KR20210141554A - 세포외 소포 접합체 및 이의 용도 - Google Patents

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KR20210141554A
KR20210141554A KR1020217033075A KR20217033075A KR20210141554A KR 20210141554 A KR20210141554 A KR 20210141554A KR 1020217033075 A KR1020217033075 A KR 1020217033075A KR 20217033075 A KR20217033075 A KR 20217033075A KR 20210141554 A KR20210141554 A KR 20210141554A
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KR
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extracellular vesicle
linker
moiety
protein
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KR1020217033075A
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루셀 이. 맥코넬
스리람 사티야나라야난
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코디악 바이오사이언시즈, 인크.
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Abstract

본 발명은 말레이미드 모이어티를 통해 세포외 소포 (예를 들어, 엑소좀)에 공유적으로 연결된 생물학적 활성 분자를 포함하는 세포외 소포에 관한 것으로, 이는 암 및 기타 질환의 예방 또는 치료를 위한 제제로서 유용할 수 있다. 또한 세포외 소포를 생산하는 방법 및 세포외 소포를 사용하여 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 제공된다.

Description

세포외 소포 접합체 및 이의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 PCT 출원은 2019년 3월 21일 출원된 미국 가특허출원 제 62/822,014; 및 2019년 4월 17일 출원된 제 62/835,439의 우선권 이익을 주장하며; 이들 문헌 각각은 본원에 그 전문이 참고로 포함된다.
EFS-Web을 통하여 전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 설명
본 출원에서 제출된 전자적으로 제출된 서열 목록 (파일명: 4000_037PC03_SL_ST25.txt, 크기: 235,506 바이트; 및 생성일자: 2020년 3월 20일)의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
기술 분야
본 발명은 말레이미드 모이어티를 통해 세포외 소포, 예를 들어 엑소좀에 공유적으로 연결된 적어도 하나의 생물학적 활성 분자를 포함하는 세포외 소포(EV), 예를 들어 엑소좀을 제공하며, 이는 암 및 기타 질환의 예방 또는 치료를 위한 제제로서 유용할 수 있다.
배경
많은 생물활성 화합물은 치료적 관심의 대상이 되는 강력한 생물학적 활성을 가지고 있다. 그러나 이러한 화합물은 종종 비표적 기관에서 독성을 나타낸다. 비표적 조직의 노출을 제한하는 한 가지 방법은 치료 화합물을 특정 세포 유형으로 안내할 수 있는 항체와 같은 친화성 기반 시약에 소분자를 화학적으로 접합하는 것이지만 (Dosio, F. et al., Toxins (Basel) 3(7):848-883 (2011)), 이 접근법은 항체에 부착될 수 있는 관심 화합물의 분자 수 (일반적으로 항체당 2-6개 분자) 및 비표적 세포에 결합하지 않고 표적화된 관련 질환/이펙터 세포에 특이적으로 결합하는 항체의 가용성/존재에 의해 제한된다. 이 두 가지 문제는 각각 효능을 감소시키고 전신 독성을 증가시켜 항체-약물 접합체(ADC)의 사용을 제한한다. 따라서, 특정 조직 또는 기관을 선택적으로 표적화하는 동시에 치료 화합물에 대한 전체 전신 노출을 제한할 수 있는 ADC보다 더 높은 페이로드를 갖는 전달 시스템이 필요하다.
엑소좀과 같은 EV는 세포간 통신의 중요한 매개체이다. 그들은 또한 암과 같은 많은 질환의 진단과 예후에서 중요한 바이오마커이다. 엑소좀과 같은 EV는 약물 전달 수단으로서 많은 치료 영역에서 새로운 치료 방식으로서 기존 약물 전달 방법 (예를 들어, 펩티드 면역화, DNA 백신)에 비해 많은 이점을 제공한다. 그러나 이러한 장점에도 불구하고 엑소좀과 같은 많은 EV는 임상적 효능이 제한적이었다. 예를 들어, 수지상 세포 유래 엑소좀(DEX)은 수술이 불가능한 비소세포폐암(NSCLC) 환자의 1차 화학요법 후 유지 면역요법으로서 2상 임상 시험에서 조사되었다. 그러나 1차 평가변수(화학요법 중단 후 4개월에 무진행 생존(PFS) 환자의 최소 50%)에 도달하지 못하여 시험이 종료되었다. Besse, B., et al., Oncoimmunology 5(4):e1071008 (2015).
따라서, EV 기반 기술의 치료적 사용 및 기타 응용을 더 잘 가능하게 하려면 엑소좀과 같은 새롭고 더 효과적인 조작된 EV가 필요하다.
간단한 요약
본 발명은 말레이미드 모이어티를 통해 EV, 예를 들어 엑소좀에 공유적으로 연결된 생물학적 활성 분자를 포함하는 세포외 소포, 예를 들어 엑소좀을 제공한다. 일부 양상들에서, 말레이미드 모이어티는 화학식 (I)를 가지며:
Figure pct00001
(I),
이때
R1은 -C1-10 알킬렌-, -C3-8 카보사이클로-, -O-(C1-8 알킬렌)-, -아릴렌-, -C1-10 알킬렌-아릴렌-, -아릴렌-C1-10 알킬렌-, -C1-10 알킬렌-(C3-8 카보사이클로)-, -(C3-8 카보사이클로)-C1-10 알킬렌-, -C3-8 헤테로사이클로-, -C1-10 알킬렌-(C3-8 헤테로사이클로)-, -(C3-8 헤테로사이클로)-C1-10 알킬렌-, -(CH2CH2O)r-, 및 -(CH2CH2O)r-CH2-로 구성된 그룹에서 선택되고;
r은 1 내지 10의 정수이며;
*은 EV, 예를 들어, 엑소좀에 대한 말레이미드 모이어티의 공유 부착 부위를 나타내고; 및,
물결선은 생물학적 활성 분자에 대한 말레이미드 모이어티의 부착 부위를 나타낸다.
일부 양상들에서, R1은 -(CH2)s-이고, 이때 s는 4, 5, 또는 6이다. 일부 양상들에서, 말레이미드 모이어티는 화학식 (II)를 가지며, 이때 R1은 -(CH2)5-이다:
Figure pct00002
(II).
일부 양상들에서, 말레이미드 모이어티는 화학식 (III)을 가지며, 이때 R1은 -(CH2CH2O)r-CH2-이고, 이때 r은 2이다:
Figure pct00003
(III).
일부 양상들에서, 말레이미드 모이어티는 EV, 예를 들어, 엑소좀에 존재하는 작용기에 공유적으로 연결되며, 이때 작용기는 설프하이드릴 그룹이다. 일부 양상들에서, 설프하이드릴 그룹은 EV, 예를 들어, 엑소좀 표면의 단백질에 존재한다. 일부 양상들에서, 말레이미드 모이어티는 링커에 의해 생물학적 활성 분자에 연결된다. 일부 양상들에서, 링커는 절단가능한 링커를 포함한다. 일부 양상들에서, 절단가능한 링커는 프로테아제에 의해 절단된다. 일부 양상들에서, 프로테아제는 카텝신이다. 일부 양상들에서, 링커는 환원-민감성 링커 또는 산 불안정 링커이다.
일부 양상들에서, 링커는 화학식 (IV)를 가지며:
-Aa-Yy- (IV),
이때 각각의 -A-는 독립적으로 아미노산 단위이고, a는 독립적으로 1 내지 12의 정수이고; -Y-는 스페이서 단위이고 y는 0, 1 또는 2이다.
일부 양상들에서, -Aa-는 다이펩티드, 트라이펩티드, 테트라펩티드, 펜타펩티드, 또는 헥사펩티드이다. 일부 양상들에서, a는 2이고 -Aa-는 발린-알라닌, 발린-시트룰린, 페닐알라닌-라이신, N-메틸발린-시트룰린, 사이클로헥실알라닌-라이신, 및 베타-알라닌-라이신으로 구성된 그룹에서 선택된다. 일부 양상들에서, -Aa-는 발린-알라닌, 발린-시트룰린이다. 일부 양상들에서, y는 1이다.
일부 양상들에서, -Y-는 자기 희생 스페이서이다. 일부 양상들에서, -Yy-는 화학식 (V)를 가지며:
Figure pct00004
(V),
이때 각각의 R2는 독립적으로 C1-8 알킬, -O-(C1-8 알킬), 할로겐, 니트로, 또는 시아노이고; 그리고 m은 0 내지 4의 정수이다.
일부 양상들에서, m은 0, 1, 또는 2이다. 일부 양상들에서, m은 0이다. 일부 양상들에서, 절단가능한 링커는 발린-알라닌-p-아미노벤질카바메이트 또는 발린-시트룰린-p-아미노벤질카바메이트이다. 일부 양상들에서, -Y-는 비 자기 희생 스페이서이다. 일부 양상들에서, 비 자기 희생 스페이서는 -Gly- 또는 -Gly-Gly-이다.
일부 양상들에서, 링커는 산 불안정 링커이다. 일부 양상들에서, 산 불안정 링커는 시스-아코니틱 링커, 하이드라지드 링커, 티오카바모일 링커, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양상들에서, 산 불안정 링커는 생물학적 활성 분자를 산 불안정 링커에 연결하기 위한 스페이서 단위를 포함한다.
일부 양상들에서, 스페이서 단위는 화학식 (V)를 가지며:
Figure pct00005
(V),
이때 각각의 R2는 독립적으로 C1-8 알킬, -O-(C1-8 알킬), 할로겐, 니트로, 또는 시아노이고; 그리고 m은 0 내지 4의 정수이다.
일부 양상들에서, 링커는 절단불가능한 링커이다. 일부 양상들에서, 절단 불가능한 링커는 테트라에틸렌 글라이콜(TEG), 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 숙신이미드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양상들에서, 절단불가능한 링커는 생물학적 활성 분자를 절단불가능한 링커에 연결시키는 스페이서 단위를 포함한다. 일부 양상들에서, 스페이서 단위는 화학식 (V)를 가지며:
Figure pct00006
(V),
이때 각각의 R2는 독립적으로 C1-8 알킬, -O-(C1-8 알킬), 할로겐, 니트로, 또는 시아노이고; 그리고 m은 0 내지 4의 정수이다.
본 발명은 또한 생물학적 활성 분자 및 절단가능한 링커를 포함하는 EV, 예를 들어 엑소좀을 제공하며, 여기서 절단가능한 링커는 EV, 예를 들어 엑소좀을 생물학적 활성 분자에 연결하고, 절단가능한 링커는 발린-알라닌-p-아미노벤질카바메이트 또는 발린-시트룰린-p-아미노벤질카바메이트를 포함한다. 일부 양상들에서, EV, 예를 들어 엑소좀은 EV, 예를 들어 엑소좀에 존재하는 작용기를 통해 EV, 예를 들어 엑소좀을 절단가능한 링커에 연결하는 말레이미드 모이어티를 추가로 포함한다.
일부 양상들에서, 말레이미드 모이어티는 화학식 (I)를 가지며:
Figure pct00007
(I),
이때
R1은 -C1-10 알킬렌-, -C3-8 카보사이클로-, -O-(C1-8 알킬렌)-, -아릴렌-, -C1-10 알킬렌-아릴렌-, -아릴렌-C1-10 알킬렌-, -C1-10 알킬렌-(C3-8 카보사이클로)-, -(C3-8 카보사이클로)-C1-10 알킬렌-, -C3-8 헤테로사이클로-, -C1-10 알킬렌-(C3-8 헤테로사이클로)-, -(C3-8 헤테로사이클로)-C1-10 알킬렌-, -(CH2CH2O)r-, 및 -(CH2CH2O)r-CH2-로 구성된 그룹에서 선택되고;
r은 1 내지 10의 정수이며; 그리고
*은 EV, 예를 들어, 엑소좀에 대한 말레이미드 모이어티의 공유 부착 부위를 나타내고; 및,
물결선은 생물학적 활성 분자에 대한 말레이미드 모이어티의 부착 부위를 나타낸다.
일부 양상들에서, R1은 -(CH2)s-이고, 이때 s는 4, 5, 또는 6이다. 일부 양상들에서, 말레이미드 모이어티는 화학식 (II)를 가지며, 이때 R1은 -(CH2)5-이다:
Figure pct00008
(II).
일부 양상들에서, 말레이미드 모이어티는 화학식 (III)을 가지며, 이때 R1은 -(CH2CH2O)r-CH2-이고, 이때 r은 2이다:
Figure pct00009
(III).
일부 양상들에서, 말레이미드 모이어티는 EV, 예를 들어, 엑소좀에 존재하는 작용기에 공유적으로 연결된다. 일부 양상들에서, 작용기는 EV, 예를 들어, 엑소좀 상의 글리칸에 존재한다. 일부 양상들에서, 작용기는 설프하이드릴(티올)이다. 일부 양상들에서, 작용기는 EV, 예를 들어, 엑소좀 표면의 단백질에 존재한다. 일부 양상들에서, 단백질은 스캐폴드 모이어티이다. 일부 양상들에서, 단백질은 PTGFRN 폴리펩티드, BSG 폴리펩티드, IGSF2 폴리펩티드, IGSF3 폴리펩티드, IGSF8 폴리펩티드, ITGB1 폴리펩티드, ITGA4 폴리펩티드, SLC3A2 폴리펩티드, ATP 수송체 폴리펩티드, 또는 이들의 단편이다.
본 발명은 또한 말레이미드 모이어티, 절단가능한 링커, 및 생물학적 활성 분자를 포함하는 EV, 예를 들어 엑소좀을 제공하며, 여기서 말레이미드 모이어티는 EV, 예를 들어 엑소좀을 절단가능한 링커에 연결하고, 절단가능한 링커는 말레이미드 모이어티를 생물학적 활성 분자에 연결한다.
일부 양상들에서, 생물학적 활성 분자는 폴리펩티드, 펩티드, 폴리뉴클레오티드(DNA 및/또는 RNA), 화학적 화합물, 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 양상들에서, 생물학적 활성 분자는 화학적 화합물이다. 일부 양상들에서, 화학적 화합물은 소분자이다. 일부 양상들에서, 소분자는 단백질분해-표적 키메라(PROTAC)이다.
일부 양상들에서, 생물학적 활성 분자는 뉴클레오티드이고, 여기서 뉴클레오티드는 인터페론 유전자 단백질(STING) 효현제의 자극제이다. 일부 양상들에서, STING 효현제는 사이클릭 다이뉴클레오티드 STING 효현제 또는 비-사이클릭 다이뉴클레오티드 STING 효현제를 포함한다.
일부 양상들에서, EV는 화학식 (VI) 또는 (VII), 또는 이의 약학적 염을 가지는 (말레이미드 모이어티)-(절단가능한 링커)-(생물학적 활성 분자)를 포함한다:
Figure pct00010
(VI),
Figure pct00011
(VII).
일부 양상들에서, EV는 화학식 (VIII), (IX), (X), 또는 (XI), 또는 이의 약학적 염을 가지는 (말레이미드 모이어티)-(절단가능한 링커)-(생물학적 활성 분자)를 포함한다:
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
.
일부 양상들에서, EV, 예를 들어, 엑소좀은 표면의 작용기를 노출시켜 말레이미드 모이어티를 공유적으로 연결하도록 변형된다. 일부 양상들에서, 작용기는 설프하이드릴 그룹이다. 일부 양상들에서, 작용기는 EV, 예를 들어, 엑소좀을 환원제로 처리함으로써 노출된다. 일부 양상들에서, 환원제는 TCEP(트리스(2-카르복시에틸)포스핀), DTT(다이티오트레이톨), BME(2-메르캅토에탄올), 티올화제, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양상들에서, 티올화제는 트라우트 시약(2-이미노티올란)을 포함한다.
양상에서, 본 발명의 EV는 엑소좀을 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 EV, 예를 들어, 엑소좀 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 말레이미드 모이어티를 EV, 예를 들어, 엑소좀에 연결시키는 단계를 포함하는, 생물학적 활성 분자를 EV, 예를 들어, 엑소좀에 접합시키는 방법을 제공한다. 일부 양상들에서, 이러한 연결 단계는 EV, 예를 들어, 엑소좀을 환원제로 처리하는 단계를 포함한다. 일부 양상들에서, 환원제는 TCEP(트리스(2-카르복시에틸)포스핀), DTT(다이티오트레이톨), BME(2-메르캅토에탄올), 티올화제, 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 양상들에서, 티올화제는 트라우트 시약(2-이미노티올란)을 포함한다. 일부 양상들에서, 연결은 환원된 EV, 예를 들어 엑소좀을 말레이미드 모이어티와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양상들에서, 말레이미드 모이어티는 EV, 예를 들어, 엑소좀에 대한 연결 전에 생물학적 활성 분자에 화학적으로 연결된다. 일부 양상들에서, 말레이미드 모이어티는 링커에 화학적으로 연결되고, 이러한 말레이미드 모이어티가 생물학적 활성 분자에 연결된다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 EV, 예를 들어 엑소좀 및 사용 설명서를 포함하는 키트를 제공한다. 또한 생물학적 활성 분자를 EV, 예를 들어 엑소좀에 접합시키기 위한 시약, 및 접합을 수행하여 본 발명의 EV, 예를 들어 엑소좀을 만들기 위한 설명서를 포함하는 키트가 제공된다.
본 발명은 또한 본 발명의 EV, 예를 들어, 엑소좀을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 일부 양상들에서, 질환 또는 장애는 암, 염증성 장애, 신경퇴행성 장애, 중추신경계 질환, 또는 대사 질환이다. 일부 양상들에서, EV, 예를 들어 엑소좀은 정맥내, 복강내, 비강, 경구, 근육내, 피하, 비경구, 척추강내, 안내 또는 종양내 투여된다.
일부 양상들에서, 본 발명은 말레이미드 모이어티를 통해 스캐폴드 모이어티에 공유적으로 연결된 적어도 하나의 생물학적 활성 분자를 포함하는 세포외 소포 (EV)를 제공한다. 일부 양상들에서, 말레이미드 모이어티는 이작용기 분자이다. 일부 양상들에서, 말레이미드 모이어티는 적어도 하나의 링커 또는 스페이서를 포함한다. 일부 양상들에서, 링커는 절단가능한 링커이다. 일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티는 스캐폴드 단백질 또는 스캐폴드 지질이다. 일부 양상들에서, 스캐폴드 단백질은 스캐폴드 X 단백질이다. 일부 양상들에서, 스캐폴드 X 단백질은 PTGFRN 폴리펩티드, BSG 폴리펩티드, IGSF2 폴리펩티드, IGSF3 폴리펩티드, IGSF8 폴리펩티드, ITGB1 폴리펩티드, ITGA4 폴리펩티드, SLC3A2 폴리펩티드, ATP 수송체 폴리펩티드, 또는 이들의 단편이다. 일부 양상들에서, 생물학적 활성 분자는 백신 항원, 백신 애쥬번트, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양상들에서, 생물학적 활성 분자는 STING, ASO, 합성 항종양제 (예를 들어, MMAE), 사이토카인 방출 억제제 (예를 들어, MCC950), mTOR 억제제 (예를 들어, 라파마이신), 오토탁신 억제제 (예를 들어, PAT409), LPA1 길항제 (예를 들어, AM152), 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양상들에서, 세포외 소포는 표적화 모이어티, 트로피즘 (tropism) 모이어티, 항-식세포 신호, 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함한다. 일부 양상들에서, 표적화 모이어티, 트로피즘 모이어티, 항-식세포 신호, 또는 이들의 조합은 말레이미드 모이어티를 통해 세포외 소포에 연결된다.
도면의 간단한 설명
도 1A는 말레이미드 화학이 생물학적 활성 분자(BAM)를 EV (예를 들어, 엑소좀)에 화학적으로 연결하기 위해 사용될 수 있는 방법, 예를 들어, 본원에 기재된 스캐폴드 모이어티 (예를 들어, 스캐폴드 X 단백질 또는 이의 단편 또는 지질)에 의한 방법을 보여주는 도식적 표현이다. 도면에 도시된 링커는 선택적이며 존재하는 경우 링커(예를 들어, 절단가능한 링커) 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
도 1B는 EV들에 연결될 수 있는 STING 효현제 화합물들의 예를 보여준다: CP227 (말레이미드 모이어티에 연결된 Val-Ala), CP229 (말레이미드 모이어티에 연결된 Val-Cit), CP238 (콜레스테롤에 연결된 Val-Ala), CP246 (숙신이미드에 연결된 Val-Ala), CP240 (링커 없음), CP249 (말레이미드 모이어티에 연결된 Val-Ala), CP250 (말레이미드 모이어티에 연결된 Val-Ala), CP260 (말레이미드 모이어티에 연결된 Val-Cit), 및 CP261 (말레이미드 모이어티에 연결된 Val-Cit).
도 2는 설프하이드릴- 또는 아민-반응성 화합물의 STING 효능작용(IFN-β을 평가하는 PBMC 분석 결과를 보여준다. 유리 STING 효현제 화합물(닫힌 원) 및 엑소좀에 로딩된 STING 효현제 화합물(열린 원)의 활성을 테스트하였다. Exo CP227은 말레이미드 모이어티에 연결된 Val-Ala를 통해 EV에 접합된 CP227이고; Exo-CP229는 말레이미드 모이어티에 연결된 Val-Cit을 통해 EV에 접합된 CP229이고; Exo-CP232는 링커 없이 EV에 접합된 CP232이고; Exo-CP246은 숙신이미드에 연결된 Val-Cit을 통해 EV에 접합된 CP246이고; 그리고 Exo-CP250은 말레이미드 모이어티에 연결된 Val-Cit을 통해 EV에 접합된 CP250이다. 500,000 PBMC/웰을 엑소좀과 함께 밤새 배양했다. 세포 배양 상청액으로의 인터페론 베타 (IFNβ) 방출을 ELISA를 사용하여 측정하였다.
도 3A-3C는 STING 효현제 로딩에 관한 설프하이드릴 반응성 및 지질-결합 화학을 비교하는 PBMC 분석 결과를 보여준다 (중앙 그림). 도 3A는 말레이미드 모이어티에 연결된 Val-Ala를 통해 EV에 접합된 CP227인 ExoCP227과 CP227의 IFNβ 방출 및 EC50 비교를 보여준다. 도 3B는 말레이미드 모이어티에 연결된 Val-Cit를 통해 EV에 접합된 CP229인 ExoCP229과 CP229의 IFNβ 방출 및 EC50 비교를 보여준다. 도 3C는 콜레스테롤에 연결된 Val-Ala를 통해 EV에 접합된 CP238인 ExoCP238과 CP238의 IFNβ 방출 및 EC50 비교를 보여준다.
도 4A는 EV에서 (내강)에 캡슐화된 ADUS100인 ExoADUS100과 ADUS100 간의 PBMC 분석에서 IFNβ 방출의 비교 데이터를 보여준다. 도 4B는 EV에서 (내강)에 캡슐화된 CL656인 ExoCL656과 CL656 간의 PBMC 분석에서 IFNβ 방출의 비교 데이터를 보여준다. 도 4C는 도 3A-3C 및 4A-4B에 기술된 다양한 STING 효현제 및 Exo-STING 효현제의 EC50을 보여준다.
도 5A는 EV들: exoCP227, exoCP229, exoCP250, exoCP238, exoCP232 및 exoCP246의 로딩 효율을 보여준다. EV의 구조는 위에 설명되어 있다. 두 가지 실험에 대해 각 EV에 로딩되는 STING 효현제의 수를 표시한다. 도 5B는 다양한 STING 효현제 및 EV들: CP227, exo-CP227, CP229, exo-CP229, CP238, exo-CP238, ADUS100, exoADUS100, CL656, exoCL656, 및 exoCP250의 EC50 비교를 보여준다.
도 6은 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE) 및 말레이미드-Val-Cit-PABC-MMAE (vc-MMAE)의 구조를 나타낸다.
도 7은 인간 대식세포주인 RAW264.7(RAW) 세포에 대해 평가한 MMAE 세포독성을 나타낸 것이다. RAW 세포 성장에 대한 MMAE의 용량-반응 효과는 현미경 사진(상단)과 세포 성장의 측정값(좌측 하단) 및 융합성점(우측 하단)에 표시된다.
도 8A는 유리 형태 (MMAE) 또는 말레이미드-Val-Cit-PABC 링커가 있는 (vc-MMAE)의 MMAE 효능을 비교한 융합성 데이터 (confluency data)를 나타낸다.
도 8B는 유리 MMAE와 함께 엑소좀을 배양 후 엑소좀을 정리한 후 MMAE의 효능을 측정하는 융합성 데이터를 제공한다. 엑소좀을 0.1M과 2M 사이 농도의 구아니디늄 하이드로클로라이드로 세척하였다.
도 8C는 Val-Cit-MMAE와 함께 엑소좀을 배양 후 엑소좀을 정리한 후 MMAE의 효능을 측정하는 융합성 데이터를 제공한다. 엑소좀을 0.1M과 2M 사이 농도의 구아니디늄 하이드로클로라이드로 세척하였다.
도 8D는 환원 또는 비환원 조건 하에 Val-Cit-MMAE 또는 유리 MMAE와 함께 엑소좀을 배양 후 MMAE의 효능을 측정하는 융합성 데이터를 나타낸다. 엑소좀은 5mM TCEP의 존재 또는 부재 하에 Val-Cit-MMAE 또는 MMAE와 함께 배양되었다.
도 9A는 Val-Cit-MMAE가 로딩된 엑소좀의 효능에 대한 환원 조건 (0mM TCEP에서 50mM TCEP), 화합물의 로딩 농도 (10 μM 내지 100 μM vc-MMAE) 및 구아니디늄 하이드로클로라이드 (0M 또는 1M)의 존재 또는 부재의 효과를 나타낸다. 도 9B는 Val-Cit-MMAE가 로딩된 엑소좀의 효능에 대한 환원 조건 (0mM TCEP에서 50mM TCEP), 화합물의 로딩 농도 (100 μM 또는 300 μM vc-MMAE) 및 구아니디늄 하이드로클로라이드(0M 또는 1M)의 존재 또는 부재의 효과를 나타낸다.
도 10A는 PROTAC (단백질분해 표적 키메라)의 개략도를 나타낸다.
도 10B는 PROTAC의 작용 메커니즘의 개략도를 나타낸다.
도 10C는 VHL (E3 리가제) 결합 리간드 모이어티, 링커, 및 TBK1 (TANK-결합 키나제 1) 표적화 리간드를 포함하는 PROTAC에 상응하는 화학식을 나타낸다. 화학식은 PROTAC을 세포외 소포, 예를 들어 엑소좀에 화학적으로 연결하기 위해 말레이미드 링커를 사용한 유도체화에 민감한 VHL (E3 리가제) 결합 리간드 모이어티의 잠재적 위치를 보여준다 (별로 표시).
도 11은 CLIPTAC의 작용 메커니즘의 개략도이다.
도 12는 AM152 (사이클로프로판카르복실릭 애시드, 1-[4'-[3-메틸-4-[[[(1R)-1-페닐에톡시]카보닐]아미노]-5-아이속사졸릴][1,1'-바이페닐]-4-일]-) 및 AM095 (1,1′바이페닐]-4-아세틱 애시드, 4′-[3-메틸-4-[[[(1R)-1-페닐에톡시]카보닐]아미노]-5-아이속사졸릴[]-)의 화학적 구조를 보여준다. 1 및 2로 표시된 화살표는 말레이미드 반응 그룹을 도입하기 위한 유도에 적합한 위치(카르복실산 및 카바메이트)를 나타낸다. AM152에 표시된 해당 사이트는 AM095에도 있다.
도 13은 표면에 다수의 LPA1 길항제 분자를 함유하는 엑소좀 집단을 생성하기 위한, 엑소좀에 대한 LPA1 길항제 (AM152)의 접합을 보여주는 개략도이다.
도 14는 말레이미드 반응 그룹이 카르복실산 그룹을 통해 AM152에 추가될 수 있는 방법의 예를 보여준다. 본 실시예는 말레이미드 그룹과 카르복실산 반응성 클로로메틸 벤젠 그룹 사이에 개재된 C5 스페이서 및 Ala-Val 절단가능한 링커를 포함하는 반응성 복합체의 일부로서 말레이미드 그룹을 보여준다.
도 15는 AM152를 유도체화하는데 사용할 수 있는 두 가지 예시적인 시약을 보여준다. 상부 시약은 (i) AM152의 카르복실산 그룹과 반응할 수 있는 클로로메틸 벤젠 그룹 및 (ii) 말레이미드 그룹을 포함한다. (i)와 (ii) 사이에는 절단가능한 Cit-Val 다이펩티드와 C5 스페이서가 개재되어 있다. 하부 시약은 (i) AM152의 카르복실산 그룹과 반응할 수 있는 클로로메틸 벤젠 그룹 및 (ii) 말레이미드 그룹을 포함하며, (i)와 (ii) 사이에는 절단가능한 Ala-Val 다이펩티드와 C5 스페이서가 개재되어 있다.
도 16은 접합 생성물에서 (예를 들어, 카텝신 B에 의해) Cit-Val 또는 Ala-Val 다이펩티드를 절단함으로써 생성된 생성물을 나타낸다. AM152 아닐린 에스터인 생성물은 내인성 에스테라제에 의해 추가로 처리되어 유리산 AM152 생성물을 생성할 수 있다.
도 17과 18은 유리 말레이미드 그룹과 다양한 스페이서 조합을 포함하는 여러 AM152 유도체를 보여준다.
도 19는 카르복시산 그룹 보호 후, 카르복시산 그룹을 유도하는데 사용된 것과 동일한 시약들을 사용하여 이의 카바메이트 그룹에서 AM152를 유도할 수 있음을 보여준다. 생성된 생성물은 후속적으로 탈보호되어 카르복실산 그룹을 유리시킨다.
도 20은 말레이미드 그룹과의 복합체가 링커를 통해 AM152의 카바메이트 그룹에 화학적으로 연결된 예를 보여준다. 적합한 링커는 본 명세서에 개시된 임의의 링커를 포함한다.
도 21은 AM152가 유도체화되어 후속적으로 반응성 말레이미드 그룹을 통해 스캐폴드 부분에 부착되는 대신 유도체화된 스캐폴드 부분에 화학적으로 연결될 수 있음을 보여준다.
도 22는 (i) MCC950, (ii) 말레이미드 반응 그룹을 도입하기 위해 MCC950을 유도체화하는 데 사용할 수 있는 이작용기 시약, 및 (iii) 말레이미드 반응 그룹을 포함하는 MCC950 유도체의 구조를 나타낸다. 이작용기 시약의 벤젠 그룹 (**)은 MCC950의 카바메이트 그룹(*)과 반응하여 도시된 MCC950 유도체를 생성할 수 있다.
상세한 설명
본 발명은 말레이미드 모이어티에 의해 EV, 예를 들어, 엑소좀에 공유적으로 연결된 적어도 하나의 생물학적 활성 분자를 포함하는, 세포외 소포 (EV), 예를 들어, 엑소좀 및 이의 용도에 관한 것이다. 말레이미드 모이어티를 통해 연결된 생물학적 활성 분자를 포함하는 EV, 예를 들어 엑소좀은 콜레스테롤 또는 숙신이미드와 같은 기존의 모이어티에 비해 우수한 특성을 나타낸다. 다양한 양태의 비제한적인 예가 본원에 도시되어 있다.
본 발명을 보다 상세히 설명하기 전에, 본 발명은 설명된 특정 조성 또는 공정 단계에 제한되지 않으며, 이들 자체는 물론 달라질 수 있음을 이해해야 한다. 본 명세서를 읽었을 때 해당 분야의 숙련된 기술자에게 명확해지는 바와 같이, 본 명세서에 기재되고 설명된 개개의 양상들 각각은 별개의 요소들 및 특징들을 가지는데, 이들은 본 발명의 범위 또는 사상에서 벗어나지 않고 다른 몇가지 임의의 양상들의 특징들과 용이하게 분리되거나 결합될 수 있다. 명시된 임의의 방법은 명시되는 사건들의 순서로 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서로 실시될 수 있다.
본 명세서에 제공된 표제는 본 발명의 다양한 양상들의 제한이 아니며, 명세서 전체를 참조하여 정의될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어는 특정 양상들을 오직 설명하기 위한 것이며, 제한을 하고자 하는 것이 아니므로, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것임을 또한 이해하여야 한다.
따라서, 바로 아래에서 정의되는 용어들은 그 전체가 명세서를 참조하여 더욱 완전히 정의된다.
I. 정의
본 명세서의 설명이 보다 용이하게 이해될 수 있도록, 특정 용어를 먼저 정의한다. 상세한 설명 전반에 걸쳐 또 다른 정의들이 제시된다.
하나 ("a" 또는 "an")의 엔티티라는 용어는 해당 엔티티 중 하나 이상을 나타낸다; 예를 들어, "뉴클레오티드 서열"은 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 나타내는 것으로 이해된다. 용어 "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본 출원에서 호환적으로 사용된다. 또한 청구범위는 임의의 선택적 요소를 제외시키도록 작성될 수 있음을 유념하여야 한다. 그러므로 이러한 표현은 청구범위 구성들을 언급하는 것과 관련하여 “단독으로”, “오직” 등과 같은 제외 의미의 용어를 사용하기 위한 또는 부정적 제한을 사용하기 위한 선행사로서의 기능을 한다.
또한, 본 출원에서 사용되는 "및/또는"은 두 개의 구체적인 특징들 또는 구성요소들 각각에 다른 특징이나 구성요소가 있거나 없는 것을 구체적으로 개시하기위해 사용되는 것이다. 그러므로, 가령, 본 출원에서 "A 및/또는 B"의 어구에서 사용시 용어 “및/또는"은 "A 및 B," "A 또는 B," "A" (단독), 및 "B" (단독)을 포함하는 것으로 한다. 마찬가지로, 가령, "A, B, 및 / 또는 C"의 어구에서 사용시 "및/또는"이라는 용어는 다음 각 양상들을 포함하는 것으로 한다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A와 C; A와 B; B와 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).
본 명세서에서 "포함한다"라는 문구를 이용하여 기재되는 양상들은 "구성되는" 및/또는 "본질적으로 구성되는"이라는 용어로 설명되는 유사한 그 외 양상들 또한 제공하는 것으로 이해된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 관련되는 해당 분야의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같은 동일한 의미를 가진다. 예를 들어, 문헌 Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; 및 Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press는 당업자에게 본 발명에서 사용되는 많은 용어들의 일반적인 사전을 제공한다.
단위, 접두사 및 기호는 국제 단위계 (SI) 승인 형식으로 표시된다. 수치 범위는 범위를 정의하는 수치를 포함한다. 값의 범위가 인용되는 경우, 그 범위의 인용된 상한 및 하한 사이의 각각의 중간 정수 값과 이의 분수 각각 또한 이러한 값들 사이의 각 하위 범위와 함께 구체적으로 개시되는 것으로 이해되어야 한다. 임의의 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 해당 범위에 포함되거나 제외될 수 있고, 어느 하나, 둘 다 포함되지 않거나 둘 모두가 포함되는 각각의 범위 또한 본 발명에 포함된다. 따라서, 본원에 인용된 범위는 인용된 종점을 포함하는 범위 내의 모든 값에 대한 약칭으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 10의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 및 10으로 구성된 그룹의 임의의 수, 숫자의 조합 또는 하위 범위를 포함하는 것으로 이해된다.
값이 명시적으로 인용되는 경우, 인용된 값과 거의 동일한 양 또는 양인 값도 본 개시의 범위 내에 있는 것으로 이해되어야 한다. 조합이 공개되는 경우 해당 조합의 구성요소들의 각 하위 조합도 구체적으로 공개되며 발명의 범위에 속한다. 반대로, 상이한 구성요소 또는 구성요소들의 그룹이 개별적으로 개시되는 경우, 이들의 조합도 개시된다. 본 발명의 임의의 구성요소가 복수의 대안을 갖는 것으로 개시되는 경우, 각각의 대안이 단독으로 또는 다른 대안과의 임의의 조합으로 배제되는 본 발명의 예가 또한 본원에 개시되며; 본 발명의 하나 이상의 구성요소가 이렇게 배제될 수 있고, 이렇게 배제된 구성요소들의 모든 조합이 본원에 개시된다.
뉴클레오티드는 일반적으로 허용되는 단일 문자 코드로 표시된다. 달리 표시되지 않는 한, 뉴클레오티드 서열은 5'에서 3' 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 기재된다. 뉴클레오티드는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회에서 권장하는 일반적으로 공지된 한 글자 기호로 본원에서 참조된다. 따라서 A는 아데닌을 나타내고, C는 시토신을 나타내고, G는 구아닌을 나타내고, T는 티민을 나타내고, U는 우라실을 나타낸다.
아미노산 서열은 아미노에서 카르복시 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 기재된다. 아미노산들은 통상적으로 알려진 3글자 기호로 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회에 의해 권고되는 1-글자 기호들로 본원에서 지칭된다.
"약"이라는 용어는 본원에서 대략적으로, 거의, 근방의, 또는 ~의 영역을 의미하는 것으로 본 명세서에서 사용된다. "약"이라는 용어가 수치 범위와 함께 사용되는 경우 명시된 수치 값의 위아래 경계를 확장하여 해당 범위를 변형시킨다. 일반적으로, 용어 "약"은 명시된 값의 위 또는 아래의 수치 값을 예를 들어 10%의 변동에 의해 위 또는 아래 (더 높거나 낮음)로 변형시킬 수 있다.
용어 "투여", "투여하는" 및 그의 문법적 변형은 조성물, 예컨대 본 발명의 EV (예를 들어, 엑소좀)를 약학적으로 허용되는 경로를 통해 대상체로 도입하는 것을 지칭한다. 본 발명의 EV(예를 들어, 엑소좀)와 같은 조성물의 대상체 내로의 도입은 종양내, 경구, 폐내, 비강내, 비경구 (정맥내, 동맥내, 근육내, 복강내, 또는 피하), 직장내, 림프내, 척수강내, 안구주위 또는 국소를 비롯한 임의의 적합한 경로에 의한다. 투여에는 자가 투여와 다른 사람에 의한 투여가 포함된다. 적절한 투여 경로는 조성물 또는 제제가 그 의도한 기능을 수행할 수 있게 한다. 예를 들어, 적합한 경로가 정맥내인 경우, 조성물 또는 제제를 대상체의 정맥에 도입함으로써 조성물을 투여한다.
본원에 사용된 용어 "효현제"는 수용체에 결합하고 수용체를 활성화하여 생물학적 반응을 생성하는 분자를 지칭한다. 수용체는 내인성 또는 외인성 효현제에 의해 활성화될 수 있다. 내인성 효현제의 비제한적 예는 호르몬, 신경전달물질, 및 사이클릭 다이뉴클레오티드를 포함한다. 외인성 효현제의 비제한적 예는 약물, 소분자, 및 사이클릭 다이뉴클레오티드를 포함한다. 효현제는 완전, 부분 또는 역 효현제일 수 있다.
용어 "아미노산 치환"은 모체 또는 참조 서열 (예를 들어, 야생형 서열)에 존재하는 아미노산 잔기를 또 다른 아미노산 잔기로 대체하는 것을 지칭한다. 아미노산은 예를 들어 화학적 펩티드 합성을 통해 또는 당업계에 공지된 재조합 방법을 통해 모체 또는 참조 서열 (예를 들어, 야생형 폴리펩티드 서열)에서 치환될 수 있다. 따라서, "위치 X에서의 치환"이라는 말은 위치 X에 존재하는 아미노산의 대체 아미노산 잔기로의 치환을 지칭한다. 일부 양상들에서, 치환 패턴은 도식 AnY에 따라 기재될 수 있으며, 여기서 A는 위치 n에 자연적으로 또는 원래 존재하는 아미노산에 상응하는 단일 문자 코드이고, Y는 치환 아미노산 잔기이다. 다른 양상에서, 치환 패턴은 스키마 An(YZ)에 따라 설명될 수 있으며, 여기서 A는 위치 n에 자연적으로 또는 원래 존재하는 아미노산을 치환하는 아미노산 잔기에 상응하는 단일 문자 코드이고, Y 및 Z는 A를 대체할 수 있는 대체 치환 아미노산 잔기들이다.
본원에 사용된 용어 "길항제"는 수용체에 결합할 때 생물학적 반응 자체를 유발하기보다는 효현제 매개 반응을 차단하거나 약화시키는 분자를 지칭한다. 많은 길항제는 수용체 상의 구조적으로 정의된 결합 부위에서 내인성 리간드 또는 기질과 경쟁하여 효능을 달성한다. 길항제의 비제한적 예는 알파 차단제, 베타-차단제 및 칼슘 채널 차단제를 포함한다. 길항제는 경쟁적, 비경쟁적 또는 반경쟁적 길항제일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 천연 또는 부분적으로 또는 전적으로 합성 생산된 면역글로불린 및 이의 단편을 포함한다. 상기 용어는 또한 면역글로불린 결합 도메인에 상동성인 결합 도메인을 갖는 임의의 단백질을 포함한다. "항체"는 항원에 특이적으로 결합하고 이를 인식하는 면역글로불린 유전자 또는 이의 단편의 프레임워크 영역을 포함하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 항체라는 용어의 사용은 전체 항체, 폴리클로날, 모노클로날 및 재조합 항체, 이의 단편을 포함하는 것을 의미하며, 단일 사슬 항체, 인간화 항체, 쥐과 항체, 키메라, 마우스-인간, 마우스-영장류, 영장류-인간 모노클로날 항체, 항-이디오타입 항체, 항체 단편, 예를 들어, scFv, (scFv)2, Fab, Fab', 및 F(ab')2, F(ab1)2, Fv, dAb 및 Fd 단편, 디아바디, 및 항체-관련 폴리펩티드을 추가로 포함한다. 항체는 원하는 생물학적 활성 또는 기능을 나타내는 한 이중특이적 항체 및 다중특이적 항체를 포함한다. 본 발명의 일부 양상에서, 생물학적 활성 분자는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 분자이다.
용어 "항체-약물 접합체" 및 "ADC"는 호환적으로 사용되며, 예를 들어, 치료제 (때때로 본원에서 제제, 약물 또는 활성 약학 성분으로 지칭됨) 또는 제제에 공유적으로 연결된 항체를 지칭한다. 본 발명의 일부 양상에서, 생물학적 활성 분자는 항체-약물 접합체이다.
본 명세서에서 사용되는 하나 이상의 관심 값에 적용되는 "대략"이라는 용어는 명시된 기준 값과 유사한 값을 의미한다. 특정 양상들에서, 용어 “대략”은, 달리 언급이 없거나 내용으로부터 명확하지 않은 한, 어느 한 방향으로 (이상으로 또는 이하로) 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 미만에 속하는 값들의 범위를 지칭한다 (이러한 숫자가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우는 제외).
용어 "아릴"은 카보사이클릭 방향족 그룹을 지칭한다. 아릴 그룹의 예는 페닐, 나프틸 및 안트라세닐을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 카보사이클릭 방향족 그룹은, -C1-8 알킬, -O-(C1-8 알킬), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2-, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN을 포함하는 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 하나 이상의 그룹들로 치환되지 않거나 치환될 수 있으며, 이때 각 R'은 독립적으로 H, -C1-8 알킬, 또는 아릴이다.
용어 "아릴렌"은 2개의 공유 결합을 가지는 아릴 그룹을 지칭하며, 하기 구조에 나타낸 바와 같이 오르토, 메타 또는 파라 배열일 수 있다:
Figure pct00015
여기서 페닐 그룹은, -C1-8 알킬, -O-(C1-8 알킬), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2-, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN을 포함하는 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 최대 4개 그룹들로 치환되지 않거나 치환될 수 있으며, 이때 각 R'은 독립적으로 H, -C1-8 알킬, 또는 아릴이다.
본원에 사용된 용어 "생물학적 활성 분자"는 EV, 예를 들어 엑소좀에 연결, 예를 들어 말레이미드 모이어티를 통해 화학적으로 연결 될 수 있는 임의의 분자를 지칭하며, 이때 이러한 분자는 이를 필요로 하는 대상체에서 치료 또는 예방 효과를 가질 수 있거나 또는 진단 목적으로 사용될 수 있다. 따라서, 예로서, 용어 생물학적 활성 분자는 단백질 (예를 들어, 항체, 단백질, 폴리펩티드, 및 이의 유도체, 단편 및 변이체), 지질 및 이의 유도체, 탄수화물 (예를 들어, 당단백질의 글리칸 부분), 또는 소분자를 포함한다. 일부 양상들에서, 생물학적 활성 분자는 방사성동위원소이다. 일부 양상들에서, 생물학적 활성 분자는 검출가능한 모이어티, 예를 들어 방사성핵종, 형광 분자 또는 조영제이다.
본원에서 사용되는 용어 "C1-8 알킬"은 1 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지형 포화 탄화수소를 지칭한다. 대표적인 "C1-8 알킬" 그룹은, 메틸, 에틸, n-프로필, n-부틸, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸, 아이소프로필, sec-부틸, 아이소부틸, tert-부틸, 아이소펜틸 및 2-메틸부틸을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 "C1-10 알킬렌"은 화학식 -(CH2)1-10-의 포화, 직쇄 탄화수소 그룹을 지칭한다. C1-10 알킬렌의 예는 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 부틸렌, 펜틸렌, 헥실렌, 헵틸렌, 옥틸렌, 노닐렌 및 데실렌을 포함한다.
용어 "C3-8 카보사이클"은 3-, 4-, 5-, 6-, 7- 또는 8-원 포화 또는 불포화 비-방향족 카보사이클릭 고리를 지칭한다. 대표적인 C3-8 카보사이클에는, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로펜타디에닐, 사이클로헥실, 사이클로헥세닐, 1,3-사이클로헥사디에닐, 1,4-사이클로헥사디에닐, 사이클로헵틸, 1,3-사이클로헵타디에닐, 1,3,5-사이클로헵타트리에닐, 사이클로옥틸, 및 사이클로옥타디에닐이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. C3-8 카보사이클 그룹은, -C1-8 알킬, -O-(C1-8 알킬), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2-, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN을 포함하는 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 하나 이상의 그룹들로 치환되지 않거나 치환될 수 있으며, 이때 각 R'은 독립적으로 H, -C1-8 알킬, 또는 아릴이다.
용어 "C3-8 카보사이클로"는 카보사이클의 수소 분자들 중 하나 이상이 결합으로 대체된, 상기 정의된 C3-8 카보사이클 그룹을 지칭한다.
용어 "C3-8 헤테로사이클"은 1 내지 4개의 고리 탄소 원자가 O, S 및 N으로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택된 헤테로원자로 대체된 방향족 또는 비방향족 C3-8 카보사이클을 지칭한다. C3-8 헤테로사이클의 대표적인 예들은, 벤조퓨라닐, 벤조티오펜, 인돌릴, 벤조피라졸릴, 쿠마리닐, 아이소퀴놀리닐, 피롤릴, 티오페닐, 퓨라닐, 티아졸릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 트라이아졸릴, 퀴놀리닐, 피리미디닐, 피리디닐, 피리도닐, 피라지닐, 피리다지닐, 아이소티아졸릴, 아이속사졸릴 및 테트라졸릴을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. C3-8 헤테로사이클은, -C1-8 알킬, -O-(C1-8 알킬), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2-, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN을 포함하는 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 최대 7개 그룹들로 치환되지 않거나 치환될 수 있으며, 이때 각 R'은 독립적으로 H, -C1-8 알킬, 또는 아릴이다.
용어 "C3-8 헤테로사이클로"는 헤테로사이클 그룹의 수소 분자들 중 하나가 결합으로 대체된 상기 정의된 C3-8 헤테로사이클 그룹을 지칭한다. C3-8 헤테로사이클로는, -C1-8 알킬, -O-(C1-8 알킬), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2-, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN을 포함하는 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 최대 6개 그룹들로 치환되지 않거나 치환될 수 있으며, 이때 각 R'은 독립적으로 H, -C1-8 알킬, 또는 아릴이다.
"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 비슷한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 패밀리는 당분야에 정의되어 있는데, 염기성 측쇄 (가령, 리산, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (가령, 아스파르트산, 글루타민산), 전하를 띄지 않는 극성 측쇄(가령, 글라이신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄 (가령, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-가지 측쇄 (가령, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (가령, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 따라서, 폴리펩티드의 아미노산이 동일한 측쇄 패밀리의 다른 아미노산으로 대체되는 경우, 치환은 보존적인 것으로 간주된다. 또 다른 양상에서, 아미노산 스트링은 측쇄 패밀리 구성원의 순서 및/또는 조성이 상이한 구조적으로 유사한 스트링으로 보존적으로 대체될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "보존된"은 비교되는 2개 이상의 서열의 동일한 위치에서 변경되지 않고 발생하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩티드 서열의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 각각 지칭한다. 상대적으로 보존된 뉴클레오티드 또는 아미노산은 서열의 다른 곳에서 나타나는 뉴클레오티드 또는 아미노산보다 더 관련된 서열들 사이에서 보존되는 것들이다.
일부 양상들에서, 둘 이상의 서열이 서로 100% 동일한 경우 "완전히 보존된" 또는 "동일한"이라고 한다. 일부 양상들에서, 2개 이상의 서열들이 서로 적어도 약 70% 동일, 적어도 약 80% 동일, 적어도 약 90% 동일, 또는 적어도 약 95% 동일한 경우 "매우 보존된"이라고 한다. 일부 양상들에서, 둘 이상의 서열이 적어도 약 30% 동일, 적어도 약 40% 동일, 적어도 약 50% 동일, 적어도 약 60% 동일, 적어도 약 70% 동일, 서로 적어도 약 80% 동일, 적어도 약 90% 동일, 또는 적어도 약 95% 동일한 경우 "보존된" 이라고 한다. 서열의 보존은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 전체 길이에 적용될 수 있거나 이의 부분, 영역 또는 특징부에 적용될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "통상적인 EV 단백질"은 이전에 EV에 풍부한 것으로 알려진 단백질을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "통상적인 엑소좀 단백질"은 CD9, CD63, CD81, PDGFR, GPI 단백질, 락타데린 LAMP2, 및 LAMP2B를 포함하나 이에 제한되지 않는, 엑소좀에 풍부한 것으로 이전에 알려진 단백질, 또는 이들의 단편, 또는 이에 결합하는 펩티드를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "유도체"는 EV, 예를 들어 엑소좀, 구성성분 (예를 들어, 스캐폴드 단백질, 예컨대 스캐폴드 X 및/또는 스캐폴드 Y, 지질 또는 탄수화물) 또는 반응성 말레이미드 그룹 또는 말레이미드 그룹과 반응하기 쉬운 티올 그룹을 도입하도록 화학적으로 변형된 생물학적 활성 분자 (예를 들어, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 지질, 탄수화물, 항체 또는 이의 단편, PROTAC 등)를 지칭한다. 예를 들어, (i) 예를 들어 유리 아미노 그룹과 반응하는 그룹, 및 (ii) 말레이미드 그룹을 포함하는 이작용기 시약으로 변형된 항체는 EV, 예를 들어, 엑소좀 상의 스캐폴드 X 단백질의 유리 티올 그룹과 반응할 수 있는 반응성 말레이미드 그룹을 포함하는 항체 유도체를 생성할 수 있다. 반대로, EV, 예를 들어 엑소좀 상의 스캐폴드 X는 (i) 예를 들어 유리 아미노 그룹과 반응하는 그룹, 및 (ii) 말레이미드 그룹을 포함하는 이작용기 시약으로 변형되어 생물학적 활성 분자, 예를 들어 항체에서 유리 티올 그룹과 반응할 수 있는 반응성 말레이미드 그룹을 포함하는 스캐폴드 X 유도체를 생성할 수 있다.
용어 "부형제" 및 "담체"는 호환적으로 사용되며 화합물의 투여를 더욱 용이하게 하기 위해 약학 조성물에 첨가되는 불활성 물질을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "세포외 소포", "EV" 및 이들의 문법적 변형은 호환적으로 사용되며 내부 공간을 둘러싸는 막을 포함하는 세포 유래 소포를 지칭한다. 세포외 소포는 이들이 유래된 세포보다 작은 직경을 갖는 모든 막-결합 소포 (예를 들어, 엑소좀, 나노소포)를 포함한다. 일부 양상들에서, 세포외 소포의 직경 범위는 20 nm에서 1000 nm이며, 세포외 소포의 외부 표면에 나타나는 내부 공간 (즉, 내강) 및/또는 막에 걸친 다양한 거대분자 페이로드를 포함할 수 있다. 일부 양상들에서, 페이로드는 아데노 관련 바이러스 (AAV), 핵산 (예를 들어, DNA 또는 RNA, 예를 들어 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA 또는 mRNA), 모르폴리노, 단백질, 탄수화물, 지질, 소분자, 항원, 백신 애쥬번트, 및/또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 추가 페이로드는 아래에 자세히 설명되어 있다. 일부 양상들에서, EV, 예를 들어, 엑소좀은 표적화 모이어티, 트로피즘 모이어티, 또는 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 일부 양상들에서, 세포외 소포 또는 EV라는 용어는 세포외 소포 (EV)의 집단을 지칭한다.
특정 양상들에서, 세포외 소포는 스캐폴드 모이어티를 포함한다. 예로서 그리고 제한없이, 세포외 소포는 세포사멸체, 세포 단편, 직접 또는 간접 조작 (예를 들어, 연속 압출 또는 알칼리 용액으로 처리)에 의해 세포로부터 유도된 소포, 소포화된 소기관, 및 살아있는 세포에 의해 (예를 들어, 직접 원형질막 출아 또는 후기 엔도솜과 원형질막의 융합에 의해) 생성된 소포를 포함한다. 세포외 소포는 살아있는 또는 죽은 유기체, 이식된 조직 또는 기관, 원핵 또는 진핵 세포, 및/또는 배양된 세포로부터 유래될 수 있다. 일부 양상들에서, 세포외 소포는 하나 이상의 트랜스진 산물을 발현하는 세포에 의해 생성된다.
본원에 사용된 용어 "엑소좀"은 직경이 20-300 nm (예를 들어, 40-200 nm)인 세포외 소포를 지칭한다. 엑소좀은 내부 공간 (즉, 내강)을 둘러싸는 막을 포함하고, 일부 양상에서, 직접 원형질막 출아 또는 후기 엔도솜과 원형질막의 융합에 의해 세포 (예를 들어, 생산자 세포)로부터 생성될 수 있다. 특정 양상들에서, 엑소좀은 스캐폴드 모이어티를 포함한다. 하기한 바와 같이, 엑소좀은 생산자 세포로부터 유래될 수 있고, 그의 크기, 밀도, 생화학적 파라미터, 또는 이들의 조합에 기초하여 생산자 세포로부터 단리될 수 있다. 일부 양상들에서, 본 발명의 엑소좀은 하나 이상의 트랜스진 산물을 발현하는 세포에 의해 생성된다. 일부 양상들에서, 용어 엑소좀은 엑소좀들의 집단을 지칭한다.
일부 양상들에서, 본 발명의 EV, 예를 들어, 엑소좀, 예를 들어, 나노소포는 적어도 하나의 생물학적 활성 분자 (예를 들어, 단백질, 예컨대 항체 또는 ADC, RNA 또는 DNA, 예컨대 안티센스 올리고뉴클레오티드, 소분자 약물, 독소, PROTAC, AAV, 또는 모르폴리노)를 EV, 예를 들어 엑소좀, 예를 들어, 나노소포에 말레이미드 모이어티를 통해 화학적으로 연결함으로써 조작된다. 일부 양상들에서, 말레이미드 모이어티는 이작용기 시약의 일부이다.
일부 양상들에서, 본 발명의 EV, 예를 들어, 엑소좀, 예를 들어, 나노소포는 세포외 소포의 외부 표면 또는 EV의 내부 (내강) 표면에 나타나는 내부 공간 (즉, 내강) 및/또는 막에 걸친 다양한 거대분자 페이로드를 포함할 수 있다. 일부 양상들에서, 페이로드는 예를 들어 핵산, 단백질, 탄수화물, 지질, 소분자, 및/또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 특정 양상들에서, EV, 예를 들어 엑소좀은 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X 단백질 또는 이의 단편을 포함한다. EV, 예를 들어, 엑소좀은 살아있는 또는 죽은 유기체, 이식된 조직 또는 기관, 원핵 또는 진핵 세포, 및/또는 배양된 세포로부터 유래될 수 있다. 일부 양상들에서, EV, 예를 들어, 엑소좀은 하나 이상의 트랜스진 산물을 발현하는 세포에 의해 생성된다. 다른 양상들에서, 본 발명의 EV는 제한없이 나노소포, 마이크로솜, 미세소포, 세포외체 또는 세포자멸체이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 단백질의 "단편" (예를 들어, 치료 단백질과 같은 생물학적 활성 분자, 또는 스캐폴드 X 단백질 또는 그의 단편, 또는 스캐폴드 Y 단백질 또는 그의 단편과 같은 스캐폴드 단백질)은 자연 발생 단백질과 비교하여 N- 및/또는 C-말단 결실된 또는 단백질의 임의의 부분이 결실된, 자연 발생 서열보다 짧은 단백질의 아미노산 서열을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "기능적 단편"은 단백질 기능을 유지하는 단백질 단편을 지칭한다. 따라서, 일부 양상들에서, 스캐폴드 단백질의 기능적 단편, 예를 들어, 스캐폴드 X 단백질의 단편은 EV, 예를 들어 엑소좀의 내강 표면 또는 외부 표면 상에 모이어티, 예를 들어 생물학적 활성 분자를 예를 들어 말레이미드 모이어티를 통해 연결하거나 부착하는 능력을 보유한다. 유사하게, 특정 양상들에서, 스캐폴드 Y 단백질의 단편은 EV, 예를 들어 엑소좀의 내강 표면 상에 모이어티, 예를 들어 생물학적 활성 분자를 예를 들어 말레이미드 모이어티를 통해 부착하는 능력을 보유한다.
단편이 기능적 단편인지 여부는 웨스턴 블롯, FACS 분석, 및 예를 들어, GFP와 같은 자가형광 단백질을 이용한 단편들의 융합을 포함하는, EV, 예를 들어, 엑소좀의 단백질 함량을 결정하는 당업계에 공지된 임의의 방법들에 의해 평가될 수 있다. 특정 양상들에서, 스캐폴드 X 단백질의 기능적 단편은 EV, 예를 들어, 엑소좀의 내강 또는 외부 표면에 생물학적 활성 분자를, 예를 들어, 말레이미드 모이어티를 통해 부착시키는 자연 발생 스캐폴드 X 단백질의 능력을 예를 들어, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 100% 보유한다.
본원에서 사용되는, 본 발명의 EV (예를 들어, 엑소좀)의 내강 또는 외부 표면에 생물학적 활성 분자를 (i) "연결하는 것" 또는 “부착하는 것”이라는 용어는 생물학적 활성 분자를, 예를 들어, 화학적 링커, 예를 들어, 말레이미드 모이어티를 통해 "화학적으로 연결하는" 또는 "접합시키는 것", 및 (ii) (예를 들어, 펩티드 결합, 아미노산 링커, 및/또는 스캐폴드 단백질에 의해) 생물학적 활성 분자를 EV (예를 들어, 엑소좀)의 내강 또는 외부 표면 상에 위치한 스캐폴드 단백질의 일부분 또는 EV (예를 들어, 엑소좀)에 "비-화학적으로 연결시키는 것" (이는 또한 "융합시키는 것" 또는 "융합"으로도 지칭됨)을 포함한다.
본원에서 사용되는, 용어 "융합시키는 것", "융합된", 또는 "비-화학적으로 연결시키는 것"은 본 발명의 EV (예를 들어, 엑소좀)의 내강 또는 외부 표면에 생물학적 활성 분자를, 예를 들어, 스캐폴드 단백질에 의해 "융합시키는 것", "융합된", 또는 "비-화학적으로 연결시키는 것"이라는 용어는 각각 생물학적 활성 분자를 EV (예를 들어, 엑소좀)의 내강 또는 외부 표면에 위치한 스캐폴드 분자 (예를 들어, 단백질)의 일부분에 연결시키는 것을 지칭한다. 일부 양상들에서, 생물학적 활성 분자 간의 융합은 유전적 융합(즉, 키메라 발현)을 통해 수행될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "화학적으로 연결하는 것" 및 "접합시키는 것"은 호환적으로 사용되며 각각은 예를 들어, EV, 스캐폴드 모이어티, 생물학적 활성 모이어티, 링커 또는 링커들, 표적화 모이어티 및/또는 트로피즘 모이어티, 또는 이들의 임의의 조합을 각각 포함하는 둘 이상의 모이어티들의, 화학적 모이어티, 예를 들어, 말레이미드 모이어티를 사용한 공유 부착을 지칭한다. 결과적으로, 제1 모이어티 (예를 들어, 스캐폴드, 예를 들어, 스캐폴드 X 단백질 또는 지질, 예를 들어, 콜레스테롤)는 하나의 모이어티에 존재하는 말레이미드 그룹과 다른 하나의 모이어티에 존재하는 설프하이드릴 그룹 사이의 반응에 의해 형성된 티오에터 링키지를 통해 제2 모이어티, 예를 들어, 생물학적 활성 모이어티에 "화학적으로 연결"될 것이다.
본원에 사용된 용어 "세포외"는 용어 "외부", "외측" 및 "소포외"와 호환적으로 사용될 수 있으며, 이때 각 용어는 EV, 예를 들어, 엑소좀을 둘러싸는 막 외부에 있는 요소를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "세포내"는 용어 "내부", "내측" 및 "소포내"와 호환적으로 사용될 수 있으며, 이때 각 용어는 EV, 예를 들어, 엑소좀을 둘러싸는 막 내부에 있는 요소를 지칭한다. "내강"이라는 용어는 EV, 예를 들어 엑소좀을 둘러싸는 막 내부 공간을 지칭한다. 따라서, EV, 예를 들어 엑소좀의 내강 내부에 있는 요소는 본 명세서에서 "내강에 위치하는" 또는 "내강"인 것으로 지칭될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "상동성"은 중합체 분자들 사이, 예를 들어, 핵산 분자들 (예를 들어, DNA 분자들 및/또는 RNA 분자들) 사이 및/또는 폴리펩티드 분자들 사이의 전반적인 관련성을 지칭한다. 일반적으로 "상동성"이라는 용어는 두 분자 간의 진화적 관계를 의미한다. 따라서 상동성인 두 분자는 공통의 진화적 조상을 가지게 된다. 본 발명의 내용과 관련하여, 용어 상동성은 동일성 및 유사성을 모두 포함한다.
일부 양상들에서, 중합체 분자는 분자 내 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%의 단량체가 동일하거나 (정확하기 동일한 단량체) 또는 유사한 (보존적 치환) 경우 서로 "상동성"인 것으로 간주된다. "상동성"이라는 용어는 반드시 적어도 2개의 서열들 (폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열들) 간의 비교를 의미한다.
본 발명과 관련하여, 치환(아미노산 치환으로 지칭되는 경우에도)은 핵산 수준에서 수행된다, 즉, 아미노산 잔기를 대체 아미노산 잔기로 치환하는 것은 제1 아미노산을 인코딩하는 코돈을 제2 아미노산을 인코딩하는 코돈으로 치환함으로써 수행된다.
본원에서 사용된 용어 "동일성"은 중합체 분자 사이, 예를 들어, 폴리펩티드 분자들 또는 폴리뉴클레오티드 분자들 (예를 들어, DNA 분자들 및/또는 RNA 분자들) 사이의 전반적인 단량체 보존을 지칭한다. 추가 수식어가 없는 "동일한"이라는 용어, 예를 들어, 단백질 A가 단백질 B와 동일하다는 것은 서열이 100% 동일함 (100% 서열 동일성)을 의미한다. 2개의 서열을, 예를 들어 "70% 동일함"으로 설명하는 것은 예를 들어 "70% 서열 동일성"을 갖는 것으로 설명하는 것과 동일하다.
2개 폴리펩티드 서열들의 퍼센트 동일성의 계산은, 예를 들면, 최적의 비교를 위해 2개의 서열들을 정렬함으로써 수행될 수 있다 (예컨대, 최적 정렬을 위해 제 1 및 제 2 폴리펩티드 서열들 중 하나 또는 둘 모두에 갭이 도입될 수 있고 비-동일성 서열들은 비교 목적에서 무시될 수 있다). 특정 양상들에서, 비교 목적을 위해 정렬된 서열의 길이는 기준 서열의 최소한 약 30%, 최소한 약 40%, 최소한 약 50%, 최소한 약 60%, 최소한 약 70%, 최소한 약 80%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 또는 약 100% 길이이다. 그 후 상응하는 아미노산 위치들에서의 아미노산들을 비교한다.
제 1 서열에서의 위치가 제 2 서열의 상응하는 위치에서와 동일한 아미노산에 점유되면, 이 때 이 분자들은 해당 위치에서 동일하다. 2개 서열들 간 퍼센트 동일성은, 갭의 수, 그리고 2개 서열들의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 각 갭의 길이를 고려한, 해당 서열들이 공유하는 동일한 위치들의 수의 함수이다. 2개 서열들 간의 퍼센트 동일성의 서열 비교 및 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 이루어질 수 있다.
단백질 및 뉴클레오티드 서열의 정렬을 위해 다양한 업체의서 적합한 소프트웨어 프로그램을 사용할 수 있다. 퍼센트 서열 동일성을 결정하기 위한 한 가지 적합한 프로그램은 미국 정부의 국립 생명공학 정보 센터 BLAST 웹 사이트(blast.ncbi.nlm.nih.gov)에서 사용할 수 있는 BLAST 프로그램 제품군의 일부인 bl2seq이다. Bl2seq는 BLASTN 또는 BLASTP 알고리즘을 사용하여 두 서열들 간의 비교를 수행한다. BLASTN은 핵산 서열을 비교하는데 사용되는 반면 BLASTP는 아미노산 서열을 비교하는데 사용된다. 다른 적합한 프로그램은 예를 들어 EMBOSS 생물정보학 프로그램 제품군의 일부인 Needle, Stretcher, Water 또는 Matcher이며 이들은 또한 www.ebi.ac.uk/Tools/psa의 유럽 생물정보학 연구소 (EBI)로부터 이용가능하다.
서열 정렬은 MAFFT, Clustal(ClustalW, Clustal X 또는 Clustal Omega), MUSCLE 등과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 참조 서열과 정렬되는 단일 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 표적 서열 내부에서 서로 다른 영역들은 각각 고유한 퍼센트 서열 동일성을 가질 수 있다. 퍼센트 서열 동일성 값은 가장 근사한 10분의 1까지 반올림됨을 유의하라. 예를 들어, 80.11, 80.12, 80.13, 및 80.14는 80.1로 내림되나, 80.15, 80.16, 80.17, 80.18, 및 80.19는 80.2로 올림된다. 또한 길이 값은 항상 정수이다.
특정 양상들에서, 제 2 서열 아미노산 서열 (또는 핵산 서열)의 제 1 아미노산 서열 (또는 핵산 서열)에 대한 동일성 백분율 (%ID)은 %ID = 100 x (Y/Z)로 산출되는데, 여기에서 Y는 (육안 검사 또는 특정 서열 정렬 프로그램에 의해 정렬 된 바와 같은) 제 1 및 제 2 서열의 정렬에서 동일하게 정합되는 점수의 아미노산 잔기 (또는 핵염기)의 수이고, Z는 제 2 서열에서의 잔기의 총수이다. 제 1 서열의 길이가 제 2 서열보다 긴 경우, 제 2 서열에 대한 제 1 서열의 동일성 백분율은 제 1 서열에 대한 제 2 서열의 동일성 백분율보다 높다.
당업자는 퍼센트 서열 동일성의 계산을 위한 서열 정렬의 생성이 독점적으로 1차 서열 데이터에 의해 이루어지는 이원 서열-서열 비교에 제한되지 않는다는 것을 이해할 것이다. 또한, 서열 정렬은 서열 데이터를 구조 데이터(예를 들어, 결정학적 단백질 구조), 기능 데이터(예를 들어, 돌연변이 위치) 또는 계통 발생 데이터와 같은 이종 출처의 데이터와 통합함으로써 생성될 수 있음이 이해될 것이다. 다중 서열 정렬을 생성하기 위해 이종 데이터를 통합하는 적합한 프로그램은 www.tcoffee.org에서 이용가능한, 대안적으로 예를 들어 EBI에서 이용가능한 T-Coffee이다. 또한 퍼센트 서열 동일성을 계산하는 데 사용되는 최종 정렬은 자동으로 또는 수동으로 구성될 수 있음이 이해될 것이다.
