CN117377499A - 经由优化的接头和锚定部分与生物活性分子连接的细胞外囊泡 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及细胞外囊泡(例如，外泌体)，其包含经由优化的接头和锚定部分共价连接到细胞外囊泡的生物活性分子，其可用作防治或治疗癌症或其他疾病的药剂。本文还提供了用于生产细胞外囊泡的方法和使用细胞外囊泡治疗疾病或病症的方法。

Description

经由优化的接头和锚定部分与生物活性分子连接的细胞外 囊泡
相关申请的交叉引用
本PCT申请要求2021年2月17日提交的美国临时申请号63/150,523的优先权权益，其通过引用整体并入本文。
通过EFS-WEB以电子方式提交的序列表的引用
在本申请提交的以电子方式提交的序列表(名称：4000.125PC01_Seqlisting_ST25.txt；大小：766,399字节；以及创建日期：2022年2月17日)的内容以引用的方式整体并入本文。
技术领域
本公开提供了细胞外囊泡(EV)(例如，外泌体)，其可以用作防治或治疗癌症和其他疾病的药剂，其包括至少一种经由优化的接头(linker)和锚定部分连接到细胞外囊泡(例如，外泌体)的生物活性分子。
背景技术
很多生物活性化合物具有有治疗意义的有效生物活性。然而，这些化合物通常在非靶标器官中表现出毒性。限制非靶标组织暴露的一种方式是将小分子化学缀合至基于亲和力的试剂(例如抗体)，其可以将治疗性化合物引导至特定的细胞类型(Dosio,F.et al.,Toxins(Basel)3(7):848-883(2011))，但这种方法受到可以连接到抗体上的感兴趣化合物的分子数量(通常每个抗体2-6个分子)的限制，以及受到特异性结合到被靶向的相关患病/效应细胞而不结合到非靶标细胞的抗体的可用性/存在的限制。这两个问题分别通过降低效力和增加全身毒性来限制抗体-药物缀合物(ADC)的使用。因此，需要具有比ADC更高的有效负载(payload)的递送系统，其可以选择性地靶向特定组织或器官，同时限制治疗性化合物的总体全身暴露。
EV(例如，外泌体)是细胞间通讯的重要介质。它们也是许多疾病(例如癌症)的诊断和预后的重要生物标志物。作为药物递送载体，EV(例如，外泌体)在许多治疗领域作为一种新的治疗模式，提供了许多优于传统药物递送方法(例如，肽免疫、DNA疫苗)的优势。然而，尽管有其优点，许多EV(例如，外泌体)的临床效力有限。例如，在不能手术的非小细胞肺癌(NSCLC)患者的一线化疗后，将树枝状细胞来源的外泌体(DEX)在II期临床试验中作为维持免疫疗法进行了研究。然而，由于未达到主要终点(至少50％的患者在化疗停止后具有4个月的无进展生存时间(PFS))，该试验被终止。Besse,B.,et al.,Oncoimmunology 5(4):e1071008(2015)。
因此，需要新的、更有效的工程化EV(例如，外泌体)，以更好地实现基于EV的技术的治疗用途和其他应用。
发明内容
本公开提供了一种细胞外囊泡(EV)，其包括经由根据式：[AM]-L1-[SP1]-L2-[SP2]-L3-[BAM](式1)的锚定部分(AM)共价连接到EV的生物活性分子(BAM)，其中：[AM]是锚定部分；L1是可裂解或不可裂解的键联(linkage)；L2和L3是可选的可裂解或不可裂解的键联；SP1是可选的第一间隔子(spacer)；以及，SP2是可选的第二间隔子。
在一些方面，锚定部分[AM]包含固醇(sterol)、脂质、维生素、肽、或其组合以及可选地间隔子。在一些方面，可选的间隔子是烷基间隔子。在一些方面，烷基间隔子是C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14或C15。在一些方面，烷基间隔子是C6或C8。在一些方面，可选的间隔子是甘醇间隔子。在一些方面，甘醇间隔子具有2(二甘醇)、3(三甘醇)、4(四甘醇；TEG)、5(五甘醇)、6(六甘醇；HEG)、7、8、9、10、11、12、13、14或15个甘醇单元。在一些方面，甘醇间隔子是四甘醇(TEG)。
在一些方面，固醇选自由胆固醇、麦角固醇、7-脱氢胆固醇、24S-羟基胆固醇、羊毛固醇、环阿屯醇、岩藻固醇、大褐马尾藻固醇(saringosterol)、菜油固醇、β-谷固醇、谷甾烷醇、粪固醇、燕麦固醇和豆固醇组成的组。在一些方面，固醇是胆固醇。在一些方面，脂质是脂肪酸。在一些方面，脂肪酸是直链脂肪酸。在一些方面，脂肪酸是直链脂肪酸、支链脂肪酸、不饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸、羟基脂肪酸、多元羧酸、或其任何组合。在一些方面，直链脂肪酸是丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸或硬脂酸。在一些方面，直链脂肪酸是棕榈酸。在一些方面，维生素是维生素E(生育酚或生育三烯酚)、维生素D、维生素K、核黄素(riboflavin)、烟酸或吡哆醇(pyridoxine)。在一些方面，维生素是维生素E(生育酚或生育三烯酚)。
在一些方面，L1是包含磷酸二酯键的可裂解的键联或包含硫代磷酸酯键的不可裂解的键联。在一些方面，L2是可选的包含磷酸二酯酶键的可裂解的键联或包含硫代磷酸酯键的不可裂解的键联。在一些方面，L3是可选的包含磷酸二酯酶键的可裂解的键联或包含硫代磷酸酯键的不可裂解的键联。在一些方面，SP1可选的第一间隔子和/或SP2可选的第二间隔子独立地包括烷基间隔子、甘醇间隔子、或其组合。在一些方面，烷基间隔子是C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14或C15。在一些方面，烷基间隔子是C3或C6。在一些方面，甘醇间隔子具有2(二甘醇)、3(三甘醇)、4(四甘醇；TEG)、5(五甘醇)、6(六甘醇；HEG)、7、8、9、10、11、12、13、14或15个甘醇单元。在一些方面，甘醇间隔子是四甘醇(TEG)或六甘醇(HEG)。在一些方面，每个不可裂解的间隔子独立地选自烷基、二甘醇、三甘醇、四甘醇(TEG)、六甘醇(HEG)、五甘醇、聚乙二醇(PEG)、甘油、二甘油、三甘油、四甘油(TG)、五甘油、六甘油(HG)、聚甘油(PG)、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、或其任何组合。在一些方面，聚乙二醇(PEG)的特征在于式R1-(O-CH2-CH2)n-或R1-(O-CH2-CH2)n-O-，其中R1是氢、甲基或乙基，并且n是1至15之间的整数。在一些方面，聚甘油(PG)的特征在于式((R1—O—(CH2—CHOH—CH2O)n—)，其中R1是氢、甲基或乙基，并且n是1至15之间的整数。
在一些方面，L1、L2或L3可裂解的键联或其任何组合包括氧化还原可裂解的接头、活性氧可裂解的接头、pH依赖性可裂解的接头、酶可裂解的接头、蛋白酶可裂解的接头、酯酶可裂解的接头、磷酸酶可裂解的接头、光活化的可裂解的接头、自分解性的接头、或其任何组合。在一些方面，L1、L2或L3可裂解的键联或其任何组合包括自分解性的接头。在一些方面，L1、L2或L3可裂解的键联或其任何组合包括肉桂基、萘基、联苯基、杂环、同源芳族、香豆素、呋喃、噻吩、噻唑、噁唑、异噁唑、吡咯、吡唑、吡啶、咪唑酮、三唑、或其任何组合。
在一些方面，L1、L2或L3可裂解的键联或其任何组合具有式：-Aa-Yy-，其中每个–A-独立地是氨基酸单元或其组合，a独立地是1至15的整数；-Y-是间隔子单元，并且y是0、1或2。在一些方面，-Aa-是二肽、三肽、四肽、五肽或六肽、或其组合，其中组合中的每个二肽、三肽、四肽、五肽或六肽可以相同或不同。在一些方面，a是2，并且–Aa-是选自由缬氨酸-丙氨酸、缬氨酸-瓜氨酸、苯丙氨酸-赖氨酸、N-甲基缬氨酸-瓜氨酸、环己基丙氨酸-赖氨酸、谷氨酸-缬氨酸-瓜氨酸、和β-丙氨酸-赖氨酸组成的组。在一些方面，–Aa-是缬氨酸-丙氨酸、缬氨酸-瓜氨酸、或谷氨酸-缬氨酸-瓜氨酸。在一些方面，y是1。在一些方面，-Y-是自分解性的间隔子。在一些方面，–Yy-具有下式：
其中每个R2独立地是C1-8烷基、-O-(C1-8烷基)、卤素、硝基或氰基；并且m是0至4的整数。在一些方面，m是0、1或2。在一些方面，m是0。
在一些方面，L1、L2或L3可裂解的键联或其任何组合包括缬氨酸-丙氨酸-氨基甲酸对氨基苄酯、或缬氨酸-瓜氨酸-氨基甲酸对氨基苄酯。在一些方面，-Y-是非自分解性的间隔子。在一些方面，非自分解性的间隔子是–Gly-或–Gly-Gly-。
在一些方面，锚定部分[AM]包含支架蛋白。在一些方面，锚定部分[AM]和/或支架部分是支架X。在一些方面，支架X选自由前列腺素F2受体负调节因子(PTGFRN蛋白)；basigin(BSG蛋白)；免疫球蛋白超家族成员2(IGSF2蛋白)；免疫球蛋白超家族成员3(IGSF3蛋白)；免疫球蛋白超家族成员8(IGSF8蛋白)；整联蛋白β-1(ITGB1蛋白)；整联蛋白α-4(ITGA4蛋白)；4F2细胞表面抗原重链(SLC3A2蛋白)；ATP转运蛋白的类型(ATP1A1、ATP1A2、ATP1A3、ATP1A4、ATP1B3、ATP2B1、ATP2B2、ATP2B3和ATP2B4蛋白)；其功能性片段；及其任何组合组成的组。在一些方面，支架X是PTGFRN蛋白或其功能性片段。在一些方面，支架X包含如SEQ ID NO:302中列出的氨基酸序列。在一些方面，支架X包含与SEQ ID NO:302至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或约100％同一的氨基酸序列。在一些方面，生物活性分子[BAM]经由锚定部分[AM]连接到EV的外表面。在一些方面，生物活性分子[BAM]是多肽、肽、多核苷酸(DNA和/或RNA)、化学化合物、或其任何组合。在一些方面，生物活性分子[BAM]是化学化合物。在一些方面，化学化合物是小分子。
在一些方面，生物活性分子[BAM]包含反义寡核苷酸(ASO)、siRNA、miRNA、shRNA、mRNA、核酸、或其任何组合。在一些方面，生物活性分子[BAM]包含肽、蛋白质、抗体或其抗原结合片段、或其任何组合。在一些方面，其抗原结合片段包含scFv、(scFv)2、Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab1)2、Fv、dAb和Fd片段、双功能抗体(diabody)、抗体相关多肽、或其任何片段。在一些方面，生物活性分子[BAM]包含ASO。在一些方面，ASO靶向转录物。在一些方面，转录物是STAT6转录物、CEBP/β转录物、STAT3转录物、KRAS转录物、NRAS转录物、NLPR3转录物、或其任何组合。在一些方面，EV是外泌体。在一些方面，外泌体是天然外泌体。在一些方面，外泌体是过表达PTGFRN的外泌体或其功能性片段。
本公开提供了一种药物组合物，其包含本文所公开的细胞外囊泡和药学上可接受的载剂。
本公开提供了一种试剂盒，其包含本文所公开的EV或药物组合物和使用说明书。
本公开提供了在有需要的受试者中治疗或预防疾病或病症的方法，其包括向受试者施用本文所公开的EV或药物组合物。在一些方面，该疾病或病症是癌症、炎症性病症、神经退行性疾病、中枢神经疾病或代谢性疾病。在一些方面，EV通过静脉内、腹膜内、鼻内、经口、肌内、皮下、胃肠外或瘤内施用。
本公开提供了将生物活性分子(BAM)连接到EV的方法，其包括将锚定部分(AM)连接到EV，其中根据式：[AM]-L1-[SP1]-L2-[SP2]-L3-[BAM]将锚定部分连接到生物活性部分(BAM)，其中：[AM]是锚定部分；L1是可裂解或不可裂解的键联；L2和L3是可选的可裂解或不可裂解的键联；SP1是可选的第一间隔子；以及，SP2是可选的第二间隔子。
在一些方面，[AM]是胆固醇-C6、胆固醇-TEG、生育酚-C8、生育酚、或棕榈酸酯-C6。在一些方面，L1、L2或L3或其组合是磷酸二酯键。在一些方面，SP1是C3、C6、TEG或HEG。在一些方面，L1、L2或L3或其组合是硫代磷酸酯键。在一些方面，SP2是C3、C6、TEG或HEG。在一些方面，L1、L2或L3或其组合是硫代磷酸酯键。在一些方面，[BAM]是反义寡核苷酸(ASO)。
本公开提供了增加连接到EV的生物活性分子(BAM)的负载密度的方法，其包括筛选根据式：[AM]-L1-[SP1]-L2-[SP2]-L3-[BAM]连接到生物活性部分(BAM)的大量的锚定部分(AM)，其中：[AM]是锚定部分；L1是可裂解或不可裂解的键联；L2和L3是可选的可裂解或不可裂解的键联；SP1是可选的第一间隔子；以及，SP2是可选的第二间隔子。
在一些方面，[AM]是胆固醇-C6、胆固醇-TEG、生育酚-C8、生育酚、或棕榈酸酯-C6。在一些方面，L1、L2或L3或其组合是磷酸二酯键。在一些方面，SP1是C3、C6、TEG或HEG。在一些方面，L1、L2或L3或其组合是硫代磷酸酯键。在一些方面，SP2是C3、C6、TEG或HEG。在一些方面，L1、L2或L3或其组合是硫代磷酸酯键。在一些方面，[BAM]是反义寡核苷酸(ASO)。在一些方面，连接到EV的生物活性分子(BAM)的负载密度增加至少约1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少8倍、至少约9倍、或至少约10倍。
本公开提供了一种细胞外囊泡(EV)，其包括根据式：[AM]-L1-[SP1]-L2-[SP2]-L3-[ASO]经由锚定部分[AM]共价连接到EV的反义寡核苷酸[ASO]，其中：[AM]是选自由胆固醇-C6、胆固醇-TEG、生育酚-C8、生育酚和棕榈酸酯-C6组成的组的锚定部分；L1是磷酸二酯酶可裂解的键联；SP1是选自由C3、C6、TEG和HEG组成的组的可选的第一间隔子；L2是可选的硫代磷酸酯不可裂解的键联；SP2是选自由C3、C6、TEG和HEG组成的组的可选的第二间隔子；以及，L3是可选的硫代磷酸酯不可裂解的键联。
在一些方面，EV是外泌体。在一些方面，外泌体是天然外泌体。在一些方面，连接到外泌体的ASO的负载密度增加了至少约1.5倍。在一些方面，锚定部分[AM]是胆固醇-C6。在一些方面，每个外泌体的ASO分子的平均数量为5032+/-386。在一些方面，每个外泌体的ASO分子的平均数量在约4500至约5500之间。在一些方面，每个外泌体的ASO分子的平均数量在约4500至约4600之间、约4600至约4700之间、约4700至约4800之间、约4800至约4900之间、约4900至约5000之间、约5000至约5100之间、约5100至约5200之间、约5200至约5300之间、约5300至约5400之间、或约5400至约5500之间。在一些方面，每个外泌体的ASO分子的平均数量为至少约4500、至少约4600、至少约4700、至少约4800、至少约4900、至少约5000、至少约5100、至少约5200、至少约5300、至少约5400、或至少约5500。在一些方面，负载效率为73％至93％。在一些方面，负载效率在约70％至约95％之间。在一些方面，负载效率在约70％至约75％之间、约75％至约80％之间、约80％至约85％之间、约85％至约90％之间、或约90％至约95％之间。在一些方面，负载效率为至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、或至少约95％。在一些方面，锚定部分[AM]是胆固醇-TEG。在一些方面，每个外泌体的ASO分子的平均数量为3991+/-490。在一些方面，每个外泌体的ASO分子的平均数量在约3500至约4500之间。在一些方面，每个外泌体的ASO分子的平均数量在约3500至约3600之间、约3600至约3700之间、约3700至约3800之间、约3800至约3900之间、约3900至约4000之间、约4000至约4100之间、约4100至约4200之间、约4200至约4300之间、约4300至约4400之间、或约4400至约4500之间。在一些方面，每个外泌体的ASO分子的平均数量为至少约3500、至少约3600、至少约3700、至少约3800、至少约3900、至少约4000、至少约4100、至少约4200、至少约4300、至少约4400、或至少约4500。在一些方面，负载效率为56％至79％。在一些方面，负载效率在约50％至约85％之间。在一些方面，负载效率在约50％至约55％之间、约55％至约60％之间、约60％至约65％之间、约65％至约70％之间、约70％至约75％之间、约75％至约80％之间、或约80％至约85％之间。在一些方面，负载效率为至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、或至少约85％。在一些方面，锚定部分[AM]是生育酚-C8、生育酚或棕榈酸酯-C6。在一些方面，每个外泌体的ASO分子的平均数量为4241+/-722。在一些方面，每个外泌体的ASO分子的平均数量在约3500至约5000之间。在一些方面，每个外泌体的ASO分子的平均数量在约3500至约3600之间、约3600至约3700之间、约3700至约3800之间、约3800至约3900之间、约3900至约4000之间、约4000至约4100之间、约4100至约4200之间、约4200至约4300之间、约4300至约4400之间、约4400至约4500之间、约4500至约4600之间、约4600至约4700之间、约4700至约4800之间、约4800至约4900之间、或约4900至约5000之间。在一些方面，每个外泌体的ASO分子的平均数量为至少约3500、至少约3600、至少约3700、至少约3800、至少约3900、至少约4000、至少约4100、至少约4200、至少约4300、至少约4400、至少约4500、至少约4600、至少约4700、至少约4800、至少约4900、或至少约5000。在一些方面，负载效率为57％至73％。在一些方面，负载效率在约50％至约80％之间。在一些方面，负载效率在约50％至约55％之间、约55％至约60％之间、约60％至约65％之间、约65％至约70％之间、约70％至约75％之间、或约75％至约80％之间。在一些方面，负载效率为至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、或至少约80％。在一些方面，外泌体是过表达PTGFRN的外泌体。在一些方面，连接到外泌体的ASO的负载密度增加了至少约2倍。在一些方面，锚定部分[AM]是胆固醇-C6。在一些方面，每个外泌体的ASO分子的平均数量为2442+/-339。在一些方面，每个外泌体的ASO分子的平均数量在约2000至约3000之间。在一些方面，每个外泌体的ASO分子的平均数量在约2000至约2100之间、约2100至约2200之间、约2200至约2300之间、约2300至约2400之间、约2400至约2500之间、约2500至约2600之间、约2600至约2700之间、约2700至约2800之间、约2800至约2900之间、或约2900至约3000之间。在一些方面，每个外泌体的ASO分子的平均数量为至少约2000、至少约2100、至少约2200、至少约2300、至少约2400、至少约2500、至少约2600、至少约2700、至少约2800、至少约2900、或至少约3000。在一些方面，负载效率为27％至46％。在一些方面，负载效率在约25％至约50％之间。在一些方面，负载效率在约25％至约30％之间、约30％至约35％之间、约35％至约40％之间、约40％至约45％之间、或约45％至约50％之间。在一些方面，负载效率为至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、或至少约50％。在一些方面，锚定部分[AM]是胆固醇-TEG。在一些方面，每个外泌体的ASO分子的平均数量为1728+/-264。在一些方面，每个外泌体的ASO分子的平均数量在约1400至约2100之间。在一些方面，每个外泌体的ASO分子的平均数量在约1400至约1500之间、约1500至约1600之间、约1600至约1700之间、约1700至约1800之间、约1800至约1900之间、约1900至约2000之间、或约2000至约2100之间。在一些方面，每个外泌体的ASO分子的平均数量为至少约1400、至少约1500、至少约1600、至少约1700、至少约1800、至少约1900、至少约2000、或至少约2100。在一些方面，负载效率为19％至33％。在一些方面，负载效率在约15％至约35％之间。在一些方面，负载效率在约15％至约20％之间、约20％至约25％之间、约25％至约30％之间、或约30％至约35％之间。在一些方面，负载效率为至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、或至少约35％。在一些方面，锚定部分[AM]是生育酚-C8、生育酚或棕榈酸酯-C6。在一些方面，每个外泌体的ASO分子的平均数量为2979+/-1006。在一些方面，每个外泌体的ASO分子的平均数量在约1900至约4000之间。在一些方面，每个外泌体的ASO分子的平均数量在约1900至约2000之间、约2000至约2100之间、约2100至约2200之间、约2200至约2300之间、约2300至约2400之间、约2400至约2500之间、约2500至约2600之间、约2600至约2700之间、约2700至约2800之间、约2800至约2900之间、约2900至约3000之间、约3000至约3100之间、约3100至约3200之间、约3200至约3300之间、约3300至约3400之间、约3400至约3500之间、约3500至约3600之间、约3600至约3700之间、约3700至约3800之间、约3800至约3900之间、或约3900至约4000之间。在一些方面，每个外泌体的ASO分子的平均数量为至少约1900、至少约2000、至少约2100、至少约2200、至少约2300、至少约2400、至少约2500、至少约2600、至少约2700、至少约2800、至少约2900、至少约3000、至少约3100、至少约3200、至少约3300、至少约3400、至少约3500、至少约3600、至少约3700、至少约3800、至少约3900、或至少约4000。在一些方面，负载效率为37％至68％。在一些方面，负载效率在约30％至约75％之间。在一些方面，负载效率在约30％至约35％之间、约35％至约40％之间、约40％至约45％之间、约45％至约50％之间、约50％至约55％之间、约55％至约60％之间、约60％至约65％之间、约65％至约70％之间、或约70％至约75％之间。在一些方面，负载效率为至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、或至少约75％。
本公开提供了一种外泌体，其包括根据式：[AM]-L1-[SP1]-L2-[SP2]-L3-[BAM]经由锚定部分[AM]共价连接到外泌体的反义寡核苷酸[ASO]，其中：[AM]是胆固醇-TEG；L1是磷酸二酯酶可裂解的键；SP1是C3；L2是硫代磷酸酯不可裂解的键；SP2是TEG；以及，L3是硫代磷酸酯不可裂解的键。
在一些方面，外泌体是天然外泌体。在一些方面，每个外泌体的ASO分子的平均数量为约4780。在一些方面，每个外泌体的ASO分子的平均数量在约4500至约5000之间。在一些方面，每个外泌体的ASO分子的平均数量为至少4500。在一些方面，负载效率为约80％。在一些方面，负载效率在约70％至约90％之间。在一些方面，负载效率为至少约70％。在一些方面，外泌体是过表达PTGFRN的外泌体。在一些方面，每个外泌体的ASO分子的平均数量为约1659。在一些方面，每个外泌体的ASO分子的平均数量在约1500至约2000之间。在一些方面，每个外泌体的ASO分子的平均数量为至少约1500。在一些方面，负载效率为约28％。在一些方面，负载效率在约20％至约35％之间。在一些方面，负载效率为至少约20％。
本公开还提供了一种外泌体，其包括根据式：[AM]-L1-[SP1]-L2-[BAM]经由锚定部分[AM]共价连接到外泌体的反义寡核苷酸[ASO]，其中：[AM]是胆固醇-TEG；L1是磷酸二酯酶可裂解的键；SP1是TEG；以及L2是硫代磷酸酯不可裂解的键。
在一些方面，外泌体是天然外泌体。在一些方面，每个外泌体的ASO分子的平均数量为约4090。在一些方面，每个外泌体的ASO分子的平均数量在约3500至约4500之间。在一些方面，每个外泌体的ASO分子的平均数量为至少3500。在一些方面，负载效率为约68％。在一些方面，负载效率为至少约60％。在一些方面，负载效率在约60％至约70％之间。在一些方面，外泌体是过表达PTGFRN的外泌体。在一些方面，每个外泌体的ASO分子的平均数量为约1890。在一些方面，每个外泌体的ASO分子的平均数量在约1400至约2400之间。在一些方面，每个外泌体的ASO分子的平均数量为至少约1400。在一些方面，负载效率为约31％。在一些方面，负载效率在约20％至约40％之间。在一些方面，负载效率为至少约20％。
附图说明
图1是示出外泌体的一般结构(左)，与配体连接的示例性生物活性分子(例如，寡核苷酸)，其允许经由接头连接到外泌体的外表面(中)，以及经由接头连接到脂质锚定物(例如，胆固醇)的生物活性分子(例如，寡核苷酸)如何连接到外泌体的膜(右)的示意图。
图2是示出本申请中所公开的构建体的一般结构的示意图，其包括例如膜锚定部分(例如，脂质或脂质加间隔子)、生物活性分子和接头、或其组合。应注意，锚定部分可以表示包含疏水结构域的复杂分子。
图3示出了适用于固相合成的示例性膜锚定脂质块(block)。
图4示出了可以散布在锚定部分(例如，脂质)和生物活性分子(例如，ASO)之间的示例性间隔子及其组合。在每个间隔子之间可以包括稳定的或可裂解的接头。还示出了适用于固相合成的间隔子块。
图5示出了不同的构建体，其包括脂质锚定物(包括相关的接头，其中市售的锚定物包括接头)、间隔子的组合和ASO，其中FFLuc是与萤火虫萤光素酶蛋白的mRNA互补的ASO序列。当不同结构负载在天然外泌体上时，给出了负载效率、每个外泌体的ASO数量和每个外泌体的ASO数量的组平均值。ASO/EV的量与效力呈正相关，其中效力被确定为在细胞系中稳定表达的萤火虫萤光素酶表达的敲低(knock-down)的量。
图6示出了不同的构建体，其包括脂质锚定物(包括相关的接头，其中市售的锚定物包括接头)、间隔子的组合和ASO，其中FFLuc是与萤火虫萤光素酶蛋白的mRNA互补的ASO序列。当不同结构负载在过表达PTGFRN的外泌体上时，给出了负载效率、每个外泌体的ASO数量和每个外泌体的ASO数量的组平均值。ASO/EV的量与效力呈正相关，其中效力被确定为在细胞系中稳定表达的萤火虫萤光素酶表达的敲低的量。
图7示出了外泌体类型、锚定部分(即膜锚定物)、囊泡表面近端的间隔子(即间隔子1)和囊泡表面远端的间隔子(即间隔子2)对负载密度(即ASO/EV)的贡献的统计分析。在图7中，联合分析了天然EV和PrX EV(过表达PTGFRN)。生成R2≥0.91的综合最小二乘法模型，并证明外泌体类型、膜锚定物和间隔子1对负载密度有统计学意义(p<0.05)。这表明接头技术可以以平台方式应用于选定的ASO序列，接头组分的贡献在很大程度上独立于ASO序列。
图8A和8B示出了分别考虑天然EV和PrX EV的统计模型。为了提高统计模型的准确性，为天然外泌体(图8A；R2≥0.95)和过表达PTGFRN的外泌体(图8B；PrX；R2≥0.97)生成单独的最小二乘模型。
图8C示出了每种结构性质对每个外泌体的ASO分子的数量的相对贡献。膜锚定物、生育酚和间隔子1、C3为两种类型的外泌体提供了最大的负载密度增加。
图9A、9B和9C示出了具体的锚定物-间隔子构建体对天然外泌体中萤光素酶敲低的效力。实验中所使用的构建体如图9A所示。图9B示出了构建体T1-T9的效力。图9C示出了构建体C1-C9和L1-L3的效力。图9A中的箭头突出了提供最多萤光素酶敲低的结构。
图10A和10B示出了与用接头实现的负载密度相比，荧光素酶蛋白天然外泌体(图10A)或过表达PTGFRN的外泌体(图10B)的信号的敲低。最佳接头由萤火虫萤光素酶的最大ASO/EV负载和/或最小归一化表达来定义。胆固醇和生育酚-c8分别被证明是用于与天然外泌体和具有过表达PTGFRN的外泌体结合的最佳锚定部分。TEG和C3在间隔子1的选项的效力中提供了最大的增加。
图11示出了将用于生成示例4的锚定物-接头-ASO构建体的膜锚定物(脂质)、接头和反义寡核苷酸。每个ASO名称后的括号之间的数字表示所评估的不同接头结构的数量。
图12示出了示例4中给出的实验中的ASO的序列。FFLUC和RLUC以靶向的荧光报告基因命名。MYC和STAT6 ASO以ASO靶向的基因命名。Nb：LNA残基(包括LNA-5MeC和LNA T/LNA-5MeU)。Nm：2'-O'MOE残基(包括MOE-5MeC和MOE-T/MOED-5MeU)。dN：DNA残基。(5MdC)：5-甲基-dC。s：硫代膦酸酯骨架修饰。
图13A示出了生成统计模型(R2＝0.86)以确定不同结构参数对外泌体上的负载密度的贡献。所考虑的结构参数为ASO、间隔子1、间隔子2和膜锚定物。
图13B示出了与exoASO-STAT6对照(Chol-TEG-HEG接头)相比，每一个被测的接头构建体的每个外泌体的ASO构建体的数量。
图13C是每个接头组分对负载密度的相对影响的示意图。
图14A-14E示出了表示在不同缓冲液中孵育2、4或8天后，与负载有包含STAT6 ASO的结构(构建体)的外泌体相关的ASO的量的稳定性图。所评估的结构是胆固醇-TEG-无-STAT6(图14A)；胆固醇-C6-C3-STAT6(图14B)；生育酚-C8-TEG-STAT6(图14C)；生育酚-TEG-HEG-STAT6(图14D)；和棕榈酸酯-C6-HEG-STAT6(图14E)。
图15提供了稳定性和负载密度结果的总结。当外泌体在高盐或高盐加蔗糖条件下储存时，稳定性更高，与温度无关。在没有蔗糖的高盐条件下，外泌体在高温下更稳定。在低盐条件下负载密度较低。用胆固醇或生育酚脂质锚定物构建的ASO比具有棕榈酸酯的接头具有更高的负载密度。在高盐和低温条件下，具有单个间隔子的ASO构建体比具有两个间隔子的ASO构建体不稳定。
图16示出了在所测试的盐、温度和蔗糖条件下，颗粒计数没有变化。
图17示出了在所测试的盐、温度和蔗糖条件下，颗粒尺寸没有变化。
图18示出了对于exoASO-STAT6对照，每个外泌体的效力与负载密度呈正相关。
图19A示出了具有POI/PS变体的脂质-接头-ASO结构设计的示例。PO：磷酸二酯；PSA：硫代磷酸酯。
图19B示出了以基于ASO浓度(nM)归一化的IC50值测量的效力。
图19C示出了以基于每个外泌体颗粒(p/mL)归一化的IC50值测量的效力。
图20示出了具有五种不同接头的exoASO的稳定性。％相关ASO损失根据以下公式计算：％相关ASO损失＝([ASO]0-[ASO]N)/[ASO]0，其中[ASO]0是第0天的总相关ASO浓度，[ASO]N是第N天的相关ASO浓度。
图21示出了通过颗粒浓度测量的具有五种不同接头的exoASO的稳定性，其在4℃下保持稳定超过8天。
图22示出了通过颗粒尺寸测量的具有五种不同接头的exoASO的稳定性，其在4℃下保持稳定超过8天。
图23A示出了具有Val-Cit可裂解的接头机制的脂质-接头-ASO结构设计的示例，其中ASO是STAT6 ASO。
图23B示出了图23A中呈现的构建体的效力，其测量为基于ASO浓度(nM)归一化的IC50值。
图24示出了脂质-接头-ASO设计的示例，其中ASO是EGFP ASO。
图25示出了具有氧化还原可裂解的接头机制的示例性脂质-接头-ASO设计，其中ASO是STAT6 ASO。
图26示出了图25中呈现的构建体的效力，其测量为基于ASO浓度(nM)归一化的IC50值。
图27示出了脂质-接头-ASO构建体(在这种情况下为靶向EGFP的ASO)的负载、纯化和表征过程的示意图。
图28示出了EGFP剪接拯救实验(rescue assay)的发展的示意图。开发了293AAV-pCB-2754细胞系，以评估具有各种接头的EGFP和exoEGFP的功效。654处的点突变导致不能完全转录EGFP；因此，没有观察到来自EGFP或纳米萤光素酶的荧光。通过用ASO处理，EGFP得到拯救，因此，观察到EGFP和纳米萤光素酶信号。纳米荧光素酶的荧光用于功效的高通量定量。还示出EGFP ASO的修饰序列。Nm：2'-O'MOE残基(包括MOE-5MeC和MOE-T/MOED-5MeU)；s：硫代膦酸酯骨架修饰。EGFP ASO的碱基序列是GCTATTACCTTAACCCAG(SEQ ID NO:1093)。
图29示出了在EGFP剪接拯救实验中使用的新开发的细胞系在三个剂量水平下的细胞活力(CTG测定)和功效方面的表征。
图30示出了使用EGFP剪接拯救实验的具有各种PO和不可裂解PEG接头的exoASO-EGFP的负载密度和功效。“低”和“高”是对成对实验中实现的负载密度的相对定性参考，其中通过调节负载温度和ASO浓度来控制负载密度。下图中的图例描述了效力测定中向每个样本施用ASO的剂量。
具体实施方式
本公开涉及细胞外囊泡(EV)(例如，外泌体)，其包括至少一种经由优化的接头和锚定部分共价连接到EV(例如，外泌体)的生物活性分子及其用途。在本公开中示出了各个方面的非限制性示例。
在更详细地描述本公开之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定组合物或过程步骤，因此当然可以变化。本领域技术人员在阅读本公开后将明白，本文所描述和说明的每个单个的方面都具有离散的组分和特征，该离散的组分和特征可以在不脱离本发明的范围或精神的情况下，容易地与另外几个方面中的任一个的特征分离或组合。任何列举的方法都可以按照列举的事件的顺序或逻辑上可能的任何其他顺序进行。
本文提供的标题不限制本公开的各个方面，可以通过整体参考本说明书而定义。还应当理解，本文所用的术语仅用于描述具体方面的目的，而不旨在进行限制，因为本公开的范围将仅由所附权利要求限定。
因此，如下直接定义的术语通过整体参考说明书被更详细地定义。
I.定义
为了能够更容易地理解本说明书，首先定义某些术语。另外的定义在整个详细描述中阐述。
应注意，术语“一个/种(a或an)”实体是指一个/种或多个/种该实体；例如，“核苷酸序列”应理解为表示一个或多个核苷酸序列。因此，术语“一个/种(a或an)”、“一个/种或多个/种”和“至少一个/种”在本文中可互换地使用。应进一步注意，权利要求可拟订成不包括任何可选的元素。因此，此陈述意图用作与权利要求要素的描述联合使用此类排他性术语如“单独地”、“仅仅”等或使用否定限制的在先基础。
此外，本文使用的“和/或”应被视为具体地公开两个指定特征或组分中的每个与或不与另一个一起存在。因此，如在诸如“A和/或B”的短语中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独的)和“B”(单独的)。同样，如在诸如“A、B和/或C”的短语中使用术语“和/或”旨在包括以下方面的每一方面：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独的)；B(单独的)；和C(单独的)。
应当理解，本文无论在何处用措辞“包括(comprising)”来描述方面，都还提供了以“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的其他类似方面。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开相关的领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。例如，the Concise Dictionary of Biomedicineand Molecular Biology,Juo,Pei-Show,2nd ed.,2002,CRC Press；The Dictionary ofCell and Molecular Biology,3rd ed.,1999,Academic Press；和the OxfordDictionary of Biochemistry and Molecular Biology,Revised,2000,OxfordUniversity Press为技术人员提供了本公开中使用的许多术语的通用词典。
单位、前缀和符号以它们的国际单位制(Système International de Unites)(SI)认可的形式表示。数值范围包括定义范围的数值。在列举值范围的情况下，应当理解，还具体公开了该范围的所列举的上限与下限之间的每个中间整数值及其每个分数，以及此类值之间的每个子范围。任何范围的上限和下限可以独立地包括在该范围内或从该范围中排除，并且包括两个限值中的任一个、两个限值都不包括或两个限制都包括在内的每个范围也涵盖在本公开中。因此，本文所列举的范围应理解为该范围内所有值(包括所列举端点)的简写。例如，1至10的范围被理解为包括来自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10组成的组中的任何数值、数值组合或子范围。
在明确列举值的情况下，应当理解，在数量或量上与所列举的值大致相同的值也在本公开的范围内。在公开组合的情况下，该组合的要素的每个子组合也被具体公开，并且在本公开的范围内。相反，在单个地公开不同要素或要素组的情况下，也公开了所述要素或要素组的组合。在本公开的任何要素被公开为具有多个替代方案的情况下，其中每个替代方案被单独排除或者与其他替代方案的任何组合被排除的本公开的示例也由此而被公开；超过一个本公开的要素可具有此类排除，并且具有此类排除的要素的所有组合均特此被公开。
核苷酸以其普遍接受的单字母代码提及。除非另有说明，否则核苷酸序列从左至右以5'至3'方向书写。核苷酸在本文中以其由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的众所周知的单字母符号提及。因此，A代表腺嘌呤，C代表胞嘧啶，G代表鸟嘌呤，T代表胸腺嘧啶，U代表尿嘧啶。
氨基酸序列从左至右以氨基至羧基的方向书写。氨基酸可以在本文中由其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。
术语“约”在本文中用于意指大致近似地、左右或在……范围内。当术语“约”与数值范围结合使用时，它通过扩展所示的数值的上限和下限来修饰该范围。一般而言，术语“约”可以通过例如向上或向下(升高或降低)10％的变化来修饰大于和小于所述值的数值。
术语“施用(administration、administering)”及其语法变型是指经由药学上可接受的途径将本公开的组合物(诸如EV(例如，外泌体))引入受试者。通过任何合适的途径将本公开的组合物(诸如EV(例如，外泌体))引入受试者，所述途径包括瘤内、经口、肺内、鼻内、胃肠外(静脉内、动脉内、肌肉内、腹膜内或皮下)、直肠内、淋巴内、鞘内、眼周或局部途径。施用包括自我施用和由其他人施用。合适的施用途径允许组合物或试剂执行其预期功能。例如，如果合适的途径是静脉内途径，则通过将组合物或试剂引入受试者的静脉来施用组合物。
如本文中所用，术语“激动剂”是指结合受体并活化受体以产生生物反应的分子。受体可被内源性或外源性激动剂活化。内源性激动剂的非限制性示例包括激素、神经递质和环状二核苷酸。外源性激动剂的非限制性示例包括药物、小分子和环状二核苷酸。激动剂可以是完全、部分或反向激动剂。
术语“氨基酸置换”是指将亲本序列或参考序列(例如，野生型序列)中存在的一个氨基酸残基用另一个氨基酸残基取代。例如，经由化学肽合成或通过本领域已知的重组方法，可以在亲本或参考序列(例如，野生型多肽序列)中置换氨基酸。因此，提及“在X位置换”是指X位存在的氨基酸被替代性的氨基酸残基置换。在一些方面，置换模式可以根据模式AnY来描述，其中A是对应于天然或最初存在于n位的氨基酸的单字母代码，并且Y是置换氨基酸残基。在其他方面，置换模式可以根据模式An(YZ)来描述，其中A是对应于置换天然或最初存在于n位的氨基酸的氨基酸残基的单字母代码，并且Y和Z是置换可以替代A的氨基酸残基的替代方案。
如本文中所用，术语“拮抗剂”是指阻断或抑制激动剂介导的反应的分子，而不是在结合到受体时自身引发生物反应的分子。许多拮抗剂通过与受体上结构确定的结合位点上的内源性配体或底物竞争来实现其效力。拮抗剂的非限制性示例包括α阻断剂、β阻断剂和钙通道阻断剂。拮抗剂可以是竞争性、非竞争性拮抗剂或无竞争性拮抗剂。
如本文所用，术语“抗体”涵盖不论天然或部分或全部以合成方式产生的免疫球蛋白及其片段。该术语还涵盖任何具有与免疫球蛋白结合结构域同源的结合结构域的蛋白质。“抗体”还包括多肽，其包含来自免疫球蛋白基因或其片段的特异性结合和识别抗原的框架区。术语抗体的使用意在包括完全抗体、多克隆抗体、单克隆抗体和重组抗体、它们的片段，并且还包括单链抗体、人源化抗体、鼠抗体、嵌合单克隆抗体、小鼠-人类单克隆抗体、小鼠-灵长类动物单克隆抗体、灵长类动物-人类单克隆抗体、抗独特型抗体、抗体片段(例如，如scFv、(scFv)2、Fab、Fab'和F(ab')2、F(ab1)2、Fv、dAb和Fd片段)、双功能抗体和抗体相关多肽。抗体包括双特异性抗体和多特异性抗体，只要它们表现出所需的生物活性或功能。在本公开的一些方面，生物活性分子是抗体或包含其抗原结合片段的分子。
术语“抗体-药物缀合物”和“ADC”可互换使用，是指(例如，共价地)连接到一种或多种治疗剂(本文有时称为药剂、药物或活性药物成分)的抗体。在本公开的一些方面，生物活性分子是抗体-药物缀合物。
如本文所用，当应用于一个或多个目的值时，术语“约”是指与所述参考值相似的值。在某些方面，术语“约”是指落入所述参考值任一方向(大于或小于)中的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少的一系列值，除非另有说明或从上下文中另外显而易见的(除非该数字超过可能值的100％)。
术语“芳基”是指碳环芳族基团。芳基基团的示例包括但不限于苯基、萘基和蒽基。碳环芳族基团可以是未取代的或被一个或多个基团取代，所述一个或多个基团包括但不限于-C1-8烷基、-O-(C1-8烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2-、-NHC(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2和-CN，其中每个R'独立地是H、-C1-8烷基或芳基。
术语“亚芳基”是指具有两个共价键的芳基基团，可以是邻位、间位或对位构型，如以下结构所示：
其中苯基基团可以是未取代的或被至多四个基团取代，所述基团包括但不限于-C1-8烷基、-O-(C1-8烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2-、-NHC(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2和-CN，其中每个R'独立地是H、-C1-8烷基或芳基。
如本文所用，术语“生物活性分子”是指可以经由锚定部分连接到EV(例如，外泌体)的任何分子，其中该分子可以在有需要的受试者中具有治疗或防治作用，或者用于诊断目的。因此，例如，术语生物活性分子包括蛋白质(例如，抗体、蛋白质、多肽及其衍生物、片段和变体)、脂质及其衍生物、碳水化合物(例如，糖蛋白中的聚糖部分)或小分子。在一些方面，生物活性分子是放射性同位素。在一些方面，生物活性分子是可检测部分，例如，放射性核素、荧光分子或造影剂。在一些方面，生物活性分子可以是或可以包括靶向部分或向性(tropism)部分。在一些方面，生物活性分子可以是或可以包括例如亲和配体，例如生物素。在一些方面，生物活性分子可以是或可以包括能够改善药代动力学或药效学性质的部分，例如能够增加血浆半衰期的部分，如PEG部分。
如本文所用，术语“C1-8烷基”是指具有1至8个碳原子的直链或支链饱和烃。代表性“C1-8烷基”基团包括但不限于甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基、异丙基、仲丁基、异丁基、叔丁基、异戊基和2-甲基丁基。
术语“C1-10亚烷基”是指式–(CH2)1-10-的饱和直链烃基。C1-10亚烷基的示例包括亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基、亚庚基、亚辛基、亚壬基和亚癸基。
术语“C3-8碳环”是指3元、4元、5元、6元、7元或8元饱和或不饱和非芳族碳环。代表性C3-8碳环包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环戊二烯基、环己基、环己烯基、1,3-环己二烯基、1,4-环己二烯基、环庚基、1,3-环庚二烯基、1,3,5-环庚三烯基、环辛基和环辛二烯基。C3-8碳环基团可以是未取代的或被一个或多个基团取代，所述基团包括但不限于-C1-8烷基、-O-(C1-8烷基)、芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2-、-NHC(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2和-CN，其中每个R'独立地是H、-C1-8烷基或芳基。
术语“C3-8碳环”是指上文定义的C3-8碳环基团，其中碳环的氢原子中的一个或多个被键替代。
术语“C3-8杂环”是指芳族或非芳族C3-8碳环，其中环碳原子中的一个至四个独立地被杂原子替代，该杂原子选自由O、S和N组成的组。C3-8杂环的代表性示例包括但不限于苯并呋喃基、苯并噻吩、吲哚基、苯并吡唑基、香豆素基、异喹啉基、吡咯基、噻吩基、呋喃基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、三唑基、喹啉基、嘧啶基、吡啶基、吡啶酮基、吡嗪基、哒嗪基、异噻唑基、异噁唑基和四唑基。C3-8杂环可以是未取代的或被至多七个基团取代，所述基团包括但不限于-C1-8烷基、-O-(C1-8烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2-、-NHC(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2和-CN，其中每个R'独立地是H、-C1-8烷基或芳基。
