KR20180129903A - 암을 치료하기 위한 Toll-유사 수용체 9 작용물질 및 종양 항원을 함유한 입자의 종양내 투여 - Google Patents

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크리스티아나 귀두치
에드위나 나이크
로버트 제이. 밀레이
스튜어트 디. 치프먼
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다이나박스 테크놀로지 코퍼레이션
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Abstract

본 개시는 Toll-유사 수용체 9 작용물질 (TLR9) 및 종양 항원을 함유하는 입자들의 종양내 전달에 의해 암을 치료하는 방법에 관한 것으로, TLR9 작용물질은 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 키메릭 화합물이다. 본 개시의 방법은 적어도 하나의 종량으로 입자들을 주사하는 것을 포함하고, 포유류 대상체의 주사된 및 주사되지 않은 종양 두 가지를 치료하는 데 효과적이다. 추가적으로, 본 개시는 입자들을 함유하는 면역원성 조성물뿐만 아니라, 그것의 제조 방법 역시 제공한다.

Description

암을 치료하기 위한 Toll-유사 수용체 9 작용물질 및 종양 항원을 함유한 입자의 종양내 투여
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2016년 12월 27일에 출원된 미국 가출원 번호 62/439,438, 및 2016년 4월 15일에 출원된 미국 가출원 번호 62/323,622의 유익을 주장하며, 상기 출원들은 그 전문이 참조로 본원에 포함된다.
ASCII 텍스트 파일로서 서열 목록의 제출
.
기술분야
본 개시는 Toll-유사 수용체 9 (TLR9) 작용물질(agonist) 및 종양 항원을 함유한 입자들의 종양내 전달에 의해 암을 치료하는 방법에 관한 것으로, TLR9 작용물질은 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 키메릭 화합물이다. 본 개시의 방법은 입자들의 적어도 하나의 종양으로의 주사를 포함하며, 포유류 대상체의 주사된 및 주사되지 않은 종양 둘 다를 치료하는 데 효과적이다. 추가적으로, 본 개시는 입자들을 함유한 면역원성 조성물, 뿐만 아니라 그것의 제조 방법을 제공한다.
미국 암 협회에 따르면, 해마다 5십만명을 넘는 미국인이 암으로 사망하는 것으로 예상되며, 암으로 따지면 4건의 사망당 거의 하나에 해당한다. 2015년도에, 백오십만건의 새로운 암 사례가 진단된 것으로 예측된다. 시간이 흐르면서 비록 생존율이 개선되긴 하였지만, 30%를 넘는 암 환자가 여전히 진단 후 5년 이내에 사망한다.
메틸화되지 않은 CG 다이뉴클레오타이드를 함유한 폴리뉴클레오타이드는 Toll-유사 수용체 9 (TLR9)를 발현하는 세포들을 활성화시킴으로써 선천적 면역 체계를 자극한다. 여러 폴리뉴클레오타이드 TLR9 작용물질이 암에 대한 면역치료제로서 테스트되었다. 폴리뉴클레오타이드 TLR9 작용물질의 임상전 및 제 2기 실험의 결과들은 유망하였던 한편, 폴리뉴클레오타이드 TLR9 작용물질의 전신적 투여는 화학요법 양생법과 조합될 때 비-소세포 폐암 환자의 생존율을 개선하지 못하였다 (Schmidt, Nature Biotechnology 2007, 25:825-826).
폴리뉴클레오타이드 TLR9 작용물질의 투여 경로는 중요한 것으로 밝혀졌는데, 종양내 주사가 정맥내 주사보다 월등한 항종양 면역 반응을 초래하였다 (Lou et al., J Immunother 2011, 34:279-288). 그렇기는 하지만, 폴리뉴클레오타이드 TLR9 작용물질-함유 암 백신의 효능을 개선하고자 하는 필요성이 업계에 남아 있다.
본 개시는 Toll-유사 수용체 9 작용물질 (TLR9) 및 종양 항원을 함유한 입자들의 종양내 전달에 의해 암을 치료하는 방법에 관련되고, 이때 TLR9 작용물질은 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 키메릭 화합물이다. 본 개시의 방법은 적어도 하나의 종양 병변에 입자들을 주사하는 것을 포함하고, 포유류 대상체 (예컨대 인간 대상체)에서 주사된 및 주사되지 않은 종양을 모두 치료하는데 효과적이다. 추가적으로, 본 개시는 입자들을 함유한 면역원성 조성물, 뿐만 아니라 그것의 제조 방법을 제공한다.
특히, 본 개시는 포유류 대상체 (예컨대, 인간 대상체)에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 그 방법은 대상체에게 유효량의 면역원성 조성물을 종양내 전달에 의해 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 면역원성 조성물은 각각 생체에 적합한(biocompatible) 멀티머화제(multimerization agent)와 회합된 TLR9 작용물질 및 종양 항원을 포함한 입자를 포함하며, 멀티머화제는 10 내지 25,000 나노미터의 직경 및/또는 약 10,000 내지 약 1,000,000 달톤의 분자량을 가지고, TLR9 작용물질은 서열 5'-TCGNs-3' (SEQ ID NO:1)을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 여기서 각각의 N은 선택된 뉴클레오사이드로부터 독립적으로 선택되고, s는 4 내지 47이며, 종양 항원은 폴리펩타이드를 포함하고, TLR9 작용물질 및 종양 항원은 어느 것이든지 각각 하나 이상의 공유 결합에 의해 멀티머화제와 회합되거나, 또는 각각 흡착에 의해 멀티머화제와 회합된다. 일부 구체예에서 종양 항원은 약 9 내지 약 2000개의 아미노산의 폴리펩타이드를 포함한다. 특정 바람직한 구체예에서 종양 항원은 약 9 내지 약 60개의 아미노산의 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구체예에서, 멀티머화제는 10 내지 25,000 나노미터의 직경을 가진다. 일부 바람직한 구체예에서 멀티머화제는 500 내지 5,000 나노미터의 직경을 가진다. 일부 구체예에서, 멀티머화제는 약 10,000 내지 약 1,000,000 달톤의 분자량을 가진다. 일부 구체예에서, 멀티머화제는 10 내지 25,000 나노미터의 직경 및 약 10,000 내지 약 1,000,000 달톤의 분자량을 가진다. 일부 바람직한 구체예에서, 멀티머화제는 500 내지 5,000 나노미터의 직경 및 약 10,000 내지 약 1,000,000 달톤의 분자량을 가진다. 다르게 주지되지 않는 한, TLR9 작용물질과 종양 항원은 둘 다 동일한 멀티머화제 (동일한 복합체 또는 분자)와 각각 회합된다.
일부 측면으로, 본 개시는 포유류 대상체 (예컨대, 인간 대상체)에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 그 방법은 대상체에게 유효량의 면역원성 조성물을 종양내 전달에 의하여 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 면역원성 조성물은 각각 생체에 적합한 멀티머화제와 회합되어 있는 TLR9 작용물질 및 종양 항원을 포함하는 입자를 포함하며, 멀티머화제는 0.1 내지 25 마이크로미터, 0.5 내지 25 마이크로미터, 또는 1 내지 25 마이크로미터, 또는 0.5 내지 5 마이크로미터의 직경을 가지는 알루미늄 염 복합체를 포함하고, TLR9 작용물질은 서열 5'-TCGNs-3' (SEQ ID NO:1)을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 여기서 각각의 N은 독립적으로 선택된 뉴클레오사이드이고, s는 4 내지 47이며, 종양 항원은 폴리펩타이드를 포함하고, TLR9 작용물질 및 종양 항원은 흡착에 의해 동일한 복합체와 회합된다. 일부 구체예에서 폴리펩타이드는 8 내지 1800개의 아미노산, 약 9 내지 약 1000개의 아미노산, 또는 약 10 내지 약 100개의 아미노산이다. 유사하게, 일부 구체예에서, 폴리펩타이드는 길이가 약 9 내지 약 2000개, 약 9 내지 약 1000개, 약 9 내지 약 100개, 또는 약 9 내지 약 60개의 아미노산이다.
다른 측면으로, 본 개시는 포유류 대상체 (예컨대, 인간 대상체)에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 그 방법은 대상체에게 유효량의 면역원성 조성물을 종양내 전달에 의하여 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 면역원성 조성물은 각각 생체에 적합한 멀티머화제와 회합된 TLR9 작용물질 및 종양 항원을 포함하는 입자를 포함하며, 멀티머화제는 약 10 내지 1,000 나노미터의 직경 및/또는 약 10,000 내지 약 1,000,000 달톤의 분자량을 가지는 다당을 포함하고, TLR9 작용물질은 서열 5'-TCGNs-3' (SEQ ID NO:1)을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 여기서 각각의 N은 독립적으로 선택된 뉴클레오사이드이고, s는 4 내지 47이며, 종양 항원은 폴리펩타이드를 포함하고, TLR9 작용물질 및 종양 항원은 각각 하나 이상의 공유 결합에 의해 다당의 동일한 분자와 회합된다. 일부 구체예에서, 멀티머화제는 약 10 내지 1,000 나노미터의 직경을 가지는 다당을 포함한다. 일부 구체예에서, 멀티머화제는 약 10,000 내지 약 1,000,000 달톤의 분자량을 가지는 다당을 포함한다. 일부 구체예에서, 멀티머화제는 약 10 내지 1,000 나노미터의 직경 및 약 10,000 내지 약 1,000,000 달톤의 분자량을 가지는 다당을 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리펩타이드는 8 내지 1800개의 아미노산, 약 9 내지 약 1000개의 아미노산, 또는 약 10 내지 약 100개의 아미노산이다. 유사하게, 일부 구체예에서, 폴리펩타이드는 길이가 약 9 내지 약 2000개, 약 9 내지 약 1000개, 약 9 내지 약 100개, 또는 약 9 내지 약 60개의 아미노산이다.
멀티머화제가 0.1 내지 25 마이크로미터, 약 0.5 내지 약 25 마이크로미터, 약 1 내지 약 25 마이크로미터, 또는 0.5 내지 5 마이크로미터의 직경을 가지는 알루미늄 염 복합체를 포함하고, TLR9 작용물질 및 종양 항원은 각각 동일한 복합체와 흡착에 의해 회합되어 있는 일부 구체예에서, 입자들은 마이크로입자들이다. 일부 구체예에서, 알루미늄 염 복합체는 수산화 알루미늄 복합체를 포함한다. 멀티머화제가 약 10 내지 약 1,000 나노미터의 직경 및/또는 약 10,000 내지 약 1,000,000 달톤의 분자량을 가지는 다당을 포함하고, TLR9 작용물질 및 종양 항원은 각각 하나 이상의 공유 결합에 의해 다당의 동일한 분자와 회합되어 있는 다른 구체예에서, 입자들은 나노입자들이다. 일부 구체예에서, 다당은 수크로오스와 에피클로로히드린, 덱스트란, 만난, 키토산, 아가로오스, 및 전분의 분지된 코폴리머로 구성되는 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 다당은 약 100,000 내지 약 700,000 달톤의 분자량을 가지는 수크로오스와 에피클로로히드린의 분지된 코폴리머이다. 일부 구체예에서, 다당은 약 400,000 ± 100,000 달톤의 분자량을 가지는 수크로오스와 에피클로로히드린의 분지된 코폴리머이다 (예컨대, GE Healthcare에 의해 시판되는 FICOLL® PM 400).
일부 구체예에서, TLR9 작용물질은 5'-(TCG(Nq))iNw(X1X2CGX2'X1'(CG)p)jNv-3' (SEQ ID NO:2)로 구성되는 폴리뉴클레오타이드이고, 여기서 각각의 N은 독립적으로 선택된 뉴클레오사이드이며; p는 0 또는 1이고; q는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이며; v는 0 내지 41이고; w는 0, 1 또는 2이며; i는 1, 2, 3 또는 4이고; j는 1, 2, 3 또는 4이며; X1 및 X1'는 자기-상보성 뉴클레오사이드이고; 및 X2 및 X2'는 자기-상보성 뉴클레오사이드이며; 폴리뉴클레오타이드는 길이가 9 내지 50개의 뉴클레오타이드이다. 일부의 이런 구체예들에서, q는 0, 1 또는 2이다. 일부의 이런 구체예들에서, p는 0 또는 1이고; q는 0, 1 또는 2이며; v는 0 내지 20이고; w는 0이며; i는 1이고; 및 j는 1, 2, 3 또는 4이다.
일부 구체예에서, TLR9 작용물질은 5'-TCGNq(X1X2CGX2'X1'CG)jNv-3' (SEQ ID NO:3)으로 구성되는 폴리뉴클레오타이드이고, 여기서 각각의 N은 독립적으로 선택된 뉴클레오사이드이며; q는 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고; v는 1 내지 39이며; j는 1, 2, 3 또는 4이고; X1 및 X1'는 자기-상보성 뉴클레오사이드이며; 및 X2 및 X2'는 자기-상보성 뉴클레오사이드이고; 폴리뉴클레오타이드는 길이가 12 내지 50개의 뉴클레오타이드이다.
일부 구체예에서, TLR9 작용물질은 5'-TCGNqAACGTTCGAACGTTCGAANr-3' (SEQ ID NO:4)로 구성되는 폴리뉴클레오타이드이고, 여기서 각각의 N은 독립적으로 선택된 뉴클레오사이드이며; q　=　0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고; r은 0 내지 29이다.
일부 구체예에서, TLR9 작용물질은 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된 서열로 구성되는 폴리뉴클레오타이드이다:
5'-TCG AAC GTT CGA ACG TTC GAA CGT TCG AAT-3' (SEQ ID NO:6);
5'-TCG TTC GAA CGT TCG AAC GTT CGA A-3' (SEQ ID NO:7);
5'-TCG AAC GTT CGA ACG TTC GAA TTT T-3' (SEQ ID NO:8);
5'-TCG TAA CGT TCG AAC GTT CGA ACG TTA-3' (SEQ ID NO:9); 및
5'-TCG TAA CGT TCG AAC GTT CGA AC-3' (SEQ ID NO:10).
일부 구체예에서, TLR9 작용물질은 5'-TCG AAC GTT CGA ACG TTC GAA CGT TCG AAT-3'(SEQ ID NO:6)으로 구성되는 폴리뉴클레오타이드이다.
일부 구체예에서, TLR9 작용물질은 식 Nu1-Sp1-Nu2-Sp2-Nu3의 키메릭 화합물이고, 식에서 Nu1, Nu2 및 Nu3은 길이가 7 내지 50개의 뉴클레오타이드로부터 독립적으로 선택된 핵산 모이어티이며, Nu1은 서열 5'-TCGNs-3'로 구성되고, 이때 s는 4 내지 47이며, Sp1 및 Sp2는 헥사에틸렌 글리콜 (HEG), 트라이에틸렌 글리콜 (TEG), 프로필, 부틸 및 헥실로 구성되는 군의 적어도 하나의 구성원을 포함하는 동일하거나 상이한 비핵산 스페이서 모이어티이고, Sp1은 Nu1 및 Nu2에 공유 결합되며, Sp2는 Nu2 및 Nu3에 공유 결합된다. 일부의 이런 구체예들에서, Nu2는 서열 5'-AACGTTNm-3'로 구성되고, 이때 m은 1 내지 44이다 (SEQ ID NO:73). 일부의 이런 구체예들에서, Nu3은 서열 5'-AACGTTNm-3'로 구성되고, 이때 m은 1 내지 44이다 (SEQ ID NO:73). 일부의 이런 구체예들에서, Nu2 및 Nu3은 독립적으로 서열 5'-AACGTTNm-3'로 구성되며, 이때 m은 1 내지 44이다 (SEQ ID NO:73). 일부의 이런 구체예들에서, TLR9 작용물질은 다음과 같이 3개의 핵산 모이어티와 2개의 헥사에틸렌 글리콜 (HEG) 스페이서를 포함하는 키메릭 화합물이다:
5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:5) 또는
5'-TCGCCGG-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGCCGG-3' (SEQ ID NO:72).
일부 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 키메릭 화합물의 뉴클레오타이드들 사이 및/또는 뉴클레오타이드와 키메릭 화합물의 스페이서 사이의 하나 이상의 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합이다. 일부의 이런 구체예들에서, 뉴클레오타이드들 사이 및 뉴클레오타이드와 스페이서 사이의 모든 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합이다.
포유류 대상체 (예컨대,　인간 대상체)에게 유효량의 면역원성 조성물을 종양내 전달에 의해 투여하는 단계를 포함하고, 이때 면역원성 조성물은 다당을 포함하는 생체에 적합한 멀티머화제와 각각 회합되어 있는 TLR9 작용물질 및 종양 항원을 포함한 입자를 포함하는, 포유류 대상체 (예컨대,　인간 대상체)에서의 암 치료 방법의 일부 구체예에서, 조성물은 TLR9 작용물질 대 다당의 평균 몰 비율 및 항원 대 다당의 평균 몰 비율이 각각 약 10 내지 약 120의 범위 내에 있는, 입자들의 불균일한 혼합물을 포함한다.
포유류 대상체 (예컨대,　인간 대상체)에게 유효량의 면역원성 조성물을 종양내 전달에 의해 투여하는 단계를 포함하고, 이때 면역원성 조성물은 알루미늄 염 복합체를 포함하는 생체에 적합한 멀티머화제와 각각 회합되어 있는 TLR9 작용물질 및 종양 항원을 포함한 입자를 포함하는, 포유류 대상체 (예컨대,　인간 대상체)에서의 암 치료 방법의 일부 구체예에서, 조성물은 TLR9 작용물질 대 알루미늄 염 복합체의 비율 및 항원 대 알루미늄 염 복합체의 비율이 각각 약 0.1 내지 약 1 (중량/중량)의 범위 내에 있는 입자들의 불균일한 혼합물을 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 TLR9 작용물질 대 알루미늄 염 복합체의 비율이 약 0.1 내지 약 1 (중량/중량)의 범위 내에 있는 한편, 항원 대 알루미늄 염 복합체의 비율이 0.005 내지 약 1 (중량/중량)의 더 넓은 범위를 가지는 입자들의 불균일한 혼합물을 포함한다. 추가의 구체예에서, 조성물은 동시 흡착된 항원 및 TLR9 작용물질 대 알루미늄 염 복합체의 비율이 각각 약 0.1 내지 약 2.5 (w/w)의 범위 내에 있거나, 또는 약 0.1 내지 약 5.0 (w/w)의 범위 내에 있는 입자들의 혼합물을 포함한다.
일부 구체예에서, 종양 항원은 전체 길이 단백질 또는 그것의 단편의 아미노산 서열을 포함한다 (예컨대, 길이가 약 10 내지 약 100개의 아미노산인 폴리펩타이드). 일부 구체예에서, 종양 항원은 WT1, MUC1, LMP2, HPV E6, HPV E7, EGFRvIII, Her-2/neu, 이디오타입, MAGE A3, p53, NY-ESO-1 (CTAG1), PSMA, CEA, MelanA/Mart1, Ras, gp100, 프로테이나제 3, bcr-able, 티로시나제, 서비빈(survivin), PSA, hTERT, 육종 전위 중단점, EphA2, PAP, MP-IAP, AFP, EpCAM, ERG, NA17-A, PAX3, ALK, 안드로겐 수용체, 사이클린 B1, MYCN, PhoC, TRP-2, 메소텔린, PSCA, MAGE A1, CYP1B1, PLAC1, BORIS, ETV6-AML, NY-BR-1, RGS5, SART3, 탄산 탈수효소 IX, PAX5, OY-TES1, 정자 단백질 17, LCK, HMWMAA, 별칭P-4, SSX2, XAGE 1, B7-H3, 레구마인, Tie 2, Page4, VEGFR2, MAD-CT-1, FAP, PAP, PDGFR-베타, MAD-CT-2, CEA, TRP-1 (gp75), BAGE1, BAGE2, BAGE3, BAGE4, BAGE5, CAMEL, MAGE-A2, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, 및 Fos-관련 항원 1로 구성되는 군의 하나 이상의 전체 길이 단백질 또는 폴리펩타이드 단편을 포함한다. 일부 바람직한 구체예에서, 종양 항원은 gp100, hTERT, MAGE　A1, MAGE A3, MAGE A10, MelanA/Mart1, NY-ESO-1, PSA, Ras, 서비빈, TRP1 (gp75), TRP2, 및 티로시나제로 구성되는 군의 하나 이상으로부터의 아미노산 서열 또는 그것의 단편을 포함한다.