본원에 사용된 용어 "면역 조절인자"는 EV (예를 들어, 엑소좀)와 접촉하는 표적 (예를 들어, 표적 세포)에 작용하고 면역계를 조절하는 물질을 지칭한다. EV(예를 들어, 엑소좀) 및/또는 생산자 세포에 도입될 수 있는 면역 조절인자의 비제한적 예에는 체크포인트 억제제의 조절인자, 체크포인트 억제제의 리간드, 사이토카인, 이들의 유도체, 또는 이들의 임의의 조합과 같은 물질이 포함된다. 면역 조절인자는 또한 효현제, 길항제, 항체, 항원 결합 단편, 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 siRNA, miRNA, lncRNA, mRNA 또는 DNA, 또는 소분자를 포함할 수 있다. 본 발명의 일부 양상들에서, 생물학적 활성 분자는 면역 조절인자이다.
본원에 사용된 "면역 반응"은 외래 인자 또는 비정상, 예를 들어 암 세포에 대한 척추동물 내의 생물학적 반응을 지칭하며, 이러한 반응은 이들 인자 및 이에 의해 야기되는 질환에 대해 유기체를 보호한다. 면역 반응은 면역계의 하나 이상의 세포(예를 들어, T 림프구, B 림프구, 자연 살해(NK) 세포, 대식세포, 호산구, 비만 세포, 수지상 세포 또는 호중구) 및 이들 세포 중 어느 하나 또는 간에 의해 생성되는 가용성 거대분자 (항체, 사이토카인, 및 보체 포함)의 작용에 의해 매개되며, 병원체들로 감염된 침습성 병원체들, 세포들 또는 조직들, 암 또는 그 외 이상 세포들, 또는, 자가면역 또는 병리학적 염증의 경우, 정상 세포 또는 조직들의 선택적 표적화, 이에 대한 결합, 손상, 파괴 및/또는 이의 신체로부터의 제거를 가져올 수 있다. 면역 반응은, 예를 들어 T 세포, 예를 들어, 이펙터 T 세포, Th 세포, CD4+ 세포, CD8+ T 세포, 또는 Treg 세포의 활성화 또는 억제, 또는 면역계의 임의의 다른 세포, 예를 들어, NK 세포의 활성화 또는 억제를 포함한다. 따라서 면역 반응은 체액성 면역 반응 (예를 들어, B-세포에 의해 매개됨), 세포성 면역 반응 (예를 들어, T 세포에 의해 매개됨), 또는 체액성 및 세포성 면역 반응 둘 다를 포함할 수 있다. 본 발명의 일부 양상들에서, 생물학적 활성 분자는 면역 반응을 유도할 수 있는 분자이다.
일부 양상들에서, 면역 반응은 "억제성" 면역 반응이다. 억제 면역 반응은 자극 (예를 들어, 항원)의 효과를 차단하거나 감소시키는 면역 반응이다. 특정 양상들에서, 억제 면역 반응은 자극에 대한 억제 항체의 생산을 포함한다. 일부 양상들에서, 면역 반응은 "자극성" 면역 반응이다. 자극성 면역 반응은 표적 항원(예를 들어, 종양 항원 또는 바이러스)을 파괴하고 제거할 수 있는 이펙터 세포(예를 들어, 세포독성 T 림프구)를 생성하는 면역 반응이다.
본원에 사용된 용어 "면역접합체"는 결합 분자 (예를 들어, 항체) 및 이러한 결합 분자에 화학적으로 접합된 하나 이상의 모이어티, 예를 들어, 치료 또는 진단 모이어티를 포함하는 화합물을 지칭한다. 일반적으로 면역접합체는 다음 일반식으로 정의된다: A-(L-M)n 이때 A는 결합 분자 (예를 들어, 항체)이고, L은 선택적 링커이며, M은 예를 들어 치료제, 검출가능한 표지 등이 될 수 있는 이종 모이어티이고, n은 정수이다. 일부 양상들에서, 다수의 이종 모이어티는 동일한 결합 분자 (예를 들어, 항체)의 상이한 부착점에 화학적으로 접합될 수 있다. 다른 양상들에서, 다수의 이종 모이어티는 연쇄되어 이러한 결합 분자 (예를 들어, 항체)의 부착점에 부착될 수 있다. 일부 양상들에서, 다수의 이종 모이어티 (동일하거나 상이함)는 결합 분자 (예를 들어, 항체)에 접합될 수 있다.
면역접합체는 상기 식의 역순으로 또한 정의될 수 있다: 일부 양상들에서, 면역접합체는 "항체-약물 접합체" ("ADC")이다. 본 발명과 관련하여 용어 "면역접합체"는 화학적 또는 효소적 접합체 분자들에 제한되지 않는다. 본 발명에서 사용된 용어 "면역접합체"는 또한 유전자 융합을 포함한다. 본 발명의 일부 양상들에서, 생물학적 활성 분자는 면역접합체이다.
본원에서 사용되는 용어 "단리된", "정제된", "추출된" 및 이의 문법적 변화형은 호환적으로 사용되며 하나 이상의 정제 과정, 예를 들어, 원하는 EV, 예를 들어, 엑소좀 제재의 선택 또는 농축을 거친, 원하는 EV (예를 들어, 공지의 또는 공지되지 않은 양 및/또는 농도의 복수의 EV) 제재의 상태를 지칭한다. 일부 양상들에서, 본원에서 사용되는 단리 또는 정제는 생산자 세포를 함유하는 샘플로부터 EV, 예를 들어, 엑소좀을 제거, 부분적으로 제거 (예를 들어, 일 분획)하는 과정이다. 일부 양상들에서, 단리된 EV, 예를 들어, 엑소좀, 조성물은 검출가능한 바람직하지 않은 활성을 갖지 않거나, 대안적으로, 바람직하지 않은 활성의 수준 또는 양은 허용되는 수준 또는 양 이하이다. 다른 양상들에서, 단리된 EV, 예를 들어, 엑소좀, 조성물은 허용되는 양 및/또는 농도 이상의 원하는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 양 및/또는 농도를 가진다. 다른 양상들에서, 단리된 EV, 예를 들어 엑소좀, 조성물은 조성물이 수득되는 출발 물질 (예를 들어, 생산자 세포 제제)에 비해 풍부하다. 이러한 농축은 출발 물질에 비해 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 적어도 약 99.9%, 적어도 약 99.99%, 적어도 약 99.999%, 적어도 약 99.9999%, 또는 99.9999% 초과 만큼 일 수 있다. 일부 양상들에서, 단리된 EV, 예를 들어, 엑소좀, 제재는 잔류 생물학적 생성물이 실질적으로 없다. 일부 양상들에서, 단리된 EV, 예를 들어, 엑소좀, 제재는 생물학적 오염 물질이 100% 없거나, 적어도 약 99% 없거나, 적어도 약 98% 없거나, 적어도 약 97% 없거나, 적어도 약 96% 없거나, 적어도 약 95% 없거나, 적어도 약 94% 없거나, 적어도 약 93% 없거나, 적어도 약 92% 없거나, 적어도 약 91% 없거나, 또는 적어도 약 90% 없다. 잔류 생물학적 생성물에는 비생물적 물질 (화학물질 포함) 또는 원치않는 핵산, 단백질, 지질 또는 대사산물이 포함될 수 있다. 잔류 생물학적 생성물이 실질적으로 없다는 것은 또한 EV, 예를 들어 엑소좀, 조성물이 검출가능한 생산자 세포를 포함하지 않으며, 그리고 EV, 예를 들어 엑소좀만 검출가능함을 의미할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "내강-조작된 EV"는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 막의 내강 표면 또는 이의 내강이 그 조성에 있어서 변형된 EV, 예를 들어, 엑소좀을 지칭하며, 그 결과 이러한 조작된 EV, 예를 들어, 엑소좀의 내강 표면 또는 내강은, 변형 전 EV, 예를 들어, 엑소좀, 또는 자연 발생 EV, 예를 들어, 엑소좀의 그것과 상이하다.
조작은 내강 (즉, EV 내부의 공극)에서 또는 EV (예를 들어, 엑소좀)의 막, 특히, EV의 내강 표면에서 직접 이루어지고, 그 결과 EV, 예를 들어, 엑소좀의 내강 및/또는 내강 표면이 변화될 수 있다. 예를 들어, 막은 단백질, 지질, 소분자, 탄수화물 등의 조성이 변형되고, 그 결과 EV, 예를 들어 엑소좀의 내강 표면은 변형된다. 유사하게, 내강 내 함량들이 변형될 수 있다. 조성은 화학적, 물리적 또는 생물학적 방법에 의해, 또는 이전에 화학적, 물리적 또는 생물학적 방법에 의해 변형된 세포로부터 생성됨에 의해 변경될 수 있다. 구체적으로, 조성은 유전 공학에 의해 또는 이전에 유전 공학에 의해 변형된 세포로부터 생성됨에 의해 변경될 수 있다. 일부 양상들에서, 내강-조작된 EV, 예를 들어, 내강-조작된 엑소좀은, EV, 예를 들어, 엑소좀의 내강 표면 또는 내강에 노출될 수 있는, 또는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 내강 표면에 모이어티를 연결시킬 수 있는, 외인성 단백질 (즉, EV, 예를 들어, 엑소좀이 자연적으로 발현하지 않는 단백질) 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다. 다른 양상들에서, 내강-조작된 EV, 예를 들어, 내강-조작된 엑소좀은, EV, 예를 들어, 엑소좀의 내강에 노출될 수 있는, 또는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 내강 표면에 모이어티를 연결시킬 수 있는 자연 EV, 예를 들어, 엑소좀, 단백질 (예를 들어, 스캐폴드 X 또는 스캐폴드 Y) 또는 이의 단편 또는 변이체의 더 높은 발현을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "거대분자"는 핵산, 단백질, 지질, 탄수화물, 대사산물, 또는 이들의 조합을 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "말레이미드 모이어티" 또는 "MM"은 EV, 예를 들어, 엑소좀을 링커 또는 생물학적 활성 분자에 연결하는 화학적 모이어티를 지칭하고 말레이미드 그룹을 포함한다:
Figure pct00016
이때 *는 EV, 예를 들어, 엑소좀 상의 임의의 티올 그룹 (예를 들어, 스캐폴드 X 단백질에 존재하는 유리 티올)에 대한 부착점을 나타내고, 물결선은 잔부 말레이미드 모이어티에 대한 부착 부위를 나타낸다.
일부 양상들에서, *는 항체, PROTAC 또는 기타 생물학적 활성 분자의 티올기에 대한 부착점을 나타내고 물결선은 EV, 예를 들어 엑소좀 (예를 들어, 스캐폴드 X 단백질)에 대한 잔부 말레이미드 모이어티의 부착 부위를 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "거대분자"는 핵산, 단백질, 지질, 탄수화물, 대사산물, 또는 이들의 조합을 지칭한다.
EV, 예를 들어, 엑소좀의 내용에서 사용될 때 본원에 기재된 용어 "변형된"은 EV, 예를 들어, 엑소좀 및/또는 이의 생산자 세포의 변경 또는 조작을 지칭하며, 그 결과 변형된 EV, 예를 들어, 엑소좀은 자연 발생 EV, 예를 들어, 엑소좀과 상이하다. 일부 양상들에서, 본원에 기재된 변형된 EV, 예를 들어 엑소좀은 자연 발생 EV, 예를 들어, 엑소좀의 막과 비교하여 단백질, 지질, 소분자, 탄수화물 등의 조성이 상이한 막을 포함한다. 예를 들어, 이러한 막은 보다 높은 밀도 또는 수의 자연 EV, 예를 들어, 엑소좀을 포함하고, 단백질 및/또는 막은 EV, 예를 들어, 엑소좀에서 자연적으로 발견되지 않는 단백질들을 포함한다. 특정 양상들에서, 막에 대한 이러한 변형은 EV, 예를 들어 엑소좀의 외부 표면을 변경한다 (예를 들어, 본원에 기재된 표면 조작된 EV 및 엑소좀). 특정 양상들에서, 막에 대한 이러한 변형은 EV, 예를 들어, 엑소좀의 내강 표면을 변화시킨다 (예를 들어, 본원에 기재된 내강-조작된 EV 및 엑소좀).
본원에 사용된 용어 "변형된 단백질" 또는 "단백질 변형"은 단백질의 비돌연변이 아미노산 서열에 대해 적어도 약 15% 동일성을 갖는 단백질을 지칭한다. 단백질의 변형은 단백질의 단편 또는 변이체를 포함한다. 단백질의 변형은 단백질의 단편 또는 변이체에 대한 화학적 또는 물리적 변형을 추가로 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "조절하다", "변형하다" 및 이들의 문법적 변형은 일반적으로 특정 농도, 수준, 발현, 기능 또는 거동에 적용될 때, 가령, 예를 들어, 길항제 또는 효현제로서 작용하도록 예를 들어, 특정 농도, 수준, 발현, 기능 또는 거동을 증가 또는 감소시킴으로써, 예를 들어, 직접 또는 간접적으로 촉진/자극/상향 조절 또는 방해/억제/하향조절함으로써 변경시키는 능력을 지칭한다. 일부 경우에 조절인자는 대조에 비해, 또는 일반적으로 예상되는 평균 활성 수준에 비해 또는 대조 활성 수준에 비해 특정 농도, 수준, 활성 또는 기능을 증가 및/또는 감소시킬 수 있다.
본원에 사용된 용어 "나노소포"는 직경이 약 20 nm 내지 약 250 nm (예를 들어, 약 30 내지 약 150 nm)인 세포외 소포를 지칭하고 나노소포가 조작되지 않은 세포에 의해 생성되지 않도록 직접 또는 간접 조작함으로써 세포 (예를 들어, 생산자 세포)로부터 생성된다. 나노소포체를 생산하기 위한 세포의 적절한 조작은 연속 압출, 알칼리 용액으로 처리, 초음파 처리 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 양상들에서, 나노소포의 생산은 생산자 세포의 파괴를 초래할 수 있다. 일부 양상들에서, 본원에 기재된 나노소포의 집단은 원형질막으로부터의 직접 출아 또는 원형질막과 후기 엔도솜의 융합에 의해 세포로부터 유래된 소포가 실질적으로 없다. 특정 양상들에서, 나노소포는 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X 단백질 또는 그의 단편 및/또는 스캐폴드 Y 단백질 또는 그의 단편을 포함한다. 나노소포는, 일단 생산자 세포로부터 유래되면, 그 크기, 밀도, 생화학적 파라미터, 또는 이들의 조합에 기초하여 생산자 세포로부터 단리될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "페이로드"는 본 발명의 EV, 예를 들어 엑소좀과 접촉하는 표적 (예를 들어, 표적 세포)에 작용하는 생물학적 활성 분자 (예를 들어, 치료제)를 지칭한다. EV, 예를 들어, 엑소좀에 도입될 수 있는 페이로드의 비제한적인 예는 치료제, 예를 들어, 뉴클레오티드(예를 들어, 검출가능한 모이어티 또는 독소를 포함하거나 전사를 방해하는 뉴클레오티드), 핵산 (예를 들어, 효소와 같은 폴리펩티드를 인코딩하는 mRNA 분자 또는 DNA 또는 miRNA, dsDNA, lncRNA, 및 siRNA와 같은 조절 기능을 가지는 RNA 분자), 아미노산 (예를 들어, 검출가능한 모이어티 또는 독소를 포함하거나 번역을 방해하는 아미노산), 폴리펩티드 (예를 들어, 효소), 지질, 탄수화물, 및 소분자 (예를 들어, 소분자 약물 및 독소)를 포함한다. 특정 양상들에서, 페이로드는 항원을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "항원"은 대상체에 도입될 때 그 자체에 대한 면역 반응 (세포성 또는 체액성)을 유발하는 임의의 제제를 지칭한다. 일부 양상들에서, 항원, 즉, 백신은 면역 반응을 유도하는데 사용된다. 다른 양상들에서, 페이로드는 애쥬번트를 포함한다. 일부 양상들에서, 페이로드 분자는 말레이미드 모이어티를 통해 EV, 예를 들어 엑소좀에 공유적으로 연결된다.
용어 "약학적으로 허용되는 담체", "약학적으로 허용되는 부형제" 및 이들의 문법적 변형은 인간을 포함한 동물에 사용하기 위해 미국 연방 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 미국 약전에 나열된 제제, 뿐만 아니라 대상체에 대한 조성물의 투여를 금지하고 투여된 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 제거하지 않는 정도로 바람직하지 않은 생리학적 효과의 생성을 유발하지 않는 임의의 담체 또는 희석제를 포함한다. 약학 조성물을 제조하는 데 유용하고 일반적으로 안전하고 무독성이며 바람직한 부형제 및 담체가 포함된다.
본원에 기재된 용어 "약학 조성물"은 하나 이상의 다른 화학적 성분들, 가령, 약학적으로-허용되는 담체 및 부형제와 혼합된, 또는 이와 섞인, 또는 이에 현탁된 본원에 기재된 하나 이상의 화합물, 가령, 예를 들어, EV, 가령, 본 발명의 엑소좀을 지칭한다. 약학 조성물의 한 가지 목적은 이를 필요로 하는 대상체에게 EV, 예를 들어 엑소좀 제제의 투여를 용이하게 하는 것이다.
본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 이들의 유사체, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭한다. 이 용어는 분자의 일차적 구조를 나타낸다. 따라서, 이 용어는 삼중, 이중 및 단일 가닥 데옥시리보핵산 ("DNA") 뿐만 아니라 삼중, 이중 및 단일 가닥 리보핵산 ("RNA")을 포함한다. 이는 또한, 예를 들어, 알킬화에 의해, 및/또는 캡핑에 의해 변형된, 그리고 비변형된 형태의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 보다 구체적으로, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 폴리데옥시리보뉴클레오티드 (2-데옥시-D-리보스 함유), tRNA, rRNA, hRNA, siRNA 및 mRNA를 포함하는 폴리리보뉴클레오티드 (D-리보스 함유), 스플라이싱 여부에 관계없이, 퓨린 또는 피리미딘 염기의 N- 또는 C-글리코시드인 임의의 다른 유형의 폴리뉴클레오티드, 노르뉴클레오티드 백본을 내포하는 기타 중합체, 예를 들어, 폴리아미드 (예를 들어, 펩티드 핵산 "PNAs") 및 폴리모르폴리노 중합체, 및, 중합체가 DNA 및 RNA에서 발견되는 것과 같은 염기 페어링 및 염기 스태킹을 허용하는 구성의 핵염기를 포함하는 경우 기타 합성 서열-특이적 핵산 중합체를 포함한다. 본 발명의 일부 양상들에서, 말레이미드 모이어티를 통해, EV, 예를 들어 엑소좀에 부착된 생물학적 활성 분자는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 특정 양상들에서, 폴리뉴클레오티드는 mRNA를 포함한다. 다른 양상에서, mRNA는 합성 mRNA이다. 일부 양상들에서, 합성 mRNA는 적어도 하나의 비천연 핵염기를 포함한다. 일부 양상들에서, 특정 종류의 모든 핵염기는 비-자연 핵염기로 대체되어 있다 (예를 들어, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드의 모든 우리딘은 비-자연 핵염기, 예를 들어 5-메톡시우리딘으로 대체될 수 있다). 본 발명의 일부 양상에서, 생물학적 활성 분자는 폴리뉴클레오티드이다.
일부 양상들에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 말레이미드 모이어티와 반응하는 데 사용될 수 있는 티올 그룹을 도입하도록 변형될 수 있다. 일부 양상들에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 티올 그룹과 반응하는 데 사용될 수 있는 말레이미드 모이어티를 도입하도록 변형될 수 있다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산 중합체들을 지칭하기 위해 본 명세서에서 호환적으로 사용된다. 중합체는 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 상기 용어는 또한 자연적으로, 또는 개입에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함하는데; 예를 들어, 다이설파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 라벨링 성분과의 접합(conjugation)과 같은 임의의 다른 조작 또는 변형을 포함할 수 있다. 또한 상기 정의에는 하나 또는 그 이상의 아미노산 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산, 가령, 호모시스테인, 오르니틴, p-아세틸페닐알라닌, D-아미노산 및 크레아틴을 포함함), 뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 변형물도 포함하는 폴리펩티드가 포함된다. 본 발명의 일부 양상에서, 말레이미드 모이어티를 통해 EV, 예를 들어 엑소좀에 부착된 생물학적 활성 분자는 폴리펩티드, 예를 들어, 항체 또는 그의 유도체, 예컨대 ADC, PROTAC, 독소, 융합 단백질 또는 효소이다.
본원에 사용된 용어 "폴리펩티드"는 임의의 크기, 구조 또는 기능의 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드를 지칭한다. 폴리펩티드는 유전자 산물, 자연 발생 폴리펩티드, 합성 폴리펩티드, 상동체, 오솔로그, 파라로그, 단편 및 기타 균등물, 전술한 것의 변이체 및 유사체를 포함한다. 폴리펩티드는 단일 폴리펩티드일 수 있거나 이량체, 삼량체 또는 사량체와 같은 다분자 복합체일 수 있다. 이들은 또한 단일쇄 또는 다중쇄 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 가장 일반적으로 다이설파이드 결합은 다중 사슬 폴리펩티드에서 발견된다. 용어 폴리펩티드는 또한 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공 화학적 유사체인 아미노산 중합체에 적용될 수 있다. 일부 양상들에서, "펩티드"는 50개 이하의 아미노산 길이, 예를 들어, 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50개 아미노산 길이 일 수 있다.
일부 양상들에서, 본원에 개시된 폴리펩티드는 말레이미드 모이어티와 반응하는 데 사용될 수 있는 티올 그룹을 도입하도록 변형될 수 있다. 일부 양상들에서, 본원에 개시된 폴리펩티드는 티올 그룹과 반응하는 데 사용될 수 있는 말레이미드 모이어티를 도입하도록 변형될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "예방하다", "예방하는" 및 이의 변화형은 질환, 장애 및/또는 상태의 발병을 부분적으로 또는 완전히 지연시키는 것; 특정 질환, 장애 및/또는 상태의 하나 이상의 증상, 특징 또는 임상 징후의 발병을 부분적으로 또는 완전히 지연시키는 것; 특정 질환, 장애 및/또는 상태의 하나 이상의 증상, 특징 또는 징후의 발병을 부분적으로 또는 완전히 지연시키는 것; 특정 질환, 장애 및/또는 상태로부터의 진행을 부분적으로 또는 완전히 지연시키는 것; 및/또는 질환, 장애 및/또는 상태와 관련된 병리 발생 위험을 감소시키는 것을 지칭한다. 일부 양상들에서, 결과의 예방은 예방적 치료를 통해 달성된다.
본원에 사용된 용어 "생산자 세포"는 EV, 예를 들어 엑소좀을 생성하기 위해 사용되는 세포를 지칭한다. 생산자 세포는 시험관내 배양된 세포 또는 생체내 세포일 수 있다. 생산자 세포는 EV, 예를 들어 엑소좀 생성에 효과적인 것으로 알려진 세포, 예를 들어, HEK293 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 중간엽 줄기 세포(MSC), BJ 인간 포피 섬유아세포, fHDF 섬유아세포, AGE.HN® 신경전구세포, CAP® 양수세포, 지방간엽줄기세포, RPTEC/TERT1 세포를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 양상들에서, 생산자 세포는 항원 제시 세포가 아니다. 일부 양상들에서, 생산자 세포는 수지상 세포, B 세포, 비만 세포, 대식세포, 호중구, Kupffer-Browicz 세포, 이들 세포 중 임의의 것으로부터 유래된 세포 또는 이들의 조합이 아니다.
본원에 사용된 "예방적"은 질환 또는 병태의 발병을 예방하거나 질환 또는 병태와 관련된 증상을 예방 또는 지연시키기 위해 사용되는 치료 또는 작용 과정을 지칭한다.
본원에 사용된 "예방"은 건강을 유지하고 출혈 에피소드의 발병을 예방 또는 지연시키거나 질환 또는 병태와 관련된 증상을 예방 또는 지연시키기 위해 취해지는 조치를 지칭한다.
"재조합" 폴리펩티드 또는 단백질은 재조합 DNA 기술을 통해 생산된 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭한다. 조작된 숙주 세포에서 발현된 재조합으로 생성된 폴리펩티드 및 단백질은 임의의 적합한 기술에 의해 분리, 분획화되거나 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 자연 또는 재조합 폴리펩티드와 마찬가지로 본 발명의 목적을 위해 단리된 것으로 간주된다. 본원에 개시된 폴리펩티드는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 재조합적으로 생산될 수 있다. 대안적으로, 본원에 개시된 단백질 및 펩티드는 화학적으로 합성될 수 있다. 본 발명의 일부 양상들에서, EV, 예를 들어 엑소좀에 존재하는 스캐폴드 X 단백질 및/또는 스캐폴드 Y 단백질은 생산자 세포에서 스캐폴드 단백질을 과발현함으로써 재조합적으로 생산될 수 있으며, 따라서 생성된 EV, 예를 들어 엑소좀에서 스캐폴드 단백질의 수준은 이러한 스캐폴드 단백질을 과발현하지 않는 생산자 세포의 EV, 예를 들어 엑소좀에 존재하는 스캐폴드 단백질의 수준과 관련하여 유의하게 증가된다.
본원에 사용된 용어 "스캐폴드 모이어티"는, 페이로드, 예를 들어 생물학적 활성 분자, 또는 임의의 다른 관심 화합물 (예를 들어, AAV)을 내강 표면 상의 EV, 예를 들어, 엑소좀에 (예를 들어, 스캐폴드 Y 단백질) 또는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 외부 표면 상에 (예를 들어, 스캐폴드 X 단백질) 연결시키는데 사용될 수 있는 분자, 예를 들어, 이의 단백질 또는 단편 (예를 들어, 이의 기능적 단편)을 지칭한다. 일부 양상들에서, 스캐폴드 단백질은 EV, 예를 들어 엑소좀에 자연적으로 존재하지 않는 폴리펩티드이다. 특정 양상들에서, 스캐폴드 모이어티는 합성 분자를 포함한다. 일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티는 비-폴리펩티드 모이어티를 포함한다. 다른 양상들에서, 스캐폴드 모이어티는 예를 들어, EV, 예를 들어, 엑소좀에 자연적으로 존재하는, 예를 들어, 지질, 탄수화물, 단백질, 또는 이들의 조합 (예를 들어, 당단백질 또는 단백질지질)을 포함한다. 일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티는 EV, 예를 들어 엑소좀에 자연적으로 존재하지 않는 지질, 탄수화물 또는 단백질을 포함한다. 일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티는 EV, 예를 들어 엑소좀에 자연적으로 존재하지만 EV, 예를 들어 엑소좀에서 기본/고유/야생형 수준과 관련하여 풍부해진 지질 또는 탄수화물을 포함한다. 일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티는 EV, 예를 들어 엑소좀에 자연적으로 존재하지만 기본/고유/야생형 수준과 관련하여 생산자 세포에서 재조합 과발현에 의해 예를 들어, EV, 예를 들어 엑소좀에 풍부해진 단백질을 포함한다. 특정 양상들에서, 스캐폴드 모이어티는 스캐폴드 X 단백질 또는 이의 단편이다. 일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티는 스캐폴드 Y 단백질 또는 이의 단편이다. 추가 양상들에서, EV는 스캐폴드 X 단백질 또는 그의 단편 및 스캐폴드 Y 단백질 또는 그의 단편 둘 다를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "스캐폴드 X"는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 표면에서 확인된 EV, 예를 들어 엑소좀, 단백질을 지칭하고 EV에서 과발현되도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 10,195,290에 기재되어 있으며, 이 문헌은 그 전문이 참고로 본원에 포함된다. 스캐폴드 X 단백질의 비제한적 예에는 다음이 포함된다: 프로스타글란딘 F2 수용체 음성 조절인자("PTGFRN"); 바시긴("BSG"); 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원 2("IGSF2"); 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원 3("IGSF3"); 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원 8("IGSF8"); 인테그린 베타-1("ITGB1"); 인테그린 알파-4("ITGA4"); 4F2 세포 표면 항원 중쇄("SLC3A2"); 및 ATP 수송체 단백질의 종류("ATP1A1," "ATP1A2," "ATP1A3," "ATP1A4," "ATP1B3," "ATP2B1," "ATP2B2," "ATP2B3," "ATP2B"), 이의 단편, 및 이들의 임의의 조합. 일부 양상들에서, 스캐폴드 X 단백질은 전체 단백질 또는 이의 단편(예를 들어, 기능적 단편, 예를 들어, EV, 예를 들어, 엑소좀의 외부 표면 또는 내강 표면 상에 또 다른 모이어티를 연결시킬 수 있는 최소 단편) 일 수 있다. 일부 양상들에서, 스캐폴드 X는 생물학적 활성 분자를 EV, 예를 들어 엑소좀의 외부 표면 또는 내강에 연결할 수 있다. 본 발명의 일부 양상에서, 생물학적 활성 분자는 말레이미드 모이어티를 통해 스캐폴드 X 단백질 또는 이의 단편에 화학적으로 연결될 수 있다. 일부 양상들에서, 생물학적 활성 분자는 EV, 예를 들어 엑소좀의 내강 표면 상의 말레이미드 모이어티를 통해 스캐폴드 X 단백질 또는 이의 단편에 화학적으로 연결될 수 있다. 본 발명과 함께 사용될 수 있는 다른 스캐폴드 모이어티의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: 아미노펩티다제 N(CD13); 네프릴라이신(멤브레인 메탈로엔도펩티다제; MME); 엑토뉴클레오티드 피로포스파타제/포스포디에스테라제 패밀리 구성원 1(ENPP1); 뉴로필린-1(NRP1); CD9, CD63, CD81, PDGFR, GPI 단백질, 락타데린, LAMP2, 및 LAMP2B, 이들의 단편, 및 이들의 임의의 조합.
일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티 (예를 들어, 미국 특허 제 10,195,290에 기술된 EV 단백질, 이의 전문이 본원에 참고로 포함됨)는 또 다른 분자 (즉, 제2 결합 파트너)를 결합시키는 데 사용될 수 있는 결합 파트너 (예를 들어, 항원 결합 도메인, 캡시드 단백질, Fc 수용체, 화학적으로 유도된 이량체의 결합 파트너 또는 이들의 임의의 조합)와 융합을 형성한다.
본원에 사용된 용어 "결합 파트너"는 서로 상호작용하여 다량체 (예를 들어, 이량체)를 형성하는 적어도 2개의 요소 중 하나의 구성원을 지칭한다. 일부 양상들에서, 결합 파트너는 제2 결합 파트너와 상호작용하는 제1 결합 파트너이다. 일부 양상들에서, 결합 파트너는 제2 결합 파트너 및/또는 제3 결합 파트너와 상호작용하는 제1 결합 파트너이다. 임의의 결합 파트너가 본원에 개시된 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 일부 양상들에서, 결합 파트너는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 지방산, 소분자, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 특정 양상들에서, 결합 파트너 (예를 들어, 제1 결합 파트너 및/또는 제2 결합 파트너)는 화학적으로 유도된 이량체의 제1 및 제2 결합 파트너로부터 선택된다.
본원에 사용된 용어 "스캐폴드 Y"는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 내강 내부에서 확인된 EV, 예를 들어 엑소좀, 단백질을 지칭하고 EV에서 과발현되도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 국제 특허출원 PCT/US2018/061679에 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 참고로 본원에 포함된다. 스캐폴드 Y 단백질의 비제한적 예는 다음을 포함한다: 미리스토일화된 알라닌이 풍부한 단백질 키나제 C 기질("MARCKS"); 미리스토일화된 알라닌이 풍부한 단백질 키나제 C 기질 유사 1("MARCKSL1"); 및 뇌산 가용성 단백질 1("BASP1"), 이의 단편, 및 이의 임의의 조합. 일부 양상들에서, 스캐폴드 Y 단백질은 전체 단백질 또는 이의 단편(예를 들어, 기능적 단편, 예를 들어, EV, 예를 들어, 엑소좀의 내강 표면에 모이어티를 연결시킬 수 있는 최소 단편) 일 수 있다. 일부 양상들에서, 스캐폴드 Y 단백질 또는 이의 단편은 모이어티를 EV, 예를 들어 엑소좀의 내강 표면에 연결할 수 있다. 본 발명의 일부 양상에서, 모이어티, 예를 들어, 생물학적 활성 분자는 스캐폴드 Y 단백질 또는 이의 단편에 연결, 예를 들어 화학적으로 연결될 수 있다. 일부 양상들에서, 모이어티, 예를 들어 생물학적 활성 분자는 EV, 예를 들어 엑소좀의 내강 표면 상의 스캐폴드 Y 단백질 또는 이의 단편에 연결, 예를 들어 화학적으로 연결될 수 있다.
특정 양상들에서, 스캐폴드 단백질은 EV 단백질의 단편을 포함한다. 일부 양상들에서, 스캐폴드 단백질은 MARCKS, MARCKSL1 또는 BASP1의 단편을 포함한다. 일부 양상들에서, 스캐폴드 단백질은 아미노산 서열 GGKLSKK (서열번호: 17)를 포함한다. 일부 양상들에서, 스캐폴드 단백질은 아미노산 서열 GGKLSKK (서열 번호: 17)를 포함하고, 여기서 C-말단 글라이신 잔기는 미리스토일화되어 있다.
일부 양상들에서, 스캐폴드 단백질은 막횡단 단백질이다. 본원에 사용된 "막횡단 단백질"은 세포외 도메인 (예를 들어, EV, 예를 들어, 엑소좀의 막 외부, 예를 들어, 소포외에 위치하는 적어도 하나의 아미노산), 막횡단 도메인 (예를 들어, EV의 막 내부에, 예를 들어, 엑소좀의 막 내부에 위치하는 적어도 하나의 아미노산), 및 세포내 도메인 (예를 들어, EV, 예를 들어 엑소좀의 막 내부에 위치하는 적어도 하나의 아미노산)을 포함하는 임의의 단백질을 지칭한다. 일부 양상들에서, 본원에 기재된 스캐폴드 단백질은 I형 막횡단 단백질이고, 여기서 막횡단 단백질의 N-말단은 EV, 예를 들어 엑소좀을 둘러싸는 세포외 공간, 예를 들어, 막 외부에 위치한다. 일부 양상들에서, 본원에 기재된 스캐폴드 단백질은 II형 막횡단 단백질이며, 여기서 막횡단 단백질의 N-말단은 EV, 예를 들어, 엑소좀을 둘러싸는 세포내 공간, 예를 들어, 막 내부, 예를 들어, 막의 내강 측, 예를 들어, 소포내에 위치한다.
본원에 사용된 용어 "자기 희생 스페이서"는 제1 모이어티 (예를 들어, 절단가능한 링커)에 대한 결합이 절단되는 경우 제2 모이어티 (예를 들어, 생물학적 활성 분자)으로부터 자발적으로 분리되는 하기에 정의된 스페이서를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "유사성"은 중합체 분자들 사이, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 분자들 (예를 들어, DNA 분자들 및/또는 RNA 분자들) 사이 및/또는 폴리펩티드 분자들 사이의 전반적인 관련성을 지칭한다. 서로에 대한 중합체 분자의 유사성 퍼센트 계산은 동일성 퍼센트의 계산과 동일한 방식으로 수행될 수 있으며, 단 유사성 퍼센트 계산은 당업계에서 이해되는 바와 같이 보존적 치환을 고려한다. 유사성의 백분율은 사용된 비교 스케일, 즉 아미노산이 비교되는지 여부, 예를 들어, 진화적 근접성, 전하, 부피, 유연성, 극성, 소수성, 방향성, 등전점, 항원성 또는 이들의 조합에 따라 결정되는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 용어 "스페이서"는 2개의 이격된 모이어티 (예를 들어, 절단가능한 링커 및 생물학적 활성 분자)를 일반적으로 안정한 다이파르테이트 분자로 함께 공유적으로 연결할 수 있는 이작용기 화학적 모이어티를 지칭한다.
달리 지시되지 않는 한, 하나 이상의 입체중심을 갖는 화합물에 대한 언급은 각각의 입체이성질체 및 이러한 입체이성질체들의 모든 조합을 의미한다.
용어 "대상체", "환자", "개체" 및 "숙주" 및 이들의 변화형은 본 명세서에서 호환가능하게 사용되며, 진단, 치료 또는 치료가 필요한 인간, 가축 (예를 들어, 개, 고양이 등), 농장 동물 (예를 들어, 소, 양, 돼지, 말 등) 및 실험 동물 (예를 들어, 원숭이, 쥐, 생쥐, 토끼, 기니피그 등), 특히 인간을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 포유동물 대상체를 지칭한다. 본원에 기재된 방법은 인간 치료 및 수의학적 적용 모두에 적용할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "실질적으로 없는"은 EV, 예를 들어 엑소좀을 포함하는 샘플이 거대분자, 예를 들어 오염물질을 질량/부피(m/v) 백분율 농도로 10% 미만으로 포함함을 의미한다. 일부 분획들은 0.001% 미만, 0.01% 미만, 0.05% 미만, 0.1% 미만, 0.2% 미만, 0.3% 미만, 0.4% 미만, 0.5% 미만, 0.6% 미만, 0.7% 미만, 0.8% 미만, 0.9% 미만, 1% 미만, 2% 미만, 3% 미만, 4% 미만, 5% 미만, 6% 미만, 7% 미만, 8% 미만, 9% 미만, 또는 10% (m/v)의 거대분자를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "표면-조작된 EV" (예를 들어, 스캐폴드 X-조작된 엑소좀)는 EV의 막 또는 표면 조성이 변형된 EV를 지칭하며, 그 결과 조작된 EV의 표면은 변형 이전 EV 또는 자연 발생 EV의 조성과 상이하다.
본원에서 사용되는 용어 "표면-조작된 엑소좀" (예를 들어, 스캐폴드 X-조작된 엑소좀)는 엑소좀의 막 또는 표면 (외부 표면 또는 내강 표면) 조성이 변형된 엑소좀을 지칭하며, 그 결과 조작된 엑소좀의 표면은 변형 이전 엑소좀 또는 자연 발생 엑소좀의 조성과 상이하다.
이러한 조작은 EV, 예를 들어, 엑소좀의 표면에서 또는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 막에서 이루어질 수 있으며, 그 결과 EV, 예를 들어, 엑소좀의 표면은 변경된다. 예를 들어, 막은 예를 들어 단백질, 지질, 소분자, 탄수화물, 또는 이들의 조합의 조성이 변형될 수 있다. 조성은 화학적, 물리적 또는 생물학적 방법에 의해, 또는 이전에 또는 동시에 화학적, 물리적 또는 생물학적 방법에 의해 변형된 세포로부터 생성됨에 의해 변경될 수 있다. 구체적으로, 조성은 유전 공학에 의해 또는 이전에 유전 공학에 의해 변형된 세포로부터 생성됨에 의해 변경될 수 있다. 일부 양상들에서, 표면 조작된 EV, 예를 들어, 엑소좀은 외인성 단백질(즉, EV, 예를 들어 엑소좀이 자연적으로 발현하지 않는 단백질) 또는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 표면에 노출될 수 있는 또는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 표면에 모이어티를 연결할 수 있는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다. 다른 양상들에서, 표면-조작된 EV, 예를 들어, 엑소좀은 자연 EV, 예를 들어, 엑소좀 단백질 (예를 들어, 스캐폴드 X 단백질) 또는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 표면에 노출될 수 있는 또는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 표면에 모이어티를 연결할 수 있는 이의 단편 또는 변이체의 더 높은 발현 (예를 들어, 더 높은 수)을 포함한다. 특정 양상에서, 표면-조작된 EV, 예를 들어, 엑소좀은, 하나 이상의 막 성분들, 예를 들어, 단백질, 가령, 스캐폴드 X 단백질 또는 이의 단편, 지질, 소분자, 탄수화물, 또는 이들의 임의의 조합의 변형을 포함하며, 이때 상기 성분들 중 적어도 하나는, 예를 들어, 생물학적 활성 분자에, 예를 들어, 말레이미드 모이어티에 의해 연결, 예를 들어, 화학적으로 연결된다.
본원에서 사용되는 용어 "치료적 유효량"은 이를 필요로 하는 대상체에서 원하는 치료 효과, 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 생성하기에 충분한 본 발명의 EV 또는 엑소좀을 포함하는 시약 또는 약학 화합물의 양이다. 예방이 요법으로 간주될 수 있기 때문에 치료적 유효량은 "예방적 유효량"일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치료하다", "치료" 또는 "치료하는"은 예를 들어 질환 또는 병태의 중증도 감소; 질환 과정 기간의 감소; 질환 또는 병태와 관련된 하나 이상의 증상의 개선 또는 제거; 질환 또는 병태를 반드시 치료하는 것은 아니지만 질환 또는 병태가 있는 대상체에게 유익한 효과를 제공하는 것; 또는 이들의 임의의 조합을 지칭한다. 이 용어는 또한 질환 또는 병태 또는 이의 증상의 예방 또는 방지를 포함한다. 한 양상에서, 용어 "치료하는" 또는 "치료"는, 이를 필요로 하는 대상체에서 예를 들어, 항원 (백신 항원) 및 선택적으로 EV, 예를 들어, 엑소좀의 외부 표면에 애쥬번트를 포함하는 EV, 예를 들어, 엑소좀을 투여함으로써 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 분자 (예를 들어, 기능적 분자, 항원, 애쥬번트, 스캐폴드 X 단백질 또는 단편 및/또는 스캐폴드 Y 단백질 또는 이의 단편)의 "변이체"는 당업계에 공지된 방법으로 비교할 때 또 다른 분자와 특정한 구조적 및 기능적 동일성을 공유하는 분자를 지칭한다. 예를 들어, 단백질의 변이체는 또 다른 단백질에서 치환, 삽입, 결실, 프레임 이동 또는 재배열을 포함할 수 있다.
일부 양상들에서, 스캐폴드 X의 변이체 또는 유도체는 전장의 성숙 PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, 또는 ATP 수송체 단백질 또는 이러한 PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, 또는 ATP 수송체 단백질의 단편 (예를 들어, 기능적 단편)에 적어도 약 70% 동일성을 가지는 스캐폴드 X 변이체를 포함한다.
일부 양상들에서, 본원에 개시된 스캐폴드 X 단백질 단편의 변이체 또는 변이체들, 또는 이의 유도체는 EV, 예를 들어 엑소좀에 특이적으로 표적화되는 능력을 보유한다. 일부 양상들에서, 스캐폴드 X 또는 스캐폴드 X 유도체는 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어, 보존적 아미노산 치환을 포함한다.
일부 양상들에서, 스캐폴드 Y의 변이체 또는 이의 유도체는 MARCKS, MARCKSL1, BASP1 또는 이러한 MARCKS, MARCKSL1 또는 BASP1의 단편에 적어도 70%의 동일성을 갖는 변이체를 포함한다.
일부 양상들에서, 스캐폴드 Y 단백질 단편의 변이체 또는 변이체들, 또는 이의 유도체는 EV, 예를 들어 엑소좀의 내강 표면에 특이적으로 표적화되는 능력을 보유한다. 일부 양상들에서, 스캐폴드 Y 단백질은 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어 보존적 아미노산 치환을 포함한다.
자연적으로 발생하는 변이체를 "대립유전자 변이체"라고 하며 유기체의 염색체에서 주어진 위치를 차지하는 유전자의 여러 대체 형태 중 하나를 나타낸다 (Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985)). 이들 대립유전자 변이체는 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드 수준에서 다양할 수 있고 본 발명에 포함된다. 대안적으로, 비-자연 발생 변이체는 돌연변이유발 기술 또는 직접 합성에 의해 생성될 수 있다.
알려진 단백질 조작 방법들 및 재조합 DNA 기술을 사용하여 변이체를 생성하여 폴리펩티드의 특성을 개선하거나 변경할 수 있다. 예를 들어, 생물학적 기능의 실질적인 손실 없이 분비된 단백질의 N-말단 또는 C-말단으로부터 하나 이상의 아미노산이 결실될 수 있다. 그 전체 내용이 참조로 포함되는, Ron et al., J. Biol. Chem. 268: 2984-2988 (1993)은 3, 8 또는 27개의 아미노 말단 아미노산 잔기를 결실시킨 후에도 헤파린 결합 활성을 갖는 변이체 KGF 단백질을 보고하였다. 유사하게, 인터페론 감마는 이 단백질의 카르복시 말단으로부터 8-10개 아미노산 잔기를 결실시킨 후 최대 10배 더 높은 활성을 나타냈다. (Dobeli et al., J. Biotechnology 7:199-216 (1988), 본원에 그 전문이 참고로 포함됨.)
더욱이, 충분한 증거들이 변이체가 종종 자연 발생 단백질과 유사한 생물학적 활성을 유지함을 나타낸다. 예를 들어, Gayle 및 공동 연구자들 (J. Biol. Chem 268:22105-22111(1993), 전문이 본원에 참조로 포함됨)은 인간 사이토카인 IL-1a의 광범위한 돌연변이 분석을 수행했다. 그들은 무작위 돌연변이를 사용하여 분자의 전체 길이에 걸쳐 변이체당 평균 2.5개의 아미노산 변화를 갖는 3,500개 이상의 개별 IL-1a 돌연변이를 생성했다. 가능한 모든 아미노산 위치에서 다중 돌연변이를 조사했다. 연구자들은 "[결합 또는 생물학적 활성]에 거의 영향을 미치지 않으면서 [대부분의] 분자가 변경될 수 있다"는 것을 발견했다. (요약 참조.) 실제로 조사된 3,500개 이상의 뉴클레오티드 서열 중 23개의 고유한 아미노산 서열만이 야생형과 활성이 유의하게 다른 단백질을 생성했다.
상기 명시된 바와 같이, 변이체 또는 유도체는 예를 들어 변형된 폴리펩티드를 포함한다. 일부 양상들에서, 예를 들어 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 지질, 당단백질의 변이체 또는 유도체는 화학적 변형 및/또는 내인성 변형의 결과이다. 일부 양상들에서, 변이체 또는 유도체는 생체내 변형의 결과이다. 일부 양상들에서, 변이체 또는 유도체는 시험관내 변형의 결과이다. 또 다른 양상에서, 변이체 또는 유도체는 생산자 세포에서의 세포내 변형의 결과이다.
변이체 및 유도체에 존재하는 변형은 예를 들어 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 부착, 헴 모이어티의 공유 부착, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유 부착, 포스포티딜이노시톨의 공유 부착, 가교, 고리화, 다이설파이드 결합 형성, 탈메틸화, 공유 가교 형성, 시스테인 형성, 파이로글루타메이트 형성, 포르밀화, 감마-카르복실화, 글리코실화, 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI)의 공유 부착, 수산화, 아이오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 페길화 (Mei et al., Blood 116:270-79 (2010), 이는 그 전문이 본원에 참고로 포함됨), 단백질분해 가공, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황산화, 단백질에 대한 아미노산의 전이-RNA 매개 첨가, 가령, 아르기닐화 및 유비퀴틴화를 포함한다.
일부 양상들에서, 스캐폴드 X 단백질 및/또는 스캐폴드 Y 단백질은 임의의 편리한 위치에서 변형될 수 있다. 일부 양상들에서, 생물학적 활성 분자는 편리한 위치에서 변형될 수 있다. 본 발명의 특정 양상에서, EV, 예를 들어, 엑소좀, 성분 (예를 들어, 단백질, 예컨대 스캐폴드 X 단백질, 스캐폴드 Y 단백질, 지질, 글리칸, 또는 이들의 조합) 및/또는 생물학적 활성 분자 (예를 들어, 항체 또는 ADC, PROTAC, 사이클릭 다이뉴클레오티드와 같은 소분자, MMAE와 같은 독소, STING 효현제, 내성화제, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 백신 항원과 같은 항원, 애쥬번트, 표적화 모이어티, 트로피즘 모이어티, 또는 이들의 임의의 조합)은 적어도 하나의 말레이미드 모이어티를 포함하는 유도체를 생성하도록 변형될 수 있다.
II. 접합된 EV, 예를 들어, 엑소좀
세포외 소포 (EV)는 일반적으로 직경이 20nm에서 1000nm이다; 예를 들어, 작은 세포외 소포인 엑소좀은 일반적으로 직경이 100~200nm이다. 엑소좀과 같은 EV는 제한적인 지질 이중층 및 다양한 단백질 및 핵산 세트로 구성된다 (Maas, S.L.N., et al., Trends. Cell Biol. 27(3):172-188 (2017)). EV, 예를 들어, 엑소좀은 별개의 세포 유형 및 조직에서 우선적으로 흡수되며, 표적 세포 표면의 수용체와 상호작용하는 단백질을 표면에 추가함으로써 이들의 향성이 유도될 수 있다 (Alvarez-Erviti, L., et al., Nat. Biotechnol. 29(4):341-345 (2011)).
항체와 달리 EV (예를 들어, 엑소좀)는 표면에 부착된, EV (예를 들어, 엑소좀)당 수천에서 수만 분자 정도의 많은 수의 분자를 수용할 수 있다. 따라서 EV (예를 들어, 엑소좀)-약물 접합체는 고농도의 치료 화합물을 개별 세포 유형에 전달하는 동시에 화합물에 대한 전반적인 전신 노출을 제한하고, 그리하여 오프-타겟 독성을 감소시키는 플랫폼을 나타낸다.
본 발명은 유리 티올 그룹을 포함하는 제1 분자 엔터티를 말레이미드 그룹을 포함하는 제2 분자 엔터티와 반응시킴으로써 조작된 EV, 예를 들어 엑소좀을 제공하며, 이때 말레이미드 모이어티는 도 1A에 제시된 바와 같이 제1 분자 엔터티 (예를 들어, EV, 예를 들어, 엑소좀, 또는 이의 성분, 가령, 스캐폴드 X 단백질 또는 지질)를 말레이미드 모이어티를 통해 제2 분자 엔터티 (예를 들어, 생물학적 활성 분자)와 공유적으로 연결시킨다.
말레이미드 모이어티를 통해 EV (예를 들어, 엑소좀)에 부착될 수 있는 생물학적 활성 분자들의 비제한적인 예는 제제, 예를 들어, 뉴클레오티드(예를 들어, 검출가능한 모이어티 또는 독소를 포함하거나 전사를 방해하는 뉴클레오티드), 핵산 (예를 들어, 효소와 같은 폴리펩티드를 인코딩하는 mRNA 분자 또는 DNA 또는 miRNA, dsDNA, lncRNA, 또는 siRNA와 같은 조절 기능을 가지는 RNA 분자), 모르폴리노, 아미노산 (예를 들어, 검출가능한 모이어티 또는 독소를 포함하거나 번역을 방해하는 아미노산), 폴리펩티드 (예를 들어, 효소), 지질, 탄수화물, 소분자 (예를 들어, 소분자 약물 및 독소), 항원 (예를 들어, 백신 항원), 애쥬번트 (예를 들어, 백신 애쥬번트) 등을 포함한다.
일부 양상들에서, 본 발명의 EV (예를 들어, 엑소좀)는 하나 이상의 유형의 생물학적 활성 분자를 포함할 수 있다. 일부 양상들에서, 생물학적 활성 분자는, 예를 들어 소분자, 예를 들어 사이클릭 다이뉴클레오티드, 독소, 예를 들어 아우리스타틴 (예를 들어, 모노에틸 아우리스타틴 E, MMAE), 항체 (예를 들어, 네이키드 항체 또는 항체-약물 접합체), STING 효현제, 내성화제, 안티센스 올리고뉴클레오티드, PROTAC, 모르폴리노, 라이소포스파티드산 수용체 길항제 (예를 들어, LPA1 길항제) 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 일부 양상들에서, 본 발명의 EV (예를 들어, 엑소좀)는 예를 들어 백신 항원 및 선택적으로 백신 애쥬번트를 포함할 수 있다. 일부 양상들에서, 본 발명의 EV (예를 들어, 엑소좀)는 치료 페이로드 (예를 들어, STING 또는 하기 개시된 하나의 페이로드) 및 표적화 모이어티 및/또는 트로피즘 모이어티를 포함할 수 있다.
따라서, 본원에 개시된 방법은 도 1A에 제시된 분자 엔터티들을 생성할 수 있으며, 이때 EV (예를 들어, 엑소좀) 또는 이의 임의의 분자 성분, 가령, 폴리펩티드 (예를 들어, 스캐폴드 X 단백질 또는 이의 단편), 지질 , 지단백질, 당단백질, 또는 EV (예를 들어, 엑소좀)에 위치한 자연 발생 또는 비-자연 발생 단백질의 임의의 변이체 또는 유도체는 말레이미드 모이어티를 통해 생물학적 활성 분자, 예를 들어, 치료 페이로드, 표적화 모이어티, 트로피즘 모이어티, 또는 이들의 임의의 조합에 화학적으로 연결될 수 있다. 도 1A에 도시된 바와 같이, 일부 양상들에서, 설프하이드릴 (티올) 그룹을 포함하는 EV (예를 들어, 엑소좀) 또는 이의 분자 성분은 생물학적 활성 모이어티에 부착된 말레이미드 그룹과 반응할 수 있다. 다른 양상들에서, 말레이미드 그룹을 포함하는 EV (예를 들어, 엑소좀) 또는 이의 분자 성분은 생물학적 활성 모이어티에 존재하는 설프하이드릴 (티올) 그룹과 반응할 수 있다. 두 경우 모두 최종 생성물은 티오에터 결합을 통해 EV (예를 들어, 엑소좀)에 화학적으로 부착된 생물학적 활성 분자이다.
II.A. 말레이미드 모이어티
말레이미드 모이어티는 말레이미드 그룹을 포함하는 임의의 화학적 모이어티 (예를 들어, EV, 예를 들어 엑소좀을 링커, 예를 들어 펩티드에 연결하는 이작용기 화학적 모이어티) 일 수 있다:
Figure pct00017
이때
(i) *는 EV (예를 들어, 엑소좀)에 존재하는 임의의 이용가능한 말레이미드-반응 그룹, 예를 들어, 스캐폴드 X 단백질의 유리 티올 그룹에 대한 부착점을 나타내고; 그리고,
(ii) 물결선은 나머지 말레이미드 모이어티에 대한 부착 부위를 나타낸다.
일부 양상들에서, 말레이미드 모이어티는 EV (예를 들어, 엑소좀)에 부착된 황 원자, 예를 들어 티올 그룹의 자연 발생 황 원자 또는 화학적 변형 또는 돌연변이를 통해 도입된 황 원자에 부착된다.
일부 양상들에서, 말레이미드 모이어티는 화학식 (I)를 가지며:
Figure pct00018
(I),
이때
(i) R1은 -C1-10 알킬렌-, -C3-8 카보사이클로-, -O-(C1-8 알킬렌)-, -아릴렌-, -C1-10 알킬렌-아릴렌-, -아릴렌-C1-10 알킬렌-, -C1-10 알킬렌-(C3-8 카보사이클로)-, -(C3-8 카보사이클로)-C1-10 알킬렌-, -C3-8 헤테로사이클로-, -C1-10 알킬렌-(C3-8 헤테로사이클로)-, -(C3-8 헤테로사이클로)-C1-10 알킬렌-, -(CH2CH2O)r-, 및 -(CH2CH2O)r-CH2-로 구성된 그룹에서 선택되고;
(ii) r은, 예를 들어, 1 내지 10의 정수이고;
(iii) *는 EV (예를 들어, 엑소좀)에 존재하는 이용가능한 반응성 황 원자, 예를 들어, 티올 그룹의 황에 대한 부착점을 나타내고; 그리고,
(iv) 물결선은 생물학적 활성 분자에 대한 말레이미드 모이어티의 부착 부위를 나타낸다.
일부 양상들에서, R1은 -C1-8 알킬렌-, -C3-6 카보사이클로-, -O-(C1-6 알킬렌)-, -아릴렌-, -C1-8 알킬렌-아릴렌-, -아릴렌-C1-8 알킬렌-, -C1-8 알킬렌-(C3-6 카보사이클로)-, -(C3-6 카보사이클로)-C1-8 알킬렌-, -C3-6 헤테로사이클로-, -C1-8 알킬렌-(C3-6 헤테로사이클로)-, -(C3-6 헤테로사이클로)-C1-8 알킬렌-, -(CH2CH2O)r-, 및 -(CH2CH2O)r-CH2-이고; 이때 r은, 예를 들어, 1 내지 10의 정수이고;
일부 양상들에서, R1은 -(CH2)s-, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, -O-(CH2)s-, -페닐-, -CH2-페닐-, -페닐-CH2-, - CH2-사이클로펜틸-, -사이클로펜틸- CH2-, -CH2-사이클로헥실-, -사이클로헥실-CH2-, -(CH2CH2O)r-, 및 -(CH2CH2O)r-CH2-이고; 이때 r은, 예를 들어, 1 내지 6의 정수이다.
일부 양상들에서, R1은 -(CH2)s-이고, 이때 s는, 예를 들어, 4, 5, 또는 6이다.
일부 양상들에서, 말레이미드 모이어티는 화학식 (II)를 가지며, 이때 R1은 -(CH2)5-이다:
Figure pct00019
(II).
일부 양상들에서, 말레이미드 모이어티는 화학식 (III)을 가지며, 이때 R1은 -(CH2CH2O)r-CH2-이고, 이때 r은 2이다:
Figure pct00020
(III).
일부 양상들에서, 말레이미드 모이어티는 EV (예를 들어, 엑소좀)에 존재하는 작용기에 공유적으로 연결되며, 이때 작용기는 설프하이드릴 (티올) 그룹이다. 한 양상에서, 설프하이드릴 그룹은 EV (예를 들어, 엑소좀) 표면 상의 단백질, 예를 들어, 스캐폴드 X 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체이다. 예를 들어, 일부 양상들에서, 설프하이드릴 그룹은 티올 지질, 예를 들어, 콜레스테롤-SH, DSPE-SH, 또는 이의 유도체, 예를 들어, 콜레스테롤-PEG-SH 또는 DSPE-PEG-SH 상에 존재할 수 있다.
다른 양상들에서, 말레이미드 모이어티는 말레이미드 모이어티를 제공하도록 화학적으로 유도체화된 EV (예를 들어, 엑소좀) 상에 존재하는 작용기에 공유적으로 연결된다. 예를 들어, 한 양상에서, EV (예를 들어, 엑소좀)에 존재하는 아민 작용기 (예를 들어, 라이신 또는 아르기닌 측쇄 상의 아민, 또는 단백질의 말단 아민 그룹)는 예를 들어 숙신이미드 모이어티 및 말레이미드 모이어티를 포함하는 이작용기 시약으로 유도체화될 수 있다.
다른 양상들에서, EV (예를 들어, 엑소좀)에 존재하는 카르복실 작용기 (예를 들어, 글루탐산 또는 아스파르트산의 측쇄 상의 카르복실, 또는 단백질의 말단 카르복실 그룹)는 예를 들어 아이소시아네이트 모이어티 및 말레이미드 모이어티를 포함하는 이작용기 시약으로 유도체화될 수 있다. 또 다른 양상들에서, EV (예를 들어, 엑소좀)에 존재하는 카르보닐 (산화된 탄수화물)은 예를 들어 하이드라진 모이어티 및 말레이미드 모이어티를 포함하는 이작용기 시약으로 유도체화될 수 있다.
일반적으로, 본원에 개시된 방법은 EV (예를 들어, 엑소좀)의 표면 (외부 표면 또는 내강 표면)에 존재하는 분자 (예를 들어, 단백질, 지질, 당)와 반응할 때 공유적으로 또는 비공유적으로 분자를 변형시켜 적어도 하나의 말레이미드 모이어티를 포함하는 변형된 분자를 생성할 것이다. EV (예를 들어, 엑소좀)의 표면 (외부 표면 또는 내강 표면)에 존재하는 분자는 자연적으로 발생할 수 있거나 비-자연적으로 발생할 수 있다, 즉, 이는 예를 들어, 화학적 변형, 비-자연 발생 분자를 포함하는 조성물과의 배양을 통해, 또는 돌연변이를 통해 (예를 들어, 하나 이상의 시스테인 아미노산을 돌연변이를 통해 단백질에 도입함으로써) 변형되어 있다.
말레이미드 모이어티를 포함하는 이작용기 시약들, 수많은 말레이미드-포함 단위들이 다량체화 할 수 있는 시약들, 또는 말레이미드 그룹을 통해 기능적 모이어티를 첨가할 수 있는 말레이미드-포함 시약들 (예를 들어, PEG)은, 예를 들어, 하이드라진 모이어티 및 말레이미드 모이어티를 포함하는 이작용기 시약들, 아이소시아네이트 모이어티 및 말레이미드 모이어티를 포함하는 이작용기 시약들, N-하이드록시 숙신이미딜 에스터 모이어티 및 말레이미드 모이어티를 포함하는 이작용기 시약들, 숙신이미드 모이어티 및 말레이미드 모이어티를 포함하는 이작용기 시약들, 비오틴-말레이미드, 스트렙타비딘-말레이미드, N-4-말레이미드 부티릭 애시드, N-(4-말레이미드부틸옥시) 숙신이미드, N-[5-(3′-말레이미드 프로필아미드)-1-카르복시펜틸]이미노다이아세틱 애시드, 말레이미드-PEG-숙신이미딜 에스터 (예를 들어, 말레이미드-PEG12-숙신이미딜 에스터, 말레이미드-PEG2-숙신이미딜 에스터, 말레이미드-PEG2000-숙신이미딜 에스터, 말레이미드-PEG5000-숙신이미딜 에스터, 또는 말레이미드-PEGn-숙신이미딜 에스터 이때 1<n<5000), 말레이미드-PEG-말레이미드 (예를 들어, 예를 들어, 말레이미드-PEG12-말레이미드, 말레이미드-PEG2-말레이미드, 말레이미드-PEG2000-말레이미드, 말레이미드-PEG5000-말레이미드, 또는 말레이미드-PEGn-말레이미드 이때 1<n<5000), 말레이미드-OH, 말레이미드-PEGn-OH 이때 1<n<5000, 말레이미드-폴리(에틸렌 글라이콜)-b-폴리(ε-카프로락톤), (S)-(-)-N-(1-페닐에틸)말레이미드, N-(4-클로로페닐)말레이미드, N-(1-피레닐)말레이미드, 메톡시폴리에틸렌 글라이콜 말레이미드, 폴리(에틸렌 글라이콜) 메틸 에터 말레이미드, N-(4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,10,10,11,11,11-헵타데카플루오로운데실)말레이미드, 데페록사민-말레이미드 (즉, 킬레이터-말레이미드), 말레이미드 글리시딜 에터, 이작용기 말레이미도 DTPA, 이작용기 NOTA-말레이미드 킬레이터, 호모이작용기 말레이미드 가교제 (즉, 각 말단에 말레이미드 그룹을 가지는 것들), 비스-말레이미도폴리알킬렌 글라이콜, DBCO-말레이미드, 벤조트라이아졸 말레이미드, 알킨 말레이미드, 말레이미드 작용기화 지질, 말레이미드 작용기화 PEG 지질, 및 일반적으로 적어도 하나의 말레이미드 모이어티, 적어도 하나의 추가 반응성 모이어티 (예를 들어, 말레이미드 또는 또 다른 반응 그룹) 및 하나 이상의 선택적 링커들 (예를 들어, PEG 또는 또 다른 중합체, 가령, 폴리글리세롤)을 포함하는 임의의 분자를 포함한다.
II.B. 링커
본 발명의 EV, 예를 들어 엑소좀은 말레이미드 모이어티를 생물학적 활성 분자 또는 EV (예를 들어, 엑소좀)에 연결 (즉, 결부)시키는 하나 이상의 링커를 포함할 수 있다. 일부 양상들에서, 말레이미드 모이어티는 링커에 의해 생물학적 활성 분자에 연결된다. 링커는, 예를 들어 화학식 (II) 또는 (III)의 말레이미드 모이어티를 생물학적 활성 분자에 연결할 수 있는 임의의 화학적 모이어티일 수 있다. 일부 양상들에서, 말레이미드 모이어티는 하나 이상의 링커를 포함할 수 있다. 일부 양상들에서, 본원에 개시된 링커 또는 이들의 조합은 예를 들어 말레이미드 모이어티를 생물학적 활성 분자에, 제1 생물학적 활성 모이어티를 제2 생물학적 활성 모이어티에, EV (예를 들어, 막 지질 또는 이의 스캐폴드 단백질)를 말레이미드 모이어티에, 또는 EV (예를 들어, 막 지질 또는 이의 스캐폴드 단백질)를 생물학적 활성 모이어티에 연결하는 데 사용될 수 있다.
일부 양상들에서, 용어 "링커"는 펩티드 또는 폴리펩티드 서열 (예를 들어, 합성 펩티드 또는 폴리펩티드 서열) 또는 비-폴리펩티드, 예를 들어 알킬 사슬을 지칭한다. 일부 양상들에서, 2개 이상의 링커는 탠덤 (tandem)으로 연결될 수 있다. 다수의 링커가 본원에 개시된 말레이미드 모이어티에 존재할 때, 각각의 링커는 동일하거나 상이할 수 있다. 일반적으로, 링커는 가요성을 제공하거나 또는 입체 방해를 방지/개선한다. 링커는 전형적으로 절단되지 않지만; 특정 양상들에서, 이러한 절단이 바람직할 수 있다. 따라서, 일부 양상들에서, 링커는 링커의 서열 내에 위치하거나 또는 링커 서열의 양 말단에서 링커에 연접할 수 있는 하나 이상의 프로테아제-절단가능한 부위를 포함할 수 있다.
일부 양상들에서, 링커는 펩티드 링커이다. 일부 양상들에서, 펩티드 링커는 적어도 약 2, 적어도 약 3, 적어도 약 4, 적어도 약 5, 적어도 약 10, 적어도 약 15, 적어도 약 20, 적어도 약 25, 적어도 약 30, 적어도 약 35, 적어도 약 40, 적어도 약 45, 적어도 약 50, 적어도 약 55, 적어도 약 60, 적어도 약 65, 적어도 약 70, 적어도 약 75, 적어도 약 80, 적어도 약 85, 적어도 약 90, 적어도 약 95, 또는 적어도 약 100개 아미노산을 포함할 수 있다.
일부 양상들에서, 펩티드 링커는 적어도 약 110, 적어도 약 120, 적어도 약 130, 적어도 약 140, 적어도 약 150, 적어도 약 160, 적어도 약 170, 적어도 약 180, 적어도 약 190, 또는 적어도 약 200개 아미노산을 포함할 수 있다.
다른 양상들에서, 펩티드 링커는 적어도 약 200, 적어도 약 300, 적어도 약 400, 적어도 약 500, 적어도 약 600, 적어도 약 700, 적어도 약 800, 적어도 약 900, 또는 적어도 약 1,000개 아미노산을 포함할 수 있다. 펩티드 링커는 1 내지 약 5개 아미노산, 1 내지 약 10개 아미노산, 1 내지 약 20개 아미노산, 약 10 내지 약 50개 아미노산, 약 50 내지 약 100개 아미노산, 약 100 내지 약 200개 아미노산, 약 200 내지 약 300개 아미노산, 약 300 내지 약 400개 아미노산, 약 400 내지 약 500개 아미노산, 약 500 내지 약 600개 아미노산, 약 600 내지 약 700개 아미노산, 약 700 내지 약 800개 아미노산, 약 800 내지 약 900개 아미노산, 또는 약 900 내지 약 1000개 아미노산을 포함할 수 있다.
일부 양상들에서, 링커는 글라이신/세린 링커이다. 일부 양상들에서, 펩티드 링커는 공식 [(Gly)n-Ser]m (서열 번호: 46)에 따른 글라이신/세린 링커이고, 이때 n은 1 내지 100의 임의의 정수이고, m은 1 내지 100의 임의의 정수이다. 다른 양상들에서, 글라이신/세린 링커는 공식 [(Gly)x-Sery]z (서열 번호: 47)에 따르며, 이때, x는 1 내지 4의 정수이고, y는 0 또는 1이며, z는 1 내지 50의 정수이다. 일부 양상들에서, 펩티드 링커는 서열 Gn (서열 번호: 48)을 포함하며, 이때 n은 1 내지 100의 정수일 수 있다. 일부 양상들에서, 펩티드 링커는 서열 (GlyAla)n (서열 번호: 49)을 포함할 수 있으며, 이때 n은 1 내지 100의 정수이다. 다른 양상들에서, 펩티드 링커는 서열 (GlyGlySer)n (서열 번호: 50)을 포함할 수 있으며, 이때 n은 1 내지 100의 정수이다.
