KR20200006972A - 면역조절 폴리뉴클레오티드, 이의 항체 접합체, 및 이의 사용 방법 - Google Patents

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에드워드 형석 하
렉스만 엘티푸
딩궈 리우
빈 리우
쥬세페 델로 아이아코노
브라이언 알. 메이드
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Abstract

면역조절 폴리뉴클레오티드가 개시된다. 면역조절 폴리뉴클레오티드는 5-변형된 우리딘, 5-변형된 시티딘, 총 6 내지 16 개 뉴클레오티드, 및/또는 1 이상의 비염기 스페이서 및/또는 인터뉴클레오시드 포스포트리에스터를 함유할 수 있다. 또한, 표적화 모이어티 및 1 이상의 면역조절 폴리뉴클레오티드를 함유하는 접합체가 개시된다. 면역조절 폴리뉴클레오티드 및 접합체는 1 이상의 보조 모이어티를 추가로 함유할 수 있다. 또한, 면역조절 폴리뉴클레오티드 또는 1 이상의 입체화학적으로 풍부화된 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트를 함유하는 접합체를 함유하는 조성물이 개시된다. 또한, 면역조절 폴리뉴클레오티드 또는 접합체를 함유하는 약학 조성물 및 이의 사용 방법이 개시된다.

Description

면역조절 폴리뉴클레오티드, 이의 항체 접합체, 및 이의 사용 방법
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 각각 2017년 4월 14일 및 7월 27일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/485,748호 및 제62/537,925호의 우선권의 이익을 주장하며; 이들 각각의 개시내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 면역계 반응을 조절하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본원은 면역조절 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 또한, 본원은 5-변형된 우리딘 또는 5-변형된 시티딘을 포함하고 약 6 내지 약 16 개 뉴클레오티드 범위의 길이를 갖는 면역조절 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 또한, 본원은 표적화 모이어티 및 1 이상의 면역조절 폴리뉴클레오티드를 포함하는 접합체(conjugate)를 제공한다. 본원은 면역조절 폴리뉴클레오티드 또는 표적화 모이어티 및 1 이상의 면역조절 폴리뉴클레오티드를 포함하는 접합체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 본원은 질환, 예컨대 암을 치료하기 위한 이의 사용 방법을 제공한다.
배경
병원균-연관 분자 패턴(pathogen-associated molecular pattern)(PAMP)은 다양한 병원균과 연관된 분자이며 톨-유사 수용체(toll-like receptor)(TLR) 및 선천적 면역 반응을 활성화시키는 다른 패턴 인식 수용체(pattern recognition receptor)(PRR)에 의해 인식된다. 병원균의 부재시 면역계를 모집하는 PAMP의 능력은 선천적 면역계 반응의 사용을 통한 세포 파괴(예를 들어, 항암 요법)를 포함한 다양한 질환의 치료를 위한 전략을 제공한다. 다양한 치료 적용을 위해 조사되어 왔던 PAMP의 하나의 클래스는 면역자극 폴리뉴클레오티드, 예컨대 CpG ODN(예를 들어, 아가톨리모드(agatolimod))이다. CpG ODN은 면역 세포(예를 들어, B 세포, 단핵구, 및 플라스마사이토이드 수지상 세포(plasmacytoid dendritic cell)(pDC))에서 TLR9 이합체화를 매개하여, 사이토카인(예를 들어, I 형 인터페론 및 인터류킨)을 상향조절함으로써, 천연 킬러(nature killer) 세포를 활성화시키는 것으로 여겨진다.
CpG ODN은 일반적으로 3 개의 클래스로 분류된다: 클래스 A, 클래스 B, 및 클래스 C. 클래스 A CpG ODN은 통상적으로 3'- 및 5'-말단에 포스포로티오에이트 백본(backbone)을 갖는 poly-G 꼬리 및 포스페이트 백본을 포함하는 중앙 회문 서열을 함유한다. 클래스 A CpG ODN은 통상적으로 중앙 회문 서열 내에 CpG를 함유한다. 클래스 B CpG ODN은 통상적으로 완전 포스포로티오에이트 백본을 포함하며, 클래스 B CpG ODN의 5' 말단의 서열은 보통 TLR9 활성화를 위해 중요하다. 클래스 C CpG ODN은 이중복합(duplex)의 형성을 가능하게 하는 3'-말단 서열을 갖는 완전 포스포로티오에이트 백본을 포함한다. CpG ODN은 보통 혈청에서의 분해에 민감하다. 따라서, CpG ODN의 약물동태학은 치료제로서 이들의 개발에서의 제한 요소 중 하나일 수 있다. 또한, CpG ODN은 보통 생체내(in vivo)에서 불균일한 조직 분포를 나타내며, 주요 축적 부위는 간, 신장, 및 비장이다. 이러한 분포는 PAMP와 연관된 표적외 활성 및 국소 독성을 유도할 수 있다. 따라서, CpG ODN의 치료적 적용은 본원에 기재된 약물동태학적/약력학적 도전(challenge)을 처리함으로써 용이해질 수 있다.
따라서, 새로운 면역조절 폴리뉴클레오티드에 대한 필요성이 있다.
발명의 요약
일반적으로, 본 발명은 면역조절(예를 들어, 면역자극) 폴리뉴클레오티드, 및 표적화 모이어티 및 1 이상의 면역조절(예를 들어, 면역자극) 폴리뉴클레오티드를 함유하는 접합체에 관한 것이다.
일 양태에서, 면역조절 폴리뉴클레오티드가 개시된다. 면역조절 폴리뉴클레오티드는 면역자극 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 대안적으로, 면역조절 폴리뉴클레오티드는 면역억제 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
일부 실시양태에서, 면역조절 폴리뉴클레오티드는 1 이상(예를 들어, 1 또는 2 개)의 비염기 스페이서(abasic spacer) 또는 포스포트리에스터를 함유한다. 특별한 실시양태에서, 면역조절 폴리뉴클레오티드는 1 이상(예를 들어, 1 내지 5 개)의 인터뉴클레오시드(internucleoside) 포스포트리에스터를 함유한다. 추가 실시양태에서, 인터뉴클레오시드 포스포트리에스터 중 적어도 하나는 접합기(conjugating group)를 함유한다. 또 추가의 실시양태에서, 면역조절 폴리뉴클레오티드는 말단 포스포에스터(예를 들어, 5'-말단 포스포에스터 또는 3'-말단 포스포에스터)를 추가로 함유한다. 또 추가의 실시양태에서, 말단 포스포에스터는 접합기를 함유한다. 다른 실시양태에서, 면역조절 폴리뉴클레오티드는 5'-캡(cap) 또는 3'-캡을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 면역조절 폴리뉴클레오티드는 5'-5' 캡인 5'-캡을 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 5'-5' 캡은 인터뉴클레오시드 포스페이트, 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트, 또는 인터뉴클레오시드 포스포로디티오에이트에 공유결합된 접합기를 함유한다. 일부 실시양태에서, 면역조절 폴리뉴클레오티드는 인터뉴클레오시드 포스페이트, 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트, 또는 인터뉴클레오시드 포스포로디티오에이트에 공유결합된 접합기를 함유하는 3'-캡을 포함한다.
추가 실시양태에서, 면역조절 폴리뉴클레오티드는 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 보조모이어티, 말단 포스포디에스터, 말단 포스포트리에스터, 5'-5' 캡, 또는 -OR' 기인 5'-캡핑기(capping group)를 함유하되, R'은 생체내가역성기, 비-생체내가역성기, 또는 O-보호기이다. 또 추가의 실시양태에서, 5'-캡핑기는 포스페이트, 포스포로티오에이트, 또는 포스포로디티오에이트에 결합된 선택적으로 치환된 C1-6 알킬을 포함하는 모노포스페이트 또는 말단 포스포디에스터이다. 또 추가의 실시양태에서, 면역조절 폴리뉴클레오티드는 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 보조모이어티, 말단 포스포디에스터, 말단 포스포트리에스터, 및 -OR' 기인 3'-캡핑기를 함유하되, R'은 생체내가역성기, 비-생체내가역성기, 또는 O-보호기이다. 일부 실시양태에서, 3'-캡핑기는 포스페이트, 포스포로티오에이트, 또는 포스포로디티오에이트에 결합된 선택적으로 치환된 C1-6 알킬을 포함하는 모노포스페이트 또는 말단 포스포디에스터이다.
특별한 실시양태에서, 면역조절 폴리뉴클레오티드는 1 이상(예를 들어, 1 또는 2 개)의 비염기 스페이서를 함유한다. 추가 실시양태에서, 비염기 스페이서 중 적어도 하나는 인터뉴클레오시드 비염기 스페이서이다. 또 추가의 실시양태에서, 비염기 스페이서 중 적어도 하나는 3'-말단 비염기 스페이서이다. 또 추가의 실시양태에서, 비염기 스페이서 중 적어도 하나는 접합기를 포함한다.
특정 실시양태에서, 면역조절 폴리뉴클레오티드는 5-변형된 우리딘(예를 들어, 5-할로우리딘(예를 들어, 5-브로모우리딘 또는 5-요오도우리딘) 또는 5-변형된 시티딘)을 함유한다. 추가 실시양태에서, 5-변형된 우리딘(예를 들어, 5-할로우리딘(예를 들어, 5-브로모우리딘 또는 5-요오도우리딘))은 2 개의 5'-말단 뉴클레오시드 중 적어도 하나이거나 면역조절 폴리뉴클레오티드에서 면역자극 서열(immunostimulating sequence)(ISS) 내에 존재한다. 또 추가의 실시양태에서, 5-변형된 우리딘(예를 들어, 5-할로우리딘)은 인터뉴클레오시드 포스포디에스터 포스페이트에 결합된 3'-위치를 포함한다. 특정 실시양태에서, 5-변형된 우리딘(예를 들어, 5-할로우리딘)은 인터뉴클레오시드 포스포디에스터 포스포로티오에이트에 결합된 3'-위치를 포함한다. 또 추가의 실시양태에서, 5-변형된 우리딘(예를 들어, 5-할로우리딘)은 5'-말단이다. 일부 실시양태에서, 5-변형된 우리딘은 5-브로모우리딘이다. 특별한 실시양태에서, 면역조절 폴리뉴클레오티드는 제2 및 제3 뉴클레오시드로서 또는 제3 및 제4 뉴클레오시드로서 시티딘 및 구아노신을 함유한다.
특별한 실시양태에서, 면역조절 폴리뉴클레오티드는 5'-말단 면역자극 서열을 함유한다. 특정 실시양태에서, 인터뉴클레오시드 포스포트리에스터 중 적어도 하나는 5'-말단 면역자극 서열에 결합되는 5'-탄소 원자를 갖는 뉴클레오시드의 3'-탄소 원자에 결합된다.
추가 실시양태에서, 면역조절 폴리뉴클레오티드는 총 6 내지 16(예를 들어, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16) 개의 뉴클레오티드를 포함한다. 또 추가의 실시양태에서, 면역조절 폴리뉴클레오티드에서의 인터뉴클레오시드 가교기 중 적어도 10%(예를 들어, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%)는 포스포로티오에이트를 함유한다. 또 추가의 실시양태에서, 면역조절 폴리뉴클레오티드에서의 인터뉴클레오시드 가교기 중 적어도 50%는 포스포로티오에이트를 함유한다.
일부 실시양태에서, 면역조절 폴리뉴클레오티드는 면역조절 폴리뉴클레오티드 내의 핵염기에 공유결합된 접합기를 포함한다.
특정 실시양태에서, 면역조절 폴리뉴클레오티드는 1 이상의 보조 모이어티를 포함한다. 특별한 실시양태에서, 면역조절 폴리뉴클레오티드는 보조 모이어티 중 적어도 하나를 함유하는 접합 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 보조 모이어티는 100 Da 내지 2,500 Da의 분자량을 갖는 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)을 함유한다. 추가 실시양태에서, 각각의 PEG는 독립적으로 총 적어도 3 개의 에틸렌 글리콜 반복 단위를 함유한다. 또 추가의 실시양태에서, 각각의 PEG는 독립적으로 총 적어도 20 개의 에틸렌 글리콜 반복 단위를 함유한다. 또 추가의 실시양태에서, 각각의 PEG는 독립적으로 총 적어도 50 이하의 에틸렌 글리콜 반복 단위를 함유한다. 다른 실시양태에서, 면역조절 폴리뉴클레오티드는 1 내지 8 개의 PEG를 함유한다.
특별한 실시양태에서, 면역조절 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된(예를 들어, 표 2에) 폴리뉴클레오티드이다.
다른 양태에서, 상보적 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 면역조절 폴리뉴클레오티드를 함유하는 혼성화된 면역조절 폴리뉴클레오티드가 개시된다.
또 다른 양태에서, 면역조절 폴리뉴클레오티드가 적어도 하나의 입체화학적으로 풍부화된 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트를 함유하는 면역조절 폴리뉴클레오티드를 함유하는 조성물이 개시된다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 입체화학적으로 풍부화된 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트는 면역조절 폴리뉴클레오티드에서 면역자극 서열 내의 CpG의 5'-말단 뉴클레오시드와 시티딘 사이에 배치된다. 추가 실시양태에서, 하나의 입체화학적으로 풍부화된 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트는 면역조절 폴리뉴클레오티드 내의 제1 및 제2 뉴클레오시드를 연결한다. 또 추가의 실시양태에서, 하나의 입체화학적으로 풍부화된 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트는 면역조절 폴리뉴클레오티드에서 면역자극 서열 내의 CpG의 시티딘의 5'-탄소 원자에 결합된다. 또 추가의 실시양태에서, 하나의 입체화학적으로 풍부화된 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트는 면역조절 폴리뉴클레오티드 내의 제4 및 제5 뉴클레오시드를 연결한다. 특정 실시양태에서, 입체화학적으로 풍부화된 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트는 S-입체발생이다. 특별한 실시양태에서, 입체화학적으로 풍부화된 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트는 R-입체발생이다.
또 다른 양태에서, 표적화 모이어티 및 1 이상의 면역조절 폴리뉴클레오티드를 함유한 접합체가 개시된다.
일부 실시양태에서, 표적화 모이어티는 항원-결합 모이어티, 폴리펩티드, 압타머, 또는 1 이상의 소분자를 포함하는 기이다. 특정 실시양태에서, 표적화 모이어티는 항원-결합 모이어티(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편)이다. 추가 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편은 N-말단 또는 C-말단 Q-태그(tag)를 포함하되, 면역조절 폴리뉴클레오티드(들)가 독립적으로 N-말단 또는 C-말단 Q-태그에 공유결합된다. 또 추가의 실시양태에서, Q-태그는 항체 또는 항체 단편의 중쇄 또는 경쇄 내에 배치된다.
특별한 실시양태에서, 면역조절 폴리뉴클레오티드는 다른 양태에서 개시된 바와 같다.
특정 실시양태에서, 면역조절 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나는 5-변형된 우리딘 또는 5-변형된 시티딘을 함유한다. 추가 실시양태에서, 면역조절 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나는 5-할로우리딘, 5-알키닐우리딘, 또는 5-헤테로사이클릴우리딘인 5-변형된 우리딘을 포함한다. 또 추가의 실시양태에서, 5-변형된 우리딘은 5-할로우리딘(예를 들어, 5-브로모우리딘 또는 5-요오도우리딘)이다. 일부 실시양태에서, 5-변형된 우리딘은 면역조절 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나의 2 개의 5'-말단 뉴클레오티드 중 하나이다. 다른 실시양태에서, 5-변형된 우리딘은 인터뉴클레오시드 포스포에스터 포스페이트에 결합된 3'-위치를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 5-변형된 우리딘은 인터뉴클레오시드 포스포에스터 포스포로티오에이트에 결합된 3'-위치를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 면역조절 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나는 제2 및 제3 뉴클레오시드로서 시티딘 및 구아노신을 함유한다. 특별한 실시양태에서, 면역조절 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나는 제3 및 제4 뉴클레오시드로서 시티딘 및 구아노신을 함유한다.
일부 실시양태에서, 면역조절 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나는 총 6 내지 16(예를 들어, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16) 개의 뉴클레오티드를 함유한다.
추가 실시양태에서, 면역조절 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나는 1 이상의 비염기 스페이서 또는 인터뉴클레오시드 포스포트리에스터를 함유한다. 또 추가의 실시양태에서, 적어도 하나의 비염기 스페이서 또는 적어도 하나의 포스포트리에스터는 링커를 함유한다.
특별한 실시양태에서, 면역조절 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나는 1 이상(예를 들어, 1 또는 2 개)의 비염기 스페이서를 함유한다. 다른 실시양태에서, 비염기 스페이서 중 적어도 하나는 인터뉴클레오시드 비염기 스페이서이다. 또 다른 실시양태에서, 비염기 스페이서 중 적어도 하나는 3'-말단 비염기 스페이서이다.
특정 실시양태에서, 면역조절 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나는 1 이상(예를 들어, 1 내지 5 개)의 인터뉴클레오시드 포스포트리에스터를 함유한다.
일부 실시양태에서, 접합체는 링커에 결합된 1 이상의 보조 모이어트를 추가로 함유한다. 추가 실시양태에서, 적어도 하나의 보조 모이어티는 100 Da 내지 2,500 Da의 분자량을 갖는 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)을 함유한다. 또 추가의 실시양태에서, 각각의 PEG는 독립적으로 총 적어도 3(예를 들어, 적어도 5, 적어도 6, 적어도, 7 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 12, 적어도 14, 적어도 16, 적어도 18, 또는 적어도 20) 개의 에틸렌 글리콜 반복 단위를 함유한다. 또 추가의 실시양태에서, 각각의 PEG는 독립적으로 총 50 이하(예를 들어, 45 이하, 40 이하, 35 이하, 또는 30 이하)의 에틸렌 글리콜 반복 단위를 함유한다. 특정 실시양태에서, 접합체는 1 내지 8 개의 PEG를 함유한다.
특별한 실시양태에서, 면역조절 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나에서의 5'-캡핑기는 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 보조 모이어티, 말단 포스포디에스터, 말단 포스포트리에스터, 또는 -OR' 기이되, R'은 생체내가역성기, 비-생체내가역성기, 또는 O-보호기이다. 추가 실시양태에서, 5'-캡핑기는 포스페이트, 포스포로티오에이트, 또는 포스포로디티오에이트에 결합된 선택적으로 치환된 C1-6 알킬을 함유하는 모노포스페이트 또는 말단 포스포디에스터이다. 또 추가의 실시양태에서, 면역조절 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나에서의 3'-캡핑기는 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 보조 모이어티, 말단 포스포디에스터, 말단 포스포트리에스터, 또는 -OR' 기이되, R'은 생체내가역성기, 비-생체내가역성기, 또는 O-보호기이다. 다른 실시양태에서, 3'-캡핑기는 포스페이트, 포스포로티오에이트, 또는 포스포로디티오에이트에 결합된 선택적으로 치환된 C1-6 알킬을 함유하는 모노포스페이트 또는 말단 포스포디에스터이다.
특정 실시양태에서, 면역조절 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나는 링커에 결합된 핵염기를 함유한다.
추가 실시양태에서, 접합체는 1 내지 6(예를 들어, 1 내지 4) 개의 면역조절 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 또 추가의 실시양태에서, 접합체는 하나의 면역조절 폴리뉴클레오티드만을 함유한다. 또 추가의 실시양태에서, 접합체는 2 개의 면역조절 폴리뉴클레오티드만을 함유한다. 다른 실시양태에서, 접합체는 하나의 표적화 모이어티를 함유한다.
일부 실시양태에서, 면역조절 폴리뉴클레오티드는 4 개의 5'-말단 뉴클레오티드 내에 인간 면역자극 서열을 함유한다. 특정 실시양태에서, 면역조절 폴리뉴클레오티드의 4 개의 5'-말단 뉴클레오티드 내의 인간 면역자극 서열은 뉴클레오시드로 치환된 포스포에스터에 결합된 5'-탄소 원자를 함유하는 시티딘을 포함한다.
특별한 실시양태에서, 면역조절 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나는 5-변형된 우리딘 또는 5-변형된 시티딘을 함유한다.
특정 실시양태에서, 면역조절 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나는 이의 보체에 혼성화된다.
추가 실시양태에서, 면역조절 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나는 적어도 하나의 입체화학적으로 풍부화된 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트를 함유한다.
추가 양태에서, 표적화 모이어티 및 1 이상의 면역조절 폴리뉴클레오티드를 포함하는 접합체를 함유하고, 각각의 면역조절 폴리뉴클레오티드가 독립적으로 링커를 포함하되, 표적화 모이어티가 링커에 공유결합되고, 면역조절 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나가 적어도 하나의 입체화학적으로 풍부화된 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트를 함유하는 조성물이 개시된다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 입체화학적으로 풍부화된 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트는 면역조절 폴리뉴클레오티드에서 면역자극 서열 내의 CpG의 5'-말단 뉴클레오시드와 시티딘 사이에 배치된다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 입체화학적으로 풍부화된 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트는 면역조절 폴리뉴클레오티드에서 면역자극 서열 내의 CpG의 시티딘의 5'-탄소 원자에 결합된다. 특별한 실시양태에서, 적어도 하나의 입체화학적으로 풍부화된 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트는 면역조절 폴리뉴클레오티드 내의 제1 및 제2 뉴클레오시드를 연결한다. 추가 실시양태에서, 적어도 하나의 입체화학적으로 풍부화된 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트는 면역조절 폴리뉴클레오티드 내의 제4 및 제5 뉴클레오시드를 연결한다. 또 추가의 실시양태에서, 입체화학적으로 풍부화된 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트는 S-입체발생이다. 또 추가의 실시양태에서, 입체화학적으로 풍부화된인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트는 R-입체발생이다.
또 추가의 양태에서, 약학적 허용 담체 및 본 발명의 면역조절 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 입체화학적으로 풍부화된 조성물, 또는 본 발명의 접합체를 함유하는 약학 조성물이 개시된다.
또 추가의 양태에서, 면역조절 폴리뉴클레오티드가 세포 내로 수송되게 하는 조건 하에서 세포를 본 발명의 면역조절 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 조성물, 본 발명의 접합체, 또는 본 발명의 약학 조성물과 접촉시키며, 접촉 후에, 엔도솜 톨-유사 수용체(endosomal toll-like receptor)의 활성이 조절되는 것에 의해 엔도솜 톨-유사 수용체를 포함하는 세포에서 엔도솜 톨-유사 수용체를 조절하는 방법이 개시된다.
일부 실시양태에서, 면역조절 폴리뉴클레오티드는 면역자극 폴리뉴클레오티드이고, 방법은 엔도솜 톨-유사 수용체를 작용시키기 위한 것이다.
특별한 실시양태에서, 면역조절 폴리뉴클레오티드는 면역억제 폴리뉴클레오티드이고, 방법은 엔도솜 톨-유사 수용체를 길항시키기 위한 것이다.
다른 양태에서, 1 이상의 면역조절 폴리뉴클레오티드가 세포 내로 수송되게 하는 조건 하에서 항원-제시 세포(antigen-presenting cell)를 본 발명의 면역조절 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 조성물, 본 발명의 접합체, 또는 본 발명의 약학 조성물과 접촉시키며, 접촉 후에, 세포에서 적어도 하나의 사이토카인의 수준이 증가하고, 표적화 모이어티가 항원-제시 세포를 표적화하되, 면역조절 폴리뉴클레오티드는 면역자극 폴리뉴클레오티드인 것에 의해 엔도솜 톨-유사 수용체를 포함하는 항원-제시 세포에서 1 이상의 사이토카인을 유도하는 방법이 개시된다.
일부 실시양태에서, 항원-제시 세포는 B 세포이다. 특정 실시양태에서, 1 이상의 사이토카인 중 적어도 하나는 염증성 사이토카인이다. 특별한 실시양태에서, 항원-제시 세포는 플라스마사이토이드 수지상 세포이고, 표적화 모이어티가 플라스마사이토이드 수지상 세포를 표적화한다. 특정 실시양태에서, 항원-제시 세포는 대식세포이다. 추가 실시양태에서, 사이토카인 중 적어도 하나는 I 형 인터페론이다. 또 추가의 실시양태에서, 톨-유사 수용체는 TLR9이다.
또 다른 양태에서, 환자에게 본 발명의 면역조절 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 조성물, 본 발명의 접합체, 또는 본 발명의 약학 조성물의 유효량을 투여하되, 표적화 모이어티가 B 세포를 표적화하고, 면역조절 폴리뉴클레오티드가 TLR9 작용제인 면역자극 폴리뉴클레오티드인 것에 의해 환자에서 액상 종양을 치료하는 방법이 개시된다.
특정 실시양태에서, 액상 종양은 혈액학적 종양이다(예를 들어, 혈액학적 종양은 림프종임). 특별한 실시양태에서, 림프종은 비-호지킨(non-Hodgkin) B 세포 림프종이다. 추가 실시양태에서, 림프종은 외투 세포 림프종, 광범위 큰 B 세포 림프종, 소포성 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 또는 다발성 골수종이다.
또 다른 양태에서, 환자에게 본 발명의 면역조절 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 조성물, 본 발명의 접합체, 또는 본 발명의 약학 조성물을 투여하되, 표적화 모이어티가 플라스마사이토이드 수지상 세포를 표적화하고, 면역조절 폴리뉴클레오티드가 TLR9 작용제인 면역자극 폴리뉴클레오티드인 것에 의해 환자에서 고형 종양을 치료하는 방법이 개시된다. 일부 실시양태에서, 환자에서 고형 종양을 치료하기 위한 방법은 환자에게 본원에 개시된 바와 같은 면역조절 폴리뉴클레오티드를 투여하되, 면역조절 폴리뉴클레오티드가 환자에서 B 세포를 표적화하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 목적을 위한(예를 들어, 환자에서 액상 또는 고형 종양을 치료하기 위한) 생산물(예를 들어, 의약)의 제조에서 본 발명의 면역조절 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 접합체, 본 발명의 조성물, 또는 본 발명의 약학 조성물의 사용을 제공한다는 것이 이해되어야 한다. 또한, 본 발명은 본원에 기재된 목적을 위한(예를 들어, 환자에서 액상 또는 고형 종양을 치료하기 위한) 본 발명의 면역조절 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 접합체, 본 발명의 조성물, 또는 본 발명의 약학 조성물의 사용을 제공한다는 것이 또한 이해되어야 한다. 또한, 본 발명은 본원에 기재된 목적에 따른(예를 들어, 환자에서 액상 또는 고형 종양을 치료하기 위한) 사용을 위해 본 발명의 면역조절 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 접합체, 본 발명의 조성물, 또는 본 발명의 약학 조성물을 제공한다는 것이 추가로 이해되어야 한다.
본 발명의 임의의 양태에서, 링커는 본원에 개시된 바와 같을 수 있다(예를 들어, 화학식 (II), (V), 및 (VI)-(XV) 중 어느 하나에 따름). 본 발명의 임의의 양태에서, 접합기는 본원에 개시된 바와 같을 수 있다.
본원은 하기 화학식 (A)의 올리고뉴클레오티드 또는 이의 입체 이성질체, 2 이상의 부분입체 이성질체의 혼합물, 호변 이성질체, 또는 2 이상의 호변 이성질체의 혼합물; 또는 이의 약학적 허용 염, 용매화물, 또는 수화물을 제공한다:
[화학식 (A)]
Figure pct00001
상기 식에서,
각각의 XN은 독립적으로 뉴클레오티드이고;
X3'은 3' 말단 뉴클레오티드이며;
X5'는 5' 말단 뉴클레오티드이고;
YP는 인터뉴클레오시드 포스포트리에스터이며;
b 및 c는 각각 약 0 내지 약 25 범위의 정수이고; 단, 이들의 합은 5 이상이되;
올리고뉴클레오티드는 변형된 핵염기를 갖는 뉴클레오티드를 포함한다.
또한, 본원은 N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 이의 입체 이성질체, 2 이상의 부분입체 이성질체의 혼합물, 호변 이성질체, 또는 2 이상의 호변 이성질체의 혼합물; 또는 이의 약학적 허용 염, 용매화물, 또는 수화물을 제공한다;
상기 식에서,
x는 1 내지 4 범위의 정수이고;
N1은 부재하거나 2'-데옥시티미딘이며;
N2는 변형된 핵염기를 갖는 2'-데옥시리보뉴클레오티드이고;
N3은 각각 선택적으로 3'-포스포트리에스터를 포함하는 2'-데옥시아데노신 또는 2'-데옥시티미딘이며;
N4는 2'-데옥시아데노신 또는 2'-데옥시티미딘이며;
N5는 선택적으로 3'-포스포트리에스터를 포함하는 2'-데옥시티미딘이다.
또한, 본원은 하기 화학식 (B)의 화합물 또는 이의 입체 이성질체, 2 이상의 부분입체 이성질체의 혼합물, 호변 이성질체, 또는 2 이상의 호변 이성질체의 혼합물; 또는 이의 약학적 허용 염, 용매화물, 또는 수화물을 제공한다:
[화학식 (B)]
Figure pct00002
상기 식에서,
Rx는 접합기이고;
LN은 링커이며;
각각의 Q는 독립적으로 포스포트리에스터를 포함하는 올리고뉴클레오티드이고;
E는 1, 2, 3, 또는 4의 정수이다.
또한, 본원은 하기 화학식 (C)의 화합물 또는 이의 입체 이성질체, 2 이상의 부분입체 이성질체의 혼합물, 호변 이성질체, 또는 2 이상의 호변 이성질체의 혼합물; 또는 이의 약학적 허용 염, 용매화물, 또는 수화물을 제공한다:
[화학식 (C)]
Figure pct00003
상기 식에서,
Ab는 항체이고;
각각의 LN은 독립적으로 링커이며;
각각의 Q는 독립적으로 포스포트리에스터를 포함하는 올리고뉴클레오티드이고;
각각의 e는 독립적으로 1, 2, 3, 또는 4의 정수이며;
f는 1, 2, 3, 또는 4의 정수이다.
일 양태에서, 본원은 CpG-Ab 면역접합체의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하되, CpG-Ab 면역접합체가 종양 연관 항원(tumor associates antigen)(TAA)에 결합하지 않는, 암을 갖는 대상체에서 암을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 적어도 하나의 톨-유사 수용체를 발현하는 정상 면역 세포와 연관된 표적 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 정상 면역 세포는 TLR9를 발현한다. 일부 실시양태에서, 정상 면역 세포는 항원 제시 세포(APC)이다. 일부 실시양태에서, APC는 B 세포, 수지상 세포 또는 대식세포이다. 일부 실시양태에서, 표적 항원은 MHC 분자, T 세포 공동자극 분자, 면역 체크포인트 분자, B 세포 특이적 항원, 수지상 세포 특이적 항원 및 대식세포 특이적 항원으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, MHC 분자는 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 분자로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, T 세포 공동자극 분자는 OX40, CD2, CD27, CDS, ICAM-1, LFA-1/CD11a/CD18, ICOS/CD278, 4-1BB/CD137, GITR, CD30, CD40, BAFFR, HVEM, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3, 및 CD83으로 이루어진 목록으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 분자는 PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-1, TIM-3, LAG-3, CEACAM-1, CEACAM-5, CLTA-4, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD47, CD160, 2B4, CD172a, 및 TGFR로 이루어진 목록으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 표적 항원은 CD1, CD2, CD3, CD5, CD6, CD9, CD11, CD14, CD17, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD30, CD32, CD37, CD38, CD39, CD40, CD44, CD45R(B220), CD49, CD52, CD55, CD56, CD64, CD66(암배아 항원(Carcinoembrionic antigen), CEA), CD68, CD70, CD74, CD79b, CD80, CD93, CD115, CD123, CD126, CD127, CD137, CD138, CD163, CD196, CD197, CD200R, CD205, CD206, CD207, CD208, CD209, CD267, CD269, CD274, CD300a, CD301, CD303, CD304, CD319, CD336, CLEC5a, CLEC6, CLEC9a, CXCL16, CX3CR1, 및 DC-STAMP로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 표 2로부터 선택된 면역자극 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 p236, p238, p243, p246, p275, p276, p308, p313, p347, p361, p362, p425, p433, p434, p435, p436, p437, p438, p477, p478, p479, p480, p481, p482, p483, p484, p485, p486, p487, p488 및 p489로 이루어진 그룹으로부터 선택된 면역자극 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 T 세포 에피토프에 접합되지 않는다. 일부 실시양태에서, T 세포 에피토프는 오브알부민(ovalbumin)(OVA)의 에피토프이다. 일부 실시양태에서, 암은 고형 종양이다. 일부 실시양태에서, 암은 액상 종양이다. 본원에 제공된 방법의 일부 실시양태에서, 암은 재발암이다. 본원에 제공된 방법의 일부 실시양태에서, 투여 및 공동-투여는 전신 투여를 통한 것이다. 본원에 제공된 방법의 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체의 치료적 유효량은 대상체에서 보체 경로를 활성화하기 위해 효과적이지 않다. 본원에 제공된 방법의 일부 실시양태에서, 양은 대상체에서 보체 C3을 활성화하기 위해 효과적이지 않다.
일부 실시양태에서, 본원은 CpG-Ab 면역접합체의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하되, CpG-Ab 면역접합체가 종양 연관 항원(TAA)에 특이적으로 결합하고, TAA가 CD19, CD20, CD22, exportin 7, Her2, Src, EGFR, CD52, CXCR-4, Muc-1 및 DNA로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항원이 아닌, 암을 갖는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, TAA에 대한 CpG-Ab 면역접합체의 결합은 TAA를 발현하는 암 세포 내로의 CpG-Ab 면역접합체의 내부화를 용이하게 한다. 일부 실시양태에서, TAA에 대한 CpG-Ab 면역접합체의 결합은 TAA를 발현하는 암 세포의 엔도솜으로의 CpG-Ab 면역접합체의 수송을 용이하게 한다. 일부 실시양태에서, TAA에 대한 CpG-Ab 면역접합체의 결합은 TAA를 발현하는 암 세포에서 TLR9 시그널링 경로의 활성화를 용이하게 한다. 일부 실시양태에서, TAA 및 TLR9는 TAA를 발현하는 암 세포의 동일한 세포막 상에 위치한다. 일부 실시양태에서, TAA 및 TLR9 둘 다는 TAA를 발현하는 암 세포의 세포막 상에 위치한다. 일부 실시양태에서, TAA 및 TLR9 둘 다는 TAA를 발현하는 암 세포의 엔도솜 막 상에 위치한다. 일부 실시양태에서, TAA에 대한 CpG-Ab 면역접합체의 결합은 TAA를 발현하는 암 세포의 아폽토시스(apoptosis)를 유도한다. 일부 실시양태에서, TAA는 정상 면역 세포에 의해 발현되지 않는다. 일부 실시양태에서, TAA는 정상 면역 세포에 의해 발현된다. 일부 실시양태에서, 정상 면역 세포는 항원 제시 세포(APC)이다. 일부 실시양태에서, TAA는 CD8, CD11b, CD11c, CD14, CD33, CD40, CD123, CD157, CD168, CD169, CD172a, CD200, CD204, CD205, CD301, CD302, CD303, CD304, 및 CD206으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 TAA 또는 암에 의해 발현된 임의의 다른 TAA에 접합되지 않는다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 표 2로부터 선택된 면역자극 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 p236, p238, p243, p246, p275, p276, p308, p313, p347, p361, p362, p425, p433, p434, p435, p436, p437, p438, p477, p478, p479, p480, p481, p482, p483, p484, p485, p486, p487, p488 및 p489로 이루어진 그룹으로부터 선택된 면역자극 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 T 세포 에피토프에 접합되지 않는다. 일부 실시양태에서, T 세포는 오브알부민(OVA)이다. 일부 실시양태에서, 암은 고형 종양이다. 일부 실시양태에서, 암은 액상 종양이다. 본원에 제공된 방법의 일부 실시양태에서, 암은 재발암이다. 본원에 제공된 방법의 일부 실시양태에서, 투여 및 공동-투여는 전신 투여를 통한 것이다. 본원에 제공된 방법의 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체의 치료적 유효량은 대상체에서 보체 경로를 활성화하기 위해 효과적이지 않다. 본원에 제공된 방법의 일부 실시양태에서, 양은 대상체에서 보체 C3을 활성화하기 위해 효과적이지 않다.
일부 실시양태에서, 본원은 CpG-Ab 면역접합체의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 면역요법 저항성 또는 불응성 암을 갖는 대상체에서 면역요법 저항성 또는 불응성 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 종양 연관 항원에 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 적어도 하나의 톨-유사 수용체를 발현하는 정상 면역 세포와 연관된 표적 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 종양 연관 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 암은 면역 체크포인트 조절제를 이용한 치료에 대해 저항성이다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체에게 면역 체크포인트 조절제를 공동-투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 표 2로부터 선택된 면역자극 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 표 2에 나타낸 바와 같은 p236, p238, p243, p246, p275, p276, p308, p313, p347, p361, p362, p425, p433, p434, p435, p436, p437, p438, p477, p478, p479, p480, p481, p482, p483, p484, p485, p486, p487, p488 및 p489로 이루어진 그룹으로부터 선택된 면역자극 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 암은 고형 종양이다. 일부 실시양태에서, 암은 액상 종양이다. 본원에 제공된 방법의 일부 실시양태에서, 암은 재발암이다. 본원에 제공된 방법의 일부 실시양태에서, 투여 및 공동-투여는 전신 투여를 통한 것이다. 본원에 제공된 방법의 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체의 치료적 유효량은 대상체에서 보체 경로를 활성화하기 위해 효과적이지 않다. 본원에 제공된 방법의 일부 실시양태에서, 양은 대상체에서 보체 C3을 활성화하기 위해 효과적이지 않다.
일부 실시양태에서, 본원은 CpG-Ab 면역접합체의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하되, CpG-Ab 면역접합체가 적어도 하나의 톨-유사 수용체를 발현하는 정상 면역 세포와 연관된 표적 항원에 특이적으로 결합하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 예방하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이러한 방법은 종양 연관 항원을 CpG-Ab 면역접합체와 공동-투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 종양 연관 항원에 접합되지 않는다. 일부 실시양태에서, 정상 면역 세포는 TLR9를 발현한다. 일부 실시양태에서, 정상 면역 세포는 항원 제시 세포(APC)이다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 표 2로부터 선택된 면역자극 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 표 2에 나타낸 바와 같은 p236, p238, p243, p246, p275, p276, p308, p313, p347, p361, p362, p425, p433, p434, p435, p436, p437, p438, p477, p478, p479, p480, p481, p482, p483, p484, p485, p486, p487, p488 및 p489로 이루어진 그룹으로부터 선택된 면역자극 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 암은 고형 종양이다. 일부 실시양태에서, 암은 액상 종양이다. 본원에 제공된 방법의 일부 실시양태에서, 암은 재발암이다. 본원에 제공된 방법의 일부 실시양태에서, 투여 및 공동-투여는 전신 투여를 통한 것이다. 본원에 제공된 방법의 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체의 치료적 유효량은 대상체에서 보체 경로를 활성화하기 위해 효과적이지 않다. 본원에 제공된 방법의 일부 실시양태에서, 양은 대상체에서 보체 C3을 활성화하기 위해 효과적이지 않다.
일부 실시양태에서, 본원은 CpG-Ab 면역접합체의 치료적 유효량을 암 백신과 공동-투여하는 것을 포함하되, CpG-Ab 면역접합체가 적어도 하나의 톨-유사 수용체를 발현하는 정상 면역 세포와 연관된 표적 항원에 특이적으로 결합하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 예방하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 암 백신의 아쥬반트로서 제형화된다. 일부 실시양태에서, 암은 고형 종양이다. 일부 실시양태에서, 암은 액상 종양이다. 본원에 제공된 방법의 일부 실시양태에서, 암은 재발암이다. 본원에 제공된 방법의 일부 실시양태에서, 투여 및 공동-투여는 전신 투여를 통한 것이다. 본원에 제공된 방법의 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체의 치료적 유효량은 대상체에서 보체 경로를 활성화하기 위해 효과적이지 않다. 본원에 제공된 방법의 일부 실시양태에서, 양은 대상체에서 보체 C3을 활성화하기 위해 효과적이지 않다.
일부 실시양태에서, 본원은 CpG-Ab 면역접합체의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하되, CpG-Ab 면역접합체가 적어도 하나의 톨-유사 수용체를 발현하는 정상 면역 세포와 연관된 표적 항원에 특이적으로 결합하는, 대상체에서 적응성 면역 반응(adaptive immune response)을 유도하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 암을 갖는다. 일부 실시양태에서, 표적 항원은 TAA가 아니다. 일부 실시양태에서, 표적 항원은 CD19, CD20, CD22, STAT3, exportin 7, Her2, Src, EGFR, CD52, CXCR-4, Muc-1 및 DNA로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항원이 아닌 TAA이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 감염성 질환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 정상 면역 세포는 TLR9를 발현한다. 일부 실시양태에서, 정상 면역 세포는 항원 제시 세포(APC)이다. 일부 실시양태에서, 적응성 면역 반응은 CD8+ T 세포 의존성이다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 표 2로부터 선택된 면역자극 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 표 2에 나타낸 바와 같은 p236, p238, p243, p246, p275, p276, p308, p313, p347, p361, p362, p425, p433, p434, p435, p436, p437, p438, p477, p478, p479, p480, p481, p482, p483, p484, p485, p486, p487, p488 및 p489로 이루어진 그룹으로부터 선택된 면역자극 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 암은 고형 종양이다. 일부 실시양태에서, 암은 액상 종양이다. 본원에 제공된 방법의 일부 실시양태에서, 암은 재발암이다. 본원에 제공된 방법의 일부 실시양태에서, 투여 및 공동-투여는 전신 투여를 통한 것이다. 본원에 제공된 방법의 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체의 치료적 유효량은 대상체에서 보체 경로를 활성화하기 위해 효과적이지 않다. 본원에 제공된 방법의 일부 실시양태에서, 양은 대상체에서 보체 C3을 활성화하기 위해 효과적이지 않다.
일부 실시양태에서, 본원은 대상체에게 표 6으로부터 선택된 CpG-Ab 면역접합체의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 종양 연관 항원(TAA)에 결합한다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 TAA 이외의 표적 항원에 결합한다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 TLR 수용체를 발현하는 정상 면역 세포와 연관된 표적 항원에 결합한다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 표 2에 나타낸 바와 같은 p236, p238, p243, p246, p275, p276, p308, p313, p347, p361, p362, p425, p433, p434, p435, p436, p437, p438, p477, p478, p479, p480, p481, p482, p483, p484, p485, p486, p487, p488 및 p489를 포함하는 CpG-Ab 면역접합체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 추가 암 치료제의 치료적 유효량을 공동-투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 추가 암 치료제는 제2 TAA, T 세포 공동자극 분자, 및 면역 체크포인트 조절제로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 제2 TAA는 TAA와 동일하다. 일부 실시양태에서, 제2 TAA는 TAA와 상이하다. 일부 실시양태에서, T 세포 공동자극 분자는 OX40, CD2, CD27, CDS, ICAM-1, LFA-1/CD11a/CD18, ICOS/CD278, 4-1BB/CD137, GITR, CD30, CD40, BAFFR, HVEM, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3, 및 CD83 또는 이의 리간드로 이루어진 목록으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, T 세포 공동자극 분자는 항-OX40 항체, 항-ICOS/CD278 항체 또는 항-4-1BB/CD137 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 조절제는 PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3, LAG-3, CEACAM-1, CEACAM-5, CLTA-4, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD47, CD160, 2B4, CD172a, 및 TGFR로 이루어진 목록으로부터 선택된 면역 체크포인트 분자의 억제제이다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 조절제는 항-CD47 항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이다. 일부 실시양태에서, 암은 고형 종양이다. 일부 실시양태에서, 암은 액상 종양이다. 본원에 제공된 방법의 일부 실시양태에서, 암은 재발암이다. 본원에 제공된 방법의 일부 실시양태에서, 투여 및 공동-투여는 전신 투여를 통한 것이다. 본원에 제공된 방법의 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체의 치료적 유효량은 대상체에서 보체 경로를 활성화하기 위해 효과적이지 않다. 본원에 제공된 방법의 일부 실시양태에서, 양은 대상체에서 보체 C3을 활성화하기 위해 효과적이지 않다.
본원에 제공된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 상기 정의된 바와 같은 화학식 (A)의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 상기 정의된 바와 같은 화학식 (B)의 화합물을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 상기 정의된 바와 같은 화학식 (C)의 화합물을 포함한다.
도면의 간단한 설명
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도 1a는 상응하는 구조를 갖는 축약형을 나타내는 일련의 구조이다. 축약형은 표 2에서 사용된 것들이다.
도 1b는 상응하는 구조를 갖는 축약형을 나타내는 일련의 구조이다. 축약형은 표 2에서 사용된 것들이다.
도 2는 단일-가닥 CpG ODN(레인 A(p145) 및 D(p88)) 및 어닐링된(annealed) 이중-가닥 CpG ODN(레인 B(p88/p144) 및 C(p88/p145))의 에티듐 브로마이드-염색된 변성 겔의 이미지이다.
도 3a는 폴리뉴클레오티드(각각 레인 B, C, D, E, F, G, 및 H에 상응하는 p76, p77, p78, p79, p80, p81, 및 p82)와의 마우스 트랜스글루타미나아제-매개된 접합 전(레인 A) 및 후의 Q-태그된 항-CD38 항체의 에티듐 브로마이드-염색된 환원 겔의 이미지이다. HC+1은 폴리뉴클레오티드에 접합된 Q-태그된 항-CD38 항체 중쇄의 밴드를 나타낸다. HC는 Q-태그된 항-CD38 항체 중쇄의 밴드를 나타낸다. LC는 항-CD38 항체 경쇄를 나타낸다.
도 3b는 폴리뉴클레오티드(각각 레인 B, C, D, E, F, 및 G에 상응하는 p83, p84, p85, p86, p87, 및 p88)와의 미생물 트랜스글루타미나아제-매개된 접합 전(레인 A) 및 후의 Q-태그된 항-CD38 항체의 에티듐 브로마이드-염색된 환원 겔의 이미지이다. HC+1은 폴리뉴클레오티드에 접합된 Q-태그된 항-CD38 항체 중쇄의 밴드를 나타낸다. HC는 Q-태그된 항-CD38 항체 중쇄의 밴드를 나타낸다. LC는 항-CD38 항체 경쇄를 나타낸다.
도 4a는 단일-가닥 폴리뉴클레오티드(레인 B, p88을 갖는 Dar1 접합체) 또는 이중-가닥 폴리뉴클레오티드(레인 C, D, E, 및 F)에 대한 쌍극 부가환화(dipolar cycloaddition)를 통한 접합 전(레인 A) 및 후의 아지드 링커에 접합된 Q-태그된 항-CD38의 에티듐 브로마이드-염색된 변성 겔의 이미지이다. 레인 C는 무-금속 1,3-쌍극 부가환화에 의해 p88/p145 이중-가닥 CpG에 연결된 Q-태그된 항-CD38 항체의 접합체에 대해 단리된 제1 AEX 피크에 상응한다. 레인 D는 무-금속 1,3-쌍극 부가환화에 의해 p88/p145 이중-가닥 CpG에 연결된 Q-태그된 항-CD38 항체의 접합체에 대해 단리된 제2 AEX 피크에 상응한다. 레인 E는 무-금속 1,3-쌍극 부가환화에 의해 p88/p144 이중-가닥 CpG에 연결된 Q-태그된 항-CD38 항체의 접합체에 대해 단리된 제1 AEX 피크에 상응한다. 레인 F는 무-금속 1,3-쌍극 부가환화에 의해 p88/p144 이중-가닥 CpG에 연결된 Q-태그된 항-CD38 항체의 접합체에 대해 단리된 제2 AEX 피크에 상응한다.
도 4b는 280 nm 및 260 nm에서의 흡광도를 기본으로 하여 신호를 나타내는 리툭시맙-p19 접합체를 함유하는 미가공 혼합물(crude mixture)에 대한 AEX-HPLC 흔적을 나타내는 그래프이다. 리툭시맙-p19 접합체에 상응하는 3 개의 피크가 있다.
도 4c는 도 4b에서 열거된 미가공 혼합물, p19, 및 리툭시맙-p19 AEX 피크 1, 2, 및 3에 대한 AEX-HPLC 흔적의 합성을 나타내는 그래프이다.
도 4d는 리툭시맙-PEG24-N3(레인 A), 미가공 접합 반응(conjugation reaction) 혼합물(레인 B), 및 단리된 리툭시맙-p19 AEX 피크 1(레인 C), 2(레인 D), 및 3(레인 E)을 비교한 변성 SDS PAGE 6% 트리스-글리신 겔의 이미지이다.
도 5는 뮤린 비장세포에서 용량-의존적으로 IL-6을 유도하는 뮤린 면역자극 폴리뉴클레오티드의 효능을 나타내는 그래프이다. 도시된 데이터는 p18의 뮤린 면역자극 폴리뉴클레오티드에 대해 적어도 15 개의 포스포로티오에이트가 면역자극 활성을 달성하기 위해 바람직하다는 것을 나타낸다. 접합된 표적화 모이어티의 부재시, 포스포로티오에이트 백본은 IL-6을 유도하는 면역자극 폴리뉴클레오티드의 효능을 제어하는 중요한 특징이다.
도 6은 처치 5.5 시간 후 알칼리 포스파타아제의 수준에 의해 측정된 바와 같은 라모스 블루(Ramos Blue) 세포에서 용량-의존적으로 NFκB의 활성화에서 본 발명의 면역접합체 및 CpG 7909의 효능을 나타내는 그래프이다. x-축은 접합체의 농도(nM)를 log 스캐일로 제공한다.
도 7은 처치 24 시간 및 QB 항온처리 2.5 시간 후 알칼리 포스파타아제의 수준에 의해 측정된 바와 같은 라모스 블루 세포에서 용량-의존적으로 NFκB의 활성화에서 면역접합체 및 CpG 7909의 효능을 나타내는 그래프이다. x 축은 접합체의 농도(M)의 log를 선형 스캐일로 제공한다.
도 8은 처치 48 시간 및 QB 항온처리 2.5 시간 후 알칼리 포스파타아제의 수준에 의해 측정된 바와 같은 라모스 블루 세포에서 용량-의존적으로 NFκB의 활성화에서 면역접합체의 효능을 나타내는 그래프이다. x 축은 접합체의 농도(M)의 log를 선형 스캐일로 제공한다.
도 9는 알칼리 포스파타아제의 수준에 의해 측정된 바와 같은 라모스 블루 세포에서 용량-의존적으로 NFκB의 활성화에서 p1 및 p6 폴리뉴클레오티드의 효능을 비교한 그래프이다.
도 10은 알칼리 포스파타아제의 수준에 의해 측정된 바와 같은 라모스 블루 세포에서 용량-의존적으로 NFκB의 활성화에서 면역접합체의 효능을 나타내는 그래프이다.
도 11은 알칼리 포스파타아제의 수준에 의해 측정된 바와 같은 라모스 블루 세포에서 용량-의존적으로 NFκB의 활성화에서 면역접합체의 효능을 나타내는 그래프이다.
도 12는 알칼리 포스파타아제의 수준에 의해 측정된 바와 같은 라모스 블루 세포에서 용량-의존적으로 NFκB의 활성화에서 면역접합체의 효능을 나타내는 그래프이다.
도 13은 알칼리 포스파타아제의 수준에 의해 측정된 바와 같은 라모스 블루 세포에서 용량-의존적으로 NFκB의 활성화에서 면역접합체의 효능을 나타내는 그래프이다.
도 14는 알칼리 포스파타아제의 수준에 의해 측정된 바와 같은 라모스 블루 세포에서 용량-의존적으로 NFκB의 활성화에서 면역접합체의 효능을 나타내는 그래프이다.
도 15는 DB 세포에서 IL-6의 용량-의존적 유도에서 면역접합체의 효능을 나타내는 그래프이다. y-축은 PPIB 수준에 대해 정규화된 IL6 분비의 증가에 대한 배율을 나타낸다.
도 16은 라모스 블루 세포에서 NFκB의 용량-의존적 유도에서 면역접합체의 효능을 나타내는 그래프이다. 이 도면은 NFκB를 활성화하기 위한 하나의 폴리뉴클레오티드(Dar1) 또는 2 개의 폴리뉴클레오티드(Dar2)를 갖는 접합체를 비교한다.
도 17은 DB 세포에서 IL-6의 용량-의존적 유도에서 면역접합체의 효능을 나타내는 그래프이다. 이 도면은 IL6을 유도하기 위한 하나의 폴리뉴클레오티드(Dar1) 또는 2 개의 폴리뉴클레오티드(Dar2)를 갖는 접합체를 비교한다. y-축은 PPIB 수준에 대해 정규화된 IL6 분비의 증가에 대한 배율을 나타낸다.
도 18은 알칼리 포스파타아제 판독에 의해 측정된 바와 같은 라모스-블루 세포에서 NFκB를 활성화하는데 다양한 길이의 면역자극 폴리뉴클레오티드를 함유하는 면역접합체의 효능을 나타내는 그래프이다.
도 19는 알칼리 포스파타아제 판독에 의해 측정된 바와 같은 라모스-블루 세포에서 NFκB를 활성화하는데 다양한 길이의 면역자극 폴리뉴클레오티드를 함유하는 면역접합체의 효능을 나타내는 그래프이다.
도 20은 인터뉴클레오시드 포스포디에스터 포스포로티오에이트에 결합된 5'-말단 5-요오도-2-데옥시우리딘을 갖는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 접합체의 면역자극 활성에 대한 인터뉴클레오시드 포스포디에스터 포스페이트에 결합된 5'-말단 5-요오도-2-데옥시우리딘을 갖는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 접합체의 면역자극 활성의 비교를 나타내는 그래프이다. 면역자극 활성은 알칼리 포스파타아제 판독에 의해 측정된 바와 같이 라모스-블루 세포에서 NFκB 활성화의 측정을 통해 평가하였다.
도 21은 인터뉴클레오시드 포스포디에스터 포스포로티오에이트에 결합된 5'-말단 5-요오도-2-데옥시우리딘을 갖는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 접합체의 면역자극 활성에 대한 인터뉴클레오시드 포스포디에스터 포스페이트에 결합된 5'-말단 5-요오도-2-데옥시우리딘을 갖는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 접합체의 면역자극 활성의 비교를 나타내는 그래프이다. 면역자극 활성은 알칼리 포스파타아제 판독에 의해 측정된 바와 같이 라모스-블루 세포에서 NFκB 활성화의 측정을 통해 평가하였다.
도 22는 1 이상의 5-요오도-2-데옥시우리딘을 함유하는 접합체의 면역자극 활성의 비교를 나타내는 그래프이다. 면역자극 활성은 알칼리 포스파타아제 판독에 의해 측정된 바와 같이 라모스-블루 세포에서 NFκB 활성화의 측정을 통해 평가하였다.
도 23은 5-요오도-2-데옥시우리딘을 함유하거나 결여된 접합체의 면역자극 활성의 비교를 나타내는 그래프이다. 면역자극 활성은 알칼리 포스파타아제 판독에 의해 측정된 바와 같이 라모스-블루 세포에서 NFκB 활성화의 측정을 통해 평가하였다.
도 24는 포스페이트-기반 또는 포스포로티오에이트-기반인 인터뉴클레오시드 포스포트리에스터를 함유하는 접합체의 면역자극 활성의 비교를 나타내는 그래프이다. 면역자극 활성은 알칼리 포스파타아제 판독에 의해 측정된 바와 같이 라모스-블루 세포에서 NFκB 활성화의 측정을 통해 평가하였다.
도 25는 포스페이트-기반 또는 포스포로티오에이트-기반인 인터뉴클레오시드 포스포트리에스터를 함유하는 접합체의 면역자극 활성의 비교를 나타내는 그래프이다. 면역자극 활성은 알칼리 포스파타아제 판독에 의해 측정된 바와 같이 라모스-블루 세포에서 NFκB 활성화의 측정을 통해 평가하였다.
도 26a는 1 이상의 포스포로티오에이트-기반 인터뉴클레오시드 포스포트리에스터를 함유하는 접합체의 면역자극 활성의 비교를 나타내는 그래프이다. 면역자극 활성은 알칼리 포스파타아제 판독에 의해 측정된 바와 같이 라모스-블루 세포에서 NFκB 활성화의 측정을 통해 평가하였다.
도 26b는 1 이상의 포스포로티오에이트-기반 인터뉴클레오시드 포스포트리에스터를 함유하는 접합체의 면역자극 활성의 비교를 나타내는 그래프이다. 면역자극 활성은 알칼리 포스파타아제 판독에 의해 측정된 바와 같이 라모스-블루 세포에서 NFκB 활성화의 측정을 통해 평가하였다.
도 27은 항체 및 1 이상의 면역자극 폴리뉴클레오티드를 함유하는 접합체의 면역자극 활성의 비교를 나타내는 그래프이다. 면역자극 활성은 알칼리 포스파타아제 판독에 의해 측정된 바와 같이 라모스-블루 세포에서 NFκB 활성화의 측정을 통해 평가하였다.
도 28은 항체에서 중쇄 Q-태그 또는 경쇄 Q-태그를 통해 접합된 면역자극 폴리뉴클레오티드의 세포 의존 세포독성(cellular dependent cytotoxicity)(CDC)의 비교를 나타내는 그래프이다. CDC 어세이는 인간 혈청에서 접합체와 함께 항온처리된 다우디(Daudi) 세포에서 수행하였으며 세포독성은 형광에 의해 측정하였다.
도 29는 보조 모이어티를 갖는 접합체의 면역자극 활성의 비교를 나타내는 그래프이다. 면역자극 활성은 알칼리 포스파타아제 판독에 의해 측정된 바와 같이 라모스-블루 세포에서 NFκB 활성화의 측정을 통해 평가하였다. 괄호 내의 표시는 접합체에서 사용된 링커/보조 모이어티 구조를 나타내고, AM 없음은 접합체 SB-189가 보조 모이어티를 함유하지 않는다는 것을 나타낸다.
도 30은 보조 모이어티를 갖는 접합체의 CDC 활성의 비교를 나타내는 그래프이다. CDC 어세이는 인간 혈청에서 접합체와 함께 항온처리된 다우디 세포에서 수행하였으며 세포독성은 형광에 의해 측정하였다.
도 31은 Q-태그를 통해 뮤린 항-CD22 항체에 연결된 절단 뮤린 교차-반응성 인간 면역자극 폴리뉴클레오티드(p275)를 함유하는 접합체를 사용한 A20 마우스 B-세포 림프종 세포에서의 IL6의 유도를 나타내는 그래프이다.
도 32는 Q-태그를 통해 뮤린 항-CD22 항체에 연결된 절단 뮤린 교차-반응성 인간 면역자극 폴리뉴클레오티드(p275)를 함유하는 접합체를 사용한 A20 마우스 B-세포 림프종 세포에서의 IL6의 유도를 나타내는 그래프이다.
도 33a는 면역자극 폴리뉴클레오티드 또는 비접합된 면역자극 폴리뉴클레오티드를 함유하는 접합체를 사용한 A20 마우스 B-세포 림프종 세포에서의 IL6의 유도를 나타내는 그래프이다.
도 33b는 다양한 농도의 유리 항-마우스 CD22 항체의 존재 하에 항-마우스 CD22 항체 및 면역자극 폴리뉴클레오티드를 함유하는 접합체에 의한 A20 마우스 B-세포 림프종 세포에서의 IL6의 유도를 나타내는 그래프이다.
도 34a는 CpG-2336, 클래스 A CpG ODN에 의한 인간 PBMC에서의 인터페론-α의 유도를 나타내는 그래프이다.
도 34b는 접합체 SB-340을 사용한 인간 PBMC에서의 인터페론-α의 유도를 나타내는 그래프이다. 항-BDCA2 항체, SB-341, 및 p246을 이 실험에서 대조군으로서 사용하였다. Y-축은 450 nm의 파장에서 임의 단위의 광학 밀도를 제공한다.
도 34c는 접합체 SB-342를 사용한 정제된 플라스마사이토이드 세포에서의 인터페론-α의 유도를 나타내는 그래프이다. 항-BDCA2 항체, 항-BDCA4 항체, 및 SB-343을 이 실험에서 대조군으로서 사용하였다.
도 35는 다양한 5'-말단 변형 및 인터뉴클레오시드 트리에스터와 폴리뉴클레오티드의 면역자극 활성의 비교를 나타내는 그래프이다.
도 36은 다양한 5'-말단 변형 및 인터뉴클레오시드 트리에스터와 폴리뉴클레오티드의 면역자극 활성의 비교를 나타내는 그래프이다.
도 37a는 A20 마우스 B-세포 림프종 세포를 이용한 마우스의 접종 후, 비히클(생리식염수) 또는 본 발명의 면역자극 폴리뉴클레오티드(p326) 및 대조군(p18)의 삼중 종양내 투여 후, 종양 부피 성장 진행을 나타내는 그래프이다. 투여 시간은 X-축 상에 화살표로 나타난다.
도 37b는 A20 마우스 B-세포 림프종 세포를 이용한 마우스의 접종 후, 비히클(생리식염수), 면역자극 폴리뉴클레오티드(p3), 항-CD22 항체(CD22), 또는 접합체 SB-338, SB-339, 또는 SB-344의 삼중 정맥내 투여 후, 종양 부피 성장 진행을 나타내는 그래프이다. 투여 시간은 X-축 상에 화살표로 나타난다.
도 38a는 A20 마우스 B-세포 림프종 세포를 이용한 마우스의 접종 후, 비히클(생리식염수) 또는 면역자극 폴리뉴클레오티드의 삼중 종양내 투여 후, 종양 부피 성장 진행을 나타내는 그래프이다.
도 38b는 A20 마우스 B-세포 림프종 세포를 이용한 마우스의 접종 후, 비히클(생리식염수) 또는 면역자극 폴리뉴클레오티드의 삼중 종양내 투여 후 20 일차에, 종양 부피 값을 나타내는 그래프이다.
도 39a는 A20 마우스 B-세포 림프종 세포를 이용한 마우스의 접종 후, (i) 본 발명의 접합체(SB-337)의 단일 정맥내 투여, 또는 (ii) 비히클(생리식염수) 또는 면역자극 폴리뉴클레오티드의 삼중 종양내 투여 후, 종양 부피 성장 진행을 나타내는 그래프이다.
도 39b는 A20 마우스 B-세포 림프종 세포를 이용한 마우스의 접종 후, (i) 본 발명의 접합체(SB-337)의 단일 정맥내 투여, 또는 (ii) 비히클(생리식염수) 또는 면역자극 폴리뉴클레오티드의 삼중 종양내 투여 후 20 일차에, 종양 부피 값을 나타내는 그래프이다.
도 40은 A20 마우스 림프종 세포가 접종된 후 생리식염수, 유리 항체, 항체-면역자극 폴리뉴클레오티드 접합체, 또는 유리 면역자극 폴리뉴클레오티드로 처치된 Balb/c 마우스에 대한 생존율(%)을 나타내는 그래프이다. 대조군은 비-접종된, 미처치된 Balb/c 마우스이다. CD22-10 및 CD22-3으로서 확인된 선은 치료 요법에 대한 마우스 생존율(%)을 제공한다: 각각 10 mg/kg의 유리 항-마우스 CD22 항체 및 3 mg/kg의 유리 항-마우스 CD22 항체. SB-337-10 및 SB-337-3으로서 확인된 선은 치료 요법에 대한 마우스 생존율(%)을 제공한다: 각각 10 mg/kg의 SB-337 및 3 mg/kg의 SB-337.
도 41a는 37℃에서 최대 24 시간 동안 마우스 혈청에서 항온처리된 폴리뉴클레오티드 샘플의 변성 겔의 이미지이다.
도 41b는 37℃에서 최대 24 시간 동안 마우스 혈청에서 항온처리된 폴리뉴클레오티드 샘플의 변성 겔의 이미지이다.
도 41c는 37℃에서 최대 24 시간 동안 래트 혈청에서 항온처리된 폴리뉴클레오티드 샘플의 변성 겔의 이미지이다.
도 41d는 37℃에서 최대 24 시간 동안 원숭이 혈청에서 항온처리된 폴리뉴클레오티드 샘플의 변성 겔의 이미지이다.
도 41e는 37℃에서 최대 24 시간 동안 인간 혈청에서 항온처리된 폴리뉴클레오티드 샘플의 변성 겔의 이미지이다.
도 42는 80% 마우스 혈청에서 폴리뉴클레오티드 안정성에 대한 면역자극 폴리뉴클레오티드의 5'-말단에서의 포스페이트-기반 및 포스포로티오에이트-기반 인터뉴클레오시드 포스포디에스터의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 43은 80% 마우스 혈청에서의 노화 실험에서 분해된 p246 및 온전한 p246의 비율을 나타내는 그래프이다.
도 44는 80% 마우스 혈청에서 폴리뉴클레오티드의 안정성에 대한 5'-말단 뉴클레오티드 구조의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 45는 80% 마우스 혈청, 80% 비-인간 영장류(non-human primate)(NHP) 혈청, 및 80% 인간 혈청에서 폴리뉴클레오티드의 안정성에 대한 5'-말단 뉴클레오티드 구조의 효과를 나타내는 그래프이다. 마우스 혈청 데이터는 별표로 표시되며, 이는 이들 데이터가 별도의 연구에서 얻어졌기 때문이다.
도 46a는 파종성 B-세포 림프종을 갖는 마우스에게 CpG-Ab(마우스 항-CD22 mAb에 접합된 CpG ODN)의 정맥내 용량을 투여한 실시예 6에 기재된 바와 같은 실험 계획을 도시한다.
도 46b는 (i) 3mg/kg CpG(p313)-mAb(CD22) 접합체(채워진 다이아몬드); (ii) 10 mg/kg CpG-mAb(CD22)(채워진 삼각형); (iii) 네이키드(naked) CpG ODN(빈 삼각형); (iv) 10 mg/kg CD22 mAb(채워진 사각형); (v) 10 mg/kg GpC-mAb 대조군 접합체(빈 사각형); 또는 (vi) 생리식염수(채워진 원)로 1, 3 및 5 일차에 처치된 파종성 B-세포 림프종을 갖는 마우스의 생존율을 나타낸다.
도 46c는 1 차 종양 도전에서 생존한 후 47 일차에 2 차 종양 도전을 받은 마우스의 생존율을 나타낸다. 2 차 종양 도전 후의 생존자에게는 처치가 제공되지 않았다. 1, 3, 및 5 일차에 10 mg/kg CpG-mAb(CD22)로 처치된 생존자(역삼각형); 1, 3, 및 5 일차에 3 mg/kg CpG-mAb(CD22)로 처치된 생존자(다이아몬드); 47 일차에 종양 세포로 도전 받고 생리식염수로 처치된 2 차 대조군(정삼각형).
도 46d는 마우스가 1 차 및 2 차 종양 도전에서 생존한 후 90 일차에 3 차 종양 도전을 받은 실험을 나타낸다. 2 차 및 3 차 종양 도전 후의 생존자에게는 처치가 제공되지 않았다. 3 차 대조군은 90 일차에 종양 세포로 도전 받았으며 생리식염수로 처치되었다. 생존자(사각형) 및 대조군(원)의 종양 부피를 90 일차 내지 120 일차에 모니터링하였다.
도 47a는 고형 B-세포 림프종을 갖는 마우스에게 CpG-Ab(마우스 항-CD22 mAb에 접합된 CpG ODN)의 정맥내 용량을 투여한 실시예 7에 기재된 바와 같은 실험 계획을 도시한다.
도 47b는 9, 12 및 14 일차에 (i) 3 mg/kg CpG-mAb(CD22)(빈 다이아몬드); (ii) 10 mg/kg CpG-mAb(CD22)(큰 채워진 삼각형); (iii) 네이키드 CpG ODN(빈 삼각형); (iv) 10 mg/kg CD22 mAb(채워진 사각형); (v) 10 mg/kg GpC-mAb 대조군 접합체(작은 채워진 사각형), 또는 (vi) 생리식염수(채워진 원)로 처치된 고형 B-세포 림프종을 갖는 마우스의 종양 부피를 나타낸다.
도 47c는 대조군(생리식염수 및 SB-339)과 비교하여 10 mg/kg의 SB-337 DAR1 또는 10 mg/kg의 SB-337 DAR2로 처치된 고형 B-세포 림프종을 갖는 마우스의 종양 부피를 나타낸다.
도 47d는 대조군(생리식염수 및 SB-339)과 비교하여 10 mg/kg의 SB-337 PEG24Bis DAR1 또는 10 mg/kg의 SB-337 PEG24Bis DAR2로 처치된 고형 B-세포 림프종을 갖는 마우스의 종양 부피를 나타낸다.
도 47e는 생리식염수 대조군과 비교하여 10 mg/kg의 PD-1, 10 mg/kg의 PD-1 + 3 mg/kg의 SB-337 DAR1; 또는 10 mg/kg의 PD-1 + 3 mg/kg의 SB-337 DAR2로 처치된 고형 B-세포 림프종을 갖는 마우스의 종양 부피를 나타낸다.
47f는 대조군(생리식염수 및 mCD22)과 비교하여 마우스의 체중에 대한 p347, SB-337 DAR1, 및 SB-337 DAR2의 효과를 나타낸다.
도 48a는 고형 결장 암종을 갖는 마우스에게 B-세포 표적화 CpG-Ab(마우스 항-CD22 mAb에 접합된 CpG ODN) 단독 또는 항-PD-1 항체와의 조합의 정맥내 용량을 투여한 실시예 8에 기재된 바와 같은 실험 계획을 도시한다.
도 48b는 (i) 3 mg/kg CpG-mAb(CD22)(정삼각형); (ii) 항-PD-1 항체(채워진 사각형); (iii) 항-PD-1 항체와 조합된 3 mg/kg CpG-mAb(CD22)(역삼각형); 및 (iv) 생리식염수(채워진 원)를 투여받은 후 고형 B-세포 림프종 모델을 갖는 마우스의 종양 부피를 나타낸다.
도 49a는 (i) 10 mg/kg CpG-mAb(CD22)(삼각형) 또는 생리식염수(원)를 투여받은 후 고형 B-세포 림프종을 갖는 면역-적격 Balb/C 마우스에서의 종양 부피를 나타낸다.
도 49b는 (i) 10 mg/kg CpG-mAb(CD22)(사각형), (ii) 네이키드 CpG ODN(삼각형) 또는 (iii) 생리식염수(원)를 투여받은 후 고형 B-세포 림프종을 갖는 면역-저하 Nu/Nu 마우스에서의 종양 부피를 나타낸다.
도 49c는 (i) 10 mg/kg CpG-mAb(CD22)(사각형), (ii) 네이키드 CpG ODN(삼각형) 또는 (iii) 생리식염수(원)를 투여받은 후 고형 B-세포 림프종을 갖는 면역-저하 SCID 마우스에서의 종양 부피를 나타낸다.
도 50a는 (i) CpG-mAb(CD22) 단독(빈 원); (ii) CpG-mAb(CD22) 및 CD4+ T 세포 고갈 처치(빈 사각형); (iii) CD4+ T 세포 고갈 처치(채워진 사각형); 또는 (iv) 생리식염수(채워진 원)를 투여받은 후 가용성 B-세포 림프종을 갖는 마우스의 생존율을 나타낸다.
도 50b는 (i) CpG-mAb(CD22) 단독(빈 원); (ii) CpG-mAb(CD22) 및 천연 킬러(NK) 세포 고갈 처치(빈 사각형); (iii) NK 세포 고갈 처치(채워진 사각형); 또는 (iv) 생리식염수(채워진 원)을 투여받은 후 가용성 B-세포 림프종을 갖는 마우스의 생존율을 나타낸다.
도 50c는 (i) CpG-mAb(CD22) 단독(빈 원); (ii) CpG-mAb(CD22) 및 CD8+ T 세포 고갈 처치(빈 사각형); (iii) CD8+ T 세포 고갈 처치(채워진 사각형); 또는 (iv) 생리식염수(채워진 원)를 투여받은 후 가용성 B-세포 림프종을 갖는 마우스의 생존율을 나타낸다.
도 51a는 CpG-mAb(CD22)(사각형) 또는 생리식염수(원)를 투여받은 후 고형 B-세포 림프종을 갖는 마우스에서의 종양 부피를 나타낸다. 17 일차에 분해를 위해 마우스를 희생시키고 종양을 수집하였다.
도 51b는 (i) CpG-Ab(사각형) 또는 (ii) 생리식염수(원)로 처치된 고형 B-세포 림프종을 갖는 마우스로부터 수집된 종양에서 CD4+ 또는 CD8+ 생존 게이트 세포(gate cell)의 퍼센트를 나타낸다.
도 51c는 (i) CpG-Ab(사각형) 또는 (ii) 생리식염수(원)로 처치된 마우스에서 CD8+ 종양 세포의 퍼센트와 종양 부피 사이의 상관관계를 나타낸다.
도 52a는 (i) CpG-mAb(CD22) 단독(빈 원); (ii) 항-PD-1 항체 단독(채워진 사각형); (iii) 항-PD-1 항체와 조합된 CpG-mAb(CD22)(빈 사각형); 또는 (iv) 생리식염수(채워진 원)를 투여받은 후 고형 B-세포 림프종을 갖는 마우스에서의 종양 부피를 나타낸다.
도 52b는 (i) CpG-mAb(CD22) 단독(빈 원); (ii) 항-PD-L1 항체 단독(채워진 삼각형); (iii) 항-PD-L1 항체와 조합된 CpG-mAb(CD22)(빈 삼각형); 또는 (iv) 생리식염수(채워진 원)를 투여받은 후 고형 B-세포 림프종을 갖는 마우스에서의 종양 부피를 나타낸다.
도 52c는 (i) CpG-mAb(CD22) 단독(빈 원); (ii) 항-PD-1 항체 단독(채워진 사각형); (iii) 항-PD-1 항체와 조합된 CpG-mAb(CD22)(빈 사각형); (iv) 항-PD-1 항체 및 CD8+ T 세포 고갈 처치와 조합된 CpG-mAb(CD22); 또는 (v) 생리식염수(채워진 원)를 투여받은 후 고형 B-세포 림프종을 갖는 마우스에서의 종양 부피를 나타낸다.
도 53a는 (i) 항-PD-1 항체 단독(사각형); (ii) 항-PD-1 항체와 조합된 CpG-mAb(CD22)(다이아몬드); 또는 (iii) 생리식염수(원)를 투여받은 후 고형 B-세포 림프종을 갖는 마우스에서의 평균 종양 부피를 나타낸다.
도 53b는 항-PD-1 항체 단독을 투여받은 후 고형 B-세포 림프종을 갖는 개별 마우스에서의 종양 부피를 나타낸다.
도 53c는 CpG-mAb(CD22)/항-PD-1 항체 조합 처치를 투여받은 후 고형 B-세포 림프종을 갖는 개별 마우스에서의 종양 부피를 나타낸다.
도 53d는 2 차 종양 도전 후 1 차 종양 도전으로부터의 생존자(정삼각형) 및 나이브(naive) 대조군(역삼각형)의 종양 부피를 나타낸다.
도 54a는 (i) 항-OX40 항체 단독(삼각형); (ii) 항-OX40 항체와 조합된 CpG-mAb(CD22)(다이아몬드); 또는 (iii) 생리식염수(원)를 투여받은 후 고형 B-세포 림프종을 갖는 마우스에서의 종양 부피를 나타낸다.
도 54b는 (i) 항-ICOS 항체 단독(사각형); (ii) 항-ICOS 항체와 조합된 CpG-mAb(CD22)(삼각형); 또는 (iii) 생리식염수(원)를 투여받은 후 고형 B-세포 림프종을 갖는 마우스에서의 종양 부피를 나타낸다.
도 54c는 (i) 항-4-1BB 항체 단독(다이아몬드); (ii) 항-4-1BB 항체와 조합된 CpG-mAb(CD22)(삼각형); 또는 (iii) 생리식염수(원)를 투여받은 후 고형 B-세포 림프종을 갖는 마우스에서의 종양 부피를 나타낸다.
도 55a는 10, 13 및 16 일차 각각에 (i) 10 mg/kg CpG-mAb(CD22) 또는 (i) 생리식염수를 투여받은 후 결장 암종을 갖는 마우스에서의 종양 부피를 나타낸다.
도 55b는 세포를 AH1 항원으로 자극하기 전 또는 후에 (i) CpG-mAb(CD22) 또는 (i) 생리식염수로 처치된 마우스로부터 단리된 106개의 비장세포에서의 IFN-감마 분비 세포의 수를 나타낸다.
도 56a는 10, 12 및 14 일차 각각에 (i) 10 mg/kg CpG-Ab(PD-L1)(다이아몬드); (i) 10 mg/kg CpG-Ab(CD205)(삼각형); 또는 (iii) 생리식염수의 정맥내 용량을 투여받은 후 고형 B-세포 림프종을 갖는 마우스에서의 평균 종양 부피를 나타낸다.
도 56b는 10, 12, 및 14 일차에 10 mg/kg CpG-Ab(CD205)의 정맥내 용량을 투여받은 후 B-세포 림프종을 갖는 개별 마우스에서의 종양 부피를 나타낸다.
도 56c는 10, 12 및 14 일차에 10 mg/kg CpG-Ab(PD-L1)의 정맥내 용량을 투여받은 후 B-세포 림프종을 갖는 개별 마우스에서의 종양 부피를 나타낸다.
도 56d는 38 일차에 2 차 종양 도전 후 CpG-Ab(CD205)(사각형)로 처치되거나CpG-Ab(PD-L1)(삼각형) 및 나이브 대조군(원)으로 처치된 1 차 종양 도전으로부터의 생존자의 종양 부피를 나타낸다.
도 57a는 10, 12 및 14 일차 각각에 (i) 10 mg/kg CpG-Ab(CD205)(삼각형); (ii) 10 mg/kg 항-CD205 항체(사각형); (iii) 10 mg/kg 마우스 IgG(빈 원); 또는 (iv) 생리식염수(채워진 원)의 정맥내 용량을 투여받은 후 고형 B-세포 림프종을 갖는 마우스에서의 평균 종양 부피를 나타낸다.
도 57b는 10, 12 및 14 일차 각각에 10 mg/kg 항-CD205 항체의 정맥내 용량을 투여받은 후 고형 B-세포 림프종을 갖는 개별 마우스에서의 종양 부피를 나타낸다.
도 57c는 10, 12 및 14 일차 각각에 10 mg/kg CpG-Ab(CD205)의 정맥내 용량을 투여받은 후 고형 B-세포 림프종을 갖는 개별 마우스에서의 종양 부피를 나타낸다.
도 57d는 10, 12 및 14 일차 각각에 10 mg/kg 래트 IgG2a 항체의 정맥내 용량을 투여받은 후 고형 B-세포 림프종을 갖는 개별 마우스에서의 종양 부피를 나타낸다.
도 58은 p246에 접합된 항-CD38 항체(채워진 사각형), p4에 접합된 항-CD38 항체(채워진 원), 비접합된 p246(빈 사각형) 또는 비접합된 p4(빈 원)로 처치된 후 인간 라모스 세포에서의 NFκB 활성화를 나타낸다.
도 59는 원숭이 혈청을 지모산(역삼각형; 양성 대조군), p1(채워진 원), 또는 본원에 제공된 바와 같은 2 개의 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드(채워진 사각형 및 채워진 삼각형)와 함께 항온처리한 후 보체 활성화(C3 방출에 의해 측정되는 바와 같음)를 나타낸다.
도 60a는 10, 12 및 14 일차 각각에 (i) 생리식염수(채워진 원); (ii) 3 mg/kg CpG-Ab(4523-CD22; SB-337)(사각형); (iii) 3 mg/kg CD19-mAb(채워진 역삼각형); (iv) 3 mg/kg CpG-Ab(4523-CD19; SB-388)(채워진 다이아몬드); (v) 1.9 ㎍/마우스 네이키드 CpG (P347)(정삼각형); (vi) 19 ㎍/마우스 네이키드 CpG(p347)(빈 역삼각형); (vii) 190 ㎍/마우스 네이키드 CpG(P347)(빈 다이아몬드)의 정맥내 용량 후 A20 마우스 B-세포 림프종 세포 이종이식을 갖는 마우스의 평균 종양 부피 성장 진행을 나타낸다.
도 60b는 10, 12 및 14 일차 각각에 (i) 생리식염수(단색); (ii) 3 mg/kg CpG-Ab(SB-337)(체크무늬); (iii) 3 mg/kg CD19-mAb(수평선); (iv) 3 mg/kg CpG-Ab(SB-388)(수직선); (v)1.9 ㎍/마우스 네이키드 CpG(P347)(하향 사선)의 정맥내 용량 후 A20 마우스 B-세포 림프종 세포 이종이식을 갖는 마우스의 20 일차의 평균 종양 부피를 나타낸다.
도 60c는 10, 12 및 14 일차 각각에 (i) 생리식염수(채움); (ii) 3 mg/kg CpG-Ab(SB-337)(체크무늬); (iii) 3 mg/kg CD19-mAb(수평선); (iv) 3 mg/kg CpG-Ab(SB-388)(수직선); (v)1.9 ㎍/마우스 네이키드 CpG(P347)(하향 사선); (vi) 19 ㎍/마우스 네이키드 CpG(P347)(격자); (vii) 190 ㎍/마우스 네이키드 CpG(P347)(상향 사선)의 정맥내 용량 후 A20 마우스 B-세포 림프종 세포 이종이식을 갖는 마우스의 20 일차에 제거된 종양 중량 변화에 따른 평균 체중 변화를 나타낸다.
도 61a는 7, 9, 11, 및 13 일차 각각에 (i) 생리식염수(채워진 원); 또는 (ii) p347(채워진 사각형)의 종양내 투여 후 B16F10 흑색종 재-도전, 및 14 일차의 재-도전 후 마우스의 평균 종양 부피 성장 진행을 나타낸다.
도 61b는 7, 9, 11, 및 13 일차 각각에 생리식염수(상부 패널), 또는 p347(하부 패널)의 종양내 투여 후 B16F10 흑색종 재-도전, 및 14 일차의 재-도전 후 마우스로부터의 폐 전이를 나타낸다.
도 61c는 7, 10, 12, 및 14 일차 각각에 (i) 생리식염수(정삼각형); 또는 (ii) p347(역삼각형)의 종양내 투여 후 CT26 대장 이종이식물이 접종된 마우스의 평균 종양 부피 성장 진행을 나타낸다.
도 62a는 10, 12, 및 14 일차 각각에 (i) 생리식염수(원); 또는 (ii) 10 mg/kg CpG-mAb(SB-337)(사각형)의 정맥내 투여 후 CT26 대장 모델을 사용한 유전적 B-세포 결핍 마우스의 평균 종양 부피 성장 진행을 나타낸다.
도 62b는 10, 12, 및 14 일차 각각에 (i) 생리식염수(원); 또는 (ii) 10 mg/kg CpG-mAb(SB-337)(사각형)의 정맥내 투여 후 CT26 대장 모델을 사용한 항-CD20 mAb B-세포 고갈된 마우스의 평균 종양 부피 성장 진행을 나타낸다.
도 63a는 (i) 생리식염수(원); (ii) 10 mg/kg 항-CD22(정삼각형); (iii) 10 mg/kg 항-PD-L1(역삼각형); (iv) 10 mg/kg CD22-CpG(SB-337)(사각형); 또는 (v) 10 mg/kg CD22-CpG(SB-337) + 10 mg/kg 항-PD-L1(다이아몬드)의 투여 후 MC38 대장 공통유전자 모델을 사용한 마우스의 평균 종양 부피 성장 진행을 나타낸다. 항-CD22 및 CD22-CpG를 10, 12, 및 14 일차에 정맥내로 투여하였으며; 항-PD-L1을 10, 13, 및 17 일차에 복강내로 투여하였다. * p=0.01; ** p = 0.001.
도 63b는 10, 12, 및 14 일차에 생리식염수의 정맥내 투여 후 MC38 대장 공통유전자 모델을 사용한 각각의 마우스의 종양 부피 성장 진행을 나타낸다.
도 63c는 10, 12, 및 14 일차에 10 mg/kg의 항-CD22 mAb의 정맥내 투여 후 MC38 대장 공통유전자 모델을 사용한 각각의 마우스의 종양 부피 성장 진행을 나타낸다.
도 63d는 10, 13, 및 17 일차에 10 mg/kg의 항-PD-L1의 복강내 투여 후 MC38 대장 공통유전자 모델을 사용한 각각의 마우스의 종양 부피 성장 진행을 나타낸다.
도 63e는 10, 12, 및 14 일차에 10 mg/kg의 CD22-CpG(SB-337)의 정맥내 투여 후 MC38 대장 공통유전자 모델을 사용한 각각의 마우스의 종양 부피 성장 진행을 나타낸다.
도 63f는 10, 12, 및 14 일차에 10 mg/kg의 CD22-CpG(SB-337)의 정맥내 투여 + 10, 13, 및 17 일차에 10 mg/kg의 항-PD-L1의 복강내 투여 후 MC38 대장 공통유전자 모델을 사용한 각각의 마우스의 종양 부피 성장 진행을 나타낸다.
도 64a는 10, 12, 및 14 일차에 (i) 생리식염수(원); (ii) 10 mg/kg 항-CD22(사각형); (iii) 10 mg/kg CD22-CpG(SB-337)(삼각형); 또는 (iv) 10 mg/kg CD22-CpG(SB-337) + 10 mg/kg 항-PD-L1(다이아몬드)의 투여 후 B16F10 흑색종 모델을 사용한 마우스의 평균 종양 부피 성장 진행을 나타낸다. 항-CD22 및 CD22-CpG를 정맥내로 투여하였으며; 항-PD-L1을 복강내로 투여하였다. ** p=0.08; *** p = 0.03.
도 64b는 (i) 생리식염수(원); (ii) 10 mg/kg CD22-CpG(SB-337)(원); (iii) 10 mg/kg 항-PD1(사각형); (iv) 10 mg/kg CD22-CpG(SB-337) + 10 mg/kg 항-PD1(정삼각형); (v) 10 mg/kg 항-PD-L1(역삼각형); (vi) 10 mg/kg CD22-CpG + 10 mg/kg 항-PD-L1(다이아몬드)의 투여 후 LLC1 루이스(Lewis) 폐 암종 모델을 사용한 마우스의 평균 종양 부피 성장 진행을 나타낸다. 항-CD22 및 CD22-CpG를 7, 10, 및 13 일차에 정맥내로 투여하였으며; 항-PD-L1 및 항-PD1을 7, 10, 및 14 일차에 복강내로 투여하였다. ** p = 0.023.
도 65a는 12, 17, 20, 및 24 일차 각각에 (i) 생리식염수(원); (ii) 10 mg/kg CD22-CpG(SB-337)(삼각형); 또는 (iii) 10 mg/kg DEC205-CpG(SB-3096)의 정맥내 투여 후 CT26 대장 모델을 사용한 마우스의 평균 종양 부피 성장 진행을 나타낸다.
도 65b는 12, 17, 20, 및 24 일차 각각에 생리식염수의 정맥내 투여 후 CT26 대장 모델을 사용한 각각의 마우스의 종양 부피 성장 진행을 나타낸다.
도 65c는 12, 17, 20, 및 24 일차 각각에 10 mg/kg CD22-CpG(SB-337)의 정맥내 투여 후 CT26 대장 모델을 사용한 각각의 마우스의 종양 부피 성장 진행을 나타낸다.
도 65d는 12, 17, 20, 및 24 일차 각각에 10 mg/kg DEC205-CpG(SB-3096)의 정맥내 투여 후 CT26 대장 모델을 사용한 각각의 마우스의 종양 부피 성장 진행을 나타낸다.
도 66a는 (i) 생리식염수(작은 원); (ii) CD4 고갈(큰 원); (iii) 3 mg/kg CD22-CpG(SB-337)(사각형); 또는 (iv) CD4 고갈 + 3 mg/kg CD22-CpG(SB-337)(다이아몬드)의 투여 후 CT26 대장 모델을 사용한 마우스의 평균 종양 부피 성장 진행을 나타낸다. CD22-CpG를 10, 13; 및 15 일차에 정맥내로 투여하였다. CD4 고갈은 항-CD4를 사용하여 수행하였다.
도 66b는 (i) 생리식염수(원); (ii) CD4 고갈(정삼각형); (iii) 3 mg/kg CD22-CpG(SB-337)(사각형); 또는 (iv) CD4 고갈 + 3 mg/kg CD22-CpG(SB-337)(역삼각형)의 투여 후 A20 림프종 모델을 사용한 마우스의 평균 종양 부피 성장 진행을 나타낸다. CD22-CpG를 10, 12; 및 14 일차에 정맥내로 투여하였다. CD4 고갈은 항-CD4를 사용하여 수행하였다.
도 67a는 1nM CD22 Ab(체크무늬); 1nM CpG(SB-4715)(수평선); 또는 1nM CpG-Ab(SB-337)(수직선)와의 시험관내(in vitro) 항온처리 후 CD19+/B220+ B-세포에 대한 CD40, CD70, CD80, CD86, MHC-I, MHC II, 및 4-1 BBL 표면 발현의 평균 형광 강도(mean fluorescence intensity)(MFI)를 나타낸다.
도 67b는 생리식염수(단색); 10 mg/kg CD22 Ab(체크무늬); 10 mg/kg CpG(SB-4715)(수평선); 또는 10 mg/kg CpG-Ab(SB-337)(수직선)의 생체내 투여 후 CD19+/B220+ B-세포에 대한 CD40, CD80, CD86, 및 MHC II 표면 발현의 평균 형광 강도(MFI)를 나타낸다.
도 68a는 (i) 생리식염수(단색); (ii) Ab(항-CD22)(체크무늬); (iii) CpG-Ab(SB-337)(수평선); 또는 (iv) CpG(SB-4715)(수직선)로 처치된 마우스에서 총 T-세포(CD3+) 집단에 대한 활성화된 T-세포(CD71+, CD3+)의 퍼센트를 나타낸다.
도 68b는 (i) 생리식염수(단색); (ii) Ab(항-CD22)(체크무늬); (iii) CpG-Ab(SB-337)(수평선); 또는 (iv) CpG(SB-4715)(수직선)로 처치된 마우스에서 총 T-세포(CD3+) 집단에 대한 활성화된 T-세포(Ki67+, CD3+)의 퍼센트를 나타낸다.
도 69a는 10, 12, 14 일차 각각에 (i) 생리식염수(원); (ii) 10 mg/kg CD22-CpG(SB-337)(사각형); (iii) 10 mg/kg CD22(정삼각형); 또는 (iv) 유리 CpG(P347)(역삼각형)의 정맥내 투여 후 CT26 대장 모델을 사용한 마우스의 평균 종양 부피 성장 진행을 나타낸다.
도 69b는 (i) 생리식염수(작은 원); (ii) 10 mg/kg CD22-CpG(SB-337)(작은 사각형); (iii) 10 mg/kg CD22(작은 정삼각형); 또는 (iv) 유리 CpG(P347)(작은 역삼각형)로 처치된 마우스로부터의 배출 림프절 세포(draining lymph node cell); 또는 (v) 생리식염수(다이아몬드); (vi) 10 mg/kg CD22-CpG(SB-337)(큰 원); (vii) 10 mg/kg CD22(큰 사각형); 또는 (viii) 유리 CpG(P347)(큰 정삼각형)로 처치된 마우스로부터의 비-배출 림프절 세포의 입양 전달 후 CT26 대장 모델을 사용한 마우스의 평균 종양 부피 성장 진행을 나타낸다.
도 69c는 (i) 생리식염수(상향 좁은 사선); (ii) 10 mg/kg CD22-CpG(SB-337)(하향 좁은 사선); (iii) 10 mg/kg CD22(격자); 또는 (iv) 유리 CpG(P347)(넓은 하향 사선)로 처치된 마우스로부터의 배출 림프절 세포; 또는 (v) 생리식염수(단색); (vi) 10 mg/kg CD22-CpG(SB-337)(체크무늬); (vii) 10 mg/kg CD22(수평선); 또는 (viii) 유리 CpG(P347)(비어있음)로 처치된 마우스로부터의 비-배출 림프절 세포의 입양 전달 후 CT26 대장 모델을 사용한 마우스에 대한 24 일차의 평균 종양 부피를 나타낸다.
도 70a는 (i) 생리식염수(단색); (ii) 10 mg/kg Ab(CD22)(체크무늬); (iii) 5.7 ug/용량 유리 CpG(p347)(수평선); 또는 (iv) 10 mg/kg CpG-mAb(SB-337)(수직선)로 정맥내로 처치된 나이브 마우스에서 IL-6의 혈장 농도를 나타낸다.
도 70b는 (i) 생리식염수(단색); (ii) 10 mg/kg Ab(CD22)(체크무늬); (iii) 5.7 ug/용량 유리 CpG(p347)(수평선); 또는 (iv) 10 mg/kg CpG-mAb(SB-337)(수직선)로 정맥내로 처치된 나이브 마우스에서 IL-1β의 혈장 농도를 나타낸다.
도 70c는 (i) 생리식염수(단색); (ii) 10 mg/kg Ab(CD22)(체크무늬); (iii) 5.7 ug/용량 유리 CpG(p347)(수평선); 또는 (iv) 10 mg/kg CpG-mAb(SB-337)(수직선)로 정맥내로 처치된 나이브 마우스에서 IL-10의 혈장 농도를 나타낸다.
도 70d는 (i) 생리식염수(단색); (ii) 10 mg/kg Ab(CD22)(체크무늬); (iii) 5.7 ug/용량 유리 CpG(Sp347)(수평선); 또는 (iv) 10 mg/kg CpG-mAb(SB-337)(수직선)로 정맥내로 처치된 나이브 마우스에서 IL-12p70의 혈장 농도를 나타낸다.