术语“C3-8杂环”是指上文定义的C3-8杂环基团，其中杂环基团的氢原子中的一个被键替代。C3-8杂环可以是未取代的或被至多六个基团取代，所述基团包括但不限于-C1-8烷基、-O-(C1-8烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2-、-NHC(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2和-CN，其中每个R'独立地是H、-C1-8烷基或芳基。
“保守的氨基酸置换”是氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，如果多肽中的一个氨基酸被来自相同侧链家族的另一个氨基酸替代，则这种置换被认为是保守的。在另一个方面，氨基酸串可以被侧链家族成员的顺序和/或组成不同而结构上类似的串保守替代。
如本文所用，术语“保守的”分别指多核苷酸序列或多肽序列的核苷酸或氨基酸残基，它们是在被比较的两个或更多个序列的相同位置上未改变的那些。相对保守的核苷酸或氨基酸是在比序列中别处存在的核苷酸或氨基酸更相关的序列中保守的核苷酸或氨基酸。
在一些方面，如果两个或更多个序列彼此100％同一，则它们被称为“完全保守的”或“同一的”。在一些方面，如果两个或更多个序列彼此至少70％同一、至少80％同一、至少90％同一或至少95％同一，则它们被称为“高度保守的”。在一些方面，如果两个或更多个序列彼此约70％同一、约80％同一、约90％同一、约95％同一、约98％或约99％同一，则它们被称为“高度保守的”。在一些方面，如果两个或更多个序列彼此至少30％同一、至少40％同一、至少50％同一、至少60％同一、至少70％同一、至少80％同一、至少90％同一或至少95％同一，则它们被称为“保守的”。在一些方面，如果两个或更多个序列彼此约30％同一、约40％同一、约50％同一、约60％同一、约70％同一、约80％同一、约90％同一、约95％同一、约98％同一或约99％同一，则它们被称为“保守的”。序列的保守性可以适用于多核苷酸或多肽的全长或者可以适用于它们的部分、区域或特征。
如本文所用，术语“常规EV蛋白”意指此前已知富集于EV中的蛋白质。
如本文所用，术语“常规外泌体蛋白”意指此前已知富集于外泌体中的蛋白质，所述蛋白质包括但不限于CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPI锚定蛋白、乳凝集素LAMP2和LAMP2B、它们的片段、或与它们结合的肽。
如本文所用，术语“衍生物”是指EV(例如，外泌体)、组分(例如，蛋白，诸如支架X、脂质或碳水化合物)或生物活性分子(例如，多肽、多核苷酸、脂质、碳水化合物、抗体或它们的片段、PROTAC等)，所述生物活性分子已经被化学修饰为引入反应性部分(例如，亚磷酰胺部分)。
术语“赋形剂”和“载剂”可互换使用，是指添加至药物组合物中以进一步促进化合物的施用的惰性物质。
如本文所用，术语“细胞外囊泡”、“EV”以及它们的语法变型可互换使用，是指包含包封内部空间的膜的细胞来源的囊泡。细胞外囊泡包括所有与膜结合的囊泡(例如，外泌体、纳米囊泡)，其直径小于其所源自的细胞的直径。在一些方面，细胞外囊泡的直径在20nm至1000nm的范围内，并且可包含在内部空间(即，腔)内、展示在细胞外囊泡的外表面上和/或跨膜的各种大分子有效负载。在一些方面，有效负载可以包括核酸、蛋白质、碳水化合物、脂质、小分子和/或它们的组合。在某些方面，细胞外囊泡包括支架部分。例如但不限于，细胞外囊泡包括凋亡小体、细胞片段、通过直接或间接操纵(例如，通过连续挤出或用碱性溶液进行的处理)而来源于细胞的囊泡、含有小囊的细胞器，以及由活细胞产生的囊泡(例如，通过直接质膜出芽或晚期内体(endosome)与质膜融合)。细胞外囊泡可源自活的或死的生物体、外植组织或器官、原核或真核细胞和/或培养的细胞。在一些方面，细胞外囊泡由表达一种或多种转基因产物的细胞产生。
如本文所用，术语“外泌体”是指直径在20-300nm之间(例如，在40-200nm之间)的细胞外囊泡。外泌体包含包封内部空间(即，腔)的膜，并且在一些方面，可以通过直接质膜出芽或通过晚期内体与质膜的融合而从细胞(例如，生产细胞)生成。在某些方面，外泌体包含支架部分。如下文所述，外泌体可以来源于生产细胞，并且基于其尺寸、密度、生物化学参数、或它们的组合从生产细胞中分离。在一些方面，本公开的外泌体由表达一种或多种转基因产物的细胞产生。
在一些方面，本公开的EV(例如，外泌体，例如，纳米囊泡)通过将至少一种生物活性分子(例如，蛋白质，诸如抗体或ADC、RNA或DNA(诸如反义寡核苷酸)、小分子药物、毒素)经由锚定部分共价连接到EV(例如，外泌体，例如，纳米囊泡)来工程化。
在一些方面，本公开的EV(例如，外泌体或纳米囊泡)可以包含在内部空间(即，腔)内、显示在EV的外部(外)表面或内部(腔)表面上和/或跨膜的各种大分子有效负载。在一些方面，有效负载可以包括例如核酸、蛋白质、碳水化合物、脂质、小分子和/或它们的组合。在某些方面，EV(例如，外泌体)包含支架部分(例如，支架X)。EV(例如，外泌体)可以来源于活的或死的生物体、外植组织或器官、原核或真核细胞和/或培养的细胞。在一些方面，EV(例如，外泌体)由表达一种或多种转基因产物的细胞产生。在其他方面，本公开的EV是但不限于纳米囊泡、微粒体、微囊泡、胞外体或凋亡小体。
图1是示出外泌体的一般结构，与配体连接的示例性生物活性分子(例如，寡核苷酸)，其允许经由接头连接到外泌体的外表面，以及经由接头连接到脂质锚定物(例如，胆固醇)的生物活性分子(例如，寡核苷酸)如何连接到外泌体的膜的示意图。
如本文所用，术语蛋白质(例如，生物活性分子，诸如治疗性蛋白质或支架蛋白(诸如支架X))的“片段”是指与天然存在的蛋白质相比，蛋白质的氨基酸序列比天然存在的序列更短、N-末端和/或C-末端缺失或蛋白质的任何部分缺失。
如本文中所用，术语“功能性片段”是指保留蛋白质功能的蛋白质片段。因此，在一些方面，支架蛋白(例如，支架X蛋白)的功能性片段保留了将生物活性分子锚定在EV(例如，外泌体)的腔表面或外表面上的能力。
片段是否是功能性片段可以通过任何本领域已知的测定EV(例如，外泌体)的蛋白质含量的方法来评估，所述方法包括蛋白质印迹、FACS分析和片段与自发荧光蛋白(如，例如GFP)的融合。在某些方面，支架X蛋白的功能性片段保留了天然存在的支架X蛋白将生物活性分子锚定在EV(例如，外泌体)的腔或外表面上的能力的例如至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。
如本文所用，将生物活性分子经由支架蛋白“锚定”在本公开的EV(例如，外泌体)的腔或外表面上是指将生物活性分子分别共价连接或非共价连接到位于EV(例如，外泌体)的腔或外表面的支架分子部分上。
如本文所用，术语“同源性”是指聚合物分子之间的总相关性，例如核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总相关性。通常，术语“同源性”意味着两个分子之间的进化关系。因此，同源的两个分子将具有共同的进化祖先。在本公开的上下文中，术语同源性涵盖同一性和相似性。
在一些方面，如果聚合物分子中至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的单体同一(完全相同的单体)或相似(保守置换)，则所述聚合物分子被认为是彼此“同源的”。术语“同源的”必然是指至少两个序列(多核苷酸或多肽序列)之间的比较。
在本公开的上下文中，置换(即使它们被称为氨基酸置换)在核酸水平上进行，即通过将编码第一氨基酸的密码子置换为编码第二氨基酸的密码子来进行将氨基酸残基置换为替代性氨基酸残基。
如本文所用，术语“同一性”是指聚合分子之间，例如多肽分子或多核苷酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)之间的总单体保守性。无任何附加限定词的术语“同一的”，例如蛋白质A与蛋白质B同一，意味着序列100％同一(100％序列同一性)。将两个序列描述为例如“70％同一”相当于将它们描述为具有例如“70％序列同一性”。
例如，两个多肽序列的同一性百分比的计算可以通过出于最佳比较目的而对两个序列进行的比对来进行(例如，可以在第一多肽序列和第二多肽序列中的一者或二者中引入空位(gap)以实现最佳比对，出于比较目的，可以忽略不相同的序列)。在某些方面，出于比较目的而比对的序列的长度为参考序列长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。然后比较相应氨基酸位置的氨基酸。
当第一序列中的一个位置被与第二序列中的相应位置相同的氨基酸占据时，则该位置的分子是相同的。两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置数量的函数，考虑到空位的数量和每个空位的长度，需要引入空位以实现两个序列的最佳比对。序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的确定可以使用数学算法来完成。
合适的软件程序可以从各种来源获得，并且可用于蛋白质和核苷酸序列二者的比对。确定序列同一性百分比的一种合适的程序是bl2seq，其为可从美国政府国家生物技术信息中心BLAST网站(blast.ncbi.nlm.nih.gov)获得的BLAST程序套件的一部分。Bl2seq使用BLASTN或BLASTP算法在两个序列之间进行比较。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。其他合适的程序是例如Needle、Stretcher、Water或Matcher，其为生物信息学程序的EMBOSS套件的一部分，并且也可在www.ebi.ac.uk/Tools/psa.上从欧洲生物信息学研究所(EBI)获得。
序列比对可以使用本领域已知的方法(诸如MAFFT、Clustal(ClustalW、Clustal X或Clustal Omega)、MUSCLE等)进行。
与多核苷酸或多肽参考序列比对的单个多核苷酸或多肽靶序列内的不同区域可以各自具有它们自己的序列同一性百分比。应注意，序列同一性百分比值四舍五入至最接近的十分位。例如，80.11、80.12、80.13和80.14向下舍入到80.1，而80.15、80.16、80.17、80.18和80.19向上舍入到80.2。还应注意，长度值将始终是整数。
在某些方面，第一氨基酸序列(或核酸序列)与第二氨基酸序列(或核酸序列)的同一性百分比(％ID)的计算式为％ID＝100×(Y/Z)，其中Y是在第一序列和第二序列的比对(如通过目视检查或特定的序列比对程序比对)中评分为相同匹配的氨基酸残基(或核碱基)数，并且Z是第二序列中的残基总数。如果第一序列的长度长于第二序列，则第一序列与第二序列的同一性百分比将高于第二序列与第一序列的同一性百分比。
本领域技术人员将理解，用于计算序列同一性百分比的序列比对的生成不限于仅由一级序列数据驱动的二进制序列-序列比较。还应理解，序列比对可通过将序列数据与来自异构源的数据(诸如结构数据(例如，晶体学蛋白质结构)、功能数据(例如，突变的位置)或系统发育数据)整合而生成。整合异构数据以生成多重序列比对的合适程序是可在www.tcoffee.org上获得，以及可替代地可以例如从EBI获得的T-Coffee。还应理解，用于计算百分比序列同一性的最终比对可以自动地或手动地加以验证。
如本文所用，术语“分离的”、“纯化的”、“提取的”及其语法变型可互换使用，并且是指已进行一个或多个纯化过程(例如，所需EV(例如，外泌体)的制剂的选择或富集)的所需EV(例如，多个已知或未知量的和/或浓度的EV)的制剂状态。在一些方面，如本文所用的分离或纯化是从含有生产细胞的样品中除去、部分除去(例如，一部分)EV(例如，外泌体)的过程。在一些方面，分离的EV(例如，外泌体)组合物没有可检测的非所需活性，或可替代地，非所需活性的水平或量处于或低于可接受的水平或量。在其他方面，分离的EV(例如，外泌体)组合物所需EV(例如，外泌体)的量和/或浓度处于或高于可接受的量和/或浓度。在其他方面，与从中获得组合物的起始材料(例如，生产细胞制剂)相比，分离的EV(例如，外泌体)组合物得到富集。与起始材料相比，这种富集可以富集至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.9％、至少约99.99％、至少约99.999％、至少约99.9999％或大于99.9999％。在一些方面，分离的EV(例如，外泌体)制剂基本上不含残留的生物产物。在一些方面，分离的EV(例如，外泌体)制剂100％不含、至少约99％不含、至少约98％不含、至少约97％不含、至少约96％不含、至少约95％％不含、至少约94％不含、至少约93％不含、至少约92％不含、至少约91％不含或至少约90％不含任何污染性生物物质。残留生物产物可以包括非生物材料(包括化学物质)或不合需要的核酸、蛋白质、脂质或代谢物。基本上不含残留的生物产物还可以意味着EV(例如，外泌体)组合物不含可检测的生产细胞，并且只有EV(例如，外泌体)是可检测的。
术语“连接的”、“融合的”及其语法变型可互换使用，并指将第一部分(例如，第一氨基酸序列或核苷酸序列)分别共价连接或非共价连接到第二部分(例如，第二氨基酸序列、核苷酸序列)和/或脂质(例如，胆固醇)。第一部分可以与第二部分直接连接或并置(juxtaposed)，或可替代地，介入部分可以将第一部分共价连接到第二部分。术语“连接的”不仅指在C-末端或N-末端第一部分与第二部分的融合，还包括将整个第一部分(或第二部分)插入第二部分(或第一部分，分别地)中的任何两点(例如，氨基酸)。在一方面，第一部分通过肽键或接头连接到第二部分。第一部分可以通过磷酸二酯键或接头连接到第二部分。接头可以是肽或多肽(对于多肽链)或核苷酸或核苷酸链(对于核苷酸链)或任何化学部分(对于多肽或多核苷酸链或任何化学分子)。术语“连接的”也用连接符号(-)表示。在一些方面，EV(例如，外泌体)上的支架X蛋白可以经由接头、间隔子或其组合与生物活性分子连接或融合。
术语“经修饰的”当在本文所述的EV(例如，外泌体)的上下文中使用时，是指EV(例如，外泌体)和/或其生产细胞的改变或工程化，以使得经修饰的EV(例如，外泌体)不同于天然存在的EV(例如，外泌体)。在一些方面，与天然存在的EV(例如，外泌体)的膜相比，本文所述的经修饰的EV(例如，外泌体)包含在蛋白质、脂质、小分子、碳水化合物等的组成方面不同的膜。例如，膜包含更高密度或数量的天然EV(例如，外泌体)、蛋白质，和/或膜包含在EV(例如，外泌体)中非天然存在的蛋白质。在某些方面，对膜的这种修饰改变EV(例如，外泌体)(例如，本文所述的表面工程化的EV和外泌体)的外表面。
如本文所用，术语“经修饰的蛋白质”或“蛋白质修饰”是指与蛋白质的非突变氨基酸序列具有至少15％同一性的蛋白质。蛋白质的修饰包括蛋白质的片段或变体。蛋白质的修饰还可以包括对蛋白质的片段或变体的化学或物理修饰。
如本文所用，术语“调节”、“修饰”及其语法变型当应用于特定浓度、水平、表达、功能或行为时，通常指通过增加或减少，例如通过直接或间接促进/刺激/上调或干扰/抑制/下调特定浓度、水平、表达、功能或行为(例如，作为拮抗剂或激动剂)来改变的能力。在一些情况下，相对于对照，或相对于通常可预期的平均活性水平，或相对于对照活性水平，调节剂可以增加和/或减少一定的浓度、水平、活性或功能。
如本文所用，术语“纳米囊泡”是指直径在20nm-250nm之间(例如，在30nm-150nm之间)的细胞外囊泡，并且通过直接或间接操纵由细胞(例如，生产细胞)生成，以使得在没有操纵的情况下细胞将不会产生纳米囊泡。为了产生纳米囊泡而对细胞进行的适当操纵包括但不限于连续挤出、用碱性溶液进行的处理、超声处理、或它们的组合。在一些方面，纳米囊泡的产生可以导致生产细胞的破坏。在一些方面，本文所述的纳米囊泡群体基本上不含通过从质膜直接出芽或晚期内体与质膜融合的方式而来源于细胞的囊泡。在某些方面，纳米囊泡包含支架部分，例如支架X。一旦来源于生产细胞，纳米囊泡就可基于其大小、密度、生物化学参数、或它们的组合从生产细胞中分离。
如本文所用，术语“有效负载”是指作用于与本公开的EV(例如，外泌体)接触的靶标(例如，靶细胞)的生物活性分子(例如，治疗剂)。可引入到EV(例如，外泌体)中的有效负载的非限制性示例包括治疗剂，诸如核苷酸(例如，包含可检测部分或毒素或破坏转录的核苷酸)、核酸(例如，编码多肽(诸如酶)的DNA或mRNA分子，或具有调控功能的RNA分子(诸如miRNA、dsDNA、lncRNA和siRNA))、氨基酸(例如，包含可检测部分或毒素或破坏翻译的氨基酸)、多肽(例如，酶)、脂质、碳水化合物和小分子(例如，小分子药物和毒素)。在某些方面，有效负载包括抗原。如本文所用，术语“抗原”是指当引入受试者时引发针对自身的免疫应答(细胞或体液)的任何试剂。在一些方面，有效负载分子经由本文所公开的接头、间隔子、或其组合共价连接到EV(例如，外泌体)。在其他方面，有效负载包括佐剂。
术语“药学上可接受的载剂”或“药学上可接受的赋形剂”及其语法变型涵盖美国联邦政府监管机构批准的或美国药典中列出的用于动物(包括人)的任何试剂，以及不会导致产生以至于禁止将组合物施用于受试者的程度的非所需的生理效应并且不会消除所施用的化合物的生物活性和性质的任何载剂或稀释剂。包括可用于制备药物组合物的赋形剂和载剂，它们通常是安全、无毒和所需要的。
如本文所用，术语“药物组合物”是指与一种或多种其他化学组分混合或掺和或悬浮于一种或多种其他化学组分(诸如药学上可接受的载剂和赋形剂)中的一种或多种本文所述的化合物，例如，如本公开的EV(诸如外泌体)。药物组合物的一个目的是促进EV(例如，外泌体)的制剂向受试者的施用。
如本文所用，术语“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸的聚合物，包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、它们的类似物、或它们的混合物。该术语是指分子的一级结构。因此，该术语包括三链、双链和单链脱氧核糖核酸(“DNA”)，以及三链、双链和单链核糖核酸(“RNA”)。它还包括经修饰的(例如通过烷基化和/或通过加帽修饰)多核苷酸形式，以及未经修饰的多核苷酸形式。具体而言，术语“多核苷酸”包括聚脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)、聚核糖核苷酸(含有D-核糖)，包括tRNA、rRNA、hRNA、siRNA和mRNA，无论是剪接的还是未剪接的，任何其他类型的多核苷酸(它是嘌呤或嘧啶碱基的N-糖苷或C-糖苷)，以及其他含有正核苷酸骨架的聚合物，例如聚酰胺(例如，肽核酸“PNA”)和多吗啉聚合物，以及其他合成序列特异性核酸聚合物(前提条件是聚合物含有核碱基，所述核碱基的构型允许碱基配对和碱基堆积，诸如存在于DNA和RNA中)。在本公开的一些方面，经由本文所公开的接头、间隔子、或其组合连接到EV(例如，外泌体)的生物活性分子是多核苷酸，例如反义寡核苷酸。在特定方面，多核苷酸包括mRNA。在其他方面，mRNA是合成mRNA。在一些方面，合成mRNA包含至少一种非天然核碱基。在一些方面，某类核碱基中的所有都已被非天然核碱基替代(例如，本文公开的多核苷酸中的所有尿苷都可以被非天然核碱基(例如，5-甲氧基尿苷)替代)。在本公开的一些方面，生物活性分子是多核苷酸(例如，反义寡核苷酸，ASO)。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指任何长度的氨基酸的聚合物。聚合物可以包含经修饰的氨基酸。这些术语还涵盖已被天然修饰或通过介入修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化、或任何其他操作或修饰(诸如与标记组分缀合)。该定义还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸，诸如高半胱氨酸、鸟氨酸、对乙酰苯丙氨酸、D-氨基酸和肌酸)以及本领域已知的其他修饰的多肽。在本公开的一些方面，经由本文所公开的接头、间隔子、或其组合连接到EV(例如，外泌体)的生物活性分子是多肽，例如抗体或其衍生物，诸如ADC、PROTAC、毒素、融合蛋白或酶。
如本文所用，术语“多肽”是指任何大小、结构或功能的蛋白质、多肽和肽。多肽包括基因产物、天然存在的多肽、合成多肽、同源物、直系同源物、旁系同源物、片段以及前述物质的其他等同物、变体和类似物。多肽可以是单个多肽或可以是多分子复合物，诸如二聚体、三聚体或四聚体。它们还可以包括单链多肽或多链多肽。最常见的二硫键存在于多链多肽中。术语多肽还可以适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物。在一些方面，“肽”可以小于或等于50个氨基酸长度，例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸长度。
如本文所用，术语“预防(prevent、preventing)”及其变型是指部分或完全延迟疾病、病症和/或病状的发作；部分或完全延迟特定疾病、病症和/或病状的一个或多个症状、特征或临床表现的发作；部分或完全延迟特定疾病、病症和/或病状的一个或多个症状、特征或表现的发作；部分或完全延迟特定疾病、病症和/或病状的进展；和/或降低发展与疾病、病症和/或病状相关的病理的风险。在一些方面，通过防治性治疗来实现预防结局。
如本文所用，术语“生产细胞”是指用于生成EV(例如，外泌体)的细胞。生产细胞可以是体外培养的细胞，也可以是体内细胞。生产细胞包括但不限于已知能够有效生成EV(例如，外泌体)的细胞，例如，HEK293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、间充质干细胞(MSC)、BJ人包皮成纤维细胞、fHDF成纤维细胞、神经元前体细胞、/>羊水细胞、脂肪间充质干细胞、RPTEC/TERT1细胞。在某些方面，生产细胞不是抗原呈递细胞。在一些方面，生产细胞不是树突细胞、B细胞、肥大细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、Kupffer-Browicz细胞、源自这些细胞中的任一者的细胞、或其任何组合。
如本文所用，“防治性(prophylactic)”是指用于预防疾病或病状的发作，或用于预防或延迟与疾病或病状相关的症状的治疗或作用过程。
如本文所用，“防治(prophylaxis)”是指为维持健康和预防或延迟出血发作的发病，或为预防或延迟与疾病或病状相关的症状而采取的措施。
“重组”多肽或蛋白质是指经由重组DNA技术产生的多肽或蛋白质。为了本公开的目的而分离的在经工程化的宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白质被认为是已通过任何合适的技术分离、分馏或部分或基本上纯化的天然或重组多肽。本文所公开的多肽可以使用本领域已知的方法重组产生。或者，本文所公开的蛋白质和肽可以是化学合成的。在本公开的一些方面，存在于EV(例如，外泌体)中的支架X蛋白通过在生产细胞中过表达支架蛋白来重组生产，从而所得的EV(例如，外泌体)中的支架蛋白的水平相对于不过表达此类支架蛋白的生产细胞的EV(例如，外泌体)中存在的支架蛋白的水平显著增加。
如本文所用，术语“支架部分”是指在EV(例如，外泌体)的外表面上，可用于将有效负载(例如，生物活性分子)锚定到EV(例如，外泌体)的分子，例如蛋白质，诸如支架X。在某些方面，支架部分包含合成分子。在一些方面，支架部分包含非多肽部分。在其他方面，支架部分包含例如天然存在于EV(例如，外泌体)中的脂质、碳水化合物、蛋白质、或其组合(例如，糖蛋白或蛋白脂质)。在一些方面，支架部分包含不天然存在于EV(例如，外泌体)中的脂质、碳水化合物或蛋白质。在一些方面，支架部分包含天然存在于EV(例如，外泌体)中，但是相对于基础/天然/野生型水平，已经富集于EV(例如，外泌体)中的脂质或碳水化合物。在一些方面，支架部分包含天然存在于EV(例如，外泌体)中，但是相对于基础/天然/野生型水平，已经富集于EV(例如，外泌体)中，例如通过在生产细胞中重组过表达的蛋白质。在某些方面，支架部分是支架X。
如本文所用，术语“支架X”是指在EV(例如，外泌体)的表面上已鉴定到的EV(例如，外泌体)蛋白。参见，例如，美国专利号10,195,290，其通过引用整体并入本文。支架X蛋白的非限制性示例包括：前列腺素F2受体负调节因子(“PTGFRN”)；basigin(“BSG”)；免疫球蛋白超家族成员2(“IGSF2”)；免疫球蛋白超家族成员3(“IGSF3”)；免疫球蛋白超家族成员8(“IGSF8”)；整联蛋白β-1(“ITGB1”)；整联蛋白α-4(“ITGA4”)；4F2细胞表面抗原重链(“SLC3A2”)；和ATP转运蛋白的类型(“ATP1A1”、“ATP1A2”、“ATP1A3”、“ATP1A4”、“ATP1B3”、“ATP2B1”、“ATP2B2”、“ATP2B3”、“ATP2B”)。在一些方面，支架X蛋白可以是完整的蛋白质或其片段(例如，功能性片段，例如，能够将另一个部分锚定在EV(例如，外泌体)的外表面上或腔表面上的最小片段)。在一些方面，支架X可以将生物活性分子锚定到EV(例如，外泌体)的外表面或腔。在本公开的一些方面，生物活性分子可以例如经由本文所公开的接头、间隔子、或其组合共价连接到支架X。可以用于本公开的其他支架部分的非限制性示例包括：氨基肽酶N(CD13)；脑啡肽酶，AKA膜金属内肽酶(MME)；外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员1(ENPP1)；神经纤毛蛋白-1(NRP1)；CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPI锚定蛋白、乳凝集素、LAMP2和LAMP2B。
如本文所用，术语“相似性”是指聚合分子之间，例如多核苷酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总相关性。聚合物分子彼此之间的相似性百分比的计算可以与同一性百分比的计算相同的方式进行，不同之处在于相似性百分比的计算考虑了本领域所理解的保守置换。应当理解，相似性百分比取决于所使用的比较尺度，即是否比较氨基酸，例如根据它们的进化近似度、电荷、体积、柔性、极性、疏水性、芳香性、等电点、抗原性、或其组合。
除非另有说明，否则提及具有一个或多个立体中心的化合物旨在指其每种立体异构体及其立体异构体的所有组合。
术语“受试者”、“患者”、“个体”和“宿主”及其变型在本文中可互换使用，并且是指需要诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物受试者，包括但不限于人、家畜(例如，狗、猫等)、农场动物(例如，奶牛、绵羊、猪、马等)和实验室动物(例如，猴、大鼠、小鼠、兔、豚鼠等)，特别是人。本文所描述的方法适用于人的疗法和兽医应用。
如本文所用，术语“基本上不含”是指包含EV(例如，外泌体)的样品包含按质量/体积(m/v)百分比浓度计小于10％的大分子(例如，污染物)。一些级分可含有少于0.001％、少于0.01％、少于0.05％、少于0.1％、少于0.2％、少于0.3％、少于0.4％、少于0.5％、少于0.6％、少于0.7％、少于0.8％、少于0.9％、少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于6％、少于7％、少于8％、少于9％或少于10％(m/v)的大分子。
如本文所用，术语“表面工程化的EV”(例如，支架X工程化的外泌体)是指EV的膜或EV的表面在其组成上进行修饰，以使得工程化的EV的表面不同于修饰前的EV的表面或天然存在的EV的表面的EV。
如本文所用，术语“表面工程化的外泌体”(例如，支架X工程化的外泌体)是指外泌体的膜或外泌体的表面(内表面或腔表面)在其组成上进行修饰，以使得工程化的外泌体的表面不同于修饰前的外泌体的表面或天然存在的外泌体的表面的外泌体。
工程化可以在EV(例如，外泌体)的表面上，或在EV(例如，外泌体)的膜中，以使得EV(例如，外泌体)的表面被改变。例如，膜在例如其蛋白质、脂质、小分子、碳水化合物、或其组合的组成上可以进行修饰。可以通过化学、物理或生物方法或通过由预先或同时通过化学、物理或生物方法进行修饰的细胞产生来改变组成。具体而言，可以通过基因工程或通过由预先通过基因工程修饰的细胞产生来改变组成。在一些方面，表面工程化的EV(例如，外泌体)包含外源性蛋白质(即，EV(例如，外泌体)不天然表达的蛋白质)或其片段或变体，它们可以暴露于EV(例如，外泌体)的表面，或者可以是暴露于EV(例如，外泌体)的表面上的部分的锚定点(连接件)。在其他方面，表面工程化的EV(例如，外泌体)包含更高表达(例如更高数量)的天然EV(例如，外泌体)蛋白质(例如，支架X)或其片段或变体，它们可以暴露于EV(例如，外泌体)的表面，或者可以是暴露于EV(例如，外泌体)的表面上的部分的锚定点(连接件)。在特定方面，表面工程化的EV(例如，外泌体)包含一种或多种膜组分的修饰，例如蛋白质(诸如支架X)、脂质、小分子、碳水化合物、或其组合，其中至少一种组分经由本文所公开的接头、间隔子、或其组合共价连接到生物活性分子。
如本文所用，术语“治疗有效量”是足以对有需要的受试者产生所需的治疗效果、药理学和/或生理学效果的包含本公开的EV或外泌体的试剂或药物化合物的量。治疗有效量可以是“防治有效量”，因为防治可以被认为是治疗。
如本文所用，术语“治疗(treat、treatment或treating)”是指例如疾病或病状的严重度降低；病程持续时间的缩短；与疾病或病状相关的一种或多种症状的改善或消除；向患有疾病或病状的受试者提供有益作用，但不一定治愈疾病或病状。该术语还包括疾病或病状或其症状的防治或预防。在一个方面，术语“治疗(treating或treatment)”是指在受试者中诱导针对抗原的免疫应答。
如本文中所用，术语分子(例如，功能性分子、抗原或支架X)的“变体”是指通过本领域已知的方法进行比较后与另一个分子共有某些结构和功能同一性的分子。例如，蛋白质的变体可以包括另一种蛋白质中的置换、插入、缺失、移码或重排。
在一些方面，支架X的变体或衍生物包括与全长、成熟PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2或ATP转运蛋白或PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2或ATP转运蛋白的片段(例如，功能性片段)具有至少约70％同一性的支架X变体。
在一些方面，本文公开的支架X蛋白的变体或片段变体或其衍生物保留了特异性靶向EV(例如，外泌体)的能力。在一些方面，支架X或支架X衍生物包含一个或多个突变，例如保守氨基酸置换。
天然存在的变体被称为“等位基因变体”，并且是指占据生物体的染色体上给定基因座的基因的若干替代形式之一(Genes II,Lewin,B.,ed.,John Wiley&Sons,New York(1985))。这些等位基因变体可在多核苷酸和/或多肽水平上变化，并且包含在本公开中。或者，非天然存在的变体可通过诱变技术或直接合成产生。
使用蛋白质工程化和重组DNA技术的已知方法，可生成变体以改进或改变多肽的特征。例如，可从分泌蛋白质的N-末端或C-末端使一个或多个氨基酸缺失，而基本上不损失生物功能。Ron等人，J.Biol.Chem.268:2984-2988(1993)(通过引用整体并入本文)报道了即使在缺失3个、8个或27个氨基末端氨基酸残基之后仍具有肝素结合活性的变体KGF蛋白。类似地，干扰素γ在从这种蛋白的羧基端缺失8-10个氨基酸残基后显示出高达十倍的活性。(Dobeli等人，J.Biotechnology 7:199-216(1988)，通过引用整体并入本文)。
此外，大量的证据表明，变体通常保留着与天然存在的蛋白质相似的生物活性。例如，Gayle及同事(J.Biol.Chem 268:22105-22111(1993)，通过引用整体并入本文)对人细胞因子IL-1a进行了广泛的突变分析。他们利用随机诱变生成了3,500多种单独的IL-1a突变体，在分子的整个长度上每种变体有平均2.5个氨基酸的变化。在每个可能的氨基酸位置都检查到多重突变。研究人员发现，“[大多数]分子可被改变，而对[结合或生物活性]几乎没有影响。”(参见摘要)。事实上，在所检查的超过3,500个的核苷酸序列中，只有23个独特的氨基酸序列产生了与野生型活性显著不同的蛋白质。
如上所述，变体或衍生物包括例如经修饰的多肽。在一些方面，例如多肽、多核苷酸、脂质、糖蛋白的变体或衍生物是化学修饰和/或内源性修饰的结果。在一些方面，变体或衍生物是体内修饰的结果。在一些方面，变体或衍生物是体外修饰的结果。在另外其他方面，变体或衍生物是生产细胞中的胞内修饰的结果。
变体和衍生物中存在的修饰包括，例如，乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸盐的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚定物形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化(Mei等人，Blood 116:270-79(2010)，其通过引用整体并入本文)、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒酰化(selenoylation)、硫酸化、转运RNA介导的向蛋白质中添加氨基酸，诸如精氨酰化和泛素化(ubiquitination)。
在一些方面，可以在任何方便的位置修饰支架X。在一些方面，可以在任何方便的位置修饰生物活性分子。在本公开的特定方面，EV(例如，外泌体)、组分(例如，蛋白质诸如支架X、脂质或聚糖)和/或生物活性分子(例如，抗体或ADC、PROTAC、小分子(诸如环状二核苷酸)、毒素(诸如MMAE)、STING激动剂、耐受剂、反义寡核苷酸)可以被修饰以产生包含至少一个本文所公开的接头、间隔子、或其组合的衍生物。
II.包含优化的接头的EV(例如，外泌体)
细胞外囊泡(EV)的直径通常为20nm至1000nm；例如，外泌体是小的细胞外囊泡，通常直径为100至200nm。EV(例如，外泌体)由限制性脂质双层和多种蛋白质和核酸组成(Maas,S.L.N.,et al.,Trends.Cell Biol.27(3):172-188(2017))。EV(例如，外泌体)在离散的细胞类型和组织中表现出优先摄取，并且可以通过向其表面添加与靶细胞表面上的受体相互作用的蛋白质来引导它们的向性(Alvarez-Erviti,L.,et al.,Nat.Biotechnol.29(4):341-345(2011))。
与抗体不同，EV(例如，外泌体)可以容纳连接到其表面的大量分子，每个EV(例如，外泌体)可以容纳数千个至数万个分子。因此，EV(例如，外泌体)-药物缀合物代表了一种将高浓度的治疗性化合物递送到离散细胞类型，同时限制对化合物的整体全身暴露，从而降低脱靶毒性的平台。在EV(例如，外泌体)表面上的大量分子的容纳可以例如受到所使用的生物活性分子的类型(例如，抗体比反义寡核苷酸体积更大)、所使用的膜锚定物的类型(例如，蛋白质锚定物比脂质或脂质加间隔子锚定物体积更大)，以及连接生物活性分子和膜锚定物的接头和间隔子的组合的影响。在这方面，本公开提供了连接生物活性分子(例如，ASO)和膜锚定物(例如，脂质)的接头和间隔子的特定组合，其中膜锚定物将生物活性分子连接到EV(例如，外泌体)的表面。
在一些方面，本公开提供了“生物活性分子”(BAM)(例如，ASO)，其直接或间接地(例如经由一个或多个接头组合)，例如共价地连接到一个或多个锚定部分(AM)。锚定部分可以插入EV(例如，外泌体)的脂质双层中，从而允许用BAM(例如，ASO)负载外泌体。目前，外泌体作为极性BAM(例如，ASO)的递送媒介物的商业化的主要障碍是非常低效的负载。如本文所示，这一障碍可通过在将其负载到EV(例如，外泌体)之前，使用将BAM连接到AM的特定接头/间隔子组合(即“优化的接头”)来克服。因此，如本文所述，使用优化的接头有助于将BAM(例如，ASO)负载到EV(例如，外泌体)上。
与先前报道的通过例如电穿孔或阳离子脂质转染将未修饰的BAM引入EV(例如，外泌体)中的负载效率和BAM密度相比，本文所述的用包含BAM(例如，ASO)的构建体负载EV(例如，外泌体)的组合物和方法，所述BAM经由优化的接头连接到AM(例如脂质，如固醇)，显著提高了负载效率和BAM密度。与先前报道的当通过例如电穿孔或阳离子脂质转染将未修饰的BAM引入EV(例如，外泌体)中时的效力相比，本文所公开的组合物和方法还显著提高了EV(例如，外泌体)的效力。
图2中示出了显示本申请中所公开的构建体的一般结构的示意图，其包括例如膜锚定部分(例如，脂质或脂质加间隔子)、生物活性分子和接头、或其组合。
图3和图4中示出了本公开的接头的示例性的关键构建块，例如膜锚定物(脂质)、间隔子及其组合，以及用于其化学合成的化合物(例如，亚磷酰胺)。在图11中还示出了具体的构建块。示例性的构建体例如在图5、图6和图9A中示出。
本公开提供了一种细胞外囊泡(EV)，其包括根据下式经由锚定部分(AM)共价连接到EV的生物活性分子(BAM)：
[AM]-L1-[SP1]-L2-[SP2]-L3-[BAM](式1)
其中：
[AM]是锚定部分；
L1是可裂解或不可裂解的键联，
L2和L3是可选的可裂解或不可裂解的键联；
SP1是可选的第一间隔子；以及
SP2是可选的第二间隔子。
如本文所用，术语“优化的接头”是指结构元件的组合，其包括例如连接锚定部分[AM]和生物活性分子[BAM]的“键联”和“间隔子”。与在不存在本公开的优化的接头的情况下包含相同锚定部分[AM]和生物活性分子[BAM]的相应构建体相比，本公开的这些优化的接头允许将生物活性分子(例如，ASO)更有效且更大量地负载到EV(例如，外泌体)的表面上。换言之，相对于具有结构[AM]-L1-[BAM]的构建体，本文所公开的构建体(例如，式1[AM]-L1-[SP1]-L2-[SP2]-L3-[BAM]的构建体)使得(i)EV负载效率更高，(ii)每个EV的[BAM]数量更高，(iii)每个EV的[BAM]密度更高，(iv)[BAM]效力更高，或(v)其中的任何组合。
如本文所使用的，术语“键联”是指连接例如锚定部分[AM]和间隔子[SP]、间隔子[SP]和生物活性分子[BAM]、或锚定部分[AM]和生物活性分子[BAM]的任何稳定键或化学基团。在存在超过一个锚定部分[AM]或生物活性分子[BAM]的构建体中，键联可以连接两个锚定部分或两个生物活性部分。在一些方面，“键联”可以是键，例如，磷酸二酯(可裂解的)键或硫代磷酸酯(不可裂解的)键。在其他方面，“键联”可以包括接头，例如，可裂解的接头或不可裂解的接头。在一些方面，键联可以包括多个接头和键，其可以响应不同的刺激，例如pH、温度、酶等。
如本文所用，术语“间隔子”是指能够将两个间隔开的部分(例如，生物活性分子)共价连接在一起形成通常稳定的二元(dipartate)分子的化学部分。一般来说，间隔子是不可裂解的。例如，间隔子可以是烷基链，或者例如由甘醇或甘油单元形成的聚合物链。
在一些方面，本公开的“优化的接头”防止生物部分聚集在EV(例如，外泌体)的表面。在一些方面，连接锚定部分[AM]和生物活性分子[BAM]的优化的接头的长度在约2nm至约30nm之间。
在一些方面，优化的接头的长度为约2nm、约3nm、约4nm、约5nm、约6nm、约7nm、约8nm、约9nm、约10nm、约11nm、约12nm、约13nm、约14nm、约15nm、约16nm、约17nm、约18nm、约19nm、约20nm、约21nm、约22nm、约23nm、约24nm、约25nm、约26nm、约27nm、约28nm、约29nm、或约30nm。在一些方面，优化的接头的长度为至少约2nm、至少约3nm、至少约4nm、至少约5nm、至少约6nm、至少约7nm、至少约8nm、至少约9nm、至少约10nm、至少约11nm、至少约12nm、至少约13nm、至少约14nm、至少约15nm、至少约16nm、至少约17nm、至少约18nm、至少约19nm、至少约20nm、至少约21nm、至少约22nm、至少约23nm、至少约24nm、至少约25nm、至少约26nm、至少约27nm、至少约28nm、至少约29nm、或至少约30nm。在一些方面，优化的接头的长度为小于约2nm、小于约3nm、小于约4nm、小于约5nm、小于约6nm、小于约7nm、小于约8nm、小于约9nm、小于约10nm、小于约11nm、小于约12nm、小于约13nm、小于约14nm、小于约15nm、小于约16nm、小于约17nm、小于约18nm、小于约19nm、小于约20nm、小于约21nm、小于约22nm、小于约23nm、小于约24nm、小于约25nm、小于约26nm、小于约27nm、小于约28nm、小于约29nm、或小于约30nm。
在一些方面，优化的接头的长度为约2nm至约4nm、约3nm至约5nm、约4nm至约6nm、约5nm至约7nm、约6nm至约8nm、约7nm至约9nm、约8nm至约10nm、约9nm至约11nm、约10nm至约12nm、约11nm至约13nm、约12nm至约14nm、约13nm至约15nm、约14nm至约16nm、约15nm至约17nm、约16nm至约18nm、约17nm至约19nm、约18nm至约20nm、约19nm至约21nm、约20nm至约22nm、约21nm至约23nm、约22nm至约24nm、约23nm至约25nm、约24nm至约26nm、约25nm至约27nm、约26nm至约28nm、约27nm至约29nm、约28nm至约30nm、约2nm至约6nm、约4nm至约8nm、约6nm至约10nm、约8nm至约12nm、约10nm至约14nm、约12nm至约16nm、约14nm至约18nm、约16nm至约20nm、约18nm至约22nm、约20nm至约24nm、约22nm至约26nm、约24nm至约28nm、约26nm至约30nm、约2nm至约10nm、约4nm至约12nm、约6nm至约14nm、约8nm至约16nm、约10nm至约18nm、约12nm至约20nm、约14nm至约22nm、约16nm至约24nm、约18nm至约26nm、约20nm至约28nm、约22nm至约30nm、约2nm至约12nm、约4nm至约14nm、约6nm至约16nm、约8nm至约18nm、约10nm至约20nm、约12nm至约22nm、约14nm至约24nm、约16nm至约26nm、约18nm至约28nm、约20nm至约30nm、约2nm至约5nm、约5nm至约10nm、约10nm至约15nm、约15nm至约20nm、约20nm至约25nm、或约25nm至约30nm。
在一些方面，锚定部分[AM]包含固醇、脂质(例如，磷脂(phospholipid))、维生素、肽、或其组合以及可选地接头或间隔子。通常，AM可以包括能够插入EV(例如，外泌体)的脂质双层、与EV(例如，外泌体)的表面静电相互作用、或其组合的任何疏水部分或其组合。
在一些方面，锚定部分[AM]可以包括例如疏水性部分(例如脂质，如固醇)和间隔子，其中间隔子是烷基间隔子，通常是直链烷基间隔子。在一些方面，连接到疏水部分的烷基间隔子选自由C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14或C15组成的组，其中C表示甲基单元(碳单元)，并且数字表示烷基间隔子中甲基单元(碳单元)的数目。在一些方面，烷基间隔子包括单个碳单元(C1)。在一些方面，烷基间隔子是C2。在一些方面，烷基间隔子是C3。在一些方面，烷基间隔子是C4。在一些方面，烷基间隔子是C5。在一些方面，烷基间隔子是C6。在一些方面，烷基间隔子是C7。在一些方面，烷基间隔子是C8。在一些方面，烷基间隔子是C9。在一些方面，烷基间隔子是C10。在一些方面，烷基间隔子是C11。在一些方面，烷基间隔子是C12。在一些方面，烷基间隔子是C13。在一些方面，烷基间隔子是C14。在一些方面，烷基间隔子是C15。在一些方面，连接到在锚定部分[AM]中的固醇、脂质、维生素或肽的间隔子是长度等于C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14或C15直链烷基间隔子的长度的任何分子或其组合。
在一些方面，锚定部分[AM]可以包括例如疏水性部分(例如脂质，如固醇)和间隔子，其中间隔子是甘醇间隔子。在一些方面，甘醇间隔子选自二甘醇、三甘醇、四甘醇(TEG)、五甘醇、六甘醇(HEG)、七甘醇、八甘醇、九甘醇或十甘醇。在一些方面，甘醇间隔子可以包括11、12、13、14或15个甘醇单元。在一些方面，甘醇间隔子是HEG。在一些方面，甘醇间隔子是TEG。在一些方面，连接到锚定部分[AM]中的固醇、脂质、维生素或肽的间隔子是长度等于二甘醇、三甘醇、四甘醇(TEG)、五甘醇、六甘醇(HEG)、七甘醇、八甘醇、九甘醇或十甘醇接头的长度的任何分子或其组合。在一些方面，连接到锚定部分[AM]中固醇、脂质、维生素或肽的间隔子是长度等于具有11、12、13、14或15个甘醇单元的甘醇间隔子的长度的任何分子或其组合。
在一些方面，锚定部分[AM]包括固醇，例如，固醇选自由胆固醇、麦角固醇、7-脱氢胆固醇、24S-羟基胆固醇、羊毛固醇、环阿屯醇、岩藻固醇、大褐马尾藻固醇、菜油固醇、β-谷固醇、谷甾烷醇、粪固醇、燕麦固醇、豆固醇、或其组合组成的组。在一些特定方面，锚定部分[AM]包括胆固醇。
