビタミンＥ（トコフェロール又はトコトリエノール）、ビタミンＤ、ビタミンＫ、リボフラビン、ナイアシン、又はピリドキシンである。一部の態様では、ビタミンは、ビタミンＥ（トコフェロール又はトコトリエノール）である。
[0010]一部の態様では、Ｌ１は、ホスホジエステル結合を含む切断性連結又はホスホロチオエート結合を含む非切断性連結である。一部の態様では、Ｌ２は、ホスホジエステル結合を含む任意選択の切断性連結又はホスホロチオエート結合を含む非切断性連結である。一部の態様では、Ｌ３は、ホスホジエステル結合を含む任意選択の切断性連結又はホスホロチオエート結合を含む非切断性連結である。一部の態様では、任意選択の第１のスペーサーであるＳＰ１及び／又は任意選択の第２のスペーサーであるＳＰ２は、アルキルスペーサー、グリコールスペーサー、又はこれらの組合せを独立的に含む。一部の態様では、アルキルスペーサーは、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、又はＣ１５である。一部の態様では、アルキルスペーサーは、Ｃ３又はＣ６である。一部の態様では、グリコールスペーサーは、２（ジエチレングリコール）、３（トリエチレングリコール）、４（テトラエチレングリコール；ＴＥＧ）、５（ペンタエチレングリコール）、６（ヘキサエチレングリコール；ＨＥＧ）、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のグリコール単位を有する。一部の態様では、グリコールスペーサーは、テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）又はヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）である。一部の態様では、各非切断性スペーサーは、アルキル、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）、ペンタエチレングリコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、グリセロール、ジグリセロール、トリグリセロール、テトラグリセロール（ＴＧ）、ペンタグリセロール、ヘキサグリセロール（ＨＧ）、ポリグリセロール（ＰＧ）、スクシンイミド、マレイミド、又はこれらの任意の組合せから独立的に選択される。一部の態様では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、式Ｒ１－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－又はＲ１－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－Ｏ－（式中、Ｒ１は、水素、メチル又はエチルであり、ｎは、１～１５の間の整数である）によって特徴付けられる。一部の態様では、ポリグリセロール（ＰＧ）は、式（（Ｒ１－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨＯＨ－ＣＨ２Ｏ）ｎ－）（式中、Ｒ１は、水素、メチル又はエチルであり、ｎは、１～１５の間の整数である）によって特徴付けられる。
[0011]一部の態様では、切断性連結であるＬ１、Ｌ２、若しくはＬ３、又はこれらの任意の組合せは、酸化還元切断性リンカー、活性酸素種切断性リンカー、ｐＨ依存性切断性リンカー、酵素切断性リンカー、プロテアーゼ切断性リンカー、エステラーゼ切断性リンカー、ホスファターゼ切断性リンカー、光活性化切断性リンカー、自己犠牲リンカー、又はこれらの任意の組合せを含む。一部の態様では、切断性連結であるＬ１、Ｌ２、若しくはＬ３、又はこれらの任意の組合せは、自己犠牲リンカーを含む。一部の態様では、切断性連結であるＬ１、Ｌ２、若しくはＬ３、又はこれらの任意の組合せは、シンナミル基、ナフチル基、ビフェニル基、複素環式環、ホモ芳香族基、クマリン、フラン、チオフェン、チアゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、ピロール、ピラゾール、ピリジン、イミダゾン、トリアゾール、又はこれらの任意の組合せを含む。
[0012]一部の態様では、切断性連結であるＬ１、Ｌ２、若しくはＬ３、又はこれらの任意の組合せは、式：－Ａａ－Ｙｙ－（式中、各－Ａ－は、独立的にアミノ酸単位又はその組合せであり、ａは、独立的に１～１５の整数であり；－Ｙ－は、スペーサー単位であり、ｙは、０、１、又は２である）を有する。一部の態様では、－Ａａ－は、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、若しくはヘキサペプチド、又はこれらの組合せであり、組合せにおける各ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、又はヘキサペプチドは、同一であっても異なっていてもよい。一部の態様では、ａは、２であり、－Ａａ－は、バリン－アラニン、バリン－シトルリン、フェニルアラニン－リシン、Ｎ－メチルバリン－シトルリン、シクロヘキシルアラニン－リシン、グルタミン酸－バリン－シトルリン、及びベータ－アラニン－リシンからなる群から選択される。一部の態様では、－Ａａ－は、バリン－アラニン、バリン－シトルリン、又はグルタミン酸－バリン－シトルリンである。一部の態様では、ｙは、１である。一部の態様では、－Ｙ－は、自己犠牲スペーサーである。一部の態様では、－Ｙｙ－は、式：
Figure 2024506711000002
（式中、各Ｒ２は、独立的にＣ１～８アルキル、－Ｏ－（Ｃ１～８アルキル）、ハロゲン、ニトロ、又はシアノであり；ｍは、０～４の整数である）を有する。一部の態様では、ｍは、０、１、又は２である。一部の態様では、ｍは、０である。
[0013]一部の態様では、切断性連結であるＬ１、Ｌ２、若しくはＬ３、又はこれらの任意の組合せは、バリン－アラニン－ｐ－アミノベンジルカルバメート又はバリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルカルバメートを含む。一部の態様では、－Ｙ－は、非自己犠牲スペーサーである。一部の態様では、非自己犠牲スペーサーは、－Ｇｌｙ－又は－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－である。
[0014]一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、足場タンパク質を含む。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］及び／又は足場部分は、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘである。一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、プロスタグランジンＦ２受容体陰性調節因子（ＰＴＧＦＲＮタンパク質）；ベイシジン（ＢＳＧタンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２（ＩＧＳＦ２タンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（ＩＧＳＦ３タンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（ＩＧＳＦ８タンパク質）；インテグリンベータ－１（ＩＴＧＢ１タンパク質）；インテグリンアルファ－４（ＩＴＧＡ４タンパク質）；４Ｆ２細胞表面抗原重鎖（ＳＬＣ３Ａ２タンパク質）；ＡＴＰトランスポータータンパク質のクラス（ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ４タンパク質）；これらの機能的断片；及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される。一部の態様には、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、ＰＴＧＦＲＮタンパク質又はその機能的断片である。一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、配列番号３０２に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、配列番号３０２に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は約１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の態様では、生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］は、アンカー部分［ＡＭ］を介してＥＶの外側表面に連結されている。一部の態様では、生物学的に活性な分子［ＡＭ］は、ポリペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）、化学化合物、又はこれらの任意の組合せである。一部の態様では、生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］は、化学化合物である。一部の態様では、化学化合物は、小分子である。
[0015]一部の態様では、生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、核酸、又はこれらの任意の組合せを含む。一部の態様では、生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］は、ペプチド、タンパク質、抗体若しくはその抗原結合断片、又はこれらの任意の組合せを含む。一部の態様では、その抗原結合断片は、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、及びＦｄ断片、ダイアボディ、抗体関連ポリペプチド、又はこれらの任意の断片を含む。一部の態様では、生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］は、ＡＳＯを含む。一部の態様では、ＡＳＯは、転写物を標的とする。一部の態様では、転写物は、ＳＴＡＴ６転写物、ＣＥＢＰ／β転写物、ＳＴＡＴ３転写物、ＫＲＡＳ転写物、ＮＲＡＳ転写物、ＮＬＰＲ３転写物、又はこれらの任意の組合せである。一部の態様では、ＥＶは、エクソソームである。一部の態様では、エクソソームは、天然のエクソソームである。一部の態様では、エクソソームは、ＰＴＧＦＲＮを過剰に発現するエクソソーム又はその機能的断片である。
[0016]本開示は、本明細書で開示されている細胞外ベシクル及び薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物を提供する。
[0017]本開示は、本明細書で開示されているＥＶ又は医薬組成物及び使用のための説明書を含むキットを提供する。
[0018]本開示は、それを必要とする対象における疾患又は障害を処置又は防止する方法であって、本明細書で開示されているＥＶ又は医薬組成物を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。一部の態様では、疾患又は障害は、がん、炎症性障害、神経変性障害、中枢神経疾患、又は代謝性疾患である。一部の態様では、ＥＶは、静脈内、腹腔内、経鼻的、経口的、筋肉内、皮下、非経口的、又は腫瘍内に投与される。
[0019]本開示は、生物学的に活性な部分（ＢＡＭ）をＥＶに結合させる方法であって、アンカー部分（ＡＭ）をＥＶに連結させるステップを含み、アンカー部分（ＡＭ）が、式：［ＡＭ］－Ｌ１－［ＳＰ１］－Ｌ２－［ＳＰ２］－Ｌ３－［ＢＡＭ］（式中、［ＡＭ］は、アンカー部分であり；Ｌ１は、切断性又は非切断性の連結であり；Ｌ２及びＬ３は、任意選択の切断性又は非切断性の連結であり；ＳＰ１は、任意選択の第１のスペーサーであり；ＳＰ２は、任意選択の第２のスペーサーである）による生物学的に活性な部分（ＢＡＭ）に結合している、方法を提供する。
[0020]一部の態様では、［ＡＭ］は、コレステロール－Ｃ６、コレステロール－ＴＥＧ、トコフェロール－Ｃ８、トコフェロール、又はパルミチン酸－Ｃ６である。一部の態様では、Ｌ１、Ｌ２、若しくはＬ３、又はこれらの組合せは、ホスホジエステル結合である。一部の態様では、ＳＰ１は、Ｃ３、Ｃ６、ＴＥＧ、又はＨＥＧである。一部の態様では、Ｌ１、Ｌ２、若しくはＬ３、又はこれらの組合せは、ホスホロチオエート結合である。一部の態様では、ＳＰ２は、Ｃ３、Ｃ６、ＴＥＧ、又はＨＥＧである。一部の態様では、Ｌ１、Ｌ２、若しくはＬ３、又はこれらの組合せは、ホスホロチオエート結合である。一部の態様では、［ＢＡＭ］は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。
[0021]本開示は、ＥＶに結合した生物学的に活性な部分（ＢＡＭ）の負荷密度を増加させる方法であって、式：［ＡＭ］－Ｌ１－［ＳＰ１］－Ｌ２－［ＳＰ２］－Ｌ３－［ＢＡＭ］（式中、［ＡＭ］は、アンカー部分であり；Ｌ１は、切断性又は非切断性連結であり；Ｌ２及びＬ３は、任意選択の切断性又は非切断性連結であり；ＳＰ１は、任意選択の第１のスペーサーであり；ＳＰ２は、任意選択の第２のスペーサーである）による生物学的に活性な分子（ＢＡＭ）に結合している、方法を提供する。
[0022]一部の態様では、［ＡＭ］は、コレステロール－Ｃ６、コレステロール－ＴＥＧ、トコフェロール－Ｃ８、トコフェロール、又はパルミチン酸－Ｃ６である。一部の態様では、Ｌ１、Ｌ２、若しくはＬ３、又はこれらの組合せは、ホスホジエステル結合である。一部の態様では、ＳＰ１は、Ｃ３、Ｃ６、ＴＥＧ、又はＨＥＧである。一部の態様では、Ｌ１、Ｌ２、若しくはＬ３、又はこれらの組合せは、ホスホロチオエート結合である。一部の態様では、ＳＰ２は、Ｃ３、Ｃ６、ＴＥＧ、又はＨＥＧである。一部の態様では、Ｌ１、Ｌ２、若しくはＬ３、又はこれらの組合せは、ホスホロチオエート結合である。一部の態様では、［ＢＡＭ］は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。一部の態様では、ＥＶに結合した生物学的に活性な分子（ＢＡＭ）の負荷密度は、少なくとも約１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、又は少なくとも約１０倍増加している。
[0023]本開示は、式：［ＡＭ］－Ｌ１－［ＳＰ１］－Ｌ２－［ＳＰ２］－Ｌ３－［ＡＳＯ］（式中、［ＡＭ］は、コレステロール－Ｃ６、コレステロール－ＴＥＧ、トコフェロール－Ｃ８、トコフェロール、及びパルミチン酸－Ｃ６からなる群から選択されるアンカー部分であり；Ｌ１は、ホスホジエステラーゼ切断性連結であり；ＳＰ１は、Ｃ３、Ｃ６、ＴＥＧ及びＨＥＧからなる群から選択される任意選択の第１のスペーサーであり；Ｌ２は、任意選択のホスホロチオエート非切断性連結であり；ＳＰ２は、Ｃ３、Ｃ６、ＴＥＧ、及びＨＥＧからなる群から選択される任意選択の第２のスペーサーであり；Ｌ３は、任意選択のホスホロチオエート非切断性連結である）によるアンカー部分［ＡＭ］を介してＥＶに共有結合により連結したアンチセンスオリゴヌクレオチド［ＡＳＯ］を含む細胞外ベシクル（ＥＶ）を提供する。
[0024]一部の態様では、ＥＶは、エクソソームである。一部の態様では、エクソソームは、天然のエクソソームである。一部の態様では、エクソソームに結合したＡＳＯの負荷密度は、少なくとも約１．５倍増加している。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、コレステロール－Ｃ６である。一部の態様では、エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、５０３２＋／－３８６である。一部の態様では、エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、約４５００～約５５００の間である。一部の態様では、エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、約４５００～約４６００の間、約４６００～約４７００の間、約４７００～約４８００の間、約４８００～約４９００の間、約４９００～約５０００の間、約５０００～約５１００の間、約５１００～約５２００の間、約５２００～約５３００の間、約５３００～約５４００の間、又は約５４００～約５５００の間である。一部の態様では、エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、少なくとも約４５００、少なくとも約４６００、少なくとも約４７００、少なくとも約４８００、少なくとも約４９００、少なくとも約５０００、少なくとも約５１００、少なくとも約５２００、少なくとも約５３００、少なくとも約５４００、又は少なくとも約５５００である。一部の態様では、負荷効率は、７３％～９３％である。一部の態様では、負荷効率は、約７０％～約９５％の間である。一部の態様では、負荷効率は、約７０％～約７５％の間、約７５％～約８０％の間、約８０％～約８５％の間、約８５％～約９０％の間、又は約９０％～約９５％の間である。一部の態様では、負荷効率は、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％である。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、コレステロール－ＴＥＧである。一部の態様では、エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、３９９１＋／－４９０である。一部の態様では、エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、約３５００～約４５００の間である。一部の態様では、エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、約３５００～約３６００の間、約３６００～約３７００の間、約３７００～約３８００の間、約３８００～約３９００の間、約３９００～約４０００の間、約４０００～約４１００の間、約４１００～約４２００の間、約４２００～約４３００の間、約４３００～約４４００の間、又は約４４００～約４５００の間である。一部の態様では、エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、少なくとも約３５００、少なくとも約３６００、少なくとも約３７００、少なくとも約３８００、少なくとも約３９００、少なくとも約４０００、少なくとも約４１００、少なくとも約４２００、少なくとも約４３００、少なくとも約４４００、又は少なくとも約４５００である。一部の態様では、負荷効率は、５６％～７９％である。一部の態様では、負荷効率は、約５０％～約８５％の間である。一部の態様では、負荷効率は、約５０％～約５５％の間、約５５％～約６０％の間、約６０％～約６５％の間、約６５％～約７０％の間、約７０％～約７５％の間、約７５％～約８０％の間、又は約８０％～約８５％の間である。一部の態様では、負荷効率は、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約８５％である。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、トコフェロール－Ｃ８、トコフェロール、又はパルミチン酸－Ｃ６である。一部の態様では、エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、４２４１＋／－７２２である。一部の態様では、エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、約３５００～約５０００の間である。一部の態様では、エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、約３５００～約３６００の間、約３６００～約３７００の間、約３７００～約３８００の間、約３８００～約３９００の間、約３９００～約４０００の間、約４０００～約４１００の間、約４１００～約４２００の間、約４２００～約４３００の間、約４３００～約４４００の間、約４４００～約４５００の間、約４５００～約４６００の間、約４６００～約４７００の間、約４７００～約４８００の間、約４８００～約４９００の間、又は約４９００～約５０００の間である。一部の態様では、エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、少なくとも約３５００、少なくとも約３６００、少なくとも約３７００、少なくとも約３８００、少なくとも約３９００、少なくとも約４０００、少なくとも約４１００、少なくとも約４２００、少なくとも約４３００、少なくとも約４４００、少なくとも約４５００、少なくとも約４６００、少なくとも約４７００、少なくとも約４８００、少なくとも約４９００、又は少なくとも約５０００である。一部の態様では、負荷効率は、５７％～７３％である。一部の態様では、負荷効率は、約５０％～約８０％の間である。一部の態様では、負荷効率は、約５０％～約５５％の間、約５５％～約６０％の間、約６０％～約６５％の間、約６５％～約７０％の間、約７０％～約７５％の間、又は約７５％～約８０％の間である。一部の態様では、負荷効率は、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、又は少なくとも約８０％である。一部の態様では、エクソソームは、ＰＴＧＦＲＮを過剰に発現するエクソソームである。一部の態様では、エクソソームに結合したＡＳＯの負荷密度は、少なくとも約２倍増加している。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、コレステロール－Ｃ６である。一部の態様では、エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、２４４２＋／－３３９である。一部の態様では、エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、約２０００～約３０００の間である。一部の態様では、エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、約２０００～約２１００の間、約２１００～約２２００の間、約２２００～約２３００の間、約２３００～約２４００の間、約２４００～約２５００の間、約２５００～約２６００の間、約２６００～約２７００の間、約２７００～約２８００の間、約２８００～約２９００の間、又は約２９００～約３０００の間である。一部の態様では、エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、少なくとも約２０００、少なくとも約２１００、少なくとも約２２００、少なくとも約２３００、少なくとも約２４００、少なくとも約２５００、少なくとも約２６００、少なくとも約２７００、少なくとも約２８００、少なくとも約２９００、又は少なくとも約３０００である。一部の態様では、負荷効率は、２７％～４６％である。一部の態様では、負荷効率は、約２５％～約５０％の間である。一部の態様では、負荷効率は、約２５％～約３０％の間、約３０％～約３５％の間、約３５％～約４０％の間、約４０％～約４５％の間、又は約４５％～約５０％の間である。一部の態様では、負荷効率は、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、又は少なくとも約５０％である。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、コレステロール－ＴＥＧである。一部の態様では、エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、１７２８＋／－２６４である。一部の態様では、エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、約１４００～約２１００の間である。一部の態様では、エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、約１４００～約１５００の間、約１５００～約１６００の間、約１６００～約１７００の間、約１７００～約１８００の間、約１８００～約１９００の間、約１９００～約２０００の間、又は約２０００～約２１００の間である。一部の態様では、エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、少なくとも約１４００、少なくとも約１５００、少なくとも約１６００、少なくとも約１７００、少なくとも約１８００、少なくとも約１９００、少なくとも約２０００、又は少なくとも約２１００である。一部の態様では、負荷効率は、１９％～３３％である。一部の態様では、負荷効率は、約１５％～約３５％の間である。一部の態様では、負荷効率は、約１５％～約２０％の間、約２０％～約２５％の間、約２５％～約３０％の間、又は約３０％～約３５％の間である。一部の態様では、負荷効率は、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、又は少なくとも約３５％である。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、トコフェロール－Ｃ８、トコフェロール、又はパルミチン酸－Ｃ６である。一部の態様では、エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、２９７９＋／－１００６である。一部の態様では、エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、約１９００～約４０００の間である。一部の態様では、エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、約１９００～約２０００の間、約２０００～約２１００の間、約２１００～約２２００の間、約２２００～約２３００の間、約２３００～約２４００の間、約２４００～約２５００の間、約２５００～約２６００の間、約２６００～約２７００の間、約２７００～約２８００の間、約２８００～約２９００の間、約２９００～約３０００の間、約３０００～約３１００の間、約３１００～約３２００の間、約３２００～約３３００の間、約３３００～約３４００の間、約３４００～約３５００の間、約３５００～約３６００の間、約３６００～約３７００の間、約３７００～約３８００の間、約３８００～約３９００の間、又は約３９００～約４０００の間である。一部の態様では、エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、少なくとも約１９００、少なくとも約２０００、少なくとも約２１００、少なくとも約２２００、少なくとも約２３００、少なくとも約２４００、少なくとも約２５００、少なくとも約２６００、少なくとも約２７００、少なくとも約２８００、少なくとも約２９００、少なくとも約３０００、少なくとも約３１００、少なくとも約３２００、少なくとも約３３００、少なくとも約３４００、少なくとも約３５００、少なくとも約３６００、少なくとも約３７００、少なくとも約３８００、少なくとも約３９００、又は少なくとも約４０００である。一部の態様では、負荷効率は、３７％～６８％である。一部の態様では、負荷効率は、約３０％～約７５％の間である。一部の態様では、負荷効率は、約３０％～約３５％の間、約３５％～約４０％の間、約４０％～約４５％の間、約４５％～約５０％の間、約５０％～約５５％の間、約５５％～約６０％の間、約６０％～約６５％の間、約６５％～約７０％の間、又は約７０％～約７５％の間である。一部の態様では、負荷効率は、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、又は少なくとも約７５％である。
[0025]本開示は、式：［ＡＭ］－Ｌ１－［ＳＰ１］－Ｌ２－［ＳＰ２］－Ｌ３－［ＢＡＭ］（式中、［ＡＭ］は、コレステロール－ＴＥＧであり；Ｌ１は、ホスホジエステラーゼ切断性結合であり；ＳＰ１は、Ｃ３であり；Ｌ２は、ホスホロチオエート非切断性結合であり；ＳＰ２は、ＴＥＧであり；Ｌ３は、ホスホロチオエート非切断性結合である）によるアンカー部分［ＡＭ］を介してエクソソームに共有結合により連結したアンチセンスオリゴヌクレオチド［ＡＳＯ］を含むエクソソームを提供する。
[0026]一部の態様では、エクソソームは、天然のエクソソームである。一部の態様では、エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、約４７８０である。一部の態様では、エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、約４５００～約５０００の間である。一部の態様では、エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、少なくとも４５００である。一部の態様では、負荷効率は、約８０％である。一部の態様では、負荷効率は、約７０％～約９０％の間である。一部の態様では、負荷効率は、少なくとも約７０％である。一部の態様では、エクソソームは、ＰＴＧＦＲＮを過剰に発現するエクソソームである。一部の態様では、エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、約１６５９である。一部の態様では、エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、約１５００～約２０００の間である。一部の態様では、エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、少なくとも約１５００である。一部の態様では、負荷効率は、約２８％である。一部の態様では、負荷効率は、約２０％～約３５％の間である。一部の態様では、負荷効率は、少なくとも約２０％である。
[0027]本開示は、式：［ＡＭ］－Ｌ１－［ＳＰ１］－Ｌ２－［ＢＡＭ］（式中、［ＡＭ］は、コレステロール－ＴＥＧであり；Ｌ１は、ホスホジエステラーゼ切断性結合であり；ＳＰ１は、ＴＥＧであり；Ｌ２は、ホスホロチオエート非切断性結合である）によるアンカー部分［ＡＭ］を介してエクソソームに共有結合により連結したアンチセンスオリゴヌクレオチド［ＡＳＯ］を含むエクソソームを提供する。
[0028]一部の態様では、エクソソームは、天然のエクソソームである。一部の態様では、エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、約４０９０である。一部の態様では、エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、約３５００～約４５００の間である。一部の態様では、エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、少なくとも約３５００である。一部の態様では、負荷効率は、約６８％である。一部の態様では、負荷効率は、少なくとも約６０％である。一部の態様では、負荷効率は、約６０％～約７０％の間である。一部の態様では、エクソソームは、ＰＴＧＦＲＮを過剰に発現するエクソソームである。一部の態様では、エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、約１８９０である。一部の態様では、エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、約１４００～約２４００の間である。一部の態様では、エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、少なくとも約１４００である。一部の態様では、負荷効率は、約３１％である。一部の態様では、負荷効率は、約２０％～約４０％の間である。一部の態様では、負荷効率は、少なくとも約２０％である。
エクソソーム（左）、リンカーを介してエクソソームの外側表面への結合を可能にするリガンドに接続した例示的な生物学的に活性な分子（例えば、オリゴヌクレオチド）（中央）、及びリンカーを介して脂質アンカー（例えば、コレステロール）に接続した生物学的に活性な分子（例えば、オリゴヌクレオチド）がエクソソームの膜にどのように結合することができるか（右）の一般的構造を示す概略図である。 例えば、膜アンカー部分（例えば、脂質又は脂質とスペーサー）、生物学的に活性な分子、及びリンカー又はこれらの組合せを含む本出願において開示された構築物の一般的構成を示す略図である。アンカー部分が疎水性ドメインを含有する複合分子を表す場合があることに留意されたい。 固相合成に好適な例示的な膜アンカー脂質ブロックを示す。 アンカー部分（例えば、脂質）と生物学的に活性な分子（例えば、ＡＳＯ）との間に散在し得る例示的なスペーサー及びその組合せを示す。安定又は切断性リンカーは各スペーサー間に含まれ得る。固相合成に好適なスペーサーブロックも示されている。 脂質アンカー（市販のアンカーがリンカーを含む関連するリンカーを含む）、スペーサーの組合せ、及びＡＳＯ（ＦＦＬｕｃは、ホタルルシフェラーゼタンパク質のｍＲＮＡに対して相補的なＡＳＯ配列である）を含む様々な構築物を示す。負荷効率、エクソソーム当たりのＡＳＯ数、及びエクソソーム当たりのＡＳＯ数の群平均は、異なる構造が天然のエクソソームに負荷された場合に与えられる。ＡＳＯ／ＥＶの量は効力と正の相関があり、効力は、細胞株において安定して発現されるホタルルシフェラーゼの発現のノックダウン量として決定される。 脂質アンカー（市販のアンカーがリンカーを含む関連するリンカーを含む）、スペーサーの組合せ、及びＡＳＯ（ＦＦＬｕｃは、ホタルルシフェラーゼタンパク質のｍＲＮＡに対して相補的なＡＳＯ配列である）を含む様々な構築物を示す。負荷効率、エクソソーム当たりのＡＳＯ数、及びエクソソーム当たりのＡＳＯ数の群平均は、ＰＴＧＦＲＮが過剰に発現するエクソソームに負荷された場合に与えられる。ＡＳＯ／ＥＶの量は効力と正の相関があり、効力は、細胞株において安定して発現されるホタルルシフェラーゼの発現のノックダウン量として決定される。 エクソソームの種類、アンカー部分（すなわち、膜アンカー）、ベシクル表面に対して近位のスペーサー（すなわち、スペーサー１）、及びベシクル表面に対して遠位のスペーサー（すなわち、スペーサー２）の負荷密度（すなわち、ＡＳＯ／ＥＶ）への寄与の統計解析を示す。図７では、天然のＥＶとＰｒＸ ＥＶ（ＰＴＧＦＲＮを過剰に発現する）とを一緒に解析した。Ｒ２が０．９１以上の統合的な最小二乗法モデルを作成し、エクソソームの種類、膜アンカー、及びスペーサー１が負荷密度に対して統計的に有意に寄与する（ｐは０．０５未満）ことを実証した。これは、リンカー技術が、リンカー成分の寄与がＡＳＯ配列とほとんど無関係な選択ＡＳＯ配列にわたって、プラットフォーム方式で適用され得ることを示す。 図８Ａ及び８Ｂは、天然のＥＶとＰｒＸ ＥＶとが別々に考えられる統計モデルを示す。統計モデルの精度を改善するために、別々の最小二乗法モデルを天然のエクソソーム（図８Ａ；Ｒ２は０．９５以上）及びＰＴＧＦＲＮを過剰に発現するエクソソーム（図８Ｂ；ＰｒＸ；Ｒ２は０．９７以上）について作成した。 図８Ａ及び８Ｂは、天然のＥＶとＰｒＸ ＥＶとが別々に考えられる統計モデルを示す。統計モデルの精度を改善するために、別々の最小二乗法モデルを天然のエクソソーム（図８Ａ；Ｒ２は０．９５以上）及びＰＴＧＦＲＮを過剰に発現するエクソソーム（図８Ｂ；ＰｒＸ；Ｒ２は０．９７以上）について作成した。 図８Ｃは、各構造特性のエクソソーム当たりのＡＳＯ分子の質に対する相対的寄与を示す。膜アンカーのトコフェロール及びスペーサー１のＣ３が、両種類のエクソソームの負荷密度において最大の増加をもたらした。 図９Ａ、９Ｂ、及び９Ｃは、特定のアンカー－スペーサー構築物の天然のエクソソームにおけるルシフェラーゼノックダウンへの効力を示す。実験において使用した構築物を図９Ａに示す。図９Ｂは、構築物Ｔ１～Ｔ９の効力を示す。図９Ｃは、構築物Ｃ１～Ｃ９及びＬ１～Ｌ３の効力を示す。図９Ａの矢印は、最大のルシフェラーゼノックダウンをもたらした構造を強調する。 図９Ａ、９Ｂ、及び９Ｃは、特定のアンカー－スペーサー構築物の天然のエクソソームにおけるルシフェラーゼノックダウンへの効力を示す。実験において使用した構築物を図９Ａに示す。図９Ｂは、構築物Ｔ１～Ｔ９の効力を示す。図９Ｃは、構築物Ｃ１～Ｃ９及びＬ１～Ｌ３の効力を示す。図９Ａの矢印は、最大のルシフェラーゼノックダウンをもたらした構造を強調する。 図９Ａ、９Ｂ、及び９Ｃは、特定のアンカー－スペーサー構築物の天然のエクソソームにおけるルシフェラーゼノックダウンへの効力を示す。実験において使用した構築物を図９Ａに示す。図９Ｂは、構築物Ｔ１～Ｔ９の効力を示す。図９Ｃは、構築物Ｃ１～Ｃ９及びＬ１～Ｌ３の効力を示す。図９Ａの矢印は、最大のルシフェラーゼノックダウンをもたらした構造を強調する。 図１０Ａ及び１０Ｂは、リンカーにより達成された負荷密度と比較した、ルシフェラーゼタンパク質である天然のエクソソーム（図１０Ａ）又はＰＴＧＦＲＮを過剰に発現するエクソソーム（図１０Ｂ）に対するシグナルのノックダウンを示す。最適なリンカーは、ＡＳＯ／ＥＶの最大負荷及び／又は正規化されたホタルルシフェラーゼの最小発現によって規定される。コレステロール及びトコフェロール－ｃ８は、それぞれ天然のエクソソーム及びＰＴＧＦＲＮを過剰に発現するエクソソームとの会合に関して、最良のアンカー部分であることが示された。ＴＥＧ及びＣ３は、スペーサー１に対する選択肢の効力において最大の増加をもたらした。 図１０Ａ及び１０Ｂは、リンカーにより達成された負荷密度と比較した、ルシフェラーゼタンパク質である天然のエクソソーム（図１０Ａ）又はＰＴＧＦＲＮを過剰に発現するエクソソーム（図１０Ｂ）に対するシグナルのノックダウンを示す。最適なリンカーは、ＡＳＯ／ＥＶの最大負荷及び／又は正規化されたホタルルシフェラーゼの最小発現によって規定される。コレステロール及びトコフェロール－ｃ８は、それぞれ天然のエクソソーム及びＰＴＧＦＲＮを過剰に発現するエクソソームとの会合に関して、最良のアンカー部分であることが示された。ＴＥＧ及びＣ３は、スペーサー１に対する選択肢の効力において最大の増加をもたらした。
実施例４のアンカー－リンカー－ＡＳＯ構築物を作成するために使用した膜アンカー（脂質）、リンカー、及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを示す。各ＡＳＯ名の後の括弧内の数は、評価した異なるリンカー構造の数を示す。 実施例４で示された実験におけるＡＳＯ配列を示す。ＦＦＬＵＣ及びＲＬＵＣは、標的とされる発光レポーター遺伝子にちなんで名付けられた。ＭＹＣ及びＳＴＡＴ６ ＡＳＯは、ＡＳＯによって標的とされる遺伝子にちなんで名付けられた。Ｎｂ：ＬＡＮ残基（ＬＮＡ－５ＭｅＣ及びＬＮＡ Ｔ／ＬＮＡ－５ＭｅＵを含む）。Ｎｍ：２’－Ｏ’ＭＯＥ残基（ＭＯＥ－５ＭｅＣ及びＭＯＥ－Ｔ／ＭＯＥＤ－５ＭｅＵを含む）。ｄＮ：ＤＮＡ残基。（５ＭｄＣ）：５－メチル－ｄＣ。ｓ：ホスホロチオエート骨格修飾。 図１３Ａは、様々な構造パラメーターのエクソソームでの負荷密度への寄与を決定するために統計モデル（Ｒ２＝０．８６）を作成したことを示す。考慮される構造パラメーターは、ＡＳＯ、スペーサー１、スペーサー２、及び膜アンカーであった。 図１３Ｂは、ｅｘｏＡＳＯ－ＳＴＡＴ６対照（Ｃｈｏｌ－ＴＥＧ－ＨＥＧリンカー）と比較した、試験したリンカー構築物のそれぞれのエクソソーム当たりのＡＳＯ構築物数を示す。 図１３Ｃは、負荷密度への各リンカー構成成分の相対的影響の略図である。 図１４Ａ～１４Ｅは、様々な緩衝剤中での２、４、又は８日間のインキュベーション後に、ＳＴＡＴ６ ＡＳＯを含む構造（構築物）を負荷したエクソソームに会合したＡＳＯの量を表す安定性プロットを示す。評価した構造は、コレステロール－ＴＥＧ－Ｎｏｎｅ－ＳＴＡＴ６（図１４Ａ）；コレステロール－Ｃ６－Ｃ３－ＳＴＡＴ６（図１４Ｂ）；トコフェロール－Ｃ８－ＴＥＧ－ＳＴＡＴ６（図１４Ｃ）；トコフェロール－ＴＥＧ－ＨＥＧ－ＳＴＡＴ６（図１４Ｄ）；及びパルミチン酸－Ｃ６－ＨＥＧ－ＳＴＡＴ６（図１４Ｅ）であった。 図１４Ａ～１４Ｅは、様々な緩衝剤中での２、４、又は８日間のインキュベーション後に、ＳＴＡＴ６ ＡＳＯを含む構造（構築物）を負荷したエクソソームに会合したＡＳＯの量を表す安定性プロットを示す。評価した構造は、コレステロール－ＴＥＧ－Ｎｏｎｅ－ＳＴＡＴ６（図１４Ａ）；コレステロール－Ｃ６－Ｃ３－ＳＴＡＴ６（図１４Ｂ）；トコフェロール－Ｃ８－ＴＥＧ－ＳＴＡＴ６（図１４Ｃ）；トコフェロール－ＴＥＧ－ＨＥＧ－ＳＴＡＴ６（図１４Ｄ）；及びパルミチン酸－Ｃ６－ＨＥＧ－ＳＴＡＴ６（図１４Ｅ）であった。 図１４Ａ～１４Ｅは、様々な緩衝剤中での２、４、又は８日間のインキュベーション後に、ＳＴＡＴ６ ＡＳＯを含む構造（構築物）を負荷したエクソソームに会合したＡＳＯの量を表す安定性プロットを示す。評価した構造は、コレステロール－ＴＥＧ－Ｎｏｎｅ－ＳＴＡＴ６（図１４Ａ）；コレステロール－Ｃ６－Ｃ３－ＳＴＡＴ６（図１４Ｂ）；トコフェロール－Ｃ８－ＴＥＧ－ＳＴＡＴ６（図１４Ｃ）；トコフェロール－ＴＥＧ－ＨＥＧ－ＳＴＡＴ６（図１４Ｄ）；及びパルミチン酸－Ｃ６－ＨＥＧ－ＳＴＡＴ６（図１４Ｅ）であった。 図１４Ａ～１４Ｅは、様々な緩衝剤中での２、４、又は８日間のインキュベーション後に、ＳＴＡＴ６ ＡＳＯを含む構造（構築物）を負荷したエクソソームに会合したＡＳＯの量を表す安定性プロットを示す。評価した構造は、コレステロール－ＴＥＧ－Ｎｏｎｅ－ＳＴＡＴ６（図１４Ａ）；コレステロール－Ｃ６－Ｃ３－ＳＴＡＴ６（図１４Ｂ）；トコフェロール－Ｃ８－ＴＥＧ－ＳＴＡＴ６（図１４Ｃ）；トコフェロール－ＴＥＧ－ＨＥＧ－ＳＴＡＴ６（図１４Ｄ）；及びパルミチン酸－Ｃ６－ＨＥＧ－ＳＴＡＴ６（図１４Ｅ）であった。 図１４Ａ～１４Ｅは、様々な緩衝剤中での２、４、又は８日間のインキュベーション後に、ＳＴＡＴ６ ＡＳＯを含む構造（構築物）を負荷したエクソソームに会合したＡＳＯの量を表す安定性プロットを示す。評価した構造は、コレステロール－ＴＥＧ－Ｎｏｎｅ－ＳＴＡＴ６（図１４Ａ）；コレステロール－Ｃ６－Ｃ３－ＳＴＡＴ６（図１４Ｂ）；トコフェロール－Ｃ８－ＴＥＧ－ＳＴＡＴ６（図１４Ｃ）；トコフェロール－ＴＥＧ－ＨＥＧ－ＳＴＡＴ６（図１４Ｄ）；及びパルミチン酸－Ｃ６－ＨＥＧ－ＳＴＡＴ６（図１４Ｅ）であった。 安定性及び負荷密度の結果のまとめを与える。安定性は、温度とは無関係に、高塩又は高塩及びスクロースの条件下でエクソソームを保存した場合に高かった。スクロースを含まない高塩条件下でのエクソソームは、高温でより安定であった。負荷密度は、低塩条件下で低かった。コレステロール又はトコフェロールの脂質アンカーにより構築したＡＳＯは、パルミチン酸を有するリンカーよりも高い負荷密度を有した。高塩及び低温の条件下では、単一のスペーサーを有するＡＳＯ構築物は、２つのスペーサーを有するＡＳＯ構築物よりも安定性が低かった。
試験した塩、温度、及びスクロース条件下では、粒子数に変化がなかったことを示す。 試験した塩、温度、及びスクロース条件下では、粒子サイズに変化がなかったことを示す。 ｅｘｏＡＳＯ－ＳＴＡＴ６対照では、エクソソーム当たりの効力が負荷密度と正に相関したことを示す。 図１９Ａは、ＰＯＩ／ＰＳを変化させた脂質－リンカー－ＡＳＯ構造設計の例を示す。ＰＯ：ホスホジエステル；ＰＳＡ：ホスホロチオエート。 図１９Ｂは、ＡＳＯ濃度（ｎＭ）に基づいて正規化したＩＣ５０値として測定される効力を示す。 図１９Ｃは、エクソソーム粒子（ｐ／ｍＬ）当たりに基づいて正規化したＩＣ５０値として測定される効力を示す。 ５つの異なるリンカーによるｅｘｏＡＳＯの安定性を示す。会合したＡＳＯ喪失の％は、式：会合したＡＳＯ喪失の％＝（［ＡＳＯ］０－［ＡＳＯ］Ｎ）／［ＡＳＯ］０（式中、［ＡＳＯ］０は、０日目の会合したＡＳＯの総濃度であり、［ＡＳＯ］Ｎは、Ｎ日目の会合したＡＳＯ濃度である）に基づいて計算される。 粒子濃度によって測定した、５つの異なるリンカーによるｅｘｏＡＳＯの安定性を示し、これは、４℃で８日間にわたり安定なままであった。 粒子サイズによって測定した、５つの異なるリンカーによるｅｘｏＡＳＯの安定性を示し、これは、４℃で８日間にわたり安定なままであった。 図２３Ａは、ＡＳＯがＳＴＡＴ６ ＡＳＯである、Ｖａｌ－Ｃｉｔ切断性リンカー機構を有する脂質－リンカー－ＡＳＯ構造設計の例を示す。 図２３Ｂは、ＡＳＯ濃度（ｎＭ）に基づいて正規化したＩＣ５０値として測定される図２３Ａに示した構築物の効力を示す。 ＡＳＯがＥＧＦＰ ＡＳＯである、脂質－リンカー－ＡＳＯ設計の例を示す。 ＡＳＯがＳＴＡＴ６ ＡＳＯである、酸化還元切断性リンカー機構を有する脂質－リンカー－ＡＳＯ設計の例を示す。 ＡＳＯ濃度（ｎＭ）に基づいて正規化したＩＣ５０値として測定される図２５に示した構築物の効力を示す。 脂質－リンカー－ＡＳＯ構築物、この場合には、ＥＧＦＰを標的とするＡＳＯに関する負荷、精製、及び特徴付けのプロセスの略図を示す。 ＥＧＦＰスプライシングレスキューアッセイの開発の略図を示す。様々なリンカーを有するＥＧＦＰ及びｅｘｏＥＧＦＰの有効性を評価するために、２９３ＡＡＶ－ｐＣＢ－２７５４細胞株を開発した。６５４における点突然変異によってＥＧＦＰは完全に転写されないため、ＥＧＦＰ又はＮａｎｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅからの発光は観察されない。ＡＳＯで処理すると、ＥＧＦＰが救済され、したがって、ＥＧＦＰとＮａｎｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅシグナルの両方が観察された。ＮａｎｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅの発光を有効性のハイスループット定量化のために用いた。ＥＧＦＰ ＡＳＯの配列の修飾も示されている。Ｎｍ：２’－Ｏ’ＭＯＥ残基（ＭＯＥ－５ＭｅＣ及びＭＯＥ－Ｔ／ＭＯＥＤ－５ＭｅＵを含む）；ｓ：ホスホロチオエート骨格修飾。ＥＧＦＰ ＡＳＯの塩基配列は、ＧＣＴＡＴＴＡＣＣＴＴＡＡＣＣＣＡＧ（配列番号１０９３）である。 ３つの用量レベルにおける細胞生存率（ＣＴＧアッセイ）及び有効性について、ＥＧＦＰスプライシングレスキューアッセイにおいて使用される新たに開発された細胞株の特徴付けを示す。 ＥＧＦＰスプライシングレスキューアッセイを使用して、様々なＰＯ及び非切断性ＰＥＧリンカーによるｅｘｏＡＳＯ－ＥＧＦＰの負荷密度及び有効性を示す。「低」及び「高」は、負荷温度及びＡＳＯ濃度のモジュレーションによって負荷密度が制御される、一組の実験において達成された負荷密度に対する相対的で定性的な参照である。下段のプロットの凡例は、効力アッセイにおいて各試料に投与されたＡＳＯの用量を示している。
[0065]本開示は、最適化リンカー及びアンカー部分を介して、細胞外ベシクル（ＥＶ）、例えばエクソソームに共有結合により連結した少なくとも１つの生物学的に活性な分子を含むＥＶ、例えばエクソソーム、並びにその使用を対象とする。様々な態様の非限定的な例が本開示に示されている。
[0066]本開示がより詳細に説明される前に、本発明が説明される特定の組成物又は処理ステップに限定されず、当然のことながら変更されてもよいことが理解されるべきである。本開示を読めば当業者には明らかなように、本明細書において記載及び例示された個々の態様の各々は、本発明の範囲又は趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの態様のいずれかの特徴から容易に分離する又はそれと組み合わせることができる個別の構成成分及び特徴を有する。任意の記載された方法は、記載された事象の順序又は論理的に可能な他の順序で実施することができる。
[0067]本明細書で示される見出しは、本開示の様々な態様の限定ではなく、全体として本明細書を参照して定義され得る。本開示の範囲は添付の特許請求の範囲のみによって限定されるため、本明細書で使用される用語は、単に特定の態様を説明するためのものに過ぎず、限定的であることを意図しないことも理解されるべきである。
[0068]したがって、すぐ下に定義される用語は、全体として本明細書を参照してより十分に定義される。
Ｉ．定義
[0069]本発明の記載をより容易に理解することができるように、ある特定の用語が最初に定義される。さらなる定義は詳細な説明全体を通して記載されている。
[0070]用語「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」の実体は、その実体のうちの１つ又は複数を指すことに留意されるべきであり、例えば、「ヌクレオチド配列」は、１つ又は複数のヌクレオチド配列を表すことが理解される。このように、用語「１つの（ａ）（又は「１つの（ａｎ）」）」、「１つ又は複数の（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、及び「少なくとも１つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」は、本明細書において互換的に使用され得る。特許請求の範囲が任意選択のいずれかの要素を除外するように起草できることにさらに留意されたい。このように、この記載は、請求項要素の記載と併せて、「単に（ｓｏｌｅｌｙ）」、「単に（ｏｎｌｙ）」などの排他的用語を使用する場合、又は否定的限定を使用する場合の先行詞としての役割を果たすことを意図する。
[0071]さらに、「及び／又は（ａｎｄ／ｏｒ）」は、本明細書で使用される場合、他の要件若しくは構成要素を有するか又は有さない、２つの特定の要件又は構成要素のそれぞれについての具体的開示として解釈されるべきである。よって、本明細書において「Ａ及び／又はＢ（Ａ ａｎｄ／ｏｒ Ｂ）」などの句において使用される用語「及び／又は（ａｎｄ／ｏｒ）」は、「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ」（単独）、並びに「Ｂ」（単独）を含むことを意図する。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ（Ａ，Ｂ，ａｎｄ／ｏｒ Ｃ）」などの句において使用される用語「及び／又は（ａｎｄ／ｏｒ）」は、以下の態様のそれぞれを包含することを意図する：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；並びにＣ（単独）。
[0072]本明細書において「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という表現で態様が記載されている場合には、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」及び／又は「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語で記載されている別の類似の態様も提供されることが理解される。
[0073]別段に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示に関する技術分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。例えば、ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｕｏ，Ｐｅｉ－Ｓｈｏｗ、第２版、２００２年、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３版、１９９９年、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；及びｔｈｅ Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、改訂版、２０００年、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓは、本開示で使用される用語の多くについて一般的な辞書を当業者に提供する。
[0074]単位、接頭辞、及び記号は、国際単位系（ＳＩ）で認められている形式で表記されている。数値範囲は、その範囲を規定する数値を包含する。値の範囲が記載されている場合、その範囲の上限と下限の間に介在する各整数値、及びその各分数も、このような値の間の各下位範囲と一緒に具体的に開示されていることが理解されるべきである。任意の範囲の上限及び下限は、その範囲に独立的に含まれることもその範囲から除外されることもあり、いずれか一方、いずれも、又は両方の限界値が含まれる各範囲も、本開示に包含される。よって、本明細書に記載された範囲は、記載された端点を包含する、その範囲内の値のすべての略記であると理解される。例えば、１～１０という範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０からなる群に由来する任意の数、数の組合せ、又は下位範囲を含むことが理解される。
[0075]値が明示的に記載されている場合、記載された値とほぼ同じ量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）又は量（ａｍｏｕｎｔ）である値も本開示の範囲内であることが理解されるべきである。組合せが開示されている場合、その組合せの要素の各部分的組合せも具体的に開示されており、本開示の範囲内である。逆に、異なる要素又は要素の群が個別に開示されている場合、その組合せも開示されている。ある開示のいずれかの要素が複数の選択肢を有することが開示されている場合、各選択肢が単一で又は他の選択肢とのいずれかの組合せで除外されるその開示の例も本明細書で開示されており；ある開示の２つ以上の要素がこのような除外を有する可能性があり、このような除外を有する要素のすべての組合せが本明細書で開示されている。
[0076]ヌクレオチドは、一般的に受け入れられている１文字コードで呼ばれる。別段に示されていなければ、ヌクレオチド配列は５’から３’の方向で左から右に書かれる。ヌクレオチドは、本明細書において、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名法委員会によって推奨される一般的に知られている１文字記号で呼ばれる。したがって、Ａはアデニンを表し、Ｃはシトシンを表し、Ｇはグアニンを表し、Ｔはチミンを表し、Ｕはウラシルを表す。
[0077]アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの方向で左から右に書かれる。アミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名法委員会によって推奨される一般的に知られている３文字記号又は１文字記号で呼ばれる。
[0078]用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）、およそ（ｒｏｕｇｈｌｙ）、およそ（ａｒｏｕｎｄ）、又はその領域内を意味するために本明細書で使用される。用語「約」が数値範囲と併せて使用される場合、記載された数値の上下に境界を拡張することによってその範囲を修正する。一般に、用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、例えば１０パーセントの上下（高低）の変動によって、記載された値の上下に数値を修正することができる。
[0079]用語「投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」、「投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」、及びこれらの文法的変形は、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）などの組成物を、薬学的に許容できる経路を介して対象に導入することを指す。本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）などの組成物の対象への導入は、腫瘍内、経口的、肺内、経鼻、非経口的（静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下）、直腸内、リンパ内、髄腔内、眼周囲、又は局所的を含む任意の好適な経路によるものである。投与には、自己投与及び他者による投与が含まれる。好適な投与経路は、組成物又は薬剤がその意図する機能を発揮することを可能にする。例えば、好適な経路が静脈内である場合、組成物は、組成物又は薬剤を対象の静脈に導入することによって投与される。
[0080]本明細書で使用される場合、用語「アゴニスト」は、受容体に結合し、受容体を活性化して生物学的応答を引き起こす分子を指す。受容体は、内因性アゴニスト又は外因性アゴニストのいずれかによって活性化され得る。内因性アゴニストの非限定的な例としては、ホルモン、神経伝達物質、及び環状ジヌクレオチドが挙げられる。外因性アゴニストの非限定的な例としては、薬物、小分子、及び環状ジヌクレオチドが挙げられる。アゴニストは、完全アゴニスト、部分アゴニスト、又は逆アゴニストであり得る。
[0081]用語「アミノ酸置換」は、親配列又は参照配列（例えば、野生型配列）に存在するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置き換えることを指す。アミノ酸は、親配列又は参照配列（例えば、野生型ポリペプチド配列）において、例えば、化学的ペプチド合成を介して、又は当技術分野で公知の組換え方法によって置換され得る。したがって、「Ｘ位の置換」という言及は、Ｘ位に存在するアミノ酸の代替アミノ酸残基による置換を指す。一部の態様では、置換パターンは、図式ＡｎＹによって記載することができ、ここで、Ａは、ｎ位に天然に又は元々存在するアミノ酸に対応する１文字コードであり、Ｙは、置換アミノ酸残基である。他の態様では、置換パターンは、図式Ａｎ（ＹＺ）によって記載することができ、ここで、Ａは、ｎ位に天然に又は元々存在するアミノ酸を置換するアミノ酸残基に対応する１文字コードであり、Ｙ及びＺは、Ａを置き換えることができる代替の置換アミノ酸残基である。
[0082]本明細書で使用される場合、用語「アンタゴニスト」は、受容体に結合した際に、それ自体が生物学的応答を惹起するのではなく、アゴニストに媒介される応答を遮断又は減弱させる分子を指す。多くのアンタゴニストは、受容体上の構造的に規定された結合部位で内因性リガンド又は基質と競合することによってその効力を実現する。アンタゴニストの非限定的な例としては、アルファ遮断剤、ベータ遮断剤、及びカルシウムチャネル遮断剤が挙げられる。アンタゴニストは、競合的、非競合的、又は不競合的なアンタゴニストであり得る。
[0083]本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、天然又は部分的若しくは全体的に合成的に産生された免疫グロブリン、及びその断片を包含する。この用語は、免疫グロブリン結合ドメインと相同である結合ドメインを有する任意のタンパク質も網羅する。「抗体」は、抗原と特異的に結合し、それを認識する、免疫グロブリン遺伝子由来のフレームワーク領域を含むポリペプチド又はその断片も含む。抗体という用語の使用は、全抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、その断片を含むことを意味し、一本鎖抗体、ヒト化抗体、マウス抗体、キメラ、マウス－ヒト、マウス－霊長類、霊長類－ヒトモノクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、抗体断片、例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、及びＦｄ断片、ダイアボディ、及び抗体関連ポリペプチドをさらに含む。抗体は、所望の生物学的な活性又は機能を示す限り、二特異性抗体及び多重特異性抗体を含む。本開示の一部の態様では、生物学的に活性な分子は、抗体又はその抗原結合断片を含む分子である。
[0084]用語「抗体－薬物コンジュゲート」及び「ＡＤＣ」は、互換的に使用され、治療剤（本明細書において、薬剤、薬物、又は薬学的有効成分と称されることがある）又は薬剤に、例えば共有結合的に連結した抗体を指す。本開示の一部の態様では、生物学的に活性な分子は、抗体－薬物コンジュゲートである。
[0085]本明細書で使用される場合、目的の１つ又は複数の値に適用される用語「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、記載された基準値に類似する値を指す。ある特定の態様では、用語「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、別段記載されていない限り又はそうでなければ文脈から明らかでない限り（このような数値が可能な値の１００％を超える場合を除く）、記載された基準値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、又はそれより低い割合のいずれかの方向（より大きい又はより小さい）に収まる値の範囲を指す。
[0086]用語「アリール」は、炭素環式芳香族基を指す。アリール基の例としては、以下に限定されないが、フェニル、ナフチル及びアントラセニルが挙げられる。炭素環式芳香族基は、非置換であっても、又は－Ｃ１～８アルキル、－Ｏ－（Ｃ１～８アルキル）、－アリール、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ’、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２－、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）Ｒ’、－ＯＨ、－ハロゲン、－Ｎ３、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｒ’）、－Ｎ（Ｒ’）２及び－ＣＮ（式中、各Ｒ’は、独立的に、Ｈ、－Ｃ１～８アルキル、又はアリールである）を含むがこれらに限定されない１つ又は複数の基で置換されていてもよい。
[0087]用語「アリーレン」は、２つの共有結合を有するアリール基を指し、以下の構造：
Figure 2024506711000003
［式中、フェニル基は、非置換であっても、又は－Ｃ１～８アルキル、－Ｏ－（Ｃ１～８アルキル）、－アリール、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ’、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２－、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）Ｒ’、－ＯＨ、－ハロゲン、－Ｎ３、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｒ’）、－Ｎ（Ｒ’）２及び－ＣＮ（式中、各Ｒ’は、独立的に、Ｈ、－Ｃ１～８アルキル、又はアリールである）を含むがこれらに限定されない最大４つの基で置換されていてもよい］に示されているオルト、メタ、又はパラ立体配置であってもよい。
[0088]本明細書で使用される用語「生物学的に活性な分子」は、アンカー部分を介してＥＶ、例えばエクソソームに結合することができる任意の分子を指し、分子は、それを必要とする対象において治療効果若しくは予防効果を有することができるか、又は診断目的で使用することができる。したがって、例として、生物学的に活性な分子という用語は、タンパク質（例えば、抗体、タンパク質、ポリペプチド、並びにそれらの誘導体、断片、及びバリアント）、脂質及びそれらの誘導体、炭水化物（例えば、糖タンパク質中のグリカン部分）、又は小分子を含む。一部の態様では、生物学的に活性な分子は、放射性同位体である。一部の態様では、生物学的に活性な分子は、検出可能な部分、例えば、放射性核種、蛍光分子、又は造影剤である。一部の態様では、生物学的に活性な分子は、標的部分又は指向性部分であっても又はそれを含んでもよい。一部の態様では、生物学的に活性な分子は、例えば、ビオチンなどの親和性リガンドであっても又はそれを含んでもよい。一部の態様では、生物学的に活性な分子は、薬物動態特性又は薬力学的特性を改善することが可能な部分、例えば、血漿中半減期を増加させることが可能な部分、例えば、ＰＥＧ部分であっても又はそれを含んでもよい。
[0089]用語「Ｃ１～８アルキル」は、本明細書で使用される場合、１～８個の炭素原子を有する直鎖の又は分岐した、飽和炭化水素を指す。代表的な「Ｃ１～８アルキル」基としては、以下に限定されないが、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｎ－ブチル、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル、イソプロピル、ｓｅｃ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、イソペンチル、及び２－メチルブチルが挙げられる。
[0090]用語「Ｃ１～１０アルキレン」は、式－（ＣＨ２）１～１０－の飽和した直鎖炭化水素基を指す。Ｃ１～１０アルキレンの例としては、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン、ヘプチレン、オクチレン、ノニレン、及びデカレンが挙げられる。
[0091]用語「Ｃ３～８炭素環」は、３、４、５、６、７又は８員の飽和又は不飽和非芳香族炭素環式環を指す。代表的なＣ３～８炭素環としては、以下に限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンタジエニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、１，３－シクロヘキサジエニル、１，４－シクロヘキサジエニル、シクロヘプチル、１，３－シクロヘプタジエニル、１，３，５－シクロヘプタトリエニル、シクロオクチル、及びシクロオクタジエニルが挙げられる。Ｃ３～８炭素環式基は、非置換であっても、又は－Ｃ１～８アルキル、－Ｏ－（Ｃ１～８アルキル）、アリール、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ’、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２－、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）Ｒ’、－ＯＨ、－ハロゲン、－Ｎ３、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｒ’）、－Ｎ（Ｒ’）２及び－ＣＮ（式中、各Ｒ’は、独立的に、Ｈ、－Ｃ１～８アルキル、又はアリールである）を含むがこれらに限定されない１つ又は複数の基で置換されていてもよい。
[0092]用語「Ｃ３～８カルボシクロ」は、炭素環式の水素原子のうちの１つ又は複数が結合で置き換えられている、上記で定義されたＣ３－８炭素環式基を指す。
[0093]用語「Ｃ３～８複素環」は、環の炭素原子のうちの１～４つが、Ｏ、Ｓ及びＮからなる群から選択されるヘテロ原子で独立的に置き換えられている芳香族又は非芳香族Ｃ３～８炭素環を指す。Ｃ３～８複素環の代表的な例としては、以下に限定されないが、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェン、インドリル、ベンゾピラゾリル、クマリニル、イソキノリニル、ピロリル、チオフェニル、フラニル、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、キノリニル、ピリミジニル、ピリジニル、ピリドニル、ピラジニル、ピリダジニル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル及びテトラゾリルが挙げられる。Ｃ３～８複素環は、非置換であっても、又は－Ｃ１～８アルキル、－Ｏ－（Ｃ１～８アルキル）、－アリール、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ’、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２－、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）Ｒ’、－ＯＨ、－ハロゲン、－Ｎ３、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｒ’）、－Ｎ（Ｒ’）２、及び－ＣＮ（式中、各Ｒ’は、独立的に、Ｈ、－Ｃ１～８アルキル、又はアリールである）を含むがこれらに限定されない最大７つの基で置換されていてもよい。