도 70e는 (i) 생리식염수(단색); (ii) 10 mg/kg Ab(CD22)(체크무늬); (iii) 5.7 ug/용량 유리 CpG(p347)(수평선); 또는 (iv) 10 mg/kg CpG-mAb(SB-337)(수직선)로 정맥내로 처치된 나이브 마우스에서 IFNγ의 혈장 농도를 나타낸다.
도 70f는 (i) 생리식염수(단색); (ii) 10 mg/kg Ab(CD22)(체크무늬); (iii) 5.7 ug/용량 유리 CpG(p347)(수평선); 또는 (iv) 10 mg/kg CpG-mAb(SB-337)(수직선)로 정맥내로 처치된 나이브 마우스에서 TNFα의 혈장 농도를 나타낸다.
도 71a는 10, 13, 및 17 일차 각각에 (i) 생리식염수(원); 또는 (ii) 10 mg/kg CpG-mAb(SB-337)(사각형)의 정맥내 투여 후 CT26 대장 모델을 사용한 마우스로부터의 비장에서 총 세포에 대한 B-세포(B220+)의 퍼센트를 나타낸다. * p < 0.05
도 71b는 10, 13, 및 17 일차 각각에 (i) 생리식염수(원); 또는 (ii) 10 mg/kg CpG-mAb(SB-337)(사각형)의 정맥내 투여 후 CT26 대장 모델을 사용한 마우스로부터의 비장에서 총 세포에 대한 배중심(germinal center)(GC) 세포(B220+, IgDlo, Fas+)의 퍼센트를 나타낸다. * p < 0.05
도 71c는 10, 13, 및 17 일차 각각에 (i) 생리식염수(원); 또는 (ii) 10 mg/kg CpG-mAb(SB-337)(사각형)의 정맥내 투여 후 CT26 대장 모델을 사용한 마우스로부터의 비장에서 총 세포에 대한 T 여포 보조(Tfh) 세포(CD4+, CXCR5+, PD-1+)의 퍼센트를 나타낸다. * p < 0.05
도 71d는 10, 13, 및 17 일차 각각에 (i) 생리식염수; 또는 (ii) 10 mg/kg CpG-mAb(SB-337)의 정맥내 투여 후 CT26 대장 모델을 사용한 마우스로부터의 IL-21의 상대 배수 변화를 나타낸다. * p < 0.05
도 71e는 10, 13, 및 17 일차 각각에 (i) 생리식염수; 또는 (ii) 10 mg/kg CpG-mAb(SB-337)의 정맥내 투여 후 CT26 대장 모델을 사용한 마우스로부터의 Bcl-6의 상대 배수 변화를 나타낸다. * p < 0.05
도 71f는 10, 13, 및 17 일차 각각에 (i) 생리식염수; 또는 (ii) 10 mg/kg CpG-mAb(SB-337)의 정맥내 투여 후 CT26 대장 모델을 사용한 마우스로부터의 IRF-4의 상대 배수 변화를 나타낸다. * p < 0.05
도 72a는 10, 13, 및 17 일차 각각에 (i) 생리식염수; 또는 (ii) 3 mg/kg CpG-mAb(SB-337)의 정맥내 투여 후 CT26 대장 모델을 사용한 마우스로부터의 비장에서 IL-6의 상대 배수 변화를 나타낸다.
도 72b는 10, 13, 및 17 일차 각각에 (i) 생리식염수; 또는 (ii) 3 mg/kg CpG-mAb(SB-337)의 정맥내 투여 후 CT26 대장 모델을 사용한 마우스로부터의 비장에서 IL-10의 상대 배수 변화를 나타낸다.
도 72c는 10, 13, 및 17 일차 각각에 (i) 생리식염수; 또는 (ii) 3 mg/kg CpG-mAb(SB-337)의 정맥내 투여 후 CT26 대장 모델을 사용한 마우스로부터의 비장에서 IL-1β의 상대 배수 변화를 나타낸다.
도 72d는 10, 13, 및 17 일차 각각에 (i) 생리식염수; 또는 (ii) 3 mg/kg CpG-mAb(SB-337)의 정맥내 투여 후 CT26 대장 모델을 사용한 마우스로부터의 비장에서 TNFα의 상대 배수 변화를 나타낸다.
도 73a는 10, 13, 및 17 일차 각각에 (i) 생리식염수; 또는 (ii) 3 mg/kg CpG-mAb(SB-337)의 정맥내 투여 후 CT26 대장 모델을 사용한 마우스로부터의 배출 림프절에서 IL-6의 상대 배수 변화를 나타낸다.
도 73b는 10, 13, 및 17 일차 각각에 (i) 생리식염수; 또는 (ii) 3 mg/kg CpG-mAb(SB-337)의 정맥내 투여 후 CT26 대장 모델을 사용한 마우스로부터의 배출 림프절에서 IL-10의 상대 배수 변화를 나타낸다.
도 73c는 10, 13, 및 17 일차 각각에 (i) 생리식염수; 또는 (ii) 3 mg/kg CpG-mAb(SB-337)의 정맥내 투여 후 CT26 대장 모델을 사용한 마우스로부터의 배출 림프절에서 IL-1β의 상대 배수 변화를 나타낸다.
도 73d는 10, 13, 및 17 일차 각각에 (i) 생리식염수; 또는 (ii) 3 mg/kg CpG-mAb(SB-337)의 정맥내 투여 후 CT26 대장 모델을 사용한 마우스로부터의 배출 림프절에서 TNFα의 상대 배수 변화를 나타낸다.
도 74a는 10, 13, 및 16 일차 각각에 (i) 생리식염수; 또는 (ii) 3 mg/kg CpG-mAb(SB-337)의 정맥내 투여 후 CT26 대장 모델을 사용한 마우스에서 IgM의 농도를 나타낸다. * p < 0.05
도 74b는 10, 13, 및 16 일차 각각에 (i) 생리식염수; 또는 (ii) 3 mg/kg CpG-mAb(SB-337)의 정맥내 투여 후 CT26 대장 모델을 사용한 마우스에서 IgG2a의 농도를 나타낸다. * p < 0.05
도 74c는 10, 13, 및 16 일차 각각에 (i) 생리식염수; 또는 (ii) 3 mg/kg CpG-mAb(SB-337)의 정맥내 투여 후 CT26 대장 모델을 사용한 마우스에서 IgG의 농도를 나타낸다. * p < 0.05
도 75는 상업적으로 이용 가능한 2 차 항-마우스 IgG2a-HRP 항체인 2nd Ab1을 사용하여 측정된 생리식염수(원), 또는 3 mg/kg의 CpG-mAb(SB-337)(사각형)로 정맥내로 처치된; 또는 제2 상업적으로 이용 가능한 2 차 항-마우스 IgG2a-HRP 항체인 2nd Ab2를 사용한 생리식염수(역삼각형), 또는 3 mg/kg의 CpG-mAb(SB-337)(다이아몬드)를 이용한 처치를 측정한 마우스로부터의 혈청에서 마우스 항-AH1 IgG2a의 계획 및 정량화를 나타낸다.
도 76a는 (i) 생리식염수(원); 또는 (ii) 10 mg/kg CpG-mAb(SB-337)(사각형)의 매주 정맥내 투여 후 마우스로부터의 비장에서 총 B-세포(B220+)에 대한 조절 B 세포(Breg; CD19+, B220+, CD1dhi)의 퍼센트를 나타낸다. * p < 0.001
도 76b는 (i) 생리식염수(원); 또는 (ii) 10 mg/kg CpG-mAb(SB-337)(사각형)의 매주 정맥내 투여 후 마우스로부터의 비장에서 총 세포에 대한 조절 B 세포(Breg; CD19+, B220+, CD1dhi)의 퍼센트를 나타낸다. * p < 0.001
도 77a는 14, 17, 및 30 일차 각각에 (i) 생리식염수(원); (ii) 10 mg/kg CpG-mAb(SB-337)(사각형); 또는 (iii) 10 mg/kg CpG(삼각형)로 정맥내로 처치된 CT26 대장 모델을 사용한 마우스로부터의 비장 림프절에서 총 세포에 대한 비장 골수성 수지상 세포(mDC; B220-, CD11C+; DEC205hi)의 퍼센트를 나타낸다. * p = 0.0002, & p = 0.003, # p = 0.002.
도 77b는 14, 17, 및 30 일차 각각에 (i) 생리식염수(원); (ii) 10 mg/kg CpG-mAb(SB-337)(사각형); 또는 (iii) 10 mg/kg CpG(삼각형)로 정맥내로 처치된 CT26 대장 모델을 사용한 마우스로부터의 총 세포에 대한 통합(pooled) 림프절(LN) 골수성 수지상 세포(mDC; B220-, CD11C+; CD8+)의 퍼센트를 나타낸다. 샘플은 배출 림프절(dLN) 및 비-배출 림프절(ndLN)로부터 얻었다.
도 78a는 10, 13, 및 15 일차 각각에 (i) 생리식염수(원); (ii) 플라스마사이토이드 수지상 세포(pDC) 고갈(역삼각형); (iii) 3 mg/kg CD22-CpG(SB-337)(사각형); 또는 (iv) pDC 고갈 + 3 mg/kg CD22-CpG(SB-337)(정삼각형)를 이용한 처치 후 CT26 대장 모델을 사용한 마우스의 평균 종양 부피 성장 진행을 나타낸다.
도 78b는 10, 12, 및 14 일차 각각에 (i) 생리식염수(작은 원); (ii) 플라스마사이토이드 수지상 세포(pDC) 고갈(다이아몬드); (iii) 3 mg/kg CD22-CpG(SB-337)(사각형); 또는 (iv) pDC 고갈 + 3 mg/kg CD22-CpG(SB-337)(큰 원)를 이용한 처치 후 A20 림프종 모델을 사용한 마우스의 평균 종양 부피 성장 진행을 나타낸다.
도 79a는 10, 12, 및 14 일차 각각에 (i) 생리식염수(단색); 또는 (ii) 3 mg/kg CpG-mAb(SB-337)(체크무늬)의 정맥내 투여 후 CT26 대장 모델을 사용한 마우스로부터의 T-세포 유전자의 유전자 발현에서의 상대 배수 변화를 나타낸다.
도 79b는 10, 12, 및 14 일차 각각에 (i) 생리식염수(단색); 또는 (ii) 3 mg/kg CpG-mAb(SB-337)(수평선)의 정맥내 투여 후 CT26 대장 모델을 사용한 마우스로부터의 대식세포 유전자의 유전자 발현에서의 상대 배수 변화를 나타낸다.
도 79c는 10, 12, 및 14 일차 각각에 (i) 생리식염수(단색); 또는 (ii) 3 mg/kg CpG-mAb(SB-337)(수직선)의 정맥내 투여 후 CT26 대장 모델을 사용한 마우스로부터의 사이토카인 유전자의 유전자 발현에서의 상대 배수 변화를 나타낸다.
도 79d는 10, 12, 및 14 일차 각각에 (i) 생리식염수(단색); (ii) 3 mg/kg CpG-mAb(SB-337)(상향 사선); (iii) 항-PD-L1(하향 사선); (iv) 3 mg/kg CpG-mAb + 항-PD-L1(SB-337)(격자)의 정맥내 투여 후 CT26 대장 모델을 사용한 마우스로부터의 세포사멸 효소 유전자의 유전자 발현에서의 상대 배수 변화를 나타낸다.
도 80a는 24-72 시간 동안 (i) CpG(p425)(사각형); (ii) CpG-Ab(SB-430)(삼각형); 또는 (iii) Ab(다이아몬드)를 이용한 시험관내 처치에 반응한 인간 1 차 B-세포로부터의 IL-6의 농도에 대한 용량 반응 곡선을 나타낸다.
도 80b는 24-72 시간 동안 (i) CpG(p425)(삼각형); 또는 (ii) CpG-Ab(SB-430)(원)를 이용한 시험관내 처치에 반응한 인간 1 차 B-세포 상의 MHC II 발현의 평균 형광 강도(MFI)에 대한 용량 반응 곡선을 나타낸다.
도 80c는 24-72 시간 동안 (i) CpG(p425)(삼각형); 또는 (ii) CpG-Ab(SB-430)(원)를 이용한 시험관내 처치에 반응한 인간 1 차 B-세포 상의 CD86 발현의 평균 형광 강도(MFI)에 대한 용량 반응 곡선을 나타낸다.
도 80d는 24-72 시간 동안 (i) CpG(p425)(삼각형); 또는 (ii) CpG-Ab(SB-430)(원)를 이용한 시험관내 처치에 반응한 인간 1 차 B-세포 상의 CD70 발현의 평균 형광 강도(MFI)에 대한 용량 반응 곡선을 나타낸다.
도 80e는 24-72 시간 동안 (i) CpG(p425)(삼각형); 또는 (ii) CpG-Ab(SB-430)(원)를 이용한 시험관내 처치에 반응한 인간 1 차 B-세포 상의 CD20 발현의 평균 형광 강도(MFI)에 대한 용량 반응 곡선을 나타낸다.
도 81은 24 시간 동안 (i) hCD22-hCpG(SB-430)(사각형); (ii) 유리 인간 CpG 7909 (역삼각형); 또는 (iii) 유리 인간 CpG Solstice(p425)(상향 화살표)을 이용한 시험관내 처치에 반응한 1 차 인간 비장세포로부터의 IL-6의 농도에 대한 용량 반응 곡선을 나타낸다.
도 82a는 다우디 버킷 림프종(Daudi Burkitt lymphoma) 세포의 피하 이식 전 복강내로(IP) 주사된 신선한 인간 말초 혈액 단핵 세포(human peripheral blood mononuclear cell)(hPBMC) 및 12, 14, 및 16 일차 각각의 정맥내(IV) 처치를 사용한 인간화된 마우스 모델 실험에 대한 계획을 나타낸다.
도 82b는 다우디 버킷 림프종 세포의 피하 이식 전 신선한 인간 말초 혈액 단핵 세포가 복강내로 주사되고 12, 14, 및 16 일차 각각에 (i) 생리식염수(원); (ii) 5 mg/kg hCD22 Ab(사각형); (iii) 5.7 ㎍/용량 CpG(p425)(빈 삼각형); 또는 (iv) 5 mg/kg hCD22-CpG(SB-430)(채워진 삼각형)로 정맥내(IV) 처치된 인간화된 마우스 모델에서의 평균 종양 부피 성장 진행을 나타낸다.
도 83은 정맥내로 또는 피하로 투여된 마우스에서 CpG-항체 접합체 SB-337 DAR1의 약물동태학적 프로파일을 나타낸다.
도 84는 정맥내로 투여된 마우스에서 CpG-항체 접합체 SB-337 DAR1의 약물동태학적 프로파일을 나타낸다.
도 85는 정맥내로 투여된 마우스에서 CpG-항체 접합체 SB-337 DAR1의 약물동태학적 프로파일을 나타낸다.
도 86은 정맥내로 투여된 마우스에서 CpG-항체 접합체 SB-337 DAR1 및 SB-337 DAR2의 약물동태학적 프로파일을 나타낸다.
도 87a 및 87b는 정맥내로 투여된 마우스에서 CpG-항체 접합체의 약물동태학적 프로파일을 나타낸다.
정의
본원에 사용된 바와 같은 용어 "비염기 스페이서"는 다음 구조의 2가 기를 나타낸다:
[화학식 (I)]
Figure pct00004
상기 식에서,
n1은 0 또는 1이고,
n2는 1 내지 6의 정수이며,
R1은 면역조절 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오시드에 대한 결합이고,
R2는 면역조절 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오시드 또는 캡핑기에 대한 결합이며,
각각의 L1은 독립적으로 포스포디에스터 또는 포스포트리에스터이고,
각각의 L2는 당 유사체이며,
단,
비염기 스페이서가 인터뉴클레오시드, 비염기 스페이서이고, 각각의 n1이 1인 경우, R2는 뉴클레오시드에 대한 결합아고,
비염기 스페이서가 말단, 비염기 스페이서이고, 각각의 n1이 독립적으로 0 또는 1인 경우, R2는 캡핑기에 대한 결합이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "약"은 인용된 값의 ±10%인 값을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "알칸-테트라일"은 달리 명시되지 않는 경우, 1 내지 16 개 탄소를 갖는 4가, 아사이클릭(acyclic), 직쇄 또는 분지쇄, 포화 탄화수소기를 나타낸다. 알칸-테트라일은 선택적으로 알킬에 대해 기재된 바와 같이 치환될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "알칸-트리일"은 달리 명시되지 않는 경우, 1 내지 16 개 탄소를 갖는 3가, 아사이클릭, 직쇄 또는 분지쇄, 포화 탄화수소기를 나타낸다. 알칸-트리일은 선택적으로 알킬에 대해 기재된 바와 같이 치환될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "알카노일"은 카보닐기를 통해 부모 분자 기에 부착되는 수소 또는 알킬기를 나타내고 포르밀(즉, 카복시알데하이드기), 아세틸, 프로피오닐, 부티릴, 및 iso-부티릴로 예시된다. 비치환된 알카노일기는 1 내지 7 개의 탄소를 함유한다. 알카노일기는 알킬기에 대해 본원에 기재된 바와 같이 비치환되거나 치환(예를 들어, 선택적으로 치환된 C1-7 알카노일)될 수 있다. 말미의 "-오일"은 본원에 정의된 다른 기, 예를 들어 아릴, 사이클로알킬, 및 헤테로사이클릴에 부가되어, "아릴로일", "사이클로알카노일", 및 "(헤테로사이클릴)오일"을 정의할 수 있다. 이들 기는 각각 아릴, 사이클로알킬, 또는 헤테로사이클릴에 부착된 카보닐기를 나타낸다. "아릴로일", "사이클로알카노일", 및 "(헤테로사이클릴)오일" 각각은 선택적으로 각각 "아릴", "사이클로알킬", 또는 "헤테로사이클릴"에 대해 정의된 바와 같이 치환될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "알케닐"은 1, 2, 또는 3 개의 탄소-탄소 이중 결합을 함유하는 아사이클릭 1가 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소기를 나타낸다. 알케닐기의 비-제한적인 예는 에테닐, 프로프-1-에닐, 프로프-2-에닐, 1-메틸에테닐, 부트-1-에닐, 부트-2-에닐, 부트-3-에닐, 1-메틸프로프-1-에닐, 2-메틸프로프-1-에닐, 및 1-메틸프로프-2-에닐을 포함한다. 알케닐기는 선택적으로 알킬에 대해 본원에 정의된 바와 같이 치환될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "알케닐렌"은 1 개의 수소가 제거되어, 이 기가 2가가되게 하는 직쇄 또는 분지쇄 알케닐기를 지칭한다. 알케닐렌기의 비-제한적인 예는 에텐-1,1-디일; 에텐-1,2-디일; 프로프-1-엔-1,1-디일, 프로프-2-엔-1,1-디일; 프로프-1-엔-1,2-디일, 프로프-1-엔-1,3-디일; 프로프-2-엔-1,1-디일; 프로프-2-엔-1,2-디일; 부트-1-엔-1,1-디일; 부트-1-엔-1,2-디일; 부트-1-엔-1,3-디일; 부트-1-엔-1,4-디일; 부트-2-엔-1,1-디일; 부트-2-엔-1,2-디일; 부트-2-엔-1,3-디일; 부트-2-엔-1,4-디일; 부트-2-엔-2,3-디일; 부트-3-엔-1,1-디일; 부트-3-엔-1,2-디일; 부트-3-엔-1,3-디일; 부트-3-엔-2,3-디일; 부타-1,2-디엔-1,1-디일; 부타-1,2-디엔-1,3-디일; 부타-1,2-디엔-1,4-디일; 부타-1,3-디엔-1,1-디일; 부타-1,3-디엔-1,2-디일; 부타-1,3-디엔-1,3-디일; 부타-1,3-디엔-1,4-디일; 부타-1,3-디엔-2,3-디일; 부타-2,3-디엔-1,1-디일; 및 부타-2,3-디엔-1,2-디일을 포함한다. 알케닐렌기는 알킬에 대해 기재된 바와 같이 비치환되거나 치환(예를 들어, 선택적으로 치환된 알케닐렌)될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "알콕시"는 달리 명시되지 않는 경우, 화학식 -OR의 화학적 치환기를 나타내되, R은 C1-6 알킬기이다. 일부 실시양태에서, 알킬기는 본원에 정의된 바와 같이 추가로 치환될 수 있다. 용어 "알콕시"는 본원에 정의된 다른 형태, 예를 들어 아릴, 사이클로알킬, 또는 헤테로사이클릴과 조합되어, "아릴 알콕시", "사이클로알킬 알콕시", 및 "(헤테로사이클릴)알콕시"기를 정의할 수 있다. 이들 기는 각각 아릴, 사이클로알킬, 또는 헤테로사이클릴로 치환된 알콕시를 나타낸다. "아릴 알콕시", "사이클로알킬 알콕시", 및 "(헤테로사이클릴)알콕시" 각각은 선택적으로 각각의 개별 부위에 대해 본원에 정의된 바와 같이 치환될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "알킬"은 달리 명시되지 않는 경우, 비치환되었을 때 1 내지 12 개 탄소를 갖는 아사이클릭 직쇄 또는 분지쇄 포화 탄화수소기를 지칭한다. 특정 바람직한 실시양태에서, 비치환된 알킬은 1 내지 6 개의 탄소를 갖는다. 알킬기는 메틸; 에틸; n- 및 iso-프로필; n-, sec-, iso- 및 tert-부틸; 네오펜틸 등으로 예시되며, 다음으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된 1, 2, 3, 또는 2 이상의 탄소의 알킬기의 경우, 4 이상의 치환기로 선택적으로 치환되어, 원자가를 허용할 수 있다: 아미노; 아릴; 아릴옥시; 아지도; 사이클로알킬; 사이클로알콕시; 사이클로알케닐; 사이클로알키닐; 할로; 헤테로사이클릴; (헤테로사이클릴)옥시; 하이드록시; 니트로; 티올; 실릴; 시아노; =O; =S; =NR', 상기 식에서 R'은 H, 알킬, 아릴, 또는 헤테로사이클릴이다. 각각의 치환기는 그 자체가 비치환되거나, 각각의 기에 대해 본원에 정의된 비치환된 치환기(들)로 치환되어, 원자가를 허용할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "알킬아미노"는 화학식 -N(RN1)2 또는 -NHRN1을 갖는 기를 지칭하며, 상기 식에서 RN1은 본원에 정의된 바와 같은 알킬이다. 알킬아미노의 알킬 부위는 선택적으로 알킬에 대해 정의된 바와 같이 치환될 수 있다. 치환된 알킬아미노에 대한 각각의 선택적 치환기는 그 자체가 비치환되거나, 각각의 기에 대해 본원에 정의된 비치환된 치환기(들)로 치환되어, 원자가를 허용할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "알킬 사이클로알킬렌"은 2 개의 원자가가 2 개의 수소 원자를 대체하는 알킬 사이클로알칸인 포화 2가 탄화수소기를 지칭한다. 바람직하게는, 2 개의 원자가 중 적어도 하나는 사이클로알칸 부위 상에 존재한다. 알칸 및 사이클로알칸 부위는 선택적으로 본원에 기재된 바와 같은 개별 기와 같이 치환될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "알킬렌"은 2 개의 원자가가 2 개의 수소 원자를 대체하는 직쇄 또는 분지쇄 포화 탄화수소인 포화 2가 탄화수소기를 지칭한다. 본원에 정의된 알킬렌의 원자가는 선택적 치환기를 포함하지 않는다. 알킬렌기의 비-제한적인 예는 메틸렌, 에탄-1,2-디일, 에탄-1,1-디일, 프로판-1,3-디일, 프로판-1,2-디일, 프로판-1,1-디일, 프로판-2,2-디일, 부탄-1,4-디일, 부탄-1,3-디일, 부탄-1,2-디일, 부탄-1,1-디일, 및 부탄-2,2-디일, 부탄-2,3-디일을 포함한다. 용어 "Cx-y 알킬렌"은 x 내지 y 개의 탄소를 갖는 알킬렌기를 나타낸다. x에 대한 예시적인 값은 1, 2, 3, 4, 5, 및 6이고, y에 대한 예시적인 값은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 및 12이다. 알킬렌은 선택적으로 알킬에 대해 본원에 기재된 바와 같이 치환될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "알킬설페닐"은 화학식 -S-(알킬)의 기로 나타낸다. 알킬설페닐은 선택적으로 알킬에 대해 정의된 바와 같이 치환될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "알킬설피닐"은 화학식 -S(O)-(알킬)의 기로 나타낸다. 알킬설피닐은 선택적으로 알킬에 대해 정의된 바와 같이 치환될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "알킬설포닐"은 화학식 -S(O)2-(알킬)의 기로 나타낸다. 알킬설포닐은 선택적으로 알킬에 대해 정의된 바와 같이 치환될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "알키닐"은 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 함유하는 2 내지 6 개의 탄소 원자의 1가 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소기를 나타내며 에티닐, 1-프로피닐 등으로 예시된다. 알키닐기는 알킬에 대해 정의된 바와 같이 비치환되거나 치환(예를 들어, 선택적으로 치환된 알키닐)될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "5-알키닐우리딘"은 핵염기가 다음 구조의 5-알키닐우라실인 뉴클레오시드를 나타낸다:
Figure pct00005
, 상기 식에서 R은 뉴클레오시드의 펜타푸라노오스의 아노머 탄소에 대한 결합이고, X는 알키닐이다. 일부 실시양태에서, X는 에티닐 또는 프로피닐이다(예를 들어, X는 에티닐임).
본원에 사용된 바와 같은 용어 "알키닐렌"은 1 또는 2 개의 탄소-탄소 삼중 결합을 포함하고 비치환되었을 때 C 및 H만을 함유하는 직쇄 또는 분지쇄 2가 치환기를 지칭한다. 알키닐렌기의 비-제한적인 예는 에틴-1,2-디일; 프로프-1-인-1,3-디일; 프로프-2-인-1,1-디일; 부트-1-인-1,3-디일; 부트-1-인-1,4-디일; 부트-2-인-1,1-디일; 부트-2-인-1,4-디일; 부트-3-인-1,1-디일; 부트-3-인-1,2-디일; 부트-3-인-2,2-디일; 및 부타-1,3-디인-1,4-디일을 포함한다. 알키닐렌기는 알키닐기에 대해 기재된 바와 같이 비치환되거나 치환(예를 들어, 선택적으로 치환된 알키닐렌)될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "아미노"는 -N(RN1)2를 나타내며, 상기 식에서 아미노가 비치환되는 경우, RN1 및 H 둘 다; 또는 아미노가 치환되는 경우, 각각의 RN1은 독립적으로 H, -OH, -NO2, -N(RN2)2, -SO2ORN2, -SO2RN2, -SORN2, -COORN2, N-보호기, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 아릴, 아릴알킬, 아릴옥시, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 헤테로알킬, 또는 헤테로사이클릴이고, 단 적어도 하나의 RN1이 H가 아니면, 각각의 RN2는 독립적으로 H, 알킬, 또는 아릴이다. 각각의 치환기는 그 자체가 비치환될 수 있거나 각각의 기에 대해 본원에 정의된 비치환된 치환기(들)로 치환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노는 비치환된 아미노(즉, -NH2) 또는 치환된 아미노(예를 들어, -NHRN1)이되, 상기 식에서 RN1은 독립적으로 -OH, -SO2ORN2, -SO2RN2, -SORN2, -COORN2, 선택적으로 치환된 알킬, 또는 선택적으로 치환된 아릴이며, 각각의 RN2는 선택적으로 치환된 알킬 또는 선택적으로 치환된 아릴일 수 있다. 일부 실시양태에서, 치환된 아미노는 알킬아미노일 수 있고, 상기 식에서 알킬기는 선택적으로 알킬에 대해 본원에 정의된 바와 같이 치환된다. 특정 실시양태에서, 아미노기는 -NHRN1이고, 상기 식에서 RN1은 선택적으로 치환된 알킬이다. RN1이 선택적으로 치환된 알킬인 -NHRN1의 비-제한적인 예는 다음을 포함한다: 선택적으로 치환된 알킬아미노, 단백질성 아미노산, 비-단백질성 아미노산, 단백질성 아미노산의 C1-6 알킬 에스터, 및 비-단백질성 아미노산의 C1-6 알킬 에스터.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "아미노알킬"은 본원에 정의된 바와 같이 1, 2, 또는 3 개의 아미노기로 치환된 알킬을 나타낸다. 아미노알킬은 알킬기에 대해 기재된 바와 같이 추가로 선택적으로 치환될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "아렌-테트라일"은 3 개의 수소 원자가 원자가로 치환된 아릴기인 4가 기를 나타낸다. 아렌-테트라일은 선택적으로 아릴에 대해 본원에 기재된 바와 같이 치환될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "아릴"은 1 또는 2 개의 방향족 고리를 갖는 모노-, 비사이클릭, 또는 멀티사이클릭 카보사이클릭 고리 시스템을 나타낸다. 아릴기는 6 내지 10 개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 비치환된 카보사이클릭 아릴기 내의 모든 원자는 탄소 원자이다. 카보사이클릭 아릴기의 비-제한적인 예는 페닐, 나프틸, 1,2-디하이드로나프틸, 1,2,3,4-테트라하이드로나프틸, 플루오레닐, 인다닐, 인데닐 등을 포함한다. 아릴기는 비치환되거나 다음으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 치환기로 치환될 수 있다: 알킬; 알케닐; 알키닐; 알콕시; 알킬설피닐; 알킬설페닐; 알킬설포닐; 아미노; 아릴; 아릴옥시; 아지도; 사이클로알킬; 사이클로알콕시; 사이클로알케닐; 사이클로알키닐; 할로; 헤테로알킬; 헤테로사이클릴; (헤테로사이클릴)옥시; 하이드록시; 니트로; 티올; 실릴; 및 시아노. 각각의 치환기는 그 자체가 비치환되거나 각각의 기에 대해 본원에 정의된 비치환된 치환기(들)로 치환될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "아릴 알킬"은 아릴기로 치환된 알킬기를 나타낸다. 아릴 및 알킬 부위는 선택적으로 본원에 기재된 바와 같은 개별 기와 같이 치환될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "아릴 알킬렌"은 하나의 수소 원자가 원자가로 치환된 아릴 알킬기를 나타낸다. 아릴 알킬렌은 선택적으로 아릴 알킬에 대해 본원에 기재된 바와 같이 치환될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "아릴렌"은 하나의 수소 원자가 원자가로 치환된 아릴기를 나타낸다. 아릴렌은 선택적으로 아릴에 대해 본원에 기재된 바와 같이 치환될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "아릴옥시"는 달리 명시되지 않는 경우, 화학식 -OR의 화학적 치환기이되, 상기 식에서 R은 아릴기이다. 선택적으로 치환된 아릴옥시에서, 아릴기는 선택적으로 아릴에 대해 본원에 기재된 바와 같이 치환된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "보조 모이어티"는 친수성 중합체, 양성으로 하전된 중합체, 또는 당알코올을 함유하는 1가 기를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "선택적으로 치환된 N"은 2가 -N(RN1)- 기 또는 3가 -N= 기를 나타낸다. 아자기는 비치환될 수 있되, 상기 식에서 RN1은 H 또는 부재이고, 또는 치환되되, RN1은 RN1이 H이 아닌 것을 제외하고 "아미노"에 대해 정의된 바와 같다. 2 개의 아자기는 연결되어, "디아자"를 형성할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "선택적으로 치환된 N-보호된 아미노"는 본원에 정의된 바와 같은 치환된 아미노를 나타내며, 상기 식에서 적어도 하나의 치환기는 N-보호기이고 나머지 치환기는 N-보호된 아미노가 비치환된 경우, H이거나, N-보호된 아미노가 치환된 경우, H 이외의 치환기이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "아지도"는 -N3 기를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "벌키기(bulky group)"는 디설파이드에 대한 라디칼 결합이 라디칼이 sp 3-혼성화된 탄소인 경우, 1 이하의 수소 원자를 보유하거나 라디칼이 sp 2-혼성화된 탄소인 경우, 수소 원자를 보유하지 않는 탄소 원자인, 임의의 치환기 또는 본원에 정의된 바와 같은 치환기의 기를 나타낸다. 라디칼은 sp-혼성화된 탄소가 아니다. 벌키기는 탄소 원자를 통해서만 디설파이드에 결합된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "5'-5' 캡"은 화학식 R'-Nuc1-O-(LP)n-의 기를 나타내되, 상기 식에서 R'은 포스페이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스터, 포스포디에스터, 하이드록실, 또는 수소이고; Nuc1은 뉴클레오시드이며; 각각의 LP는 독립적으로 -P(=XE1)(-XE2-RE2A)-O-이고; n은 1, 2, 또는 3이고;
상기 식에서 각각의 XE1 및 각각의 XE2는 독립적으로 O 또는 S이며, 각각의 RE2A는 독립적으로 수소, 생체내가역성기, 비-생체내가역성기, 보조 모이어티, 접합기, 표적화 모이어티에 결합된 링커, 또는 표적화 모이어티 및 1 이상(예를 들어, 1 내지 6 개)의 보조 모이어티에 결합된 링커이고;
R'은 뉴클레오시드의 3'-탄소에 결합되며, -O-는 뉴클레오시드의 5'-탄소에 결합된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "캡핑기"는 폴리뉴클레오티드의 5'- 또는 3'-말단에 위치한 1가 또는 2가 기를 나타낸다. 캡핑기는 말단 포스포에스터; 디포스페이트; 트리포스페이트; 보조 모이어티; 생체내가역성기; 비-생체내가역성기; 5' 캡(예를 들어, 5'-5' 캡); 고체 지지체; 표적화 모이어티 및 선택적으로 1 이상(예를 들어, 1 내지 6 개)의 보조 모이어티에 결합된 링커; 또는 -OR' 기이되, R'은 수소, 생체내가역성기, 비-생체내가역성기, 고체 지지체, 및 O-보호기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 기 -OR', 디포스페이트, 트리포스페이트, 생체내가역성기, 비-생체내가역성기, 고체 지지체, 및 보조 모이어티는 1가 캡핑기의 예이다. 말단 포스포에스터는 말단 포스포에스터가 표적화 모이어티에 대한 링커를 포함하지 않는 경우, 1가이거나, 말단 포스포에스터가 표적화 모이어티에 대한 링커를 포함하는 경우, 2가일 수 있는 캡핑기의 예이다. 표적화 모이어티(보조 모이어티가 있거나 없이)에 결합된 링커는 2가 캡핑기의 예이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "카보사이클릭"은 방향족 또는 비-방향족일 수 있는 고리가 탄소 원자에 의해 형성되는 선택적으로 치환된 C3-16 모노사이클릭, 비사이클릭, 또는 트리사이클릭 구조를 나타낸다. 카보사이클릭 구조는 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알키닐, 및 특정 아릴기를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "카보닐"은 -C(O)- 기를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은 표현 "Cx-y"은 표현에 바로 뒤따르는 명칭의 기가 비치환되었을 때 총 x 내지 y 개의 탄소 원자를 함유한다는 것을 나타낸다. 기가 복합기(예를 들어, 아릴 알킬)인 경우, Cx-y는 표현에 바로 뒤따르는 명칭의 부위가 비치환되었을 때 총 x 내지 y 개의 탄소 원자를 함유한다는 것을 나타낸다. 예를 들어, (C6-10-아릴)-C1-6-알킬은 아릴 부위가 비치환되었을 때 총 6 내지 10 개의 탄소 원자를 함유하고, 알킬 부위가 비치환되었을 때 총 1 내지 6 개의 탄소 원자를 함유하는 기이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "시아노"는 -CN 기를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "부가환화 반응"은 활성화가 없거나, 화학적 촉매에 의한 활성화, 또는 열 에너지를 사용한 활성화가 있고, n이 1, 2, 또는 3일 때, 총 [4n +2] π 전자가 결합 형성에 참여하는 2 개 성분의 반응을 나타낸다. 부가환화 반응은 또한 [4n] π 전자가 참여하고, 광화학 활성화가 있으며, n이 1, 2, 또는 3인 2 개 성분의 반응이다. 바람직하게는 [4n +2] π 전자가 결합 형성에 참여하며, n = 1이다. 대표적인 부가환화 반응은 알켄과 1,3-디엔의 반응(디엘-알더 반응(Diels-Alder reaction)), 알켄과 α,β-비치환된 카보닐의 반응(헤테로 디엘-알더 반응), 및 알킨과 아지도 화합물의 반응(예를 들어, 휴이젠(
Figure pct00006
) 부가환화)을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "사이클로알케닐"은 달리 명시되지 않는 경우, 고리 내에 적어도 하나의 이중 결합 및 3 내지 10 개의 탄소 원자를 갖는 비-방향족 카보사이클릭기(예를 들어, C3-C10 사이클로알케닐)를 지칭한다. 사이클로알케닐의 비-제한적인 예는 사이클로프로프-1-에닐, 사이클로프로프-2-에닐, 사이클로부트-1-에닐, 사이클로부트-1-에닐, 사이클로부트-2-에닐, 사이클로펜트-1-에닐, 사이클로펜트-2-에닐, 사이클로펜트-3-에닐, 노르보르넨-1-일, 노르보르넨-2-일, 노르보르넨-5-일, 및 노르보르넨-7-일을 포함한다. 사이클로알케닐기는 사이클로알킬에 대해 기재된 바와 같이 비치환되거나 치환(예를 들어, 선택적으로 치환된 사이클로알케닐)될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "사이클로알케닐 알킬"은 각각 본원에 정의된 바와 같이 사이클로알케닐기로 치환된 알킬기를 나타낸다. 사이클로알케닐 및 알킬 부위는 본원에 정의된 개별 기와 같이 치환될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "사이클로알케닐렌"은 하나의 수소 원자가 원자가로 치환된 사이클로알케닐기인 2가 기를 나타낸다. 사이클로알케닐렌은 선택적으로 사이클로알킬에 대해 본원에 기재된 바와 같이 치환될 수 있다. 사이클로알케닐렌의 비-제한적인 예는 사이클로알켄-1,3-디일이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "사이클로알콕시"는 화학식 -OR의 화학적 치환기를 나타내되, 상기 식에서 R은 달리 명시되지 않는 경우, 사이클로알킬기이다. 일부 실시양태에서, 사이클로알킬기는 본원에 정의된 바와 같이 추가로 치환될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "사이클로알킬"은 달리 명시되지 않는 경우, 3 내지 10 개의 탄소를 갖는 사이클릭 알킬기(예를 들어, C3-C10 사이클로알킬)를 지칭한다. 사이클로알킬기는 모노사이클릭 또는 비사이클릭일 수 있다. 비사이클릭 사이클로알킬기는 비사이클로[p.q.0]알킬 형의 것일 수 있으며, 상기 식에서 각각의 p 및 q는 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7이고, 단 p 및 q의 합은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8이다. 대안적으로, 비사이클릭 사이클로알킬기는 가교된 사이클로알킬 구조, 예를 들어 비사이클로[p.q.r]알킬을 포함할 수 있으며, 상기 식에서 r은 1, 2, 또는 3이고, 각각의 p 및 q는 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이며, 단 p, q, 및 r의 합은 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8이다. 사이클로알킬기는 스피로사이클릭기, 예를 들어 스피로[p.q]알킬일 수 있으며, 상기 식에서 각각의 p 및 q는 독립적으로 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7이고, 단 p 및 q의 합은 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9이다. 사이클로알킬의 비-제한적인 예는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸, 1-비사이클로[2.2.1.]헵틸, 2-비사이클로[2.2.1.]헵틸, 5-비사이클로[2.2.1.]헵틸, 7-비사이클로[2.2.1.]헵틸, 및 데카리닐을 포함한다. 사이클로알킬기는 비치환되거나 다음으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 치환기로 치환(예를 들어, 선택적으로 치환된 사이클로알킬)될 수 있다: 알킬; 알케닐; 알키닐; 알콕시; 알킬설피닐; 알킬설페닐; 알킬설포닐; 아미노; 아릴; 아릴옥시; 아지도; 사이클로알킬; 사이클로알콕시; 사이클로알케닐; 사이클로알키닐; 할로; 헤테로알킬; 헤테로사이클릴; (헤테로사이클릴)옥시; 하이드록시; 니트로; 티올; 실릴; 시아노; =O; =S; =NR', 상기 식에서 R'은 H, 알킬, 아릴, 또는 헤테로사이클릴이다. 각각의 치환기는 그 자체가 비치환되거나 각각의 기에 대해 본원에 정의된 비치환된 치환기(들)로 치환될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "사이클로알킬 알킬"은 각각 본원에 정의된 바와 같이 사이클로알킬기로 치환된 알킬기를 나타낸다. 사이클로알킬 및 알킬 부위는 선택적으로 본원에 기재된 개별 기와 같이 치환될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "사이클로알킬렌"은 하나의 수소 원자가 원자가로 치환된 사이클로알킬기인 2가 기를 나타낸다. 사이클로알킬렌의 비-제한적인 예는 사이클로알칸-1,3-디일이다. 사이클로알킬렌은 선택적으로 사이클로알킬에 대해 본원에 기재된 바와 같이 치환될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "사이클로알키닐"은 달리 명시되지 않는 경우, 1 또는 2 개의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖고 8 내지 12 개의 탄소를 갖는 1가 카보사이클릭기를 지칭한다. 사이클로알키닐은 하나의 고리횡단 결합 또는 다리를 포함할 수 있다. 사이클로알키닐의 비-제한적인 예는 사이클로옥티닐, 사이클로노니닐, 사이클로데시닐, 및 사이클로데카디닐을 포함한다. 사이클로알키닐기는 사이클로알킬에 대해 정의된 바와 같이 비치환되거나 치환(예를 들어, 선택적으로 치환된 사이클로알키닐)될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "디하이드로피리다진기"는 1,2,4,5-테트라진기와 변형된(strained) 사이클로알케닐 사이의 부가환화를 통해 얻을 수 있는 2가 기를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "할로"는 브롬, 염소, 요오드, 및 불소로부터 선택된 할로겐을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "5-할로우리딘"은 핵염기가 다음 구조의 5-할로우라실인 뉴클레오시드를 나타낸다:
Figure pct00007
, 상기 식에서 R은 뉴클레오시드의 펜타푸라노오스의 아노머 탄소에 대한 결합이고, X는 플루오로, 클로로, 브로모, 요오도이다. 일부 실시양태에서, X는 브로모 또는 요오도이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "헤테로알칸-테트라일"은 하나의 헤테로원자에 의해 1 회; 각 시간에 독립적으로 하나의 헤테로원자에 의해 2 회; 각 시간에 독립적으로 하나의 헤테로원자에 의해 3 회; 또는 각 시간에 독립적으로 하나의 헤테로원자에 의해 4 회 중단된 알칸-테트라일기를 지칭한다. 각각의 헤테로원자는 독립적으로 O, N, 또는 S이다. 일부 실시양태에서, 헤테로원자는 O 또는 N이다. 비치환된 CX-Y 헤테로알칸-테트라일은 X 내지 Y 개의 탄소 원자뿐 아니라, 본원에 정의된 바와 같은 헤테로원자를 함유한다. 헤테로알칸-테트라일기는 헤테로알킬에 대해 기재된 바와 같이 비치환되거나 치환(예를 들어, 선택적으로 치환된 헤테로알칸-테트라일)될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "헤테로알칸-트리일"은 하나의 헤테로원자에 의해 1 회; 각 시간에 독립적으로 하나의 헤테로원자에 의해 2 회; 각 시간에 독립적으로 하나의 헤테로원자에 의해 3 회; 또는 각 시간에 독립적으로 하나의 헤테로원자에 의해 4 회 중단된 알칸-트리일기를 지칭한다. 각각의 헤테로원자는 독립적으로 O, N, 또는 S이다. 일부 실시양태에서, 헤테로원자는 O 또는 N이다. 비치환된 CX-Y 헤테로알칸-트리일은 X 내지 Y 개의 탄소 원자뿐 아니라, 본원에 정의된 바와 같은 헤테로원자를 함유한다. 헤테로알칸-트리일기는 헤테로알킬에 대해 기재된 바와 같이 비치환되거나 치환(예를 들어, 선택적으로 치환된 헤테로알칸-트리일)될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "헤테로알킬"은 1 또는 2 개의 헤테로원자에 의해 1 회; 각 시간에 독립적으로 1 또는 2 개의 헤테로원자에 의해 2 회; 각 시간에 독립적으로 1 또는 2 개의 헤테로원자에 의해 3 회; 또는 각 시간에 독립적으로 1 또는 2 개의 헤테로원자에 의해 4 회 중단된 알킬, 알케닐, 또는 알키닐기를 지칭한다. 각각의 헤테로원자는 독립적으로 O, N, 또는 S이다. 일부 실시양태에서, 헤테로원자는 O 또는 N이다. 헤테로알킬기 중 어느 것도 2 개의 인접한 산소 또는 황 원자를 포함하지 않는다. 헤테로알킬기는 비치환되거나 치환(예를 들어, 선택적으로 치환된 헤테로알킬)될 수 있다. 헤테로알킬이 치환되고 치환기가 헤테로원자에 결합될 때, 치환기는 헤테로원자의 특성 및 원자가에 따라 선택된다. 따라서, 헤테로원자에 결합되어, 원자가를 허용하는 치환기는 =O, -N(RN2)2, -SO2ORN3, -SO2RN2, -SORN3, -COORN3, N보호기, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알키닐, 헤테로사이클릴, 또는 시아노로 이루어진 그룹으로부터 선택되되, 상기 식에서 각각의 RN2는 독립적으로 H, 알킬, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알키닐, 아릴, 또는 헤테로사이클릴이고, 각각의 RN3은 독립적으로 알킬, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알키닐, 아릴, 또는 헤테로사이클릴이다. 이들 치환기 각각은 그 자체가 비치환되거나 각각의 기에 대해 본원에 정의된 비치환된 치환기(들)로 치환될 수 있다. 헤테로알킬이 치환되고 치환기가 탄소에 결합될 때, 치환기는 알킬에 대해 기재된 것들로부터 선택되며, 단 헤테로원자에 결합된 탄소 원자 상의 치환기는 Cl, Br, 또는 I가 아니다. 탄소 원자는 헤테로알킬기의 말단에서 발견된다는 것이 이해된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "헤테로아릴옥시"는 구조 -OR을 지칭하되, R은 헤테로아릴이다. 헤테로아릴옥시는 선택적으로 헤테로사이클릴에 대해 정의된 바와 같이 치환된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "헤테로사이클릴"은 달리 명시되지 않는 경우, 질소, 산소, 및 황으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된 1, 2, 3, 또는 4 개의 헤테로원자를 함유하는 융합되거나 가교된 5-, 6-, 7-, 또는 8-원자 고리를 갖는 모노사이클릭, 비사이클릭, 트리사이클릭, 또는 테트라사이클릭 고리 시스템을 나타낸다. 헤테로사이클릴은 방향족 또는 비-방향족일 수 있다. 비-방향족 5-원자 헤테로사이클릴은 0 또는 1 개의 이중 결합을 갖고, 비-방향족 6- 및 7-원자 헤테로사이클릴기는 0 내지 2 개의 이중 결합을 가지며, 비-방향족 8-원자 헤테로사이클릴기는 0 내지 2 개의 이중 결합 및/또는 0 또는 1 개의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는다. 헤테로사이클릴기는 달리 명시되지 않는 경우, 1 내지 16 개의 탄소 원자를 포함한다. 특정 헤테로사이클릴기는 최대 9 개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 비-방향족 헤테로사이클릴기는 피롤리닐, 피롤리디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 호모피페리디닐, 피페라지닐, 피리다지닐, 옥사졸리디닐, 이소옥사졸리디닐, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 티아졸리디닐, 테트라하이드로푸라닐, 디하이드로푸라닐, 테트라하이드로티에닐, 디하이드로티에닐, 디하이드로인돌릴, 테트라하이드로퀴놀릴, 테트라하이드로이소퀴놀릴, 피라닐, 디하이드로피라닐, 디티아졸릴 등을 포함한다. 헤테로사이클릭 고리 시스템이 적어도 하나의 방향족 공명 구조 또는 적어도 하나의 방향족 호변 이성질체를 갖는 경우, 이러한 구조는 방향족 헤테로사이클릴(즉, 헤테로아릴)이다. 헤테로아릴기의 비-제한적인 예는 벤즈이미다졸릴, 벤조푸라닐, 벤조티아졸릴, 벤조티에닐, 벤즈옥사졸릴, 푸릴, 이미다졸릴, 인돌릴, 이소인다졸릴, 이소퀴놀리닐, 이소티아졸릴, 이소티아졸릴, 이소옥사졸릴, 옥사디아졸릴, 옥사졸릴, 푸리닐, 피롤릴, 피리디닐, 피라지닐, 피리미디닐, 퀴나졸리닐, 퀴놀리닐, 티아디아졸릴(예를 들어, 1,3,4-티아디아졸), 티아졸릴, 티에닐, 트리아졸릴, 테트라졸릴 등을 포함한다. 용어 "헤테로사이클릴"은 또한 퀴누클리딘, 트로판, 또는 디아자-비사이클로[2.2.2]옥탄과 같이 모노사이클릭 고리의 2 개의 비-인접한 원자를 1 이상의 탄소 및/또는 헤테로원자가 가교시키는 가교된 멀티사이클릭 구조를 갖는 헤테로사이클릭 화합물을 나타낸다. 용어 "헤테로사이클릴"은 상기 헤테로사이클릭 고리 중 임의의 것이 1, 2, 또는 3 개의 카보사이클릭 고리, 예를 들어 아릴 고리, 사이클로헥산 고리, 사이클로헥센 고리, 사이클로펜탄 고리, 사이클로펜텐 고리, 또는 다른 모노사이클릭 헤테로사이클릭 고리에 융합되는 비사이클릭, 트리사이클릭, 및 테트라사이클릭기를 포함한다. 융합된 헤테로사이클릴의 예는 1,2,3,5,8,8a-헥사하이드로인돌리진; 2,3-디하이드로벤조푸란; 2,3-디하이드로인돌; 및 2,3-디하이드로벤조티오펜을 포함한다. 헤테로사이클릴기는 비치환되거나 다음으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 치환기로 치환될 수 있다: 알킬; 알케닐; 알키닐; 알콕시; 알킬설피닐; 알킬설페닐; 알킬설포닐; 아미노; 아릴; 아릴옥시; 아지도; 사이클로알킬; 사이클로알콕시; 사이클로알케닐; 사이클로알키닐; 할로; 헤테로알킬; 헤테로사이클릴; (헤테로사이클릴)옥시; 하이드록시; 니트로; 티올; 실릴; 시아노; =O; =S; =NR', 상기 식에서 R'은 H, 알킬, 아릴, 또는 헤테로사이클릴이다. 각각의 치환기는 그 자체가 비치환되거나 각각의 기에 대해 본원에 정의된 비치환된 치환기(들)로 치환될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "헤테로사이클릴 알킬"은 각각 본원에 정의된 바와 같은 헤테로사이클릴기로 치환된 알킬기를 나타낸다. 헤테로사이클릴 및 알킬 부위는 선택적으로 본원에 기재된 개별 기와 같이 치환될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "(헤테로사이클릴)아자"는 화학식 -N(RN1)(RN2)의 화학적 치환기를 나타내되, 상기 식에서 RN1은 헤테로사이클릴기이고, RN2는 H, -OH, -NO2, -N(RN2)2, -SO2ORN2, -SO2RN2, -SORN2, -COORN2, N-보호기, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 아릴, 아릴알킬, 아릴옥시, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 헤테로알킬, 또는 헤테로사이클릴이다. 바람직하게는, RN2는 H이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "헤테로사이클릴렌"은 하나의 수소 원자가 원자가로 치환된 헤테로사이클릴기를 나타낸다. 헤테로사이클릴렌은 선택적으로 헤테로사이클릴에 대해 기재된 방식으로 치환될 수 있다. 헤테로사이클릴렌의 비-제한적인 예는 헤테로사이클-1,3-디일이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "(헤테로사이클릴)옥시"는 화학식 -OR의 화학적 치환기를 나타내되, 상기 식에서 R은 달리 명시되지 않는 경우, 헤테로사이클릴기이다. (헤테로사이클릴)옥시는 선택적으로 헤테로사이클릴에 대해 기재된 방식으로 치환될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "하이드록실" 및 "하이드록시"는 -OH 기를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "면역조절 폴리뉴클레오티드"는 독립적으로 인터뉴클레오시드 포스포에스터 및 선택적으로 인터뉴클레오시드 비염기 스페이서로 이루어진 그룹으로부터 선택된 인터뉴클레오시드 가교기에 의해 함께 공유결합된 총 6 내지 50 개의 인접한 뉴클레오시드를 함유하는 폴리뉴클레오티드 구조체를 나타낸다. 면역조절 폴리뉴클레오티드는 5'- 및 3'-말단에서 각각 5'- 및 3'-캡핑기로 캡핑된다. 면역조절 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 면역조절 폴리뉴클레오티드가 전달된 항원-제시 세포에서(예를 들어, 면역조절 폴리뉴클레오티드가 전달되지 않은 다른 항원-제시 세포와 비교하여) NFκB의 활성화에서의 변화 또는 적어도 하나의 염증성 사이토카인 또는 적어도 하나의 I 형 인터페론의 분비에서의 변화에 의해 결정된 바와 같이, 선천적 면역 반응을 조절할 수 있다. 면역조절 폴리뉴클레오티드는 접합기, 또는 면역조절 폴리뉴클레오티드가 접합체의 일부인 경우, 표적화 모이어티 및 선택적으로 1 이상(예를 들어, 1 내지 6 개)의 보조 모이어티(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)에 결합된 링커를 함유할 수 있다. 접합기 또는 링커는 포스포트리에스터 또는 말단 캡핑기의 일부일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "면역자극 폴리뉴클레오티드"는 예를 들어, 면역자극 폴리뉴클레오티드가 전달된 항원-제시 세포에서(예를 들어, 면역자극 폴리뉴클레오티드가 전달되지 않은 다른 항원-제시 세포와 비교하여) NFκB의 활성화에서의 증가 또는 적어도 하나의 염증성 사이토카인 또는 적어도 하나의 I 형 인터페론의 분비에서의 증가에 의해 결정된 바와 같이, 선천적 면역 반응을 활성화할 수 있는 면역조절 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 면역자극 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 시티딘-p-구아노신(CpG) 서열을 함유하되, 상기 식에서 p는 인터뉴클레오시드 포스포디에스터(예를 들어, 포스페이트 또는 포스포로티오에이트) 또는 인터뉴클레오시드 포스포트리에스터 또는 포스포티오트리에스터이다. 본원에 사용된 바와 같이, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 세균 또는 바이러스 기원의 CpG ODN과 같이 자연적으로 존재하거나, 합성될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 면역자극 폴리뉴클레오티드에서의 CpG 서열은 2'-데옥시 리보오스를 함유한다. 일부 실시양태에서, 면역자극 폴리뉴클레오티드에서의 CpG 서열은 비메틸화된다. 일부 실시양태에서, 면역자극 폴리뉴클레오티드는 본원에 제공된 바와 같은 화학식 (A)의 올리고뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 면역자극 폴리뉴클레오티드는 본원에 제공된 바와 같은 화학식 (B)의 화합물이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "면억억제 폴리뉴클레오티드"는 예를 들어, 면역억제 폴리뉴클레오티드가 전달된 항원-제시 세포에서(예를 들어, 면역억제 폴리뉴클레오티드가 전달되지 않은 다른 항원-제시 세포와 비교하여) NFκB의 활성화에서의 감소 또는 적어도 하나의 염증성 사이토카인 또는 적어도 하나의 I 형 인터페론의 분비에서의 감소에 의해 결정된 바와 같이, 선천적 면역 반응을 길항할 수 있는 면역조절 폴리뉴클레오티드를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "인터뉴클레오시드 가교기"는 인터뉴클레오시드 포스포에스터 또는 인터뉴클레오시드 비염기 스페이서를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "5-변형된 시티딘"은 핵염기가 다음 구조의 것인 뉴클레오시드를 나타낸다:
Figure pct00008
, 상기 식에서 R은 뉴클레오시드의 펜타푸라노오스의 아노머 탄소에 대한 결합이고, X는 할로겐, 알키닐, 알케닐, 알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 또는 아릴이다. 일부 실시양태에서, 5-변형된 시티딘은 5-할로 시티딘(예를 들어, 5-요오도 시티딘 또는 5-브로모 시티딘)이다. 다른 실시양태에서, 5-변형된 시티딘은 5-알키닐 시티딘이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "5-변형된 우리딘"은 핵염기가 다음 구조의 것인 뉴클레오시드를 나타낸다:
Figure pct00009
, 상기 식에서 R은 뉴클레오시드의 펜타푸라노오스의 아노머 탄소에 대한 결합이고, X는 할로겐, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 또는 아릴이며, 단 5-변형된 우리딘은 티미딘이 아니다. 일부 실시양태에서, 5-변형된 우리딘은 5-할로우리딘(예를 들어, 5-요오도우리딘 또는 5-브로모우리딘)이다. 다른 실시양태에서, 5-변형된 우리딘은 5-알키닐 우리딘이다. 일부 실시양태에서, 5-변형된 우리딘은 2-데옥시리보오스를 함유한 뉴클레오시드이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "니트로"는 -NO2 기를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "비-생체내가역성"은 엔도솜 내부에 존재하는 조건 하에서 분해에 대해 저항성인 화학기를 지칭한다. 비-생체내가역성기는 티오에스터 및/또는 디설파이드를 함유하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "핵염기"는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 당 모이어티의 1' 위치에 결합된 질소-함유 헤테로사이클릭 고리를 나타낸다. 핵염기는 비변형되거나 변형될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "비변형된" 또는 "천연" 핵염기는 퓨린 염기인 아데닌(A) 및 구아닌(G), 및 피리미딘 염기인 티민(T), 시토신(C) 및 우라실(U)을 포함한다. 변형된 핵염기는 다른 합성 및 천연 핵염기, 예컨대 5-메틸시토신(5-me-C 또는 m5c), 5-하이드록시메틸 시토신, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 6-메틸 및 아데닌 및 구아닌의 다른 알킬 유도체, 2-프로필 및 아데닌 및 구아닌의 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-요오도, 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신, 5-알키닐(예를 들어, 5-에티닐) 우라실, 5-아세트아미도-우라실, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함한다. 또한, 핵염기는 미국 특허 제3,687,808호에 기재된 것; The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990에 기재된 것; Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613에 기재된 것; 및 Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289 302, (Crooke et al., ed., CRC Press, 1993)에 기재된 것을 포함한다. 특정 핵염기는 본 발명의 혼성화된 폴리뉴클레오티드의 결합 친화도를 증가시키기 위해 특히 유용하며, 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 포함하여, 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린을 포함한다. 5-메틸시토신 치환은 핵산 이중복합 안정성을 0.6-1.2℃ 증가시키는 것으로 나타났다. (Sanghvi et al., eds., Antisense Research and Applications 1993, CRC Press, Boca Raton, pages 276-278). 이들은 특별한 실시양태에서, 2'-O-메톡시에틸 당 변형체와 조합될 수 있다. 이들 변형된 핵염기뿐 아니라, 다른 변형된 핵염기 중 일부의 제조를 교시하는 미국 특허는, 비제한적으로, 상기 언급된 미국 특허 제3,687,808호; 제4,845,205호; 제5,130,302호; 제5,134,066호; 제5,175,273호; 제5,367,066호; 제5,432,272호; 제5,457,187호; 제5,459,255호; 제5,484,908호; 제5,502,177호; 제5,525,711호; 제5,552,540호; 제5,587,469호; 제5,594,121호; 제5,596,091호; 제5,614,617호; 및 제5,681,941호를 포함한다. 본 발명의 목적을 위해, 본원에 사용된 바와 같은 "변형된 핵염기"는 추가로 본원에 기재된 바와 같은 1 이상의 보호기를 포함하는 천연 또는 비-천연 핵염기를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "뉴클레오시드"는 펜타푸라노오스-핵염기 조합을 나타낸다. 펜타푸라노오스는 2-데옥시리보오스 또는 이의 변형된 버전이되, 상기 식에서 위치 2는 OR, R, 할로(예를 들어, F), SH, SR, NH2, NHR, NR2, 또는 CN으로 치환되고, R은 선택적으로 치환된 C1-6 알킬(예를 들어, C1-6 알킬 또는 (C1-6 알콕시)-C1-6-알킬) 또는 선택적으로 치환된 (C6-14 아릴)-C1-4-알킬이다. 특정 실시양태에서, 위치 2는 OR 또는 F로 치환되되, 상기 식에서 R은 C1-6 알킬 또는 (C1-6-알콕시)-C1-6-알킬이다. 펜타푸라노오스는 아노머 탄소의 핵염기에 결합된다. 일부 실시양태에서, 용어 "뉴클레오시드"는 다음 구조를 갖는 2가 기를 지칭한다:
Figure pct00010
, 상기 식에서 B1은 핵염기이고; Y는 H, 할로겐(예를 들어, F), 하이드록실, 선택적으로 치환된 C1-6 알콕시(예를 들어, 메톡시 또는 메톡시에톡시), 또는 보호된 하이드록실기이며; Y1은 H 또는 C1-6 알킬(예를 들어, 메틸)이고; 3' 및 5' 각각은 다른 기에 대한 결합의 위치를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "뉴클레오티드"는 포스페이트, 포스포로티오에이트, 또는 포스포로디티오에이트에 결합되는 뉴클레오시드를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "옥소"는 2가 산소 원자를 나타낸다(예를 들어, 옥소의 구조는 =O로서 나타낼 수 있음).
본원에 사용된 바와 같은 용어 "환자"는 인간 또는 비-인간 동물(예를 들어, 포유동물)을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 대상체는 환자로부터의 샘플(들)의 업계 실험실 시험(들)에서 알려지거나 알려지지 않은 자격이 있는 전문가(예를 들어, 의사 또는 임상 간호사)에 의해 결정된 바와 같이, 종양(예를 들어, 액상 종양 또는 고형 종양)으로 고통받고 있을 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "Ph"는 페닐을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "포스포에스터"는 포스페이트, 포스포로티오에이트, 또는 포스포로디티오에이트를 함유하는 기를 나타내되, 상기 식에서 적어도 하나의 원자가는 비-수소 치환기에 공유결합되며, 단 적어도 하나의 비-수소 치환기는 적어도 하나의 뉴클레오시드를 함유하는 기이다. 하나 및 하나의 원자가만이 뉴클레오시드를 함유하는 기에 공유결합되는 포스포에스터는 말단 포스포에스터이다. 2 개의 원자가가 뉴클레오시드-함유 기에 공유결합되는 포스포에스터는 인터뉴클레오시드 포스포에스터이다. 포스포에스터는 다음 구조의 기일 수 있다:
Figure pct00011
상기 식에서,
XE1 및 XE2 각각은 독립적으로 O 또는 S이고;
RE1 및 RE3 각각은 독립적으로 수소 또는 뉴클레오시드에 대한 결합; 비염기 스페이서의 당 유사체; 생체내가역성기; 비-생체내가역성기; 보조 모이어티; 접합기; 표적화 모이어티에 결합된 링커; 표적화 모이어티 및 1 이상(예를 들어, 1 내지 6 개)의 보조 모이어티에 결합된 링커; 또는 화학식 -P(=XE1)(-XE2-RE2A)-O-의 기에서의 인 원자이되,
상기 식에서, RE2A는 수소, 생체내가역성기, 비-생체내가역성기, 보조 모이어티, 접합기, 표적화 모이어티에 결합된 링커, 또는 표적화 모이어티 및 1 이상(예를 들어, 1 내지 6 개)의 보조 모이어티에 결합된 링커이며;
RE2는 수소, 생체내가역성기, 비-생체내가역성기, 보조 모이어티, 접합기, 표적화 모이어티에 결합된 링커, 또는 표적화 모이어티 및 1 이상(예를 들어, 1 내지 6 개)의 보조 모이어티에 결합된 링커이고;
단, RE1 및 RE3 중 적어도 하나는 적어도 하나의 뉴클레오시드를 함유한 기에 대한 결합이다.
RE1 및 RE3 각각이 독립적으로 적어도 하나의 뉴클레오시드를 함유하는 기에 대한 결합인 경우, 포스포에스터는 인터뉴클레오시드 포스포에스터이다. RE1 및 RE3 중 하나가 뉴클레오시드를 함유하지 않는 기에 대한 결합인 경우, 포스포에스터는 말단 포스포에스터이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "포스포디에스터"는 3 개의 원자가 중 2 개가 비-수소 치환기로 치환되는 한편, 나머지 원자가는 수소로 치환된 포스포에스터를 지칭한다. 포스포디에스터는 포스페이트, 포스포로티오에이트, 또는 포스포로디티오에이트; 뉴클레오시드(들), 비염기 스페이서(들), 및/또는 포스포릴기(들)에 대한 1 또는 2 개의 결합; 및 포스포디에스터가 뉴클레오시드, 비염기 스페이서, 또는 포스포릴기에 대한 하나의 결합만을 함유하는 경우, 생체내가역성기; 비-생체내가역성기; 보조 모이어티; 접합기; 표적화 모이어티에 결합된 링커; 및 표적화 모이어티 및 1 이상(예를 들어, 1 내지 6 개)의 보조 모이어티에 결합된 링커로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된 하나의 기로 구성된다. 말단 포스포디에스터는 뉴클레오시드를 함유하는 기에 대한 하나의 결합, 및 생체내가역성기; 비-생체내가역성기; 보조 모이어티; 접합기; 포스포릴기; 및 표적화 모이어티 및 선택적으로 1 이상(예를 들어, 1 내지 6 개)의 보조 모이어티에 결합된 링커로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나의 기를 포함한다. 인터뉴클레오시드 포스포디에스터는 뉴클레오시드-함유 기에 대한 2 개의 결합을 포함한다. 포스포디에스터는 다음 구조의 기일 수 있다:
Figure pct00012
상기 식에서,
XE1 및 XE2 각각은 독립적으로 O 또는 S이고;
RE1 및 RE3 각각은 독립적으로 수소 또는 뉴클레오시드에 대한 결합; 비염기 스페이서의 당 유사체; 생체내가역성기; 비-생체내가역성기; 보조 모이어티; 접합기; 표적화 모이어티에 결합된 링커; 표적화 모이어티 및 1 이상(예를 들어, 1 내지 6 개)의 보조 모이어티에 결합된 링커; 또는 화학식 -P(=XE1)(-XE2-RE2A)-O-의 기에서의 인 원자이되,
상기 식에서, RE2A는 수소, 생체내가역성기, 비-생체내가역성기, 보조 모이어티, 접합기, 표적화 모이어티에 결합된 링커, 또는 표적화 모이어티 및 1 이상(예를 들어, 1 내지 6 개)의 보조 모이어티에 결합된 링커이며;
RE2는 수소, 생체내가역성기, 비-생체내가역성기, 보조 모이어티, 접합기, 표적화 모이어티에 결합된 링커, 또는 표적화 모이어티 및 1 이상(예를 들어, 1 내지 6 개)의 보조 모이어티에 결합된 링커이고;
단, RE1, RE2, 및 RE3 중 하나 및 하나만은 수소이며;
단, RE1 및 RE3 중 적어도 하나는 적어도 하나의 뉴클레오시드를 함유한 기에 대한 결합이다.
RE1 및 RE3 둘 다가 적어도 하나의 뉴클레오시드를 함유하는 기에 대한 결합인 경우, 포스포디에스터는 인터뉴클레오시드 포스포디에스터이다. RE1 및 RE3 중 하나 및 하나만이 뉴클레오시드를 함유하는 기에 대한 결합인 경우, 포스포디에스터는 말단 포스포디에스터이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "포스포릴"은 하기 화학식의 치환기를 지칭한다:
Figure pct00013
상기 식에서,
XE1 및 XE2 각각은 독립적으로 O 또는 S이고;
RE2A는 수소, 생체내가역성기, 비-생체내가역성기, 보조 모이어티, 접합기, 표적화 모이어티에 결합된 링커, 또는 표적화 모이어티 및 1 이상(예를 들어, 1 내지 6 개)의 보조 모이어티에 결합된 링커이며;
RE3A는 수소 또는 개방 원자가이다.
기가 포스포릴에 결합되는 것으로 확인될 때, 기는 포스포릴의 인 원자에 결합된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "포스포트리에스터"는 모든 3 개의 원자가가 비-수소 치환기로 치환된 포스포에스터를 지칭한다. 포스포트리에스터는 포스페이트, 포스포로티오에이트, 또는 포스포로디티오에이트; 뉴클레오시드(들), 또는 비염기 스페이서(들), 및/또는 포스포릴기(들)에 대한 1 또는 2 개의 결합; 및 생체내가역성기; 비-생체내가역성기; 보조 모이어티; 접합기; 및 표적화 모이어티 및 선택적으로 1 이상(예를 들어, 1 내지 6 개)의 보조 모이어티에 결합된 링커로부터 독립적으로 선택된 1 또는 2 개의 기로 구성된다. 말단 포스포트리에스터는 뉴클레오시드를 함유하는 기 및 생체내가역성기; 비-생체내가역성기; 보조 모이어티; 접합기; 포스포릴기; 및 표적화 모이어티 및 선택적으로 1 이상(예를 들어, 1 내지 6 개)의 보조 모이어티에 결합된 링커로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된 2 개의 기에 대한 하나의 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 말단 포스포트리에스터는 표적화 모이어티 및 선택적으로 1 이상(예를 들어, 1 내지 6 개)의 보조 모이어티에 결합된 1 또는 0 개의 링커를 함유한다. 인터뉴클레오시드 포스포트리에스터는 뉴클레오시드-함유 기에 대한 2 개의 결합을 포함한다. 포스포트리에스터는 다음 구조의 기일 수 있다:
Figure pct00014
상기 식에서,
XE1 및 XE2 각각은 독립적으로 O 또는 S이고;
RE1 및 RE3 각각은 독립적으로 뉴클레오시드에 대한 결합; 비염기 스페이서의 당 유사체; 생체내가역성기; 비-생체내가역성기; 보조 모이어티; 접합기; 표적화 모이어티에 결합된 링커; 표적화 모이어티 및 1 이상(예를 들어, 1 내지 6 개)의 보조 모이어티에 결합된 링커; 또는 화학식 -P(=XE1)(-XE2-RE2A)-O-의 기에서의 인 원자이되,
상기 식에서, RE2A는 수소; 생체내가역성기; 비-생체내가역성기; 보조 모이어티; 접합기; 표적화 모이어티에 결합된 링커; 또는 표적화 모이어티 및 1 이상(예를 들어, 1 내지 6 개)의 보조 모이어티에 결합된 링커이며;
RE2는 생체내가역성기; 비-생체내가역성기; 보조 모이어티; 접합기; 표적화 모이어티에 결합된 링커; 또는 표적화 모이어티 및 1 이상(예를 들어, 1 내지 6 개)의 보조 모이어티에 결합된 링커이고;
단, RE1 및 RE3 중 적어도 하나는 적어도 하나의 뉴클레오시드를 함유한 기에 대한 결합이다.
RE1 및 RE3 둘 다가 적어도 하나의 뉴클레오시드를 함유하는 기에 대한 결합인 경우, 포스포트리에스터는 인터뉴클레오시드 포스포트리에스터이다. RE1 및 RE3 중 하나 및 하나만이 뉴클레오시드를 함유하는 기에 대한 결합인 경우, 포스포트리에스터는 말단 포스포트리에스터이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "생리학적 조건"은 생존한 포유동물의 전문 항원-제시 세포 내부에 존재할 수 있는 조건을 지칭한다. 생리학적 조건은 약 35℃ 내지 약 42℃의 온도 및 약 6 내지 약 8의 수성 pH를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "보호기"는 화학 합성 동안 1 이상의 바람직하지 않은 반응에 참여하는 것으로부터 하이드록시, 아미노, 또는 카보닐을 보호하도록 의도된 기를 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "O-보호기"는 화학 합성 동안 1 이상의 바람직하지 않은 반응에 참여하는 것으로부터 하이드록시 또는 카보닐기를 보호하도록 의도된 기를 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "N-보호기"는 화학 합성 동안 1 이상의 바람직하지 않은 반응에 참여하는 것으로부터 질소 함유(예를 들어, 아미노 또는 히드라진) 기를 보호하도록 의도된 기를 나타낸다. 일반적으로 사용되는 O- 및 N-보호기는 본원에 참고로 포함되는 Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis," 3rd Edition (John Wiley & Sons, New York, 1999)에 개시되어 있다. 예시적 O- 및 N-보호기는 알카노일, 아릴로일, 또는 카바밀기, 예컨대 포르밀, 아세틸, 프로피오닐, 피발로일, t-부틸아세틸, 2-클로로아세틸, 2-브로모아세틸, 트리플루오로아세틸, 트리클로로아세틸, 프탈릴, o-니트로페녹시아세틸, α-클로로부티릴, 벤조일, 4-클로로벤조일, 4-브로모벤조일, t-부틸디메틸실릴, 트리-iso-프로필실릴옥시메틸, 4,4'-디메톡시트리틸, 이소부티릴, 페녹시아세틸, 4-이소프로필페녹시아세틸, 디메틸포름아미디노, 및 4-니트로벤조일을 포함한다.
카보닐 함유 기를 보호하기 위한 예시적 O-보호기는, 비제한적으로, 아세탈, 아실랄, 1,3-디티안, 1,3-디옥산, 1,3-디옥솔란, 및 1,3-디티올란을 포함한다.
다른 O-보호기는, 비제한적으로, 치환된 알킬, 아릴, 및 아릴-알킬 에터(예를 들어, 트리틸; 메틸티오메틸; 메톡시메틸; 벤질옥시메틸; 실록시메틸; 2,2,2,-트리클로로에톡시메틸; 테트라하이드로피라닐; 테트라하이드로푸라닐; 에톡시에틸; 1-[2-(트리메틸실릴)에톡시]에틸; 2-트리메틸실릴에틸; t-부틸 에터; p-클로로페닐, p-메톡시페닐, p-니트로페닐, 벤질, p-메톡시벤질, 및 니트로벤질); 실릴 에터(예를 들어, 트리메틸실릴; 트리에틸실릴; 트리이소프로필실릴; 디메틸이소프로필실릴; t-부틸디메틸실릴; t-부틸디페닐실릴; 트리벤질실릴; 트리페닐실릴; 및 디페닐메틸실릴); 카보네이트(예를 들어, 메틸, 메톡시메틸, 9-플루오레닐메틸; 에틸; 2,2,2-트리클로로에틸; 2-(트리메틸실릴)에틸; 비닐, 알릴, 니트로페닐; 벤질; 메톡시벤질; 3,4-디메톡시벤질; 및 니트로벤질)를 포함한다.
다른 N-보호기는, 비제한적으로, 키랄 보조제, 예컨대 보호된 또는 비보호된 D, L 또는 D, L-아미노산, 예컨대 알라닌, 류신, 페닐알라닌 등; 설포닐-함유 기, 예컨대 벤젠설포닐, p-톨루엔설포닐 등; 카바메이트 형성기, 예컨대 벤질옥시카보닐, p-클로로벤질옥시카보닐, p-메톡시벤질옥시카보닐, p-니트로벤질옥시카보닐, 2-니트로벤질옥시카보닐, p-브로모벤질옥시카보닐, 3,4-디메톡시벤질옥시카보닐, 3,5-디메톡시벤질 옥시카보닐, 2,4-디메톡시벤질옥시카보닐, 4-메톡시벤질옥시카보닐, 2-니트로-4,5-디메톡시벤질옥시카보닐, 3,4,5-트리메톡시벤질옥시카보닐, 1-(p-비페닐릴)-1-메틸에톡시카보닐, α,α-디메틸-3,5-디메톡시벤질옥시카보닐, 벤즈하이드릴옥시 카보닐, t-부틸옥시카보닐, 디이소프로필메톡시카보닐, 이소프로필옥시카보닐, 에톡시카보닐, 메톡시카보닐, 알릴옥시카보닐, 2,2,2,-트리클로로에톡시카보닐, 페녹시카보닐, 4-니트로페녹시 카보닐, 플루오레닐-9-메톡시카보닐, 사이클로펜틸옥시카보닐, 아다만틸옥시카보닐, 사이클로헥실옥시카보닐, 페닐티오카보닐 등, 아릴-알킬기, 예컨대 벤질, 트리페닐메틸, 벤질옥시메틸 등 및 실릴기, 예컨대 트리메틸실릴 등을 포함한다. 유용한 N-보호기는 포르밀, 아세틸, 벤조일, 피발로일, t-부틸아세틸, 알라닐, 페닐설포닐, 벤질, t-부틸옥시카보닐(Boc), 및 벤질옥시카보닐(Cbz)이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "피리드-2-일 히드라존"은 하기 구조의 기를 나타낸다:
Figure pct00015
, 상기 식에서 R'은 독립적으로 H 또는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬이다. 피리드-2-일 히드라존은 비치환될 수 있다(즉, 각각의 R'은 H임).
본원에 사용된 바와 같은 용어 "입체화학적으로 풍부화된"은 인용된 기의 하나의 입체 이성질체 구성에 대해 동일한 기의 반대 입체 이성질체에 비교한 국소 입체화학적 우선성을 지칭한다. 따라서, 입체화학적으로 풍부화된 포스포로티오에이트를 함유한 폴리뉴클레오티드는 소정의 입체화학의 포스포로티오에이트가 반대 입체화학의 포스포로티오에이트 보다 우선적으로 존재하는 가닥이다. 이 우선성은 소정의 입체화학의 포스포로티오에이트에 대한 부분입체 이성질체 비를 사용하여 수치적으로 나타낼 수 있다. 소정의 입체화학의 포스포로티오에이트에 대한 부분입체 이성질체 비는 반대 입체화학을 갖는 것으로 확인된 포스포로티오에이트를 갖는 부분입체 이성질체에 대한 소정의 입체화학을 갖는 것으로 확인된 포스포로티오에이트를 갖는 부분입체 이성질체의 몰비이다. 소정의 입체화학의 포스포로티오에이트에 대한 부분입체 이성질체 비는 1.1 이상(예를 들어, 4 이상, 9 이상, 19 이상, 또는 39 이상)일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "Q-태그"는 -NH2 아민을 함유하는 화합물과의 트랜스글루타미나아제-매개된 반응시, 폴리펩티드의 부위를 함유하는 접합체를 제공하는 글루타민 잔기를 함유하는 폴리펩티드의 부위를 지칭하되, 글루타민 잔기는 화합물에 결합된 아마이드를 포함하도록 변형된 측쇄를 포함한다. Q-태그는 당업계에 알려져 있다. Q-태그의 비-제한적인 예는 LLQGG 및 GGGLLQGG이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "변형된 사이클로알케닐"은 개방 원자가가 H로 치환된 경우, 적어도 16 kcal/mol의 고리 변형 에너지를 갖는 사이클로알케닐기를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "당 유사체"는 2 개의 하이드록실기를 포스페이트, 포스포로티오에이트, 또는 포스포로디티오에이트 내의 산소 원자에 대한 결합, 또는 캡핑기로 치환하도록 변형된 C3-6 단당류 또는 C36 당알코올(예를 들어, 글리세롤)인 2가 또는 3가 기를 나타낸다. 당 유사체는 상보적 가닥에서 핵염기와의 수소 결합에 관여할 수 있는 핵염기를 함유하지 않는다. 당 유사체는 사이클릭 또는 아사이클릭이다. 당 유사체에 포함되는 추가의 선택적 변형은 나머지 하이드록실기 또는 탄소-결합된 수소 원자 중 1, 2, 또는 3 개의 H; 선택적으로 치환된 C1-6 알킬; 본원에 정의된 바와 같은 -LinkA(-T)p; 접합기; -(CH2)t1-ORZ(상기 식에서, t1은 1 내지 6의 정수이고, RZ는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬, 선택적으로 치환된 C2-6 알케닐, 선택적으로 치환된 C2-6 알키닐, 선택적으로 치환된 C6-14 아릴, 선택적으로 치환된 C3-8 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 (C1-9 헤테로사이클릴)-C1-6-알킬, 선택적으로 치환된 (C6-10 아릴)-C1-6-알킬, 또는 선택적으로 치환된 (C3-8 사이클로알킬)-C1-6-알킬임)로의 치환; 1 또는 2 개의 불포화(들)(예를 들어, 1 또는 2 개의 이중 결합)의 도입; 및 1, 2, 또는 3 개의 수소 또는 하이드록실기의 알킬, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 또는 헤테로사이클릴에 대해 정의된 바와 같은 치환기로의 치환이다. 당 유사체의 비-제한적인 예는 선택적으로 치환된 C2-6 알킬렌, 선택적으로 치환된 C2-6 알케닐렌, 선택적으로 치환된 C5 사이클로알칸-1,3-디일, 선택적으로 치환된 C5 사이클로알켄-1,3-디일, 선택적으로 치환된 헤테로사이클-1,3-디일(예를 들어, 선택적으로 치환된 피롤리딘-2,5-디일, 선택적으로 치환된 테트라하이드로푸란-2,5-디일, 또는 선택적으로 치환된 테트라하이드로티오펜-2,5-디일), 또는 선택적으로 치환된 (C1-4 알킬)-(C3-8 사이클로알킬렌)(예를 들어, 선택적으로 치환된 (C1 알킬)-(C3 사이클로알킬렌))이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "설파이드"는 2가 -S- 또는 =S 기를 나타낸다. 디설파이드는 -S-S-이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "표적화 모이어티"는 소정의 표적 세포 집단(예를 들어, 항원-제시 세포(APC; 예를 들어, 전문 APC(예를 들어, B-세포, pDC, 또는 대식세포)))과 연관된 수용체 또는 다른 수용성(receptive) 모이어티와 특이적으로 결합하거나 반응적으로 연합되거나 복합체화되는 모이어티(예를 들어, 소분자, 예를 들어, 카보하이드레이트)를 나타낸다. 본 발명의 접합체는 표적화 모이어티를 함유한다. 표적화 모이어티는 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 조작된 유도체(예를 들어, Fcab 또는 융합 단백질(예를 들어, scFv))일 수 있다. 표적화 모이어티는 폴리펩티드일 수 있다. 대안적으로, 표적화 모이어티는 소분자(예를 들어, 만노오스) 또는 소분자의 클러스터(예를 들어, 만노오스의 클러스터)일 수 있다. 표적화 모이어티를 포함하는 본 발명의 접합체는 표적화 모이어티가 결합하는 표적에 대해 100 nM 미만의 Kd를 나타낼 수 있다. Kd는 당업계에 알려진 방법을 사용하여, 예를 들어 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance)(SPR)을 사용하여, 예를 들어 BIACORETM 시스템(GE Healthcare, Little Chalfont, the United Kingdom)을 사용하여 측정된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "1,2,4,5-테트라진기"는 다음 화학식의 기를 나타낸다:
Figure pct00016
, 상기 식에서 R'은 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴이고; R"은 선택적으로 치환된 알킬렌, 선택적으로 치환된 헤테로알킬렌, 선택적으로 치환된 아릴렌, 선택적으로 치환된 사이클로알킬렌, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴렌, 또는 기 -Ra-Rb-이되, 각각의 Ra 및 Rb는 독립적으로 선택적으로 치환된 알킬렌, 선택적으로 치환된 헤테로알킬렌, 선택적으로 치환된 아릴렌, 선택적으로 치환된 사이클로알킬렌, 또는 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴렌이다.
용어 "치료 효과"는 약학적 활성 물질에 의해 야기된 대상체, 구체적으로 포유동물, 및 더욱 구체적으로 인간에서의 국소 또는 전신 효과를 지칭한다. 따라서, 상기 용어는 동물 또는 인간에서 질환의 진단, 치유, 완화, 치료 또는 예방 또는 바람직한 신체적 또는 정신적 발달 및 상태의 향상에서 사용하도록 의도된 임의의 물질을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료적 유효량" 또는 "치료적 유효 용량"은 치료될 질환의 증상을 개선, 치료, 또는 적어도 부분적으로 막기 위해 필요한 면역조절 폴리뉴클레오티드 또는 접합체의 양을 나타낸다. 이 용도를 위해 효과적인 양은 질환의 중증도 및 대상체의 체중 및 일반 상태에 의존한다. 통상적으로, 시험관내에서 사용되는 투여량은 약학 조성물의 생체내 투여를 위해 유용한 양에서 유용한 안내를 제공할 수 있으며, 동물 모델이 사용되어, 특별한 질환의 치료를 위해 효과적인 투여량을 결정할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "티오카보닐"은 C(=S) 기를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "티오헤테로사이클릴렌"은 기 -S-R-을 나타내되, 상기 식에서 R은 헤테로사이클릴렌이다. 헤테로사이클릴렌은 선택적으로 헤테로사이클릴에 대해 기재된 방식으로 치환될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "티올"은 -SH 기를 나타낸다.
환자에서의 질환 또는 병태에 대한 참고에서 사용된 바와 같은 용어 "치료하는 것"은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 접합체를 환자에게 투여하는 것에 의해 환자에서 유익하거나 소망하는 결과, 예를 들어 임상 결과를 얻는 것을 지칭하는 것으로 의도된다. 유익하거나 소망하는 결과는 질환 또는 병태의 1 이상의 증상의 경감 또는 개선; 질환 또는 병태의 정도의 축소; 질환 또는 병태의 안정화(즉, 악화되지 않음); 질환 또는 병태의 확산의 예방; 질환 또는 병태의 진행의 지연 또는 늦춤; 질환 또는 병태의 일시적 완화; 및 관해(부분적 또는 전체적)를 포함할 수 있다. 질환 또는 병태를 "일시적 완화시키는 것"은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 접합체를 이용한 치료의 부재시 정도 또는 시간 경과와 비교하여, 질환 또는 병태의 정도 및/또는 바람직하지 않은 임상 징후가 감소하고/하거나 진행의 시간 경과가 늦춰지는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "트리아졸로사이클로알케닐렌"은 8-원자 고리에 융합된 1,2,3-트리아졸 고리를 함유하는 헤테로사이클릴렌을 지칭하며, 이의 모든 엔도사이클릭 원자는 탄소 원자이고, 다리목 원자는 sp2-혼성화된 탄소 원자이다. 트리아조사이클로알케닐렌은 선택적으로 헤테로사이클릴에 대해 기재된 방식으로 치환될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "트리아졸로헤테로사이클릴렌"은 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하는 8-원자 고리에 융합된 1,2,3-트리아졸 고리를 함유하는 헤테로사이클릴렌을 지칭한다. 트리아졸로헤테로사이클릴렌의 다리목 원자는 탄소 원자이다. 트리아졸로헤테로사이클릴렌은 선택적으로 헤테로사이클릴에 대해 기재된 방식으로 치환될 수 있다.
용어 "면역조절 폴리뉴클레오티드", "면역자극 폴리뉴클레오티드", "면역억제 폴리뉴클레오티드", 및 "접합체"는 각각 면역조절 폴리뉴클레오티드, 면역자극 폴리뉴클레오티드, 면역억제 폴리뉴클레오티드 및 접합체의 염을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 용어 "면역조절 폴리뉴클레오티드", "면역자극 폴리뉴클레오티드", "면역억제 폴리뉴클레오티드", 및 "접합체"는 포스페이트, 포스포로티오에이트, 또는 포스포로디티오에이트의 양성화된, 중성 형태(P-XH 모이어티, 상기 식에서 X는 O 또는 S임) 및 포스페이트, 포스포로티오에이트, 또는 포스포로디티오에이트의 탈양성화된, 이온 형태(P-X- 모이어티, 상기 식에서 X는 O 또는 S임) 둘 다를 포함한다. 따라서, 수소로서 RE1, RE2, 및 RE3 중 1 이상을 갖는 것으로 기재된 포스포에스터 및 포스포디에스터는 포스페이트, 포스포로티오에이트, 또는 포스포로디티오에이트가 탈양성화된, 이온 형태로 존재하는 염을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "선천적 면역 반응" 및 "선천적 면역력"은 당업계에 인식되어 있으며, 다양한 경로를 통한 사이토카인 생산 및 세포 사멸을 포함한 상이한 형태의 세포 활동을 포함하는 병원균-연관된 분자 패턴의 인식시 신체의 면역계가 개시되는 비-특이적 방어 메커니즘을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 선천적 면역 반응은 톨-유사 수용체 9(TLR9)에 의해 매개된 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드에 대한 세포 반응을 포함하며, 이는 비제한적으로, 염증성 사이토카인의 생산(예를 들어, I 형 인터페론 또는 IL-10 생산) 증가, NFκB 경로의 활성화, 면역 세포의 증식, 성숙, 분화 및/또는 생존 증가, 및 일부 경우에, 아폽토시스의 유도를 포함한다. 선천적 면역력의 활성화는 당업계에 알려진 방법을 사용하여, 예컨대 (NF)-κB 활성화를 측정하여 검출될 수 있다.
용어 "적응성 면역 반응" 및 "적응성 면역력"은 당업계에 인식되어 있으며, 체액 반응 및 세포-매개된 반응 둘 다를 포함하는 특정 항원의 인식시 신체의 면역계가 개시되는 항원-특이적 방어 메커니즘을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 적응성 면역 반응은 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드에 의해 촉발되고/되거나 증가된 세포 반응을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역자극 폴리뉴클레오티드 또는 이의 일부는 항원-특이적 적응성 면역 반응의 항원 표적이다. 다른 실시양태에서, 면역자극 폴리뉴클레오티드는 항원-특이적 적응성 면역 반응의 항원 표적은 아니지만, 그럼에도 불구하고 적응성 면역 반응을 증가시킨다. 적응성 면역 반응의 활성화는 당업계에 알려진 방법을 사용하여, 예컨대 항원-특이적 항체 생산, 또는 항원-특이적 세포-매개된 세포독성의 수준을 측정하여 검출될 수 있다.
용어 "톨-유사 수용체"(또는 "TLR")는 당업계에 인식되어 있으며, 미생물 병원균을 인식하는 선천적 면역계의 센서로서 초기에 확인된 패턴 인식 수용체의 패밀리를 지칭한다. TLR은 보통 "PAMP"(pathogen associated molecular pattern(병원균 연관된 분자 패턴))로서 지칭되는 미생물에서의 별개의 구조를 인식한다. TLR에 대한 리간드 결합은 선천적 면역 반응 및/또는 적응성 면역 반응을 유도하는 세포내 시그널링 경로의 캐스케이드를 호출한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "톨-유사 수용체" 또는 "TLR"은 또한 세포에 의해 발현된 톨-유사 수용체 단백질의 기능적 단편을 지칭한다. 인간에서는, TLR-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7/8, 및 -9를 포함한 10 개의 TLR이 확인되었다. D'Arpa and Leung, Adv. Wound Care, 6:330-343 (2017), 이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. TLR을 코딩하는 인간 유전자가 알려져 있다.
CD289(cluster of differentiation 289(분화 클러스터 289))로도 표기되는 톨-유사 수용체 9(TLR9)는 톨-유사 수용체(TLR) 패밀리의 멤버이다. Du et al., Eur. Cytokine Netw., 11:362-371 (2000), 이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. TLR9는 수지상 세포(DC), B 림프구, 대식세포, 천연 킬러 세포, 및 다른 항원 제시 세포를 포함한 면역계 세포에서 발현되는 중요한 수용체이다. TLR9 활성화는 선천적 및 적응성 면역력을 가교하는 시그널링 캐스케이드를 촉발시킨다. Martinez-Campos et al., Viral Immunol., 30:98-105 (2016); Notley et al., Sci. Rep., 7:42204 (2017); 이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 천연 TLR-9 작용제는 비메틸화된 시토신-구아닌 디뉴클레오티드(CpG)-함유 올리고데옥시뉴클레오티드(CpG ODN)를 포함한다. 본 발명에서 사용되는 TLR-9 리간드는, 비제한적으로, 본원에 제공된 바와 같은 자연적으로 존재하거나 합성인 CpG ODN, 및 다른 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드 및/또는 면역접합체를 포함한다. TLR9 시그널링 경로의 활성화는 당업계에 알려진 방법을 사용하여, 예컨대 골수 분화 항원 88(myeloid differentiation antigen 88)(MyD88)의 모집, 핵 인자(nuclear factor)(NF)-κB, c-Jun N-말단 키나아제(JNK), 및 p38 미토겐-활성화된 단백질 키나아제(mitogen-activated protein kinase)(MAPK) 시그널링 경로의 활성화, 인터페론 조절 인자-7의 활성화, 1 이상의 사이토카인, 예컨대 I 형 인터페론(IFN), 인터류킨(IL)-6, IL-10, 및 IL-12의 발현 수준, 1 이상의 면역 세포 집단, 예컨대 NK 세포, 천연 킬러 T 세포, 단핵구의 활성화, 및 세포독성 림프구(cytotoxic lymphocyte)(CTL) 및 T 보조-1(Th1) 반응의 수준, 및 면역글로불린 분비의 수준을 측정하여 검출될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "TLR-발현 세포"는 톨-유사 수용체를 발현하고 작용제에 대한 톨-유사 수용체의 결합시 톨-유사 수용체 시그널링 경로를 활성화할 수 있는 세포를 지칭한다. 톨-유사 수용체는 세포 표면 상 및/또는 세포의 1 이상의 세포내 구획, 예컨대 엔도솜 또는 식포의 막 상에서 발현될 수 있다. TLR-발현 세포는 톨-유사 수용체 이외의 1 이상의 세포 표면 항원을 추가로 발현할 수 있다. 특정 면역 세포는 TLR을 발현하고, 면역 세포에서 TLR 시그널링 경로의 활성화는 선천적 면역 반응, 및/또는 적응성 면역 반응을 유도한다. TLR 시그널링 경로에 의해 활성화된 면역 세포는 신체로부터 다른 질환에 걸린 세포의 제거를 도울 수 있다. 특정 질환에 걸린 세포(예를 들어, 암 세포 또는 바이러스-감염된 세포)는 TLR을 발현하고, 질환에 걸린 세포에서 TLR 시그널링 경로의 활성화는 예컨대, 유도된 아폽토시스를 통해 질환에 걸린 세포의 사멸을 야기할 수 있다. TLR9-발현 세포의 예는, 비제한적으로, 수지상 세포(DC), B 세포, T 세포, 랑게르한스 세포(Langerhans cell), 각질형성세포, 비만 세포, 내피 세포, 근섬유아세포, 및 1 차 섬유아세포를 포함한다. 세포가 임의의 톨-유사 수용체(예를 들어, TLR9)를 발현하는지 여부를 결정하는 것은 당업계에 알려진 방법을 사용하여, 예컨대 세포에서 톨-유사 수용체의 mRNA를 검출하여 수행될 수 있다.