在一些方面，锚定部分[AM]包括脂肪酸，由脂肪酸组成或基本上由脂肪酸组成，例如，直链脂肪酸。在一些方面，锚定部分[AM]包括以下各项、由以下各项组成或基本上由以下各项组成：直链脂肪酸、支链脂肪酸、不饱和脂肪酸、单不饱和肪酸、多不饱和脂肪酸、羟基脂肪酸、多元羧酸、或其任何组合。例如，在一些方面，直链脂肪酸包括以下各项、由以下各项组成或基本上由以下各项组成：丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、或其组合。在一些特定方面，直链脂肪酸是棕榈酸。
在一些方面，锚定部分[AM]包括以下各项、由以下各项组成或基本上由以下各项组成：磷脂(例如，卵磷脂)、磷脂酰胆碱、磷酸肌醇(phosphoinositol)、鞘磷脂(phosphosphingolipid)、磷酸乙醇胺、磷脂酸、或其任何组合。
在一些方面，锚定部分[AM]包括以下各项、由以下各项组成或基本上由以下各项组成：维生素，例如维生素E(生育酚或生育三烯酚)、维生素D(例如维生素D2或麦角钙化醇、维生素D3或胆钙化醇、或其组合)、维生素K、核黄素、烟酸、吡哆醇、或其组合。
在本公开的上下文中，锚定部分[AM]中的脂质部分(例如，不同的脂肪酸、不同的固醇、不同的维生素、或其组合)的组合意味着构建体群体中本文所公开的一些构建体(例如，式1的构建体)可以具有不同的脂质部分。例如，对于相同的生物分子[BAM]，式1的一些构建体可以具有不同的锚定部分[AM]，例如，一些可以包含脂肪酸，而另一些可以包含维生素或固醇。选择具有不同脂质部分的构建体的组合通常会使EV(例如，外泌体)上的膜中的脂质更好地堆积，这可以导致更高的负载效率和BAM密度。
在一些方面，锚定部分[AM]包括维生素。在一些方面，锚定部分[AM]由维生素组成。在一些方面，锚定部分[AM]包括维生素和烷基间隔子。在一些方面，锚定部分[AM]由维生素和烷基间隔子组成。在一些方面，锚定部分[AM]包括生育酚和烷基间隔子。在一些方面，锚定部分[AM]由生育酚和烷基间隔子组成。在一些方面，锚定部分[AM]包括维生素和辛基(C8)烷基间隔子。在一些方面，锚定部分[AM]由维生素和辛基(C8)烷基间隔子组成。在一些方面，锚定部分[AM]包括生育酚和辛基(C8)烷基间隔子。在一些方面，锚定部分[AM]由生育酚和辛基(C8)烷基间隔子组成。在一些方面，锚定部分[AM]包括生育酚。在一些方面，锚定部分[AM]由生育酚组成。
在一些方面，锚定部分[AM]包括脂肪酸和烷基间隔子。在一些方面，锚定部分[AM]由脂肪酸和烷基间隔子组成。在一些方面，锚定部分[AM]包括棕榈酸酯和烷基间隔子。在一些方面，锚定部分[AM]由棕榈酸酯和烷基间隔子组成。在一些方面，锚定部分[AM]包括脂肪酸和己基(C6)烷基间隔子。在一些方面，锚定部分[AM]由脂肪酸和己基(C6)烷基间隔子组成。在一些方面，锚定部分[AM]包括棕榈酸酯和己基(C6)烷基间隔子。在一些方面，锚定部分[AM]由棕榈酸酯和己基(C6)烷基间隔子组成。
在一些方面，锚定部分[AM]包括固醇和甘醇间隔子。在一些方面，锚定部分[AM]由固醇和甘醇间隔子组成。在一些方面，锚定部分[AM]包括胆固醇和甘醇间隔子。在一些方面，锚定部分[AM]由胆固醇和甘醇间隔子组成。在一些方面，锚定部分[AM]包括固醇和TEG甘醇间隔子。在一些方面，锚定部分[AM]由固醇和TEG甘醇间隔子组成。在一些方面，锚定部分[AM]包括胆固醇和TEG甘醇间隔子。在一些方面，锚定部分[AM]由胆固醇和TEG甘醇间隔子组成。在一些方面，锚定部分[AM]包括固醇和烷基间隔子。在一些方面，锚定部分[AM]由固醇和烷基间隔子组成。在一些方面，锚定部分[AM]包括固醇和己基(C6)烷基间隔子。在一些方面，锚定部分[AM]由固醇和己基(C6)烷基间隔子组成。在一些方面，锚定部分[AM]包括胆固醇和烷基间隔子。在一些方面，锚定部分[AM]由胆固醇和烷基间隔子组成。在一些方面，锚定部分[AM]包括胆固醇和己基(C6)烷基间隔子。在一些方面，锚定部分[AM]由胆固醇和己基(C6)烷基间隔子组成。
在一些方面，L1是包含磷酸二酯键的可裂解的键联。在一些方面，L1是包含硫代磷酸酯键的不可裂解的键联。在一些方面，L2是可选的包含磷酸二酯键的可裂解的键联。在一些方面，L2是可选的包含硫代磷酸酯键的不可裂解的键联。在一些方面，L3是可选的包含磷酸二酯键的可裂解的键联。在一些方面，L3是可选的包含硫代磷酸酯键的不可裂解的键联。
在一些方面，L1是磷酸二酯键。在一些方面，L1是硫代磷酸酯键。在一些方面，L2是磷酸二酯键。在一些方面，L2是硫代磷酸酯键。在一些方面，L3是磷酸二酯键。在一些方面，L3是硫代磷酸酯键。
在一些方面，L1、L2或L3中的每一个独立地包含磷酸二酯键或硫代磷酸酯键，以及本文所公开的一个或多个可裂解的或不可裂解的接头或间隔子。
在一些方面，SP1可选的第一间隔子和/或SP2可选的第二间隔子独立地包括间隔子(例如，烷基间隔子或甘醇间隔子)、或其组合。在一些方面，SP1可选的第一间隔子包括烷基间隔子或由烷基间隔子组成，该烷基间隔子是C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14或C15。在一些方面，SP1是C3或C6烷基间隔子。在一些方面，SP2可选的第一间隔子包括烷基间隔子或由烷基间隔子组成，该烷基间隔子是C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14或C15。在一些方面，SP2是C3或C6烷基间隔子。
在一些方面，SP1可选的第一间隔子包括甘醇间隔子或由甘醇间隔子组成，该甘醇间隔子具有2(二甘醇)、3(三甘醇)、4(四甘醇；TEG)、5(五甘醇)、6(六甘醇；HEG)、7、8、9、10、11、12、13、14或15个甘醇单元。在一些方面，S1是四甘醇(TEG)或六甘醇(HEG)甘醇间隔子。在一些方面，SP2可选的第一间隔子包括甘醇间隔子或由甘醇间隔子组成，该甘醇间隔子具有2(二甘醇)、3(三甘醇)、4(四甘醇；TEG)、5(五甘醇)、6(六甘醇；HEG)、7、8、9、10、11、12、13、14或15个甘醇单元。在一些方面，S2是四甘醇(TEG)或六甘醇(HEG)甘醇间隔子。
在一些方面，SP1间隔子包括烷基间隔子，并且SP2间隔子也包括烷基间隔子。在一些方面，SP1间隔子包括甘醇间隔子，并且SP2间隔子也包括甘醇间隔子。在一些方面，SP1间隔子包括烷基间隔子，并且SP2间隔子包括甘醇间隔子。在一些方面，SP1间隔子包括甘醇间隔子，并且SP2间隔子包括烷基间隔子。在一些方面，SP1间隔子由烷基间隔子组成，并且SP2间隔子也由烷基间隔子组成。在一些方面，SP1间隔子由甘醇间隔子组成，并且SP2间隔子也由甘醇间隔子组成。在一些方面，SP1间隔子由烷基间隔子组成，并且SP2间隔子由甘醇间隔子组成。在一些方面，SP1间隔子由甘醇间隔子组成，并且SP2间隔子由烷基间隔子组成。
在一些方面，每个不可裂解的间隔子独立地选自由以下各项组成的组：烷基(例如，C2、C3、C4、C5、C6、C7或C8)、甘醇(例如，二甘醇、三甘醇、四甘醇(TEG)、六甘醇(HEG)、五甘醇、聚乙二醇(PEG))、甘油(例如，二甘油、三甘油、四甘油(TG)、五甘油、六甘油(HG)、聚甘油(PG))、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、或其任何组合。
在一些方面，锚定部分[AM]中的间隔子、第一(近端)间隔子[SP1]、第二(远端)间隔子[SP2]、或其任何组合，可包含由式R1-(O-CH2-CH2)n-或R1-(O-CH2-CH2)n-O-表征的聚乙二醇(PEG)或由其组成，其中R1为氢、甲基或乙基，并且n为1至15之间的整数。因此，在一些方面，n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。这些PEG可分别描述为PEG1、PEG2、PEG3、PEG4、PEG5、PEG6、PEG7、PEG8、PEG9、PEG10、PEG11、PEG12、PEG13、PEG14或PEG15，或PEG1-O-、PEG2-O-、PEG3-O-、PEG4-O-、PEG5-O-、PEG6-O-、PEG7-O-、PEG8-O-、PEG9-O-、PEG10-O-、PEG11-O-、PEG12-O-、PEG13-O-、PEG14-O-或PEG15-O-。
在一些方面，锚定部分[AM]中的间隔子、第一(近端)间隔子[SP1]、第二(远端)间隔子[SP2]、或其任何组合，可包含由式(R1—O—(CH2—CHOH—CH2O)n—)表征的聚甘油(PG)或由其组成，其中R1为氢、甲基或乙基，并且n为1至15之间的整数。因此，在一些方面，n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。这些PEG可描述为PG1、PG2、PG3、PG4、PG5、PG6、PG7、PG8、PG9、PG10、PG11、PG12、PG13、PEG14或PEG15。
在一些方面，L1、L2或L3键联或其任何组合可以包括可裂解的键联或由可裂解的键联组成，该可裂解的键联包括氧化还原可裂解的接头、活性氧类可裂解的接头、pH依赖性可裂解的接头、酶可裂解的接头、蛋白酶可裂解的接头、酯酶可裂解的接头、磷酸酶可裂解的接头、光活化的可裂解的接头、自分解性的接头、或其任何组合。在一些方面，L1键联包括可裂解的键联，该可裂解的键联包括氧化还原可裂解的接头、活性氧类可裂解的接头、pH依赖性可裂解的接头、酶可裂解的接头、蛋白酶可裂解的接头、酯酶可裂解的接头、磷酸酶可裂解的接头、光活化的可裂解的接头、自分解性的接头或其任何组合。在一些方面，L1键联由可裂解的键联组成，该可裂解的键联包括氧化还原可裂解的接头、活性氧类可裂解的接头、pH依赖性可裂解的接头、酶可裂解的接头、蛋白酶可裂解的接头、酯酶可裂解的接头、磷酸酶可裂解的接头、光活化的可裂解的接头、自分解性的接头、或其任何组合。在一些方面，L2键联包括可裂解的键联，该可裂解的键联包括氧化还原可裂解的接头、活性氧类可裂解的接头、pH依赖性可裂解的接头、酶可裂解的接头、蛋白酶可裂解的接头、酯酶可裂解的接头、磷酸酶可裂解的接头、光活化的可裂解的接头、自分解性的接头、或其任何组合。在一些方面，L2键联由可裂解的键联组成，该可裂解的键联包括氧化还原可裂解的接头、活性氧类可裂解的接头、pH依赖性可裂解的接头、酶可裂解的接头、蛋白酶可裂解的接头、酯酶可裂解的接头、磷酸酶可裂解的接头、光活化的可裂解的接头、自分解性的接头、或其任何组合。在一些方面，L3键联包括可裂解的键联，该可裂解的键联包括氧化还原可裂解的接头、活性氧类可裂解的接头、pH依赖性可裂解的接头、酶可裂解的接头、蛋白酶可裂解的接头、酯酶可裂解的接头、磷酸酶可裂解的接头、光活化的可裂解的接头、自分解性的接头、或其任何组合。在一些方面，L3键联由可裂解的键联组成，该可裂解的键联包括氧化还原可裂解的接头、活性氧类可裂解的接头、pH依赖性可裂解的接头、酶可裂解的接头、蛋白酶可裂解的接头、酯酶可裂解的接头、磷酸酶可裂解的接头、光活化的可裂解的接头、自分解性的接头、光活化的可裂解的接头、自分解性的接头、或其任何组合。
在一些方面，本文所公开的可裂解的键联(例如，L1、L2或L3键联或其任何组合)包括自分解性的接头(例如，对氨基苄基氨基甲酸酯，pABC)或由其组成。在一些方面，L1包括自分解性的接头(例如，对氨基苄基氨基甲酸酯，pABC)。在一些方面，L1由自分解性的接头(例如，对氨基苄基氨基甲酸酯，pABC)组成。在一些方面，L2包括自分解性的接头(例如，对氨基苄基氨基甲酸酯，pABC)。在一些方面，L2由自分解性的接头(例如，对氨基苄基氨基甲酸酯，pABC)组成。在一些方面，L3包括自分解性的接头(例如，对氨基苄基氨基甲酸酯，pABC)。在一些方面，L3由自分解性的接头(例如，对氨基苄基氨基甲酸酯，pABC)组成。
在一些方面，本文所公开的可裂解的键联(例如，L1、L2或L3键联或其任何组合)包括以下各项或由以下各项组成：肉桂基、萘基、联苯基、杂环、同源芳族、香豆素、呋喃、噻吩、噻唑、噁唑、异噁唑、吡咯、吡唑、吡啶、咪唑酮、三唑、或其任何组合。在一些方面，L1包含可裂解的接头，所述接头选自由以下各项组成的组：肉桂基、萘基、联苯基、杂环、同源芳族、香豆素、呋喃、噻吩、噻唑、噁唑、异噁唑、吡咯、吡唑、吡啶、咪唑酮、三唑、或其任何组合。在一些方面，L1由可裂解的接头组成，所述接头选自由以下各项组成的组：肉桂基、萘基、联苯基、杂环、同源芳族、香豆素、呋喃、噻吩、噻唑、噁唑、异噁唑、吡咯、吡唑、吡啶、咪唑酮、三唑、或其任何组合。在一些方面，L2包含可裂解的接头，所述接头选自由以下各项组成的组：肉桂基、萘基、联苯基、杂环、同源芳族、香豆素、呋喃、噻吩、噻唑、噁唑、异噁唑、吡咯、吡唑、吡啶、咪唑酮、三唑、或其任何组合。在一些方面，L2由可裂解的接头组成，所述接头选自由以下各项组成的组：肉桂基、萘基、联苯基、杂环、同源芳族、香豆素、呋喃、噻吩、噻唑、噁唑、异噁唑、吡咯、吡唑、吡啶、咪唑酮、三唑、或其任何组合。在一些方面，L3包含可裂解的接头，所述接头选自由以下各项组成的组：肉桂基、萘基、联苯基、杂环、同源芳族、香豆素、呋喃、噻吩、噻唑、噁唑、异噁唑、吡咯、吡唑、吡啶、咪唑酮、三唑、或其任何组合。在一些方面，L3由可裂解的接头组成，所述接头选自由以下各项组成的组：肉桂基、萘基、联苯基、杂环、同源芳族、香豆素、呋喃、噻吩、噻唑、噁唑、异噁唑、吡咯、吡唑、吡啶、咪唑酮、三唑、或其任何组合。
在一些方面，本文所公开的可裂解的键联(例如，L1、L2或L3键联或其任何组合)包括具有下式的键联(通常是二肽或三肽接头)或由其组成：
-Aa-Yy-
其中每个–A-独立地是氨基酸单元或其组合，a独立地是1至15的整数；-Y-是间隔子单元，并且y是0、1或2。在一些方面，L1包括上述的-Aa-Yy-接头或由其组成。在一些方面，L2包括上述的-Aa-Yy-接头或由其组成。在一些方面，L3包括上述的-Aa-Yy-接头或由其组成。
在某些方面，-Aa-是二肽、三肽、四肽、五肽或六肽。在一些方面，其中a是2(即二肽可裂解的接头)，–Aa-是选自由缬氨酸-丙氨酸、缬氨酸-瓜氨酸、苯丙氨酸-赖氨酸、N-甲基缬氨酸-瓜氨酸、环己基丙氨酸-赖氨酸、和β-丙氨酸-赖氨酸组成的组。在一些方面，其中a是3(即三肽可裂解的接头)，–Aa-是谷氨酸-缬氨酸-瓜氨酸。在一些方面，y是1，即式-Aa-Yy-的可裂解的接头包括单个间隔子。在一些方面，式-Aa-Yy-的可裂解的接头可以包括超过一个间隔子，例如两个间隔子。在某些方面，两个间隔子是相同的。在其他方面，两个间隔子是不同的。在一些方面，单个间隔子可以是可裂解的或不可裂解的。在一些方面，第一间隔子(Aa的近端)可以是可裂解的，而第二间隔子(Aa的远端)可以是不可裂解的。在一些方面，第一间隔子(Aa的近端)可以是不可裂解的，而第二间隔子(Aa的远端)可以是可裂解的。在一些方面，间隔子都可以都是不可裂解的。在一些方面，间隔子都可以都是可裂解的。
在一些方面，–Y-间隔子可以是自分解性的间隔子，例如，对氨基苄基氨基甲酸酯(pABC)。如本文所用，术语“自分解性的间隔子”是指如果其与第二部分(例如，生物活性分子、键联、间隔子或锚定部分)的键被裂解，则将自发地与第一部分(例如，生物活性分子、键联、间隔子或锚定部分)分离的间隔子。
在一些方面，–Yy-具有下式：
其中每个R2独立地是C1-8烷基、-O-(C1-8烷基)、卤素、硝基或氰基；并且m是0至4的整数。在一些方面，m是0、1或2。在一些方面，m是0。
在一些方面，本文所公开的可裂解的键联(例如，L1、L2或L3可裂解的键联或其任何组合)包括缬氨酸-丙氨酸-氨基甲酸对氨基苄酯、或缬氨酸-瓜氨酸-氨基甲酸对氨基苄酯、或由其组成。
在一些方面，-Y-是非自分解性的间隔子，例如，肽间隔子。肽间隔子通常是Gly聚合物或Gly/Ser聚合物。在一些方面，-Y-肽间隔子包含-Gly-或-Gly-Gly-，或由其组成。下文更详细地公开其它肽间隔子，例如(Gly4Ser)n间隔子。
在一些方面，除了脂质、维生素或固醇之外或代替脂质、维生素、或固醇，锚定部分[AM]可以包括支架蛋白(例如，支架X蛋白，例如PTGFRN或其片段)，或可以结合到EV(例如，外泌体)膜中存在的支架蛋白的结合分子，例如，可以特异性结合到在EV(例如，外泌体)的表面上天然或重组表达PTGRN的抗体或其结合部分。因此，在一些方面，锚定部分[AM]和/或支架部分是支架X。
在一些方面，支架X选自由前列腺素F2受体负调节因子(PTGFRN蛋白)；basigin(BSG蛋白)；免疫球蛋白超家族成员2(IGSF2蛋白)；免疫球蛋白超家族成员3(IGSF3蛋白)；免疫球蛋白超家族成员8(IGSF8蛋白)；整联蛋白β-1(ITGB1蛋白)；整联蛋白α-4(ITGA4蛋白)；4F2细胞表面抗原重链(SLC3A2蛋白)；ATP转运蛋白的类型(ATP1A1、ATP1A2、ATP1A3、ATP1A4、ATP1B3、ATP2B1、ATP2B2、ATP2B3和ATP2B4蛋白)；其功能性片段；及其任何组合组成的组。在一些方面，支架X是PTGFRN蛋白或其功能性片段。在一些方面，支架X包含如SEQ IDNO:302中列出的氨基酸序列。在一些方面，支架X包含与SEQ ID NO:302至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一的氨基酸序列。下文详细公开了不同的支架X蛋白。
在一些方面，生物活性分子[BAM]经由锚定部分[AM]连接到EV的外表面，其中[AM]和[BAM]通过本文所公开的优化的接头(即，包括上述公开的特定结构、组分和长度限制的接头)连接。在一些方面，生物活性分子[BAM]包括以下各项或由以下各项组成：多肽、肽、多核苷酸(DNA和/或RNA)、化学化合物、或其任何组合。
在一些方面，生物活性分子[BAM]包括化学化合物，例如小分子药物。在一些方面，生物活性分子[BAM]包括反义寡核苷酸(ASO)、siRNA、miRNA、shRNA、mRNA、核酸、antimir、RNA诱饵(RNA decoy)、或其任何组合。在一些方面，ASO是间隙聚体(gapmer)。下文详细公开了特异性核酸生物活性分子，例如针对特异性靶标如NLRP3、STAT6、CEBP/β、STAT3、NRas、KRAS或Pmp22的ASO。
在一些方面，生物活性分子[BAM]包括以下各项或由以下各项组成：肽、蛋白质、抗体或其抗原结合部分、或其任何组合。在一些方面，其抗原结合部分包含scFv、(scFv)2、Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab1)2、Fv、dAb和Fd片段、双功能抗体、抗体相关多肽、或其任何片段。在一些方面，抗体或其抗原结合部分可以结合到在EV(例如，外泌体)的膜中存在的蛋白X蛋白。
在一些方面，生物活性分子[BAM]包括ASO或由ASO组成。在一些方面，ASO可以靶向前体mRNA(pre-mRNA)或成熟mRNA，包括蛋白质编码区(外显子)、非编码区(例如，5'或3'非翻译区或内含子)、内含子-外显子连接、或调控区(例如，启动子)。在一些方面，ASO靶向蛋白质转录物，例如，STAT6转录物、CEBP/β转录物、STAT3转录物、KRAS转录物、NRAS转录物、NLPR3转录物、或其任何组合。下文提供了针对特异性靶标的ASO的详细描述。
在本公开的一些方面，EV是外泌体，例如天然外泌体，或过表达重组蛋白(例如，支架X蛋白如PTGFRN或其功能部分)的外泌体。下文详细公开了外泌体的类型，包括不同的大小、组成或制造方法。
本公开还提供了包含本文所公开的EV(细胞外囊泡)(例如，外泌体)的药物组合物，其包含构建体(例如包含本公开的优化的接头的式1的构建体)以及药学上可接受的载剂。还提供了包含本文所公开的任何EV或药物组合物的试剂盒，所述试剂盒包含构建体(诸如式1的构建体)和使用说明书，所述构建体包含本公开的优化的接头。
本公开提供了在有需要的受试者中治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括将本公开的EV(例如，外泌体)或包含这种EV(例如，外泌体)的药物组合物施用于受试者。在一些方面，该疾病或病症是癌症、炎症性病症、神经退行性疾病、中枢神经疾病或代谢性疾病。在一些方面，本文所公开的EV(例如，外泌体)可以静脉内、腹膜内、经鼻、经口、肌肉内、皮下、肠胃外、鞘内、肿瘤周围(peritumorally)、眼内或瘤内施用。
本公开提供了一种将生物活性分子[BAM]连接到EV(例如，外泌体)的方法，其包括将锚定部分[AM]连接到该EV，其中根据下式锚定部分[AM]连接到生物活性部分[BAM]：
[AM]-L1-[SP1]-L2-[SP2]-L3-[BAM]
其中[AM]是锚定部分；L1是可裂解或不可裂解的键联；L2和L3是可选的可裂解或不可裂解的键联；SP1是可选的第一间隔子；以及，SP2是可选的第二间隔子。在一些方面，[AM]是胆固醇-C6、胆固醇-TEG、生育酚-C8、生育酚、或棕榈酸酯-C6。在一些方面，L1是磷酸二酯键。在一些方面，SP1是C3、C6、TEG或HEG。在一些方面，L2是硫代磷酸酯键。在一些方面，SP2是C3、C6、TEG或HEG。在一些方面，L3是硫代磷酸酯键。在一些方面，[BAM]是反义寡核苷酸(ASO)，例如，间隙聚体。在一些方面，连接[AM]和[BAM]的优化的接头的长度为约5nm至约10nm、约10nm至约15nm、约15nm至约20nm、约20nm至约25nm、或约25至约30nm。
本公开还提供了增加连接到EV的生物活性分子(BAM)的负载密度的方法，其包括筛选根据下式连接到生物活性部分(BAM)的大量的锚定部分(AM)：
[AM]-L1-[SP1]-L2-[SP2]-L3-[BAM]
其中[AM]是锚定部分；L1是可裂解或不可裂解的键联；L2和L3是可选的可裂解或不可裂解的键联；SP1是可选的第一间隔子；以及，SP2是可选的第二间隔子。在一些方面，[AM]是胆固醇-C6、胆固醇-TEG、生育酚-C8、生育酚、或棕榈酸酯-C6。在一些方面，L1是磷酸二酯键。在一些方面，SP1是C3、C6、TEG或HEG。在一些方面，L2是硫代磷酸酯键。在一些方面，SP2是C3、C6、TEG或HEG。在一些方面，L3是硫代磷酸酯键。在[BAM]是反义寡核苷酸(ASO)。在一些方面，连接[AM]和[BAM]的优化的接头的长度为约5nm至约10nm、约10nm至约15nm、约15nm至约20nm、约20nm至约25nm、或约25至约30nm。在一些方面，相对于对照，连接到EV(例如，外泌体)的生物活性分子[BAM]的负载密度增加至少约1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约5.5倍、至少约6倍、至少约6.5倍、至少约7倍、至少约7.5倍、至少约8倍、至少约8.5倍、至少约9倍、至少约9.5倍、或至少约10倍。在一些方面，对照是缺乏优化的接头的相应的构建体。例如，在一些方面，对于具有结构[AM]-L1-[SP1]-L2-[SP2]-L3-[BAM]的构建体的对照是具有结构[AM]-[BAM]的构建体。
一种细胞外囊泡(EV)，其根据下式经由锚定部分(AM)共价连接到EV的生物活性分子(BAM)：
[AM]-L1-[SP1]-L2-[SP2]-L3-[ASO]
其中[AM]是选自由胆固醇-C6、胆固醇-TEG、生育酚-C8、生育酚和棕榈酸酯-C6组成的组的锚定部分；L1是磷酸二酯酶可裂解的键联；SP1是选自由C3、C6、TEG和HEG组成的组的可选的第一间隔子；L2是可选的硫代磷酸酯不可裂解的键联；SP2是选自由C3、C6、TEG和HEG组成的组的可选的第二间隔子；以及，L3是可选的硫代磷酸酯不可裂解的键联。在一些方面，EV是外泌体，例如天然外泌体或重组外泌体。在其中外泌体是天然外泌体的一些方面，连接到外泌体的ASO的负载密度相对于对照增加了至少约1.5倍(见上文)。在其中外泌体是过表达PTGFRN的外泌体的一些方面，连接到外泌体上的ASO的负载密度相对于对照(例如，没有优化的接头的构建体，如[AM]-[BAM])增加了至少约2倍。
在一些方面，其中外泌体是天然外泌体并且锚定部分[AM]是胆固醇-C6。在一些方面，每个天然外泌体的ASO分子的平均数量为5032+/-386。在一些方面，每个天然外泌体的ASO分子的平均数量在约4500至约5500之间。在一些方面，每个天然外泌体的ASO分子的平均数量在约4500至约4600之间、约4600至约4700之间、约4700至约4800之间、约4800至约4900之间、约4900至约5000之间、约5000至约5100之间、约5100至约5200之间、约5200至约5300之间、约5300至约5400之间、或约5400至约5500之间。在一些方面，每个天然外泌体的ASO分子的平均数量为至少约4500、至少约4600、至少约4700、至少约4800、至少约4900、至少约5000、至少约5100、至少约5200、至少约5300、至少约5400、或至少约5500。在一些方面，天然外泌体的负载效率为73％至93％。在一些方面，天然外泌体的负载效率在约70％至约95％之间。在一些方面，天然外泌体的负载效率在约70％至约75％之间、约75％至约80％之间、约80％至约85％之间、约85％至约90％之间、或约90％至约95％之间。在一些方面，天然外泌体的负载效率为至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、或至少约95％。
在其中外泌体是天然外泌体并且锚定部分[AM]是胆固醇-TEG的一些方面，每个外泌体的ASO分子的平均数量为3991+/-490。在一些方面，每个天然外泌体的ASO分子的平均数量在约3500至约4500之间。在一些方面，每个天然外泌体的ASO分子的平均数量在约3500至约3600之间、约3600至约3700之间、约3700至约3800之间、约3800至约3900之间、约3900至约4000之间、约4000至约4100之间、约4100至约4200之间、约4200至约4300之间、约4300至约4400之间、或约4400至约4500之间。在一些方面，每个天然外泌体的ASO分子的平均数量为至少约3500、至少约3600、至少约3700、至少约3800、至少约3900、至少约4000、至少约4100、至少约4200、至少约4300、至少约4400、或至少约4500。在一些方面，天然外泌体的负载效率为56％至79％。在一些方面，天然外泌体的负载效率在约50％至约85％之间。在一些方面，天然外泌体的负载效率在约50％至约55％之间、约55％至约60％之间、约60％至约65％之间、约65％至约70％之间、约70％至约75％之间、约75％至约80％之间、或约80％至约85％之间。在一些方面，天然外泌体的负载效率为至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、或至少约85％。
在其中外泌体是天然外泌体并且锚定部分[AM]是生育酚-C8、生育酚或棕榈酸酯-C6的一些方面，每个天然外泌体的ASO分子的平均数量为4241+/-722。在一些方面，每个天然外泌体的ASO分子的平均数量在约3500至约5000之间。在一些方面，每个天然外泌体的ASO分子的平均数量在约3500至约3600之间、约3600至约3700之间、约3700至约3800之间、约3800至约3900之间、约3900至约4000之间、约4000至约4100之间、约4100至约4200之间、约4200至约4300之间、约4300至约4400之间、约4400至约4500之间、约4500至约4600之间、约4600至约4700之间、约4700至约4800之间、约4800至约4900之间、或约4900至约5000之间。在一些方面，每个天然外泌体的ASO分子的平均数量为至少约3500、至少约3600、至少约3700、至少约3800、至少约3900、至少约4000、至少约4100、至少约4200、至少约4300、至少约4400、至少约4500、至少约4600、至少约4700、至少约4800、至少约4900、或至少约5000。在一些方面，天然外泌体的负载效率为57％至73％。在一些方面，天然外泌体的负载效率在约50％至约80％之间。在一些方面，天然外泌体的负载效率在约50％至约55％之间、约55％至约60％之间、约60％至约65％之间、约65％至约70％之间、约70％至约75％之间、或约75％至约80％之间。在一些方面，天然外泌体的负载效率为至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、或至少约80％。在一些方面，每个天然外泌体的ASO分子的平均数量为超过5000、超过6000、超过7000、超过8000、超过9000、超过10,000、超过11,000、超过12,000、超过13,000、超过14,000、超过15,000、超过16,000、超过17,000、超过18,000、超过19,000或超过20,000。在一些方面，每个外泌体的ASO分子的平均数量在约5000至约6,000、约6,000至约7,000、约7,000至约8,000、约8,000至约9,000、约9,000至约10,000、约10,000至约11,000、约11,000至约12,000、约12,000至约13,000、约13,000至约14,000、约14,000至约15,000、约15,000至约16,000、约16,000至约17,000、约17,000至约18,000、约18,000至约19,000、或约19,0000至约20,000之间。
在其中外泌体是支架-X外泌体并且锚定部分[AM]是胆固醇-C6的一些方面，每个外泌体的ASO分子的平均数量为2442+/-339。在一些方面，每个支架-X外泌体的ASO分子的平均数量在约2000至约3000之间。在一些方面，每个支架-X外泌体的ASO分子的平均数量在约2000至约2100之间、约2100至约2200之间、约2200至约2300之间、约2300至约2400之间、约2400至约2500之间、约2500至约2600之间、约2600至约2700之间、约2700至约2800之间、约2800至约2900之间、或约2900至约3000之间。在一些方面，每个支架-X外泌体的ASO分子的平均数量为至少约2000、至少约2100、至少约2200、至少约2300、至少约2400、至少约2500、至少约2600、至少约2700、至少约2800、至少约2900、或至少约3000。在一些方面，支架-X外泌体的负载效率为27％至46％。在一些方面，支架-X外泌体的负载效率在约25％至约50％之间。在一些方面，支架-X外泌体的负载效率在约25％至约30％之间、约30％至约35％之间、约35％至约40％之间、约40％至约45％之间、或约45％至约50％之间。在一些方面，支架-X外泌体的负载效率为至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、或至少约50％。
在其中外泌体是支架-X外泌体并且锚定部分[AM]是胆固醇-TEG的一些方面，每个外泌体的ASO分子的平均数量为1728+/-264。在一些方面，每个支架-X外泌体的ASO分子的平均数量在约1400至约2100之间。在一些方面，每个支架-X外泌体的ASO分子的平均数量在约1400至约1500之间、约1500至约1600之间、约1600至约1700之间、约1700至约1800之间、约1800至约1900之间、约1900至约2000之间、或约2000至约2100之间。在一些方面，每个支架-X外泌体的ASO分子的平均数量为至少约1400、至少约1500、至少约1600、至少约1700、至少约1800、至少约1900、至少约2000、或至少约2100。在一些方面，支架-X外泌体的负载效率为19％至33％。在一些方面，支架-X外泌体的负载效率在约15％至约35％之间。在一些方面，支架-X外泌体的负载效率在约15％至约20％之间、约20％至约25％之间、约25％至约30％之间、或约30％至约35％之间。在一些方面，支架-X外泌体的负载效率为至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、或至少约35％。在其中外泌体是支架-X外泌体并且锚定部分[AM]是生育酚-C8、生育酚或棕榈酸酯-C6的一些方面，每个外泌体的ASO分子的平均数量为2979+/-1006。在一些方面，每个支架-X外泌体的ASO分子的平均数量在约1900至约4000之间。在一些方面，每个支架-X外泌体的ASO分子的平均数量在约1900至约2000之间、约2000至约2100之间、约2100至约2200之间、约2200至约2300之间、约2300至约2400之间、约2400至约2500之间、约2500至约2600之间、约2600至约2700之间、约2700至约2800之间、约2800至约2900之间、约2900至约3000之间、约3000至约3100之间、约3100至约3200之间、约3200至约3300之间、约3300至约3400之间、约3400至约3500之间、约3500至约3600之间、约3600至约3700之间、约3700至约3800之间、约3800至约3900之间、或约3900至约4000之间。在一些方面，每个支架-X外泌体的ASO分子的平均数量为至少约1900、至少约2000、至少约2100、至少约2200、至少约2300、至少约2400、至少约2500、至少约2600、至少约2700、至少约2800、至少约2900、至少约3000、至少约3100、至少约3200、至少约3300、至少约3400、至少约3500、至少约3600、至少约3700、至少约3800、至少约3900、或至少约4000。在一些方面，支架-X外泌体的负载效率为37％至68％，负载效率在约30％至约75％之间。在一些方面，负载效率在约30％至约35％之间、约35％至约40％之间、约40％至约45％之间、约45％至约50％之间、约50％至约55％之间、约55％至约60％之间、约60％至约65％之间、约65％至约70％之间、或约70％至约75％之间。在一些方面，支架-X外泌体的负载效率为至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、或至少约75％。
在一些方面，每个支架-X外泌体的ASO分子的平均数量为超过5000、超过6000、超过7000、超过8000、超过9000、超过10,000、超过11,000、超过12,000、超过13,000、超过14,000、超过15,000、超过16,000、超过17,000、超过18,000、超过19,000或超过20,000。在一些方面，每个支架-X外泌体的ASO分子的平均数量在约5000至约6,000、约6,000至约7,000、约7,000至约8,000、约8,000至约9,000、约9,000至约10,000、约10,000至约11,000、约11,000至约12,000、约12,000至约13,000、约13,000至约14,000、约14,000至约15,000、约15,000至约16,000、约16,000至约17,000、约17,000至约18,000、约18,000至约19,000、或约19,0000至约20,000之间。
本公开还提供了一种外泌体，其包括根据下式经由锚定部分[AM]共价连接到外泌体的反义寡核苷酸[ASO]：
[AM]-L1-[SP1]-L2-[SP2]-L3-[BAM]
其中[AM]是胆固醇-TEG；L1是磷酸二酯酶可裂解的键；SP1是C3；L2是硫代磷酸酯不可裂解的键；SP2是TEG；以及，L3是硫代磷酸酯不可裂解的键。当外泌体是天然外泌体时，每个外泌体的ASO分子的平均数量为至少4500，例如，在约4500至约5000之间(例如，约4780)，并且负载效率为至少约70％，例如，在约70％至约90％之间(例如，约80％)。当外泌体是过表达PTGFRN的外泌体时，每个外泌体的ASO分子的平均数量为至少约1500，例如，在约1500至约2000之间(例如，约1659)，并且负载效率为至少约20％，例如，在约20％至约35％之间(例如，约28％)。
本公开还提供了一种外泌体，其包括根据下式经由锚定部分[AM]共价连接到外泌体的反义寡核苷酸[ASO]：
[AM]-L1-[SP1]-L2-[BAM]
其中[AM]是胆固醇-TEG；L1是磷酸二酯酶可裂解的键；SP1是TEG；以及L2是硫代磷酸酯不可裂解的键。当外泌体是天然外泌体时，每个外泌体的ASO分子的平均数量为至少约3500，例如，在约3500至约4500之间(例如，约4090)，并且负载效率为至少约60％，例如，在约60％至约70％之间(例如，约68％)。当外泌体是过表达PTGFRN的外泌体时，每个外泌体的ASO分子的平均数量为至少约1400，例如，在约1400至约2400之间(例如，约1890)，并且负载效率为至少约20％，例如，在约20％至约40％之间(例如，约31％)。
例如，在图4、图5、图9A、图11和图13中呈现了本公开的特定的优化的接头组合。
在一些方面，本公开提供了一种外泌体，其包括根据式：[AM]-[SP1]-L1-[SP2]-[BAM]经由锚定部分[AM]共价连接到外泌体的生物活性分子，其中[AM]是脂质锚定物，[SP1]是第一间隔子(相对于外泌体表面的近端)，[SP2]是第二间隔子(相对于外泌体表面的远端)，[BAM]是本文所公开的生物活性分子，并且[SP1]和[SP2]通过可裂解的接头连接。在一些方面，可裂解的接头是磷酸二酯可裂解的接头。在一些方面，脂质选自由棕榈酸、胆固醇、生育酚和16:0氰尿酸(氰尿酰氯)乙醇胺(PE)组成的组。在一些方面，间隔子1选自由C3、C6、C8、TEG和无(None)组成的组。在一些方面，间隔子2选自由C3、TEG、HEG和无(None)组成的组。无(None)表示构建体中没有间隔子1或间隔子2(no Spacer 1or Spacer 2)。
在一些方面，本公开提供了一种外泌体，其包括根据式：[AM]-[SP1]-L1-[SP2]-[ASO]经由锚定部分[AM]共价连接到外泌体的反义寡核苷酸[ASO]，其中[AM]是脂质锚定物，[SP1]是第一间隔子(相对于外泌体表面的近端)，[SP2]是第二间隔子(相对于外泌体表面的远端)，[ASO]是反义寡核苷酸，并且[SP1]和[SP2]通过可裂解的接头连接。在一些方面，可裂解的接头是磷酸二酯可裂解的接头。在一些方面，脂质选自由棕榈酸、胆固醇、生育酚和16:0氰尿酸(氰尿酰氯)PE组成的组。在一些方面，间隔子1选自由C3、C6、C8、TEG和无(None)组成的组。在一些方面，间隔子2选自由C3、TEG、HEG和无(None)组成的组。
在一些方面，本公开提供了根据式：[AM]-[SP1]-L1-[SP2]-的膜锚定构建体，其中[AM]是脂质锚定物，[SP1]是第一间隔子(相对于囊泡(例如，外泌体)的膜的近端)，[SP2]是第二间隔子(相对于囊泡(例如，外泌体)的膜的远端)，并且[SP1]和[SP2]通过可裂解的接头连接。在一些方面，可裂解的接头是磷酸二酯可裂解的接头。在一些方面，脂质选自由棕榈酸、胆固醇、生育酚和16:0氰尿酸(氰尿酰氯)PE组成的组。在一些方面，间隔子1选自由C3、C6、C8、TEG和无(None)组成的组。在一些方面，间隔子2选自由C3、TEG、HEG和无(None)组成的组。
在一些方面，本公开提供了选自由以下各项组成的组的构建体：生育酚-C8-TEG-[ASO]、生育酚-TEG-无(None)-[ASO]、胆固醇-TEG-C3-[ASO]、胆固醇-C6-C3-[ASO]、胆固醇-TEG-HEG-[ASO]、胆固醇-TEG-无(None)-[ASO]和棕榈酸酯-C6-HEG-[ASO]。
在一些方面，本公开提供了一种外泌体，其包括选自由以下各项组成的组的膜锚定构建体：生育酚-C8-TEG-[ASO]、生育酚-TEG-无(None)-[ASO]、胆固醇-TEG-C3-[ASO]、胆固醇-C6-C3-[ASO]、胆固醇-TEG-HEG-[ASO]、胆固醇-TEG-无(None)-[ASO]和棕榈酸酯-C6-HEG-[ASO]。
在一些方面，本公开提供了选自由以下各项组成的组的膜锚定构建体：生育酚-C8-TEG、生育酚-TEG-无(None)、胆固醇-TEG-C3、胆固醇-C6-C3、胆固醇-TEG-HEG、胆固醇-TEG-无(None)和棕榈酸酯-C6-HEG。在一些方面，膜锚定构建体包括生育酚-C8-TEG、由生育酚-C8-TEG组成、或基本上由生育酚-C8-TEG组成。在一些方面，膜锚定构建体包括生育酚-TEG-无(None)、由生育酚-TEG-无(None)组成、或基本上由生育酚-TEG-无(None)组成。在一些方面，膜锚定构建体包括胆固醇-TEG-C3、由胆固醇-TEG-C3组成、或基本上由胆固醇-TEG-C3组成。在一些方面，膜锚定构建体包括胆固醇-C6-C3、由胆固醇-C6-C3组成、或基本上由胆固醇-C6-C3组成。在一些方面，膜锚定构建体包括胆固醇-TEG-HEG、由胆固醇-TEG-HEG组成、或基本上由胆固醇-TEG-HEG组成。在一些方面，膜锚定构建体包括胆固醇-TEG-无(None)、由胆固醇-TEG-无(None)组成、或基本上由胆固醇-TEG-无(None)组成。在一些方面，膜锚定构建体包括棕榈酸酯-C6-HEG、由棕榈酸酯-C6-HEG组成、或基本上由棕榈酸酯-C6-HEG组成。
在一些方面，本公开提供了一种外泌体，其包含经由膜锚定构建体共价连接到外泌体的表面的生物活性分子，所述膜锚定构建体选自由以下各项组成的组：生育酚-C8-TEG、生育酚-TEG-无(None)、胆固醇-TEG-C3、胆固醇-C6-C3、胆固醇-TEG-HEG、胆固醇-TEG-无(None)和棕榈酸酯-C6-HEG。在一些方面，膜锚定构建体包括生育酚-C8-TEG、由生育酚-C8-TEG组成、或基本上由生育酚-C8-TEG组成。在一些方面，膜锚定构建体包括生育酚-TEG-无(None)、由生育酚-TEG-无(None)组成、或基本上由生育酚-TEG-无(None)组成。在一些方面，膜锚定构建体包括胆固醇-TEG-C3、由胆固醇-TEG-C3组成、或基本上由胆固醇-TEG-C3组成。在一些方面，膜锚定构建体包括胆固醇-C6-C3、由胆固醇-C6-C3组成、或基本上由胆固醇-C6-C3组成。在一些方面，膜锚定构建体包括胆固醇-TEG-HEG、由胆固醇-TEG-HEG组成、或基本上由胆固醇-TEG-HEG组成。在一些方面，膜锚定构建体包括胆固醇-TEG-无(None)、由胆固醇-TEG-无(None)组成、或基本上由胆固醇-TEG-无(None)组成。在一些方面，膜锚定构建体包括棕榈酸酯-C6-HEG、由棕榈酸酯-C6-HEG组成、或基本上由棕榈酸酯-C6-HEG组成。
在一些方面，本文所公开的外泌体可以在保持外泌体的稳定性和/或促进更高负载密度的条件下制备和/或储存。在一些方面，包含经由膜锚定构建体连接到外泌体的表面的ASO的外泌体可在低盐缓冲液(例如，包含约50mM NaCl)中维持约2、4、6或8天，所述膜锚定构建体选自由以下组成的组：生育酚-C8-TEG、生育酚TEG-无(None)、胆固醇-TEG-C3、胆固醇-C6-C3、胆固醇-TEG-HEG、胆固醇-TEG-无(None)和棕榈酸酯-C6-HEG。在一些方面，包含经由膜锚定构建体连接到外泌体的表面的ASO的外泌体可在高盐缓冲液(例如，包含约150mM NaCl)中维持约2、4、6或8天，所述膜锚定构建体连选自由以下各项组成的组：生育酚-C8-TEG、生育酚TEG-无(None)、胆固醇-TEG-C3、胆固醇-C6-C3、胆固醇-TEG-HEG、胆固醇-TEG-无(None)和棕榈酸酯-C6-HEG。在一些方面，包含经由膜锚定构建体连接到外泌体的表面的ASO的外泌体可在进一步包含蔗糖的高盐缓冲液(例如，包含约150mM NaCl)中维持约2、4、6或8天，所述膜锚定构建体选自由以下各项组成的组：生育酚-C8-TEG、生育酚TEG-无(None)、胆固醇-TEG-C3、胆固醇-C6-C3、胆固醇-TEG-HEG、胆固醇-TEG-无(None)和棕榈酸酯-C6-HEG。在一些方面，包含经由膜锚定构建体连接到外泌体表面的ASO的外泌体可在4℃或25℃下在低盐缓冲液、高盐缓冲液或进一步包含蔗糖的高盐缓冲液(例如，包含约150mM NaCl)中维持约2、4、6或8天，所述膜锚定构建体选自由以下各项组成的组：生育酚-C8-TEG、生育酚TEG-无(None)、胆固醇-TEG-C3、胆固醇-C6-C3、胆固醇-TEG-HEG、胆固醇-TEG-无(None)、和棕榈酸酯-C6-HEG。
本公开还提供了一种增加外泌体的负载密度的方法，其包括在高盐条件下(例如，使用包含约150mM NaCl的高盐缓冲液)负载外泌体。在一些方面，外泌体负载有连接(例如，共价连接)到膜锚定构建体的ASO，所述膜锚定结构体选自例如由以下各项组成的组：生育酚-C8-TEG、生育酚TEG-无(None)、胆固醇-TEG-C3、胆固醇-C6-C3、胆固醇-TEG-HEG、胆固醇-TEG-无(None)和棕榈酸酯-C6-HEG。
锚定部分[AM]
本文所公开的构建体(例如，式1的构建体)包括至少一个锚定部分[AM]，其经由本公开的优化的接头将至少一种生物活性分子[BAM]锚定到EV(例如，外泌体)的表面。能够将生物活性分子[BAM]锚定到EV(例如，外泌体)的表面的合适的锚定部分[AM]包括，例如，如下文详细描述的固醇(例如，胆固醇)、脂质、磷脂、溶血磷脂、脂肪酸、脂溶性维生素、支架部分(例如，蛋白质X)、或其组合。
在一些方面，锚定部分[AM]包括脂质或由脂质组成。脂质锚定部分[AM]可以包括本领域已知的任何脂质，例如棕榈酸或糖基磷脂酰肌醇。在一些方面，脂质是脂肪酸、磷脂(phosphatide)、磷脂(phospholipid)(例如，磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、或磷脂酰乙醇胺)或其类似物(例如，磷脂酰胆碱、卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、脑磷脂、或磷脂酰丝氨酸、或其类似物或部分，如其部分水解的部分)。