[0094]用語「Ｃ３～８ヘテロシクロ」は、ヘテロ環式基の水素原子のうちの１つが結合で置き換えられている、上記で定義されたＣ３－８複素環式基を指す。Ｃ３～８ヘテロシクロは、非置換であっても、又は－Ｃ１～８アルキル、－Ｏ－（Ｃ１～８アルキル）、－アリール、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ’、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２－、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）Ｒ’、－ＯＨ、－ハロゲン、－Ｎ３、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｒ’）、－Ｎ（Ｒ’）２及び－ＣＮ（式中、各Ｒ’は、独立的に、Ｈ、－Ｃ１～８アルキル、又はアリールである）を含むがこれらに限定されない最大６つの基で置換されていてもよい。
[0095]
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されており、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。よって、ポリペプチドにおけるアミノ酸が同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸で置き換えられている場合、その置換は保存的であると考えられる。別の態様では、アミノ酸のストリングは、側鎖ファミリーのメンバーの順序及び／又は組成が異なる構造的に類似するストリングと保存的に置き換えることができる。
[0096]本明細書で使用される場合、用語「保存された」は、比較される２つ以上の配列の同じ位置に非改変状態で存在するものである、それぞれポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列のヌクレオチド又はアミノ酸残基を指す。比較的保存されたヌクレオチド又はアミノ酸は、配列の他所に出現するヌクレオチド又はアミノ酸より関連性の高い配列の間で保存されているものである。
[0097]一部の態様では、２つ以上の配列は、これらが互いに１００％同一であれば、「完全に保存されている」か又は「同一」であると言われる。一部の態様では、２つ以上の配列は、これらが互いに少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、又は少なくとも９５％同一であれば、「高度に保存されている」と言われる。一部の態様では、２つ以上の配列は、これらが互いに約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％、又は約９９％同一であれば、「高度に保存されている」と言われる。一部の態様では、２つ以上の配列は、これらが互いに少なくとも３０％同一、少なくとも４０％同一、少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、又は少なくとも９５％同一であれば、「保存されている」と言われる。一部の態様では、２つ以上の配列は、これらが互いに約３０％同一、約４０％同一、約５０％同一、約６０％同一、約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、又は約９９％同一であれば、「保存されている」と言われる。配列の保存は、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの全長に適用してもよく、又はその一部、領域若しくは特徴に適用してもよい。
[0098]本明細書で使用される場合、用語「従来のＥＶタンパク質」は、ＥＶにおいて濃縮される以前から知られているタンパク質を意味する。
[0099]本明細書で使用される場合、用語「従来のエクソソームタンパク質」は、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＰＤＧＦＲ、ＧＰＩアンカータンパク質、ラクタドヘリンＬＡＭＰ２、及びＬＡＭＰ２Ｂ、これらの断片、又はこれらに結合するペプチドを含むがこれらに限定されない、エクソソーム中で濃縮されることが以前から知られているタンパク質を意味する。
[00100]用語「誘導体」は、本明細書で使用される場合、反応性部分（例えば、ホスホラミダイト部分）を導入するために化学的に修飾されたＥＶ、例えばエクソソーム、構成成分（例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘなどのタンパク質、脂質、炭水化物）、又は生物学的に活性な分子（例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、抗体又はその断片、ＰＲＯＴＡＣなど）を指す。
[00101]用語「賦形剤」及び「担体」は、互換的に使用され、化合物の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。
[00102]本明細書で使用される場合、用語「細胞外ベシクル」、「ＥＶ」、及びその文法上の変形は、互換的に使用され、内部空間を囲む膜を含む細胞由来のベシクルを指す。細胞外ベシクルは、これらが由来する細胞よりも小さな直径を有するすべての膜結合ベシクル（例えば、エクソソーム、ナノベシクル）を含む。一部の態様では、細胞外ベシクルは、直径は２０ｎｍ～１０００ｎｍの範囲であり、内部空間（すなわち、内腔）内に、細胞外ベシクルの外部表面に提示されて、及び／又は膜にまたがって、様々な高分子ペイロードを含み得る。一部の態様では、ペイロードは、核酸、タンパク質、炭水化物、脂質、小分子、及び／又はこれらの組合せを含み得る。ある特定の態様では、細胞外ビヒクルは、足場部分を含む。例としてであって限定されないが、細胞外ベシクルは、アポトーシス小体、細胞の断片、直接的又は間接的な操作（例えば、連続的な押出し又はアルカリ溶液による処理）によって細胞から導出されたベシクル、小胞化したオルガネラ、及び生細胞によって産生されたベシクル（例えば、直接的な原形質膜の出芽又は後期エンドソームの原形質膜との融合によって）を含む。細胞外ベシクルは、生きた若しくは死んだ生物、外植された組織若しくは器官、原核細胞若しくは真核細胞、及び／又は培養細胞に由来し得る。一部の態様では、細胞外ベシクルは、１つ又は複数の導入遺伝子産物を発現する細胞によって産生される。
[00103]本明細書で使用される場合、用語「エクソソーム」は、２０～３００ｎｍ（例えば、４０～２００ｎｍ）の間の直径を有する細胞外ベシクルを指す。エクソソームは、内部空間（すなわち、内腔）を囲む膜を含み、一部の態様では、直接的な原形質膜の出芽又は後期エンドソームの原形質膜との融合によって、細胞（例えば、産生細胞）から生じ得る。ある特定の態様では、エクソソームは、足場部分を含む。後述するように、エクソソームは、産生細胞に由来し、そのサイズ、密度、生化学的パラメーター、又はこれらの組合せに基づいて産生細胞から単離することができる。一部の態様では、本開示のエクソソームは、１つ又は複数の導入遺伝子産物を発現する細胞によって産生される。
[00104]一部の態様では、本開示のＥＶ、例えばエクソソーム、例えばナノベシクルは、アンカー部分を介して、少なくとも１つの生物学的に活性な分子（例えば、抗体又はＡＤＣなどのタンパク質、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどのＲＮＡ又はＤＮＡ、小分子薬物、毒素）を、ＥＶ、例えばエクソソーム、例えばナノベシクルに共有結合によって連結させることによって操作される。
[00105]一部の態様では、本開示のＥＶ、例えば、エクソソーム又はナノベシクルは、ＥＶの内部空間（すなわち、内腔）内に、ＥＶの外部（外側）表面若しくは内部（内腔）表面上に提示されて、及び／又は膜にまたがって、様々な高分子ペイロードを含み得る。一部の態様では、ペイロードは、例えば、核酸、タンパク質、炭水化物、脂質、小分子、及び／又はこれらの組合せを含み得る。ある特定の態様では、ＥＶ、例えばエクソソームは、足場部分（例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ）を含む。ＥＶ、例えばエクソソームは、生きた若しくは死んだ生物、外植された組織若しくは器官、原核細胞若しくは真核細胞、及び／又は培養細胞に由来し得る。一部の態様では、ＥＶ、例えばエクソソームは、１つ又は複数の導入遺伝子産物を発現する細胞によって産生される。他の態様では、本開示のＥＶは、限定されないが、ナノベシクル、ミクロソーム、マイクロベシクル、細胞外体、又はアポトーシス体である。
[00106]エクソソーム、リンカーを介してエクソソームの外側表面への結合を可能にするリガンドに接続した例示的な生物学的に活性な分子（例えば、オリゴヌクレオチド）、及びリンカーを介して脂質アンカー（例えば、コレステロール）に接続した生物学的に活性な分子（例えば、オリゴヌクレオチド）がエクソソームの膜にどのように結合することができるかの一般的構造の概略図が図１に示されている。
[00107]本明細書で使用される場合、タンパク質（例えば、治療用タンパク質などの生物学的に活性な分子、又はＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘなどの足場タンパク質）の「断片」という用語は、天然に存在する配列より短いか、Ｎ末端及び／若しくはＣ末端が欠失しているか、又は天然に存在するタンパク質と比較して欠失したタンパク質のいずれかの部分であるタンパク質のアミノ酸配列を指す。
[00108]本明細書で使用される場合、用語「機能的断片」は、タンパク質の機能を保持するタンパク質の断片を指す。したがって、一部の態様では、足場タンパク質、例えばＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘタンパク質の機能的断片は、生物学的に活性な分子を、ＥＶ、例えばエクソソームの内腔面又は外部表面に係留する能力を保持する。
[00109]断片が機能的断片であるか否かは、ウエスタンブロット、ＦＡＣＳ解析及び断片と例えばＧＦＰのような自己蛍光タンパク質との融合を含む、ＥＶ、例えばエクソソームのタンパク質含量を決定するための当技術分野で公知の任意の方法によって評価することができる。ある特定の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘタンパク質の機能的断片は、例えば、生物学的に活性な分子を、ＥＶ、例えばエクソソームの内腔又は外部表面に係留する天然に存在するＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘタンパク質の能力の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％又は少なくとも約１００％を保持する。
[00110]本明細書で使用される場合、足場タンパク質を介して、生物学的に活性な分子を、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）の内腔又は外部表面に「係留する（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ）」とは、生物学的に活性な分子を、それぞれ、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の内腔又は外部表面に位置する足場分子の一部に、共有結合又は非共有結合により結合させることを指す。
[00111]本明細書で使用される場合、用語「相同性」は、ポリマー分子間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／又はＲＮＡ分子）間及び／又はポリペプチド分子間の全体的関連性を指す。一般に、用語「相同性」は、２つの分子間の進化的関係を意味する。よって、相同である２つの分子は、共通の進化的祖先を有することになる。本開示の文脈では、相同性という用語は、同一性と類似性の両方を包含する。
[00112]一部の態様では、ポリマー分子は、分子内のモノマーの少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％が同一である（正確に同じモノマーである）か又は類似する（保存的置換）場合に、互いに「相同」であると考えられる。「相同な」という用語は、少なくとも２つの配列（ポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列）間の比較を必然的に指す。
[00113]本開示の文脈では、置換（これらがアミノ酸置換として言及される場合でも）は、核酸レベルで行われ、すなわち、アミノ酸残基を代替のアミノ酸残基で置換することは、第１のアミノ酸をコードするコドンを第２のアミノ酸をコードするコドンで置換することによって行われる。
[00114]本明細書で使用される場合、用語「同一性」は、ポリマー分子間、例えば、ポリペプチド分子又はポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／又はＲＮＡ分子）間の全体的モノマー保存を指す。いずれのさらなる修飾語も有さない「同一な」という用語、例えば、タンパク質Ａはタンパク質Ｂと同一であるとは、配列が１００％同一（１００％の配列同一性）であることを意味する。２つの配列が、例えば「７０％同一である」という記載は、これらが、例えば、「７０％の配列同一性」を有するという記載と等しい。
[00115]例えば、２つのポリペプチド配列の同一性パーセントの計算は、２つの配列を最適な比較のためにアラインさせることによって実施することができる（例えば、最適なアライメントのために第１のポリペプチド配列と第２のポリペプチド配列の一方又は両方にギャップを導入することができ、同一でない配列は比較するために無視することができる）。ある特定の態様では、比較のためにアラインされた配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸が比較される。
[00116]第１の配列における位置が第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸によって占められている場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適アライメントに導入される必要のあるギャップの数、及び各ギャップの長さを考慮して、配列によって共有される同一な位置の数の関数である。配列の比較及び２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。
[00117]タンパク質配列とヌクレオチド配列の両方のアライメントに好適なソフトウェアプログラムは、様々な供給源から入手可能である。配列同一性のパーセントを決定するための１つの好適なプログラムは、米国政府の国立バイオテクノロジー情報センターのＢＬＡＳＴウェブサイトから入手可能なＢＬＡＳＴプログラム一式の一部であるｂｌ２ｓｅｑである。ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮ又はＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを使用する２つの配列間の比較を実施する。ＢＬＡＳＴＮは核酸配列を比較するために使用されるが、一方、ＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列を比較するために使用される。他の好適なプログラムは、例えば、バイオインフォマティクスプログラムのＥＭＢＯＳＳ一式の一部である、Ｎｅｅｄｌｅ、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ、Ｗａｔｅｒ、又はＭａｔｃｈｅｒであり、欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＢＩ）（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ）からも入手可能である。
[00118]配列アライメントは、ＭＡＦＦＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ（ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ又はＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ）、ＭＵＳＣＬＥなどのような当技術分野で公知の方法を使用して行うことができる。
[00119]ポリヌクレオチド又はポリペプチド参照配列とアラインする単一のポリヌクレオチド又はポリペプチド標的配列内の異なる領域は、それぞれ独自の配列同一性パーセントを有し得る。配列同一性パーセントの値は小数点以下第２位を四捨五入することに留意されたい。例えば、８０．１１、８０．１２、８０．１３、及び８０．１４は８０．１に切り捨てられ、８０．１５、８０．１６、８０．１７、８０．１８、及び８０．１９は８０．２に切り上げられる。長さの値は常に整数となることにも留意されたい。
[00120]ある特定の態様では、第１のアミノ酸配列（又は核酸配列）の第２のアミノ酸配列（又は核酸配列）に対する同一性百分率（％ＩＤ）は、％ＩＤ＝１００×（Ｙ／Ｚ）として計算され、ここで、Ｙは、第１及び第２の配列のアライメント（目視検査又は特定の配列アライメントプログラムによってアラインされたもの）において完全一致としてスコア化されたアミノ酸残基（又は核酸塩基）の数であり、Ｚは、第２の配列中の残基の総数である。第１の配列の長さが第２の配列よりも長い場合、第１の配列の第２の配列に対する同一性パーセントは、第２の配列の第１の配列に対する同一性パーセントよりも高くなる。
[00121]当業者は、配列同一性パーセントの計算のための配列アラインメントの生成が一次配列データによって排他的に駆動されるバイナリ配列間比較に限定されないことを認識するであろう。また、配列アライメントは、配列データを、構造データ（例えば、結晶学的タンパク質構造）、機能データ（例えば、突然変異の位置）、又は系統学的データなどの異種供給源からのデータと統合することによって生成され得ることも認識されるであろう。異種データを統合して多重配列アライメントを生成する好適なプログラムは、ｗｗｗ．ｔｃｏｆｆｅｅ．ｏｒｇ、或いはＥＢＩなどから入手可能なＴ－Ｃｏｆｆｅｅである。配列同一性パーセントを計算するために使用される最終的なアライメントは、自動的又は手動で精選され得ることも認識されるであろう。
[00122]本明細書で使用される場合、用語「単離された」、「精製された」、「抽出された」、及びそれらの文法上の変形は、互換的に使用され、１つ又は複数の精製工程、例えば所望のＥＶ、例えばエクソソーム調製物の選択又は濃縮を経た、所望のＥＶ（例えば、既知又は未知の量及び／又は濃度の複数のＥＶ）調製物の状態を指す。一部の態様では、単離すること又は精製することは、本明細書で使用される場合、ＥＶ、例えばエクソソームを産生細胞を含有する試料から取り除く、部分的に取り除く（例えば、その画分）工程である。一部の態様では、単離されたＥＶ、例えばエクソソームの組成物は検出可能な望ましくない活性を有さないか、或いは、望ましくない活性のレベル又は量が許容可能なレベル若しくは量であるか又はそれを下回る。他の態様では、単離されたＥＶ、例えばエクソソームの組成物は、許容できる量及び／又は濃度であるか又はそれを上回る、所望のＥＶ、例えばエクソソームの量及び／又は濃度を有する。他の態様では、単離されたＥＶ、例えばエクソソームの組成物は、組成物が得られる出発材料（例えば、産生細胞調製物）と比較して濃縮されている。この濃縮は、出発材料と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．９％、少なくとも約９９．９９％、少なくとも約９９．９９９％、少なくとも約９９．９９９９％であるか、又は９９．９９９９％を超え得る。一部の態様では、単離されたＥＶ、例えばエクソソームの調製物は、残留生物由来物質を実質的に含まない。一部の態様では、単離されたＥＶ、例えばエクソソームの調製物は、いずれかの夾雑する生体物質を１００％含まないか、少なくとも約９９％含まないか、少なくとも約９８％含まないか、少なくとも約９７％含まないか、少なくとも約９６％含まないか、少なくとも約９５％含まないか、少なくとも約９４％含まないか、少なくとも約９３％含まないか、少なくとも約９２％含まないか、少なくとも約９１％含まないか、又は少なくとも約９０％含まない。残留生体由来物質は、アビオティック物質（化学物質を含む）又は不要な核酸、タンパク質、脂質、若しくは代謝産物を含み得る。残留生体由来物質を実質的に含まないとは、ＥＶ、例えばエクソソームの組成物が検出可能な産生細胞を含有しないこと、及びＥＶ、例えばエクソソームのみが検出可能であることも意味し得る。
[00123]用語「連結した」、「融合した」、及びその文法上の変形は、互換的に使用され、それぞれ、第２の部分、例えば第２のアミノ酸配列、ヌクレオチド配列、及び／又は脂質（例えば、コレステロール）に、共有結合又は非共有結合により接合した第１の部分、例えば、第１のアミノ酸配列又は核酸配列を指す。第１の部分は、第２の部分に直接接合若しくは並置され得るか、或いは介在する部位が第１の部分を第２の部分に共有結合により接合させ得る。用語「連結した」は、Ｃ末端又はＮ末端における第１の部分の第２の部分への融合だけでなく、第１の部分（又は第２の部分）全体の、第２の部分（又はそれぞれ、第１の部分）のいずれか２点、例えばアミノ酸への挿入も含む。一態様では、第１の部分はペプチド結合又はリンカーによって第２の部分に連結されている。第１の部分は、ホスホジエステル結合又はリンカーによって第２の部分に連結され得る。リンカーは、ペプチド若しくはポリペプチド（ポリペプチド鎖では）又はヌクレオチド若しくはヌクレオチド鎖（ヌクレオチド鎖では）又は任意の化学部分（ポリペプチド若しくはポリヌクレオチド鎖又は任意の化学分子では）であり得る。用語「連結した」は、ハイフン（－）によっても示される。一部の態様では、ＥＶ、例えばエクソソームにおけるＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘタンパク質は、リンカー、スペーサー、又はこれらの組合せを介して、生物学的に活性な分子に連結又は融合され得る。
[00124]用語「修飾された」は、本明細書に記載のＥＶ、例えばエクソソームに関連して使用される場合、修飾されたＥＶ、例えばエクソソームが天然に存在するＥＶ、例えばエクソソームと異なるように、ＥＶ、例えばエクソソーム及び／又はその産生細胞を変更又は操作することを指す。一部の態様では、本明細書に記載の修飾されたＥＶ、例えばエクソソームは、天然に存在するＥＶ、例えばエクソソームの膜と比較して、タンパク質、脂質、小分子、炭水化物などの組成が異なる膜を含む。例えば、膜は、より高密度若しくはより多数の天然のＥＶ、例えばエクソソームを含む、及び／又は膜は、ＥＶ、例えばエクソソーム中に天然に見られないタンパク質を含む。ある特定の態様では、膜へのこのような修飾は、ＥＶ、例えばエクソソームの外部表面を変化させる（例えば、本明細書に記載の表面を操作されたＥＶ及びエクソソーム）。
[00125]本明細書で使用される場合、用語「修飾されたタンパク質」又は「タンパク質修飾」は、タンパク質の非突然変異アミノ酸配列に対して少なくとも１５％の同一性を有するタンパク質を指す。タンパク質の修飾は、タンパク質の断片又はバリアントを含む。タンパク質の修飾は、タンパク質の断片又はバリアントに対する化学的、又は物理的修飾をさらに含み得る。
[00126]本明細書で使用される場合、用語「モジュレートする」、「修飾する」、及びこれらの文法上の変形は、特定の濃度、レベル、発現、機能又は挙動に適用された場合、例えば、アンタゴニスト又はアゴニストとして作用するために、特定の濃度、レベル、発現、機能又は挙動を、増加させるか又は低下させる、例えば、直接的又は間接的に、促進する／刺激する／上方調節する又は妨げる／阻害する／下方調節することによって、変更する能力を一般に指す。一部の事例では、モジュレーターは、対照と比較して、又は一般的に予測される平均活性レベルと比較して、又は対照の活性レベルと比較してある特定の濃度、レベル、活性若しくは機能を増加及び／又は低下させ得る。
[00127]本明細書で使用される場合、用語「ナノベシクル」は、２０～２５０ｎｍの間（例えば、３０～１５０ｎｍの間）の直径を有する細胞外ベシクルを指し、ナノベシクルが操作なしに細胞によって産生されないように直接的又は間接的な操作によって細胞（例えば、産生細胞）から生成される。ナノベシクルを産生する細胞の適切な操作としては、以下に限定されないが、連続的押出し、アルカリ溶液による処理、超音波処理、又はこれらの組合せが挙げられる。一部の態様では、ナノベシクルの産生は、産生細胞の破壊をもたらす可能性がある。一部の態様では、本明細書に記載のナノベシクルの集団は、原形質膜からの直接出芽又は後期エンドソームの原形質膜との融合によって細胞から誘導されるベシクルを実質的に含まない。ある特定の態様では、ナノベシクルは、足場部分、例えばＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘを含む。ナノベシクルは、一旦産生細胞から誘導されると、そのサイズ、密度、生化学的パラメーター、又はこれらの組合せに基づいて、産生細胞から単離され得る。
[00128]本明細書で使用される場合、用語「ペイロード」は、本開示のＥＶ、例えばエクソソームと接触した標的（例えば、標的細胞）で作用する生物学的に活性な分子（例えば、治療剤）を指す。ＥＶ、例えばエクソソームに導入され得るペイロードの非限定的な例としては、ヌクレオチド（例えば、検出可能な部分若しくは毒素を含むヌクレオチド、又は転写を破壊するヌクレオチド）、核酸（例えば、酵素などのポリペプチドをコードするＤＮＡ若しくはｍＲＮＡ分子、又はｍｉＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、及びｓｉＲＮＡなどの調節機能を有するＲＮＡ分子）、アミノ酸（例えば、検出可能な部分若しくは毒素を含むか、又は翻訳を破壊するアミノ酸）、ポリペプチド（例えば、酵素）、脂質、炭水化物、及び小分子（例えば、小分子薬物及び毒素）が挙げられる。ある特定の態様では、ペイロードは抗原を含む。本明細書で使用される場合、用語「抗原」は、対象に導入された場合にそれ自体に免疫応答（細胞性又は体液性）を誘発するいずれかの薬剤を指す。一部の態様では、ペイロード分子は、本明細書で開示されているリンカー、スペーサー、又はこれらの組合せを介して、ＥＶ、例えばエクソソームに共有結合により連結される。他の態様では、ペイロードはアジュバントを含む。
[00129]用語「薬学的に許容できる担体」、「薬学的に許容できる賦形剤」、及びこれらの文法上の変形は、ヒトを含む動物において使用するための、米国連邦政府の規制当局によって承認されたか、又は米国薬局方に列挙された薬剤のいずれか、並びに対象への組成物の投与を禁止する程度まで望ましくない生理学的効果の生成を引き起こさず、且つ投与された化合物の生物活性及び特性を無効にしない任意の担体又は希釈剤を包含する。医薬組成物の調製に有用であり、一般に安全で、無毒性であり、望ましい賦形剤及び担体が含まれる。
[00130]本明細書で使用される場合、用語「医薬組成物」は、本開示のＥＶ、例えばエクソソームなどの、本明細書に記載の化合物のうちの１つ又は複数を、薬学的に許容できる担体及び賦形剤などの１つ又は複数の他の化学構成成分と混合若しくは混和させるか、又はその中に懸濁させたものを指す。医薬組成物の１つの目的は、対象へのＥＶ、例えばエクソソームの調製物の投与を容易にすることである。
[00131]用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、それらのアナログ、又はそれらの混合物を含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指す。この用語は分子の一次構造を指す。よって、この用語には、三本鎖、二本鎖及び一本鎖のデオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）、並びに三本鎖、二本鎖及び一本鎖のリボ核酸（「ＲＮＡ」）が含まれる。例えば、アルキル化、及び／又はキャッピングによる修飾形態のポリヌクレオチド、並びに非修飾形態のポリヌクレオチドも含まれる。より詳細には、用語「ポリヌクレオチド」は、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及びｍＲＮＡを含む、ポリデオキシリボヌクレオチド（２－デオキシ－Ｄ－リボースを含有する）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ－リボースを含有する）、スプライシングされたか又はスプライシングされていないかにかかわらず、プリン塩基又はピリミジン塩基のＮ－又はＣ－グリコシドである他の種類のポリヌクレオチド、並びに非ヌクレオチド骨格を含有する他のポリマー、例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸「ＰＮＡ」）及びポリモルホリノポリマー、並びにポリマーが、ＤＮＡ及びＲＮＡに見られるような塩基対合及び塩基スタッキングを可能にする立体配置で核酸塩基を含有する他の合成配列特異的核酸ポリマーを含む。本開示の一部の態様では、本明細書で開示されているリンカー、スペーサー、又はこれらの組合せを介して、ＥＶ、例えばエクソソームに結合した生物学的に活性な分子は、ポリヌクレオチド、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドである。特定の態様では、ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡを含む。他の態様では、ｍＲＮＡは、合成ｍＲＮＡである。一部の態様では、合成ｍＲＮＡは、少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む。一部の態様では、ある特定の分類のすべての核酸塩基は、非天然核酸塩基で置き換えられている（例えば、本明細書で開示されているポリヌクレオチドのすべてのウリジンは、非天然核酸塩基、例えば５－メトキシウリジンで置き換えられている可能性がある）。本開示の一部の態様では、生物学的に活性な分子は、ポリヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＡＳＯ）である。
[00132]用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書で互換的に使用される。ポリマーは、修飾されたアミノ酸を含み得る。この用語は、天然に又は介入；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は標識構成成分とのコンジュゲーションなどの任意の他の操作若しくは修飾によって修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。例えば、アミノ酸の１つ又は複数のアナログ（例えば、ホモシステイン、オルニチン、ｐ－アセチルフェニルアラニン、Ｄ－アミノ酸、及びクレアチンなどの非天然アミノ酸を含む）を含有するポリペプチド、及び当技術分野で公知の他の修飾もこの定義内に含まれる。本開示の一部の態様では、本明細書で開示されているリンカー、スペーサー、又はこれらの組合せを介して、ＥＶ、例えばエクソソームに結合した生物学的に活性な分子は、ポリペプチド、例えば、ＡＤＣ、ＰＲＯＴＡＣ、毒素、融合タンパク質、又は酵素などの抗体又はその誘導体である。
[00133]用語「ポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、任意のサイズ、構造、又は機能のタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを指す。ポリペプチドは、遺伝子産物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、ホモログ、オルソログ、パラログ、前記のものの断片及び他の均等物、バリアント、及びアナログを含む。ポリペプチドは、単一のポリペプチドであっても、又は二量体、三量体若しくは四量体などの多分子の複合体であってもよい。これらは、一本鎖又は複数鎖のポリペプチドも含み得る。最も一般的なジスルフィド連結は、複数鎖のポリペプチドに見られる。ポリペプチドという用語は、１つ又は複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的アナログであるアミノ酸ポリマーにも当てはまる可能性がある。一部の態様では、「ペプチド」は、５０アミノ酸長未満であるか又はそれに等しい、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０アミノ酸長であり得る。
[00134]用語「防止する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「防止すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」、及びその変形は、本明細書で使用される場合、疾患、障害及び／若しくは状態の発症を部分的若しくは完全に遅延させること；特定の疾患、障害、及び／若しくは状態の１つ若しくは複数の症状、特徴、若しくは臨床症状の発症を部分的若しくは完全に遅延させること；特定の疾患、障害、及び／若しくは状態の１つ若しくは複数の症状、特徴、若しくは症状の発症を部分的若しくは完全に遅延させること；特定の疾患、障害、及び／若しくは状態からの進行を部分的若しくは完全に遅延させること；並びに／又は疾患、障害、及び／若しくは状態に関連する病態を発症するリスクを低下させることを指す。一部の態様では、転帰を防止することは、予防的処置によって実現される。
[00135]本明細書で使用される場合、用語「産生細胞」は、ＥＶ、例えばエクソソームを生成するために使用される細胞を指す。産生細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される細胞であるか、又はｉｎ ｖｉｖｏの細胞であり得る。産生細胞としては、以下に限定されないが、ＥＶ、例えばエクソソームを生成するのに有効であることが知られている細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、ＢＪヒト包皮線維芽細胞、ｆＨＤＦ線維芽細胞、ＡＧＥ．ＨＮ（登録商標）神経前駆細胞、ＣＡＰ（登録商標）羊膜細胞、脂肪間葉系幹細胞、ＲＰＴＥＣ／ＴＥＲＴ１細胞が挙げられる。ある特定の態様では、産生細胞は、抗原提示細胞ではない。一部の態様では、産生細胞は、樹状細胞、Ｂ細胞、マスト細胞、マクロファージ、好中球、Ｋｕｐｆｆｅｒ－Ｂｒｏｗｉｃｚ細胞、これらの細胞のいずれかに由来する細胞、又はこれらのいずれかの組合せではない。
[00136]本明細書で使用される場合、「予防の」は、疾患若しくは状態の発症を予防するために、又は疾患若しくは状態に関連する症状を防止若しくは遅延させるために使用される治療法又は一連の作用を指す。
[00137]本明細書で使用される場合、「予防」は、健康を維持し、出血エピソードの発症を予防若しくは遅延させるために、又は疾患若しくは状態に関連する症状を防止若しくは遅延させるためにとられる手段を指す。
[00138]「組換え」ポリペプチド又はタンパク質は、組換えＤＮＡ技術によって産生されるポリペプチド又はタンパク質を指す。操作された宿主細胞において発現される組換えによって産生されたポリペプチド及びタンパク質は、本開示の目的のために単離されたと考えられ、任意の好適な技法によって分離され、画分化され、又は部分的若しくは実質的に精製された天然ポリペプチド又は組合せポリペプチドも同様である。本明細書で開示されているポリペプチドは、当技術分野で公知の方法を使用して組換えによって産生され得る。或いは、本明細書で開示されているタンパク質及びペプチドは、化学的に合成することができる。本開示の一部の態様では、ＥＶ、例えばエクソソームに存在するＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘタンパク質は、産生細胞において足場タンパク質を過剰発現させることによって組換えにより産生され、その結果、得られたＥＶ、例えばエクソソーム中の足場タンパク質のレベルは、このような足場タンパク質を過剰発現していない産生細胞のＥＶ、例えば、エクソソーム中に存在する足場タンパク質のレベルに対して有意に増加する。
[00139]本明細書で使用される場合、用語「足場部分」は、例えば、ＥＶ、例えばエクソソームの外部表面で、ペイロード、例えば生物学的に活性な分子を、ＥＶ、例えばエクソソームに係留させるために使用することができる分子、例えばＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘなどのタンパク質を指す。ある特定の態様では、足場部分は、合成分子を含む。一部の態様では、足場部分は、非ポリペプチド部分を含む。他の態様では、例えば、足場部分は、ＥＶ、例えばエクソソームに天然に存在する脂質、炭水化物、タンパク質、又はこれらの組合せ（例えば、糖タンパク質又はプロテオリピド）を含む。一部の態様では、足場部分は、ＥＶ、例えばエクソソームには天然に存在しない脂質、炭水化物、又はタンパク質を含む。一部の態様では、足場部分は、ＥＶ、例えばエクソソームに天然に存在するが、基礎／天然／野生型のレベルに対して、ＥＶ、例えばエクソソームで濃縮された脂質又は炭水化物を含む。一部の態様では、足場部分は、ＥＶ、例えばエクソソームに天然に存在するが、例えば、基礎／天然／野生型のレベルに対して、産生細胞における組換えによる過剰発現によって、ＥＶ、例えばエクソソームで濃縮されたタンパク質を含む。ある特定の態様では、足場部分は、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘである。
[00140]本明細書で使用される場合、用語「Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ」は、ＥＶ、例えばエクソソームの表面で特定されたＥＶ、例えばエクソソームのタンパク質を指す。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第１０，１９５，２９０号を参照されたい。Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘタンパク質の非限定的な例としては、プロスタグランジンＦ２受容体陰性調節因子（「ＰＴＧＦＲＮ」）；ベイシジン（「ＢＳＧ」）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２（「ＩＧＳＦ２」）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（「ＩＧＳＦ３」）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（「ＩＧＳＦ８」）；インテグリンベータ－１（「ＩＴＧＢ１」）；インテグリンアルファ－４（「ＩＴＧＡ４」）；４Ｆ２細胞表面抗原重鎖（「ＳＬＣ３Ａ２」）；及びＡＴＰトランスポータータンパク質のクラス（「ＡＴＰ１Ａ１」、「ＡＴＰ１Ａ２」、「ＡＴＰ１Ａ３」、「ＡＴＰ１Ａ４」、「ＡＴＰ１Ｂ３」、「ＡＴＰ２Ｂ１」、「ＡＴＰ２Ｂ２」、「ＡＴＰ２Ｂ３」、「ＡＴＰ２Ｂ」）が挙げられる。一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘタンパク質は、全タンパク質又はその断片（例えば、機能的断片、例えば、ＥＶ、例えばエクソソームの外部表面又は内腔表面に別の部位を係留することが可能な最小断片）であり得る。一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、生物学的に活性な分子を、ＥＶ、例えばエクソソームの外部表面又は内腔に係留することができる。本開示の一部の態様では、生物学的に活性な分子は、例えば、本明細書で開示されているリンカー、スペーサー、又はこれらの組合せを介して、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘに共有結合され得る。本開示に関して使用することができる他の足場部分の非限定的な例としては、アミノペプチダーゼＮ（ＣＤ１３）；Ｎｅｐｒｉｌｙｓｉｎ、別名膜メタロエンドペプチダーゼ（ＭＭＥ）；エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー１（ＥＮＰＰ１）；Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ－１（ＮＲＰ１）；ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＰＤＧＦＲ、ＧＰＩアンカータンパク質、ラクトアドヘリン、ＬＡＭＰ２、及びＬＡＭＰ２Ｂが挙げられる。
[00141]本明細書で使用される場合、用語「類似性」は、ポリマー分子間、例えば、ポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／又はＲＮＡ分子）間及び／又はポリペプチド分子間の全体的関連性を指す。ポリマー分子の互いへの類似性パーセントの計算は、類似性パーセントの計算では当技術分野で理解されている保存的置換を考慮に入れること以外は、同一性パーセントの計算と同じように実施することができる。類似性のパーセンテージが、使用される比較スケール、すなわち、アミノ酸が、例えば、それらの進化的近接性、電荷、体積、可撓性、極性、疎水性、芳香族性、等電点、抗原性、又はこれらの組合せに従って比較されるかどうかに依存することが理解される。
[00142]別段に示されていない限り、１つ又は複数の立体中心を有する化合物への言及は、その各立体異性体、及び立体異性体のすべての組合せを意図する。
[00143]用語「対象」、「患者」、「個体」、及び「宿主」、並びにこれらの変形は、本明細書で互換的に使用され、診断、処置、又は治療が所望される、ヒト、飼育動物（例えば、イヌ、ネコなど）、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）、及び実験動物（例えば、サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモットなど）、特にヒトを含むがこれらに限定されない任意の哺乳動物対象を指す。本明細書に記載の方法は、ヒトの治療と獣医学的適用の両方に適用可能である。
[00144]本明細書で使用される場合、用語「実質的に含まない」は、ＥＶ、例えばエクソソームを含む試料が、質量／体積（ｍ／ｖ）パーセンテージ濃度で、１０％未満の巨大分子、例えば夾雑物しか含まない。一部の画分は、０．００１％未満、０．０１％未満、０．０５％未満、０．１％未満、０．２％未満、０．３％未満、０．４％未満、０．５％未満、０．６％未満、０．７％未満、０．８％未満、０．９％未満、１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、６％未満、７％未満、８％未満、９％未満、又は１０％未満（ｍ／ｖ）の巨大分子しか含有しない場合がある。
[00145]本明細書で使用される場合、用語「表面を操作されたＥＶ」（例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘで操作されたエクソソーム）は、操作されたＥＶの表面が修飾前のＥＶ又は天然に存在するＥＶの表面と異なるように、ＥＶの膜又は表面の組成が修飾されたＥＶを指す。
[00146]本明細書で使用される場合、用語「表面を操作されたエクソソーム」（例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘで操作されたエクソソーム）は、操作されたエクソソームの表面が修飾前のエクソソーム又は天然に存在するエクソソームの表面と異なるように、エクソソームの膜又は表面（外部表面又は内腔表面）の組成が修飾されたエクソソームを指す。
[00147]操作は、ＥＶ、例えばエクソソームの表面が変化するように、ＥＶ、例えばエクソソームの表面、又はＥＶ、例えばエクソソームの膜内でなされ得る。例えば、膜は、例えば、タンパク質、脂質、小分子、炭水化物、又はこれらの組合せの組成が修飾され得る。組成は、化学的、物理的、若しくは生物学的な方法によって、又は化学的、物理的、若しくは生物学的な方法によって以前に若しくは同時に修飾された細胞から生成されることによって変化させることができる。具体的には、組成は、遺伝子工学によって、又は遺伝子工学によって以前に修飾された細胞から生成されることによって変化させることができる。一部の態様では、表面を操作されたＥＶ、例えばエクソソームは、ＥＶ、例えばエクソソームの表面に露出され得るか、又はＥＶ、例えばエクソソームの表面に露出された部分のアンカーポイント（結合）となり得る、外因性タンパク質（すなわち、ＥＶ、例えばエクソソームが天然には発現しないタンパク質）又はその断片若しくはバリアントを含む。他の態様では、表面を操作されたＥＶ、例えばエクソソームは、ＥＶ、例えばエクソソームの表面に露出され得るか、又はＥＶ、例えばエクソソームの表面に露出された部分のアンカーポイント（結合）となり得る、より高い発現の（例えば、より多数の）天然のＥＶ、例えばエクソソームのタンパク質（例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ）又はその断片若しくはバリアントを含む。具体的な態様では、表面を操作されたＥＶ、例えばエクソソームは、１つ又は複数の膜構成成分、例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘなどのタンパク質、脂質、小分子、炭水化物、又はこれらの組合せの修飾を含み、構成成分の少なくとも１つは、本明細書で開示されているリンカー、スペーサー、又はこれらの組合せを介して、生物学的に活性な分子に共有結合されている。
[00148]本明細書で使用される場合、用語「治療有効量」は、それを必要とする対象に所望の治療効果、薬理学的効果及び／又は生理学的効果をもたらすのに十分である、本開示のＥＶ又はエクソソームを含む試薬又は医薬化合物の量である。治療有効量は、予防を治療と考えることができるため、「予防有効量」であり得る。
[00149]用語「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、又は「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、本明細書で使用される場合、例えば、疾患又は状態の重症度の低減；疾患経過期間の低減；疾患又は状態に関連する１つ又は複数の症状の軽快又は排除；疾患又は状態を必ずしも治癒させることなく、疾患又は状態を有する対象に有益な効果を提供することを指す。この用語は、疾患若しくは状態又はその症状の予防又は防止も含む。一態様では、用語「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」又は「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、対象において抗原に対する免疫応答を誘導することを意味する。
[00150]本明細書で使用される場合、分子（例えば、機能的分子、抗原、又はＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘ）の「バリアント」という用語は、当技術分野で公知の方法によって比較すると、別の分子とある特定の構造的及び機能的同一性を共有する分子を指す。例えば、タンパク質のバリアントは、別のタンパク質における置換、挿入、欠失、フレームシフト又は再配列を含み得る。
[00151]一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘのバリアント又は誘導体は、完全長の、成熟ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、若しくはＡＴＰトランスポータータンパク質に対して少なくとも約７０％の同一性を有するＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘバリアント、又はＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、若しくはＡＴＰトランスポータータンパク質の断片（例えば、機能的断片）を含む。
[00152]一部の態様では、本明細書で開示されているＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘタンパク質のバリアント若しくはその断片のバリアント、又はその誘導体は、ＥＶ、例えばエクソソームを特異的に標的とする能力を保持する。一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ又はＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘ誘導体は、１つ又は複数の変異、例えば保存的アミノ酸置換を含む。
[00153]天然に存在するバリアントは、「対立遺伝子バリアント」と呼ばれ、生物の染色体上の所与の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代替形態のうちの１つを指す（Ｇｅｎｅｓ ＩＩ、Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５））。これらの対立遺伝子バリアントは、ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドレベルで変化する可能性があり、本開示に含まれる。或いは、天然に存在しないバリアントは、突然変異誘発技法又は直接的合成によって産生され得る。
[00154]タンパク質操作及び組換えＤＮＡ技術の公知の方法を使用して、ポリペプチドの特徴を改善又は変更するためにバリアントが生成され得る。例えば、１つ又は複数のアミノ酸は、生物学的機能を実質的に喪失させずに、分泌タンパク質のＮ末端又はＣ末端から欠失され得る。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｏｎら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：２９８４～２９８８頁（１９９３）は、３、８、又は２７個のアミノ末端のアミノ酸残基を欠失させた後にもヘパリン結合活性を有するバリアントＫＧＦタンパク質を報告した。同様に、インターフェロンガンマは、このタンパク質のカルボキシ末端から８～１０個のアミノ酸残基を欠失させた後に、最大１０倍高い活性を呈した。（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｄｏｂｅｌｉら、Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１９９～２１６頁（１９８８））。
[00155]さらに、バリアントが天然に存在するタンパク質と同様の生物活性を保持することが多いことを実証する十分な証拠がある。例えば、Ｇａｙｌｅ及び共同研究者（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ２６８：２２１０５～２２１１１頁（１９９３））は、ヒトサイトカインＩＬ－１ａの広範な変異解析を行った。彼らは、ランダム突然変異誘発を使用して、３，５００個を超える個々のＩＬ－１ａ変異体を生成し、分子の全長にわたってバリアント当たり平均２．５個のアミノ酸を変化させた。複数の変異が、可能性のあるすべてのアミノ酸位置で調査された。研究者らは、「分子の大部分が、（結合又は生物活性）にほとんど影響を与えることなく変更され得る」ことを発見した。（要約を参照されたい）。実際、調査された３５００を超えるヌクレオチド配列のうち、野生型と活性が有意に異なるタンパク質を産生したのは、２３個の固有のアミノ酸配列だけであった。
[00156]上述したように、バリアント又は誘導体は、例えば、修飾されたポリペプチドを含む。一部の態様では、例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖タンパク質のバリアント又は誘導体は、化学修飾及び／又は内因性修飾の結果である。一部の態様では、バリアント又は誘導体は、ｉｎ ｖｉｖｏ修飾の結果である。一部の態様では、バリアント又は誘導体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ修飾の結果である。さらに他の態様では、バリアント又は誘導体は、産生細胞における細胞内修飾の結果である。
[00157]バリアント又は誘導体に存在する修飾としては、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合による架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ－カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカーの形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｍｅｉら、Ｂｌｏｏｄ １１６：２７０～７９頁（２０１０））、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などの転移ＲＮＡに媒介されるタンパク質へのアミノ酸付加、及びユビキチン化が挙げられる。
[00158]一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、任意の都合のよい位置で修飾され得る。一部の態様では、生物学的に活性な分子は、任意の都合のよい位置で修飾され得る。本開示の特定の態様では、ＥＶ、例えばエクソソームの構成成分（例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘなどのタンパク質、脂質、又はグリカン）及び／又は生物学的に活性な分子（例えば、抗体若しくはＡＤＣ、ＰＲＯＴＡＣ、環状ジヌクレオチドなどの小分子、ＭＭＡＥなどの毒素、ＳＴＩＮＧアゴニスト、寛容化剤、又はアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、本明細書で開示されている少なくとも１つのリンカー、スペーサー、又はこれらの組合せを含む誘導体を得るために修飾され得る。
ＩＩ．最適化リンカーを含むＥＶ（例えば、エクソソーム）
[00159]細胞外ベシクル（ＥＶ）は、典型的には、２０ｎｍ～１０００ｎｍの直径を有し、例えば、小さな細胞外ベシクルであるエクソソームは、典型的には、１００～２００ｎｍの直径を有する。ＥＶ、例えばエクソソームは、限定的な脂質二重層及びタンパク質と核酸の多様なセットから構成されている（Ｍａａｓ，Ｓ．Ｌ．Ｎ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２７（３）：１７２～１８８頁（２０１７））。ＥＶ、例えばエクソソームは、別個の細胞型及び組織において優先的な取込みを示し、標的細胞表面のレセプターと相互作用するタンパク質をその表面に加えることによって、これらの向性を対象とすることができる（Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ，Ｌ．ら、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２９（４）：３４１～３４５頁（２０１１））。
[00160]抗体と異なる、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、その表面に結合した多数の分子をＥＶ（例えば、エクソソーム）当たり数千～数万のオーダーで収容することができる。よって、ＥＶ（例えば、エクソソーム）－薬物コンジュゲートは、高濃度の治療用化合物を別個の細胞型に送達するプラットフォームを表すが、同時に化合物への全体的な全身曝露を制限し、次にオフターゲット毒性を低減する。ＥＶ（例えば、エクソソーム）表面での多数の分子の収容は、例えば、使用される生物学的に活性な分子の種類（例えば、抗体は、アンチセンスオリゴヌクレオチドよりも嵩高い）、使用される膜アンカーの種類（例えば、タンパク質アンカーは、脂質又は脂質とスペーサーアンカーよりも嵩高い）、及び生物学的に活性な分子と膜アンカーとを接続させるリンカーとスペーサーとの組合せによって影響され得る。この点で、本開示は、生物学的に活性な分子（例えば、ＡＳＯ）と膜アンカー（例えば、脂質）とを接続させるリンカーとスペーサーとの特定の組合せを提供し、膜アンカーは、生物学的に活性な分子をＥＶ（例えば、エクソソーム）の表面に結合させる。
[00161]一部の態様では、本開示は、直接的に又は例えば、１つ若しくは複数のリンカーの組合せを介して間接的に、１つ又は複数のアンカー部分（ＡＭ）に、例えば共有結合した「生物学的に活性な分子」（ＢＡＭ）、例えばＡＳＯを提供する。アンカー部分を、ＥＶ、例えばエクソソームの脂質二重層中に挿入し、エクソソームにＢＡＭ、例えばＡＳＯを負荷させ得る。現在、極性ＢＡＭ、例えばＡＳＯのための送達ビヒクルとして、エクソソームを商業化するための主な障害は、負荷が非常に非効率的であることである。本明細書で示されているように、この障害は、ＢＡＭをＥＶ、例えばエクソソームに負荷する前に、ＢＡＭをＡＭに接続させる特定のリンカー／スペーサーの組合せ（すなわち、「最適化リンカー」）を使用することによって克服することができる。よって、本明細書に記載されているように、最適化リンカーの使用は、ＢＡＭ、例えばＡＳＯの、ＥＶ、例えばエクソソームへの負荷を容易にする。
[00162]ＥＶ（例えば、エクソソーム）に、本明細書で示される最適化リンカーを介してＡＭ（例えば、ステロールなどの脂質）に接続されたＢＡＭ、例えば、ＡＳＯを含む構築物を負荷する組成物及び方法は、例えば、電気穿孔又はカチオン性脂質トランスフェクションによって未修飾のＢＡＭをＥＶ（例えば、エクソソーム）に導入する場合に以前に報告された負荷効率及びＢＡＭ密度と比較して、負荷効率及びＢＡＭ密度を有意に改善する。本明細書で開示されている組成物及び方法はまた、例えば、電気穿孔又はカチオン性脂質トランスフェクションによって修飾されていないＢＡＭがＥＶ（例えば、エクソソーム）に導入された場合に、以前に報告された効力と比較して、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の効力を有意に改善する。
[00163]例えば、膜アンカー部分（例えば、脂質又は脂質とスペーサー）、生物学的に活性な分子、及びリンカー又はこれらの組合せを含む本出願で開示されている構築物の一般的構成を示す略図が図２に示されている。
[00164]本開示のリンカー、例えば膜アンカー（脂質）、スペーサー及びこれらの組合せ、並びにこれらの化学合成に使用される化合物（例えば、ホスホラミダイト）に重要な例示的な構築ブロックが図３及び４に示されている。具体的な構築ブロックは、図１１にも表される。例示的な構築物は、例えば、図５、図６及び図９Ａに示されている。
[00165]本開示は、式：
［ＡＭ］－Ｌ１－［ＳＰ１］－Ｌ２－［ＳＰ２］－Ｌ３－［ＢＡＭ］（式１）
（式中、
［ＡＭ］は、アンカー部分であり、
Ｌ１は、切断性又は非切断性の連結であり、
Ｌ２及びＬ３は、任意選択の切断性又は非切断性の連結であり、
ＳＰ１は、任意選択の第１のスペーサーであり、
ＳＰ２は、任意選択の第２のスペーサーである）
によるアンカー部分（ＡＭ）を介してＥＶに共有結合により連結した生物学的に活性な分子（ＢＡＭ）を含む細胞外ベシクル（ＥＶ）を提供する。
[00166]本明細書で使用される場合、用語「最適化リンカー」は、アンカー部分［ＡＭ］と生物活性分子［ＢＡＭ］とを接続させる、例えば、「連結」及び「スペーサー」を含む構造的エレメントの組合せを指す。本開示のこれらの最適化リンカーは、本開示の最適化リンカーの非存在下で、同じアンカー部分［ＡＭ］及び生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］を含む対応する構築物よりも、より効率的に、多数の生物活性分子（例えば、ＡＳＯ）をＥＶ（例えば、エクソソーム）の表面に負荷することを可能にする。言い換えれば、本明細書で開示されている構築物、例えば、式１［ＡＭ］－Ｌ１－［ＳＰ１］－Ｌ２－［ＳＰ２］－Ｌ３－［ＢＡＭ］の構築物は、構成［ＡＭ］－Ｌ１－［ＢＡＭ］を有する構築物に関して、（ｉ）より高いＥＶ負荷効率、（ｉｉ）より多数のＥＶ当たりの［ＢＡＭ］数、（ｉｉｉ）より高いＥＶ当たりの［ＢＡＭ］密度、（ｉｖ）より高い［ＢＡＭ］効力、又は（ｖ）これらのいずれかの組合せをもたらす。
[00167]本明細書で使用される場合、用語「連結」は、例えば、アンカー部分［ＡＭ］とスペーサー［ＳＰ］、スペーサー［ＳＰ］と生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］、又はアンカー部分［ＡＭ］と生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］とを接続させる任意の安定な結合又は化学基を指す。２つ以上のアンカー部分［ＡＭ］又は生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］が存在する構築物では、連結は、２つのアンカー部分又は２つの生物学的に活性な部分を接続させ得る。一部の態様では、「連結」は、結合、例えばホスホジエステル（切断性）又はホスホロチオエート（非切断性）結合であり得る。他の態様では、「連結」は、リンカー、例えば切断性又は非切断性のリンカーを含み得る。一部の態様では、連結は、複数のリンカー及び結合を含む可能性があり、例えばｐＨ、温度、酵素などの異なる刺激に応答し得る。
[00168]用語「スペーサー」は、本明細書で使用される場合、２つの間隔のあいた部分（例えば、生物学的に活性な分子）を共有結合により連結させて、通常安定な異なる分子にすることが可能な化学的部分を指す。一般に、スペーサーは、切断性ではない。例えば、スペーサーは、アルキル鎖、又はグリコール単位若しくはグリセロール単位の例によって形成されるポリマー鎖であり得る。
[00169]一部の態様では、本開示の「最適化リンカー」は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の表面での生物学的部位の凝集を防止する。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］と生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］とを接続させる最適化リンカーの長さは、約２ｎｍ～約３０ｎｍの間である。
[00170]一部の態様では、最適化リンカーの長さは、約２ｎｍ、約３ｎｍ、約４ｎｍ、約５ｎｍ、約６ｎｍ、約７ｎｍ、約８ｎｍ、約９ｎｍ、約１０ｎｍ、約１１ｎｍ、約１２ｎｍ、約１３ｎｍ、約１４ｎｍ、約１５ｎｍ、約１６ｎｍ、約１７ｎｍ、約１８ｎｍ、約１９ｎｍ、約２０ｎｍ、約２１ｎｍ、約２２ｎｍ、約２３ｎｍ、約２４ｎｍ、約２５ｎｍ、約２６ｎｍ、約２７ｎｍ、約２８ｎｍ、約２９ｎｍ、又は約３０ｎｍである。一部の態様では、最適化リンカーの長さは、少なくとも約２ｎｍ、少なくとも約３ｎｍ、少なくとも約４ｎｍ、少なくとも約５ｎｍ、少なくとも約６ｎｍ、少なくとも約７ｎｍ、少なくとも約８ｎｍ、少なくとも約９ｎｍ、少なくとも約１０ｎｍ、少なくとも約１１ｎｍ、少なくとも約１２ｎｍ、少なくとも約１３ｎｍ、少なくとも約１４ｎｍ、少なくとも約１５ｎｍ、少なくとも約１６ｎｍ、少なくとも約１７ｎｍ、少なくとも約１８ｎｍ、少なくとも約１９ｎｍ、少なくとも約２０ｎｍ、少なくとも約２１ｎｍ、少なくとも約２２ｎｍ、少なくとも約２３ｎｍ、少なくとも約２４ｎｍ、少なくとも約２５ｎｍ、少なくとも約２６ｎｍ、少なくとも約２７ｎｍ、少なくとも約２８ｎｍ、少なくとも約２９ｎｍ、又は少なくとも約３０ｎｍである。一部の態様では、最適化リンカーの長さは、約２ｎｍ未満、約３ｎｍ未満、約４ｎｍ未満、約５ｎｍ未満、約６ｎｍ未満、約７ｎｍ未満、約８ｎｍ未満、約９ｎｍ未満、約１０ｎｍ未満、約１１ｎｍ未満、約１２ｎｍ未満、約１３ｎｍ未満、約１４ｎｍ未満、約１５ｎｍ未満、約１６ｎｍ未満、約１７ｎｍ未満、約１８ｎｍ未満、約１９ｎｍ未満、約２０ｎｍ未満、約２１ｎｍ未満、約２２ｎｍ未満、約２３ｎｍ未満、約２４ｎｍ未満、約２５ｎｍ未満、約２６ｎｍ未満、約２７ｎｍ未満、約２８ｎｍ未満、約２９ｎｍ未満、又は約３０ｎｍ未満である。
[00171]一部の態様では、最適化リンカーの長さは、約２ｎｍ～約４ｎｍ、約３ｎｍ～約５ｎｍ、約４ｎｍ～約６ｎｍ、約５ｎｍ～約７ｎｍ、約６ｎｍ～約８ｎｍ、約７ｎｍ～約９ｎｍ、約８ｎｍ～約１０ｎｍ、約９ｎｍ～約１１ｎｍ、約１０ｎｍ～約１２ｎｍ、約１１ｎｍ～約１３ｎｍ、約１２ｎｍ～約１４ｎｍ、約１３ｎｍ～約１５ｎｍ、約１４ｎｍ～約１６ｎｍ、約１５ｎｍ～約１７ｎｍ、約１６ｎｍ～約１８ｎｍ、約１７ｎｍ～約１９ｎｍ、約１８ｎｍ～約２０ｎｍ、約１９ｎｍ～約２１ｎｍ、約２０ｎｍ～約２２ｎｍ、約２１ｎｍ～約２３ｎｍ、約２２ｎｍ～約２４ｎｍ、約２３ｎｍ～約２５ｎｍ、約２４ｎｍ～約２６ｎｍ、約２５ｎｍ～約２７ｎｍ、約２６ｎｍ～約２８ｎｍ、約２７ｎｍ～約２９ｎｍ、約２８ｎｍ～約３０ｎｍ、約２ｎｍ～約６ｎｍ、約４ｎｍ～約８ｎｍ、約６ｎｍ～約１０ｎｍ、約８ｎｍ～約１２ｎｍ、約１０ｎｍ～約１４ｎｍ、約１２ｎｍ～約１６ｎｍ、約１４ｎｍ～約１８ｎｍ、約１６ｎｍ～約２０ｎｍ～ａｂｏｕｔ、約１８ｎｍ～約２２ｎｍ、約２０ｎｍ～約２４ｎｍ、約２２ｎｍ～約２６ｎｍ、約２４ｎｍ～約２８ｎｍ、約２６ｎｍ～約３０ｎｍ、約２ｎｍ～約１０ｎｍ、約４ｎｍ～約１２ｎｍ、約６ｎｍ～約１４ｎｍ、約８ｎｍ～約１６ｎｍ、約１０ｎｍ～約１８ｎｍ、約１２ｎｍ～約２０ｎｍ、約１４ｎｍ～約２２ｎｍ、約１６ｎｍ～約２４ｎｍ、約１８ｎｍ～約２６ｎｍ、約２０ｎｍ～約２８ｎｍ、約２２ｎｍ～約３０ｎｍ、約２ｎｍ～約１２ｎｍ、約４ｎｍ～約１４ｎｍ、約６ｎｍ～約１６ｎｍ、約８ｎｍ～約１８ｎｍ、約１０ｎｍ～約２０ｎｍ、約１２ｎｍ～約２２ｎｍ、約１４ｎｍ～約２４ｎｍ、約１６ｎｍ～約２６ｎｍ、約１８ｎｍ～約２８ｎｍ、約２０ｎｍ～約３０ｎｍ、約２ｎｍ～約５ｎｍ、約５ｎｍ～約１０ｎｍ、約１０ｎｍ～約１５ｎｍ、約１５ｎｍ～約２０ｎｍ、約２０ｎｍ～約２５ｎｍ、又は約２５ｎｍ～約３０ｎｍである。
[00172]一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、ステロール、脂質（例えば、リン脂質）、ビタミン、ペプチド、又はこれらの組合せ及び任意選択でリンカー又はスペーサーを含む。一般に、ＡＭは、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の脂質二重層中に挿入する、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の表面と静電的に相互作用する、又はこれらの組合せが可能ないずれかの疎水性部分又はその組合せを含み得る。
[00173]一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、例えば、疎水性部分（例えば、ステロールなどの脂質）及びスペーサーを含む可能性があり、スペーサーは、アルキルスペーサー、一般に直鎖アルキルスペーサーである。一部の態様では、疎水性部分に結合したアルキルスペーサーは、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４又はＣ１５からなる群から選択され、Ｃは、メチル単位（炭素単位）を示し、数は、アルキルスペーサー中のメチル単位（炭素単位）の数を示す。一部の態様では、アルキルスペーサーは、単一の炭素単位（Ｃ１）を含む。一部の態様では、アルキルスペーサーはＣ２である。一部の態様では、アルキルスペーサーはＣ３である。一部の態様では、アルキルスペーサーはＣ４である。一部の態様では、アルキルスペーサーはＣ５である。一部の態様では、アルキルスペーサーはＣ６である。一部の態様では、アルキルスペーサーはＣ７である。一部の態様では、アルキルスペーサーはＣ８である。一部の態様では、アルキルスペーサーはＣ９である。一部の態様では、アルキルスペーサーはＣ１０である。一部の態様では、アルキルスペーサーはＣ１１である。一部の態様では、アルキルスペーサーはＣ１２である。一部の態様では、アルキルスペーサーはＣ１３である。一部の態様では、アルキルスペーサーはＣ１４である。一部の態様では、アルキルスペーサーはＣ１５である。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］のステロール、脂質、ビタミン、又はペプチドに結合したスペーサーは、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、又はＣ１５直鎖アルキルスペーサーのものと長さが等しい任意の分子又はこれらの組合せである。