용어 "면역 세포"는 당업계에 인식되어 있으며, 본원에 사용된 바와 같이 숙주 방어 메커니즘에 관련된 임의의 세포, 예컨대 전-염증성 사이토카인을 생산하는 세포, 및 조직 손상 및/또는 질환 발병에 참여하는 세포를 지칭한다. 면역 세포의 예는, 비제한적으로, T 세포, B 세포, 천연 킬러 세포, 호중구, 비만 세포, 대식세포, 항원-제시 세포(APC), 호염구, 및 호산구를 포함한다.
용어 "항원 제시 세포" 또는 "APC"는 당업계에 인식되어 있으며, 특정 림프구, 예컨대 T 세포에 의한 인식을 위해 항원을 처리하고 제시하는 것에 의해 세포 면역 반응을 매개하는 면역 세포의 이종 기를 지칭한다. 항원 제시 세포의 예시적 유형은, 비제한적으로, 예를 들어, B 세포, 단핵구, 수지상 세포, 및 랑게르한스 세포를 포함한 전문 항원 제시 세포뿐 아니라, 예를 들어 각질형성세포, 내피 세포, 별아교세포, 섬유아세포, 및 희돌기교세포를 포함한 다른 항원 제시 세포를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항원 제시 세포"는 생체내에서 발견되는 항원 제시 세포 및 생체내 세포로부터 유래된 시험관내 세포 배양액에서 발견되는 것을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 항원 제시 세포는 또한, 인공적으로 변형되어, 예컨대 유전적으로 변형되어, 톨-유사 수용체(예를 들어, TLR9)를 발현하거나 톨-유사 수용체(예를 들어, TLR9)의 발현 수준을 조절하는 APC를 포함한다.
용어 "수지상 세포" 또는 "DC"는 당업계에 인식되어 있으며, 특화된 항원-감지 및 항원-제시 세포(APC)의 이종 기를 지칭한다. 인간 DC는 3 개의 주요 서브세트로 분류된다: 플라스마사이토이드 DC(pDC), 골수 DC(mDC) 및 단핵구-유래된 DC(MDDC). Schraml et al., Curr. Opin. Immunol., 32:13-20 (2015); 이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. DC의 서브세트는 별개의 TLR 발현 패턴을 기반으로 확인될 수 있다. 예로서, DC의 골수 또는 "종래의" 서브세트(mDC)는 자극되었을 때 TLR 1-8을 발현하고, 활성화 마커(예를 들어, CD80, CD86, MHC 클래스 I 및 II, CCR7), 전-염증성 사이토카인, 및 케모카인의 캐스케이드가 생산된다. 이 자극의 결과 및 생성된 발현은 항원-특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포 프라이밍(priming)이다. 이들 DC는 항원을 흡수하고 이들을 적절한 형태로 T 세포에 제시하는 향상된 능력을 얻는다. DC의 플라스마사이토이드 서브세트(pDC)는 활성화시 TLR7 및 TLR9를 발현하고, NK 세포뿐 아니라, T-세포의 활성화를 야기한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "항원"은 선천적 면역 반응 및 적응성 면역 반응 둘 다를 포함한 면역 반응을 유도할 수 있는 분자 또는 이의 항원성 단편을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 항원은 단백질, 펩티드, 다당류, 지질, 핵산, 특히 RNA 및 DNA, 뉴클레오티드, 및 다른 생물학적 또는 생화학적 물질일 수 있다. 용어 "면역 반응을 유도하다"는 자극자, 예컨대 항원에 대해 반응한 생체내 면역 세포의 자극을 지칭한다. 면역 반응은 세포 면역 반응, 예를 들어 T 세포 및 대식세포 자극, 및 체액 면역 반응, 예를 들어 B 세포 및 상보적 자극 및 항체 생산 둘 다로 구성된다. 면역 반응은, 비제한적으로, 항체 면역어세이, 증식 어세이 등을 포함하여 당업계에 잘 알려진 기술을 사용하여 측정될 수 있다.
용어 "항원성 단편" 및 "항체 결합 단편"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 본원에 사용된 바와 같은 항원성 단편은 특정 반응에서 항원 결합 분자, 예를 들어 항체와 복합체화될 수 있다. 본원에 지칭된 특정 반응은 항원 또는 항원성 단편이 이의 상응하는 항체와 고도로 선택적인 방식으로 반응할 것이며, 다른 항원에 의해 호출될 수 있는 다수의 다른 항체와는 그렇지 않을 것이라는 것을 나타낸다. 이러한 반응의 특이성은 항원에서 1 이상의 에피토프(면역원 결정인자)의 존재에 의해 결정된다. 본원에 사용된 바와 같이, 항원 또는 이의 항원성 단편은 하나의 에피토프를 갖거나, 하나를 초과하는 에피토프를 가질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "T 세포 에피토프"는 T 세포에 의해 생산된 항원의 임의의 에피토프를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "종양 연관 항원" 또는 "TAA"는 본원에 제공된 바와 같은 치료 또는 예방 치료를 투여받은(예를 들어, 면역자극 폴리뉴클레오티드 또는 CpG-Ab 면역접합체의 치료 용량을 투여받은) 암 환자에서의 고형 종양의 스트로마에서 또는 암세포에 의해 발현된 항원을 지칭한다. TAA는 본원에 제공된 치료 또는 예방 치료에서 표적화되거나 표적화되지 않을 수 있다. TAA는 암 세포 상에서 과잉발현, 돌연변이 또는 잘못 조절되지 않아야 하지만, TAA가 정상 세포에서 갖는 바와 동일한 특징을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, TAA는 암 세포에서 과잉발현, 돌연변이 또는 잘못 조절될 수 있다. TAA는 단백질, 핵산, 지질 또는 다른 항원일 수 있다. TAA는 세포-표면 발현된 TAA, 세포내 TAA 또는 핵내 TAA일 수 있다. 고형 종양의 맥락에서, TAA는 고형 종양 덩어리의 스트로마에서 발현될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "스트로마"는 암 세포 이외의 고형 종양 덩어리에서의 성분을 지칭한다. 예를 들어, 스트로마는 섬유아세포, 상피 세포, 다른 혈관 성분 또는 세포외 매트릭스 성분을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "스트로마"는 면역계의 성분, 예컨대 면역 세포(예를 들어, B-세포, T-세포, 수지상 세포, 대식세포, 천연 킬러 세포 등)를 포함하지 않는다. 다양한 TAA가 당업계에 알려져 있다. TAA를 확인하는 것은 당업계에 알려져 있는, 예컨대 그 내용이 본원에 참고로 포함되는 Zhang et al., Methods Mol. Biol., 520:1-10 (2009)에 개시된 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 상응하는 항원과 비-공유결합으로, 가역적으로, 및 특정 방식으로 결합할 수 있는 면역글로불린 패밀리의 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들어, 자연적으로 발생되는 IgG 항체는 이황화물 결합에 의해 서로 연결된 적어도 2 개의 중(H)쇄 및 2 개의 경(L)쇄를 포함하는 테트라머이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서는 VH로서 축약됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3 개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서는 VL로서 축약됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)으로 지칭되는 더욱 보존된 영역과 함께 산재된 상보성 결정 영역(CDR)으로 지칭되는 초가변성의 영역으로 추가로 하위분류될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 다음 순서로 아미노-말단으로부터 카복시-말단으로 배열된 3 개의 CDR 및 4 개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포) 및 고전적인 보체계(complement system)의 제1 성분(Clq)을 포함하여 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 항체는, 비제한적으로, 단클론 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 낙타과 항체, 키메라 항체, 및 항-이디오타입(항-Id) 항체(예를 들어, 본 발명의 항체에 대한 항-Id 항체를 포함함)를 포함한다. 항체는 임의의 아이소타입/클래스(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 또는 서브클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)의 것일 수 있다.
경쇄 및 중쇄 둘 다는 구조적 및 기능적 상동의 영역으로 분류된다. 용어 "불변" 및 "가변"은 기능적으로 사용된다. 이와 관련하여, 경쇄(VL) 및 중쇄(VH) 부위 둘 다의 가변 도메인은 항원 인식 및 특이성을 결정한다는 것이 인식될 것이다. 반대로, 경쇄(CL) 및 중쇄(CH1, CH2 또는 CH3)의 불변 도메인은 중요한 생물학적 특성, 예컨대 분비, 태반경유 이동성, Fc 수용체 결합, 보체 결합 등을 부여한다. 관례상, 불변 영역 도메인의 넘버링은 이들이 항체의 항원 결합 부위 또는 아미노-말단으로부터 더욱 멀어지게 될수록 증가한다. N-말단은 가변 영역이고 C-말단에서는 불변 영역이며; CH3 및 CL 도메인은 실제로 각각 중쇄 및 경쇄의 카복시-말단 도메인을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 맥락에 따라, 용어 "항체"는 또한 항체 분자의 항원 결합 단편을 지칭할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "항원 결합 단편"은 항원의 에피토프와 특이적으로 상호작용하는(예를 들어, 결합, 입체 장해, 안정화/탈안정화, 공간 분포에 의함) 능력을 함유하는 항체의 1 이상의 부위를 지칭한다. 결합 단편의 예는, 비제한적으로, 단일쇄 Fv(scFv), 이황화물-결합된 Fv(sdFv), Fab 단편, F(ab') 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편; F(ab)2 단편, 힌지 영역에서 이황화물 다리에 의해 연결된 2 개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; 항체의 단일 암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; VH 또는 VL 도메인으로 구성된 dAb 단편(Ward et al., Nature, 341:544-546 (1989)); 단일 도메인 항체(VHH), 및 단리된 상보성 결정 영역(CDR), 또는 항체의 다른 에피토프-결합 단편을 포함한다.
용어 "특이적으로 결합하다", "선택적으로 결합하다" 등은 제1 개체가 비-표적인 제3 개체에 결합하는 것에 비해 더 큰 특이성 및 친화도로 제2, 표적 개체에 결합하는, 2 개의 분자, 화합물, 세포 및/또는 입자 사이의 화학적 상호작용을 지칭한다. 일부 실시양태에서, "특이적 결합"은 제3 비-표적 개체에 대한 친화도에 비해 적어도 10 배, 적어도 50 배, 적어도 100 배, 적어도 500 배, 적어도 1000 배 이상인 제2 표적 개체에 대한 제1 개체의 친화도를 지칭한다. 일부 실시양태에서, "특이적 결합"은 항원(또는 이의 항원성 단편)과 항체(또는 이의 항원-결합 단편) 사이의 상호작용을 기재하는 맥락에서 사용된다. 특별한 실시양태에서, "특이적 결합"은 10-5 M 이하, 10-6 M 이하, 또는 10-7 M 이하의 해리 상수(KD)를 갖는 소정의 항원에 대한 항체의 결합, 또는 소정의 항원 이외의 비특이적 항원에 대한 결합을 위한 이의 KD에 비해 적어도 2 배 적은 KD를 갖는 소정의 항원에 대한 항체의 결합을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 특이적 결합은 단백질 및 다른 생물제제의 이종 집단에서, 예를 들어 생물학적 샘플, 예를 들어 혈액, 혈청, 혈장 또는 조직 샘플에서 소정의 항원의 존재를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 특정 지정된 면역어세이 조건 하에서, 특별한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 결합제는 적어도 2 배 백그라운드(background)로 특별한 항원에 특이적으로 결합하고 샘플에 존재하는 다른 항원에 상당한 양으로 상당히 결합하지 않는다. 일 실시양태에서, 지정된 면역어세이 조건 하에서, 특별한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 결합제는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 배 백그라운드로 특별한 항원에 결합하고 샘플에 존재하는 다른 항원에 상당한 양으로 상당히 결합하지 않는다. 이러한 조건 하에서 항체 또는 결합제에 대한 특이적 결합은 항체 또는 결합제가 특별한 단백질에 대한 이의 특이성에 대해 선택되도록 요구할 수 있다. 바람직하거나 적절한 바와 같이, 이 선택은 다른 종(예를 들어, 마우스 또는 래트) 또는 다른 서브타입으로부터의 분자와 교차-반응하는 항체를 빼냄으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 일부 실시양태에서, 특정 소망하는 분자와 교차-반응하는 항체 또는 항체 단편이 선택된다.
용어 "암" 또는 "종양"은 암-유발 세포의 통상적인 특징, 예컨대 비제어된 증식, 불멸, 전이 가능성, 급속한 성장 및 증식 속도, 및 특징적인 형태학적 특징을 포함하는 세포의 존재를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이러한 세포는 면역 체크포인트 억제제, 예컨대 PD-1, PD-L1, 및/또는 CTLA-4의 발현 및 활성으로 인해 부분적으로 또는 완전히 이러한 특징을 나타낸다. 암 세포는 보통 고형 종양의 형태로 있으며, 이는 종양 덩어리를 기반으로, 예를 들어 CAT 스캔, MR 이미징, X-레이, 초음파 또는 촉진과 같은 절차에 의해 검출 가능하고/하거나 환자로부터 얻을 수 있는 샘플에서 1 이상의 암-특이적 항원의 발현 때문에 검출 가능하다. 일부 실시양태에서, 고형 종양은 측정 가능한 면적을 가질 필요가 없다. 암 세포는 또한 암 세포가 동물 내에서 단독으로 또는 산재되어 존재할 수 있는 액상 종양의 형태로 있을 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "파종성 종양" 및 "액상 종양"은 상호교환적으로 사용되며, 비제한적으로, 백혈병 및 림프종 및 다른 혈구 암을 포함한다.
용어 "백혈병"은 "아구"로 지칭되는 미성숙 백혈구의 비장상적 증가가 특징인 혈액 또는 골수의 암의 유형을 지칭한다. 백혈병은 광범위한 질환을 포괄하는 광범위한 용어이다. 결국, 이는 혈액, 골수, 및 림프계에 영향을 주는 매우 광범위한 그룹의 질환의 일부이며, 이는 모두 혈액학적 신생물로서 알려져 있다. 백혈병은 4 개의 주요 범주인 급성 림프구성(또는 림프아구) 백혈병(ALL), 급성 골수성(또는 골수 또는 비-림프성) 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 및 만성 골수성 백혈병(CML)으로 분류될 수 있다. 백혈병의 추가 유형은 모발상 세포 백혈병(HCL), T-세포 전림프구성 백혈병(T-PLL), 거대 과립 림프구성 백혈병, 및 성인 T-세포 백혈병을 포함한다.
용어 "림프종"은 림프 세포로부터 발달된 혈구 종양의 그룹을 지칭한다. 림프종의 2 개의 주요 범주는 호지킨 림프종(HL) 및 비-호지킨 림프종(NHL)이다. 림프종은 림프 조직의 임의의 신생물을 포함한다. 주요 클래스는 림프 및 혈액 둘 다에 속하고 둘 다에 만연한 백혈구의 유형인 림프구의 암이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "암"은 전암뿐 아니라 악성 암을 포함하며, 또한 원발성 종양(예를 들어, 세포가 원래 종양의 부위 이외의 대상체의 신체의 부위로 이동하지 않은 것) 및 2 차 종양(예를 들어, 원래 종양의 부위와 상이한 2 차 부위로의 종양 세포의 전이, 이동으로부터 발생된 것), 재발암 및 불응성 암을 포함한다.
용어 "암 재발(recurrence)" 및 "암 재발(relapse)"은 상호교환적으로 사용되며 관해 후 징후, 증상 또는 질환의 복귀를 지칭한다. 재발암 세포는 원발성 종양의 동일한 부위에서 또는 다른 위치, 예컨대 2 차 암에서 다시 나타날 수 있다. 암 세포는 원발성 암과 동일한 질환 형태 또는 상이한 질환 형태로 다시 나타날 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 원발성 암은 고형 종양이고, 재발암은 액상 종양이다. 다른 실시양태에서, 원발성 암은 액상 종양이고, 재발암은 고형 종양이다. 또 다른 실시양탱서, 원발성 암 및 재발암은 둘 다 고형 종양이거나, 둘 다 액상 종양이다. 일부 실시양태에서, 재발암은 원발성 종양에 의해서도 발현된 적어도 하나의 종양 연관 항원을 발현한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "불응성 암"은 치료에 반응하지 않는 암, 예를 들어 치료(예를 들어, 면역요법을 이용한 치료)의 개시에서 저항성인 암 또는 치료 동안 저항성이 될 수 있는 암을 지칭한다. 용어 "반응하다", "반응" 또는 "반응성"은 예를 들어, 종양 크기의 감소 또는 종양 성장 억제의 의미의 항암 반응을 지칭한다. 상기 용어는 또한 재발의 증거 없이 첫번째 사건 또는 사망으로서 두번째 원발성 암에 대해 검열하는 1 차 재발까지의 기간인 재발까지의 시간 증가, 또는 치료로부터 임의의 원인으로 인한 사망까지의 기간인 전체 생존 증가에 의해 반영된 바와 같은 예후 개선을 지칭한다. 반응하는 것 또는 반응을 갖는 것은 자극자에 노출되었을 때 얻어진 유익한 종료점이 있다는 것을 의미한다. 대안적으로, 음성적 또는 유해한 증상은 자극자에 대한 노출시 최소화되거나, 이동되거나 약화된다. 종양 또는 대상체가 호의적인 반응을 나타낼 가능성을 평가하는 것은 종양 또는 대상체가 호의적인 반응을 나타내지 않을(즉, 반응의 결여를 나타내거나 비-반응성일) 가능성을 평가하는 것과 동등하다는 것이 인식될 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 암은, 비제한적으로, B 세포암, 예를 들어 다발성 골수종, 발덴스트롬(
Figure pct00017
) 마크로글로불린혈증, 중쇄병, 예컨대 알파쇄병, 감마쇄병, 및 뮤쇄병, 양성 단세포군 감마글로불린병증, 및 면역세포 아밀로이드증, 흑색종, 유방암, 폐암, 기관지암, 대장암, 전립선암, 췌장암, 위암, 난소암, 비뇨기 방광암, 뇌 또는 중추신경계 암, 말초신경계 암, 식도암, 자궁경부암, 자궁 또는 자궁내막암, 구강 또는 인두의 암, 간암, 신장암, 고환암, 담도암, 소장 또는 맹장암, 침샘암, 갑상선암, 부신암, 골육종, 연골육종, 혈액학적 조직의 암 등을 포함한다. 본 발명에 의해 포함되는 방법에 적용 가능한 암의 유형의 다른 비-제한적인 예는 인간 육종 및 암종, 예를 들어 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 척색종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종, 윤활막종, 악성중피종, 유윙 종양(Ewing's tumor), 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 대장암, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평세포암종, 기저세포암종, 선암종, 땀샘암종, 피지샘암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭샘암종, 수질암종, 기관지원성 암종, 신세포암종, 간세포암, 담관암, 간암, 융모막암종, 정상피종, 배아암종, 빌름스 종양(Wilms' tumor), 자궁경부암, 골암, 뇌종양, 고환암, 폐암종, 소세포 폐암종, 방광암종, 상피암종, 신경교종, 별아교세포종, 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막세포종, 송과체종, 혈관아세포종, 청신경초종, 핍지교종, 뇌수막종, 흑색종, 신경모세포종, 망막모세포종; 백혈병, 예를 들어, 급성 림프구성 백혈병 및 급성 골수구성 백혈병(골수아구, 전골수구, 골수단핵구, 단핵구 및 적백혈병); 만성 백혈병(만성 골수구성(과립구성) 백혈병 및 만성 림프구성 백혈병); 및 진성적혈구 증가증, 림프종(호지킨병 및 비-호지킨병), 다발성 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 및 중쇄병을 포함한다. 일부 실시양태에서, 암은 사실상 상피성이며, 비제한적으로, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 부인암, 신세포암, 후두암, 폐암, 구강암, 두경부암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 또는 피부암을 포함한다. 다른 실시양태에서, 암은 유방암, 전립선암, 폐암, 또는 결장암이다. 또 다른 실시양태에서, 상피암은 비소세포 폐암, 비유두상 신세포암종, 자궁경부 암종, 난소 암종(예를 들어, 혈청 난소 암종), 또는 유방 암종이다. 상피암은, 비제한적으로, 혈청, 자궁내막모양, 점액, 투명 세포, 브레너(Brenner), 또는 미분화된 것을 포함한 다양한 다른 방식이 특징일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "암 요법" 또는 "암 치료제"는 항-종양 효과를 가하거나 항-종양 활성을 가질 수 있는 요법 또는 약제를 지칭한다. 이러한 항-종양 효과 또는 항-종양 활성은 종양 세포 증식, 생존력, 또는 전이 활성의 속도에서의 감소로서 나타낼 수 있다. 항-종양 활성을 나타내는 가능한 방식은 요법 동안 발생하는 비정상 세포의 성장 속도에서의 감소 또는 종양 크기 안정성 또는 감소를 나타내는 것이다. 이러한 활성은, 비제한적으로, 이종이식 모델, 동종이식 모델, MMTV 모델, 및 항-종양 활성을 조사하기 위해 당업계에 알려진 다른 공지의 모델을 포함하여, 허용된 시험관내 또는 생체내 종양 모델을 사용하여 평가될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 임의의 질환 또는 장애를 "예방하다", "예방하는 것" 또는 "예방"은 본원에 기재된 바와 같은 질환 또는 병태, 또는 이의 증상의 전체적인 또는 부분적인 개시, 재발 또는 확산의 예방을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 대상체는 이러한 대상체가 생물학적으로, 의학적으로 또는 이러한 치료로부터 삶의 질에 있어서 이득을 얻는 경우, 치료를 "필요로 한다".
용어 "치료제"는 당업계에 인식되어 있으며 이를 필요로 하는 대상체에게 투여시 생물학적으로, 생리학적으로, 또는 약학적으로 활성이고 국소로 또는 전신으로 작용하여 유익한 치료 효과를 대상체에게 가하는 임의의 물질을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "면역접합체" 또는 "항체-약물-접합체(antibody-drug-conjugate)(ADC)"는 항원 결합 모이어티(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)와 본원에 기재된 바와 같은 면역조절 폴리뉴클레오티드의 결합을 지칭한다. 결합은 공유결합, 또는 비-공유 상호작용일 수 있으며, 킬레이트화를 포함할 수 있다. 당업계에 알려지거나 본원에 제공된 다양한 링커가 면역접합체를 형성하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역접합체는 본원에 제공된 바와 같은 화학식 (C)의 접합체이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "항원 결합 모이어티"는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티를 지칭하며, 비제한적으로, 항체 및 항원 결합 단편을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "CpG-Ab 면역접합체" 또는 "CpG-Ab"는 항체(Ab) 또는 이의 항원 결합 단편과 본원에 기재된 바와 같은 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드의 결합을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "T-세포 작용제"는 세포의 혼합된 출발 집단으로부터 T 세포의 증식, 분화, 및/또는 생존을 선택적으로 자극하는 임의의 약제를 지칭한다. 따라서, 생성된 세포 집단은 세포의 출발 집단과 비교하여 증가된 수의 T 세포로 풍부화된다. 본 발명에 사용되는 T 세포 작용제는, 비제한적으로, T 세포 수용체(TCR)뿐 아니라, T 세포 공동-자극 분자에 특이적으로 결합하는 항원 분자를 포함한다. T 세포 공동-자극 분자의 예는, 비제한적으로, OX40, CD2, CD27, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), ICOS(CD278), 4-1BB(CD137), GITR, CD30, CD40, BAFFR, HVEM, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3 및 CD83 리간드를 포함한다. 특별한 실시양태에서, T-세포 작용제는 T 세포 공동-자극 분자에 대한 항체이다. 특별한 실시양태에서, T 세포 작용제는 종양 연관 항원(TAA)이다. 특별한 실시양태에서, T 세포 작용제는 병원성 항원이다.
본원에 사용된 바와 같이, "면역 체크포인트" 또는 "면역 체크포인트 분자"는 신호를 조절하는 면역계 내의 분자이다. 면역 체크포인트 분자는 자극 체크포인트 분자로서, 즉 신호를 높일 수 있거나, 또는 억제 체크포인트 분자로서, 즉 신호를 낮출 수 있다. 구체적 실시양태에서, 면역 체크포인트는 T 세포에 의해 또는 항원 제시 세포(APC)에 의해 발현된 단백질이다. 특정 유형의 암 세포는 면역 체크포인트 단백질을 발현하여, 면역 클리어란스(clearance)를 회피한다. 암 세포에 의해 발현된 면역 체크포인트 단백질과 T 세포에 의해 발현된 면역 체크포인트 단백질 사이의 상호작용을 억제하기 위한 면역 체크포인트 조절제의 사용은 특정 암 치료에서 효과적인 것으로 입증되었다.
본원에 사용된 바와 같이, "면역 체크포인트 조절제"는 대상체에서 면역 체크포인트의 활성을 변경할 수 있는 약제이다. 특정 실시양태에서, 면역 체크포인트 조절제는, 비제한적으로, PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3, LAG-3, CEACAM-1, CEACAM-5, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, CD47, 2B4 및 TGFR을 포함한 1 이상의 면역 체크포인트 분자의 기능을 변경한다. 면역 체크포인트 조절제는 면역 체크포인트의 작용제 또는 길항제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 조절제는 면역 체크포인트 결합 단백질(예를 들어, 항체, 항체 Fab 단편, 2가 항체, 항체 약물 접합체, scFv, 융합 단백질, 2가 항체, 또는 4가 항체)이다. 다른 실시양태에서, 면역 체크포인트 조절제는 소분자이다. 특별한 실시양태에서, 면역 체크포인트 조절제는 항-PDl 또는 항-PD-Ll 항체이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "표적화된 전달" 또는 동사형 "표적화하다"는 임의의 다른 기관, 조직, 세포 또는 세포내 구획(비-표적 위치로서 지칭됨)보다는 특정 기관, 조직, 세포 및/또는 세포내 구획(표적화된 위치로서 지칭됨)에서 전달된 약제(예컨대, 면역자극 폴리뉴클레오티드)의 도달을 촉진하는 과정을 지칭한다. 표적화된 전달은 당업계에 알려진 방법을 사용하여, 예를 들어 전신 투여 후 표적화된 세포 집단에서 전달된 약제의 농도를 비-표적 세포 집단에서 전달된 약제의 농도와 비교함으로써 검출될 수 있다. 본원에 제공된 바와 같이, 표적화된 전달은 비-표적 위치와 비교하여 표적화된 위치에서 적어도 2 배 높은 농도를 야기한다. 표적화된 전달은 표적화된 세포와 연관된 수신 모이어티에 대한 표적화 모이어티의 특이적 결합에 의해 달성될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 표적화된 세포와 연관된 수신 모이어티는 표적화된 세포의 표면 상 또는 세포기질 내부에 위치할 수 있다. 일부 실시양태에서, 수신 모이어티는 표적화된 세포와 연관된 항원이다.
용어 "비정상"은 유기체, 조직, 세포 또는 이의 성분의 맥락에서 사용될 때, "정상적인"(예상된) 각각의 특징을 나타내는 유기체, 조직, 세포 또는 이의 성분과 적어도 하나의 관찰 가능하거나 검출 가능한 특징(예를 들어, 연령, 치료, 일시 등)이 상이한 유기체, 조직, 세포 또는 이의 성분을 지칭한다. 하나의 세포 또는 조직 유형에 대해 정상적이거나 예상되는 특징은 상이한 세포 또는 조직 유형에 대해 비정상일 수 있다. 일부 실시양태에서, 비정상 세포는 암 세포이다.
용어 "병용 요법"은 본 발명에 기재된 병태 또는 장애(예를 들어, 암)를 치료하기 위한 2 이상의 치료제의 투여를 지칭한다. 이러한 투여는 실질적으로 동시 방식의 이들 치료제의 공동-투여, 예컨대 치료제의 고정된 비를 갖는 단일 제형을 또는 각각의 치료제에 대해 별도의 제형(예를 들어, 캡슐 및/또는 정맥내 제형)으로 투여하는 것을 포함한다. 또한, 이러한 투여는 대략 동일한 시간 또는 상이한 시간에 순차적으로 또는 별도의 방식으로의 각각의 유형의 치료제의 사용을 포함하기도 한다. 이러한 투여는 또한 상이한 시점에 및/또는 상이한 투여 경로를 통해 투여될 수 있는 별도의 제형으로서 제형화되는 각각의 성분을 포함한다. 임의의 경우에, 병용 요법의 치료 요법은 본원에 기재된 병태 또는 장애를 치료하는데 유익한 치료 효과를 제공할 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "공동-투여하는 것" 또는 "공동-투여" 등은 2 이상의 치료제(예를 들어, 면역접합체 및 면역 체크포인트 조절제), 화합물, 요법 등을 동일한 시간 또는 그 즈음에 투여하는 행동을 지칭한다. 공동-투여하는 것은 동시 투여를 지칭할 수 있되, 본 발명의 상이한 치료제, 예를 들어 면역접합체, T 세포 작용제, 면역 체크포인트 조절제, 또는 다른 화학요법제는 대상체에 대한 동시 투여를 위해 동일한 제형으로 조합되거나, 별도로 제형화될 수 있다. 공동-투여하는 것은 또한 순차적 투여를 지칭할 수 있다. 본 발명의 상이한 치료제, 예를 들어 면역접합체, T 세포 작용제, 면역 체크포인트 조절제, 또는 다른 화학요법제를 투여하는 순서 또는 순차는 달라질 수 있으며 임의의 특별한 순차로 국한되지 않는다. 공동-투여하는 것은 또한 2 이상의 약제가 신체의 상이한 지역에 또는 상이한 전달 계획을 통해 투여되는, 예를 들어 혈액 내로 또는 종양 근위로 제1 약제가 전신으로 투여되고 제2 약제가 종양내로 투여되거나, 제1 약제가 종양내로 투여되고 제2 약제가 전신으로 투여되는 상황을 지칭할 수 있다. 공동-투여하는 것은 또한 예를 들어, 제1 약제가 종양내로 투여되고 제2 약제가 종양내로 투여되는 동일한 전달 계획을 통해 투여되는 2 이상의 약제를 지칭할 수 있다.
"종양내 주사"는 종양 세포 덩어리 및/또는 종양 미세환경 내로 직접 본원에 제공된 바와 같은 약제를 투여하는 것을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 종양 미세환경은 생존, 증식, 또는 확산하기 위한 신생물 과정을 위한 구조적 및/또는 기능적 환경을 생성하는 신생물 환경을 포함한다. 종양 미세환경은 종양을 형성하는 1 이상의 신생물 세포를 감싸고 영양을 공급하는 세포, 분자, 섬유아세포, 세포외 매트릭스 및 혈관으로 구성된다. 종양 미세환경에서 세포 또는 조직의 예는, 비제한적으로, 종양 맥관구조, 종양 침윤 림프구, 섬유아세포 망상 세포, 혈관내피 전구 세포(endothelial progenitor cell)(EPC), 암-연관 섬유아세포, 주피세포, 다른 기질 세포, 세포외 매트릭스(ECM)의 성분, 수지상 세포, 항원 제시 세포, T-세포, 조절 T-세포, 대식세포, 호중구, 및 종양 근위에 위치한 다른 면역 세포를 포함한다. 종양 미세환경에 영향을 주는 세포 기능의 예는, 비제한적으로, 사이토카인 및/또는 케모카인의 생산, 사이토카인에 대한 반응, 펩티드 항원의 항원 처리 및 제시, 백혈구 주화성 및 이동의 조절, 유전자 발현의 조절, 보체 활성화, 시그널링 경로의 조절, 세포-매개된 세포독성, 세포-매개된 면역력, 체액 면역 반응, 및 다른 선천적 또는 적응성 면역 반응을 포함한다. 이들 세포 기능의 조절 효과를 측정한다.
용어 "대상체", "환자", "개체" 등은 본원에서 상호 교환적으로 사용되며 본원에 제공된 방법에 대해 시험관내 또는 생체내로 수정 가능한 임의의 동물 또는 이의 세포를 지칭한다. 특정 비-제한적 실시양태에서, 환자, 대상체 또는 개체는 포유동물, 예컨대 인간, 또는 다른 동물, 예컨대 야생 동물(예컨대, 왜가리, 황새, 두루미 등), 가축(예컨대, 오리, 거위 등) 또는 실험 동물(예컨대, 오랑우탄, 원숭이, 래트, 마우스, 토끼, 기니피그, 마르모트, 들다람쥐 등)이다.
암의 맥락에서 사용된 바와 같은 용어 "생존"은 다음 중 임의의 것을 포함한다: 전체 생존으로도 알려진 사망까지의 생존(상기 사망은 원인과 관계없거나 종양 관련일 수 있음); "무-재발 생존"(용어 재발은 국소화된 재발 및 원격 재발 둘 다를 포함해야 함); 무전이 생존; 무질환 생존(용어 질환은 암 및 이와 연관된 질환을 포함해야 함). 상기 생존의 길이는 정의된 시작점(예를 들어, 진단 또는 치료의 시작 시간) 및 종료점(예를 들어, 사망, 재발 또는 전이)를 참고하여 계산될 수 있다. 또한, 치료의 효능에 대한 기준은 화학요법에 대한 반응, 생존의 확률, 소정의 기간 내에 전이의 확률, 및 종양 재발의 확률을 포함하도록 확장될 수 있다.
본 발명은 면역조절(예를 들어, 면역자극) 폴리뉴클레오티드 및 표적화 모이어티 및 1 이상의 면역조절(예를 들어, 면역자극) 폴리뉴클레오티드를 함유하는 접합체를 제공한다. 면역조절 폴리뉴클레오티드는 5-변형된 우리딘 또는 5-변형된 시티딘을 함유할 수 있다. 면역조절 폴리뉴클레오티드의 5'-말단에서(예를 들어, 2 개의 5'-말단 뉴클레오시드 중에서) 5-변형된 우리딘(예를 들어, 5-에티닐-우리딘)의 포함은 폴리뉴클레오티드의 면역조절 특성을 향상시킬 수 있다. 면역조절 폴리뉴클레오티드는 길이가 18 내지 28 개 뉴클레오티드인 통상의 CpG ODN에 비해 짧을 수 있다(예를 들어, 총 6 내지 16 개 뉴클레오티드 또는 12 내지 14 개 뉴클레오티드를 함유함). 본 발명의 짧은 면역조절 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 총 6 내지 16 개 뉴클레오티드 또는 12 내지 14 개 뉴클레오티드를 함유하는 것)는 긴 CpG ODN과 비교하여, 긴, 통상의 CpG ODN의 면역조절 활성을 함유할 수 있으며 높은 면역조절 활성(예를 들어, NFκB 활성화에 의해 또는 적어도 하나의 사이토카인(예를 들어, IL-6 또는 IL-10)의 발현 수준에서의 변화에 의해 측정되는 바와 같음)을 나타낼 수 있다. 유리하게는, 짧은 면역조절 폴리뉴클레오티드는 제조하기에 용이하고 더욱 경제적이며, 이는 이들의 합성이 전체 길이의 통상의 CpG ODN의 합성에 비해 더 적은 폴리뉴클레오티드 합성 단계를 포함할 것이기 때문이다. 면역조절 폴리뉴클레오티드는 1 이상의 비염기 스페이서 및/또는 인터뉴클레오시드 포스포트리에스터를 함유할 수 있다.
본 발명의 면역조절 폴리뉴클레오티드는 이들의 면역자극 활성을 실질적으로 희생하지 않으면서 대부분의 인터뉴클레오시드 포스페이트(예를 들어, 50% 초과의 인터뉴클레오시드 포스페이트)를 함유하는 CpG ODN의 것에 비해 우수한 안정성(예를 들어, 뉴클레아제에 대한 안정성)을 나타낼 수 있다. 이 효과는 예를 들어, 적어도 50%(예를 들어, 적어도 70%)의 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트를 포함하는 것에 의해 또는 인터뉴클레오시드 포스포트리에스터 및/또는 인터뉴클레오시드 비염기 스페이서의 포함을 통해 달성될 수 있다. 포스포트리에스터 및 비염기 스페이서는 또한 표적화 모이어티에 대한 접합을 위해 편리하다. 포스페이트-기반 포스포트리에스터 및 비염기 스페이서는 또한 완전 포스포로티오에이트 백본을 갖는 폴리뉴클레오티드에 비해 표적-외 활성의 감소를 위해 사용될 수 있다. 이론에 구애됨 없이, 이 효과는 표적 세포로의 표적화 모이어티-매개된 전달의 방해 없이 자가-전달을 감소시킴으로써 달성될 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 15 개 이하의 인접한 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트(예를 들어, 14 개 이하, 13 개 이하, 12 개 이하, 11 개 이하, 또는 10 개 이하의 인접한 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 총 12 내지 16 개의 뉴클레오시드를 함유하는 면역자극 폴리뉴클레오티드는 10 개 이하의 인접한 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트를 함유할 수 있다.
본 발명의 면역자극 폴리뉴클레오티드는 총 50 개 이하의 뉴클레오시드(예를 들어, 30 개 이하, 28 개 이하, 또는 16 개 이하의 뉴클레오시드)를 함유할 수 있다. 본 발명의 면역자극 폴리뉴클레오티드는 총 적어도 6 개의 뉴클레오시드(예를 들어, 10 개 이상 또는 12 개 이상의 뉴클레오시드)를 함유할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 면역자극 폴리뉴클레오티드는 총 6 내지 30 개의 뉴클레오시드(예를 들어, 총 6 내지 28 개 뉴클레오시드, 총 6 내지 20 개 뉴클레오시드, 총 6 내지 16 개 뉴클레오시드, 총 10 내지 20 개 뉴클레오시드, 총 10 내지 16 개 뉴클레오시드, 총 12 내지 28 개 뉴클레오시드, 총 12 내지 20 개 뉴클레오시드, 또는 총 12 내지 16 개 뉴클레오시드)를 함유할 수 있다.
본 발명의 면역자극 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 하나 또는 양측 말단에(예를 들어, 6 개의 5'-말단 뉴클레오시드 또는 6 개의 3'-말단 뉴클레오시드 내부) 1 이상의 포스포트리에스터(예를 들어, 인터뉴클레오시드 포스포트리에스터) 및/또는 포스포로티오에이트(예를 들어, 1 내지 6 개 또는 1 내지 4개)를 포함할 수 있다. 1 이상의 인터뉴클레오시드 포스포트리에스터 및/또는 포스포로티오에이트의 포함은 엑소뉴클레아제-매개된 분해의 속도를 감소시킴으로써 폴리뉴클레오티드의 안정성을 향상시킬 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 면역자극 폴리뉴클레오티드는 포스포트리에스터 또는 말단 포스포디에스터를 함유하되, 포스포트리에스터 또는 말단 포스포디에스터는 표적화 모이어티 또는 접합기 및 선택적으로 1 이상(예를 들어, 1 내지 6 개)의 보조 모이어티에 결합된 링커를 포함한다. 특별한 실시양태에서, 면역자극 폴리뉴클레오티드는 하나의 링커만을 함유한다. 일부 실시양태에서, 면역자극 폴리뉴클레오티드는 하나의 접합기만을 함유한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 면역자극 폴리뉴클레오티드)는 가닥 및 이의 부분 또는 전체 보체를 포함한 혼성화된 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 혼성화된 폴리뉴클레오티드는 적어도 6 개의 상보적 염기쌍(예를 들어, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23 개), 포함된 짧은 가닥에 존재하는 최대 총 수의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 예를 들어, 혼성화된 폴리뉴클레오티드의 혼성화된 부위는 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23 개의 염기쌍을 함유할 수 있다.
본 발명의 접합체는 표적화 모이어티 및 1 이상의 면역조절(예를 들어, 면역자극) 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 1 내지 6 개 또는 1 내지 4 개(예를 들어, 1 또는 2 개)의 면역조절(예를 들어, 면역자극) 폴리뉴클레오티드)를 함유한다. 접합체에서, 각각의 면역조절 폴리뉴클레오티드는 독립적으로 링커를 포함한다. 표적화 모이어티는 링커에 공유결합된다. 링커는 면역조절 폴리뉴클레오티드 내의 핵염기, 비염기 스페이서, 포스페이트, 포스포로티오에이트, 또는 포스포로디티오에이트에 결합될 수 있다. 본 발명의 접합체에 의해 표적화된 세포는 전문 APC(예를 들어, B 세포, pDC, 또는 대식세포)이다. 표적화 모이어티는 항원-결합 모이어티(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편), 폴리펩티드, 압타머, 또는 1 이상의 소분자(예를 들어, 만노오스)를 포함하는 기일 수 있다. 본 발명의 접합체에서, 표적화 모이어티는 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 본 발명의 접합체는 항체 또는 항체 단편 및 항체 또는 항체 단편 내의 Q-태그에 공유결합으로 연결된 1 이상의 면역조절 폴리뉴클레오티드를 함유할 수 있다. Q-태그는 N-말단 또는 C-말단일 수 있다. Q-태그는 항체 또는 항체 단편의 중쇄 또는 경쇄 내에 배치될 수 있다. 특이적으로 표적화된 조직 및 세포에 대한 본 발명의 면역조절 폴리뉴클레오티드의 표적화 모이어티-기반 전달의 사용은 생체내에서 면역조절 폴리뉴클레오티드의 통상적으로 불균일한 분포의 약점을 극복할 수 있다. 또한, 본 발명의 면역조절 폴리뉴클레오티드의 표적화 모이어티-기반 전달은 면역조절 폴리뉴클레오티드의 전신 투여 또는 표적 조직에 대한 투여에 유리할 수 있으며, 이는 전신 투여 및 표적 조직에 대한 투여가 생체내 혈액 순환을 통한 면역조절 폴리뉴클레오티드의 바람직하지 않은 분포를 생산할 수 있는 반면에, 본 발명의 접합체가 전신으로 투여될 때에도, 주로 표적 조직 또는 세포에서 세포내 전달을 겪을 수 있기 때문이다. 분포-관련 이점은 짧은 면역조절 폴리뉴클레오티드(들)(예를 들어, 총 6 내지 16 개 뉴클레오시드(예를 들어, 총 10 내지 16 개 또는 12 내지 16 개 뉴클레오시드)를 함유하는 면역조절 폴리뉴클레오티드)를 함유하는 접합체에서 특히 현저할 수 있다.
본 발명의 접합체는 1 이상(예를 들어, 1 내지 6 개)의 보조 모이어티(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG))를 추가로 함유할 수 있다. 보조 모이어티는 캡핑기, 생체내가역성기, 또는 비-생체내가역성기 중 일부일 수 있다. 보조 모이어티는 링커에(예를 들어, 면역조절(예를 들어, 면역자극) 폴리뉴클레오티드 내의 포스페이트, 포스포로티오에이트, 또는 포스포로디티오에이트에 결합된 링커에) 결합될 수 있다. 본 발명의 접합체에서의 보조 모이어티(예를 들어, PEG)의 포함은 이러한 보조 모이어티가 결여된 기준 접합체에 비해 접합체의 약물동태학적 및/또는 생체내분포 특성을 개선할 수 있다.
본 발명의 1 이상의 면역조절 폴리뉴클레오티드는 항원-제시 세포(APC; 예를 들어, 전문 APC(예를 들어, B-세포, pDC, 또는 대식세포))를 표적화하는 표적화 모이어티(예를 들어, 항원-결합 모이어티)에 접합될 수 있다. 엔도솜 톨-유사 수용체(예를 들어, TLR9)를 함유하는 세포(예를 들어, 항원-제시 세포(APC; 예를 들어, 전문 APC(예를 들어, B-세포, pDC, 또는 대식세포)))에 대한 본 발명의 면역조절 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명의 접합체의 전달은 세포 내의 엔도솜 톨-유사 수용체를 작용(면역자극 폴리뉴클레오티드에 대해) 또는 길항(면역 억제 폴리뉴클레오티드에 대해)하기 위해 사용될 수 있다. 이론에 구애됨 없이, 엔도솜 톨-유사 수용체의 활성화는 염증성 사이토카인(예를 들어, IL-6, IL-10, 및/또는 I 형 인터페론)을 유도할 수 있으며; 이 활성은 다양한 종양(예를 들어, 환자에서 고형 및 액상 종양)의 치료를 위해 유용한 것으로 여겨진다.
일 실시양태에서, 본원은 하기 화학식 (A)의 올리고뉴클레오티드 또는 이의 입체 이성질체, 2 이상의 부분입체 이성질체의 혼합물, 호변 이성질체, 또는 2 이상의 호변 이성질체의 혼합물; 또는 이의 약학적 허용 염, 용매화물, 또는 수화물을 제공한다:
[화학식 (A)]
Figure pct00018
상기 식에서,
각각의 XN은 독립적으로 뉴클레오티드이고;
X3'은 3' 말단 뉴클레오티드이며;
X5'는 5' 말단 뉴클레오티드이고;
YP는 인터뉴클레오시드 포스포트리에스터이며;
b 및 c는 각각 약 0 내지 약 25 범위의 정수이고; 단, 이들의 합은 5 이상이되;
올리고뉴클레오티드는 변형된 핵염기를 갖는 뉴클레오티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, b는 약 1 내지 약 15 범위의 정수이다. 특정 실시양태에서, b는 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 또는 약 15의 정수이다. 특정 실시양태에서, b는 약 3, 약 4, 약 11, 또는 약 14의 정수이다. 특정 실시양태에서, b는 약 3의 정수이다. 특정 실시양태에서, b는 약 4의 정수이다. 특정 실시양태에서, b는 약 11의 정수이다. 특정 실시양태에서, b는 약 14의 정수이다.
특정 실시양태에서, c는 약 0 내지 약 10 범위의 정수이다. 특정 실시양태에서, c는 약 0, 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 또는 약 10의 정수이다. 특정 실시양태에서, c는 약 0 또는 약 8의 정수이다. 특정 실시양태에서, c는 약 0의 정수이다. 특정 실시양태에서, c는 약 8의 정수이다.
특정 실시양태에서, b는 약 3의 정수이고 c는 약 8의 정수이다. 특정 실시양태에서, b는 약 4의 정수이고 c는 약 8의 정수이다. 특정 실시양태에서, b는 약 11의 정수이고 c는 약 0의 정수이다. 특정 실시양태에서, b는 약 14의 정수이고 c는 약 0의 정수이다.
특정 실시양태에서, b 및 c는 함께 총 약 5 내지 약 20의 범위이다. 특정 실시양태에서, b 및 c는 함께 총 약 5 내지 약 15의 범위이다. 특정 실시양태에서, b 및 c는 함께 총 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 또는 약 15이다. 특정 실시양태에서, b 및 c는 함께 총 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 또는 약 14이다. 특정 실시양태에서, b 및 c는 함께 총 약 11이다. 특정 실시양태에서, b 및 c는 함께 총 약 12이다. 특정 실시양태에서, b 및 c는 함께 총 약 14이다.
특정 실시양태에서, 각각의 XN은 독립적으로 2'-데옥시리보뉴클레오티드 또는 2'-변형된 리보뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 각각의 XN은 독립적으로 2'-데옥시아데노신(A), 2'-데옥시구아노신(G), 2'-데옥시시티딘(C), 5-할로-2'-데옥시시티딘, 2'-데옥시티미딘(T), 2'-데옥시우리딘(U), 5-할로-2'-데옥시우리딘, 2'-플루오로리보뉴클레오티드, 2'-메톡시리보뉴클레오티드, 또는 2'-(2-메톡시에톡시)리보뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 각각의 XN은 독립적으로 2'-데옥시리보뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 각각의 XN은 독립적으로 2'-데옥시아데노신, 2'-데옥시구아노신, 2'-데옥시시티딘, 5-할로-2'-데옥시시티딘, 2'-데옥시티미딘, 2'-데옥시우리딘, 또는 5-할로-2'-데옥시우리딘이다. 특정 실시양태에서, 각각의 XN은 독립적으로 2'-데옥시아데노신, 2'-데옥시구아노신, 2'-데옥시시티딘, 2'-데옥시티미딘, 5-브로모-2'-데옥시우리딘, 또는 5-요오도-2'-데옥시우리딘이다.
특정 실시양태에서, X3'은 2'-데옥시리보뉴클레오티드 또는 2'-변형된 리보뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, X3'은 2'-데옥시리보뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, X3'은 2'-데옥시아데노신, 2'-데옥시구아노신, 2'-데옥시시티딘, 5-할로-2'-데옥시시티딘, 2'-데옥시티미딘, 2'-데옥시우리딘, 5-할로-2'-데옥시우리딘, 2'-플루오로리보뉴클레오티드, 2'-메톡시리보뉴클레오티드, 또는 2'-(2-메톡시에톡시)리보뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, X3'은 2'-데옥시아데노신, 2'-데옥시구아노신, 2'-데옥시시티딘, 5-할로-2'-데옥시시티딘, 2'-데옥시티미딘, 2'-데옥시우리딘, 또는 5-할로-2'-데옥시우리딘이다. 특정 실시양태에서, X3'은 2'-데옥시티미딘이다. 특정 실시양태에서, X3'은 치환된 피리미딘 염기를 갖는 2'-데옥시리보뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, X3'은 5-치환된 피리미딘 염기를 갖는 2'-데옥시리보뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, X3'은 2'-데옥시티미딘, 5-할로-2'-데옥시시티딘, 또는 5-할로-2'-데옥시우리딘이다. 특정 실시양태에서, X3'은 2'-데옥시티미딘, 5-브로모-2'-데옥시시티딘, 5-요오도-2'-데옥시시티딘, 5-브로모-2'-데옥시우리딘, 또는 5-요오도-2'-데옥시우리딘이다. 특정 실시양태에서, X3'은 2'-데옥시티미딘, 5-브로모-2'-데옥시우리딘, 또는 5-요오도-2'-데옥시우리딘이다. 특정 실시양태에서, X3'은 3' 캡핑기를 포함하는 말단 뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 3' 캡핑기는 말단 포스포에스터이다. 특정 실시양태에서, 3' 캡핑기는 3-하이드록실-프로필포스포릴(즉, -P(O2)-CH2CH2CH2OH)이다.
특정 실시양태에서, X5'는 2'-데옥시리보뉴클레오티드 또는 2'-변형된 리보뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, X5'는 2'-데옥시리보뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, X5'는 2'-데옥시아데노신, 2'-데옥시구아노신, 2'-데옥시시티딘, 5-할로-2'-데옥시시티딘, 2'-데옥시티미딘, 2'-데옥시우리딘, 5-할로-2'-데옥시우리딘, 2'-플루오로리보뉴클레오티드, 2'-메톡시리보뉴클레오티드, 또는 2'-(2-메톡시에톡시)리보뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, X5'는 2'-데옥시아데노신, 2'-데옥시구아노신, 2'-데옥시시티딘, 5-할로-2'-데옥시시티딘, 2'-데옥시티미딘, 2'-데옥시우리딘, 또는 5-할로-2'-데옥시우리딘이다. 특정 실시양태에서, X5'는 치환된 피리미딘 염기를 갖는 2'-데옥시리보뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, X5'는 5-치환된 피리미딘 염기를 갖는 2'-데옥시리보뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, X5'는 2'-데옥시티미딘, 5-할로-2'-데옥시시티딘, 또는 5-할로-2'-데옥시우리딘이다. 특정 실시양태에서, X5'는 5-할로-2'-데옥시시티딘이다. 특정 실시양태에서, X5'는 5-할로-2'-데옥시우리딘이다. 특정 실시양태에서, X5'는 2'-데옥시티미딘, 5-브로모-2'-데옥시시티딘, 5-요오도-2'-데옥시시티딘, 5-브로모-2'-데옥시우리딘, 또는 5-요오도-2'-데옥시우리딘이다. 특정 실시양태에서, X5'는 2'-데옥시티미딘, 5-브로모-2'-데옥시우리딘, 또는 5-요오도-2'-데옥시우리딘이다. 특정 실시양태에서, X5'는 5-브로모-2'-데옥시우리딘이다. 특정 실시양태에서, X5'는 5-요오도-2'-데옥시우리딘이다. 특정 실시양태에서, X5'는 3'-포스포로티오에이트기를 갖는다. 특정 실시양태에서, X5'는 Rp의 키랄성(chirality)을 갖는 3'-포스포로티오에이트기를 갖는다. 특정 실시양태에서, X5'는 Sp의 키랄성을 갖는 3'-포스포로티오에이트기를 갖는다.
특정 실시양태에서, YP는 인터뉴클레오시드 포스포티오트리에스터이다.
특정 실시양태에서, YP는
Figure pct00019
이되,
상기 식에서, Z는 O 또는 S이고; d는 약 0 내지 약 50 범위의 정수이다. 특정 실시양태에서, Z는 O이다. 특정 실시양태에서, Z는 S이다. 특정 실시양태에서, d는 약 0 내지 약 10 범위의 정수이다. 특정 실시양태에서, d는 약 0 내지 약 5 범위의 정수이다. 특정 실시양태에서, d는 약 0, 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 또는 약 5의 정수이다. 특정 실시양태에서, d는 약 0, 약 1, 또는 약 3의 정수이다.
특정 실시양태에서, YP는
Figure pct00020
이되,
상기 식에서, Z는 O 또는 S이고; d는 약 0 내지 약 50 범위의 정수이다. 특정 실시양태에서, Z는 O이다. 특정 실시양태에서, Z는 S이다. 특정 실시양태에서, d는 약 0 내지 약 10 범위의 정수이다. 특정 실시양태에서, d는 약 0 내지 약 5 범위의 정수이다. 특정 실시양태에서, d는 약 0, 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 또는 약 5의 정수이다. 특정 실시양태에서, d는 약 0, 약 1, 또는 약 3의 정수이다.
특정 실시양태에서, 화학식 (A)의 올리고뉴클레오티드는 하나의 추가 인터뉴클레오시드 포스포트리에스터를 포함한다. 일 실시양태에서, 추가 인터뉴클레오시드 포스포트리에스터는 C1-6 알킬포스포트리에스터이다. 다른 실시양태에서, 추가 인터뉴클레오시드 포스포트리에스터는 에틸포스포트리에스터이다.
특정 실시양태에서, 화학식 (A)의 올리고뉴클레오티드는 하나의 5-할로-2'-데옥시우리딘을 포함한다. 일 실시양태에서, 5-할로-2'-데옥시우리딘은 5-플루오로-2'-데옥시우리딘, 5-브로모-2'-데옥시우리딘, 또는 5-요오도-2'-데옥시우리딘이다. 다른 실시양태에서, 5-할로-2'-데옥시우리딘은 5-브로모-2'-데옥시우리딘 또는 5-요오도-2'-데옥시우리딘이다. 또 다른 실시양태에서, 5-할로-2'-데옥시우리딘은 5-플루오로-2'-데옥시우리딘이다. 또 다른 실시양태에서, 5-할로-2'-데옥시우리딘은 5-브로모-2'-데옥시우리딘이다. 또 다른 실시양태에서, 5-할로-2'-데옥시우리딘은 5-요오도-2'-데옥시우리딘이다.
특정 실시양태에서, 화학식 (A)의 올리고뉴클레오티드는 3 이상의 2'-데옥시시티딘을 포함한다. 특정 실시양태에서, 화학식 (A)의 올리고뉴클레오티드는 3 개의 2'-데옥시시티딘을 포함한다.
특정 실시양태에서, 화학식 (A)의 올리고뉴클레오티드는 4 이상의 2'-데옥시구아노신을 포함한다. 특정 실시양태에서, 화학식 (A)의 올리고뉴클레오티드는 4 개의 2'-데옥시구아노신을 포함한다.
특정 실시양태에서, 화학식 (A)의 올리고뉴클레오티드는 3 개의 2'-데옥시시티딘 및 4 개의 2'-데옥시구아노신을 포함한다. 특정 실시양태에서, 화학식 (A)의 올리고뉴클레오티드는 1, 2, 또는 3 개의 CG 디뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 화학식 (A)의 올리고뉴클레오티드는 3 개의 CG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 화학식 (A)의 올리고뉴클레오티드는 3 이상의 2'-데옥시티미딘을 포함한다. 특정 실시양태에서, 화학식 (A)의 올리고뉴클레오티드는 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 개의 2'-데옥시티미딘을 포함한다. 특정 실시양태에서, 화학식 (A)의 올리고뉴클레오티드는 3, 4, 5, 또는 8 개의 2'-데옥시티미딘을 포함한다.
특정 실시양태에서, 화학식 (A)의 올리고뉴클레오티드는 2'-데옥시아데노신을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 화학식 (A)의 올리고뉴클레오티드는 1 또는 2 개의 2'-데옥시아데노신을 포함한다.
특정 실시양태에서, 화학식 (A)의 올리고뉴클레오티드는 약 5 내지 약 20 개 또는 약 6 내지 약 15 개 뉴클레오티드 범위의 길이를 갖는다. 특정 실시양태에서, 화학식 (A)의 올리고뉴클레오티드는 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 또는 약 15 개의 길이를 갖는다. 특정 실시양태에서, 화학식 (A)의 올리고뉴클레오티드는 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 또는 약 15 개의 길이를 갖는다.
특정 실시양태에서, 화학식 (A)의 올리고뉴클레오티드는 1 이상의 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트를 포함한다. 특정 실시양태에서, 화학식 (A)의 올리고뉴클레오티드에서 모든 인터뉴클레오시드 포스포에스터는 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트이다. 특정 실시양태에서, 화학식 (A)의 올리고뉴클레오티드는 1 이상의 키랄 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트를 포함한다.
특정 실시양태에서, 화학식 (A)의 올리고뉴클레오티드는 p275, p276, p313, 또는 p347이다. 특정 실시양태에서, 화학식 (A)의 올리고뉴클레오티드는 p236, p238, p243, p246, p308, p361, p362, 또는 p425이다. 특정 실시양태에서, 화학식 (A)의 올리고뉴클레오티드는 p236, p238, p243, p246, p275, p276, p308, p313, p347, p361, p362, p425, p433, p434, p435, p436, p437, p438, p477, p478, p479, p480, p481, p482, p483, p484, p485, p486, p487, p488, 또는 p489이다.
특정 실시양태에서, 화학식 (A)의 올리고뉴클레오티드는 면역조절 올리고뉴클레오티드이다.
일 실시양태에서, 본원은 N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 입체 이성질체, 2 이상의 부분입체 이성질체의 혼합물, 호변 이성질체, 또는 2 이상의 호변 이성질체의 혼합물; 또는 이의 약학적 허용 염, 용매화물, 또는 수화물을 제공하되, 상기 식에서,
x는 1 내지 4 범위의 정수이고;
N1은 부재하거나 2'-데옥시티미딘이며;
N2는 변형된 핵염기를 갖는 2'-데옥시리보뉴클레오티드이고;
N3은 각각 선택적으로 3'-포스포트리에스터를 포함하는 2'-데옥시아데노신 또는 2'-데옥시티미딘이며;
N4는 2'-데옥시아데노신 또는 2'-데옥시티미딘이며;
N5는 선택적으로 3'-포스포트리에스터를 포함하는 2'-데옥시티미딘이고;
C는 2'-데옥시시티딘이며 G는 2'-데옥시구아노신이다.
특정 실시양태에서, N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T에서, x는 1, 2, 3, 또는 4의 정수이다. 특정 실시양태에서, N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T에서, x는 1의 정수이다. 특정 실시양태에서, N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T에서, x는 4의 정수이다.
특정 실시양태에서, N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T에서, N1은 부재한다. 특정 실시양태에서, N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T에서, N1은 2'-데옥시티미딘이다.
특정 실시양태에서, N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T에서, N2는 치환된 피리미딘 염기를 갖는 2'-데옥시리보뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T에서, N2는 5-치환된 피리미딘 염기를 갖는 2'-데옥시리보뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T에서, N2는 5-할로-2'-데옥시시티딘 또는 5-할로-2'-데옥시우리딘이다. 특정 실시양태에서, N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T에서, N2는 5-브로모-2'-데옥시우리딘 또는 5-요오도-2'-데옥시우리딘이다.
특정 실시양태에서, N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T에서, N3은 3'-포스포트리에스터를 포함하는 2'-데옥시아데노신이다. 특정 실시양태에서, N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T에서, N3은 2'-데옥시티미딘이다. 특정 실시양태에서, N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T에서, N3은 3'-포스포트리에스터를 포함하는 2'-데옥시티미딘이다.
특정 실시양태에서, N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T에서, N4는 2'-데옥시아데노신이다. 특정 실시양태에서, N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T에서, N4는 2'-데옥시티미딘이다.
특정 실시양태에서, N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T에서, N5는 2'-데옥시티미딘이다. 특정 실시양태에서, N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T에서, N5는 3'-포스포트리에스터를 포함하는 2'-데옥시티미딘이다.
특정 실시양태에서, N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T의 올리고뉴클레오티드는 1 이상의 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트를 포함한다. 특정 실시양태에서, N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T의 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 키랄 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트를 포함한다.
특정 실시양태에서, N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T의 올리고뉴클레오티드는 p275, p276, 또는 p313이다. 특정 실시양태에서, N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T의 올리고뉴클레오티드는 p236, p238, p243, p246, p308, p361, p362, 또는 p425이다. 특정 실시양태에서, N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T의 올리고뉴클레오티드는 p236, p238, p243, p246, p275, p276, p308, p313, p347, p361, p362, p425, p433, p434, p435, p436, p437, p438, p477, p478, p479, p480, p481, p482, p483, p484, p485, p486, p487, p488, 또는 p489이다.
면역자극 폴리뉴클레오티드
본 발명의 면역자극 폴리뉴클레오티드는 PAMP로서 기능할 수 있으며 TLR9 시그널링을 촉발시킴으로써(예를 들어, TLR9 작용제로서) 선천적 면역 반응을 활성화하거나 적응성 면역 반응을 자극할 수 있다. 본 발명의 면역자극 폴리뉴클레오티드에서 사용될 수 있는 서열은 클래스 B CpG 폴리뉴클레오티드, 또는 5-할로우리딘 또는 5-알키닐우리딘을 포함한 이의 변형, 또는 이의 절단된 버전(예를 들어, 총 6 내지 16 개의 뉴클레오시드를 함유하는 것)에 대해 당업자에게 알려져 있다. 본 발명의 절단된 면역자극 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 총 6 내지 16 개의 뉴클레오시드를 함유하는 것)는 절단된 클래스 B CpG 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 이로부터 1 이상의 3'-말단 뉴클레오티드가 제거되거나 서열내 뉴클레오티드 중 1 이상이 절단된 클래스 B CpG 폴리뉴클레오티드 서열)을 함유할 수 있다.
본 발명의 면역자극 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 면역자극 서열(ISS)을 함유한다. 예를 들어, 본 발명의 면역자극 폴리뉴클레오티드는 1, 2, 3 또는 4 개의 ISS를 함유할 수 있다. 면역자극 폴리뉴클레오티드에서 ISS는 표적화된 기관에 의존한다. 본 발명의 면역자극 폴리뉴클레오티드에서 사용된 ISS의 일반적인 특징은 시티딘-p-구아노신 서열이되, p는 인터뉴클레오시드 포스포디에스터(예를 들어, 포스페이트 또는 포스포로티오에이트) 또는 인터뉴클레오시드 포스포트리에스터이다. 바람직하게는, ISS에서 시티딘 및 구아노신은 2'-데옥시리보오스를 함유한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 면역자극 폴리뉴클레오티드는 1, 2, 또는 3 개의 인간 ISS를 함유한다. 예를 들어, 인간 ISS는 C G 또는 N C G 일 수 있되, N 은 우리딘, 시티딘, 또는 티미딘, 또는 본원에 개시된 바와 같은 우리딘 또는 시티딘의 변형된 버전(예를 들어, 5-할로우리딘(예를 들어, 5-요오도우리딘 또는 5-브로모우리딘), 5-알키닐우리딘(예를 들어, 5-에티닐우리딘 또는 5-프로피닐우리딘), 5-헤테로아릴우리딘, 또는 5-할로시티딘)이고; G 는 구아노신 또는 본원에 개시된 바와 같은 이의 변형된 버전(예를 들어, 7-데아자구아노신)이다. 바람직하게는, 인간 ISS는 N C G (예를 들어, 상기 식에서 N 은 5-할로우리딘임)이다. 일부 실시양태에서, 인간 ISS는 U C G (예를 들어, 상기 식에서 U 는 5-알키닐우리딘(예를 들어, 5-에티닐우리딘)임)이다. 바람직하게는, 인간을 표적화하는 본 발명의 면역자극 폴리뉴클레오티드는 5'-말단 뉴클레오티드를 포함하는 4 개의 인접한 뉴클레오티드 내에 ISS를 함유한다(예를 들어, 본 발명의 면역자극 폴리뉴클레오티드는 5'-말단 ISS를 함유함). 뮤린 ISS는 헥사머 뉴클레오티드 서열이다: Pu-Pu-CG-Py-Py, 상기 식에서 각각의 Pu는 독립적으로 퓨린 뉴클레오티드이고, 각각의 Py는 독립적으로 피리미딘 뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 면역자극 폴리뉴클레오티드에서의 CpG에 대한 5'-측면 뉴클레오티드는 2'-알콕시리보오스를 함유하지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 면역자극 폴리뉴클레오티드에서의 CpG에 대해 5'-측면 뉴클레오티드는 당류로서 2'-데옥시리보오스만을 함유한다.
본 발명의 면역자극 폴리뉴클레오티드의 구조적 특징은 다음을 포함할 수 있다: (1) 포스포로티오에이트의 높은 함량(예를 들어, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 또는 적어도 80%의 뉴클레오시드가 포스포로티오에이트에 의해 연결될 수 있음), (2) poly-G 꼬리의 부재, (3) 면역자극 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오시드는 2'-데옥시리보오스 또는 2'-변형된 리보오스(예를 들어, 2'-할로(예를 들어, 2'-플루오로) 또는 선택적으로 치환된 2'-알콕시(예를 들어, 2'-메톡시))를 함유할 수 있음, 및/또는 (4) N C G 인 5'-말단 ISS의 포함, 상기 식에서 N 은 우리딘, 시티딘, 또는 티미딘, 또는 본원에 개시된 바와 같은 우리딘 또는 시티딘의 변형된 버전(예를 들어, 5-할로우리딘(예를 들어, 5-요오도우리딘 또는 5-브로모우리딘), 5-알키닐우리딘(예를 들어, 5-에티닐우리딘 또는 5-프로피닐우리딘), 5-헤테로아릴우리딘, 또는 5-할로시티딘)이고; G 는 구아노신 또는 본원에 개시된 바와 같은 이의 변형된 버전(예를 들어, 7-데아자구아노신)임.
일부 실시양태에서, 접합체는 하나의 표적화 모이어티(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편) 및 표적화 모이어티에 공유결합으로 연결된 하나의 면역조절 폴리뉴클레오티드를 함유한다.
면역억제 폴리뉴클레오티드
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 TLR9 시그널링의 활성화를 감소시킴으로써(예를 들어, TLR9 길항작용을 통함) 적응성 면역 반응을 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 면역억제 폴리뉴클레오티드는 다음 화학식에 의해 기재된 바와 같이 CpG에 대해 5'-측면인 적어도 2 개의 2'-알콕시뉴클레오티드를 포함한다: N1-N2-CG, 상기 식에서 N1 및 N2 각각은 독립적으로 2'-알콕시리보오스(예를 들어, 2'-메톡시리보오스)를 함유한 뉴클레오티드이다.
폴리뉴클레오티드의 구조적 특징
비염기 스페이서
본원에 개시된 면역조절 폴리뉴클레오티드는 1 이상(예를 들어, 1 또는 2 개)의 비염기 스페이서(예를 들어, 인터뉴클레오시드 비염기 스페이서 및/또는 말단 비염기 스페이서)를 포함할 수 있다. 면역조절 폴리뉴클레오티드가 2 이상의 비염기 스페이서를 포함할 때, 비염기 스페이서의 구조는 동일하거나 상이할 수 있다.
비염기 스페이서는 화학식 (I)의 것이다:
[화학식 (I)]
Figure pct00021
상기 식에서,
n1은 0 또는 1이고,
n2는 1 내지 6의 정수이며,
R1은 면역조절 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오시드에 대한 결합이고,
R2는 면역조절 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오시드 또는 캡핑기에 대한 결합이며,
각각의 L1은 독립적으로 포스포디에스터 또는 포스포트리에스터이고,
각각의 L2는 당 유사체이다.
특별한 실시양태에서, 비염기 스페이서가 인터뉴클레오시드, 비염기 스페이서인 경우, n1은 1이고, R2는 뉴클레오시드에 대한 결합이며, 비염기 스페이서가 말단, 비염기 스페이서인 경우, n1은 0 또는 1이고, R2는 캡핑기에 대한 결합이다.
일부 실시양태에서, 비염기 스페이서는 인터뉴클레오시드, 비염기 스페이서 또는 3'-말단, 비염기 스페이서이다. 특정 실시양태에서, 각각 2 개의 인접한 L2 기는 L1 기에 의해 분리된다(예를 들어, 2 개의 인접한 L2 기 사이에 배치된 L1에 대해 n1은 1임).
특정 실시양태에서, 면역자극 폴리뉴클레오티드는 면역자극 폴리뉴클레오티드의 5'-말단 뉴클레오티드를 포함하는 4 개의 인접한 뉴클레오티드 내에 배치된 ISS를 함유하되,
ISS는 N C G 이고, 상기 식에서 N 은 우리딘, 시티딘, 또는 티미딘, 또는 본원에 개시된 바와 같은 우리딘 또는 시티딘의 변형된 버전(예를 들어, 5-할로우리딘(예를 들어, 5-요오도우리딘 또는 5-브로모우리딘), 5-알키닐우리딘(예를 들어, 5-에티닐우리딘 또는 5-프로피닐우리딘), 5-헤테로아릴우리딘, 또는 5-할로시티딘)이고,
N 및 C는 포스포디에스터 또는 포스포트리에스터를 통해 서로 연결된다.
당 유사체
당 유사체는 2 개의 하이드록실기를 (i) 하나의 포스포에스터 내의 산소 원자 및 (ii) 다른 포스포에스터 내의 산소 원자 또는 캡핑기에 대한 결합으로 치환하도록 변형된 C3-6 단당류 또는 C36 당알코올(예를 들어, 글리세롤)인 2가 또는 3가 기이다. 당 유사체는 사이클릭 또는 아사이클릭이다. 당 유사체에 포함된 추가의 선택적인 변형은 나머지 하이드록실기 또는 탄소-결합된 수소 원자 중 1, 2, 또는 3 개의 H; 선택적으로 치환된 C1-6 알킬; 본원에 정의된 바와 같은 -LinkA(-T)p; 접합기; -(CH2)t1-ORZ(상기 식에서, t1은 1 내지 6의 정수이고, RZ는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬, 선택적으로 치환된 C2-6 알케닐, 선택적으로 치환된 C2-6 알키닐, 선택적으로 치환된 C6-14 아릴, 선택적으로 치환된 C3-8 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 (C1-9 헤테로사이클릴)-C1-6-알킬, 선택적으로 치환된 (C6-10 아릴)-C1-6-알킬, 또는 선택적으로 치환된 (C3-8 사이클로알킬)-C1-6-알킬임)로의 치환; 1 또는 2 개의 불포화(들)(예를 들어, 1 또는 2 개의 이중 결합)의 도입; 및 1, 2, 또는 3 개의 수소 또는 하이드록실기의 알킬, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 또는 헤테로사이클릴에 대해 정의된 바와 같은 치환기로의 치환이다. 일부 실시양태에서, RZ는 선택적으로 치환된 C1-6 아미노알킬(예를 들어, -NH2를 함유한 선택적으로 치환된 C1-6 아미노 알킬)이다.
당 유사체의 비-제한적인 예는 선택적으로 치환된 C2-6 알킬렌, 선택적으로 치환된 C2-6 알케닐렌, 선택적으로 치환된 C5 사이클로알칸-1,3-디일, 선택적으로 치환된 C5 사이클로알켄-1,3-디일, 선택적으로 치환된 헤테로사이클-1,3-디일(예를 들어, 선택적으로 치환된 피롤리딘-2,5-디일, 선택적으로 치환된 테트라하이드로푸란-2,5-디일, 또는 선택적으로 치환된 테트라하이드로티오펜-2,5-디일), 또는 선택적으로 치환된 (C1-4 알킬)-(C3-8 사이클로알킬렌)(예를 들어, 선택적으로 치환된 (C1 알킬)-(C3 사이클로알킬렌))이다. 당 유사체의 비-제한적인 예는
Figure pct00022
이되,
상기 식에서,
R1 및 R2 각각은 독립적으로 포스포에스터 내의 산소 원자에 대한 결합이고;
R3 및 R4 각각은 독립적으로 H; 선택적으로 치환된 C1-6 알킬; -(CH2)t1-ORZ; 또는 -LinkA-RT이되;
상기 식에서, t1은 1 내지 6의 정수이고;
RZ는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬, 선택적으로 치환된 C2-6 알케닐, 선택적으로 치환된 C2-6 알키닐, 선택적으로 치환된 C6-14 아릴, 선택적으로 치환된 C3-8 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 (C1-9 헤테로사이클릴)-C1-6-알킬, 선택적으로 치환된 (C6-10 아릴)-C1-6-알킬, 선택적으로 치환된 (C3-8 사이클로알킬)-C1-6-알킬이며;
LinkA는 링커이고;
RT는 표적화 모이어티에 대한 결합; 접합 모이어티; 선택적으로 치환된 C1-6 알킬, 선택적으로 치환된 C2-6 알케닐, 선택적으로 치환된 C2-6 알키닐, 선택적으로 치환된 C6-14 아릴, 선택적으로 치환된 C3-8 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 (C1-9 헤테로사이클릴)-C1-6-알킬, 선택적으로 치환된 (C6-10 아릴)-C1-6-알킬, 또는 선택적으로 치환된 (C3-8 사이클로알킬)-C1-6-알킬이다.
특정 실시양태에서, RZ는 선택적으로 치환된 C1-6 아미노알킬(예를 들어, -NH2를 함유한 선택적으로 치환된 C1-6 아미노 알킬)이다.
포스포에스터
본 발명의 면역조절 폴리뉴클레오티드는 1 이상의 인터뉴클레오시드 포스포트리에스터 및/또는 1 또는 2 개의 말단 포스포디에스터 및/또는 포스포트리에스터를 함유할 수 있다. 포스포트리에스터는 1 또는 2 개의 원자가가 뉴클레오시드 및/또는 비염기 스페이서로 치환되고, 나머지 원자가가 생체내가역성기, 비-생체내가역성기, 표적화 모이어티에 결합된 링커, 또는 접합기에 결합되는 포스페이트, 포스포로티오에이트, 또는 포스포로디티오에이트를 함유할 수 있다. 인터뉴클레오시드 포스포트리에스터는 2 개의 뉴클레오시드 및/또는 비염기 스페이서에 결합되고, 나머지 원자가는 생체내가역성기, 비-생체내가역성기, 표적화 모이어티에 결합된 링커, 또는 접합기에 결합된다. 인터뉴클레오시드 포스포디에스터는 2 개의 뉴클레오시드 및/또는 비염기 스페이서에 결합된다. 말단 포스포디에스터는 면역조절 폴리뉴클레오티드의 5'- 또는 3'-말단에 포스페이트, 포스포로티오에이트, 또는 포스포로디티오에이트를 함유하되, 2 개의 나머지 원자가 중 하나는 생체내가역성기, 비-생체내가역성기, 표적화 모이어티에 결합된 링커, 또는 접합기에 결합된다.
링커 및 접합 모이어티
본 발명의 면역조절 폴리뉴클레오티드는 표적화 모이어티 및 선택적으로 1 이상의 보조 모이어티에 결합된 링커를 함유할 수 있다. 링커는 43 Da 내지 10 kDa(예를 들어, 100 Da 내지 8 kDa, 100 Da 내지 7 kDa, 또는 100 Da 내지 3 kDa)의 분자량을 갖는다. 링커는 본원에서 LinkA로서 나타낼 수 있다. 링커는 제1 원자가가 인터뉴클레오시드 또는 말단 포스페이트, 인터뉴클레오시드 또는 말단 포스포로티오에이트, 인터뉴클레오시드 또는 말단 포스포로디티오에이트, 비염기 스페이서, 캡핑기, 또는 핵염기에 결합되고, 제2 원자가가 표적화 모이어티에 결합되는 다가 기일 수 있다. 링커는 1 이상의 원자가를 추가로 포함할 수 있으며, 이들 각각은 독립적으로 보조 모이어티에 결합된다. 일부 실시양태에서(예를 들어, 표적화 모이어티가 소분자일 때), 면역조절 폴리뉴클레오티드는 다중 표적화 모이어티에 대한 다중 링커를 함유한다. 다른 실시양태에서(예를 들어, 표적화 모이어티가 항체 또는 이의 항원-결합 단편일 때), 면역조절 폴리뉴클레오티드는 표적화 모이어티에 대한 하나의 링커를 함유할 수 있다.
본원에 개시된 면역조절 폴리뉴클레오티드는 접합기를 포함할 수 있다. 접합기는 접합 반응(예를 들어, 부가환화 반응(예를 들어, 쌍극 부가환화), 아마이드화 반응, 또는 친핵성 방향족 치환)을 겪을 수 있거나 관능기의 탈보호시 접합 반응을 겪을 수 있게 되는 관능기인 적어도 하나의 접합 모이어티를 포함한다. 상보적 반응기와 반응시, 접합기는 본 발명의 면역조절 폴리뉴클레오티드에서 링커를 생산한다.
특별한 실시양태에서, 표적화 모이어티에 결합된 링커는 인터뉴클레오시드 포스포트리에스터의 일부이다. 특정 실시양태에서, 표적화 모이어티에 결합된 링커는 비염기 스페이서의 일부이다.
일부 실시양태에서, 링커(예를 들어, LinkA) 또는 접합기는 하기 화학식 (II)의 것이다:
[화학식 (II)]
Figure pct00023
상기 식에서,
Z1은 2가 기, 3가 기, 4가 기, 또는 5가 기이되, 원자가 중 하나는 QA1에 결합되고, 제2 원자가는 개방되거나, 화학식 (II)가 링커에 대한 것인 경우, RT에 결합되며, 나머지 원자가 각각은 존재할 때 독립적으로 보조 모이어티에 결합되고;
Z2는 부재하거나, 2가 기, 3가 기, 4가 기, 또는 5가 기이되, 원자가 중 하나는 QA1에 결합되고, 제2 원자가는 QA2 또는 RT에 결합되며, 나머지 원자가 각각은 존재할 때 독립적으로 보조 모이어티에 결합되고;
Z3은 부재하거나, 2가 기, 3가 기, 4가 기, 또는 5가 기이되, 원자가 중 하나는 QA2에 결합되고, 제2 원자가는 RT에 결합되며, 나머지 원자가 각각은 존재할 때 독립적으로 보조 모이어티에 결합되고;
RT는 부재하거나 표적화 모이어티에 대한 결합이며;
k는 0 또는 1이다.
화학식 (II)가 링커에 대한 것인 경우,
QA1 및 QA2는 독립적으로 부재하거나, 선택적으로 치환된 C2-12 헤테로알킬렌(예를 들어, -C(O)-N(H)-, -N(H)-C(O)-, -S(O)2-N(H)-, 또는 -N(H)-S(O)2-를 함유하는 헤테로알킬렌), 선택적으로 치환된 C1-12 티오헤테로사이클릴렌(예를 들어,
Figure pct00024
,
Figure pct00025
,
Figure pct00026
,
Figure pct00027
, 또는
Figure pct00028
), 선택적으로 치환된 C1-12 헤테로사이클릴렌(예를 들어, 1,2,3-트리아졸-1,4-디일 또는
Figure pct00029
), 사이클로부트-3-엔-1,2-디온-3,4-디일, 피리드-2-일 히드라존, 선택적으로 치환된 C6-16 트리아졸로헤테로사이클릴렌(예를 들어,
Figure pct00030
또는
Figure pct00031
), 선택적으로 치환된 C8-16 트리아졸로사이클로알케닐렌 (예를 들어,
Figure pct00032
), 또는 디하이드로피리다진기(예를 들어, trans-
Figure pct00033
, trans-
Figure pct00034
,
Figure pct00035
, 또는
Figure pct00036
)이고;
RT는 표적화 모이어티에 대한 결합이며;
단, QA1 및 QA2 중 적어도 하나가 존재한다.
화학식 (II)가 접합기 대한 것인 경우,
(i) QA2는 부재하고, QA1은 접합 모이어티, 예를 들어 선택적으로 치환된 C2-12 알키닐, 선택적으로 치환된 N-보호된 아미노, 아지도, N-말레이미도, S-보호된 티올,
Figure pct00037
,
Figure pct00038
,
Figure pct00039
또는 이의 N-보호된 버전,
Figure pct00040
,
Figure pct00041
,
Figure pct00042
, 엔도사이클릭 탄소-탄소 삼중 결합을 함유하는 선택적으로 치환된 C6-16 헤테로사이클릴(예를 들어,
Figure pct00043
), 1,2,4,5-테트라진기(예를 들어,
Figure pct00044
또는
Figure pct00045
), 또는 선택적으로 치환된 C8-16 사이클로알키닐(예를 들어,
Figure pct00046
), -NHRN1, 선택적으로 치환된 C4-8 변형된 사이클로알케닐(예를 들어, trans-사이클로옥테닐 또는 노르보네닐), 또는 -COOR12 또는 -CHO를 함유하는 선택적으로 치환된 C1-16 알킬이며;
k는 0이거나;
(ii) QA1은 링커에 대해 정의된 바와 같고, QA2는 접합 모이어티, 예를 들어 선택적으로 치환된 C2-12 알키닐, 선택적으로 치환된 N-보호된 아미노, 아지도, N-말레이미도, S-보호된 티올,
Figure pct00047
,
Figure pct00048
,
Figure pct00049
또는 이의 N-보호된 버전,
Figure pct00050
,
Figure pct00051
,
Figure pct00052
, 엔도사이클릭 탄소-탄소 삼중 결합을 함유하는 선택적으로 치환된 C6-16 헤테로사이클릴(예를 들어,
Figure pct00053
), 1,2,4,5-테트라진기(예를 들어,
Figure pct00054
또는
Figure pct00055
), 또는 선택적으로 치환된 C8-16 사이클로알키닐(예를 들어,
Figure pct00056
), -NHRN1, 선택적으로 치환된 C4-8 변형된 사이클로알케닐(예를 들어, trans-사이클로옥테닐 또는 노르보네닐), 또는 -COOR12 또는 -CHO를 함유하는 선택적으로 치환된 C1-16 알킬이며;
k는 1이되;
RN1은 H, N-보호기, 또는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬이고;
각각의 R12는 독립적으로 H 또는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬이며;
R13은 할로겐(예를 들어, F)이고;
Z3 및 RT는 부재한다.
특정 실시양태에서, Z1은 분지기(branching group) 및 2 개의 2가 세그먼트(segment)를 갖되, 분지기는 2 개의 2가 세그먼트 각각에 결합되고,
2가 세그먼트 중 하나는 인터뉴클레오시드 또는 말단 포스페이트, 인터뉴클레오시드 또는 말단 포스포로티오에이트, 인터뉴클레오시드 또는 말단 포스포로디티오에이트, 비염기 스페이서, 또는 핵염기에 결합되며, 나머지 2가 세그먼트는 QA1에 결합되고;
분지기는 선택적으로 치환된 C1-12 알칸-트리일 또는 선택적으로 치환된 C2-12 헤테로알칸-트리일이되, 2 개의 원자가는 2가 세그먼트로 치환되고, 나머지 원자가는
Figure pct00057
로 치환되되,
상기 식에서,
p1은 1, 2, 또는 3이고;
각각의 s2는 독립적으로 0 내지 10의 정수이며;
각각의 QB 및 각각의 QD는 독립적으로 부재하거나, -CO-, -NH-, -O-, -S-, -SO2-, -OC(O)-, -COO-, -NHC(O)-, -C(O)NH-, -CH2-, -CH2NH-, -NHCH2-, -CH2O-, 또는 -OCH2-이고;
각각의 QC는 독립적으로 부재하거나, 선택적으로 치환된 C1-12 알킬렌, 선택적으로 치환된 C2-12 알케닐렌, 선택적으로 치환된 C2-12 알키닐렌, 선택적으로 치환된 C2-12 헤테로알킬렌, 선택적으로 치환된 C1-9 헤테로사이클릴렌, 또는 -P(Z)(OH)-이되, Z는 O 또는 S이며;
각각의 QG는 독립적으로 선택적으로 치환된 C1-6 알칸-트리일, 선택적으로 치환된 C1-6 알칸-테트라일, 선택적으로 치환된 C2-6 헤테로알칸-트리일, 또는 선택적으로 치환된 C2-6 헤테로알칸-테트라일이고;
각각의 QH는 독립적으로 RM1 또는 -QG[(-QB-QC-QD)s2-RM1]p1이되, 각각의 RM1은 독립적으로 보조 모이어티에 대한 결합이다.
특정 실시양태에서, Z2는 분지기 및 2 개의 2가 세그먼트를 갖되, 분지기는 2 개의 2가 세그먼트 각각에 결합되고,
2가 세그먼트 중 하나는 표적화 모이어티 또는 QA2에 결합되며, 나머지 2가 세그먼트는 QA1에 결합되고;
분지기는 선택적으로 치환된 C1-12 알칸-트리일 또는 선택적으로 치환된 C2-12 헤테로알칸-트리일이되, 2 개의 원자가는 2가 세그먼트로 치환되고, 나머지 원자가는
Figure pct00058
로 치환되되,
상기 식에서,
p1은 1, 2, 또는 3이고;
각각의 s2는 독립적으로 0 내지 10의 정수이며;
각각의 QB 및 각각의 QD는 독립적으로 부재하거나, -CO-, -NH-, -O-, -S-, -SO2-, -OC(O)-, -COO-, -NHC(O)-, -C(O)NH-, -CH2-, -CH2NH-, -NHCH2-, -CH2O-, 또는 -OCH2-이고;
각각의 QC는 독립적으로 부재하거나, 선택적으로 치환된 C1-12 알킬렌, 선택적으로 치환된 C2-12 알케닐렌, 선택적으로 치환된 C2-12 알키닐렌, 선택적으로 치환된 C2-12 헤테로알킬렌, 선택적으로 치환된 C1-9 헤테로사이클릴렌, 또는 -P(Z)(OH)-이되, Z는 O 또는 S이며;
각각의 QG는 독립적으로 선택적으로 치환된 C1-6 알칸-트리일, 선택적으로 치환된 C1-6 알칸-테트라일, 선택적으로 치환된 C2-6 헤테로알칸-트리일, 또는 선택적으로 치환된 C2-6 헤테로알칸-테트라일이고;
각각의 QH는 독립적으로 RM1 또는 -QG[(-QB-QC-QD)s2-RM1]p1이되, 각각의 RM1은 독립적으로 보조 모이어티에 대한 결합이다.
특정 실시양태에서, Z3은 분지기 및 2 개의 2가 세그먼트를 갖되, 분지기는 2 개의 2가 세그먼트 각각에 결합되고,
2가 세그먼트 중 하나는 표적화 모이어티에 결합되며, 나머지 2가 세그먼트는 QA2에 결합되고;
분지기는 선택적으로 치환된 C1-12 알칸-트리일 또는 선택적으로 치환된 C2-12 헤테로알칸-트리일이되, 2 개의 원자가는 2가 세그먼트로 치환되고, 나머지 원자가는
Figure pct00059
로 치환되되,
상기 식에서,
p1은 1, 2, 또는 3이고;
각각의 s2는 독립적으로 0 내지 10의 정수이며;
각각의 QB 및 각각의 QD는 독립적으로 부재하거나, -CO-, -NH-, -O-, -S-, -SO2-, -OC(O)-, -COO-, -NHC(O)-, -C(O)NH-, -CH2-, -CH2NH-, -NHCH2-, -CH2O-, 또는 -OCH2-이고;
각각의 QC는 독립적으로 부재하거나, 선택적으로 치환된 C1-12 알킬렌, 선택적으로 치환된 C2-12 알케닐렌, 선택적으로 치환된 C2-12 알키닐렌, 선택적으로 치환된 C2-12 헤테로알킬렌, 선택적으로 치환된 C1-9 헤테로사이클릴렌, 또는 -P(Z)(OH)-이되, Z는 O 또는 S이며;
각각의 QG는 독립적으로 선택적으로 치환된 C1-6 알칸-트리일, 선택적으로 치환된 C1-6 알칸-테트라일, 선택적으로 치환된 C2-6 헤테로알칸-트리일, 또는 선택적으로 치환된 C2-6 헤테로알칸-테트라일이고;
각각의 QH는 독립적으로 RM1 또는 -QG[(-QB-QC-QD)s2-RM1]p1이되, 각각의 RM1은 독립적으로 보조 모이어티에 대한 결합이다.
Z1, Z2, 또는 Z3에서 2가 세그먼트는 -(-QB-QC-QD-)s1-일 수 있되,
각각의 s1은 독립적으로 1 내지 50(예를 들어, 1 내지 30)의 정수이며;
각각의 QB 및 각각의 QD는 독립적으로 부재하거나, -CO-, -NH-, -O-, -S-, -SO2-, -OC(O)-, -COO-, -NHC(O)-, -C(O)NH-, -CH2-, -CH2NH-, -NHCH2-, -CH2O-, 또는 -OCH2-이고;
각각의 QC는 독립적으로 부재하거나, 선택적으로 치환된 C1-12 알킬렌, 선택적으로 치환된 C2-12 알케닐렌, 선택적으로 치환된 C2-12 알키닐렌, 선택적으로 치환된 C2-12 헤테로알킬렌, 또는 선택적으로 치환된 C1-9 헤테로사이클릴렌이며;
단, QB, QC, 및 QD 중 적어도 하나가 존재한다.
특정 실시양태에서, 적어도 하나의 QC는 2가 세그먼트 내에 존재한다. 특별한 실시양태에서, QC는 2가 세그먼트의 각각의 모노머 단위 내에 존재한다. 일부 실시양태에서, Z1은 존재하는 QC를 통해 결합된다. 추가 실시양태에서, QB 및 QD 중 적어도 하나는 Z1의 각각의 모노머 단위 내에 존재한다. 또 추가의 실시양태에서, QB 및 QD 중 적어도 하나는 Z2의 각각의 모노머 단위 내에 존재한다. 특별한 실시양태에서, Z1, Z2, 및 Z3 중 단 하나는, 존재할 때, 분지기를 함유한다.
또 추가의 실시양태에서, Z1, Z2, 및 Z3 중 1, 2, 또는 3 개는 독립적으로
[화학식 (III)]
Figure pct00060
이되,
상기 식에서,
각각의 s1은 독립적으로 1 내지 50(예를 들어, 1 내지 30)의 정수이며;
각각의 QB 및 각각의 QD는 독립적으로 부재하거나, -CO-, -NH-, -O-, -S-, -SO2-, -OC(O)-, -COO-, -NHC(O)-, -C(O)NH-, -CH2-, -CH2NH-, -NHCH2-, -CH2O-, 또는 -OCH2-이고;
각각의 QC는 독립적으로 부재하거나, 선택적으로 치환된 C1-12 알킬렌, 선택적으로 치환된 C2-12 알케닐렌, 선택적으로 치환된 C2-12 알키닐렌, 선택적으로 치환된 C2-12 헤테로알킬렌, 선택적으로 치환된 C1-9 헤테로사이클릴렌, 또는 -P(Z)(OH)-이되, Z는 O 또는 S이며;
QE는 부재하거나 화학식 (IV)의 분지기이다:
[화학식 (IV)]
Figure pct00061
상기 식에서,
p1은 1, 2, 또는 3이고;
각각의 s2는 독립적으로 0 내지 10의 정수이며;
QF는 선택적으로 치환된 C1-12 알칸-트리일 또는 선택적으로 치환된 C2-12 헤테로알칸-트리일이고;
각각의 QG는 독립적으로 선택적으로 치환된 C1-6 알칸-트리일, 선택적으로 치환된 C1-6 알칸-테트라일, 선택적으로 치환된 C2-6 헤테로알칸-트리일, 또는 선택적으로 치환된 C2-6 헤테로알칸-테트라일이며;
각각의 QH는 독립적으로 RM1 또는 -QG[(-QB-QC-QD)s2-RM1]p1이되, 각각의 RM1은 독립적으로 보조 모이어티에 대한 결합이다.
화학식 (IV)에서, p1이 1인 경우, QG는 부재하고; p1이 2 또는 3인 경우, 적어도 하나의 QG가 존재한다.
특별한 실시양태에서, Z1은 존재하는 QC를 통해 인터뉴클레오시드 또는 말단 포스페이트, 인터뉴클레오시드 또는 말단 포스포로티오에이트, 인터뉴클레오시드 또는 말단 포스포로디티오에이트, 비염기 스페이서, 캡핑기, 또는 핵염기에 결합된다.