通常，锚定部分是例如经由固相合成化学连接的。然而，锚定部分[AM]可酶促连接到生物活性分子[BAM]。锚定部分[AM]可在任何化学上可行的位置，例如在核苷酸序列(例如，ASO)的5'端和/或3'端，直接地或经由接头或间隔子组合间接地缀合到生物活性分子[BAM]。在一个方面，锚定部分[AM]直接地或经由本文所公开的优化的接头间接地仅缀合到生物活性分子[BAM]的3'端。在一个方面，锚定部分[AM]仅缀合到核苷酸序列(例如，ASO)的5'端。在一个方面，锚定部分[AM]在不是核苷酸序列(例如，ASO)的3'端或5'端的位置缀合。
在一些方面，本公开的锚定部分[AM]可以包括以下公开的任何疏水基团修饰：
在一些方面，本公开的锚定部分可包含本文所公开的两种或更多种类型的锚定部分。例如，在一些方面，锚定部分可包含两种脂质(例如磷脂和脂肪酸)、或两种磷脂、或两种脂肪酸、或脂质和维生素、或胆固醇和维生素等，合在一起具有6-30个碳原子(即，6-30的等价碳数(ECN))。
锚定部分：胆固醇和其它固醇
在一些方面，锚定部分[AM]包含固醇、类固醇、藿烷类(hopanoid)、羟基类固醇、开环类固醇(secosteroid)、或其具有亲脂性质的类似物。在一些方面，锚定部分包含固醇，如植物固醇、真菌固醇(mycosterol)或动物固醇。示例性动物固醇包括胆固醇和24S-羟基胆固醇；示例性植物固醇包括麦角固醇(真菌固醇)、菜油固醇、谷固醇和豆固醇。在一些方面，固醇选自麦角固醇、7-脱氢胆固醇、胆固醇、24S-羟基胆固醇、羊毛固醇、环阿屯醇、岩藻固醇、大褐马尾藻固醇、菜油固醇、β-谷固醇、谷甾烷醇、粪固醇、燕麦固醇或豆固醇。固醇可以是游离的固醇、酰化的(固醇酯)、烷基化的(固醇烷基醚)、硫酸化的(硫酸固醇)，或连接到糖苷部分的(固醇糖苷)，其本身可以是酰化的(酰化固醇糖苷)。
在一些方面，锚定部分[AM]包括类固醇。在一些方面，类固醇选自二氢睾酮、熊果醇、龙舌蓝皂苷配基(hecigenin)、薯蓣皂苷配基(diosgenin)、黄体酮或皮质醇。
例如，固醇可(经由固相合成或缀合)连接，例如，经由固醇的可用的—OH基团连接到间隔子[SP]。示例性固醇具有如下所示的通用骨架：
作为另一示例，麦角固醇具有以下结构：
胆固醇具有以下结构：
在一些方面，固醇或类固醇是亚磷酰胺。在一些方面，固醇或类固醇是包含接头(例如烷基(C3、C6或C8)接头或甘醇接头(例如，TEG))的亚磷酰胺。在一些方面，固醇/类固醇-亚磷酰胺或固醇/类固醇-接头-亚磷酰胺经由固相合成，例如经由可裂解的(例如，磷酸二酯)或不可裂解的(例如，硫代磷酸酯)键联，连接到间隔子[SP]或连接到生物活性分子[BAM]。
锚定部分：脂肪酸
在一些方面，锚定部分[AM]包括脂肪酸。在一些方面，脂肪酸是短链、中链或长链脂肪酸。在一些方面，脂肪酸是饱和脂肪酸。在一些方面，脂肪酸是不饱和脂肪酸。在一些方面，脂肪酸是单不饱和脂肪酸。在一些方面，脂肪酸是多不饱和脂肪酸，如ω-3(ω-3)或ω-6(ω-6)脂肪酸。
在一些方面，脂质(例如，脂肪酸)具有C2-C18链。在一些方面，脂质(例如，脂肪酸)具有C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17或C18链。在一些方面，脂肪酸具有C2链。在一些方面，脂肪酸具有C3链。在一些方面，脂肪酸具有C4链。在一些方面，脂肪酸具有C5链。在一些方面，脂肪酸具有C6链。在一些方面，脂肪酸具有C7链。在一些方面，脂肪酸具有C8链。在一些方面，脂肪酸具有C9链。在一些方面，脂肪酸具有C10链。在一些方面，脂肪酸具有C11链。在一些方面，脂肪酸具有C12链。在一些方面，脂肪酸具有C13链。在一些方面，脂肪酸具有C14链。在一些方面，脂肪酸具有C15链。在一些方面，脂肪酸具有C16链。在一些方面，脂肪酸具有C17链。在一些方面，脂肪酸具有C18链。
在一些方面，脂肪酸具有C4-C18链。在一些方面，脂肪酸具有C2-C3、C2-C4、C2-C5、C2-C6、C2-C7、C2-C8、C2-C9、C2-C10、C2-C11、C2-C12、C2-C13、C2-C14、C2-C15、C2-C16、C2-C17、C2-C18、C3-C4、C3-C5、C3-C6、C3-C7、C3-C8、C3-C9、C3-C10、C3-C11、C3-C12、C3-C13、C3-C14、C3-C15、C3-C16、C3-C17、C3-C18、C4-C5、C4-C6、C4-C7、C4-C8、C4-C9、C4-C10、C4-C11、C4-C12、C4-C13、C4-C14、C4-C15、C4-C16、C4-C17、C4-C18、C5-C6、C5-C7、C5-C8、C5-C9、C5-C10、C5-C11、C5-C12、C5-C13、C5-C14、C5-C15、C5-C16、C5-C17、C5-C18、C6-C7、C6-C8、C6-C9、C6-C10、C6-C11、C6-C12、C6-C13、C6-C14、C6-C15、C6-C16、C6-C17、C6-C18、C7-C8、C7-C9、C7-C10、C7-C11、C7-C12、C7-C13、C7-C14、C7-C15、C7-C16、C7-C17、C7-C18、C8-C9、C8-C10、C8-C11、C8-C12、C8-C13、C8-C14、C8-C15、C8-C16、C8-C17、C8-C18、C9-C10、C9-C11、C9-C12、C9-C13、C9-C14、C9-C15、C9-C16、C9-C17、C9-C18、C10-C11、C10-C12、C10-C13、C10-C14、C10-C15、C10-C16、C10-C17、C10-C18、C11-C12、C11-C13、C11-C14、C11-C15、C11-C16、C11-C17、C11-C18、C12-C13、C12-C14、C12-C15、C12-C16、C12-C17、C12-C18、C13-C14、C13-C15、C13-C16、C13-C17、C13-C18、C14-C15、C14-C16、C14-C17、C14-C18、C15-C16、C15-C17、C15-C18、C16-C17、C16-C18、或C17-C18链。
在一些方面，锚定部分[AM]包含两种脂肪酸，每种脂肪酸独立地选自具有链的脂肪酸，该链具有前述碳原子范围或数量中的任一者。在一些方面，其中一种脂肪酸独立地为具有C2-C3、C2-C4、C2-C5、C2-C6、C2-C7、C2-C8、C2-C9、C2-C10、C2-C11、C2-C12、C2-C13、C2-C14、C2-C15、C2-C16、C2-C17、C2-C18、C3-C4、C3-C5、C3-C6、C3-C7、C3-C8、C3-C9、C3-C10、C3-C11、C3-C12、C3-C13、C3-C14、C3-C15、C3-C16、C3-C17、C3-C18、C4-C5、C4-C6、C4-C7、C4-C8、C4-C9、C4-C10、C4-C11、C4-C12、C4-C13、C4-C14、C4-C15、C4-C16、C4-C17、C4-C18、C5-C6、C5-C7、C5-C8、C5-C9、C5-C10、C5-C11、C5-C12、C5-C13、C5-C14、C5-C15、C5-C16、C5-C17、C5-C18、C6-C7、C6-C8、C6-C9、C6-C10、C6-C11、C6-C12、C6-C13、C6-C14、C6-C15、C6-C16、C6-C17、C6-C18、C7-C8、C7-C9、C7-C10、C7-C11、C7-C12、C7-C13、C7-C14、C7-C15、C7-C16、C7-C17、C7-C18、C8-C9、C8-C10、C8-C11、C8-C12、C8-C13、C8-C14、C8-C15、C8-C16、C8-C17、C8-C18、C9-C10、C9-C11、C9-C12、C9-C13、C9-C14、C9-C15、C9-C16、C9-C17、C9-C18、C10-C11、C10-C12、C10-C13、C10-C14、C10-C15、C10-C16、C10-C17、C10-C18、C11-C12、C11-C13、C11-C14、C11-C15、C11-C16、C11-C17、C11-C18、C12-C13、C12-C14、C12-C15、C12-C16、C12-C17、C12-C18、C13-C14、C13-C15、C13-C16、C13-C17、C13-C18、C14-C15、C14-C16、C14-C17、C14-C18、C15-C16、C15-C17、C15-C18、C16-C17、C16-C18、或C17-C18链的脂肪酸，并且另一种脂肪酸独立地为具有C2-C3、C2-C4、C2-C5、C2-C6、C2-C7、C2-C8、C2-C9、C2-C10、C2-C11、C2-C12、C2-C13、C2-C14、C2-C15、C2-C16、C2-C17、C2-C18、C3-C4、C3-C5、C3-C6、C3-C7、C3-C8、C3-C9、C3-C10、C3-C11、C3-C12、C3-C13、C3-C14、C3-C15、C3-C16、C3-C17、C3-C18、C4-C5、C4-C6、C4-C7、C4-C8、C4-C9、C4-C10、C4-C11、C4-C12、C4-C13、C4-C14、C4-C15、C4-C16、C4-C17、C4-C18、C5-C6、C5-C7、C5-C8、C5-C9、C5-C10、C5-C11、C5-C12、C5-C13、C5-C14、C5-C15、C5-C16、C5-C17、C5-C18、C6-C7、C6-C8、C6-C9、C6-C10、C6-C11、C6-C12、C6-C13、C6-C14、C6-C15、C6-C16、C6-C17、C6-C18、C7-C8、C7-C9、C7-C10、C7-C11、C7-C12、C7-C13、C7-C14、C7-C15、C7-C16、C7-C17、C7-C18、C8-C9、C8-C10、C8-C11、C8-C12、C8-C13、C8-C14、C8-C15、C8-C16、C8-C17、C8-C18、C9-C10、C9-C11、C9-C12、C9-C13、C9-C14、C9-C15、C9-C16、C9-C17、C9-C18、C10-C11、C10-C12、C10-C13、C10-C14、C10-C15、C10-C16、C10-C17、C10-C18、C11-C12、C11-C13、C11-C14、C11-C15、C11-C16、C11-C17、C11-C18、C12-C13、C12-C14、C12-C15、C12-C16、C12-C17、C12-C18、C13-C14、C13-C15、C13-C16、C13-C17、C13-C18、C14-C15、C14-C16、C14-C17、C14-C18、C15-C16、C15-C17、C15-C18、C16-C17、C16-C18、或C17-C18链的脂肪酸。在一些方面，每种脂肪酸独立地具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个碳原子的链。
合适的脂肪酸包括饱和直链脂肪酸、饱和支链脂肪酸、不饱和脂肪酸、羟基脂肪酸和多元羧酸。
有用的饱和直链脂肪酸的示例包括具有偶数个碳原子的那些，诸如丁酸(C4)、己酸(C6)、辛酸(C8)、癸酸(C10)、月桂酸(C12)、肉豆蔻酸(C14)、棕榈酸(C16)、或硬脂酸(C18)，以及具有奇数个碳原子的那些，诸如丙酸(C3)、正戊酸(C5)、庚酸(C7)、壬酸(C9)、十一烷酸(C11)、十三烷酸(C13)、十五烷酸(C15)、或十七烷酸(C17)。
合适的饱和支链脂肪酸的示例包括异丁酸、异己酸、异辛酸、异癸酸、异月桂酸、11-甲基十二烷酸、异肉豆蔻酸、13-甲基-十四烷酸、异棕榈酸、15-甲基-十六烷酸、或异硬脂酸。合适的饱和奇数碳支链脂肪酸包括以异丁基封端的反异脂肪酸，诸如6-甲基-辛酸、8-甲基-癸酸、10-甲基-十二烷酸、12-甲基-十四烷酸、或14-甲基-十六烷酸。
合适的不饱和脂肪酸的示例包括4-癸烯酸、癸烯酸、4-十二碳烯酸、5-十二碳烯酸、月桂烯酸、4-十四碳烯酸、5-十四碳烯酸、9-十四碳烯酸、棕榈油酸、6-十八碳烯酸、油酸等。
合适的羟基脂肪酸的示例包括α-羟基月桂酸、α-羟基肉豆蔻酸、α-羟基棕榈酸、α-羟基硬脂酸、ω-羟基月桂酸、α-羟基花生酸、9-羟基-12-十八碳烯酸、蓖麻油酸、9-羟基-反式-10,12-十八碳二烯酸、9,10-二羟基硬脂酸、12-羟基硬脂酸等。
合适的多元羧酸的示例包括草酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、D,L-苹果酸等。
在一些方面，每种脂肪酸独立地选自丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一酸、月桂酸、十三酸、肉豆蔻酸、十五酸、棕榈酸、十七酸、或硬脂酸。
在一些方面，每种脂肪酸独立地选自α-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、亚油酸、γ-亚油酸、二高-γ-亚油酸、花生四烯酸、二十二碳四烯酸、棕榈油酸、异油酸、桐酸(paullinic acid)、油酸、反油酸、伯色五烯酸(bosseopentaenoic acid)、沙丁鱼酸(sardine acid)、或另一种单不饱和脂肪酸或多不饱和脂肪酸。
在一些方面，脂肪酸中的一种或两种是必需脂肪酸。鉴于某些必需脂肪酸的有益健康作用，可通过在治疗剂中包含此类脂肪酸来增加所公开的负载治疗剂的外泌体的治疗益处。在一些方面，必需脂肪酸是选自由以下各项组成的组的n-6或n-3必需脂肪酸：亚麻酸、γ-亚麻酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、肾上腺酸、二十二碳五烯n-6酸、α-亚麻酸、或硬脂酸。
脂肪酸链在其链长度上差异很大，并且可以根据链长进行分类，例如从短到很长。短链脂肪酸(SCFA)是具有约五个或更少个碳的链的脂肪酸(例如，丁酸)。在一些方面，脂肪酸是SCFA。中链脂肪酸(MCFA)包括具有约6-12个碳的链的脂肪酸，其可形成中链甘油三酯。在一些方面，脂肪酸是MCFA。长链脂肪酸(LCFA)包括具有13-21个碳的链的脂肪酸。在一些方面，脂肪酸是LCFA。在一些方面，脂肪酸是LCFA。
锚定部分：磷脂
在一些方面，锚定部分[AM]包括磷脂。磷脂是一类为所有细胞膜的主要组分的脂质。由于它们的两亲特征，它们可以形成脂质双层。磷脂分子的结构一般由两个疏水性脂肪酸“尾部”和由磷酸基团组成的亲水性“头部”组成。例如，磷脂可以是根据下式的脂质：
其中Rp代表磷脂部分，并且R1和R1代表具有或不具有相同或不同的不饱和度的脂肪酸部分。
磷脂部分可以选自例如由磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、2溶血磷脂酰胆碱和鞘磷脂(sphingomyelin)组成的非限制性组。
特定的磷脂可以促进与脂质双层(例如，外泌体膜的脂质双层)的融合。例如，阳离子磷脂可以与膜的一种或多种带负电荷的磷脂相互作用。磷脂与膜的融合可允许含脂质组合物的一种或多种要素与膜结合或穿过膜。
脂肪酸部分可以选自例如由月桂酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻油酸(myristoleic acid)、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸组成的非限制性组。
在本公开中用作锚定部分的磷脂可以是天然磷脂或非天然磷脂。还考虑了非天然磷脂种类，其包括具有修饰和置换(包括支化、氧化、环化和炔烃)的天然种类。例如，磷脂可以用一种或多种炔烃(例如，其中一个或多个双键被三键替代的烯基)官能化或与其交联。在适当的反应条件下，炔基基团可以在暴露于叠氮化物时发生铜催化的环加成反应。
磷脂包括但不限于甘油磷脂，诸如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和磷脂酸。可用于本文所公开的锚定部分的磷脂的示例包括：磷脂酰乙醇胺(例如，二月桂酰基磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰乙醇胺、1-棕榈酰基-2-油烯基磷脂酰乙醇胺、1-油烯基-2-棕榈酰基磷脂酰乙醇胺和二芥酰基磷脂酰乙醇胺)；磷脂酰甘油(例如，二月桂酰基磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油、二棕榈酰基磷脂酰甘油、二硬脂酰基磷脂酰甘油、二油酰基磷脂酰甘油、1-棕榈酰基-2-油烯基-磷脂酰甘油、1-油烯基-2-棕榈酰基-磷脂酰甘油和二芥酰基磷脂酰甘油)；磷脂酰丝氨酸(例如，二月桂酰基磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰基磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰基磷脂酰丝氨酸、二硬脂酰基磷脂酰丝氨酸、二油酰基磷脂酰丝氨酸、1-棕榈酰基-2-油烯基-磷脂酰丝氨酸、1-油烯基-2-棕榈酰基-磷脂酰丝氨酸和二芥酰基磷脂酰丝氨酸)；磷脂酸(例如，二月桂酰基磷脂酸、二肉豆蔻酰基磷脂酸、二棕榈酰基磷脂酸、二硬脂酰基磷脂酸、二油酰基磷脂酸、1-棕榈酰基-2-油烯基磷脂酸、1-油烯基-2-棕榈酰基磷脂酸和二芥酰基磷脂酸)；以及磷脂酰肌醇(例如，二月桂酰基磷脂酰肌醇、二肉豆蔻酰基磷脂酰肌醇、二棕榈酰基磷脂酰肌醇、二硬脂酰基磷脂酰肌醇、二油酰基磷脂酰肌醇、1-棕榈酰基-2-油烯基-磷脂酰肌醇、1-油烯基-2-棕榈酰基磷脂酰肌醇和二芥酰基磷脂酰肌醇)。
磷脂可以是对称的或不对称的类型。如本文所用，术语“对称的磷脂”包括具有匹配脂肪酸部分的甘油磷脂和鞘脂，其中可变脂肪酸部分和鞘氨醇主链的烃链包括相当数量的碳原子。如本文所用，术语“不对称的磷脂”包括溶血脂质(lysolipids)、具有不同脂肪酸部分(例如，具有不同碳原子数和/或不饱和度(例如，双键)的脂肪酸部分)的甘油磷脂和鞘脂，其中可变脂肪酸部分和鞘氨醇主链的烃链包括不同数量的碳原子(例如，可变脂肪酸部分包括比烃链多至少两个碳原子或比烃链少至少两个碳原子)。
在一些方面，锚定部分[AM]包括具有10个碳(C10)、12个碳(C12)、14个碳(C14)、16个碳(C16)或18个碳(C18)的磷脂(例如，对称的磷脂)。在一些方面，锚定部分[AM]包括具有14个碳(C14)的对称的磷脂。在一些方面，锚定部分[AM]包括具有16个碳(C16)的对称的磷脂。在一些方面，锚定部分[AM]包括具有18个碳(C18)的对称的磷脂。在一些方面，磷脂酰是乙醇胺(PE)。因此，在一些方面，锚定部分[AM]包括C14 PE。因此，在一些方面，锚定部分[AM]包括C16 PE。因此，在一些方面，锚定部分[AM]包括C18 PE。在一些方面，PE的酰基链不包含不饱和度。因此，在一些方面，锚定部分[AM]包含C14:0PE、C16:0PE或C18:0PE。
在一些方面，锚定部分[AM]包含磷脂，所述磷脂包含三聚氰酸(氰尿酸)基团。在一些方面，包含三聚氰酸基团的磷脂是PE。在一些方面，包含三聚氰酸基团的磷脂是C14:0PE、C16:0PE或C18:0PE。在特定方面，如图11所示，包含三聚氰酸基团的磷脂是C16:0氰尿酸PE。
在一些方面，锚定部分[AM]包含至少一种对称的磷脂。对称的磷脂可以选自由以下各项组成的非限制性组：1,2-二丙酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(03:0PC)、1,2-二丁酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(04:0PC)、1,2-二戊酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(05:0PC)、1,2-二己酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(06:0PC)、1,2-二庚酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(07:0PC)、1,2-二辛酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(08:0PC)、1,2-二壬酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(09:0PC)、1,2-二癸酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(10:0PC)、1,2-二(十一碳酰基)-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(11:0PC，DUPC)、1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(12:0PC)、1,2-二(十三碳酰基)-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(13:0PC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(14:0PC，DMPC)、1,2-二(十五碳酰基)-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(15:0PC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(16:0PC，DPPC)、1,2-二植烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(4ME 16:0PC)、1,2-二(十七碳酰基)-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(17:0PC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:0PC，DSPC)、1,2-二反肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(14:1(Δ9-反式)PC)、1,2-二顺棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(16:1(Δ9-顺式)PC)、1,2-二反棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(16:1(Δ9-反式)PC)、1,2-二石油烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:1(Δ6-顺式)PC)、1,2-二顺油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:1(Δ9-顺式)PC，DOPC)、1,2-二反油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:1(Δ9-反式)PC)、1,2-二亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:2(顺式)PC，DLPC)、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:3(顺式)PC，DLnPC)、1,2-二己酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(06:0PE)、1,2-二辛酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(08:0PE)、1,2-二癸酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(10:0PE)、1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(12:0PE)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(14:0PE)、1,2-二(十五烷酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(15:0PE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(16:0PE)、1,2-二植烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(4ME 16:0PE)、1,2-二(十七烷酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(17:0PE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(18:0PE，DSPE)、1,2-二棕榈油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(16:1PE)、1,2-二顺油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(18:1(Δ9-顺式)PE，DOPE)、1,2-二反油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(18:1(Δ9-反式)PE)、1,2-二亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(18:2PE，DLPE)、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(18:3PE，DLnPE)、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:0二醚PC)、1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸-外消旋-(1-甘油)钠盐(DOPG)、及其任何组合。
在一些方面，锚定部分[AM]包含选自由以下各项组成的非限制性组的至少一种对称的磷脂：DLPC、DMPC、DOPC、DPPC、DSPC、DUPC、18:0二醚PC、DLnPC、DAPC、DHAPC、DOPE、4ME16:0PE、DSPE、DLPE、DLnPE、DAPE、DHAPE、DOPG、及其任何组合。
在一些方面，锚定部分[AM]包含至少一种不对称的磷脂。不对称的磷脂可选自由以下各项组成的非限制性组：1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(14:0-16:0PC，MPPC)、1-肉豆蔻酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(14:0-18:0PC，MSPC)、1-棕榈酰基-2-乙酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(16:0-02:0PC)、1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(16:0-14:0PC，PMPC)、1-棕榈酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(16:0-18:0PC，PSPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(16:0-18:1PC，POPC)、1-棕榈酰基-2-亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(16:0-18:2PC，PLPC)、1-棕榈酰基-2-花生四烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(16:0-20:4PC)、1-棕榈酰基-2-二十二碳六烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(14:0-22:6PC)、1-硬脂酰基-2-肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:0-14:0PC，SMPC)、1-硬脂酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:0-16:0PC，SPPC)、1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:0-18:1PC，SOPC)、1-硬脂酰基-2-亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:0-18:2PC)、1-硬脂酰基-2-花生四烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:0-20:4PC)、1-硬脂酰基-2-二十二碳六烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:0-22:6PC)、1-油酰基-2-肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:1-14:0PC，OMPC)、1-油酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:1-16:0PC，OPPC)、1-油酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:1-18:0PC，OSPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(16:0-18:1PE，POPE)、1-棕榈酰基-2-亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(16:0-18:2PE)、1-棕榈酰基-2-花生四烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(16:0-20:4PE)、1-棕榈酰基-2-二十二碳六烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(16:0-22:6PE)、1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(18:0-18:1PE)、1-硬脂酰基-2-亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(18:0-18:2PE)、1-硬脂酰基-2-花生四烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(18:0-20:4PE)、1-硬脂酰基-2-二十二碳六烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(18:0-22:6PE)、1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、及其任何组合。
为了提供更显著的核酸酶抗性、细胞摄取效率和更显著的RNA干扰效应，磷脂酰乙醇胺可用作锚定部分，例如二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、1-棕榈酰基-2-油烯基-磷脂酰乙醇胺和二油酰基磷脂酰乙醇胺。
锚定部分：溶血脂质(例如，溶血磷脂)
在一些方面，锚定部分[AM]包含溶血脂质，例如溶血磷脂。溶血脂质是脂质的衍生物，其中一个或两个脂肪酰基链已被除去(通常通过水解)。溶血脂质是脂质的衍生物，其中一个或两个脂肪酰基链已通过水解除去。
在一些方面，锚定部分包含上文所公开的任何磷脂，其中一个或两个酰基链已通过水解除去，并且因此所得溶血磷脂包含一个脂肪酸酰基链或不包含脂肪酸酰基链。
在一些方面，锚定部分包含溶血性甘油磷脂、溶血性鞘糖脂、溶血性磷脂酰胆碱、溶血性磷脂酰乙醇胺、溶血性磷脂酰肌醇、或溶血性磷脂酰丝氨酸。
在一些方面，锚定部分[AM]包含选自由以下各项组成的非限制性组的溶血脂质：1-己酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(06:0Lyso PC)、1-庚酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(07:0Lyso PC)、1-辛酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(08:0Lyso PC)、1-壬酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(09:0Lyso PC)、1-癸酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(10:0Lyso PC)、1-十一烷酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(11:0Lyso PC)、1-月桂酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(12:0Lyso PC)、1-十三碳酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(13:0Lyso PC)、1-肉豆蔻酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(14:0Lyso PC)、1-十五碳酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(15:0Lyso PC)、1-棕榈酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(16:0Lyso PC)、1-十七碳酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(17:0Lyso PC)、1-硬脂酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:0Lyso PC)、或1-油酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:1Lyso PC)、1-肉豆蔻酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(14:0Lyso PE)、1-棕榈酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(16:0Lyso PE)1-硬脂酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(18:0Lyso PE)、1-油酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(18:1Lyso PE)、1-十六烷基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、及其任何组合。
锚定部分：维生素
在一些方面，锚定部分[AM]包含亲脂性维生素，例如维生素A、维生素E、维生素K、维生素D、叶酸、维生素B2(核黄素)、维生素B3(烟酸)、或维生素B6(吡哆醇)。
在一些方面，锚定部分[AM]包括维生素D或由维生素D组成。维生素D是一组脂溶性的开环类固醇，负责用于增加肠道对钙、镁和磷酸盐的吸收，以及许多其他生物效应。在人类中，这组最重要的化合物是维生素D3(也称为胆钙化醇)和维生素D2(麦角钙化醇)。
在一些方面，锚定部分[AM]包括维生素B9(叶酸)或由维生素B9(叶酸)组成。
在一些方面，锚定部分[AM]包括维生素B2(核黄素)或由维生素B2(核黄素)组成。
在一些方面，锚定部分[AM]包括维生素B3(烟酸)或由维生素B3(烟酸)组成。
在一些方面，锚定部分[AM]包括维生素B6(吡哆醇)或由维生素B6(吡哆醇)组成。
在一些方面，锚定部分[AM]包括维生素A或由维生素A组成。维生素A是一组不饱和营养有机化合物，其包括视黄醇、视黄醛、视黄酸和几种维生素原A类胡萝卜素(最显著的是β-胡萝卜素)。在一些方面，锚定部分包括视黄醇。在一些方面，锚定部分[AM]包括类视黄醇(retinoid)。类视黄醇是一类为维生素A的同效维生素或与其化学相关的化学化合物。在一些方面，锚定部分包含第一代类视黄醇(例如，视黄醇、维甲酸、异维甲酸或阿利维甲酸)、第二代类视黄醇(例如，依曲替酯(etretinate)或阿曲汀(acitretin))、第三代类视黄醇(例如，阿达帕林、贝沙罗汀或他扎罗汀)、或其任何组合。
在一些方面，锚定部分[AM]包括维生素E或由维生素E组成。生育酚是一类甲基化酚，其中许多具有维生素E活性。因此，在一些方面，锚定部分包含α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、或其组合。
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生育三烯酚也具有维生素E活性。生育三烯酚与生育酚之间的关键化学结构差异在于与生育酚的饱和侧链相比，生育三烯酚具有含三个碳-碳双键的不饱和类异戊二烯侧链。在一些方面，锚定部分包含α-生育三烯酚、β-生育三烯酚、γ-生育三烯酚、δ-生育三烯酚、或其组合。生育三烯酚可用下式表示
α(α)-生育三烯酚：R1＝Me，R2＝Me，R3＝Me；
β(β)-生育三烯酚：R1＝Me，R2＝H，R3＝Me；
γ(γ)-生育三烯酚：R1＝H，R2＝Me，R3＝Me；
δ(δ)-生育三烯酚：R1＝H，R2＝H，R3＝Me。
在一些方面，锚定部分[AM]包括维生素K或由维生素K组成。在化学上，维生素K家族包含2-甲基-1.4-萘醌(3-)衍生物。维生素K包含两种天然同效维生素：维生素K1和维生素K2。维生素K1(也称为植物甲萘醌、叶绿醌或(E)-植物甲萘醌)的结构以存在植基为特征。维生素K2(甲基萘醌)的结构以分子中存在的聚异戊二烯侧链为特征，所述侧链可含有6至13个异戊二烯基单元。因此，维生素K2由许多相关的化学亚型组成，具有不同长度的由类异戊二烯原子基团组成的碳侧链。MK-4是维生素K2的最常见形式。诸如MK-7、MK-8和MK-9的长链形式在发酵食品中占主导地位。更长链形式的维生素K2，诸如MK-10至MK-13由细菌合成，但它们未被良好吸收，并且几乎没有生物学功能。除了维生素K的天然形式外，还存在许多合成形式的维生素K，诸如维生素K3(甲萘醌；2-甲基萘-1,4-二酮)、维生素K4和维生素K5。
因此，在一些方面，锚定部分包含维生素K1、K2(例如，MK-4、MK-5、MK-6、MK-7、MK-8、MK-9、MK-10、MK-11、MK-12或MK-13)、K3、K4、K5、或其任何组合。
在化学上，维生素K家族包含2-甲基-1,4-萘醌(3-)衍生物。维生素K包含两种天然同效维生素：维生素K1(叶绿醌)和维生素K2(甲基萘醌)。结果，维生素K2由许多相关的化学亚型组成，具有不同长度的由类异戊二烯原子基团组成的碳侧链。研究最多的两种是甲基萘醌-4(MK-4)和甲基萘醌-7(MK-7)。因此，在一些方面，维生素K是MK-4、MK-5、或其组合。
支架部分
在一些方面，锚定部分[AM]包含可插入EV(例如，外泌体)的膜中的支架部分，例如支架X蛋白(例如，PTGFR或所公开的片段)，或能够经由亲和性(例如，抗体或其结合部分)与支架部分(例如，支架X蛋白)相互作用的分子，存在于天然或重组表达的EV(例如，外泌体)的膜中。在一些方面，一个或多个支架部分可以是CD47、CD55、CD49、CD40、CD133、CD59、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(glypican-1)、CD9、CD63、CD81、整联蛋白、选择蛋白(selectins)、凝集素、钙粘蛋白(cadherins)、本领域技术人员已知的其他类似多肽、或其任何组合。可以用于本公开的其他支架部分的非限制性示例包括：氨基肽酶N(CD13)；脑啡肽酶，AKA膜金属内肽酶(MME)；外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员1(ENPP1)；神经纤毛蛋白-1(NRP1)；或其任何组合。
在其他方面，通过在生产细胞中重组表达支架部分，在EV(例如，外泌体)的膜中表达一个或多个支架部分。从生产细胞获得的EV(例如，外泌体)可以进一步修饰为与马来酰亚胺部分或接头缀合。在其他方面，支架部分(例如，支架X)是去糖基化的。在一些方面，支架部分(例如，支架X)是高度糖基化的，例如在相同条件下高于天然存在的支架X。
支架部分：支架X
在一些方面，锚定部分[AM]可以包括本文所公开的支架部分，例如支架X，例如PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP转运蛋白、或其片段或变体。在一些方面，锚定部分[AM]可以包含配体(例如，抗体或其结合部分)，该配体可以特异性结合到本文所公开的支架部分，例如支架X，例如PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP转运蛋白、或其片段或变体。
在一些方面，与不过表达支架蛋白质(例如，PTGFRN)的天然EV(例如，外泌体)相比，表面(例如，支架X)工程化EV(例如，外泌体)(即过表达支架蛋白(例如，PTGFRN)的EV)表现出优异的特征。例如，与天然存在的EV(例如，外泌体)相比，表面(例如，支架X)工程化EV(例如，外泌体)在其外表面上可以含有更多支架蛋白。因此，与天然存在的EV(例如，外泌体)相比，表面(例如，支架X)工程化EV(例如，外泌体)可以具有更大、更特异或更可控的生物活性。
在一些方面，支架X包含前列腺素F2受体负调节剂(PTGFRN多肽)。PTGFRN多肽也可称为CD9配偶体1(CD9P-1)、含Glu-Trp-Ile EWI基序的蛋白F(EWI-F)、前列腺素F2-α受体调节蛋白、前列腺素F2-α受体相关蛋白、或CD315。
其他支架X蛋白的非限制性示例可见于2019年2月5日发布的美国专利号US10195290B1，其通过引用整体并入。
键联和间隔子
本公开的优化的接头包括键联的组合，例如，可裂解的或不可裂解的键(例如，分别为磷酸二酯键或硫代磷酸酯键)和可裂解的或不裂解的接头和间隔子。键联和间隔子的组合的主要功能是在一个或多个锚定部分[AM]和一个或多个生物活性分子[BAM]之间提供最佳间距。例如，在ASO的情况下，接头和间隔子的组合的目标是减少空间位阻并定位ASO，使其能够与靶核酸(例如，mRNA或miRNA)相互作用。其他目标是增加EV(例如，外泌体)的负载效率、增加每个EV的BAM数量、增加在EV上的BAM的表面密度、增加BAM结合到EV后的效力、或其任何组合。在本公开的上下文中，术语“接头组合”是指构成本文所公开的优化的接头的键联和间隔子的组合。
一些接头可能易受裂解影响(“可裂解的接头”)，从而促进生物活性分子[BAM]的释放。因此，在一些方面，本文所公开的接头组合可以包括可裂解的接头。在生物活性分子保持活性的条件下，此类可裂解的接头可能例如易受酸诱导的裂解、光诱导的裂解、肽酶诱导的裂解、酯酶诱导的裂解和二硫键裂解影响。或者，接头可基本上抵抗裂解(“不可裂解的接头”)。在一些方面，可裂解的接头包含间隔子。在一些方面，间隔子是PEG。
在一些方面，接头组合包含至少2、至少3、至少4、至少5、或至少6个、或更多个本文所公开的不同接头。在一些方面，接头组合中的接头可通过酯键(例如，磷酸二酯或硫代磷酸酯)连接。
在一些方面，接头是锚定部分[AM]和生物活性分子[BAM](例如，ASO)之间的直接键。
不可裂解的接头
在一些方面，接头组合包含“不可裂解的接头”。不可裂解的接头是能够连接本文所公开的构建体(例如，式1的构建体)的两个或更多个组分的任何化学部分。例如，不可裂解的接头可以将锚定部分[AM]和间隔子[SP]连接，将第一间隔子[SP]连接到第二间隔子[SP]，或将间隔子[SP]连接到生物活性分子[BAM]。不可裂解的接头基本上耐受酸诱导的裂解、光诱导的裂解、肽酶诱导的裂解、酯酶诱导的裂解和二硫键裂解。
此外，不可裂解的是指在环状二核苷酸和/或抗体不会失去其活性的条件下，接头中或与接头相邻的化学键经受由酸、光不稳定裂解剂、肽酶、酯酶或裂解二硫键的化学或生理化合物诱导的裂解的能力。
在一些方面，接头组合包括不可裂解的接头，所述不可裂解的接头包含例如四甘醇(TEG)、六甘醇(HEG)、聚乙二醇(PEG)、琥珀酰亚胺、或其任何组合。在一些方面，不可裂解的接头包含间隔子单元以将生物活性分子连接到不可裂解的接头。
在一些方面，一个或多个不可裂解的接头包含连接在一起的较小单元(例如，HEG、TEG、甘油、C2至C12烷基等)。在一个方面，键联是酯键联(例如，磷酸二酯或硫代磷酸酯)或其它键联。
不可裂解的接头/间隔子：乙二醇(HEG、TEG、PEG)
在一些方面，接头组合包含不可裂解的接头，其中所述不可裂解的接头包含特征为式R3-(O-CH2-CH2)n-或R3-(0-CH2-CH2)n-O-的聚乙二醇(PEG)，其中R3是氢、甲基或乙基，并且n具有2至200的值。在一些方面，接头包含间隔子，其中所述间隔子是PEG。
在一些方面，PEG接头是低聚乙二醇，例如二甘醇、三甘醇、四甘醇(TEG)、五甘醇、或六甘醇(HEG)接头。
在一些方面，n具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15的值。在一些方面，n在2至10之间、在10至15之间。在一些特定方面，n具有从2至5、从5至10、或从10至15的值。在一些方面，PEG是支链PEG。支链PEG具有3至10个源自中心核心基团的PEG链。