[00174]一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、例えば、疎水性部分（例えば、ステロールなどの脂質）及びスペーサーを含む可能性があり、スペーサーは、グリコールスペーサーである。一部の態様では、グリコールスペーサーは、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）、ペンタエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）、ヘプタエチレングリコール、オクタエチレングリコール、ノナエチレングリコール、又はデカエチレングリコールからなる群から選択される。一部の態様では、グリコールスペーサーは、１１、１２、１３、１４又は１５個のグリコール単位を含み得る。一部の態様では、グリコールスペーサーはＨＥＧである。一部の態様では、グリコールスペーサーはＴＥＧである。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］のステロール、脂質、ビタミン、又はペプチドに結合したスペーサーは、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）、ペンタエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）、ヘプタエチレングリコール、オクタエチレングリコール、ノナエチレングリコール、又はデカエチレングリコールリンカーのものと長さが等しい任意の分子又はこれらの組合せである。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］のステロール、脂質、ビタミン、又はペプチドに結合したスペーサーは、１１、１２、１３、１４、又は１５個のグリコール単位を有するグリコールスペーサーのものと長さが等しい任意の分子又はこれらの組合せである。
[00175]一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、ステロールを含み、ステロールは、コレステロール、エルゴステロール、７－デヒドロコレステロール、２４Ｓ－ヒドロキシコレステロール、ラノステロール、シクロアルテノール、フコステロール、サリンゴステロール、カンペステロール、β－シトステロール、シトスタノール、コプロスタノール、アベナステロール、スチグマステロール、又はこれらの組合せからなる群から選択される。一部の具体的な態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、コレステロールを含む。
[00176]一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、脂肪酸、例えば直鎖脂肪酸を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、直鎖脂肪酸、分岐脂肪酸、不飽和脂肪酸、モノ不飽和脂肪酸、ポリ不飽和脂肪酸、ヒドロキシ脂肪酸、ポリカルボン酸、又はこれらの任意の組合せを含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。例えば、一部の態様では、直鎖脂肪酸は、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、又はこれらの組合せを含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。一部の具体的な態様では、直鎖脂肪酸は、パルミチン酸である。
[00177]一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、リン脂質、例えばレシチン、ホスファチジルコリン、ホスホイノシトール、ホスホスフィンゴ脂質、ホスホエタノールアミン、ホスファチジン酸、又はこれらの組合せを含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。
[00178]一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、ビタミン、例えばビタミンＥ（トコフェロール又はトコトリエノール）、ビタミンＤ（例えば、ビタミンＤ２若しくはエルゴカルシフェロール、ビタミンＤ３若しくはコレカルシフェロール、又はこれらの組合せ）、ビタミンＫ、リボフラビン、ナイアシン、ピリドキシン、又はこれらの組合せを含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。
[00179]本開示の文脈では、アンカー部分［ＡＭ］における脂質部分、例えば様々な脂肪酸、様々なステロール、様々なビタミン、又はこれらの組合せは、構築物集団中の本明細書で開示されている構築物の一部、例えば式１の構築物が、様々な脂質部分を有し得ることを意味する。例えば、同じ生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］では、式１の構築物の一部は、様々なアンカー部分［ＡＭ］を有してもよく、例えば、一部は脂肪酸を含んでもよく、一方他の部分はビタミン又はステロールを含んでもよい。異なる脂質部分を有する構築物の組合せを選択することにより、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の膜の脂質でより良好なパッキングが一般にもたらされ、より高い負荷効率及びＢＡＭ密度がもたらされ得る。
[00180]一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、ビタミンを含む。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、ビタミンからなる。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、ビタミン及びアルキルスペーサーを含む。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、ビタミン及びアルキルスペーサーからなる。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、トコフェロール及びアルキルスペーサーを含む。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、トコフェロール及びアルキルスペーサーからなる。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、ビタミン及びオクチル（Ｃ８）アルキルスペーサーを含む。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、ビタミン及びオクチル（Ｃ８）アルキルスペーサーからなる。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、トコフェロール及びオクチル（Ｃ８）アルキルスペーサーを含む。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、トコフェロール及びオクチル（Ｃ８）アルキルスペーサーからなる。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、トコフェロールを含む。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、トコフェロールからなる。
[00181]一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、脂肪酸及びアルキルスペーサーを含む。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、脂肪酸及びアルキルスペーサーからなる。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、パルミチン酸及びアルキルスペーサーを含む。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、パルミチン酸及びアルキルスペーサーからなる。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、脂肪酸及びヘキシル（Ｃ６）アルキルスペーサーを含む。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、脂肪酸及びヘキシル（Ｃ６）アルキルスペーサーからなる。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、パルミチン酸及びヘキシル（Ｃ６）アルキルスペーサーを含む。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、パルミチン酸及びヘキシル（Ｃ６）アルキルスペーサーからなる。
[00182]一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、ステロール及びグリコールスペーサーを含む。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、ステロール及びグリコールスペーサーからなる。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、コレステロール及びグリコールスペーサーを含む。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、コレステロール及びグリコールスペーサーからなる。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、ステロール及びＴＥＧグリコールスペーサーを含む。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、ステロール及びＴＥＧグリコールスペーサーからなる。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、コレステロール及びＴＥＧグリコールスペーサーを含む。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、コレステロール及びＴＥＧグリコールスペーサーからなる。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、ステロール及びアルキルスペーサーを含む。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、ステロール及びアルキルスペーサーからなる。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、ステロール及びヘキシル（Ｃ６）アルキルスペーサーを含む。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、ステロール及びヘキシル（Ｃ６）アルキルスペーサーからなる。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、コレステロール及びアルキルスペーサーを含む。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、コレステロール及びアルキルスペーサーからなる。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、コレステロール及びヘキシル（Ｃ６）アルキルスペーサーを含む。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、コレステロール及びヘキシル（Ｃ６）アルキルスペーサーからなる。
[00183]一部の態様では、Ｌ１は、ホスホジエステル結合を含む切断性連結である。一部の態様では、Ｌ１は、ホスホロチオエート結合を含む非切断性連結である。一部の態様では、Ｌ２は、ホスホジエステル結合を含む任意選択の切断性連結である。一部の態様では、Ｌ２は、ホスホロチオエート結合を含む任意選択の非切断性連結である。一部の態様では、Ｌ３は、ホスホジエステル結合を含む任意選択の切断性連結である。一部の態様では、Ｌ３は、ホスホロチオエート結合を含む任意選択の非切断性連結である。
[00184]一部の態様では、Ｌ１は、ホスホジエステル結合である。一部の態様では、Ｌ１は、ホスホロチオエート結合である。一部の態様では、Ｌ２は、ホスホジエステル結合である。一部の態様では、Ｌ２は、ホスホロチオエート結合である。一部の態様では、Ｌ３は、ホスホジエステル結合である。一部の態様では、Ｌ３は、ホスホロチオエート結合である。
[00185]一部の態様では、Ｌ１、Ｌ２、又はＬ３はそれぞれ、ホスホジエステル又はホスホロチオエート結合、及び本明細書で開示されている１つ又は複数の切断性又は非切断性のリンカー又はスペーサーを独立的に含む。
[00186]一部の態様では、任意選択の第１のスペーサーであるＳＰ１及び／又は任意選択の第２のスペーサーであるＳＰ２は、スペーサー（例えば、アルキルスペーサー又はグリコールスペーサー）、又はこれらの組合せを独立的に含む。一部の態様では、任意選択の第１のスペーサーであるＳＰ１は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、又はＣ１５であるアルキルスペーサーを含むか又はそれからなる。一部の態様では、ＳＰ１は、Ｃ３又はＣ６アルキルスペーサーである。一部の態様では、任意選択の第１のスペーサーであるＳＰ２は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、又はＣ１５であるアルキルスペーサーを含むか又はそれからなる。一部の態様では、ＳＰ２は、Ｃ３又はＣ６アルキルスペーサーである。
[00187]一部の態様では、任意選択の第１のスペーサーであるＳＰ１は、２（ジエチレングリコール）、３（トリエチレングリコール）、４（テトラエチレングリコール；ＴＥＧ）、５（ペンタエチレングリコール）、６（ヘキサエチレングリコール；ＨＥＧ）、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のグリコール単位を有するグリコールスペーサーを含むか又はそれからなる。一部の態様では、Ｓ１は、テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）又はヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）のグリコールスペーサーである。一部の態様では、任意選択の第１のスペーサーであるＳＰ２は、２（ジエチレングリコール）、３（トリエチレングリコール）、４（テトラエチレングリコール；ＴＥＧ）、５（ペンタエチレングリコール）、６（ヘキサエチレングリコール；ＨＥＧ）、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のグリコール単位を有するグリコールスペーサーを含むか又はそれからなる。一部の態様では、Ｓ２は、テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）又はヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）のグリコールスペーサーである。
[00188]一部の態様では、ＳＰ１スペーサーはアルキルスペーサーを含み、ＳＰ２スペーサーもアルキルスペーサーを含む。一部の態様では、ＳＰ１スペーサーはグリコールスペーサーを含み、ＳＰ２スペーサーもグリコールスペーサーを含む。一部の態様では、ＳＰ１スペーサーはアルキルスペーサーを含み、ＳＰ２スペーサーはグリコールスペーサーを含む。一部の態様では、ＳＰ１スペーサーはグリコールスペーサーを含み、ＳＰ２スペーサーはアルキルスペーサーを含む。一部の態様では、ＳＰ１スペーサーはアルキルスペーサーからなり、ＳＰ２スペーサーもアルキルスペーサーからなる。一部の態様では、ＳＰ１スペーサーはグリコールスペーサーからなり、ＳＰ２スペーサーもグリコールスペーサーからなる。一部の態様では、ＳＰ１スペーサーはアルキルスペーサーからなり、ＳＰ２スペーサーはグリコールスペーサーからなる。一部の態様では、ＳＰ１スペーサーはグリコールスペーサーからなり、ＳＰ２スペーサーはアルキルスペーサーからなる。
[00189]一部の態様では、各非切断性スペーサーは、アルキル（例えば、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７又はＣ８）、グリコール（例えば、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）、ペンタエチレングリコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、グリセロール（例えば、ジグリセロール、トリグリセロール、テトラグリセロール（ＴＧ）、ペンタグリセロール、ヘキサグリセロール（ＨＧ）、ポリグリセロール（ＰＧ））、スクシンイミド、マレイミド、又はこれらの任意の組合せからなる群から独立的に選択される。
[00190]一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］のスペーサー、第１の（近位の）スペーサー［ＳＰ１］、第２の（遠位の）スペーサー［ＳＰ２］、又はこれらの任意の組合せは、式Ｒ１－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－又はＲ１－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－Ｏ－（式中、Ｒ１は、水素、メチル又はエチルであり、ｎは、１～１５の間の整数である）によって特徴付けられるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むか又はそれからなり得る。よって、一部の態様では、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５である。これらのＰＥＧは、それぞれ、ＰＥＧ１、ＰＥＧ２、ＰＥＧ３、ＰＥＧ４、ＰＥＧ５、ＰＥＧ６、ＰＥＧ７、ＰＥＧ８、ＰＥＧ９、ＰＥＧ１０、ＰＥＧ１１、ＰＥＧ１２、ＰＥＧ１３、ＰＥＧ１４若しくはＰＥＧ１５、又はＰＥＧ１－Ｏ－、ＰＥＧ２－Ｏ－、ＰＥＧ３－Ｏ－、ＰＥＧ４－Ｏ－、ＰＥＧ５－Ｏ－、ＰＥＧ６－Ｏ－、ＰＥＧ７－Ｏ－、ＰＥＧ８－Ｏ－、ＰＥＧ９－Ｏ－、ＰＥＧ１０－Ｏ－、ＰＥＧ１１－Ｏ－、ＰＥＧ１２－Ｏ－、ＰＥＧ１３－Ｏ－、ＰＥＧ１４－Ｏ－若しくはＰＥＧ１５－Ｏ－と記載され得る。
[00191]一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］のスペーサー、第１の（近位の）スペーサー［ＳＰ１］、第２の（遠位の）スペーサー［ＳＰ２］、又はこれらの任意の組合せは、式（（Ｒ１－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨＯＨ－ＣＨ２Ｏ）ｎ－）（式中、Ｒ１は、水素、メチル又はエチルであり、ｎは、１～１５の間の整数である）によって特徴付けられるポリグリセロール（ＰＧ）を含むか又はそれからなり得る。よって、一部の態様では、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５である。これらのＰＥＧは、ＰＧ１、ＰＧ２、ＰＧ３、ＰＧ４、ＰＧ５、ＰＧ６、ＰＧ７、ＰＧ８、ＰＧ９、ＰＧ１０、ＰＧ１１、ＰＧ１２、ＰＧ１３、ＰＧ１４又はＰＧ１５と記載され得る。
[00192]一部の態様では、Ｌ１、Ｌ２、若しくはＬ３連結、又はこれらの任意の組合せは、酸化還元切断性リンカー、活性酸素種切断性リンカー、ｐＨ依存性切断性リンカー、酵素切断性リンカー、プロテアーゼ切断性リンカー、エステラーゼ切断性リンカー、ホスファターゼ切断性リンカー、光活性化切断性リンカー、自己犠牲リンカー、又はこれらの任意の組合せを含む切断性連結を含むか又はそれからなり得る。一部の態様では、Ｌ１連結は、酸化還元切断性リンカー、活性酸素種切断性リンカー、ｐＨ依存性切断性リンカー、酵素切断性リンカー、プロテアーゼ切断性リンカー、エステラーゼ切断性リンカー、ホスファターゼ切断性リンカー、光活性化切断性リンカー、自己犠牲リンカー、又はこれらの任意の組合せを含む切断性連結を含む。一部の態様では、Ｌ１連結は、酸化還元切断性リンカー、活性酸素種切断性リンカー、ｐＨ依存性切断性リンカー、酵素切断性リンカー、プロテアーゼ切断性リンカー、エステラーゼ切断性リンカー、ホスファターゼ切断性リンカー、光活性化切断性リンカー、自己犠牲リンカー、又はこれらの任意の組合せを含む切断性連結からなる。一部の態様では、Ｌ２連結は、酸化還元切断性リンカー、活性酸素種切断性リンカー、ｐＨ依存性切断性リンカー、酵素切断性リンカー、プロテアーゼ切断性リンカー、エステラーゼ切断性リンカー、ホスファターゼ切断性リンカー、光活性化切断性リンカー、自己犠牲リンカー、又はこれらの任意の組合せを含む切断性連結を含む。一部の態様では、Ｌ２連結は、酸化還元切断性リンカー、活性酸素種切断性リンカー、ｐＨ依存性切断性リンカー、酵素切断性リンカー、プロテアーゼ切断性リンカー、エステラーゼ切断性リンカー、ホスファターゼ切断性リンカー、光活性化切断性リンカー、自己犠牲リンカー、又はこれらの任意の組合せを含む切断性連結からなる。一部の態様では、Ｌ３連結は、酸化還元切断性リンカー、活性酸素種切断性リンカー、ｐＨ依存性切断性リンカー、酵素切断性リンカー、プロテアーゼ切断性リンカー、エステラーゼ切断性リンカー、ホスファターゼ切断性リンカー、光活性化切断性リンカー、自己犠牲リンカー、又はこれらの任意の組合せを含む切断性連結を含む。一部の態様では、Ｌ３連結は、酸化還元切断性リンカー、活性酸素種切断性リンカー、ｐＨ依存性切断性リンカー、酵素切断性リンカー、プロテアーゼ切断性リンカー、エステラーゼ切断性リンカー、ホスファターゼ切断性リンカー、光活性化切断性リンカー、自己犠牲リンカー、又はこれらの任意の組合せを含む切断性連結からなる。
[00193]一部の態様では、本明細書で開示されている切断性連結、例えば、Ｌ１、Ｌ２、若しくはＬ３連結又はこれらの任意の組合せは、自己犠牲リンカー（例えば、ｐ－アミノベンジルカルバメート、ｐＡＢＣ）を含むか又はそれからなる。一部の態様では、Ｌ１は、自己犠牲リンカー（例えば、ｐ－アミノベンジルカルバメート、ｐＡＢＣ）を含む。一部の態様では、Ｌ１は、自己犠牲リンカー（例えば、ｐ－アミノベンジルカルバメート、ｐＡＢＣ）からなる。一部の態様では、Ｌ２は、自己犠牲リンカー（例えば、ｐ－アミノベンジルカルバメート、ｐＡＢＣ）を含む。一部の態様では、Ｌ２は、自己犠牲リンカー（例えば、ｐ－アミノベンジルカルバメート、ｐＡＢＣ）からなる。一部の態様では、Ｌ３は、自己犠牲リンカー（例えば、ｐ－アミノベンジルカルバメート、ｐＡＢＣ）を含む。一部の態様では、Ｌ３は、自己犠牲リンカー（例えば、ｐ－アミノベンジルカルバメート、ｐＡＢＣ）からなる。
[00194]一部の態様では、本明細書で開示されている切断性連結、例えば、Ｌ１、Ｌ２、若しくはＬ３連結又はこれらの任意の組合せは、シンナミル基、ナフチル基、ビフェニル基、複素環式環、ホモ芳香族基、クマリン、フラン、チオフェン、チアゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、ピロール、ピラゾール、ピリジン、イミダゾン、トリアゾール、又はこれらの任意の組合せを含むか又はそれからなる。一部の態様では、Ｌ１は、シンナミル基、ナフチル基、ビフェニル基、複素環式環、ホモ芳香族基、クマリン、フラン、チオフェン、チアゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、ピロール、ピラゾール、ピリジン、イミダゾン、トリアゾール、又はこれらの任意の組合せからなる群から選択される切断性リンカーを含む。一部の態様では、Ｌ１は、シンナミル基、ナフチル基、ビフェニル基、複素環式環、ホモ芳香族基、クマリン、フラン、チオフェン、チアゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、ピロール、ピラゾール、ピリジン、イミダゾン、トリアゾール、又はこれらの任意の組合せからなる群から選択される切断性リンカーからなる。一部の態様では、Ｌ２は、シンナミル基、ナフチル基、ビフェニル基、複素環式環、ホモ芳香族基、クマリン、フラン、チオフェン、チアゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、ピロール、ピラゾール、ピリジン、イミダゾン、トリアゾール、又はこれらの任意の組合せからなる群から選択される切断性リンカーを含む。一部の態様では、Ｌ２は、シンナミル基、ナフチル基、ビフェニル基、複素環式環、ホモ芳香族基、クマリン、フラン、チオフェン、チアゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、ピロール、ピラゾール、ピリジン、イミダゾン、トリアゾール、又はこれらの任意の組合せからなる群から選択される切断性リンカーからなる。一部の態様では、Ｌ３は、シンナミル基、ナフチル基、ビフェニル基、複素環式環、ホモ芳香族基、クマリン、フラン、チオフェン、チアゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、ピロール、ピラゾール、ピリジン、イミダゾン、トリアゾール、又はこれらの任意の組合せからなる群から選択される切断性リンカーを含む。一部の態様では、Ｌ３は、シンナミル基、ナフチル基、ビフェニル基、複素環式環、ホモ芳香族基、クマリン、フラン、チオフェン、チアゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、ピロール、ピラゾール、ピリジン、イミダゾン、トリアゾール、又はこれらの任意の組合せからなる群から選択される切断性リンカーからなる。
[00195]一部の態様では、本明細書で開示されている切断性連結、例えば、Ｌ１、Ｌ２、若しくはＬ３連結又はこれらの任意の組合せは、式：
－Ａａ－Ｙｙ－
（式中、各－Ａ－は、独立的にアミノ酸単位又はその組合せであり、ａは、独立的に１～１５の整数であり；－Ｙ－は、スペーサー単位であり、ｙは、０、１、又は２である）を有する連結（一般に、ジペプチド又はトリペプチドリンカー）を含むか又はそれからなる。一部の態様では、Ｌ１は、上記－Ａａ－Ｙｙ－リンカーを含むか又はそれからなる。一部の態様では、Ｌ２は、上記－Ａａ－Ｙｙ－リンカーを含むか又はそれからなる。一部の態様では、Ｌ３は、上記－Ａａ－Ｙｙ－リンカーを含むか又はそれからなる。
[00196]一部の態様では、－Ａａ－は、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、又はヘキサペプチドである。ａが２（すなわち、ジペプチド切断性リンカー）である一部の態様では、－Ａａ－は、バリン－アラニン、バリン－シトルリン、フェニルアラニン－リシン、Ｎ－メチルバリン－シトルリン、シクロヘキシルアラニン－リシン、及びベータ－アラニン－リシンからなる群から選択される。ａが３（すなわち、トリペプチド切断性リンカー）である一部の態様では、－Ａａ－は、グルタミン酸－バリン－シトルリンである。一部の態様では、ｙは１であり、すなわち、式－Ａａ－Ｙｙ－の切断性リンカーは単一のスペーサーを含む。一部の態様では、式－Ａａ－Ｙｙ－の切断性リンカーは、２つ以上のスペーサー、例えば２つのスペーサーを含み得る。一部の態様では、２つのスペーサーは同一である。他の態様では、２つのスペーサーは異なる。一部の態様では、単一のスペーサーは、切断性であっても又は非切断性であってもよい。一部の態様では、第１のスペーサー（Ａａに対して近位の）は切断性であってもよく、第２のスペーサー（Ａａに対して遠位の）は非切断性であってもよい。一部の態様では、第１のスペーサー（Ａａに対して近位の）は非切断性であってもよく、第２のスペーサー（Ａａに対して遠位の）は切断性であってもよい。一部の態様では、両方のスペーサーが非切断性であってもよい。一部の態様では、両方のスペーサーが切断性であってもよい。
[00197]一部の態様では、－Ｙ－スペーサーは、自己犠牲スペーサー、例えばｐ－アミノベンジルカルバメート（ｐＡＢＣ）であり得る。用語「自己犠牲スペーサー」は、本明細書で使用される場合、第２の部分（例えば、生物学的に活性な分子、連結、スペーサー、又はアンカー部分）への結合が切断された場合に、第１の部分（例えば、生物学的に活性な分子、連結、スペーサー、又はアンカー部分）から自発的に分離されるスペーサーを指す。
[00198]一部の態様では、－Ｙｙ－は、式：
Figure 2024506711000004
（式中、各Ｒ２は、独立的にＣ１～８アルキル、－Ｏ－（Ｃ１～８アルキル）、ハロゲン、ニトロ、又はシアノであり；ｍは、０～４の整数である）を有する。一部の態様では、ｍは、０、１、又は２である。一部の態様では、ｍは、０である。
[00199］一部の態様では、本明細書で開示されている切断性連結、例えば、Ｌ１、Ｌ２、若しくはＬ３連結又はこれらの任意の組合せは、バリン－アラニン－ｐ－アミノベンジルカルバメート又はバリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルカルバメートを含むか又はそれからなる。
[00200]一部の態様では、－Ｙ－は、非自己犠牲スペーサー、例えばペプチドスペーサーである。ペプチドスペーサーは、一般に、Ｇｌｙポリマー又はＧｌｙ／Ｓｅｒポリマーである。一部の態様では、－Ｙ－ペプチドスペーサーは、－Ｇｌｙ－又は－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－を含むか又はそれからなる。（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎスペーサーなどの他のペプチドスペーサーは、以下により詳細に開示されている。
[00201]一部の態様では、脂質、ビタミン、又はステロールに加えて又はその代わりに、アンカー部分［ＡＭ］が、足場タンパク質（例えば、ＰＴＧＦＲＮなどのＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘタンパク質又はその断片）、又はＥＶ（例えば、エクソソーム）に存在する足場タンパク質に結合し得る結合分子、例えば、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の表面で天然又は組換えによって発現したＰＴＧＲＮに特異的に結合し得る抗体若しくはその結合部分を含み得る。よって、一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］及び／又は足場部分は、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘである。
[00202]一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、プロスタグランジンＦ２受容体陰性調節因子（ＰＴＧＦＲＮタンパク質）；ベイシジン（ＢＳＧタンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２（ＩＧＳＦ２タンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（ＩＧＳＦ３タンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（ＩＧＳＦ８タンパク質）；インテグリンベータ－１（ＩＴＧＢ１タンパク質）；インテグリンアルファ－４（ＩＴＧＡ４タンパク質）；４Ｆ２細胞表面抗原重鎖（ＳＬＣ３Ａ２タンパク質）；ＡＴＰトランスポータータンパク質のクラス（ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ４タンパク質）；これらの機能的断片；及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される。一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、ＰＴＧＦＲＮタンパク質又はその機能的断片である。一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、配列番号３０２に示されるアミノ酸配列を含む。一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、配列番号３０２に対して少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一なアミノ酸配列を含む。様々なＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘタンパク質が以下に詳細に開示されている。
[00203]一部の態様では、生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］は、アンカー部分［ＡＭ］を介してＥＶの外部表面に結合されており、［ＡＭ］と［ＢＡＭ］は、本明細書で開示されている最適化リンカー（すなわち、上で開示されている特定の構成、構成成分、及び長さの制約を含むリンカー）によって接続されている。一部の態様では、生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］は、ポリペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）、化学化合物、又はこれらの任意の組合せを含むか又はそれからなる。
[00204]一部の態様では、生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］は、化学化合物、例えば小分子薬物を含む。一部の態様では、生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、核酸、抗ｍｉＲ、ＲＮＡデコイ、又はこれらの任意の組合せを含む。一部の態様では、ＡＳＯは、ギャップマーである。特定の核酸である生物学的に活性な分子、例えば特定の標的に対するＡＳＯ、例えば、ＮＬＲＰ３、ＳＴＡＴ６、ＣＥＢＰ／β、ＳＴＡＴ３、ＮＲａｓ、ＫＲＡＳ、又はＰｍｐ２２が以下に詳細に開示されている。
[00205]一部の態様では、生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］は、ペプチド、タンパク質、抗体若しくはその抗原結合部分、又はこれらの任意の組合せを含むか又はそれからなる。一部の態様では、その抗原結合部分は、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、及びＦｄ断片、ダイアボディ、抗体関連ポリペプチド、又はこれらの任意の断片を含む。一部の態様では、抗体及びその抗原結合部分は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の膜に存在するＰｒｏｔｅｉｎ Ｘタンパク質に結合し得る。
[00206]一部の態様では、生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］は、ＡＳＯを含むか又はそれからなる。一部の態様では、ＡＳＯは、タンパク質コード領域（エクソン）、非コード領域（例えば、５’若しくは３’非翻訳領域、又はイントロン）、イントロン－エクソン接合部、又は調節領域（例えば、プロモーター）を含む、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ又は成熟ｍＲＮＡを標的とし得る。一部の態様では、ＡＳＯは、タンパク質転写物、例えば、ＳＴＡＴ６転写物、ＣＥＢＰ／β転写物、ＳＴＡＴ３転写物、ＫＲＡＳ転写物、ＮＲＡＳ転写物、ＮＬＰＲ３転写物、又はこれらの任意の組合せを標的とする。特定の標的を対象とするＡＳＯについての詳細な説明が以下に与えられる。
[00207]本開示の一部の態様では、ＥＶは、エクソソーム、例えば、天然のエクソソーム、又は組換えタンパク質、例えばＰＴＧＦＲＮなどのＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘ若しくはその機能的部分を過剰発現するエクソソームである。様々なサイズ、組成、又は製造方法を含むエクソソームの種類が以下に詳細に開示されている。
[00208]本開示は、本明細書で開示されているＥＶ（細胞外ベシクル）（例えば、エクソソーム）を含む医薬組成物であって、本開示の最適化リンカーを含む式１の構築物などの構築物、及び薬学的に許容できる担体を含む、医薬組成物も提供する。本明細書で開示されているいずれかのＥＶ又は医薬組成物を含むキットであって、本開示の最適化リンカーを含む、式１の構築物などの構築物及び使用説明書を含む、キットも提供される。
[00209]本開示は、それを必要とする対象における疾患又は障害を処置又は防止する方法であって、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）又はこのようなＥＶ（例えば、エクソソーム）を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。一部の態様では、疾患又は障害は、がん、炎症性障害、神経変性障害、中枢神経疾患、又は代謝性疾患である。一部の態様では、本明細書で開示されているＥＶ（例えば、エクソソーム）は、静脈内、腹腔内、経鼻的、経口的、筋肉内、皮下、非経口的、髄腔内、腫瘍周囲、眼内、又は腫瘍内に投与され得る。
[00210]本開示は、生物学的に活性な部分［ＢＡＭ］をＥＶ（例えば、エクソソーム）に結合させる方法であって、アンカー部分（ＡＭ）をＥＶに連結させるステップを含み、アンカー部分［ＡＭ］が、式：
［ＡＭ］－Ｌ１－［ＳＰ１］－Ｌ２－［ＳＰ２］－Ｌ３－［ＢＡＭ］
（式中、［ＡＭ］は、アンカー部分であり；Ｌ１は、切断性又は非切断性の連結であり；Ｌ２及びＬ３は、任意選択の切断性又は非切断性の連結であり；ＳＰ１は、任意選択の第１のスペーサーであり；ＳＰ２は、任意選択の第２のスペーサーである）による生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］に結合している、方法を提供する。一部の態様では、［ＡＭ］は、コレステロール－Ｃ６、コレステロール－ＴＥＧ、トコフェロール－Ｃ８、トコフェロール、又はパルミチン酸－Ｃ６である。一部の態様では、Ｌ１は、ホスホジエステル結合である。一部の態様では、ＳＰ１は、Ｃ３、Ｃ６、ＴＥＧ、又はＨＥＧである。一部の態様では、Ｌ２は、ホスホロチオエート結合である。一部の態様では、ＳＰ２は、Ｃ３、Ｃ６、ＴＥＧ、又はＨＥＧである。一部の態様では、Ｌ３は、ホスホロチオエート結合である。一部の態様では、［ＢＡＭ］は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、例えばギャップマーである。一部の態様では、［ＡＭ］と［ＢＡＭ］とを接続させる最適化リンカーの長さは、約５ｎｍ～約１０ｎｍ、約１０ｎｍ～約１５ｎｍ、約１５ｎｍ～約２０ｎｍ、約２０ｎｍ～約２５ｎｍ、又は約２５～約３０ｎｍである。
[00211]本開示は、ＥＶに結合した生物学的に活性な分子（ＢＡＭ）の負荷密度を増加させる方法であって、式：
［ＡＭ］－Ｌ１－［ＳＰ１］－Ｌ２－［ＳＰ２］－Ｌ３－［ＢＡＭ］
（式中、［ＡＭ］は、アンカー部分であり；Ｌ１は、切断性又は非切断性の連結であり；Ｌ２及びＬ３は、任意選択の切断性又は非切断性の連結であり；ＳＰ１は、任意選択の第１のスペーサーであり；ＳＰ２は、任意選択の第２のスペーサーである）による生物学的に活性な分子（ＢＡＭ）に結合しているアンカー部分（ＡＭ）のライブラリーをスクリーニングするステップを含む、方法を提供する。一部の態様では、［ＡＭ］は、コレステロール－Ｃ６、コレステロール－ＴＥＧ、トコフェロール－Ｃ８、トコフェロール、又はパルミチン酸－Ｃ６である。一部の態様では、Ｌ１は、ホスホジエステル結合である。一部の態様では、ＳＰ１は、Ｃ３、Ｃ６、ＴＥＧ、又はＨＥＧである。一部の態様では、Ｌ２は、ホスホロチオエート結合である。一部の態様では、ＳＰ２は、Ｃ３、Ｃ６、ＴＥＧ、又はＨＥＧである。一部の態様では、Ｌ３は、ホスホロチオエート結合である。一部の態様では、［ＢＡＭ］は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。一部の態様では、［ＡＭ］と［ＢＡＭ］とを接続させる最適化リンカーの長さは、約５ｎｍ～約１０ｎｍ、約１０ｎｍ～約１５ｎｍ、約１５ｎｍ～約２０ｎｍ、約２０ｎｍ～約２５ｎｍ、又は約２５～約３０ｎｍである。一部の態様では、ＥＶ、例えばエクソソームに結合した生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］の負荷密度は、対照に対して、少なくとも約１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９倍、少なくとも約９．５倍、又は少なくとも約１０倍増加している。一部の態様では、対照は、最適化リンカーを欠く対応する構築物である。例えば、一部の態様では、構造［ＡＭ］－Ｌ１－［ＳＰ１］－Ｌ２－［ＳＰ２］－Ｌ３－［ＢＡＭ］を有する構築物に関する対照は、構造［ＡＭ］－［ＢＡＭ］を有する対照構築物である。
[00212]式：
［ＡＭ］－Ｌ１－［ＳＰ１］－Ｌ２－［ＳＰ２］－Ｌ３－［ＡＳＯ］
（式中、［ＡＭ］は、コレステロール－Ｃ６、コレステロール－ＴＥＧ、トコフェロール－Ｃ８、トコフェロール、及びパルミチン酸－Ｃ６からなる群から選択されるアンカー部分であり；Ｌ１は、ホスホジエステラーゼ切断性連結であり；ＳＰ１は、Ｃ３、Ｃ６、ＴＥＧ及びＨＥＧからなる群から選択される任意選択の第１のスペーサーであり；Ｌ２は、任意選択のホスホロチオエート非切断性連結であり；ＳＰ２は、Ｃ３、Ｃ６、ＴＥＧ、及びＨＥＧからなる群から選択される任意選択の第２のスペーサーであり；Ｌ３は、任意選択のホスホロチオエート非切断性連結である）によるアンカー部分［ＡＭ］を介してＥＶに共有結合により連結したアンチセンスオリゴヌクレオチド［ＡＳＯ］を含む細胞外ベシクル（ＥＶ）。一部の態様では、ＥＶは、エクソソーム、例えば天然のエクソソーム又は組換えエクソソームである。エクソソームが天然のエクソソームである一部の態様では、エクソソームに結合したＡＳＯの負荷密度は、対照に対して少なくとも約１．５倍増加している（上記を参照されたい）。エクソソームがＰＴＧＦＲＮを過剰発現するエクソソームである一部の態様では、エクソソームに結合したＡＳＯの負荷密度は、対照、例えば、［ＡＭ］－［ＢＡＭ］などの最適化リンカーを含まない構築物に対して、少なくとも約２倍増加している。
[00213]エクソソームが天然のエクソソームであり、アンカー部分［ＡＭ］がコレステロール－Ｃ６である一部の態様において。一部の態様では、天然のエクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、５０３２＋／－３８６である。一部の態様では、天然のエクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、約４５００～約５５００の間である。一部の態様では、天然のエクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、約４５００～約４６００の間、約４６００～約４７００の間、約４７００～約４８００の間、約４８００～約４９００の間、約４９００～約５０００の間、約５０００～約５１００の間、約５１００～約５２００の間、約５２００～約５３００の間、約５３００～約５４００の間、又は約５４００～約５５００の間である。一部の態様では、天然のエクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、少なくとも約４５００、少なくとも約４６００、少なくとも約４７００、少なくとも約４８００、少なくとも約４９００、少なくとも約５０００、少なくとも約５１００、少なくとも約５２００、少なくとも約５３００、少なくとも約５４００、又は少なくとも約５５００である。一部の態様では、天然のエクソソームの負荷効率は、７３％～９３％である。一部の態様では、天然のエクソソームの負荷効率は、約７０％～約９５％の間である。一部の態様では、天然のエクソソームの負荷効率は、約７０％～約７５％の間、約７５％～約８０％の間、約８０％～約８５％の間、約８５％～約９０％の間、又は約９０％～約９５％の間である。一部の態様では、天然のエクソソームの負荷効率は、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％である。
[00214]エクソソームが天然のエクソソームであり、アンカー部分［ＡＭ］がコレステロール－ＴＥＧである一部の態様では、エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、３９９１＋／－４９０である。一部の態様では、天然のエクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、約３５００～約４５００の間である。一部の態様では、天然のエクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、約３５００～約３６００の間、約３６００～約３７００の間、約３７００～約３８００の間、約３８００～約３９００の間、約３９００～約４０００の間、約４０００～約４１００の間、約４１００～約４２００の間、約４２００～約４３００の間、約４３００～約４４００の間、又は約４４００～約４５００の間である。一部の態様では、天然のエクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、少なくとも約３５００、少なくとも約３６００、少なくとも約３７００、少なくとも約３８００、少なくとも約３９００、少なくとも約４０００、少なくとも約４１００、少なくとも約４２００、少なくとも約４３００、少なくとも約４４００、又は少なくとも約４５００である。一部の態様では、天然のエクソソームの負荷効率は、５６％～７９％である。一部の態様では、天然のエクソソームの負荷効率は、約５０％～約８５％の間である。一部の態様では、天然のエクソソームの負荷効率は、約５０％～約５５％の間、約５５％～約６０％の間、約６０％～約６５％の間、約６５％～約７０％の間、約７０％～約７５％の間、約７５％～約８０％の間、又は約８０％～約８５％の間である。一部の態様では、天然のエクソソームの負荷効率は、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約８５％である。
[00215]エクソソームが天然のエクソソームであり、アンカー部分［ＡＭ］がトコフェロール－Ｃ８、トコフェロール、又はパルミチン酸－Ｃ６である一部の態様では、天然のエクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、４２４１＋／－７２２である。一部の態様では、天然のエクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、約３５００～約５０００の間である。一部の態様では、天然のエクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、約３５００～約３６００の間、約３６００～約３７００の間、約３７００～約３８００の間、約３８００～約３９００の間、約３９００～約４０００の間、約４０００～約４１００の間、約４１００～約４２００の間、約４２００～約４３００の間、約４３００～約４４００の間、約４４００～約４５００の間、約４５００～約４６００の間、約４６００～約４７００の間、約４７００～約４８００の間、約４８００～約４９００の間、又は約４９００～約５０００の間である。一部の態様では、天然のエクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、少なくとも約３５００、少なくとも約３６００、少なくとも約３７００、少なくとも約３８００、少なくとも約３９００、少なくとも約４０００、少なくとも約４１００、少なくとも約４２００、少なくとも約４３００、少なくとも約４４００、少なくとも約４５００、少なくとも約４６００、少なくとも約４７００、少なくとも約４８００、少なくとも約４９００、又は少なくとも約５０００である。一部の態様では、天然のエクソソームの負荷効率は、５７％～７３％である。一部の態様では、天然のエクソソームの負荷効率は、約５０％～約８０％の間である。一部の態様では、天然のエクソソームの負荷効率は、約５０％～約５５％の間、約５５％～約６０％の間、約６０％～約６５％の間、約６５％～約７０％の間、約７０％～約７５％の間、又は約７５％～約８０％の間である。一部の態様では、天然のエクソソームの負荷効率は、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、又は少なくとも約８０％である。一部の態様では、天然のエクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、５００を超えるか、６０００を超えるか、７０００を超えるか、８０００を超えるか、９０００を超えるか、１０，０００を超えるか、１１，０００を超えるか、１２，０００を超えるか、１３，０００を超えるか、１４，０００を超えるか、１５，０００を超えるか、１６，０００を超えるか、１７，０００を超えるか、１８，０００を超えるか、１９，０００を超えるか、又は２０，０００を超える。一部の態様では、エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、約５０００～約６，０００、約６，０００～約７，０００、約７，０００～約８，０００、約８，０００～約９，０００、約９，０００～約１０，０００、約１０，０００～約１１，０００、約１１，０００～約１２，０００ 約１２，０００～約１３，０００、約１３，０００～約１４，０００、約１４，０００～約１５，０００、約１５，０００～約１６，０００、約１６，０００～約１７，０００、約１７，０００～約１８，０００、約１８，０００～約１９，０００、又は約１９，０００～約２０，０００の間である。
[00216]エクソソームがＳｃａｆｆｏｌｄ－Ｘエクソソームであり、アンカー部分［ＡＭ］がコレステロール－Ｃ６である一部の態様では、エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、２４４２＋／－３３９である。一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ－Ｘエクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、約２０００～約３０００の間である。一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ－Ｘエクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、約２０００～約２１００の間、約２１００～約２２００の間、約２２００～約２３００の間、約２３００～約２４００の間、約２４００～約２５００の間、約２５００～約２６００の間、約２６００～約２７００の間、約２７００～約２８００の間、約２８００～約２９００の間、又は約２９００～約３０００の間である。一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ－Ｘエクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、少なくとも約２０００、少なくとも約２１００、少なくとも約２２００、少なくとも約２３００、少なくとも約２４００、少なくとも約２５００、少なくとも約２６００、少なくとも約２７００、少なくとも約２８００、少なくとも約２９００、又は少なくとも約３０００である。一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ－Ｘエクソソームの負荷効率は、２７％～４６％である。一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ－Ｘエクソソームの負荷効率は、約２５％～約５０％の間である。一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ－Ｘエクソソームの負荷効率は、約２５％～約３０％の間、約３０％～約３５％の間、約３５％～約４０％の間、約４０％～約４５％の間、又は約４５％～約５０％の間である。一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ－Ｘエクソソームの負荷効率は、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、又は少なくとも約５０％である。
[00217]エクソソームがＳｃａｆｆｏｌｄ－Ｘエクソソームであり、アンカー部分［ＡＭ］がコレステロール－ＴＥＧである一部の態様では、エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、１７２８＋／－２６４である。一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ－Ｘエクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、約１４００～約２１００の間である。一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ－Ｘエクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、約１４００～約１５００の間、約１５００～約１６００の間、約１６００～約１７００の間、約１７００～約１８００の間、約１８００～約１９００の間、約１９００～約２０００の間、又は約２０００～約２１００の間である。一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ－Ｘエクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、少なくとも約１４００、少なくとも約１５００、少なくとも約１６００、少なくとも約１７００、少なくとも約１８００、少なくとも約１９００、少なくとも約２０００、又は少なくとも約２１００である。一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ－Ｘエクソソームの負荷効率は、１９％～３３％である。一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ－Ｘエクソソームの負荷効率は、約１５％～約３５％の間である。一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ－Ｘエクソソームの負荷効率は、約１５％～約２０％の間、約２０％～約２５％の間、約２５％～約３０％の間、又は約３０％～約３５％の間である。一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ－Ｘエクソソームの負荷効率は、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、又は少なくとも約３５％である。エクソソームがＳｃａｆｆｏｌｄ－Ｘエクソソームであり、アンカー部分［ＡＭ］がトコフェロール－Ｃ８、トコフェロール、又はパルミチン酸－Ｃ６である一部の態様では、エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、２９７９＋／－１００６である。一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ－Ｘエクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、約１９００～約４０００の間である。一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ－Ｘエクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、約１９００～約２０００の間、約２０００～約２１００の間、約２１００～約２２００の間、約２２００～約２３００の間、約２３００～約２４００の間、約２４００～約２５００の間、約２５００～約２６００の間、約２６００～約２７００の間、約２７００～約２８００の間、約２８００～約２９００の間、約２９００～約３０００の間、約３０００～約３１００の間、約３１００～約３２００の間、約３２００～約３３００の間、約３３００～約３４００の間、約３４００～約３５００の間、約３５００～約３６００の間、約３６００～約３７００の間、約３７００～約３８００の間、約３８００～約３９００の間、又は約３９００～約４０００の間である。一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ－Ｘエクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、少なくとも約１９００、少なくとも約２０００、少なくとも約２１００、少なくとも約２２００、少なくとも約２３００、少なくとも約２４００、少なくとも約２５００、少なくとも約２６００、少なくとも約２７００、少なくとも約２８００、少なくとも約２９００、少なくとも約３０００、少なくとも約３１００、少なくとも約３２００、少なくとも約３３００、少なくとも約３４００、少なくとも約３５００、少なくとも約３６００、少なくとも約３７００、少なくとも約３８００、少なくとも約３９００、又は少なくとも約４０００である。一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ－Ｘエクソソームの負荷効率は、３７％～６８％の間である。負荷効率は、約３０％～約７５％の間である。一部の態様では、負荷効率は、約３０％～約３５％の間、約３５％～約４０％の間、約４０％～約４５％の間、約４５％～約５０％の間、約５０％～約５５％の間、約５５％～約６０％の間、約６０％～約６５％の間、約６５％～約７０％の間、又は約７０％～約７５％の間である。一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ－Ｘエクソソームの負荷効率は、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、又は少なくとも約７５％である。
[00218]一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ－Ｘエクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、５０００を超えるか、６０００を超えるか、７０００を超えるか、８０００を超えるか、９０００を超えるか、１０，０００を超えるか、１１，０００を超えるか、１２，０００を超えるか、１３，０００を超えるか、１４，０００を超えるか、１５，０００を超えるか、１６，０００を超えるか、１７，０００を超えるか、１８，０００を超えるか、１９，０００を超えるか、又は２０，０００を超える。一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ－Ｘエクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、約５０００～約６，０００、約６，０００～約７，０００、約７，０００～約８，０００、約８，０００～約９，０００、約９，０００～約１０，０００、約１０，０００～約１１，０００、約１１，０００～約１２，０００、約１２，０００～約１３，０００、約１３，０００～約１４，０００、約１４，０００～約１５，０００、約１５，０００～約１６，０００、約１６，０００～約１７，０００、約１７，０００～約１８，０００、約１８，０００～約１９，０００、又は約１９，０００～約２０，０００の間である。
[00219]本開示は、式：
［ＡＭ］－Ｌ１－［ＳＰ１］－Ｌ２－［ＳＰ２］－Ｌ３－［ＢＡＭ］
（式中、［ＡＭ］は、コレステロール－ＴＥＧであり；Ｌ１は、ホスホジエステラーゼ切断性結合であり；ＳＰ１は、Ｃ３であり；Ｌ２は、ホスホロチオエート非切断性結合であり；ＳＰ２は、ＴＥＧであり；Ｌ３は、ホスホロチオエート非切断性結合である）によるアンカー部分［ＡＭ］を介してエクソソームに共有結合により連結したアンチセンスオリゴヌクレオチド［ＡＳＯ］を含むエクソソームも提供する。エクソソームが天然のエクソソームである場合、エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、少なくとも４５００、例えば、約４５００～約５０００の間（例えば、約４７８０）であり、負荷効率は、少なくとも約７０％、例えば、約７０％～約９０％の間（例えば、約８０％）である。エクソソームがＰＴＧＦＲＮを過剰に発現するエクソソームである場合、エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、少なくとも約１５００、例えば、約１５００～約２０００の間（例えば、約１６５９）であり、負荷効率は、少なくとも約２０％、例えば、約２０％～約３５％の間（例えば、約２８％）である。
[00220]本開示は、式：
［ＡＭ］－Ｌ１－［ＳＰ１］－Ｌ２－［ＢＡＭ］
（式中、［ＡＭ］は、コレステロール－ＴＥＧであり；Ｌ１は、ホスホジエステラーゼ切断性結合であり；ＳＰ１は、ＴＥＧであり；Ｌ２は、ホスホロチオエート非切断性結合である）によるアンカー部分［ＡＭ］を介してエクソソームに共有結合により連結したアンチセンスオリゴヌクレオチド［ＡＳＯ］を含むエクソソームも提供する。エクソソームが天然のエクソソームである場合、エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、少なくとも約３５００、例えば、約３５００～約４５００の間（例えば、約４０９０）であり、負荷効率は、少なくとも約６０％、例えば、約６０％～約７０％の間（例えば、約６８％）である。エクソソームがＰＴＧＦＲＮを過剰に発現するエクソソームである場合、エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数は、少なくとも約１４００、例えば、約１４００～約２４００の間（例えば、約１８９０）であり、負荷効率は、少なくとも約２０％、例えば、約２０％～約４０％の間（例えば、約３１％）である。
[00221]本開示の具体的な最適化リンカーの組合せは、例えば、図４、図５、図９Ａ、図１１、及び図１３に提示されている。
[00222]一部の態様では、本開示は、式：［ＡＭ］－［ＳＰ１］－Ｌ１－［ＳＰ２］－［ＢＡＭ］（式中、［ＡＭ］は、脂質アンカーであり、［ＳＰ１］は、第１のスペーサー（エクソソーム表面に対して近位の）であり、［ＳＰ２］は、第２のスペーサー（エクソソーム表面に対して遠位の）であり、［ＢＡＭ］は、本明細書で開示されている生物学的に活性な分子であり、［ＳＰ１］と［ＳＰ２］とは、切断性リンカーによって連結されている）によるアンカー部分［ＡＭ］を介してエクソソームに共有結合により連結した生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］を含むエクソソームを提供する。一部の態様では、切断性リンカーは、ホスホジエステル切断性リンカーである。一部の態様では、脂質は、パルミチン酸、コレステロール、トコフェロール、及び１６：０ Ｃｙａｎｕｒ（塩化シアヌル）エタノールアミン（ＰＥ）からなる群から選択される。一部の態様では、スペーサー１は、Ｃ３、Ｃ６、Ｃ８、ＴＥＧ、及びＮｏｎｅからなる群から選択される。一部の態様では、スペーサー２は、Ｃ３、ＴＥＧ、ＨＥＧ及びＮｏｎｅからなる群から選択される。Ｎｏｎｅは、構築物中にスペーサー１もスペーサー２も存在しないことを示す。
[00223]一部の態様では、本開示は、式：［ＡＭ］－［ＳＰ１］－Ｌ１－［ＳＰ２］－［ＡＳＯ］（式中、［ＡＭ］は、脂質アンカーであり、［ＳＰ１］は、第１のスペーサー（エクソソーム表面に対して近位の）であり、［ＳＰ２］は、第２のスペーサー（エクソソーム表面に対して遠位の）であり、［ＡＳＯ］は、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、［ＳＰ１］と［ＳＰ２］とは、切断性リンカーによって連結されている）によるアンカー部分［ＡＭ］を介してエクソソームに共有結合により連結したアンチセンスオリゴヌクレオチド［ＡＳＯ］を含むエクソソームを提供する。一部の態様では、切断性リンカーは、ホスホジエステル切断性リンカーである。一部の態様では、脂質は、パルミチン酸、コレステロール、トコフェロール、及び１６：０ Ｃｙａｎｕｒ（塩化シアヌル）ＰＥからなる群から選択される。一部の態様では、スペーサー１は、Ｃ３、Ｃ６、Ｃ８、ＴＥＧ、及びＮｏｎｅからなる群から選択される。一部の態様では、スペーサー２は、Ｃ３、ＴＥＧ、ＨＥＧ及びＮｏｎｅからなる群から選択される。
[00224]一部の態様では、本開示は、式［ＡＭ］－［ＳＰ１］－Ｌ１－［ＳＰ２］－（式中、［ＡＭ］は、脂質アンカーであり、［ＳＰ１］は、第１のスペーサー（ベシクル、例えばエクソソームの膜に対して近位の）であり、［ＳＰ２］は、第２のスペーサー（ベシクル、例えばエクソソームの膜に対して遠位の）であり、［ＳＰ１］と［ＳＰ２］とは、切断性リンカーによって連結されている）による膜アンカー構築物を提供する。一部の態様では、切断性リンカーは、ホスホジエステル切断性リンカーである。一部の態様では、脂質は、パルミチン酸、コレステロール、トコフェロール、及び１６：０ Ｃｙａｎｕｒ（塩化シアヌル）ＰＥからなる群から選択される。一部の態様では、スペーサー１は、Ｃ３、Ｃ６、Ｃ８、ＴＥＧ、及びＮｏｎｅからなる群から選択される。一部の態様では、スペーサー２は、Ｃ３、ＴＥＧ、ＨＥＧ及びＮｏｎｅからなる群から選択される。
[00225]一部の態様では、本開示は、トコフェロール－Ｃ８－ＴＥＧ－［ＡＳＯ］、トコフェロール－ＴＥＧ－Ｎｏｎｅ－［ＡＳＯ］、コレステロール－ＴＥＧ－Ｃ３－［ＡＳＯ］、コレステロール－Ｃ６－Ｃ３－［ＡＳＯ］、コレステロール－ＴＥＧ－ＨＥＧ－［ＡＳＯ］、コレステロール－ＴＥＧ－Ｎｏｎｅ－［ＡＳＯ］、及びパルミチン酸－Ｃ６－ＨＥＧ－［ＡＳＯ］からなる群から選択される構築物を提供する。
[00226]一部の態様では、本開示は、トコフェロール－Ｃ８－ＴＥＧ－［ＡＳＯ］、トコフェロール－ＴＥＧ－Ｎｏｎｅ－［ＡＳＯ］、コレステロール－ＴＥＧ－Ｃ３－［ＡＳＯ］、コレステロール－Ｃ６－Ｃ３－［ＡＳＯ］、コレステロール－ＴＥＧ－ＨＥＧ－［ＡＳＯ］、コレステロール－ＴＥＧ－Ｎｏｎｅ－［ＡＳＯ］、及びパルミチン酸－Ｃ６－ＨＥＧ－［ＡＳＯ］からなる群から選択される膜に係留した構築物を含むエクソソームを提供する。
[00227]一部の態様では、本開示は、トコフェロール－Ｃ８－ＴＥＧ、トコフェロール－ＴＥＧ－Ｎｏｎｅ、コレステロール－ＴＥＧ－Ｃ３、コレステロール－Ｃ６－Ｃ３、コレステロール－ＴＥＧ－ＨＥＧ、コレステロール－ＴＥＧ－Ｎｏｎｅ、及びパルミチン酸－Ｃ６－ＨＥＧからなる群から選択される膜アンカー構築物を提供する。一部の態様では、膜アンカー構築物は、トコフェロール－Ｃ８－ＴＥＧを含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。一部の態様では、膜アンカー構築物は、トコフェロール－ＴＥＧ－Ｎｏｎｅを含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。一部の態様では、膜アンカー構築物は、コレステロール－ＴＥＧ－Ｃ３を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。一部の態様では、膜アンカー構築物は、コレステロール－Ｃ６－Ｃ３を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。一部の態様では、膜アンカー構築物は、コレステロール－ＴＥＧ－ＨＥＧを含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。一部の態様では、膜アンカー構築物は、コレステロール－ＴＥＧ－Ｎｏｎｅを含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。一部の態様では、膜アンカー構築物は、パルミチン酸－Ｃ６－ＨＥＧを含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。