일부 이런 구체예에서, 종양 항원은 둘 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질이고, 이때 각각의 폴리펩타이드는 상이한 종양 항원들로부터의 아미노산 서열 또는 동일한 종양 항원으로부터의 비연속성 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 변형예에서, 융합 단백질은 제 1 폴리펩타이드 및 제 2 폴리펩타이드를 포함하며, 이때 각각의 폴리펩타이드는 동일한 종양 항원으로부터의 비연속성 아미노산 서열들을 포함한다. 일부 이런 구체예에서, 종양 항원은 종양의 세포에 의해 발현된 포유류 항원을 포함한다. 하나의 변형예에서, 포유류 항원은 포유류 대상체로부터의 정상 세포에 존재하는 유전자에 비해 돌연변이를 포함하는 신생항원이거나 그런 돌연변이를 포함하는 유전자에 의해 암호화된다. 일부 이런 구체예에서, 종양 항원은 종양에 의해 발현된 바이러스 항원을 포함한다. 하나의 변형예에서, 바이러스 항원은 HPV E6 및 HPV E7 중 하나 또는 둘 다를 포함한다. 일부 바람직한 구체예에서, 종양 항원은 인간 암/고환 항원 1 (CTAG1, NY-ESO-1로도 알려져 있음) 단백질 또는 그것의 단편의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 변형예에서, 종양 항원은 SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, 및 그것들의 조합으로 구성되는 군 중 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 본원에 기술된 일부 바람직한 구체예에서, 포유류 대상체는 인간이다.
방법의 일부 구체예에서, 종양내 전달은 면역원성 조성물의 적어도 하나의 종양으로의 주사를 포함한다. 일부 이런 구체예에서, 암을 치료하는 것은 주사된 종양에서 종양 항원-특이적 T 세포의 축적, 예를 들어 면역원성 조성물이 종양외 부위에 투여되었던 것보다 더 큰 수의 축적을 유도하는 것을 포함한다. 일부 이런 구체예에서, 암을 치료하는 것은 전신적 종양 항원-특이적 T 세포 반응, 예를 들어 면역원성 조성물이 종양외 부위에 투여되었던 것보다 더 큰 규모의 전신적 종양 항원-특이적 T 세포 반응을 유도하는 것을 포함한다. 일부 이런 구체예에서, 암을 치료하는 것은 전신적 종양 항원-특이적 T 세포 반응을 유도하는 것을 포함한다. 일부 이런 구체예에서, 암을 치료하는 것은 주사된 종양에서 CD4+ FoxP3+ 조절 T 세포의 수를 감소시키는 것을 포함한다. 일부 이런 구체예에서, 대상체는 주사된 종양에 더불어 하나 이상의 주사되지 않은 종양을 가지며 암을 치료하는 것은 다음 중 하나의 이상을 포함한다: (a) 주사되지 않은 종양의 수를 감소시키는 것; (b) 주사되지 않은 종양의 부피를 감소시키는 것; 및 (c) 주사되지 않은 종양의 성장을 지연시키는 것. 일부 이런 구체예에서, 암을 치료하는 것은 다음 중 하나의 이상을 포함한다: (d) 대상체의 생존 시간을 증가시키는 것; (e) 주사된 종양의 부피를 감소시키는 것; 및 (f) 주사된 종양의 성장을 지연시키는 것. 일부 구체예에서, 암을 치료하는 것은 진행이 없는 생존을 증가시키는 것 또는 진행까지의 시간을 증가시키는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 종양은 육종 또는 암종이다. 일부 구체예에서, 종양은 림프종이다. 일부 구체예에서, 암은 유방암, 전립선암, 폐암, 대장암, 자궁암, 방광암, 흑색종, 두경부암, 비-호지킨 림프종, 신장암, 난소암, 췌장암, 및 갑상선암으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 암은 구강, 소화계, 호흡계, 피부, 유방, 생식계, 비뇨기계, 안과계, 신경계, 내분비계 및 림프종으로 구성되는 군으로부터 선택된 부위의 원발성 암이다.
일부 구체예에서, 방법은 추가로 대상체에게 유효량의 제 2 치료제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 이런 구체예에서, 제 2 치료제는 악티노마이신(actinomycin), 아파티닙(afatinib), 알렉티닙(alectinib), 아스파라기나제(asparaginase), 아자시티딘(azacitidine), 아자티오프린(azathioprine), 비칼루타미드(bicalutamide), 비니메티닙(binimetinib), 블레오마이신(bleomycin), 보르테조밉(bortezomib), 캄프토테신(camptothecin), 카르보플라틴(carboplatin), 카페시타빈(capecitabine), 카르무스틴(carmustine), 세르티닙(certinib), 시스플라틴(cisplatin), 클로람부실(chlorambucil), 코비메티닙(cobimetinib), 크리조티닙(crizotinib), 사이클로포스파미드(사이클로phosphamide), 시타라빈(cytarabine), 다브라페닙(dabrafenib), 다카르바진(dacarbazine), 다우노루비신(daunorubicin), 도세탁셀(docetaxel), 독시플루리딘(doxifluridine), 독소루비신(doxorubicin), 엔코라페닙(encorafenib), 에를로티닙(erlotinib), 에피루비신(epirubicin), 에포틸론(epothilone), 에토포시드(etoposide), 플루다라빈(fludarabine), 플루타민(flutamine), 플루오로우라실(fluorouracil), 게피티닙(gefitinib), 겜시타빈(gemcitabine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 이다루비신(idarubicin), 이포스파미드(ifosfamide), 이마티닙(imatinib), 이리노테칸(irinotecan), 라파티닙(lapatinib), 레트로졸(letrozole), 메클로르에타민(mechlorethamine), 메르캅토퓨린(mercaptopurine), 메토트렉세이트(methotrexate), 미토마이신(mitomycin), 미토크산트론(mitoxantrone), 옥트레오티드(octreotide), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 파클리탁셀(paclitaxel), 페메트렉세드(pemetrexed), 랄티트렉세드(raltitrexed), 소라페닙(sorafenib), 수니티닙(sunitinib), 타목시펜(tamoxifen), 테모졸로미드(temozolomide), 테니포시드(teniposide), 티오구아닌(tioguanine), 토포테칸(topotecan), 트라메티닙(trametinib), 발루비신(valrubicin), 베무라페닙(vemurafenib), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 빈데신(vindesine), 비노렐빈(vinorelbine), 및 그것들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 화학요법제를 포함한다. 일부 구체예에서, 제 2 치료제는 BRAF 억제제 및 MEK 억제제 중 하나 또는 둘 다를 포함한다. 일부 구체예에서, 제 2 치료제는 HDAC 억제제 (예컨대, 보로니스타트(voronistat) [SAHA], 로미뎁신(romidepsin), 엔티노스타트(entinostat), 아벡시노스타트(abexinostat), 엘리노스타트(elinostat) [CHR-3996], 파노비노스타트(panobinostat), 퀴지노스타트(quisinostat) [JNJ-26481585], 4SC-202, 레스미노스타트(resminostat) [SB939], 프라시노스타트(pracinostat) [CI-9940], 및 발프로에이트(valproate) 참조), 및 DNA 메틸트란스퍼라제 억제제 (예컨대, 아자시티딘(azacytidine), 데시타빈(decitabine), 제불라린(zebularine), SGI-1027, RG-108, 및 신펀진(sinfungin) 참조), 및 그것들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 후생적 조절제를 포함한다.
일부 이런 구체예에서, 제 2 치료제는 억제성 면역 체크포인트 분자, 예를 들어 PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4 (CD152), LAG-3, TIM-3, TIGIT, IL-10, 인돌아민 2,3-다이옥시게나제 (IDO), P-셀렉틴 당단백질 리간드-1 (PSGL-1) 및 TGF-베타로 구성되는 군으로부터 선택된 억제성 면역 체크포인트 분자의 길항물질이다. 일부 이런 구체예에서, 제 2 치료제는 면역 조절 분자의 작용물질이다. 일부 이런 구체예에서, 면역 조절 분자는 CD27, CD40, OX40 (CD134), GITR, 4-1BB CD137, CD28 및 ICOS (CD278)로 구성되는 군으로부터 선택된다. 일부 이런 구체예에서, 제 2 치료제는 항체, 그것의 단편 또는 유도체를 포함한다. 일부 이런 구체예에서, 제 2 치료제는 억제성 면역 체크포인트 분자의 길항물질이고 제 2 치료제는 항체, 그것의 단편 또는 유도체를 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 추가로 대상체에게 방사선 요법(radiation therapy)을 투여하는 단계 및/또는 유효량의 제 2 치료제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 이런 구체예에서, 유효량의 면역원성 조성물 및 유효량의 제 2 치료제는 함께 종양에 대한 협력 효과 또는 더 나은 효과를 초래한다. 일부 이런 구체예에서, 유효량의 면역원성 조성물 및 유효량의 제 2 치료제는 함께 종양에 대한 부가 효과 또는 더 나은 효과를 초래한다. 일부 이런 구체예에서, 유효량의 면역원성 조성물 및 유효량의 제 2 치료제는 함께 종양에 대한 상조 효과를 초래한다.
방법의 일부 구체예에서, 암을 치료하는 것은 면역원성 조성물의 반복된 투여가 금지된 그런 심각한 독감-유사 증상의 발생을 초래하지 않고, 이때 독감-유사 증상은 열, 두통, 오한, 근육통 및 피로로 구성되는 군의 하나 이상을 포함한다.
일부 측면으로, 본 개시는 각각이 생체에 적합한 멀티머화제와 회합되어 있는 TLR9 작용물질 및 종양 항원을 포함하는 입자를 포함하는 면역원성 조성물을 제공하며, 이때 멀티머화제는 10 내지 10,000 나노미터의 직경 및/또는 약 10,000 내지 약 1,000,000 달톤의 분자량을 가지고; TLR9 작용물질은 서열 5'-TCGNs-3' (SEQ ID NO:1)를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 각각의 N은 독립적으로 선택된 뉴클레오사이드이며, s는 4 내지 47이고; 종양 항원은 8 내지 1800개의 아미노산, 약 9 내지 약 1000개의 아미노산, 또는 약 10 내지 약 100개의 아미노산의 폴리펩타이드를 포함하며; TLR9 작용물질 및 종양 항원은 각각 하나 이상의 공유 결합에 의해 멀티머화제와 회합되거나, 또는 각각 흡착에 의해 멀티머화제와 회합된다. 일부 구체예에서, 멀티머화제는 알루미늄 염 복합체이고, TLR9 작용물질 및 종양 항원은 각각 흡착에 의해 동일한 복합체와 회합된다. 하나의 변형예에서, 알루미늄 염 복합체는 수산화 알루미늄 복합체를 포함한다. 일부 구체예에서, 멀티머화제는 다당이고, TLR9 작용물질 및 종양 항원은 각각 하나 이상의 공유 결합에 의해 다당의 동일한 분자와 회합된다. 하나의 변형예에서, 다당은 수크로오스와 에피클로로히드린, 덱스트란, 만난, 키토산, 아가로오스, 및 전분의 분지된 코폴리머로 구성되는 군으로부터 선택된다. 추가의 변형예에서, 다당은 약 100,000 내지 약 700,000 달톤, 또는 약 300,000 내지 약 500,000 달톤, 또는 약 400,000 ± 100,000 달톤의 분자량을 가지는, 수크로오스와 에피클로로히드린의 분지된 코폴리머이다 (예컨대, GE Healthcare에 의해 시판되는 FICOLL® PM 400).
조성물의 일부 구체예에서, 입자는 식 (I)의 화합물이다:
[D-L1-L2-(PEG)-L3]x-F-[L3-(PEG)-L2-A]t (I),
식에서,
D는 TLR9 작용물질이고;
L1은 알킬티오 기를 포함하는 제 1 링커이며;
L2는 석신이미드 기를 포함하는 제 2 링커이고;
L3은 아미드 기를 포함하는 제 3 링커이며;
PEG는 폴리에틸렌 글리콜 (예컨대, -(OCH2CH2)n-, 여기서 n은 2 내지 80의 정수임)이고;
t 및 x는 독립적으로 3 내지 200의 정수이며;
A는 종양 항원이고; 및
F는 다당으로, 에테르 기를 통해 L3에 연결된다.
조성물의 일부 구체예에서, TLR9 작용물질은 5'-TCGNqAACGTTCGAACGTTCGAANr-3' (SEQ ID NO:4)로 구성되는 폴리뉴클레오타이드이고, 여기서 각각의 N은 독립적으로 선택된 뉴클레오사이드이며, q는　0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고, r은 0 내지 29이다. 한 변형예에서, TLR9 작용물질은 5'-TCG AAC GTT CGA ACG TTC GAA CGT TCG AAT-3' (SEQ ID NO:6)으로 구성되는 폴리뉴클레오타이드이다.
조성물의 일부 구체예에서, TLR9 작용물질은 식 Nu1-Sp1-Nu2-Sp2-Nu3의 키메릭 화합물이고, 식에서 Nu1, Nu2 및 Nu3은 길이가 7 내지 50개의 뉴클레오타이드인 독립적으로 선택된 핵산 모이어티이며, Nu1은 서열 5'-TCGNs-3'로 구성되고, 여기서 s는 4 내지 47이며; Sp1 및 Sp2는 헥사에틸렌 글리콜 (HEG), 트라이에틸렌 글리콜 (TEG), 프로필, 부틸 및 헥실로 구성되는 군의 적어도 하나의 구성원을 포함하는 동일하거나 상이한 비 핵산 스페이서 모이어티이고; Sp1은 Nu1 및 Nu2에 공유 결합되며, Sp2는 Nu2 및 Nu3에 공유 결합된다. 일부 이런 구체예에서, Nu2 및/또는 Nu3은 독립적으로 서열 5'-AACGTTNm-3' (여기서 m은 1 내지 44임)(SEQ ID NO:73)로 구성된다. 일부 이런 구체예에서, TLR9 작용물질은 다음과 같이 3개의 핵산 모이어티 및 2개의 헥사에틸렌 글리콜 (HEG) 스페이서를 포함하는 키메릭 화합물이다:
5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:5) 또는
5'-TCGCCGG-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGCCGG-3' (SEQ ID NO:72).
TLR9 작용물질이 식 Nu1-Sp1-Nu2-Sp2-Nu3의 키메릭 화합물이 조성물의 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 키메릭 화합물의 뉴클레오타이드들 사이의 및/또는 키메릭 화합물의 뉴클레오타이드와 스페이서 사이의 하나 이상의 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합이다. 한 변형예에서, 뉴클레오타이드들 사이의 및 뉴클레오타이드와 스페이서 사이의 모든 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합이다.
일부 측면으로, 식 (I)의 화합물의 제조 방법이 제공된다:
[D-L1-L2-(PEG)-L3]x-F-[L3-(PEG)-L2-A]t (I),
식에서,
D는 TLR9 작용물질이고;
L1은 알킬티오 기를 포함하는 제 1 링커이며;
L2는 석신이미드 기를 포함하는 제 2 링커이고;
L3은 아미드 기를 포함하는 제 3 링커이며;
PEG는 폴리에틸렌 글리콜 (예컨대, -(OCH2CH2)n-, 여기서 n은 2 내지 80의 정수임)이고;
t 및 x는 독립적으로 3 내지 200의 정수이며;
A는 약 9 내지 약 1000개의 아미노산의 폴리펩타이드를 포함하는 종양 항원이고; 및
F는 약 10,000 내지 약 1,000,000 달톤의 분자량을 가지는 다당이고, 에테르 기를 통해 L3에 연결되며,
TLR9 작용물질은 서열 5'-TCGNs-3'를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 s는 4 내지 47이며, 각각의 N은 뉴클레오사이드이고, 뉴클레오타이드들 사이의 및 3'-말단 뉴클레오타이드와 L1 사이의 하나 이상의 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합이며, 및
A는 약 9 내지 약 1000개의 아미노산의 폴리펩타이드를 포함하는 종양 항원이고 적어도 하나의 티올 기를 포함하며,
상기 방법은
식 D-L1a-SH (식에서 D는 식 (I)에 대해 규정된 것과 같고 L1a는 (CH2)m이며, 이때 m은 2 내지 9의 정수임)의 화합물을 식 (II)의 화합물과 반응시키는 단계, 및 식 A의 화합물을 식 (II)의 화합물과 반응시키는 단계를 포함한다:
[L2a-(PEG)-L3]y-F (II)
식에서, L3, PEG 및 F는 식 (I)에 대해 규정된 것과 같고;
L2a는
Figure pct00001
이며; 및
y는 3 내지 350의 정수이고; 단 y는 t와 x의 합보다 적지 않다.
식 (I)의 화합물의 제조 방법의 일부 구체예에서, 방법은 식 D-L1a-SH의 화합물을, 중간체를 형성하기 위하여 식 (II)의 화합물과 반응시키는 단계, 및 계속해서 식 A의 화합물을 중간체와 반응시키는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 식 D-L1a-SH의 화합물 및 식 A의 화합물을 식 (II)의 화합물과 동시에 반응시키는 단계를 포함한다. 일부 이런 구체예에서, 반응은 구아니딘 염산염을 포함한 매질에서 수행된다.
식 (I)의 화합물의 제조 방법의 일부 구체예에서, D는 식 Nu1-Sp1-Nu2-Sp2-Nu3의 키메릭 화합물이고, 식에서 Nu1, Nu2 및 Nu3은 길이가 7 내지 50개의 뉴클레오타이드인 독립적으로 선택된 핵산 모이어티이며, Nu1은 서열 5'-TCGNs-3'로 구성되고, 이때 s는 4 내지 47이며; Sp1 및 Sp2는 헥사에틸렌 글리콜 (HEG), 트라이에틸렌 글리콜 (TEG), 프로필, 부틸 및 헥실로 구성되는 군의 적어도 하나의 구성원을 포함하는 동일하거나 상이한 비 핵산 스페이서 모이어티이고; Sp1은 Nu1 및 Nu2에 공유 결합되며, Sp2는 Nu2 및 Nu3에 공유 결합된다. 일부 이런 구체예에서, Nu2는 서열 5'-AACGTTNm-3' (여기서 m은 1 내지 44임) (SEQ ID NO:73)으로 구성된다. 일부 이런 구체예에서, Nu3은 서열 5'-AACGTTNm-3' (여기서 m은 1 내지 44임) (SEQ ID NO:73)으로 구성된다. 일부 이런 구체예에서, Nu2 및 Nu3은 독립적으로 서열 5'-AACGTTNm-3' (여기서 m은 1 내지 44임) (SEQ ID NO:73)으로 구성된다. 일부 이런 구체예에서, D는 5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:5) 또는 5'-TCGCCGG-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGCCGG-3' (SEQ ID NO:72)이다.
식 (I)의 화합물의 제조 방법의 일부 구체예에서, 폴리펩타이드는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 이런 구체예에서, 적어도 하나의 시스테인 잔기는 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 위치하거나, 또는 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단의 5개의 아미노산 내에 있다.
식 (I)의 화합물의 제조 방법의 일부 구체예에서, 다당은 수크로오스 및 에피클로로히드린, 덱스트란, 만난, 키토산, 아가로오스, 및 전분의 분지된 코폴리머로 구성되는 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 다당은 약 100,000 내지 약 700,000 달톤, 또는 약 300,000 내지 약 500,000 달톤, 또는 약 400,000 ± 100,000 달톤의 분자량을 가지는 수크로오스 및 에피클로로히드린의 분지된 코폴리머이다 (예컨대, GE Healthcare에 의해 시판되는 FICOLL® PM 400).
일부 측면으로, 각각 흡착에 의해 생체에 적합한 멀티머화제와 회합된 TLR9 작용물질 및 종양 항원을 포함하는 동시-흡착 입자의 제조 방법이 제공되며, 여기서
멀티머화제는 0.1 내지 25 마이크로미터, 약 0.5 내지 약 25 마이크로미터, 약 1 내지 약 25 마이크로미터, 또는 약 0.5 내지 약 5 마이크로미터의 직경을 가지는 알루미늄 염 복합체이고,
TLR9 작용물질은 서열 5'-TCGNs-3' (SEQ ID NO:1)을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 이때 s는 4 내지 47이고 각각의 N은 뉴클레오사이드이며,
종양 항원은 8 내지 1800개의 아미노산, 약 9 내지 약 1000개의 아미노산, 또는 약 10 내지 약 100개의 아미노산의 폴리펩타이드를 포함하고,
상기 방법은
약 5% 내지 약 30% 아이소프로판올을 함유한 수용액에 용해된 종양 항원을 완충액에 평형화된 알루미늄 염 복합체에 첨가하는 단계, 및 TLR9 작용물질을 완충액에 평형화된 알루미늄 염 복합체에 첨가하는 단계를 포함하며,
여기서 완충액은 약 6 내지 약 9의 pH 범위에 있고 완충액은 포스페이트 완충액이 아니다.