특정 양상에서, 펩티드 링커의 서열은 GGGG (서열 번호: 30)이다.
일부 양상들에서, 펩티드 링커는 서열 (GlyAla)n을 포함할 수 있으며, 이때 n은 1 내지 100의 정수이다. 다른 양상들에서, 펩티드 링커는 서열 (GlyGlySer)n을 포함할 수 있으며, 이때 n은 1 내지 100의 정수이다.
다른 양상들에서, 펩티드 링커는 서열 (GGGS)n (서열 번호:31)을 포함한다. 또 다른 양상들에서, 펩티드 링커는 서열 (GGS)n(GGGGS)n (서열 번호:217)을 포함한다. 이러한 예들에서, n은 1 내지 100의 정수일 수 있다. 다른 예들에서, n은 1 내지 20의 정수, 즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 일 수 있다. 일부 양상들에서 n은 1 내지 100의 정수이다.
추가적인 링커의 예들에는, GGG, SGGSGGS (서열 번호:218), GGSGGSGGSGGSGGG (서열 번호:219), GGSGGSGGGGSGGGGS (서열 번호:220), GGSGGSGGSGGSGGSGGS (서열 번호:221), 또는 GGGGSGGGGSGGGGS (서열 번호:222)이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 양상들에서, 링커는 폴리-G 서열 (GGGG)n (서열 번호:223)이고, 이때 n은 1-100의 정수일 수 있다.
일부 양상들에서, 펩티드 링커는 합성, 즉, 비-자연 발생적이다. 한 양상에서, 펩티드 링커는 아미노산의 제1 선형 서열을 아미노산의 제2 선형 서열에 연결 또는 유전적으로 융합시키는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 (또는 폴리펩티드) (예를 들어, 자연 또는 비-자연 발생 펩티드)를 포함하며, 이는 제2 선형 서열에는 자연적으로 연결 또는 유전적으로 융합되지 않는다. 예를 들어, 한 양상에서 펩티드 링커는 자연 발생적 폴리펩티드의 변형된 형태(예를 들어, 부가, 치환 또는 결실과 같은 돌연변이를 포함)인 비-자연 발생적 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
다른 양상들에서, 펩티드 링커는 비-자연 발생적 아미노산을 포함할 수 있다. 또 다른 양상에서, 펩티드 링커는 자연에서 발생하지 않는 선형 서열로 발생하는 자연 발생적 아미노산을 포함할 수 있다. 또 다른 양상들에서, 펩티드 링커는 자연 발생적 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다.
일부 양상들에서, 링커는 비-펩티드 링커를 포함한다. 다른 양상들에서, 링커는 비-펩티드 링커로 구성된다. 일부 양상들에서, 비-펩티드 링커는, 예를 들어, 말레이미도 카프로일 (MC), 말레이미도 프로파노일(MP), 메톡실 폴리에틸렌글라이콜 (MPEG), 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스터 (MBS), 숙신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)부티레이트 (SMPB), N-숙신이미딜(4-아이오도아세틸)아미노벤조네이트 (SIAB), 숙신이미딜 6-[3-(2-피리딜다이티오)-프로피온아미드]헥사노에이트 (LC-SPDP), 4-숙신이미딜옥시카보닐-알파-메틸-알파-(2-피리딜다이티오)톨루엔 (SMPT), 등일 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제 7,375,078 참조).
링커는 당업계에 공지된 기술 (예를 들어, 화학적 접합, 재조합 기술 또는 펩티드 합성)을 사용하여 말레이미드 모이어티 내부에 도입될 수 있다. 일부 양상들에서, 링커는 재조합 기술을 사용하여 도입될 수 있다. 다른 양상들에서, 링커는 고체상 펩티드 합성을 사용하여 도입될 수 있다. 특정 양상들에서, 본원에 개시된 말레이미드 모이어티는 재조합 기술을 사용하여 도입된 하나 이상의 링커 및 고체상 펩티드 합성 또는 당업계에 공지된 화학적 접합 방법을 사용하여 도입된 하나 이상의 링커를 동시에 포함할 수 있다.
링커는 절단에 민감하여 ("절단가능한 링커") 생물학적 활성 분자의 방출을 촉진할 수 있다. 그러므로, 일부 양상들에서, 본원에 개시된 말레이미드 모이어티는 절단가능한 링커를 포함할 수 있다. 이러한 절단가능한 링커는 생물학적 활성 분자가 활성을 유지하는 조건하에서, 예를 들어, 산-유도 절단, 광-유도 절단, 펩티다제-유도 절단, 에스테라제-유도 절단, 및 다이설파이드 결합 절단 되기 쉽다. 대안적으로, 링커는 절단에 대해 실질적으로 내성일 수 있다 ("절단불가능한 링커").
일부 절단가능한 링커는 프로테아제에 의해 절단된다 ("프로테아제 절단가능한 링커"). 특정 펩티드들 만이 세포 내부 또는 외부에서 쉽게 절단된다. 예를 들어, Trout et al., 79 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 626-629 (1982) 및 Umemoto et al. 43 Int. J. Cancer, 677-684 (1989) 참고. 절단가능한 링커는 α-아미노산 단위 및 펩티드 결합으로 구성된 절단가능한 부위를 포함할 수 있으며, 이러한 펩티드 결합은 화학적으로 한 아미노산의 카르복실레이트와 제2 아미노산의 아미노 그룹 사이의 아미드 결합이다. 카르복실레이트와 라이신의 α-아미노산 그룹 사이의 결합과 같은 그 외 아미드 결합은 펩티드 결합이 아닌 것으로 이해되고 절단 불가능한 것으로 간주된다.
일부 양상들에서, 프로테아제-절단가능한 링커는 프로테아제, 예를 들어, 예를 들어, 네프릴라이신 (CALLA 또는 CD10), 티멧 올리고펩티다제 (TOP), 류코트리엔 A4 가수분해효소, 엔도텔린 전환 효소, ste24 프로테아제, 뉴로라이신, 미토콘드리아 중간체 펩티다제, 간질 콜라게나제, 콜라게나제, 스트로멜라이신, 마크로파지 엘라스타제, 마트릴라이신, 젤라티나제, 메프린, 프로콜라겐 C-엔도펩티다제, 프로콜라겐 N-엔도펩티다제, ADAM 및 ADAMT 메탈로프로테이나제, 미엘린 관련 메탈로프로테이나제, 에나멜라이신, 종양 괴사 인자 α-전환 효소, 인슐라이신, 나르딜라이신, 미토콘드리아 가공 펩티다제, 마그놀라이신, 닥틸라이신 유사 메탈로프로테아제, 호중구 콜라게나제, 기질 메탈로펩티다제, 막형 기질 메탈로프로테이나제, SP2 엔도펩티다제, 전립선 특이적 항원 (PSA), 플라스민, 유로키나제, 인간 섬유아세포 활성화 단백질 (FAPα), 트립신, 키모트립신, 칼데크린, 췌장 엘라스타제, 췌장 엔도펩티다제, 엔테로펩티다제, 백혈구 엘라스타제, 골수아세포, 키마제, 트립타제, 그랜자임, 각질층 키모트립신 효소, 아크로신, 칼리크레인, 보체 성분 및 인자, 대체-보체 경로 c3/c5 전환효소, 만노스 결합 단백질 관련 세린 프로테아제, 응고 인자, 트롬빈, 단백질 c, u 및 t형 플라스미노겐 활성화제, 카텝신 G, 헵신, 프로스타신, 간세포 성장 인자 활성화 엔도펩티다제, 서브틸라이신/켁신 유형 전구단백질 전환효소, 퓨린, 전구단백질 전환효소, 프롤릴 펩티다제, 아실아미노아실 펩티다제, 펩티딜-글리카미나제, 신호 펩티다제, n-말단 친핵체 아미노하이드롤라제, 20s 프로테아좀, γ-글루타밀 트랜스펩티다제, 미토콘드리아 엔도펩티다제, 미토콘드리아 엔도펩티다제 Ia, htra2 펩티다제, 마트립타제, 부위 1 프로테아제, 레구마인, 카텝신, 시스테인 카텝신, 칼페인, 유비퀴틴 아이소펩티다제 T, 카스파제, 글리코실포스파티딜이노시톨리프로테인 트랜스아미다제, 암 전구응고제, 프로호르몬 티올 프로테아제, γ-글루타밀 가수분해효소, 블레오마이신 가수분해효소, 세프라제, 카텝신 B, 카텝신 D, 카텝신 L, 카텝신 M, 프로테이나제 K, 펩신, 키모신 가스트릭신, 레닌, 얍신 (yapsin) 및/또는 맵신 (mapsins), 전립선 특이적 항원 (PSA), 또는 일반적인 임의의 Asp-N, Glu-C, Lys-C 또는 Arg-C 프로테아제에 대한 절단 부위를 포함한다. 예를 들어, 본원에 그 전문이 참고로 포함되는 Cancer Res. 77(24):7027-7037 (2017)을 참조하라. 일부 양상들에서, 절단가능한 링커 성분은 1 내지 10개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드를 포함한다. 이들 양상들에서, 펩티드는 프로테아제에 의한 링커의 절단을 허용하여, 리소좀 효소와 같은 세포내 프로테아제에 노출시 생물학적 활성 분자의 방출을 촉진한다 (Doronina et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21:778-784). 예시적인 펩티드는 다이펩티드, 트라이펩티드, 테트라펩티드, 펜타펩티드, 및 헥사펩티드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 다이펩티드에는 발린-알라닌 (val-ala), 발린-시트룰린 (val-cit), 페닐알라닌-라이신 (phe-lys), N-메틸-발린-시트룰린, 사이클로헥실알라닌-라이신, 및 베타-알라닌-라이신이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 예시적인 트라이펩티드는 글라이신-발린-시트룰린 (gly-val-cit) 및 글라이신-글라이신-글라이신 (gly-gly-gly)을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
펩티드는 자연 발생 및/또는 비-자연 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 용어 "자연 발생 아미노산"은 Ala, Asp, Cys, Glu, Phe, Gly, His, He, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, 및 Tyr을 지칭한다. "비-자연 아미노산" (즉, 아미노산은 자연적으로 발생하지 않음)은 비제한적인 예로서 호모세린, 호모아르기닌, 시트룰린, 페닐글라이신, 타우린, 아이오도티로신, 셀레노시스테인, 노르류신 ("Nle"), 노르발린 ("Nva"), 베타-알라닌, L- 또는 D-나프탈라닌, 오르니틴("Orn") 등을 포함한다. 펩티드는 특정 효소, 예를 들어 종양 관련 프로테아제, 카텝신 B, C 및 D, 또는 플라스민 프로테아제에 의한 효소적 절단을 위해 설계되고 최적화될 수 있다.
아미노산은 또한 자연 및 비-자연 아미노산의 D-형을 포함한다. "D-"는 자연 발생 ("L-") 아미노산의 배열과 반대로 "D" (우회전성) 배열을 갖는 아미노산을 표시한다. 자연 및 비자연 아미노산은 상업적으로 구입하거나 (Sigma Chemical Co., Advanced Chemtech) 당업계에 공지된 방법을 사용하여 합성할 수 있다.
일부 링커는 에스테라제 ("에스테라제 절단가능한 링커")에 의해 절단된다. 특정 에스테르만이 세포 내부 또는 외부에 존재하는 에스테라제에 의해 절단될 수 있다. 에스터는 카르복시산과 알콜의 축합에 의해 형성된다. 단순 에스터는 단순 알콜, 가령, 지방족 알콜, 및 소형 사이클릭 및 소형 방향족 알콜로 생성된 에스터이다.
일부 양상들에서, 링커는 "환원-민감성 링커"이다. 일부 양상들에서, 환원-민감성 링커는 다이설파이드 결합을 포함한다. 일부 양상들에서, 링커는 "산 불안정 링커"이다. 일부 양상들에서, 산 불안정 링커는 하이드라존을 포함한다. 적합한 산 불안정 링커는 또한 예를 들어, 시스-아코니틱 링커, 하이드라지드 링커, 티오카바모일 링커, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 양상들에서, 링커는 절단불가능한 링커를 포함한다. 절단불가능한 링커는 말레이미드 모이어티를 생물학적 활성 분자에 안정한 공유 방식으로 연결할 수 있는 임의의 화학적 모이어티이며 상기 절단가능한 링커에서 나열된 범주에 속하지 않는다. 따라서, 절단불가능한 링커는 산-유도 절단, 광-유도 절단, 펩티다제-유도 절단, 에스테라제-유도 절단, 및 다이설파이드 결합 절단에 대해 실질적으로 내성이 있다. 또한, 절단불가능성은 링커 내 또는 링커에 인접한 화학 결합이, 사이클릭 다이뉴클레오티드 및/또는 항체가 활성을 잃지 않는 조건하에서, 산, 광불안정성 절단제, 펩티다제, 에스테라제 또는 다이설파이드 결합을 절단하는 화학적 또는 생리학적 화합물에 의해 유도된 절단을 견디는 능력을 의미한다. 일부 양상들에서, 생물학적 활성 분자는 스페이서를 통해 링커에 부착된다. 한 양상에서, 스페이서는 자기 희생 스페이서이다. 또 다른 양태에서, 스페이서는 비-자기 희생 스페이서이다.
일부 양상들에서, 링커는 예를 들어 테트라에틸렌 글라이콜 (TEG), 헥사에틸렌 글라이콜 (HEG), 폴리에틸렌 글라이콜 (PEG), 숙신이미드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 절단 불가능한 링커를 포함한다. 일부 양상들에서, 절단불가능한 링커는 생물학적 활성 분자를 절단불가능한 링커에 연결시키는 스페이서 단위를 포함한다. 일부 양상들에서, 하나 이상의 절단불가능한 링커는 함께 연결된 더 작은 단위들 (예를 들어, HEG, TEG, 글리세롤, C2 내지 C12 알킬 등)를 포함한다. 한 양상에서, 링키지 (linkage)는 에스터 링키지 (예를 들어, 포스포다이에스터 또는 포스포로티오에이트 에스터) 또는 기타 링키지이다.
II.B.1 에틸렌 글라이콜 (HEG, TEG, PEG) 링커
일부 양상들에서, 링커는 절단불가능한 링커를 포함하고, 이때 절단불가능한 링커는 화학식 R3-(O-CH2-CH2)n- 또는 R3-(0-CH2-CH2)n-O-로 특징되는 폴리에틸렌 글라이콜 (PEG)을 포함하고, 이때 R3는 수소, 메틸 또는 에틸이고 n은 2 내지 200의 값을 가진다. 일부 양상들에서, 링커는 스페이서를 포함하고, 이때 스페이서는 PEG이다.
일부 양상들에서, PEG 링커는 올리고-에틸렌 글라이콜, 예를 들어, 다이에틸렌 글라이콜, 트라이에틸렌 글라이콜, 테트라 에틸렌 글라이콜 (TEG), 펜타에틸렌 글라이콜, 또는 헥사에틸렌 글라이콜 (HEG) 링커이다.
일부 양상들에서, n은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 189, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 또는 200의 값을 가진다.
일부 양상들에서, n은 2 내지 10, 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 90 내지 100, 100 내지 110, 110 내지 120, 120 내지 130, 130 내지 140, 140 내지 150, 150 내지 160, 160 내지 170, 170 내지 180, 180 내지 190, 또는 190 내지 200이다.
일부 특정 양상들에서, n은 3 내지 200, 3 내지 20, 10 내지 30, 또는 9 내지 45의 값을 가진다.
일부 양상들에서, PEG는 분지형 PEG이다. 분지형 PEG는 중앙 코어 그룹에서 나오는 3 내지 10개의 PEG 사슬을 가진다.
특정 양상들에서, PEG 모이어티는 단분산 폴리에틸렌 글라이콜이다. 본 발명의 내용에서, 단분산 폴리에틸렌 글라이콜 (mdPEG)은 하나의 정의된 사슬 길이 및 분자량을 갖는 PEG이다. mdPEG는 일반적으로 중합 혼합물로부터 크로마토그래피로 단리하여 생성된다. 특정 화학식에서, 단분산 PEG 모이어티는 약어 mdPEG로 지정된다.
일부 양상들에서, PEG는 방사형(Star) PEG이다. Star PEG는 중앙 코어 그룹에서 나오는 10 내지 100개의 PEG 사슬을 가진다.
일부 양상들에서, PEG는 빗살형(Comb) PEG이다. 빗살형 PEG에는 일반적으로 중합체 백본에 그래프트된 여러 PEG 사슬들이 있다.
특정 양상들에서, PEG는 100g/몰 내지 3000g/몰, 특히 100g/몰 내지 2500g/몰, 보다 특히 약 100g/몰 내지 2000g/몰의 몰 질량을 가진다. 특정 양상들에서, PEG는 200g/몰 내지 3000g/몰, 특히 300g/몰 내지 2500g/몰, 보다 특히 약 400g/몰 내지 2000g/몰의 몰 질량을 가진다.
일부 양상들에서, PEG는 PEG100, PEG200, PEG300, PEG400, PEG500, PEG600, PEG700, PEG800, PEG900, PEG1000, PEG1100, PEG1200, PEG1300, PEG1400, PEG1500, PEG1600, PEG1700, PEG1800, PEG1900, PEG2000, PEG2100, PEG2200, PEG2300, PEG2400, PEG2500, PEG1600, PEG1700, PEG1800, PEG1900, PEG2000, PEG2100, PEG2200, PEG2300, PEG2400, PEG2500, PEG2600, PEG2700, PEG2800, PEG2900, 또는 PEG3000이다. 한 특정 양상에서, PEG는 PEG400이다. 또 다른 특정 양상에서, PEG는 PEG2000이다.
일부 양상들에서, 본 발명의 링커는 여러 개의 PEG 링커, 예를 들어 PEG, HEG 또는 TEG 링커가 연접된 절단가능한 링커를 포함할 수 있다.
일부 양상들에서, 링커는 (HEG)n 및/또는 (TEG)n을 포함하고, 이때 n은 1 내지 50의 정수이고, 각 단위는 예를 들어 포스페이트 에스터 링커, 포스포로티오에이트 에스터 링키지, 또는 이들의 조합을 통해 연결된다.
II.B.2 글리세롤 및 폴리글리세롤 (PG)
일부 양상들에서, 링커는 글리세롤 단위 또는 화학식 ((R3―O―(CH2―CHOH―CH2O)n―)로 기재되는 폴리글리세롤 (PG)을 포함하는 절단불가능한 링커를 포함하고, 이때 R3은 수소, 메틸 또는 에틸이고, 및 n은 3 내지 200의 값을 가진다. 일부 양상들에서, n은 3 내지 20의 값을 가진다. 일부 양상들에서, n은 10 내지 30의 값을 가진다.
일부 양상들에서, PG 링커는 다이글리세롤, 트라이글리세롤, 테트라글리세롤(TG), 펜타글리세롤 또는 헥사글리세롤 (HG) 링커이다.
일부 양상들에서, n은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 189, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 또는 200의 값을 가진다.
일부 양상들에서, n은 2 내지 10, 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 90 내지 100, 100 내지 110, 110 내지 120, 120 내지 130, 130 내지 140, 140 내지 150, 150 내지 160, 160 내지 170, 170 내지 180, 180 내지 190, 또는 190 내지 200이다.
이들 양상들의 일부 대체예들에서, n은 9 내지 45의 값을 가진다. 일부 양상들에서, 이종 모이어티는 화학식 (R3―O―(CH2―CHOR5―CH2―O)n―)로 기재되는 분지형 폴리글리세롤이고 이때 R5는 수소 또는 화학식 (R3―O―(CH2―CHOH―CH2―O)n―)로 기재된 선형 글리세롤 사슬이고 R3는 수소, 메틸 또는 에틸이다. 일부 양상들에서, 이종 모이어티는 화학식 (R3―O―(CH2―CHOR5―CH2―O)n―)로 기재되는 고분지형 폴리글리세롤이고, 이때 R5는 수소 또는 화학식 (R3―O―(CH2―CHOR6―CH2―O)n―)로 기재되는 글리세롤 사슬이고, 여기서 R6는 수소 또는 화학식 (R3―O―(CH2―CHOR7―CH2―O)n―)로 기재되는 글리세롤 사슬이고, R7은 수소 또는 화학식 (R3―O―(CH2―CHOH―CH2―O)n―)로 기재되는 선형 글리세롤 사슬이고 R3는 수소, 메틸 또는 에틸이다. 고분지형 글리세롤 및 이의 합성 방법은 Oudshorn et al. (2006) Biomaterials 27:5471-5479; Wilms et al. (20100 Acc. Chem. Res. 43, 129-41에 기재되어 있으며, 이는 본원에 참고문헌으로 인용된다.
특정 양상들에서, PG는 100g/몰 내지 3000g/몰, 특히 100g/몰 내지 2500g/몰, 보다 특히 약 100g/몰 내지 2000g/몰의 몰 질량을 가진다. 특정 양상들에서, PG는 200g/몰 내지 3000g/몰, 특히 300g/몰 내지 2500g/몰, 보다 특히 약 400g/몰 내지 2000g/몰의 몰 질량을 가진다.
일부 양상들에서, PG는 PG100, PG200, PG300, PG400, PG500, PG600, PG700, PG800, PG900, PG1000, PG1100, PG1200, PG1300, PG1400, PG1500, PG1600, PG1700, PG1800, PG1900, PG2000, PG2100, PG2200, PG2300, PG2400, PG2500, PG1600, PG1700, PG1800, PG1900, PG2000, PG2100, PG2200, PG2300, PG2400, PG2500, PG2600, PG2700, PG2800, PG2900, 또는 PG3000이다. 한 특정 양상에서, PG는 PG400이다. 또 다른 특정 양상에서, PG는 PG2000이다.
일부 양상들에서, 링커는 (글리세롤)n 및/또는 (HG)n 및/또는 (TG)n을 포함하고, 이때 n은 1 내지 50의 정수이고, 각 단위는 예를 들어 포스페이트 에스터 링커, 포스포로티오에이트 에스터 링키지, 또는 이들의 조합을 통해 연결된다.
II.B.3 지방족 (알킬) 링커
일부 양상들에서, 링커는 적어도 하나의 지방족 (알킬) 링커, 예를 들어, 프로필, 부틸, 헥실, 또는 C2-C12 알킬, 예를 들어, C2-C10 알킬 또는 C2-C6 알킬을 포함한다.
일부 양상들에서, 링커는 알킬 사슬, 예를 들어 비치환된 알킬을 포함한다. 일부 양상들에서, 링커 조합은 치환 또는 치환되지 않은 알케닐, 치환 또는 치환되지 않은 알키닐, 아릴알킬, 아릴알케닐, 아릴알키닐, 헤테로아릴알킬, 헤테로아릴알케닐, 헤테로아릴알키닐, 헤테로사이클릴알킬, 헤테로사이클릴알케닐, 헤테로사이클릴알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알킬아릴알킬, 알킬아릴알케닐, 알킬아릴알키닐, 알케닐아릴알킬, 알케닐레일 알케닐, 알케닐 아릴 알키닐, 알키닐 아릴 알킬, 알키닐 아릴 알케닐, 알키닐 아릴 알키닐, 알킬 헤테로아릴 알킬, 알킬 헤테로아릴 알킬, 알킬 헤테로아릴 알케닐, 알킬 헤테로아릴 알키닐, 알케닐 헤테로아릴 알킬, 알케닐 헤테로아릴 알케닐, 알케닐 헤테로아릴 알키닐, 알키닐 헤테로아릴알킬, 알키닐헤테로아릴알케닐, 알키닐헤테로아릴알키닐, 알킬헤테로사이클릴알킬, 알킬헤테로사이클릴알케닐, 알킬헤테로사이클릴알키닐, 알케닐헤테로사이클릴알킬, 알케닐헤테로사이클릴알케닐, 또는 알케닐헤테로사이클릴알키닐을 포함한다.
선택적으로 이들 성분들은 치환된다. 치환기는 알콜, 알콕시 (예를 들어 메톡시, 에톡시, 및 프로폭시), 직쇄 또는 분지쇄 알킬 (예를 들어 C1-C12 알킬), 아민, 아미노알킬 (예를 들어 아미노 C1-C12 알킬), 포스포라미다이트, 포스페이트, 포스포라미데이트, 포스포로다이티오에이트, 티오포스페이트, 하이드라지드, 하이드라진, 할로겐, (예를 들어 F, Cl, Br, 또는 I), 아미드, 알킬아미드 (예를 들어 아미드 C1-C12 알킬), 카르복시산, 카르복실릭 에스터, 카르복시산 무수물, 카르복시산 할로겐화물, 에터, 설포닐 할라이드, 이미데이트 에스터, 아이소시아네이트, 아이소티오시아네이트, 할로포르메이트, 카보두이미드 부가물, 알데하이드, 케톤, 설프하이드릴, 할로아세틸, 알킬 할라이드, 알킬 설포네이트, C(〓O)CH〓CHC(〓O) (말레이미드), 티오에터, 시아노, 당 (예를 들어 만노스, 갈락토스, 및 글루코스), α, β-불포화 카보닐, 알킬 수은, 또는 α,β-불포화 설폰을 포함한다.
용어 "알킬"은 그 자체로 또는 또 다른 치환기의 일부로서, 달리 언급이 없는 한, 지정된 수의 탄소 원자를 가지는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 라디칼을 의미한다 (예를 들어, C1-C10은 1 내지 10개 탄소 원자를 의미함). 전형적으로, 알킬 그룹은 1 내지 24개의 탄소 원자, 예를 들어 1 내지 10개의 탄소 원자, 1 내지 8개의 탄소 원자 또는 1 내지 6개의 탄소 원자를 가질 것이다. "저급 알킬" 그룹은 1 내지 4개 탄소 원자를 가지는 알킬 그룹이다. 용어 "알킬"은 2가- 및 다가 라디칼을 포함한다. 예를 들어, 용어 "알킬"은 적절한 경우, 예를 들어 화학식이 알킬 그룹이 2가임을 나타내거나 치환기가 연결되어 고리를 형성하는 경우 "알킬렌"을 포함한다. 알킬 라디칼의 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소-프로필, n-부틸, tert-부틸, 아이소-부틸, sec-부틸 뿐만 아니라 예를 들어, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸 및 n-옥틸의 상동체 및 이성질체를 포함한다.
용어 "알킬렌"은 그 자체로 또는 다른 치환기의 일부로서 2가 (2라디칼) 알킬 그룹을 의미하며, 이때 알킬은 본원에 정의되어 있다. "알킬렌"은 -CH2CH2CH2CH2-로 예시되나 이에 제한되지 않는다. 전형적으로, "알킬렌" 그룹은 1 내지 24개의 탄소 원자, 예를 들어 10개 이하의 탄소 원자 (예를 들어, 1 내지 8 또는 1 내지 6개 탄소 원자)를 가질 것이다. "저급 알킬렌" 그룹은 1 내지 4개 탄소 원자를 가지는 알킬렌 그룹이다.
용어 "알케닐"은 그 자체로 또는 다른 치환기의 일부로서 2 내지 24개의 탄소 원자 및 하나 이상의 이중 결합을 갖는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 전형적인 알케닐 그룹은 2 내지 10개의 탄소 원자와 적어도 하나의 이중 결합을 가진다. 한 양상에서, 알케닐 그룹은 2 내지 8개의 탄소 원자 또는 2 내지 6개의 탄소 원자 및 1 내지 3개의 이중 결합을 가진다. 예시적인 알케닐 그룹들은 비닐, 2-프로페닐, 1-부트-3-에닐, 크로틸, 2-(부타다이에닐), 2,4-펜타다이에닐, 3-(1,4-펜타다이에닐), 2-아이소펜테닐, 1-펜트-3-에닐, 1-헥스-5-에닐 등을 포함한다.
용어 "알키닐"은 그 자체로 또는 다른 치환기의 일부로서 2 내지 24개의 탄소 원자 및 하나 이상의 삼중 결합을 갖는 불포화 또는 다중불포화 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 전형적인 알케닐 그룹은 2 내지 10개의 탄소 원자와 적어도 하나의 이중 결합을 가진다. 본 발명의 한 양상에서, 알키닐 그룹은 2 내지 6개의 탄소 원자 및 적어도 하나의 삼중 결합을 가진다. 예시적인 알키닐 그룹은 프로프-1-이닐, 프로프-2-이닐(즉, 프로파르길), 에티닐 및 3-부티닐을 포함한다.
용어 “알콕시”, “알킬아미노” 및 “알킬티오” (또는 티오알콕시)는 통상적인 의미로 사용되며, 각각 산소 원자, 아미노 그룹, 또는 황 원자를 통해 분자의 잔기에 부착되는 알킬 그룹들을 지칭한다.
용어 "헤테로알킬"은 그 자체로 또는 다른 용어와 조합되어, 명시된 수의 탄소 원자 (예를 들어, C2-C10, 또는 C2-C8) 및 예를 들어, N, O, S, Si, B 및 P (한 양상에서, N, O 및 S)에서 선택된 적어도 하나의 헤테로원자로 구성된 안정한, 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 라디칼을 의미하며, 이때 질소, 황 및 인 원자는 선택적으로 산화되고, 질소 원자(들)는 선택적으로 4차화된다. 헤테로원자(들)는 헤테로알킬 그룹의 임의의 내부 위치에 위치한다. 헤테로알킬 그룹의 예들에는, -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2-S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -CH2-Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3, 및 -CH=CH-N(CH3)-CH3가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, -CH2-NH-OCH3 및 -CH2-O-Si(CH3)3와 같이 최대 2개의 헤테로원자들이 연속될 수 있다.
유사하게, 그 자체 또는 또다른 치환기의 일부로서 용어 "헤테로알킬렌"은 -CH2-CH2-S-CH2-CH2- 및 -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-에 예시된 바와 같이 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 헤테로알킬로부터 유도된 이가 라디칼을 의미한다. 전형적으로, 헤테로알킬 그룹은 3 내지 24개의 원자 (수소를 제외한 탄소 및 헤테로원자) (3- 내지 24-원 헤테로알킬)를 가질 것이다. 또 다른 예에서, 헤테로알킬 그룹은 총 3 내지 10개의 원자 (3- 내지 10-원 헤테로알킬) 또는 3 내지 8개의 원자 (3- 내지 8-원 헤테로알킬)를 가진다. 용어 "헤테로알킬"은 적절한 경우, 예를 들어 화학식이 헤테로알킬 그룹이 2가임을 나타내거나 치환기가 연결되어 고리를 형성하는 경우 "헤테로알킬렌"을 포함한다.
용어 "사이클로알킬"은 그 자체로 또는 다른 용어와 조합하여 3 내지 24개의 탄소 원자, 예를 들어, 3 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 포화 또는 불포화 비방향족 카보사이클릭 라디칼 (예를 들어, C3-C8 사이클로알킬 또는 C3-C6 사이클로알킬)을 나타낸다. 사이클로알킬의 예에는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸, 1-사이클로헥센일, 3-사이클로헥센일, 사이클로헵틸, 등이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 용어 "사이클로알킬"은 또한 가교된, 폴리사이클릭 (예를 들어, 바이사이클릭) 구조, 예를 들어 노르보닐, 아다만틸 및 바이사이클로[2.2.1]헵틸을 포함한다. "사이클로알킬" 그룹은 아릴 (예를 들어, 페닐), 헤테로아릴 (예를 들어, 피리딜) 및 비-방향족 (예를 들어, 카보사이클 또는 헤테로사이클) 고리에서 선택된 적어도 하나 (예를 들어, 1 내지 3개)의 다른 고리에 융합될 수 있다. "사이클로알킬" 그룹이 융합된 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로사이클 고리를 포함하는 경우, "사이클로알킬" 그룹은 카보사이클 고리를 통해 분자의 잔부에 부착된다.
용어 "헤테로사이클로알킬," "헤테로사이클릭," "헤테로사이클," 또는 "헤테로사이클릴"은 그 자체로 또는 다른 용어와 조합되어, 예를 들어, N, O, S, Si, B 및 P (예를 들어, N, O 및 S)에서 선택된 적어도 하나 내지 최대 5개의 헤테로원자 (예를 들어, 질소, 산소 및 황에서 선택된 1 내지 4개 헤테로원자)를 함유하는 카보사이클릭, 비-방향족 고리 (예를 들어, 3- 내지 8-원 고리 및 예를 들어, 4-, 5-, 6- 또는 7-원 고리) (이때 질소, 황 및 인 원자는 선택적으로 산화되고, 그리고 질소 원자(들)는 선택적으로 4차화되고), 또는 적어도 하나 내지 최대 10개 헤테로원자 (예를 들어, N, O 및 S에서 선택된 1 내지 5개 헤테로원자)를 해당 분야의 통상의 기술자에게 공지된 안정한 조합으로 함유하는 4- 내지 8-원 고리의 융합 고리계를 나타낸다. 예시적인 헤테로사이클로알킬 그룹은 융합된 페닐 고리를 포함한다. "헤테로사이클릭" 그룹이 융합된 아릴, 헤테로아릴 또는 사이클로알킬 고리를 포함하는 경우, "헤테로사이클릭" 그룹은 헤테로사이클을 통해 분자의 잔부에 부착된다. 헤테로원자는 헤테로사이클이 그 분자의 잔부에 부착되는 위치를 차지할 수 있다.
본 발명의 예시적인 헤테로사이클로알킬 또는 헤테로사이클릭 그룹은 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 티오모르폴리닐 S-옥사이드, 티오모르폴리닐 S,S-다이옥사이드, 피페라지닐, 호모피페라지닐, 피롤리디닐, 피롤리닐, 이미다졸리디닐, 테트라하이드로피라닐, 피페리디닐, 테트라하이드로퓨라닐, 테트라하이드로티에닐, 피페리디닐, 호모피페리디닐, 호모모르폴리닐, 호모티오모르폴리닐, 호모티오모르폴리닐 S,S-다이옥사이드, 옥사졸리디노닐, 다이하이드로피라졸릴, 다이하이드로피롤릴, 다이하이드로피라졸릴, 다이하이드로피리딜, 다이하이드로피리미디닐, 다이하이드로퓨릴, 다이하이드로피라닐, 테트라하이드로티에닐 S-옥사이드, 테트라하이드로티에닐 S,S-다이옥사이드, 호모티오모르폴리닐 S-옥사이드, 1-(1,2,5,6-테트라하이드로피리딜), 1-피페리디닐, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐, 4-모르폴리닐, 3-모르폴리닐, 테트라하이드로퓨란-2-일, 테트라하이드로퓨란-3-일, 테트라하이드로티엔-2-일, 테트라하이드로티엔-3-일, 1-피페라지닐, 2-피페라지닐, 등을 포함한다.
"아릴"은 단일 고리 (예를 들어, 페닐)를 가지거나 다른 방향족 또는 비방향족 고리 (예를 들어, 1 내지 3개의 다른 고리)에 융합된 5-, 6- 또는 7-원, 방향족 카보사이클릭 그룹을 의미한다. "아릴" 그룹이 비방향족 고리 (예를 들어, 1,2,3,4-테트라하이드로나프틸) 또는 헤테로아릴 그룹을 포함하는 경우, "아릴" 그룹은 아릴 고리(예를 들어, 페닐 고리)를 통해 분자의 잔부에 결합된다. 아릴 그룹은 (예를 들어, 본원에 기재된 1 내지 5개의 치환기로) 선택적으로 치환된다. 한 예에서, 아릴 그룹은 6 내지 10개의 탄소 원자를 가진다. 아릴 그룹의 비제한적인 예는 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 퀴놀린, 인다닐, 인데닐, 다이하이드로나프틸, 플루오레닐, 테트랄리닐, 벤조[d][1,3]다이옥솔릴 또는 6,7,8,9-테트라하이드로-5H-벤조[a]사이클로헵테닐을 포함한다. 한 양상에서, 아릴 그룹은 페닐, 벤조[d][1,3]다이옥솔릴 및 나프틸로부터 선택된다. 또 다른 양상에서, 아릴 그룹은 페닐이다.
용어 "아릴알킬" 또는 "아랄킬"은 아릴 그룹 또는 헤테로아릴 그룹이 알킬 그룹에 부착되어, 라디칼 -알킬-아릴 및 -알킬-헤테로아릴을 생성하는 라디칼들을 포함하는 것으로 하며, 이때 알킬, 아릴 및 헤테로아릴은 본원에 정의되어 있다. 예시적인 "아릴알킬" 또는 "아랄킬" 그룹은 벤질, 펜에틸, 피리딜메틸 등을 포함한다.
"아릴옥시"는 그룹 -O-아릴을 의미하며, 이때 아릴은 본원에 정의된 바와 같다. 한 예에서, 아릴옥시 그룹의 아릴 부분은 페닐 또는 나프틸이다. 한 양상에서, 아릴옥시 그룹의 아릴 부분은 페닐이다.
용어 "헤테로아릴" 또는 "헤테로방향족"은 N, O, S, Si 및 B(예를 들어, N, O 및 S)로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자 (예를 들어, 1 내지 5개의 헤테로원자, 예를 들어, 1 내지 3개의 헤테로원자)를 함유하는 다중불포화 5-, 6- 또는 7-원 방향족 모이어티를 지칭하며, 이때 질소 및 황 원자는 선택적으로 산화되고, 질소 원자(들)는 선택적으로 4차화된다. "헤테로아릴" 그룹은 단일 고리이거나 또는 다른 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬 고리 (예를 들어, 1 내지 3개의 다른 고리들)에 융합될 수 있다. "헤테로아릴" 그룹이 융합된 아릴, 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬 고리를 포함하는 경우, "헤테로아릴" 그룹은 헤테로아릴 그룹을 통해 분자의 잔부에 부착된다. 헤테로아릴 그룹은 탄소 또는 헤테로원자를 통해 분자의 잔부에 부착될수 있다.
한 예에서, 헤테로아릴 그룹은 4 내지 10개 탄소 원자 및 O, S 및 N에서 선택된 1 내지 5개 헤테로원자를 가진다. 헤테로아릴 그룹의 비-제한적 예는 피리딜, 피리미디닐, 퀴놀리닐, 벤조티에닐, 인돌릴, 인돌리닐, 피리다지닐, 피라지닐, 아이소인돌릴, 아이소퀴놀릴, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 프탈라지닐, 이미다졸릴, 아이속사졸릴, 피라졸릴, 옥사졸릴, 티아졸릴, 인돌리지닐, 인다졸릴, 벤조티아졸릴, 벤즈이미다졸릴, 벤조퓨라닐, 퓨라닐, 티에닐, 피롤릴, 옥사다이아졸릴, 티아다이아졸릴, 트라이아졸릴, 테트라졸릴, 아이소티아졸릴, 나프티리디닐, 아이소크로마닐, 크로마닐, 테트라하이드로아이소퀴놀리닐, 아이소인돌리닐, 아이소벤조테트라하이드로퓨라닐, 아이소벤조테트라하이드로티에닐, 아이소벤조티에닐, 벤즈옥사졸릴, 피리도피리딜, 벤조테트라하이드로퓨라닐, 벤조테트라하이드로티에닐, 퓨리닐, 벤조다이옥솔릴, 트라이아지닐, 프테리디닐, 벤조티아졸릴, 이미다조피리딜, 이미다조티아졸릴, 다이하이드로벤즈아이속사지닐, 벤즈아이속사지닐, 벤즈옥사지닐, 다이하이드로벤즈아이소티아지닐, 벤조피라닐, 벤조티오피라닐, 크로모닐, 크로마노닐, 피리딜-N-옥사이드, 테트라하이드로퀴놀리닐, 다이하이드로퀴놀리닐, 다이하이드로퀴놀리노닐, 다이하이드로아이소퀴놀리노닐, 다이하이드로쿠마리닐, 다이하이드로아이소쿠마리닐, 아이소인돌리노닐, 벤조다이옥사닐, 벤즈옥사졸리노닐, 피롤릴 N-옥사이드, 피리미디닐 N-옥사이드, 피리다지닐 N-옥사이드, 피라지닐 N-옥사이드, 퀴놀리닐 N-옥사이드, 인돌릴 N-옥사이드, 인돌리닐 N-옥사이드, 아이소퀴놀릴 N-옥사이드, 퀴나졸리닐 N-옥사이드, 퀴녹살리닐 N-옥사이드, 프탈라지닐 N-옥사이드, 이미다졸릴 N-옥사이드, 아이속사졸릴 N-옥사이드, 옥사졸릴 N-옥사이드, 티아졸릴 N-옥사이드, 인돌리지닐 N-옥사이드, 인다졸릴 N-옥사이드, 벤조티아졸릴 N-옥사이드, 벤즈이미다졸릴 N-옥사이드, 피롤릴 N-옥사이드, 옥사다이아졸릴 N-옥사이드, 티아다이아졸릴 N-옥사이드, 트라이아졸릴 N-옥사이드, 테트라졸릴 N-옥사이드, 벤조티오피라닐 S-옥사이드, 벤조티오피라닐 S,S-다이옥사이드를 포함한다. 예시적인 헤테로아릴 그룹은 이미다졸릴, 피라졸릴, 티아다이아졸릴, 트라이아졸릴, 아이속사졸릴, 아이소티아졸릴, 이미다졸릴, 티아졸릴, 옥사다이아졸릴, 및 피리딜을 포함한다. 다른 예시적인 헤테로아릴 그룹은 1-피롤릴, 2-피롤릴, 3-피롤릴, 3-피라졸릴, 2-이미다졸릴, 4-이미다졸릴, 피라지닐, 2-옥사졸릴, 4-옥사졸릴, 2-페닐-4-옥사졸릴, 5-옥사졸릴, 3-아이속사졸릴, 4-아이속사졸릴, 5-아이속사졸릴, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 5-티아졸릴, 2-퓨릴, 3-퓨릴, 2-티에닐, 3-티에닐, 2-피리딜, 3-피리딜, 피리딘-4-일, 2-피리미딜, 4-피리미딜, 5-벤조티아졸릴, 퓨리닐, 2-벤즈이미다졸릴, 5-인돌릴, 1-아이소퀴놀릴, 5-아이소퀴놀릴, 2-퀴녹살리닐, 5-퀴녹살리닐, 3-퀴놀릴, 및 6-퀴놀릴을 포함한다. 상기 명시된 아릴 및 헤테로아릴 고리계 각각에 대한 치환기는 하기 허용가능한 아릴 그룹 치환기들의 그룹에서 선택된다.
지방족 링커들의 예에는 다음 구조들이 포함된다: ―O―CO―O―,―NH―CO―O―, ―NH―CO―NH―, ―NH―(CH2)n1―, ―S―(CH2)n1―, ―CO―(CH2)n1―CO―, ―CO―(CH2)n1―NH―, ―NH―(CH2)n1―NH―, ―CO―NH―(CH2)n1―NH―CO―, ―C(〓S)―NH―(CH2)n1―NH―CO―, ―C(〓S)―NH―(CH2)n1―NH―C―(〓S)―, ―CO―O―(CH2)n1―O―CO―, ―C(〓S)―O―(CH2)n1―O―CO―, ―C(〓S)―O―(CH2)n1―O―C―(〓S)―, ―CO―NH―(CH2)n1―O―CO―, ―C(〓S)―NH―(CH2)n1―O―CO―, ―C(〓S)―NH―(CH2)n1―O―C―(〓S)―, ―CO―NH―(CH2)n1―O―CO―, ―C(〓S)―NH―(CH2)n1―CO―, ―C(〓S)―O―(CH2)n1―NH―CO―, ―C(〓S)―NH―(CH2)n1―O―C―(〓S)―, ―NH―(CH2CH2O)n2―CH(CH2OH)―, ―NH―(CH2CH2O)n2―CH2―, ―NH―(CH2CH2O)n2―CH2―CO―, ―O―(CH2)n3―S―S―(CH2)n4―O―P(〓O)2―, ―CO―(CH2)n3―O―CO―NH―(CH2)n4―, ―CO―(CH2)n3―CO―NH―(CH2)n4―, ― (CH2)n1NH―, ―C(O)(CH2) n1NH―, ―C(O)―(CH2) n1-C(O)―, ―C(O)―(CH2) n1-C(O)O―, ―C(O)―O―, ―C(O)―(CH2) n1-NH―C(O)―, ―C(O)―(CH2) n1―, ―C(O)―NH―, ―C(O)―, ― (CH2) n1-C(O)―, ― (CH2) n1-C(O)O―, ― (CH2) n1―, ― (CH2) n1-NH―C(O)―, 이때 n1은 1 내지 40 (예를 들어, 2 내지 20, 또는 2 내지 12)의 정수이고; n2는 1 내지 20 (예를 들어, 1 내지 10, 또는 1 내지 6)의 정수이고; n3 및 n4는 동일하거나 상이할 수 있으며, 1 내지 20 (예를 들어, 1 내지 10, 또는 1 내지 6)의 정수이다.
일부 양상들에서, 링커는 (C3)n, (C4)n, (C5)n, (C6)n, (C7)n, 또는 (C8)n, 또는 이들의 조합을 포함하고, 이때 n은 1 내지 50의 정수이고, 각 단위는 예를 들어 포스페이트 에스터 링커, 포스포로티오에이트 에스터 링키지, 또는 이들의 조합을 통해 연결된다.
II.B.4 절단가능한 링커
일부 양상들에서, 링커는 절단가능한 링커 일 수 있다. 절단가능한 링커라는 용어는 끊어지거나 절단될 수 있는 하나 이상의 링키지 또는 화학 결합을 포함하는 링커를 의미한다. 본원에서 사용되는 절단이라는 용어는 2개 이상의 비교적 작은 분자를 생성하는 방식으로 비교적 큰 분자에서 1개 이상의 화학 결합을 파괴하는 것을 지칭한다. 절단은, 예를 들어, 뉴클레아제, 펩티다제, 프로테아제, 포스파타제, 산화효소 또는 환원효소에 의해, 또는, 예를 들어, 특정 물리화학적 조건, 예를 들어, 산화환원 환경, pH, 반응성 산소 종의 존재 또는 특정 파장의 빛에 의해 매개될 수 있다.
일부 양상들에서, 본원에서 사용되는 용어 "절단가능"은 예를 들어, 포스포다이에스터 및 다이설파이드와 같은 빠르게 분해가능한 링커를 지칭하는 반면, 용어 "절단불가능"은 예를 들어, 뉴클레아제 내성 포스포로티오에이트와 같은 보다 안정한 링키지를 지칭한다. 일부 양상들에서, 절단가능한 링커는 다이뉴클레오티드 또는 트라이뉴클레오티드 링커, 다이설파이드, 이민, 티오케탈, val-cit 다이펩티드, 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 양상들에서, 절단가능한 링커는 발린-알라닌-p-아미노벤질카바메이트 또는 발린-시트룰린-p-아미노벤질카바메이트를 포함한다.
II.B.4.a 산화환원 절단가능한 링커
일부 양상들에서, 링커는 산화환원 절단가능한 링커를 포함한다. 비제한적인 예로서, 절단가능한 링커의 한 유형은 환원 또는 산화시에 절단되는 산화환원 절단가능한 연결 그룹이다. 일부 양상들에서, 산화환원 절단가능한 링커는 다이설파이드 결합을 포함한다, 즉, 이는 다이설파이드 절단가능한 링커이다. 산화환원 절단가능한 링커는, 예를 들어, 세포내 메르캅탄, 산화효소 또는 환원효소에 의해 환원될 수 있다.
II.B.4.b 반응성 산소종 (ROS) 절단가능한 링커
일부 양상들에서, 링커는 예를 들어 활성화된 호중구와 같은 염증 과정에 의해 생성된 과산화물 (O2 -) 또는 과산화수소 (H2O2)와 같은 반응성 산소종 (ROS)에 의해 절단될 수 있는 절단가능한 링커를 포함할 수 있다. 일부 양상들에서, ROS 절단가능한 링커는 티오케탈 절단가능한 링커이다. 예를 들어, 본원에 그 전문이 참고로 포함되는 미국 특허 제 8,354,455B2를 참고하라.
II.B.4.c pH 의존성 절단가능한 링커
일부 양상들에서, 링커는 산성 조건(pH<7) 하에 선택적으로 절단되는 연결 그룹인 산 절단가능 연결 그룹을 포함하는 "산 불안정 링커"이다. 비제한적인 예로서, 산 절단가능한 연결 그룹은 산성 환경, 예를 들어, 약 6.0, 5.5, 5.0 이하에서 절단된다. 일부 양상들에서, pH는 약 6.5 이하이다. 일부 양상들에서, 링커는 일반적인 산으로 작용할 수 있는 효소, 예를 들어 펩티다제 (기질 특이적일 수 있음) 또는 포스파타제와 같은 제제에 의해 절단된다. 세포 내에서 엔도좀 및 리소좀과 같은 특정한 낮은 pH 소기관은 산 절단가능한 연결 그룹에 절단 환경을 제공할 수 있다. 인간 혈청의 pH는 7.4이지만 세포의 평균 pH는 약 7.1에서 7.3 범위로 약간 낮다. 엔도좀은 또한 5.5에서 6.0 범위의 산성 pH를 가지며 리소좀은 훨씬 더 산성인 pH인 약 5.0이다. 따라서, pH 의존성 절단가능한 링커들은 해당 분야에서 때때로 엔도솜적으로 불안정한 링커로 불린다.
산 절단가능한 그룹은 일반식 -C=NN-, C (O) O, 또는 -OC (O)을 가질 수 있다. 또 다른 비제한적인 예는, 에스터 산소 (알콕시 그룹)에 부착된 탄소가 아릴 그룹, 치환된 알킬 그룹, 또는 다이메틸 펜틸 또는 t-부틸과 같은 3차 알킬 그룹에 부착되는 경우이다. 산 절단가능한 연결 그룹들의 예는 아민, 이민, 아미노 에스터, 벤조산 이민, 다이오르토 에스터, 폴리포스포에스터, 폴리포스파젠, 아세탈, 비닐 에테르, 하이드라존, 시스-아코니테이트, 하이드라지드, 티오카바모일, 이미진, 아지도메틸-메틸말레산 무수물, 티오프로피오네이트, 마스킹된 엔도솜 용해제, 시트라코닐 그룹, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다이설파이드 링키지는 또한 pH에 취약하다.
일부 양상들에서, 링커는 낮은 pH-불안정성 하이드라존 결합을 포함한다. 이러한 산-불안정 결합은 접합체, 예를 들어 항체-약물 접합체 분야에서 광범위하게 사용되어 왔다. 예를 들어, 그 전문이 본원에 참고로 포함되어 있는 Zhou et al. (2011) Biomacromolecules 12:1460-7; Yuan et al. (2008) Acta Biomater. 4:1024-37; Zhang et al. (2008) Acta Biomater. 6:838-50; Yang et al. (2007) J. Pharmacol. Exp. Ther. 321:462-8; Reddy et al. (2006) Cancer Chemother. Pharmacol. 58:229-36; Doronina et al. (2003) Nature Biotechnol. 21:778-84를 참고하라.
특정 양상들에서, 링커는 다음에서 선택된 낮은 pH-불안정 결합을 포함한다: 다이올 및 케톤을 형성하기 위해 산성 환경 (예를 들어, pH 7 미만, 약 4 초과)에서 불안정한 케탈; 산성 환경 (예를 들어, pH 7 미만, 약 4 초과)에서 불안정하여 다이올 및 알데하이드를 형성하는 아세탈; 산성 환경(예를 들어, pH 7 미만, 약 4 초과)에서 불안정하여 아민 및 알데하이드 또는 케톤을 형성하는 이민 또는 이미늄; 산성 조건하에서 불안정한 실리콘-산소-탄소 링키지; 규소-질소 (실라잔) 링키지; 규소-탄소 링키지 (예를 들어, 아릴실란, 비닐실란 및 알릴실란); 말레메이트 (말레산 무수물 유도체 및 아민으로부터 합성된 아미드 결합); 오르토 에스터; 하이드라존; 산 촉매 가수분해를 거치도록 설계된 활성화된 카르복시산 유도체 (예를 들어, 에스터, 아미드); 또는 비닐 에터.
추가 예는 미국 특허 제 9,790,494B2 및 제 8,137,695B2에 기재되어 있으며, 그 내용은 그 전문이 참고로 본원에 포함된다.
II.B.4.d 효소 절단가능한 링커
일부 양상들에서, 링커는 세포내 또는 세포외 효소, 예를 들어, 프로테아제, 에스테라제, 뉴클레아제, 아미다제에 의해 절단가능한 링커를 포함할 수 있다. 링커 조합에서 특정 링커를 절단할 수 있는 효소의 범위는 링커의 특정 결합 및 화학 구조에 따라 다르다. 따라서, 펩티드 링커는 예를 들어 펩티다제에 의해 절단될 수 있고, 에스터 링키지를 함유하는 링커는 예를 들어 에스테라제에 의해 절단될 수 있고; 아미드 링키지를 함유하는 링커는 예를 들어 아미다제에 의해 절단될 수 있는 등이다.
II.B.4.e 프로테아제 절단가능한 링커
일부 양상들에서, 링커는 프로테아제 절단가능한 링커, 즉 내인성 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 링커를 포함한다. 특정 펩티드들 만이 세포 내부 또는 외부에서 쉽게 절단된다. 예를 들어, Trout et al., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:626-629, 및 Umemoto et al. (1989) Int. J. Cancer 43:677-684를 참고하라. 절단가능한 링커는 α-아미노산 단위 및 펩티드 결합으로 구성된 절단가능한 부위를 포함할 수 있으며, 이러한 펩티드 결합은 화학적으로 한 아미노산의 카르복실레이트와 제2 아미노산의 아미노 그룹 사이의 아미드 결합이다. 카르복실레이트와 라이신의 α-아미노산 그룹 사이의 결합과 같은 그 외 아미드 결합은 펩티드 결합이 아닌 것으로 이해되고 절단 불가능한 것으로 간주된다.
일부 양상들에서, 프로테아제-절단가능한 링커는 프로테아제, 예를 들어, 예를 들어, 네프릴라이신 (CALLA 또는 CD10), 티멧 올리고펩티다제 (TOP), 류코트리엔 A4 가수분해효소, 엔도텔린 전환 효소, ste24 프로테아제, 뉴로라이신, 미토콘드리아 중간체 펩티다제, 간질 콜라게나제, 콜라게나제, 스트로멜라이신, 마크로파지 엘라스타제, 마트릴라이신, 젤라티나제, 메프린, 프로콜라겐 C-엔도펩티다제, 프로콜라겐 N-엔도펩티다제, ADAM 및 ADAMT 메탈로프로테이나제, 미엘린 관련 메탈로프로테이나제, 에나멜라이신, 종양 괴사 인자 α-전환 효소, 인슐라이신, 나르딜라이신, 미토콘드리아 가공 펩티다제, 마그놀라이신, 닥틸라이신 유사 메탈로프로테아제, 호중구 콜라게나제, 기질 메탈로펩티다제, 막형 기질 메탈로프로테이나제, SP2 엔도펩티다제, 전립선 특이적 항원 (PSA), 플라스민, 유로키나제, 인간 섬유아세포 활성화 단백질 (FAPα), 트립신, 키모트립신, 칼데크린, 췌장 엘라스타제, 췌장 엔도펩티다제, 엔테로펩티다제, 백혈구 엘라스타제, 골수아세포, 키마제, 트립타제, 그랜자임, 각질층 키모트립신 효소, 아크로신, 칼리크레인, 보체 성분 및 인자, 대체-보체 경로 c3/c5 전환효소, 만노스 결합 단백질 관련 세린 프로테아제, 응고 인자, 트롬빈, 단백질 c, u 및 t형 플라스미노겐 활성화제, 카텝신 G, 헵신, 프로스타신, 간세포 성장 인자 활성화 엔도펩티다제, 서브틸라이신/켁신 유형 전구단백질 전환효소, 퓨린, 전구단백질 전환효소, 프롤릴 펩티다제, 아실아미노아실 펩티다제, 펩티딜-글리카미나제, 신호 펩티다제, n-말단 친핵체 아미노하이드롤라제, 20s 프로테아좀, γ-글루타밀 트랜스펩티다제, 미토콘드리아 엔도펩티다제, 미토콘드리아 엔도펩티다제 Ia, htra2 펩티다제, 마트립타제, 부위 1 프로테아제, 레구마인, 카텝신, 시스테인 카텝신, 칼페인, 유비퀴틴 아이소펩티다제 T, 카스파제, 글리코실포스파티딜이노시톨리프로테인 트랜스아미다제, 암 전구응고제, 프로호르몬 티올 프로테아제, γ-글루타밀 가수분해효소, 블레오마이신 가수분해효소, 세프라제, 카텝신 B, 카텝신 D, 카텝신 L, 카텝신 M, 프로테이나제 K, 펩신, 키모신 가스트릭신, 레닌, 얍신 (yapsin) 및/또는 맵신 (mapsins), 전립선 특이적 항원 (PSA), 또는 일반적인 임의의 Asp-N, Glu-C, Lys-C 또는 Arg-C 프로테아제에 대한 절단 부위를 포함한다. 예를 들어, 본원에 그 전문이 참고로 포함되는 Cancer Res. 77(24):7027-7037 (2017)을 참조하라. 일부 양상들에서, 절단가능한 링커 성분은 1 내지 10개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드를 포함한다. 이들 양상들에서, 펩티드는 프로테아제에 의한 링커의 절단을 허용하여, 리소좀 효소와 같은 세포내 프로테아제에 노출시 생물학적 활성 분자의 방출을 촉진한다. 예시적인 펩티드는 다이펩티드, 트라이펩티드, 테트라펩티드, 펜타펩티드, 및 헥사펩티드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
펩티드는 자연 발생 및/또는 비-자연 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 용어 "자연 발생 아미노산"은 Ala, Asp, Cys, Glu, Phe, Gly, His, He, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, 및 Tyr을 지칭한다. "비-자연 아미노산" (즉, 아미노산은 자연적으로 발생하지 않음)은 비제한적인 예로서 호모세린, 호모아르기닌, 시트룰린, 페닐글라이신, 타우린, 아이오도티로신, 셀레노시스테인, 노르류신 ("Nle"), 노르발린 ("Nva"), 베타-알라닌, L- 또는 D-나프탈라닌, 오르니틴("Orn") 등을 포함한다. 펩티드는 특정 효소, 예를 들어 종양 관련 프로테아제, 카텝신 B, C 및 D, 또는 플라스민 프로테아제에 의한 효소적 절단을 위해 설계되고 최적화될 수 있다.
아미노산은 또한 자연 및 비-자연 아미노산의 D-형을 포함한다. "D-"는 자연 발생 ("L-") 아미노산의 배열과 반대로 "D" (우회전성) 배열을 갖는 아미노산을 표시한다. 자연 및 비자연 아미노산은 상업적으로 구입하거나 (Sigma Chemical Co., Advanced Chemtech) 당업계에 공지된 방법을 사용하여 합성할 수 있다.
예시적인 다이펩티드에는 발린-알라닌, 발린-시트룰린, 페닐알라닌-라이신, N-메틸-발린-시트룰린, 사이클로헥실알라닌-라이신, 및 베타-알라닌-라이신이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 예시적인 트라이펩티드는 글라이신-발린-시트룰린 (gly-val-cit) 및 글라이신-글라이신-글라이신 (gly-gly-gly)을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
II.B.4.f 에스테라제 절단가능한 링커
일부 링커는 에스테라제 ("에스테라제 절단가능한 링커")에 의해 절단된다. 특정 에스테르만이 세포 내부 또는 외부에 존재하는 에스테라제 및 아미다제에 의해 절단될 수 있다. 에스터는 카르복시산과 알콜의 축합에 의해 형성된다. 단순 에스터는 단순 알콜, 가령, 지방족 알콜, 및 소형 사이클릭 및 소형 방향족 알콜로 생성된 에스터이다. 에스터계 절단가능한 연결 그룹의 예는 알킬렌, 알케닐렌 및 알키닐렌 기의 에스터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 에스터 절단가능한 연결 그룹은 일반식 -C (O) O- 또는 -OC (O)-를 가진다.
II.B.4.g 포스파타제 절단가능한 링커
일부 양상들에서, 링커 조합은 포스페이트 그룹을 분해하거나 가수분해하는 물질에 의해 절단되는 포스페이트계 절단가능한 연결 그룹을 포함할 수 있다. 세포내 인산 그룹을 절단하는 물질의 예는 세포내 포스파타제와 같은 효소이다. 포스페이트계 연결 그룹의 예는 ―O―P (O) (ORk)―O―, ―O―P (S) (ORk) ―O―, ―O―P (S) (SRk) ― O-, -S-P (O) (ORk) -O-, -O-P (O) (ORk) -S-, -S-P (O) (ORk) -S-, -O-P (S) (ORk) -S-, -SP (S) (ORk) -O-, -OP (O) (Rk) -O-, -OP (S) (Rk) -O- , -SP (O) (Rk) -O-, -SP (S) (Rk) -O-, -SP (O) (Rk) -S-, 또는 -OP (S) (Rk) -S-이고, 이때, Rk는 NH2, BH3, CH3, C1-6 알킬, C6-10 아릴, C1-6 알콕시 또는 C6-10 아릴-옥시이다. 일부 양상들에서, C1-6 알킬 및 C6-10 아릴은 치환되지 않는다. 또 다른 비-제한적 예들은 -O-P (O) (OH) -O-, -O-P (S) (OH) -O-, -O-P (S) (SH) -O-, -S-P (O) (OH) -O-, -O-P (O) (OH) -S-, -S-P (O) (OH) -S-, -O-P (S) ( OH) -S-, -S-P (S) (OH) -O-, -O-P (O) (H) -O-, -O-P (S) (H) -O-, -S -P (O) (H) -O-, -SP (S) (H) -O-, -SP (O) (H) -S-, -OP (S) (H)-S-, 또는 -O-P (O) (OH) -O-이다.
II.B.4.h 광활성화 절단가능한 링커
일부 양상들에서, 상기 조합은 광활성화 절단가능한 링커, 예를 들어, 니트로벤질 링커 또는 니트로벤질 반응 그룹을 포함하는 링커를 포함한다.
II.C 자기 희생 스페이서
일부 양상들에서, 본 발명의 EV (예를 들어, 엑소좀)에서 자기 희생 스페이서는 프로테아제-절단가능한 링커의 효소적 절단 후에 1,4 제거를 거친다. 일부 양상들에서, 본 발명의 EV (예를 들어, 엑소좀)에서 자기 희생 스페이서는 프로테아제-절단가능한 링커의 효소적 절단 후에 1,6 제거를 거친다. 일부 양상들에서, 자기 희생 스페이서는, 예를 들어 p-아미노벤질 카바메이트(PABC), p-아미노 벤질 에터 (PABE), p-아미노 벤질 카보네이트, 또는 이들의 조합이다.
특정 양상들에서, 자기 희생 스페이서는 방향족 그룹을 포함한다. 일부 양상들에서, 방향족 그룹은 벤질, 신나밀, 나프틸 및 바이페닐로 구성된 그룹에서 선택된다. 일부 양상들에서, 방향족 그룹은 헤테로사이클릭이다. 다른 양상들에서, 방향족 그룹은 적어도 하나의 치환기를 포함한다. 일부 양상들에서, 적어도 하나의 치환기는 F, Cl, I, Br, OH, 메틸, 메톡시, NO2, NH2, NO3+, NHCOCH3, N(CH3)2, NHCOCF3, 알킬, 할로알킬, C1-C8 알킬할라이드, 카르복실레이트, 설페이트, 설파메이트, 및 설포네이트로 구성된 그룹에서 선택된다.
다른 양상들에서, 방향족 그룹의 적어도 하나의 C는 N, O, 또는 C-R''로 치환되고, 이때 R''은 H, F, Cl, I, Br, OH, 메틸, 메톡시, NO2, NH2, NO3+, NHCOCH3, N(CH3)2, NHCOCF3, 알킬, 할로알킬, C1-C8 알킬할라이드, 카르복실레이트, 설페이트, 설파메이트, 및 설포네이트에서 독립적으로 선택된다.
일부 양상들에서, 자기 희생 스페이서는 아미노벤질 카바메이트 그룹, 아미노벤질 에터 그룹, 또는 아미노벤질 카보네이트 그룹을 포함한다. 한 양상에서, 자기 희생 스페이서는 p-아미노 벤질 카바메이트 (PABC)이다. P-아미노 벤질 카바메이트 (PABC)는 자기 희생 부위 특이적 전구약물 활성화를 위한 가장 효율적이고 가장 널리 사용되는 커넥터 링키지이다 (예를 들어, Carl et al. (1981) J. Med. Chem. 24:479-480; WO 1981/001145; Rautio et al. (2008) Nature Reviews Drug Discovery 7:255-270; Simplicio et al. (2008) Molecules 13:519-547 참조, 이들 모두는 본원에 그 전문이 참고로 포함됨). PABC는 프로테아제 및 1,6 자발적 단편화에 의한 절단시 모든 아민 약물, 펩티드 및 단백질의 방출을 허용한다.
일부 양상들에서, 자기 희생 스페이서는 생물학적 활성 분자 (예를 들어, 항체)를 프로테아제 절단가능한 기질에 연결한다. 특정 양상에서, PABC 자기 희생 스페이서의 카바메이트 그룹은 생물학적 활성 분자 (예를 들어, 항체)의 N-말단에 연결되고, PABC 자기 희생 스페이서의 아미노 그룹은 프로테아제-절단가능한 기질에 연결된다.
아미노벤질 그룹의 방향족 고리는 방향족 고리 상의 하나 이상의 (예를 들어, R1 및/또는 R2) 치환기로 임의로 치환될 수 있으며, 이는 고리를 형성하는 4개의 비치환 탄소 중 하나에 다른 방식으로 부착된 수소를 대체한다. 본원에서 사용되는 기호 "Rx" (예를 들어, R1, R2, R3, R4)는 본원에 기재된 치환기 그룹을 나타내는 일반 약어이다.
치환기 그룹은 p-아미노벤질 그룹의 자기 희생 능력을 향상시킬 수 있다. Hay et al. (1999) J. Chem Soc., Perkin Trans. 1:2759-2770 참고; 또한, Sykes et al. J. (2000) Chem. Soc., Perkin Trans. 1:1601-1608 참고.
자기 희생적 제거는 예를 들어, 1,4 제거, 1,6 제거 (예를 들어, PABC), 1,8 제거 (예를 들어, p-아미노-신나밀 알코올), β-제거, 고리화-제거 (예를 들어, 4-아미노부탄올 에스터 및 에틸렌다이아민), 고리화/락톤화, 고리화/락톨화 등을 통해 발생할 수 있다. 예를 들어, Singh et al. (2008) Curr. Med. Chem. 15:1802-1826 및 Greenwald et al. (2000) J. Med. Chem. 43:475-487을 참고하라.
일부 양상들에서, 자기 희생 스페이서는, 예를 들어, 신나밀, 나프틸, 또는 바이페닐 그룹을 포함할 수 있다 (예를 들어, Blencowe et al. (2011) Polym. Chem. 2:773-790 참조). 일부 양상들에서, 자기 희생 스페이서는 헤테로사이클 고리를 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 제 7,375,078; 7,754,681 참조). 수성 및 생리학적 조건 모두하에서 자기 희생성인, 수많은 호모방향족 (예를 들어, Carl et al. (1981) J. Med. Chem. 24:479; Senter et al. (1990) J. Org. Chem. 55:2975; Taylor et al. (1978) J. Org. Chem. 43:1197; Andrianomenjanahary et al. (1992) Bioorg. Med. Chem. Lett. 2:1903 참조), 및 쿠마린 (예를 들어, Weinstein et al. (2010) Chem. Commun. 46:553 참조), 퓨란, 티오펜, 티아졸, 옥사졸, 아이속사졸, 피롤, 피라졸 (예를 들어, Hay et al. (2003) J. Med. Chem. 46:5533 참조), 피리딘 (예를 들어, Perry-Feigenbaum et al. (2009) Org. Biomol. Chem. 7:4825 참조), 이미다존 (예를 들어, Nailor et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. Z:1267; Hay and Denny (1997) Tetrahedron Lett. 38:8425 참조), 및 트라이아졸 (예를 들어, Bertrand and Gesson (2007) J. Org. Chem. 72:3596 참조) 계 헤테로방향족 그룹들은 해당 분야에 공지되어 있다. 또한, 본원에 그 전문이 참조로 포함되어 있는 미국 특허 제 7,691,962; 7,091,186; 및 미국 특허출원 공개공보 제 US2006/0269480; US2010/0092496; US2010/0145036; US2003/0130189; 및 US2005/0256030를 참조하라.
