CN110770345A - 免疫调节多核苷酸、抗体缀合物及其使用方法 - Google Patents

免疫调节多核苷酸、抗体缀合物及其使用方法 Download PDF

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B·刘
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Abstract

本发明公开了免疫调节多核苷酸。所述免疫调节多核苷酸可包含5‑修饰的尿苷，5‑修饰的胞苷，总共6至16个核苷酸和/或一个或多个无碱基间隔子和/或核苷间磷酸三酯。还公开了包含靶向部分和一个或多个免疫调节多核苷酸的缀合物。所述免疫调节多核苷酸和缀合物可以进一步包含一个或多个辅助部分。还公开了包含所述免疫调节多核苷酸或包含一个或多个立体化学富集的核苷间硫代磷酸酯的所述缀合物的组合物。进一步公开了包含所述免疫调节多核苷酸或所述缀合物的药物组合物及其使用方法。

Description

免疫调节多核苷酸、抗体缀合物及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求分别于2017年4月14日和7月27日提交的美国临时申请号62/485,748和62/537,925的权益；其每一个的公开内容通过引用整体并入本文。
发明领域
本发明涉及用于调节免疫系统应答的组合物和方法。本文提供了免疫调节多核苷酸。本文还提供了包含5位-修饰的尿苷或5位-修饰的胞苷并且长度范围为约6至约16个核苷酸的免疫调节多核苷酸。本文还提供了包含靶向部分和一个或多个免疫调节多核苷酸的缀合物。本文提供了药物组合物，其包含免疫调节多核苷酸或包含靶向部分和一个或多个免疫调节多核苷酸的缀合物。本文提供了其用于治疗疾病例如癌症的方法。
背景技术
病原体相关分子模式(Pathogen-associatedmolecularpattems，PAMP)是与各种病原体相关的分子，并被激活先天性免疫应答的toll样受体(TLR)和其他模式识别受体(PRR)所识别。PAMPs在没有病原体的情况下募集免疫系统的能力提供了一种通过使用先天免疫系统反应来治疗涉及细胞破坏(例如抗癌治疗)的多种疾病的策略。已经研究用于多种治疗应用的一类PAMP是免疫刺激多核苷酸，例如CpG ODN(例如，agatolimod)。CpG ODN被认为介导免疫细胞(例如，B细胞，单核细胞和浆细胞样树突状细胞(pDC))中的TLR9二聚化以上调细胞因子(例如，I型干扰素和白介素)，从而激活天然杀伤细胞。
CpG ODN通常分为三类：A型，B型和C型。A型CpG ODN通常包含在3′-和5′-末端具有硫代磷酸酯骨架的poly-G尾巴，以及包括磷酸酯骨架的中央回文序列。A型CpG ODN通常在中央回文序列中包含CpG。B型CpG ODN通常包含完整的硫代磷酸酯骨架，并且B型CpG ODN5′端的序列通常对于TLR9激活至关重要。C型CpG ODN包含具有3′端序列的完整硫代磷酸酯骨架，从而可以形成双链体。CpG ODN通常容易在血清中降解。因此，CpG ODN的药代动力学可能是其发展为治疗剂的限制因素之一。此外，CpG ODN在体内通常表现出不均匀的组织分布，主要的积累部位在肝脏，肾脏和脾脏中。这种分布会引起脱靶活性和与PAMPs相关的局部毒性。因此，可通过解决本文所述的药代动力学/药效学挑战来促进CpG ODN的治疗应用。
因此，需要新的免疫调节多核苷酸。
发明内容
总的来说，本发明涉及免疫调节(例如，免疫刺激)多核苷酸和包含靶向部分和一个或多个免疫调节(例如，免疫刺激)多核苷酸的缀合物。
一方面，公开了免疫调节多核苷酸。所述免疫调节多核苷酸可以是免疫刺激多核苷酸。或者，所述免疫调节多核苷酸可以是免疫抑制多核苷酸。
在一些实施方案中，所述免疫调节多核苷酸包含一个或多个(例如1或2)无碱基间隔子(abasic spacers)或磷酸三酯。在特定的实施方案中，所述免疫调节多核苷酸包含一个或多个(例如1至5)核苷间磷酸三酯。在进一步的实施方案中，核苷间磷酸三酯中的至少一个包含缀合基团。在其他实施方案中，所述免疫调节多核苷酸还包含末端磷酸酯(例如5′-末端磷酸酯或3′-末端磷酸酯)。在其他实施方案中，末端磷酸酯包含缀合基团。在其他实施方案中，所述免疫调节多核苷酸包括5′-端帽或3′-端帽。在其他实施方案中，所述免疫调节多核苷酸包含5′端帽，即5′-5′端帽。在其他实施方案中，所述5’-5’端帽含有共价键接至核苷间磷酸酯、核苷间硫代磷酸酯或核苷间二硫代磷酸酯的缀合基团。在一些实施方案中，所述免疫调节多核苷酸包括3′-端帽，其含有共价键接至核苷间磷酸酯、核苷间硫代磷酸或核苷间二硫代磷酸酯的缀合基团。
在其他实施方案中，所述免疫调节多核苷酸包含5′-封端基团，其是单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、辅助部分、末端磷酸二酯、末端磷酸三酯、5′-5′端帽或-OR基团′，其中R′是生物可逆(bioreversible)基团，非生物可逆基团或O-保护基(O-protecting group)。在其他实施方案中，所述5′-封端基团是单磷酸酯或末端磷酸二酯，其包括与磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键接的任选取代的C1-6烷基。在其他实施方案中，所述免疫调节多核苷酸包含3′封端基团，其为单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、辅助部分、末端磷酸二酯、末端磷酸三酯和-OR′基团，其中R′是生物可逆基团、非生物可逆基团或O-保护基。在一些实施方案中，所述3′-封端基团是单磷酸酯或末端磷酸二酯，其包含与磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键接的任选取代的C1-6烷基。
在特定的实施方案中，所述免疫调节多核苷酸包含一个或多个(例如1或2个)无碱基间隔子。在进一步的实施方案中，至少一个所述无碱基间隔子是核苷间无碱基间隔子。在另外的实施方案中，至少一个所述无碱基间隔子是3’-末端无碱基间隔子。在另外的实施方案中，至少一个所述无碱基间隔子包括缀合基团。
在某些实施方案中，所述免疫调节多核苷酸包含5位修饰的尿苷(例如5-卤代尿苷(例如5-溴尿苷或5-碘尿苷)或5位修饰的胞苷)。在进一步的实施方案中，所述5-修饰的尿苷(例如5-卤代尿苷(例如5-溴代尿苷或5-碘代尿苷))是两个5′-末端核苷中的至少一个或存在于免疫调节多核苷酸免疫刺激序列(ISS)中。在另外的实施方案中，所述5-修饰的尿苷(例如5-卤代尿苷)包括与核苷间磷酸二酯磷酸酯键接的3’-位。在某些实施方案中，所述5-修饰的尿苷(例如5-卤代尿苷)包括与核苷间磷酸二酯硫代磷酸酯键接的3′-位。在其他实施方案中，所述5-修饰的尿苷(例如5-卤代尿苷)是5′-末端。在一些实施方案中，所述5-修饰的尿苷是5-溴尿苷。在特定的实施方案中，所述免疫调节多核苷酸含有胞苷和鸟苷作为第二和第三核苷或作为第三和第四核苷。
在特定的实施方案中，所述免疫调节多核苷酸包含5′-末端免疫刺激序列。在某些实施方案中，至少一个所述核苷间磷酸三酯键接至核苷的3′-碳原子，该核苷具有键接至5′-末端免疫刺激序列的5′-碳原子。
在其他实施方案中，所述免疫调节多核苷酸包含总共6至16个(例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16)个核苷酸。在其他实施例中，至少10％(例如，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％或至少90％)的所述免疫调节多核苷酸中的核苷间桥连基团含有硫代磷酸酯。在其他实施方案中，所述免疫调节多核苷酸中至少50％的核苷间桥连基团含有硫代磷酸酯。
在一些实施方案中，所述免疫调节多核苷酸包括共价键接至所述免疫调节多核苷酸中的核碱基的缀合基团。
在某些实施方案中，所述免疫调节多核苷酸包括一个或多个辅助部分。在特定的实施方案中，所述免疫调节多核苷酸包括含有至少一个辅助部分的缀合部分。在一些实施方案中，至少一个所述辅助部分包含分子量为100Da至2,500Da的聚(乙二醇)(PEG)。在进一步的实施方案中，每个PEG独立地包含总共至少3个乙二醇重复单元。在另外的实施方案中，每个PEG独立地包含总共至少20个乙二醇重复单元。在其他实施方案中，每个PEG独立地包含总共50个或更少的乙二醇重复单元。在其他实施方案中，免疫调节多核苷酸包含1至8个PEG。
在特定的实施方案中，所述免疫调节多核苷酸是本文公开的多核苷酸(例如，表2中)。
在另一方面，公开了杂交的免疫调节多核苷酸，其包含与互补多核苷酸杂交的免疫调节多核苷酸。
在另一方面，公开了包含免疫调节多核苷酸的组合物，其中所述免疫调节多核苷酸包含至少一个立体化学富集的核苷间硫代磷酸酯。
在一些实施方案中，至少一个立体化学富集的核苷间硫代磷酸酯置于免疫调节多核苷酸中的免疫刺激序列中CpG的5′-末端核苷和胞苷之间。在其他实施方案中，一个立体化学富集的核苷间硫代磷酸酯连接免疫调节多核苷酸中的第一和第二核苷。在其他实施方案中，一个立体化学富集的核苷间硫代磷酸酯与在免疫调节多核苷酸中的免疫刺激序列中CpG的胞苷的5′-碳原子键接。在其他实施方案中，一个立体化学富集的核苷间硫代磷酸酯连接免疫调节多核苷酸中的第四和第五核苷。在某些实施方案中，所述立体化学富集的核苷间硫代磷酸酯是S-立体异构的。在特定的实施方案中，所述立体化学富集的核苷间硫代磷酸酯是R-立体异构的。
在另一方面，公开了包含靶向部分和一个或多个免疫调节多核苷酸的缀合物。
在一些实施方案中，所述靶向部分是抗原结合部分、多肽、适体或包括一个或多个小分子的基团。在某些实施方案中，所述靶向部分是抗原结合部分(例如，抗体或其抗原结合片段)。在进一步的实施方案中，所述抗体或抗体片段包括N端或C端的Q-标签，其中所述免疫调节多核苷酸独立地共价键接至N端或C端的Q-标签。在另外的实施方案中，Q-标签位于抗体或抗体片段的重链或轻链中。
在特定的实施方案中，所述免疫调节多核苷酸如其他方面所公开。
在某些实施方案中，至少一个所述免疫调节多核苷酸包含5-修饰的尿苷或5-修饰的胞苷。在进一步的实施方案中，所述免疫调节多核苷酸中的至少一个包含5-修饰的尿苷，其是5-卤代尿苷，5-炔基尿苷或5-杂环基尿苷。在另外的实施方案中，所述5-修饰的尿苷是5-卤代尿苷(例如5-溴代尿苷或5-碘代尿苷)。在一些实施方案中，所述5-修饰的尿苷是所述至少一个免疫调节多核苷酸的两个5′-末端核苷酸之一。在其他实施方案中，所述5-修饰的尿苷包含键接至核苷间磷酸酯磷酸酯的3′-位。在其他实施方案中，所述5-修饰的尿苷包含与核苷间磷酸酯硫代磷酸酯键接的3′-位。在其他实施方案中，所述免疫调节多核苷酸中的至少一个含有胞苷和鸟苷作为第二和第三核苷。在特定的实施方案中，至少一个所述免疫调节多核苷酸含有胞苷和鸟苷作为第三和第四核苷。
在一些实施方案中，所述免疫调节多核苷酸中的至少一个包含总共6至16个(例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16)个核苷酸。
在进一步的实施方案中，至少一个所述免疫调节多核苷酸包含一个或多个无碱基间隔子或核苷间磷酸三酯。在另外的实施方案中，至少一个无碱基间隔子或至少一个磷酸三酯包含所述接头。
在特定的实施方案中，至少一个所述免疫调节多核苷酸含有一个或多个(例如1或2个)无碱基间隔子。在其他实施方案中，至少一个所述无碱基间隔子是核苷间无碱基间隔子。在其他实施方案中，至少一个无碱基间隔子是3’-末端无碱基间隔子。
在某些实施方案中，至少一个所述免疫调节多核苷酸包含一个或多个(例如1-5)核苷间磷酸三酯。
在一些实施方案中，所述缀合物还包含一个或多个键接至所述接头的辅助部分。在另外的实施方案中，至少一个所述辅助部分包含分子量为100Da至2,500Da的聚(乙二醇)(PEG)。在另外的实施方案中，每个PEG独立地包含总共至少3个(例如，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，至少12个，至少14个，至少16，至少18或至少20个)乙二醇重复单元。在其他实施方案中，每个PEG独立地包含总共50个或更少(例如45个或更少，40个或更少，35个或更少或30个或更少)的乙二醇重复单元。在某些实施方案中，所述缀合物包含1至8个PEG。
在特定实施方案中，至少一个所述免疫调节多核苷酸中的5′-封端基团是单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、辅助部分、末端磷酸二酯、末端磷酸三酯或基团-OR′，其中R′是生物可逆基团、非生物可逆基团或O保护基。在进一步的实施方案中，所述5′-封端基团是单磷酸酯或末端磷酸二酯，其包含与磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键接的任选取代的C1-6烷基。在其他实施方案中，至少一个所述免疫调节多核苷酸中的3′-封端基团是单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、辅助部分、末端磷酸二酯、末端磷酸三酯或-OR′基团，其中R′是生物可逆基团、非生物可逆基团或O保护基。在其他实施方案中，所述3′-封端基团是单磷酸酯或末端磷酸二酯，其包含与磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键接的任选取代的C1-6烷基。
在某些实施方案中，所述免疫调节多核苷酸中的至少一个包含键接至所述接头的核碱基。
在另外的实施方案中，所述缀合物包含1-6个(例如1-4个)免疫调节多核苷酸。在其他实施方案中，所述缀合物仅包含一个免疫调节多核苷酸。在其他实施方案中，所述缀合物仅包含两个免疫调节多核苷酸。在其他实施方案中，所述缀合物包含一个靶向部分。
在一些实施方案中，所述免疫调节多核苷酸在四个5′-末端核苷酸内包含人免疫刺激序列。在某些实施方案中，所述免疫调节多核苷酸的4个5′-末端核苷酸内的人免疫刺激序列包括胞苷，所述胞苷含有与被核苷取代的磷酸酯键接的5′-碳原子。
在特定的实施方案中，至少一个所述免疫调节多核苷酸包含5-修饰的尿苷或5-修饰的胞苷。
在某些实施方案中，至少一个所述免疫调节多核苷酸与其互补序列杂交。
在进一步的实施方案中，至少一个所述免疫调节多核苷酸包含至少一个立体化学富集的核苷间硫代磷酸酯。
在另一方面，公开了包含缀合物的组合物，所述缀合物包含靶向部分和一个或多个免疫调节多核苷酸，每个所述免疫调节多核苷酸独立地包括接头，其中所述靶向部分与所述接头共价键接，并且至少一个所述免疫调节多核苷酸含有至少一个立体化学富集的核苷间硫代磷酸。
在一些实施方案中，至少一个立体化学富集的核苷硫代磷酸位于在所述免疫调节多核苷酸中的免疫刺激序列的CpG的5′-末端核苷和胞苷之间。在某些实施方案中，至少一个立体化学富集的核苷间硫代磷酸与在所述免疫调节多核苷酸中的免疫刺激序列的CpG的胞苷的5′-碳原子键接。在特定的实施方案中，至少一个立体化学富集的核苷间硫代磷酸连接所述免疫调节多核苷酸中的第一和第二核苷。在其他实施方案中，至少一个立体化学富集的核苷间硫代磷酸连接所述免疫调节多核苷酸中的第四和第五核苷。在另外的实施方案中，所述立体化学富集的核苷间硫代磷酸是S-立体异构的。在另外的实施方案中，所述立体化学富集的核苷间硫代磷酸是R-立体异构的。
在另一方面，公开了组合物，其包含药学上可接受的载体和本发明所述的免疫调节多核苷酸、本发明所述的立体化学富集的组合物或本发明所述的缀合物的药物组合物。
在另一方面，公开了在细胞内调节内体toll样受体的方法，所述细胞包含所述内体toll样受体，所述方法通过使所述细胞与本发明所述的免疫调节多核苷酸、本发明所述的组合物、本发明所述的缀合物或本发明所述的药物组合物在允许所述免疫调节多核苷酸被转运到细胞中的条件下，接触，其中，在接触后，所述内体toll样受体的活性被调节。
在一些实施方案中，免疫调节多核苷酸是免疫刺激多核苷酸，并且该方法用于激动内体toll样受体。
在特定的实施方案中，免疫调节多核苷酸是免疫抑制多核苷酸，并且该方法用于拮抗内体toll样受体。
在另一方面，公开了在包含内体toll样受体的抗原呈递细胞中诱导一个或多个细胞因子的方法，所述方法通过使所述抗原呈递细胞与本发明所述的免疫调节多核苷酸、本发明所述的组合物、本发明所述的缀合物或本发明所述的药物组合物在允许一个或多个所述免疫调节多核苷酸被运输到所述细胞中的条件下接触，在接触后，所述细胞中至少一个细胞因子的水平增加，其中所述靶向部分靶向所述抗原呈递细胞，并且其中所述免疫调节多核苷酸是免疫刺激多核苷酸。
在一些实施方案中，所述抗原呈递细胞是B细胞。在某些实施方案中，所述一个或多个细胞因子中的至少一个是炎性细胞因子。在特定实施方案中，所述抗原呈递细胞是浆细胞样树突细胞，并且其中所述靶向部分靶向浆细胞样树突细胞。在某些实施方案中，所述抗原呈递细胞是巨噬细胞。在进一步的实施方案中，至少一个所述细胞因子是I型干扰素。在另外的实施方式中，所述toll样受体是TLR9。
在另一方面，公开了通过向患者施用有效量的本发明所述的免疫调节多核苷酸本发明所述的组合物、本发明所述的缀合物或药物组合物来治疗患者的液体肿瘤的方法，其中所述靶向部分靶向B细胞，并且其中所述免疫调节多核苷酸是作为TLR9激动剂的免疫刺激多核苷酸。
在某些实施方案中，所述液体肿瘤是血液肿瘤(例如，所述血液肿瘤是淋巴瘤)。在特定的实施方案中，所述淋巴瘤是非霍奇金B细胞淋巴瘤。在进一步的实施方案中，所述淋巴瘤是套细胞淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤，慢性淋巴细胞性白血病或多发性骨髓瘤。
在另一方面，公开了通过向患者施用本发明所述的免疫调节多核苷、本发明所述的组合物、本发明所述的缀合物或本发明所述的药物组合物来治疗患者的实体瘤的方法，其中所述靶向部分靶向浆细胞样树突状细胞，并且其中所述免疫调节多核苷酸是作为TLR9激动剂的免疫刺激性多核苷酸。在一些实施方案中，用于治疗患者实体瘤的方法包括向患者施用本文公开的免疫调节多核苷酸，其中所述免疫调节多核苷酸靶向患者中的B细胞。
应当理解，本发明还提供了本发明所述的免疫调节多核苷酸、本发明所述的缀合物、本发明所述的组合物或本发明所述的药物组合物在制备用于以下目的的产品(例如药物)中的用途：本文所述的目的(例如，用于治疗患者的液体或实体瘤)。还应理解，本发明还提供本发明所述的免疫调节多核苷酸、本发明所述的缀合物、本发明所述的组合物或本发明所述的药物组合物用于本文所述目的的用途(例如，用于治疗液体或实体瘤)。此外，应理解，本发明还提供了根据使用本发明的免疫调节多核苷酸、本发明的缀合物、本发明的组合物或本发明的药物组合物用于本文所述目的(例如，用于治疗患者的液体或实体瘤)。
在本发明的任何方面，所述接头可以如本文公开的(例如，根据式(II)、(V)和(VI)-(XV)中的任何一个)。在本发明的任何方面，所述缀合基团可以如本文所公开。
本文提供式(A)的寡核苷酸：
X5′-(XN)b-YP-(XN)c-X3′ (A)
或其立体异构体、两个或更多个非对映异构体的混合物、互变异构体或两个或更多个互变异构体的混合物；或其药学上可接受的盐，溶剂化物或水合物；其中：
每个XN独立地是核苷酸；
X3′是3′末端核苷酸；
X5′是5′末端核苷酸；
YP是核苷间磷酸三酯；和
b和c分别为约0至约25的整数；其总和不得少于5；
其中寡核苷酸包含具有修饰的核碱基的核苷酸。
本文还提供了具有N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T序列的寡核苷酸，或其立体异构体、两个或更多个非对映异构体的混合物、互变异构体或两个或更多个互变异构体的混合物；或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物；其中：
x为1至4的整数；
N1不存在或2′-脱氧胸苷；
N2是具有修饰核碱基的2′-脱氧核糖核苷酸；
N3是2′-脱氧腺苷或2′-脱氧胸苷，各自任选地包含3′-磷酸三酯；
N4为2′-脱氧腺苷或2′-脱氧胸苷；和
N5是任选地包含3′-磷酸三酯的2′-脱氧胸苷。
本文另外提供式(B)的化合物：
RX-LN-(Q)e (B)
或其立体异构体、两个或更多个非对映异构体的混合物、互变异构体或两个或更多个互变异构体的混合物；或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物；其中：
Rx是缀合基团；
LN是接头；
每个Q独立地是包含磷酸三酯的寡核苷酸；和
e是1、2、3或4的整数。
本文还提供了式(C)的化合物：
Figure BDA0002320320380000091
或其立体异构体、两个或更多个非对映异构体的混合物、互变异构体或两个或更多个互变异构体的混合物；或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物；其中：
Ab是抗体；
每个LN独立地是一个接头；
每个Q独立地是包含磷酸三酯的寡核苷酸；
每个e独立为1、2、3或4的整数；和
f是1、2、3或4的整数。
在一个方面，本文提供了用于在患有癌症的对象中治疗癌症的方法，其包括向该对象施用治疗有效量的CpG-Ab免疫缀合物，其中该CpG-Ab免疫缀合物不结合肿瘤相关抗原(TAA)。在一些实施方案中，所述CpG-Ab免疫缀合物特异性结合至靶抗原，所述靶抗原与表达至少一种toll样受体的正常免疫细胞相关。在一些实施方案中，所述正常免疫细胞表达TLR9。在一些实施方案中，所述正常免疫细胞是抗原呈递细胞(APC)。在一些实施方案中，所述APC是B细胞、树突细胞或巨噬细胞。在一些实施方案中，所述靶抗原选自MHC分子、T细胞共刺激分子、免疫检查点分子、B细胞特异性抗原、树突细胞特异性抗原和巨噬细胞特异性抗原。在一些实施方案中，所述MHC分子选自I类MHC和II类MHC分子。在一些实施方案中，所述T细胞共刺激分子选自OX40，CD2，CD27，CDS，ICAM-1，LFA-1/CD11a/CD18，ICOS/CD278、4-1BB/CD137，GITR，CD30，CD40，BAFFR，HVEM，CD7，LIGHT，NKG2C，SLAMF7，NKp80，CD160，B7-H3和CD83。在一些实施方案中，所述免疫检查点分子选自PD-1，PD-L1，PD-L2，TIM-1，TIM-3，LAG-3，CEACAM-1，CEACAM-5，CLTA-4，VISTA，BTLA，TIGIT，LAIR1，CD47，CD160、2B4，CD172a和TGFR。在一些实施方案中，所述靶抗原选自CD1，CD2，CD3，CD5，CD6，CD9，CD11，CD14，CD17，CD18，CD19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD24，CD25，CD26，CD27 CD30，CD32，CD37，CD38，CD39，CD40，CD44，CD45R(B220)，CD49，CD52，CD55，CD56，CD64，CD66(癌胚抗原，CEA)，CD68，CD70，CD74，CD79b，CD80，CD93，CD115，CD123，CD126，CD127，CD137，CD138，CD163，CD196，CD197，CD200R，CD205，CD206，CD207，CD208，CD209，CD267，CD269，CD274，CD300a，CD301，CD303，CD304，CD319，CD336，CLEC5a，CLEC6，CLEC9a，CXCL16，CX3CR1和DC-STAMP。在一些实施方案中，所述CpG-Ab免疫缀合物包含选自表2的免疫刺激多核苷酸。在一些实施方案中，所述CpG-Ab免疫缀合物包含选自p236，p238，p243，p246，p275，p276，p308，p313，p347，p361，p362，p425，p433，p434，p435，p436，p437，p438，p477，p478，p479，p480，p481，p482，p483，p484，p485，p486，p487，p488和p489的免疫刺激多核苷酸。在一些实施方案中，所述CpG-Ab免疫缀合物不缀合至T细胞表位。在一些实施方案中，所述T细胞表位是卵清蛋白(OVA)的表位。在一些实施方案中，所述癌症是实体瘤。在一些实施方案中，所述癌症是液体肿瘤。在本文提供的方法的一些实施方案中，所述癌症是复发性癌症。在本文提供的方法的一些实施方案中，所述施用或共同施用是通过全身施用。在本文提供的方法的一些实施方案中，治疗有效量的所述CpG-Ab免疫缀合物不能有效激活对象中的补体途径。在本文提供的方法的一些实施方案中，该量不能有效激活对象中的补体C3。
在一些实施方案中，本文提供了在患有癌症的对象中治疗癌症的方法，其包括向对象施用治疗有效量的CpG-Ab免疫缀合物，其中所述CpG-Ab免疫缀合物与肿瘤相关抗原(TAA)特异性结合，其中所述TAA不是选自CD19，CD20，CD22，输出蛋白7，Her2，Src，EGFR，CD52，CXCR-4，Muc-1和DNA的抗原。在一些实施方案中，所述CpG-Ab免疫缀合物与所述TAA的结合促进了所述CpG-Ab免疫缀合物内化到表达所述TAA的癌细胞中。在一些实施方案中，所述CpG-Ab免疫缀合物与所述TAA的结合促进了所述CpG-Ab免疫缀合物向表达所述TAA的癌细胞的内体的转运。在一些实施方案中，所述CpG-Ab免疫缀合物与所述TAA的结合促进表达所述TAA的癌细胞中TLR9信号传导途径的活化。在一些实施方案中，所述TAA和所述TLR9位于表达所述TAA的癌细胞的同一细胞膜上。在一些实施方案中，所述TAA和所述TLR9均位于表达所述TAA的癌细胞的细胞膜上。在一些实施方案中，所述TAA和所述TLR9均位于表达所述TAA的癌细胞的内体膜上。在一些实施方案中，所述CpG-Ab免疫缀合物与所述TAA的结合诱导表达所述TAA的癌细胞的凋亡。在一些实施方案中，所述TAA不由正常免疫细胞表达。在一些实施方案中，所述TAA由正常免疫细胞表达。在一些实施方案中，所述正常免疫细胞是抗原呈递细胞(APC)。在一些实施方案中，所述TAA选自CD8，CD11b，CD11c，CD14，CD33，CD40，CD123，CD157，CD168，CD169，CD172a，CD200，CD204，CD205，CD301，CD302，CD303，CD304和CD206。在一些实施方案中，所述CpG-Ab免疫缀合物不与所述TAA或癌症表达的任何其他TAA缀合。在一些实施方案中，所述CpG-Ab免疫缀合物包含选自表2的免疫刺激多核苷酸。在一些实施方案中，所述CpG-Ab免疫缀合物包含选自p236，p238，p243，p246，p275，p276，p308，p313，p347，p361，p362，p425，p433，p434，p435，p436，p437，p438，p477，p478，p479，p480，p481，p482，p483，p484，p485，p486，p487，p488和p489的免疫刺激多核苷酸。在一些实施方案中，所述CpG-Ab免疫缀合物不缀合至T细胞表位。在一些实施方案中，所述T细胞表位是卵白蛋白(OVA)。在一些实施方案中，所述癌症是实体瘤。在一些实施方案中，所述癌症是液体肿瘤。在本文提供的方法的一些实施方案中，所述癌症是复发性癌症。在本文提供的方法的一些实施方案中，所述施用或共同施用是通过全身施用。在本文提供的方法的一些实施方案中，治疗有效量的所述CpG-Ab免疫缀合物不能有效激活对象中的补体途径。在本文提供的方法的一些实施方案中，该量不能有效激活对象中的补体C3。
在一些实施方案中，本文提供了在患有免疫治疗抗性或难治性癌症的对象中治疗免疫治疗抗性或难治性癌症的方法，其包括向该对象施用治疗有效量的CpG-Ab免疫缀合物。在一些实施方案中，所述CpG-Ab免疫缀合物不结合肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，所述CpG-Ab免疫缀合物特异性结合至靶抗原，所述靶抗原与表达至少一个toll样受体的正常免疫细胞相关。在一些实施方案中，所述CpG-Ab免疫缀合物特异性结合肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，所述癌症对免疫检查点调节剂的治疗有抗性。在一些实施方案中，该方法还包括向对象共同施用所述免疫检查点调节剂。在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物包含选自表2的免疫刺激多核苷酸。在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物包含选自表2中的p236，p238，p243，p246，p275，p276，p308，p313，p347，p361，p362，p425，p433，p434，p435，p436，p437，p438，p477，p478，p479，p480，p481，p482，p483，p483，p484，p485，p486，p487，p488和p489的免疫刺激多核苷酸。在一些实施方案中，所述癌症是实体瘤。在一些实施方案中，所述癌症是液体肿瘤。在本文提供的方法的一些实施方案中，所述癌症是复发性癌症。在本文提供的方法的一些实施方案中，所述施用或共同施用是通过全身施用。在本文提供的方法的一些实施方案中，治疗有效量的所述CpG-Ab免疫缀合物不能有效激活所述对象中的补体途径。在本文提供的方法的一些实施方案中，该量不能有效激活所述对象中的补体C3。
在一些实施方案中，本文提供了在有此需要的对象中预防癌症的方法，其包括向该对象施用治疗有效量的CpG-Ab免疫缀合物，其中该CpG-Ab免疫缀合物特异性结合至靶抗原，所述靶抗原与表达至少一个toll样受体正常免疫细胞相关。在一些实施方案中，这种方法进一步包括将所述肿瘤相关抗原与所述CpG-Ab免疫缀合物共同施用。在一些实施方案中，所述CpG-Ab免疫缀合物不与所述肿瘤相关抗原缀合。在一些实施方案中，所述正常免疫细胞表达TLR9。在一些实施方案中，所述正常免疫细胞是抗原呈递细胞(APC)。在一些实施方案中，所述CpG-Ab免疫缀合物包含选自表2的免疫刺激多核苷酸。在一些实施方案中，所述CpG-Ab免疫缀合物包含选自如表2所示的p236，p238，p243，p246，p275，p276，p308，p313，p347，p361，p362，p425，p433，p434，p435，p436，p437，p438，p477，p478，p479，p480，p481，p482，p483，p484，p485，p486，p487，p488和p489的免疫刺激多核苷酸。在一些实施方案中，所述癌症是实体瘤。在一些实施方案中，所述癌症是液体肿瘤。在本文提供的方法的一些实施方案中，所述癌症是复发性癌症。在本文提供的方法的一些实施方案中，所述施用或共同施用是通过全身施用。在本文提供的方法的一些实施方案中，治疗有效量的所述CpG-Ab免疫缀合物不能有效激活所述对象中的补体途径。在本文提供的方法的一些实施方案中，该量不能有效激活所述对象中的补体C3。
在一些实施方案中，本文提供了在有需要的对象中预防癌症的方法，其包括将治疗有效量的CpG-Ab免疫缀合物与癌症疫苗共同施用，其中所述CpG-Ab免疫缀合物特异性结合至靶抗原，所述靶抗原与表达至少一个toll样受体的正常免疫细胞相关。在一些实施方案中，将所述CpG-Ab免疫缀合物配制为所述癌症疫苗的佐剂。在一些实施方案中，所述癌症是实体瘤。在一些实施方案中，所述癌症是液体肿瘤。在本文提供的方法的一些实施方案中，所述癌症是复发性癌症。在本文提供的方法的一些实施方案中，所述施用或共同施用是通过全身施用。在本文提供的方法的一些实施方案中，治疗有效量的所述CpG-Ab免疫缀合物不能有效激活所述对象中的补体途径。在本文提供的方法的一些实施方案中，该量不能有效激活对象中的补体C3。
在一些实施方案中，本文提供了在对象中诱导适应性免疫应答的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的CpG-Ab免疫缀合物，其中所述CpG-Ab免疫缀合物特异性结合至靶抗原，所述靶抗原与表达至少一个toll样受体的正常免疫细胞相关。在一些实施方案中，所述对象患有癌症。在一些实施方案中，所述靶抗原不是TAA。在一些实施方案中，所述靶抗原是TAA，其不是选自CD19、CD20、CD22、STAT3、输出蛋白7、Her2、Src、EGFR、CD52、CXCR-4、Muc-1和DNA的抗原。在一些实施方案中，所述对象患有传染病。在一些实施方案中，所述正常免疫细胞表达TLR9。在一些实施方案中，所述正常免疫细胞是抗原呈递细胞(APC)。在一些实施方案中，所述适应性免疫应答是CD8+T细胞依赖性的。在一些实施方案中，所述CpG-Ab免疫缀合物包含选自表2的免疫刺激多核苷酸。在一些实施方案中，所述CpG-Ab免疫缀合物包含如表2所示的选自p236，p238，p243，p246，p275，p276，p308，p313，p347，p361，p362，p425，p433，p434，p435，p436，p437，p438，p477，p478，p479，p480，p481，p482，p483，p484，p485，p486，p487，p488和p489的免疫刺激多核苷酸。在一些实施方案中，所述癌症是实体瘤。在一些实施方案中，所述癌症是液体肿瘤。在本文提供的方法的一些实施方案中，所述癌症是复发性癌症。在本文提供的方法的一些实施方案中，所述施用或共同施用是通过全身施用。在本文提供的方法的一些实施方案中，治疗有效量的所述CpG-Ab免疫缀合物不能有效激活所述对象中的补体途径。在本文提供的方法的一些实施方案中，该量不能有效激活对象中的补体C3。
在一些实施方案中，本文提供了在患有癌症的对象中治疗癌症的方法，包括向该对象施用治疗有效量的选自表6的CpG-Ab免疫缀合物。在一些实施方案中，该CpG-Ab免疫缀合物结合肿瘤相关抗原(TAA)。在一些实施方案中，所述CpG-Ab免疫缀合物结合所述TAA以外的靶抗原。在一些实施方案中，所述CpG-Ab免疫缀合物结合至靶抗原，所述靶抗原与表达toll样受体的正常免疫细胞相关。在一些实施方案中，所述CpG-Ab免疫缀合物选自由CpG-Ab免疫缀合物组成的组，其包括如表2所示的p236，p238，p243，p246，p275，p276，p308，p313，p347，p361，p362，p425，p433，p434，p435，p436，p437，p438，p477，p478，p479，p480，p481，p482，p483，p484，p485，p486，p487，p488和p489。在一些实施方案中，进一步包括共同施用治疗有效量至少一个另外的癌症治疗剂。在一些实施方案中，所述至少一个另外的癌症治疗剂选自第二TAA、T细胞共刺激分子和免疫检查点调节剂。在一些实施例中，所述第二TAA与所述TAA相同。在一些实施例中，所述第二TAA不同于所述TAA。在一些实施方案中，所述T细胞共刺激分子选自OX40，CD2，CD27，CDS，ICAM-1，LFA-1/CD11a/CD18，ICOS/CD278、4-1BB/CD137，GITR，CD30，CD40，BAFFR，HVEM，CD7，LIGHT，NKG2C，SLAMF7，NKp80，CD160，B7-H3和CD83或其配体。在一些实施方案中，所述T细胞共刺激分子是抗OX40抗体，抗ICOS/CD278抗体或抗4-1BB/CD137抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，其中所述免疫检查点调节剂选自PD-1，PD-L1，PD-L2，TIM-3，LAG-3，CEACAM-1，CEACAM-5，CLTA-4，VISTA，BTLA，TIGIT，LAIR1，CD47，CD160、2B4，CD172a和TGFR。在一些实施方案中，所述免疫检查点调节剂是抗CD47抗体，抗PD-1抗体，抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述癌症是实体瘤。在一些实施方案中，所述癌症是液体肿瘤。在本文提供的方法的一些实施方案中，所述癌症是复发性癌症。在本文提供的方法的一些实施方案中，所述施用或共同施用是通过全身施用。在本文提供的方法的一些实施方案中，治疗有效量的所述CpG-Ab免疫缀合物不能有效激活所述对象中的补体途径。在本文提供的方法的一些实施方案中，该量不能有效激活所述对象中的补体C3。
在本文提供的任何方法的一些实施方案中，其中所述CpG-Ab免疫缀合物包含如上所定义的式(A)的寡核苷酸。在本文提供的任何方法的一些实施方案中，其中所述CpG-Ab免疫缀合物包含如上定义的式(B)的化合物。在本文提供的任何方法的一些实施方案中，其中所述CpG-Ab免疫缀合物是如上定义的式(C)的化合物。
附图的简要说明
该应用文件包含至少一个彩色绘图。专利局将根据要求以及支付必要的费用，提供带有彩色附图的本专利或专利申请的副本。
图1A是示出具有相应结构的缩写的一系列结构。所述缩写是表2中使用的缩写。
图1B是示出具有相应结构的缩写的一系列结构。所述缩写是表2中使用的缩写。
图2是单链CpG ODN(泳道A(p145)和D(p88))和退火的双链CpG ODN(泳道B(p88/p144)和C(p88/P145))的溴化乙锭-染色的变性凝胶图像。
图3A是在小鼠转谷氨酰胺酶介导的与多核苷酸的缀合之前(泳道A)和之后(p76，p77，p78，p79，p80，p81和p82分别对应于泳道B，C，D，E，F，G和H)的Q-标记的抗CD38抗体的溴化乙锭-染色的还原凝胶的图像。HC+1表示与多核苷酸偶联的Q-标记的抗CD38抗体重链的条带。HC表示Q-标记的抗CD38抗体重链的条带。LC表示抗CD38抗体轻链。
图3B是Q-标记的抗CD38抗体在微生物转谷氨酰胺酶介导的缀合之前(泳道A)和与多核苷酸p83，p84，p85，p86，p87和p88缀合之后(分别对应于B，C，D，E，F和G泳道)的溴化乙锭-染色的还原凝胶的图像。HC+1表示与多核苷酸缀合的Q-标记的抗CD38抗体重链的条带。HC表示Q-标记的抗CD38抗体重链的条带。LC表示抗CD38抗体轻链。
图4A是在Q-标记的抗CD38与叠氮化物接头缀合之前(泳道A)和通过偶极环加成缀合至单链多核苷酸(泳道B，Dar1缀合至p88)或缀合至双链多核苷酸之后(泳道C，D，E和F)的溴化乙锭-染色的变性凝胶的图像。泳道C对应于通过无金属的1，3-偶极环加成与p88/p145双链CpG连接的Q-标记的抗CD38抗体的缀合物的分离的第一AEX峰。泳道D对应于通过无金属的1，3-偶极环加成与p88/p145双链CpG连接的Q标记的抗CD38抗体的缀合物的分离的第二AEX峰。泳道E对应于通过无金属的1，3-偶极环加成与p88/p144双链CpG连接的Q标记的抗CD38抗体的缀合物的分离的第一AEX峰。泳道F对应于通过无金属的1，3-偶极环加成与p88/p144双链CpG连接的Q标记的的抗CD38抗体的缀合物的分离的第二AEX峰。
图4B是显示含有利妥昔单抗-p19缀合物的粗混合物的AEX-HPLC迹线的图，其显示基于280nm和260nm处的吸光度的信号。存在与利妥昔单抗-p19缀合物相对应的三个峰。
图4C是显示AEX-HPLC迹线的复合图，其为：粗混合物，p19和在图4B中列举的利妥昔单抗-p19AEX峰1、2和3。
图4D是比较利妥昔单抗-PEG24-N3(泳道A)，粗结合反应混合物(泳道B)和分离的利妥昔单抗-p19AEX峰1(泳道C)，2(泳道D)和3(泳道E)的变性SDSPAGE6％tris-甘氨酸凝胶图像。
图5是显示鼠免疫刺激多核苷酸在鼠脾细胞中剂量依赖性诱导IL-6的功效的图。所示数据表明，对于p18的鼠免疫刺激多核苷酸序列，优选至少15个硫代磷酸酯以获得免疫刺激活性。在没有缀合的靶向部分的情况下，硫代磷酸酯骨架是控制免疫刺激多核苷酸诱导IL-6的功效的重要特征。
图6是显示本发明的免疫缀合物和CPG7909在Ramos Blue细胞中剂量依赖地活化NFκB的功效的图，其通过5.5小时处理后碱性磷酸酶的水平所评估。x轴提供了对数刻度上的所述缀合物浓度(nM)。
图7是显示所述免疫缀合物和CpG 7909在Ramos Blue细胞中剂量依赖性地激活NFκB的功效的图，其通过在处理24小时和QB温育2.5小时后碱性磷酸酶的水平所评估。x轴提供线性标度上缀合物浓度(M)的对数。
图8是显示免疫缀合物在Ramos Blue细胞中剂量依赖性地激活NFκB的功效的图，如通过处理48小时和QB温育2.5小时后碱性磷酸酶的水平所评估。x轴提供线性标度上缀合物浓度(M)的对数。
图9是通过碱性磷酸酶水平评估的p1和p6多核苷酸在Ramos Blue细胞中剂量依赖性地激活NFκB的功效的比较图。
图10是显示免疫缀合物在Ramos Blue细胞中剂量依赖性地激活NFκB的功效的图，其通过碱磷酸酶的水平所评估。
图11是显示免疫缀合物在Ramos Blue细胞中剂量依赖性地激活NFκB的功效的图，其通过碱性磷酸酶的水平所评估。
图12是显示免疫缀合物在Ramos Blue细胞中剂量依赖性地活化NFκB的功效的图，其通过碱性磷酸酶的水平所评估。
图13是显示免疫缀合物在Ramos Blue细胞中剂量依赖性地激活NFκB的功效的图，其通过碱性磷酸酶的水平所评估。
图14是的免疫缀合物在Ramos Blue细胞中剂量依赖性地激活NFκB的功效的图，其通过碱性磷酸酶的水平所评估。
图15是显示免疫缀合物在DB细胞中IL-6的剂量依赖性诱导的功效的图。y轴显示归一化为PPIB水平的IL6分泌增加的乘数。
图16是显示在Ramos Blue细胞中免疫缀合物剂量依赖性诱导NFκB的功效的图。该图比较了具有一个多核苷酸(Dar1)或两个多核苷酸(Dar2)激活NFκB。
图17是显示在DB细胞中所述免疫缀合物剂量依赖性诱导IL-6的功效的图。该图比较了具有一个多核苷酸(Dar1)或两个多核苷酸(Dar2)的缀合物诱导IL6。y轴显示归一化为PPIB水平的IL6分泌增加的乘数。
图18是显示通过碱性磷酸酶读数测量的，包含不同长度的免疫刺激多核苷酸的所述免疫缀合物在Ramos-Blue细胞中激活的NFκB中的功效。
图19是显示通过碱性磷酸酶读数测量的，包含不同长度的免疫刺激多核苷酸的免疫缀合物在Ramos-Blue细胞中激活NFκB的功效。
图20是显示含有具有连接至核苷间磷酸二酯的5′-末端5-碘-2-脱氧尿苷的多核苷酸的缀合物的免疫刺激活性与含有具有连接至核苷间磷酸二酯硫代磷酸酯的5′-末端5-碘-2-脱氧尿苷的多核苷酸的缀合物的免疫刺激活性的比较的图。通过测量Ramos-Blue细胞中NFκB的活化来评估免疫刺激活性，如通过碱性磷酸酶的读数来测定。
图21是显示含有具有与核苷酸间磷酸二酯磷酸结合的5′-末端5-碘-2-脱氧尿苷的多核苷酸的缀合物的免疫刺激活性与含有具有与核苷间磷酸二酯硫代磷酸酯键接的5′-末端5-碘-2-脱氧尿苷的多核苷酸的缀合物的免疫刺激活性的比较的图。通过测量Ramos-Blue细胞中NFκB的活化来评估免疫刺激活性，如通过碱性磷酸酶的读数来测定。
图22是显示含有一个或多个5-碘-2-脱氧尿苷的缀合物的免疫刺激活性的比较的图。通过测量Ramos-Blue细胞中NFκB的活化来评估免疫刺激活性，如通过碱性磷酸酶的读数来测定。
图23是显示含有或缺乏5-碘-2-脱氧尿苷的缀合物的免疫刺激活性的比较的图。通过测量Ramos-Blue细胞中NFκB的活化来评估免疫刺激活性，如通过碱性磷酸酶的读数来测定。
图24是显示含有基于磷酸酯或基于硫代磷酸酯的核苷间磷酸三酯的缀合物的免疫刺激活性的比较的图。通过测量Ramos-Blue细胞中NFκB的活化来评估免疫刺激活性，如通过碱性磷酸酶的读数来测定。
图25是显示含有基于磷酸酯或基于硫代磷酸酯的核苷间磷酸三酯的缀合物的免疫刺激活性的比较的图。通过测量Ramos-Blue细胞中NFκB的活化来评估免疫刺激活性，如通过碱性磷酸酶的读数来测定。
图26A是显示含有一个或多个基于硫代磷酸酯的核苷间磷酸三酯的缀合物的免疫刺激活性的比较的图。通过测量Ramos-Blue细胞中NFκB的活化来评估免疫刺激活性，如通过碱性磷酸酶的读数来测定。
图26B是显示含有一个或多个基于硫代磷酸酯的核苷间磷酸三酯的缀合物的免疫刺激活性的比较的图。通过测量Ramos-Blue细胞中NFκB的活化来评估免疫刺激活性，如通过碱性磷酸酶的读数来测定。
图27是显示含有抗体和一个或多个免疫刺激多核苷酸的缀合物的免疫刺激活性的比较的图。通过测量Ramos-Blue细胞中NFκB的活化来评估免疫刺激活性，如通过碱性磷酸酶的读数来测定。
图28是显示通过抗体中的重链Q-标签或轻链Q-标签缀合的免疫刺激多核苷酸的细胞依赖性细胞毒性(CDC)的比较的图。在人血清中与缀合物一起孵育的Daudi细胞中进行CDC分析，并通过荧光测量细胞毒性。
图29是显示具有辅助部分的缀合物的免疫刺激活性的比较的图。通过测量Ramos-Blue细胞中NFκB的活化来评估免疫刺激活性，如通过碱性磷酸酶的读数来测定。括号中的标记表示缀合物中使用的接头/辅助部分结构，无AM表示缀合物SB-189不包含辅助部分。
图30是显示具有辅助部分的缀合物的CDC活性的比较的图。在人血清中与缀合物一起孵育的Daudi细胞中进行CDC分析，并通过荧光测量细胞毒性。
图31是显示使用包含通过Q-标签连接至小鼠抗CD22抗体的截短的鼠交叉反应性人免疫刺激多核苷酸(p275)的缀合物在A20小鼠B细胞淋巴瘤细胞中诱导IL6的图。
图32是显示使用包含通过Q标签连接至小鼠抗CD22抗体的截短的鼠交叉反应性人免疫刺激多核苷酸(p275)的缀合物在A20小鼠B细胞淋巴瘤细胞中诱导IL6的图。
图33A是显示使用包含免疫刺激多核苷酸的缀合物或未缀合的免疫刺激多核苷酸在A20小鼠B细胞淋巴瘤细胞中诱导IL6的图。
图33B是显示在存在变化浓度的游离抗小鼠CD22抗体的情况下，包含抗小鼠CD22抗体和免疫刺激多核苷酸的缀合物在A20小鼠B细胞淋巴瘤细胞中诱导IL6的图。
图34A是显示通过A型CpG ODN CPG-2336在人PBMC中诱导干扰素-α的图。
图34B是显示使用缀合物SB-340在人PBMC中诱导干扰素-α的图。抗BDCA2抗体，SB-341和p246用作本实验的对照。Y轴以450纳米波长提供任意单位的光密度。
图34C是显示使用缀合物SB-342在纯化的浆细胞样细胞中诱导干扰素-α的图。抗BDCA2抗体，抗BDCA4抗体和SB-343用作该实验的对照。
图35是显示具有各种5’-末端修饰和核苷间三酯的多核苷酸的免疫刺激活性的比较的图。
图36是显示具有各种5’-末端修饰和核苷间三酯的多核苷酸的免疫刺激活性的比较的图。
图37A是显示在用A20小鼠B细胞淋巴瘤细胞接种小鼠以及随后三次瘤内施用媒介物(盐水)或本发明的免疫刺激多核苷酸(p326)和对照(p18)后肿瘤体积生长进展的图。用X轴上的箭头表示施用时间。
图37B是显示在用A20小鼠B细胞淋巴瘤细胞接种小鼠并随后三次静脉施用媒介物(盐水)，免疫刺激多核苷酸(p3)，抗CD22抗体(CD22)，或缀合物SB-338，SB-339或SB-344。用X轴上的箭头表示施用时间。
图38A是显示在用A20小鼠B细胞淋巴瘤细胞接种小鼠并随后三次瘤内施用媒介物(盐水)或免疫刺激多核苷酸后肿瘤体积生长进程的图。
图38B是显示在用A20小鼠B细胞淋巴瘤细胞接种小鼠和随后三次瘤内施用媒介物(盐水)或免疫刺激多核苷酸后第20天的肿瘤体积值的图。
图39A是显示在用A20小鼠B细胞淋巴瘤细胞接种小鼠之后和(i)随后、单次、静脉内施用本发明的缀合物(SB-337)或(ii)随后三次瘤内施用媒介物(盐水)或免疫刺激多核苷酸后肿瘤体积生长进程的图。
图39B是显示在用A20小鼠B细胞淋巴瘤细胞接种小鼠(i)随后、单次静脉内注射本发明的缀合物(SB-337)或(ii)随后、三次瘤内施用媒介物(盐水)或免疫刺激多核苷酸后第20天肿瘤体积值的图。
图40是显示用A20小鼠淋巴瘤细胞接种Balb/c小鼠并随后用盐水游离抗体、抗体-免疫刺激多核苷酸缀合物或游离免疫刺激多核苷酸治疗的存活率(％)的图。对照组是未接种的、未治疗的Balb/c小鼠。标识为CD22-10和CD22-3的线为治疗方案提供了小鼠存活率(％)：分别为10mg/kg的游离抗小鼠CD22抗体和3mg/kg的游离抗小鼠CD22抗体。标识为SB-337-10和SB-337-3的线为治疗方案提供了小鼠存活率(％)：分别为10mg/kg SB-337和3mg/kg SB-337。
图41A是在小鼠血清中在37℃下孵育长达24小时的多核苷酸样品的变性凝胶的图像。
图41B是在小鼠血清中于37℃下孵育长达24小时的多核苷酸样品的变性凝胶的图像。
图41C是在37℃在大鼠血清中孵育长达24小时的多核苷酸样品的变性凝胶的图像。
图41D是在猴子血清中于37℃下孵育长达24小时的多核苷酸样品的变性凝胶的图像。
图41E是在人血清中于37℃下孵育长达24小时的多核苷酸样品的变性凝胶的图像。
图42是显示在免疫刺激多核苷酸的5’末端的基于磷酸酯和基于硫代磷酸酯的核苷间磷酸二酯对80％小鼠血清中多核苷酸稳定性的影响。
图43是显示在80％小鼠血清中的老化实验中降解的p246和完整的p246的比例的图。
图44是显示5’-末端核苷酸结构对80％小鼠血清中多核苷酸稳定性的影响的图。
图45是显示5’-末端核苷酸结构对多核苷酸在80％小鼠血清，80％非人灵长类(NHP)血清和80％人血清中的稳定性的影响的图。小鼠血清数据用星号标记，这些数据是在单独的研究中获得的。
图46A示出了如实施例6中所述的实验方案，其中对具有弥散的B细胞淋巴瘤的小鼠给予静脉内剂量的CpG-Ab(缀合至小鼠抗CD22mAb的CpG ODN)。
图46B显示了在第1、3和5天用(i)3mg/kg CpG(p313)-mAb(CD22)缀合物(实心菱形)；(ii)10mg/kg CpG-mAb(CD22)(实心三角形)；(iii)裸露的CpG ODN(空心三角形)；(iv)10mg/kg CD22 mAb(实心方形)；(v)10mg/kg GpC-mAb对照偶联物(空心正方形)；或(vi)盐水(实心圆)治疗的具有弥散的B细胞淋巴瘤的小鼠的存活率。
图46C显示了在第一次肿瘤激发后存活并随后在第47天经历第二次肿瘤激发的小鼠的存活率。在第二次肿瘤激发后未对幸存者进行治疗。在第1、3和5天用10mg/kg CpG-mAb(CD22)治疗的幸存者(向下的三角形)；在第1、3和5天用3mg/kg CpG-mAb(CD22)治疗的幸存者(菱形)；第二对照组在第47天用肿瘤细胞激发并用盐水处理(上三角)。
图46D显示了实验，其中在第一和第二次肿瘤激发后存活的小鼠随后在第90天接受第三次肿瘤激发。在第二次或第三次肿瘤激发后未对幸存者进行治疗。在第90天用肿瘤细胞激发第三对照组，并用盐水处理。在第90天至第120天之间监测幸存者(正方形)和对照组(圆形)的肿瘤体积。
图47A示出了如实施例7中所述的实验方案，其中给患有实体B细胞淋巴瘤的小鼠静脉剂量施用CpG-Ab(缀合至小鼠抗CD22mAb的CpG ODN)。
图47B显示了在第9、12和14天用(i)3mg/kg CpG-mAb(CD22)(空心菱形)；(ii)10mg/kg CpG-mAb(CD22)(大实心三角形)；(iii)裸CpG ODN(空心三角形)；(iv)10mg/kgCD22 mAb(实心方形)；(v)10mg/kg GpC-mAb对照偶联物(小实心正方形)，或(vi)盐水(实心圆形)治疗的具有实体B细胞淋巴瘤的小鼠的肿瘤体积。
图47C显示与对照(盐水和SB-339)相比，用10mg/kg的SB-337DAR1或10mg/kg的SB-337 DAR2治疗的具有实体B细胞淋巴瘤的小鼠的肿瘤体积。
图47D显示了与对照(盐水和SB-339)相比，用10mg/kg的SB-337PEG24Bis DAR1或10mg/kg的SB-337 PEG24Bis DAR2治疗的具有实体B细胞淋巴瘤的小鼠的肿瘤体积。
图47E显示了用10mg/kg的PD-1、10mg/kg的PD-1和3mg/kg的SB-337DAR1、10mg/kg的PD-1和3mg/kg的SB-337 DAR2与盐水对照组相比治疗的具有实体B细胞淋巴瘤的小鼠的肿瘤体积。
图47F显示了p347，SB-337 DAR1和SB-337 DAR2与对照(盐水和mCD22)相比对小鼠体重的影响。
图48A示出了如实施例8中所述的实验方案，其中给患有实体结肠癌的小鼠单独给予B细胞靶向CpG-Ab(与小鼠抗CD22 mAb缀合的CpG ODN)静脉剂量或与抗PD-1抗体组合。
图48B显示了接受(i)3mg/kg CpG-mAb(CD22)(实心三角形)(ii)抗PD-1抗体(实心正方形)；(iii)3mg/kg CpG-mAb(CD22)与抗PD-1抗体组合(下三角)；(iv)盐水(实心圆)后具有实体B细胞淋巴瘤模型的小鼠的肿瘤体积。
图49A显示了在接受(i)10mg/kg CpG-mAb(CD22)(三角形)或盐水(圆形)后具有实体B细胞淋巴瘤的具有免疫能力的Balb/C小鼠中的肿瘤体积。
图49B显示了在接受(i)10mg/kg CpG-mAb(CD22)(正方形)，(ii)裸露的CpG ODN(三角形)或(iii)盐水(圆形)后具有实体B细胞淋巴瘤的免疫受损的Nu/Nu小鼠中的肿瘤体积。
图49C显示了在接受(i)10mg/kg CpG-mAb(CD22)(正方形)，(ii)裸露的CpG ODN(三角形)或(iii)盐水(圆形)之后，具有实体B细胞淋巴瘤的免疫受损SCID小鼠中的肿瘤体积。
图50A示出了接受(i)单独的CpG-mAb(CD22)(空心圆)；(ii)CpG-mAb(CD22)和CD4+T细胞耗竭处理(空心正方形)；(iii)CD4+T细胞耗竭处理(实心正方形)；或(iv)盐水(实心圆)后患有可溶性B细胞淋巴瘤的小鼠的存活率。
图50B显示了接受(i)单独的CpG-mAb(CD22)(空心圆)；(ii)CpG-mAb(CD22)和自然杀伤(NK)细胞耗竭处理(空心正方形)；(iii)NK细胞耗竭处理(实心正方形)；或(iv)盐水(实心圆)后患有可溶性B细胞淋巴瘤的小鼠的存活率。
图50C显示了接受(i)单独的CpG-mAb(CD22)(空心圆)；(ii)CpG-mAb(CD22)和CD8+T细胞耗竭治疗(空心正方形)；(iii)CD8+T细胞耗竭处理(实心正方形)；或(iv)盐水(实心圆)后具有可溶性B细胞淋巴瘤的小鼠的存活率。
图51A显示了在接受CpG-mAb(CD22)(正方形)或盐水(圆形)后具有实体B细胞淋巴瘤的小鼠中的肿瘤体积。在第17天处死小鼠并收获肿瘤用于消化。
图51B显示了从具有用(i)CpG-Ab(正方形)或(ii)盐水(圆形)治疗的实体B细胞淋巴瘤的小鼠收获的肿瘤中CD4+或CD8+活门细胞的百分比。
图51C显示了用(i)CpG-Ab(正方形)或(ii)盐水(圆形)处理的小鼠中CD8+肿瘤细胞的百分比与肿瘤体积之间的相关性。
图52A显示了在接受(i)单独的CpG-mAb(CD22)(空心圆)；(ii)单独的抗PD-1抗体(实心正方形)；(iii)CpG-mAb(CD22)与抗PD-1抗体组合(空心正方形)；或(iv)盐水(实心圆)后具有实体B细胞淋巴瘤的小鼠中的肿瘤体积。
图52B显示了在接受(i)单独的CpG-mAb(CD22)(空心圆)；(ii)单独的抗PD-L1抗体(实心三角形)；(iii)CpG-mAb(CD22)与抗PD-L1抗体组合(空心三角形)；或(iv)盐水(实心圆)后具有实体B细胞淋巴瘤的小鼠中的肿瘤体积。
图52C显示了在接受(i)单独的CpG-mAb(CD22)(空心圆)；(ii)单独的抗PD-1抗体(实心正方形)；(iii)CpG-mAb(CD22)与抗PD-1抗体组合(空心正方形)；(iv)CpG-mAb(CD22)结合抗PD-1抗体和CD8+T细胞耗竭治疗；或(v)盐水(实心圆)后具有实体B细胞淋巴瘤的小鼠中的肿瘤体积。
图53A显示了在接受(i)单独的抗PD-1抗体(正方形)；(ii)CpG-mAb(CD22)与抗PD-1抗体的组合(菱形)；或(iii)盐水(圆形)后具有实体B细胞淋巴瘤的小鼠中的平均肿瘤体积。
图53B显示了在单独接受抗PD-1抗体后具有实体B细胞淋巴瘤的个体小鼠中的肿瘤体积。
图53C显示了在接受CpG-mAb(CD22)/抗PD-1抗体组合治疗后具有实体B细胞淋巴瘤的个体小鼠中的肿瘤体积。
图53D显示了来自第一次肿瘤激发(上三角)的幸存者和在第二次肿瘤激发后的未经治疗的对照组(下三角)的肿瘤体积。
图54A显示了在接受(i)单独的抗OX40抗体(三角形)；(ii)CpG-mAb(CD22)与抗OX40抗体组合(菱形)；或(iii)盐水(圆形)后具有实体B细胞淋巴瘤的小鼠中的肿瘤体积。
图54B显示了在接受(i)单独的抗-ICOS抗体(正方形)；(ii)CpG-mAb(CD22)与抗ICOS抗体组合(三角形)；或(iii)盐水(圆形)之后具有实体B细胞淋巴瘤的小鼠中的肿瘤体积。
图54C显示在接受(i)单独的抗4-1BB抗体(菱形)；(ii)CpG-mAb(CD22)与抗4-1BB抗体组合(三角形)；或(iii)盐水(圆形)后具有实体B细胞淋巴瘤的小鼠中的肿瘤体积。
图55A显示了在第10、13和16天分别接受(i)10mg/kg CpG-mAb(CD22)或(i)盐水后患有结肠癌的小鼠中的肿瘤体积。
图55B显示了在用AH1抗原刺激细胞之前或之后，从用(i)CpG-mAb(CD22)或(i)盐水处理的小鼠中分离的106个脾细胞中的IFN-γ分泌细胞的数目。
图56A显示了在第10、12和14天接受(i)10mg/kg CpG-Ab(PD-L1)(菱形)(i)10mg/kg CpG-Ab(CD205)(三角形)；或(iii)盐水的静脉内剂量后具有实体B细胞淋巴瘤的小鼠中的平均肿瘤体积；
图56B显示了在第10、12和14天接受10mg/kg CpG-Ab(CD205)的静脉内剂量后具有B细胞淋巴瘤的个体小鼠中的肿瘤体积。
图56C显示了在第10、12和14天接受10mg/kg CpG-Ab(PD-L1)的静脉内剂量后具有B细胞淋巴瘤的个体小鼠中的肿瘤体积。
图56D显示了来自第一次肿瘤激发的幸存者(用CpG-Ab(CD205)(正方形)或CpG-Ab(PD-L1)(三角形)治疗)和在第38天给予第二次肿瘤激发后未经治疗的对照组(圆形)处理的肿瘤体积。
图57A显示了在第10、12和14天每一天接受静脉内剂量(i)10mg/kg CpG-Ab(CD205)(三角形)；(ii)10mg/kg抗CD205抗体(正方形)；(iii)10mg/kg小鼠IgG(空心圆)；或(iv)盐水(实心圆)后具有实体B细胞淋巴瘤的小鼠中的平均肿瘤体积。
图57B显示了在第10天，第12天和第14天的每一天接受静脉内剂量的10mg/kg抗CD205抗体后，患有实体B细胞淋巴瘤的个体小鼠中的肿瘤体积。
图57C显示了在第10天，第12天和第14天的每一天接受10mg/kg CpG-Ab(CD205)的静脉内剂量后，患有实体B细胞淋巴瘤的个体小鼠中的肿瘤体积。
图57D显示了在第10天，第12天和第14天的每一天接受静脉内剂量的10mg/kg大鼠IgG2a抗体后，患有实体B细胞淋巴瘤的个体小鼠中的肿瘤体积。
图58显示在用与p246缀合的抗CD38抗体(实心方块)、与p4缀合的抗CD38抗体(实心圆)、未缀合的p246(空心方块)或未缀合的p4(空心圆)处理后人Ramos细胞中的NFκB活化。
图59显示了在猴血清中用酵母聚糖(倒三角；阳性对照)、p1(实心圆)或两种本文提供的含CpG的免疫刺激多核苷酸(实心方形和实心三角形)孵育后的补体激活(通过C3释放测量)。
图60A显示了在第10、12和14天的每一天静脉内施用(i)盐水(实心圆)；(ii)3mg/kg CpG-Ab(4523-CD22；SB-337)(正方形)；(iii)3mg/kg CD19-mAb(向下的实心三角形)；(iv)3mg/kg CpG-Ab(4523-CD19；SB-388)(空心菱形)；(v)1.9μg/小鼠裸露的CpG(P347)(上三角)；(vi)19μg/小鼠裸露的CpG(p347)(向下的空心三角形)；(vii)190μg/小鼠裸露的CpG(P347)(空心菱形)后，具有A20小鼠B细胞淋巴瘤细胞异种移植物的小鼠的平均肿瘤体积生长进程。
图60B显示了在第10、12和14天的每一天静脉内施用(i)盐水(实心)；(ii)3mg/kgCpG-Ab(SB-337)(方格)；(iii)3mg/kg CD19-mAb(水平)；(iv)3mg/kg CpG-Ab(SB-388)(垂直)；(v)1.9μg/小鼠裸露的CpG(P347)(向下对角线)后，具有A20小鼠B细胞淋巴瘤细胞异种移植物的小鼠在第20天的平均肿瘤体积。
图60C显示了在第10、12和14天的每一天静脉内施用(i)盐水(填充的)；(ii)3mg/kg CpG-Ab(SB-337)(方格)；(iii)3mg/kg CD19-mAb(水平)；(iv)3mg/kg CpG-Ab(SB-388)(垂直)；(v)1.9μg/小鼠裸露的CpG(P347)(向下对角线)；(vi)19μg/小鼠裸露的CpG(P347)(网格)；(vii)190μg/小鼠裸露的CpG(P347)(向上对角线)之后，在第20天，具有A20小鼠B细胞淋巴瘤细胞异种移植物的小鼠在去除肿瘤重量变化后的平均体重变化。
图61A显示了，在瘤内给药(i)盐水(实心圆)；或(ii)p347(实心正方形)后B16F10黑素瘤再激发后小鼠的平均肿瘤体积生长进程，其中在第7、9、11和13天的每天给药，并在第14天再次激发。
图61B显示了，在瘤内给药盐水(上图)或p347(下图)后，B16F10黑色素瘤再次激发后小鼠的肺转移，在第7、9、11和13天的每天给药，并在第14天再次激发。
图61C显示了在第7、10、12和14天的每一天在瘤内给药(i)盐水(向上的三角形)或(ii)p347(向下三角形)后，用CT26结直肠异种移植物接种的小鼠的平均肿瘤体积生长进程。
图62A显示了在第10、12和14天的每一天静脉内给药(i)盐水(圆形)或(ii)10mg/kg CpG-mAb(SB-337)(正方形)后，使用CT26结肠直肠模型的遗传B细胞缺陷型小鼠的平均肿瘤体积生长进程。
图62B显示了在第10、12和14天的每一天静脉内给药(i)盐水(圆形)或(ii)10mg/kg CpG-mAb(SB-337)(正方形)后，使用CT26结直肠模型的抗CD20 mAb B细胞耗竭的小鼠的平均肿瘤体积生长进程。
图63A显示了在给药(i)盐水(圆形)；(ii)10mg/kg抗CD22(向上的三角形)；(iii)10mg/kg抗PD-L1(向下三角形)；(iv)10mg/kg CD22-CpG(SB-337)(正方形)；或(v)10mg/kgCD22-CpG(SB-337)+10mg/kg抗PD-L1(菱形)后，使用MC38结肠直肠同源模型的小鼠的平均肿瘤体积生长进程。在第10、12和14天静脉注射抗CD22和CD22-CpG；在第10、13和17天腹膜内给予抗PD-L1。*p＝0.01；**p＝0.001。
图63B显示了在第10、12和14天静脉给药盐水后，使用MC38结肠直肠同源模型的每只小鼠的肿瘤体积生长进展
图63C显示了在第10、12和14天静脉内施用10mg/kg抗CD22mAb后，使用MC38结肠直肠同源模型的每只小鼠的肿瘤体积生长进程。
图63D显示了在第10、13和17天腹膜内施用10mg/kg抗PD-L1后，使用MC38结肠直肠同源模型的每只小鼠的肿瘤体积生长进展。
图63E显示了在第10、12和14天静脉内施用10mg/kg的CD22-CpG(SB-337)后，使用MC38结肠直肠同源模型的每只小鼠的肿瘤体积生长进程。
图63F显示了在第10、12和14天静脉内给药10mg/kgCD22-CpG(SB-337)以及在第10、13和17天腹膜内给药10mg/kg抗PD-L1后，使用MC38结肠直肠同源模型的每只小鼠的肿瘤体积生长进程。
图64A显示在第10、12和14天给药(i)盐水(圆形)(ii)10mg/kg抗CD22(正方形)；(iii)10mg/kg CD22-CpG(SB-337)(三角形)；(iv)10mg/kg的CD22-CpG(SB-337)+10mg/kg的抗PD-L1(菱形)后，使用B16F10黑色素瘤模型的小鼠的平均肿瘤体积生长进程。静脉给药抗-CD22和CD22-CpG；腹膜内给予抗PD-L1。**p＝0.08；***p＝0.03。
图64B显示了在给药(i)盐水(圆形)；(ii)10mg/kgCD22-CpG(SB-337)(圆形)；(iii)10mg/kg抗PD1(正方形)；(iv)10mg/kg CD22-CpG(SB-337)+10mg/kg抗PD1(向上的三角形)；(v)10mg/kg抗PD-L1(向下的三角形)；(vi)10mg/kgCD22-CpG+10mg/kg抗PD-L1(菱形)后使用LLC1 Lewis肺癌模型的小鼠的平均肿瘤体积生长进程。在第7、10和13天静脉注射抗CD22和CD22-CpG；在第7、10和14天腹膜内给予抗PD-L1和抗PD1。**p＝0.023。
图65A显示了在第12、17、20和24天的每一天静脉内给药(i)盐水(圆形)；(ii)10mg/kg CD22-CpG(SB-337)(三角形)；或(iii)10mg/kg DEC205-CpG(SB-3096)后使用CT26结肠直肠模型的小鼠的平均肿瘤体积生长进程。
图65B显示了在第12、17、20和24天的每一天静脉内注射盐水之后，使用CT26结肠直肠模型的每只小鼠的肿瘤体积生长进程。
图65C显示了在第12、17、20和24天分别静脉内施用10mg/kg CD22-CpG(SB-337)后，使用CT26结肠直肠模型的每只小鼠的肿瘤体积生长进程。
图65D显示了在第12、17、20和24天分别静脉内施用10mg/kg DEC205-CpG(SB-3096)后，使用CT26结肠直肠模型的每只小鼠的肿瘤体积生长进程。
图66A显示了在给药(i)盐水(小圆形)；(ii)CD4耗竭(大圆形)；(iii)3mg/kgCD22-CpG(SB-337)(正方形)；或(iv)CD4耗竭+3mg/kg CD22-CpG(SB-337)(菱形)后使用CT26结肠直肠模型的小鼠的平均肿瘤体积生长进程。在第10、13、15天静脉注射CD22-CpG；使用抗CD4进行CD4耗竭。
图66B显示了在给药(i)盐水(圆形)；(ii)CD4耗竭(向上的三角形)；(iii)3mg/kgCD22-CpG(SB-337)(正方形)；或(iv)CD4耗竭+3mg/kg CD22-CpG(SB-337)(向下的三角形)后使用A20淋巴瘤模型的小鼠的平均肿瘤体积生长进程。在第10、12和14天静脉注射CD22-CpG；使用抗CD4进行CD4耗竭。
图67A显示了与1nM CD22 Ab(方格)；1nM CpG(SB-4715)(水平线)；或1nM CpG-Ab(SB-337)(垂直线)体外孵育后CD19+/B220+B细胞上CD40，CD70，CD80，CD86，MHC-1，MHC II和4-1BBL表面表达的平均荧光强度(MFI)。
图67B显示了在体内用盐水(实心)；10mg/kg CD22 Ab(方格)；10mg/kg CpG(SB-4715)(水平线)；或10mg/kg CpG-Ab(SB-337)(垂直线)给药后，CD19+/B220+B细胞上CD40，CD80，CD86和MHC II表面表达的平均荧光强度(MFT)。
图68A显示了在用(i)盐水(实心)；(ii)Ab(抗CD22)(方格)；(iii)CpG-Ab(SB-337)(水平)；或(iv)CpG(SB-4715)(垂直)处理的小鼠中，活化的T细胞(CD71+，CD3+)相对于总T细胞(CD3+)群的百分比。
图68B显示了在用(i)盐水(实心)；(ii)Ab(抗CD22)(方格)；(iii)CpG-Ab(SB-337)(水平)；或(iv)CpG(SB-4715)(垂直)处理的小鼠中，活化的T细胞(Ki67+，CD3+)相对于总T细胞(CD3+)群的百分比。
图69A显示了在第10、12、14天的每一天在静脉内给药(i)盐水(圆形)；(ii)10mg/kg CD22-CpG(SB-337)(正方形)；(iii)10mg/kg CD22(向上的三角形)；或(iv)游离CpG(P347)(向下的三角形)后使用CT26结肠直肠模型的小鼠的平均肿瘤体积生长进程。
图69B显示了在用(i)盐水(小圆形)；(ii)10mg/kg CD22-CpG(SB-337)(小方块)；(iii)10mg/kg CD22(向上的小三角形)；或(iv)游离CpG(P347)(向下的小三角形)处理的小鼠的引流淋巴结细胞过继性转移后，或用(v)盐水(菱形)；(vi)10mg/kg CD22-CpG(SB-337)(大圆形)；(vii)10mg/kg CD22(大方块)；或(viii)游离CpG(P347)(向上的大三角形)处理的小鼠的非引流淋巴结细胞后过继性转移后，使用CT26结直肠模型的小鼠的平均肿瘤体积生长进程。
图69C显示了在用(i)盐水(向上窄对角线)；(ii)10mg/kg CD22-CpG(SB-337)(向下窄对角线)；(iii)10mg/kg CD22(网格)；或(iv)游离CpG(P347)(向下大对角线)处理的小鼠的引流淋巴结细胞过继性转移后；或用(v)盐水(实心)；(vi)10mg/kgCD22-CpG(SB-337)(方格)；(vii)10mg/kg CD22(水平)；或(viii)游离CpG(P347)(空)处理的小鼠的非引流淋巴结细胞过继性转移之后，使用CT26结直肠模型的小鼠在第24天的平均肿瘤体积。
图70A显示了静脉给药(i)盐水(实心)；(ii)10mg/kg Ab(CD22)(方格)；(iii)5.7ug/剂量游离的CpG(p347)(水平)；或(iv)10mg/kgCpG-mAb(SB-337)(垂直)的未经治疗的小鼠中IL-6的血浆浓度。
图70B显示了静脉给药(i)盐水(实心)；(ii)10mg/kg Ab(CD22)(方格)；(iii)5.7ug/剂量的游离CpG(p347)(水平)；或(iv)10mg/kg CpG-mAb(SB-337)(垂直)的未经治疗的小鼠中IL-1β的血浆浓度。
图70C显示了静脉给药(i)盐水(实心)；(ii)10mg/kg Ab(CD22)(方格)；(iii)5.7ug/剂量的游离CpG(p347)(水平)；或(iv)10mg/kg CpG-mAb(SB-337)(垂直)的未经治疗的小鼠中IL-10的血浆浓度。
图70D显示了静脉给药(i)盐水(实心)；(ii)10mg/kg Ab(CD22)(方格)；(iii)5.7ug/剂量的游离CpG(Sp347)(水平)；或(iv)10mg/kg CpG-mAb(SB-337)(垂直)的未经治疗的小鼠中IL-12p70的血浆浓度。
图70E显示了静脉给药(i)盐水(实心)；(ii)10mg/kg Ab(CD22)(方格)；(iii)5.7ug/剂量的游离CpG(p347)(水平)；或(iv)10mg/kg CpG-mAb(SB-337)(垂直)的未经治疗的小鼠中IFNγ的血浆浓度。