동시-흡착 입자의 제조 방법의 일부 구체예에서, 알루미늄 염 복합체는 수산화 알루미늄 복합체를 포함한다. 일부 구체예에서, 완충액은 약 7 내지 약 6의 pH 범위에 있다. 일부 구체예에서, 종양 항원은 약 10% 내지 약 20%의 유기 용매 (예컨대, 아이소프로판올)을 함유한 수용액에 용해된다. 일부 구체예에서, TLR9 작용물질은 약 7의 pH를 가지는 아세테이트 완충액에 용해된다. 일부 구체예에서, 종양 항원 및 TLR9 작용물질은 동시에 알루미늄 염 복합체에 흡착된다. 일부 구체예에서, 종양 항원이 먼저 알루미늄 염 복합체에 흡착되고 이어서 TLR9 작용물질이 흡착된다. 일부 구체예에서, TLR9 작용물질이 먼저 알루미늄 염 복합체에 흡착되고 이어서 종양 항원이 흡착된다. 일부 구체예에서, TLR9 작용물질은 5'-TCGNqAACGTTCGAACGTTCGAANr-3' (SEQ ID NO:4)로 구성되는 폴리뉴클레오타이드이고, 여기서 각각의 N은 독립적으로 선택된 뉴클레오사이드이며, q는　0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고, r은 0 내지 29이다. 한 변형예에서, TLR9 작용물질은 5'-TCG AAC GTT CGA ACG TTC GAA CGT TCG AAT-3' (SEQ ID NO:6)으로 구성되는 폴리뉴클레오타이드이다. 일부 구체예에서, TLR9 작용물질은 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, 및 SEQ ID NO:10으로 구성되는 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오타이드이다. 일부 구체예에서, TLR9 작용물질은 식 Nu1-Sp1-Nu2-Sp2-Nu3의 키메릭 화합물이고, 식에서 Nu1, Nu2 및 Nu3은 길이가 7 내지 50개의 뉴클레오타이드인 독립적으로 선택된 핵산 모이어티이며, Nu1은 서열 5'-TCGNs-3'로 구성되고, 이때 s는 4 내지 47이며; Sp1 및 Sp2는 헥사에틸렌 글리콜 (HEG), 트라이에틸렌 글리콜 (TEG), 프로필, 부틸 및 헥실로 구성되는 군의 적어도 하나의 구성원을 포함하는 동일하거나 상이한 비 핵산 스페이서 모이어티이고; Sp1은 Nu1 및 Nu2에 공유 결합되며, Sp2는 Nu2 및 Nu3에 공유 결합된다. 일부 이런 구체예에서, Nu2 및/또는 Nu3은 독립적으로 서열 5'-AACGTTNm-3' (여기서 m은 1 내지 44임) (SEQ ID NO:73)으로 구성된다. 일부 이런 구체예에서, TLR9 작용물질은 5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:5) 또는 5'-TCGCCGG-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGCCGG-3' (SEQ ID NO:72)이다. 본 개시의 일부 바람직한 구체예에서, 종양 항원은 길이가 8 내지 1800개의 아미노산, 바람직하게는 길이가 9 내지 1000개인 아미노산, 보다 바람직하게는 길이가 10 내지 100개의 아미노산인 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 변형예에서, 종양 항원은 2개 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질이고, 이때 각각의 폴리펩타이드는 상이한 종양 항원으로부터의 아미노산 서열 또는 동일한 종양 항원으로부터의 비연속성 아미노산 서열을 포함한다. 일부 변형예에서, 융합 단백질은 제 1 폴리펩타이드 및 제 2 폴리펩타이드를 포함하고, 여기서 각각의 폴리펩타이드는 동일한 종양 항원으로부터의 비연속성 아미노산 서열을 포함한다. 일부 변형예에서, 종양 항원은 포유류 대상체로부터의 정상 세포에 존재하는 유전자와 관련하여 돌연변이를 포함하는 유전자에 의해 암호화된 네오항원을 포함한다. 다른 변형예에서, 종양 항원은 종양에 의해 발현된 바이러스 항원을 포함한다. 일부 바람직한 구체예에서, 종양 항원은 인간 암/고환 항원 1 (CTAG1, NY-ESO-1로도 알려져 있음) 단백질 또는 그것의 단편의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 변형예에서, 종양 항원은 SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, 및 그것들의 조합으로 구성되는 군 중 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시는 일부 바람직한 구체예에서, 각각이 수산화 알루미늄 복합체와 회합되어 있는 TLR9 작용물질 및 종양 항원을 포함하는 입자를 포함하는 면역원성 조성물을 제공하며; 여기서 수산화 알루미늄 복합체는 약 0.1 내지 약 25 마이크로미터 (바람직하게는 약 0.5 내지 약 25 마이크로미터 또는 약 0.5 내지 약 2.5 마이크로미터)의 직경을 가지며; TLR9 작용물질은 SEQ ID NO:6의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고; 종양 항원은 길이가 적어도 8개의 아미노산인, SEQ ID NO:60의 인간 암/고환 항원 1 또는 그것의 단편의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드를 포함하며; TLR9 작용물질 및 종양 항원은 각각 흡착에 의해 수산화 알루미늄 복합체와 회합된다. 일부 구체예에서, the 종양 항원은 SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, 및 그것들의 조합으로 구성되는 군 중 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 TLR9 작용물질 대 알루미늄 염 복합체의 평균 비율이 약 0.2 내지 약 1.2 (중량/중량)의 범위 내에 있고, 종양 항원 대 알루미늄 염 복합체의 평균 비율이 약 0.005 내지 약 2.0 (중량/중량)의 범위 내에 있으며 알루미늄 염 복합체의 중량이 알루미늄 함량을 기준으로 하는 입자들의 불균일한 혼합물을 포함한다. 또한 종양내 전달에 의하여 유효량의 면역원성 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유류 대상체 (예컨대, 인간 대상체)에서 암을 치료하는 방법이 제공된다.
더욱이, 본 개시는 다음의 단계들을 포함하는 멸균된 면역원성 조성물의 제조 방법을 제공한다:
(a) 유기 용매를 포함한 수용액에 하나 이상의 펩타이드 항원을 용해시켜서 수성 펩타이드 용액을 제조하는 단계;
(b) 수성 펩타이드 용액을 수산화 알루미늄 복합체를 포함한 슬러리와 접촉시켜서 수산화 알루미늄 복합체에 흡착된 펩타이드 항원을 포함하는 입자들을 제조하는 단계;
(c) 펩타이드-수산화 알루미늄 입자를 분리하여 중성 완충액에 복원시켜서 완충된 펩타이드-수산화 알루미늄 입자 용액을 제조하는 단계;
(d) 완충된 펩타이드-수산화 알루미늄 입자 용액을 오토클레이빙하여 멸균된 입자 용액을 제조하는 단계;
(e) TLR9 작용물질을 중성 완충액에 용해시켜서 완충된 TLR9 작용물질 용액을 제조하는 단계;
(f) 완충된 TLR9 작용물질 용액을 약 0.2 마이크로미터 필터를 통해 통과시켜서 멸균된 TLR9 작용물질 용액을 제조하는 단계; 및
(g) 멸균된 입자 용액과 멸균된 TLR9 작용물질 용액을 접촉시켜서 각각이 수산화 알루미늄 복합체에 흡착된 TLR9 작용물질 및 펩타이드 항원을 포함하는 입자들을 포함하는 멸균된 면역원성 용액을 제조하는 단계;
여기서 하나 이상의 펩타이드 항원은 각각 길이가 약 9 내지 2000개의 아미노산인 폴리펩타이드를 포함하는 종양 항원이고,
수산화 알루미늄 복합체는 약 500 내지 약 5,000 나노미터의 직경을 가지며,
TLR9 작용물질은 길이가 12 내지 50개의 뉴클레오타이드의 CpG-함유 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구체예에서, 유기 용매는 아이소프로필 알코올, 다이메틸 설폭사이드, 다이메틸포름아미드, 포름산, 에탄올, 2-부탄올, 아세톤, 아세트산, 및 그것들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 종양 항원은 각각 길이가 약 8 내지 약 60개의 아미노산인 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구체예에서, 중성 완충액은 약 6 내지 약 9의 pH 범위에 있고 완충액은 포스페이트 완충액이 아니다. 일부 구체예에서, 단계 (a) 내지 (d)는 단계 (e) 및 (f) 전에 또는 동시에 일어난다. 일부 구체예에서, 멸균된 면역원성 조성물은 각각의 펩타이드 항원 대 수산화 알루미늄 복합체의 비율 및 TLR9 작용물질 대 수산화 알루미늄 복합체의 비율이 약 0.1 내지 약 5.0 (중량/중량)(예컨대, 펩타이드 : alum : TLR9 = 0.1 내지 5.0 : 1:0 : 0.1 내지 5.0)의 범위 내에 있는 입자들의 불균일한 혼합물을 포함한다. 일부 구체예에서, TLR9 작용물질은 서열 5'-TCGNs-3' (SEQ ID NO:1)을 포함하고, 여기서 s는 4 내지 47이며 각각의 N은 뉴클레오사이드이다. 이런 구체예들의 하위세트에서, TLR9 작용물질은 5'-TCGNqAACGTTCGAACGTTCGAANr-3' (SEQ ID NO:4)를 포함하는 폴리뉴클레오타이드이며, 여기서 각각의 N은 독립적으로 선택된 뉴클레오사이드이고, q는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이며, r은 0 내지 29이다. 일부 바람직한 구체예에서, TLR9 작용물질은 5'-TCG AAC GTT CGA ACG TTC GAA CGT TCG AAT-3' (SEQ ID NO:6)으로 구성되는 폴리뉴클레오타이드이다. 일부 구체예에서, 멸균된 면역원성 조성물은 각각의 펩타이드 항원 대 수산화 알루미늄 복합체의 비율이 약 0.6 내지 1.2 : 1.0 (w/w)의 범위에 있고, TLR9 작용물질 대 수산화 알루미늄 복합체의 비율이 약 1.7 내지 3.4 : 1.0 (w/w)의 범위에 있는 입자들의 불균일한 혼합물을 포함한다. 일부 바람직한 구체예에서, 각각의 펩타이드 항원 대 수산화 알루미늄 복합체의 비율은 약 1.2 : 1.0 (w/w)이고, TLR9 작용물질 대 수산화 알루미늄 복합체의 비율은 약 3.4 : 1.0 (w/w)이다. 본원에서 기술된 것과 같이, 수산화 알루미늄 복합체의 중량은 알루미늄 함량을 기준으로 한다. 다른 구체예에서, TLR9 작용물질은 식 Nu1-Sp1-Nu2-Sp2-Nu3의 키메릭 화합물이고, 식에서 Nu1, Nu2 및 Nu3은 길이가 7 내지 50개의 뉴클레오타이드인 독립적으로 선택된 핵산 모이어티이며, Nu1은 서열 5'-TCGNs-3'로 구성되고, 이때 s는 4 내지 47이며, Sp1 및 Sp2는 헥사에틸렌 글리콜 (HEG), 트라이에틸렌 글리콜 (TEG), 프로필, 부틸 및 헥실로 구성되는 군의 적어도 하나의 구성원을 포함하는 동일하거나 상이한 비 핵산 스페이서 모이어티이고, Sp1은 Nu1 및 Nu2에 공유 결합되며, Sp2는 Nu2 및 Nu3에 공유 결합된다. 일부 바람직한 구체예에서, TLR9 작용물질은 5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:5) 또는 5'-TCGCCGG-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGCCGG-3' (SEQ ID NO:72)와 같이 3개의 핵산 모이어티 및 2개의 헥사에틸렌 글리콜 (HEG) 스페이서를 포함하는 키메릭 화합물이다. 일부 구체예에서, 펩타이드 항원은 종양 항원이다. 일부 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 종양 항원은 길이가 적어도 8개의 아미노산인 SEQ ID NO:60의 인간 암/고환 항원 1 또는 그것의 단편의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 종양 항원은 SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, 및 그것들의 조합으로 구성되는 군 중 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 또한 유효량의 면역원성 조성물을 대상체에게 종양내 전달에 의해 투여하는 단계를 포함하는, 포유류 대상체 (예컨대, 인간 대상체)에서 암을 치료하는 방법이 제공된다.
도 1A 및 1B는 [CpG-PEG6]x-FICOLL-[(PEG6-펩타이드]t와 같은, 다당 멀티머화제 (GE Healthcare에 의해 시판되는 FICOLL® 브랜드 다당)에 각각 컨쥬게이트되어 있는 TLR9 작용물질 (CpG) 및 종양 항원 (펩타이드)을 포함하는 예시 입자 (나노입자)를 제조하기 위해 사용된 제조 계획에 대한 흐름도를 도시한다.
도 2는 [CpG-PEG6]x-FICOLL-[(PEG6-펩타이드]t와 같은, 다당 멀티머화제 (FICOLL)에 각각 컨쥬게이트되어 있는 TLR9 작용물질 (CpG) 및 종양 항원 (펩타이드)을 포함하는 예시 입자 (나노입자)의 제조를 도시한다.
도 3A 내지 3D는 백신접종되지 않은 대조군에 비교한, TLR9 작용물질-함유 나노입자의 종양내 (IT) 또는 피하 (SC) 투여 후의 종양-포함 마우스의 시간에 따른 종양 부피의 변화를 도시한 성장 곡선을 도시한다. 도시된 평균 종양 부피는 5 내지 6마리 마우스의 그룹의 2회의 독립적인 실험을 나타낸다. 도 3A에서, EG7-OVA 림프종 종양을 가진 마우스들은 치료되지 않은 채로 남겨지거나 이식 후 제 4, 7 및 11일에 TLR9 작용물질-함유 나노입자를 받았다. 2개 그룹에서, 나노입자는 또한 오브알부민 (OVA) 단백질을 함유하였다. 도 3B에서, B16-OVA 흑색종 종양을 가진 마우스들은 치료되지 않은 채로 남겨지거나 이식 후 제 10, 14 및 17일에 TLR9 작용물질-함유 나노입자를 받았다. 2개 그룹에서, 나노입자는 또한 오브알부민 (OVA) 단백질을 함유하였다. 도 3C에서, B16-OVA 흑색종 종양을 가진 마우스들은 치료되지 않은 채로 남겨지거나 이식 후 제 8, 12 및 16일에 TLR9 작용물질-함유 나노입자를 받았다. 2개 그룹에서, 나노입자는 또한 오브알부민 폴리펩타이드 (OVApep)를 받았다. 도 3D에서, B16-OVA 흑색종 종양을 가진 마우스들은 치료되지 않은 채로 남겨지거나 이식 후 제 8, 12 및 16일에 TLR9 작용물질-함유 나노입자를 받았다. 2개 그룹에서, 나노입자는 또한 3개의 흑색종 분화 항원 (Triple)의 에피토프들을 포함하여 폴리펩타이드를 함유하였다.
도 4는 백신접종되지 않은 대조군에 비교한, TLR9 작용물질-함유 나노입자의 종양내 (IT) 투여 후의 종양-포함 마우스의 시간에 따른 종양 부피의 변화를 도시한 성장 곡선을 도시한다. EG7-OVA 림프종 종양을 가진 마우스들은 치료되지 않은 채로 남겨지거나 제 0, 3 및 7일에 TLR9 작용물질-함유 나노입자를 받았다. 2개의 독립적인 실험을 나타내는 데이터는 4 내지 6마리의 마우스의 그룹들의 평균 종양 부피로서 제시된다. 한 그룹에서 나노입자는 또한 오브알부민 폴리펩타이드 (OVApep)를 함유한 한편, 다른 그룹에서 별도의 나노입자가 OVApep를 함유하였다. 개략도에서, 회색의 원형은 GE Healthcare에 의해 시판되는 FICOLL® 브랜드 다당을 나타내고, 진한색 파선(wavy line)은 D61-01 TLR9 작용물질 (CpG)을 나타내며, 진한 타원형은 OVApep 항원을 나타낸다. 통계학적 유의미성은 쌍을 이루지 않은 학생 t-테스트 및 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 계산되었고, 0.05 미만의 p 값을 유의미한 것으로 간주하였다.
도 5는 백신접종되지 않은 대조군에 비교한, TLR9 작용물질-함유 나노입자의 종양내 (IT) 또는 피하 (SC) 투여 후에 종양-포함 마우스의 림프구에 의한 항원-특이적 IFN-γ 분비를 보여주는 그래프를 도시한다. 수립된 EG7-OVA 림프종 또는 B16-OVA 흑색종 종양을 포함하는 마우스들은 치료되지 않은 채로 남겨지거나 제 0, 7 및 10일에 TLR9 작용물질-함유 나노입자를 받았다. 2개의 그룹에서, 나노입자는 또한 오브알부민 폴리펩타이드 (OVApep)를 함유하였다. 림프구는 제 13일에 수집된 종양-누출 림프절로부터 얻어졌고, 다양한 농도의 OVA 부류I 펩타이드로 재자극되었다. 상층액 중의 IFN-γ 분비가 ELISA에 의해 평가되었다. 2개의 독립적인 실험을 나타내는 데이터는 그룹당 2 내지 3개의 복제물을 생성하기 위하여 2 내지 5마리 마우스로부터 모아진 림프절로부터 분리된 림프구의 평균 IFN-γ 농도로서 제시된다.
도 6A는 백신접종되지 않은 대조군에 비교한, TLR9 작용물질-함유 나노입자의 종양내 (IT) 또는 피하 (SC) 투여 후에 종양-포함 마우스의 비장세포에 의한 항원-특이적 IFN-γ 분비를 보여주는 그래프를 도시한다. 수립된 EG7-OVA 림프종 또는 B16-OVA 흑색종 종양을 포함한 마우스들은 치료되지 않은 채로 남겨지거나 제 0, 3 및 7일에 TLR9 작용물질-함유 나노입자를 받았다. 2개의 그룹에서, 나노입자는 또한 오브알부민 폴리펩타이드 (OVApep)를 함유하였다. 비장세포는 제 10일에 수집된 비장으로부터 얻어졌고, 다양한 농도의 OVA 부류I 펩타이드로 재자극되었다. 상층액 중의 IFN-γ 분비가 ELISA에 의해 평가되었다. 2개의 독립적인 실험을 나타내는 데이터는 그룹당 2 내지 3개의 복제물을 생성하기 위하여 2 내지 5마리 마우스로부터 모아진 비장으로부터 분리된 림프구의 평균 IFN-γ 농도로서 제시된다. 도 6B는 좌우에 B16-OVA 흑색종 종양의 수립 및 후속되는 TLR9 작용물질-함유 나노입자로의 치료에 대한 스케줄의 개략을 도시한다. 도 6C는 백신접종되지 않은 대조군에 비교한, TLR9 작용물질-함유 나노입자의 종양내 (IT) 또는 피하 (SC) 투여 후에 종양-포함 마우스의 시간에 따른 백신접종된 및 백신접종되지 않은 종양 부피의 변화를 도시한 성장 곡선을 도시한다. 2개 그룹에서, 나노입자는 또한 오브알부민 폴리펩타이드 (OVApep)를 함유하였다.