在某些方面，PEG部分是单分散聚乙二醇。在本公开的上下文中，单分散聚乙二醇(mdPEG)是具有单一的、限定链长和分子量的PEG。mdPEG通常通过色谱法从聚合混合物中分离而产生。在某些式中，单分散PEG部分被指定为缩写mdPEG。
在一些方面，PEG是星形PEG。星形PEG具有10至15个源自中心核心基团的PEG链。在一些方面，PEG是梳形PEG。梳形PEG具有通常接枝到聚合物主链上的多个PEG链。
在一些方面，本公开的接头组合可包含若干PEG接头，例如侧接PEG、HEG或TEG接头的可裂解的接头。在一些方面，接头组合包含超过一个(HEG)和/或(TEG)单元，其中每个单元例如经由磷酸酯接头、硫代磷酸酯键联、或其组合连接，并且其中接头中碳单元的总数为C15或更少。
不可裂解的接头/间隔子：甘油和聚甘油(PG)
在一些方面，接头组合包含不可裂解的接头，所述不可裂解的接头包含由式((R3—O—(CH2—CHOH—CH2O)n—)所描述的甘油单元或聚甘油(PG)，其中R3是氢、甲基或乙基，并且n具有1至15的值。在一些方面，n具有1至5的值。在一些方面，n具有5至10的值。在一些方面，n具有10至15的值。
在一些方面，PG接头是二甘油、三甘油、四甘油(TG)、五甘油或六甘油(HG)接头。在一些方面，n具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的值。在一些方面，n在2至5之间、在5至10之间、或在10至15之间。
在这些方面的一些替代方案中，n具有1至15的值。在一些方面，异源部分是由式(R3—O—(CH2—CHOR5—CH2—O)n—)所描述的支链聚甘油，其中R5是氢；或由式(R3—O—(CH2—CHOH—CH2—O)n—)所描述的直链甘油链，并且R3是氢、甲基或乙基。在一些方面，异源部分是由式(R3—O—(CH2—CHOR5—CH2—O)n—)所描述的超支化聚甘油，其中R5是氢；或由式(R3—O—(CH2—CHOR6—CH2—O)n—)所描述的甘油链，其中R6是氢；或由式(R3—O—(CH2—CHOR7—CH2—O)n—)所描述的甘油链，其中R7是氢；或由式(R3—O—(CH2—CHOH—CH2—O)n—)所描述的直链甘油链，并且R3是氢、甲基或乙基。超支化甘油及其合成方法在Oudshorn等人(2006)Biomaterials 27:5471-5479；Wilms等人(20100Acc.Chem.Res.43,129-41以及其中引用的参考文献中进行描述。
在一些方面，接头组合包含超过一个(甘油)和/或(HG)和/或(TG)单元，其中每个单元例如经由磷酸酯接头、硫代磷酸酯键联、或其组合连接，并且其中接头中碳单元的总数为C15或更少。
不可裂解的接头：脂肪族(烷基)接头
在一些方面，接头组合包含至少一个脂肪族(烷基)接头，例如丙基、丁基、己基、或C2-C15烷基，如C2-C10烷基或C2-C6烷基。
在一些方面，接头组合包含烷基链，例如未取代的烷基。在一些方面，接头组合包含经取代的或未取代的烯基、经取代的或未取代的炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、杂环基烷基、杂环基烯基、杂环基炔基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基杂芳基烷基、烷基杂芳基烷基、烷基杂芳基烯基、烷基杂芳基炔基、烯基杂芳基烷基、烯基杂芳基烯基、烯基杂芳基炔基、炔基杂芳基烷基、炔基杂芳基烯基、炔基杂芳基炔基、烷基杂环基烷基、烷基杂环基烯基、烷基杂环基炔基、烯基杂环基烷基、烯基杂环基烯基、或烯基杂环基炔基。
可选地，这些组分被取代。取代基包括醇、烷氧基(如甲氧基、乙氧基和丙氧基)、直链或支链烷基(如C1-C15烷基)、胺、氨基烷基(如氨基C1-C15烷基)、亚磷酰胺、磷酸酯、氨基磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代磷酸酯、酰肼、肼、卤素(如F、Cl、Br或I)、酰胺、烷基酰胺(如酰胺C1-C15烷基)、羧酸、羧酸酯、羧酸酐、羧酸卤化物、醚、磺酰基卤化物、亚氨酸酯(imidateester)、异氰酸酯、异硫氰酸酯、卤代甲酸酯、碳化二亚胺加合物、醛、酮、巯基、卤代乙酰基、烷基卤化物、烷基磺酸酯、C(═O)CH═CHC(═O)(马来酰亚胺)、硫醚、氰基、糖(如甘露糖、半乳糖和葡萄糖)、α,β-不饱和羰基、烷基汞、或α,β-不饱和砜。
除非另有说明，术语“烷基”，本身或作为另一取代基的一部分，意指具有指定碳原子数(例如，C1-C10意指1至10个碳原子)的直链或支链烃基。通常，烷基将具有1至15个碳原子，例如具有1至10个碳原子、1至8个碳原子、或1至6个碳原子。“低级烷基”基团是具有1至4个碳原子的烷基。术语“烷基”包括二价和多价基团。例如，在适当的情况下，例如，当式表示烷基是二价时或者当取代基连接在一起形成环时，术语“烷基”包括“亚烷基”。烷基基团的示例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、以及例如正戊基、正己基、正庚基和正辛基的同系物和异构体。
术语“亚烷基”，本身或作为另一取代基的一部分，意指二价(双基)烷基，其中烷基在本文中定义。“亚烷基”例如但不限于–CH2CH2CH2CH2-。通常，“亚烷基”基团将具有1至15个碳原子，例如，具有10个或更少个碳原子(例如，1至8个或1至6个碳原子)。“低级亚烷基”基团是具有1至4个碳原子的亚烷基。
术语“烯基”，本身或作为另一取代基的一部分，是指具有2至15个碳原子和至少一个双键的直链或支链烃基。典型的烯基具有2至10个碳原子和至少一个双键。在一方面，烯基具有2至8个碳原子或2至6个碳原子和1至3个双键。示例性烯基包括乙烯基、2-丙烯基、1-丁-3-烯基、巴豆基(crotyl)、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、2-异戊烯基、1-戊-3-烯基、1-己-5-烯基等。
术语“炔基”，本身或作为另一个取代基的一部分，是指具有2至15个碳原子和至少一个三键的直链或支链、不饱和或多不饱和烃基。典型的“炔基”具有2至10个碳原子和至少一个三键。在本公开的一个方面，炔基具有2至6个碳原子和至少一个三键。示例性炔基包括丙-1-炔基、丙-2-炔基(即，炔丙基)、乙炔基和3-丁炔基。
术语“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷硫基”(或硫代烷氧基)以其常规含义使用，并且是指分别经由氧原子、氨基或硫原子连接到分子的其余部分的烷基。
术语“杂烷基”，本身或与另一术语组合，意指由指定数目的碳原子(例如，C2-C10或C2-C8)和选自例如N、O、S、Si、B和P(在一方面，N、O和S)的至少一个杂原子组成的稳定的直链或支链烃基团，其中氮、硫和磷原子可选地被氧化，并且一个或多个氮原子可选地被季铵化。一个或多个杂原子被置于杂烷基的任何内部位置。杂烷基的示例包括但不限于-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-CH2-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3和-CH＝CH-N(CH3)-CH3。至多两个杂原子可以是连续的，诸如例如-CH2-NH-OCH3和–CH2-O-Si(CH3)3。
类似地，术语“杂亚烷基”，本身或作为另一取代基的一部分，是指衍生自杂烷基的二价基团，例如但不限于-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和–CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。通常，杂烷基将具有3至24个原子(碳和杂原子，不包括氢)(3元至24元杂烷基)。在另一示例中，杂烷基总共具有3至10个原子(3元至10元杂烷基)或3至8个原子(3元至8元杂烷基)。在适当的情况下，例如，当式表示杂烷基是二价时或者当取代基连接在一起形成环时，术语“杂烷基”包括“杂亚烷基”。
术语“环烷基”，本身或与其它术语组合，表示饱和或不饱和的非芳族碳环基团，所述基团具有3至24个碳原子，例如具有3至12个碳原子(例如，C3-C8环烷基或C3-C6环烷基)。环烷基的示例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。术语“环烷基”也包括桥联多环(例如，双环)结构，诸如降冰片基(norbornyl)、金刚烷基和双环[2.2.1]庚基。“环烷基”基团可与至少一个(例如，1至3个)选自芳基(例如，苯基)、杂芳基(例如，吡啶基)和非芳族(例如，碳环或杂环)环的其它环稠合。当“环烷基”基团包括稠合的芳基、杂芳基或杂环时，则“环烷基”基团经由碳环连接到分子的其余部分。
术语“杂环烷基”、“杂环的”、“杂环”或“杂环基”，本身或与其它术语组合，表示在本领域技术人员已知的稳定组合中，含有至少一个并且至多5个选自例如，N、O、S、Si、B和P(例如，N、O和S)的杂原子的碳环非芳族环(例如，3元至8元环以及例如，4、5、6或7元环)，其中氮、硫和磷原子可选被氧化，并且一个或多个氮原子可选被季铵化(例如，1至4个选自氮、氧和硫的杂原子)，或含有至少一个并且至多10个杂原子(例如，1至5个选自N、O和S的杂原子)的4元至8元环的稠合的环体系。示例性杂环烷基包括稠合的苯环。当“杂环”基团包括稠合的芳基、杂芳基或环烷基环时，则“杂环的”基团经由杂环连接到分子的其余部分。杂原子可占据杂环与分子的其余部分连接的位置。
本公开的示例性杂环烷基或杂环基团包括吗啉基、硫代吗啉基、硫代吗啉基S-氧化物、硫代吗啉基S,S-二氧化物、哌嗪基、高哌嗪基(homopiperazinyl)、吡咯烷基、吡咯啉基、咪唑烷基、四氢吡喃基、哌啶基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、哌啶基、高哌啶基、高吗啉基、高硫代吗啉基(homothiomorpholinyl)、高硫代吗啉基S,S-二氧化物、噁唑烷酮基(oxazolidinonyl)、二氢吡唑基、二氢吡咯基、二氢吡唑基、二氢吡啶基、二氢嘧啶基、二氢呋喃基、二氢吡喃基、四氢噻吩基S-氧化物、四氢噻吩基S,S-二氧化物、高硫代吗啉基S-氧化物、1-(1,2,5,6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。
“芳基”意指具有单环(例如，苯基)或稠合到其它芳族或非芳族环(例如，1至3个其它环)的5、6或7元芳族碳环基团。当“芳基”基团包括非芳族环(诸如在1,2,3,4-四氢萘基中)或杂芳基时，则“芳基”基团经由芳环(例如，苯环)连接到分子的其余部分。芳基是可选经取代的(例如，具有本文所述的1至5个取代基)。在一个示例中，芳基具有6至10个碳原子。芳基的非限制性示例包括苯基、1-萘基、2-萘基、喹啉、茚满基(indanyl)、茚基、二氢萘基、芴基、四氢萘基(tetralinyl)、苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基或6,7,8,9-四氢-5H-苯并[a]环庚烯基。在一方面，芳基选自苯基、苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基和萘基。在另一方面，芳基是苯基。
术语“芳基烷基”或“芳烷基”旨在包括其中芳基或杂芳基与烷基连接以生成基团-烷基-芳基和-烷基-杂芳基(其中烷基、芳基和杂芳基在本文中定义)的那些基团。示例性“芳基烷基”或“芳烷基”包括苄基、苯乙基、吡啶基甲基等。
“芳氧基”意指基团-O-芳基，其中芳基如本文所定义。在一个示例中，芳氧基的芳基部分是苯基或萘基。在一方面，芳氧基的芳基部分是苯基。
术语“杂芳基”或“杂芳族”是指含有至少一个选自N、O、S、Si和B(例如，N、O和S)的杂原子(例如，1至5个杂原子，诸如1-3个杂原子)的多不饱和的5、6或7元芳族部分，其中氮和硫原子可选地被氧化，并且一个或多个氮原子可选被季铵化。“杂芳基”基团可以是单环或与其它芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基环(例如，1至3个其它环)稠合。当“杂芳基”包括稠合的芳基、环烷基或杂环烷基环时，则“杂芳基”经由杂芳环连接到分子的其余部分。杂芳基可通过碳或杂原子连接到分子的其余部分。
在一个示例中，杂芳基具有4至10个碳原子和1至5个选自O、S和N的杂原子。杂芳基的非限制性示例包括吡啶基、嘧啶基、喹啉基、苯并噻吩基、吲哚基、吲哚啉基、哒嗪基、吡嗪基、异吲哚基、异喹啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、酞嗪基、咪唑基、异噁唑基、吡唑基、噁唑基、噻唑基、吲哚嗪基、吲唑基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、噁二唑基、噻二唑基、三唑基、四唑基、异噻唑基、萘啶基、异色满基(isochromanyl)、色满基、四氢异喹啉基、异吲哚啉基、异苯并四氢呋喃基、异苯并四氢噻吩基、异苯并噻吩基、苯并噁唑基、吡啶并吡啶基(pyridopyridyl)、苯并四氢呋喃基、苯并四氢噻吩基、嘌呤基、苯并二氧杂环戊烯基(benzodioxolyl)、三嗪基、蝶啶基、苯并噻唑基、咪唑并吡啶基、咪唑并噻唑基、二氢苯并异噁嗪基(dihydrobenzisoxazinyl)、苯并异噁嗪基(benzisoxazinyl)、苯并噁嗪基、二氢苯并异噻嗪基(dihydrobenzisothiazinyl)、苯并吡喃基、苯并噻喃基、色酮基、色满酮基(chromanonyl)、吡啶基-N-氧化物、四氢喹啉基、二氢喹啉基、二氢喹啉酮基、二氢异喹啉酮基、二氢香豆素基、二氢异香豆素基、异吲哚啉酮基(isoindolinonyl)、苯并二噁烷基、苯并噁唑啉酮基(benzoxazolinonyl)、吡咯基N-氧化物、嘧啶基N-氧化物、哒嗪基N-氧化物、吡嗪基-N-氧化物、喹啉基-N-氧化物、吲哚基N-氧化物、吲哚啉基N-氧化物、异喹啉基N-氧化物、喹唑啉基N-氧化物、喹喔啉基N-氧化物、酞嗪基N-氧化物、咪唑基N-氧化物、异噁唑基N-氧化物、噁唑基N-氧化物、噻唑基N-氧化物、吲哚嗪基N-氧化物、吲唑基N-氧化物、苯并噻唑基N-氧化物、苯并咪唑基N-氧化物、吡咯基N-氧化物、噁二唑基N-氧化物、噻二唑基N-氧化物、三唑基N-氧化物、四唑基N-氧化物、苯并噻喃基S-氧化物、苯并噻喃基S,S-二氧化物。示例性杂芳基包括咪唑基、吡唑基、噻二唑基、三唑基、异噁唑基、异噻唑基、咪唑基、噻唑基、噁二唑基和吡啶基。其它示例性杂芳基包括1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、吡啶-4-基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基、6-喹啉基。以上所提到的芳环和杂芳环体系中每个的取代基选自由以下所述的可接受的芳基取代基组成的组。
脂肪族接头的示例包括以下结构：—O—CO—O—、—NH—CO—O—、—NH—CO—NH—、—NH—(CH2)n1—、—S—(CH2)n1—、—CO—(CH2)n1—CO—、—CO—(CH2)n1—NH—、—NH—(CH2)n1—NH—、—CO—NH—(CH2)n1—NH—CO—、—C(═S)—NH—(CH2)n1—NH—CO—、—C(═S)—NH—(CH2)n1—NH—C—(═S)—、—CO—O—(CH2)n1—O—CO—、—C(═S)—O—(CH2)n1—O—CO—、—C(═S)—O—(CH2)n1—O—C—(═S)—、—CO—NH—(CH2)n1—O—CO—、—C(═S)—NH—(CH2)n1—O—CO—、—C(═S)—NH—(CH2)n1—O—C—(═S)—、—CO—NH—(CH2)n1—O—CO—、—C(═S)—NH—(CH2)n1—CO—、—C(═S)—O—(CH2)n1—NH—CO—、—C(═S)—NH—(CH2)n1—O—C—(═S)—、—NH—(CH2CH2O)n2—CH(CH2OH)—、—NH—(CH2CH2O)n2—CH2—、—NH—(CH2CH2O)n2—CH2—CO—、—O—(CH2)n3—S—S—(CH2)n4—O—P(═O)2—、—CO—(CH2)n3—O—CO—NH—(CH2)n4—、—CO—(CH2)n3—CO—NH—(CH2)n4—、—(CH2)n1NH—、—C(O)(CH2)n1NH—、—C(O)—(CH2)n1-C(O)—、—C(O)—(CH2)n1-C(O)O—、—C(O)—O—、—C(O)—(CH2)n1-NH—C(O)—、—C(O)—(CH2)n1—、—C(O)—NH—、—C(O)—、—(CH2)n1-C(O)—、—(CH2)n1-C(O)O—、—(CH2)n1—、—(CH2)n1-NH—C(O)—；其中n1是在1至15之间(例如，2至20、或2至12)的整数；n2是在1至15之间(例如，1至10、或1至6)的整数；n3和n4可以相同或不同，并且是在1至15之间(例如，1至10、或1至6)的整数，并且其中在所述接头中的碳单元的总数为C15或更少。
在一些方面，接头组合包含(C3)n、(C4)n、(C5)n、(C6)n、(C7)n或(C8)n、或其组合，其中n是在1至5之间的整数，其中在所述接头中的碳单元的总数为C15或更少，并且每个单元例如经由磷酸酯接头、硫代磷酸酯键、或其组合连接。
可裂解的接头
在一些方面，本文公开的构建体(例如，式1的构建体)的不同组分可以通过可裂解的接头被连接。术语可裂解的接头是指包含至少一个可断裂或裂解的键联或化学键的接头。如本文所用，术语裂解是指以产生两个或更多个相对较小的分子的方式使相对大的分子中的一个或多个化学键断裂。裂解可由例如核酸酶、肽酶、蛋白酶、磷酸酶、氧化酶或还原酶介导，或者例如由特定物理化学条件(例如氧化还原环境、pH、活性氧(reactive oxygenspecies)的存在或特定波长的光)介导。
在一些方面，如本文所用，术语“可裂解的”是指例如可快速降解的接头，诸如例如磷酸二酯和二硫化物，而术语“不可裂解的”是指例如更稳定的键联，诸如例如耐核酸酶的硫代磷酸酯。
在一些方面，可裂解的接头是二核苷酸或三核苷酸接头、二硫化物、亚胺、硫缩酮、val-cit二肽、或其任何组合。
在一些方面，可裂解的接头包含缬氨酸-丙氨酸-氨基甲酸对氨基苄酯、或缬氨酸-瓜氨酸-氨基甲酸对氨基苄酯。
可裂解的接头：氧化还原可裂解的接头
在一些方面，接头组合包含氧化还原可裂解的接头。作为非限制性示例，一种类型的可裂解的接头是在还原时或在氧化时裂解的氧化还原可裂解的连接基团。在一些方面，氧化还原可裂解的接头含有二硫键，即，它是二硫化物可裂解的接头。例如，氧化还原可裂解的接头可通过细胞内硫醇、氧化酶或还原酶被还原。
可裂解的接头：活性氧(ROS)可裂解的接头
在一些方面，接头组合可包含可裂解的接头，所述可裂解的接头可由活性氧(ROS)，诸如例如由炎症过程(如活化的嗜中性粒细胞)产生的超氧化物(Of)或过氧化氢(H2O2)裂解。在一些方面，ROS可裂解的接头是硫缩酮可裂解的接头。参见，例如，美国专利8,354,455B2，其通过引用整体并入本文。
可裂解的接头：pH依赖性可裂解的接头
在一些方面，接头是包含酸可裂解的连接基团的“酸不稳定型接头”，所述连接基团是在酸性条件(pH<7)下选择性地裂解的连接基团。
作为非限制性示例，酸可裂解的连接基团在酸性环境(例如，约6.0、5.5、5.0或更低)中裂解。在一些方面，pH是约6.5或更低。在一些方面，接头由试剂(诸如可充当广义酸的酶，例如肽酶(其可以是底物特异性的)或磷酸酶)裂解。在细胞中，某些低pH细胞器(诸如内体和溶酶体)可为酸可裂解的连接基团提供裂解环境。虽然人血清的pH是7.4，但细胞中的平均pH略低，在约7.1至7.3的范围内。内体也具有酸性pH，在5.5至6.0的范围内，并且溶酶体是在甚至更酸性的pH下约5.0。因此，pH依赖性可裂解的接头在本领域中有时称为内体不稳定型接头。
酸可裂解的基团可具有通式-C＝NN-、C(O)O或-OC(O)。在另一个非限制性示例中，例如，当连接到酯氧(烷氧基)的碳连接到芳基、经取代的烷基或叔烷基(如二甲基戊基或叔丁基)时。酸可裂解的连接基团的示例包括但不限于胺、亚胺、氨基酯、苯甲酸亚胺、二原酸酯、聚磷酸酯、聚磷腈、缩醛、乙烯基醚、腙、顺式-乌头酸酯、酰肼、硫代氨基甲酰基、imizine、叠氮甲基-甲基马来酸酐、硫代丙酸酯、掩蔽的内体溶解剂、柠康酰基(citraconyl)、或其任何组合。二硫键联也易受pH影响。
在一些方面，接头包含低pH不稳定型腙键。此类酸不稳定型键已广泛用于缀合物领域，例如抗体-药物缀合物。参见例如，Zhou等人(2011)Biomacromolecules12:1460-7；Yuan等人(2008)Acta Biomater.4:1024-37；Zhang等人(2007)Acta Biomater.6:838-50；Yang等人(2007)J.Pharmacol.Exp.Ther.321:462-8；Reddy等人(2006)CancerChemother.Pharmacol.58:229-36；Doronina等人(2003)Nature Biotechnol.21:778-84。
在某些方面，接头包含选自以下的低pH不稳定型键：在酸性环境(例如，pH小于7，大于约4)中不稳定、从而形成二醇和酮的缩酮类；在酸性环境(例如，pH小于7，大于约4)中不稳定、从而形成二醇和醛的缩醛类；在酸性环境(例如，pH小于7，大于约4)中不稳定、从而形成胺和醛或酮的亚胺类或亚胺盐正离子类(iminiums)；在酸性条件下不稳定的硅-氧-碳键联；硅-氮(硅氮烷)键联；硅-碳键联(例如，芳基硅烷、乙烯基硅烷和烯丙基硅烷)；马来酰胺酸(maleamate)(从马来酸酐衍生物和胺合成的酰胺键)；原酸酯；腙；被设计为经受酸催化的水解的活化羧酸衍生物(例如，酯、酰胺)；或乙烯基醚。
其它示例可在美国专利号9,790,494B2和8,137,695B2中找到，其内容通过引用整体并入本文。
可裂解的接头：酶可裂解的接头
在一些方面，接头组合可包含可由细胞内或细胞外酶，例如蛋白酶、酯酶、核酸酶、酰胺酶(amidades)裂解的接头。可裂解接头组合中的特定接头的酶的范围取决于接头的特定键和化学结构。因此，肽接头可例如由肽酶(peptidades)裂解，含有酯键联的接头可例如由酯酶裂解；含有酰胺键联的接头可例如由酰胺酶裂解；等等。
可裂解的接头：酶可裂解的接头：蛋白酶可裂解的接头
在一些方面，接头组合包含蛋白酶可裂解的接头，即可由内源性蛋白酶裂解的接头。只有某些肽在细胞内或细胞外容易地裂解。参见例如，Trout等人，79Proc.Natl.Acad.Sci.USA,626-629(1982)和Umemoto等人，43Int.J.Cancer,677-684(1989)。可裂解的接头可含有由α-氨基酸单元和肽键组成的可裂解的位点，肽键在化学上是一个氨基酸的羧酸根与第二氨基酸的氨基之间的酰胺键。其它酰胺键(诸如羧酸根与赖氨酸的α-氨基之间的键)不被理解为是肽键并且被认为是不可裂解的。
在一些方面，蛋白酶可裂解的接头包含蛋白酶的裂解位点，所述蛋白酶是例如脑啡肽酶(neprilysin)(CALLA或CDlO)、甲拌磷寡肽酶(TOP)、白三烯A4水解酶、内皮素转化酶、ste24蛋白酶、溶神经素、线粒体中间肽酶、间质胶原酶、胶原酶、溶基质素、巨噬细胞弹性蛋白酶、溶基质蛋白素(matrilysin)、明胶酶、穿膜肽酶(meprin)、前胶原C-内肽酶、前胶原N-内肽酶、ADAM和ADAMT金属蛋白酶、髓鞘相关金属蛋白酶、釉质溶解素(enamelysin)、肿瘤坏死因子α-转化酶、胰岛素降解酶(insulysin)、苯乙肼裂解酶(nardilysin)、线粒体加工肽酶、magnolysin、dactylysin样金属蛋白酶、嗜中性粒细胞胶原酶、基质金属蛋白酶、膜型基质金属蛋白酶、SP2内肽酶、前列腺特异性抗原(PSA)、纤溶酶、尿激酶、人成纤维细胞活化蛋白质(FAPα)、胰蛋白酶、糜蛋白酶(chymotrypsin)、降钙蛋白酶(caldecrin)、胰弹性蛋白酶、胰内肽酶、肠肽酶、白细胞弹性蛋白酶、成髓细胞、类糜蛋白酶(chymase)、类胰蛋白酶、颗粒酶、角质层糜蛋白酶、顶体素、激肽释放酶、补体成分和因子、补体替代途径的c3/c5转化酶、甘露糖结合蛋白相关的丝氨酸蛋白酶、凝血因子、凝血酶、蛋白c、u和t型纤溶酶原激活物、组织蛋白酶G、跨膜丝氨酸蛋白酶(hepsin)、前列腺蛋白(prostasin)、肝细胞生长因子活化内肽酶、枯草杆菌蛋白酶/kexin型前蛋白转化酶、弗林蛋白酶、前蛋白转化酶、脯氨酰肽酶、酰基氨基酰基肽酶、肽基-glycaminase、信号肽酶、n-末端亲核氨基水解酶、20s蛋白酶体、γ-谷氨酰转肽酶、线粒体内肽酶、线粒体内肽酶Ia、htra2肽酶、蛋白裂解酶(matriptase)、位点1蛋白酶、天冬酰胺内肽酶(legumain)、组织蛋白酶、半胱氨酸组织蛋白酶、钙蛋白酶、泛素异肽酶T、半胱天冬酶(caspase)、糖基磷脂酰肌醇蛋白转酰胺酶、癌症促凝素、激素原硫醇蛋白酶、γ-谷氨酰基水解酶、博莱霉素水解酶、成纤维细胞活化蛋白(seprase)、组织蛋白酶B、组织蛋白酶D、组织蛋白酶L、组织蛋白酶M、蛋白酶K、胃蛋白酶、凝乳酶、胃亚蛋白酶(gastricsin)、肾素、酵母天冬酶(yapsin)和/或mapsin、前列腺特异性抗原(PSA)、或一般的任何Asp-N、Glu-C、Lys-C或Arg-C蛋白酶。参见例如，Cancer Res.77(24):7027-7037(2017)，其通过引用整体并入本文。
在一些方面，可裂解的接头组分包含肽，所述肽包含一至十个氨基酸残基。在这些方面中，肽允许通过蛋白酶裂解接头，从而有助于在暴露于细胞内蛋白酶(如溶酶体酶)时释放生物活性分子(Doronina et al.(2003)Nat.Biotechnol.21:778-784)。示例性肽包括但不限于二肽、三肽、四肽、五肽和六肽。
肽可包含天然存在的和/或非天然氨基酸残基。术语“天然存在的氨基酸”是指Ala、Asp、Cys、Glu、Phe、Gly、His、He、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、Trp和Tyr。作为非限制性示例，“非天然氨基酸”(即氨基酸不是天然存在的)包括高丝氨酸、高精氨酸、瓜氨酸、苯基甘氨酸、牛磺酸、碘代酪氨酸、硒代半胱氨酸、正亮氨酸(“Nle”)、正缬氨酸(“Nva”)、β-丙氨酸、L-或D-萘丙氨酸、鸟氨酸(“Orn”)等。肽可被设计和优化以由特定酶进行酶促裂解，所述特定酶例如肿瘤相关蛋白酶、组织蛋白酶B、C和D或纤溶酶蛋白酶。
氨基酸还包括天然和非天然氨基酸的D-形式。“D-”表示具有“D”(右旋)构型的氨基酸，与天然存在的(“L-”)氨基酸中的构型相反。可以商购(Sigma Chemical Co.,Advanced Chemtech)或使用本领域已知的方法合成天然或非天然氨基酸。示例性二肽包括但不限于缬氨酸-丙氨酸、缬氨酸-瓜氨酸、苯丙氨酸-赖氨酸、N-甲基-缬氨酸-瓜氨酸、环己基丙氨酸-赖氨酸和β-丙氨酸-赖氨酸。示例性三肽包括但不限于甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。
可裂解的接头：酶可裂解的接头：酯酶可裂解的接头
一些接头由酯酶裂解(“酯酶可裂解的接头”)。只有某些酯可由细胞内部或外部存在的酯酶和酰胺酶裂解。酯通过羧酸与醇之间的缩合作用形成。简单的酯是用简单的醇(诸如脂肪醇)和小的环醇以及小的芳族醇产生的酯。基于酯的可裂解的连接基团的示例包括但不限于亚烷基、亚烯基和亚炔基的酯。酯可裂解的连接基团具有通式-C(O)O-或-OC(O)-。
可裂解的接头：酶可裂解的接头：磷酸酶可裂解的接头
在一些方面，接头组合可包含基于磷酸酯的可裂解的连接基团，所述连接基团由降解或水解磷酸酯基团的试剂裂解。裂解细胞内磷酸酯基团的试剂的示例是酶，如细胞内磷酸酶。基于磷酸酯的连接基团的示例是—O—P(O)(ORk)—O—、—O—P(S)(ORk)—O—、—O—P(S)(SRk)—O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-SP(S)(ORk)-O-、-OP(O)(Rk)-O-、-OP(S)(Rk)-O-、-SP(O)(Rk)-O-、-SP(S)(Rk)-O-、-SP(O)(Rk)-S-、或-OP(S)(Rk)-S-。在各个方面，Rk是以下各项中的任一个：NH2、BH3、CH3、C1-6烷基、C6-10芳基、C1-6烷氧基和C6-10芳基-氧基。在一些方面，C1-6烷基和C6-10芳基是未取代的。其它非限制性示例是-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O-、-SP(S)(H)-O-、-SP(O)(H)-S-、-OP(S)(H)-S-、或-O-P(O)(OH)-O-。
可裂解的接头：光活化可裂解的接头
在一些方面，组合接头包含光活化可裂解的接头，例如硝基苄基接头或包含硝基苄基反应性基团的接头。
可裂解的接头：自分解性的接头
在一些方面，接头组合包含自分解性的接头。在一些方面，本公开的EV(例如，外泌体)中的自分解性的接头在蛋白酶可裂解的接头的酶促裂解后经历1,4消除。在一些方面，本公开的EV(例如，外泌体)中的自分解性的接头在蛋白酶可裂解的接头的酶促裂解后经历1,6消除。在一些方面，自分解性的接头是例如对氨基苄基(pAB)衍生物，如对氨基苄基氨基甲酸酯(pABC)、对氨基苄基醚(PABE)、对氨基苄基碳酸酯、或其组合。在某些方面，自分解性的接头包含芳族基团。在一些方面，芳族基团选自由以下各项组成的组：苄基、肉桂基、萘基和联苯基。在一些方面，芳族基团是杂环的。在其它方面，芳族基团包含至少一个取代基。在一些方面，至少一个取代基选自由以下各项组成的组：F、Cl、I、Br、OH、甲基、甲氧基、NO2、NH2、NO3+、NHCOCH3、N(CH3)2、NHCOCF3、烷基、卤代烷基、C1-C8烷基卤化物、羧酸酯、硫酸酯、氨基磺酸酯和磺酸酯。在其它方面，芳族基团中的至少一个C被N、O或C-R*取代，其中R*独立地选自H、F、Cl、I、Br、OH、甲基、甲氧基、NO2、NH2、NO3+、NHCOCH3、N(CH3)2、NHCOCF3、烷基、卤代烷基、C1-C8烷基卤化物、羧酸酯、硫酸酯、氨基磺酸酯和磺酸酯。
在一些方面，自分解性的接头包含氨基甲酸氨基苄酯基团(例如，对氨基苄基氨基甲酸酯)、氨基苄基醚基团、或氨基苄基碳酸酯基团。在一个方面，自分解性的接头是对氨基苄基氨基甲酸酯(pABC)。pABC是用于自分解性位点特异性前药活化的最有效且最广泛的连接子(connector)键联(参见例如，Carl et al.J.Med.Chem.24:479-480(1981)；WO 1981/001145；Rautio et la,Nature Rev.Drug Disc.7:255-270(2008)；Simplicio et al.,Molecules 13:519-547(2008))。
在一些方面，自分解性的接头将生物活性分子(例如，ASO)连接到蛋白酶可裂解的底物(例如，Val-Cit)。在具体方面，pABC自分解性的接头的氨基甲酸酯基团连接到生物活性分子(例如，ASO)的氨基，并且pABC自分解性的接头的氨基连接到蛋白酶可裂解的底物。
氨基苄基的芳环可以可选地被芳环上的一个或多个(例如，R1和/或R2)取代基置换，所述取代基替代以其它方式连接到形成环的四个未取代的碳中的一个的氢。如本文所用，符号“Rx”(例如，R1、R2、R3、R4)是表示如本文所述的取代基的一般缩写。取代基可提高对氨基苄基的自分解能力(Hay et al.,J.Chem Soc.,Perkin Trans.1:2759-2770(1999)；还参见，Sykes et al.J.Chem.Soc.,Perkin Trans.1:1601-1608(2000))。
可以例如经由1,4消除、1,6消除(例如，pABC)、1,8消除(例如，对氨基肉桂醇)、β-消除、环化消除(例如，4-氨基丁醇酯和乙二胺)、环化/内酯化(lactonization)、环化/内酯化(lactolization)等发生自分解性消除。参见例如，Singh et al.Curr.Med.Chem.15:1802-1826(2008)；Greenwald et al.J.Med.Chem.43:475-487(2000)。
在一些方面，自分解性的接头可包含例如肉桂基、萘基或联苯基(参见例如，Blencowe et al.Polym.Chem.2:773-790(2011))。在一些方面，自分解性的接头包含杂环(参见例如，美国专利号7,375,078；7,754,681)。许多同源芳族(参见例如，Carl etal.J.Med.Chem.24:479(1981)；Senter et al.J.Org.Chem.55:2975(1990)；Taylor etal.J.Org.Chem.43:1197(1978)；Andrianomenjanahary et al.Bioorg.Med.Chem.Lett.2:1903(1992))以及在水性和生理条件下可自分解的基于杂芳族基团的香豆素(参见例如，Weinstein et al.Chem.Commun.46:553(2010))、呋喃、噻吩、噻唑、噁唑、异噁唑、吡咯、吡唑(参见例如，Hay et al.J.Med.Chem.46:5533(2003))、吡啶(参见例如，Perry-Feigenbaum et al.Org.Biomol.Chem.7:4825(2009))、咪唑酮(参见例如，Nailor etal.Bioorg.Med.Chem.Lett.Z:1267(1999)；Hay and Denny,Tetrahedron Lett.38:8425(1997))和三唑(参见例如，Bertrand和Gesson,J.Org.Chem.72:3596(2007))是本领域已知的。还参见美国专利号7,691,962；7,091,186；美国专利公布号US2006/0269480；US2010/0092496；US2010/0145036；US2003/0130189；US2005/0256030)。
在一些方面，本文所公开的接头组合包含串联的超过一个的自分解性的接头，例如两个或更多个pABC单元。参见例如，de Groot et al.J.Org.Chem.66:8815-8830(2001)。在一些方面，本文所公开的接头组合可包含与荧光探针连接的自分解性的接头(例如，对氨基苄醇或对羧基苯甲醛或乙醛酸(glyoxilic acid)的半硫代缩醛胺(hemithioaminal)衍生物)(参见例如，Meyer et al.Org.Biomol.Chem.8:1777-1780(2010))。
当自分解性的接头中的取代基由其从左至右书写的常规化学式指定时，其同样包括将由从右向左书写结构得到的化学上相同的取代基。例如，“-CH2O-”还意在表示“-OCH2-”。
自分解性中的取代基(例如，在如上所述的对氨基苄基自分解性的接头中的R1和/或R2取代基)可包括例如烷基、亚烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氨基、烷硫基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、芳基烷基、芳氧基、杂芳基等。当本公开的化合物包含超过一个取代基时，则独立地选择每个取代基。
在一些具体方面中，自分解性的接头连接到具有下式的可裂解的肽接头，组合具有下式：
-Aa-Yy-
其中每个–A-独立地是氨基酸单元或其组合，a独立地是1至12的整数；并且-Y-是自分解性的间隔子，并且y是1或2。在某些方面，-Aa-是二肽、三肽、四肽、五肽或六肽。在一些方面，–Aa-是选自由缬氨酸-丙氨酸、缬氨酸-瓜氨酸、苯丙氨酸-赖氨酸、N-甲基缬氨酸-瓜氨酸、环己基丙氨酸-赖氨酸、和β-丙氨酸-赖氨酸组成的组。在一些方面，–Aa-是缬氨酸-丙氨酸或缬氨酸-瓜氨酸。
在一些方面，自分解性的接头–Yy-具有下式：
其中每个R2独立地是C1-8烷基、-O-(C1-8烷基)、卤素、硝基或氰基；并且m是0至4的整数。在一些方面，m是0、1或2。在一些方面，m是0。
在一些方面，可裂解的接头是可裂解的肽接头(例如，二肽接头)，其包括自分解性的接头，例如，缬氨酸-丙氨酸-氨基甲酸对氨基苄酯、或缬氨酸-瓜氨酸-氨基甲酸对氨基苄酯。
肽接头
在一些方面，术语“接头”是指肽或多肽序列(例如，合成肽或多肽序列)或非多肽，例如烷基链。在一些方面，可将两个或更多个接头串联连接。一般来说，接头提供了灵活性或防止/改善了空间位阻。接头通常不被裂解；然而，在某些方面，这种裂解可以是合乎需要的。因此，在一些方面，接头可包含一个或多个蛋白酶可裂解的位点，其可位于接头序列内或在接头序列的任一端侧接所述接头。
在一些方面，接头是肽接头。在一些方面，肽接头可包含至少约2、至少约3、至少约4、至少约5、至少约10、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约55、至少约60、至少约65、至少约70、至少约75、至少约80、至少约85、至少约90、至少约95、或至少约100个氨基酸。
在一些方面，接头是甘氨酸/丝氨酸接头。在一些方面，肽接头是根据式：[(Gly)n-Ser]m的甘氨酸/丝氨酸接头，其中n是1至100的任何整数并且m是1至100的任何整数。在其它方面，甘氨酸/丝氨酸接头是根据式：[(Gly)x-Sery]z，其中x是1至4的整数，y是0或1，并且z是1至50的整数。在一些方面，肽接头包含序列Gn，其中n可以是1至100的整数。在一些方面，肽接头可包含序列(GlyAla)n，其中n是在1至100之间的整数。在一些方面，肽接头可包含序列(GlyGlySer)n，其中n是在1至100之间的整数。
在一些方面，肽接头是合成的，即非天然存在的。在一个方面中，肽接头包含肽(或多肽)(例如，天然或非天然存在的肽)，所述肽包含将第一线性氨基酸序列与第二线性氨基酸序列连接或遗传融合，所述第一线性氨基酸序列在自然界中与所述第二线性氨基酸序列不是天然连接或遗传融合的。例如，在一方面，肽接头可包含非天然存在的多肽，所述多肽是天然存在的多肽的经修饰形式(例如，包含突变诸如增添、替换或缺失)。
在其它方面，肽接头可包含非天然存在的氨基酸。在其它方面，肽接头可包含在自然界中不存在的线性序列中存在的天然存在的氨基酸。在其它方面，肽接头可包含天然存在的多肽序列。
生物活性分子[BAM]
在一些方面，本文公开的EV(例如，外泌体)能够递送经由锚定部分[AM]连接到EV(例如，外泌体)的生物活性分子[BAM]，其中锚定部分[AM]经由本文所公开的优化的接头连接到生物活性分子[BAM]。生物活性分子[BAM]是作用于靶标(例如，靶细胞)的试剂。接触可出现在体外或受试者体内。如本公开中所述的可以连接到EV(例如，外泌体)的生物活性分子[BAM]的非限制性示例包括试剂，诸如核苷酸(例如，包含可检测部分或毒素或破坏转录的核苷酸)、核酸(例如，编码多肽(诸如酶)的DNA或mRNA分子，或具有调控功能的RNA分子(诸如miRNA、dsDNA、lncRNA、mRNA、siRNA或ASO))、氨基酸(例如，包含可检测部分或毒素或破坏翻译的氨基酸)、多肽(例如，酶)、脂质、碳水化合物和小分子(例如，小分子药物和毒素)。
在一些方面，本文所公开的EV(例如，外泌体)可以包括例如使用本文所公开的构建体连接的超过一个的生物活性分子[BAM]。例如，在一些方面，EV(例如，外泌体)可以包括本公开的多个构建体(例如，式1的构建体)群体，其中每个构建体群体携带不同的生物活性分子[BAM]。
因此，在一些方面，本公开的EV(例如，外泌体)群体可以包括如下所述的多个构建体。
[AM1]-(优化的接头1)-[BAM1]
[AM2]-(优化的接头2)-[BAM2]
…
[AMn]-(优化的接头n)-[BAMn]
其中[AM1]..[AMn]可以是相同或不同的锚定部分(优化的接头1)..(优化的接头n)可以是相同或不同的优化的接头，并且[BAM1]..[BAMn]可以是相同或不同的生物活性分子。
在一些方面，本公开的EV(例如，外泌体)可以包括包含本文所公开的优化的接头的构建体(例如，式1的构建体)，其中每个构建体携带超过一个的生物活性分子[BAM]，如下所示。
[AM]-(优化的接头)-[BAM1]..[BAMn]
其中[BAM1]..[BAMn]可以是相同或不同的生物活性分子。
在一些方面，包含本文所公开的优化的接头的构建体可包含呈非线性排列的多个生物活性分子，如下所例示，例如，包含两个、三个或更多个生物活性部分的排列是分支排列。
[BAM1]
[AM]-(优化的接头)---|
[BAM2]
[BAM1]
[AM]-(优化的接头)---|---[BAM2]
[BAM3]
在一些方面，本公开的EV(例如，外泌体)可以包括构建体群体，所述构建体群体包括上面所公开的任何拓扑排列及其组合。
在一些方面，生物活性分子[BAM]靶向肿瘤抗原。肿瘤抗原的非限制性示例包括：甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、上皮肿瘤抗原(ETA)、粘蛋白1(MUC1)、Tn-MUC1、粘蛋白16(MUC16)、酪氨酸酶、黑素瘤相关抗原(MAGE)、肿瘤蛋白p53(p53)、CD4、CD8、CD45、CD80、CD86、程序性死亡配体1(PD-L1)、程序性死亡配体2(PD-L2)、NY-ESO-1、PSMA、TAG-72、HER2、GD2、cMET、EGFR、间皮素、VEGFR、α-叶酸受体、CE7R、IL-3、癌症-睾丸抗原(CTA)、MART-1gp100、TNF相关细胞凋亡诱导配体、或其组合。
在一些方面，生物活性分子[BAM]是靶向部分，例如抗体或其结合部分或配体，其特异性结合在肌肉细胞上的标记物。在一些方面，肌肉细胞是平滑肌细胞。在一些方面，肌肉细胞是骨骼肌细胞。在一些方面，肌肉细胞是心肌细胞。在一些方面，在肌肉细胞上的标记物选自α-平滑肌肌动蛋白、VE-钙粘蛋白、钙结合蛋白/CALD1、钙调蛋白1、hexim 1、组胺H2R；胃动素R/GPR38、转胶蛋白/TAGLN、及其任何组合。在一些方面，在肌肉细胞上的标记物选自α-肌聚糖、β-肌聚糖、钙蛋白酶抑制剂、肌酸激酶MM/CKMM、eIF5A、烯醇化酶2/神经元特异性烯醇化酶、ε-肌聚糖、FABP3/H-FABP、GDF-8/肌肉生长抑制素(Myostatin)、GDF-11/GDF-8、整联蛋白α7、整联蛋白α7β1、整联蛋白β1/CD29、MCAM/CD146、MyoD、肌细胞生成素(myogenin)、肌球蛋白轻链激酶抑制剂、NCAM-1/CD56、肌钙蛋白I、及其任何组合。在一些方面，在肌肉细胞上的标记物是肌球蛋白重链、肌球蛋白轻链、或其组合。
在一些方面，生物活性分子[BAM]是小分子。在一些方面，小分子是蛋白降解靶向嵌合体(PROTAC)。在一些方面，生物活性分子[BAM]包括核苷酸，其中核苷酸是干扰素基因刺激蛋白(STING)激动剂。STING是一种环状二核苷酸的胞质传感器，通常由细菌产生。激活后，它会产生I型干扰素并启动免疫反应。
在一些方面，STING激动剂包括环状二核苷酸STING激动剂或非环状二核苷酸STING激动剂。已知环状嘌呤二核苷酸可刺激或增强患者的免疫或炎症反应，例如但不限于cGMP、环状二GMP(c-di-GMP)、cAMP、环状二AMP(c-di-AMP)、环状GMP AMP(cGAMP)、环二IMP(c-di-IMP)、环形AMP-IMP(cAIMP)、及其任何类似物。CDN可以具有连接环状二核苷酸或其任何组合的2'2'、2'3'、2'5'、3'3'或3'5'键。环状嘌呤二核苷酸可以经由标准有机化学技术进行修饰，以产生嘌呤二核苷酸的类似物。合适的嘌呤二核苷酸包括但不限于腺嘌呤、鸟嘌呤、肌苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、异鸟嘌呤、或本领域已知的任何其他合适的嘌呤二核苷酸。环状二核苷酸可以是经修饰的类似物。可使用本领域已知的任何合适的修饰，包括但不限于硫代磷酸酯、双硫代磷酸酯(biphosphorothioate)、氟化和二氟化修饰。还可使用非环状二核苷酸激动剂，诸如5,6-二甲基呫吨酮-4-乙酸(DMXAA)，或本领域已知的任何其他非环状二核苷酸激动剂。
可以设想，任何STING激动剂都可以用作生物活性分子[BAM]。STING激动剂中有DMXAA、STING激动剂-1、ML RR-S2 CDA、ML RR-S2c-di-GMP、ML-RR-S2 cGAMP、2'3'-c-di-AM(PS)2、2'3'-cGAMP、2'3'-cGAMPdFHS、3'3'-cGAMP、3'3'-cGAMPdFSH、cAIMP、cAIM(PS)2、3'3'-cAIMP、3'3'-cAIMPdFSH、2'2'-cGAMP、2'3'-cGAM(PS)2、3'3'-cGAMP、c-di-AMP、2'3'-c-di-AMP、2'3'-c-di-AM(PS)2、c-di-GMP、2'3'-c-di-GMP、c-di-IMP、c-di-UMP、或其任何组合。在一个特定方面，STING激动剂是3'3'-cAIMPdFSH，或者命名为3-3cAIMPdFSH。还可以使用本领域已知的其他STING激动剂。
在一些方面，生物活性分子[BAM]是抗体或其抗原结合片段。在一些方面，生物活性分子[BAM]是抗体-药物缀合物(ADC)。在一些方面，生物活性分子[BAM]是小分子，其含有合成抗肿瘤剂(例如，单甲基澳瑞他汀E(MMAE)(vedotin))、细胞因子释放抑制剂(例如，MCC950)、mTOR抑制剂(例如，雷帕霉素及其类似物(rapalogs))、自分泌运动因子抑制剂(例如，PAT409或PAT505)、溶血磷脂酸受体拮抗剂(例如，BMS-986020)、STING拮抗剂(CL656)、或其任何组合。)。在一些方面，生物活性分子[BAM]是融合肽(fusogenic peptide)。