图70F显示了用静脉内给药(i)盐水(实心)；(ii)10mg/kg Ab(CD22)(方格)；(iii)5.7ug/剂量的游离CpG(p347)(水平)；或(iv)10mg/kg CpG-mAb(SB-337)(垂直)的未经治疗的小鼠中TNFα的血浆浓度。
图71A显示在第10、13和17天分别每天静脉内给药(i)盐水(圆形)；或(ii)10mg/kgCpG-mAb(SB-337)(正方形)后，使用CT26结肠直肠模型的小鼠脾脏中B细胞(B220+)相对于总细胞的百分比。*p＜0.05
图71B显示了在第10、13和17天分别每天静脉内给药(i)盐水(圆形)；或(ii)10mg/kg CpG-mAb(SB-337)(正方形)后，使用CT26结直肠模型的小鼠生发中心(germinalcenter，GC)细胞(B220+，IgDlo，Fas+)相对于小鼠脾脏中总细胞的百分比。*p＜0.05
图71C显示在第10、13和17天分别每天静脉内给药(i)盐水(圆形)或(ii)10mg/kgCpG-mAb(SB-337)(正方形)后，使用CT26结肠直肠模型的小鼠脾脏中的T滤泡辅助(Tfh)细胞(CD4+，CXCR5+，PD-1+)相对于总脾细胞的百分比。*p＜0.05
图71D显示在第10、13和17天分别每天静脉内给药(i)盐水；或(ii)10mg/kg CpG-mAb(SB-337)后，使用CT26结肠直肠模型的小鼠IL-21的相对倍数变化。*p＜0.05
图71E显示了在第10、13和17天分别每天静脉内给药(i)盐水；或(ii)10mg/kgCpG-mAb(SB-337)之后，使用CT26结肠直肠模型小鼠的Bcl-6的相对倍数变化。*p＜0.05
图71F显示了在第10、13和17天分别每天静脉内给药(i)盐水；或(ii)10mg/kgCpG-mAb(SB-337)之后，使用CT26结肠直肠模型的小鼠的IRF-4的相对倍数变化。*p＜0.05
图72A显示了在第10、13和17天分别每天静脉内给药(i)盐水；或(ii)3mg/kg CpG-mAb(SB-337)之后，使用CT26结肠直肠模型的小鼠脾脏中IL-6的相对倍数变化。
图72B显示了在第10、13和17天分别每天静脉内给药(i)盐水；或(ii)3mg/kg CpG-mAb(SB-337)之后，使用CT26结肠直肠模型的小鼠脾脏中IL-10的相对倍数变化。
图72C显示了在第10、13和17天分别每天静脉内给药(i)盐水；或(ii)3mg/kg CpG-mAb(SB-337)之后，使用CT26结肠直肠模型的小鼠脾脏中IL-1β的相对倍数变化。
图72D显示了在第10、13和17天分别每天静脉内给药(i)盐水；或(ii)3mg/kg CpG-mAb(SB-337)后，使用CT26结肠直肠模型的小鼠脾脏中TNFα的相对倍数变化。
图73A显示了在第10、13和17天分别每天静脉内给药(i)盐水；或(ii)3mg/kg CpG-mAb(SB-337)之后，使用CT26结肠直肠模型的小鼠引流淋巴结中IL-6的相对倍数变化。
图73B显示了在第10、13和17天分别每天静脉内给药(i)盐水；或(ii)3mg/kg CpG-mAb(SB-337)后，使用CT26结肠直肠模型的小鼠引流淋巴结中IL-10的相对倍数变化。
图73C显示第10、13和17天分别每天静脉内给药(i)盐水；或(ii)3mg/kg CpG-mAb(SB-337)后，使用CT26结肠直肠模型的小鼠的引流淋巴结中IL-1β的相对倍数变化。
图73D显示了在第10、13和17天分别每天静脉内给药(i)盐水；或(ii)3mg/kg CpG-mAb(SB-337)之后，使用CT26结肠直肠模型的小鼠引流淋巴结中TNFα的相对倍数变化。
图74A显示了在第10、13和16天分别每天静脉内给药(i)盐水；或(ii)3mg/kg CpG-mAb(SB-337)之后，使用CT26结肠直肠模型的小鼠中IgM的浓度。*p＜0.05。
图74B显示了在第10、13和16天分别每天静脉内给药(i)盐水；或(ii)3mg/kg CpG-mAb(SB-337)之后，使用CT26结肠直肠模型的小鼠中IgG2a的浓度。*p＜0.05
图74C显示在第10、13和16天分别每天静脉内给药(i)盐水；或(ii)3mg/kg CpG-mAb(SB-337)后，使用CT26结肠直肠模型的小鼠中IgG的浓度。*p＜0.05
图75显示了使用市售的二抗小鼠IgG2a-HRP抗体，2nd Ab1测量静脉用盐水(圆形)或3mg/kg CpG-mAb(SB-337)(正方形)或使用第二种市售二抗小鼠IgG2a-HRP抗体，2nd Ab2测量用盐水(向下的三角形)或3mg/kg CpG-mAb(SB-337)(菱形)处理的小鼠血清中的抗AH1IgG2a的示意图和定量。
图76A显示在每周静脉内给药(i)盐水(圆形)或(ii)10mg/kg CpG-mAb(SB-337)(正方形)后，小鼠脾脏中调节性B细胞(Breg；CD19+，B220+，CD1dhi)相对于总B细胞(B220+)的百分比。*p＜0.001
图76B显示了在每周静脉内给药(i)盐水(圆形)或(ii)10mg/kg CpG-mAb(SB-337)(正方形)后，小鼠脾脏中调节性B细胞(Bregs；CD19+，B220+，CD1dhi)相对于总细胞的百分比。*p＜0.001
图77A显示了在第14天，第17天和第30天的每天在静脉内给药(i)盐水(圆形)；(ii)10mg/kg CpG-mAb(SB-337)(正方形)；或(iii)10mg/kg CpG(三角形)的使用CT26结肠直肠模型的小鼠脾脏淋巴结中脾髓样树突状细胞(mDC；B220-，CD11C+；DEC205hi)相对于总细胞的百分比。*p＝0.0002，&p＝0.003，#p＝0.002。
图77B显示在第14、17和30天的每一天静脉内给药(i)盐水(圆形)；(ii)10mg/kgCpG-mAb(SB-337)(正方形)；或(iii)10mg/kgCpG(三角形)的使用CT26结肠直肠模型的小鼠的合并的淋巴结(LN)髓样树突状细胞(mDC；B220-，CD11C+；CD8+)相对于小鼠的总细胞的百分比。从引流淋巴结(dLN)和非引流淋巴结(ndLN)取样。
图78A显示了在第10、13和15天的每一天用(i)盐水(圆形)；(ii)浆细胞样树突状细胞(pDC)耗竭(向下三角形)；(iii)3mg/kg CD22-CpG(SB-337)(正方形)；或(iv)pDC耗竭+3mg/kg CD22-CpG(SB-337)(向上的三角形)处理后，使用CT26结肠直肠模型的小鼠的平均肿瘤体积生长进程。
图78B显示了在第10、12和14天的每一天用(i)盐水(小圆形)；(ii)浆细胞样树突状细胞(pDC)耗竭(菱形)；(iii)3mg/kg CD22-CpG(SB-337)(正方形)；或(iv)pDC耗竭+3mg/kg CD22-CpG(SB-337)(大圆形)处理后，使用A20淋巴瘤模型的小鼠的平均肿瘤体积生长进程。
图79A显示了在第10、12和14天的每一天静脉内给药(i)盐水(实心)；或(ii)3mg/kg CpG-mAb(SB-337)(方格)后，使用CT26结肠直肠模型的小鼠T细胞基因的基因表达的相对倍数变化。
图79B显示了在第10、12和14天的每一天静脉内给药(i)盐水(实心)；或(ii)3mg/kg CpG-mAb(SB-337)(水平)后，使用CT26结肠直肠模型的小鼠巨噬细胞基因的基因表达的相对倍数变化。
图79C显示在第10、12和14天的每一天静脉内给药(i)盐水(实心)，或(ii)3mg/kgCpG-mAb(SB-337)(垂直)后，使用CT26结肠直肠模型的小鼠的细胞因子基因的基因表达的相对倍数变化。
图79D显示在第10、12和14天的每一天静脉内给药(i)盐水(实心)；(ii)3mg/kgCpG-mAb(SB-337)(向上对角线)；(iii)抗PD-L1(向下对角线)；(iv)3mg/kg CpG-mAb+抗PD-L1(SB-337)(网格)后，使用CT26结肠直肠模型的小鼠的凋亡酶基因的基因表达的相对倍数变化。
图80A显示了响应于用(i)CpG(p425)(正方形)；(ii)CpG-Ab(SB-430)(三角形)；或(iii)Ab(菱形)体外处理24-72小时人原代B细胞的IL-6浓度的剂量响应曲线。
图80B显示了响应于用(i)CpG(p425)(三角形)；或(ii)CpG-Ab(SB-430)(圆形)体外处理24-72小时的人原代B细胞上的MHCII表达的平均荧光强度(MFI)的剂量响应曲线。
图80C显示了响应于用(i)CpG(p425)(三角形)；或(ii)CpG-Ab(SB-430)(圆形)体外处理24-72小时的人原代B细胞上CD86表达的平均荧光强度(MFI)的剂量响应曲线。
图80D显示了响应于(i)CpG(p425)(三角形)；或(ii)CpG-Ab(SB-430)(圆形)体外处理24-72小时人原代B细胞上CD70表达的平均荧光强度(MFT)的剂量响应曲线。
图80E显示了响应于用(i)CpG(p425)(三角形)；或(ii)CpG-Ab(SB-430)(圆形)体外处理24-72小时人原代B细胞上CD20表达的平均荧光强度(MFT)的剂量响应曲线。
图81显示了响应于用(i)hCD22-hCpG(SB-430)(正方形)；(ii)游离人CpG 7909(向下三角形)；或(iii)游离人CpG Solstice(p425)(向上箭头)体外处理24小时原代人脾细胞的IL-6浓度的剂量反应曲线。
图82A显示了在Daudi Burkitt淋巴瘤细胞的皮下移植和第12、14和16天的静脉内(IV)处理之前，使用腹膜内(IP)注射的新鲜人外周血单核细胞(hPBMC)进行人源化小鼠模型实验的方案。
图82B显示在皮下移植Daudi Burkitt淋巴瘤细胞和在第12、14和16天分别每天静脉内(IV)用(i)盐水(圆形)；(ii)5mg/kg hCD22 Ab(正方形)；(iii)5.7μg/剂量CpG(p425)(空心三角形)；或(iv)5mg/kg hCD22-CpG(SB-430)(实心三角形)处理之前，腹膜内注射新鲜人外周血单核细胞的人源化小鼠模型中平均肿瘤体积生长进程。
图83显示了CpG抗体缀合物SB-337 DAR1在静脉内或皮下施用的小鼠中的药代动力学曲线。
图84显示了静脉内施用的小鼠中CpG-抗体缀合物SB-337 DAR1的药代动力学曲线。
图85显示了静脉内施用的小鼠中CpG-抗体缀合物SB-337 DAR1的药代动力学曲线。
图86显示了静脉内施用的小鼠中CpG-抗体缀合物SB-337 DAR1和SB-337 DAR2的药代动力学曲线。
图87A和87B显示了静脉内施用CpG-抗体缀合物的小鼠中的药代动力学曲线。
详细说明
定义
如本文所用，术语“无碱基间隔子”表示具有以下结构的二价基团：
R1-L1-[-L2-(L1)n1-]n2-R2，
(I)
其中：
n1为0或1
n2是1到6之间的整数
R1是与免疫调节多核苷酸中核苷键接的键，
R2是与免疫调节多核苷酸中的核苷或封端基团键接的键，
每个L1独立地为磷酸二酯或磷酸三酯，并且
每个L2是糖类似物，
条件是
如果无碱基间隔子为核苷间无碱基间隔子，则每个n1为1，并且R2为与核苷键接的键，并且
如果无碱基间隔子是末端无碱基间隔子，则每个n1独立地为0或1，并且R2为与封端基团键接的键。
如本文所用，术语“约”表示为所述值的±10％的值。
除非另有说明，否则本文所用的术语“烷烃-四基”表示具有1至16个碳的四价、无环、直链或支链的饱和烃基。烷烃-四基可以如对烷基所述任选地被取代。
除非另有说明，否则本文所用的术语“烷烃-三基”表示具有1至16个碳的三价、无环、直链或支链的饱和烃基。烷烃-三基可如对烷基所述任选地被取代。
如本文所用，术语“烷酰基”表示氢或通过羰基键接至母体分子基团的烷基，其实例为甲酰基(即，羧醛基)，乙酰基，丙酰基，丁酰基，和异丁酰基。未取代的烷酰基含有1至7个碳。所述烷酰基可以是未取代的如本文对于烷基所述取代(例如，任选取代的C1-7烷酰基)。可以将末端“酰基”加至本文定义的另一个基团，例如芳基、环烷基和杂环基，以定义“芳酰基”、“环烷酰基”和“(杂环基)酰基”。这些基团分别代表一个羰基与芳基、环烷基或杂环烷基相连。“芳酰基”、“环烷酰基”和“(杂环基)酰基”中的每一个可以任选地被如在“芳基”，“环烷基”或“杂环基”中所定义的那样取代。
如本文所用，术语“烯基”表示含有一个，两个或三个碳-碳双键的无环单价直链或支链烃基。烯基的非限制性实例包括乙烯基，丙-1-烯基，丙-2-烯基，1-甲基乙烯基，丁-1-烯基，丁-2-烯基，丁-3-烯基，1-甲基丙-1-烯基，2-甲基丙-1-烯基和1-甲基丙-2-烯基。烯基可以被如本文所定义的烷基任选取代。
如本文所用，术语“亚烯基”是指除去一个氢从而使该基团为二价的直链或支链烯基。亚烯基的非限制性实例包括乙烯-1，1-二基；乙烯-1，2-二基；丙-1-烯-1，1-二基；丙-2-烯-1，1-二基；丙-1-烯-1，2-二基；丙-1-烯-1，3-二基；丙-2-烯-1，1-二基；丙-2-烯-1，2-二基；丁-1-烯-1，1-二基；丁-1-烯-1，2-二基；丁-1-烯-1，3-二基；丁-1-烯-1，4-二基；丁-2-烯-1，1-二基；丁-2-烯-1，2-二基；丁-2-烯-1，3-二基；丁-2-烯-1，4-二基；丁-2-烯-2，3-二基；丁-3-烯-1，1-二基；丁-3-烯-1，2-二基；丁-3-烯-1，3-二基；丁-3-烯-2，3-二基；丁-1，2-二烯-1，1-二基；丁-1，2-二烯-1，3-二基；丁-1，2-二烯-1，4-二基；丁-1，3-二烯-1，1-二基；丁-1，3-二烯-1，2-二基；丁-1，3-二烯-1，3-二基；丁-1，3-二烯-1，4-二基；丁-1，3-二烯-2，3-二基；丁-2，3-二烯-1，1-二基和丁-2，3-二烯-1，2-二基。所述亚烯基可以是如对于烷基所述未取代的或取代的(例如，任选取代的亚烯基)。
除非另有说明，否则本文所用的术语“烷氧基”表示式-OR的化学取代基，其中R是C1-6烷基。在一些实施方案中，所述烷基可以如本文所定义被进一步取代。术语“烷氧基”可以与本文定义的其他术语例如芳基、环烷基或杂环基结合，以定义“芳基烷氧基”、“环烷基烷氧基”和“(杂环基)烷氧基”基团。这些基团分别代表被芳基、环烷基或杂环基取代的烷氧基。对于每个单独的部分，“芳基烷氧基”、“环烷基烷氧基”和“(杂环基)烷氧基”中的每一个可以任选地如本文所定义地被取代。
如本文所用，术语“烷基”是指无环的直链或支链饱和烃基，除非另有说明，否则其在未被取代时具有1至12个碳。在某些优选的实施方案中，未取代的烷基具有1至6个碳。所述烷基的例子有甲基；乙基；正丙基和异丙基；正，仲，异和叔丁基；新戊基等，并且可以被任选地取代，其价键允许地，为一个、两个、三个，或者在具有两个或更多个碳的烷基的情况下，四个或更多个独立地被选自以下的取代基取代：氨基；芳基；芳氧基；叠氮；环烷基；环烷氧基；环烯基；环炔基；卤代；杂环基；(杂环基)氧基；羟基；硝基；巯基；硅烷基；氰基；＝O；＝S；＝NR’，其中R’是H、烷基、芳基或杂环基。每个取代基本身可以是未取代的，或在价键允许的情况下，被本文中各基团所定义的未取代的取代基取代。
如本文所用，术语“烷基氨基”是指具有式-N(RN1)2或-NHRN1的基团，其中RN1为如本文所定义的烷基。烷基氨基的烷基部分可以如对烷基所定义的那样被任选地取代。取代的烷基氨基上的每个任选的取代基本身可以是未取代的，或在价键允许的情况下，被本文所定义的每个相应基团的未取代的取代基取代。
如本文所用，术语“烷基环亚烷基”是指饱和的二价烃基，其为烷基环烷烃，其中两个价键取代两个氢原子。优选地，所述两个价键中的至少一个存在于环烷烃部分上。所述烷烃和环烷烃部分可以任选地被为本文所述的各个基团取代。
如本文所用，术语“亚烷基”是指为直链或支链饱和烃的饱和二价烃基，其中两个价键取代两个氢原子。本文定义的亚烷基的价键不包括任选的取代基。亚烷基的非限制性实例包括亚甲基，乙烷-1，2-二基，乙烷-1，1-二基，丙烷-1，3-二基，丙烷-1，2-二基，丙烷-1，1-二基，丙烷-2，2-二基，丁烷-1，4-二基，丁烷-1，3-二基，丁烷-1，2二基，丁烷-1，1-二基和丁烷-2，2-二基，丁烷-2，3-二基。术语“Cx-y亚烷基”表示具有在x和y之间的碳的亚烷基。x的示例性值为1、2、3、4、5和6，y的示例性值为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12。亚烷基可以如本文所述对烷基任选地取代。
如本文所用，术语“烷基亚硫基”表示式-S-(烷基)的基团。烷基亚硫基可以如对烷基所定义的那样被任选地取代。
如本文所用，术语“烷基亚磺酰基”表示式-S(O)-(烷基)的基团。烷基亚磺酰基可以如对烷基所定义的那样被任选地取代。
本文所用的术语“烷基磺酰基”表示式-S(O)2-(烷基)的基团。烷基磺酰基可以如对烷基所定义的那样被任选地取代。
如本文所用，术语“炔基”表示具有至少一个碳-碳三键的二至六个碳原子的单价直链或支链烃基，并且以乙炔基，1-丙炔基等为例。炔基可以未取代或如对烷基所定义的那样被任选地取代(例如，任选取代的炔基)。
如本文所用，术语“5-炔基尿苷”代表核苷，其中核碱基是具有以下结构的5-炔基尿嘧啶：
其中R是与所述核苷的五呋喃糖的异头碳键接的键，X是炔基。在一些实施方案中，X为乙炔基或丙炔基(例如，X为乙炔基)。
如本文所用，术语“亚炔基”是指直链或支链二价取代基，其包含一个或两个碳-碳三键并且在未取代时仅包含C和H。亚炔基的非限制性实例包括乙炔基1，2-二基；丙-1-炔-1，3-二基；丙-2-炔-1，1-二基；丁-1-炔-1，3-二基；丁-1-炔-1，4-二基；丁-2-炔-1，1-二基；丁-2-炔-1，4-二基；丁-3-炔-1，1-二基；丁-3-炔-1，2-二基；丁-3-炔-2，2-二基；和丁-1，3-二炔-1，4-二基。如对于炔基所述，亚炔基可以可以如对炔基所定义的那样未取代或取代(例如，任选取代的亚炔基)。
如本文所用，术语“氨基”表示-N(RN1)2，其中如果氨基未被取代，则两个RN1均为H；或者，如果氨基被取代，则每个RN1独立地为H、-O、-NO2、-N(RN2)2、-SO2ORN、-SO2RN2、-SORN2、-COORN2、N-保护基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基、芳基烷基、芳氧基、环烷基、环烯基、杂烷基或杂环基，条件是至少一个RN1不是H，并且其中每个RN2独立地为H、烷基或芳基。每个取代基本身可以是未取代的，或被本文为每个相应基团定义的未取代的取代基取代。在一些实施方案中，所述氨基是未取代的氨基(即，-NH2)或取代的氨基(例如，-NHRN1)，其中RN1独立地是-OH、-SO2ORN2、-SO2RN2、-SORN2、-COORN2、任选取代的烷基或任选取代的芳基，并且每个RN2可以是任选取代的烷基或任选取代的芳基。在一些实施方案中，取代的氨基可以是烷基氨基，其中烷基如本文针对烷基所述任选地被取代。在某些实施方案中，氨基是-NHRN1，其中RN1是任选取代的烷基。-NHRN1的非限制性实例，其中RN1是任选取代的烷基，包括：任选取代的烷基氨基，蛋白原氨基酸，非蛋白原氨基酸，蛋白原氨基酸的C1-6烷基酯和非蛋白氨基酸的C1-6烷基酯。
如本文所用，术语“氨基烷基”表示被如本文所定义的一个，两个或三个氨基取代的烷基。氨基烷基可以如烷基所述进一步被任选地取代。
如本文所用，术语“亚芳基-四基”表示为芳基的四价基团，其中三个氢原子被价键取代。亚芳基-四基可以如本文对于芳基所述任选地被取代。
如本文所用，术语“芳基”表示具有一个或两个芳环的单、双环或多环碳环系统。芳基可包含6至10个碳原子。未取代的碳环芳基基团内的所有原子均为碳原子。碳环芳基的非限制性实例包括苯基，萘基，1，2-二氢萘基，1，2，3，4-四氢萘基，芴基，茚满基，茚基等。芳基可以未被取代或被一个、两个、三个、四个或五个取代基独立地选自：烷基，烯基，炔基，烷氧基，烷基亚磺酰基，烷基亚硫基，烷基磺酰基，氨基，芳基，芳氧基，叠氮，环烷基，环烷氧基，环烯基，环炔基，卤代，杂烷基，杂环基，(杂环基)氧基，羟基，硝基，巯基，硅烷基，和氰基取代。每个取代基本身可以是未取代的，或被本文为每个相应基团定义的未取代的取代基取代。
如本文所用，术语“芳基烷基”表示被芳基取代的烷基。芳基和烷基部分任选地被取代作为本文所述的单个基团。
如本文所用，术语“芳基亚烷基”表示其中一个氢原子被价键取代的芳基烷基。如本文对于芳基烷基所述，芳基亚烷基可以任选地被取代。
如本文所用，术语“亚芳基”表示芳基，其中一个氢原子被价键取代。亚芳基可以如本文对于芳基所述任选地被取代。
除非另有说明，否则本文所用的术语“芳氧基”表示式-OR的化学取代基，其中R是芳基。在任选取代的芳氧基中，芳基如本文对于芳基所述被任选取代。
如本文所用，术语“辅助部分”表示包含亲水性聚合物、带正电的聚合物或糖醇的单价基团。
如本文所用，术语“任选取代的N”表示二价-N(RN1)-基团或三价-N＝基团。氮杂基团可以是未取代的，其中RN1是H或不存在，或者是取代的，其中RN1如对“氨基”的定义，但RN1不是H。两个氮杂基团可以连接形成“二氮杂”。
如本文所用，术语“任选取代的N-保护的氨基”表示如本文所定义的取代的氨基，其中如果N-保护的氨基，则至少一个取代基为N-保护基，另一个取代基为H。如果N-保护的氨基被取代，则其为未取代的，或为H以外的取代基。
如本文所用，术语“叠氮基”代表-N3基团。
如本文所用，术语“大分子基团”表示如本文所定义的任何取代基或取代基基团，其中如果自由基被sp3-杂化，则与二硫键的基团键接是带有一个氢原子或更少氢原子的碳原子。如果该自由基是sp2-杂化的碳，则碳原子或不具有氢原子。该自由基不是sp-杂化的碳。大分子基团仅通过碳原子键接至二硫键。
如本文所用，术语“5′-5′端帽结构”表示式R’-Nuc1-O-(LP)n-的基团，其中R′为磷酸酯，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，磷酸三酯，磷酸二酯，羟基或氢；Nuc1是核苷；每个LP独立地为-p(＝XE1)(-XE2-RE2A)-O-；n为1、2或3；
其中每个XE1和每个XE2独立地为O或S，每个RE2A独立地为氢、生物可逆基团、非生物可逆基团、辅助部分、缀合基团、键接至靶向部分的连接基或键接至靶向部分和一个或多个(例如1至6个)辅助部分；和
其中R′与核苷的3′-碳键接，-O-与核苷的5′-碳键接。
如本文所用，术语“封端基团”表示位于多核苷酸的5′-或3′-末端的单价或二价基团。封端基团是末端磷酸酯；二磷酸酯；三磷酸酯；辅助部分；生物可逆基团；非生物可逆基团；5′端帽结构(例如5′-5′端帽结构)；固相支持体；与靶向部分和任选地与一个或多个(例如1至6)辅助部分键接的接头；或-OR′基团，其中R′选自氢、生物可逆基团、非生物可逆基团、固体载体和O-保护基。-OR′基团、二磷酸酯、三磷酸酯、生物可逆基团、非生物可逆基团、固体支持物和辅助部分是一价封端基团的实例。末端磷酸酯是封端基团的一个实例，如果末端磷酸酯不包括与靶向部分的连接基，则其可以为单价，或者如果末端磷酸酯包括与靶向部分的连接基，则为二价的封端基团。键接至靶向部分(具有我们的无辅助部分)的连接基是二价封端基团的一个实例。
如本文所用，术语“碳环的”表示任选取代的C3-16单环，双环或三环结构，其中可以为芳族或非芳族的环由碳原子形成。碳环结构包括环烷基，环烯基，环炔基和某些芳基。
如本文所用，术语“羰基”表示-C(O)-基团。
如本文所用，表述“Cx-y”表示当未取代时，其名称后紧跟该表述的基团包含总共x至y个碳原子。如果该基团是复合基团(例如芳基烷基)，则Cx-y表示该部分的名称紧随表达式之后，当未被取代时，总共包含x至y个碳原子。例如，(C6-10-芳基)-C1-6-烷基是这样的基团，其中芳基部分当未被取代时，总共包含6至10个碳原子，而烷基部分当未被取代时，含有1至6个碳原子。
如本文所用，术语“氰基”表示-CN基团。
如本文所用，术语“环加成反应”表示两种组分的反应总共[4n+2]π个电子参与键形成，其中当不存在活化，通过化学催化剂活化或使用热能活化时，n为1、2或3。环加成反应也是两个成分的反应，其中涉及[4n]π电子，存在光化学活化，并且n为1，2或3。最优方案，[4n+2]π电子参与键形成，n＝1。代表性的环加成反应包括烯烃与1，3-二烯的反应(Diels-Alder反应)，烯烃与α，β-不饱和羰基的反应(杂Diels-Alder反应)，以及炔烃与叠氮基化合物的反应(例如，Hüisgen环加成反应)。
除非另有说明，否则本文所用的术语“环烯基”是指在环中具有至少一个双键并且具有三个至十个碳的非芳族碳环基团(例如，C3-C10环烯基)。环烯基的非限制性实例包括环丙-1-烯基，环丙-2-烯基，环丁-1-烯基，环丁-1-烯基，环丁-2-烯基，环戊-1-烯基，环戊-2-烯基，环戊-3-烯基，降冰片烯-1-基，降冰片烯-2-基，降冰片烯-5-基和降冰片烯-7-基。环烯基可以是如对环烷基所述未取代的或取代的(例如，任选取代的环烯基)。
如本文所用，术语“环烯基烷基”表示各自被如本文所定义的被环烯基取代的烷基。环烯基和烷基部分可以被取代为本文定义的各个基团。
如本文所用，术语“亚环烯基”表示作为环烯基的二价基团，其中一个氢原子被价键取代。如本文对于环烷基所述，亚环烯基可以任选地被取代。亚环烯基的非限制性实例是环烯基-1，3-二基。
除非另有说明，否则本文所用的术语“环烷氧基”表示式-OR的化学取代基，其中R是环烷基。在一些实施方案中，环烷基可以如本文所定义被进一步取代。
除非另有说明，否则本文所用的术语“环烷基”是指具有三至十个碳的环状烷基(例如，C3-C10环烷基)。环烷基可以是单环或双环的。双环环烷基可以是双环[p.q.0]烷基类型，其中p和q各自独立地为1、2、3、4、5、6或7，条件是p和q之和为2，3、4、5、6、7或8。或者，双环环烷基可包括桥接的环烷基结构，例如双环[p.q.r]烷基，其中r为1、2或3，p和q分别独立地为1、2、3、4、5或6，条件是p，q和r之和为3、4、5、6、7或8。环烷基可以是螺环基，例如，螺烷基[p.q]，其中p和q各自独立地为2、3、4、5、6或7，条件是p和q之和为4、5、6、7、8或9。环烷基的非限制性实例包括环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环庚基，1-双环[2.2.1.]庚基，2-双环[2.2.1.]庚基，5-双环[2.2.1.]庚基，7-双环[2.2.1.]庚基和十氢萘基。环烷基可以是未取代的或被1、2、3、4或5个独立地选自以下的取代基取代的(例如，任选取代的环烷基)：烷基；烯基；炔基；烷氧基；烷基亚磺酰基；烷基亚硫基；烷基磺酰基；氨基；芳基；芳氧基；叠氮；环烷基；环烷氧基；环烯基；环炔基；卤代；杂烷基；杂环基；(杂环基)氧基；羟基；硝基；巯基；硅烷基；氰基；＝O；＝S；＝NR’，其中R’是H，烷基，芳基或杂环基。每个取代基本身可以是未取代的，或被本文为每个相应基团定义的未取代的取代基取代。
如本文所用，术语“环烷基烷基”表示被如本文所定义的环烷基取代的烷基。环烷基和烷基部分可以任选地被取代为本文所述的各个基团。
如本文所用，术语“亚环烷基”表示作为环烷基的二价基团，其中一个氢原子被价键取代。环亚烷基的非限制性实例是环烷-1，3-二基。环亚烷基可以如本文对于环烷基所述任选地被取代。
如本文所用，除非另有说明，否则术语“环炔基”是指具有一个或两个碳-碳三键并且具有八个至十二个碳的单价碳环基团。环炔基可包含一个跨环键或桥。环炔基的非限制性实例包括环辛炔基，环壬炔基，环癸炔基和环癸二炔基。环炔基可未取代或如本文对于环烷基所定义的取代(例如，任选取代的环炔基)。
如本文所用，术语“二氢哒嗪基团”表示可通过在1，2，4，5-四嗪基团和应变的环烯基之间环加成而获得的二价基团。
如本文所用，术语“卤代”表示选自溴，氯，碘和氟的卤素。
如本文所用，术语“5-卤代嘧啶核苷”表示核苷，其中核碱基是具有以下结构的5-卤代尿嘧啶：
Figure BDA0002320320380000401
其中R是与所述核苷的五呋喃糖的异头碳键接的键，且X是氟，氯，溴，碘。在一些实施方案中，X是溴或碘。
如本文所用，术语“杂烷烃-四基”是指一次插入一个杂原子的烷烃-四基；两次，每次独立地插入一个杂原子；3次，每次独立地插入一个杂原子；或四次，每次独立地插入一个杂原子。每个杂原子独立地是O，N或S。在一些实施方案中，杂原子是O或N。未取代的Cx-Y杂烷烃-四基含有X至Y个碳原子以及本文所定义的杂原子。杂烷烃-四基可以是未取代的或如对于杂烷基所述取代(例如，任选取代的杂烷烃-四基)。
如本文所用，术语“杂烷烃-三基”是指一次插入一个杂原子的烷烃-三基；两次，每次独立地插入一个杂原子；3次，每次独立地插入一个杂原子；或四次，每次独立地插入一个杂原子。每个杂原子独立地是O，N或S。在一些实施方案中，杂原子是O或N。未取代的CX-Y杂烷烃-三基含有X至Y个碳原子以及如本文所定义的杂原子。杂烷烃-三基可以是未取代或如对于杂烷基所述的取代(例如，任选取代的杂烷烃-三基)。
如本文所用，术语“杂烷基”是指一次被插入一个或两个杂原子的烷基，烯基或炔基；两次，每次独立地被一个或两个杂原子取代；三次，每次独立地由一个或两个杂原子组成；或四次，分别独立地被一个或两个杂原子取代。每个杂原子独立地是O，N或S。在一些实施方案中，杂原子是O或N。杂烷基基团都不包括两个连续的氧或硫原子。杂烷基可以是未取代的或取代的(例如，任选取代的杂烷基)。当杂烷基被取代并且取代基与杂原子键接时，根据杂原子的性质和价键选择取代基。因此，在价键允许的情况下，键接至杂原子的取代基选自＝O，-N(RN2)2，-SO2ORN3，-SO2RN2，-SORN3，-COORN3，N-保护基，烷基，烯基，炔基，芳基，环烷基，环烯基，环炔基，杂环基或氰基，其中每个RN2独立地为H，烷基，环烷基，环烯基，环炔基，芳基或杂环基，每个RN3独立地为烷基，环烷基，环烯基，环炔基，芳基或杂环基。这些取代基中的每一个本身可以是未取代的，也可以被本文定义的每个基团的未取代的取代基取代。当杂烷基被取代并且该取代基与碳键接时，该取代基选自烷基中所述的那些，条件是与该杂原子键接的碳原子上的取代基不是Cl，Br或I。可以理解，碳原子是在杂烷基的末端发现。
如本文所用，术语“杂芳氧基”是指-OR结构，其中R为杂芳基。杂芳氧基可以如对杂环基所定义的那样被任选地取代。
如本文所用，术语“杂环基”表示具有稠合或桥接的5-、6-、7-或8-元环的单环、双环、三环或四环系统，除非另有说明，否则包含一个、两个、三个或四个杂原子，杂原子独立地选自氮、氧和硫。杂环基可以是芳族或非芳族的。非芳香族5元杂环基具有零个或一个双键，非芳香族6元和7元杂环基具有零个至两个双键，非芳族8元杂环基具有零至两个双键和/或零或一个碳-碳三键。除非另有说明，否则杂环基包括1至16个碳原子。某些杂环基可包含多达9个碳原子。非芳族杂环基包括吡咯啉基，吡咯烷基，吡唑啉基，吡唑烷基，咪唑啉基，咪唑烷基，哌啶基，高哌啶基，哌嗪基，哒嗪基，恶唑啉基，异恶唑啉基，吗啉基，硫代吗啉基，噻唑烷基，异噻唑烷基，噻唑烷基，四氢呋喃基，二氢呋喃基，四氢噻吩基，二氢噻吩基，二氢吲哚基，四氢喹啉基，四氢异喹啉基，吡喃基，二氢吡喃基，二噻唑基等。如果杂环系统具有至少一个芳族共振结构或至少一个芳族互变异构体，则该结构为芳族杂环基(即杂芳基)。杂芳基的非限制性实例包括苯并咪唑基，苯并呋喃基，苯并噻唑基，苯并噻吩基，苯并恶唑基，呋喃基，咪唑基，吲哚基，异吲唑基，异喹啉基，异噻唑基，异噻唑基，异恶唑基，恶二唑基，恶唑基，嘌呤基，吡咯基，吡啶基，吡嗪基，嘧啶基，喹唑啉基，喹啉基，噻二唑(例如1，3，4-噻二唑)，噻唑基，噻吩基，三唑基，四唑基等。术语“杂环基”还表示具有桥联多环结构的杂环化合物，其中一个或多个碳和/或杂原子桥联一个单环的两个非相邻成员，例如，奎尼丁、托品烷或二氮杂双环[2.2.2]辛烷。术语“杂环基”包括双环、三环和四环基团，其中任何上述杂环稠合至一个、两个或三个碳环上，例如芳基环、环己烷环、环己烯环、环戊烷环、环戊烯环或另一个单环杂环。稠合杂环基的实例包括1，2，3，5，8，8a-六氢吲哚嗪；2，3-二氢苯并呋喃；2，3-二氢吲哚；和2，3-二氢苯并噻吩。杂环基可以是未取代的或被1、2、3、4或5个独立地选自：烷基；烯基；炔基；烷氧基；烷基亚磺酰基；烷基亚硫基；烷基磺酰基；氨基；芳基；芳氧基；叠氮；环烷基；环烷氧基；环烯基；环炔基；卤代；杂烷基；杂环；(杂环基)氧基；羟基；硝基；巯基；硅烷基；氰基；＝O；＝S；＝NR’，其中R’是H、烷基、芳基或杂环基的取代基取代。每个取代基本身可以是未取代的，或被本文为每个相应基团定义的未取代的取代基取代。
如本文所用，术语“杂环基烷基”表示被杂环基取代的烷基，各自如本文所定义。杂环基和烷基部分可以任选地被取代作为本文所述的各个基团。
如本文所用，术语“(杂环基)氮杂”表示式-N(RN1)(RN2)的化学取代基，其中RN1为杂环基，且RN2为H，-OH，-NO2，-N(RN2)2，-SO2ORN2，-SO2RN2，-SORN2，-COORN2，N-保护基，烷基，烯基，炔基，烷氧基，芳基，芳烷基，芳氧基，环烷基，环烯基，杂烷基或杂环基。优选地，RN2是H。
如本文所用，术语“亚杂环基”代表杂环基，其中一个氢原子被价键取代。亚杂环基可以以对于杂环基所述的方式任选地被取代。亚杂环基的非限制性实例是杂环-1，3-二基。
本文所用的术语“(杂环基)氧基”表示式-OR的化学取代基，其中R为杂环基，除非另有说明。(杂环基)氧基可以以对于杂环基所述的方式任选地被取代。
如本文可互换使用的术语“羟基(hydroxyl)”和“羟基(hydroxy)”表示-OH基团。
如本文所用，术语“免疫调节多核苷酸”表示多核苷酸构建体，其包含总共6至50个通过核苷间桥连基团共价结合在一起的连续核苷，所述核苷间桥连基团独立地选自核苷间磷酸酯和任选的核苷间无碱基间隔子。所述免疫调节多核苷酸分别在5′-和3′-末端分别被5′-和3′-封端基团封端。所述免疫调节多核苷酸能够调节先天性免疫应答，如通过抗原呈递细胞中NFκB的活化变化或至少一个炎性细胞因子或至少一个I型干扰素的分泌变化所确定，免疫调节多核苷酸被递送到所述抗原呈递细胞(例如，与未向其递送免疫调节多核苷酸的另一种抗原呈递细胞相比)。所述免疫调节多核苷酸可以包含缀合基团，或者，如果所述免疫调节多核苷酸是缀合物的一部分，则可以包含与靶向部分以及任选地与一个或多个(例如1至6个)辅助部分(例如聚乙二醇)键接的接头。所述缀合基团或所述接头可以是磷酸三酯或末端封端基团的一部分。
如本文所用，术语“免疫刺激多核苷酸”表示能够激活先天性免疫应答的免疫调节多核苷酸，如通过例如抗原呈递细胞中NFκB的激活增加或至少一个炎性细胞因子或至少有一个I型干扰素的分泌的增加来确定，其中免疫刺激多核苷酸被递送到该抗原呈递细胞(例如，与未递送免疫刺激多核苷酸的另一种抗原呈递细胞相比)。在一些实施方案中，所述免疫刺激多核苷酸包含至少一个胞苷-p-鸟苷(CpG)序列，其中p是核苷间磷酸二酯(例如磷酸或硫代磷酸酯)或核苷间磷酸三酯或硫代磷酸三酯。如本文所用，所述含CpG的免疫刺激多核苷酸可以天然存在，例如细菌或病毒来源或合成的CpG ODN。例如，在一些实施方案中，所述免疫刺激多核苷酸中的CpG序列含有2′-脱氧核糖。在一些实施方案中，所述免疫刺激多核苷酸中的CpG序列是未甲基化的。在一些实施方案中，所述免疫刺激多核苷酸是本文提供的式(A)的寡核苷酸。在一些实施方案中，所述免疫刺激多核苷酸是本文提供的式(B)的化合物。
如本文所用，术语“免疫抑制多核苷酸”表示能够拮抗先天性免疫应答的免疫调节多核苷酸，其通过例如抗原呈递细胞中NFκB的活化的减少或至少一个炎性细胞因子或至少一个I型干扰素的分泌的减少来确定，其中免疫抑制多核苷酸被递送至所述抗原呈递细胞(例如，与未递送免疫抑制多核苷酸的另一种抗原呈递细胞相比)。
如本文所用，术语“核苷间桥连基团”表示核苷间磷酸酯或核苷间无碱基间隔子。
如本文所用，术语“5-修饰的胞苷”代表核苷，其中核碱基具有以下结构：
Figure BDA0002320320380000431
其中R是与所述核苷的五呋喃糖的异头碳键接的键，且X是卤素，炔基，烯基，烷基，环烷基，杂环基或芳基。在一些实施方案中，所述5-修饰的胞苷是5-卤代胞苷(例如5-碘胞苷或5-溴胞苷)。在其他实施方案中，所述5-修饰的胞苷是5-炔基胞苷。
如本文所用，术语“5-修饰的尿苷”代表核苷，其中核碱基具有以下结构：
Figure BDA0002320320380000432
其中R是与所述核苷的五呋喃糖的异头碳键接的键，并且X是卤素，烷基，烯基，炔基，环烷基，杂环基或芳基，条件是所述5-修饰的尿苷不是胸苷。在一些实施方案中，所述5-修饰的尿苷是5-卤代尿苷(例如5-碘代尿苷或5-溴代尿苷)。在其他实施方案中，所述5-修饰的尿苷是5-炔基尿苷。在一些实施方案中，所述5-修饰的尿苷是含有2-脱氧核糖的核苷。
如本文所用，术语“硝基”表示-NO2基团。
如本文所用，术语“非生物可逆的(non-bioreversible)”是指在内体内部存在的条件下对降解具有抗性的化学基团。非生物可逆基团不包含硫酯和/或二硫键。
如本文所用，术语“核碱基”表示结合至核苷酸或核苷的糖部分的1′位置的含氮杂环。核碱基可以是未修饰的或修饰的。如本文所用，“未修饰的”或“天然的”核碱基包括嘌呤碱基的腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基的胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的核碱基包括其他合成和天然核碱基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C或m5c)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，6-甲基和其他烷基衍生物的腺嘌呤和鸟嘌呤，2-丙基和其他烷基衍生物的腺嘌呤和鸟嘌呤，2-硫尿嘧啶，2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶，5-卤尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-卤代，8-氨基，8-硫醇，8-硫代烷基，8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代特别是5-碘，5-溴，5-三氟甲基等5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，5-炔基(例如5-乙炔基)尿嘧啶，5-乙酰氨基-尿嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮杂鸟嘌呤和7-脱氮杂腺嘌呤和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。其他核碱基包括在美国专利No.3,687,808；The Concise Encyclopedia Of Polymer Science AndEngineering，第858-859页，Kroschwitz，J.I.，ed.John Wiley&Sons，1990；Englisch等，Angewandte Chemie，International Edition，1991，30，613；Sanghvi，Y.S.，Chapter 15，Antisense Research and Applications，第289-302页，(Crooke等，ed.，CRC Press，1993)所公开的内容。某些核碱基对于增加本发明的杂交多核苷酸的结合亲和力特别有用，所述多核苷酸包括5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶和N-2，N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤，5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已经显示5-甲基胞嘧啶取代可将核酸双链体稳定性提高0.6-1.2℃(Sanghvi等，eds.，Antisense Research and Applications 1993，CRCPress，Boca Raton，第276-278页)。在特定的实施方案中，这些可以与2′-O-甲氧基乙基糖修饰结合。教导制备某些这些修饰的核碱基以及其他修饰的核碱基的美国专利包括但不限于上述美国专利编号：3,687,808；4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121；5,596,091；5,614,617；和5,681,941。为了本公开的目的，本文所用的“修饰的核碱基”还表示天然或非天然的核碱基，其包括一个或多个本文所述的保护基。
如本文所用，术语“核苷”代表五呋喃糖-核碱基的组合。所述五呋喃糖是2-脱氧核糖或其修饰形式，其中位置2被OR、R、卤素(例如，F)、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN取代，其中R是任选取代的C1-6烷基(例如，C1-6烷基或(C1-6烷氧基)-C1-6-烷基)或任选取代的(C6-14芳基)-C1-4烷基。在某些实施方案中，位置2被OR或F取代，其中R是C1-6烷基或(C1-6-烷氧基)-C1-6-烷基。所述五呋喃糖在异头碳键接至核碱基。在一些实施方案中，术语“核苷”是指具有以下结构的二价基团：
Figure BDA0002320320380000451
其中B1是一个核碱基；Y为H，卤素(例如F)，羟基，任选取代的C1-6烷氧基(例如甲氧基或甲氧基乙氧基)或保护的羟基；Y1是H或C1-6烷基(例如甲基)；每个3′和5′分别表示与另一个基团键接的键的位置。
如本文所用，术语“核苷酸”是指与磷酸酯，硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键接的核苷。
如本文所用，术语“氧代”表示二价氧原子(例如，氧代的结构可以显示为＝O)。
如本文所用，术语“患者”表示人类或非人类动物(例如，哺乳动物)。在一些实施方案中，对象可能患有由合格专业人员(例如医生或护士从业人员)确定的肿瘤(例如液体肿瘤或实体瘤)，无论是否对来自患者的样本经过本领域实验室测试。
如本文所用，术语“Ph”表示苯基。
如本文所用，术语“磷酸酯(phosphoester)”表示包含磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯的基团，其中至少一个价键与非氢取代基共价键接，条件是至少一个非氢取代基是含有至少一个核苷的基团。其中一个和唯一一个价键与含有核苷的基团共价键接的磷酸酯是末端磷酸酯。其中两个价键与含核苷基团共价键接的磷酸酯是核苷间磷酸酯。磷酸酯可以是具有以下结构的基团：
Figure BDA0002320320380000452
其中
XE1和XE2各自独立地为O或S；
RE1和RE3各自独立地为氢或与核苷；无碱基间隔子的糖类似物；生物可逆基团；非生物可逆基团；辅助部分；缀合基团；键接至靶向部分的接头；键接至靶向部分和一个或多个(例如1至6个)辅助部分的接头；或式-P(＝XE1)(-XE2-RE2A)-O-中的磷原子键接的键，
其中RE2A是氢，生物可逆基团，非生物可逆基团，辅助部分，缀合基团，与靶向部分键接的接头或键接至靶向部分和一个或多个(例如1至6个)辅助部分的接头；
条件是RE1和RE3中的至少一个与包含至少一个核苷的基团键接。如果RE1和RE3中的每一个独立地与包含至少一个核苷的基团键接的键，则该磷酸酯是核苷间磷酸酯。如果RE1和RE3之一与不包含核苷的基团键接的键，则该磷酸酯为末端磷酸酯。
本文所用的术语“磷酸二酯”是指磷酸酯，其中三个价键中的两个被非氢取代基取代，而剩余价键被氢取代。磷酸二酯由如下部分组成：磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯；与核苷、无碱基间隔子和/或磷酰基的一个或两个键；如果磷酸二酯仅包含一个与核苷、无碱基间隔子或磷酰基的键，则一个独立地选自生物可逆基团的基团；非生物可逆基团；辅助部分；缀合基团；与靶向部分键接的接头或键接至靶向部分和一个或多个(例如1至6个)辅助部分的接头。末端磷酸二酯包括与含有核苷的基团的一个键，和一个基团，其选自生物可逆基团、非生物可逆基团、辅助部分、缀合基团、与靶向部分键接的接头或键接至靶向部分和一个或多个(例如1至6个)辅助部分的接头。核苷间磷酸二酯包括与含核苷基团的两个键。磷酸二酯可以是具有以下结构的基团：
Figure BDA0002320320380000461
其中
XE1和XE2各自独立地为O或S；
RE1和RE3各自独立地为氢或与核苷；无碱基间隔子的糖类似物；生物可逆基团；非生物可逆基团；辅助部分；缀合基团；与靶向部分键接的接头或键接至靶向部分和一个或多个(例如1至6个)辅助部分的接头；或式-P(＝XE1)(-XE2-RE2A)-O-中的磷原子键接的键，
其中RE2A是氢，生物可逆基团，非生物可逆基团，辅助部分，缀合基团，与靶向部分键接的接头或键接至靶向部分和一个或多个(例如1至6个)辅助部分的接头；和
RE2是氢，生物可逆基团，非生物可逆基团，辅助部分，缀合基团，与靶向部分键接的接头或键接至靶向部分和一个或多个(例如1至6个)辅助部分的接头；
条件是RE1，RE2和RE3中只有一个是氢；和
条件是RE1和RE3中的至少一个与包含至少一个核苷的基团键接的键。
如果RE1和RE3的两者均是与包含至少一个核苷的基团键接的键，则磷酸二酯为核苷间磷酸二酯。如果RE1和RE3中的有且只有一个是与包含核苷的基团键接的键，则磷酸二酯为末端磷酸二酯。
如本文所用，术语“磷酰基”是指下式的取代基
-P(＝XE1)(-XE2-RE2A)-O-RE3A，
其中
XE1和XE2中的每一个独立地为O或S；
RE2A是氢、生物可逆基团、非生物可逆基、辅助部、缀合基团、与靶向部分键接的接头或键接至靶向部分和一个或多个(例如1至6个)辅助部分的接头，和
RE3A是氢或开放的价键。
当基团被识别为键接至磷酰基时，该基团键接至磷酰基的磷原子。
如本文所用，术语“磷酸三酯”是指其中所有三个价键均被非氢取代基取代的磷酸酯。磷酸三酯由如下组成：磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯；核苷，无碱基间隔子和/或磷酰基的一个或两个键；一个或两个基团，其独立地选自：生物可逆基团的；非生物可逆基团；辅助部分；缀合基团；和与靶向部分和任选的一个或多个(例如1至6个)辅助部分键接的接头；。末端磷酸三酯包括与包含核苷的基团的一个键和两个基团，其独立地选自生物可逆基团；非生物可逆基团；辅助部分；缀合基团；和与靶向部分和任选一个或多个(例如1至6个)辅助部分键接的接头；。在一些实施方案中，末端磷酸三酯包含键接至靶向部分以及任选地结合至一个或多个(例如1至6)辅助部分的1或0个接头。核苷间磷酸三酯包括与含核苷基团的两个键。磷酸三酯可以是具有以下结构的基团：
Figure BDA0002320320380000471
其中
XE1和XE2各自独立地为O或S；
RE1和RE3各自独立地是与核苷；无碱基间隔子的糖类似物；生物可逆基团；非生物可逆基团；辅助部分；缀合基团；与靶向部分键接的接头；键接至靶向部分和一个或多个(例如1至6个)辅助部分的接头；或式-P(＝XE1)(-XE2-RE2A)-O-中的磷原子键接的键，
其中RE2A是氢；生物可逆基团；非生物可逆基团；辅助部分；缀合基团；与靶向部分键接的接头或键接至靶向部分和一个或多个(例如1至6个)辅助部分的接头；和
RE2是生物可逆基团；非生物可逆基团；辅助部分；缀合基团；一个与靶向部分键接的接头或键接至靶向部分和一个或多个(例如1至6个)辅助部分的接头；
条件是RE1和RE3中的至少一个是与包含至少一个核苷的基团键接的键。如果RE1和RE3均是与包含至少一个核苷的基团键接的键，则磷酸三酯为核苷间磷酸三酯。如果RE1和RE3中只有一个与包含核苷的基团键接的键，则磷酸三酯为末端磷酸三酯。
如本文所用，术语“生理条件”是指可能存在于活的、哺乳动物的、专业抗原呈递细胞内的条件。生理条件包括温度从大约35℃到大约42℃和水性pH大约6到大约8。
如本文所用，术语“保护基”表示旨在保护羟基、氨基或羰基免于参与化学合成期间的一个或多个不希望的反应的基团。如本文所用，术语“O-保护基”表示旨在保护羟基或羰基免于参与化学合成期间的一个或多个不希望的反应的基团。如本文所用，术语“N-保护基”表示旨在保护含氮(例如，氨基或肼)基团免于参与化学合成期间的一个或多个不希望的反应的基团。常用的O-和N-保护基在Greene，“Protective Groups in OrganicSynthesis，”3rd Edition(John Wiley&Sons，New York，1999)中公开，其通过引用并入本文。示例性的O-和N-保护基包括烷酰基，芳酰基或氨基甲酰基，例如甲酰基，乙酰基，丙酰基，新戊酰基，叔丁基乙酰基，2-氯乙酰基，2-溴乙酰基，三氟乙酰基，三氯乙酰基，邻苯二甲酰基，邻硝基苯氧基乙酰基，α-氯丁酰基，苯甲酰基，4-氯苯甲酰基，4-溴苯甲酰基，叔丁基二甲基甲硅烷基，三异丙基甲硅烷基氧甲基，4，4′-二甲氧基三苯甲基，异丁酰基，苯氧基乙酰基，4-异丙基苯氧基乙酰基，二甲基甲酰胺基和4-硝基苯甲酰基。
用于保护含羰基的基团的示例性O-保护基包括但不限于：缩醛，酰基，1，3-二硫杂环戊烷，1，3-二氧六环，1，3-二氧戊环和1，3-二硫杂环戊烷。
其他O-保护基包括但不限于：取代的烷基，芳基和芳基-烷基醚(例如，三苯甲基；甲硫基甲基；甲氧基甲基；苄氧基甲基；甲硅烷氧基甲基；2，2，2，-三氯乙氧基甲基；四氢吡喃基；四氢呋喃基；乙氧基乙基；1-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]乙基；2-三甲基甲硅烷基乙基；叔丁基醚；对氯苯基；对甲氧基苯基；对硝基苯基；苄基；对甲氧基苄基和硝基苄基)；甲硅烷基醚(例如三甲基甲硅烷基；三乙基甲硅烷基；三异丙基甲硅烷基；二甲基异丙基甲硅烷基；叔丁基二甲基甲硅烷基；叔丁基二苯基甲硅烷基；三苄基甲硅烷基；三苯基甲硅烷基；和二苯甲基甲硅烷基)；碳酸盐(例如，甲基，甲氧基甲基，9-芴基甲基；乙基；2,2,2-三氯乙基；2-(三甲基甲硅烷基)乙基；乙烯基，烯丙基，硝基苯基；苄基；甲氧基苄基；3，4-二甲氧基苄基；和硝基苄基)。
其他N-保护基包括但不限于手性助剂，例如保护的或未保护的D，L或D、L-氨基酸，例如丙氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸等；含磺酰基的基团，例如苯磺酰基，对甲苯磺酰基等；氨基甲酸酯形成基团，例如苄氧基羰基，对氯苄氧基羰基，对甲氧基苄氧基羰基，对硝基苄氧基羰基，2-硝基苄氧基羰基，对溴苄氧基羰基，3，4-二甲氧基苄氧基羰基，3，5-二甲氧基苄氧基羰基，2，4-二甲氧基苄氧基羰基，4甲氧基苄氧基羰基，2-硝基-4，5-二甲氧基苄氧基羰基，3，4，5三甲氧基苄氧基羰基，1-(对联苯甲酰基)-1-甲基乙氧基羰基，α，α-二甲基-3，5二甲氧基苄氧基羰基，苯甲酰氧基羰基，叔丁氧基羰基，二异丙基甲氧基羰基，异丙氧基羰基，乙氧基羰基，甲氧基羰基，烯丙氧基羰基，2，2，2-三氯乙氧基羰基，苯氧基羰基，4-硝基苯氧基羰基，芴基-9-甲氧基羰基，环戊基氧基羰基，金刚烷氧基羰基，环己基氧基羰基，苯硫羰基等，芳基烷基如苄基，三苯基甲基，苄氧基甲基等，以及甲硅烷基如三甲基甲硅烷基等。有用的N-保护基是甲酰基，乙酰基，苯甲酰基，新戊酰基，叔丁基乙酰基，丙氨酰基，苯磺酰基，苄基，叔丁氧羰基(Boc)和苄氯羰基(Cbz)。
如本文所用，术语“吡啶-2-基腙”代表结构的基团：
Figure BDA0002320320380000491
Figure BDA0002320320380000492
其中每个R′独立为H或任选取代的C1-6烷基。吡啶-2-基腙可以是未取代的(即每个R′为H)。
如本文所用，术语“立体化学富集的”是指相对于相同基团的相反立体异构构型，对所列举基团的一个立体异构构型的局部立体化学偏好。因此，含有立体化学富集的硫代磷酸酯的多核苷酸是链，其中预定立体化学的硫代磷酸酯优先于相反立体化学的硫代磷酸酯存在。可以使用预定立体化学的硫代磷酸酯的非对映体比率在数值上表达该偏好。预定立体化学的硫代磷酸酯的非对映异构体比率是具有预定的立体化学的硫代磷酸酯的非对映异构体相对于具有相反的立体化学的识别的硫代磷酸酯的非对映异构体的摩尔比。预定立体化学的硫代磷酸酯的非对映体比率可以大于或等于1.1(例如，大于或等于4，大于或等于9，大于或等于19，或大于或等于39)。
如本文所用，术语“Q-标签”是指含有谷氨酰胺残基的多肽的一部分，其在与谷氨酰胺酶与含有-NH2胺的化合物进行转谷氨酰胺酶介导的反应后，提供了含有多肽的一部分的缀合物。其中谷氨酰胺残基包括侧链，该侧链经修饰以包括与化合物键接的酰胺。Q-标签是本领域已知的。Q-标签的非限制性实例是LLQGG和GGGGLLQGG。
如本文所用，术语“应变的环烯基”是指如果开放价被H取代的环烯基，其环应变能为至少16kcal/mol。
如本文所用，术语“糖类似物”表示为C3-6单糖或C3-6糖醇(例如甘油)的二价或三价基团，其被修饰以取代两个羟基以键接至磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯或封端基团中的氧原子。糖类似物不包含能够与互补链中的核碱基进行氢键键合的核碱基。糖类似物是环状或无环的。糖类似物中包含的其他可选修饰是：用H取代一个、两个或三个其余的羟基或与碳键接的氢原子；任选取代的C1-6烷基；本文定义的-LinkA(-T)p；缀合基团；-(CH2)t1-ORZ，其中t1是1到6的整数，并且Rz是任选取代的C1-6烷基，任选取代的C2-6烯基，任选取代的C2-6炔基，任选取代的C6-14芳基，取代的C3-8环烷基，任选取代的(C1-9杂环基)-C1-6-烷基，任选取代的(C6-10芳基)-C1-6-烷基或任选取代的(C3-8环烷基)-C1-6-烷基；；引入一个或两个不饱和键(例如一个或两个双键)；用一个烷基、烯基、环烷基、环烯基或杂环基所定义的取代基取代一个、两个或三个氢或羟基。糖类似物的非限制性实例是任选取代的C2-6亚烷基，任选取代的C2-6亚烯基，任选取代的C5环烷-1，3-二基，任选取代的C5环烯-1，3-二基，任选取代的杂环-1，3-二基(例如，任选取代的吡咯烷-2，5-二基，任选取代的四氢呋喃-2,5-二基或任选取代的四氢噻吩-2，5-二基)或任选取代的(C1-4烷基)-(C3-8亚烷基)(例如，任选取代的(C1烷基)-(C3环亚烷基))。
如本文所用，术语“硫化物”表示二价-S-或＝S基团。二硫化物是-S-S-。
如本文所用，术语“靶向部分”表示与给定靶细胞群(例如，抗原呈递细胞(APC；例如，专业APC(例如，B细胞，pDC或巨噬细胞)))相关的受体或其他受体部分特异性结合或反应性缔合或复合的部分(例如小分子，例如碳水化合物)。本发明的缀合物包含靶向部分。所述靶向部分可以是抗体或其抗原结合片段或其工程化衍生物(例如，Fcab或融合蛋白(例如，scFv))。所述靶向部分可以是多肽。或者，所述靶向部分可以是小分子(例如，甘露糖)或小分子簇(例如，甘露糖簇)。包括靶向部分的本发明的缀合物对于与靶向部分结合的靶标可显示小于100nM的Kd。使用本领域已知的方法，例如使用表面等离振子共振(SPR)，例如使用BIACORETM系统(GE Healthcare，Little Chalfont，the United Kingdom)测量Kd。
如本文所用，术语“1，2，4，5-四嗪基团”表示下式的基团，
Figure BDA0002320320380000511
其中R’是任选取代的烷基，任选取代的芳基，任选取代的环烷基，任选取代的杂环基；R”为任选取代的亚烷基，任选取代的杂亚烷基，任选取代的亚芳基，任选取代的亚环烷基，任选取代的亚杂环基或基团-Ra-Rb-，其中Ra和Rb各自独立地为任选取代的亚烷基，任选取代的杂亚烷基，任选取代的亚芳基，任选取代的亚环烷基或任选取代的亚杂环基。
术语“治疗作用”是指由药理活性物质引起的在对象、特别是哺乳动物、更特别是人类中的局部或全身作用。因此，该术语是指旨在用于诊断、治愈、缓解、治疗或预防疾病或增强动物或人类所需的身心发育和状况的任何物质。如本文所用，术语“治疗有效量”或“治疗有效剂量”表示改善，治疗或至少部分地抑制要治疗的疾病的症状所必需的免疫调节多核苷酸或缀合物的量。对于该用途有效的量取决于疾病的严重程度以及对象的体重和总体状况。通常，体外使用的剂量可以在体内施用药物组合物的量方面提供有用的指导，并且动物模型可以用于确定治疗特定疾病的有效剂量。
如本文所用，术语“硫代羰基”表示C(＝S)基团。
如本文所用，术语“硫杂亚杂环基”表示基团-SR-，其中R为亚杂环基。硫杂亚杂环基可以以对于杂环基所述的方式任选地被取代。
如本文所用，术语“硫醇”表示-SH基团。
参照患者的疾病或病症使用的术语“治疗”旨在指通过施用本发明的多核苷酸或缀合物在患者中获得有益的或期望的结果，例如临床结果给病人有益或期望的结果可能包括缓解或改善一种疾病或病症的一种或多种症状；疾病或状况范围的缩小；使疾病或状况稳定(即不恶化)；预防疾病或状况的传播；延缓或减缓疾病或状况的进展；减轻疾病或状况；和缓解(无论是部分缓解还是全部缓解)。“缓解”疾病或病症是指与不进行抗抑郁药治疗的程度或时间相比，疾病或病症的程度和/或不良临床表现有所减轻，和/或进展的时程减慢了的多核苷酸或缀合物的发明。
如本文所用，术语“三唑并环亚烯基”是指含有与8元环稠合的1，2，3-三唑环的杂环烯基，其所有内环原子均为碳原子，并且桥头原子为sp2-杂化的碳原子。三唑环亚烯基任选以杂环基描述的方式被取代。
如本文所用，术语“三唑杂亚杂环基”是指含有稠合至包含至少一个杂原子的8元环的1，2，3-三唑环的亚杂环基。三唑杂亚杂环基中的桥头原子是碳原子。三唑杂亚杂环基可以以对杂环基所述的方式任选地被取代。
应理解，术语“免疫调节多核苷酸”、“免疫刺激多核苷酸”、“免疫抑制多核苷酸”和“缀合物”分别包括免疫调节多核苷酸、免疫刺激多核苷酸、免疫抑制多核苷酸和缀合物的盐。例如，术语“免疫调节多核苷酸”、“免疫刺激多核苷酸”、“免疫抑制多核苷酸”和“缀合物”涵盖磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯的质子化中性形式(P-XH部分，其中X为O或S)，和磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯的去质子化离子形式(P-X-部分，其中X为O或S)。因此，应理解，描述为具有RE1，RE2和RE3中的一个或多个作为氢的磷酸酯和磷酸二酯涵盖了盐，其中磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯以去质子化的离子形式存在。
术语“先天性免疫应答”和“先天免疫”是本领域公认的，并且是指人体免疫系统在识别病原体相关分子模式时启动的非特异性防御机制，其涉及不同形式的细胞活性包括通过各种途径产生的细胞因子和细胞死亡。如本文所用，先天性免疫应答包括由toll样受体9(TLR9)介导的对包含CpG的免疫刺激多核苷酸的细胞应答，其包括但不限于增加炎症细胞因子的产生(例如I型干扰素或IL-10产生)，激活NFκB通路，增加免疫细胞的增殖、成熟、分化和/或存活，并在某些情况下诱导细胞凋亡。可以使用本领域已知的方法来检测先天免疫的激活，例如测量(NF)-κB的激活。
术语“适应性免疫应答”和“适应性免疫”在本领域中是公认的，并且是指机体的免疫系统在识别出特定抗原后启动的抗原特异性防御机制，包括体液应答和细胞介导的应答。如本文所用，适应性免疫应答包括由含CpG的免疫刺激多核苷酸触发和/或增强的细胞应答。在一些实施方案中，免疫刺激多核苷酸或其一部分是抗原特异性适应性免疫应答的抗原靶标。在其他实施方案中，免疫刺激多核苷酸不是抗原特异性适应性免疫应答的抗原靶标，但是仍然增强了适应性免疫应答。可以使用本领域已知的方法来检测适应性免疫应答的激活，例如测量抗原特异性抗体的产生或抗原特异性细胞介导的细胞毒性水平。
术语“Toll样受体”(或“TLR”)在本领域中是公认的，并且是指模式识别受体的家族，其最初被识别为识别微生物病原体的先天免疫系统的传感器。TLRs识别微生物中的不同结构，通常称为“PAMPs”(病原体相关的分子模式)。配体与TLR的结合会激活一系列细胞内信号传导途径，从而诱导先天性免疫应答和/或适应性免疫应答。如本文所用，术语“toll样受体”或“TLR”还指细胞表达的toll样受体蛋白的功能片段。在人类中，已经鉴定出十种TLR，包括TLR-1，-2，-3，-4，-5，-6，-7/8和-9。D’Arpa和Leung，Adv.Wound Care，6：330-343(2017)，其内容通过引用整体并入本文。编码TLR的人类基因是已知的。
Toll样受体9(TLR9)，也称为CD289(分化簇289)，是toll样受体(TLR)家族的成员。Du et al.，Eur.Cytokine Netw.，11：362-371(2000)，其内容通过引用整体并入本文。TLR9是在免疫系统细胞(包括树突状细胞(DC)，B淋巴细胞，巨噬细胞，自然杀伤细胞和其他抗原呈递细胞)中表达的重要受体。TLR9激活触发信号级联，从而桥接先天免疫和适应性免疫。Martinez-Campos等，Viral Immunol.，30：98-105(2016)；Notley等，Sci.Rep.，7：42204(2017)；其每一个的内容通过引用整体并入本文。天然TLR-9激动剂包括含有未甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)的寡脱氧核苷酸(CpG ODN)。在本公开中发现使用的TLR-9配体包括但不限于天然存在的或合成的CpG ODN，以及本文提供的其他含CpG的免疫刺激多核苷酸和/或免疫缀合物。可以使用本领域已知的方法检测TLR9信号通路的激活，例如测量髓样分化抗原88(MyD88)的募集，核因子(NF)-κB、c-Jun N端激酶(JNK)和p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的激活，干扰素调节因子7的激活，一个或多个细胞因子(例如I型干扰素(IFN)、白介素(IL)-6、IL-10和IL-12)的表达水平，一个或多个免疫细胞群(如NK细胞，自然杀伤性T细胞，单核细胞)的激活以及细胞毒性淋巴细胞(CTL)和T辅助-1(Th1)应答的水平以及免疫球蛋白的分泌水平。
如本文所用，术语“TLR表达细胞”是指表达toll样受体并且能够在toll样受体与激动剂结合后激活toll样受体信号传导途径的细胞。Toll样受体可以在细胞的一个或多个细胞内区室例如内体或吞噬体的细胞表面和/或膜上表达。表达TLR的细胞可以进一步表达除toll样受体以外的一个或多个细胞表面抗原。某些免疫细胞表达TLR，并且免疫细胞中TLR信号传导途径的激活引发先天性免疫应答和/或适应性免疫应答。通过TLR信号通路激活的免疫细胞可以帮助从体内消除其他患病细胞。某些患病细胞(例如，癌细胞或病毒感染的细胞)表达TLR，并且患病细胞中TLR信号传导途径的激活可导致患病细胞死亡，例如通过诱导凋亡。表达TLR9的细胞的实例包括但不限于树突细胞(DCs)，B细胞，T细胞，郎格罕细胞，角质细胞，肥大细胞，内皮细胞，成肌纤维细胞和原代成纤维细胞。可以使用本领域已知的方法来确定细胞是否表达任何toll样受体(例如TLR9)，例如检测细胞中toll样受体的mRNA。
如本文所用，术语“免疫细胞”是本领域公认的，是指参与宿主防御机制的任何细胞，例如产生促炎性细胞因子的细胞和参与组织损伤和/或疾病的细胞发病。免疫细胞的例子包括但不限于T细胞，B细胞，自然杀伤细胞，嗜中性粒细胞，肥大细胞，巨噬细胞，抗原呈递细胞(APC)，嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞。
术语“抗原呈递细胞”或“APC”在本领域中是公认的，并且是指免疫细胞的异质群，其通过处理和呈递抗原以被某些淋巴细胞例如T细胞识别来介导细胞免疫应答。抗原呈递细胞的示例性类型包括但不限于专业抗原呈递细胞，包括例如B细胞，单核细胞，树突状细胞和郎格罕细胞，以及其他抗原呈递细胞包括例如角质细胞，内皮细胞，星形胶质细胞，成纤维细胞和少突胶质细胞。如本文所用，术语“抗原呈递细胞”包括在体内发现的抗原呈递细胞和在源自体内细胞的体外细胞培养物中发现的抗原呈递细胞。如本文所用，抗原呈递细胞还包括人工修饰的APC，例如经过基因修饰的APC，以表达toll样受体(例如TLR9)或调节Toll样受体的表达水平(例如TLR9)。
术语“树突状细胞”或“DC”在本领域中是公认的，并且是指专门的抗原敏感和抗原呈递细胞(APC)的异质群。人类DC分为三个主要子集：浆细胞样DC(pDC)，髓样DC(mDC)和单核细胞衍生DC(MDDC)。Schraml等，Curr.Opin.Immunol.，32：13-20(2015)；其内容通过引用整体并入本文。可以基于不同的TLR表达模式来识别DC的子集。举例来说，DC(mDC)的髓样或“常规”子集在刺激时表达TLRs 1-8，以及一系列促炎标记(例如CD80，CD86，I类和II类MHC，CCR7)促炎产生细胞因子和趋化因子。这种刺激和表达的结果是抗原特异性CD4+和CD8+T细胞启动。这些DC获得增强的吸收抗原并将其以适当形式呈递给T细胞的能力。DC(pDC)的浆细胞样亚群在激活后表达TLR7和TLR9，从而激活NK细胞和T细胞。
如本文所用，术语“抗原”是指能够引发免疫应答的分子或其抗原片段，所述免疫应答包括先天性免疫应答和适应性免疫应答。如本文所用，抗原可以是蛋白质，肽，多糖，脂质，核酸，尤其是RNA和DNA，核苷酸以及其他生物或生化物质。术语“引起免疫应答”是指响应于诸如抗原之类的刺激而在体内刺激免疫细胞。免疫应答包括细胞免疫应答，例如T细胞和巨噬细胞刺激，以及体液免疫应答，例如B细胞和补体刺激以及抗体产生。可以使用本领域熟知的技术来测量免疫应答，包括但不限于抗体免疫测定，增殖测定等。
术语“抗原片段”和“抗体结合片段”在本文可互换使用。本文所用的抗原片段能够在特定反应中与抗原结合分子例如抗体复合。本文所指的特异性反应表明抗原或抗原片段将以高度选择性的方式与其相应的抗体反应，而不与可能被其他抗原诱发的多种其他抗体反应。这种反应的特异性取决于抗原中是否存在一个或多个表位(免疫原性决定簇)。如本文所用，抗原或其抗原片段可以具有一个表位，或具有不止一个表位。
如本文所用，术语“T细胞表位”是指由T细胞产生的抗原的任何表位。
如本文所用，术语“肿瘤相关抗原”或“TAA”是指由接受本文所提供的治疗或预防护理的癌症患者中的癌细胞或实体瘤的基质中表达的抗原(例如，接受治疗剂量的免疫刺激多核苷酸或CpG-Ab免疫偶联物)。所述TAA在本文提供的治疗或预防护理中可能被靶向也可能不会被靶向。所述TAA不必在癌细胞上过度表达、突变或失调，但可以具有与正常细胞中TAA相同的功能。在一些实施方案中，所述TAA可以在癌细胞中过度表达，突变或失调。所述TAA可以是蛋白质，核酸，脂质或其他抗原。所述TAA可以是细胞表面表达的TAA，细胞内TAA或核内TAA。在实体瘤的情况下，所述TAA可以在实体瘤块的基质中表达。如本文所用，术语“基质”是指除了癌细胞以外的实体瘤块中的组分。例如，所述基质可以包括成纤维细胞，上皮细胞，其他血管成分或细胞外基质成分。如本文所用，术语“基质”不包括免疫系统的组分，例如免疫细胞(例如，B细胞，T细胞，树突状细胞，巨噬细胞，天然杀伤细胞等)。各种TAA是本领域已知的。可以使用本领域已知的方法来进行TAA的鉴定，例如Zhang等，MethodsMol.Biol.，520：1-10(2009)中公开的方法；其内容通过引用包含在本文中。
如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白家族的多肽，其能够非共价键地、可逆地且以特异性方式结合相应抗原。例如，天然存在的IgG抗体是四聚体，其包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1，CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分为高变异性区域，称为互补决定区(CDR)，其间散布着更为保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，四个FR从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。
如本文所用，抗体包括但不限于单克隆抗体，人抗体，人源化抗体，骆驼类抗体，嵌合抗体和抗独特型(抗-Id)抗体(包括例如本发明的抗体的抗-Id抗体)。抗体可以是任何同种型/类别(例如IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY)或亚类(例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)。
轻链和重链均分为结构和功能同源性区域。术语“常数”和“变量”在功能上使用。在这方面，应当理解，轻链(VL)和重链(VH)部分的可变结构域决定了抗原识别和特异性。相反，轻链(CL)和重链(CH1，CH2或CH3)的恒定结构域赋予重要的生物学特性，例如分泌，胎盘迁移性，Fc受体结合，补体结合等。按照惯例，恒定区结构域的编号随着其远离抗体的抗原结合位点或氨基末端而增加。N端是可变区，而C端是恒定区。CH 3和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基末端结构域。
如本文所用，取决于上下文，术语“抗体”也可以指抗体分子的抗原结合片段。如本文所用，术语“抗原结合片段”是指抗体的一个或多个部分，其保留与抗原的表位特异性相互作用(例如，通过结合，空间位阻，稳定/去稳定，空间分布)的能力。结合片段的实例包括但不限于单链Fv(scFv)，二硫键连接的Fvs(sdFv)，Fab片段，F(ab′)片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段。F(ab)2片段，是包含两个通过铰链区的二硫键连接的Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；Fv片段由抗体单臂的VL和VH结构域组成；dAb片段(Ward等，Nature，341∶544-546(1989))，其由VH或VL结构域组成；单结构域抗体(VHH)和分离的互补决定区(CDR)或抗体的其他表位结合片段。