일부 양상들에서, 본원에 개시된 말레이미드 모이어티는 직렬로 하나 이상의 자기 희생 스페이서, 예를 들어 2개 이상의 PABC 단위를 포함한다. 예를 들어, de Groot et al. (2001) J. Org. Chem. 66:8815-8830를 참조하라. 일부 양상들에서, 본원에 개시된 말레이미드 모이어티는 형광 프로브에 연결된 자기 희생 스페이서 (예를 들어, p-카르복시벤즈알데하이드 또는 글리옥실산의 헤미티오아민 유도체 또는 p-아미노벤질알콜)를 포함할 수 있다 (예를 들어, Meyer et al. (2010) Org. Biomol. Chem. 8:1777-1780 참조).
자기 희생 링커의 치환기 그룹이 좌에서 우로 기재하여 종래의 화학식으로 명시된 경우, 이들은 우에서 좌로 기재한 구조로부터 생성되는 화학적으로 동일한 치환기들을 균등하게 포함한다. 예를 들어, "-CH2O-"는 "-OCH2-"도 언급하는 것으로 한다.
자기 희생 링커의 치환기, 예를 들어, 상기 논의한 p-아미노벤질 자기 희생 링커의 예를 들어, R1 및/또는 R2 치환기는, 예를 들어, 알킬, 알킬렌, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알킬아미노, 알킬티오, 헤테로알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 아릴알킬, 아릴옥시, 헤테로아릴, 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 화합물이 하나 이상의 치환기를 포함하는 경우, 각각의 치환기는 독립적으로 선택된다.
일부 특정 양상들에서, 링커는 화학식 (IV)를 가지며:
-Aa-Yy- (IV),
이때 각각의 -A-는 독립적으로 아미노산 단위이고, a는 독립적으로 1 내지 12의 정수이고; -Y-는 스페이서 단위이고 y는 0, 1 또는 2이다. 일부 양상들에서, -Aa-는 다이펩티드, 트라이펩티드, 테트라펩티드, 펜타펩티드, 또는 헥사펩티드이다. 일부 양상들에서, -Aa-는 발린-알라닌, 발린-시트룰린, 페닐알라닌-라이신, N-메틸발린-시트룰린, 사이클로헥실알라닌-라이신, 및 베타-알라닌-라이신으로 구성된 그룹에서 선택된다. 일부 양상들에서, -Aa-는 발린-알라닌, 발린-시트룰린이다. 일부 양상들에서, y는 1이다. 일부 양상들에서, -Y-는 자기 희생 스페이서이다.
일부 양상들에서, 자기 희생 스페이서 -Yy-는 화학식 (V)를 가지며:
Figure pct00021
(V),
이때 각각의 R2는 독립적으로 C1-8 알킬, -O-(C1-8 알킬), 할로겐, 니트로, 또는 시아노이고; 그리고 m은 0 내지 4의 정수이다. 일부 양상들에서, m은 0, 1, 또는 2이다. 일부 양상들에서, m은 0이다.
일부 양상들에서, 화학식 (IV)의 절단가능한 링커는 발린-알라닌-p-아미노벤질카바메이트 또는 발린-시트룰린-p-아미노벤질카바메이트이다. 일부 양상들에서, 스페이서 단위 -Y-는 비 자기 희생 스페이서, 예를 들어 예를 들어, -Gly- 또는 -Gly-Gly-이다.
일부 양상들에서, 링커는 산 불안정 링커이다. 일부 양상들에서, 산 불안정 링커는 시스-아코니틱 링커, 하이드라지드 링커, 티오카바모일 링커, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양상들에서, 산 불안정 링커는 생물학적 활성 분자를 산 불안정 링커에 연결하기 위한 스페이서 단위를 포함한다. 적합한 스페이서 단위는 -Yy-와 관련하여 위에서 설명한 것들이다.
일부 양상들에서, 링커는 예를 들어 테트라에틸렌 글라이콜 (TEG), 폴리에틸렌 글라이콜 (PEG), 숙신이미드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 절단 불가능한 링커이다. 일부 양상들에서, 절단불가능한 링커는 생물학적 활성 분자를 절단불가능한 링커에 연결시키는 스페이서 단위를 포함한다.
일부 양상들에서, 본 발명은 생물학적 활성 분자 및 절단가능한 링커를 포함하는 EV (예를 들어 엑소좀)을 제공하며, 여기서 절단가능한 링커는 EV (예를 들어 엑소좀)을 생물학적 활성 분자에 연결하고, 절단가능한 링커는 발린-알라닌-p-아미노벤질카바메이트 또는 발린-시트룰린-p-아미노벤질카바메이트를 포함한다. 일부 양상들에서, EV (예를 들어, 엑소좀)은 EV (예를 들어, 엑소좀)에 존재하는 작용기를 통해 EV (예를 들어, 엑소좀)을 절단가능한 링커에 연결하는 말레이미드 모이어티를 추가로 포함한다. 적합한 말레이미드 모이어티는 상기 기재된 것들, 가령, 예를 들어, 화학식 (I), (II) 및 (III)의 말레이미드 모이어티와 같다 일부 양상들에서, 말레이미드 모이어티는 EV (예를 들어, 엑소좀) 상에 존재하는 작용기에 공유적으로 연결되고, 여기서 작용기는 설프하이드릴 (티올)이고, 여기서 설프하이드릴 그룹은 EV (예를 들어, 엑소좀)의 표면, 예를 들어, EV(예를 들어, 엑소좀)의 외부 표면 상의 단백질 상에 있다.
본 발명은 또한 말레이미드 모이어티, 절단가능한 링커, 및 생물학적 활성 분자를 포함하는 EV (예를 들어, 엑소좀)을 제공하며, 여기서 말레이미드 모이어티는 EV (예를 들어, 엑소좀)을 절단가능한 링커에 연결하고, 절단가능한 링커는 말레이미드 모이어티를 생물학적 활성 분자에 연결한다.
II.D 생물학적 활성 분자
일부 양상들에서, 본원에 개시된 EV (예를 들어, 엑소좀)는 페이로드( 예를 들어, 말레이미드 부분을 통해 EV, 예를 들어, 엑소좀에 화학적으로 연결된 생물학적 활성 분자)를 표적에 전달할 수 있다. 페이로드는 EV (예를 들어, 엑소좀)와 접촉하는 표적 (예를 들어, 표적 세포)에 작용하는 물질이다. 접촉은 시험관내 또는 대상체에서 발생할 수 있다. 말레이미드 모이어티를 통해 EV (예를 들어, 엑소좀)에 연결, 예를 들어, 화학적으로 연결될 수 있는 페이로드의 비제한적인 예는 제제, 예를 들어, 뉴클레오티드(예를 들어, 검출가능한 모이어티 또는 독소를 포함하거나 전사를 방해하는 뉴클레오티드), 핵산 (예를 들어, 효소와 같은 폴리펩티드를 인코딩하는 mRNA 분자 또는 DNA 또는 miRNA, dsDNA, lncRNA, 또는 siRNA와 같은 조절 기능을 가지는 RNA 분자), 모르폴리노, 아미노산 (예를 들어, 검출가능한 모이어티 또는 독소를 포함하거나 번역을 방해하는 아미노산), 폴리펩티드 (예를 들어, 효소), 지질, 탄수화물, 소분자 (예를 들어, 소분자 약물 및 독소), 항원 (예를 들어, 백신 항원), 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 양상들에서, EV (예를 들어, 엑소좀)은 하나 이상의 페이로드, 예를 들어, EV (예를 들어, 엑소좀)의 내강 용액 내 제1 페이로드, 및 말레이미드 모이어티를 통해 예를 들어, EV (예를 들어, 엑소좀)의 외부 표면에 연결된 제2 페이로드를 포함할 수 있다. 일부 양상들에서, 페이로드는 소분자를 포함한다. 일부 양상들에서, 페이로드는 펩티드를 포함한다. 일부 양상들에서, 페이로드는 항원, 예를 들어 백신 항원을 포함한다. 일부 양상들에서, 페이로드는 백신 애쥬번트를 포함한다.
II.D.1 항원 및 백신 항원을 표적으로 하는 페이로드
일부 양상들에서, 페이로드는 항원, 예를 들어 종양 항원과 상호작용한다. 일부 양상들에서, 항원, 예를 들어 종양 항원의 생물학적 기능은 페이로드와의 상호작용에 의해 조절된다 (예를 들어, 항원이 수용체인 경우 페이로드는 수용체 효현제 또는 수용체 길항제일 수 있다). 다른 양상들에서, 페이로드는 면역 반응을 유도할 수 있는 항원 (즉, 백신 항원)을 포함한다. 일부 양상들에서, 페이로드는 면역 반응을 유도할 수 있는 항원 (즉, 백신 항원) 및 애쥬번트 (즉, 백신 애쥬번트)를 포함할 수 있다. 일부 양상들에서, 백신 항원 및 백신 애쥬번트는 동일한 EV, 예를 들어, 엑소좀 상에 존재할 수 있다. 다른 양상들에서, 백신 및 백신 애쥬번트는 상이한 EV, 예를 들어, 엑소좀에 존재할 수 있다.
종양 항원의 비제한적 예는 다음을 포함한다: 알파-태아단백질 (AFP), 암배아 항원(CEA), 상피 종양 항원(ETA), 뮤신 1(MUC1), Tn-MUC1, 뮤신 16(MUC16), 티로시나제, 흑색종 관련 항원(MAGE), 종양 단백질 p53(p53), CD4, CD8, CD45, CD80, CD86, 예정사 리간드 1(PD-L1), 예정사 리간드 2(PD-L2), NY-ESO-1, PSMA, TAG-72, HER2, GD2, cMET, EGFR, 메조텔린, VEGFR, 알파-엽산 수용체, CE7R, IL-3, 암-고환 항원(CTA), MART-1 gp100, TNF-관련 세포사멸-유도 리간드, 또는 이들의 조합.
종양 항원과 상호작용하여, 예를 들어, 종양 항원의 생물학적 기능을 조절하는 페이로드는, 예를 들어, 항체 및 이의 결합 단편, 압타머, 항체 약물 접합체 (ADC), 및 소분자를 포함한다.
일부 양상들에서, 항원은 보편적인 종양 항원이다. 본원에 사용된 용어 "보편적 종양 항원"은 일반적으로 비종양 세포에서보다 종양 세포에서 더 높은 수준으로 발현되고 상이한 기원의 종양에서도 발현되는 단백질과 같은 면역원성 분자를 지칭한다. 일부 양상들에서, 보편적인 종양 항원은 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 이상의 암(예를 들어, 인간 암)에서 발현된다. 일부 양상들에서, 보편적인 종양 항원은 비종양 세포 (예를 들어, 정상 세포)에서 발현될 수 있지만 종양 세포에서 발현되는 것보다 낮은 수준이다. 특정 양상들에서, 보편적인 종양 항원의 발현 수준은 비-종양 세포와 비교하여 종양 세포에서 약 1배, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배 또는 그 이상이다. 특정 양상들에서, 보편적인 종양 항원은 정상 세포에서는 발현되지 않고 종양 세포에서만 발현된다. 본 발명과 함께 사용될 수 있는 보편적인 종양 항원의 비제한적인 예는 종양 혈관계의 내피 라이닝 항원, 서바이빈, 종양 단백질 D52 (TPD52), 안드로겐 수용체 에피토프, 에프린 A형 수용체 2 (EphA2), 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT), 서바이빈, 마우스 이중 분 2 상동체 (MDM2), 시토크롬 P450 1B1 (CYP1B), HER2/neu, 빌름스 종양 유전자 1(WT1), 리빈, 알파태아단백(AFP), 암배아 항원(CEA), 뮤신 16(MUC16), MUC1, 전립선 특이적 막 항원(PSMA), p53 또는 사이클린(D1)을 포함한다.
추가 양상에서, 항원은 신생항원을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "신생항원"은 종양 특이적 돌연변이 유전자에 의해 인코딩되는 항원을 지칭한다.
일부 양상들에서, 항원은 박테리아, 바이러스, 진균, 원생동물, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 유래된다. 일부 양상들에서, 항원은 발암 바이러스 (본원에서 암 관련 바이러스(CAV)로도 지칭됨)로부터 유래된다. 추가 양상에서, 항원은 다음을 포함하는 그룹으로부터 유래된다: 인간 감마 헤르페스 바이러스 4(예를 들어, 엡스타인 바 바이러스(EBV)), 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 거대세포바이러스, 황색포도상구균, 결핵균, 클라미디아 트라코마티스, HIV-1, HIV-2, 코로나 바이러스(예를 들어, COVID -19, MERS-CoV 및 SARS CoV), 필로바이러스 (예를 들어, 마르부르크 및 에볼라), 스트렙토코쿠스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에, 플라스모디아 종 (예를 들어, 비박스 및 팔시파룸), 치쿤구니야 바이러스, 인유두종 바이러스 (HPV), B형 간염 바이러스 (HBV), C형 간염 바이러스 (HCV), 인간 T-림프자극성 바이러스 (HTLV1), 인간 헤르페스 바이러스 8 (HHV8), 메르켈 세포 폴리오마바이러스 (MCV), 단순 헤르페스 바이러스 2 (HSV-2), 클렙시엘라 종, 슈도모나스 아에루기노사, 엔테로코쿠스 종, 프로테우스 종, 엔테로박터 종, 악티노박터 종, 응고효소-음성 스타필로코카이 (CoNS), 마이코플라즈마 종, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 (AAV), 또는 이들의 조합.
일부 양상들에서, EBV에서 유래한 항원은 BZLF1이다. BZLF1 (Zta 또는 EB1으로도 알려짐)은 암을 유발하고 인간 인구의 95%의 B 세포를 주로 감염시키는 EBV의 조기 바이러스 유전자이다. 이 유전자 (다른 유전자와 함께)는 질환 진행의 다른 단계들에서 다른 EBV 유전자들의 발현을 생성하고 바이러스를 잠복형에서 용해형으로 전환하는데 관여한다. ZEBRA(BamHI Z 엡스타인-바 바이러스 복제 활성화제, Zta 및 BZLF1이라고도 함))는 BZLF1에 의해 인코딩된 EBV의 초기 용해 단백질이다. 본원에 그 전문이 모두 참고로 포함되는, Hartlage et al. (2015) Cancer Immunol. Res. 3(7): 787-94, 및 Rist et al.(2015) J. Virology 70:703-12를 참고하라. EBV 항원, 예를 들어 BZLF1을 포함하는 본원에 개시된 EV, 예를 들어 엑소좀은 예를 들어, 이식-후 림프증식성 장애 (PTLD)를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 EV는 EBV 양성 이식을 받는 EBV 음성 환자에게 투여될 수 있다. BZLF1은 PTLD 환자의 지속적인 관해와 관련된 우성 T 세포 항원이다. BZLF1을 포함하는 본원에 개시된 EV, 예를 들어 엑소좀은 BZLF1에 대한 강력한 CD8 T-세포 매개 면역을 유도할 수 있다. 따라서 점막 면역 및 조직 상주 기억 세포는 환자를 PTLDF가 발생하지 않도록 보호할 수 있다. 비제한적인 예시적인 항원은 미국 특허 제 8617564B2에 개시된 항원을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 양상들에서, 항원은 결핵균에서 유래하여 세포 및/또는 체액성 면역 반응을 유도한다. 일부 양상들에서, 항원은 결핵균 (TB 항원)의 하나 이상의 에피토프를 포함한다. ESAT-6, TB10.4, CFP10, Rv2031(hspX), Rv2654c(TB7.7) 및 Rv1038c(EsxJ)를 비롯한 다양한 항원이 결핵균 감염과 관련되어 있다. 예를 들어, 본원에 그 전문이 참고로 포함되는, Lindestam et al., J. Immunol. 188(10):5020-31 (2012)를 참조하라. 일부 양상들에서, 본 발명에 유용한 항원은 ESAT6의 하나 이상의 에피토프를 포함한다. 일부 양상들에서, 본 발명에 유용한 항원은 TB10.4의 하나 이상의 에피토프를 포함한다. 일부 양상들에서, 본 발명에 유용한 항원은 CFP10의 하나 이상의 에피토프를 포함한다. 일부 양상들에서, 본 발명에 유용한 항원은 Rv2031 (hspX)의 하나 이상의 에피토프를 포함한다. 일부 양상들에서, 본 발명에 유용한 항원은 Rv2654c (TB7.7)의 하나 이상의 에피토프를 포함한다. 일부 양상들에서, 본 발명에 유용한 항원은 Rv1038c (EsxJ)의 하나 이상의 에피토프를 포함한다. 일부 양상들에서, 본 발명에 유용한 항원은 ESAT6, TB10.4 (ESAT-6-유사 단백질 EsxH; cfp7), CFP10, Rv2031 (hspX), Rv2654c (TB7.7), Rv1038c (EsxJ), 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 그룹에서 선택된 에피토프를 포함한다.
일부 양상들에서, TB 항원은 TB 항원의 특정 에피토프, 예를 들어 ESAT6 또는 TB10.4의 특정 에피토프를 포함한다. 일부 양상들에서, ESAT6 항원은 MTEQQWNFAGIEAAASAIQGNVTSIHSLLDEGKQSLTKLAAAWGGSGSEAYQGVQQKWDATATELNNALQNLARTISEAGQAMASTEGNVTGMFA (서열 번호: 230; GenBank: AWM98862.1)에 제시된 아미노산 서열 중 3개 이상의 아미노산, 4개 이상의 아미노산, 5개 이상의 아미노산, 6개 이상의 아미노산, 7개 이상의 아미노산, 8개 이상의 아미노산, 9개 이상의 아미노산, 10개 이상의 아미노산, 11개 이상의 아미노산, 12개 이상의 아미노산, 13개 이상의 아미노산, 14개 이상의 아미노산, 15개 이상의 아미노산을 갖는 에피토프를 포함한다. 일부 양상들에서, TB10.4 항원은 MSQIMYNYPAMLGHAGDMAGYAGTLQSLGAEIAVEQAALQSAWQGDTGITYQAWQAQWNQAMEDLVRAYHAMSSTHEANTMAMMARDPAEAAKWGG (서열 번호: 231; NCBI 참조 서열: WP_057308237.1)에 제시된 아미노산 서열 중 3개 이상의 아미노산, 4개 이상의 아미노산, 5개 이상의 아미노산, 6개 이상의 아미노산, 7개 이상의 아미노산, 8개 이상의 아미노산, 9개 이상의 아미노산, 10개 이상의 아미노산, 11개 이상의 아미노산, 12개 이상의 아미노산, 13개 이상의 아미노산, 14개 이상의 아미노산, 15개 이상의 아미노산을 갖는 에피토프를 포함한다.
일부 양상들에서, 항원은 자가 항원을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "자기-항원"은 숙주 세포 또는 조직에 의해 발현되는 항원을 지칭한다. 정상적인 건강한 상태에서 이러한 항원은 신체에서 자기로 인식되고 면역 반응을 일으키지 않는다. 그러나 특정 질환 상태에서 신체의 면역 체계는 자가 항원을 이물질로 인식하고 이에 대한 면역 반응을 일으켜 자가 면역을 일으킬 수 있다. 특정 양상들에서, 본 발명의 EV, 예를 들어, 엑소좀은 자기-항원 (즉, T 세포 반응이 유도되어 자기면역을 초래하는 자기 (생식세포) 단백질)을 포함할 수 있다. 이러한 EV, 예를 들어 엑소좀은 자기반응 T 세포를 표적으로 하고 이들의 활성을 억제하는 데 사용될 수 있다. 자기-항원 (관련 질환 또는 장애 포함)의 비-제한적 예는 다음을 포함한다: (i) 베타 세포 단백질, 인슐린, 섬 항원 2(IA-2), 글루탐산 탈탄산효소 (GAD65) 및 아연 수송체 8 (ZNT8) (I형 당뇨병), (ii) 수초 희소돌기아교세포 당단백질 (MOG), 수초 염기성 단백질 (MBP), 단백지질 단백질( PLP) 및 수초-관련 당단백질 (MAG) (다발성 경화증), (iii) 시트룰린화 항원 및 활액 단백질 (류마티스 관절염), (iv) 아쿠아포린-4 (AQP4) (시신경척수염), (v) 니코틴성 아세틸콜린 수용체 (nAChR) (중증 근무력증), (vi) 데스모글레인-1 (DSG1) 및 데소글레인-2 (DSG2) (심상천포창), (v) 갑상선자극호르몬 수용체 (그레이브스병), (vi) IV형 콜라겐 (굿파스처 증후군), (vii) 티로글로불린, 갑상선 과산화효소, 및 갑상선 자극 호르몬 수용체 (TSHR) (하시모토 갑상선염), 또는 (viii) 이들의 조합.
II.D.2 PROTAC
일부 양상들에서, 페이로드는 단백질분해-표적 키메라 (PROTAC)를 포함한다. PROTAC은 표적 단백질에 대한 리간드, E3 유비퀴틴화 리가아제에 대한 리간드 및 두 리간드를 연결하는 링커로 구성된 이종이작용기 분자이다. 표적:PROTAC:E3 3원 복합체가 형성되면 E2 유비퀴틴 접합 효소가 유비퀴틴을 표적 단백질 표면의 라이신 잔기로 전달한다. 일부 양상들에서, PROTAC 표적은, 예를 들어, ERα, BCR-ABL, BRD4, PDE4, ERRα, RIPK2, c-ABL, BRD2, BRD3, BRD4, FKBP12, TBK1, BRD9, EGFR, c-Met, Sirt2, CDK9, FLT3, BTK, ALK, AR, TRIM24, SMAD3, RAR, PI3K, PCAF, METAP2, HER2, HDAC6, GCN5, ERK1/2, DHODH, CRABP-II, FLT4, 또는 CK2이다. 일부 양상들에서, PROTAC 표적 리간드는, 예를 들어, 4-OHT, 다사티닙, JQ1, PDE4 억제제, JQ1, 클로로알칸, 티졸리딘다이온계 리간드, RIPK2 억제제, 보수티닙, JQ1 유도체, OTX015, 강철인자, TBK1 억제제, BI-7273, 라파티닙, 게피티닙, 아파티닙, 포레티닙, Sirt2 억제제 3b, HJB97, SNS-032, 아미노피라졸 유사체, AC220, RN-486, 세리티닙, AR 길항제, IACS-7e, 또는 이브루티닙 유도체. 일부 양상들에서, PROTAC E3 리간드는, 예를 들어, LCL161 유도체, VHL1, 하이드록시프롤린 유도체, 포말리도마이드, 탈리도마이드, HIF-1α 유래 (R)-하이드록시프롤린, VHL 리간드 2, VH032 유도체, 레날리도마이드, 탈리도마이드 유도체 또는 VL-269. 일부 양상들에서, E3 리가제는, 예를 들어, IAP, VHL, 또는 CRBN이다. 예를 들어, 그 전문이 본원에 참고로 포함되는, An & Fu (2018) EBioMedicine 36:553-562를 참고하라.
본원에 개시된 방법에 따라 사용될 수 있는 PROTACS 및 관련 기술들은 예를 들어, WO2018106870, US2018155322, WO2018098288, WO2018098280, WO2018098275, WO2018089736, WO2018085247, US20180125821, US20180099940, WO2018064589, WO2018053354, WO2017223452, WO2017201449, WO2017197056, WO2017197051, WO2017197046, WO2017185036, WO2017185034, WO2017185031, WO2017185023, WO2017182418, US20170305901, WO2017176708, US20170281784, WO2017117474, WO2017117473, WO2017079723, US9938264, US20170065719, WO2017024319, WO2017024318, WO2017024317, US20170037004, US20170008904, US20180147202, WO2018051107, WO2018033556, US20160272639, US20170327469, WO2017212329, WO2017211924, US20180085465, US20160045607, US20160022642, WO2017046036, US20160058872, US20180134688, US20180118733, US20180050021, US9855273, US20140255361, US9115184, US20180093990, US20150119435, US20140356322, US20140112922, US9765019, US20180100001, US7390656, 또는 US7208157에 개시되어 있으며, 이들 모두는 본원에 그 전문이 참고로 포함된다.
일부 양상들에서, EV (예를 들어, 엑소좀)에 여러 PROTAC이 존재하는 경우 이러한 PROTAC은 동일할 수도 있고 다를 수도 있다. 일부 양상들에서, 본원에 개시된 EV (예를 들어, 엑소좀)에 여러 PROTAC이 존재하는 경우 이러한 PROTAC은 동일할 수도 있고 다를 수도 있다. 일부 양상들에서, 본 발명의 EV(예를 들어, 엑소좀) 조성물은 둘 이상의 EV 집단들, 예를 들어, 엑소좀을 포함할 수 있고, 여기서 EV, 예를 들어 엑소좀의 각 집단은 상이한 PROTAC 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 양상들에서, PROTAC는 적어도 하나의 설프하이드릴 그룹을 포함하고, 이때 말레이미드 모이어티는 EV, 예를 들어, 엑소좀을 PROTAC에 연결한다. 일부 양상들에서, 설프하이드릴 그룹은 PROTAC의 E3 리가제 리간드 모이어티에 위치한다. 일부 양상들에서, 설프하이드릴 그룹은 PROTAC의 표적 단백질 리간드 모이어티에 위치한다. 일부 양상들에서, 설프하이드릴 그룹은 PROTAC의 링커 모이어티에 위치한다. 일부 양상들에서, 설프하이드릴 그룹은 PROTAC의 자연 발생 반응 그룹이다.
다른 양상들에서, 말레이미드 모이어티는 PROTAC, 예를 들어, 화학적 유도체화를 통해 도입된다. 일부 양상들에서, 화학적 유도체화는 PROTAC에 존재하는 화학적 그룹과 반응할 수 있는 모이어티를 포함하는 이작용기 링커 (이작용기 시약)를 통해 일어나며, 이러한 모이어티는 본원에 개시된 말레이미드 모이어티와 반응할 수 있는 모이어티를 포함한다.
일부 양상들에서, E3 리가제 리간드는 절단가능한 링커, 예를 들어 PABC를 통해 PROTAC에 부착된다. 다른 양상들에서, 표적 리간드는 절단가능한 링커, 예를 들어, PABC를 통해 PROTAC에 부착된다. 다른 양상들에서, E3 리가제 리간드와 표적 리간드 모두 절단가능한 링커를 통해 PROTAC에 부착된다. 일부 양상들에서, 절단가능한 링커들 모두는 동일한 절단가능한 링커일 수 있다. 다른 양상들에서, 절단가능한 링커들 모두는 상이하다.
PROTAC, 예를 들어, EV, 예를 들어, 본원에 개시된 엑소좀에 연결된 PROTAC의 기능성은 당업계에 공지된 시험관내 및 생체내 방법에 따라 평가될 수 있다. 예를 들어, PROTAC은 표적 단백질의 유비퀴틴 매개 분해를 유도하기 때문에 PROTAC 활성은 표적 단백질의 분해 (예를 들어, 웨스턴 블롯)를 직접 측정하거나 표적 단백질에 의해 매개되는 기능적 활성 (예를 들어, 인산화의 변화 또는 표적 단백질이 단백질 키나제인 경우 인산화-매개 세포 신호전달)을 측정하는 분석을 사용하여 결정될 수 있다.
일부 특정 양상에서, PROTAC은 TBK1 표적화 리간드, 링커, 및 VHL (E3 리가제) 결합 리간드를 포함한다 (예를 들어, 도 10C 참조).
다른 양상들에서, EV, 예를 들어, 엑소좀은 CLIPTAC (클릭-형성된 PROTAC) 형성을 위한 두 가지 전구체를 포함한다. 따라서, EV, 예를 들어, 본 발명의 엑소좀은 말레이미드 모이어티를 통해 EV에 연결된 2개의 CLIPTAC 전구체 집단을 포함할 수 있다. UV가 표적 세포에 결합되면 CLIPTAC 전구체는 생체-직교 클릭 조합에 의해 세포 내에서 결합되어 이종이작용기 PROTAC을 생성할 수 있다. 본원에 그 전문이 참고문헌으로 포함된 Lebraud et al. (2016) ACS Cent. Sci. 2:927-934를 참고하라.
일반적으로, PROTAC는 화학식 [ULM]-[L]-[PTM]에 따라 기재될 수 있으며, 이때 [ULM]은 유비퀴틴-L 결합 모이어티 (제1 리간드), [L]은 링커이고, [PTM]은 단백질 표적화 모이어티 (제2 리간드)이다. 예시적인 PROTAC들을 다음 표에 나타낸다. 표는 [ULM] 및 해당 [ULM] 리간드가 표적으로 하는 유비퀴틴화 효소와 [PTM] 및 해당 [ULM] 리간드가 표적으로 하는 단백질을 나타낸다.
표 1: 예시적인 PROTACS
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Figure pct00030
위의 표에 개시된 다른 모든 특허 출원 및 특허는 그 전문이 참고로 포함된다.
PROTAC에서 사용될 수 있는 구체적인 링커들은, 예를 들어, 미국 공개 특허출원 US20180050021A1, US20180118733A1, US20180009779A1, US20180085465A1, US20180134684A1, 및 US20180134688A1, 미국 특허 제 US9694084B2, US9821068B2, US9770512B2, 및 US9750816B2, 및 국제 특허출원 공개공보 WO2018085247A1에 개시되어 있으며, 이들은 본원에 그 전문이 참고로 포함된다. WO2017212329A1은 클릭 반응을 통해 생성된 링커를 포함하는 PROTAC의 형성을 개시한다.
II.D.3 인터페론 유전자 (STING) 효현제의 자극제
일부 양상들에서, 페이로드는 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 뉴클레오티드는 인터페론 유전자 단백질 (STING) 효현제의 자극제이다. STING은 일반적으로 박테리아에 의해 생성되는 사이클릭 다이뉴클레오티드의 세포질 센서이다. 활성화되면 I형 인터페론이 생성되고 면역 반응이 시작된다.
일부 양상들에서, 본 발명의 EV (예를 들어, 엑소좀)는 EV (예를 들어, 엑소좀)에 연결된, 예를 들어 말레이미드 모이어티를 통해 화학적으로 연결된 하나 이상의 STING 효현제를 포함한다. 일부 양상들에서, STING 효현제는 사이클릭 뉴클레오티드 STING 효현제 또는 비-사이클릭 다이뉴클레오티드 STING 효현제를 포함한다.
사이클릭 퓨린 다이뉴클레오티드, 예를 들어, (이에 제한되는 것은 아님), cGMP, 사이클릭 다이-GMP (c-다이-GMP), cAMP, 사이클릭 다이-AMP (c-다이-AMP), 사이클릭-GMP-AMP (cGAMP), 사이클릭 다이-IMP (c-다이-IMP), 사이클릭 AMP-IMP (cAIMP), 및 이의 유사체는 환자의 면역 또는 염증 반응을 자극 또는 향상시키는 것으로 공지되어 있다. CDN은 사이클릭 다이뉴클레오티드, 또는 이의 임의의 조합을 연결하는 2’2’, 2’3’, 2’5’, 3’3’, 또는 3’5’ 결합을 가질 수 있다.
사이클릭 퓨린 다이뉴클레오티드는 표준 유기 화학 기술을 통해 변형되어 퓨린 다이뉴클레오티드의 유사체를 생성할 수 있다. 적합한 퓨린 다이뉴클레오티드는 아데닌, 구아닌, 이노신, 하이포잔틴, 잔틴, 아이소구아닌, 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 적절한 퓨린 다이뉴클레오티드를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 사이클릭 다이뉴클레오티드는 변형된 유사체일 수 있다. 포스포로티오에이트, 바이포스포로티오에이트, 플루오리네이트 및 다이플루오리네이트 변형을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 적합한 변형이 사용될 수 있다.
5,6-다이메틸잔테논-4-아세트산 (DMXAA), 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 비-사이클릭 다이뉴클레오티드 효현제와 같은 비 사이클릭 다이뉴클레오티드 효현제가 또한 사용될 수 있다.
임의의 STING 효현제가 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 특히 STING 효현제는 DMXAA, STING 효현제-1, ML RR-S2 CDA, ML RR-S2c-다이-GMP, ML-RR-S2 cGAMP, 2’3’-c-다이-AM(PS)2, 2’3’-cGAMP, 2’3’-cGAMPdFHS, 3'3'-cGAMP, 3'3'-cGAMPdFSH, cAIMP, cAIM(PS)2, 3’3’-cAIMP, 3’3’-cAIMPdFSH, 2’2’-cGAMP, 2’3’-cGAM(PS)2, 3'3'-cGAMP, c-다이-AMP, 2'3'-c-다이-AMP, 2’3’-c-다이-AM(PS)2, c-다이-GMP, 2’3’-c-다이-GMP, c-다이-IMP, c-다이-UMP 또는 이의 임의의 조합이다. 특정 양상에서, STING 효현제는, 대안적으로 3-3 cAIMPdFSH으로 명시되는 3’3’-cAIMPdFSH이다. 또 다른 해당 분야에 공지된 STING 효현제 또한 사용될 수 있다.
일부 양상들에서, 본 발명에 유용한 STING 효현제는 하기로 구성된 그룹에서 선택된 화합물을 포함한다:
일부 양상들에서, 본 발명에 유용한 STING 효현제는 하기 화학식을 가지는 화합물을 포함하며:
화학식 1 화학식 2 화학식 3
Figure pct00031
,
Figure pct00032
,
Figure pct00033
,
이때:
X1은 H, OH, 또는 F이고;
X2는 H, OH, 또는 F이고;
Z는 OH, OR1, SH 또는 SR1이고, 이때:
R1은 Na 또는 NH4이고, 또는
R1은 생체내 OH 또는 SH를 제공하는 효소-불안정성 그룹, 예를 들어, 피발로일옥시메틸이고;
B1 및 B2는 다음에서 선택된 염기이고:
Figure pct00034
다음을 조건으로 한다:
- 화학식 1에서: X1 및 X2는 OH가 아니고,
- 화학식 2에서: X1 및 X2가 OH일 때, B1은 아데닌이 아니고 B2 는 구아닌이 아니고, 및
- 화학식 3에서: X1 및 X2가 OH일 때, B1은 아데닌이 아니고 B2 는 구아닌이 아니고, Z는 OH가 아니다. 그 내용이 본원에 전부 참고문헌으로 포함되어 있는, WO 2016/096174를 참고하라.
일부 양상들에서, 본 발명에 유용한 STING 효현제는 다음을 포함한다:
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
및
이의 약학적으로 허용되는 염. WO 2016/096174A1을 참고하라.
다른 양상들에서, 본 발명에 유용한 STING 효현제는 하기 화학식을 가지는 화합물을 포함한다:
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
또는 임의의 이의 약학적으로 허용되는 염.
일부 양상들에서, 본 발명에 유용한 STING 효현제는 하기 화학식을 가지는 화합물을 포함한다:
Figure pct00044
이때 각 기호는, 그 전문이 본원에 참고문헌으로 포함되는 WO 2014/093936에 정의된 바와 같다.
일부 양상들에서, 본 발명에 유용한 STING 효현제는 하기 화학식을 가지는 화합물을 포함한다:
Figure pct00045
이때 각 치환기는 WO 2014/189805에 정의되어 있으며, 이의 내용은 본원에 그 전문이 참고로 포함된다.
일부 양상들에서, 본 발명에 유용한 STING 효현제는 하기 화학식을 가지는 화합물을 포함하며:
Figure pct00046
이때 각 치환기는 WO 2015/077354에 정의되어 있으며, 이의 내용은 본원에 그 전문이 참고로 포함된다. Cell reports 11, 1018-1030 (2015) 또한 참고하라.
일부 양상들에서, 본 발명에 유용한 STING 효현제는 WO 2013/185052 및 Sci. Transl. Med. 283,283ra52 (2015)에 기재된 c-다이-AMP, c-다이-GMP, c-다이-IMP, c-AMP-GMP, c-AMP-IMP, 및 c-GMP-IMP를 포함하며, 이는 본원에 그 전문이 참고로 포함된다.
일부 양상들에서, 본 발명에 유용한 STING 효현제는 다음에서 선택된 화학식을 가지는 화합물을 포함하며:
Figure pct00047
이때 각 치환기 (즉, R1, R2, R3, R4, 및 X)는 WO 2014/189806에 정의되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
일부 양상들에서, 본 발명에 유용한 STING 효현제는 하기 화학식을 가지는 화합물을 포함하며:
Figure pct00048
이때 각 치환기 (즉, R1, R2, R3, R4, R5, R6, Y1 및 Y2)는 WO 2015/185565에 정의되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
일부 양상들에서, 본 발명에 유용한 STING 효현제는 하기 화학식에서 선택된 화합물을 포함하며:
Figure pct00049
이때 각 치환기는 WO 2014/179760에 정의되어 있으며 (즉, X 및 Y), 이의 내용은 본원에 그 전문이 참고로 포함된다.
일부 양상들에서, 본 발명에 유용한 STING 효현제는 하기 화학식 중 하나를 가지는 화합물을 포함하며:
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
이때 각 치환기 (즉, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, Xa, Xa1, Xb, Xb1, Xc. Xd, Xe, 및 Xf)는 WO 2014/179335에 정의되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
일부 양상들에서, 본 발명에 유용한 STING 효현제는 WO 2015/017652에 기재된 하기 화학식을 가지는 화합물을 포함하며:
Figure pct00053
상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
일부 양상들에서, 본 발명에 유용한 STING 효현제는 WO 2016/096577에 기재된 하기 화학식을 가지는 화합물을 포함하며:
Figure pct00054
상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
일부 양상들에서, 본 발명에 유용한 STING 효현제는 하기 화학식을 가지는 화합물을 포함하며:
Figure pct00055
이때 모든 치환기 (즉, R1, R2, R3, R4, R5, 및 R6)는 WO 2011/003025에 기재되어 있으며, 이 문헌의 내용은 본원에 그 전문이 참고로 포함된다.
일부 양상들에서, 본 발명에 유용한 STING 효현제는 하기 화학식을 가지는 화합물을 포함하며:
Figure pct00056
이때 각 치환기 (즉, R1, R2, R3, R4, R5 및 R6)는 WO 2016/145102에 정의되어 있으며, 이 문헌의 내용은 본원에 그 전문이 참고로 포함된다.
일부 양상들에서, 본 발명에 유용한 STING 효현제는 하기 화학식을 가지는 화합물을 포함하며:
Figure pct00057
이때 모든 치환기는 WO 2017/027646에 정의되어 있으며, 이의 내용은 본원에 그 전문이 참고로 포함된다.
일부 양상들에서, 본 발명에 유용한 STING 효현제는 하기 화학식을 가지는 화합물을 포함하며:
Figure pct00058
이때 모든 치환기는 WO 2017/075477에 정의되어 있으며, 이의 내용은 본원에 그 전문이 참고로 포함된다.
일부 양상들에서, 본 발명에 유용한 STING 효현제는 하기 화학식을 가지는 화합물을 포함하며:
Figure pct00059
이때 모든 치환기는 WO 2017/027645에 정의되어 있으며, 이의 내용은 본원에 그 전문이 참고로 포함된다.
일부 양상들에서, 본 발명에 유용한 STING 효현제는 하기 화학식을 가지는 화합물을 포함하며:
Figure pct00060
이때 모든 치환기는 WO 2018/100558에 정의되어 있으며, 이의 내용은 본원에 그 전문이 참고로 포함된다.
일부 양상들에서, 본 발명에 유용한 STING 효현제는 하기 화학식을 가지는 화합물을 포함하며:
Figure pct00061
이때 모든 치환기는 WO 2017/175147에 정의되어 있으며, 이의 내용은 본원에 그 전문이 참고로 포함된다.
일부 양상들에서, 본 발명에 유용한 STING 효현제는 다음 화학식을 가지는 화합물을 포함하며:
Figure pct00062
, 또는
Figure pct00063
이때 모든 치환기는 WO 2017/175156에 정의되어 있으며, 이의 내용은 본원에 그 전문이 참고로 포함된다.
일부 양상들에서, EV (예를 들어, 엑소좀)는 사이클릭 다이뉴클레오티드 STING 효현제 및/또는 비-사이클릭 다이뉴클레오티드 STING 효현제를 포함한다. 일부 양상들에서, 몇가지 사이클릭 다이뉴클레오티드 STING 효현제가 본원에 개시된 EV (예를 들어, 엑소좀)에 존재하는 경우, 이러한 STING 효현제는 동일할 수 있거나 또는 이들은 상이할 수 있다. 일부 양상들에서, 몇가지 비-사이클릭 다이뉴클레오티드 STING 효현제가 존재하는 경우, 이러한 STING 효현제는 동일할 수 있거나 또는 상이할 수 있다. 일부 양상들에서, 본 발명의 EV(예를 들어, 엑소좀) 조성물은 둘 이상의 EV 집단들, 예를 들어, 엑소좀을 포함할 수 있고, 여기서 EV, 예를 들어 엑소좀의 각 집단은 상이한 STING 효현제 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 구체적인 양상들에서, 본 발명의 EV, 예를 들어, 엑소좀은 화학식 (IV)를 가지는 (MM)-(링커)-(생물학적 활성 분자)를 포함한다:
Figure pct00064
일부 구체적인 양상들에서, 본 발명의 EV (예를 들어, 엑소좀)은 화학식 (V)를 가지는 (MM)-(링커)-(생물학적 활성 분자)를 포함한다:
Figure pct00065
일부 구체적인 양상들에서, 본 발명의 EV (예를 들어, 엑소좀)는 화학식 (VI) (CP249)를 가지는 화합물을 포함한다:
Figure pct00066
일부 구체적인 양상들에서, 본 발명의 EV (예를 들어, 엑소좀)는 화학식 (VII) (CP250)를 가지는 화합물을 포함한다:
Figure pct00067
일부 구체적인 양상들에서, 본 발명의 EV (예를 들어, 엑소좀)는 화학식 (VIII) (CP260)를 가지는 화합물을 포함한다:
일부 구체적인 양상들에서, 본 발명의 EV (예를 들어, 엑소좀)는 화학식 (VIII) (CP260)를 가지는 화합물을 포함한다:
Figure pct00068
일부 구체적인 양상들에서, 본 발명의 EV (예를 들어, 엑소좀)는 화학식 (IX) (CP261)를 가지는 화합물을 포함한다:
Figure pct00069
일부 양상들에서, 본 발명의 EV 접합체에 유용한 STING 효현제는 CP247, CP250, CP260, CP261, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 양상들에서, 본 발명의 EV 접합체에 유용한 STING 효현제는 CP247, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 일부 양상들에서, 본 발명의 EV 접합체에 유용한 STING 효현제는 CP250, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 일부 양상들에서, 본 발명의 EV 접합체에 유용한 STING 효현제는 CP260, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 일부 양상들에서, 본 발명의 EV 접합체에 유용한 STING 효현제는 CP261, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다.
다른 양상들에서, 본 발명의 EV 접합체에 유용한 STING 효현제는 CP227, CP229 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다른 양상들에서, 본 발명의 EV 접합체에 유용한 STING 효현제는 CP227 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 다른 양상들에서, 본 발명의 EV 접합체에 유용한 STING 효현제는 CP229 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
II.D.4 TLR 효현제
일부 양상들에서, 페이로드는 TLR 효현제를 포함한다. TLR 효현제의 비-제한적 예들은 다음을 포함한다: TLR2 효현제 (예를 들어, 리포테이코산, 비정형 LPS, MALP-2 및 MALP-404, OspA, 포린, LcrV, 리포만난, GPI, 라이소포스파티딜세린, 리포포스포글리칸 (LPG), 글리코포스파티딜이노시톨 (GPI), 자이모산, hsp60, gH/gL 당단백질, 헤마글루티닌), TLR3 효현제 (예를 들어, 이중-가닥 RNA, 예를 들어, 폴리(I:C)), TLR4 효현제 (예를 들어, 지질다당류 (LPS), 리포테이코산, β-데펜신 2, 피브로넥틴 EDA, HMGB1, 스내핀, 테나신 C), TLR5 효현제 (예를 들어, 플라젤린), TLR6 효현제, TLR7/8 효현제 (예를 들어, 단일-가닥 RNA, CpG-A, 폴리 G10, 폴리 G3, 레지퀴모드), TLR9 효현제 (예를 들어, 비메틸화 CpG DNA), 및 이들의 조합. TLR 효현제의 비-제한적 예들은 WO2008115319A2, US20130202707A1, US20120219615A1, US20100029585A1, WO2009030996A1, WO2009088401A2, 및 WO2011044246A1에서 찾을 수 있으며, 이들 각각은 그 전문이 참고로 포함된다.
II.D.5 항체
일부 양상들에서, 페이로드는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 양상들에서, 페이로드는 ADC를 포함한다. 일부 양상들에서, 페이로드는 합성 항종양제 (예를 들어, 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE) (베도틴)), 사이토카인 방출 억제제 (예를 들어, MCC950), mTOR 억제제 (예를 들어, 라파마이신 및 그 유사체 (라파로그)), 오토탁신 억제제 (예를 들어, PAT409), 라이소포스파티드산 수용체 길항제 (예를 들어, AM152, BMS-986020으로도 알려짐), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 소분자를 포함한다.
II.D.6 대식세포-표적화 생물학적 활성 분자
일부 양상들에서, 페이로드는 대식세포를 표적으로 하는 생물학적 활성 분자를 포함한다. 다른 양상들에서, 페이로드는 대식세포 분극화를 유도하는 생물학적 활성 분자를 포함한다. 대식세포 분극화는 대식세포가 미세환경의 신호에 응답하여 상이한 기능 프로그램들을 채택하는 과정이다. 이러한 능력은 유기체에서 여러 역할과 관련이 있다: 이들은 선천 면역계의 강력한 이펙터 세포이지만 세포 파편 제거, 배아 발달 및 조직 복구에도 중요하다.
단순화된 분류에 의해 대식세포 표현형은 2개의 그룹으로 나뉜다: M1 (고전적으로 활성화된 대식세포) 및 M2 (대안적으로 활성화된 대식세포). 이러한 광범위한 분류는 표현형을 특정 상태로 전환하도록 자극하는 분자들로 배양된 대식세포를 처리한 시험관내 연구를 기반으로 한다. 화학적 자극 외에도, 대식세포가 성장하는 기본 기질의 강성은 분극 상태, 기능적 역할 및 이동 방식을 지시할 수 있음이 밝혀졌다. M1 대식세포는 식균 작용 및 전염증성 사이토카인과 살균 분자의 분비와 같은 병원체에 대한 직접적인 숙주 방어에 중요한 전염증성 유형으로 설명되었었다. M2 대식세포는 이와 정 반대의 기능을 가지는 것으로 설명되었다: 손상된 조직들의 복구 및 염증의 해소 단계의 조절. 이후, 더 광범위한 시험관내 및 생체외 연구에서 대식세포 표현형이 훨씬 더 다양하고 유전자 발현 및 기능 양상에서 서로 중첩되어 이러한 많은 하이브리드 상태가 미세 환경에 의존하는 활성화 상태의 연속체를 형성한다는 것을 보여주었다. 더욱이, 생체내에서 상이한 조직 대식세포 집단들 사이의 유전자 발현 프로파일에 있어서 다양성이 높다. 따라서 대식세포 활성화 스펙트럼은, 환경으로부터 오는 서로 다른 많은 신호들에 반응하는 복잡한 조절 경로를 포함하여 보다 광범위한 것으로 간주된다. 대식세포 표현형의 다양성은 여전히 생체내에서 완전히 특성화되어야 한다.
대식세포 유형의 불균형은 여러 면역-관련 질환과 관련이 있다. 예를 들어, M1/M2 비율 증가는 염증성 장 질환의 발병 및 마우스 비만과 관련될 수 있다. 다른 한편으로, 시험관내 실험은 조직 섬유증의 주요 매개체로서 M2 대식세포를 포함시켰다. 여러 연구에서 M2 대식세포의 섬유증 프로파일을 전신 경화증의 발병기전과 연관시켰다. 대식세포 표적화 생물학적 활성 분자들의 비-제한적 예들은 다음과 같다: PI3Kγ (포스파티딜이노시톨-4,5-bis포스페이트 3-키나제 촉매 서브유닛 감마), RIP1 (수용체 상호작용 단백질 (RIP) 키나제 1, RIPK1), HIF-1α (저산소증-유도 인자 1-알파), AHR1 (부착 및 균사 조절인자 1), miR146a, miR155, IRF4 (인터페론 조절 인자 4), PPARγ (퍼옥시좀 증식인자-활성화 수용체 감마), IL-4RA (인터루킨-4 수용체 서브유닛 알파), TLR8 (톨-유사 수용체 8), 및 TGF-β1 (전환 성장 인자 베타-1 전구단백질).
일부 양상들에서, 페이로드는 PI3Kγ 단백질 또는 전사체 (PI3Kγ 길항제)를 표적하는 생물학적 활성 분자를 포함한다. 일부 양상들에서, PI3Kγ 길항제는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 다른 양상들에서, PI3Kγ 길항제는 소분자이다. 일부 양상들에서, ASO는 전사체, 예를 들어, PI3Kγ를 인코딩하는 mRNA를 표적한다. PI3Kγ 유전자에 대한 서열은 염색체 위치 7q22.3 및 공개적으로 이용가능한 GenBank 등록 번호 NC_000007.14 (106865282..106908980)에서 찾을 수 있으며, 이는 전문이 참고로 포함된다. 인간 PI3Kγ 단백질에 대한 서열은 공개적으로 이용가능한 UniProt 등록 번호 P48736에서 찾을 수 있으며, 이는 본원에 그 전문이 참고로 포함된다.
일부 양상들에서, 페이로드는 RIP1 단백질 또는 전사체를 표적하는 생물학적 활성 분자 (RIP1 길항제)를 포함한다. 일부 양상들에서, RIP1 길항제는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 다른 양상들에서, RIP1 길항제는 소분자이다. 일부 양상들에서, ASO는 전사체, 예를 들어, RIP1을 인코딩하는 mRNA를 표적한다. RIP1 유전자에 대한 서열은 염색체 위치 6p25.2 및 공개적으로 이용가능한 GenBank 등록 번호 NC_000006.12 (3063967..3115187)에서 찾을 수 있으며, 이는 전문이 참고로 포함된다. 인간 RIP1 단백질에 대한 서열은 공개적으로 이용가능한 UniProt 등록 번호 Q13546에서 찾을 수 있으며, 이는 본원에 그 전문이 참고로 포함된다.
일부 양상들에서, 페이로드는 HIF-1α 단백질 또는 전사체를 표적하는 생물학적 활성 분자 (HIF-1α 길항제)를 포함한다. 일부 양상들에서, HIF-1α 길항제는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 다른 양상들에서, HIF-1α 길항제는 소분자이다. 일부 양상들에서, ASO는 전사체, 예를 들어, HIF-1α를 인코딩하는 mRNA를 표적한다. HIF-1α 유전자에 대한 서열은 염색체 위치 14q23.2 및 공개적으로 이용가능한 GenBank 등록 번호 NC_000014.9 (61695513..61748259)에서 찾을 수 있으며, 이는 전문이 참고로 포함된다. 인간 HIF-1α 단백질에 대한 서열은 공개적으로 이용가능한 UniProt 등록 번호 Q16665에서 찾을 수 있으며, 이는 본원에 그 전문이 참고로 포함된다. 일부 양상들에서, ASO는 HIF-2α를 인코딩하는 mRNA를 표적한다. HIF-2α 유전자에 대한 서열은 염색체 위치 2p21 및 공개적으로 이용가능한 GenBank 등록 번호 NC_000002.12 (46297407..46386697)에서 찾을 수 있으며, 이는 전문이 참고로 포함된다. 인간 HIF-2α 단백질에 대한 서열은 공개적으로 이용가능한 UniProt 등록 번호 Q99814에서 찾을 수 있으며, 이는 본원에 그 전문이 참고로 포함된다.
일부 양상들에서, 페이로드는 AHR1 단백질 또는 전사체를 표적하는 생물학적 활성 분자 (AHR1 길항제)를 포함한다. 다른 양상들에서, AHR1 길항제는 소분자이다.
일부 양상들에서, 페이로드는 miR146a (miR146a 안타고미어)를 표적으로 하는 생물학적 활성 분자를 포함한다. 일부 양상들에서, miR146a 안타고미어는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 일부 양상들에서, ASO는 miR146a-5p (ugagaacugaauuccauggguu) (서열 번호: 226)에 결합한다. 일부 양상들에서, ASO는 miR146a-3p (ccucugaaauucaguucuucag) (서열 번호: 227)에 결합한다.
일부 양상들에서, 페이로드는 miR155를 모방하는 생물학적 활성 분자 (miR155 모방체)를 포함한다. 일부 양상들에서, miR155 모방체는 RNA 또는 DNA이다. 일부 양상들에서, miR155 모방체는 miR155-5p (uuaaugcuaaucgugauaggggu) (서열 번호: 228)의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양상들에서, miR155 모방체는 miR155-3p (cuccuacauauuagcauuaaca) (서열 번호: 229)의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 양상들에서, 페이로드는 IRF-4 단백질 또는 전사체를 표적하는 생물학적 활성 분자 (IRF4 길항제)를 포함한다. 일부 양상들에서, IRF4 길항제는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 일부 양상들에서, ASO는 전사체, 예를 들어, IRF-4를 인코딩하는 mRNA를 표적한다. IRF-4 유전자에 대한 서열은 염색체 위치 6p25.3 및 공개적으로 이용가능한 GenBank 등록 번호 NC_000006.12 (391739..411443)에서 찾을 수 있으며, 이는 전문이 참고로 포함된다. 인간 IRF-4 단백질에 대한 서열은 공개적으로 이용가능한 UniProt 등록 번호 Q15306에서 찾을 수 있으며, 이는 본원에 그 전문이 참고로 포함된다.
일부 양상들에서, 페이로드는 PPARγ 단백질 또는 전사체를 표적하는 생물학적 활성 분자 (PPARγ 길항제)를 포함한다. 일부 양상들에서, PPARγ 길항제는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 다른 양상들에서, PPARγ 길항제는 소분자이다. 일부 양상들에서, ASO는 전사체, 예를 들어, PPARγ를 인코딩하는 mRNA를 표적한다. PPARγ 유전자에 대한 서열은 염색체 위치 3p25.2 및 공개적으로 이용가능한 GenBank 등록 번호 NC_000003.12 (12287485..12434356)에서 찾을 수 있으며, 이는 전문이 참고로 포함된다. 인간 PPARγ 단백질에 대한 서열은 공개적으로 이용가능한 UniProt 등록 번호 P37231에서 찾을 수 있으며, 이는 본원에 그 전문이 참고로 포함된다.
일부 양상들에서, 페이로드는 IL-4RA 단백질 또는 전사체를 표적하는 생물학적 활성 분자 (IL-4RA 길항제)를 포함한다. 일부 양상들에서, IL-4RA 길항제는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 일부 양상들에서, ASO는 전사체, 예를 들어, IL-4RA를 인코딩하는 mRNA를 표적한다. IL-4RA 유전자에 대한 서열은 염색체 위치 16p12.1 및 공개적으로 이용가능한 GenBank 등록 번호 NC_000016.10 (27313668..27364778)에서 찾을 수 있으며, 이는 전문이 참고로 포함된다. 인간 IL-4RA 단백질에 대한 서열은 공개적으로 이용가능한 UniProt 등록 번호 P24394에서 찾을 수 있으며, 이는 본원에 그 전문이 참고로 포함된다.
일부 양상들에서, 페이로드는 톨-유사 수용체 8 (TLR8)의 효현제인 생물학적 활성 분자를 포함한다. TLR8은 또한 CD288로도 지칭된다. TLR8은 선천 면역 및 적응 면역의 핵심 구성성분이다. TLR (톨-유사 수용체)은 미생물에 특정한 분자 패턴을 인식하여 병원체에 대한 숙주 면역 반응을 제어한다. 이는 MYD88 및 TRAF6을 통해 작용하여 NF-카파-B 활성화, 사이토카인 분비 및 염증 반응을 초래한다. 인간 TLR8 단백질에 대한 서열은 공개적으로 이용가능한 UniProt 등록 번호 Q9NR97에서 찾을 수 있으며, 이는 본원에 그 전문이 참고로 포함된다.
일부 양상들에서, 페이로드는 TGF-β1 단백질 또는 전사체를 표적하는 생물학적 활성 분자 (TGF-β1 길항제)를 포함한다. 일부 양상들에서, TGF-β1 길항제는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 일부 양상들에서, ASO는 전사체, 예를 들어, TGF-β1을 인코딩하는 mRNA를 표적한다. TGF-β1 유전자에 대한 서열은 염색체 위치 19q13.2 및 공개적으로 이용가능한 GenBank 등록 번호 NC_000019.10 (41330323..41353922, 보체)에서 찾을 수 있으며, 이는 전문이 참고로 포함된다. 인간 TGF-β1 단백질에 대한 서열은 공개적으로 이용가능한 UniProt 등록 번호 P01137에서 찾을 수 있으며, 이는 본원에 그 전문이 참고로 포함된다. ASO는 변형된 당 모이어티, 즉 DNA 및 RNA에서 발견되는 리보스 당 모이어티와 비교할 때 당 모이어티의 변형을 갖는 하나 이상의 뉴클레오시드를 포함 할 수 있다. 주로 친화성 및/또는 뉴클레아제 내성과 같은 올리고뉴클레오티드의 특정한 특성을 개선하기 위한 목적으로 리보스 당 모이어티가 변형된 수많은 뉴클레오시드가 만들어졌다. 이러한 변형에는, 리보스 고리 구조가, 예를 들어, 헥소스 고리 (HNA), 또는, 일반적으로 리보스 고리 (LNA)의 C2'와 C4' 탄소 사이에 바이라디칼 가교를 갖는 바이사이클릭 고리, 또는 일반적으로 C2'와 C3' 탄소 사이에 결합이 없는 연결되지 않은 리보스 고리 (예컨대, UNA)로의 교체에 의해 변형되는 경우가 포함된다. 다른 당 변형된 뉴클레오시드는, 예를 들어, 바이사이클로헥소스 핵산 (WO2011/017521) 또는 트라이사이클릭 핵산 (WO2013/154798)을 포함한다. 변형된 뉴클레오시드는 또한 예를 들어, 펩티드 핵산 (PNA) 또는 모르폴리노 핵산의 경우에 당 모이어티가 비-당 모이어티로 교체된 뉴클레오시드를 포함한다. 당 변형은 또한 리보스 고리의 치환기 그룹을 수소 이외의 그룹으로 변경하거나 RNA 뉴클레오시드에서 자연적으로 발견되는 2'-OH 그룹으로 변경하여 이루어진 변형을 포함한다. 예를 들어, 치환기는 2', 3', 4' 또는 5' 위치에 도입 될 수 있다. 변형된 당 모이어티를 갖는 뉴클레오시드는 또한 2' 치환된 뉴클레오시드와 같은 2' 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 실제로, 2' 치환된 뉴클레오시드를 개발하는데 많은 노력을 해왔으며, 많은 2' 치환된 뉴클레오시드는 올리고뉴클레오티드에 통합 될 때 유익한 특성, 예를 들어, 개선된 뉴클레오시드 내성 및 개선된 친화도를 갖는 것으로 밝혀졌다. 2' 당 변형된 뉴클레오시드는 2' 위치에 H 또는 -OH 이외의 치환기를 가지거나(2' 치환된 뉴클레오시드) 2' 연결된 바이라디칼을 포함하는 뉴클레오시드로서, 2' 치환된 뉴클레오시드 및 LNA(2'- 4' 바이라디칼 가교된) 뉴클레오시드를 포함한다. 예를 들어, 2' 변형된 당은 올리고뉴클레오티드에 대한 향상된 결합 친화도 (예컨대, 2' 당 변형 뉴클레오시드를 개선시키는 친화도) 및/또는 증가된 뉴클레아제 내성을 제공 할 수 있다. 2' 치환된 변형 뉴클레오시드의 예는 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA (MOE), 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-RNA, 2'-플루로-DNA, 아라비노 핵산 (ANA), 및 2'-플루오로-ANA 뉴클레오시드이다. 추가 예로서, 예컨대, Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443; Uhlmann, Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213, 및 Deleavey and Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937을 참고하라. 아래에 일부 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드를 예시한다.
Figure pct00070
LNA 뉴클레오시드는 뉴클레오시드의 리보스 당 고리의 C2'와 C4' 사이에 링커 그룹 (바이라디칼 또는 가교로 지칭됨) (즉, 2'-4' 가교)을 포함하는 변형된 뉴클레오시드로, 리보스 고리의 입체형태를 제한 또는 잠금한다. 이러한 뉴클레오시드는 문헌에서 가교 핵산 또는 바이사이클릭 핵산 (BNA)으로도 명명된다. 리보스 입체형태의 잠금은 LNA가 상보적 RNA 또는 DNA 분자에 대한 올리고뉴클레오티드에 통합 될 때 향상된 혼성화 (이중나선 안정화) 친화성과 연관된다. 이는 올리고뉴클레오티드/보체 이중나선의 용융 온도를 측정하여 관례적으로 결정될 수 있다.
비 제한적인 예시적 LNA 뉴클레오시드가 WO 99/014226, WO 00/66604, WO 98/039352, WO 2004/046160, WO 00/047599, WO 2007/134181, WO 2010/077578, WO 2010/036698, WO 2007/090071, WO 2009/006478, WO 2011/156202, WO 2008/154401, WO 2009/067647, WO 2008/150729, Morita 외, Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12, 73-76, Seth 외, J. Org. Chem. 2010, Vol 75(5) pp. 1569-81, 및 Mitsuoka 외, Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238에 개시되어 있다.
일부 양상들에서, 본 발명의 ASO의 변형된 뉴클레오시드 또는 LNA 뉴클레오시드는 화학식 I 또는 II의 일반 구조를 가지며:
Figure pct00071
또는
Figure pct00072
화학식 I 화학식 II
이때
W는 -O-, -S-, -N(Ra)-, -C(RaRb)-, 특히 -O-에서 선택되고;
B는 핵염기 또는 변형된 핵염기 모이어티이고;
Z는 인접 뉴클레오시드 또는 5'-말단 그룹에 대한 뉴클레오시드간 링키지이고;
Z*는 인접 뉴클레오시드 또는 3'-말단 그룹에 대한 뉴클레오시드간 링키지이고;
R1, R2, R3, R5 및 R5*는 수소, 할로겐, 알킬, 알케닐, 알키닐, 하이드록시, 알콕시, 알콕시알킬, 알케닐옥시, 카르복실, 알콕시카보닐, 알킬카보닐, 포르밀 아지드, 헤테로사이클 및 아릴에서 독립적으로 선택되고; 및
X, Y, Ra 및 Rb는 본원에 정의된 바와 같다.
II.D.7 올리고뉴클레오티드
일부 양상들에서, 페이로드는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 포스포로다이아미데이트 모르폴리노 올리고머(PMO), 또는 펩티드-접합 포스포로다이아미데이트 모르폴리노 올리고머(PPMO), 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO), siRNA, miRNA, shRNA, 핵산, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다.
일부 양상들에서, ASO는 PI3Kγ 길항제이다. 일부 양상들에서, ASO는 전사체, 예를 들어, PI3Kγ를 인코딩하는 mRNA를 표적한다. PI3Kγ 유전자에 대한 서열은 염색체 위치 7q22.3 및 공개적으로 이용가능한 GenBank 등록 번호 NC_000007.14 (106865282..106908980)에서 찾을 수 있으며, 이는 전문이 참고로 포함된다. 인간 PI3Kγ 단백질에 대한 서열은 공개적으로 이용가능한 UniProt 등록 번호 P48736에서 찾을 수 있으며, 이는 본원에 그 전문이 참고로 포함된다.
일부 양상들에서, ASO는 RIP1 길항제이다. 일부 양상들에서, ASO는 전사체, 예를 들어, RIP1을 인코딩하는 mRNA를 표적한다. RIP1 유전자에 대한 서열은 염색체 위치 6p25.2 및 공개적으로 이용가능한 GenBank 등록 번호 NC_000006.12 (3063967..3115187)에서 찾을 수 있으며, 이는 전문이 참고로 포함된다. 인간 RIP1 단백질에 대한 서열은 공개적으로 이용가능한 UniProt 등록 번호 Q13546에서 찾을 수 있으며, 이는 본원에 그 전문이 참고로 포함된다.
일부 양상들에서, ASO는 HIF-1α 길항제이다. 일부 양상들에서, ASO는 전사체, 예를 들어, HIF-1α를 인코딩하는 mRNA를 표적한다. HIF-1α 유전자에 대한 서열은 염색체 위치 14q23.2 및 공개적으로 이용가능한 GenBank 등록 번호 NC_000014.9 (61695513..61748259)에서 찾을 수 있으며, 이는 전문이 참고로 포함된다. 인간 HIF-1α 단백질에 대한 서열은 공개적으로 이용가능한 UniProt 등록 번호 Q16665에서 찾을 수 있으며, 이는 본원에 그 전문이 참고로 포함된다. 일부 양상들에서, ASO는 HIF-2α를 인코딩하는 mRNA를 표적한다. HIF-2α 유전자에 대한 서열은 염색체 위치 2p21 및 공개적으로 이용가능한 GenBank 등록 번호 NC_000002.12 (46297407..46386697)에서 찾을 수 있으며, 이는 전문이 참고로 포함된다. 인간 HIF-2α 단백질에 대한 서열은 공개적으로 이용가능한 UniProt 등록 번호 Q99814에서 찾을 수 있으며, 이는 본원에 그 전문이 참고로 포함된다.
일부 양상들에서, ASO는 IRF4 길항제이다. 일부 양상들에서, ASO는 전사체, 예를 들어, IRF-4를 인코딩하는 mRNA를 표적한다. IRF-4 유전자에 대한 서열은 염색체 위치 6p25.3 및 공개적으로 이용가능한 GenBank 등록 번호 NC_000006.12 (391739..411443)에서 찾을 수 있으며, 이는 전문이 참고로 포함된다. 인간 IRF-4 단백질에 대한 서열은 공개적으로 이용가능한 UniProt 등록 번호 Q15306에서 찾을 수 있으며, 이는 본원에 그 전문이 참고로 포함된다.
일부 양상들에서, ASO는 PPARγ 길항제이다. 일부 양상들에서, ASO는 전사체, 예를 들어, PPARγ를 인코딩하는 mRNA를 표적한다. PPARγ 유전자에 대한 서열은 염색체 위치 3p25.2 및 공개적으로 이용가능한 GenBank 등록 번호 NC_000003.12 (12287485..12434356)에서 찾을 수 있으며, 이는 전문이 참고로 포함된다. 인간 PPARγ 단백질에 대한 서열은 공개적으로 이용가능한 UniProt 등록 번호 P37231에서 찾을 수 있으며, 이는 본원에 그 전문이 참고로 포함된다.
일부 양상들에서, ASO는 IL-4RA 길항제이다. 일부 양상들에서, ASO는 전사체, 예를 들어, IL-4RA를 인코딩하는 mRNA를 표적한다. IL-4RA 유전자에 대한 서열은 염색체 위치 16p12.1 및 공개적으로 이용가능한 GenBank 등록 번호 NC_000016.10 (27313668..27364778)에서 찾을 수 있으며, 이는 전문이 참고로 포함된다. 인간 IL-4RA 단백질에 대한 서열은 공개적으로 이용가능한 UniProt 등록 번호 P24394에서 찾을 수 있으며, 이는 본원에 그 전문이 참고로 포함된다.
일부 양상들에서, ASO는 TGF-β1 길항제이다. 일부 양상들에서, ASO는 전사체, 예를 들어, TGF-β1을 인코딩하는 mRNA를 표적한다. TGF-β1 유전자에 대한 서열은 염색체 위치 19q13.2 및 공개적으로 이용가능한 GenBank 등록 번호 NC_000019.10 (41330323..41353922, 보체)에서 찾을 수 있으며, 이는 전문이 참고로 포함된다. 인간 TGF-β1 단백질에 대한 서열은 공개적으로 이용가능한 UniProt 등록 번호 P01137에서 찾을 수 있으며, 이는 본원에 그 전문이 참고로 포함된다.