[00228]一部の態様では、本開示は、トコフェロール－Ｃ８－ＴＥＧ、トコフェロール－ＴＥＧ－Ｎｏｎｅ、コレステロール－ＴＥＧ－Ｃ３、コレステロール－Ｃ６－Ｃ３、コレステロール－ＴＥＧ－ＨＥＧ、コレステロール－ＴＥＧ－Ｎｏｎｅ、及びパルミチン酸－Ｃ６－ＨＥＧからなる群から選択される膜アンカー構築物を介して、エクソソームの表面に共有結合により連結した生物学的に活性な分子を含むエクソソームを提供する。一部の態様では、膜アンカー構築物は、トコフェロール－Ｃ８－ＴＥＧを含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。一部の態様では、膜アンカー構築物は、トコフェロール－ＴＥＧ－Ｎｏｎｅを含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。一部の態様では、膜アンカー構築物は、コレステロール－ＴＥＧ－Ｃ３を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。一部の態様では、膜アンカー構築物は、コレステロール－Ｃ６－Ｃ３を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。一部の態様では、膜アンカー構築物は、コレステロール－ＴＥＧ－ＨＥＧを含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。一部の態様では、膜アンカー構築物は、コレステロール－ＴＥＧ－Ｎｏｎｅを含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。一部の態様では、膜アンカー構築物は、パルミチン酸－Ｃ６－ＨＥＧを含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。
[00229]一部の態様では、本明細書で開示されているエクソソームは、エクソソームの安定性を保護する及び／又はより高い負荷密度を促進する条件下で調製及び／又は保存され得る。一部の態様では、トコフェロール－Ｃ８－ＴＥＧ、トコフェロール－ＴＥＧ－Ｎｏｎｅ、コレステロール－ＴＥＧ－Ｃ３、コレステロール－Ｃ６－Ｃ３、コレステロール－ＴＥＧ－ＨＥＧ、コレステロール－ＴＥＧ－Ｎｏｎｅ、及びパルミチン酸－Ｃ６－ＨＥＧからなる群から選択される膜アンカー構築物を介して、その表面に結合したＡＳＯを含むエクソソームは、低塩緩衝剤（例えば、約５０ｍＭのＮａＣｌを含む）中で、約２、４、６又は８日間維持され得る。一部の態様では、トコフェロール－Ｃ８－ＴＥＧ、トコフェロール－ＴＥＧ－Ｎｏｎｅ、コレステロール－ＴＥＧ－Ｃ３、コレステロール－Ｃ６－Ｃ３、コレステロール－ＴＥＧ－ＨＥＧ、コレステロール－ＴＥＧ－Ｎｏｎｅ、及びパルミチン酸－Ｃ６－ＨＥＧからなる群から選択される膜アンカー構築物を介して、その表面に結合したＡＳＯを含むエクソソームは、高塩緩衝剤（例えば、約１５０ｍＭのＮａＣｌを含む）中で、約２、４、６又は８日間維持され得る。一部の態様では、トコフェロール－Ｃ８－ＴＥＧ、トコフェロール－ＴＥＧ－Ｎｏｎｅ、コレステロール－ＴＥＧ－Ｃ３、コレステロール－Ｃ６－Ｃ３、コレステロール－ＴＥＧ－ＨＥＧ、コレステロール－ＴＥＧ－Ｎｏｎｅ、及びパルミチン酸－Ｃ６－ＨＥＧからなる群から選択される膜アンカー構築物を介して、その表面に結合したＡＳＯを含むエクソソームは、スクロースをさらに含む高塩緩衝剤（例えば、約１５０ｍＭのＮａＣｌを含む）中で、約２、４、６又は８日間維持され得る。一部の態様では、トコフェロール－Ｃ８－ＴＥＧ、トコフェロール－ＴＥＧ－Ｎｏｎｅ、コレステロール－ＴＥＧ－Ｃ３、コレステロール－Ｃ６－Ｃ３、コレステロール－ＴＥＧ－ＨＥＧ、コレステロール－ＴＥＧ－Ｎｏｎｅ、及びパルミチン酸－Ｃ６－ＨＥＧからなる群から選択される膜アンカー構築物を介して、その表面に結合したＡＳＯを含むエクソソームは、４℃又は２５℃のいずれかで、低塩緩衝剤、高塩緩衝剤、又はスクロースをさらに含む高塩緩衝剤（例えば、約１５０ｍＭのＮａＣｌを含む）中で、約２、４、６又は８日間維持され得る。
[00230]本開示は、エクソソームの負荷密度を増加させる方法であって、高塩条件下で（例えば、約１５０ｍＭのＮａＣｌを含む高塩緩衝剤を使用して）エクソソームを負荷するステップを含む、方法も提供する。一部の態様では、エクソソームは、例えば、トコフェロール－Ｃ８－ＴＥＧ、トコフェロール－ＴＥＧ－Ｎｏｎｅ、コレステロール－ＴＥＧ－Ｃ３、コレステロール－Ｃ６－Ｃ３、コレステロール－ＴＥＧ－ＨＥＧ、コレステロール－ＴＥＧ－Ｎｏｎｅ、及びパルミチン酸－Ｃ６－ＨＥＧからなる群から選択される膜アンカー構築物に結合した（例えば、共有結合した）ＡＳＯと共に負荷される。
アンカー部分［ＡＭ］
[00231]本明細書で開示されている構築物、例えば式１の構築物は、少なくとも１つの生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］を、本開示の最適化リンカーを介して、ＥＶ、例えばエクソソームの表面に係留する少なくとも１つのアンカー部分［ＡＭ］を含む。生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］を、ＥＶ、例えばエクソソームの表面に係留することが可能な好適なアンカー部分［ＡＭ］は、例えば、ステロール（例えば、コレステロール）、脂質、リン脂質、リゾリン脂質、脂肪酸、脂溶性ビタミン、足場部分（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｘ）、又は以下に詳細に記載されているこれらの組合せを含む。
[00232］一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、脂質を含むか又はそれからなる。脂質アンカー部分［ＡＭ］は、当技術分野で公知の任意の脂質、例えば、パルミチン酸又はグリコシルホスファチジルイノシトールを含み得る。一部の態様では、脂質は、脂肪酸、ホスファチド、リン脂質（例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、又はホスファチジルエタノールアミン）、又はそのアナログ（例えば、ホスファチジルコリン、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、セファリン、又はホスファチジルセリン又はそのアナログ若しくは一部、例えば部分的に加水分解されたその一部）である。
[00233]一般に、アンカー部分は、例えば、固相合成によって化学的に結合されている。しかし、アンカー部分［ＡＭ］は、生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］に酵素的に結合され得る。アンカー部分［ＡＭ］は、任意の化学的に実行可能な位置、例えば、ヌクレオチド配列、例えばＡＳＯの５’及び／又は３’末端で、リンカー又はスペーサーの組合せを介して直接的又は間接的に生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］にコンジュゲートされ得る。一態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、本明細書で開示されている最適化リンカーを介して、直接的又は間接的に、生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］の３’末端にのみコンジュゲートされる。一態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、ヌクレオチド配列、例えばＡＳＯの５’末端にのみコンジュゲートされる。一態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、ヌクレオチド配列、例えばＡＳＯの３’末端又は５’末端ではない位置にコンジュゲートされる。
[00234]一部の態様では、本開示のアンカー部分［ＡＭ］は、以下に開示されている疎水性基の修飾のいずれかを含み得る：
Figure 2024506711000005
[00235]一部の態様では、本開示のアンカー部分は、本明細書で開示されている２種類以上のアンカー部分を含み得る。例えば、一部の態様では、アンカー部分は、合わせて６～３０個の炭素原子（すなわち、６～３０の同等の炭素数（ＥＣＮ））を有する２つの脂質、例えばリン脂質及び脂肪酸、又は２つのリン脂質、又は２つの脂肪酸、又は脂質及びビタミン、又はコレステロール及びビタミンなどを含み得る。
アンカー部分：コレステロール及び他のステロール
[00236]一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、ステロール、ステロイド、ホパノイド、ヒドロキシステロイド、セコステロイド、又は脂溶性を有するそのアナログを含む。一部の態様では、アンカー部分は、植物ステロール、菌類ステロール、又は動物ステロールなどのステロールを含む。例示的な動物ステロールとしては、コレステロール及び２４Ｓ－ヒドロキシコレステロールが挙げられ、例示的な植物ステロールとしては、エルゴステロール（菌類ステロール）、カンペステロール、シトステロール、及びスチグマステロールが挙げられる。一部の態様では、ステロールは、エルゴステロール、７－デヒドロコレステロール、コレステロール、２４Ｓ－ヒドロキシコレステロール、ラノステロール、シクロアルテノール、フコステロール、サリンゴステロール、カンペステロール、β－シトステロール、シトスタノール、コプロスタノール、アベナステロール、及びスチグマステロールから選択される。ステロールは、遊離ステロール、アシル化ステロール（ステロールエステル）、アルキル化ステロール（ステリルアルキルエーテル）、硫酸化ステロール（硫酸ステロール）、又はグリコシド部分と連結しており（ステリルグリコシド）、それ自体がアシル化されている可能性のあるステロール（アシル化ステロールグリコシド）のいずれかとして見られる場合がある。
[00237]一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、ステロイドを含む。一部の態様では、ステロイドは、ジヒドロテストステロン、ウバオール、ヘシゲニン、ジオスゲニン、プロゲステロン、又はコルチゾールから選択される。
[00238]例えば、ステロールは、例えば、ステロールの利用可能な－ＯＨ基を介して、スペーサー［ＳＰ］に結合されていてもよい（固相合成又はコンジュゲーションにより）。例示的なステロールは、以下に示されている一般的骨格を有する：
Figure 2024506711000006
[00239]さらなる例として、エルゴステロールは以下の構造を有する：
Figure 2024506711000007
[00240]コレステロールは以下の構造を有する：
Figure 2024506711000008
[00241]一部の態様では、ステロール又はステロイドは、ホスホラミダイトである。一部の態様では、ステロール又はステロイドは、リンカー、例えばアルキル（Ｃ３、Ｃ６又はＣ８）又はグリコールリンカー（例えば、ＴＥＧ）を含むホスホラミダイトである。一部の態様では、ステロール／ステロイド－ホスホラミダイト、又はステロール／ステロイド－リンカー－ホスホラミダイトは、固相合成により、例えば、切断性（例えば、ホスホジエステル）又は非切断性（例えば、ホスホロチオエート）連結を介して、スペーサー［ＳＰ］又は生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］に結合されている。
アンカー部分：脂肪酸
[00242]一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、脂肪酸を含む。一部の態様では、脂肪酸は、短鎖、中鎖、又は長鎖脂肪酸である。一部の態様では、脂肪酸は、飽和脂肪酸である。一部の態様では、脂肪酸は、不飽和脂肪酸である。一部の態様では、脂肪酸は、モノ不飽和脂肪酸である。一部の態様では、脂肪酸は、ポリ不飽和脂肪酸、例えばω－３（オメガ－３）又はω－６（オメガ－６）脂肪酸である。
[00243]一部の態様では、脂質、例えば脂肪酸は、Ｃ２～Ｃ１８鎖を有する。一部の態様では、脂質、例えば脂肪酸は、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、又はＣ１８鎖を有する。一部の態様では、脂肪酸は、Ｃ２鎖を有する。一部の態様では、脂肪酸は、Ｃ３鎖を有する。一部の態様では、脂肪酸は、Ｃ４鎖を有する。一部の態様では、脂肪酸は、Ｃ５鎖を有する。一部の態様では、脂肪酸は、Ｃ６鎖を有する。一部の態様では、脂肪酸は、Ｃ７鎖を有する。一部の態様では、脂肪酸は、Ｃ８鎖を有する。一部の態様では、脂肪酸は、Ｃ９鎖を有する。一部の態様では、脂肪酸は、Ｃ１０鎖を有する。一部の態様では、脂肪酸は、Ｃ１１鎖を有する。一部の態様では、脂肪酸は、Ｃ１２鎖を有する。一部の態様では、脂肪酸は、Ｃ１３鎖を有する。一部の態様では、脂肪酸は、Ｃ１４鎖を有する。一部の態様では、脂肪酸は、Ｃ１５鎖を有する。一部の態様では、脂肪酸は、Ｃ１６鎖を有する。一部の態様では、脂肪酸は、Ｃ１７鎖を有する。一部の態様では、脂肪酸は、Ｃ１８鎖を有する。
[00244]一部の態様では、脂肪酸は、Ｃ４～Ｃ１８鎖を有する。一部の態様では、脂肪酸は、Ｃ２～Ｃ３、Ｃ２～Ｃ４、Ｃ２～Ｃ５、Ｃ２～Ｃ６、Ｃ２～Ｃ７、Ｃ２～Ｃ８、Ｃ２～Ｃ９、Ｃ２～Ｃ１０、Ｃ２～Ｃ１１、Ｃ２～Ｃ１２、Ｃ２～Ｃ１３、Ｃ２～Ｃ１４、Ｃ２～Ｃ１５、Ｃ２～Ｃ１６、Ｃ２～Ｃ１７、Ｃ２～Ｃ１８、Ｃ３～Ｃ４、Ｃ３～Ｃ５、Ｃ３～Ｃ６、Ｃ３～Ｃ７、Ｃ３～Ｃ８、Ｃ３～Ｃ９、Ｃ３～Ｃ１０、Ｃ３～Ｃ１１、Ｃ３～Ｃ１２、Ｃ３～Ｃ１３、Ｃ３～Ｃ１４、Ｃ３～Ｃ１５、Ｃ３～Ｃ１６、Ｃ３～Ｃ１７、Ｃ３～Ｃ１８、Ｃ４～Ｃ５、Ｃ４～Ｃ６、Ｃ４～Ｃ７、Ｃ４～Ｃ８、Ｃ４～Ｃ９、Ｃ４～Ｃ１０、Ｃ４～Ｃ１１、Ｃ４～Ｃ１２、Ｃ４～Ｃ１３、Ｃ４～Ｃ１４、Ｃ４～Ｃ１５、Ｃ４～Ｃ１６、Ｃ４～Ｃ１７、Ｃ４～Ｃ１８、Ｃ５～Ｃ６、Ｃ５～Ｃ７、Ｃ５～Ｃ８、Ｃ５～Ｃ９、Ｃ５～Ｃ１０、Ｃ５～Ｃ１１、Ｃ５～Ｃ１２、Ｃ５～Ｃ１３、Ｃ５～Ｃ１４、Ｃ５～Ｃ１５、Ｃ５～Ｃ１６、Ｃ５～Ｃ１７、Ｃ５～Ｃ１８、Ｃ６～Ｃ７、Ｃ６～Ｃ８、Ｃ６～Ｃ９、Ｃ６～Ｃ１０、Ｃ６～Ｃ１１、Ｃ６～Ｃ１２、Ｃ６～Ｃ１３、Ｃ６～Ｃ１４、Ｃ６～Ｃ１５、Ｃ６～Ｃ１６、Ｃ６～Ｃ１７、Ｃ６～Ｃ１８、Ｃ７～Ｃ８、Ｃ７～Ｃ９、Ｃ７～Ｃ１０、Ｃ７～Ｃ１１、Ｃ７～Ｃ１２、Ｃ７～Ｃ１３、Ｃ７～Ｃ１４、Ｃ７～Ｃ１５、Ｃ７～Ｃ１６、Ｃ７～Ｃ１７、Ｃ７～Ｃ１８、Ｃ８～Ｃ９、Ｃ８～Ｃ１０、Ｃ８～Ｃ１１、Ｃ８～Ｃ１２、Ｃ８～Ｃ１３、Ｃ８～Ｃ１４、Ｃ８～Ｃ１５、Ｃ８～Ｃ１６、Ｃ８～Ｃ１７、Ｃ８～Ｃ１８、Ｃ９～Ｃ１０、Ｃ９～Ｃ１１、Ｃ９～Ｃ１２、Ｃ９～Ｃ１３、Ｃ９～Ｃ１４、Ｃ９～Ｃ１５、Ｃ９～Ｃ１６、Ｃ９～Ｃ１７、Ｃ９～Ｃ１８、Ｃ１０～Ｃ１１、Ｃ１０～Ｃ１２、Ｃ１０～Ｃ１３、Ｃ１０～Ｃ１４、Ｃ１０～Ｃ１５、Ｃ１０～Ｃ１６、Ｃ１０～Ｃ１７、Ｃ１０～Ｃ１８、Ｃ１１～Ｃ１２、Ｃ１１～Ｃ１３、Ｃ１１～Ｃ１４、Ｃ１１～Ｃ１５、Ｃ１１～Ｃ１６、Ｃ１１～Ｃ１７、Ｃ１１～Ｃ１８、Ｃ１２～Ｃ１３、Ｃ１２～Ｃ１４、Ｃ１２～Ｃ１５、Ｃ１２～Ｃ１６、Ｃ１２～Ｃ１７、Ｃ１２～Ｃ１８、Ｃ１３～Ｃ１４、Ｃ１３～Ｃ１５、Ｃ１３～Ｃ１６、Ｃ１３～Ｃ１７、Ｃ１３～Ｃ１８、Ｃ１４～Ｃ１５、Ｃ１４～Ｃ１６、Ｃ１４～Ｃ１７、Ｃ１４～Ｃ１８、Ｃ１５～Ｃ１６、Ｃ１５～Ｃ１７、Ｃ１５～Ｃ１８、Ｃ１６～Ｃ１７、Ｃ１６～Ｃ１８、又はＣ１７～Ｃ１８鎖を有する。
[00245]一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、２つの脂肪酸を含み、その各々は、前記範囲又は数の炭素原子のいずれか１つを有する鎖を有する脂肪酸から独立的に選択される。一部の態様では、脂肪酸のうちの１つは、独立的に、Ｃ２～Ｃ３、Ｃ２～Ｃ４、Ｃ２～Ｃ５、Ｃ２～Ｃ６、Ｃ２～Ｃ７、Ｃ２～Ｃ８、Ｃ２～Ｃ９、Ｃ２～Ｃ１０、Ｃ２～Ｃ１１、Ｃ２～Ｃ１２、Ｃ２～Ｃ１３、Ｃ２～Ｃ１４、Ｃ２～Ｃ１５、Ｃ２～Ｃ１６、Ｃ２～Ｃ１７、Ｃ２～Ｃ１８、Ｃ３～Ｃ４、Ｃ３～Ｃ５、Ｃ３～Ｃ６、Ｃ３～Ｃ７、Ｃ３～Ｃ８、Ｃ３～Ｃ９、Ｃ３～Ｃ１０、Ｃ３～Ｃ１１、Ｃ３～Ｃ１２、Ｃ３～Ｃ１３、Ｃ３～Ｃ１４、Ｃ３～Ｃ１５、Ｃ３～Ｃ１６、Ｃ３～Ｃ１７、Ｃ３～Ｃ１８、Ｃ４～Ｃ５、Ｃ４～Ｃ６、Ｃ４～Ｃ７、Ｃ４～Ｃ８、Ｃ４～Ｃ９、Ｃ４～Ｃ１０、Ｃ４～Ｃ１１、Ｃ４～Ｃ１２、Ｃ４～Ｃ１３、Ｃ４～Ｃ１４、Ｃ４～Ｃ１５、Ｃ４～Ｃ１６、Ｃ４～Ｃ１７、Ｃ４～Ｃ１８、Ｃ５～Ｃ６、Ｃ５～Ｃ７、Ｃ５～Ｃ８、Ｃ５～Ｃ９、Ｃ５～Ｃ１０、Ｃ５～Ｃ１１、Ｃ５～Ｃ１２、Ｃ５～Ｃ１３、Ｃ５～Ｃ１４、Ｃ５～Ｃ１５、Ｃ５～Ｃ１６、Ｃ５～Ｃ１７、Ｃ５～Ｃ１８、Ｃ６～Ｃ７、Ｃ６～Ｃ８、Ｃ６～Ｃ９、Ｃ６～Ｃ１０、Ｃ６～Ｃ１１、Ｃ６～Ｃ１２、Ｃ６～Ｃ１３、Ｃ６～Ｃ１４、Ｃ６～Ｃ１５、Ｃ６～Ｃ１６、Ｃ６～Ｃ１７、Ｃ６～Ｃ１８、Ｃ７～Ｃ８、Ｃ７～Ｃ９、Ｃ７～Ｃ１０、Ｃ７～Ｃ１１、Ｃ７～Ｃ１２、Ｃ７～Ｃ１３、Ｃ７～Ｃ１４、Ｃ７～Ｃ１５、Ｃ７～Ｃ１６、Ｃ７～Ｃ１７、Ｃ７～Ｃ１８、Ｃ８～Ｃ９、Ｃ８～Ｃ１０、Ｃ８～Ｃ１１、Ｃ８～Ｃ１２、Ｃ８～Ｃ１３、Ｃ８～Ｃ１４、Ｃ８～Ｃ１５、Ｃ８～Ｃ１６、Ｃ８～Ｃ１７、Ｃ８～Ｃ１８、Ｃ９～Ｃ１０、Ｃ９～Ｃ１１、Ｃ９～Ｃ１２、Ｃ９～Ｃ１３、Ｃ９～Ｃ１４、Ｃ９～Ｃ１５、Ｃ９～Ｃ１６、Ｃ９～Ｃ１７、Ｃ９～Ｃ１８、Ｃ１０～Ｃ１１、Ｃ１０～Ｃ１２、Ｃ１０～Ｃ１３、Ｃ１０～Ｃ１４、Ｃ１０～Ｃ１５、Ｃ１０～Ｃ１６、Ｃ１０～Ｃ１７、Ｃ１０～Ｃ１８、Ｃ１１～Ｃ１２、Ｃ１１～Ｃ１３、Ｃ１１～Ｃ１４、Ｃ１１～Ｃ１５、Ｃ１１～Ｃ１６、Ｃ１１～Ｃ１７、Ｃ１１～Ｃ１８、Ｃ１２～Ｃ１３、Ｃ１２～Ｃ１４、Ｃ１２～Ｃ１５、Ｃ１２～Ｃ１６、Ｃ１２～Ｃ１７、Ｃ１２～Ｃ１８、Ｃ１３～Ｃ１４、Ｃ１３～Ｃ１５、Ｃ１３～Ｃ１６、Ｃ１３～Ｃ１７、Ｃ１３～Ｃ１８、Ｃ１４～Ｃ１５、Ｃ１４～Ｃ１６、Ｃ１４～Ｃ１７、Ｃ１４～Ｃ１８、Ｃ１５～Ｃ１６、Ｃ１５～Ｃ１７、Ｃ１５～Ｃ１８、Ｃ１６～Ｃ１７、Ｃ１６～Ｃ１８、又はＣ１７～Ｃ１８鎖を有する脂肪酸であり、他の１つは、独立的に、Ｃ２～Ｃ３、Ｃ２～Ｃ４、Ｃ２～Ｃ５、Ｃ２～Ｃ６、Ｃ２～Ｃ７、Ｃ２～Ｃ８、Ｃ２～Ｃ９、Ｃ２～Ｃ１０、Ｃ２～Ｃ１１、Ｃ２～Ｃ１２、Ｃ２～Ｃ１３、Ｃ２～Ｃ１４、Ｃ２～Ｃ１５、Ｃ２～Ｃ１６、Ｃ２～Ｃ１７、Ｃ２～Ｃ１８、Ｃ３～Ｃ４、Ｃ３～Ｃ５、Ｃ３～Ｃ６、Ｃ３～Ｃ７、Ｃ３～Ｃ８、Ｃ３～Ｃ９、Ｃ３～Ｃ１０、Ｃ３～Ｃ１１、Ｃ３～Ｃ１２、Ｃ３～Ｃ１３、Ｃ３～Ｃ１４、Ｃ３～Ｃ１５、Ｃ３～Ｃ１６、Ｃ３～Ｃ１７、Ｃ３～Ｃ１８、Ｃ４～Ｃ５、Ｃ４～Ｃ６、Ｃ４～Ｃ７、Ｃ４～Ｃ８、Ｃ４～Ｃ９、Ｃ４～Ｃ１０、Ｃ４～Ｃ１１、Ｃ４～Ｃ１２、Ｃ４～Ｃ１３、Ｃ４～Ｃ１４、Ｃ４～Ｃ１５、Ｃ４～Ｃ１６、Ｃ４～Ｃ１７、Ｃ４～Ｃ１８、Ｃ５～Ｃ６、Ｃ５～Ｃ７、Ｃ５～Ｃ８、Ｃ５～Ｃ９、Ｃ５～Ｃ１０、Ｃ５～Ｃ１１、Ｃ５～Ｃ１２、Ｃ５～Ｃ１３、Ｃ５～Ｃ１４、Ｃ５～Ｃ１５、Ｃ５～Ｃ１６、Ｃ５～Ｃ１７、Ｃ５～Ｃ１８、Ｃ６～Ｃ７、Ｃ６～Ｃ８、Ｃ６～Ｃ９、Ｃ６～Ｃ１０、Ｃ６～Ｃ１１、Ｃ６～Ｃ１２、Ｃ６～Ｃ１３、Ｃ６～Ｃ１４、Ｃ６～Ｃ１５、Ｃ６～Ｃ１６、Ｃ６～Ｃ１７、Ｃ６～Ｃ１８、Ｃ７～Ｃ８、Ｃ７～Ｃ９、Ｃ７～Ｃ１０、Ｃ７～Ｃ１１、Ｃ７～Ｃ１２、Ｃ７～Ｃ１３、Ｃ７～Ｃ１４、Ｃ７～Ｃ１５、Ｃ７～Ｃ１６、Ｃ７～Ｃ１７、Ｃ７～Ｃ１８、Ｃ８～Ｃ９、Ｃ８～Ｃ１０、Ｃ８～Ｃ１１、Ｃ８～Ｃ１２、Ｃ８～Ｃ１３、Ｃ８～Ｃ１４、Ｃ８～Ｃ１５、Ｃ８～Ｃ１６、Ｃ８～Ｃ１７、Ｃ８～Ｃ１８、Ｃ９～Ｃ１０、Ｃ９～Ｃ１１、Ｃ９～Ｃ１２、Ｃ９～Ｃ１３、Ｃ９～Ｃ１４、Ｃ９～Ｃ１５、Ｃ９～Ｃ１６、Ｃ９～Ｃ１７、Ｃ９～Ｃ１８、Ｃ１０～Ｃ１１、Ｃ１０～Ｃ１２、Ｃ１０～Ｃ１３、Ｃ１０～Ｃ１４、Ｃ１０～Ｃ１５、Ｃ１０～Ｃ１６、Ｃ１０～Ｃ１７、Ｃ１０～Ｃ１８、Ｃ１１～Ｃ１２、Ｃ１１～Ｃ１３、Ｃ１１～Ｃ１４、Ｃ１１～Ｃ１５、Ｃ１１～Ｃ１６、Ｃ１１～Ｃ１７、Ｃ１１～Ｃ１８、Ｃ１２～Ｃ１３、Ｃ１２～Ｃ１４、Ｃ１２～Ｃ１５、Ｃ１２～Ｃ１６、Ｃ１２～Ｃ１７、Ｃ１２～Ｃ１８、Ｃ１３～Ｃ１４、Ｃ１３～Ｃ１５、Ｃ１３～Ｃ１６、Ｃ１３～Ｃ１７、Ｃ１３～Ｃ１８、Ｃ１４～Ｃ１５、Ｃ１４～Ｃ１６、Ｃ１４～Ｃ１７、Ｃ１４～Ｃ１８、Ｃ１５～Ｃ１６、Ｃ１５～Ｃ１７、Ｃ１５～Ｃ１８、Ｃ１６～Ｃ１７、Ｃ１６～Ｃ１８、又はＣ１７～Ｃ１８鎖を有する脂肪酸である。一部の態様では、各脂肪酸は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７又は１８個の炭素原子の
鎖を独立的に有する。
[00246]好適な脂肪酸は、飽和直鎖脂肪酸、飽和分岐脂肪酸、不飽和脂肪酸、ヒドロキシ脂肪酸、及びポリカルボン酸を含む。
[00247]有用な飽和直鎖脂肪酸の例としては、酪酸（Ｃ４）、カプロン酸（Ｃ６）、カプリル酸（Ｃ８）、カプリン酸（Ｃ１０）、ラウリン酸（Ｃ１２）、ミリスチン酸（Ｃ１４）、パルミチン酸（Ｃ１６）、又はステアリン酸（Ｃ１８）などの偶数の炭素原子を有するもの、及びプロピオン酸（Ｃ３）、ｎ－吉草酸（Ｃ５）、エナント酸（Ｃ７）、ペラルゴン酸（Ｃ９）、ヘンデカン酸（Ｃ１１）、トリデカン酸（Ｃ１３）、ペンタデカン酸（Ｃ１５）、又はヘプタデカン酸（Ｃ１７）などの奇数の炭素原子を有するものが挙げられる。
[00248]好適な飽和分岐脂肪酸の例としては、イソ酪酸、イソカプロン酸、イソカプリル酸、イソカプリン酸、イソラウリン酸、１１－メチルドデカン酸、イソミリスチン酸、１３－メチル－テトラデカン酸、イソパルミチン酸、１５－メチル－ヘキサデカン酸、又はイソステアリン酸が挙げられる。好適な飽和奇数炭素分岐脂肪酸としては、イソブチル基を末端に有するアンテイソ脂肪酸、例えば、６－メチル－オクタン酸、８－メチル－デカン酸、１０－メチル－ドデカン酸、１２－メチル－テトラデカン酸、又は１４－メチル－ヘキサデカン酸が挙げられる。
[00249]好適な不飽和脂肪酸の例としては、４－デセン酸、カプロレイン酸、４－ドデセン酸、５－ドデセン酸、ラウロレイン酸、４－テトラデセン酸、５－テトラデセン酸、９－テトラデセン酸、パルミトレイン酸、６－オクタデセン酸、オレイン酸などが挙げられる。
[00250]好適なヒドロキシ脂肪酸の例としては、α－ヒドロキシラウリン酸、α－ヒドロキシミリスチン酸、α－ヒドロキシパルミチン酸、α－ヒドロキシステアリン酸、ω－ヒドロキシラウリン酸、α－ヒドロキシアラキン酸、９－ヒドロキシ－１２－オクタデセン酸、リシノール酸、９－ヒドロキシ－トランス－１０，１２－オクタデカジエン酸、９，１０－ジヒドロキシステアリン酸、１２－ヒドロキシステアリン酸などが挙げられる。
[00251]好適なポリカルボン酸の例としては、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、Ｄ，Ｌ－リンゴ酸などが挙げられる。
[00252]一部の態様では、各脂肪酸は、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデシル酸、ラウリン酸、トリデシル酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、マルガリン酸、又はステアリン酸から独立的に選択される。
[00253]一部の態様では、各脂肪酸は、α－リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、リノール酸、ガンマ－リノール酸、ジホモ－ガンマ－リノール酸、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、パルミトレイン酸、バクセン酸、パウリン酸、オレイン酸、エライジン酸、ボセオペンタエン酸、イワシ酸、又は別のモノ不飽和脂肪酸若しくはポリ不飽和脂肪酸から独立的に選択される。
[00254]一部の態様では、脂肪酸の一方又は両方が、必須脂肪酸である。特定の必須脂肪酸の有益な健康効果を考慮すると、開示された治療薬が負荷されたエクソソームの治療効果は、そのような脂肪酸を治療剤に含めることによって増加される場合がある。一部の態様では、必須脂肪酸は、リノレン酸、ガンマ－リノレン酸、ジホモ－ガンマ－リノレン酸、アラキドン酸、アドレン酸、ドコサペンタエン酸ｎ－６、アルファ－リノレン酸、又はステアリドン酸からなる群から選択されるｎ－６又はｎ－３必須脂肪酸である。
[00255]脂肪酸鎖は、その鎖の長さが大きく異なり、鎖の長さによって、例えば短いものから非常に長いものまで分類されてもよい。短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）は、炭素数が約５以下の鎖を有する脂肪酸である（例えば、酪酸）。一部の態様では、脂肪酸は、ＳＣＦＡである。中鎖脂肪酸（ＭＣＦＡ）は、炭素数約６～１２の鎖を有する脂肪酸を含み、中鎖トリグリセリドを形成し得る。一部の態様では、脂肪酸は、ＭＣＦＡである。長鎖脂肪酸（ＬＣＦＡ）は、炭素数１３～２１の鎖を有する脂肪酸を含む。一部の態様では、脂肪酸は、ＬＣＦＡである。一部の態様では、脂肪酸は、ＬＣＦＡである。
アンカー部分：リン脂質：
[00256]一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、リン脂質を含む。リン脂質は、すべての細胞膜の主要な構成成分である脂質の分類である。これらは、その両親媒性特性のために脂質二重層を形成し得る。リン脂質分子の構造は、一般に、２つの疎水性脂肪酸「テール」とリン酸基からなる親水性「ヘッド」からなる。例えば、リン脂質は、以下の式：
Figure 2024506711000009
（式中、Ｒｐは、リン脂質部分を表し、Ｒ１及びＲ２は、同一であっても異なっていてもよい不飽和を有するか又は有さない脂肪酸部分を表す）による脂質であり得る。
[00257]リン脂質部分は、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、２リゾホスファチジルコリン、及びスフィンゴミエリンからなる非限定的な群から選択されてよい。
[00258]特定のリン脂質は、脂質二重層、例えばエクソソーム膜の脂質二重層への融合を容易にし得る。例えば、カチオン性リン脂質は、膜の１つ又は複数の負に荷電したリン脂質と相互作用し得る。リン脂質の膜への融合は、脂質含有組成物のうちの１つ又は複数の要素が、膜に結合するか又は膜を通過するのを可能にし得る。
[00259]脂肪酸部分は、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、又はリノレン酸からなる非限定的な群から選択されてよい。
[00260]本開示のアンカー部分を使用するリン脂質は、天然又は非天然のリン脂質であり得る。分岐、酸化、環化、及びアルキンを含む修飾及び置換を有する天然種を含む非天然リン脂質種も企図される。例えば、リン脂質は、１つ又は複数のアルキン（例えば、１つ又は複数の二重結合が三重結合で置き換えられたアルケニル基）で官能基化されるか又はそれに架橋されていてもよい。適切な反応条件下で、アルキン基は、アジドに曝露されると、銅触媒による環化付加反応を起こす。
[00261]リン脂質としては、以下に限定されないが、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、及びホスファチジン酸などのグリセロリン脂質が挙げられる。本明細書で開示されているアンカー部分において使用され得るリン脂質の例としては、ホスファチジルエタノールアミン（例えば、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン、１－パルミトイル－２－オレイルホスファチジルエタノールアミン、１－オレイル－２－パルミトイルホスファチジルエタノールアミン、及びジエルコイルホスファチジルエタノールアミン）、ホスファチジルグリセロール（例えば、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジオレイルホスファチジルグリセロール、１－パルミトイル－２－オレイル－ホスファチジルグリセロール、１－オレイル－２－パルミトイル－ホスファチジルグリセロール、及びジエルコイルホスファチジルグリセロール）；ホスファチジルセリン（例えば、ジラウロイルホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、ジステアロイルホスファチジルセリン、ジオレイルホスファチジルセリン、１－パルミトイル－２－オレイル－ホスファチジルセリン、１－オレイル－２－パルミトイル－ホスファチジルセリン、及びジエルコイルホスファチジルセリン）；ホスファチジン酸（例えば、ジラウロイルホスファチジン酸、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジステアロイルホスファチジン酸、ジオレオイルホスファチジン酸、１－パルミトイル－２－オレイルホスファチジン酸、１－オレイル－２－パルミトイルホスファチジン酸、及びジエルコイルホスファチジン酸）；及びホスファチジルイノシトール（例えば、ジラウロイルホスファチジルイノシトール、ジミリストイルホスファチジルイノシトール、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール、ジステアロイルホスファチジルイノシトール、ジオレオイルホスファチジルイノシトール、１－パルミトイル－２－オレイル－ホスファチジルイノシトール、１－オレイル－２－パルミトイル－ホスファチジルイノシトール、及びジエルコイルホスファチジルイノシトール）が挙げられる。
[00262]リン脂質は、対称型であっても非対称型であってもよい。本明細書で使用される場合、用語「対称リン脂質」は、一致する脂肪酸部分を有するグリセロリン脂質、及び可変脂肪酸部分とスフィンゴシン骨格の炭化水素鎖とが同数の炭素原子を含むスフィンゴ脂質を含む。本明細書中で使用される場合、用語「非対称リン脂質」は、リゾ脂質、異なる脂肪酸部分（例えば、異なる数の炭素原子及び／又は不飽和部分（例えば、二重結合）を有する脂肪酸部分）を有するグリセロリン脂質、並びに可変脂肪酸部分及びスフィンゴシン骨格の炭化水素鎖が異なる数の炭素原子を含む（例えば、可変脂肪酸部分が炭化水素鎖より少なくとも２個多い炭素原子又は炭化水素鎖より少なくとも２個少ない炭素原子を含む）スフィンゴ脂質を含む。
[00263]一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、１０個の炭素（Ｃ１０）、１２個の炭素（Ｃ１２）、１４個の炭素（Ｃ１４）、１６個の炭素（Ｃ１６）又は１８個の炭素（Ｃ１８）を含むリン脂質、例えば対称リン脂質を含む。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、１４個の炭素（Ｃ１４）を含む対称リン脂質を含む。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、１６個の炭素（Ｃ１６）を含む対照リン脂質を含む。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、１８個の炭素（Ｃ１８）を含む対照リン脂質を含む。一部の態様では、リン脂質は、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）である。したがって、一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、Ｃ１４ ＰＥを含む。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、Ｃ１６ ＰＥを含む。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、Ｃ１８ ＰＥを含む。一部の態様では、ＰＥのアシル鎖は、不飽和部分を含有しない。したがって、一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、Ｃ１４：０ ＰＥ、Ｃ１６：０ ＰＥ、又はＣ１８：０ ＰＥを含む。
[00264]一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、シアヌル酸（ｃｙａｎｕｒ）基を含むリン脂質を含む。一部の態様では、シアヌル酸基を含むリン脂質は、ＰＥである。一部の態様では、シアヌル酸基を含むリン脂質は、Ｃ１４：０ ＰＥ、Ｃ１６：０ ＰＥ、又はＣ１８：０ ＰＥである。特定の態様では、シアヌル酸基を含むリン脂質は、図１１に示されているＣ１６：０ Ｃｙａｎｕｒ ＰＥである。
[00265]一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、少なくとも１つの対称リン脂質を含む。対称リン脂質は、１，２ジプロピオニルｓｎ－グリセロ３ホスホコリン（０３：０ ＰＣ）、１，２ジブチリルｓｎグリセロ３ホスホコリン（０４：０ ＰＣ）、１，２ジペンタノイルｓｎグリセロ３ホスホコリン（０５：０ ＰＣ）、１，２ジヘキサノイルｓｎグリセロ３ホスホコリン（０６：０ ＰＣ）、１，２ジヘプタノイルｓｎグリセロ３ホスホコリン（０７：０ ＰＣ）、１，２ジオクタノイルｓｎグリセロ３ホスホコリン（０８：０ ＰＣ）、１，２ジノナノイルｓｎグリセロ３ホスホコリン（０９：０ ＰＣ）、１，２ジデカノイルｓｎグリセロ３ホスホコリン（１０：０ ＰＣ）、１，２ジウンデカノイルｓｎグリセロ３ホスホコリン（１１：０ ＰＣ、ＤＵＰＣ）、１，２ジラウロイルｓｎグリセロ３ホスホコリン（１２：０ ＰＣ）、１，２ジトリデカノイルｓｎグリセロ３ホスホコリン（１３：０ ＰＣ）、１，２－ジミリストイルｓｎグリセロ３ホスホコリン（１４：０ ＰＣ、ＤＭＰＣ）、１，２－ジペンタデカノイルｓｎグリセロ３ホスホコリン（１５：０ ＰＣ）、１，２－ジパルミトイルｓｎグリセロ３ホスホコリン（１６：０ ＰＣ、ＤＰＰＣ）、１，２ジフィタノイルｓｎグリセロ３ホスホコリン（４ＭＥ １６：０ ＰＣ）、１，２ジヘプタデカノイルｓｎグリセロ３ホスホコリン（１７：０ ＰＣ）、１，２ジステアロイルｓｎグリセロ３ホスホコリン（１８：０ ＰＣ、ＤＳＰＣ）、１，２ジミリステライドイルｓｎグリセロ３ホスホコリン（１４：１（Δ９－Ｔｒａｎｓ） ＰＣ）、１，２ジパルミトレオイルｓｎグリセロ３ホスホコリン（１６：１（Δ９－Ｃｉｓ）ＰＣ）、１，２ジパルミテライドイルｓｎグリセロ３ホスホコリン（１６：１（Δ９－Ｔｒａｎｓ）ＰＣ）、１，２ジペトロセレノイルｓｎグリセロ３ホスホコリン（１８：１（Δ６－Ｃｉｓ）ＰＣ）、１，２ジオレオイルｓｎグリセロ３ホスホコリン（１８：１（Δ９－Ｃｉｓ）ＰＣ、ＤＯＰＣ）、１，２ジエライドイルｓｎグリセロ３ホスホコリン（１８：１（Δ９－Ｔｒａｎｓ）ＰＣ）、１，２ジリノレオイルｓｎグリセロ３ホスホコリン（１８：２（Ｃｉｓ）ＰＣ、ＤＬＰＣ）、１，２ジリノレノイルｓｎグリセロ３ホスホコリン（１８：３（Ｃｉｓ）ＰＣ、ＤＬｎＰＣ）、１，２ジヘキサノイルｓｎグリセロ３ホスホエタノールアミン（０６：０ ＰＥ）、１，２ジオクタノイルｓｎグリセロ３ホスホエタノールアミン（０８：０ ＰＥ）、１，２ジデカノイルｓｎグリセロ３ホスホエタノールアミン（１０：０ ＰＥ）、１，２ジラウロイルｓｎグリセロ３ホスホエタノールアミン（１２：０ ＰＥ）、１，２ジミリストイルｓｎグリセロ３ホスホエタノールアミン（１４：０ ＰＥ）、１，２ジペンタデカノイルｓｎグリセロ３ホスホエタノールアミン（１５：０ ＰＥ）、１，２ジパルミトイルｓｎグリセロ３ホスホエタノールアミン（１６：０ ＰＥ）、１，２ジフィタノイルｓｎグリセロ３ホスホエタノールアミン（４ＭＥ １６：０ ＰＥ）、１，２ジヘプタデカノイルｓｎグリセロ３ホスホエタノールアミン（１７：０ ＰＥ）、１，２ジステアロイルｓｎグリセロ３ホスホエタノールアミン（１８：０ ＰＥ、ＤＳＰＥ）、１，２ジパルミトレオイルｓｎグリセロ３ホスホエタノールアミン（１６：１ ＰＥ）、１，２ジオレオイルｓｎグリセロ３ホスホエタノールアミン（１８：１（Δ９－Ｃｉｓ）ＰＥ、ＤＯＰＥ）、１，２ジエライドイルｓｎグリセロ３ホスホエタノールアミン（１８：１（Δ９－Ｔｒａｎｓ）ＰＥ）、１，２ジリノレオイルｓｎグリセロ３ホスホエタノールアミン（１８：２ ＰＥ、ＤＬＰＥ）、１，２ジリノレノイルｓｎグリセロ３ホスホエタノールアミン（１８：３ ＰＥ、ＤＬｎＰＥ）、１，２ジＯオクタデセニルｓｎグリセロ３ホスホコリン（１８：０ Ｄｉｅｔｈｅｒ ＰＣ）、１，２ジオレオイルｓｎグリセロ３ホスホラック（１グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、及びこれらの任意の組合せからなる非限定的な群から選択されていよい。
[00266]一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、ＤＬＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＵＰＣ、１８：０ Ｄｉｅｔｈｅｒ ＰＣ、ＤＬｎＰＣ、ＤＡＰＣ、ＤＨＡＰＣ、ＤＯＰＥ、４ＭＥ １６：０ ＰＥ、ＤＳＰＥ、ＤＬＰＥ，ＤＬｎＰＥ、ＤＡＰＥ、ＤＨＡＰＥ、ＤＯＰＧ、及びこれらの任意の組合せからなる非限定的な群から選択される少なくとも１つの対称リン脂質を含む。
[00267]一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、少なくとも１つの非対称リン脂質を含む。非対称リン脂質は、１ミリストイル２パルミトイルｓｎグリセロ３ホスホコリン（１４：０～１６：０ ＰＣ、ＭＰＰＣ）、１ミリストイル２ステアロイルｓｎグリセロ３ホスホコリン（１４：０～１８：０ ＰＣ、ＭＳＰＣ）、１パルミトイル２アセチルｓｎグリセロ３ホスホコリン（１６：０～０２：０ ＰＣ）、１パルミトイル２ミリストイルｓｎグリセロ３ホスホコリン（１６：０～１４：０ ＰＣ、ＰＭＰＣ）、１パルミトイル２ステアロイルｓｎグリセロ３ホスホコリン（１６：０～１８：０ ＰＣ、ＰＳＰＣ）、１パルミトイル２オレオイルｓｎグリセロ３ホスホコリン（１６：０～１８：１ ＰＣ、ＰＯＰＣ）、１パルミトイル２リノレオイルｓｎグリセロ３ホスホコリン（１６：０～１８：２ ＰＣ、ＰＬＰＣ）、１パルミトイル２アラキドノイルｓｎグリセロ３ホスホコリン（１６：０～２０：４ ＰＣ）、１パルミトイル２ドコサヘキサエノイルｓｎグリセロ３ホスホコリン（１４：０～２２：６ ＰＣ）、１ステアロイル２ミリストイルｓｎグリセロ３ホスホコリン（１８：０～１４：０ ＰＣ、ＳＭＰＣ）、１ステアロイル２パルミトイルｓｎグリセロ３ホスホコリン（１８：０～１６：０ ＰＣ、ＳＰＰＣ）、１ステアロイル２オレオイルｓｎグリセロ３ホスホコリン（１８：０～１８：１ ＰＣ、ＳＯＰＣ）、１ステアロイル２リノレオイルｓｎグリセロ３ホスホコリン（１８：０～１８：２ ＰＣ）、１ステアロイル２アラキドノイルｓｎグリセロ３ホスホコリン（１８：０～２０：４ ＰＣ）、１ステアロイル２ドコサヘキサエノイルｓｎグリセロ３ホスホコリン（１８：０～２２：６ ＰＣ）、１オレオイル２ミリストイルｓｎグリセロ３ホスホコリン（１８：１～１４：０ ＰＣ、ＯＭＰＣ）、１オレオイル２パルミトイルｓｎグリセロ３ホスホコリン（１８：１～１６：０ ＰＣ、ＯＰＰＣ）、１オレオイル２ステアロイルｓｎグリセロ３ホスホコリン（１８：１～１８：０ ＰＣ、ＯＳＰＣ）、１パルミトイル２オレオイルｓｎグリセロ３ホスホエタノールアミン（１６：０～１８：１ ＰＥ、ＰＯＰＥ）、１パルミトイル２リノレオイルｓｎグリセロ３ホスホエタノールアミン（１６：０～１８：２ ＰＥ）、１パルミトイル２アラキドノイルｓｎグリセロ３ホスホエタノールアミン（１６：０～２０：４ ＰＥ）、１パルミトイル２ドコサヘキサエノイルｓｎグリセロ３ホスホエタノールアミン（１６：０～２２：６ ＰＥ）、１ステアロイル２オレオイルｓｎグリセロ３ホスホエタノールアミン（１８：０～１８：１ ＰＥ）、１ステアロイル２リノレイルｓｎグリセロ３ホスホエタノールアミン（１８：０～１８：２ ＰＥ）、１ステアロイル２アラキドノイルｓｎグリセロ３ホスホエタノールアミン（１８：０～２０：４ ＰＥ）、１ステアロイル２ドコサヘキサエノイルｓｎグリセロ３ホスホエタノールアミン（１８：０～２２：６ ＰＥ）、１オレオイル２コレステリルヘミスクシノイルｓｎグリセロ３ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、及びこれらの任意の組合せからなる非限定的な群から選択されてよい。
[00268]より顕著なヌクレアーゼ耐性、細胞取込み効率、及びより顕著なＲＮＡ干渉効果を与えるために、ホスファチジルエタノールアミン、例えば、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、１－パルミトイル－２－オレイル－ホスファチジルエタノールアミン、及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミンがアンカー部位として使用されてもよい。
アンカー部分：リゾ脂質（例えば、リゾリン脂質）
[00269]一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、リゾ脂質、例えばリゾリン脂質を含む。リゾ脂質は、一方又は両方の脂肪アシル鎖が、一般には加水分解により除去された脂質の誘導体である。リゾリン脂質は、一方又は両方の脂肪アシル鎖が加水分解により除去されたリン脂質の誘導体である。
[00270]一部の態様では、アンカー部分は、一方又は両方のアシル鎖が加水分解によって除去され、したがって、得られたリゾリン脂質が１つの脂肪酸アシル鎖を含むか又は脂肪酸アシル鎖を含まない、上に開示されているリン脂質のいずれかを含む。
[00271]一部の態様では、アンカー部分は、リゾグリセロリン脂質、リゾグリコスフィンゴ脂質、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルイノシトール、又はリゾホスファチジルセリンを含む。
[00272]一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、１ヘキサノイル２ヒドロキシｓｎグリセロ３ホスホコリン（０６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、１ヘプタノイル２ヒドロキシｓｎグリセロ３ホスホコリン（０７：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、１オクタノイル２ヒドロキシｓｎグリセロ３ホスホコリン（０８：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、１ノナノイル２ヒドロキシｓｎグリセロ３ホスホコリン（０９：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、１デカノイル２ヒドロキシｓｎグリセロ３ホスホコリン（１０：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、１ウンデカノイル２ヒドロキシｓｎグリセロ３ホスホコリン（１１：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、１ラウロイル２ヒドロキシｓｎグリセロ３ホスホコリン（１２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、１トリデカノイル２ヒドロキシｓｎグリセロ３ホスホコリン（１３：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、１ミリスチル２ヒドロキシｓｎグリセロ３ホスホコリン（１４：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、１ペンタデカノイル２ヒドロキシｓｎグリセロ３ホスホコリン（１５：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、１パルミトイル２ヒドロキシｓｎグリセロ３ホスホコリン（１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、１ヘプタデカノイル２ヒドロキシｓｎグリセロ３ホスホコリン（１７：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、１ステアロイル２ヒドロキシｓｎグリセロ３ホスホコリン（１８：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、又は１オレオイル２ヒドロキシｓｎグリセロ３ホスホコリン（１８：１ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、１ミリストイル２ヒドロキシｓｎグリセロ３ホスホエタノールアミン（１４：０ Ｌｙｓｏ ＰＥ）、１パルミトイル２ヒドロキシｓｎグリセロ３ホスホエタノールアミン（１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＥ）、１ステアロイル２ヒドロキシｓｎグリセロ３ホスホエタノールアミン（１８：０ Ｌｙｓｏ ＰＥ）、１オレオイル２ヒドロキシｓｎグリセロ３ホスホエタノールアミン（１８：１ Ｌｙｓｏ ＰＥ）、１ヘキサデシルｓｎグリセロ３ホスホコリン（Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、及びこれらの任意の組合せからなる非限定的な群から選択される。
アンカー部分：ビタミン
[00273]一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、脂溶性ビタミン、例えば、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＤ、葉酸、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン）、又はビタミンＢ６（ピリドキシン）を含む。
[00274]一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、ビタミンＤを含むか又はそれからなる。ビタミンＤは、カルシウム、マグネシウム、リン酸の腸管吸収、及び多くの他の生物学的作用の増加を担う脂溶性セルコステロイドの一群である。ヒトでは、この群の中で最も重要な化合物は、ビタミンＤ３（コレカルシフェロールとしても公知）及びビタミンＤ２（エルゴカルシフェロール）である。
Figure 2024506711000010
[00275]一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、ビタミンＢ９（葉酸）を含むか又はそれからなる。
Figure 2024506711000011
[00276]一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、ビタミンＢ２（リボフラビン）を含むか又はそれからなる。
Figure 2024506711000012
[00277]一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、ビタミンＢ３（ナイアシン）を含むか又はそれからなる。
Figure 2024506711000013
[00278]一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、ビタミンＢ６（ピリドキシン）を含むか又はそれからなる。
Figure 2024506711000014
[00279]一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、ビタミンＡを含むか又はそれからなる。ビタミンＡは、レチノール、レチナール、レチノイン酸、及びいくつかのプロビタミンＡカロテノイド（特にベータカロテン）を含む不飽和栄養有機化合物の一群である。一部の態様では、アンカー部分は、レチノールを含む。一部の態様では、アンカー部分は、レチノイドを含む。レチノイドは、ビタミンＡのビタマーである化学的化合物の分類であるか又はそれに化学的に関連する。一部の態様では、アンカー部分は、第１世代のレチノイド（例えば、レチノール、トレチノイン、イソトレアチノイン、又はアリトレチノイン）、第２世代のレチノイド（例えば、エトレチネート又はアシトレチン）、第３世代のレチノイド（例えば、アダパレン、ベキサロテン、又はタザロテン）、又はこれらの任意の組合せを含む。
Figure 2024506711000015
[00280]一部の態様では、アンカー部分は、ビタミンＥを含むか又はそれからなる。トコフェロールは、その多くがビタミンＥ活性を有するメチル化フェノールの分類である。よって、一部の態様では、アンカー部分は、アルファ－トコフェロール、ベータ－トコフェロール、ガンマ－トコフェロール、デルタ－トコフェロール、又はこれらの組合せを含む。
Figure 2024506711000016
[00281]トコトリエノールは、ビタミンＥ活性も有する。トコトリエノールとトコフェロールの間の決定的な化学構造の違いは、トコトリエノールが３つの炭素－炭素二重結合を含む不飽和イソプレノイド側鎖を有するのに対し、トコフェロールは飽和側鎖を有することである。一部の態様では、アンカー部分は、アルファ－トコトリエノール、ベータ－トコトリエノール、ガンマ－トコトリエノール、デルタ－トコトリエノール、又はこれらの組合せを含む。トコトリエノールは、以下の式で表すことができる
Figure 2024506711000017
アルファ（α）－トコトリエノール：Ｒ１＝Ｍｅ、Ｒ２＝Ｍｅ、Ｒ３＝Ｍｅ；
ベータ（β）－トコトリエノール：Ｒ１＝Ｍｅ、Ｒ２＝Ｈ、Ｒ３＝Ｍｅ；
ガンマ（γ）－トコトリエノール：Ｒ１＝Ｈ、Ｒ２＝Ｍｅ、Ｒ３＝Ｍｅ；
デルタ（δ）－トコトリエノール：Ｒ１＝Ｈ、Ｒ２＝Ｈ、Ｒ３＝Ｍｅ。
[00282]一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、ビタミンＫを含むか又はそれからなる。化学的に、ビタミンＫファミリーは、２－メチル－１．４－ナフトキノン（３－）誘導体を含む。ビタミンＫは、２つの天然のビタマー：ビタミンＫ１及びビタミンＫ２を含む。ビタミンＫ１（フィトナジオン、フィロキノン、又は（Ｅ）－フォトナジオンとしても公知）の構造は、フィチル基の存在によって特徴付けられる。ビタミンＫ２（メナキノン）の構造は、６～１３個のイソプレニル単位を含有し得る分子内に存在するポリイソプレニル側鎖によって特徴付けられる。よって、ビタミンＫ２は、イソプレノイド原子群から構成される炭素側鎖の長さが異なる、いくつかの関連する化学的サブタイプからなる。ＭＫ－４は、ビタミンＫ２の最も一般的な形態である。ＭＫ－７、ＭＫ－８及びＭＫ－９などの長鎖型は発酵食品に多く含まれる。ＭＫ－１０～ＭＫ－１３などの長鎖型のビタミンＫ２は、細菌によって合成されるが、吸収率が良好ではなく、生物学的機能をほとんど有さない。天然型のビタミンＫに加えて、ビタミンＫ３（メナジオン；２－メチルナフタレン－１，４－ジオン）、ビタミンＫ４、及びビタミンＫ５などのいくつかの合成形態のビタミンＫも存在する。
[00283]したがって、一部の態様では、アンカー部分は、ビタミンＫ１、Ｋ２（例えば、ＭＫ－４、ＭＫ－５、ＭＫ－６、ＭＫ－７、ＭＫ－８、ＭＫ－９、ＭＫ－１０、ＭＫ－１１、ＭＫ－１２、又はＭＫ－１３）、Ｋ３、Ｋ４、Ｋ５、又はこれらの任意の組合せを含む。
[00284]化学的に、ビタミンＫファミリーは、２－メチル－１．４－ナフトキノン（３－）誘導体を含む。ビタミンＫは、２つの天然のビタマー：ビタミンＫ１（フィロキノン）及びビタミンＫ２（メナキノン）を含む。よって、ビタミンＫ２は、イソプレノイド原子群から構成される炭素側鎖の長さが異なる、いくつかの関連する化学的サブタイプからなる。２つの最も研究されたものは、メナキノン－４（ＭＫ－４）及びメナキノン－７（ＭＫ－７）である。よって、一部の態様では、ビタミンＫは、ＭＫ－４、ＭＫ－５、又はこれらの組合せである。
足場部分
[00285]一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の膜に挿入され得る足場部分、例えばＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘタンパク質（例えば、ＰＴＧＦＲ又は開示された断片）、又は天然に若しくは組換えにより発現したＥＶ（例えば、エクソソーム）の膜に存在する足場部分、例えばＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘタンパク質（例えば、ＰＴＧＦＲ又は開示された断片）と、親和性（例えば、抗体又はその結合部分）によって相互作用することが可能な分子を含む。一部の態様では、１つ又は複数の足場部分は、ＣＤ４７、ＣＤ５５、ＣＤ４９、ＣＤ４０、ＣＤ１３３、ＣＤ５９、グリピカン－１、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、インテグリン、セレクチン、レクチン、カドヘリン、当業者に公知の他の類似ポリペプチド、又はこれらの任意の組合せであり得る。本開示と共に使用され得る他の足場部分の非限定的な例としては、アミノペプチダーゼＮ（ＣＤ１３）；ネプリライシン、別名膜メタロエンドペプチダーゼ（ＭＭＥ）；エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー１（ＥＮＰＰ１）；ニューロピリン－１（ＮＲＰ１）；又はこれらの任意の組合せが挙げられる。
[00286]他の態様では、１つ又は複数の足場部分は、産生細胞において足場部分を組換え発現させることによって、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の膜に発現される。産生細胞から得られたＥＶ（例えば、エクソソーム）は、マレイミド部分又はリンカーにコンジュゲートされるようにさらに修飾することができる。他の態様では、足場部分、例えばＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘは脱グリコシル化される。一部の態様では、足場部分、例えばＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、高度に、例えば、同一条件下の天然に存在するＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘよりも高度にグリコシル化される。
足場部分：Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ
[00287]一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、本明細書で開示されている足場部分、例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ、例えば、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰトランスポーター、又はこれらの断片若しくはバリアント含み得る。他の態様では、アンカー部分［ＡＭ］は、本明細書で開示されている足場部分、例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ、例えば、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰトランスポーター、又はこれらの断片若しくはバリアントに特異的に結合し得るリガンド（例えば、抗体またはその結合部分）を含み得る。
[00288]一部の態様では、表面（例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ）を操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）、すなわち、足場タンパク質（例えば、ＰＴＧＦＲＮ）を過剰発現するＥＶは、足場タンパク質（例えば、ＰＴＧＦＲＮ）を過剰に発現しない天然のＥＶ（例えば、エクソソーム）と比較して、優れた特徴を実証する。例えば、表面（例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ）を操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）は、その外部表面に、天然に存在するＥＶ（例えば、エクソソーム）よりも多くの足場タンパク質を含有し得る。したがって、表面（例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ）を操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）は、天然に存在するＥＶ（例えば、エクソソーム）と比較して、より大きいか、より特異的であるか、又はより制御された生物活性を有し得る。
[00289]一部の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、プロスタグランジンＦ２受容体陰性調節因子（ＰＴＧＦＲＮポリペプチド）を含む。ＰＴＧＦＲＮポリペプチドは、ＣＤ９パートナー１（ＣＤ９Ｐ－１）、Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｉｌｅ ＥＷＩモチーフ含有タンパク質Ｆ（ＥＷＩ－Ｆ）、プロスタグランジンＦ２－アルファ受容体調節タンパク質、プロスタグランジンＦ２－アルファ受容体関連タンパク質、又はＣＤ３１５とも称され得る。
[00290]他のＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘタンパク質の非限定的な例は、参照によりその全体が組み込まれる、２０１９年２月５日に発行された米国特許第１０１９５２９０号に見い出すことができる。
連結及びスペーサー
[00291]本開示の最適化リンカーは、連結、例えば、切断性又は非切断性の結合（例えば、それぞれ、ホスホジエステル結合又はホスホロチオエート結合）及び切断性又は非切断性のリンカーと、スペーサーとの組合せを含む。連結とスペーサーとの組合せの主な機能は、アンカー部分（１つ又は複数）［ＡＭ］と生物学的に活性な分子（１つ又は複数）［ＢＡＭ］との間に最適な間隔を与えることである。例えば、ＡＳＯの場合には、リンカーとスペーサーとの組合せの目的は、立体障害を低下させ、ＡＳＯが標的核酸分子、例えばｍＲＮＡ又はｍｉＲＮＡと相互作用し得るようにＡＳＯを位置付けることである。他の目的は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の負荷効率を増加させること、ＥＶ当たりのＢＡＭ数を増加させること、ＥＶ上のＢＡＭの表面密度を増加させること、ＥＶへの組込み後のＢＡＭの効力を増加させること、又はこれらの任意の組合せである。本開示の文脈では、用語「リンカーの組合せ」は、本明細書で開示されている最適化リンカーを構成する連結とスペーサーとの組合せを指す。
[00292]いくつかのリンカーは切断を受けやすく（「切断性リンカー」）、それによって、生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］の放出を容易にし得る。よって、一部の態様では、本明細書で開示されているリンカーの組合せは、切断性リンカーを含み得る。このような切断性リンカーは、例えば、生物学的に活性な分子が活性なままである条件で、酸誘導性切断、光誘導性切断、ペプチダーゼ誘導性切断、エステラーゼ誘導性切断、及びジスルフィド結合切断を受けやすい場合がある。或いは、リンカーは、切断に対して実質的に耐性である場合がある（「非切断性リンカー」）。一部の態様では、切断性リンカーは、スペーサーを含む。一部の態様では、スペーサーは、ＰＥＧである。
[00293]一部の態様では、リンカーの組合せは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、若しくは少なくとも６個又はそれより多い本明細書で開示されている様々なリンカーを含む。一部の態様では、リンカーの組合せにおけるリンカーは、エステル結合（例えば、ホスホジエステル又はホスホロチオエートエステル）によって連結され得る。
[00294]一部の態様では、リンカーは、アンカー部分［ＡＭ］と生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］、例えばＡＳＰとの間の直接結合である。
非切断性リンカー
[00295]一部の態様では、リンカーの組合せは、「非切断性リンカー」を含む。非切断性リンカーは、本明細書で開示されている構築物、例えば式１の構築物のうちの２つ以上の構成成分を連結させることが可能な任意の化学的部分である。例えば、非切断性リンカーは、アンカー部分［ＡＭ］とスペーサー［ＳＰ］とを、第１のスペーサー［ＳＰ１］を第２のスペーサー［ＳＰ］に、又はスペーサー［ＳＰ］を生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］に連結させることができる。非切断性リンカーは、酸誘導性切断、光誘導性切断、ペプチダーゼ誘導性切断、ペプチダーゼ誘導性切断、エステラーゼ誘導性切断及びジスルフィド結合の切断に対して実質的に耐性である。
[00296]さらに、非切断性は、環状ジヌクレオチド及び／又は抗体がその活性を失わない条件下で、酸、感光性切断剤、ペプチダーゼ、エステラーゼ、又はジスルフィド結合を切断する化学的若しくは生理学的化合物によって誘導される切断に耐える、リンカー又はリンカーに隣接する化学結合の能力を指す。
[00297]一部の態様では、リンカーの組合せは、例えば、テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、スクシンイミド、又はこれらの任意の組合せを含む非切断性リンカーを含む。一部の態様では、非切断性リンカーは、生物学的に活性な分子を非切断性リンカーに連結させるスペーサー単位を含む。
[00298]一部の態様では、１つ又は複数の非切断性リンカーは、一緒に連結したより小さい単位（例えば、ＨＥＧ、ＴＥＧ、グリセロール、Ｃ２～Ｃ１２アルキルなど）を含む。一態様では、連結は、エステル連結（例えば、ホスホジエステル又はホスホロチオエートエステル）又は他の連結である。
非切断性リンカー／スペーサー：エチレングリコール（ＨＥＧ、ＴＥＧ、ＰＥＧ）
[00299]一部の態様では、リンカーの組合せは、非切断性リンカーを含み、非切断性リンカーは、式Ｒ３－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－又はＲ３－（０－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－Ｏ－（Ｒ３は、水素、メチル又はエチルであり、ｎは２～２００の値を有する）によって特徴付けられるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。一部の態様では、リンカーはスペーサーを含み、スペーサーはＰＥＧである。
[00300]一部の態様では、ＰＥＧリンカーは、オリゴ－エチレングリコール、例えば、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）、ペンタエチレングリコール、又はヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）リンカーである。
[00301]一部の態様では、ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５の値を有する。一部の態様では、ｎは、２～１０の間、１０～１５の間である。一部の具体的態様では、ｎは、２～５、５～１０、又は１０～１５の値を有する。一部の実施形態では、ＰＥＧは、分岐ＰＥＧである。分岐ＰＥＧは、中央のコア基から出ている３～１０本のＰＥＧ鎖を有する。
[00302]ある特定の態様では、ＰＥＧ部分は、単分散ポリエチレングリコールである。本開示の文脈では、単分散ポリエチレングリコール（ｍｄＰＥＧ）は、単一の、規定された鎖長及び分子量を有するＰＥＧである。ｍｄＰＥＧは、典型的には、クロマトグラフィーによる重合混合物からの分離によって生成される。特定の式では、単分散ＰＥＧ部分にはｍｄＰＥＧの略号が付与される。
[00303]一部の態様では、ＰＥＧは、Ｓｔａｒ ＰＥＧである。Ｓｔａｒ ＰＥＧは、中央のコア基から出ている１０～１５本のＰＥＧ鎖を有する。一部の実施形態では、ＰＥＧは、Ｃｏｍｂ ＰＥＧである。Ｃｏｍｂ ＰＥＧは、ポリマー骨格に通常グラフトされた複数のＰＥＧ鎖を有する。
[00304]一部の態様では、本開示のリンカーの組合せは、いくつかのＰＥＧリンカー、例えば、ＰＥＧ、ＨＥＧ、又はＴＥＧリンカーに隣接した切断性リンカーを含み得る。一部の態様では、リンカーの組合せは、２つ以上の（ＨＥＧ）及び／又は（ＴＥＧ）単位を含み、各単位は、例えば、リン酸エステルリンカー、ホスホロチオエートエステル連結、又はこれらの組合せを介して接続されており、リンカーにおける炭素単位の総数はＣ１５以下である。
非切断性リンカー／スペーサー：グリセロール及びポリグリセロール（ＰＧ）
[00305]一部の態様では、リンカーの組合せは、グリセロール単位又は式（（Ｒ３－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨＯＨ－ＣＨ２Ｏ）ｎ－）に記載のポリグリセロール（ＰＧ）を含む非切断性リンカーを含み、Ｒ３は、水素、メチル又はエチルであり、ｎは、１～１５の値を有する。一部の態様では、ｎは１～５の値を有する。一部の態様では、ｎは５～１０の値を有する。一部の態様では、ｎは１０～１５の値を有する。
[00306]一部の態様では、ＰＧリンカーは、ジグリセロール、トリグリセロール、テトラグリセロール（ＴＧ）、ペンタグリセロール、又はヘキサグリセロール（ＨＧ）リンカーである。一部の態様では、ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５の値を有する。一部の態様では、ｎは、２～５の間、５～１０の間、又は１０～１５の間である。
[00307]これらの態様の一部の代替では、ｎは１～１５の値を有する。一部の態様では、異種部分は、式（Ｒ３－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨＯＲ５－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－）に記載の分岐ポリグリセロールであり、Ｒ５は、水素又は式（Ｒ３－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨＯＨ－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－）に記載の直鎖グリセロール鎖であり、Ｒ３は、水素、メチル又はエチルである。一部の態様では、異種部分は、式（Ｒ３－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨＯＲ５－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－）に記載の多分岐ポリグリセロールであり、Ｒ５は、水素又は式（Ｒ３－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨＯＲ６－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－）に記載のグリセロール鎖であり、Ｒ６は、水素又は式（Ｒ３－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨＯＲ７－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－）に記載のグリセロール鎖であり、Ｒ７は、水素又は式（Ｒ３－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨＯＨ－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－）に記載の直鎖グリセロール鎖であり、Ｒ３は、水素、メチル又はエチルである。多分岐グリセロール及びその合成方法は、Ｏｕｄｓｈｏｒｎら（２００６） Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２７：５４７１～５４７９頁；Ｗｉｌｍｓら（２０１００ Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． ４３、１２９～４１頁、及びそれらにおいて引用される参照文献に記載されている。
[00308]一部の態様では、リンカーの組合せは、２つ以上の（グリセロール）及び／又は（ＨＧ）若しくは／又は（ＴＧ）単位を含み、各単位は、例えば、リン酸エステルリンカー、ホスホロチオエートエステル連結、又はこれらの組合せを介して接続されており、リンカーにおける炭素単位の総数はＣ１５以下である。
非切断性リンカー：脂肪族（アルキル）リンカー
[00309]一部の態様では、リンカーの組合せは、例えば、プロピル、ブチル、ヘキシル、又はＣ２～Ｃ１０アルキル若しくはＣ２～Ｃ６アルキルなどのＣ２～Ｃ１５アルキルの少なくとも１つの脂肪族（アルキル）リンカーを含む。
[00310]一部の態様では、リンカーの組合せは、アルキル鎖、例えば、非置換アルキルを含む。一部の態様では、リンカーの組合せは、置換又は非置換のアルケニル、置換又は非置換のアルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、又はアルケニルヘテロシクリルアルキニルを含む。
[00311]これらの構成成分は任意選択的に置換されている。置換は、アルコール、アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、及びプロポキシ）、直鎖若しくは分岐鎖アルキル（例えば、Ｃ１～Ｃ１５アルキル）、アミン、アミノアルキル（例えば、アミノＣ１～Ｃ１５アルキル）、ホスホラミダイト、ホスフェート、ホスホロアミデート、ホスホロジチオエート、チオホスフェート、ヒドラジド、ヒドラジン、ハロゲン、（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩ）、アミド、アルキルアミド（例えば、アミドＣ１～Ｃ１５アルキル）、カルボン酸、カルボン酸エステル、カルボン酸無水物、カルボン酸ハロゲン化物、エーテル、ハロゲン化スルホニル、イミデートエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、ハロホルメート、カルボジイミド付加物、アルデヒド、ケトン、スルフヒドリル、ハロアセチル、ハロゲン化アルキル、アルキルスルホネート、Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ＝ＣＨＣ（＝Ｏ）（マレイミド）、チオエーテル、シアノ、糖（例えば、マンノース、ガラクトース、及びグルコース）、α，β－不飽和カルボニル、アルキル水銀、又はα，β－不飽和スルホンを含む。