术语“特异性结合”，“选择性结合”等是指两个分子、化合物、细胞和/或颗粒之间的化学相互作用，其中第一实体以比作为非靶的第三实体更高的特异性和亲和力与第二靶实体结合。在一些实施方案中，“特异性结合”可以指第一实体与第二靶标实体的亲和力，其是相对于对第三个非靶实体，至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍或更大的亲和力。在一些实施方案中，在描述抗原(或其抗原片段)和抗体(或其抗原结合片段)之间的相互作用的上下文中使用“特异性结合”。在特定的实施方案中，“特异性结合”是指抗体与预定抗原的解离常数(KD)为10-5M或更小，10-6M或更小，10-7M或更小，或抗体与预定抗原结合时，其KD值至少比与预定抗原以外的非特异性抗原结合时的KD值少两倍。在一些实施方案中，可使用特异性结合来确定在异质蛋白质和其他生物制剂中预定抗原的存在，例如在生物样品，例如血液、血清、血浆或组织样品中。因此，在某些指定的免疫测定条件下，具有特定结合特异性的抗体或结合剂与特定抗原的结合至少是背景的两倍，并且基本上不与样品中存在的其他抗原大量结合。在一个实施方案中，在指定的免疫测定条件下，具有特定结合特异性的抗体或结合剂与特定抗原结合至少是背景的两倍、三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍或十倍，并且基本上没有与样品中存在的其他抗原大量结合。在这种条件下与抗体或结合剂的特异性结合可能需要针对其对特定蛋白质的特异性选择抗体或结合剂。根据需要或适当，可以通过减去与来自其他物种(例如，小鼠或大鼠)或其他亚型的分子交叉反应的抗体来实现该选择。或者，在一些实施方案中，选择与某些所需分子交叉反应的抗体或抗体片段。
术语“癌”或“肿瘤”是指具有致癌细胞典型特征的细胞的存在，所述特征例如不受控制的增殖、永生、转移潜力、快速生长和增殖速率以及某些特征形态特征。在一些实施方案中，由于免疫检查点抑制剂例如PD-1，PD-L1和/或CTLA-4的表达和活性，此类细胞部分或全部显示出此类特征。癌细胞通常是实体瘤的形式，其可以基于肿瘤块而被检测到，例如通过诸如CAT扫描、MR成像、X射线、超声或触诊的过程，和/或基于由于从患者获得的样品中一种或多种癌症特异性抗原的表达而被检测到。在一些实施方案中，实体瘤不需要具有可测量的尺寸。癌细胞也可以是液体肿瘤的形式，该癌细胞可以单独存在或散布在动物体内。如本文所用，术语“弥散性肿瘤”和“液体肿瘤”可互换使用，并且包括但不限于白血病和淋巴瘤以及其他血细胞癌。
术语“白血病”是指以未成熟白细胞异常增加为特征的一种血液或骨髓癌，称为“原幼细胞”。白血病是广义的术语，涵盖多种疾病。反过来，它又是影响血液、骨髓和淋巴系统的更广泛疾病的一部分，这些疾病都被称为血液肿瘤。白血病可分为四个主要类别：急性淋巴细胞白血病(ALL)，急性髓性(或骨髓或非淋巴)白血病(AML)，慢性淋巴细胞白血病(CLL)和慢性髓性白血病(CML)。其他类型的白血病包括毛细胞白血病(HCL)，T细胞淋巴细胞性白血病(T-PLL)，大颗粒淋巴细胞性白血病和成人T细胞白血病。
术语“淋巴瘤”是指从淋巴细胞发展而来的一组血细胞肿瘤。淋巴瘤的两个主要类别是霍奇金淋巴瘤(HL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)淋巴瘤包括淋巴组织的任何肿瘤。主要类别是淋巴细胞的癌症，淋巴细胞是一种既属于淋巴液又属于血液并且遍及两者的白细胞。
如本文所用，术语“癌症”包括恶变前和恶性癌症，并且还包括原发性肿瘤(例如，其细胞未迁移至对象体内除原始肿瘤的部位以外的部位的那些)和继发性肿瘤(例如，那些因转移，肿瘤细胞迁移至与原始肿瘤部位不同的继发部位而引起的肿瘤)，复发性癌症和难治性癌症。
术语“癌症复发(recurrence)”和“癌症复发(relapse)”可互换使用，并且指缓解后症状，症状或疾病的复发。所述复发的癌细胞可能重新出现在所述原发性肿瘤的相同部位或其他位置，例如继发性癌症中。所述癌细胞可能以与原发性癌症相同的疾病形式或不同的疾病形式重新出现。例如，在一些实施方案中，原发性癌症是实体瘤，而所述复发性癌症是液体瘤。在其他实施方案中，原发性癌症是液体肿瘤，而所述复发性癌症是实体瘤。在其他实施方案中，所述原发性癌症和所述复发性癌症均为实体瘤，或均为液体肿瘤。在一些实施方案中，所述复发性肿瘤表达至少一种肿瘤相关抗原，其也由所述原发性肿瘤表达。
如本文所用，术语“难治性癌症”是指对治疗无反应的癌症，例如，在治疗开始时具有抗性的癌症(例如，免疫疗法的治疗)或可能在治疗过程中变得耐药。术语“应答”，“应答”或“应答性”是指抗癌应答，例如，在减小肿瘤大小或抑制肿瘤生长的意义上。这些术语还可以指预后的改善，例如反映为复发时间的增加，(这是指在没有复发证据的情况下第二次原发癌的首次复发检查(即首次发病或没有复发的证据下的死亡)的期间，或者整体生存率的提高，这是指从治疗到因任何原因死亡的期间。做出应答或有应答意味着在暴露于刺激时会有一个有益的终点。可替代地，在暴露于刺激时，负面或有害症状被最小化、减轻或衰减。将理解的是，评估肿瘤或对象将表现出有利的应答的可能性等同于评估肿瘤或对象将不表现出有利的应答的可能性(即，将表现出缺乏应答或无应答)。
如本文所用，癌症包括但不限于：B细胞癌，例如多发性骨髓瘤，
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巨球蛋白血症，重链疾病，例如α链疾病，γ链疾病和μ链疾病，良性单克隆肺炎和免疫细胞淀粉样变性病，黑色素瘤，乳腺癌，肺癌，支气管癌，结肠直肠癌，前列腺癌，胰腺癌，胃癌，卵巢癌，膀胱癌，脑或中枢神经系统癌，外周神经系统癌，食道癌，宫颈癌，子宫或子宫内膜癌，口腔或咽癌，肝癌，肾癌，睾丸癌，胆道癌，小肠或阑尾癌，唾液腺癌，甲状腺癌，肾上腺癌癌，骨肉瘤，软骨肉瘤，血液组织癌等。适用于本发明所涵盖的方法的其他类型的癌症的非限制性实例包括人肉瘤和癌，例如纤维肉瘤，粘肉肉瘤，脂肪肉瘤，软骨肉瘤，成骨肉瘤，脊索瘤，血管肉瘤，内皮肉瘤，淋巴管肉瘤，淋巴管肉瘤，内皮细胞瘤，尤因氏肿瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤，结肠癌，结肠直肠癌，胰腺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳头状癌，乳头状腺癌，膀胱腺癌，髓样癌，支气管癌，肾细胞癌，肝癌，胆管癌，肝癌，绒毛膜癌，鼻息肉瘤，胚胎癌，威尔姆斯氏肿瘤，子宫颈癌，骨癌，脑瘤，睾丸癌，肺癌，小细胞肺癌，膀胱癌，上皮癌，神经胶质瘤，星形细胞瘤，髓母细胞瘤，颅咽管瘤，室管膜瘤，松果体瘤，血管母细胞瘤，听神经瘤，少突胶质细胞瘤，脑膜瘤，黑素瘤，神经母细胞瘤，视网膜母细胞瘤；白血病，例如急性淋巴细胞白血病和急性粒细胞白血病(粒细胞，早幼粒细胞，粒单核细胞，单核细胞和红白血病)，慢性白血病(慢性粒细胞性(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞性白血病)，和真性红细胞增多症，淋巴瘤(霍奇金氏病和非霍奇金氏病)，多发性骨髓瘤，沃尔登斯特罗姆巨球蛋白血症和重链疾病。在一些实施方案中，癌症本质上是上皮癌，包括但不限于膀胱癌，乳腺癌，宫颈癌，结肠癌，妇科癌，肾癌，喉癌，肺癌，口腔癌，头颈癌，卵巢癌，癌症，胰腺癌，前列腺癌或皮肤癌。在其他实施方案中，癌症是乳腺癌，前列腺癌，肺癌或结肠癌。在其他实施方案中，上皮癌是非小细胞肺癌，非乳头状肾细胞癌，子宫颈癌，卵巢癌(例如浆液性卵巢癌)或乳腺癌。上皮癌可以以多种其他方式表征，包括但不限于浆液性，子宫内膜样，粘液性，透明细胞，Brenner或未分化。
如本文所用，术语“癌症疗法”或“癌症治疗剂”是指可以发挥抗肿瘤作用或具有抗肿瘤活性的那些疗法或药剂。这样的抗肿瘤作用或抗肿瘤活可以表现为肿瘤细胞的增殖、生存力或转移活性的速率的降低。显示抗肿瘤活性的一种可能方法是显示在治疗过程中出现的异常细胞生长速率或肿瘤尺寸稳定或缩小的下降。可以使用可接受的体外或体内肿瘤模型，包括但不限于异种移植模型、同种异体移植模型、MMTV模型和本领域已知的研究抗肿瘤活性的其他已知模型，来评估这种活性。
如本文所用，术语任何疾病或病症的“预防”(prevent)，“预防”(preventing)或“预防”(prevention)是指预防本文所述的疾病或病症或其症状的全部或部分发作、复发或扩散。
如本文所用，对象对治疗是“有需要的”，如果该对象从该治疗中将在生物学、医学或生活质量上受益。
术语“治疗剂”是本领域公认的，并且是指在向有需要的对象给药后具有生物、生理或药理学活性，并且局部或全身地起作用以对所述对象产生有益治疗作用。
本文所用的术语“免疫缀合物”或“抗体-药物-缀合物(ADC)”是指抗原结合部分(例如，抗体或其抗原结合片段)与本文所述的免疫调节多核苷酸的连接。连接可以是共价键或非共价相互作用，并且可以包括螯合。为了形成免疫缀合物，可以使用本领域已知的或本文提供的各种接头。在一些实施方案中，免疫缀合物是本文提供的式(C)的缀合物。
如本文所用，术语“抗原结合部分”是指能够特异性结合抗原的部分，并且包括但不限于抗体和抗原结合片段。
本文所用的术语“CpG-Ab免疫缀合物”或“CpG-Ab”是指抗体(Ab)或其抗原结合片段与本文所述的含CpG的免疫刺激多核苷酸的连接。
如本文所用，术语“T细胞激动剂”是指从混合的起始细胞群选择性刺激T细胞的增殖、分化和/或存活的任何试剂。因此，与起始细胞群相比，所得细胞群富含增加数量的T细胞。在本公开中发现使用的T细胞激动剂包括但不限于与T细胞受体(TCR)特异性结合的抗原分子，以及T细胞共刺激分子。T细胞共刺激分子的实例包括但不限于OX40，CD2，CD27，CDS，ICAM-1，LFA-1(CD11a/CD18)，ICOS(CD278)，4-1BB(CD137)，GITR，CD30，CD40，BAFFR，HVEM，CD7，LIGHT，NKG2C，SLAMF7，NKp80，CD160，B7-H3和CD83配体。在特定的实施方案中，所述T细胞激动剂是针对T细胞共刺激分子的抗体。在特定的实施方案中，所述T细胞激动剂是肿瘤相关抗原(TAA)。在特定的实施方案中，所述T细胞激动剂是病原性抗原。
如本文所用，“免疫检查点”或“免疫检查点分子”是免疫系统中调节信号的分子。免疫检查点分子可以是刺激性检查点分子，即调高信号，或抑制性检查点分子，即调低信号。在特定的实施方案中，免疫检查点是由T细胞或抗原呈递细胞(APC)表达的蛋白质。某些类型的癌细胞表达免疫检查点蛋白来逃避免疫清除。使用免疫检查点调节剂抑制癌细胞表达的免疫检查点蛋白与T细胞表达的免疫检查点蛋白之间的相互作用已被证明在某些癌症治疗中有效。
如本文所用，“免疫检查点调节剂”是能够改变对象中免疫检查点的活性的试剂。在某些实施方案中，免疫检查点调节剂改变一个或多个免疫检查点分子的功能，包括但不限于PD-1，PD-L1，PD-L2，TIM-3，LAG-3，CEACAM-1，CEACAM-5，VISTA，BTLA，TIGIT，LAIR1，CD160，CD47，2B4和TGFR。所述免疫检查点调节剂可以是免疫检查点的激动剂或拮抗剂。在一些实施方案中，所述免疫检查点调节剂是免疫检查点结合蛋白(例如，抗体，抗体Fab片段，二价抗体，抗体药物缀合物，scFv，融合蛋白，二价抗体或四价抗体)。在其他实施方案中，所述免疫检查点调节剂是小分子。在一个特定的实施方案中，所述免疫检查点调节剂是抗PD1或抗PD-L1抗体。
如本文所用，术语“靶向递送”或动词形式“靶”是指促进递送的试剂(例如免疫刺激多核苷酸)到达特定器官、组织、细胞和/或细胞内隔室(称为目标位置)比任何其他器官、组织、细胞或细胞内隔室(称为非目标位置)更多。靶向递送可以使用本领域已知的方法来检测，例如，通过比较全身施用后靶细胞群中递送的试剂的浓度与非靶细胞群中递送的试剂的浓度。如本文所提供的，与非靶标位置相比，靶向递送导致在靶标位置的浓度高至少2倍。靶向递送可以通过靶向部分与与靶向细胞相关的接收部分的特异性结合来实现。如本文所用，与靶细胞相关的接收部分可以位于靶细胞的表面或胞溶胶内。在一些实施方案中，所述接收部分是与靶细胞相关的抗原。
当在生物、组织、细胞或其成分的上下文中使用时，术语“异常的”是指在至少一种可观察或可检测的特征方面与来自显示“正常的”(预期的)各自特征的那些生物、组织、细胞或其组成部分不同的那些生物、组织、细胞或其成分(例如年龄，治疗，一天中的时间等)。对于一种细胞或组织类型而言的正常的或预期的特征对于另一种细胞或组织类型而言可能是异常的。在一些实施方案中，异常细胞是癌细胞。
术语“组合疗法”是指给予两个或更多个治疗剂以治疗本公开中描述的疾病或病症(例如，癌症)。这种施用包括以基本上同时的方式共同施用这些治疗剂，例如施用具有固定比率的治疗剂的单一制剂或以每个治疗剂的单独制剂(例如胶囊和/或静脉内制剂)的形式。另外，这种施用还包括在大约同时或不同时间以顺序或分开的方式使用每种类型的治疗剂。这种施用还包括将每种成分配制成单独的制剂，其可以在不同的时间和/或通过不同的施用途径施用。在任何情况下，组合疗法的治疗方案将在治疗本文所述的状况或病症中提供有益的治疗效果。
如本文所用，术语“共同施用”或“共同施用”等是指在相同或者大约相同时间施用两个或更多个治疗剂(例如，免疫缀合物和免疫检查点调节剂)、化合物、治疗或类似物。共同施用可以指同时施用，其中本公开内容的不同治疗剂，例如免疫缀合物、T细胞激动剂、免疫检查点调节剂或其他化学治疗剂，可以组合成相同制剂，或分开配制以同时施用对于对象。共同给药也可以指顺序施用。施用本发明的不同治疗剂，例如免疫缀合物、T细胞激动剂、免疫检查点调节剂或其他化学治疗剂的顺序或序列可以变化，并且不限于任何特定的序列。共同施用还可以指将两个或更多个试剂施用于身体的不同区域或通过不同的递送方案的情况，例如，其中第一试剂是全身施用，第二试剂是瘤内施用，或其中第一试剂是瘤内施用，第二试剂是是在血液中全身施用或在肿瘤的近端施用。共同施用还可以指通过相同的递送方案施用的两个或更多个药剂，例如，其中第一试剂在瘤内施用而第二试剂在瘤内施用。
“瘤内注射”是指将本文提供的试剂直接施用于肿瘤细胞团和/或肿瘤微环境。如本文所用，肿瘤微环境包括瘤形成环境，其为肿瘤过程存活、扩展或扩散创造了结构和/或功能环境。肿瘤微环境通过细胞、分子、成纤维细胞、细胞外基质和血管构成，它们围绕并喂养形成肿瘤的一个或多个肿瘤细胞。肿瘤微环境中的细胞或组织的实例包括但不限于肿瘤脉管系统，肿瘤浸润淋巴细胞，成纤维细胞网状细胞，内皮祖细胞(EPC)，癌相关成纤维细胞，周细胞，其他基质细胞，细胞外成分基质(ECM)，树突状细胞，抗原呈递细胞，T细胞，调节性T细胞，巨噬细胞，嗜中性粒细胞和其他靠近肿瘤的免疫细胞。影响肿瘤微环境的细胞功能的例子包括但不限于细胞因子和/或趋化因子的产生，对细胞因子的反应，抗原加工和肽抗原的呈递，白细胞趋化性和迁移的调节，基因表达的调节，补体激活，信号通路的调节，细胞介导的细胞毒性，细胞介导的免疫，体液免疫应答以及其他先天性或适应性免疫应答。测量调节这些细胞功能的效果。
术语“对象”，“患者”，“个体”等在本文中可互换使用，并且是指可以在本文中提供的方法修改的在体外或体内的任何动物或其细胞。在某些非限制性实施方案中，患者，对象或个体是哺乳动物，例如人，或其他动物，例如野生动物(例如苍鹭，鹳，鹤等)，家畜(例如鸭子，鹅)等)或实验动物(例如猩猩，猴子，大鼠，小鼠，兔子，豚鼠，土拨鼠，松鼠等)。
在癌症的情况下使用的术语“存活”包括以下任一项：直至死亡的存活，也称为总体存活(其中所述死亡可能不论原因或与肿瘤相关)；“无复发生存”(其中术语“复发”应包括局部和远处复发)；无转移生存；无病生存(其中术语疾病应包括癌症和与其相关的疾病)。所述存活的长度可以参考定义的起点(例如诊断时间或治疗开始时间)和终点(例如死亡，复发或转移)来计算。另外，治疗功效的标准可以扩展到包括对化学疗法的反应，存活的可能性，在给定时间段内转移的可能性以及肿瘤复发的可能性。
本发明提供了免疫调节(例如，免疫刺激)多核苷酸和包含靶向部分和一个或多个免疫调节(例如，免疫刺激)多核苷酸的缀合物。所述免疫调节多核苷酸可以包含5-修饰的尿苷或5-修饰的胞苷。在所述免疫调节多核苷酸的5′-末端(例如，在两个5′-末端核苷中)包含5-修饰的尿苷(例如5-乙炔基-尿苷)可以增强所述多核苷酸的免疫调节特性。免疫调节多核苷酸可以比长度为18至28个核苷酸的典型CpG ODN更短(例如，总共包含6至16个核苷酸或12至14个核苷酸)。本发明的较短的免疫调节多核苷酸(例如，包含总共6至16个核苷酸或12至14个核苷酸的那些)可以保留较长的典型CpG ODN的免疫调节活性，并且与更长的CpG ODN相比，可以表现出较高的免疫调节活性(例如，通过测量NFκB的激活或至少一个细胞因子(例如IL-6或IL-10)表达水平的变化)。有利的是，所述较短的免疫调节多核苷酸是更易于且更经济的制备，因为它们的合成将包括比全长的典型的CpG ODN少的多核苷酸合成步骤。所述免疫调节多核苷酸可包含一个或多个无碱基间隔子和/或核苷间磷酸三酯。
本发明的免疫调节多核苷酸可以表现出优于主要是含有核苷间磷酸酯的CpG ODN(，例如，多于50％的核苷间磷酸酯)的稳定性(例如，针对核酸酶的稳定性)，而基本上不牺牲其免疫刺激活性。该作用可以例如通过掺入至少50％(例如，至少70％)的核苷间硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯或通过包含核苷间磷酸三酯和/或核苷间无碱基间隔子来实现。磷酸三酯和无碱基间隔子也方便的用于缀合至靶向部分。相对于具有完全硫代磷酸酯骨架的多核苷酸，基于磷酸的磷酸三酯和无碱基间隔子也可用于降低脱靶活性。不希望受到理论的束缚，可以通过减少自我传递而不破坏靶向部分介导的向靶细胞的传递来实现这种效果。因此，本发明的多核苷酸可包含15个或更少的连续核苷间硫代磷酸酯(例如14个或更少，13个或更少，12个或更少，11个或更少或10个或更少的连续核苷间硫代磷酸酯)。例如，包含总共12至16个核苷的免疫刺激多核苷酸可以包含10个或更少的连续核苷间硫代磷酸酯。
本发明的免疫刺激多核苷酸可包含总共50个或更少的核苷(例如30个或更少，28个或更少或16个或更少的核苷)。本发明的免疫刺激多核苷酸可包含总共至少6个核苷(例如10个或更多个或12个或更多个核苷)。例如，本发明的免疫刺激多核苷酸可包含总共6至30个核苷(例如，总共6至28个核苷，总共6至20个核苷，总共6至16个核苷，总共10至20个核苷，总共10至16个核苷，总共12至28个核苷，总共12至20个核苷，或总共12至16个核苷)。
本发明的免疫刺激多核苷酸可以包括一个或多个磷酸三酯(例如，核苷间磷酸三酯)和/或硫代磷酸酯(例如，从1至6或从1至4)，例如在一个或两个末端(例如，在六个5′末端核苷或六个3′末端核苷中)。包含一个或多个核苷间磷酸三酯和/或硫代磷酸酯可以通过降低核酸外切酶介导的降解速率来增强所述多核苷酸的稳定性。
在某些实施方案中，本发明的免疫刺激多核苷酸包含磷酸三酯或末端磷酸二酯，其中所述磷酸三酯或末端磷酸二酯包括与靶向部分或缀合基团以及任选地与一个或多个(例如1个至6个)辅助部分键接的接头。在特定的实施方案中，所述免疫刺激多核苷酸仅包含一个接头。在一些实施方案中，所述免疫刺激多核苷酸仅包含一个缀合基团。
本发明的多核苷酸(例如，免疫刺激多核苷酸)可以是包括链及其部分或全部补体的杂交多核苷酸。杂交的多核苷酸可以具有至少6个互补碱基对(例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23)，最多不超过所包含的较短链中存在的核苷酸总数。例如，杂交的多核苷酸的杂交部分可包含6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个碱基
本发明的缀合物包含靶向部分和一个或多个免疫调节(例如，免疫刺激)多核苷酸(例如1至6或1至4(例如1或2)免疫调节(例如，免疫刺激)多核苷酸)。在缀合物中，每个所述免疫调节多核苷酸独立地包括接头。靶向部分与接头共价键接。所述接头可以与免疫调节多核苷酸中的核碱基、无碱基间隔子、磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键接。本发明的缀合物靶向的细胞是专业的APCs(例如，B细胞，pDC或巨噬细胞)。所述靶向部分可以是抗原结合部分(例如，抗体或其抗原结合片段)、多肽、适体或包括一个或多个小分子(例如，甘露糖)的基团。在本发明的缀合物中，所述靶向部分可以是抗体或抗体片段。本发明的缀合物可以包含抗体或抗体片段和与该抗体或抗体片段中的Q-标签共价连接的一个或多个免疫调节多核苷酸。所述Q-标签可以是N末端或C末端。所述Q-标签可以设置在抗体或抗体片段的重链或轻链中。使用基于靶向部分的本发明的免疫调节多核苷酸向特异性靶向的组织和细胞的递送可以克服免疫调节多核苷酸在体内通常不均匀分布的缺点。此外，本发明的免疫调节多核苷酸的基于靶向部分的递送可能有利于全身施用或免疫调节多核苷酸向靶组织施用，因为全身施用和向靶组织的施用可能通过体内血液循环产生不希望的所述免疫调节多核苷酸分布。而本发明的缀合物即使在全身给药时也可主要在靶组织或细胞内进行细胞内递送。与分布有关的优点在包含短的免疫调节多核苷酸(例如，包含总共6至16个核苷(例如，总共10至16或12至16个核苷)的免疫调节多核苷酸)的缀合物中尤其明显。
本发明的缀合物可进一步包含一个或多个(例如1至6个)辅助部分(例如，聚乙二醇(PEG))。所述辅助部分可以是封端基团、生物可逆基团或非生物可逆基团的一部分。所述辅助部分可以键接至所述接头(例如，键接至免疫调节(例如，免疫刺激)多核苷酸中的磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯的接头)。相对于缺少此类辅助部分的参考缀合物，在本发明的缀合物中包括辅助部分(例如PEG)可以改善所述缀合物的药代动力学和/或生物分布特性。
本发明的一个或多个免疫调节多核苷酸可以与靶向抗原呈递细胞(APC；例如专业APC(例如，B细胞，pDC或巨噬细胞)的靶向部分(例如，抗原结合部分)缀合。将本发明的免疫调节多核苷酸或本发明的缀合物递送至含有内体toll样受体(例如TLR9)的细胞(例如抗原呈递细胞(APC；例如专业APC(例如B细胞，pDC或巨噬细胞)))可用于激动(对于免疫刺激多核苷酸)或拮抗(对于免疫抑制多核苷酸)细胞中的内体toll样受体。不受理论的束缚，内体toll样受体的活化可以诱导促炎性细胞因子(例如，IL-6，IL-10和/或I型干扰素)。该活性被认为可用于治疗各种肿瘤(例如患者的实体瘤和液体瘤)。
在一个实施方案中，本文提供式(A)的寡核苷酸：
X5′-(XN)b-YP-(XN)c-X3′ (A)
或其立体异构体，两个或更多个非对映异构体的混合物，互变异构体或两个或更多个互变异构体的混合物；或其药学上可接受的盐，溶剂化物或水合物；
其中：
每个XN独立地是核苷酸；
X3′是3′末端核苷酸；
X5′是5′末端核苷酸；
YP是核苷间磷酸三酯；和
b和c分别为约0至约25的整数；其总和不得少于5；
其中寡核苷酸包含具有修饰的核碱基的核苷酸。
在某些实施例中，b是大约1至大约15的整数。在某些实施例中，b是约1，约2，约3，约4，约5，约6，约7，约8，约9，约10，约11，约12，约13，约14或约15的整数。在某些实施例中，b是约3，约4，约11或约14的整数。在某些实施例中，b是大约3的整数。在某些实施例中，b是大约4的整数。在某些实施例中，b是大约11的整数。在某些实施例中，b是大约14的整数。
在某些实施方式中，c是约0至约10的整数。在某些实施方式中，c是约0，约1，约2，约3，约4，约5，约6，约7，约8，约9或约10的整数。在某些实施例中，c是约0或约8的整数。在某些实施例中，c是约0的整数。在某些实施例中，c是约8的整数。
在某些实施例中，b是大约3的整数，并且c是大约8的整数。在某些实施例中，b是大约4的整数并且c是大约8的整数。在一些实施方案中，b是大约11的整数，c是大约0的整数。在某些实施例中，b是大约14的整数，c是大约0的整数。
在某些实施例中，b和c的总数在约5至约20的范围内。在某些实施例中，b和c的总数在约5至约15的范围内。在某些实施例中，b和c的总和为约5，约6，约7，约8，约9，约10，约11，约12，约13，约14或约15。在某些实施例中，b和c的总和为约8，约9，约10，约11，约12，约13或约14。在某些实施例中，b和c总共合计约为11。在某些实施例中，b和c总共合计约为12。在某些实施例中，b和c总和约14。
在某些实施方案中，每个XN独立地是2′-脱氧核糖核苷酸或2′-修饰的核糖核苷酸。在某些实施方案中，每个XN独立地为2′-脱氧腺苷(A)，2′-脱氧鸟苷(G)，2′-脱氧胞苷(C)，5-卤代-2′-脱氧胞苷，2′-脱氧胸苷(T)，2′-脱氧尿苷(U)，5-卤代-2′-脱氧尿苷，2′-氟核糖核苷酸，2′-甲氧基核糖核苷酸或2′-(2-甲氧基乙氧基)核糖核苷酸。在某些实施方案中，每个XN独立地是2′-脱氧核糖核苷酸。在某些实施方案中，每个XN独立地为2′-脱氧腺苷，2′-脱氧鸟苷，2′-脱氧胞苷，5-卤代-2′-脱氧胞苷，2′-脱氧胸苷，2′-脱氧尿苷或5-卤代-2′脱氧尿苷。在某些实施方案中，每个XN是每个XN独立地是2′-脱氧腺苷，2′-脱氧鸟苷，2′-脱氧胞苷，2′-脱氧胸苷，5-溴-2′-脱氧尿苷或5-碘-2′-脱氧尿苷。
在某些实施方案中，X3′是2′-脱氧核糖核苷酸或2′-修饰的核糖核苷酸。在某些实施方案中，X3′是2′-脱氧核糖核苷酸。在某些实施方案中，X3′是2′-脱氧腺苷，2′-脱氧鸟苷，2′-脱氧胞苷，5-卤代-2′-脱氧胞苷，2′-脱氧胸苷，2′-脱氧尿苷，5-卤代-2′-脱氧尿苷，2′-氟核糖核苷酸，2′-甲氧基核糖核苷酸或2′-(2-甲氧基乙氧基)核糖核苷酸。在某些实施方案中，X3′是2′-脱氧腺苷，2′-脱氧鸟苷，2′-脱氧胞苷，5-卤代-2′-脱氧胞苷，2′-脱氧胸苷，2′-脱氧尿苷或5-卤代-2′脱氧尿苷。在某些实施方案中，X3′是2′-脱氧胸苷。在某些实施方案中，X3′是具有取代的嘧啶碱基的2′-脱氧核糖核苷酸。在某些实施方案中，X3′是具有5-取代的嘧啶碱基的2′-脱氧核糖核苷酸。在某些实施方案中，X3′是2′-脱氧胸苷，5-卤代-2′-脱氧胞苷或5-卤代-2′-脱氧尿苷。在某些实施方案中，X3′是2′-脱氧胸苷，5-溴-2′-脱氧胞苷，5-碘-2′-脱氧胞苷，5-溴-2′-脱氧尿苷或5-碘-2′-脱氧尿苷。在某些实施方案中，X3′是2′-脱氧胸苷，5-溴-2′-脱氧尿苷或5-碘-2′-脱氧尿苷。在某些实施方案中，X3′是包含3′封端基团的末端核苷酸。在某些实施方案中，3′封端基团是末端磷酸酯。在某些实施方案中，3′封端基团是3-羟基-丙基磷酰基(即，-P(O2)-CH2CH2CH2OH)。
在某些实施方案中，X5′是2′-脱氧核糖核苷酸或2′-修饰的核糖核苷酸。在某些实施方案中，X5′是2′-脱氧核糖核苷酸。在某些实施方案中，X5′是2′-脱氧腺苷，2′-脱氧鸟苷，2′-脱氧胞苷，5-卤代-2′-脱氧胞苷，2′-脱氧胸苷，2′-脱氧尿苷，5-卤代-2′-脱氧尿苷，2′-氟核糖核苷酸，2′-甲氧基核糖核苷酸或2′-(2-甲氧基乙氧基)核糖核苷酸。在某些实施方案中，X5′是2′-脱氧腺苷，2′-脱氧鸟苷，2′-脱氧胞苷，5-卤代-2′-脱氧胞苷，2′-脱氧胸苷，2′-脱氧尿苷或5-卤代-2′脱氧尿苷。在某些实施方案中，X5′是具有取代的嘧啶碱基的2′-脱氧核糖核苷酸。在某些实施方案中，X5′是具有5-取代的嘧啶碱基的2′-脱氧核糖核苷酸。在某些实施方案中，X5′是2′-脱氧胸苷，5-卤代-2′-脱氧胞苷或5-卤代-2′-脱氧尿苷。在某些实施方案中，X5′是5-卤代-2′-脱氧胞苷。在某些实施方案中，X5′是5-卤代-2′-脱氧尿苷。在某些实施方案中，X5′是2′-脱氧胸苷，5-溴-2′-脱氧胞苷，5-碘-2′-脱氧胞苷，5-溴-2′-脱氧尿苷或5-碘-2′-脱氧尿苷。在某些实施方案中，X5′是2′-脱氧胸苷，5-溴-2′-脱氧尿苷或5-碘-2′-脱氧尿苷。在某些实施方案中，X5′是5-溴-2′-脱氧尿苷。在某些实施方案中，X5′是5-碘-2′-脱氧尿苷。在某些实施方案中，X5′具有3′-磷酸邻苯二甲酸基团。在某些实施方案中，X5′具有手性为Rp的3′-磷酸邻苯二甲酸基。在某些实施方案中，X5′具有具有Sp的手性的3′-磷酸邻苯二甲酸基。
在某些实施方案中，YP是核苷间硫代磷酸三酯。
在某些实施例中，YP为：
Figure BDA0002320320380000671
其中Z为O或S；d是约0至约50的整数。在某些实施例中，Z是O。在某些实施例中，Z是S。在某些实施例中，d是约0至约10的整数。在某些实施例中，d是约0至约5的整数。在某些实施方案中，d是约0，约1，约2，约3，约4或约5的整数。在某些实施方案中，d是约0、约1或约3的整数。
在某些实施例中，YP为：
其中Z为O或S；d是约0至约50的整数。在某些实施例中，Z是O。在某些实施例中，Z是S。在某些实施例中，d是约0至约10的整数。在某些实施例中，d是约0至约5的整数。在某些实施方案中，d是约0，约1，约2，约3，约4或约5的整数。在某些实施方案中，d是约0、约1或约3的整数。
在某些实施方案中，式(A)的寡核苷酸包含一个另外的核苷间磷酸三酯。在一个实施方案中，另外的核苷间磷酸三酯是C1-6烷基磷酸三酯。在另一个实施方案中，另外的核苷间磷酸三酯是乙基磷酸三酯。
在某些实施方案中，式(A)的寡核苷酸包含一个5-卤代-2′-脱氧尿苷。在一个实施方案中，5-卤代-2′-脱氧尿苷是5-氟-2′-脱氧尿苷，5-溴-2′-脱氧尿苷或5-碘-2′-脱氧尿苷。在另一个实施方案中，5-卤代-2′-脱氧尿苷是5-溴-2′-脱氧尿苷或5-碘-2′-脱氧尿苷。在另一个实施方案中，5-卤代-2′-脱氧尿苷是5-氟-2′-脱氧尿苷。在另一个实施方案中，5-卤代-2′-脱氧尿苷是5-溴-2′-脱氧尿苷。在另一个实施方案中，5-卤代-2′-脱氧尿苷是5-碘-2′-脱氧尿苷。
在某些实施方案中，式(A)的寡核苷酸包含三个或更多个2′-脱氧胞苷。在某些实施方案中，式(A)的寡核苷酸包含三个2′-脱氧胞苷。
在某些实施方案中，式(A)的寡核苷酸包含四个或更多个2′-脱氧鸟苷。在某些实施方案中，式(A)的寡核苷酸包含四个2′-脱氧鸟苷。
在某些实施方案中，式(A)的寡核苷酸包含三个2′-脱氧胞苷和四个2′-脱氧鸟苷。在某些实施方案中，式(A)的寡核苷酸包含一个，两个或三个CG二核苷酸。在某些实施方案中，式(A)的寡核苷酸包含三个CG二核苷酸。
在某些实施方案中，式(A)的寡核苷酸包含三个或更多个2′-脱氧胸苷。在某些实施方案中，式(A)的寡核苷酸包含三个，四个，五个，六个，七个或八个2′-脱氧胸苷。在某些实施方案中，式(A)的寡核苷酸包含三个，四个，五个或八个2′-脱氧胸苷。
在某些实施方案中，式(A)的寡核苷酸不包含2′-脱氧腺苷。在某些实施方案中，式(A)的寡核苷酸包含一个或两个2′-脱氧腺苷。
在某些实施方案中，式(A)的寡核苷酸的长度为约5至约20或约6至约15个核苷酸。在某些实施方案中，式(A)的寡核苷酸的长度为约6，约7，约8，约9，约10，约11，约12，约13，约14或约15。式(A)的寡核苷酸的长度为约10，约11，约12，约13，约14或约15。
在某些实施方案中，式(A)的寡核苷酸包含一个或多个核苷间硫代磷酸酯。在某些实施方案中，式(A)的寡核苷酸中的所有核苷间磷酸酯是核苷间硫代磷酸酯。在某些实施方案中，式(A)的寡核苷酸包含一个或多个手性核苷间硫代磷酸酯。
在某些实施方案中，式(A)的寡核苷酸是p275，p276，p313或p347。在某些实施方案中，式(A)的寡核苷酸是p236，p238，p243，p246，p308，p361，p362或p425。在某些实施方案中，式(A)的寡核苷酸是p236，p238，p243，p246，p275，p276，p308，p313，p347，p361，p362，p425，p433，p434，p435，p436，p437，p438，p477，p478，p479，p480，p481，p482，p483，p484，p485，p486，p487，p488或p489。
在某些实施方案中，式(A)的寡核苷酸是免疫调节寡核苷酸。
在一个实施方案中，本文提供了具有N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T序列的寡核苷酸，或其立体异构体，两个或更多个非对映异构体的混合物，互变异构体或两个或更多个互变异构体的混合物；或其药学上可接受的盐，溶剂化物或水合物；其中：
x为1至4的整数；
N1为不存在或2′-脱氧胸苷；
N2是具有修饰核碱基的2′-脱氧核糖核苷酸；
N3是2′-脱氧腺苷或2′-脱氧胸苷，各自任选地包含3′-磷酸三酯；
N4为2′-脱氧腺苷或2′-脱氧胸苷；
N5是任选地包含3′-磷酸三酯的2′-脱氧胸苷；和
C为2′-脱氧胞苷，G为2′-脱氧鸟苷。
在某些实施例中，在N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T中，x是1、2、3或4的整数。在某些实施例中，在N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T中，x是1的整数。在N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T中，x是4的整数。
在某些实施例中，在N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T中，N1不存在。在某些实施方案中，在N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T中，N1是2′-脱氧胸苷。
在某些实施方案中，在N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T中，N2是具有取代的嘧啶碱基的2′-脱氧核糖核苷酸。在某些实施方案中，在N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T中，N2是具有5-取代的嘧啶碱基的2′-脱氧核糖核苷酸。在某些实施方案中，在N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T中，N2为5-卤代-2′-脱氧胞苷或5-卤代-2′-脱氧尿苷。在某些实施方案中，在N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T中，N2为5-溴-2′-脱氧尿苷或5-碘-2′-脱氧尿苷。
在某些实施方案中，在N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T中，N3是包含3′-磷酸三酯的2′-脱氧腺苷。在某些实施方案中，在N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T中，N3是2′-脱氧胸苷。在某些实施方案中，在N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T中，N3是包含3′-磷酸三酯的2′-脱氧胸苷。
在某些实施方案中，在N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T中，N4是2′-脱氧腺苷。在某些实施方案中，在N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T中，N4是2′-脱氧胸苷。
在某些实施方案中，在N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T中，N5是2′-脱氧胸苷。在某些实施方案中，在N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T中，N5是包含3′-磷酸三酯的2′-脱氧胸苷。
在某些实施方案中，N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T的寡核苷酸包含一个或多个核苷间硫代磷酸酯。在某些实施方案中，N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T的寡核苷酸包含至少一个手性核苷硫代磷酸酯。
在某些实施方案中，N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T的寡核苷酸是p275，p276或p313。在某些实施方案中，N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T的寡核苷酸是p236，p238，p243，p246，p308，p361，p362或p425。在某些实施方案中，N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T的寡核苷酸是p236，p238，p243，p246，p275，p276，p308，p313，p347，p361，p362，p425，p433，p434，p435，p436，p437，p438，p477，p478，p479，p480，p481，p482，p483，p484，p485，p486，p487，p488或p489。
免疫刺激多核苷酸
本发明的免疫刺激多核苷酸可以起PAMPs的作用，并且可以通过触发TLR9信号传导(例如，作为TLR9激动剂)来激活先天性免疫应答或刺激适应性免疫应答。可以用于本发明的免疫刺激多核苷酸的序列是本领域中已知的B型CpG多核苷酸的序列，或其修饰，：包括5-卤代尿苷或5-炔基尿苷，或其截短形式(例如，总共包含6个至16个核苷)。本发明的截短的免疫刺激多核苷酸(例如，总共含有6至16个核苷)可以包含截短的B型CpG多核苷酸序列(例如，B类CpG多核苷酸序列，其一个或多个3′末端核苷酸被消除或一个或多个序列内核苷酸被去除)。
本发明的免疫刺激多核苷酸包含至少一个免疫刺激序列(ISS)。例如，本发明的免疫刺激多核苷酸可以包含1、2、3或4个ISS。所述免疫刺激多核苷酸中的ISS取决于目标生物。在本发明的免疫刺激多核苷酸中使用的所述ISS的共同特征是胞苷-p-鸟苷序列，其中p是核苷间磷酸二酯(例如磷酸酯或硫代磷酸酯)或核苷间磷酸三酯。优选地，ISS中的胞苷和鸟苷含有2′-脱氧核糖。在一些实施方案中，本发明的免疫刺激多核苷酸包含1、2或3个人ISS。例如，人ISS可以是CG或NCG，其中N是尿苷、胞苷或胸苷、或尿苷或胞苷的修饰形式，如本文公开的(例如5-卤代尿苷(例如5-碘代尿苷或5-溴尿苷)，5-炔基尿苷(例如5-乙炔基尿苷或5-丙炔基尿苷)，5-杂芳基尿苷或5-卤代胞苷)；如本文所公开，G是鸟苷或其修饰形式(例如7-脱氮鸟苷)。优选地，人ISS是NCG(例如，其中N是5-卤代尿苷)。在一些实施方案中，人ISS是UCG(例如，其中U是5-炔基尿苷(例如5-乙炔基尿苷))。优选地，靶向人的本发明的免疫刺激多核苷酸在包含5′-末端核苷酸的四个连续核苷酸内包含ISS(例如，本发明的免疫刺激多核苷酸包含5′-末端ISS)。鼠ISS是六聚核苷酸序列：Pu-Pu-CG-Py-Py，其中每个Pu独立地是嘌呤核苷酸，每个Py独立地是嘧啶核苷酸。
在一些实施方案中，本发明的免疫刺激多核苷酸中相对于CpG的5′侧翼核苷酸不包含2′-烷氧基核糖。优选地，本发明的免疫刺激多核苷酸中相对于CpG的5′侧翼核苷酸仅包含2′-脱氧核糖作为糖。
本发明的免疫刺激多核苷酸的结构特征可以包括：(1)高含量的硫代磷酸酯(例如，至少50％，至少60％，至少70％或至少80％的核苷可以连接至硫代磷酸酯)(2)不存在多聚-G(poly-G)尾巴，(3)免疫刺激多核苷酸中的核苷可能含有2′-脱氧核糖或2′-修饰的核糖(例如2′-卤代(例如2′-氟))或任选取代的2′-烷氧基(例如2′-甲氧基)，和/或(4)包含5′末端ISS，即NCG，其中N为尿苷、胞苷或胸苷，或如本文所公开的尿苷或胞苷的修饰形式(例如5-卤代尿苷(例如5-碘尿苷或5-溴尿苷)，5-炔基尿苷(例如5-乙炔基尿苷或5-丙炔基尿苷)，5-杂芳基尿苷或5-卤代胞苷)；如本文所公开，G是鸟苷或其修饰形式(例如7-脱氮鸟苷)。
在一些实施方案中，缀合物包含一个靶向部分(例如，抗体或其抗原结合片段)和与该靶向部分共价连接的一个免疫调节多核苷酸。
免疫抑制多核苷酸
本发明的多核苷酸可以通过减少TLR9信号传导的激活(例如，通过TLR9拮抗作用)来抑制适应性免疫应答。在一些实施方案中，本发明的免疫抑制多核苷酸包括相对于CpG为5′侧翼的至少两个2′-烷氧基核苷酸，如下式所描述：N1-N2-CG，其中N1和N2各自独立地为含有2′-烷氧基核糖(例如2′-甲氧基核糖)的核苷酸。
多核苷酸的结构特征
无碱基间隔子
本文公开的免疫调节多核苷酸可以包括一个或多个(例如，一个或两个)无碱基间隔子(例如，核苷间无碱基间隔子和/或末端无碱基间隔子)。当免疫调节多核苷酸包括两个或多个无碱基间隔子时，无碱基间隔子的结构可以相同或不同。
无碱基间隔子具有式(I)：
R1-L1-[-L2-(L1)n1-]n2-R2，
(I)
其中
n1为0或1
n2是1到6之间的整数
R1是与免疫调节多核苷酸中核苷键接的键，
R2是与免疫调节多核苷酸中的核苷键接或封端基团键接的键，
每个L1独立地为磷酸二酯或磷酸三酯，并且
每个L2是糖类似物。
在特定的实施方案中，如果无碱基间隔子是核苷间无碱基间隔子，则n1是1，并且R2是与核苷键接的键，并且如果无碱基间隔子是末端无碱基间隔子，则n1是0或1，以及R2是与封端基团键接的键。
在一些实施方案中，无碱基间隔子是核苷间无碱基间隔子或3′-末端无碱基间隔子。在某些实施例中，每两个连续的L2基团被L1基团隔开(例如，对于分布在两个连续的L2基团之间的L1，n1为1)。
在某些实施方案中，免疫刺激多核苷酸包含位于四个连续核苷酸内的ISS，所述四个连续核苷酸包括免疫刺激多核苷酸的5′-末端核苷酸，其中ISS是NCG，其中N是尿苷、胞苷或胸苷，或如本文所公开的尿苷或胞苷的修饰形式(例如5-卤代尿苷(例如5-碘代尿苷或5-溴代尿苷)，5-炔基尿苷(例如5-乙炔基尿苷或5-丙炔基尿苷)，5-杂芳基尿苷或5-卤代胞苷)，和
其中N和C通过磷酸二酯或磷酸三酯彼此连接。
糖类似物
糖类似物是作为C3-6单糖或C3-6糖醇(例如甘油)的二价或三价基团，其被修饰以用与(i)一个磷酸酯中的氧原子键接的并且与(ii)另一个磷酸酯中的一个氧原子或一个封端基团键接的键来取代两个羟基。糖类似物是环状或无环的。糖类似物中包含的其他可选修饰是：用H；任选取代的C1-6烷基；-本文定义的-LinkA(-T)p；缀合基团；-(CH2)t1-ORZ，其中t1是1到6的整数，并且RZ是任选取代的C1-6烷基，任选取代的C2-6烯基，任选取代的C2-6炔基，任选取代的C6-14芳基，取代的C3-8环烷基，任选取代的(C1-9杂环基)-C1-6-烷基，任选取代的(C6-10芳基)-C1-6-烷基或任选取代的(C3-8环烷基)-C1-6-烷基；引入一个或两个不饱和键(例如一个或两个双键)来取代一个、两个或三个其余的羟基或碳键接的氢原子；以及用一个烷基、烯基、环烷基、环烯基或杂环基所定义的取代基来取代一个、两个或三个氢或羟基。在一些实施方案中，RZ是任选取代的C1-6氨基烷基(例如，任选取代的含-NH2的C1-6氨基烷基)。
糖类似物的非限制性实例是任选取代的C2-6亚烷基，任选取代的C2-6亚烯基，任选取代的C5环烷-1，3-二基，任选取代的C5环烯-1，3-二基，任选取代的杂环-1，3-二基(例如，任选取代的吡咯烷-2，5-二基，任选取代的四氢呋喃-2，5-二基或任选取代的四氢噻吩-2，5-二基)或任选取代的(C1-4烷基)-(C3-8亚亚环烷基)(例如，任选取代的(C1烷基)-(C3亚环烷基))。
糖类似物的非限制性实例是：
Figure BDA0002320320380000731
其中
R1和R2各自独立地是与磷酸酯中的氧原子键接的键；
R3和R4各自独立地为H；任选取代的C1-6烷基；-(CH2)t1-ORZ；或-LinkA-RT；
其中t1是1到6的整数；
RZ为任选取代的C1-6烷基，任选取代的C2-6烯基，任选取代的C2-6炔基，任选取代的C6-14芳基，任选取代的C3-8环烷基，任选取代的(C1-9杂环基)-C1-6-烷基，任选取代的(C6-10芳基)-C1-6-烷基，任选取代的(C3-8环烷基)-C1-6-烷基；
LinkA是接头；和
RT是与靶向部分；缀合部分；任选取代的C1-6烷基，任选取代的C2-6烯基，任选取代的C2-6炔基，任选取代的C6-14芳基，任选取代的C3-8环烷基，任选取代的(C1-9杂环基)-C1-6-烷基，任选取代的(C6-10芳基)-C1-6-烷基，或任选取代的(C3-8环烷基)-C1-6-烷基键接的键。
在某些实施方案中，RZ为任选取代的C1-6氨基烷基(例如，任选取代的含-NH2的C1-6氨基烷基)。
磷酸酯
本发明的免疫调节多核苷酸可以包含一个或多个核苷间磷酸三酯和/或一个或两个末端磷酸二酯和/或磷酸三酯。磷酸三酯可包含磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯，其中一个或两个价键被核苷和/或无碱基间隔子取代，其余价键键接至生物可逆基团、非生物可逆基团、键接至靶向部分或缀合基团的接头。核苷间磷酸三酯键接至两个核苷和/或无碱基间隔子，其余价键键接至生物可逆基团、非生物可逆基团、键接至靶向部分或缀合基团的接头。核苷间磷酸二酯键接至两个核苷和/或无碱基间隔子。末端磷酸二酯在免疫调节多核苷酸的5′-或3′-末端包含磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯，其中两个其余价键之一与生物可逆基团、非生物可逆基团、键接至靶向部分或结合基团的接头键接。
接头和缀合部分
本发明的免疫调节多核苷酸可以包含与靶向部分和任选的一个或多个辅助部分结合的接头。所述接头的分子量为43Da至10kDa(例如100Da至8kDa，100Da至7kDa或100Da至3kDa)。所述接头在本文中可以表示为LinkA。所述接头可以是多价基团，其中第一价与如下键接：核苷间或末端磷酸酯，核苷间或末端硫代磷酸酯，核苷间或末端二硫代磷酸酯，无碱基间隔子，封端基团或核碱基，并且第二价键接至靶向部分。所述接头可以进一步包括一个或多个价键，每个价键独立地键接至辅助部分。在一些实施方案中(例如，当所述靶向部分是小分子时)，免疫调节多核苷酸包含与多个靶向部分键接的多个接头。在其他实施方案中(例如，当靶向部分是抗体或其抗原结合片段时)，免疫调节多核苷酸可包含一个与靶向部分键接的接头。
本文公开的免疫调节多核苷酸可以包括缀合基团。缀合基团包括至少一个缀合部分，其为能够进行缀合反应(例如，环加成反应(例如，偶极环加成)，酰胺化反应或亲核芳香取代)的官能团或使其能够进行官能团脱保护后进行缀合反应的官能团。与互补反应性基团反应后，缀合基团产生了在本发明的免疫调节多核苷酸中的接头。
在特定实施方案中，键接至靶向部分的接头是核苷间磷酸三酯的一部分。在某些实施方案中，键接至靶向部分的接头是无碱基间隔子的一部分。
在一些实施方案中，接头(例如，LinkA)或缀合基团具有式(II)：
-Z1-QA1-Z2-(-QA2-Z3-)k-RT，
(II)
其中
Z1为二价基团、三价基团、四价基团或五价基团，其中一个价键与QA1键接，第二个价键开放，或如果式(II)用于接头，则与RT键接，并且每个其余的价键(如果存在)独立地键接至辅助部分；
Z2为不存在、二价基团、三价基团、四价基团或五价基团，其中一个价键与QA1键接，第二个价键与QA2或RT键接，每个其余的价键(如果存在)，独立地键接至辅助部分；
Z3为不存在、二价基团、三价基团、四价基团或五价基团，其中一个价键与QA2键接，第二个价键与RT键接，并且每个其余的价键(如果存在)独立地键接至辅助部分；
RT为不存在或是与靶向部分键接的键；
k为0或1。
如果式(II)为接头，
QA1和QA2独立地为不存在，任选取代的C2-12杂亚烷基(例如，含-C(O)-N(H)-，-N(H)-C(O)-，-S(O)2-N(H)-，或者-N(H)-S(O)2-的杂亚烷基)，任选取代的C1-12硫杂亚杂环基(例如，
Figure BDA0002320320380000751
Figure BDA0002320320380000752
)，任选取代的C1-12杂环亚基(例如1，2，3-三唑-1，4-二基或)，环丁-3-烯-1，2-二酮-3，4-二基，吡啶-2-基腙，任选取代的C6-16三唑杂环亚戊基(例如
Figure BDA0002320320380000761
)，任选取代的C8-16三唑环亚烯基(例如
Figure BDA0002320320380000762
)，或二氢哒嗪基团(例如，反式
Figure BDA0002320320380000763
反式
Figure BDA0002320320380000764
)；和
RT是与靶向部分键接的键；
条件是存在QA1和QA2中的至少一个。
如果式(II)用于缀合基团，那么
要么
(i)QA2不存在，并且QA1是缀合部分，例如任选取代的C2-12炔基、任选取代的N-保护的氨基、叠氮基、N-马来酰亚胺基、S-保护的硫醇，
Figure BDA0002320320380000765
或其N-保护的形式，
Figure BDA0002320320380000766
含有环内碳-碳三键(例如
Figure BDA0002320320380000767
)的任选取代的C6-16杂环基，1，2，4，5-四嗪基团(例如
Figure BDA0002320320380000771
)，或任选取代的C8-16环炔基(例如
Figure BDA0002320320380000772
)，-NHRN1，任选取代的C4-8应变环烯基(例如，反式-环辛烯基或降冰片烯基)，或任选取代的含-COOR12或-CHO的C1-16烷基；以及
k为0；
要么
(ii)QA1如对接头所定义，并且QA2是缀合部分，例如，任选取代的C2-12炔基，任选取代的N-保护的氨基，叠氮基，N-马来酰亚胺基，S-保护的硫醇、
Figure BDA0002320320380000773
或其N-的受保护形式，
Figure BDA0002320320380000774
，包含环内碳-碳三键(例如
Figure BDA0002320320380000776
)的任选取代的C6-16杂环基，1，2，4，5-四嗪基团(例如)，或任选取代的C8-16环炔基(例如，
Figure BDA0002320320380000778
)，-NHRN1，任选取代的C4-8应变环烯基(例如，反式环辛烯基或降冰片烯基)或任选取代的含有-COOR12或-CHO的C1-16烷基；以及
k是1；
其中
RN1是H，N-保护基或任选取代的C1-6烷基；
每个R12独立地为H或任选取代的C1-6烷基；
R13是卤素(例如F)；
Z3和RT都不存在。
在某些实施方案中，Z1具有支链基团和两个二价片段，其中该支链基团键接至两个二价片段每一个，
其中，
所述二价片段之一与核苷间或末端磷酸酯、核苷间或末端硫代磷酸酯、核苷间或末端二硫代磷酸酯、无碱基间隔子或核碱基键接，并且其余的二价片段与QA1结合。
所述支链基团是任选取代的C1-12烷烃-三基或任选取代的C2-12杂烷烃-三基，其中两个价键被二价片段取代，而其余的价键被
Figure BDA0002320320380000781
取代。
其中
p1是1、2或3；
每个s2独立地是一个0到10的整数；
每个QB和每个QD都分别为不存在，-CO-，-NH-，-O-，-S-，-SO2-，
-OC(O)-，-COO-，-NHC(O)-，-C(O)NH-，-CH2-，-CH2NH-，-NHCH2-，-CH2O-或-OCH2-；和
每个QC独立地为存在，任选取代的C1-12亚烷基，任选取代的C2-12亚烯基，任选取代的C2-12亚炔基，任选取代的C2-12杂亚烷基，任选取代的C1-9亚杂环基或-P(Z)(OH)-，其中Z为O或S；
每个QG独立地为任选取代的C1-6烷烃-三基，任选取代的C1-6烷烃-四基，任选取代的C2-6杂烷烃-三基或任选取代的C2-6杂烷烃-四基；和
每个QH独立为RM1或-QG[(-QB-C-D)s2-RM1]p1，其中每个RM1独立地为与辅助部分键接的键。
在某些实施方案中，Z2具有支链基团和两个二价片段，其中该支链基团键接到两个二价片段的每一个上，
其中
二价片段之一与靶向部分或QA2键接，其余的二价片段与QA1键接；
支链基团是任选取代的C1-12烷烃-三基或任选取代的C2-12杂烷烃-三基，其中两个价键被二价片段取代，而其余价键被
Figure BDA0002320320380000791
取代。
其中
p1是1、2或3；
每个s2独立地是一个0到10的整数；
每个QB和每个QD都分别为不存在，-CO-，-NH-，-O-，-S-，-SO2-，-OC(O)-，-COO-，-NHC(O)-，-C(O)NH-，-CH2-，-CH2NH-，-NHCH2-，-CH2O-或-OCH2-；和
每个QC独立地为不存在，任选取代的C1-12亚烷基，任选取代的C2-12亚烯基，任选取代的C2-12亚炔基，任选取代的C2-12杂亚烷基，任选取代的C1-9亚杂环基或-P(Z)(OH)-，其中Z为O或S；
每个QG独立地为任选取代的C1-6烷烃-三基，任选取代的C1-6烷烃-四基，任选取代的C2-6杂烷烃-三基或任选取代的C2-6杂烷烃-四基；和
每个QH独立为RM1或-QG[(-QB-QC-QD)s2-RM1]p1，其中每个RM1独立为与辅助部分键接的键。
在某些实施方案中，Z3具有支链基团和两个二价片段，其中该支链基团键接至两个二价片段的每一个，
其中
二价片段之一与靶向部分键接，其余的二价片段与QA2键接；
支链基团是任选取代的C1-12烷烃-三基或任选取代的C2-12杂烷烃-三基，其中两个价键被二价片段取代，而其余价键被
Figure BDA0002320320380000801
取代。
其中
p1是1、2或3；
每个s2独立地是一个0到10的整数；
每个QB和每个QD都分别为不存在，-CO-，-NH-，-O-，-S-，-SO2-，-OC(O)-，-COO-，-NHC(O)-，-C(O)NH-，-CH2-，-CH2NH-，-NHCH2-，-CH2O-或-OCH2-；和
每个QC独立地为不存在，任选取代的C1-12亚烷基，任选取代的C2-12亚烯基，任选取代的C2-12亚炔基，任选取代的C2-12杂亚烷基，任选取代的C1-9亚杂环基或-P(Z)(OH)-其中Z为O或S；
每个QG独立地为任选取代的C1-6烷烃-三基，任选取代的C1-6烷烃-四基，任选取代的C2-6杂烷烃-三基或任选取代的C2-6杂烷烃-四基；和
每个QH独立为RM1或-QG[(-QB-QC-QD)s2-RM1]p1，其中每个RM1独立为与辅助部分键接的键。
Z1，Z2或Z3中的二价片段可能是-(-QB-QC-QD-)s1-，
其中
每个s1独立地是1到50的整数(例如1到30)；
每个QB和每个QD都分别独立的为不存在，-CO-，-NH-，-O-，-S-，-SO2-，-OC(O)-，-COO-，-NHC(O)-，-C(O)NH-，-CH2-，-CH2NH-，-NHCH2-，-CH2O-或-OCH2-；和
每个QC独立地为不存在，任选取代的C1-12亚烷基，任选取代的C2-12亚烯基，任选取代的C2-12亚炔基，任选取代的C2-12杂亚烷基或任选取代的C1-9亚杂环基；
前提是存在QB，QC和QD中的至少一个。
在某些实施方案中，在二价片段中存在至少一个QC。在特定的实施方案中，QC存在于二价片段的每个单体单元中。在一些实施方案中，Z1通过存在的QC键接。在另外的实施方案中，Z1的每个单体单元中存在QB和QD中的至少一个。在另外的实施方案中，Z2的每个单体单元中存在QB和QD中的至少一个。在特定的实施方案中，当存在时，Z1，Z2和Z3中只有一个包含支链基团。
在又一些实施例中，Z1，Z2和Z3中的一个、两个或三个独立地为
-(-QB-QC-QD-)s1-QE-(-QB-QC-QD-)s1-，
(III)
其中
每个s1独立地是1到50的整数(例如1到30)；
每个QB和每个QD都分别为不存在-CO-，-NH-，-O-，-S-，-SO2-，-OC(O)-，-COO-，-NHC(O)-，-C(O)NH-，-CH2-，-CH2NH-，-NHCH2-，-CH2O-或-OCH2-；和
每个QC为独立地为不存在，任选取代的C1-12亚烷基，任选取代的C2-12亚烯基，任选取代的C2-12亚炔基，任选取代的C2-12杂亚烷基，任选取代的C1-9亚杂环基或-P(Z)(OH)-其中Z为O或S；和
QE为不存在或式(IV)的支链基团：
Figure BDA0002320320380000811
其中
p1是1、2或3；
每个s2独立地是一个0到10的整数；
QF是任选取代的C1-12烷烃-三基或任选取代的C2-12杂烷烃-三基；和
每个QG独立地为任选取代的C1-6烷烃-三基，任选取代的C1-6烷烃-四基，任选取代的C2-6杂烷烃-三基或任选取代的C2-6杂烷烃-四基；和
每个QH独立为RM1或-QG[(-QB-QC-QD)s2-RM1]p1，其中每个RM1独立为与辅助部分键接的键。
在式(IV)中，如果p1为1，则不存在QG；如果p1为2或3，则至少存在一个QG。
在特定的实施方案中，Z1通过存在的QC键接至核苷间或末端的磷酸酯、核苷间或末端的硫代磷酸酯、核苷间或末端的二硫代磷酸酯、无碱基间隔子、封端基团或核碱基。
在特定的实施方案中，在二价片段中存在QB，QC，QD和QE中的至少一个(例如，存在至少一个QC，存在QE或不存在QE)。在某些实施例中，每个QB和每个QD独立地为不存在，-CO-，-NH-，-O-，-S-，-SO2-，-NHC(O)-，-C(O)NH-，-CH2-，-CH2NH-，-NHCH2-，-CH2O-，或者-OCH2-。
在一些实施例中，-(-QB-QC-QD-)s1-组合以形成一个基团：
-QB-(CH2)g1-(CH2OCH2)g2-(CH2)g3-QD-，
其中
(i)g2是1到50的整数；
(ii)g1为1且QB为-NHCO-，-CONH-或-O-；或g1为0且QD为-NHCO-；和
(iii)g3为1，QB为-NHCO-，-CONH-或-O-；或g3为0，QD为-CONH-。
可以保护缀所述合部分直到辅助部分缀合到所述多核苷酸上。例如，被保护的缀合部分可以包括-COORPGO或-NHRPGN，其中RPGO是O-保护基(例如，羧基保护基)，而RPGN是N-保护基。
在其他实施例中，接头A为
Figure BDA0002320320380000821
其中
QA1和QA2均为不存在，且独立地为任选取代的C2-12杂亚烷基(例如含-C(O)-N(H)-，-N(H)-C(O)-，-S(O)2-N(H)-，或-N(H)-S(O)2-)，任选取代的C1-12硫杂亚杂环基(例如
Figure BDA0002320320380000822
)，任选取代的C1-12杂环亚基(例如1，2，3-三唑-1，4-二基或
Figure BDA0002320320380000832
)，环丁-3-烯-1，2-二酮-3，4-二基，吡啶-2-基腙，任选取代的C6-16三唑杂亚杂环基(例如，
Figure BDA0002320320380000833
Figure BDA0002320320380000834
)，任选取代的C8-16三唑环亚烯基(例如
Figure BDA0002320320380000835
)，或二氢哒嗪基(例如反式
反式-)，条件是QA1和QA2中的至少一个存在，
RT是与靶向部分键接的键；
RP是与核苷间桥连基团、核碱基、封端基团或无碱基间隔子键接的键；
QT为-CO-，-NH-，-NH-CH2-，或-CO-CH2-；
每个Qs独立地为任选取代的C2-12亚烷基，任选取代的C2-12亚烯基，任选取代的C2-12亚炔基或任选取代的(C6-10芳基)-C1-6亚烷基；
每个RM独立地为H，辅助部分，-(CH2)q7-CO-N(RM1)2，或-C[-CH2O-(CH2)q7-CO-N(RM1)2]3，其中每个q7独立1至5的整数，且每个RM1独立地为H或辅助部分；
X1，X3和X5各自独立地为不存在，-O-，-NH-，-CH2-NH-，-C(O)-，-C(O)-NH-，-NH-C(O)-，-NH-C(O)-NH-，-O-C(O)-NH-，-NH-C(O)-O-，-CH2-NH-C(O)-NH-，-CH2-O-C(O)-NH-，或-CH2-NH-C(O)-O-；
X7为不存在，-O-，-O-P(O)(OH)-O-，-O-P(S)(OH)-O-，-NH-，-CH2-NH-，-C(O)-，-C(O)-NH-，-NH-C(O)-，-NH-C(O)-NH-，-O-C(O)-NH-，-NH-C(O)-O-，-CH2-NH-C(O)-NH-，-CH2-O-C(O)-NH-，或，-CH2-NH-C(O)-O-；
X2，X4和X6的每一个各自独立地为不存在，-O-，-NH-，-C(O)-，-C(O)-NH-，-NH-C(O)-，-NH-C(O)-NH-，-O-C(O)-NH-，或-NH-C(O)-O-；
x1和每个x5独立地为0或1；
每个x2独立地是0到50的整数(例如1到40或1到30)；
每个x3独立地是1到11的整数；
x4是0、1或2；和
每个x6独立地是0到10(例如1到6)的整数，前提是x6的两者的总和等于或小于12。
在其他实施方式中，LinkA是
Figure BDA0002320320380000841
Figure BDA0002320320380000851
其中
QA1是任选取代的C2-12杂亚烷基(例如，含-C(O)-N(H)-，-N(H)-C(O)-，-S(O)2-N(H)-，或-N(H)-S(O)2-的杂亚烷基)，任选取代的C1-12硫杂亚杂环基(例如，
Figure BDA0002320320380000852
Figure BDA0002320320380000853
)，
任选取代的C1-12亚杂环基(例如，1，2，3-三唑-1，4-二基或
Figure BDA0002320320380000861
)，环丁-3-烯-1，2-二酮-3，4-二基或吡啶-2-基腙)，任选取代的C6-16三唑亚杂环基(例如
Figure BDA0002320320380000862
)，任选取代的C8-16三唑环亚烯基(例如，)，或二氢哒嗪基(例如，反式-
Figure BDA0002320320380000864
反式
Figure BDA0002320320380000865
)；每个RM1独立地为H或辅助部分；
RT是与靶向部分键接的键；
RP是与核苷间桥连基团、核碱基、封端基团或无碱基间隔子键接的键；
QT为-CO-，-NH-，-NH-CH2-，或-CO-CH2-；
QP为-C(O)-N(H)-，-N(H)-C(O)-，-S(O)2-N(H)-，或-N(H)-S(O)2-；
每个QS独立地为任选取代的C2-12亚烷基，任选取代的C2-12亚烯基，任选取代的C2-12亚炔基或任选取代的(C6-10芳基)-C1-6亚烷基；
q1，q3和q7各自独立地为0或1；
q2和q8分别是0至50的整数(例如1至40或1至30)；
q4是0到10的整数；
q5和q6各自独立地是1至10的整数(例如1至6)；和
q9是1到10的整数。
在其他实施方式中，LinkA是
Figure BDA0002320320380000871
Figure BDA0002320320380000881
其中
在每个结构式中，一个
Figure BDA0002320320380000882
代表单键，另一个
Figure BDA0002320320380000883
代表双键。
每个RM1独立地为H或辅助部分；
RT是与靶向部分键接的键；
RP是与核苷间桥连基团、核碱基、封端基团或无碱基间隔子键接的键；
QT为-CO-，-CO-CH2-，-NH-，或-NH-CH2-；
QP为-C(O)-N(H)-，-N(H)-C(O)-，-S(O)2-N(H)-，或-N(H)-S(O)2-；
每个QS独立地为任选取代的C2-12亚烷基，任选取代的C2-12亚烯基，任选取代的C2-12亚炔基或任选取代的(C6-10芳基)-C1-6亚烷基；
q1，q3和q7各自独立地为0或1；
q2和q8分别是0至50的整数(例如1至40或1至30)；
q4是0到10的整数；
q5和q6各自独立地是1至10的整数(例如1至6)；和
q9是1到10的整数。
在一些实施方案中，q5为0。在其他实施方案中，q5是2-6的整数。
在特定的实施方案中，缀合基团为：
Figure BDA0002320320380000884
其中
QA1独立为任选取代的C2-12杂亚烷基(例如，含-C(O)-N(H)-，-N(H)-C(O)-，-S(O)2-N(H)-或-N(H)-S(O)2-的杂亚烷基)，任选取代的C1-12硫杂亚杂环基(例如，
Figure BDA0002320320380000885
Figure BDA0002320320380000891
)，任选取代的C1-12亚杂环基(例如1，2，3-三唑-1，4-二基或
Figure BDA0002320320380000892
)，环丁-3-烯-1，2-二酮-3，4-二基，吡啶-2-基腙，任选取代的C6-16三唑杂亚杂环基(例如，
Figure BDA0002320320380000893
)，任选取代的C8-16三唑环亚烯基(例如
Figure BDA0002320320380000894
)，或二氢哒嗪基(例如，反式-
Figure BDA0002320320380000895
反式-
Figure BDA0002320320380000896
)；
QA2是任选取代的C2-12炔基，任选取代的N-保护的氨基，叠氮基，N-马来酰亚胺基，S-保护的硫醇，
Figure BDA0002320320380000897
或其N保护形式，
Figure BDA0002320320380000902
含有环碳-碳三键的任选取代的C6-16杂环基(例如，)，1，2，4，5-四嗪基(例如，
Figure BDA0002320320380000905
Figure BDA0002320320380000906
)，或任选取代的C8-16环炔基(例如，
Figure BDA0002320320380000907
)，-NHRN1，任选取代的C4-8应变环烯基(例如，反式环辛烯基或降冰片烯基)，或含-COOR12或-CHO的任选取代的C1-16烷基；
RN1是H，N-保护基或任选取代的C1-6烷基；
每个R12独立地为H或任选取代的C1-6烷基；
R13是卤素(例如F)；
RP是与核苷间桥连基团、核碱基、封端基团或无碱基间隔子键接的键；
每个QS独立地为任选取代的C2-12亚烷基，任选取代的C2-12亚烯基，任选取代的C2-12亚炔基或任选取代的(C6-10芳基)-C1-6亚烷基；
每个RM独立地为H，辅助部分，-(CH2)q7-CO-N(RM1)2，或-C[-CH2O-(CH2)q7-CO-N(RM1)2]3，其中每个q7独立地是1至5的整数，并且每个RM1独立地是H或辅助部分；
每个X3和X5各自独立地为不存在，-O-，-NH-，-CH2-NH-，-C(O)-，-C(O)-NH-，-NH-C(O)-，-NH-C(O)-NH-，-O-C(O)-NH-，-NH-C(O)-O-，-CH2-NH-C(O)-NH-，-CH2-O-C(O)-NH-，或-CH2-NH-C(O)-O-；
X7为不存在，-O-，-O-P(O)(OH)-O-，-O-P(S)(OH)-O-，-NH-，-CH2-NH-，-C(O)-，-C(O)-NH-，-NH-C(O)-，-NH-C(O)-NH-，-O-C(O)-NH-，-NH-C(O)-O-，-CH2-NH-C(O)-NH-，-CH2-O-C(O)-NH-，或-CH2-NH-C(O)-O-；
每个X2，X4，和X6独立地为不存在，-O-，-NH-，-O-，-C(O)-，-C(O)-NH-，-NH-C(O)-，-NH-C(O)-NH-，-O-C(O)-NH-，或-NH-C(O)-O-；
x1和每个x5分别为0或1；
每个x2独立地是0到50的整数(例如1到40或1到30)；
每个x3独立地是1到11的整数；
x4是0、1或2；和
每个x6独立地是0到10(例如1到6)的整数，前提是x6的两者的总和等于或小于12。
在一些实施方案中，缀合基团为：
Figure BDA0002320320380000911
其中
QA1是任选取代的C2-12炔基，任选取代的N-保护的氨基，叠氮基，N-马来酰亚胺基，S-保护的硫醇，
Figure BDA0002320320380000912
Figure BDA0002320320380000913
或其N保护的形式，
Figure BDA0002320320380000914
Figure BDA0002320320380000915
含有环碳-碳三键的任选取代的C6-16杂环基(例如，
Figure BDA0002320320380000916
)，1，2，4，5-四嗪基(例如，
Figure BDA0002320320380000917
Figure BDA0002320320380000921
)，或者任选取代的C8-16环炔基(例如，
Figure BDA0002320320380000922
)，-NHRN1，任选取代的C4-8应变环烯基(例如，反式环辛烯基或降冰片烯基)，或任选取代的含-COOR12或-CHO的C1-16烷基；
RN1是H，N-保护基或任选取代的C1-6烷基；
每个R12独立地为H或任选取代的C1-6烷基；
R13是卤素(例如F)；
RP是与核苷间桥连基团、核碱基、封端基团或无碱基间隔子键接的键；
每个QS独立地为任选取代的C2-12亚烷基，任选取代的C2-12亚烯基，任选取代的C2-12亚炔基或任选取代的(C6-10芳基)-C1-6亚烷基；
X7为不存在，-O-，-NH-，-O-P(O)(OH)-O-，-O-P(S)(OH)-O-，-CH2-NH-，-C(O)-，-C(O)-NH-，-NH-C(O)-，-NH-C(O)-NH-，-O-C(O)-NH-，-NH-C(O)-O-，-CH2-NH-C(O)-NH-，-CH2-O-C(O)-NH-，或，-CH2-NH-C(O)-O-；
X6为不存在，-O-，-NH-，-O-，-C(O)-，-C(O)-NH-，-NH-C(O)-，-NH-C(O)-NH-，-O-C(O)-NH-，或-NH-C(O)-O-；
x1独立为0或1；
每个x2独立地是0到50的整数(例如1到40或1到30)；
每个x3独立地是1到11的整数；和
x4是0、1或2。
在某些实施方案中，缀合基团为：
Figure BDA0002320320380000923
其中
QA1是任选取代的C2-12炔基，任选取代的N-保护的氨基，叠氮基，N-马来酰亚胺基，S-保护的硫醇，
Figure BDA0002320320380000924
Figure BDA0002320320380000931
或其N保护的形式，
Figure BDA0002320320380000933