특별한 실시양태에서, QB, QC, QD, 및 QE 중 적어도 하나는 2가 세그먼트 내애 존재한다(예를 들어, 적어도 하나의 QC가 존재하거나, QE가 존재하거나, QE가 부재함). 특정 실시양태에서, 각각의 QB 및 각각의 QD는 독립적으로 부재하거나, -CO-, -NH-, -O-, -S-, -SO2-, -NHC(O)-, -C(O)NH-, -CH2-, -CH2NH-, -NHCH2-, -CH2O-, 또는 -OCH2-이다.
일부 실시양태에서, -(-QB-QC-QD-)s1-는 조합되어 다음 기를 형성한다:
Figure pct00062
상기 식에서,
(i) g2는 1 내지 50의 정수이고;
(ii) g1은 1이고 QB는 -NHCO-, -CONH-, 또는 -O-이거나; g1은 0이고 QD는 -NHCO-이며;
(iii) g3은 1이고 QB는 -NHCO-, -CONH-, 또는 -O-이거나; g3은 0이고 QD는 -CONH-이다.
접합 모이어티는 보조 모이어티가 폴리뉴클레오티드에 접합될 때까지 보호될 수 있다. 예를 들어, 보호되는 접합 모이어티는 -COORPGO 또는 -NHRPGN을 포함할 수 있되, RPGO는 O-보호기(예를 들어, 카복실 보호기)이고, RPGN은 N-보호기이다.
추가 실시양태에서, Link A는
[화학식 (V)]
Figure pct00063
이되,
상기 식에서,
QA1 및 QA2 각각은 부재하거나, 독립적으로 선택적으로 치환된 C2-12 헤테로알킬렌(예를 들어, -C(O)-N(H)-, -N(H)-C(O)-, -S(O)2-N(H)-, 또는 -N(H)-S(O)2-를 함유하는 헤테로알킬렌), 선택적으로 치환된 C1-12 티오헤테로사이클릴렌(예를 들어,
Figure pct00064
,
Figure pct00065
,
Figure pct00066
,
Figure pct00067
, 또는
Figure pct00068
), 선택적으로 치환된 C1-12 헤테로사이클릴렌(예를 들어, 1,2,3-트리아졸-1,4-디일 또는
Figure pct00069
), 사이클로부트-3-엔-1,2-디온-3,4-디일, 피리드-2-일 히드라존, 선택적으로 치환된 C6-16 트리아졸로헤테로사이클릴렌(예를 들어,
Figure pct00070
또는
Figure pct00071
), 선택적으로 치환된 C8-16 트리아졸로사이클로알케닐렌(예를 들어,
Figure pct00072
), 또는 디하이드로피리다진기(예를 들어, trans-
Figure pct00073
, trans-
Figure pct00074
,
Figure pct00075
, 또는
Figure pct00076
)이고, 단, QA1 및 QA2 중 적어도 하나는 존재하며;
RT는 표적화 모이어티에 대한 결합이고;
RP는 인터뉴클레오시드 가교기, 핵염기, 캡핑기, 또는 비염기 스페이서에 대한 결합이며;
QT는 -CO-, -NH-, -NH-CH2-, 또는 -CO-CH2-이고;
각각의 QS는 독립적으로 선택적으로 치환된 C2-12 알킬렌, 선택적으로 치환된 C2-12 알케닐렌, 선택적으로 치환된 C2-12 알키닐렌, 또는 선택적으로 치환된 (C6-10 아릴)-C1-6-알킬렌이며;
각각의 RM은 독립적으로 H, 보조 모이어티, -(CH2)q7-CO-N(RM1)2, 또는 -C[-CH2O-(CH2)q7-CO-N(RM1)2]3이되, 각각의 q7은 독립적으로 1 내지 5의 정수이고, 각각의 RM1은 독립적으로 H 또는 보조 모이어티이며;
X1, X3, 및 X5 각각은 독립적으로 부재하거나, -O-, -NH-, -CH2-NH-, -C(O)-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-, -NH-C(O)-NH-, -O-C(O)-NH-, -NH-C(O)-O-, -CH2-NH-C(O)-NH-, -CH2-O-C(O)-NH-, 또는 -CH2-NH-C(O)-O-이고;
X7은 부재하거나, -O-, -O-P(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -NH-, -CH2-NH-, -C(O)-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-, -NH-C(O)-NH-, -O-C(O)-NH-, -NH-C(O)-O-, -CH2-NH-C(O)-NH-, -CH2-O-C(O)-NH-, 또는 -CH2-NH-C(O)-O-이며;
X2, X4, 및 X6 각각은 독립적으로 부재하거나, -O-, -NH-, -C(O)-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-, -NH-C(O)-NH-, -O-C(O)-NH-, 또는 -NH-C(O)-O-이고;
x1 및 각각의 x5는 독립적으로 0 또는 1이며;
각각의 x2는 독립적으로 0 내지 50(예를 들어, 1 내지 40 또는 1 내지 30)의 정수이고;
각각의 x3은 독립적으로 1 내지 11의 정수이며;
x4는 0, 1, 또는 2이고;
각각의 x6은 독립적으로 0 내지 10(예를 들어, 1 내지 6)의 정수이며, 단 양측 x6의 합은 12 이하이다.
또 추가의 실시양태에서, LinkA는
[화학식 (VI)]
Figure pct00077
[화학식 (VII)]
Figure pct00078
[화학식 (VIII)]
Figure pct00079
[화학식 (IX)]
Figure pct00080
또는,
[화학식 (X)]
Figure pct00081
이되,
상기 식에서,
QA1은 선택적으로 치환된 C2-12 헤테로알킬렌(예를 들어, -C(O)-N(H)-, -N(H)-C(O)-, -S(O)2-N(H)-, 또는 -N(H)-S(O)2-를 함유하는 헤테로알킬렌), 선택적으로 치환된 C1-12 티오헤테로사이클릴렌(예를 들어,
Figure pct00082
,
Figure pct00083
,
Figure pct00084
,
Figure pct00085
, 또는
Figure pct00086
), 선택적으로 치환된 C1-12 헤테로사이클릴렌(예를 들어, 1,2,3-트리아졸-1,4-디일 또는
Figure pct00087
), 사이클로부트-3-엔-1,2-디온-3,4-디일, 또는 피리드-2-일 히드라존), 선택적으로 치환된 C6-16 트리아졸로헤테로사이클릴렌(예를 들어,
Figure pct00088
또는
Figure pct00089
), 선택적으로 치환된 C8-16 트리아졸로사이클로알케닐렌(예를 들어,
Figure pct00090
), 또는 디하이드로피리다진기(예를 들어, trans-
Figure pct00091
, trans-
Figure pct00092
,
Figure pct00093
, 또는
Figure pct00094
)이고;
각각의 RM1은 독립적으로 H 또는 보조 모이어티이며;
RT는 표적화 모이어티에 대한 결합이고;
RP는 인터뉴클레오시드 가교기, 핵염기, 캡핑기, 또는 비염기 스페이서에 대한 결합이며;
QT는 -CO-, -NH-, -NH-CH2-, 또는 -CO-CH2-이고;
QP는 -C(O)-N(H)-, -N(H)-C(O)-, -S(O)2-N(H)-, 또는 -N(H)-S(O)2-이며;
각각의 QS는 독립적으로 선택적으로 치환된 C2-12 알킬렌, 선택적으로 치환된 C2-12 알케닐렌, 선택적으로 치환된 C2-12 알키닐렌, 또는 선택적으로 치환된 (C6-10 아릴)-C1-6-알킬렌이고;
q1, q3, 및 q7 각각은 독립적으로 0 또는 1이며;
q2 및 q8 각각은 0 내지 50(예를 들어, 1 내지 40 또는 1 내지 30)의 정수이고;
q4는 0 내지 10의 정수이며;
q5 및 q6 각각은 독립적으로 1 내지 10(예를 들어, 1 내지 6)의 정수이고;
q9는 1 내지 10의 정수이다.
또 추가의 실시양태에서, LinkA는
[화학식 (XI)]
Figure pct00095
[화학식 (XII)]
Figure pct00096
[화학식 (XIII)]
Figure pct00097
[화학식 (XIV)]
Figure pct00098
또는
[화학식 (XV)]
Figure pct00099
이되,
상기 식에서,
각각의 구조식에서, 하나의
Figure pct00100
는 단일 결합을 나타내고, 다른
Figure pct00101
는 이중 결합을 나타내며;
각각의 RM1은 독립적으로 H 또는 보조 모이어티이고;
RT는 표적화 모이어티에 대한 결합이며;
RP는 인터뉴클레오시드 가교기, 핵염기, 캡핑기, 또는 비염기 스페이서에 대한 결합이고;
QT는 -CO-, -CO-CH2-, -NH-, 또는 -NH-CH2-이며;
QP는 -C(O)-N(H)-, -N(H)-C(O)-, -S(O)2-N(H)-, 또는 -N(H)-S(O)2-이고;
각각의 QS는 독립적으로 선택적으로 치환된 C2-12 알킬렌, 선택적으로 치환된 C2-12 알케닐렌, 선택적으로 치환된 C2-12 알키닐렌, 또는 선택적으로 치환된 (C6-10 아릴)-C1-6-알킬렌이며;
q1, q3, 및 q7 각각은 독립적으로 0 또는 1이고;
q2 및 q8 각각은 0 내지 50(예를 들어, 1 내지 40 또는 1 내지 30)의 정수이며;
q4는 0 내지 10의 정수이고;
q5 및 q6 각각은 독립적으로 1 내지 10(예를 들어, 1 내지 6)의 정수이며;
q9는 1 내지 10의 정수이다.
일부 실시양태에서, q5는 0이다. 다른 실시양태에서, q5는 2 내지 6의 정수이다.
특별한 실시양태에서, 접합기는
[화학식 (XVI)]
Figure pct00102
이되,
상기 식에서,
QA1은 독립적으로 선택적으로 치환된 C2-12 헤테로알킬렌(예를 들어, -C(O)-N(H)-, -N(H)-C(O)-, -S(O)2-N(H)-, 또는 -N(H)-S(O)2-를 함유하는 헤테로알킬렌), 선택적으로 치환된 C1-12 티오헤테로사이클릴렌(예를 들어,
Figure pct00103
,
Figure pct00104
,
Figure pct00105
,
Figure pct00106
, 또는
Figure pct00107
), 선택적으로 치환된 C1-12 헤테로사이클릴렌(예를 들어, 1,2,3-트리아졸-1,4-디일 또는
Figure pct00108
), 사이클로부트-3-엔-1,2-디온-3,4-디일, 피리드-2-일 히드라존, 선택적으로 치환된 C6-16 트리아졸로헤테로사이클릴렌(예를 들어,
Figure pct00109
또는
Figure pct00110
), 선택적으로 치환된 C8-16 트리아졸로사이클로알케닐렌(예를 들어,
Figure pct00111
), 또는 디하이드로피리다진기(예를 들어, trans-
Figure pct00112
, trans-
Figure pct00113
,
Figure pct00114
, 또는
Figure pct00115
)이고;
QA2는 선택적으로 치환된 C2-12 알키닐, 선택적으로 치환된 N-보호된 아미노, 아지도, N-말레이미도, S-보호된 티올,
Figure pct00116
,
Figure pct00117
,
Figure pct00118
또는 이의 N-보호된 버전,
Figure pct00119
,
Figure pct00120
,
Figure pct00121
, 엔도사이클릭 탄소-탄소 삼중 결합을 함유하는 선택적으로 치환된 C6-16 헤테로사이클릴(예를 들어,
Figure pct00122
), 1,2,4,5-테트라진기(예를 들어,
Figure pct00123
또는
Figure pct00124
), 또는 선택적으로 치환된 C8-16 사이클로알키닐(예를 들어,
Figure pct00125
), -NHRN1, 선택적으로 치환된 C4-8 변형된 사이클로알케닐 (예를 들어, trans-사이클로옥테닐 또는 노르보네닐), 또는 -COOR12 또는 -CHO를 함유하는 선택적으로 치환된 C1-16 알킬이며;
RN1은 H, N-보호기, 또는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬이고;
각각의 R12는 독립적으로 H 또는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬이며;
R13은 할로겐(예를 들어, F)이고;
RP는 인터뉴클레오시드 가교기, 핵염기, 캡핑기, 또는 비염기 스페이서에 대한 결합이며;
각각의 QS는 독립적으로 선택적으로 치환된 C2-12 알킬렌, 선택적으로 치환된 C2-12 알케닐렌, 선택적으로 치환된 C2-12 알키닐렌, 또는 선택적으로 치환된 (C6-10 아릴)-C1-6-알킬렌이고;
각각의 RM은 독립적으로 H, 보조 모이어티, -(CH2)q7-CO-N(RM1)2, 또는 -C[-CH2O-(CH2)q7-CO-N(RM1)2]3이되, 각각의 q7은 독립적으로 1 내지 5의 정수이고, 각각의 RM1은 독립적으로 H 또는 보조 모이어티이며;
X3 및 X5 각각은 독립적으로 부재하거나, -O-, -NH-, -CH2-NH-, -C(O)-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-, -NH-C(O)-NH-, -O-C(O)-NH-, -NH-C(O)-O-, -CH2-NH-C(O)-NH-, -CH2-O-C(O)-NH-, 또는 -CH2-NH-C(O)-O-이고;
X7 은 부재하거나, -O-, -O-P(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -NH-,-CH2-NH-, -C(O)-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-, -NH-C(O)-NH-, -O-C(O)-NH-, -NH-C(O)-O-, -CH2-NH-C(O)-NH-, -CH2-O-C(O)-NH-, 또는 -CH2-NH-C(O)-O-이며;
X2, X4, 및 X6 각각은 독립적으로 부재하거나, -O-, -NH-, -O-, -C(O)-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-, -NH-C(O)-NH-, -O-C(O)-NH-, 또는 -NH-C(O)-O-이고;
x1 및 각각의 x5는 독립적으로 0 또는 1이며;
각각의 x2는 독립적으로 0 내지 50(예를 들어, 1 내지 40 또는 1 내지 30)의 정수이고;
각각의 x3은 독립적으로 1 내지 11의 정수이며;
x4는 0, 1, 또는 2이고;
각각의 x6은 독립적으로 0 내지 10(예를 들어, 1 내지 6)의 정수이며, 단 양측 x6의 합은 12 이하이다.
일부 실시양태에서, 접합기는
[화학식 (XVII)]
Figure pct00126
이되,
상기 식에서,
QA1은 선택적으로 치환된 C2-12 알키닐, 선택적으로 치환된 N-보호된 아미노, 아지도, N-말레이미도, S-보호된 티올,
Figure pct00127
,
Figure pct00128
,
Figure pct00129
또는 이의 N-보호된 버전,
Figure pct00130
,
Figure pct00131
,
Figure pct00132
, 엔도사이클릭 탄소-탄소 삼중 결합을 함유하는 선택적으로 치환된 C6-16 헤테로사이클릴(예를 들어,
Figure pct00133
), 1,2,4,5-테트라진기(예를 들어,
Figure pct00134
또는
Figure pct00135
), 또는 선택적으로 치환된 C8-16 사이클로알키닐(예를 들어,
Figure pct00136
), -NHRN1, 선택적으로 치환된 C4-8 변형된 사이클로알케닐(예를 들어, trans-사이클로옥테닐 또는 노르보네닐), 또는 -COOR12 또는 -CHO를 함유하는 선택적으로 치환된 C1-16 알킬이고;
RN1은 H, N-보호기, 또는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬이며;
각각의 R12는 독립적으로 H 또는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬이고;
R13은 할로겐(예를 들어, F)이며;
RP는 인터뉴클레오시드 가교기, 핵염기, 캡핑기, 또는 비염기 스페이서에 대한 결합이고;
각각의 QS는 독립적으로 선택적으로 치환된 C2-12 알킬렌, 선택적으로 치환된 C2-12 알케닐렌, 선택적으로 치환된 C2-12 알키닐렌, 또는 선택적으로 치환된 (C6-10 아릴)-C1-6-알킬렌이며;
X7은 부재하거나, -O-, -NH-, -O-P(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -CH2-NH-, -C(O)-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-, -NH-C(O)-NH-, -O-C(O)-NH-, -NH-C(O)-O-, -CH2-NH-C(O)-NH-, -CH2-O-C(O)-NH-, 또는 -CH2-NH-C(O)-O-이고;
X6은 부재하거나, -O-, -NH-, -O-, -C(O)-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-, -NH-C(O)-NH-, -O-C(O)-NH-, 또는 -NH-C(O)-O-이며;
x1은 독립적으로 0 또는 1이고;
각각의 x2는 독립적으로 0 내지 50(예를 들어, 1 내지 40 또는 1 내지 30)의 정수이며;
각각의 x3은 독립적으로 1 내지 11의 정수이고;
x4는 0, 1, 또는 2이다.
특정 실시양태에서, 접합기는
[화학식 (XVIII)]
Figure pct00137
또는
[화학식 (XIX)]
Figure pct00138
이되,
상기 식에서
QA1은 선택적으로 치환된 C2-12 알키닐, 선택적으로 치환된 N-보호된 아미노, 아지도, N-말레이미도, S-보호된 티올,
Figure pct00139
,
Figure pct00140
,
Figure pct00141
또는 이의 N-보호된 버전,
Figure pct00142
,
Figure pct00143
,
Figure pct00144
, 엔도사이클릭 탄소-탄소 삼중 결합을 함유하는 선택적으로 치환된 C6-16 헤테로사이클릴(예를 들어,
Figure pct00145
), 1,2,4,5-테트라진기(예를 들어,
Figure pct00146
또는
Figure pct00147
), 또는 선택적으로 치환된 C8-16 사이클로알키닐(예를 들어,
Figure pct00148
), -NHRN1, 선택적으로 치환된 C4-8 변형된 사이클로알케닐(예를 들어, trans-사이클로옥테닐 또는 노르보네닐), 또는 -COOR12 또는 -CHO를 함유하는 선택적으로 치환된 C1-16 알킬이고;
RN1은 H, N-보호기, 또는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬이며;
각각의 R12는 독립적으로 H 또는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬이고;
R13은 할로겐(예를 들어, F)이며;
RP는 인터뉴클레오시드 가교기, 핵염기, 캡핑기, 또는 비염기 스페이서에 대한 결합이고;
QP는 -C(O)-N(H)-, -N(H)-C(O)-, -S(O)2-N(H)-, 또는 -N(H)-S(O)2-이며;
각각의 QS는 독립적으로 선택적으로 치환된 C2-12 알킬렌, 선택적으로 치환된 C2-12 알케닐렌, 선택적으로 치환된 C2-12 알키닐렌, 또는 선택적으로 치환된 (C6-10 아릴)-C1-6-알킬렌이고;
q1 및 q3 각각은 독립적으로 0 또는 1이며;
q2는 0 내지 50(예를 들어, 1 내지 40 또는 1 내지 30)의 정수이고;
q4는 0 내지 10의 정수이며;
q5는 1 내지 10(예를 들어, 1 내지 6)의 정수이다.
또 추가의 실시양태에서, 접합기는
[화학식 (XX)]
Figure pct00149
또는
[화학식 (XXI)]
Figure pct00150
이되,
상기 식에서,
RP는 인터뉴클레오시드 가교기, 핵염기, 캡핑기, 또는 비염기 스페이서에 대한 결합이고;
QP는 -C(O)-N(H)-, -N(H)-C(O)-, -S(O)2-N(H)-, 또는 -N(H)-S(O)2-이며;
각각의 QS는 독립적으로 선택적으로 치환된 C2-12 알킬렌, 선택적으로 치환된 C2-12 알케닐렌, 선택적으로 치환된 C2-12 알키닐렌, 또는 선택적으로 치환된 (C6-10 아릴)-C1-6-알킬렌이고;
q1 및 q3 각각은 독립적으로 0 또는 1이며;
q2는 0 내지 50(예를 들어, 1 내지 40 또는 1 내지 30)의 정수이고;
q4는 0 내지 10의 정수이며;
q5는 1 내지 10(예를 들어, 1 내지 6)의 정수이다.
특정 예시적 실시양태에서, 접합기는
Figure pct00151
,
Figure pct00152
,
Figure pct00153
,
Figure pct00154
,
Figure pct00155
,
Figure pct00156
,
Figure pct00157
,
Figure pct00158
,
Figure pct00159
,
Figure pct00160
,
Figure pct00161
,
Figure pct00162
,
Figure pct00163
,
Figure pct00164
,
Figure pct00165
,
Figure pct00166
,
Figure pct00167
,
Figure pct00168
,
Figure pct00169
,
Figure pct00170
,
Figure pct00171
,
Figure pct00172
,
Figure pct00173
,
Figure pct00174
,
Figure pct00175
,
Figure pct00176
,
Figure pct00177
,
Figure pct00178
, 또는
Figure pct00179
이되, 상기 식에서 q2는 1 내지 50의 정수(예를 들어, 1 내지 24 또는 1 내지 8의 정수(예를 들어, 2 또는 3))이고, q4는 0 내지 10의 정수(예를 들어, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8)이며, q10은 0 내지 8의 정수(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6)이고, q11은 0 또는 1이며, Z는 O 또는 S이고, 각각의 RM은 독립적으로 H, 보조 모이어티, -(CH2)q7-CO-N(RM1)2, 또는 -C[-CH2O-(CH2)q7-CO-N(RM1)2]3이되, 각각의 q7은 독립적으로 1 내지 5의 정수이고, 각각의 RM1은 독립적으로 H 또는 보조 모이어티이다.
다음 예시적 접합기는 금속-촉매화된 부가환화를 통한 표적화 모이어티에 대한 접합을 위해 사용될 수 있다:
Figure pct00180
,
Figure pct00181
,
Figure pct00182
,
Figure pct00183
,
Figure pct00184
,
Figure pct00185
,
Figure pct00186
,
Figure pct00187
,
Figure pct00188
,
Figure pct00189
, 및
Figure pct00190
이되, 상기 식에서 q2는 1 내지 50의 정수(예를 들어, 1 내지 24 또는 1 내지 8의 정수(예를 들어, 2 또는 3))이고, q4는 0 내지 10의 정수(예를 들어, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8)이며, q10은 0 내지 8의 정수(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6)이고, q11은 0 또는 1이며, Z는 O 또는 S이다.
다음 예시적 접합기는 무-금속 부가환화를 통한 표적화 모이어티에 대한 접합을 위해 사용될 수 있다:
Figure pct00191
,
Figure pct00192
,
Figure pct00193
,
Figure pct00194
,
Figure pct00195
,
Figure pct00196
,
Figure pct00197
,
Figure pct00198
,
Figure pct00199
,
Figure pct00200
,
Figure pct00201
,
Figure pct00202
,
Figure pct00203
,
Figure pct00204
,
Figure pct00205
,
Figure pct00206
,
Figure pct00207
,
Figure pct00208
, 및
Figure pct00209
이되, 상기 식에서 q2는 1 내지 50의 정수(예를 들어, 1 내지 24 또는 1 내지 8의 정수(예를 들어, 2 또는 3))이고, q4는 0 내지 10 의 정수(예를 들어, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8)이며, q10은 0 내지 8의 정수(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6)이고, q11은 0 또는 1이며, Z는 O 또는 S이고, 각각의 RM은 독립적으로 H, 보조 모이어티, -(CH2)q7-CO-N(RM1)2, 또는 -C[-CH2O-(CH2)q7-CO-N(RM1)2]3이되, 각각의 q7은 독립적으로 1 내지 5의 정수이고, 각각의 RM1은 독립적으로 H 또는 보조 모이어티이다.
다음 예시적 접합기는 아마이드 형성을 통한 표적화 모이어티에 대한 접합을 위해 사용될 수 있다:
Figure pct00210
,
Figure pct00211
, 및
Figure pct00212
, 상기 식에서, q2는 0 내지 50의 정수(예를 들어, 1 내지 8의 정수(예를 들어, 2 또는 3))이고, q12는 1 내지 11의 정수(예를 들어, 1 내지 5의 정수(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 또는 5)이다.
생체내가역성기
생체내가역성기는 135 Da 내지 10 kDa(예를 들어, 135 Da 내지 5 kDa, 200 Da 내지 5 kDa, 또는 200 Da 내지 2 kDa)의 분자량을 갖고 디설파이드(-S-S-)를 함유하는 1가 치환기이다. 생체내가역성기에서, 디설파이드 및 생채내가역성기의 원자가를 공유결합으로 연결하는 원자의 단쇄는 2 내지 10 개 원자(예를 들어, 2 내지 6 개 원자 또는 4 내지 6 개 원자(예를 들어, 4 또는 5 개 원자))일 수 있다. 생체내가역성기는 생리학적 조건 하에서 세포내에서 절단 가능할 수 있다.
생체내가역성기는 포스포에스터에 포함되어, 예를 들어 본 발명의 면역조절 폴리뉴클레오티드의 전체 음성 전하를 감소시킬 수 있다. 면역조절 폴리뉴클레오티드의 전체 음성 전하에서의 감소는 본 발명의 면역조절 폴리뉴클레오티드 및/또는 접합체의 세포 흡수를 향상시킬 수 있다. 본 발명의 면역조절 폴리뉴클레오티드는 포스포에스터 및/또는 비염기 스페이서에 1 이상의 생체내가역성기를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 면역조절 폴리뉴클레오티드는 1 내지 6 개 생체내가역성기(예를 들어, 1 내지 4 개 생체내가역성기(예를 들어, 1, 2, 또는 3 개 생체내가역성기))를 포함할 수 있다.
생체내가역성기는 하기 화학식 (XXII)의 것일 수 있다:
[화학식 (XXII)]
Figure pct00213
상기 식에서,
LinkB는 포스페이트, 포스포로티오에이트, 또는 포스포로디티오에이트에 결합된 sp 3-혼성화된 탄소 원자, 및 -S-S-에 결합된 탄소 원자를 함유하는 2가 기이고, R5는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬, 선택적으로 치환된 C6-10 아릴, 또는 -LinkC(-RM)r이거나, LinkB는 포스페이트, 포스포로티오에이트, 또는 포스포로디티오에이트에 결합된 sp 3-혼성화된 탄소 원자, 및 -S-S-에 결합된 탄소 원자를 함유하는 3가 링커이되, LinkB의 제3 원자가는 -S-S- 및 R5와 조합되어, 선택적으로 치환된 C3-9 헤테로사이클릴렌을 형성하며;
LinkC는 다가 기이고;
각각의 RM은 독립적으로 H, 보조 모이어티, 또는 -QG[(-QB-QC-QD)s2-RM1]p1이되,
상기 식에서,
각각의 RM1은 독립적으로 H 또는 보조 모이어티이고,
각각의 QB 및 각각의 QD는 독립적으로 부재하거나, -CO-, -NH-, -O-, -S-, -SO2-, -OC(O)-, -COO-, -NHC(O)-, -C(O)NH-, -CH2-, -CH2NH-, -NHCH2-, -CH2O-, 또는 -OCH2-이며,
각각의 QC는 독립적으로 부재하거나, 선택적으로 치환된 C1-12 알킬렌, 선택적으로 치환된 C2-12 알케닐렌, 선택적으로 치환된 C2-12 알키닐렌, 선택적으로 치환된 C2-12 헤테로알킬렌, 또는 선택적으로 치환된 C1-9 헤테로사이클릴렌이고,
각각의 QG는 독립적으로 선택적으로 치환된 C1-6 알칸-트리일, 선택적으로 치환된 C1-6 알칸-테트라일, 선택적으로 치환된 C2-6 헤테로알칸-트리일, 또는 선택적으로 치환된 C2-6 헤테로알칸-테트라일이며,
각각의 s2는 독립적으로 0 내지 10의 정수이고,
p1은 2 또는 3이며;
r은 1 내지 6의 정수(예를 들어, 1, 2, 또는 3)이다.
특정 실시양태에서, LinkB 및/또는 R5는 -S-S-에 부착된 벌키기를 포함한다. -S-S-에 부착된 벌키기의 포함은, 예를 들어 폴리뉴클레오티드 합성 동안 황-황 결합의 안정성을 향상시킬 수 있다.
추가 실시양태에서, LinkB는 1, 2, 또는 3 개의 그룹으로 구성되며, 각각의 그룹은 독립적으로 선택적으로 치환된 C1-12 알킬렌, 선택적으로 치환된 C2-12 알케닐렌, 선택적으로 치환된 C2-12 알키닐렌, 선택적으로 치환된 C6-10 아릴렌, 선택적으로 치환된 C2-12 헤테로알킬렌, 및 선택적으로 치환된 C1-9 헤테로사이클릴렌으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특별한 실시양태에서, LinkB 및 -S-S-는 조합되어, 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 구조를 형성한다:
Figure pct00214
Figure pct00215
상기 식에서,
각각의 R6은 독립적으로 C2-7 알카노일; C1-6 알킬; C2-6 알케닐; C2-6 알키닐; C1-6 알킬설피닐; C6-10 아릴; 아미노; (C6-10 아릴)-C1-4-알킬; C3-8 사이클로알킬; (C3-8 사이클로알킬)-C1-4-알킬; C3-8 사이클로알케닐; (C3-8 사이클로알케닐)-C1-4-알킬; 할로; C1-9 헤테로사이클릴; C1-9 헤테로아릴; (C1-9 헤테로사이클릴)옥시; (C1-9 헤테로사이클릴)아자; 하이드록시; C1-6 티오알콕시; (CH2)qCO2RA(상기 식에서, q는 0 내지 4의 정수이고, RA 는 C1-6 알킬, C6-10 아릴, 및 (C6-10 아릴)-C1-4-알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택됨); -(CH2)qCONRBRC(상기 식에서, q는 0 내지 4의 정수이고, RB 및 RC는 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C6-10 아릴, 및 (C6-10 아릴)-C1-4-알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택됨); -(CH2)qSO2RD(상기 식에서, q는 0 내지 4의 정수이고, RD는 C1-6 알킬, C6-10 아릴, 및 (C6-10 아릴)-C1-4-알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택됨); -(CH2)qSO2NRERF(상기 식에서, q는 0 내지 4의 정수이고, RE 및 RF 각각은, 독립적으로, 수소, 알킬, 아릴, 및 (C6-10 아릴)-C1-4-알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택됨); 티올; 아릴옥시; 사이클로알콕시; 아릴알콕시; (C1-9 헤테로사이클릴)-C1-4-알킬; (C1-9 헤테로아릴)-C1-4-알킬; C3-12 실릴; 시아노; 또는 -S(O)RH(상기 식에서, RH는 수소, C1-C6 알킬, C6-10 아릴, 및 (C6-10 아릴)-C1-4-알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택됨)이거나; 또는 2 개의 인접한 R6 기는 R6 기 각각이 부착되는 원자와 함께 조합되어, C6 아릴, C2-5 헤테로사이클릴, 또는 C2-5 헤테로아릴로 이루어진 그룹으로부터 선택된 사이클릭기를 형성하되, 사이클릭기는 선택적으로 C2-7 알카노일; C1-6 알킬; C2-6 알케닐; C2-6 알키닐; C1-6 알킬설피닐; C6-10 아릴; 아미노; (C6-10 아릴)-C1-4-알킬; C3-8 사이클로알킬; (C3-8 사이클로알킬)-C1-4-알킬; C3-8 사이클로알케닐; (C3-8 사이클로알케닐)-C1-4-알킬; 할로; C1-9 헤테로사이클릴; C1-9 헤테로아릴; (C1-9 헤테로사이클릴)옥시; (C1-9 헤테로사이클릴)아자; 하이드록시; C1-6 티오알콕시; -(CH2)qCO2RA(상기 식에서, q는 0 내지 4의 정수이고, RA는 C1-6 알킬, C6-10 아릴, 및 (C6-10 아릴)-C1-4-알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택됨); -(CH2)qCONRBRC(상기 식에서, q는 0 내지 4의 정수이고, RB 및 RC는 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C6-10 아릴, 및 (C6-10 아릴)-C1-4-알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택됨); -(CH2)qSO2RD(상기 식에서, q는 0 내지 4의 정수이고, RD는 C1-6 알킬, C6-10 아릴, 및 (C6-10 아릴)-C1-4-알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택됨); -(CH2)qSO2NRERF(상기 식에서, q는 0 내지 4의 정수이고, RE 및 RF 각각은, 독립적으로, 수소, 알킬, 아릴, 및 (C6-10 아릴)-C1-4-알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택됨); 티올; 아릴옥시; 사이클로알콕시; 아릴알콕시; (C1-9 헤테로사이클릴)-C1-4-알킬; (C1-9 헤테로아릴)-C1-4-알킬; C3-12 실릴; 시아노; 및 -S(O)RH(상기 식에서, RH는 수소, C1-C6 알킬, C6-10 아릴, 및 (C6-10 아릴)-C1-4-알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택됨)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1, 2, 또는 3 개의 치환기로 치환되고;
m1은 0, 1, 또는 2이며;
m2는 0, 1, 2, 3, 또는 4이거나;
LinkB, -S-S-, 및 R5는 조합되어
Figure pct00216
를 함유하는 기를 형성한다.
또 추가의 실시양태에서, LinkC는 0 내지 3 개의 다가 모노머(예를 들어, 선택적으로 치환된 C1-6 알칸-트리일, 선택적으로 치환된 C1-6 알칸-테트라일, 또는 3가 질소 원자) 및 1 이상의 2가 모노머(예를 들어, 1 내지 40 개)를 포함할 수 있되, 각각의 2가 모노머는 독립적으로 선택적으로 치환된 C1-6 알킬렌; 선택적으로 치환된 C2-6 알케닐렌; 선택적으로 치환된 C2-6 알키닐렌; 선택적으로 치환된 C3-8 사이클로알킬렌; 선택적으로 치환된 C3-8 사이클로알케닐렌; 선택적으로 치환된 C6-14 아릴렌; N, O, 및 S로부터 선택된 1 내지 4 개의 헤테로원자를 갖는 선택적으로 치환된 C1-9 헤테로아릴렌; N, O, 및 S로부터 선택된 1 내지 4 개의 헤테로원자를 갖는 선택적으로 치환된 C1-9 헤테로사이클릴렌; 이미노; 선택적으로 치환된 N; O; 또는 S(O)m(상기 식에서, m은 0, 1, 또는 2임)이다. 일부 실시양태에서, 각각의 모노머는 독립적으로 선택적으로 치환된 C1-6 알킬렌; 선택적으로 치환된 C3-8 사이클로알킬렌; 선택적으로 치환된 C3-8 사이클로알케닐렌; 선택적으로 치환된 C6-14 아릴렌; N, O, 및 S로부터 선택된 1 내지 4 개의 헤테로원자를 갖는 선택적으로 치환된 C1-9 헤테로아릴렌; N, O, 및 S로부터 선택된 1 내지 4 개의 헤테로원자를 갖는 선택적으로 치환된 C1-9 헤테로사이클릴렌; 이미노; 선택적으로 치환된 N; O; 또는 S(O)m(상기 식에서, m은 0, 1, 또는 2임(예를 들어, m은 2임))이다. 특정 실시양태에서, 각각의 모노머는 독립적으로 선택적으로 치환된 C1-6 알킬렌; 선택적으로 치환된 C3-8 사이클로알킬렌; 선택적으로 치환된 C3-8 사이클로알케닐렌; 선택적으로 치환된 C6-14 아릴렌; N, O, 및 S로부터 선택된 1 내지 4 개의 헤테로원자를 갖는 선택적으로 치환된 C1-9 헤테로아릴렌; N, O, 및 S로부터 선택된 1 내지 4 개의 헤테로원자를 갖는 선택적으로 치환된 C1-9 헤테로사이클릴렌; 선택적으로 치환된 N; O; 또는 S(O)m(상기 식에서, m은 0, 1, 또는 2임(예를 들어, m은 2임))이다. 보조 모이어티를 접합 모이어티 또는 이의 반응 생산물에 연결하는 비-생체내가역성 링커는 2 내지 500(예를 들어, 2 내지 300, 2 내지 200, 2 내지 100, 또는 2 내지 50) 개의 이러한 모노머를 포함할 수 있다. LinkC는 1 이상의 폴리에틸렌 글리콜을 포함할 수 있다(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜은 88 Da 내지 1 kDa(예를 들어, 88 Da 내지 500 Da)의 분자량을 가질 수 있음).
화학식 (IIa)의 기 -LinkC(-RM)r의 제조에서 사용될 수 있는 화합물은 본원뿐 아니라 WO 2015/188197호에도 기재되어 있다. -LinkC(-RM)r의 비-제한적인 예는 다음을 포함한다:
Figure pct00217
,
Figure pct00218
,
Figure pct00219
,
Figure pct00220
, 및
Figure pct00221
,
상기 식에서,
R14는 -S-S-에 대한 결합이고,
RM은 보조 모이어티 또는 -QG[(-QB-QC-QD)s2-RM1]p1이되,
각각의 RM1 은 독립적으로 H 또는 보조 모이어티이고,
각각의 QB 및 각각의 QD는 독립적으로 부재하거나, -CO-, -NH-, -O-, -S-, -SO2-, -OC(O)-, -COO-, -NHC(O)-, -C(O)NH-, -CH2-, -CH2NH-, -NHCH2-, -CH2O-, 또는 -OCH2-이며,
각각의 QC는 독립적으로 부재하거나, 선택적으로 치환된 C1-12 알킬렌, 선택적으로 치환된 C2-12 알케닐렌, 선택적으로 치환된 C2-12 알키닐렌, 선택적으로 치환된 C2-12 헤테로알킬렌, 또는 선택적으로 치환된 C1-9 헤테로사이클릴렌이고;
각각의 QG는 독립적으로 선택적으로 치환된 C1-6 알칸-트리일, 선택적으로 치환된 C1-6 알칸-테트라일, 선택적으로 치환된 C2-6 헤테로알칸-트리일, 또는 선택적으로 치환된 C2-6 헤테로알칸-테트라일이며,
각각의 s2는 독립적으로 0 내지 10의 정수이고,
p1은 2 또는 3이며;
각각의 r4는 독립적으로 1 내지 6의 정수이고;
각각의 r5는 독립적으로 0 내지 10의 정수이다.
특정 실시양태에서, RM은 보조 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 RM1은 보조 모이어티이다.
특정 실시양태에서, 생체내가역성 링커기는
Figure pct00222
이되, 상기 기의 일 말단은 폴리뉴클레오티드에 연결되고 나머지 말단은 표적 모이어티(일 실시양태에서, 항체)에 연결된다.
비-생체내가역성기
비-생체내가역성기는 혈청 또는 엔도솜에서 생리학적 조건 하에서 절단 가능한 결합을 함유하지 않는 1가 치환기(예를 들어, 에스터, 티오에스터, 또는 디설파이드)이다. 비-생체내가역성기는 선택적으로 치환된 C2-16 알킬; 선택적으로 치환된 C3-16 알케닐; 선택적으로 치환된 C3-16 알키닐; 선택적으로 치환된 C3-8 사이클로알킬; 선택적으로 치환된 C3-8 사이클로알케닐; 선택적으로 치환된 (C3-8 사이클로알킬)-C1-4-알킬; 선택적으로 치환된 (C3-8 사이클로알케닐)-C1-4-알킬; 선택적으로 치환된 C6-14 아릴; 선택적으로 치환된 (C6-14 아릴)-C14-알킬; N, O, 및 S로부터 선택된 1 내지 4 개의 헤테로원자를 갖는 선택적으로 치환된 C1-9 헤테로아릴; N, O, 및 S로부터 선택된 1 내지 4 개의 헤테로원자를 갖는 선택적으로 치환된 (C1-9 헤테로아릴)-C1-4-알킬; N, O, 및 S로부터 선택된 1 내지 4 개의 헤테로원자를 갖는 선택적으로 치환된 C2-9 헤테로사이클릴(상기 식에서, 헤테로사이클릴은 S-S 결합을 함유하지 않음); N, O, 및 S로부터 선택된 1 내지 4 개의 헤테로원자를 갖는 선택적으로 치환된 (C2-9 헤테로사이클릴)-C1-4-알킬(상기 식에서, 헤테로사이클릴은 S-S 결합을 함유하지 않음); 또는 하기 화학식 (XXIII)의 기일 수 있다:
[화학식 (XXIII)]
Figure pct00223
,
상기 식에서,
L3은 C2-6 알킬렌이고;
R7은 선택적으로 치환된 C2-6 알킬; 선택적으로 치환된 C6-14 아릴; 선택적으로 치환된 (C6-14 아릴)-C1-4-알킬; 선택적으로 치환된 C3-8 사이클로알킬; 선택적으로 치환된 (C3-8 사이클로알킬)-C1-4-알킬; N, O, 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1 내지 4 개의 헤테로원자를 갖는 선택적으로 치환된 C1-9 헤테로아릴; N, O, 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1 내지 4 개의 헤테로원자를 갖는 선택적으로 치환된 (C1-9 헤테로아릴)-C1-4-알킬; N, O, 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1 내지 4 개의 헤테로원자를 갖는 선택적으로 치환된 C2-9 헤테로사이클릴(상기 식에서, 헤테로사이클릴은 S-S 결합을 함유하지 않음); N, O, 및 S로부터 선택된 1 내지 4 개의 헤테로원자를 갖는 선택적으로 치환된 (C2-9 헤테로사이클릴)-C1-4-알킬(상기 식에서, 헤테로사이클릴은 S-S 결합을 함유하지 않음); 및 -OH, C1-6 알콕시, 또는 -COOH로 종결되는 폴리(에틸렌 글리콜)이며;
R8은 H 또는 C1-6 알킬이다.
비-생체내가역성 포스포트리에스터는 접합기, C2-16 알킬,
Figure pct00224
,
Figure pct00225
,
Figure pct00226
,
Figure pct00227
,
Figure pct00228
,
Figure pct00229
,
Figure pct00230
, 또는
Figure pct00231
와 아지도-함유 기질과의 부가환화 반응에 의해 형성된 기인 치환기로 치환된 포스페이트 또는 포스포로티오에이트일 수 있되,
상기 식에서,
n은 1내지 6의 정수이고;
R9는 선택적으로 치환된 C6 아릴; 1 또는 2 개의 질소 원자를 함유한 6 개의 원자 고리인 선택적으로 치환된 C4-5 헤테로아릴; 또는 1 또는 2 개의 질소 원자를 함유한 6 개의 원자 고리인 선택적으로 치환된 C4-5 헤테로사이클릴이며;
R10은 H 또는 C1-6 알킬이고;
R11은 할로겐, -COOR11A, 또는 -CON(R11B)2이되, R11A 및 R11B 각각은 독립적으로 H, 선택적으로 치환된 C1-6 알킬, 선택적으로 치환된 C6-14 아릴, 선택적으로 치환된 C1-9 헤테로아릴, 또는 선택적으로 치환된 C2-9 헤테로사이클릴이며;
아지도-함유 기질은
Figure pct00232
이다.
일부 실시양태에서, 비-생체내가역성기는 LinkD(-RM1)r1이되, LinkD는 다가 링커이고, 각각의 RM1은 독립적으로 H 또는 보조 모이어티이며, r1은 1 내지 6의 정수이다.
일부 경우에, -LinkD(-RM1)r1은 하기 화학식 (XXIV)의 것이다:
[화학식 (XXIV)]
Figure pct00233
상기 식에서,
r1은 1 내지 6의 정수이고;
각각의 r2는 독립적으로 0 내지 50(예를 들어, 0 내지 30)의 정수이되, 반복 단위가 동일하거나 상이하며;
QR은 [-Q4-Q5-Q6]r2-QL-이되, QL은 선택적으로 치환된 C2-12 헤테로알킬렌(예를 들어, -C(O)-N(H)-, -N(H)-C(O)-, -S(O)2-N(H)-, 또는 -N(H)-S(O)2-를 함유하는 헤테로알킬렌), 선택적으로 치환된 C1-12 티오헤테로사이클릴렌(예를 들어,
Figure pct00234
,
Figure pct00235
,
Figure pct00236
,
Figure pct00237
, 또는
Figure pct00238
), 선택적으로 치환된 C1-12 헤테로사이클릴렌(예를 들어, 1,2,3-트리아졸-1,4-디일 또는
Figure pct00239
), 사이클로부트-3-엔-1,2-디온-3,4-디일, 피리드-2-일 히드라존, 선택적으로 치환된 C6-16 트리아졸로헤테로사이클릴렌(예를 들어,
Figure pct00240
또는
Figure pct00241
), 선택적으로 치환된 C8-16 트리아졸로사이클로알케닐렌(예를 들어,
Figure pct00242
), 또는 디하이드로피리다진기(예를 들어, trans-
Figure pct00243
, trans-
Figure pct00244
,
Figure pct00245
, 또는
Figure pct00246
)이고;
Q3은 r1이 1인 경우, 선형 기(예를 들어, [-Q4-Q5-Q6]r2-)이거나, r1이 2 내지 6의 정수인 경우, 분지기(예를 들어, [-Q4-Q5-Q6]s-Q8([-Q4-Q5-Q6]r2-(Q8)r3)r4이되, r3은 0 또는 1이고, r4는 0, 1, 2, 또는 3임)이며; 각각의 r2는 독립적으로 0 내지 50(예를 들어, 0 내지 30)의 정수이되, 반복 단위는 동일하거나 상이하고;
각각의 Q4 및 각각의 Q6은 독립적으로 부재하거나, -CO-, -NH-, -O-, -S-, -SO2-, -OC(O)-, -COO-, -NHC(O)-, -C(O)NH-, -CH2-, -CH2NH-, -NHCH2-, -CH2O-, 또는 -OCH2-이며;
각각의 Q5는 독립적으로 부재하거나, 선택적으로 치환된 C1-12 알킬렌, 선택적으로 치환된 C2-12 알케닐렌, 선택적으로 치환된 C2-12 알키닐렌, 선택적으로 치환된 C2-12 헤테로알킬렌, 또는 선택적으로 치환된 C1-9 헤테로사이클릴렌이고;
각각의 Q7은 독립적으로 부재하거나, -CO-, -NH-, -O-, -S-, -SO2-, -CH2-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)NH-, -NH-C(O)-, -NH-CH(Ra)-C(O)-, 또는 -C(O)-CH(Ra)-NH-이며;
각각의 Q8은 독립적으로 선택적으로 치환된 C1-6 알칸-트리일, 선택적으로 치환된 C1-6 알칸-테트라일, 선택적으로 치환된 C2-6 헤테로알칸-트리일, 또는 선택적으로 치환된 C2-6 헤테로알칸-테트라일이고;
각각의 Ra는 독립적으로 H 또는 아미노산 측쇄이며;
각각의 RM1은 독립적으로 H 또는 보조 모이어티이다.
화학식 (XXIV)에서, Q4, Q5, 및 Q6 중 적어도 하나가 존재한다. 화학식 (XXIV)에서, LinkD는 각각의 r3이 0인 경우, 단일 분지 지점, 또는 적어도 하나의 r3이 1인 경우, 다중 분기 지점을 포함할 수 있다. 화학식 (XXIV)에서, QR은 -Q5-Q4-QL- 일 수 있되, Q5는 선택적으로 치환된 C2-12 헤테로알킬렌 또는 선택적으로 치환된 C1-12 알킬렌이고, Q4는 -CO-, -NH-, 또는 -O-이다. 화학식 (XXIV)에서, QL은 다음일 수 있다:
Figure pct00247
.
화학식 (XXIV)에서, Q3은 화학식 [-Q4-Q5-Q6]r2-의 선형 기일 수 있되, Q4, Q5, 및 Q6은 화학식 (XXIV)에 대해 정의된 바와 같다. 대안적으로, Q3은 분지기 [-Q4-Q5-Q6]r2-Q8([-Q4-Q5-Q6]r2-(Q8)r3)r4일 수 있되, 각각의 Q8은 독립적으로 선택적으로 치환된 C1-6 알칸-트리일, 선택적으로 치환된 C1-6 알칸-테트라일, 선택적으로 치환된 C2-6 헤테로알칸-트리일, 또는 선택적으로 치환된 C2-6 헤테로알칸-테트라일이되;
상기 식에서,
각각의 r2는 독립적으로 0 내지 50(예를 들어, 0 내지 30)의 정수이되, 반복 단위는 동일하거나 상이하고;
r3은 0 또는 1이며;
r4는 0, 1, 2, 또는 3이고;
r3이 0일 때, LinkD는 3가 또는 4가 기이며,
r3이 1일 때, LinkD는 4가, 5가, 또는 6가 기이다.
특정 실시양태에서, r3은 0이다.
일부 실시양태에서, Q8은
Figure pct00248
이다.
화학식 (I)의 기 LinkD(-RM1)p의 제조에서 사용될 수 있는 화합물은 본원뿐만 아니라, WO 2015/188197호에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, 비-생체내가역성 링커기는
Figure pct00249
이되, 상기 식에서 기의 일 말단은 폴리뉴클레오티드에 연결되고 나머지 말단은 표적 모이어티(일 실시양태에서, 항체)에 연결된다.
보조 모이어티
보조 모이어티는 염료 또는 친수기 또는 이의 조합(예를 들어, 친수성 중합체(예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)), 양성 하전된 중합체(예를 들어, 폴리(에틸렌 이민)), 또는 당알코올(예를 들어, 글루시톨))을 함유한 1가 기이다. 보조 모이어티는 100 Da 내지 2.5 kDa(예를 들어, 350 Da 내지 2.5 kDa, 100 Da 내지 1,200 Da, 또는 1 kDa 내지 2.5 kDa)의 이론적 분자량을 가질 수 있다.
염료는 흡수의 가시화 또는 세포 내부의 본 발명의 접합체의 이동의 모니터링(예를 들어, Fluorescence Recovery After Photobleaching(광퇴색후 형광 회복시간)(FRAP)을 사용함)의 목적을 위해 포스포에스터기에 포함될 수 있다. 당업계에 알려진 염료는 5'- 또는 3'-말단에서 포스페이트 또는 포스포로티오에이트를 통해 또는 2 개의 연이은 뉴클레오시드를 함께 결합시키는 포스페이트 또는 포스포로티오에이트를 통해 폴리뉴클레오티드에 연결된 보조 모이어티로서 포함될 수 있다. 염료로서 사용될 수 있는 유용한 구조의 비-제한적인 예는 FITC, RD1, 알로피코시아닌(allophycocyanin)(APC), aCFTM 염료(Biotium, Hayward, CA), BODIPY(InvitrogenTM 10 of Life Technologies, Carlsbad, CA), AlexaFluor®(InvitrogenTM of Life Technologies, Carlsbad, CA), DyLight Fluor(Thermo Scientific Pierce Protein Biology Products, Rockford, IL), ATTO(ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany), FluoProbe(Interchim SA,
Figure pct00250
, France), 및 Abberior Probe(Abberior GmbH,
Figure pct00251
, Germany)를 포함한다.
본 발명의 면역조절 폴리뉴클레오티드 및 본 발명의 접합체에서 보조 모이어티로서 사용될 수 있는 친수성 중합체 및 양성 하전된 중합체는 당업계에 알려져 있다. 친수성 중합체의 비-제한적인 예는 폴리(에틸렌 글리콜)이다. 양성 하전된 중합체의 비-제한적인 예는 폴리(에틸렌 이민)이다.
당알코올-기반 보조 모이어티는 예를 들어, 아미노-말단 글루시톨 또는 글루시톨 클러스터일 수 있다. 아미노-말단 글루시톨 보조 모이어티는
Figure pct00252
이다.
글루시톨 클러스터의 비-제한적인 예는
Figure pct00253
및
Figure pct00254
이다.
일 실시양태에서, 본원은 하기 화학식 (B)의 화합물 또는 입체 이성질체, 2 이상의 부분입체 이성질체의 혼합물, 호변 이성질체, 또는 2 이상의 호변 이성질체의 혼합물; 또는 이의 약학적 허용 염, 용매화물, 또는 수화물을 제공한다:
[화학식 (B)]
Figure pct00255
상기 식에서,
Rx는 접합기이고;
LN은 링커이며;
각각의 Q는 독립적으로 포스포트리에스터를 포함하는 올리고뉴클레오티드이고;
e는 1, 2, 3, 또는 4의 정수이다.
특정 실시양태에서, 화학식 (B)에서, Rx는
Figure pct00256
이다.
특정 실시양태에서, 화학식 (B)에서, LN은 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 링커이다.
특정 실시양태에서, 화학식 (B)에서, LN은
Figure pct00257
이되, d는 약 0 내지 약 50 범위의 정수이다. 특정 실시양태에서, d는 약 0 내지 약 10 범위의 정수이다. 특정 실시양태에서, d는 약 0 내지 약 5 범위의 정수이다. 특정 실시양태에서, d는 약 0, 약 1, 또는 약 3의 정수이다.
특정 실시양태에서, 화학식 (B)에서, e는 1의 정수이다.
특정 실시양태에서, 화학식 (B)에서, 각각의 Q는 독립적으로 하기 화학식 (D)의 구조를 갖는다:
[화학식 (D)]
Figure pct00258
상기 식에서, XN, X3', X5', YP, b, 및 c는 각각 본원에 정의된 바와 같다.
표적화 모이어티
본 발명의 접합체에서 사용된 표적화 모이어티는 접합된 페이로드(payload) 폴리뉴클레오티드의 표적화된 전달을 위해 신체 내의 특정 세포 및 조직을 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 접합체에 의해 표적화된 세포는 전문 APC(예를 들어, B 세포, pDC, 또는 대식세포)이다. 표적화 모이어티는 항원-결합 모이어티(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편), 폴리펩티드, 압타머, 또는 1 이상의 소분자(예를 들어, 만노오스)를 포함하는 기일 수 있다. 본 발명의 접합체 내의 표적화 모이어티는 생체내에서 면역조절 폴리뉴클레오티드의 불균일한 조직 분포의 문제를 해결하는데 효과적일 수 있다.
항원-결합 모이어티
본 발명의 접합체 내의 항원-결합 모이어티는 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예를 들어, F(ab)2 또는 Fab) 또는 이의 조작된 유도체(예를 들어, Fcab 또는 융합 단백질(예를 들어, scFv))일 수 있다. 인간 또는 키메라(예를 들어, 인간화된) 항체는 본 발명의 접합체에서 항체로서 사용될 수 있다.
항원-결합 모이어티는 항원-결합 모이어티에 의해 인식되는 표면 항원을 갖는 세포를 표적화한다. 특히, APC는 본 발명의 접합체 내의 항원-결합 모이어티에 의해 표적화될 수 있다. B 세포는 항-CD38, 항-CD79b, 항-CD30, 항-CD22, 또는 항-CD20, 항-CD19 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 이의 조작된 유도체에 의해 표적화될 수 있다. 플라스마사이토이드 수지상 세포(pDC)는 항-DEC205, 항-CD304, 항-CD303, 항-CD40, 항-CD74, 항-BDCA2, 또는 항-CD123 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 이의 조작된 유도체에 의해 표적화될 수 있다. 대식세포는 항-CD163, 항-CD40, 항-CD74, 항-CD206, 또는 항-CD123 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 이의 조작된 유도체에 의해 표적화될 수 있다.
항-CD38 항체의 비-제한적인 예는 WO 2012/092616호에 개시된 다라투무맙, SAR650984, MOR202, 또는 항체 Ab79, Ab19, Ab43, Ab72, 및 Ab110 중 임의의 것이며, 이들 항체의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 항-CD79b 항체의 비-제한적인 예는 WO 2014/011521호에 개시된 huMA79b v28이다. 항-CD22 항체의 비-제한적인 예는 US 2014/0127197호에 개시된 10F4이다. 항-CD20 항체의 비-제한적인 예는 리툭시맙이다. 항-DEC205 항체의 비-제한적인 예는 US 2010/0098704호에서 제공되며, 이의 항체는 본원에 참고로 포함된다. 항-CD40 항체의 비-제한적인 예는 루카투무맙 및 다세투주맙이다. 항-CD304 항체의 비-제한적인 예는 베센쿠맙이다.
폴리펩티드
표적화 모이어티는 세포에 대해 친화도를 갖는(예를 들어, 세포 유형, 예를 들어 플라스마사이토이드 세포에 대해 친화도를 갖는) 폴리펩티드일 수 있다. 폴리펩티드의 비-제한적인 예는 RGD 펩티드, 라비스 바이러스 당단백질(rabies virus glycoprotein)(RVG), 및 DC3 펩티드이다.
소분자
표적화 모이어티는 표적화된 세포의 표면 상에 발현된 수용체를 복합체화시킬 수 있는 소분자일 수 있다. 본 발명의 접합체 내의 표적화 모이어티로서 사용될 수 있는 소분자의 비-제한적인 예는 엽산, 만노오스, PSMA 리간드, 및 만노오스 클러스터이다.
엽산은 표적화 모이어티로서 사용될 수 있다. 본 발명의 접합체에서, 엽산은 다음 구조의 것일 수 있다:
Figure pct00259
.
만노오스 또는 만노오스 클러스터는 본 발명의 접합체를 플라스마사이토이드 수지상 세포 및 대식세포에 표적화하기 위해 사용될 수 있으며, 이는 이들 세포가 이들 표면 상에 만노오스 수용체를 발현하기 때문이다.
만노오스 클러스터는 당업계에 알려져 있다. 만노오스 보조 모이어티(예를 들어, 만노오스 클러스터)는 하기 화학식 (XXV)의 것일 수 있다:
[화학식 (XXV)]
Figure pct00260
상기 식에서,
p3은 1, 2, 또는 3이고;
각각의 s3은 독립적으로 0 내지 50(예를 들어, 0 내지 30)의 정수이며;
각각의 QM1 및 각각의 QM3은 독립적으로 부재하거나, -CO-, -NH-, -O-, -S-, -SO2-, -OC(O)-, -COO-, -NHC(O)-, -C(O)NH-, -CH2-, -CH2NH-, -NHCH2-, -CH2O-, 또는 -OCH2-이고;
각각의 QM2는 독립적으로 부재하거나, 선택적으로 치환된 C1-12 알킬렌, 선택적으로 치환된 C2-12 알케닐렌, 선택적으로 치환된 C2-12 알키닐렌, 선택적으로 치환된 C2-12 헤테로알킬렌, 또는 선택적으로 치환된 C1-9 헤테로사이클릴렌이며;
QM4는 부재하거나(p3이 1인 경우), 선택적으로 치환된 C1-6 알칸-트리일(p3이 2인 경우), 선택적으로 치환된 C1-6 알칸-테트라일(p3이 3인 경우), 선택적으로 치환된 C2-6 헤테로알칸-트리일(p3이 2인 경우), 또는 선택적으로 치환된 C2-6 헤테로알칸-테트라일(p3이 3인 경우)이고;
각각의 QM5는 독립적으로 만노오스 또는 -QM6[(-QM1-QM2-QM3)s2-RM2]p1이되, 각각의 RM2는 독립적으로 만노오스이며;
각각의 QM6은, 존재하는 경우, 독립적으로 선택적으로 치환된 C1-6 알칸-트리일, 선택적으로 치환된 C1-6 알칸-테트라일, 선택적으로 치환된 C2-6 헤테로알칸-트리일, 또는 선택적으로 치환된 C2-6 헤테로알칸-테트라일이다.
만노오스 클러스터의 비-제한적인 예는
Figure pct00261
,
Figure pct00262
,
Figure pct00263
이되,
상기 식에서, 각각의 a는 독립적으로 0 내지 10의 정수이다.
접합체(conjugate)
일 실시양태에서, 본원은 하기 화학식 (C)의 접합체 또는 이의 입체 이성질체, 2 이상의 부분입체 이성질체의 혼합물, 호변 이성질체, 또는 2 이상의 호변 이성질체의 혼합물; 또는 이의 약학적 허용 염, 용매화물, 또는 수화물을 제공한다:
[화학식 (C)]
Figure pct00264
상기 식에서, Ab는 표적화 모이어티이고; f는 1, 2, 3, 또는 4의 정수이며; LN, Q, 및 e는 각각 본원에 정의된 바와 같다.
특정 실시양태에서, 화학식 (C)에서, Ab는 항체이다. 특정 실시양태에서, 화학식 (C)에서, Ab는 단클론 항체이다.
특정 실시양태에서, 화학식 (C)에서, f는 1 또는 2의 정수이다. 특정 실시양태에서, 화학식 (C)에서, f는 1의 정수이다.
특정 실시양태에서, 화학식 (C)에서, e 및 f 둘 다는 각각 1의 정수이다. 용어 "DAR"은 CpG 항체 접합체의 약물-항체 비, 더욱 구체적으로 폴리뉴클레오티드-항체 비를 지칭한다. 일 실시양태에서, CpG 항체 접합체는 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 8, 약 1 내지 약 4, 또는 약 1 내지 약 2 개 범위의 DAR을 갖는다. 다른 실시양태에서, CpG 항체 접합체는 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 또는 약 8 개의 DAR을 갖는다.
접합체의 제조
접합체
표적화 모이어티를 1 이상의 면역조절 폴리뉴클레오티드에 접합하기 위해 유용한 반응이 본원에 기재되어 있으며 당업계에 알려져 있다(예를 들어, 생물직교 반응(bioorthogonal reaction)). 이 결합을 형성하기 위해 사용될 수 있는 예시적 반응은 트리아졸 모이어티를 형성하기 위한 아지도와 알킨-기반 접합기(예를 들어, 엔도사이클릭 탄소-탄소 삼중 결합을 함유하는 선택적으로 치환된 C6-16 헤테로사이클릴렌 또는 선택적으로 치환된 C8-16 사이클로알키닐) 사이의 휴이젠 부가환화(금속-촉매화된 또는 무-금속); 친디엔체와 디엔/헤테로-디엔 사이의 디엘-알더 반응; 다른 페리사이클릭 반응, 예컨대 엔 반응을 통한 결합 형성; 아마이드 또는 티오아마이드 결합 형성; (예를 들어, 아지도 화합물과의) 설폰아마이드 결합 형성; 알코올 또는 페놀 알킬화(예를 들어, 윌리엄슨(Williamson) 알킬화), 옥심, 히드라존, 또는 세미카바자이드기를 형성하기 위한 축합 반응; 친핵체(예를 들어, 아민 및 티올)에 의한 접합체 첨가 반응; 이황화물 결합 형성; 및 카보닐(예를 들어, 활성화된 카복실산 에스터, 예컨대 펜타플루오로페닐(PFP) 에스터 또는 테트라플루오로페닐(TFP) 에스터) 또는 친전자적 아렌(예를 들어, 올리고플루오르화된 아렌, 플루오로벤조니트릴기, 또는 플루오로니트로벤젠기에서의 SNAr)에서의 친핵성 치환(예를 들어, 아민, 티올, 또는 하이드록실 친핵체에 의함)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 접합 반응은 쌍극 부가환화이고, 접합 모이어티는 아지도, 엔도사이클릭 탄소-탄소 삼중 결합을 함유하는 선택적으로 치환된 C6-16 헤테로사이클릴렌, 또는 선택적으로 치환된 C8-16 사이클로알키닐을 포함한다. 상보적 반응기 및 접합기는 이들의 상호간의 상보성에 대해 선택된다. 예를 들어, 아지드는 접합기 및 상보적 반응기 중 하나에서 사용될 수 있는 한편, 알킨은 나머지 접합기 및 상보적 반응기에서 사용될 수 있다.
친핵체/친전자체 반응
친핵체 및 친전자체는, 비제한적으로, C-H 결합 내로의 친전자체에 의한 삽입, O-H 결합 내로의 친전자체에 의한 삽입, N-H 결합 내로의 친전자체에 의한 삽입, 알켄에 걸친 친전자체의 첨가, 알킨에 걸친 친전자체의 첨가, 친전자적 카보닐 중심으로 첨가, 친전자적 카보닐 중심에서의 치환, 케텐으로의 첨가, 이소시아네이트로의 친핵성 첨가, 이소티오시아네이트로의 친핵성 첨가, 친전자적 실릴기에서의 친핵성 치환, 알킬 할라이드 또는 슈도할라이드에서 이탈기(예를 들어, 할라이드 또는 슈도할라이드)의 친핵성 변위; 활성화된 카복실산 에스터(예를 들어, PFP 에스터 또는 TFP 에스터), 티오에스터, 안하이드라이드, 또는 아실 할라이드의 카보닐에서의 친핵성 첨가/제거; α, β-불포화 카보닐기로의 친핵체의 1,4-접합체 첨가, 에폭시드의 친핵성 고리 개방, 전자 부족 방향족 화합물의 친핵성 방향족 치환, 활성화된 인 중심으로의 친핵성 첨가, 활성화된 인 중심에서의 친핵성 치환, 활성화된 황 중심으로의 친핵성 첨가, 및 활성화된 황 중심에서의 친핵성 치환으로부터 선택된 결합 형성 반응에서 결합될 수 있다.
친핵성 접합기는 선택적으로 치환된 알켄, 선택적으로 치환된 알킨, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴, 하이드록실, 아미노, 알킬아미노, 아닐리도, 또는 티오일 수 있다.
친전자적 접합기는 아지드, 활성화된 카보닐(예를 들어, 활성화된 카복실산 에스터(예를 들어, 석신이미딜 에스터 또는 설포석신이미딜 에스터), 티오에스터, 안하이드라이드, 또는 아실 할라이드), 이소시아네이트, 티오이소시아네이트, 마이클(Michael) 수용체(예를 들어, 말레이미드), 알킬 할라이드 또는 슈도할라이드, 에폭시드, 에피설파이드, 아지리딘, 또는 전자-부족 아릴이다.
예를 들어, 접합은 축합 반응을 통해 발생하여, 히드라존 결합인 결합을 형성할 수 있다.
접합은 예를 들어, 카복실-기반 접합기(예를 들어, 카복실산, 에스터, 또는 -CONH2)의 활성화 및 접합기에서 1 차 아민과의 후속 반응에 의한 아마이드 결합의 형성을 포함한다. 활성화제는 다음과 같은 다양한 카보디이미드일 수 있다: EDC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드), EDAC(1-에틸-3(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드), DCC(디사이클로헥실 카보디이미드), CMC(1-사이클로헥실-3-(2-모르폴리노에틸) 카보디이미드), DIC(디이소프로필 카보디이미드) 또는 우드워드 시약 K(Woodward's reagent K)(N-에틸-3-페닐이소옥사졸리움-3'-설포네이트). -CONH2인 카복실-기반 접합기의 활성화는 트랜스글루타미나아제를 사용하여 달성될 수 있다. 활성화된 NHS-에스터-기반 접합기와 1 차 아민-기반 접합기의 반응은 또한 아마이드 결합의 형성을 야기한다.
폴리뉴클레오티드는 카보닐-기반 접합기를 함유할 수 있다. 2 차 아민의 동시 형성을 갖는 접합은 환원적 아민화를 통해(즉, 아민-기반 접합기를 알데하이드-기반 접합기와 반응시킨 후, 하이드라이드 공여체(예를 들어, 소듐 시아노보로하이드라이드 또는 소듐 트리아세트옥시보로하이드라이드)를 이용한 환원에 의해) 달성될 수 있다.
에터 형성은 또한 표적화 모이어티를 1 이상의 폴리뉴클레오티드에 접합하여, 본 발명의 접합체를 형성하기 위해 사용될 수 있다. 에터 결합 형성은 에폭시드-기반 접합기와 하이드록시-기반 접합기 사이의 반응을 포함할 수 있다.
티올은 또한 접합기로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 이황화물 결합의 형성을 통한 접합은 피리딜디설파이드 매개된 티올-디설파이드 교환에 의해 달성될 수 있다. 술프하드릴(sulfhydryl)-기반 접합기의 도입은 예를 들어, 트라우트 시약(Traut's Reagent)(2-이미노티올란) SATA(N-석신이미딜 S-아세틸티오아세테이트, SATP(석신이미딜 아세틸티오프로피오네이트), SPDP(N-석신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트, SMPT(석신이미딜옥시카보닐-α-메틸-α-(2-피리딜디티오)톨루엔), N-아세틸호모시스테인티오락톤, SAMSA(S-아세틸메르캅토석신 안하이드라이드), AMBH(2-아세트아미도-4-메르캅토부티르산 히드라지드), 및 시스타민(2,2'-디티오비스(에틸아민)에 의해 매개된다.
티오에터 결합 형성은 술프히드릴 기반 접합기를 말레이미드- 또는 요오도아세틸-기반 접합기와 반응시킴으로써 또는 에폭시-기반 접합기와 반응시킴으로써 수행될 수 있다.
말레이미드-기반 접합기는 SMCC(석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트), 설포-SMCC(설포석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복실레이트), MBS(m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스터), 설포-MBS(m-말레이미도벤조일-N-설포하이드록시 석신이미드 에스터), SMPB(석신이미딜-4-(p-말레이미도페닐)부티레이트), 설포-SMPB(설포석신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)부티레이트), GMBS(N-α-말레이미도부투릴-옥시석신이미드 에스터), 설포 GMBS(N-α-말레이미도부투릴-옥시설포석신이미드 에스터)에 의해 도입될 수 있다.
카바메이트 결합의 형성을 통한 접합은 하이드록시-기반 접합기와 CDI(N,N'-카보닐디이미다졸) 또는 DSC(N,N'-디석신이미딜 카보네이트) 또는 N-하이드록시석신이미딜클로로포르메이트의 반응 및 아민-기반 접합기와의 후속 반응에 의해 수행될 수 있다.
부가환화 반응
부가환화 반응은 소망하는 공유 결합을 형성하기 위해 사용될 수 있다. 대표적인 부가환화 반응은, 비제한적으로, 트리아졸 모이어티를 제공하기 위한 알켄-기반 접합기와 1,3-디엔-기반 접합기의 반응(디엘-알더 반응), 알켄-기반 접합기와 α,β-불포화 카보닐-기반 접합기의 반응(헤테로 디엘-알더 반응), 및 알킨-기반 접합기와 아지도-기반 접합기의 반응(휴이젠 부가환화, 이의 금속-촉매화된 및 무-금속 변이체를 포함함)을 포함한다. 부가환화 반응을 위한 시약을 포함하는 접합기의 선택된 비-제한적인 예는 알켄, 알킨, 1,3-디엔, α,β-불포화 카보닐, 및 아지드이다. 예를 들어, 아지드와 알킨 사이의 휴이젠 부가환화(클릭(click) 반응)는 다양한 생물학적 개체의 기능화를 위해 사용되어 왔다.
변형된 알킨-기반 접합기는 하나의 엔도사이클릭 탄소-탄소 삼중 결합(예를 들어, 엔도사이클릭 탄소-탄소 삼중 결합을 함유하는 선택적으로 치환된 C6-16 헤테로사이클릴렌 또는 선택적으로 치환된 C8-16 사이클로알키닐)을 포함하는 카보사이클릭 또는 헤테로사이클릭 고리 시스템이다. 변형된 알킨-기반 접합기는 표적화 모이어티를 아지도 접합기를 이용한 무-금속 쌍극 부가환화를 통해 폴리뉴클레오티드에 접합하기 위해 유용할 수 있다.
커플링 반응
접합기는, 비제한적으로, 수소규소화반응, 올레핀 교차-복분해, 접합체 첨가, 스틸(Stille) 커플링, 스즈키(Suzuki) 커플링, 소노가시라(Sonogashira) 커플링, 히야마(Hiyama) 커플링, 및 헥(Heck) 반응을 위한 반응물을 포함한다. 이들 반응을 위한 접합 모이어티는 하이드리도실란, 알켄(예를 들어, 활성화된 알켄, 예컨대 에논 또는 에노에이트), 알킨, 아릴 할라이드, 아릴 슈도할라이드(예를 들어, 트리플레이트 또는 노나플레이트), 알킬 할라이드, 및 알킬 슈도할라이드(예를 들어, 트리플레이트, 노나플레이트, 및 포스페이트)를 포함한다. 교차-커플링 반응을 위한 촉매는 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 촉매는 유기금속 복합체 또는 금속 염(예를 들어, Pd(0), Pd(II), Pt(0), Pt(II), Pt(IV), Cu(I), 또는 Ru(II))일 수 있다. 첨가제, 예컨대 리간드(예를 들어, PPh3, PCy3, BINAP, dppe, dppf, SIMes, 또는 SIPr) 및 금속 염(예를 들어, LiCl)이 첨가되어, 교차-커플링 반응을 용이하게 할 수 있다.
면역조절 폴리뉴클레오티드의 제조
면역조절 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 뉴클레오시드 포스포르아미다이트로부터 폴리뉴클레오티드의 화학 합성의 업계에 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 뉴클레오시드 포스포르아미다이트 및 면역조절 폴리뉴클레오티드의 합성의 비-제한적인 예는 실시예에서 제공된다. 포스포르아미다이트는 포스포르아미다이트의 P 원자에 공유결합으로 연결된 접합기를 포함할 수 있다.
표적화 모이어티 부위의 제조
표적화 모이어티는 면역조절 폴리뉴클레오티드 내의 접합기와 표적화 모이어티에 결합된 상보적 반응기 사이의 결합을 형성함으로써 1 이상의 폴리뉴클레오티드에 접합될 수 있다. 표적화 모이어티는 본질적으로 상보적 반응기(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 조작된 유도체 내의 Q-태그(예를 들어, LLQGG, GGGLLQGG, 또는 당업계에 알려진 다른 Q-태그 서열))를 포함할 수 있거나, 이는 상보적 반응기를 포함하도록 변형(예를 들어, 상보적 반응기를 Q-태그에 부착하는 것에 의함)될 수 있다. 이러한 상보적 반응기를 표적화 모이어티 내로 도입하는 방법은 당업계에 알려져 있다.
상보적 반응기는 선택적으로 치환된 C2-12 알키닐, 선택적으로 치환된 N-보호된 아미노, 아지도, N-말레이미도, S-보호된 티올,
Figure pct00265
,
Figure pct00266
,
Figure pct00267
또는 이의 N-보호된 버전,
Figure pct00268
,
Figure pct00269
,
Figure pct00270
, 엔도사이클릭 탄소-탄소 삼중 결합을 함유하는 선택적으로 치환된 C6-16 헤테로사이클릴(예를 들어,
Figure pct00271
), 1,2,4,5-테트라진기(예를 들어,
Figure pct00272
또는
Figure pct00273
), 선택적으로 치환된 C8-16 사이클로알키닐(예를 들어,
Figure pct00274
), -NHRN1, 선택적으로 치환된 C4-8 변형된 사이클로알케닐(예를 들어, trans-사이클로옥테닐 또는 노르보네닐), 또는 -COOR12 또는 -CHO를 함유하는 선택적으로 치환된 C1-16 알킬을 포함할 수 있되;
상기 식에서,
RN1은 H, N-보호기, 또는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬이고;
각각의 R12는 독립적으로 H, 선택적으로 치환된 C1-6 알킬, 또는 O-보호기(예를 들어, 카복실 보호기)이며;
R13은 할로겐(예를 들어, F)이다.
상보적 반응기는 접합 반응까지 보호될 수 있다. 예를 들어, 보호되는 상보적 반응기는 -COORPGO 또는 -NHRPGN을 포함할 수 있되, RPGO는 O-보호기(예를 들어, 카복실 보호기)이고, RPGN은 N-보호기이다.
일부 실시양태에서, 상보적 반응기는 -Z3-QA3 기이되,
상기 식에서,
Z3은 2가, 3가, 4가, 또는 5가 기이되, 원자가 중 하나는 QA3으로 치환되고, 원자가 중 하나는 개방되며, 나머지 원자가 각각은 존재하는 경우, 독립적으로 보조 모이어티로 치환되고;
QA3은 선택적으로 치환된 C2-12 알키닐, 선택적으로 치환된 N-보호된 아미노, 아지도, N-말레이미도, S-보호된 티올,
Figure pct00275
,
Figure pct00276
,
Figure pct00277
또는 이의 N-보호된 버전,
Figure pct00278
,
Figure pct00279
,
Figure pct00280
, 엔도사이클릭 탄소-탄소 삼중 결합을 함유하는 선택적으로 치환된 C6-16 헤테로사이클릴(예를 들어,
Figure pct00281
), 1,2,4,5-테트라진기(예를 들어,
Figure pct00282
또는
Figure pct00283
), 선택적으로 치환된 C8-16 사이클로알키닐(예를 들어,
Figure pct00284
), -NHRN1, 선택적으로 치환된 C4-8 변형된 사이클로알케닐(예를 들어, trans-사이클로옥테닐 또는 노르보네닐), 또는 -COOR12 또는 -CHO를 함유하는 선택적으로 치환된 C1-16 알킬이되;
상기 식에서,
RN1은 H, N-보호기, 또는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬이고;
각각의 R12는 독립적으로 H, 선택적으로 치환된 C1-6 알킬, 또는 O-보호기(예를 들어, 카복실 보호기)이며;
R13은 할로겐(예를 들어, F)이다.
특정 실시양태에서, Z3은 분지기 및 2 개의 2가 세그먼트로 구성되되, 분지기는 2 개의 2가 세그먼트 각각에 결합되고,
2가 세그먼트 중 하나는 개방 원자가이며, 나머지 2가 세그먼트는 QA3에 결합되고;
분지기는 선택적으로 치환된 C1-12 알칸-트리일, 선택적으로 치환된 C1-12 알칸-테트라일, 선택적으로 치환된 C2-12 헤테로알칸-트리일, 및 선택적으로 치환된 C2-12 헤테로알칸-테트라일로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된 1 또는 2 개의 모노머로 구성되되, 분지기의 2 개의 원자가는 2 개의 2가 세그먼트에 결합되고, 나머지 원자가 각각은 독립적으로 보조 모이어티로 치환된다.
Z3에서 2가 세그먼트는 -(-QB-QC-QD-)s1-일 수 있되,
상기 식에서,
각각의 s1은 독립적으로 1 내지 50(예를 들어, 1 내지 30)의 정수이고;
각각의 QB 및 각각의 QD는 독립적으로 부재하거나, -CO-, -NH-, -O-, -S-, -SO2-, -OC(O)-, -COO-, -NHC(O)-, -C(O)NH-, -CH2-, -CH2NH-, -NHCH2-, -CH2O-, 또는 -OCH2-이며;
각각의 QC는 독립적으로 부재하거나, 선택적으로 치환된 C1-12 알킬렌, 선택적으로 치환된 C2-12 알케닐렌, 선택적으로 치환된 C2-12 알키닐렌, 선택적으로 치환된 C2-12 헤테로알킬렌, 또는 선택적으로 치환된 C1-9 헤테로사이클릴렌이다.
추가 실시양태에서, QB 및 QD 중 적어도 하나는 Z3의 각각의 모노머 단위 내에 존재한다.
또 추가의 실시양태에서, -Z3-QA3은
Figure pct00285
이되,
상기 식에서,
각각의 s1은 독립적으로 1 내지 50(예를 들어, 1 내지 30)의 정수이고;
QA3은 본원에 기재된 바와 같으며;
각각의 QB 및 각각의 QD는 독립적으로 부재하거나, -CO-, -NH-, -O-, -S-, -SO2-, -OC(O)-, -COO-, -NHC(O)-, -C(O)NH-, -CH2-, -CH2NH-, -NHCH2-, -CH2O-, 또는 -OCH2-이고;
각각의 QC는 독립적으로 부재하거나, 선택적으로 치환된 C1-12 알킬렌, 선택적으로 치환된 C2-12 알케닐렌, 선택적으로 치환된 C2-12 알키닐렌, 선택적으로 치환된 C2-12 헤테로알킬렌, 또는 선택적으로 치환된 C1-9 헤테로사이클릴렌이며;
QE는 부재하거나 본원에 기재된 바와 같은 화학식 (IV)의 분지기이다.
특정 실시양태에서, 각각의 QB 및 각각의 QD는 독립적으로 부재하거나, -CO-, -NH-, -O-, -S-, -SO2-, -NHC(O)-, -C(O)NH-, -CH2-, -CH2NH-, -NHCH2-, -CH2O-, 또는 -OCH2-이다.
일부 실시양태에서, -(-QB-QC-QD-)s1-은 조합되어 다음 기를 형성한다:
Figure pct00286
상기 식에서,
(i) g2는 1 내지 50(예를 들어, 1 내지 40 또는 1 내지 30)의 정수이고;
(ii) g1은 1이고 QB는 -NHCO-, -CONH-, 또는 -O-이거나; g1은 0이고 QD는 -NHCO-이며;
(iii) g3은 1이고 QB는 -NHCO-, -CONH-, 또는 -O-이거나; g3은 0이고 QD는 -CONH-이다.
추가 실시양태에서, 상보적 반응기는
Figure pct00287
또는
Figure pct00288
이되,
상기 식에서,
QA2는 부재하거나, 독립적으로 선택적으로 치환된 C2-12 헤테로알킬렌(예를 들어, -C(O)-N(H)-, -N(H)-C(O)-, -S(O)2-N(H)-, 또는 -N(H)-S(O)2-를 함유하는 헤테로알킬렌), 선택적으로 치환된 C1-12 티오헤테로사이클릴렌(예를 들어,
Figure pct00289
,
Figure pct00290
,
Figure pct00291
,
Figure pct00292
, 또는
Figure pct00293
), 선택적으로 치환된 C1-12 헤테로사이클릴렌(예를 들어, 1,2,3-트리아졸-1,4-디일 또는
Figure pct00294
), 사이클로부트-3-엔-1,2-디온-3,4-디일, 피리드-2-일 히드라존, 선택적으로 치환된 C6-16 트리아졸로헤테로사이클릴렌(예를 들어,
Figure pct00295
또는
Figure pct00296
), 선택적으로 치환된 C8-16 트리아졸로사이클로알케닐렌(예를 들어,
Figure pct00297
), 또는 디하이드로피리다진기(예를 들어, trans-
Figure pct00298
, trans-
Figure pct00299
,
Figure pct00300
, 또는
Figure pct00301
)이고;
QA3은 선택적으로 치환된 C2-12 알키닐, 선택적으로 치환된 N-보호된 아미노, 아지도, N-말레이미도, S-보호된 티올,
Figure pct00302
,
Figure pct00303
,
Figure pct00304
또는 이의 N-보호된 버전,
Figure pct00305
,
Figure pct00306
,
Figure pct00307
, 엔도사이클릭 탄소-탄소 삼중 결합을 함유하는 선택적으로 치환된 C6-16 헤테로사이클릴(예를 들어,
Figure pct00308
), 1,2,4,5-테트라진기(예를 들어,
Figure pct00309
또는
Figure pct00310
), 또는 선택적으로 치환된 C8-16 사이클로알키닐(예를 들어,
Figure pct00311
), -NHRN1, 선택적으로 치환된 C4-8 변형된 사이클로알케닐(예를 들어, trans-사이클로옥테닐 또는 노르보네닐), 또는 -COOR12 또는 -CHO를 함유하는 선택적으로 치환된 C1-16 알킬이며;
RN1은 H, N-보호기, 또는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬이고;
각각의 R12는 독립적으로 H 또는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬이며;
R13은 할로겐(예를 들어, F)이고;
RT는 표적화 모이어티에 대한 결합이며;
QT는 -CO-, -NH-, -NH-CH2-, 또는 -CO-CH2-이고;
X1, X3, 및 X5 각각은 독립적으로 부재하거나, -O-, -NH-, -CH2-NH-, -C(O)-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-, -NH-C(O)-NH-, -O-C(O)-NH-, -NH-C(O)-O-, -CH2-NH-C(O)-NH-, -CH2-O-C(O)-NH-, 또는 -CH2-NH-C(O)-O-이며;
X2 및 X4 각각은 독립적으로 부재하거나, -O-, -NH-, -C(O)-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-, -NH-C(O)-NH-, -O-C(O)-NH-, 또는 -NH-C(O)-O-이고;
x2는 0 내지 50(예를 들어, 1 내지 40 또는 1 내지 30)의 정수이며;
x3은 1 내지 11의 정수이고;
각각의 x5는 독립적으로 0 또는 1이며;
각각의 x6은 독립적으로 0 내지 10(예를 들어, 1 내지 6)의 정수이고, 단 양측 x6의 합은 12 이하이다.
또 추가의 실시양태에서, 상보적 반응기는
Figure pct00312
,
Figure pct00313
,
Figure pct00314
,
Figure pct00315
,
Figure pct00316
,
Figure pct00317
,
또는
Figure pct00318
이되,
상기 식에서,
QA3은 선택적으로 치환된 C2-12 알키닐, 선택적으로 치환된 N-보호된 아미노, 아지도, N-말레이미도, S-보호된 티올,
Figure pct00319
,
Figure pct00320
,
Figure pct00321
또는 이의 N-보호된 버전,
Figure pct00322
,
Figure pct00323
,
Figure pct00324
, 엔도사이클릭 탄소-탄소 삼중 결합을 함유하는 선택적으로 치환된 C6-16 헤테로사이클릴(예를 들어,
Figure pct00325
), 1,2,4,5-테트라진기(예를 들어,
Figure pct00326
또는
Figure pct00327
), 또는 선택적으로 치환된 C8-16 사이클로알키닐(예를 들어,
Figure pct00328
), -NHRN1, 선택적으로 치환된 C4-8 변형된 사이클로알케닐 (예를 들어, trans-사이클로옥테닐 또는 노르보네닐), 또는 -COOR12 또는 -CHO를 함유하는 선택적으로 치환된 C1-16 알킬이고;
각각의 RM1은 독립적으로 H 또는 보조 모이어티이며;
RN1은 H, N-보호기, 또는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬이고;
각각의 R12는 독립적으로 H 또는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬이며;
R13은 할로겐(예를 들어, F)이고;
QT는 -CO-, -NH-, -NH-CH2-, 또는 -CO-CH2-이며;
RT는 표적화 모이어티에 대한 결합이고;
q5 및 q6 각각은 독립적으로 1 내지 10(예를 들어, 1 내지 6)의 정수이며;
q7은 0 또는 1이고;
q8은 0 내지 50(예를 들어, 1 내지 40 또는 1 내지 30)의 정수이며;
q9는 1 내지 10의 정수이다.
또 추가의 실시양태에서, 상보적 반응기는
Figure pct00329
,
Figure pct00330
,
Figure pct00331
,
Figure pct00332
,
Figure pct00333
,
Figure pct00334
,
또는
Figure pct00335
이되,
상기 식에서,
각각의 RM1은 독립적으로 H 또는 보조 모이어티이고;
QT는 -CO-, -NH-, -NH-CH2-, 또는 -CO-CH2-이며;
RT는 표적화 모이어티에 대한 결합이고;
q5 및 q6 각각은 독립적으로 1 내지 10(예를 들어, 1 내지 6)의 정수이며;
q7은 0 또는 1이고;
q8은 0 내지 50(예를 들어, 1 내지 40 또는 1 내지 30)의 정수이며;
q9는 1 내지 10의 정수이다.
고체 지지체
본원에 개시된 면역조절 폴리뉴클레오티드는 고체 지지체에 결합될 수 있다. 폴리뉴클레오티드와 함께 사용될 수 있는 절단 가능한 고체 지지체는 당업계에 알려져 있다. 고체 지지체의 비-제한적인 예는 예를 들어, 당업계에 알려진 절단 가능한 링커(예를 들어, 숙시네이트-기반 링커)를 통해 가닥에 결합된 조절 공극 유리 또는 세공 폴리스티렌(예를 들어, UNYLINKERTM)을 포함한다.
방법
본 발명의 접합체는 APC 유형에 대한 표면 수용체를 인식하는 표적화 모이어티를 사용하는 것에 의한 전문 APC(예를 들어, B 세포, pDC, 또는 대식세포)에 대한 면역조절 폴리뉴클레오티드의 선택적 전달을 위해 사용될 수 있다. 이론에 구애됨 없이, 본 발명의 접합체는 전문 APC(예를 들어, B 세포, pDC, 또는 대식세포)의 엔도솜 내로 수송될 수 있으며(예를 들어, 능동 수송을 통함), 이는 1 이상의 엔도솜 톨-유사 수용체(예를 들어, TLR9)를 발현하는 것으로 여겨진다. 따라서, 엔도솜으로 전달된 면역자극 폴리뉴클레오티드는 엔도솜 톨-유사 수용체(예를 들어, TLR9)를 작용시킬 수 있다. 유사하게는, 엔도솜으로 전달된 면역억제 폴리뉴클레오티드는 엔도솜 톨-유사 수용체(예를 들어, TLR9)를 길항시킬 수 있다.
사이토카인 유도
엔도솜 톨-유사 수용체는 본 발명의 면역자극 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 본 발명의 접합체에서 제공됨)를 사용하여 작용되어, APC에서 사이토카인을 유도할 수 있다. 예를 들어, B 세포에서 TLR9를 작용시키는 것은 염증성 사이토카인(예를 들어, IL-6 및 IL-10)의 NFκB-매개된 분비의 활성화를 야기할 수 있는 반면에, pDC 또는 대식세포에서 TLR9를 작용시키는 것은 I 형 인터페론(예를 들어, IFNα 또는 IFNβ)을 유도할 수 있다. APC에서 사이토카인의 유도는 당업계에 알려진 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, APC에서 유도된 사이토카인의 수준은 세포를 본 발명의 면역자극 폴리뉴클레오티드 또는 접합체와 접촉시킨 후에(예를 들어, 기준 세포, 예컨대 본 발명의 면역자극 폴리뉴클레오티드 또는 접합체가 기준 세포로 전달되지 않았다는 점에서 시험된 세포와 상이한 기준 세포와 비교하였을 때) 더 높을 수 있다(예를 들어, 적어도 1%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50% 높음).
액상(혈액학적) 및 고형 종양의 치료
본 발명의 면역자극 폴리뉴클레오티드 및/또는 접합체는 액상(예를 들어, 혈액학적) 또는 고형 종양을 치료하는 방법에서 사용될 수 있다. 이론에 구애됨 없이, 본원에 기재된 바와 같이 TLR9를 작용시키는 것 및 사이토카인을 유도하는 것은 액상 또는 고형 종양에 대한 선천적 또는 적응성 면역 반응을 자극할 수 있는 것으로 여겨진다. 통상적으로, TLR9를 작용시키는 것은 건강한 B 세포에 대한 전-증식 효과를 갖는다. 반면에, TLR9 작용제 면역자극 폴리뉴클레오티드는 B 림프종 세포에 대해 항-증식 효과를 나타낸다. TLR9 작용제 면역자극 폴리뉴클레오티드의 항-증식 효과는 B 림프종 세포에 대한 전달을 필요로 하지 않는다. 대신에, B 림프종 세포에 대한 항-증식 효과는 면역자극 폴리뉴클레오티드를 다른 APC(예를 들어, 건강한 APC)로 전달함으로써 유도될 수 있다. 이론에 구애됨 없이, 본 발명의 면역자극 폴리뉴클레오티드는 APC(예를 들어, 건강한 APC)에서 1 이상의 사이토카인을 유도할 수 있고, 1 이상의 유도된 사이토카인은 B 림프종 세포로 수송되어, 항-증식 효과를 유도할 수 있는 것으로 여겨진다. 따라서, B 세포를 표적화하는 본 발명의 접합체 및 본 발명의 면역자극 폴리뉴클레오티드는 액상 종양, 예를 들어 비-호지킨 B-세포 림프종의 치료에서 유용할 수 있다. 본 발명의 면역자극 폴리뉴클레오티드 및 이의 접합체를 사용하여 치료될 수 있는 림프종의 비-제한적인 예는 외투 세포 림프종, 광범위 큰 B 세포 림프종, 소포성 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 및 다발성 골수종이다. pDC 및 대식세포에서 TLR9를 작용시키는 것은 I 형 인터페론(예를 들어, IFNα 또는 IFNβ)을 유도하고 NK 세포를 활성화시킬 수 있으며, 이는 종양 세포(예를 들어, 고형 종양 세포)를 사멸시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 면역자극 폴리뉴클레오티드 또는 접합체에 의해 자극된 선천적 면역 반응은 종양 세포의 분해를 야기할 수 있다. 종양 세포 분해 생산물, 즉 종양-연관 항원은 그 다음에 pDC에 의해 모집되어, 나머지 종양 세포에 대한 CD8+ T 세포를 프라이밍시키는 것에 의해, 고형 종양에 대한 적응성 면역 반응을 자극할 수 있다.
본 발명의 접합체는 생체내에서 면역자극 폴리뉴클레오티드의 불균일한 조직 분포의 문제를 해결할 수 있다. 따라서, 본 발명의 접합체는 환자에게 전신으로 또는 작용의 표적화된 부위로부터 먼 부위에 투여될 수 있다.