[00312]用語「アルキル」は、それ自体で又は別の置換基の一部として、別段に記載されていない限り、指定された数の炭素原子（例えば、Ｃ１～Ｃ１０は１～１０個の炭素原子を意味する）を有する直鎖又は分岐鎖炭化水素ラジカルを意味する。典型的には、アルキル基は１～１５個の炭素原子を有し、例えば１～１０個の炭素原子、１～８個の炭素原子又は１～６個の炭素原子を有する。「低級アルキル」基は、１～４個の炭素原子を有するアルキル基である。用語「アルキル」は、二価及び多価のラジカルを含む。適宜、例えば、式がアルキル基が二価であることを示す場合又は置換基が接合して環を形成している場合には、用語「アルキル」は「アルキレン」を含む。アルキルラジカルの例としては、以下に限定されないが、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉｓｏ－プロピル、ｎ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｉｓｏ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、並びに例えばｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル及びｎ－オクチルのホモログ及び異性体が挙げられる。
[00313]用語「アルキレン」は、それ自体で又は別の置換基の一部として、二価の（ジラジカル）アルキル基を意味し、アルキルは本明細書において定義されている。「アルキレン」は、以下に限定されないが、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－によって例示される。典型的には、「アルキレン」基は、１～１５個の炭素原子を有し、例えば１０個以下の炭素原子（例えば、１～８個又は１～６個の炭素原子）を有する。「低級アルキレン」基は、１～４個の炭素原子を有するアルキレン基である。
[00314]用語「アルケニル」は、それ自体で又は別の置換基の一部として、２～１５個の炭素原子を有し、少なくとも１つの二重結合を有する直鎖又は分岐鎖の炭化水素ラジカルを指す。典型的なアルケニル基は、２～１０個の炭素原子及び少なくとも１つの二重結合を有する。一態様では、アルケニル基は、２～８個の炭素原子又は２～６個の炭素原子及び１～３個の二重結合を有する。例示的なアルケニル基としては、ビニル、２－プロペニル、１－ブタ－３－エニル、クロチル、２－（ブタジエニル）、２，４－ペンタジエニル、３－（１，４－ペンタジエニル）、２－イソペンテニル、１－ペンタ－３－エニル、１－ヘキサ－５－エニルなどが挙げられる。
[00315]用語「アルキニル」は、それ自体で又は別の置換基の一部として、２～１５個の炭素原子を有し、少なくとも１つの三重結合を有する直鎖又は分岐鎖の不飽和又は多価不飽和炭化水素ラジカルを指す。典型的な「アルキニル」基は、２～１０個の炭素原子及び少なくとも１つの三重結合を有する。本開示の一態様では、アルキニル基は、２～６個の炭素原子及び少なくとも１つの三重結合を有する。例示的なアルキニル基としては、プロパ－１－イニル、プロパ－２－イニル（すなわち、プロパルギル）、エチニル及び３－ブチニルが挙げられる。
[00316]用語「アルコキシ」、「アルキルアミノ」及び「アルキルチオ」（又はチオアルキル）は、それらの従来の意味で使用され、それぞれ、酸素原子、アミノ基、又は硫黄原子を介して分子の残りの部分に結合しているアルキル基を指す。
[00317]用語「ヘテロアルキル」は、それ自体で又は別の用語と組み合わせて、記述した数の炭素原子（例えば、Ｃ２～Ｃ１０、又はＣ２～Ｃ８）及び例えば、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、Ｂ及びＰ（一態様では、Ｎ、Ｏ及びＳ）から選択される少なくとも１つのヘテロ原子からなる安定な、直鎖又は分岐鎖の炭化水素ラジカルを意味し、窒素、硫黄及びリン原子は任意選択的に酸化され、窒素原子（複数可）は任意選択的に四級化されている。ヘテロ原子（複数可）は、ヘテロアルキル基の内部の任意の位置に配置されている。ヘテロアルキル基の例としては、以下に限定されないが、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ３、－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｓ（Ｏ）－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｓ（Ｏ）２－ＣＨ３、－ＣＨ＝ＣＨ－Ｏ－ＣＨ３、－ＣＨ２－Ｓｉ（ＣＨ３）３、－ＣＨ２－ＣＨ＝Ｎ－ＯＣＨ３、及び－ＣＨ＝ＣＨ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ３が挙げられる。最大２個のヘテロ原子は、例えば、－ＣＨ２－ＮＨ－ＯＣＨ３及び－ＣＨ２－Ｏ－Ｓｉ（ＣＨ３）３のように連続的であり得る。
[00318]同様に、用語「ヘテロアルキレン」は、それ自体で又は別の置換基の一部として、以下に限定されないが、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ２－及び－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＨ２－によって例示されるように、ヘテロアルキルに由来する二価のラジカルを意味する。典型的には、ヘテロアルキル基は、３～２４個の原子（炭素及び水素を除くヘテロ原子）を有する（３～２４員のヘテロアルキル）。別の例では、ヘテロアルキル基は、合計３～１０個の原子（３～１０員のヘテロアルキル）又は３～８個の原子（３～８員のヘテロアルキル）を有する。適宜、例えば、式がヘテロアルキル基が二価であることを示す場合又は置換基が接合して環を形成している場合には、用語「ヘテロアルキル」は「ヘテロアルキレン」を含む。
[00319]用語「シクロアルキル」は、それ自体で又は他の用語と組み合わせて、３～２４個の炭素原子、例えば、３～１２個の炭素原子を有する、飽和又は不飽和の、非芳香族炭素環式ラジカル（例えば、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル又はＣ３～Ｃ６シクロアルキル）を表す。シクロアルキルの例としては、以下に限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、１－シクロヘキセニル、３－シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが挙げられる。用語「シクロアルキル」は、架橋した、多環式（例えば、二環式）構造、例えば、ノルボルニル、アダマンチル及びビシクロ［２．２．１］ヘプチルも含む。「シクロアルキル」基は、アリール（例えば、フェニル）、ヘテロアリール（例えば、ピリジル）及び非芳香族（例えば、炭素環式又は複素環式の）環から選択される少なくとも１つ（例えば、１～３個）の他の環に融合され得る。「シクロアルキル」基が融合したアリール、ヘテロアリール又は複素環式環を含む場合、「シクロアルキル」基は、炭素環式環を介して分子の残りの部分に結合している。
[00320]用語「ヘテロシクロアルキル」、「複素環式の」、「複素環」、又は「ヘテロシクリル」は、それ自体で又は他の用語と組み合わせて、例えば、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、Ｂ及びＰ（例えば、Ｎ、Ｏ及びＳ）から選択される少なくとも１つであって最大５個のヘテロ原子を含有する炭素環式の非芳香族環（例えば、３～８員の環及び例えば、４、５、６又は７員の環）であって、窒素、硫黄及びリン原子が任意選択的に酸化されており、窒素原子が任意選択的に四級化されている（例えば、窒素、酸素及び硫黄から選択される１～４個のヘテロ原子）、炭素環式の非芳香族環、又は当業者に公知の安定な組合せで、少なくとも１つであって最大１０個のヘテロ原子（Ｎ、Ｏ及びＳから選択された１～５個のヘテロ原子）を含有する４～８員の環の融合環系を表す。例示的なヘテロシクロアルキル基は、融合フェニル環を含む。「複素環式」基が融合したアリール、ヘテロアリール又はシクロアルキル環を含む場合、「複素環式」基は、複素環を介して分子の残りの部分に結合している。ヘテロ原子は、複素環が分子の残りの部分に結合している位置を占め得る。
[00321]本開示の例示的なヘテロシクロアルキル又は複素環式基としては、モルホリニル、チオモルホリニル、チオモルホリニルＳ－オキシド、チオモルホリニルＳ，Ｓ－ジオキシド、ピペラジニル、ホモピペラジニル、ピロリジニル、ピロリニル、イミダゾリジニル、テトラヒドロピラニル、ピペリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ピペリジニル、ホモピペリジニル、ホモモルホリニル、ホモチオモルホリニル、ホモチオモルホリニルＳ，Ｓ－ジオキシド、オキサゾリジノニル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピロリル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピリジル、ジヒドロピリミジニル、ジヒドロフリル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロチエニルＳ－オキシド、テトラヒドロチエニルＳ，Ｓ－ジオキシド、ホモチオモルホリニルＳ－オキシド、１－（１，２，５，６－テトラヒドロピリジル）、１－ピペリジニル、２－ピペリジニル、３－ピペリジニル、４－モルホリニル、３－モルホリニル、テトラヒドロフラン－２－イル、テトラヒドロフラン－３－イル、テトラヒドロチエン－２－イル、テトラヒドロチエン－３－イル、１－ピペラジニル、２－ピペラジニルなどが挙げられる。
[00322]「アリール」によって、単一の環（例えば、フェニル）を有するか又は他の芳香族若しくは非芳香族環（例えば、１～３個の他の環）に融合している５、６又は７員の芳香族炭素環式基が意味される。「アリール」基が非芳香族環（例えば、１，２，３，４－テトラヒドロナフチル）又はヘテロアリール基を含む場合、「アリール」基は、アリール環（例えば、フェニル環）を介して分子の残りの部分に結合される。アリール基は、任意選択的に置換されている（例えば、本明細書に記載の１～５個の置換基で）。一実施例では、アリール基は、６～１０個の炭素原子を有する。アリール基の非限定的な例としては、フェニル、１－ナフチル、２－ナフチル、キノリン、インダニル、インデニル、ジヒドロナフチル、フルオレニル、テトラリニル、ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソリル又は６，７，８，９－テトラヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［ａ］シクロヘプテニルが挙げられる。一態様では、アリール基は、フェニル、ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソリル及びナフチルから選択される。アリール基は、また別の態様では、フェニルである。
[00323]用語「アリールアルキル」又は「アラルキル」は、アリール基又はヘテロアリール基がアルキル基に結合して、ラジカルである－アルキル－アリール及び－アルキル－ヘテロアリールを生じるこれらのラジカルを含むことを意味し、アルキル、アリール及びヘテロアリールは本明細書において定義されている。例示的な「アリールアルキル」又は「アラルキル」基は、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチル等を含む。
[00324]
「アリールオキシ」によって、－Ｏ－アリールという基が意味され、アリールは本明細書に記載されている通りである。一実施例では、アリールオキシ基のアリール部分が、フェニル又はナフチルである。アリールオキシ基のアリール部分は、一態様では、フェニルである。
[00325]用語「ヘテロアリール」又は「ヘテロ芳香族の」は、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ及びＢ（例えば、Ｎ、Ｏ及びＳ）から選択される少なくとも１つのヘテロ原子（例えば、１～５個のヘテロ原子、例えば１～３個のヘテロ原子）を含有する、ポリ飽和５、６又は７員の芳香族部分を指し、窒素及び硫黄の原子は任意選択的に酸化されており、窒素原子（複数可）は任意選択的に四級化されている。「ヘテロアリール」基は、単一の環であるか又は他のアリール、ヘテロアリール、シクロアルキル若しくはヘテロシクロアルキル環（例えば、１～３個の他の環）に融合され得る。「ヘテロアリール」基が融合したアリール、シクロアルキル又はヘテロシクロアルキル環を含む場合、「ヘテロアリール」基は、ヘテロアリール環を介して分子の残りの部分に結合している。ヘテロアリール基は、炭素原子又はヘテロ原子を介して、分子の残りの部分に結合され得る。
[00326]一実施例では、ヘテロアリール基は、４～１０個の炭素原子並びＯ、Ｓ及びＮから選択される１～５個のヘテロ原子を有する。ヘテロアリール基の非限定的な例としては、ピリジル、ピリミジニル、キノリニル、ベンゾチエニル、インドリル、インドリニル、ピリダジニル、ピラジニル、イソインドリル、イソキノリル、キナゾリニル、キノキサリニル、フタラジニル、イミダゾリル、イソオキサゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、インドリジニル、インダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、フラニル、チエニル、ピロリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、イソチアゾリル、ナフチリジニル、イソクロマニル、クロマニル、テトラヒドロイソキノリニル、イソインドリニル、イソベンゾテトラヒドロフラニル、イソベンゾテトラヒドロチエニル、イソベンゾチエニル、ベンゾオキサゾリル、ピリドピリジル、ベンゾテトラヒドロフラニル、ベンゾテトラヒドロチエニル、プリニル、ベンゾジオキソリル、トリアジニル、プテリジニル、ベンゾチアゾリル、イミダゾピリジル、イミダゾチアゾリル、ジヒドロベンゾイソオキサジニル、ベンゾイソオキサジニル、ベンゾオキサジニル、ジヒドロベンゾイソチアジニル、ベンゾピラニル、ベンゾチオピラニル、クロモニル、クロマノニル、ピリジル－Ｎ－オキシド、テトラヒドロキノリニル、ジヒドロキノリニル、ジヒドロキノリノニル、ジヒドロイソキノリノニル、ジヒドロクマリニル、ジヒドロイソクマリニル、イソインドリノニル、ベンゾジオキサニル、ベンゾオキサゾリノニル、ピロリルＮ－オキシド、ピリミジニルＮ－オキシド、ピリダジニルＮ－オキシド、ピラジニルＮ－オキシド、キノリニルＮ－オキシド、インドリルＮ－オキシド、インドリニルＮ－オキシド、イソキノリルＮ－オキシド、キナゾリニルＮ－オキシド、キノキサリニルＮ－オキシド、フタラジニルＮ－オキシド、イミダゾリルＮ－オキシド、イソオキサゾリルＮ－オキシド、オキサゾリルＮ－オキシド、チアゾリルＮ－オキシド、インドリジニルＮ－オキシド、インダゾリルＮ－オキシド、ベンゾチアゾリルＮ－オキシド、ベンゾイミダゾリルＮ－オキシド、ピロリルＮ－オキシド、オキサジアゾリルＮ－オキシド、チアジアゾリルＮ－オキシド、トリアゾリルＮ－オキシド、テトラゾリルＮ－オキシド、ベンゾチオピラニルＳ－オキシド、ベンゾチオピラニルＳ，Ｓ－ジオキシドが挙げられる。例示的なヘテロアリール基としては、イミダゾリル、ピラゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、オキサジアゾリル、及びピリジルが挙げられる。他の例示的なヘテロアリール基としては、１－ピロリル、２－ピロリル、３－ピロリル、３－ピラゾリル、２－イミダゾリル、４－イミダゾリル、ピラジニル、２－オキサゾリル、４－オキサゾリル、２－フェニル－４－オキサゾリル、５－オキサゾリル、３－イソオキサゾリル、４－イソオキサゾリル、５－イソオキサゾリル、２－チアゾリル、４－チアゾリル、５－チアゾリル、２－フリル、３－フリル、２－チエニル、３－チエニル、２－ピリジル、３－ピリジル、ピリジン－４－イル、２－ピリミジル、４－ピリミジル、５－ベンゾチアゾリル、プリニル、２－ベンゾイミダゾリル、５－インドリル、１－イソキノリル、５－イソキノリル、２－キノキサリニル、５－キノキサリニル、３－キノリル、及び６－キノリルが挙げられる。上述のアリール及びヘテロアリール環系の各置換基は、以下に記載する許容できるアリール基置換基群から選択される。
[00327]脂肪族リンカーの例としては、以下の構造：－Ｏ－ＣＯ－Ｏ－；－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－；－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－；－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ１－；－Ｓ－（ＣＨ２）ｎ１－；－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ１－ＣＯ－；－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ１－ＮＨ－；－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ１－ＮＨ－；－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ１－ＮＨ－ＣＯ－；－Ｃ（＝Ｓ）－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ１－ＮＨ－ＣＯ－；－Ｃ（＝Ｓ）－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ１－ＮＨ－Ｃ－（＝Ｓ）－；－ＣＯ－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－ＣＯ－；－Ｃ（＝Ｓ）－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－ＣＯ－；－Ｃ（＝Ｓ）－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－Ｃ－（＝Ｓ）－；－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－ＣＯ－；－Ｃ（＝Ｓ）－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－ＣＯ－；－Ｃ（＝Ｓ）－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－Ｃ－（＝Ｓ）－；－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－ＣＯ－；－Ｃ（＝Ｓ）－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ１－ＣＯ－；－Ｃ（＝Ｓ）－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ１－ＮＨ－ＣＯ－；－Ｃ（＝Ｓ）－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－Ｃ－（＝Ｓ）－；－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ２－ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）－；－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ２－ＣＨ２－；－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ２－ＣＨ２－ＣＯ－；－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ３－Ｓ－Ｓ－（ＣＨ２）ｎ４－Ｏ－Ｐ（＝Ｏ）２－；－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ３－Ｏ－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ４－；－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ３－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ４－；－（ＣＨ２）ｎ１ＮＨ－；－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ１ＮＨ－；－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ２）ｎ１－Ｃ（Ｏ）－；－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ２）ｎ１－Ｃ（Ｏ）Ｏ－；－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－；－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ２）ｎ１－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－；－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ２）ｎ１－；－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－；－Ｃ（Ｏ）－；－（ＣＨ２）ｎ１－Ｃ（Ｏ）－；－（ＣＨ２）ｎ１－Ｃ（Ｏ）Ｏ－；－（ＣＨ２）ｎ１－；－（ＣＨ２）ｎ１－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－；（式中、ｎ１は、１～１５の間の整数（例えば、２～２０、又は２～１２）であり；ｎ２は、１～１５の間の整数（例えば、１～１０、又は１～６）であり；ｎ３及びｎ４は、同一であっても異なっていてもよく、１～１５の間の整数（例えば、１～１０、又は１～６）であり、リンカーにおける炭素単位の総数はＣ１５以下である）を含む。
[00328]一部の態様では、リンカーの組合せは、（Ｃ３）ｎ、（Ｃ４）ｎ、（Ｃ５）ｎ、（Ｃ６）ｎ、（Ｃ７）ｎ、若しくは（Ｃ８）ｎ、又はこれらの組合せを含み、ｎは、１～５の間の整数であり、リンカーにおける炭素単位の総数はＣ１５以下であり、各単位は、例えば、リン酸エステルリンカー、ホスホロチオエートエステル連結、又はこれらの組合せを介して接続されている。
切断性リンカー
[00329]一部の態様では、本明細書で開示されている構築物、例えば式１の構築物の様々な構成成分は、切断性リンカーによって連結され得る。切断性リンカーという用語は、破壊又は切断され得る少なくとも１つの連結又は化学結合を含むリンカーを指す。本明細書で使用される場合、切断という用語は、比較的大きな分子における、２つ以上の比較的小さな分子を生じるような１つ又は複数の化学結合の破壊を指す。切断は、例えば、ヌクレアーゼ、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、オキシダーゼ、若しくはレダクターゼによって、又は特定の生理化学条件、例えば、酸化還元環境、ｐＨ、活性酸素種の存在、若しくは特定の光波長によって媒介されてもよい。
[00330]一部の態様では、用語「切断性」は、本明細書で使用される場合、例えば、ホスホジエステル及びジスルフィドなどの迅速に分解可能なリンカーを指すが、用語「非切断性」は、例えば、ヌクレアーゼ耐性ホスホロチオエートなどのより安定な連結を指す。
[00331]一部の態様では、切断性リンカーは、ジヌクレオチド若しくはトリヌクレオチドリンカー、ジスルフィド、イミン、チオケタール、ｖａｌ－ｃｉｔジペプチド、又はこれらの任意の組合せである。
[00332］一部の態様では、切断性リンカーは、バリン－アラニン－ｐ－アミノベンジルカルバメート又はバリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルカルバメートを含む。
切断性リンカー：酸化還元切断性リンカー
[00333]一部の態様では、リンカーの組合せは、酸化還元切断性リンカーを含む。非限定的な例として、１種の切断性リンカーは、還元時又は酸化時に切断される酸化還元切断性連結基である。一部の態様では、酸化還元切断性リンカーはジスルフィド結合を含有し、すなわち、これはジスルフィド切断性リンカーである。酸化還元切断性リンカーは、例えば、細胞内メルカプタン、オキシダーゼ、又はレダクターゼによって還元され得る。
切断性リンカー：活性酸素種（ＲＯＳ）切断性リンカー
[00334]一部の態様では、リンカーの組合せは、例えば、活性化好中球などの炎症プロセスによって生成されるスーパーオキシド（Ｏｆ）又は過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）のような活性酸素種（ＲＯＳ）によって切断され得る切断性リンカーを含み得る。一部の態様では、ＲＯＳ切断性リンカーは、チオケタール切断性リンカーである。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，３５４，４５５号を参照されたい。
切断性リンカー：ｐＨ依存性切断性リンカー
[00335]一部の態様では、リンカーは、酸性条件下（ｐＨが７未満）で選択的に切断される連結基である酸切断性連結基を含む「酸不安定リンカー」である。
[00336]非限定的な例として、酸切断性連結基は、酸性環境において、例えば、約６．０、５．５、５．０以下で切断される。一部の態様では、ｐＨは、約６．５以下である。一部の態様では、リンカーは、一般的な酸として作用し得る酵素、例えばペプチダーゼ（基質特異的であってもよい）又はホスファターゼなどの薬剤によって切断される。細胞内で、エンドソーム及びリソソームなどのある特定の低ｐＨオルガネラは、酸切断性連結基に対して切断環境をもたらし得る。ヒト血清のｐＨは７．４であるが、細胞内の平均ｐＨは僅かに低く、約７．１～７．３の範囲である。エンドソームも５．５～６．０の範囲の酸性ｐＨを有し、リソソームはより高い酸性ｐＨの約５．０である。したがって、ｐＨ依存性切断性リンカーは、当技術分野ではエンドソーム的に不安定なリンカーと呼ばれることもある。
[00337]酸切断性基は、一般式－Ｃ＝ＮＮ－、Ｃ（Ｏ）Ｏ、又は－ＯＣ（Ｏ）を有してもよい。別の非限定的な例において、エステル酸素（アルコキシ基）に結合した炭素が、アリール基、置換アルキル基、又は例えば、ジメチルペンチル若しくはｔ－ブチルなどの第三級アルキル基に結合している場合。酸切断性連結基の例としては、以下に限定されないが、アミン、イミン、アミノエステル、安息香酸イミン、ジオルトエステル、ポリホスホエステル、ポリホスファゼン、アセタール、ビニルエーテル、ヒドラゾン、ｃｉｓ－アコニテート、ヒドラジド、チオカルバモイル、イミジン、アジドメチル－メチルマレイン酸無水物、チオプロピオネート、マスクされたエンドソーム溶解剤、シトラコニル基、又はこれらの任意の組合せが挙げられる。ジスルフィド連結もｐＨの影響を受けやすい。
[00338]一部の態様では、リンカーは、低ｐＨ不安定ヒドラゾン結合を含む。このような酸不安定結合は、コンジュゲート、例えば抗体－薬物コンジュゲートの分野において広く使用されてきた。例えば、Ｚｈｏｕら（２０１１） Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ １２：１４６０～７頁；Ｙｕａｎら（２００８） Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒ． ４：１０２４～３７頁；Ｚｈａｎｇら（２００７） Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒ． ６：８３８～５０頁；Ｙａｎｇら（２００７） Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ． ３２１：４６２～８頁；Ｒｅｄｄｙら（２００６） Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ５８：２２９～３６頁；Ｄｏｒｏｎｉｎａら（２００３） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２１：７７８～８４頁を参照されたい。
[00339]ある特定の態様では、リンカーは、以下から選択される低ｐＨ不安定結合を含む：ジオール及びケトンを形成するために酸性環境（例えば、ｐＨ７未満、約４より大きい）で不安定であるケタール；ジオール及びアルデヒドを形成するために酸性環境（例えば、ｐＨ７未満、約４より大きい）で不安定なアセタール；アミン及びアルデヒド又はケトンを形成するために酸性環境（例えば、ｐＨ７未満、約４より大きい）で不安定なイミン又はイミニウム；酸性条件下で不安定なケイ素－酸素－炭素連結；ケイ素－窒素（シラザン）連結；ケイ素－炭素連結（例えば、アリールシラン、ビニルシラン、及びアリルシラン）；マレアメート（無水マレイン酸誘導体及びアミンから合成されるアミド結合）；オルトエステル；ヒドラゾン；酸触媒加水分解を受けるように設計された活性化カルボン酸誘導体（例えば、エステル、アミド）；又はビニルエーテル。
[00340]さらなる例は、その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第９，７９０，４９４号及び同第８，１３７，６９５号に見い出される場合がある。
切断性リンカー：酵素切断性リンカー
[00341]一部の態様では、リンカーの組合せは、細胞内又は細胞外酵素、例えば、プロテアーゼ、エステラーゼ、ヌクレアーゼ、アミダーゼによって切断可能なリンカーを含み得る。リンカーの組合せ中で特定のリンカーを切断することができる酵素の範囲は、リンカーの特定の結合及び化学構造に依存する。したがって、ペプチドリンカーは、例えばペプチダーゼによって切断され得る、エステル連結を含有するリンカーは、例えばエステラーゼによって切断され得る、アミド連結を含有するリンカーは、例えばアミダーゼによって切断され得るなどである。
切断性リンカー：酵素切断性リンカー：プロテアーゼ切断性リンカー
[00342]一部の態様では、リンカーの組合せは、プロテアーゼ切断性リンカー、すなわち、内因性プロテアーゼによって切断され得るリンカーを含む。ある特定のペプチドだけが、細胞の内側又は外側で容易に切断される。例えば、Ｔｒｏｕｔら、７９ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、６２６～６２９頁（１９８２）及びＵｍｅｍｏｔｏら ４３ Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ、６７７～６８４頁（１９８９）を参照されたい。切断性リンカーは、α－アミノ酸単位及びペプチド結合から構成される切断性部位を含有することができ、これは、化学的には、１つのアミノ酸のカルボキシレートと第２のアミノ酸のアミノ基との間のアミド結合である。他のアミド結合、例えば、リシンのカルボキシレートとα－アミノ酸基との間の結合は、ペプチド結合ではないと理解され、非切断性であると考えられる。
[00343]一部の態様では、プロテアーゼ切断可能リンカーは、プロテアーゼの切断部位、例えば、ネプリライシン（ＣＡＬＬＡ又はＣＤｌＯ）、チメットオリゴペプチダーゼ（ＴＯＰ）、ロイコトリエンＡ４加水分解酵素、エンドセリン変換酵素、ステ２４プロテアーゼ、ニューロライシン、ミトコンドリア中間ペプチダーゼ、間質コラゲナーゼ、コラゲナーゼ、ストロメライシン、マクロファージエラスターゼ、マトリライシン、ゼラチナーゼ、メプリン、プロコラーゲンＣエンドペプチダーゼ、プロコラーゲンＮエンドペプチダーゼ、ＡＤＡＭ及びＡＤＡＭＴメタロプロテイナーゼ、ミエリン関連メタロプロテイナーゼ、エナメリシン、腫瘍壊死因子α変換酵素、インスリジン、ナルディライシン、ミトコンドリアプロセシングペプチダーゼ、マグノリシン、ダクチリジン様メタロプロテアーゼ、好中球コラゲナーゼ、マトリックスメタロペプチダーゼ、膜型マトリックスメタロプロテイナーゼ、ＳＰ２エンドペプチダーゼ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、プラスミン、ウロキナーゼ、ヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰα）、トリプシン、キモトリプシン、カルデクリン、膵臓エラスターゼ、膵臓エンドペプチダーゼ、エンテロペプチダーゼ、白血球エラスターゼ、骨髄芽球、キマーゼ、トリプターゼ、グランザイム、角質層キモトリプシン酵素、アクロシン、カリクレイン、補体成分及び因子、補体代替経路ｃ３／ｃ５転換酵素、マンノース結合タンパク質関連セリンプロテアーゼ、凝固因子、トロンビン、プロテインｃ、ｕ型及びｔ型プラスミノーゲンアクチベーター、カテプシンＧ、ヘプシン、プロスタシン、肝細胞増殖因子活性化エンドペプチダーゼ、サブチリシン／ケキシン型プロタンパク質転換酵素、フリン、プロタンパク質転換酵素、プロリルペプチダーゼ、アシルアミノアシルペプチダーゼ、ペプチジルグリカミナーゼ、シグナルペプチダーゼ、Ｎ末端求核アミノヒドロラーゼ、２０ｓプロテアソーム、γ－グルタミルトランスペプチダーゼ、ミトコンドリアエンドペプチダーゼ、ミトコンドリアエンドペプチダーゼＩａ、ｈｔｒａ２ペプチダーゼ、マトリプターゼ、部位１プロテアーゼ、レグメイン、カテプシン、システインカテプシン、カルパイン、ユビキチンイソペプチダーゼＴ、カスパーゼ、グリコシルホスファチジルイノシトールタンパク質トランスアミダーゼ、がん凝血促進剤、プロホルモンチオールプロテアーゼ、γ－グルタミル加水分解酵素、ブレオマイシン加水分解酵素、セプラーゼ、カテプシンＢ、カテプシンＤ、カテプシンＬ、カテプシンＭ、プロテイナーゼＫ、ペプシン、キモシン、ガストリシン、レニン、ヤプシン及び／又はマプシン、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、又は一般に、Ａｓｐ－Ｎ、Ｇｌｕ－Ｃ、Ｌｙｓ－Ｃ若しくはＡｒｇ－Ｃプロテアーゼを含む。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ７７（２４）：７０２７～７０３７頁（２０１７）を参照されたい。
[00344]一部の態様では、切断性リンカーの構成成分は、１～１０個のアミノ酸残基を含むペプチドを含む。これらの態様では、ペプチドは、プロテアーゼによるリンカーの切断を可能にし、それによって、細胞内プロテアーゼ、例えばリソソーム酵素への曝露時に生物学的に活性な分子の放出を容易にする（Ｄｏｒｏｎｉｎａら（２００３） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２１：７７８～７８４頁）。例示的なペプチドとしては、以下に限定されないが、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、及びヘキサペプチドが挙げられる。
[00345]ペプチドは、天然に存在する及び／又は非天然のアミノ酸残基を含んでよい。用語「天然に存在するアミノ酸」は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｈｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｉｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、及びＴｙｒを指す。「非天然アミノ酸」（すなわち、天然に存在しないアミノ酸）としては、非限定的な例として、ホモセリン、ホモアルギニン、シトルリン、フェニルグリシン、タウリン、ヨードチロシン、セレノシステイン、ノルロイシン（「Ｎｌｅ」）、ノルバリン（「Ｎｖａ」）、ベータ－アラニン、Ｌ－又はＤ－ナフタラニン、オルニチン（「Ｏｒｎ」）などが挙げられる。ペプチドは、特定の酵素、例えば、腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、Ｃ及びＤ、又はプラスミンプロテアーゼによる酵素切断のために設計及び最適化され得る。
[00346]アミノ酸は、天然及び非天然アミノ酸のＤ形態も含む。「Ｄ－」は、天然に存在する（「Ｌ－」）アミノ酸の立体配置に対して、「Ｄ」（右旋性）立体配置を有するアミノ酸を示す。天然及び非天然のアミノ酸は、商業的に購入することができ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ）、又は当技術分野で公知の方法を使用して合成することができる。例示的なジペプチドとしては、以下に限定されないが、バリン－アラニン、バリン－シトルリン、フェニルアラニン－リシン、Ｎ－メチル－バリン－シトルリン、シクロヘキシルアラニン－リシン、及びベータアラニン－リシンが挙げられる。例示的なトリペプチドとしては、以下に限定されないが、グリシン－バリン－シトルリン（ｇｌｙ－ｖａｌ－ｃｉｔ）及びグリシン－グリシン－グリシン（ｇｌｙ－ｇｌｙ－ｇｌｙ）が挙げられる。
切断性リンカー：酵素切断性リンカー：エステラーゼ切断性リンカー
[00347]一部のリンカーは、エステラーゼによって切断される（「エステラーゼ切断性リンカー」）。ある特定のエステルのみが、細胞の内側又は外側に存在するエステラーゼ及びアミダーゼによって切断され得る。エステルは、カルボン酸とアルコールとの縮合によって形成される。単純エステルは、脂肪族アルコールなどの単純アルコール、及び低級環状アルコール及び低級芳香族アルコールにより生成されるエステルである。エステルベースの切断性連結基の例としては、以下に限定されないが、アルキレン基、アルケニレン基及びアルキニレン基のエステルが挙げられる。エステル切断性連結基は、一般式－Ｃ（Ｏ）Ｏ－又は－ＯＣ（Ｏ）－を有する。
切断性リンカー：酵素切断性リンカー：ホスファターゼ切断性リンカー
[00348]一部の態様では、リンカーの組合せは、リン酸基を分解又は加水分解する薬剤によって切断されるリン酸ベースの切断性連結基を含み得る。細胞内リン酸基を切断する薬剤の例は、細胞内ホスファターゼなどの酵素である。リン酸ベースの連結基の例は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－ＳＰ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－ＯＰ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－ＯＰ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－ＳＰ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－ＳＰ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－ＳＰ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｓ－、又は－ＯＰ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｓ－である。
様々な態様では、Ｒｋは以下のいずれかである：ＮＨ２、ＢＨ３、ＣＨ３、Ｃ１～６アルキル、Ｃ６～１０アリール、Ｃ１～６アルコキシ及びＣ６～１０アリール－オキシ。一部の態様では、Ｃ１～６アルキル及びＣ６～１０アリールは非置換である。さらなる非限定的な例は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－ＳＰ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－ＳＰ（Ｏ）（Ｈ）－Ｓ－、－ＯＰ（Ｓ）（Ｈ）－Ｓ－、又は－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－である。
切断性リンカー：光活性化切断性リンカー
[00349]一部の態様では、組合せリンカーは、光活性化切断性リンカー、例えばニトロベンジルリンカー又はニトロベンジル反応性基を含むリンカーを含む。
切断性リンカー：自己犠牲リンカー
[00350]一部の態様では、リンカーの組合せは、自己犠牲リンカーを含む。一部の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）における自己犠牲リンカーは、プロテアーゼ切断性リンカーの酵素切断後に１，４脱離を受ける。一部の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）における自己犠牲リンカーは、プロテアーゼ切断性リンカーの酵素切断後に１，６脱離を受ける。一部の態様では、自己犠牲リンカーは、例えば、ｐ－アミノベンジル（ｐＡＢ）誘導体、例えば、ｐ－アミノベンジルカルバメート（ｐＡＢＣ）、ｐ－アミノベンジルエーテル（ＰＡＢＥ）、ｐ－アミノベンジルカルバメート、又はこれらの組合せである。ある特定の態様では、自己犠牲リンカーは、芳香族基を含む。一部の態様では、芳香族基は、ベンジル、シンナミル、ナフチル、及びビフェニルからなる群から選択される。一部の態様では、芳香族基は複素環である。他の態様では、芳香族基は、少なくとも１つの置換基を含む。一部の態様では、少なくとも１つの置換基は、Ｆ、Ｃｌ、Ｉ、Ｂｒ、ＯＨ、メチル、メトキシ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＮＯ３＋、ＮＨＣＯＣＨ３、Ｎ（ＣＨ３）２、ＮＨＣＯＣＦ３、アルキル、ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ８ハロゲン化アルキル、カルボン酸、硫酸、スルファミン酸、及びスルホン酸からなる群から選択される。他の態様では、芳香族基における少なくとも１つのＣは、Ｎ、Ｏ、又はＣ－Ｒ＊で置換されており、Ｒ＊は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｉ、Ｂｒ、ＯＨ、メチル、メトキシ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＮＯ３＋、ＮＨＣＯＣＨ３、Ｎ（ＣＨ３）２、ＮＨＣＯＣＦ３、アルキル、ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ８ハロゲン化アルキル、カルボン酸、硫酸、スルファミン酸、及びスルホン酸から独立的に選択される。
[00351]一部の態様では、自己犠牲リンカーは、アミノベンジルカルバメート基（例えば、パラ－アミノベンジルカルバメート）、アミノベンジルエーテル基、又はアミノベンジルカーボネート基を含む。一態様では、自己犠牲リンカーは、ｐ－アミノベンジルカルバメート（ｐＡＢＣ）である。ｐＡＢＣは、自己犠牲部位特異的プロドラッグ活性化にとって最も効率的且つ最も広範なコネクター連結である（例えば、Ｃａｒｌら、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２４：４７９～４８０頁（１９８１）；国際公開第１９８１／００１１４５号；Ｒａｕｔｉｏら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ． ７：２５５～２７０頁（２００８）；Ｓｉｍｐｌｉｃｉｏら、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ １３：５１９～５４７頁（２００８）を参照されたい）。
[00352]一部の態様では、自己犠牲リンカーは、生物学的に活性な分子（例えば、ＡＳＯ）をプロテアーゼ切断性基質（例えば、Ｖａｌ－Ｃｉｔ）に接続させる。特定の態様では、ｐＡＢＣ自己犠牲リンカーのカルバメート基は、生物学的に活性な分子（例えば、ＡＳＯ）のアミノ基に接続されており、ｐＡＢＣ自己犠牲リンカーのアミノ基は、プロテアーゼ切断性基質に接続されている。
[00353]アミノベンジル基の芳香族環は、芳香族環の１つ又は複数の（例えば、Ｒ１及び／又はＲ２）置換基で任意選択的に置換されている可能性があり、この置換基は、そうでなければ環を形成する４つの非置換炭素のうちの１つに結合している水素を置き換える。本明細書で使用される場合、記号「Ｒｘ」（例えば、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４）は、本明細書に記載されている置換基を表す一般的な略号である。置換基は、ｐ－アミノベンジル基の自己犠牲能力を改善し得る（Ｈａｙら、Ｊ． Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．、Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ． １：２７５９～２７７０頁（１９９９）；Ｓｙｋｅｓら Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ． １：１６０１～１６０８頁（２０００）も参照されたい）。
[00354]自己犠牲的脱離は、例えば、１，４脱離、１，６脱離（例えば、ｐＡＢＣ）、１，８脱離（例えば、ｐ－アミノ－シンナミルアルコール）、β－脱離、環化－脱離（例えば、４－アミノブタノールエステル及びエチレンジアミン）、環化／ラクトン化、環化／ラクトール化などを介して起こり得る。例えば、ＳｉｎｇｈらＣｕｒｒ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １５：１８０２～１８２６頁（２００８）；ＧｒｅｅｎｗａｌｄらＪ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ４３：４７５～４８７頁（２０００）を参照されたい。
[00355]一部の態様では、自己犠牲リンカーは、例えば、シンナミル、ナフチル、又はビフェニル基を含み得る（例えば、Ｂｌｅｎｃｏｗｅら Ｐｏｌｙｍ． Ｃｈｅｍ． ２：７７３～７９０頁（２０１１）を参照されたい）。一部の態様では、自己犠牲リンカーは、複素環式環を含む（例えば、米国特許第７，３７５，０７８号；同第７，７５４，６８１号を参照されたい）。水性条件下及び生理学的条件下で自己犠牲である多数のホモ芳香族（例えば、Ｃａｒｌら Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２４：４７９頁（１９８１）；Ｓｅｎｔｅｒら Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ５５：２９７５頁（１９９０）；Ｔａｙｌｏｒら Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ４３：１１９７頁（１９７８）；Ａｎｄｒｉａｎｏｍｅｎｊａｎａｈａｒｙら Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． ２：１９０３頁（１９９２）を参照されたい）、及びクマリン（例えば、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｕｎ． ４６：５５３頁（２０１０）を参照されたい）、フラン、チオフェン、トリアゾール、オキサゾール、イソキサゾール、ピロール、ピラゾール（例えば、Ｈａｙら Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ４６：５５３３頁（２００３）を参照されたい）、ピリジン（例えば、Ｐｅｒｒｙ－Ｆｅｉｇｅｎｂａｕｍら Ｏｒｇ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｃｈｅｍ． ７：４８２５頁（２００９）を参照されたい）、イミダゾン（例えば、Ｎａｉｌｏｒら Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． Ｚ：１２６７頁（１９９９）；Ｈａｙ及びＤｅｎｎｙ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ３８：８４２５頁（１９９７）を参照されたい）、及びトリアゾール（例えば、Ｂｅｒｔｒａｎｄ及びＧｅｓｓｏｎ、Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ７２：３５９６頁（２００７）を参照されたい）ベースのヘテロ芳香族基が当技術分野で公知である。米国特許第７，６９１，９６２号；同第７，０９１，１８６号；米国特許出願第２００６／０２６９４８０号；同第２０１０／００９２４９６号；同第２０１０／０１４５０３６号；同第２００３／０１３０１８９号；同第２００５／０２５６０３０号も参照されたい。
[00356]一部の態様では、本明細書で開示されているリンカーの組合せは、２つ以上の自己犠牲リンカー、例えば、２つ以上のｐＡＢＣ単位をタンデムに含む。例えば、ｄｅ Ｇｒｏｏｔら Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ６６：８８１５～８８３０頁（２００１）を参照されたい。一部の態様では、本明細書で開示されているリンカーの組合せは、蛍光発生プローブに連結した自己犠牲リンカー（例えば、ｐ－アミノベンジルアルコール又はｐ－カルボキシベンズアルデヒド又はグリオキシル酸のヘミチオアミノ誘導体）を含み得る（例えば、Ｍｅｙｅｒら Ｏｒｇ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｃｈｅｍ． ８：１７７７～１７８０頁（２０１０）を参照されたい）。
[00357]自己犠牲リンカーの置換基が、左から右に書かれた従来の化学式によって特定される場合、これらは、構造を右から左に書くことによって生じる、化学的に同一の置換基を等しく包含する。例えば、「－ＣＨ２Ｏ－」は、「－ＯＣＨ２－」も記載することを意図する。
[00358]自己犠牲における置換基、例えば、上で議論したようなｐ－アミノベンジル自己犠牲リンカーにおけるＲ１及び／又はＲ２置換基としては、例えば、アルキル、アルキレン、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルアミノ、アルキルチオ、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アリールアルキル、アリールオキシ、ヘテロアリールなどを挙げることができる。本開示の化合物が２つ以上の置換基を含む場合、各置換基は独立的に選択される。
[00359]一部の具体的態様では、自己犠牲リンカーは、以下の式、以下の式を有する組合せを有する切断性ペプチドリンカーに結合している：
－Ａａ－Ｙｙ－
（式中、各－Ａ－は、独立的にアミノ酸単位又はその組合せであり、ａは、独立的に１～１２の整数であり；－Ｙ－は、自己犠牲スペーサーであり、ｙは、１、又は２である）。一部の態様では、－Ａａ－は、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、又はヘキサペプチドである。一部の態様では、－Ａａ－は、バリン－アラニン、バリン－シトルリン、フェニルアラニン－リシン、Ｎ－メチルバリン－シトルリン、シクロヘキシルアラニン－リシン、及びベータ－アラニン－リシンからなる群から選択される。一部の態様では、－Ａａ－は、バリン－アラニン又はバリン－シトルリンである。
[00360]一部の態様では、自己犠牲リンカー－Ｙｙ－は、以下の式：
Figure 2024506711000019
（式中、各Ｒ２は、独立的にＣ１～８アルキル、－Ｏ－（Ｃ１～８アルキル）、ハロゲン、ニトロ、又はシアノであり；ｍは、０～４の整数である）を有する。一部の態様では、ｍは、０、１、又は２である。一部の態様では、ｍは、０である。
[00361]一部の態様では、切断性リンカーは、自己犠牲リンカーを含む切断性ペプチドリンカー（例えば、ジペプチドリンカー）、例えば、バリン－アラニン－ｐ－アミノベンジルカルバメート又はバリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルカルバメートである。
ペプチドリンカー
[00362]一部の態様では、用語「リンカー」は、ペプチド若しくはポリペプチド配列（例えば、合成ペプチド又はポリペプチド配列）又は非ポリペプチド、例えば、アルキル鎖を指す。一部の態様では、２つ以上のリンカーは、タンデムに連結され得る。一般に、リンカーは、可撓性を提供するか又は立体障害を防止／緩和する。リンカーは、典型的には切断されないが、ある特定の態様では、このような切断が望ましい可能性がある。したがって、一部の態様では、リンカーは、１つ又は複数のプロテアーゼ切断性部位を含む可能性があり、リンカーの配列内又はリンカー配列のいずれかの末端でリンカーに隣接して位置し得る。
[00363]一部の態様では、リンカーは、ペプチドリンカーである。一部の態様では、ペプチドリンカーは、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、又は少なくとも約１００個のアミノ酸を含み得る。
[00364]一部の態様では、リンカーは、グリシン／セリンリンカーである。一部の態様では、ペプチドリンカーは、式［（Ｇｌｙ）ｎ－Ｓｅｒ］ｍ（式中、ｎは、１～１００の任意の整数であり、ｍは、１～１００の任意の整数である）によるグリシン／セリンリンカーである。他の態様では、グリシン／セリンリンカーは、式［（Ｇｌｙ）ｘ－Ｓｅｒｙ］ｚ（式中、ｘは、１～４の整数であり、ｙは、０又は１であり、ｚは、１～５０の整数である）によるものである。一部の態様では、ペプチドリンカーは、配列Ｇｎを含み、ｎは、１～１００の整数であり得る。一部の態様では、ペプチドリンカーは、配列（ＧｌｙＡｌａ）ｎを含み、ｎは、１～１００の間の整数であり得る。一部の態様では、ペプチドリンカーは、配列（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）ｎを含み、ｎは、１～１００の間の整数であり得る。
[00365]一部の態様では、ペプチドリンカーは、合成である、すなわち天然に存在しない。一態様では、ペプチドリンカーは、アミノ酸の第１の直鎖配列を、それが天然では連結していないか又は天然では遺伝的に融合していないアミノ酸の第２の直鎖配列に連結されているか又は遺伝的に融合されているアミノ酸配列を含むペプチド（又はポリペプチド）（例えば、天然の又は天然に存在しないペプチド）を含む。例えば、一態様では、ペプチドリンカーは、天然に存在するポリペプチドの修飾形態である（例えば、付加、置換又は欠失などの変異を含む）天然に存在しないポリペプチドを含み得る。
[00366]他の態様では、ペプチドリンカーは、天然に存在しないアミノ酸を含み得る。また他の態様では、ペプチドリンカーは、天然に存在しない直鎖配列中に存在する天然に存在するアミノ酸を含み得る。さらに他の態様では、ペプチドリンカーは、天然に存在するポリペプチド配列を含み得る。
生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］
[00367]一部の態様では、本明細書で開示されているＥＶ（例えば、エクソソーム）は、アンカー部分［ＡＭ］を介して、ＥＶ、例えばエクソソームに結合した生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］を送達することが可能であり、アンカー部分［ＡＭ］は、本明細書で開示されている最適化リンカーを介して、生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］に接続されている。生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］は、標的（例えば、標的細胞）で作用する薬剤である。接触させることは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又は対象において起こり得る。本開示に記載されているＥＶ、例えばエクソソームに結合され得る生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］の非限定的な例としては、ヌクレオチド（例えば、検出可能な部分若しくは毒素を含むヌクレオチド、又は転写を破壊するヌクレオチド）、核酸（例えば、酵素などのポリペプチドをコードするＤＮＡ若しくはｍＲＮＡ分子、又はｍｉＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はＡＳＯなどの調節機能を有するＲＮＡ分子）、アミノ酸（例えば、検出可能な部分若しくは毒素を含むか、又は翻訳を破壊するアミノ酸）、ポリペプチド（例えば、酵素）、脂質、炭水化物、及び小分子（例えば、小分子薬物及び毒素）が挙げられる。
[00368]一部の態様では、本明細書で開示されているＥＶ（例えば、エクソソーム）は、例えば、本明細書で開示されている構築物を使用して、結合した２つ以上の生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］を含み得る。例えば、一部の態様では、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、本開示の構築物（例えば、式１の構築物）の複数の集団を含むことができ、構築物の各集団は、異なる生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］を運ぶ。
[00369]したがって、一部の態様では、本開示のＥＶ、例えばエクソソームの集団は、以下に例示される複数の構築物を含み得る。
［ＡＭ１］－（最適化リンカー１）－［ＢＡＭ１］
［ＡＭ２］－（最適化リンカー２）－［ＢＡＭ２］
…
［ＡＭｎ］－（最適化リンカー）－［ＢＡＭｎ］
（式中、［ＡＭ１］．．［ＡＭｎ］は、同一又は異なるアンカー部分であってよく、（最適化リンカー１）．．（最適化リンカーｎ）は、同一又は異なる最適化リンカーであってよく、［ＢＡＭ１］．．［ＢＡＭｎ］は、同一又は異なる生物学的に活性な分子であってよい。）
[00370]一部の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）は、本明細書で開示されている最適化リンカーを含む構築物（例えば、式１の構築物）を含んでよく、各構築物は、以下に例示されている２つ以上の生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］を運ぶ。
［ＡＭ］－（最適化リンカー）－［ＢＡＭ１］．．［ＢＡＭｎ］
式中、［ＢＡＭ１］．．［ＢＡＭｎ］は、同一又は異なる生物学的に活性な分子であってよい。
[00371]一部の態様では、本明細書で開示されている最適化リンカーを含む構築物は、以下に例示されている非直鎖配置の複数の生物学的に活性な分子を含んでよく、例えば、２、３、又はそれより多い生物学的に活性な部分を含む配置は分岐状配置である。
［ＢＡＭ１］
［ＡＭ］－（最適化リンカー）－－－｜
［ＢＡＭ２］

［ＢＡＭ１］
［ＡＭ］－（最適化リンカー）－－－｜－－－［ＢＡＭ２］
［ＢＡＭ３］
[00372]一部の態様では、本開示のＥＶ、例えばエクソソームは、上に開示されているトポロジカル配置のいずれか及びそれらの組合せを含む構築物の集団を含み得る。
[00373]一部の態様では、生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］は、腫瘍抗原を標的とする。腫瘍抗原の非限定的な例としては：アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、上皮性腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、Ｔｎ－ＭＵＣ１、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、チロシナーゼ、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、プログラム死リガンド２（ＰＤ－Ｌ２）、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ－７２、ＨＥＲ２、ＧＤ２、ｃＭＥＴ、ＥＧＦＲ、Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＶＥＧＦＲ、アルファ－葉酸受容体、ＣＥ７Ｒ、ＩＬ－３、がん精巣抗原（ＣＴＡ）、ＭＡＲＴ－１ ｇｐ１００、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド、又はこれらの組合せが挙げられる。
[00374]一部の態様では、生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］は、標的分子、例えば、筋肉細胞のマーカーに特異的に結合する抗体若しくはその結合部分又はリガンドである。一部の態様では、筋肉細胞は、平滑筋細胞である。一部の態様では、筋肉細胞は、骨格筋細胞である。一部の態様では、筋肉細胞は、心筋細胞である。一部の態様では、筋肉細胞のマーカーは、アルファ－平滑筋アクチン、ＶＥ－カドヘリン、カルデスモン／ＣＡＬＤ１、カルポニン１、ヘキシム１、ヒスタミンＨ２ Ｒ；モチリンＲ／ＧＰＲ３８、トランスジェリン／ＴＡＧＬＮ、及びこれらの任意の組合せから選択される。一部の態様では、筋肉細胞のマーカーは、アルファ－サルコグリカン、ベータ－サルコグリカン、カルパイン阻害剤、クレアチンキナーゼＭＭ／ＣＫＭＭ、ｅＩＦ５Ａ、エノラーゼ２／ニューロン特異的エノラーゼ、イプシロン－サルコグリカン、ＦＡＢＰ３／Ｈ－ＦＡＢＰ、ＧＤＦ－８／Ｍｙｏｓｔａｔｉｎ、ＧＤＦ－１１／ＧＤＦ－８、インテグリンアルファ７、インテグリンアルファ７ベータ１、インテグリンベータ１／ＣＤ２９、ＭＣＡＭ／ＣＤ１４６、ＭｙｏＤ、ミオジェニン、ミオシン軽鎖キナーゼ阻害剤、ＮＣＡＭ－１／ＣＤ５６、トロポニンＩ、及びこれらの任意の組合せから選択される。一部の態様では、筋肉細胞のマーカーは、ミオシン重鎖、ミオシン軽鎖、又はこれらの組合せである。
[00375]一部の態様では、生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］は、小分子である。一部の態様では、小分子は、タンパク質分解誘導キメラ分子（ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｃｈｉｍｅｒａ）である。一部の態様では、生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］は、ヌクレオチドを含み、ヌクレオチドは、インターフェロン遺伝子刺激因子タンパク質（ＳＴＩＮＧ）のアゴニストである。ＳＴＩＮＧは、典型的には、細菌によって生成される環状ジヌクレオチドの細胞質センサーである。活性化の際に、これは、Ｉ型インターフェロンの産生をもたらし、免疫応答を開始する。
[00376]一部の態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、環状ヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニスト又は非環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニストを含む。環状プリンジヌクレオチド、例えば、以下に限定されないが、ｃＧＭＰ、環状ジＧＭＰ（ｃ－ジ－ＧＭＰ）、ｃＡＭＰ、環状ジＡＭＰ（ｃ－ジ－ＡＭＰ）、環状ＧＭＰ－ＡＭＰ（ｃＧＡＭＰ）、環状ジＩＭＰ（ｃ－ジ－ＩＭＰ）、環状ＡＭＰ－ＩＭＰ（ｃＡＩＭＰ）、及びこれらの任意のアナログは、患者における免疫応答又は炎症応答を刺激又は増強することが知られている。ＣＤＮは、環状ジヌクレオチドを連結する２’２’、２’３’、２’５’、３’３’、若しくは３’５’結合、又はこれらの任意の組合せを有してもよい。環状プリンジヌクレオチドは、プリンジヌクレオチドのアナログを生成するために、標準的な有機化学技法によって修飾されてよい。好適なプリンジヌクレオチドとしては、以下に限定されないが、アデニン、グアニン、イノシン、ヒポキサンチン、キサンチン、イソグアニン、又は当技術分野で公知の任意の他の適切なプリンジヌクレオチドが挙げられる。環状ジヌクレオチドは修飾されたアナログであってよい。以下に限定されないが、ホスホロチオエート、ビホスホロチオエート、フルオリネート、及びジフルオリネート修飾を含む、当技術分野で公知の任意の好適な修飾が使用されてよい。５，６－ジメチルキサンテノン－４－酢酸（ＤＭＸＡＡ）、又は当技術分野で公知の任意の他の非環状ジヌクレオチドアゴニストなどの非環状ジヌクレオチドアゴニストも使用されてもよい。
[00377]任意のＳＴＩＮＧアゴニストが生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］として使用され得ることが企図される。ＳＴＩＮＧアゴニストの中には、ＤＭＸＡＡ、ＳＴＩＮＧアゴニスト－１、ＭＬ ＲＲ－Ｓ２ ＣＤＡ、ＭＬ ＲＲ－Ｓ２ｃ－ジ－ＧＭＰ、ＭＬ－ＲＲ－Ｓ２ ｃＧＡＭＰ、２’３’－ｃ－ジ－ＡＭ（ＰＳ）２、２’３’－ｃＧＡＭＰ、２’３’－ｃＧＡＭＰｄＦＨＳ、３’３’－ｃＧＡＭＰ、３’３’－ｃＧＡＭＰｄＦＳＨ、ｃＡＩＭＰ、ｃＡＩＭ（ＰＳ）２、３’３’－ｃＡＩＭＰ、３’３’－ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、２’２’－ｃＧＡＭＰ、２’３’－ｃＧＡＭ（ＰＳ）２、３’３’－ｃＧＡＭＰ、ｃ－ジ－ＡＭＰ、２’３’－ｃ－ジ－ＡＭＰ、２’３’－ｃ－ジ－ＡＭ（ＰＳ）２、ｃ－ジ－ＧＭＰ、２’３’－ｃ－ジ－ＧＭＰ、ｃ－ジ－ＩＭＰ、ｃ－ジ－ＵＭＰ、又はこれらの任意の組合せがある。具体的態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、３’３’－ｃＡＩＭＰｄＦＳＨであり、別称３－３ ｃＡＩＭＰｄＦＳＨである。当技術分野で公知のさらなるＳＴＩＮＧアゴニストも使用されてよい。
[00378]一部の態様では、生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］は、抗体又はその抗原結合断片である。一部の態様では、生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］は、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。一部の態様では、生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］は、合成抗腫瘍剤（例えば、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）（ベドチン））、サイトカイン放出阻害剤（例えば、ＭＣＣ９５０）、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン及びそのアナログ（ラパログ））、オートタキシン阻害剤（例えば、ＰＡＴ４０９又はＰＡＴ５０５）、リゾホスファチジン酸受容体アンタゴニスト（例えば、ＢＭＳ－９８６０２０）、ＳＴＩＮＧアンタゴニスト（例えば、ＣＬ６５６）、又はこれらの任意の組合せを含む小分子である。一部の態様では、生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］は、融合ペプチドである。
[00379]一部の態様では、生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、ｉｎ ｖｉｖｏで発現される様々な遺伝子（転写物）を標的とする。一部の態様では、本開示の生物学的に活性な分子は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，０３４，５０６号に開示されたモルホリノ骨格構造を含む。
[00380]一部の態様では、生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］は、マクロファージを標的とする。一部の態様では、生物学的に活性な分子は、マクロファージの極性化を誘導する。マクロファージの極性化は、マクロファージが微小環境からのシグナルに応答して異なる機能プログラムを採用するプロセスである。この能力は生物における複数の役割に関連し、これらは自然免疫系の強力なエフェクター細胞であるが、細胞デブリの除去、胚発生及び組織修復においても重要である。