含有环碳-碳三键的任选取代的C6-16杂环基(例如，
Figure BDA0002320320380000934
)，1，2，4，5-四嗪基(例如，
Figure BDA0002320320380000935
Figure BDA0002320320380000936
)，或任选取代的C8-16环炔基(例如，)，-NHRN1，任选取代的C4-8应变环烯基(例如，反式-环辛烯基或降冰片烯基)，或任选取代的含-COOR12或-CHO的C1-16烷基；
RN1是H，N-保护基或任选取代的C1-6烷基；
每个R12独立地为H或任选取代的C1-6烷基；
R13是卤素(例如F)；
RP是与核苷间桥连基团、核碱基、封端基团或无碱基间隔子键接的键；
QP是-C(O)-N(H)-，-N(H)-C(O)-，-S(O)2-N(H)-，或者-N(H)-S(O)2-；
每个Qs独立地为任选取代的C2-12亚烷基，任选取代的C2-12亚烯基，任选取代的C2-12亚炔基或任选取代的(C6-10芳基)-C1-6亚烷基；
每个q1和q3各自独立地为0或1；
q2是0到50的整数(例如1到40或1到30)；
q4是0到10的整数；和
q5是1到10(例如1到6)的整数
在其他实施方案中，缀合基团为：
Figure BDA0002320320380000941
其中
RP是与核苷间桥连基团、核碱基、封端基团或无碱基间隔子键接的键；
QP是-C(O)-N(H)-，-N(H)-C(O)-，-S(O)2-N(H)-，或-N(H)-S(O)2-；
每个QS独立地为任选取代的C2-12亚烷基，任选取代的C2-12亚烯基，任选取代的C2-12亚炔基或任选取代的(C6-10芳基)-C1-6亚烷基；
q1和q3的每个各自独立地为0或1；
q2是0到50的整数(例如1到40或1到30)；
q4是0到10的整数；和
q5是1到10(例如1到6)的整数。
在某些示例性实施方式中，缀合基团为：
Figure BDA0002320320380000942
Figure BDA0002320320380000951
Figure BDA0002320320380000961
Figure BDA0002320320380000971
其中q2是1到50的整数(例如1到24或1到8的整数(例如2或3))，q4是0到10的整数(例如0、1、2、3，4、5、6、7或8)，q10是0到8的整数(例如1、2、3、4、5或6)，q11是0或1，Z是O或S，每个RM独立为H、辅助部分、-(CH2)q7-CO-N(RM1)2、或-C[-CH2O-(CH2)q7-CO-N(RM1)2]3，其中每个q7为独立地为1至5的整数，并且每个RM1独立地为H或辅助部分。
下列示例性的缀合基团可用于通过金属催化的环加成缀合至靶向部分：
Figure BDA0002320320380000972
Figure BDA0002320320380000981
Figure BDA0002320320380000982
其中q2是1到50的整数(例如1到24或1到8的整数(例如2或3))，q4是0到10的整数(例如0、1、2、3，4、5、6、7或8)，q10是0到8的整数(例如1、2、3、4、5或6)，q11是0或1，Z是O或S。
以下示例性的缀合基团可用于通过无金属的环加成而与靶向部分缀合：
Figure BDA0002320320380000983
Figure BDA0002320320380000991
Figure BDA0002320320380001001
其中q2是1到50的整数(例如1到24或1到8的整数(例如2或3))，q4是0到10的整数(例如0、1、2、3，4、5、6、7或8)，q10是0到8的整数(例如1、2、3、4、5或6)，q11是0或1，Z是O或S，每个RM独立为H、辅助部分、-(CH2)q7-CO-N(RM1)2或-C[-CH2O-(CH2)q7-CO-N(RM1)2]3，其中每个q7独立地为1至5的整数，并且每个RM1独立地为H或辅助部分。
下列示例性缀合基团可用于通过酰胺形成缀合至靶向部分：
Figure BDA0002320320380001011
其中q2是0到50的整数(例如1到8的整数(例如2或3))，q12是1到11的整数(例如1到5的整数(例如1、2、3、4或5))
生物可逆基团
生物可逆基团是分子量为135Da至10kDa(例如135Da至5kDa，200Da至5kDa或200Da至2kDa)的一价取代基，并含有二硫键(-S-S-)。在生物可逆基团中，共价连接二硫键的最短原子链和生物可逆基团的价键可为2至10个原子(例如2至6个原子或4至6个原子(例如4或5个原子)))。生物可逆基团在生理条件下可在细胞内断裂。
生物可逆基团可包含在磷酸酯中，例如以减少本发明的免疫调节多核苷酸的整体负电荷。免疫调节多核苷酸的总负电荷的减少可以增强本发明的免疫调节多核苷酸和/或缀合物的细胞摄取。本发明的免疫调节多核苷酸可以在磷酸酯和/或无碱基间隔子中包括一个或多个生物可逆基团。在一些实施方案中，本发明的免疫调节多核苷酸可包含1至6个生物可逆基团(例如1至4个生物可逆基团(例如1、2或3个生物可逆基团))。
生物可逆基团可以具有式(XXII)：
R5-S-S-(LinkB)-，
(XXII)
其中
LinkB是一个二价基团，包含与磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键接的sp3-杂化碳原子，以及与-S-S-键接的碳原子，以及R5为任选取代的C1-6烷基，任选取代的C6-10芳基，或-LinkC(-RM)r，或LinkB是三价接头，其包含与磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键接的sp3-杂化碳原子和与-S-S-结合的碳原子，其中LinkB的第三价键与-S-S-和R5结合形成任选取代的C3-9亚杂环基；
LinkC是一个多价基团；
每个RM独立地为H，辅助部分或-QG[(-QB-QC-QD)s2-RM1]p1，
其中
每个RM1独立地为H或辅助部分，
每个QB和每个QD都分别独立地为不存在，-CO-，-NH-，-O-，-S-，-SO2-，-OC(O)-，-COO-，-NHC(O)-，-C(O)NH-，-CH2-，-CH2NH-，-NHCH2-，-CH2O-，或-OCH2-，
每个QC独立地为不存在，任选取代的C1-12亚烷基，任选取代的C2-12亚烯基，任选取代的C2-12亚炔基，任选取代的C2-12杂亚烷基或任选取代的C1-9亚杂环基，
每个QG独立地为任选取代的C1-6烷烃-三基，任选取代的C1-6烷烃-四基，任选取代的C2-6杂烷烃-三基或任选取代的C2-6杂烷烃-四基。
每个s2独立地是一个0到10的整数，并且
p1是2或3；
和
r是1到6之间的整数(例如1、2或3)。
在某些实施例中，LinkB和/或R5包括附接到-S-S-的大位阻基团。与-S-S-相连的大位阻基团的加入可能会增强硫-硫键的稳定性，例如在多核苷酸合成过程中。
在进一步的实施方案中，LinkB由1、2或3个基团组成，每个基团独立地选自任选取代的C1-12亚烷基，任选取代的C2-12亚烯基，任选取代的C2-12亚炔基，任选取代的C6-10亚芳基，任选取代的C2-12杂亚烷基和任选取代的C1-9亚杂环基。
在特定的实施方式中，LinkB和-S-S-结合以形成选自以下的结构：
Figure BDA0002320320380001021
其中
每个R6独立地为C2-7烷酰基；C1-6烷基；C2-6烯基；C2-6炔基；C1-6烷基亚磺酰基；C6-10芳基；氨基；(C6-10芳基)-C1-4-烷基；C3-8环烷基；(C3-8环烷基)-C1-4-烷基；C3-8环烯基；(C3-8环烯基)-C1-4-烷基；卤素；C1-9杂环基；C1-9杂芳基；(C1-9杂环基)氧基；(C1-9杂环基)氮杂；羟基；C1-6硫代烷氧基；-(CH2)qCO2RA，其中q是0至4的整数，且RA选自C1-6烷基，C6-10芳基和(C6-10芳基)-C1-4烷基；-(CH2)qCONRBRC，其中q是从零到四的整数，并且其中RB和RC独立地选自氢，C1-6烷基，C6-10芳基和(C6-10芳基)-C1-4烷基；-(CH2)qSO2RD，其中q是0至4的整数，并且RD选自C1-6烷基，C6-10芳基和(C6-10芳基)-C1-4烷基；-(CH2)qSO2NRERF，其中q为0至4的整数，且RE和RF各自独立地选自氢，烷基，芳基和(C6-10芳基)-C1-4-烷基；巯基；芳氧基；环烷氧基；芳烷氧基；(C1-9杂环基)-C1-4-烷基；(C1-9杂芳基)-C1-4-烷基；C3-12甲硅烷基；氰基；或-S(O)RH，其中RH选自氢，C1-C6烷基，C6-10芳基和(C6-10芳基)-C1-4-烷基；或两个相邻的R6基团以及每个R6基团所连接的原子一起形成一个环基，该环基选自C6芳基，C2-5杂环基或C2-5杂芳基，其中环基任选地被1、2或3个取代基取代，取代基选自C2-7烷酰基；C1-6烷基；C2-6烯基；C2-6炔基；C1-6烷基亚磺酰基；C6-10芳基；氨基；(C6-10芳基)-C1-4-烷基；C3-8环烷基；(C3-8环烷基)-C1-4-烷基；C3-8环烯基；(C3-8环烯基)-C1-4-烷基；卤素；C1-9杂环基；C1-9杂芳基；(C1-9杂环基)氧基；(C1-9杂环基)氮杂；羟基；C1-6硫代烷氧基；-(CH2)qCO2RA，其中q是0至4的整数，且RA选自C1-6烷基，C6-10芳基和(C6-10芳基)-C1-4烷基。-(CH2)qCONRBRC，其中q是从零到四的整数，并且其中RB和RC独立地选自氢，C1-6烷基，C6-10芳基和(C6-10芳基)-C1-4烷基；-(CH2)qSO2RD，其中q是0至4的整数，并且RD选自C1-6烷基，C6-10芳基和(C6-10芳基)-C1-4烷基；-(CH2)qSO2NRERF，其中q为0至4的整数，且RE和RF各自独立地选自氢，烷基，芳基和(C6-10芳基)-C1-4-烷基；巯基；芳氧基；环烷氧基；芳烷氧基；(C1-9杂环基)-C1-4-烷基；(C1-9杂芳基)-C1-4-烷基；C3-12甲硅烷基；氰基；-S(O)RH，其中RH选自氢，C1-C6烷基，C6-10芳基和(C6-10芳基)-C1-4-烷基。
m1为0、1或2；和
m2是0、1、2、3或4；
或LinkB，-S-S-和R5合并组成一个包含
Figure BDA0002320320380001041
的基团。
在其他实施方案中，LinkC可包含0至3个多价单体(例如，任选取代的C1-6烷烃-三基，任选取代的C1-6烷烃四基或三价氮原子)和一个或多个二价单体(例如1至40)，其中每个二价单体独立地是任选取代的C1-6亚烷基；任选取代的C2-6亚烯基；任选取代的C2-6亚炔基；任选取代的C3-8亚环烷基；任选取代的C3-8亚环烯基；任选取代的C6-14亚芳基；具有1-4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的C1-9杂亚芳基；具有1-4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的C1-9亚杂环基；亚氨基；任选取代的N；O；或S(O)m，其中m是0、1或2。在一些实施方案中，每个单体独立地是任选取代的C1-6亚烷基；任选取代的C3-8亚环烷基；任选取代的C3-8亚环烯基；任选取代的C6-14亚芳基；具有1-4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的C1-9杂亚芳基；具有1-4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的C1-9亚杂环基；亚氨基；任选取代的N；O；或S(O)m，其中m为0、1或2(例如m为2)。在某些实施方案中，每个单体独立地是任选取代的C1-6亚烷基；任选取代的C3-8亚环烷基；任选取代的C3-8亚环烯基；任选取代的C6-14亚芳基；具有1-4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的C1-9杂亚芳基；具有1-4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的C1-9亚杂环基；任选取代的N；O；或S(O)m，其中m为0、1或2(例如m为2)。将辅助部分连接至缀合部分或其反应产物的非生物可逆性接头可包括2至500个(例如2至300、2至200、2至100或2至50个)此类单体。LinkC可包括一个或多个聚乙二醇(例如，聚乙二醇可具有88Da至1kDa的分子量(例如88Da至500Da)。
本文以及WO2015/188197中描述了可用于制备式(IIa)中的-LinkC(-RM)r基团的化合物。-LinkC(-RM)r的非限制性示例包括：
Figure BDA0002320320380001042
Figure BDA0002320320380001051
其中
R14是键接-S-S-的键，
RM是辅助部分或-QG[(-QB-QC-QD)s2-RM1]p1，
其中
每个RM1独立地为H或辅助部分，
每个QB和每个QD都独立地为不存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-、或-OCH2-，
每个QC独立地为不存在、任选取代的C1-12亚烷基、任选取代的C2-12亚烯基、任选取代的C2-12亚炔基、任选取代的C2-12杂亚烷基或任选取代的C1-9亚杂环基；
每个QG独立地为任选取代的C1-6烷烃-三基、任选取代的C1-6烷烃-四基、任选取代的C2-6杂烷烃-三基或任选取代的C2-6杂烷烃-四基。
每个s2独立地是一个0到10的整数，并且
p1是2或3；
每个r4独立地是1到6的整数；和
每个r5独立地是一个0到10的整数。
在某些实施方案中，RM是辅助部分。在一些实施方案中，至少一个RM1是辅助部分。
在某些实施方案中，生物可逆性接头基团是其中该基团的一端连接至多核苷酸，而另一端连接至靶标部分(在一个实施方案中，为抗体)。
非生物可逆基团
非生物可逆基团是一价取代基，其不包含在生理条件下在血清或内体中可断裂的键(例如，酯，硫代酯或二硫化物)。所述非生物可逆基团可以是任选取代的C2-16烷基；任选取代的C3-16烯基；任选取代的C3-16炔基；任选取代的C3-8环烷基；任选取代的C3-8环烯基；任选取代的(C3-8环烷基)-C1-4-烷基；任选取代的(C3-8环烯基)-C1-4-烷基；任选取代的C614芳基；任选取代的(C6-14芳基)-C14-烷基；具有1-4个选自N，O和S的杂原子的任选取代的C1-9杂芳基；具有1-4个选自N，O和S的杂原子的任选取代的(C1-9杂芳基)-C1-4-烷基；具有1-4个选自N，O和S的杂原子的任选取代的C2-9杂环基，其中所述杂环基不包含S-S键；具有1-4个选自N，O和S的杂原子的任选取代的(C2-9杂环基)-C1-4-烷基，其中杂环基不包含S-S键；或一组式(XXIII)：
Figure BDA0002320320380001062
其中
L3为C2-6烷基；
R7是任选取代的C2-6烷基；任选取代的C6-14芳基；任选取代的(C6-14芳基)-C1-4-烷基；任选取代的C3-8环烷基；任选取代的(C3-8环烷基)-C1-4-烷基；具有1-4个选自N，O和S的杂原子的任选取代的C1-9杂芳基；具有1-4个选自N，O和S的杂原子的任选取代的(C1-9杂芳基)-C1-4-烷基；具有1-4个选自N，O和S的杂原子的任选取代的C2-9杂环基，其中所述杂环基不包含S-S键；具有1-4个选自N，O和S的杂原子的任选取代的(C2-9杂环基)-C1-4-烷基，其中所述杂环基不包含S-S键；和-OH封端的聚乙二醇，C1-6烷氧基或-COOH；和
R8是H或C1-6烷基。
非生物可逆的磷酸三酯可以是被取代基取代的磷酸酯或硫代磷酸酯，所述取代基为缀合基团、C2-16烷基、
Figure BDA0002320320380001071
Figure BDA0002320320380001072
与含叠氮基的底物通过环加成反应形成的基团，
其中
n为1至6的整数；
R9是任选取代的C6芳基；任选取代的C4-5杂芳基，其为含有1或2个氮原子的六元环；或任选取代的C4-5杂环基，其为含有1或2个氮原子的六元环；
R10为H或C1-6烷基；
R11为卤素，-COOR11A或-CON(R11B)2，其中R11A和R11B各自独立为H，任选取代的C1-6烷基，任选取代的C6-14芳基，任选取代的C1-9杂芳基或任选取代的C2-9杂环基；和
含叠氮基的底物是
Figure BDA0002320320380001073
在一些实施方案中，非生物可逆基团是-LinkD(-RM1)r1，其中LinkD是多价接头，每个RM1独立地是H或辅助部分，并且r1是1至6的整数。
在某些情况下，-LinkD(-RM1)r1为式(XXIV)：
-QR-Q3([-Q4-Q5-Q6]r2-Q7-RM1)r1，
(XXIV)
其中
r1是1到6的整数；
每个r2独立地是0至50(例如0至30)的整数，其中重复单元相同或不同；
QR是[-Q4-Q5-Q6]r2-QL-，其中QL是任选取代的C2-12杂亚烷基(例如含有-C(O)-N(H)-，-N(H)-C(O)-，-S(O)2-N(H)-，或-N(H)-S(O)2-的杂亚烷基)，任选取代的C1-12硫杂亚杂环基(例如，
Figure BDA0002320320380001081
Figure BDA0002320320380001082
)，任选取代的C1-12亚杂环基(例如1，2，3-三唑-1，4-二基或
Figure BDA0002320320380001083
)，环丁-3-烯-1，2-二酮-3，4-二基，吡啶-2-基腙，任选取代的C6-16三唑杂亚杂环基(例如，
Figure BDA0002320320380001084
Figure BDA0002320320380001085
)，任选取代的C8-16三唑环亚烯基(例如，)，或二氢哒嗪基(例如，反式-
Figure BDA0002320320380001091
反式-
Figure BDA0002320320380001092
Figure BDA0002320320380001093
)；
Q3是线性基团(例如，[-Q4-Q5-Q6]r2-)，如果r1为1或支链基团(例如，[-Q4-Q5-Q6]s-Q8([-Q4-Q5-Q6]r2-(Q8)r3)r4，其中r3为0或1，r4为0、1、2或3)，如果r1是2到6的整数；每个r2独立地是0至50(例如0至30)的整数，其中重复单元相同或不同；
每个Q4和每个Q6独立地为不存在，-CO-，-NH-，-O-，-S-，-SO2-，-OC(O)-，-COO-，-NHC(O)-，-C(O)NH-，-CH2-，-CH2NH-，-NHCH2-，-CH2O-，或-OCH2-；
每个Q5独立地为不存在，任选取代的C1-12亚烷基，任选取代的C2-12亚烯基，任选取代的C2-12亚炔基，任选取代的C2-12杂亚烷基或任选取代的C1-9亚杂环基；
每个Q7独立为不存在，-CO-，-NH-，-O-，-S-，-SO2-，-CH2-，-C(O)O-，-OC(O)-，-C(O)NH-，-NH-C(O)-，-NH-CH(Ra)-C(O)-，或-C(O)-CH(Ra)-NH-；
每个Q8独立地为任选取代的C1-6烷烃-三基，任选取代的C1-6烷烃-四基，任选取代的C2-6杂烷烃-三基或任选取代的C2-6杂烷烃-四基；和
每个Ra独立地为H或氨基酸侧链；和
每个RM1独立地为H或辅助部分。
在式(XXIV)中，存在Q4，Q5和Q6中的至少一个。在式(XXIV)中，LinkD可以包含单个分支点(如果每个r3为0)或多个分支点(如果至少一个r3为1)。在式(XXIV)中，QR可以为-Q5-Q4-QL-，其中Q5是任选取代的C2-12杂亚烷基或任选取代的C1-12亚烷基，而Q4是-CO-，-NH-或-O-。在式(XXIV)中，QL可以是：
Figure BDA0002320320380001101
反式-反式-
Figure BDA0002320320380001103
Figure BDA0002320320380001104
在式(XXIV)中，Q3可以是式[-Q4-Q5-Q6]r2-的线性基团，其中Q4，Q5和Q6如式(XXIV)所定义。另外，Q3可以是[-Q4-Q5-Q6]r2-Q8([-Q4-Q5-Q6]r2-(Q8)r3)r4，的支链基团，其中每个Q8独立地为任选取代的C1-6烷烃-三基，任选取代的C1-6烷烃-四基，任选取代的C2-6杂烷烃-三基或任选取代的C2-6杂烷烃-四基；
其中
每个r2独立地是0至50(例如0至30)的整数，其中重复单元相同或不同；
r3为0或1；
r4是0、1、2或3；
其中，
当r3为0时，LinkD为三价或四价基团，并且，
当r3为1时，LinkD为四价，五价或六价基团。
在某些实施例中，r3是0。
在一些实施例中，Q8为：
Figure BDA0002320320380001111
本文以及WO2015/188197中描述了可用于制备式(I)中的-LinkD(-RM1)p基团的化合物。
在某些实施方案中，非生物可逆接头基团是
其中所述基团的一个末端与多核苷酸连接，而另一末端与靶标部分连接(在一个实施方案中，为抗体)。
辅助部分
辅助部分是包含染料或亲水基团或其组合的一价基团(例如，亲水聚合物(例如，聚(乙二醇)(PEG)))，带正电荷的聚合物(例如，聚(乙烯)亚胺)，或糖醇(例如葡萄糖醇))。辅助部分的理论分子量可为100Da至2.5kDa(例如350Da至2.5kDa，100Da至1200kDa或1kDa至2.5kDa)。
为了使摄取可视化或监测本发明的缀合物在细胞内的移动(例如，使用光漂白后的荧光回收(FRAP))，可以将染料包括在磷酸酯基团中。本领域已知的染料可以作为辅助部分通过磷酸酯或硫代磷酸酯的5′-或3′-末端或通过将两个连续核苷结合在一起的磷酸酯或硫代磷酸酯键接至多核苷酸。可以用作染料的有用结构的非限制性实例包括FITC，RD1，别藻蓝蛋白(APC)，aCFTM染料(Biotium，Hayward，CA)，BODIPY(Life Technologies的InvitrogenTM 10，Carlsbad，CA)，(Life Technologies的InvitrogenTM，Carlsbad，CA)，DyLight Fluor(Thermo Scientific Pierce Protein Biology Products，Rockford，IL)，ATTO(德国锡根的ATTO-TEC GmbH)，FluoProbe(Intermom SA，Motlucon，法国)和Abberior Probes(德国哥廷根的Abberior GmbH)。
可用作本发明的免疫调节多核苷酸和本发明的缀合物中的辅助部分的亲水性聚合物和带正电荷的聚合物是本领域已知的。亲水聚合物的非限制性实例是聚(乙二醇)。带正电的聚合物的非限制性实例是聚(乙烯亚胺)。
基于糖醇的辅助部分可以是例如氨基封端的葡萄糖醇或葡萄糖醇簇。氨基末端的葡萄糖醇辅助部分为：
Figure BDA0002320320380001121
葡萄糖醇簇的非限制性实例是：
Figure BDA0002320320380001122
在一个实施方案中，本文提供了式(B)的化合物：
Rx-LN-(Q)e (B)
或其立体异构体，两个或更多个非对映体，互变异构体，或两个或更多个互变异构体的混合物；或其药学上可接受的盐，溶剂化物，或水合物；
其中：
Rx是缀合基团；
LN是接头；
每个Q独立地是包含磷酸三酯的寡核苷酸；和
e为1，2，3，或4的整数。
在某些实施方案中，在式(B)中，Rx为
在某些实施方案中，在式(B)中，LN是包含聚乙二醇的接头。
在某些实施方案中，在式(B)中，LN为
Figure BDA0002320320380001124
其中d为约0至约50的整数。在某些实施方案中，d为约0至约10的整数。在某些实施方案中，是约0至约5的整数。在某些实施例中，d是约0，约1或约3的整数。
在某些实施方式中，在式(B)中，e是1的整数。
在某些实施方案中，在式(B)中，每个Q独立地具有式(D)的结构：
Figure BDA0002320320380001131
其中，XN，X3’，X5’，YP，b和c均如本文所定义。
靶向部分
本发明的缀合物中使用的靶向部分可以用于靶向体内的特定细胞和组织，以靶向递送缀合的有效载荷多核苷酸。本发明的缀合物靶向的细胞是专业的APCs(例如，B细胞，pDC或巨噬细胞)。所述靶向部分可以是抗原结合部分(例如，抗体或其抗原结合片段)、多肽、适体或包括一个或多个小分子(例如，甘露糖)的基团。本发明的缀合物中的靶向部分可以有效解决体内免疫调节多核苷酸的组织分布不均匀的问题。
抗原结合部分
本发明的缀合物中的抗原结合部分可以是抗体或其抗原结合片段(例如，F(ab)2或Fab)或其工程改造的衍生物(例如，Fcab或融合蛋白(例如scFv))。人或嵌合(例如，人源化)抗体可以用作本发明缀合物中的抗体。
抗原结合部分靶向具有被抗原结合部分识别的表面抗原的细胞。特别地，APCs可以被本发明的缀合物中的抗原结合部分靶向。B细胞可以被抗-CD38，抗-CD79b，抗-CD30，抗-CD22或抗-CD20，抗-CD19抗体或其抗原结合片段或它们的工程衍生物靶向。浆细胞样树突细胞(pDC)可以被抗-DEC205，抗-CD304，抗-CD303，抗-CD40，抗-CD74，抗-BDCA2或抗-CD123抗体或其抗原结合片段或它们的工程衍生物靶向。巨噬细胞可被抗-CD163，抗-CD40，抗-CD74，抗-CD206或抗-CD123抗体或其抗原结合片段或它们的工程衍生物靶向。
抗-CD38抗体的非限制性实例是达雷木单抗(daratumumab)，SAR650984，MOR202或WO2012/092616中公开的抗体Ab79、Ab19、Ab43、Ab72和Ab110中的任何一种，这些抗体的公开内容通过引用并入本文。抗CD79b抗体的非限制性实例是WO 2014/011521中公开的huMA79b v28。抗-CD22抗体的非限制性实例是US 2014/0127197中公开的10F4。抗-CD20抗体的非限制性实例是利妥昔单抗。抗-DEC205抗体的非限制性实例在US 2010/0098704中提供，其抗体通过引用并入本文。抗-CD40抗体的非限制性实例是lucatumumab和dacetuzumab。抗-CD304抗体的非限制性实例是vesencumab。
多肽
靶向部分可以是对细胞具有亲和力的多肽(例如，对细胞类型例如浆细胞样细胞具有亲和力的多肽)。多肽的非限制性实例是RGD肽，狂犬病病毒糖蛋白(RVG)和DC3肽。
小分子
靶向部分可以是能够与在靶细胞表面上表达的受体复合的小分子。可用作本发明的缀合物中的靶向部分的小分子的非限制性实例是叶酸，甘露糖，PSMA配体和甘露糖簇。
叶酸盐可以用作靶向部分。在本发明的缀合物中，叶酸可以具有以下结构：
甘露糖或甘露糖簇可用于将本发明的缀合物靶向浆细胞样树突细胞和巨噬细胞，因为这些细胞在其表面上表达甘露糖受体。
甘露糖簇在本领域中是已知的。甘露糖辅助部分(例如甘露糖簇)可以具有式(XXV)：
-(-QM1-QM2-QM3-)s3-QM4[(-QM1-QM2-QM3-)s3-QM5]p3，
(XXV)
其中
p3是1、2或3；
每个s3独立地是0到50的整数(例如0到30)；
每个QM1和每个QM3为独立的不存在，-CO-，-NH-，-O-，-S-，-SO2-，-OC(O)-，-COO-，-NHC(O)-，-C(O)NH-，-CH2-，-CH2NH-，-NHCH2-，-CH2O-，或-OCH2-；并且
每个QM2为独立地不存在，任选取代的C1-12亚烷基，任选取代的C2-12亚烯基，任选取代的C2-12亚炔基，任选取代的C2-12杂亚烷基或任选取代的C1-9亚杂环基；
QM4不存在(如果p3为1)，任选取代的C1-6烷烃-三基(如果p3为2)，任选取代的C1-6烷烃-四基(如果p3为3)，任选取代的C2-6杂烷烃-三基(如果p3为2)，或任选取代的C2-6杂烷烃-四基(如果p3为3)；
每个QM5独立为甘露糖或-QM6[(-QM1-QM2-QM3)s2-RM2]p1，其中每个RM2独立为甘露糖；和
每个QM6，如果存在的话，是独立地任选取代的C1-6烷烃-三基，任选取代的C1-6烷烃-四基，任选取代的C2-6杂烷烃-三基或任选取代的C2-6杂烷烃-四基。
甘露糖簇的非限制性实例是：
Figure BDA0002320320380001151
Figure BDA0002320320380001161
其中每个a独立为0到10的整数。
缀合物
在一个实施方案中，本文提供式(C)的缀合物：
Figure BDA0002320320380001162
或其立体异构体、两个或更多个非对映异构体的混合物、互变异构体或两个或更多个互变异构体的混合物；或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物；
其中Ab是靶向部分；f是1、2、3或4的整数；LN、Q和e各自如本文所定义。
在某些实施方案中，在式(C)中，Ab是抗体。在某些实施方案中，在式(C)中，Ab是单克隆抗体。
在某些实施方式中，在式(C)中，f是1或2的整数。在某些实施方式中，在式(C)中，f是1的整数。
在某些实施方式中，在式(C)中，e和f为均为1的整数。
术语“DAR”是指CpG抗体缀合物的药物-抗体比率，更具体地是多核苷酸-抗体比率。在一个实施方案中，CpG抗体缀合物的DAR为约1至约20，约1至约10，约1至约8，约1至约4或约1至约2。在另一个实施方案中，CpG抗体缀合物的DAR为约1，约2，约3，约4，约5，约6，约7或约8。
缀合物的制备
缀合物
本文描述了可用于将靶向部分与一个或多个免疫调节多核苷酸缀合的反应，并且是本领域已知的(例如，生物正交反应)。可用于形成该键的示例性反应包括叠氮基与基于炔烃的缀合基团(例如，含有内环碳-碳三键或碳原子任选取代的C6-16亚杂环基或任选取代的C8-16环炔基)之间的Hüisgen环加成(金属催化或无金属)形成三唑部分；亲二烯体与二烯/杂二烯之间的Diels-Alder反应；通过其他周环反应(如烯反应)形成键；酰胺或硫代酰胺键的形成；磺酰胺键的形成(例如与叠氮基化合物)；醇或酚烷基化(例如Williamson烷基化)，形成肟、腙或氨基脲基的缩合反应；亲核试剂(例如胺和硫醇)的共轭加成反应；二硫键形成；和在羰基上(例如在活化的羧酸酯，如五氟苯基(PFP)酯或四氟苯基(TFP)酯)或在亲电芳烃(低氟化芳烃，氟苄腈基或氟硝基苯基上的SNAr)进行亲核取代(被氨基、硫醇或羟基或亲核试剂)。在一些实施方案中，缀合反应是偶极环加成，并且缀合部分包括叠氮基，含有环内碳-碳三键的任选取代的C6-16亚杂环基或任选取代的C8-16环炔基。选择互补的反应性基团和缀合基团是因为它们相互互补。例如，可以在缀合基团和互补反应性基团之一中使用叠氮化物，而在缀合基团和互补反应性基团中的另一个中可以使用炔烃。
亲核/亲电子反应亲核试剂和亲电试剂可以参与形成键的反应，所述反应选自但不限于亲电试剂插入C-H键，亲电试剂插入O-H键，亲电试剂插入N-H键，亲电试剂跨烯烃、跨炔烃的亲电试剂加成，亲电羰基中心加成，亲电羰基中心上取代，乙烯酮加成，异氰酸酯的亲核加成，异硫氰酸酯的亲核加成，亲电子甲硅烷基的亲核取代，烷基卤化物或拟卤化物中的离去基团(例如卤化物或拟卤化物)的亲核取代；在活化的羧酸酯(例如，PFP酯或TFP酯)、硫代羧酸酯、酸酐或酰卤的羰基上的亲核加成/消除反应；向α，β-不饱和羰基进行亲核1，4-共轭加成，环氧化物的亲核开环，电子不足的芳族化合物的亲核芳族取代，向活化磷中心的亲核加成，在活化磷中心的亲核取代，向活性硫中心的亲核加成，以及在活性硫中心的亲核取代。
亲核缀合基团可以是任选取代的烯烃，任选取代的炔基，任选取代的芳基，任选取代的杂环基，羟基，氨基，烷基氨基，苯胺基或硫基。
亲电缀合基团可以是叠氮化物，活化的羰基(例如，活化的羧酸酯(例如，琥珀酰亚胺酯或磺基琥珀酰亚胺酯)，硫代酸酯，酸酐或酰基卤)，异氰酸酯，硫代异氰酸酯，Michael受体(例如，马来酰亚胺)，烷基卤或假卤，环氧化物，环硫醚，氮丙啶或缺电子的芳基。
例如，可通过缩合反应发生缀合以形成作为接头的腙键。
缀合可以包含酰胺键的形成(例如，通过活化基于羧基的缀合基团(例如，羧酸，酯或-CONH2))并随后与在缀合基团中的伯胺的反应。活化剂可以是各种碳二亚胺，例如：EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)，EDAC(1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)，DCC(二环己基碳二亚胺)，CMC(1-环己基-3-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺)，DIC(二异丙基碳二亚胺)或伍德沃德试剂K(N-乙基-3-苯基异恶唑-3′-磺酸盐)。使用转谷氨酰胺酶可以激活基于羧基的缀合基团获得-CONH2。活化的基于NHS-酯的缀合基团与基于伯胺的缀合基团的反应也导致酰胺键的形成。
多核苷酸可以包含基于羰基的缀合基团。可以通过还原胺化(例如，通过使胺基缀合基团与醛基缀合基团反应，然后用氢化物供体(例如氰基硼氢化钠或三乙酰氧基硼氢化钠)还原)来实现与仲胺的结合形成。
醚的形成还可以用于将靶向部分与一个或多个多核苷酸缀合以形成本发明的缀合物。醚键的形成可涉及基于环氧化物的缀合基团与基于羟基的缀合基团之间的反应。
硫醇也可以用作缀合基团。例如，可以通过吡啶基二硫键介导的硫醇-二硫键交换来完成通过二硫键形成的缀合。基于巯基的缀合基团的引入例如由Traut′s Reagent(2-亚氨基噻吩)SATA(N-琥珀酰亚胺基S-乙酰硫代乙酸酯)，SATP(琥珀酰亚胺基乙酰硫代丙酸酯)，SPDP(N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯，SMPT(琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)甲苯)，N-乙酰基半胱氨酸硫代内酯，SAMSA(S-乙酰基巯基琥珀酸酐)，AMBH(2-乙酰胺基-4-巯基丁酸酰肼)和胱胺(2，2′-二硫代双(乙胺)。
硫醚键的形成可以通过使基于巯基的缀合基团与基于马来酰亚胺或碘乙酰基的缀合基团反应或与基于环氧化物的缀合基团反应来进行。
基于马来酰亚胺的缀合基团可以通过SMCC(琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯)，磺基SMCC(磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯)，MBS(间-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)，磺基-MBS(间-马来酰亚胺苯甲酰基-N-磺基羟基琥珀酰亚胺酯)，SMPB(琥珀酰亚胺基-4-(对马来酰基苯基)丁酸酯)，磺基-SMPB(磺基琥珀酰亚胺基4-(p-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯)，GMBS(N-α-马来酰酰亚胺丁酰基-氧代琥珀酰亚胺酯)，磺基GMBS(N-α-马来酰亚胺丁酰基-氧磺基琥珀酰亚胺酯)。
形成氨基甲酸酯键的缀合可以通过使基于羟基的缀合基团与CDI(N，N′-羰基二咪唑)或DSC(N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯)或N-羟基琥珀酰亚胺基氯甲酸酯反应而进行。随后与基于胺基缀合基团反应。
环加成反应
环加成反应可以用于形成所需要的共价键。代表性环加成反应的示例包括但不限于，基于烯烃的缀合基团与基于1，3-二烯的缀合基团的反应(Diels-A1der反应)，基于烯烃的缀合基团与基于α，β-不饱和羰基缀合基团的反应(杂Diels-Alder反应)。以及基于炔基的缀合基团与基于叠氮基缀合基团的反应(Hüisgen环加成，包括其金属催化的和无金属的变体)得到三唑部分。用于环加成反应的包括反应物的缀合基团的选定的非限制性实例是：烯烃，炔烃，1，3-二烯，α，β-不饱和羰基和叠氮化物。例如，叠氮化物和炔烃之间的Hüisgen环加成反应(点击反应)已用于多种生物实体的功能化。
应变炔基缀合基团是包含一个环内碳-碳三键的碳环或杂环系统(例如，任选地取代的含有内环碳-碳三键C6-16的亚杂环基或任选地取代的C8-16环炔基)。应变的基于炔烃的缀合基团可用于通过具有叠氮基缀合基团的无金属偶极环加成而将靶向部分缀合至多核苷酸。
偶联反应
缀合基团可包括但不限于用于氢化硅烷化，烯烃交叉复分解，缀合物加成，Stille偶联，Suzuki偶联，Sonogashira偶联，Hiyama偶联和Heck反应的反应物。这些反应的缀合部分包括氢化硅烷，烯烃(例如，活化的烯烃，例如烯酮或烯酸酯)，炔烃，芳基卤化物，芳基假卤化物(例如，三氟甲磺酸酯或壬二酸酯)，烷基卤化物和烷基假卤化物(例如，三氟甲磺酸酯，壬酸酯，和磷酸酯)。用于交叉偶联反应的催化剂是本领域众所周知的。这样的催化剂可以是有机金属配合物或金属盐(例如，Pd(0)，Pd(II)，Pt(0)，Pt(II)，Pt(IV)，Cu(I)，或Ru(II)。可以加入添加剂，例如配体(例如PPh3，PCy3，BINAP，dppe，dppf，SIMes，或SIPr)和金属盐(例如LiCl)，以促进交叉偶联反应。
免疫调节多核苷酸的制备
可以根据多核苷酸化学合成领域中已知的方法，例如从核苷亚磷酰胺制备免疫调节多核苷酸。实施例中提供了核苷亚磷酰胺和免疫调节多核苷酸的合成的非限制性实例。亚磷酰胺可包括共价连接至亚磷酰胺的P原子的缀合基团。
靶向部分的制备
可通过在免疫调节多核苷酸中的缀合基团与结合至靶向部分的互补反应性基团之间形成键，将靶向部分与一个或多个多核苷酸缀合。靶向部分可固有地在抗体或其抗原结合片段或其工程衍生物中具有互补反应性基团(例如，Q-标签(例如，LLQGG，GGGLLQGG或本领域已知的另一Q-标签序列))，或者可以对其进行修饰以包括互补反应性基团(例如，通过将互补反应性基团连接至Q-标签)。将这种互补反应性基团引入靶向部分的方法是本领域已知的。
互补反应性基团可包括任选取代的C2-12炔基，任选取代的N-保护的氨基，叠氮基，N-马来酰亚胺基，S-保护的硫醇， 或其N保护的形式，
Figure BDA0002320320380001203
Figure BDA0002320320380001204
含有内环碳-碳三键的任选取代的C6-16杂环基(例如，
Figure BDA0002320320380001205
)，1，2，4，5-四嗪基(例如，
Figure BDA0002320320380001206
Figure BDA0002320320380001207
)，任选取代的C8-16环炔基(例如，
Figure BDA0002320320380001208
)，-NHRN1，任选取代的C4-8应变环烯基(例如，反式-环辛烯基或降冰片烯基)，或任选取代的含-COOR12或-CHO的C1-16烷基；
其中
RN1是H，N-保护基或任选取代的C1-6烷基；
每个R12独立地为H，任选取代的C1-6烷基或O-保护基(例如，羧基保护基)；和
R13是卤素(例如，F)。
可以保护互补反应性基团直到缀合反应。例如，被保护的互补反应基可以包括-COORPGO或-NHRPGN，其中RPGO是O-保护基(例如羧基保护基)，而RPGN是N-保护基。
在一些实施方案中，互补反应性基团是基团-Z3-QA3，
其中
Z3是二价、三价、四价或五价基团，其中一个价键被QA3取代，一个价键是开放的，并且每个其余的价键(如果存在的话)独立地被一个辅助部分取代；
QA3是任选取代的C2-12炔基，任选取代的N-保护的氨基，叠氮基，N-马来酰亚胺基，S-保护的硫醇，
Figure BDA0002320320380001211
Figure BDA0002320320380001212
或其N保护的形式，
Figure BDA0002320320380001213
Figure BDA0002320320380001214
含有环碳-碳三键的任选取代的C6-16杂环基(例如，)，1，2，4，5-四嗪基(例如，
Figure BDA0002320320380001216
Figure BDA0002320320380001217
)，任选取代的C8-16环炔基(例如，
Figure BDA0002320320380001218
)，-NHRN1，任选取代的C4-8应变环烯基(例如，反式-环辛烯基或降冰片烯基)，或任选取代的含-COOR12或-CHO的C1-16烷基；
其中
RN1是H，N-保护基或任选取代的C1-6烷基；
每个R12独立地为H，任选取代的C1-6烷基或O-保护基(例如，羧基保护基)；和
R13是卤素(例如，F)。
在某些实施方案中，Z3由支链基团和两个二价片段组成，其中该支链基团键接到两个二价片段的每一个上，
其中
所述二价片段之一具有开放价键，其余二价片段键接至QA3；和
所述支链基团由一个或两个独立地选自任选取代的C1-12烷烃-三基，任选取代的C1-12烷烃-四基，任选取代的C2-12杂烷烃-三基和任选取代的C2-12杂烷烃-四基的单体组成，其中支链基团的两个价键键接到两个二价片段上，并且每个其余的价键独立地被辅助部分取代。
Z3中的二价片段可以是-(-QB-QC-QD-)s1-，
其中
每个s1独立地是1到50的整数(例如1到30)；
每个QB和每个QD都分别为不存在，-CO-，-NH-，-O-，-S-，-SO2-，-OC(O)-，-COO-，-NHC(O)一，-C(O)NH-，-CH2-，-CH2NH-，-NHCH2-，-CH2O-，或-OCH2-；和
每个QC独立地为不存在，任选取代的C1-12亚烷基，任选取代的C2-12亚烯基，任选取代的C2-12亚炔基，任选取代的C2-12杂亚烷基或任选取代的C1-9亚杂环基。
在进一步的实施方案中，Z3的每个单体单元中存在QB和QD中的至少一个。
在另外的实施例中，-Z3-QA3是
-(-QB-QC-QD-)s1-QE(-QB-QC-QD-)s1-QA3，
(Vb)
其中
每个s1独立地是1到50的整数(例如1到30)；
QA3如本文所述；
每个QB和每个QD都分别独立地为不存在，-CO-，-NH-，-O-，-S-，-SO2-，-OC(O)-，-COO-，-NHC(O)-，-C(O)NH-，-CH2-，-CH2NH-，-NHCH2-，-CH2O-，或-OCH2-；和
每个QC独立地为不存在，任选取代的C1-12亚烷基，任选取代的C2-12亚烯基，任选取代的C2-12亚炔基，任选取代的C2-12杂亚烷基或任选取代的C1-9亚杂环基；和
QE为不存在或如本文所述的式(IV)的支链基团。
在某些实施例中，每个QB和每个QD独立地为不存在，-CO-，-NH-，-O-，-S-，-SO2-，-NHC(O)-，-C(O)NH-，-CH2-，-CH2NH-，-NHCH2-，-CH2O-，或-OCH2-。
在一些实施例中，-(-QB-QC-QD-)s1-组合以形成一个基团：
-QB-(CH2)g1-(CH2OCH2)g2-(CH2)g3-QD-，
其中
(i)g2是1到50的整数(例如1到40或1到30)；
(ii)g1为1且QB为-NHCO-，-CONH-或-O-；或g1为0且QD为-NHCO-；和
(iii)g3为1，QB为-NHCO-，-CONH-或-O-；或g3为0，QD为-CONH-。
在其他实施方案中，互补反应性基团为：
Figure BDA0002320320380001231
其中
QA2不存在，可独立任选取代的C2-12杂亚烷基(例如，含-C(O)-N(H)-，-N(H)-C(O)-，-S(O)2-N(H)-或-N(H)-S(O)2-的杂亚烷基)，任选取代的C1-12硫杂亚杂环基(例如，
Figure BDA0002320320380001241
Figure BDA0002320320380001242
)，任选取代的C1-12亚杂环基(例如1，2，3-三唑-1，4-二基或
Figure BDA0002320320380001243
)，环丁-3-烯-1，2-二酮-3，4-二基，吡啶-2-基腙，任选取代的C6-16三唑杂亚杂环基(例如，或者
Figure BDA0002320320380001245
)，任选取代的C8-16三唑环亚烯基(例如，
Figure BDA0002320320380001246
)，或二氢哒嗪基(例如，反式-
Figure BDA0002320320380001247
反式-
Figure BDA0002320320380001248
Figure BDA0002320320380001249
)；
QA3是任选取代的C2-12炔基，任选取代的N-保护的氨基，叠氮基，N-马来酰亚胺基，S-保护的硫醇，
Figure BDA0002320320380001251
Figure BDA0002320320380001252
或其N保护的形式，
Figure BDA0002320320380001253
Figure BDA0002320320380001254
含有环碳-碳三键的任选取代的C6-16杂环基(例如，
Figure BDA0002320320380001255
)，1，2，4，5-四嗪基(例如，
Figure BDA0002320320380001256
Figure BDA0002320320380001257
)，或任选取代的C8-16环炔基(例如，
Figure BDA0002320320380001258
)，-NHRN1，任选取代的C4-8应变环烯基(例如，反式-环辛烯基或降冰片烯基)，或任选取代的含-COOR12或-CHO的C1-16烷基；
RN1是H，N-保护基或任选取代的C1-6烷基；
每个R12独立地为H或任选取代的C1-6烷基；
R13是卤素(例如F)；
RT是与靶向部分的键；
QT是-CO-，-NH-，-NH-CH2-，或者-CO-CH2-；
X1，X3和X5各自独立地不存在，-O-，-NH-，-CH2-NH-，-C(O)-，-C(O)-NH-，-NH-C(O)-，-NH-C(O)-NH-，-O-C(O)-NH-，-NH-C(O)-O-，-CH2-NH-C(O)-NH-，-CH2-O-C(O)-NH-，或者-CH2-NH-C(O)-O-；
X2和X4各自独立地不存在，-O-，-NH-，-C(O)-，-C(O)-NH-，-NH-C(O)-，-NH-C(O)-NH-，-O-C(O)-NH-，或-NH-C(O)-O-；
x2是0到50的整数(例如1到40或1到30)；
x3是1到11的整数；和
每个x5独立地为0或1；和
每个x6独立地是0到10(例如1到6)的整数，前提是x6的两者的总和等于或小于12。
在其他实施方案中，互补反应性基团为：
Figure BDA0002320320380001271
其中
QA3是任选取代的C2-12炔基，任选取代的N-保护的氨基，叠氮基，N-马来酰亚胺基，S-保护的硫醇，
Figure BDA0002320320380001273
或者其N保护形式，
Figure BDA0002320320380001274
Figure BDA0002320320380001275
含有环碳-碳三键的任选取代的C6-16杂环基(例如，
Figure BDA0002320320380001276
)，1，2，4，5-四嗪基(例如，
Figure BDA0002320320380001277
Figure BDA0002320320380001278
)，或任选取代的C8-16环炔基(例如，)，-NHRN1，任选取代的C4-8应变环烯基(例如，反式-环辛烯基或降冰片烯基)，或任选取代的含-COOR12或-CHO的C1-16烷基；
每个RM1独立地为H或辅助部分；
RN1是H，N-保护基或任选取代的C1-6烷基；
每个R12独立地为H或任选取代的C1-6烷基；
R13是卤素(例如F)；
QT是-CO-，-NH-，-NH-CH2-，或-CO-CH2-；
RT是与靶向部分的键；
q5和q6各自独立地是1至10的整数(例如1至6)；
q7是0或1；
q8是0至50的整数(例如1至40或1至30)；和
q9是1到10的整数。
在其他实施方案中，互补反应性基团是：
Figure BDA0002320320380001281
Figure BDA0002320320380001291
或者
Figure BDA0002320320380001292
其中
每个RM1独立地为H或辅助部分；
QT是-CO-，-NH-，-NH-CH2-，或-CO-CH2-；
RT是与靶向部分键接的键；
q5和q6各自独立地是1至10的整数(例如1至6)；
q7是0或1；
q8是0至50的整数(例如1至40或1至30)；和
q9是1到10的整数。
固体支持物
本文公开的免疫调节多核苷酸可以与固体支持物结合。可以与多核苷酸一起使用的可断裂的固体支持物是本领域已知的。固体载体的非限制性实例包括例如通过本领域已知的可断裂的接头(例如，基于琥珀酸酯的接头)与链结合的受控孔玻璃或大孔聚苯乙烯(例如，UNYLINKERTM)。
方法
本发明的缀合物可通过使用识别APC类型的表面受体的靶向部分而用于将免疫调节多核苷酸选择性递送至专业APC(例如，B细胞，pDC或巨噬细胞)。不受理论的束缚，认为本发明的缀合物可以被运输(例如，通过主动运输)到表达一个或多个的内体toll样受体(例如TLR9)的专业APC(例如，B细胞，pDC或巨噬细胞)的内体中。因此，递送至内体的免疫刺激多核苷酸可以激动内体toll样受体(例如TLR9)。类似地，递送至内体的免疫抑制多核苷酸可以拮抗内体toll样受体(例如TLR9)。
细胞因子诱导
可以使用本发明的免疫刺激多核苷酸(例如，以本发明的缀合物)激动内体toll样受体，以诱导APCs中的细胞因子。例如，在B细胞中激动TLR9可以导致NFκB介导的炎性细胞因子(例如IL-6和IL-10)的激活，而在pDC或巨噬细胞中激动TLR9可以诱导I型干扰素(例如，IFNα或IFNβ)。可以使用本领域已知的方法确定APC中细胞因子的诱导。例如，在细胞与本发明的免疫刺激多核苷酸或缀合物接触后(例如，与参照细胞相比时，例如参照细胞与测试细胞不同之处在于本发明的免疫刺激多核苷酸或缀合物不递送至参考细胞)，APC中诱导的细胞因子的水平可以更高(例如高至少1％，至少10％，至少20％，至少30％，至少40％或至少50％)。
液体(血液学)和实体瘤的治疗
本发明的免疫刺激多核苷酸和/或缀合物可以用于治疗液体(例如血液学)或实体瘤的方法。不希望被理论所束缚，据认为本文所述的激动TLR9和诱导细胞因子可刺激针对液体或实体瘤的先天性或适应性免疫应答。通常，激动性TLR9对健康B细胞具有促增殖作用。相反，TLR9激动剂免疫刺激多核苷酸显示出对B淋巴瘤细胞的抗增殖作用。TLR9激动剂免疫刺激多核苷酸的抗增殖作用不需要传递至B淋巴瘤细胞。相反，可通过将免疫刺激多核苷酸递送至另一个APC(例如健康的APC)来诱导对B淋巴瘤细胞的抗增殖作用。不希望被理论所束缚，认为本发明的免疫刺激多核苷酸可以在APC(例如，健康的APC)中诱导一个或多个细胞因子，并且可以将一个或多个诱导的细胞因子转运至B淋巴瘤细胞以诱导具有抗增殖作用。因此，靶向B细胞的本发明的缀合物和本发明的免疫刺激多核苷酸可用于治疗液体肿瘤，例如非霍奇金B细胞淋巴瘤。可以使用本发明的免疫刺激多核苷酸及其缀合物治疗的淋巴瘤的非限制性实例是套细胞淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤，慢性淋巴细胞性白血病和多发性骨髓瘤。使pDC和巨噬细胞中的TLR9激动可以诱导I型干扰素(例如IFNα或IFNβ)并激活NK细胞，后者可以杀死肿瘤细胞(例如实体瘤细胞)。因此，由本发明的免疫刺激多核苷酸或缀合物刺激的先天性免疫应答可导致肿瘤细胞的降解。然后可以通过pDC募集肿瘤细胞降解产物，即肿瘤相关抗原，以针对剩余的肿瘤细胞引发CD8+T细胞，从而刺激针对实体瘤的适应性免疫应答。
本发明的缀合物可以解决体内免疫刺激多核苷酸的组织分布不均匀的问题。因此，本发明的缀合物可以全身地或在远离目标作用部位的部位施用于患者。
Toll样受体(TLR)信号作为先天免疫和适应性免疫之间的桥梁。Toll样受体激动剂能够诱导针对患病细胞(例如癌细胞或病原体感染细胞)的免疫应答，因此可以用作预防或治疗此类疾病的治疗剂。因此，在某些方面，本文提供了使用toll样受体(TLR)激动剂预防或治疗疾病的方法。此类方法包括向有需要的对象施用能够激活TLR的治疗剂，其中在施用TLR激动剂后，在该对象中诱导针对所治疗疾病的免疫应答。在某些实施方案中，该疾病选自赘生性疾病，例如癌症，和传染性疾病，例如病毒感染。
在一些实施方案中，本文提供了在患有癌症的对象中治疗癌症的方法，其包括向对象施用治疗有效量的TLR激动剂。如本文所述，在各种实施方案中，可以用本方法成功治疗的癌症类型包括原发性癌症，继发性癌症，复发性癌症和难治性癌症。进一步如本文所述，在各种实施方案中，可以用本方法成功治疗的癌症类型包括实体瘤和液体瘤。负责的从业人员可以根据临床标准确定癌症的成功治疗方法，例如通过治疗后的如下结果所示：癌症存活率、癌症消退(例如肿瘤大小缩小)、部分或完全的癌症缓解，包括无癌表型(即患者体内可检测不到癌细胞)。
因此，在一些实施方案中，用于预防或治疗癌症的方法包括向有需要的对象施用治疗有效量的一个或多个选自以下TLR激动剂：TLR1激动剂，TLR2激动剂，TLR3激动剂，TLR4激动剂，TLR5激动剂，TLR6激动剂，TLR7激动剂，TLR8激动剂，TLR9激动剂和TLR10激动剂。在本公开中发现使用的TLR激动剂的非限制性实例包括但不限于Pam3Cys，TLR1/2激动剂；CFA，TLR2激动剂；MALP2，TLR2激动剂；Pam2Cys，TLR2激动剂；FSL-1，一个TLR-2激动剂；Hib-OMPC，TLR-2激动剂；聚核糖核酸：聚核糖核酸(Poly I：C)，一个TLR3激动剂；聚腺苷-聚尿苷酸(polyAU)，TLR3激动剂；用聚-L-赖氨酸和羧甲基纤维素(Hiltonol)稳定的聚肌苷酸-聚胞苷酸，TLR3激动剂；细菌LPS是TLR4激动剂，细菌鞭毛蛋白是TLR5激动剂；咪喹莫特，TLR7激动剂；雷西莫德，TLR7/8激动剂；洛索立宾，TLR7/8激动剂；和未甲基化的CpG ODN，一个TLR9激动剂。本领域已知并在本公开中发现用途的其他TLR激动剂还包括但不限于与TLR4受体结合的氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸酯(AGPs)，已知其可用作疫苗佐剂和免疫刺激剂，以刺激细胞因子的产生、激活巨噬细胞、促进先天性免疫应答并增加被免疫动物的抗体产量。
本领域已知的并且在本公开中发现使用的其他TLR激动剂还包括其他病原体相关的分子模式(PAMPs)和损伤相关的分子模式(DAMPs)。(P.D’Arpa和K.Leung，Supra)。PAMPs的例子包括脂蛋白，脂肽，肽聚糖，酵母聚糖，脂多糖，奈瑟氏孔蛋白，鞭毛蛋白，补体蛋白，半乳糖神经酰胺，鼠李二肽。肽聚糖，脂蛋白和脂蛋白酸是革兰氏阳性的细胞壁成分。脂多糖由大多数细菌表达，其中MPL是一个例子。鞭毛蛋白是指由病原性和共生细菌分泌的细菌鞭毛的结构成分。rt.-半乳糖苷神经酰胺(rt.-GalCer)是天然杀伤T细胞(NKT)的激活剂。Muramyl二肽是所有细菌共有的生物活性肽聚糖基序。DAMPs的例子包括通过涉及分泌性溶酶体的非经典分泌机制分泌的蛋白质，例如高迁移率族盒(HMGB)1和半乳凝素-3；坏死细胞释放的分子，例如S100蛋白，HMGB1，IL-1a，半乳糖凝集素3，HSP60，HSP70，HSP72，组蛋白和核酸；细胞外基质分子，例如透明质酸，硫酸肝素，纤连蛋白和降解的基质成分。
含有CpG的寡脱氧核苷酸(ODN)是TLR9的激动剂，并激活针对肿瘤的先天免疫和适应性免疫。如本文所述，免疫刺激多核苷酸，包括天然存在的CpG ODN和合成的含CpG的多核苷酸，都被认为是用于预防或治疗癌症的治疗剂。
相应地，在一些实施方案中，本文提供了在患有癌症的对象中治疗癌症的方法，其包括向对象施用治疗有效量的含CpG的免疫刺激多核苷酸。在一些实施方案中，在上述用于治疗癌症的方法中施用的含CpG的免疫刺激多核苷酸能够在施用后激活TLR-医学信号通路。在一些实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸是天然存在的。天然存在的含CpG的免疫刺激多核苷酸的实例包括但不限于细菌或病毒来源的CpG ODN。在一些实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸是人工合成的。在一些实施方案中，合成的含CpG的免疫刺激多核苷酸具有与其天然对应物相同的序列。在一些实施方案中，合成的含CpG的免疫刺激多核苷酸的序列不同于天然存在的含CpG的免疫刺激多核苷酸。在一些实施方案中，将含CpG的免疫刺激多核苷酸化学修饰以包含一种或多种通常在核酸中不常见的化学实体。
在一些实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸是本公开表2中所列的免疫刺激多肽之一。在一些实施方案中，含CpG的多核苷酸选自p236，p238，p243，p246，p275，p276，p308，p313，p347，p361，p362，p425，p433，p434，p435，p436，p437，p438，p477，p478，p479，p480，p481，p482，p483，p484，p485，p486，p487，p488和p489。在一些实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸是p236。在一些实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸是p238。在一些实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸是p238。在一些实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸是p243。在一些实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸是p246。在一些实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸是p275。在一些实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸是p276。在一些实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸是p308。在一些实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸是313。在一些实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸是p347。在一些实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸是p361。在一些实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸是p362。在一些实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸是p425。在一些实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸是p433。在一些实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸是p434。在一些实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸是p435。在一些实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸是p436。在一些实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸是p437。在一些实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸是p438。在一些实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸是p477。在一些实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸是p478。在一些实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸是p479。在一些实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸是p480。在一些实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸是p481。在一些实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸是p482。在一些实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸是p483。在一些实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸是p484。在一些实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸是p485。在一些实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸是p486。在一些实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸是p487。在一些实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸是p488。在一些实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸是p489。
如本文提供的，含CpG的免疫刺激多核苷酸可以是独立的(free-standing)或是形成较大分子或复合物的一部分。在一些实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸不缀合(共价的或非共价的)至抗原或其抗原片段。在一些实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸不与正常免疫细胞或其抗原性片段编码和表达的抗原缀合。在一些实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸不与T细胞抗原或其表位缀合。在一些实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸不与卵清蛋白(OVA)或其表位缀合。在一些实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸不与日本雪松花粉过敏原Cryj2 T细胞表位肽缀合。在一些实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸不与肿瘤相关抗原缀合。
在特定实施方案中，将含CpG的免疫刺激多核苷酸缀合至靶向部分，以在施用于对象后靶向递送至特定的器官、组织、细胞和/或细胞室。在一些实施方案中，靶向部分是抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，靶向部分包含本文所述的化学部分。
在一些实施方案中，与其他非靶向细胞相比，靶向部分特异性地促进含CpG的免疫刺激多核苷酸到达靶细胞或细胞群。可以使用本领域已知的方法检测靶向递送，例如测量靶细胞或细胞群中含CpG的免疫刺激多核苷酸的细胞浓度，并将其与非靶细胞或细胞群中含CpG的免疫刺激多核苷酸的细胞浓度进行比较。例如，可以使用细胞标记物来鉴定和纯化特定的细胞群。用于检测和测量含CpG的免疫刺激多核苷酸的靶向递送的其他方法是本领域技术人员已知的，并且落在本公开的范围内。
在一些实施方案中，与非靶向细胞或细胞群相比，靶向部分递送至少2倍的含CpG的免疫刺激多核苷酸至靶向细胞或细胞群。在一些实施方案中，与非靶向细胞或细胞群相比，靶向部分递送至少5倍的含CpG的免疫刺激多核苷酸至靶向细胞或细胞群。在一些实施方案中，与非靶向细胞或细胞群相比，靶向部分递送至少10倍的含CpG的免疫刺激多核苷酸至靶向细胞或细胞群。在一些实施方案中，与非靶向细胞或细胞群相比，靶向部分递送至少20倍的含CpG的免疫刺激多核苷酸至靶向细胞或细胞群。在一些实施方案中，与非靶向细胞或细胞群相比，靶向部分递送至少30倍的含CpG的免疫刺激多核苷酸至靶向细胞或细胞群。在一些实施方案中，与非靶向细胞或细胞群相比，靶向部分递送至少40倍的含CpG的免疫刺激多核苷酸至靶向细胞或细胞群。在一些实施方案中，与非靶向细胞或细胞群相比，靶向部分递送至少50倍的含CpG的免疫刺激多核苷酸至靶向细胞或细胞群。在一些实施方案中，与非靶向细胞或细胞群相比，靶向部分递送至少100倍的含CpG的免疫刺激多核苷酸至靶向细胞或细胞群。在一些实施方案中，与非靶向细胞或细胞群相比，靶向部分递送多于100倍的含CpG的免疫刺激多核苷酸至靶向细胞或细胞群。
在一些实施方案中，靶向部分通过与位于靶细胞附近、之上和/或内部的接收部分特异性结合而将含CpG的免疫刺激多核苷酸递送至靶细胞。在一些实施方案中，靶向部分是抗体或其抗原结合片段，而接收部分是由靶细胞产生的抗原或其抗原片段。在一些实施方案中，接收部分是细胞表面抗原。在一些实施方案中，接收部分位于靶细胞的胞质溶胶内。在一些实施方案中，接收部分与靶细胞的细胞内细胞器例如内体或吞噬体相关。在一些实施方案中，在结合靶向部分后，靶向细胞将包含CpG的免疫刺激多核苷酸内化。在一些实施方案中，接收部分促进含CpG的免疫刺激多核苷酸的内化。在一些实施方案中，靶向细胞进一步将内化的含CpG的免疫刺激多核苷酸转运至细胞内区室，例如内体或吞噬体。在一些实施方案中，接收部分促进含CpG的免疫刺激多核苷酸的运输。
在治疗癌症的方法的一些实施方案中，靶向细胞表达至少一个toll样受体，例如TLR7和/或TLR9。在一些实施方案中，靶向细胞是正常免疫细胞，例如抗原呈递细胞(APC)。在一些实施方案中，靶向细胞是癌细胞，例如B细胞淋巴瘤细胞。在一些实施方案中，接收部分与toll样受体位于同一细胞膜上。在一些实施方案中，接收部分和toll样受体都位于靶细胞的细胞膜上。在一些实施方案中，接收部分和toll样受体都位于靶细胞的内体膜或吞噬体膜上。在一些实施方案中，靶向部分与接收部分的结合促进含CpG的免疫刺激多核苷酸与靶细胞表达的TLR9受体的结合。
在一些实施方案中，将含CpG的免疫刺激多核苷酸缀合至抗体或其抗原结合片段以形成CpG-Ab免疫缀合物。在一些实施方案中，缀合是通过共价键，例如通过本文提供的化学接头分子。在其他实施方案中，缀合是通过非共价键，例如通过配体与其受体之间的结合相互作用。可以结合本公开使用的非共价键的其他实例包括但不限于静电相互作用(例如TAT或精胺或鱼精蛋白复合物)和生物素-亲和素/链霉亲和素相互作用。
在一些实施方案中，所述抗体选自抗CD20抗体，抗CD22抗体，抗CD30抗体，抗CD37抗体，抗CD38抗体，抗CD40抗体，抗CD74抗体，抗CD79b抗体，抗CD205抗体，抗CD274抗体，抗CD303抗体，抗CD304抗体，抗CD19抗体，抗CD1抗体，抗CD2抗体，抗CD3抗体，抗CD5抗体，抗CD6抗体，抗CD9抗体，抗CD11抗体，抗CD18抗体，抗CD21抗体，抗CD23抗体，抗CD24抗体，抗CD25抗体，抗CD26抗体，抗CD44抗体，抗CD45R抗体，抗CD49抗体，抗CD66(癌胚抗原，CEA)抗体，抗CD93抗体，抗CD52抗体，抗CD56抗体，抗CD123抗体，抗CD138抗体，抗CD163抗体，抗CD206抗体。在一些实施方案中，该抗体是抗CD20抗体。在一些实施方案中，该抗体是抗CD22抗体。在一些实施方案中，该抗体是抗CD30抗体。在一些实施方案中，该抗体是抗CD38抗体。在一些实施方案中，该抗体是抗CD40抗体。在一些实施方案中，该抗体是抗CD74抗体。在一些实施方案中，该抗体是抗CD76b抗体。在一些实施方案中，该抗体是抗CD205抗体。在一些实施方案中，该抗体是抗CD274抗体。在一些实施方案中，该抗体是抗CD303抗体。在一些实施方案中，该抗体是抗CD304抗体。在一些实施方案中，该抗体是抗CD19抗体。在一些实施方案中，该抗体是抗CD1抗体。在一些实施方案中，该抗体是抗CD2抗体。在一些实施方案中，该抗体是抗CD3抗体。在一些实施方案中，该抗体是抗CD5抗体。在一些实施方案中，该抗体是抗CD6抗体。在一些实施方案中，该抗体是抗CD9抗体。在一些实施方案中，该抗体是抗CD11抗体。在一些实施方案中，该抗体是抗CD18抗体。在一些实施方案中，该抗体是抗CD21抗体。在一些实施方案中，该抗体是抗CD23抗体。在一些实施方案中，该抗体是抗CD24抗体。在一些实施方案中，该抗体是抗CD25抗体。在一些实施方案中，该抗体是抗CD26抗体。在一些实施方案中，该抗体是抗304抗体。在一些实施方案中，该抗体是抗CD44抗体。在一些实施方案中，该抗体是抗CD45R抗体。在一些实施方案中，该抗体是抗CD49抗体。在一些实施方案中，该抗体是抗CD66(癌胚抗原，CEA)抗体。在一些实施方案中，该抗体是抗CD93抗体。在一些实施方案中，该抗体是抗CD52抗体。在一些实施方案中，该抗体是抗CD56抗体。在一些实施方案中，该抗体是抗CD123抗体。在一些实施方案中，该抗体是抗CD138抗体。在一些实施方案中，该抗体是抗CD163抗体。在一些实施方案中，该抗体是抗CD206抗体。在一些实施方案中，该抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，该抗体是人抗体。在一些实施方案中，抗体是人源化抗体。
在一些实施方案中，CpG-Ab缀合物是在本公开的表6-A或6-B中列出的免疫缀合物之一。在一些实施方案中，CpG-Ab缀合物选自如表6-A和6-B中所示的SB-342，SB-343，SB-341，SB-340，SB-179，SB-181，SB-186，SB-189，SB-228，SB-229，SB-242，SB-263，SB-337，SB-267，SB-284，SB-312，SB-313，SB-347，SB-373，SB-382，SB-388，SB-389，SB-408，SB-416，SB-419，SB-421，SB-423，SB-426，SB-427，SB-428，SB-429和SB-430。