일부 양상들에서, ASO는 STAT6 전사체, CEBP/β 전사체, STAT3 전사체, KRAS 전사체, NRAS 전사체, NLPR3 전사체, 또는 이의 임의의 조합인, 전사체이다.
STAT6 (STAT6)는 신호 변환기 및 전사 활성제 6으로도 알려져 있다. STAT6/STAT6의 동의어는 공지되어 있으며, IL-4 STAT; STAT, 인터루킨4 유도; 전사 인자 IL-4 STAT; STAT6B; STAT6C; 및 D12S1644를 포함한다. 인간 STAT6 유전자의 서열은 공개적으로 이용 가능한 GenBank 등록 번호 NC_000012.12:c57111413-57095404에서 찾을 수 있다. 인간 STAT6 유전자는 염색체 위치 12q13.3의, 57111413-57095404, 보체에서 발견된다.
CEBP/β (CEBP/β)는 CCAAT/인핸서 결합 단백질 베타로도 알려져 있다. CEBP/β/CEBP/β 의 동의어는 공지되어 있으며 C/EBP 베타; 간 활성화제 단백질; LAP; 간 강화 억제 단백질; LIP; 핵인자 NF-IL6; 전사 인자 5; TCF-5; CEBPB; CEBPb; CEBPβ; CEBP/B; 및 TCF5를 포함한다. 인간 CEBP/β 유전자의 서열은 공개적으로 이용 가능한 GenBank 등록 번호 NC_000020.11 (50190583..50192690).에서 찾을 수 있다. 인간 CEBP/β 유전자는 염색체 위치 20q13.13의, 50190583-50192690에서 발견된다.
NRas는 골지체와 원형질막 사이를 왕복하는 막 단백질을 인코딩하는 종양유전자이다. NRas-인코딩 게놈 DNA는 염색체 위치 1p13.2 (즉, GenBank 등록 번호 NG_007572의 뉴클레오티드 5001~17438)에서 찾을 수 있다. N-ras 돌연변이는 흑색종, 갑상선 암종, 기형암종, 섬유육종, 신경모세포종, 횡문근 육종, 버킷 림프종, 급성 전골수구성 백혈병, T 세포 백혈병 및 만성 골수성 백혈병에서 기재되었다. 발암성 N-Ras는 마우스에서 급성 골수성 백혈병 (AML)- 또는 만성 골수단구성 백혈병(CMML)과 유사한 질환을 유발할 수 있다. 신경모세포종 RAS 바이러스 종양유전자(NRas)는 다양한 명칭으로 당업계에 공지되어 있다. 이러한 명칭에는 다음이 포함된다: GTPase NRas, N-ras 단백질 부분 4, 신경모세포종 RAS 바이러스 (v-ras) 종양유전자 상동체 신경모세포종 RAS 바이러스 종양유전자 상동체, 전환 단백질 N-Ras 및 v-ras 신경모세포종 RAS 바이러스 종양유전자 상동체.
신호 변환기 및 전사 활성화 인자 3(STAT3)은 세포 표면 수용체에서 핵으로 신호를 전달하는 신호 변환기 및 전사 활성화 인자이다. STAT3는 많은 인간 암에서 종종 과활성화된다. STAT3-인코딩 게놈 DNA는 염색체 위치 17q21.2 (즉, GenBank 등록 번호 NG_007370.1의 뉴클레오티드 5001~80,171)에서 찾을 수 있다.
NLRP3(NLRP3)은 3을 포함하는 NLR 패밀리 피린 도메인으로도 알려져 있다. NLRP3/NLRP3의 동의어는 공지되어 있으며, NLRP3; C1orf7; CIAS1; NALP3; PYPAF1; 뉴클레오티드-결합 올리고머화 도메인, 류신이 풍부한 반복부 및 피린 도메인 함유 단백질 3; 감기 유발 자가염증 증후군 1 단백질; 크라이오핀; NACHT, LRR 및 PYD 도메인 함유 단백질 3; 지오텐신/바소프레신 수용체 AII/AVP-유사; 캐터필러 단백질 1.1; CLR1.1; 감기 유발 자가염증 증후군 1 단백질; 및 PYRIN 함유 APAF1 유사 단백질 1을 포함한다. 인간 NLRP3 유전자의 서열은 공개적으로 이용 가능한 GenBank 등록 번호 NC_000001.11:247416156-247449108에서 찾을 수 있다. 인간 NLRP3 유전자는 염색체 위치 1q44의, 247,416,156-247,449,108에서 발견된다.
KRAS는 다양한 이름으로 당업계에 알려져 있다. 이러한 명칭에는 다음이 포함된다: KRAS 원종양유전자, GTPase; V-Ki-Ras2 Kirsten 쥐 육종 2 바이러스성 종양유전자 상동체; GTPase KRas; C-Ki-Ras; K-Ras 2; KRAS2; RASK2; V-Ki-Ras2 Kirsten 쥐 육종 바이러스성 종양유전자 상동체; Kirsten 쥐 육종 바이러스성 원종양 유전자; 세포 형질전환 원종양유전자; 세포 C-Ki-Ras2 원종양유전자; 형질전환 단백질 P21; PR310 C-K-Ras 종양유전자; C-Kirsten-Ras 단백질; K-Ras P21 단백질; 및 종양유전자 KRAS2. 인간 KRAS 유전자에 대한 서열은 염색체 위치 12p12.1 및 공개적으로 이용가능한 GenBank 등록번호 NC_000012(25,204,789 - 25,250,936)에서 찾을 수 있다. 인간 야생형 KRAS 전사체의 게놈 서열은 NC_000012의 잔기 25,204,789 - 25,250,936의 역보체에 해당한다.
II.D.8 수송 펩티드
일부 양상들에서, 페이로드는 세포 수송, 세포 침투 또는 융합 생성 펩티드를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "수송 펩티드"는 세포의 세포막을 가로지르는 카고 이동 촉진, 세포 또는 EV로부터의 카고 분비, 및 세포 또는 EV로부터의 카고 방출 및 세포 이동의 다른 수단을 포함하는, 세포 또는 세포들 내부에서 부착된 카고의 이동을 촉진하는 임의의 펩티드 서열을 지칭한다. 구체적이지만 비제한적인 예에서, 수송 펩티드는 세포 투과 펩티드, 비고전적인 분비 서열, 엔도솜 방출 도메인, 수용체 결합 도메인, 및 융합생성 펩티드로부터 유래된 서열일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "세포 투과 펩티드"는 세포막 또는 EV의 막과 같은 지질 이중층을 가로지르는 부착된 카고의 이동을 촉진하는 임의의 펩티드 서열을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "비고전적 분비 서열"은 ER-골지 독립 경로를 통해 세포로부터 부착된 카고의 분비를 제공하는 임의의 단백질 또는 펩티드 서열을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "엔도솜 방출 도메인"은 세포 또는 EV의 엔도솜으로부터 부착된 카고의 방출을 촉진하는 임의의 펩티드 서열을 의미한다. 본 명세서에 사용되는 용어 "수용체 결합 도메인"은 표면 결합 세포 수용체와 상호작용할 수 있는 임의의 RNA 또는 단백질 도메인을 지칭하는 것을 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "융합생성 펩티드"는 EV 또는 세포로부터 카고 배출을 촉진하는 임의의 펩티드 서열을 지칭하는 것을 의미한다.
일부 양상들에서, 본 발명의 EV, 예를 들어 엑소좀은 수송 펩티드 및 제2 페이로드, 예를 들어 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 간섭 RNA)와 같은 또 다른 생물학적 활성 분자를 포함한다.
II.D.9 아데노 관련 바이러스 (AAV)
일부 양상들에서, 페이로드는 아데노 관련 바이러스 (AAV)를 포함한다. 일부 양상들에서, AAV는 말레이미드 모이어티를 통해 EV의 내강 표면에 연결, 예를 들어, 화학적으로 연결된다. 일부 양상들에서, AAV는 말레이미드 모이어티를 통해 EV의 외부 표면에 연결, 예를 들어, 화학적으로 연결된다. 일부 양상들에서, AAV는 말레이미드 모이어티를 통해 스캐폴드, 예를 들어, 단백질 스캐폴드 예를 들어 단백질 X 스캐폴드 또는 이의 단편에, 또는 지질 스캐폴드 (예를 들어, 콜레스테롤)에 연결, 예를 들어, 화학적으로 연결된다. 일부 양상들에서, AAV는 AAV 캡시드 단백질에 존재하는 말레이미드 그룹과 스캐폴드에 존재하는 (예를 들어, 자연적으로 존재하거나 링커 또는 이작용기 시약을 통해 도입된) 설프하이드릴 그룹 사이의 반응을 통해 스캐폴드 모이어티에 화학적으로 연결된다. 일부 양상들에서, AAV는 AAV 캡시드 단백질에 존재하는 (예를 들어, 자연적으로 존재하거나 링커 또는 이작용기 시약을 통해 도입된) 설프하이드릴 그룹과 스캐폴드 모이어티에 존재하는 말레이미드 그룹 사이의 반응을 통해 스캐폴드 모이어티에 화학적으로 연결된다.
일부 양상들에서, AAV는 유전자 카세트를 포함한다. 일부 양상들에서, 유전자 카세트는 분비 단백질, 수용체, 구조 단백질, 신호 전달 단백질, 감각 단백질, 조절 단백질, 수송 단백질, 저장 단백질, 방어 단백질, 운동 단백질, 응고인자, 성장인자, 항산화제, 사이토카인, 케모카인, 효소, 종양억제유전자, DNA 복구단백질, 구조단백질, 저밀도지단백수용체, 알파글루코시다아제, 낭포성 섬유증 막횡단 전도 조절인자, 또는 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택된 단백질을 인코딩한다. 일부 양상들에서, 유전자 카세트는 인자 VIII 단백질 또는 인자 IX 단백질을 인코딩한다. 일부 양상들에서, 인자 VIII 단백질은 야생형 인자 VIII, B-도메인 결실 인자 VIII, 인자 VIII 융합 단백질, 또는 이들의 임의의 조합이다.
일부 양상들에서, AAV는 AAV 유형 1, AAV 유형 2, AAV 유형 3A, AAV 유형 3B, AAV 유형 4, AAV 유형 5, AAV 유형 6, AAV 유형 7, AAV 유형 8, AAV 유형 9, AAV 유형 10, AAV 유형 11, AAV 유형 12, AAV 유형 13, 뱀 AAV, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 양 AAV, 염소 AAV, 새우 AAV, 합성 AAV, 이들의 임의의 조합으로 구성된 그룹에서 선택된다.
II.D.10 면역 조절인자
일부 양상들에서, 페이로드는 면역 조절인자를 포함한다. 특정 양상들에서, 면역 조절인자는 말레이미드 모이어티를 통해, EV, 예를 들어, 엑소좀의 외부 표면의 또는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 내강 표면의 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X 단백질 또는 이의 단편에 연결, 예를 들어, 화학적으로 연결된다. 특정 양상들에서, 면역 조절인자는 말레이미드 모이어티를 통해, EV, 예를 들어, 엑소좀의 내강 표면의 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y 단백질 또는 이의 단편에 연결, 예를 들어, 화학적으로 연결된다. 추가 양상들에서, 면역 조절인자는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 내강에 존재한다.
일부 양상들에서, 면역 조절인자는 음성 체크포인트 조절인자에 대한 억제제 또는 음성 체크포인트 조절인자의 결합 파트너에 대한 억제제를 포함한다. 특정 양상들에서, 음성 체크포인트 조절인자는 세포독성 T-림프구 관련 단백질 4 (CTLA-4), 세포 예정사 단백질 1(PD-1), 림프구 활성화 유전자 3(LAG-3), T-세포 면역글로불린 뮤신 함유 단백질 3 (TIM-3), B 및 T 림프구 감쇠기(BTLA), Ig 및 ITIM 도메인이 있는 T 세포 면역수용체(TIGIT), T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제제(VISTA), 아데노신 A2a 수용체(A2aR), 킬러 세포 면역글로불린 유사 수용체(KIR), 인돌아민 2,3-디옥시게나제(IDO), CD20, CD39, CD73, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 양상들에서, 면역 조절인자는 양성 공동-자극 분자에 대한 활성화인자 또는 양성 공동-자극 분자의 결합 파트너에 대한 활성화인자를 포함한다. 특정 양상들에서, 양성 공동-자극 분자는 TNF 수용체 슈퍼패밀리 구성원 (예를 들어, CD120a, CD120b, CD18, OX40, CD40, Fas 수용체, M68, CD27, CD30, 4-1BB, TRAILR1, TRAILR2, TRAILR3, TRAILR4, RANK, OCIF, TWEAK 수용체, TACI, BAFF 수용체, ATAR, CD271, CD269, AITR, TROY, CD358, TRAMP, 및 XEDAR)이다. 일부 양상들에서, 양성 공동자극 분자의 활성화인자는 TNF 슈퍼패밀리 구성원 (예를 들어, TNFα, TNF-C, OX40L, CD40L, FasL, LIGHT, TL1A, CD27L, Siva, CD153, 4-1BB l리간드, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, CAMLG, NGF, BDNF, NT-3, NT-4, GITR 리간드, 및 EDA-2)이다. 추가 양상들에서, 양성 공동-자극 분자는 CD28-슈퍼패밀리 공동-자극 분자 (예를 들어, ICOS 또는 CD28)이다. 일부 양상들에서, 양성 공동 자극 분자의 활성화인자는 ICOSL, CD80 또는 CD86이다.
일부 양상들에서, 면역 조절인자는 사이토카인 또는 사이토카인의 결합 파트너를 포함한다. 특정 양상들에서, 사이토카인은 IL-2, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-21, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 양상들에서, 면역 조절인자는 배 중심 반응에 필요한 세포내 상호작용을 지원하는 단백질을 포함한다. 특정 양상들에서, 배 중심 반응에 필요한 세포내 상호작용을 지원하는 단백질은 신호 림프구 활성화 분자 (SLAM) 계열 구성원 또는 SLAM 관련 단백질 (SAP)을 포함한다. 일부 양상들에서, SLAM 계열 구성원은 SLAM 계열 구성원 1, CD48, CD229 (Ly9), Ly108, 2B4, CD84, NTB-A, CRACC, BLAME, CD2F-10, 또는 이들의 조합을 포함한다.
II.D.10 라이소포스파티딕 애시드 (LPA) 억제제
일부 양상들에서, 페이로드는 라이소포스파티딕 애시드 (LPA)의 억제제, 예를 들어, LPA-1 억제제를 포함한다. 특정 양상들에서, LPA-1 억제제는 말레이미드 모이어티를 통해, EV, 예를 들어, 엑소좀의 외부 표면의 또는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 내강 표면의 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X 단백질 또는 이의 단편에 연결, 예를 들어, 화학적으로 연결된다. 특정 양상들에서, LPA-1 억제제는 말레이미드 모이어티를 통해, EV, 예를 들어, 엑소좀의 내강 표면의 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y 단백질 또는 이의 단편에 연결, 예를 들어, 화학적으로 연결된다. 추가 양상들에서, LPA-1 억제제는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 내강에 존재한다.
LPA는 세포 예정사로부터 세포를 보호하고 구제하는 매우 강력한 내인성 지질 매개인자이다. LPA는 고친화성 LPA-1 수용체를 통한 섬유화의 중요한 매개인자이다. 그러므로, LPA 억제제들은 항섬유화 물질로 기능할 수 있다.
일부 양상들에서, LPA-1 억제제는 마우스 또는 재조합 인간 LPA-1에 대해 IC50 값이 각각 0.73 및 0.98 μM인 LPA-1의 강력한 경구 생체이용 길항제인 AM095를 포함한다. 시험관 내에서 AM095는마우스 LPA-1/CHO 세포와 인간 A2058 흑색종 세포 모두의 LPA-1 유도 화학주성을 0.78μM 및 0.23μM의 IC50 값으로 억제하는 것으로 나타났다. 생체 내에서 AM095는 마우스에서 8.3 mg/kg의 ED50 값으로 LPA 유도 히스타민 방출을 용량 의존적으로 차단할 수 있다. 또한 AM095는 폐에서 10mg/kg의 ED50 값으로 BALF 콜라겐과 단백질을 현저히 감소시키는 것으로 밝혀졌다. AM095는 또한 마우스에서 블레오마이신에 의해 유도된 대식세포 및 림프구 침윤을 모두 감소시키는 것으로 나타났다. 본원에 그 전문이 참고로 포함되는 Swaney et al. (2018) Mol. Can. Res. 16:1601-1613을 참고하라.
일부 양상들에서, LPA-1 억제제는 AM152 (BMS-986020으로도 공지됨)를 포함한다. AM152는 BSEP, MRP4 및 MDR3에 대해 각각 4.8μM, 6.2μM 및 7.5μM의 IC50으로 담즙산 및 인지질 수송체를 억제하는 고친화성 LPA-1 길항제이다. AM152는 특발성 폐 섬유증 (IPF) 치료에 사용될 수 있다. 본원에 그 전문이 참고로 포함되는, Kihara et al. (2015) Exp. Cell Res. 333:171-7; Rosen et al. (2017) European Respiratory Journal 50:PA1038; 및, Palmer et al. (2018) Chest 154:1061-1069를 참고하라. AM152의 2상 연구 (Palmer 2018에 기재됨)는 담낭 독성 및 간 수송체 (2개의 특정 수송체)의 초기 간 독성 징후로 인해 조기에 종료되었다.
LPA-1 억제제를 포함하는 EV (예를 들어, 엑소좀)에 관한 추가 개시내용은 본 발명의 다른 곳에서 제공된다 (예를 들어, 실시예 5 참조).
II.D.11 NLRP3 억제제
일부 양상들에서, 페이로드는 인플라마좀 억제제, 예를 들어 NLRP3 억제제를 포함한다. 특정 양상들에서, NLRP3 억제제는 말레이미드 모이어티를 통해, EV, 예를 들어, 엑소좀의 외부 표면의 또는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 내강 표면의 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X 단백질 또는 이의 단편에 연결, 예를 들어, 화학적으로 연결된다. 특정 양상들에서, NLRP3 억제제는 말레이미드 모이어티를 통해, EV, 예를 들어, 엑소좀의 내강 표면의 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y 단백질 또는 이의 단편에 연결, 예를 들어, 화학적으로 연결된다. 추가 양상들에서, NLRP3 억제제는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 내강에 존재한다.
NALP3, NACHT 또는 크라이오피린으로도 알려진 NLRP3은 인간에서 NLRP3 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이다. NLRP3는 대식세포에서 주로 발현되며 인플라마좀의 구성성분이다. NLRP3는 병원체 유래, 환경 및 숙주 유래 요인을 감지하고 많은 염증성 질환과 관련된 복합체인 인플라마좀 형성을 개시한다. NLRP3 인플라마솜은 조립 시 카스파제-1을 활성화하고 IL1β의 처리 및 방출을 매개하는 선천 면역 센서이다. 통풍, 제2형 당뇨병, 다발성 경화증, 알츠하이머병 및 죽상동맥경화증을 비롯한 많은 질환의 마우스 모델의 개선은 NLRP3 인플라마좀의 결실에 의해 발생하는 것으로 나타났다. NLRP3 인플라마좀은 예를 들어, 알츠하이머병, 파킨슨병 및 프리온병과 같은 단백질 미스폴딩 질환에서 발생하는 통풍 및 신경염증의 발병기전에 일정 역할을 한다. Liu-Bryan (2010) Immunology and Cell Biology 88:20-23; Heneka et al. (2013) Nature 493:674-678; Shi et al. (2015) Life Sciences 135:9-14; Levy et al. (2015) Nature Medicine 21:213-215.
일부 양상들에서, NLPR3 억제제는 다이아릴설포닐우레아-함유 화합물이다. 일부 양상들에서, 다이아릴설포닐우레아-함유 화합물은 MCC950 또는 이의 유도체이다.
CP-456773으로도 알려진 MCC950 (N-[[(1,2,3,5,6,7-헥사하이드로-s-인다센-4-일)아미노]카보닐]-4-(1-하이드록시-1-메틸에틸)-2-퓨란설폰아미드)은 NLRP3 (NOD 유사 수용체(NLR) 피린 도메인 함유 단백질 3) 인플라마좀의 강력하고 선택적인 억제제이다. MCC950은 인플라마좀 어댑터 단백질 ASC (세포사멸 관련 Speck-유사 단백질 포함 CARD)의 올리고머화를 방지하여 ATP, MSU 및 니제라이신과 같은 NLRP3 활성화인자에 의해 유도되는 IL1β의 방출을 차단한다. Coll et al. (2015) Nature Med. 21:248-255. MCC950은 LPS로 프라이밍되고 ATP 또는 니제라이신으로 활성화되는 대식세포에서 약 7.5nM의 IC50으로 IL-1β의 방출을 차단한다. MCC950은 NLRP3에 의해 유도되는 IL1β의 방출을 차단하지만 MCC950은 NLRC4, AIM2 또는 NLRP1 인플라마좀을 억제하지 않는다. 또한 MCC950은 TLR2 신호 전달 또는 NLRP3의 프라이밍을 억제하지 않는다.
MCC950은 생체 내에서 활성화되어 IL-1β 생성을 차단하고 다발성 경화증 마우스 모델에서 생존을 향상시킨다. MCC950은 또한 심근경색 모델에서 NLRP3 유도 IL-1β 생성을 억제한다. van Hout et al (2015) Eur. Heart J. ehw247. MCC950은 Muckle-Wells 증후군이 있는 개체의 생체 외 샘플에서도 활성이다. MCC950은 자가 염증 및 자가 면역 질환을 포함한 NLRP3 관련 증후군의 치료를 위한 잠재적 치료제이다.
II.E 생체 분포 변형제
일부 양상들에서, EV, 예를 들어, 엑소좀은 생체 분포 변형 물질을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 " 생체 분포 변형제"는 생체 내 또는 시험관 내 (예를 들어, 다양한 종류의 세포의 혼합 배양에서) 세포외 소포 (예를 들어, 엑소좀, 나노소포)의 분포를 변형시킬 수 있는 제제 (즉, 페이로드)를 나타낸다. 일부 양상들에서, 용어 "표적화 모이어티"는 용어 생체 분포 변형제와 호환적으로 사용될 수 있다. 일부 양상들에서, 표적화 모이어티는 EV (예를 들어, 엑소좀) ("트로피즘 모이어티")의 향성을 변경시킨다. 본원에 사용된 용어 "트로피즘 모이어티"는 EV(예를 들어, 엑소좀) 상에서 발현될 때 EV의 자연적 움직임을 변경 및/또는 향상시키는 표적화 모이어티를 지칭한다. 예를 들어, 일부 양상들에서, 트로피즘 모이어티는 특정 세포, 조직 또는 기관에 의한 EV의 흡수를 촉진할 수 있다. 본 발명과 함께 사용될 수 있는 트로피즘 모이어티의 비제한적인 예는 수지상 세포 (예를 들어, Clec9A 또는 DEC205) 또는 T 세포 (예를 들어, CD3) 상에서 특이적으로 발현되는 마커에 결합할 수 있는 것들을 포함한다. 달리 언급이 없는 한, 본원에 사용된 용어 "표적화 모이어티"는 트로피즘 모이어티를 포함한다.
일부 양상들에서, EV, 예를 들어, 엑소좀은, 표적화 모이어티, 즉, 본 발명의 EV, 예를 들어, 엑소좀을 표적 (예를 들어, 표적 단백질, 예를 들어, 수용체)을 포함하는 특정 세포 유형 또는 기관에 지시하는 생물학적 활성 분자를 포함하며 또 다른 페이로드(예를 들어, 또 다른 생물학적 활성 분자)는 치료, 예방 또는 진단 효과를 가질 수 있다. 특정 양상들에서, 표적화 모이어티는 말레이미드 모이어티를 통해, EV, 예를 들어, 엑소좀의 외부 표면의 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X 단백질 또는 이의 단편에 연결, 예를 들어, 화학적으로 연결된다.
일부 양상들에서, 표적화 모이어티는 외인성 표적화 모이어티, 예를 들어 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 표적 세포 또는 조직의 표면 상에 존재하는 단백질(예를 들어, 수용체)에 특이적으로 결합하는 단백질 또는 펩티드이다.
일부 양상들에서, 표적화 모이어티는 수지상 세포에 대한 마커에 특이적으로 결합한다. 특정 양상들에서, 마커는 수지상 세포에만 존재한다. 일부 양상들에서, 수지상 세포는 형질세포양 수지상 세포 (pDC), 골수/통상적 수지상 세포 1 (cDC1), 골수/통상적 수지상 세포 2 (cDC2), 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 특정 양상들에서, 수지상 세포는 cDC1이다. 추가 양상들에서, 마커는 C형 렉틴 도메인 패밀리 9 멤버 A(Clec9a) 단백질, 수지상 세포 특이적 세포간 접착 분자-3-그랩 비-인테그린(DC-SIGN), CD207, CD40, Clec6, 수지상 세포 면역수용체(DCIR), DEC-205, 렉틴-유사 산화된 저밀도 지단백질 수용체-1(LOX-1), MARCO, Clec12a, DC-아시알로당단백질 수용체(DC-ASGPR), DC 면역 수용체 2(DCIR2), 덱틴-1, 대식세포 만노스 수용체(MMR), BDCA-1(CD303, Clec4c), 덱틴-2, Bst-2(CD317), 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 양상들에서, 마커는 Clec9a 단백질이다.
일부 양상들에서, 본 발명의 EV, 예를 들어, 엑소좀은 EV, 예를 들어 엑소좀의, 특정 조직 또는 세포에 대한 향성을 증가시키는 조직 또는 세포 특이적 리간드, 즉, 트로피즘 모이어티를 포함할 수 있다. 그러므로, 일부 양상들에서, EV, 예를 들어, 엑소좀에 대한, 특정 조직 또는 세포 유형에 대한 전달은 세포 유형-지시된 향성에 대한 모이어티를 (예를 들어, 특정 중성 세포 유형의 표면에 존재하는 항원을 표적하는 면역-친화성 리간드) EV, 예를 들어, 엑소좀에 연결함으로써 개선될 수 있다. 특정 양상들에서, 트로피즘 모이어티는 말레이미드 모이어티를 통해, EV, 예를 들어, 엑소좀의 외부 표면의 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X 단백질 또는 이의 단편에 연결, 예를 들어, 화학적으로 연결된다.
향성은 항-식세포 신호 (예를 들어, CD47 및/또는 CD24), 반감기 연장 모이어티 (예를 들어, 알부민 또는 PEG), 또는 이들의 임의의 조합을 본 발명의 EV, 예를 들어, 엑소좀의 외부 표면에 부착함으로써 더욱 개선될 수 있다. 특정 양상들에서, 항-식세포 신호는 말레이미드 모이어티를 통해, EV, 예를 들어, 엑소좀의 외부 표면의 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X 단백질 또는 이의 단편에 연결, 예를 들어, 화학적으로 연결된다.
약동학, 생체분포, 특히 트로피즘 및 원하는 조직 또는 해부학적 위치에서의 체류는 또한 적절한 투여 경로 (예를 들어, 중추 신경계에 대한 향성을 개선하기 위한 경막내 투여 또는 안구내 투여)를 선택함으로써 달성될 수 있다.
일부 양상들에서, 중추신경계에 대한 향성이 요구되는 경우, 본 발명의 EV, 예를 들어, 엑소좀은 특정 중추신경계 조직 또는 세포에 대한 EV, 예를 들어 엑소좀, 향성을 증가시키는 조직 또는 세포-특이적 표적 리간드를 포함할 수 있다. 일부 양상들에서, 세포는 신경아교 세포이다. 일부 양상들에서, 신경아교 세포는 희소돌기아교세포, 성상아교세포, 뇌실막 세포, 미세아교세포, 슈반 세포, 위성 신경아교 세포, 후각 피복 세포, 또는 이들의 조합이다. 일부 양상들에서, 세포는 신경 줄기 세포이다. 일부 양상들에서, 슈반 세포에 대한 EV, 예를 들어, 엑소좀, 향성을 증가시키는 세포-특이적 표적 리간드는 슈반 세포 표면 마커, 예를 들어, 수초 염기성 단백질 (MBP), 수초 단백질 제로 (P0), P75NTR, NCAM, PMP22, 및 이들의 임의의 조합에 결합한다. 일부 양상들에서, 세포 특이적 트로피즘 모이어티는 항체 또는 이의 항원 결합 부분, 압타머, 또는 슈반 세포의 표면 상에 발현된 수용체의 효현제 또는 길항제를 포함한다.
원칙적으로, 본 발명의 EV, 예를 들어, 엑소좀을 특정 표적 세포 또는 조직 (예를 들어, 말초 신경의 슈반 세포)으로 지시할 수 있는 적어도 하나의 트로피즘 모이어티를 포함하는 EV, 예를 들어 엑소좀은, 트로피즘 모이어티의 존재 (단독으로 항식세포 신호의 존재 및 특정 투여 경로의 사용과 함께)가 원하는 표적 세포 또는 조직을 향한 EV, 예를 들어, 엑소좀의 향성을 유도할 것이기 때문에, 당업계에 공지된 임의의 적절한 투여 방법 (예를 들어, 정맥 주사 또는 주입)를 사용하여 투여될 수 있다.
일부 양상들에서, 본원에 개시된 표적화 모이어티 및/또는 트로피즘 모이어티는 스캐폴드 모이어티 (예를 들어, 스캐폴드 X 단백질 모이어티 또는 이의 단편, 또는 지질 모이어티)를 통해 본 발명의 EV, 예를 들어, 엑소좀에 연결될 수 있으며, 이때 표적화 및/또는 트로피즘 모이어티는 말레이미드 모이어티 그리고, 선택적으로, 하나 이상의 링커 (예를 들어, 절단가능한 링커)를 통해 스캐폴드 모이어티에 화학적으로 연결된다.
II.F EV, 예를 들어, 엑소좀
본 발명의 EV, 예를 들어, 엑소좀은 약 20 내지 약 300 nm의 직경을 가질 수 있다. 특정 양상들에서, 본 발명의 EV, 예를 들어, 엑소좀은 약 20 내지 약 290 nm, 약 20 내지 약 280 nm, 약 20 내지 약 270 nm, 약 20 내지 약 260 nm, 약 20 내지 약 250 nm, 약 20 내지 약 240 nm, 약 20 내지 약 230 nm, 약 20 내지 약 220 nm, 약 20 내지 약 210 nm, 약 20 내지 약 200 nm, 약 20 내지 약 190 nm, 약 20 내지 약 180 nm, 약 20 내지 약 170 nm, 약 20 내지 약 160 nm, 약 20 내지 약 150 nm, 약 20 내지 약 140 nm, 약 20 내지 약 130 nm, 약 20 내지 약 120 nm, 약 20 내지 약 110 nm, 약 20 내지 약 100 nm, 약 20 내지 약 90 nm, 약 20 내지 약 80 nm, 약 20 내지 약 70 nm, 약 20 내지 약 60 nm, 약 20 내지 약 50 nm, 약 20 내지 약 40 nm, 약 20 내지 약 30 nm, 약 30 내지 약 300 nm, 약 30 내지 약 290 nm, 약 30 내지 약 280 nm, 약 30 내지 약 270 nm, 약 30 내지 약 260 nm, 약 30 내지 약 250 nm, 약 30 내지 약 240 nm, 약 30 내지 약 230 nm, 약 30 내지 약 220 nm, 약 30 내지 약 210 nm, 약 30 내지 약 200 nm, 약 30 내지 약 190 nm, 약 30 내지 약 180 nm, 약 30 내지 약 170 nm, 약 30 내지 약 160 nm, 약 30 내지 약 150 nm, 약 30 내지 약 140 nm, 약 30 내지 약 130 nm, 약 30 내지 약 120 nm, 약 30 내지 약 110 nm, 약 30 내지 약 100 nm, 약 30 내지 약 90 nm, 약 30 내지 약 80 nm, 약 30 내지 약 70 nm, 약 30 내지 약 60 nm, 약 30 내지 약 50 nm, 약 30 내지 약 40 nm, 약 40 내지 약 300 nm, 약 40 내지 약 290 nm, 약 40 내지 약 280 nm, 약 40 내지 약 270 nm, 약 40 내지 약 260 nm, 약 40 내지 약 250 nm, 약 40 내지 약 240 nm, 약 40 내지 약 230 nm, 약 40 내지 약 220 nm, 약 40 내지 약 210 nm, 약 40 내지 약 200 nm, 약 40 내지 약 190 nm, 약 40 내지 약 180 nm, 약 40 내지 약 170 nm, 약 40 내지 약 160 nm, 약 40 내지 약 150 nm, 약 40 내지 약 140 nm, 약 40 내지 약 130 nm, 약 40 내지 약 120 nm, 약 40 내지 약 110 nm, 약 40 내지 약 100 nm, 약 40 내지 약 90 nm, 약 40 내지 약 80 nm, 약 40 내지 약 70 nm, 약 40 내지 약 60 nm, 약 40 내지 약 50 nm, 약 50 내지 약 300 nm, 약 50 내지 약 290 nm, 약 50 내지 약 280 nm, 약 50 내지 약 270 nm, 약 50 내지 약 260 nm, 약 50 내지 약 250 nm, 약 50 내지 약 240 nm, 약 50 내지 약 230 nm, 약 50 내지 약 220 nm, 약 50 내지 약 210 nm, 약 50 내지 약 200 nm, 약 50 내지 약 190 nm, 약 50 내지 약 180 nm, 약 50 내지 약 170 nm, 약 50 내지 약 160 nm, 약 50 내지 약 150 nm, 약 50 내지 약 140 nm, 약 50 내지 약 130 nm, 약 50 내지 약 120 nm, 약 50 내지 약 110 nm, 약 50 내지 약 100 nm, 약 50 내지 약 90 nm, 약 50 내지 약 80 nm, 약 50 내지 약 70 nm, 약 50 내지 약 60 nm, 약 60 내지 약 300 nm, 약 60 내지 약 290 nm, 약 60 내지 약 280 nm, 약 60 내지 약 270 nm, 약 60 내지 약 260 nm, 약 60 내지 약 250 nm, 약 60 내지 약 240 nm, 약 60 내지 약 230 nm, 약 60 내지 약 220 nm, 약 60 내지 약 210 nm, 약 60 내지 약 200 nm, 약 60 내지 약 190 nm, 약 60 내지 약 180 nm, 약 60 내지 약 170 nm, 약 60 내지 약 160 nm, 약 60 내지 약 150 nm, 약 60 내지 약 140 nm, 약 60 내지 약 130 nm, 약 60 내지 약 120 nm, 약 60 내지 약 110 nm, 약 60 내지 약 100 nm, 약 60 내지 약 90 nm, 약 60 내지 약 80 nm, 약 60 내지 약 70 nm, 약 70 내지 약 300 nm, 약 70 내지 약 290 nm, 약 70 내지 약 280 nm, 약 70 내지 약 270 nm, 약 70 내지 약 260 nm, 약 70 내지 약 250 nm, 약 70 내지 약 240 nm, 약 70 내지 약 230 nm, 약 70 내지 약 220 nm, 약 70 내지 약 210 nm, 약 70 내지 약 200 nm, 약 70 내지 약 190 nm, 약 70 내지 약 180 nm, 약 70 내지 약 170 nm, 약 70 내지 약 160 nm, 약 70 내지 약 150 nm, 약 70 내지 약 140 nm, 약 70 내지 약 130 nm, 약 70 내지 약 120 nm, 약 70 내지 약 110 nm, 약 70 내지 약 100 nm, 약 70 내지 약 90 nm, 약 70 내지 약 80 nm, 약 80 내지 약 300 nm, 약 80 내지 약 290 nm, 약 80 내지 약 280 nm, 약 80 내지 약 270 nm, 약 80 내지 약 260 nm, 약 80 내지 약 250 nm, 약 80 내지 약 240 nm, 약 80 내지 약 230 nm, 약 80 내지 약 220 nm, 약 80 내지 약 210 nm, 약 80 내지 약 200 nm, 약 80 내지 약 190 nm, 약 80 내지 약 180 nm, 약 80 내지 약 170 nm, 약 80 내지 약 160 nm, 약 80 내지 약 150 nm, 약 80 내지 약 140 nm, 약 80 내지 약 130 nm, 약 80 내지 약 120 nm, 약 80 내지 약 110 nm, 약 80 내지 약 100 nm, 약 80 내지 약 90 nm, 약 90 내지 약 300 nm, 약 90 내지 약 290 nm, 약 90 내지 약 280 nm, 약 90 내지 약 270 nm, 약 90 내지 약 260 nm, 약 90 내지 약 250 nm, 약 90 내지 약 240 nm, 약 90 내지 약 230 nm, 약 90 내지 약 220 nm, 약 90 내지 약 210 nm, 약 90 내지 약 200 nm, 약 90 내지 약 190 nm, 약 90 내지 약 180 nm, 약 90 내지 약 170 nm, 약 90 내지 약 160 nm, 약 90 내지 약 150 nm, 약 90 내지 약 140 nm, 약 90 내지 약 130 nm, 약 90 내지 약 120 nm, 약 90 내지 약 110 nm, 약 90 내지 약 100 nm, 약 100 내지 약 300 nm, 약 110 내지 약 290 nm, 약 120 내지 약 280 nm, 약 130 내지 약 270 nm, 약 140 내지 약 260 nm, 약 150 내지 약 250 nm, 약 160 내지 약 240 nm, 약 170 내지 약 230 nm, 약 180 내지 약 220 nm, 또는 약 190 내지 약 210 nm의 직경을 가진다. 본원에 기재된 EV (예를 들어, 엑소좀)의 크기는 당업계에 공지된 방법에 따라 측정될 수 있다. 본 발명의 EV는 엑소좀, 미세소포, 세포자멸체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양상들에서, 본 발명의 EV는 엑소좀 및/또는 미세소포의 집단을 포함한다.
본 발명의 EV, 예를 들어, 엑소좀은 내부 표면 (내강 표면) 및 외부 표면 (예를 들어, 세포외 표면)을 포함하는 이중-지질 막 ("엑소좀 막" 또는 "EV 막")을 포함한다. 내부 표면은 EV (예를 들어, 엑소좀)의 내부 코어, 즉 EV의 내강을 대면한다. 특정 양상들에서, 외부 표면은 엔도솜, 다포체 또는 생산자 세포의 막/세포질과 접촉될 수 있다.
일부 양상들에서, EV, 예를 들어 엑소좀 막은 이중-지질 막, 예를 들어, 지질 이중층을 포함한다. 일부 양상들에서, EV, 예를 들어 엑소좀 막은 지질 및 지방산을 포함한다. 일부 양상들에서, EV, 예를 들어 엑소좀, 막은 인지질, 당지질, 지방산, 스핑고리피드, 포스포글리세리드, 스테롤, 콜레스테롤, 및 포스파티딜세린을 포함하는 지질을 포함한다. 일부 양상들에서, EV, 예를 들어 엑소좀 막은 내부 첨판과 외부 첨판을 포함한다. 내부 및 외부 첨판의 조성은 당업계에 공지된 이중층 분포 분석에 의해 결정될 수 있다 (예를 들어, Kuypers et al., Biohim Biophys Acta 1985 819:170 참조).
일부 양상들에서, 외부 첨판의 조성은 대략 70-90% 콜린 인지질, 대략 0-15% 산성 인지질, 및 대략 5-30% 포스파티딜에탄올아민이다. 일부 양상들에서, 내부 첨판의 조성은 대략 15-40% 콜린 인지질, 대략 10-50% 산성 인지질, 및 대략 30-60% 포스파티딜에탄올아민이다. 일부 양상들에서, EV 또는 엑소좀 막은 글리칸과 같은 하나 이상의 다당류를 포함한다. EV 또는 엑소좀 표면의 글리칸은 말레이미드 모이어티 또는 글리칸과 말레이미드 모이어티를 연결하는 링커에 부착제 역할을 할 수 있다. 글리칸은 EV (예를 들어, 엑소좀)의 표면 상의 하나 이상의 단백질에, 예를 들어 PTGFRN 폴리펩티드와 같은 스캐폴드 X에 또는 EV (예를 들어, 엑소좀)의 지질 막에 존재할 수 있다. 글리칸은 말레이미드 모이어티를 글리칸에 부착하기 위한 작용기의 역할을 할 수 있는 티오푸코스를 갖도록 변형될 수 있다. 일부 양상들에서, 스캐폴드 X는 EV (예를 들어, 엑소좀)에 추가 부착을 허용하기 위해 많은 수의 글리칸을 발현하도록 변형될 수 있다.
II.G. 스캐폴드 모이어티
일부 양상들에서, 생물학적 활성 분자는 EV (예를 들어, 엑소좀)의 외부 표면 또는 내강 표면에 연결된다. 일부 양상들에서, 생물학적 활성 분자는 말레이미드 모이어티를 통해, EV (예를 들어, 엑소좀)의 외부 표면 또는 내강 표면의 스캐폴드 모이어티 (예를 들어, 스캐폴드 X)에 연결, 예를 들어, 화학적으로 연결된다. 일부 양상들에서, 생물학적 활성 분자는 말레이미드 모이어티를 통해, EV (예를 들어, 엑소좀)의 외부 표면에 또는 말레이미드 모이어티를 통해 내강 표면의 스캐폴드 모이어티 (예를 들어, 콜레스테롤 모이어티)에 연결, 예를 들어, 화학적으로 연결된다.
예를 들어, 전장 성숙 PTGRN은 16개의 시스테인을 포함한다, 즉, 16개의 설프하이드릴 그룹을 포함하며, 그 중 14개는 단백질의 세포외 부분에 있고 그 중 2개는 세포내 부분에 있다. PTGRN은 6개의 다이설파이드 가교를 가지며 모두 세포외에 존재한다. 따라서, PTGRN은 2개의 세포외 설프하이드릴 그룹 및 2개의 세포내 설프하이드릴그룹을 가진다. 그러므로, 일부 양상들에서, 생물학적 활성 모이어티는 생물학적 활성 모이어티에 존재하는 말레이미드 반응 그룹과 스캐폴드 X 단백질 (예를 들어, PTGRN 또는 이의 단편)에 존재하는 설프하이드릴 그룹 중 하나 사이의 반응에 의해 말레이미드 모이어티를 통해 스캐폴드 X 단백질 (예를 들어, PTGRN 또는 이의 단편)에 화학적으로 연결될 수 있다. 반대로, 이작용기 시약, 예를 들어 SMCC (숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트)와 스캐폴드 X 단백질의 라이신 측쇄 사이의 반응에 의해 도입되는 말레이미드 반응 그룹을 포함하는 스캐폴드 X 단백질 (예를 들어, PTGRN 또는 이의 단편)은 생물학적 활성 분자에 존재하는 설프하이드릴 그룹과 반응될 수 있다.
특정 양상들에서, 하나 이상의 모이어티는 트랜스펙션에 의해 EV (예를 들어, 엑소좀) 내부에 도입될 수 있다. 일부 양상들에서, 하나 이상의 모이어티는 합성 거대분자, 예를 들어 양이온 지질 및 중합체를 사용하여 EV (예를 들어, 엑소좀)에 도입될 수 있다 (Papapetrou et al., Gene Therapy 12: S118-S130 (2005)). 특정 양상들에서, 화학물질, 예를 들어, 칼슘 포스페이트, 사이클로덱스트린, 또는 폴리브렌을 사용하여 EV (예를 들어, 엑소좀)에 하나 이상의 모이어티를 도입할 수 있다.
일부 양상들에서, 하나 이상의 스캐폴드 모이어티는 CD47, CD55, CD49, CD40, CD133, CD59, 글리피칸-1, CD9, CD63, CD81, 인테그린, 셀렉틴, 렉틴, 캐드헤린, 당업자에게 공지된 기타 유사한 폴리펩티드, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
다른 양상들에서, 하나 이상의 스캐폴드 모이어티는 생산자 세포에서 스캐폴드 모이어티를 재조합적으로 발현함으로써 EV, 예를 들어, 엑소좀의 막에서 발현된다. 생산자 세포로부터 얻은 EV, 예를 들어, 엑소좀은 말레이미드 모이어티 또는 링커에 접합되도록 추가로 변형될 수 있다. 다른 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X는 탈당화된다. 일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X는 동일한 조건하에서 많이, 예를 들어, 자연 발생 스캐폴드 X 보다 많이 당화된다.
II.G.1 막횡단 스캐폴드 모이어티 (예를 들어, 스캐폴드 X)
스캐폴드 모이어티의 다양한 변형 또는 단편이 본 발명의 양상들에 사용될 수 있다. 예를 들어, 결합제에 대한 향상된 친화도를 갖도록 변형된 스캐폴드 모이어티는 결합제를 사용하여 정제할 수 있는 표면 조작된 EV, 예를 들어 엑소좀을 생성하는 데 사용될 수 있다. EV, 예를 들어, 엑소좀 및/또는 멤브레인을 보다 효과적으로 표적하도록 변형된 스캐폴드 모이어티가 사용될 수 있다. EV (예를 들어, 엑소좀) 막에 대한 특이적이고 효과적인 표적화에 필요한 최소 단편을 포함하도록 변형된 스캐폴드 모이어티도 사용될 수 있다. 일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티는 본원에 기재된 말레이미드 모이어티에 연결될 수 있다. 다른 양상들에서, 스캐폴드 모이어티는 말레이미드 모이어티에 연결되지 않는다.
스캐폴드 모이어티는 또 다른 분자 (예를 들어, 반응 그룹, 예를 들어, 설프하이드릴 그룹을 포함하는 단백질 링커, 단백질 서열, 또는 이들의 조합) 상의 말레이미드와 반응할 수 있는 또 다른 모이어티에 대해 예를 들어, 융합 단백질, 예를 들어, 스캐폴드 X의 융합 단백질로서 발현되도록 합성적으로 또는 재조합적으로 조작될 수 있다 예를 들어, 융합 단백질은 또 다른 모이어티에 연결된 본원에 개시된 스캐폴드 모이어티 (예를 들어, 스캐폴드 X, 예를 들어, PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, ATP 수송체, 또는 이의 단편 또는 변이체)를 포함할 수 있다. 융합 단백질의 경우, 제2 모이어티는 자연 펩티드, 재조합 펩티드, 합성 펩티드, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 다른 양상들에서, 스캐폴드 모이어티는 CD9, CD63, CD81, PDGFR, GPI 단백질, 락타데린, LAMP2, 또는 LAMP2B, 또는 이의 임의의 조합 일 수 있다. 본 발명과 함께 사용될 수 있는 다른 스캐폴드 모이어티의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: 아미노펩티다제 N(CD13); 네프릴라이신, AKA 멤브레인 메탈로엔도펩티다제 (MME); 엑토뉴클레오티드 피로포스파타제/포스포디에스테라제 패밀리 구성원 1(ENPP1); 뉴로필린-1(NRP1); 또는 이들의 임의의 조합.
일부 양상들에서, 융합 분자는 직접 또는 중간체(예를 들어, 화학적으로 유도 가능한 이량체, 항원 결합 도메인 또는 수용체)를 통해 생물학적 활성 분자에 연결된, 예를 들어, 말레이미드 모이어티에 의해 화학적으로 연결된 본원에 개시된 스캐폴드 단백질 (예를 들어, PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, ATP 수송체, 또는 이의 단편 또는 변이체)을 포함할 수 있다. 일부 양상들에서, 융합 분자는 말레이미드 모이어티를 통해 예를 들어, 표적화 모이어티에 또는 트로피즘 모이어티에 화학적으로 연결될 수 있다.
일부 양상들에서, 본원에 기재된 표면 (예를 들어, 스캐폴드 X)-조작된 EV, 예를 들어, 엑소좀은 당업계에 공지된 EV, 예를 들어, 엑소좀에 비해 우수한 특성을 나타낸다. 예를 들어, 표면 (예를 들어, 스캐폴드 X)-조작된 EV는 자연 발생 EV, 예를 들어, 엑소좀, 또는 통상적인 EV (예를 들어, 엑소좀) 단백질을 사용하여 생성된 EV, 예를 들어, 엑소좀 보다 EV (예를 들어, 엑소좀)의 외부 표면 또는 내강 표면에 보다 많이 풍부한 변형된 단백질을 포함한다. 더욱이, 본 발명의 표면 (예를 들어, 스캐폴드 X)-조작된 EV, 예를 들어, 엑소좀은 자연 발생 EV, 예를 들어, 엑소좀, 또는 통상적인 EV (예를 들어, 엑소좀) 단백질을 사용하여 생성된 EV, 예를 들어, 엑소좀에 비해 더 큰, 더 특이적인, 또는 더 제어되는 생물학적 활성을 가질 수 있다.
일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X 단백질은, 프로스타글란딘 F2 수용체 음성 조절인자 (PTGFRN 폴리펩티드)를 포함한다. PTGFRN 폴리펩티드는 또한 CD9 파트너 1(CD9P-1), Glu-Trp-Ile EWI 모티프-함유 단백질 F(EWI-F), 프로스타글란딘 F2-알파 수용체 조절 단백질, 프로스타글란딘 F2-알파 수용체 관련 단백질 또는 CD315로도 지칭될 수 있다. 인간 PTGFRN 폴리펩티드 (Uniprot 등록 번호 Q9P2B2)의 전장 아미노산 서열은 표 2에 서열 번호: 1로 제시된다. PTGFRN 폴리펩티드는 신호 펩티드 (서열 번호: 1의 아미노산 1 내지 25), 세포외 도메인 (서열 번호: 1의 아미노산 26 내지 832), 막횡단 도메인 (서열 번호: 1의 아미노산 833 내지 853), 및 세포질 도메인 (서열 번호: 1의 아미노산 854 내지 879)을 포함한다. 성숙 PTGFRN 폴리펩티드는 신호 펩티드, 즉, 서열 번호: 1의 아미노산 26 내지 879가 없는 서열 번호: 1로 구성된다. 일부 양상들에서, 본 발명에 유용한 PTGFRN 폴리펩티드 단편은 PTGFRN 폴리펩티드의 막횡단 도메인을 포함한다. 다른 양상들에서, 본 발명에 유용한 PTGFRN 폴리펩티드 단편은 PTGFRN 폴리펩티드의 막횡단 도메인 및 (i) 막횡단 도메인의 N 말단의 적어도 약 5, 적어도 약 10, 적어도 약 15, 적어도 약 20, 적어도 약 25, 적어도 약 30, 적어도 약 40, 적어도 약 50, 적어도 약 70, 적어도 약 80, 적어도 약 90, 적어도 약 100, 적어도 약 110, 적어도 약 120, 적어도 약 130, 적어도 약 140, 적어도 약 150개 아미노산, (ii) 막횡단 도메인의 C 말단의 적어도 약 5, 적어도 약 10, 적어도 약 15, 적어도 약 20, 또는 적어도 약 25개 아미노산, 또는 (i) 및 (ii) 모두를 포함한다.
일부 양상들에서, PTGFRN 폴리펩티드의 단편들은 하나 이상의 기능적 또는 구조적 도메인, 예를 들어 IgV가 없다.
다른 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X는, 서열 번호: 1의 아미노산 26 내지 879에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X는, PTGFRN 폴리펩티드의 단편 (서열 번호: 1의 위치 687 내지 878에 해당)인, 서열 번호: 2에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
아미노산다른 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X는, 하나의 아미노산 돌연변이, 2개의 아미노산 돌연변이, 3개의 아미노산 돌연변이, 4개의 아미노산 돌연변이, 5개의 아미노산 돌연변이, 6개의 아미노산 돌연변이, 또는 7개의 아미노산 돌연변이를 제외하고 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함한다. 돌연변이는 치환, 삽입, 결실, 또는 이의 임의의 조합일 수 있다. 일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X는, 서열 번호: 2의 아미노산 서열 및 서열 번호: 2의 N 말단 및/또는 C 말단에 1개 아미노산, 2개 아미노산, 3개 아미노산, 4개 아미노산, 5개 아미노산, 6개 아미노산, 7개 아미노산, 8개 아미노산, 9개 아미노산, 10개 아미노산, 11개 아미노산, 12개 아미노산, 13개 아미노산, 14개 아미노산, 15개 아미노산, 16개 아미노산, 17개 아미노산, 18개 아미노산, 19개 아미노산, 또는 20개 아미노산 또는 그 이상을 포함한다.
다른 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X는 서열 번호: 1의 아미노산 26 내지 879, 서열 번호: 1의 아미노산 833 내지 853, 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 1에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 양상들에서, 스캐폴드 X는 하나의 아미노산 돌연변이, 2개의 아미노산 돌연변이, 3개의 아미노산 돌연변이, 4개의 아미노산 돌연변이, 5개의 아미노산 돌연변이, 6개의 아미노산 돌연변이, 또는 7개의 아미노산 돌연변이를 제외하고 아미노산 26 내지 879, 서열 번호: 1의 아미노산 833 내지 853, 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함한다. 돌연변이는 치환, 삽입, 결실, 또는 이의 임의의 조합일 수 있다.
일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X는, 서열 번호: 1의 아미노산 26 내지 879, 서열 번호: 1의 아미노산 833 내지 853, 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 1의 아미노산 서열 및 서열 번호: 1의 아미노산 26 내지 879, 서열 번호: 1의 아미노산 833 내지 853, 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 1의 N 말단 및/또는 C 말단에 1개 아미노산, 2개 아미노산, 3개 아미노산, 4개 아미노산, 5개 아미노산, 6개 아미노산, 7개 아미노산, 8개 아미노산, 9개 아미노산, 10개 아미노산, 11개 아미노산, 12개 아미노산, 13개 아미노산, 14개 아미노산, 15개 아미노산, 16개 아미노산, 17개 아미노산, 18개 아미노산, 19개 아미노산, 또는 20개 아미노산 또는 그 이상을 포함한다.
다른 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X는, 서열 번호: 186, 187, 188, 189, 190, 또는 191에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 아미노산다른 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X는, 하나의 아미노산 돌연변이, 2개의 아미노산 돌연변이, 3개의 아미노산 돌연변이, 4개의 아미노산 돌연변이, 5개의 아미노산 돌연변이, 6개의 아미노산 돌연변이, 또는 7개의 아미노산 돌연변이를 제외하고 서열 번호: 186, 187, 188, 189, 190, 또는 191의 아미노산 서열을 포함한다. 돌연변이는 치환, 삽입, 결실, 또는 이의 임의의 조합일 수 있다. 일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X는, 서열 번호: 186, 187, 188, 189, 190, 또는 191의 아미노산 서열 및 서열 번호: 186, 187, 188, 189, 190, 또는 191의 N 말단 및/또는 C 말단에 1개 아미노산, 2개 아미노산, 3개 아미노산, 4개 아미노산, 5개 아미노산, 6개 아미노산, 7개 아미노산, 8개 아미노산, 9개 아미노산, 10개 아미노산, 11개 아미노산, 12개 아미노산, 13개 아미노산, 14개 아미노산, 15개 아미노산, 16개 아미노산, 17개 아미노산, 18개 아미노산, 19개 아미노산, 또는 20개 아미노산 또는 그 이상을 포함한다.
표 2. 스캐폴드 단백질 서열 예시
Figure pct00073
Figure pct00074
Figure pct00075
Figure pct00076
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다른 구체예들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X는, BSG 단백질, IGSF8 단백질, IGSF3 단백질, ITGB1 단백질, SLC3A2 단백질, ITGA4 단백질, ATP1A1 단백질, ATP1A2 단백질, ATP1A3 단백질, ATP1A4 단백질, ATP1A5 단백질, ATP2B1 단백질, ATP2B2 단백질, ATP2B3 단백질, ATP2B4 단백질, 또는 IGSF2 단백질을 포함하며, 이는 상응하는 성숙 BSG 단백질, IGSF8 단백질, IGSF3 단백질, ITGB1 단백질, SLC3A2 단백질, ITGA4 단백질, ATP1A1 단백질, ATP1A2 단백질, ATP1A3 단백질, ATP1A4 단백질, ATP1A5 단백질, ATP2B1 단백질, ATP2B2 단백질, ATP2B3 단백질, ATP2B4 단백질, 또는 IGSF2 단백질 (신호 펩티드 없음)에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양상들에서, BSG 단백질, IGSF8 단백질, IGSF3 단백질, ITGB1 단백질, SLC3A2 단백질, ITGA4 단백질, ATP1A1 단백질, ATP1A2 단백질, ATP1A3 단백질, ATP1A4 단백질, ATP1A5 단백질, ATP2B1 단백질, ATP2B2 단백질, ATP2B3 단백질, ATP2B4 단백질, 또는 IGSF2 단백질은 하나 이상의 기능적 또는 구조적 도메인, 예를 들어 IgV가 없다.
스캐폴드 X 단백질들의 비-제한적 예들은 2019년 2월 5일에 등록된 미국 특허 제 US 10,195,290B1에서 다음 ATP 수송체 단백질: ATP1A1, ATP1A2, ATP1A3, ATP1A4, ATP1B3, ATP2B1, ATP2B2, 및 ATP2B4), CD9, CD63, CD81, PDGFR, GPI 단백질, 락타데린, LAMP2, 및 LAMP2B로 찾을 수 있으며, 이 문헌은 본원에 그 전문이 참고로 포함된다.
일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X는, 바시긴 (BSG 단백질)을 포함한다. BSG 단백질은 5F7, 콜라게나제 자극 인자, 세포외 기질 메탈로프로테이나제 유도인자 (EMMPRIN), 백혈구 활성화 항원 M6, OK 혈액형 항원, 종양 세포 유래 콜라게나제 자극 인자(TCSF) 또는 CD147로도 알려져 있다. 인간 BSG 단백질의 Uniprot 번호는 P35613이다. BSG 단백질의 신호 펩티드는 서열번호: 3의 아미노산 1 내지 21이다. 서열 번호:3의 아미노산 138-323은 세포외 도메인이고, 서열 번호:3의 아미노산 324 내지 344는 막횡단 도메인이고, 서열 번호:3의 아미노산 345 내지 385는 BSG의 세포질 도메인이다.
다른 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X는 인간 BSG 단백질 (서열 번호:3)의 아미노산 22 내지 385에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양상들에서, 바시긴 폴리펩티드의 단편은 하나 이상의 기능적 또는 구조적 도메인, 예를 들어 IgV, 예를 들어, 인간 BSG 단백질의 아미노산 221 내지 315가 없다.
다른 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X는, 서열 번호: 193, 194, 또는 195에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 아미노산다른 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X는, 하나의 아미노산 돌연변이, 2개의 아미노산 돌연변이, 3개의 아미노산 돌연변이, 4개의 아미노산 돌연변이, 5개의 아미노산 돌연변이, 6개의 아미노산 돌연변이, 또는 7개의 아미노산 돌연변이를 제외하고 서열 번호: 193, 194, 또는 195의 아미노산 서열을 포함한다. 돌연변이는 치환, 삽입, 결실, 또는 이의 임의의 조합일 수 있다. 일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X는, 서열 번호: 193, 194, 또는 195의 아미노산 서열 및 서열 번호: 193, 194, 또는 195의 N 말단 및/또는 C 말단에 1개 아미노산, 2개 아미노산, 3개 아미노산, 4개 아미노산, 5개 아미노산, 6개 아미노산, 7개 아미노산, 8개 아미노산, 9개 아미노산, 10개 아미노산, 11개 아미노산, 12개 아미노산, 13개 아미노산, 14개 아미노산, 15개 아미노산, 16개 아미노산, 17개 아미노산, 18개 아미노산, 19개 아미노산, 또는 20개 아미노산 또는 그 이상을 포함한다.
일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X는 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원 8 (IgSF8 또는 IGSF8 단백질)을 포함하며, 이는 CD81 파트너 3, Glu-Trp-Ile EWI 모티프-함유 단백질 2 (EWI-2), 각질형성 관련 막횡단 단백질 4 (KCT-4), LIR-D1, 프로스타글란딘 조절 유사 단백질 (PGRL) 또는 CD316세포로도 알려져 있다. 전장 인간 IGSF8 단백질은 Uniprot에서 등록 번호 Q969P0이며 본원에서 서열 번호: 4로 제시된다. 인간 IGSF8 단백질은 신호 펩티드 (인간 IGSF8 단백질; 서열 번호: 4의 아미노산 1 내지 27), 세포외 도메인 (인간 IGSF8 단백질; 서열 번호: 4의 아미노산 28 내지 579), 막횡단 도메인 (인간 IGSF8 단백질; 서열 번호: 4의 아미노산 580 내지 600), 및 세포질 도메인 (인간 IGSF8 단백질; 서열 번호: 4의 아미노산 601 내지 613)을 가진다.
다른 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X는, 인간 IGSF8 단백질 (서열 번호: 4)의 아미노산 28 내지 613에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양상들에서, IGSF8 단백질은 하나 이상의 기능적 또는 구조적 도메인, 예를 들어 IgV가 없다. 아미노산다른 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X는, 하나의 아미노산 돌연변이, 2개의 아미노산 돌연변이, 3개의 아미노산 돌연변이, 4개의 아미노산 돌연변이, 5개의 아미노산 돌연변이, 6개의 아미노산 돌연변이, 또는 7개의 아미노산 돌연변이를 제외하고 인간 IGSF8 단백질 (서열 번호: 4)의 아미노산 서열을 포함한다. 돌연변이는 치환, 삽입, 결실, 또는 이의 임의의 조합일 수 있다. 일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X는, 인간 IGSF8 단백질 (서열 번호: 4)의 아미노산 서열 및 인간 IGSF8 단백질 (서열 번호: 4)의 N 말단 및/또는 C 말단에 1개 아미노산, 2개 아미노산, 3개 아미노산, 4개 아미노산, 5개 아미노산, 6개 아미노산, 7개 아미노산, 8개 아미노산, 9개 아미노산, 10개 아미노산, 11개 아미노산, 12개 아미노산, 13개 아미노산, 14개 아미노산, 15개 아미노산, 16개 아미노산, 17개 아미노산, 18개 아미노산, 19개 아미노산, 또는 20개 아미노산 또는 그 이상을 포함한다.
일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X는, 서열 번호: 197, 198, 199, 또는 200에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 아미노산다른 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X는, 하나의 아미노산 돌연변이, 2개의 아미노산 돌연변이, 3개의 아미노산 돌연변이, 4개의 아미노산 돌연변이, 5개의 아미노산 돌연변이, 6개의 아미노산 돌연변이, 또는 7개의 아미노산 돌연변이를 제외하고 서열 번호: 197, 198, 199, 또는 200의 아미노산 서열을 포함한다. 돌연변이는 치환, 삽입, 결실, 또는 이의 임의의 조합일 수 있다. 일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X는, 서열 번호: 197, 198, 199, 또는 200의 아미노산 서열 및 서열 번호: 197, 198, 199, 또는 200의 N 말단 및/또는 C 말단에 1개 아미노산, 2개 아미노산, 3개 아미노산, 4개 아미노산, 5개 아미노산, 6개 아미노산, 7개 아미노산, 8개 아미노산, 9개 아미노산, 10개 아미노산, 11개 아미노산, 12개 아미노산, 13개 아미노산, 14개 아미노산, 15개 아미노산, 16개 아미노산, 17개 아미노산, 18개 아미노산, 19개 아미노산, 또는 20개 아미노산 또는 그 이상을 포함한다.
일부 양상들에서, 본 발명의 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X는 Glu-Trp-Ile EWI 모티프-함유 단백질 3 (EWI-3)으로도 알려진 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원 3 (IgSF3 또는 IGSF3 단백질)을 포함하고, 서열 번호: 203의 아미노산 서열로 제시된다. 인간 IGSF3 단백질은 신호 펩티드 (서열 번호: 203의 IGSF3 단백질의 아미노산 1 내지 19), 세포외 도메인 (서열 번호: 203의 IGSF3 단백질의 아미노산 20 내지 1124), 막횡단 도메인 (IGSF3 단백질의 아미노산 1125 내지 1145), 및 세포질 도메인(서열 번호: 203의 IGSF3 단백질의 아미노산 1146 내지 1194)을 가진다.
다른 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X는, IGSF3 단백질 (서열 번호: 203)의 아미노산 28 내지 613에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양상들에서, IGSF3 단백질은 하나 이상의 기능적 또는 구조적 도메인, 예를 들어 IgV가 없다.
일부 양상들에서, 본 발명의 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X는 인테그린 베타-1(ITGB1 단백질)을 포함하며, 이는 피브로넥틴 수용체 서브유닛 베타, 당단백질 IIa(GPIIA), VLA-4 서브유닛 베타 또는 CD29로도 알려져 있고, 서열 번호: 5의 아미노산 서열로 제시된다. 인간 ITGB1 단백질은 신호 펩티드 (서열 번호: 5의 인간 ITGB1 단백질의 아미노산 1 내지 20), 세포외 도메인 (서열 번호: 5의 인간 ITGB1 단백질의 아미노산 21 내지 728), 막횡단 도메인 (서열 번호: 5의 인간 ITGB1 단백질의 아미노산 729 내지 751), 및 세포질 도메인 (서열 번호: 5의 인간 ITGB1 단백질의 아미노산 752 내지 798)을 가진다.
다른 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X는, 인간 ITGB1 단백질 (서열 번호: 5)의 아미노산 21 내지 798에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양상들에서, ITGB1 단백질은 하나 이상의 기능적 또는 구조적 도메인, 예를 들어 IgV가 없다.
다른 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X는 ITGA4 단백질을 포함하고, 이는 신호 펩티드 (서열 번호: 6의 인간 ITGB1 단백질의 아미노산 1 내지 33) 없는 서열 번호: 6의 인간 ITGB1 단백질에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양상들에서, ITGA4 단백질은 하나 이상의 기능적 또는 구조적 도메인, 예를 들어 IgV가 없다.
다른 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X는 SLC3A2 단백질을 포함하고, 이는 신호 펩티드 없는 서열 번호: 7의 SLC3A2 단백질에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양상들에서, SLC3A2 단백질은 하나 이상의 기능적 또는 구조적 도메인, 예를 들어 IgV가 없다.
다른 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X는 ATP1A1 단백질을 포함하고, 이는 신호 펩티드 없는 서열 번호: 204의 ATP1A1 단백질에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양상들에서, ATP1A1 단백질은 하나 이상의 기능적 또는 구조적 도메인, 예를 들어 IgV가 없다.
다른 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X는 ATP1A2 단백질을 포함하고, 이는 신호 펩티드 없는 서열 번호: 205의 ATP1A2 단백질에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양상들에서, ATP1A2 단백질은 하나 이상의 기능적 또는 구조적 도메인, 예를 들어 IgV가 없다.
다른 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X는 ATP1A3 단백질을 포함하고, 이는 신호 펩티드 없는 서열 번호: 206의 ATP1A3 단백질에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양상들에서, ATP1A3 단백질은 하나 이상의 기능적 또는 구조적 도메인, 예를 들어 IgV가 없다.
다른 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X는 ATP1A4 단백질을 포함하고, 이는 신호 펩티드 없는 서열 번호: 207의 ATP1A4 단백질에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양상들에서, ATP1A4 단백질은 하나 이상의 기능적 또는 구조적 도메인, 예를 들어 IgV가 없다.
다른 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X는 ATP1B3 단백질을 포함하고, 이는 신호 펩티드 없는 서열 번호: 208의 ATP1B3 단백질에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양상들에서, ATP1B3 단백질은 하나 이상의 기능적 또는 구조적 도메인, 예를 들어 IgV가 없다.
다른 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X는 ATP2B1 단백질을 포함하고, 이는 신호 펩티드 없는 서열 번호: 209의 ATP2B1 단백질에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양상들에서, ATP2B1 단백질은 하나 이상의 기능적 또는 구조적 도메인, 예를 들어 IgV가 없다.
다른 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X는 ATP2B2 단백질을 포함하고, 이는 신호 펩티드 없는 서열 번호: 210의 ATP2B2 단백질에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양상들에서, ATP2B2 단백질은 하나 이상의 기능적 또는 구조적 도메인, 예를 들어 IgV가 없다.
다른 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X는 ATP2B3 단백질을 포함하고, 이는 신호 펩티드 없는 서열 번호: 211의 ATP2B3 단백질에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양상들에서, ATP2B3 단백질은 하나 이상의 기능적 또는 구조적 도메인, 예를 들어 IgV가 없다.