[00381]簡略化された分類では、マクロファージの表現型は２つの群に分けられている：Ｍ１（古典的に活性化されたマクロファージ）及びＭ２（代替的に活性化されたマクロファージ）。この大まかな分類は、培養マクロファージを、特定の状態への表現型の切替えを刺激する分子で処理したｉｎ ｖｉｔｒｏ研究を基礎とした。化学的刺激に加えて、マクロファージが増殖する下の基質の硬さによって、極性化状態、機能的役割及び遊走方式が方向付けられ得ることが示されている。Ｍ１マクロファージは、貪食並びに炎症性サイトカイン及び殺微生物分子の分泌などの、病原体に対する直接的な宿主防御において重要な、炎症性型として記載された。Ｍ２マクロファージは、炎症の収束期及び損傷組織の修復の調節という、まったく正反対の機能を有することが記載された。その後、より広範なｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｅｘ ｖｉｖｏの研究により、マクロファージの表現型がはるかに多様であり、遺伝子発現及び機能の点で互いに重複することが示され、これらの多くのハイブリッド状態が、微小環境に依存する活性化状態の連続体を形成することを明らかにした。さらに、ｉｎ ｖｉｖｏでは、組織マクロファージの異なる集団間で、遺伝子発現プロファイルに高い多様性がある。よって、マクロファージの活性化スペクトルは、環境からの多種多様なシグナルに応答するための複雑な調節経路を含む、より広範なものであると考えられる。マクロファージ表現型の多様性は、ｉｎ ｖｉｖｏではまだ完全に特徴付けられていないままである。
[00382]マクロファージ型のアンバランスは、いくつかの免疫関連疾患に関連する。
例えば、Ｍ１／Ｍ２比の増加は、炎症性腸疾患の発症、及びマウスの肥満と相関する場合がある。他方で、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験では、Ｍ２マクロファージが組織線維症の主要なメディエーターであることが示唆された。いくつかの研究は、Ｍ２マクロファージの線維化プロファイルを全身性硬化症の病因と関連付けた。マクロファージを標的とする生物学的に活性な分子の非限定的な例は：ＰＩ３Ｋγ（ホスファチジルイノシトール－４，５－ビスホスフェート３－キナーゼ触媒サブユニットガンマ）、ＲＩＰ１（受容体相互作用タンパク質（ＲＩＰ）キナーゼ１、ＲＩＰＫ１）、ＨＩＦ－１α（低酸素誘導因子１－アルファ）、ＡＨＲ１（接着及び菌糸調節因子１）、ｍｉＲ１４６ａ、ｍｉＲ１５５、ＩＲＦ４（インターフェロン調節因子４）、ＰＰＡＲγ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ）、ＩＬ－４ＲＡ（インターロイキン４受容体サブユニットアルファ）、ＴＬＲ８（Ｔｏｌｌ様受容体８）、ＴＧＦ－β１（形質転換成長因子ベータ１プロタンパク質）である。
[00383]一部の態様では、ＢＡＭは、ＡＳＯ（例えば、以下で開示されているＮＬＲＰ３、ＳＴＡＴ６、ＣＥＢＰ／β、ＳＴＡＴ３、ＮＲａｓ、ＫＲＡＳ、Ｐｍｐ２２を標的とするＡＳＯ）を含む。一部の態様では、ＡＳＯは、ギャップマー、ミクスマー、又はトータルマーである。一部の態様では、ＡＳＯ（例えば、以下に開示されているＮＬＲＰ３、ＳＴＡＴ６、ＣＥＢＰ／β、ＳＴＡＴ３、ＮＲａｓ、ＫＲＡＳ、Ｐｍｐ２２を標的とするＡＳＯ）は、修飾された糖部分、すなわちＤＮＡ及びＲＮＡに見られるリボース糖部分と比較した場合の糖部分の修飾を有する１つ又は複数のヌクレオシドを含み得る。リボース糖部分が修飾された多数のヌクレオシドが、主にオリゴヌクレオチドのある特定の特性、例えば親和性及び／又はヌクレアーゼ耐性を改善する目的で、作製されてきた。
[00384]このような修飾には、例えば、ヘキソース環（ＨＮＡ）、典型的にはリボース環上のＣ２’及びＣ４’炭素間にビラジカル架橋を有する二環式環（ＬＮＡ）、又は典型的にはＣ２’及びＣ３’炭素間の結合を欠く非連結リボース環（例えば、ＵＮＡ）での置換えにより、リボース環構造が修飾されたものが含まれる。他の糖修飾ヌクレオシドには、例えば、ビシクロヘキソース核酸（国際公開第２０１１／０１７５２１号）又は三環式核酸（国際公開第２０１３／１５４７９８号）が含まれる。修飾ヌクレオシドには、糖部分が、非糖部分、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）、又はモルホリノ核酸で置き換えられているヌクレオシドも含まれる。
[00385]糖の修飾には、リボース環上の置換基を水素以外の基、又はＲＮＡヌクレオシドにおいて天然に見られる２’－ＯＨ基に変更することによりなされる修飾も含まれる。置換基は、例えば、２’、３’、４’、又は５’位に導入されてよい。修飾された糖部分を有するヌクレオシドには、２’置換ヌクレオシドなどの２’修飾ヌクレオシドも含まれる。実際に、２’置換ヌクレオシドの開発には多くの焦点が当てられており、多数の２’置換ヌクレオシドが、ヌクレオシド耐性の増強及び親和性の増強など、オリゴヌクレオチドに組み込まれた場合に有益な特性を有することが見い出されている。
[00386]２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位にＨ若しくは－ＯＨ以外の置換基を有する（２’置換ヌクレオシド）か、又は２’連結ビラジカルを含むヌクレオシドであり、２’置換ヌクレオシド及びＬＮＡ（２’－４’ビラジカル架橋）ヌクレオシドを含む。例えば、２’修飾糖は、オリゴヌクレオチドに対する結合親和性の増強（例えば、親和性を増強する２’糖修飾ヌクレオシド）及び／又はヌクレアーゼ耐性の増加をもたらす場合がある。２’置換修飾ヌクレオシドの例は、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ、２’－フルロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、及び２’－フルオロ－ＡＮＡヌクレオシドである。さらなる例としては、例えば、Ｆｒｅｉｅｒ ＆ Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１９９７、２５、４４２９～４４４３頁；Ｕｈｌｍａｎｎ、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、２０００、３（２）、２９３～２１３頁；及びＤｅｌｅａｖｅｙ及びＤａｍｈａ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１２、１９、９３７頁を参照されたい。以下は、いくつかの２’置換修飾ヌクレオシドの例示である。
Figure 2024506711000020
[00387]ＬＮＡヌクレオシドは、ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’との間にリンカー基（ビラジカル又は架橋と称される）を含み（すなわち、２’－４’架橋）、リボース環の立体構造を制限又はロックする修飾ヌクレオシドである。これらのヌクレオシドは、文献において架橋核酸又は二環式核酸（ＢＮＡ）とも呼ばれている。リボースの立体構造のロックは、ＬＮＡが相補的なＲＮＡ又はＤＮＡ分子に対してオリゴヌクレオチドに組み込まれた際のハイブリダイゼーションの親和性の向上（二重鎖安定化）と関連している。このことは、オリゴヌクレオチド／相補二重鎖の融解温度を測定することによって、日常的に決定することができる。
[00388]非限定的な、例示的ＬＮＡヌクレオシドは、そのすべてが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第９９／０１４２２６号、国際公開第００／６６６０４号、国際公開第９８／０３９３５２号、国際公開第２００４／０４６１６０号、国際公開第００／０４７５９９号、国際公開第２００７／１３４１８１号、国際公開第２０１０／０７７５７８号、国際公開第２０１０／０３６６９８号、国際公開第２００７／０９００７１号、国際公開第２００９／００６４７８号、国際公開第２０１１／１５６２０２号、国際公開第２００８／１５４４０１号、国際公開第２００９／０６７６４７号、国際公開第２００８／１５０７２９号、Ｍｏｒｉｔａら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． １２、７３～７６頁、Ｓｅｔｈら、Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ２０１０、７５巻（５） １５６９～８１頁、又はＭｉｔｓｕｏｋａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００９、３７（４）、１２２５～１２３８頁に開示されている。一部の態様では、本開示のＡＳＯの修飾ヌクレオシド又はＬＮＡヌクレオシドは、式Ｉ又は式ＩＩの一般構造：
Figure 2024506711000021
（式中、
Ｗは、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｎ（Ｒａ）－、－Ｃ（ＲａＲｂ）－、特に－Ｏ－から選択され；
Ｂは、核酸塩基又は修飾核酸塩基部分であり；
Ｚは、隣接ヌクレオシド又は５’－末端基へのヌクレオシド間連結であり；
Ｚ＊は、隣接ヌクレオシド又は３’－末端基へのヌクレオシド間連結であり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ５＊は、水素、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、アジド、複素環及びアリールから独立的に選択され；
Ｘ、Ｙ、Ｒａ及びＲｂは、本明細書において定義される通りである）
を有する。
ＮＬＲＰ３を標的とするＡＳＯ
[00389]一部の態様では、生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］は、抗ＮＬＲＰ３ ＡＳＯである。ＮＬＲＰ３（ＮＬＲＰ３）は、ＮＬＲファミリーピリンドメイン含有３としても公知である。別段に示されていない限り、用語「ＮＬＲＰ３」は、本明細書で使用される場合、１つ又は複数の種（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、及びクマ）に由来するＮＬＲＰ３を指し得る。ヒトＮＬＲＰ３遺伝子の配列は、公的に入手可能なＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿０００００１．１１：２４７４１６１５６－２４７４４９１０８に見い出すことができる。ヒトＮＬＲＰ３遺伝子は、染色体位置１ｑ４４の２４７，４１６，１５６～２４７，４４９，１０８に見られる。ヒトＮＬＲＰ３ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ転写物の配列（配列番号１）は、染色体１ｑ４４の残基２４７，４１６，１５６～２４７，４４９，１０８の逆相補配列に対応する。ＮＬＲＰ３ ｍＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０７９８２１．２）は、配列番号３のヌクレオチド「ｔ」がｍＲＮＡ中の「ｕ」として示されていることを除いて、配列番号３に与えられている。ヒトＮＬＲＰ３タンパク質の配列は、公的に入手可能な受託番号で見出すことができる：Ｑ９６Ｐ２０、（カノニカル配列、配列番号２）、Ｑ９６Ｐ２０－２（配列番号４）、Ｑ９６Ｐ２０－３（配列番号５）、Ｑ９６Ｐ２０－４（配列番号６）、Ｑ９６Ｐ２０－５（配列番号７）、及びＱ９６Ｐ２０－６（配列番号８）に見い出すことができ、これらは各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本開示の抗ＮＬＲＰ３ ＡＳＯは、ＮＬＲＰ３タンパク質の天然バリアントの発現を低下させるか又は阻害するように設計され得る。
[00390]抗ＮＬＲＰ３ ＡＳＯの標的核酸配列の一例は、ＮＬＲＰ３ ｐｒｅ－ｍＲＮＡである。配列番号１は、ヒトＮＬＲＰ３ゲノム配列（すなわち、染色体１ｑ４４のヌクレオチド２４７，４１６，１５６～２４７，４４９，１０８の逆相補配列）を表す。配列番号１は、配列番号１のヌクレオチド「ｔ」がｐｒｅ－ｍＲＮＡの「ｕ」として示されていることを除いて、ＮＬＲＰ３ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列と同一である。ある特定の態様では、「標的核酸」は、ＮＬＲＰ３タンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントのイントロン、及びそれに由来するＲＮＡ核酸、例えばｐｒｅ－ｍＲＮＡを含む。他の態様では、標的核酸は、ＮＬＲＰ３タンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントのエクソン領域、及びそれに由来するＲＮＡ核酸、例えばｐｒｅ－ｍＲＮＡを含む。また他の態様では、標的核酸は、ＮＬＲＰ３タンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントのエクソン－イントロン接合部、及びそれに由来するＲＮＡ核酸、例えばｐｒｅ－ｍＲＮＡを含む。ＮＬＲＰ３ ｐｒｅ－ｍＲＮＡによってコードされるヒトＮＬＲＰ３タンパク質配列は、配列番号３として示されている。他の態様では、標的核酸は、ＮＬＲＰ３タンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントの非翻訳領域、例えば、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、又はその両方を含む。
[00391]一部の態様では、本開示の抗ＮＬＲＰ３ ＡＳＯは、ＮＬＲＰ３転写物、例えば配列番号１のイントロン内の領域にハイブリダイズする。ある特定の態様では、本開示の抗ＮＬＲＰ３ ＡＳＯは、ＮＬＲＰ３転写物のエクソン内の領域、例えば配列番号１にハイブリダイズする。他の態様では、本開示の抗ＮＬＲＰ３ ＡＳＯは、ＮＬＲＰ３転写物のエクソン－イントロン接合部内の領域、例えば、配列番号１にハイブリダイズする。一部の態様では、本開示の抗ＮＬＲＰ３ ＡＳＯは、ＮＬＲＰ３転写物内の領域（例えば、イントロン、エクソン、又はエクソン－イントロン接合部）、例えば、配列番号 １にハイブリダイズし、抗ＮＬＲＰ３ ＡＳＯはギャップマー設計を有する。
[00392]一部の態様では、抗ＮＬＲＰ３ ＡＳＯは、ＮＬＲＰ３タンパク質の特定のアイソフォーム（例えば、アイソフォーム１）をコードするｍＲＮＡを標的とする。一部の態様では、抗ＮＬＲＰ３ ＡＳＯは、ＮＬＲＰ３タンパク質のすべてのアイソフォームを標的とする。他の態様では、抗ＮＬＲＰ３ ＡＳＯは、ＮＬＲＰ３タンパク質の２つのアイソフォーム（例えば、アイソフォーム１とアイソフォーム２、アイソフォーム３とアイソフォーム４、及びアイソフォーム５とアイソフォーム６）を標的とする。
[00393]一部の態様では、本開示の抗ＮＬＲＰ３ ＡＳＯのヌクレオチド配列又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号１０１～２００から選択される配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性、例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％の配列同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、少なくとも約９８％の配列同一性、少なくとも約９９％の配列同一性、例えば約１００％配列同一性（相同性）を有する。
[00394]一部の態様では、抗ＮＬＲＰ３ ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、配列番号１０１～２００からなる群から選択される配列のうちの１つ、又はその少なくとも１０個の連続ヌクレオチドの領域から選択されるか、又はそれを含み、抗ＮＬＲＰ３ ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、対応するＮＬＲＰ３転写物と比較した場合に、１、２、３、又は４個のミスマッチを任意選択的に含み得る。
[00395]一部の態様では、抗ＮＬＲＰ３ ＡＳＯは、配列番号１０１～２００からなる群から選択される配列を含む。
[00396]一部の態様では、抗ＮＬＲＰ３ ＡＳＯは、配列番号１０１～２００のいずれか１つに記載されている配列を含む。一部の態様では、抗ＮＬＲＰ３ ＡＳＯは、配列番号１０１～２００に記載される配列と少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一の配列を含むか又はそれからなる。一部の態様では、抗ＮＬＲＰ３ ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は配列番号１０１～２００からなる群から選択される配列のうちの１つ、又はその少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０個の連続ヌクレオチドの領域から選択されるか、又はそれを含む。一部の態様では、抗ＮＬＲＰ３ ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、配列番号１０１～２００からなる群から選択される配列のうちの１つ、又はその少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０個の連続ヌクレオチドの領域から選択されるか、又はそれを含み、抗ＮＬＲＰ３ ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、対応するＮＬＲＰ３転写物と比較した場合に、１、２、３、又は４個のミスマッチを任意選択的に含み得る。一部の態様では、抗ＮＬＲＰ３ ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の置換を除いて、配列番号１０１～２００からなる群から選択される配列のうちの１つから選択されるか、又はそれを含み、置換されたＡＳＯは、ＮＬＲＰ３転写物に結合し得る。一部の態様では、抗ＮＬＲＰ３ ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、配列番号１０１～２００からなる群から選択される配列のうちの１つ、又はその少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０個の連続ヌクレオチドの領域から選択されるか、又はそれを含み、抗ＮＬＲＰ３ ＡＳＯ（又はその連続ヌクレオチド部分）は、対応するＮＬＲＰ３転写物に対して相補的な１、２、３、又は４個のさらなる５’及び／又は３’ヌクレオチドを任意選択的に含み得る。
[00397]一部の態様では、本明細書で開示されているＮＬＲＰ３転写物を標的とする抗ＮＬＲＰ３ ＡＳＯの、ＮＬＲＰ３をコードするｍＲＮＡ転写物への結合は、ＮＬＲＰ３の発現レベル及び／又は活性レベルを低下させ得る。
[00398]一部の態様では、本明細書に記載の任意の抗ＮＬＲＰ３ ＡＳＯは、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）、すなわち、本明細書で開示されている最適化リンカーを含む構築物、例えば、生物学的に活性な部分［ＢＡＭ］が本明細書に記載の抗ＮＬＲＰ３ ＡＳＯ又はその組合せである式１の構築物を含むＥＶ（例えば、エクソソーム）の一部であり得る。
ＳＴＡＴ６を標的とするＡＳＯ
[00399]一部の態様では、生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］は、抗ＳＴＡＴ６ ＡＳＯである。ＳＴＡＴ６（ＳＴＡＴ６）は、シグナル伝達兼転写活性化因子６としても公知である。別段に示されていない限り、用語「ＳＴＡＴ６」は、本明細書で使用される場合、１つ又は複数の種（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、及びクマ）に由来するＳＴＡＴ６を指し得る。
[00400]ヒトＳＴＡＴ６ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ転写物の配列（配列番号１１）は、染色体１２ｑ１３．３の残基５７１１１４１３～５７０９５４０４の逆相補配列、相補配列に対応する。ＳＴＡＴ６ ｍＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１１７８０７８．１）は、配列番号１３のヌクレオチド「ｔ」がｍＲＮＡ中の「ｕ」として示されていることを除いて、配列番号１３に与えられている。ヒトＳＴＡＴ６タンパク質の配列は、公的に入手可能な受託番号Ｐ４２２２６－１（カノニカル配列、配列番号１２）、Ｐ４２２２６－２（配列番号１４）、及びＰ４２２２６－３（配列番号１５）に見い出すことができ、これらは各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
[00401]ヒトＳＴＡＴ６遺伝子産物の天然バリアントは公知である。例えば、ヒトＳＴＡＴ６タンパク質の天然バリアントは、Ｍ１１８Ｒ、Ｄ４１９Ｎ、及びこれらの任意の組合せから選択される１つ又は複数のアミノ酸置換を含有し得る。選択的スプライシングから生じるヒトＳＴＡＴ６タンパク質のさらなるバリアントも当技術分野で公知である。ＳＴＡＴ６アイソフォーム２（ＵｎｉＰｒｏｔにおける識別子：Ｐ４２２２６－２）は、カノニカル配列（配列番号１３）と以下のように異なる：配列番号１３に対して、残基１～１７４の欠失及び１７５ＰＳＥ１７７の１７５ＭＥＱ１７７への置換。ＳＴＡＴ６アイソフォーム３（識別子：Ｐ４２２２６－３）の配列は、カノニカル配列（配列番号１３）と以下のように異なる：配列番号１３に対して、残基１～１１０の欠失。したがって、本開示の抗ＳＴＡＴ６ ＡＳＯは、ＳＴＡＴ６タンパク質の天然バリアントの発現を低下させるか又は阻害するように設計され得る。
[00402]抗ＳＴＡＴ６ ＡＳＯの標的核酸配列の一例は、ＳＴＡＴ６ ｐｒｅ－ｍＲＮＡである。配列番号１１は、ヒトＳＴＡＴ６ゲノム配列（すなわち、染色体１２ｑ１３．３のヌクレオチド５７１１１４１３～５７０９５４０４の逆相補配列、相補配列）を表す。配列番号１１は、配列番号１１のヌクレオチド「ｔ」がｐｒｅ－ｍＲＮＡの「ｕ」として示されていることを除いて、ＳＴＡＴ６ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列と同一である。ある特定の態様では、「標的核酸」は、ＳＴＡＴ６タンパク質をコードする核酸のイントロン又はその天然に存在するバリアント、及びそれに由来するＲＮＡ核酸、例えばｐｒｅ－ｍＲＮＡを含む。他の態様では、標的核酸は、ＳＴＡＴ６タンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントのエクソン領域、及びそれに由来するＲＮＡ核酸、例えばｐｒｅ－ｍＲＮＡを含む。またある特定の態様では、標的核酸は、ＳＴＡＴ６タンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントのエクソン－イントロン接合部、及びそれに由来するＲＮＡ核酸、例えばｐｒｅ－ｍＲＮＡを含む。ＳＴＡＴ６ ｐｒｅ－ｍＲＮＡによってコードされるヒトＳＴＡＴ６タンパク質配列は、配列番号１３として示されている。他の態様では、標的核酸は、ＳＴＡＴ６タンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントの非翻訳領域、例えば、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、又はその両方を含む。
[00403]一部の態様では、本開示の抗ＳＴＡＴ６ ＡＳＯは、ＳＴＡＴ６転写物、例えば配列番号１１のイントロン内の領域にハイブリダイズする。ある特定の態様では、本開示の抗ＳＴＡＴ６ ＡＳＯは、ＳＴＡＴ６転写物のエクソン内の領域、例えば配列番号１１にハイブリダイズする。他の態様では、本開示の抗ＳＴＡＴ６ ＡＳＯは、ＳＴＡＴ６転写物のエクソン－イントロン接合部内の領域、例えば配列番号１１にハイブリダイズする。一部の態様では、本開示の抗ＳＴＡＴ６ ＡＳＯは、ＳＴＡＴ６転写物（例えば、イントロン、エクソン、又はエクソン－イントロン接合部）内の領域、例えば配列番号１１にハイブリダイズし、抗ＳＴＡＴ６ ＡＳＯは、ギャップマー設計を有する。
[00404]一部の態様では、抗ＳＴＡＴ６ ＡＳＯは、ＳＴＡＴ６タンパク質の特定のアイソフォーム（例えば、アイソフォーム１）をコードするｍＲＮＡを標的とする。一部の態様では、ＡＳＯは、ＳＴＡＴ６タンパク質のすべてのアイソフォームを標的とする。他の態様では、抗ＳＴＡＴ６ ＡＳＯは、ＳＴＡＴ６タンパク質の２つのアイソフォーム（例えば、アイソフォーム１とアイソフォーム２、アイソフォーム１とアイソフォーム３、又はアイソフォーム２とアイソフォーム３）を標的とする。
[00405]一部の態様では、本開示のペイロード（例えば、ＡＳＯ）は、ＳＴＡＴ６転写物のイントロン内の領域にハイブリダイズする。ある特定の態様では、ペイロードは、ＳＴＡＴ６転写物のエクソン内の領域にハイブリダイズする。一部の態様では、ペイロードは、ＳＴＡＴ６転写物のエクソン－イントロン接合部内の領域にハイブリダイズする。一部の態様では、ペイロードは、ＳＴＡＴ６転写物内の領域（例えば、イントロン、エクソン、又はエクソン－イントロン接合部）にハイブリダイズする。ＳＴＡＴ６転写物の領域を特異的に標的とすることができるペイロード（例えば、ＡＳＯ）の非限定的な例。
[00406]一部の態様では、本明細書で開示されているＳＴＡＴ６転写物を標的とする抗ＳＴＡＴ６ ＡＳＯの、ＳＴＡＴ６をコードするｍＲＮＡ転写物への結合は、ＳＴＡＴ６の発現レベル及び／又は活性レベルを低下させ得る。
[00407]一部の態様では、本明細書に記載の任意の抗ＳＴＡＴ６ ＡＳＯは、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）、すなわち、本明細書で開示されている最適化リンカーを含む構築物、例えば、生物学的に活性な部分［ＢＡＭ］が本明細書に記載の抗ＳＴＡＴ６ ＡＳＯ又はその組合せである式１の構築物を含むＥＶ（例えば、エクソソーム）の一部であり得る。
[00408]一部の態様では、本開示の抗ＳＴＡＴ６ ＡＳＯは、配列番号１０９１の塩基配列を含む。一部の態様では、本開示の抗ＳＴＡＴ６ ＡＳＯは、図１２に示されているＳＴＡＴ６ ＡＳＯ配列を含む。
ＭＹＣを標的とするＡＳＯ
[00409]一部の態様では、生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］は、抗ＭＹＣ ＡＳＯである。別段に示されていない限り、用語「ＭＹＣ」は、本明細書で使用される場合、１つ又は複数の種（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、及びクマ）に由来するＭＹＣを指し得る。
[00410]一部の態様では、本開示の抗ＭＹＣ ＡＳＯは、配列番号１０９２の塩基配列を含む。一部の態様では、本開示の抗ＭＹＣ ＡＳＯは、図１２に示されているＭＹＣ ＡＳＯ配列を含む。
ＣＥＢＰ／βを標的とするＡＳＯ
[00411]一部の態様では、生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］は、抗ＣＥＢＰ／β ＡＳＯである。別段に示されていない限り、用語「ＣＥＢＰ／β」は、本明細書で使用される場合、１つ又は複数の種（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、及びクマ）に由来するＣＥＢＰ／βを指し得る。
[00412]ヒトＣＥＢＰ／β遺伝子の配列は、公的に入手可能なＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００００２０．１１（５０１９０５８３．．５０１９２６９０）に見い出すことができる。ヒトＣＥＢＰ／β遺伝子は、５０１９０５８３～５０１９２６９０の染色体位置２０ｑ１３．１３に見られる。
[00413]ヒトＣＥＢＰ／β ｐｒｅ－ｍＲＮＡ転写物の配列（配列番号２１）は、染色体２０ｑ１３．１３の残基５０１９０５８３～５０１９２６９０の逆相補配列に対応する。ＣＥＢＰ／β ｍＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１２８５８７８．１）は、配列番号２３のヌクレオチド「ｔ」がｍＲＮＡ中の「ｕ」として示されていることを除いて、配列番号２３に与えられている。ヒトＣＥＢＰ／βタンパク質の配列は、公的に入手可能な受託番号Ｐ１７６７６（カノニカル配列、配列番号２２）、Ｐ１７６７６－２（配列番号２４）、及びＰ１７６７６－３（配列番号２５）に見い出すことができ、これらは各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
[00414]ヒトＣＥＢＰ／β遺伝子産物の天然バリアントは公知である。例えば、ヒトＣＥＢＰ／βタンパク質の天然バリアントは、Ａ２４１Ｐ、Ａ２５３Ｇ、Ｇ１９５Ｓ、及びこれらの任意の組合せから選択される１つ又は複数のアミノ酸置換を含有し得る。選択的スプライシングから得られるヒトＣＥＢＰ／βタンパク質のさらなるバリアントも当技術分野で公知である。ＣＥＢＰ／βアイソフォーム２（ＵｎｉＰｒｏｔの識別子：Ｐ１７６７６－２）は、カノニカル配列（配列番号２３）と以下のように異なる：配列番号２３に対して、残基１～２３の欠失。ＣＥＢＰ／βアイソフォーム３（識別子：Ｐ１７６７６－３）の配列は、カノニカル配列（配列番号２３）と以下のように異なる：配列番号２３に対して、残基１～１９８の欠失。したがって、本開示の抗ＣＥＢＰｂ ＡＳＯは、タンパク質の天然バリアントの発現を低下させるか又は阻害するように設計され得る。
[00415]抗ＣＥＢＰｂ ＡＳＯの標的核酸配列の一例は、ＣＥＢＰ／β ｐｒｅ－ｍＲＮＡである。配列番号２１は、ヒトＣＥＢＰ／βゲノム配列（すなわち、染色体２０ｑ１３．１３のヌクレオチド５０１９０５８３～５０１９２６９０の逆相補配列）を表す。配列番号２１は、配列番号２１のヌクレオチド「ｔ」がｐｒｅ－ｍＲＮＡの「ｕ」として示されていることを除いて、ＣＥＢＰ／β ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列と同一である。ある特定の態様では、「標的核酸」は、ＣＥＢＰ／βタンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントのイントロン、及びそれに由来するＲＮＡ核酸、例えばｐｒｅ－ｍＲＮＡを含む。他の態様では、標的核酸は、ＣＥＢＰ／βタンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントのエクソン領域、及びそれに由来するＲＮＡ核酸、例えばｐｒｅ－ｍＲＮＡを含む。また他の態様では、標的核酸は、ＣＥＢＰ／βタンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントのエクソン－イントロン接合部、及びそれに由来するＲＮＡ核酸、例えばｐｒｅ－ｍＲＮＡを含む。ＣＥＢＰ／β ｐｒｅ－ｍＲＮＡによってコードされるヒトＣＥＢＰ／βタンパク質配列は、配列番号２３として示されている。他の態様では、標的核酸は、ＣＥＢＰ／βタンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントの非翻訳領域、例えば、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、又はその両方を含む。
[00416]一部の態様では、本開示の抗ＣＥＢＰｂ ＡＳＯは、ＣＥＢＰ／β転写物のイントロン内の領域、例えば配列番号２１にハイブリダイズする。ある特定の態様では、本開示の抗ＣＥＢＰｂ ＡＳＯは、ＣＥＢＰ／β転写物のエクソン内の領域、例えば配列番号２１にハイブリダイズする。他の態様では、本開示の抗ＣＥＢＰｂ ＡＳＯは、ＣＥＢＰ／β転写物のエクソン－イントロン接合部内の領域、例えば配列番号２１にハイブリダイズする。一部の態様では、本開示の抗ＣＥＢＰｂ ＡＳＯは、ＣＥＢＰ／β転写物（例えば、イントロン、エクソン、又はエクソン－イントロン接合部）内の領域、例えば配列番号２１にハイブリダイズし、抗ＣＥＢＰｂ ＡＳＯは、ギャップマー設計を有する。
[00417]一部の態様では、抗ＣＥＢＰｂ ＡＳＯは、ＣＥＢＰ／βタンパク質の特定のアイソフォーム（例えば、アイソフォーム１）をコードするｍＲＮＡを標的とする。一部の態様では、抗ＣＥＢＰｂ ＡＳＯは、ＣＥＢＰ／βタンパク質のすべてのアイソフォームを標的とする。他の態様では、抗ＣＥＢＰｂ ＡＳＯは、ＣＥＢＰ／βタンパク質の２つのアイソフォーム（例えば、アイソフォーム１とアイソフォーム２、アイソフォーム１とアイソフォーム３、又はアイソフォーム２とアイソフォーム３）を標的とする。
[00418]一部の態様では、本明細書で開示されているＣＥＢＰｂ転写物を標的とする抗ＣＥＢＰｂ ＡＳＯの、ＣＥＢＰｂをコードするｍＲＮＡ転写物への結合は、ＣＥＢＰｂの発現レベル及び／又は活性レベルを低下させ得る。
[00419]一部の態様では、本明細書に記載の任意の抗ＣＥＢＰｂ ＡＳＯは、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）、すなわち、本明細書で開示されている最適化リンカーを含む構築物、例えば、生物学的に活性な部分［ＢＡＭ］が本明細書に記載の抗ＣＥＢＰｂ ＡＳＯ又はその組合せである式１の構築物を含むＥＶ（例えば、エクソソーム）の一部であり得る。
ＳＴＡＴ３を標的とするＡＳＯ
[00420]一部の態様では、生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］は、抗ＳＴＡＴ３ ＡＳＯである。シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）は、細胞表面受容体からのシグナルを核に伝達するシグナル伝達兼転写活性化因子である。ＳＴＡＴ３は、多くのヒトがんにおいて過剰に活性化されることが多い。
[00421]シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）は、様々な名称で当技術分野で公知である。このような名称には、ＤＮＡ結合タンパク質ＡＰＲＦ、及び急性期応答因子が含まれる。ヒトＳＴＡＴ３をコードするｍＲＮＡは、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３１５０．３において見い出すことができ、配列（配列番号４３）によって表される。
[00422]ヒトＳＴＡＴ３遺伝子産物の天然バリアントは公知である。したがって、本開示のＡＳＯは、ＳＴＡＴ３タンパク質の天然バリアントの発現を低下させるか又は阻害するように設計され得る。
[00423]配列番号４１は、配列番号４１のヌクレオチド「ｔ」がｐｒｅ－ｍＲＮＡの「ｕ」として示されていることを除いて、ＳＴＡＴ３ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列と同一である。ある特定の態様では、「標的核酸」は、ＳＴＡＴ３タンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントのイントロン、及びそれに由来するＲＮＡ核酸、例えばｐｒｅ－ｍＲＮＡを含む。他の態様では、標的核酸は、ＳＴＡＴ３タンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントのエクソン領域、及びそれに由来するＲＮＡ核酸、例えばｐｒｅ－ｍＲＮＡを含む。また他の態様では、標的核酸は、ＳＴＡＴ３タンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントのエクソン－イントロン接合部、及びそれに由来するＲＮＡ核酸、例えばｐｒｅ－ｍＲＮＡを含む。ＳＴＡＴ３ ｐｒｅ－ｍＲＮＡによってコードされるヒトＳＴＡＴ３タンパク質配列は、配列番号４２として示されている。他の態様では、標的核酸は、ＳＴＡＴ３タンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントの非翻訳領域、例えば、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、又はその両方を含む。
[00424]また他の態様では、標的核酸は、ＳＴＡＴ３タンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントのエクソン－イントロン接合部、及びそれに由来するＲＮＡ核酸、例えばｐｒｅ－ｍＲＮＡを含む。ＳＴＡＴ３ ｐｒｅ－ｍＲＮＡによってコードされるヒトＳＴＡＴ３タンパク質配列は、配列番号４３として示されている。他の態様では、標的核酸は、ＳＴＡＴ３タンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントの非翻訳領域、例えば、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、又はその両方を含む。
[00425]一部の態様では、本開示の抗ＳＴＡＴ３ ＡＳＯは、ＳＴＡＴ３転写物のイントロン内の領域、例えば配列番号４１又は配列番号４３にハイブリダイズする。ある特定の態様では、本開示の抗ＳＴＡＴ３ ＡＳＯは、ＳＴＡＴ３転写物のエクソン内の領域、例えば配列番号４１又は配列番号４３にハイブリダイズする。他の態様では、本開示の抗ＳＴＡＴ３ ＡＳＯは、ＳＴＡＴ３転写物のエクソン－イントロン接合部内の領域、例えば配列番号４１又は配列番号４３にハイブリダイズする。一部の態様では、本開示の抗ＳＴＡＴ３ ＡＳＯは、ＳＴＡＴ３転写物（例えば、イントロン、エクソン、又はエクソン－イントロン接合部）内の領域、例えば配列番号４１又は配列番号４３にハイブリダイズし、抗ＳＴＡＴ３ ＡＳＯは、ギャップマー設計を有する。
[00426]一部の態様では、抗ＳＴＡＴ３ ＡＳＯは、ＳＴＡＴ３タンパク質の特定のアイソフォーム（例えば、アイソフォーム１）をコードするｍＲＮＡを標的とする。一部の態様では、ＡＳＯは、ＳＴＡＴ３タンパク質のすべてのアイソフォームを標的とする。他の態様では、ＡＳＯは、ＳＴＡＴ３タンパク質の２つのアイソフォーム（例えば、アイソフォーム１（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ４０７６３－１）とアイソフォーム２（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ４０７６３－２）、アイソフォーム２とアイソフォーム３（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ４０７６３－３）を標的とする。
[00427]一部の態様では、本開示の抗ＳＴＡＴ３ ＡＳＯは、ＳＴＡＴ３転写物のイントロン内の領域、例えば配列番号４１又は配列番号４３にハイブリダイズする。ある特定の態様では、本開示の抗ＳＴＡＴ３ ＡＳＯは、ＳＴＡＴ３転写物のエクソン内の領域、例えば配列番号４１又は配列番号４３にハイブリダイズする。他の態様では、本開示の抗ＳＴＡＴ３ ＡＳＯは、ＳＴＡＴ３転写物のエクソン－イントロン接合部内の領域、例えば配列番号４１又は配列番号４３にハイブリダイズする。一部の態様では、本開示の抗ＳＴＡＴ３ ＡＳＯは、ＳＴＡＴ３転写物（例えば、イントロン、エクソン、又はエクソン－イントロン接合部）内の領域、例えば配列番号４１又は配列番号４３にハイブリダイズし、ＡＳＯは、ギャップマー設計を有する。
[00428]一部の態様では、本開示の抗ＳＴＡＴ３ ＡＳＯは、ＳＴＡＴ３転写物内の複数の標的領域（例えば、ゲノム配列、配列番号４１）にハイブリダイズする。一部の態様では、ＡＳＯは、ＳＴＡＴ３転写物内の２つの異なる標的領域にハイブリダイズする。一部の態様では、抗ＳＴＡＴ３ ＡＳＯは、ＳＴＡＴ３転写物内の３つの異なる標的領域にハイブリダイズする。一部の態様では、ＳＴＡＴ３転写物内の複数の領域（例えば、ゲノム配列、配列番号４１）にハイブリダイズする抗ＳＴＡＴ３ ＡＳＯは、ＳＴＡＴ３転写物内の単一の領域（例えば、ゲノム配列、配列番号４１）にハイブリダイズする抗ＳＴＡＴ３ ＡＳＯと比較して、ＳＴＡＴ３発現を低下させることにおいてより強力である（例えば、より低いＥＣ５０を有する）。
[00429]本開示の抗ＳＴＡＴ３ ＡＳＯは、ＳＴＡＴ３転写物の領域の相補配列に対応する連続ヌクレオチド配列、例えば、配列番号４１に対応するヌクレオチド配列を含む。
[00430]一部の態様では、本明細書で開示されているＳＴＡＴ３転写物を標的とする抗ＳＴＡＴ３ ＡＳＯの、ＳＴＡＴ３をコードするｍＲＮＡ転写物への結合は、ＳＴＡＴ３の発現レベル及び／又は活性レベルを低下させ得る。
[00431]一部の態様では、本明細書に記載の任意の抗ＳＴＡＴ３ ＡＳＯは、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）、すなわち、本明細書で開示されている最適化リンカーを含む構築物、例えば、生物学的に活性な部分［ＢＡＭ］が本明細書に記載の抗ＳＴＡＴ３ ＡＳＯ又はその組合せである式１の構築物を含むＥＶ（例えば、エクソソーム）の一部であり得る。
ＮＲＡＳを標的とするＡＳＯ
[00432]一部の態様では、生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］は、抗ＮＲａｓ ＡＳＯである。ＮＲａｓは、ゴルジ装置と原形質膜との間を行き来する膜タンパク質をコードするがん遺伝子である。ＮＲａｓをコードするゲノムＤＮＡは、染色体位置１ｐ１３．２（すなわち、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＧ＿００７５７２の５００１～１７４３８までのヌクレオチド）に見い出すことができる。具体的には、パルミトイル化の非存在下で、ＧＦＰタグ付きＮ－ＲａｓがサイトゾルとＥＲ／ゴルジ体膜との間で迅速な交換を受けること、及び野生型ＧＦＰ－Ｎ－Ｒａｓが非小胞体機構によってゴルジ複合体へリサイクルされることが、タイムラプス顕微鏡とフォトブリーチング技法との組合せによって明らかにされた。Ｎ－ｒａｓの変異は、黒色腫、甲状腺癌、奇形癌、線維肉腫、神経芽腫、横紋筋肉腫、バーキットリンパ腫、急性前骨髄球性白血病、Ｔ細胞白血病、及び慢性骨髄性白血病において記載されている。発癌性Ｎ－Ｒａｓは、マウスにおいて急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）又は慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）様疾患を誘導し得る。
[00433]神経芽腫ＲＡＳウイルスがん遺伝子（ＮＲａｓ）は、様々な名称で当技術分野で公知である。このような名称には、ＧＴＰａｓｅ ＮＲａｓ、Ｎ－ｒａｓタンパク質パート４、神経芽腫ＲＡＳウイルス（ｖ－ｒａｓ）がん遺伝子ホモログ 神経芽腫ＲＡＳウイルスがん遺伝子ホモログ、形質転換タンパク質Ｎ－Ｒａｓ、及びｖ－ｒａｓ神経芽腫ＲＡＳウイルスがん遺伝子ホモログを含む。
[00434]ＮＲＡＳ遺伝子は、主に細胞分裂の調節に関与するＮ－Ｒａｓと呼ばれるタンパク質を作製するための指示を与える。ヒトＮＲＡＳをコードするｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００２５２４．５に見い出すことができ、コード配列（配列番号５３）によって表される。
[00435]ヒトＮＲａｓ遺伝子産物の天然バリアントは公知である。例えば、ヒトＮＲａｓタンパク質の天然バリアントは、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１３Ｄ、Ｔ５０Ｉ、Ｇ６０Ｅ、及びこれらの任意の組合せから選択される１つ又は複数のアミノ酸置換を含有し得る。Ｇ１３Ｒ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｒ、及びＰ３４Ｌなどの選択的スプライシングから得られるヒトＮＲａｓタンパク質のさらなるバリアントも当技術分野で公知である。したがって、本開示の抗ＮＲａｓ ＡＳＯは、ＳＴＡＴ３タンパク質の天然バリアントの発現を低下させるか又は阻害するように設計され得る。
[00436]配列番号５１は、配列番号５１のヌクレオチド「ｔ」がｐｒｅ－ｍＲＮＡの「ｕ」として示されていることを除いて、ＮＲａｓ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列と同一である。ある特定の態様では、「標的核酸」は、ＮＲａｓタンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントのイントロン、及びそれに由来するＲＮＡ核酸、例えばｐｒｅ－ｍＲＮＡを含む。他の態様では、標的核酸は、ＮＲａｓタンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントのエクソン領域、及びそれに由来するＲＮＡ核酸、例えばｐｒｅ－ｍＲＮＡを含む。また他の態様では、標的核酸は、ＮＲａｓタンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントのエクソン－イントロン接合部、及びそれに由来するＲＮＡ核酸、例えばｐｒｅ－ｍＲＮＡを含む。ＮＲａｓ ｐｒｅ－ｍＲＮＡによってコードされるヒトＮＲａｓタンパク質配列は、配列番号５２として示されている。他の態様では、標的核酸は、ＮＲａｓタンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントの非翻訳領域、例えば、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、又はその両方を含む。
[00437]ある特定の態様では、本開示の抗ＮＲａｓ ＡＳＯは、ＮＲａｓ ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を下方調節する（例えば、低下させるか又は除去する）ことも可能である。この点に関して、本開示の抗ＮＲａｓ ＡＳＯは、典型的には、ヒト細胞、例えば腫瘍細胞などの哺乳動物細胞において、ＮＲａｓ ｍＲＮＡレベルの低下により、ＮＲａｓタンパク質の間接的阻害に影響を及ぼし得る。特に、本開示は、ＮＲａｓ ｐｒｅ－ｍＲＮＡの１つ又は複数の領域（例えば、イントロン領域、エクソン領域、及び／又はエクソン－イントロン接合領域）を標的とする抗ＮＲａｓ ＡＳＯを対象とする。別段に示されていない限り、用語「ＮＲａｓ」は、本明細書で使用される場合、１つ又は複数の種（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、及びクマ）に由来するＮＲａｓを指し得る。
[00438]一部の態様では、本開示の抗ＮＲａｓ ＡＳＯは、ＮＲＡＳ転写物のイントロン内の領域、例えば配列番号５１又は配列番号５３にハイブリダイズする。ある特定の態様では、本開示のＡＳＯは、ＮＲＡＳ転写物のエクソン内の領域、例えば配列番号５１又は配列番号５３にハイブリダイズする。他の態様では、本開示のＡＳＯは、ＮＲＡＳ転写物のエクソン－イントロン接合部内の領域、例えば配列番号５１又は配列番号５３にハイブリダイズする。一部の態様では、本開示の抗ＮＲａｓ ＡＳＯは、ＮＲＡＳ転写物（例えば、イントロン、エクソン、又はエクソン－イントロン接合部）内の領域、例えば配列番号５１又は配列番号５３にハイブリダイズし、ＡＳＯは、ギャップマー設計を有する。
[00439]一部の態様では、本開示の抗ＮＲａｓ ＡＳＯは、ＮＲａｓ転写物内の複数の標的領域（例えば、ゲノム配列、配列番号５１）にハイブリダイズする。一部の態様では、抗ＮＲａｓ ＡＳＯは、ＮＲａｓ転写物内の２つの異なる標的領域にハイブリダイズする。一部の態様では、抗ＮＲａｓ ＡＳＯは、ＮＲａｓ転写物内の３つの異なる標的領域にハイブリダイズする。一部の態様では、ＮＲａｓ転写物内の複数の領域（例えば、ゲノム配列、配列番号５１）にハイブリダイズする抗ＮＲａｓ ＡＳＯは、ＮＲａｓ転写物内の単一の領域（例えば、ゲノム配列、配列番号５１）にハイブリダイズする抗ＮＲａｓ ＡＳＯと比較して、ＮＲａｓ発現を低下させることにおいてより強力である（例えば、より低いＥＣ５０を有する）。
[00440]一部の態様では、ＡＳＯは、ＮＲＡＳタンパク質の特定のアイソフォーム（例えば、アイソフォーム１、ＮＣＢＩ ＩＤ：ＮＰ＿００１２２９８２１．１）をコードするｍＲＮＡを標的とする。一部の態様では、ＡＳＯは、ＮＲａｓタンパク質のすべてのアイソフォームを標的とする。他の態様では、ＡＳＯは、ＮＲａｓタンパク質の２つのアイソフォーム（例えば、アイソフォーム１とアイソフォーム２（ＮＣＢＩ ＩＤ：ＮＰ＿００９０８９．４）、アイソフォーム２とアイソフォーム３（ＮＣＢＩ ＩＤ：ＮＰ＿００１１２３９９５）、及びアイソフォーム３とアイソフォーム４（ＮＣＢＩ ＩＤ：ＮＰ＿００１２２９８２０．１））を標的とする。
[00441]本開示の抗ＮＲａｓ ＡＳＯは、ＮＲａｓ転写物の領域の相補配列に対応する連続ヌクレオチド配列、例えば、配列番号５１に対応するヌクレオチド配列を含む。
[00442]一部の態様では、本明細書で開示されているＮＲａｓ転写物を標的とする抗ＮＲａｓ ＡＳＯの、ＮＲａｓをコードするｍＲＮＡ転写物への結合は、ＮＲａｓの発現レベル及び／又は活性レベルを低下させ得る。
[00443]一部の態様では、本明細書に記載の任意の抗ＮＲａｓ ＡＳＯは、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）、すなわち、本明細書で開示されている最適化リンカーを含む構築物、例えば、生物学的に活性な部分［ＢＡＭ］が本明細書に記載の抗ＮＲａｓ ＡＳＯ又はその組合せである式１の構築物を含むＥＶ（例えば、エクソソーム）の一部であり得る。
ＫＲＡＳを標的とするＡＳＯ
[00444]一部の態様では、生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］は、抗ＫＲＡＳ ＡＳＯである。ヒトＫＲＡＳ遺伝子の配列は、染色体位置１２ｐ１２．１及び公的に入手可能なＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００００１２（２５，２０４，７８９～２５，２５０，９３６）に見い出すことができる。ヒト野生型ＫＲＡＳ転写物のゲノム配列は、ＮＣ＿００００１２（配列番号３５）の残基２５，２０４，７８９～２５，２５０，９３６の逆相補配列に対応する。配列番号３１で与えられるＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄゲノム配列は、ヌクレオチド位置５，５８７においてグアニンからアデニンへの置換を有する点で配列番号３５とは異なる。例示的なＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡ配列は、配列番号３３のヌクレオチド「ｔ」がｍＲＮＡ中の「ｕ」として示されていることを除いて、配列番号３３に与えられている。配列番号３３で与えられるＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡは、ヌクレオチド位置２２５においてグアニンからアデニンへの置換を有する点で野生型ｍＲＮＡ配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４９８５．５；配列番号３７））とは異なる。ヒトＫＲＡＳタンパク質の配列は、公的に入手可能な受託番号Ｐ０１１１６（カノニカル配列）、Ａ８Ｋ８Ｚ５、Ｂ０ＬＰＦ９、Ｐ０１１１８、及びＱ９６Ｄ１０に見い出すことができ、これらは各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
[00445]ヒトＫＲＡＳタンパク質（Ｐ０１１１６）には選択的スプライシングから得られる２つのアイソフォームが存在する。アイソフォーム２Ａ（受託番号：Ｐ０１１１６－１；配列番号３８）は、カノニカル配列である。Ｋ－Ｒａｓ４Ａとしても公知である。アイソフォーム２Ｂ（受託番号：Ｐ０１１１６－２；Ｋ－Ｒａｓ４Ｂとしても公知；配列番号３６）は、以下のように、カノニカル配列とは異なる：（ｉ）１５１～１５３：ＲＶＥ→ＧＶＤ；及び（ｉｉ）１６５～１８９：ＱＹＲＬＫＫＩＳＫＥＥＫＴＰＧＣＶＫＩＫＫＣＩＩＭ（配列番号５９９）→ＫＨＫＥＫＭＳＫＤＧＫＫＫＫＫＫＳＫＴＫＣＶＩＭ（配列番号６００）。一部の態様では、本明細書で開示されている抗ＫＲＡＳ ＡＳＯは、ＫＲＡＳタンパク質アイソフォーム２Ａ、アイソフォーム２Ｂ、又はその両方の発現を低下させるか又は阻害し得る。
[00446]ヒトＫＲＡＳ遺伝子産物の天然バリアントは公知である。例えば、ヒトＫＲＡＳタンパク質の天然バリアントは、Ｋ５Ｅ、Ｋ５Ｎ、Ｇ１０ＧＧ、Ｇ１０Ｖ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１２Ｉ、Ｇ１２Ｌ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｅ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｖ、Ｖ１４Ｉ、Ｌ１９Ｆ、Ｔ２０Ｍ、Ｑ２２Ｅ、Ｑ２２Ｈ、Ｑ２２Ｋ、Ｑ２２Ｒ、Ｑ２５Ｈ、Ｎ２６Ｙ、Ｆ２８Ｌ、Ｅ３１Ｋ、Ｄ３３Ｅ、Ｐ３４Ｌ、Ｐ３４Ｑ、Ｐ３４Ｒ、Ｉ３６Ｍ、Ｒ４１Ｋ、Ｄ５７Ｎ、Ｔ５８Ｉ、Ａ５９Ｔ、Ｇ６０Ｄ、Ｇ６０Ｒ、Ｇ６０Ｓ、Ｇ６０Ｖ、Ｑ６１Ａ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｐ、Ｑ６１Ｒ、Ｅ６３Ｋ、Ｓ６５Ｎ、Ｒ６８Ｓ、Ｙ７１Ｈ、Ｔ７４Ａ、Ｌ７９Ｉ、Ｒ９７Ｉ、Ｑ９９Ｅ、Ｍ１１１Ｌ、Ｋ１１７Ｎ、Ｋ１１７Ｒ、Ｄ１１９Ｇ、Ｓ１２２Ｆ、Ｔ１４４Ｐ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６Ｔ、Ａ１４６Ｖ、Ｋ１４７Ｅ、Ｋ１４７Ｔ、Ｒ１４９Ｋ、Ｌ１５９Ｓ、Ｉ１６３Ｓ、Ｒ１６４Ｑ、Ｉ１８３Ｎ、Ｉ８４Ｍ、又はその組合せから選択される１つ又は複数のアミノ酸置換を含有し得る。ＫＲＡＳタンパク質アイソフォーム２Ｂに対して特異的である天然バリアントは、Ｖ１５２Ｇ、Ｄ１５３Ｖ、Ｆ１５６Ｉ、Ｆ１５６Ｌ、又はこれらの組合せから選択される１つ又は複数のアミノ酸置換を含有する。本開示の抗ＫＲＡＳ ＡＳＯは、ＫＲＡＳタンパク質のバリアント（例えば、当技術分野で公知の任意のバリアント）のうちの１つ又は複数の発現を低下させるか又は阻害するように設計され得る。一部の態様では、ＫＲＡＳ変異体は、Ｇ１２Ｄのアミノ酸置換を有する。一部の態様では、本開示の抗ＫＲＡＳ ＡＳＯは、１つ又は複数のＫＲＡＳ変異体を標的とする。他の態様では、抗ＫＲＡＳ ＡＳＯが標的とするＫＲＡＳ変異体は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ（配列番号３２）である。ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡ及びＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄタンパク質の例示的な配列は、配列番号３３及び配列番号３２に与えられる。
[00447]一部の態様では、本明細書で開示されている抗ＫＲＡＳ ＡＳＯの標的核酸配列は、ＫＲＡＳ ｐｒｅ－ｍＲＮＡの１つ又は複数の領域を含む。例えば、配列番号３１（上記）は、配列番号３１のヌクレオチド「ｔ」がｐｒｅ－ｍＲＮＡの「ｕ」として示されていることを除いて、ＫＲＡＳ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列と同一である。本明細書で使用される場合、用語「標的核酸配列」は、本明細書で開示されている抗ＫＲＡＳ ＡＳＯに対して相補的である核酸配列を指す。ある特定の態様では、標的核酸配列は、ＫＲＡＳタンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントのエクソン領域、及びそれに由来するＲＮＡ核酸、例えばｐｒｅ－ｍＲＮＡを含む。一部の態様では、標的核酸配列は、ＫＲＡＳタンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントのイントロン、及びそれに由来するＲＮＡ核酸、例えばｐｒｅ－ｍＲＮＡを含む。さらなる態様では、標的核酸配列は、ＫＲＡＳタンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントのエクソン－イントロン接合部、及びそれに由来するＲＮＡ核酸、例えばｐｒｅ－ｍＲＮＡを含む。一部の態様では、例えば、研究又は診断において使用される場合、標的核酸は、本明細書に記載のＤＮＡ又はＲＮＡ核酸標的に由来するｃＤＮＡ又は合成オリゴヌクレオチドであり得る。一部の態様では、標的核酸は、ＫＲＡＳタンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントの非翻訳領域、例えば、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、又はその両方を含む。
[00448]したがって、一部の態様では、本明細書で開示されている抗ＫＲＡＳ ＡＳＯは、ＫＲＡＳ転写物のエクソン領域、例えば、配列番号３１又は配列番号３３にハイブリダイズする。一部の態様では、本開示の抗ＫＲＡＳ ＡＳＯは、ＫＲＡＳ転写物のイントロン領域、例えば配列番号３１にハイブリダイズする。一部の態様では、抗ＫＲＡＳ ＡＳＯは、ＫＲＡＳ転写物のエクソン－イントロン接合部、例えば、配列番号３１にハイブリダイズする。一部の態様では、本開示の抗ＫＲＡＳ ＡＳＯは、ＫＲＡＳ転写物（例えば、イントロン、エクソン、又はエクソン－イントロン接合部）内の領域、例えば配列番号３１にハイブリダイズする。
[00449]一部の態様では、本明細書で開示されているＡＳＯの標的核酸配列は、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡ、例えば、配列番号３３である。したがって、ある特定の態様では、本明細書で開示されている抗ＫＲＡＳ ＡＳＯは、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡの１つ又は複数の領域にハイブリダイズし得る。一部の態様では、本開示の抗ＫＲＡＳ ＡＳＯは、ＫＲＡＳタンパク質の特定のアイソフォームをコードするｍＲＮＡを標的とする。ある特定の態様では、本明細書で開示されている抗ＫＲＡＳ ＡＳＯは、その任意のバリアント（本明細書に記載のもの）を含むＫＲＡＳタンパク質のすべてのアイソフォームを標的とし得る。一部の態様では、本開示の抗ＫＲＡＳ ＡＳＯによって標的とされ得るＫＲＡＳタンパク質は、Ｇ１２Ｄアミノ酸置換を含む。
[00450]一部の態様では、本明細書で開示されているＫＲＡＳ転写物を標的とする抗ＫＲＡＳ ＡＳＯの、ＫＲＡＳをコードするｍＲＮＡ転写物への結合は、ＫＲＡＳの発現レベル及び／又は活性レベルを低下させ得る。
[00451]一部の態様では、本明細書に記載の任意の抗ＫＲＡＳ ＡＳＯは、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）、すなわち、本明細書で開示されている最適化リンカーを含む構築物、例えば、生物学的に活性な部分［ＢＡＭ］が本明細書に記載の抗ＫＲＡＳ ＡＳＯ又はその組合せである式１の構築物を含むＥＶ（例えば、エクソソーム）の一部であり得る。
Ｐｍｐ２２を標的とするＡＳＯ
[00452]一部の態様では、生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］は、抗Ｐｍｐ２２ ＡＳＯである。末梢性ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）は、成長停止特異的タンパク質３（ＧＡＳ－３）としても公知であり、ＰＭＰ２２遺伝子によってコードされている。ＰＭＰ２２は、１６０個のアミノ酸から構成される２２ｋＤａの膜貫通型糖タンパク質であり、末梢神経系のシュワン細胞で主に発現される。シュワン細胞は、ＰＭＰ２２の高発現を示し、コンパクトミエリン中の総タンパク質の２～５％を占め得る。コンパクトミエリンは、末梢神経細胞のミエリン鞘の大部分である、神経軸索を電気的に絶縁する保護脂肪層である。成体の中枢神経系では、ＰＭＰ２２の発現レベルは比較的低い。
[00453]ＰＭＰ２２は、コンパクトミエリンの形成及び維持において不可欠な役割を果たす。シュワン細胞が神経軸索と接触すると、ＰＭＰ２２の発現は著しく上方調節されるが、軸索の変性又は切断時にはＰＭＰ２２は下方調節される。ＰＭＰ２２は、他の細胞及び細胞外マトリックスとの接着に関与し、ミエリンの機能を支えるタンパク質である閉鎖帯（ｚｏｎｕｌａ－ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ）１及びオクルディンとの関連を示している。細胞接着機能と共に、ＰＭＰ２２はシュワン細胞の増殖中も上方調節され、細胞周期の調節における役割が示唆される。ＰＭＰ２２は、神経以外の組織でも検出可能であり、その発現は、成長停止特異的（ｇａｓ－３）機能を果たすことが示されている。
[00454]ＰＭＰ２２遺伝子の不適切な遺伝子投与は、ミエリン鞘の異常なタンパク質合成及び機能を引き起こす可能性がある。ミエリンの構成成分は化学量論的に設定されているため、構成成分の発現が不規則になると、ミエリンの不安定化及び神経障害を引き起こす可能性がある。ＰＭＰ２２遺伝子発現の変化は、シャルコーマリートゥース１Ａ型（ＣＭＴ１Ａ）、デジェリンソッタス病、及び遺伝性圧脆弱性ニューロパチー（ＨＮＰＰ）などの種々の神経障害と関連している。ＰＭＰ２２が多すぎると（例えば、遺伝子の重複が原因）、ＣＭＴ１Ａとなる。ＰＭＰ２２の遺伝子重複は、ＣＭＴの最も一般的な遺伝的原因であり、ＰＭＰ２２の過剰産生により、複数のシグナル伝達経路に欠陥が生じ、ＫＮＯＸ２０、ＳＯＸ１０及びＥＧＲ２のような転写因子が機能不全に陥る。
[00455]ヒトＰＭＰ２２遺伝子の配列は、公的に入手可能なＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ受託番号ＮＭ＿０００３０４に見い出すことができる。代替のＲｅｆＳｅｑ ｍＲＮＡ転写物は、それぞれ、受託番号ＮＭ＿００１２８１４５５、ＮＭ－００１２８１４５６、ＮＭ－１５３３２１、及びＮＭ＿１５３３２２を有する。ヒトＰＭＰ２２遺伝子は、染色体位置１７ｐ１２の１５，２２９，７７７～１５，２６５，３２６に見られる。
[00456]ヒトＰＭＰ２２ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ転写物の配列（配列番号２６４）は、染色体位置１７ｐ１２の残基１５，２２９，７７７～１５，２６５，３２６の逆相補配列に対応する。ＰＭＰ２２ ｍＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００３０４．４）は、配列番号５８に与えられる。ヒトＰＭＰ２２タンパク質の配列は、公的に入手可能なＵｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ０１４５３（カノニカル配列、配列番号６０）に見い出すことができる。潜在的なＰＭＰ２２アイソフォームは、それぞれ、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ａ８ＭＵ７５、Ｊ３ＫＱＷ０、Ａ０Ａ２Ｒ８Ｙ５Ｌ５、Ｊ３ＫＴ３６、及びＪ３ＱＳ０８を有する。本明細書で開示されている受託番号に対応するデータベース実体の公的に入手可能なコンテンツは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
[00457]本開示の抗ＰＭＰ２２ ＡＳＯは、ＰＭＰ２２タンパク質の天然バリアントの発現を低下させるか又は阻害するように設計され得る。
[00458]抗ＰＭＰ２２ ＡＳＯの標的核酸配列の一例は、ＰＭＰ２２ ｐｒｅ－ｍＲＮＡである。配列番号５８は、ヒトＰＭＰ２２ゲノム配列（すなわち、染色体１７ｐ１２のヌクレオチド１５２２９７７７～１５２６５３２６の逆相補配列、相補配列）を表す。配列番号５８は、配列番号５８のヌクレオチド「ｔ」がｐｒｅ－ｍＲＮＡの「ｕ」として示されていることを除いて、ＰＭＰ２２ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列と同一である。
[00459]一部の態様では、抗ＰＭＰ２２ ＡＳＯは、配列番号２６４（ＰＭＰ２２完全ｍＲＮＡ転写物）に示されるヌクレオチド配列に対応するＰＭＰ２２転写物のヌクレオチド１～１８２８内の核酸配列、又は配列番号５９（ＰＭＰ２２コード配列）に示されるヌクレオチド配列に対応するＰＭＰ２２転写物のヌクレオチド２０８～６９０内の核酸配列に相補的である、１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む。
[00460]一部の態様では、連続ヌクレオチド配列は、ＰＭＰ２２転写物内の核酸配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約１００％相補的である。一部の態様では、抗ＰＭＰ２２ ＡＳＯは、ヒト細胞（例えば、シュワン細胞）におけるＰＭＰ２２タンパク質発現を低下させることが可能であるが、ヒト細胞はＰＭＰ２２タンパク質を発現する。
[00461]一部の態様では、ＰＭＰ２２タンパク質発現は、抗ＰＭＰ２２ ＡＳＯに曝露されていないヒト細胞におけるＰＭＰ２２タンパク質発現と比較して、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は約１００％低下する。
[00462]一部の態様では、抗ＰＭＰ２２ ＡＳＯは、ヒト細胞（例えば、免疫細胞）におけるＰＭＰ２２ ｍＲＮＡのレベルを低下させることが可能であるが、ヒト細胞はＰＭＰ２２ ｍＲＮＡを発現する。一部の態様では、ＰＭＰ２２ ｍＲＮＡのレベルは、抗ＰＭＰ２２ ＡＳＯに曝露されていないヒト細胞におけるＰＭＰ２２ ｍＲＮＡのレベルと比較して、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は約１００％低下する。
[00463]ある特定の態様では、標的核酸は、ＰＭＰ２２タンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントのイントロン、及びそれに由来するＲＮＡ核酸、例えばｐｒｅ－ｍＲＮＡを含む。他の態様では、標的核酸は、ＰＭＰ２２タンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントのエクソン領域、及びそれに由来するＲＮＡ核酸、例えばｐｒｅ－ｍＲＮＡを含む。また他の態様では、標的核酸は、ＰＭＰ２２タンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントのエクソン－イントロン接合部、及びそれに由来するＲＮＡ核酸、例えばｐｒｅ－ｍＲＮＡを含む。一部の態様では、例えば、研究又は診断において使用される場合、標的核酸は、上記ＤＮＡ又はＲＮＡ核酸標的に由来するｃＤＮＡ又は合成オリゴヌクレオチドであり得る。ヒトＰＭＰ２２をコードする配列（ＣＤＳ）は配列番号５９に示されており、ＰＭＰ２２ ｐｒｅ－ｍＲＮＡのコード配列によってコードされるタンパク質配列は配列番号６０に示されている。他の態様では、標的核酸は、ＰＭＰ２２タンパク質をコードする核酸又はその天然に存在するバリアントの非翻訳領域、例えば、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、又はその両方を含む。
[00464]一部の態様では、本開示の抗ＰＭＰ２２ ＡＳＯは、ＰＭＰ２２転写物、例えば配列番号５８のイントロン内の領域にハイブリダイズする。ある特定の態様では、本開示のＡＳＯは、ＰＭＰ２２転写物のエクソン内の領域、例えば配列番号５８にハイブリダイズする。他の態様では、本開示の抗ＰＭＰ２２ ＡＳＯは、ＰＭＰ２２転写物のエクソン－イントロン接合部内の領域、例えば配列番号５８にハイブリダイズする。
[00465]一部の態様では、本明細書に記載の任意の抗ＰＭＰ２２ ＡＳＯは、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）、すなわち、本明細書で開示されている最適化リンカーを含む構築物、例えば、生物学的に活性な部分［ＢＡＭ］が本明細書に記載の抗ＰＭＰ２２ ＡＳＯ又はその組合せである式１の構築物を含むＥＶ（例えば、エクソソーム）の一部であり得る。
細胞外ベシクル（ＥＶ）、例えばエクソソーム
[00466]本明細書で開示されている最適化リンカーを含む構築物、例えば式１の構築物は、構築物を細胞外ベシクル（ＥＶ）、例えばエクソソームに結合させる少なくとも１つのアンカー部分［ＡＭ］を含み得る。本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）は、約２０～約３００ｎｍの間の直径を有し得る。ある特定の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）は、約２０～約２９０ｎｍ、約２０～約２８０ｎｍ、約２０～約２７０ｎｍ、約２０～約２６０ｎｍ、約２０～約２５０ｎｍ、約２０～約２４０ｎｍ、約２０～約２３０ｎｍ、約２０～約２２０ｎｍ、約２０～約２１０ｎｍ、約２０～約２００ｎｍ、約２０～約１９０ｎｍ、約２０～約１８０ｎｍ、約２０～約１７０ｎｍ、約２０～約１６０ｎｍ、約２０～約１５０ｎｍ、約２０～約１４０ｎｍ、約２０～約１３０ｎｍ、約２０～約１２０ｎｍ、約２０～約１１０ｎｍ、約２０～約１００ｎｍ、約２０～約９０ｎｍ、約２０～約８０ｎｍ、約２０～約７０ｎｍ、約２０～約６０ｎｍ、約２０～約５０ｎｍ、約２０～約４０ｎｍ、又は約２０～約３０ｎｍの間の直径を有する。本明細書に記載のＥＶ（例えば、エクソソーム）のサイズは、当技術分野で公知の方法によって測定することができる。