도 7A는 좌우에 B16-OVA 흑색종 종양의 수립 및 후속되는 TLR9 작용물질-함유 나노입자 (D61-01-Fic-OVApep)로의 치료에 대한 스케줄의 개략을 도시한다. 마우스들은 종양 세포 접종 후 제 10, 13 및 17일에 우측 종양에 (IT) 또는 두 가지 종양으로부터 떨어진 부위에서 (SC) 백신접종되었다. 마지막 면역화 후 3일 후에, 종양을 수집하여 RNA를 추출하고 유전자 발현 분석을 수행하였고, 좌측 종양의 부피가 기록되었다. 도 7B는 종양내 경로에 의한 면역원성 조성물 (D61-01-Fic-OVApep)의 투여가 피하 경로를 통한 면역원성 조성물의 종양외 투여와 비교하여 멀리 떨어진 부위의 주사되지 않은 종양에 반해 더 강한 항-종양 반응을 유도하였음을 나타낸다. 도 7C는 나노스트링 유전자 발현 분석에 의해 측정되는 바, 종양 미세환경에 존재하는 규정된 면역 세포 유형들의 크기를 나타내는 그래프들을 도시한다. CD8+ T 세포, 세포독성 세포, Th1 세포 및 NK 세포들의 존재를 확인하는 징후는 백신접종된 IT 마우스 대비 SC로 백신접종된 또는 보조제 단독 (D61-01-Fic)으로 처리된 마우스로부터의 비주사 종양에서 유의미하게 상향조절된다. 데이터는 치료 조건당 n = 3을 나타낸다. 통계학적 유의미성은 쌍을 이루지 않은 학생 t-테스트 및 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 계산되었고, 0.05 미만의 값들이 유의미한 것으로 간주되었다. * p = 0.05, ** p ≤= 0.01 및 *** p ≤= 0.001.
도 8A는 마우스의 피하 공간 및 폐에서 B16-OVA 흑색종 종양의 수립을 보여주는 그림을 도시한다. 공존하는 피하 종양 및 폐 종양을 포함한 마우스들은 피하에 성장하는 종양에 (IT) 또는 멀리 떨어진 부위에서 (SC) D61-01-Fic-OVApep로 백신접종되었다. D61-01-Fic 보조제는 대조군으로서 IT로 투여되었다. 폐 종양은 B16-0VA 종양 세포를 정맥내 경로에 의해 주사함으로써 수립되었다. 마우스들은 피하 종양의 이식 후 제 8, 12, 15 및 18일에 백신접종되었다. 마지막 백신접종 후 7일 후에, 마우스들은 희생되었고 폐가 수집되었다. 그런 다음 폐는 포르말린에 고정되었고 거시적 전이의 수가 계수되었다. 도 8B는 주사된 종양의 부피를 보여주는 그래프를 도시하는데, 그것은 백신을 직접 종양에 투여하는 것이 멀리 떨어진 부위의 면역화 (SC) 또는 보조제 단독과 비교하여 월등한 항종양 활성을 초래하는 것을 증명한다. 도 8C는 각각의 연구 그룹으로부터의 마우스의 폐의 대표적인 사진을 도시한다. 도 8D는 2개의 독립적인 실험으로부터의 누적 전이 데이터의 그래프를 도시한다. 통계학적 유의미성은 쌍을 이루지 않은 학생 t-테스트 및 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 계산되었고, 0.05 미만의 값들이 유의미한 것으로 간주되었다. * p = 0.05, ** p ≤= 0.01 및 *** p ≤= 0.001.
도 9는 각각 수산화 알루미늄 입자에 동시 흡착된 TLR9 작용물질 (CpG) 및 하나 이상의 종양 항원 (펩타이드)을 포함하는 예시적인 입자 (미세입자)를 제조하기 위해 사용된 제조 계획에 대한 흐름도를 제공한다.
도 10A 내지 10C는 백신접종되지 않은 대조군에 비교한, TLR9 작용물질-함유 미세입자의 종양내 (IT) 또는 피하 (SC) 투여 후에 종양-포함 마우스의 시간에 따른 종양 부피의 변화를 도시한 성장 곡선을 도시한다. 도시된 평균 종양 부피는 5 내지 7마리 마우스의 그룹들의 적어도 2회의 독립적인 실험을 나타낸다. 도 10A에서, 마우스들은 치료되지 않은 채로 남겨지거나 이식 후 제 8, 11 및 15일에 TLR9 작용물질-함유 미세입자를 받았다. 2개의 그룹에서, 미세입자는 또한 오브알부민 폴리펩타이드 (OVApep)를 함유하였다. 도 10B에서, B16-OVA 흑색종 종양을 가진 마우스들은 치료되지 않은 채로 남겨지거나 이식 후 제 8, 11 및 15일에 TLR9 작용물질-함유 미세입자를 받았다. 2개의 그룹에서, 미세입자는 또한 3개의 흑색종 분화 항원 (Triple)의 에피토프를 포함한 폴리펩타이드를 함유하였다. 도 10C에서, EG7-OVA 림프종 종양을 가진 마우스들은 치료되지 않은 채로 남겨지거나 이식 후 제 8, 11 및 15일에 TLR9 작용물질-함유 미세입자를 받았다. 2개의 그룹에서, 미세입자는 또한 오브알부민 폴리펩타이드 (OVApep)를 함유하였다. 이 실험에서, Alum은 Brenntag Biosector A/S에 의해 시판되는 수산화 알루미늄 복합체인 ALHYDROGEL® 85이다.
도 11A 내지 11B는 종양내 경로에 의한 면역원성 조성물 (DV61-04-Alum-OVApep)의 투여가 종양으로부터 멀리 떨어진 부위에 피하 주사를 통한 종야외 투여와 비교하여 월등한 항-종양 반응을 유도하였음을 증명한다. 공존하는 피하 및 폐 종양을 포함한 마우스들이 피하에 성장하는 종양에 (IT 백신) 또는 멀리 떨어진 부위에서 (SC 백신) D61-04-Alum-OVApep로 백신접종되었다. IT로 제공된 DV61-04-Alum이 대조군으로서 사용되었다. 폐 종양은 B16-OVA 종양 세포를 정맥내 경로에 의해 주사함으로써 수립되었다. 마우스들은 피하 종양의 이식 후 제 11, 14, 18 및 21일에 백신접종되었다. 마지막 백신접종 후 4일 후에, 마우스들은 희생되었고 폐가 수집되었다. 그런 다음 폐는 포르말린에 고정되었고 거시적 전이의 수가 계수되었다. 이 실험에서, Alum은 Biosector A/S에 의해 시판되는 수산화 알루미늄 복합체인 ALHYDROGEL® 85이다.
본 개시는 Toll-유사 수용체 9 작용물질 (TLR9) 및 종양 항원을 함유한 입자들의 종양내 전달에 의해 암을 치료하는 방법에 관련되며, 이때 TLR9 작용물질 은 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 키메릭 화합물이다. 본 개시의 방법은 적어도 하나의 종양으로의 입자들의 주사를 포함하며, 포유류 대상체의 주사된 또는 주사되지 않은 종양 둘 다의 치료에 효과적이다. 대안적으로, 본 개시는 그런 입자들을 함유하는 면역원성 조성물, 뿐만 아니라 그것의 제조 방법을 제공한다.
I. 일반적인 방법 및 정의
본 개시의 실시는, 다르게 표시되지 않는 한, 당업계의 기술 내에 있는 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학, 생화학, 핵산 화학, 및 면역학의 종래 기법들을 사용할 것이다. 그러한 기법들은 전체적으로 문헌에 기술되어 있고, 예를 들면 다음을 참조한다: Animal Cell Culture, sixth edition (Freshney, Wiley-Blackwell, 2010); Antibodies, A Laboratory Manual, second edition (Greenfield, ed., Cold Spring Harbor Publications, 2013); Bioconjugate Techniques, third edition (Hermanson, Academic Press, 1996); Current Protocols in Cell Biology (Bonifacino et al., ed., John Wiley & Sons, Inc., 1996, including supplements through 2014); Current Protocols in Immunology (Coligan et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., 1991 including supplements through 2014); Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., 1987, including supplements through 2014); Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry (Egli et al., ed., John Wiley & Sons, Inc., 2000, including supplements through 2014); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, third edition (Sambrook and Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, fourth edition (Green and Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012); Oligoneucleotide Synthesis: Methods and Applications (Herdewijn, ed., Humana Press, 2004); Protocols for Oligoneucleotides and Analogs, Synthesis and Properties (Agrawal, ed., Humana Press, 1993); 및 Using Antibodies: A Laboratory Manual (Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998).
본원에서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단일 대상을 나타내는 용어들은 다르게 표시되지 않는한 복수의 대상을 포함한다. 예를 들어 "부형제"는 하나 이상의 부형제를 포함한다.
본원에서 사용되는 구절 "포함하는"은 단부가 개방되어 있고, 그런 구체예들이 추가적인 요소들을 포함할 수 있음을 나타낸다. 대조적으로, 구절 "~으로 구성되는"은 닫혀 있으며, 그러한 구체예들이 추가적인 요소들을 포함하지 않는 것을 나타낸다 (미량의 불순물은 제외함). 구절 "본질적으로 ~으로 구성되는"은 부분적으로 닫혀 있고, 그러한 구체예들이 그런 구체예들의 기본적인 특성을 실질적으로 변화시키지 않는 요소들을 추가로 포함할 수 있음을 나타낸다. 본원에서 "포함하는"으로서 기술된 측면 및 구체예들은 구체예들로 "구성되는" 및 "본질적으로 구성되는"을 포함하는 것으로 인지되어야 한다.
본원에서 값과 관련하여 사용되는 용어 "약"은 그 값의 90% 내지 110%를 포함한다 (예컨대 약 20 μg의 서비빈 항원은 18 μg 내지 22 μg의 서비빈 항원을 나타내고 20 μg의 서비빈 항원을 포함한다).
본원에서 상호교화적으로 사용되는 용어 "폴리뉴클레오타이드," "올리고뉴클레오타이드" 및 "핵산"은 단일-가닥 DNA (ssDNA), 이중-가닥 DNA (dsDNA), 단일-가닥 RNA (ssRNA) 및 이중-가닥 RNA (dsRNA), 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오사이드, 또는 그것들의 조합을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는 일반적으로, 포스포다이에스테르 결합을 통해 연합된 뉴클레오사이드의 폴리머이지만, 대체 결합, 예컨대 포스포로티오에이트 에스테르가 사용될 수도 있다. 뉴클레오사이드는 당에 결합된 퓨린 (아데닌 (A) 또는 구아닌 (G) 또는 그것들의 유도체) 또는 피리미딘 (티민 (T), 시토신 (C) 또는 우라실 (U), 또는 그것들의 유도체) 염기로 구성된다. DNA에서 4개의 뉴클레오사이드 유닛 (또는 염기)은 데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 티미딘, 및 데옥시시티딘으로 불린다. RNA에서 4개의 뉴클레오사이드 유닛 (또는 염기)은 아데노신, 구아노신, 우리딘 및 시티딘으로 불린다. 뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드의 포스페이트 에스테르이다.
용어 "회문식 서열(palindromic sequence)" 또는 "회문(palindrome)"은 역 반복부인 핵산 서열, 예컨대, ABCDD'C'B'A'일 때, A, 및 A', B 및 B', C 및 C', D 및 D'가 왓슨-크릭 염기쌍을 형성할 수 있는 핵산 서열을 나타낸다. 그러한 서열은 단일-가닥이거나 이중-가닥 구조를 형성할 수 있거나 또는 일부 조건 하에서 헤어핀 루프 구조를 형성할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 사용되는 것과 같이, "8개 염기 회문"은 회문식 서열이 길이가 8개 염기인, 예컨대 ABCDD'C'B'A'인 핵산 서열을 나타낸다. 회문식 서열은 또한 비-회문식 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드의 일부일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 회문식 서열 부분 및 하나 이상의 비-회문식 서열을 함유할 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오타이드 서열은 전체적으로 회문식일 수 있다. 하나 이상의 회문식 서열 부분을 가진 폴리뉴클레오타이드에서, 회문식 서열 부분들은 서로 중복될 수도 있고 중복되지 않을 수도 있다.
용어 "개체" 및 "대상체"는 포유류를 나타낸다. "포유류"는, 한정하는 것은 아니지만 인간, 비-인간 영장류 (예컨대 원숭이), 농경용 가축, 스포츠용 동물, 설치류 (예컨대 마우스 및 래트) 및 애완동물 (예컨대 개 및 고양이)을 포함한다.
용어 "항원"은 항체에 의해 또는 T 세포 항원 수용체에 의해 특이적으로 인지되고 결합되는 물질을 나타낸다. 항원은 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 당단백질, 다당, 복합 탄수화물, 당, 강글리오시드, 지질 및 인지질; 그것들의 일부분 및 그것들의 조합을 포함할 수 있다. 항원은 본 개시의 조성물에 존재할 때 합성이거나 자연으로부터 분리된 것일 수 있다. 본 개시의 방법에서 투여하기에 적합한 항원은 항원-특이적 B 세포 또는 T 세포 반응을 유도할 수 있는 임의의 분자를 포함한다. 합텐이 "항원"의 범주 내에 포함된다. "합텐"은 그 자체로는 면역원성이 아니지만 일반적으로 더 큰 면역원성 분자 (담체)와 컨쥬게이트될 때 면역원성이 되기 쉬운 저분자량 화합물이다.
"폴리펩타이드 항원"은 정제된 천연 펩타이드, 합성 펩타이드, 재조합 펩타이드, 미정제 펩타이드 추출물, 또는 부분적으로 정제된 또는 미정제된 활성 상태의 펩타이드 (예컨대 약독화된 또는 비활성화된 바이러스, 미생물 또는 세포의 부분인 펩타이드), 또는 그러한 펩타이드들의 단편을 포함할 수 있다. 폴리펩타이드 항원은 바람직하게는 길이가 적어도 6개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 길이가 8 내지 1800개의 아미노산, 보다 바람직하게는 길이가 9 내지 1000개의 아미노산, 또는 길이가 10 내지 100개의 아미노산이다. 유사하게, 일부 구체예에서, 폴리펩타이드는 길이가 약 9 내지 약 2000개, 약 9 내지 약 1000개, 약 9 내지 약 100개, 또는 약 9 내지 약 60개의 아미노산이다. 일부 구체예에서, 폴리펩타이드는 길이가 적어도 (하한선) 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80 또는 90개의 아미노산이다. 일부 구체예에서, 폴리펩타이드는 길이가 최대 (상한선) 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 250, 200, 150 또는 100개의 아미노산이다. 일부 구체예에서, 폴리펩타이드 항원은 길이가 10 내지 100개의 아미노산이다.
본원에서 사용되는 용어 "면역원성"은 포유류 대상체에게 적합한 조건 하에서 투여시 적응 면역 반응을 유도하는 작용제 (예컨대, 폴리펩타이드 항원)의 능력을 나타낸다. 면역 반응은 B 세포 (체액성) 및/또는 T 세포 (세포성) 반응일 수 있다.
"보조제"는 항원과 같은 면역원성 작용제와 혼합될 때, 혼합물에 노출될 때 수령체(recipient)에서 그 작용제에 대한 면역 반응을 비특이적으로 향상 또는 강화시키는 물질을 나타낸다.
용어 "작용물질"은 광범위한 의미로 사용되고 수용체를 통해 신호전달을 활성화하는 모든 분자를 포함한다. 일부 구체예에서, 작용물질은 수용체에 결합한다. 예를 들어, TLR9 작용물질은 TLR9 수용체에 결합하여 TLR9-신호전달 경로를 활성화한다. 다른 예시에서, 면역 조절 분자 CD27의 작용물질은 CD27 신호전달 경로에 결합하여 그것을 활성화한다.
용어 "길항물질"은 광범위한 의미로 사용되고, 작용물질의 생물학적 활성을 적어도 부분적으로 차단하는 모든 분자를 포함한다. 일부 구체예에서, 길항물질은 작용물질에 결합하는 한편, 다른 구체예에서, 길항물질은 작용물질의 리간드에 결합한다. 예를 들어, 억제성 면역 체크포인트 분자 PD-1의 길항물질은 PD-1 신호전달 경로에 결합하여 그것을 차단한다.
용어 "면역조절 서열" 및 "ISS"는 측정 가능한 면역 반응 (예컨대 시험관내에서, 생체내에서, 및/또는 생체외에서)을 자극하는 핵산 서열을 나타낸다. 본 개시의 목적에 대해, 용어 ISS는 메틸화되지 않은 CG 다이뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 서열을 나타낸다. 측정 가능한 면역 반응의 예로는, 한정하는 것은 아니지만, 항원-특이적 항체 생성, 사이토카인 분비, 림프구 활성화 및 림프구 증식을 포함한다.
용어 "CpG" 및 "CG"는 본원에서, 다르게 진술되지 않는 한, 포스페이트에 의해 분리된 시토신 및 구아닌을 나타내기 위하 상호교환적으로 사용된다. 이 용어들은 시토신 및 구아닌의 염기쌍과는 반대로 서열을 선형화하는 것을 나타낸다. 본 개시의 폴리뉴클레오타이드는 적어도 하나의 메틸화되지 않은 CpG 다이뉴클레오타이드를 함유한다. 즉 CpG 다이뉴클레오타이드의 시토신은 메틸화되지 않는다 (즉 5-메틸시토신이 아니다).
본 개시의 "CpG PNs" 또는 "CpG 폴리뉴클레오타이드"는 길이가 7 내지 50개의 뉴클레오타이드로, 하나 이상의 메틸화되지 않은 CG 다이뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 바람직한 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드는 올리고데옥시뉴클레오타이드 (ODN)이다. 일부 바람직한 구체예에서, CpG PN은 그것의 5' 단부에 TCG를 포함하는데, 그것은 B 세포를 자극하는 능력을 부여한다. 일부 구체예에서, CpG PN은 CG-함유 회문을 포함하고, 그것은 인간 형질세포양 수지상 세포 (PDC) 성숙 및 제 1형 인터페론 (예컨대, IFN-α, IFN-γ, 등)의 고수준의 분비를 유도하는 능력을 부여한다. 일부 구체예에서, CpG PN은 바람직하게는 길이가 12 내지 50개의 뉴클레오타이드이다. 일부 구체예에서, PN은 길이가 적어도 (하한선) 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 또는 45개의 뉴클레오타이드이다. 일부 구체예에서, PN은 길이가 최대 (상한선) 50, 45, 40, 38, 36, 34, 32, 30, 28, 26, 24, 22 또는 20개의 뉴클레오타이드이다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 회문식 서열은 길이가 적어도 (하한선) 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 또는 30개의 염기이다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 회문식 서열은 길이가 최대 (상한선) 32, 30, 28, 26, 24, 22, 20, 18, 16, 14, 12 또는 10개의 염기이다. 즉, 적어도 하나의 회문식 서열은 길이가 8 내지 32개의 염기이다.
본원에서 사용되는 용어 "안티센스" 및 "안티센스 서열"은 mRNA의 암호화 가닥에 상보하는 서열을 가진 폴리뉴클레오타이드의 비-암호화 가닥을 나타낸다. 바람직한 구체예에서, 본 개시의 폴리뉴클레오타이드는 안티센스 서열, 또는 RNAi 분자 (miRNA 및 siRNA)가 아니다. 즉 바람직한 구체예에서, 본 개시의 폴리뉴클레오타이드는 그것이 사용될 포유류 대상체의 전사물 (또는 유전자)에 대해 유의할만한 상동성 (또는 상보성)을 갖지 않는다. 예를 들어, 인간 대상체에서 면역 반응을 조절하기 위한 본 개시의 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게는 인간 게놈의 핵산 서열에 대해 그것의 길이상으로 80% 미만이 동일하다 (예컨대 길이가 50개의 뉴클레오타이드인 폴리뉴클레오타이드는 인간 전사물과 50개의 염기 중 40개 정도의 염기를 공유할 것이다). 즉, 바람직한 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드는 그것이 사용될 포유류 대상체 (예컨대, 인간, 비인간 영장류, 농경용 가축, 개, 고양이, 토끼, 래트, 마우스 등)의 핵산 서열에 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25% 또는 20% 미만으로 동일하다.
반응 또는 파라미터의 "자극"은, 그렇지 않으면 관심의 파라미터를 제외한 동일한 조건과 비교할 때, 또는 대안적으로, 다른 조건과 비교하여, 그 반응 또는 파라미터를 유도하는 것 및/또는 향상시키는 것을 포함한다 (예컨대 TLR 작용물질의 부재와 비교하여 TLR 작용물질의 존재하에 TLR-신호전달의 증가). 예를 들어, 면역 반응의 "자극"은 반응의 증가를 의미한다.