在一些方面，生物活性分子[BAM]包括反义寡核苷酸(ASO)。在某些方面，ASO靶向体内表达的各种基因(转录物)。在一些方面，本公开的生物活性分子包括在美国专利号5,034,506中所公开的吗啉基骨架结构，其通过引用整体并入本文。)。
在一些方面，生物活性分子[BAM]靶向巨噬细胞。在其他方面，生物活性分子诱导巨噬细胞极化。巨噬细胞极化是巨噬细胞对来自其微环境的信号采取不同功能程序的过程。这种能力与它们在生物体中的多重作用有关：它们是先天免疫系统的强大效应细胞，但在清除细胞碎片、胚胎发育和组织修复方面也很重要。
通过简化分类，巨噬细胞表型已分为2组：M1(经典活化巨噬细胞)和M2(替代活化巨噬细胞)。这种广泛的分类是基于体外研究，在所述体外研究中将培养的巨噬细胞用刺激其表型转换成特定状态的分子进行处理。除了化学刺激外，已经表明巨噬细胞生长的底层基质的硬度可以指导极化状态、功能作用和迁移模式。M1巨噬细胞被描述为促炎性类型，在宿主直接防御病原体方面(诸如促炎性细胞因子和杀微生物分子的吞噬和分泌)中起重要作用。M2巨噬细胞被描述为具有完全相反功能：调节炎症的消退期和修复受损组织。后来，更广泛的体外和离体研究表明，巨噬细胞表型更加多样化，在基因表达和功能方面相互重叠，这揭示了这些许多混合状态形成了依赖于微环境的连续活化状态。此外，在体内，不同组织巨噬细胞群体之间的基因表达谱具有高度多样性。因此，巨噬细胞活化谱被认为是更广泛的，涉及对来自环境的过多不同信号作出反应的复杂调节途径。巨噬细胞表型的多样性仍有待在体内充分表征。
巨噬细胞类型的不平衡与许多免疫相关疾病有关。例如，增加的M1/M2比率可能与炎性肠病的发展以及小鼠肥胖相关。在另一方面，体外实验表明M2巨噬细胞作为组织纤维化的主要介质。多项研究已将M2巨噬细胞的纤维化特征与系统性硬化的发病机制联系起来。靶向生物活性分子的巨噬细胞的非限制性示例是：PI3Kγ(磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚基γ)、RIP1(受体相互作用蛋白(RIP)激酶1，RIPK1)、HIF-1α(缺氧诱导因子1-α)、AHR1(粘附和菌丝调节因子1)、miR146a、miR155、IRF4(干扰素调节因子4)、PPARγ(过氧化物酶体增殖物激活受体γ)、IL-4RA(白介素-4受体亚基α)、TLR8(Toll样受体8)和TGF-β1(转化生长因子β-1前蛋白)。
在一些方面，BAM包括ASO(例如，以下所公开的靶向NLRP3、STAT6、CEBP/β、STAT3、NRas、KRAS、Pmp22的ASO)。在一些方面，所述ASO是间隙聚体、混合聚体(mixmer)或全聚体(totalmer)。在一些方面，ASO(例如，以下所公开的靶向NLRP3、STAT6、CEBP/β、STAT3、NRas、KRAS、Pmp22的ASO)可以包含一种或多种核苷，该核苷具有修饰的糖部分，即与DNA和RNA中发现的核糖糖部分相比时的糖部分的修饰。已经制备了具有核糖部分修饰的许多核苷，主要目的是改善寡核苷酸的某些性质，诸如亲和力和/或核酸酶抗性。
此类修饰包括其中核糖环结构被修饰的那些，例如通过用己糖环(HNA)或双环替代(它通常在核糖环(LNA)上的C2'和C4'碳之间具有双自由基桥)，或者未连接的核糖环(它通常在C2'和C3'碳之间缺乏键(例如，UNA))。其他糖修饰的核苷包括例如双环己糖核酸(WO2011/017521)或三环核酸(WO2013/154798)。经修饰的核苷还包括其中糖部分被非糖部分替代的核苷，例如在肽核酸(PNA)或吗啉核酸的情况下。
糖修饰还包括经由将核糖环上的取代基更改为除氢以外的基团或RNA核苷中天然存在的2'-OH基团进行的修饰。例如，可以在2'、3'、4'或5'位置引入取代基。具有经修饰的糖部分的核苷还包括2'修饰的核苷，诸如2'替换的核苷。事实上，很多注意力都集中在开发2'取代的核苷上，并且发现许多2'取代的核苷在掺入寡核苷酸时具有有益的性质，诸如增强的核苷抗性和增强的亲和力。
2'糖修饰的核苷是在2'位置具有除H或-OH之外的取代基(2'取代的核苷)或包含2'连接双自由基的核苷，并且包括2'取代核苷和LNA(2'-4'双自由基桥接)核苷。例如，2'修饰的糖可以提供增强的结合亲和力(例如，增强亲和力的2'糖修饰的核苷)和/或增强的对寡核苷酸的核酸酶抗性。2'取代的经修饰的核苷的示例是2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2'-氨基-DNA、2'-氟-RNA、2'-氟-DNA、阿拉伯核酸(ANA)和2'-氟-ANA核苷。对于另外的示例，参见，例如，Freier&Altmann；Nucl.AcidRes.,1997,25,4429-4443；Uhlmann,Curr.Opinion in Drug Development,2000,3(2),293-213；和Deleavey和Damha,Chemistry and Biology 2012,19,937。下面是一些2'取代的经修饰的核苷的图示。
LNA核苷是经修饰的核苷，它在核苷的核糖环(即，2'-4'桥)的C2'和C4'之间包含接头基团(称为双自由基或桥)，它限制或锁定核糖环的构象。这些核苷在文献中也称为桥接核酸或双环核酸(BNA)。当LNA掺入互补RNA或DNA分子的寡核苷酸中时，核糖构象的锁定与增强的杂交亲和力(双链稳定)有关。这可以通过测量寡核苷酸/互补双链的解链温度(melting temperature)来常规确定。
非限制性示例性LNA核苷在WO 99/014226、WO 00/66604、WO 98/039352、WO 2004/046160、WO 00/047599、WO 2007/134181、WO 2010/077578、WO 2010/036698、WO 2007/090071、WO 2009/006478、WO 2011/156202、WO 2008/154401、WO 2009/067647、WO 2008/150729、Morita et al.,Bioorganic&Med.Chem.Lett.12,73-76、Seth et al.,J.Org.Chem.2010,Vol 75(5)pp.1569-81和Mitsuoka et al.,Nucleic Acids Research2009,37(4),1225-1238中有所公开，所有这些通过引用整体并入本文。在一些方面，本公开的ASO的经修饰的核苷或LNA核苷具有式I或式II的一般结构：
其中
W选自-O-、-S-、-N(Ra)-、-C(RaRb)-，特别是-O-；
B是核碱基或经修饰的核碱基部分；
Z是与相邻的核苷或5'-末端基团的核苷间键联；
Z*是与相邻的核苷或3'-末端基团的核苷间键联；
R1、R2、R3、R5和R5*独立地选自氢、卤素、烷基、烯基、炔基、羟基、烷氧基、烷氧基烷基、烯氧基、羧基、烷氧基羰基、烷基羰基、甲酰基、叠氮、杂环和芳基；并且
X、Y、Ra和Rb如本文所定义。
靶向NLRP3的ASO
在一些方面，生物活性分子[BAM]是抗NLRP3 ASO。NLRP3(NLRP3)也称为含NLR家族pyrin结构域3。除非另有说明，否则如本文所用的术语“NLRP3”可指来自一个或多个物种(例如，人类、非人灵长类动物、狗、猫、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠、马、牛和熊)的NLRP3。人NLRP3基因的序列可见于公开获得的GenBank登录号NC_000001.11:247416156-247449108。NLRP3基因可见于染色体位置1q44的247,416,156-247,449,108。人NLRP3前体mRNA转录物的序列(SEQ ID NO:1)对应于染色体1q44的残基247,416,156-247,449,108的反向互补序列(reverse complement)。NLRP3 mRNA序列(GenBank登录号NM_001079821.2)提供于SEQ IDNO:3中，除了SEQ ID NO:3中的核苷酸“t”在mRNA中显示为“u”。人NLRP3蛋白的序列可见于公开获得的登录号：Q96P20(规范序列，SEQ ID NO:2)、Q96P20-2(SEQ ID NO:4)、Q96P20-3(SEQ ID NO:5)、Q96P20-4(SEQ ID NO:6)、Q96P20-5(SEQ IDNO:7)和Q96P20-6(SEQ ID NO:8)，其各自通过引用整体并入本文。本公开的抗NLRP3 ASO可以被设计为减少或抑制NLRP3蛋白的天然变体的表达。
抗NLRP3 ASO的靶核酸序列的一个示例是NLRP3前体mRNA。SEQ ID NO:1表示人NLRP3基因组序列(即，染色体1q44的核苷酸247,416,156-247,449,108的反向互补序列)。SEQ ID NO:1与NLRP3前体mRNA序列同一，除了SEQ ID NO:1中的核苷酸“t”在前体mRNA中显示为“u”。在某些方面，“靶核酸”包含编码NLRP3蛋白的核酸或其天然存在的变体以及源自其的RNA核酸(例如，前体mRNA)的内含子。在其它方面，靶核酸包含编码NLRP3蛋白的核酸或其天然存在的变体以及源自其的RNA核酸(例如，前体mRNA)的外显子区域。在其它方面，靶核酸包含编码NLRP3蛋白的核酸或其天然存在的变体以及源自其的RNA核酸(例如，前体mRNA)的外显子-内含子接合点。由NLRP3前体mRNA编码的人NLRP3蛋白序列显示为SEQ IDNO:3。在其它方面，靶核酸包含编码NLRP3蛋白的核酸或其天然存在的变体的非翻译区，例如5'UTR、3'UTR、或两者。
在一些方面，本公开的抗NLRP3 ASO与NLRP3转录物(例如，SEQ ID NO:1)的内含子内的区域杂交。在某些方面，本公开的抗NLRP3 ASO与NLRP3转录物(例如，SEQ ID NO:1)的外显子内的区域杂交。在其它方面，本公开的抗NLRP3ASO与NLRP3转录物(例如，SEQ ID NO:1)的外显子-内含子接合点内的区域杂交。在一些方面，本公开的抗NLRP3 ASO与NLRP3转录物(例如，SEQ ID NO:1)内的区域(例如，内含子、外显子或外显子-内含子接合点)杂交，其中抗NLRP3 ASO具有间隙聚体设计。
在一些方面，抗NLRP3 ASO靶向编码NLRP3蛋白的特定同种型(例如，同种型1)的mRNA。在一些方面，抗NLRP3 ASO靶向NLRP3蛋白的所有同种型。在其它方面，抗NLRP3 ASO靶向NLRP3蛋白的两种同种型(例如，同种型1和同种型2、同种型3和同种型4、以及同种型5和同种型6)。
在一些方面，本公开的抗NLRP3 ASO的核苷酸序列或连续核苷酸序列与选自SEQID NO:101至200的序列具有至少约80％的序列同一性，例如至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％的序列同一性、至少约97％的序列同一性、至少约98％的序列同一性、至少约99％的序列同一性、例如约100％的序列同一性(同源)。
在一些方面，抗NLRP3 ASO(或其连续核苷酸部分)选自以下各项或包含以下各项：选自由SEQ ID NO:101至200组成的组的序列中的一个或其至少10个连续核苷酸的区域，其中当与相应的NLRP3转录物相比时，所述抗NLRP3 ASO(或其连续核苷酸部分)可以可选地包含一个、两个、三个或四个错配(mismatche)。
在一些方面，抗NLRP3 ASO包含选自由SEQ ID NO:101-200组成的组的序列。
在一些方面，抗NLRP3 ASO包含SEQ ID NO:101至200中任一项所述的序列。在一些方面，抗NLRP3 ASO包含以下各项或由以下各项组成：与SEQ ID NO:101至200中所述序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或约100％同一的序列。在一些方面，抗NLRP3 ASO(或其连续核苷酸部分)选自以下各项或包含以下各项：选自由SEQ IDNO:101至200的序列组成的组中的一个或其至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核苷酸的区域。在一些方面，抗NLRP3 ASO(或其连续核苷酸部分)选自以下各项或包含以下各项：选自由SEQ ID NO:101至200组成的组的序列中的一个或其至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核苷酸的区域，其中当与相应的NLRP3转录物相比时，所述抗NLRP3 ASO(或其连续核苷酸部分)可以可选地包含一个、两个、三个或四个错配。在一些方面，抗NLRP3 ASO(或其连续核苷酸部分)选自以下各项或包含以下各项：选自由SEQ ID NO:101至200组成的组的序列中的一个，除了1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个置换，其中置换的ASO可以与NLRP3转录物结合。在一些方面，抗NLRP3 ASO(或其连续核苷酸部分)选自以下各项或包含以下各项：选自由SEQ ID NO:101至200组成的组的序列中的一个或其至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核苷酸的区域，其中所述抗NLRP3 ASO(或其连续核苷酸部分)可以可选地包含与相应的NLRP3转录物互补的一个、两个、三个或四个另外的5'和/或3'核苷酸。
在一些方面，本文所公开的靶向NLRP3转录物的抗NLRP3 ASO与编码NLRP3的mRNA转录物的结合可降低NLRP3表达水平和/或活性水平。
在一些方面，本文所述的任何抗NLRP3 ASO可以是本公开的EV(例如，外泌体)的一部分，即包含构建体(例如，式1的构建体)的EV(如，外泌体)，该构建体包含本文所公开的优化的接头，其中生物活性部分[BAM]是本文所述抗NLRP3 ASO或其组合。
靶向STAT6的ASO
在一些方面，生物活性分子[BAM]是抗STAT6 ASO。STAT6(STAT6)也称为信号转导及转录激活因子6。除非另有说明，否则如本文所用的术语“STAT6”可指来自一个或多个物种(例如，人类、非人灵长类动物、狗、猫、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠、马、牛和熊)的STAT6。
人STAT6前体mRNA转录物的序列(SEQ ID NO:11)对应于染色体12q13.3的残基57111413-57095404互补序列的反向互补序列。STAT6 mRNA序列(GenBank登录号NM_001178078.1)提供于SEQ ID NO:13中，除了SEQ ID NO:13中的核苷酸“t”在mRNA中显示为“u”。人STAT6蛋白的序列可见于公开获得的登录号：P42226-1、(规范序列，SEQ ID NO:12)、P42226-2(SEQ ID NO:14)和P42226-3(SEQ ID NO:15)，其中每一个通过引用整体并入本文。
人STAT6基因产物的天然变体是已知的。例如，人STAT6蛋白的天然变体可以包含一个或多个选自M118R、D419N及其任何组合的氨基酸置换。由可变剪接产生的人STAT6蛋白的其他变体也是本领域已知的。STAT6同种型2(UniProt的标识符：P42226-2)与规范序列(SEQ ID NO:13)的区别如下：相对于SEQ ID NO:13，残基1-174的缺失和175PSE177被175MEQ177置换。STAT6同种型3的序列(标识符：P42226-3)与规范序列(SEQ ID NO:13)的区别如下：相对于SEQ ID NO:13的残基1-110的缺失。因此，本公开的抗STAT6 ASO可以被设计为减少或抑制STAT6蛋白的天然变体的表达。
抗STAT6 ASO的靶核酸序列的一个示例是STAT6前体mRNA。SEQ ID NO:11表示人STAT6基因组序列(即，染色体12q13.3的核苷酸57111413-57095404互补序列的反向互补序列)。SEQ ID NO:11与STAT6前体mRNA序列同一，除了SEQ ID NO:11中的核苷酸“t”在前体mRNA中显示为“u”。在某些方面，“靶核酸”包含编码STAT6蛋白的核酸或其天然存在的变体以及源自其的RNA核酸(例如，前体mRNA)的内含子。在其它方面，靶核酸包含编码STAT6蛋白的核酸或其天然存在的变体以及源自其的RNA核酸(例如，前体mRNA)的外显子区域。在其它方面，靶核酸包含编码STAT6蛋白的核酸或其天然存在的变体以及源自其的RNA核酸(例如，前体mRNA)的外显子-内含子接合点。由STAT6前体mRNA编码的人STAT6蛋白序列显示为SEQID NO:13。在其它方面，靶核酸包含编码STAT6蛋白的核酸或其天然存在的变体的非翻译区，例如5'UTR、3'UTR、或两者。
在一些方面，本公开的抗STAT6 ASO与STAT6转录物(例如，SEQ ID NO:11)的内含子内的区域杂交。在某些方面，本公开的抗STAT6 ASO与STAT6转录物(例如，SEQ ID NO:11)的外显子内的区域杂交。在其它方面，本公开的抗STAT6ASO与STAT6转录物(例如，SEQ IDNO:11)的外显子-内含子接合点内的区域杂交。在一些方面，本公开的抗STAT6 ASO与STAT6转录物(例如，SEQ ID NO:11)内的区域(例如，内含子、外显子或外显子-内含子接合点)杂交，其中抗STAT6 ASO具有间隙聚体设计。
在一些方面，抗STAT6 ASO靶向编码STAT6蛋白的特定同种型(例如，同种型1)的mRNA。在一些方面，ASO靶向STAT6蛋白的所有同种型。在其它方面，抗STAT6 ASO靶向STAT6蛋白的两种同种型(例如，同种型1和同种型2、同种型1和同种型3、或同种型2和同种型3)。
在一些方面，本公开的有效负载(例如，ASO)与STAT6转录物的内含子内的区域杂交。在某些方面，有效负载与STAT6转录物的外显子内的区域杂交。在一些方面，有效负载与STAT6转录物的外显子-内含子接合点内的区域杂交。在一些方面，有效负载与STAT6转录物内的区域(例如，内含子、外显子或外显子-内含子接合点)杂交。可以特异性靶向STAT6转录物的区域的有效负载(例如，ASO)的非限制性示例。
在一些方面，本文所公开的靶向STAT6转录物的抗STAT6 ASO与编码STAT6的mRNA转录物的结合可降低STAT6表达水平和/或活性水平。
在一些方面，本文所述的任何抗STAT6 ASO可以是本公开的EV(例如，外泌体)的一部分，即包含构建体(例如，式1的构建体)的EV(如，外泌体)，该构建体包含本文所公开的优化的接头，其中生物活性部分[BAM]是本文所述抗STAT6 ASO或其组合。
在一些方面，本公开的抗STAT6 ASO包括SEQ ID NO:1091的碱基序列。在一些方面，本公开的抗STAT6 ASO包括图12中所示的STAT6 ASO序列。
靶向MYC的ASO
在一些方面，生物活性分子[BAM]是抗MYC ASO。除非另有说明，否则如本文所用的术语“MYC”可指来自一个或多个物种(例如，人类、非人灵长类动物、狗、猫、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠、马、牛和熊)的MYC。
在一些方面，本公开的抗MYC ASO包括SEQ ID NO:1092的碱基序列。在一些方面，本公开的抗MYC ASO包括图12中所示的MYC ASO序列。
靶向CEBP/β的ASO
在一些方面，生物活性分子[BAM]是抗CEBP/βASO。除非另有说明，否则如本文所用的术语“CEBP/β”可指来自一个或多个物种(例如，人类、非人灵长类动物、狗、猫、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠、马、牛和熊)的CEBP/β。
人CEBP/β基因的序列可见于公开获得的GenBank登录号NC_000020.11(50190583..50192690)。CEBP/基因可见于染色体位置20q13.13的50190583-50192690。
人CEBP/β前体mRNA转录物的序列(SEQ ID NO:21)对应于染色体20q13.13的残基50190583-50192690的反向互补序列。CEBP/βmRNA序列(GenBank登录号NM_001285878.1)提供于SEQ ID NO:23中，除了SEQ ID NO:23中的核苷酸“t”在mRNA中显示为“u”。人CEBP/β蛋白的序列可见于公开获得的登录号：P17676、(规范序列，SEQ ID NO:22)、P17676-2(SEQ IDNO:24)和P17676-3(SEQ ID NO:25)，其中每一个通过引用整体并入本文。
人CEBP/β基因产物的天然变体是已知的。例如，人CEBP/β蛋白的天然变体可以包含一个或多个选自A241P、A253G、G195S及其任何组合的氨基酸置换。由可变剪接产生的人CEBP/β蛋白的其他变体也是本领域已知的。CEBP/β同种型2(UniProt的标识符：P17676-2)与规范序列(SEQ ID NO:23)的区别如下：相对于SEQ ID No:23的残基1-23的缺失。CEBP/β同种型3的序列(标识符：P17676-3)与规范序列(SEQ ID NO:23)的区别如下：相对于SEQ IDNO:23的残基1-198的缺失。因此，本公开的抗CEBPb ASO可以被设计为减少或抑制蛋白的天然变体的表达。
抗CEBPb ASO的靶核酸序列的一个示例是CEBP/β前体mRNA。SEQ ID NO:21表示人CEBP/β基因组序列(即，染色体20q13.13的核苷酸50190583-50192690的反向互补序列)。SEQ ID NO:21与CEBP/β前体mRNA序列同一，除了SEQ ID NO:21中的核苷酸“t”在前体mRNA中显示为“u”。在某些方面，“靶核酸”包含编码CEBP/β蛋白的核酸或其天然存在的变体以及源自其的RNA核酸(例如，前体mRNA)的内含子。在其它方面，靶核酸包含编码CEBP/β蛋白的核酸或其天然存在的变体以及源自其的RNA核酸(例如，前体mRNA)的外显子区域。在其它方面，靶核酸包含编码CEBP/β蛋白的核酸或其天然存在的变体以及源自其的RNA核酸(例如，前体mRNA)的外显子-内含子接合点。由CEBP/β前体mRNA编码的人CEBP/β蛋白序列如SEQ IDNO:23所示。在其它方面，靶核酸包含编码CEBP/β蛋白的核酸或其天然存在的变体的非翻译区，例如5'UTR、3'UTR、或两者。
在一些方面，本公开的抗CEBPb ASO与CEBP/β转录物(例如，SEQ ID NO:21)的内含子内的区域杂交。在某些方面，本公开的抗CEBPb ASO与CEBP/β转录物(例如，SEQ ID NO:21)的外显子内的区域杂交。在其它方面，本公开的抗CEBPb ASO与CEBP/β转录物(例如，SEQID NO:21)的外显子-内含子接合点内的区域杂交。在一些方面，本公开的抗CEBPb ASO与CEBP/β转录物(例如，SEQ ID NO:21)内的区域(例如，内含子、外显子或外显子-内含子接合点)杂交，其中抗CEBPb ASO具有间隙聚体设计。
在一些方面，抗CEBPb ASO靶向编码CEBP/β蛋白的特定同种型(例如，同种型1)的mRNA。在一些方面，抗CEBPb ASO靶向CEBP/β蛋白的所有同种型。在其它方面，抗CEBPb ASO靶向CEBP/β蛋白的两种同种型(例如，同种型1和同种型2、同种型1和同种型3、或同种型2和同种型3)。
在一些方面，本文所公开的靶向CEBPb转录物的抗CEBPb ASO与编码CEBPb的mRNA转录物的结合可降低CEBPb表达水平和/或活性水平。
在一些方面，本文所述的任何抗CEBPb ASO可以是本公开的EV(例如，外泌体)的一部分，即包含构建体(例如，式1的构建体)的EV(如，外泌体)，该构建体包含本文所公开的优化的接头，其中生物活性部分[BAM]是本文所述抗CEBPb ASO或其组合。
靶向STAT3的ASO
在一些方面，生物活性分子[BAM]是抗STAT3 ASO。信号转导及转录激活因子3(STAT3)是可将信号从细胞表面受体传输到细胞核的信号转导及转录激活因子。STAT3在许多人类癌症中经常被过度激活。
信号转导及转录激活因子3(STAT3)在本领域中有多个名称。这些名称包括：DNA结合蛋白APRF和急性期反应因子。编码人STAT3的mRNA可见于Genbank登录号NM_003150.3，并且由序列(SEQ ID NO:43)表示。
人STAT3基因产物的天然变体是已知的。因此，本公开的ASO可以被设计为减少或抑制STAT3蛋白的天然变体的表达。
SEQ ID NO:41与STAT3前体mRNA序列同一，除了SEQ ID NO:41中的核苷酸“t”在前体mRNA中显示为“u”。在某些方面，“靶核酸”包含编码STAT3蛋白的核酸或其天然存在的变体以及源自其的RNA核酸(例如，前体mRNA)的内含子。在其它方面，靶核酸包含编码STAT3蛋白的核酸或其天然存在的变体以及源自其的RNA核酸(例如，前体mRNA)的外显子区域。在其它方面，靶核酸包含编码STAT3蛋白的核酸或其天然存在的变体以及源自其的RNA核酸(例如，前体mRNA)的外显子-内含子接合点。由STAT3前体mRNA编码的人STAT3蛋白序列显示为SEQ ID NO:42。在其它方面，靶核酸包含编码STAT3蛋白的核酸或其天然存在的变体的非翻译区，例如5'UTR、3'UTR、或两者。
在其它方面，靶核酸包含编码STAT3蛋白的核酸或其天然存在的变体以及源自其的RNA核酸(例如，前体mRNA)的外显子-内含子接合点。由STAT3前体mRNA编码的人STAT3蛋白序列显示为SEQ ID NO:43。在其它方面，靶核酸包含编码STAT3蛋白的核酸或其天然存在的变体的非翻译区，例如5'UTR、3'UTR、或两者。
在一些方面，本公开的抗STAT3 ASO与STAT3转录物(例如，SEQ ID NO:41或SEQ IDNO:43)的内含子内的区域杂交。在某些方面，本公开的抗STAT3 ASO与STAT3转录物(例如，SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:43)的外显子内的区域杂交。在其它方面，本公开的抗STAT3ASO与STAT3转录物(例如，SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:43)的外显子-内含子接合点内的区域杂交。在一些方面，本公开的抗STAT3ASO与STAT3转录物(例如，SEQ ID NO:41或SEQ IDNO:43)内的区域(例如，内含子、外显子或外显子-内含子接合点)杂交，其中抗STAT3 ASO具有间隙聚体设计。
在一些方面，抗STAT3 ASO靶向编码STAT3蛋白的特定同种型(例如，同种型1)的mRNA。在一些方面，ASO靶向STAT3蛋白的所有同种型。在其他方面，ASO靶向STAT3蛋白的两种同种型(例如，同种型(UniProt ID:P40763-1)和同种型2(UniProt ID:P40763-2)、同种型2和同种型3(UniProt ID:P40763-3)。
在一些方面，本公开的抗STAT3 ASO与STAT3转录物(例如，SEQ ID NO:41或SEQ IDNO:43)的内含子内的区域杂交。在某些方面，本公开的抗STAT3 ASO与STAT3转录物(例如，SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:43)的外显子内的区域杂交。在其它方面，本公开的抗STAT3ASO与STAT3转录物(例如，SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:43)的外显子-内含子接合点内的区域杂交。在一些方面，本公开的抗STAT3ASO与STAT3转录物(例如，SEQ ID NO:41或SEQ IDNO:43)内的区域(例如，内含子、外显子或外显子-内含子接合点)杂交，其中ASO具有间隙聚体设计。
在一些方面，本公开的抗STAT3 ASO与STAT3转录物(例如，基因组序列，SEQ IDNO:41)内的多个靶区域杂交。在一些方面，ASO与STAT3转录物内的两个不同靶区域杂交。在一些方面，抗STAT3 ASO与STAT3转录物内的三个不同靶区域杂交。在一些方面，相较于与STAT3转录物(例如，基因组序列，SEQ ID NO:41)内的单个区域杂交的抗STAT3 ASO，与STAT3转录物(例如，基因组序列，SEQ ID NO:41)内的多个区域杂交的抗STAT3 ASO在降低STAT3表达方面更有效(例如，具有较低EC50)。
本公开的抗STAT3 ASO包括与STAT3转录物(例如，与SEQ ID NO:41相对应的核苷酸序列)的区域的互补序列相对应的连续核苷酸序列。
在一些方面，本文所公开的靶向STAT3转录物的抗STAT3 ASO与编码STAT3的mRNA转录物的结合可降低STAT3表达水平和/或活性水平。
在一些方面，本文所述的任何抗STAT3 ASO可以是本公开的EV(例如，外泌体)的一部分，即包含构建体(例如，式1的构建体)的EV(如，外泌体)，该构建体包含本文所公开的优化的接头，其中生物活性部分[BAM]是本文所述抗STAT3 ASO或其组合。
靶向NRAS的ASO
在一些方面，生物活性分子[BAM]是抗NRas ASO。NRas是编码膜蛋白的致癌基因，所述膜蛋白在高尔基体和质膜之间穿梭。编码NRas的基因组DNA可见于染色体位置1p13.2(即，GenBank登录号NG_007572的核苷酸5001至17438)。具体而言，延时显微镜和光漂白技术的结合表明，在没有棕榈酰化的情况下，GFP标记的N-Ras在细胞质基质(cytosol)和ER/高尔基体膜之间进行快速交换，并且野生型GFP-N-Ras通过非泡状机制再循环到高尔基体复合物。N-ras突变已在黑素瘤、甲状腺癌、畸胎癌、纤维肉瘤、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、伯基特淋巴瘤、急性早幼粒细胞白血病、T细胞白血病和慢性粒细胞白血病中有所描述。致癌性N-Ras可在小鼠中诱发急性骨髓性白血病(AML)或慢性粒单核细胞白血病(CMML)-样疾病。
神经母细胞瘤RAS病毒癌基因(NRas)在本领域中有多个名称。此类名称包括：GTPase NRas、N-ras蛋白第4部分、神经母细胞瘤RAS病毒(v-ras)致癌基因同源物、神经母细胞瘤RAS病毒致癌基因同源物、转化蛋白N-Ras和v-ras神经母细胞瘤RAS病毒致癌基因同源物。
NRAS基因提供了用于制造名为N-Ras的蛋白质的指令，该蛋白质主要参与调节细胞分裂。编码人NRAS的mRNA序列可见于NCBI参考序列NM_002524.5，并且由编码序列(SEQID NO:53)表示。
人NRas基因产物的天然变体是已知的。例如，人NRas蛋白的天然变体可以包含一个或多个选自G12D、G13D、T50I、G60E及其任何组合的氨基酸置换。由可变剪接产生的人NRas蛋白的其他变体在本领域中也是已知的，例如：G13R、Q61K、Q61R和P34L。因此，本公开的抗NRas ASO可以被设计为减少或抑制STAT3蛋白的天然变体的表达。
SEQ ID NO:51与NRas前体mRNA序列同一，除了SEQ ID NO:51中的核苷酸“t”在前体mRNA中显示为“u”。在某些方面，“靶核酸”包含编码NRas蛋白的核酸或其天然存在的变体以及源自其的RNA核酸(例如，前体mRNA)的内含子。在其它方面，靶核酸包含编码NRas蛋白的核酸或其天然存在的变体以及源自其的RNA核酸(例如，前体mRNA)的外显子区域。在其它方面，靶核酸包含编码NRas蛋白的核酸或其天然存在的变体以及源自其的RNA核酸(例如，前体mRNA)的外显子-内含子接合点。由NRas前体mRNA编码的人NRas蛋白序列显示为SEQIDNO:52。在其它方面，靶核酸包含编码NRas蛋白的核酸或其天然存在的变体的非翻译区，例如5'UTR、3'UTR、或两者。
在某些方面，本公开的抗NRas ASO还能够下调(例如，减少或去除)NRas mRNA或蛋白质的表达。在这方面，本公开的抗NRas ASO通常在哺乳动物细胞(例如人类细胞，例如肿瘤细胞)中可以通过降低NRas mRNA水平来影响对NRas蛋白的间接抑制。特别地，本公开涉及靶向NRas前体mRNA的一个或多个区域(例如，内含子区域、外显子区域和/或外显子-内含子接合点区域)的抗NRas ASO。除非另有说明，否则如本文所用的术语“NRas”可指来自一个或多个物种(例如，人类、非人灵长类动物、狗、猫、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠、马、牛和熊)的NRas。
在一些方面，本公开的抗NRas ASO与NRAS转录物(例如，SEQ ID NO:51或SEQ IDNO:53)的内含子内的区域杂交。在某些方面，本公开的抗NRas ASO与NRAS转录物(例如，SEQID NO:51或SEQ ID NO:53)的外显子内的区域杂交。在其它方面，本公开的抗NRas ASO与NRAS转录物(例如，SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:53)的外显子-内含子接合点内的区域杂交。在一些方面，本公开的抗NRas ASO与NRAS转录物(例如，SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:53)内的区域(例如，内含子、外显子或外显子-内含子接合点)杂交，其中ASO具有间隙聚体设计。
在一些方面，本公开的抗NRas ASO与NRas转录物(例如，基因组序列，SEQ ID NO:51)内的多个靶区域杂交。在一些方面，抗NRas ASO与NRas转录物内的两个不同靶区域杂交。在一些方面，抗NRas ASO与NRas转录物内的三个不同靶区域杂交。在一些方面，相较于与NRas转录物(例如，基因组序列，SEQ ID NO:51)内的单个区域杂交的抗NRas ASO，与NRas转录物(例如，基因组序列，SEQ ID NO:51)内的多个区域杂交的抗NRas ASO在降低NRas表达方面更有效(例如，具有较低EC50)。
在一些方面，ASO靶向编码NRAS蛋白的特定同种型(例如，同种型1，NCBI ID:NP_001229821.1)的mRNA。在一些方面，ASO靶向NRas蛋白的所有同种型。在其他方面，ASO靶向NRas蛋白的两种同种型(例如，同种型1和同种型2(NCBI ID:NP_009089.4)、同种型2和同种型3(NCBI ID:NP_001123995)以及同种型3和同种型4(NCBI ID:NP_001229820.1))。
本公开的抗NRas ASO包括与NRas转录物(例如，与SEQ ID NO:51相对应的核苷酸序列)的区域的互补序列相对应的连续核苷酸序列。
在一些方面，本文所公开的靶向NRas转录物的抗NRas ASO与编码NRas的mRNA转录物的结合可降低NRas表达水平和/或活性水平。
在一些方面，本文所述的任何抗NRas ASO可以是本公开的EV(例如，外泌体)的一部分，即包含构建体(例如，式1的构建体)的EV(如，外泌体)，该构建体包含本文所公开的优化的接头，其中生物活性部分[BAM]是本文所述抗NRas ASO或其组合。
靶向KRAS的ASO
在一些方面，生物活性分子[BAM]是抗KRAS ASO。人KRAS基因的序列可见于染色体位置12p12.1和公开获得的GenBank登录号NC_000012(25,204,789–25,250,936)。人野生型KRAS转录物的基因组序列对应于NC_000012的残基25,204,789–25,250,936的反向互补序列(SEQ ID NO:35)。在SEQ ID NO:31中所提供的KRAS G12D基因组序列与SEQ ID NO:35的不同之处在于：其在核苷酸位置5,587处具有鸟嘌呤到腺嘌呤的置换。示例性KRAS G12DmRNA序列提供于SEQ ID NO:33中，除了SEQ ID NO:33中的核苷酸“t”在mRNA中显示为“u”。在SEQ ID NO:33中所提供的KRAS G12D mRNA与野生型mRNA序列(例如，GenBank登录号NM_004985.5；SEQ ID NO:37)的不同之处在于：其在核苷酸位置225处具有鸟嘌呤到腺嘌呤的置换。人KRAS蛋白的序列可见于公开可获得的登录号：P01116(规范序列)、A8K8Z5、B0LPF9、P01118和Q96D10，其每一个通过引用整体并入本文。
人KRAS蛋白(P01116)有两种同种型，其由可变剪接产生。同种型2A(登录号：P01116-1；SEQ ID NO:38)是规范序列。它也被称为K-Ras4A。同种型2B(登录号：P01116-2；也称为K-Ras4B；SEQ ID NO:36)与规范序列的不同之处如下：(i)151-153：RVE→GVD；和(ii)165-189：QYRLKKISKEEKTPGCVKIKKCIIM(SEQ ID NO:599)→KHKEKMSKDGKKKKKKSKTKCVIM(SEQ ID NO:600)。在一些方面，本文所公开的抗KRAS ASO可以减少或抑制KRAS蛋白同种型2A、同种型2B、或两者的表达。
人KRAS基因产物的天然变体是已知的。例如，人KRAS蛋白的天然变体可以包含一个或多个选自以下各项的氨基酸置换：K5E、K5N、G10GG、G10V、G12A、G12C、G12F、G12I、G12L、G12R、G12S、G12V、G13C、G13D、G13E、G13R、G13V、V14I、L19F、T20M、Q22E、Q22H、Q22K、Q22R、Q25H、N26Y、F28L、E31K、D33E、P34L、P34Q、P34R、I36M、R41K、D57N、T58I、A59T、G60D、G60R、G60S、G60V、Q61A、Q61H、Q61K、Q61L、Q61P、Q61R、E63K、S65N、R68S、Y71H、T74A、L79I、R97I、Q99E、M111L、K117N、K117R、D119G、S122F、T144P、A146P、A146T、A146V、K147E、K147T、R149K、L159S、I163S、R164Q、I183N、I84M、或其组合。对KRAS蛋白同种型2B特异性的天然变体包含一个或多个选自V152G、D153V、F156I、F156L、或其组合的氨基酸置换。本公开的抗KRAS ASO可被设计为减少或抑制KRAS蛋白的一种或多种变体(例如，本领域已知的任何变体)的表达。在一些方面，KRAS突变体具有G12D的氨基酸置换。在一些方面，本公开的抗KRAS ASO靶向一种或多种KRAS突变体。在其他方面，抗KRAS ASO靶向的KRAS突变体是KRAS G12D(SEQID NO:32)。KRAS G12D mRNA和KRAS G12D蛋白的示例性序列提供于SEQ ID NO:33和SEQ IDNO:32中。
在一些方面，本文所公开的抗KRAS ASO的靶核酸序列包括KRAS前体mRNA的一个或多个区域。例如，SEQ ID NO:31(如上所述)与KRAS前体mRNA序列同一，除了SEQ ID NO:31中的核苷酸“t”在前体mRNA中显示为“u”。如本文所用，术语“靶核酸序列”是指与本文所公开的抗KRAS ASO互补的核酸序列。在某些方面，靶核酸序列包含编码KRAS蛋白的核酸或其天然存在的变体以及源自其的RNA核酸(例如，前体mRNA)的外显子区域。在一些方面，靶核酸序列包含编码KRAS蛋白的核酸或其天然存在的变体以及源自其的RNA核酸(例如，前体mRNA)的内含子。在其它方面，靶核酸序列包含编码KRAS蛋白的核酸或其天然存在的变体以及源自其的RNA核酸(例如，前体mRNA)的外显子-内含子接合点。在一些方面，例如，当用于研究或诊断时，靶核酸可以是源自本文所述的DNA或RNA核酸靶标的cDNA或合成寡核苷酸。在一些方面，靶核酸包含编码KRAS蛋白的核酸或其天然存在的变体的非翻译区，例如5'UTR、3'UTR、或两者。
因此，在一些方面，本文所公开的抗KRAS ASO与KRAS转录物(例如，SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:33)的外显子区域杂交。在一些方面，本公开的抗KRAS ASO与KRAS转录物(例如，SEQ ID NO:31)的内含子区域杂交。在一些方面，本公开的抗KRAS ASO与KRAS转录物(例如，SEQ ID NO:31)的外显子-内含子接合点杂交。在一些方面，本公开的抗KRAS ASO与KRAS转录物(例如，SEQ ID NO:31)内的区域(例如，内含子、外显子或外显子-内含子接合点)杂交。
在一些方面，本文所公开的ASO的靶核酸序列是KRAS mRNA，例如SEQ ID NO:33。因此，在某些方面，本文所公开的抗KRAS ASO可以与KRAS mRNA的一个或多个区域杂交。在一些方面，本公开的抗KRAS ASO靶向编码KRAS蛋白的特定同种型的mRNA。在某些方面，本文所公开的抗KRAS ASO可以靶向KRAS蛋白的所有同种型，包括其任何变体(例如，本文所述的那些)。在一些方面，可被本公开的抗KRAS ASO靶向的KRAS蛋白包括G12D氨基酸置换。
在一些方面，本文所公开的靶向KRAS转录物的抗KRAS ASO与编码KRAS的mRNA转录物的结合可降低KRAS表达水平和/或活性水平。
在一些方面，本文所述的任何抗KRAS ASO可以是本公开的EV(例如，外泌体)的一部分，即包含构建体(例如，式1的构建体)的EV(如，外泌体)，该构建体包含本文所公开的优化的接头，其中生物活性部分[BAM]是本文所述抗NRas ASO或其组合。
靶向Pmp22的ASO
在一些方面，生物活性分子[BAM]是抗Pmp22 ASO。外周鞘磷脂蛋白22(PMP22)也称为生长停滞特异性蛋白3(GAS-3)，其由PMP22基因编码。PMP22是由160个氨基酸组成的22kDa跨膜糖蛋白，其主要在周围神经系统的施旺细胞(Schwann cell)中表达。施旺细胞表现出PMP22的高表达，其中PMP22可占致密髓鞘(compact myelin)中总蛋白质含量的2-5％。致密髓鞘是周围神经元的髓鞘(myelin sheath)的主体，是一种为神经元轴突提供电绝缘的保护性脂肪层。PMP22在成人中枢神经系统中的表达水平相对较低。
PMP22在致密髓鞘的形成和维持中起着重要作用。当施旺细胞与神经元轴突接触时，PMP22的表达显著上调，而PMP22在轴突变性或横断(transection)过程中下调。PMP22已显示出与封闭小带蛋白1(zonula-occludens 1)和闭合蛋白(occludin)相关，这些蛋白质参与与其他细胞和细胞外基质的粘附，并支持髓鞘的功能。除了细胞粘附功能外，PMP22在施旺细胞增殖过程中也上调，表明其在细胞周期调节中发挥作用。PMP22在非神经组织中是可检测的，其中PMP22表达已被证明具有生长停滞特异性(gas-3)功能。
PMP22基因的基因剂量不当可导致髓鞘的蛋白质合成和功能异常。由于髓鞘的成分是化学计量设定的，任何成分的不规则表达都可能导致髓鞘失稳(destabilization)和神经性疾病。PMP22基因表达的改变与多种神经病变有关，如腓骨肌萎缩症1A型(Charcot–Marie–Tooth type 1A，CMT1A)、德热里纳-索塔斯病(Dejerine–Sottas disease)和遗传性压力易感性周围神经病(HNPP)。(例如，由基因重复引起的)PMP22过多导致CMT1A。PMP22的基因复制是CMT最常见的遗传原因，其中PMP22的过量产生导致多种信号通路的缺陷和转录因子(如KNOX20、SOX10和EGR2)的功能障碍(dysfunction)。
人PMP22基因的序列可见于公开获得的NCBI RefSeq Acc.No.NM_000304。替代的RefSeq mRNA转录物的登录号分别为NM_001281455、NM-001281456、NM-153321和NM_153322。人PMP22基因可见于染色体位置17p12的15,229,777-15,265,326。
人PMP22前体mRNA转录物的序列(SEQ ID NO:264)对应于染色体位置17p12的残基15,229,777-15,265,326的反向互补序列。PMP22 mRNA序列(GenBank登录号NM_000304.4)提供于SEQ ID NO:58中。人PMP22蛋白的序列可见于公开获得的Uniprot登录号Q01453(规范序列，SEQ ID NO:60)。可能的PMP22同种型分别具有Uniprot登录号A8MU75、J3KQW0、A0A2R8Y5L5、J3KT36和J3QS08。与本文所公开的登录号相对应的数据库条目的公开获得的内容通过引用整体并入。
本公开的抗PMP22 ASO可以被设计为减少或抑制PMP22蛋白的天然变体的表达。
抗PMP22 ASO的靶核酸序列的示例是PMP22前体mRNA。SEQ ID NO:58代表人PMP22基因组序列(即染色体17p12的核苷酸15,229,777-15,265,326互补序列的反向互补序列)。SEQ ID NO:58与PMP22前体mRNA序列同一，除了SEQ ID NO:58中的核苷酸“t”在前体mRNA中显示为“u”。
在一些方面，抗PMP22 ASO包含长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与对应于SEQ ID NO:264(PMP22全mRNA转录物)中所述核苷酸序列的PMP22转录物的核苷酸1至1828或对应于SEQ ID NO:59(PMP22编码序列)中所述核苷酸序列的PMP22转录物的核苷酸208至690内的核酸序列互补。
在一些方面，连续核苷酸序列与PMP22转录物内的核酸序列互补至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或约100％。在一些方面，抗PMP22ASO能够减少人细胞(例如，施旺细胞)中PMP22蛋白的表达，其中人细胞表达PMP22蛋白。