다른 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X는 ATP2B4 단백질을 포함하고, 이는 신호 펩티드 없는 서열 번호: 212의 ATP2B4 단백질에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양상들에서, ATP2B4 단백질은 하나 이상의 기능적 또는 구조적 도메인, 예를 들어 IgV가 없다.
다른 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X는 IGSF2 단백질을 포함하고, 이는 신호 펩티드 없는 IGSF2 단백질 (서열 번호: 202)에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양상들에서, IGSF2 단백질은 하나 이상의 기능적 또는 구조적 도메인, 예를 들어 IgV가 없다.
다른 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X 단백질의 비제한적 예는 2019년 2월 5일 등록된 미국 특허 제 US10195290B1에서 찾을 수 있으며, 이는 그 전문이 참고로 포함된다.
일부 양상들에서, 서열은 고유 단백질의 N-말단에서 적어도 약 5, 적어도 약 10, 적어도 약 50, 적어도 약 100, 적어도 약 200, 적어도 약 300, 적어도 약 400, 적어도 약 500, 적어도 약 600, 적어도 약 700, 또는 적어도 약 800개 아미노산이 없는 스캐폴드 모이어티의 단편을 인코딩한다. 일부 양상들에서, 서열은 고유 단백질의 C-말단에서 적어도 약 5, 적어도 약 10, 적어도 약 50, 적어도 약 100, 적어도 약 200, 적어도 약 300, 적어도 약 400, 적어도 약 500, 적어도 약 600, 적어도 약 700, 또는 적어도 약 800개 아미노산이 없는 스캐폴드 모이어티의 단편을 인코딩한다. 일부 양상들에서, 서열은 고유 단백질의 N-말단 및 C-말단 모두에서 적어도 약 5, 적어도 약 10, 적어도 약 50, 적어도 약 100, 적어도 약 200, 적어도 약 300, 적어도 약 400, 적어도 약 500, 적어도 약 600, 적어도 약 700, 또는 적어도 약 800개 아미노산이 없는 스캐폴드 모이어티의 단편을 인코딩한다. 일부 양상들에서, 서열은 고유 단백질의 하나 이상의 기능적 또는 구조적 도메인이 없는 스캐폴드 모이어티의 단편을 인코딩한다.
일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X, 예를 들어, PTGFRN 단백질은 하나 이상의 이종 단백질에 연결된다. 하나 이상의 이종 단백질은 스캐폴드 모이어티의 N-말단에 연결될 수 있다. 하나 이상의 이종 단백질은 스캐폴드 모이어티의 C-말단에 연결될 수 있다. 일부 양상들에서, 하나 이상의 이종 단백질은 스캐폴드 모이어티의 N-말단 및 C-말단 모두에 연결된다. 일부 양상들에서, 이종 단백질은 포유동물 단백질이다. 일부 양상들에서, 이종 단백질은 인간 단백질이다.
일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X는, 임의의 모이어티를 EV (예를 들어, 엑소좀)의 내강 표면 및 외부 표면에 동시에 연결시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, PTGFRN 폴리펩티드는 하나 이상의 생물학적 활성 분자를 말레이미드 모이어티를 통해 간접적으로 또는 말레이미드 모이어티에 직접 연결하거나 EV (예를 들어, 엑소좀)의 외부 표면 뿐만 아니라 내강 표면에 링커를 연결하는데 사용될 수 있다. 그러므로, 특정 양상들에서, 스캐폴드 X는 이중적인 목적을 위해 사용될 수 있다.
다른 양상들에서, 본 발명의 EV, 예를 들어 엑소좀은 자연 발생 EV, 예를 들어 엑소좀과 비교하여 더 많은 수의 스캐폴드 X 단백질을 포함한다. 일부 양상들에서, 본 발명의 EV, 예를 들어, 엑소좀은 자연 발생 EV (예를 들어, 엑소좀)에 비해 적어도 약 5 배, 적어도 약 10 배, 적어도 약 20 배, 적어도 약 30 배, 적어도 약 40 배, 적어도 약 50 배, 적어도 약 60 배, 적어도 약 70 배, 적어도 약 80 배, 적어도 약 90 배, 적어도 약 100 배, 적어도 약 110 배, 적어도 약 120 배, 적어도 약 130 배, 적어도 약 140 배, 적어도 약 150 배, 적어도 약 160 배, 적어도 약 170 배, 적어도 약 180 배, 적어도 약 190 배, 적어도 약 200 배, 적어도 약 210 배, 적어도 약 220 배, 적어도 약 230 배, 적어도 약 240 배, 적어도 약 250 배, 적어도 약 260 배, 적어도 약 270 배 더 많은 수의 스캐폴드 X (예를 들어, PTGFRN 폴리펩티드)를 포함한다.
본 발명의 EV (예를 들어, 엑소좀) 상의 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X, 예를 들어, PTGFRN 폴리펩티드의 수는 적어도 약 100, 적어도 약 200, 적어도 약 300, 적어도 약 400, 적어도 약 500, 적어도 약 600, 적어도 약 700, 적어도 약 800, 적어도 약 900, 적어도 약 1000, 적어도 약 1100, 적어도 약 1200, 적어도 약 1300, 적어도 약 1400, 적어도 약 1500, 적어도 약 1600, 적어도 약 1700, 적어도 약 1800, 적어도 약 1900, 적어도 약 2000, 적어도 약 2100, 적어도 약 2200, 적어도 약 2300, 적어도 약 2400, 적어도 약 2500, 적어도 약 2600, 적어도 약 2700, 적어도 약 2800, 적어도 약 2900, 적어도 약 3000, 적어도 약 4000, 적어도 약 5000, 적어도 약 6000, 적어도 약 7000, 적어도 약 8000, 적어도 약 9000, 또는 적어도 약 10000개이다.
일부 양상들에서, 본 발명의 EV, 예를 들어, 엑소좀 상의 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X, 예를 들어, PTGFRN 폴리펩티드의 수는 약 100 내지 약 100,000, 약 200 내지 약 9000, 약 300 내지 약 9000, 약 400 내지 약 9000, 약 500 내지 약 9000, 약 600 내지 약 8000, 약 800 내지 약 8000, 약 900 내지 약 8000, 약 1000 내지 약 8000, 약 1100 내지 약 8000, 약 1200 내지 약 8000, 약 1300 내지 약 8000, 약 1400 내지 약 8000, 약 1500 내지 약 8000, 약 1600 내지 약 8000, 약 1700 내지 약 8000, 약 1800 내지 약 8000, 약 1900 내지 약 8000, 약 2000 내지 약 8000, 약 2100 내지 약 8000, 약 2200 내지 약 8000, 약 2300 내지 약 8000, 약 2400 내지 약 8000, 약 2500 내지 약 8000, 약 2600, 약 2700 내지 약 8000, 약 2800 내지 약 8000, 약 2900 내지 약 8000, 약 3000 내지 약 8000, 약 4000 내지 약 8000, 약 5000 내지 약 8000, 약 6000 내지 약 8000, 약 7000 내지 약 8000, 약 8000, from 7000 내지 약 9000, 또는 약 6000 내지 약 10000개이다.
일부 양상들에서, 본 발명의 EV (예를 들어, 엑소좀) 상의 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X, 예를 들어, PTGFRN 폴리펩티드의 수는 약 5000 내지 약 8000, 예를 들어, 약 5000, 약 6000, 약 7000, 또는 약 8000개이다. 일부 양상들에서, 본 발명의 EV (예를 들어, 엑소좀) 상의 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X, 예를 들어, PTGFRN 폴리펩티드의 수는 약 6000 내지 약 8000, 예를 들어, 약 6000, 약 7000, 또는 약 8000개이다. 일부 양상들에서, 본 발명의 EV (예를 들어, 엑소좀) 상의 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X, 예를 들어, PTGFRN 폴리펩티드의 수는 약 4000 내지 약 9000, 예를 들어, 약 4000, 약 5000, 약 6000, 약 7000, 약 8000, 약 9000개이다.
II.G.2 내강 스캐폴드 모이어티 (예를 들어, 스캐폴드 Y)
일부 양상들에서, 본 발명의 EV, 예를 들어 엑소좀은 자연 발생 EV, 예를 들어 엑소좀과 상이한 내부 공간 (즉, 내강)을 포함한다. 예를 들어, EV, 예를 들어 엑소좀은 EV, 예를 들어 엑소좀의 내강 표면 상의 조성이 자연 발생 EV, 예를 들어 엑소좀과 상이한 단백질, 지질 또는 글리칸 함량을 갖도록 변경될 수 있다.
일부 양상들에서, 조작된 EV, 예를 들어, 엑소좀은, 엑소좀의 내강 표면의 조성 또는 함량을 변화시키는 스캐폴드 모이어티 (예를 들어, 엑소좀 단백질, 예를 들어, 스캐폴드 Y) 또는 이러한 스캐폴드 모이어티의 변형 또는 단편을 인코딩하는 외인성 서열로 형질전환된 세포로부터 생산될 수 있다. EV, 예를 들어, 엑소좀의 내강 표면에서 발현될 수 있는, EV, 예를 들어, 엑소좀, 단백질의 다양한 변형 또는 단편들이 본 발명의 양상들에서 사용될 수 있다.
일부 양상들에서, EV, 예를 들어 엑소좀의 내강 표면을 변화시킬 수 있는 EV, 예를 들어 엑소좀, 단백질은 MARCKS 단백질, MARCKSL1 단백질, BASP1 단백질, 또는 이의 임의의 조합을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y는, 뇌산 가용성 단백질 1 (BASP1 단백질)을 포함한다. BASP1 단백질은 22kDa 신경 조직에 풍부한 산성 단백질 또는 신경 축삭막 단백질 NAP-22로도 알려져 있다. 전장 인간 BASP1 단백질 서열 (이성질체 1)이 표 3에 제시되어 있다. 대안적 스플라이싱에 의해 생성된 이성질체는 표 3의 BASP1 단백질(이성질체 1)로부터 아미노산 88 내지 141이 누락되어 있다.
표 3. 스캐폴드 단백질 서열 예시
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일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y는 MARCKS, MARKSL1, BASP1, 이들의 임의의 기능적 단편, 변이체 또는 유도체, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성된 그룹에서 선택되는 단백질을 포함한다. 일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y는 Src 단백질 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y는 예를 들어, 미국 특허 제 9,611,481에 개시된 서열을 포함한다.
일부 양상들에서, 본 발명의 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y는, MARCKS 단백질, 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함한다. MARCKS 단백질 (Uniprot 등록 번호 P29966)은 단백질 키나제 C 기질, 80kDa 단백질, 경쇄로도 알려져 있다. 전장 인간 MARCKS 단백질은 332개 아미노산 길이이고 아미노산 잔기 152-176에서 칼모듈린-결합 도메인을 포함한다. 일부 양상들에서, 본 발명의 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y는 성숙 MARCKS 단백질 (즉, N-말단 메티오닌 없음)을 포함한다. 일부 양상들에서, 본 발명의 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y는 성숙한 MARCKS 단백질로부터 유래된다, 즉, 이는 성숙한 MARCKS 단백질의 단편, 변이체 또는 유도체이고, 따라서 비성숙 단백질에 존재하는 N-말단 단백질이 없다.
일부 양상들에서, 본 발명의 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y는 MARCKS-유사 단백질 1로도 공지된 MARCKSL1 단백질(Uniprot 등록 번호 P49006), 및 대식세포 미리스토일화된 알라닌-풍부 C 키나제 기질을 포함한다. 전장 인간 MARCKSL1 단백질은 195개 아미노산 길이이다. MARCKSL1 단백질은 아미노산 잔기 87-110에서 지질 결합 및 칼모듈린 결합에 관여하는 이펙터 도메인을 가지고 있다. 일부 양상들에서, 본 발명의 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y는 성숙 MARCKSL1 단백질 (즉, N-말단 메티오닌 없음)을 포함한다. 일부 양상들에서, 본 발명의 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y는 성숙한 MARCKSL1 단백질로부터 유래된다, 즉, 이는 성숙한 MARCKSL1 단백질의 단편, 변이체 또는 유도체이고, 따라서 비성숙 단백질에 존재하는 N-말단 단백질이 없다.
일부 양상들에서, 본 발명의 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y는 22kDa 신경 조직에 풍부한 산성 단백질 또는 신경 축삭 막 단백질 NAP-22로도 알려진 BASP1 단백질(Uniprot 등록 번호 P80723)을 포함한다. 전장 인간 BASP1 단백질 서열 (이성질체 1)은 227개 아미노산 길이이다. 대안적 스플라이싱에 의해 생성된 이성질체는 이성질체 1로부터 아미노산 88 내지 141이 누락되어 있다. 일부 양상들에서, 본 발명의 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y는 성숙 BASP1 단백질 (즉, N-말단 메티오닌 없음)을 포함한다. 일부 양상들에서, 본 발명의 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y는 성숙한 BASP1 단백질로부터 유래된다, 즉, 이는 성숙한 BASP1 단백질의 단편, 변이체 또는 유도체이고, 따라서 비성숙 단백질에 존재하는 N-말단 단백질이 없다. 성숙 BASP1 단백질 서열은 서열 번호: 10의 첫번째 메티오닌이 없으므로 서열 번호: 10의 아미노산 2 내지 227을 포함한다.
다른 양상들에서, 본 발명에 유용한 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y는 서열 번호: 10의 아미노산 2 내지 227, 즉, BASP1의 성숙 형태 (즉, 서열 번호: 10에 존재하는 N-말단 메티오닌 아미노산이 없음)에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 X 단백질은, 서열 번호: 10 (BASP1)의 성숙 형태, 즉, 서열 번호: 10에 존재하는 N-말단 메티오닌 아미노산이 없는 형태의 기능적 단편에 적어도 약 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 양상들에서, 본 발명에 유용한 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y는, 하나의 아미노산 돌연변이, 2개의 아미노산 돌연변이, 3개의 아미노산 돌연변이, 4개의 아미노산 돌연변이, 5개의 아미노산 돌연변이, 6개의 아미노산 돌연변이, 또는 7개의 아미노산 돌연변이를 제외하고 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함한다. 돌연변이는 치환, 삽입, 결실, 또는 이의 임의의 조합일 수 있다. 일부 양상들에서, 본 발명에 유용한 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y는, 서열 번호:10의 아미노산 서열 및 서열 번호: 10의 N 말단 및/또는 C 말단에 1개 아미노산, 2개 아미노산, 3개 아미노산, 4개 아미노산, 5개 아미노산, 6개 아미노산, 7개 아미노산, 8개 아미노산, 9개 아미노산, 10개 아미노산, 11개 아미노산, 12개 아미노산, 13개 아미노산, 14개 아미노산, 15개 아미노산, 16개 아미노산, 17개 아미노산, 18개 아미노산, 19개 아미노산, 또는 20개 아미노산 또는 그 이상을 포함한다.
다른 양상들에서, 본 발명에 유용한 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y는 서열 번호:9 (MARCKSL1)의 성숙 형태, 즉, 서열 번호: 9에 존재하는 N-말단 메티오닌 아미노산이 없는 형태에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y는 서열 번호: 9 (MARCKSL1)의 성숙 형태, 즉, 서열 번호: 9에 존재하는 N-말단 메티오닌 아미노산이 없는 형태의 기능적 단편에 적어도 약 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 양상들에서, 본 발명에 유용한 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y는, 하나의 아미노산 돌연변이, 2개의 아미노산 돌연변이, 3개의 아미노산 돌연변이, 4개의 아미노산 돌연변이, 5개의 아미노산 돌연변이, 6개의 아미노산 돌연변이, 또는 7개의 아미노산 돌연변이를 제외하고 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함한다. 돌연변이는 치환, 삽입, 결실, 또는 이의 임의의 조합일 수 있다. 일부 양상들에서, 본 발명에 유용한 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y는, 서열 번호: 9의 아미노산 서열 및 서열 번호: 9의 N 말단 및/또는 C 말단에 1개 아미노산, 2개 아미노산, 3개 아미노산, 4개 아미노산, 5개 아미노산, 6개 아미노산, 7개 아미노산, 8개 아미노산, 9개 아미노산, 10개 아미노산, 11개 아미노산, 12개 아미노산, 13개 아미노산, 14개 아미노산, 15개 아미노산, 16개 아미노산, 17개 아미노산, 18개 아미노산, 19개 아미노산, 또는 20개 아미노산 또는 그 이상을 포함한다.
다른 양상들에서, 본 발명에 유용한 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y는 서열 번호: 8 (MARCKS)의 성숙 형태, 즉, 서열 번호: 8에 존재하는 N-말단 메티오닌 아미노산이 없는 형태에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y는 서열 번호: 8 (MARCKS)의 성숙 형태, 즉, 서열 번호: 8에 존재하는 N-말단 메티오닌 아미노산이 없는 형태의 기능적 단편에 적어도 약 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 양상들에서, 본 발명에 유용한 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y는, 하나의 아미노산 돌연변이, 2개의 아미노산 돌연변이, 3개의 아미노산 돌연변이, 4개의 아미노산 돌연변이, 5개의 아미노산 돌연변이, 6개의 아미노산 돌연변이, 또는 7개의 아미노산 돌연변이를 제외하고 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함한다. 돌연변이는 치환, 삽입, 결실, 또는 이의 임의의 조합일 수 있다. 일부 양상들에서, 본 발명에 유용한 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y는, 서열 번호: 8의 아미노산 서열 및 서열 번호: 8의 N 말단 및/또는 C 말단에 1개 아미노산, 2개 아미노산, 3개 아미노산, 4개 아미노산, 5개 아미노산, 6개 아미노산, 7개 아미노산, 8개 아미노산, 9개 아미노산, 10개 아미노산, 11개 아미노산, 12개 아미노산, 13개 아미노산, 14개 아미노산, 15개 아미노산, 16개 아미노산, 17개 아미노산, 18개 아미노산, 19개 아미노산, 또는 20개 아미노산 또는 그 이상을 포함한다.
특정 양상들에서, PCT/US2018/061679에 개시된 서열 번호: 1-109의 단백질 서열은 본 발명의 스캐폴드 Y (예를 들어, 링커에 연결된 스캐폴드 모이어티)가 되기에 충분하다.
특정 양상들에서, 본 발명에 유용한 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y는 MGXKLSKKK (서열 번호: 224) 또는 GXKLSKKK (서열 번호: 225)를 갖는 펩티드를 포함하며, 여기서 X는 알라닌 또는 임의의 다른 아미노산이다. 일부 양상들에서, EV (예를 들어, 엑소좀)는 (M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+) 또는 (G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)의 서열을 가지는 펩티드를 포함하고, 이때 각 괄호 위치는 아미노산을 나타내고, 여기서 π는 (Pro, Gly, Ala, Ser)으로 구성된 그룹에서 선택된 임의의 아미노산이고, x는 임의의 아미노산이고, Φ는 (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met)으로 구성된 그룹에서 선택되는 임의의 아미노산이고, (+)는 (Lys, Arg, His)로 구성된 그룹에서 선택되는 임의의 아미노산이고; 5번 위치는 (+)가 아니고 6번 위치는 (+)도 아니고 (Asp 또는 Glu)도 아니다. 추가 양상들에서, 본원에 기재된 EV (예를 들어, 엑소좀) (예를 들어, 조작된 엑소좀)는 (M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+) 또는 (G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)의 서열을 가지는 펩티드를 포함하고, 이때 각 괄호의 위치는 아미노산을 나타내고, 그리고 이때 π은 (Pro, Gly, Ala, Ser)으로 구성된 그룹에서 선택된 임의의 아미노산이고, X는 임의의 아미노산이고, Φ는 (Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Met)으로 구성된 그룹에서 선택된 임의의 아미노산이고, 및 (+)는 (Lys, Arg, His)으로 구성된 그룹에서 선택된 임의의 아미노산이고; 5번 위치는 (+)가 아니고 6번 위치는 (+)도 아니고 (Asp 또는 Glu)도 아니다. 아미노산 명명법은 Aasland et al., FEBS Letters 513 (2002) 141-144를 참조하라.
다른 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y는 2019년 2월 5일에 등록된 미국 특허 10,195,290B1에 개시된 서열들 중 하나에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기재된 스캐폴드 Y-조작된 엑소좀은 PCT/US2018/061679에 기재된 임의의 서열 (PCT/US2018/061679의 서열 번호 4-109)로 형질전환된 세포로부터 생산될 수 있다.
다른 양상들에서, 본 발명의 EV, 예를 들어 엑소좀은 자연 발생 EV, 예를 들어 엑소좀과 비교하여 더 많은 수의 스캐폴드 Y 단백질을 포함한다. 일부 양상들에서, 본 발명의 EV, 예를 들어, 엑소좀은 자연 발생 EV, 예를 들어, 엑소좀에 비해 적어도 약 5 배, 적어도 약 10 배, 적어도 약 20 배, 적어도 약 30 배, 적어도 약 40 배, 적어도 약 50 배, 적어도 약 60 배, 적어도 약 70 배, 적어도 약 80 배, 적어도 약 90 배, 적어도 약 100 배, 적어도 약 110 배, 적어도 약 120 배, 적어도 약 130 배, 적어도 약 140 배, 적어도 약 150 배, 적어도 약 160 배, 적어도 약 170 배, 적어도 약 180 배, 적어도 약 190 배, 적어도 약 200 배, 적어도 약 210 배, 적어도 약 220 배, 적어도 약 230 배, 적어도 약 240 배, 적어도 약 250 배, 적어도 약 260 배, 적어도 약 270 배 더 많은 수의 스캐폴드 Y (예를 들어, BASP-1 폴리펩티드)를 포함한다. 본 발명의 EV, 예를 들어, 엑소좀 상의 스캐폴드 Y, 예를 들어, BASP-1 폴리펩티드의 수는 적어도 약 100, 적어도 약 200, 적어도 약 300, 적어도 약 400, 적어도 약 500, 적어도 약 600, 적어도 약 700, 적어도 약 800, 적어도 약 900, 적어도 약 1000, 적어도 약 1100, 적어도 약 1200, 적어도 약 1300, 적어도 약 1400, 적어도 약 1500, 적어도 약 1600, 적어도 약 1700, 적어도 약 1800, 적어도 약 1900, 적어도 약 2000, 적어도 약 2100, 적어도 약 2200, 적어도 약 2300, 적어도 약 2400, 적어도 약 2500, 적어도 약 2600, 적어도 약 2700, 적어도 약 2800, 적어도 약 2900, 적어도 약 3000, 적어도 약 4000, 적어도 약 5000, 적어도 약 6000, 적어도 약 7000, 적어도 약 8000, 적어도 약 9000, 또는 적어도 약 10000개 이다. 일부 양상들에서, 본 발명의 EV, 예를 들어, 엑소좀 상의 스캐폴드 Y, 예를 들어, BASP-1 폴리펩티드의 수는 약 100 내지 약 100,000, 약 200 내지 약 9000, 약 300 내지 약 9000, 약 400 내지 약 9000, 약 500 내지 약 9000, 약 600 내지 약 8000, 약 800 내지 약 8000, 약 900 내지 약 8000, 약 1000 내지 약 8000, 약 1100 내지 약 8000, 약 1200 내지 약 8000, 약 1300 내지 약 8000, 약 1400 내지 약 8000, 약 1500 내지 약 8000, 약 1600 내지 약 8000, 약 1700 내지 약 8000, 약 1800 내지 약 8000, 약 1900 내지 약 8000, 약 2000 내지 약 8000, 약 2100 내지 약 8000, 약 2200 내지 약 8000, 약 2300 내지 약 8000, 약 2400 내지 약 8000, 약 2500 내지 약 8000, 약 2600, 약 2700 내지 약 8000, 약 2800 내지 약 8000, 약 2900 내지 약 8000, 약 3000 내지 약 8000, 약 4000 내지 약 8000, 약 5000 내지 약 8000, 약 6000 내지 약 8000, 약 7000 내지 약 8000, 약 8000, from 7000 내지 약 9000, 또는 약 6000 내지 약 10000개이다. 일부 양상들에서, 본 발명의 EV, 예를 들어, 엑소좀 상의 스캐폴드 Y, 예를 들어, BASP-1 폴리펩티드의 수는 약 5000 내지 약 8000, 예를 들어, 약 5000, 약 6000, 약 7000, 또는 약 8000개이다. 일부 양상들에서, 본 발명의 EV, 예를 들어, 엑소좀 상의 스캐폴드 Y, 예를 들어, BASP-1 폴리펩티드의 수는 약 6000 내지 약 8000, 예를 들어, 약 6000, 약 7000, 또는 약 8000개이다. 일부 양상들에서, 본 발명의 EV, 예를 들어, 엑소좀 상의 스캐폴드 Y, 예를 들어, BASP-1 폴리펩티드의 수는 약 4000 내지 약 9000, 예를 들어, 약 4000, 약 5000, 약 6000, 약 7000, 약 8000, 약 9000개이다.
일부 양상들에서, 본 발명에 유용한 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y는 "N-말단 도메인" (ND) 및 "이펙터 도메인" (ED)을 포함하며, 여기서 ND 및/또는 ED는 EV, 예를 들어 엑소좀의 내강 표면과 결부된다. 일부 양상들에서, 본 발명에 유용한 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y는 세포내 도메인, 막횡단 도메인 및 세포외 도메인을 포함하고; 여기서 세포내 도메인은 "N-말단 도메인" (ND) 및 "이펙터 도메인" (ED)을 포함하고; 여기서 ND 및/또는 ED는 EV, 예를 들어 엑소좀의 내강 표면과 결부된다. 본원에서 사용되는 용어 "~와 결부된"은 막 성분에 대한 공유 연결을 포함하지 않는 본 발명의 스캐폴드 단백질과 EV, 예를 들어, 엑소좀의 내강 표면 사이의 상호작용을 지칭한다. 예를 들어, 본 발명에 유용한 스캐폴드 모이어티는 예를 들어 지질 (예를 들어, 미리스트산), 및/또는 막 인지질의 음으로 하전된 헤드와 정전기적으로 상호작용하는 다염기성 도메인을 통해 EV의 내강 표면과 결부될 수 있다. 다른 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y는 N-말단 도메인(ND) 및 이펙터 도메인(ED)을 포함하며, 여기서 이온 상호작용에 의해 ND는 EV의 내강 표면과 결부되고 ED는 EV의 내강 표면과 결부되며, 여기서 ED는 순서대로 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 또는 7개 이상의 연속 염기성 아미노산, 예를 들어 라이신(Lys)을 포함한다.
다른 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y는 N-말단 도메인(ND) 및 이펙터 도메인(ED)을 포함하며, 여기서 이온 상호작용에 의해 ND는 EV의 내강 표면과 결부되고 ED는 EV의 내강 표면과 결부되며, 여기서 ED는 순서대로 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 또는 7개 이상의 연속 라이신(Lys)을 포함한다.
다른 양상들에서, ED는 하나 이상의 낮은 복잡성 영역, 예를 들어 PEST 모티프를 추가로 포함한다. PEST 서열은 프롤린(P), 글루탐산(E), 세린(S), 트레오닌(T)이 풍부한 펩티드 서열이다. 일부 양상들에서, ED는 음전하를 띤 잔기(예를 들어, Glu)와 일시적인 인산화를 겪는 많은 Ser 및 Thr을 추가로 포함한다 (그리하여 둘 다 ED 외부 영역에 음전하를 추가함).
일부 양상들에서, ND는 지질화를 통해, 예를 들어, 미리스토일화를 통해 EV, 예를 들어 엑소좀의 내강 표면과 결부된다. 일부 양상들에서, ND는 N 말단에 Gly가 있다. 일부 양상들에서, N-말단 Gly는 미리스토일화되어 있다.
일부 양상들에서, ED는 이온 상호작용에 의해 EV, 예를 들어, 엑소좀의 내강 표면과 결부된다. 일부 양상들에서, ED는 정전기 상호작용, 특히 끌어당기는 정전기 상호작용에 의해 EV, 예를 들어 엑소좀의 내강 표면과 결부된다.
일부 양상들에서, ED는 (i) 염기성 아미노산 (예를 들어, 라이신), 또는 (ii) 폴리펩티드 서열에서 서로 옆에 있는 2개 이상의 염기성 아미노산 (예를 들어, 라이신)을 포함한다. 일부 양상들에서, 염기성 아미노산은 라이신 (Lys; K), 아르기닌 (Arg, R) 또는 히스티딘 (His, H)이다. 일부 양상들에서, 염기성 아미노산은 (Lys)n이고, 이때 n은 1 내지 10의 정수이다.
일부 양상들에서, ED는 (i) ED의 라이신 반복 또는 (ii) ND의 라이신 반복, 예를 들어 ND의 C 말단에 K 및 ED의 N 말단에 K를 포함하며, 여기서 ND와 ED는 직접, 즉 펩티드 결합에 의해 연결되어 있다. 일부 양상들에서, EV, 예를 들어, 엑소좀의 내강에서 이종 모이어티, 예를 들어 생물학적 활성 분자를 연결할 수 있는 아미노산의 최소 수는, 예를 들어, 약 7 내지 약 15, 약 7 내지 약 14, 약 7 약 13개, 약 7개 내지 약 12개, 약 7개 내지 약 11개, 약 7개 내지 약 10개, 약 7개 내지 약 9개, 또는 약 7개 내지 약 8개의 아미노산 단편이다.
다른 양상들에서, ED의 N 말단이 ND의 C 말단에서 라이신에 직접 연결된 경우, 즉 라이신이 ED의 N 말단에 있고 ND의 C 말단에 있는 라이신에 융합되는 경우 ED는 적어도 하나의 라이신을 포함하고 ND는 C 말단에서 라이신을 포함한다. 다른 양상들에서, ED의 N 말단이 링커, 예를 들어 하나 이상의 아미노산에 의해 ND의 C 말단에 연결되는 경우, ED는 2개 이상의 라이신, 3개 이상의 라이신, 4개 이상의 라이신, 5개 이상의 라이신, 6개 이상의 라이신 또는 7개 이상의 라이신을 포함한다. 일부 양상들에서, ED는 적어도 2개의 연속 라이신 (Lys)을 순서대로 포함한다.
일부 양상들에서, ED는 K, KK, KKK, KKKK (서열 번호: 11), KKKKK (서열 번호: 12), R, RR, RRR, RRRR (서열 번호: 13); RRRRR (서열 번호: 14), KR, RK, KKR, KRK, RKK, KRR, RRK, (K/R)(K/R)(K/R)(K/R) (서열 번호: 15), (K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(K/R) (서열 번호: 16), 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양상들에서, ED는 KK, KKK, KKKK (서열 번호: 11), KKKKK (서열 번호: 12), 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양상들에서, ND는 G:X2:X3:X4:X5:X6로 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 이때 G는 Gly을 나타내고; 이때 ":"는 펩티드 결합을 나타내고; 이때 X2 내지 X6 각각은 독립적으로 아미노산을 나타내고; 그리고 이때 X6는 염기성 아미노산을 나타낸다. 일부 양상들에서, X6 아미노산은 Lys, Arg, 및 His로 구성된 그룹에서 선택된다. 일부 양상들에서, X5 아미노산은 Pro, Gly, Ala 및 Ser으로 구성된 그룹에서 선택된다. 일부 양상들에서, X2 아미노산은 Pro, Gly, Ala 및 Ser으로 구성된 그룹에서 선택된다. 일부 양상들에서, X4는 Pro, Gly, Ala, Ser, Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Gln, 및 Met로 구성된 그룹에서 선택된다.
일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y는, N-말단 도메인 (ND) 및 이펙터 도메인 (ED)을 포함하고, 이때 ND는 G:X2:X3:X4:X5:X6에 제시된 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 G는 Gly를 나타내고; 여기서 ":"는 펩티드 결합을 나타내고; 여기서 X2내지 X6은 각각 독립적으로 아미노산이고; 여기서 X6은 염기성 아미노산을 포함하고, ED는 펩티드 결합에 의해 X6에 연결되고 ED의 N 말단에 하나 이상의 라이신을 포함한다.
일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y의 ND는 G:X2:X3:X4:X5:X6의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 G는 Gly를 나타내고; ":"는 펩티드 결합을 나타내고; X2는 Pro, Gly, Ala 및 Ser로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산을 나타내고; X3는 임의의 아미노산을 나타내고; X4는 Pro, Gly, Ala, Ser, Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Gln 및 Met로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산을 나타내고; X5는 Pro, Gly, Ala 및 Ser로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산을 나타내고; X6은 Lys, Arg 및 His로 구성된 그룹에서 선택된 아미노산을 나타낸다.
일부 양상들에서, X3 아미노산은 Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, His, 및 Arg로 구성된 그룹에서 선택된다.
일부 양상들에서, ND 및 ED는 링커에 의해 결합된다. 일부 양상들에서, 링커는 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 일부 양상들에서, 용어 "링커"는 펩티드 또는 폴리펩티드 서열 (예를 들어, 합성 펩티드 또는 폴리펩티드 서열) 또는 비-폴리펩티드, 예를 들어 알킬 사슬을 지칭한다. 일부 양상들에서, 2개 이상의 링커는 탠덤 (tandem)으로 연결될 수 있다. 일반적으로, 링커는 가요성을 제공하거나 또는 입체 방해를 방지/개선한다. 링커는 전형적으로 절단되지 않지만; 특정 양상들에서, 이러한 절단이 바람직할 수 있다. 따라서, 일부 양상들에서, 링커는 링커의 서열 내에 위치하거나 또는 링커 서열의 양 말단에서 링커에 연접할 수 있는 하나 이상의 프로테아제-절단가능한 부위를 포함할 수 있다. ND 및 ED가 링커에 의해 결합되는 경우, ED는 2개 이상의 라이신, 3개 이상의 라이신, 4개 이상의 라이신, 5개 이상의 라이신, 6개 이상의 라이신, 또는 7개 이상의 라이신을 포함한다. ND 및 ED를 결합하는 데 사용될 수 있는 링커는 본 명세서의 다른 부분에 개시되어 있다.
일부 양상들에서, 링커는 펩티드 링커이다. 일부 양상들에서, 펩티드 링커는 적어도 약 2, 적어도 약 3, 적어도 약 4, 적어도 약 5, 적어도 약 10, 적어도 약 15, 적어도 약 20, 적어도 약 25, 적어도 약 30, 적어도 약 35, 적어도 약 40, 적어도 약 45, 적어도 약 50, 적어도 약 55, 적어도 약 60, 적어도 약 65, 적어도 약 70, 적어도 약 75, 적어도 약 80, 적어도 약 85, 적어도 약 90, 적어도 약 95, 또는 적어도 약 100개 아미노산을 포함할 수 있다.
일부 양상들에서, 링커는 글라이신/세린 링커이다. 일부 양상들에서, 펩티드 링커는 공식 [(Gly)n-Ser]m (서열 번호: 46)에 따른 글라이신/세린 링커이고, 이때 n은 1 내지 100의 임의의 정수이고, m은 1 내지 100의 임의의 정수이다. 다른 양상들에서, 글라이신/세린 링커는 공식 [(Gly)x-Sery]z (서열 번호: 47)에 따르며, 이때, x는 1 내지 4의 정수이고, y는 0 또는 1이며, z는 1 내지 50의 정수이다. 일부 양상들에서, 펩티드 링커는 서열 Gn (서열 번호: 48)을 포함하며, 이때 n은 1 내지 100의 정수일 수 있다. 일부 양상들에서, 펩티드 링커는 서열 (GlyAla)n (서열 번호: 49)을 포함할 수 있으며, 이때 n은 1 내지 100의 정수이다. 다른 양상들에서, 펩티드 링커는 서열 (GlyGlySer)n (서열 번호: 50)을 포함할 수 있으며, 이때 n은 1 내지 100의 정수이다.
일부 양상들에서, 펩티드 링커는 합성, 즉, 비-자연 발생적이다. 한 양상에서, 펩티드 링커는 아미노산의 제1 선형 서열을 아미노산의 제2 선형 서열에 연결 또는 유전적으로 융합시키는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 (또는 폴리펩티드) (예를 들어, 자연 또는 비-자연 발생 펩티드)를 포함하며, 이는 제2 선형 서열에는 자연적으로 연결 또는 유전적으로 융합되지 않는다. 예를 들어, 한 양상에서 펩티드 링커는 자연 발생적 폴리펩티드의 변형된 형태(예를 들어, 부가, 치환 또는 결실과 같은 돌연변이를 포함)인 비-자연 발생적 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
다른 양상들에서, 펩티드 링커는 비-자연 발생적 아미노산을 포함할 수 있다. 또 다른 양상에서, 펩티드 링커는 자연에서 발생하지 않는 선형 서열로 발생하는 자연 발생적 아미노산을 포함할 수 있다. 또 다른 양상들에서, 펩티드 링커는 자연 발생적 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다.
일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y는, ND―ED를 포함하고, 이때: ND 는 G:X2:X3:X4:X5:X6을 포함하고; 이때: G는 Gly를 나타내고; ":"는 펩티드 결합을 나타내고; X2는 Pro, Gly, Ala, 및 Ser으로 구성된 그룹에서 선택된 아미노산을 나타내고; X3는 임의의 아미노산을 나타내고; X4는 Pro, Gly, Ala, Ser ,Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Glu, 및 Met로 구성된 그룹에서 선택된 아미노산을 나타내고; X5는 Pro, Gly, Ala, 및 Ser로 구성된 그룹에서 선택된 아미노산을 나타내고; X6는 Lys, Arg, 및 His로 구성된 그룹에서 선택된 아미노산을 나타내고; "―"은 선택적 링커를 나타내고; 그리고 ED는 (i) 하나 이상의 아미노산 또는 펩티드 결합에 의해 X6에 연결되는 적어도 2개의 연속 라이신 (Lys) 또는 (ii) 펩티드 결합에 의해 X6에 직접 연결되는 적어도 하나의 라이신을 포함하는 이펙터 도메인이다.
일부 양상들에서, X2 아미노산은 Gly 및 Ala으로 구성된 그룹에서 선택된다. 일부 양상들에서, X3 아미노산은 Lys이다. 일부 양상들에서, X4 아미노산은 Leu 또는 Glu이다. 일부 양상들에서, X5 아미노산은 Ser 및 Ala으로 구성된 그룹에서 선택된다. 일부 양상들에서, X6 아미노산은 Lys이다. 일부 양상들에서, X2 아미노산은 Gly, Ala, 또는 Ser이고; X3 아미노산은 Lys 또는 Glu이고; X4 아미노산은 Leu, Phe, Ser, 또는 Glu이고; X5 아미노산은 Ser 또는 Ala이고; 그리고 X6 아미노산은 Lys이다. 일부 양상들에서, "―" 링커는 펩티드 결합 또는 하나 이상의 아미노산들을 포함한다.
일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티에서 ED는 Lys (K), KK, KKK, KKKK (서열 번호: 11), KKKKK (서열 번호: 12), Arg (R), RR, RRR, RRRR (서열 번호: 13); RRRRR (서열 번호: 14), KR, RK, KKR, KRK, RKK, KRR, RRK, (K/R)(K/R)(K/R)(K/R) (서열 번호: 15), (K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(K/R) (서열 번호: 16), 또는 이의 임의의 조합을 포함한다.
일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y는, (i) GGKLSKK (서열 번호: 17), (ii) GAKLSKK (서열 번호: 18), (iii) GGKQSKK (서열 번호: 19), (iv) GGKLAKK (서열 번호: 20), 또는 (v) 이들의 임의의 조합으로 구성된 그룹에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y에서 ND는, (i) GGKLSK (서열 번호: 51), (ii) GAKLSK (서열 번호: 52), (iii) GGKQSK (서열 번호: 53), (iv) GGKLAK (서열 번호: 54), 및 (v) 이들의 임의의 조합으로 구성된 그룹에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 스캐폴드 단백질에서 ED는 K, KK, KKK, KKKG (서열 번호: 55), KKKGY (서열 번호: 56), KKKGYN (서열 번호: 57), KKKGYNV (서열 번호: 58), KKKGYNVN (서열 번호: 59), KKKGYS (서열 번호: 60), KKKGYG (서열 번호: 61), KKKGYGG (서열 번호: 62), KKKGS (서열 번호: 63), KKKGSG (서열 번호: 64), KKKGSGS (서열 번호: 66), KKKS (서열 번호: 67), KKKSG (서열 번호: 68), KKKSGG (서열 번호: 69), KKKSGGS (서열 번호: 70), KKKSGGSG (서열 번호: 71), KKSGGSGG (서열 번호: 72), KKKSGGSGGS (서열 번호: 73), KRFSFKKS (서열 번호: 241) 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 그룹에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양상들에서, 본 발명에 유용한 스캐폴드 Y의 폴리펩티드 서열은 (i) GGKLSKK (서열 번호: 21), (ii) GAKLSKK (서열 번호: 18), (iii) GGKQSKK (서열 번호: 19), (iv) GGKLAKK (서열 번호: 20), 또는 (v) 이들의 임의의 조합으로 구성된 그룹에서 선택된 아미노산 서열로 구성된다.
일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y는 (i) GGKLSKKK (서열 번호: 22), (ii) GGKLSKKS (서열 번호: 23), (iii) GAKLSKKK (서열 번호: 24), (iv) GAKLSKKS (서열 번호: 25), (v) GGKQSKKK (서열 번호: 26), (vi) GGKQSKKS (서열 번호: 27), (vii) GGKLAKKK (서열 번호: 28), (viii) GGKLAKKS (서열 번호: 29), 및 (ix) 이들의 임의의 조합으로 구성된 그룹에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양상들에서, 본 발명에 유용한 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y의 폴리펩티드 서열은 (i) GGKLSKKK (서열 번호: 22), (ii) GGKLSKKS (서열 번호: 23), (iii) GAKLSKKK (서열 번호: 24), (iv) GAKLSKKS (서열 번호: 25), (v) GGKQSKKK (서열 번호: 26), (vi) GGKQSKKS (서열 번호: 27), (vii) GGKLAKKK (서열 번호: 28), (viii) GGKLAKKS (서열 번호: 29), 및 (ix) 이들의 임의의 조합으로 구성된 그룹에서 선택된 아미노산 서열로 구성된다. 일부 양상들에서, 본 발명의 스캐폴드 단백질은 적어도 2개의 연속 라이신 (Lys)을 순서대로 포함한다.
일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y는 적어도 약 8, 적어도 약 9, 적어도 약 10, 적어도 약 11, 적어도 약 12, 적어도 약 13, 적어도 약 14, 적어도 약 15, 적어도 약 16, 적어도 약 17, 적어도 약 18, 적어도 약 19, 적어도 약 20, 적어도 약 21, 적어도 약 22, 적어도 약 23, 적어도 약 24, 적어도 약 25, 적어도 약 26, 적어도 약 27, 적어도 약 28, 적어도 약 29, 적어도 약 30, 적어도 약 31, 적어도 약 32, 적어도 약 33, 적어도 약 34, 적어도 약 35, 적어도 약 36, 적어도 약 37, 적어도 약 38, 적어도 약 39, 적어도 약 39, 적어도 약 40, 적어도 약 41, 적어도 약 42, 적어도 약 43, 적어도 약 44, 적어도 약 45, 적어도 약 46, 적어도 약 47, 적어도 약 48, 적어도 약 49, 적어도 약 50, 적어도 약 55, 적어도 약 60, 적어도 약 65, 적어도 약 70, 적어도 약 75, 적어도 약 80, 적어도 약 85, 적어도 약 90, 적어도 약 95, 적어도 약 100, 적어도 약 105, 적어도 약 110, 적어도 약 115, 적어도 약 120, 적어도 약 125, 적어도 약 130, 적어도 약 135, 적어도 약 140, 적어도 약 145, 적어도 약 150, 적어도 약 155, 적어도 약 160, 적어도 약 165, 적어도 약 170, 적어도 약 175, 적어도 약 180, 적어도 약 185, 적어도 약 190, 적어도 약 195, 적어도 약 200, 적어도 약 205, 적어도 약 210, 적어도 약 215, 적어도 약 220, 적어도 약 225, 적어도 약 230, 적어도 약 235, 적어도 약 240, 적어도 약 245, 적어도 약 250, 적어도 약 255, 적어도 약 260, 적어도 약 265, 적어도 약 270, 적어도 약 275, 적어도 약 280, 적어도 약 285, 적어도 약 290, 적어도 약 295, 적어도 약 300, 적어도 약 305, 적어도 약 310, 적어도 약 315, 적어도 약 320, 적어도 약 325, 적어도 약 330, 적어도 약 335, 적어도 약 340, 적어도 약 345, 또는 적어도 약 350개 아미노산 길이이다.
일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y는 약 5 내지 약 10, 약 10 내지 약 20, 약 20 내지 약 30, 약 30 내지 약 40, 약 40 내지 약 50, 약 50 내지 약 60, 약 60 내지 약 70, 약 70 내지 약 80, 약 80 내지 약 90, 약 90 내지 약 100, 약 100 내지 약 110, 약 110 내지 약 120, 약 120 내지 약 130, 약 130 내지 약 140, 약 140 내지 약 150, 약 150 내지 약 160, 약 160 내지 약 170, 약 170 내지 약 180, 약 180 내지 약 190, 약 190 내지 약 200, 약 200 내지 약 210, 약 210 내지 약 220, 약 220 내지 약 230, 약 230 내지 약 240, 약 240 내지 약 250, 약 250 내지 약 260, 약 260 내지 약 270, 약 270 내지 약 280, 약 280 내지 약 290, 약 290 내지 약 300, 약 300 내지 약 310, 약 310 내지 약 320, 약 320 내지 약 330, 약 330 내지 약 340, 또는 약 340 내지 약 250개 아미노산 길이이다.
일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y는, (i) GGKLSKKKKGYNVN (서열 번호: 32), (ii) GAKLSKKKKGYNVN (서열 번호: 33), (iii) GGKQSKKKKGYNVN (서열 번호: 34), (iv) GGKLAKKKKGYNVN (서열 번호: 35), (v) GGKLSKKKKGYSGG (서열 번호: 36), (vi) GGKLSKKKKGSGGS (서열 번호: 37), (vii) GGKLSKKKKSGGSG (서열 번호: 38), (viii) GGKLSKKKSGGSGG (서열 번호: 39), (ix) GGKLSKKSGGSGGS (서열 번호: 40), (x) GGKLSKSGGSGGSV (서열 번호: 41), 또는 (xi) GAKKSKKRFSFKKS (서열 번호: 42)를 포함한다.
일부 양상들에서, 본 발명에 유용한 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y의 폴리펩티드 서열은 (i) GGKLSKKKKGYNVN (서열 번호: 32), (ii) GAKLSKKKKGYNVN (서열 번호: 33), (iii) GGKQSKKKKGYNVN (서열 번호: 34), (iv) GGKLAKKKKGYNVN (서열 번호: 35), (v) GGKLSKKKKGYSGG (서열 번호: 36), (vi) GGKLSKKKKGSGGS (서열 번호: 37), (vii) GGKLSKKKKSGGSG (서열 번호: 38), (viii) GGKLSKKKSGGSGG (서열 번호: 39), (ix) GGKLSKKSGGSGGS (서열 번호: 40), (x) GGKLSKSGGSGGSV (서열 번호: 41), 또는 (xi) GAKKSKKRFSFKKS (서열 번호: 42)로 구성된다.
본 발명에 유용한 스캐폴드 모이어티, 예를 들어 스캐폴드 Y의 비제한적인 예는 하기에 나열되어 있다. 일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y는 표 4에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y는 표 4에 제시된 아미노산 서열로 구성된다.
표 4. 스캐폴드 모이어티 예시
Figure pct00082
Figure pct00083
Figure pct00084
일부 양상들에서, 본 발명에 유용한 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y는 N-말단 Met를 함유하지 않는다. 일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티, 예를 들어, 스캐폴드 Y는 지질로서 기능하는 스캐폴드 단백질의 N-말단에 지질화된 아미노산, 예를 들어 미리스토일화된 아미노산을 포함한다. 일부 양상들에서, 스캐폴드 단백질의 N-말단에 있는 아미노산 잔기는 Gly이다. N-말단 Gly의 존재는 N-미리스토일화에 대한 절대 요건이다. 일부 양상들에서, 스캐폴드 단백질의 N-말단에 있는 아미노산 잔기는 합성이다. 일부 양상들에서, 스캐폴드 단백질의 N-말단에 있는 아미노산 잔기는 글라이신 유사체, 예를 들어, 알릴글라이신, 부틸글라이신 또는 프로파길글라이신이다.
다른 양상들에서, 지질은 당업계에 공지된 임의의 지질, 예를 들어 팔미트산 또는 글리코실포스파티딜이노시톨일 수 있다. 통상적이지 않은 환경하에서, 예를 들어 미리스트산이 제한되는 배양 배지를 사용하면 짧은 사슬 및 불포화를 포함한 일부 다른 지방산이 N-말단 글라이신에 부착될 수 있다. 예를 들어, BK 채널에서 미리스테이트는 하이드록시에스터 결합을 통해 내부 세린/트레오닌 또는 티로신 잔기에 번역 후 부착되는 것으로 보고되었다. 당업계에 공지된 스캐폴드 모이어티로서 작용할 수 있는 막 모이어티들이 하기 표에 제시되어 있다.
표 5: 변형 그룹
Figure pct00085
II.G.3 스캐폴드 단백질 융합 구조체
일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티는 하나 이상의 이종 단백질에 연결된다. 하나 이상의 이종 단백질은 스캐폴드 모이어티의 N-말단에 연결될 수 있다. 하나 이상의 이종 단백질은 스캐폴드 모이어티의 C-말단에 연결될 수 있다. 일부 양상들에서, 하나 이상의 이종 단백질은 스캐폴드 모이어티의 N-말단 및 C-말단 모두에 연결된다. 일부 양상들에서, 이종 단백질은 포유동물 단백질이다. 일부 양상들에서, 이종 단백질은 인간 단백질이다.
일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티는 엑소좀의 내강 표면 및/또는 외부 표면에 임의의 모이어티를 연결하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, PTGFRN 폴리펩티드는 EV (예를 들어, 엑소좀)의 외부 표면 이외에도 내강 내부 (예를 들어, 내강 표면)의 생물학적 활성 분자를 연결하는 데 사용될 수 있다. 그러므로, 특정 양상들에서, 스캐폴드 모이어티는 두 가지 목적으로, 예를 들어, EV, 예를 들어, 엑소좀의 내강 표면 상의 생물학적 활성 분자 및 외부 표면 상의 제2 생물학적 활성 분자 또는 기타 페이로드, 또는 엑소좀의 외부 표면 상의 생물학적 활성 분자 및 EV, 예를 들어, 엑소좀의 내강 표면 상의 제2 생물학적 활성 분자 또는 기타 페이로드를 위해 사용될 수 있다.
II.G.4 지질
말레이미드 모이어티와의 화학적 연결을 통해 EV, 예를 들어 엑소좀의 표면에 생물학적 활성 분자를 연결할 수 있는 적합한 스캐폴드 모이어티는, 아래에 자세히 설명된, 예를 들어 스테롤 (예를 들어, 콜레스테롤), 인지질, 라이소인지질, 지방산 또는 지용성 비타민을 포함한다.
일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티는 지질일 수 있다. 지질 스캐폴드 모이어티는 당업계에 공지된 임의의 지질, 예를 들어 팔미트산 또는 글리코실포스파티딜이노시톨일 수 있다. 일부 양상들에서, 지질은 지방산, 포스파티드, 인지질 (예를 들어, 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 세린 또는 포스파티딜 에탄올아민) 또는 이들의 유사체 (예를 들어, 포스파티딜콜린, 레시틴, 포스파티딜에탄올아민, 세팔린 또는 포스파티딜세린 또는 이의 유사체 또는 부분, 예를 들어, 이의 부분적으로 가수분해된 부분)이다.
스캐폴드 모이어티는 말레이미드 모이어티를 사용하여 생물학적 활성 분자에 연결, 예를 들어, 화학적으로 연결될 수 있다. 이러한 연결은 임의의 화학적으로 가능한 위치, 예를 들어, 생물학적 활성 분자 (예를 들어, ASO)의 뉴클레오티드 서열의 5' 및/또는 3' 말단에서 직접 또는 링커 또는 링커 조합에 의해 간접적일 수 있다. 한 양상에서, 스캐폴드 모이어티는 생물학적 활성 분자의 3' 말단에만 연결, 예를 들어 말레이미드 모이어티를 통해 화학적으로 연결된다. 한 양상에서, 스캐폴드 모이어티는 예를 들어 생물학적 활성 분자 (예를 들어, ASO)의 뉴클레오티드 서열의 5' 말단에만 연결, 예를 들어, 말레이미드 모이어티를 통해 화학적으로 연결된다. 한 양상에서, 스캐폴드 모이어티는 예를 들어 생물학적 활성 분자 (예를 들어, ASO)의 뉴클레오티드 서열의 3' 말단 또는 5' 말단이 아닌 위치에서 연결, 예를 들어 말레이미드 모이어티를 통해 화학적으로 연결된다.
일부 양상들에서, 생물학적 활성 분자는, 예를 들어 위에 개시된 임의의 지질(예를 들어, 팔미트산, 미리스트산, 지방산, 파르네실, 게라닐 - 게라닐 또는 콜레스테롤)에 연결, 예를 들어, 말레이미드 부분을 통해, 링커를 통해 직접적으로 또는 간접적으로 화학적으로 연결될 수 있다. 일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티는 본원에 개시된 둘 이상의 유형의 스캐폴드 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티는 2개의 지질, 예를 들어 인지질 및 지방산, 또는 2개의 인지질, 또는 2개의 지방산, 또는 지질 및 비타민, 또는 콜레스테롤 및 비타민 등을 포함할 수 있으며, 이는 합하여 6-80개의 탄소 원자 (즉, 약 6 내지 약 80의 당량 탄소수 (ECN))를 가진다.
일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티의 조합, 예를 들어, 지질 (예를 들어, 지방산)의 조합은 약 6 내지 약 80, 약 8 내지 약 80, 약 10 내지 약 80, 약 12 내지 약 80, 약 14 내지 약 80, 약 16 내지 약 80, 약 18 내지 약 80, 약 20 내지 약 80, 약 22 내지 약 80, 약 24 내지 약 80, 약 26 내지 약 80, 약 28 내지 약 80, 약 30 내지 약 80, 약 4 내지 약 76, 약 6 내지 약 76, 약 8 내지 약 76, 약 10 내지 약 76, 약 12 내지 약 76, 약 14 내지 약 76, 약 16 내지 약 76, 약 18 내지 약 76, 약 20 내지 약 76, 약 22 내지 약 76, 약 24 내지 약 76, 약 26 내지 약 76, 약 28 내지 약 76, 약 30 내지 약 76, 약 6 내지 약 72, 약 8 내지 약 72, 약 10 내지 약 72, 약 12 내지 약 72, 약 14 내지 약 72, 약 16 내지 약 72, 약 18 내지 약 72, 약 20 내지 약 72, 약 22 내지 약 72, 약 24 내지 약 72, 약 26 내지 약 72, 약 28 내지 약 72, 약 30 내지 약 72, 약 6 내지 약 68, 약 8 내지 약 68, 약 10 내지 약 68, 약 12 내지 약 68, 약 14 내지 약 68, 약 16 내지 약 68, 1 약 8 내지 약 68, 약 20 내지 약 68, 약 22 내지 약 68, 약 24 내지 약 68, 약 26 내지 약 68, 약 28 내지 약 68, 약 30 내지 약 68, 약 6 내지 약 64, 약 8 내지 약 64, 약 10 내지 약 64, 약 12 내지 약 64, 약 14 내지 약 64, 약 16 내지 약 64, 약 18 내지 약 64, 약 20 내지 약 64, 약 22 내지 약 64, 약 24 내지 약 64, 약 26 내지 약 64, 약 28 내지 약 64, 약 30 내지 약 64, 약 6 내지 약 60, 약 8 내지 약 60, 약 10 내지 약 60, 약 12 내지 약 56, 약 14 내지 약 56, 약 16 내지 약 56, 약 18 내지 약 56, 약 20 내지 약 56, 약 22 내지 약 56, 약 24 내지 약 56, 약 26 내지 약 56, 약 28 내지 약 56, 약 30 내지 약 56, 약 6 내지 약 52, 약 8 내지 약 52, 약 10 내지 약 52, 약 12 내지 약 52, 약 14 내지 약 52, 약 16 내지 약 52, 약 18 내지 약 52, 약 20 내지 약 52, 약 22 내지 약 52, 약 24 내지 약 52, 약 26 내지 약 52, 약 28 내지 약 52, 약 30 내지 약 52, 약 6 내지 약 48, 약 8 내지 약 48, 약 10 내지 약 48, 약 12 내지 약 48, 약 14 내지 약 48, 1 약 6 내지 약 48, 1 약 8 내지 약 48, 약 20 내지 약 48, 2 약 2 내지 약 48, 약 24 내지 약 48, 약 26 내지 약 48, 약 28 내지 약 48, 약 30 내지 약 48, 약 6 내지 약 44, 약 8 내지 약 44, 약 10 내지 약 44, 약 12 내지 약 44, 약 14 내지 약 44, 약 16 내지 약 44, 약 18 내지 약 44, 약 20 내지 약 44, 약 22 내지 약 44, 약 24 내지 약 44, 2 약 6 내지 약 44, 약 28 내지 약 44, 약 30 내지 약 44, 약 6 내지 약 40, 약 8 내지 약 40, 약 10 내지 약 40, 약 12 내지 약 40, 약 14 내지 약 40, 약 16 내지 약 40, 약 18 내지 약 40, 약 20 내지 약 40, 2 약 2 내지 약 40, 약 24 내지 약 40, 약 26 내지 약 40, 2 약 8 내지 약 40, 약 30 내지 약 40, 약 6 내지 약 36, 약 8 내지 약 36, 약 10 내지 약 36, 약 12 내지 약 36, 약 14 내지 약 36, 약 16 내지 약 36, 약 18 내지 약 36, 약 20 내지 약 36, 약 22 내지 약 36, 약 24 내지 약 36, 약 26 내지 약 36, 약 28 내지 약 36, 약 30 내지 약 36, 약 6 내지 약 32, 약 8 내지 약 32, 1 약 0 내지 약 32, 약 12 내지 약 32, 약 14 내지 약 32, 1 약 6 내지 약 32, 1 약 8 내지 약 32, 약 20 내지 약 32, 약 22 내지 약 32, 약 24 내지 약 32, 약 26 내지 약 32, 28 내지 약 32, 또는 약 30 내지 약 32의 ECN을 가진다.
II.G.3.a 콜레스테롤 및 기타 스테롤
일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티는 스테롤, 스테로이드, 호파노이드, 하이드록시스테로이드, 세코스테로이드, 또는 친유성 특성을 갖는 이들의 유사체를 포함한다. 일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티는 파이토스테롤, 마이코스테롤 또는 동물성스테롤과 같은 스테롤을 포함한다. 예시적인 동물성 스테롤은 콜레스테롤 및 24S-하이드록시콜레스테롤을 포함하고; 예시적인 파이토스테롤은 에르고스테롤 (마이코스테롤), 캄페스테롤, 시토스테롤, 및 스티그마스테롤을 포함한다. 일부 양상들에서, 스테롤은 에르고스테롤, 7-디하이드로콜레스테롤, 콜레스테롤, 24S-하이드록시콜레스테롤, 라노스테롤, 사이클로아르테놀, 푸코스테롤, 사린고스테롤, 캄페스테롤, β-시토스테롤, 시토스탄올, 코프로스탄올, 아베나스테롤, 또는 스티그마스테롤로부터 선택된다. 스테롤은 유리 스테롤, 아실화 (스테롤 에스터), 알킬화 (스테릴 알킬 에터), 설페이트화 (스테롤 설페이트)로서 또는 그 자체가 아실화 (아실화 스테롤 글리코시드) 될 수 있는 글리코시드 모이어티 (스테릴 글리코시드)에 연결된 것으로서 발견될 수 있다.
일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티는 스테로이드를 포함한다. 일부 양상들에서, 스테로이드는 다이하이드로테스토스테론, 우바올, 헤시게닌, 디오스게닌, 프로게스테론 또는 코르티솔로부터 선택된다.
예를 들어, 스테롤은 생물학적 활성 분자에 직접 또는 스테롤의 이용가능한 -OH 그룹에서 링커 조합을 통해 접합될 수 있다. 예시적인 스테롤은 하기 나타낸 일반적인 골격을 가진다:
Figure pct00086
추가 예로서, 에르고스테롤은 하기 구조를 가진다:
Figure pct00087
콜레스테롤은 하기 구조를 가진다:
Figure pct00088
따라서, 일부 양상들에서, 스테롤 또는 스테로이드의 유리 -OH 그룹을 사용하여 생물학적 활성 분자, 예를 들어 ASO를 직접적으로 또는 링커 조합을 통해 스테롤 (예를 들어, 콜레스테롤) 또는 스테로이드에 접합시킨다.
II.G.3.b 지방산
일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티는 지방산을 포함한다. 일부 양상들에서, 지방산은 단쇄, 중쇄 또는 장쇄 지방산이다. 일부 양상들에서, 지방산은 포화 지방산이다. 일부 양상들에서, 지방산은 불포화 지방산이다. 일부 양상들에서, 지방산은 단일불포화 지방산이다. 일부 양상들에서, 지방산은 ω-3 (오메가-3) 또는 ω-6 (오메가-6) 지방산과 같은 다중불포화 지방산이다.
일부 양상들에서, 지질, 예를 들어, 지방산은 C2-C60 사슬을 가진다. 일부 양상들에서, 지질, 예를 들어, 지방산은 C2-C28 사슬을 가진다. 일부 양상들에서, 지방산은 C2-C40 사슬을 가진다. 일부 양상들에서, 지방산은 C2-C12 또는 C4-C12사슬을 가진다. 일부 양상들에서, 지방산은 C4-C40 사슬을 가진다. 일부 양상들에서, 지방산은 C4-C40, C2-C38, C2-C36, C2-C34, C2-C32, C2-C30, C4-C30, C2-C28, C4-C28, C2- C26, C4-C26, C2-C24, C4-C24, C6-C24, C8-C24, C10-C24, C2-C22, C4-C22, C6-C22, C8-C22, C10-C22, C2-C20, C4-C20, C6-C20, C8-C20, C10-C20, C2-C18, C4-C18, C6-C18, C8-C18, C10-C18, C12-C18, C14-C18, C16-C18, C2-C16, C4-C16, C6-C16, C8-C16, C10-C16, C12-C16, C14-C16, C2-C15, C4-C15, C6-C15, C8-C15, C9-C15, C10-C15, C11-C15, C12-C15, C13-C15, C2-C14, C4-C14, C6-C14, C8-C14, C9-C14, C10-C14, C11-C14, C12-C14, C2-C13, C4-C13, C6-C13, C7-C13, C8-C13, C9-C13, C10-C13, C10-C13, C11-C13, C2-C12, C4-C12, C6-C12, C7-C12, C8-C12, C9-C12, C10-C12, C2-C11, C4-C11, C6-C11, C7-C11, C8-C11, C9-C11, C2-C10, C4-C10, C2-C9, C4-C9, C2-C8, C2-C7, C4-C7, C2-C6, 또는 C4-C6, 사슬을 가진다. 일부 양상들에서, 지방산은 C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C24, C25, C26, C27, C28, C29, C30, C31, C32, C33, C34, C35, C36, C37, C38, C39, C40, C41, C42, C43, C44, C45, C46, C47, C48, C49, C50, C51, C52, C53, C54, C55, C56, C57, C58, C59, 또는 C60 사슬을 가진다.
일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티는 2개의 지방산을 포함하고, 이들 각각은 전술한 탄소 원자 범위 또는 수 중 어느 하나를 갖는 사슬을 갖는 지방산으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 양상들에서, 지방산 중 하나는 독립적으로 C6-C21 사슬을 가진 지방산이고 다른 하나는 독립적으로 C12-C36 사슬을 가진 지방산이다. 일부 양상들에서, 각 지방산은 독립적으로 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17 또는 약 18개 탄소 원자의 사슬을 가진다.
적합한 지방산은 포화 직쇄 지방산, 포화 분지형 지방산, 불포화 지방산, 하이드록시 지방산 및 폴리카르복실산을 포함한다. 일부 양상들에서, 이러한 지방산은 최대 약 32개의 탄소 원자를 가진다.
유용한 포화 직쇄 지방산의 예는 짝수의 탄소 원자를 가지는 것들, 예를 들어 부티릭 애시드, 카프로익 애시드, 카프릴릭 애시드, 카프릭 애시드, 라우릭 애시드 미리스틱 애시드, 팔미틱 애시드, 스테아릭 애시드, 아라킥 애시드, 베헤닉 애시드, 리그노세릭 애시드, 헥사코사노익 애시드, 옥타코사노익 애시드, 트라이아콘타노익 애시드 및 n-도트라이아콘타노익 애시드, 및 홀수의 탄소 원자를 가지는 것들, 예를 들어 프로피오닉 애시드, n-발러릭 애시드, 에난틱 애시드, 펠라르고닉 애시드, 헵타데카노익 애시드, 트라이데카노익 애시드, 펜타데카노익 애시드, 노나데카노익 애시드, 헤네이코사노익 애시드, 트라이코사노익 애시드, 펜타코사노익 애시드, 및 헵타코사노익 애시드를 포함한다.
적합한 불포화 분지형 지방산의 예는 아이소부티릭 애시드, 아이소카프로익 애시드, 아이소카프릴릭 애시드, 아이소카프릭 애시드, 아이소라우릭 애시드, 11-메틸도데카노익 애시드, 아이소미리스틱 애시드, 13-메틸-테트라데카노익 애시드, 아이소팔미틱 애시드, 15-메틸-헥사데카노익 애시드, 아이소스테아릭 애시드, 17-메틸옥타데카노익 애시드, 아이소아라킥 애시드, 19-메틸-에이코사노익 애시드, α-에틸-헥사노익 애시드, α-헥실데카노익 애시드, α-헵틸운데카노익 애시드, 2-데실테트라데카노익 애시드, 2-운데실테트라데카노익 애시드, 2-데실펜타데카노익 애시드, 2-운데실펜타데카노익 애시드, 및 Fine 옥소콜 1800 산 (Fine oxocol 1800 acid) (Nissan Chemical Industries, Ltd 제품)을 포함한다. 적합한 포화 홀수-탄소 분지형 지방산은 아이소부틸 그룹으로 종결되는 anteiso 지방산, 예를 들어 6-메틸-옥타노익 애시드, 8-메틸-데카노익 애시드, 10-메틸-도데카노익 애시드, 12-메틸-테트라데카노익 애시드, 14-메틸-헥사데카노익 애시드, 16-메틸-옥타데카노익 애시드, 18-메틸-에이코사노익 애시드, 20-메틸-도코사노익 애시드, 22-메틸-테트라코사노익 애시드, 24-메틸-헥사코사노익 애시드, 및 26-메틸옥타코사노익 애시드를 포함한다.
적합한 불포화 지방산의 예들은 4-데케노익 애시드, 카프롤레익 애시드, 4-도데케노익 애시드, 5-도데케노익 애시드, 라우롤레익 애시드, 4-테트라데케노익 애시드, 5-테트라데케노익 애시드, 9-테트라데케노익 애시드, 팔미톨레익 애시드, 6-옥타데케노익 애시드, 올레익 애시드, 9-옥타데케노익 애시드, 11-옥타데케노익 애시드, 9-에이코세노익 애시드, 시스-11-에이코세노익 애시드, 세톨레익 애시드, 13-도코세노익 애시드, 15-테트라코세노익 애시드, 17-헥사코세노익 애시드, 6,9,12,15-헥사데카테트라에노익 애시드, 리놀레익 애시드, 리놀레닉 애시드, α-엘레오스테아릭 애시드, β-엘레오스테아릭 애시드, 퓨니식 애시드, 6,9,12,15-옥타데카테트라에노익 애시드, 파리나릭 애시드, 5,8,11,14-에이코사테트라에노익 애시드, 5,8,11,14,17-에이코사펜타노익 애시드, 7,10,13,16,19-도코사펜타에노익 애시드, 4,7,10,13,16,19-도코사헥사에노익 애시드 등을 포함한다.