반응 또는 파라미터의 "억제"는, 그렇지 않으면 관심의 파라미터를 제외한 동일한 조건과 비교할 때, 또는 대안적으로, 다른 조건과 비교하여, 그 반응 또는 파라미터를 차단하는 것 및/또는 억압하는 것을 포함한다 (예컨대 PD-1 길항물질의 부재하에 PD-1 리간드의 존재와 비교하여 PD-1 리간드 및 PD-1 길항물질의 존재하에 PD-1-신호전달의 감소). 예를 들어, 면역 반응의 "억제"는 반응의 감소를 의미한다.
본원에 개시된 작용제의 "유효량"은 구체적으로 진술된 목적을 수행하기에 충분한 양이다. "유효량"은 진술된 목적과 관련하여 실험적으로 측정될 수 있다. 작용제의 "유효량" 또는 "충분한 양"은 원하는 생물학적 효과, 예컨대 유익한 임상 결과를 포함하는 유익한 결과에 영향을 미치기에 적당한 양이다. 용어 "치료적 유효량"은 대상체 (예컨대 인간과 같은 포유류)의 질환 또는 장애를 "치료"하기에 효과적인 작용제 (예컨대, 폴리뉴클레오타이드 TLR9 작용물질)의 양을 나타낸다. 작용제의 "유효량" 또는 "충분한 양"은 하나 이상의 용량으로 투여될 수 있다.
용어 질환의 "치료하는" 또는 "치료"는 질환의 징후 또는 증상을 경감시키기 위한 노력으로, 프로토콜을 실행하는 것을 나타내며, 하나 이상의 약물을 개체 (인간 또는 기타)에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 그러므로, "치료하는" 또는 "치료"는 징후 또는 증상의 완전한 경감을 필요로 하지 않으며, 치유를 필요로 하지 않고, 구체적으로 개체에 영향을 미치는 단지 완화 효과만을 가지는 프로토콜을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 및 당업계에서 널리 인지되고 있는 것과 같이, "치료"는 임상 결과를 포함하여, 유익한 또는 바람직한 결과를 얻기 위한 접근법이다. 유익한 또는 원하는 임상 결과는, 한정하는 것은 아니지만, 검출 가능하거나 검출가능하지 않거나 간에, 하나 이상의 증상의 경감 또는 개선, 질환의 정도의 감소, 질환 진전의 지연 또는 둔화, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 퇴행 (부분적이든 총체적이든)을 포함한다. "치료"는 또한 치료를 받지 않은 개체의 예상 생존과 비교하여 연장된 생존을 의미할 수 있다. 질환 또는 장애를 "완화시키는 것"은 예상된 미치료 결과와 비교하여, 질환 또는 장애의 정도 및/또는 바람직하지 못한 임상적 징후들이 줄어들거나 및/또는 질환 또는 장애의 진행의 시간 과정이 느려지는 것을 의미한다. 추가로, 완화 및 치료는 본질적으로는 1회 용량의 투여에 의해 일어나지 않지만, 일련의 용량의 투여시에 자주 일어난다.
본원에서 사용되는 용어 "알루미늄 염"은 백신 항원에 대한 원하는 면역 반응을 증가시키기 위한 백신 보조제로서의 사용에 적합한 알루미늄-함유 무기 화학적 화합물의 부류를 나타낸다 (예컨대 동시에 투여된 항원에 대하여 항체를 생성하거나 세포-매개된 면역력을 유도한다; 예컨대 Lindblad, 2004 Vaccine 22:3658-3668 참조). 백신에 사용될 때, 알루미늄 염은 전형적으로 여러 다형태 중 임의의 한 형태의 결정 구조를 가진 불규칙한-형상 및 크기의 입자들의 습식-겔 현탁액이다. 항원은 정전기 상호작용, 리간드 교환, 및/또는 소수성 상호작용을 포함하여, 여러 메커니즘에 의해 입자들에 흡착된다. 백신 보조제로서 통상적으로 사용된 알루미늄 염은 예를 들어, 수산화 알루미늄 (예컨대, Brenntag Biosector A/S에 의해 시판되는 ALHYDROGEL® 1.3%, ALHYDROGEL® 2% 및 ALHYDROGEL® 85 보조제), 알루미늄 옥사이드 하이드록사이드 (aluminum oxide hydroxide), 및 알루미늄 포스페이트 (예컨대, Brenntag Biosector A/S에 의해 시판되는 ADJU-PHOS®)를 포함한다. 비록, ALHYDROGEL® 85가 예시의 방법에 사용되었지만, 본 개시는 이 브랜드의 수산화 알루미늄 보조제의 사용에 전혀 제한되지 않는다. 다른 브랜드 및 비-브랜드의 알루미늄-함유 보조제들은 그것들이 비슷한 물리화학적 특성을 가지고 있다면 본원에 기술된 방법 및 조성물에 사용하기에 적합하다. 인간 백신에의 통합에 부합할 수 있는 그러한 특성으로는 500 내지 10,000 nm 직경 크기 범위; 다공성 결정 구조; 및 순(net) 표면 전하를 들 수 있다 (예컨대 Hem and HogenEsch, 2007 Expert Rev Vaccines, 6:685-698 참조). 본 개시의 조성물 및 방법에 사용하기에 적합한 알루미늄 염은 수산화 알루미늄 염 (또한 본원에서 "alum"으로서도 언급됨)이며, 그것은 전체적으로 음전하를 가지는 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드를 흡착할 수 있는 순 양전하를 가진다.
II. Toll 유사 수용체 9 (TLR9) 작용물질 및 종양 항원을 포함하는 입자들의 조성물 및 합성
본 개시의 입자들은 TLR9 작용물질을 포함하며, TLR9 작용물질은 서열 5'-TCGNs-3' (SEQ ID NO:1)를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 N은 독립적으로 선택된 뉴클레오사이드이며 s는 4 내지 47이다. 예시의 TLR9 작용물질은 표 S1-1에 제공되며 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 키메릭 화합물로서 존재할 수 있다. 일부 구체예에서, TLR9 작용물질은 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, 및 SEQ ID NO:73으로 구성되는 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오타이드이다.
일부 구체예에서, TLR9 작용물질은 5'-TCGNqAACGTTCGAACGTTCGAANr-3' (SEQ ID NO:4)로 구성되는 폴리뉴클레오타이드이고, 여기서 각각의 N은 독립적으로 선택된 뉴클레오사이드이며, q는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고, r은 0 내지 29이다. 일부 구체예에서, TLR9 작용물질은 5'-TCG AAC GTT CGA ACG TTC GAA CGT TCG AAT-3' (SEQ ID NO:6)로 구성되는 폴리뉴클레오타이드이다.
다른 구체예에서, TLR9 작용물질은 식 Nu1-Sp1-Nu2-Sp2-Nu3의 키메릭 화합물이고, 여기서 Nu1, Nu2 및 Nu3은 길이가 7 내지 50개의 뉴클레오타이드인 독립적으로 선택된 핵산 모이어티이며, Nu1은 서열 5'-TCGNs-3'로 구성되고, 이때 s는 4 내지 47이며, Sp1 및 Sp2는 헥사에틸렌 글리콜 (HEG), 트라이에틸렌 글리콜 (TEG), 프로필, 부틸 및 헥실로 구성되는 군의 적어도 하나의 구성원을 포함하는 동일하거나 상이한 비 핵산 스페이서 모이어티이고, Sp1은 Nu1 및 Nu2에 공유 결합되며, Sp2는 Nu2 및 Nu3에 공유 결합된다. 일부 구체예에서, 키메릭 화합물의 Nu2 및/또는 Nu3은 서열 5'-AACGTTNm-3'로 구성되고, 여기서 m은 1 내지 44이다 (SEQ ID NO:73). 일부 구체예에서, 키메릭 화합물의 Nu2는 서열 5'-AACGTTNm-3'로 구성되고, 여기서 m은 1 내지 44이다 (SEQ ID NO:73). 일부 구체예에서, 키메릭 화합물의 Nu3은 서열 5'-AACGTTNm-3'로 구성되고, 여기서 m은 1 내지 44이다 (SEQ ID NO:73). 일부 구체예에서, 키메릭 화합물의 Nu2 및 Nu3은 서열 5'-AACGTTNm-3'로 구성되고, 여기서 m은 1 내지 44이다 (SEQ ID NO:73). 일부 구체예에서, Sp1 및 Sp2는 헥사에틸렌 글리콜 (HEG)이다.
일부 바람직한 구체예에서, TLR9 작용물질은
5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:5), 또는
5' TCGCCGG-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGCCGG-3' (SEQ ID NO:72)이다.
본 개시의 입자들은 또한 종양 항원을 포함하여, 종양 항원은 8 내지 1800개의 아미노산, 9 내지 1000개의 아미노산, 또는 10 내지 100개의 아미노산의 폴리펩타이드이다. 구체적으로, 종양 항원은 적어도 하나의 전체 길이 단백질 또는 그것의 단편의 아미노산 서열을 포함한다. 적합한 종양 항원은 당업계에 기술되어 있다 (예컨대 Cheever et al., 2009 Clinical Cancer Research, 15:5323-5337; 및 Caballero and Chen, 2009, Cancer Science, 100:2014-2021 참조). 예를 들어, 적합한 종양 항원은, 한정하는 것은 아니지만, WT1, MUC1, LMP2, HPV E6, HPV E7, EGFRvIII, Her-2/neu, 이디오타입, MAGE A3, p53, NY-ESO-1 (CTAG1B), PSMA, GD2, CEA, MelanA/Mart1, Ras, gp100, 프로테이나제 3, bcr-able, 티로시나제, 서비빈, PSA, hTERT, 육종 전위 중단점, EphA2, PAP, MP-IAP, AFP, EpCAM, ERG, NA17-A, PAX3, ALK, 안드로겐 수용체, 사이클린 B1, MYCN, PhoC, TRP-2, 메소텔린, PSCA, MAGE A1, CYP1B1, PLAC1, BORIS, ETV6-AML, NY-BR-1, RGS5, SART3, 탄산 탈수효소 IX, PAX5, OY-TES1, 정자 단백질 17, LCK, HMWMAA, 별칭P-4, SSX2, XAGE 1, B7-H3, 레구마인, Tie 2, Page4, VEGFR2, MAD-CT-1, FAP, PAP, PDGFR-베타, MAD-CT-2, CEA, TRP-1 (gp75), BAGE1, BAGE2, BAGE3, BAGE4, BAGE5, CAMEL, MAGE-A2, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, 및 Fos-관련 항원 1을 포함한다. 대표적인 종양 항원의 아미노산 서열이 하기 표 I에 열거된 수탁 번호하에 UniProtKB 데이터베이스에 목록으로 열거되고, 본원에 참조로 포함된다.
종양 항원들
종양 항원 단백질 유전자 UniProtKB
수탁 번호
WT-1 빌름스 종양 단백질 WT1 P19544
MUC-1 뮤신-1 MUC1 P15941
LMP2 잠복성 막 단백질 2 LMP2 P13285
HPV E6 HPV 단백질 E6 E6 P03126
HPV E7 HPV 단백질 E7 E7 P03129
EGFRvIII 상피 성장 인자 수용체 EGRF P00533
Her-2/neu 수용체 티로신-단백질 키나아제 erbB-2 ERBB2 P04626
MAGE A1 흑색종-관련 항원 1 MAGEA1 P43355
MAGE A2 흑색종-관련 항원 2 MAGEA2 P43356
MAGE A3 흑색종-관련 항원 3 MAGEA3 P43357
MAGE A4 흑색종-관련 항원 4 MAGEA4 Q1RN33
MAGE A5 흑색종-관련 항원 5 MAGEA5 P43359
MAGE A6 흑색종-관련 항원 6 MAGEA6 P43360
MAGE A8 흑색종-관련 항원 8 MAGEA8 P43361
MAGE A9 흑색종-관련 항원 9 MAGEA9 P43362
MAGE A10 흑색종-관련 항원 10 MAGEA10 P43363
MAGE A11 흑색종-관련 항원 11 MAGEA11 P43364
MAGE A12 흑색종-관련 항원 12 MAGEA12 Q6FHH8
p53 세포 종양 항원 p53 TP53 P04637
NY-ESO-1 암/고환 항원 1 CTAG1A P78358
PSMA 글루탐산염 카르복시펩티다제 2 FOLH1 Q04609
CEA 암배아 항원-관련 세포 부착 분자 1 CEACAM1 P13688
MelanA/Mart1 T-세포 1에 의해 인지된 흑색종 항원 MLANA Q16655
Ras GTPase KRas KRAS P01116
gp100 멜라닌 생성 세포 단백질 PMEL PMEL P40967
프로테이나제 3 프로테이나제 3 PRTN3 D6CHE9
bcr-able 티로신-단백질 키나아제 ABL1 ABL1 P00519
티로시나제 티로시나제 TYR P14679
서비빈 배큘로바이러스 IAP 반복부-함유 단백질 5 BIRC5 O15392
PSA 전립선-특이적 항원 KLK3 P07288
hTERT 텔로머라제 역 전사효소 TERT O14746
육종 전위 중단점 RNA-결합 단백질 EWS EWSR1 Q01844
EphA2 에프린 유형-A 수용체 2 EPHA2 P29317
PAP 전립선산 포스파타제 ACPP P15309
MP-IAP 배큘로바이러스 IAP 반복부-함유 단백질 7 BIRC7 Q96CA5
AFP 알파-페토단백질 AFP P02771
EpCAM 상피 세포 부착 분자 EPCAM P16422
ERG 전사단계 조절제 ERG ERG P11308
NA17-A 알파-1,6-만노실당단백질 6-베타-N-아세틸글루코사미닐트란스퍼라제 A MGAT5 Q09328
PAX3 쌍을 이룬 박스 단백질 Pax-3 PAX3 P23760
ALK ALK 티로신 키나아제 수용체 ALK Q9UM73
안드로겐 수용체 안드로겐 수용체 AR P10275
사이클린 B1 G2/유사분열-특이적 사이클린-B1 CCNB1 P14635
MYCN N-myc 원종양유전자 단백질 MYCN P04198
PhoC
TRP-2 L-도파크롬 토토머라제 DCT P40126
메소텔린 메소텔린 MSLN Q13421
PSCA 전립선 줄기 세포 항원 PSCA O43653
CYP1B1 사이토크롬 P450 1B1 CYP1B1 Q16678
PLAC1 태반-특이적 단백질 PLAC1 Q9HBJ0
BORIS 전사단계 억제제 CTCFL CTCFL Q8NI51
ETV6-AML 전사 인자 ETV6 ETV6 P41212
NY-BR-1 안키린 반복 도메인-함유 단백질 30A ANKRD30A Q9BXX3
RGS5 G-단백질 신호전달 5의 조절자 RGS5 O15539
SART3 T-세포 3에 의해 인식된 편평 세포 암종 항원 SART3 Q15020
탄산 탈수효소 IX 탄산 탈수효소 9 CA9 Q16790
PAX5 쌍을 이룬 박스 단백질 Pax-5 PAX5 Q02548
OY-TES1 아크로신-결합 단백질 ACRBP Q8NEB7
정자 단백질 17 정자 표면 단백질 Sp17 SPA17 Q15506
LCK 티로신-단백질 키나아제 Lck LCK P06239
HMWMAA 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4 CSPG4 Q6UVK1
별칭P-4 A-키나아제 고정 단백질 4 별칭P4 Q5JQC9
SSX2 단백질 SSX2 SSX2 Q16385
XAGE 1 X 항원 패밀리 구성원 1 XAGE 1 Q9HD64
B7-H3 CD276 항원 CD276 Q5ZPR3
레구마인 레구마인 LGMN Q99538
Tie 2 안지오포이에틴-1 수용체 TEK Q02763
Page4 P 항원 패밀리 구성원 4 PAGE4 O60829
VEGFR2 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 KDR P35968
MAD-CT-1 정자 프로타민 P1 PRM1 P04553
MAD-CT-2 프로타민-2 PRM2 P04554
FAP 프롤릴 엔도펩티다제 FAP FAP Q12884
PAP 전립선산 포스파타제 ACPP P15309
PDGFR-베타 태반-유래 성장 인자 수용체 베타 PDGFRB P09619
CEA 암배아 항원-관련 세포 부착 분자 5 CEACAM5 P06731
TRP-1 (gp75) 5,6-다이하이드록시인돌-2-카르복실산 산화효소 TYRP1 P17643
BAGE1 B 흑색종 항원 1 BAGE1 Q13072
BAGE2 B 흑색종 항원 2 BAGE2 Q86Y30
BAGE3 B 흑색종 항원 3 BAGE3 Q86Y29
BAGE4 B 흑색종 항원 4 BAGE4 Q86Y28
BAGE5 B 흑색종 항원 5 BAGE5 Q86Y27
CAMEL 흑색종에서 CTL-인식된 항원 CAMEL O95987
Fos-관련 항원 1 Fos-관련 항원 1 FOSL1 P15407
일부 바람직한 구체예에서, 종양 항원은 gp100, hTERT, MAGE A1, MAGE A3, MAGE A10, MelanA/Mart1, NY-ESO-1 (CTAG1B), PSA, Ras, 서비빈, TRP1 (gp75), TRP2, 및 티로시나제로 구성되는 군의 하나 이상으로부터의 아미노산 서열 또는 그것의 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, 종양 항원은 종양에 의해 발현된 포유류 항원 (예컨대, Triple 펩타이드) 또는 바이러스 항원 (예컨대, HPV1 E6 및/또는 HPV E7)을 포함한다. 일부 구체예에서, 포유류 항원은 네오항원이거나 포유류 대상체로부터의 정상 세포에 존재하는 유전자에 비해 돌연변이를 포함한 유전자에 의해 암호화된다. 네오항원은 특히 T 세포가 암 세포와 비-암 세포 사이를 식별하는 것을 가능하게 하는데 유용한 것으로 여겨진다 (예컨대, Schumacher and Schreiber, 2015 Science 348:69-74; Desrichard et al., 2016 Clinical Cancer Res, 22:807-812; Wang and Wang, 2017 Cell Research 27:11-37 참조).
일부 구체예에서, 종양 항원은 둘 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질이고, 이때 각각의 폴리펩타이드는 상이한 종양 항원으로부터의 아미노산 서열 또는 동일한 종양 항원으로부터의 비연속성 아미노산 서열을 포함한다. 일부 이런 구체예에서, 융합 단백질은 제 1 폴리펩타이드 및 제 2 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 각각의 폴리펩타이드는 동일한 종양 항원으로부터의 비연속성 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 폴리펩타이드는 시스테인의 티올기를 통한 공유 결합을 가능하게 하기 위해 N- 또는 C-말단에 단일 시스테인 잔기를 포함하도록 변형된다. 다른 경우에 1 내지 3개의 아미노산 잔기, 또는 비-천연 아미노산 잔기가, 당업계에 공지된 많은 생체컨쥬게이트 화학을 통한 공유 결합을 가능하게 하기 위하여 변형된 폴리펩타이드 항원을 생성하기 위해 폴리펩타이드 항원의 N-말단 및 C-말단 중 하나 또는 양 말단에 첨가된다. 본 개시는 본원에서 상세하게 설명된 임의의 입자들, 예를 들어, 각각이 생체에 적합한 멀티머화제와 회합되어 있는 TLR9 작용물질 및 종양 항원을 포함하는 입자를 포함하는 면역원성 조성물을 제공하며, 여기서
멀티머화제는 10 내지 10,000 나노미터의 직경 및/또는 약 10,000 내지 약 1,000,000 달톤의 분자량을 가지고;
TLR9 작용물질은 서열 5'-TCGNs-3' (SEQ ID NO:1)를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 여기서 각각의 N은 독립적으로 선택된 뉴클레오사이드이고, s는 4 내지 47이며;
종양 항원은 약 9 내지 약 1000개의 아미노산의 폴리펩타이드를 포함하고;
TLR9 작용물질 및 종양 항원은 각각 하나 이상의 공유 결합에 의해 멀티머화제와 회합되거나, 또는 각각 흡착에 의해 멀티머화제와 회합된다.
A. TLR9 작용물질 : 알루미늄 염 복합체 : 종양 항원 동시-흡착물
본 개시는 TLR9 작용물질 및 종양 항원을 함유하는 입자의 제조 방법, 뿐만 아니라 조성물 및 그 안에서 유용한 중간체를 제공한다.