톨-유사 수용체(TLR) 시그널링은 선천적 면역력과 적응성 면역력 사이의 가교로서 작동한다. 톨-유사 수용체 작용제는 질환에 걸린 세포(예컨대, 암 세포 또는 병원균 감염된 세포)에 대해 면역 반응을 유도할 수 있으므로, 이러한 질환을 예방 또는 치료하기 위한 치료제로서 제공될 수 있다. 따라서, 특정 양태에서, 본원은 톨-유사 수용체(TLR) 작용제를 사용하여 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 TLR을 활성시킬 수 있는 치료제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하되, TLR 작용제의 투여시, 치료될 질환에 대한 면역 반응이 대상체에서 유도된다. 특정 실시양태에서, 질환은 신생물 질환, 예컨대 암, 및 감염성 질환, 예컨대 바이러스 감염으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본원은 대상체에게 TLR 작용제의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 암을 갖는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 본원에 기재된 바와 같이, 다양한 실시양태에서, 본 방법으로 성공적으로 치료될 수 있는 암의 유형은 원발성 암, 2 차 암, 재발암 및 불응성 암을 포함한다. 또한, 본원에 기재된 바와 같이, 다양한 실시양태에서, 본 방법으로 성공적으로 치료될 수 있는 암의 유형은 고형 종양 및 액상 종양을 포함한다. 암의 성공적 치료는 암 생존, 암 퇴행(예를 들어, 종양 크기의 축소), 치료로부터 야기된 무-암 표현형(즉, 환자에서 검출 가능한 암 세포 없음)을 포함한 부분적 또는 완전 암 관해에 의해 나타난 바와 같이, 임상 기준을 기본으로 하여 담당 의사에 의해 결정될 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 암을 예방 또는 치료하기 위한 방법은 TLR1 작용제, TLR2 작용제, TLR3 작용제, TLR4 작용제, TLR5 작용제, TLR6 작용제, TLR7 작용제, TLR8 작용제, TLR9 작용제, 및 TLR10 작용제로부터 선택된 1 이상의 TLR 작용제(들)의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 본 발명에서 사용되는 TLR 작용제의 비-제한적인 예는, 비제한적으로, Pam3Cys, TLR1/2 작용제; CFA, TLR2 작용제; MALP2, TLR2 작용제; Pam2Cys, TLR2 작용제; FSL-I, TLR-2 작용제; Hib-OMPC, TLR-2 작용제; 폴리리보신:폴리리보사이티드산((polyribosinic:polyribocytidic acid)(Poly l:C)), TLR3 작용제; 폴리아데노신-폴리우리딜산(poly AU), TLR3 작용제; poly-L-리신 및 카복시메틸셀룰로오스로 안정화된 폴리이노신-폴리사이티딜산(Hiltonol), TLR3 작용제; 세균 LPS TLR4 작용제, 세균 플라젤린 TLR5 작용제; 이미퀴모드, TLR7 작용제; 레시퀴모드, TLR7/8 작용제; 록소리빈(loxoribine), TLR7/8 작용제; 및 비메틸화된 CpG ODN, TLR9 작용제를 포함한다. 당업계에 알려지고 본 발명에서 사용되는 추가 TLR 작용제는, 비제한적으로, TLR4 수용체에 결합하는 아미노알킬 글루코사미니드 포스페이트(AGP)를 추가로 포함하며, 이는 면역화된 동물에서의 사이토카인 생산 자극, 대식세포 활성화, 선천적 면역 반응 촉진, 및 항체 생산 증가를 위한 백신 아쥬반트 및 면역자극자로서 유용한 것으로 알려져 있다.
당업계에 알려지고 본 발명에서 사용되는 추가 TLR 작용제는 다른 병원균-연관 분자 패턴(PAMP) 및 손상-연관 분자 패턴(DAMP)을 추가로 포함한다. (상기 P. D'Arpa and K. Leung) PAMP의 예는 지방단백질, 지방폴리펩티드, 펩티도글리칸, 지모산, 지질다당류, 나이세리아 포린, 플라젤린, 프로필린, 갈락토세라마이드, 무라밀 디펩티드를 포함한다. 펩티도글리칸, 지방단백질, 및 리포테이코산은 그람-양성의 세포 벽 성분이다. 지질다당류는 대부분의 세균에 의해 발현되며, MPL이 하나의 예이다. 플라젤린은 병원균 및 공생균에 의해 분비되는 세균 플라젤라의 구조적 성분을 지칭한다. rt.-갈락토실세라마이드(rt.-GalCer)는 천연 킬러 T(NKT) 세포의 활성제이다. 무라밀 디펩티드는 모든 세균에 공통된 생활성 펩티도글리칸 모티프이다. DAMP의 예는 분비성 리소좀, 예를 들어 고 이동성 군 박스(high mobility group box)(HMGB)1 및 갈렉틴-3; 및 괴사성 세균에 의해 방출된 분자, 예를 들어 S100 단백질, HMGB1, IL-1a, 갈렉틴-3, HSP60, HSP70, HSP72, 히스톤, 및 핵산; 및 세포외 기질 분자, 예를 들어 하이알루로난, 헤파린 설페이트, 피브로넥틴, 및 분해된 기질 성분을 포함한 비고전적 분배 메커니즘을 통해 분비되는 단백질을 포함한다.
CpG를 함유한 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)는 TLR9에 대한 작용제이며 종양에 대해 선천적 및 적응성 면역력 둘 다를 활성화시킨다. 본원에 기재된 바와 같이, 자연적으로 존재하는 CpG ODN 및 합성 CpG-함유 폴리뉴클레오티드 둘 다를 포함하는 면역자극 폴리뉴클레오티드는 암을 예방 또는 치료하기 위한 치료제로서 고려된다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본원은 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 갖는 대상체에서 암을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 암을 치료하기 위한 상기 방법에서 투여되는 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 투여시 TLR-매개된 시그널링 경로를 활성화시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 자연적으로 존재한다. 자연적으로 존재하는 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드의 예는, 비제한적으로, 세균 또는 바이러스 기원의 CpG ODN을 포함한다. 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 인공적으로 합성된다. 일부 실시양태에서, 합성 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 이의 천연 대응물과 동일한 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 합성 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드의 서열은 자연적으로 존재하는 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드와 상이하다. 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 화학적으로 변형되어, 핵산에서 보통 발견되지 않는 1 이상의 화학적 개체를 함유한다.
일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 표 2에 열거된 면역자극 폴리펩티드 중 하나이다. 일부 실시양태에서, CpG-함유 폴리뉴클레오티드는 p236, p238, p243, p246, p275, p276, p308, p313, p347, p361, p362, p425, p433, p434, p435, p436, p437, p438, p477, p478, p479, p480, p481, p482, p483, p484, p485, p486, p487, p488 및 p489로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 p236이다. 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 p238이다. 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 p238이다. 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 p243이다. 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 p246이다. 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 p275이다. 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 p276이다. 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 p308이다. 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 313이다. 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 p347이다. 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 p361이다. 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 p362이다. 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 p425이다. 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 p433이다. 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 p434이다. 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 p435이다. 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 p436이다. 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 p437이다. 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 p438이다. 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 p477이다. 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 p478이다. 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 p479이다. 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 p480이다. 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 p481이다. 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 p482이다. 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 p483이다. 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 p484이다. 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 p485이다. 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 p486이다. 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 p487이다. 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 p488이다. 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 p489이다.
본원에 제공된 바와 같이, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 독립형이거나 큰 분자 또는 복합체의 일부를 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 항원 또는 이의 항원성 단편에 공유결합으로 또는 비-공유결합으로 접합되지 않는다. 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 정상 면역 세포 또는 이의 항원성 단편에 의해 코딩 및 발현된 항원에 접합되지 않는다. 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 T 세포 항원 또는 이의 에피토프에 접합되지 않는다. 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 오브알부민(OVA) 또는 이의 에피토프에 접합되지 않는다. 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 일본 삼나무 꽃가루 알레르겐 Cryj2 T-세포 에피토프 펩티드에 접합되지 않는다. 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 종양 연관 항원에 접합되지 않는다.
특별한 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 대상체에게 투여시 특정 기관, 조직, 세포 및/또는 세포 구획에 대한 표적화된 전달을 위해 표적화 모이어티에 접합된다. 일부 실시양태에서, 표적화 모이어티는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 일부 실시양태에서, 표적화 모이어티는 본원에 기재된 바와 같은 화학 모이어티를 포함한다.
일부 실시양태에서, 표적화 모이어티는 다른 비-표적화된 세포에 비해 더욱 표적화된 세포 또는 세포 집단에서 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드의 도달을 특이적으로 촉진한다. 표적화된 전달은 당업계에 알려진 방법을 사용하여, 예컨대 표적화된 세포 또는 세포 집단에서 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드의 세포 농도를 측정하고 비-표적화된 세포 또는 세포 집단에서 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드의 세포 농도에 이를 비교하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 세포 마커는 특정 세포 집단을 확인하고 정제하기 위해 사용될 수 있다. CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드의 표적화된 전달을 검출 및 측정하기 위한 다른 방법은 당업자에게 알려져 있으며, 본 발명의 범위 내에 속한다.
일부 실시양태에서, 표적화 모이어티는 비-표적화된 세포 또는 세포 집단에 비해 표적화된 세포 또는 세포 집단에 적어도 2 배 많은 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드를 전달한다. 일부 실시양태에서, 표적화 모이어티는 비-표적화된 세포 또는 세포 집단에 비해 표적화된 세포 또는 세포 집단에 적어도 5 배 많은 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드를 전달한다. 일부 실시양태에서, 표적화 모이어티는 비-표적화된 세포 또는 세포 집단에 비해 표적화된 세포 또는 세포 집단에 적어도 10 배 많은 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드를 전달한다. 일부 실시양태에서, 표적화 모이어티는 비-표적화된 세포 또는 세포 집단에 비해 표적화된 세포 또는 세포 집단에 적어도 20 배 많은 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드를 전달한다. 일부 실시양태에서, 표적화 모이어티는 비-표적화된 세포 또는 세포 집단에 비해 표적화된 세포 또는 세포 집단에 적어도 30 배 많은 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드를 전달한다. 일부 실시양태에서, 표적화 모이어티는 비-표적화된 세포 또는 세포 집단에 비해 표적화된 세포 또는 세포 집단에 적어도 40 배 많은 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드를 전달한다. 일부 실시양태에서, 표적화 모이어티는 비-표적화된 세포 또는 세포 집단에 비해 표적화된 세포 또는 세포 집단에 적어도 50 배 많은 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드를 전달한다. 일부 실시양태에서, 표적화 모이어티는 비-표적화된 세포 또는 세포 집단에 비해 표적화된 세포 또는 세포 집단에 적어도 100 배 많은 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드를 전달한다. 일부 실시양태에서, 표적화 모이어티는 비-표적화된 세포 또는 세포 집단에 비해 표적화된 세포 또는 세포 집단에 100 배 이상 많은 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드를 전달한다.
일부 실시양태에서, 표적화 모이어티는 표적화된 세포 근처, 상부 및/또는 내부에 위치한 수신 모이어티에 특이적으로 결합함으로써 표적화된 세포에 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드를 전달한다. 일부 실시양태에서, 표적화 모이어티는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고, 수신 모이어티는 표적화된 세포 또는 이의 항원 단편에 의해 생산된 항원이다. 일부 실시양태에서, 수신 모이어티는 세포 표면 항원이다. 일부 실시양태에서, 수신 모이어티는 표적화된 세포의 세포기질 내에 위치한다. 일부 실시양태에서, 수신 모이어티는 표적화된 세포의 세포내 세포소기관, 예컨대 엔도솜 또는 식포와 연관된다. 일부 실시양태에서, 표적화 모이어티의 결합시, 표적화된 세포는 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드를 내부화한다. 일부 실시양태에서, 수신 모이어티는 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드의 내부화를 용이하게 한다. 일부 실시양태에서, 표적화된 세포는 내부화된 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드를 세포내 구획, 예컨대 엔도솜 또는 식포로 추가로 수송한다. 일부 실시양태에서, 수신 모이어티는 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드의 수송을 용이하게 한다.
암을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 표적화된 세포는 적어도 하나의 톨-유사 수용체, 예컨대 TLR 7 및/또는 TLR9를 발현한다. 일부 실시양태에서, 표적화된 세포는 정상 면역 세포, 예컨대 항원 제시 세포(APC)이다. 일부 실시양태에서, 표적화된 세포는 암 세포, 예컨대 B 세포 림프종 세포이다. 일부 실시양태에서, 수신 모이어티는 톨-유사 수용체와 동일한 세포막 상에 위치한다, 일부 실시양태에서, 수신 모이어티 및 톨-유사 수용체 둘 다는 표적화된 세포의 세포막 상에 위치한다. 일부 실시양태에서, 수신 모이어티 및 톨-유사 수용체 둘 다는 표적화된 세포의 엔도솜막 또는 식포막 상에 위치한다. 일부 실시양태에서, 수신 모이어티에 대한 표적화 모이어티의 결합은 표적화된 세포에 의해 발현된 TLR9 수용체에 대한 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드의 결합을 용이하게 한다.
일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 접합되어, CpG-Ab 면역접합체를 형성한다. 일부 실시양태에서, 접합은 공유 결합, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 화학적 링커 분자를 통한 것이다. 다른 실시양태에서, 접합은 비-공유 결합, 예컨대 리간드와 이의 수용체 사이의 결합 상호작용을 통한 것이다. 본 발명과 결합되어 사용될 수 있는 비-공유 결합의 다른 예는, 비제한적으로, 정전기 상호작용(예를 들어, TAT 또는 스페르민 또는 프로타민 복합체) 및 비오틴-아비딘/스트렙타비딘 상호작용을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 항-CD20 항체, 항-CD22 항체, 항-CD30 항체, 항 CD37 항체, 항-CD38 항체, 항-CD40 항체, 항-CD74 항체, 항-CD79b 항체, 항-CD205 항체, 항-CD274 항체, 항-CD303 항체, 항-CD304 항체, 항-CD19 항체, 항-CD1 항체, 항-CD2 항체, 항-CD3 항체, 항-CD5 항체, 항-CD6 항체, 항-CD9 항체, 항-CD11 항체, 항-CD18 항체, 항-CD21 항체, 항-CD23 항체, 항-CD24 항체, 항-CD25 항체, 항-CD26 항체, 항-CD44 항체, 항-CD45R 항체, 항-CD49 항체, 항-CD66(암배아 항원, CEA) 항체, 항-CD93 항체, 항-CD52 항체, 항-CD56 항체, 항-CD123 항체, 항-CD138 항체, 항-CD163 항체, 항-CD206 항체로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-CD20 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-CD22 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-CD30 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-CD38 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-CD40 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-CD74 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-CD76b 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-CD205 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-CD274 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-CD303 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-CD304 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-CD19 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-CD1 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-CD2 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-CD3 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-CD5 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-CD6 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-CD9 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-CD11 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-CD18 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-CD21 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-CD23 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-CD24 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-CD25 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-CD26 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-CD304 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-CD44 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-CD45R 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-CD49 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-CD66(암배아 항원, CEA) 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-CD93 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-CD52 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-CD56 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-CD123 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-CD138 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-CD163 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-CD206 항체이다.
일부 실시양태에서, 항체는 단클론 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간화된 항체이다.
일부 실시양태에서, CpG-Ab 접합체는 본 발명의 표 6-A 또는 6-B에 열거된 면역접합체 중 하나이다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 접합체는 표 6-A 또는 6-B에 나타낸 바와 같은 SB-342, SB-343, SB-341, SB-340, SB-179, SB-181, SB-186, SB-189, SB-228, SB-229, SB-242, SB-263, SB-337, SB-267, SB-284, SB-312, SB-313, SB-347, SB-373, SB-382, SB-388, SB-389, SB-408, SB-416, SB-419, SB-421, SB-423, SB-426, SB-427, SB-428, SB-429, 및 SB-430으로부터 선택된다.
CpG-Ab 면역접합체는 1 이상의 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드 및 1 이상의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 면역접합체에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드 사이의 분자비(Ab:CpG 비)는 1:1 내지 1:100의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체의 Ab:CpG 비는 1:1이다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체의 Ab:CpG 비는 1:2이다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체의 Ab:CpG 비는 1:3이다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체의 Ab:CpG 비는 1:4이다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체의 Ab:CpG 비는 1:5이다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체의 Ab:CpG 비는 1:6이다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체의 Ab:CpG 비는 1:7이다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체의 Ab:CpG 비는 1:8이다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체의 Ab:CpG 비는 1:9이다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체의 Ab:CpG 비는 1:10이다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체의 Ab:CpG 비는 1:15이다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체의 Ab:CpG 비는 1:20이다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체의 Ab:CpG 비는 1:30이다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체의 Ab:CpG 비는 1:40이다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체의 Ab:CpG 비는 1:50이다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체의 Ab:CpG 비는 1:60이다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체의 Ab:CpG 비는 1:70이다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체의 Ab:CpG 비는 1:80이다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체의 Ab:CpG 비는 1:90이다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체의 Ab:CpG 비는 1:100이다.
일부 실시양태에서, 암을 치료하기 위한 방법은 암을 갖는 대상체에게 CpG-Ab 면역접합체의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하되, 대상체에 대한 투여시, CpG-Ab 면역접합체는 정상 면역 세포를 표적화한다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 T 세포, B 세포, 천연 킬러 세포, 호중구, 비만 세포, 대식세포, 항원-제시 세포(APC), 호염구, 및 호산구로부터 선택된 1 이상의 유형(들)의 정상 세포를 표적화한다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 정상 APC를 표적화한다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 B 세포, 단핵구, 수지상 세포, 랑게르한스 세포, 각질형성세포, 내피 세포, 별아교세포, 섬유아세포, 및 희돌기교세포로부터 선택된 1 이상의 유형(들)의 정상 APC를 표적화한다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 정상 B 세포를 표적화한다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 정상 수지상 세포를 표적화한다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 정상 대식세포를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 1 이상의 유형(들)의 정상 세포를 표적화하는 CpG-Ab 면역접합체는 비정상 세포, 예컨대 암 세포를 표적화하지 않는다.
일부 실시양태에서, 암을 치료하기 위한 방법은 암을 갖는 대상체에게 CpG-Ab 면역접합체의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하되, 대상체에 대한 투여시, CpG-Ab 면역접합체는 적어도 하나의 톨-유사 수용체를 발현하는 세포를 표적화한다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 TLR9를 발현하는 세포를 표적화한다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 TLR7을 발현하는 세포를 표적화한다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 수지상 세포(DC), B 세포, T 세포, 랑게르한스 세포, 각질형성세포, 비만 세포, 내피 세포, 근섬유아세포, 및 1 차 섬유아세포로부터 선택된 TLR-발현 세포를 표적화한다.
일부 실시양태에서, 암을 치료하기 위한 방법은 암을 갖는 대상체에게 CpG-Ab 면역접합체의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하되, CpG-Ab 면역접합체는 치료되는 암의 비정상 세포를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 이러한 비정상 세포는 암 세포이다. 일부 실시양태에서, 이러한 비정상 세포는 치료되는 종양의 기질 세포이다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 B 세포암, 예를 들어 다발성 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 중쇄병, 예컨대 알파쇄병, 감마쇄병, 및 뮤쇄병, 양성 단세포군 감마글로불린병증, 및 면역세포 아밀로이드증, 흑색종, 유방암, 폐암, 기관지암, 대장암, 전립선암, 췌장암, 위암, 난소암, 비뇨기 방광암, 뇌 또는 중추신경계 암, 말초신경계 암, 식도암, 자궁경부암, 자궁 또는 자궁내막암, 구강 또는 인두의 암, 간암, 신장암, 고환암, 담도암, 소장 또는 맹장암, 침샘암, 갑상선암, 부신암, 골육종, 연골육종, 혈액학적 조직의 암 등으로부터 선택된 1 이상의 유형(들)의 암 세포를 표적화한다. 본 발명에 의해 포함되는 방법에 적용 가능한 암의 유형의 다른 비-제한적인 예는 인간 육종 및 암종, 예를 들어 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 척색종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종, 윤활막종, 악성중피종, 유윙 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 대장암, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평세포암종, 기저세포암종, 선암종, 땀샘암종, 피지샘암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭샘암종, 수질암종, 기관지원성 암종, 신세포암종, 간세포암, 담관암, 간암, 융모막암종, 정상피종, 배아암종, 빌름스 종양, 자궁경부암, 골암, 뇌종양, 고환암, 폐암종, 소세포 폐암종, 방광암종, 상피암종, 신경교종, 별아교세포종, 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막세포종, 송과체종, 혈관아세포종, 청신경초종, 핍지교종, 뇌수막종, 흑색종, 신경모세포종, 망막모세포종; 백혈병, 예를 들어, 급성 림프구성 백혈병 및 급성 골수세포 백혈병(골수아구, 전골수구, 골수단핵구, 단핵구 및 적백혈병); 만성 백혈병(만성 골수세포(과립구) 백혈병 및 만성 림프구성 백혈병); 및 진성적혈구 증가증, 림프종(호지킨병 및 비-호지킨병), 다발성 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 및 중쇄병을 포함한다. 일부 실시양태에서, 암은 본질적으로 상피성이며, 비제한적으로, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 부인암, 신세포암, 후두암, 폐암, 구강암, 두경부암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 또는 피부암을 포함한다. 다른 실시양태에서, 암은 유방암, 전립선암, 폐암, 또는 결장암이다. 또 다른 실시양태에서, 상피암은 비소세포 폐암, 비유두상 신세포암종, 자궁경부 암종, 난소 암종(예를 들어, 혈청 난소 암종), 또는 유방 암종이다. 상피암은, 비제한적으로, 혈청, 자궁내막모양, 점액, 투명 세포, 브레너, 또는 미분화된 것을 포함한 다양한 다른 방식이 특징일 수 있다.
일부 실시양태에서, 암을 치료하기 위한 방법은 암을 갖는 대상체에게 CpG-Ab 면역접합체의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하되, CpG-Ab 면역접합체는 치료되는 암의 비정상 세포를 표적화하며 또한 T 세포, B 세포, 천연 킬러 세포, 호중구, 비만 세포, 대식세포, 항원-제시 세포(APC), 호염구, 및 호산구로부터 선택된 정상 면역 세포를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 치료되는 암의 비정상 세포를 표적화하는 CpG-Ab 면역접합체는 또한 B 세포, 단핵구, 수지상 세포, 랑게르한스 세포, 각질형성세포, 내피 세포, 별아교세포, 섬유아세포, 및 희돌기교세포로부터 선택된 정상 APC를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 치료되는 암의 비정상 세포를 표적화하는 CpG-Ab 면역접합체는 또한 수지상 세포(DC), B 세포, T 세포, 랑게르한스 세포, 각질형성세포, 비만 세포, 내피 세포, 근섬유아세포, 및 1 차 섬유아세포로부터 선택된 TLR 수용체를 발현하는 세포를 표적화한다. 특별한 실시양태에서, 이러한 비정상 세포는 암성 면역 세포이다. 특별한 실시양태에서, 이러한 비정상 세포는 림프종 세포 또는 백혈병 세포이다. 특별한 실시양태에서, 이러한 비정상 세포는 B 세포 림프종 세포이고, CpG-Ab 면역접합체는 대상체에서 B 세포 림프종 세포 및 정상 B 세포 둘 다를 표적화한다.
일부 실시양태에서, 암을 치료하기 위한 방법은 암을 갖는 대상체에게 CpG-Ab 면역접합체의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하되, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 표적화된 세포에 도달시 TLR9 매개된 시그널링 경로를 활성화시킨다. 이러한 활성화는 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드와 표적화된 세포의 표면 상 또는 세포기질 내에 발현된 TLR9 수용체의 결합을 통한 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체에 의해 표적화된 세포는 CpG-Ab 면역접합체를 내부화할 수 있다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체에 의해 표적화된 세포는 면역접합체의 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드 부분을 내부화할 수 있다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체에 의해 표적화된 세포는 내부화된 CpG-Ab 면역접합체 또는 이의 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드 부분을 TLR 수용체를 발현한 세포내 세포소기관으로 수송할 수 있다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체에 의해 표적화된 세포는 내부화된 CpG-Ab 면역접합체 또는 이의 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드 부분을 세포의 엔도솜 또는 식포로 수송할 수 있다.
일부 실시양태에서, 암을 치료하기 위한 방법은 암을 갖는 대상체에게 CpG-Ab 면역접합체의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하되, CpG-Ab 면역접합체는 표적화된 세포와 연관된 항원에 특이적으로 결합한다. 본원에 기재된 바와 같이, 표적화된 세포와 연관된 항원은 표적 세포의 표면 상 및/또는 세포기질 내에서 발견될 수 있다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 표적화된 세포의 표면 상에 존재하는 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 표적화된 세포의 세포기질 내에 존재하는 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 표적화된 세포의 세포내 구획 또는 세포소기관의 막 상에 존재하는 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 표적화된 세포의 엔도솜 또는 식포 막 상에 존재하는 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체에 의한 결합시, 표적 항원은 표적화된 세포 내로의 CpG-Ab 면역접합체 또는 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드의 내부화를 용이하게 한다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체에 의한 결합시, 표적 항원은 표적화된 세포의 엔도솜으로의 CpG-Ab 면역접합체 또는 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드의 수송을 용이하게 한다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체에 의한 결합시, 표적 항원은 표적화된 세포에 의해 발현된 TLR9에 대한 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드의 결합을 용이하게 한다.
일부 실시양태에서, 표적화된 세포와 연관된 항원은 표적화된 세포에 의해 코딩 및 발현된 단백질이다. 상기 실시양태에서, 단백질 항원은 표적화된 세포의 내인성 유전자(예를 들어, 표적화된 세포 게놈에 의해 코딩됨) 또는 외인성 유전자(예를 들어, 표적화된 세포로 인공적으로 도입된 유전자에 의해 코딩됨)에 의해 코딩될 수 있다. 다른 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체의 표적 항원은 표적화된 세포에 의해 코딩 또는 발현되지 않는다. 일부 실시양태에서, 표적화된 세포와 연관된 항원은 표적화된 세포에 의해 흡수된 외인성 항원(예를 들어, APC에 의해 흡수 및 처리된 항원)이다.
비-제한적인 예로서, 일부 실시양태에서, 정상 면역 세포를 표적화하기 위해, CpG-Ab 면역접합체의 표적 항원은 정상 면역 세포(예를 들어, B 세포 항원)에 의해 코딩 및 발현된다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체의 표적 항원은 정상 면역 세포의 내인성 유전자에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체의 표적 항원은 정상 면역 세포 내로 도입된 외인성 유전자(예를 들어, 리포터 유전자)에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체의 표적 항원은 면역 세포(예를 들어, 항원 또는 바이러스 항원과 연관된 종양)에 의해 흡수 및 처리된 질환 항원이다.
비-제한적인 예로서, 일부 실시양태에서, 비정상 세포(예를 들어, 암 세포 또는 병원균 감염된 세포)를 표적화하기 위해, CpG-Ab 면역접합체의 표적 항원은 비정상 세포의 내인성 유전자에 의해 코딩된 단백질일 수 있다. 다양한 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체의 표적 항원은 표적화된 세포에서 과잉발현, 돌연변이되거나(mutated) 또는 잘못 조절된다. 다른 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체의 표적 항원은 항원이 정상 세포에서 갖는 바와 동일한 특징을 갖는다. 다른 실시양태에서, CpG-면역접합체의 표적 항원은 비정상 세포 내로 도입된(예를 들어, 병원균 감염을 통함) 외인성 유전자에 의해 코딩된다.
일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 T 세포, B 세포, 천연 킬러 세포, 호중구, 비만 세포, 대식세포, 항원-제시 세포(APC), 호염구, 및 호산구로부터 선택된 정상 면역 세포에 의해 코딩 및 발현된 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 B 세포, 단핵구, 수지상 세포, 랑게르한스 세포, 각질형성세포, 내피 세포, 별아교세포, 섬유아세포, 및 희돌기교세포로부터 선택된 정상 항원-제시 세포(APC)에 의해 코딩 및 발현된 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 정상 B 세포에 의해 의해 코딩 및 발현된 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 정상 수지상 세포에 의해 코딩 및 발현된 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 대식세포에 의해 코딩 및 발현된 항원에 특이적으로 결합한다.
일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 면역 체크포인트 분자, T 세포 공동자극 분자, MHC 단백질(MHC 클래스 I 및 II 분자를 포함함), 및 다른 면역 세포 특이적 항원으로부터 선택된 정상 면역 세포에 의해 코딩 및 발현된 항원에 특이적으로 결합한다.
특별한 실시양태에서, 본 발명에서 사용되는 면역 체크포인트 분자는, 비제한적으로, PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3, LAG-3, CEACAM-1, CEACAM-5, CLTA-4, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD47, CD160, 2B4 및 TGFR을 포함한다.
특별한 실시양태에서, 본 발명에서 사용되는 T 세포 공동자극 분자는, 비제한적으로, OX40, CD2, CD27, CDS, ICAM-1, LFA-1/CD11a/CD18, ICOS/CD278, 4-1BB/CD137, GITR, CD30, CD40, BAFFR, HVEM, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3, 및 CD83을 포함한다.
특별한 실시양태에서, 본 발명에서 사용되는 B 세포 특이적 항원은, 비제한적으로, B220/CD45R, B7-1/CD80, B7-2/CD86, BCMA/TNFRSF17, BLIMP1/PRDM1, C1q R1/CD93, CD117/c-키트, CD11b/인테그린 알파 M, CD19, CD1c/BDCA-1, CD1d, CD20, CD21, CD23/Fc 엡실론 RII, CD24, CD25/IL-2 R 알파, CD27/TNFRSF7, CD34, CD37, CD38, CD40/TNFRSF5, CD43, CD5, CD69, CD72, CD83, CXCR4, CXCR5, DEP-1/CD148, EMMPRIN/CD147, FCRL3/FcRH3, Flt-3/Flk-2, HLA-DR, IgM, IL-10, IL-12 R 베타 2, IL-12/IL-35 p35, IL-21, IL-21 R, IL-27 R 알파/WSX-1/TCCR, IL-27/IL-35 EBI3 서브유닛, IL-3 R 알파/CD123, IL-4 R 알파, IL-7 R 알파/CD127, IRF4, MHC 클래스 II(I-A/I-E), 네프릴리신/CD10, Pax5/BSAP, Sca-1/Ly6, Siglec-2/CD22, STAT1, STAT3, 신데칸-1/CD138, TACI/TNFRSF13B, TGF-베타, TIM-1/KIM-1/HAVCR, TLR4를 포함한다. 특별한 실시양태에서, B 세포 특이적 항원은 CD1, CD2, CD5, CD9, CD11, CD17, CD18, CD19, CD20, CD21/CD35, CD22, CD23, CD24, CD25, CD27, CD30, CD38, CD40, CD45R/B220, CD69, CD70, CD78, CD79a(Igα), CD79b(Igβ), CD80, CD86, CD93(C1Rqp), CD137/4-1BB, CD138, CD252/OX40L, CD267, CD268/BAFF-R, CD279/PD1, CD319, PDL-2, Pax-5, IgD, IgM, Notch 2, 및 TLR4로부터 선택된다.
특별한 실시양태에서, 본 발명에서 사용되는 수지상 세포 특이적 항원은, 비제한적으로, B220/CD45R, BATF3, BST-2/테터린, CD11b/인테그린 알파 M, CD11c, CD14, CD163, CD19, CD1c/BDCA-1, CD1d1, CD20, CD3, CD4, CD8, CLEC9a, CX3CR1, DC-SIGN/CD209, DEC-205/CD205, DLEC/CLEC4C/BDCA-2, E-카드헤린, EpCAM/TROP1, F4/80, Fc 엡실론 RI 알파, Fc 감마 RI/CD64, Fc 감마 RIA/CD64, Fc 감마 RIB/CD64, Fc 감마 RIII(CD16), Fc 감마 RIIIA/CD16a, Fc 감마 RIIIB/CD16b, GFI-1, HLA-DR, IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, IGSF4A/SynCAM1, 이카로스, IL-1 베타/IL-1F2, IL-10, IL-12, IL-2, IL-23, IL-3 R 알파/CD123, IL-6, iNOS, 인테그린 알파 E/CD103, IRF4, IRF8, 랑게린/CD207, Ly-6G(Gr-1), Ly-6G/Ly-6C(Gr-1), MHC 클래스 II(I-A/I-E), MMR/CD206, NCAM-1/CD56, 뉴로필린-1, NFIL3/E4BP4, 산화 질소, PU.1/Spi-1, SIRP 알파/CD172a, Spi-B, 트롬보모듈린/BDCA-3, TLR7, TLR9, TNF-알파, 및 XCR1을 포함한다. 추가 수지상 세포 항원 및 수지상 세포 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 Rafael
Figure pct00336
Current Protocols in Cytometry (2001) 9.17.1-9.17.15; Hock et al.. Immunology 83:573-581; Jiang, W., et al. Nature 375:151-155; and Bender et al.J. Immunol. Methods 196:121-135; and M. Colli et al. Immunology. 2013 Sep; 140(1): 22-30에 기재된 것과 같이 당업계에 알려져 있으며, 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 특별한 실시양태에서, 수지상 세포 특이적 항원은 CD1a, CD1b/c, CD4, CD8, CD11b, CD11c, CD40, CD45R/B220, CD49d, CD80, CD83, CD85a, CD85f, CD85g/ILT7, CD85i, CD85j, CD86, CD123, CD197/CCR7, CD205, CD206, CD207, CD208, CD209, CD273/B7-DC/PD-L2, CD303/BDCA-2, CD304/뉴로필린-1, DC 마커/33D1, F4/80, MHC 클래스 I, 파신, HLA-DR 및 Siglec H로부터 선택된다. 특별한 실시양태에서, 수지상 세포 특이적 항원은 CD1a, CD1b, CD1c, CD4, CD8, CD11b, CD11c, CD40, CD45R/B220, CD49d, CD80, CD83, CD85g/ILT7, CD86, CD123, CD197(CCR7), CD273(B7-DC, PD-L2), CD303(BDCA-2), CD304(뉴로필린-1), DC 마커(33D1), F4/80, HLA-DR, MHC 클래스 II, Siglec H로부터 선택된 플라스마사이토이드 수지상 세포 항원이다.
특별한 실시양태에서, 본 발명에서 사용되는 대식세포 표면 항원은, 비제한적으로, 액티빈 A, AIF-1/Iba1, 아르기나아제 1/ARG1, B7-1/CD80, B7-2/CD86, 칼시토닌 R, CCL1/I-309/TCA-3, CCL11/에오탁신, CCL14/HCC-1/HCC-3, CCL15/MIP-1 델타, CCL16/HCC-4, CCL17/TARC, CCL18/PARC, CCL19/MIP-3 베타, CCL2/JE/MCP-1, CCL20/MIP-3 알파, CCL22/MDC, CCL23/Ck 베타 8-1, CCL23/MPIF-1, CCL24/에오탁신-2/MPIF-2, CCL26/에오탁신-3, CCL3/CCL4, CCL3/MIP-1 알파, CCL4/MIP-1 베타, CCL5/RANTES, CCL8/MCP-2, CCR2, CCR5, CD11b/인테그린 알파 M, CD11c, CD15/루이스 X, CD163, CD200R1, CD200R1L, CD36/SR-B3, CD43, CD45, CD68/SR-D1, CLEC10A/CD301, COX-2, CX3CL1/프렉탈카인, CX3CR1, CXCL1/GRO 알파/KC/CINC-1, CXCL10/IP-10/CRG-2, CXCL11/I-TAC, CXCL13/BLC/BCA-1, CXCL16, CXCL2/GRO 베타/MIP-2/CINC-3, CXCL3/GRO 감마/CINC-2/DCIP-1, CXCL5/ENA-70, CXCL5/ENA-74, CXCL5/ENA-78, CXCL9/MIG, CXCR1/IL-8 RA, CXCR2/IL-8 RB, DC-SIGN/CD209, DEC-205/CD205, 덱틴-1/CLEC7A, 덱틴-2/CLEC6A, EMR1, F4/80, Fc 엡실론 RI 알파, Fc 감마 RI/CD64, Fc 감마 RIA/CD64, Fc 감마 RIB/CD64, Fc 감마 RII/CD32, Fc 감마 RIII(CD16), FIZZ1/RELM 알파, 갈렉틴-3, GATA-6, G-CSF, GITR 리간드/TNFSF18, GM-CSF, HLA-DR, ID2, IFN-감마, IFN-감마 R1/CD119, IL-1 베타/IL-1F2, IL-1 RII, IL-10, IL-15, IL-17/IL-17A, IL-18/IL-1F4, IL-1ra/IL-1F3, IL-23, IL-4 R 알파, IL-6, IL-8/CXCL8, iNOS, 인테그린 알파 L/CD11a, IRF4, IRF5, LAMP-2/CD107b, 랑게린/CD207, LILRB4/CD85k/ILT3, L-셀렉틴/CD62L, LXR 알파/NR1H3, Ly-6G(Gr-1), Ly-6G/Ly-6C(Gr-1), MARCO, M-CSF R/CD115, Mer, MFG-E8, MHC 클래스 II(I-A/I-E), MMR/CD206, NFATC1, NGFI-B 알파/Nur77/NR4A1, PPAR 델타/NR1C2, PPAR 감마/NR1C3, RANK/TNFRSF11A, RUNX3/CBFA3, Siglec-1/CD169, Siglec-3/CD33, Siglec-F, SIGNR1/CD209b, SIRP 알파/CD172a, SLAM/CD150, SOCS-3, 스핑고신 키나아제 1/SPHK1, 스핑고신 키나아제 2/SPHK2, SR-AI/MSR, SR-BI, STAT1, STAT6, TGF-베타, TIM-4, TLR1, TLR2, TLR4, TLR8, TNF-알파, TRACP/PAP/ACP5, VCAM-1/CD106, VEGF, 및 YM1/키티나아제 3-유사 3을 포함한다. 특별한 실시양태에서, 대식세포 특이적 항원은 CD11a, CD11b, CD11c, CD14, CD15(SSEA-1), CD16/32, CD33, CD64, CD68, CD80, CD85k(ILT3), CD86, CD105(엔도글린), CD107b, CD115, CD163, CD195(CCR5), CD282(TLR2), CD284(TLR4), F4/80, GITRL, HLA-DR, Mac-2(갈렉틴-3), MHC 클래스 II로부터 선택된다.
특별한 실시양태에서, 본 발명에서 사용되는 T 세포 특이적 항원은, 비제한적으로, CD3, CD4, CD8, CD25, CD127, 및 CD196/CCR6, CD197/CCR7, CD62L, CD69, 및 CD45RO를 포함한다.
특별한 실시양태에서, 본 발명에서 사용되는 T 여포 보조 특이적 항원은, 비제한적으로, BCL-6, Stat-3, CD3, CD4, CD84, CD126/IL-6Rα, CD150/SLAM), CD154/CD40L, CD185/CXCR5, CD252/OX40L, CD278/ICOS, CD279/PD1, 및 TCR α/β를 포함한다. 특별한 실시양태에서, 본 발명에서 사용되는 Th1 세포 특이적 항원은, 비제한적으로, GM-CSF, IFN-γ, IL-2, T-bet, 세포외 마커, CD4, CD26, CD94, CD119, CD183, CD191(CCR1), CD195(CCR5), CD254(TRANCE, RANKL), CD366(Tim-3), IL-18R, 림포톡신 베타 수용체(LTβR), TNF-α, 및 TNF-β를 포함한다. 특별한 실시양태에서, 본 발명에서 사용되는 Th2 세포 특이적 항원은, 비제한적으로, c-MAF, GATA3, GM-CSF, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, 세포외 마커, CCR8, CD4, CD184(CXCR4), CD193(CCR3), CD194(CCR4), CD197(CCR7), CD278(ICOS), CD294(CRTH2), CD365(Tim-1), 및 IL-1R을 포함한다. 특별한 실시양태에서, 본 발명에서 사용되는 Th9 세포 특이적 항원은, 비제한적으로, GATA3, IRF4, Stat-6, CD3, CD4, 및 TCR α/β를 포함한다. 특별한 실시양태에서, 본 발명에서 사용되는 Th17 세포 특이적 항원은, 비제한적으로, IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-22, RORα, RORγt, Stat-3, CD3, CD4, CD38, CD161/NK-1.1, CD194/CCR4, CD196/CCR6, IL-1R 및 TGF-β를 포함한다. 특별한 실시양태에서, 본 발명에서 사용되는 Th22 세포 특이적 항원은, 비제한적으로, AHR, CCR10, CD3, CD$, CD194/CCR4, CD196/CCR6, 및 TCR α/β를 포함한다. 특별한 실시양태에서, 본 발명에서 사용되는 Treg 세포 특이적 항원은, 비제한적으로, FOXP3, 헬리오스, 세포외 마커, CD4, CD25, CD39, CD62L, CD73, CD103, CD134, CD152/CTLA-4, CD194/CCR4, CD223, FR4, GARP, GITR, 및 TGF-β를 포함한다.
특별한 실시양태에서, 본 발명에서 사용되는 천연 킬러 세포 특이적 항원은, 비제한적으로, CD11b, CD11c, CD16/32, CD49b, CD56(NCAM), CD57, CD69, CD94, CD122, CD158(Kir), CD161(NK-1.1), CD244(2B4), CD314(NKG2D), CD319(CRACC), CD328(Siglec-7), CD335(NKp46), Ly49, Ly108, Vα24-Jα18 TCR(iNKT), 그라눌리신, 그랜자임, 및 퍼포린을 포함한다.
특별한 실시양태에서, 본 발명에서 사용되는 내피 세포 특이적 항원은, 비제한적으로, CD31, CD34, CD54, CD61, CD62E/E-셀렉틴, CD105/엔도글린, CD106/VCAM-1, CD144/VE-카드헤린, CD146/MUC18, Mel-CAM, CD201/EPCR, CD202b/Tie2/Tek, CD309/VEGFR2 - Flk-1, 포도플라닌, 및 VEGFR3을 포함한다. 특별한 실시양태에서, 본 발명에서 사용되는 호염기성 세포 특이적 항원은, 비제한적으로, 전-주 기저 단백질 1(Pro-Major Basic Protein 1), CD13, CD44, CD54, CD63, CD69, CD107a, CD123, CD193/CCR3, CD203c, FcεRIα, IgE, 및 TLR4를 포함한다. 특별한 실시양태에서, 본 발명에서 사용되는 별아교세포 특이적 항원은, 비제한적으로, S100B, CD40, CD80, CD86, CD88, 및 GFAP를 포함한다. 특별한 실시양태에서, 본 발명에서 사용되는 호산구성 세포 특이적 항원은, 비제한적으로, C3AR, CD15(SSEA-1), CD23, CD49d, CD52, CD53, CD88, CD129, CD183, CD191, CD193, CD244(2B4), CD294, CD305, FcεRIα, 갈렉틴-9, MRP-14, Siglec-8, 및 Siglec-10을 포함한다. 특별한 실시양태에서, 본 발명에서 사용되는 비만 세포 특이적 항원은, 비제한적으로, CD117/C-키트, CD203c 및 FcεRIα를 포함한다. 특별한 실시양태에서, 본 발명에서 사용되는 섬유아세포 특이적 항원은, 비제한적으로, CD10, CD29, CD47, CD81, CD91, CD121a를 포함한다.
특별한 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 CD19, CD20, CD22, CD30, CD38, CD40, CD74, CD79b, CD205, CD274, CD303, 및 CD304로부터 선택되는 정상 면역 세포와 연관된 표적 항원에 특이적으로 결합한다. 특별한 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 CD19, CD20, CD22, CD30, CD38, CD40, CD74, CD79b, CD205, CD274, CD303, 및 CD304로부터 선택된 표적 항원에 특이적으로 결합한다.
일부 실시양태에서, 정상 면역 세포(예를 들어, APC)와 연관된 항원에 특이적으로 결합하는 CpG-Ab 면역접합체는 비정상 세포를 표적화하지 않는다. 일부 실시양태에서, 정상 면역 세포(예를 들어, APC)와 연관된 항원에 특이적으로 결합하는 CpG-Ab 면역접합체는 비정상 세포와 연관된 항원에 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 정상 면역 세포(예를 들어, APC)와 연관된 항원에 특이적으로 결합하는 CpG-Ab 면역접합체는 본원에 제공된 방법으로 치료되는 암의 종양 연관 항원에 결합하지 않는다.
일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 각질형성세포, 랑게르한스 세포, T 세포, B 세포, 비만 세포, 내피 세포, 근섬유아세포, 및 1 차 섬유아세포로부터 선택된 TLR-발현 세포와 연관된 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, TLR-발현 세포와 연관된 항원에 특이적으로 결합하는 CpG-Ab 면역접합체는 비정상 세포를 표적화하지 않는다. 일부 실시양태에서, TLR-발현 세포와 연관된 항원에 특이적으로 결합하는 CpG-Ab 면역접합체는 비정상 세포와 연관된 항원에 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, TLR-발현 세포와 연관된 항원에 특이적으로 결합하는 CpG-Ab 면역접합체는 본원에 제공된 방법으로 치료되는 암의 종양 연관 항원에 결합하지 않는다.
일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 본 방법에 의해 치료되는 암의 종양 연관 항원에 특이적으로 결합한다. 본 발명의 CpG-Ab 면역접합체에 의해 표적화될 수 있는 종양 연관 항원(TAA)의 예는, 비제한적으로, EGFR, EGFRvIII, gp100 또는 Pmel17, HER2/neu, 메소텔린, CEA, MART-1/멜란-A, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MUC-1, GPNMB, HMW-MAA, TIM1, ROR1, CD19, gp100, 디펩티딜 펩티다아제 IV(DPPIV), 아데노신 데아미나아제-결합 단백질(ADAbp), 사이클로필린 b, 대장 연관 항원(CRC)-C017-1A/GA733, 암배아 항원(CEA) 및 이의 면역원 에피토프 CAP-1 및 CAP-2, etv6, aml1, 전립선 특이적 항원(PSA) 및 이의 면역원 에피토프 PSA-1, PSA-2, 및 PSA-3, 전립선-특이적 막 항원(PSMA), T-세포 수용체/CD3-제타쇄, 종양 항원의 MAGE-패밀리(예를 들어, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-Xp2(MAGE-B2), MAGE-Xp3(MAGE-B3), MAGE-Xp4(MAGE-B4), MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-05), 종양 항원의 GAGE-패밀리(예를 들어, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9), BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4, 티로시나아제, p53, MUC 패밀리(예를 들어, MUC1, MUC16 등; 예를 들어, 미국 특허 제6,054,438호; WO98/04727호; 또는 WO98/37095호 참고), p21ras, RCAS1, 알파-태아단백질, E-카드헤린, 알파-카테닌, 베타-카테닌 및 감마-카테닌, p120ctn, PRAME, NY-ESO-1, cdc27, 선종성 용종증 대장 단백질(adenomatous polyposis coli protein)(APC), 포드린, 코넥신 37, Ig-유전자형, p15, gp75, GM2 및 GD2 강글리오시드, 종양 항원 뇌 글리코겐 포스포릴라아제의 Smad 패밀리, SSX-1, SSX-2(HOM-MEL-40), SSX-1, SSX-4, SSX-5, SCP-1 및 CT-7, 및 c-erbB-2 및 바이러스 항원, 예컨대 HPV-16 및 HPV-18 E6 및 E7 항원 및 EBV-코딩된 핵 항원(EBNA)-1뿐 아니라, 마커(베타-갈락토시다아제, 루시페라아제 . . . ), βhCG, WT1, TRP-2, NY-BR-1, NY-CO-58, MN(gp250), 텔로머라아제, 및 생식 세포 유래된 종양 항원의 서열 중 전부 또는 일부를 포함하는 서열을 포함한다. 종양 연관 항원은 또한 혈액군 항원, 예를 들어 Lea, Leb, LeX, LeY, H-2, B-1, B-2 항원을 포함한다. 종양 연관 항원은 상기 Zhang et al.에 개시된 바와 같이 당업계에 알려진 방법을 사용하여 확인될 수 있다.
특히, 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD38, CD40, CD44, CD45R(B220), CD49, CD52, CD56, CD70, CD74, CD79a, CD79b, CD93, CD123, CD138, CD163, CD205, CD206, CD274, CD303, 및 CD304, 엽산 수용체 알파, 엽산 수용체 베타, 메소텔린, PSMA, Her-2, EGFR, 트랜스페린 수용체, 인테그린, 크립토, EphA2, AGS-5, AGS-16, CanAg, EpCAM, IL4 수용체, IL2 수용체, 루이스 Y, GPNMB로부터 선택된 종양 연관 항원에 특이적으로 결합한다.
다른 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 CD19, CD20, CD22portin 7, Her2, Src, EGFR, CD52, CXCR-4, Muc-1 및 DNA로부터 선택된 종양 연관 항원에 결합하지 않는다.
일부 실시양태에서 종양 연관 항원은 1 이상의 정상 면역 세포와 연관된다. 일부 실시양태에서 종양 연관 항원은 또한 1 이상의 TLR-발현 세포와 연관된다. 특별한 실시양태에서, 종양 연관 항원은 정상 면역 세포에 의해 코딩 및 발현된 단백질이다. 특별한 실시양태에서, 정상 면역 세포는 종양 연관 항원을 함유 또는 발현하도록 인공적으로 조작되어 왔다. 특별한 실시양태에서, 종양 연관 항원은 APC에 의해 흡수 및 처리된 외인성 항원이다. 특별한 실시양태에서, 암은 면역 세포 암이고, CpG-Ab 면역접합체는 종양 연관 항원에 특이적으로 결합함으로써, 암성 면역 세포 및 정상 면역 세포 둘 다를 표적화한다. 특별한 실시양태에서, 암은 림프종 또는 백혈병이다. 특별한 실시양태에서, 암은 B 세포 림프종이다.
본원에 기재된 바와 같은 암을 치료하는 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법으로 치료되는 암은 고형 종양이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법으로 치료되는 암은 액상 종양이다. 특별한 실시양태에서, 본원에 개시된 방법으로 치료되는 암은 림프종 또는 백혈병이다. 특별한 실시양태에서, 본원에 개시된 방법으로 치료되는 암은 외투 세포 림프종(MCL), 광범위 큰 B-세포 림프종(DLBCL), 버킷 림프종, 다발성 흑색종(MM), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 골수성 백혈병(AML), 소림프구 림프종(SLL), 모발상 세포 백혈병(HCL), 림프형질세포성 림프종(LPL), 골격근 림프종(SML), 비장 변연대 림프종(SMZL), 여포 중심 림프종(FCL), 대장암, 비소세포 폐암(NSCLC), 두경부암, 유방암, 췌장암, 교모세포종(GBM), 전립선암, 식도암, 신세포암종, 간암종, 방광암 및 위암종으로 이루어진 목록으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법으로 치료되는 암은 적어도 하나의 면역요법에 대해 저항성이다. 일부 실시양태에서, 암을 치료하는 방법은 암을 갖는 대상체에게 (i) CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드 또는 CpG-Ab 면역접합체의 치료적 유효량; 및 (ii) 암이 면역요법제 단독으로 치료될 때, 치료되는 암이 저항성이거나 반응하지 않는 것으로 나타난 면역요법제를 공동-투여하는 것을 포함한다.
특별한 실시양태에서, 본원에 제공된 방법으로 치료되는 암은 면역 체크포인트 조절제를 이용한 치료에 대해 반응하지 않는 것으로 나타났다. 특별한 실시양태에서, 면역 체크포인트 조절제는 PD-1의 억제제이다. 특별한 실시양태에서, 면역 체크포인트 조절제는 PD-L1의 억제제이다. 일부 실시양태에서, 암을 치료하는 방법은 암을 갖는 대상체에게 (i) CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드 또는 CpG-Ab 면역접합체의 치료적 유효량; 및 (ii) PD-1의 억제제의 치료적 유효량을 공동-투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 암을 치료하는 방법은 암을 갖는 대상체에게 (i) CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드 또는 CpG-Ab 면역접합체의 치료적 유효량; 및 (ii) PD-L1의 억제제의 치료적 유효량을 공동-투여하는 것을 포함한다. 특히, 일부 실시양태에서, PD-1의 억제제는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일부 실시양태에서, PD-L1의 억제제는 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
특정 양태에서, 본원은 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 TLR 작용제의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 암 발달에 민감한 대상체에서 암을 예방하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체에게 본원에 기재된 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드 또는 CpG-Ab 면역접합체의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 특별한 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 본원에 기재된 바와 같은 정상 면역 세포를 표적화한다. 특별한 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 본원에 기재된 바와 같은 TLR-발현 세포를 표적화한다. 특별한 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 본원에 기재된 바와 같은 정상 면역 세포와 연관된 항원에 특이적으로 결합한다. 특별한 실시양태에서, 정상 면역 세포와 연관된 항원에 특이적으로 결합하는 CpG-Ab 면역접합체는 예방되는 암의 종양 연관 항원에 결합하지 않다. 특별한 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 본원에 기재된 바와 같은 TLR-발현 세포와 연관된 항원에 특이적으로 결합한다. 특별한 실시양태에서, TLR-발현 세포와 연관된 항원에 특이적으로 결합하는 CpG-Ab 면역접합체는 예방되는 암의 종양 연관 항원에 결합하지 않는다. 특별한 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 본원에 기재된 바와 같이 예방되는 암의 종양 연관 항원에 특이적으로 결합한다. 특별한 실시양태에서, 예방되는 암의 종양 연관 항원은 또한 정상 면역 세포 또는 TLR-발현 세포와 연관된다. 특별한 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 CD19, CD20, CD22, STAT3, exportin 7, Her2, Src, EGFR, CD52, CXCR-4, Muc-1 및 DNA로부터 선택된 항원에 특이적으로 결합하지 않는다.
일부 실시양태에서, 암을 예방하는 방법은 암 발달에 민감한 대상체에게 (i) CpG-Ab 면역접합체의 치료적 유효량 및 (ii) 예방되는 암의 종양 연관 항원을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양 연관 항원은 CpG-Ab 면역접합체에 접합되지 않는다. 특별한 실시양태에서, 종양 연관 항원은 암 백신으로서 제형화된다. 특별한 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 암 백신의 아쥬반트로서 제형화된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법을 사용하여 예방 또는 치료되는 암은 이전 암의 부분 또는 완전 관해에 있는 대상체에서 재발하는 암의 사건이다. 특별한 실시양태에서, 이전 암은 액상 암이고 예방 또는 치료되는 재발암은 액상 암이다. 특별한 실시양태에서, 이전 암은 고형 암이고 예방 또는 치료되는 재발암은 고형 암이다. 특별한 실시양태에서, 이전 암은 액상 암이고 예방 또는 치료되는 재발암은 고형 암이다. 특별한 실시양태에서, 이전 암은 고형 암이고 예방 또는 치료되는 재발암은 액상 암이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법을 사용하여 예방 또는 치료되는 암은 대상체가 부분 또는 완전 관해를 나타낸 후에 대상체에서 재발하는 암의 제1 사건이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법을 사용하여 예방 또는 치료되는 암은 대상체가 부분 또는 완전 관해를 나타낸 후에 대상체에서 재발하는 암의 제2 사건이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법을 사용하여 예방 또는 치료되는 암은 대상체가 부분 또는 완전 관해를 나타낸 후에 대상체에서 재발하는 암의 제3 사건이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법을 사용하여 예방 또는 치료되는 암은 대상체가 부분 또는 완전 관해를 나타낸 후에 대상체에서 재발하는 암의 제3 사건 후에 재발하는 암의 사건이다.
특정 양태에서, 본원은 이를 필요로 하는 대상체에서 적응성 면역 반응을 유도하는 방법을 제공하되, 방법은 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 TLR 작용제의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 특별한 실시양태에서, 적응성 면역 반응을 유도하는 방법은 본원에 기재된 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드 또는 CpG-Ab 면역접합체의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 특별한 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 본원에 기재된 바와 같은 정상 면역 세포를 표적화한다. 특별한 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 본원에 기재된 바와 같은 TLR-발현 세포를 표적화한다. 특별한 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 암 세포 또는 병원균 감염된 세포로부터 선택된 질환에 걸린 세포를 표적화한다. 특별한 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 본원에 기재된 바와 같은 정상 면역 세포와 연관된 항원에 특이적으로 결합한다. 특별한 실시양태에서, 정상 면역 세포와 연관된 항원에 특이적으로 결합하는 CpG-Ab 면역접합체는 질환 항원에 결합하지 않는다. 특별한 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 본원에 기재된 바와 같은 TLR-발현 세포와 연관된 항원에 특이적으로 결합한다. 특별한 실시양태에서, TLR-발현 세포와 연관된 항원에 특이적으로 결합하는 CpG-Ab 면역접합체는 질환 항원에 결합하지 않는다. 특별한 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 본원에 기재된 바와 같은 질환 항원에 특이적으로 결합한다. 특별한 실시양태에서, 질환에 걸린 항원은 또한 정상 면역 세포 또는 TLR-발현 세포와 연관된다. 특별한 실시양태에서, 질환에 걸린 항원은 종양 연관 항원 또는 병원성 항원이다. 특별한 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 CD19, CD20, CD22, STAT3, exportin 7, Her2, Src, EGFR, CD52, CXCR-4, Muc-1 및 DNA로부터 선택된 항원에 특이적으로 결합하지 않는다.
본원에 기재된 방법 및 용도의 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 대상체에서 TLR9-매개된 시그널링 경로를 활성화시키기 위해 충분한 투여량으로 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 CpG-Ab 면역접합체에 의해 표적화된 세포 집단에서 TLR9 매개된 시그널링 경로를 활성화시키기 위해 충분한 투여량으로 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 본원에 기재된 바와 같이, 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체에 의해 표적화된 세포 집단은 TLR9를 발현한다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체에 의해 표적화된 세포 집단은 표적화된 세포의 세포 표면 상, 표적화된 세포의 엔도솜 막 상, 또는 표적화된 세포의 세포 표면 상 및 엔도솜 막 상 둘 다에서 TLR9를 발현할 수 있다.
특히, 본원에 기재된 방법 및 용도의 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 (a) 표적화된 세포 상의 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드에 의한 TLR9 수용체에 대한 특이적 결합; (b) 표적화된 세포에 의한 CpG-Ab 면역접합체 또는 이의 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드 부위의 효율적인 내부화; (c) 표적화된 세포 내의 1 이상의 시그널링 경로 활성화; (d) 표적화된 세포에 의한 1 이상의 염증성 사이토카인의 분비 유도; (e) 표적화된 세포에 의한 1 이상의 염증성 사이토카인의 분비 억제; (f) 표적화된 세포의 1 이상의 유전자의 발현 상향조절; (g) 표적화된 세포의 1 이상의 유전자의 발현 억제; (h) 표적화된 정상 면역 세포 활성화, 및 (i) 표적화된 암 세포의 아폽토시스 유도, (j) 표적화된 암 세포의 괴사 유도로부터 선택된 1 이상의 효과를 유도하기 위해 효과적인 투여량으로 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다.
특히, 본원에 기재된 방법 및 용도의 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체의 투여시, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 표적화된 세포의 TLR9 수용체에 특이적으로 결합한다. 특히, 일부 실시양태에서, 표적화된 세포와 연관된 항원에 대한 CpG-Ab 면역접합체의 결합은 TLR9 수용체에 대한 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드의 특이적 결합을 용이하게 한다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체의 표적 항원은 TLR9 수용체 근처에 위치한다. 특별한 실시양태에서, 표적 항원 및 TLR9 수용체 둘 다는 표적화된 세포의 세포막 상에 위치한다. 특별한 실시양태에서, 표적 항원 및 TLR9 수용체 둘 다는 표적화된 세포의 세포내 막 상에 위치한다. 특별한 실시양태에서, 표적 항원 및 TLR9 수용체 둘 다는 표적화된 세포의 엔도솜 또는 식포 막 상에 위치한다. 일부 실시양태에서, 표적 항원은 세포막 상에 위치하고 CpG-Ab 면역접합체에 대한 결합시 세포기질 내로의 CpG-Ab 면역접합체의 내부화를 용이하게 한다.
특히, 본원에 기재된 방법 및 용도의 일부 실시양태에서, 방법은 정상 면역 세포를 표적화하는 CpG-Ab 면역접합체의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하되, CpG-Ab 면역접합체의 투여시, 표적화된 세포에서 1 이상의 면역원 시그널링 경로가 활성화된다. 특별한 실시양태에서, 활성화된 시그널링 경로는 핵 인자(NF)- κB 시그널링 경로, c-Jun N-말단 키나아제(JNK) 시그널링 경로, AP1 시그널링 경로, IRF3/7 경로, 및 p38 미토겐-활성화된 단백질 키나아제(MAPK) 시그널링 경로로부터 선택된 1 이상이다. 세포 시그널링 경로의 활성화는 당업계에 알려진 방법을 사용하여, 예컨대, 비제한적으로, 발현이 관심 시그널링 경로의 활성화시 특이적으로 유도되는 분자 마커의 존재를 검출하여 검출될 수 있다.
특히, 본원에 기재된 방법 및 용도의 일부 실시양태에서, 방법은 정상 면역 세포를 표적화하는 CpG-Ab 면역접합체의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하되, CpG-Ab 면역접합체의 투여시, 1 이상의 염증성 사이토카인의 분비가 유도된다. 특별한 실시양태에서, 1 이상의 염증성 사이토카인은 I 형 인터페론(IFN), 인터류킨(IL)-6, IL10, IL-12, IL-18, 및 종양 괴사 인자(TNF)로부터 선택된다.
특히, 본원에 기재된 방법 및 용도의 일부 실시양태에서, 방법은 정상 면역 세포를 표적화하는 CpG-Ab 면역접합체의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하되, CpG-Ab 면역접합체의 투여시, 1 이상의 추가 단백질의 발현이 상향조절된다. 특별한 실시양태에서, 상향조절된 단백질은 항원 제시 분자(예를 들어, MHC 클래스 I 및 II), 사이토카인 수용체(예를 들어, IL-6 수용체, IL-10 수용체, IL-12 수용체, TNF-α 수용체, TNF-β 수용체, IFN-α 수용체, IFN-β 수용체, IFN-γ), 케모카인 수용체(예를 들어, 케모카인 수용체 7), T 세포 공동자극 분자(예를 들어, CD3, CD28, CD27, CD30, CD40, CD80/B7-1, CD86/B7-2, CD134/OX-40, OX-40L, CD137/4-1BB, 4-1BBL, CD278/ICOS, B7-H3, B7h/B7RP-1, LIGHT 등), 및 T 세포 성숙 조절 단백질(예를 들어, 인돌아민 2,3-디옥시게나아제)로부터 선택된 1 이상이다.
특히, 본원에 기재된 방법 및 용도의 일부 실시양태에서, 방법은 정상 면역 세포를 표적화하는 CpG-Ab 면역접합체의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하되, CpG-Ab 면역접합체의 투여시, 정상 면역 세포의 1 이상의 집단의 증식, 분화, 성숙 및/또는 생존이 증가된다. 특별한 실시양태에서, 정상 면역 세포의 1 이상의 증가된 집단은 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 천연 킬러 세포, T 보조 세포, B 세포, 및 APC(mDC를 포함함)로부터 선택된다. 본원에 기재된 방법 및 용도의 일부 실시양태에서, 방법은 정상 면역 세포를 표적화하는 CpG-Ab 면역접합체의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하되, CpG-Ab 면역접합체의 투여시, 정상 면역 세포의 1 이상의 집단의 증식, 분화, 성숙 및/또는 생존이 감소된다. 특별한 실시양태에서, 정상 면역 세포의 1 이상의 감소된 집단은 B-reg 세포 및 T-reg 세포로부터 선택된다.
특별한 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체의 투여시, 항원 제시 활성은 대상체의 APC에서 증가된다. 일부 실시양태에서, APC는 B 세포, 단핵구, 수지상 세포, 및 랑게르한스 세포, 각질형성세포, 내피 세포, 별아교세포, 섬유아세포, 및 희돌기교세포로부터 선택된다. 특별한 실시양태에서, APC는 B 세포이다. 특별한 실시양태에서, APC는 수지상 세포이다. 특별한 실시양태에서, APC는 대식세포이다. 일부 실시양태에서, 수지상 세포는 pDC이다. 특별한 실시양태에서, 증가된 항원 제시 활성은 활성화된 APC에 의한 종양 연관 항원의 더욱 효율적인 제시를 야기한다.
특별한 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체의 투여시, 치료 또는 예방되는 암의 1 이상의 종양 연관 항원에 대한 항원-특이적 CD4+ T 세포 매개된 면역력이 증가된다. 특별한 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체의 투여시, CD4+ T 세포에 의한 종양 침윤이 증가된다. 특별한 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체의 투여시, 치료 또는 예방되는 암의 1 이상의 종양 연관 항원에 대한 항원-특이적 CD8+ T 세포 매개된 면역력이 증가된다. 특별한 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체의 투여시, CD8+ T 세포에 의한 종양 침윤이 증가된다. 특별한 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체의 투여시, 치료 또는 예방되는 암의 1 이상의 종양 연관 항원에 대해 특이적인 면역글로불린의 B 세포 분비가 증가된다.
특히, 본원에 기재된 방법 및 용도의 일부 실시양태에서, 방법은 질환에 걸린 세포를 표적화하는 CpG-Ab 면역접합체의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하되, CpG-Ab 면역접합체의 투여시, 1 이상의 세포사멸 시그널링 경로는 표적화된 질환에 걸린 세포의 아폽토시스를 촉발시키도록 유도된다. 일부 실시양태에서, 질환에 걸린 세포는 암 세포이다.
특히, 본원에 기재된 방법 및 용도의 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 대상체에서 보체계를 활성화시키기 위해 효과적이지 않은 양으로 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 대상체에서 보체 C1을 활성화시키기 위해 효과적이지 않은 양으로 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 대상체에서 보체 C3을 활성화시키기 위해 효과적이지 않은 양으로 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 보체 활성화는 당업계에 알려진 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 일부 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 대상체에서 항체-의존성 세포-매개된 세포독성을 유도하기 위해 CpG-Ab 면역접합체의 항체 부위에 대해 효과적이지 않은 양으로 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다.
본원에 기재된 바와 같이, CpG-함유 폴리뉴클레오티드를 포함하는 치료제, 접합체 또는 조성물은 암을 예방 또는 치료하기 위한 적어도 하나의 추가 치료제와 조합되어 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 병용 요법은 치료제 단독의 별도의 효과에 비해 양호한 상승작용 치료 효과를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 이러한 병용 요법은 치료제 단독의 별도의 효과의 합에 비해 양호한 상승작용 치료 효과를 나타낸다.
따라서, 특정 양태에서, 본원은 적어도 하나의 추가 암 치료제와 조합된 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드를 사용하여 암을 예방 또는 치료하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 방법은 (i) CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드의 치료적 유효량, 및 (ii) 적어도 하나의 추가 암 치료제의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 특별한 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 독립형 폴리뉴클레오티드로서 투여된다. 특별한 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 CpG-Ab 면역접합체로서 투여된다. 특별한 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드 및 추가 치료제는 동일한 조성물로 제형화된다. 다른 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드 및 추가 치료제는 별도의 조성물로 제형화된다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 추가 암 치료제는 T 세포 작용제, 면역 체크포인트 조절제, STING 작용제, RIG-I 작용제, 다른 톨-유사 수용체 작용제로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 추가 암 치료제는 T 세포 공동자극 분자이다. 일부 실시양태에서, T 세포 공동자극 분자는 OX40, CD2, CD27, CDS, ICAM-1, LFA-1/CD11a/CD18, ICOS/CD278, 4-1BB/CD137, GITR, CD30, CD40, BAFFR, HVEM, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3, 및 CD83, 또는 이의 리간드로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 공동자극 분자의 리간드는 공동자극 분자에 특이적으로 결합하는 항체이다. 특별한 실시양태에서, 추가 암 치료제는 항-OX40 항체, 항-OX40L 항체, 항-ICOS 항체, 항-CTLA4 항체, 항-CD40L 항체, 항-CD28 항체, 항-LFA1 항체, 항-TIM1/TIM3 항체, 항-PD1 항체, 항-PDL1 항체, 항-CD27 항체 및 항-4-1BB 항체로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 추가 암 치료제는 상기 방법으로 예방 또는 치료되는 암에 의해 생산된 종양 연관 항원이다. 일부 실시양태에서, 예방 또는 치료되는 암은 백혈병, 림프종, 흑색종, 대장암, 유방암, 전립선암, 신장암, 췌장암, 두경부암, 피부암, 및 뇌암, 폐암이고, 종양 연관 항원은 CD19, CD20, CD22, CD38, CD138, CD30, CD52, CD56, CD79, CD123, CD206, CD303, CD304, EGFR, 엽산 수용체 알파, 엽산 수용체 베타, 메소텔린, Her2, 트랜스페린 수용체, 및 PSMA로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 추가 암 치료제는 PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3, LAG-3, CEACAM-1, CEACAM-5, CLTA-4, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD47, CD160, 2B4, CD172a, 및 TGFR로부터 선택된 면역 체크포인트 조절제이다. 특별한 실시양태에서, 추가 암 치료제는 PD-1 억제제이다. 특별한 실시양태에서, 추가 암 치료제는 PD-L1 억제제이다. 특별한 실시양태에서, 추가 암 치료제는 CD47 억제제이다. 일부 실시양태에서, 추가 암 치료제는 면역 체크포인트 조절제에 특이적으로 결합하는 항체이다. 일부 실시양태에서, 특별한 실시양태에서, 추가 암 치료제는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 특별한 실시양태에서, 추가 암 치료제는 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 특별한 실시양태에서, 추가 암 치료제는 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 특별한 실시양태에서, 추가 암 치료제는 항-CD172a 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 특별한 실시양태에서, 추가 암 치료제는 항-OX40 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 특별한 실시양태에서, 추가 암 치료제는 항-TIM3 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 특별한 실시양태에서, 추가 암 치료제는 항-LAG3 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 항-PD-1 및 항-PD-L1 항체 및 이의 용도는 예를 들어, US20180030137호, US9815898호, US20170313776호, US20170313774호, US20170267762호, WO2017019846호, WO2018013017호, US20180022809호, US20180002423호, WO2017220990호, WO2017218435호, WO2017215590호, US9828434호, 및 WO2017196867호에 기재되어 있다. 항-CD47 항체 및 이의 용도는 예를 들어, US9663575호, US9803016호, US20170283498호, US20170369572호, WO2017215585호, WO2017196793호, 및 WO2017049251호에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 추가 암 치료제는 STING 경로 작용제이다. STING(stimulator of interferon genes(인터페론 유전자의 자극자)이고, TMEM173, MITA, ERIS, 및 MPYS로도 알려짐)은 사이클릭 디뉴클레오티드(CDN)의 직접 결합에 반응하여 입체구조 변화를 겪어, TBK1 활성화, IRF-3 인산화, 및 IFN-β 및 다른 사이토카인의 생산을 야기하는 ER에 국소화된 막관통성 단백질이다. 종양-체류 숙주 항원 제시 세포에서의 STING 경로는 종양 연관 항원에 대한 자발적 CD8+ T 세포 반응의 유도와 관련된다. 이 경로의 활성화 및 IFN-β의 후속 생산은 또한 항-종양 효과에 기여한다. 일부 실시양태에서, STING 경로 작용제는 ADU-S100이다. 추가 STING 작용제 및 이의 용도는 예를 들어, US20180028553호, US20170319680호, US20170298139호, US20060040887호, US20080286296호, US20120041057호, US20140205653호, WO2014179335호, WO 2014179760호, US20150056224호, WO 2016096174호, WO 2017011444호, WO 2017027645호, 및 WO 2017027646호에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 추가 암 치료제는 RIG-I 경로 작용제이다. RIG-I(retinoic acid-inducible gene-I(레티노산-유도 유전자-I))은 감염의 초기 단계에서 병원성 미생물에 대한 방어를 위해 숙주의 선천적 면역계를 개시하는 패턴-인식 수용체의 멤버이다. (RIG-I)-유사 수용체 패밀리의 3 개의 멤버가 있다: RIG-I, MDA5(melanoma differentiation factor 5(흑색종 분화 인자 5)), 및 LGP2(laboratory of genetics and physiology 2(유전학 및 생리학의 실험실 2)), 이들은 대부분의 세포 및 조직 유형에서 발현된다. RIG-I은 다양한 RNA 바이러스의 인식 및 그 후의 I 형 IFN 생산 및 항바이러스 유전자 발현을 구동하기 위한 후속 시그널링의 활성화를 위한 세포질 센서로서 기능한다. 활성화된 RIG-I은 CARD-CARD-매개된 상호작용을 통해 후속 어댑터 분자 MAVS(IPS-1, CARDIF, 및 VISA로도 알려짐)를 모집한다. 올리고머릭 RIG-I CARD 조립체 및 MAVS의 중합성 제형은 함께 2 개의 분지로의 시그널링의 분기를 매개하는 단백질 복합체에 대한 시그널링 플랫폼으로서 제공된다. 하나의 분지는 종양 괴사 인자 수용체-연관 인자(TRAF)-2/6 및 수용체-상호작용 단백질 1을 모집하여, 그 후에 IKK 복합체를 활성화하여, NF-κB 활성화를 야기한다. 나머지 분지는 TRAF3을 통해 신호를 보내고 TANK/IKKγ/IKKε/TBK1 복합체를 활성화하여, 인터페론 조절 인자(IRF)-3 및 -7의 인산화 및 이합체화를 야기한다. Liu et al., Front Immunol. 2017, 7:662. 이 경로의 활성화는 항-종양 효과에 기여한다. 일부 실시양태에서, RIG-I 경로 작용제는 RGT100이다. RIG-I 작용제 및 이의 용도는 예를 들어, US20170057978호, US20170258897호, US9381208호, US9738680호, US9650427호, WO2017173427호, 및 WO2017011622호에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 추가 암 치료제는 TLR1 작용제, TLR2 작용제, TLR3 작용제, TLR4 작용제, TLR5 작용제, TLR6 작용제, TLR7 작용제, TLR8 작용제, 및 TLR10 작용제로부터 선택되는 톨-유사 수용체이다.
추가 실시양태에서, 암을 치료하는 방법과 관련하여, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 1 이상의 추가 치료제 또는 절차와 조합되어(독립형 형태로 또는 CpG-Ab 면역접합체로서) 투여되며, 예를 들어, 추가 치료제 또는 절차는 화학요법, 표적화된 항-암 요법, 암살상 약물, 세포독성제, 면역-기반 요법, 사이토카인, 수술 절차, 방사선 절차, 공동자극 분자의 활성제, 억제성 분자의 억제제, 백신, 세포 면역요법, 및 암살상 바이러스 요법으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본원에 제공된 바와 같이, CpG-함유 폴리뉴클레오티드(독립형 형태로 또는 CpG-Ab 접합체로서)는 예를 들어, 비-비경구적 또는 비경구적 투여에 의해 투여될 수 있다. 비경구적 투여는 투여의 근육내, 정맥내, 동맥내, 두개내, 피하, 안와내, 심실내, 척추내, 척추강내, 복강내, 직장, 및 국부 경로를 포함할 수 있다. 투여의 국부 경로는 투여의 경피, 피내, 구강, 및 설하 경로를 포함할 수 있다. 약학 조성물은 선택된 투여 경로에 따라 제형화된다. 비경구적 투여는 선택된 기간에 걸친 연속 주입에 의한 것일 수 있다. 특별한 실시양태에서, 투여는 피하, 근육내, 피내, 점막, 질, 자궁경부, 종양-주위, 종양-내, 또는 종양-배출 림프절(들) 내로 직접이다. 폴리뉴클레오티드 및/또는 접합체는 바람직하게는 약학적 허용 담체와 함께 투여된다. 본원에 기재된 장애의 치료를 위해 제형화된 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 및/또는 접합체의 약학 제형이 또한 본 발명의 일부이다.
대상체에게 투여되는 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드(독립형 형태로 또는 CpG-Ab 면역접합체로서)의 실제 투여량은 신체적 및 생리학적 인자, 예컨대 환자의 체중, 병태의 중증도, 치료되는 질환의 유형, 이전 또는 동시발생 치료적 개입, 특발증 및 투여의 경로에 의해 결정될 수 있다. CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드(독립형 형태로 또는 CpG-Ab 면역접합체로서)의 실제 투여량은 단일 용량으로 또는 일련의 순차적인 용량으로 투여될 수 있다. 투여량 및 투여의 경로에 따라, 바람직한 투여량의 투여 수 및/또는 유효량은 대상체의 반응에 따라 달라질 수 있다. 투여를 담당하는 의사는 임의의 경우에, 개별 환자에 대해 조성물 중 활성 성분(들)의 농도, 적절한 용량(들) 및 스케줄(들)을 결정할 것이다.
특정 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 종료점을 포함하여 0.01 mg/체중kg 내지 1000 mg/체중kg의 범위의 투여량의 독립형 형태로 투여된다. 다른 비-제한적인 예에서, 용량은 또한 약 0.01 mg/체중kg 내지 약 0.05 mg/체중kg을 포함할 수 있다. 다른 비-제한적인 예에서, 용량은 또한 투여 당 약 0.01 mg/체중kg, 약 0.05 mg/체중kg, 약 0.1 mg/체중kg, 약 0.2 mg/체중kg, 약 0.3 mg/체중kg, 약 0.4 mg/체중kg, 약 0.5 mg/체중kg, 약 0.6 mg/체중kg, 약 0.7 mg/체중kg, 약 0.8 mg/체중kg, 약 0.9 mg/체중kg, 약 1 mg/체중kg, 약 2 mg/체중kg, 약 3 mg/체중kg, 약 4 mg/체중kg, 약 5 mg/체중kg, 약 6 mg/체중kg, 약 7 mg/체중kg, 약 8 mg/체중kg, 약 9 mg/체중kg, 약 10 mg/체중kg, 약 20 mg/체중kg, 약 30 mg/체중kg, 약 40 mg/체중kg, 약 50 mg/체중kg, 약 60 mg/체중kg, 약 70 mg/체중kg, 약 80 mg/체중kg, 약 90 mg/체중kg, 약 100 mg/체중kg, 약 200 mg/체중kg, 약 300 mg/체중kg, 약 400 mg/체중kg, 약 500 mg/체중kg, 약 600 mg/체중kg, 약 700 mg/체중kg, 약 800 mg/체중kg, 약 900 mg/체중kg, 약 1000 mg/체중kg, 또는 그 이상, 및 이의 유도가능한 임의의 범위를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, CpG-Ab 면역접합체는 종료점을 포함하여, 약 1 ㎍/체중kg 내지 약 500 mg/체중kg의 범위의 투여량으로 투여된다. 다른 비-제한적인 예에서, 용량은 또한 투여당 약 1 ㎍/체중kg, 약 5 ㎍/체중kg, 약 10 ㎍/체중kg, 약 50 ㎍/체중kg, 약 100 ㎍/체중kg, 약 200 ㎍/체중kg, 약 350 ㎍/체중kg, 약 500 ㎍/체중kg, 약 1 mg/체중kg, 약 5 mg/체중kg, 약 10 mg/체중kg, 약 50 mg/체중kg, 약 100 mg/체중kg, 약 200 mg/체중kg, 약 350 mg/체중kg, 약 500 mg/체중kg, 약 1000 mg/체중kg 또는 그 이상, 및 이의 유도가능한 임의의 범위를 포함할 수 있다. 본원에 열거된 수치로부터 유도가능한 범위의 비-제한적인 예에서, 상기 기재된 수치를 기본으로 하여 약 5 mg/kg/체중 내지 약 100 mg/kg/체중, 약 5 ㎍/kg/체중 내지 약 500 mg/kg/체중 등의 범위가 투여될 수 있다.
특별한 실시양태에서, CpG-Ab 접합체는 각각의 용량이 투여 당 약 3 mg/kg/체중인 3 회 순차 용량으로 투여된다. 특별한 실시양태에서, CpG-Ab 접합체는 각각의 용량이 투여 당 약 10 mg/kg/체중인 3 회 순차 용량으로 투여된다. 특별한 실시양태에서, 순차 용량은 48 시간 간격으로 수행된다.
본원에 제공된 바와 같이, 병용 요법은 2 이상의 치료제의 투여를 포함한다. 이러한 투여는 실질적으로 동시의 방식의, 예컨대 활성 성분의 고정된 비를 갖는 단일 제형으로의 또는 각각의 치료제에 대해 별도의 제형(예를 들어, 캡슐 및/또는 정맥내 제형)으로의 이들 치료제의 공동-투여를 포함한다. 또한, 이러한 투여는 동시이거나 순차적인 각각의 유형의 약제의 투여를 포함하기도 한다. 이러한 투여는 또한 상이한 위치에서 또는 상이한 투여 경로를 통해(예를 들어, 종양내로 및/또는 전신으로) 투여될 수 있는 별도의 제형으로서 제형화되는 각각의 성분을 포함한다. 임의의 경우에, 병용 요법의 치료 요법은 본원에 기재된 병태 또는 장애를 치료하는데 유익한 효과를 제공하기 위해 담당 의사에 의해 결정될 수 있다.
특정 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드 또는 CpG-Ab 면역접합체는 적어도 하나의 추가 암 치료제의 투여와 대략 동일한 시간에 투여된다. 비-제한적인 예로서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드 또는 CpG-Ab 면역접합체 및 적어도 하나의 추가 암 치료제의 투여는 동시, 예컨대 서로 30 분 이내, 서로 25 분 이내, 서로 20 분 이내, 서로 15 분 이내, 서로 10 분 이내, 서로 5 분 이내, 또는 서로 1 분 이내일 수 있다.
특정 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드 또는 CpG-Ab 면역접합체는 적어도 하나의 추가 암 치료제와 순차적으로 투여된다. 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드 또는 CpG-Ab 면역접합체는 적어도 하나의 추가 암 치료제의 투여 전에 투여된다. 일부 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드 또는 CpG-Ab 면역접합체는 적어도 하나의 추가 암 치료제의 투여 후에 투여된다. 비-제한적인 예로서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드 또는 CpG-Ab 면역접합체 및 적어도 하나의 추가 암 치료제의 투여는 서로 적어도 30 분, 서로 적어도 1 시간, 서로 적어도 6 시간, 서로 적어도 12 시간, 서로 적어도 24 시간, 서로 적어도 36 시간, 서로 적어도 48 시간, 서로 적어도 3 일, 서로 적어도 1 주, 서로 적어도 2 주, 또는 서로 적어도 1 개읠 동안 분리될 수 있다.
특정 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 면역 체크포인트 조절제의 투여 전에 투여된다. 이러한 방법에서, 면역 체크포인트 조절제는 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드 투여의 48 시간 이내, 예컨대 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드 투여의 적어도 또는 적어도 약 또는 약 또는 5 분, 15 분, 30 분, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 12 시간, 16 시간, 18 시간, 20 시간, 22 시간, 24 시간, 30 시간, 36 시간, 40 시간 또는 48 시간 이내에 투여될 수 있다. 일부 방법 및 용도에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 면역 체크포인트 조절제 투여 전 각각 포함하여 6 시간 내지 30 시간 또는 12 시간 내지 24 시간에 투여된다. 특정 실시양태에서, 면역 체크포인트 조절제는 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드 투여의 3 일, 4 일, 5 일, 7 일, 2 주, 3 주, 또는 4 주 이내에 투여될 수 있다. 투여의 타이밍 및 순서는 필요한 경우, 특정 면역 체크포인트 조절제에 대해 경험적으로 결정될 수 있다. 이들 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 독립형 형태로 또는 CpG-Ab 면역접합체로서 투여될 수 있다.
특정 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드 및 면역 체크포인트 조절제 둘 다는 일련의 순차 용량을 통해 투여된다. 특별한 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드의 제1 용량 및 면역 체크포인트 조절제의 제1 용량은 동시에 투여되고, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드의 후속 용량(들) 및 면역 체크포인트 조절제의 후속 용량(들)은 순차적으로 투여된다. 이들 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 독립형 형태로 또는 CpG-Ab 면역접합체로서 투여될 수 있다.
특정 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 T 세포 작용제의 투여 전에 투여된다. 이러한 방법에서, T 세포 작용제는 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드 투여의 48 시간 이내, 예컨대 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드 투여의 적어도 또는 적어도 약 또는 약 또는 5 분, 15 분, 30 분, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 12 시간, 16 시간, 18 시간, 20 시간, 22 시간, 24 시간, 30 시간, 36 시간, 40 시간 또는 48 시간 이내에 투여될 수 있다. 일부 방법 및 용도에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 T 세포 작용제의 투여 전 각각 포함하여 6 시간 내지 30 시간 또는 12 시간 내지 24 시간에 투여된다. 특정 실시양태에서, T 세포 작용제는 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드 투여의 3 일, 4 일, 5 일, 7 일, 2 주, 3 주, 또는 4 주 이내에 투여될 수 있다. 투여의 타이밍 및 순서는 필요한 경우, 특정 T 세포 작용제에 대해 경험적으로 결정될 수 있다. 이들 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 독립형 형태로 또는 CpG-Ab 면역접합체로서 투여될 수 있다.
특정 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드 및 T 세포 작용제 둘 다는 일련의 순차 용량을 통해 투여된다. 특별한 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드의 제1 용량 및 T 세포 작용제의 제1 용량은 동시에 투여되고, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드의 후속 용량(들) 및 T 세포 작용제의 후속 용량(들)은 순차적으로 투여된다. 이들 실시양태에서, CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 독립형 형태로 또는 CpG-Ab 면역접합체로서 투여될 수 있다.
자가면역 질환의 치료
TLR9를 길항하는 것은 전-염증성 사이토카인의 분비를 감소시키는 것을 도울 수 있다. 따라서, 본 발명의 면역억제 폴리뉴클레오티드 및 이의 접합체는 전-염증성 사이토카인의 과잉발현이 특징인 질환(예를 들어, 자가면역 질환)의 치료에서 유용할 수 있다. 자가면역 질환의 비-제한적인 예는 건선, 류마티스 관절염, 낭창, 길랭-바레(Guillain-Barre) 증후군, 혈관염, 중증 근무력증, 강직성 척추염, 용혈성 빈혈, 결절성 다발동맥염, 특발성 혈소판감소성 자반, 항인지질 항체 증후군, 원발성 담즙성 경변증, 크론병(Crohn's disease), 궤양성 대장염, 자가면역 간염, 피부경화증, 피부근육염, 및 원형 탈모이다.
약학 조성물
면역조절 폴리뉴클레오티드의 전달은 당업자에게 알려진 다양한 방법을 사용하여 세포를 면역조절 폴리뉴클레오티드 또는 접합체와 접촉시킴으로써 달성될 수 있다. 특별한 실시양태에서, 본 발명의 면역조절 폴리뉴클레오티드 또는 접합체는 약학적 허용 부형제 및/또는 약학적 허용 담체를 포함한 약학 조성물로서 제형화될 수 있다. 약학 조성물은 액체 또는 고체(예를 들어, 동결건조) 형태로 있을 수 있다.
인간 사용을 위해, 본 발명의 면역조절 폴리뉴클레오티드 또는 접합체는 단독으로 또는 의도된 투여 경로 및 표준 제약 실습에 대해 선택된 약학적 담체와 혼합되어 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 약학 조성물은 약학적으로 사용될 수 있는 제제로의 본 발명의 접합체 처리를 용이하게 하는 1 이상의 생리학적 허용 담체, 부형제, 및 보조제를 사용하여 종래 방식으로 제형화될 수 있다.
자주 사용되는 담체 또는 부형제는 당류(예를 들어, 락토오스, 만니톨), 유단백질, 젤라틴, 전분, 비타민, 셀룰로오스 및 이의 유도체, 폴리(에틸렌 글리콜) 및 용매, 예컨대 살균수, 알코올, 글리세롤, 및 다가 알코올을 포함한다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양분 첨가액을 포함할 수 있다. 다른 약학적 허용 담체는 수용액, 비-독성 부형제를 포함하며, 이는 예를 들어 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., Gennaro, Ed., Lippencott Williams & Wilkins (2005), 및 The United States Pharmacopeia: The National Formulary (USP 36 NF31), published in 2013에 기재된 바와 같은 염, 보존제, 완충액 등을 포함한다. 약학 조성물의 다양한 성분의 pH 및 정확한 농도는 당업계의 일상적인 관행에 따라 조정될 수 있다. Goodman and Gilman's, the Pharmacological Basis for Therapeutics를 참고한다.
본 발명의 약학 조성물 제조시, 활성 성분은 통상적으로 부형제(예를 들어, 동결건조된 제형)와 혼합되거나 부형제에 의해 희석된다. 부형제가 희석제로서 제공될 때, 이는 고체, 반고체, 또는 액체 물질(예를 들어, 인사염-완충 생리식염수)일 수 있으며, 이는 활성 성분에 대한 비히클, 담체 또는 배지로서 작용한다. 따라서, 조성물은 정제, 분말, 엘릭시르제, 현탁액, 에멀전, 용액, 및 시럽의 형태로 있을 수 있다. 당업계에 알려진 바와 같이, 희석제의 유형은 의도된 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 생성된 조성물은 추가 약제, 예를 들어 보존제를 포함할 수 있다. 제형은 추가로 윤활제, 예를 들어 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 미네랄 오일; 습윤제; 유화제 및 현탁제; 보존제, 예를 들어 메틸- 및 프로필하이드록시-벤조에이트; 감미제; 및 향미제를 포함할 수 있다. 다른 예시적 부형제는 Handbook of Pharmaceutical Excipients, 6th Edition, Rowe et al., Eds., Pharmaceutical Press (2009)에 기재되어 있다. 보존제는 항미생물제, 항산화제, 킬레이트제, 및 불활성 가스를 포함할 수 있다.
이들 약학 조성물은 종래의 방식으로, 예를 들어 종래의 혼합, 용해, 과립화, 드라제-제조, 세정, 유화, 캡슐화, 포획, 또는 동결건조 공정에 의해 제조될 수 있다. 제형을 제조하기 위한 당업계에 잘 알려진 방법은 예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., Gennaro, Ed., Lippencott Williams & Wilkins (2005), 및 Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York에서 발견된다. 적절한 제형은 선택된 투여 경로에 의존한다. 이러한 조성물의 제형 및 제제는 약학 제형의 당업자에게 잘 알려져 있다. 제형을 제조시, 폴리뉴클레오티드 또는 접합체는 밀링되어, 다른 성분과 조합되기 전에 적절한 입자 크기를 제공할 수 있다.
투여의 경로
본 발명의 약학 조성물은 국소로 또는 전신으로 투여될 수 있다. 치료적 유효량은 인자, 예컨대 대상체에서 질환 진행의 정도, 개인의 연령, 성별, 및 체중에 따라 달라질 것이다. 투여량 요법은 최적의 치료 반응을 제공하기 위해 조정될 수 있다. 예를 들어, 몇몇의 분할된 용량이 매일 투여되거나, 용량은 치료 상황의 위급에 의해 나타낸 바와 비례하여 감소될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 투여의 선택된 경로에 따라 다양한 형태로 환자에게 투여될 수 있다. 본원에 기재된 방법에서 사용되는 폴리뉴클레오티드 및/또는 접합체는 예를 들어, 비경구적 투여에 의해 투여될 수 있다. 비경구적 투여는 근육내, 정맥내, 동맥내, 두개내, 피하, 안와내, 심실내, 척추내, 척추강내, 복강내, 직장, 및 국부 투여 경로를 포함할 수 있다. 국부 투여 경로는 경피, 피내, 구강, 및 설하 투여 경로를 포함할 수 있다. 약학 조성물은 선택된 투여 경로에 따라 제형화된다. 비경구적 투여는 선택된 기간에 걸친 연속 주입에 의한 것일 수 있다. 폴리뉴클레오티드 및/또는 접합체는 바람직하게는 약학적 허용 담체와 함께 투여된다. 본원에 기재된 장애의 치료를 위해 제형화된 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 및/또는 접합체의 약학 제형은 또한 본 발명의 일부이다.
비경구적 투여를 위한 제형
본원에 기재된 본 발명의 면역조절(예를 들어, 면역자극) 폴리뉴클레오티드 및/또는 접합체는 본원에 기재된 바와 같은 약학적 허용 비경구적(예를 들어, 정맥내, 근육내, 또는 피하) 제형으로 이를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있다. 약학 제형은 또한 종래의 비-독성 약학적 허용 담체 및 아쥬반트를 함유하는 투여량 형태 또는 제형으로 비경구적으로(예를 들어, 정맥내로, 근육내로, 또는 피하로) 투여될 수 있다. 특히, 비경구적 투여를 위해 적합한 제형은 항산화제, 완충액, 세균 발육 저지제 및 환자의 혈액과 등장성인 제형이 되게 하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비-수성 살균 주사액; 및 현탁제 및 비후제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 살균 현탁액을 포함한다. 예를 들어, 이러한 조성물을 제조하기 위해, 본 발명의 면역조절 폴리뉴클레오티드 또는 접합체는 비경구적으로 허용 가능한 액체 비히클 내에 용해 또는 현탁될 수 있다. 사용될 수 있는 허용 가능한 비히클 및 용매 중에는, 물, 적절한 양의 염산, 수산화나트륨 또는 적합한 완충액(예를 들어, 인산염 완충 생리식염수)의 첨가에 의해 적합한 pH로 조정된 물, 1,3-부탄디올, 링거액(Ringer's solution) 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 수성 제형은 또한 1 이상의 보존제, 예를 들어 메틸, 에틸 또는 n-프로필 p-하이드록시벤조에이트를 함유할 수 있다. 비경구적 제형에 관한 추가 정보는 예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 미국 약전-국민의약품집(United States Pharmacopeia-National Formulary)(USP-NF)에서 찾아볼 수 있다.
본 발명의 접합체의 비경구적 제형은 비경구적 투여를 위해 적합한 것으로서 USP-NF에 의해 확인된 제제의 4 개의 일반적인 유형 중 임의의 하나일 수 있다:
(1) "주사용 약물": 약물 주사와 같은 비경구적 투여를 위해 적절한 살균 비히클과 조합될 건조(예를 들어, 동결건조) 고체로서의 약물 물질(예를 들어, 본 발명의 접합체);
(2) "약물 주사가능 에멀전": 적합한 에멀전 배지 내에 용해 또는 분산되는 약물 물질(예를 들어, 본 발명의 접합체)의 액체 제제;
(3) "약물 주사가능 현탁액": 적합한 액체 배지에 현탁된 약물 물질(예를 들어, 본 발명의 접합체)의 액체 제제; 및
(4) "주사가능 현탁액용 약물": 약물 주사가능 현탁액과 같은 비경구적 투여를 위해 적절한 살균 비히클과 조합될 건조 고체로서의 약물 물질(예를 들어, 본 발명의 접합체).
비경구적 투여를 위한 예시적 제형은 계면활성제, 예를 들어 하이드록시프로필셀룰로오스와 적합하게 혼합된 물에서 제조된 폴리뉴클레오티드 및/또는 접합체의 용액을 포함한다. 분산액은 또한 알코올이 있거나 없는 글리세롤, 액체 폴리(에틸렌 글리콜), DMSO 및 이의 혼합물 중, 및 오일 중에서 제조될 수 있다. 저장 및 사용의 일상 조건 하에서, 이들 제제는 보존제를 함유하여, 미생물의 성장을 예방할 수 있다. 적합한 제형의 선택 및 제조를 위한 종래의 절차 및 성분은 예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., Gennaro, Ed., Lippencott Williams & Wilkins (2005) 및 The United States Pharmacopeia: The National Formulary (USP 36 NF31), published in 2013에 기재되어 있다.