在一些方面，与未暴露于抗PMP22 ASO的人细胞中PMP22蛋白表达相比，PMP22蛋白表达减少至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或约100％。
在一些方面，抗PMP22 ASO能够降低人细胞(例如，免疫细胞)中PMP22mRNA的水平，其中人细胞表达PMP22 mRNA。在一些方面，与未暴露于抗PMP22ASO的人细胞中PMP22 mRNA的水平相比，PMP22 mRNA的水平减少至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或约100％。
在某些方面，靶核酸包含编码PMP22蛋白的核酸或其天然存在的变体以及源自其的RNA核酸(例如，前体mRNA)的内含子。在其它方面，靶核酸包含编码PMP22蛋白的核酸或其天然存在的变体以及源自其的RNA核酸(例如，前体mRNA)的外显子区域。在其它方面，靶核酸包含编码PMP22蛋白的核酸或其天然存在的变体以及源自其的RNA核酸(例如，前体mRNA)的外显子-内含子接合点。在一些方面，例如，当用于研究或诊断时，靶核酸可以是源自上述DNA或RNA核酸靶标的cDNA或合成寡核苷酸。人PMP22编码序列(CDS)显示为SEQ ID NO:59，并且由PMP22前体mRNA中的编码序列编码的蛋白质序列显示为SEQ ID NO:60。在其它方面，靶核酸包含编码PMP22蛋白的核酸或其天然存在的变体的非翻译区，例如5'UTR、3'UTR、或两者。
在一些方面，本公开的抗PMP22 ASO与PMP22转录物(例如，SEQ ID NO:58)的内含子内的区域杂交。在某些方面，本公开的ASO与PMP22转录物(例如，SEQ ID NO:58)的外显子内的区域杂交。在其它方面，本公开的抗PMP22 ASO与PMP22转录物(例如，SEQ ID NO:58)的外显子-内含子接合点内的区域杂交。
在一些方面，本文所述的任何抗PMP22 ASO可以是本公开的EV(例如，外泌体)的一部分，即包含构建体(例如，式1的构建体)的EV(如，外泌体)，该构建体包含本文所公开的优化的接头，其中生物活性部分[BAM]是本文所述抗PMP22 ASO或其组合。
细胞外囊泡(EV)，例如，外泌体
包含本文所公开的优化的接头的构建体(例如式1的构建体)可以包含至少一个锚定部分[AM]，其将构建体连接到细胞外囊泡(EV)(例如，外泌体)。本公开的EV(例如，外泌体)可以具有在约20至约300nm之间的直径。在某些方面，本公开的EV(例如，外泌体)具有在约20至约290nm、约20至约280nm、约20nm至约270nm、约20至约260nm、约20至约250nm、约20至240nm、约20至约230nm、约20至约220nm、约20至约210nm、约20至约200nm、约20至约190nm、约20至约180nm、约20至约170nm、约20至约160nm、约20至150nm、约20至约140nm、约20至约130nm、约20至约120nm、约20至约110nm、约20至100nm、约20至约90nm、约20至约80nm、约20至约70nm、约20至约60nm、约20m至约50nm、约20至约40nm、或约20至约30nm之间的直径。可根据本领域已知的方法测量本文所述的EV(例如，外泌体)的大小。
本公开的EV(例如，外泌体)包含双脂膜(“外泌体膜”或“EV膜”)，它包含内表面(腔表面)和外表面。内表面面向EV(例如，外泌体)的内核，即EV的腔。
EV膜或外泌体膜包含脂质和脂肪酸。示例性脂质包括磷脂、糖脂、脂肪酸、鞘脂、磷酸甘油酯、固醇、胆固醇和磷脂酰丝氨酸。EV膜或外泌体膜包含内小叶和外小叶。内小叶和外小叶的组成可通过本领域中已知的跨双层分布测定来确定，参见例如Kuypers et al.,Biohim Biophys Acta 1985 819:170。
在一些方面，外小叶的组成为在约70％至约90％之间的胆碱磷脂、在约0％至约15％之间的酸性磷脂和在约5％至约30％之间的磷脂酰乙醇胺。在一些方面，内小叶的组成为在约15％至约40％之间的胆碱磷脂、在约10％至约50％之间的酸性磷脂和在约30％至约60％之间的磷脂酰乙醇胺。在一些方面，EV膜或外泌体膜包含一种或多种多糖，诸如聚糖。EV或外泌体表面上的聚糖可以作为马来酰亚胺部分的连接部或连接聚糖和马来酰亚胺部分的接头。聚糖可以存在于EV(例如，外泌体)表面上的一种或多种蛋白质上，例如支架X，诸如PTGFRN多肽，或在EV(例如，外泌体)的脂质膜上。聚糖可以被修饰为具有硫代岩藻糖(thiofucose)，所述硫代岩藻糖可以作为用于将马来酰亚胺部分连接到聚糖的官能团。在一些方面，可以修饰支架X以表达大量聚糖以允许在EV(例如，外泌体)上进行另外的连接。
制备方法
本公开的EV(例如，外泌体)可以通过化学合成、重组DNA技术、较大分子的生物化学或酶促片段化、上述的组合、或通过任何其它方法来制备。在一方面，本公开提供了一种经由本文所公开的优化的接头将生物活性分子连接到EV(例如，外泌体)的方法，例如，经由固相合成或缀合。
外泌体生产：在一些方面，本文所公开的EV(例如，外泌体)可以从体外生长的细胞或受试者的体液制备。当从体外细胞培养物生产外泌体时，可以使用各种生产细胞，例如HEK293细胞、CHO细胞和MSC。在某些方面，生产细胞是HEK293细胞。在一些方面，生产细胞不是树突细胞、巨噬细胞、B细胞、肥大细胞、嗜中性粒细胞、Kupffer-Browicz细胞、源自这些细胞中的任一者的细胞、或其任何组合。
人胚肾293细胞(通常也称为HEK 293、HEK-293、293细胞，或者不太准确地称为HEK细胞)是最初源自在组织培养物中生长的人胚肾细胞的特定细胞系。
HEK 293细胞是1973年在荷兰莱顿的Alex van der Eb实验室通过用剪切的腺病毒5DNA转染正常人胚胎肾细胞的培养物而产生的。培养细胞并用腺病毒转染。随后的分析表明，所述转化是通过从病毒基因组的左臂插入约4.5千碱基来实现的，其被整合至人染色体19中。
对HEK 293和五种衍生细胞系的基因组和转录组的综合研究将HEK 293转录组与人肾脏、肾上腺、垂体和中枢神经组织的基因组和转录组进行了比较。HEK 293模式与肾上腺细胞最相似，肾上腺细胞具有许多神经元特性。HEK 293细胞具有复杂的核型，其表现为每个染色体的两个或更多个拷贝，并且染色体模式数为64。它们被描述为亚三倍体，含有的染色体数量少于单倍体人配子的三倍。染色体异常包括总计X染色体的三个拷贝以及染色体17和染色体22的四个拷贝。可用于生产EV的HEK293细胞的变体包括但不限于HEK 293F、HEK 293FT和HEK 293T。
固相合成：本领域已知的固相合成可以另外地或替代地用于产生本申请中所公开的构建体。在一些方面，本文所公开的优化的接头的两个或更多个组分可以使用固相合成彼此连接(例如，连接(concatenated))。例如，可以合成ASO，并且可以经由常规的合成步骤将不同的间隔子或其组合添加到ASO中。示例性的亚磷酰胺间隔子(例如，C3-亚磷酰胺、TEG-亚磷酰胺和HEG-亚磷酰胺)呈现在图4中。在一些方面，间隔子或间隔子的组合可以经由合成进一步延伸以结合膜锚定部分，如图3所示，其示出了可用于经由固相合成产生本公开的优化的接头的亚磷酰胺，例如辛基-生育酚亚磷酰胺、生育酚亚磷酰胺、棕榈酸酯-C6亚磷酰胺、胆固醇-TEG亚磷酰胺或胆固醇-C6亚磷酰胺。合适的固相技术(包括自动化合成技术)描述于例如F.Eckstein(ed.),Oligonucleotides and Analogues,a PracticalApproach,Oxford University Press,New York(1991)和Toy,P.H.；Lam,Y(ed.),Solid-Phase Organic synthesis,concepts,Strategies,and Applications,John Wiley&Sons,Inc.New Jersey(2012)中。
缀合：在一些方面，本文所公开的优化的接头的两个或更多个组分可以使用缀合彼此连接(例如，连接)。除胺反应性化合物外，那些具有与巯基(-SH)形成键的化学基团的化合物是蛋白质和其他生物缀合技术最常见的交联剂和修饰试剂。巯基(也称为硫醇)存在于蛋白质中的半胱氨酸(Cys，C)氨基酸的侧链中。半胱氨酸巯基对通常通过多肽链内或多肽链之间的二硫键(–S–S–)连接，作为天然三级或四级蛋白质结构的基础。通常，只有游离或还原的巯基(-SH)[而不是二硫键中的硫原子]可用于与硫醇反应性化合物反应。
巯基基团是蛋白质缀合和标记的有用靶标。首先，巯基存在于大多数蛋白质中，但数量不如伯胺多；因此，经由巯基基团进行交联更具选择性和精确性。其次，蛋白质中的巯基通常与二硫键有关，因此这些位点的交联通常不会显著改变潜在的蛋白质结构或阻断结合位点。第三，可用的(即，游离的)巯基基团的数量可以很容易地控制或修改；它们可以通过天然二硫键的还原产生，或者它们可以通过使用巯基加成试剂(诸如，2-亚氨基硫烷盐酸盐(Traut试剂)、SATA、SATP或SAT(PEG))与伯胺反应而引入分子中。最后，将巯基反应性基团与胺反应性基团组合以制备异双官能交联剂，提供更大的灵活性和对交联程序的控制。例如，使用含有马来酰亚胺基团和NHS酯的3-马来酰亚胺丙酸NHS酯，NHS酯可用于标记蛋白质的伯胺(-NH2)、胺修饰的寡核苷酸和其他含胺分子。马来酰亚胺基团将与硫醇基团反应形成共价键，使生物分子与硫醇连接。
当反应混合物的pH值在6.5至7.5之间时，马来酰亚胺基团与巯基基团特异性反应；结果是形成不可逆的稳定硫醚键(即，键不能用还原剂裂解)。在更具碱性的条件下(pH>8.5)，反应有利于伯胺，并且也增加了马来酰亚胺基团水解成非反应性马来酰胺酸的速率。马来酰亚胺不与酪氨酸、组氨酸或甲硫氨酸反应。
含硫醇的化合物(诸如二硫苏糖醇(DTT)和β-巯基乙醇(BME))必须从与马来酰亚胺一起使用的反应缓冲液中排除，因为它们会竞争偶联位点。例如，如果使用DTT还原蛋白质中的二硫键以使巯基基团可用于缀合，则必须在开始马来酰亚胺反应之前使用脱盐柱彻底除去DTT。有趣的是，二硫键还原剂TCEP不含硫醇，在涉及马来酰亚胺试剂的反应之前不必除去。
过量的马来酰亚胺可以在反应结束时通过添加游离的硫醇来淬灭。EDTA可以包含在偶联缓冲液中以螯合杂散的二价金属，否则会促进巯基的氧化(非反应性)。
在一方面，连接包括用还原剂处理EV(例如，外泌体)。合适的还原剂包括例如TCEP(三(2-羧乙基)膦)、DTT(二硫苏糖醇)、BME(2-巯基乙醇)、硫醇化剂、及其任何组合。硫醇化剂可以包括例如Traut试剂(2-亚氨基硫烷盐酸盐)。
在用还原剂处理之后，连接反应还包括使还原的EV(例如，外泌体)与马来酰亚胺部分接触。在一方面，马来酰亚胺部分在连接到EV(例如，外泌体)之前连接到生物活性分子。在一些方面，马来酰亚胺部分还连接到接头，以将马来酰亚胺部分连接到生物活性分子。因此，在一些方面，一个或多个接头或间隔子插入马来酰亚胺部分和生物活性分子之间。
本文所公开的锚定部分[AM]、间隔子[SP]或间隔子组合或生物活性分子[BAM]中的任何一种可以与反应性部分缀合，所述反应性部分例如氨基反应性部分(例如，NHS-酯、对硝基苯酚、异硫氰酸酯、异氰酸酯或醛)、硫醇反应性部分(例如，丙烯酸酯、马来酰亚胺或吡啶基二硫化物)、羟基反应性部分(例如，异硫氰酸酯或异氰酸酯)、羧酸反应性部分(例如，环氧化物)、或叠氮化物反应性部分(例如，炔烃)。
可用于经由化学缀合共价结合本文所公开的两种组分(例如，锚定部分[AM]和间隔子[SP]、两个间隔子[SP]、间隔子[SP]和生物活性分子[BAM]、或锚定部分[AM]和生物活性部分[BAM])的示例性反应性部分包括，例如，N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯、N-4-马来酰亚胺丁酸、S-(2-吡啶基二硫代)半胱胺、碘代乙酰氧基琥珀酰亚胺、N-(4-马来酰亚胺丁酰基氧基)琥珀酰亚胺、N-[5-(3'-马来酰亚胺丙基酰胺)-1-羧基戊基]亚氨基二乙酸、N-(5-氨基戊基)亚氨基二乙酸、和1'-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)。双功能接头(含有两个官能团的接头)也是可用的。
在一些方面，锚定部分[AM]、间隔子[SP]、或生物活性分子[BAM]可包含末端氧氨基，例如—ONH2、肼基、—NHNH2、巯基(即，SH或硫醇)或烯烃(例如，CH═CH2)。在一些方面，锚定部分[AM]、间隔子[SP]、或生物活性分子[BAM]可例如在末端位置包含亲电子部分，例如醛、烷基卤化物、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、间硝基苯磺酸酯(nosylate)、或对溴苯磺酸酯、或活化的羧酸酯，例如NHS酯、亚磷酰胺、或五氟苯基酯。在一些方面，可通过将配体的亲核基团(例如，羟基、硫醇或氨基)与亲电子基团偶联来形成共价键。本发明适用于所有方式的反应性基团和反应性部分，包括但不限于本领域已知的那些。
如本文所用，术语“保护基团”是指本领域中已知在合成程序期间保护反应性基团(包括但不限于羟基、氨基和硫醇基团)免受不需要的反应的影响的不稳定化学部分。保护基团通常选择性地和/或正交地用于在其它反应性位点在反应期间保护位点，并且然后可被除去以留下原样未受保护的基团或可用于进一步反应。如本领域中已知的保护基团通常描述于Greene and Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,3rd edition,JohnWiley&Sons,New York(1999)中。
另外，各种合成步骤可以交替顺序或次序进行以得到所需的化合物。可用于合成本文所述的化合物的合成化学转化和保护基团方法论(保护和脱保护)在本领域中是已知的，并且包括例如在如以下文献中描述的那些：R.Larock,Comprehensive OrganicTransformations,VCH Publishers(1989)；T.W.Greene and P.G.M.Wuts,ProtectiveGroups in Organic Synthesis,2d.Ed.,John Wiley and Sons(1991)；L.Fieser andM.Fieser,Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis,John Wiley andSons(1994)；和L.Paquette,ed.,Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis,John Wiley and Sons(1995)，以及其后续版本。
胺反应性部分：在一些方面，反应性部分是胺反应性部分。如本文所用，术语“胺反应性部分”是指可与具有氨基部分(例如，伯胺)的反应性基团反应的化学基团。示例性胺反应性部分是N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS-酯)、对硝基苯酚、异硫氰酸酯、异氰酸酯和醛。与伯胺反应的替代反应性部分在本领域中也是众所周知的。在一些方面，胺反应性部分可连接到本公开的锚定部分[AM]、间隔子[SP]、或生物活性分子[BAM]的末端位置。在一些方面，胺反应性部分是NHS-酯。通常，NHS-酯反应性部分与反应性基团的伯胺反应而产生稳定的酰胺键和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。在一些方面，胺反应性部分是对硝基苯酚基团。通常，对硝基苯酚反应性部分是与反应性基团的伯胺反应而产生稳定的氨基甲酸酯部分和对硝基苯酚的活化的氨基甲酸酯。在一些方面，胺反应性部分是异硫氰酸酯。通常，异硫氰酸酯与反应性基团的伯胺反应而产生稳定的硫脲部分。在一些方面，胺反应性部分是异氰酸酯。通常，异氰酸酯与反应性基团的伯胺反应而产生稳定的脲部分。在一些方面，胺反应性部分是醛。通常，醛与伯胺反应而形成席夫碱(Schiff base)，席夫碱可通过还原性胺化进一步还原而形成共价键。
硫醇反应性部分：在一些方面，反应性部分是硫醇反应性部分。如本文所用，术语“硫醇反应性部分”是指可与具有硫醇部分(例如，巯基)的反应性基团反应的化学基团。示例性的硫醇反应性部分是丙烯酸酯、马来酰亚胺和吡啶基二硫化物。与硫醇反应的替代反应性部分在本领域中也是众所周知的。在一些方面，硫醇反应性部分可连接到本公开的锚定部分[AM]、间隔子[SP]、或生物活性分子[BAM]的末端位置。在一些方面，硫醇反应性部分是丙烯酸酯。通常，丙烯酸酯与硫醇在β碳处与丙烯酸酯的羰基反应而形成稳定的硫化物键。在一些方面，硫醇反应性部分是马来酰亚胺。通常，马来酰亚胺与硫醇在β碳或羰基处反应而形成稳定的硫化物键。在一些方面，硫醇反应性部分是吡啶基二硫化物。通常，吡啶基二硫化物与硫醇在β硫原子处与吡啶基反应而形成稳定的二硫键和吡啶-2-硫酮。
羟基反应性部分：在一些方面，反应性部分是羟基反应性部分。如本文所用，术语“羟基反应性部分”是指可与具有羟基部分的反应性基团反应的化学基团。示例性的羟基反应性部分是异硫氰酸酯和异氰酸酯。与羟基部分反应的替代反应性部分在本领域中也是众所周知的。在一些方面，羟基反应性部分可连接到本公开的锚定部分[AM]、间隔子[SP]、或生物活性分子[BAM]的末端位置。在一些方面，羟基反应性部分是异硫氰酸酯。通常，异硫氰酸酯与反应性基团的羟基反应而产生稳定的硫代氨基甲酸酯部分。在一些方面，胺反应性部分是异氰酸酯。通常，异氰酸酯与反应性基团的羟基反应而产生稳定的氨基甲酸酯部分。
羧酸反应性部分：在一些方面，反应性部分是羧酸反应性部分。如本文所用，术语“羧酸反应性部分”是指可与具有羧酸部分的反应性基团反应的化学基团。示例性的羧酸反应性部分是环氧化物。与羧酸部分反应的替代反应性部分在本领域中也是众所周知的。在一些方面，羧酸反应性部分可连接到本公开的锚定部分[AM]、间隔子[SP]、或生物活性分子[BAM]的末端位置。在一些方面，羧酸反应性部分是环氧化物。通常，环氧化物与反应性基团的羧酸在环氧化物的任一碳原子处反应而形成2-羟基乙基乙酸酯部分。
叠氮化物反应性部分：在一些方面，反应性部分是叠氮化物反应性部分。如本文所用，术语“叠氮化物反应性部分”是指可与具有叠氮化物部分的反应性基团反应的化学基团。示例性的叠氮化物反应性部分是炔烃。与叠氮化物部分反应的替代反应性部分在本领域中也是众所周知的。在一些方面，羧酸反应性部分可连接到本公开的锚定部分[AM]、间隔子[SP]、或生物活性分子[BAM]的末端位置。在一些方面，叠氮化物反应性部分是炔烃。通常，炔烃通过1,3-偶极环加成反应(也称为“点击化学”)与反应性基团的叠氮化物反应而形成1,2,3-三唑部分。
治疗用途
本公开提供了在有需要的受试者中治疗疾病或病症的方法，其包括将包含本公开的EV(例如，外泌体)(即本文所公开的包含优化的接头的EV)的组合物施用于受试者。本公开还提供了在有需要的受试者中预防或改善疾病或病症的症状的方法，其包括将包含本公开的EV(例如，外泌体)的组合物施用于受试者。本公开还提供了在有需要的受试者中诊断疾病或病症的方法，其包括将包含本公开的EV(例如，外泌体)(即本文所公开的包含优化的接头的EV)的组合物施用于受试者。
在一方面，疾病或病症是癌症、炎症性疾病、神经退行性疾病、中枢神经疾病或代谢性疾病。
本公开还提供了在有需要的受试者中预防和/或治疗疾病或病症的方法，其包括将本公开的EV(例如，外泌体)(即本文所公开的包含优化的接头的EV)施用于受试者。在一些方面，可以用本方法治疗的疾病或病症包括癌症、移植物抗宿主病(GvHD)、自身免疫性疾病、传染病或纤维化疾病。在一些方面，治疗是防治性的。在其他方面，本公开的EV(例如，外泌体)(即本文所公开的包含优化的接头的EV)用于诱导免疫应答。在其他方面，本公开的EV(例如，外泌体)(即本文所公开的包含优化的接头的EV)用于给受试者接种疫苗。
在一些方面，疾病或病症是癌症。当施用于患有癌症的受试者时，在某些方面，本公开的EV(例如，外泌体)(即本文所公开的包含优化的接头的EV)可以上调免疫应答并且增强受试者免疫系统的肿瘤靶向。在一些方面，所治疗的癌症的特征在于白细胞(T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突细胞、单核细胞)到肿瘤微环境或所谓的“热肿瘤”或“炎性肿瘤”中的浸润。在一些方面，所治疗的癌症的特征在于低水平或不可检测的水平的白细胞到肿瘤微环境或所谓的“冷肿瘤”或“非炎性肿瘤”的浸润。在一些方面，以足以将“冷肿瘤”转化为“热肿瘤”的量和持续时间施用EV(例如，外泌体)，即，所述施用导致白细胞(诸如T细胞)至肿瘤微环境的浸润。在某些方面，癌症包括膀胱癌、宫颈癌、肾细胞癌、睾丸癌、结直肠癌、肺癌、头颈癌、以及卵巢癌、淋巴瘤、肝癌、胶质母细胞瘤、黑素瘤、骨髓瘤、白血病、胰腺癌、或其组合。在其他方面，术语“远端肿瘤(distal tumor)”或“远处肿瘤(distant tumor)”是指从原始(或原发)肿瘤扩散到远处器官或远处组织(例如，淋巴结)的肿瘤。在一些方面，本公开的EV(例如，外泌体)(即本文所公开的包含优化的接头的EV)治疗转移扩散后的肿瘤。
在一些方面，疾病或病症是移植物抗宿主病(GvHD)。在一些方面，可以用本公开治疗的疾病或病症是自身免疫性疾病。自身免疫性疾病的非限制性示例包括：多发性硬化、周围神经炎、干燥综合征(Sjogren's syndrome)、类风湿性关节炎、脱发、自身免疫性胰腺炎、肠白塞病(Behcet's disease)、大疱性类天疱疮、乳糜泻(celiac disease)、德维克病(Devic's disease)(视神经脊髓炎)、肾小球肾炎、IgA肾病、各种血管炎、硬皮病、糖尿病、动脉炎、白癜风(vitiligo)、溃疡性结肠炎、肠易激综合征、牛皮癣、葡萄膜炎、系统性红斑狼疮、及其组合。
在一些方面，疾病或病症是传染病。在一些方面，疾病或病症是致癌病毒。在一些方面，可以用本公开治疗的传染病包括但不限于人类γ疱疹病毒4(爱泼斯坦-巴尔病毒)、甲型流感病毒、乙型流感病毒、巨细胞病毒、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、HIV-1、HIV-2、冠状病毒(例如，MERS-CoV和SARS CoV)、丝状病毒(例如，马尔堡病和埃博拉病)、化脓性链球菌、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、疟原虫种(例如，间日疟和恶性疟)、Chikunga病毒、人乳头瘤病毒(HPV)、乙型肝炎、丙型肝炎、人类疱疹病毒8、单纯疱疹病毒2(HSV2)、克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、肠球菌属(Enterococcus sp.)、变形杆菌属(Proteus sp.)、肠杆菌属(Enterobacter sp.)、放线菌属(Actinobacter sp.)、凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)、支原体属(Mycoplasmasp.)、或其组合。
在一些方面，可以用本方法治疗的疾病或病症包括庞贝氏病(Pompe disease)、戈谢病(Gaucher)、溶酶体贮积症、胰纤维性囊肿病、囊性纤维化、杜显和贝克肌肉萎缩症(Duchenne and Becker muscular dystrophy)、转甲状腺素淀粉样变性、血友病A、血友病B、腺苷脱氨酶缺乏症、莱伯氏先天性黑蒙(Leber's congenital amaurosis)、X连锁肾上腺脑白质营养不良、异染性脑白质营养不良、OTC缺乏症、糖原贮积病1A(glycogen storagedisease 1A)、克里格勒-纳贾尔综合征(Criggler-Najjar syndrome)、原发性高草酸尿症1型、急性间歇性卟啉病、苯丙酮尿症、家族性高胆固醇血症、黏多糖贮积症VI型、α1抗胰蛋白酶缺乏症、雷特综合征(Retts Syndrome)、Dravet综合征、天使症候群(AngelmanSyndrome)、DM1病、脆性X染色体综合征(Fragile X disease)、亨廷顿病(HuntingtonsDisease)、弗里德里希共济失调(Friedreichs ataxia)、CMT病(也称为Charcot-Marie-Tooth病、遗传性运动和感觉神经病变(HMSN)、或腓骨肌萎缩症)、CMT1X病、儿茶酚胺敏感性多形性室性心动过速、脊髓小脑共济失调3型(SCA3)疾病、肢带肌营养不良、或高胆固醇血症。在一些方面，治疗是防治性的。
在一些方面，疾病或病症是神经退行性疾病。在一些方面，神经退行性疾病选自阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、朊病毒病、运动神经元疾病、亨廷顿病、脊髓小脑共济失调、脊髓性肌萎缩症、及其任何组合。
在某些方面，该疾病或病症包括肌营养不良。在一些方面，肌营养不良选自杜氏型肌肉营养不良症(DMD)、强直性肌营养不良、面肩肱型肌营养异常(FSHD)、先天性肌营养不良、肢带型肌营养不良(包括但不限于LGMD2B、LGMD2D、LGNMD2L、LGMD2C、LGMD2E和LGMD2A)及其任何组合。
在一些方面，所述疾病或病症选自AADC缺乏症(CNS)、ADA-SCID、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、β-地中海贫血(严重镰状细胞)、癌症(头颈部鳞状细胞)、尼曼-皮克病C型(Niemman-Pick Type C Disease)、脑ALD、无脉络膜症(Choroideremia)、充血性心力衰竭、囊性纤维化、杜氏肌肉营养不良症(DMD)、法布瑞氏症(Fabry disease)、青光眼、神经胶质瘤(癌症)、血友病A、血友病B、HoFH(高胆固醇血症)、亨廷顿病、脂蛋白脂酶缺乏症、Leber遗传性视神经病变(LHON)、异染性脑白质营养不良(Metachromatic leukodystrophy)、MPS I(Hurler综合征)、MPS II(Hunter's综合征)和MPS III(Sanfilippo综合征)、帕金森氏病、庞贝氏病、隐性营养不良性大疱性表皮松解症、RPE65缺乏症(视力丧失)、脊髓性肌萎缩症(SMAI)、湿性AMD(视网膜疾病)、维斯科特-奥尔德里奇综合征(Wiskott Aldrich syndrome，WAS)、黏多糖贮积症IIIA型(MPS IIIA)、X-连锁肌小管性肌病、X-连锁视网膜色素变性、及其任何组合。
在一些方面，通过静脉内将EV(例如，外泌体)施用至受试者的循环系统。在一些方面，将EV(例如，外泌体)输注到合适的液体中并且施用到受试者的静脉中。在一些方面，通过动脉内将EV(例如，外泌体)施用至受试者的循环系统。在一些方面，将EV(例如，外泌体)输注到合适的液体中并且施用到受试者的动脉中。在一些方面，通过鞘内施用将EV(例如，外泌体)施用至受试者。在一些方面，经由注射将EV(例如，外泌体)施用到椎管或蛛网膜下腔体中以使其到达脑脊液(CSF)。在一些方面，通过瘤内将EV(例如，外泌体)施用至受试者的一个或多个肿瘤中。在一些方面，通过鼻内施用将EV(例如，外泌体)施用至受试者。在一些方面，EV(例如，外泌体)可以以局部施用或全身施用的形式通过鼻子吹入。在某些方面，EV(例如，外泌体)作为鼻喷雾剂施用。在一些方面，通过腹膜内施用将EV(例如，外泌体)施用至受试者。在一些方面，将EV(例如，外泌体)输注到合适的液体中并且注射到受试者的腹膜中。在一些方面，腹膜内施用导致EV(例如，外泌体)分布到淋巴。在一些方面，腹膜内施用导致EV(例如，外泌体)分布到胸腺、脾和/或骨髓。在一些方面，腹膜内施用导致EV(例如，外泌体)分布到一个或多个淋巴结。在一些方面，腹膜内施用导致EV(例如，外泌体)分布到颈淋巴结、腹股沟淋巴结、纵隔淋巴结、或胸骨淋巴结中的一个或多个。在一些方面，腹膜内施用导致EV(例如，外泌体)分布到胰腺。在一些方面，通过眼周施用将EV(例如，外泌体)施用至受试者。在一些方面，将EV(例如，外泌体)注射到眼周组织。眼周药物施用包括结膜下、前房眼球筋膜囊下、后房眼球筋膜囊下和眼球后施用途径。
药物组合物和施用方法
本公开还提供了适用于施用于受试者的包含本公开的EV(例如，外泌体)(即本文所公开的包含优化的接头的EV)的药物组合物。药物组合物通常包含多个EV(例如，外泌体)和药学上可接受的赋形剂或载剂，所述多个EV包含经由本文所公开的优化的接头共价连接到所述多个EV(例如，外泌体)的生物活性分子，该药物组合物呈以适合施用于受试者的形式。药学上可接受的赋形剂或载剂部分地由所施用的特定组合物以及用于施用该组合物的特定方法决定。因此，存在很多种包含多个EV(例如，外泌体)的药物组合物的合适制剂。(参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.18th ed.(1990))。药物组合物通常是无菌配制的，并且完全符合美国食品和药物管理局的所有良好生产规范(GMP)规程。在一些方面，药物组合物包含一种或多种化学化合物，例如，如本公开的共价连接到EV(例如，外泌体)的小分子，即本文所公开的包含优化的接头的EV。
在一些方面，药物组合物包含一种或多种治疗剂和本公开的EV(例如，外泌体)，即本文所公开的包含优化的接头的EV。在某些方面，EV(例如，外泌体)与一种或多种其他治疗剂在药学上可接受的载剂中共同施用。在一些方面，包含EV(例如，外泌体)的药物组合物在施用另外的治疗剂之前施用。在其它方面，包含EV(例如，外泌体)的药物组合物在施用另外的治疗剂之后施用。在其它方面，包含EV(例如，外泌体)的药物组合物与另外的治疗剂同时施用。
本公开提供了药物组合物，所述药物组合物包含具有所需纯度的本公开的EV(例如，外泌体)(即本文所公开的包含优化的接头的EV)，以及药学上可接受的载剂或赋形剂，所述药物组合物呈以适合施用于受试者的形式。药学上可接受的赋形剂或载剂可以部分地由所施用的特定组合物以及用于施用该组合物的特定方法决定。因此，存在很多种包含多个细胞外囊泡的药物组合物的合适制剂。(参见，例如，Remington's PharmaceuticalSciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.21st ed.(2005))。药物组合物通常是无菌配制的，并且完全符合美国食品和药物管理局的所有良好生产规范(GMP)规程。
在一些方面，药物组合物包含一种或多种治疗剂和本公开的EV(例如，外泌体)，即本文所公开的包含优化的接头的EV。在某些方面，EV(例如，外泌体)与一种或多种其他治疗剂在药学上可接受的载剂中共同施用。在一些方面，包含EV(例如，外泌体)的药物组合物在施用另外的治疗剂之前施用。在其它方面，包含EV(例如，外泌体)的药物组合物在施用另外的治疗剂之后施用。在其它方面，包含EV(例如，外泌体)的药物组合物与另外的治疗剂同时施用。
可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所使用的剂量和浓度下对接受者(例如，动物或人)是无毒的，并且包括缓冲液(例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸)；抗氧化剂(包括抗坏血酸和甲硫氨酸)；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁基或苄基醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质(例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；亲水性聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)；氨基酸(例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸)；单糖、二糖及其他碳水化合物(包括葡萄糖、甘露糖或糊精)；螯合剂(例如EDTA)；糖(例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇)；成盐抗衡离子(例如钠离子)；金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂(例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG))。
载剂或稀释剂的示例包括但不限于水、盐水、林格氏液(Ringer'ssolutions)、右旋糖溶液和5％人血清白蛋白。此类介质和化合物用于药学上活性物质的用途在本领域中众所周知。除非任何常规介质或化合物与本文所述的细胞外囊泡不相容，否则考虑其在组合物中的使用。还可将补充治疗剂掺入组合物中。通常，将药物组合物配制成可与其预期施用途径相容。本公开的EV(例如，外泌体)(即本文所公开的包含优化的接头的EV)可以通过胃肠外、局部、静脉内、经口、皮下、动脉内、皮内、透皮、直肠、颅内、腹膜内、鼻内、瘤内、鞘内、眼内、肌内途径或作为吸入剂施用。在某些方面，包含EV(例如，外泌体)的药物组合物通过静脉内(例如，通过注射)施用。可将EV(例如，外泌体)可选地与在治疗所述EV(例如，外泌体)所要治疗的疾病、病症或病状方面至少部分有效的其他治疗剂组合施用。
溶液或悬浮液可以包括以下组分：无菌稀释剂，诸如水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌化合物，诸如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合化合物，诸如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂，诸如乙酸酯、柠檬酸酯或磷酸酯；以及用于调节张力的化合物，诸如氯化钠或右旋糖。pH可用酸或碱(例如盐酸或氢氧化钠)来调节。制剂可封闭在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
适用于可注射用途的药物组合物包括无菌水溶液(如果是水溶性)或分散液和无菌散剂(powders)。对于静脉内施用，合适的载剂包括生理盐水、抑菌水、聚氧乙烯蓖麻油EL(Cremophor ELTM)(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。组合物通常是无菌的并且具有达到容易注射的程度的流动性。载剂可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)以及它们的合适混合物的溶剂或分散介质。可例如通过使用包衣(诸如卵磷脂)、通过在分散液的情况下维持所需粒度、以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。微生物作用的预防可通过各种抗菌和抗真菌化合物(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞(thimerosal)等)来实现。如果需要，可将例如糖、多元醇(诸如甘露糖醇、山梨糖醇)和氯化钠的等渗化合物(isotonic compounds)添加至组合物中。可注射的组合物的延长吸收可通过在组合物中包含延迟吸收的化合物(例如，单硬脂酸铝和明胶)来实现。
根据需要，可以通过将本公开的EV(例如，外泌体)(即本文所公开的包含优化的接头的EV)以有效量和在合适的溶剂中与本文所列举的一种或多种成分的组合掺合来制备无菌可注射的溶液。一般地，通过将EV(例如，外泌体)掺入含有碱性分散介质和任何所需其他组分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌可注射的溶液的无菌粉末的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥，所述方法从其预先无菌过滤的溶液中产生活性组分加上任何其他的所需组分的粉末。可将EV(例如，外泌体)以贮库注射或植入制剂的形式施用，所述制剂可以以允许EV(例如，外泌体)的持续或脉冲释放的方式配制。
本公开的包含EV(例如，外泌体)(即本文所公开的包含优化的接头的EV)的组合物的全身施用也可以通过经粘膜方式进行。对于经粘膜施用，在制剂中使用适合于待渗透的屏障的渗透剂。此类渗透剂在本领域中是公知的，并且对于经粘膜施用，包括例如清洁剂、胆汁盐(bile salts)和梭链孢酸(fusidic acid)衍生物。经粘膜施用可通过使用例如鼻喷剂来实现。
在某些方面，将包含本公开的EV(例如，外泌体)(即本文所公开的包含优化的接头的EV)的药物组合物静脉内施用于将受益于该药物组合物的受试者。在某些其他方面，例如通过淋巴管内注射或通过结节内注射(参见例如Senti et al.,PNAS105(46):17908(2008))或通过肌内注射、通过皮下施用、通过瘤内注射、通过直接注射至胸腺中或至肝脏中来将组合物施用至淋巴系统。
在某些方面，包含本公开的EV(例如，外泌体)(即本文所公开的包含优化的接头的EV)的药物组合物作为液体悬浮液施用。在某些方面，将药物组合物作为能够在施用后形成贮库的制剂施用。在某些优选的方面，贮库缓慢释放EV(例如，外泌体)进入循环，或保持贮库形式。
通常，药学上可接受的组合物被高度纯化为不含污染物，具有生物相容性并且不具有毒性，并且适合于施用于受试者。如果水是载剂的组分，则水经高度纯化并且被处理为不含污染物(例如，内毒素)。
药学上可接受的载剂可以是乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯聚吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、苯甲酸甲基羟酯、苯甲酸丙基羟酯、滑石、硬脂酸镁和/或矿物油，但不限于此。药物组合物可还包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、香味增强剂、乳化剂、悬浮剂和/或防腐剂。
本文所述的药物组合物包含本公开的EV(例如，外泌体)(即本文所公开的包含优化的接头的EV)和可选地药物活性剂或治疗剂。治疗剂可以是生物剂、小分子剂或核酸剂。
提供了包含药物组合物的剂型，所述药物组合物包含本公开的EV(例如，外泌体)(即本文所公开的包含优化的接头的EV)。在一些方面，剂型被配制为液体悬浮液以用于静脉内注射。在一些方面，剂型被配制为液体悬浮液以用于瘤内注射。
在某些方面，本公开的EV(例如，外泌体)(即本文所公开的包含优化的接头的EV)的制备物经受辐射，例如X射线、γ射线、β粒子、α粒子、中子、质子、元素核、紫外线，以破坏残留的具有复制能力的核酸。
在某些方面，使用超过1、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100或超过100kGy的辐射剂量，使本公开的EV(例如，外泌体)(即本文所公开的包含优化的接头的EV)的制备物经受γ辐射。
在某些方面，使用超过0.1、0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000的辐射剂量，使本公开的EV(例如，外泌体)(即本文所公开的包含优化的接头的EV)的制备物经受X射线辐射。
本公开的EV(例如，外泌体)可以与其他药物同时使用。具体而言，本公开的EV(例如，外泌体)可以与药物(诸如激素治疗剂、化学治疗剂、免疫治疗剂、抑制细胞生长因子或细胞生长因子受体作用的药物等)一起使用。
试剂盒
本公开还提供了试剂盒或制造产品，所述试剂盒或制造产品包括本公开的一种或多种EV(例如，外泌体)(即本文所公开的包含优化的接头的EV)可选地使用说明书。在一些方面，试剂盒或制造产品包含本文所述的药物组合物，所述药物组合物包含至少一种本公开的EV(例如，外泌体)(即本文所公开的包含优化的接头的EV)和使用说明书。在一些方面，试剂盒或制造产品包含在一个或多个容器中的至少一种本公开的EV(例如，外泌体)(即本文所公开的包含优化的接头的EV)或包含EV(例如，外泌体)的药物组合物。本领域的技术人员将容易地认识到，本公开的EV(例如，外泌体)、包含本公开的EV(例如，外泌体)(即本文所公开的包含优化的接头的EV)的药物组合物或它们的组合可以容易地掺入已建立的试剂盒格式之一中，所述试剂盒格式是本领域熟知的。
在一些方面，试剂盒或制造产品包含EV(例如，外泌体)、一种或多种生物活性分子、经由本文所公开的优化的接头(例如，经由缀合或固相合成)将一种或多种生物活性分子共价连接到EV(例如，外泌体)的试剂，以及进行反应以经由本文所公开的优化的接头将一种或多种生物活性分子共价连接到EV(例如，外泌体)的说明。
在一些方面，试剂盒包含经由本文所公开的优化的接头(例如，经由缀合(例如马来酰亚胺化学)或固相合成)将生物活性分子与EV(例如，外泌体)缀合的试剂，以及进行缀合的说明书。
除非另有指示，否则本公开的实践将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。这些技术在文献中充分地进行了解释。参见，例如，Sambrook etal.,ed.(1989)MolecularCloning A Laboratory Manual(2nd ed.；Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Sambrook et al.,ed.(1992)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,(Cold SpringsHarbor Laboratory,NY)；D.N.Glover ed.,(1985)DNA Cloning,Volumes Iand II；Gait,ed.(1984)Oligonucleotide Synthesis；Mullis et al.U.S.Pat.No.4,683,195；Hamesand Higgins,eds.(1984)Nucleic Acid Hybridization；Hames and Higgins,eds.(1984)Transcription And Translation；Freshney(1987)Culture Of Animal Cells(AlanR.Liss,Inc.)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press)(1986)；Perbal(1984)APractical Guide To Molecular Cloning；the treatise,Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.)；Miller and Calos eds.(1987)Gene Transfer VectorsFor Mammalian Cells,(Cold Spring Harbor Laboratory)；Wu et al.,eds.,Methods InEnzymology,Vols.154and 155；Mayer and Walker,eds.(1987)Immunochemical MethodsIn Cell And Molecular Biology(Academic Press,London)；Weir and Blackwell,eds.,(1986)Handbook Of Experimental Immunology,Volumes I-IV；Manipulating the MouseEmbryo,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1986)；Crooke,Antisense drug Technology:Principles,Strategies and Applications,2ndEd.CRC Press(2007)和Ausubel et al.(1989)Current Protocols in MolecularBiology(John Wiley and Sons,Baltimore,Md.)。
本文所提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用整体并入本文。本公开中所公开的数据库条目和电子出版物通过引用整体并入。在本申请中通过引用并入的数据库条目或电子出版物的版本是在提交本申请时公开可用的数据库条目或电子出版物的最新版本。本申请中所公开的与基因或蛋白质标识符(例如，由公共数据库(如Genbank、Refseq或Uniprot)的登录号或数据库标识符识别的基因或蛋白质)相对应的数据库条目通过引用整体并入。与基因或蛋白质相关的并入信息不限于包含在数据库条目中的序列数据。通过引用并入的信息包括在提交本申请时公开可用的数据库的最新版本中的数据库条目的全部内容。在发生冲突的情况下，将以包括定义的本说明书为准。此外，材料、方法和示例仅为说明性的，并不旨在进行限制。
示例
以下示例仅用于说明目的，不应被解释为以任何方式限制本发明的范围或内容。除非另有指示，否则本发明的实践将采用本领域技术范围内的蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。这些技术在文献中充分地进行了解释。参见，例如，T.E.Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman andCompany,1993)；Green&Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,4thEdition(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2012)；Colowick&Kaplan,Methods inEnzymology(Academic Press)；Remington:The Science and Practice of Pharmacy,22nd Edition(Pharmaceutical Press,2012)；Sundberg&Carey,Advanced OrganicChemistry:Parts A and B,5th Edition(Springer,2007)。