한 측면으로, 본 개시는 각각이 흡착에 의해 생체에 적합한 멀티머화제 (예컨대, 알루미늄 염 복합체)와 회합된 TLR9 작용물질 및 종양 항원을 포함하는 입자의 제조 방법을 제고하며, 방법은 종양 항원 및 TLR9 작용물질을 약 6 내지 9, 바람직하게는 약 7 내지 8의 pH를 가진 완충액에 평형화된 알루미늄 염 복합체와 혼합하는 단계를 포함한다. 용해를 향상시키기 위하여, 종양 항원은 물 또는 완충액 중의 5% 내지 30% (바람직하게는 10% 내지 20%)의 유기 용매에 용해된다. 적합한 유기 용매는, 한정하는 것은 아니지만, 아세트산, 아세톤, 아니솔, 1-부탄올, 2-부탄올, 부틸 아세테이트, 3차-부틸 메틸 에테르, 쿠멘, 다이메틸 설폭사이드, 에탄올, 에틸 아세테이트, 에틸 에테르, 에틸 포르메이트, 포름산, 헵탄, 아이소부틸 아세테이트, 아이소프로필 아세테이트, 메틸 아세테이트, 3-메틸-1-부탄올, 메틸에틸케톤, 메틸아이소부틸케톤, 2-메틸-1-프로판올, 펜탄, 1-펜탄올, 1-프로판올, 2-프로판올 (아이소프로판올), 프로필 아세테이트, 및 그것들의 조합을 포함한다. 일부 바람직한 구체예에서, 종양 항원은 물 또는 완충액 중의 5% 내지 30% (바람직하게는 10% 내지 20%) 아이소프로판올에 용해된다. TLR9 작용물질은 또한 완충액에 용해될 수 있다. 효율적인 흡착을 위해서, 포스페이트 완충액은 피해야 한다. 종양 항원 및 TLR9 작용물질은 멀티머화제 (예컨대, 알루미늄 염 복합체)에 동시에 또는 순차적으로 흡착될 수 있다. 예를 들어, 종양 항원의 용액이 소정 시간 동안 흡착을 허용하기 위해 완충액 중의 멀티머화제에 첨가될 수 있고; 그런 다음 TLR9 작용물질이 흡착을 위해 혼합물에 첨가되거나; 또는 TLR9 작용물질 용액이 소정 시간 동안 흡착을 허용하기 위해 완충액 중의 멀터머화제에 첨가되고; 그런 다음 종양 항원이 흡착을 위해 혼합물에 첨가될 수 있다. 대안적으로, 종양 항원 및 TLR9 작용물질의 용액이 동시에 멀티머화제 (예컨대, the 알루미늄 염 복합체) 상에 종양 항원 및 TLR9 작용물질의 흡착을 허용하기 위하여 동시에 첨가되거나, 또는 하나가 다른 것의 직후에 첨가된다.
일부 구체예에서, 각각이 흡착에 의해 생체에 적합한 멀티머화제와 회합되어 있는 TLR9 작용물질 및 종양 항원을 포함하는 입자의 제조 방법이 제공되며, 여기서
- 멀티머화제는 100 내지 25,000 나노미터, 500 내지 25,000 나노미터 또는 1 내지 25 마이크로미터의 입자 직경을 가지는 알루미늄 염 복합체 (예컨대, 수산화 알루미늄 복합체 또는 ALHYDROGEL®)이고,
- TLR9 작용물질은 서열 5'-TCGNs-3' (SEQ ID NO:1)을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 여기서 s는 4 내지 47이고 각각의 N은 뉴클레오사이드이며,
- 종양 항원은 약 8 내지 1800개의 아미노산, 9 내지 약 1000개의 아미노산, 또는 약 10 내지 약 100개의 아미노산의 폴리펩타이드를 포함하고,
방법은
약 5% 내지 약 30% (바람직하게는 약 10% 내지 약 20%) 아이소프로판올 또는 다른 유기 용매를 함유한 수용액에 용해된 종양 항원, 및 TLR9 작용물질을 완충액 중에 평형화된 알루미늄 염 복합체에 첨가하는 단계를 포함하며,
이때 완충액은 약 6 내지 약 9 (바람직하게는 약 7 내지 약 8)의 pH 범위에 있으며 완충액은 포스페이트 완충액이 아니다.
일부 구체예에서, 알루미늄 염 복합체는 수산화 알루미늄 복합체 (예컨대, ALHYDROGEL®)를 포함한다. 일부 구체예에서, 종양 항원 및 TLR9 작용물질은 동시에 알루미늄 염 복합체에 흡착된다. 일부 구체예에서, 종양 항원이 먼저 알루미늄 염 복합체에 흡착되고 이어서 TLR9 작용물질이 흡착된다. 일부 구체예에서, TLR9 작용물질이 먼저 알루미늄 염 복합체에 흡착되고 이어서 종양 항원이 흡착된다.
약 6 내지 9의 pH 범위에 있는 임의의 적합한 완충액, 예를 들어 임의의 비-포스페이트 완충액이 방법의 알루미늄 염 복합체 결합 반응에 대해 사용될 수 있다. 포스페이트 완충액은 알루미늄 염 복합체 상의 결합 부위에 대해 경합하여 로딩 용량을 감소시키기 때문에 일반적으로 사용하지 않는다. 추가적으로, 리간드 : 알루미늄 염 복합체의 포스페이트에 대한 노출은 리간드가 포스페이트에 의해 방출되는 경우에 포스페이트 리간드 교환을 유발할 수 있다. Lindblad, Immunology and Cell Biology 2004, 82, 497-505 참조. 일부 구체예에서, 완충액은 아세테이트 완충액 (예컨대 pH 약 7의 아세트산 나트륨 완충액)이다. 일부 구체예에서, 완충액은 중탄산염 완충액 (예컨대 pH 약 8의 중탄산 나트륨 완충액)이다. 일부 구체예에서, TLR9 작용물질은 비-포스페이트 완충액에 용해된다. 일부 구체예에서, 알루미늄 염 복합체 (예컨대, 수산화 알루미늄 복합체 또는 ALHYDROGEL®)는 비-포스페이트 완충액에 평형화된다. 적합한 비-포스페이트 완충액은, 한정하는 것은 아니지만, 아세테이트 완충액, 중탄산염 완충액, 보레이트 완충액, 탄산염 완충액, 시트레이트 완충액, 글리신 완충액, 프탈레이트 완충액, 테트라보레이트 완충액, 및 TRIS 완충액을 포함한다.
많은 단백질 및 펩타이드 항원이 효율적으로 및 안정적으로 알루미늄 보조제에 흡착되어 수십년에 걸쳐 연구에서 및 임상 적용에서 동물 및 인간 모두에 대한 백신용 보조제로서 사용되어 왔다. Aebig et al., J. Immunol. Methods 2007, 323(2):139-146 참조. 일반적으로, 항원과 알루미늄 보조제 사이의 회합은 정전기력에 의해 대부분 구동되는 것으로 여겨지지만; 수소 결합, 반 데르 발스 상호작용, 및 소수성-소수성 상호작용 또한 역할을 할 수 있다. 그러므로, 결합 용량 및 효율은 각각의 펩타이드의 독특한 특성; 예컨대, 완충액 유형 및 조성물, 펩타이드 농도, 이온 강도, pH, 시간 및 온도를 포함한 결합 조건뿐만 아니라, 서열, 용해도, 구조, 전하 및 소수성에 따라 예상된다.
CpG-ODNs와는 달리, 문제의 많은 펩타이드 항원이 고도로 소수성이고 통상적으로 알루미늄 염 복합체에 대한 결합에 사용된 수성 완충액 중의 유용한 농도에서 가용성이지 못하다. 본 개시는 모든 수성 시스템이 사용될 때보다 펩타이드의 더 높은 결합 효율 및 결합 용량을 초래하는, 수성 완충액에 첨가된 하나 이상의 유기 용매 (예컨대 아세트산, 아세톤, 아니솔, 1-부탄올, 2-부탄올, 부틸 아세테이트, 다이메틸 설폭사이드 [DMSO], 에탄올, 포름산, 아이소프로판올, 2-프로판올, 아세토니트릴, 1,2-다이클로로에탄, N,N-다이메틸포름아미드, 트라이플루오로아세트산, 및 그것들의 조합)를 사용하는 보조-용매 시스템을 제공한다. 예시적인 구체예에서, 아이소프로판올이 종양 항원의 용해를 향상시키고, 그로써 종양 항원의 멀티머화제에의 흡착을 용이하게 하기 위한 보조 용매로서 사용된다. 필요한 아이소프로판올의 양은 종양 항원 및 멀티머화제의 성질에 좌우될 수 있다. 예를 들어, 소수성이 더 많은 종양 항원 폴리펩타이드가 소수성이 더 적은 종양 항원 폴리펩타이드보다 용해 및 효율적인 흡착을 위해 더 많은 아이소프로판올을 필요로 하는 경향이 있다. 아이소프로판올 보조 용매 시스템의 사용은 상이한 소수성을 가진 많은 상이한 유형의 펩타이드에 적용될 수 있다. 유기 용매의 바람직한 구체예로는, 한정하는 것은 아니지만, 아이소프로판올, DMSO, 에탄올, 포름산, 및 아세트산을 들 수 있다.
임의의 양의 아이소프로판올 (또는 다른 적합한 유기 용매)이 폴리펩타이드를 용해시키기에 필요한 양 (최소량)과 알루미늄 염의 재수화 또는 용해를 유발할 수 있는 양 (최대량) 사이에서 사용될 수 있다. 아이소프로판올에 대한 적절한 대체물로는, 한정하는 것은 아니지만, 다음을 들 수 있다: 아세트산, 아세톤, 아니솔, 1-부탄올, 2-부탄올, 부틸 아세테이트, 3차-부틸 메틸 에테르, 쿠멘, 다이메틸 설폭사이드, 에탄올, 에틸 아세테이트, 에틸 에테르, 에틸 포르메이트, 포름산, 헵탄, 아이소부틸 아세테이트, 아이소프로필 아세테이트, 메틸 아세테이트, 3-메틸-1-부탄올, 메틸에틸케톤, 메틸아이소부틸케톤, 2-메틸-1-프로판올, 펜탄, 1-펜탄올, 1-프로판올, 및 프로필 아세테이트. 일부 구체예에서, 종양 항원은 약 5% 내지 약 30%, 약 5% 내지 약 25%, 약 5% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 15%, 약 5% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 25%, 약 10% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 20%, 약 15% 내지 약 25%, 약 15% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 30%, 또는 약 12% 내지 약 18%의 아이소프로판올을 함유한 수성 용액에 용해된다. 일부 구체예에서, 종양 항원은 약 5%, 약 8%, 약 10%, 약 11%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 25%, 또는 약 30%의 아이소프로판올을 함유한 수성 용액에 용해된다. 일부 구체예에서, 종양 항원은 물 또는 수성 완충액 중의 약 10% 내지 약 20%의 아이소프로판올에 용해된다. 일부 구체예에서, 종양 항원은 물 중의 약 5% 내지 약 30%, 바람직하게는 약 10% 내지 약 20%의 아이소프로판올에 용해된다. 일부 구체예에서, 종양 항원은 수성 완충액 (예컨대, pH 약 8의 중탄산 나트륨 완충액) 중의 약 5% 내지 약 30%, 바람직하게는 약 10% 내지 약 20%의 아이소프로판올에 용해된다.
일부 구체예에서, 각각이 흡착에 의해 생체에 적합한 멀티머화제와 회합되어 있는 TLR9 작용물질 및 종양 항원을 포함하는 미세입자의 제조 방법은 추가로 다음의 단계들 중 하나 이상을 포함한다: (i) 약 5% 내지 약 30% (바람직하게는 약 10% 내지 약 20%)의 아이소프로판올을 함유한 수성 용액에 종양 항원을 용해시키는 단계, (ii) TLR9 작용물질을 물 또는 비-포스페이트 완충액에 용해시키는 단계, 및 (iii) 알루미늄 염 복합체 (예컨대, 수산화 알루미늄 복합체 또는 ALHYDROGEL®)를 비-포스페이트 완충액에 사전-평형화시키는 단계.
멀티머화제 (예컨대, 수산화 알루미늄 복합체 또는 ALHYDROGEL®)의 양에 비교하여 사용된 TLR9 작용물질 (예컨대, CpG-ODN) 및 종양 항원 (예컨대, 펩타이드 항원)의 양은 공동 흡착물 중의 TLR9 작용물질:수산화 알루미늄:종양 항원의 바람직한 비율을 제공하기 위해 조정될 수 있다. 일부 구체예에서, TLR9 작용물질 (예컨대, CpG-ODN)의 멀티머화제 (예컨대, 수산화 알루미늄 복합체 또는 ALHYDROGEL®)에 대한 중량에 의한 비율은 약 0.2:1 내지 약 2:1, 약 0.4:1 내지 약 2:1, 약 0.6:1 내지 약 2:1, 약 0.8:1 내지 약 2:1, 약 0.2:1 내지 약 3:1, 약 0.2:1 내지 약 4:1, 또는 약 0.2:1 내지 약 5:1이다. 일부 바람직한 구체예에서, TLR9 작용물질:수산화 알루미늄 (w/w) 비율은 약 0.2 내지 약 1.2의 범위에 있다. 일부 바람직한 구체예에서, TLR9 작용물질:수산화 알루미늄 (w/w) 비율은 (하한선) 약 0.2:1, 약 0.3:1, 약 0.4:1, 약 0.5:1, 약 0.6:1, 약 0.7:1, 약 0.8:1, 약 0.9:1, 약 1:1, 약 1.2:1, 약 1.5:1, 약 2.0:1, 약 2.5:1, 약 3.0:1, 약 4:1, 또는 약 5:1보다 크다. 일부 구체예에서, TLR9 작용물질:수산화 알루미늄 (w/w) 비율은 약 5:1, 약 4:1, 약 3:1, 약 2.5:1, 약 2:1, 약 1.8:1, 약 1.5:1, 약 1.2:1, 약 1:1, 약 0.9:1, 약 0.8:1, 약 0.7:0 또는 약 0.6:1보다 작다 (상한선). 즉, TLR9 작용물질:수산화 알루미늄 (w/w) 비율은 약 0.2:1 내지 약 5:1의 범위에 있고, 이때 하한선은 상한선보다 적다. 일부 구체예에서, the TLR9 작용물질:수산화 알루미늄 (w/w) 비율은 약 0.4:1, 약 0.6:1, 약 0.8:1, 약 1:1, 또는 약 1.2:1이다.
일부 구체예에서, 종양 항원 (예컨대, 펩타이드 항원(들))의 멀티머화제 (예컨대, 수산화 알루미늄 복합체 또는 ALHYDROGEL®)에 대한 중량에 의한 비율은 약 0.01:1 내지 약 2:1, 약 0.05:1 내지 약 2:1, 약 0.1:1 내지 약 2:1, 약 0.2:1 내지 약 2:1, 약 0.4:1 내지 약 2:1, 약 0.6:1 내지 약 2:1, 약 0.8:1 내지 약 2:1, 약 1.0:1 내지 약 2:1, 또는 약 1.5:1 내지 약 2:1이다. 일부 바람직한 구체예에서, 종양 항원:수산화 알루미늄 (w/w) 비율은 약 0.005:1 내지 약 2:1의 범위에 있다. 일부 구체예에서, 종양 항원:수산화 알루미늄 (w/w) 비율은 (하한선) 약 0.005:1, 약 0.01:1, 약 0.05:1, 약 0.1:1, 약 0.2:1, 약 0.4:1, 약 0.5:1, 약 0.6:1, 약 0.8:1, 약 1:1, 약 1.2:1 또는 약 1.5:1보다 크다. 일부 구체예에서, 종양 항원:수산화 알루미늄 (w/w) 비율의 각각은 (상한선) 약 2:1, 약 1.8:1, 약 1.5:1, 약 1.2:1, 약 1:1, 약 0.8:1, 또는 약 0.6:1보다 작다. 즉, 종양 항원:수산화 알루미늄 (w/w) 비율은 약 0.2:1 내지 약 2:1, 또는 약 0.005:1 내지 약 2:1의 범위에 있고, 이때 하한선은 상한선보다 작다. 일부 구체예에서, 종양 항원:수산화 알루미늄 (w/w) 비율은 약 0.4:1, 약 0.6:1, 약 0.8:1, 약 1:1, 또는 약 1.2:1이다.
일부 구체예에서, TLR9 작용물질 (예컨대, CpG-ODN), 종양 항원 (예컨대, 펩타이드 항원(s)) 및 멀티머화제 (예컨대, 수산화 알루미늄 복합체 또는 ALHYDROGEL®)의 적절한 양이 약 0.4:1:0.4 내지 약 2:1:2, 바람직하게는 약 0.6:1:0.6 내지 약 1.2:1:1.2의 TLR9 작용물질:수산화 알루미늄:종양 항원 (w/w/w) 비율을 가지는 동시 흡착물을 제공하기 위해 혼합된다. 일부 구체예에서, 동시 흡착물 TLR9 작용물질:수산화 알루미늄:종양 항원 (w/w/w) 비율은 약 0.2:1:0.01 내지 약 5:1:2, 바람직하게는 약 1:1:0.05 내지 약 4:1:0.6이다. 흡착물 중의 TLR9 작용물질:수산화 알루미늄 (w/w) 비율 및 종양 항원:수산화 알루미늄 (w/w) 비율은 상이하거나 동일할 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 흡착물 중의 TLR9 작용물질:수산화 알루미늄:종양 항원 (w/w/w) 비율은 약 0.8:1:1.3이다. 일부 구체예에서, 흡착물 중의 TLR9 작용물질:수산화 알루미늄:종양 항원 (w/w/w) 비율은 약 1:1:1이다.
B. TLR9 작용물질-다당-종양 항원 공동-컨쥬게이트
한 측면으로, 본 개시는 각각이 생체에 적합한 멀티머화제 (예컨대, a 다당)에 공유 결합되어 있는 TLR9 작용물질 및 종양 항원을 포함하는 입자들의 제조 방법을 제공하며, 방법은 티올 기를 포함하는 또는 티올 기로 기능화된 TLR9 작용물질을 말레이미드 기로 기능화된 다당과 반응시키는 단계, 및 티올기 (예컨대 종양 항원 펩타이드로부터의 시스테인 티올 또는 알킬-티올 기)를 포함하는 종양 항원을 말레이미드 기로 기능화된 다당과 반응시키는 단계를 포함한다. 종양 항원 및 TLR9 작용물질은 다당에 동시에 또는 순차적으로 공유 결합될 수 있다. 예를 들어, 티올 기를 포함하는 또는 티올 기로 기능화된 TLR9 작용물질은 다당에 결합된 말레이미드 기 중 일부와 반응되도록 허용될 수 있고, 그런 다음 종양 항원이 다당에 결합된 나머지 말레이미드 기와 반응될 수 있다. 종양 항원은 또한 다당의 말레이미드 기와 먼저 반응하는 것이 허용될 수 있고, 그런 다음 TLR9 작용물질이 다당의 나머지 말레이미드 기와 반응하도록 허용된다. 대안적으로, 말레이미드 기로 기능화된 다당 및 티올 기를 포함하는 종양 항원이 동시에 말레이미드 기로 기능화된 다당과 반응하도록 허용될 수 있다. 일부 경우에, 반응들은 반응 혼합물의 pH를 조절하기 위해 완충액에서 수행된다. 완충액에의 구아니딘 염산염의 포함은 종양 항원, 특히 소수성 종양 항원의 용해를 보조한다.