생체적합성, 생분해성 락티드 중합체, 락티드/글리콜라이드 공중합체, 또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체가 사용되어, 폴리뉴클레오티드 및/또는 접합체의 방출을 제어할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 및/또는 접합체에 대해 다른 잠재적으로 유용한 비경구적 전달 시스템은 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체 입자, 삼투압 펌프 또는 이식 가능한 주입 시스템을 포함한다. 비경구적 제형은 폴리뉴클레오티드 및/또는 접합체의 즉시 방출 또는 지연된/연장된 방출을 위해 제형화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 또는 접합체의 비경구적 방출을 위한 예시적 제형은 수용액, 재구성용 분말, 공용매 용액, 오일/물 에멀전, 현탁액, 미소구체, 및 중합성 겔을 포함한다.
다음 실시예는 본 발명을 예시할 것이다. 이들은 본 발명을 임의의 방식으로 제한하지 않을 것이다.
실시예
실시예 1. 뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드의 합성 및 정제
면역조절 폴리뉴클레오티드의 예시적 합성물 및 이를 위한 전구체가 하기에 기재된다.
전구체
본 발명의 폴리뉴클레오티드의 제조에 유용한 전구체는 WO 2015/188197호에서 제공된다(예를 들어, PEG 쇄를 함유하는 포스포르아미다이트, 표적화 모이어티, 및 생체내가역성기).
포스포르아미다이트 및 다른 모노머
본 발명의 폴리뉴클레오티드의 합성에 유용한 뉴클레오시드-함유 중간물은 WO 2015/188197호에 개시되어 있다(예를 들어, WO 2015/188197호의 화합물 U1-U54, A1-A15, C1-9, 및 G1-G12).
상업적으로 이용 가능한 포스포르아미다이트를 Glen Research(Sterling, VA) 또는 ChemGenes(Wilmington, MA)에서 구매하였다. 필요할 때, 다른 포스포르아미다이트를 본원의 다른 곳에 기재된 표준 반응 조건을 사용하여 적절하게 보호된 뉴클레오시드로부터 제조하였다.
화합물 S61B
Figure pct00337
DCM(5.0 mL) 중 S61(0.48 g, 2.0 mmol)의 용액에 S61A(0.60 g, 2.0 mmol) 및 ETT(아세토니트릴 중 0.25 M, 4.8 mL, 1.2 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 2 시간 동안 교반하였다. 휘발물의 증발은 잔류물을 제공하였으며, 이를 에틸아세테이트/헥산을 사용한 플래시 실리카 겔 칼럼 정제(Combi Flash Rf 기구 상 0-30% 구배)에 적용하여, 무색 오일로서 화합물 S61B(0.49 g, 55%)를 얻었다. 31P NMR (202MHz, CDCl3; ppm): δ147.83 (s).
화합물 S108
Figure pct00338
디옥산(100 mL) 중 2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에탄올(S108A, 25.0 g, 167 mmol) 및 N-메틸 모르폴린(21.0 mL, 191 mmol)의 교반 혼합물에 디옥산(50 mL) 중 Fmoc-OSu(62.2 g, 184 mmol)의 용액을 적하하여 첨가하였다. 밤새 교반한 후에, 반응물을 진공내(in vacuo)에서 농축시켜, 담황색 오일을 제공하였다. 미가공물을 EtOAc에 재-용해시키고 포화 NaHCO3(aq.) 및 염수로 세척하였다. 유기층을 진공내에서 제거하여 오일을 제공하였으며, 이를 SiO2 크로마토그래피에 의해 정제하여, FmocNH-PEG2-OH(S108, 55 g, 88% 수율)를 제공하였다. ESI+ m/z 계산값 371.4, 결과값 372.2 [M+H]+.
X1 및 X2 비염기 스페이서 합성 - 일반 계획:
Figure pct00339
화합물 S110
Figure pct00340
0℃의 아르곤 하의 THF(40 mL) 중 NaH(13.2 g, 미네랄 오일 중 60%, 230.0 mmol)의 현탁액에 THF(20 mL) 중 디올(S109, 4.92 g, 22.0 mmol)의 용액을 적하하여 첨가하였으며; 생성된 혼합물을 실온까지 승온시키고 1 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고, THF(25 mL) 중 프로파르길 브로마이드(18.6 g, 158.4 mmol)의 용액을 천천히 첨가하였으며, 생성된 혼합물을 실온까지 승온시키고 밤새 40℃에서 교반하였다. 생산물을 TLC에 의해 관찰된 바와 같이 소모시킨 후에, 반응물을 0℃의 물의 적하 첨가에 의해 켄칭시켰으며, 생성된 혼합물을 디클로로메탄(50 mL x 2)으로 추출하였다. 조합된 유기층을 염수로 세척하고 무수 Na2SO4 상에서 건조하고, 여과, 및 증발시켜, 잔류물을 얻었으며, 이를 ISCO companion(헥산/에틸 아세테이트, 0 - 30%)을 사용한 플래시 실리카 겔 칼럼에 의해 정제하여, 오일로서 5.92 g(89.5%)의 화합물 S110을 얻었다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3; ppm): δ7.49-7.47 (dd, J 8.0, 1.5 Hz, 2H), 7.38-7.34 (m, 3H), 5.43 (s, 1H), 4.21 (d, J 2.5 Hz, 2H), 4.12 (t, J 2.5 Hz, 4H), 4.10 (s, 1H), 3.91 (s, 1H), 3.89 (s, 1H), 3.37 (s, 2H); C18H20O4에 대한 ESI MS 계산값 300.34, 관찰값 [M+H]+ 301.3.
화합물 S111
Figure pct00341
비스-프로파르길 화합물 S110(5.9 g, 19.64 mmol)을 아세트산/물 혼합물(60 mL, 75:25)에 용해시키고, 반응을 50℃에서 2 시간 동안 계속하였다. 반응의 완료 후, 용액을 증발시키고 톨루엔(2 x 20 mL)으로 공동-증발시켰다. 잔류물을 ISCO companion(헥산/에틸 아세테이트, 20 - 80%)을 사용한 플래스 실리카 겔 칼럼을 사용하여 임의의 정밀검사 없이 직접 정제하여, 오일로서 3.02 g(72.5%)의 화합물 S111을 얻었다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3; ppm): δ4.15 (d, J 2.5 Hz, 4H), 3.68 (s, 4H), 3.59 (s, 4H), 2.44 (t, J 2.5 Hz, 2H), 2.30-2.40 (br, 2H); C11H16O4에 대한 ESI MS 계산값 212.24, 관찰값 [M+H]+ 213.2.
화합물 S112
Figure pct00342
0℃의 디클로로메탄(25 mL) 중 디올 S111(3.0 g, 14.2 mmol), N,N-디이소프로필에틸아민(3.15 mL, 17.0 mmol), 및 DMAP(0.36 g, 2.83 mmol)의 용액에 디클로로메탄(40 mL) 중 디메톡시트리틸 클로라이드(4.8 g, 14.2 mmol)의 용액을 적하하여 첨가하고, 반응을 실온에서 밤새 계속하였다. 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고 물에 이어 염수로 세척하였으며, 유기층을 무수 Na2SO4 상에서 건조하고, 여과, 및 증발시켰다. 생성된 잔류물을 ISCO companion(헥산/에틸 아세테이트, 0 - 40%)을 사용한 플래시 실리카 겔 칼럼에 의해 정제하여, 백색 고체로서 5.29 g(73%)의 모노 DMT 보호된 화합물 S112를 얻었다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3; ppm): δ7.4-7.42 (m, 2H), 7.32-7.31 (m, 4H), 7.28-7.25 (m, 2H), 6.84-6.81 (m, 4H), 4.09 (d, J 2.5 Hz, 4H), 3.79 (s, 6H), 3.67 (d, J 6.0 Hz, 2H), 3.64-3.56 (m, 4H), 3.13 (s, 2H), 2.39 (t, J 2.5 Hz, 2H); C32H34O6에 대한 ESI MS 계산값 514.6, 관찰값 [M+Na]+ 537.4.
화합물 S113
Figure pct00343
디클로로메탄(4 mL) 중 DMT-보호된 화합물 S112(0.5 g, 0.98 mmol)의 용액에 실온의 디클로로메탄(3 mL) 중 2'-시아노에틸-N,N,N',N'-테트라이소프로필 포스포르아미다이트(0.58 g, 1.95 mmol)의 용액에 이어, 아르곤 분위기 하의 5-벤질티오-1H-테트라졸(BTT; 아세토니트릴 중 0.25 M 용액, 0.78 mL, 0.18 mmol)을 적하하여 첨가하였다. 반응을 출발 물질이 소멸될 때까지(2 시간) 계속하였으며, 미가공 혼합물을 20 mL의 디클로로메탄으로 희석하고, 포화된 NaHCO3 용액(10 mL) 및 염수(10 mL)로 순차적으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조하였다. 용매를 진공내에서 증발시키고, 미가공 혼합물을 공동-용매로서 3% 트리에틸아민을 갖는 에틸 아세테이트/헥산을 사용한 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(Combi Flash Rf 기구 상 0-30% 구배)에 의해 정제하여, 오일로서 0.53 g의 화합물 S113(75%)을 얻었다. C41H51N2O7P에 대한 ESI MS 계산값 714.82, 관찰값 715.6 [M+H]+; 31P NMR (202MHz, CDCl3): δ147.89.
화합물 S114
Figure pct00344
아르곤 분위기 하의 8.0 mL의 건조 디클로로메탄 중 DMT-보호된 화합물 S112(0.98 g, 1.9 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(0.39 mL, 2.09 mmol)의 -78℃ 용액에 비스-(N,N-디이소프로필아미노)-클로로포스핀(0.56 g, 2.09 mmol)의 디클로로메탄(4.0 mL) 용액을 적하하여 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온까지 승온시키는 한편, 교반을 1 시간 동안 계속하였다. 2.0 mL의 건조 디클로로메탄 중 3-부틴-1-올(0.14 g, 1.9 mmol)의 용액을 실온에서 첨가하였으며; 생성된 혼합물을 10 분 동안 교반하고, 그 시간에 아세토니트릴(4.6 mL, 1.15 mmol) 중 ETT의 0.25 M 용액을 첨가하고, 교반을 추가 3 시간 동안 계속하였다. 반응의 완료 후, TLC에 의해 출발 물질의 소멸에 의해 관찰된 바와 같이, 미가공 혼합물을 20 mL의 디클로로메탄으로 세척하고 포화된 NaHCO3 용액(10 mL) 및 염수(10 mL)로 순차적으로 세척하고 무수 Na2SO4 상에서 건조하였다. 휘발물을 진공내에서 증발시키고, 미가공 혼합물을 용매 시스템으로서 3% 트리에틸아민을 갖는 에틸 아세테이트/헥산을 사용한 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(Combi Flash Rf 기구 상 0-40% 구배)에 의해 정제하여, 오일로서 0.33 g의 화합물 S114(25%)를 얻었다. C42H52NO7P에 대한 ESI MS 계산값 713.83, 관찰값 714.7 [M+H]+; 31P NMR (202MHz, CDCl3): δ146.89.
X3 및 X4 비염기 스페이서 합성 - 일반 계획:
Figure pct00345
화합물 S116
Figure pct00346
화합물 S116을 화합물 S110에 대해 기재된 프로토콜을 사용하여 91% 수율로 오일로서 제조하였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3; ppm): δ7.51 (d, J 7.5 Hz, 2H), 7.37-7.32 (m, 3H), 5.56 (s, 1H), 3.37-3.35 (m, 4H), 4.10-4.07 (dd, J 13.0 Hz, J 2.5 Hz, 2H), 3.65-3.64 (m, 1H), 2.43-2.42 (t, J 6.5 Hz, 1H); C13H14O3에 대한 ESI MS 계산값 218.24, 관찰값 [M+H]+ 219.2.
화합물 S117
Figure pct00347
화합물 S117을 화합물 S111에 대해 기재된 프로토콜을 사용하여 91% 수율로 오일로서 제조하였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3; ppm): δ4.33 (s, 2H), 3.83-3.70 (m, 5H), 2.48 (s, 1H), 2.04 (br, 2H); C6H10O3에 대한 ESI MS 계산값 130.14, 관찰값 [M+Na]+ 153.0.
화합물 S118
Figure pct00348
화합물 S118을 화합물 S112에 대해 기재된 프로토콜을 사용하여 54% 수율로 백색 고체로서 제조하였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3; ppm): δ7.43 (d, J 7.5 Hz, 2H), 7.37-7.27 (m, 5H), 7.23-7.16 (m, 2H), 6.83 (d, J 9.0 Hz, 3H), 6.78-6.76 (dd J 8.5 Hz, 1H), 4.35-4.22 (m, 2H), 3.77 (s, 6H) 3.76-3.72 (m, 2H), 3.71-3.64 (m, 1H), 3.27-3.19 (m, 2H), 2.48 (t, J 4.5 Hz, 1H), 2.03-1.96 (m, 1H); C27H28O5에 대한 ESI MS 계산값 432.50, 관찰값 [M+Na]+ 455.4.
화합물 S119
Figure pct00349
화합물 S119를 화합물 S113에 대해 기재된 프로토콜을 사용하여 86% 수율로 오일로서 제조하였다. C36H45N2O6P에 대한 ESI MS 계산값 432.72, 관찰값 433.5 [M+H]+; 31P NMR (202MHz, CDCl3): δ149.05, 148.96.
화합물 S120
Figure pct00350
화합물 S120을 화합물 S114에 대해 기재된 프로토콜을 사용하여 47% 수율로 오일로서 제조하였다. C37H46NO6P에 대한 ESI MS 계산값 431.73, 관찰값 432.5 [M+H]+; 31P NMR (202MHz, CDCl3): δ147.80, 147.71.
X5 및 X6 비염기 스페이서 합성 - 일반 계획:
Figure pct00351
화합물 S121
Figure pct00352
디옥산(25 mL) 중 S116(4.0 g, 22.2 mmol)의 용액에 최소량의 물에 용해된 KOH(0.12 g, 2.2 mmol)의 용액을 첨가하고, 생성된 혼합물을 적어도 30 분 동안 실온에서 교반하였다. 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 디옥산(15 mL) 중 아크릴로니트릴(2.35 g, 44.4 mmol)의 용액을 적하하여 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 반응시켰다. 휘발물을 진공내에서 증발시키고, 잔류물을 물로 희석하였으며, pH를 중성 근처로 조정하였다. 미가공 생산물을 에틸 아세테이트(2 x 50 mL)로 추출하고, 조합된 유기층을 염수로 세척하고 무수 Na2SO4 상에서 건조하고, 여과, 및 증발시켜, 잔류물을 얻었으며, 이를 ISCO companion(디클로로메탄/메탄올, 0 - 5%)을 사용한 플래시 실리카 겔 칼럼에 의해 정제하여, 백색 고체로서 3.1 g(60%)의 화합물 S121을 얻었다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3; ppm): δ7.49 (d, J 7.0 Hz, 2H), 7.36-7.34 (m, 3H), 5.56 (s, 1H), 3.36 (d, J 13.0 Hz 2H), 4.10-4.07 (dd, J 13.0 Hz, J 2.0 Hz, 2H), 3.84 (t, J 6.5 Hz, 2H), 3.42 (m, 1H), 3.69 (t, J 6.5 Hz, 2H); C13H15NO3에 대한 ESI MS 계산값 233.2, 관찰값 [M+Na]+ 256.3.
화합물 S122
Figure pct00353
0℃의 THF(10 mL) 중 리튬 알루미늄 하이드라이드(0.83 g, 4.0 mmol)의 현탁액에 THF(15 mL) 중 화합물 S121(1.28 g, 5.5 mmol)의 용액을 적하하여 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온까지 승온시켰으며, 교반을 3 시간 동안 계속하였다. 반응의 완료 후, 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고 필요한 물(약 2-3 mL)의 적하 첨가에 의해 켄칭시켰다. 추가의 약 8 mL이 물을 첨가하고, 미가공 생산물을 에틸 아세테이트(2 x 25 mL) 내로 추출하였다. 조합된 유기층을 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조하고, 여과, 및 증발시켜, 화합물 S122를 얻었으며, 이를 다음 단계에서 추가 정제 없이 사용하였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3; ppm): δ7.49 (d, J 7.0 Hz, 2H), 7.40-7.32 (m, 3H), 5.55 (d, J 5.0 Hz, 1H), 4.34 (d, J 13.0 Hz, 1H), 4.20-4.11 (dd, J 12.0 Hz 4H), 4.05-4.03 (d, J 13.0 Hz, J 2.0 Hz, 1H), 3.66-3.62 (m, 2H), 3.27 (m, 1H), 2.86 (t, J 6.5 Hz, 1H), 2.16 (br, 2H); C13H19NO3에 대한 ESI MS 계산값 237.2, 관찰값 [M+H]+ 238.2.
화합물 S123
Figure pct00354
0℃의 디클로로메탄(8 mL) 중 화합물 S122(1.0 g, 4.2 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(2.3 mL, 12.6 mmol)에 Fmoc-OSu(1.7 g, 5.0 mmol)의 용액을 적하하여 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 반응시켰다. 완료 후, 반응 혼합물을 디클로로메탄(10 mL)으로 희석하고 물에 이어 염수로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조하고, 여과, 및 증발시켜, 잔류물을 얻었다. 잔류물을 ISCO companion(헥산/에틸 아세테이트, 0 - 50%)을 사용한 플래시 실리카 겔 칼럼에 의해 정제하여, 백색 고체로서 0.65 g(35%)의 화합물 S123을 얻었다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3; ppm): δ7.75 (d, J 7.5 Hz, 2H), 7.58 (d, J 7.5 Hz, 2H), 7.51 (d, J 7.5 Hz, 2H), 7.37 (t, J 7.5 Hz, 2H), 7.31-7.26 (m, 5H), 5.57 (s, 1H), 5.48 (br, 1H), 4.46-4.32 (m, 4H), 4.15 (d, J 7.0 Hz, 1H), 4.06 (t, J 12.5 Hz 2H), 3.67 (m, 2H), 3.54 (m, 2H), 3.41 (s, 1H), 1.88 (t, J 6.0 Hz, 2H); C28H29NO5에 대한 ESI MS 계산값 459.5, 관찰값 [M+Na]+ 482.5.
화합물 S124
Figure pct00355
화합물 S124를 화합물 S111에 대해 기재된 프로토콜을 사용하여 오일로서 정량적 수율로 제조하였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3; ppm): δ7.76 (d, J 7.5 Hz, 2H), 7.58 (d, J 7.5 Hz, 2H), 7.39 (t, J 7.5 Hz, 2H), 7.32 (t, J 7.5 Hz, 2H), 5.18 (br, 1H), 4.44 (d, J 6.5 Hz, 2H), 4.21 (t, J 6.5 Hz, 1H), 4.76-4.73 (dd, J 11.5, 3.5 Hz 2H), 3.67-60 (m, 4H), 3.42 (m, 1H), 3.37 (br, 2H), 2.07 (m, 2H), 1.75 (br, 2H); C21H25NO5에 대한 ESI MS 계산값 371.4, 관찰값 [M+Na]+ 394.3.
화합물 S125
Figure pct00356
화합물 S125를 화합물 S112에 대해 기재된 프로토콜을 사용하여 48%의 생산물(S125) 수율로 백색 고체로서 제조하였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3; ppm): δ7.75 (t, J 7.5 Hz, 2H), 7.58 (t, J 7.5 Hz, 2H), 7.40-7.38 (m, 3H), 7.32-27 (m, 7H), 7.18-7.16 (m, 3H), 6.83 (t, J 7.0 Hz, 4H), 5.16 (br, 1H), 4.44 (d, J 6.5 Hz, 2H), 4.20 (m, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.79 (m, 1H), 3.76 (s, 3H), 3.74 (m, 2H), 3.66-3.62 (m, 4H), 3.43-3.37 (m, 2H), 2.31 (br, 1H), 1.76 (br, 2H); C42H43NO7에 대한 ESI MS 계산값 673.7, 관찰값 [M+Na]+ 696.7.
화합물 S126
Figure pct00357
화합물 S126을 화합물 S113에 대해 기재된 프로토콜을 사용하여 78%의 생산물(S126) 수율로 오일로서 제조하였다. C51H60N3O8P에 대한 ESI MS 계산값 874.0, 관찰값 896.9 [M+Na]+, 913.0 [M+K]+; 31P NMR (202MHz, CDCl3; ppm): δ148.90, 148.76.
비염기 스페이서 S131 의 합성 - 일반 계획:
Figure pct00358
화합물 S127
Figure pct00359
아르곤 하의 디클로로메탄(50 mL) 중 S109(2.56 g, 11.4 mmol)의 용액에 브로모아세토니트릴(3.01 g, 25.1 mmol), 은(I) 산화물(5.28g, 22.8 mmol), 및 테트라부틸암모늄 요오다이드(0.84 g, 2.28 mmol)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 밤새 교반하였다. 혼합물을 Celite® 상에서 여과하고, 여과물을 증발시켜, 흑색 잔류물을 얻었으며, 이를 ISCO companion(헥산/에틸 아세테이트, 15 - 90%) 상의 플래시 실리카 겔 칼럼 정제에 적용하여, 점성 오일로서 1.34 g(39%)의 소망하는 화합물 S127을 얻었다. C16H18N2O4에 대한 ESI MS 계산값 302.3, 관찰값 [M+H]+ 303.3.
화합물 S128
Figure pct00360
THF(30 mL) 중 화합물 S127(1.34g, 4.43 mmol)의 용액에 아르곤 하의 THF(2M, 8.9 mL, 17.7 mmol) 중 LiAlH4의 용액을 첨가하고, 혼합물을 55℃로 4 시간 동안 가열하였다. THF(2M, 4 mL, 8.0 mmol) 중 LiAlH4의 다른 부분을 첨가하고, 교반을 4 시간 동안 계속하였다. 반응의 완료 후, 혼합물을 실온으로 냉각시키고 Na2SO4.10H2O로 켄칭시켰다. 고체를 여과 제거하고 에틸 아세테이트로 세척하였다. 여과물을 무수 Na2SO4 상에서 건조하였다. 혼합물을 여과하고 증발시켜, 잔류물을 얻었으며, 이를 디클로로메탄(20mL)에 용해시켰다. 이 용액에 Fmoc-OSu(1.5g, 4.43 mmol) 및 DIEA(0.87 mL, 5.0 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 1 시간 동안 교반한 다음에, 증발시켜, 잔류물을 얻었으며, 이를 ISCO companion(헥산/에틸 아세테이트, 20 - 90%) 상의 플래시 실리카 겔 칼럼 정제에 적용하여, 백색 폼(foam)으로서 1.04 g(31%)의 화합물 S128을 얻었다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3; ppm): δ7.75 (4H, dd, J 7.5, 4.5 Hz), 7.58 (4H, t, J 7.0 Hz), 7.48 (2H, d, J 7.0 Hz), 7.41-7.34 (7H, m), 7.32-7.26 (4H, m), 5.44 (1H, s), 5.15-5.05 (2H, m), 4.44 (2H, d, J 5.5 Hz), 4.38 (2H, d, J 6.0 Hz), 4.25-4.15 (2H, m), 4.10 (2H, d, J 11.5 Hz), 3.82 (2H, d, J 11.5 Hz), 3.78 (2H, s), 3.53 (2H, s), 3.42 (2H, s), 3.36-3.27 (4H, m), 3.25 (2H, s); C46H46N2O8에 대한 ESI MS 계산값 754.9, 관찰값 [M+H]+ 755.3.
화합물 S129
Figure pct00361
화합물 S128(1.1 g, 1.51 mmol)을 AcOH/H2O 혼합물(10 mL, 3:1)에 용해시키고, 반응을 55℃에서 5 시간 동안 계속하였다. 반응의 완료 후에, 휘발물을 증발시키고 톨루엔(2x 20 mL)으로 공동-증발시켰으며, 잔류물을 ISCO companion(헥산/에틸 아세테이트, 30 - 100%) 상의 플래시 실리카 겔 칼럼 정제에 적용하여, 백색 폼으로서 0.54 g(54%)의 화합물 S129를 얻었다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3; ppm): δ7.75 (4H, d, J 7.5 Hz), 7.58 (4H, d, J 7.5 Hz), 7.39 (4H, t, J 7.5 Hz), 7.30 (4H, t, J 7.5Hz), 5.20-5.05 (2H, m), 4.41 (4H, d, J 6.5 Hz), 4.21 (4H, t, J 6.5 Hz), 3.64 (4H, s), 3.48 (8H, s), 3.36 (4H, s); C39H42N2O8에 대한 ESI MS 계산값 666.7, 관찰값 [M+H]+ 667.3.
화합물 S130
Figure pct00362
0℃의 디클로로메탄(6 mL) 중 디올 S129(0.73g, 1.1 mmol), DIPEA(0.19 mL, 1.1 mmol) 및 DMAP(0.013 g, 0.11 mmol)의 용액에 디클로로메탄(1mL) 중 DMTrCl(0.34 g, 0.99 mmol)의 용액을 적하하여 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온까지 승온시키고 밤새 교반하였다. 혼합물을 증발시켜, 잔류물을 얻었으며, 이를 ISCO(헥산/에틸 아세테이트, 20 - 100%) 상의 플래시 실리카 겔 칼럼 정제에 적용하여, 백색 폼으로서 0.47 g(44%)의 모노 디메톡시트리틸 보호된 화합물 S130을 얻었다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3; ppm): δ7.75 (4H, d, J 7.5 Hz), 7.58 (4H, d, J 7.5 Hz), 7.39 (4H, t, J 7.5 Hz), 7.32-7.25 (8H, m), 7.17 (4H, d, J 6.5 Hz), 6.83 (4H, d, J 6.5 Hz), 5.20-5.05 (2H, m), 4.41 (4H, d, J 6.5 Hz), 4.21 (4H, t, J 6.5 Hz), 3.82 (6H, s), 3.64 (4H, s), 3.48 (8H, s), 3.36 (4H, s); C60H60N2O10에 대한 ESI MS 계산값 969.1, 관찰값 [M+Na]+ 991.3.
화합물 S131
Figure pct00363
건조 CH2Cl2(1.0 mL) 중 비스-(N,N-디이소프로필아미노)-클로로포스핀(0.085 g, 0.32 mmol)의 용액을 -78℃의 건조 CH2Cl2(3.0mL) 중 3-Fmoc-아미노-프로판-1-올(0.090 g, 0.30 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(0.18 mL, 1.05 mmol)의 용액에 적하하여 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온까지 승온시키고 1.5 시간 동안 교반하였다. 1.0 mL의 건조 CH2Cl2 중 화합물 S130(0.30 g, 0.30 mmol)의 용액을 첨가하고, 생성된 혼합물을 10 분 동안 교반하였다. ETT(0.72 mL, 아세토니트릴 중 0.25M, 0.18 mmol)의 용액을 반응 혼합물에 첨가하고, 생성된 혼합물을 3 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 CH2Cl2(20mL)로 희석하고 포화된 수성 소듐 바이카보네이트(20mL) 및 염수(20mL)로 세척하였다. 유기층을 무수 소듐 설페이트 상에서 건조하고, 여과물을 진공내에서 증발시켜, 잔류물을 제공하였으며, 이를 공동-용매 시스템으로서 3% 트리에틸아민을 갖는 에틸 아세테이트/헥산을 사용한 ISCO companion 상의 플래시 실리카 겔 칼럼 정제(0-30% 구배)에 적용하여, 백색 폼으로서 0.12 g의 생산물 S131(32%)을 얻었다. C84H91N4O13P에 대한 ESI MS 계산값 1395.6, 관찰값 1395.7[M]+; 31P NMR (202MHz, CDCl3): δ146.41.
화합물 dT4
Figure pct00364
FmocNH-PEG2-하이드록실-디이소프로필아미노-dT(5'-DMT) 포스포르아미다이트 (dT4) 의 합성. CH2Cl2(40 mL) 중 5'-DMT-데옥시티미딘(4.30 g, 7.89 mmol) 및 DIEA(1.51 mL, 8.68 mmol)의 교반 현탁액을 아르곤 하에서 -78℃로 냉각하였다. CH2Cl2(10 mL) 중 비스(디이소프로필아미노)클로로포스핀(2.32 g, 8.68 mmol)의 용액을 적하하여 첨가하였다. 혼합물을 냉각조로부터 제거하고 1 시간 동안 교반하였다. CH2Cl2(15 mL) 중 FmocNH-Peg2-OH(S108, 2.93 g, 7.89 mmol)를 반응 혼합물에 이어 ETT(아세토니트릴 중 0.25 M, 18.9 mL)의 용액에 첨갛였다. 밤새 교반한 후, 혼합물을 진공내에서 농축시키고, EtOAc에 재-용해시키고, 포화 NaHCO3(aq.) 및 염수로 세척하였다. 유기층을 진공내에서 제거하여, 백색 폼을 제공하였다. 이 미가공 물질을 SiO2 크로마토그래피에 의해 정제하여, 제목의 포스포르아미다이트(dT4, 4.1 g, 50% 수율)를 제공하였다.
상기 기재된 합성 프로토콜을 다양한 트리에스터의 다른 포스포르아미다이트 전구체의 합성을 위해 사용하였다.
화합물 dU6
Figure pct00365
실온의 Ar(g) 하의 THF(10 mL) 중 dU1(3.3 g, 5.0 mmol), 1-메틸이미다졸(1.2 mL, 15.0 mmol) 및 요오드(1.9 g, 15.0 mmol)의 용액에 THF(5 mL) 중 tert-부틸디메틸실릴 클로라이드(0.8 g, 5.5 mmol)의 용액을 교반하면서 적하하여 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. TLC로 반응 완료를 확인하였다. 용매를 진공내에서 제거하였으며, 미가공물을 에틸 아세테이트에 용해시키고 Aq. Na2S2O3(conc)로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4 상에서 건조하고, 여과하였으며 리큐어(liquor)를 증발시켰다. 미가공물을 ISCO companion(헥산/에틸 아세테이트, 0-50%)을 사용한 플래시 실리카 겔 칼럼에 의해 정제하여, 고체로서 dU2를 정량적 수율로 얻었다. NMR은 간행물 Nucleic Acids Research, 2011, Vol. 39, No. 9, 3962-3971과 일치한다.
트리이소프로필실란(1.0 mL, 5.0 mmol)을 갖는 80% 수성 아세트산 용액(40 mL)에 용해된 dU2(3.9 g, 5.0 mmol)의 용액을 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. TLC로 반응 완료를 확인하였다. 용매를 진공내에서 제거하였다. 미가공물을 ISCO companion(헥산/에틸 아세테이트, 0-60%)을 사용한 플래시 실리카 겔 칼럼에 의해 정제하여, 고체로서 1 g(43 %)의 소망하는 화합물 dU3을 얻었다. C15H25IN2O5Si에 대한 ESI MS 계산값 468.4, 관찰값 [M+Na]+ 491.0.
Ar(g) 하에서 얼음 수조에서 0℃로 냉각된 THF(20 mL) 중 dU3(1.0 g, 2.2 mmol)의 용액에 소듐 하이드라이드(60% 분산, 0.2 g, 4.7 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 30 분 동안 0℃에서 교반하였다. 요오도메탄(0.7 mL, 10.8 mmol)을 적하하여 첨가하고 반응물을 0℃에서 3 시간 동안 교반하였다. RP-HPLC/MS로 반응 완료를 확인하였다. 반응물을 0℃의 메탄올 20 mL로 켄칭시켰으며 실온까지 승온시켰다. Aq. NaHCO3(포화)를 첨가하고 혼합물을 CH2Cl2로 추출하였다. 유기상을 Na2SO4 상에서 건조하고, 여과시켰으며 리큐어를 진공내에서 농축시켰다. 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(헥산/에틸 아세테이트, 0-50%)에 의한 정제는 고체 dU4(0.6 g, 58 % 수율)를 제공하였다. C16H27IN2O5Si에 대한 ESI MS 계산값 482.4, 관찰값 [M+H]+ 483.1.
Ar(g) 하에서 THF(20 mL)에 용해된 dU4(0.6 g, 1.3 mmol)의 냉각된(0℃) 용액에 Tert-부틸암모늄 플루오라이드(1 M THF, 3 mL, 3.0 mmol)를 교반하면서 적하하여 첨가하였다. 냉각된 용액을 30 분 동안 교반한 다음에, 실온으로 승온시켰다. 3.5 시간 후에, RP-HPLC/MS는 반응 완료를 확인하였다. 미가공 생산물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(디클로로메탄/메탄올, 0-10%)에 의해 정제하여, 고체 dU5(0.4 g, 92 % 수율)를 제공하였다.C10H13IN2O5에 대한 ESI MS 계산값 368.1, 관찰값 [M+H]+ 369.0.
실온의 Ar(g) 하의 디클로로메탄(5 mL) 중 용액 dU5(0.4 g, 1.2 mmol)에 디클로로메탄(5 mL) 중 2'-시아노에틸-N, N, N', N'-테트라이소프로필 포스포르아미다이트의 용액(0.4 mL, 1.3 mmol)을 교반하면서 적하하여 첨가하였다. 반응물을 실온에서 30 분 동안 교반하였다. 그 다음에, 에틸티오테트라졸(ACN 중 0.25 M 용액, 2.9 mL, 0.7 mmol)을 첨가하고 반응을 밤새 계속하였다. TLC로 반응 완료를 확인하였다. 용매를 진공내에서 제거하고 미가공 혼합물을 20 mL의 디클로로메탄으로 희석하였으며, 이어서 포화된 NaHCO3 용액(10 mL) 및 염수(10 mL)로 세척하였다. 건조된 유기상을 Na2SO4 상에서 건조하고, 여과시켰으며 리큐어를 증발시켰다. 미가공 혼합물을 에틸 아세테이트에 용해시키고 ISCO companion(헥산/에틸 아세테이트, 0-100%)을 사용한 실리카 겔 칼럼에 의해 정제하여, 고체로서 0.3 g(49.9%)의 소망하는 화합물 dU6을 얻었다. C19H30N4O6P에 대한 ESI MS 계산값 568.3, 관찰값 567.3 [M-H]-; 31P NMR(202MHz, CDCl3, ppm): δ149.25.
화합물 dU9
하기에 나타낸 표준 반응 조건 하에서 dU3을 반응시킴으로써 제목의 화합물을 제조하였다. 31P-NMR (202 mHz, CDCl3, ppm): δ149.42, 149.31; MS ESI- m/z 결과값 667.1 [M-H]. MS ESI+ m/z 결과값 669.2 [M+H], 691.3 [M+Na].
Figure pct00366
보조 모이어티에 결합된 링커의 제조
화합물 PP2, PP3, 및 PP4
Figure pct00367
(5-아지도발레릴)-ε-N-Boc 리신( PP1 )의 제조. ε-N-Boc 리신(9.46 g, 38.4 mmol) 및 K2CO3(2.67 g, 19.3 mmol)을 1:1 THF:H2O(60 mL)에 용해시켰다. THF(10 mL) 중 펜타플루오로페닐-5-아지도발레레이트(10.8 g, 34.9 mmol)를 첨가하고, 반응물을 밤새 실온에서 교반하였다. 소망하는 생성물을 RP-HPLC-MS에 의해 관찰하였다, 394.2 [M+Na]. 반응물을 1N HCl(aq.)로 적정함으로써 pH 5로 산성화하고, 생산물을 EtOAc(3 x 100 mL)로 추출하였다. 유기층을 H2O(50 mL) 및 염수(50 mL)로 순차적으로 세척하였다. 유기층을 MgSO4 상에서 건조하고 진공내에서 두꺼운 시럽으로 농축시켰다. 미가공 생산물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여, 백색 침상(needle)으로서 소망하는 생산물 PP2(8.1 g, 62% 수율)를 제공하였다. ESI MS+ 질량 계산값 C16H29N5O5: 371.4, 결과값: 394.2 [M+Na] +.
PP1 의 페길화를 위한 일반 프로토콜: (5-아지도발레릴)-ε-N-(NH-Boc PEG24) 리신( PP4 )의 제조. PP1(0.74 g, 2.0 mmol)를 HCl(2 mL, 디옥산 중 4N)로 4 시간 동안 처리하였다. HPLC-MS는 완전 탈보호, 272.2 [M+H] +를 나타내었다. 반응물을 1:1 H2O:아세토니트릴(10 mL)로 희석하고, 냉동시키고, 밤새 동결건조하여, 백색 고체로서 PP2를 정량적 수율로 제공하였다. DMF(3 mL) 중 NHBoc-PEG24 산(1.1 g, 0.88 mmol)을 HATU(0.34 g, 0.88 mmol), HOBt(0.14 g, 0.88 mmol), 및 DIEA(0.7 mL, 4.0 mmol)로 활성화시킨 다음에, PP2(0.24 g, 0.8 mmol)로 2 시간 동안 처리하였다. RP-HPLCMS는 소망하는 PP4의 형성을 나타내었다. 미가공물을 RP-HPLC에 의해 정제하여, 백색 고체로서 PP4(0.55 g, 46 % 수율)를 제공하였다. ESI MS+ 질량 계산값 C67H130N6O30: 1499.77, 결과값: 1499.9 [M+H] +, 1400.8 [M-Boc]+.
Figure pct00368
비스PegX-NH2 및 트리스PegX-NH2(상기 식에서, X = 다양한 PEG 길이)를 WO2015/188197호에 기재된 절차를 사용하여 상업적으로 이용 가능한 출발 물질로부터 제조하였다.
PP2 , PP3 , 및 PP4 의 페길화를 위한 일반 프로토콜: DMF(1 mL)에 용해된 리신 PP1(38 mg, 0.1 mmol)을 HATU(37 mg, 0.1 mmol), N,N-디이소프로필에틸아민(49 mL, 0.3 mmol), 및 mPEG48-NH2(200 mg, 0.09 mmol)로 처리하였다. RP-HPLC-MS는 PP1에 대한 완전 PEG48 첨가를 나타내었다. 미가공물을 RP-HPLC에 의해 정제하여, 백색 고체로서 NHBoc PP7(97 mg, 42% 수율)을 제공하였다. ESI MS+ 질량 계산값 C113H224N6O52: 2499.03, 결과값: 833.7 [M+3H]3+, 625.6 [M+4H]4+. PP7을 HCl(2 mL, 디옥산 중 4N)로 4 시간 동안 탈보호시켰다. HPLC-MS는 출발 물질의 질량을 갖는 피크의 소멸에 의해 관찰된 바와 같이, 완전 탈보호를 나타내었다. 반응물을 1:1 H2O:아세토니트릴(10 mL)로 희석하고, 냉동시키고, 밤새 동결건조하여, 정량적으로 백색 고체 PP8을 제공하였다. ESI MS+ 질량 계산값 C108H216N6O50: 2398.88, 결과값: 1199.8 [M+2H]2+, 800.3 [M+3H]3+, 600.5 [M+4H]4+, 480.6 [M+5H]5+.
Figure pct00369
이 계획에서, 조건은
A) 6-메틸테트라진-OSu, HATU, 휘니그 염기(
Figure pct00370
), DMF; 및
B) DBCO-CpG, 아세토니트릴/H2O이되;
6-메틸 테트라진-OSu가 다음 식의 것이고:
Figure pct00371
,
DBCO-CpG가 다음 식의 것이다:
Figure pct00372
.
폴리뉴클레오티드가 로딩된 링커( PP28 및 PP30 )의 제조를 위한 일반 프로토콜.
PP12 및 PP16 의 테트라진-접합 처리: PP12(43 mg, 0.12 mmol)를 DMF(0.5 mL)에 용해시키고, HATU(4.6 mg, 0.12 mmol), DIEA(12.7 μL, 0.73 mmol)로, 5 분 후, 6-메틸-테트라진-OSu(19.9 mg, 0.61 mmol)로 처리하였다. 미가공 반응물을 실온에서 30 분 동안 교반하였다. RP-HPLCMS는 PP12에 대한 6-메틸-테트라진 카복실레이트의 완전 커플링을 나타내었다. 미가공물을 RP-HPLC에 의해 정제하고, 통합 분획을 동결건조하여, 자색 고체로서 PP27(39 mg, 85 % 수율)을 제공하였다. ESI MS+ 질량 계산값 C170H325N11O76: 3739.47, 확인값: 833.7 [M+3H]3+, 625.6 [M+4H]4. 순수 PP27을 아세토니트릴:물(1:1) 중 DBCO-CpG에서 처리하고 37℃에서 1-2 시간 동안 및 추가 1 시간 동안 실온에서 항온처리하여, PP28을 얻었다. PP28을 예비 AEX(20 mM 포스페이트 및 20 mM 포스페이트-1M 소듐 브로마이드)에 의해 정제하였다.
CpG 로딩된 링커 PP28 및 PP30 으로의 대안적 원-포트(one-pot) 경로. PP12(400 nmol)를 아세토니트릴:물(1:1) 중 DBCO-CpG(420 nmol)로 처리하고 37℃에서 1-2 시간, 그 다음에 추가 1 시간 동안 실온에서 항온처리하였다. DMSO 저장액 중 테트라진-OSu(4000 nmol)를 미가공 PP12-DBCO-CpG 용액에 첨가하고 자색 용액을 3 시간 동안 실온에서 1-2 시간 동안 반응시켜, PP28을 제공하였다. 미가공물 PP28을 예비 RP-HPLC(수중 50 mM TEAA 및 10% 아세토니트릴:물) 또는 예비 AEX(20 mM 포스페이트 및 20 mM 포스페이트-1M 소듐 브로마이드)에 의해 정제하였다.
Figure pct00373
테트라진-PEG24-OPFP( PP32 )의 제조. Ar(g) 하의 DMF/물(1:1, 12 mL) 중 아미노-PEG24-카복실산(1.0 g, 0.9 mmol) 및 디이소프로필에틸아민(0.8 mL, 4.4 mmol)의 용액에 DMF(3 mL) 중 메틸테트라진페닐아세틸 석신이미딜 에스터(370 mg, 1.1 mmol)를 교반하면서 적하하여 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. RP-HPLC/MS는 생산물의 형성을 나타내었다. 용매를 진공내에서 제거하고 미가공물을 RP-HPLC(TFA 변형제)에 의해 정제하여, PP31, 1.1 g(80%)을 제공하였다. C62H111N5O27에 대한 ESI MS 계산값 1358.56, 관찰값 [M+H]+ 1358.8. Ar(g) 하의 디클로로메탄(3 mL) 중 PP31(109 mg, 0.08 mmol)의 용액에 무수 피리딘(32 mg, 0.4 mmol) 및 펜타플루오로페닐 트리플루오로아세테이트(67 mg, 0.24 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 용매를 진공내에서 제거하였다. 미가공 생산물을 EtOAc에 재용해시키고 aq. NaHCO3(5% w/v)(3x) 및 염수(1x)로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4 상에서 건조하고, 여과하고, 진공내에서 농축시켜, PP32를 정량적으로 얻었다. 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다. C68H110F5N5O27에 대한 ESI MS 계산값 1524.61, 관찰값 [M+2H]2+ 763.0.
Figure pct00374
PP34 의 제조. Ar(g) 하의 DMF/물(1:1, 10 mL) 중 mPEG48-아민(2.15 g, 1.00 mmol) 및 디이소프로필에틸아민(0.87 mL, 5.00 mmol)의 용액에 DMF(5 mL) 중 Nα-Cbz-Nε-Boc-L-리신 석신이미딜 에스터(570mg, 1.2 mmol)를 교반하면서 적하하여 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. RP-HPLC/MS는 생산물, PP33의 형성을 나타내었다. 반응 혼합물을 진공내에서 농축시키고 실리카 겔 크로마토그래피(CH2Cl2:MeOH 0-10%)에 의해 정제하였다. 회수된 PP33을 다음 반응에서 직접 사용하였다. C116H223N3O53에 대한 ESI MS 계산값 2508.0, 관찰값 [M+3H]3+ 836.7, [M+4H]4+ 627.9. MeOH 중 PP33(1.00 mmol)의 용액을 질소(g)로 씻어내고, 활성화된 탄소 상의 팔라듐(10 중량%, 촉매)을 첨가하였다. 용액을 교대로 배출시키고 수소(g)(3X)로 퍼지시켰다. 2 시간 후의 RP-HPLC/MS는 PP34의 형성을 나타내었다. 이종 혼합물을 셀라이트 층을 통해 여과하고 방대한 양의 메탄올로 세척하였다. 진공내에서 용매의 제거는 PP34(2.0 g, 84% 수율, 2 단계에 걸침)를 산출하였다. C108H217N3O51에 대한 ESI MS 계산값 2373.87, 관찰값 [M+3H]3+ 792.0.
Figure pct00375
PP37 의 제조. Ar(g) 하의 DMF/물(1:1, 10 mL) 중 PP32(124 mg, 0.08 mmol) 및 디이소프로필에틸아민(31 mg, 0.24 mmol)의 용액에 DMF/물(1:1, 10 mL) 중 PP34(230 mg, 0.1 mmol)를 교반하면서 적하하여 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2 시간 동안 교반하였으며 RP-HPLC/MS는 생산물 PP35의 형성을 나타내었다. 용매를 진공내에서 제거하였으며 PP35를 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다. C170H326N8O77에 대한 ESI MS 계산값 3714.4, 관찰값 [M+4H]4+ 929.5, [M+5H]5+ 743.8. 미가공 PP35(0.08 mmol)를 Ar(g) 하에서 HCl(디옥산 중 4 N, 5 mL)로 처리하였다. 반응물을 실온에서 2 시간 동안 교반하였으며 RP-HPLC/MS는 Boc 보호기의 완전 제거를 나타내었다. 용매를 진공내에서 제거하고 아민을 DMF(5 mL) 중 비스-Peg3-PFP 에스터(230 mg, 0.4 mmol) 및 디이소프로필에틸아민(140 uL, 0.8 mmol)의 용액으로 아실화하였다. 2 시간 후, RP-HPLC/MS는 생산물 PP37의 형성을 나타내었다. 용매를 진공내에서 제거하고 미가공물을 RP-HPLC(TFA 변형제)에 의해 정제하여, 테트라-TFA 염으로서 PP37 31 mg을 8.7% 수율로 제공하였다. C181H333F5N8O81에 대한 ESI MS 계산값 4012.56, 관찰값 [M+3H]3+ 1338.3, [M+4H]4+ 1004.0, [M+5H]5+ 803.4, [M+6H]6+ 669.
보조 모이어티를 함유하는 링커의 목록:
Figure pct00376
Figure pct00377
Figure pct00378
상기 표에서, Y 또는 Z로서 확인된 기는 다음 구조를 갖는다:
Figure pct00379
상기 표에서, "p313 + N3-발레르아마이드"로서 확인된 기 Z는 Z로서 p313과 N3-발레르아마이드를 갖는 링커 사이의 부가환화 반응의 생산물을 지칭한다.
표 1에 나타낸 포스포르아미다이트 모노머를 본원 및 WO 2015/188197호에 기재된 표준 합성 절차를 사용하여 합성하였다.
키랄 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 합성에서 사용된 비사이클릭 옥사자포스폴리딘 모노머를 Wada, J. Am. Chem. Soc. 130:16031-16037, 2008에 의해 보고된 바와 같은 문헌 프로토콜을 사용하여 제조하였다.
Figure pct00380
Figure pct00381
Figure pct00382
Figure pct00383
Figure pct00384
Figure pct00385
Figure pct00386
Figure pct00387
Figure pct00388
키랄 비염기 스페이서 - 화합물 X7, X8, X9 및 X10:
Figure pct00389
X7 및 X8 합성:
Figure pct00390
X9 및 X10 합성:
Figure pct00391
다음은 당업계에 알려진 방법 및 본원에 기재된 방법을 사용하여 제조될 수 있는 추가 친수성 뉴클레오시드 포스포르아미다이트이다:
Figure pct00392
,
상기 식에서, R은 OH, 선택적으로 치환된 아미노, 또는 -CO2R1(R1은 H 또는 반대이온임)이고, n은 1 내지 4의 정수이며;
Figure pct00393
,
상기 식에서, R은 OH, OAc, OMe, 선택적으로 치환된 아미노, 또는 CO2R1(R1은 H 또는 반대이온임)이고, n은 1 내지 51의 정수이다.
다음은 당업계에 알려진 방법 및 본원에 기재된 방법을 사용하여 제조될 수 있는 추가 치환된 뉴클레오시드 포스포르아미다이트이다:
Figure pct00394
상기 식에서, R 및 R1 각각은 독립적으로 H 또는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬(예를 들어, Me, Et, i-Pr, 또는 n-Bu)이다.
다음 포스포르아미다이트는 Glen Research(Sterling, VA) 또는 ChemGenes(Wilmington, MA)에서 구매하거나 본원에 기재된 표준 프로토콜을 사용하여 제조하였다:
Figure pct00395
이들 중간물은 본 발명의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 5'-말단 변형된 뉴클레오시드를 함유하는 폴리뉴클레오티드)의 제조에서 사용될 수 있다. 5'-말단 변형된 뉴클레오시드의 비-제한적인 예는 5-할로우리딘, 5-알키닐우리딘, 5-헤테로아릴우리딘, 및 5-할로시티딘이다.
5'- 캡핑:
a) 5'-5'-캡핑:
Figure pct00396
b) 5'-포스페이트 또는 포스포로티오에이트 캡핑:
Figure pct00397
소분자-기반 표적화 모이어티의 합성
소분자-기반 표적화 모이어티의 제조를 위해 유용한 예시적 화합물은 WO 2015/188197호에 기재되어 있다(예를 들어, WO 2015/188197호에 기재된 화합물 M1-M30).
글루시톨 보조 모이어티의 합성
글루시톨-기반 보조 모이어티의 제조를 위해 유용한 예시적 화합물은 WO 2015/188197호에 기재되어 있다(예를 들어, WO 2015/188197호에 기재된 화합물 POH1-POH10).
일반 폴리뉴클레오티드 합성:
일반 계획:
Figure pct00398
실험 상세내용:
자동화된 폴리뉴클레오티드 합성(1 μmol 스캐일)을 다음 시약 및 용매를 이용하여 MerMade 6 또는 12 상에서 수행하였다:
산화제 - THF/피리딘/H2O 중 0.02M I2(사이클 당 60 초 산화),
황화 시약 II - 디티아졸 유도체/피리딘/아세토니트릴(6:4 피리딘:아세토니트릴 중 0.05 M)(사이클 당 60 초)
탈블록 - 3% 트리클로로아세트산(사이클 당 2x 40 초 탈블록),
캡 혼합 A - THF/2,6-루티딘/Ac2O(사이클 당 60 초 캡핑), 및
캡 혼합 B - THF 중 16% 메틸 이미다졸(사이클 당 60 초 캡핑).
표준 폴리뉴클레오티드 합성 조건에 대한 예외는 다음과 같다:
- Uny-링커로 지칭되는 비-뉴클레오시드 링커를 갖는 CPG 지지체를 사용하였다.
- 출발 물질의 용해도에 따라 변형된 2'-데옥시-포스포르아미다이트 중 일부를 THF/아세토니트릴 혼합물(1:4) 중 100 mM로 용해시킨 것을 제외하고, 모든 2'-데옥시리보오스-포스포르아미다이트를 합성 전에 100% 무수 아세토니트릴 중 100 mM로 재현탁하였다.
- 포스포르아미다이트 활성화를 2.5 배 몰 과량의 5-벤질티오-1H-테트라졸(BTT)로 수행하였다. 활성화된 2'-데옥시리보오스-포스포르아미다이트를 삽입 당 2x 1 분 커플링 동안 결합하였으며 변형된 포스포르아미다이트를 삽입 당 2x 3 분 커플링 동안 결합하였다.
- 백본의 황화를 피리딘/아세토니트릴(6:4) 중 0.05 M 황화 시약 II로 1 분 동안 수행하였다.
폴리뉴클레오티드 탈보호 & 정제 프로토콜:
자동화된 폴리뉴클레오티드 합성 후, 고체 지지체 및 염기 보호기(예컨대, A-Bz, C-Ac, G-iBu 등) 및 포스포트리에스터의 메틸 에스터를 절단하고 1 mL의 AMA(메탄올 중 1:1 비의 36% aq. 암모니아 및 40% 메틸아민)에서 2 시간 동안 또는 실온 이상에서 탈-보호시킨 후 원심 증발시켰다.
미가공 폴리뉴클레오티드 펠릿을 100 μL의 50% 아세토니트릴에 재현탁하고, 65℃로 간단하게 가열하고 완전히 볼텍싱(vortex)시켰다.
폴리뉴클레오티드 정제를 위해, 100 μL 미가공 폴리뉴클레오티드를 다음 완충액/구배와 함께 RP-HPLC 상에 주입하였다:
- 완충액 A = 수중 50 mM TEAA;
- 완충액 B = 90% 아세토니트릴; 및
- 유속 = 1 mL/분;
- 구배:
○ 0 - 2 분(100% 완충액 A / 0% 완충액 B),
○ 2 - 42 분(0% 내지 60% 완충액 B), 및
○ 42 - 55 분(60% 내지 100% 완충액 B).
DBCO 접합 및 정제 프로토콜:
DBCO NHS를 본원에 기재된 바와 같은 미가공 2'-데옥시 DMT-폴리뉴클레오티드에 접합하였다. 미가공 폴리뉴클레오티드 펠릿을 45 μL DMSO에 재현탁하고, 65℃로 간단하게 가열하고 완전히 볼텍싱시켰다. 5 μL의 DIPEA를 첨가한 다음에, DMSO(1M)에 사전-용해된 DBCO-NHS 에스터(30 eq)를 첨가하였다. 반응을 10 분 동안 또는 생산물 형성이 MALDI에 의해 확인될 때까지 방치하였다. 총 80 μL의 폴리뉴클레오티드 샘플을 다음 완충액/구배와 함께 RP-HPLC 상에 주입하였다:
- 완충액 A = 수중 50 mM TEAA;
- 완충액 B = 90% 아세토니트릴;
- 유속 = 1 mL/분;
- 구배:
○ 0 - 2 분(90% 완충액 A / 10% 완충액 B),
○ 2 - 42 분(0% 내지 60% 완충액 B), 및
○ 42 - 55 분(60% 내지 100% 완충액 B).
우세한 RP-HPLC 피크에 걸쳐, 0.5 mL 분획을 수집하고 MALDI-TOF 질량 분석에 의해 분석하여 소망하는 덩어리의 존재를 확인하였다. 대량-선택되고, 정제된 분획을 냉동시키고 동결건조하였다. 일단 건조하면, 분획을 재-현탁하고, 상응하는 분획과 조합하였으며, 냉동 및 동결건조하였다.
DMT 절단: 동결건조된 펠릿을 20 μL의 50% 아세토니트릴에 현탁하고 80 μL의 아세트산을 첨가하고, 샘플을 실온에서 1 시간 동안 방치한 채 유지하였으며, 냉동 및 동결건조하였다. 건조된 샘플을 20% 아세토니트릴에 재-용해시키고 NAP 10(SephadexTM-G25 DNA Grade) 칼럼을 통해 탈염시켰다. 수집된 순수한 분획을 최종 생산물을 위해 냉동 및 동결건조하였다.
비염기 스페이서를 사용한 일반 접합 계획:
클릭 반응 - 일반 계획:
Figure pct00399
상기 식에서,
각각의 q는 0 또는 1이고;
각각의 m은 0 내지 5의 정수이며;
Z는 O 또는 S이고;
RO은 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오시드에 대한 결합이며;
R은 H, 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오시드, 고체 지지체, 또는 캡핑기(예를 들어, -(CH2)3-OH)에 대한 결합이고;
각각의 R'는 독립적으로 H, -Q1-QA1, 생체내가역성기, 또는 비-생체내가역성기이며;
각각의 R"는 독립적으로 H, -Q1-QA-Q2-T, 생체내가역성기, 또는 비-생체내가역성기이고;
각각의 RA는 독립적으로 H 또는 -ORC이되, RC는 -Q1-QA1, 생체내가역성기, 비-생체내가역성기, 또는 고체 지지체에 대한 결합이며;
각각의 RB는 독립적으로 H 또는 -ORD이되, RD는 -Q1-QA-Q2-T, 생체내가역성기, 또는 비-생체내가역성기이고;
상기 식에서,
각각의 Q1은 독립적으로 2가, 3가, 4가, 또는 5가 기이되, 하나의 원자가는 QA 또는 QA1에 결합되고; 제2 원자가는 개방되어 있으며, 나머지 원자가 각각은, 존재할 때, 독립적으로 보조 모이어티에 결합되고;
각각의 Q2는 독립적으로 2가, 3가, 4가, 또는 5가 기이되, 하나의 원자가는 QA에 결합되며; 제2 원자가는 T에 결합되고, 나머지 원자가 각각은, 존재할 때, 독립적으로 보조 모이어티에 결합되며;
QA는 1,2,3-트리아졸-1,4-디일, 선택적으로 치환된 C6-16 트리아졸로헤테로사이클릴렌(예를 들어,
Figure pct00400
또는
Figure pct00401
), 선택적으로 치환된 C8-16 트리아졸로사이클로알케닐렌(예를 들어,
Figure pct00402
), 또는 디하이드로피리다진기(예를 들어, trans-
Figure pct00403
, 또는 trans-
Figure pct00404
)이고;
QA1은 선택적으로 치환된 C2-12 알키닐, 엔도사이클릭 탄소-탄소 삼중 결합을 함유하는 선택적으로 치환된 C6-16 헤테로사이클릴(예를 들어,
Figure pct00405
), 선택적으로 치환된 C8-16 사이클로알키닐(예를 들어,
Figure pct00406
), 또는 선택적으로 치환된 C4-8 변형된 사이클로알케닐(예를 들어, trans-사이클로옥테닐)이며;
T는 표적화 모이어티이고,
단, 출발 물질은 적어도 하나의 -Q1-QA1을 함유하며, 생산물은 -Q1-QA-Q2-T를 함유하고;
단, 출발 물질 및 생산물은 고체 지지체에 대한 0 또는 1 개의 결합을 함유한다.
접합 방법
Cu-촉매화된 클릭 반응
구리-THPTA 복합체 제조
카퍼 설페이트 펜타하이드레이트(CuSO4-5H2O)의 5 mM 수용액 및 트리스(3-하이드록시프로필트리아졸릴메틸)아민(THPTA)의 10 mM 수용액을 1:1(v/v)(1:2 몰비)로 혼합하고 실온에서 1 시간 동안 방치하였다. 이 복합체는 예를 들어, 하기 일반 접합 계획에 나타낸 바와 같은 휴이젠 부가환화를 촉매화하기 위해 사용될 수 있다.
일반 절차(100 nM 스캐일):
1.7 mL 에펜도르프 튜브(Eppendorf tube) 중 710 μL의 물 및 100 μL tert-부탄올(최종 부피의 10%)의 용액에 60 μL의 구리-THPTA 복합체에 이어서, 올리고의 2mM 용액 50 μL, 20 mM 수성 소듐 아스코르베이트 용액 60 μL 및 표적화 모이어티-아지드의 10 mM 용액 20 μL를 첨가하였다. 전체 혼합 후에, 용액을 상온에서 1 시간 동안 방치하였다. 반응의 완료를 겔 분석에 의해 확인하였다. 반응 혼합물을 5-10 배 몰 과량의 SiliaMetS® TAAcONa(EDTA 나트륨 염에 결합된 수지)를 함유한 스크류 캡 바이알에 첨가한다. 혼합물을 1 시간 동안 교반한다. 그 다음에, 이 혼합물을 illustra™Nap™-10 칼럼 Sephadex™을 통해 용출시킨다. 그 다음에, 생성된 용액을 밤새 냉동 및 동결건조한다.
아마이드 결합을 통한 접합:
아마이드화를 통한 접합은 당업계에 알려진 아마이드화 결합 조건 하에서 수행될 수 있다. Aaronson et al., Bioconjugate Chem. 22:1723-1728, 2011을 참고한다.
Figure pct00407
상기 식에서,
각각의 q는 0 또는 1이고;
각각의 m은 0 내지 5의 정수이며;
Z는 O 또는 S이고;
RO은 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오시드에 대한 결합이며;
R은 H, 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오시드, 고체 지지체, 또는 캡핑기(예를 들어, -(CH2)3-OH)에 대한 결합이고;
각각의 R'는 독립적으로 H, -Q1-QA1, 생체내가역성기, 또는 비-생체내가역성기이며;
각각의 R"는 독립적으로 H, -Q1-QA-Q1-T, 생체내가역성기, 또는 비-생체내가역성기이고;
각각의 RA는 독립적으로 H 또는 -ORC이되, RC는 -Q1-QA1, 생체내가역성기, 또는 비-생체내가역성기이며;
각각의 RB는 독립적으로 H 또는 -ORD이되, RD는 -Q1-QA-Q2-T, 생체내가역성기, 또는 비-생체내가역성기이고;
상기 식에서
각각의 Q1은 독립적으로 2가, 3가, 4가, 또는 5가 기이되, 하나의 원자가는 QA 또는 QA1에 결합되고, 제2 원자가는 개방되어 있으며, 나머지 원자가 각각은, 존재할 때, 독립적으로 보조 모이어티에 결합되고;
각각의 Q2는 독립적으로 2가, 3가, 4가, 또는 5가 기이되, 하나의 원자가는 QA에 결합되며, 제2 원자가는 T에 결합되고, 나머지 원자가 각각은, 존재할 때, 독립적으로 보조 모이어티에 결합되며;
QA는 -C(O)-N(H)- 또는 -N(H)-C(O)-를 함유하는 선택적으로 치환된 C2-12 헤테로알킬렌이고;
QA1은 -NHRN1 또는 -COOR12이되, RN1은 H, N-보호기, 또는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬이며, R12는 H, 선택적으로 치환된 C1-6 알킬, 또는 O-보호기이고;
T는 표적화 모이어티이며,
단, 출발 물질은 적어도 하나의 -Q1-QA1을 함유하고, 생산물은 -Q1-QA-Q2-T를 함유한다.
용액 상 접합:
Figure pct00408
,
상기 식에서,
m은 0 내지 5의 정수이고;
Z는 O 또는 S이며;
RO은 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오시드에 대한 결합이고;
R은 H, 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오시드, 또는 캡핑기에 대한 결합이며;
각각의 R'는 독립적으로 H, -Q1-NH2, 생체내가역성기, 또는 비-생체내가역성기이고;
각각의 R"는 독립적으로 H, -Q1-NH-CO-Q2-T, 생체내가역성기, 또는 비-생체내가역성기이며;
각각의 RA는 독립적으로 H 또는 -ORC이되, RC는 -Q1-NH2, 생체내가역성기, 또는 비-생체내가역성기이고;
각각의 RB는 독립적으로 H 또는 -ORD이되, RD는 -Q1-NH-CO-Q2-T, 생체내가역성기, 또는 비-생체내가역성기이며;
상기 식에서,
각각의 Q1은 독립적으로 2가, 3가, 4가, 또는 5가 기이되, 하나의 원자가는 -NH-CO- 또는 -NH2에 결합되고, 제2 원자가는 개방되어 있으며, 나머지 원자가 각각은, 존재할 때, 독립적으로 보조 모이어티에 결합되고;
각각의 Q2는 독립적으로 2가, 3가, 4가, 또는 5가 기이되, 하나의 원자가는 -NH-CO-에 결합되며, 제2 원자가는 T에 대한 결합이고, 나머지 원자가 각각은, 존재할 때, 독립적으로 보조 모이어티에 결합되며;
T는 표적화 모이어티이고,
단, 출발 물질은 -Q1-NH2를 함유하며, 생산물은 -Q1-NH-CO-Q2-T를 함유한다.
지지체 상 접합:
Figure pct00409
상기 식에서,
Z는 O 또는 S이고;
RO는 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오시드에 대한 결합이며;
각각의 Q2는 독립적으로 2가, 3가, 4가, 또는 5가 기이되, 하나의 원자가는 -NH-CO-에 결합되고, 제2 원자가는 T에 대한 결합이며, 나머지 원자가 각각은, 존재할 때, 독립적으로 보조 모이어티에 결합되고;
T는 표적화 모이어티이다.
Figure pct00410
상기 식에서,
n은 1 내지 8의 정수이고;
A는 O 또는 -CH2-이며;
Z는 O 또는 S이고;
RO는 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오시드에 대한 결합이며;
각각의 Q2는 독립적으로 2가, 3가, 4가, 또는 5가 기이되; 하나의 원자가는 아지드 또는 트리아졸에 결합되고, 제2 원자가는 T에 결합되며, 나머지 원자가 각각은, 존재할 때, 독립적으로 보조 모이어티에 결합되며;
T는 표적화 모이어티이다.
Figure pct00411
상기 식에서,
n은 1 내지 8의 정수이고;
A는 O 또는 -CH2-이며;
Z는 O 또는 S이고;
RO는 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오시드에 대한 결합이며;
각각의 Q2는 독립적으로 2가, 3가, 4가, 또는 5가 기이되; 하나의 원자가는 아지드 또는 트리아졸에 결합되고, 제2 원자가는 T에 결합되며, 나머지 원자가 각각은, 존재할 때, 독립적으로 보조 모이어티에 결합되며;
T는 표적화 모이어티이다.
Figure pct00412
상기 식에서,
n은 1 내지 8의 정수이고;
A는 O 또는 -CH2-이며;
Z는 O 또는 S이고;
RO는 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오시드에 대한 결합이며;
각각의 Q2는 독립적으로 2가, 3가, 4가, 또는 5가 기이되; 하나의 원자가는 아지드 또는 트리아졸에 결합되고, 제2 원자가는 T에 결합되며, 나머지 원자가 각각은, 존재할 때, 독립적으로 보조 모이어티에 결합되며;
각각의 T는 독립적으로 표적화 모이어티이다.
포스포트리에스터의 Fmoc 탈보호의 대표적인 실시예:
Fmoc-보호된 아민을 갖는 포스포트리에스터를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 탈보호 조건에 적용하여 포스포트리에스터의 포스포디에스터로의 관찰 가능한 전환 없이 Fmoc 탈보호를 야기하였다.
Figure pct00413
p68에 대한 DBCO-NHS 접합 - 대표적인 실시예:
포스포트리에스터 내의 아미노기에 대한 DBCO-NHS 접합을 질량 분석에 의해 입증된 바와 같이 10 분 내에 실온에서 완료하였다.
Figure pct00414
DBCO 접합기를 함유한 p68(표 2 참고)의 RP-HPLC 정제를 다음 조건을 사용하여 수행하였다:
- 완충액 A = 수중 50 mM TEAA;
- 완충액 B = 90% 아세토니트릴; 및
- 유속 = 1 mL/분;
- 구배:
○ 0 - 2 분(100% 완충액 A / 0% 완충액 B),
○ 2 - 22 분(0% 내지 100% 완충액 B), 및
○ 22 - 25 분(100% 완충액 B).
예를 들어, 본원에 기재된 것과 같은 2'-변형된 뉴클레오시드 포스포르아미다이트를 사용하여 폴리뉴클레오티드를 제조하기 위해 유사한 절차를 사용할 수 있다. 이러한 절차는 국제특허출원 PCT/US2015/034749호에서 제공되며; PCT/US2015/034749호의 디설파이드 포스포트리에스터 올리고뉴클레오티드 합성의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
표 2에 열거된 면역조절 폴리뉴클레오티드를 제조하기 위해 본원에 기재된 일반 절차를 따랐다.
Figure pct00415
Figure pct00416
Figure pct00417
Figure pct00418
Figure pct00419
Figure pct00420
Figure pct00421
Figure pct00422
Figure pct00423
Figure pct00424
Figure pct00425
Figure pct00426
Figure pct00427
Figure pct00428
Figure pct00429
Figure pct00430
Figure pct00431
Figure pct00432
Figure pct00433
Figure pct00434
Figure pct00435
Figure pct00436
Figure pct00437
Figure pct00438
Figure pct00439
Figure pct00440
표 2에서, 칼럼 A는 DB 세포에서의 IL-6 발현(EC50, nM)을 제공하고; 칼럼 B는 DB 세포에서의 IL-10 발현(EC50, nM)을 제공하며; 칼럼 C는 라모스 블루 세포에서의 NFκB 활성화(EC50, nM)를 제공하고; 칼럼 D는 Hela-hTLR9-NFκB-luc 세포에서의 NFκB 활성화(EC50, nM)를 제공하며; 칼럼 E는 Hela-mTLR9-NFκB-luc 세포에서의 NFκB 활성화(EC50, nM)를 제공하고; 칼럼 F는 마우스 비장세포에서의 IL-6 분비(EC50, nM)를 제공하며; 칼럼 G는 95% 마우스 혈장에서 24 시간 사전항온처리 후 마우스 비장세포에서의 IL-6 분비(EC50, nM)를 제공하고; 칼럼 H는 마우스 골수 분화된 DC에서의 IL-6 분비(EC50, nM)를 제공하며; 칼럼 I는 RNAiMax를 이용한 2 시간 형질감염 후 마우스 HEK-Blue 세포에서의 NFκB 활성화(EC50, nM)를 제공하고; 칼럼 J는 RNAiMax를 이용한 2 시간 형질감염 후 인간 HEK-Blue 세포에서의 NFκB 활성화(EC50, nM)를 제공한다.
본원에 포함된 표를 통틀어 제공된 서열에 대한 중요 기술어는 다음과 같다: 소문자 = 뉴클레오시드-3'-포스포로티오에이트; 대문자 = 뉴클레오시드-3'-포스페이트; 이탤릭체 소문자 = 3' tBuDS-Ph (오쏘) 트리에스터를 갖는 뉴클레오시드(PS); 이탤릭체 대문자 = 3' tBuDS-Ph (오쏘) 트리에스터를 갖는 뉴클레오시드(PO); dt = dT(DBCO); 볼드체 이중 밑줄친 t = DBCO-C6-dT; 볼드체 소문자 = 3' n-부틸 트리에스터를 갖는 뉴클레오시드(PS); 볼드체 대문자 = 3' n-부틸 트리에스터를 갖는 뉴클레오시드(PO); 이탤릭 볼드체 소문자 = 3' 호모프로파르길 트리에스터(hPro)를 갖는 뉴클레오시드(PS); 이탤릭체 밑줄친 소문자 = 3' DBCO-NH-PEG2 트리에스터(N1)를 갖는 뉴클레오시드(PS); 이탤릭체 밑줄친 대문자 = 3' DBCO-NH-PEG2 트리에스터(N1)를 갖는 뉴클레오시드(PO); 이중 밑줄친 t = dT PEG2-NH2 트리에스터(PS); 이중 밑줄친 T = dT PEG2-NH2 트리에스터(PO); 이탤릭체 이중 밑줄친 소문자 = 3' PEG2-NH2 트리에스터(N1)를 갖는 뉴클레오시드(PS); 이탤릭체 이중 밑줄친 대문자 = 3' PEG2-NH2 트리에스터(N1)를 갖는 뉴클레오시드(PO); 볼드 이탤릭체 밑줄친 대문자 U = 5-요오도-2'-데옥시우리딘(PO); 볼드 이텔릭체 밑줄친 소문자 u = 5-요오도-2'-데옥시우리딘(PS); 볼드체 밑줄 = 2'-플루오로뉴클레오티드(PO); 어퍼스트로피는 어퍼스트로피의 좌측에 문자로 확인된 뉴클레오티드가 2'-OMe-변형된 리보오스를 함유한다는 것을 나타낸다; 밑줄친 ng = 7-데아자-2'-데옥시구아노신(PS); 밑줄친 pT = PEG4 dT 트리에스터(PO); 밑줄친 pt = PEG4 dT 트리에스터(PS); fT = 5-트리플루오로메틸-티미딘(PO); fU = 5-플루오로-2'-데옥시우리딘(PO); bU = 5-브로모-2'-데옥시우리딘(PO); ft = 5-트리플루오로메틸-티미딘(PS); fu = 5-플루오로-2'-데옥시우리딘(PS); bu = 5-브로모-2'-데옥시우리딘(PS); C3 = C3 스페이서(-(CH2)3-OH)(PO); c3 = C3 스페이서(-(CH2)3-OH)(PS); C6 = 헥산-1,6-디일; NH2C6 = 6-아미노헥스-1-일; Te = 3' 에틸 트리에스터를 갖는 티미딘(PO); Ge = 3' 에틸 트리에스터를 갖는 구아노신(PO); Ce = 3' 에틸 트리에스터를 갖는 시티딘(PO); Ue = 3' 에틸 트리에스터를 갖는 5-요오도우리딘(PO); ue = 3' 에틸 트리에스터를 갖는 5-요오도우리딘(PS); iu = 5-요오도-2'-데옥시우리딘을 기본으로 하는 5'-5' 캡(PS); iU = 5-요오도-2'-데옥시우리딘을 기본으로 하는 5'-5' 캡(PO); X5 = X5-DBCO(PO); x5 = x5-DBCO(PS); X3 = X3 비염기 스페이서(PO); 및 IR700은 염료이다. 여기서, 기술어 (PO)는 3'-포스페이트를 나타내고; (PS)는 3'-포스포로티오에이트를 나타낸다; od = 5'-오쏘디설파이드 포스포디에스터; o = 5'-포스페이트(PO); ods = 5'-오쏘디설파이드 포스포로티오에이트; s = 5'-포스포로티오에이트(PS); 첨자 "r" = Rp PS; 첨자 "s" = Sp PS; Af = 2'-플루오로-아데노신(PO); Csi = dC O-실릴트리에스터(PO); Tsi = dT O-실릴트리에스터(PO); tm = 2'-OMe 티미딘(PS); t(m) = 2'-OMOE 티미딘(PS). 구조는 도 1a 및 1b에 나타내었다.
이중-가닥 CpG:
어닐링 및 겔 분석:
폴리뉴클레오티드 p88(1 mL, 5 mM 저장액)을 DPBS(24.7 mL)와 함께 p144(3.3 mL, 2 mM 저장액)에 첨가하였다. 폴리뉴클레오티드 p88을 유사한 방식으로 p145로 처리하였다. 혼합물을 65℃로 10 분 동안 가열하였다. TBE 요소 겔에 의한 분석은 p88의 완전 아닐링을 나타내었다(도 2 참고). 1 μL의 각각의 샘플을 제거하고, 5 μL의 포름아마이드 로딩 완충액에 첨가하였으며, 웰 당 15% TBE-요소 겔 상에 200 볼트로 40 분 동안 로딩한 후, 에티듐 브로마이드(EtBr) 염색하였다. p88, p144, 및 p145의 구조에 대해 표 2를 참고한다.
p88/p144를 사용한 이중 가닥-CpG - 대표적인 실시예 (1):
Figure pct00441
p88/p145를 사용한 이중 가닥-CpG - 대표적인 실시예 (2):
Figure pct00442
실시예 2: 본 발명의 예시적 접합체의 제조
하기 제조시, 다음 항체를 사용하였다: 항-CD38 항체는 WO 2012/092616호에 개시된 Ab79이며, 이 항체의 개시내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함되고; 항-CD79b 항체는 WO 2014/011521호에 개시된 huMA79bv28이며, 이 항체의 개시내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함되고; 항-CD30 항체는 브렌툭시맙이고; 항-CD22 항체는 US 20140127197호에 개시된 10F4이며, 이 항체의 개시내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함되고; 항-CD20 항체는 리툭시맙이다.
다른 항체가 본원에 기재된 접합체에 포함될 수 있으며, 예를 들어 항-DEC205 항체는 US 2010/0098704호에 개시된 항체일 수 있다(예를 들어, 다음 서열을 갖는 경쇄:
Figure pct00443
Figure pct00444
; 및 다음 서열을 갖는 중쇄:
Figure pct00445
Figure pct00446
를 가짐); 항-CD303 항체는 다음 경쇄 서열
Figure pct00447
Figure pct00448
, 및 다음 중쇄 서열:
Figure pct00449
Figure pct00450
을 가질 수 있다; 항-CD40 항체는 루카투무맙 또는 다세투주맙일 수 있다; 항-CD74 항체는 밀라투주맙일 수 있다; 항-CD304 항체는 베센쿠맙일 수 있다; 항-CD38 항체는 다라투무맙, SAR650984(Sanofi-Immunogen), 또는 MOR202(Morphosys-Celgene)일 수 있다. 이들 항체는 Q-태그(예를 들어, 중쇄 내의 LLQGG(서열번호 493) 또는 경쇄 내의 GGGLLQGG(서열번호 494))를 포함할 수 있다.
다른 항체가 본원에 기재된 접합체에 포함될 수 있으며, 예를 들어 항-PD-L1 항체는 다음 서열을 갖는 경쇄:
Figure pct00451
Figure pct00452
, 및 다음 중쇄 서열:
Figure pct00453
을 갖는, mAbs (2016), 8, 593 및 US8217149호에 기재된 항체일 수 있다.
A. 미생물 트랜스글루타미나아제(mTG)에 의해 매개된 Q-태그된 항체에 대한 접합을 위한 일반 절차
Figure pct00454
효소 접합을 위한 일반 조건:
최종 항체 농도 = 50 μM
항체 : 트랜스글루타미나아제(mTG) 비: 10:1
링커 : Ab 비: 100:1
mTG MW=38 kDa, 100 mU/mg, ε280 = 71850 M-1 cm-1
트리스 완충액 중 2% w/v = 20 mg/mL = 5 μM
트리스 완충액: 25 mM 트리스, 150 mM NaCl, pH 8.5
트리스 완충액 또는 DMSO 중 링커 용액
DMSO ≤최종 부피의 5% v/v
일반 프로토콜:
트리스 완충액 중 Q-태그된 항체(예를 들어, CD22-Q 및 CD38-Q로서 표기되는 Q-태그된 항-CD22 항체 또는 Q-태그된 항-CD38 항체)의 용액에 아지도 아미노 링커 및 mTG를 순차적으로 첨가하였다. 혼합물을 37℃로 2 시간 동안 승온시켰으며, 이 시간에, 용리제로서 DPBS를 사용한 Amicon 30kD 스핀 농축기를 통해 항체를 매달린 아지도-링커(Ab-N3)로 완충액 교환함으로써 과량의 링커 및 mTG를 제거하였다. 그 다음에, Ab-N3의 샘플을 환원시키고 하기 기재된 바와 같이 RP-HPLC에 의해 링커 접합의 정도에 대해 특징지었다. CpG 폴리뉴클레오티드의 포스포트리에스터 중 알킨을 Ab-N3 중 아지도로 후속 휴이젠 부가환화하는 것은 본 발명의 예시적 접합체를 제공하였다(도 3a 및 3b 참고).
B. 활성화된 카복실산 에스터(예를 들어, TFP 또는 PFP)의 사용을 통한 항체에 대한 접합을 위한 일반 절차
Figure pct00455
일반 프로토콜:
DPBS 완충액 중 항체의 용액에 아지도-PEG24-PFP를 첨가하고, 생성된 혼합물을 밤새 실온에서 방치하였으며, 이 시간에, 생성된 Ab-N3를 용리제로서 DPBS를 사용한 Amicon 30kD 스핀 농축기를 통해 완충액 교환함으로써 과량의 아지도-PEG24-PFP를 제거하였다. 그 다음에, Ab-N3의 샘플을 환원시키고 하기 기재된 바와 같이 RP-HPLC에 의해 링커 접합의 정도에 대해 특징지었다. CpG 폴리뉴클레오티드의 포스포트리에스터 중 알킨을 Ab-N3 중 아지도로 후속 휴이젠 부가환화하는 것은 본 발명의 예시적 접합체를 제공하였다.
항체/이중-가닥 면역조절 폴리뉴클레오티드 접합 프로토콜
완전 아닐링된 이중 가닥 CpG 폴리뉴클레오티드(p88/p144 및 p88/p145)를 항-CD38Q-N3 항체(39 mL, 40 mM)에 첨가하였다. 혼합물을 37℃로 2 시간 동안 가열하고 음이온 교환 수지(AEX) 상의 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 2 개의 주요한 피크를 수집하고, Amicon 30 kD 농축기를 통해 눙축하였으며, 트리-글리신 변성 겔, 1 시간 동안 200 볼트에 이어, 에티듐 브로마이드 염색에 의해 분석하였다(도 4a 참고).
항-CD20 항체 면역조절 폴리뉴클레오티드 접합체
TFP 부분이 리툭시맙에 연결되고 아지드가 면역자극 폴리뉴클레오티드에 연결된, TFP-PEG24-N3 링커를 통해 면역자극 폴리뉴클레오티드(p19)에 접합된 리툭시맙을 함유하는 접합체. 접합체의 미가공 혼합물을 다음 조건 하에서 AEX-HPLC에 의해 정제하였다:
완충액 A: 20 mM 소듐 포스페이트, 15% iPrOH(aq.)
완충액 B: 20 mM 소듐 포스페이트, 1M 소듐 브로마이드, 15% iPrOH(aq.)
칼럼: Thermo Scientific Dionex DNASwift, 5 x 150 mm
10 분 간 10-95% 완충액 B, 그 다음에 세척 및 재-평형
구배: 10 분 간 10 - 95% B, 5 분 95% B 세척
미가공 혼합물의 AEX-HPLC 흔적을 도 4b에 나타내었다(피크 1, 2, 및 3에 대한 피크 영역은 각각 피크 1, 2, 및 3의 총 영역의 28%, 40%, 및 32%임). 도 4c는 미가공 혼합물 및 도 4b의 숫자 1, 2, 및 3에 의해 확인된 단리된 피크에 대한 조합된 HPLC 흔적을 나타낸다. 도 4d는 리툭시맙-PEG24-N3, 미가공 혼합물, 및 단리된 피크 1, 2, 및 3의 비교를 제공한다. 리툭시맙-p19-DAR1(약물-항체 비 = 1, 즉 하나의 p19 폴리뉴클레오티드에 접합된 하나의 항체가 있음)을 이의 분자량(MW = 155400)에 의해 확인하였다.
본원에 기재된 접합 절차를 사용하여, 표 6에 열거된 본 발명의 예시적 접합체를 제조하였다.
RP-HPLC에 의한 비접합된 및 접합된 중쇄의 정량화
휴이젠 부가환화 전에 Ab-N3 샘플을 분석하여, 아지도 링커에 대한 접합 효율을 평가하였다. 첫번째로, DTT(20 mM DTT) 및 5 M 구아니딘-HCl을 사용한 Ab-N3(5 μM)의 환원을 65℃에서 30 분 동안 수행하였다. 생성된 단백질성 생산물을 다음 조건 하에서 RP-HPLC에 의해 분석하였다:
■ 칼럼: Pursuit Diphenyl 5, 4.6 x 250 mm, 5 μm
■ 칼럼 온도: 60℃
■ MPA: 수중 0.1% TFA, MPB: 아세토니트릴 중 0.1% TFA
■ 구배: 17 분 간 35 - 50% MPB
■ 280 nm에서 검출
비접합된 중쇄 및 접합된 중쇄(HC-N3)의 퍼센트가 표 5에서 제공되며 이는 접합된 및 비접합된 중쇄에 대한 총 피크 영역의 퍼센트를 기본으로 한다.
Figure pct00456
폴리뉴클레오티드 포스페이트 백본을 갖는 접합체는 포스포로티오에이트 백본을 갖는 접합체에 비해 음이온 교환 칼럼을 통해 더 빠르게 용출될 수 있다.
CpG 폴리뉴클레오티드에 접합된 Q-태그된 항-CD38 항체를 함유하는 접합체를 본원에 기재된 바와 같이 제조하였다. 이 실험에서, 합성에서 사용된 CpG 폴리뉴클레오티드는 p19, p21, 및 p88이었다. 단리된 접합체를 다음 조건 하에서 AEX-HPLC 분석하였다:
방법 A: 10 분 간 10-95% B, 그 다음에 세척 & 재-평형
방법 B: 10 분 간 10-50% B, 그 다음에 세척 & 재-평형
칼럼: Thermo Scientific Dionex DNASwift, 분석적 5 x 150 mm
완충액 A: 20 mM 소듐 포스페이트, 15% iPrOH(aq.)
완충액 B: 20 mM 소듐 포스페이트, 1 M 소듐 브로마이드, 15% i-PrOH(aq.)
AEX-HPLC 흔적 중 SB-037(항-CD38Q-p19) 접합체에 상응하는 피크에 대한 체류 시간은 SB-038(항-CD38Q-p21)에 상응하는 시간에 비해 길었다.
Figure pct00457
Figure pct00458
Figure pct00459
Figure pct00460
Figure pct00461
Figure pct00462
Figure pct00463
Figure pct00464
Figure pct00465
Figure pct00466
Figure pct00467
Figure pct00468
Figure pct00469
Figure pct00470
Figure pct00471
Figure pct00472
Figure pct00473
Figure pct00474
Figure pct00475
Figure pct00476
표 6-A에서, 칼럼 A는 DB 세포에서의 IL-6 발현(EC50, nM)을 제공하고; 칼럼 B는 DB 세포에서의 IL-10 발현(EC50, nM)을 제공하며; 칼럼 C는 라모스 블루 세포에서의 NFκB 활성화(EC50, nM)를 제공하고; 칼럼 D는 마우스 혈청에서 24 시간 사전항온처리 후 라모스 블루 세포에서의 NFκB 활성화(EC50, nM)를 제공하며; 칼럼 E는 마우스 A20 림프종 세포에서 qPCR에 의한 IL-6 유도(EC50, nM)를 제공하고; 칼럼 F 는 마우스 A20-hCD20 림프종 세포에서의 IL-6 유도(EC50, nM)를 제공한다. 모든 DBCO/아지도 접합을 무-금속 1,3-쌍극 부가환화 반응 조건 하에서 수행하였으며; DAR1은 1의 폴리뉴클레오티드/항체 비를 나타내고; DAR2는 2의 폴리뉴클레오티드/항체 비를 나타내며; 없음은 활성화 없음을 나타낸다. 표 6-A에서, *은 차선의 활성화를 나타낸다. 표 6-A에서, CD38은 항-CD38 항체를 나타내고; CD22는 항-CD22 항체를 나타내며; CD79b는 항-CD79b 항체를 나타내고; 마우스CD22는 항-마우스CD22 항체를 나타내며; BDCA2는 항-BDCA2 항체를 나타내고; BDCA4는 항-BDCA4 항체를 나타낸다. 표 6-A에서, TCO는 표적화 모이어티에 결합된 trans-사이클로옥테닐-기반 기이다. TCO는 도 1b에 도시된 구조를 갖는다.
Figure pct00477
Figure pct00478
Figure pct00479
Figure pct00480
Figure pct00481
표 6-2에서, 칼럼 A는 라모스 블루 세포에서의 NFκB 활성화(EC50, nM)를 제공하고; 칼럼 B는 마우스 비장세포, DAR1에서의 IL-6 분비(EC50, nm)를 제공하며; 칼럼 C는 마우스 비장세포, DAR2에서의 IL-6 분비(EC50, nm)를 제공하고; 칼럼 D는 다우디- NFκB-Luc 세포, DAR1에서의 NFκB 활성화(EC50, nm)를 제공하며; 칼럼 E는 다우디- NFκB-Luc 세포, DAR2에서의 NFκB 활성화(EC50, nm)를 제공한다. 표 6-2에서, CD38은 항-CD38 항체를 나타내고; CD22는 항-CD22 항체를 나타내며; 마우스CD22는 항-마우스CD22 항체를 나타내고; DAR1은 1의 폴리뉴클레오티드/항체 비를 나타내고; DAR2는 2의 폴리뉴클레오티드/항체 비를 나타낸다.
실시예 3. 본 발명의 예시적 접합체의 시험관내 및 생체내 프로파일링
세포: 인간 DB, 다우디, 라지(Raji), 라모스, SUDHL10, 및 NCI-H929, 및 마우스 A20 세포를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)(ATCC)으로부터 구매하고 10% FBS를 함유한 RPMI에서 배양하였다. 라모스-블루 및 HEK-Blue-hTLR9 세포를 Invivogen으로부터 구매하고 공급자의 권고에 따라 유지하였다. 모든 세포의 TLR9 발현을 qPCR에 의해 확인하였다.
유세포분석: 관심 수용체의 세포 표면 발현을 CyFlow ML 유세포분석기(Partec) 및 상업적으로 이용 가능한 항체(Biolegend, BD Biosciences, San Diego)를 사용하여 FACS 분석에 의해 측정하였다.
면역자극 폴리뉴클레오티드 또는 이의 접합체의 시험관내 프로파일링
일부 실험에서, 면역자극 폴리뉴클레오티드 또는 이의 접합체의 활성을 인간 또는 마우스 림프종 세포를 사용하여 평가하였다. 이들 실험에서, 시험 화합물을 96-웰 플레이트 내의 세포(1-4 x105/웰)에 첨가하고 37℃, 5% CO2에서 24-72 시간 동안 항온처리하였다. 항온처리 기간의 종료시, 배양 배지를 제거하고 사이토카인 분비(DB 세포) 또는 NFkB 활성화의 척도로서의 알칼리 포스파타아제 분비(라모스-블루, HEK-Blue-hTLR9 세포)를 평가하기 위해 사용하였다. 분비된 사이토카인을 상업적으로 이용 가능한 ELISA 키트에 의해 측정하였다. 나머지 세포를 용해시키고, 정제된 총 RNA 및 사이토카인 유전자 발현(IL-6 및 IL-10)을 qPCR에 의해 정량화하였으며, 하우스-키핑 유전자(B2M, GAPDH, 또는 PPIB)에 대해 정규화하였다. 다른 사이토카인(예를 들어, IL-8, IL-12a, 및 IL-12b)에 대한 유전자 발현을 또한 당업계에 알려진 방법, 예를 들어 qPCR을 사용하여 결정할 수 있다.
일부 실험에서, 면역자극 폴리뉴클레오티드를 인간 또는 마우스 TLR-9 및 NFkB-루시페라아제 리포터 플라스미드를 안정적으로 발현하는 HeLa 세포에서 프로파일링하였다. 세포내 루시페라아제 활성을 루시페린(Britelite, Perkin Elmer)의 첨가에 의해 정량화하고 발광 신호를 Victor2 루미노미터(Perkin Elmer)를 사용하여 포착하였다.
일부 실험에서, 면역자극 폴리뉴클레오티드의 활성을 새롭게 단리된 마우스 비장세포를 사용하여 평가하였다. C57Bl6 마우스로부터의 비장을 수집하고, 얼음-냉각 PBS를 사용하여 살균 70 μm 필터를 통해 깍둑썰기하였다. 그 다음에, 세포를 PBS로 세척하고 적혈구를 상업적 RBC 용해 완충액을 사용하여 용해시켰다. 세포를 4℃의 PBS로 다시 세척하고, 10% FBS를 함유한 RPMI에 재-현탁하였으며 96-웰 플레이트에 시딩(2x105 세포/웰)하고 37℃, 5% CO2에서 2-4 시간 동안 항온처리하였다. 그 다음에, 시험 화합물을 첨가하고 37℃, 5% CO2에서 추가 24-72 시간 동안 항온처리하였다. 상청액을 조심스럽게 제거하고 사이토카인 수준을 ELISA에 의해 정량화하였다. 세포를 용해시키고, 총 RNA를 정제하였으며, 유전자 발현을 표준 방법을 사용하여 qPCR에 의해 측정하였다.
일부 실험에서, 시험 화합물을 마우스 골수 분화된 수지상 세포(DC)와 함께 항온처리시 사이토카인 분비에 대해 평가하였다. 이들 실험에서, 마우스 1 차 골수 간세포를 C57Bl6 마우스의 대퇴골 및 경골로부터 공개된 프로토콜에 따라 단리시켰다. 세포를 즉시 4℃의 PBS로 세척하고 적혈구를 상업적 용해 완충액을 사용하여 용해시켰다. 세포를 10% 송아지 태아 혈청을 함유한 RPMI에 1.2x106 세포/mL로 현탁하고, 96-웰 플레이트에 시딩하였으며, 재조합 마우스 GM-CSF(100 ng/ml) 및 마우스 TNFα(10 ng/ml)와 함께 또는 FLT3L의 첨가와 함께 7 일 동안 DC로 분화시켰다. 시험 화합물을 첨가하고 24-72 시간 동안 항온처리하였다. 사이토카인 분비를 배양 상청액에서 ELISA에 의해 측정하고 세포를 용해시켰으며 표준 방법을 사용하여 qPCR에 의해 유전자 발현을 평가하기 위해 사용하였다.
일부 실험에서, 시험 화합물을 마우스, 래트, 원숭이, 또는 건강한 인간으로부터의 95% 혈장에서 항온처리하여, 안정성을 평가하였다. 이들 실험에서, 혈액(EDTA)을 적어도 3 마리의 개체로부터 수집하였으며; 혈장을 원심분리에 의해 단리시키고 통합하였다. 시험 화합물을 실링된 튜브 내의 혈장에 섞고 37℃에서 1-72 시간 동안 항온처리하였으며, 그 후에 화합물을 적절한 농도로 RPMI + 10% FBS에 희석하고 상기 나타낸 시험 시스템에서 기능적 활성에 대해 평가하였다.
일부 실험에서, 림프구 증식에 대한 시험 화합물의 효과를 당업계에 알려진 방법을 사용하여, 예를 들어 1, 2, 4 또는 7 일 동안 1x105 세포/웰과 함께 항온처리 후 Cell Titer Glo 키트(Promega)를 사용하여 평가할 수 있다.
일부 실험에서, 세포 아폽토시스에 대한 시험 화합물의 효과를 당업계에 알려진 방법을 사용하여, 예를 들어 CyFlow ML 유세포분석기(Partec)를 사용하는 FACS에 의한 아넥신-V 세포 표면 발현에 의해 평가할 수 있다.