[00467]本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）は、内部表面（内腔表面）及び外部表面を含む二重脂質膜（「エクソソーム膜」又は「ＥＶ膜」）を含む。内部表面は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の内核、すなわちＥＶの内腔に面する。
[00468]ＥＶ又はエクソソーム膜は、脂質及び脂肪酸を含む。例示的な脂質は、リン脂質、糖脂質、脂肪酸、スフィンゴ脂質、ホスホグリセリド、ステロール、コレステロール、及びホスファチジルセリンを含む。ＥＶ膜又はエクソソーム膜は、内層及び外層を含む。内層及び外層の組成は、当技術分野で公知の二重層間分配アッセイによって決定することができ、例えば、Ｋｕｙｐｅｒｓら、Ｂｉｏｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １９８５ ８１９：１７０頁を参照されたい。
[00469]一部の態様では、外層の組成は、約７０％～約９０％の間のコリンリン脂質、約０％～約１５％の間の酸性リン脂質、及び約５％～約３０％の間のホスファチジルエタノールアミンである。一部の態様では、内層の組成は、約１５％～約４０％の間のコリンリン脂質、約１０％～約５０％の間の酸性リン脂質、及び約３０％～約６０％の間のホスファチジルエタノールアミンである。一部の態様では、ＥＶ又はエクソソーム膜は、グリカンなどの１つ又は複数の多糖類を含む。ＥＶ又はエクソソームの表面のグリカンは、マレイミド部分又はグリカンとマレイミド部分を接続するリンカーへの付着物として機能し得る。グリカンは、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の表面の１つ又は複数のタンパク質、例えば、ＰＴＧＦＲＮポリペプチドなどのＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘ、又はＥＶ（例えば、エクソソーム）の脂質膜上に存在し得る。グリカンは、マレイミド部分をグリカンに結合させるための官能基として機能し得るチオフコースを有するように修飾され得る。一部の態様では、ＥＶ（例えば、エクソソーム）にさらに結合できるように、グリカンを多く発現するようにＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘを修飾することができる。
作製方法
[00470]本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）は、化学合成、組換えＤＮＡ技術、より大きな分子の生化学的又は酵素的断片化、前述の組合せ、又は任意の他の方法によって生成することができる。一態様では、本開示は、本明細書で開示されている最適化連結を介して、例えば固相合成又はコンジュゲーションによって、生物学的に活性な分子をＥＶ（例えば、エクソソーム）に結合させる方法を提供する。
[00471]エクソソーム産生：一部の態様では、本明細書で開示されているＥＶ（例えば、エクソソーム）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させた細胞又は対象の体液から産生することができる。エクソソームがｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養から産生される場合、様々な産生細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、及びＭＳＣを使用することができる。ある特定の態様では、産生細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。一部の態様では、産生細胞は、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、マスト細胞、好中球、Ｋｕｐｆｆｅｒ－Ｂｒｏｗｉｃｚ細胞、これらの細胞のいずれかに由来する細胞、又はこれらのいずれかの組合せではない。
[00472]ヒト胚性腎臓２９３細胞は、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ－２９３、２９３細胞とも呼ばれることが多く、より正確性は低いがＨＥＫ細胞とも呼ばれ、元々、組織培養で増殖させたヒト胚性腎臓細胞に由来する特定の細胞株である。
[00473]ＨＥＫ２９３細胞は、１９７３年に、オランダ、ライデンのＡｌｅｘ ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂの研究室において、正常なヒト胚性腎臓細胞の培養物の、剪断したアデノウイルス５ＤＮＡによるトランスフェクションによって作成された。細胞は培養され、アデノウイルスによってトランスフェクトされた。その後の解析により、形質転換がウイルスゲノムの左腕から約４．５キロ塩基を挿入することによってもたらされ、ヒト第１９染色体に組み込まれたことが示された。
[00474]ＨＥＫ２９３及び５つの誘導体細胞株のゲノム及びトランスクリプトームを包括的に研究し、ＨＥＫ２９３のトランスクリプトームをヒトの腎臓、副腎、下垂体、及び中枢神経組織のものと比較した。ＨＥＫ２９３のパターンは、多くの神経特性を有する副腎細胞のパターンに最もよく似ていた。ＨＥＫ２９３細胞は、複雑な核型を有し、各染色体に２つ以上のコピーを示し、モーダル染色体数は６４本である。ＨＥＫ２９３細胞は、低三倍体として説明され、一倍体ヒト配偶子の３倍未満の染色体数を含有する。染色体異常には、Ｘ染色体の３コピーと、第１７染色体及び第２２染色体の４コピーとの合計が含まれる。ＥＶを産生するのに有用なＨＥＫ２９３細胞のバリアントとしては、以下に限定されないが、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＨＥＫ２９３ＦＴ、及びＨＥＫ２９３Ｔが挙げられる。
[00475]固相合成：当技術分野で公知の固相合成は、本出願に開示されている構築物を生成するために追加的又は代替的に採用され得る。一部の態様では、本明細書に開示されている最適化リンカーの２つ以上の構成成分は、固相合成を使用して互いに結合（例えば、鎖状に連結）され得る。例えば、ＡＳＯが合成され、異なるスペーサー又はその組合せが、従来の合成ステップによってＡＳＯに添加され得る。例示的なホスホラミダイトスペーサー（例えば、Ｃ３－ホスホラミダイト、ＴＥＧ－ホスホラミダイト、及びＨＥＧ－ホスホラミダイト）は、図４に示されている。一部の態様では、スペーサー又はスペーサーの組合せは、オクチル－トコフェロールホスホラミダイト、トコフェロールホスホラミダイト、パルミチン酸－Ｃ６ホスホラミダイト、コレステロール－ＴＥＧホスホラミダイト又はコレステロール－Ｃ６ホスホラミダイトなどの固相合成によって、本開示の最適化リンカーを生成するために使用され得るホスホラミダイトを示す図３に例示されるように、膜アンカー部分を組み込むために合成によってさらに拡張され得る。自動合成技法を含む好適な固相技法は、例えば、Ｆ． Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（編）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）及びＴｏｙ，Ｐ．Ｈ．；Ｌａｍ，Ｙ（編）、Ｓｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ Ｏｒｇａｎｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（２０１２）に記載されている。
[00476]コンジュゲーション：一部の態様では、本明細書に開示されている最適化リンカーの２つ以上の構成成分は、コンジュゲーションを使用して互いに結合（例えば、鎖状に連結）され得る。アミン反応性化合物以外に、スルフヒドリル（－ＳＨ）と結合を形成する化学基を有する化合物は、タンパク質及び他のバイオコンジュゲート技法において最も一般的な架橋剤及び修飾試薬である。スルフヒドリルはチオールとも呼ばれ、タンパク質中のシステイン（Ｃｙｓ、Ｃ）アミノ酸の側鎖に存在する。システインスルフヒドリル基の対は、タンパク質のネイティブな三次構造又は四次構造の基礎として、ポリペプチド鎖内又は鎖間でジスルフィド結合（－Ｓ－Ｓ－）によって連結されることが多い。典型的には、チオール反応性化合物との反応に利用できるのは、遊離又は還元スルフヒドリル基（－ＳＨ）［ジスルフィド結合中の硫黄原子ではなく］だけである。
[00477]スルフヒドリル基は、タンパク質のコンジュゲーション及び標識に有用な標的である。第１に、スルフヒドリルは、ほとんどのタンパク質に存在するが、第一級アミンほど数が多くないため、スルフヒドリル基を介した架橋はより選択的且つ正確である。第２に、タンパク質中のスルフヒドリル基は、ジスルフィド結合に関与することが多いため、これらの部位での架橋は、典型的には、タンパク質の基本構造を大きく修正することも、結合部位をブロックすることもない。第３に、利用可能な（すなわち、遊離の）スルフヒドリル基の数は容易に制御又は修正することができ、スルフヒドリル基は、ネイティブなジスルフィド結合の還元によって生成され得るか、又は２－イミノチオラン（Ｔｒａｕｔ試薬）、ＳＡＴＡ、ＳＡＴＰ、又はＳＡＴ（ＰＥＧ）などのスルフヒドリル付加試薬を使用して、第一級アミンとの反応により分子中に導入され得る。最後に、スルフヒドリル反応性基をアミン反応性基と組み合わせてヘテロ二官能性架橋剤を作製すると、架橋手順の柔軟性及び制御性が高まる。例えば、マレイミド基とＮＨＳエステルとを含有する３－マレイミドプロピオン酸ＮＨＳエステルを使用して、ＮＨＳエステルは、タンパク質、アミン修飾オリゴヌクレオチド、及び他のアミン含有分子の第一級アミン（－ＮＨ２）を標識するのに使用することができる。マレイミド基は、チオール基と反応して共有結合を形成し、生体分子のチオールとの接続を可能にする。
[00478]マレイミド基は、反応混合物のｐＨが６．５～７．５の間である場合に、スルフヒドリル基と特異的に反応して、その結果、可逆的ではない（すなわち、結合を還元剤で切断することができない）安定なチオエーテル連結が形成される。よりアルカリ性の条件（ｐＨが８．５より大きい）では、反応は第一級アミンに有利であり、マレイミド基が加水分解して非反応性のマレアミック酸になる速度も速くなる。マレイミドは、チロシン、ヒスチジン又はメチオニンと反応しない。
[00479]ジチオトレイトール（ＤＴＴ）及びベータ－メルカプトエタノール（ＢＭＥ）などのチオール含有化合物は、カップリング部位に対して競合するため、マレイミドと使用する反応緩衝剤から除外されなければならない。例えば、ＤＴＴをタンパク質のジスルフィドを還元してスルフヒドリル基をコンジュゲーションに利用できるようにするために使用する場合、マレイミド反応を開始する前に、脱塩カラムを使用して、ＤＴＴを徹底的に除去しなければならない。興味深いことに、ジスルフィド還元剤であるＴＣＥＰは、チオールを含有せず、マレイミド試薬に関与する反応の前に除去する必要がない。
[00480]過剰なマレイミドは、遊離チオールを添加することによって、反応の最後にクエンチされ得る。ＥＤＴＡは、それ以外ではスルフヒドリル（非反応性）の酸化を促進する、漂遊した二価金属をキレートするために、カップリング緩衝剤に含まれ得る。
[00481]一態様では、連結は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を還元剤で処理することを含む。好適な還元剤としては、例えば、ＴＣＥＰ（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン）、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）、ＢＭＥ（２－メルカプトエタノール）、チオール化剤、及びこれらの任意の組合せが挙げられる。チオール化剤は、例えば、Ｔｒａｕｔ試薬（２－イミノチオラン）を含み得る。
[00482]還元剤で処理した後、連結反応は、還元ＥＶ（例えば、エクソソーム）をマレイミド部分と接触させることをさらに含む。一態様では、マレイミド部分は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）への連結前に、生物学的に活性な分子に連結される。一部の態様では、マレイミド部分は、マレイミド部分を生物学的に活性な分子に接続させるためのリンカーにさらに結合される。したがって、一部の態様では、１つ又は複数のリンカー又はスペーサーは、マレイミド部分と生物学的に活性な分子との間に介在する。
[00483]本明細書で開示されているアンカー部分［ＡＭ］、スペーサー［ＳＰ］若しくはスペーサーの組合せ、又は生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］のいずれかは、反応性部分、例えば、アミノ反応性部分（例えば、ＮＨＳ－エステル、ｐ－ニトロフェノール、イソチオシアネート、イソシアネート、又はアルデヒド）、チオール反応性部位（例えば、アクリレート、マレイミド、又はピリジルジスルフィド）、ヒドロキシ反応性部位（例えば、イソチオシアネート又はイソシアネート）、カルボン酸反応性部位（例えば、エポキシド）、又はアジド反応性部位（例えば、アルキン）にコンジュゲートされ得る。
[00484]化学的コンジュゲーションを介して、本明細書に開示されている２つの構成成分（例えば、アンカー部分［ＡＭ］とスペーサー［ＳＰ］、２つのスペーサー［ＳＰ］、スペーサー［ＳＰ］と生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］、又はアンカリング部分［ＡＭ］と生物学的に活性な部分［ＢＡＭ］）を共有結合させるために使用され得る例示的な反応性部分としては、例えば、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート、Ｎ－４－マレイミド酪酸、Ｓ－（２－ピリジルジチオ）システアミン、ヨードアセトキシスクシンイミド、Ｎ－（４－マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド、Ｎ－［５－（３’－マレイミドプロピルアミド）－１－カルボキシペンチル］イミノ二酢酸、Ｎ－（５－アミノペンチル）イミノ二酢酸、及び１’－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホラミダイト）が挙げられる。二官能性リンカー（２つの官能基を含有するリンカー）も使用可能である。
[00485]一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］、スペーサー［ＳＰ］、又は生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］は、末端オキシアミノ基、例えば、－ＯＮＨ２、ヒドラジノ基、－ＮＨＮＨ２、メルカプト基（すなわち、ＳＨ又はチオール）、又はオレフィン（例えば、ＣＨ＝ＣＨ２）を含み得る。一部の態様では、アンカー部分［ＡＭ］、スペーサー［ＳＰ］、又は生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］は、親電子性部分、例えば末端位置に、例えばアルデヒド、ハロゲン化アルキル、メシレート、トシレート、ノシレート、又はブロシレート、又は活性化カルボン酸エステル、例えばＮＨＳエステル、ホスホラミダイト、又はペンタフルオロフェニルエステルを含み得る。一部の態様では、共有結合は、リガンドの求核基、例えば、ヒドロキシル基、チオール基又はアミノ基を求電子基とカップリングさせることによって形成され得る。本発明は、当技術分野で公知のものを含むがこれらに限定されないあらゆる様式の反応性基及び反応性部分に適している。
[00486]用語「保護基」は、本明細書で使用される場合、ヒドロキシ基、アミノ基及びチオール基を含むがこれらに限定されない反応性基を、合成手順の間の望ましくない反応に対して保護するために当技術分野で公知の不安定な化学部分を指す。保護基は、典型的には、他の反応部位での反応中に部位を保護するために選択的及び／又は直交的に使用され、次いで、保護されていない基をそのまま残すか、又はさらなる反応に利用できるように取り除くことができる。当技術分野で公知の保護基は、Ｇｒｅｅｎｅ及びＷｕｔｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第３版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９）に一般的に記載されている。
[00487]さらに、種々の合成ステップは、所望の化合物を与えるために、別の順番又は順序で実施されてもよい。本明細書に記載の化合物を合成するのに有用な合成化学変換及び保護基方法論（保護及び脱保護）は、当技術分野で公知であり、例えば、Ｒ． Ｌａｒｏｃｋ、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ、ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８９）；Ｔ． Ｗ． Ｇｒｅｅｎｅ及びＰ． Ｇ． Ｍ． Ｗｕｔｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９１）；Ｌ． Ｆｉｅｓｅｒ及びＭ． Ｆｉｅｓｅｒ、Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９４）；並びにＬ． Ｐａｑｕｅｔｔｅ編 Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９５）、並びにそれ以降の版に記載されたようなものを含む。
[00488]アミン反応性部分：一部の態様では、反応性部分は、アミン反応性部分である。本明細書で使用される場合、用語「アミン反応性部分」は、アミノ部分を有する反応性基、例えば第一級アミンと反応し得る化学基を指す。例示的なアミン反応性部分は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ－エステル）、ｐ－ニトロフェノール、イソチオシアネート、イソシアネート、及びアルデヒドである。第一級アミンと反応する代替の反応性部位も当技術分野で周知である。一部の態様では、アミン反応性部位は、本開示のアンカー部分［ＡＭ］、スペーサー［ＳＰ］、又は生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］の末端位置に結合され得る。一部の態様では、アミン反応性部分は、ＮＨＳ－エステルである。典型的には、ＮＨＳ－エステル反応性部分は、反応性基の第一級アミンと反応して、安定なアミド結合及びＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）をもたらす。一部の態様では、アミン反応性部分は、ｐ－ニトロフェノール基である。典型的には、ｐ－ニトロフェノール反応性部分は、反応性基の第一級アミンと反応して、安定なカルバメート部分及びｐ－ニトロフェノールを生じる活性化カルバメートである。一部の態様では、アミン反応性部分は、イソチオシアネートである。典型的には、イソチオシアネートは反応性基の第一級アミンと反応して、安定なチオ尿素部分をもたらす。一部の態様では、アミン反応性部分は、イソシアネートである。典型的には、イソシアネートは反応性基の第一級アミンと反応して、安定な尿素部分をもたらす。一部の態様では、反応性部位のアミンは、アルデヒドである。典型的には、アルデヒドは第一級アミンと反応してシッフ塩基を形成し、このシッフ塩基は還元的アミノ化によってさらに還元されて共有結合を形成し得る。
[00489]チオール反応性部分：一部の態様では、反応性部分は、チオール反応性部分である。本明細書で使用される場合、用語「チオール反応性部分」は、チオール部分（又はメルカプト基）を有する反応性基と反応し得る化学基を指す。例示的なチオール反応性部位は、アクリレート、マレイミド、及びピリジルジスルフィドである。チオールと反応する代替の反応性部位も当技術分野で周知である。一部の態様では、チオール反応性部位は、本開示のアンカー部分［ＡＭ］、スペーサー［ＳＰ］、又は生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］の末端位置に結合され得る。一部の態様では、チオール反応性部分は、アクリレートである。典型的には、アクリレートは、アクリレートのカルボニルに対する炭素βでチオールと反応して、安定なスルフィド結合を形成する。一部の態様では、チオール反応性部分は、マレイミドである。典型的には、マレイミドは、炭素β又はカルボニルのいずれかでチオールと反応して、安定なスルフィド結合を形成する。一部の態様では、チオール反応性部分は、ピリジルジスルフィドである。典型的には、ピリジルジスルフィドは、ピリジルに対する硫黄原子βでチオールと反応して、安定なジスルフィド結合及びピリジン－２－チオンを形成する。
[00490]ヒドロキシ反応性部分：一部の態様では、反応性部分は、ヒドロキシ反応性部分である。本明細書で使用される場合、用語「ヒドロキシ反応性部分」は、ヒドロキシ部分を有する反応性基と反応し得る化学基を指す。例示的なヒドロキシ反応性部分は、イソチオシアネート及びイソシアネートである。ヒドロキシ部分と反応する代替の反応性部分も当技術分野で周知である。一部の態様では、ヒドロキシ反応性部分は、本開示のアンカー部分［ＡＭ］、スペーサー［ＳＰ］、又は生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］の末端位置に結合され得る。一部の態様では、ヒドロキシ反応性部分は、イソチオシアネートである。典型的には、イソシアネートは反応性基のヒドロキシと反応して、安定なカルバモチオエート部分をもたらす。一部の態様では、反応性部位は、イソシアネートである。典型的には、イソシアネートは反応性基のヒドロキシルと反応して、安定なカルバメート部分をもたらす。
[00491]カルボン酸反応性部分：一部の態様では、反応性部分は、カルボン酸反応性部分である。本明細書で使用される場合、用語「カルボン酸反応性部分」は、カルボン酸部分を有する反応性基と反応し得る化学基を指す。例示的なカルボン酸反応性部分は、エポキシドである。カルボン酸部分と反応する代替の反応性部分も当技術分野で周知である。一部の態様では、カルボン酸反応性部分は、本開示のアンカー部分［ＡＭ］、スペーサー［ＳＰ］、又は生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］の末端位置に結合され得る。一部の態様では、カルボン酸反応性部分は、エポキシドである。典型的には、エポキシドは、エポキシドの炭素原子のいずれかで反応性基のカルボン酸と反応して、酢酸２－ヒドロキシエチル部分を形成する。
[00492]アジド反応性部分：一部の態様では、反応性部分は、アジド反応性部分である。本明細書で使用される場合、用語「アジド反応性部分」は、アジド部分を有する反応性基と反応し得る化学基を指す。例示的なアジド反応性部分は、アルキンである。アジド部分と反応する代替の反応性部分も当技術分野で周知である。一部の態様では、カルボン酸反応性部分は、本開示のアンカー部分［ＡＭ］、スペーサー［ＳＰ］、又は生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］の末端位置に結合され得る。一部の態様では、アジド反応性部分は、アルキンである。典型的には、アルキンは、「クリック化学」とも称される１，３－双極性環化付加反応により反応性基のアジドと反応して、１，２，３－トリアゾール部分を形成する。
治療的使用
[00493]本開示は、それを必要とする対象における疾患又は状態を処置する方法であって、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）、すなわち、本明細書で開示されている最適化リンカー含むＥＶを含む組成物を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。本開示は、それを必要とする対象における疾患又は状態の症状を防止又は軽快する方法であって、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）を含む組成物を対象に投与するステップを含む、方法も提供する。本開示は、それを必要とする対象における疾患又は状態を診断する方法であって、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）、すなわち、本明細書で開示されている最適化リンカーを含むＥＶを含む組成物を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。
[00494]一態様では、疾患又は障害は、がん、炎症性疾患、神経変性障害、中枢神経疾患又は代謝性疾患である。
[00495]本開示は、それを必要とする対象における疾患又は障害を防止及び／又は処置する方法であって、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）、すなわち、本明細書で開示されている最適化リンカーを含むＥＶを対象に投与するステップを含む、方法も提供する。一部の態様では、本方法で処置され得る疾患又は障害は、がん、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、自己免疫疾患、感染性疾患、又は線維性疾患を含む。一部の態様では、処置は予防的である。他の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）、すなわち、本明細書で開示されている最適化リンカーを含むＥＶを使用して、免疫応答を誘導する。他の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）、すなわち、本明細書で開示されている最適化リンカーを含むＥＶを使用して、対象にワクチン接種する。
[00496]一部の態様では、疾患又は障害は、がんである。がんを有する対象に投与される場合、ある特定の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）、すなわち、本明細書で開示されている最適化リンカーを含むＥＶは、免疫応答を上方調節し、対象の免疫系の腫瘍標的化を増強することができる。一部の態様では、処置されるがんは、腫瘍微小環境への白血球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球）の浸潤、又はいわゆる「ホット腫瘍」若しくは「炎症性腫瘍」によって特徴付けられる。一部の態様では、処置されるがんは、腫瘍微小環境への白血球浸潤のレベルが低いか又は検出されないこと、いわゆる「コールド腫瘍」又は「非炎症性腫瘍」によって特徴付けられる。一部の態様では、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、「コールド腫瘍」を「ホット腫瘍」に変換するのに十分な量及び時間で投与される。すなわち、前記投与は、腫瘍微小環境への白血球（Ｔ細胞など）の浸潤をもたらす。ある特定の態様では、がんは、膀胱がん、子宮頸がん、腎細胞がん、精巣がん、結腸直腸がん、肺がん、頭頸部がん、及び卵巣がん、リンパ腫、肝臓がん、膠芽腫、黒色腫、骨髄腫、白血病、膵臓がん、又はこれらの組合せを含む。他の態様では、「遠位腫瘍」又は「遠隔腫瘍」という用語は、元の（又は原発の）腫瘍から遠隔器官又は遠隔組織、例えばリンパ節に広がった腫瘍を指す。一部の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）、すなわち、本明細書で開示されている最適化リンカーを含むＥＶは、転移拡散後の腫瘍を処置することができる。
[00497]一部の態様では、疾患又は障害は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）である。一部の態様では、本開示で処置され得る疾患又は障害は、自己免疫疾患である。自己免疫疾患の非限定的な例としては：多発性硬化症、末梢神経炎、シェーグレン症候群、関節リウマチ、脱毛症、自己免疫性膵炎、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、セリアック病、デービック病（視神経脊髄炎）、糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、各種血管炎、強皮症、糖尿病、動脈炎、白斑、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群、乾癬、ブドウ膜炎、全身性エリテマトーデス、及びこれらの組合せが挙げられる。
[00498]一部の態様では、疾患又は障害は、感染性疾患である。ある特定の態様では、疾患又は障害は、腫瘍ウイルスである。一部の態様では、本開示で処置され得る感染性疾患としては、以下に限定されないが、ヒトガンマヘルペスウイルス４（エプスタインバーウイルス）、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、サイトメガロウイルス、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、クラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、コロナウイルス（例えば、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ ＣｏＶ）、フィロウイルス（例えば、マールブルグ及びエボラ）、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、プラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉａ）種（例えば、ビバックス（ｖｉｖａｘ）及びファルシパルム（ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ））、チクンガウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヒトヘルペスウイルス８、単純ヘルペスウイルス２（ＨＳＶ２）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）種、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）種、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）種、アクチノバクター属（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒ）種、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＣｏＮＳ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）種、又はこれらの組合せが挙げられる。
[00499]一部の態様では、本方法で処置され得る疾患又は障害は、ポンペ病、ゴーシェ病、ライソゾーム貯蔵障害、ムコビシドーシス、嚢胞性線維症、デュシェンヌ型及びベッカー型筋ジストロフィー、トランスサイレチンアミロイドーシス、血友病Ａ、血友病Ｂ、アデノシン－デアミナーゼ欠損症、レーバー先天性黒内障、Ｘ連鎖性副腎白質ジストロフィー、メタクロマチック白質ジストロフィー、ＯＴＣ欠損症、糖原病１Ａ、Ｃｒｉｇｇｌｅｒ－Ｎａｊａｒ症候群、原発性高シュウ酸尿症１型、急性間欠性ポルフィリン症、フェニルケトン尿症、家族性高コレステロール血症、ムコ多糖症ＶＩ型、１型抗トリプシン欠乏症、レット症候群、ドラベ症候群、アンジェルマン症候群、ＤＭ１病、脆弱Ｘ病、ハンチントン病、フリードライヒ失調症、ＣＭＴ病（シャルコーマリートゥース病としても公知、遺伝性運動感覚性ニューロパチー（ＨＭＳＮ）、又は腓骨筋萎縮症としても公知）、ＣＭＴ１Ｘ疾患、カテコールアミン作動性多形性心室頻拍症、脊髄小脳失調症３型（ＳＣＡ３）疾患、肢帯型筋ジストロフィー、又は高コレステロール血症を含む。一部の態様では、処置は予防的である。
[00500]一部の態様では、疾患又は障害は、神経変性疾患である。一部の態様では、神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン病、運動ニューロン病、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、脊髄性筋萎縮症、及びこれらの任意の組合せから選択される。
[00501]ある特定の態様では、疾患又は障害は、筋ジストロフィーを含む。一部の態様では、筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、筋強直性ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）、先天性筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ２Ｂ、ＬＧＭＤ２Ｄ、ＬＧＮＭＤ２Ｌ、ＬＧＭＤ２Ｃ、ＬＧＭＤ２Ｅ及びＬＧＭＤ２Ａを含むが、これらに限定されない）、及びこれらの任意の組合せから選択される。
[00502]一部の態様では、疾患又は障害は、ＡＡＤＣ欠損症（ＣＮＳ）、ＡＤＡ－ＳＣＩＤ、アルファ－１抗トリプシン欠乏症、β－サラセミア（重症鎌状赤血球）、がん（頭頸部扁平細胞）、ニーマンピックＣ型疾患、脳性ＡＬＤ、脈絡膜血症、うっ血性心不全、嚢胞性線維症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ファブリー病、緑内障、神経膠腫（がん）、血友病Ａ、血友病Ｂ、ＨｏＦＨ（高コレステロール血症）、ハンチントン病、リポタンパク質リパーゼ欠損症、レーバー遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）、メタクロマチック白質ジストロフィー、ＭＰＳ Ｉ（ハーラー症候群）、ＭＰＳ ＩＩ（ハンター症候群）、ＭＰＳ ＩＩＩ（サンフィリッポ症候群）、パーキンソン病、ポンペ病、劣性ジストロフィー性表皮水疱症、ＲＰＥ６５欠損症（視力低下）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ Ｉ）、湿性ＡＭＤ（網膜疾患）、ウィスコットアルドリッチ症候群（ＷＡＳ）、ムコ多糖症ＩＩＩＡ型（ＭＰＳ ＩＩＩＡ）、Ｘ連鎖性筋管ミオパチー、Ｘ連鎖性網膜色素変性症、及びこれらの任意の組合せから選択される。
[00503]一部の態様では、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、対象の循環系に静脈内投与される。一部の態様では、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、好適な液体に注入され、対象の静脈に投与される。一部の態様では、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、対象の循環系に動脈内投与される。一部の態様では、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、好適な液体に注入され、対象の動脈に投与される。一部の態様では、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、髄腔内投与によって対象に投与される。一部の態様では、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、脳脊髄液（ＣＳＦ）に到達するように、脊柱管内、又はくも膜下腔内に注射を介して投与される。一部の態様では、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、対象の１つ又は複数の腫瘍に腫瘍内投与される。一部の態様では、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、鼻腔内投与によって対象に投与される。一部の態様では、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、局所投与又は全身投与のいずれかの形態で鼻から気腹させることができる。ある特定の態様では、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、鼻腔スプレーとして投与される。一部の態様では、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、腹腔内投与により対象に投与される。一部の態様では、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、好適な液体に注入され、対象の腹膜内に注入される。一部の態様では、腹腔内投与は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）のリンパ管への分布をもたらす。一部の態様では、腹腔内投与は、胸腺、脾臓、及び／又は骨髄へのＥＶ（例えば、エクソソーム）の分布をもたらす。一部の態様では、腹腔内投与は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の１つ又は複数のリンパ節への分布をもたらす。一部の態様では、腹腔内投与は、頸部リンパ節、鼠径リンパ節、縦隔リンパ節、又は胸骨リンパ節のうちの１つ又は複数へのＥＶ（例えば、エクソソーム）の分布をもたらす。一部の態様では、腹腔内投与は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の膵臓への分布をもたらす。一部の態様では、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、眼周囲投与により対象に投与される。一部の態様では、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、眼周囲組織に注射される。眼周囲への薬物投与には、結膜下投与、前テノン嚢下投与、後テノン嚢下投与、及び眼球後投与の経路が含まれる。
医薬組成物及び投与方法
[00504]本開示は、対象に投与するのに好適な本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）、すなわち、本明細書で開示されている最適化リンカーを含むＥＶを含む医薬組成物も提供する。医薬組成物は、一般に、本明細書で開示されている最適化リンカーを介して、複数のＥＶ（例えば、エクソソーム）に共有結合により連結された生物学的に活性な分子を含む複数のＥＶ（例えば、エクソソーム）、及び対象への投与に好適な形態の薬学的に許容できる賦形剤又は担体を含む。薬学的に許容できる賦形剤又は担体は、投与される特定の組成物、及び組成物を投与するために使用される特定の方法によって部分的に決定される。したがって、複数のＥＶ（例えば、エクソソーム）を含む医薬組成物の多種多様な好適な製剤が存在する。（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ． 第１８版（１９９０）を参照されたい）。医薬組成物は、一般に、無菌で、且つ米国食品医薬品局のすべての適正製造基準（ＧＭＰ）規制を完全に遵守して製剤化される。一部の態様では、医薬組成物は、例えば、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）、すなわち、本明細書で開示されている最適化リンカーを含むＥＶに共有結合により連結した小分子などの１つ又は複数の化学化合物を含む。
[00505]一部の態様では、医薬組成物は、１つ又は複数の治療剤及び本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）、すなわち、本明細書で開示されている最適化リンカーを含むＥＶを含む。ある特定の態様では、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、薬学的に許容できる担体中で、１つ又は複数の追加の治療剤と同時に投与される。一部の態様では、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を含む医薬組成物は、追加の治療剤の投与前に投与される。他の態様では、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を含む医薬組成物は、追加の治療剤の投与後に投与される。さらなる態様では、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を含む医薬組成物は、追加の治療剤と同時に投与される。
[00506]本開示は、対象に投与するのに好適な形態で、所望の純度を有する、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）、すなわち、本明細書で開示されている最適化リンカーを含むＥＶ、及び薬学的に許容できる担体又は賦形剤を含む医薬組成物を提供する。薬学的に許容できる賦形剤又は担体は、投与される特定の組成物、及び組成物を投与するために使用される特定の方法によって部分的に決定され得る。したがって、複数の細胞外ベシクルを含む医薬組成物の多種多様な好適な製剤が存在する。（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ． 第２１版（２００５）を参照されたい）。医薬組成物は、一般に、無菌で、且つ米国食品医薬品局のすべての適正製造基準（ＧＭＰ）規制を完全に遵守して製剤化される。
[00507]一部の態様では、医薬組成物は、１つ又は複数の治療剤及び本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）、すなわち、本明細書で開示されている最適化リンカーを含むＥＶを含む。ある特定の態様では、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、薬学的に許容できる担体中で、１つ又は複数の追加の治療剤と同時に投与される。一部の態様では、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を含む医薬組成物は、追加の治療剤の投与前に投与される。他の態様では、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を含む医薬組成物は、追加の治療剤の投与後に投与される。さらなる態様では、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を含む医薬組成物は、追加の治療剤と同時に投与される。
[00508]許容できる担体、賦形剤、又は安定剤は、用いられる投薬量及び濃度でレシピエント（例えば、動物又はヒト）に対して無毒であり、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール；メチル若しくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基より少ない）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリシンなどのアミノ酸；単糖、二糖、及びグルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース若しくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩を形成する対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；並びに／又はトゥイーン（ＴＷＥＥＮ）（商標）、プルロニクス（ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ）（商標）若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
[00509]担体又は希釈剤の例には、以下に限定されないが、水、食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンが含まれる。医薬活性物質に対するこのような媒体及び化合物の使用は当技術分野で周知である。いずれかの従来の培地又は化合物が本明細書に記載の細胞外ベシクルと不適合である場合を除き、組成物におけるその使用が企図される。補足的な治療剤もまた、組成物に組み込むことができる。典型的には、医薬組成物は、その意図する投与経路に適合するように製剤化される。本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）、すなわち、本明細書で開示されている最適化リンカーを含むＥＶは、非経口、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、皮内、経皮、直腸、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内、腫瘍内、髄腔内、眼内、筋肉内経路又は吸入剤として投与することができる。ある特定の態様では、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を含む医薬組成物は、静脈内、例えば注射により投与される。ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）が意図される疾患、障害又は状態を処置する際に少なくとも部分的に有効な他の治療剤と組み合わせて任意選択的に投与され得る。
[00510]溶液又は懸濁物には、以下の構成成分：無菌希釈剤、例えば、水、食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒；抗細菌化合物、例えば、ベンジルアルコール又はメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム；キレート化合物、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；緩衝剤、例えば、酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩；及び張性の調整のための化合物、例えば、塩化ナトリウム又はデキストロースが含まれ得る。ｐＨは、酸又は塩基、例えば、塩酸又は水酸化ナトリウムで調整され得る。調製物は、ガラス製又はプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器又は多回投与バイアルに封入することができる。
[00511]注射可能な使用に好適な医薬組成物には、無菌水溶液（水溶性の場合）又は分散液及び無菌粉末が含まれる。静脈内投与では、好適な担体には、生理的食塩水、静菌性水、クレモホールＥＬ（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ）（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。組成物は、一般に無菌であり、容易にシリンジできる程度に流動性がある。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの好適な混合物を含有する溶媒又は分散媒などであり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング、例えばレシチンの使用によって、分散液の場合には要求される粒子サイズの維持によって、及び界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌化合物及び抗真菌化合物、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成され得る。所望により、等張化合物、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、及び塩化ナトリウムが組成物に添加され得る。注射用組成物の延長された吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる化合物、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含めることによってもたらされ得る。
[00512]本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）、すなわち、本明細書で開示されている最適化リンカーを含むＥＶを、有効量で、適切な溶媒中に、所望の場合本明細書に列挙される成分の１つ又は組合せと共に、組み込むことにより、無菌注射用溶液を調製することができる。一般に、分散液は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を、塩基性分散媒体及び所望の他の成分を含有する無菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。無菌の注射可能な溶液の調製のための無菌粉末の場合、調製の方法は、その予め無菌濾過した溶液から、活性成分プラス任意のさらなる所望の成分の粉末を生じる、真空乾燥及び凍結乾燥である。ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の持続的又は拍動的放出を可能にするような様式で製剤化することができるデポー注射剤又は埋込み製剤の形態で投与することができる。
[00513]本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）、すなわち、本明細書で開示されている最適化リンカーを含むＥＶを含む組成物の全身投与は、経粘膜手段によることもできる。経粘膜投与では、浸透させるバリアに適切な浸透剤が製剤に使用される。このような浸透剤は一般に当技術分野で公知であり、例えば、経粘膜投与では、洗剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、例えば、鼻腔スプレーの使用によって達成され得る。
[00514]ある特定の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）、すなわち、本明細書で開示されている最適化リンカーを含むＥＶを含む医薬組成物は、医薬組成物から利益を受ける対象に静脈内投与される。ある特定の他の態様では、組成物は、リンパ系、例えば、リンパ管内注射又は結節内注射（例えば、Ｓｅｎｔｉら、ＰＮＡＳ １０５（４６）：１７９０８頁（２００８）を参照されたい）、又は筋肉内注射、皮下投与、腫瘍内注射、胸腺、若しくは肝臓への直接注射によって投与される。
[00515]ある特定の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）、すなわち、本明細書で開示されている最適化リンカーを含むＥＶを含む医薬組成物は、液体懸濁液として投与される。ある特定の態様では、医薬組成物は、投与後にデポーを形成することが可能な製剤として投与される。ある特定の好ましい態様では、デポーは、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を循環中にゆっくりと放出するか、又はデポー形態のままである。
[00516]典型的には、薬学的に許容できる組成物は、夾雑物を含まないように高度に精製され、生体適合性であり、毒性がなく、対象への投与に適している。水が担体の構成成分である場合、水は高度に精製され、夾雑物、例えばエンドトキシンを含まないように処理される。
[00517]薬学的に許容できる担体としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシ安息香酸塩、プロピルヒドロキシ安息香酸塩、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び／又は鉱油であり得るが、これらに限定されない。医薬組成物は、滑沢剤、湿潤剤、甘味剤、風味増強剤、乳化剤、懸濁化剤、及び／又は保存剤をさらに含み得る。
[00518]本明細書に記載の医薬組成物は、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）、すなわち、本明細書で開示されている最適化リンカーを含むＥＶ、及び任意選択的に薬学的に活性な薬剤又は治療剤を含む。治療剤は、生物学的薬剤、低分子薬剤、又は核酸薬剤であり得る。
[00519]本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）、すなわち、本明細書で開示されている最適化リンカーを含むＥＶを含む医薬組成物を含む剤形が提供される。一部の態様では、剤形は、静脈内注射用の液体懸濁剤として製剤化される。一部の態様では、剤形は、腫瘍内注射用の液体懸濁剤として製剤化される。
[00520]ある特定の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）、すなわち、本明細書で開示されている最適化リンカーを含むＥＶの調製物は、残存する複製コンピテント核酸を損傷させるために、放射線、例えば、Ｘ線、ガンマ線、ベータ粒子、アルファ粒子、中性子、陽子、元素核、ＵＶ線に供される。
[00521]ある特定の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）、すなわち、本明細書で開示されている最適化リンカーを含むＥＶの調製物は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、又は１００ｋＧｙを超える照射線量を使用するガンマ線照射に供される。
[00522]ある特定の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）、すなわち、本明細書で開示されている最適化リンカーを含むＥＶの調製物は、０．１、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００を超える照射線量を使用するＸ線照射に供される。
[00523]本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）は、他の薬物と同時に使用されてよい。具体的には、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）は、ホルモン治療剤、化学療法剤、免疫療法剤、細胞増殖因子又は細胞増殖因子受容体の作用を阻害する医薬などの医薬と一緒に使用されてよい。
キット
[00524]本開示は、本開示の１つ又は複数のＥＶ（例えば、エクソソーム）、すなわち、本明細書で開示されている最適化リンカーを含むＥＶ、及び任意選択的に使用説明書を含むキット、又は製造品も提供する。一部の態様では、キット、又は製造品は、本開示の少なくとも１つのＥＶ（例えば、エクソソーム）、すなわち、本明細書で開示されている最適化リンカーを含むＥＶ、及び使用説明書を含む、本明細書に記載の医薬組成物を含有する。一部の態様では、キット、又は製造品は、１つ又は複数の容器中に、本開示の少なくとも１つのＥＶ（例えば、エクソソーム）、すなわち、本明細書で開示されている最適化リンカーを含むＥＶ、又はＥＶ（例えば、エクソソーム）を含む医薬組成物を含む。当業者であれば、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）、すなわち、本明細書で開示されている最適化リンカーを含むＥＶを含む医薬組成物、又はそれらの組合せが、当技術分野で周知の確立されたキット形式の１つに容易に組み込まれ得ることを容易に認識するであろう。
[00525]一部の態様では、キット、又は製造品は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）、１つ又は複数の生物学的に活性な分子、本明細書で開示されている最適化リンカーを介して、例えば、コンジュゲーション又は固相合成により、１つ又は複数の生物学的に活性な分子をＥＶ（例えば、エクソソーム）に共有結合させるための試薬、及び本明細書で開示されている最適化リンカーを介して、１つ又は複数の生物学的に活性な分子をＥＶ（例えば、エクソソーム）に共有結合させるための反応を実行するための説明書を含む。
[00526]一部の態様では、キットは、本明細書で開示されている最適化リンカーを介して、例えばコンジュゲーション（例えばマレイミド化学）又は固相合成によって、生物学的に活性な分子をＥＶ（例えばエクソソーム）にコンジュゲートするための試薬、及びコンジュゲーションを実行するための指示書を含む。
[00527]本開示の実践には、別段に示されていない限り、当業者の技術範囲内である細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学の従来技術を用いることになる。このような技法は、文献中で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら編（１９９２） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮＹ）；Ｄ． Ｎ． Ｇｌｏｖｅｒ編、（１９８５） ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第Ｉ及びＩＩ巻；Ｇａｉｔ編（１９８４） Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｍｕｌｌｉｓら 米国特許第４，６８３，１９５号；Ｈａｍｅｓ及びＨｉｇｇｉｎｓ編（１９８４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ｈａｍｅｓ及びＨｉｇｇｉｎｓ編（１９８４） Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９８７） Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）（１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ（１９８４） Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．）；Ｍｉｌｌｅｒ及びＣａｌｏｓ編（１９８７） Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｗｕら編、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５４及び１５５巻；Ｍａｙｅｒ及びＷａｌｋｅｒ編（１９８７） Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｗｅｉｒ及びＢｌａｃｋｗｅｌｌ編、（１９８６） Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第Ｉ～ＩＶ巻；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、（１９８６）；）；Ｃｒｏｏｋｅ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、第２版 ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（２００７）並びにＡｕｓｕｂｅｌら（１９８９）におけるＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍｄ．）を参照されたい。
[00528]本明細書において言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、及び他の参照文献は、参照によりその全体が組み込まれる。本開示において開示されるデータベースエントリー及び電子出版物は、参照によりその全体が組み込まれる。本出願において参照により組み込まれるデータベースエントリー又は電子出版物のバージョンは、本出願が出願された時点で公的に利用可能であったデータベースエントリー又は電子出版物の最新バージョンである。本出願において開示されている遺伝子又はタンパク質の識別子（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ、Ｒｅｆｓｅｑ、又はＵｎｉｐｒｏｔなどの公開データベースの受託番号又はデータベース識別子によって特定される遺伝子又はタンパク質）に対応するデータベースエントリーは、参照によりその全体が組み込まれる。組み込まれる遺伝子又はタンパク質に関連する情報は、データベースエントリーに含有される配列データに限定されない。参照により組み込まれる情報は、本出願が出願された時点で公的に利用可能であったデータベースの最新バージョンにおけるデータベースエントリーの内容全体を含む。矛盾が生じる場合、定義を含む本明細書が優先される。加えて、材料、方法、及び実施例は例示にすぎず、限定することを意図しない。
[00529]以下の実施例は、例示のみを目的として提供されるものであり、本発明の範囲又は内容を何ら限定するものとして解釈されるべきではない。本発明の実践は、別段に示されていない限り、当業者であれば、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技法及び薬理学の従来の方法を採用することになる。このような技法は、文献中で十分に説明されている。例えば、Ｔ．Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９３）；Ｇｒｅｅｎ ＆ Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第４版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２０１２）；Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ＆ Ｋａｐｌａｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２２版（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ、２０１２）；Ｓｕｎｄｂｅｒｇ ＆ Ｃａｒｅｙ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：第Ａ及びＢ部、第５版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、２００７）を参照されたい。
実施例１
エクソソームの生成
[00530]本明細書に記載のエクソソームを生成するために、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞株（ＨＥＫ２９３ＳＦ）を使用した。天然の細胞を使用し、「天然のエクソソーム」を生成し、プロスタグランジンＦ２受容体陰性調節因子（ＰＴＧＦＲＮ）というタンパク質で安定的にトランスフェクトした細胞を使用し、「プロテインＸエクソソーム」を生成した。非トランスフェクト又はトランスフェクトＨＥＫ２９３ＳＦ細胞を、化学的に規定された培地で７日間高密度に増殖させた。
[00531]次いで、順化した細胞培養液を回収し、室温にて３００～８００×ｇで５分間遠心分離し、細胞と大きなデブリを除去した。培地上清に１００Ｕ／ｍＬのベンゾナーゼ（ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ）（登録商標）を補充し、水浴中で、３７℃で１時間インキュベートした。上清を回収し、４℃にて１６，０００×ｇで３０分間遠心分離し、残存する細胞デブリと他の大きな夾雑物を除去した。次いで、上清を４℃にて１３３，９００×ｇで３時間超遠心分離し、エクソソームをペレット化した。上清を捨て、チューブの底からすべての残留培地を吸引した。ペレットを２００～１０００μＬのＰＢＳ（－Ｃａ－Ｍｇ）中に再懸濁した。
[00532]エクソソーム集団をさらに濃縮するために、ペレットを密度勾配精製（スクロース又はオプチプレ（ＯＰＴＩＰＲＥＰ）（商標））により処理した。勾配を、ＳＷ ４１ Ｔｉローターに入れた１２ｍＬのＵｌｔｒａ－Ｃｌｅａｒ（３４４０５９）チューブ中で、４℃にて２００，０００×ｇで１６時間回転させ、エクソソーム画分を分離した。
[00533]エクソソーム層を上層から静かに取り除き、３８．５ ｍＬのＵｌｔｒａ－Ｃｌｅａｒ（３４４０５８）チューブ中の約３２．５ｍＬのＰＢＳで希釈し、４℃にて１３３，９００×ｇで３時間、再度超遠心分離して精製エクソソームをペレット化した。得られたペレットを最小体積のＰＢＳ（約２００μＬ）中に再懸濁し、４℃で保存した。
[00534]オプチプレ（商標）勾配では、ＳＷ ４１ Ｔｉローター用の１２ｍＬのＵｌｔｒａ－Ｃｌｅａｒ（３４４０５９）チューブに等量の１０％、３０％、及び４５％のオプチプレ（商標）を入れて、３層の無菌勾配を調製した。ペレットをオプチプレ（商標）勾配に添加し、４℃にて２００，０００×ｇで１６時間超遠心分離し、エクソソーム画分を分離した。次いで、エクソソーム層をチューブの上部約３ｍＬから静かに回収した。
[00535]エクソソーム画分を３８．５ｍＬのＵｌｔｒａ－Ｃｌｅａｒ（３４４０５８）チューブ中の約３２ｍＬのＰＢＳ中で希釈し、４℃にて１３３，９００×ｇで３時間超遠心分離して、精製エクソソームをペレット化した。次いで、ペレット化したエクソソームを最小体積のＰＢＳ（約２００μＬ）に再懸濁し、使用するまで４℃で保存した。
実施例２
エクソソームへのＡＳＯ負荷
[00536]１ｘ１０１３Ｐ／ｍＬのエクソソーム０ｕＬをＡＳＯ（１００ｕＭ）１０ｕＬと混合した。９８０ｕＬのＰＢＳを添加し、次いで、１００ｋｇで２０分間超遠心分離した。上部５００ｕＬの上清（「上清」）を除去した。ペレットをデカントし、５００ｕＬのＰＢＳ中に再懸濁した（「ペレット」）。「負荷効率」は、ペレット中のＡＳＯとＡＳＯの総量（すなわち、上清中のＡＳＯとペレット中のＡＳＯとの和）との比として計算した。
[00537]ＡＳＯ負荷プロセスは、図２７に例示されている。
実施例３
ＡＳＯリンカーの構造が操作されたエクソソーム又は天然のエクソソームの効力及び負荷量に及ぼす影響
[00538]ＡＳＯリンカーの構造が操作されたエクソソーム又は天然のエクソソームに負荷されたＡＳＯの量に及ぼす影響、及びＡＳＯリンカーの構造がＡＳＯの効力に及ぼす影響を評価した。
[00539]異なるリンカーにコンジュゲートした固定ＡＳＯ配列の負荷効率を、操作されたエクソソームにおいて評価した。ＰＴＧＦＲＮを過剰に発現するエクソソーム（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｘエクソソーム）をＨＥＫ２９３細胞において産生させ、精製した。ＡＳＯペイロードを混合することによってエクソソーム表面に負荷した。したがって、１ｘ１０１３Ｐ／ｍＬの濃度のエクソソームを、異なるリンカー構造にコンジュゲートしたホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬｕｃ）の配列を有する１００ｕＭのＡＳＯと１：１で混合した。負荷効率は、エクソソームに結合させた出発ＡＳＯのパーセンテージとして計算した。
[00540]図６は、使用した構築物の構造を示している。構築物Ｃ１～Ｃ９は、コレステロール－Ｃ６脂質アンカーを使用した。構築物Ｔ１～Ｔ９は、コレステロール－ＴＥＧ脂質アンカーを使用した。構築物Ｌ１は、トコフェロール－Ｃ８脂質アンカーを使用し、構築物Ｌ２及びＬ３は、トコフェロールパルミチン酸－Ｃ６脂質アンカーを使用した。図６に示した他のリンカー構成成分は、ホスホジエステル（ＰＯ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）、ヘキサメチレン（Ｃ６）、トリメチレン（Ｃ３）、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）、及びヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）である。
[00541]結果は、操作されたエクソソーム当たりの負荷されたＡＳＯ分子の量が、リンカー構造に影響されることを示した（図６）。一般に、負荷効率は、コレステロール－ＴＥＧアンカーを有する構築物よりもコレステロール－Ｃ６アンカーを有する構築物の方が高かった。最も高い負荷効率である６８．７８％は、トコフェロール－Ｃ８脂質アンカーを有する構築物で観察され、これはエクソソーム当たり４，１２７ＡＳＯ単位の負荷に相当した。