CpG-Ab免疫缀合物可以包含一个或多个含CpG的免疫刺激多核苷酸和一个或多个抗体或其抗原结合片段。抗体或其抗原结合片段与免疫缀合物中的含CpG的免疫刺激多核苷酸之间的分子比(Ab∶CpG比)可以为1∶1至1∶100。在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物的Ab∶CpG比率为1∶1。在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物的Ab∶CpG比率为1∶2。在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物的Ab∶CpG比率为1∶3。在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物的Ab∶CpG比率为1∶4。在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物的Ab∶CpG比率为1∶5。在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物的Ab∶CpG比率为1∶6。在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物的Ab∶CpG比率为1∶7。在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物的Ab∶CpG比率为1∶8。在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物的Ab∶CpG比率为1∶9。在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物的Ab∶CpG比率为1∶10。在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物的Ab∶CpG比率为1∶15。在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物的Ab∶CpG比率为1∶20。在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物的Ab∶CpG比率为1∶30。在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物的Ab∶CpG比率为1∶40。在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物的Ab∶CpG比率为1∶50。在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物的Ab∶CpG比率为1∶60。在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物的Ab∶CpG比率为1∶70。在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物的Ab∶CpG比率为1∶80。在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物的Ab∶CpG比率为1∶90。在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物的Ab∶CpG比率为1∶100。
在一些实施方案中，用于治疗癌症的方法包括向患有癌症的对象施用治疗有效量的CpG-Ab免疫缀合物，其中在向对象施用时，CpG-Ab免疫缀合物靶向正常免疫细胞。在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物靶向选自T细胞，B细胞，自然杀伤细胞，嗜中性粒细胞，肥大细胞，巨噬细胞，抗原呈递细胞(APC)，嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞的一种或多种正常细胞。在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物靶向正常的APC。在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物靶向选自B细胞，单核细胞，树突状细胞，朗格汉斯细胞，角质形成细胞，内皮细胞，星形胶质细胞，成纤维细胞和少突胶质细胞的一种或多种类型的正常APC。在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物靶向正常B细胞。在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物靶向正常树突细胞。在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物靶向正常巨噬细胞。在一些实施方案中，靶向一种或多种类型的正常细胞的CpG-Ab免疫缀合物不靶向异常细胞，例如癌细胞。
在一些实施方案中，用于治疗癌症的方法包括向患有癌症的对象施用治疗有效量的CpG-Ab免疫缀合物，其中在向对象施用时，CpG-Ab免疫缀合物靶向表达至少一个toll样受体的细胞。在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物靶向表达TLR9的细胞。在一些实施方案中，CpG-免疫缀合物靶向表达TLR7的细胞。在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物靶向选自树突细胞(DCs)，B细胞，T细胞，朗格汉斯细胞，角质形成细胞，肥大细胞，内皮细胞，成肌纤维细胞和原代成纤维细胞的表达TLR的细胞。
在一些实施方案中，用于治疗癌症的方法包括向患有癌症的对象施用治疗有效量的CpG-Ab免疫缀合物，其中所述CpG-Ab免疫缀合物靶向正在被治疗的癌症的异常细胞。在一些实施方案中，这样的异常细胞是癌细胞。在一些实施方案中，这样的异常细胞是被治疗的肿瘤的基质细胞。在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物靶向一种或多种类型的癌细胞，B细胞癌，例如多发性骨髓瘤，
Figure BDA0002320320380001371
巨球蛋白血症，重链疾病，例如α链疾病，γ链病和mu链病，良性单克隆尿囊病和免疫细胞淀粉样变性病，黑素瘤，乳腺癌，肺癌，支气管癌，结肠直肠癌，前列腺癌，胰腺癌，胃癌，卵巢癌，膀胱癌，脑或中枢神经系统癌，周围神经系统癌，食道癌，宫颈癌，子宫或子宫内膜癌，口腔癌或咽癌，肝癌，肾癌，睾丸癌，胆道癌，小肠或阑尾癌，唾液腺癌，甲状腺癌，肾上腺癌，骨肉瘤，软骨肉瘤，血液组织癌等。适用于本发明所涵盖的方法的其他类型的癌症的非限制性实例包括人肉瘤和癌，例如纤维肉瘤，粘肉肉瘤，脂肪肉瘤，软骨肉瘤，成骨肉瘤，脊索瘤，血管肉瘤，内皮肉瘤，淋巴管肉瘤，淋巴管内皮细胞肉瘤，滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤，结肠癌，结肠直肠癌，胰腺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳头状癌，乳头状腺癌，膀胱腺癌，髓样癌，支气管癌，肾细胞癌，肝癌，胆管癌，肝癌，绒毛膜癌，鼻息肉瘤，胚胎癌，威尔姆斯氏肿瘤，子宫颈癌，骨癌，脑瘤，睾丸癌，肺癌，小细胞肺癌癌，膀胱癌，上皮癌，神经胶质瘤，星形细胞瘤，髓母细胞瘤，颅咽管瘤，室管膜瘤，松果体瘤，血管母细胞瘤，听神经瘤，少突胶质细胞瘤，脑膜瘤，黑素瘤，神经母细胞瘤，视网膜母细胞瘤；白血病，例如急性淋巴细胞白血病和急性粒细胞白血病(粒细胞，早幼粒细胞，粒单核细胞，单核细胞和红白血病)；慢性白血病(慢性粒细胞性(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞性白血病)；和真性红细胞增多症，淋巴瘤(霍奇金氏病和非霍奇金氏病)，多发性骨髓瘤，沃尔登斯特罗姆巨球蛋白血症和重链疾病。在一些实施方案中，癌症本质上是上皮癌，包括但不限于膀胱癌，乳腺癌，宫颈癌，结肠癌，妇科癌，肾癌，喉癌，肺癌，口腔癌，头颈癌，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌或皮肤癌。在其他实施方案中，癌症是乳腺癌，前列腺癌，肺癌或结肠癌。在其他实施方案中，上皮癌是非小细胞肺癌，非乳头状肾细胞癌，子宫颈癌，卵巢癌(例如浆液性卵巢癌)或乳腺癌。上皮癌可以以多种其他方式表征，包括但不限于浆液性，子宫内膜样，粘液性，透明细胞，Brenner或未分化的。
在一些实施方案中，用于治疗癌症的方法包括向患有癌症的对象施用治疗有效量的CpG-Ab免疫缀合物，其中所述CpG-Ab免疫缀合物靶向被治疗的癌症的异常细胞并且还靶向正常免疫细胞，所述正常免疫细胞选自T细胞，B细胞，自然杀伤细胞，嗜中性粒细胞，肥大细胞，巨噬细胞，抗原呈递细胞(APC)，嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞。在一些实施方案中，靶向被治疗的癌症的异常细胞的CpG-Ab免疫缀合物还靶向选自B细胞，单核细胞，树突状细胞，朗格汉斯细胞，角质形成细胞，内皮细胞，星形胶质细胞，成纤维细胞和少突胶质细胞的正常APC。在一些实施方案中，靶向被治疗的癌症的异常细胞的CpG-Ab免疫缀合物还靶向表达TLR受体的细胞，其选自树突细胞(DCs)，B细胞，T细胞，朗格汉斯细胞，角质形成细胞，肥大细胞，内皮细胞，成肌纤维细胞和原代成纤维细胞。在特定的实施方案中，这样的异常细胞是癌性免疫细胞。在特定的实施方案中，这样的异常细胞是淋巴瘤细胞或白血病细胞。在特定的实施方案中，这种异常细胞是B细胞淋巴瘤细胞，并且CpG-Ab免疫缀合物靶向对象中的B细胞淋巴瘤细胞和正常B细胞。
在一些实施方案中，用于治疗癌症的方法包括向患有癌症的对象施用治疗有效量的CpG-Ab免疫缀合物，其中含CpG的免疫刺激多核苷酸在到达靶细胞时激活TLR9介导的信号传导途径。这种活化可以通过使含CpG的免疫刺激多核苷酸与在靶细胞的表面或细胞质内表达的TLR9受体结合而实现。在一些实施方案中，被CpG-Ab免疫缀合物靶向的细胞能够内化CpG-Ab免疫缀合物。在一些实施方案中，由CpG-Ab免疫缀合物靶向的细胞能够内化免疫缀合物的含CpG的免疫刺激多核苷酸部分。在一些实施方案中，由CpG-Ab免疫缀合物靶向的细胞能够将内化的CpG-Ab免疫缀合物或其含CpG的免疫刺激多核苷酸部分转运至表达TLR受体的细胞内细胞器。在一些实施方案中，由CpG-Ab免疫缀合物靶向的细胞能够将内化的CpG-Ab免疫缀合物或其含CpG的免疫刺激多核苷酸部分转运至细胞的内体或吞噬体。
在一些实施方案中，用于治疗癌症的方法包括向患有癌症的对象施用治疗有效量的CpG-Ab免疫缀合物，其中所述CpG-Ab免疫缀合物特异性结合与靶细胞相关的抗原。如本文所述，与靶细胞相关的抗原可以在靶细胞的表面和/或细胞溶胶中发现。在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物特异性结合至靶细胞表面上存在的抗原。在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物特异性结合至靶细胞的细胞溶胶内存在的抗原。在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物与靶细胞的细胞内区室或细胞器的膜上存在的抗原特异性结合。在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物特异性结合驻留在靶细胞的内体或吞噬体膜上的抗原。在一些实施方案中，在与CpG-Ab免疫缀合物结合后，靶抗原促进CpG-Ab免疫缀合物或含CpG的免疫刺激多核苷酸内化到靶细胞中。在一些实施方案中，在与CpG-Ab免疫缀合物结合后，靶抗原促进CpG-Ab免疫缀合物或含CpG的免疫刺激多核苷酸向靶细胞的内体的转运。在一些实施方案中，在与CpG-Ab免疫缀合物结合后，靶抗原促进含CpG的免疫刺激多核苷酸与靶细胞表达的TLR9的结合。
在一些实施方案中，与靶细胞相关的抗原是由靶细胞编码和表达的蛋白质。在那些实施方案中，蛋白质抗原可以由靶细胞的内源基因(例如，由靶细胞基因组编码)或外源基因(例如，由人工引入靶细胞的基因编码)编码。在其他实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物的靶抗原不由靶细胞编码或表达。在一些实施方案中，与靶细胞相关的抗原是被靶细胞摄取的外源性抗原(例如，由APC内吞并加工的抗原)。
作为非限制性实例，在一些实施方案中，为了靶向正常免疫细胞，CpG-Ab免疫缀合物的靶抗原由正常免疫细胞编码和表达(例如，B细胞抗原)。在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物的靶抗原由正常免疫细胞的内源基因编码。在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物的靶抗原由引入正常免疫细胞中的外源基因(例如，报道基因)编码。在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物的靶抗原是被免疫细胞吸收和加工的疾病抗原(例如，肿瘤相关抗原或病毒抗原)。
作为非限制性实例，在一些实施方案中，为了靶向异常细胞(例如癌细胞或病原体感染的细胞)，CpG-Ab免疫缀合物的靶抗原可以是由异常细胞内源性基因编码的蛋白。在各种实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物的靶抗原在靶细胞中过度表达、突变或失调。在其他实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物的靶抗原具有与该抗原在正常细胞中相同的特征。在其他实施方案中，CpG-免疫缀合物的靶抗原由引入异常细胞(例如，通过病原体感染)的外源基因编码。
在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物特异性结合由选自T细胞，B细胞，天然杀伤细胞，嗜中性粒细胞，肥大细胞，巨噬细胞，抗原呈递细胞(APC)，嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞的正常免疫细胞编码和表达的抗原。在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物特异性结合由选自以下的正常抗原呈递细胞(APC)编码和表达的抗原：B细胞，单核细胞，树突状细胞，朗格汉斯细胞，角质形成细胞，内皮细胞，星形胶质细胞，成纤维细胞和少突胶质细胞。在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物特异性结合由正常B细胞编码和表达的抗原。在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物特异性结合由正常树突细胞编码和表达的抗原。在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物特异性结合由巨噬细胞编码和表达的抗原。
在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物特异性结合由正常免疫细胞编码和表达的抗原，所述抗原选自免疫检查点分子，T细胞共刺激分子，MHC蛋白(包括I类和II类MHC分子)和其他免疫细胞特异性抗原。
在特定实施方案中，在本公开中发现使用的免疫检查点分子包括但不限于PD-1，PD-L1，PD-L2，TIM-3，LAG-3，CEACAM-1，CEACAM-5，CLTA-4，VISTA，BTLA，TIGIT，LAIR1，CD47，CD160、2B4和TGFR。
在特定的实施方案中，在本发明中发现使用的T细胞共刺激分子包括但不限于OX40，CD2，CD27，CDS，ICAM-1，LFA-1/CD11a/CD18，ICOS/CD278，4-1BB/CD137，GITR，CD30，CD40，BAFFR，HVEM，CD7，LIGHT，NKG2C，SLAMF7，NKp80，CD160，B7-H3和CD83。
在特定的实施方案中，在本发明中发现使用的B细胞特异性抗原包括但不限于B220/CD45R，B7-1/CD80，B7-2/CD86，BCMA/TNFRSF17，BLIMP1/PRDM1，C1q R1/CD93，CD117/c-kit，CD11b/整联蛋白αM，CD19，CD1c/BDCA-1，CD1d，CD20，CD21，CD23/FαεRII，CD24，CD25/IL-2Rα，CD27/TNFRSF7，CD34，CD37，CD38，CD40/TNFRSF5，CD43，CD5，CD69，CD72，CD83，CXCR4，CXCR5，DEP-1/CD148，EMMPRIN/CD147，FCRL3/FcRH3，Flt-3/Flk-2，HLA-DR，IgM，IL-10，IL-12Rβ2，IL-12/IL-35p35，IL-21，IL-21R，IL-27Rα/WSX-1/TCCR，IL-27/IL-35EBI3亚基，IL-3Rα/CD123，IL-4Rα，IL-7Rα/CD127，IRF4，MHC II类(IA/IE)，Neprilysin/CD 10，Pax5/BSAP，Sca-1/Ly6，Siglec-2/CD22，STAT 1，STAT3，Syndecan-1/CD 138，TACI/TNFRSF13B，TGF-B，TIM-1/KIM-1/HAVCR，TLR4。在特定实施方案中，B细胞特异性抗原选自CD1，CD2，CD5，CD9，CD11，CD17，CD18，CD19，CD20，CD21/CD35，CD22，CD23，CD24，CD25，CD27，CD30，CD38，CD40，CD45R/B220，CD69，CD70，CD78，CD79a(Igα)，CD79b(Igβ)，CD80，CD86，CD93(C1RqP)，CD137/4-1BB，CD138，CD252/OX40L，CD267，CD268/BAFF-R，CD279/PD1，CD319，PDL-2，Pax-5，IgD，IgM，Notch 2和TLR4。
在特定的实施方案中，在本公开中发现使用的树突细胞特异性抗原包括但不限于B220/CD45R，BATF3，BST-2/系链in，CD11b/整联蛋白αM，CD11c，CD14，CD163，CD19，CD1c/BDCA-1，CD1d1，CD20，CD3，CD4，CD8，CLEC9a，CX3CR1，DC-SIGN/CD209，DEC-205/CD205，DLEC/CLEC4C/BDCA-2，E-钙黏着蛋白，EpCAM/TROP1，F4/80，FcεRIα，FcγRI/CD64，FcγRIA/CD64，FcγRIB/CD64，FcγRIII(CD16)，FcγRIIIA/CD16a，FcγRIIIB/CD16b，GFI-1，HLA-DR，IFN-α，IFN-β，IFN-γ，IGSF4A/SynCAM1，Ikaros，IL-1β/IL-1F2，IL-10，IL-12，IL-2，IL-23，IL-3Rα/CD123，IL-6，iNOS，整联蛋白αE/CD103，IRF4，IRF8，Langerin/CD207，Ly-6G(Gr-1)，Ly-6G/Ly-6C(Gr-1)，II类MHC(IA/IE)，MMR/CD206，NCAM-1/CD56，Neuropilin-1，NFIL3/E4BP4，一氧化氮，PU.1/Spi-1，SIRPα/CD172a，Spi-B，血栓调节蛋白/BDCA-3，TLR7，TLR9，TNF-α和XCR1。另外的树突状细胞抗原和特异性结合树突状细胞抗原的抗体是本领域已知的，例如在Rafael
Figure BDA0002320320380001421
Current Protocols in Cytometry(2001)9.17.1-9.17.15；Hock等.Immunology 83：573-581；Jiang，W.，等Nature 375：151-155；和Bender等J.Immunol.Methods 196：121-135；和M.Colli等Immunology.2013 Sep；140(1)：22-30中描述的那些，每个内容均通过引用全文并入本文。在特定的实施方案中，树突细胞特异性抗原选自CD1a，CD1b/c，CD4，CD8，CD11b，CD11c，CD40，CD45R/B220，CD49d，CD80，CD83，CD85a，CD85f，CD85g/ILT7，CD85i，CD85j，CD86，CD123，CD197/CCR7，CD205，CD206，CD207，CD208，CD209，CD273/B7-DC/PD-L2，CD303/BDCA-2，CD304/神经纤毛蛋白-1，DC标记/33D1，F4/80，I类MHC，fascin，HLA-DR和Siglec H。在特定实施方案中，树突细胞特异性抗原是浆细胞样树突细胞抗原，其选自CD1a，CD1b，CD1c，CD4，CD8，CD11b，CD11c，CD40，CD45R/B220，CD49d，CD80，CD83，CD85g/ILT7，CD86，CD123，CD197(CCR7)，CD273(B7-DC，PD-L2)，CD303(BDCA-2)，CD304(Neuropilin-1)，DC标记(33D1)，F4/80，HLA-DR，II类MHC，SiglecH。
在特定的实施方案中，发现在本公开中使用的巨噬细胞表面抗原包括但不限于激活素A，AIF-1/Iba1，精氨酸酶1/ARG1，B7-1/CD80，B7-2/CD86，降钙素R，CCL1/I-309/TCA-3，CCL11/趋化因子，CCL14/HCC-1/HCC-3，CCL15/MIP-1δ，CCL16/HCC-4，CCL17/TARC，CCL18/PARC，CCL19/MIP-3β，CCL2/JE/MCP-1，CCL20/MIP-3α，CCL22/MDC，CCL23/Ckβ8-1，CCL23/MPIF-1，CCL24/Eotaxin-2/MPIF-2，CCL26/Eotaxin-3，CCL3/CCL4，CCL3/MIP-1α，CCL4/MIP-1β，CCL5/RANTES，CCL8/MCP-2，CCR2，CCR5，CD11b/IntegrinαM，CD11c，CD15/LewisX，CD163，CD200R1，CD200R1L，CD36/SR-B3，CD43，CD45，CD68/SR-D1，CLEC10A/CD301，COX-2，CX3CL1/FFactalkine，CX3CR1，CXCL1/GROα/KC/CINC-1，CXCL10/IP-10/CRG-2，CXCL11/I-TAC，CXCL13/BLC/BCA-1，CXCL16，CXCL2/GROβ/MIP-2/CINC-3，CXCL3/GROgamma/CINC-2/DCIP-1，CXCL5/ENA-70，CXCL5/ENA-74，CXCL5/ENA-78，CXCL9/MIG，CXCR1/IL-8RA，CXCR2/IL-8RB，DC-SIGN/CD209，DEC-205/CD205，Dectin-1/CLEC7A，Dectin-2/CLEC6A，EMR1，F4/80，FcεRIα，FcγRI/CD64，FcγRIA/CD64，FcγRIB/CD64，FcγRII/CD32，FcγRIII(CD16)，FIZZ1/RELMα，半乳糖凝集素-3，GATA-6，G-CSF，GITR配体/TNFSF18，GM-CSF，HLA-DR，ID2，IFN-γ，IFN-γR1/CD119，IL-1β/IL-1F2，IL-1RII，IL-10，IL-15，IL-17/IL-17A，IL-18/IL-1F4，IL-1ra/IL-1F3，IL-23，IL-4Rα，IL-6，IL-8/CXCL8，iNOS，整联蛋白αL/CD11a，IRF4，IRF5，LAMP-2/CD107b，Langerin/CD207，LILRB4/CD85k/ILT3，L-选择素/CD62L，LXRα/NR1H3，Ly-6G(Gr-1)，Ly-6G/Ly-6C(Gr-1)，MARCO，M-CSFR/CD115，Mer，MFG-E8，MHCII类(IA/IE)，MMR/CD206，NFATC1，NGFI-Bα/Nur77/NR4A1，PPARdelta/NR1C2，PPARγ/NR1C3，RANK/TNFRSF11A，RUNX3/CBFA3，Siglec-1/CD169，Siglec-3/CD33，Siglec-F，SIGNR1/CD209b，SIRPα/CD172a，SLAM/CD150，SOCS-3，鞘氨醇激酶1/SPHK1，鞘氨醇激酶2/SPHK2，SR-AI/MSR，SR-BI，STAT1，STAT6，TGF-β，TIM-4，TLR1，TLR2，TLR4，TLR8，TNF-α，TRACP/PAP/ACP5，VCAM-1/CD106，VEGF和YM1/几丁质酶3样3。在一些实施方案中，巨噬细胞特异性抗原选自CD11a，CD11b，CD11c，CD14，CD15(SSEA-1)，CD16/32，CD33，CD64，CD68，CD80，CD85k(ILT3)，CD86，CD105(Endoglin)，CD107b，CD115，CD163，CD195(CCR5)，CD282(TLR2)，CD284(TLR4)，F4/80，GITLL，HLA-DR，Mac-2(Galectin-3)，II类MHC。
在特定实施方案中，在本公开中发现使用的T细胞特异性抗原包括但不限于CD3，CD4，CD8，CD25，CD127和CD196/CCR6，CD197/CCR7，CD62L，CD69和CD45RO。
在特定的实施方案中，在本公开中发现使用的T卵泡辅助细胞特异性抗原包括但不限于BCL-6，Stat-3，CD3，CD4，CD84，CD126/IL-6Rα，CD150/SLAM)，CD154/CD40L，CD185/CXCR5，CD252/OX40L，CD278/ICOS，CD279/PD1和TCRα/β。在特定实施方案中，发现在本公开中使用的Thl细胞特异性抗原包括但不限于GM-CSF，IFN-γ，IL-2，T-bet，细胞外标记，CD4，CD26，CD94，CD119，CD183，CD191(CCR1)，CD195(CCR5)，CD254(TRANCE，RANKL)，CD366(Tim-3)，IL-18R，淋巴毒素β受体(LTβR)，TNF-α和TNF-β。在特定实施方案中，在本公开中发现使用的Th2细胞特异性抗原包括但不限于c-MAF，GATA3，GM-CSF，IL-4，IL-5，IL-6，IL-10，IL-13，细胞外标记，CCR8，CD4，CD184(CXCR4)，CD193(CCR3)，CD194(CCR4)，CD197(CCR7)，CD278(ICOS)，CD294(CRTH2)，CD365(Tim-1)和IL-1R。在特定的实施方案中，发现在本公开中使用的Th9细胞特异性抗原包括但不限于GATA3，IRF4，Stat-6，CD3，CD4和TCRα/β。在特定实施方案中，发现在本公开中使用的Th17细胞特异性抗原包括但不限于IL-17A，IL-17F，IL-21，IL-22，RORα，RORγt，Stat-3，CD3，CD4，CD38，CD161/NK-1.1，CD194/CCR4，CD196/CCR6，IL-1R和TGF-β。在特定实施方案中，发现在本公开中使用的Th22细胞特异性抗原包括但不限于AHR，CCR10，CD3，CD$，CD194/CCR4，CD196/CCR6和TCRα/β。在特定实施方案中，在本公开中发现使用的Treg细胞特异性抗原包括但不限于FOXP3，Helios，细胞外标记，CD4，CD25，CD39，CD62L，CD73，CD103，CD134，CD152/CTLA-4，CD194/CCR4，CD223，FR4，GARP，GITR和TGF-β。
在特定的实施方案中，发现在本公开中使用的天然杀伤细胞特异性抗原包括但不限于CD11b，CD11c，CD16/32，CD49b，CD56(NCAM)，CD57，CD69，CD94，CD122，CD158(Kir)，CD161(NK-1.1)，CD244(2B4)，CD314(NKG2D)，CD319(CRACC)，CD328(Siglec-7)，CD335(NKp46)，Ly49，Ly108，Vα24-Jα18TCR(iNKT)，颗粒溶素，颗粒酶和穿孔素。
在特定的实施方案中，在本公开中发现使用的内皮细胞特异性抗原包括但不限于CD31，CD34，CD54，CD61，CD62E/E-选择素，CD105/Endoglin，CD106/VCAM-1，CD144/VE-钙黏着蛋白，CD146/MUC18，Mel-CAM，CD201/EPCR，CD202b/Tie2/Tek，CD309/VEGFR2-Flk-1，Podoplanin和VEGFR3。在特定实施方案中，发现在本公开中使用的嗜碱性粒细胞细胞特异性抗原包括但不限于Pro-Major碱性蛋白1，CD13，CD44，CD54，CD63，CD69，CD107a，CD123，CD193/CCR3，CD203c，FcεRIα，IgE和TLR4。在特定的实施方案中，在本公开中发现使用的星形胶质细胞特异性抗原包括但不限于S100B，CD40，CD80，CD86，CD88和GFAP。在特定实施方案中，发现在本公开中使用的嗜酸性粒细胞特异性抗原包括但不限于C3AR，CD15(SSEA-1)，CD23，CD49d，CD52，CD53，CD88，CD129，CD183，CD191，CD193，CD244(2B4)，CD294，CD305，FcεRIα，半乳凝素9，MRP-14，Siglec-8和Siglec-10。在特定的实施方案中，在本公开中发现使用的肥大细胞特异性抗原包括但不限于CD117/C-kit，CD203c和FcεRIα。在特定的实施方案中，发现在本公开中使用的成纤维细胞特异性抗原包括但不限于CD10，CD29，CD47，CD81，CD91，CD121a。
在特定的实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物特异性与正常免疫细胞相关的靶抗原结合，其选自CD19，CD20，CD22，CD30，CD38，CD40，CD74，CD79b，CD205，CD274，CD303，和CD304。在特定的实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物特异性结合选自CD19，CD20，CD22，CD30，CD38，CD40，CD74，CD79b，CD205，CD274，CD303和CD304的靶抗原。
在一些实施方案中，特异性结合于正常免疫细胞(例如，APC)相关的抗原的CpG-Ab免疫缀合物不靶向异常细胞。在一些实施方案中，特异性结合于正常免疫细胞(例如，APC)相关的抗原的CpG-Ab免疫缀合物不结合与异常细胞相关的抗原。在一些实施方案中，特异性结合于正常免疫细胞(例如，APC)相关的抗原的CpG-Ab免疫缀合物不结合用本文提供的方法治疗的癌症的肿瘤相关抗原。
在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物特异性结合与选自角化细胞，朗格汉斯细胞，T细胞，B细胞，肥大细胞，内皮细胞，肌成纤维细胞和原代成纤维细胞的TLR表达细胞相关的抗原。在一些实施方案中，特异性结合与表达TLR的细胞相关的抗原的CpG-Ab免疫缀合物不靶向异常细胞。在一些实施方案中，特异性结合与TLR表达细胞相关的抗原的CpG-Ab免疫缀合物不结合与异常细胞相关的抗原。在一些实施方案中，特异性结合与表达TLR的细胞相关的抗原的CpG-Ab免疫缀合物不结合用本文提供的方法治疗的癌症的肿瘤相关抗原。
在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物特异结合通过本发明方法治疗的癌症的肿瘤相关抗原。可以被本公开的CpG-Ab免疫缀合物靶向的肿瘤相关抗原(TAA)的实例包括但不限于包含EGFR，EGFRvIII，gp100或Pmel17，HER2/neu，间皮素，CEA，MART-1/Melan-A，MAGE-A1，MAGE-A2，MAGE-A3，MAGE-A4，MUC-1，GPNMB，HMW-MAA，TIM1，ROR1，CD19，gp100，二肽基肽酶IV(DPPIV)，腺苷脱氨酶结合蛋白(ADAbp)，亲环蛋白b，结直肠相关抗原(CRC)-C017-1A/GA733，癌胚抗原(CEA)及其免疫原性表位CAP-1和CAP-2，etv6，aml1，前列腺特异性抗原(PSA)及其免疫原性表位PSA-1，PSA-2和PSA-3，前列腺特异性膜抗原(PSMA)，T细胞受体/CD3-ξ链，肿瘤抗原的MAGE家族(例如，MAGE-A1，MAGE-A2，MAGE-A3，MAGE-A4，MAGE-A5，MAGE-A6，MAGE-A7，MAGE-A8，MAGE-A9，MAGE-A10，MAGE-A11，MAGE-A12，MAGE-Xp2(MAGE-B2)，MAGE-Xp3(MAGE-B3)，MAGE-Xp4(MAGE-B4)，MAGE-C1，MAGE-C2，MAGE-C3，MAGE-C4，MAGE-05)，肿瘤抗原的GAGE家族(例如GAGE-1，GAGE-2，GAGE-3，GAGE-4，GAGE-5，GAGE-6，GAGE-7，GAGE-8，GAGE-9)，BAGE，RAGE，LAGE-1，NAG，GnT-V，MUM-1，CDK4，酪氨酸酶，p53，MUC家族(例如MUC1，MUC16等；参见例如美国专利6,054,438；WO98/04727；或WO98/37095)，p21ras，RCAS1，α-甲胎蛋白，E-钙粘着蛋白，α-catenin，β-catenin和γ-catenin，p120ctn，PRAME，NY-ESO-1，cdc27，腺瘤性息肉病大肠杆菌蛋白(APC)，fodrin，连接蛋白37，Ig独特型，p15，gp75，GM2和GD2神经节苷脂，Smad家族的肿瘤抗原脑糖原磷酸化酶，SSX-1，SSX-2(HOM-MEL-40)，SSX-1，SSX-4，SSX-5，SCP-1和CT-7，c-erbB-2和病毒抗原，例如HPV-16和HPV-18E6和E7抗原以及EBV编码的核抗原(EBNA)-1，以及标记(β-半乳糖苷酶，萤光素酶...)，βhCG，WT1，TRP-2，NY-BR-1，NY-CO-58，MN(gp250)，端粒酶和生殖细胞衍生的肿瘤抗原。肿瘤相关抗原还包括血型抗原，例如，Lea，Leb，LeX，LeY，H-2，B-1，B-2抗原。可以使用本领域已知的方法来鉴定肿瘤相关的抗原，例如Zhang等人，Supra.所公开的方法。
特别地，在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物特异性结合选自CD19，CD20，CD22，CD25，CD30，CD33，CD38，CD40，CD44，CD45R(B220)，CD49，CD52，CD56，CD70，CD74，CD79a，CD79b，CD93，CD123，CD138，CD163，CD205，CD206，CD274，CD303和CD304，叶酸受体α，叶酸受体β，间皮素，PSMA，Her-2，EGFR，转铁蛋白受体，整联蛋白，cripto，EphA2，AGS-5，AGS-16，CanAg，EpCAM，IL4受体，IL2受体，路易斯Y，GPNMB的肿瘤相关抗原。
在其他实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物不结合选自CD19，CD20，CD22portin7，Her2，Src，EGFR，CD52，CXCR-4，Muc-1和DNA的肿瘤相关抗原。
在一些实施方案中，肿瘤相关抗原与一种或多种正常免疫细胞相关。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原也与一种或多种表达TLR的细胞相关。在特定的实施方案中，肿瘤相关抗原是正常免疫细胞编码和表达的蛋白质。在特定的实施方案中，正常的免疫细胞已经被人工工程化以包含或表达肿瘤相关抗原。在特定的实施方案中，肿瘤相关抗原是由APC吸收并加工的外源性抗原。在特定实施方案中，癌症是免疫细胞癌，并且CpG-Ab免疫缀合物通过与肿瘤相关抗原特异性结合而靶向癌性免疫细胞和正常免疫细胞。在特定的实施方案中，癌症是淋巴瘤或白血病。在特定的实施方案中，癌症是B细胞淋巴瘤。
在本文所述的治疗癌症的方法的一些实施方案中，用本文公开的方法治疗的癌症是实体瘤。在一些实施方案中，用本文公开的方法治疗的癌症是液体肿瘤。在特定的实施方案中，用本文公开的方法治疗的癌症是淋巴瘤或白血病。在特定实施方案中，用本文公开的方法治疗的癌症选自套细胞淋巴瘤(MCL)，弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，伯基兹(Burkitts)淋巴瘤，多发性黑素瘤(MM)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，急性髓细胞性白血病(AML)，小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)，毛细胞白血病(HCL)，淋巴浆细胞性淋巴瘤(LPL)，骨骼肌淋巴瘤(SML)，脾边缘区淋巴瘤(SMZL)，滤泡中心性淋巴瘤(FCL))，大肠癌，非小细胞肺癌(NSCLC)，头颈癌，乳腺癌，胰腺癌，胶质母细胞瘤(GBM)，前列腺癌，食道癌，肾细胞癌，肝癌，膀胱癌和胃癌。
在一些实施方案中，用本文公开的方法治疗的癌症对至少一种免疫疗法有抗性。在一些实施方案中，治疗癌症的方法包括向患有癌症的对象共同施用(i)治疗有效量的含CpG的免疫刺激多核苷酸或CpG-Ab免疫缀合物；(ii)免疫治疗剂，当单独用其治疗癌症时，被治疗的癌症表现出抵抗或不应答的免疫治疗剂。
在特定的实施方案中，用本文提供的方法治疗的癌症已经显示了对免疫检查点调节剂的治疗没有反应。在特定的实施方案中，免疫检查点调节剂是PD-1的抑制剂。在特定的实施方案中，免疫检查点调节剂是PD-L1的抑制剂。在一些实施方案中，治疗癌症的方法包括向患有癌症的对象共同施用(i)治疗有效量的含CpG的免疫刺激多核苷酸或CpG-Ab免疫缀合物；(ii)治疗有效量的PD-1抑制剂。在一些实施方案中，治疗癌症的方法包括向患有癌症的对象共同施用(i)治疗有效量的含CpG的免疫刺激多核苷酸或CpG-Ab免疫缀合物；(ii)治疗有效量的PD-L1抑制剂。特别地，在一些实施方案中，PD-1的抑制剂是抗PD-1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，PD-L1的抑制剂是抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。
在某些方面，本文提供了在易患癌症的对象中预防癌症的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的本文所述的TLR激动剂。在一些实施方案中，该方法包括向对象施用治疗有效量的本文所述的含CpG的免疫刺激多核苷酸或CpG-Ab免疫缀合物。在特定的实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物靶向本文所述的正常免疫细胞。在特定的实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物靶向本文所述的表达TLR的细胞。在特定的实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物与本文所述的与正常免疫细胞相关的抗原特异性结合。在特定的实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物特异性结合与正常免疫细胞相关的抗原，而不结合被预防的癌症的肿瘤相关抗原。在特定的实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物与本文所述的与表达TLR的细胞相关的抗原特异性结合。在特定的实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物特异性结合与表达TLR的细胞相关的抗原，而不结合被预防的癌症的肿瘤相关抗原。在特定实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物特异性结合如本文所述被预防的癌症的肿瘤相关抗原。在特定的实施方案中，被预防的癌症的与肿瘤相关的抗原也与正常免疫细胞或表达TLR的细胞相关。在特定的实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物不特异性结合选自CD19，CD20，CD22，STAT3，输出蛋白7，Her2，Src，EGFR，CD52，CXCR-4，Muc-1和DNA的抗原。
在一些实施方案中，预防癌症的方法进一步包括向易患癌症的对象施用(i)治疗有效量的CpG-Ab免疫缀合物和(ii)被预防的癌症的肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原不与CpG-Ab免疫缀合物缀合。在特定的实施方案中，将肿瘤相关抗原配制为癌症疫苗。在特定的实施方案中，将CpG-Ab免疫缀合物配制为癌症疫苗的佐剂。
在一些实施方案中，使用本文提供的方法预防或治疗的癌症是部分或完全缓解先前癌症的对象的癌症复发发作。在特定的实施方案中，先前的癌症是液体癌症，而被预防或治疗的复发癌症是液体癌症。在特定的实施方案中，先前的癌症是实体癌，而被预防或治疗的复发性癌症是实体癌。在特定的实施方案中，先前的癌症是液体癌，而被预防或治疗的复发性癌症是实体癌。在特定的实施方案中，先前的癌症是实体癌，而被预防或治疗的复发性癌症是液体癌。
在一些实施方案中，使用本文提供的方法预防或治疗的癌症是在对象显示部分或完全缓解之后对象的癌症复发的第一次发作。在一些实施方案中，使用本文提供的方法预防或治疗的癌症是在对象显示部分或完全缓解之后对象的癌症复发的第二次发作。在一些实施方案中，使用本文提供的方法预防或治疗的癌症是对象显示部分或完全缓解后对象中癌症复发的第三次发作。在一些实施方案中，使用本文提供的方法预防或治疗的癌症是在对象显示部分或完全缓解之后对象中癌症复发的第三发作之后的癌症复发的发作。
在某些方面，本文提供了在有需要的对象中诱导适应性免疫应答的方法，其中所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的本文所述的TLR激动剂。在特定的实施方案中，诱导适应性免疫应答的方法包括向有需要的对象施用治疗有效量的本文所述的含CpG的免疫刺激多核苷酸或CpG-Ab免疫缀合物。在特定的实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物靶向本文所述的正常免疫细胞。在特定的实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物靶向本文所述的表达TLR的细胞。在特定的实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物靶向选自癌细胞或病原体感染的细胞的患病细胞。在特定的实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物与本文所述的与正常免疫细胞相关的抗原特异性结合。在特定的实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物特异性结合与正常免疫细胞相关的抗原，而不结合疾病抗原。在特定的实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物与本文所述的与表达TLR的细胞相关的抗原特异性结合。在特定的实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物特异性结合与表达TLR的细胞相关的抗原，而不结合疾病抗原。在特定的实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物与本文所述的疾病抗原特异性结合。在特定的实施方案中，患病的抗原还与正常的免疫细胞或表达TLR的细胞相关。在特定实施方案中，患病抗原是肿瘤相关抗原或病原性抗原。在特定的实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物不特异性结合选自CD19，CD20，CD22，STAT3，输出蛋白7，Her2，Src，EGFR，CD52，CXCR-4，Muc-1和DNA的抗原。
在本文描述的方法和用途的一些实施方案中，将含CpG的免疫刺激多核苷酸以足以激活对象中TLR9介导的信号传导途径的剂量施用于有此需要的对象。在一些实施方案中，将CpG-Ab免疫缀合物以足以在CpG-Ab免疫缀合物靶向的细胞群中激活TLR9介导的信号传导途径的剂量施用于有此需要的对象。如本文所述，在一些实施方案中，被CpG-Ab免疫缀合物靶向的细胞群体表达TLR9。在一些实施方案中，被CpG-Ab免疫缀合物靶向的细胞群可以在靶细胞的细胞表面上表达TLR9，在靶细胞的内体膜上或均在靶细胞的细胞表面和内体膜上表达TLR9。
特别地，在本文描述的方法和用途的一些实施方案中，将含CpG的免疫刺激多核苷酸以有效诱导一种或多种效果的剂量施用于有需要的对象，所述效果选自(a)通过在靶细胞上含有CpG的免疫刺激多核苷酸与TLR9受体特异性结合；(b)通过靶细胞有效地内化CpG-Ab免疫缀合物或其含CpG的免疫刺激多核苷酸部分；(c)激活靶细胞中的一个或多个信号通路；(d)由靶细胞诱导分泌一个或多个炎性细胞因子；(e)抑制靶细胞分泌一个或多个炎性细胞因子；(f)上调靶细胞的一个或多个基因的表达；(g)抑制靶细胞的一个或多个基因的表达；(h)激活靶向的正常免疫细胞，和(i)诱导靶癌细胞的凋亡，(j)诱导靶癌细胞的坏死。
特别地，在本文描述的方法和用途的一些实施方案中，其中在施用CpG-Ab免疫缀合物后，含CpG的免疫刺激多核苷酸特异性结合靶细胞的TLR9受体。特别地，在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物与与靶细胞相关的抗原的结合促进了含CpG的免疫刺激多核苷酸与TLR9受体的特异性结合。在一些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物的靶抗原位于TLR9受体附近。在特定的实施方案中，靶抗原和TLR9受体均位于靶细胞的细胞膜上。在特定的实施方案中，靶抗原和TLR9受体都位于靶细胞的细胞内膜上。在特定的实施方案中，靶抗原和TLR9受体均位于靶细胞的内体或吞噬体膜上。在一些实施方案中，靶抗原位于细胞膜上，并在与CpG-Ab免疫缀合物结合后促进CpG-Ab免疫缀合物内化到细胞质中。
特别地，在本文描述的方法和用途的一些实施方案中，该方法包括向有需要的对象施用治疗有效量的靶向正常免疫细胞的CpG-Ab免疫缀合物，其中在施用CpG-Ab时在免疫缀合物后，靶向细胞中的一个或多个免疫原性信号通路被激活。在特定实施方案中，激活的信号传导途径选自核因子(NF)-κB信号传导途径，c-Jun N-末端激酶(JNK)信号传导途径，AP1信号传导途径，IRF3/7途径，和p38丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信号通路。可以使用本领域已知的方法来检测细胞信号转导途径的激活，例如但不限于检测分子标记物的存在，该分子标记物的表达在感兴趣的信号转导激活后被特异性地诱导。
特别地，在本文描述的方法和用途的一些实施方案中，该方法包括向有需要的对象施用治疗有效量的靶向正常免疫细胞的CpG-Ab免疫缀合物，其中在施用CpG-Ab时免疫缀合物中，诱导一个或多个炎性细胞因子的分泌。在特定的实施方案中，一个或多个炎性细胞因子选自I型干扰素(IFN)，白介素(IL)-6，IL10，IL-12，IL-18和肿瘤坏死因子(TNF)。
特别地，在本文描述的方法和用途的一些实施方案中，所述方法包括向有需要的对象施用治疗有效量的靶向正常免疫细胞的CpG-Ab免疫缀合物，其中在施用CpG-Ab免疫缀合物时，一个或多个其他蛋白质的表达上调。在特定的实施方案中，上调的蛋白选自抗原呈递分子(例如，I类和II类MHC)，细胞因子受体(例如，IL-6受体，IL-10受体，IL-12受体，TNF-α受体，TNF-β受体，IFN-α受体，IFN-β受体，IFN-γ)，趋化因子受体(例如趋化因子受体7)，T细胞共刺激分子(例如CD3，CD28，CD27，CD30，CD40，CD80/B7-1，CD86/B7-2，CD134/OX-40，OX-40L，CD137/4-1BB，4-1BBL，CD278/ICOS，B7-H3，B7h/B7RP-1，LIGHT等)，以及T细胞成熟调节蛋白(例如吲哚胺2，3-二加氧酶)中的一个或多个。
特别地，在本文描述的方法和用途的一些实施方案中，所述方法包括向有需要的对象施用治疗有效量的靶向正常免疫细胞的CpG-Ab免疫缀合物，其中在施用CpG-Ab时免疫缀合物，一个或多个正常免疫细胞群的增殖，分化，成熟和/或存活增加。在特定实施方案中，一个或多个增加的正常免疫细胞群体选自CD4+T细胞，CD8+T细胞，天然杀伤细胞，T辅助细胞，B细胞和APCs(包括mDCs)。在本文描述的方法和用途的一些实施方案中，该方法包括向有需要的对象施用治疗有效量的靶向正常免疫细胞的CpG-Ab免疫缀合物，其中在施用CpG-Ab免疫缀合物后，一个或多个正常免疫细胞群的增殖、分化、成熟和/或存活降低。在特定的实施方案中，一个或多个正常免疫细胞的减少的细胞群选自B-reg细胞和T-reg细胞。
在特定的实施方案中，在施用CpG-Ab免疫缀合物后，对象的APCs中抗原呈递活性增加。在一些实施方案中，APC选自B细胞，单核细胞，树突状细胞和朗格汉斯细胞，角质形成细胞，内皮细胞，星形胶质细胞，成纤维细胞和少突胶质细胞。在特定的实施方案中，APC是B细胞。在特定的实施方案中，APC是树突细胞。在特定的实施方案中，APC是巨噬细胞。在一些实施方案中，树突细胞是pDC。在特定的实施方案中，增加的抗原呈递活性导致被活化的APCs更有效地呈递肿瘤相关抗原。
在特定的实施方案中，在施用CpG-Ab免疫缀合物后，针对治疗或预防的癌症的一个或多个肿瘤相关抗原的抗原特异性CD4+T细胞介导的免疫增强。在特定的实施方案中，在施用CpG-Ab免疫缀合物后，CD4+T细胞的肿瘤浸润增加。在特定的实施方案中，在施用CpG-Ab免疫缀合物后，针对治疗或预防的癌症的一个或多个肿瘤相关抗原的抗原特异性CD8+T细胞介导的免疫增强。在特定实施方案中，在施用CpG-Ab免疫缀合物后，CD8+T细胞的肿瘤浸润增加。在特定的实施方案中，在施用CpG-Ab免疫缀合物后，增加了针对待治疗或预防的癌症的一个或多个肿瘤相关抗原的免疫球蛋白的B细胞分泌。
特别地，在本文描述的方法和用途的一些实施方案中，该方法包括向有需要的对象施用治疗有效量的靶向患病细胞的CpG-Ab免疫缀合物，其中在施用CpG-Ab免疫缀合物后，诱导了一个或多个细胞凋亡信号通路，触发了目标病变细胞的凋亡。在一些实施方案中，患病细胞是癌细胞。
在本文描述的方法和用途的一些实施方案中，将CpG-Ab免疫缀合物以激活对象的补体系统无效的量施用于需要其的对象。在一些实施方案中，将含CpG的免疫刺激多核苷酸以无法有效活化对象中的补体C1的量施用于有此需要的对象。在一些实施方案中，将含CpG的免疫刺激多核苷酸以无法有效活化对象中的补体C3的量施用于有此需要的对象。补体激活可以使用本领域已知的方法检测。在一些实施方案中，向有需要的对象如下的量施用CpG-Ab免疫缀合物：该量下CpG-Ab免疫缀合物的抗体部分在对象中无法有效诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。
如本文所述，可以将包含含有CpG的多核苷酸的治疗剂、缀合物或组合物与至少一种其他预防或治疗癌症的治疗剂组合使用。在一些实施方案中，这样的组合疗法表现出比单独的任何一种治疗剂的单独效果更好的协同治疗效果。在一些实施方案中，这样的组合疗法表现出比单独的治疗剂的单独作用总和更好的协同治疗作用。
因此，在某些方面，本文提供了使用含CpG的免疫刺激多核苷酸与至少一种其他癌症治疗剂组合来预防或治疗癌症的方法。这样的方法包括向有需要的对象施用(i)治疗有效量的含CpG的免疫刺激多核苷酸，和(ii)治疗有效量的至少一种其他癌症治疗剂。在特定的实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸以独立的多核苷酸的形式施用。在特定的实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸以CpG-Ab免疫缀合物施用。在特定的实施方案中，将包含CpG的免疫刺激多核苷酸和另外的治疗剂配制在相同的组合物中。在其他实施方案中，将包含CpG的免疫刺激多核苷酸和另外的治疗剂配制在分开的组合物中。
在一些实施方案中，至少一种另外的癌症治疗剂选自T细胞激动剂，免疫检查点调节剂，STING激动剂，RIG-1激动剂，其他toll样受体激动剂。
在一些实施方案中，另外的癌症治疗剂是T细胞共刺激分子。在一些实施方案中，T细胞共刺激分子选自OX40，CD2，CD27，CDS，ICAM-1，LFA-1/CD1la/CD18，ICOS/CD278、4-1BB/CD137，GITR，CD30，CD40，BAFFR，HVEM，CD7，LIGHT，NKG2C，SLAMF7，NKp80，CD160，B7-H3和CD83或其配体。在一些实施方案中，共刺激分子的配体是特异性结合该共刺激分子的抗体。在特定实施方案中，另外的癌症治疗剂选自抗OX40抗体，抗OX40L抗体，抗ICOS抗体，抗CTLA4抗体，抗CD40L抗体，抗CD28抗体，抗-LFA1抗体，抗TIM1/TIM3抗体，抗PD1抗体，抗PDL1抗体，抗CD27抗体和抗4-1BB抗体。
在一些实施方案中，另外的癌症治疗剂是由该方法预防或治疗的癌症产生的肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，被预防或治疗的是白血病，淋巴瘤，黑素瘤，结直肠癌，乳腺癌，前列腺癌，肾癌，胰腺癌，头颈癌，皮肤癌，和脑癌，肺癌的癌症，肿瘤相关抗原选自CD19，CD20，CD22，CD38，CD138，CD30，CD52，CD56，CD79，CD123，CD206，CD303，CD304，EGFR，叶酸受体α，叶酸受体β，间皮素，HER2，转铁蛋白受体和PSMA。在一些实施方案中，另外的癌症治疗剂是免疫检查点，选自PD-1，PD-L1，PD-L2，TIM-3，LAG-3，CEACAM-1，CEACAM-5，CLTA-4，VISTA，BTLA，TIGIT，LAIR1，CD47，CD160，2B4，CD172a和TGFR抑制剂。在特定的实施方案中，另外的癌症治疗剂是PD-1抑制剂。在特定的实施方案中，另外的癌症治疗剂是PD-L1抑制剂。在特定的实施方案中，另外的癌症治疗剂是CD47抑制剂。在一些实施方案中，另外的癌症治疗剂是与免疫检查点调节剂特异性结合的抗体。在一些实施方案中，在特定的实施方案中，另外的癌症治疗剂是抗PD-1抗体或其抗原结合片段。在特定的实施方案中，另外的癌症治疗剂是抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。在特定的实施方案中，另外的癌症治疗剂是抗CD47抗体或其抗原结合片段。在具体实施方案中，另外的癌症治疗剂是抗CD172a抗体或其抗原结合片段，在特定实施例中，另外的癌症治疗剂是抗OX40抗体或其抗原结合片段，其在具体实施方案中，附加的癌症治疗剂是抗TIM3抗体或其抗原结合片段。在特定实施方案中，另外的癌症治疗剂是抗LAG3抗体或其抗原结合片段。抗PD-1和抗PD-L1抗体和它们的用途被描述在，例如，US 20180030137，US 9815898，US 20170313776，US 20170313774，US20170267762，WO 2017019846，WO 2018013017，US 20180022809，US 20180002423，WO2017220990，WO 2017218435，WO 2017215590，US 9828434，和WO 2017196867。抗CD47抗体及其用途描述，例如US 9663575，US 9803016，US 20170283498，US 20170369572，WO2017215585，WO 2017196793，和WO 2017049251。
在一些实施方案中，另外的癌症治疗剂是STING途径激动剂。STING(干扰素刺激基因，也被称为TMEM173，MITA，ERIS，和MPYS的刺激剂)是响应于环状二核苷酸(CDNs)的直接结合经历构象变化的位于ER跨膜蛋白，导致下游信号传导级联涉及TBK1活化，IRF-3的磷酸化，IFN-β和其它细胞因子的产生。肿瘤驻留宿主抗原呈递细胞中的STING途径参与了针对肿瘤相关抗原的自发CD8+T细胞应答的诱导。该途径的活化和随后的IFN-β的产生也有助于抗肿瘤作用。在一些实施方案中，STING途径激动剂是ADU-S100。另外的STING激动剂及其用途描述于，例如，US 20180028553，US 20170319680，US 20170298139，US 20060040887，US20080286296，US 20120041057，US 20140205653，WO 2014179335，WO 2014179760，US20150056224，WO 2016096174，WO 2017011444，WO 2017027645和WO 2017027646。
在一些实施方案中，另外的癌症治疗剂是RIG-I途径激动剂。RIG-I(维甲酸诱导基因I)是模式识别受体的成员，可启动宿主的先天免疫系统以在感染的早期阶段防御病原微生物。(RIG-I)-样受体家族的三个成员：RIG-I，MDA5(黑素瘤分化因子5)，和LGP2(遗传学实验室和生理学2)，这是在大多数细胞和组织类型中表达。RIG-I充当细胞质传感器，用于识别各种RNA病毒并随后激活下游信号传导，以驱动I型IFN产生和抗病毒基因表达。激活的RIG-I通过CARD-CARD介导的相互作用募集其下游衔接子分子MAVS(也称为IPS-1，CARDIF和VISA)。寡聚的RIG-ICARD组装体和MAVS的聚合形式一起充当蛋白质复合物的信号传递平台，这些蛋白质复合物介导信号的分叉成两个分支。一个分支募集了肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)-2/6和受体相互作用蛋白1，以随后激活IKK复合物，从而激活NF-κB。其他分支通过TRAF3发出信号并激活TANK/IKKγ/IKK∈/TBK1复合物，导致干扰素调节因子(IRF)-3和-7的磷酸化和二聚化。Liu等，Front Immunol.2017，7：662。该途径的激活有助于抗肿瘤作用。在一些实施方案中，RIG-1途径激动剂是RGT100。RIG-1激动剂及其用途描述在例如US20170057978，US 20170258897，US 9381208，US 9738680，US 9650427，WO 2017173427和WO2017011622中。
在一些实施方案中，所述另外的癌症治疗剂是toll样受体激动剂，其选自TLR1激动剂，TLR2激动剂，TLR3激动剂，TLR4激动剂，TLR5激动剂，TLR6激动剂，TLR7激动剂，TLR8激动剂和TLR10激动剂。
在其他实施方案中，关于治疗癌症的方法，将含CpG的免疫刺激多核苷酸(以独立形式或作为CpG-Ab免疫缀合物的形式)与一个或多个其他治疗剂或程序组合施用，例如其中其他治疗剂或程序选自化学疗法，靶向抗癌疗法，溶瘤药，细胞毒性剂，基于免疫的疗法，细胞因子，外科手术程序，放射程序，共刺激分子的激活剂，抑制分子的抑制剂，疫苗，细胞免疫疗法和溶瘤病毒疗法。
如本文所提供的，含CpG的多核苷酸(以独立形式或作为CpG-Ab缀合物的形式)可以例如通过非肠胃外或肠胃外施用来施用。肠胃外给药可以包括肌内，静脉内，动脉内，颅内，皮下，眶内，心室内，脊柱内，鞘内，腹膜内，直肠和局部给药途径。局部给药途径可包括透皮，皮内，颊和舌下给药途径。根据选择的给药途径配制药物组合物。肠胃外给药可以通过在选定的时间段内连续输注来进行。在特定实施方案中，施用是皮下，肌内，皮内，粘膜，阴道，宫颈，肿瘤周围，肿瘤内或直接进入引流肿瘤的淋巴结。期望将多核苷酸和/或缀合物与药学上可接受的载体一起施用。配制用于治疗本文所述病症的本文所述多核苷酸和/或缀合物的药物制剂也是本发明的一部分。
可以通过物理和生理因素，例如体重，病情严重程度，正在治疗的疾病类型，既往或同时发生的治疗干预措施，患者的特发性疾病以及给药途径确定给予对象的含CpG的免疫刺激多核苷酸(以独立形式或作为CpG-Ab缀合物的形式)的实际剂量。含CpG的免疫刺激多核苷酸(以独立形式或作为CpG-Ab缀合物的形式)的实际剂量可以单剂量或一系列连续剂量给药。取决于剂量和给药途径，优选剂量和/或有效量的给药次数可以根据对象的反应而变化。无论如何，负责给药的从业人员将确定组合物中活性成分的浓度，适当剂量和个体对象的用药时间表。
在某些实施方案中，以独立形式施用含CpG的免疫刺激多核苷酸，其剂量范围为0.01毫克/千克体重至1000毫克/千克体重，包括端点。在其他非限制性实例中，剂量还可包含约0.01毫克/千克体重至约0.05毫克/千克体重。在其他非限制性实例中，剂量还可包含约0.01毫克/千克体重，约0.05毫克/千克体重，约0.1毫克/千克体重，约0.2毫克/千克体重，约0.3毫克/千克体重，约0.4毫克/千克体重，约0.5毫克/千克体重，约0.6毫克/千克体重，约0.7毫克/千克体重，约0.8毫克/千克体重，约0.9毫克/千克体重，约1毫克/千克体重，约2毫克/kg体重，约3毫克/kg体重，约4毫克/kg体重，约5毫克/kg体重，约6毫克/kg体重，约7毫克/kg体重，约8毫克/kg体重，约9毫克/kg体重，约10毫克/kg体重，约20毫克/kg体重，约30毫克/kg体重，约40毫克/kg体重，约50毫克/kg体重，约60毫克/kg体重，约70毫克/kg体重，约80毫克/kg体重，约90毫克/kg体重，约100毫克/kg体重，约200毫克/kg体重，约300毫克/kg体重，约400毫克/kg体重，约500毫克/kg体重，约600毫克/kg体重，约700毫克/kg体重，约800毫克/kg体重，约900毫克/kg体重，约1000毫克/kg体重，或每次施用更高，以及其中可衍生的任何范围。
在某些实施方案中，CpG-Ab免疫缀合物以约1微克/千克体重至约500毫克/千克体重(包括端点)的剂量施用。在其他非限制性实例中，剂量还可以包括约1微克/千克体重，约5微克/千克体重，约10微克/千克体重，约50微克/千克体重，约100微克/千克体重。体重，约200微克/千克体重，约350微克/千克体重，约500微克/千克体重，约1毫克/千克体重，约5毫克/千克体重，约10毫克/千克体重，约50毫克/千克体重，约100毫克/千克体重，约200毫克/千克体重，约350毫克/千克体重，约500毫克/千克体重，约1000毫克/千克体重或更多每次施用，以及其中可衍生的任何范围。在从本文列出的数字衍生的范围的非限制性实例中，可以根据上述数字进行给药，范围为约5毫克/kg/体重至约100毫克/kg/体重，约5微克/kg/体重至约500毫克/kg/体重等。
在特定的实施方案中，CpG-Ab缀合物以三个连续剂量施用，每个剂量每次施用约3毫克/kg/体重。在特定的实施方案中，CpG-Ab缀合物以三个连续剂量施用，每个剂量每次施用约10毫克/kg/体重。在特定的实施方案中，以48小时的间隔进行顺序给药。
如本文所提供的，组合疗法涉及两个或更多个治疗剂的施用。此类施用包括以基本上同时的方式共同施用这些治疗剂，例如以具有固定比例的活性成分的单一制剂或针对每个治疗剂的单独制剂(例如胶囊和/或静脉内制剂)共同施用。另外，这种施用还包括同时或顺序地施用每种类型的治疗剂。这样的施用还涵盖了被配制为单独制剂的每种组分，其可以在不同位置或通过不同施用途径(例如，肿瘤内和/或全身性)施用。在任何情况下，组合疗法的治疗方案可以由负责的从业者确定，以提供治疗本文所述症状或病症的有益效果。
在某些实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸或CpG-Ab免疫缀合物与至少一种其他癌症治疗剂大约同时施用。作为非限制性实例，含CpG的免疫刺激多核苷酸或CpG-Ab免疫缀合物和至少一种其他癌症治疗剂的施用可以同时进行，例如彼此之间在30分钟之内，彼此之间的25分钟之内，彼此之间的20分钟内，彼此之间的15分钟之内，彼此之间的10分钟之内，彼此之间的5分钟之内或彼此之间的1分钟之内。
在某些实施方案中，将含CpG的免疫刺激多核苷酸或CpG-Ab免疫缀合物与至少一种另外的癌症治疗剂顺序施用。在一些实施方案中，在施用至少一种另外的癌症治疗剂之前施用含有CpG的免疫刺激多核苷酸或CpG-Ab免疫缀合物。在一些实施方案中，在施用至少一种另外的癌症治疗剂之后施用含有CpG的免疫刺激多核苷酸或CpG-Ab免疫缀合物。作为非限制性实例，含CpG的免疫刺激多核苷酸或CpG-Ab免疫缀合物与至少一种另外的癌症治疗剂的施用可以彼此分开至少30分钟，彼此分开至少1小时，彼此分开至少6小时，彼此分开至少12小时，彼此分开至少24小时，彼此分开至少36小时，彼此分开至少48小时，彼此分开至少3天，彼此分开至少1周，彼此之间分开至少2周或彼此之间分开至少1个月。
在某些实施方案中，在给予免疫检查点调节剂之前给予含有CpG的免疫刺激多核苷酸。在这样的方法中，可以在施用含CpG的免疫刺激多核苷酸的48小时内，例如在至少或至少约或约或5分钟，15分钟，30分钟，1小时，2小时，3小时，4小时，6小时，8小时，12小时，16小时，18小时，20小时，22小时，24小时，30小时，36小时，40小时或48小时内，施用免疫检查点调节剂。在一些方法和用途中，在施用免疫检查点调节剂之前6小时至30小时或12小时至24小时，包括两端点在内，施用含CpG的免疫刺激多核苷酸。在某些实施方案中，可以在施用含CpG的免疫刺激多核苷酸的3天，4天，5天，7天，2周，3周或4周内施用免疫检查点调节剂。必要时，可以根据经验确定特定免疫检查点调节剂的给药时间和顺序。在这些实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸可以以独立形式(free-standing form)或作为CpG-Ab免疫缀合物施用。
在某些实施方案中，通过一系列连续剂量施用含CpG的免疫刺激多核苷酸和免疫检查点调节剂。在特定实施方案中，同时施用第一剂量的含CpG的免疫刺激多核苷酸和第一剂量的免疫检查点调节剂，以及顺序施用随后的剂量的含CpG的免疫刺激多核苷酸和随后的剂量的免疫检查点调节剂。在这些实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸可以以独立形式或作为CpG-Ab免疫缀合物施用。
在某些实施方案中，在施用T细胞激动剂之前施用含有CpG的免疫刺激多核苷酸。在此类方法中，可以在施用含CpG的免疫刺激多核苷酸的48小时内，例如在至少或至少约或约或5分钟，15分钟，30分钟，1小时，2小时，3小时，4小时，6小时，8小时，12小时，16小时，18小时，20小时，22小时，24小时，30小时，36小时，40小时或48小时内，施用T细胞激动剂。在某些方法和用途中，在施用T细胞激动剂之前6小时至30小时或12小时至24小时，包括两个端点施用含CpG的免疫刺激多核苷酸。在某些实施方案中，可以在给予含CpG的免疫刺激多核苷酸的3天，4天，5天，7天，2周，3周或4周内给予T细胞激动剂。如果需要的话，对于特定的T细胞激动剂，可以根据经验确定给药的时间和顺序。在这些实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸可以以独立形式或作为CpG-Ab免疫缀合物施用。
在某些实施方案中，通过一系列连续剂量施用含CpG的免疫刺激多核苷酸和T细胞激动剂。在特定实施方案中，同时施用第一剂量的含CpG的免疫刺激多核苷酸和第一剂量的T细胞激动剂，以及顺序施用随后的剂量的含CpG的免疫刺激多核苷酸和后续的剂量T细胞激动剂。在这些实施方案中，含CpG的免疫刺激多核苷酸可以以独立形式或作为CpG-Ab免疫缀合物施用。
自身免疫性疾病的治疗
拮抗TLR9可以帮助减少促炎性细胞因子的分泌。因此，本发明的免疫抑制多核苷酸及其缀合物可用于治疗特征在于促炎性细胞因子过表达的疾病(例如自身免疫性疾病)。自身免疫性疾病的非限制性例子是：牛皮癣，类风湿性关节炎，狼疮，格林-巴利综合征，血管炎，重症肌无力，强直性脊柱炎，溶血性贫血，结节性多动脉炎，特发性血小板减少性紫癜，抗磷脂抗体综合征，原发性胆道疾病，原发性胆道疾病溃疡性结肠炎，自身免疫性肝炎，硬皮病，皮肌炎和斑秃。
药物组合物
免疫调节多核苷酸的递送可以通过使用本领域技术人员已知的多种方法使细胞与免疫调节多核苷酸或缀合物接触来实现。在特定的实施方案中，本发明的免疫调节多核苷酸或缀合物可以被配制成包含药学上可接受的赋形剂和/或药学上可接受的载体的药物组合物。药物组合物可以是液体或固体(例如冻干)形式。
对于人类使用，本发明的免疫调节多核苷酸或缀合物可以单独施用或与根据预期施用途径和标准药学实践选择的药物载体混合施用。因此，根据本发明使用的药物组合物可以使用一个或多个生理上可接受的载体，赋形剂和助剂以常规方式配制，所述载体，赋形剂和助剂有助于将本发明的缀合物加工成可药用的制剂。
常用的载体或赋形剂包括糖(例如乳糖，甘露醇)，牛奶蛋白，明胶，淀粉，维生素，纤维素及其衍生物，聚乙二醇和溶剂，例如无菌水，酒精，甘油，和多元醇。静脉内媒介物可以包括液体和营养补充剂。其他药学上可接受的载体包括水溶液，无毒的赋形剂，包括盐，防腐剂，缓冲液等，例如在于2013年发布的Remington：The Science and Practice ofPharmacy，21st Ed.，Gennaro，Ed.，Lippencott Williams&Wilkins(2005)，and The UnitedStates Pharmacopeia：The National Formulary(USP 36 NF31)中所述。可以根据本领域的常规操作来调节药物组合物各种成分的pH值和确切浓度。参见Goodman和Gilman′s，thePharmacological Basis for Therapeutics.