본 발명의 접합체의 세포 의존성 세포독성(CDC) 활성을 다음과 같이 평가하였다. 다우디 세포를 10%FBS 및 Pen/Strep이 보충된 RPMI1640 GlutaMAX에서 배양하였다. 세포를 원심분리하고, 배지를 제거하고, 0.8 × 106 세포/mL의 농도 및 50 μL/웰의 부피의 10% 인간 혈청(SIGMA cat#S1764, LOT#SLBQ0752V, 46CH50)이 보충된 OPTIMEM에 재현탁함으로써 96-웰 포멧 상에 다우디 세포를 플레이팅하였다. 화합물 희석액 플레이트를 이중 농도의 OPTIMEM에서 제조하고, 화합물 희석액의 웰 당 50 μL를 첨가하여 5%의 인간 혈청의 최종 농도를 제공하였다. 플레이팅된 배양액을 5% CO2 하의 37℃에서 2 시간 동안 항온처리하였다. Alamar Blue 생활성 시약(10 μL/웰)을 첨가하고, 생성된 배양액을 5% CO2 하의 37℃에서 3-18 시간 동안 항온처리하였다. 결과를 형광(EX560 및 EM590)을 사용하여 플레이트 판독기 상에서 판독하였다.
인간 말초 혈액 단핵 세포(hPBMC)에서 본 발명의 접합체의 사이토카인 유도를 다음과 같이 평가하였다. 인간 PBMC를 샌디에이고 혈액 은행(San Diego Blood Bank)으로부터 얻은 LRS로부터 단리시켰다. 플라스마사이토이드 수지상 세포를 MACs 키트(Miltenyi Biotec)로 hPBMC로부터 단리시키고 즉시 완전 RPMI에서 96-웰 포맷 상에 플리이팅하였다(5x104 세포/웰 밀도). 화합물을 2 시간 후 첨가하고 5% CO2 하의 37℃에서 20 시간 동안 항온처리하였다. 항온처리 후에, 배지를 수집하고 사이토카인 수준을 ELISA(BioLegend)에 의해 결정하였다.
시험관내 프로파일링 실험의 결과를 표 2 및 6-23 및 도 5-33에 요약하였다.
도 5는 IL-6의 발현 수준에 의해 결정된 바와 같이, 항체에 비접합된 CpG 폴리뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 백본이 사이토카인을 유도하도록 요구한다는 것을 나타낸다.
도 6-8은 본 발명의 예시적 접합체와 포스포로티오에이트 백본을 갖는 비접합된 CpG 폴리뉴클레오티드의 TLR9 작용제 활성의 비교를 제공한다.
도 9-15는 (1) 접합된 표적화 모이어티의 부재시 면역자극 폴리뉴클레오티드의 TLR9 작용제 활성을 위해 포스포로티오에이트가 중요하다는 것, 및 (2) CpG 폴리뉴클레오티드의 5'-말단 뉴클레오시드에 결합된 포스페이트에 대한 표적화 모이어티의 접합이 이의 TLR9 작용제 활성을 감소시킨다는 것을 나타낸다.
도 16 및 17은 2 개의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 본 발명의 접합체가 NFκB 활성화에 의해 측정된 바와 같이, 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 본 발명의 접합체에 비해 높은 면역자극 활성을 나타낼 수 있다는 것을 나타낸다.
표 7은 5'-말단 5-요오도우리딘의 포함이 면역자극 폴리뉴클레오티드의 활성을 향상시킨다는 것을 나타낸다.
Figure pct00482
표 8 및 9는 면역자극 폴리뉴클레오티드 서열의 3'-절단 및 ISS 사이의 짧은 간격이 유해하지 않을 수 있으며 오히려 면역자극 폴리뉴클레오티드의 면역자극 활성을 개선할 수 있다는 것을 나타낸다. 이들 표는 또한 가능한 적은 2 개의 ISS가 면역자극을 위해 충분할 수 있다는 것을 나타낸다.
Figure pct00483
Figure pct00484
도 18은 포스포로티오에이트-기반인 모든 인터뉴클레오시드 포스포에스터를 갖는 면역자극 폴리뉴클레오티드를 함유하는 접합체가 유리 p1의 것과 유사한 활성을 나타내며 짧은 면역자극 폴리뉴클레오티드를 함유하는 접합체가 전장 면역자극 폴리뉴클레오티드를 함유하는 접합체의 것과 유사한 활성을 나타낸다는 것을 나타낸다. 도 18에 나타낸 데이터를 표 10에 열거하였다.
Figure pct00485
도 19는 포스포로티오에이트-기반인 모든 인터뉴클레오시드 포스포에스터를 갖는 짧은 면역자극 폴리뉴클레오티드를 함유하는 접합체가 포스포로티오에이트-기반인 모든 인터뉴클레오시드 포스포에스터를 갖는 긴 면역자극 폴리뉴클레오티드를 함유하는 접합체의 것에 비해 우수한 활성을 나타낸다는 것을 나타낸다. 도 19에 나타낸 데이터를 표 11에 요약하였다.
Figure pct00486
도 20 및 21은 5'-말단 ISS 내에 포스페이트-기반 인터뉴클레오시드 포스포에스터(들)를 갖는 면역자극 폴리뉴클레오티드가 5'-말단 ISS 내에 포스포로티오에이트-기반 인터뉴클레오시드 포스포에스터(들)를 갖는 면역자극 폴리뉴클레오티드에 비해 높은 면역자극 활성을 나타낸다는 것을 나타낸다. 도 20 및 21에 나타낸 데이터를 표 12에 요약하였다.
Figure pct00487
도 22는 5'-말단 인간 ISS 서열이 바람직하게는 UCG라는 것을 나타낸다. 도 22에 나타낸 데이터를 표 13에 요약하였다.
Figure pct00488
도 23은 5'-말단 ISS 내의 5-요오도우리딘의 포함이 면역자극 폴리뉴클레오티드의 면역자극 활성에 대해 강한 향상 효과를 갖는다는 것을 나타낸다. 도 23에 나타낸 데이터를 표 14에 요약하였다.
Figure pct00489
도 24 및 25는 포스페이트-기반 인터뉴클레오시드 포스포트리에스터를 함유하는 폴리뉴클레오티드의 면역자극 활성이 포스포로티오에이트-기반 인터뉴클레오시드 포스포트리에스터를 함유하는 상응하는 폴리뉴클레오티드의 것에 비해 높을 수 있다는 것을 나타낸다. 도 24 및 25에 나타낸 데이터를 표 15에 요약하였다.
Figure pct00490
표 16은 포스포트리에스터 삽입이 면역자극 폴리뉴클레오티드에서 용인된다는 것을 나타낸다.
Figure pct00491
표 17 및 18은 비염기 스페이서 삽입이 면역자극 폴리뉴클레오티드에서 용인된다는 것을 나타낸다.
Figure pct00492
Figure pct00493
도 26a 및 26b는 포스포로티오에이트-기반 인터뉴클레오시드 포스포트리에스터의 높은 함량이 면역자극 폴리뉴클레오티드의 면역자극 활성에 영향을 준다는 것을 나타낸다. 이 효과는 3'-말단으로부터 더욱 멀리 배치된 포스포로티오에이트-기반 인터뉴클레오시드 포스포트리에스터를 갖는 면역자극 폴리뉴클레오티드에서 특히 확연하다. 도 26a 및 26b에 나타낸 데이터를 표 19에 요약하였다.
Figure pct00494
표 20은 표적화 모이어티를 면역자극 폴리뉴클레오티드에 연결하는 긴 링커가 짧은 링커를 갖는 접합체에 비해 접합체의 면역자극 활성을 향상시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
Figure pct00495
*(PEGx)는 항체에 부착된 상보적 반응기 내의 에틸렌 글리콜 단위의 수를 나타낸다.
도 27은 Q-태그를 통한 항체 중쇄에 대한 접합이 PFP 화학 사용을 통한 항체 경쇄에 대한 접합에 비해 우수한 면역자극 활성을 나타내는 접합체를 제공할 수 있다는 것을 나타낸다. 도 27에 나타낸 데이터를 표 21에 요약하였다.
Figure pct00496
*DAR은 폴리뉴클레오티드/항체 비를 나타낸다.
도 28은 항체 중쇄 접합체가 항체 경쇄 접합체에 비해 우수한 면역자극 활성을 나타낼 수 있다는 것을 나타낸다. 도 28에 나타낸 데이터를 표 22에 요약하였다.
Figure pct00497
* (PEGx)는 NH2-PEGx-N3로부터 형성된 항체에 부착된 상보적 반응기 내의 에틸렌 글리콜 단위의 수를 나타낸다.
도 29는 보조 모이어티 (예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜)들)의 포함이 본 발명의 접합체의 면역자극 활성을 향상시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 도 29에 나타낸 데이터를 표 23에 요약하였다.
Figure pct00498
* (PEGx)는 접합체에서 사용된 상보적 반응기를 나타낸다.
표 24는 PEG 보조 모이어티의 포함이 표적화 모이어티에 비접합된 면역자극 폴리뉴클레오티드의 자가-전달에 상당한 영향을 미치지 않았다는 것을 나타낸다. 표 24의 데이터는 세포와 면역자극 폴리뉴클레오티드의 항온처리 20 시간 후, ELISA에 의해 측정된 바와 같은 A20 세포에서의 IL6 분비에 대한 것이다.
Figure pct00499
* (PEGx)는 접합체에서 사용된 상보적 반응기를 나타낸다.
도 30은 보조 모이어티가 접합체의 세포 의존성 세포독성에 영향을 줄 수 있다는 것을 나타낸다. 도 30에 나타낸 데이터를 표 25에 요약하였다.
Figure pct00500
* (PEGx)는 접합체에서 사용된 상보적 반응기를 나타낸다.
도 31 및 32는 절단된 면역자극 폴리뉴클레오티드를 함유하는 접합체를 사용한 마우스 A20 세포 내의 IL6의 유도를 나타낸다. 이들 어세이에서 사용된 항체는 뮤린 항-CD20 항체 또는 뮤린 항-CD22 항체였다. Q-태그를 항체에 대한 폴리뉴클레오티드의 접합을 위해 사용하였다. 도 31 및 32에 나타낸 데이터를 표 26에 요약하였다.
Figure pct00501
1 (PEGx)는 접합체에서 사용된 상보적 반응기를 나타낸다.
* 는 차선의 활성화를 나타낸다.
도 33a는 예시적 접합체 및 면역자극 폴리뉴클레오티드를 사용한 마우스 A20 세포에서 IL6의 유도를 나타낸다. 이들 어세이에서 사용된 항체는 뮤린 항-CD22 항체였다. Q-태그를 항체에 대한 폴리뉴클레오티드의 접합을 위해 사용하였다. 도 33a에 나타낸 데이터를 표 27에 요약하였다.
Figure pct00502
* (PEGx)는 접합체에서 사용된 상보적 반응기를 나타낸다. PEG23은 NH2-PEG23-N3로부터 형성된 상보적 반응기이다.
도 33b는 면역자극 접합체의 활성이 면역자극 접합체에 포함된 항체에 의해 표적화되는 동일한 수용체를 표적화하는 과량(0-10 배)의 유리 항체의 존재에 의해 길항된다는 것을 나타낸다. IL6 분비를 접합체 및 비접합된 폴리뉴클레오티드의 면역자극 효율을 평가하기 위해 사용하였다. 이들 데이터는 (1) 표적화 모이어티가 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 면역자극 활성을 개선한다는 것, 및 (2) 본 발명의 접합체 내의 면역자극 폴리뉴클레오티드의 세포내 전달이 세포 표면 수용체-매개될 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 비접합된 폴리뉴클레오티드에 대한 접합체의 면역자극 활성에서의 향상은 면역자극 폴리뉴클레오티드의 세포내 전달에서의 개선으로 인한 것일 수 있다.
도 34a는 CpG-2336, 클래스 A CpG ODN에 의한 인간 PBMC에서 인터페론-α의 유도를 나타낸다. 도 34b는 접합체 SB-340을 사용한 인간 PBMC에서 인터페론-α의 유도를 나타낸다. 항-BDCA2 항체, SB-341, 및 p246을 이 실험에서 대조군으로서 사용하였다. 도 34c는 정제된 플라스마사이토이드 세포에서 인터페론-α의 유도를 나타낸다. 항-BCDA4 항체 및 이의 접합체(SB-343)를 대조군으로서 사용하였다.
도 35 및 36은 QuantiBlue를 사용한 NFκB 활성화에 의해 측정된 바와 같은, 24 시간에 다양한 5'-변형을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 인터뉴클레오시드 트리에스터의 면역자극 활성을 나타낸다.
고형 종양 모델에서의 생체내 프로파일링
A20 마우스 B-세포 림프종 세포를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)으로부터 구매하고 10% FBS를 함유하는 RPMI에서 배양하였다. 실험 당일에, 세포를 수집하고, HBSS에 재-현탁하였으며 6-8 주령의 암컷 Balb/c 마우스(Charles River)에 피하로 접종(마우스 당 5x106 세포)하였다. 10 일 후, 마우스를 무작위화하고, 8-10 마리의 마우스를 갖는 각각의 그룹에게 3 회 용량의 시험 물품(면역자극 폴리뉴클레오티드 또는 접합체)을 하루 걸러서(Q2D), 종양내(I.T., 25 μL) 또는 정맥내(I.V., 100 μL) 주사에 의해 투여하였다. 종양 부피를 치료 효능을 평가하기 위해 사용하였다. 종양 부피를 다음 식을 사용하여 주 당 2 회 계산하였다: V = (L x W2)/2, 상기 식에서 V는 종양 부피이고, L은 종양 길이이며, W는 종양 폭이다.
도 37a 및 37b는 본 발명의 면역자극 폴리뉴클레오티드를 이용한 종양의 치료가 종양 성장을 중지 및 심지어 역전시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 이들 실험에서, 본 발명의 면역자극 폴리뉴클레오티드를 차트의 X-축에 따른 화살표로 확인된 시간에 종양내로 또는 정맥내로 투여하였다. 이들 데이터는 또한 접합체가 접합체의 유리 개별 성분에 비해 이들의 항-종양 활성에서 우수하다는 것을 나타낸다. 도 37b에 나타낸 생체내 프로파일링 시험의 상세내용은 표 28에서 제공된다.
Figure pct00503
* (PEGx)는 접합체에서 사용된 상보적 반응기를 나타낸다.
도 38a는 본 발명의 면역자극 폴리뉴클레오티드를 이용한 종양의 치료가 비변형된 면역자극 폴리뉴클레오티드 또는 5'-말단 ISS가 결여된 면역자극 폴리뉴클레오티드와 비교하여, 종양 크기를 감소시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 이들 실험에서, 본 발명의 면역자극 폴리뉴클레오티드를 종양내로 투여하였다.
도 38b는 A20 마우스 B-세포 림프종 세포를 갖는 시험된 마우스의 피하 접종 및 이어서 상기 기재된 바와 같은 생리식염수, 본 발명의 면역자극 폴리뉴클레오티드, 또는 비변형된 면역자극 폴리뉴클레오티드의 3 회 용량의 종양내 투여 후 20 일차의 종양 부피를 나타낸다. 이들 실험에서, 본 발명의 면역자극 폴리뉴클레오티드를 종양내로 투여하였다.
도 39a는 본 발명의 접합체의 정맥내 투여가 본 발명의 비접합된 면역자극 폴리뉴클레오티드의 직접 종양내 투여만큼 종양 치료에 효과적일 수 있다는 것을 나타낸다. 생리식염수 및 비접합된 면역자극 폴리뉴클레오티드를 종양내로 투여하였으며, SB-337을 정맥내로 투여하였다.
도 39b는 A20 마우스 B-세포 림프종 세포를 갖는 시험된 마우스의 피하 접종 및 이어서 상기 기재된 바와 같은 생리식염수, 면역자극 폴리뉴클레오티드, 또는 접합체의 3 회 용량의 투여 후 20 일차의 종양 부피를 나타낸다. 생리식염수 및 면역자극 폴리뉴클레오티드를 종양내로 3 회 용량으로 투여하였으며, SB-337을 정맥내로 1 회 투여하였다.
액상 종양 모델에서의 생체내 프로파일링
A20 마우스 B-세포 림프종 세포를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)으로부터 구매하고 10% FBS를 함유하는 RPMI에서 배양하였다. 실험 당일에, 세포를 수집하고, HBSS에 재-현탁하였으며 6-8 주령의 암컷 Balb/c 마우스(Charles River)에 정맥내로 접종(마우스 당 5x106 세포)하였다. 다음날 시작하여, 8-10 마리/그룹에게 3 회 용량의 시험 물품(면역자극 폴리뉴클레오티드 또는 접합체)을 하루 걸러서(Q2D), 정맥내(I.V., 100 μL) 주사에 의해 투여하였다. 47 일차에, 생존한 마우스를 재-도전하였다(마우스 당 5x106 A20 세포). 연령 및 크기가 일치하는 새로운 대조군을 첨가하고 A20 마우스 종양 세포를 접종하였다. 비-접종된, 미-처치된 한배새끼를 대조군으로서 포함시켰다. 생존율(%)을 모니터링하여 치료 효능을 평가하였다.
도 40은 생리식염수, 본 발명의 접합체, 또는 면역자극 폴리뉴클레오티드를 이용한 처치를 겪은 마우스 집단에 대한 생존율을 나타낸다. 도 40에 나타낸 생체내 프로파일링 시험의 상세내용은 표 29에서 제공된다.
Figure pct00504
** μg/용량.
실시예 4. 면역자극 폴리뉴클레오티드의 혈청 안정성
프로토콜: 1 μL의 2 mM 저장액(포스포트리에스터를 갖는 CpG 폴리뉴클레오티드)을 19 μL의 신선한 마우스 혈청 내에 위치시켰다. 20 μL의 샘플을 PCR 플레이트 내에 위치시키고 37℃의 열순환기 상에서 가열하였다. 2 μL의 샘플을 지시된 시점에 제거하고, 18 μL의 포름아마이드 로딩 완충액에 첨가하였으며 겔 분석 전에 냉동시켰다. 2 μL를 15% TBE-요소 겔 상에 웰 당 로딩시켰으며, 30 분 동안 200 볼트에 이어, 에티듐 브로마이드 염색하였다(도 41a 및 41b 참고). 포스포트리에스터를 함유하는 CpG 폴리뉴클레오티드의 안정성을 또한 래트 혈청, 원숭이 혈청, 및 인간 혈청에서 평가하였다(도 41c, 41d, 및 41e 참고).
AEX HPLC에 의한 면역자극 폴리뉴클레오티드의 혈청 안정성 분석:
면역자극 폴리뉴클레오티드(수중 40 μM)를 80% 마우스 혈청 중 8 μM의 최종 농도로 희석하였다. 표본을 특정 시점(통상적으로 4 시간, 24 시간, 및 48 시간)에 취하고 1:1 10 mM EDTA로 켄칭시켰다. 샘플을 유동상 A(20mM 소듐 포스페이트 pH 8, 15% v/v 이소프로판올) 및 유동상 B(20 mM 소듐 포스페이트 pH 8, 1.5 M 소듐 브로마이드, 15% v/v 이소프로판올); 10 분 간 20 - 98% 유동상 B의 구배; 260 nm의 검출을 갖는 0.6 mL/분 유속을 사용한 60℃의 DNAPac PA200, 4 x 250 mm 칼럼 상의 음이온 교환 HPLC에 의해 분석하였다. HPLC 흔적에서, 주요 피크를 각각의 시점에 통합시키고, 미-성숙된 샘플에 대한 % 피크 영역을 계산하였다. 동일한 방법을 사용하여, 래트 혈청, 원숭이 혈청, 및 인간 혈청에서 면역자극 폴리뉴클레오티드의 안정성을 분석하였다.
도 42는 5'-말단 뉴클레오시드에 결합된 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트를 함유하는 면역자극 폴리뉴클레오티드가 5'-말단 뉴클레오시드에 결합된 인터뉴클레오시드 포스페이트를 함유하는 면역자극 폴리뉴클레오티드에 비해 높은 혈청 안정성을 나타낸다는 것을 나타낸다. 표 30에 나타낸 바와 같이, NFκB 활성화에 의해 측정된 바와 같이, 5'-말단에 인터뉴클레오시드 포스페이트를 갖는 면역자극 폴리뉴클레오티드는 5'-말단에 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트를 갖는 면역자극 폴리뉴클레오티드에 비해 높은 면역자극 활성을 나타낼 수 있다.
Figure pct00505
도 43은 온전한 p246의 질량에 비해 127 Da 적은 m/z를 갖는 물질에 상응하는 HPLC 피크 영역에서의 증가의 관찰을 통해 결정된 바와 같이, 5-요오도우리딘-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드가 요오드의 손실을 통해 시간에 걸쳐 혈청에서 분해를 겪을 수 있다는 것을 나타낸다.
도 44는 5-브로모우리딘이 혈청 안정성 및 면역자극 활성의 우수한 조합을 갖는 면역자극 폴리뉴클레오티드를 제공할 수 있다는 것을 나타낸다. 도 44에 나타낸 데이터를 표 31에 요약하였다.
Figure pct00506
**은 차선의 활성화를 나타낸다.
요오도-dU는 5-요오도-2'-데옥시우리딘이고, dT는 티미딘이며, dU는 2'-데옥시우리딘이고, CF3-dT는 5-트리플루오로메틸-티미딘이며, 플루오로-dU는 5-플루오로-2'-데옥시우리딘이고, C3은 C3 스페이서 -(CH2)3-OH이다.
도 45는 소정의 시간 간격으로 나머지 온전한 폴리뉴클레오티드의 퍼센트에 의해 측정된 바와 같은, 혈청(비-인간 영장류(NHP), 인간, 또는 마우스)에서 폴리뉴클레오티드의 안정성을 나타낸다. 도 43의 데이터를 표 32에 요약하였다.
Figure pct00507
이 표에 인용된 값은 접종의 개시 후 소정의 시간 간격으로 측정된 온전한 폴리뉴클레오티드의 퍼센트이다.
인간 면역자극 접합체의 대표적인 예
Figure pct00508
뮤린 면역자극 접합체의 대표적인 예
Figure pct00509
* TCO는 표적화 모이어티에 결합된 trans-사이클로옥테닐-기반 기이다. TCO는 도 1b에 도시된 구조를 갖는다.
실시예 5
본 실시예는 본원에 제공된 항체(CpG-Ab)에 접합된 CpG 폴리뉴클레오티드가 다양한 액상 및 고형 종양의 치료에서 효과적이라는 것을 나타낸다. 구체적으로, B-세포 표적화된 CpG-Ab는 암을 갖는 대상체에서 선천적 및 적응성 면역 반응에 영향을 줄 수 있다. 이러한 B-세포 표적화된 CpG-Ab는 CpG-Ab 표적(예를 들어, CD22)을 발현하지 않고 CpG-Ab 면역조절 폴리뉴클레오티드의 표적(예를 들어, TLR9 작용제)을 발현하지 않는 종양을 포함한 비-B-세포 종양(예를 들어, 결장 암종)의 치료를 위해 유용할 수 있다. 또한, 플라스마사이토이드 수지상 세포 또는 대식세포와 같은 비-B-세포 항원 제시 세포(APC)에 표적화된 CpG-Ab는 액상 종양(예를 들어, 림프종)의 치료를 위해 유용하다. CpG-Ab의 광범위한 항종양 효능이 대상체에 대한 이들의 전신 투여 후 관찰되었다. B-세포 표적화된 CpG-Ab를 포함한 CpG-Ab의 항-종양 효과는 세포 매개된 면역력을 포함하며 숙주의 T-세포 기능, 예컨대 CD8+ T-세포 기능에 의존적이라는 것이 밝혀졌다. 예를 들어, B-세포 표적화된 CpG-Ab를 포함한 CpG-Ab는 고형 종양의 CD4+ 및 CD8+ T-세포 침윤을 증가시켰다. 또한, CpG-Ab는 적응성이고 오래 지속되는 항-종양 면역력을 제공하는 것으로 밝혀졌다. 체크포인트 억제제, 예컨대 항-PD1 항체 및 항-PD-L1 항체를 이용한 상승작용 효과를 관찰하였다. CpG-Ab는 명확한 상보적 프로파일을 갖고, 예를 들어 상보적 C3을 활성화시키지 않도록 설계되었다.
실시예 6. B-세포 표적화 CpG-Ab 접합체는 파종성(액상) B-세포 림프종을 치료하는데 효과적이다.
파종성(액상) B-세포 림프종 질환 모델을 A20 림프종 세포(TLR9+/CD22+)를 이용한 면역 적격 BALB/c 마우스(8-10 마리의 마우스/그룹)의 정맥내 주사에 의해 생성하였다. 시험 화합물을 세포 주사 후 1, 3 및 5 일차에 정맥내로 투여하고 동물 생존을 40 일 동안 모니터링하였다.
면역자극 폴리뉴클레오티드를 합성하고 상기 실시예 1 및 2에 기재된 바와 같은 마우스-항-CD22 단클론 항체(mAb)에 접합하였다. 이 접합체(표 6-A에 나타낸 바와 같은 SB-337)를 다음 실시예에서 CpG-mAb(CD22)로 지칭한다. CpG 디뉴클레오티드를 GpC 디뉴클레오티드로 치환한 합성 폴리뉴클레오티드를 유사하게 제조하고 항-CD22 mAb에 접합하여 다음 실험에서 대조군 접합체(SB-339)로서 제공하였다.
마우스에게 상기 기재된 바와 같이 0 일차에 A20 림프종 세포를 주사하였다. 그 다음에, 1, 3 및 5 일차 각각에, 마우스에게 (i) 3mg/kg CpG-mAb(CD22); (ii) 10 mg/kg CpG-mAb(CD22); (iii) 비접합된 CpG(표 2에 나타낸 바와 같은 p347); (iv) 10 mg/kg CD22 mAb(CD22); 또는 (v) 10 mg/kg GpC-mAb(대조군 접합체)의 정맥내 주사를 투여하였다. 또한, 음성 대조군에게는 1, 3 및 5 일차에 생리식염수만을 투여하였다. 그룹들의 생존율을 40 일 동안 모니터링하였다.
도 46b에 나타낸 바와 같이, CpG-mAb로 처치된 마우스는 음성 대조군과 비교하여 상당히 긴 생존을 가졌다. 처치는 투여량 의존적 효과를 나타내었다. 구체적으로, 10 mg/kg CpG-mAb(CD22)를 투여받은 그룹은 40-일 관찰 윈도우 내에서 100% 생존율을 지속하였으며, 이는 90% 생존율을 지속한 3 mg/kg CpG-mAb(CD22)를 투여받은 그룹의 결과에 비해 약간 양호하다.
또한, 네이키드 CpG ODN 또는 항-CD22 mAb 단독을 이용한 처치는 또한 생리식염수만을 투여받은 음성 대조군과 비교하여 그룹 생존을 연장시켰으나, 양측 그룹은 40-일 관찰 윈도우 내에 사망하였다. GpC-mAb 대조군을 이용한 처치는 또한 음성 대조군과 비교하여 그룹 생존을 연장시켰으며, 이 효과는 대조군 접합체의 항-CD22 mAb 성분이 원인일 수 있다.
이들 데이터는 본원에 제공된 바와 같은 CpG ODN 및, CpG ODN 및 B 세포 표면 항원을 표적화하는 항체를 함유하는 CpG-Ab 접합체가 파종성 B-세포 림프종을 치료하는데 효과적이라는 것을 제시한다.
다음으로, 1 차 종양 도전으로부터의 생존자에게 47 일차에 2 차 종양 도전시켰다. 구체적으로, A20 림프종 세포의 제2 용량(5x106 세포)을 1, 3 및 5 일차에 10 mg/kg 또는 3 mg/kg CpG-mAb(CD22)로 처치된 생존자에 정맥내로 주사하였다. 나이브 대조군에게 47 일차에 동일한 용량의 A20 림프종 세포를 투여하였다. 마우스 그룹의 생존율에 대해 43 일(즉, 1 차 종양 도전 후 총 90 일) 동안 모니터링을 계속하였다.
도 46c에 나타낸 바와 같이, 1 차 종양 도전의 결과와 마찬가지로, 나이브 대조군은 또한 이들이 47 일차에 A20 세포를 투여받은 후 40 일 이내에 사망하였다(즉, 대략 85 일차에 사망하였음). 10 mg/kg 및 3 mg/kg 처치 그룹 둘 다는 대조군에 비해 상당히 양호한 생존율을 나타내었다. 구체적으로, 도 46c에 나타낸 바와 같이, 마우스가 5 일차에 CpG-mAb(CD22)의 최종 투여 후 임의의 처치를 투여받지 않았음에도 불구하고, 90-일 관찰 윈도우의 종료시 10 mg/kg 처치 그룹은 100% 생존율을 유지하였으며, 3 mg/kg 처치 그룹은 60%의 생존율을 유지하였다.
다음으로, 연장된 항-종양 효과를 1 차 및 2 차 도전으로부터의 생존자에게 3 차 종양 도전시킨 후에 추가로 모니터링하였다. 구체적으로, 5x106 A20 림프종 세포(TLR9+/CD22+)를 90 일차에 마우스 어깨 상에 피하로 이식함으로써 고형 B-세포 림프종 질환 모델을 생존자 마우스에서 생성하였다. 나이브 대조군에게 90 일차에 동일한 용량의 A20 림프종 세포를 이식하였다. 종양 생착(engraftment)의 크기를 30 일 동안(즉, 90 일차에서 120 일차 동안) 모니터링하였다.
구체적으로, 도 46d에 나타낸 바와 같이, 종양 부피는 대조군에서 급격하게 증가하여, 20 일 이내에 3000 mm3를 초과하는 크기에 도달하였다. 반대로, 생존자에게는 5 일차에 CpG-mAb(CD22)의 최종 투여 후 임의의 추가 처치를 투여하지 않았음에도 불구하고, 생존자 그룹은 30-일 관찰 기간을 통틀어 무-종양을 유지하였다. 이들 실험은 가용성 종양 생존자가 또한 고형 종양 도전으로부터 생존하였음을 나타낸다. 생존자는 추후에 새로운 종양 생착을 강하게 억제하는 항-종양 면역력을 얻었다.
함께 고려하면, 이들 데이터는 본원에 제공된 CpG-Ab 접합체가 대상체에서 종양에 대한 지속된 적응성 면역력을 유도할 수 있다는 것을 제시한다.
실시예 7. B-세포 표적화 CpG-Ab 접합체는 고형 B 세포 림프종을 치료하는데 효과적이다.
면역 적격 BALB/c 마우스에 5x106 A20 림프종 세포(TLR9+/CD22+)를 이식함으로써 고형 B-세포 림프종 질환 모델을 생성하였다. 세포를 마우스 어깨 상에 피하로 주사하고 종양 성장을 모니터링하였다. CpG-mAb(CD22) 접합체 및 GpC-mAb 대조군 접합체를 상기 기재된 바와 같이 제조하였다.
마우스에게 상기 기재된 바와 같이 0 일차에 A20 림프종 세포를 이식하였다. 그 다음에, 9, 12 및 14 일차 각각에, 마우스에게 (i) 3 mg/kg CpG-mAb(CD22); (ii) 10 mg/kg CpG-mAb(CD22); (iii) 네이키드 CpG ODN; (iv) 10 mg/kg CD22 mAb(채워진 사각형); 또는 (v) 10 mg/kg GpC-mAb(대조군 접합체)의 정맥내 주사를 투여하였다. 또한, 음성 대조군에게 9, 12 및 14 일차에 생리식염수만을 투여하였다. 마우스 그룹의 종양 부피를 23 일 동안 모니터링하였다. 결과를 도 47b 내지 47e에 나타내었다.
도 47b에 나타낸 바와 같이, CpG-mAb(CD22)로 처치된 마우스는 음성 대조군과 비교하여 상당히 작은 종양 부피를 가졌다. CpG-mAb(CD22)로 처치된 모든 마우스의 종양 부피는 25-일 기간의 종료시 2000 mm3 미만을 유지하였다. 처치는 투여량 의존적 효과를 나타내었다. 구체적으로, 10 mg/kg CpG-mAb(CD22)를 투여받은 그룹은 3 mg/kg CpG-mAb(CD22)를 투여받은 그룹과 비교하여 25-일 기간의 종료시 작은 종양 부피를 가졌다. 또한, 네이키드 CpG ODN 단독을 이용한 처치는 음성 대조군에 비해 상당히 작은 종양 부피를 야기하였으며, 종양 부피는 적어도 20 일 동안 2000 mm3 미만을 유지하였다. 함께 고려하면, 이들 데이터는 CpG ODN 및, CpG ODN 및 B 세포 표면 항원을 표적화하는 항체를 함유하는 CpG-Ab 접합체가 고형 B-세포 림프종을 치료하는데 효과적이라는 것을 제시한다. 마우스의 중량에 대한 CpG-mAb(CD22) 접합체의 효과를 또한 연구하였으며 결과를 도 47f에 나타내었다.
실시예 8. B-세포 표적화 CpG-Ab 접합체는 비-B 세포 암종을 치료하는데 효과적이다.
면역 적격 BALB/c 마우스의 옆구리에 0.2x106 CT26 세포(CD22-/PD-L1(저)/TLR9-)를 피하로 이식함으로써 결장 암종 질환 모델을 생성하였다. CpG-mAb(CD22) 접합체를 상기 기재된 바와 같이 제조하였다.
마우스에게 상기 기재된 바와 같이 0 일차에 CT26 세포를 이식하였다. 그 다음에, 마우스에게 (i) CpG-mAb(CD22) 단독; (ii) 항-PD-1 항체 단독; (iii) 항-PD-1 항체와 조합된 CpG-mAb(CD22); 또는 (iv) 생리식염수의 정맥내 주사를 투여하였다. 구체적으로, 3 mg/kg CpG-mAb(CD22)를 5 일차에 처음 주사하고, 투여를 8 일차 및 11 일차에 반복하였다. 10 mg/kg 항-PD-1을 6 일차에 처음 주사하고, 투여를 9 및 12 일차에 반복하였다. 마우스 그룹의 종양 부피를 18 일 동안 모니터링하였다.
도 48b에 나타낸 바와 같이, CpG-mAb(CD22) 또는 항-PD-1 단독, 또는 조합된 2 개의 약제를 이용한 처치 모두는 대조군과 비교하여 관찰 기간의 종료시 종양 부피를 상당히 감소시켰다. 조합 치료의 항-종양 효과는 항-PD-1 단독을 이용한 처치에 비해 더욱 현저하였다.
함께 고려하면, 이들 데이터는 고형 종양 세포 자체가 TLR9 또는 CpG-mAb(CD22) 접합체의 항원 표적을 발현하지 않음에도 불구하고, B-세포 표적화 CpG-mAb(CD22) 접합체의 전신 투여가 고형 종양을 치료하기 위해 효과적이라는 것을 제시한다. 항-종양 효과는 B-세포 표적화 CpG-mAb(CD22) 접합체의 투여시 B-세포 활성화에 기여할 수 있다. 또한, 항-PD-1 항체 및 B-세포 표적화 CpG-mAb(CD22) 접합체 둘 다를 사용한 병용 요법은 항-PD-1 항체 단독을 사용한 처치와 비교하여 고형 종양을 치료하는데 효과적이다.
실시예 9. 적격 면역계에서 CpG-Ab 접합체의 항-종양 효과.
다음으로, 면역-적격 및 면역-저하 시스템에서 CpG-Ab 접합체의 항-종양 효과를 평가하기 위해 실험을 수행하였다. 면역 적격 BALB/c 마우스 및 면역-저하 Nu/Nu 마우스 및 SCID 마우스에 각각 5x106 A20 림프종 세포(TLR9+/CD22+)를 이식함으로써 고형 B-세포 림프종 모델을 생성하였다. CpG-mAb(CD22) 접합체를 상기 기재된 바와 같이 제조하였다.
Figure pct00510
면역-적격 그룹에서, 10 mg/kg CpG-mAb(CD22)를 10, 12 및 14 일차에 정맥내로 투여하였다. 음성 대조군에게 상기 일자에 생리식염수만의 정맥내 주사를 투여하였다. 종양 부피를 20 일 동안 모니터링하였다. 도 49a에 나타낸 바와 같이, CpG-mAb(CD22)의 정맥내 투여는 면역-적격 Balb/C 마우스에서 무-종양 표현형을 야기한 한편, 대조군의 종양 부피는 관찰 기간 동안 증가를 계속하였다.
면역-저하 그룹에서, 10 mg/kg CpG-mAb(CD22) 또는 네이키드 CpG를 8 및 11 일차에 정맥내로 투여하였다. 음성 대조군에게 상기 일자에 생리식염수만의 i.v. 주사를 투여하였다. 종양 부피를 15 일 동안 모니터링하였다. 도 49b 및 49c에 나타낸 바와 같이, 네이키드 CpG ODN 또는 CpG-mAb(CD22) 접합체의 i.v. 투여는 음성 대조군과 비교하여 면역-저하 Nu/Nu 마우스 또는 SCID 마우스에서 종양 성장에 영향을 주지 않았다.
함께 고려하면, 이들 데이터는 CpG-Ab 접합체의 항-종양 효과가 T-세포 면역력에 의존적이라는 것을 제시한다.
실시예 10. CpG-Ab 접합체의 항-종양 효과는 CD8 + T-세포 의존적이다.
다음으로, CpG-Ab 접합체의 항-종양 효과를 위해 필요한 림프구의 활성을 시험하기 위해 실험을 수행하였다. 구체적으로, CpG-Ab 접합체의 항-종양 효과를 각각 항-CD4 항체(-2, -1, 0, 5, 8, 12 일차의 500 ug/마우스), 항-CD8 항체(-2, -1, 0, 5, 8, 12 일차의 100 ug/마우스), 또는 항-아시알로 GM1 항체(-2, -1, 0, 5, 8, 12 일차의 25 ug/마우스)의 복강내 주사에 의해 얻어진 CD4+ T 세포 고갈된 마우스, CD8+ T 세포 고갈된 마우스, 및 NK 세포 고갈된 마우스에서 평가하였다. 세포 고갈을 FACS 분석에 의해 확인하였다. 모든 고갈 항체를 Bioexcell로부터 구매하였다.
파종성 B-세포 림프종 모델 마우스를 상기 기재된 바와 같이 생성하였다. CpG-mAb(CD22) 접합체를 상기 기재된 바와 같이 제조하였다.
이들 림프구 고갈 실험에서, 마우스에게 상기 기재된 바와 같이 0 일차에 A20 림프종 세포(5x106)를 주사하였다. 그 다음에, 1, 3 및 5 일차 각각에, 마우스에게 (i) CD4+ T 세포 고갈을 위해 -2, -1, 0, 5, 8, 12 일차에 3 mg/kg CpG-mAb(CD22) 및 항-CD4 고갈 항체, 500 ug/마우스; (ii) NK 세포 고갈을 위해 -2, -1, 0, 5, 8, 12 일차에 3 mg/kg CpG-mAb(CD22) 및 항-아시알로 GM1 항체의 25 ug/마우스; 및 (iii) CD8+ T 세포 고갈을 위해 -2, -1, 0, 5, 8, 12 일차에 3 mg/kg CpG-mAb(CD22) 및 항-CD8 고갈 항체, 100 ug/마우스의 정맥내 주사를 투여하였다. 또한, 양성 대조군에게는 1, 3, 및 5 일차에 3 mg/kg CpG-mAb(CD22)를 투여하였으며, 음성 대조군에게는 1, 3 및 5 일차에 생리식염수만을 투여하였다. 그룹의 생존율을 85 일 동안 모니터링하였다.
도 50a에 나타낸 바와 같이, CpG-mAb(CD22) 처치를 투여받은 마우스는 CpG-mAb(CD22)로 처치되지 않은 그룹과 비교하여 상당히 양호한 생존을 나타내었다. CD4+ T 세포 고갈은 생존에 상당히 영향을 주지 않았다. 구체적으로, CpG-mAb(CD22)로 처치된(T-세포 고갈 처치 있거나 없음) 2 개의 마우스 그룹 둘 다는 종양 세포로의 도전 후 적어도 85 일 동안 50% 생존율을 유지한 한편, CpG-mAb(CD22) 처치 없는(T-세포 고갈 처치 있거나 없음) 2 개의 마우스 그룹 둘 다는 40 일 이내에 사망하였다.
NK 세포 또는 CD8+ 세포의 고갈은 둘 다 CpG-mAb(CD22)로 처치된 마우스에서 악화된 생존을 야기하였다. 도 50b에 나타낸 바와 같이, CpG-mAb(CD22) 및 NK 세포 고갈 처치 둘 다를 투여받은 그룹은 40 일차에 약 90% 생존율, 및 85 일차에 약 10% 생존율을 나타내었다. 더욱 현저하게는, 도 50c에 나타낸 바와 같이, 90% 초과의 CD8+ T 세포 고갈된 마우스가 심지어 CpG-mAb(CD22) 처치 후에도 30 일 이내에 사망하였다. 이 결과는 대조군에서 관찰된 결과(모든 마우스가 대략 30 일차에 사망함)와 유사하였다. 이들 데이터는 CpG-Ab의 항-종양 효과가 적어도 CD8+ T 세포 의존적이라는 것을 제시한다.
실시예 11. CpG-Ab 접합체는 T-세포 종양 침윤을 증가시킨다.
고형 B-세포 림프종 모델 마우스를 상기 기재된 바와 같이 생성하였다. CpG-mAb(CD22) 접합체를 상기 기재된 바와 같이 제조하였다.
마우스에게 0 일차에 A20 림프종 세포로 피하로 도전시킨지 10, 12 및 14 일 후에 10 mg/kg CpG-mAb(CD22) 접합체의 정맥내 투여를 투여하였다. 17 일차에 수집된 종양을 HBSS 중 1mg/mL 콜라게나아제 IV, 100U/mL DNAse I을 함유한 분해 완충액에서 37℃에서 30 분 동안 항온처리함으로써 순차적으로 분해시켰다. 그 다음에, 분해된 세포를 70 um 체를 통해 여과하고, 세척하고, 항-CD4-PE 또는 항-CD8-PE 항체와 함께 얼음 상에서 항온처리하고 FACS에 의해 분석하였다.
도 51a에 나타낸 바와 같이, 종양 성장은 대조군과 비교하여 CpG-mAb(CD22)로 처치된 그룹에서 더 늦었다. CpG-mAb(CD22) 처치된 마우스로부터의 17 일차의 종양 부피는 대조군 마우스에 비해 상당히 작았다. 도 51b에 나타낸 바와 같이, 종양 조직에서 CD4+ 세포 및 CD8+ 세포의 퍼센트는 둘 다 대조군에 비해 처치된 그룹에서 상당히 높았다. 또한, 도 51c에 나타낸 바와 같이, 종양 부피는 종양에서의 CD8+ 세포의 퍼센트와 역비례하는 연관성이 있다.
함께 고려하면, 이들 데이터는 고형 종양을 갖는 마우스로의 CpG-Ab 접합체의 전신 투여가 종양 내로의 T-세포 침윤을 상당히 증가시킬 수 있다는 것을 제시한다. 종양 및/또는 종양 미세환경에서 면역 세포, 특히 CD8+ T 세포의 증가된 수는 종양에 대한 면역 공격 및 종양 성장의 억제제를 용이하게 한다.
실시예 12. CpG-Ab 접합체 및 면역 체크포인트 단백질의 항체의 상승작용 효과.
CpG-Ab 접합체 및 면역 체크포인트 단백질 항체 둘 다를 사용한 병용 요법의 항-종양 효과를 평가하기 위해 실험을 수행하였다.
고형 B-세포 림프종 모델 마우스를 상기 기재된 바와 같이 생성하였다. CpG-mAb(CD22) 접합체를 상기 기재된 바와 같이 제조하였다. 항-PD1 항체(클론 J43)를 Bioxcell로부터 구매하고 항-PDL1 항체(아테졸리주맙)를 사내에서 제조하였다.
마우스에게 상기 기재된 바와 같이 0 일차에 A20 림프종 세포를 이식하였다. 그 다음에, 마우스에게 (i) CpG-mAb(CD22); (ii) 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체의 복강내 주사; (iii) 항-PD-1 항체와 조합된 CpG-mAb(CD22) 또는 항-PD-L1 항체와 조합된 CpG-mAb(CD22); 또는 (iv) 생리식염수의 정맥내 주사를 투여하였다. 구체적으로, CpG-mAb(CD22)(단독 또는 면역 체크포인트 단백질 항체와의 조합)를 투여받은 그룹에 대해, 3 mg/kg CpG-mAb(CD22)의 제1 용량을 10 일차에 처음 투여한 다음에, 동일한 투여를 12 및 14 일차에 반복하였다. 또한, 면역 체크포인트 단백질 항체(단독 또는 CpG-mAb(CD22)와의 조합)를 투여받은 그룹에 대해, 10 mg/kg 면역 체크포인트 단백질 항체의 제1 용량을 10 일차에 처음 투여한 다음에, 동일한 투여를 13 및 16 일차에 반복하였다. 마우스 그룹의 종양 부피를 모니터링하였다.
CpG-mAb(CD22) 및 면역 체크포인트 단백질 항체가 2 개의 약제를 별도로 이용한 처치와 비교하여 강한 종양-억제 효과를 나타냈다는 것이 실험으로부터 관찰되었다. 구체적으로, 도 52a 및 52b에 나타낸 바와 같이, 병용 요법으로 처치된 마우스는 CpG-mAb(CD22) 또는 면역 체크포인트 항체 단독을 이용한 처치와 비교하여 상당히 작은 종양 크기를 가졌다.
관찰된 상승작용 효과가 또한 CD8+ T 세포 활성에 대해 의존적인지 여부를 시험하기 위해, 추가 그룹의 마우스에게 (i) 10, 12 및 14 일차 각각에 10 mg/kg CpG-mAb(CD22), (ii) 10, 13 및 16일차 각각에 10 mg/kg 항-PD-1 항체, 및 (iii) 항CD8 항체(200 ug/마우스, 복강내, 0 일차에 출발하여 실험에 걸쳐 2 회/주 투여함)를 투여하여, CD8+ T 세포를 고갈시켰다. 도 52c에 나타낸 바와 같이, 생리식염수 처치된 대조군과 마찬가지로, 이 실험 그룹의 종양 부피는 급속도로 성장하였으며, 이는 CpG-mAb(CD22) 및 면역 체크포인트 단백질 항체 둘 다를 사용한 병용 요법의 종양 억제에서의 상승작용 효과가 또한 CD8+ T 세포 의존적이라는 것을 제시한다.
또한, CpG-mAb(CD22) 및 항-PD-1 항체 둘 다를 사용한 병용 요법으로 처치되고 1 차 종양 도전으로부터 생존한 마우스를 2 차 종양 도전시켰다. 구체적으로, 조합 처치 그룹으로부터의 생존자에게 A20 세포의 제2 용량을 30 일차에 어깨 상에 피하로 투여하였다. 생존자 그룹에게 2 차 종양 도전 후 임의의 추가 처치를 투여하지 않았다. 나이브 대조군에게 동일한 용량의 종양 세포를 투여하였다. 종양 부피를 25 일 동안(즉, 30 일차에서 55 일차 동안) 추가로 모니터링하였다.
도 53a 내지 53c에 나타낸 바와 같이, 대조군 또는 항-PD-1 항체 단독으로 처치된 그룹과 반대로, CpG-Ab/항-PD-1 조합은 관찰 기간을 통틀어 모든 개체에서 종양 성장을 상당히 억제하였다. 또한, 조합 처치는 대략 D18에서 출발한 2 마리의 개체에서 단계화된 종양을 퇴행시켰다.
조합 처치 그룹으로부터의 생존자를 상기 기재된 바와 같이 2 차 종양 도전시켰다. 도 53d에 나타낸 바와 같이, 2 차 종양 도전 후, 나이브 대조군에서의 종양 부피가 급속도로 증가하여, 20 일 이내에 2000 mm3를 초과하는 평균 부피에 도달하였다. 반대로, 생존자 그룹은 25-일 관찰 윈도우를 통틀어 무-종양을 유지하였다. 이들 결과는 CpG-Ab 접합체 및 면역 체크포인트 단백질 항체를 사용한 병용 요법이 대상체에서 종양에 대한 지속된 적응성 면역력을 유도할 수 있다는 것을 제시한다.
실시예 13. CpG-Ab 접합체 및 T 세포 작용제의 상승작용 효과.
다음으로, CpG-Ab 접합체 및 T 세포 작용제 둘 다를 사용한 병용 요법의 항-종양 효과를 평가하기 위해 실험을 수행하였다.
고형 B-세포 림프종 모델 마우스를 상기 기재된 바와 같이 생성하였다. CpG-mAb(CD22) 접합체를 상기 기재된 바와 같이 제조하였다.
마우스에게 상기 기재된 바와 같이 0 일차에 A20 림프종 세포를 이식하였다. 그 다음에, 마우스에게 (i) CpG-mAb(CD22); (ii) 항-OX-40 항체(클론 OX-86, 10 mg/kg, Bioxcell), 항-ICOS 항체(클론 7E.17G9, 10 mg/kg, Bioxcell), 또는 항-4-1BB 항체(클론 3H3, 1 mg/kg, Bioxcell)의 복강내 주사; (iii) 항-OX-40 항체와 조합된 CpG-mAb(CD22), 항-ICOS 항체와 조합된 CpG-mAb(CD22), 또는 항-4-1BB 항체와 조합된 CpG-mAb(CD22); 또는 (iv) 생리식염수의 정맥내 주사를 투여하였다. 구체적으로, CpG-mAb(CD22)(단독 또는 T-세포 자극 항체와 조합됨)를 투여받은 그룹에 대해, 3 mg/kg CpG-mAb(CD22)의 제1 용량을 10 일차에 처음 투여한 다음에, 동일한 투여를 12 및 14 일차에 반복하였다. 또한, T-세포 자극 항체(단독 또는 CpG-mAb(CD22)와 조합됨)를 투여받은 그룹에 대해, T-세포 자극 항체의 제1 용량을 10 일차에 투여한 다음에, 동일한 투여를 13 및 17 일차에 반복하였다. 마우스 그룹의 종양 부피를 모니터링하였다.
CpG-mAb(CD22) 및 T-세포 자극 항체가 T-세포 자극 항체 단독을 이용한 처치에서 관찰되지 않은 종양-억제 효과를 상승작용으로 나타냈다는 것이 이 실험으로부터 관찰되었다. 구체적으로, 도 54a 내지 54c에 나타낸 바와 같이, 병용 요법으로 처치된 마우스는 음성 대조군 또는 T-세포 자극 항체(항-OX-40, 항-ICOS, 또는 항-4-1BB) 단독으로 처치된 그룹과 비교하여 상당히 작은 종양 크기를 가졌다.
실시예 14. B-세포 표적화 CpG-Ab는 비장세포에서 종양 항원 특이적 세포독성 T-세포 반응을 유도한다.
결장 암종 질환 모델을 상기 기재된 바와 같이 생성하였다. CpG-mAb(CD22) 접합체를 상기 기재된 바와 같이 제조하였다.
마우스에게 상기 기재된 바와 같이 0 일차에 CT26 세포를 이식하였다. 그 다음에, 마우스에게 10, 13, 및 16 일차에 10 mg/kg CpG-mAb(CD22) 또는 생리식염수의 정맥내 주사를 투여하였다. 마우스 그룹의 종양 부피를 17 일 동안 모니터링하였다. 도 55a에 나타낸 바와 같이, CpG-mAb(CD22)를 이용한 처치는 대조군과 비교하여 종양 성장을 상당히 억제하였다.
17 일차(최종 투여 후 24 시간)에, 마우스를 희생시켰으며, 비장세포를 단리시키고 항-IFN-감마 항체가 코팅된 ELISPOT 플레이트에 플레이팅하였다(4x105 세포/웰). 세포를 100 ug/mL의 CT26 세포 표면 항원(AH1 펩티드)으로 24 시간 동안 37℃에서 도전시키고 IFN-감마 분비 T 세포를 계수하였다. 도 55b에 나타낸 바와 같이, IFN-감마 분비 세포의 수는 대조군과 비교하여 CpG-mAb(CD22)로 처치된 그룹에서 상당히 증가하였다. 이들 데이터는 B-세포 표적화 CpG-Ab 접합체가 대상체에 대한 투여시 종양 항원 특이적 세포독성 T-세포 반응을 유도할 수 있다는 것을 제시한다.
실시예 15. 수지상 세포를 표적화하는 CpG-Ab 접합체는 항-종양 적응성 면역력을 유도한다.
고형 B-세포 림프종 질환 모델을 상기 기재된 바와 같이 생성하였다. 서열번호 313의 서열(p313)을 갖는 면역자극 폴리뉴클레오티드를 합성하고 실시예 1 및 2에 기재된 바와 같은 항-CD205 항체 또는 항-PD-L1 항체에 접합하였다. 이들 접합체를 각각 CpG-Ab(CD205) 및 CpG-Ab(PD-L1)로서 지칭한다.
마우스에게 상기 기재된 바와 같이 0 일차에 A20 세포를 이식하였다. 그 다음에, 마우스에게 10, 12, 및 14 일차에 (i) 10 mg/kg CpG-Ab(CD205); (ii) 10 mg/kg CpG-Ab(PD-L1); 또는 (iii) 생리식염수의 정맥내 주사를 투여하였다. 마우스 그룹의 종양 부피를 약 41 일 동안 모니터링하였다.
도 56a에 나타낸 바와 같이, CpG-Ab(CD205)를 이용한 처치는 대조군과 비교하여 종양 성장을 상당히 억제하였다. 도 56b에 추가로 나타낸 바와 같이, CpG-Ab(CD205) 접합체는 그룹 내의 모든 8 마리 개체에서 종양 성장을 퇴행시켰으며, 총 8 마리 개체 중 7 마리에서 무-종양 표현형을 야기하였다.
도 56c에 나타낸 바와 같이 CpG-Ab(PD-L1)를 이용한 처치는 종양 성장을 퇴행시켰으며, 총 8 마리 개체 중 3 마리에서 무-종양 표현형을 야기하였다.
또한, CpG-Ab 접합체로 처치된 그룹으로부터의 생존자를 2 차 종양 도전시켰다. 구체적으로, 생존자에게 5x106의 A20 세포를 피하로 37 일차에 추가 처치 없이 투여하였다. 고형 B-세포 림프종을 갖는 마우스의 나이브 그룹에게 동일한 용량의 A20 세포를 투여하였다. 마우스 그룹의 종양 부피를 2 차 도전 후 17 일 동안 관찰하였다. 도 56d에 나타낸 바와 같이, 종양 부피는 대조군에서 급속도로 증가한 한편, CpG-Ab(PD-L1) 처치 그룹 또는 CpG-Ab(CD205) 처치 그룹으로부터의 생존자는 17-일 관찰 윈도우를 통틀어 무-종양을 유지하였다.
별도의 실험에서, 고형 B-세포 림프종을 갖는 마우스의 4 개 그룹(8 마리 개체/그룹)을 10, 12, 및 14 일차 각각에 (i) 10 mg/kg CpG-Ab(CD205) 접합체; (ii) 10 mg/kg 마우스 항-CD205 단클론 항체; (iii) 10 mg/kg 래트 IgG, 또는 (iv) 생리식염수의 정맥내 투여로 처치하였다. 마우스 그룹의 종양 부피를 27 일 동안 모니터링하였다.
도 57a 및 57c에 나타낸 바와 같이, CpG-Ab(CD205) 접합체를 이용한 처치는 종양 성장을 퇴행시켰으며 치료 그룹 중 모든 8 마리 개체에서 무-종양 표현형을 야기하였다. 또한, 종양은 항-DEC205 항체 및 래트 IgG 대조군 항체로 처치된 마우스에서 퇴행되었다. 이는 아마도 어떠한 마우스도 무-종양이 아니었지만, IgG2와 같은 양측 항체가 중간 항-종양 활성을 야기하는 활성 Fc 이펙터 기능을 보유한다는 사실로 인한 것이다. 따라서, 항-DEC205 항체가 항-종양 활성을 나타낸 사실에도 불구하고, CpG-CD205 접합체는 상당히 더욱 효과적이었으며, 이는 모든 마우스가 무-종양이었기 때문이다.
함께 고려하면, 이들 데이터는 수지상 세포를 표적화하는 CpG-Ab 접합체가 대상체에 대한 투여시 종양에 대한 지속된 적응성 면역력을 유도할 수 있다는 것을 제시한다.
실시예 16. CpG-CD19 접합체는 양호한 효능을 나타낸다.
상기 기재된 바와 같이, 마우스에 4x106 A20 림프종 세포를 이식함으로써 고형 B-세포 림프종 질환 모델을 생성하였다. 간단하게는, 세포를 피하로 주사하고 종양 성장을 캘리퍼를 사용하여 측정하였다. CpG-mAb 접합체 및 네이키드 CpG를 상기 기재된 바와 같이 제조하였다.
마우스에게 0 일차에 A20 림프종 세포를 이식하였다. 마우스를 10 일 동안 단계화시킨 다음에, 10, 12 및 14 일차에 처치하고, 종양 성장을 20 일차까지 측정하였다(도 60a). 처치는 (i) 3 mg/kg CpG-Ab(SB-337; CD22에 접합된 p313)(사각형); (iii) 3 mg/kg 항-CD19(채워진 역삼각형); (iv) 3 mg/kg CpG-Ab(SB-388; CD19에 접합된 p313)(채워진 다이아몬드); (v) 1.9 μg/마우스 유리 CpG(p347)(정삼각형); (vi) 19 μg/마우스 유리 CpG(p347)(빈 역삼각형); 또는 (vii) 190 μg/마우스 유리 CpG(p347)(빈 다이아몬드)의 정맥내 주사를 포함하였다. 또한, 음성 대조군에게 생리식염수만을 투여하였다(채워진 원). 마우스 그룹의 종양 부피를 10 일차에 출발하여 20 일차까지 계속 캘리퍼를 사용하여 측정하였다(도 60a). 20 일차에, 마우스를 희생시키고 종양 부피를 측정하였다(도 60b). 결과는 CD19에 접합된 p313을 함유한 CpG-Ab 접합체(SB-388)가 양호한 효능을 나타내었다는 것, 및 2) 효능이 동일한 CpG(p313)를 함유하지만, CD22에 접합된 CpG-Ab 접합체(SB-337)와 유사하였다는 것을 나타내었다.
또한, 종양 중량에서의 변화를 무시한 마우스의 체중 변화를 평가하였다(도 60c). 예비 안전성 결과는 체중 변화에 기반하여 CD19 CpG-Ab(SB-388)가 이의 동등한 용량의 CpG에 비해 덜 독성이었다는 것을 나타내었다.
현재 및 다음 실시예에서, CpG-4715는 표 2에 나타낸 바와 같은 p347에 상응하고; CpG-4523은 표 2에 나타낸 바와 같은 p313에 상응한다. SB-1490은 표 6-A에 나타낸 바와 같은 SB-337에 상응하고; SB-3055는 표 6-B에 나타낸 바와 같은 SB-388에 상응한다.
실시예 17. 고형 종양에서 CpG4715의 종양내 투여는 효과적이다.
고형 종양에서 CpG의 종양내 투여를 평가하기 위해, 알비노 C57Bl/6 마우스(n = 8/그룹)에게 1x106 B16F10 흑색종 세포를 옆구리 상에 피하로 접종하였다. 종양을 7 일 동안 성장시킨 다음에, p347을 7, 9, 11, 및 13 일차에 종양내로(50 μL의 생리식염수 중 30 ㎍) 주사하였다. 음성 대조군으로서, 50 μL의 생리식염수를 생리식염수 처치된 그룹에 종양내로 주사하였다. 종양 부피를 27 일차까지 모니터링하였다. 결과는 생리식염수에 비해 p347로 처치된 마우스에서 작은 종양 부피로 나타난 바와 같이, p347이 고형 종양 유형에서 효과적이라는 것을 나타내었다(도 61a).
또한, 14 일차에 1x106 B16F10 흑색종 세포를 꼬리 정맥으로 정맥내로 주사함으로써 마우스에 B16F10 흑색종 세포를 재-도전시킴으로써 CpG의 전신 효과를 모니터링하였다. 마우스를 희생시키고 이들의 폐를 절제하여 종양 전이를 평가하는 27 일차까지 종양 부피를 모니터링하였다. 결과는 비-처치된 흑색종 세포를 꼬리 정맥으로 주사하는 것에 의한 마우스 재-도전시, 생리식염수 처치된 그룹과 비교하여 p347 처치된 그룹에서 폐 전이가 덜 있었던 것으로 드러났다(도 61b). 종합적으로, 이들 결과는 CpG가 전신 효과를 제공한다는 것, 및 면역 활성화로부터의 연장된 효과가 폐에 대한 전이의 총 수를 감소시킬 수 있다는 것을 나타내었다.
전신 효과에 관계된 작용의 메커니즘을 더욱 조심스럽게 결정하기 위해, 상기 기재된 바와 같이 CT-26 대장 마우스 모델을 사용하였다. 간단하게는, 종양을 7 일 동안 성장시킨 다음에, p347을 7, 10, 12, 및 14 일차에 종양내로(50 μL의 생리식염수 중 10 ㎍) 주사하였다. 음성 대조군으로서, 50 μL의 생리식염수를 생리식염수 처치된 그룹에 종양내로 주사하였다. 종양 부피를 21 일차까지 모니터링하였다(도 61c). B16F10 흑색종 모델과 마찬가지로, CpG4715의 종양내 투여는 CT26 고형 종양에서 효과적이었다. 중요하게는, 결과는 숙주 TLR9가 CpG 처치의 기능을 위해 충분하며, 이는 CT26 세포가 TLR9-이기 때문이라는 것을 나타내었다.
실시예 18. CpG-Ab 접합체의 항-종양 효과는 B-세포 의존적이다.
CpG의 활성에 대한 B 세포의 역할을 평가하기 위해 실험을 수행하였다. 이 효과를 위해, 상기 기재된 바와 같이 유전적 B-세포 결핍인 Jh 녹아웃(knockout) 마우스(Igh-Jtm1DhuN?+N2; Taconic Biosciences, Inc)에서 CT26 대장 모델을 사용하였다(도 62a). 이들 마우스는 Ig 중쇄 유전자자리의 내인성 뮤린 J 세그먼트의 결여를 가져, 발달 진행 및 세포 정량 둘 다에서 급격하게 변경된 B 계통의 세포를 야기한다. 마우스는 비장, 골수, 림프절, 말초 혈액 또는 복막에서 성숙한(면역글로불린-보유) B-림프구를 함유하지 않으며, 이들은 혈청에서 검출 가능한 IgM 또는 IgG를 갖지 않는다.
CT26 이종이식물을 상기 기재된 바와 같이 생성하였다. 종양을 7 일 동안 성장시킨 다음에, 마우스를 10, 12, 및 14 일차에 10 mg/kg CpG-mAb(CD22-CpG; SB-337), 또는 생리식염수로 정맥내로 처치하였다. 종양 부피를 17 일 동안 모니터링하였으며, 어떠한 상당한 변화도 생리식염수와 CpG-mAb 그룹 사이에 관찰되지 않았다. 이는 B-세포가 CpG 활성을 위해 필요하다는 것을 나타내었다.
결과는, 면역적격 마우스에게 항-CD20 mAb를 투여함으로써, 고갈된 B-세포를 갖는 마우스 백그라운드의 CT-26 대장 모델을 사용하여 추가로 지지되었다(도 62b). 종양 부피를 27 일 동안 측정하였다. CpG-mAb 처치 그룹의 항-종양 효과는 B 세포 고갈이 없는 처치와 비교하여 상당히 감소되었다. 이 결과는 CpG 활성이 B-세포 의존적이라는 것을 추가로 뒷받침하였다.
실시예 19. B-세포 활성화는 공통유전자 마우스 모델에서 CpG 항-종양 활성을 향상시킨다.
CpG 항-종양 활성에 대한 B-세포 활성화의 효과를 평가하기 위해 MC38 대장암 세포를 사용하여 대장암의 공통유전자 모델을 수행하였다. MC38 대장암 세포는 항원/TLR9 음성이다. 간단하게는, 알비노 암컷 C57Bl/6 마우스(n=8/그룹)에게 0.3x106 MC38 세포를 옆구리 상에 피하로 접종하였다. 이종이식물을 10 일 동안 성장시킨 다음에, 시험 화합물을 (i) 생리식염수(원); (ii) 10 mg/kg 항-CD22(정삼각형); (iii) 10 mg/kg 항-PD-L1(역삼각형); (iv) 10 mg/kg CD22-CpG(SB-337)(사각형); 또는 (v) 10 mg/kg CD22-CpG(SB-337) + 10 mg/kg 항-PD-L1(다이아몬드)와 함께 주사하였다. 항-CD22 및 CD22-CpG를 10, 12, 및 14 일차에 정맥내로 투여하였으며; 항-PD-L1을 10, 13, 및 17 일차에 복강내로 투여하였다(도 63a). 종양 부피를 17 일차까지 모니터링하였다(도 63a).
결과는 10 mg/kg CD22-CpG(SB-337)(사각형)를 이용한 처치가 생리식염수 처치에 비해 종양 부피를 상당히 감소시켰다는 것을 나타내었다(도 63a). 유사하게는, 10 mg/kg CD22-CpG(SB-337) + 10 mg/kg 항-PD-L1(다이아몬드)을 이용한 처치가 생리식염수 처치된 마우스와 비교하여, 종양 부피를 상당히 감소시켰다. 각각의 처치에 대한 개별 마우스에 대한 결과를 또한 나타내었다(도 63b-도 63f).
또한, B-세포 활성화의 평가를 B16F10 흑색종 모델을 사용하여 수행하였다. 간단하게는, 1x106 B16F10 흑색종 세포를 마우스의 옆구리 상에 피하로 접종하고, 종양을 10 일 동안 성장시켰다. 그 다음에, 마우스에게 10, 12, 및 14 일차에 (i) 생리식염수(원); (ii) 10 mg/kg 항-CD22(사각형); (iii) 10 mg/kg CD22-CpG(SB-337)(삼각형); 또는 (iv) 10 mg/kg CD22-CpG(SB-337) + 10 mg/kg 항-PD-L1(다이아몬드)을 투여하였다(도 64a). 항-CD22 및 CD22-CpG를 정맥내로 투여하였으며; 항-PD-L1(아테졸리주맙)을 복강내로 투여하였다. 결과는 CD22-CpG 처치가 종양 부피를 감소시켰다는 것을 나타내었다(p = 0.08). 유사하게는, CD22-CpG + 항-PD-L1을 이용한 처치가 종양 부피를 상당히 감소시켰다(p = 0.03).
대장 및 흑색종 모델과 마찬가지로, LLC1 루이스 폐암 세포를 접종한 마우스는 유사한 결과를 나타내었다. 마우스에게 LLC1 루이스 폐암 세포를 접종하고 마우스의 평균 종양 부피 성장 진행을 추적하였다. 7 일차에 출발하여, 마우스를 (i) 생리식염수(원); (ii) 10 mg/kg CD22-CpG(SB-337)(원); (iii) 10 mg/kg 항-PD1(사각형); (iv) 10 mg/kg CD22-CpG(SB-337) + 10 mg/kg 항-PD1(정삼각형) (v) 10 mg/kg 항-PD-L1(역삼각형); (vi) 10 mg/kg CD22-CpG + 10 mg/kg 항-PD-L1(다이아몬드)로 처치하였다(도 64b). 항-CD22 및 CD22-CpG를 7, 10, 및 13 일차에 정맥내로 투여하였으며; 항-PD-L1 및 항-PD1을 7, 10, 및 14 일차에 복강내로 투여하였다. 결과는 10 mg/kg CD22-CpG 단독 또는 10 mg/kg 항-PD1과의 조합(정삼각형) 또는 10 mg/kg 항-PD-L1과의 조합(다이아몬드)으로 처치된 마우스가 종양 부피에서 상당한 감소를 나타냈다는 것을 나타내었다(p = 0.023). 함께 고려하면, 이들 결과는 CD22-CpG 처치가 LLC1 종양 부피를 감소시킬 수 있다는 것을 나타내었다.
실시예 20. B-세포 또는 수지상 세포에 대한 CpG 표적화의 효능
B-세포에 대한 CpG 표적화 대 수지상 세포에 대한 CpG 표적화의 효능을 비교하기 위해 실험을 수행하였다. 상기 기재된 바와 같이 CT26 대장 모델을 사용하여, B 세포를 표적화하기 위해 CD22에 접합된 CpG(CD22-CpG; SB-337), 수지상 세포를 표적화하기 위해 DEC205에 접합된 CpG(DEC205-CpG; SB-419), 또는 생리식염수로 마우스를 정맥내로 처치하였다. 마우스를 12, 17, 20, 및 24 일차에 10 mg/kg의 CpG-Ab로 처치하였다. 종양 부피를 측정하고 평균 부피(도 65a)뿐 아니라, 각각의 마우스에 대한 개별 종양 부피(도 65b-65d)가 제시된다. 결과는 B-세포 또는 수지상 세포를 CpG-Ab 접합체로 표적화하는 것이 종양 부피를 감소시킬 수 있다는 것을 드러낸다.
실시예 21. CpG-Ab 활성은 CT26 대장 모델에서 CD4+ T-세포 의존적이지만, A20 림프종 모델에서는 그렇지 않다.
CpG에 대한 작용의 메커니즘에서 T-세포의 역할을 조사하기 위해, 2 개의 마우스 모델을 사용하였다. 제1 모델에서, CT26 대장암 세포를 사용하였다. 간단하게는, CT26 마우스 모델을 상기 기재된 바와 같이 생성하였으며, 마우스의 평균 종양 부피 성장 진행을 (i) 생리식염수(작은 원); (ii) CD4 고갈(큰 원); (iii) 3 mg/kg CD22-CpG(SB-337)(사각형); 또는 (iv) CD4 고갈 + 3 mg/kg CD22-CpG(SB-337)(다이아몬드)의 투여 후 추적하였다. CD22-CpG를 10, 13; 및 15 일차에 정맥내로 투여하였다(도 66a). CD4 고갈을 10, 13 및 17 일차에 복강내로 주사된 항-CD4 항체(클론 GK1.5, 400ug/용량)를 사용하여 수행하였다. 이 실험으로부터의 결과는 CD4 항체를 사용한 CD4+ T-세포 고갈이 CT26 대장암 모델에서 CpG-Ab 활성을 억제한다는 것을 입증하였다(도 66a).
반대로, CpG-Ab 활성은 A20 림프종 모델에서 CD4+ T-세포 고갈시 억제되지 않았다. 간단하게는, A20 림프종 모델을 사용한 마우스의 평균 종양 부피 성장 진행을 마우스에게 (i) 생리식염수(원); (ii) CD4 고갈(정삼각형); (iii) 3 mg/kg CD22-CpG(SB-337)(사각형); 또는 (iv) CD4 고갈 + 3 mg/kg CD22-CpG(SB-337)(역삼각형)를 투여한 후에 추적하였다(도 66b). CD22-CpG를 10, 12; 및 14 일차에 정맥내로 투여하였다. CD4 고갈을 10, 13 및 17 일차에 복강내로 주사된 항-CD4 항체(클론 GK1.5, 400ug/용량)를 사용하여 수행하였다. 이 모델에서, CD22-CpG는 생리식염수에 비해 종양 모델을 감소시켰다. 그러나, CD4 고갈은 CpG-Ab 활성에 영향을 주지 않았다.
실시예 22. B-세포 CpG-Ab는 표면 T-세포 공동-자극자를 유도한다.
B-세포 지시된 CpG-Ab(SB-1490)에서 T-세포 활성화의 역할을 항체, CpG(p347), 또는 CpG-Ab(SB-337)로 처치된 B-세포 상의 표면 T-세포 공동-자극자의 발현을 측정함으로써 분석하였다. 마우스 비장을 수집하고 70 마이크론 체를 통과시켜, 단일 세포 현탁액을 생성하였다. 적혈구(RBC)를 RBC 용해 완충액과 5 분 동안 실온에서의 항온처리에 의해 용해시킨 다음에, 완전 배지로 켄칭시켰다. B-세포를 마우스 B-세포 단리 키트(Miltenyi Biotec)를 사용한 음성 선택에 의해 추가로 단리시켰다. 세포를 온화한 원심분리에 의해 수집하고, 세척하고, 10% 송아지 태아 혈청(FBS), 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(PS)을 함유한 RPMI에 2x106 세포/mL로 재-현탁하였다. 그 다음에, 세포를 96-웰 플레이트에 시딩하고, 지시된 농도(1nM)의 시험 화합물로 처치하였으며, 37℃에서 72 시간 동안 항온처리하였다. 그 다음에, 세포를 온화한 원심분리에 의해 수집하고 FACS 완충액에 재-현탁하였다. 다시 원심분리한 후, 세포를 그 다음에 500 μL FACS 완충액에 재-현탁하였다. 마우스 FcR 블로커(Blocker)를 첨가하고 10 분 동안 실온에서 항온처리하였다. 세포를 얼음으로 이동시키고 적절한 표지된 FACS 항체(하기 실시예 참고)를 첨가하였으며 얼음 상에서 30 분 동안 항온처리하였다. 비-특이적 아이소타입 대조군을 사용하였다. 그 다음에, 세포를 에펜도르프 튜브 내의 FACS 완충액에서 수집하였다. 세포를 원심분리하고, FACS 완충액으로 1 회 세척한 다음에, 재-원심분리하였다. 그 다음에, 세포를 1mL FACS 완충액에서 다시 재-현탁한 다음에, 얼음 상에서 CyFlow ML FACS 기계에 의한 분석까지 유지하였다. 데이터를 Flow Jo 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
항체, 유리 CpG(SB-4715), 또는 CpG-Ab(SB-1490) 접합체와 함께 마우스 비장 B-세포의 시험관내 항온처리로부터의 결과는 B-세포 지시된 CpG-Ab 접합체가 표면 T-세포 공동-자극자, 예컨대 CD40, CD70, CD80, CD86, MHC-I, MHC-II, 및 4-1 BBL을 유도한다는 것을 드러냈다(도 67a).
유사한 결과를 생체내 처치된 마우스로부터 얻었다. 간단하게는, 마우스를 10 mg/kg로 주 당 3 회 처치하고, CD19+/B220+ B-세포를 최종 투여 3 일 후에 분석하였다. 마우스 비장/림프절을 수집하고, PBS로 헹구었으며 70 마이크론 체를 통과시켜, 단일 세포 현탁액을 생성하였다. 세포를 온화하게 원심분리한 다음에, FACS 완충액에 재-현탁하였다. FcR 블로커를 첨가하고(1:20 희석액) 10 분 동안 실온에서 항온처리하였다. 세포를 얼음으로 이동시키고 적절한 표지된 FACS 항체(또는 비-특이적 아이소타입 대조군)를 첨가하였으며 얼음 상에서 30 분 동안 항온처리하였다. 세포를 에펜도르프 튜브 내의 FACS 완충액에서 수집하였다. 세포를 원심분리한 다음에, 1mL FACS 완충액으로 1 회 세척한 다음에, 다시 원심분리하였다. 세포를 1mL FACS 완충액에서 다시 재-현탁한 다음에, 얼음 상에서 CyFlow ML FACS 기계에 의한 분석까지 유지하였다. 데이터를 Flow Jo 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. CpG-Ab를 이용한 처치는 생리식염수에 비해 CD40, CD80, CD86, 및 MHC-II의 표면 발현 증가를 야기하였다(도 67b).
Figure pct00511
실시예 23. B-세포 CpG-Ab는 2 차 림프 조직에서 T-세포 활성화를 유도한다.
2 차 림프 조직에서 T-세포의 활성화를 FACS에 의해 측정하여, B-세포 표적화된 CpG-Ab 접합체의 기능적 효과를 평가하였다. 간단하게는, Balb/c 마우스를 (i) 생리식염수(단색); (ii) 10 mg/kg Ab(항-CD22)(체크무늬); (iii) 10 mg/kg CpG-Ab(SB-SB-337)(수평선); 또는 (iv) 동등한 용량의 CpG(p347)(수직선)로 주 당 3 회 처치하였다. 최종 투여 3 일 후, 마우스 비장 및 림프절을 수집하고, CD3 T-세포를 FACS에 의해 분석하였다. 마우스 비장/림프절을 수집하고, PBS로 헹구었으며 70 um 체를 통과시켜, 단일 세포 현탁액을 생성하였다. 세포를 온화하게 원심분리한 다음에, FACS 완충액에 재-현탁하였다. FcR 블로커를 첨가하고(1:20 희석액) 10 분 동안 실온에서 항온처리하였다. 세포를 얼음으로 이동시키고 적절한 표지된 FACS 항체(또는 비-특이적 아이소타입 대조군)를 첨가하였으며 얼음 상에서 30 분 동안 항온처리하였다. 세포를 에펜도르프 튜브 내의 FACS 완충액에서 수집하였다. 세포를 원심분리한 다음에, 1mL FACS 완충액으로 1 회 세척한 다음에, 다시 원심분리하였다. 세포를 1mL FACS 완충액에서 다시 재-현탁한 다음에, 얼음 상에서 CyFlow ML FACS 기계에 의한 분석까지 유지하였다. 데이터를 Flow Jo 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
활성화된 T-세포를 총 T-세포 집단(CD3+)에 대한 CD71+, CD3+ 세포의 퍼센트를 측정함으로써 정량화하였다(도 68a). 활성화된 T-세포를 또한 총 T-세포 집단(CD3+)에 대한 Ki67+, CD3+ 세포의 양을 측정함으로써 정량화하였다(도 68b). FACS 결과는 B-세포 표적화 CpG-Ab 접합체가 더 적은 정도의 유리 CpG까지 2 차 림프 조직에서 활성화된 T-세포의 퍼센트를 증가시킨다는 것을 드러냈다.
실시예 24. 입양 전달된 림프절 세포는 종양 성장을 억제한다.
B-세포 표적화 CpG-Ab 접합체에서 T-세포 활성화의 역할을 추가로 분석하기 위한 실험을 CT-26 마우스 대장암 모델을 사용하여 수행하였다. CT-26 마우스 대장 모델을 상기 기재된 바와 같이 생성하였다. 종양을 10 일차에 단계화하고 10, 12, 14 일차에 (i) 생리식염수(원); (ii) 10 mg/kg CD22-CpG(SB-337)(사각형); (iii) 10 mg/kg CD22(정삼각형); 또는 (iv) 유리 CpG(p347)(역삼각형)를 정맥내로 투여하였다(도 69a). 종양 성장을 22 일 동안(접종일로부터 32 일) 모니터링하였다(도 69a). 상기 기재된 다른 결과와 마찬가지로, CD22-CpG는 다른 처치 그룹에 비해 낮은 종양 부피를 야기하였다.
32 일차에, 마우스를 희생시키고 림프절(배출 또는 비-배출)을 단리시켰으며 각각의 처치 그룹의 마우스로부터 통합하였다. 림프절을 70 mm 체에 통과시켜, 단일 세포 현탁액을 생성하였다. 세포를 얼음-냉각 PBS로 2 회 세척하고 계수하였다. 1x107 세포(대략 70% T-세포)를 HBSS 완충액에서 0.1x106 CT-26 세포와 혼합하고, 혼합액을 표준 프로토콜에 따라 나이브 BalbC 마우스의 옆구리 상에 피하로 접종하였다. 종양 부피를 이들 마우스에서 24 일 동안 모니터링하였다(도 69b). 결과는 입양 전달된 림프절 세포가 종양 성장을 억제한다는 것을 나타내었다(도 69c).
실시예 25. B-세포 CpG-Ab는 선천적 면역 반응을 유도한다.
나이브 마우스를 (i) 생리식염수(단색); (ii) 10 mg/kg Ab(CD22)(체크무늬); (iii) 5.7ug CpG(p347)(수평선); 또는 (iv) 10 mg/kg CpG-mAb(SB-337)로 정맥내로 처치함으로써 선천적 면역 반응에 대한 B-세포 표적화 CpG-Ab 접합체의 효과를 분석하였다. 혈액을 지시된 시점에 꼬리로부터 수집하고 혈청을 원심분리에 의해 단리시켰다. 혈청 사이토카인 수준을 비드-기반 복합 분석(LEGENDplex, Biolegend)에 의해 측정하였다.
마우스를 처치한 후에, 선천적 면역 반응과 연관된 다중 혈장 사이토카인(즉, IL-6, IL-10, IL-1β, IL-12p70, IFNγ, 및 TNFα)을 처치 1 시간, 6 시간, 및 24 시간 후에 측정하였다(도 70a-70f). 결과는 B-세포 표적화 CpG-Ab 접합체가 T-세포, 수지상 세포(DC), 및 천연 킬러(NK) 세포 활성화를 위해 호의적인 사이토카인 프로파일을 유도한다는 것을 나타내었다. 특히, IL-1β(도 70c), 및 IL-12p70(도 70d) 농도가 6 시간에 고도로 상승하였다. 또한, 유리 CpG가 TNFα(도 70f) 혈장 농도 수준을 1 시간에 고도로 증가시켰다는 것이 관찰된 반면에, 이 효과는 CpG-mAb 접합체에 대해 관찰되지 않았으며, 이는 CpG-mAb가 유리 CpG에 비해 안전성 이점을 가질 수 있다는 것을 제시하였다.
실시예 26. B-세포 CpG-Ab는 B-세포 분화 및 배중심 형성을 유도한다.
B-세포 CpG-Ab가 B-세포 분화 및 배중심 형성을 유도하는지 여부를 평가하기 위해, CT-26 대장암 모델을 상기 기재된 방법에 따라 사용하였다. 간단하게는, 마우스에게 CT-26 대장암 세포를 접종하고, 10 일 동안 성장시켰다. 그 다음에, 마우스를 10, 13, 및 17 일차에 생리식염수 또는 10 mg/kg CpG-mAb(SB-1490)로 정맥내로 처치하고 최종 투여 24 시간 후 희생시켰다. 비장을 단리시키고, 단일 세포 제제를 상술한 바와 같이 제조하였으며, 비장에서 세포의 총 수에 대한 B-세포(B220+; 도 71a), GC 세포(B220+, IgDlo, Fas+; 도 71b), 및 T 여포 보조(Tfh) 세포(CD4+, CXCR5+, PD-1+; 도 71c)의 퍼센트를 FACS 분석을 사용하여 결정하였다. 또한, IL-21(도 71d), Bcl-6(도 71e), 및 IRF-4(도 71f) 유전자 발현의 상대 배수 변화를 표준 qPCR 방법을 사용하여 결정하였다. 결과는 CpG-mAb가 B-세포, GC 세포, 및 Tfh 세포의 퍼센트를 특이적으로 증가시켰을뿐 아니라, IL-21, Bcl-6, 및 IRF-4의 발현 수준을 특이적으로 증가시켰다는 것을 입증하였다. 함께 고려하면, 이들 결과는 B-세포 표적화 CpG-Ab 접합체가 B-세포 분화 및 GC 형성을 유도한다는 것을 입증하였다.
실시예 27. B-세포 CpG-Ab는 선천적 및 적응성 면역 반응을 유도한다.
선천적 및 적응성 면역 반응에 대한 B-세포 CpG-Ab 처치의 효과를 CT-26 대장암 모델을 사용하여 측정하였다. CT-26 대장 마우스 모델을 상기 기재된 바와 같이 생성하였다. 선천적 면역 반응을 평가하기 위해, 종양을 피하로 접종하고 10 일 동안 성장시켰다. 10, 13, 및 17 일차에, 마우스를 생리식염수, 또는 3 mg/kg의 CpG-mAb(SB-337)로 정맥내로 처치하고 최종 투여 24 시간 후에 희생시켰다. 세포를 비장 및 림프절로부터 단리시키고, 선천적 면역 반응과 연관된 몇몇 유전자(즉, IL-6, IL-10, IL-1β, 및 TNFα)의 유전자 발현을 qPCR에 의해 측정하였다. 결과는 CpG-mAb를 이용한 처치가 비장(도 72a-c) 및 배출 림프절(도 73a-c)에서 IL-6, IL-10, 및 IL-1β의 발현을 증가시켰다는 것을 드러냈다. 그러나, CpG-mAb는 비장(도 72d) 또는 배출 림프절(도 73d)에서 TNFα 발현을 증가시키지 않았다. 종합적으로, 이들 결과는 B-세포 표적화 CpG-Ab 접합체가 선천적 면역 반응을 유도한다는 것을 입증하였다.
다음으로, 적응성 면역 반응에 대한 B-세포 CpG-Ab 처치의 효과를 CT-26 고형 종양 모델을 사용하여 측정하였다. CT-26 대장 마우스 모델을 상기 기재된 바와 같이 생성하였다. 적응성 면역 반응을 평가하기 위해, 종양을 피하로 접종하고 10 일 동안 성장시켰다. 10, 13, 및 16 일차에, 마우스를 생리식염수, 또는 3 mg/kg의 CpG-mAb(SB-337)로 정맥내로 처치하고 마우스를 24 일차에 희생시켰으며, 혈액을 심장 천자에 의해 수집하고 IgM, IgG 및 IgG2a의 혈청 수준을 ELISA에 의해 측정하였다. 혈청을 마우스로부터 수집하고 IgM, IgG, 및 IgG2a의 수준을 측정하였다. CpG-mAb, IgM(도 74a), IgG(도 74b), IgG2a(도 74c)로 처치된 마우스에 대해 모두 생리식염수 처치된 마우스에 비해 상당히 증가하였다.
종양-특이적 항체의 수준을 기질로서 CT-26 종양 항원 AH1을 사용하여 ELISA를 수행함으로써 추가로 분석하였다. AH1 펩티드를 96-웰 플레이트 상에 밤새 코팅한 다음에, 웰을 ELISA 세척 완충액으로 3 회 세척하여, 과량의 펩티드를 제거하였다. 마우스 혈청 샘플을 첨가하고 2 시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 그 다음에, 웰을 x3 회 다시 헹구고 혈청 내의 마우스 항-AH1 IgG2a의 양을 2 개의 상이한 상업적으로 이용 가능한 2 차 항-마우스 IgG2a-HRP 항체인 2nd Ab1 및 2nd Ab2를 사용하여 측정하였다(도 75). 웰을 다시 세척하고 TMB 기질액(100 μL)을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 15-30 분 동안 또는 소망하는 색이 발생할 때까지 항온처리한 후, 정지액(100 μL)을 각각의 웰에 첨가하고 플레이트를 450 nm에서 판독하였다. 마우스의 혈청에 더 많은 IgG2a가 있는 것과 마찬가지로, CpG-mAb를 이용한 처치는 혈청에서 상당히 많은 종양-특이적 IgG2a를 야기하였다. 이들 결과는 B-세포 CpG-Ab가 고 친화도 종양-특이적 항체로의 클래스 전환을 생산하는 적응성 반응을 유도한다는 것을 나타내었다.
실시예 28. B-세포 CpG-Ab는 B-reg 집단을 감소시킨다.
비장 B-reg 세포에 대한 B-세포 표적화 CpG-Ab 접합체의 효과를 분석하였다. Balb/C 마우스(n = 8)를 1, 4 및 7 일차에 생리식염수 또는 10 mg/kg의 CpG-Ab(SB-337)로 [[정맥내로]] 처치하였다. 마우스를 최종 투여 24 시간 후 희생시켰다. B-세포(B220+)에 대한 비장 Breg 세포(CD19+, B220+, CD1dhi)의 퍼센트를 결정하였다(도 76a). 또한, 세포의 총 수에 대한 비장 B-reg 세포(CD19+, B220+, CD1dhi)의 퍼센트를 결정하였다(도 76b). 양측 파라미터 하에서 B-reg 세포의 퍼센트의 정량화는 CpG-mAb 처치가 생리식염수 처치에 비해 마우스 내의 B-reg 집단을 상당히 감소시켰다는 것을 드러냈다(도 76a 및 도 76b). 이들 결과는 B-세포 CpG-Ab가 B-reg 집단을 감소시킨다는 것을 입증하였다.
실시예 29. B-세포 CpG-Ab는 2 차 림프 조직에서 DC 집단을 증식시킨다.
2 차 림프 조직에서 수지상 세포 집단에 대한 B-세포 표적화된 CpG-Ab 처치의 효과를 평가하기 위해, CT-26 고형 종양 모델을 사용하였다. 마우스를 14, 17, 20 일차에 생리식염수, 5.7 ug/용량 CpG(p347), 또는 10 mg/kg CpG-mAb(SB-337)로 정맥내로 처치하였다. 비장으로부터의 세포를 상기 기재된 바와 같이 단리시켰다. 세포의 총 수에 대한 비장 골수성 수지상 세포(mDC; B220-, CD11C+, DEC205hi)의 퍼센트를 계산하였다. 비장 mDC 퍼센트의 정량화는 유리 CpG 및 CpG-mAb 처치 둘 다가 생리식염수 처치에 비해 mDC 세포의 퍼센트를 상당히 증가시켰다는 것을 드러냈다(각각 p=0.003; p = 0.0002)(도 77a). 또한, CpG-Ab 처치 후 mDC 세포의 퍼센트는 유리 CpG에 비해 상당히 증가하였다(p = 0.002)(도 77a). 함께 고려하면, 이들 결과는 CpG-Ab 처치가 비장에서 mDC 풀을 확장시킨다는 것을 입증하였다.
또한, 통합된 림프절 mDC 세포(B220-, CD11C+, CD8+)의 퍼센트를 결정하였다. CpG-mAb를 이용한 마우스의 처치는 배출 림프절(dLN), 및 비-배출 림프절(ndLN) 둘 다에서 LN mDC의 퍼센트 증가를 야기하였다(도 77b). 그러나, 효과는 유리 CpG로 처치시 관찰되지 않았으며(도 77b), 이는 CpG-Ab 접합체와 유리 CpG 사이의 차별적 효과를 강조한다. 결과는 B-세포 표적화 CpG-Ab 접합체가 비장, 및 림프절 둘 다에서 수지상 세포 집단을 증식시킬 수 있다는 것을 나타내었다.
실시예 30. pDC는 CpG-Ab 활성에 기여한다.
CpG-Ab 활성에 대한 플라스마사이토이드 수지상 세포(pDC)의 기여를 결정하기 위해 CT26 대장암 모델 및 A20 림프종 모델을 사용한 실험을 수행하였다. CT-26 대장 모델에서, 종양을 10 일 동안 성장시킨 다음에, 마우스를 10, 13, 및 15 일차에 생리식염수, 또는 3 mg/kg CD22-CpG(SB-337)로 정맥내로 처치하였다. 또한, 일부 마우스에게 10, 13, 및 17 일차에 PDCA1 항체, 클론 BX444(마우스 당 300 ㎍)를, 단독으로 또는 CD22-CpG(SB-337)와의 조합으로 복강내로 주사하여, pDC 세포를 고갈시켰다. 종양 부피 진행을 측정하였으며, 결과는 pDC 고갈이 CT-26 대장 모델에서 CD22-CpG의 효능을 감소시켰다는 것을 나타내었다(도 78a).
A20 림프종 모델은 유사한 결과를 산출하였다. A20 림프종 종양을 10 일 동안 성장시킨 다음에, 마우스를 10, 12, 및 14 일차에 생리식염수, 또는 3 mg/kg CD22-CpG(SB-337)로 정맥내로 처치하였다. 또한, 일부 마우스에게 10, 13, 및 17 일차에 PDCA1 항체, 클론 BX444(마우스 당 300 ㎍)를, 단독으로 또는 CD22-CpG(SB-337)와의 조합으로 복강내로 주사하여, pDC 세포를 고갈시켰다. 종양 부피 진행을 측정하였으며, 결과는 pDC 고갈이 A20 림프종 모델에서 CD22-CpG의 효능을 감소시켰다는 것을 나타내었다(도 78b). 함께 고려하면, 결과는 pDC가 CpG-Ab 활성에 기여한다는 것을 입증하였다.
실시예 31. CpG-mAb는 T-세포 종양 침윤을 증가시켰다.
T-세포 침윤에 대한 CpG-mAb 접합체의 효과를 A20 림프종 모델을 사용하여 결정하였다. 간단하게는, A20 세포를 마우스 내로 피하로 접종하고, 10, 13, 및 17 일차에 마우스를 생리식염수 또는 3 mg/kg의 CpG-mAb(SB-337)로 정맥내로 처치하였으며 동물을 최종 투여 24 시간 후에 희생시켰다. 일부 실험에서, 마우스를 또한 10 mg/kg 항-PD-L1으로 처치하였다(도 79d). 마우스로부터의 종양을 제거하고, 4℃에서 균질화하였으며, mRNA를 표준 방법에 의해 추출하고 유전자 발현 분석을 T-세포 유전자, 예컨대 CD3, CD4, CD8a, 및 CD8b(도 79a); 대식세포 유전자, 예컨대 CD38, GPR18, iNOS, FPR2, Egr2, Arg1, CD206, Adgre1, CD68, 및 Cd11b(도 79b); 사이토카인 유전자, 예컨대 IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-13, IL-21, TNFα, IFNγ, 및 TGFβ(도 79c); 및 세포사멸 효소 유전자, 예컨대 그랜자임 B, 및 퍼포린(도 79d)에 대해 qPCR에 의해 수행하였다. 펩티딜프로필 이소머라아제 B(PPIB)에 대한 유전자 발현의 분석을 결정하였다. 결과는 CpG-mAb가 T-세포 유전자(도 79a), 대식세포 유전자(도 79b), 및 특정 사이토카인 유전자(도 79c)의 발현을 증가시켰다는 것을 나타내었다. 또한, CpG-mAb 및 CpG-mAb+ 항-PD-L1 둘 다는 세포사멸 효소 유전자의 발현을 증가시켰다(도 79d). 종합적으로, CpG-mAb로 처치된 마우스에 대한 종양 유전자 발현 프로파일은 면역 세포의 존재 및/또는 활성화와 일치하였다.