示例1
外泌体生成
为了生成本文所述的外泌体，使用人胚肾(HEK)细胞系(HEK293SF)。使用天然细胞生成“天然外泌体”，并使用稳定转染前列腺素F2受体负调控因子(PTGFRN)的蛋白质的细胞生成“蛋白X外泌体”。将未转染或转染的HEK293SF细胞在化学成份确定的培养基中生长至高密度持续7天。
然后收集条件细胞培养基，并在室温下以300-800xg离心5分钟，以去除细胞和大碎片。用100U/mL补充培养基上清液，并在37℃水浴中孵育1小时。收集上清液，并在4℃下以16,000xg离心30分钟，以去除残留的细胞碎片和其他大的污染物。然后将上清液在4℃下以133,900xg超速离心3小时，以沉淀出外泌体。丢弃上清液，并从管的底部吸取任何残留的培养基。将沉淀重悬于200-1000μL PBS(-Ca-Mg)中。
为了进一步富集外泌体群体，通过密度梯度纯化(蔗糖或OPTIPREPTM)加工沉淀。将梯度在4℃下以200,000xg在置于SW 41Ti转子中的12mL Ultra-Clear(344059)管中旋转16小时，以分离外泌体部分。
将外泌体层从顶层轻轻去除，并将其在38.5mL Ultra-Clear(344058)管中稀释于约32.5mL PBS中，并且在4℃下再次以133,900xg超速离心3小时，以沉淀纯化的外泌体。将所得的沉淀重悬于最小体积的PBS(约200μL)中，并在4℃下储存。
对于OPTIPREPTM梯度，在用于SW 41Ti转子的12mL Ultra-Clear(344059)管中，用等体积的10％、30％和45％的OPTIPREPTM制备3层无菌梯度。将沉淀加入到OPTIPREPTM梯度，并在4℃下以200,000xg超速离心16小时，以分离外泌体部分。然后从管的顶部约3mL轻轻收集外泌体层。
将外泌体部分在38.5mL Ultra-Clear(344058)管中稀释于约32mL PBS中，并在4℃下以133,900xg超速离心3小时，以沉淀出纯化的外泌体。然后将沉淀的外泌体重悬在最小体积的PBS(约200μL)中，并在4℃下储存直到准备使用。
示例2
负载在外泌体上的ASO
将10uL的1x1013P/mL的外泌体与10uL的ASO(100uM)混合。加入980uL的PBS，然后以100kg离心20分钟)。去除顶部500uL的上清液(“上清液”)。将沉淀轻轻倒出并重悬于500uLPBS(“沉淀”)中。“负载效率”计算为沉淀中的ASO与ASO的总量(即上清液中的ASO加上沉淀中的ASO)之间的比率。
在图27中举例说明了ASO负载过程。
示例3
ASO接头结构对工程化或天然外泌体的效力和负载量的影响
评估了ASO接头结构对工程化或天然外泌体中ASO的负载量的影响，以及ASO接头结构对ASO效力的影响。
在工程化外泌体中评估与不同接头缀合的固定ASO序列的负载有效性。在HEK293细胞中产生并纯化过表达PTGFRN(蛋白X外泌体)的外泌体。ASO有效负载通过混合负载到外泌体的表面上。因此，将浓度为1x1013 P/mL的外泌体与100uM ASO以1:1混合，ASO具有与不同接头结构缀合的萤火虫萤光素酶(FFLuc)序列。负载效率计算为与外泌体偶联的起始ASO的百分比。
图6示出了所使用的构建体的结构。构建体C1至C9使用胆固醇-C6脂质锚定物。构建体T1至T9使用胆固醇-TEG脂质锚定物。构建体L1使用生育酚-C8脂质锚定物，而构建体L2和L3使用生育酚棕榈酸酯-C6脂质锚定物。图6中所示的其它接头组分为：磷酸二酯酶(PO)、硫代磷酸酯(PS)、六亚甲基(C6)、三亚甲基(C3)、三甘醇(TEG)和六甘醇(HEG)。
结果表明，每个工程化外泌体负载的ASO分子的量受到接头结构的影响(图6)。通常，具有胆固醇-C6锚定物的构建体的负载效率高于具有胆固醇-TEG锚定物的构建体的负载效率。对于具有生育酚-C8脂质锚定物的构建体，观察到最高的负载效率为68.78％，对应于每个外泌体4,127个ASO单位的负载。
图5中与使用工程化外泌体评估的不同接头缀合的相同固定ASO序列的负载效率也使用天然外泌体进行评估。参见图5。在HEK293细胞中产生并纯化天然外泌体。将浓度为1x1013 P/mL的外泌体与100uM ASO以1:1混合，ASO具有与不同接头结构缀合的萤火虫萤光素酶序列。负载效率计算为与外泌体偶联的起始ASO的百分比。与工程化外泌体的情况一样，每个天然外泌体负载的ASO分子的量受到接头结构的影响(图5)。同样，具有胆固醇-C6脂质锚定物的构建体显示出比具有胆固醇-TEG脂质锚定的构建体更高的负载效率。观察到构建体C2和C3的负载效率超过90％(93.6％和90.67％)，分别对应于每个外泌体5,616和5,440个ASO单位。因此，天然外泌体中的最大负载效率和每个外泌体的ASO数量显著高于过表达PTGFRN的工程化外泌体中的(图6)。
基于ASO接头结构开发了负载密度的预测模型(图7和图8)。模型显示，负载密度按重要性递减顺序取决于外泌体>膜锚定物(AM)>近端EV间隔子(SP1)～远端EV间隔子(SP2)。在蛋白X外泌体中，SP1的贡献比SP2的贡献更重要。另一方面，在天然外泌体中SP2的贡献高于SP1的贡献。
作为接头修饰的函数，负载密度的倍数增加在外泌体(即在天然外泌体和蛋白质X外泌体)中是一致的。表现最好的膜锚定物是生育酚和胆固醇。最佳的S1间隔子是C3和TEG，它们明显优于HEG。
使用生育酚-C8膜锚定物导致异常的外泌体负载，但在效力上没有类似的提高。
生成稳定的H1299细胞，其组成性表达萤火虫萤光素酶蛋白。将天然外泌体负载与萤火虫萤光素酶蛋白的mRNA互补的ASO，当将其添加到细胞中时，会导致萤光素酶蛋白质的信号敲低(knock-down)。比较地评估图9A中所描述的接头结构以确定对效力的影响(图9B：T1-T9；图9C：C1-C9，L1-L3)，箭头突出显示了提供最多萤光素酶敲低的结构(图9A，图9B)。添加到细胞中的ASO负载的外泌体的相对量是不同的，如图例中提供的相对的“感染复数(multiplicity of infection)”比率所示。每个接头结构(C1-C9、T1-T9、L1-L3)的敲低通过T7样品(对照)中ASO的量进行归一化。结构T2、T4和C2-C5提供了效力的最佳增加，通过接头的优化实现了效力的≥2倍的增加。
生成稳定的H1299细胞，其组成性表达萤火虫萤光素酶蛋白。将天然外泌体(图10A)或过表达PTGFRN的外泌体(图10B)负载与萤火虫萤光素酶蛋白的mRNA互补的ASO，当将其添加到细胞中时，会导致萤光素酶蛋白质的信号敲低。测定每个ASO接头的萤光素酶的最小归一化表达(指示最大敲低量)，并与用接头实现的负载密度进行比较。最佳接头由萤火虫萤光素酶的最大ASO/EV负载和/或最小归一化表达来定义。对于该ASO序列，胆固醇和生育酚-c8分别被证明是用于与天然外泌体和具有过表达PTGFRN的外泌体结合的最佳锚定部分。TEG和C3在选择间隔子1的效力中提供了最大的增加。
示例4
负载密度、稳定性和效力与ASO-接头-脂质结构的相关性
使用相同的ASO序列，为了将寡核苷酸(即反义寡核苷酸(ASO))连接到天然外泌体或具有过表达PTGFRN的外泌体，评估了不同的接头化学。采用了五种不同的膜锚定物：胆固醇、棕榈酸酯、生育酚、18:1PDP PE和16:0氰尿酸PE。ASO经由直链接头与这些膜锚定物缀合，该直链接头由一种或多种以下组分组成：三亚甲基(C3)、六亚甲基(C6)、辛基亚甲基(C8)、三甘醇(TEG)和六甘醇(HEG)。接头之间的键是磷酸二酯键。用于设计ASO-接头-脂质构建体的组分在图11中示出。
图12示出了在当前示例中所公开的实验中所使用的经修饰的ASO的序列。ASO以靶基因命名。命名为FFLUC和RLUC的两种ASO靶向它们的FFLUC或RLUC荧光基因受体。命名为STAT6和MYC的两种ASO靶向STAT6和MYC治疗基因。FFLUC、RLUC、STAT6和MYC ASO的碱基序列分别为5'-TCGAAGTACTCGGCGTAGGT-3'(SEQ ID NO:1089)、5'-AACCCAGGGTCGGACTCGAT-3'(SEQ ID NO:1090)、5'-GCAAGATCCCGGATTCGGTC-3'(SEQ ID NO:1091)和5'-GACGTGGCACCTCTTGAGGA-3'(SEQ ID NO:1092)，它们如图12中所示被修饰。
负载密度与ASO-接头-脂质结构的相关性：最佳的接头设计将产生高负载密度(每个EV负载的ASO量)，以最大化每个外泌体的效力和每个ASO分子的高效力。ASO有效负载是用四种不同的寡核苷酸序列和多达14种不同的接头结构组合设计的。然后这些有效负载被负载在具有过表达PTGFRN的外泌体上，并测定负载密度。生成了统计模型(R2＝0.86)以确定不同结构参数对外泌体上的负载密度的贡献。统计模型如图13A所示。
接头筛选显示，ASO序列、膜锚定物和间隔子1(外泌体表面近端的接头)对负载密度有显著影响。每种脂质都具有不同的分配系数，该分配系数定义了可以稳定存在于疏水膜中的脂质的平衡量。混合的直链和环状疏水结构可以提供改进的ASO负载，因为烷基链允许芳香环进入磷脂双层的更大内部体积。脂质成分可以影响膜的流动性，可能是例如由诱导的偶极相互作用、偶极相互作用和/或电荷相互作用介导的。最后，含水负载缓冲液中脂质的自缔合(self-association)可能导致整个结构的性能差异。类似地，不同的ASO序列采用略微不同的构象，并以序列依赖的方式与外泌体表面自缔合和/或缔合。
接头筛选显示，负载密度受到间隔子1(外泌体近端的接头)的存在的显著影响。相反，间隔子2(即离外泌体表面最远的接头)没有显著的影响，这表明进一步增加间隔子长度超过间隔子1所提供的长度并不能为负载提供有意义的优势。这些发现表明，在接头设计中，紧邻膜的区域的构型、构象或取向的改变是至关重要的。疏水接头(例如C3、C6和C8)比亲水接头(例如TEG和HEG)更疏水，因此在能量上更有利于与膜的疏水内部缔合以及渗透膜的疏水内部。通过充当疏水系链(tether)并增加膜锚定物可以进入的膜的非极性体积，接头可以增加有效负载的负载密度。亲水性间隔子1可以改善围绕高电荷和亲水性磷酸盐头部基团和外泌体外表面的区域中的热力学结合平衡。增加接头长度将增加ASO的间距并减少阴离子ASO的静电排斥。在离外泌体表面一定距离之外，这种益处变得微不足道。
总之，有效负载结构的所有部分对其负载密度都有不同程度的影响，但通过ASO结构保持了趋势(见图13B和图13C)。主要因素是所使用的ASO，其依次是近端EV间隔子(间隔子1)、膜锚定物(脂质)和远端EV间隔子(间隔子2)。
exoASO的稳定性：ASO-接头-脂质的负载依赖于脂质部分和外泌体的磷脂双层之间的疏水相互作用。为了检查这种脂质缔合的弹性，我们在一系列缓冲条件下评估了接头/脂质结构的五种组合，以确定对缔合稳定性的影响。所使用的实验条件在下表进行总结。
HEG：六甘醇间隔子，TEG：四甘醇间隔子；C3：三亚甲基；C6：六亚甲基，无(none)：表示在该位置不包括额外的间隔子；STAT6：敲低信号转导及转录激活因子6的表达的ASO序列
如前表所述，将ASO-接头-脂质负载在外泌体上，并在两种不同温度的三种缓冲条件下维持8天。通过从总ASO含量中减去解离的游离ASO来评估外泌体相关ASO的量，在图13A-13E中称为“ASO(uM)”。
图19A-19C示出了在图13B中所示的exoASO-STAT6对照(Chol-TEG-HEG)中使用磷酸二酯或硫代磷酸酯键联的效果。当两种接头都是硫代磷酸酯(PS)时，观察到以ASO浓度(nM)或外泌体颗粒(p/mL)定量的最高效力。当最接近脂质锚定部分的键联是磷酸二酯而远端键联是硫代磷酸酯时，观察到最低效力。
通常，NaCl增加的缓冲液会导致更高的负载密度。高盐和低盐缓冲条件下的负载密度随接头-脂质结构的变化而变化。在25℃和4℃下在三种不同缓冲条件下，外泌体相关ASO的浓度在8天内保持稳定。参见图15。此外，颗粒计数(图16)和颗粒尺寸(图17)没有改变。还参见图20-22。数据表明，具有不同脂质/接头结构的ASO在所测试的缓冲条件、时间范围和温度、在GMP生产和临床试验中成功实施所必需的特性下是稳定的。
ExoASO的效力:图18示出了对于exoASO-STAT6对照，每个外泌体的效力与负载密度呈正相关。然而，在所测试的不同接头结构中，效力和负载密度之间没有明显的相关性。换言之，在接头结构中，更高的负载密度并不一定导致更高的效力。在所测试的接头中，有三个显示出较低的IC50值(即较高的效力)。这些接头是Chol-TEG、Chol-C6-C3和Toco-C8-TEG。
除了上面所公开的不可裂解的构建体外，还测试了使用可裂解的接头的其他构建体，例如Val-Cit可裂解的接头。图23A中示出了具有Val-Cit可裂解的接头机制的脂质-接头-ASO结构设计的示例，其中ASO是STAT6 ASO。图23B中示出了图23A中所描述的构建体的效力。
还测试了的可裂解的接头的另一个示例是氧化还原接头。图25示出了具有氧化还原可裂解的接头机制的示例性脂质-接头-ASO设计，其中ASO是STAT6ASO，并且在图26中示出了其效力。
示例5
EGFP剪接拯救实验
开发了EGFP剪接拯救实验来表征本文所公开的接头构建体。开发了293AAV-pCB-2754细胞系，以评估具有各种接头的EGFP和exoEGFP的功效。654处的点突变导致不能完全转录EGFP；因此，没有观察到来自EGFP或纳米萤光素酶的荧光。通过用ASO的治疗，EGFP得到拯救，因此，观察到EGFP和纳米萤光素酶信号。纳米荧光素酶的荧光用于功效的高通量定量。图28示出了EGFP剪接拯救实验的发展的示意图。图28中也示出了测试中所使用的EGFPASO的修饰序列。EGFP ASO的碱基序列是GCTATTACCTTAACCCAG(SEQ ID NO:1093)。图24中示出了在EGFP实验中用于测试的脂质-接头-ASO设计的示例，即ASO是图28中所示的经修饰的EGFP ASO的构建体。所测试的接头包括可裂解的接头和不可裂解的接头。图27中示出了在EGFP拯救实验中所使用的脂质-接头-EGFP构建体的负载、纯化和表征过程。
在EGFP剪接拯救实验中所使用的新开发的细胞系在三个剂量水平下的细胞活力(CTG测定)和功效方面进行了表征。参见图29。
图30示出了使用EGFP剪接拯救实验的具有各种PO和不可裂解PEG接头的exoASO-EGFP的负载密度和功效。“低”和“高”是对成对实验中实现的负载密度的相对定性参考，其中通过调节负载温度和ASO浓度来控制负载密度。
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应当了解，详细描述部分(不是发明内容和摘要部分)旨在用于解释权利要求。发明内容和摘要部分可以阐明如发明人所构想的本公开的一个或多个但非所有的示例性方面，并且因此，并不旨在以任何方式限制本公开和所附权利要求。
上面已经借助示出特定功能的实现及其关系的功能构建块来描述本公开。为了方便描述，这些功能构建块的边界在本文被任意限定。只要适当地执行特定功能及其关系，就可限定替代边界。
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Claims (174)

1.一种细胞外囊泡(EV)，其包括根据下式经由锚定部分(AM)与EV共价连接的生物活性分子(BAM)：
[AM]-L1-[SP1]-L2-[SP2]-L3-[BAM](式1)
其中：
[AM]是锚定部分；
L1是可裂解或不可裂解的键联；
L2和L3是可选的可裂解或不可裂解的键联；
SP1是可选的第一间隔子；以及
SP2是可选的第二间隔子。
2.根据权利要求1所述的细胞外囊泡，其中所述锚定部分[AM]包含固醇、脂质、维生素、肽、或其组合以及可选地间隔子。
3.根据权利要求2所述的细胞外囊泡，其中所述可选的间隔子是烷基间隔子。
4.根据权利要求3所述的细胞外囊泡，其中所述烷基间隔子是C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14或C15。
5.根据权利要求3所述的细胞外囊泡，其中所述烷基间隔子是C6或C8。
6.根据权利要求2所述的细胞外囊泡，其中所述可选的间隔子是甘醇间隔子。
7.根据权利要求5所述的细胞外囊泡，其中所述甘醇间隔子具有2(二甘醇)、3(三甘醇)、4(四甘醇；TEG)、5(五甘醇)、6(六甘醇；HEG)、7、8、9、10、11、12、13、14或15个甘醇单元。
8.根据权利要求5所述的细胞外囊泡，其中所述甘醇间隔子是四甘醇(TEG)。
9.根据权利要求2所述的细胞外囊泡，其中所述固醇选自由以下各项组成的组：胆固醇、麦角固醇、7-脱氢胆固醇、24S-羟基胆固醇、羊毛固醇、环阿屯醇、岩藻固醇、大褐马尾藻固醇、菜油固醇、β-谷固醇、谷甾烷醇、粪固醇、燕麦固醇和豆固醇。
10.根据权利要求2所述的细胞外囊泡，其中所述固醇是胆固醇。
11.根据权利要求2所述的细胞外囊泡，其中所述脂质是脂肪酸。
12.根据权利要求11所述的细胞外囊泡，其中所述脂肪酸是直链脂肪酸。
13.根据权利要求11所述的细胞外囊泡，其中所述脂肪酸是直链脂肪酸、支链脂肪酸、不饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸、羟基脂肪酸、多元羧酸、或其任何组合。
14.根据权利要求12所述的细胞外囊泡，其中所述直链脂肪酸是丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸或硬脂酸。
15.根据权利要求12所述的细胞外囊泡，其中所述直链脂肪酸是棕榈酸。
16.根据权利要求2所述的细胞外囊泡，其中所述维生素是维生素E(生育酚或生育三烯酚)、维生素D、维生素K、核黄素、烟酸或吡哆醇。
17.根据权利要求2所述的细胞外囊泡，其中所述维生素是维生素E(生育酚或生育三烯酚)。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的细胞外囊泡，其中L1是包含磷酸二酯键的可裂解的键联或包含硫代磷酸酯键的不可裂解的键联。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的细胞外囊泡，其中L2是可选的包含磷酸二酯键的可裂解的键联或包含硫代磷酸酯键的不可裂解的键联。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的细胞外囊泡，其中L3是可选的包含磷酸二酯键的可裂解的键联或包含硫代磷酸酯键的不可裂解的键联。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的细胞外囊泡，其中SP1可选的第一间隔子和/或SP2可选的第二间隔子独立地包括烷基间隔子、甘醇间隔子、或其组合。
22.根据权利要求21所述的细胞外囊泡，其中所述烷基间隔子是C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14或C15。
23.根据权利要求21所述的细胞外囊泡，其中所述烷基间隔子是C3或C6。
24.根据权利要求21所述的细胞外囊泡，其中所述甘醇间隔子具有2(二甘醇)、3(三甘醇)、4(四甘醇；TEG)、5(五甘醇)、6(六甘醇；HEG)、7、8、9、10、11、12、13、14或15个甘醇单元。
25.根据权利要求21所述的细胞外囊泡，其中所述甘醇间隔子是四甘醇(TEG)或六甘醇(HEG)。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的细胞外囊泡，其中每个不可裂解的间隔子独立地选自烷基、二甘醇、三甘醇、四甘醇(TEG)、六甘醇(HEG)、五甘醇、聚乙二醇(PEG)、甘油、二甘油、三甘油、四甘油(TG)、五甘油、六甘油(HG)、聚甘油(PG)、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、或其任何组合。
27.根据权利要求26所述的细胞外囊泡，其中所述聚乙二醇(PEG)的特征在于式R1-(O-CH2-CH2)n-或R1-(O-CH2-CH2)n-O-，其中R1是氢、甲基或乙基，并且n是1至15之间的整数。
28.根据权利要求26所述的细胞外囊泡，其中所述聚甘油(PG)的特征在于式((R1—O—(CH2—CHOH—CH2O)n—)，其中R1是氢、甲基或乙基，并且n是1至15之间的整数。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的细胞外囊泡，其中L1、L2或L3可裂解的键联或其任何组合包括氧化还原可裂解的接头、活性氧可裂解的接头、pH依赖性可裂解的接头、酶可裂解的接头、蛋白酶可裂解的接头、酯酶可裂解的接头、磷酸酶可裂解的接头、光活化的可裂解的接头、自分解性的接头、或其任何组合。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的细胞外囊泡，其中L1、L2或L3可裂解的键联或其任何组合包括自分解性的接头。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的细胞外囊泡，其中L1、L2或L3可裂解的键联或其任何组合包括肉桂基、萘基、联苯基、杂环、同源芳族、香豆素、呋喃、噻吩、噻唑、噁唑、异噁唑、吡咯、吡唑、吡啶、咪唑酮、三唑、或其任何组合。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的细胞外囊泡，其中L1、L2或L3可裂解的键联或其任何组合具有式：
-Aa-Yy-
其中每个–A-独立地是氨基酸单元或其组合，a独立地是1至15的整数；-Y-是间隔子单元，并且y是0、1或2。
33.根据权利要求32所述的细胞外囊泡，其中-Aa-是二肽、三肽、四肽、五肽或六肽、或其组合，其中组合中的每个二肽、三肽、四肽、五肽或六肽能够是相同的或不同的。
34.根据权利要求33所述的细胞外囊泡，其中a是2，并且–Aa-是选自由以下各项组成的组：缬氨酸-丙氨酸、缬氨酸-瓜氨酸、苯丙氨酸-赖氨酸、N-甲基缬氨酸-瓜氨酸、环己基丙氨酸-赖氨酸、谷氨酸-缬氨酸-瓜氨酸、和β-丙氨酸-赖氨酸。
35.根据权利要求33所述的细胞外囊泡，其中所述–Aa-是缬氨酸-丙氨酸、缬氨酸-瓜氨酸、或谷氨酸-缬氨酸-瓜氨酸。
36.根据权利要求31至35中任一项所述的细胞外囊泡，其中y是1。
37.根据权利要求31至36中任一项所述的细胞外囊泡，其中-Y-是自分解性的间隔子。
38.根据权利要求37所述的细胞外囊泡，其中–Yy-具有下式：
其中每个R2独立地是C1-8烷基、-O-(C1-8烷基)、卤素、硝基或氰基；并且m是0至4的整数。
39.根据权利要求38所述的细胞外囊泡，其中m是0、1或2。
40.根据权利要求38所述的细胞外囊泡，其中m是0。
41.根据权利要求31至40中任一项所述的细胞外囊泡，其中L1、L2或L3可裂解的键联或其任何组合包括缬氨酸-丙氨酸-氨基甲酸对氨基苄酯、或缬氨酸-瓜氨酸-氨基甲酸对氨基苄酯。
42.根据权利要求31至36中任一项所述的细胞外囊泡，其中-Y-是非自分解性的间隔子。
43.根据权利要求42所述的细胞外囊泡，其中所述非自分解性的间隔子是–Gly-或–Gly-Gly-。
44.根据权利要求1至43中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述锚定部分[AM]包含支架蛋白。
45.根据权利要求44所述的细胞外囊泡，其中所述锚定部分[AM]和/或支架部分是支架X。
46.根据权利要求45所述的细胞外囊泡，其中所述支架X选自由以下各项组成的组：前列腺素F2受体负调节因子(PTGFRN蛋白)；basigin(BSG蛋白)；免疫球蛋白超家族成员2(IGSF2蛋白)；免疫球蛋白超家族成员3(IGSF3蛋白)；免疫球蛋白超家族成员8(IGSF8蛋白)；整联蛋白β-1(ITGB1蛋白)；整联蛋白α-4(ITGA4蛋白)；4F2细胞表面抗原重链(SLC3A2蛋白)；ATP转运蛋白的类型(ATP1A1、ATP1A2、ATP1A3、ATP1A4、ATP1B3、ATP2B1、ATP2B2、ATP2B3和ATP2B4蛋白)；其功能性片段；及其任何组合。
47.根据权利要求45所述的细胞外囊泡，其中所述支架X是PTGFRN蛋白或其功能性片段。
48.根据权利要求45所述的细胞外囊泡，其中所述支架X包含如SEQ ID NO:302中列出的氨基酸序列。
49.根据权利要求45所述的细胞外囊泡，其中所述支架X包含与SEQ ID NO:302至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或约100％同一的氨基酸序列。
50.根据权利要求1至49中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述生物活性分子[BAM]经由锚定部分[AM]连接到EV的外表面。
51.根据权利要求1至50中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述生物活性分子是多肽、肽、多核苷酸(DNA和/或RNA)、化学化合物、或其任何组合。
52.根据权利要求51所述的细胞外囊泡，其中所述生物活性分子是化学化合物。
53.根据权利要求52所述的细胞外囊泡，其中所述化学化合物是小分子。
54.根据权利要求1至53中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述生物活性分子包含反义寡核苷酸(ASO)、siRNA、miRNA、shRNA、mRNA、核酸、或其任何组合。
55.根据权利要求1至54中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述生物活性分子包含肽、蛋白质、抗体或其抗原结合片段、或其任何组合。
56.根据权利要求55所述的细胞外囊泡，其中所述其抗原结合片段包含scFv、(scFv)2、Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab1)2、Fv、dAb和Fd片段、双功能抗体、抗体相关多肽、或其任何片段。
57.根据权利要求54所述的细胞外囊泡，其中所述生物活性分子包含ASO。
58.根据权利要求57所述的细胞外囊泡，其中所述ASO靶向转录物。
59.根据权利要求58所述的细胞外囊泡，其中所述转录物是STAT6转录物、CEBP/β转录物、STAT3转录物、KRAS转录物、NRAS转录物、NLPR3转录物、或其任何组合。
60.根据权利要求1至59中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述EV是外泌体。
61.根据权利要求60所述的细胞外囊泡，其中所述外泌体是天然外泌体。
62.根据权利要求60所述的细胞外囊泡，其中所述外泌体是过表达PTGFRN的外泌体或其功能性片段。
63.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至62中任一项所述的细胞外囊泡和药学上可接受的载剂。
64.一种试剂盒，其包含根据权利要求1至62中任一项所述的EV或根据权利要求63所述的药物组合物和使用说明书。
65.一种在有需要的受试者中治疗或预防疾病或病症的方法，其包括向受试者施用根据权利要求1至62中任一项所述的EV或根据权利要求63所述的药物组合物。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症、炎症性病症、神经退行性疾病、中枢神经疾病或代谢性疾病。
67.根据权利要求65或66所述的方法，其中所述EV通过静脉内、腹膜内、鼻内、经口、肌内、皮下、胃肠外或肿瘤内施用。
68.一种将生物活性分子(BAM)连接到EV的方法，其包括将锚定部分(AM)连接到EV，其中根据下式所述锚定部分(AM)连接到生物活性部分(BAM)：
[AM]-L1-[SP1]-L2-[SP2]-L3-[BAM]
其中：
[AM]是锚定部分；
L1是可裂解或不可裂解的键联；
L2和L3是可选的可裂解或不可裂解的键联；
SP1是可选的第一间隔子；以及
SP2是可选的第二间隔子。
69.根据权利要求68所述的方法，其中[AM]是胆固醇-C6、胆固醇-TEG、生育酚-C8、生育酚、或棕榈酸酯-C6。
70.根据权利要求68或69所述的方法，其中L1、L2或L3或其组合是磷酸二酯键。
71.根据权利要求68至70中任一项所述的方法，其中SP1是C3、C6、TEG或HEG。
72.根据权利要求68至71中任一项所述的方法，其中L1、L2或L3或其组合是硫代磷酸酯键。
73.根据权利要求68至72中任一项所述的方法，其中SP2是C3、C6、TEG或HEG。
74.根据权利要求68至73中任一项所述的方法，其中L1、L2或L3或其组合是硫代磷酸酯键。
75.根据权利要求68至74中任一项所述的方法，其中[BAM]是反义寡核苷酸(ASO)。
76.一种增加连接到EV的生物活性分子(BAM)的负载密度的方法，其包括筛选根据下式连接到生物活性部分(BAM)的大量的锚定部分(AM)：
[AM]-L1-[SP1]-L2-[SP2]-L3-[BAM]
其中：
[AM]是锚定部分；
L1是可裂解或不可裂解的键联；
L2和L3是可选的可裂解或不可裂解的键联；
SP1是可选的第一间隔子；以及
SP2是可选的第二间隔子。
77.根据权利要求76所述的方法，其中[AM]是胆固醇-C6、胆固醇-TEG、生育酚-C8、生育酚、或棕榈酸酯-C6。
78.根据权利要求76或77所述的方法，其中L1、L2或L3或其组合是磷酸二酯键。
79.根据权利要求76至78中任一项所述的方法，其中SP1是C3、C6、TEG或HEG。
80.根据权利要求76至79中任一项所述的方法，其中L1、L2或L3或其组合是硫代磷酸酯键。
81.根据权利要求76至80中任一项所述的方法，其中SP2是C3、C6、TEG或HEG。
82.根据权利要求76至81中任一项所述的方法，其中L1、L2或L3或其组合是硫代磷酸酯键。
83.根据权利要求76至82中任一项所述的方法，其中[BAM]是反义寡核苷酸(ASO)。
84.根据权利要求76至83中任一项所述的方法，其中连接到EV的生物活性分子(BAM)的负载密度增加至少约1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少8倍、至少约9倍、或至少约10倍。
85.一种细胞外囊泡(EV)，其包括根据下式经由锚定部分[AM]与EV共价连接的反义寡核苷酸[ASO]：
[AM]-L1-[SP1]-L2-[SP2]-L3-[ASO]
其中：
[AM]是选自由胆固醇-C6、胆固醇-TEG、生育酚-C8、生育酚和棕榈酸酯-C6组成的组的锚定部分；
L1是磷酸二酯酶可裂解的键联；
SP1是选自由C3、C6、TEG和HEG组成的组的可选的第一间隔子；
L2是可选的硫代磷酸酯不可裂解的键联；
SP2是选自由C3、C6、TEG和HEG组成的组的可选的第二间隔子；以及
L3是可选的硫代磷酸酯不可裂解的键联。
86.根据权利要求84所述的EV，其中所述EV是外泌体。
87.根据权利要求85所述的EV，其中所述外泌体是天然外泌体。
88.根据权利要求86所述的EV，其中连接到外泌体的ASO的负载密度增加了至少约1.5倍。
89.根据权利要求86所述的EV，其中所述锚定部分[AM]是胆固醇-C6。
90.根据权利要求88所述的EV，其中每个外泌体的ASO分子的平均数量为5032+/-386。
91.根据权利要求88所述的EV，其中每个外泌体的ASO分子的平均数量在约4500至约5500之间。
92.根据权利要求88所述的EV，其中每个外泌体的ASO分子的平均数量在约4500至约4600之间、约4600至约4700之间、约4700至约4800之间、约4800至约4900之间、约4900至约5000之间、约5000至约5100之间、约5100至约5200之间、约5200至约5300之间、约5300至约5400之间、或约5400至约5500之间。
93.根据权利要求88所述的EV，其中每个外泌体的ASO分子的平均数量为至少约4500、至少约4600、至少约4700、至少约4800、至少约4900、至少约5000、至少约5100、至少约5200、至少约5300、至少约5400、或至少约5500。
94.根据权利要求88所述的EV，其中所述负载效率为73％至93％。
95.根据权利要求88所述的EV，其中所述负载效率在约70％至约95％之间。
96.根据权利要求88所述的EV，其中所述负载效率在约70％至约75％之间、约75％至约80％之间、约80％至约85％之间、约85％至约90％之间、或约90％至约95％之间。
97.根据权利要求88所述的EV，其中所述负载效率为至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、或至少约95％。
98.根据权利要求86所述的EV，其中所述锚定部分[AM]是胆固醇-C6。
99.根据权利要求93所述的EV，其中每个外泌体的ASO分子的平均数量为3991+/-490。
100.根据权利要求97所述的EV，其中每个外泌体的ASO分子的平均数量在约3500至约4500之间。
101.根据权利要求97所述的EV，其中每个外泌体的ASO分子的平均数量在约3500至约3600之间、约3600至约3700之间、约3700至约3800之间、约3800至约3900之间、约3900至约4000之间、约4000至约4100之间、约4100至约4200之间、约4200至约4300之间、约4300至约4400之间、或约4400至约4500之间。
102.根据权利要求97所述的EV，其中每个外泌体的ASO分子的平均数量为至少约3500、至少约3600、至少约3700、至少约3800、至少约3900、至少约4000、至少约4100、至少约4200、至少约4300、至少约4400、或至少约4500。
103.根据权利要求97所述的EV，其中所述负载效率为56％至79％。
104.根据权利要求97所述的EV，其中所述负载效率在约50％至约85％之间。
105.根据权利要求97所述的EV，其中所述负载效率在约50％至约55％之间、约55％至约60％之间、约60％至约65％之间、约65％至约70％之间、约70％至约75％之间、约75％至约80％之间、或约80％至约85％之间。
106.根据权利要求97所述的EV，其中所述负载效率为至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、或至少约85％。
107.根据权利要求86所述的EV，其中所述锚定部分[AM]是生育酚-C8、生育酚或棕榈酸酯-C6。
108.根据权利要求106所述的EV，其中每个外泌体的ASO分子的平均数量为4241+/-722。
109.根据权利要求106所述的EV，其中每个外泌体的ASO分子的平均数量在约3500至约5000之间。
110.根据权利要求106所述的EV，其中每个外泌体的ASO分子的平均数量在约3500至约3600之间、约3600至约3700之间、约3700至约3800之间、约3800至约3900之间、约3900至约4000之间、约4000至约4100之间、约4100至约4200之间、约4200至约4300之间、约4300至约4400之间、约4400至约4500之间、约4500至约4600之间、约4600至约4700之间、约4700至约4800之间、约4800至约4900之间、或约4900至约5000之间。
111.根据权利要求106所述的EV，其中每个外泌体的ASO分子的平均数量为至少约3500、至少约3600、至少约3700、至少约3800、至少约3900、至少约4000、至少约4100、至少约4200、至少约4300、至少约4400、至少约4500、至少约4600、至少约4700、至少约4800、至少约4900、或至少约5000。
112.根据权利要求106所述的EV，其中所述负载效率为57％至73％。
113.根据权利要求106所述的EV，其中所述负载效率在约50％至约80％之间。
114.根据权利要求106所述的EV，其中所述负载效率在约50％至约55％之间、约55％至约60％之间、约60％至约65％之间、约65％至约70％之间、约70％至约75％之间、或约75％至约80％之间。
115.根据权利要求106所述的EV，其中所述负载效率为至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、或至少约80％。
116.根据权利要求84所述的EV，其中所述外泌体是过表达PTGFRN的外泌体。
117.根据权利要求115所述的EV，其中连接到外泌体的ASO的负载密度增加了至少约2倍。
118.根据权利要求115所述的EV，其中所述锚定部分[AM]是胆固醇-C6。
119.根据权利要求117所述的EV，其中每个外泌体的ASO分子的平均数量为2442+/-339。
120.根据权利要求117所述的EV，其中每个外泌体的ASO分子的平均数量在约2000至约3000之间。
121.根据权利要求117所述的EV，其中每个外泌体的ASO分子的平均数量在约2000至约2100之间、约2100至约2200之间、约2200至约2300之间、约2300至约2400之间、约2400至约2500之间、约2500至约2600之间、约2600至约2700之间、约2700至约2800之间、约2800至约2900之间、或约2900至约3000之间。
122.根据权利要求117所述的EV，其中每个外泌体的ASO分子的平均数量为至少约2000、至少约2100、至少约2200、至少约2300、至少约2400、至少约2500、至少约2600、至少约2700、至少约2800、至少约2900、或至少约3000。
123.根据权利要求117所述的EV，其中所述负载效率为27％至46％。
124.根据权利要求117所述的EV，其中所述负载效率在约25％至约50％之间。
125.根据权利要求117所述的EV，其中所述负载效率在约25％至约30％之间、约30％至约35％之间、约35％至约40％之间、约40％至约45％之间、或约45％至约50％之间。
126.根据权利要求117所述的EV，其中所述负载效率为至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、或至少约50％。
127.根据权利要求115所述的EV，其中所述锚定部分[AM]是胆固醇-TEG。
128.根据权利要求126所述的EV，其中每个外泌体的ASO分子的平均数量为1728+/-264。
129.根据权利要求126所述的EV，其中每个外泌体的ASO分子的平均数量在约1400至约2100之间。
130.根据权利要求126所述的EV，其中每个外泌体的ASO分子的平均数量在约1400至约1500之间、约1500至约1600之间、约1600至约1700之间、约1700至约1800之间、约1800至约1900之间、约1900至约2000之间、或约2000至约2100之间。
131.根据权利要求126所述的EV，其中每个外泌体的ASO分子的平均数量为至少约1400、至少约1500、至少约1600、至少约1700、至少约1800、至少约1900、至少约2000、或至少约2100。
132.根据权利要求126所述的EV，其中所述负载效率为19％至33％。
133.根据权利要求126所述的EV，其中所述负载效率在约15％至约35％之间。
134.根据权利要求126所述的EV，其中所述负载效率在约15％至约20％之间、约20％至约25％之间、约25％至约30％之间、或约30％至约35％之间。
135.根据权利要求126所述的EV，其中所述负载效率为至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、或至少约35％。
136.根据权利要求115所述的EV，其中所述锚定部分[AM]是生育酚-C8、生育酚或棕榈酸酯-C6。
137.根据权利要求135所述的EV，其中每个外泌体的ASO分子的平均数量为2979+/-1006。
138.根据权利要求135所述的EV，其中每个外泌体的ASO分子的平均数量在约1900至约4000之间。
139.根据权利要求135所述的EV，其中每个外泌体的ASO分子的平均数量在约1900至约2000之间、约2000至约2100之间、约2100至约2200之间、约2200至约2300之间、约2300至约2400之间、约2400至约2500之间、约2500至约2600之间、约2600至约2700之间、约2700至约2800之间、约2800至约2900之间、约2900至约3000之间、约3000至约3100之间、约3100至约3200之间、约3200至约3300之间、约3300至约3400之间、约3400至约3500之间、约3500至约3600之间、约3600至约3700之间、约3700至约3800之间、约3800至约3900之间、或约3900至约4000之间。
140.根据权利要求135所述的EV，其中每个外泌体的ASO分子的平均数量为至少约1900、至少约2000、至少约2100、至少约2200、至少约2300、至少约2400、至少约2500、至少约2600、至少约2700、至少约2800、至少约2900、至少约3000、至少约3100、至少约3200、至少约3300、至少约3400、至少约3500、至少约3600、至少约3700、至少约3800、至少约3900、或至少约4000。
141.根据权利要求135所述的EV，其中所述负载效率为37％至68％。
142.根据权利要求135所述的EV，其中所述负载效率在约30％至约75％之间。
143.根据权利要求135所述的EV，其中所述负载效率在约30％至约35％之间、约35％至约40％之间、约40％至约45％之间、约45％至约50％之间、约50％至约55％之间、约55％至约60％之间、约60％至约65％之间、约65％至约70％之间、或约70％至约75％之间。
144.根据权利要求135所述的EV，其中所述负载效率为至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、或至少约75％。
145.一种外泌体，其包括根据下式经由锚定部分[AM]与外泌体共价连接的反义寡核苷酸[ASO]：
[AM]-L1-[SP1]-L2-[SP2]-L3-[BAM]
其中[AM]是胆固醇-TEG；L1是磷酸二酯酶可裂解的键；SP1是C3；L2是硫代磷酸酯不可裂解的键；SP2是TEG；以及，L3是硫代磷酸酯不可裂解的键。
146.根据权利要求144所述的外泌体，其中所述外泌体是天然外泌体。
147.根据权利要求145所述的外泌体，其中每个外泌体的ASO分子的平均数量为约4780。
148.根据权利要求145所述的外泌体，其中每个外泌体的ASO分子的平均数量在约4500至约5000之间。
149.根据权利要求145所述的外泌体，其中每个外泌体的ASO分子的平均数量为约4500。
150.根据权利要求145所述的外泌体，其中所述负载效率为约80％。
151.根据权利要求145所述的外泌体，其中所述负载效率在约70％至约90％之间。
152.根据权利要求145所述的外泌体，其中所述负载效率为至少约70％。
153.根据权利要求144所述的外泌体，其中所述外泌体是过表达PTGFRN的外泌体。
154.根据权利要求152所述的外泌体，其中每个外泌体的ASO分子的平均数量为约1659。
155.根据权利要求152所述的外泌体，其中每个外泌体的ASO分子的平均数量在约1500至约2000之间。
156.根据权利要求152所述的外泌体，其中每个外泌体的ASO分子的平均数量为至少约1500。
157.根据权利要求152所述的外泌体，其中所述负载效率为约28％。
158.根据权利要求152所述的外泌体，其中所述负载效率在约20％至约35％之间。
159.根据权利要求152所述的外泌体，其中所述负载效率为至少约20％。
160.一种外泌体，其包括根据下式经由锚定部分[AM]与外泌体共价连接的反义寡核苷酸[ASO]：
[AM]-L1-[SP1]-L2-[BAM]
其中[AM]是胆固醇-TEG；L1是磷酸二酯酶可裂解的键；SP1是TEG；以及L2是硫代磷酸酯不可裂解的键。
161.根据权利要求159所述的外泌体，其中所述外泌体是天然外泌体。
162.根据权利要求160所述的外泌体，其中每个外泌体的ASO分子的平均数量为约4090。
163.根据权利要求160所述的外泌体，其中每个外泌体的ASO分子的平均数量在约3500至约4500之间。
164.根据权利要求160所述的外泌体，其中每个外泌体的ASO分子的平均数量为至少3500。
165.根据权利要求160所述的外泌体，其中所述负载效率为约68％。
166.根据权利要求160所述的外泌体，其中所述负载效率为至少约60％。
167.根据权利要求160所述的外泌体，其中所述负载效率在约60％至约70％之间。
168.根据权利要求159所述的外泌体，其中所述外泌体是过表达PTGFRN的外泌体。
169.根据权利要求167所述的外泌体，其中每个外泌体的ASO分子的平均数量为约1890。
170.根据权利要求167所述的外泌体，其中每个外泌体的ASO分子的平均数量在约1400至约2400之间。
171.根据权利要求167所述的外泌体，其中每个外泌体的ASO分子的平均数量为至少约1400。
172.根据权利要求167所述的外泌体，其中所述负载效率为约31％。
173.根据权利要求167所述的外泌体，其中所述负载效率在约20％至约40％之间。
174.根据权利要求167所述的外泌体，其中所述负载效率为至少约20％。
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