일부 구체예에서, 하기 식 (I)의 TLR9 작용물질-다당-종양 항원 공동-컨쥬게이트 화합물의 제조 방법이 제공된다:
[D-L1-L2-(PEG)-L3]x-F-[L3-(PEG)-L2-A]t (I),
식에서,
D는 TLR9 작용물질이고;
L1은 알킬티오 기를 포함하는 제 1 링커이며;
L2는 석신이미드 기를 포함하는 제 2 링커이고;
L3은 아미드 기를 포함하는 제 3 링커이며;
PEG는 폴리에틸렌 글리콜 (예컨대, -(OCH2CH2)n-, 여기서 n은 2 내지 80의 정수임)이고;
t 및 x는 독립적으로 3 내지 200의 정수이며;
A는 종양 항원이고; 및
F는 약 10,000 내지 약 1,000,000 달톤의 분자량을 가지는 다당이고, 에테르 기를 통해 L3에 연결되며,
TLR9 작용물질은 서열 5'-TCGNs-3'를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 s는 4 내지 47이며, 각각의 N은 뉴클레오사이드이고, 뉴클레오타이드들 사이의 및 3'-말단 뉴클레오타이드와 L1 사이의 하나 이상의 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합이며, 및
A는 약 9 내지 약 1000개의 아미노산의 폴리펩타이드를 포함하는 종양 항원이고 적어도 하나의 티올 기를 포함하며,
상기 방법은
식 D-L1a-SH (식에서 D는 식 (I)에 대해 규정된 것과 같고 L1a는 (CH2)m이며, 이때 m은 2 내지 9의 정수임)의 화합물을 식 (II)의 화합물과 반응시키는 단계, 및 식 A의 화합물을 식 (II)의 화합물과 반응시키는 단계를 포함한다:
[L2a-(PEG)-L3]y-F (II)
식에서, L3, PEG 및 F 식 (I)에 대해 규정된 것과 같고;
L2a는
Figure pct00002
이며;
y는 6 내지 350의 정수이고; 단 y는 t와 x의 합보다 적지 않다 (y >= t + x).
일부 구체예에서, 방법은 중간체를 형성하기 위하여 식 D-L1a-SH의 화합물을 식 (II)의 화합물과 반응시키는 단계, 및 식 A의 화합물을 중간체와 반응시키는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 중간체를 형성하기 위하여 식 A의 화합물을 식 (II)의 화합물과 반응시키는 단계, 및 식 D-L1a-SH의 화합물을 중간체와 반응시키는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 반응은 구아니딘 염산염을 포함하는 매질 (예컨대 완충액)에서 수행된다.
식 (I)의 TLR9 작용물질-다당-종양 항원 공동-컨쥬게이트 화합물에서 TLR9 작용물질 D 및 종양 항원 A의 수는 독립적으로 3 내지 약 200의 범위일 수 있다. 즉, x와 t는 독립적으로 3 내지 200의 정수이다. 일부 구체예에서, x와 t는 독립적으로 (하한선) 3, 6, 9, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 150보다 큰 정수이다. 일부 구체예에서, x와 t는 독립적으로 (상한선) 200, 190, 180, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 또는 40보다 작은 정수이다. 즉 x와 t는 독립적으로 약 3 내지 200의 범위의 정수일 수 있고, 이때 하한선은 상한선보다 작다. 예를 들어, 일부 구체예에서, x는 10 내지 200, 10 내지 150, 10 내지 120, 15 내지 100, 15 내지 50, 20 내지 120, 또는 20 내지 40이다. 일부 구체예에서, x는 약 30 ± 10이다. 바람직한 구체예에서, x는 약 30이다. 일부 구체예에서, t는 10 내지 200, 10 내지 150, 10 내지 120, 12 내지 100, 12 내지 80, 20 내지 80, 또는 35 내지 75이다. 일부 구체예에서, t는 약 55 ± 20이다. 바람직한 구체예에서, t는 약 55이다.
일부 구체예에서, 종양 항원은 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 구체예에서, 종양 항원은 약 9 내지 약 1000개의 아미노산의 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구체예에서 마지막 하나의 시스테인 잔기는 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 위치한다. 일부 구체예에서, 종양 항원은 종양 세포에 의해 발현된 포유류 항원의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 종양 항원은 종양에 의해 발현된 바이러스 항원의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에, 식 (II)의 화합물의 모든 말레이미드 기는 D에 결합된 티올 또는 A의 티올과 반응한다. 그러므로 일부 구체예에서, y = t + x이다. 다른 경우에, 식 (II)의 화합물의 일부 말레이미드 기만이 D에 결합된 티올 또는 A의 티올과 반응하는 한편, 일부는 D에 결합된 티올 또는 A의 티올과 반응하지 않는다. 그러므로, 일부 구체예에서, y > t + x이다. 일부 구체예에서, y는 (하한선) 6, 9, 12, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 155, 165, 190 또는 200보다 큰 정수이다. 일부 구체예에서, y는 (상한선) 350, 300, 275, 250, 225, 215, 210, 205, 200, 190, 180, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60 또는 50보다 작은 정수이다. 즉 y는 약 6 내지 350의 범위의 정수일 수 있고, 이때 하한선은 상한선보다 작다. 예를 들어, 일부 구체예에서, y는 20 내지 350, 30 내지 300, 155 내지 215, 165 내지 205, 20 내지 250, 90 내지 250, 120 내지 250, 120 내지 220, 160 내지 220, 20 내지 200, 60 내지 180, 90 내지 150, 100 내지 140, 또는 110 내지 130이다. 바람직한 구체예에서, y는 약 190, 약 185, 약 150 또는 약 120이다. 일부 구체예에서, y는 약 190 ± 30 또는 약 185 ± 30이다. 일부 구체예에서 y가 t와 x의 합보다 큰 정수일 때, 핵산 모이어티 D와 반응하지 않는 말레이미드 기들은 캡핑되거나 및/또는 가수분해된다. 일부 구체예에서 y가 t와 x의 합보다 큰 정수일 때, 핵산 모이어티 D와 반응하지 않는 말레이미드 기들은 시스테인으로 캡핑되거나 및/또는 물에 의해 가수분해된다.
식 (II)의 반응성 티올 화합물 D-L1a-SH 및 말레이미드 기능화된 다당은 본원에 기술되고 당업계에 공지되어 있는 방법, 예를 들어 2016년 1월 22일에 출원되고 로서 공개된 PCT 특허 출원 PCT/US2016/014635 (그 내용은 참조로 본원에 포함됨)에 기술되어 있는 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
반응성 티올 화합물 D-L1a-SH는 종종 사용 전에 보다 안정적인 이황화 화합물로부터 제조된다. 일부 구체예에서, 방법은 식 D-L1a-SS-L1a-OH의 이황화 화합물을 환원제 (예컨대, 포스핀 화합물)와 반응시키는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, D는 본원에서 식 (I)에 대해 규정된 것과 같고 L1a는 (CH2)m이며, 이때 m은 2 내지 9의 정수이다. 일부 구체예에서, m은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9이다. 일부 구체예에서, m은 3 내지 6이다. 일부 이런 구체예에서, m은 3 또는 6이다. 한 구체예에서, m은 6이다. 한 구체예에서, m은 3이다. 환원제의 한 예시는 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 염산염 (TCEP)이다.
본원에는 식 D-L1a-SH의 화합물 또는 식 D-L1a-SS-L1a-OH의 화합물이 기술되는데, 여기서 D는 본원에서 설명된 TLR9 작용물질이고, L1a는 (CH2)m이며, 이때 m은 2 내지 9의 정수이다. 일부 이런 구체예에서, D는 서열 5'-TCGNs-3' (SEQ ID NO:1)를 포함하는 폴리뉴클레오타이드이고, 여기서 s는 4 내지 47이며, 각각의 N은 뉴클레오사이드이다. 일부 구체예에서, m은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9이다. 일부 구체예에서, m은 3 내지 6이거나 m은 3 또는 6이다. 한 구체예에서, m은 6이다. 한 구체예에서, m은 3이다.
식 (II)의 화합물에서 PEG는 PEG를 포함하는 활성화된 에스테르 화합물과 반응하는 다가 다당 F의 아민 유도체를 통해 도입될 수 있다. 일부 구체예에서, 식 (I)의 화합물의 제조 방법은 추가로 식 (III)의 화합물:
[NH2CH2CH2NHC(O)CH2]z-F (III)
(식에서, F는 식 (I)에 대해 규정된 것과 같고 z는 6 내지 400의 정수임)을,
식 L2a-(PEG)-L3a-Lv의 화합물 (식에서 L2a 및 PEG는 식 (II)에 대해 규정된 것과 같고; L3a는 -NHC(O)CH2CH2C(O)- 또는 -C(O)-이며; Lv는 이탈기임)과 반응시켜서 식 (II)의 화합물을 형성하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, PEG를 포함하는 활성화된 에스테르 화합물은 N-하이드록시석신이미드 (NHS 또는 HOSu) 에스테르이고, Lv는 (2,5-다이옥소피롤리딘-1-일)옥시 (즉 OSu)이다. 당업계에 알려져 있는 다른 활성화된 카르복실산 또는 에스테르가 식 (III)의 아민과 반응하여 식 (II)의 화합물을 형성하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, F는 약 100,000 내지 700,000 달톤의 분자량을 가지는 수크로오스와 에피클로로히드린의 분지된 코폴리머이다. 일부 구체예에서, F는 약 400,000 ± 100,000 달톤의 분자량을 가지는 수크로오스와 에피클로로히드린의 분지된 코폴리머 (예컨대, FICOLL® PM 400)이고, 식 (III)의 화합물은 AECM- FICOLL®400의 화합물이다. 사용된 식 (III)의 화합물 (예컨대 AECM-FICOLL®400의 화합물)에 대한 활성화된 에스테르 L2a-(PEG)-L3a-Lv (예컨대, NHS 에스테르 L2a-(PEG)-L3a-OSu)의 상대적인 양에 따라, 식 (III)의 화합물의 아미노기의 일부 또는 전부는 페길화될 수 있다. 그러므로 일부 구체예에서, z는 y와 같다. 일부 구체예에서, z는 (하한선) 6, 9, 12, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 155, 165, 190 또는 200보다 큰 정수이다. 일부 구체예에서, z는 (상한선) 400, 350, 300, 275, 250, 225, 215, 210, 205, 200, 190, 180, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60 또는 50보다 작은 정수이다. z는 약 6 내지 400의 범위의 정수일 수 있고, 이때 하한선은 상한선보다 작다. 예를 들어, 일부 구체예에서, z는 20 내지 400, 50 내지 300, 190 내지 250, 200 내지 240, 20 내지 350, 30 내지 300, 155 내지 215, 165 내지 205, 20 내지 250, 90 내지 250, 120 내지 250, 120 내지 220, 160 내지 220, 20 내지 200, 60 내지 180, 90 내지 150, 100 내지 140, 또는 110 내지 130이다. 바람직한 구체예에서, z는 약 220, 약 190, 약 150 또는 약 120이다. 일부 구체예에서, z는 약 220 ± 30 또는 약 220 ± 20이다. 일부 구체예에서 z가 y보다 큰 정수일 때, 과잉 아민은 캡핑된다. 일부 구체예에서 z가 y보다 큰 정수일 때, 과잉 아민은 설포-NHS-아세테이트 또는 NHS-아세테이트로 캡핑된다.
FICOLL®은 수크로오스를 에피클로로히드린과 가교-결합시킴으로써 합성되며, 그로 인해 고도로 분지된 구조가 생성된다. 아미노에틸카르복시메틸-FICOLL (AECM-FICOLL®)은 Inman, 1975, J. Imm. 114:704-709의 방법에 의해 제조될 수 있다. AECM-FICOLL은 그런 다음 헤테로이중기능성 가교결합제, 예컨대 6-말레이미도 카프로일 아실 N-하이드록시석신이미드 에스테르와 반응될 수 있고, 그런 다음 티올-유도체화된 핵산 모이어티에 컨쥬게이트될 수 있다 (Lee et al., 1980, Mol. Imm. 17:749-56 참조). 다른 다당도 유사하게 변형될 수 있다.
방법에 사용된 NHS 에스테르 (L2a-(PEG)-L3a-OSu)는 상업적 공급원으로부터 얻을 수 있거나 당업계에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다.
일부 구체예에서, 식 (I)의 화합물의 제조 방법은
식 L2a-(PEG)-L3a-Lv의 화합물
(식에서 L2a는 말레이미드 기를 포함한 모이어티이고,
PEG는 폴리에틸렌 글리콜 (예컨대, -(OCH2CH2)n-, 여기서 n = 2 내지 80)이며,
L3a는 -NHC(O)CH2CH2C(O)-이고, 및
Lv는 이탈기 (예컨대, (2,5-다이옥소피롤리딘-1-일)옥시)임)을,
식 (III)의 화합물:
[NH2CH2CH2NHC(O)CH2]z-F (III)
(식에서, F는 수크로오스와 에피클로로히드린의 분지된 코폴리머이고 에테르 기를 통해 L3에 연결되고,
z는 독립적으로 6 내지 400의 정수임)
과 반응시켜서 식 (II)의 화합물:
[L2a-(PEG)-L3]y-F (II)
(식에서 y는 6 내지 350의 정수임)을 형성하는 단계를 추가로 포함한다.
본 개시는 또한 식 (II)의 화합물의 분포로부터 본원에 설명된 식 (I)의 화합물의 분포를 포함하는 조성물의 제조 방법을 제공한다. 한 측면으로, 식 (I)의 화합물을 포함하는 조성물의 제조 방법이 제공되는데:
[D-L1-L2-(PEG)-L3]x-F-[L3-(PEG)-L2-A]t (I),
식에서,
D는 TLR9 작용물질이고;
L1은 알킬티오 기를 포함하는 제 1 링커이며;
L2는 석신이미드 기를 포함하는 제 2 링커이고;
L3은 아미드 기를 포함하는 제 3 링커이며;
PEG는 폴리에틸렌 글리콜 (예컨대, -(OCH2CH2)n-, 여기서 n은 2 내지 80의 정수임)이고;
t 및 x는 독립적으로 3 내지 200의 정수이며;
A는 종양 항원이고; 및
F는 약 10,000 내지 약 1,000,000 달톤의 분자량을 가지는 다당이고, 에테르 기를 통해 L3에 연결되며,
TLR9 작용물질은 서열 5'-TCGNs-3'를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 s는 4 내지 47이며, 각각의 N은 뉴클레오사이드이고, 뉴클레오타이드들 사이의 및 3'-말단 뉴클레오타이드와 L1 사이의 하나 이상의 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합이며, 및
A는 약 9 내지 약 1000개의 아미노산의 폴리펩타이드를 포함하는 종양 항원이고 적어도 하나의 티올을 포함하며,
상기 방법은
식 D-L1a-SH의 화합물 (식에서 D는 독립적으로 식 (I)에 대해 규정된 것과 같고 L1a는 (CH2)m이며, 이때 m은 독립적으로 2 내지 9의 정수임)을 포함하는 조성물을 식 (II)의 화합물의 분포를 포함하는 조성물과 반응시키는 단계, 및 식 A의 화합물을 포함하는 조성물을 식 (II)의 화합물의 분포를 포함하는 조성물과 반응시키는 단계를 포함한다:
[L2a-(PEG)-L3]y-F (II)
식에서, L3, PEG 및 F는식 (I)에 대해 규정된 것과 같고;
L2a는
Figure pct00003
이며;
y는 6 내지 350의 정수이고; 단 t와 x의 합보다 작지 않다 (y >= t + x).
일부 구체예에서, 식 (II)의 화합물을 포함하는 조성물 중의 F 모이어티는 약 200,000 내지 약 600,000 달톤의 평균 분자량을 가지며, 조성물 중의 식 (II)의 화합물은 약 60 내지 약 250의 평균 로딩 비율 (y)을 가진다. 일부 구체예에서, 식 (II)의 화합물을 포함하는 조성물 중의 F 모이어티는 약 400,000 ± 100,000 달톤의 평균 분자량을 가진다. 일부 구체예에서, 조성물 중의 식 (II)의 화합물은 약 120 ± 30, 약 150 ± 30, 약 185 ± 30 또는 약 190 ± 30의 평균 로딩 비율 (y)을 가진다. 공동-컨쥬게이트 조성물 중의 TLR9 작용물질에 대한 평균 로딩 비율 (x) 및 종양 항원의 평균 로딩 비율 (t)은 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물 중의 식 (I)의 공동-컨쥬게이트 화합물은 약 10 내지 약 120, 약 10 내지 약 100, 약 10 내지 약 80, 약 10 내지 약 60, 약 20 내지 약 40, 또는 약 30 ± 10의 TLR9 작용물질에 대한 평균 로딩 비율 (x), 및/또는 약 10 내지 약 120, 약 10 내지 약 100, 약 20 내지 약 100, 약 25 내지 약 100, 약 35 내지 약 75, 또는 약 55 ± 20의 종양 항원에 대한 평균 로딩 비율 (t)을 가진다. FICOLL 유도체에 대한 로딩 비율은 몰 기준이다.
일부 구체예에서, 식 (I)의 화합물을 포함하는 조성물의 제조 방법은
식 L2a-(PEG)-L3a-Lv의 화합물
(식에서, L2a는 말레이미드 기를 포함한 모이어티이고,
PEG는 폴리에틸렌 글리콜 (예컨대, -(OCH2CH2)n-, 여기서 n = 2 내지 80)이며,
L3a는 -NHC(O)CH2CH2C(O)-이고, 및
Lv는 이탈기 (예컨대, (2,5-다이옥소피롤리딘-1-일)옥시)임)을,
식 (III)의 화합물:
[NH2CH2CH2NHC(O)CH2]z-F (III)
(식에서, F는 수크로오스와 에피클로로히드린의 분지된 코폴리머이고 에테르 기를 통해 L3에 연결되고,
z는 독립적으로 6 내지 400의 정수이며;
식 (III)의 화합물을 포함하는 조성물 중의 F 모이어티는 약 200,000 내지 약 600,000 달톤의 평균 분자량을 가지고, 식 (III)의 화합물은 약 60 내지 약 280의 평균 로딩 비율 (z)을 가짐)
과 반응시켜서 식 (II)의 화합물:
[L2a-(PEG)-L3]y-F (II)
(식에서 y는 6 내지 350의 정수임)을 포함하는 조성물을 형성하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 식 (III)의 화합물을 포함하는 조성물 중의 F 모이어티는 약 300,000 및 약 500,000 달톤의 평균 분자량을 가진다. 일부 구체예에서, F 모이어티는 약 400,000 ± 100,000 달톤의 평균 분자량을 가진다. 일부 구체예에서, 식 (III)의 화합물은 약 50 내지 약 350, 약 50 내지 약 280, 약 60 내지 약 250, 약 60 내지 약 180, 약 60 내지 약 150, 약 90 내지 약 280, 약 90 내지 약 250, 약 90 내지 약 200, 약 90 내지 약 150, 약 120 내지 약 280, 약 120 내지 약 250, 약 150 내지 약 280, 약 150 내지 약 250, 약 180 내지 약 280, 약 180 내지 약 250, 약 200 내지 약 250 또는 약 210 내지 약 230의 평균 로딩 비율 (z)을 가진다. 일부 구체예에서, 식 (III)의 화합물은 약 120 ± 30, 약 150 ± 30, 약 180 ± 30, 약 220 ± 30 또는 약 220 ± 20의 평균 로딩 비율 (z)을 가진다. 일부 구체예에서, 식 (III)의 화합물을 포함하는 조성물은 AECM FICOLL® 400이다.
일부 구체예에서, 식 (I)의 화합물 또는 식 (I)의 화합물을 포함하는 조성물의 제조 방법은 식 (I)의 화합물, 및/또는 식 (II)의 화합물 및 식 (III)의 화합물과 같은 임의의 중간체 화합물을 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 투석여과에 의해 식 (I)의 화합물을 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 100,000 분자량 컷 오프 (MWCO) 막을 사용하는 투석여과에 의해 식 (I)의 화합물을 정제하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에서 설명된 임의의 방법을 사용하여 각각이 생체에 적합한 멀티머화제와 회합되어 있는 TLR9 작용물질 및 종양 항원을 포함하는 입자를 포함하는 면역원성 조성물에 대해, 추가로 본원에 기술된 방법을 사용하여 제조된 조성물 또는 입자가 제공된다.
본원에서 설명된 입자들의 입자 크기는 당업계에 공지되고 본원에 기술된 방법들을 사용하여 측정되는데, 예를 들어, 동적 광 산란 (DLS)이 입자 크기 범위 및 평균 입자 크기를 측정하기 위하여 사용될 수 있다. 유동 캠 (Flow Cam) (Particle Characterization Lab, Novato, CA) 방법이 또한 입자들의 평균 직경 및 크기 분포를 측정하기 위해 사용될 수 있다.
TLR9 작용물질-다당-종양 항원 공동-컨쥬게이트 폴리머의 분자량은 당업계에 공지되어 있는 방법, 예를 들어, 점도를 기반으로 한 유체 역학 방법 및 광산란을 기반으로 한 방법들을 사용하여 측정될 수 있다.