[00542]また、操作されたエクソソームを使用して図５で評価した、異なるリンカーにコンジュゲートした同じ固定ＡＳＯ配列の負荷効率を、天然のエクソソームを使用して評価した。図５を参照されたい。天然のエクソソームをＨＥＫ２９３細胞において産生させ、精製した。１×１０１３Ｐ／ｍＬの濃度のエクソソームを、異なるリンカー構造にコンジュゲートしたホタルルシフェラーゼの配列を有する１００ｕＭのＡＳＯと１：１で混合した。負荷効率は、エクソソームに結合させた出発ＡＳＯのパーセンテージとして計算した。操作されたエクソソームの場合と同様に、天然のエクソソーム当たりの負荷されたＡＳＯ分子の量は、リンカー構造に影響された（図５）。ここでも、コレステロール－Ｃ６脂質アンカーを有する構築物は、コレステロール－ＴＥＧ脂質アンカーを有する構築物よりも高い負荷効率を示した。９０％を超える負荷効率が構築物Ｃ２及びＣ３で観察され（９３．６％及び９０．６７％）、それぞれ、エクソソーム当たり５，６１６及び５，４４０ＡＳＯ単位に相当した。よって、エクソソーム当たりの最大負荷効率とＡＳＯ数は、ＰＴＧＦＲＮを過剰に発現する操作されたエクソソームよりも天然のエクソソームにおいて有意に高かった（図６）。
[00543]ＡＳＯリンカー構造に基づいて、負荷密度の予測モデルを開発した（図７及び図８）。このモデルから、負荷密度が、重要性の高い順に、エクソソーム＞膜アンカー（ＡＭ）＞近位ＥＶスペーサー（ＳＰ１）～遠位ＥＶスペーサー（ＳＰ２）に依存することが示される。プロテインＸエクソソームでは、ＳＰ１の寄与がＳＰ２の寄与よりも重要であった。一方、天然のエクソソームでは、ＳＰ２の寄与がＳＰ１の寄与よりも高かった。
[00544]リンカー修飾の関数としての負荷密度の倍数増加は、エクソソーム全体にわたり、すなわち天然のエクソソームとプロテインＸエクソソームで一貫していた。最も優れた膜アンカーは、トコフェロールとコレステロールであった。最も優れたＳ１スペーサーはＣ３とＴＥＧであり、ＨＥＧよりも有意に優れていた。
[00545]トコフェロール－Ｃ８膜アンカーの使用により、エクソソームへの負荷は卓越していたが、効力は同程度には増加しなかった。
[00546]ホタルルシフェラーゼタンパク質を構成的に発現する安定なＨ１２９９細胞を生成した。細胞に添加するとルシフェラーゼタンパク質のシグナルがノックダウンされる、ホタルルシフェラーゼタンパク質のｍＲＮＡに対して相補的なＡＳＯを天然のエクソソームに負荷した。図９Ａに記載されたリンカー構造を比較評価して、効力（図９Ｂ：Ｔ１～Ｔ９；図９Ｃ：Ｃ１～Ｃ９、Ｌ１～Ｌ３）への影響を決定し、最もルシフェラーゼノックダウンをもたらした構造を矢印で強調した（図９Ａ、９Ｂ）。細胞に添加したＡＳＯ負荷エクソソームの相対量は、凡例に示した相対的な「感染多重度」比で示したように変化させた。各リンカー構造（Ｃ１～Ｃ９、Ｔ１～Ｔ９、Ｌ１～Ｌ３）のノックダウンは、Ｔ７試料（対照）のＡＳＯ量で正規化した。構造Ｔ２、Ｔ４、及びＣ２～Ｃ５は、リンカーの最適化により２倍以上の効力増加が達成され、効力の最高の増加をもたらした。
[00547]ホタルルシフェラーゼタンパク質を構成的に発現する安定なＨ１２９９細胞を生成した。天然のエクソソーム（図１０Ａ）又はＰＴＧＦＲＮを過剰発現するエクソソーム（図１０Ｂ）に、細胞に添加するとルシフェラーゼタンパク質のシグナルがノックダウンされる、ホタルルシフェラーゼタンパク質のｍＲＮＡに対して相補的なＡＳＯを負荷した。ルシフェラーゼの最小正規化発現（最大ノックダウンを示す）を各ＡＳＯリンカーについて決定し、リンカーで達成された負荷密度と比較した。最適なリンカーは、ＡＳＯ／ＥＶの最大負荷及び／又は正規化されたホタルルシフェラーゼの最小発現によって規定される。このＡＳＯ配列では、コレステロール及びトコフェロール－ｃ８は、それぞれ、天然のエクソソーム及びＰＴＧＦＲＮを過剰に発現するエクソソームと関連して、最良のアンカー部分であることが示された。ＴＥＧ及びＣ３は、スペーサー１に対する選択肢の効力において最大の増加をもたらした。
実施例４
負荷密度、安定性、及び効力のＡＳＯ－リンカー－脂質構造との相関性
[00548]同じＡＳＯ配列を使用して、オリゴヌクレオチド（すなわち、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ））を天然のエクソソーム又はＰＴＧＦＲＮを過剰に発現するエクソソームに結合させるために、異なるリンカーの化学的性質を評価した。コレステロール、パルミチン酸、トコフェロール、１８：１ ＰＤＰ ＰＥ及び１６：０Ｃｙａｎｕｒ ＰＥの５種類の膜アンカーを用いた。これらの膜アンカーに、以下の構成成分：トリメチレン（Ｃ３）、ヘキサメチレン（Ｃ６）、オクチルエチレン（Ｃ８）、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）、及びヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）のうちの１つ又は複数から構成される直鎖リンカーを介して、ＡＳＯをコンジュゲートした。リンカー間の結合はホスホジエステル結合であった。ＡＳＯ－リンカー－脂質構築物の設計に使用した成分を図１１に示す。
[00549]図１２は、本実施例で開示した実験において使用した修飾ＡＳＯの配列を示す。ＡＳＯは標的遺伝子にちなんで命名した。ＦＦＬＵＣ及びＲＬＵＣと名付けられた２つのＡＳＯは、ＦＦＬＵＣ及びＲＬＵＣ発光遺伝子レポーターを標的とする。ＳＴＡＴ６及びＭＹＣと名付けられた２つのＡＳＯは、ＳＴＡＴ６及びＭＹＣ治療遺伝子を標的とする。ＦＦＬＵＣ、ＲＬＵＣ、ＳＴＡＴ６、及びＭＹＣ ＡＳＯの塩基配列はそれぞれ、５’－ＴＣＧＡＡＧＴＡＣＴＣＧＧＣＧＴＡＧＧＴ－３’（配列番号１０８９）、５’－ＡＡＣＣＣＡＧＧＧＴＣＧＧＡＣＴＣＧＡＴ－３’（配列番号１０９０）、５’－ＧＣＡＡＧＡＴＣＣＣＧＧＡＴＴＣＧＧＴＣ－３’（配列番号１０９１）、及び５’－ＧＡＣＧＴＧＧＣＡＣＣＴＣＴＴＧＡＧＧＡ－３’（配列番号１０９２）であり、これらは、図１２に示されているように修飾された。
[00550]ＡＳＯ－リンカー－脂質構造と負荷密度の相関：最適なリンカーの設計は、エクソソーム当たりの効力を最大化する高い負荷密度（ＥＶ当たりの負荷されたＡＳＯの量）とＡＳＯ分子当たりの高い効力をもたらす。ＡＳＯペイロードを、４つの異なるオリゴヌクレオチド配列と最大１４の異なるリンカー構造とでコンビナトリアル設計した。次いで、これらのペイロードをＰＴＧＦＲＮが過剰に発現するエクソソームに負荷し、負荷密度を決定した。統計モデル（Ｒ２＝０．８６）を作成し、エクソソームへの負荷密度に対する異なる構造パラメーターの寄与を決定した。統計モデルを図１３Ａに示す。
[00551]リンカーのスクリーニングにより、ＡＳＯ配列、膜アンカー、及びスペーサー１（エクソソーム表面に対して近位のリンカー）が負荷密度に有意な影響を及ぼすことが明らかになった。各脂質は、疎水性膜に安定に存在できる脂質の平衡量を規定する異なる分配係数を有する。直鎖及び環状のハイブリッド疎水性構造は、アルキル鎖が芳香環をリン脂質二重層のより大きな内容積部にアクセスさせるため、ＡＳＯの負荷を改善する場合がある。脂質の組成は、膜の流動性に影響を与える可能性があり、例えば、誘導双極子相互作用、双極子相互作用、及び／又は電荷相互作用によって媒介される可能性がある。最後に、水性負荷緩衝剤中での脂質の自己会合が、構造間の性能差につながる場合がある。同様に、異なるＡＳＯ配列はわずかに異なる立体構造をとり、配列依存的にエクソソーム表面と自己会合及び／又は会合する。
[00552]リンカーのスクリーニングにより、エクソソーム対して近位のリンカーであるスペーサー１の存在が、負荷密度に有意な影響を与えることが明らかになった。逆に、エクソソーム表面から最も遠いリンカーであるスペーサー２は、有意な効果を有さず、スペーサー１によってもたらされる以上にスペーサー長をさらに増加させても、負荷に意味のある利点をもたらさないことを示唆した。これらの知見から、リンカーの設計には、膜に隣接するエリアの立体配置、立体構造、又は配向の変化が重要であることが示唆される。Ｃ３、Ｃ６及びＣ８などの疎水性リンカーは、ＴＥＧ及びＨＥＧなどの親水性リンカーよりも疎水性が高く、よって、膜の疎水性内部と会合し、浸透するのにエネルギー的に有利である。疎水性テザーとして作用し、膜アンカーがアクセスできる膜の非極性体積を増加させることにより、リンカーはペイロードの負荷密度を増加させることができる。親水性スペーサー１は、高電荷で親水性のリン酸塩頭部基及びエクソソーム外部表面の周辺領域における熱力学的結合平衡を改善する場合がある。リンカーの長さを増加させると、ＡＳＯの間隔が広がり、アニオン性ＡＳＯの静電反発が低下する。エクソソーム表面からある特定の距離を超えると、その利益は小さくなる。
[00553]まとめると、ペイロード構造のすべての部分が、その負荷密度に異なる程度で影響を及ぼすが、傾向はＡＳＯ構造全体にわたり維持されている（図１３Ｂ及び図１３Ｃを参照されたい）。主な要因は使用されるＡＳＯであり、近位ＥＶスペーサー（スペーサー１）、膜アンカー（脂質）、及び遠位ＥＶスペーサー（スペーサー２）がそれに続く。
[00554]ｅｘｏＡＳＯの安定性：ＡＳＯ－リンカー－脂質の負荷は、脂質部分とエクソソームのリン脂質二重層との間の疎水性相互作用に依拠する。この脂質会合の弾性を調査するために、本発明者らは、リンカー／脂質構造の５つの組合せを様々な緩衝剤条件で評価し、会合の安定性への影響を決定した。使用した実験条件を以下の表にまとめている。
Figure 2024506711000022
[00555]ＡＳＯ－リンカー－脂質をエクソソームに負荷し、前の表に記載したように、３つの緩衝剤条件で、２つの異なる温度にて８日間維持した。図１３Ａ～１３Ｅにおいて「ＡＳＯ（ｕＭ）」と呼ばれる、エクソソームに会合したＡＳＯの量は、全ＡＳＯ含量から解離した遊離ＡＳＯを差し引くことによって評価した。
[00556]図１３Ｂに示されているｅｘｏＡＳＯ－ＳＴＡＴ６対照（Ｃｈｏｌ－ＴＥＧ－ＨＥＧ）におけるホスホジオエステル又はホスホロチオエート連結の使用の効果を、図１９Ａ～１９Ｃに示す。ＡＳＯ濃度（ｎＭ）又はエクソソーム粒子（ｐ／ｍＬ）として定量した最も高い効力は、両方のリンカーがホスホロチオエート（ＰＳ）である場合に観察された。最も低い効力は、脂質アンカー部分に最も近い連結がホスホジエステルであり、遠位の連結がホスホロチオエートである場合に観察された。
[00557]一般に、ＮａＣｌを増加させた緩衝剤の方がより高い負荷密度をもたらした。高塩と低塩の緩衝剤条件間の負荷密度は、リンカー－脂質構造によって変化した。３つの異なる緩衝剤条件におけるエクソソームが会合したＡＳＯの濃度は、２５℃と４℃の両方で８日間にわたり安定したままであった。図１５を参照されたい。さらに、粒子数（図１６）及び粒子サイズ（図１７）は変化しなかった。図２０～２２も参照されたい。このデータは、多様な脂質／リンカー構造を有するＡＳＯが、ＧＭＰ製造における実施の成功及び臨床試験での使用に必要な特性である、試験した緩衝剤条件、時間範囲及び温度下で安定であることを示した。
[00558]ｅｘｏＡＳＯの効力：図１８は、ｅｘｏＡＳＯ－ＳＴＡＴ６対照では、エクソソーム当たりの効力が負荷密度と正に相関したことを示す。しかし、試験した異なるリンカー構造の中で、効力と負荷密度の間には明らかな相関はなかった。言い換えれば、リンカー構造全体にわたり、負荷密度が高ければ高いほど必ずしも効力が高いという訳ではなかった。試験したリンカーのうち、３つがより低いＩＣ５０値（すなわち、より高い効力）を示した。これらのリンカーは、Ｃｈｏｌ－ＴＥＧ、Ｃｈｏｌ－Ｃ６－Ｃ３、及びＴｏｃｏ－Ｃ８－ＴＥＧであった。
[00559]上記に開示されている非切断性構築物に加えて、切断性リンカーを使用する他の構築物、例えばＶａｌ－Ｃｉｔ切断性リンカーを試験した。ＡＳＯがＳＴＡＴ６ ＡＳＯであるＶａｌ－Ｃｉｔ切断性リンカー機構を有する脂質－リンカー－ＡＳＯ構造設計の例を図２３Ａに示す。図２３Ａに記載の構築物の効力を図２３Ｂに示す。
[00560]さらに試験した切断性リンカーの別の例は、酸化還元リンカーであった。図２５は、ＡＳＯがＳＴＡＴ６ ＡＳＯである、酸化還元切断性リンカー機構を有する例示的な脂質－リンカー－ＡＳＯ設計を示し、その効力を図２６に示す。
実施例５
ＥＧＦＰスプライシングレスキューアッセイ
[00561]ＥＧＦＰスプライシングレスキューアッセイを開発し、本明細書で開示されているリンカー構築物を特徴付けた。様々なリンカーを有するＥＧＦＰ及びｅｘｏＥＧＦＰの有効性を評価するために、２９３ＡＡＶ－ｐＣＢ－２７５４細胞株を開発した。６５４における点突然変異によってＥＧＦＰは完全に転写されないため、ＥＧＦＰ又はＮａｎｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅからの発光は観察されない。ＡＳＯで処理すると、ＥＧＦＰが救済され、したがって、ＥＧＦＰとＮａｎｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅシグナルの両方が観察された。Ｎａｎｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅの発光を有効性のハイスループット定量化のために用いた。図２８は、ＥＧＦＰスプライシングレスキューアッセイの開発の略図を示す。本試験で使用したＥＧＦＰ ＡＳＯの配列の修飾も図２８に示されている。ＥＧＦＰ ＡＳＯの塩基配列は、ＧＣＴＡＴＴＡＣＣＴＴＡＡＣＣＣＡＧ（配列番号１０９３）である。ＥＧＦＰアッセイで試験するための脂質－リンカー－ＡＳＯ設計の例、すなわち、ＡＳＯが図２８に示した修飾ＥＧＦＰ ＡＳＯであった構築物を図２４に示す。試験したリンカーには、切断性リンカーと非切断性リンカーの両方が含まれた。ＥＧＦＰレスキューアッセイにおいて使用した脂質－リンカー－ＥＧＦＰ構築物の負荷、精製、及び特徴付けのプロセスを図２７に示す。
[00562]３つの用量レベルにおける細胞生存率（ＣＴＧアッセイ）及び有効性について、ＥＧＦＰスプライシングレスキューアッセイにおいて使用した新たに開発された細胞株を特徴付けた。図２９を参照されたい。
[00563]図３０は、ＥＧＦＰスプライシングレスキューアッセイを使用して、様々なＰＯ及び非切断性ＰＥＧリンカーによるｅｘｏＡＳＯ－ＥＧＦＰの負荷密度及び有効性を示す。「低」及び「高」は、負荷温度及びＡＳＯ濃度のモジュレーションによって負荷密度が制御される、一組の実験において達成された負荷密度に対する相対的で定性的な参照である。
[00564]特許請求の範囲を解釈するために使用されることを意図しているのは、要約及び要旨のセクションではなく、詳細な説明のセクションであることが認識されるべきである。要約及び要旨のセクションは、本発明者（ら）によって企図された本開示の１つ又は複数の例示的な態様を示すことができるが、すべてではなく、よって、本開示及び添付の特許請求の範囲を何らかの方法で限定することを意図するものではない。
[00565]本開示は、指定された機能及びその関係の実行を例示する機能的構成要素の助けを借りて上述されてきた。これらの機能的構成要素の境界は、本明細書では、説明の便宜のために任意に定義されている。指定された機能及びその関係が適切に実施される限り、別の境界を定義することができる。
[00566]具体的な態様についての前述の説明は、本開示の一般的な性質を十分に明らかにするため、他者は、当業者内の知識を適用することにより、過度の実験を行うことなく、本開示の一般的な概念から逸脱することなく、このような具体的な態様を様々な用途のために容易に修正及び／又は翻案することができる。したがって、このような翻案及び修正は、本明細書に提示された教示及び指針に基づいて、開示された態様の均等物の意味及び範囲内にあることが意図される。本明細書の用語又は語法は、教示及び指針に照らして当業者によって解釈されるべきものであるように、本明細書の語法又は用語は、説明のためのものであり、限定するためのものではないことを理解されたい。
[00567]本開示の広さ及び範囲は、上述の例示的態様のいずれかによって限定されるべきではなく、以下の特許請求の範囲及びその均等物に従ってのみ定義されるべきである。
[00568]本出願を通じて引用される可能性のあるすべての引用文献（参照文献、特許、特許出願、及びウェブサイトを含む）の内容は、その中で引用された参照文献と同様に、いかなる目的であれ、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。

Claims (174)

  1. 式：
    ［ＡＭ］－Ｌ１－［ＳＰ１］－Ｌ２－［ＳＰ２］－Ｌ３－［ＢＡＭ］（式１）
    （式中、
    ［ＡＭ］は、アンカー部分であり、
    Ｌ１は、切断性又は非切断性の連結であり、
    Ｌ２及びＬ３は、任意選択の切断性又は非切断性の連結であり、
    ＳＰ１は、任意選択の第１のスペーサーであり、
    ＳＰ２は、任意選択の第２のスペーサーである）
    によるアンカー部分（ＡＭ）を介して、細胞外ベシクル（ＥＶ）に共有結合により連結した生物学的に活性な分子（ＢＡＭ）を含む細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  2. 前記アンカー部分［ＡＭ］が、ステロール、脂質、ビタミン、ペプチド、又はこれらの組合せ及び任意選択でスペーサーを含む、請求項１に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  3. 前記任意選択のスペーサーが、アルキルスペーサーである、請求項２に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  4. 前記アルキルスペーサーが、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、又はＣ１５である、請求項３に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  5. 前記アルキルスペーサーが、Ｃ６又はＣ８である、請求項３に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  6. 前記任意選択のスペーサーが、グリコールスペーサーである、請求項２に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  7. 前記グリコールスペーサーが、２（ジエチレングリコール）、３（トリエチレングリコール）、４（テトラエチレングリコール；ＴＥＧ）、５（ペンタエチレングリコール）、６（ヘキサエチレングリコール；ＨＥＧ）、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のグリコール単位を有する、請求項５に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  8. 前記グリコールスペーサーが、テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）である、請求項５に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  9. 前記ステロールが、コレステロール、エルゴステロール、７－デヒドロコレステロール、２４Ｓ－ヒドロキシコレステロール、ラノステロール、シクロアルテノール、フコステロール、サリンゴステロール、カンペステロール、β－シトステロール、シトスタノール、コプロスタノール、アベナステロール、及びスチグマステロールからなる群から選択される、請求項２に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  10. 前記ステロールが、コレステロールである、請求項２に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  11. 前記脂質が、脂肪酸である、請求項２に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  12. 前記脂肪酸が、直鎖脂肪酸である、請求項１１に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  13. 前記脂肪酸が、直鎖脂肪酸、分岐脂肪酸、不飽和脂肪酸、モノ不飽和脂肪酸、ポリ不飽和脂肪酸、ヒドロキシ脂肪酸、ポリカルボン酸、又はこれらの任意の組合せである、請求項１１に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  14. 前記直鎖脂肪酸が、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、又はステアリン酸である、請求項１２に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  15. 前記直鎖脂肪酸が、パルミチン酸である、請求項１２に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  16. 前記ビタミンが、ビタミンＥ（トコフェロール又はトコトリエノール）、ビタミンＤ、ビタミンＫ、リボフラビン、ナイアシン、又はピリドキシンである、請求項２に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  17. 前記ビタミンが、ビタミンＥ（トコフェロール又はトコトリエノール）である、請求項２に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  18. Ｌ１が、ホスホジエステル結合を含む切断性連結又はホスホロチオエート結合を含む非切断性連結である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  19. Ｌ２が、ホスホジエステル結合を含む任意選択の切断性連結又はホスホロチオエート結合を含む非切断性連結である、請求項１～１８のいずれか一項に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  20. Ｌ３が、ホスホジエステル結合を含む任意選択の切断性連結又はホスホロチオエート結合を含む非切断性連結である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  21. 任意選択の第１のスペーサーである前記ＳＰ１及び／又は任意選択の第２のスペーサーである前記ＳＰ２が、アルキルスペーサー、グリコールスペーサー、又はこれらの組合せを独立的に含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  22. 前記アルキルスペーサーが、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、又はＣ１５である、請求項２１に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  23. 前記アルキルスペーサーが、Ｃ３又はＣ６である、請求項２１に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  24. 前記グリコールスペーサーが、２（ジエチレングリコール）、３（トリエチレングリコール）、４（テトラエチレングリコール；ＴＥＧ）、５（ペンタエチレングリコール）、６（ヘキサエチレングリコール；ＨＥＧ）、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のグリコール単位を有する、請求項２１に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  25. 前記グリコールスペーサーが、テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）又はヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）である、請求項２１に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  26. 各非切断性スペーサーが、アルキル、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）、ペンタエチレングリコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、グリセロール、ジグリセロール、トリグリセロール、テトラグリセロール（ＴＧ）、ペンタグリセロール、ヘキサグリセロール（ＨＧ）、ポリグリセロール（ＰＧ）、スクシンイミド、マレイミド、又はこれらの任意の組合せから独立的に選択される、請求項１～２５のいずれか一項に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  27. 前記ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が、式Ｒ１－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－又はＲ１－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－Ｏ－（式中、Ｒ１は、水素、メチル又はエチルであり、ｎは、１～１５の間の整数である）によって特徴付けられる、請求項２６に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  28. 前記ポリグリセロール（ＰＧ）が、式（（Ｒ１－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨＯＨ－ＣＨ２Ｏ）ｎ－）（式中、Ｒ１は、水素、メチル又はエチルであり、ｎは、１～１５の間の整数である）によって特徴付けられる、請求項２６に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  29. 切断性連結である前記Ｌ１、Ｌ２、若しくはＬ３、又はこれらの任意の組合せが、酸化還元切断性リンカー、活性酸素種切断性リンカー、ｐＨ依存性切断性リンカー、酵素切断性リンカー、プロテアーゼ切断性リンカー、エステラーゼ切断性リンカー、ホスファターゼ切断性リンカー、光活性化切断性リンカー、自己犠牲リンカー、又はこれらの任意の組合せを含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  30. 切断性連結である前記Ｌ１、Ｌ２、若しくはＬ３、又はこれらの任意の組合せが、自己犠牲リンカーを含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  31. 切断性連結である前記Ｌ１、Ｌ２、若しくはＬ３、又はこれらの任意の組合せが、シンナミル基、ナフチル基、ビフェニル基、複素環式環、ホモ芳香族基、クマリン、フラン、チオフェン、チアゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、ピロール、ピラゾール、ピリジン、イミダゾン、トリアゾール、又はこれらの任意の組合せを含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  32. 切断性連結である前記Ｌ１、Ｌ２、若しくはＬ３、又はこれらの任意の組合せが、式：
    －Ａａ－Ｙｙ－
    （式中、各－Ａ－は、独立的にアミノ酸単位又はその組合せであり、ａは、独立的に１～１５の整数であり；－Ｙ－は、スペーサー単位であり、ｙは、０、１、又は２である）を有する、請求項１～３１のいずれか一項に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  33. －Ａａ－が、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、若しくはヘキサペプチド、又はこれらの組合せであり、前記組合せにおける各ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、又はヘキサペプチドが、同一であっても異なっていてもよい、請求項３２に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  34. ａが、２であり、－Ａａ－が、バリン－アラニン、バリン－シトルリン、フェニルアラニン－リシン、Ｎ－メチルバリン－シトルリン、シクロヘキシルアラニン－リシン、グルタミン酸－バリン－シトルリン、及びベータ－アラニン－リシンからなる群から選択される、請求項３３に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  35. 前記－Ａａ－が、バリン－アラニン、バリン－シトルリン、又はグルタミン酸－バリン－シトルリンである、請求項３３に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  36. ｙが１である、請求項３１～３５のいずれか一項に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  37. －Ｙ－が－自己犠牲スペーサーである、請求項３１～３６のいずれか一項に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  38. －Ｙｙ－が、式：
    Figure 2024506711000023
    （式中、各Ｒ２は、独立的にＣ１～８アルキル、－Ｏ－（Ｃ１～８アルキル）、ハロゲン、ニトロ、又はシアノであり；ｍは、０～４の整数である）を有する、請求項３７に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  39. ｍが、０、１、又は２である、請求項３８に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  40. ｍが、０である、請求項３８に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  41. 切断性連結である前記Ｌ１、Ｌ２、若しくはＬ３、又はこれらの任意の組合せが、バリン－アラニン－ｐ－アミノベンジルカルバメート又はバリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルカルバメートを含む、請求項３１～４０のいずれか一項に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  42. －Ｙ－が、非自己犠牲スペーサーである、請求項３１～３６のいずれか一項に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  43. 前記非自己犠牲スペーサーが、－Ｇｌｙ－又は－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－である、請求項４２に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  44. 前記アンカー部分［ＡＭ］が、足場タンパク質を含む、請求項１～４３のいずれか一項に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  45. 前記アンカー部分［ＡＭ］及び／又は前記足場部分が、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘである、請求項４４に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  46. 前記Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘが、プロスタグランジンＦ２受容体陰性調節因子（ＰＴＧＦＲＮタンパク質）；ベイシジン（ＢＳＧタンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２（ＩＧＳＦ２タンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（ＩＧＳＦ３タンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（ＩＧＳＦ８タンパク質）；インテグリンベータ－１（ＩＴＧＢ１タンパク質）；インテグリンアルファ－４（ＩＴＧＡ４タンパク質）；４Ｆ２細胞表面抗原重鎖（ＳＬＣ３Ａ２タンパク質）；ＡＴＰトランスポータータンパク質のクラス（ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ４タンパク質）；これらの機能的断片；及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項４５に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  47. 前記Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘが、ＰＴＧＦＲＮタンパク質又はその機能的断片である、請求項４５に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  48. 前記Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘが、配列番号３０２に示されるアミノ酸配列を含む、請求項４５に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  49. 前記Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘが、配列番号３０２に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は約１００％同一なアミノ酸配列を含む、請求項４５に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  50. 前記生物学的に活性な分子［ＢＡＭ］が、アンカー部分［ＡＭ］を介して前記ＥＶの外側表面に連結されている、請求項１～４９のいずれか一項に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  51. 前記生物学的に活性な分子が、ポリペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）、化学化合物、又はこれらの任意の組合せである、請求項１～５０のいずれか一項に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  52. 前記生物学的に活性な分子が、化学化合物である、請求項５１に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  53. 前記化学化合物が、小分子である、請求項５２に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  54. 前記生物学的に活性な分子が、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、核酸、又はこれらの任意の組合せを含む、請求項１～５３のいずれか一項に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  55. 前記生物学的に活性な分子が、ペプチド、タンパク質、抗体若しくはその抗原結合断片、又はこれらの任意の組合せを含む、請求項１～５４のいずれか一項に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  56. 前記その抗原結合断片が、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、及びＦｄ断片、ダイアボディ、抗体関連ポリペプチド、又はこれらの任意の断片を含む、請求項５５に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  57. 前記生物学的に活性な分子が、ＡＳＯを含む、請求項５４に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  58. 前記ＡＳＯが、転写物を標的とする、請求項５７に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  59. 前記転写物が、ＳＴＡＴ６転写物、ＣＥＢＰ／β転写物、ＳＴＡＴ３転写物、ＫＲＡＳ転写物、ＮＲＡＳ転写物、ＮＬＰＲ３転写物、又はこれらの任意の組合せである、請求項５８に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  60. 前記ＥＶが、エクソソームである、請求項１～５９のいずれか一項に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  61. 前記エクソソームが、天然のエクソソームである、請求項６０に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  62. 前記エクソソームが、ＰＴＧＦＲＮを過剰に発現するエクソソーム又はその機能的断片である、請求項６０に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  63. 請求項１～６２のいずれか一項に記載の細胞外ベシクル及び薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
  64. 請求項１～６２のいずれか一項に記載のＥＶ又は請求項６３に記載の医薬組成物及び使用説明書を含むキット。
  65. それを必要とする対象における疾患又は障害を処置又は防止する方法であって、請求項１～６２のいずれか一項に記載のＥＶ又は請求項６３に記載の医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む、方法。
  66. 前記疾患又は障害が、がん、炎症性障害、神経変性障害、中枢神経疾患、又は代謝性疾患である、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記ＥＶが、静脈内、腹腔内、経鼻的、経口的、筋肉内、皮下、非経口的、又は腫瘍内に投与される、請求項６５又は６６に記載の方法。
  68. 生物学的に活性な分子（ＢＡＭ）をＥＶに結合させる方法であって、アンカー部分（ＡＭ）を前記ＥＶに連結させるステップを含み、前記アンカー部分（ＡＭ）が、式：
    ［ＡＭ］－Ｌ１－［ＳＰ１］－Ｌ２－［ＳＰ２］－Ｌ３－［ＢＡＭ］
    （式中、
    ［ＡＭ］は、アンカー部分であり、
    Ｌ１は、切断性又は非切断性の連結であり、
    Ｌ２及びＬ３は、任意選択の切断性又は非切断性の連結であり、
    ＳＰ１は、任意選択の第１のスペーサーであり、
    ＳＰ２は、任意選択の第２のスペーサーである）
    による前記生物学的に活性な部分（ＢＡＭ）に結合している、方法。
  69. ［ＡＭ］が、コレステロール－Ｃ６、コレステロール－ＴＥＧ、トコフェロール－Ｃ８、トコフェロール、又はパルミチン酸－Ｃ６である、請求項６８に記載の方法。
  70. Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、又はこれらの組合せが、ホスホジエステル結合である、請求項６８又は６９に記載の方法。
  71. ＳＰ１が、Ｃ３、Ｃ６、ＴＥＧ、又はＨＥＧである、請求項６８～７０のいずれか一項に記載の方法。
  72. Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、又はこれらの組合せが、ホスホロチオエート結合である、請求項６８～７１のいずれか一項に記載の方法。
  73. ＳＰ２が、Ｃ３、Ｃ６、ＴＥＧ又はＨＥＧである、請求項６８～７２のいずれか一項に記載の方法。
  74. Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、又はこれらの組合せが、ホスホロチオエート結合である、請求項６８～７３のいずれか一項に記載の方法。
  75. ［ＢＡＭ］が、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である、請求項６８～７４のいずれか一項に記載の方法。
  76. ＥＶに結合した生物学的に活性な分子（ＢＡＭ）の負荷密度を増加させる方法であって、式：
    ［ＡＭ］－Ｌ１－［ＳＰ１］－Ｌ２－［ＳＰ２］－Ｌ３－［ＢＡＭ］
    （式中、
    ［ＡＭ］は、アンカー部分であり、
    Ｌ１は、切断性又は非切断性の連結であり、
    Ｌ２及びＬ３は、任意選択の切断性又は非切断性の連結であり、
    ＳＰ１は、任意選択の第１のスペーサーであり、
    ＳＰ２は、任意選択の第２のスペーサーである）
    による生物学的に活性な部分（ＢＡＭ）に結合したアンカー部分（ＡＭ）のライブラリーをスクリーニングするステップを含む、方法。
  77. ［ＡＭ］が、コレステロール－Ｃ６、コレステロール－ＴＥＧ、トコフェロール－Ｃ８、トコフェロール、又はパルミチン酸－Ｃ６である、請求項７６に記載の方法。
  78. Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、又はこれらの組合せが、ホスホジエステル結合である、請求項７６又は７７に記載の方法。
  79. ＳＰ１が、Ｃ３、Ｃ６、ＴＥＧ、又はＨＥＧである、請求項７６～７８のいずれか一項に記載の方法。
  80. Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、又はこれらの組合せが、ホスホロチオエート結合である、請求項７６～７９のいずれか一項に記載の方法。
  81. ＳＰ２が、Ｃ３、Ｃ６、ＴＥＧ又はＨＥＧである、請求項７６～８０のいずれか一項に記載の方法。
  82. Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、又はこれらの組合せが、ホスホロチオエート結合である、請求項７６～８１のいずれか一項に記載の方法。
  83. ［ＢＡＭ］が、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である、請求項７６～８２のいずれか一項に記載の方法。
  84. ＥＶに結合した生物学的に活性な分子（ＢＡＭ）の負荷密度が、少なくとも約１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、又は少なくとも約１０倍増加している、請求項７６～８３のいずれか一項に記載の方法。
  85. 式：
    ［ＡＭ］－Ｌ１－［ＳＰ１］－Ｌ２－［ＳＰ２］－Ｌ３－［ＡＳＯ］
    （式中、
    ［ＡＭ］が、コレステロール－Ｃ６、コレステロール－ＴＥＧ、トコフェロール－Ｃ８、トコフェロール、及びパルミチン酸－Ｃ６からなる群から選択されるアンカー部分であり、
    Ｌ１が、ホスホジエステラーゼ切断性の連結であり、
    ＳＰ１が、Ｃ３、Ｃ６、ＴＥＧ及びＨＥＧからなる群から選択される任意選択の第１のスペーサーであり、
    Ｌ２が、任意選択のホスホロチオエート非切断性の連結であり、
    ＳＰ２が、Ｃ３、Ｃ６、ＴＥＧ、及びＨＥＧからなる群から選択される任意選択の第２のスペーサーであり、
    Ｌ３が、任意選択のホスホロチオエート非切断性の連結である）
    によるアンカー部分［ＡＭ］を介して、ＥＶに共有結合により連結したアンチセンスオリゴヌクレオチド［ＡＳＯ］を含む細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  86. 前記ＥＶが、エクソソームである、請求項８４に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  87. 前記エクソソームが、天然のエクソソームである、請求項８５に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  88. 前記エクソソームに結合したＡＳＯの負荷密度が、少なくとも約１．５倍増加している、請求項８６に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  89. 前記アンカー部分［ＡＭ］が、コレステロール－Ｃ６である、請求項８６に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  90. エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数が、５０３２＋／－３８６である、請求項８８に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  91. エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数が、約４５００～約５５００の間である、請求項８８に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  92. エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数が、約４５００～約４６００の間、約４６００～約４７００の間、約４７００～約４８００の間、約４８００～約４９００の間、約４９００～約５０００の間、約５０００～約５１００の間、約５１００～約５２００の間、約５２００～約５３００の間、約５３００～約５４００の間、又は約５４００～約５５００の間である、請求項８８に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  93. エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数が、少なくとも約４５００、少なくとも約４６００、少なくとも約４７００、少なくとも約４８００、少なくとも約４９００、少なくとも約５０００、少なくとも約５１００、少なくとも約５２００、少なくとも約５３００、少なくとも約５４００、又は少なくとも約５５００である、請求項８８に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  94. 前記負荷効率が、７３％～９３％である、請求項８８に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  95. 前記負荷効率が、約７０％～約９５％の間である、請求項８８に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  96. 前記負荷効率が、約７０％～約７５％の間、約７５％～約８０％の間、約８０％～約８５％の間、約８５％～約９０％の間、又は約９０％～約９５％の間である、請求項８８に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  97. 前記負荷効率が、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％である、請求項８８に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  98. 前記アンカー部分［ＡＭ］が、コレステロール－ＴＥＧである、請求項８６に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  99. エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数が、３９９１＋／－４９０である、請求項９３に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  100. エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数が、約３５００～約４５００の間である、請求項９７に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  101. エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数が、約３５００～約３６００の間、約３６００～約３７００の間、約３７００～約３８００の間、約３８００～約３９００の間、約３９００～約４０００の間、約４０００～約４１００の間、約４１００～約４２００の間、約４２００～約４３００の間、約４３００～約４４００の間、又は約４４００～約４５００の間である、請求項９７に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  102. エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数が、少なくとも約３５００、少なくとも約３６００、少なくとも約３７００、少なくとも約３８００、少なくとも約３９００、少なくとも約４０００、少なくとも約４１００、少なくとも約４２００、少なくとも約４３００、少なくとも約４４００、又は少なくとも約４５００である、請求項９７に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  103. 前記負荷効率が、５６％～７９％である、請求項９７に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  104. 前記負荷効率が、約５０％～約８５％の間である、請求項９７に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  105. 前記負荷効率が、約５０％～約５５％の間、約５５％～約６０％の間、約６０％～約６５％の間、約６５％～約７０％の間、約７０％～約７５％の間、約７５％～約８０％の間、又は約８０％～約８５％の間である、請求項９７に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  106. 前記負荷効率が、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約８５％である、請求項９７に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  107. 前記アンカー部分［ＡＭ］が、トコフェロール－Ｃ８、トコフェロール、又はパルミチン酸－Ｃ６である、請求項８６に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  108. エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数が、４２４１＋／－７２２である、請求項１０６に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  109. エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数が、約３５００～約５０００の間である、請求項１０６に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  110. エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数が、約３５００～約３６００の間、約３６００～約３７００の間、約３７００～約３８００の間、約３８００～約３９００の間、約３９００～約４０００の間、約４０００～約４１００の間、約４１００～約４２００の間、約４２００～約４３００の間、約４３００～約４４００の間、約４４００～約４５００の間、約４５００～約４６００の間、約４６００～約４７００の間、約４７００～約４８００の間、約４８００～約４９００の間、又は約４９００～約５０００の間である、請求項１０６に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  111. エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数が、少なくとも約３５００、少なくとも約３６００、少なくとも約３７００、少なくとも約３８００、少なくとも約３９００、少なくとも約４０００、少なくとも約４１００、少なくとも約４２００、少なくとも約４３００、少なくとも約４４００、少なくとも約４５００、少なくとも約４６００、少なくとも約４７００、少なくとも約４８００、少なくとも約４９００、又は少なくとも約５０００である、請求項１０６に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  112. 前記負荷効率が、５７％～７３％である、請求項１０６に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  113. 前記負荷効率が、約５０％～約８０％の間である、請求項１０６に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  114. 前記負荷効率が、約５０％～約５５％の間、約５５％～約６０％の間、約６０％～約６５％の間、約６５％～約７０％の間、約７０％～約７５％の間、又は約７５％～約８０％の間である、請求項１０６に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  115. 前記負荷効率が、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、又は少なくとも約８０％である、請求項１０６に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  116. 前記エクソソームが、ＰＴＧＦＲＮを過剰に発現するエクソソームである、請求項８４に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  117. 前記エクソソームに結合したＡＳＯの負荷密度が、少なくとも約２倍増加している、請求項１１５に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  118. 前記アンカー部分［ＡＭ］が、コレステロール－Ｃ６である、請求項１１５に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  119. エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数が、２４４２＋／－３３９である、請求項１１７に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  120. エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数が、約２０００～約３０００の間である、請求項１１７に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  121. エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数が、約２０００～約２１００の間、約２１００～約２２００の間、約２２００～約２３００の間、約２３００～約２４００の間、約２４００～約２５００の間、約２５００～約２６００の間、約２６００～約２７００の間、約２７００～約２８００の間、約２８００～約２９００の間、又は約２９００～約３０００の間である、請求項１１７に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  122. エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数が、少なくとも約２０００、少なくとも約２１００、少なくとも約２２００、少なくとも約２３００、少なくとも約２４００、少なくとも約２５００、少なくとも約２６００、少なくとも約２７００、少なくとも約２８００、少なくとも約２９００、又は少なくとも約３０００である、請求項１１７に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  123. 前記負荷効率が、２７％～４６％である、請求項１１７に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  124. 前記負荷効率が、約２５％～約５０％の間である、請求項１１７に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  125. 前記負荷効率が、約２５％～約３０％の間、約３０％～約３５％の間、約３５％～約４０％の間、約４０％～約４５％の間、又は約４５％～約５０％の間である、請求項１１７に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  126. 前記負荷効率が、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、又は少なくとも約５０％である、請求項１１７に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  127. 前記アンカー部分［ＡＭ］が、コレステロール－ＴＥＧである、請求項１１５に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  128. エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数が、１７２８＋／－２６４である、請求項１２６に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  129. エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数が、約１４００～約２１００の間である、請求項１２６に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  130. エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数が、約１４００～約１５００の間、約１５００～約１６００の間、約１６００～約１７００の間、約１７００～約１８００の間、約１８００～約１９００の間、約１９００～約２０００の間、又は約２０００～約２１００の間である、請求項１２６に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  131. エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数が、少なくとも約１４００、少なくとも約１５００、少なくとも約１６００、少なくとも約１７００、少なくとも約１８００、少なくとも約１９００、少なくとも約２０００、又は少なくとも約２１００である、請求項１２６に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  132. 前記負荷効率が、１９％～３３％である、請求項１２６に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  133. 前記負荷効率が、約１５％～約３５％の間である、請求項１２６に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  134. 前記負荷効率が、約１５％～約２０％の間、約２０％～約２５％の間、約２５％～約３０％の間、又は約３０％～約３５％の間である、請求項１２６に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  135. 前記負荷効率が、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、又は少なくとも約３５％である、請求項１２６に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  136. 前記アンカー部分［ＡＭ］が、トコフェロール－Ｃ８、トコフェロール、又はパルミチン酸－Ｃ６である、請求項１１５に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  137. エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数が、２９７９＋／－１００６である、請求項１３５に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  138. エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数が、約１９００～約４０００の間である、請求項１３５に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  139. エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数が、約１９００～約２０００の間、約２０００～約２１００の間、約２１００～約２２００の間、約２２００～約２３００の間、約２３００～約２４００の間、約２４００～約２５００の間、約２５００～約２６００の間、約２６００～約２７００の間、約２７００～約２８００の間、約２８００～約２９００の間、約２９００～約３０００の間、約３０００～約３１００の間、約３１００～約３２００の間、約３２００～約３３００の間、約３３００～約３４００の間、約３４００～約３５００の間、約３５００～約３６００の間、約３６００～約３７００の間、約３７００～約３８００の間、約３８００～約３９００の間、又は約３９００～約４０００の間である、請求項１３５に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  140. エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数が、少なくとも約１９００、少なくとも約２０００、少なくとも約２１００、少なくとも約２２００、少なくとも約２３００、少なくとも約２４００、少なくとも約２５００、少なくとも約２６００、少なくとも約２７００、少なくとも約２８００、少なくとも約２９００、少なくとも約３０００、少なくとも約３１００、少なくとも約３２００、少なくとも約３３００、少なくとも約３４００、少なくとも約３５００、少なくとも約３６００、少なくとも約３７００、少なくとも約３８００、少なくとも約３９００、又は少なくとも約４０００である、請求項１３５に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  141. 前記負荷効率が、３７％～６８％である、請求項１３５に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  142. 前記負荷効率が、約３０％～約７５％の間である、請求項１３５に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  143. 前記負荷効率が、約３０％～約３５％の間、約３５％～約４０％の間、約４０％～約４５％の間、約４５％～約５０％の間、約５０％～約５５％の間、約５５％～約６０％の間、約６０％～約６５％の間、約６５％～約７０％の間、又は約７０％～約７５％の間である、請求項１３５に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  144. 前記負荷効率が、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、又は少なくとも約７５％である、請求項１３５に記載の細胞外ベシクル（ＥＶ）。
  145. 式：
    ［ＡＭ］－Ｌ１－［ＳＰ１］－Ｌ２－［ＳＰ２］－Ｌ３－［ＢＡＭ］
    （式中、［ＡＭ］は、コレステロール－ＴＥＧであり；Ｌ１は、ホスホジエステラーゼ切断性結合であり；ＳＰ１は、Ｃ３であり；Ｌ２は、ホスホロチオエート非切断性結合であり；ＳＰ２は、ＴＥＧであり；Ｌ３は、ホスホロチオエート非切断性結合である）によるアンカー部分［ＡＭ］を介してエクソソームに共有結合により連結したアンチセンスオリゴヌクレオチド［ＡＳＯ］を含むエクソソーム。
  146. 前記エクソソームが、天然のエクソソームである、請求項１４４に記載のエクソソーム。
  147. エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数が、約４７８０である、請求項１４５に記載のエクソソーム。
  148. エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数が、約４５００～約５０００の間である、請求項１４５に記載のエクソソーム。
  149. エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数が、少なくとも４５００である、請求項１４５に記載のエクソソーム。
  150. 負荷効率が、約８０％である、請求項１４５に記載のエクソソーム。
  151. 負荷効率が、約７０％～約９０％の間である、請求項１４５に記載のエクソソーム。
  152. 負荷効率が、少なくとも約７０％である、請求項１４５に記載のエクソソーム。
  153. 前記エクソソームが、ＰＴＧＦＲＮを過剰に発現するエクソソームである、請求項１４４に記載のエクソソーム。
  154. エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数が、約１６５９である、請求項１５２に記載のエクソソーム。
  155. エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数が、約１５００～約２０００の間である、請求項１５２に記載のエクソソーム。
  156. エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数が、少なくとも約１５００である、請求項１５２に記載のエクソソーム。
  157. 負荷効率が、約２８％である、請求項１５２に記載のエクソソーム。
  158. 負荷効率が、約２０％～約３５％の間である、請求項１５２に記載のエクソソーム。
  159. 負荷効率が、少なくとも約２０％である、請求項１５２に記載のエクソソーム。
  160. 式：
    ［ＡＭ］－Ｌ１－［ＳＰ１］－Ｌ２－［ＢＡＭ］
    （式中、［ＡＭ］は、コレステロール－ＴＥＧであり；Ｌ１は、ホスホジエステラーゼ切断性結合であり；ＳＰ１は、ＴＥＧであり；Ｌ２は、ホスホロチオエート非切断性結合である）によるアンカー部分［ＡＭ］を介して、エクソソームに共有結合により連結したアンチセンスオリゴヌクレオチド［ＡＳＯ］を含むエクソソーム。
  161. 前記エクソソームが、天然のエクソソームである、請求項１５９に記載のエクソソーム。
  162. エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数が、約４０９０である、請求項１６０に記載のエクソソーム。
  163. エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数が、約３５００～約４５００の間である、請求項１６０に記載のエクソソーム。
  164. エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数が、少なくとも３５００である、請求項１６０に記載のエクソソーム。
  165. 負荷効率が、約６８％である、請求項１６０に記載のエクソソーム。
  166. 負荷効率が、少なくとも約６０％である、請求項１６０に記載のエクソソーム。
  167. 負荷効率が、約６０％～約７０％の間である、請求項１６０に記載のエクソソーム。
  168. 前記エクソソームが、ＰＴＧＦＲＮを過剰に発現するエクソソームである、請求項１５９に記載のエクソソーム。
  169. エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数が、約１８９０である、請求項１６７に記載のエクソソーム。
  170. エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数が、約１４００～約２４００の間である、請求項１６７に記載のエクソソーム。
  171. エクソソーム当たりのＡＳＯ分子の平均数が、少なくとも約１４００である、請求項１６７に記載のエクソソーム。
  172. 負荷効率が、約３１％である、請求項１６７に記載のエクソソーム。
  173. 負荷効率が、約２０％～約４０％の間である、請求項１６７に記載のエクソソーム。
  174. 負荷効率が、少なくとも約２０％である、請求項１６７に記載のエクソソーム。

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