在制备本发明的药物组合物中，通常将活性成分与赋形剂混合(例如，在冻干制剂中)或用赋形剂稀释。当赋形剂用作稀释剂时，它可以是固体、半固体或液体材料(例如磷酸盐缓冲盐水)，其充当活性成分的媒介物、载体或介质。因此，组合物可以是片剂、散剂、酏剂、悬浮剂、乳剂、溶液剂和糖浆剂形式。如本领域中已知的，稀释剂的类型可以根据预期的给药途径而变化。所得的组合物可以包含其他试剂，例如防腐剂。所述制剂可以另外包括：润滑剂，例如滑石、硬脂酸镁和矿物油；润湿剂；乳化和悬浮剂；防腐剂，例如，甲基和丙基羟基苯甲酸酯；甜味剂；和调味剂。其他示例性的赋形剂在Handbook of PharmaceuticalExcipients，6th Edition，Rowe等，Eds.，Pharmaceutical Press(2009)中进行了描述。防腐剂可以包括抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体。
这些药物组合物可以以常规方式制造，例如通过常规混合，溶解，制粒，糖衣丸制作，浸出，乳化，包囊，包埋或冻干方法。例如，在Remington：The Science and Practice ofPharmacy，21st Ed.，Gennaro，Ed.，Lippencott Williams&Wilkins(2005)，和Encyclopediaof Pharmaceutical Technology，eds.J.Swarbrick和J.C.Boylan，1988-1999，MarcelDekker，New York中的本领域众所周知的方法。适当的制剂取决于所选的给药途径。这种组合物的制剂和制备是药物制剂领域技术人员众所周知的。在制备制剂时，可以在与其他成分结合之前将多核苷酸或缀合物研磨以提供合适的粒度。
施用途径
本发明的药物组合物可以局部或全身给药。治疗有效量将根据多种因素而变化，例如对象中疾病进展的程度、个体的年龄、性别和体重。可以调整剂量方案以提供最佳的治疗反应。例如，如治疗情况的紧急情况所示，可以每天施用数个分开的剂量或可以成比例地减少剂量。
如本领域技术人员将理解的，取决于选择的施用途径，本发明的药物组合物可以多种形式施用给患者。本文所述方法中使用的多核苷酸和/或缀合物可以例如通过肠胃外施用。肠胃外给药可以包括肌内，静脉内，动脉内，颅内，皮下，眶内，心室内，脊柱内，鞘内，腹膜内，直肠和局部给药途径。局部给药途径可包括透皮，皮内，颊和舌下给药途径。根据选择的给药途径配制药物组合物。肠胃外给药可以通过在选定的时间段内连续输注来进行。期望将多核苷酸和/或缀合物与药学上可接受的载体一起施用。配制用于治疗本文所述病症的本文所述多核苷酸和/或缀合物的药物制剂也是本发明的一部分。
肠胃外给药制剂
本文所述的本发明的免疫调节(例如，免疫刺激)多核苷酸和/或缀合物可以本文所述的药学上可接受的肠胃外(例如，静脉内、肌肉内或皮下)制剂的形式给予有需要的患者。药物制剂还可以以含有常规的、无毒的药学上可接受的载体和佐剂的剂型或制剂经肠胃外(例如静脉内、肌内或皮下)给药。特别地，适合于肠胃外给药的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，其可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质，其使制剂与患者的血液等渗。水性和非水性无菌悬浮液，可包括悬浮剂和增稠剂。例如，为了制备这样的组合物，可以将本发明的免疫调节多核苷酸或缀合物溶解或悬浮在肠胃外可接受的液体媒介物中。可以使用的可接受的媒介物和溶剂是水，水通过添加适量的盐酸、氢氧化钠或适当的缓冲液(例如磷酸盐缓冲液)、1，3-丁二醇、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液调节至适当的pH值。水性制剂还可以包含一个或多个防腐剂，例如对羟基苯甲酸甲酯、乙酯或正丙酯。关于肠胃外制剂的其他信息可以在例如United States Pharmacopeia-National Formulary(USP-NF)中找到，其通过引用并入本文。
本发明的缀合物的肠胃外制剂可以是由USP-NF鉴定为适合肠胃外施用的四种常规类型的制剂中的任何一种：
(1)“注射用药物”：干燥的(例如冻干的)固体形式的药物物质(例如本发明的缀合物)，其与用于肠胃外给药的适当的无菌载体组合作为药物注射剂；
(2)“可注射药物的乳剂”：将药物物质(例如本发明的缀合物)溶解或分散在合适的乳剂介质中的液体制剂；
(3)“药物注射混悬剂”：悬浮在合适的液体介质中的药物物质(例如，本发明的缀合物)的液体制剂；和
(4)“用于注射混悬剂的药物”：作为干燥固体的药物物质(例如本发明的缀合物)，其与用于肠胃外给药的适当无菌运载体组合作为药物注射混悬剂。
用于肠胃外施用的示例性制剂包括在水中适当地与表面活性剂例如羟丙基纤维素混合制备的多核苷酸和/或缀合物的溶液。分散液也可以在甘油、液体聚(乙二醇)、DMSO及其混合，在有或没有酒精的情况下以及在油中制备。在正常的储存和使用条件下，这些制剂可能含有防腐剂以防止微生物的生长。选择和制备合适制剂的常规程序和成分描述于例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，21st Ed.，Gennaro，Ed.，Lippencott Williams&Wilkins(2005)and in The United States Pharmacopeia：TheNational Formulary(USP 36 NF31)，于2013年发表。
生物相容的、可生物降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可用于控制多核苷酸和/或缀合物的释放。用于多核苷酸和/或缀合物的其他潜在有用的肠胃外递送系统包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵或可植入的输注系统。可以配制肠胃外制剂以用于多核苷酸和/或缀合物的快速释放或持续/延长释放。用于肠胃外释放多核苷酸或缀合物的示例性制剂包括：水溶液、用于重构的粉末、助溶剂溶液、油/水乳液、悬浮液、微球和聚合物凝胶。
以下是本发明的示例，其并非以任何方式限制这项发明。
实施例
实施例1.核苷酸和多核苷酸的合成和纯化
免疫调节多核苷酸及其前体的示例性合成描述如下。
前体
可用于制备本发明的多核苷酸的前体在WO 2015/188197中提供(例如，亚磷酰胺，靶向部分和含有PEG链的生物可逆基团)。
亚磷酰胺和其他单体
在WO2015/188197中公开了可用于合成本发明的多核苷酸的含核苷的中间体(例如，WO2015/188197中的化合物U1-U54，A1-A15，C1-9和G1-G12)。
可商购的亚磷酰胺购自Glen Research(Sterling，VA)或ChemGenes(Wilmington，MA)。需要时，可使用此处所述的标准反应条件，从经过适当保护的核苷中制备其他磷酰胺。
化合物S61B
Figure BDA0002320320380001611
向S61(0.48g，2.0mmol)在DCM(5.0mL)中的溶液中添加S61A(0.60g，2.0mmol)和ETT(0.25M的乙腈溶液，4.8mL，1.2mmol)。将混合物搅拌2小时。蒸发挥发物得到残余物，将其进行快速硅胶柱纯化，使用乙酸乙酯/己烷(在Combi Flash Rf仪器上梯度为0-30％)，得到化合物S61B，为无色油状物(0.49g，55％)。31P NMR(202MHz，CDCl3；ppm)：δ147.83(s)。
化合物S108
向搅拌中的2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙醇](S108A，25.0g，167mmol)和N-甲基吗啉(21.0mL，191mmol)的二氧六环(100mL)混合物中滴加Fmoc-OSu(62.2g，184mmol)的二氧六环(50mL)溶液。搅拌过夜后，将反应真空浓缩，得到浅黄色油。将粗产物再溶解于EtOAc中，并用饱和NaHCO3和盐水洗涤。真空除去有机层，得到油状物，将其通过SiO2色谱纯化，得到FmocNH-PEG2-OH(S108，55g，88％收率)。ESI+m/z calcd 371.4，found 372.2[M+H]+。
X1和X2碱基间隔子的合成-一般方案：
Figure BDA0002320320380001621
化合物S110
Figure BDA0002320320380001622
在氩气下于0℃下向NaH(13.2g，60％在矿物油中，230.0mmol)在THF(40mL)中的悬浮液中逐滴添加二醇(S109，4.92g，22.0mmol)在THF(20mL)中的溶液；将得到的混合物温热至室温并搅拌1h。将反应混合物冷却至0℃，缓慢加入炔丙基溴(18.6g，158.4mmol)的THF(25mL)溶液，并将所得混合物加热至室温，并在40℃搅拌过夜。通过TLC观察，产物耗尽后，通过在0℃下逐滴加入水淬灭反应，并将所得混合物用二氯甲烷(50mL×2)萃取。合并的有机层用盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤，蒸发，得到残余物，将其使用ISCO companion通过快速硅胶柱(己烷/乙酸乙酯，0-30％)纯化，得到5.92g(89.5％)油状的化合物S110。1HNMR(500MHz，CDCl3；ppm)：δ7.49-7.47(dd，J 8.0，1.5Hz，2H)，7.38-7.34(m，3H)，5.43(s，1H)，4.21(d，J 2.5Hz，2H)，4.12(t，J 2.5Hz，4H)，4.10(s，1H)，3.91(s，1H)，3.89(s，1H)，3.37(s，2H)；ESI MS for C18H20O4计算300.34，观察[M+H]+ 301.3。
化合物S111
将双炔丙基化合物S110(5.9g，19.64mmol)溶于乙酸/水混合物(60mL，75∶25)中，在50℃下继续反应2h。反应完成后，将溶液蒸发并与甲苯(2×20mL)共蒸发。所得残余物使用ISCO companion通过快速硅胶柱(己烷/乙酸乙酯，20-80％)纯化而无需任何后处理，得到3.02g(72.5％)油状的化合物S111。1H NMR(500MHz，CDCl3；ppm)：δ4.15(d，J2.5Hz，4H)，3.68(s，4H)，3.59(s，4H)，2.44(t，J2.5Hz，2H)，2.30-2.40(br，2H)；ESI MS for C11H16O4计算212.24，观察[M+H]+ 213.2。
化合物S112
Figure BDA0002320320380001632
在0℃下，向二醇S111(3.0g，14.2mmol)，N，N-二异丙基乙胺(3.15mL，17.0mmol)和DMAP(0.36g，2.83mmol)的二氯甲烷(25mL)溶液中滴加二甲氧基三苯甲基氯(4.8g，14.2mmol)的二氯甲烷(40mL)溶液，反应持续在室温下过夜。混合物用二氯甲烷稀释，先后用水和盐水洗涤，有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并蒸发。所得残余物使用ISCO companion通过快速硅胶柱(己烷/乙酸乙酯，0-40％)纯化，得到5.29g(73％)单DMT保护的白色化合物S112。1H NMR(500MHz，CDCl3；ppm)：δ7.4-7.42(m，2H)，7.32-7.31(m，4H)，7.28-7.25(m，2H)，6.84-6.81(m，4H)，4.09(d，J 2.5Hz，4H)，3.79(s，6H)，3.67(d，J 6.0Hz，2H)，3.64-3.56(m，4H)，3.13(s，2H)，2.39(t，J 2.5Hz，2H)；ESI MS for C32H34O6计算514.6，观察[M+Na]+537.4。
化合物S113
Figure BDA0002320320380001641
在室温下向DMT保护的化合物S112(0.5g，0.98mmol)的二氯甲烷(4mL)溶液中滴加2′-氰基乙基-N，N，N′，N′-四异丙基亚磷酰胺溶液(0.58g，1.95mmol)的二氯甲烷(3mL)，然后在氩气气氛下加入5-苄硫基-1H-四唑(BTT；0.25M乙腈溶液，0.78mL，0.18mmol)。继续反应直到起始原料消失(2h)，并将粗混合物用20mL二氯甲烷稀释，依次用饱和NaHCO3溶液(10mL)和盐水(10mL)洗涤，并用无水Na2SO4干燥。真空蒸发溶剂，并将粗混合物通过硅胶柱色谱法纯化，使用具有3％三乙胺的乙酸乙酯/己烷作为助溶剂(在Combi Flash Rf仪器上梯度为0-30％)，得到0.53g油状化合物S113(75％)。ESI MS for C41H51N2O7P计算714.82，观察715.6[M+H]+；31P NMR(202MHz，CDCl3)：δ147.89。
化合物S114
Figure BDA0002320320380001642
在氩气下，向-78℃的DMT保护的化合物S112(0.98g，1.9mmol)和N，N-二异丙基乙胺(0.39mL，2.09mmol)在8.0mL无水二氯甲烷中的溶液中滴加双(N，N-二异丙基氨基)-氯膦(0.56g，2.09mmol)的二氯甲烷(4.0mL)溶液。使反应混合物温热至室温，同时保持搅拌1h。在室温下加入3-丁炔-1-醇(0.14g，1.9mmol)在2.0mL无水二氯甲烷中的溶液。将所得混合物搅拌10分钟，这时加入0.25M ETT乙腈溶液(4.6mL，1.15mmol)，并另外继续搅拌3h。如通过TLC消失的起始原料所示反应完成后，将粗混合物用20mL二氯甲烷稀释，并依次用饱和NaHCO3溶液(10mL)和盐水(10mL)洗涤，并用无水Na2SO4干燥。真空蒸发挥发物，并将粗混合物通过硅胶柱色谱法纯化，使用乙酸乙酯/己烷和3％三乙胺作为溶剂体系(在Combi FlashRf仪器上梯度为0-40％)，得到0.33g油状化合物S114(25％)。ESI MS for C42H52NO7P计算713.83，观察714.7[M+H]+；31P NMR(202MHz，CDCl3)：δ146.89。
X3和X4碱基间隔子合成-一般方案：
Figure BDA0002320320380001651
化合物S116
Figure BDA0002320320380001652
使用针对化合物S110所述的方案制备油状化合物S116，产率为91％。1H NMR(500MHz，CDCl3；ppm)：δ7.51(d，J 7.5Hz，2H)，7.37-7.32(m，3H)，5.56(s，1H)，3.37-3.35(m，4H)，4.10-4.07(dd，J 13.0Hz，J 2.5Hz，2H)，3.65-3.64(m，1H)，2.43-2.42(t，J 6.5Hz，1H)；ESI MS for C13H14O3计算218.24，观察[M+H]+ 219.2。
化合物S117
Figure BDA0002320320380001661
使用针对化合物S111所述的方案制备油状化合物S117，其收率为91％。1H NMR(500MHz，CDCl3；ppm)：δ4.33(s，2H)，3.83-3.70(m，5H)，2.48(s，1H)，2.04(br，2H)；ESI MSfor C6H10O3计算130.14，观察[M+Na]+ 153.0。
化合物S118
使用针对化合物S112所述的方案制备白色固体化合物S118，产率为54％。1H NMR(500MHz，CDCl3；ppm)：δ7.43(d，J 7.5Hz，2H)，7.37-7.27(m，5H)，7.23-7.16(m，2H)，6.83(d，J 9.0Hz，3H)，6.78-6.76(dd，J 8.5Hz，1H)，4.35-4.22(m，2H)，3.77(s，6H)，3.76-3.72(m，2H)，3.71-3.64(m，1H)，3.27-3.19(m，2H)，2.48(t，J 4.5Hz，1H)，2.03-1.96(m，1H)；ESIMS for C27H28O5计算432.50，观察[M+Na]+ 455.4。
化合物S119
Figure BDA0002320320380001663
使用针对化合物S113所述的方案制备油状化合物S119，产率86％。ESI MS forC36H45N2O6P计算432.72，观察433.5[M+H]+；31P NMR(202MHz，CDCl3)：δ149.05，148.96。
化合物S120
Figure BDA0002320320380001671
使用针对化合物S114描述的方案制备油状化合物S120，收率为47％。ESI MS forC37H46NO6P计算431.73，观察432.5[M+H]+；31P NMR(202MHz，CDCl3)：δ147.80，147.71。
X5和X6碱基间隔子合成-一般方案：
Figure BDA0002320320380001672
化合物S121
Figure BDA0002320320380001673
向S116(4.0g，22.2mmol)的二氧六环(25mL)溶液中加入溶解于最小量的水中的KOH(0.12g，2.2mmol)溶液，并将得到的混合物在室温搅拌至少30分钟。将混合物冷却至0℃，逐滴加入丙烯腈(2.35g，44.4mmol)的二氧六环(15mL)溶液，并使所得混合物在室温下反应过夜。真空蒸发挥发物，将残余物用水稀释，并将pH调节至接近中性。粗产物用乙酸乙酯(2×50mL)萃取，合并的有机层用盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤，蒸发，得到残余物，将其使用ISCO companion通过快速硅胶柱(二氯甲烷/甲醇，0-5％)纯化。得到3.1g(60％)白色固体的化合物S121。1H NMR(500MHz，CDCl3；ppm)：δ7.49(d，J 7.0Hz，2H)，7.36-7.34(m，3H)，5.56(s，1H)，3.36(d，J 13.0Hz，2H)，4.10-4.07(dd，J 13.0Hz，J 2.0Hz，2H)，3.84(t，J6.5Hz，2H)，3.42(m，1H)，3.69(t，J 6.5Hz，2H)；ESI MS for C13H15NO3计算233.2，观察[M+Na]+ 256.3。
化合物S122
Figure BDA0002320320380001681
在0℃下，向氢化铝锂(0.83g，4.0mmol)在THF(10mL)中的悬浮液中滴加化合物S121(1.28g，5.5mmol)在THF(15mL)中的溶液，加热所得混合物到室温，并继续搅拌3小时。反应完成后，将反应混合物冷却至0℃，并根据需要通过滴加水(约2-3mL)淬灭。额外的加入约8mL水，并将粗产物萃取至乙酸乙酯(2×25mL)中。合并的有机层用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并蒸发，得到化合物S122，其无需进一步纯化即可用于随后的步骤。1H NMR(500MHz，CDCl3；ppm)：δ7.49(d，J 7.0Hz，2H)，7.40-7.32(m，3H)，5.55(d，J 5.0Hz，1H)，4.34(d，J 13.0Hz，1H)，4.20-4.11(dd，J 12.0Hz，4H)，4.05-4.03(d，J 13.0Hz，J 2.0Hz，1H)，3.66-3.62(m，2H)，3.27(m，1H)，2.86(t，J 6.5Hz，1H)，2.16(br，2H)；ESI MS forC13H19NO3计算237.2，观察[M+H]+ 238.2。
化合物S123
Figure BDA0002320320380001691
在0℃下，向化合物S122(1.0g，4.2mmo1)和N，N-二异丙基乙胺(2.3mL，12.6mmol)的二氯甲烷(8mL)溶液中滴加Fmoc-OSu(1.7g，5.0mmol)溶液，并且使所得混合物在室温下反应3小时。完成后，将反应混合物用二氯甲烷(10mL)稀释，先后用水和盐水洗涤。分离有机层，用无水Na2SO4干燥，过滤，蒸发，得到残余物。残余物使用ISCO companion通过快速硅胶柱(己烷/乙酸乙酯，0-50％)纯化，得到0.65g(35％)白色固体的化合物S123。1H NMR(500MHz，CDCl3；ppm)：δ7.75(d，J 7.5Hz，2H)，7.58(d，J 7.5Hz，2H)，7.51(d，J 7.5Hz，2H)，7.37(t，J 7.5Hz，2H)，7.31-7.26(m，5H)，5.57(s，1H)，5.48(br，1H)，4.46-4.32(m，4H)，4.15(d，J 7.0Hz，1H)，4.06(t，J 12.5Hz，2H)，3.67(m，2H)，3.54(m，2H)，3.41(s，1H)，1.88(t，J 6.0Hz，2H)；ESI MS for C28H29NO5计算459.5，观察[M+Na]+482.5。
化合物S124
Figure BDA0002320320380001692
使用针对化合物S111描述的方案制备定量收率油状化合物S124。1H NMR(500MHz，CDCl3；ppm)：δ7.76(d，J 7.5Hz，2H)，7.58(d，J 7.5Hz，2H)，739(t，J 7.5Hz，2H)，7.32(t，J7.5Hz，2H)，5.18(br，1H)，4.44(d，J 6.5Hz，2H)，4.21(t，J 6.5Hz，1H)，4.76-4.73(dd，J11.5，3.5Hz，2H)，3.67-60(m，4H)，3.42(m，1H)，3.37(br，2H)，2.07(m，2H)，1.75(br，2H)；ESI MS for C21H25NO5计算371.4，观察[M+Na]+ 394.3。
化合物S125
Figure BDA0002320320380001701
使用针对化合物S112所述的方案制备白色固体化合物S125，其产率为48％。1HNMR(500MHz，CDCl3；ppm)：δ7.75(t，J 7.5Hz，2H)，7.58(t，J 7.5Hz，2H)，7.40-7.38(m，3H)，7.32-27(m，7H)，7.18-7.16(m，3H)，6.83(t，J 7.0Hz，4H)，5.16(br，1H)，4.44(d，J 6.5Hz，2H)，4.20(m，1H)，3.80(s，3H)，3.79(m，1H)，3.76(s，3H)，3.74(m，2H)，3.66-3.62(m，4H)，3.43-3.37(m，2H)，2.31(br，1H)，1.76(br，2H)；ESI MS for C42H43NO7计算673.7，观察[M+Na]+ 696.7。
化合物S126
使用针对化合物S113所述的方案制备油状化合物S126，其产率为78％。ESI MSfor C51H60N3O8P计算874.0，观察896.9[M+Na]+ 913.0[M+K]+；31P NMR(202MHz，CDCl3；ppm)：δ148.90，148.76。
无碱基间隔子S131的合成-一般方案：
Figure BDA0002320320380001703
化合物S127
Figure BDA0002320320380001711
在氩气下向S109(2.56g，11.4mmol)在二氯甲烷(50mL)中的溶液中添加溴乙腈(3.01g，25.1mmol)，氧化银(I)(5.28g，22.8mmol)和四丁基碘化铵(0.84g，2.28mmol)，并将所得混合物搅拌过夜。将混合物通过硅藻土过滤，并将滤液蒸发，得到黑色残余物，将其在ISCO companion上进行快速硅胶柱纯化(己烷/乙酸乙酯，15-90％)，得到1.34g(39％)为粘稠油的化合物S127。ESI MSfor C16H18N2O4计算302.3，观察[M+H]+ 303.3。
化合物S128
Figure BDA0002320320380001712
在氩气下向化合物S127(1.34g，4.43mmol)在THF(30mL)中的溶液中添加LiAlH4在THF(2M，8.9mL，17.7mmol)中的溶液，并将混合物加热至55℃搅拌4h。加入另一部分LiAlH4在THF中的溶液(2M，4mL，8.0mmol)，并继续搅拌4小时。反应完成后，将混合物冷却至室温，并用Nα2SO4.10H2O淬灭。滤出固体，并用乙酸乙酯洗涤。滤液经无水Na2SO4干燥。将混合物过滤并蒸发，得到残余物，将其溶于二氯甲烷(20mL)中。向该溶液中加入Fmoc-OSu(1.5g，4.43mmol)和DIEA(0.87mL，5.0mmol)。将混合物搅拌1小时，然后蒸发，得到残余物，将其在ISCO companion上进行快速硅胶柱纯化(己烷/乙酸乙酯，20-90％)，得到1.04g(31％)白色泡沫化合物S128。1H NMR(500MHz，CDCl3；ppm)：δ7.75(4H，dd，J 7.5，4.5Hz)，7.58(4H，t，J7.0Hz)，7.48(2H，d，J 7.0Hz)，7.41-7.34(7H，m)，7.32-7.26(4H，m)，5.44(1H，s)，5.15-5.05(2H，m)，4.44(2H，d，J 5.5Hz)，4.38(2H，d，J 6.0Hz)，4.25-4.15(2H，m)，4.10(2H，d，J11.5Hz)，3.82(2H，d，J 11.5Hz)，3.78(2H，s)，3.53(2H，s)，3.42(2H，s)，3.36-3.27(4H，m)，3.25(2H，s)；ESI MS for C46H46N2O8计算754.9，观察[M+H]+ 755.3。
化合物S129
Figure BDA0002320320380001721
将化合物S128(1.1g，1.51mmol)溶解在AcOH/H2O混合物(10mL，3∶1)中，并在55℃下继续反应5小时。反应完成后，将挥发物蒸发并与甲苯(2x 20mL)共蒸发，并将残余物在ISCO companion上进行快速硅胶柱纯化(己烷/乙酸乙酯，30-100％)，得到0.54g(54％)为白色泡沫的化合物S129。1H NMR(500MHz，CDCl3；ppm)：δ7.75(4H，d，J 7.5Hz)，7.58(4H，d，J7.5Hz)，7.39(4H，t，J 7.5Hz)，7.30(4H，t，J 7.5Hz)，5.20-5.05(2H，m)，4.41(4H，d，J6.5Hz)，4.21(4H，t，J 6.5Hz)，3.64(4H，s)，3.48(8H，s)，3.36(4H，s)；ESI MS forC39H42N2O8计算666.7，观察[M+H]+ 667.3。
化合物S130
Figure BDA0002320320380001722
在0℃下，向二醇S129(0.73g，1.1mmol)，DIPEA(0.19mL，1.1mmol)和DMAP(0.013g，0.11mmol)的二氯甲烷(6mL)溶液中滴加DMTrCl(0.34g，0.99mmol)的二氯甲烷(1mL)溶液。将所得混合物温热至室温，并搅拌过夜。蒸发混合物，得到残余物，将其在ISCO(己烷/乙酸乙酯，20-100％)上进行快速硅胶柱纯化，得到0.47g(44％)为白色泡沫的单二甲氧基三苯甲基保护的化合物S130。1H NMR(500MHz，CDCl3ppm)：δ7.75(4H，d，J 7.5Hz)，7.58(4H，d，J7.5Hz)，7.39(4H，t，J 7.5Hz)，7.32-7.25(8H，m)，7.17(4H，d，J 6.5Hz)，6.83(4H，d，J6.5Hz)，5.20-5.05(2H，m)，4.41(4H，d，J 6.5Hz)，4.21(4H，t，J 6.5Hz)，3.82(6H，s)，3.64(4H，s)，3.48(8H，s)，3.36(4H，s)；ESI MS for C60H60N2O10计算969.1，观察[M+Na]+ 991.3。
化合物S131
Figure BDA0002320320380001731
在-78℃下，将双-(N，N-二碘丙基氨基)-氯膦(0.085g，0.32mmol)的无水二氯甲烷(1.0mL)溶液滴加到3-Fmoc-氨基-丙烷-1-醇(O.090g，0.30mmol)和N，N-二异丙基乙胺(0.18mL，1.05mmol)的无水二氯甲烷(3.0mL)溶液中。将反应混合物温热至室温并搅拌1.5小时。加入化合物S130(0.30g，0.30mmol)在1.0mL无水CH2Cl2中的溶液，并将所得混合物搅拌10分钟。将ETT(0.72mL，0.25M乙腈溶液，0.18mmol)溶液添加至反应混合物，并将所得混合物搅拌3h。将混合物用二氯甲烷(20mL)稀释，并用饱和碳酸氢钠水溶液(20mL)和盐水(20mL)洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥，并真空蒸发滤液，得到残余物，将其在ISCOcompanion上进行快速硅胶柱纯化，使用乙酸乙酯/己烷和3％三乙胺作为助溶剂系统(0-30％梯度)。得到0.12g为白色泡沫产物S131(32％)。ESI MS for C84H91N4O13P计算1395.6，观察1395.7[M]+；31P NMR(202MHz，CDCl3)：δ146.41。
化合物dT4
Figure BDA0002320320380001732
FmocNH-PEG2-羟基-二异丙基氨基-dT(5′-DMT)亚磷酰胺(dT4)的合成。将5′-DMT-脱氧胸苷(4.30g，7.89mmol)和DIEA(1.51mL，8.68mmol)在CH2Cl2(40mL)中的搅拌悬浮液在氩气下冷却至-78℃。滴加双(二异丙基氨基)氯膦(2.32g，8.68mmol)的CH2Cl2(10mL)溶液。将混合物从冷却浴中移出并搅拌1h。将在CH2Cl2(15mL)中的FmocNH-Peg2-OH(S108，2.93g，7.89mmol)加入到反应混合物中，然后加入ETT(0.25M的乙腈，18.9mL)溶液。搅拌过夜后，将混合物真空浓缩，再溶解于EtOAc，并用饱和NaHCO3和盐水洗涤。真空除去有机层，得到白色泡沫。将该粗物质通过SiO2色谱纯化，得到标题亚磷酰胺(dT4，4.1g，50％收率)。
上述合成方案用于合成各种三酯的其他亚磷酰胺前体。
化合物dU6
Figure BDA0002320320380001741
在室温氩气条件下，向dU1(3.3g，5.0mmol)，1-甲基咪唑(1.2mL，15.0mmol)和碘(1.9g，15.0mmol)的THF(10mL)中的溶液中在搅拌下逐滴滴加叔丁基二甲基甲硅烷基氯(0.8g，5.5mmol)的THF(5mL)溶液。将反应在室温搅拌1小时。TLC确认反应完成。真空除去溶剂，将粗产物溶解在乙酸乙酯中，并用饱和Na2S2O3(浓缩)水溶液洗涤。经Na2SO4干燥有机相，过滤并蒸发液体。粗品使用ISCO companion通过快速硅胶柱(己烷/乙酸乙酯，0-50％)纯化，以定量收率得到固体形式的dU2。NMR与已发表的一致。Nucleic Acids Research，2011，Vol.39，No.9，3962-3971.
在室温下将溶解于具有三异丙基硅烷(1.0mL，5.0mmol)的80％乙酸水溶液(40mL)中的dU2(3.9g，5.0mmol)溶液搅拌1小时。TLC确认反应完成。真空除去溶剂。粗品使用ISCOcompanion快速硅胶柱(己烷/乙酸乙酯，0-60％)纯化，得到1g(43％)固体形式的所需化合物dU3。ESI MS for C15H25IN2O5Si计算468.4，观察[M+Na]+ 491.0。
在氩气(g)冰水浴中冷却至0℃下向dU3(1.0g，2.2mmol)在THF(20mL)中的溶液中加入氢化钠(60％分散，0.2g，4.7mmol)。将反应在0℃下搅拌30分钟。逐滴加入碘甲烷(0.7mL，10.8mmol)，并将反应在0℃下搅拌3小时。RP-HPLC/MS证实反应完成。在0℃下用20mL甲醇淬灭反应，并温热至室温。添加NaHCO3饱和水溶液，并将混合物用CH2Cl2萃取。有机相经Na2SO4干燥，过滤并将液体真空浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化(己烷/乙酸乙酯，0-50％)，得到固体dU4(0.6g，58％产率)。ESI MS for C16H27IN2O5Si计算482.4，观察[M+H]+ 483.1。
在氩气条件下，将氟化叔丁基氟化铵(1M THF，3mL，3.0mmol)滴加到
(5-叠氮戊基)-β-N-Boc赖氨酸(PP1)的制备。将ε-N-Boc赖氨酸(9.46g，38.4mmol)和K2CO3(2.67g，19.3mmol)溶解在1∶1 THF：H2O(60mL)中。加入在THF(10mL)中的五氟苯基-5-叠氮戊酸酯(10.8g，34.9mmol)，并将反应在室温搅拌过夜。通过RP-HPLC-MS观察到所需产物，394.2[M+Na]。通过用1N HCl(水溶液)滴定将反应酸化至pH 5，并将产物用EtOAc(3×100mL)萃取。依次用H2O(50mL)和盐水(50mL)洗涤有机层。有机层经MgSO4干燥，并真空浓缩成浓浆。粗产物通过硅胶柱色谱法纯化，得到期望的产物PP2，为白色针状物(8.1g，62％收率)。ESI MS+mass计算C16H29N5O5：371.4，found：394.2[M+Na]+。
PP1聚乙二醇化的一般方案：制备(5-叠氮戊基)-ε-N-(NH-Boc PEG24)赖氨酸(PP4少。将PP1(0.74g，2.0mmol)用HCl(2mL，4N in dioxane)处理4h。HPLC-MS显示完全脱保护，为272.2[M+H]+。用1∶1 H2O：乙腈(10mL)稀释反应，冷冻，并冻干过夜，以定量收率得到呈白色固体的PP2。用HATU(0.34g，0.88mmol)，HOBt(0.14g，0.88mmol)和DIEA(0.7mL，4.0mmol)将在DMF(3mL)中的NHBoc-PEG24酸(1.1g，0.88mmol)活化，然后用PP2处理(0.24g，0.8mmol)2小时。RP-HPLCMS显示形成所需的PP4。粗产物通过RP-HPLC纯化，得到为白色固体PP4(0.55g，46％产率)。ESI MS+mass计算C67H130N6O30：1499.77，found：1499.9[M+H]+，1400.8[M-Boc]+。
Figure BDA0002320320380001771
使用WO2015/188197中所述的方法，由可商购的起始材料制备BisPegX-NH2和TrisPegX-NH2(其中X＝各种PEG长度)。
PP2，PP3和PP4的聚乙二醇化的一般规程：将溶解在DMF(1mL)中的赖氨酸PP1(38mg，0.1mmol)用HATU(37mg，0.1mmol)，N，N-二异丙基乙胺(49mL，0.3mmol)和mPEG48-NH2(200mg，0.09mmol)处理。RP-HPLC-MS显示将PEG48完全添加到PP1中。粗产物通过RP-HPLC纯化，得到NHBocPP7，为白色固体(97mg，42％收率)。ESI MS+mass计算C113H224N6O52：2499.03，found：833.7[M+3H]3+，625.6[M+4H]4+。将PP7用HCl(2mL，4N在二氧六环中)脱保护4小时。HPLC-MS显示完全脱保护，如具有大量起始原料的峰的消失所观察到的。用1∶1 H2O：乙腈(10mL)稀释反应，冷冻，并冻干过夜，以定量得到白色固体PP8。ESI MS+mass计算C108H216N6O50：2398.88，found：1199.8[M+2H]2+，800.3[M+3H]3+，600.5[M+4H]4+，480.6[M+5H]5+。
在该方案中，条件是：
A)6-甲基四嗪-OSu，HATU，Hünig’s base，DMF；和
B)DBCO-CpG，乙腈/H2O；
其中6-甲基四嗪-OSu具有下式：
Figure BDA0002320320380001782
和
DBCO-CpG具有下式：
Figure BDA0002320320380001791
制备装载有多核苷酸(PP28和PP30)的接头的一般规程。
PP12和PP16的四嗪-缀合柄：将PP12(43mg，0.12mmol)溶于DMF(0.5mL)，用HATU(4.6mg，0.12mmol)，DIEA(12.7μL，0.73mmol)处理，并在5min后，加入6-甲基-四嗪-OSu(19.9mg，0.61mmol)。将粗反应在室温下搅拌30分钟，RP-HPLCMS显示6-甲基-四嗪羧酸盐与PP12完全偶联。通过RP-HPLC纯化粗产物，并将合并的级分冻干，得到呈紫色固体的PP27(39mg，85％收率)。ESI MS+mass计算C170H325N11O76：3739.47，found：833.7[M+3H]3+，625.6[M+4H]4。将纯PP27在DBCO-CpG的乙腈：水(1∶1)中处理，并在37℃下孵育1-2小时，然后在室温下再孵育1小时，得到PP28。通过制备型AEX(20mM磷酸盐和20mM磷酸盐-1M溴化钠)纯化PP28。
CpG加载的接头PP28和PP30的另一种一锅法路线。将PP12(400nmol)用DBCO-CpG(420nmol)在乙腈：水(1∶1)中处理，并在37℃下孵育1-2小时，然后在室温下再孵育1小时。将在DMSO储备溶液中的四嗪-OSu(4000nmol)添加到粗PP12-DBCO-CpG溶液中，使紫色溶液在室温下反应3小时，持续1-2小时，得到PP28。通过制备型RP-HPLC(在水中50mM TEAA和10％乙腈：水)或制备型AEX(20mM磷酸盐和20mM磷酸盐-1M溴化钠)纯化PP28。
Figure BDA0002320320380001792
制备四嗪-PEG24-OPFP(PP32)。在氩气下向氨基-PEG24-羧酸(1.0g，0.9mmol)和二异丙基乙胺(0.8mL，4.4mmol)在DMF/水(1∶1，12mL)中的溶液在搅拌下逐滴加入在DMF(3mL)中的甲基四嗪苯基乙酰基琥珀酰亚胺酯(370mg，1.1mmol)。反应在室温下搅拌2小时。RP-HPLC/MS表明形成产物。真空除去溶剂，并将粗产物通过RP-HPLC(TFA改性剂)纯化，得到1.1g(80％)的PP31。ESI MS for C62H111N5O27计算1358.56，观察[M+H]+ 1358.8。在氩气下向PP31(109mg，0.08mmol)的二氯甲烷(3mL)溶液中加入无水吡啶(32mg，0.4mmol)和五氟苯基三氟乙酸酯(67mg，0.24mmol)。反应在室温下搅拌过夜。真空除去溶剂。将粗产物重新溶解在EtOAc中，并用NaHCO3水溶液(5％w/v)(3x)和盐水(1x)洗涤。有机相经Na2SO4干燥，过滤，并真空浓缩，定量得到PP32。无需进一步纯化即可用于下一步。ESI MS for C68H110F5N5O27计算1524.61，观察[M+2H]2+ 763.0。
Figure BDA0002320320380001802
PP34的制备。在氩气下向mPEG48-胺(2.15g，1.00mmol)和二异丙基乙胺(0.87mL，5.00mmol)在DMF/水(1∶1，10mL)的溶液中搅拌下逐滴滴加Nα-Cbz-Nε-Boc-L-赖氨酸琥珀酰亚胺酯(570mg，1.2mmol)在DMF(5mL)中的溶液。将反应混合物在室温搅拌2小时。RP-HPLC/MS表明形成产物PP33。将反应混合物真空浓缩并通过硅胶色谱法纯化(CH2Cl2：MeOH 0-10％)。回收的PP33可直接用于下一步反应。ESI MS for C116H223N3O53计算2508.0，观察[M+3H]3+ 836.7，[M+4H]4+ 627.9。用氮气冲洗PP33(1.00mmol)在MeOH中的溶液，并加入活性炭上的钯(10重量％，催化的)。将该溶液交替抽真空，并用氢气(3X)吹扫。2小时后RP-HPLC/MS显示PP34的形成。通过硅藻土床过滤多样混合物，并用大量的甲醇洗涤。真空除去溶剂，得到PP34(2.0g，84％产率，经2步)。ESI MS for C108H217N3O51计算2373.87，观察[M+3H]3+792.0。
Figure BDA0002320320380001811
PP37的制备。在氩气下向PP32(124mg，0.08mmol)和二异丙基乙胺(31mg，0.24mmol)在DMF/水(1∶1，10mL)的溶液中搅拌下逐滴加入PP34(230mg，0.1mmol)在DMF/水中水(1∶1，10mL)。将反应在室温搅拌2小时，并且RP-HPLC/MS表明形成产物PP35。真空除去溶剂，PP35无需进一步纯化即可用于下一步。ESI MS for C170H326N8O77计算3714.4，观察[M+4H]4+ 929.5，[M+5H]5+ 743.8。在氩气下，用HCl(4N二氧六环溶液，5mL)处理粗制的PP35(0.08mmol)。将反应在室温搅拌2小时，并且RP-HPLC/MS表明Boc保护基的完全去除。真空除去溶剂，并将胺用bis-Peg3-PFP酯(230mg，0.4mmol)在DMF(5mL)和二异丙基乙胺(140μL，0.8mmol)中的溶液酰化。2小时后，RP-HPLC/MS表明产物PP37的形成在真空中除去溶剂，并将粗产物通过RP-HPLC(TFA改性剂)纯化，以四TFA盐的形式提供PP37，31mg，收率为8.7％。ESI MS for C181H333F5N8O81计算4012.56，观察[M+3H]3+ 1338.3，[M+4H]4+ 1004.0，[M+5H]5+803.4，[M+6H]6+ 669。
包含辅助部分的接头列表：
Figure BDA0002320320380001821
Figure BDA0002320320380001831
在上表中，标识为Y或Z的组具有以下结构：
Figure BDA0002320320380001832
在上表中，被标识为“p313+N3-戊酰胺”的基团Z是指p313与具有N3-戊酰胺作为Z的接头之间的环加成反应的产物。
使用本文和WO2015/188197中描述的标准合成方法合成表1中所示的亚磷酰胺单体。
使用文献Wada，J.Am.Chem.Soc.130：16031-16037，2008方法制备用于手性硫代磷酸酯寡核苷酸合成的双环氧杂氮磷吡啶单体。
表1
Figure BDA0002320320380001841
Figure BDA0002320320380001851
Figure BDA0002320320380001871
Figure BDA0002320320380001881
Figure BDA0002320320380001891
Figure BDA0002320320380001901
手性无碱间隔子-化合物X7，X8，X9和X10：
Figure BDA0002320320380001911
X7和X8合成：
Figure BDA0002320320380001912
X9和X10合成：
Figure BDA0002320320380001913
以下是可以使用本领域已知的方法和本文描述的方法制备的其他亲水性核苷亚磷酰胺：
Figure BDA0002320320380001921
其中R为OH、任选取代的氨基或-CO2R1(R1为H或平衡离子)，且n为1至4的整数；
Figure BDA0002320320380001922
其中R为OH、OAc、OMe、任选取代的氨基或CO2R1(R1为H或平衡离子)，n为1至51的整数。
以下是可以使用本领域已知的方法和本文描述的方法制备的其他取代的核苷亚磷酰胺：
其中R和R1各自独立地为H或任选取代的C1-6烷基(例如，Me，Et，i-Pr，或n-Bu)
以下亚磷酰胺购自Glen Research(Sterling，VA)或ChemGenes(Wilmington，MA)或使用本文所述的标准方案制备：
Figure BDA0002320320380001941
这些中间体可用于制备本发明的多核苷酸(例如，含有5′-末端修饰的核苷的多核苷酸)。5′-末端修饰的核苷的非限制性实例是5-卤代尿苷，5-炔基尿苷，5-杂芳基尿苷和5-卤代胞苷。
5’-封端：
α)5’-5’-封端：
Figure BDA0002320320380001951
b)5’-磷酸酯或硫代磷酸酯封端：
Figure BDA0002320320380001952
基于小分子的靶向部分的合成
在WO 2015/188197中描述了用于制备基于小分子的靶向部分的示例性化合物(例如，在WO 2015/188197中描述的化合物M1-M30)。
葡萄糖醇辅助部分的合成
在WO2015/188197中描述了用于制备基于葡萄糖醇的辅助部分的示例性化合物(例如，在WO 2015/188197中描述的化合物POH1-POH10)。
一般多核苷酸合成：
一般方案：
Figure BDA0002320320380001961
实验细节：
使用以下试剂和溶剂在MerMade 6或12上自动进行多核苷酸合成(1μmol规模)：
氧化剂-在THF/吡啶/H2O中为0.02M I2(每个循环60s氧化)，
硫化试剂II-二-噻唑衍生物/吡啶/乙腈(0.05M，在6∶4吡啶：乙腈中)(每个循环60s)
解封-3％三氯乙酸(每个循环2x 40s解封)，
端帽混合A-THF/2，6-二甲基吡啶/Ac2O(每个循环60s封端)，和
端帽混合B-在THF中的16％甲基咪唑(每个循环60s封端)
标准多核苷酸合成条件的例外如下：
-CPG支持使用称为Uny-linker的非核苷接头。
-在合成之前，将所有2′-脱氧核糖-磷酰胺重悬于100mM的100％无水乙腈中，除了部分修饰的2′-脱氧核糖-磷酰胺溶解于THF/乙腈混合物(1∶4)中至100mM取决于原料的溶解度。
-用2.5倍摩尔过量的5-苄硫基-1H-四唑(BTT)进行亚磷酰胺活化。每次插入将活化的2′-脱氧核糖-磷酰胺偶联2x 1分钟，每次插入将修饰的亚磷酰胺偶联2x 3分钟。
添加80μL的乙酸，将样品在室温下静置1h，冷冻并冻干。将干燥的样品重新溶解在20％乙腈中，并通过NAP 10(SephadexTM-G25 DNA Grade)色谱柱脱盐。将收集的纯级分冷冻并冻干得到最终产物。
使用无碱基间隔子的一般缀合方案：
点击反应-一般方案：
其中
每个q为0或1；
m为0-5的整数。
Z为O或S；
RO是与多核苷酸中核苷键接的键；
R是与H、多核苷酸中的核苷、固体支持物或封端基团(例如-(CH2)3-OH)键接的键；
每个R’独立地为H，-Q1-QA1，生物可逆基团或非生物可逆基团；
每个R”独立地为H，-Q1-QA-Q2-T，生物可逆基团或非生物可逆基团；
每个RA独立地为H或-ORC，其中RC为-Q1-QA1、生物可逆基团、非生物可逆基团或与固体支持物键接的键；
每个RB独立为H或-ORD，其中RD为-Q1-QA-Q2-T、生物可逆基团或非生物可逆基团；
其中
每个Q1独立地为二价，三价，四价或五价基团，其中一个价键与QA或QA1键接；第二价键是开放的，并且当存在时，每个其余的价键独立地键接至辅助部分；
每个Q2独立地为二价，三价，四价或五价基团，其中一个价键与QA结合；第二价键与T键接，并且其余的每个价键，当其存在时，独立地键接至辅助部分；
QA为1，2，3-三唑-1，4-二基，任选取代的C6-16三唑杂亚杂环基(例如，
Figure BDA0002320320380001981
)，任选取代的C8-16三唑环亚烯基(例如，
Figure BDA0002320320380001982
)，或二氢哒嗪基(例如，反式-
Figure BDA0002320320380001983
或反式-
Figure BDA0002320320380001984
)；
QA1是任选取代的C2-12炔基，任选取代的含内环碳-碳三键C6-16杂环基，(例如，
Figure BDA0002320320380001985
)，任选取代的C8-16环炔基(例如，
Figure BDA0002320320380001986
)，或任选取代的C4-8应变的环烯基(例如，反式环辛烯基)；和
T是靶向部分
条件是原料至少包含至少一个-Q1-QA1，并且产品包含-Q1-QA-Q2-T；和
条件是起始原料和产物含有0或1个键固体支持物键接的键。
缀合方法
铜催化的点击反应
铜-THPTA复合物的制备
将5mM的五水合硫酸铜水溶液(CuSO4-5H2O)和10mM的三(3-羟丙基三唑基甲基)胺(THPTA)水溶液按1∶1(v/v)(1∶2摩尔比)混合并在室温下放置1小时。该配合物可用于催化Huisgen环加成反应，例如，如下面的一般缀合方案所示。
一般步骤(100nM规模)：
向1.7mL Eppendorf管中的710μL水和100μL叔丁醇(最终体积的10％)的溶液中，加入60μL铜-THPTA络合物，然后加入50μL 2mM的oligo溶液，60μL 20mM抗坏血酸钠水溶液和20μL 10mM靶向性叠氮化物溶液。充分混合后，使溶液在室温下静置1小时。通过凝胶分析确认反应完成。将反应混合物加入到螺帽瓶中，该螺帽瓶中含有5-10倍摩尔过量的
Figure BDA0002320320380001992
TAAcONa(树脂结合的EDTA钠盐)。将混合物搅拌1小时。然后将该混合物通过illustraTM NapTM-10色谱柱SephadexTM洗脱。然后将所得溶液冷冻并冻干过夜。
通过酰胺键缀合：
通过酰胺化的缀合可以在本领域已知的酰胺化反应条件下进行。参见，例如，Aaronson等，Bioconjugate Chem.22：1723-1728，2011。
Figure BDA0002320320380001991
其中
每个q为0或1；
m为0至5的整数。
Z为O或S；
RO是与多核苷酸中的核苷键接的键；
R是与H、多核苷酸中的核苷、固体支持物或封端基团(例如-(CH2)3-OH)键接的键；
每个R’独立为H，-Q1-QA1，生物可逆基团或非生物可逆基团；
每个R”独立地为H，-Q1-QA-Q1-T，生物可逆基团或非生物可逆基团；
每个RA独立为H或-ORC，其中RC为-Q1-QA1、生物可逆基团或非生物可逆基团；
每个RB独立为H或-ORD，其中RD为-Q1-QA-Q2-T、生物可逆基团或非生物可逆基团；
其中，
每个Q1独立地为二价、三价、四价或五价基团，其中一个价键与QA或QA1键接，第二个价键开放，其余的每个价键(如果存在)独立地键接至辅助部分；
每个Q2独立地为二价、三价、四价或五价基团，其中一个价键键接至QA，第二个价键键接至T，并且其余的每个价键(如果存在时)独立地键接至辅助部分；
QA是含有-C(O)-N(H)-或者-N(H)-C(O)-的任选取代的C2-12杂亚烷基；
QA1为-NHRN1或-COOR12，其中RN1为H，N-保护基或任选取代的C1-6烷基，R12为H，任选取代的C1-6烷基或O-保护基；和
T是靶向部分
条件是原料至少包含一个-Q1-QA1，并且产物包含-Q1-QA-Q2-T。
溶液相缀合：
Figure BDA0002320320380002001
其中
m是0至5的整数；
Z为O或S；
RO是与多核苷酸中核苷键接的键；
R为与H、多核苷酸中的核苷或封端基团键接的键；
每个R’独立地为H，-Q1-NH2，生物可逆基团或非生物可逆基团；
每个R”独立地为H，-Q1-NH-CO-Q2-T，生物可逆基团或非生物可逆基团；
每个RA独立为H或-ORC，其中RC为-Q1-NH2、生物可逆基团或非生物可逆基团；
每个RB独立为H或-ORD，其中RD为-Q1-NH-CO-Q2-T、生物可逆基团或非生物可逆基团；
其中
每个Q1独立地为二价，三价，四价或五价基团，其中一个价键与-NH-CO-或-NH2键接，第二个价键是开放的，其余每个价键(如果存在)均独立地键接辅助部分；
每个Q2独立地是一个二价、三价、四价或五价基团，其中一个价键与-NH-CO-键接，第二个价键是与T键接的键，其余的每个价键(如果存在)均独立地键接辅助部分；和
T是靶向部分
条件是原料包含-Q1-NH2，而产物包含-Q1-NH-CO-Q2-T。
支持物上(On-support)缀合：
Figure BDA0002320320380002011
其中
Z为O或S；
RO是与多核苷酸中核苷键接的键；
每个Q2独立地是一个二价、三价、四价或五价基团，其中一个价键与-NH-CO-键接，第二个价键是与T键接的键，其余的每个价键(如果存在)均独立地键接辅助部分；和
T是靶向部分。
其中
n是1至8的整数；
A是O或-CH2-；
Z为O或S；
RO是与多核苷酸中核苷键接的键；
每个Q2独立地为二价、三价、四价或五价基团；其中一个价键与叠氮化物或三唑键接，第二个价键键接至T，并且其余的每个价键(如果存在)独立地键接至辅助部分；和
T是靶向部分。
Figure BDA0002320320380002031
其中
n是1至8的整数；
A是O或-CH2-；
Z为O或S；
RO是与多核苷酸中核苷键接的键；
每个Q2独立地为二价、三价、四价或五价基团；其中一个价键与叠氮化物或三唑键接，第二个价键键接至T，并且每个剩余的价键(如果存在)独立地键接至辅助部分；和
T是靶向部分。
Figure BDA0002320320380002041
其中
n是1至8的整数；
A是O或-CH2-；
Z为O或S；
RO是键接多核苷酸中核苷的键；
每个Q2独立地为二价，三价，四价或五价基团；其中一个价键与叠氮化物或三唑键接，第二个价键键接至T，并且其余的每个价键(如果存在)独立地键接至辅助部分；和
每个T独立地是靶向部分。
磷酸三酯Fmoc脱保护的代表性实例：.
使包括具有Fmoc-保护的胺的磷酸三酯的多核苷酸经受脱保护条件，导致Fmoc脱保护，而未观察到磷酸三酯向磷酸二酯的转化。
TCCATGACGTTCCTGACGTT(p68；参见表2)
DBCO-NHS与p68结合-代表性示例：
质谱分析表明，在室温下，在10分钟内完成了磷酸三酯中的氨基与DBCO-NHS的偶联。
Figure BDA0002320320380002052
使用以下条件进行包含DBCO缀合基团的p68(参见表2)的RP-HPLC纯化：
-缓冲液A＝水中的50mM TEAA；
-缓冲液B＝90％的乙腈；和
-流速＝1mL/min；
-梯度：
ο 0-2分钟(100％缓冲液A/0％缓冲液B)，
ο 2-22分钟(0％至100％缓冲液B)，以及
ο 22-25分钟(100％缓冲液B)。
可使用类似的步骤来制备多核苷酸，使用例如如本文所述2′-修饰的核苷亚磷酰胺。国际专利申请PCT/US2015/034749中提供了这样的步骤。PCT/US2015/034749中的二硫化物磷酸三酯寡核苷酸合成的公开内容通过引用并入本文。
遵循本文所述的一般步骤以制备表2中所列的免疫调节多核苷酸。
表2
Figure BDA0002320320380002071
Figure BDA0002320320380002081
Figure BDA0002320320380002091
Figure BDA0002320320380002101
Figure BDA0002320320380002121
Figure BDA0002320320380002141
Figure BDA0002320320380002151
Figure BDA0002320320380002171
Figure BDA0002320320380002191
Figure BDA0002320320380002211
Figure BDA0002320320380002231
Figure BDA0002320320380002241
Figure BDA0002320320380002251
Figure BDA0002320320380002271
Figure BDA0002320320380002291
Figure BDA0002320320380002301
Figure BDA0002320320380002321
Figure BDA0002320320380002331
Figure BDA0002320320380002341
Figure BDA0002320320380002351
Figure BDA0002320320380002361
在表2中，A栏提供了DB-6细胞中IL-6的表达(EC50，nM)；B栏提供了在DB细胞中的IL-10表达(EC50，nM)；C栏提供了Ramosblue细胞中的NFκB激活(EC50，nM)；D栏提供NFκB激活Hela-hTLR9-NFκB-luc细胞(EC50，nM)；E栏提供NFκB激活Hela-mTLR9-NFκB-luc细胞(EC50，nM)；F栏提供小鼠脾细胞中的IL-6分泌(EC50，nM)；G列提供了在95％小鼠血浆中预孵育24小时后小鼠脾细胞中IL-6的分泌(EC50，nM)；H栏提供小鼠骨髓分化的DC中的IL-6分泌(EC50，nM)；第I栏提供了RNAiMax转染2h后小鼠HEK-Blue细胞中的NFκB激活(EC50，nM)；第J栏提供了RNAiMax转染2h后，人HEK-Blue细胞中的NFκB激活(EC50，nM)。
在此表中提供的序列的关键描述符如下：小写＝核苷3′-硫代磷酸酯；大写＝核苷3′-磷酸酯；小写斜体＝具有3′tBuDS-Ph(邻位)三酯(PS)的核苷；斜体大写＝具有3′tBuDS-Ph(邻位)三酯(PO)的核苷；dt＝dT(DBCO)；粗体小写＝具有3′正丁基三酯(PS)的核苷；加粗的大写＝具有3′正丁基三酯(PO)的核苷；斜体粗体小写＝具有3′均炔丙基三酯(hPro)(PS)的核苷；带下划线的斜体小写＝具有3′DBCO-NH-PEG2三酯(N1)(PS)的核苷；斜体下划线大写＝具有3′DBCO-NH-PEG2三酯(N1)(PO)的核苷；
Figure BDA0002320320380002363
Figure BDA0002320320380002371
Figure BDA0002320320380002372
下划线的体＝2′-氟核苷酸(PO)；撇号表示由撇号左侧的字母标识的核苷酸包含2′-OMe修饰的核糖；带下划线的 ng＝7-deaza-2′-deoxyguanosine(PS)；带下划线的pT＝PEG4dT三酯(PO)；带下划线的pt＝PEG4dT三酯(PS)；fT＝5-三氟甲基胸苷(PO)；fU＝5-氟-2′-脱氧尿苷(PO)；bU＝5-溴-2′-脱氧尿苷(PO)；ft＝5-三氟甲基胸苷(PS)；fu＝5-氟-2′-脱氧尿苷(PS)；bu＝5-溴-2′-脱氧尿苷(PS)；C3＝C3间隔子(-(CH2)3-OH)(PO)；c3＝C3间隔子(-(CH2)3-OH)(PS)；C6＝己烷-1，6-二基；NH2 C6＝6-氨基己-1-基；Te＝带有3′乙基三酯(PO)的胸苷；Ge＝具有3′乙基三酯(PO)的鸟苷；Ce＝具有3′乙基三酯(PO)的胞苷；Ue＝具有3′乙基三酯(PO)的5-碘尿苷；ue＝具有3′乙基三酯(PS)的5-碘尿苷；iu＝基于5碘2′-脱氧尿苷(PS)的5′-5′端帽；iU＝基于5碘2′-脱氧尿苷(PO)的5′-5′端帽；X5＝X5-DBCO(PO)；x5＝x5-DBCO(PS)；X3＝X3无碱基间隔子(PO)；IR700是染料。在这里，描述符(PO)代表3′-磷酸酯；(PS)代表3’-硫代磷酸酯；od＝5′-邻二硫磷酸二酯；o＝5′-磷酸(PO)；ods＝5′-邻二硫硫代磷酸酯；s＝5′-硫代磷酸酯(PS)；上标“r”＝Rp PS；上标“s”＝Sp PS；Af＝2’-氟代腺苷(PO)；Csi＝dC O-甲硅烷基三酯(PO)；Tsi＝dT O-甲硅烷基三酯(PO)；tm＝2′-OMe胸苷(PS)；t(m)＝2′-OMOE胸苷(PS)。结构在图1和2中示出。
双链CpG：
退火和凝胶分析：
用DPBS(24.7mL)将多核苷酸p88(1mL，5mM储备液)添加至p144(3.3mL，2mM储备液)。用p145以类似方式处理多核苷酸p88。将混合物加热至65℃10分钟。用TBE尿素凝胶分析表明p88完全退火(见图2)。取出1μL的每个样品，加到5μL的甲酰胺上样缓冲液中，并在200伏的电压下每孔上样到15％TBE-脲凝胶上40分钟，然后进行溴化乙锭(EtBr)染色。有关p88，p144和p145的结构，请参见表2。
使用p88/p144的双链CpG-代表性实例(1)：
Figure BDA0002320320380002381
使用p88/p145的双链CpG--代表性实例(2)：
实施例2：本发明示例性缀合物的制备
在以下制备中，使用了以下抗体：抗CD38抗体是WO2012/092616中公开的Ab79，该抗体的公开内容通过引用整体并入本文；抗CD79b抗体是WO 2014/011521中公开的huMA79bv28，该抗体的公开内容通过引用整体并入本文。抗CD30抗体是brentuximab；抗CD22抗体是US 20140127197中公开的10F4，该抗体的公开内容通过引用整体并入本文。抗CD20抗体是利妥昔单抗。
其他抗体可以整合入本文所述的缀合物中，例如，抗DEC205抗体可以是US 2010/0098704中公开的抗体(例如，具有以下序列的轻链：
和具有以下序列的重链：
Figure BDA0002320320380002384
抗CD303抗体可以具有轻链序列：
和重链序列：
Figure BDA0002320320380002393
抗CD40抗体可以是lucatumumab或dacetuzumab；抗CD74抗体可以是milatuzumab；抗CD304抗体可以是vesencumab；抗CD38抗体可以是daratumumab，SAR650984(Sanofi-Immunogen)或MOR202(Morphosys-Celgene)。这些抗体可包括Q-标签(例如，重链内的LLQGG(SEQ ID NO：493)或轻链内的GGGGLQGG(SEQ ID NO：494))。
可以将其他抗体整合入本文所述的缀合物中，例如：抗PD-L1抗体可以是mAbs(2016)，8,593和US 8217149中所述的抗体，其轻链具有以下序列：
Figure BDA0002320320380002394
和重链序列：
Figure BDA0002320320380002401
A.用微生物转谷氨酰胺酶(mTG)介导的Q-标记抗体缀合的一般步骤
表3谷氨酰胺转胺酶介导的缀合的示例性设置
Figure BDA0002320320380002402
酶缀合的一般条件：
最终抗体浓度＝50μM
抗体：转谷氧酰胺酶(mTG)比例：10∶1
接头：Ab比率：100∶1
mTG MW＝38kDa，100mU/mg，ε280＝71850M11 cm-1
在Tris缓冲液中2％w/v＝20mg/mL＝5μM
Tris缓冲液：25mM Tris，150mM NaCl，pH 8.5
Tris缓冲液或DMSO的接头溶液
DMSO≤最终体积的5％v/v
一般方案：
向tris缓冲液中的Q-标记的抗体(例如，Q-标记的抗CD22抗体或Q-标记的抗CD38抗体，分别命名为CD22-Q和CD38-Q)的溶液中顺序添加叠氮基氨基接头和mTG。将混合物加热至37℃2h，这时，通过缓冲液去除多余的接头和mTG，通过Amicon 30kD旋转浓缩器(使用DPBS作为洗脱液)与侧向叠氮基接头(Ab-N3)交换抗体。然后将Ab-N3样品还原，并通过RP-HPLC对接头缀合度进行表征，如下所述。随后在Ab-N3中的叠氮基与CpG多核苷酸的磷酸三酯中的炔烃进行Hüisgen环加成反应提供了本发明的示例性缀合物(参见图3A和3B)。
B.通过使用活化的羧酸酯(例如TFP或PFP)与抗体缀合的一般步骤
表4.TFP-酯或PFP-酯封端的叠氮-聚乙二醇与抗原结合部分(如抗体)缀合的示例性方案
一般方案：
向抗体的DPBS缓冲液溶液中，添加叠氮基-PEG24-PFP，并将所得混合物在室温下放置过夜，此时，通过缓冲液去除多余的叠氮基-PEG24-PFP,通过Amicon 30kD旋转浓缩器(使用DPBS作为洗脱液)交换生成的Ab-N3。然后将Ab-N3样品还原，并通过RP-HPLC对接头缀合度进行表征，如下所述。随后，CpG多核苷酸的磷酸三酯中的炔烃在Ab-N3中与叠氮基的Hüisgen环加成反应提供了本发明的示例性缀合物。
抗体/双链免疫调节多核苷酸偶联方案
将完全退火的双链CpG多核苷酸(p88/p144和p88/p145)添加至抗CD38Q-N3抗体(39mL，40mM)。将混合物加热至37℃2小时，并通过在阴离子交换树脂(AEX)上的色谱法纯化。收集两个主要峰，通过Amicon 30kD浓缩器浓缩，并通过200伏特的三甘氨酸变性凝胶分析1小时，然后进行溴乙锭染色(见图4A)。
抗CD20抗体免疫调节多核苷酸缀合物
包含利妥昔单抗的缀合物，其通过TFP-PEG24-N3接头与免疫刺激多核苷酸(p19)缀合，其中TFP部分与利妥昔单抗相连，叠氮化物与免疫刺激多核苷酸相连。缀合物的粗混合物在以下条件下通过AEX-HPLC纯化：
缓冲液A：20mM磷酸钠，15％iPrOH(水溶液)
缓冲液B：20mM磷酸钠，1M溴化钠，15％iPrOH(水溶液)
色谱柱：Thermo Scientific Dionex DNASwift，5 x 150毫米
10分钟内使用10-95％的缓冲液B，然后洗涤并重新平衡
梯度：10分钟内10-95％B，洗5分钟95％B
粗混合物的AEX-HPLC迹线示于图4B(峰1、2和3的峰面积分别为峰1，2和3总面积的28％，40％和32％)。图4C显示了粗混合物的组合HPLC迹线，并在图4B中用数字1、2和3标识了分离的峰。图4D提供了利妥昔单抗-PEG24-N3，粗反应混合物，和分离的峰1、2和3的比较。通过分子量鉴定为利妥昔单抗-p19-DAR1(药物-抗体比例＝1，即，一个抗体与一个p19多核苷酸偶联)(MW＝155400)。
本文所述的缀合步骤已用于制备表6中列出的本发明的示例性缀合物。RP-HPLC定量未缀合重链和缀合重链
在Hüisgen环加成之前分析Ab-N3样品，以评估叠氮基接头的缀合效率。首先，在65℃下用DTT(20mM DTT)和5M盐酸胍(5μM)还原Ab-N330分钟。在以下条件下，通过RP-HPLC分析所得的蛋白质产物：
■色谱柱：PursuitDiphenyl5，4.6x250mm，5μm
■色谱柱温度：60℃
■MPA：水中0.1％TFA，MPB：乙腈中0.1％TFA
■Gradient：17分钟内达到35-50％MPB
■在280nm处检测
未缀合的重链和缀合的重链(HC-N3)的百分比在表5中提供，并且其基于缀合和未缀合的重链的峰面积的总的百分比。
表5.抗体HC缀合程度的定量
Figure BDA0002320320380002421
具有多核苷酸磷酸酯骨架的缀合物比具有硫代磷酸酯骨架的缀合物可以更快地通过阴离子交换柱洗脱
如本文所述制备含有缀合至CpG多核苷酸的Q-标记的抗CD38抗体的缀合物。在该实验中，合成中使用的CpG多核苷酸为p19，p21和p88。在以下条件下对分离的缀合物进行AEX-HPLC分析：
方法A：10-95％B 10分钟，然后洗涤并重新平衡
方法B：10-50％B 10分钟，然后洗涤并重新平衡
色谱柱：Thermo Scientific Dionex DNASwift，分析5 x 150mm
缓冲液A：20mM磷酸钠，15％iPrOH(水溶液)
缓冲液B：20mM磷酸钠，1M溴化钠，15％i-PrOH(水溶液)
在AEX-HPLC迹线中对应于SB-037(抗CD38Q-p19)缀合物的峰的保留时间大于对应于SB-038(抗CD38Q-p21)的峰的保留时间。
表6-A
Figure BDA0002320320380002441
Figure BDA0002320320380002451
Figure BDA0002320320380002461
Figure BDA0002320320380002471
Figure BDA0002320320380002481
Figure BDA0002320320380002491
Figure BDA0002320320380002511
Figure BDA0002320320380002521
Figure BDA0002320320380002531
Figure BDA0002320320380002541
Figure BDA0002320320380002551
Figure BDA0002320320380002561
Figure BDA0002320320380002571
Figure BDA0002320320380002581
Figure BDA0002320320380002601
在表6-A中，列A提供了DB细胞中的IL-6表达(EC50，nM)；B栏提供了在DB细胞中的IL-10表达(EC50，nM)；C栏提供NFκB活化的Ramosblue细胞(EC50，nM)；D栏提供了在小鼠血清中预温育24小时后Ramosblue细胞中的NFκB激活(EC50，nM)；E栏通过qPCR提供在小鼠A20淋巴瘤细胞中的IL-6诱导(EC50，nM)；F栏提供小鼠A20-hCD20淋巴瘤细胞中的IL-6诱导(EC50，nM)。所有DBCO/叠氮基缀合反应均在无金属的1，3-偶极环加成反应条件下进行；DAR1表示多核苷酸/抗体比为1；DAR2表示多核苷酸/抗体之比为2；h/a表示无激活。在表6-A中，*表示次优激活。在表6-A中，CD38代表抗CD38抗体。CD22代表抗CD22抗体；CD79b代表抗CD79b抗体；小鼠CD22代表抗小鼠CD22抗体；BDCA2代表抗BDCA2抗体；BDCA4代表抗BDCA4抗体。在表6-A中，TCO是键接至靶向部分的基于反式环辛烯基的基团。TCO具有图1B所示的结构。
表6-B
Figure BDA0002320320380002611
Figure BDA0002320320380002621
在表6-2中，A栏提供了NFκB激活Ramos blue细胞(EC50，nM)；B栏提供小鼠脾细胞中的IL-6分泌，DAR1(EC50，nm)；C列提供小鼠脾细胞中的IL-6分泌，DAR2(EC50，nm)；D栏提供Daudi-NFκB-Luc细胞中的NFκB活化，DAR1(EC50，nm)；E栏提供Daudi-NFκB-Luc细胞中的NFκB活化，DAR2(EC50，nm)。在表6-2中，CD38代表抗CD38抗体。CD22代表抗CD22抗体；小鼠CD22代表抗小鼠CD22抗体；DAR1表示多核苷酸/抗体比为1；DAR2表示多核苷酸/抗体比为2。
实施例3.本发明的示例性缀合物的体外和体内分析
细胞：人DB，Daudi，Raji，Ramos，SUDHL10和NCI-H929，以及小鼠A20细胞购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，并在含10％FBS的RPMI中培养。Ramos-blue和HEK-Blue-hTLR9细胞购自Invivogen，并根据供应商的建议进行保存。通过qPCR确认所有细胞的TLR9表达。
流式细胞术：使用CyFlow ML流式细胞仪(Partec)和市售抗体(Biolegend，BDBiosciences，San Diego)通过FACS分析测量目的受体的细胞表面表达。
免疫刺激多核苷酸或其缀合物的体外分析：
在一些实验中，使用人或小鼠淋巴瘤细胞评估免疫刺激多核苷酸或其缀合物的活性。在这些实验中，将测试化合物添加到96孔板的细胞中(1-4×105/孔)，并在37℃，5％CO2下孵育24-72小时。在孵育期结束时，将培养基移出并用于评估细胞因子分泌(DB细胞)或碱性磷酸酶分泌，以衡量NFkB激活(Ramos-blue，HEK-Blue-hTLR9细胞)。通过可商购的ELISA试剂盒测量分泌的细胞因子。裂解剩余的细胞，纯化总RNA，并通过qPCR定量细胞因子基因表达(IL-6和IL-10)，并归一化为house-keeping基因(B2M，GAPDH或PPIB)。也可以使用本领域已知的方法，例如qPCR，确定其他细胞因子(例如，IL-8，IL-12a和IL-12b)的基因表达。
在一些实验中，在稳定表达人或小鼠TLR-9和NFkB-荧光素酶报告质粒的HeLa细胞中分析了免疫刺激多核苷酸。通过添加荧光素(Britelite，PerkinElmer)定量细胞内荧光素酶活性，并使用Victor2发光计(Perkin Elmer)捕获发光信号。
在一些实验中，使用新鲜分离的小鼠脾细胞评估免疫刺激多核苷酸的活性。收获来自C57B16小鼠的脾脏，使用冰-冷的PBS通过无菌的70μm过滤器切块。然后用PBS洗涤细胞，并使用市售的RBC裂解缓冲液裂解红细胞。将细胞再次在4℃下用PBS洗涤，重悬于含10％FBS的RPMI中，并接种在96孔板中(2x105个细胞/孔)，并在37℃，5％CO2下孵育2-4小时。然后加入测试化合物，并在37℃，5％CO2下孵育额外的24-72小时。小心地除去上清液，并通过ELISA定量细胞因子水平。裂解细胞，纯化总RNA，并使用标准方法通过qPCR测量基因表达。
在一些实验中，在与小鼠骨髓分化的树突状细胞(DC)孵育后，评估测试化合物的细胞因子分泌。在这些实验中，根据公开的方案从C57B16小鼠的股骨和胫骨中分离了小鼠原代骨髓祖细胞。立即在4℃下用PBS洗涤细胞，并使用市售裂解缓冲液裂解红细胞。将细胞以1.2x106细胞/ml的浓度悬浮在含10％胎牛血清的RPMI中，接种在96孔板中，并用重组小鼠GM-CSF(100ng/ml)和小鼠TNFα(10ng/ml)或加入FLT3L7天使其分化为DC。加入测试化合物并孵育24-72小时。通过ELISA测量培养基上清液中的细胞因子分泌，裂解细胞，并使用标准方法通过qPCR评估基因表达。
在一些实验中，将测试化合物在来自小鼠，大鼠，猴子或健康人的95％血浆中孵育以评估稳定性。在这些实验中，从至少3个个体中采集了血液(EDTA)；离心分离血浆并合并。将测试化合物掺入密封管中的血浆中，并在37℃下孵育1-72小时，然后将化合物在RPMI+10％FBS中稀释至合适的浓度，并评估上述测试系统中的功能活性。
在一些实验中，可以使用本领域已知的方法来评估测试化合物对淋巴细胞增殖的作用，例如在以1x105个细胞/孔孵育1、2、4或7天后，使用Cell Titer Glo试剂盒(Promega)。
在一些实验中，可以使用本领域已知的方法，例如通过使用CyFlow ML流式细胞仪(Partec)通过FACS通过膜联蛋白-V细胞表面表达来评估测试化合物对细胞凋亡的作用。
本发明的缀合物的细胞依赖性细胞毒性(CDC)活性如下评估。Daudi细胞在补充有10％FBS和Pen/Strep的RPMI1640 GlutaMAX中培养。通过离心细胞，除去培养基并重悬于补充有10％人血清(SIGMAcat#S1764，LOT#SLBQ0752V，46CH50)的OPTIMEM中，以0.8×106细胞/mL的浓度、50μL/孔的体积将Daudi细胞接种到96孔板中。在OPTIMEM中以双倍浓度制备化合物稀释板，并每孔加入50μL化合物稀释液，使人血清的终浓度为5％。将板培养物在37℃，5％CO2下孵育2小时。加入Alamar Blue活力试剂(10μL/孔)，并将所得培养物在37℃，5％CO2下孵育3-18h。在板读取器上使用荧光(EX560和EM590)读取结果。
如下评估本发明的缀合物在人外周血单核细胞(hPBMC)中的细胞因子诱导。从圣地亚哥血库(San Diego Blood Bank)获得的LRS中分离出人PBMC。用MACs试剂盒(MiltenyiBiotec)从hPBMCs中分离出浆细胞样树突状细胞，然后立即接种到在完全RPMI中的96孔格式(5x104细胞/孔密度)中。2小时后添加化合物，并在37℃和5％CO2下孵育20小时。孵育后，收集培养基并通过ELISA(BioLegend)测定细胞因子水平。
体外分析实验的结果总结在表2和6-23以及图5-33中。
图5显示，未缀合抗体的CpG多核苷酸需要硫代磷酸酯骨架来诱导细胞因子，如通过IL-6的表达水平所决定的。
图6-8提供了本发明的示例性缀合物和具有硫代磷酸酯骨架的未缀合的CpG多核苷酸的TLR9激动剂活性的比较。
图9-15显示(1)在不存在缀合的靶向部分的情况下，硫代磷酸酯对于免疫刺激多核苷酸的TLR9激动剂活性是重要的，以及(2)靶向部分与结合至多核苷酸的CpG 5′-末端核苷的磷酸酯的缀合降低其TLR9激动剂活性。
图16和17显示，包括两个多核苷酸的本发明的缀合物可以表现出免疫刺激活性，如通过NFκB活化所测量的，其相对于包括一个多核苷酸的本发明的缀合物而言更高。
表7显示5′-末端5-碘尿苷的加入增强了免疫刺激多核苷酸的活性。
表7
Figure BDA0002320320380002671
表8和9显示免疫刺激多核苷酸序列的3′截短和ISS之间的较短间隔可能不是有害的，甚至可以改善免疫刺激多核苷酸的免疫刺激活性。这些表还显示，少至两个ISS就足以进行免疫刺激。
表8
Figure BDA0002320320380002681
表9
Figure BDA0002320320380002682
图18显示了包含具有基于硫代磷酸酯的所有核苷间磷酸酯的免疫刺激多核苷酸的缀合物表现出与游离pl相当的活性，并且包含短免疫刺激多核苷酸的缀合物表现出的活性与包含全长免疫刺激多核苷酸的缀合物相当。图18中所示的数据列在表10中。
表10
图19显示了包含具有基于硫代磷酸酯的所有核苷间磷酸酯的较短的免疫刺激多核苷酸的缀合物的活性优于包含具有基于硫代磷酸酯的所有核苷间磷酸酯的较长的免疫刺激多核苷酸的缀合物的活性。图19显示的数据总结在表11中。
表11
图20和21显示，与在5’-末端ISS中具有基于硫代磷酸酯的核苷间磷酸酯的免疫刺激多核苷酸相比，在5’-末端ISS中具有基于磷酸酯的核苷磷酸酯的免疫刺激多核苷酸表现出更高的免疫刺激活性。图20、21显示的数据总结在表12中。
表12
Figure BDA0002320320380002701
图22显示5′末端人ISS序列优选为UCG。图22显示的数据总结在表13中。
表13
Figure BDA0002320320380002702
图23显示在5’-末端ISS中包含5-碘尿苷对免疫刺激多核苷酸的免疫刺激活性具有更强的增强作用。图23显示的数据总结在表14中。
表14
Figure BDA0002320320380002703
图24和25显示，含有基于磷酸酯的核苷间磷酸三酯的多核苷酸的免疫刺激活性可能高于含有基于硫代磷酸酯的核苷间磷酸三酯的相应的多核苷酸的免疫刺激活性。图24、25显示的数据总结在表15中。
表15
Figure BDA0002320320380002711
表16显示在免疫刺激多核苷酸中磷酸三酯的插入是耐受的。
表16
Figure BDA0002320320380002712
表17和18显示在免疫刺激多核苷酸中无碱基间隔子的插入是耐受的。
表17
Figure BDA0002320320380002721
表18
Figure BDA0002320320380002731
*次优激活
图26A和26B显示基于硫代磷酸酯的核苷间磷酸三酯的较高含量影响免疫刺激多核苷酸的免疫刺激活性。该作用在具有基于硫代磷酸酯的核苷间磷酸三酯被设置在距3′末端更远的地方的免疫刺激多核苷酸中尤为明显。图26A和26B显示的数据总结在表19中。
表19
Figure BDA0002320320380002741
*次优激活
**无活性
表20显示，相对于具有较短接头的缀合物，将靶向部分与免疫刺激多核苷酸连接的更长的接头可以增强缀合物的免疫刺激活性。
表20
Figure BDA0002320320380002742
*(PEGx)表示与抗体连接的互补反应性基团中乙二醇单元的数目。
图27显示通过使用Q-标签与抗体重链的缀合可以提供相对于通过使用PFP化学与抗体轻链的缀合可以提供表现出更优异的免疫刺激活性的缀合物。图27显示的数据总结在表21中。
表21
*DAR代表多核苷酸/抗体比率。
图28显示相对于抗体轻链缀合物，抗体重链缀合物可表现出更优异的免疫刺激活性。图28显示的数据总结在表22中。
表22
*(PEGx)表示连接到由NH2-PEGx-N3形成的抗体的互补反应性基团中的乙二醇单元的数目。
图29显示包含辅助部分(例如，聚(乙二醇))可以增强本发明的缀合物的免疫刺激活性。图29显示的数据总结在表23中。
表23
Figure BDA0002320320380002753
*(PEGx)表示缀合物中使用的互补反应性基团。
表24显示，包含PEG辅助部分不显著影响未与靶向部分缀合的免疫刺激多核苷酸的自我递送。表24中的数据是用免疫刺激多核苷酸孵育细胞20小时后，通过ELISA测量的A20细胞中IL6分泌的数据。
表24
*(PEGx)表示缀合物中使用的互补反应性基团。
图30显示辅助部分可影响缀合物的细胞依赖性细胞毒性。图30显示的数据总结在表25中。
表25
Figure BDA0002320320380002762
*(PEGx)表示缀合物中使用的互补反应基团。
图31和32显示了使用包含截短的免疫刺激多核苷酸的缀合物在小鼠A20细胞中诱导IL6。在这些测定中使用的抗体是鼠抗CD20抗体或鼠抗CD22抗体。Q-标签用于多核苷酸与抗体的缀合。图31和图32显示的数据总结在表26中。
表26
1(PEGx)表示缀合物中使用的互补反应性基团。
*表示次优激活。
图33A显示了使用示例性缀合物和免疫刺激多核苷酸在小鼠A20细胞中诱导IL6。这些测定法中使用的抗体是鼠抗CD22抗体。Q-标签用于多核苷酸与抗体的缀合。图33A显示的数据总结在表27中。
表27
*(PEGx)表示缀合物中使用的互补反应性基团。PEG23是由NH2-PEG23-N3形成的互补反应性基团。
图33B显示了免疫刺激缀合物的活性被过量的(0-10倍)游离抗体的存在所拮抗，所述游离抗体靶向与免疫刺激缀合物中包含的抗体靶向的受体相同的受体。IL6分泌用于评估缀合和未缀合的多核苷酸的免疫刺激效率。这些数据表明(1)靶向部分改善了本发明的多核苷酸的免疫刺激活性，和(2)本发明的缀合物中免疫刺激多核苷酸的细胞内递送可能是细胞表面受体介导的。因此，相对于未缀合的多核苷酸，缀合物的免疫刺激活性的增强很可能是由于免疫刺激多核苷酸的细胞内递送的改善。
图34A显示了A型CpG ODN CpG-2336在人PBMC中诱导干扰素-α。图34B显示了使用缀合物SB-340在人PBMC中诱导干扰素-α。抗BDCA2抗体，SB-341和p246用作本实验的对照。图34C显示了在纯化的浆细胞样细胞中干扰素-α的诱导。抗BCDA4抗体及其缀合物(SB-343)用作对照。
图35和36显示了具有各种5’-修饰的多核苷酸和核苷间三酯在24小时的免疫刺激活性，如通过使用QuantiBlue的NFκB活化所测量的。
实体肿瘤模型的体内分析
A20小鼠B细胞淋巴瘤细胞购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，并在含有10％FBS的RPMI培养基中培养。在实验当天，收获细胞，将其重悬于HBSS中，并皮下接种(每只小鼠5x106个细胞)接种入6-8周龄的雌性Balb/c小鼠(Charles River)。10天后，将小鼠随机分组，每组拥有8-10只小鼠。每隔一天(Q2D)、通过瘤内注射(I.T.，25μL)或静脉(I.V.，100μL)注射给予每组三剂量测试产品(免疫刺激多核苷酸或缀合物)。肿瘤体积用于评估治疗效果。每周使用以下公式计算两次肿瘤体积：V＝(L x W2)/2，其中V是肿瘤体积，L是肿瘤长度，W是肿瘤宽度。
图37A和37B显示了用本发明的免疫刺激多核苷酸治疗肿瘤可以停止甚至逆转肿瘤的生长。在这些实验中，本发明的免疫刺激多核苷酸在瘤内或静脉内以图表的X轴上的箭头所标识的时间施用。这些数据还表明，缀合物相对于缀合物的游离单个组分在其抗肿瘤活性方面是更优的。表28中提供了图37B所示的体内测试的细节。
表28
Figure BDA0002320320380002781
*(PEGx)表示缀合物中使用的互补反应性基团。
图38A显示，与未修饰的免疫刺激多核苷酸或缺乏5’-末端ISS的免疫刺激多核苷酸相比，用本发明的免疫刺激多核苷酸治疗肿瘤可减少肿瘤生长。在这些实验中，本发明的免疫刺激多核苷酸在瘤内施用。
图38B显示了用A20小鼠B细胞淋巴瘤细胞皮下接种被测小鼠并在瘤内施用三剂量的盐水、本发明的免疫刺激多核苷酸或如上所述的未修饰的免疫刺激多核苷酸之后第20天的肿瘤体积。在这些实验中，本发明的免疫刺激多核苷酸在瘤内施用。
图39A显示，本发明的缀合物的静脉内施用可以与本发明的未缀合的免疫刺激多核苷酸的直接瘤内施用一样有效地治疗肿瘤。盐水和未缀合的免疫刺激多核苷酸瘤内施用，并且SB-337静脉内施用。
图39B显示了用A20小鼠B细胞淋巴瘤细胞皮下接种被测小鼠并如上所述给予三剂量盐水、免疫刺激多核苷酸或缀合物后第20天的肿瘤体积。盐水和免疫刺激多核苷酸以三剂量在瘤内施用，并且SB-337静脉内施用一次。
液体肿瘤模型的体内分析
A20小鼠B细胞淋巴瘤细胞购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，并在含有10％FBS的RPMI培养基中培养。在实验当天，收获细胞，将其重悬于HBSS中，并静脉内接种(每只小鼠5x106个细胞)入6-8周龄的雌性Balb/c小鼠(Charles River)。从第二天开始，每隔一天(Q2D)，通过静脉内(I.V.，100μL)注射，向8-10只小鼠/组给予三剂量测试产品(免疫刺激多核苷酸或缀合物)。在第47天，对存活的小鼠进行再次激发(每只小鼠5x106 A20细胞)。加入年龄和大小匹配的新对照组，并接种A20小鼠肿瘤细胞。包括未接种、未处理的同窝小鼠作为对照。监测存活率(％)以评估治疗效果。