적합한 하이드록시 지방산의 예는 α-하이드록시라우릭 애시드, α-하이드록시미리스틱 애시드, α-하이드록시팔미틱 애시드, α-하이드록시스테아릭 애시드, ω-하이드록시라우릭 애시드, α-하이드록시아라킥 애시드, 9-하이드록시-12-옥타데케노익 애시드, 리시놀레익 애시드, α-하이드록시베헤닉 애시드, 9-하이드록시-트랜스-10,12-옥타데카디에닉 애시드, 카몰레닉 애시드, 이퓨롤릭 애시드, 9,10-다이하이드록시스테아릭 애시드, 12-하이드록시스테아릭 애시드 등을 포함한다.
적합한 폴리카르복시산의 예는 옥살산, 말론산, 숙신산, 글루타르산, 아디프산, 피멜산, 수베르산, 아젤라산, 세바스산, D,L-말산 등을 포함한다.
일부 양상들에서, 각 지방산은 프로피오닉 애시드, 부티릭 애시드, 발레릭 애시드, 카프로익 애시드, 에난틱 애시드, 카프릴릭 애시드, 펠라르고닉 애시드, 카프릭 애시드, 운데실릭 애시드, 라우릭 애시드, 트라이데실릭 애시드, 미리스틱 애시드, 펜타데실릭 애시드, 팔미틱 애시드, 마르가릭 애시드, 스테아릭 애시드, 노나데실릭 애시드, 아라키딕 애시드, 헤네이코실릭 애시드, 베헤닉 애시드, 트라이코실릭 애시드, 리그노세릭 애시드, 펜타코실릭 애시드, 세로틱 애시드, 헵타코실릭 애시드, 몬타닉 애시드, 노나코실릭 애시드, 멜리식 애시드, 헤나트라이아콘틸릭 애시드, 라세로익 애시드, 프실릭 애시드, 게딕 애시드, 세로플라스틱 애시드, 헥사트라이아콘틸릭 애시드, 헵타트라이아콘타노익 애시드, 또는 옥타트라이아콘타노익 애시드에서 독립적으로 선택된다.
일부 양상들에서, 지방산은 α-리놀레닉 애시드, 스테아리도닉 애시드, 에이코사펜타노익 애시드, 도코사헥사노익 애시드, 리놀레익 애시드, 감마-리놀레익 애시드, 다이호모-감마-리놀레익 애시드, 아라키도닉 애시드, 도코사테트라에노익 애시드, 팔미톨레익 애시드, 바세닉 애시드, 파울리닉 애시드, 올레익 애시드, 엘라이딕 애시드, 곤도익 애시드, 에루식 애시드, 네르보닉 애시드, 미드 애시드, 아드레닉 애시드, 보세오펜타에노익 애시드, 오주본도 애시드, 사르딘 애시드, 헤링 애시드, 도코사헥사노익 애시드, 또는 테트라코사놀펜타에노익 애시드, 또는 또 다른 단일불포화 또는 다중불포화 지방산에서 독립적으로 선택된다.
일부 양상들에서, 지방산들 중 하나 또는 둘 모두는 필수 지방산이다. 특정 필수 지방산의 유익한 건강 효과의 관점에서, 개시된 치료제-로딩된 엑소좀의 치료적 이점은 치료제에 이러한 지방산을 포함시킴으로써 증가될 수 있다. 일부 양상들에서, 필수 지방산은 리놀레닉 애시드, 감마-리놀레닉 애시드, 다이호모-감마-리놀레닉 애시드, 아라키도닉 애시드, 아드레닉 애시드, 도코사펜타에노익 n-6 애시드, 알파-리놀레닉 애시드, 스테아리도닉 애시드, 20:4n-3 애시드, 에이코사펜타노익 애시드, 도코사펜타에노익 n-3 애시드, 또는 도코사헥사노익 애시드로 구성된 그룹에서 선택된 n-6 또는 n-3 필수 지방산이다.
일부 양상들에서, 각각의 지방산은 올-시스-7,10,13-헥사데카트라이에노익 애시드, α-리놀레닉 애시드, 스테아리도닉 애시드, 에이코사트라이에노익 애시드, 에이코사테트라에노익 애시드, 에이코사펜타노익 애시드 (EPA), 도코사펜타에노익 애시드, 도코사헥사노익 애시드 (DHA), 테트라코사펜타에노익 애시드, 테트라코사헥사에노익 애시드, 또는 리포익 애시드에서 독립적으로 선택된다. 다른 양상들에서, 지방산은 에이코사펜타노익 애시드, 도코사헥사노익 애시드, 또는 리포익 애시드에서 선택된다. 지방산의 다른 예들은 올-시스-7,10,13-헥사데카트라이에노익 애시드, α-리놀레닉 애시드 (ALA 또는 올-시스-9,12,15-옥타데카트라이에노익 애시드), 스테아리도닉 애시드 (STD 또는 올-시스-6,9,12,15-옥타데카테트라에노익 애시드), 에이코사트라이에노익 애시드 (ETE 또는 올-시스-11,14,17-에이코사트라이에노익 애시드), 에이코사테트라에노익 애시드 (ETA 또는 올-시스-8,11,14,17-에이코사테트라에노익 애시드), 에이코사펜타노익 애시드 (EPA), 도코사펜타에노익 애시드 (DPA, 클루파노도닉 애시드 또는 올-시스-7,10,13,16,19-도코사펜타에노익 애시드), 도코사헥사노익 애시드 (DHA 또는 올-시스-4,7,10,13,16,19-도코사헥사노익 애시드), 테트라코사펜타에노익 애시드 (올-시스-9,12,15,18,21-도코사헥사노익 애시드), 또는 테트라코사헥사에노익 애시드 (니시닉 애시드 또는 올-시스-6,9,12,15,18,21-테트라코세노익 애시드)를 포함한다. 일부 양상들에서, 지방산은 중쇄 지방산, 예를 들어 리포익 애시드이다.
지방산 사슬은 사슬의 길이가 크게 다르며 사슬 길이에 따라 단쇄 내지 초 장쇄로 분류할 수 있다. 단쇄 지방산 (SCFA)은 약 5개 이하의 탄소 사슬을 갖는 지방산 (예를 들어, 부티릭 애시드)이다. 일부 양상들에서, 지방산은 SCFA이다. 중쇄 지방산 (MCFA)은 중쇄 트라이글리세라이드를 형성할 수 있는 약 6-12개의 탄소 사슬을 갖는 지방산을 포함한다. 일부 양상들에서, 지방산은 MCFA이다. 장쇄 지방산 (LCFA)은 13-21개 탄소 사슬들을 가지는 지방산을 포함한다. 일부 양상들에서, 지방산은 LCFA이다. 일부 양상들에서, 지방산은 LCFA이다. 초장쇄 지방산 (VLCFA)은 약 22개 내지 약 60개, 약 22개 내지 약 50개, 또는 약 22개 내지 약 40개와 같은 22개 이상의 탄소 사슬을 갖는 지방산을 포함한다. 일부 양상들에서, 지방산은 VLCFA이다.
II.G.3.c 인지질
일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티는 인지질을 포함한다. 인지질은 모든 세포막의 주요 구성성분인 지질의 한 종류이다. 그들은 양친매성 특성 때문에 지질 이중층을 형성할 수 있다. 인지질 분자의 구조는 일반적으로 2개의 소수성 지방산 "꼬리" 그리고 포스페이트 그룹으로 구성된 친수성 "머리"로 구성된다. 예를 들어, 인지질은 다음 화학식에 따른 지질일 수 있다:
Figure pct00089
여기서 Rp는 인지질 모이어티를 나타내고 R1 및 R2는 동일 또는 상이할 수 있는 불포화가 있거나 없는 지방산 모이어티를 나타낸다.
인지질 모이어티는, 예를 들면, 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜 글리세롤, 포스파티딜 세린, 포스파티딕 애시드, 2-라이소포스파티딜 콜린, 및 스핑고미엘린으로 구성된 비-제한적 그룹에서 선택될 수 있다.
특정 인지질은 지질 이중층, 예를 들어 엑소좀 막의 지질 이중층에 대한 융합을 촉진할 수 있다. 예를 들면, 양이온성 인지질은 막의 하나 이상의 음으로 하전된 인지질과 상호작용할 수 있다. 막에 대한 인지질의 융합은 지질-함유 조성물의 하나 이상의 요소가 막에 결합하거나 막을 통과하도록 할 수 있다.
지방산 모이어티는, 예를 들면, 라우르산, 미리스트산, 미리스톨레산, 팔미트산, 팔미톨레산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 알파-리놀렌산, 에루스산, 파이타노산 (phytanoic acid), 아라키드산, 아라키돈산, 에이코사펜타에노산, 베헨산, 도코사펜타에노산, 및 도코사헥사에노산으로 구성된 비-제한적 그룹에서 선택될 수 있다.
본 발명에서 스캐폴드 모이어티로서 사용하는 인지질은 자연 또는 비자연 인지질일 수 있다. 분지화, 산화, 고리화, 및 알킨을 포함하는 변형 및 치환된 자연 종들을 비롯한 비-자연 인지질 종들 또한 고려된다. 예를 들면, 인지질은 하나 이상의 알킨 (예컨대, 하나 이상의 이중 결합이 삼중 결합으로 대체되어 있는 알케닐 그룹)으로 기능화되거나 이에 교차결합될 수 있다. 적절한 반응 조건하에서, 알킨 그룹은 아자이드에 대한 노출시 구리-촉매화된 고리화첨가가 일어날 수 있다.
인지질에는 글리세로인지질, 가령, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티디 글리세롤, 및 포스파티딕 애시드가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에 개시된 스캐폴드 모이어티에 사용될 수 있는 인지질의 예는 다음을 포함한다
● 포스파티딜에탄올아민: 예를 들어, 다이라우로일포스파티딜에탄올아민, 다이미리스토일포스파티딜에탄올아민, 다이팔미토일포스파티딜에탄올아민, 다이스테아로일포스파티딜에탄올아민, 다이올레오일포스파티딜에탄올아민, 1-팔미토일-2-올레일포스파티딜에탄올아민, 1-올레일-2-팔미토일포스파티딜 에탄올아민, 및 다이에루코일포스파티딜 에탄올아민;
● 포스파티딜 글리세롤: 예를 들어, 다이라우로일포스파티딜 글리세롤, 다이미리스토일포스파티딜 글리세롤, 다이팔미토일포스파티딜 글리세롤, 다이스테아로일포스파티딜글리세롤, 다이올레오일포스파티딜 글리세롤, 1-팔미토일-2-올레일-포스파티딜 글리세롤, 1-올레일-2-팔미토일-포스파티딜 글리세롤, 및 다이에루코일포스파티딜 글리세롤;
● 포스파티딜 세린 : 예를 들어, 예를 들어 다이라우로일포스파티딜 세린, 다이미리스토일포스파티딜 세린, 다이팔미토일포스파티딜 세린, 다이스테아로일포스파티딜세린, 다이올레오일포스파티딜 세린, 1-팔미토일-2-올레일-포스파티딜 세린, 1-올레일-2-팔미토일-포스파티딜 세린, 및 다이에루코일포스파티딜 세린;
● 포스파티딕 애시드: 예를 들어, 다이라우로일포스파티딕 애시드, 다이미리스토일포스파티딕 애시드, 다이팔미토일포스파티딕 애시드, 다이스테아로일포스파티딕 애시드, 다이올레오일포스파티딕 애시드, 1-팔미토일-2-올레일포스파티딕 애시드, 1-올레일-2-팔미토일-포스파티딕 애시드, 및 다이에루코일포스파티딕 애시드; 및,
● 포스파티딜 이노시톨: 예를 들어, 다이라우로일포스파티딜 이노시톨, 다이미리스토일포스파티딜 이노시톨, 다이팔미토일포스파티딜 이노시톨, 다이스테아로일포스파티딜이노시톨, 다이올레오일포스파티딜 이노시톨, 1-팔미토일-2-올레일-포스파티딜 이노시톨, 1-올레일-2-팔미토일-포스파티딜 이노시톨, 및 다이에루코일포스파티딜 이노시톨.
인지질은 대칭 또는 비대칭 유형일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "대칭 인지질"은 매칭하는 지방산 모이어티를 갖는 글리세로인지질 및, 가변 지방산 모이어티 및 스핑고신 골격의 탄화수소 사슬이 비등한 수의 탄소 원자를 포함하는 스핑고지질을 포함한다. 본원에 사용된 용어 ''비대칭 인지질''은 리소지질, 상이한 지방산 모이어티(예를 들어, 상이한 수의 탄소 원자 및/또는 불포화(예를 들어, 이중 결합)를 갖는 지방산 모이어티)를 갖는 글리세로인지질, 및, 가변 지방산 모이어티 및 스핑고신 골격의 탄화수소 사슬이 서로 다른 수의 탄소 원자를 포함하는 (예를 들어, 가변 지방산 모이어티는 탄화수소 사슬보다 2개 이상 더 많은 탄소 원자 또는 탄화수소 사슬보다 2개 이상 더 적은 탄소 원자를 포함) 스핑고지질을 포함한다.
일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티는 적어도 하나의 대칭 인지질을 포함한다. 대칭 인지질은 다음으로 구성된 비-제한적 그룹에서 선택될 수 있다
1,2-다이프로피오닐-sn-글리세로-3-포스포콜린 (03:0 PC),
1,2-다이부티릴-sn-글리세로-3-포스포콜린 (04:0 PC),
1,2-다이펜타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (05:0 PC),
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1,2-다이엘라이도일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (18:1 (Δ9-Trans) PC),
1,2-다이리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (18:2 (Cis) PC, DLPC),
1,2-다이리놀레노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (18:3 (Cis) PC, DLnPC),
1,2-다이에이코세노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (20:1 (Cis) PC),
1,2-다이아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (20:4 (Cis) PC, DAPC),
1,2-다이에루코일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (22:1 (Cis) PC),
1,2-다이도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (22:6 (Cis) PC, DHAPC),
1,2-다이네르보노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (24:1 (Cis) PC),
1,2-다이헥사노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (06:0 PE),
1,2-다이옥타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (08:0 PE),
1,2-다이데카노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (10:0 PE),
1,2-다이라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (12:0 PE),
1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (14:0 PE),
1,2-다이펜타데카노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (15:0 PE),
1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (16:0 PE),
1,2-다이파이타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (4ME 16:0 PE),
1,2-다이헵타데카노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (17:0 PE),
1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (18:0 PE, DSPE),
1,2-다이팔미톨레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (16:1 PE),
1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (18:1 (Δ9- Cis) PE, DOPE),
1,2-다이엘라이도일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (18:1 (Δ9-Trans) PE),
1,2-다이리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (18:2 PE, DLPE),
1,2-다이리놀레노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (18:3 PE, DLnPE),
1,2-다이아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (20:4 PE, DAPE),
1,2-다이도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (22:6 PE, DHAPE),
1,2-다이-O-옥타데케닐-sn-글리세로-3-포스포콜린 (18:0 다이에터 PC),
1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포-rac-(1-글리세롤) 소듐 염 (DOPG), 및 이들의 임의의 조합.
일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티는 DLPC, DMPC, DOPC, DPPC, DSPC, DUPC, 18:0 다이에터 PC, DLnPC, DAPC, DHAPC, DOPE, 4ME 16:0 PE, DSPE, DLPE, DLnPE, DAPE, DHAPE, DOPG, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 비-제한적 그룹에서 선택된 적어도 하나의 대칭 인지질을 포함한다.
일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티는 적어도 하나의 비대칭 인지질을 포함한다. 비대칭 인지질은 다음으로 구성된 비-제한적 그룹에서 선택될 수 있다
1-미리스토일-2-팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (14:0-16:0 PC, MPPC),
1-미리스토일-2-스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (14:0-18:0 PC, MSPC),
1-팔미토일-2-아세틸-sn-글리세로-3-포스포콜린 (16:0-02:0 PC),
1-팔미토일-2-미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (16:0-14:0 PC, PMPC),
1-팔미토일-2-스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (16:0-18:0 PC, PSPC),
1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (16:0-18:1 PC, POPC),
1-팔미토일-2-리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (16:0-18:2 PC, PLPC),
1-팔미토일-2-아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (16:0-20:4 PC),
1-팔미토일-2-도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (14:0-22:6 PC),
1-스테아로일-2-미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (18:0-14:0 PC, SMPC),
1-스테아로일-2-팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (18:0-16:0 PC, SPPC),
1-스테아로일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (18:0-18:1 PC, SOPC),
1-스테아로일-2-리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (18:0-18:2 PC),
1-스테아로일-2-아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (18:0-20:4 PC),
1-스테아로일-2-도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (18:0-22:6 PC),
1-올레오일-2-미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (18:1-14:0 PC, OMPC),
1-올레오일-2-팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (18:1-16:0 PC, OPPC),
1-올레오일-2-스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (18:1-18:0 PC, OSPC),
1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (16:0-18:1 PE, POPE),
1-팔미토일-2-리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (16:0-18:2 PE),
1-팔미토일-2-아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (16:0-20:4 PE),
1-팔미토일-2-도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (16:0-22:6 PE),
1-스테아로일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (18:0-18:1 PE),
1-스테아로일-2-리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (18:0-18:2 PE),
1-스테아로일-2-아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (18:0-20:4 PE),
1-스테아로일-2-도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (18:0-22:6 PE),
1-올레오일-2-콜레스테릴헤미숙시노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (OChemsPC), 및
이들의 임의의 조합.
더 현저한 뉴클레아제 내성, 세포 흡수 효율 및 더 현저한 RNA 간섭 효과를 제공하기 위해 포스파티딜에탄올아민, 예를 들어, 다이미리스토일포스파티딜 에탄올아민, 다이팔미토일포스파티딜 에탄올아민, 1-팔미토일-2-올레일-포스파티딜 에탄올아민, 및 다이올레오일포스파티딜 에탄올아민을 스캐폴드 모이어티로 사용할 수 있다.
지질 (예를 들어, 인지질)과 링커 또는 생물학적 활성 분자, 예를 들어 ASO의 결합 부위는 지질 및 링커 또는 생물학적 활성 분자의 유형에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 지질의 소수성 그룹 이외의 임의의 위치는 화학적 결합에 의해 링커 또는 생물학적 활성 분자에 연결될 수 있다. 예를 들어, 포스파티딜에탄올아민을 사용하는 경우, 포스파티딜에탄올아민의 아미노 그룹과 링커 또는 생물학적 활성 분자 사이에 아미드 결합 등을 형성하여 링키지를 만들 수 있다.
포스파티딜글리세롤을 사용하는 경우, 글리세롤 잔기의 하이드록실 그룹과 링커 또는 생물학적 활성 분자 사이에 에스터 결합, 에터 결합 등을 형성함으로써 링키지를 만들 수 있다.
포스파티딜세린을 사용하는 경우, 세린 잔기의 아미노 그룹 또는 카르복실 그룹과 링커 또는 생물학적 활성 분자 사이에 아미드 결합 또는 에스터 결합 등을 형성함으로써 링키지를 만들 수 있다.
포스파티딕 애시드를 사용하는 경우, 포스페이트 잔기와 링커 또는 생물학적 활성 분자 사이에 포스포에스터 결합 등을 형성함으로써 링키지를 만들 수 있다.
포스파티딜이노시톨을 사용하는 경우, 이노시톨 잔기의 하이드록실 그룹과 링커 또는 생물학적 활성 분자 사이에 에스터 결합, 에터 결합 등을 형성함으로써 링키지를 만들 수 있다.
II.G.3.d 라이소지질 (예를 들어, 라이소인지질)
일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티는 라이소지질, 예를 들어, 라이소인지질을 포함한다. 라이소지질은 일반적으로 가수분해에 의해 지방 아실 사슬 중 하나 또는 둘 모두가 제거된 지질의 유도체이다. 라이소인지질은 지방 아실 사슬 하나 또는 둘 모두가 가수분해에 의해 제거된 인지질의 유도체이다.
일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티는 아실 사슬 하나 또는 둘 모두가 가수분해를 통해 제거된 상기 개시된 임의의 인지질을 포함하므로, 생성된 라이소인지질은 하나의 지방산 아실 사슬을 포함하거나 전혀 포함하지 않는다.
일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티는 라이소글리세로인지질, 라이소글리코스핑고지질, 라이소포스파티딜콜린, 라이소포스파티딜에탄올아민, 라이소포스파티딜이노시톨, 또는 라이소포스파티딜세린을 포함한다.
일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티는 다음으로 구성된 비-제한적 그룹에서 선택된 라이소지질을 포함한다
1-헥사노일-2-하이드록시-sn-글리세로-3-포스포콜린 (06:0 Lyso PC),
1-헵타노일-2-하이드록시-sn-글리세로-3-포스포콜린 (07:0 Lyso PC),
1-옥타노일-2-하이드록시-sn-글리세로-3-포스포콜린 (08:0 Lyso PC),
1-노나노일-2-하이드록시-sn-글리세로-3-포스포콜린 (09:0 Lyso PC),
1-데카노일-2-하이드록시-sn-글리세로-3-포스포콜린 (10:0 Lyso PC),
1-운데카노일-2-하이드록시-sn-글리세로-3-포스포콜린 (11:0 Lyso PC),
1-라우로일-2-하이드록시-sn-글리세로-3-포스포콜린 (12:0 Lyso PC),
1-트라이데카노일-2-하이드록시-sn-글리세로-3-포스포콜린 (13:0 Lyso PC),
1-미리스토일-2-하이드록시-sn-글리세로-3-포스포콜린 (14:0 Lyso PC),
1-펜타데카노일-2-하이드록시-sn-글리세로-3-포스포콜린 (15:0 Lyso PC),
1-팔미토일-2-하이드록시-sn-글리세로-3-포스포콜린 (16:0 Lyso PC),
1-헵타데카노일-2-하이드록시-sn-글리세로-3-포스포콜린 (17:0 Lyso PC),
1-스테아로일-2-하이드록시-sn-글리세로-3-포스포콜린 (18:0 Lyso PC),
1-올레오일-2-하이드록시-sn-글리세로-3-포스포콜린 (18:1 Lyso PC),
1-노나데카노일-2-하이드록시-sn-글리세로-3-포스포콜린 (19:0 Lyso PC),
1-아라키도일-2-하이드록시-sn-글리세로-3-포스포콜린 (20:0 Lyso PC),
1-베헤노일-2-하이드록시-sn-글리세로-3-포스포콜린 (22:0 Lyso PC),
1-리그노세로일-2-하이드록시-sn-글리세로-3-포스포콜린 (24:0 Lyso PC),
1-헥사코사노일-2-하이드록시-sn-글리세로-3-포스포콜린 (26:0 Lyso PC),
1-미리스토일-2-하이드록시-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (14:0 Lyso PE),
1-팔미토일-2-하이드록시-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (16:0 Lyso PE),
1-스테아로일-2-하이드록시-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (18:0 Lyso PE),
1-올레오일-2-하이드록시-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (18:1 Lyso PE),
1-헥사데실-sn-글리세로-3-포스포콜린 (C16 Lyso PC), 및
이들의 임의의 조합.
II.G.3.e 비타민
일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티는 친유성 비타민, 예를 들어, 엽산, 비타민 A, 비타민 E, 또는 비타민 K를 포함한다.
일부 양상들에서, 스캐폴드 부분은 비타민 A를 포함한다. 비타민 A는 레티놀, 레티날, 레티노산 및 여러 프로비타민 A 카로티노이드 (특히 베타 카로틴)를 포함하는 불포화 영양 유기 화합물 그룹이다. 일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티는 레티놀을 포함한다. 일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티는 레티노이드를 포함한다. 레티노이드는 비타민 A의 비타머이거나 이와 화학적으로 관련된 화합물의 한 종류이다. 일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티는 1세대 레티노이드 (예를 들어, 레티놀, 트레티노인, 아이소트레아티노인 또는 알리트레티노인), 2세대 레티노이드 (예를 들어, 에트레티네이트 또는 아시트레틴), 3세대 레티노이드 (예를 들어, 아다팔렌, 벡사로텐 또는 타자로텐), 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
Figure pct00090
Figure pct00091
일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티는 비타민 E를 포함한다. 토코페롤은 메틸화 페놀의 한 종류로 대부분이 비타민 E 활성을 가지고 있다. 따라서, 일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티는 알파-토코페롤, 베타-토코페롤, 감마-토코페롤, 델타-토코페롤, 또는 이들의 조합을 포함한다.
Figure pct00092
알파 토코페롤
Figure pct00093
베타 토코페롤
Figure pct00094
감마 토코페롤
Figure pct00095
델타 토코페롤
토코트라이에놀은 또한 비타민 E 활성을 가진다. 토코트라이에놀과 토코페롤 사이의 중요한 화학적 구조적 차이점은 토코트라이에놀에는 3개의 탄소-탄소 이중 결합이 있는 불포화 이소프레노이드 측쇄가 있는 것에 비해 토코페롤에는 포화 측쇄가 있다는 것이다. 일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티는 알파-토코트라이에놀, 베타-토코트라이에놀, 감마-토코트라이에놀, 델타-토코트라이에놀, 또는 이들의 조합을 포함한다. 토코트라이에놀은 하기 화학식으로 나타낼 수 있다
Figure pct00096
알파(α)-토코트라이에놀: R1 = Me, R2 = Me, R3 = Me;
베타(β)-토코트라이에놀: R1 = Me, R2 = H, R3= Me;
감마(γ)-토코트라이에놀: R1 = H, R2 = Me, R3= Me;
델타(δ)-토코트라이에놀: R1 = H, R2 = H, R3= Me.
일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티는 비타민 K를 포함한다. 화학적으로, 비타민 K 계열은 2-메틸-1.4-나프토퀴논 (3-) 유도체를 포함한다. 비타민 K는 2가지 자연 비타머: 비타민 K1 및 비타민 K2를 포함한다. 비타민 K1 (파이토나디온, 파일로퀴논, 또는 (E)-파이토나디온으로도 공지됨)의 구조는 파이틸 그룹의 존재에 의해 특징된다. 비타민 K2 (메나퀴논)의 구조는 6 내지 13개의 아이소프레닐 단위를 포함할 수 있는 분자에 존재하는 폴리아이소프레닐 측쇄에 의해 특징된다. 그러므로, 비타민 K2는 아이소프레노이드 원자들 그룹으로 구성된 탄소 측쇄의 길이가 서로 다른 여러 관련 화학적 하위유형들로 구성된다. MK-4는 비타민 K2의 가장 흔한 형태이다. MK-7, MK-8 및 MK-9와 같은 긴 사슬 형태는 발효 식품에서 우세하다. MK-10 내지 MK-13과 같은 더 긴 사슬 형태의 비타민 K2는 박테리아에 의해 합성되지만 잘 흡수되지 않고 생물학적 기능이 거의 없다. 자연 형태의 비타민 K 이외에도, 많은 합성 형태의 비타민 K, 예를 들어, 비타민 K3 (메나디온; 2-메틸나프탈렌-1,4-디온), 비타민 K4, 및 비타민 K5가 존재한다.
따라서, 일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티는 비타민 K1, K2 (예를 들어, MK-4, MK-5, MK-6, MK-7, MK-8, MK-9, MK-10, MK-11, MK-12, 또는 MK-13), K3, K4, K5, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다.
Figure pct00097
II.G.5 화학적으로 유도된 이량체
일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티 (예를 들어, 스캐폴드 단백질)는 화학적으로 유도된 이량체의 결합 파트너에 연결된다. 일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티 (예를 들어, 스캐폴드 단백질)는 화학적으로 유도된 이량체의 결합 파트너에 연결되고 생물학적 활성 분자는 상응하는 결합 파트너에 연결된다. 이들 양상들에서, 스캐폴드 모이어티 (예를 들어, 스캐폴드 단백질) 및 생물학적 활성 분자는 결합 파트너의 이량체화를 유도하는 화학물질의 존재하에 서로 결합한다. 일부 양상들에서, 결합 파트너는 스캐폴드 모이어티의 N-말단에 연결된다. 일부 양상들에서, 결합 파트너는 스캐폴드 모이어티 (예를 들어, 스캐폴드 단백질)의 C-말단에 연결된다. 일부 양상들에서, 결합 파트너는 스캐폴드 모이어티 (예를 들어, 스캐폴드 단백질)의 내강 도메인에 연결된다.
일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티 (예를 들어, 스캐폴드 단백질)는 친화성 물질에 연결된다. 일부 양상들에서, 친화성 물질은 스캐폴드 모이어티 (예를 들어, 스캐폴드 단백질)의 N-말단에 연결된다. 일부 양상들에서, 친화성 물질은 스캐폴드 모이어티 (예를 들어, 스캐폴드 단백질)의 C-말단에 연결된다. 일부 양상들에서, 친화성 물질은 스캐폴드 모이어티 (예를 들어, 스캐폴드 단백질)의 내강 도메인에 연결된다. 일부 양상들에서, 친화성 물질은 생물학적 활성 분자에 결합할 수 있는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 양상들에서, 친화성 물질은 수용체를 포함한다. 일부 양상들에서, 친화성 물질은 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 양상들에서, 친화성 물질은 하나 이상의 생물학적 활성 분자에 결합한다.
일부 양상들에서, 친화성 물질과 생물학적 활성 분자 사이의 상호작용은 일시적이다. 일부 양상들에서, 생물학적 활성 분자는 특정 조건하에서 친화성 물질로부터 해리된다. 특정 양상들에서, 친화성 물질의 생물학적 활성 분자에 대한 친화도는 pH 의존적이다. 일부 양상들에서, 생물학적 활성 분자는 적어도 약 3, 적어도 약 4, 적어도 약 5, 적어도 약 6, 적어도 약 7, 적어도 약 8, 적어도 약 9, 적어도 약 10, 적어도 약 11, 또는 적어도 약 12의 pH에서 친화성 물질로부터 해리된다. 일부 양상들에서, 생물학적 활성 분자에 대한 친화성 물질의 친화도는 생물학적 활성 분자 및 친화성 물질을 포함하는 용액에서 칼슘, 마그네슘, 설페이트, 포스페이트, 또는 이들의 임의 조합의 농도에 의존적이다. 일부 양상들에서, 생물학적 활성 분자에 대한 친화성 물질의 친화도는 생물학적 활성 분자 및 친화성 물질을 포함하는 용액의 염 농도 및/또는 이온 강도에 의존적이다. 일부 양상들에서, 생물학적 활성 분자 및 친화성 물질은 환원 조건하에서 해리가능하다.
일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티 (예를 들어, 스캐폴드 단백질)은 생물학적 활성 분자에 결합할 수 있는 폴리펩티드에 연결된다. 일부 양상들에서, 결합 폴리펩티드는 스캐폴드 모이어티 (예를 들어, 스캐폴드 단백질)의 N-말단에 연결된다. 일부 양상들에서, 결합 폴리펩티드는 스캐폴드 모이어티 (예를 들어, 스캐폴드 단백질)의 C-말단에 연결된다. 일부 양상들에서, 결합 폴리펩티드는 스캐폴드 모이어티 (예를 들어, 스캐폴드 단백질)의 내강 도메인에 연결된다.
일부 양상들에서, 결합 폴리펩티드는 항원-결합 도메인을 포함한다. 일부 양상들에서, 항원-결합 도메인은 항체의 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 양상들에서, 항원-결합 도메인은 단일쇄 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 양상들에서, 항원-결합 도메인은 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 양상들에서, 항원-결합 도메인은 쥐과 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 양상들에서, 항원-결합 도메인은 키메라 항체 (예를 들어, 마우스-인간, 마우스-영장류, 또는 영장류-인간 모노클로날 항체) 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 양상들에서, 항원-결합 도메인은 낙타과 항체, 상어 IgNAR, 또는 항-이디오타입 항체의 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 양상들에서, 항원-결합 도메인은 낙타과 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 양상들에서, 항원-결합 도메인은 상어 IgNAR 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 양상들에서, 항원-결합 도메인은 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
일부 양상들에서, 항원-결합 도메인은 단일쇄 항체를 포함한다. 일부 양상들에서, 항원-결합 도메인은 scFv를 포함한다. 일부 양상들에서, 항원-결합 도메인은 (scFv)2를 포함한다. 일부 양상들에서, 항원-결합 도메인은 Fab를 포함한다. 일부 양상들에서, 항원-결합 도메인은 Fab'를 포함한다. 일부 양상들에서, 항원-결합 도메인은 F(ab')2를 포함한다. 일부 양상들에서, 항원-결합 도메인은 F(ab1)2를 포함한다. 일부 양상들에서, 항원-결합 도메인은 Fv를 포함한다. 일부 양상들에서, 항원-결합 도메인은 dAb를 포함한다. 일부 양상들에서, 항원-결합 도메인은 단일쇄 Fab를 포함한다. 일부 양상들에서, 항원-결합 도메인은 Fd 단편을 포함한다.
일부 양상들에서, 항원-결합 도메인은 디아바디를 포함한다. 일부 양상들에서, 항원-결합 도메인은 미니바디를 포함한다. 일부 양상들에서, 항원-결합 도메인은 항체-관련 폴리펩티드를 포함한다. 특정 양상들에서, 항원-결합 도메인은 나노바디를 포함한다.
일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티 (예를 들어, 스캐폴드 단백질)는 Fc 수용체에 연결되고, 생물학적 활성 분자는 Fc에 연결된다. 특정 양상들에서, Fc 수용체는 Fc 감마 수용체 I (FcγR1), FcγRIIA, FcγIIB, FcγIIIA, 및 FcγIIIB에서 선택된 Fc 감마 수용체이고; Fc는 IgG의 Fc이다. 특정 양상들에서, Fc 수용체는 FcγR1이고 Fc는 IgG의 Fc이다. 일부 양상들에서, Fc 수용체는 Fc 알파 수용체 I (FcαR1)이고, 이때 Fc는 IgA의 Fc이다. 일부 양상들에서, Fc 수용체는 Fc 엡실론 수용체 I (FcεRI) 및 FcεRII에서 선택된 Fc 엡실론 수용체이고, 이때 Fc는 IgE의 Fc이다.
일부 양상들에서, 스캐폴드 모이어티 (예를 들어, 스캐폴드 단백질)은 나노바디에 연결되고; 생물학적 활성 분자는 면역글로불린 불변 영역 (Fc)에 연결된다. 특정 양상들에서, 나노바디는 Fc에 특이적으로 결합한다.
III. 제조 방법
본 발명의 EV, 예를 들어, 엑소좀은 화학적 합성, 재조합 DNA 기술, 더 큰 분자의 생화학적 또는 효소적 단편화, 상기의 조합 또는 임의의 다른 방법에 의해 생산될 수 있다. 한 양상에서, 본 발명은 생물학적 활성 분자를 EV (예를 들어, 엑소좀)에 접합시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 생물학적 활성 분자를 상기 기재된 바와 같이 말레이미드 모이어티를 통해 EV (예를 들어, 엑소좀)에 연결하는 것을 포함한다.
아민 반응성 화합물 외에도 설프하이드릴 (-SH)과 결합을 형성하는 화학 그룹을 갖는 화합물은 단백질 및 기타 생체 접합 기술을 위한 가장 일반적인 가교제 및 변형 시약이다. 티올로도 불리는 설프하이드릴은, 시스테인 (Cys, C) 아미노산의 측쇄에 있는 단백질에 존재한다. 시스테인 설프하이드릴 그룹의 쌍들은 종종 천연 3차 또는 4차 단백질 구조의 기초로서 폴리펩티드 사슬들 내부에서 또는 이들 사이에 다이설파이드 결합 (-S-S-)에 의해 연결된다. 일반적으로 유리 또는 환원된 설프하이드릴 그룹(-SH) [다이설파이드 결합의 황 원자 대신]만이 티올 반응성 화합물과의 반응에 사용할 수 있다.
설프하이드릴 그룹은 단백질 접합 및 표지에 유용한 표적이다. 첫째, 설프하이드릴은 대부분의 단백질에 존재하지만 1차 아민만큼 많지는 않다. 따라서 설프하이드릴 그룹을 통한 가교는 더 선택적이고 정확하다. 둘째, 단백질에서 설프하이드릴 그룹은 종종 다이설파이드 결합에 관여하므로 이러한 부위의 가교는 일반적으로 기본 단백질 구조를 유의하게 변형하거나 결합 부위를 유의하게 차단하지 않는다. 셋째, 이용가능한 (즉, 유리) 설프하이드릴 그룹의 수는 쉽게 제어 또는 수정될 수 있다. 이들은 천연 다이설파이드 결합의 환원에 의해 생성될 수 있거나 2-이미노티올란 (트라우트 시약), SATA, SATP 또는 SAT(PEG)와 같은 설프하이드릴 첨가 시약을 사용하여 1차 아민과의 반응을 통해 분자에 도입될 수 있다. 마지막으로, 설프하이드릴 반응 그룹과 아민 반응 그룹을 조합하여, 이종이작용기 가교제를 만드는 것은 가교 절차에 더 큰 유연성과 제어를 제공한다. 예를 들어, 말레이미드 그룹과 NHS 에스터를 포함하는 3-말레이미도-프로피오닉 NHS 에스터를 사용하여, NHS 에스터는 단백질의 1차 아민 (-NH2), 아민-변형 올리고뉴클레오티드 및 기타 아민-함유 분자를 표지하는 데 사용될 수 있다. 말레이미드 그룹은 티올 그룹과 반응하여 공유 결합을 형성하여 생물분자를 티올과 연결할 수 있다.
말레이미드 그룹은 반응 혼합물의 pH가 6.5와 7.5 사이일 때 설프하이드릴 그룹과 특이적으로 반응한다. 그 결과 가역적이지 않은 안정한 티오에터 결합이 형성된다 (즉, 결합이 환원제로 절단될 수 없음). 보다 알칼리성인 조건 (pH > 8.5)에서 반응은 1차 아민을 선호하고 말레이미드 그룹의 비반응성 말레아믹 애시드로의 가수분해 속도를 증가시킨다. 말레이미드는 티로신, 히스티딘 또는 메티오닌과 반응하지 않는다.
디티오트레이톨 (DTT) 및 베타-메르캅토에탄올 (BME)과 같은 티올 함유 화합물은 커플링 부위를 놓고 경쟁하므로 말레이미드와 함께 사용되는 반응 완충액에서 제외해야 한다. 예를 들어, DTT를 사용하여 단백질의 다이설파이드을 환원시켜 설프하이드릴 그룹을 접합에 사용할 수 있게 했다면, 말레이미드 반응을 시작하기 전에 탈염 컬럼을 사용하여 DTT를 완전히 제거해야 한다. 흥미롭게도 다이설파이드-환원제 TCEP는 티올을 포함하지 않으며 말레이미드 시약과 관련된 반응 전에 제거할 필요가 없다.
과량의 말레이미드는 유리 티올을 추가하여 반응이 끝날 때 퀀칭될 수 있다. EDTA는, 킬레이트하지 않으면 설프하이드릴 (비반응성)의 산화를 촉진하는 2가 금속을 킬레이트하기 위해 커플링 완충액에 포함될 수 있다.
한 양상에서, 연결은 EV (예를 들어, 엑소좀)를 환원제로 처리하는 것을 포함한다. 적합한 환원제는 예를 들어 TCEP (트리스(2-카르복시에틸)포스핀), DTT (디티오트레이톨), BME (2-메르캅토에탄올), 티올화제, 및 이들의 임의의 조합을 포함한다. 티올화제는 예를 들어 트라우트 시약 (2-이미노티올란)을 포함할 수 있다.
환원제로 처리 후, 연결 반응은 환원된 EV (예를 들어, 엑소좀)을 말레이미드 모이어티와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 한 양상에서, 말레이미드 모이어티는 EV (예를 들어, 엑소좀)에 대한 연결 전에 생물학적 활성 분자에 연결된다. 일부 양상들에서, 말레이미드 모이어티는 링커에 추가로 부착되고, 이러한 말레이미드 모이어티가 생물학적 활성 분자에 연결된다. 따라서, 일부 양상에서, 말레이미드 모이어티와 생물학적 활성 분자 사이에 하나 이상의 링커 또는 스페이서가 개재된다.
IV. 치료 용도
본 발명은 본 발명의 EV, 예를 들어, 엑소좀을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체의 질환 또는 병태를 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 EV, 예를 들어, 엑소좀을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체의 질환 또는 병태의 증상을 예방 또는 개선하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명의 EV, 예를 들어 엑소좀을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 진단하는 방법이 제공된다.
한 양상에서, 질환 또는 장애는 암, 염증성 질환, 신경퇴행성 장애, 중추신경계 질환, 또는 대사 질환이다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 EV, 예를 들어, 엑소좀을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공한다. 일부 양상들에서, 본 발명의 방법으로 치료될 수 있는 질환 또는 장애는 암, 이식편대숙주병 (GvHD), 자가면역 질환, 감염성 질환, 또는 섬유성 질환을 포함한다. 일부 양상들에서, 치료는 예방적이다. 다른 양상들에서, 본 발명을 위한 EV, 예를 들어, 엑소좀은 면역 반응을 유도하기 위해 사용된다. 다른 양상들에서, 본 발명을 위한 EV, 예를 들어, 엑소좀은 대상체를 백신접종하는 데 사용된다.
일부 양상들에서, 질환 또는 장애는 암이다. 특정 양상들에서, 본 발명의 EV, 예를 들어 엑소좀은 암에 걸린 대상체에게 투여될 때, 면역 반응을 상향조절하고 대상체의 면역계의 종양 표적화를 향상시킬 수 있다. 일부 양상들에서, 치료될 암은 백혈구 (T-세포, B-세포, 대식세포, 수지상 세포, 단핵구)가 종양 미세환경으로 침윤되는 것, 또는 소위 "고온 종양" 또는 "염증성 종양"을 특징으로 한다. 일부 양상들에서, 치료될 암은 백혈구의 종양 미세환경으로의 침윤의 수준이 낮거나 감지할 수 없는 수준인 것, 또는 소위 "저온 종양" 또는 "비염증성 종양"을 특징으로 한다. 일부 양상들에서, EV, 예를 들어 엑소좀은 "저온 종양"을 "고온 종양"으로 전환하기에 충분한 양 및 시간 동안 투여되며, 즉 상기 투여는, 백혈구 (예를 들어, T-세포)의 종양 미세환경 내부로의 침윤을 초래한다. 특정 양상들에서, 암은 방광암, 자궁경부암, 신장 세포암, 고환암, 결장직장암, 폐암, 두경부암, 및 난소암, 림프종, 간암, 교모세포종, 흑색종, 골수종, 백혈병, 췌장암 또는 이들의 조합을 포함한다. 다른 양상들에서, 용어 "말단 종양" 또는 "원위 종양"은 최초 (또는 원발성) 종양으로부터 먼 기관 또는 먼 조직, 예를 들어, 림프절로 퍼진 종양을 지칭한다. 일부 양상들에서, 본 발명의 EV, 예를 들어 엑소좀은 전이성 확산 후 종양을 치료한다.
일부 양상들에서, 질환 또는 장애는 이식편 대 숙주병 (GvHD)이다. 일부 양상들에서, 본 발명으로 치료될 수 있는 질환 또는 장애는 자가면역 질환이다. 자가면역 질환의 비제한적 예는 다발성 경화증, 말초 신경염, 쇼그렌 증후군, 류마티스 관절염, 탈모증, 자가면역 췌장염, 베체트병, 수포성 천포창, 셀리악병, 데빅병(시신경척수염), 사구체신염, IgA 신병증, 다양한 혈관염 (assorted vasculitides), 경피증, 당뇨병, 동맥염, 백반증, 궤양성 대장염, 과민성 대장 증후군, 건선, 포도막염, 전신성 홍반성 루푸스, 및 이들의 조합을 포함한다.
일부 양상들에서, 질환 또는 장애는 감염성 질환이다. 특정 양상들에서, 질환 또는 장애는 발암 바이러스이다. 일부 양상들에서, 본 발명으로 치료될 수 있는 감염성 질환은 인간 감마 헤르페스 바이러스 4 (엡스타인 바 바이러스), 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 거대세포 바이러스, 황색포도상구균, 결핵균, 클라미디아 트라코마티스, HIV-1, HIV-2, 코로나 바이러스(예를 들어, MERS-CoV 및 SARS CoV), 필로바이러스(예를 들어, 마르부르크 및 에볼라),스트렙토코쿠스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에, 플라스모디아 종 (예를 들어, 비박스 및 팔시파룸), 치쿤구니야 바이러스, 인유두종 바이러스 (HPV), B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 인간 헤르페스 바이러스 8, 단순 헤르페스 바이러스 2 (HSV2), 클렙시엘라 종, 슈도모나스 아에루기노사, 엔테로코쿠스 종, 프로테우스 종, 엔테로박터 종, 악티노박터 종, 응고효소-음성 스타필로코카이 (CoNS), 마이코플라즈마 종, 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 양상들에서, EV, 예를 들어, 엑소좀은 대상체의 순환계에 정맥내 투여된다. 일부 양상들에서, EV, 예를 들어 엑소좀은 적절한 액체에 주입되고 대상체의 정맥에 투여된다.
일부 양상들에서, EV, 예를 들어, 엑소좀은 대상체의 순환계에 동맥내 투여된다. 일부 양상들에서, EV, 예를 들어 엑소좀은 적절한 액체에 주입되고 대상체의 동맥에 투여된다.
일부 양상들에서, EV, 예를 들어 엑소좀은 경막내 투여에 의해 대상체에게 투여된다. 일부 양상들에서, EV, 예를 들어, 엑소좀은 뇌척수액(CSF)에 도달하도록 척추관 또는 지주막하 공간으로 주사를 통해 투여된다.
일부 양상들에서, EV, 예를 들어 엑소좀은 대상체의 하나 이상의 종양에 종양내 투여된다.
일부 양상들에서, EV, 예를 들어 엑소좀은 비강내 투여에 의해 대상체에게 투여된다. 일부 양상들에서, EV, 예를 들어, 엑소좀은 국소 투여 또는 전신 투여의 형태로 코를 통해 주입될 수 있다. 특정 양상들에서, EV, 예를 들어, 엑소좀은 비강 스프레이로 투여된다.
일부 양상들에서, EV, 예를 들어 엑소좀은 복강내 투여에 의해 대상체에게 투여된다. 일부 양상들에서, EV, 예를 들어 엑소좀은 적절한 액체에 주입되고 대상의 복막에 주입된다. 일부 양상들에서, 복강내 투여는 EV, 예를 들어 엑소좀을 림프관에 분포시킨다. 일부 양상들에서, 복강내 투여는 EV, 예를 들어 엑소좀을 흉선, 비장 및/또는 골수에 분포시킨다. 일부 양상들에서, 복강내 투여는 EV, 예를 들어 엑소좀을 하나 이상의 림프절에 분포시킨다. 일부 양상들에서, 복강내 투여는 EV, 예를 들어 엑소좀을 경부 림프절, 서혜부 림프절, 종격동 림프절 또는 흉골 림프절 중 하나 이상에 분포시킨다. 일부 양상들에서, 복강내 투여는 EV, 예를 들어 엑소좀을 췌장에 분포시킨다.
일부 양상들에서, EV, 예를 들어 엑소좀은 안구주위 투여에 의해 대상체에게 투여된다. 일부 양상들에서, EV, 예를 들어, 엑소좀은, 안구주위 조직에 주입된다. 안구주위 약물 투여에는 결막하, 전방 테논하, 후방 테논하 및 안구후부 투여 경로가 포함된다.
일부 양상들에서, EV, 예를 들어 엑소좀은 안구내 투여된다. 따라서, 본 발명은 페이로드(예를 들어, AVV)를 포함하는 본 발명의 세포외 소포 (EV), 예를 들어, 엑소좀을 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 안 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 조성물의 투여는 안구내이다.
일부 양상들에서, 안구내 투여는 유리체내 투여, 전방내 투여, 결막하 투여, 망막하 투여, 공막하 투여, 맥락막내 투여, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 그룹에서 선택된다. 일부 양상들에서, 안구내 투여는 본 발명의 EV, 예를 들어 엑소좀의 주사를 포함한다. 일부 양상들에서, 안구내 투여는 유리체내 주사이다.
V. 약학 조성물 및 투여 방법
본 발명은 또한 대상체에 투여하기에 적합한 본원에 기재된 EV, 예를 들어 엑소좀을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 약학 조성물은 일반적으로 복수의 EV, 예를 들어, 엑소좀에 말레이미드 모이어티를 통해 공유적으로 연결된 생물학적 활성 분자를 포함하는 복수의 EV, 예를 들어, 엑소좀 및 약학적으로 허용되는 부형제 또는 담체를 대상체에게 투여하기에 적합한 형태로 포함한다. 약학적으로 허용되는 부형제 또는 담체들은 부분적으로는 투여되는 특정 조성물에 의해, 뿐만 아니라 이러한 조성물을 투여하기 위해 사용되는 특정 방법에 의해 결정된다. 따라서, 다수의 EV, 예를 들어 엑소좀을 포함하는 매우 다양한 적합한 제형의 약학 조성물이 존재한다. 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18th ed. (1990)를 참고하라.
약학 조성물은 일반적으로 미국 식품의약국의 모든 의약품 제조 및 품질관리 기준 (GMP) 규정을 완전히 준수하여 제형화된다. 일부 양상들에서, 약학 조성물은 하나 이상의 화학적 화합물, 예를 들어 본원에 기재된 EV, 예를 들어 엑소좀에 공유적으로 연결된 소분자를 포함한다.
일부 양상들에서, 약학 조성물은 본원에 기재된 하나 이상의 치료제 및 EV, 예를 들어, 엑소좀을 포함한다. 특정 양상들에서, EV, 예를 들어 엑소좀은 약학적으로 허용되는 담체에서 하나 이상의 추가 치료제와 공동 투여된다. 일부 양상들에서, EV, 예를 들어 엑소좀을 포함하는 약학 조성물은 추가 치료제의 투여 전에 투여된다. 다른 양상들에서, EV, 예를 들어 엑소좀을 포함하는 약학 조성물은 추가 치료제의 투여 후에 투여된다. 추가 양상들에서, EV, 예를 들어 엑소좀을 포함하는 약학 조성물은 추가 치료제와 동시에 투여된다.
본원에서는 원하는 정도의 순도를 갖는 본 발명의 EV, 예를 들어 엑소좀, 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 대상체에게 투여하기에 적합한 형태로 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 약학적으로 허용되는 부형제 또는 담체들은 부분적으로는 투여되는 특정 조성물에 의해, 뿐만 아니라 이러한 조성물을 투여하기 위해 사용되는 특정 방법에 의해 결정될 수 있다. 따라서, 다수의 세포외 소포를 포함하는 약학 조성물의 매우 다양한 적합한 제형이 존재한다. (예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 21st ed. (2005) 참조). 약학 조성물은 일반적으로 미국 식품의약국의 모든 의약품 제조 및 품질관리 기준 (GMP) 규정을 완전히 준수하여 제형화된다.
일부 양상들에서, 약학 조성물은 본원에 기재된 하나 이상의 치료제 및 EV, 예를 들어, 엑소좀을 포함한다. 특정 양상들에서, EV, 예를 들어 엑소좀은 약학적으로 허용되는 담체에서 하나 이상의 추가 치료제와 공동 투여된다. 일부 양상들에서, EV, 예를 들어 엑소좀을 포함하는 약학 조성물은 추가 치료제의 투여 전에 투여된다. 다른 양상들에서, EV, 예를 들어 엑소좀을 포함하는 약학 조성물은 추가 치료제의 투여 후에 투여된다. 추가 양상들에서, EV, 예를 들어 엑소좀을 포함하는 약학 조성물은 추가 치료제와 동시에 투여된다.
허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제는 이용된 투여량 및 농도에서 수용자 (예를 들어, 동물 또는 인간)에 비독성이며, 완충액, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 단당류, 이당류 (예를 들어, 수크로스 또는 트레할로스), 및 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당 알콜 (예컨대 만니톨 또는 소르비톨); 염 형성 짝이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물(예를 들면, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 TWEEN™, PLURONICS™, 또는 폴리에틸렌 글라이콜(PEG)이 포함된다.
담체 또는 희석제의 예들에는 물, 식염수, 링거 용액, 포도당 용액, 및 5% 인간 혈청 알부민이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 약학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 화합물들의 사용은 해당 기술 분야에 널리 공지이다. 임의의 통상적인 매질 또는 화합물이 본원에 기재된 세포외 소포와 양립할 수 없는 경우를 제외하고, 상기 조성물에서의 이들의 사용이 고려된다. 보충 치료제 또한 상기 조성물에 혼입될 수 있다. 전형적으로, 약학 조성물은 의도된 투여 경로와 양립할 수 있도록 제형화된다. 본 발명의 EV, 예를 들어 엑소좀은 비경구, 국소, 정맥내, 경구, 피하, 동맥내, 피내, 경피, 직장, 두개내, 복강내, 비강내, 종양내, 근육내 경로에 의해 또는 흡입제로서 투여될 수 있다. 특정 양상들에서, EV, 예를 들어 엑소좀을 포함하는 약학 조성물은 정맥내로, 예를 들어, 주사로 투여된다. EV, 예를 들어 엑소좀은 선택적으로 EV, 예를 들어 엑소좀이 의도한 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 데 적어도 부분적으로 효과적인 다른 치료제와 조합하여 투여될 수 있다.
용액 또는 현탁액은 다음 성분들을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 가령, 물, 식염수 용액, 고정유(fixed oils), 폴리에틸렌 글라이콜, 글리세린, 프로필렌 글라이콜 또는 그 외 합성 용매; 항균 화합물, 가령, 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 가령, 아스코르브산 또는 소듐 바이설파이트; 킬레이트 화합물, 가령, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA); 완충제, 가령, 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트, 및 긴장성(tonicity) 조절을 위한 화합물, 가령, 소듐 클로라이드 또는 포도당. pH는 산 또는 염기, 가령, 염산 또는 수산화 나트륨를 이용하여 조정될 수 있다. 상기 제제는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰플, 일회용 실린지 또는 다중 투여용 바이얼에 봉입될 수 있다.
주사용으로 적합한 약학 조성물은 멸균 수용액 (수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 담체에는 생리식염수, 세균발육저지수, 크레모포어(Cremophor) EL™ (BASF, Parsippany, N.J.) 또는 포스페이트 완충 식염수 (PBS)가 포함된다. 상기 조성물은 일반적으로 용이하게 주사될 수 있을 정도의 멸균인 유체이다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글라이콜 및 액체 폴리에틸렌 글라이콜 및 이와 유사한 것들) 그리고 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질로 존재할 수 있다. 예를 들면, 코팅, 예를 들어, 레시틴을 사용함으로써, 분산액의 경우 필요한 입경을 유지함으로써, 그리고 계면활성제를 사용함으로써 적절한 유동성이 유지될 수 있다. 미생물 작용은 다양한 항균 및 항진균 화합물, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 방지될 수 있다. 원하는 경우, 등장성 화합물, 예를 들어, 당, 다가알콜, 가령, 만니톨, 소르비톨 및 소듐 클로라이드가 조성물에 첨가될 수 있다. 주사가능한 조성물의 장기 흡수는 흡수를 지연시키는 화합물, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 이루어질 수 있다.
멸균 주사가능한 용액은 본 발명의 유효량의 EV, 예를 들어, 엑소좀을 필요에 따라 적절한 용매에 본원에 열거된 성분 중 하나 또는 조합과 혼입함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로 분산액은 EV, 예를 들어, 엑소좀을 기본 분산 매질 및 원하는 기타 성분을 포함하는 멸균 비히클에 혼입시켜 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 진공 건조 및 동결-건조이며 이는 사전에 멸균-여과된 이의 용액으로부터 활성 성분과 함께 원하는 임의의 추가 성분으로 된 분말을 산출한다. EV, 예를 들어, 엑소좀은 EV, 예를 들어 엑소좀의 지속성 또는 박동성 방출을 허용하는 방식으로 제형화될 수 있는 데포 주사 또는 임플란트 제제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 EV, 예를 들어 엑소좀을 포함하는 조성물의 전신 투여는 또한 경점막 수단에 의할 수 있다. 경점막 투여를 위하여, 침투해야 하는 장벽에 적합한 침투제가 이러한 제형에서 사용된다. 이러한 침투제는 당업계에 일반적으로 알려져 있으며, 예를 들어, 점막 투여, 세제, 담즙 염 및 푸시딕 애시드 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 예를들어, 비강 스프레이의 사용을 통해 수행될 수 있다.
특정 양상들에서 본 발명의 EV, 예를 들어, 엑소좀을 포함하는 약학 조성물은 약학 조성물로부터 이익을 얻을 대상체에 정맥내 투여된다. 특정 다른 양상들에서, 조성물은 림프계에, 예를 들어, 림프내 주사 또는 결절내 주사에 의해 (예를 들어, Senti et al., PNAS 105(46): 17908 (2008) 참조), 또는 근육내 주사에 의해, 피하 투여에 의해, 종양내 주사에 의해, 흉선 또는 간에 직접 주사에 의해 투여된다.
특정 양상들에서, 본 발명의 EV, 예를 들어 엑소좀을 포함하는 약학 조성물은 액체 현탁액으로서 투여된다. 특정 양상들에서, 약학 조성물은 투여 후 데포를 형성할 수 있는 제형으로 투여된다. 특정 바람직한 양상에서, 데포는 EV, 예를 들어, 엑소좀을 천천히 순환계로 방출하거나 데포 형태로 유지된다.
전형적으로, 약학적으로 허용되는 조성물은 오염물이 없도록 고도로 정제되고, 생체적합성이고 독성이 없으며, 대상체에 투여하기에 적합하다. 물이 담체의 구성요소인 경우 물은 고도로 정제되고 오염 물질, 예를 들어, 내독소가 없도록 처리된다.
약학적으로 허용되는 담체는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 검, 칼슘 포스페이트, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 실리케이트, 미세결정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸하이드록시 벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 활석, 마그네슘 스테아레이트, 및 미네랄 오일일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 약학적 조성물은 윤활제, 습윤제, 감미료, 향미 증강제, 유화제, 현탁제 및/또는 방부제를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 기재된 약학 조성물은 본원에 기재된 EV, 예를 들어 엑소좀 및 선택적으로 약학 활성제 또는 치료제를 포함한다. 치료제는 생물학적 제제, 소분자 제제, 또는 핵산 제제일 수 있다.
본원에 기재된 EV, 예를 들어 엑소좀을 포함하는 약학 조성물을 포함하는 투약 형태가 제공된다. 일부 양상들에서, 투약 형태는 정맥내 주사용 액체 현탁액으로 제형화된다. 일부 양상들에서, 투약 형태는 종양내 주사용 액체 현탁액으로 제형화된다.
특정 양상들에서, 본 발명의 EV, 예를 들어, 엑소좀의 제조는 잔류 복제 가능 핵산을 손상시키기 위해 방사선, 예를 들어 X선, 감마선, 베타 입자, 알파 입자, 중성자, 양성자, 원소 핵, UV 광선 처리된다.
특정 양상들에서, 본 발명의 EV, 예를 들어, 엑소좀 제재는 약 1, 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100 이상, 또는 100 kGy 이상의 조사량을 사용하여 감마 조사된다.
특정 양상들에서, 본 발명의 EV, 예를 들어, 엑소좀 제재는 약 0.1, 약 0.5, 약 1, 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 200, 약 300, 약 400, 약 500, 약 600, 약 700, 약 800, 약 900, 약 1000, 약 2000, 약 3000, 약 4000, 약 5000, 약 6000, 약 7000, 약 8000, 약 9000, 또는 약 10000 이상의 조사 용량을 사용하여 X-선 조사된다.
본 발명의 EV, 예를 들어, 엑소좀은 다른 약물과 동시에 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 EV, 예를 들어 엑소좀은 약제, 가령, 호르몬 치료제, 화학치료제, 면역 치료제, 세포 성장 인자 또는 세포 성장 인자 수용체의 작용을 억제하는 약제와 함께 사용될 수 있다.
VI. 키트
본 발명은 또한 본 발명의 하나 이상의 EV, 예를 들어, 엑소좀 및 선택적으로 사용 설명서를 포함하는 키트, 또는 제품을 제공한다. 일부 양상들에서, 키트, 또는 제품은 본 발명의 적어도 하나의 EV, 예를 들어, 엑소좀, 및 사용 설명서를 포함하는 본원에 기재된 약학 조성물을 함유한다. 일부 양상들에서, 키트 또는 제품은 하나 이상의 용기에 본 발명의 적어도 하나의 EV, 예를 들어, 엑소좀 또는 이러한 EV, 예를 들어, 엑소좀을 포함하는 약학 조성물을 포함한다. 당업자는 본 발명의 EV, 예를 들어, 엑소좀, 이러한 본 발명의 EV, 예를 들어, 엑소좀을 포함하는 약학 조성물, 또는 이들의 조합이 당업계에 공지된 확립된 키트 형식 중 하나에 용이하게 포함될 수 있음을 쉽게 알고 있을 것이다.
일부 양상들에서, 키트 또는 제품은 EV, 예를 들어 엑소좀, 하나 이상의 생물학적 활성 분자, 말레이미드 모이어티를 통해 이러한 하나 이상의 생물학적 활성 분자를 EV, 예를 들어 엑소좀에 공유 부착하기 위한 시약, 또는 이들의 임의의 조합, 및 말레이미드 모이어티를 통해 EV, 예를 들어, 엑소좀에 상기 하나 이상의 생물학적 활성 분자를 공유 부착하는 반응을 수행하기 위한 설명서를 포함한다.
일부 양상들에서, 키트는 생물학적 활성 분자를 말레이미드 모이어티를 통해 EV, 예를 들어, 엑소좀에 접합시키기 위한 시약, 및 접합을 수행하기 위한 설명서를 포함한다.
본 발명의 실시는 달리 지시되지 않는 한, 당업계의 기술에 속하는 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 형질전환 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술들은 문헌에 자세히 설명되어 있다. 예를 들어, Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I and II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis et al. U.S. Pat. No. 4,683,195; Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155; Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London); Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); ); Crooke, Antisense drug Technology: Principles, Strategies and Applications, 2nd Ed. CRC Press (2007) 및 Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.)를 참고하라.
상기 인용된 모든 참고 문헌 뿐만 아니라 본원에 인용된 모든 참고 문헌은 그 전문이 참고로 본원에 포함된다.
하기 실시예는 제한이 아닌 예시로서 제공된다.
실시예
하기 실시예는 단지 예시의 목적으로 제공되며, 어떤 식으로든 본 발명의 범위 또는 내용을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 달리 지시되지 않는 한, 본 발명의 실시는 숙련된 기술자에게 통상적인 단백질 화학, 생화학, 재조합 DNA 기술 및 약리학적 방법을 이용할 것이다. 이러한 기술들은 문헌에 자세히 설명되어 있다. 예를 들어, T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); Green & Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012); Colowick & Kaplan, Methods In Enzymology (Academic Press); Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition (Pharmaceutical Press, 2012); Sundberg & Carey, Advanced Organic Chemistry: Parts A and B, 5th Edition (Springer, 2007)을 참고하라.
실시예 1
엑소좀 단리 및 로딩
엑소좀 단리 : 7-9일 후 HEK293 SF 세포의 고밀도 현탁 배양물의 상청액으로부터 엑소좀을 수집하였다. 세포 배양 배지를 연속적으로 원심분리하고, 이전 스핀의 상층액을 후속 스핀의 투입물로 사용했다: 세포 배양 배지를 5,000 x g에서 30 분 동안 원심분리하여 상청액을 수집하고 펠릿을 폐기한 다음; 상청액을 16,000 x g에서 30분 동안 원심분리하여 상청액을 수집하고 펠릿을 폐기하고; 이어서 상청액을 133,900 x g에서 3 시간 동안 원심분리하고, 생성된 상청액을 폐기하고 펠릿을 수집하여 1 mL PBS에 재현탁시켰다. 재현탁된 133,900 x g 펠릿을 Optiprep™ 아이오딕사놀 구배로 실행하여 추가 정제하였다: 3 mL의 Optiprep™ (60% 아이오딕사놀)을 1 mL의 재현탁된 펠릿과 혼합하여 4mL의 45% 아이오딕사놀을 생성한 다음, SW 41 Ti 로터용 12 mL Ultra-Clear (344059) 튜브에 연속적으로 3 mL 30% 아이오딕사놀, 2mL 22.5% 아이오딕사놀, 2mL 17.5% 아이오딕사놀, 및 1mL PBS를 오버레이하여 4개-층 멸균 구배를 제조하였다. 이러한 구배를 4°C에서 16시간 동안 150,000 x g에서 초원심분리했다. 초원심분리하여 엑소좀을 함유하는 것으로 알려진 상부 분획, 중간 밀도의 세포 파편을 함유하는 중간 분획, 및 고밀도 응집체 및 세포 파편을 함유하는 하부 분획을 생성하였다. 그런 다음 엑소좀 층을 튜브의 상단 ~2mL로부터 서서히 수집하였다.
엑소좀 분획을 38.5mL Ultra-Clear (344058) 튜브에서 ~32mL PBS에 희석하고 30분 동안 10,000 xg에서 원심분리하고, 상청액을 수집하고 4°C에서 3시간 동안 133,900 x g에서 초원심분리하여 정제된 엑소좀을 펠릿화했다. 그런 다음 펠릿화된 엑소좀을 최소 부피의 PBS(~200 μL)에 재현탁하고 4°C에서 보관했다. 엑소좀의 최종 정제 농도는 나노입자 추적 분석 (NTA)을 사용하여 결정되었다.
엑소좀 로딩 : 말레이미드 접합체가 있는 엑소좀을 로딩하기 위해, 엑소좀은 1 내지 50mM 농도의 TCEP(트리스(2-카르복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드)를 사용하여 화학적으로 환원되었고; 일부 경우에, 환원 단계는 실온에서 1시간 동안 1-2 M 구아니딘 하이드로클로라이드 처리를 포함하거나 이러한 처리 이후 이루어진다. PBS에서 1 mL까지 희석시키고, 100,000 x g 에서 20분 동안 원심분리하여 (TLA 120.2 로터, Beckman) 엑소좀을 펠릿화시키고, 상청액을 제거하여 폐기하고, 펠릿을 1 mL PBS에 재현탁시키고; 완충액 교환을 확실히 완전하게 하기 위해 이를 한 번 반복함으로써 엑소좀들이 PBS 내부에 교환되었다. 최종 엑소좀 펠릿을 0.1mL PBS에 재현탁하고, 여기에 로딩하고자 하는 화합물을 최대 300 μM의 최종 농도로 첨가하였다. 엑소좀을 4°C에서 밤새 배양한 후, (PBS에서 1 mL까지 희석시키고, 100,000 x g 에서 20분 동안 원심분리하여 (TLA 120.2 로터, Beckman) 엑소좀을 펠릿화시키고, 상청액을 제거하여 폐기하고, 펠릿을 1 mL PBS에 재현탁시키고; 완충액 교환을 확실히 완전하게 하기 위해 이를 한 번 반복하여) 엑소좀에 접합되지 않은 화합물을 PBS로 세척하여 제거하였다.
실시예 2
유리 및 엑소좀 연결된 STING 효현제의 효능
도 1B는 PBMC 검정에서 테스트된 STING 효현제 화합물을 제시한다. 화합물은 Sygnature사에서 합성되었다. Ficoll-Hypaque 밀도 구배를 사용하는 표준 프로토콜을 사용하여 헤파린 처리된 인간 혈액에서 PBMC를 단리하였다. 테스트할 각 조건에 대해 500,000개의 PBMC를 96웰 플레이트의 웰에 플레이팅하고 테스트 샘플과 함께 밤새 배양했다. 다음날, 세포를 플레이트에서 원심분리시키고 (10분 동안 500 x g), 상청액을 수집하였다. 세포 배양 상청액으로의 인터페론 베타 (IFNβ) 방출을 ELISA를 사용하여 측정하였다.
도 2는 PBMC 검정에 의해 평가된 설프하이드릴- 또는 아민-반응성 화합물의 STING 효능작용을 나타낸다. 3명의 다른 건강한 인간 공여자로부터 유래된 PBMC를 사용하여 유리 화합물 (닫힌 원) 또는 엑소좀에 로딩된 화합물 (열린 원)의 활성을 분석했다. 말레이미드 부착 화학이 있는 모든 화합물 (CP227, CP229, CP250)은 엑소좀-결부시 3-4 로그값의 효능 증가를 나타냈다. 수동적 로딩을 통한 엑소좀 결합(CP232)은 약 2 로그값의 효능 증가를 보였다. 특히, 숙신이미드 부착은 로딩 양의 저하를 가져왔으며 엑소좀-로딩된 샘플(CP246)에서 IFNβ 방출 유도가 검출되지 않았다.