실시예 32. 인간 CpG-Ab 활성을 확인하였다.
1 차 인간 B-세포에 대한 CpG-Ab 접합체의 효과를 3 명의 기증자로부터 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 수집 및 통합함으로써 평가하였다. 간단하게는, 백혈구 농축 혈액(LRS 챔버)을 샌디에이고 혈액 은행으로부터 얻었다. 백혈구를 표준 피콜(Ficoll) 구배 원심분리 프로토콜에 의해 단리시켰다. B-세포를 B-세포 단리 키트(Miltenyi)를 사용한 음성 선택에 의해 추가로 단리시켰다. B-세포(>95% 순도)를 10% FBS 및 1% PS를 함유한 RPMI에 재-현탁하고 96-웰 플레이트에 시딩(1x105 세포/웰)하였다. 세포를 지시된 바와 같은 농도의 범위의 CpG(p425), CpG-Ab(SB-430), 또는 Ab(hCD22)로 처치하고 37℃에서 48-72 시간 동안 항온처리하였다.
처치 후에, 배양 배지를 제거하고 분비된 IL-6 수준을 ELISA에 의해 측정하였다(도 80a). 그 다음에, 세포를 수집하고 MHC-II(도 80b), CD86(도 80c), CD70(도 80d), 및 CD20(도 80e)에 대한 세포 표면 마커를 FACS에 의해 측정하였다. 결과는 분비된 IL-6(도 80a)의 농도, 및 MHC-II(도 80b), CD86(도 80c), CD70(도 80d), 및 CD20(도 80e)에 대한 표면 마커에 의해 결정된 바와 같이, 인간 1 차 B-세포가 CpG-Ab 처치에 대해 더욱 민감하였다는 것을 나타내었다.
또한, 인간 1 차 비장세포를 CpG-Ab 접합체 및 유리 CpG를 이용한 처치에 대한 반응에 대해 분석하였다. 1 차 인간 비장세포를 Bioreclamation IVT로부터 구매하였다. 세포를 10% FBS 및 1% PS를 함유한 RPMI에 재-현탁하고(2x106 세포/mL) 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 세포를 지시된 농도의 hCD22-hCpG(SB-430), 유리 인간 CpG p1, 또는 유리 인간 CpG(Solstice; p425)로 처치하고 37℃에서 24 시간 동안 항온처리하였다. 배양 배지를 제거하고 분비된 IL-6을 ELISA에 의해 측정하였다. hCD22-hCpG를 이용한 처치는 유리 CpG p1 또는 유리 인간 CpG(solstice; p425)에 비해 낮은 용량에서 IL-6의 농도를 증가시킬 수 있었다(도 81). EC50 값은 각각 0.51 nM, 818 nM, 및 338 nM이었으며, 이는 hCpG-hAb가 인간 비장세포를 활성화시킬 수 있다는 추가 증거를 제공하였다.
NCG 마우스 중 인간화 마우스 모델을 사용하여 실험을 수행하였다. NOD/Nju 마우스에서 Prkdc 및 Il2rg 유전자자리의 순차적 CRISPR/Cas9 편집하고, NOD/Nju에 대한 유사유전자형인 마우스를 생성함으로써 이 모델을 생성하였다. NOD/Nju는 Sirpa(SIRP α) 유전자에서 돌연변이를 수반하며, 이는 외래 조혈모세포를 생착시킨다. Prkdc 녹아웃은 적절한 T-세포 및 B-세포 형성이 결여된 SCID-유사 표현형을 생성한다. Il2rg 유전자의 녹아웃은 SCID-유사 표현형을 악화시키는 한편, NK 세포 생산의 감소를 추가로 야기한다. 마우스를 우선 신선한 인간 PBMC로 복강내로 처치한 다음에, 2 일 후에 다우디 세포(2.5 x 106)의 피하 주사로 도전시켰다(도 82a). 12, 14, 및 16 일차에, 마우스를 생리식염수, 5 mg/kg hCD22 항체, 5 mg/kg hCD22-CpG(SB-430), 또는 5.7 ㎍/용량의 유리 CpG(p425)로 처치하였다. 평균 종양 부피를 32 일 동안 추적하였다(도 82b). 결과는 hCD22-CpG로 처치된 마우스가 다른 처치 그룹에 비해 작은 종양 부피를 갖는다는 것을 나타내었다. 종합적으로, 이들 결과는 CpG-Ab 접합체가 인간 세포에서 효과적이라는 것을 나타내었다.
실시예 33
자연적으로 존재하는 CpG 서열을 갖는 본 발명에 따른 CpG-함유 폴리뉴클레오티드의 효능을 입증 및 비교하기 위해, 인간 라모스 세포를 독립형 형태 또는 접합된 형태의 본 CpG-함유 폴리뉴클레오티드와 함께, 및 독립형 형태 또는 접합된 형태의 자연적으로 존재하는 클래스 B CpG 서열과 함께 항온처리한 후에 인간 라모스 세포에서의 NFκB 활성을 측정하였다. 도 58b에 나타낸 바와 같이, 본 CpG-Ab 접합체는 독립형 또는 접합된 클래스 B CpG와 비교하여 상당히 개선된 활성을 가졌다.
실시예 34
본 발명에 따른 CpG-함유 폴리뉴클레오티드가 보체 경로를 활성화시키는지 여부를 평가하기 위해, 원숭이 혈청을 지모산(양성 대조군), 자연적으로 존재하는 클래스 B CpG 서열(p1), 또는 본원에 제공된 바와 같은 2 개의 CpG-함유 폴리뉴클레오티드와 항온처리함으로써 C3 방출을 평가하였다. 도 59에 나타낸 바와 같이, 본원에 제공된 CpG-함유 면역자극 폴리뉴클레오티드는 보체 경로를 활성화시키지 않았다.
실시예 35: 마우스 비장세포 어세이를 사용한 CpG-항체 접합체의 생물학적 활성
마우스(BALB/c) 비장을 수집하고 70 μm 체에 퉁과시켜, 단일 세포 현탁액을 생성하였다. 적혈구를 RBC 용해 완충액과 함께 5 분 동안 실온에서 항온처리함으로써 용해시킨 다음에, 20:1 완전 배지로 켄칭시켰다. 세포를 온화한 원심분리에 의해 수집하고, 세척하고, 10% FBS 및 1% PS를 함유한 RPMI에 재현탁(2 x 106 세포/mL)하고 9웰 플레이트에 시딩하였다. 시험 화합물을 지시된 농도로 첨가하고 37℃에서 24 시간 동안 항온처리하였다. 배양 배지를 제거하고 분비된 IL-6을 ELISA에 의해 측정하였다. 결과를 하기 표에 요약하였다.
Figure pct00512
실시예 36: CpG-항체 접합체의 약물동태학 연구
단일 투여 실험을 위해, 시험 화합물을 (BALB/c) 마우스에 10 mg/kg IV 또는 SC로 투여하였다. 혈청 샘플을 분석을 위해 소정의 시점에 수집하고 결과를 도 83에 나타내었다.
반복 투여 실험을 위해, 시험 화합물을 1, 7, 및 14 일차에 마우스에 10 mg/kg IV로 투여하였다. 혈청 샘플을 분석을 위해 소정의 시점에 최종 주사 후 14 일차에 수집하고 PK 프로파일을 단일 용량의 시험 화합물만을 투여받은 다른 세트의 마우스와 비교하였다. 결과를 도 84에 나타내었다.
다른 단일 투여 실험에서, CpG-항체 접합체를 마우스에 10 mg/kg IV로 투여하였다. 혈청 샘플을 투여 0.08, 1, 6, 24, 48, 및 120 시간 후에 수집하였다. 혈청 샘플을 항체 및 온전한 CpG-항체 접합체 둘 다에 의해 분석하였다. 결과를 도 85에 나타내었다.
또 다른 단일 투여 실험에서, CpG-항체 접합체를 마우스에 10 mg/kg IV로 투여하였다. 마우스를 주사 0, 0.08, 1, 6, 및 24 시간 후에 희생시켰다. 혈청, 간, 및 비장 샘플을 분석하였다. 결과를 도 86에 나타내었다.
또 다른 단일 투여 실험에서, CpG-항체 접합체를 마우스에 10 mg/kg IV로 투여하였다. 혈청 샘플을 소정의 시점에 수집하고 결과를 도 87a 및 87b에 나타내었다.
상기 약학 실험에서, 혈청 샘플을 ELISA 어세이를 사용하여 분석하였다. 남아있는 온전한 CpG-항체 접합체의 양을 결정하기 위해, 혈청 샘플을 ELISA 차단 완충액을 사용하여 비오티닐화된-CpG 보체 서열로 희석한 다음에, 30 분 동안 실온에서 항온처리하였다. 희석된 혈청 샘플을 각각 100 μL로 스트렙타비딘으로 사전-코팅된 96-웰 플레이트 내의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 플레이트 셰이커(shaker) 상에서 60 분 동안 실온에서 항온처리하고, ELISA 세척 완충액으로 3 회 세척한 후에, ELISA 차단 완충액 중 최적화된 희석의 염소 항-마우스 IgG-HRP 항체(100 μL)를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 플레이트 셰이커 상에서 30 분 동안 실온에서 항온처리하고, ELISA 세척 완충액으로 3 회 세척한 후에, TMB 기질액(100 μL)을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 15-30 분 동안 또는 소망하는 색이 발생할 때까지 항온처리한 다음에, 정지액(100 μL)을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 450 nm에서 판독하였다. 혈청 내의 온전한 CpG-항체 접합체 농도를 50 nM에서 출발하여 ELISA 차단 완충액에서 연속으로 희석되는 표준 곡선을 사용하여 계산하였다. 동일한 프로토콜을 또한 사용하여, 조직을 균질화한 후의 조직에서 CpG-항체 접합체를 결정하였다.
CpG-항체 접합체의 항체 또는 항체 부위에 대해 분석하기 위해, 96-웰 플레이트를 PBS에 희석된 마우스 CD22 세포외 도메인으로 코팅하였다. 플레이트를 4℃에서 밤새 항온처리하고, ELISA 세척 완충액으로 3 회 세척하였으며, ELISA 차단 완충액으로 적어도 60 분 동안 실온에서 차단하였다. 혈청 샘플을 ELISA 차단 완충액 중 최적화된 희석 배율로 희석하였다. 희석된 혈청 샘플을 각각 100 μL로 96-웰 플레이트 내의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 플레이트 셰이커 상에서 60 분 동안 실온에서 항온처리하고 ELISA 세척 완충액으로 3 회 세척한 후에, ELISA 차단 완충액 중 최적화된 희석의 염소 항-마우스 IgG-HRP 항체(100 μL)를 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 플레이트 셰이커 상에서 30 분 동안 실온에서 항온처리하고, ELISA 세척 완충액으로 3 회 세척한 후에, TMB 기질액(100 μL)을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 15-30 분 동안 또는 소망하는 색이 발생할 때까지 항온처리한 후에, 정지액(100 μL)을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 450 nm에서 판독하였다. 혈청 내의 CD22 항체 농도를 50 nM에서 출발하여 ELISA 차단 완충액에서 연속으로 희석되는 표준 곡선을 사용하여 계산하였다.
다른 실시양태
기재된 발명의 다양한 변형 및 변화가 본 발명의 범위 및 의의를 벗어나지 않으면서 당업자에게 명확해질 것이다. 본 발명은 특정 실시양태와 관련되어 기재되었으나, 청구된 본 발명은 이러한 특정 실시양태에 과도하게 제한되지 않아야 한다는 것을 이해해야 한다. 사실, 당업자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위한 기재된 방식의 다양한 변형이 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
다른 실시양태는 청구항에 있다.
서열 목록
본 명세서는 서열 목록의 컴퓨터 판독 가능한 형태(CRF)의 사본과 함께 출원된다. 2018 년 4 월 11 일에 생성되고 크기가 116,262 바이트인, 제목이 14465-001-228_SEQLIST.txt인 CRF는 서열 목록의 서류 사본과 동일하며 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Solstice Biologics, Ltd. <120> Immunomodulating Polynucleotides, Antibody Conjugates Thereof, and Methods of Their Use <130> 105106PC <140> TBA <141> On even date herewith <150> 62/537,925 <151> 2017-07-27 <150> 62/485,748 <151> 2017-04-14 <160> 496 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 1 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 2 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 3 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 4 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 5 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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<400> 461 tacgut 6 <210> 462 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 462 tucgut 6 <210> 463 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 463 gucgtt 6 <210> 464 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 464 gacgtt 6 <210> 465 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 465 gucgut 6 <210> 466 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 466 gacgut 6 <210> 467 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide - Double stranded-CpG using p88/p145 <400> 467 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 468 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain of anti-DEC205 antibody <400> 468 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Arg Asn Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 469 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 469 tcgtcgtgac gtt 13 <210> 470 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 470 cgtcgtgtcg 10 <210> 471 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 471 cgtcgtgt 8 <210> 472 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 472 cgtcgtgt 8 <210> 473 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 473 cgtcgt 6 <210> 474 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 474 cgtcgt 6 <210> 475 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 475 cgtt 4 <210> 476 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 476 cgtt 4 <210> 477 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 477 tucgtcgtga cgtt 14 <210> 478 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 478 ttucgtcgtg acgtt 15 <210> 479 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 479 ttucgtcgtg acgtt 15 <210> 480 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 480 tucgtcgtga cgtt 14 <210> 481 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 481 ttucgtcgtg acgtt 15 <210> 482 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 482 tucgtcgtga cgtt 14 <210> 483 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 483 tucgtcgtga cgtt 14 <210> 484 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 484 tucgtcgtga cgtt 14 <210> 485 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 485 tucgtcgtga cgtt 14 <210> 486 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 486 ttucgtcgtg acgtt 15 <210> 487 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 487 cgtcgtgtcg tt 12 <210> 488 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 488 cgtcgtgtcg tt 12 <210> 489 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 489 cgtcgtgtcg tt 12 <210> 490 <211> 452 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain of anti-DEC205 antibody <400> 490 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Leu Trp Gly Trp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Leu 435 440 445 Leu Gln Gly Gly 450 <210> 491 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain of anti-CD303 antibody <400> 491 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Met Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg 50 55 60 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 65 70 75 80 Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Glu 85 90 95 Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 115 120 125 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Trp Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 130 135 140 Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn 145 150 155 160 Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 165 170 175 Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Ala Tyr Glu Lys His Lys 180 185 190 Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 195 200 205 Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 492 <211> 454 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain of anti-CD303 antibody <400> 492 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Pro Gly Asp Ser Phe Gly Tyr Tyr Tyr Pro Asp Ser 50 55 60 Val Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Thr Arg Asp Ile Tyr Tyr Asn Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 225 230 235 240 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Trp Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Trp Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Leu Leu Gln Gly Gly 450 <210> 493 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain Q-tag <400> 493 Leu Leu Gln Gly Gly 1 5 <210> 494 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain Q-tag <400> 494 Gly Gly Gly Leu Leu Gln Gly Gly 1 5 <210> 495 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain of anti-PD-L1 antibody <400> 495 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Asp Ala Ala Pro 100 105 110 Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn 130 135 140 Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn 145 150 155 160 Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr 180 185 190 Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Asn Glu Cys 210 <210> 496 <211> 452 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain of anti-PD-L1 antibody <400> 496 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr 180 185 190 Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu 245 250 255 Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser Glu Asp Asp Pro 260 265 270 Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala 275 280 285 Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Ala Ser Thr Leu Arg Val Val 290 295 300 Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu 340 345 350 Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys 355 360 365 Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn 370 375 380 Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys 405 410 415 Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly 420 425 430 Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Leu 435 440 445 Leu Gln Gly Gly 450

Claims (437)

  1. 하기 화학식 (A)의 올리고뉴클레오티드 또는 이의 입체 이성질체, 2 이상의 부분입체 이성질체의 혼합물, 호변 이성질체, 또는 2 이상의 호변 이성질체의 혼합물; 또는 이의 약학적 허용 염, 용매화물, 또는 수화물:
    [화학식 (A)]
    Figure pct00513

    상기 식에서,
    각각의 XN이 독립적으로 뉴클레오티드이고;
    X3'이 3' 말단 뉴클레오티드이며;
    X5'가 5' 말단 뉴클레오티드이고;
    YP가 인터뉴클레오시드(internucleoside) 포스포트리에스터이며;
    b 및 c가 각각 약 0 내지 약 25 범위의 정수이고; 단, 이들의 합은 5 이상이되;
    올리고뉴클레오티드가 변형된 핵염기를 갖는 뉴클레오티드를 포함한다.
  2. 제1항에 있어서,
    b가 약 1 내지 약 15 범위의 정수인 올리고뉴클레오티드.
  3. 제1항에 있어서,
    b가 약 3, 약 4, 약 11, 또는 약 14의 정수인 올리고뉴클레오티드.
  4. 제1항에 있어서,
    b가 약 3의 정수인 올리고뉴클레오티드.
  5. 제1항에 있어서,
    b가 약 4의 정수인 올리고뉴클레오티드.
  6. 제1항에 있어서,
    b가 약 11의 정수인 올리고뉴클레오티드.
  7. 제1항에 있어서,
    b가 약 14의 정수인 올리고뉴클레오티드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    c가 약 0 내지 약 10 범위의 정수인 올리고뉴클레오티드.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    c가 약 0 또는 약 8의 정수인 올리고뉴클레오티드.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    c가 약 0의 정수인 올리고뉴클레오티드.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    c가 약 8의 정수인 올리고뉴클레오티드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    b 및 c의 합이 약 5 내지 약 20의 범위인 올리고뉴클레오티드.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    b 및 c의 합이 약 5 내지 약 15의 범위인 올리고뉴클레오티드.
  14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    b 및 c의 합이 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 또는 약 14인 올리고뉴클레오티드.
  15. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    b 및 c의 합이 약 11 또는 약 14인 올리고뉴클레오티드.
  16. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    b 및 c의 합이 약 11인 올리고뉴클레오티드.
  17. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    b 및 c의 합이 약 14인 올리고뉴클레오티드.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 XN이 독립적으로 2'-데옥시리보뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드.
  19. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 XN이 독립적으로 2'-데옥시아데노신, 2'-데옥시구아노신, 2'-데옥시시티딘, 5-할로-2'-데옥시시티딘, 2'-데옥시티미딘, 2'-데옥시우리딘, 또는 5-할로-2'-데옥시우리딘인 올리고뉴클레오티드.
  20. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 XN이 독립적으로 2'-데옥시아데노신, 2'-데옥시구아노신, 2'-데옥시시티딘, 2'-데옥시티미딘, 5-브로모-2'-데옥시우리딘, 또는 5-요오도-2'-데옥시우리딘인 올리고뉴클레오티드.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    X3'이 2'-데옥시리보뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드.
  22. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    X3'이 2'-데옥시아데노신, 2'-데옥시구아노신, 2'-데옥시시티딘, 5-할로-2'-데옥시시티딘, 2'-데옥시티미딘, 2'-데옥시우리딘, 또는 5-할로-2'-데옥시우리딘인 올리고뉴클레오티드.
  23. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    X3'이 2'-데옥시티미딘인 올리고뉴클레오티드.
  24. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    X3'이 2'-변형된 리보뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드.
  25. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    X3'이 2'-메톡시 리보뉴클레오티드 또는 2'-에톡시메톡시 리보뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    X5'가 2'-데옥시리보뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드.
  27. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    X5'가 2'-데옥시아데노신, 2'-데옥시구아노신, 2'-데옥시시티딘, 5-할로-2'-데옥시시티딘, 2'-데옥시티미딘, 2'-데옥시우리딘, 또는 5-할로-2'-데옥시우리딘인 올리고뉴클레오티드.
  28. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    X5'가 치환된 피리미딘 염기를 갖는 2'-데옥시리보뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드.
  29. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    X5'가 5-치환된 피리미딘 염기를 갖는 2'-데옥시리보뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드.
  30. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    X5'가 2'-데옥시티미딘, 5-할로-2'-데옥시시티딘, 또는 5-할로-2'-데옥시우리딘인 올리고뉴클레오티드.
  31. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    X5'가 5-할로-2'-데옥시시티딘인 올리고뉴클레오티드.
  32. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    X5'가 5-할로-2'-데옥시우리딘인 올리고뉴클레오티드.
  33. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    X5'가 2'-데옥시티미딘, 5-브로모-2'-데옥시시티딘, 5-요오도-2'-데옥시시티딘, 5-브로모-2'-데옥시우리딘, 또는 5-요오도-2'-데옥시우리딘인 올리고뉴클레오티드.
  34. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    X5'가 2'-데옥시티미딘, 5-브로모-2'-데옥시우리딘, 또는 5-요오도-2'-데옥시우리딘인 올리고뉴클레오티드.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    X5'가 3'-포스포로티오에이트기를 갖는 올리고뉴클레오티드.
  36. 제35항에 있어서,
    3'-포스포로티오에이트가 키랄인 올리고뉴클레오티드.
  37. 제35항에 있어서,
    3'-포스포로티오에이트가 Rp의 키랄성(chirality)을 갖는 올리고뉴클레오티드.
  38. 제35항에 있어서,
    3'-포스포로티오에이트가 Sp의 키랄성을 갖는 올리고뉴클레오티드.
  39. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    X5'가 Rp의 키랄성을 갖는 3'-포스포로티오에이트기를 갖고 X3'이 2'-메톡시 리보뉴클레오티드 또는 2'-에톡시메톡시 리보뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드.
  40. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    X5'가 Sp의 키랄성을 갖는 3'-포스포로티오에이트기를 갖고 X3'이 2'-메톡시 리보뉴클레오티드 또는 2'-에톡시메톡시 리보뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
    YP가
    Figure pct00514
    이되,
    Z가 O 또는 S이고; d가 약 0 내지 약 50 범위의 정수인 올리고뉴클레오티드.
  42. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
    YP가
    Figure pct00515
    이되,
    Z가 O 또는 S이고; d가 약 0 내지 약 50 범위의 정수인 올리고뉴클레오티드.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서,
    Z가 O인 올리고뉴클레오티드.
  44. 제41항 또는 제42항에 있어서,
    Z가 S인 올리고뉴클레오티드.
  45. 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
    d가 약 0 내지 약 10 범위의 정수인 올리고뉴클레오티드.
  46. 제45항에 있어서,
    d가 약 0 내지 약 5 범위의 정수인 올리고뉴클레오티드.
  47. 제45항에 있어서,
    d가 약 0, 약 1, 또는 약 3의 정수인 올리고뉴클레오티드.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
    추가 인터뉴클레오시드 포스포트리에스터를 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  49. 제48항에 있어서,
    추가 인터뉴클레오시드 포스포트리에스터가 알킬포스포트리에스터인 올리고뉴클레오티드.
  50. 제48항에 있어서,
    추가 인터뉴클레오시드 포스포트리에스터가 에틸포스포트리에스터인 올리고뉴클레오티드.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나의 5-할로-2'-데옥시우리딘을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  52. 제51항에 있어서,
    5-할로-2'-데옥시우리딘이 5-브로모-2'-데옥시우리딘 또는 5-요오도-2'-데옥시우리딘인 올리고뉴클레오티드.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
    3 이상의 2'-데옥시시티딘을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서,
    3 개의 2'-데옥시시티딘을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,
    3 이상의 2'-데옥시구아노신을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서,
    4 개의 2'-데옥시구아노신을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
    3 개의 2'-데옥시시티딘 및 3 개의 2'-데옥시구아노신을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서,
    3 개의 2'-데옥시시티딘 및 4 개의 2'-데옥시구아노신을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서,
    3 이상의 2'-데옥시티미딘을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  60. 제59항에 있어서,
    3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 개의 2'-데옥시티미딘을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  61. 제59항에 있어서,
    3, 4, 5, 또는 8 개의 2'-데옥시티미딘을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  62. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서,
    0, 1, 또는 2 개의 2'-데옥시아데노신을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서,
    1 이상의 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트를 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  64. 제63항에 있어서,
    인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트 중 적어도 하나가 키랄인 올리고뉴클레오티드.
  65. 하기 화학식 (B)의 화합물 또는 입체 이성질체, 2 이상의 부분입체 이성질체의 혼합물, 호변 이성질체, 또는 2 이상의 호변 이성질체의 혼합물; 또는 이의 약학적 허용 염, 용매화물, 또는 수화물:
    [화학식 (B)]
    Figure pct00516

    상기 식에서,
    Rx가 접합기(conjugating group)이고;
    LN이 링커이며;
    각각의 Q가 독립적으로 포스포트리에스터를 포함하는 올리고뉴클레오티드이고;
    e가 1, 2, 3, 또는 4의 정수이다.
  66. 제65항에 있어서,
    Rx가
    Figure pct00517
    인 화합물.
  67. 제65항에 있어서,
    Rx가 -NH2인 화합물.
  68. 하기 화학식 (C)의 화합물 또는 이의 입체 이성질체, 2 이상의 부분입체 이성질체의 혼합물, 호변 이성질체, 또는 2 이상의 호변 이성질체의 혼합물; 또는 이의 약학적 허용 염, 용매화물, 또는 수화물:
    [화학식 (C)]
    Figure pct00518

    상기 식에서,
    Ab가 항체이고;
    각각의 LN이 독립적으로 링커이며;
    각각의 Q가 독립적으로 포스포트리에스터를 포함하는 올리고뉴클레오티드이고;
    각각의 e가 독립적으로 1, 2, 3, 또는 4의 정수이며;
    f가 1, 2, 3, 또는 4의 정수이다.
  69. 제68항에 있어서,
    f가 1 또는 2의 정수인 화합물.
  70. 제68항에 있어서,
    f가 1의 정수인 화합물.
  71. 제65항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서,
    LN이 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 링커인 화합물.
  72. 제65항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서,
    LN이
    Figure pct00519
    이되, d가 약 0 내지 약 50 범위의 정수인 화합물.
  73. 제65항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서,
    LN이
    Figure pct00520
    이되, d가 약 0 내지 약 50 범위의 정수인 화합물.
  74. 제72항 또는 제73항에 있어서,
    d가 약 0 내지 약 10 범위의 정수인 화합물.
  75. 제74항에 있어서,
    d가 약 0 내지 약 5 범위의 정수인 화합물.
  76. 제74항에 있어서,
    d가 약 0, 약 1, 또는 약 3의 정수인 화합물.
  77. 제65항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서,
    e가 1의 정수인 화합물.
  78. 제65항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 Q가 독립적으로 하기 화학식 (D)의 구조를 갖는 화합물:
    [화학식 (D)]
    Figure pct00521

    상기 식에서,
    각각의 XN이 독립적으로 뉴클레오티드이고;
    X3'이 3' 말단 뉴클레오티드이며;
    X5'가 5' 말단 뉴클레오티드이고;
    YP가 인터뉴클레오시드 포스포트리에스터의 잔기이며;
    b 및 c가 각각 약 0 내지 약 25 범위의 정수이고; 단, 이들의 합이 5 이상이되;
    올리고뉴클레오티드가 변형된 핵염기를 갖는 뉴클레오티드를 포함한다.
  79. 제78항에 있어서,
    b가 약 1 내지 약 15 범위의 정수인 화합물.
  80. 제78항에 있어서,
    b가 약 3, 약 4, 약 11, 또는 약 14의 정수인 화합물.
  81. 제78항에 있어서,
    b가 약 3의 정수인 화합물.
  82. 제78항에 있어서,
    b가 약 4의 정수인 화합물.
  83. 제78항에 있어서,
    b가 약 11의 정수인 화합물.
  84. 제78항에 있어서,
    b가 약 14의 정수인 화합물.
  85. 제78항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서,
    c가 약 0 내지 약 10 범위의 정수인 화합물.
  86. 제78항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서,
    c가 약 0 또는 약 8의 정수인 화합물.
  87. 제78항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서,
    c가 약 0의 정수인 화합물.
  88. 제78항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서,
    c가 약 8의 정수인 화합물.
  89. 제78항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서,
    b 및 c의 합이 약 5 내지 약 20 범위인 화합물.
  90. 제78항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서,
    b 및 c의 합이 약 5 내지 약 15 범위인 화합물.
  91. 제78항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서,
    b 및 c의 합이 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 또는 약 14인 화합물.
  92. 제78항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 XN이 독립적으로 2'-데옥시리보뉴클레오티드인 화합물.
  93. 제78항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 XN이 독립적으로 2'-데옥시아데노신, 2'-데옥시구아노신, 2'-데옥시시티딘, 5-할로-2'-데옥시시티딘, 2'-데옥시티미딘, 2'-데옥시우리딘, 또는 5-할로-2'-데옥시우리딘인 화합물.
  94. 제78항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 XN이 독립적으로 2'-데옥시아데노신, 2'-데옥시구아노신, 2'-데옥시시티딘, 2'-데옥시티미딘, 5-브로모-2'-데옥시우리딘, 또는 5-요오도-2'-데옥시우리딘인 화합물.
  95. 제78항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서,
    X3'이 2'-데옥시리보뉴클레오티드인 화합물.
  96. 제78항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서,
    X3'이 2'-데옥시아데노신, 2'-데옥시구아노신, 2'-데옥시시티딘, 5-할로-2'-데옥시시티딘, 2'-데옥시티미딘, 2'-데옥시우리딘, 또는 5-할로-2'-데옥시우리딘인 화합물.
  97. 제78항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서,
    X3'이 2'-데옥시티미딘인 화합물.
  98. 제78항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서,
    X3'이 2'-변형된 리보뉴클레오티드인 화합물.
  99. 제78항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서,
    X3'이 2'-메톡시 리보뉴클레오티드 또는 2'-에톡시메톡시 리보뉴클레오티드인 화합물.
  100. 제78항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서,
    X5'가 2'-데옥시리보뉴클레오티드인 화합물.
  101. 제100항에 있어서,
    X5'가 2'-데옥시아데노신, 2'-데옥시구아노신, 2'-데옥시시티딘, 5-할로-2'-데옥시시티딘, 2'-데옥시티미딘, 2'-데옥시우리딘, 또는 5-할로-2'-데옥시우리딘인 화합물.
  102. 제100항에 있어서,
    X5'가 치환된 피리미딘 염기를 갖는 2'-데옥시리보뉴클레오티드인 화합물.
  103. 제102항에 있어서,
    X5'가 5-치환된 피리미딘 염기를 갖는 2'-데옥시리보뉴클레오티드인 화합물.
  104. 제102항에 있어서,
    X5'가 2'-데옥시티미딘, 5-할로-2'-데옥시시티딘, 또는 5-할로-2'-데옥시우리딘인 화합물.
  105. 제102항에 있어서,
    X5'가 2'-데옥시티미딘, 5-브로모-2'-데옥시시티딘, 5-요오도-2'-데옥시시티딘, 5-브로모-2'-데옥시우리딘, 또는 5-요오도-2'-데옥시우리딘인 화합물.
  106. 제102항에 있어서,
    X5'가 2'-데옥시티미딘, 5-브로모-2'-데옥시우리딘, 또는 5-요오도-2'-데옥시우리딘인 화합물.
  107. 제78항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서,
    X5'가 3'-포스포로티오에이트기인 화합물.
  108. 제107항에 있어서,
    3'-포스포로티오에이트가 키랄인 화합물.
  109. 제107항에 있어서,
    3'-포스포로티오에이트가 Rp의 키랄성을 갖는 화합물.
  110. 제107항에 있어서,
    3'-포스포로티오에이트가 Sp의 키랄성을 갖는 화합물.
  111. 제78항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서,
    X5'가 Rp의 키랄성을 갖는 3'-포스포로티오에이트기이고 X3'이 2'-메톡시 리보뉴클레오티드 또는 2'-에톡시메톡시 리보뉴클레오티드인 화합물.
  112. 제78항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서,
    X5'가 Sp의 키랄성을 갖는 3'-포스포로티오에이트기이고 X3'이 2'-메톡시 리보뉴클레오티드 또는 2'-에톡시메톡시 리보뉴클레오티드인 화합물.
  113. 제78항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서,
    추가 인터뉴클레오시드 포스포트리에스터를 포함하는 화합물.
  114. 제113항에 있어서,
    추가 인터뉴클레오시드 포스포트리에스터가 알킬포스포트리에스터인 화합물.
  115. 제113항에 있어서,
    추가 인터뉴클레오시드 포스포트리에스터가 에틸포스포트리에스터인 화합물.
  116. 제78항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나의 5-할로-2'-데옥시우리딘을 포함하는 화합물.
  117. 제116항에 있어서,
    5-할로-2'-데옥시우리딘이 5-브로모-2'-데옥시우리딘 또는 5-요오도-2'-데옥시우리딘인 화합물.
  118. 제78항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서,
    3 이상의 2'-데옥시시티딘을 포함하는 화합물.
  119. 제118항에 있어서,
    3 개의 2'-데옥시시티딘을 포함하는 화합물.
  120. 제78항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서,
    4 이상의 2'-데옥시구아노신을 포함하는 화합물.
  121. 제120항에 있어서,
    4 개의 2'-데옥시구아노신을 포함하는 화합물.
  122. 제78항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서,
    3 개의 2'-데옥시시티딘 및 4 개의 2'-데옥시시티딘을 포함하는 화합물.
  123. 제78항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서,
    3 이상의 2'-데옥시티미딘을 포함하는 화합물.
  124. 제123항에 있어서,
    3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 개의 2'-데옥시티미딘을 포함하는 화합물.
  125. 제123항에 있어서,
    3, 4, 5, 또는 8 개의 2'-데옥시티미딘을 포함하는 화합물.
  126. 제78항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서,
    0, 1, 또는 2 개의 2'-데옥시아데노신을 포함하는 화합물.
  127. 제74항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서,
    1 이상의 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트를 포함하는 화합물.
  128. 제127항에 있어서,
    인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트 중 적어도 하나가 키랄인 화합물.
  129. N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T의 서열을 갖되, 상기 식에서,
    x가 1 내지 4 범위의 정수이고;
    N1이 부재하거나 2'-데옥시티미딘이며;
    N2가 변형된 핵염기를 갖는 2'-데옥시리보뉴클레오티드이고;
    N3이 각각 선택적으로 3'-포스포트리에스터를 포함하는 2'-데옥시아데노신 또는 2'-데옥시티미딘이며;
    N4가 2'-데옥시아데노신 또는 2'-데옥시티미딘이며;
    N5가 선택적으로 3'-포스포트리에스터를 포함하는 2'-데옥시티미딘인 올리고뉴클레오티드.
  130. 제129항에 있어서,
    x가 1 또는 4의 정수인 올리고뉴클레오티드.
  131. 제129항 또는 제130항에 있어서,
    x가 1의 정수인 올리고뉴클레오티드.
  132. 제129항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서,
    N1이 부재한 올리고뉴클레오티드.
  133. 제129항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서,
    N1이 2'-데옥시티미딘인 올리고뉴클레오티드.
  134. 제129항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서,
    N2가 치환된 피리미딘 염기를 갖는 2'-데옥시리보뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드.
  135. 제134항에 있어서,
    N2가 5-치환된 피리미딘 염기를 갖는 2'-데옥시리보뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드.
  136. 제134항에 있어서,
    N2가 5-할로-2'-데옥시시티딘 또는 5-할로-2'-데옥시우리딘인 올리고뉴클레오티드.
  137. 제134항에 있어서,
    N2가 5-브로모-2'-데옥시우리딘 또는 5-요오도-2'-데옥시우리딘인 올리고뉴클레오티드.
  138. 제129항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서,
    N3이 3'-포스포트리에스터를 포함하는 2'-데옥시아데노신인 올리고뉴클레오티드.
  139. 제129항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서,
    N3이 2'-데옥시티미딘인 올리고뉴클레오티드.
  140. 제129항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서,
    N3이 3'-포스포트리에스터를 포함하는 2'-데옥시티미딘인 올리고뉴클레오티드.
  141. 제129항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서,
    N4가 2'-데옥시아데노신인 올리고뉴클레오티드.
  142. 제129항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서,
    N4가 2'-데옥시티미딘인 올리고뉴클레오티드.
  143. 제129항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서,
    N5가 2'-데옥시티미딘인 올리고뉴클레오티드.
  144. 제129항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서,
    N5가 3'-포스포트리에스터를 포함하는 2'-데옥시티미딘인 올리고뉴클레오티드.
  145. 제129항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서,
    1 이상의 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트를 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  146. 제145항에 있어서,
    인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트 중 적어도 하나가 키랄인 올리고뉴클레오티드.
  147. 제129항에 있어서,
    서열번호 p236, p238, p243, p246, p275, p276, p308, p313, p347, p361, p362, p425, p433, p434, p435, p436, p437, p438, p477, p478, p479, p480, p481, p482, p483, p484, p485, p486, p487, p488, 또는 p489의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드.
  148. 1 이상의 비염기 스페이서 또는 인터뉴클레오시드 포스포트리에스터를 포함하는 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  149. 제148항에 있어서,
    면역조절 폴리뉴클레오티드가 5-할로우리딘을 포함하는 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  150. 제149항에 있어서,
    5-할로우리딘이 2 개의 5'-말단 뉴클레오시드 중 적어도 하나이거나 면역조절 폴리뉴클레오티드에서 면역자극 서열(immunostimulating sequence)(ISS) 내에 존재하는 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  151. 제149항 또는 제150항에 있어서,
    5-할로우리딘이 5-브로모우리딘인 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  152. 제149항 또는 제150항에 있어서,
    5-할로우리딘이 5-요오도우리딘인 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  153. 제149항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서,
    5-할로우리딘이 인터뉴클레오시드 포스포디에스터 포스페이트에 결합된 3'-위치를 포함하는 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  154. 제149항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서,
    5-할로우리딘이 인터뉴클레오시드 포스포디에스터 포스포로티오에이트에 결합된 3'-위치를 포함하는 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  155. 5'-말단 5-브로모우리딘을 포함하는 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  156. 제148항 내지 제155항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역조절 폴리뉴클레오티드가 1 이상의 인터뉴클레오시드 포스포트리에스터를 포함하는 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  157. 제156항에 있어서,
    1 이상의 인터뉴클레오시드 포스포트리에스터가 1 내지 5 개의 인터뉴클레오시드 포스포트리에스터로부터의 것인 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  158. 제156항 또는 제157항에 있어서,
    인터뉴클레오시드 포스포트리에스터 중 적어도 하나가 접합기를 포함하는 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  159. 제156항 또는 제157항에 있어서,
    인터뉴클레오시드 포스포트리에스터 중 적어도 하나가 접합기를 포함하는 포스포티오트리에스터인 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  160. 제148항 내지 제159항 중 어느 한 항에 있어서,
    말단 포스포에스터를 추가로 포함하는 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  161. 제160항에 있어서,
    말단 포스포에스터가 5'-말단 포스포에스터인 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  162. 제160항에 있어서,
    말단 포스포에스터가 3'-말단 포스포에스터인 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  163. 제160항 내지 제162항 중 어느 한 항에 있어서,
    말단 포스포에스터가 접합기를 포함하는 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  164. 제163항에 있어서,
    말단 포스포에스터가 접합기를 포함하는 포스포티오트리에스터인 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  165. 제148항 내지 제164항 중 어느 한 항에 있어서,
    5'-캡 또는 3'-캡을 포함하는 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  166. 제165항에 있어서,
    면역조절 폴리뉴클레오티드가 5'-5' 캡인 5'-캡을 포함하는 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  167. 제166항에 있어서,
    5'-5' 캡이 인터뉴클레오시드 포스페이트, 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트, 또는 인터뉴클레오시드 포스포로디티오에이트에 공유결합된 접합기를 포함하는 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  168. 제165항에 있어서,
    면역조절 폴리뉴클레오티드가 인터뉴클레오시드 포스페이트, 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트, 또는 인터뉴클레오시드 포스포로디티오에이트에 공유결합된 접합기를 포함하는 3'-캡을 포함하는 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  169. 제148항 내지 제168항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역조절 폴리뉴클레오티드가 5'-말단 면역자극 서열을 포함하는 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  170. 제169항에 있어서,
    인터뉴클레오시드 포스포트리에스터 중 적어도 하나가 5'-말단 면역자극 서열에 결합되는 5'-탄소 원자를 갖는 뉴클레오시드의 3'-탄소 원자에 결합되는 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  171. 제148항 내지 제170항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역조절 폴리뉴클레오티드가 1 이상의 비염기 스페이서를 포함하는 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  172. 제148항 내지 제171항 중 어느 한 항에 있어서,
    1 이상의 비염기 스페이서가 1 또는 2 개의 비염기 스페이서인 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  173. 제148항 내지 제172항 중 어느 한 항에 있어서,
    비염기 스페이서 중 적어도 하나가 인터뉴클레오시드 비염기 스페이서인 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  174. 제148항 내지 제173항 중 어느 한 항에 있어서,
    비염기 스페이서 중 적어도 하나가 3'-말단 비염기 스페이서인 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  175. 제148항 내지 제174항 중 어느 한 항에 있어서,
    비염기 스페이서 중 적어도 하나가 접합기를 포함하는 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  176. 제148항 내지 제175항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역조절 폴리뉴클레오티드가 총 6 내지 16 개의 뉴클레오티드를 포함하는 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  177. 제148항 내지 제176항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역조절 폴리뉴클레오티드에서의 인터뉴클레오시드 가교기 중 적어도 50%가 포스포로티오에이트를 포함하는 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  178. 제177항에 있어서,
    면역조절 폴리뉴클레오티드에서의 인터뉴클레오시드 가교기 중 적어도 80%가 포스포로티오에이트를 포함하는 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  179. 제148항 내지 제178항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역조절 폴리뉴클레오티드 내의 핵염기에 공유결합된 접합기를 추가로 포함하는 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  180. 제148항 또는 제179항에 있어서,
    면역조절 폴리뉴클레오티드가 제2 및 제3 뉴클레오시드로서 시티딘 및 구아노신을 포함하는 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  181. 제148항 또는 제180항에 있어서,
    면역조절 폴리뉴클레오티드가 제3 및 제4 뉴클레오시드로서 시티딘 및 구아노신을 포함하는 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  182. 제148항 내지 제181항 중 어느 한 항에 있어서,
    1 이상의 보조 모이어티를 추가로 포함하는 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  183. 제182항에 있어서,
    면역조절 폴리뉴클레오티드가 접합 모이어티를 포함하되, 접합 모이어티가 보조 모이어티 중 적어도 하나를 포함하는 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  184. 제182항 또는 제183항에 있어서,
    적어도 하나의 보조 모이어티가 100 Da 내지 2,500 Da의 분자량을 갖는 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)을 포함하는 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  185. 제184항에 있어서,
    각각의 PEG가 독립적으로 총 적어도 3 개의 에틸렌 글리콜 반복 단위를 포함하는 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  186. 제184항 또는 제185항에 있어서,
    각각의 PEG가 독립적으로 총 적어도 20 개의 에틸렌 글리콜 반복 단위를 포함하는 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  187. 제184항 내지 제186항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 PEG가 독립적으로 총 50 이하의 에틸렌 글리콜 반복 단위를 포함하는 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  188. 제182항 내지 제187항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역조절 폴리뉴클레오티드가 1 내지 8 개의 PEG를 포함하는 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  189. 제148항 내지 제188항 중 어느 한 항에 있어서,
    모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 보조 모이어티, 말단 포스포디에스터, 말단 포스포트리에스터, 5'-5' 캡, 및 기 -OR'로 이루어진 그룹으로부터 선택된 5'-캡핑기(capping group)를 포함하되, R'이 생체내가역성기, 비-생체내가역성기, 및 O-보호기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  190. 제189항에 있어서,
    5'-캡핑기가 포스페이트, 포스포로티오에이트, 또는 포스포로디티오에이트에 결합된 선택적으로 치환된 C1-6 알킬을 포함하는 모노포스페이트 또는 말단 포스포디에스터인 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  191. 제148항 내지 제190항 중 어느 한 항에 있어서,
    모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 보조 모이어티, 말단 포스포디에스터, 말단 포스포트리에스터, 및 기 -OR'로 이루어진 그룹으로부터 선택된 3'-캡핑기를 포함하되, R'이 생체내가역성기, 비-생체내가역성기, 및 O-보호기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  192. 제191항에 있어서,
    3'-캡핑기가 포스페이트, 포스포로티오에이트, 또는 포스포로디티오에이트에 결합된 선택적으로 치환된 C1-6 알킬을 포함하는 모노포스페이트 또는 말단 포스포디에스터인 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  193. 제148항 내지 제192항 중 어느 한 항에 있어서,
    접합 모이어티에 결합된 핵염기를 포함하는 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  194. 상보적 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 제148항 내지 제193항 중 어느 한 항의 면역조절 폴리뉴클레오티드를 포함하는 혼성화된 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  195. 제148항 내지 제194항 중 어느 한 항의 면역조절 폴리뉴클레오티드를 포함하되, 면역조절 폴리뉴클레오티드가 적어도 하나의 입체화학적으로 풍부화된 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트를 포함하는 조성물.
  196. 제195항에 있어서,
    적어도 하나의 입체화학적으로 풍부화된 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트가 면역조절 폴리뉴클레오티드에서 면역자극 서열 내의 CpG의 5'-말단 뉴클레오시드와 시티딘 사이에 배치되는 조성물.
  197. 제195항 또는 제196항에 있어서,
    입체화학적으로 풍부화된 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트가 S-입체발생인 조성물.
  198. 제195항 또는 제196항에 있어서,
    입체화학적으로 풍부화된 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트가 R-입체발생인 조성물.
  199. 제195항 내지 제198항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 입체화학적으로 풍부화된 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트가 면역조절 폴리뉴클레오티드에서 면역자극 서열 내의 CpG의 시티딘의 5'-탄소 원자에 결합되는 조성물.
  200. 제199항에 있어서,
    입체화학적으로 풍부화된 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트가 S-입체발생인 조성물.
  201. 제199항에 있어서,
    입체화학적으로 풍부화된 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트가 R-입체발생인 조성물.
  202. 제195항 내지 제201항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나의 입체화학적으로 풍부화된 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트가 면역조절 폴리뉴클레오티드 내의 제1 및 제2 뉴클레오시드를 연결하는 조성물.
  203. 제202항에 있어서,
    입체화학적으로 풍부화된 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트가 S-입체발생인 조성물.
  204. 제202항에 있어서,
    입체화학적으로 풍부화된 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트가 R-입체발생인 조성물.
  205. 제195항 내지 제204항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나의 입체화학적으로 풍부화된 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트가 면역조절 폴리뉴클레오티드 내의 제4 및 제5 뉴클레오시드를 연결하는 조성물.
  206. 제205항에 있어서,
    입체화학적으로 풍부화된 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트가 S-입체발생인 조성물.
  207. 제205항에 있어서,
    입체화학적으로 풍부화된 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트가 R-입체발생인 조성물.
  208. 항체 또는 항체 단편 및 1 이상의 면역조절 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 항체 또는 항체 단편이 모두 Q-태그(tag)를 포함하며, 각각의 면역조절 폴리뉴클레오티드가 독립적으로 Q-태그에 공유결합된 링커를 포함하는 접합체.
  209. 제208항에 있어서,
    Q-태그가 N-말단 Q-태그인 접합체.
  210. 제208항에 있어서,
    Q-태그가 C-말단 Q-태그인 접합체.
  211. 제208항 내지 제210항 중 어느 한 항에 있어서,
    Q-태그가 항체 또는 항체 단편의 중쇄 내에 배치되는 접합체.
  212. 제208항 내지 제210항 중 어느 한 항에 있어서,
    Q-태그가 항체 또는 항체 단편의 경쇄 내에 배치되는 접합체.
  213. 제208항 내지 제212항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역조절 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나가 5-변형된 우리딘 또는 5-변형된 시티딘을 포함하는 접합체.
  214. 표적화 모이어티 및 1 이상의 면역조절 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 각각의 면역조절 폴리뉴클레오티드가 독립적으로 링커를 포함하되, 표적화 모이어티가 링커에 공유결합되고, 면역조절 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나가 5-변형된 우리딘 또는 5-변형된 시티딘을 포함하는 접합체.
  215. 제213항 또는 제214항에 있어서,
    면역조절 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나가 5-변형된 우리딘을 포함하는 접합체.
  216. 제215항에 있어서,
    5-변형된 우리딘이 5-할로우리딘, 5-알키닐우리딘, 또는 5-헤테로사이클릴우리딘인 접합체.
  217. 제216항에 있어서,
    5-변형된 우리딘이 5-할로우리딘인 접합체.
  218. 제216항 또는 제217항에 있어서,
    5-할로우리딘이 5-브로모우리딘인 접합체.
  219. 제216항 또는 제217항에 있어서,
    5-할로우리딘이 5-요오도우리딘인 접합체.
  220. 제213항 내지 제219항 중 어느 한 항에 있어서,
    5-변형된 우리딘이 면역조절 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나의 2 개의 5'-말단 뉴클레오티드 중 하나인 접합체.
  221. 제213항 내지 제220항 중 어느 한 항에 있어서,
    5-변형된 우리딘이 인터뉴클레오시드 포스포에스터 포스페이트에 결합된 3'-위치를 포함하는 접합체.
  222. 제213항 내지 제220항 중 어느 한 항에 있어서,
    5-변형된 우리딘이 인터뉴클레오시드 포스포에스터 포스포로티오에이트에 결합된 3'-위치를 포함하는 접합체.
  223. 제208항 내지 제222항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역조절 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나가 제2 및 제3 뉴클레오시드로서 시티딘 및 구아노신을 포함하는 접합체.
  224. 제208항 내지 제222항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역조절 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나가 제3 및 제4 뉴클레오시드로서 시티딘 및 구아노신을 포함하는 접합체.
  225. 제208항 내지 제224항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역조절 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나가 총 6 내지 16 개의 뉴클레오티드를 포함하는 접합체.
  226. 표적화 모이어티 및 1 이상의 면역조절 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 각각의 면역조절 폴리뉴클레오티드가 독립적으로 링커를 포함하되, 표적화 모이어티가 링커에 공유결합되고, 면역조절 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나가 총 6 내지 16 개의 뉴클레오티드를 포함하는 접합체.
  227. 제208항 내지 제226항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역조절 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나가 1 이상의 비염기 스페이서 또는 인터뉴클레오시드 포스포트리에스터를 포함하는 접합체.
  228. 표적화 모이어티 및 1 이상의 면역조절 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 각각의 면역조절 폴리뉴클레오티드가 독립적으로 링커를 포함하되, 표적화 모이어티가 링커에 공유결합되고, 면역조절 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나가 1 이상의 비염기 스페이서 또는 인터뉴클레오시드 포스포트리에스터를 포함하는 접합체.
  229. 제228항에 있어서,
    적어도 하나의 비염기 스페이서 또는 적어도 하나의 포스포트리에스터가 링커를 포함하는 접합체.
  230. 제208항 내지 제229항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역조절 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나가 1 이상의 비염기 스페이서를 포함하는 접합체.
  231. 제230항에 있어서,
    1 이상의 인터뉴클레오시드 비염기 스페이서가 1 또는 2 개의 비염기 스페이서인 접합체.
  232. 제226항 내지 제231항 중 어느 한 항에 있어서,
    비염기 스페이서 중 적어도 하나가 인터뉴클레오시드 비염기 스페이서인 접합체.
  233. 제226항 내지 제232항 중 어느 한 항에 있어서,
    비염기 스페이서 중 적어도 하나가 3'-말단 비염기 스페이서인 접합체.
  234. 제208항 내지 제233항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역조절 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나가 1 이상의 인터뉴클레오시드 포스포트리에스터를 포함하는 접합체.
  235. 제234항에 있어서,
    1 이상의 인터뉴클레오시드 포스포트리에스터가 1 내지 5 개의 인터뉴클레오시드 포스포트리에스터인 접합체.
  236. 제208항 내지 제235항 중 어느 한 항에 있어서,
    접합체가 링커에 결합된 1 이상의 보조 모이어티를 추가로 포함하는 접합체.
  237. 표적화 모이어티, 1 이상의 보조 모이어티, 및 1 이상의 면역조절 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 각각의 면역조절 폴리뉴클레오티드가 독립적으로 표적화 모이어티에 결합된 링커를 포함하는 접합체.
  238. 제236항 또는 제237항에 있어서,
    적어도 하나의 보조 모이어티가 100 Da 내지 2,500 Da의 분자량을 갖는 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)을 포함하는 접합체.
  239. 제238항에 있어서,
    각각의 PEG가 독립적으로 총 적어도 3 개의 에틸렌 글리콜 반복 단위를 포함하는 접합체.
  240. 제238항 또는 제239항에 있어서,
    각각의 PEG가 독립적으로 총 적어도 20 개의 에틸렌 글리콜 반복 단위를 포함하는 접합체.
  241. 제238항 내지 제240항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 PEG가 독립적으로 총 50 이하의 에틸렌 글리콜 반복 단위를 포함하는 접합체.
  242. 제238항 내지 제241항 중 어느 한 항에 있어서,
    접합체가 1 내지 8 개의 PEG를 포함하는 접합체.
  243. 제208항 내지 제242항 중 어느 한 항에 있어서,
    표적화 모이어티가 항원-결합 모이어티, 폴리펩티드, 압타머, 또는 1 이상의 소분자를 포함하는 기인 접합체.
  244. 제243항에 있어서,
    표적화 모이어티가 항원-결합 모이어티인 접합체.
  245. 제243항에 있어서,
    표적화 모이어티가 항체 또는 이의 항원-결합 단편인 접합체.
  246. 제208항 내지 제245항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역조절 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나에서의 5'-캡핑기가 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 보조 모이어티, 말단 포스포디에스터, 말단 포스포트리에스터, 및 기 -OR'로 이루어진 그룹으로부터 선택되되, R'이 생체내가역성기, 비-생체내가역성기, 및 O-보호기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 접합체.
  247. 제246항에 있어서,
    5'-캡핑기가 포스페이트, 포스포로티오에이트, 또는 포스포로디티오에이트에 결합된 선택적으로 치환된 C1-6 알킬을 포함하는 모노포스페이트 또는 말단 포스포디에스터인 접합체.
  248. 제208항 내지 제247항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역조절 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나에서의 3'-캡핑기가 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 보조 모이어티, 말단 포스포디에스터, 말단 포스포트리에스터, 및 기 -OR'로 이루어진 그룹으로부터 선택되되, R'이 생체내가역성기, 비-생체내가역성기, 및 O-보호기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 접합체.
  249. 제248항에 있어서,
    3'-캡핑기가 포스페이트, 포스포로티오에이트, 또는 포스포로디티오에이트에 결합된 선택적으로 치환된 C1-6 알킬을 포함하는 모노포스페이트 또는 말단 포스포디에스터인 접합체.
  250. 제208항 내지 제249항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역조절 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나가 링커에 결합된 핵염기를 포함하는 접합체.
  251. 제208항 내지 제250항 중 어느 한 항에 있어서,
    접합체가 1 내지 6 개의 면역조절 폴리뉴클레오티드를 포함하는 접합체.
  252. 제251항에 있어서,
    접합체가 1 내지 4 개의 면역조절 폴리뉴클레오티드를 포함하는 접합체.
  253. 제252항에 있어서,
    접합체가 하나의 면역조절 폴리뉴클레오티드만을 포함하는 접합체.
  254. 제253항에 있어서,
    접합체가 2 개의 면역조절 폴리뉴클레오티드만을 포함하는 접합체.
  255. 제208항 내지 제254항 중 어느 한 항에 있어서,
    접합체가 하나의 표적화 모이어티를 포함하는 접합체.
  256. 제208항 내지 제252항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역조절 폴리뉴클레오티드가 4 개의 5'-말단 뉴클레오티드 내에 인간 면역자극 서열을 포함하는 접합체.
  257. 제256항에 있어서,
    면역조절 폴리뉴클레오티드의 4 개의 5'-말단 뉴클레오티드 내의 인간 면역자극 서열이 뉴클레오시드로 치환된 포스포에스터에 결합된 5'-탄소 원자를 포함하는 시티딘을 포함하는 접합체.
  258. 제208항 내지 제257항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역조절 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나가 5-변형된 우리딘 또는 5-변형된 시티딘을 포함하는 접합체.
  259. 제208항 내지 제258항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역조절 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나가 이의 보체에 혼성화되는 접합체.
  260. 제208항 내지 제259항 중 어느 한 항의 접합체를 포함하되, 면역조절 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나가 적어도 하나의 입체화학적으로 풍부화된 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트를 포함하는 조성물.
  261. 표적화 모이어티 및 1 이상의 면역조절 폴리뉴클레오티드를 포함는 접합체를 포함하고, 각각의 면역조절 폴리뉴클레오티드가 독립적으로 링커를 포함하되, 표적화 모이어티가 링커에 공유결합되고, 면역조절 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나가 적어도 하나의 입체화학적으로 풍부화된 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트를 포함하는 조성물.
  262. 제260항 또는 제261항에 있어서,
    적어도 하나의 입체화학적으로 풍부화된 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트가 면역조절 폴리뉴클레오티드에서 면역자극 서열 내의 CpG의 5'-말단 뉴클레오시드와 시티딘 사이에 배치되는 조성물.
  263. 제260항 내지 제262항 중 어느 한 항에 있어서,
    입체화학적으로 풍부화된 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트가 S-입체발생인 조성물.
  264. 제260항 내지 제263항 중 어느 한 항에 있어서,
    입체화학적으로 풍부화된 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트가 R-입체발생인 조성물.
  265. 제260항 내지 제264항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 입체화학적으로 풍부화된 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트가 면역조절 폴리뉴클레오티드에서 면역자극 서열 내의 CpG의 시티딘의 5'-탄소 원자에 결합되는 조성물.
  266. 제265항에 있어서,
    입체화학적으로 풍부화된 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트가 S-입체발생인 조성물.
  267. 제265항에 있어서,
    입체화학적으로 풍부화된 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트가 R-입체발생인 조성물.
  268. 제260항 내지 제267항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 입체화학적으로 풍부화된 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트가 면역조절 폴리뉴클레오티드 내의 제1 및 제2 뉴클레오시드를 연결하는 조성물.
  269. 제268항에 있어서,
    입체화학적으로 풍부화된 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트가 S-입체발생인 조성물.
  270. 제268항에 있어서,
    입체화학적으로 풍부화된 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트가 R-입체발생인 조성물.
  271. 제260항 내지 제270항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 입체화학적으로 풍부화된 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트가 면역조절 폴리뉴클레오티드 내의 제4 및 제5 뉴클레오시드를 연결하는 조성물.
  272. 제271항에 있어서,
    입체화학적으로 풍부화된 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트가 S-입체발생인 조성물.
  273. 제271항에 있어서,
    입체화학적으로 풍부화된 인터뉴클레오시드 포스포로티오에이트가 R-입체발생인 조성물.
  274. 약학적 허용 담체, 및 제148항 내지 제194항 중 어느 한 항의 면역조절 폴리뉴클레오티드, 제195항 내지 제207항 중 어느 한 항의 조성물, 제208항 내지 제259항 중 어느 한 항의 접합체 또는 제260항 내지 제273항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 약학 조성물.
  275. 엔도솜 톨-유사 수용체(endosomal toll-like receptor)를 포함하는 세포에서 엔도솜 톨-유사 수용체를 조절하는 방법으로서, 면역조절 폴리뉴클레오티드가 세포 내로 운반되게 하는 조건 하에서 세포를 제148항 내지 제194항 중 어느 한 항의 면역조절 폴리뉴클레오티드, 제195항 내지 제207항 중 어느 한 항의 조성물, 제208항 내지 제259항 중 어느 한 항의 접합체, 제260항 내지 제273항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제274항의 약학 조성물과 접촉시키는 것을 포함하되, 접촉 후에, 엔도솜 톨-유사 수용체의 활성이 조절되는 방법.
  276. 제275항에 있어서,
    면역조절 폴리뉴클레오티드가 면역자극 폴리뉴클레오티드이고, 방법이 엔도솜 톨-유사 수용체를 작용시키기 위한 것인 방법.
  277. 제274항에 있어서,
    면역조절 폴리뉴클레오티드가 면역억제 폴리뉴클레오티드이고, 방법이 엔도솜 톨-유사 수용체를 길항시키기 위한 것인 방법.
  278. 엔도솜 톨-유사 수용체를 포함하는 항원-제시 세포(antigen-presenting cell)에서 1 이상의 사이토카인을 유도하는 방법으로서, 1 이상의 면역조절 폴리뉴클레오티드가 세포 내로 운반되게 하는 조건 하에서 항원-제시 세포를 제148항 내지 제194항 중 어느 한 항의 면역조절 폴리뉴클레오티드, 제195항 내지 제207항 중 어느 한 항의 조성물, 제208항 내지 제259항 중 어느 한 항의 접합체, 제260항 내지 제273항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제274항의 약학 조성물과 접촉시키는 것을 포함하되, 접촉 후에, 세포에서 적어도 하나의 사이토카인의 수준이 증가되고, 표적화 모이어티가 항원-제시 세포를 표적화하되,
    면역조절 폴리뉴클레오티드가 면역자극 폴리뉴클레오티드인 방법.
  279. 제278항에 있어서,
    항원-제시 세포가 B 세포인 방법.
  280. 제278항 또는 제279항에 있어서,
    1 이상의 사이토카인 중 적어도 하나가 염증성 사이토카인인 방법.
  281. 제278항에 있어서,
    항원-제시 세포가 플라스마사이토이드 수지상 세포(plasmacytoid dendritic cell)이고, 표적화 모이어티가 플라스마사이토이드 수지상 세포를 인식하는 방법.
  282. 제278항에 있어서,
    항원-제시 세포가 대식세포인 방법.
  283. 제278항에 있어서,
    사이토카인 중 적어도 하나가 I 형 인터페론인 방법.
  284. 제275항 내지 제283항 중 어느 한 항에 있어서,
    톨-유사 수용체가 TLR9인 방법.
  285. 환자에서 액상 종양을 치료하는 방법으로서, 환자에게 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 면역조절 폴리뉴클레오티드, 제148항 내지 제194항 중 어느 한 항의 조성물, 제195항 내지 제207항 중 어느 한 항의 조성물, 제208항 내지 제259항 중 어느 한 항의 접합체, 제260항 내지 제273항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제274항의 약학 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하되, 표적화 모이어티가 B 세포를 표적화하고, 면역조절 폴리뉴클레오티드가 TLR9 작용제인 면역자극 폴리뉴클레오티드인 방법.
  286. 제285항에 있어서,
    액상 종양이 혈액학적 종양인 방법.
  287. 제286항에 있어서,
    혈액학적 종양이 림프종인 방법.
  288. 제287항에 있어서,
    림프종이 비-호지킨(non-Hodgkin) B 세포 림프종인 방법.
  289. 제288항에 있어서,
    림프종이 외투 세포 림프종, 광범위 큰 B 세포 림프종, 소포성 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 또는 다발성 골수종인 방법.
  290. 환자에서 고형 종양을 치료하는 방법으로서, 환자에게 제148항 내지 제194항 중 어느 한 항의 면역조절 폴리뉴클레오티드, 제195항 내지 제207항 중 어느 한 항의 조성물, 제208항 내지 제259항 중 어느 한 항의 접합체, 제260항 내지 제273항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제274항의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하되, 표적화 모이어티가 플라스마사이토이드 수지상 세포를 표적화하고, 면역조절 폴리뉴클레오티드가 TLR9 작용제인 면역자극 폴리뉴클레오티드인 방법.
  291. 제148항 내지 제194항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역조절 폴리뉴클레오티드가 면역자극 폴리뉴클레오티드인 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  292. 제208항 내지 제259항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역조절 폴리뉴클레오티드가 면역자극 폴리뉴클레오티드인 접합체.
  293. 제195항 내지 제207항 및 제260항 내지 제273항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역조절 폴리뉴클레오티드가 면역자극 폴리뉴클레오티드인 조성물.
  294. 제274항에 있어서,
    면역조절 폴리뉴클레오티드가 면역자극 폴리뉴클레오티드인 약학 조성물.
  295. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역조절 폴리뉴클레오티드가 면역억제 폴리뉴클레오티드인 면역조절 폴리뉴클레오티드.
  296. 제208항 내지 제259항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역조절 폴리뉴클레오티드가 면역억제 폴리뉴클레오티드인 접합체.
  297. 제195항 내지 제207항 및 제260항 내지 제273항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역조절 폴리뉴클레오티드가 면역억제 폴리뉴클레오티드인 조성물.
  298. 제274항에 있어서,
    면역조절 폴리뉴클레오티드가 면역억제 폴리뉴클레오티드인 약학 조성물.
  299. 제148항 내지 제194항 중 어느 한 항의 면역조절 폴리뉴클레오티드, 제195항 내지 제207항 중 어느 한 항의 조성물, 제208항 내지 제259항 중 어느 한 항의 접합체, 제260항 내지 제273항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제274항의 약학 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 갖는 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  300. 제299항에 있어서,
    암이 액상 종양인 방법.
  301. 제300항에 있어서,
    액상 종양이 혈액학적 종양인 방법.
  302. 제301항에 있어서,
    혈액학적 종양이 림프종인 방법.
  303. 제302항에 있어서,
    림프종이 비-호지킨 B 세포 림프종, 외투 세포 림프종, 광범위 큰 B-세포 림프종, 소포성 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 또는 다발성 골수종인 방법.
  304. 제299항에 있어서,
    암이 고형 종양인 방법.
  305. 제304항에 있어서,
    고형 종양이 결장 암종, 흑색종, 또는 두경부암인 방법.
  306. 제299항에 있어서,
    표적화 모이어티가 항체 또는 항체 단편인 방법.
  307. 제299항 내지 제306항 중 어느 한 항에 있어서,
    표적화 모이어티가 항원 제시 세포(APC) 상의 항원에 결합하는 방법.
  308. 제307항에 있어서,
    APC가 B-세포, 플라스마사이토이드 수지상 세포(pDC) 또는 대식세포인 방법.
  309. 제307항에 있어서,
    항원이 CD19, CD20, CD22, CD30, CD38, CD79 또는 CD79b, CD205, BDCA2, BDCA4 또는 PD-L1인 방법.
  310. 제299항 내지 제309항 중 어느 한 항에 있어서,
    접합체가 전신으로 투여되는 방법.
  311. 제310항에 있어서,
    접합체가 정맥내 주사(intravenous injection)(i.v.)에 의해 투여되는 방법.
  312. 제299항 내지 제311항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역조절 폴리뉴클레오티드가 TLR9 작용제인 방법.
  313. 제299항 내지 제312항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 양이 암에 대한 적응성 면역 반응(adaptive immune response)을 증가시키기 위해 효과적인 방법.
  314. 제313항에 있어서,
    상기 양이 세포-매개된 면역력을 증가시키기 위해 효과적인 방법.
  315. 제313항에 있어서,
    상기 양이 고형 종양에서 T-세포 종양 침윤을 증가시키기 위해 효과적인 방법.
  316. 제315항에 있어서,
    T-세포가 CD4+ 또는 CD8+ T-세포인 방법.
  317. 제313항에 있어서,
    상기 양이 환자에서 지속된 항-종양 면역력을 증가시키기 위해 효과적인 방법.
  318. 제299항 내지 제317항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 양이 대상체에서 종양 성장을 억제하거나 종양 크기를 감소시키기 위해 효과적인 방법.
  319. 제299항 내지 제318항 중 어느 한 항에 있어서,
    접합체의 투여가 비접합된 형태의 면역조절 폴리뉴클레오티드의 투여에 비해 대상체에서 염증성 사이토카인의 적은 증가를 야기하는 방법.
  320. 제319항에 있어서,
    염증성 사이토카인이 IL-6, IL-10 또는 TNFγ인 방법.
  321. 제299항 내지 제320항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 양이 대상체에서 보체 경로를 활성화하기 위해 효과적이지 않은 방법.
  322. 제321항에 있어서,
    상기 양이 대상체에서 보체 C3을 활성화하기 위해 효과적이지 않은 방법.
  323. 제299항 내지 제322항 중 어느 한 항에 있어서,
    암이 체크포인트 억제제 재발된 또는 불응성 암인 방법.
  324. 제323항에 있어서,
    체크포인트 억제제가 PD-1 억제제, PD-L1 억제제, 또는 CTLA-4-억제제인 방법.
  325. 제299항 내지 제324항 중 어느 한 항에 있어서,
    체크포인트 억제제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  326. 제325항에 있어서,
    체크포인트 억제제가 PD-1 억제제, PD-L1 억제제, 또는 CTLA-4 억제제인 방법.
  327. 제325항에 있어서,
    체크포인트 억제제가 항-PD1 항체, 항-PD-L1 항체 또는 항-CTLA-4 항체인 방법.
  328. 제299항 내지 제327항 중 어느 한 항에 있어서,
    T-세포 작용제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  329. 제328항에 있어서,
    T-세포 작용제가 OX-40, ICOS, 또는 4-1 BB 작용제인 방법.
  330. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 면역조절 폴리뉴클레오티드, 제46항 내지 제58항 중 어느 한 항의 조성물, 제148항 내지 제194항 중 어느 한 항의 접합체, 제195항 내지 제207항 중 어느 한 항의 조성물, 제208항 내지 제259항 중 어느 한 항의 접합체, 제260항 내지 제273항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제274항의 약학 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하되, 표적화 모이어티가 B-세포 항원에 결합하는, 암을 갖는 대상체에서 비-B-세포 종양을 치료하는 방법.
  331. 제148항 내지 제194항 중 어느 한 항의 면역조절 폴리뉴클레오티드, 제195항 내지 제207항 중 어느 한 항의 조성물, 제208항 내지 제259항 중 어느 한 항의 접합체, 제260항 내지 제273항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제274항의 약학 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하되, 표적화 모이어티가 B-세포 항원에 결합하는, 암을 갖는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법.
  332. 제148항 내지 제194항 중 어느 한 항의 면역조절 폴리뉴클레오티드, 제195항 내지 제207항 중 어느 한 항의 조성물, 제208항 내지 제259항 중 어느 한 항의 접합체, 제260항 내지 제273항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제274항의 약학 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하되, 표적화 모이어티가 APC 항원에 결합하는, 암을 갖는 대상체에서 액상 종양을 치료하는 방법.
  333. 제332항에 있어서,
    APC 항원이 pDC 또는 대식세포 항원인 방법.
  334. 제148항 내지 제194항 중 어느 한 항의 면역조절 폴리뉴클레오티드, 제195항 내지 제207항 중 어느 한 항의 조성물, 제208항 내지 제259항 중 어느 한 항의 접합체, 제260항 내지 제273항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제274항의 약학 조성물 및 체크포인트 억제제의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 갖는 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  335. 제334항에 있어서,
    체크포인트 억제제가 PD-1 억제제, PD-L1 억제제, 또는 CTLA-4 억제제인 방법.
  336. 제335항에 있어서,
    체크포인트 억제제가 항-PD1 항체, 항-PD-L1 항체 또는 항-CTLA-4 항체인 방법.
  337. 제148항 내지 제194항 중 어느 한 항의 면역조절 폴리뉴클레오티드, 제195항 내지 제207항 중 어느 한 항의 조성물, 제208항 내지 제259항 중 어느 한 항의 접합체, 제260항 내지 제273항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제274항의 약학 조성물 및 T-세포 작용제의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 암을 갖는 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  338. 제337항에 있어서,
    T-세포 작용제가 OX-40, ICOS, 또는 4-1 BB 작용제인 방법.
  339. 제148항 내지 제194항 중 어느 한 항의 면역조절 폴리뉴클레오티드, 제195항 내지 제207항 중 어느 한 항의 조성물, 제208항 내지 제259항 중 어느 한 항의 접합체, 제260항 내지 제273항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제274항의 약학 조성물, 또는 제125항의 약학 조성물 및 체크포인트 억제제를 포함하는 약학 조성물.
  340. 제339항에 있어서,
    약학적 허용 부형제 또는 용매를 추가로 포함하는 약학 조성물.
  341. 제148항 내지 제194항 중 어느 한 항의 면역조절 폴리뉴클레오티드, 제195항 내지 제207항 중 어느 한 항의 조성물, 제208항 내지 제259항 중 어느 한 항의 접합체, 제260항 내지 제273항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제274항의 약학 조성물 및 T-세포 작용제를 포함하는 약학 조성물.
  342. 제341항에 있어서,
    약학적 허용 부형제 또는 용매를 추가로 포함하는 약학 조성물.
  343. 표적화 모이어티가 APC 항원에 결합하고, 접합체가 대상체에서 액상 종양 또는 고형 종양의 증식을 억제할 수 있는, 제148항 내지 제194항 중 어느 한 항의 면역조절 폴리뉴클레오티드, 제195항 내지 제207항 중 어느 한 항의 조성물, 제208항 내지 제259항 중 어느 한 항의 접합체, 제260항 내지 제273항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제274항의 약학 조성물.
  344. 표적화 모이어티가 B-세포 항원에 결합하고, 접합체가 대상체에서 B-세포 종양의 증식을 억제할 수 있는, 제148항 내지 제194항 중 어느 한 항의 면역조절 폴리뉴클레오티드, 제195항 내지 제207항 중 어느 한 항의 조성물, 제208항 내지 제259항 중 어느 한 항의 접합체, 제260항 내지 제273항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제274항의 약학 조성물.
  345. 표적화 모이어티가 B-세포 항원에 결합하고, 접합체가 대상체에서 비-B-세포 종양의 증식을 억제할 수 있는, 제148항 내지 제194항 중 어느 한 항의 면역조절 폴리뉴클레오티드, 제195항 내지 제207항 중 어느 한 항의 조성물, 제208항 내지 제259항 중 어느 한 항의 접합체, 제260항 내지 제273항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제274항의 약학 조성물.
  346. 표적화 모이어티가 B-세포 항원에 결합하고, 접합체가 대상체에서 고형 종양의 증식을 억제할 수 있는, 제148항 내지 제194항 중 어느 한 항의 면역조절 폴리뉴클레오티드, 제195항 내지 제207항 중 어느 한 항의 조성물, 제208항 내지 제259항 중 어느 한 항의 접합체, 제260항 내지 제273항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제274항의 약학 조성물.
  347. 표적화 모이어티가 pDC 또는 대식세포 항원에 결합하고, 접합체가 대상체에서 액상 종양의 증식을 억제할 수 있는, 제148항 내지 제194항 중 어느 한 항의 면역조절 폴리뉴클레오티드, 제195항 내지 제207항 중 어느 한 항의 조성물, 제208항 내지 제259항 중 어느 한 항의 접합체, 제260항 내지 제273항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제274항의 약학 조성물.
  348. 표적화 모이어티가 pDC 또는 대식세포 항원에 결합하고, 접합체가 대상체에서 고형 종양의 증식을 억제할 수 있는, 제148항 내지 제194항 중 어느 한 항의 면역조절 폴리뉴클레오티드, 제195항 내지 제207항 중 어느 한 항의 조성물, 제208항 내지 제259항 중 어느 한 항의 접합체, 제260항 내지 제273항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제274항의 약학 조성물.
  349. 접합체가 세포-매개된 면역력을 증가시킬 수 있는, 제148항 내지 제194항 중 어느 한 항의 면역조절 폴리뉴클레오티드, 제195항 내지 제207항 중 어느 한 항의 조성물, 제208항 내지 제259항 중 어느 한 항의 접합체, 제260항 내지 제273항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제274항의 약학 조성물.
  350. 접합체가 대상체에서 T-세포 종양 침윤을 증가시킬 수 있는, 제148항 내지 제194항 중 어느 한 항의 면역조절 폴리뉴클레오티드, 제195항 내지 제207항 중 어느 한 항의 조성물, 제208항 내지 제259항 중 어느 한 항의 접합체, 제260항 내지 제273항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제274항의 약학 조성물.
  351. T-세포가 CD4+ 또는 CD8+ T-세포인, 제148항 내지 제194항 중 어느 한 항의 면역조절 폴리뉴클레오티드, 제195항 내지 제207항 중 어느 한 항의 조성물, 제208항 내지 제259항 중 어느 한 항의 접합체, 제260항 내지 제273항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제274항의 약학 조성물.
  352. 접합체가 대상체에서 적응성 항-종양 면역력을 증가시킬 수 있는, 제148항 내지 제194항 중 어느 한 항의 면역조절 폴리뉴클레오티드, 제195항 내지 제207항 중 어느 한 항의 조성물, 제208항 내지 제259항 중 어느 한 항의 접합체, 제260항 내지 제273항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제274항의 약학 조성물.
  353. 접합체가 대상체에서 IFNγ 분비 또는 발현을 자극할 수 있는, 제148항 내지 제194항 중 어느 한 항의 면역조절 폴리뉴클레오티드, 제195항 내지 제207항 중 어느 한 항의 조성물, 제208항 내지 제259항 중 어느 한 항의 접합체, 제260항 내지 제273항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제274항의 약학 조성물.
  354. 접합체가 대상체에서 보체 경로를 활성화하지 않는, 제148항 내지 제194항 중 어느 한 항의 면역조절 폴리뉴클레오티드, 제195항 내지 제207항 중 어느 한 항의 조성물, 제208항 내지 제259항 중 어느 한 항의 접합체, 제260항 내지 제273항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제274항의 약학 조성물.
  355. 접합체가 대상체에서 보체 C3을 활성화하지 않는, 제148항 내지 제194항 중 어느 한 항의 면역조절 폴리뉴클레오티드, 제195항 내지 제207항 중 어느 한 항의 조성물, 제208항 내지 제259항 중 어느 한 항의 접합체, 제260항 내지 제273항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제274항의 약학 조성물.
  356. CpG-Ab 면역접합체의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하되, CpG-Ab 면역접합체가 종양 연관 항원(tumor associate antigen)(TAA)에 결합하지 않는, 암을 갖는 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  357. 제356항에 있어서,
    CpG-Ab 면역접합체가 적어도 하나의 톨-유사 수용체를 발현하는 정상 면역 세포와 연관된 표적 항원에 특이적으로 결합하는 방법.
  358. 제357항에 있어서,
    정상 면역 세포가 TLR9를 발현하는 방법.
  359. 제357항 또는 제358항에 있어서,
    정상 면역 세포가 항원 제시 세포(APC)인 방법.
  360. 제359항에 있어서,
    APC가 B 세포, 수지상 세포 또는 대식세포인 방법.
  361. 제360항에 있어서,
    표적 항원이 MHC 분자, T 세포 공동자극 분자, 면역 체크포인트 분자, B 세포 특이적 항원, 수지상 세포 항원 특이적 항원 및 대식세포 특이적 항원으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  362. 제361항에 있어서,
    MHC 분자가 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 분자로부터 선택되는 방법.
  363. 제361항 또는 제362항에 있어서,
    T 세포 공동자극 분자가 OX40, CD2, CD27, CDS, ICAM-1, LFA-1/CD11a/CD18, ICOS/CD278, 4-1BB/CD137, GITR, CD30, CD40, BAFFR, HVEM, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3, 및 CD83으로 이루어진 목록으로부터 선택되는 방법.
  364. 제361항 내지 제363항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역 체크포인트 분자가 PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3, LAG-3, CEACAM-1, CEACAM-5, CLTA-4, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD47, CD160, 2B4, CD172a, 및 TGFR로 이루어진 목록으로부터 선택되는 방법.
  365. 제361항 내지 제364항 중 어느 한 항에 있어서,
    표적 항원이 CD1, CD2, CD5, CD6, CD9, CD11, CD17, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD30, CD38, CD40, CD44, CD45R(B220), CD49, CD52, CD56, CD74, CD79b, CD93, CD123, CD138, CD163, CD205, CD206, CD274, CD303, 및 CD304로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  366. 제356항 내지 제365항 중 어느 한 항에 있어서,
    CpG-Ab 면역접합체가 표 2로부터 선택된 면역자극 폴리뉴클레오티드를 포함하는 방법.
  367. 제366항에 있어서,
    CpG-Ab 면역접합체가 p236, p238, p243, p246, p275, p276, p308, p313, p347, p361, p362, p425, p433, p434, p435, p436, p437, p438, p477, p478, p479, p480, p481, p482, p483, p484, p485, p486, p487, p488, 및 p489로 이루어진 그룹으로부터 선택된 면역자극 폴리뉴클레오티드를 포함하는 방법.
  368. 제356항 내지 제367항 중 어느 한 항에 있어서,
    CpG-Ab 면역접합체가 T 세포 에피토프에 접합되지 않는 방법.
  369. 제356항 내지 제367항 중 어느 한 항에 있어서,
    T 세포 에피토프가 오브알부민(ovalbumin)(OVA)의 에피토프인 방법.
  370. CpG-Ab 면역접합체의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하되, CpG-Ab 면역접합체가 종양 연관 항원(TAA)에 특이적으로 결합하고, TAA가 CD19, CD20, CD22, STAT3, exportin 7, Her2, Src, EGFR, CD52, CXCR-4, Muc-1 및 DNA로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항원이 아닌, 암을 갖는 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  371. 제370항에 있어서,
    TAA에 대한 CpG-Ab 면역접합체의 결합이 TAA를 발현하는 암 세포 내로의 CpG-Ab 면역접합체의 내부화를 용이하게 하는 방법.
  372. 제370항 또는 제371항에 있어서,
    TAA에 대한 CpG-Ab 면역접합체의 결합이 TAA를 발현하는 암 세포의 엔도솜으로의 CpG-Ab 면역접합체의 운반을 용이하게 하는 방법.
  373. 제370항 내지 제372항 중 어느 한 항에 있어서,
    TAA에 대한 CpG-Ab 면역접합체의 결합이 TAA를 발현하는 암 세포에서 TLR9 시그널링 경로의 활성화를 용이하게 하는 방법.
  374. 제373항에 있어서,
    TAA 및 TLR9가 TAA를 발현하는 암 세포의 동일한 세포막 상에 위치하는 방법.
  375. 제374항에 있어서,
    TAA 및 TLR9 둘 다가 TAA를 발현하는 암 세포의 세포막 상에 위치하는 방법.
  376. 제374항에 있어서,
    TAA 및 TLR9 둘 다가 TAA를 발현하는 암 세포의 엔도솜 막 상에 위치하는 방법.
  377. 제370항 내지 제376항 중 어느 한 항에 있어서,
    TAA에 대한 CpG-Ab 면역접합체의 결합이 TAA를 발현하는 암 세포의 아폽토시스(apoptosis)를 유도하는 방법.
  378. 제370항 내지 제377항 중 어느 한 항에 있어서,
    TAA가 정상 면역 세포에 의해 발현되지 않는 방법.
  379. 제370항 내지 제377항 중 어느 한 항에 있어서,
    TAA가 정상 면역 세포에 의해 발현되는 방법.
  380. 제379항에 있어서,
    정상 면역 세포가 항원 제시 세포(APC)인 방법.
  381. 제370항 내지 제380항 중 어느 한 항에 있어서,
    TAA가 CD8, CD11b, CD11c, CD14, CD33, CD40, CD123, CD157, CD168, CD169, CD172a, CD200, CD204, CD205, CD301, CD302, CD303, CD304, CD205 및 CD206으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  382. 제370항 내지 제381항 중 어느 한 항에 있어서,
    CpG-Ab 면역접합체가 TAA 또는 암에 의해 발현된 임의의 다른 TAA에 접합되지 않는 방법.
  383. 제370항 내지 제383항 중 어느 한 항에 있어서,
    CpG-Ab 면역접합체가 표 2로부터 선택된 면역자극 폴리뉴클레오티드를 포함하는 방법.
  384. 제383항에 있어서,
    CpG-Ab 면역접합체가 p236, p238, p243, p246, p275, p276, p308, p313, p347, p361, p362, p425, p433, p434, p435, p436, p437, p438, p477, p478, p479, p480, p481, p482, p483, p484, p485, p486, p487, p488, 및 p489로 이루어진 그룹으로부터 선택된 면역자극 폴리뉴클레오티드를 포함하는 방법.
  385. 제370항 내지 제384항 중 어느 한 항에 있어서,
    CpG-Ab 면역접합체가 T 세포 에피토프에 접합되지 않는 방법.
  386. 제385항에 있어서,
    T 세포 에피토프가 오브알부민(OVA)인 방법.
  387. CpG-Ab 면역접합체의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 면역요법 저항성 또는 불응성 암을 갖는 대상체에서 면역요법 저항성 또는 불응성 암을 치료하는 방법.
  388. 제387항에 있어서,
    CpG-Ab 면역접합체가 종양 연관 항원에 결합하지 않는 방법.
  389. 제388항에 있어서,
    CpG-Ab 면역접합체가 적어도 하나의 톨-유사 수용체를 발현하는 정상 면역 세포와 연관된 표적 항원에 특이적으로 결합하는 방법.
  390. 제387항에 있어서,
    CpG-Ab 면역접합체가 종양 연관 항원에 특이적으로 결합하는 방법.
  391. 제387항 내지 제390항 중 어느 한 항에 있어서,
    암이 면역 체크포인트 조절제를 이용한 치료에 대해 저항성인 방법.
  392. 제391항에 있어서,
    방법이 대상체에게 면역 체크포인트 조절제를 공동-투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  393. 제387항 내지 제392항 중 어느 한 항에 있어서,
    CpG-Ab 면역접합체가 표 2로부터 선택된 면역자극 폴리뉴클레오티드를 포함하는 방법.
  394. 제393항에 있어서,
    CpG-Ab 면역접합체가 p236, p238, p243, p246, p275, p276, p308, p313, p347, p361, p362, p425, p433, p434, p435, p436, p437, p438, p477, p478, p479, p480, p481, p482, p483, p484, p485, p486, p487, p488, 및 p489로 이루어진 그룹으로부터 선택된 면역자극 폴리뉴클레오티드를 포함하는 방법.
  395. CpG-Ab 면역접합체의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하되, CpG-Ab 면역접합체가 적어도 하나의 톨-유사 수용체를 발현하는 정상 면역 세포와 연관된 표적 항원에 특이적으로 결합하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 예방하는 방법.
  396. 제395항에 있어서,
    종양 연관 항원을 CpG-Ab 면역접합체와 공동-투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  397. 제396항에 있어서,
    CpG-Ab 면역접합체가 종양 연관 항원에 접합되지 않는 방법.
  398. 제395항 내지 제397항 중 어느 한 항에 있어서,
    정상 면역 세포가 TLR9를 발현하는 방법.
  399. 제395항 또는 제398항 중 어느 한 항에 있어서,
    정상 면역 세포가 항원 제시 세포(APC)인 방법.
  400. 제395항 내지 제399항 중 어느 한 항에 있어서,
    CpG-Ab 면역접합체가 표 2로부터 선택된 면역자극 폴리뉴클레오티드를 포함하는 방법.
  401. 제400항에 있어서,
    CpG-Ab 면역접합체가 p236, p238, p243, p246, p275, p276, p308, p313, p347, p361, p362, p425, p433, p434, p435, p436, p437, p438, p477, p478, p479, p480, p481, p482, p483, p484, p485, p486, p487, p488 및 p489로 이루어진 그룹으부터 선택된 면역자극 폴리뉴클레오티드를 포함하는 방법.
  402. CpG-Ab 면역접합체의 치료적 유효량을 암 백신과 공동-투여하는 것을 포함하되, CpG-Ab 면역접합체가 적어도 하나의 톨-유사 수용체를 발현하는 정상 면역 세포와 연관된 표적 항원에 특이적으로 결합하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 예방하는 방법.
  403. 제402항에 있어서,
    CpG-Ab 면역접합체가 암 백신의 아쥬반트로서 제형화되는 방법.
  404. CpG-Ab 면역접합체의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하되, CpG-Ab 면역접합체가 적어도 하나의 톨-유사 수용체를 발현하는 정상 면역 세포와 연관된 표적 항원에 특이적으로 결합하는, 대상체에서 적응성 면역 반응을 유도하는 방법.
  405. 제404항에 있어서,
    대상체가 암을 갖는 방법.
  406. 제405항에 있어서,
    표적 항원이 TAA가 아닌 방법.
  407. 제405항에 있어서,
    표적 항원이 CD19, CD20, CD22, STAT3, exportin 7, Her2, Src, EGFR, CD52, CXCR-4, Muc-1 및 DNA로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항원이 아닌 TAA인 방법.
  408. 제405항에 있어서,
    대상체가 감염성 질환을 갖는 방법.
  409. 제404항 내지 제408항에 있어서,
    정상 면역 세포가 TLR9를 발현하는 방법.
  410. 제404항 내지 제409항에 있어서,
    정상 면역 세포가 항원 제시 세포(APC)인 방법.
  411. 제404항 내지 제410항에 있어서,
    적응성 면역 반응이 CD8+ T 세포 의존성인 방법.
  412. 제404항 내지 제411항에 있어서,
    CpG-Ab 면역접합체가 표 2로부터 선택된 면역자극 폴리뉴클레오티드를 포함하는 방법.
  413. 제412항에 있어서,
    CpG-Ab 면역접합체가 p236, p238, p243, p246, p275, p276, p308, p313, p347, p361, p362, p425, p433, p434, p435, p436, p437, p438, p477, p478, p479, p480, p481, p482, p483, p484, p485, p486, p487, p488, 및 p489로 이루어진 그룹으로부터 선택된 면역자극 폴리뉴클레오티드를 포함하는 방법.
  414. 대상체에게 표 6-A 및 6-B로부터 선택된 CpG-Ab 면역접합체의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 암을 갖는 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  415. 제414항에 있어서,
    CpG-Ab 면역접합체가 종양 연관 항원(TAA)에 결합하는 방법.
  416. 제414항 또는 제415항에 있어서,
    CpG-Ab 면역접합체가 TAA 이외의 표적 항원에 결합하는 방법.
  417. 제414항 내지 제416항 중 어느 한 항에 있어서,
    CpG-Ab 면역접합체가 TLR 수용체를 발현하는 정상 면역 세포와 연관된 표적 항원에 결합하는 방법.
  418. 제414항 내지 제417항 중 어느 한 항에 있어서,
    CpG-Ab 면역접합체가 p236, p238, p243, p246, p275, p276, p308, p313, p347, p361, p362, p425, p433, p434, p435, p436, p437, p438, p477, p478, p479, p480, p481, p482, p483, p484, p485, p486, p487, p488, 및 p489를 포함하는 CpG-Ab 면역접합체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  419. 제356항 내지 제418항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 추가 암 치료제의 치료적 유효량을 공동-투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  420. 제419항에 있어서,
    적어도 하나의 추가 암 치료제가 제2 TAA, T 세포 공동자극 분자, 및 면역 체크포인트 조절제로부터 선택되는 방법.
  421. 제420항에 있어서,
    제2 TAA가 TAA와 동일한 방법.
  422. 제420항에 있어서,
    제2 TAA가 TAA와 상이한 방법.
  423. 제420항 내지 제422항 중 어느 한 항에 있어서,
    T 세포 공동자극 분자가 OX40, CD2, CD27, CDS, ICAM-1, LFA-1/CD11a/CD18, ICOS/CD278, 4-1BB/CD137, GITR, CD30, CD40, BAFFR, HVEM, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3, 및 CD83 또는 이의 리간드로 이루어진 목록으로부터 선택되는 방법.
  424. 제423항에 있어서,
    T 세포 공동자극 분자가 항-OX40 항체, 항-ICOS/CD278 항체 또는 항-4-1BB/CD137 항체, 또는 이의 항원-결합 단편인 방법.
  425. 제420항 내지 제424항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역 체크포인트 조절제가 PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3, LAG-3, CEACAM-1, CEACAM-5, CLTA-4, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD47, CD160, 2B4, CD172a, 및 TGFR로 이루어진 그룹으로부터 선택된 면역 체크포인트 분자의 억제제인 방법.
  426. 제425항에 있어서,
    면역 체크포인트 조절제가 항-CD47 항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 또는 이의 항원-결합 단편인 방법.
  427. 제356항 내지 제426항 중 어느 한 항에 있어서,
    암이 고형 종양인 방법.
  428. 제356항 내지 제426항 중 어느 한 항에 있어서,
    암이 액상 종양인 방법.
  429. 제356항 내지 제428항 중 어느 한 항에 있어서,
    암이 재발암인 방법.
  430. 제356항 내지 제429항 중 어느 한 항에 있어서,
    투여 및 공동-투여가 전신 투여를 통하는 것인 방법.
  431. 제356항 내지 제430항 중 어느 한 항에 있어서,
    CpG-Ab 면역접합체의 치료적 유효량이 대상체에서 보체 경로를 활성화하기 위해 효과적이지 않은 방법.
  432. 제431항에 있어서,
    상기 양이 대상체에서 보체 C3을 활성화하기 위해 효과적이지 않은 방법.
  433. 제356항 내지 제432항 중 어느 한 항에 있어서,
    CpG-Ab 면역접합체가 제68항에 따른 화합물인 방법.
  434. 제356항 내지 제433항 중 어느 한 항에 있어서,
    CpG-Ab 면역접합체가 제1항에 따른 올리고뉴클레오티드를 포함하는 방법.
  435. 제356항 내지 제434항 중 어느 한 항에 있어서,
    CpG-Ab 면역접합체가 제65항에 따른 화합물을 포함하는 방법.
  436. 제356항 내지 제435항 중 어느 한 항에 있어서,
    CpG-Ab 면역접합체가 제78항에 따른 화합물을 포함하는 방법.
  437. 제356항 내지 제436항 중 어느 한 항에 있어서,
    CpG-Ab 면역접합체가 SB-342, SB-343, SB-341, SB-340, SB-179, SB-181, SB-186, SB-189, SB-228, SB-229, SB-242, SB-263, SB-337, SB-267, SB-284, SB-312, SB-313, SB-347, SB-373, SB-382, SB-388, SB-389, SB-408, SB-416, SB-419, SB-421, SB-423, SB-426, SB-427, SB-428, SB-429 및 SB-430으로부터 선택되는 방법.
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