图40显示了用盐水、本发明的缀合物或免疫刺激多核苷酸处理的小鼠群体的存活率。图40所示的体内测试的细节在表29中提供。
表29
**μg/剂量.
实施例4.免疫刺激多核苷酸的血清稳定性
方案：将1μL的2mM储备溶液(具有磷酸三酯的CpG多核苷酸)置于19μL的新鲜小鼠血清中。将20μL样品置于PCR板上，并在热循环仪上于37℃加热。在指定的时间点取出2μL样品，加到18μL的甲酰胺上样缓冲液中并冷冻，然后进行凝胶分析。将每孔2μL加到15％TBE-脲凝胶上，电压为200伏，持续30分钟，然后进行溴化乙锭染色(见图41A和41B)。还评估了大鼠血清，猴血清和人血清中含有磷酸三酯的CpG多核苷酸的稳定性(参见图41C，41D和41E)。
SerumStabilityAnalysesofImmunostimulatingPolynucleotidesbyAEXHPLC：
将免疫刺激多核苷酸(在水中40μM)在80％小鼠血清中稀释至终浓度为8μM。在指定的时间点(通常在4h，24h和48h)取等分试样，并用1∶1 10mM EDTA淬灭。在60℃下于DNAPac PA200、4 x 250mm色谱柱上通过阴离子交换HPLC分析样品，流动相A：20mM磷酸钠pH8、15％v/v异丙醇和流动相B：20mM磷酸钠pH 8、1.5M溴化钠、15％v/v异丙醇；10分钟内20-98％的B相流动相为梯度；0.6mL/min流速，在260nm处检测。在HPLC曲线中，每个时间点的主峰均被积分，并计算出相对于未老化样品的峰面积％。使用相同的方法分析大鼠血清，猴血清和人血清中免疫刺激多核苷酸的稳定性。
图42显示，含有键接至5’-末端核苷的核苷硫代磷酸酯的免疫刺激多核苷酸显示出比含有键接至5’-末端核苷的核苷间磷酸酯的免疫刺激多核苷酸更高的血清稳定性。如表30所示，通过NFκB活化测量，相对于在5’末端具有核苷硫代磷酸酯的免疫刺激多核苷酸，在5’末端具有核苷间磷酸酯的免疫刺激多核苷酸可表现出更高的免疫刺激活性。
表30
Figure BDA0002320320380002811
图43显示，含5-碘尿苷的免疫刺激多核苷酸可随着时间通过碘的损失而在血清中经历降解，如通过观察对应于m/z小于完整p246 127Da质量的物质的HPLC峰面积的增加所确定。
图44显示5-溴尿苷可以提供具有血清稳定性和免疫刺激活性的更优组合的免疫刺激多核苷酸。表31中总结了图44所示的数据。
表31
Y-(PO/PS)-X-cgtcgtgtcgtt-C3
Figure BDA0002320320380002821
**表示次优激活。
Iodo-dU是5-碘-2′-脱氧尿苷，dT为胸苷，du是2′-脱氧尿苷，CF3-dT为5-三氟甲基胸苷，Fluoro-dU是5-氟-2′-脱氧尿苷，和C3是一个C3间隔子-(CH2)3-OH。
图45显示了血清(非人灵长类动物(NHP)，人或小鼠)中多核苷酸的稳定性，通过在预定时间间隔测量剩余的完整多核苷酸的百分比。表32总结了图43的数据。
表32
该表中列出的值是在孵育开始后以预定时间间隔测得的完整多核苷酸的百分比。
人类免疫刺激缀合物的代表性实例
表33
Figure BDA0002320320380002831
小鼠免疫刺激缀合物的代表性实例
表34
Figure BDA0002320320380002841
*TCO是键接至靶向部分的基于反式环辛烯基的基团。TCO具有图1B所示的结构。
实施例5
该实施例显示了本文提供的与抗体缀合的CpG多核苷酸(CpG-Abs)在治疗各种液体和实体瘤中是有效的。具体而言，靶向B细胞的CpG-Abs可以影响患有癌症的对象的先天性和适应性免疫应答。这种靶向B细胞的CpG-Abs可用于治疗非B细胞肿瘤(例如结肠癌)，包括不表达CpG-Ab靶标(例如CD22)且不表达CpG-Ab免疫调节多核苷酸靶标的肿瘤(例如TLR9激动剂)。另外，靶向非B细胞抗原呈递细胞(APCs)(例如浆细胞样树突细胞或巨噬细胞)的CpG-Abs可用于治疗液体肿瘤(例如淋巴瘤)。在将CpG-Abs全身施用于对象后，观察到了广泛的抗肿瘤功效。已发现CpG-Abs的抗肿瘤作用(包括针对B细胞的CpG-Abs的抗肿瘤作用)涉及细胞介导的免疫，并且依赖于宿主的T细胞功能，例如CD8+T细胞功能。包括例如B细胞靶向CpG-Abs在内的CpG-Abs增加了实体瘤的CD4+和CD8+T细胞浸润。此外，已发现CpG-Abs提供了有适应性且持久的抗肿瘤免疫。已观察到与检查点抑制剂(例如抗PD1抗体和抗PD-L1抗体)的协同作用。CpG-Ab被设计为具有干净的补体特征轮廓，例如不激活补体C3。
实施例6.靶向B细胞的CpG-Ab缀合物在治疗弥散性(液体)B细胞淋巴瘤中有效。
通过在具有免疫能力的BALB/c小鼠(8-10只小鼠/组)中静脉内注射A20淋巴瘤细胞(TLR9+/CD22+)，建立了弥散的(液体)B细胞淋巴瘤疾病模型。在细胞注射后第1、3和5天静脉内施用测试化合物，并监测动物存活40天。
如上文实施例1和2中所述，将免疫刺激多核苷酸合成并缀合至小鼠抗CD22单克隆抗体(mAb)。在以下实施例中，将该缀合物(表6-A中所示的SB-337)称为CpG-mAb(CD22)。相似地，制备了用GpC二核苷酸替代CpG二核苷酸的合成多核苷酸，并将其与抗CD22mAb缀合以在以下实验中用作对照缀合物(SB-339)。
如上所述，在第0天向小鼠注射A20淋巴瘤细胞。然后，分别在第1、3和5天，给小鼠静脉注射(i)3mg/kg CpG-mAb(CD22)；(ii)10mg/kg CpG-mAb(CD22)；(iii)未缀合的CpG(p347如表2所示)；(iv)10mg/kg CD22mAb(CD22)；或(v)10mg/kg GpC-mAb(对照缀合物)。另外，阴性对照组在第l、3和5天仅接受盐水。监测各组的存活率40天。
如图46B所示，与阴性对照组相比，用CpG-mAb治疗的小鼠具有明显更长的生存期。该治疗表现出剂量依赖性作用。特别是，接受10mg/kgCpG-mAb(CD22)的组在40天观察期内维持100％的存活率，略好于接受3mg/kgCpG-mAb(CD22)存活率达90％的组的结果。
此外，与仅接受盐水的阴性对照组相比，仅接受裸露的的CpG ODN或抗CD22 mAb的治疗也延长了组的存活时间，尽管两组均在40天的观察期内死亡。与阴性对照相比，用GpC-mAb对照治疗还可以延长组的存活时间，这可能归因于对照缀合物的抗CD22 mAb成分。
这些数据表明，如本文所提供的，CpG ODN以及包含CpG ODN和靶向B细胞表面抗原的抗体的CpG-Ab缀合物在治疗弥散的B细胞淋巴瘤方面是有效的。
接下来，在第47天对来自第一次肿瘤激发的幸存者进行第二次肿瘤激发。特别地，将第二剂量的A20淋巴瘤细胞(5x106细胞)静脉内注射到在第1、3和5天用10mg/kg或3mg/kgCpG-mAb(CD22)治疗的幸存者中。在第47天，向未经治疗的对照组给予相同剂量的A20淋巴瘤细胞。继续监测该组小鼠的存活率43天(即，第一次肿瘤激发后总共90天)。
如图46C所示，与第一个肿瘤激发的结果一致，未经治疗的对照组在第47天接受A20细胞后40天内死亡(即在第85天左右死亡)。10mg/kg和3mg/kg的治疗组均显示出明显优于对照组的生存率。特别地，如图46C所示，即使在第5天的最后给药CpG-mAb(CD22)后未接受任何治疗，在90天观察期结束时小鼠，10mg/kg治疗组仍可维持100％的存活率，而3mg/kg治疗组仍可维持60％的存活率。
接下来，在来自第一和第二肿瘤激发的幸存者经受第三肿瘤激发之后，进一步监测延长的抗肿瘤作用。特别是在第90天，通过将5x106个A20淋巴瘤细胞(TLR9+/CD22+)皮下植入小鼠肩部，在幸存小鼠中建立了实体B细胞淋巴瘤疾病模型。一个未经治疗的对照组在第90天植入了相同剂量的A20淋巴瘤细胞。监测肿瘤植入物的大小30天(即在第90天和第120天之间)。
特别地，如图46D所示，对照组的肿瘤体积迅速增加，在20天内达到3000mm3以上的大小。相反，即使在第5天最后一次服用CpG-mAb(CD22)后幸存者未接受任何其他治疗，幸存者组在整个30天的观察期内仍无肿瘤。这些实验表明可溶性肿瘤幸存者也在实体瘤激发中存活下来。幸存者获得了抗肿瘤免疫力，此免疫力强烈抑制了随后新的肿瘤植入。
总的来说，这些数据表明本文提供的CpG-Ab缀合物能够在对象中诱导针对肿瘤的持续适应性免疫。
实施例7.靶向B细胞的CpG-Ab缀合物在治疗实体B细胞淋巴瘤中有效。
通过将5×106个A20淋巴瘤细胞(TLR9+/CD22+)植入到具有免疫能力的BALB/c小鼠中，建立了实体B细胞淋巴瘤疾病模型。将所述细胞皮下注射到小鼠肩上，并监测肿瘤的生长。如上所述制备CpG-mAb(CD22)缀合物和GpC-mAb对照缀合物。
如上所述，在第0天向小鼠植入A20淋巴瘤细胞。然后分别在第9、12和14天，给小鼠静脉注射(i)3mg/kgCpG-mAb(CD22)；(ii)10mg/kgCpG-mAb(CD22)；(iii)裸露的CpG ODN；(iv)10mg/kgCD22 mAb(实心正方形)；或(v)10mg/kgGpC-mAb(对照缀合物)。另外，阴性对照组在第9、12和14天仅接受盐水。监测小鼠组的肿瘤体积23天。结果示于47B至47E中。
如图47B所示，与阴性对照组相比，用CpG-mAb(CD22)治疗的小鼠的肿瘤体积明显更小。在25天结束时，所有用CpG-mAb(CD22)治疗的小鼠的肿瘤体积均保持在2000mm3以下。该治疗表现出剂量依赖性作用。特别地，与接受3mg/kgCpG-mAb(CD22)的组相比，接受10mg/kgCpG-mAb(CD22)的组在25天结束时的肿瘤体积更小。此外，仅用裸露的CpG ODN进行治疗还导致肿瘤体积明显小于阴性对照组，并且肿瘤体积保持在2000mm3以下至少20天。综上所述，这些数据表明，CpG ODN和含有CpG ODN和靶向B细胞表面抗原的抗体的CpG-Ab缀合物在治疗实体B细胞淋巴瘤方面有效。还研究了CpG-mAb(CD22)缀合物对小鼠体重的影响，结果示于图47F中。
实施例8.靶向B细胞的CpG-Ab缀合物在治疗非B细胞癌中有效。
通过将0.2x106CT26细胞(CD22-/PD-L1(low)/TLR9-)皮下植入免疫能力适中的BALB/c小鼠的腹侧来创建结肠癌疾病模型。如上所述制备CpG-mAb(CD22)缀合物。
如上所述，在第0天向小鼠植入CT26细胞。然后，给小鼠静脉内注射(i)裸露的CpG-mAb(CD22)；(ii)裸露的抗PD-1抗体；(iii)CpG-mAb(CD22)与抗PD-1抗体组合；或(iv)盐水。特别是，最初在第5天注射3mg/kg CpG-mAb(CD22)，并在第8天和第11天重复给药。在第6天初次注射10mg/kg抗-PD-1，然后给药在第9天和第12天重复给药。监测小鼠组的肿瘤体积，持续18天。
如图48B所示，与对照组相比，在观察期末，单独用CpG-mAb(CD22)或抗PD-1或两种药物组合治疗均显著降低了肿瘤体积。组合治疗的抗肿瘤作用比单独使用抗PD-1的治疗更为突出。
综上所述，这些数据共同表明，靶向B细胞的CpG-mAb(CD22)缀合物的全身给药对于治疗实体瘤是有效的，即使实体肿瘤细胞本身不表达TLR9或CpG-mAb(CD22)缀合物的抗原靶点。施用靶向B细胞的CpG-mAb(CD22)缀合物后，抗肿瘤作用可归因于B细胞活化。此外，与单独用抗PD-1抗体治疗相比，使用抗PD-1抗体和靶向B细胞的CpG-mAb(CD22)缀合物的组合疗法在治疗实体瘤中更有效。
实施例9.CpG-Ab缀合物在有能力的免疫系统中的抗肿瘤作用。
接下来，进行实验以评估CpG-Ab缀合物在具有免疫能力的和免疫受损的系统中的抗肿瘤作用。通过将5x106A20淋巴瘤细胞(TLR9+/CD22+)分别植入具有免疫能力的BALB/c小鼠和免疫受损的Nu/Nu小鼠和SCID小鼠中，创建实体B细胞淋巴瘤模型。如上所述制备CpG-mAb(CD22)缀合物。
在具有免疫能力的组中，在第10、12和14天静脉内施用10mg/kgCpG-mAb(CD22)。阴性对照组在上述天仅接受静脉内注射盐水。监测肿瘤体积20天。如图49A所示，静脉内施用CpG-mAb(CD22)在具有免疫能力的Balb/C小鼠中导致无肿瘤表型，而对照组的肿瘤体积在观察期内持续增加。
在免疫受损的组中，在第8天和第11天静脉内施用10mg/kgCpG-mAb(CD22)或裸露的CpG。在上述天数阴性对照组仅静脉内注射盐水。监测肿瘤体积15天。如图49B和49C所示，与阴性对照组相比，裸露的CpG ODN或CpG-mAb(CD22)缀合物的静脉内施用对免疫受损的Nu/Nu小鼠或SCID小鼠的肿瘤生长没有影响。
总的来说，这些数据表明CpG-Ab缀合物的抗肿瘤作用取决于T细胞免疫。
实施例10.CpG-Ab缀合物的抗肿瘤作用是CD8+T细胞依赖性的。
接下来，进行实验以检查CpG-Ab缀合物的抗肿瘤作用所需的淋巴细胞活性。特别地，通过腹膜内分别注射抗CD4抗体(500ug/小鼠，在-2，-1、0、5、8、12天)、抗CD8抗体(100ug/小鼠在-2，-1、0、5、8、12天)或抗asialoGM1抗体(25ug/小鼠，在-2，-1、0、5、8、12天)评估了CpG-Ab缀合物在CD4+T细胞耗竭小鼠，CD8+T细胞耗竭小鼠和NK细胞耗竭小鼠中的抗肿瘤作用。通过FACS分析确认细胞耗竭。所有耗竭抗体均购自Bioexcell。
如上所述创建了弥散的B细胞淋巴瘤模型小鼠。如上所述制备CpG-mAb(CD22)缀合物。
在这些淋巴细胞耗竭实验中，如上所述，在第0天给小鼠注射A20淋巴瘤细胞(5x106)。然后，分别在第1、3和5天给小鼠静脉注射(i)3mg/kgCpG-mAb(CD22)和500ug/小鼠抗CD4耗竭抗体在第-2，-1、0、5、8、12天用于耗尽CD4+T细胞；(ii)3mg/kgCpG-mAb(CD22)和25ug/小鼠抗asialo GM1抗体在第-2，-1、0、5、8、12天耗尽NK细胞；(iii)3mg/kgCpG-mAb(CD22)和100ug/小鼠抗CD8消耗抗体在第-2，-1、0、5、8、12天，以消耗CD8+T细胞。另外，阳性对照组在第1、3和5天接受3mg/kgCpG-mAb(CD22)，阴性对照组在第1、3和5天仅接受盐水。检测各组存活率85天。
如图50A所示，与未用CpG-mAb(CD22)治疗的组相比，接受CpG-mAb(CD22)治疗的小鼠显示出明显更好的存活。CD4+T细胞耗竭并没有显著影响生存率。尤其是，接受CpG-mAb(CD22)治疗的两组小鼠(有和没有T细胞耗竭处理)在受到肿瘤细胞激发后均维持50％的存活率至少85天。没有接受CpG-mAb(CD22)治疗的两组小鼠(有和没有T细胞耗竭处理)均在40天内死亡。
NK细胞或CD8+细胞的耗竭均导致在用CpG-mAb(CD22)治疗的小鼠中较差的存活。如图50B所示，接受CpG-mAb(CD22)和NK细胞耗竭处理的组在第40天表现出约90％的存活率，在第85天表现出约10％的存活率。更加突出的是，如图50C所示，即使在进行CpG-mAb(CD22)治疗后，也有超过90％的CD8+T细胞耗竭小鼠在30天内死亡。此结果与对照组(所有小鼠在第30天左右死亡)中观察到的结果相似。这些数据表明抗肿瘤作用CpG-Ab至少是CD8+T细胞依赖性的。
实施例11.CpG-Ab缀合物增加T细胞肿瘤浸润。
如上所述创建了实体B细胞淋巴瘤模型小鼠。如上所述制备CpG-mAb(CD22)缀合物。
在第0天经皮下注射A20淋巴瘤细胞激发后的10、12和14天，小鼠接受了10mg/kgCpG-mAb(CD22)缀合物的静脉内施用。随后，将第17天收获的肿瘤通过在HBSS中含有1mg/mL胶原酶IV，100U/mLDNAse I的消化缓冲液中于37℃孵育30分钟消化。然后，将消化的细胞通过70um筛过滤，洗涤，在冰上与抗CD4-PE或抗CD8-PE抗体一起孵育，并通过FACS分析。
如图51A所示，与对照组相比，CpG-mAb(CD22)治疗组的肿瘤生长较慢。CpG-mAb(CD22)治疗的小鼠在第17天的肿瘤体积显著小于对照小鼠。如图51B所示，治疗组中肿瘤组织中CD4+细胞和CD8+细胞的百分比均显著高于对照组。在图51C中，肿瘤体积与肿瘤中CD8+细胞的百分比成反比。
总而言之，这些数据表明将CpG-Ab缀合物全身施用于患有实体瘤的小鼠中可以显著增加T细胞向肿瘤的浸润。肿瘤和/或肿瘤微环境中免疫细胞，特别是CD8+T细胞数量的增加，促进了对肿瘤的免疫激发和肿瘤生长的抑制剂。
实施例12.CpG-Ab缀合物和免疫检查点蛋白的抗体的协同作用。
进行了实验以评估使用CpG-Ab缀合物和免疫检查点蛋白抗体的组合疗法的抗肿瘤作用。
如上所述建立了实体B细胞淋巴瘤小鼠模型。如上所述制备CpG-mAb(CD22)缀合物。抗PD1抗体(克隆J43)购自Bioxcell，抗PDL1抗体(atezolizumab)是在公司内部生产的。
如上所述，在第0天向小鼠植入A20淋巴瘤细胞。然后，给小鼠静脉内注射(i)CpG-mAb(CD22)；(ii)腹膜内注射抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体；(iii)CpG-mAb(CD22)与抗PD-1抗体组合或CpG-mAb(CD22)与抗PD-L1抗体组合；或(iv)盐水。特别是，对于接受CpG-mAb(CD22)(单独或与免疫检查点蛋白抗体组合)的组，在第10天最初施用3mg/kg CpG-mAb(CD22)的第一剂，然后在第12天和第14天重复相同的剂量。此外，对于接受免疫检查点蛋白抗体的组(单独或与CpG-mAb(CD22)组合使用)，最初在第10天以10mg/kg的剂量下首次施用，然后在第13天和第16天重复相同的剂量。监测小鼠组的肿瘤体积。
从该实验中观察到，与分别使用两种试剂中的任一种相比，CpG-mAb(CD22)和免疫检查点蛋白抗体协同产生更强的肿瘤抑制作用。特别地，如图52A和52B所示，与单独用CpG-mAb(CD22)或单独的免疫检查点抗体治疗相比，用组合疗法治疗的小鼠的肿瘤大小明显更小。
为了检查观察到的协同作用是否还取决于CD8+T细胞活性，另一组小鼠给予(i)第10、12和14天的每一天10mg/kgCpG-mAb(CD22)；ii)第10、13和16天各10mg/kg抗PD-1抗体，和(iii)抗CD8抗体(200ug/小鼠，腹膜内，从第0天开始并在整个实验中每周两次给药，以耗尽CD8+T胞。如图52C所示，与盐水处理的对照组一样，该实验组的肿瘤体积迅速增加，表明使用CpG-mAb(CD22)和免疫检查点蛋白抗体的组合疗法在抑制肿瘤生长方面具有的协同作用也是CD8+T细胞依赖性的。
此外，使用CpG-mAb(CD22)和抗PD-1抗体进行组合治疗的小鼠在第一次肿瘤激发中存活下来，然后进行了第二次肿瘤激发。特别地，在第30天，从组合治疗组的幸存者在肩上皮下给予第二剂量的A20细胞。在第二次肿瘤激发后，幸存者组未接受任何额外的治疗。给予未经治疗的对照组相同剂量的肿瘤细胞。进一步监测肿瘤体积25天(即在第30天和第55天之间)。
如图53A至53C所示，与对照组或单独用抗PD-1抗体治疗的组相反，CpG-Ab/抗PD-1组合在整个观察期内显著抑制了所有个体的肿瘤生长。此外，组合治疗在D18左右开始消退了两个个体的分期肿瘤。如上所述，联合治疗组的幸存者经受了第二次肿瘤激发。如图53D所示，在第二次肿瘤激发后，未经治疗的对照组的肿瘤体积迅速增加，在20天内达到2000mm3以上的平均体积。相比之下，幸存者组在整个25天的观察期内均无肿瘤。这些结果表明，使用CpG-Ab缀合物和免疫检查点蛋白抗体的组合疗法可以诱导针对对象的肿瘤的持续适应性免疫。
实施例13.CpG-Ab缀合物和T细胞激动剂的协同作用。
接下来，进行了实验以评估使用CpG-Ab缀合物和T细胞激动剂的组合疗法的抗肿瘤作用。
如上所述创建了实体B细胞淋巴瘤模型小鼠。如上所述制备CpG-mAb(CD22)缀合物。
如上所述，在第0天向小鼠植入A20淋巴瘤细胞。然后，给小鼠静脉内注射(i)CpG-mAb(CD22)；(ii)腹膜内注射抗OX-40抗体(克隆OX-86，10mg/kg，Bioxcell)、抗ICOS抗体(克隆7E.17G9，10mg/kg，Bioxcell)或抗4-1BB抗体(克隆3H3，1mg/kg，Bioxcell)；(iii)CpG-mAb(CD22)与抗OX-40抗体组合、CpG-mAb(CD22)与抗ICOS抗体组合或CpG-mAb(CD22)与抗4-1BB抗体组合；或(iv)盐水。特别是，对于接受CpG-mAb(CD22)(单独或与T细胞刺激性抗体组合)的组，在第10天开始给予3mg/kgCpG-mAb(CD22)的第一剂，然后在第12天和第14天重复相同的剂量。此外，对于接受T细胞刺激性抗体(单独或与CpG-mAb(CD22)组合使用)的组，在第10天给予第一剂T细胞刺激性抗体，然后在第13和17天重复相同的剂量。监测该组小鼠的肿瘤体积。
从该实验中观察到CpG-mAb(CD22)和T细胞刺激性抗体协同产生了肿瘤抑制作用，这在单独使用T细胞刺激性抗体的治疗中没有观察到。特别地，如图54A到54C所示，与阴性对照组或T细胞刺激性抗体(抗OX-40，抗ICOS或抗4-1BB)单独治疗组相比，接受组合疗法治疗的小鼠的肿瘤尺寸明显更小。
实施例14.靶向B细胞的CpG-Ab在脾细胞中引起肿瘤抗原特异性细胞毒性T细胞应答。
如上所述创建结肠癌疾病模型。如上所述制备CpG-mAb(CD22)缀合物。
如上所述，在第0天向小鼠植入CT26细胞。然后，在第10、13和16天给小鼠静脉注射10mg/kgCpG-mAb(CD22)或盐水。监测小鼠各组的肿瘤体积，持续17天。如图55A所示，与对照组相比，用CpG-mAb(CD22)治疗显著抑制了肿瘤生长。
在第17天(最后一次给药后24小时)，处死小鼠，分离脾细胞并将其铺在涂有抗IFN-γ抗体的ELISPOT板上(4x105细胞/孔)。在37℃下用100μg/ml的CT26细胞表面抗原(AH1肽)激发细胞24小时，并计数分泌IFN-γ的T细胞。如图55B所示，与对照相比，在用CpG-mAb(CD22)治疗的组中，IFN-γ分泌细胞的数量显著增加。这些数据表明，靶向B细胞的CpG-Ab缀合物在向对象施用后能够引发肿瘤抗原特异性细胞毒性T细胞应答。
实施例15.靶向树突状细胞的CpG-Ab缀合物引发抗肿瘤适应性免疫。
通过如上所述的方法建立了实体B细胞淋巴瘤疾病模型。如实施例1和2中所述，合成具有SEQ ID NO：313(p313)序列的免疫刺激多核苷酸，并将其与抗CD205抗体或抗PD-L1抗体缀合。这些缀合物称为CpG-Ab(CD205)和CpG-Ab(PD-L1)。
如上所述，在第0天向小鼠植入A20细胞。然后，给小鼠静脉注射(i)10mg/kgCpG-Ab(CD205)；(ii)10mg/kgCpG-Ab(PD-L1)；或(iii)盐水，在第10、12和14天。监测小鼠组的肿瘤体积约41天。
如图56A所示，与对照组相比，用CpG-Ab(CD205)治疗显著抑制了肿瘤生长。如图56B进一步所示，CpG-Ab(CD205)缀合物使该组中所有8个个体的肿瘤生长消退，并且导致总共8个个体中的7个无肿瘤表型。
如图56C所示，用CpG-Ab(PD-L1)治疗使肿瘤生长消退并导致总共8个个体中的3个无肿瘤表型。
此外，用CpG-Ab缀合物治疗的组的幸存者经受第二次肿瘤激发。特别是，在第37天，皮下给予幸存者5x106的A20细胞，无进一步治疗。给具有实体B细胞淋巴瘤的未经治疗的小鼠给予相同剂量的A20细胞。在第二次激发后17天观察小鼠组的肿瘤体积。如图56D所示，对照组的肿瘤体积迅速增加，而CpG-Ab(PD-L1)治疗组或CpG-Ab(CD205)治疗组的幸存者在整个17天的观察期内均无肿瘤。
在单独的实验中，在第10、12和14天的每一天，对四组患有实体B细胞淋巴瘤的小鼠(每组8个)用静脉内剂量的(i)10mg/kgCpG-Ab(CD205)缀合物；(ii)10mg/kg小鼠抗CD205单克隆抗体；(iii)10mg/kg大鼠IgG或(iv)盐水治疗。监测各组小鼠的肿瘤体积，持续27天。
如图57A和57C所示，用CpG-Ab(CD205)缀合物治疗使肿瘤生长消退，并最终在治疗组的所有8个个体中导致无肿瘤表型。而且，在用抗DEC205抗体和大鼠IgG对照抗体治疗的小鼠中肿瘤消退。这可能是由于以下事实：尽管没有小鼠是无肿瘤的，但两种抗体(如IgG2)都具有活跃的Fc效应子功能，其导致中等的抗肿瘤活性。因此，尽管抗DEC205抗体显示出抗肿瘤活性，但由于所有小鼠均无肿瘤，因此CpG-CD205缀合物明显更有效。
总的来说，这些数据表明靶向树突细胞的CpG-Ab缀合物在向于对象施用后可以引发针对肿瘤的持续适应性免疫。
实施例16.CpG-CD19缀合物显示出良好的功效
如上所述，通过在小鼠中植入4×106个A20淋巴瘤细胞来建立实体B细胞淋巴瘤疾病模型。简而言之，将细胞皮下注射并使用卡尺测量肿瘤生长。如上所述制备CpG-mAb缀合物和裸露的CpG。
在第0天向小鼠植入A20淋巴瘤细胞。将小鼠分期10天，然后在第10、12和14天进行治疗，并测量肿瘤生长直至第20天(图60A)。治疗包括静脉注射(i)3mg/kg CpG-Ab(SB-337；与CD22缀合的p313)(正方形)；(iii)3mg/kg抗CD19(向下的闭合三角形)；(iv)3mg/kgCpG-Ab(SB-388；p313与CD19缀合)(空心菱形)；(v)1.9μg/小鼠游离CpG(p347)(上三角)；(vi)19μg/小鼠游离CpG(p347)(向下的空心三角形)；或(vii)190μg/小鼠游离CpG(p347)(空心菱形)。另外，阴性对照组仅接受盐水(实心圆)。从第10天开始，使用卡尺测量小鼠组的肿瘤体积，并持续到第20天(图60A)。在第20天，处死小鼠并测量肿瘤体积(图60B)。结果表明，含有与CD19缀合的p313的CpG-Ab缀合物(SB-388)表现出良好的功效，并且该功效类似于含有与CD22缀合的相同CpG(p313)的CpG-Ab缀合物(SB-337)。
此外，评估了小鼠的体重变化，扣除了肿瘤重量的变化(图60C)。初步的安全性结果表明，基于体重变化，CD19 CpG-Ab(SB-388)的毒性小于其等效剂量的CpG。
在当前和以下示例中，CpG-4715对应于表2中所示的p347；CpG-4523对应于表2中所示的p313。SB-1490对应于表6-A中所示的SB-337；SB-3055对应于图6-B所示的SB-388。
实施例17.在实体瘤中瘤内给药CpG4715是有效的为了评估实体瘤中CpG的瘤内剂量，将白化C57Bl/6小鼠(n＝8/组)于侧腹皮下接种1x106B16F10黑色素瘤细胞。使肿瘤生长7天，然后在第7、9、11和13天将p347瘤内注射(30μg于50μL盐水中)。作为阴性对照，在盐水治疗组中向瘤内注射50μL生理盐水。监测肿瘤体积直至第27天。结果表明p347在实体瘤类型中是有效的，如用p347治疗的小鼠相对于盐水的较小肿瘤体积所指示的那样(图61A)。
此外，通过在第14天将1x106B16F10黑色素瘤细胞静脉内注射到尾静脉中，再次激发小鼠中来监测CpG的全身作用，直到第27天监测肿瘤体积。处死小鼠并切除其肺以评估肿瘤转移。结果表明，通过将未处理的黑色素瘤细胞注入尾静脉再次激发小鼠时，与盐水处理组相比，p347处理组的肺转移较少(图61B)。总的来说，这些结果表明CpG提供了全身作用，并且来自免疫激活的长期作用能够减少向肺转移的总数。
为了更仔细地确定与全身作用有关的作用机理，如上所述，采用了CT-26大肠小鼠模型。简而言之，使肿瘤生长7天，然后在第7、10、12和14天瘤内注射p347(10μg，在50μL盐水中)。作为阴性对照，在盐水治疗组中瘤内注射50μL的盐水。监测肿瘤体积直到第21天(图61C)。与B16F10黑色素瘤模型一致，CpG4715的瘤内给药在CT26实体瘤中有效。重要的是，由于CT26细胞是TLR9-，因此结果表明宿主TLR9足以满足CpG治疗的功能。
实施例18.CpG-Ab缀合物的抗肿瘤作用是B细胞依赖性的
进行实验以评估B细胞对CpG活性的作用。对于该作用，如上所述，在遗传B细胞缺陷的Jh敲除小鼠中(Igh-Jtm1DhuN？+N2；TaconicBiosciences，Inc)使用CT26结肠直肠模型(图62A)。这些小鼠的Ig重链基因座的内源性鼠J片段缺失，导致B谱系的细胞在发育进程和细胞数量上都发生了巨大变化。所述小鼠的脾脏，骨髓，淋巴结，外周血或腹膜中没有成熟的(含免疫球蛋白)B淋巴细胞，并且血清中没有可检测到的IgM或IgG。
如上所述，建立了CT26异种移植。肿瘤生长7天，然后在第10、12和14天用10mg/kgCpG-mAb(CD22-CpG；SB-337)或盐水静脉内治疗小鼠(图62A)。监测肿瘤体积17天，在盐水和CpG-mAb组之间没有观察到显著差异。这表明CpG活性需要B细胞。
通过在小鼠背景中使用CT-26结肠直肠模型进一步证实了该结果，该小鼠背景具有通过向小鼠具有免疫能力的小鼠施用抗CD20 mAb而耗竭了B细胞(图62B)。测量肿瘤体积27天。与没有B细胞耗竭的治疗相比，CpG-mAb治疗组的抗肿瘤作用显著降低。该结果进一步支持了CpG活性是B细胞依赖性的。
实施例19.B细胞活化增强了协同小鼠模型中的CpG抗肿瘤活性
使用MC38结肠直肠癌细胞建立了结肠直肠癌的协同模型，以评估B细胞活化对CpG抗肿瘤活性的影响。MC38大肠癌细胞是抗原/TLR9阴性的。简而言之，将白化病雌性C57Bl/6小鼠(n＝8/组)在侧腹皮下接种0.3x106MC38细胞。异种移植物生长10天，然后与如下一起注射测试化合物(i)盐水(圆形)；(ii)10mg/kg抗CD22(向上的三角形)；(iii)10mg/kg抗PD-L1(向下三角形)；(iv)10mg/kgCD22-CpG(SB-337)(正方形)；或(v)10mg/kgCD22-CpG(SB-337)+10mg/kg抗PD-L1(菱形)。在第10、12和14天静脉注射抗CD22和CD22-CpG；在第10、13和17天腹膜内施用抗PD-L1(图63A)。监测肿瘤体积直至第17天(图63A)。
结果表明，相对于盐水治疗，用10mg/kgCD22-CpG(SB-337)(正方形)治疗显著减小了肿瘤体积(图63A)。同样，与盐水治疗的小鼠相比，用10mg/kg的CD22-CpG(SB-337)+10mg/kg的抗PD-L1(菱形)治疗可显著减少肿瘤体积。还指示了每种处理的单个小鼠的结果(图63B-图63F)。
另外，使用B16F10黑色素瘤模型进行了B细胞活化的评估。简而言之，将1x106B16F10黑色素瘤细胞皮下接种在小鼠的腹侧，并使肿瘤生长10天。然后在第10、12和14天给小鼠给药(i)盐水溶液(圆形)；(ii)10mg/kg抗CD22(正方形)；(iii)10mg/kgCD22-CpG(SB-337)(三角形)；或(iv)10mg/kgCD22-CpG(SB-337)+10mg/kg抗PD-L1(菱形)(图64A)。抗CD22和CD22-CpG静脉注射；抗PD-L1(Atezolizumab)腹膜内给药。结果表明，CD22-CpG治疗减少肿瘤体积(p＝0.08)。同样，用CD22-CpG+抗PD-L1治疗显著减少肿瘤体积(p＝0.03)。
与结直肠和黑色素瘤模型一致，用LLC1 Lewis肺癌细胞接种的小鼠显示出相似的结果。用LLC1 Lewis肺癌细胞接种小鼠，并追踪小鼠的平均肿瘤体积生长进程。从第7天开始，用(i)盐水溶液(圆形)(ii)10mg/kgCD22-CpG(SB-337)(圆形)；(iii)10mg/kg抗PD1(正方形)；(iv)10mg/kgCD22-CpG(SB-337)+10mg/kg抗PD1(向上的三角形)(v)10mg/kg抗PD-L1(向下的三角形)；(vi)10mg/kgCD22-CpG+10mg/kg抗PD-L1(菱形)治疗小鼠(图64B)。在第7、10和13天静脉给予抗CD22和CD22-CpG；在第7、10和14天腹膜内给予anti-PD-L1和anti-PD1。结果显示，用10mg/kgCD22-CpG单独或与10mg/kg抗PD1组合(向上的三角形)或与10mg/kg的抗PD-L1组合处理(菱形)的小鼠现实了肿瘤体积的显著降低(p＝0.023)。综上所述，这些结果表明CD22-CpG治疗可以减少LLC1肿瘤的体积。
实施例20.将CpG靶向B细胞或树突状细胞的功效
进行实验以比较将CpG靶向B细胞与将CpG靶向树突细胞的功效。如上所述，使用CT26结肠直肠模型，静脉内给予与CD22缀合以靶向B细胞的CpG(CD22-CpG；SB-337)，与DEC205缀合以靶向树突状细胞的CpG(DEC205-CpG；SB-419)或盐水。在第12、17、20和24天用10mg/kg的CpG-Ab治疗小鼠。测量肿瘤体积并计算平均体积(图65A)以及每只小鼠的个体肿瘤体积(图65B-65D)。结果表明，将CpG-Ab缀合物靶向B细胞或树突状细胞能够减少肿瘤体积。
实施例21.CpG-Ab活性在CT26结肠直肠模型中是CD4+T细胞依赖性的，而在A20淋巴瘤模型中则不是
为了研究T细胞在CpG的作用机制中的作用，采用了两种小鼠模型。在第一个模型中，使用了CT26大肠癌细胞。简而言之，如上所述创建CT26小鼠模型，并在用(i)盐水溶液(小圆形)；(ii)CD4耗竭(大圆形)；(iii)3mg/kg CD22-CpG(SB-337)(正方形)；或(iv)CD4耗竭+3mg/kg CD22-CpG(SB-337)(菱形)给药后追踪小鼠的平均肿瘤体积生长进程。在第10、13、15天静脉给予CD22-CpG(图66A)。在10、13和17天腹膜内注射的抗CD4抗体(克隆GK1.5，400ug/剂量)进行CD4耗竭。该实验的结果表明，使用CD4抗体的CD4+T细胞耗竭在CT26结肠直肠癌模型中抑制CpG-Ab活性(图66A)。
与之相反，在A20淋巴瘤模型中，CD4+T细胞耗竭后CpG-Ab活性未受到抑制。简而言之，在给小鼠施用(i)盐水溶液(圆形)；(ii)CD4耗竭(向上的三角形)；(iii)3mg/kg CD22-CpG(SB-337)(正方形)；或(iv)CD4耗竭+3mg/kg CD22-CpG(SB-337)(向下的三角形)后，追踪使用A20淋巴瘤模型的小鼠的平均肿瘤体积生长进程(图66B)。在第10、12、14天静脉给予CD22-CpG；在第10、13和17天腹腔注射抗CD4抗体(克隆GK1.5，400ug/剂量)进行CD4耗竭。在该模型中，相对于盐水，CD22-CpG减少了肿瘤模型。但是，CD4耗竭不会影响CpG-Ab活性。
实施例22.B细胞CpG-Ab诱导表面T细胞共刺激物
通过测量用抗体、CpG(p347)或CpG-Ab(SB-337)处理的B细胞上的表面T细胞共刺激物的表达来测定T细胞活化在B细胞定向的(directed)CpG-Ab(SB-1490)中的作用。收获小鼠脾脏并通过70微米的筛以产生单细胞悬液。通过与RBC裂解缓冲液在室温下孵育5分钟来裂解红细胞(RBC)，然后用完全培养基淬灭。使用小鼠B细胞分离试剂盒(MiltenyiBiotec)，通过阴性选择进一步分离B细胞。通过柔和的离心收集细胞，洗涤，并以2x106细胞/mL的浓度重悬于含有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素/链霉素(PS)的RPMI中。然后将细胞接种在96孔板中，并以指定浓度(1nM)用测试化合物处理，并在37℃下孵育72小时。然后通过柔和的离心收集细胞，并重悬于FACS缓冲液中。再次离心后，将细胞重悬于500μLFACS缓冲液中。加入小鼠FcR阻断剂并在室温下孵育10分钟。将细胞转移到冰上，并添加适当的标记的FACS抗体(请参见以下示例)，并在冰上孵育30分钟。使用非特异性同种型对照。然后，将细胞收集在Eppendorf管中的FACS缓冲液中。离心细胞，用FACS缓冲液洗涤一次，然后再次离心。然后将细胞再次重悬于1mL FACS缓冲液中，然后置于冰上直至通过CyFlow MLFACS机器进行分析。使用Flow Jo软件分析数据。
小鼠脾脏B细胞与抗体、游离CpG(SB-4715)或CpG-Ab(SB-1490)缀合物的体外孵育结果表明，B细胞定向的CpG-Ab缀合物诱导表面T细胞共刺激物，例如CD40，CD70，CD80，CD86，MHC-1，MHC-II和4-1BBL(图67A)。
体内处理的小鼠获得了相似的结果。简而言之，小鼠以10mg/kg的剂量每周三次处理，并在最后一次给药后3天分析CD19+/B220+B细胞。收获小鼠脾/淋巴结，用PBS漂洗并通过70微米的筛以产生单细胞悬液。将细胞柔和的离心，然后重悬于FACS缓冲液中。加入FcR阻断剂(1：20稀释)并在室温下孵育10分钟。将细胞转移到冰上，并添加适当的标记的FACS抗体(或非特异性同种型对照)，并在冰上孵育30分钟。在Eppendorf管中的FACS缓冲液中收集细胞。离心细胞，然后用1mL FACS缓冲液洗涤一次，然后再次离心。再次将细胞重悬于1mLFACS缓冲液中，然后置于冰上直至用CyFlow ML FACS机进行分析。使用Flow Jo软件分析数据。相对于盐水，用CpG-Ab处理导致CD40，CD80，CD86和MHC-II的表面表达增加(图67B)。
标志物 名称 同型 荧光团
CD137L 4-1BBL 大鼠IgG2a PE
CD252 OX40L 大鼠IgG2b PE
CD274 PD-L1，B7H1 大鼠IgG2b PE
CD275 ICOSL，B7H2 大鼠IgG2a PE
实施例23.B细胞CpG-Ab诱导在次级淋巴组织中的T细胞活化
通过FACS测量次级淋巴组织中T细胞的活化，以评估靶向B细胞的CpG-Ab缀合物的功能作用。简而言之，用(i)盐水(实心)；(ii)10mg/kg抗体(抗CD22)(方格)；(iii)10mg/kgCpG-Ab(SB-SB-337)(水平)；或(iv)等效剂量的CpG(p347)(垂直)处理Balb/c小鼠，每周三次。最后一次给药后三天，收集小鼠的脾脏和淋巴结，并通过FACS分析CD3 T细胞。收获小鼠脾/淋巴结，用PBS漂洗并通过70um筛子以产生单细胞悬液。将细胞柔和的离心，然后重悬于FACS缓冲液中。加入FcR阻断剂(1：20稀释)并在室温下孵育10分钟。将细胞转移到冰上，并添加适当的标记的FACS抗体(或非特异性同种型对照)，并在冰上孵育30分钟。在Eppendorf管中的FACS缓冲液中收集细胞。离心细胞，然后用1mL FACS缓冲液洗涤一次，然后再次离心。再次将细胞重悬于1mL FACS缓冲液中，然后置于冰上直至用CyFlow ML FACS机进行分析。使用Flow Jo软件分析数据。
通过测量相对于总T细胞群体(CD3+)中的CD71+，CD3+细胞的百分比来定量活化的T细胞(图68A)。还通过相对于总T细胞群体(CD3+)测量Ki67+，CD3+细胞的量来定量活化的T细胞(图68B)。FACS结果显示，靶向B细胞的CpG-Ab缀合物以及游离CpG(以较低程度)增加了次级淋巴组织中活化T细胞的百分比。
实施例24.过继性转移的淋巴结细胞抑制肿瘤生长
使用CT-26小鼠结肠直肠癌模型进行了进一步分析T细胞活化在靶向B细胞的CpG-Ab缀合物中的作用的实验。如上所述创建了CT-26小鼠结肠直肠模型。在第10天进行肿瘤分期，并且在第10、12、14天给小鼠静脉内给予(i)盐水溶液(圆形)；(ii)10mg/kgCD22-CpG(SB-337)(正方形)；(iii)10mg/kgCD22(向上的三角形)；或(iv)游离CpG(p347)(向下的三角形)(图69A)。监测肿瘤生长22天(从接种之日起32天)(图69A)。与上述其他结果一致，相对于其他治疗组，CD22-CpG导致了更低的肿瘤体积。
在第32天，处死小鼠，并从每个治疗组的小鼠中分离并合并淋巴结(引流和不引流)。使淋巴结通过70毫米筛以产生单细胞悬液。用冰冷的PBS洗涤细胞两次并计数。将1x107细胞(约70％T细胞)与0.1x106CT-26细胞在HBSS缓冲液中混合，然后按照标准方案将混合物皮下接种到未经治疗的BalbC小鼠的腹侧。在这些小鼠中监测肿瘤体积24天(图69B)。结果表明过继性转移的淋巴结细胞抑制肿瘤生长(图69C)
实施例25.B细胞CpG-Ab诱导先天性免疫应答
通过用(i)盐水(实心)；(ii)10mg/kg Ab(CD22)(方格)；(iii)5.7ugCpG(p347)(水平)；或(iv)10mg/kgCpG-mAb(SB-337)静脉内处理未经治疗的小鼠，分析了靶向B细胞的CpG-Ab缀合物对先天性免疫应答的作用。在指定的时间点从尾巴中收集血液，并通过离心分离血清。血清细胞因子水平通过基于磁珠的多重分析(LEGENDplex，Biolegend)进行测量。
在治疗小鼠后1小时，6小时和24小时测量与先天性免疫应答相关的多种血浆细胞因子(即IL-6，IL-10，IL-1β，IL-12p70，IFNγ和TNFα)(图70A-70F)。结果表明，靶向B细胞的CpG-Ab缀合物诱导T细胞、树突状细胞(DC)和自然杀伤(NK)细胞活化的良好细胞因子谱。值得注意的是，IL-1β(图70C)和IL-12p70(图70D)的浓度在6小时时升高。此外，观察到游离CpG在1小时时强烈地增加了TNFα(图70F)的血浆浓度水平，而对于CpG-mAb缀合物未观察到这种作用，表明CpG-mAb相对于游离CpG具有安全性优势。
实施例26.B细胞CpG-Ab诱导B细胞分化和生发中心形成
为了评估B细胞CpG-Ab是否诱导B细胞分化和生发中心的形成，根据上述方法使用CT-26结肠直肠癌模型。简而言之，给小鼠接种CT-26大肠癌细胞，使其生长10天。然后在第10、13和17天用盐水或10mg/kgCpG-mAb(SB-1490)静脉内处理小鼠，并在最后一次给药后24小时处死。如上文所述制备分离的脾脏单细胞制剂，并且使用FACS分析确定B细胞(B220+；图71A)、GC细胞(B220+，IgDlo，Fas+；图71B)和T滤泡辅助细胞(Tfh)(CD4+，CXCR5+，PD-1+；图71C)相对于脾细胞总数的百分比。另外，使用标准qPCR方法确定IL-21(图71D)、Bcl-6(图71E)和IRF-4(图71F)基因表达的相对倍数变化。结果表明，CpG-mAb显著提高了B细胞、GC细胞和Tfh细胞的百分比，并且显著提高了IL-21、Bcl-6和IRF-4的表达水平。综上所述，这些结果证明靶向B细胞的CpG-Ab缀合物诱导B细胞分化和GC形成。
实施例27.B细胞CpG-Ab诱导先天性和适应性免疫应答
使用CT-26结肠直肠癌模型测量了B细胞CpG-Ab治疗对先天和适应性免疫应答的影响。如上所述创建CT-26结肠直肠小鼠模型。为了评估先天性免疫应答，将肿瘤皮下接种并生长十天。在第10、13和17天，小鼠用盐水或3mg/kg CpG-mAb(SB-337)静脉内治疗，并在最后一次给药后24小时处死。从脾脏和淋巴结中分离细胞，并通过qPCR测量与先天性免疫应答相关的几个基因(即IL-6，IL-10，IL-1β和TNFa)的基因表达。结果表明，用CpG-mAb治疗增加了脾脏(图72A-C)和引流淋巴结(图73A-C)中IL-6，IL-10和IL-1β的表达。然而，CpG-mAb在脾脏(图72D)或引流淋巴结(图73D)中均不增加TNFα表达。总体而言，这些结果证明靶向B细胞的CpG-Ab缀合物诱导先天性免疫应答。
接下来，使用CT-26实体瘤模型测量B细胞CpG-Ab治疗对适应性免疫应答的影响。如上所述创建CT-26结肠直肠小鼠模型。为了评估适应性免疫应答，将肿瘤皮下接种并生长十天。在第10、13和16天，小鼠静脉给予盐水或3mg/kg CpG-mAb(SB-337)，并在第24天处死小鼠，通过心脏穿刺收集血液并通过ELISA测定IgM、IgG和IgG2a的血清水平。从小鼠收集血清，并测量IgM、IgG和IgG2a的水平。对于用CpG-mAb治疗的小鼠，相对于盐水治疗的小鼠，IgM(图74A)、IgG(图74B)、IgG2a(图74C)均显著增加。
通过使用CT-26肿瘤抗原AH1作为底物进行ELISA，进一步分析了肿瘤特异性抗体的水平。将AH1肽包被在96孔放置板上过夜，然后用ELISA洗涤缓冲液洗涤3次，以去除多余的肽。加入小鼠血清样品，并在室温下孵育2小时。然后将孔再次洗涤3次，并使用两种不同的市售二抗小鼠IgG2a-HRP抗体，2ndAb1和2ndAb2测量血清中的小鼠抗AH1 IgG2a的量(图75)。再次洗涤孔，并向每个孔中加入TMB底物溶液(100μL)。将板在室温下孵育15-30分钟或直到形成所需的颜色后，将终止溶液(100μL)添加到每个孔中，并在450nm处读取板。与小鼠血清中存在更多的IgG2a相一致，用CpG-mAb进行治疗后，血清中的肿瘤特异性IgG2a明显增多。这些结果表明，B细胞CpG-Ab诱导了适应性应答，该应答产生了向高亲和力的肿瘤特异性抗体的类别转换。
实施例28.B细胞CpG-Ab减少B-reg群
分析了靶向B细胞的CpG-Ab缀合物对脾脏B-reg细胞的作用。在第1、4和7天，用盐水或10mg/kg CpG-Ab(SB-337)[[静脉内]]处理Balb/C小鼠(n＝8)。在最后一次给药后14天处死小鼠。相对于B细胞(B220+)的数目，确定脾脏Breg细胞(CD19+，B220+，CDldhi)的百分比(图76A)。另外，确定相对于细胞总数的脾脏B-reg细胞(CD19+，B220+，CD1dhi)的百分比(图76B)。在两个参数下对B-reg细胞的百分比的定量揭示，相对于盐水处理，CpG-mAb处理显著减少了小鼠中的B-reg群(图76A和图76B)。这些结果证明B细胞CpG-Ab减少了B-reg群。
实施例29.B细胞CpG-Ab扩大了次级淋巴组织中的DC群
为了评估B细胞靶向的CpG-Ab治疗对继发性淋巴组织中的树突细胞群的影响，使用了CT-26实体瘤模型。在第14、17、20天，用盐水，5.7ug/剂量CpG(p347)或10mg/kg CpG-mAb(SB-337)静脉内处理小鼠。如上所述，从脾脏中分离细胞。相对于细胞总数，计算了脾髓样树突状细胞(mDC；B220-，CD11C+，DEC205bi)的百分比。脾脏mDC百分比的定量显示，相对于盐水处理，游离CpG和CpG-mAb处理均显著增加了mDC细胞的百分比(分别为p＝0.003；p＝0.0002)(图77A)。此外，相对于游离CpG，cpG-Ab处理后的mDC细胞的百分比显著增加(p＝0.002)(图77A)。综上，这些结果表明，CpG-Ab治疗可扩大脾脏中的mDC库。
此外，确定合并的淋巴结mDC细胞(B220-，CD11C+，CD8+)的百分比。用CpG-mAb治疗小鼠导致在引流淋巴结(dLN)和非引流淋巴结(ndLN)两者中LN mDCs的百分比增加(图77B)。然而，在用游离CpG处理时未观察到效果(图77B)，这突出了CpG-Ab缀合物和游离CpG之间的差异作用。结果表明，靶向B细胞的CpG-Ab缀合物可以扩大脾脏和淋巴结中的树突状细胞群。
实施例30.pDC有助于CpG-Ab活性
使用CT26大肠癌模型和A20淋巴瘤模型进行实验，以确定浆细胞样树突状细胞(pDC)对CpG-Ab活性的贡献。在CT-26结肠直肠模型中，肿瘤生长10天，然后在第10、13和15天用盐水或3mg/kg CD22-CpG(SB-337)静脉内治疗小鼠。在第10、13和17天，向部分小鼠腹膜内注射PDCAl抗体、克隆BX444(每只小鼠300μg)、单独或与CD22-CpG(SB-337)组合以使pDC细胞耗竭。测量了肿瘤体积的进展，结果表明pDC的耗竭降低了CT-26结肠直肠模型中CD22-CpG的效力(图78A)。
A20淋巴瘤模型产生相似的结果。A20淋巴瘤肿瘤生长10天，然后在第10、12和14天用盐水或3mg/kgCD22-CpG(SB-337)静脉内处理小鼠。此外，在第10、13和17天对部分小鼠腹膜内注射PDCA1抗体，克隆BX444(每只小鼠300μg)，单独或与CD22-CpG(SB-337)组合以使pDC细胞耗竭。测量了肿瘤体积的进展，结果表明pDC的耗竭降低了A20淋巴瘤模型中CD22-CpG的效力(图78B)。综观来说，结果表明pDC有助于CpG-Ab活性。
实施例31.CpG-mAb增加的T细胞肿瘤浸润
使用A20淋巴瘤模型确定CpG-mAb缀合物对T细胞浸润的作用。简而言之，将A20细胞皮下接种到小鼠中，并在第10、13和17天用盐水或3mg/kgCpG-mAb(SB-337)静脉内处理小鼠，最后一次给药后24小时处死动物。在一些实验中，还用10mg/kg抗PD-L1治疗小鼠(图79D)。去除小鼠的肿瘤，在4℃下匀浆，通过标准方法提取mRNA，并通过qPCR对T细胞基因例如CD3、CD4、CD8a和CD8b(图79A)；巨噬细胞基因，例如CD38、GPR18、iNOS、FPR2、Egr2、Arg1、CD206、Adgrel、CD68和Cd11b(图79B)；细胞因子基因，例如IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-13、IL-21、TNFα、IFNγ和TGFβ(图79C)；以及凋亡酶基因，例如粒酶B和穿孔素(图79D)进行基因表达分析。相对于肽基丙基异构酶B(PPIB)的基因表达分析结果表明，CpG-mAb增加了T细胞基因(图79A)，巨噬细胞基因(图79B)和某些细胞因子基因(图79C)的表达。CpG-mAb和CpG-mAb+抗PD-L1均增加凋亡酶基因的表达(图79D)。总体上，用CpG-mAb治疗的小鼠的肿瘤基因表达谱与免疫细胞的存在和/或激活相一致。
实施例32.人CpG-Ab活性被确认
通过收集和合并来自三个供体的外周血单核细胞(PBMCs)来评估CpG-Ab缀合物对原代人B细胞的作用。简而言之，富集白细胞的血液(LRS室)是从圣地亚哥血库获得的。通过标准Ficoll梯度离心方案分离白细胞。使用B细胞分离试剂盒(Miltenyi)，通过阴性选择进一步分离B细胞。将B细胞(纯度＞95％)重悬在含有10％FBS和1％PS的RPMI中，并接种在96孔板中(1x105细胞/孔)。如所示，用一系列浓度的CpG(p425)，CpG-Ab(SB-430)或Ab(hCD22)处理细胞，并在37℃下孵育48-72小时。
处理后，除去培养基，并通过ELISA测量分泌的IL-6水平(图80A)。然后收获细胞，并通过FACS测量MHC-II(图80B)，CD86(图80C)，CD70(图80D)和CD20(图80E)的细胞表面标志物。结果表明，人原代B细胞对CpG-Ab治疗更敏感，这由分泌的IL-6的浓度(图80A)和MHC-II的表面标志物(图80B)，CD86(图80C)，CD70(图80D)和CD20(图80E)确定。
此外，分析了人类原代脾细胞对用CpG-Ab缀合物和游离CpG处理的反应。原代人脾细胞购自Bioreclamation IVT。将细胞重悬浮于含有10％FBS和1％PS(2x106细胞/ml)的RPMI中，并接种在96孔板中。用指示浓度的hCD22-hCpG(SB-430)、游离人CpG pl或游离人CpG(Solstice；p425)处理细胞，并在37℃下孵育24小时。除去培养基，并通过ELISA测量分泌的IL-6。与游离CpGp1或游离人CpG(solstice；p425)相比，用hCD22-hCpG治疗能够以较低剂量增加IL-6的浓度(图81)。EC50值分别为0.51nM，818nM和338nM，这进一步提供了hCpG-hAb可以激活人脾细胞的证据。
在人源化小鼠模型NCG小鼠中进行实验。通过对NORD/Nju小鼠中的Prkdc和Il2rg基因座进行顺序CRISPR/Cas9编辑来建立此模型，从而产生与NOD/Nju共生的小鼠。NOD/Nju在Sirpa(SIRPα)基因中携带一个突变，可以植入外来造血干细胞。Prkdc基因敲除产生缺乏适当的T细胞和B细胞形成的SCID样表型。Il2rg基因的敲除进一步加剧了SCID样表型，同时还导致NK细胞产生的减少。首先用新鲜的人PBMC腹膜内处理小鼠，然后两天后皮下注射Daudi细胞(2.5×106)激发小鼠(图82A)。在第12，14和16天，用盐水、5mg/kghCD22抗体、5mg/kghCD22-CpG(SB-430)或5.7μg/剂量的游离CpG(p425)处理小鼠。追踪平均肿瘤体积32天(图82B)。结果表明，与其他治疗组相比，用hCD22-CpG治疗的小鼠的肿瘤体积更小。总而言之，这些结果表明CpG-Ab缀合物在人细胞中是有效的。
实施例33
为了证明并比较本公开的含CpG的多核苷酸与天然存在的CpG序列的功效，在将细胞与本发明的含CpG的多核苷酸(独立形式或缀合形式)、以及与具有天然存在的B型CpG序列(独立形式或缀合形式)一起温育后，测量了人Ramos细胞中的NFκB活性。如图58B所示，本发明的CpG-Ab缀合物与独立的或缀合的B型CpG相比具有显著提高的活性。
实施例34
为了评估根据本公开的含CpG的多核苷酸是否激活补体途径，通过将猴子血清与酵母聚糖(阳性对照)天然存在的B型CpG序列(p1)或两个本文提供含CpG多核苷酸一起温育来评估C3释放。如图59所示，本文提供的含CpG的免疫刺激多核苷酸没有激活补体途径。
实施例35.使用小鼠脾细胞测定的CpG抗体缀合物的生物活性
收获小鼠(BALB/c)的脾脏，并通过70μm的筛以产生单细胞悬液。通过与RBC裂解缓冲液在室温下孵育5分钟来裂解红细胞，然后用20∶1完全培养基淬灭。通过柔和的离心收集细胞，洗涤，并重悬于含有10％FBS和1％PS的RPMI(2×106细胞/mL)中，并接种在9孔板中。以指定的浓度添加测试化合物，并在37℃下孵育24小时。除去培养基，并通过ELISA测量分泌的IL-6。结果总结在下表中。
实施例36.CpG-抗体缀合物的药代动力学研究
对于单次给药实验，将测试化合物以10mg/kg的IV或SC施用给(BALB/c)小鼠。在预定的时间点收集血清样品以进行分析，结果示于图83中。
对于重复给药实验，在第1、7和14天以10mg/kgIV向小鼠施用测试化合物。在最后一次注射后第14天在预定时间点收集血清样品用于分析，并且将PK曲线与仅接受单剂量测试化合物的另一组小鼠进行比较。结果示于图84。
在另一个单次给药实验中，以10mg/kgIV向小鼠施用CpG-抗体缀合物。施用后0.08、1、6、24、48和120小时收集血清样品。通过抗体和完整的CpG-抗体缀合物分析血清样品。结果示于图85。
在另一个单次给药实验中，将CpG-抗体缀合物以10mg/kgIV的剂量施用于小鼠。注射后0、0.08、1、6和24小时处死小鼠。分析血清、肝和脾样品。
结果示于图86。
在另一个单次给药实验中，以10mg/kgIV向小鼠施用CpG-抗体缀合物。在预定的时间点收集血清样品，结果示于87A和87B。
在上述药物实验中，使用ELISA测定法分析血清样品。为了确定剩余的完整CpG-抗体缀合物的量，使用ELISA封闭缓冲液将血清样品用生物素化的CpG互补序列稀释，然后在室温下孵育30分钟。将稀释的血清样品各自以100μL加入预先涂有链霉亲和素的96孔板的孔中。将平板在室温下于平板振荡器上孵育60分钟并用ELISA洗涤缓冲液洗涤3次后，向每孔加入以最佳稀释度在ELISA封闭缓冲液中的山羊抗小鼠IgG-HRP抗体(100℃L)。将平板在室温下在平板振荡器上温育30分钟并用ELISA洗涤缓冲液洗涤3次后，将TMB底物溶液(100℃L)添加到每个孔中。将该板在室温下孵育15-30分钟或直至显出所需的颜色，然后将终止溶液(100μL)添加到每个孔中。在450nm下读取该板。使用从50nM开始并在ELISA封闭缓冲液中连续稀释的标准曲线计算血清中完整CpG-抗体缀合物的浓度。在组织被均质化之后，相同的方案也用于确定组织中的CpG-抗体缀合物。
为了分析CpG-抗体缀合物的抗体或抗体部分，用在PBS中稀释的小鼠CD22胞外域包被96孔板。将该板在4℃下孵育过夜，用ELISA洗涤缓冲液洗涤3次，并在室温下用ELISA封闭缓冲液封闭至少60分钟。用在ELISA封闭缓冲液优化的稀释因子稀释血清样品。将稀释的血清样品各自以100μL加入96孔板的一个孔中。将平板在平板振荡器上室温孵育60分钟并用ELISA洗涤缓冲液洗涤3次后，将以最佳稀释度在ELISA封闭缓冲液中的山羊抗小鼠IgG-HRP抗体(100μL)加入板的每个孔。将平板在室温下在平板振荡器上温育30分钟并用ELISA洗涤缓冲液洗涤3次后，将TMB底物溶液(100μL)添加到每个孔中。将板在室温下孵育15-30分钟或直到显示出所需的颜色后，将终止溶液(100μL)添加到每个孔中。在450nm下读取该板。使用从50nM开始并在ELISA封闭缓冲液中连续稀释的标准曲线计算血清中CD22抗体的浓度。
其他实施方式
在不脱离本发明的范围和精神的情况下，所描述的发明的各种修改和变化对本领域技术人员将是显而易见的。尽管已经结合特定实施例描述了本发明，但是应当理解，所要求保护的本发明不应不适当地限于这些特定实施例。实际上，对于本领域技术人员显而易见的所描述的用于实施本发明的方式的各种修改都在本发明的范围内。
其他实施例在权利要求中。
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序列表
<110> 索尔斯帝斯生物有限公司
<120> 免疫调节多核苷酸、抗体缀合物及其使用方法
<130> 105106PC
<140> TBA
<141> On even date herewith
<150> 62/537,925
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<223> 合成的寡核苷酸
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 194
tccatgacgt tcctgacgtt 20
<210> 195
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 195
tccatgacgt tcctgacgtt 20
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<211> 20
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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<223> 合成的寡核苷酸
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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<220>
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<223> 合成的寡核苷酸
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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<220>
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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<220>
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<223> 合成的寡核苷酸
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<211> 13
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<220>
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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<211> 13
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸 - 使用 p88/p144的双链-CpG
<400> 234
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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<211> 13
<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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<211> 13
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 259
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<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 260
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<211> 13
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 261
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<211> 13
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 262
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<211> 13
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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<210> 265
<211> 14
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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<211> 13
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 266
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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<211> 12
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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<211> 13
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 269
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<211> 13
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 270
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<210> 271
<211> 13
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 271
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<210> 272
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 272
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<210> 273
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 273
ugctgctgtg ctt 13
<210> 274
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 274
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<210> 275
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 275
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<210> 276
<211> 13
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 276
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<210> 277
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 277
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<210> 278
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 278
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<210> 279
<211> 13
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 279
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<210> 280
<211> 13
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 280
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<210> 281
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 281
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<210> 282
<211> 13
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 282
ucgtcgtgtc gtt 13
<210> 283
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 283
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<210> 284
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 284
acgacgtgac gtt 13
<210> 285
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 285
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<210> 286
<211> 13
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 286
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<210> 287
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 287
ucgtcgtgtc gtt 13
<210> 288
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 288
ucgtcgtgtc gtt 13
<210> 289
<211> 13
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 289
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<210> 290
<211> 13
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 290
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<211> 13
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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<210> 391
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 391
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<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 392
ucgtcgtgtc gtt 13
<210> 393
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 393
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<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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<211> 13
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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<211> 13
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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<211> 14
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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<211> 13
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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<211> 13
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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<210> 409
<211> 14
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 409
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<210> 410
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 410
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<210> 411
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 411
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<210> 412
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 412
ucgtcgtgtc gtt 13
<210> 413
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 413
ucgtcgtgtc gtt 13
<210> 414
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 414
ucgtcgtgtc gtt 13
<210> 415
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 415
ucgtcgtgtc gtt 13
<210> 416
<211> 13
<212> DNA
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<220>
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<400> 416
ucgtcgtgtc gtt 13
<210> 417
<211> 13
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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ucgtcgtgtc gtt 13
<210> 418
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 418
ucgtcgtgtc gtt 13
<210> 419
<211> 13
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 419
ucgtcgtgtc gtt 13
<210> 420
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 420
ucgtcgtgtc gtt 13
<210> 421
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 421
ucgtcgtgtc gtt 13
<210> 422
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 422
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<210> 423
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 423
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<210> 424
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 424
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<210> 425
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 425
cgtcgtgtcg tt 12
<210> 426
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 426
ccgtcgtgtc gtt 13
<210> 427
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 427
ucgtcgtgtc gtt 13
<210> 428
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 428
ucgtcgtgtc gtt 13
<210> 429
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 429
ucgtcgtgtc gtt 13
<210> 430
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 430
ucgtcgtgtc gtt 13
<210> 431
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 431
ucgtcgtgtc gtt 13
<210> 432
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 432
ucgtcgtgtc gtt 13
<210> 433
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 433
cgtcgtgtcg tt 12
<210> 434
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 434
cgtcgtgtcg tt 12
<210> 435
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 435
cgtcgtgtcg tt 12
<210> 436
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 436
cgtcgtgtcg tt 12
<210> 437
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 437
cgtcgtgtcg tt 12
<210> 438
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 438
cgtcgtgtcg tt 12
<210> 439
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 439
cgtcgtgtcg tt 12
<210> 440
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 440
cgtcgtgtcg tt 12
<210> 441
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 441
cgtcgtgtcg tt 12
<210> 442
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 442
cgtcgtgtcg tt 12
<210> 443
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 443
cgtcgtgtcg tt 12
<210> 444
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 444
aacgacacga cga 13
<210> 445
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 445
cgtcgtgtcg tt 12
<210> 446
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 446
cgtcgtgtcg tt 12
<210> 447
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 447
cgtcgtgtcg tt 12
<210> 448
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 448
cgtcgtgtcg tt 12
<210> 449
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 449
cgtcgtgtcg tt 12
<210> 450
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 450
tucgtcgtga cgtt 14
<210> 451
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 451
tucgacgtga cgtt 14
<210> 452
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 452
tucgacgtt 9
<210> 453
<211> 7
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 453
tuacgtt 7
<210> 454
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 454
tacgtt 6
<210> 455
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 455
tucgtt 6
<210> 456
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 456
tacgt 5