도 3A-3C는 STING 효현제 로딩에 관한 설프하이드릴-반응성 및 지질-결합 화학의 비교를 보여준다. 2명의 다른 건강한 인간 공여자로부터 유래된 PBMC를 사용하여 3가지 화합물: CP227, CP229 및 CP238의 활성을 분석했다. 유리 (청색 원/선) 또는 엑소좀에 로딩된 (녹색 원/선) 화합물들을 테스트하였다. 설프하이드릴 반응성 말레이미드 부착 화학을 함유하는 두 화합물 (CP227 및 CP229) 모두 엑소좀에 부착될 때 3-로그값 이상의 효능 증가를 나타낸다. 대조적으로, 지질-결합 콜레스테롤 화학을 함유하는 화합물은 엑소좀에 결합될 때 1-로그값 미만의 효능 이동을 나타내었다. 따라서 말레이미드 부착은 콜레스테롤보다 우수했다.
도 4A-4C는 변형되지 않은 및 설프하이드릴 반응성 화학물질의 STING 효현제 로딩에 관한 비교를 보여준다. 사이클릭 다이뉴클레오티드 STING 효현제들 (ADUS100 및 CL656)을 수동으로 로딩한 엑소좀을 말레이미드 화학을 사용하여 엑소좀에 화학적으로 부착된 효현제(말레이미드 화합물의 경우 도 2에서와 동일한 데이터, 즉, 테스트된 화합물은 CP227, CP229 및 CP238임)와 비교했다. 두 가지 유형들의 로딩에 대한 EC50 값들을 도 4에 제시된 표에서 비교하였다. 일반적으로 말레이미드-접합된 화합물은 변형되지 않은 화합물과 비교할 때 엑소좀 매개 효능 증가가 10배 이상 증가하는 것으로 나타났다. 그러므로, 엑소좀에 대한 말레이미드 부착은 수동 로딩보다 우수하였다.
도 5A 및 5B는 상이한 STING 효현제의 로딩 및 활성의 비교를 나타낸다. 상이한 부착 화학을 사용하여 엑소좀에 로딩된 STING 효현제의 양을 질량 분석법으로 정량화하였다. STING 효현제 EC50 값을 인간 PBMC 검정으로 계산하였다. 결과는 STING 효현제 로딩/활성이 방법들에 따라 달라짐을 나타낸다.
실시예 3
엑소좀 연결된 MMAE의 효능
도 6은 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE) 및 말레이미드-vc-PABC-MMAE (vc-MMAE)의 구조를 나타낸다. 이 두 화합물은 엑소좀에 대한 세포독성 화합물 (MMAE) 로딩을 테스트하는데 사용되었다. 두 화합물 모두 시중에서 구입가능하며 MedChemExpress사에서 주문했다.
MMAE 세포독성은 RAW264.7(RAW) 세포에서 평가되었다. 도 7 참조. RAW 세포는 인간 대식세포 세포주이다. 10,000개의 RAW 세포를 96웰 플레이트의 각 웰에 접종하고 대략 5일 동안 IncuCyte 기기를 사용하여 세포 성장을 모니터링하여 세포를 이미지화 하였다. 유리 MMAE 또는 DMSO (담체 대조군)는 농도 범위 전반에 걸쳐 RAW 세포에 첨가되었으며, 1.1nM 이상의 MMAE 농도에 대해 강력한 성장 억제 및 세포 사멸이 관찰되었다. DMSO 대조군은 세포 생존력이나 성장에 어떠한 영향도 미치지 않음을 보여주었다. 이미지들은 명시된 용량의 MMAE 또는 DMSO로 처리하고 5일 후의 세포를 보여주는데; 성장 억제는 MMAE 처리 후 감소된 세포 수로부터 명확하나, 세포 사멸은 세포의 반올림으로 표시된다 (10, 100 및 300 nM 이미지들에서 명확함). MMAE는 가파른 용량-반응 곡선을 가진다.
말레이미드-Val-Cit-PABC 링커의 유무에 따른 MMAE의 효능 차이는 도 8A에 나타낸다. RAW 세포는 명시된 농도의 변형되지 않은 MMAE 또는 vc-MMAE로 처리되었다. vc-MMAE는 유리 약물로 세포에 투여될 때 변형되지 않은 MMAE보다 독성이 약 100배 작은 것으로 보인다. 따라서 MMAE를 vc 링커에 부착하면 효능이 감소한다.
도 8B는 MMAE와 함께 배양한 후 엑소좀 정제를 보여준다. 엑소좀을 4C에서 밤새 MMAE와 함께 배양한 다음 초원심분리 (100,000 x g에서 20분 동안 원심분리하여 펠릿화하고 PBS에 재현탁한 다음 2차로 펠릿화한 후 재현탁)에 의해 2회 세척했다. RAW 세포에 첨가될 때 성장 억제 또는 독성을 유도하는 것으로 밝혀진 MMAE로 처리된 엑소좀들은 어떤 조건에서도 테스트되지 않았다. 이는 유리 MMAE가 엑소좀에 유의하게 결합하지 않고 정제 절차가 엑소좀으로부터 MMAE를 제거함을 나타낸다.
도 8C는 vc-MMAE가 로딩된 엑소좀이 강력한 생물학적 활성을 나타낸다는 것을 보여준다. 엑소좀을 TCEP(5mM) 및 0.1 내지 2M 농도 범위의 구아니딘 하이드로클로라이드 (Gdn)로 화학적으로 환원시켰다. 엑소좀들을 초원심분리 (100,000 x g에서 20분 동안 원심분리하여 펠릿화하고 PBS에 재현탁한 다음 2차로 펠릿화한 후 재현탁)하여 정제한 다음, 명시된 MOI (세포 당 엑소좀의 수)로 RAW 세포들에 첨가하였다. 배양 5일 후 세포 성장 억제를 측정하여 독성을 평가했다. RAW 세포는 vc-MMAE 로딩된 엑소좀으로 처리한 후 증식에 있어서 용량 의존적 감소를 나타냈다. 따라서, vc-MMAE는 엑소좀에 유의하게 부착되었으며 키오트로픽제 및 원심분리에 의해 세척되지 않았다. 또한, 엑소좀에 부착된 MMAE는 세포 성장에 대한 강력한 억제 효과를 나타냈다.
도 8D는 엑소좀의 화학적 환원이 vc-MMAE 활성에 필요함을 보여준다. 엑소좀을 PBS에 보관하거나 5mM TCEP가 포함된 PBS로 처리한 다음 MMAE 또는 vc-MMAE와 함께 배양했다. 샘플들을 초원심분리로 세척한 다음 RAW 세포에 첨가했다. 세포 성장은 vc-MMAE와 함께 배양된 TCEP-환원 엑소좀 (진한 빨간색 삼각형)에 의해서만 현저하게 억제되었다. 이는 화학적 환원 후 엑소좀에서 생성된 설프하이드릴 그룹에 vc-MMAE 화합물의 말레이미드 그룹이 접합되었음을 나타낸다.
도 9A는 엑소좀의 효능에 대한 화합물의 로딩 농도 및 환원 조건의 효과를 보여준다. 엑소좀을 일정 범위의 환원 조건 (1M 구아니딘 하이드로클로라이드 유무에 따른 0-50mM TCEP)으로 처리하고 초원심분리로 정제한 다음 4°C에서 밤새 10 또는 100 μM vc-MMAE와 함께 배양했다. 엑소좀은 초원심분리로 정제한 다음 RAW 세포에 추가하여 세포 성장에 미치는 이의 영향을 테스트했다. TCEP 처리에 의해 화학적으로 환원되지 않은 엑소좀은 세포 성장에 영향을 미치지 않았다. 환원 조건 내에서 비교하면, 100 μM vc-MMAE를 로딩하면 10 μM vc-MMAE를 로딩하는 것과 비교하여 효능이 극적으로 증가한다. 1M Gdn의 존재하에서, 감소된 효능을 나타내는 최고 농도의 TCEP(50mM)를 제외하고 모든 농도의 TCEP는 유사한 효능을 나타냈다. 구아니딘 하이드로클로라이드가 없는 경우 TCEP의 농도를 1.5에서 15 mM으로 증가시키면 효능이 증가하였으며; 50 mM TCEP는 또한 구아니딘 하이드로클로라이드의 부재시 감소된 효능을 나타냈다.
도 9A와 유사하게 그러나 더 높은 vc-MMAE 농도에서, 도 9B는 엑소좀의 효능에 대한 화합물의 로딩 농도 및 환원 조건의 효과를 보여준다. 도 9A에 제시된 실험에서 사용된 것과 동일한 실험 조건을 사용하였으나 로딩 농도로 100 및 300 μM vc-MMAE를 사용했다. 10 및 100 μM vc-MMAE에서 관찰된 것과 유사하게, 로딩 농도를 300 μM vc-MMAE로 증가시키면 효능이 더욱 증가했다. 중요한 것은, 300 μM vc-MMAE에서 15mM TCEP의 0 및 1 M Gdn 조건간에 비등한 효능이 관찰되었으며; 이는 환원 조건과 로딩 농도가 최적화된다면 구아니딘 하이드로클로라이드 없이 로딩을 수행할 수 있음을 나타낸다.
MMAE 실험은 TCEP, 구아니딘 하이드로클로라이드 및 Val-Cit-MMAE의 농도들 간의 복잡한 상호작용을 설명하고 많은 예상치 못한 상호작용을 보여준다 (즉, 1 M Gdn이 2 M보다 우수함, 도 8B; 15 mM TCEP가 50 mM보다 우수함, 도 9A 및 9B; 1.5 mM에서 15 mM로 TCEP 농도를 증가시키면 Gdn 부재시 효능이 증가하지만, 1M Gdn에서는 차이가 없음, 도 9B).
실시예 4
엑소좀 연결된 PROTAC
도 10C에 따른 TBK1 PROTAC은 상기 개시된 방법에 따라 엑소좀에 부착된다. PROTAC은 TBK1 표적화 리간드, 링커 및 VHL E3 유비퀴틴 리가제에 결합할 수 있는 리간드를 포함한다.
PROTAC는 엑소좀, 예를 들어, 외부 표면에 및/또는 엑소좀 막의 내강 표면에 말레이미드 모이어티를 통해 (직접적으로 또는 링커에 의해 간접적으로) 부착된다. PROTAC는 말레이미드-VA-PABC 절단가능한 링커를 통해 엑소좀에 부착될 수 있다. PROTAC는 VHL (E3 리가제) 결합 리간드를 통해 엑소좀에 부착될 수 있다.
본 발명의 엑소좀에 부착된 TBK1 PROTAC의 기능성은 시험관내 또는 생체내 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 시험관내 방법에는 (i) 세포주에서 TBK1 분해를 직접 측정, (ii) STING 효현제 (폴리 I:C, CL656, LPS 등)로 자극 후 IRF3 인산화 억제 결정, 또는 (iii) 인간 단핵구에서 TBK1 단백질 녹다운을 결정하기 위한 웨스턴 블롯을 포함한다. 또 다른 시험관내 분석은 예를 들어 B16 IRF 리포터 세포주 (예를 들어, 엑소좀-PROTAC 접합체로 전처리하고, STING 효현제로 자극하고, 보고 반응을 측정) 또는 인간 단핵구(예를 들어, IFB베타 방출 측정)를 사용하여 STING 효능작용의 억제를 결정할 수 있다.
본 발명의 엑소좀-PROTAC 접합체의 기능성을 결정하기 위한 생체내 분석은, 예를 들어, 예를 들어 (i) 복막 대식세포에서 TBK1 단백질 녹다운 (예를 들어, 엑소좀-PROTAC 접합체로 복강내 투여, 복막 대식세포 수집, 및 웨스턴 블롯 또는 유세포분석에 의한 녹다운 측정), (ii) STING 효현제-유도된 혈청 사이토카인의 억제 (예를 들어, 엑소좀-PROTAC 접합체로 복강내 전처리, STING 효현제로 복강내 자극, 특정 시점에서 혈장/혈청 사이토카인 측정), 또는 (iii) STING 효현제-유도된 포스포IRF3의 억제 (예를 들어, 녹다운이 매우 선택적이고 혈청 사이토카인의 감소가 관찰되지 않는 경우, 예를 들어 항-pIRF 항체 및 유세포 분석을 사용하여 다양한 세포 유형에서 pIRF3 수준을 결정하는 것은 선택성을 나타내는 데 도움이 될 수 있음)를 결정하기 위한 분석법을 포함한다.
실시예 5
엑소좀-연결된 LPA1 억제제 - ExoAM152
라이소포스파티딕 애시드 (LPA)은 세포 예정사로부터 세포를 보호하고 구제하는 매우 강력한 내인성 지질 매개인자이다. LPA는 고친화성 LPA1 수용체를 통한 섬유화의 중요한 매개인자이다.
AM152 (BMS-986020으로도 공지)는 특이적 LPA1 억제제이다. AM152는 BSEP, MRP4 및 MDR3에 대해 각각 4.8 μM, 6.2 μM 및 7.5μM의 IC50으로 담즙산 및 인지질 수송체를 억제하는 고친화성 LPA1 길항제이다. LPA1 억제제 AM152 및 AM095의 화학적 구조가 도 12에 제시된다. 이 도면은 말레이미드 함유 시약이 AM152의 카르복실산 및/또는 카바메이트 그룹에 접합될 수 있음을 보여준다. AM095에는 동일한 반응 그룹이 존재하기 때문에 동일한 접근 방식을 사용하여 AM095를 유도체화할 수 있다.
AM095 및 AM152와 같은 LPA1 길항제는 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여 엑소좀 표면에 화학적으로 연결될 수 있다. 결과는 그 표면에 다수의 길항제 분자를 포함하는 EV, 예를 들어, 엑소좀이 될 것이다. 도 13을 참고하라.
도 14는 말레이미드 반응 그룹이 산 그룹을 통해 AM152에 추가될 수 있는 방법의 예를 보여준다. 본 실시예는 말레이미드 그룹과 카르복실산 반응성 클로로메틸 벤젠 그룹 사이에 개재된 ala-val 절단가능한 링커를 포함하는 복합체의 일부로서 말레이미드 그룹을 보여준다. 도 15는 AM152를 유도체화하는데 사용할 수 있는 두 가지 예시적인 시약을 보여준다. 상부 시약은 (i) AM152의 카르복실산 그룹과 반응할 수 있는 클로로메틸 벤젠 그룹 및 (ii) 말레이미드 그룹을 포함하며, 이들 사이에는 절단가능한 cit-val 다이펩티드와 C5 스페이서가 개재되어 있다. 하부 시약은 (i) AM152의 카르복실산 그룹과 반응할 수 있는 클로로메틸 벤젠 그룹 및 (ii) 말레이미드 그룹을 포함하며, 이들 사이에는 절단가능한 ala-val 다이펩티드와 C5 스페이서가 개재되어 있다. 말레이미드 그룹은, 후속적으로 예를 들어, 직접적으로 또는 하나 이상의 스페이서 또는 링커를 통해 간접적으로 스캐폴드 모이어티에 AM152 (또는 AM095)를 부착하는데 사용될 것이다.
도 16은 접합 생성물에서 (예를 들어, 카텝신 B에 의해) cit-val 또는 ala-val 다이펩티드를 절단함으로써 생성될 생성물을 나타낸다. AM152 아닐린 에스터인 생성물은 내인성 에스테라제에 의해 추가로 처리되어 유리산 AM152 생성물을 생성할 수 있다.
도 17은 유리 말레이미드 그룹과 다양한 스페이서 조합을 포함하는 여러 AM152 유도체를 보여준다. 추가 유도체들을 도 18에 보여준다.
도 19는 카르복시산 그룹 보호 후, 카르복시산 그룹을 유도하는데 사용된 것과 동일한 시약들을 사용하여 이의 카바메이트 그룹에서 AM152를 유도할 수 있음을 보여준다. 생성된 생성물은 후속적으로 탈보호되어 카르복실산 그룹을 유리시킨다.
도 20은 말레이미드 그룹과의 복합체가 링커를 통해 AM152의 카바메이트 그룹에 부착된 예를 보여준다. 적합한 링커는 본 명세서에 개시된 임의의 링커를 포함한다.
이 실시예에 개시된 공정은 직접적으로 또는 하나 이상의 스페이서 또는 링커를 통해 간접적으로 스캐폴드 모이어티와 후속적으로 반응할 수 있는 유리 말레이미드 반응 그룹을 포함하는 AM152 또는 AM095 유도체의 생성에 관한 것이다. 결과적으로 AM152 또는 AM095는 EV, 예를 들어, 엑소좀의 외부 표면에 부착될 것이다.
그러나, 도 21에 도시된 바와 같이, 본 발명은 또한 스캐폴드 모이어티를 먼저, 예를 들어 말레이미드를 포함하는 이작용기 그룹으로 유도체화한 다음, 예를 들어, 유리 클로로메틸 벤젠 그룹을 갖는 유도체화된 스캐폴드 모이어티를 AM152의 카르복실산 또는 카바메이트 그룹과 반응시킴으로써 실시될 수 있다.
일부 양상들에서, AM152 (또는 AM095)를 말레이미드 모이어티를 통해 EV, 예를 들어 엑소좀의 표면에 화학적으로 연결하면 비접합 AM152 (또는 AM095)의 하나 이상의 유익한 특성을 개선하고 및/또는 비접합 AM152 또는 AM095의 적어도 하나의 유해한 특성 (예를 들어, 담낭 독성 및/또는 간 독성과 같은 독성)을 감소시킨다. 일부 양상들에서, AM152 (또는 AM095)를 말레이미드 모이어티를 통해 EV, 예를 들어 엑소좀에 화학적으로 연결하면, (유리 AM152 또는 유리 AM095에 비해) 섬유성 질환, 예를 들어 폐 섬유증, 가령, IPF의 치료에서 AM152 또는 AM095의 효능을 개선시킨다.
실시예 6
엑소좀-연결된 NLRP3 억제제 - ExoMCC950
MCC950 (N-[[(1,2,3,5,6,7-헥사하이드로-s-인다센-4-일)아미노]카보닐]-4-(1-하이드록시-1-메틸에틸)-2-퓨란설폰아미드)은 NLRP3 (NOD 유사 수용체(NLR) 피린 도메인 함유 단백질 3) 인플라마좀의 강력하고 선택적인 억제제이다. MCC950은 인플라마좀 어댑터 단백질 ASC (세포사멸 관련 Speck-유사 단백질 포함 CARD)의 올리고머화를 방지하여 ATP, MSU 및 니제라이신과 같은 NLRP3 활성화인자에 의해 유도되는 IL-1β의 방출을 차단한다. Coll et al. (2015) Nature Med. 21:248-255. MCC950은 LPS로 프라이밍되고 ATP 또는 니제라이신으로 활성화되는 대식세포에서 약 7.5 nM의 IC50으로 IL-1β의 방출을 차단한다. MCC950은 NLRP3에 의해 유도되는 IL-1β의 방출을 차단하지만 MCC950은 NLRC4, AIM2 또는 NLRP1 인플라마좀을 억제하지 않는다. 또한 MCC950은 TLR2 신호 전달 또는 NLRP3의 프라이밍을 억제하지 않는다.
MCC950은 생체내에서 활성화되어 IL-1β 생성을 차단하고 다발성 경화증 마우스 모델에서 생존을 향상시킨다. MCC950은 또한 심근경색 모델에서 NLRP3 유도 IL-1β 생성을 억제한다. van Hout et al (2015) Eur. Heart J. ehw247. MCC950은 Muckle-Wells 증후군이 있는 개체의 생체 외 샘플에서도 활성이다. 그러므로, MCC950은 자가 염증 및 자가 면역 질환을 포함한 NLRP3 관련 증후군의 치료를 위한 잠재적 치료제이다.
도 22는 MCC950, 말레이미드 반응 그룹을 도입하기 위해 MCC950을 유도체화하는 데 사용할 수 있는 이작용기 시약, 및 말레이미드 반응 그룹을 포함하는 MCC950 유도체의 구조를 나타낸다. 이작용기 시약의 벤젠 그룹 (**)은 MCC950의 카바메이트 그룹(*)과 반응하여 도 22에 도시된 MCC950 유도체를 생성할 수 있다.
본 실시예에 개시된 공정은 유리 말레이미드 반응 그룹, 및 선택적으로 MCC950 모이어티와 말레이미드 그룹 사이에 개재된 하나 이상의 링커 (예를 들어, 절단가능한 링커 및/또는 하나 이상의 스페이서)를 포함하며, 후속적으로 직접적으로 또는 하나 이상의 스페이서 또는 링커를 통해 간접적으로 스캐폴드 모이어티와 반응할 수 있는 MCC950 유도체의 생성에 관한 것이다. 결과적으로 MCC950은 EV, 예를 들어, 엑소좀의 외부 표면에 부착될 것이다.
본 발명은 또한 스캐폴드 모이어티를 먼저, 예를 들어 말레이미드를 포함하는 이작용기 그룹으로 유도체화한 다음, 예를 들어, 유리 클로로메틸 벤젠 그룹 또는 벤젠 그룹을 갖는 유도체화된 스캐폴드 모이어티를 MCC950의 카바메이트 그룹 또는 또 다른 적합한 유도체화가능한 그룹과 반응시킴으로써 실시될 수 있다.
일부 양상들에서, MCC950을 말레이미드 모이어티를 통해 EV, 예를 들어 엑소좀의 표면에 화학적으로 연결하면 비접합 MCC950의 하나 이상의 유익한 특성을 개선하고 및/또는 비접합 MCC950의 적어도 하나의 유해한 특성 (예를 들어, 담낭 독성 및/또는 간 독성과 같은 독성)을 감소시킨다. 일부 양상들에서, 말레이미드 모이어티를 통해 EV, 예를 들어, 엑소좀에 MCC950을 화학적으로 연결하는 것은 NLRP3 인플라마좀 관련 질환 또는 장애, 예컨대, 다발성 경화증, 제2형 당뇨병, 알츠하이머병, 죽상동맥경화증, 신경염, 파킨슨병, 프리온병, 심근경색으로 인한 심장 손상, 통풍, 및 일반적으로 자가염증 및 자가면역 질환을 포함하는 임의의 NLRP3-관련 증후군의 치료에서 (유리 MCC950과 비교하여) MCC950 의 효능을 개선한다.
***
개요 및 요약 부분이 아닌, 상세한 설명 부분은 청구 범위를 해석하기 위해 사용되는 것으로 이해되어야 한다. 개요 및 요약 부분은 본 발명의 발명자 (들)에 의해 고려되는 본 발명의 하나 이상의 예시적인 양상들을 설명할 수 있으나 그러나 모든 구체적 예시는 아니며, 따라서, 본 발명 및 첨부된 청구 범위를 어떤 식으로든 제한하려는 것은 아니다.
본 발명은 특정 기능의 구현 및 그 관계를 설명하는 기능적 빌딩 블록을 사용하여 위에서 설명되었다. 이러한 기능적 빌딩 블록의 경계는 설명의 편의를 위해 본 명세서에서 임의로 정의되었다. 특정 기능과 그 관계가 적절히 실시되는 한, 대안적인 경계들이 정의될 수 있다.
특정 양상들에 대한 전술한 설명은 본 발명의 일반적인 성질을 충분히 보여주고, 이는 당업자의 지식 범위 내에서 지식을 적용함으로써 다른 사람들이 과도한 실험없이, 본 발명의 일반적인 사상을 벗어나지 않는 범위에서 그러한 특정 양상들과 같은 다양한 응용을 용이하게 변경 및/또는 적용시킬 수 있을 것이다. 따라서, 이러한 적용 및 수정은 본 명세서에 제시된 개시내용 및 지침에 기초하여 개시된 양상들과 균등한 의미 및 범위 내에 속하는 것으로 한다. 본 명세서의 어구 또는 용어는 본 발명의 개시내용 및 지침에 비추어 당업자가 본 명세서의 전문 용어 또는 표현을 해석할 수 있도록 설명하고자 하는 것이며 제한하려는 것이 아님을 이해해야 한다.
본 발명의 폭 및 범위는 상술한 예시적인 양상들 중 어느 것에 의해서도 제한되어서는 안되며, 다음의 청구 범위 및 그 균등물에 따라서만 정의되어야 한다.
본 출원 전반에 걸쳐 인용될 수 있는 모든 인용 참고 문헌 (문헌 참고 문헌, 특허, 특허 출원 및 웹사이트 포함)의 내용은 본원에서 인용된 참고 문헌과 마찬가지로 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 명시적으로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> CODIAK BIOSCIENCES <120> EXTRACELLULAR VESICLE CONJUGATES AND USES THEREOF <130> 4000.037PC03 <150> US 62/822,014 <151> 2019-03-21 <150> US 62/835,439 <151> 2019-04-17 <160> 231 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 879 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Arg Leu Ala Ser Arg Pro Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Ala Leu Cys Arg Gly Arg Val Val Arg Val Pro Thr Ala Thr Leu Val 20 25 30 Arg Val Val Gly Thr Glu Leu Val Ile Pro Cys Asn Val Ser Asp Tyr 35 40 45 Asp Gly Pro Ser Glu Gln Asn Phe Asp Trp Ser Phe Ser Ser Leu Gly 50 55 60 Ser Ser Phe Val Glu Leu Ala Ser Thr Trp Glu Val Gly Phe Pro Ala 65 70 75 80 Gln Leu Tyr Gln Glu Arg Leu Gln Arg Gly Glu Ile Leu Leu Arg Arg 85 90 95 Thr Ala Asn Asp Ala Val Glu Leu His Ile Lys Asn Val Gln Pro Ser 100 105 110 Asp Gln Gly His Tyr Lys Cys Ser Thr Pro Ser Thr Asp Ala Thr Val 115 120 125 Gln Gly Asn Tyr Glu Asp Thr Val Gln Val Lys Val Leu Ala Asp Ser 130 135 140 Leu His Val Gly Pro Ser Ala Arg Pro Pro Pro Ser 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His Lys Asp 515 520 525 Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys 530 535 540 Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr 545 550 555 560 Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr 565 570 575 Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Arg Gln Ala Ala Thr 580 585 590 Ala Asp Val Asn Thr Gln Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp 595 600 605 Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr 610 615 620 Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys 625 630 635 640 His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn 645 650 655 Pro Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln 660 665 670 Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys 675 680 685 Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr 690 695 700 Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr 705 710 715 720 Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 725 730 735 <210> 45 <211> 653 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> REP1 <400> 45 Met Ala Asp Thr Leu Pro Ser Glu Phe Asp Val Ile Val Ile Gly Thr 1 5 10 15 Gly Leu Pro Glu Ser Ile Ile Ala Ala Ala Cys Ser Arg Ser Gly Arg 20 25 30 Arg Val Leu His Val Asp Ser Arg Ser Tyr Tyr Gly Gly Asn Trp Ala 35 40 45 Ser Phe Ser Phe Ser Gly Leu Leu Ser Trp Leu Lys Glu Tyr Gln Glu 50 55 60 Asn Ser Asp Ile Val Ser Asp Ser Pro Val Trp Gln Asp Gln Ile Leu 65 70 75 80 Glu Asn Glu Glu Ala Ile Ala Leu Ser Arg Lys Asp Lys Thr Ile Gln 85 90 95 His Val Glu Val Phe Cys Tyr Ala Ser Gln Asp Leu His Glu Asp Val 100 105 110 Glu Glu Ala Gly Ala Leu Gln Lys Asn His Ala Leu Val Thr Ser Ala 115 120 125 Asn Ser Thr Glu Ala Ala Asp Ser Ala Phe Leu Pro Thr Glu Asp Glu 130 135 140 Ser Leu Ser Thr Met Ser Cys Glu Met Leu Thr Glu Gln Thr Pro Ser 145 150 155 160 Ser Asp Pro Glu Asn Ala Leu Glu Val Asn Gly Ala Glu Val Thr Gly 165 170 175 Glu Lys Glu Asn His Cys Asp Asp Lys Thr Cys Val Pro Ser Thr Ser 180 185 190 Ala Glu Asp Met Ser Glu Asn Val Pro Ile Ala Glu Asp Thr Thr Glu 195 200 205 Gln Pro Lys Lys Asn Arg Ile Thr Tyr Ser Gln Ile Ile Lys Glu Gly 210 215 220 Arg Arg Phe Asn Ile Asp Leu Val Ser Lys Leu Leu Tyr Ser Arg Gly 225 230 235 240 Leu Leu Ile Asp Leu Leu Ile Lys Ser Asn Val Ser Arg Tyr Ala Glu 245 250 255 Phe Lys Asn Ile Thr Arg Ile Leu Ala Phe Arg Glu Gly Arg Val Glu 260 265 270 Gln Val Pro Cys Ser Arg Ala Asp Val Phe Asn Ser Lys Gln Leu Thr 275 280 285 Met Val Glu Lys Arg Met Leu Met Lys Phe Leu Thr Phe Cys Met Glu 290 295 300 Tyr Glu Lys Tyr Pro Asp Glu Tyr Lys Gly Tyr Glu Glu Ile Thr Phe 305 310 315 320 Tyr Glu Tyr Leu Lys Thr Gln Lys Leu Thr Pro Asn Leu Gln Tyr Ile 325 330 335 Val Met His Ser Ile Ala Met Thr Ser Glu Thr Ala Ser Ser Thr Ile 340 345 350 Asp Gly Leu Lys Ala Thr Lys Asn Phe Leu His Cys Leu Gly Arg Tyr 355 360 365 Gly Asn Thr Pro Phe Leu Phe Pro Leu Tyr Gly Gln Gly Glu Leu Pro 370 375 380 Gln Cys Phe Cys Arg Met Cys Ala Val Phe Gly Gly Ile Tyr Cys Leu 385 390 395 400 Arg His Ser Val Gln Cys Leu Val Val Asp Lys Glu Ser Arg Lys Cys 405 410 415 Lys Ala Ile Ile Asp Gln Phe Gly Gln Arg Ile Ile Ser Glu His Phe 420 425 430 Leu Val Glu Asp Ser Tyr Phe Pro Glu Asn Met Cys Ser Arg Val Gln 435 440 445 Tyr Arg Gln Ile Ser Arg Ala Val Leu Ile Thr Asp Arg Ser Val Leu 450 455 460 Lys Thr Asp Ser Asp Gln Gln Ile Ser Ile Leu Thr Val Pro Ala Glu 465 470 475 480 Glu Pro Gly Thr Phe Ala Val Arg Val Ile Glu Leu Cys Ser Ser Thr 485 490 495 Met Thr Cys Met Lys Gly Thr Tyr Leu Val His Leu Thr Cys Thr Ser 500 505 510 Ser Lys Thr Ala Arg Glu Asp Leu Glu Ser Val Val Gln Lys Leu Phe 515 520 525 Val Pro Tyr Thr Glu Met Glu Ile Glu Asn Glu Gln Val Glu Lys Pro 530 535 540 Arg Ile Leu Trp Ala Leu Tyr Phe Asn Met Arg Asp Ser Ser Asp Ile 545 550 555 560 Ser Arg Ser Cys Tyr Asn Asp Leu Pro Ser Asn Val Tyr Val Cys Ser 565 570 575 Gly Pro Asp Cys Gly Leu Gly Asn Asp Asn Ala Val Lys Gln Ala Glu 580 585 590 Thr Leu Phe Gln Glu Ile Cys Pro Asn Glu Asp Phe Cys Pro Pro Pro 595 600 605 Pro Asn Pro Glu Asp Ile Ile Leu Asp Gly Asp Ser Leu Gln Pro Glu 610 615 620 Ala Ser Glu Ser Ser Ala Ile Pro Glu Ala Asn Ser Glu Thr Phe Lys 625 630 635 640 Glu Ser Thr Asn Leu Gly Asn Leu Glu Glu Ser Ser Glu 645 650 <210> 46 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> Shortest example of [(Gly)n-Ser]m linker, wherein n is any integer from 1 to 100 and m is any integer from 1 to 100 <400> 46 Gly Ser 1 <210> 47 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> Shortest example of [(Gly)x-Sery]z linker, wherein x in an integer from 1 to 4, y is 0 or 1, and z is an integers from 1 to 50 <400> 47 Gly Ser 1 <210> 48 <211> 1 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Shortest example of Gn linker, wherein n can be an integer from 1 to 100 <400> 48 Gly 1 <210> 49 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> Shortest example of (GlyAla)n linker, wherein n is an integer between 1 and 100 <400> 49 Gly Ala 1 <210> 50 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(3) <223> Linker; can comprise 1 to 100 repeats of the sequence <400> 50 Gly Gly Ser 1 <210> 51 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 51 Gly Gly Lys Leu Ser Lys 1 5 <210> 52 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 52 Gly Ala Lys Leu Ser Lys 1 5 <210> 53 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 53 Gly Gly Lys Gln Ser Lys 1 5 <210> 54 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 54 Gly Gly Lys Leu Ala Lys 1 5 <210> 55 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 55 Lys Lys Lys Gly 1 <210> 56 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 56 Lys Lys Lys Gly Tyr 1 5 <210> 57 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 57 Lys Lys Lys Gly Tyr Asn 1 5 <210> 58 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 58 Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val 1 5 <210> 59 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 59 Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn 1 5 <210> 60 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 60 Lys Lys Lys Gly Tyr Ser 1 5 <210> 61 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 61 Lys Lys Lys Gly Tyr Gly 1 5 <210> 62 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 62 Lys Lys Lys Gly Tyr Gly Gly 1 5 <210> 63 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 63 Lys Lys Lys Gly Ser 1 5 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PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 72 Lys Lys Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 73 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 73 Lys Lys Lys Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 74 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 74 Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser 1 5 <210> 75 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 75 Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp Glu 1 5 10 15 Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu Gly Ala Ala 20 25 <210> 76 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 76 Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp Glu 1 5 10 15 Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu Gly Ala 20 25 <210> 77 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 77 Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp Glu 1 5 10 15 Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu Gly 20 25 <210> 78 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 78 Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp Glu 1 5 10 15 Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu 20 25 <210> 79 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 79 Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp Glu 1 5 10 15 Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala 20 25 <210> 80 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 80 Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp Glu 1 5 10 15 Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys 20 <210> 81 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 81 Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp Glu 1 5 10 15 Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys 20 <210> 82 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 82 Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp Glu 1 5 10 15 Lys Ala Lys Glu Lys Asp 20 <210> 83 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 83 Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp Glu 1 5 10 15 Lys Ala Lys Glu Lys 20 <210> 84 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 84 Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp Glu 1 5 10 15 Lys Ala Lys Glu 20 <210> 85 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 85 Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp Glu 1 5 10 15 Lys Ala Lys <210> 86 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 86 Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp Glu 1 5 10 15 Lys Ala <210> 87 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 87 Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp Glu 1 5 10 15 Lys <210> 88 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 88 Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp Glu 1 5 10 15 <210> 89 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 89 Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp 1 5 10 15 <210> 90 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 90 Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val 1 5 10 <210> 91 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 91 Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn 1 5 10 <210> 92 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 92 Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr 1 5 10 <210> 93 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 93 Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly 1 5 10 <210> 94 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 94 Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys 1 5 <210> 95 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 95 Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys 1 5 10 15 Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn Lys Lys Glu Ala 20 25 <210> 96 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 96 Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys 1 5 10 15 Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn Lys Lys Glu 20 25 <210> 97 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 97 Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys 1 5 10 15 Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn Lys Lys 20 25 <210> 98 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 98 Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys 1 5 10 15 Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn Lys 20 25 <210> 99 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 99 Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys 1 5 10 15 Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn 20 25 <210> 100 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 100 Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys 1 5 10 15 Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys Lys 20 <210> 101 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 101 Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys 1 5 10 15 Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys 20 <210> 102 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 102 Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys 1 5 10 15 Leu Ser Gly Phe Ser Phe 20 <210> 103 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 103 Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys 1 5 10 15 Leu Ser Gly Phe Ser 20 <210> 104 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 104 Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys 1 5 10 15 Leu Ser Gly Phe 20 <210> 105 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 105 Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys 1 5 10 15 Leu Ser Gly <210> 106 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 106 Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys 1 5 10 15 Leu Ser <210> 107 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 107 Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys 1 5 10 15 Leu <210> 108 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 108 Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys 1 5 10 15 <210> 109 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 109 Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser 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Thr Ala Arg Ala Ile Ala Ile Lys Cys Gly Ile Ile His Pro Gly Glu 740 745 750 Asp Phe Leu Cys Leu Glu Gly Lys Glu Phe Asn Arg Arg Ile Arg Asn 755 760 765 Glu Lys Gly Glu Ile Glu Gln Glu Arg Ile Asp Lys Ile Trp Pro Lys 770 775 780 Leu Arg Val Leu Ala Arg Ser Ser Pro Thr Asp Lys His Thr Leu Val 785 790 795 800 Lys Gly Ile Ile Asp Ser Thr His Thr Glu Gln Arg Gln Val Val Ala 805 810 815 Val Thr Gly Asp Gly Thr Asn Asp Gly Pro Ala Leu Lys Lys Ala Asp 820 825 830 Val Gly Phe Ala Met Gly Ile Ala Gly Thr Asp Val Ala Lys Glu Ala 835 840 845 Ser Asp Ile Ile Leu Thr Asp Asp Asn Phe Ser Ser Ile Val Lys Ala 850 855 860 Val Met Trp Gly Arg Asn Val Tyr Asp Ser Ile Ser Lys Phe Leu Gln 865 870 875 880 Phe Gln Leu Thr Val Asn Val Val Ala Val Ile Val Ala Phe Thr Gly 885 890 895 Ala Cys Ile Thr Gln Asp Ser Pro Leu Lys Ala Val Gln Met Leu Trp 900 905 910 Val Asn Leu Ile Met Asp Thr Phe Ala Ser Leu Ala Leu Ala Thr Glu 915 920 925 Pro Pro Thr Glu Thr Leu Leu Leu Arg Lys Pro Tyr Gly Arg Asn Lys 930 935 940 Pro Leu Ile Ser Arg Thr Met Met Lys Asn Ile Leu Gly His Ala Val 945 950 955 960 Tyr Gln Leu Ala Leu Ile Phe Thr Leu Leu Phe Val Gly Glu Lys Met 965 970 975 Phe Gln Ile Asp Ser Gly Arg Asn Ala Pro Leu His Ser Pro Pro Ser 980 985 990 Glu His Tyr Thr Ile Ile Phe Asn Thr Phe Val Met Met Gln Leu Phe 995 1000 1005 Asn Glu Ile Asn Ala Arg Lys Ile His Gly Glu Arg Asn Val Phe 1010 1015 1020 Asp Gly Ile Phe Arg Asn Pro Ile Phe Cys Thr Ile Val Leu Gly 1025 1030 1035 Thr Phe Ala Ile Gln Ile Val Ile Val Gln Phe Gly Gly Lys Pro 1040 1045 1050 Phe Ser Cys Ser Pro Leu Gln Leu Asp Gln Trp Met Trp Cys Ile 1055 1060 1065 Phe Ile Gly Leu Gly Glu Leu Val Trp Gly Gln Val Ile Ala Thr 1070 1075 1080 Ile Pro Thr Ser Arg Leu Lys Phe Leu Lys Glu Ala Gly Arg Leu 1085 1090 1095 Thr Gln Lys Glu Glu Ile Pro Glu Glu Glu Leu Asn Glu Asp Val 1100 1105 1110 Glu Glu Ile Asp His Ala Glu Arg Glu Leu Arg Arg Gly Gln Ile 1115 1120 1125 Leu Trp Phe Arg Gly Leu Asn Arg Ile Gln Thr Gln Ile Glu Val 1130 1135 1140 Val Asn Thr Phe Lys Ser Gly Ala Ser Phe Gln Gly Ala Leu Arg 1145 1150 1155 Arg Gln Ser Ser Val Thr Ser Gln Ser Gln Asp Ile Arg Val Val 1160 1165 1170 Lys Ala Phe Arg Ser Ser Leu Tyr Glu Gly Leu Glu Lys Pro Glu 1175 1180 1185 Ser Arg Thr Ser Ile His Asn Phe Met Ala His Pro Glu Phe Arg 1190 1195 1200 Ile Glu Asp Ser Gln Pro His Ile Pro Leu Ile Asp Asp Thr Asp 1205 1210 1215 Leu Glu Glu Asp Ala Ala Leu Lys Gln Asn Ser Ser Pro Pro Ser 1220 1225 1230 Ser Leu Asn Lys Asn Asn Ser Ala Ile Asp Ser Gly Ile Asn Leu 1235 1240 1245 Thr Thr Asp Thr Ser Lys Ser Ala Thr Ser Ser Ser Pro Gly Ser 1250 1255 1260 Pro Ile His Ser Leu Glu Thr Ser Leu 1265 1270 <210> 212 <211> 874 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 212 Met Gly Asp Met Ala Asn Ser Ser Ile Glu Phe His Pro Lys Pro Gln 1 5 10 15 Gln Gln Arg Asp Val Pro Gln Ala Gly Gly Phe Gly Cys Thr Leu Ala 20 25 30 Glu Leu Arg Thr Leu Met Glu Leu Arg Gly Ala Glu Ala Leu Gln Lys 35 40 45 Ile Glu Glu Ala Tyr Gly Asp Val Ser Gly Leu Cys Arg Arg Leu Lys 50 55 60 Thr Ser Pro Thr Glu Gly Leu Ala Asp Asn Thr Asn Asp Leu Glu Lys 65 70 75 80 Arg Arg Gln Ile Tyr Gly Gln Asn Phe Ile Pro Pro Lys Gln Pro Lys 85 90 95 Thr Phe Leu Gln Leu Val Trp Glu Ala Leu Gln Asp Val Thr Leu Ile 100 105 110 Ile Leu Glu Val Ala Ala Ile Val Ser Leu Gly Leu Ser Phe Tyr Ala 115 120 125 Pro Pro Gly Glu Glu Ser Glu Ala Cys Gly Asn Val Ser Gly Gly Ala 130 135 140 Glu Asp Glu Gly Glu Ala Glu Ala Gly Trp Ile Glu Gly Ala Ala Ile 145 150 155 160 Leu Leu Ser Val Ile Cys Val Val Leu Val Thr Ala Phe Asn Asp Trp 165 170 175 Ser Lys Glu Lys Gln Phe Arg Gly Leu Gln Ser Arg Ile Glu Gln Glu 180 185 190 Gln Lys Phe Thr Val Ile Arg Asn Gly Gln Leu Leu Gln Val Pro Val 195 200 205 Ala Ala Leu Val Val Gly Asp Ile Ala Gln Val Lys Tyr Gly Asp Leu 210 215 220 Leu Pro Ala Asp Gly Val Leu Ile Gln Ala Asn Asp Leu Lys Ile Asp 225 230 235 240 Glu Ser Ser Leu Thr Gly Glu Ser Asp His Val Arg Lys Ser Ala Asp 245 250 255 Lys Asp Pro Met Leu Leu Ser Gly Thr His Val Met Glu Gly Ser Gly 260 265 270 Arg Met Val Val Thr Ala Val Gly Val Asn Ser Gln Thr Gly Ile Ile 275 280 285 Phe Thr Leu Leu Gly Ala Gly Gly Glu Glu Glu Glu Lys Lys Asp Lys 290 295 300 Lys Gly Lys Gln Gln Asp Gly Ala Met Glu Ser Ser Gln Thr Lys Ala 305 310 315 320 Lys Lys Gln Asp Gly Ala Val Ala Met Glu Met Gln Pro Leu Lys Ser 325 330 335 Ala Glu Gly Gly Glu Met Glu Glu Arg Glu Lys Lys Lys Ala Asn Ala 340 345 350 Pro Lys Lys Glu Lys Ser Val Leu Gln Gly Lys Leu Thr Lys Leu Ala 355 360 365 Val Gln Ile Gly Lys Ala Gly Leu Val Met Ser Ala Ile Thr Val Ile 370 375 380 Ile Leu Val Leu Tyr Phe Val Ile Glu Thr Phe Val Val Glu Gly Arg 385 390 395 400 Thr Trp Leu Ala Glu Cys Thr Pro Val Tyr Val Gln Tyr Phe Val Lys 405 410 415 Phe Phe Ile Ile Gly Val Thr Val Leu Val Val Ala Val Pro Glu Gly 420 425 430 Leu Pro Leu Ala Val Thr Ile Ser Leu Ala Tyr Ser Val Lys Lys Met 435 440 445 Met Lys Asp Asn Asn Leu Val Arg His Leu Asp Ala Cys Glu Thr Met 450 455 460 Gly Asn Ala Thr Ala Ile Cys Ser Asp Lys Thr Gly Thr Leu Thr Thr 465 470 475 480 Asn Arg Met Thr Val Val Gln Ser Tyr Leu Gly Asp Thr His Tyr Lys 485 490 495 Glu Ile Pro Ala Pro Ser Ala Leu Thr Pro Lys Ile Leu Asp Leu Leu 500 505 510 Val His Ala Ile Ser Ile Asn Ser Ala Tyr Thr Thr Lys Ile Leu Pro 515 520 525 Pro Glu Lys Glu Gly Ala Leu Pro Arg Gln Val Gly Asn Lys Thr Glu 530 535 540 Cys Ala Leu Leu Gly Phe Val Leu Asp Leu Lys Arg Asp Phe Gln Pro 545 550 555 560 Val Arg Glu Gln Ile Pro Glu Asp Lys Leu Tyr Lys Val Tyr Thr Phe 565 570 575 Asn Ser Val Arg Lys Ser Met Ser Thr Val Ile Arg Met Pro Asp Gly 580 585 590 Gly Phe Arg Leu Phe Ser Lys Gly Ala Ser Glu Ile Leu Leu Lys Lys 595 600 605 Cys Thr Asn Ile Leu Asn Ser Asn Gly Glu Leu Arg Gly Phe Arg Pro 610 615 620 Arg Asp Arg Asp Asp Met Val Arg Lys Ile Ile Glu Pro Met Ala Cys 625 630 635 640 Asp Gly Leu Arg Thr Ile Cys Ile Ala Tyr Arg Asp Phe Ser Ala Gly 645 650 655 Gln Glu Pro Asp Trp Asp Asn Glu Asn Glu Val Val Gly Asp Leu Thr 660 665 670 Cys Ile Ala Val Val Gly Ile Glu Asp Pro Val Arg Pro Glu Val Pro 675 680 685 Glu Ala Ile Arg Lys Cys Gln Arg Ala Gly Ile Thr Val Arg Met Val 690 695 700 Thr Gly Asp Asn Ile Asn Thr Ala Arg Ala Ile Ala Ala Lys Cys Gly 705 710 715 720 Ile Ile Gln Pro Gly Glu Asp Phe Leu Cys Leu Glu Gly Lys Glu Phe 725 730 735 Asn Arg Arg Ile Arg Asn Glu Lys Gly Glu Ile Glu Gln Glu Arg Leu 740 745 750 Asp Lys Val Trp Pro Lys Leu Arg Val Leu Ala Arg Ser Ser Pro Thr 755 760 765 Asp Lys His Thr Leu Val Lys Gly Ile Ile Asp Ser Thr Thr Gly Glu 770 775 780 Gln Arg Gln Val Val Ala Val Thr Gly Asp Gly Thr Asn Asp Gly Pro 785 790 795 800 Ala Leu Lys Lys Ala Asp Val Gly Phe Ala Met Gly Ile Ala Gly Thr 805 810 815 Asp Val Ala Lys Glu Ala Ser Asp Ile Ile Leu Thr Asp Asp Asn Phe 820 825 830 Thr Ser Ile Val Lys Ala Val Met Trp Gly Arg Asn Val Tyr Asp Ser 835 840 845 Ile Ser Lys Phe Leu Gln Phe Gln Leu Thr Val Asn Val Val Ala Val 850 855 860 Ile Val Ala Phe Thr Gly Ala Cys Ile Thr 865 870 <210> 213 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 213 Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu Ser Pro Gly Leu Ile Thr 1 5 10 15 Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys 20 25 <210> 214 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 214 Thr Val Phe Leu Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn Arg Pro 1 5 10 15 Lys Arg <210> 215 <211> 415 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 215 Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg 1 5 10 15 Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe 20 25 30 Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly 35 40 45 Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp 50 55 60 Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys 65 70 75 80 Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu 85 90 95 Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr 100 105 110 Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val 115 120 125 Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr 130 135 140 Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu 145 150 155 160 Ala Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn 165 170 175 Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe 180 185 190 Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly 195 200 205 Ser Ile Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu 210 215 220 Thr Gly Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu 225 230 235 240 Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His 245 250 255 His Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu 260 265 270 Leu Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile 275 280 285 Cys Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser 290 295 300 Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala 305 310 315 320 Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys 325 330 335 Leu Arg Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly 340 345 350 Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro 355 360 365 His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser 370 375 380 Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys 385 390 395 400 Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr 405 410 415 <210> 216 <211> 415 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 216 Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg 1 5 10 15 Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe 20 25 30 Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly 35 40 45 Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp 50 55 60 Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys 65 70 75 80 Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu 85 90 95 Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr 100 105 110 Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val 115 120 125 Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr 130 135 140 Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu 145 150 155 160 Ala Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn 165 170 175 Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe 180 185 190 Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly 195 200 205 Ser Ile Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu 210 215 220 Thr Gly Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu 225 230 235 240 Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His 245 250 255 His Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu 260 265 270 Leu Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile 275 280 285 Cys Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser 290 295 300 Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala 305 310 315 320 Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys 325 330 335 Leu Leu Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly 340 345 350 Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro 355 360 365 His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser 370 375 380 Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys 385 390 395 400 Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr 405 410 415 <210> 217 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(8) <223> Shortest example of (GGS)n(GGGGS)n linker, wherein n is an integer between 1 and 100 <400> 217 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 218 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 218 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 219 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 219 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 <210> 220 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 220 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 221 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 221 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Ser <210> 222 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 222 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 223 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(4) <223> Shortest example of (GGGG)n linker, wherein n is an integer between 1 and 100 <400> 223 Gly Gly Gly Gly 1 <210> 224 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X= any amino acid <400> 224 Met Gly Xaa Lys Leu Ser Lys Lys Lys 1 5 <210> 225 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X= is any amino acid <400> 225 Gly Xaa Lys Leu Ser Lys Lys Lys 1 5 <210> 226 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 226 ugagaacuga auuccauggg uu 22 <210> 227 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 227 ccucugaaau ucaguucuuc ag 22 <210> 228 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 228 uuaaugcuaa ucgugauagg ggu 23 <210> 229 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 229 cuccuacaua uuagcauuaa ca 22 <210> 230 <211> 95 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 230 Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser 1 5 10 15 Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly 20 25 30 Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser 35 40 45 Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu 50 55 60 Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly 65 70 75 80 Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met Phe Ala 85 90 95 <210> 231 <211> 96 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 231 Met Ser Gln Ile Met Tyr Asn Tyr Pro Ala Met Leu Gly His Ala Gly 1 5 10 15 Asp Met Ala Gly Tyr Ala Gly Thr Leu Gln Ser Leu Gly Ala Glu Ile 20 25 30 Ala Val Glu Gln Ala Ala Leu Gln Ser Ala Trp Gln Gly Asp Thr Gly 35 40 45 Ile Thr Tyr Gln Ala Trp Gln Ala Gln Trp Asn Gln Ala Met Glu Asp 50 55 60 Leu Val Arg Ala Tyr His Ala Met Ser Ser Thr His Glu Ala Asn Thr 65 70 75 80 Met Ala Met Met Ala Arg Asp Pro Ala Glu Ala Ala Lys Trp Gly Gly 85 90 95

Claims (84)

  1. 말레이미드 모이어티를 통해 세포외 소포 (EV)에 공유적으로 연결된 생물학적 활성 분자를 포함하는 EV.
  2. 청구항 1에 있어서, 말레이미드 모이어티는 화학식 (I)을 가지며:
    Figure pct00098
    (I),
    이때
    R1은 -C1-10 알킬렌-, -C3-8 카보사이클로-, -O-(C1-8 알킬렌)-, -아릴렌-, -C1-10 알킬렌-아릴렌-, -아릴렌-C1-10 알킬렌-, -C1-10 알킬렌-(C3-8 카보사이클로)-, -(C3-8 카보사이클로)-C1-10 알킬렌-, -C3-8 헤테로사이클로-, -C1-10 알킬렌-(C3-8 헤테로사이클로)-, -(C3-8 헤테로사이클로)-C1-10 알킬렌-, -(CH2CH2O)r-, 및 -(CH2CH2O)r-CH2-로 구성된 그룹에서 선택되고;
    r은 1 내지 10의 정수이며;
    *은 EV에 대한 말레이미드 모이어티의 공유 부착 부위를 나타내고; 및,
    물결선은 생물학적 활성 분자에 대한 말레이미드 모이어티의 부착 부위를 나타내는, 세포외 소포.
  3. 청구항 2에 있어서, R1은 -(CH2)s-이고, 이때 s는 4, 5, 또는 6인, 세포외 소포.
  4. 청구항 2 또는 3에 있어서, 말레이미드 모이어티는 화학식 (II)를 가지며, 이때 R1은 -(CH2)5-인 세포외 소포:
    Figure pct00099
    (II).
  5. 청구항 2에 있어서, 말레이미드 모이어티는 화학식 (III)을 가지며, 이때 R1은 -(CH2CH2O)r-CH2-이고, 이때 r은 2인, 세포외 소포:
    Figure pct00100
    (III).
  6. 청구항 1-5 중 어느 한 항에 있어서, 말레이미드 모이어티는 EV에 존재하는 작용기에 공유적으로 연결되며, 이때 작용기는 설프하이드릴 그룹인, 세포외 소포.
  7. 청구항 6에 있어서, 설프하이드릴 그룹은 EV 표면의 단백질에 존재하는, 세포외 소포.
  8. 청구항 1-7 중 어느 한 항에 있어서, 말레이미드 모이어티는 링커에 의해 생물학적 활성 분자에 연결되는, 세포외 소포.
  9. 청구항 8에 있어서, 링커는 절단가능한 링커를 포함하는, 세포외 소포.
  10. 청구항 9에 있어서, 절단가능한 링커는 프로테아제에 의해 절단되는, 세포외 소포.
  11. 청구항 10에 있어서, 프로테아제는 카텝신인, 세포외 소포.
  12. 청구항 8에 있어서, 링커는 환원-민감성 링커 또는 산 불안정 링커인, 세포외 소포.
  13. 청구항 8-12 중 어느 한 항에 있어서, 링커는 화학식 (IV)를 가지며:
    -Aa-Yy- (IV),
    이때 각각의 -A-는 독립적으로 아미노산 단위이고, a는 독립적으로 1 내지 12의 정수이고; -Y-는 스페이서 단위이고 y는 0, 1 또는 2인, 세포외 소포.
  14. 청구항 13에 있어서, -Aa-는 다이펩티드, 트라이펩티드, 테트라펩티드, 펜타펩티드, 또는 헥사펩티드인, 세포외 소포.
  15. 청구항 14에 있어서, a는 2이고 -Aa-는 발린-알라닌, 발린-시트룰린, 페닐알라닌-라이신, N-메틸발린-시트룰린, 사이클로헥실알라닌-라이신, 및 베타-알라닌-라이신으로 구성된 그룹에서 선택되는, 세포외 소포.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 -Aa-는 발린-알라닌 또는 발린-시트룰린인, 세포외 소포.
  17. 청구항 13-16 중 어느 한 항에 있어서, y는 1인, 세포외 소포.
  18. 청구항 13-17 중 어느 한 항에 있어서, -Y-는 자기 희생 스페이서인, 세포외 소포.
  19. 청구항 18에 있어서, -Yy-는 화학식 (V)를 가지며:
    Figure pct00101
    (V),
    이때 각각의 R2는 독립적으로 C1-8 알킬, -O-(C1-8 알킬), 할로겐, 니트로, 또는 시아노이고; 그리고 m은 0 내지 4의 정수인, 세포외 소포.
  20. 청구항 19에 있어서, m은 0, 1, 또는 2인, 세포외 소포.
  21. 청구항 20에 있어서, m은 0인, 세포외 소포.
  22. 청구항 8-21 중 어느 한 항에 있어서, 절단가능한 링커는 발린-알라닌-p-아미노벤질카바메이트 또는 발린-시트룰린-p-아미노벤질카바메이트인, 세포외 소포.
  23. 청구항 13-17 중 어느 한 항에 있어서, -Y-는 비 자기 희생 스페이서인, 세포외 소포.
  24. 청구항 23에 있어서, 비 자기 희생 스페이서는 -Gly- 또는 -Gly-Gly-인, 세포외 소포.
  25. 청구항 8에 있어서, 링커는 산 불안정 링커인, 세포외 소포.
  26. 청구항 25에 있어서, 산 불안정 링커는 시스-아코니틱 링커, 하이드라지드 링커, 티오카바모일 링커, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 세포외 소포.
  27. 청구항 25 또는 26에 있어서, 산 불안정 링커는 생물학적 활성 분자를 산 불안정 링커에 연결하기 위한 스페이서 단위를 포함하는, 세포외 소포.
  28. 청구항 27에 있어서, 스페이서 단위는 화학식 (V)를 가지며:
    Figure pct00102
    (V),
    이때 각각의 R2는 독립적으로 C1-8 알킬, -O-(C1-8 알킬), 할로겐, 니트로, 또는 시아노이고; 그리고 m은 0 내지 4의 정수인, 세포외 소포.
  29. 청구항 8에 있어서, 링커는 절단불가능한 링커인, 세포외 소포.
  30. 청구항 29에 있어서, 절단불가능한 링커는 테트라에틸렌 글라이콜 (TEG), 폴리에틸렌 글라이콜 (PEG), 숙신이미드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 세포외 소포.
  31. 청구항 29 또는 30에 있어서, 절단불가능한 링커는 생물학적 활성 분자를 절단불가능한 링커에 연결시키는 스페이서 단위를 포함하는, 세포외 소포.
  32. 청구항 31에 있어서, 스페이서 단위는 화학식 (V)를 가지며:
    Figure pct00103
    (V),
    이때 각각의 R2는 독립적으로 C1-8 알킬, -O-(C1-8 알킬), 할로겐, 니트로, 또는 시아노이고; 그리고 m은 0 내지 4의 정수인, 세포외 소포.
  33. 생물학적 활성 분자 및 절단가능한 링커를 포함하고, 이때 절단가능한 링커는 EV를 생물학적 활성 분자에 연결하는, 세포외 소포.
  34. 청구항 33에 있어서, 절단가능한 링커는 발린-알라닌-p-아미노벤질카바메이트 또는 발린-시트룰린-p-아미노벤질카바메이트를 포함하는, 세포외 소포.
  35. 청구항 33 또는 34에 있어서, EV에 존재하는 작용기를 통해 EV를 절단가능한 링커에 연결하는 말레이미드 모이어티를 추가로 포함하는, 세포외 소포.
  36. 청구항 35에 있어서, 말레이미드 모이어티는 화학식 (I)을 가지며:
    Figure pct00104
    (I), 이때
    R1은 -C1-10 알킬렌-, -C3-8 카보사이클로-, -O-(C1-8 알킬렌)-, -아릴렌-, -C1-10 알킬렌-아릴렌-, -아릴렌-C1-10 알킬렌-, -C1-10 알킬렌-(C3-8 카보사이클로)-, -(C3-8 카보사이클로)-C1-10 알킬렌-, -C3-8 헤테로사이클로-, -C1-10 알킬렌-(C3-8 헤테로사이클로)-, -(C3-8 헤테로사이클로)-C1-10 알킬렌-, -(CH2CH2O)r-, 및 -(CH2CH2O)r-CH2-로 구성된 그룹에서 선택되고;
    r은 1 내지 10의 정수이며; 그리고
    *은 EV에 대한 말레이미드 모이어티의 공유 부착 부위를 나타내고; 및,
    물결선은 생물학적 활성 분자에 대한 말레이미드 모이어티의 부착 부위를 나타내는, 세포외 소포.
  37. 청구항 36에 있어서, R1은 -(CH2)s-이고, 이때 s는 4, 5, 또는 6인, 세포외 소포.
  38. 청구항 36 또는 37에 있어서, 말레이미드 모이어티는 화학식 (II)를 가지며, 이때 R1은 -(CH2)5-인 세포외 소포:
    Figure pct00105
    (II).
  39. 청구항 36에 있어서, 말레이미드 모이어티는 화학식 (III)을 가지며, 이때 R1은 -(CH2CH2O)r-CH2-이고, 이때 r은 2인, 세포외 소포:
    Figure pct00106
    (III).
  40. 청구항 34-39 중 어느 한 항에 있어서, 말레이미드 모이어티는 EV에 존재하는 작용기에 공유적으로 연결되는, 세포외 소포.
  41. 청구항 40에 있어서, 작용기는 EV 상의 글리칸에 존재하는, 세포외 소포.
  42. 청구항 40에 있어서, 작용기는 설프하이드릴인, 세포외 소포.
  43. 청구항 41 또는 42에 있어서, 작용기는 EV 표면의 단백질에 존재하는, 세포외 소포.
  44. 청구항 43에 있어서, 단백질은 스캐폴드 모이어티인, 세포외 소포.
  45. 청구항 44에 있어서, 단백질은 PTGFRN 폴리펩티드, BSG 폴리펩티드, IGSF2 폴리펩티드, IGSF3 폴리펩티드, IGSF8 폴리펩티드, ITGB1 폴리펩티드, ITGA4 폴리펩티드, SLC3A2 폴리펩티드, ATP 수송체 폴리펩티드, 또는 이들의 단편인, 세포외 소포.
  46. 말레이미드 모이어티, 절단가능한 링커, 및 생물학적 활성 분자를 포함하는 세포외 소포로서, 이때 말레이미드 모이어티는 EV를 절단가능한 링커에 연결하고, 절단가능한 링커는 말레이미드 모이어티를 생물학적 활성 분자에 연결하는, 세포외 소포.
  47. 청구항 1-46 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 활성 분자는 폴리펩티드, 펩티드, 폴리뉴클레오티드 (DNA 및/또는 RNA), 화학적 화합물, 또는 이들의 임의의 조합인, 세포외 소포.
  48. 청구항 47에 있어서, 생물학적 활성 분자는 화학적 화합물인, 세포외 소포.
  49. 청구항 48에 있어서, 화학적 화합물은 소분자인, 세포외 소포.
  50. 청구항 49에 있어서, 소분자는 단백질분해-표적화 키메라 (PROTAC)인, 세포외 소포.
  51. 청구항 47에 있어서, 생물학적 활성 분자는 뉴클레오티드이고, 이때 뉴클레오티드는 인터페론 유전자 단백질 (STING) 효현제의 자극제인, 세포외 소포.
  52. 청구항 51에 있어서, STING 효현제는 사이클릭 다이뉴클레오티드 STING 효현제 또는 비-사이클릭 다이뉴클레오티드 STING 효현제를 포함하는, 세포외 소포.
  53. 청구항 52에 있어서, 화학식 (VI) 또는 (VII)
    Figure pct00107
    (VI),
    Figure pct00108
    (VII), 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 가지는 (말레이미드 모이어티)-(절단가능한 링커)-(생물학적 활성 분자)를 포함하는, 세포외 소포.
  54. 청구항 52에 있어서, 화학식 (VIII), (IX), (X), 또는 (XI)
    Figure pct00109

    또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 가지는 (말레이미드 모이어티)-(절단가능한 링커)-(생물학적 활성 분자)를 포함하는, 세포외 소포.
  55. 청구항 1-5, 8-32, 및 35-45 중 어느 한 항에 있어서, EV는 표면의 작용기를 노출시켜 말레이미드 모이어티를 공유적으로 연결하도록 변형되는, 세포외 소포.
  56. 청구항 55에 있어서, 작용기는 설프하이드릴 그룹인, 세포외 소포.
  57. 청구항 56에 있어서, 작용기는 EV를 환원제로 처리함으로써 노출되는, 세포외 소포.
  58. 청구항 57에 있어서, 환원제는 TCEP (트리스(2-카르복시에틸)포스핀), DTT (다이티오트레이톨), BME (2-메르캅토에탄올), 티올화제, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 세포외 소포.
  59. 청구항 58에 있어서, 티올화제는 트라우트 (Traut) 시약 (2-이미노티올란)을 포함하는, 세포외 소포.
  60. 청구항 1 내지 59 중 어느 한 항에 있어서, EV는 엑소좀인, 세포외 소포.
  61. 청구항 1 내지 60 중 어느 한 항의 세포외 소포 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
  62. 말레이미드 모이어티를 EV에 연결하는 단계를 포함하는, 생물학적 활성 분자를 EV에 접합시키는 방법.
  63. 청구항 62에 있어서, 연결 단계는 EV를 환원제로 처리하는 단계를 포함하는, 방법.
  64. 청구항 63에 있어서, 환원제는 TCEP (트리스(2-카르복시에틸)포스핀), DTT (다이티오트레이톨), BME (2-메르캅토에탄올), 티올화제, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
  65. 청구항 64에 있어서, 티올화제는 트라우트 시약 (2-이미노티올란)을 포함하는, 방법.
  66. 청구항 62 내지 65 중 어느 한 항에 있어서, 연결 단계는 환원된 EV를 말레이미드 모이어티와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  67. 청구항 66에 있어서, 말레이미드 모이어티는 EV에 대한 연결 전에 생물학적 활성 분자에 연결되는, 방법.
  68. 청구항 67에 있어서, 말레이미드 모이어티는 링커에 추가로 부착되어, 이러한 말레이미드 모이어티가 생물학적 활성 분자에 연결되는, 방법.
  69. 청구항 1 내지 60 중 어느 한 항의 EV 및 사용 설명서를 포함하는 키트.
  70. 생물학적 활성 분자를 EV에 접합시키기 위한 시약, 및 접합을 수행하기 위한 설명서를 포함하고, 이로써 청구항 1 내지 60 중 어느 한 항의 EV를 제조하는 키트.
  71. 청구항 1 내지 60 중 어느 한 항의 EV를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법.
  72. 청구항 71에 있어서, 질환 또는 장애는 암, 염증성 장애, 신경퇴행성 장애, 중추신경계 질환, 또는 대사 질환인, 방법.
  73. 청구항 71 또는 72에 있어서, EV는 정맥내, 복강내, 비강내, 경구, 근육내, 피하, 비경구, 종양내, 척수강내 또는 안구내 투여되는, 방법.
  74. 말레이미드 모이어티를 통해 스캐폴드 모이어티에 공유적으로 연결된 적어도 하나의 생물학적 활성 분자를 포함하는 세포외 소포 (EV).
  75. 청구항 74에 있어서, 말레이미드 모이어티는 이작용기 분자인, 세포외 소포.
  76. 청구항 74 또는 75에 있어서, 말레이미드 모이어티는 적어도 하나의 링커 또는 스페이서를 포함하는, 세포외 소포.
  77. 청구항 76에 있어서, 링커는 절단가능한 링커인, 세포외 소포.
  78. 청구항 74 내지 77 중 어느 한 항에 있어서, 스캐폴드 모이어티는 스캐폴드 단백질 또는 스캐폴드 지질인, 세포외 소포.
  79. 청구항 78에 있어서, 스캐폴드 단백질은 스캐폴드 X 단백질인, 세포외 소포.
  80. 청구항 79에 있어서, 스캐폴드 X 단백질은 PTGFRN 폴리펩티드, BSG 폴리펩티드, IGSF2 폴리펩티드, IGSF3 폴리펩티드, IGSF8 폴리펩티드, ITGB1 폴리펩티드, ITGA4 폴리펩티드, SLC3A2 폴리펩티드, ATP 수송체 폴리펩티드, 또는 이들의 단편인, 세포외 소포.
  81. 청구항 74 내지 80 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 활성 분자는 백신 항원, 백신 애쥬번트, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 세포외 소포.
  82. 청구항 74 내지 80 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 활성 분자는 STING, ASO, 합성 항종양제 (예를 들어, MMAE), 사이토카인 방출 억제제 (예를 들어, MCC950), mTOR 억제제 (예를 들어, 라파마이신), 오토탁신 억제제 (예를 들어, PAT409), LPA1 길항제 (예를 들어, AM152), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 세포외 소포.
  83. 청구항 74 내지 82 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 소포는 표적화 모이어티, 트로피즘 (tropism) 모이어티, 항-식세포 신호, 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함하는, 세포외 소포.
  84. 청구항 83에 있어서, 표적화 모이어티, 트로피즘 모이어티, 항-식세포 신호, 또는 이들의 조합은 말레이미드 모이어티를 통해 세포외 소포에 연결되는, 세포외 소포.
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