<210> 457
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 457
tucgt 5
<210> 458
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 458
tucgucgtga cgtt 14
<210> 459
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 459
tucgucgtt 9
<210> 460
<211> 7
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 460
tuacgut 7
<210> 461
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 461
tacgut 6
<210> 462
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 462
tucgut 6
<210> 463
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 463
gucgtt 6
<210> 464
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 464
gacgtt 6
<210> 465
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 465
gucgut 6
<210> 466
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 466
gacgut 6
<210> 467
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸 - 使用 p88/p145的双链-CpG
<400> 467
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 468
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗DEC205 抗体的轻链
<400> 468
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Arg Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 469
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 469
tcgtcgtgac gtt 13
<210> 470
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 470
cgtcgtgtcg 10
<210> 471
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 471
cgtcgtgt 8
<210> 472
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 472
cgtcgtgt 8
<210> 473
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 473
cgtcgt 6
<210> 474
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 474
cgtcgt 6
<210> 475
<211> 4
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 475
cgtt 4
<210> 476
<211> 4
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 476
cgtt 4
<210> 477
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 477
tucgtcgtga cgtt 14
<210> 478
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 478
ttucgtcgtg acgtt 15
<210> 479
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 479
ttucgtcgtg acgtt 15
<210> 480
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 480
tucgtcgtga cgtt 14
<210> 481
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 481
ttucgtcgtg acgtt 15
<210> 482
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 482
tucgtcgtga cgtt 14
<210> 483
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 483
tucgtcgtga cgtt 14
<210> 484
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 484
tucgtcgtga cgtt 14
<210> 485
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 485
tucgtcgtga cgtt 14
<210> 486
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 486
ttucgtcgtg acgtt 15
<210> 487
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 487
cgtcgtgtcg tt 12
<210> 488
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 488
cgtcgtgtcg tt 12
<210> 489
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 489
cgtcgtgtcg tt 12
<210> 490
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗DEC205 抗体的重链
<400> 490
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Trp Gly Trp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Leu
435 440 445
Leu Gln Gly Gly
450
<210> 491
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD303 抗体的轻链
<400> 491
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Met Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
65 70 75 80
Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Glu
85 90 95
Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
100 105 110
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
115 120 125
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Trp Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Ala Tyr Glu Lys His Lys
180 185 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 492
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD303 抗体的重链
<400> 492
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Pro Gly Asp Ser Phe Gly Tyr Tyr Tyr Pro Asp Ser
50 55 60
Val Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Thr Arg Asp Ile Tyr Tyr Asn Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Trp Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Trp Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Leu Leu Gln Gly Gly
450
<210> 493
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 Q-标签
<400> 493
Leu Leu Gln Gly Gly
1 5
<210> 494
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 Q-标签
<400> 494
Gly Gly Gly Leu Leu Gln Gly Gly
1 5
<210> 495
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗PD-L1 抗体的轻链
<400> 495
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Asp Ala Ala Pro
100 105 110
Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn
130 135 140
Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn
145 150 155 160
Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr
180 185 190
Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 496
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗PD-L1 抗体的重链
<400> 496
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr
180 185 190
Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu
245 250 255
Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser Glu Asp Asp Pro
260 265 270
Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala
275 280 285
Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Ala Ser Thr Leu Arg Val Val
290 295 300
Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu
340 345 350
Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys
355 360 365
Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn
370 375 380
Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys
405 410 415
Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly
420 425 430
Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Leu
435 440 445
Leu Gln Gly Gly
450

Claims (437)

1.式(A)的寡核苷酸：
X5'-(XN)b-YP-(XN)c-X3' (A)
或其立体异构体、两个或更多个非对映异构体的混合物、互变异构体或两个或更多个互变异构体的混合物；或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物；
其中：
每个XN独立地是核苷酸；
X3'是3'末端核苷酸；
X5'是5'末端核苷酸；
YP是核苷间磷酸三酯；和
b和c分别为约0至约25的整数；具有其总和不得少于5的附加条件；
其中寡核苷酸包含具有修饰的核碱基的核苷酸。
2.权利要求1所述的寡核苷酸，其中b是约1至约15的整数。
3.权利要求1所述的寡核苷酸，其中b是约3，约4，约11或约14的整数。
4.权利要求1所述的寡核苷酸，其中b为约3的整数。
5.权利要求1所述的寡核苷酸，其中b为约4的整数。
6.权利要求1所述的寡核苷酸，其中b是约11的整数。
7.权利要求1所述的寡核苷酸，其中b是约14的整数。
8.权利要求1至7中任一项所述的寡核苷酸，其中c是约0至约10的整数。
9.权利要求1至7中任一项所述的寡核苷酸，其中c是约0或约8的整数。
10.权利要求1至7中任一项所述的寡核苷酸，其中c是约0的整数。
11.权利要求1至7中任一项所述的寡核苷酸，其中c是约8的整数。
12.权利要求1至11中任一项所述的寡核苷酸，其中b和c之和为约5至约20。
13.权利要求1至11中任一项所述的寡核苷酸，其中b和c之和为约5至约15。
14.权利要求1至11中任一项所述的寡核苷酸，其中b和c之和为约8，约9，约10，约11，约12，约13或约14。
15.权利要求1至11中任一项所述的寡核苷酸，其中b和c之和为约11或约14。
16.权利要求1-11中任一项所述的寡核苷酸，其中b和c之和为约11。
17.权利要求1至11中任一项所述的寡核苷酸，其中b和c之和为约14。
18.权利要求1至17中任一项所述的寡核苷酸，其中，每个XN独立地是2'-脱氧核糖核苷酸。
19.权利要求1至17中任一项所述的寡核苷酸，其中每个XN独立地为2'-脱氧腺苷，2'-脱氧鸟苷，2'-脱氧胞苷，5-卤代-2'-脱氧胞苷，2'-脱氧胸苷，2'-脱氧尿苷或5-卤代2'-脱氧尿苷。
20.权利要求1至17中任一项所述的寡核苷酸，其中每个XN独立地为2'-脱氧腺苷，2'-脱氧鸟苷，2'-脱氧胞苷，2'-脱氧胸苷，5-溴-2'-脱氧尿苷或5-碘-2'-脱氧尿苷。
21.权利要求1至20中任一项所述的寡核苷酸，其中，X3′是2′-脱氧核糖核苷酸。
22.权利要求1至20中任一项所述的寡核苷酸，其中X3'是2'-脱氧腺苷，2'-脱氧鸟苷，2'-脱氧胞苷，5-卤代-2'-脱氧胞苷，2'-脱氧胸苷，2'-脱氧尿苷或5-卤代2'-脱氧尿苷。
23.权利要求1至20中任一项所述的寡核苷酸，其中，X3′是2′-脱氧胸苷。
24.权利要求1至20中任一项所述的寡核苷酸，其中，X3′是2′-修饰的核糖核苷酸。
25.权利要求1至20中任一项所述的寡核苷酸，其中，X3′是2′-甲氧基核糖核苷酸或2′-乙氧基甲氧基核糖核苷酸。
26.权利要求1至25中任一项所述的寡核苷酸，其中，X5′是2′-脱氧核糖核苷酸。
27.权利要求1至25中任一项所述的寡核苷酸，其中，X5'是2'-脱氧腺苷，2'-脱氧鸟苷，2'-脱氧胞苷，5-卤代-2'-脱氧胞苷，2'-脱氧胸苷，2'-脱氧尿苷或5-卤代2'-脱氧尿苷。
28.权利要求1至25中任一项所述的寡核苷酸，其中，X5′是具有取代的嘧啶碱基的2′-脱氧核糖核苷酸。
29.权利要求1至25中任一项所述的寡核苷酸，其中，X5′是具有5-取代的嘧啶碱基的2′-脱氧核糖核苷酸。
30.权利要求1至25中任一项所述的寡核苷酸，其中，X5'是2'-脱氧胸苷，5-卤代-2'-脱氧胞苷或5-卤代-2'-脱氧尿苷。
31.权利要求1至25中任一项所述的寡核苷酸，其中，X5′是5-卤代-2′-脱氧胞苷。
32.权利要求1至25中任一项所述的寡核苷酸，其中，X5′是5-卤代-2′-脱氧尿苷。
33.权利要求1至25中任一项所述的寡核苷酸，其中，X5'是2'-脱氧胸苷，5-溴-2'-脱氧胞苷，5-碘-2'-脱氧胞苷，5-溴-2'-脱氧尿苷或5-碘-2'-脱氧尿苷。
34.权利要求1至25中任一项所述的寡核苷酸，其中，X5′是2′-脱氧胸苷，5-溴-2′-脱氧尿苷或5-碘-2′-脱氧尿苷。
35.权利要求1至34中任一项所述的寡核苷酸，其中，X5′具有3′-硫代磷酸酯基团。
36.权利要求35所述的寡核苷酸，其中3′-硫代磷酸酯是手性的。
37.权利要求35所述的寡核苷酸，其中所述3′-硫代磷酸酯具有Rp的手性。
38.权利要求35所述的寡核苷酸，其中所述3′-硫代磷酸酯具有Sp的手性。
39.权利要求1至34中任一项所述的寡核苷酸，其中，X5′具有手性为Rp的3′-硫代磷酸酯基团，并且X3′为2′-甲氧基核糖核苷酸或2′-乙氧基甲氧基核糖核苷酸。
40.权利要求1至34中任一项所述的寡核苷酸，其中，X5′具有具有Sp的手性的3′-硫代磷酸酯基团，并且X3′是2′-甲氧基核糖核苷酸或2′-乙氧基甲氧基核糖核苷酸。
41.权利要求1至40中任一项所述的寡核苷酸，其中，YP为：
Figure FDA0002320320370000031
其中Z为O或S；d是约0至约50的整数。
42.权利要求1至40中任一项所述的寡核苷酸，其中，YP为：
Figure FDA0002320320370000032
其中Z为O或S；d是约0至约50的整数。
43.权利要求41或42所述的寡核苷酸，其中Z为O。
44.权利要求41或42所述的寡核苷酸，其中Z是S。
45.权利要求41至44中任一项所述的寡核苷酸，其中d是约0至约10的整数。
46.权利要求45所述的寡核苷酸，其中d是约0至约5的整数。
47.权利要求45所述的寡核苷酸，其中d是约0，约1或约3的整数。
48.权利要求1至47中任一项所述的寡核苷酸，其包含另外的核苷间磷酸三酯。
49.权利要求48所述的寡核苷酸，其中，所述另外的核苷间磷酸三酯是烷基磷酸三酯。
50.权利要求48所述的寡核苷酸，其中所述另外的核苷间磷酸三酯是乙基磷酸三酯。
51.权利要求1至50中任一项所述的寡核苷酸，其包含一个5-卤代-2'-脱氧尿苷。
52.权利要求51所述的寡核苷酸，其中所述5-卤代-2′-脱氧尿苷是5-溴-2′-脱氧尿苷或5-碘-2′-脱氧尿苷。
53.权利要求1至52中任一项所述的寡核苷酸，其包含三个或更多个2′-脱氧胞苷。
54.权利要求1至53中任一项所述的寡核苷酸，其包含三个2′-脱氧胞苷。
55.权利要求1至54中任一项所述的寡核苷酸，其包含三个或更多个2′-脱氧鸟苷。
56.权利要求1至55中任一项所述的寡核苷酸，其包含四个2'-脱氧鸟苷。
57.权利要求1至56中任一项所述的寡核苷酸，其包含三个2'-脱氧胞苷和三个2'-脱氧鸟苷。
58.权利要求1至57中任一项所述的寡核苷酸，其包含三个2'-脱氧胞苷和四个2'-脱氧鸟苷。
59.权利要求1至58中任一项所述的寡核苷酸，其包含三个或更多个2′-脱氧胸苷。
60.权利要求59所述的寡核苷酸，其包含三个，四个，五个，六个，七个或八个2'-脱氧胸苷。
61.权利要求59所述的寡核苷酸，其包含三个，四个，五个或八个2'-脱氧胸苷。
62.权利要求1至61中任一项所述的寡核苷酸，其包含零个，一个或两个2'-脱氧腺苷。
63.权利要求1至62中任一项所述的寡核苷酸，其包含一个或多个核苷间硫代磷酸酯。
64.权利要求63的寡核苷酸，其中所述核苷间硫代磷酸酯中的至少一个是手性的。
65.式(B)的化合物：
Rx-LN-(Q)e (B)
或其立体异构体、两个或更多个非对映异构体的混合物、互变异构体或两个或更多个互变异构体的混合物；或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物；
其中：
Rx是缀合基团；
LN是一个接头；
每个Q独立地是包含磷酸三酯的寡核苷酸；和
e是1、2、3或4的整数。
66.权利要求65的化合物，其中Rx为
Figure FDA0002320320370000051
67.权利要求65所述的化合物，其中Rx为-NH2。
68.式(C)的化合物：
Figure FDA0002320320370000052
或其立体异构体、两个或更多个非对映异构体的混合物、互变异构体或两个或更多个互变异构体的混合物；或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物；
其中：
Ab是抗体；
每个LN独立地是一个接头；
每个Q独立地是包含磷酸三酯的寡核苷酸；
每个e独立为1、2、3或4的整数；和
f是1、2、3或4的整数。
69.权利要求68所述的化合物，其中f是1或2的整数。
70.权利要求68所述的化合物，其中f是1的整数。
71.权利要求65至70中任一项所述的化合物，其中LN是包含聚乙二醇的接头。
72.权利要求65至71中任一项所述的化合物，其中LN为
Figure FDA0002320320370000061
其中d为约0至约50的整数。
73.权利要求65至71中任一项所述的化合物，其中LN为
Figure FDA0002320320370000062
其中d为约0至约50的整数。
74.权利要求72或73所述的化合物，其中d是约0至约10的整数。
75.权利要求74所述的化合物，其中d是约0至约5的整数。
76.权利要求74所述的化合物，其中d是约0，约1或约3的整数。
77.权利要求65至76中任一项所述的化合物，其中e是1的整数。
78.权利要求65至77中任一项所述的化合物，其中每个Q独立地具有式(D)的结构：
其中：
每个XN独立地是核苷酸；
X3'是3'末端核苷酸；
X5'是5'末端核苷酸；
YP是核苷间磷酸三酯的残基；和
b和c分别为约0至约25的整数；其总和不得少于5；
其中寡核苷酸包含具有修饰的核碱基的核苷酸。
79.权利要求78所述的化合物，其中b是约1至约15的整数。
80.权利要求78所述的化合物，其中b是约3，约4，约11或约14的整数。
81.权利要求78所述的化合物，其中b是约3的整数。
82.权利要求78所述的化合物，其中b是约4的整数。
83.权利要求78所述的化合物，其中b是约11的整数。
84.权利要求78所述的化合物，其中b是约14的整数。
85.权利要求78至84中任一项所述的化合物，其中c是约0至约10的整数。
86.权利要求78至84中任一项所述的化合物，其中c是约0或约8的整数。
87.权利要求78至84中任一项的化合物，其中c是约0的整数。
88.权利要求78至84中任一项所述的化合物，其中c是约8的整数。
89.权利要求78至88中任一项所述的化合物，其中b和c之和为约5至约20。
90.权利要求78至88中任一项所述的化合物，其中b和c之和为约5至约15。
91.权利要求78至88中任一项所述的化合物，其中b和c之和为约8，约9，约10，约11，约12，约13或约14。
92.权利要求78至91中任一项所述的化合物，其中每个XN独立地是2′-脱氧核糖核苷酸。
93.权利要求78至91中任一项所述的化合物，其中每个XN独立地为2'-脱氧腺苷，2'-脱氧鸟苷，2'-脱氧胞苷，5-卤代-2'-脱氧胞苷，2'-脱氧胸苷，2'-脱氧尿苷或5-卤代2'-脱氧尿苷。
94.权利要求78至91中任一项所述的化合物，其中每个XN独立地为2'-脱氧腺苷，2'-脱氧鸟苷，2'-脱氧胞苷，2'-脱氧胸苷，5-溴-2'-脱氧尿苷或5-碘-2'-脱氧尿苷。
95.权利要求78至94中任一项所述的化合物，其中，X3′是2′-脱氧核糖核苷酸。
96.权利要求78至91中任一项所述的化合物，其中X3'是2'-脱氧腺苷，2'-脱氧鸟苷，2'-脱氧胞苷，5-卤代-2'-脱氧胞苷，2'-脱氧胸苷，2'-脱氧尿苷或5-卤代2'-脱氧尿苷。
97.权利要求78至91中任一项所述的化合物，其中，X3′是2′-脱氧胸苷。
98.权利要求78至94中任一项所述的化合物，其中X3′是2′-修饰的核糖核苷酸。
99.权利要求78至94中任一项所述的化合物，其中，X3′是2′-甲氧基核糖核苷酸或2′-乙氧基甲氧基核糖核苷酸。
100.权利要求78至99中任一项所述的化合物，其中，X5′是2′-脱氧核糖核苷酸。
101.权利要求100所述的化合物，其中X5'是2'-脱氧腺苷，2'-脱氧鸟苷，2'-脱氧胞苷，5-卤代-2'-脱氧胞苷，2'-脱氧胸苷，2'-脱氧尿苷或5-卤代-2'-脱氧尿苷。
102.权利要求100所述的化合物，其中X5′是带有取代的嘧啶碱基的2’-脱氧核糖核苷酸。
103.权利要求102所述的化合物，其中X5′是具有5-取代的嘧啶碱基的2′-脱氧核糖核苷酸。
104.权利要求102所述的化合物，其中X5′是2′-脱氧胸苷，5-卤代-2′-脱氧胞苷或5-卤代-2′-脱氧尿苷。
105.权利要求102所述的化合物，其中X5'是2'-脱氧胸苷，5-溴-2'-脱氧胞苷，5-碘-2'-脱氧胞苷，5-溴-2'-脱氧尿苷或5-碘-2'-脱氧尿苷。
106.权利要求102所述的化合物，其中X5'是2'-脱氧胸苷，5-溴-2'-脱氧尿苷或5-碘-2'-脱氧尿苷。
107.权利要求78至106中任一项所述的化合物，其中X5′具有一个3′-硫代磷酸酯基团。
108.权利要求107所述的化合物，其中所述3′-硫代磷酸酯是手性的。
109.权利要求107所述的化合物，其中3′-硫代磷酸酯具有Rp的手性。
110.权利要求107所述的化合物，其中所述3′-硫代磷酸酯具有Sp的手性。
111.权利要求78至107中任一项所述的化合物，其中X5′具有手性为Rp的3′-硫代磷酸酯基团，并且X3′为2′-甲氧基核糖核苷酸或2′-乙氧基甲氧基核糖核苷酸。
112.权利要求78至107中任一项所述的化合物，其中，X5′具有Sp的手性的3′-硫代磷酸酯基团，并且X3′是2′-甲氧基核糖核苷酸或2′-乙氧基甲氧基核糖核苷酸。
113.权利要求78至112中任一项所述的化合物，其包含另外的核苷间磷酸三酯。
114.权利要求113所述的化合物，其中所述另外的核苷间磷酸三酯是烷基磷酸三酯。
115.权利要求113所述的化合物，其中所述另外的核苷间磷酸三酯是乙基磷酸三酯。
116.权利要求78至115中任一项所述的化合物，其包含一个5-卤代2'-脱氧尿苷。
117.权利要求116所述的化合物，其中5-卤代-2′-脱氧尿苷是5-溴-2′-脱氧尿苷或5-碘-2′-脱氧尿苷。
118.权利要求78至117中任一项所述的化合物，其包含三个或更多个2'-脱氧胞苷。
119.权利要求118所述的化合物，其包含三个2'-脱氧胞苷。
120.权利要求78至119中任一项所述的化合物，其包含四个或更多个2'-脱氧鸟苷。
121.权利要求120所述的化合物，其包含四个2′-脱氧鸟苷。
122.权利要求78至121中任一项所述的化合物，其包含三个2'-脱氧胞苷和四个2'-脱氧胞苷。
123.权利要求78至122中任一项所述的化合物，其包含三个或更多个2′-脱氧胸苷。
124.权利要求123所述的化合物，其包含三个，四个，五个，六个，七个或八个2'-脱氧胸苷。
125.权利要求123所述的化合物，其包含三个，四个，五个或八个2'-脱氧胸苷。
126.权利要求78至125中任一项所述的化合物，其包含零，一或两个2′-脱氧腺苷。
127.权利要求74至126中任一项所述的化合物，其包含一个或多个核苷间硫代磷酸酯。
128.权利要求127所述的化合物，其中所述核苷间硫代磷酸酯中的至少一个是手性的。
129.具有N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T序列的寡核苷酸，其中：
x为1至4的整数；
N1为不存在或2'-脱氧胸苷；
N2是具有修饰核碱基的2'-脱氧核糖核苷酸；
N3是2′-脱氧腺苷或2′-脱氧胸苷，各自任选地包含3′-磷酸三酯；
N4为2′-脱氧腺苷或2′-脱氧胸苷；和
N5是任选地包含3′-磷酸三酯的2′-脱氧胸苷。
130.权利要求129所述的寡核苷酸，其中x是1或4的整数。
131.权利要求129或130所述的寡核苷酸，其中x是1的整数。
132.权利要求129至140中任一项所述的寡核苷酸，其中N1不存在。
133.权利要求129至140中任一项所述的寡核苷酸，其中N1是2′-脱氧胸苷。
134.权利要求129至142中任一项所述的寡核苷酸，其中N2是具有取代的嘧啶碱基的2′-脱氧核糖核苷酸。
135.权利要求143所述的寡核苷酸，其中N2是具有5-取代的嘧啶碱基的2'-脱氧核糖核苷酸。
136.权利要求143所述的寡核苷酸，其中N2是5-卤代-2′-脱氧胞苷或5-卤代-2′-脱氧尿苷。
137.权利要求143所述的寡核苷酸，其中N2是5-溴-2'-脱氧尿苷或5-碘-2'-脱氧尿苷。
138.权利要求129至146中任一项所述的寡核苷酸，其中N3是包含3′-磷酸三酯的2′-脱氧腺苷。
139.权利要求129至146中任一项所述的寡核苷酸，其中N3是2’-脱氧胸苷。
140.权利要求129至146中任一项所述的寡核苷酸，其中N3是包含3′-磷酸三酯的2′-脱氧胸苷。
141.权利要求129至149中任一项所述的寡核苷酸，其中N4是2′-脱氧腺苷。
142.权利要求129至149中任一项所述的寡核苷酸，其中N4是2’-脱氧胸苷。
143.权利要求129至151中任一项所述的寡核苷酸，其中N5是2′-脱氧胸苷。
144.权利要求129至151中任一项所述的寡核苷酸，其中N5是包含3′-磷酸三酯的2′-脱氧胸苷。
145.权利要求129至153中任一项所述的寡核苷酸，其包含一个或多个核苷间硫代磷酸酯。
146.权利要求154所述的寡核苷酸，其中所述核苷间硫代磷酸酯中的至少一个是手性的。
147.权利要求129所述的寡核苷酸，其具有SEQ ID NO：p236，p238，p243，p246，p275，p276，p308，p313，p347，p361，p362，p425，p433，p434，p435，p436，p437，p438，p477，p478，p479，p480，p481，p482，p483，p484，p485，p486，p487，p488或p489的序列。
148.包含一个或多个无碱基间隔子或核苷间磷酸三酯的免疫调节多核苷酸。
149.权利要求157所述的免疫调节多核苷酸，其中所述免疫调节多核苷酸包含5-卤代尿苷。
150.权利要求158所述的免疫调节多核苷酸，其中所述5-卤代尿苷是两个5′-末端核苷中的至少一个或存在于免疫调节多核苷酸中的免疫刺激序列(ISS)中。
151.权利要求158或159所述的免疫调节多核苷酸，其中所述5-卤代尿苷是5-溴代尿苷。
152.权利要求158或159所述的免疫调节多核苷酸，其中5-卤代尿苷是5-碘代尿苷。
153.权利要求158至161中任一项所述的免疫调节多核苷酸，其中所述5-卤代尿苷包含键接至核苷间磷酸二酯磷酸酯的3′-位。
154.权利要求158至161中任一项所述的免疫调节多核苷酸，其中，所述5-卤代尿苷包含键接至核苷间磷酸二酯硫代磷酸酯的3′-位。
155.包含5’-末端5-溴尿苷的免疫调节多核苷酸。
156.权利要求157至161中任一项所述的免疫调节多核苷酸，其中所述免疫调节多核苷酸包含一个或多个核苷间磷酸三酯。
157.权利要求165所述的免疫调节多核苷酸，其中所述一个或多个核苷间磷酸三酯为1-5个。
158.权利要求165或166所述的免疫调节多核苷酸，其中所述核苷间磷酸三酯的至少一个包含缀合基团。
159.权利要求165或166所述的免疫调节多核苷酸，其中所述核苷间磷酸三酯中的至少一个是包含缀合基团的硫代磷酸三酯。
160.权利要求157至168中任一项所述的免疫调节多核苷酸，其进一步包含末端磷酸酯。
161.权利要求169所述的免疫调节多核苷酸，其特征在于，所述末端磷酸酯是5′-末端磷酸酯。
162.权利要求169所述的免疫调节多核苷酸，其中所述末端磷酸酯是3′-末端磷酸酯。
163.权利要求169至171中任一项所述的免疫调节多核苷酸，其中所述末端磷酸酯包含缀合基团。
164.权利要求172所述的免疫调节多核苷酸，其中，所述末端磷酸酯是包含缀合基团的硫代磷酸三酯。
165.权利要求157至173中任一项所述的免疫调节多核苷酸，其包含5'端帽或3'端帽。
166.权利要求174所述的免疫调节多核苷酸，其中所述免疫调节多核苷酸包含5′-端帽，所述5′-端帽是5′-5′的端帽。
167.权利要求175所述的免疫调节多核苷酸，其中5’-5’端帽包含缀合基团，所述缀合基团共价键接至核苷间磷酸酯、核苷间硫代磷酸酯或核苷间二硫代磷酸酯。
168.权利要求174所述的免疫调节多核苷酸，其中所述免疫调节多核苷酸包含3′-端帽，所述3′-端帽包含缀合基团，所述缀合基团共价键接至核苷间磷酸酯、核苷间硫代磷酸酯或核苷间二硫代磷酸酯。
169.权利要求157至177中任一项所述的免疫调节多核苷酸，其中所述免疫调节多核苷酸包含5′-末端免疫刺激序列。
170.权利要求178所述的免疫调节多核苷酸，其中至少一个核苷间磷酸三酯键接至具有5′-碳原子的核苷的3′-碳原子，所述5′-碳原子键接至5′-端免疫刺激序列。
171.权利要求157至179中任一项所述的免疫调节多核苷酸，其中所述免疫调节多核苷酸包含一个或多个无碱基间隔子。
172.权利要求157至180中任一项所述的免疫调节多核苷酸，其中所述一个或多个无碱基间隔子是一个或两个无碱基间隔子。
173.权利要求157至181中任一项所述的免疫调节多核苷酸，其中，所述无碱基间隔子中的至少一个是核苷间无碱基间隔子。
174.权利要求157至182中任一项所述的免疫调节多核苷酸，其中至少一个无碱基间隔子是3’-末端无碱基间隔子。
175.权利要求157至183中任一项所述的免疫调节多核苷酸，其中所述无碱基间隔子中的至少一个包含缀合基团。
176.权利要求157至184中任一项所述的免疫调节多核苷酸，其中该免疫调节多核苷酸包含总共6至16个核苷酸。
177.权利要求157至185中任一项所述的免疫调节多核苷酸，其中所述免疫调节多核苷酸中至少50％的核苷间桥连基团包含硫代磷酸酯。
178.权利要求186所述的免疫调节多核苷酸，其中所述免疫调节多核苷酸中至少80％的核苷间桥连基团包含硫代磷酸酯。
179.权利要求157至187中任一项所述的免疫调节多核苷酸，其进一步包含缀合基团，所述缀合基团共价结合至所述免疫调节多核苷酸中的核碱基。
180.权利要求157或188所述的免疫调节多核苷酸，其中所述免疫调节多核苷酸包含胞苷和鸟苷作为第二和第三核苷。
181.权利要求157或189所述的免疫调节多核苷酸，其中所述免疫调节多核苷酸包含胞苷和鸟苷作为第三和第四核苷。
182.权利要求157至190中任一项所述的免疫调节多核苷酸，其还包含一个或多个辅助部分。
183.权利要求191所述的免疫调节多核苷酸，其中所述免疫调节多核苷酸包含缀合部分，并且其中所述缀合部分包含所述辅助部分中的至少一个。
184.权利要求191或192所述的免疫调节多核苷酸，其中所述辅助部分中的至少一个包含分子量为100Da至2，500Da的聚(乙二醇)(PEG)。
185.权利要求193所述的免疫调节多核苷酸，其中每个PEG独立地包含总共至少3个乙二醇重复单元。
186.权利要求193或194所述的免疫调节多核苷酸，其中每个PEG独立地包含总共至少20个乙二醇重复单元。
187.权利要求193至195中任一项所述的免疫调节多核苷酸，其中每个PEG独立地包含总共50个或更少的乙二醇重复单元。
188.权利要求191至196中任一项所述的免疫调节多核苷酸，其中所述免疫调节多核苷酸包含1至8个PEG。
189.权V利要求157至197中任一项所述的免疫调节多核苷酸，其包含选自单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、辅助部分、末端磷酸二酯、末端磷酸三酯、5'-5'端帽和-OR'基团的5'封端基团，其中R'选自生物可逆基团、非生物可逆基团和O-保护基团。
190.权利要求198所述的免疫调节多核苷酸，其中5’-封端基团是单磷酸酯或末端磷酸二酯，其包含与磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键接的任选取代的C1-6烷基。
191.权利要求157至199中任一项所述的免疫调节多核苷酸，其包含选自单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、辅助部分、末端磷酸二酯、末端磷酸三酯和-OR'基团的3'封端基团，其中R'选自生物可逆基团、非生物可逆基团和O-保护基团。
192.权利要求200所述的免疫调节多核苷酸，其中3’-封端基团是单磷酸酯或末端磷酸二酯，其包含与磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键接的任选取代的C1-6烷基。
193.权利要求157至201中任一项所述的免疫调节多核苷酸，其包含结合至缀合部分的核碱基。
194.一种杂交的免疫调节多核苷酸，其包含与互补多核苷酸杂交的权利要求157至202中任一项所述的免疫调节多核苷酸。
195.一种包含权利要求157至203中任一项所述的免疫调节多核苷酸的组合物，其中所述免疫调节多核苷酸包含至少一个立体化学富集的核苷间硫代磷酸酯。
196.权利要求204所述的组合物，其中至少一个立体化学富集的核苷间硫代磷酸酯位于免疫刺激多核苷酸中的免疫刺激序列的CpG的5′-末端核苷和胞苷之间。
197.权利要求204或205所述的组合物，其中所述立体化学富集的核苷间硫代磷酸酯是S-立体异构的。
198.权利要求204或205所述的组合物，其中所述立体化学富集的核苷间硫代磷酸酯是R-立体异构的。
199.权利要求204至207中任一项所述的组合物，其中至少一个立体化学富集的核苷间硫代磷酸酯结合至免疫调节多核苷酸中的免疫刺激序列的CpG的胞苷的5′-碳原子。
200.权利要求208所述的组合物，其中所述立体化学富集的核苷间硫代磷酸酯是S-立体异构的。
201.权利要求208所述的组合物，其中所述立体化学富集的核苷间硫代磷酸酯是R-立体异构的。
202.权利要求204至210中任一项所述的组合物，其中一个立体化学富集的核苷间硫代磷酸酯连接所述免疫调节多核苷酸中的第一和第二核苷。
203.权利要求211所述的组合物，其中所述立体化学富集的核苷间硫代磷酸酯是S-立体异构的。
204.权利要求211所述的组合物，其中所述立体化学富集的核苷间硫代磷酸酯是R-立体异构的。
205.权利要求204至222中任一项所述的组合物，其中一个立体化学富集的核苷间硫代磷酸酯连接所述免疫调节多核苷酸中的第四和第五核苷。
206.权利要求214所述的组合物，其中所述立体化学富集的核苷间硫代磷酸酯是S-立体异构的。
207.权利要求214所述的组合物，其中所述立体化学富集的核苷间硫代磷酸酯是R-立体异构的。
208.一种缀合物，其包含抗体或抗体片段和一个或多个免疫调节多核苷酸，所述抗体或抗体片段包含Q-标签，并且每个所述免疫调节多核苷酸独立地包含与所述Q-标签共价键接的接头。
209.权利要求217所述的缀合物，其中所述Q标签是N末端Q-标签。
210.权利要求217所述的缀合物，其中所述Q标签是C端Q-标签。
211.权利要求217至219中任一项所述的缀合物，其中所述Q-标签位于所述抗体或所述抗体片段的重链中。
212.权利要求217至219中任一项所述的缀合物，其中所述Q-标签位于所述抗体或所述抗体片段的轻链中。
213.权利要求217至221中任一项所述的缀合物，其中所述免疫调节多核苷酸中的至少一个包含5-修饰的尿苷或5-修饰的胞苷。
214.一种缀合物，其包含靶向部分和一个或多个免疫调节多核苷酸，所述免疫调节多核苷酸中的每一个独立地包含接头，其中所述靶向部分与所述接头共价键接，其中所述免疫调节多核苷酸中的至少一个包含5-修饰的尿苷或5-修饰的胞苷。
215.权利要求222或223所述的缀合物，其中所述免疫调节多核苷酸中的至少一个包含5-修饰的尿苷。
216.权利要求224所述的缀合物，其中所述5-修饰的尿苷是5-卤代尿苷、5-炔基尿苷或5-杂环基尿苷。
217.权利要求225所述的缀合物，其中所述5-修饰的尿苷是5-卤代尿苷。
218.权利要求225或226所述的缀合物，其中所述5-卤代尿苷是5-溴代尿苷。
219.权利要求225或226所述的缀合物，其中所述5-卤代尿苷是5-碘代尿苷。
220.权利要求222至228中任一项所述的缀合物，其中所述5-修饰的尿苷是所述免疫调节多核苷酸中的至少一个的两个5′-末端核苷酸之一。
221.权利要求222至229中任一项所述的缀合物，其中所述5-修饰的尿苷包含键接至核苷间磷酸酯磷酸酯的3′-位。
222.权利要求222至229中任一项所述的缀合物，其中所述5-修饰的尿苷包含键接至核苷间磷酸酯硫代磷酸酯的3′-位。
223.权利要求217至231中任一项所述的缀合物，其中所述免疫调节多核苷酸中的至少一个包含胞苷和鸟苷作为第二和第三核苷。
224.权利要求217至231中任一项所述的缀合物，其中所述免疫调节多核苷酸中的至少一个包含胞苷和鸟苷作为第三和第四核苷。
225.权利要求217至233中任一项所述的缀合物，其中所述免疫调节多核苷酸中的至少一个包含总共6至16个核苷酸。
226.一种缀合物，其包含靶向部分和一个或多个免疫调节多核苷酸，每个所述免疫调节多核苷酸独立地包含接头，其中所述靶向部分与所述接头共价键接，所述免疫调节多核苷酸中的至少一个包含总共6至16个核苷酸。
227.权利要求217至235中任一项所述的缀合物，其中所述免疫调节多核苷酸中的至少一个包含一个或多个无碱基间隔子或核苷间磷酸三酯。
228.一种缀合物，其包含靶向部分和一个或多个免疫调节多核苷酸，每个所述免疫调节多核苷酸独立地包含接头，其中所述靶向部分与所述接头共价键接，所述免疫调节多核苷酸中的至少一个包含一个或多个无碱基间隔子或核苷间磷酸三酯。
229.权利要求237所述的缀合物，其中至少一个无碱基间隔子或至少一个磷酸三酯包含所述接头。
230.权利要求217至238中任一项所述的缀合物，其中所述免疫调节多核苷酸中的至少一个包含一个或多个无碱基间隔子。
231.权利要求239所述的缀合物，其中所述一个或多个核苷间无碱基间隔子是一个或两个无碱基间隔子。
232.权利要求235至240中任一项所述的缀合物，其中所述无碱基间隔子中的至少一个是核苷间无碱基间隔子。
233.权利要求235至241中任一项所述的缀合物，其中所述无碱基间隔子中的至少一个是3′-末端无碱基间隔子。
234.权利要求217至242中任一项所述的缀合物，其中所述免疫调节多核苷酸中的至少一个包含一个或多个核苷间磷酸三酯。
235.权利要求243所述的缀合物，其中所述一个或多个核苷间磷酸三酯为1-5个。
236.权利要求217至244中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物还包含一个或多个键接至所述接头的辅助部分。
237.一种缀合物，其包含靶向部分、一个或多个辅助部分和一个或多个免疫调节多核苷酸，所述免疫调节多核苷酸中的每个独立地包含与所述靶向部分结合的接头。
238.权利要求245或246所述的缀合物，其中所述辅助部分中的至少一个包括分子量为100Da至2,500Da的聚(乙二醇)(PEG)。
239.权利要求247所述的缀合物，其中每个PEG独立地包含总共至少3个乙二醇重复单元。
240.权利要求247或248所述的缀合物，其中每个PEG独立地包含总共至少20个乙二醇重复单元。
241.权利要求247至249中任一项所述的缀合物，其中每个PEG独立地包含总共50个或更少的乙二醇重复单元。
242.权利要求247至250中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物包含1至8个PEG。
243.权利要求217至251中任一项所述的缀合物，其中所述靶向部分是抗原结合部分、多肽、适体或包括一个或多个小分子的基团。
244.权利要求252所述的缀合物，其中所述靶向部分是抗原结合部分。
245.权利要求252所述的缀合物，其中所述靶向部分是抗体或其抗原结合片段。
246.权利要求217至254中任一项所述的缀合物，其中至少一种所述免疫调节多核苷酸中的5'-封端基团选自单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、辅助部分、末端磷酸二酯、末端磷酸三酯和基团-OR'，其中R'选自生物可逆基团、非生物可逆基团和O-保护基。
247.权利要求255所述的缀合物，其中5'-封端基团是单磷酸酯或末端磷酸二酯，其包含与磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键接的任选取代的C1-6烷基。
248.权利要求217至256中任一项所述的缀合物，其中至少一个免疫调节多核苷酸中的3'-封端基团选自单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、辅助部分、末端磷酸二酯、末端磷酸三酯和基团-OR'，其中R'选自生物可逆基团、非生物可逆基团和O-保护基。
249.权利要求257所述的缀合物，其中所述3′-封端基团是单磷酸酯或末端磷酸二酯、其包含与磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键接的任选取代的C1-6烷基。
250.权利要求217至258中任一项所述的缀合物，其中免疫调节多核苷酸中的至少一个包含键接至所述接头的核碱基。
251.权利要求217至259中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物包含1-6个免疫调节多核苷酸。
252.权利要求260的缀合物，其中所述缀合物包含1-4个免疫调节多核苷酸。
253.权利要求261所述的缀合物，其中所述缀合物仅包含一个免疫调节多核苷酸。
254.权利要求262所述的缀合物，其中所述缀合物仅包含两个免疫调节多核苷酸。
255.权利要求217至263中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物包含一个靶向部分。
256.权利要求217至261中任一项所述的缀合物，其中所述免疫调节多核苷酸在四个5′-末端核苷酸内包含人免疫刺激序列。
257.权利要求265所述的缀合物，其中所述免疫调节多核苷酸的四个5'-末端核苷酸内的人类免疫刺激序列包含胞苷，所述胞苷包含与被核苷取代的磷酸酯键接的5'-碳原子。
258.权利要求217至266中任一项所述的缀合物，其中所述免疫调节多核苷酸中的至少一个包含5-修饰的尿苷或5-修饰的胞苷。
259.权利要求217至267中任一项所述的缀合物，其中所述免疫调节多核苷酸的至少一个与其互补序列杂交。
260.一种包含v权利要求217至268中任一项所述的缀合物的组合物，其中所述免疫调节多核苷酸中的至少一个包含至少一个立体化学富集的核苷间硫代磷酸酯。
261.一种组合物，其包含包含靶向部分和一个或多个免疫调节多核苷酸的缀合物，每个所述免疫调节多核苷酸独立地包含接头，其中所述靶向部分与所述接头共价键接，所述免疫调节多核苷酸中的至少一个包含至少一个立体化学富集的核苷硫代磷酸酯。
262.权利要求269或270所述的组合物，其中至少一个立体化学富集的核苷间硫代磷酸酯位于免疫调节多核苷酸中的免疫刺激序列中的CpG的5′-末端核苷和胞苷之间。
263.权利要求269至271中任一项所述的组合物，其中所述立体化学富集的核苷间硫代磷酸酯是S-立体异构的。
264.权利要求269至272中任一项所述的组合物，其中所述立体化学富集的核苷间硫代磷酸酯是R-立体异构的。
265.权利要求269至273中任一项所述的组合物，其中至少一个立体化学富集的核苷间硫代磷酸酯键接至免疫调节多核苷酸中的免疫刺激序列的CpG胞苷的5′-碳原子。
266.权利要求274所述的组合物，其中所述立体化学富集的核苷间硫代磷酸酯是S-立体异构的。
267.权利要求274所述的组合物，其中所述立体化学富集的核苷间硫代磷酸酯是R-立体异构的。
268.权利要求269至276中任一项所述的组合物，其中至少一个立体化学富集的核苷间硫代磷酸酯连接所述免疫调节多核苷酸中的所述第一和第二核苷。
269.权利要求277所述的组合物，其中所述立体化学富集的核苷间硫代磷酸酯是S-立体异构的。
270.权利要求277所述的组合物，其中所述立体化学富集的核苷间硫代磷酸酯是R-立体异构的。
271.权利要求269至279中任一项所述的组合物，其中至少一个立体化学富集的核苷间硫代磷酸酯连接免疫调节多核苷酸中的第四和第五核苷。
272.权利要求280所述的组合物，其中所述立体化学富集的核苷间硫代磷酸酯是S-立体异构的。
273.权利要求280所述的组合物，其中所述立体化学富集的核苷间硫代磷酸酯是R-立体异构的。
274.一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和权利要求157至203中任一项所述的免疫调节多核苷酸、权利要求204至216中任一项所述的组合物、权利要求217至268中任一项所述的缀合物或权利要求269至282中任一项所述的组合物。
275.一种在细胞内调节内体toll样受体的方法，所述细胞包含所述内体toll样受体，所述方法包括使所述细胞与权利要求157至203中任一项所述的免疫调节多核苷酸、权利要求204至216中任一项所述的组合物、权利要求217至268中任一项所述的缀合物、权利要求269至282中任一项所述的组合物或权利要求283所述的药物组合物在允许所述免疫调节性多核苷酸转运到细胞中的条件下接触，其中，在接触后，所述内体toll-样受体的活受到调节。
276.权利要求284所述的方法，其中所述免疫调节多核苷酸是免疫刺激多核苷酸，并且其中所述方法用于激动内体toll样受体。
277.权利要求283所述的方法，其中所述免疫调节多核苷酸是免疫抑制多核苷酸，并且其中所述方法用于拮抗内体toll样受体。
278.一种在包含内体toll样受体的抗原呈递细胞中诱导一个或多个细胞因子的方法，所述方法包括使所述抗原呈递细胞与权利要求157至203中任一项所述的免疫调节多核苷酸、权利要求204至216中任一项所述的组合物、权利要求217至268中任一项所述的缀合物、权利要求269至282中任一项所述的组合物或权利要求283所述的药物组合物在允许将一个或多个所述免疫调节多核苷酸转运到所述细胞中的条件下接触，其中在接触后，所述细胞中至少一个细胞因子的水平增加，并且其中所述靶向部分靶向所述抗原呈递细胞，其中所述免疫调节多核苷酸是免疫刺激多核苷酸。
279.权利要求287所述的方法，其中所述抗原呈递细胞是B细胞。
280.权利要求287或288所述的方法，其中所述一个或多个细胞因子中的至少一个是炎性细胞因子。
281.权利要求287所述的方法，其中所述抗原呈递细胞是浆细胞样树突细胞，并且其中所述靶向部分识别所述浆细胞样树突细胞。
282.权利要求287所述的方法，其中所述抗原呈递细胞是巨噬细胞。
283.权利要求287所述的方法，其中所述细胞因子中的至少一个是I型干扰素。
284.权利要求284至292中任一项所述的方法，其中所述toll-样受体是TLR9。
285.一种治疗患者中的液体肿瘤的方法，该方法包括向患者施用有效量的权利要求1至45中任一项所述的免疫调节多核苷酸、权利要求157至203中任一项所述的组合物、权利要求204至216中任一项所述的组合物、权利要求217至268中任一项所述的缀合物、权利要求269至282中任一项所述的组合物或权利要求283所述的药物组合物，其中所述靶向部分靶向B细胞，并且其中所述免疫调节多核苷酸是作为TLR9激动剂的免疫刺激多核苷酸。
286.权利要求294所述的方法，其中所述液体肿瘤是血液肿瘤。
287.权利要求295所述的方法，其中所述血液肿瘤是淋巴瘤。
288.权利要求296所述的方法，其中所述淋巴瘤是非霍奇金B细胞淋巴瘤。
289.权利要求297所述的方法，其中所述淋巴瘤是套细胞淋巴瘤，弥漫大B细胞淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤，慢性淋巴细胞白血病或多发性骨髓瘤。
290.一种治疗患者实体瘤的方法，该方法包括向患者施用权利要求157至203中任一项所述的免疫调节多核苷酸、权利要求204至216中任一项所述的组合物、权利要求217至268中任一项所述的缀合物、权利要求269至282中任一项所述的组合物或权利要求283所述的药物组合物，其中所述靶向部分靶向浆细胞样树突细胞，并且其中所述免疫调节多核苷酸是作为TLR9激动剂的免疫刺激多核苷酸。
291.权利要求157至203中任一项所述的免疫调节多核苷酸，其中所述免疫调节多核苷酸是免疫刺激多核苷酸。
292.权利要求217至268中任一项所述的缀合物，其中所述免疫调节多核苷酸是免疫刺激多核苷酸。
293.权利要求204至216和269至282中任一项所述的组合物，其中所述免疫调节多核苷酸是免疫刺激多核苷酸。
294.权利要求283所述的药物组合物，其中所述免疫调节多核苷酸是免疫刺激多核苷酸。
295.权利要求1至45中任一项所述的免疫调节多核苷酸，其中所述免疫调节多核苷酸是免疫抑制多核苷酸。
296.权利要求217至268中任一项所述的缀合物，其中所述免疫调节多核苷酸是免疫抑制多核苷酸。
297.权利要求204至216和269至282中任一项所述的组合物，其中所述免疫调节多核苷酸是免疫抑制多核苷酸。
298.权利要求283所述的药物组合物，其中所述免疫调节多核苷酸是免疫抑制多核苷酸。
299.一种在患有癌症的对象中治疗癌症的方法，该方法包括给予对象治疗有效量的权利要求157至203中任一项所述的免疫调节多核苷酸、权利要求204至216中任一项所述的组合物、权利要求217至268任一项所述的缀合物、权利要求269至282中任一项所述的组合物或权利要求283所述的药物组合物。
300.权利要求308所述的方法，其中所述癌症是液体肿瘤。
301.权利要求309所述的方法，其中所述液体肿瘤是血液肿瘤。
302.权利要求310所述的方法，其中所述血液肿瘤是淋巴瘤。
303.权利要求311所述的方法，其中所述淋巴瘤是非霍奇金B细胞淋巴瘤，套细胞淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤，慢性淋巴细胞白血病或多发性骨髓瘤。
304.权利要求308所述的方法，其中所述癌症是实体瘤。
305.权利要求313所述的方法，其中所述实体瘤是结肠癌，黑色素瘤或头颈癌。
306.权利要求308所述的方法，其中所述靶向部分是抗体或抗体片段。
307.权利要求308至315中任一项所述的方法，其中所述靶向部分结合抗原呈递细胞(APC)上的抗原。
308.权利要求316所述的方法，其中所述APC是B细胞，浆细胞样树突细胞(pDC)或巨噬细胞。
309.权利要求316所述的方法，其中所述抗原是CD19，CD20，CD22，CD30，CD38，CD79或CD79b，CD205，BDCA2，BDCA4或PD-L1。
310.权利要求308至318中任一项所述的方法，其中该缀合物是全身性施用的。
311.权利要求319所述的方法，其中所述缀合物通过静脉内注射(i.v.)施用。
312.权利要求308至320中任一项所述的方法，其中所述免疫调节多核苷酸是TLR9激动剂。
313.权利要求308至311中任一项所述的方法，其中，所述量有效地提高针对癌症的适应性免疫应答。
314.权利要求322所述的方法，其中所述量有效地增加细胞介导的免疫。
315.权利要求322所述的方法，其中所述量可有效增加实体瘤中的T细胞肿瘤浸润。
316.权利要求324所述的方法，其中所述T细胞是CD4+或CD8+T细胞。
317.权利要求322所述的方法，其中所述量可有效提高患者体内持续的抗肿瘤免疫。
318.权利要求308至326中任一项所述的方法，其中所述量可有效抑制对象中的肿瘤生长或减小肿瘤尺寸。
319.权利要求308至327中任一项所述的方法，其中所述缀合物的施用相对于未缀合形式的所述免疫调节多核苷酸的施用导致对象中炎性细胞因子的更少的增加。
320.权利要求328所述的方法，其中所述炎性细胞因子是IL-6，IL-10或TNFγ。
321.权利要求308至329中任一项所述的方法，其中所述量对于激活所述对象中的补体途径无效。
322.权利要求330所述的方法，其中所述量对于激活所述对象中的补体C3无效。
323.权利要求308至331中任一项所述的方法，其中所述癌症是检查点抑制剂复发性或难治性癌症。
324.权利要求332所述的方法，其中所述检查点抑制剂是PD-1抑制剂，PD-L1抑制剂或CTLA-4抑制剂。
325.权利要求308至333中任一项所述的方法，包括向所述对象施用检查点抑制剂。
326.权利要求334所述的方法，其中检查点抑制剂是PD-1抑制剂，PD-L1抑制剂或CTLA-4抑制剂。
327.权利要求334所述的方法，其中，所述检查点抑制剂是抗PD1抗体，抗PD-L1抗体或抗CTLA-4抗体。
328.权利要求308至336中任一项所述的方法，包括向所述对象施用T细胞激动剂。
329.权利要求337所述的方法，其中所述T细胞激动剂是OX-40，ICOS或4-1BB激动剂。
330.一种在患有癌症的对象中治疗非B细胞肿瘤的方法，包括给予对象治疗有效量的权利要求1至45中任一项所述的免疫调节多核苷酸、权利要求46至58中任一项所述的组合物、权利要求157至203中任一项所述的缀合物、权利要求204至216中任一项所述的组合物、权利要求217至268中任一项所述的缀合物、权利要求269至282中任一项所述的组合物或权利要求283所述的药物组合物，其中所述靶向部分与B细胞抗原结合。
331.一种在患有癌症的对象中治疗实体瘤的方法，包括给予治疗有效量的权利要求157至203中任一项所述的免疫调节多核苷酸、权利要求204至216中任一项所述的组合物、权利要求217至268任一项所述的缀合物、权利要求269至282的任一项所述的组合物或权利要求283所述的药物组合物，其中所述靶向部分结合B细胞抗原。
332.一种在患有癌症的对象中治疗液体肿瘤的方法，其包括给对象施用治疗有效量的权利要求157至203中任一项所述的免疫调节多核苷酸、权利要求204至216中任一项所述的组合物、权利要求217至268的任一项所述的缀合物、权利要求269至282的任一项所述的组合物或权利要求283所述的药物组合物，其中所述靶向部分结合APC抗原。
333.权利要求341所述的方法，其中所述APC抗原是pDC或巨噬细胞抗原。
334.一种在患有癌症的对象中治疗癌症的方法，该方法包括给予对象治疗有效量的权利要求157至203中任一项所述的免疫调节多核苷酸、权利要求204至216中任一项所述的组合物、权利要求217至268中任一项所述的缀合物、权利要求269至282中任一项所述的组合物或权利要求283所述的药物组合物和检查点抑制剂。
335.权利要求343所述的方法，其中所述检查点抑制剂是PD-1抑制剂，PD-L1抑制剂或CTLA-4抑制剂。
336.权利要求344所述的方法，其中所述检查点抑制剂是抗PD1抗体，抗PD-L1抗体或抗CTLA-4抗体。
337.一种在患有癌症的对象中治疗癌症的方法，该方法包括给予治疗有效量的权利要求157至203中任一项所述的免疫调节多核苷酸、权利要求204至216中任一项所述的组合物、权利要求217至268中任一项所述的缀合物、权利要求269至282中任一项所述的组合物或权利要求283所述的药物组合物和T细胞激动剂。
338.权利要求346所述的方法，其中所述T细胞激动剂是OX-40，ICOS或4-1BB激动剂。
339.一种药物组合物，其包含权利要求157至203中任一项所述的免疫调节多核苷酸、权利要求204至216中任一项所述的组合物、权利要求217至268中任一项所述的缀合物、权利要求269至282中任一项所述的组合物或权利要求283所述的药物组合物，或权利要求125所述的药物组合物和检查点抑制剂。
340.权利要求348所述的药物组合物，其进一步包含药学上可接受的赋形剂或溶剂。
341.药物组合物，其包含权利要求157至203中任一项所述的免疫调节多核苷酸、权利要求204至216中任一项所述的组合物、权利要求217至268中任一项所述的缀合物、权利要求269至282中任一项所述的组合物，或权利要求283所述的药物组合物和T细胞激动剂。
342.权利要求350的药物组合物，其进一步包含药学上可接受的赋形剂或溶剂。
343.权利要求157至203中任一项所述的免疫调节多核苷酸、权利要求204至216中任一项所述的组合物、权利要求217至268中任一项所述的缀合物、权利要求269至282中任一项所述的组合物或权利要求283所述的药物组合物，其中所述靶向部分与APC抗原结合，并且其中所述缀合物能够抑制对象中的液体肿瘤或实体瘤的增殖。
344.权利要求157至203中任一项所述的免疫调节多核苷酸、权利要求204至216中任一项所述的组合物、权利要求217至268中任一项所述的缀合物、权利要求269至282中任一项所述的组合物或权利要求283所述的药物组合物，其中所述靶向部分结合B细胞抗原，并且其中所述缀合物能够抑制对象中B细胞肿瘤的增殖。
345.权利要求157至203中任一项所述的免疫调节多核苷酸、权利要求204至216中任一项所述的组合物、权利要求217至268中任一项所述的缀合物、权利要求269至282中任一项所述的组合物或权利要求283所述的药物组合物，其中所述靶向部分结合B细胞抗原，并且其中所述缀合物能够抑制对象中非B细胞肿瘤的增殖。
346.权利要求157至203中任一项所述的免疫调节多核苷酸、权利要求204至216中任一项所述的组合物、权利要求217至268中任一项所述的缀合物、权利要求269至282中任一项所述的组合物或权利要求283所述的药物组合物，其中所述靶向部分结合B细胞抗原，并且其中所述缀合物能够抑制对象中实体瘤的增殖。
347.权利要求157至203中任一项所述的免疫调节多核苷酸、权利要求204至216中任一项所述的组合物、权利要求217至268中任一项所述的缀合物、权利要求269至282中任一项所述的组合物或权利要求283所述的药物组合物，其中所述靶向部分与pDC或巨噬细胞抗原结合，并且其中所述缀合物能够抑制对象中的液体肿瘤的增殖。
348.权利要求157至203中任一项所述的免疫调节多核苷酸、权利要求204至216中任一项所述的组合物、权利要求217至268中任一项所述的缀合物、权利要求269至282中任一项的组合物或权利要求283所述的药物组合物，其中所述靶向部分与pDC或巨噬细胞抗原结合，并且其中所述缀合物能够在对象中抑制实体瘤的增殖。
349.权利要求157至203中任一项所述的免疫调节多核苷酸、权利要求204至216中任一项所述的组合物、权利要求217至268中任一项所述的缀合物、权利要求269至282中任一项所述的组合物或权利要求283所述的药物组合物，其中所述缀合物能够增加细胞介导的免疫。
350.权利要求157至203中任一项所述的免疫调节多核苷酸、权利要求204至216中任一项所述的组合物、权利要求217至268中任一项所述的缀合物、权利要求269至282中任一项所述的组合物或权利要求283所述的药物组合物，其中所述缀合物能够增加对象的T细胞肿瘤浸润。
351.权利要求157至203中任一项所述的免疫调节多核苷酸、权利要求204至216中任一项所述的组合物、权利要求217至268中任一项所述的缀合物、权利要求269至282中任一项所述的组合物或权利要求283所述的药物组合物，其中所述T细胞是CD4+或CD8+T细胞。
352.权利要求157至203中任一项所述的免疫调节多核苷酸、权利要求204至216中任一项所述的组合物、权利要求217至268中任一项所述的缀合物、，权利要求269至282中任一项所述的组合物或权利要求283所述的药物组合物，其中所述缀合物能够在对象中提高适应抗肿瘤免疫。
353.权利要求157至203中任一项所述的免疫调节多核苷酸、权利要求204至216中任一项所述的组合物、权利要求217至268中任一项所述的缀合物、权利要求269至282中任一项所述的组合物或权利要求283所述的药物组合物，其中所述缀合物能够刺激对象中的IFNγ分泌或表达。
354.权利要求157至203中任一项所述的免疫调节多核苷酸、权利要求204至216中任一项所述的组合物、权利要求217至268中任一项所述的缀合物、权利要求269至282中任一项所述的组合物或权利要求283所述的药物组合物，其中所述缀合物不激活对象的补体途径。
355.权利要求157至203中任一项所述的免疫调节多核苷酸、权利要求204至216中任一项所述的组合物、权利要求217至268中任一项所述的缀合物、权利要求269至282中任一项所述的组合物或权利要求283所述的药物组合物，其中所述缀合物不活化所述对象中的补体C3。
356.一种在患有癌症的对象中治疗癌症的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的CpG-Ab免疫缀合物，其中所述CpG-Ab免疫缀合物不结合肿瘤相关抗原(TAA)。
357.权利要求365所述的方法，其中所述CpG-Ab免疫缀合物特异结合至靶抗原，所述靶抗原与表达至少一个toll样受体的正常免疫细胞相关。
358.权利要求366所述的方法，其中所述正常免疫细胞表达TLR9。
359.权利要求366或367所述的方法，其中所述正常免疫细胞是抗原呈递细胞(APC)。
360.权利要求368所述的方法，其中所述APC是B细胞，树突状细胞或巨噬细胞。
361.权利要求369所述的方法，其中所述靶抗原选自MHC分子，T细胞共刺激分子，免疫检查点分子，B细胞特异抗原，树突细胞抗原特异抗原和巨噬细胞特异抗原。
362.权利要求370所述的方法，其中所述MHC分子选自I类MHC和II类MHC分子。
363.权利要求370或371所述的方法，其中所述T细胞共刺激分子选自OX40，CD2，CD27，CDS，ICAM-1，LFA-1/CD11a/CD18，ICOS/CD278、4-1BB/CD137，GITR，CD30，CD40，BAFFR，HVEM，CD7，LIGHT，NKG2C，SLAMF7，NKp80，CD160，B7-H3和CD83。
364.权利要求370至372中任一项所述的方法，其中所述免疫检查点分子选自PD-1，PD-L1，PD-L2，TIM-3，LAG-3，CEACAM-1，CEACAM-5，CLTA-4，VISTA，BTLA，TIGIT，LAIR1，CD47，CD160，2B4，CD172a和TGFR。
365.权利要求370至373中任一项所述的方法，其中所述靶抗原选自CD1，CD2，CD5，CD6，CD9，CD11，CD17，CD18，CD19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD24，CD25，CD26，CD27，CD30，CD38，CD40，CD44，CD45R(B220)，CD49，CD52，CD56，CD74，CD79b，CD93，CD123，CD138，CD163，CD205，CD206，CD274，CD303和CD304。
366.权利要求365至374中任一项所述的方法，其中所述CpG-Ab免疫缀合物包含选自表2的免疫刺激多核苷酸。
367.权利要求375所述的方法，其中所述CpG-Ab免疫缀合物包含选自p236，p238，p243，p246，p275，p276，p308，p313，p347，p361，p362，p425，p433，p434，p435，p436，p437，p438，p477，p478，p479，p480，p481，p482，p483，p484，p485，p486，p487，p488和p489的免疫刺激多核苷酸。
368.权利要求365至376中任一项所述的方法，其中所述CpG-Ab免疫缀合物不缀合至T细胞表位。
369.权利要求365至376中任一项所述的方法，其中所述T细胞表位是卵清蛋白(OVA)的表位。
370.一种在患有癌症的对象中治疗癌症的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的CpG-Ab免疫缀合物，其中所述CpG-Ab免疫缀合物与肿瘤相关抗原(TAA)特异结合，其中所述TAA不是选自CD19，CD20，CD22，STAT3，exportin7，Her2，Src，EGFR，CD52，CXCR-4，Muc-1和DNA的抗原。
371.权利要求379所述的方法，其中所述CpG-Ab免疫缀合物与所述TAA的结合促进所述CpG-Ab免疫缀合物在表达所述TAA的癌细胞内化。
372.权利要求379或380所述的方法，其中所述CpG-Ab免疫缀合物与所述TAA的结合促进所述CpG-Ab免疫缀合物向表达所述TAA的所述癌细胞的内体的转运。
373.权利要求379至381中任一项所述的方法，其中所述CpG-Ab免疫缀合物与TAA的结合促进表达所述TAA的癌细胞中TLR9信号传导途径的活化。
374.权利要求382所述的方法，其中所述TAA和所述TLR9位于表达所述TAA的所述癌细胞的同一细胞膜上。
375.权利要求383所述的方法，其中所述TAA和所述TLR9位于表达所述TAA的所述癌细胞的细胞膜上。
376.权利要求383的方法，其中所述TAA和所述TLR9位于表达所述TAA的所述癌细胞的内体膜上。
377.权利要求379至385中任一项所述的方法，其中所述CpG-Ab免疫缀合物与TAA的结合诱导表达所述TAA的所述癌细胞的凋亡。
378.权利要求379至386中任一项所述的方法，其中所述TAA不由正常免疫细胞表达。
379.权利要求379至386中任一项所述的方法，其中所述TAA由正常免疫细胞表达。
380.权利要求388所述的方法，其中所述正常免疫细胞是抗原呈递细胞(APC)。
381.权利要求379至389中任一项所述的方法，其中所述TAA选自CD8，CD11b，CD11c，CD14，CD33，CD40，CD123，CD157，CD168，CD169，CD172a，CD200，CD204，CD205，CD301，CD302，CD303，CD304，CD205和CD206。
382.权利要求379至390中任一项所述的方法，其中所述CpG-Ab免疫缀合物不缀合至所述TAA或所述癌症所表达的任何其他TAA。
383.权利要求379至391中任一项所述的方法，其中所述CpG-Ab免疫缀合物包含选自表2的免疫刺激多核苷酸。
384.权利要求392所述的方法，其中所述CpG-Ab免疫缀合物包含选自p236，p238，p243，p246，p275，p276，p308，p313，p347，p361，p362，p425，p433，p434，p435，p436，p437，p438，p477，p478，p479，p480，p481，p482，p483，p484，p485，p486，p487，p488和p489的免疫刺激多核苷酸。
385.权利要求379至393中任一项所述癌症所表达的的方法，其中所述CpG-Ab免疫缀合物不缀合至T细胞表位。
386.权利要求394所述的方法，其中所述T细胞表位是卵白蛋白(OVA)。
387.一种在患有免疫疗法抗性或难治性癌症的对象中治疗免疫疗法抗性或难治性癌症的方法，其包括向该对象施用治疗有效量的CpG-Ab免疫缀合物。
388.权利要求396所述的方法，其中所述CpG-Ab免疫缀合物不结合肿瘤相关抗原。
389.权利要求397所述的方法，其中所述CpG-Ab免疫缀合物特异结合至靶抗原，所述靶抗原与表达至少一个toll样受体的正常免疫细胞相关。
390.权利要求396所述的方法，其中所述CpG-Ab免疫缀合物特异结合肿瘤相关抗原。
391.权利要求396至399中任一项所述的方法，其中所述癌症对免疫检查点调节剂的治疗具有抗。
392.权利要求400所述的方法，其中所述方法进一步包括向所述对象共同施用所述免疫检查点调节剂。
393.权利要求396至401中任一项所述的方法，其中所述CpG-Ab免疫缀合物包含选自表2的免疫刺激多核苷酸。
394.权利要求402所述的方法，其中所述CpG-Ab免疫缀合物包含选自p236，p238，p243，p246，p275，p276，p308，p313，p347，p361，p362，p425，p433，p434，p435，p436，p437，p438，p477，p478，p479，p480，p481，p482，p483，p484，p485，p486，p487，p488和p489的免疫刺激多核苷酸。
395.一种在有需要的对象中预防癌症的方法，包括向该对象施用治疗有效量的CpG-Ab免疫缀合物，其中所述CpG-Ab免疫缀合物特异结合靶抗原，所述靶抗原与表达至少一个toll-样受体的正常免疫细胞相关。
396.权利要求404所述的方法，其进一步包括将肿瘤相关抗原与所述CpG-Ab免疫缀合物共同施用。
397.权利要求405所述的方法，其中所述CpG-Ab免疫缀合物不缀合至所述肿瘤相关抗原。
398.权利要求404至406中任一项所述的方法，其中所述正常免疫细胞表达TLR9。
399.权利要求404或407中任一项所述的方法，其中所述正常免疫细胞是抗原呈递细胞(APC)。
400.权利要求404至408中任一项所述的方法，其中所述CpG-Ab免疫缀合物包含选自表2的免疫刺激多核苷酸。
401.权利要求409所述的方法，其中所述CpG-Ab免疫缀合物包含选自p236，p238，p243，p246，p275，p276，p308，p313，p347，p361，p362，p425，p433，P434，P435，P436，P437，P438，P477，P478，P479，P480，P481，P482，P483，P484，P485，P486，P487，P488和P489的免疫刺激多核苷酸。
402.一种在有需要的对象中预防癌症的方法，其包括将治疗有效量的CpG-Ab免疫缀合物与癌症疫苗共同施用，其中所述CpG-Ab免疫缀合物特异结合靶抗原，所述靶抗原与表达至少一个toll-样受体的正常免疫细胞相关。
403.权利要求411的方法，其中将所述CpG-Ab免疫缀合物配制为所述癌症疫苗的佐剂。
404.一种在对象中诱导适应性免疫应答的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的CpG-Ab免疫缀合物，其中所述CpG-Ab免疫缀合物特异结合靶抗原，所述靶抗原与表达至少一个toll-样受体的正常免疫细胞相关。
405.权利要求413所述的方法，其中所述对象患有癌症。
406.权利要求414所述的方法，其中所述靶抗原不是TAA。
407.权利要求414所述的方法，其中所述靶抗原是TAA，其不是选自以下的抗原：CD19，CD20，CD22，STAT3，exportin7，Her2，Src，EGFR，CD52，CXCR-4，Muc-1和DNA。
408.权利要求414所述的方法，其中所述对象患有传染病。
409.权利要求413至417中任一项的方法，其中所述正常免疫细胞表达TLR9。
410.权利要求413至418中任一项的方法，其中所述正常免疫细胞是抗原呈递细胞(APC)。
411.权利要求413至419中任一项所述的方法，其中所述适应性免疫应答是CD8+T细胞依赖的。
412.权利要求413至420中任一项的方法，其中所述CpG-Ab免疫缀合物包含选自表2的免疫刺激多核苷酸。
413.权利要求421所述的方法，其中所述CpG-Ab免疫缀合物包含选自p236，p238，p243，p246，p275，p276，p308，p313，p347，p361，p362，p425，p433，p434，p435，p436，p437，p438，p477，p478，p479，p480，p481，p482，p483，p484，p485，p486，p487，p488和p489的免疫刺激多核苷酸。
414.一种在患有癌症的对象中治疗癌症的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的选自表6-A和6-B的CpG-Ab免疫缀合物。
415.权利要求423的方法，其中所述CpG-Ab免疫缀合物结合肿瘤相关抗原(TAA)。
416.权利要求423或424所述的方法，其中所述CpG-Ab免疫缀合物结合至不同于TAA的靶抗原。
417.权利要求423至425中任一项所述的方法，其中所述CpG-Ab免疫缀合物结合至靶抗原，所述靶抗原与表达TLR受体的正常免疫细胞相关。
418.权利要求423至426中任一项所述的方法，其中所述CpG-Ab免疫缀合物选自包括p236，p238，p243，p246，p275，p276，p308，p313，p347，p361，p362，p425，p433，p434，p435，p436，p437，p438，p477，p478，p479，p480，p481，p482，p483，p484，p485，p486，p487，p488和p489的CpG-Ab免疫缀合物的组。
419.权利要求356至427中任一项所述的方法，还包括共同施用治疗有效量的至少一个另外的癌症治疗剂。
420.权利要求428所述的方法，其中所述至少一个另外的癌症治疗剂选自第二TAA，T细胞共刺激分子和免疫检查点调节剂。
421.权利要求429所述的方法，其中，所述第二TAA与所述TAA相同。
422.权利要求429所述的方法，其中，所述第二TAA不同于所述TAA。
423.权利要求429至431中任一项所述的方法，其中所述T细胞共刺激分子选自OX40，CD2，CD27，CDS，ICAM-1，LFA-1/CD11a/CD18，ICOS/CD278，4-1BB/CD137，GITR，CD30，CD40，BAFFR，HVEM，CD7，LIGHT，NKG2C，SLAMF7，NKp80，CD160，B7-H3和CD83或其配体。
424.权利要求432所述的方法，其中所述T细胞共刺激分子是抗OX40抗体、抗ICOS/CD278抗体或抗4-1BB/CD137抗体或其抗原结合片段。
425.权利要求429至433中任一项所述的方法，其中所述免疫检查点调节剂是选自PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、LAG-3、CEACAM-1、CEACAM-5、CLTA-4、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD47、CD160、2B4、CD172a和TGFR的免疫检查点分子的抑制剂。
426.权利要求434所述的方法，其中所述免疫检查点调节剂是抗CD47抗体，抗PD-1抗体，抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。
427.权利要求365至435中任一项所述的方法，其中所述癌症是实体瘤。
428.权利要求365至435中任一项所述的方法，其中所述癌症是液体肿瘤。
429.权利要求365至437中任一项所述的方法，其中所述癌症是复发性癌症。
430.权利要求365至438中任一项所述的方法，其中所述施用或共同施用是通过全身施用。
431.权利要求365至439中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量的所述CpG-Ab免疫缀合物对激活所述对象的补体途径无效。
432.权利要求440所述的方法，其中所述量对于激活所述对象中的补体C3无效。
433.权利要求365至441中任一项所述的方法，其中所述CpG-Ab免疫缀合物是权利要求68所述的化合物。
434.权利要求365至442中任一项所述的方法，其中所述CpG-Ab免疫缀合物包含权利要求1所述的寡核苷酸。
435.权利要求365至443中任一项所述的方法，其中所述CpG-Ab免疫缀合物包含权利要求65所述的化合物。
436.权利要求365至444中任一项所述的方法，其中所述CpG-Ab免疫缀合物包含权利要求78所述的化合物。
437.权利要求365至445中任一项所述的方法，其中所述CpG-Ab免疫缀合物选自SB-342、SB-343、SB-341、SB-340、SB-179、SB-181、SB-186、SB-189、SB-228、SB-229、SB-242、SB-263、SB-337、SB-267、SB-284、SB-312、SB-313、SB-347、SB-373、SB-382、SB-388、SB-389、SB-408、SB-416、SB-419、SB-421、SB-423、SB-426、SB-427、SB-428、SB-429和SB-430。
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