III. 제약학적 조성물
본 개시의 일부 면역원성 조성물은 입자들 및 제약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 제약학적 조성물이다. 본 개시의 제약학적 조성물은 용액 또는 현탁액의 형태로 있을 수 있다. 대안적으로, 제약학적 조성물은 재수화 고체 (예컨대 동결 건조된 또는 분무 건조된 고체)일 수 있다. 본 개시의 제약학적 조성물은 바람직하게는 멸균된 것이고, 바람직하게는 본질적으로 내독소가 없다. 용어 "제약학적 조성물"은 용어 "의약 제품" 및 "약물"과 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
A. 부형제
본 개시의 제약학적으로 허용되는 부형제는 예를 들어, 용매, 벌크화제, 완충제, 등장성 조정제, 및 보존제를 포함한다. 예컨대 Pramanick et al., Pharma Times, 45:65-77, 2013 참조. 일부 구체예에서 제약학적 조성물은 용매, 벌크화제, 완충제, 및 등장성 조정제 중 하나 이상으로서 작용하는 부형제를 포함할 수 있다 (예컨대 염수 중의 염화 나트륨은 수성 비히클 및 등장성 조정제 둘 다로서 작용할 수 있다). 본 개시의 제약학적 조성물은 비경구 투여에 적합하다. 즉 본 개시의 제약학적 조성물은 장용 투여를 위해 의도된 것이 아니다.
일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 용매로서 수성 비히클을 포함한다. 적합한 비히클은 예를 들어 멸균수, 염수 용액, 포스페이트 완충 염수, 및 링거액을 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 등장성이다.
제약학적 조성물은 벌크화제를 포함할 수 있다. 벌크화제는 특히 제약학적 조성물이 투여 전에 동결건조되어야 할 때 유용하다. 일부 구체예에서, 벌크화제는 동결 또는 분무 건조 중에 및/또는 보관 중에 활성 작용제의 안정화 및 분해의 방지를 보조하는 보호제이다. 적합한 벌크화제는 수크로오스, 락토오스, 트레할로오스, 만니톨, 소르비탈, 글루코오스 및 라피노오스와 같은 당 (단당, 이당 및 다당)이다.
제약학적 조성물은 완충제를 포함할 수 있다. 완충제는 처리, 보관 및 선택적으로 복원 중에 활성제의 분해를 억제하기 위해 pH를 조절한다. 적합한 완충제는 예를 들어 아세테이트, 시트레이트, 포스페이트 또는 설페이트를 포함하는 염을 포함한다. 다른 적합한 완충제는 예를 들어 아르기닌, 글리신, 히스티딘, 및 리신과 같은 아미노산을 포함한다. 완충제는 추가로 염산 또는 수산화 나트륨을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 완충제는 조성물의 pH를 6 내지 9의 범위 내로 유지한다. 일부 구체예에서, pH는 (하한선) 6, 7 또는 8보다 크다. 일부 구체예에서, pH는 (상한선) 9, 8 또는 7보다 작다. 즉, pH는 약 6 내지 9의 범위에 있고, 이때 하한선은 상한선보다 작다.
제약학적 조성물은 등장성 조정제를 포함할 수 있다. 적합한 등장성 조정제는 예를 들어 덱스트로오스, 글리세롤, 염화 나트륨, 글리세린 및 만니톨을 포함한다.
제약학적 조성물은 보존제를 포함할 수 있다. 적합한 보존제는 예를 들어 항산화제 및 항미생물제를 포함한다. 그러나, 바람직한 구체예에서, 제약학적 조성물은 멸균된 조건하에서 제조되고 단일 사용 용기에 있음으로써, 보존제를 포함할 필요가 없다.
B. 키트
추가적으로, 본 개시는 제약학적 조성물과 같은 면역원성 조성물 및 본원에서 기술된 방법들에 대한 조성물의 사용과 관련된 설명서 세트를 포함하는 키트를 제공한다. 키트의 제약학적 조성물은 적절하게 포장된다. 예를 들어, 만약 제약학적 조성물이 동결 건조된 분말이라면, 탄력성 마개가 달린 바이알이 보통 용기-폐쇄 시스템으로서 사용되어서 탄력성 마개를 통해 유체가 주입됨으로써 분말이 쉽게 재현탁될 수 있다. 만약 제약학적 조성물이 액체라면, 고무 마개 (예컨대, Exxpro 할로부틸 엘라스토머) 및 알루미늄 크림프-탑(crimp-top)이 달린 이산화 규소 바이알 (예컨대, SCHOTT Type I plus®)이 보통 용기-폐쇄 시스템으로서 사용된다. 특정 구체예에서, 키트는 임상 실험 중에 투여 및 스케줄 가요성을 용이하게 하기 위하여 2 바이알 용기-폐쇄 시스템으로 구성된 제약학적 조성물을 함유하는데, 한 바이알은 멀티머화제 (예컨대, 수산화 알루미늄 입자)에 흡착된 종양 항원(들)을 함유하고, 제 2 바이알은 TLR9 작용물질 (예컨대, D64-04)을 함유하며, 두 용액의 규정된 부피는 투여 전에 혼합된다. 다른 바람직한 구체예에서, 키트는 "맞춤 의료" 접근법으로 종양 네오항원(들)의 사용을 용이하게 하기 위하여 2 바이알 용기-폐쇄 시스템으로 구성된 제약학적 조성물을 함유하며, 이때 한 바이알은 멀티머화제 (예컨대, 수산화 알루미늄 입자)에 흡착된 TLR9 작용물질 (예컨대, D64-04)을 함유하고, 제 2 바이알은 하나 이상의 종양 네오항원을 가진 용액을 함유하며, 두 용액의 규정된 부피가 투여 전에 혼합된다. 종양 네오항원은 전형적으로 환자의 종양 게놈을 서열분석함으로써 확인된다.
일부 구체예에서, 키트는 제약학적 조성물의 투여를 위한 장치 (예컨대 주사기 및 바늘)를 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 키트는 사전 충전된 주사기/바늘 시스템, 자동주사기, 또는 무바늘 장치를 포함한다. 제약학적 조성물의 사용과 관련된 설명서는 일반적으로 의도된 사용 방법을 위한 투여량, 스케줄 및 투여 경로에 관한 정보를 포함한다.
IV. 사용 방법
본 개시의 제약학적 조성물은 그것을 필요로 하는 포유류 대상체에서 암을 치료하는 데 적합하다. 포유류 대상체는 한정하는 것은 아니지만, 인간, 비인간 영장류, 설치류, 애완동물, 및 가축을 포함한다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 특수 결과를 이루기에 효과적인 양으로 대상체에게 투여될 수 있다.
A. 투여량 및 투여 방식
모든 제약학적 조성물이 그러한 것처럼, 유효량 및 투여 방식은 당업자들에게 명백한 여러 인자들을 기반으로 달라질 수 있다. 고려되어야 할 중요한 인자는 제약학적 조성물이 독립형 치료로서 투여될 것인지, 또는 치료제들의 조합의 일부로서 투여될 것인지이다. 고려되어야 할 다른 인자들은 이루어야 할 결과, 및 투여될 용량의 횟수를 포함한다.
적합한 투여량 범위는 원하는 효과를 제공하는 것이다. 투여량은 대상체에게 투여될 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 TLR9 작용물질의 양에 의해 결정될 수 있다. 대상체 중량에 의해 전달될 양으로 제공된 폴리뉴클레오타이드의 예시적인 투여량 범위는 약 5 내지 5000 mcg/kg이다. 일부 구체예에서, 투여량은 약 (하한선) 5, 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750 또는 1000 mcg/kg보다 크다. 일부 구체예에서, 투여량은 약 (상한선) 5000, 4000, 3000, 2000, 1000, 750, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 또는 100 mcg/kg보다 작다. 즉, 투여량은 약 5 내지 5000 mcg/kg의 범위에 있고, 이때 하한선은 상한선보다 작다. 대상체에게 전달될 양으로 제공된 폴리뉴클레오타이드의 예시적인 투여량 범위는 약 100 mcg 내지 약 100 mg이다. 일부 구체예에서, 투여량은 약 (하한선) 100, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 또는 5000 mcg보다 크다. 일부 구체예에서, 투여량은 약 (상한선) 100, 75, 50, 25, 20, 15, 또는 10 mg보다 작다. 즉, 투여량은 어디서나 약 100 내지 100,000 mcg의 범위에 있고 이때 하한선은 상한선보다 작다.
투여량은 또한 대상체에게 투여될 항원 (예컨대, 펩타이드 항원(들))의 양에 의해 결정될 수 있다. 대상체에게 전달될 양으로 제공된 예시적인 투여량 범위는 약 1　mcg 내지 50 mcg이다. 일부 구체예에서, 항원 투여량은 약 (하한선) 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 100, 250, 500, 750 또는 1000 mcg보다 크다. 일부 구체예에서, 항원 투여량은 약 (상한선) 1000, 750, 500, 250, 100, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 또는 10 mcg보다 작다. 즉, 각 항원의 항원 투여량은 약 1 내지 1000 mcg의 범위에 있고, 이때 하한선은 상한선보다 작다. 추가의 구체예에서, 대상체에게 전달될 양으로 제공된 투여량 범위는 각 항원의 1 mcg 내지 1000 mcg이다. 그런 구체예에서, 항원 투여량은 약 (하한선) 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 100, 250, 500 또는 750 mcg보다 크다. 그런 구체예에서, 항원 투여량은 약 (상한선) 1000, 750, 500, 250, 100, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 또는 10 mcg보다 작다. 즉, 각 항원의 항원 투여량은 어디서나 약 1 내지 1000 mcg의 범위에 있고, 이때 하한선은 상한선보다 작다.
일부 구체예에서, 본 개시의 제약학적 조성물은 비경구 투여 (예컨대 경구 또는 직장 투여가 아닌 투여)에 대해 의도된다. 투여의 적합한 경로는 주사, 국소, 및 흡입을 포함한다. 특히, 본 개시의 제약학적 조성물은 정맥내, 근육내, 피하, 상피 (유전자 총), 경피, 및 흡입과 같은 경로에 의해 투여될 수 있다. 그러나, 바람직한 투여 경로는 종양내 전달에 의한 것이다.
적합한 투약 양생법은 예방적 또는 치료적 맥락에서 원하는 효과를 제공하는 것이다. 선택된 경로에 의해 투여된 용량의 횟수는 1회 또는 1회 이상일 수 있다. 투약의 빈도는 2일마다, 3일마다, 4일마다, 5일마다 또는 6일마다, 주마다, 격주로, 매월, 격월로일 수 있고, 또는 용량 사이에 3 내지 12개월의 간격이 있을 수 있다. 일부 구체예에서, 2 용량이 투여되는데, 제 2 용량은 제 1 용량 후 1 내지 2개월 후에 투여된다. 일부 구체예에서, 3 용량이 투여되는데, 제 2 용량은 제 1 용량 후 1 내지 2개월 후에 투여되고, 제 3 용량은 제 2 용량 후 1 내지 5개월 후에 투여된다. 다른 구체예에서, 3, 또는 4 용량이 격주로 또는 매월 기준으로 투여될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 용량들 사이에 더 짧거나 더 긴 시간이 경과할 수 있다. 특정 구체예에서, 연속적인 투약 사이의 간격은 주 수 또는 개월 수와 관련하여 달라질 수 있다. 한 구체예에서, 한 시리즈로 2, 3, 4, 5 또는 6주째의 (또는 더 빈번한) 용량이 투여된 후에 제 2 시리즈로 여러 주 (또는 더 빈번한) 용량이 나중에 투여될 수 있다. 당업자는 실시예에서 예시된 것과 같이, 항원-특이적 항체 반응 또는 종양 퇴행과 같은 생물학적 결과를 측정함으로써 투여량 양생법을 조정할 수 있을 것이다.
B. 면역 반응의 자극
간단히 설명하면, 본 개시는 포유류 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법을 제공하며, 그 방법은 포유류 대상체에게 포유류 대상체에서 면역 반응을 자극하기에 충분한 양의 제약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 면역 반응을 "자극하는 것"은 드 노보 면역 반응 (예컨대 초기 백신접종 양생법의 결과로서)을 유도하거나 기존의 면역 반응 (예컨대 부스터 백신접종 양생법의 결과로서)을 향상시키는 것을 발생시킬 수 있는, 면역 반응을 증가시키는 것을 의미한다. 일부 구체예에서, 면역 반응을 자극하는 것은 사이토카인 생성을 자극하는 것; B 림프구 증식을 자극하는 것; 인터페론 경로-관련 유전자 발현을 자극하는 것; 화학유인물질(chemoattractant)-관련 유전자 발현을 자극하는 것; 및 형질세포양 수지상 세포 (pDC) 돌연변이를 자극하는 것으로 구성되는 군 중 하나 이상을 포함한다. 면역 반응의 자극을 측정하는 방법들은 당업계에 알려져 있고 본 개시의 생물학적 실시예에서 기술된다.
예를 들어, 본 개시는 포유류 대상체에서 항원-특이적 항체 반응을 유도하기에 충분한 양의 제약학적 조성물을 포유류 대상체에게 투여함으로써 포유류 대상체에서 항원-특이적 항체 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 항원-특이적 항체 반응을 "유도하는 것"은 항원-특이적 항체의 역가를 투여 전 기준선 역가 또는 혈청보호 수준과 같은 한계값 수준보다 위로 증가시키는 것을 의미한다.
면역 반응의 분석 (정성적 및 정량적 분석)은, 한정하는 것은 아니지만, 항원-특이적 항체 생성 (특이적 항체 하위부류를 포함함), B 세포 및 헬퍼 T 세포와 같은 림프구의 특정 집단의 활성화, IFN-알파, IFN-감마, IL-6, IL-12와 같은 사이토카인의 생성 및/또는 히스타민의 방출을 측정하는 것을 포함하여, 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 이루어질 수 있다. 항원-특이적 항체 반응을 측정하는 방법은 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA)을 포함한다. 림프구의 특정 집단의 활성화는 증식 검정에 의해, 형광-활성화 세포 분류 (FACS)로 측정될 수 있다. 사이토카인의 생성 또한 ELISA에 의해 측정될 수 있다.
바람직하게는, Th1-형 면역 반응이 자극된다 (즉 유도되거나 향상된다). 본 개시를 참조하면, Th1-형 면역 반응을 자극하는 것은 본 개시의 활성 작용제 (폴리뉴클레오타이드 TLR9 작용물질)로 처리된 세포로부터의 사이토카인 생성을 활성 작용제로 처리되지 않은 대조군 세포와 비교하여 측정함으로써 시험관내에서 또는 생체 외에서 측정될 수 있다. "Th1-형 사이토카인"의 예시로는, 한정하는 것은 아니지만, IL-2, IL-12, IFN-감마 및 IFN-알파를 포함한다. 대조적으로, "Th2-형 사이토카인"은, 한정하는 것은 아니지만, IL-4, IL-5, 및 IL-13을 포함한다. 면역조절 활서의 측정에 유용한 세포로는 면역 체계의 세포, 예컨대 항원 제공 세포 림프구, 바람직하게는 대식세포 및 T 세포를 포함한다. 적합한 면역 세포는 현질세포양 수지상 세포 및 B 세포를 포함하여 말초혈 단핵 세포와 같은 일차 세포, 또는 포유류 대상체로부터 분리된 비장세포를 포함한다.
Th1-형 면역 반응을 자극하는 것은 또한 투여 전과 후 또는 활성 작용제로 처리되지 않은 대조군에 비교하여 IL-2, IL-12, 및 인터페론의 수준을 측정함으로써 본 개시의 활성 작용제 (폴리뉴클레오타이드 TLR9 작용물질)로 처리된 포유류 대상체에서 측정될 수 있다. Th1-형 면역 반응을 자극하는 것은 또한 Th1-형 대 Th2-형 항체 역가의 비율을 측정함으로써 측정될 수 있다. "Th1-형" 항체는 인간 IgG1 및 IgG3, 및 쥐과의 IgG2a를 포함한다. 대조적으로, "Th2-형" 항체는 인간 IgG2, IgG4 및 IgE 및 쥐과의 IgG1 및 IgE를 포함한다.
C. 암의 치료
본 개시는 포유류 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 그 방법은 포유류 대상체에서 암을 치료하기에 충분한 양의 본 개시의 입자들을 포함하는 면역원성 조성물을 포유류 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 암을 "치료하는 것"은 차도를 유발하거나 그렇지 않으면 치료가 없을 때 예상 생존과 비교하여 생존을 연장시키는 것과 같은 유익한 임상 결과를 불러 오는 것을 의미한다. 일부 구체예에서, 암을 "치료하는 것"은 종양의 크기를 수축시키는 것 또는 그렇지 않으면 생존 가능한 암세포 수를 감소시키는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 암을 "치료하는 것"은 종양의 성장을 지연시키는 것을 포함한다. 일부 바람직한 구체예에서, 본 개시는 암 치료를 필요로 하는 포유류 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 그 방법은 본 개시의 입자들을 포함하는 면역원성 조성물의 유효량을 종양내 전달에 의하여 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 바람직한 구체예에서, "암을 치료하는 것"은 기술된 것과 같이 (예컨대 Eisenhauer et al., 2009 Eur J Cancer, 45:228-247 참조) 고체 종양에서의 반응 평가 기준에 따라 면역원성 조성물에 대한 환자의 반응(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors (RECIST 버전 1.1))을 평가하는 것을 포함한다. RECIST에 대해 객관적인 항-종양 반응을 측정하기 위한 반응 기준은 완전한 반응; 부분 반응; 진행성 질환; 및 안정적 질환을 포함한다.
실시예
약어: Ab (항체); Ag (항원); Alum (알루미늄 염 보조제, 예컨대 Brenntag Nordic A/S에 의해 시판되는ALHYDROGEL® 85); Al(OH)3 (수산화 알루미늄); AlPO4 (알루미늄 포스페이트); BMDC (골수-유래 수지상 세포); CC (키메릭 화합물); CpG (메틸화되지 않은 CG 다이뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 키메릭 화합물); CTAG1 (암/고환 항원 1); CTRL (대조군); DC (수지상 세포); ELISA (효소-결합 면역흡착 검정); EC50 (절반의 최대 유효 농도); FACS (형광-활성화 세포 분류); FCS (소 태아 혈청); Fic (높은 MW, GE Healthcare에 의해 시판되는 FICOLL®과 같은 수크로오스와 에피클로로히드린의 분지된 코폴리머); HEG (헥사에틸렌 글리콜); HLA (인간 백혈구 항원); Hypb (소수성); IFN-γ (인터페론-감마); IPA (아이소프로판올); IT (종양내); mcg 또는 μg (마이크로그램); MAGEA (흑색종 항원, 패밀리 A); MW (분자량); MWCO (분자량 컷오프); NaCl (염화 나트륨); NaOAc (아세트산 나트륨); NY-ESO-1 또는 NYESO1 (뉴욕 식도 편평 세포 암종 1); Nu (핵산 모이어티); ODN (올리고데옥시뉴클레오타이드); OLP (중복하는 ㄱ기긴 펩타이드); OVA (오브알부민); PADRE (PAn HLA DR-결합 에피토프); PBMC (말초혈 단핵 세포); PBS (포스페이트 완충 염수); PEG (폴리에틸렌 글리콜); PN (폴리뉴클레오타이드); SC (피하); SCC (편평 세포 암종); SEM (평균의 표준 에러); Sp (비-핵산 스페이서 모이어티); TFF (접선 유동 여과); TIL (종양 침윤 백혈구); TLR9 (Toll-유사 수용체 9); TNF-α (종양 괴사 인자-알파); 및 WT (야생형).
비록, 본 개시가 명료성 및 이해를 목적으로 예시 및 실시예에 의해 일부 상세하게 기술되었지만, 당업자들에게는 특정 변화 및 변형이 실시될 수 있다는 것이 분명할 것이다. 그러므로, 다음의 합성 및 생물학적 실시예들은 본 개시의 범주를 제한하는 것으로서 해석되지 않아야 하며, 본 개시의 범주는 첨부되는 청구범위에 의해 묘사된다.
실시예 S1: 폴리뉴클레오타이드 및 키메릭 화합물의 구조
표 S1-1은 본원에서는 일반적으로 상호교환적으로 CpGs 또는 CpG-ODNs로 언급되는 폴리뉴클레오타이드 및 키메릭 화합물의 구조를 나타낸다. 폴리뉴클레오타이드 및 키메릭 화합물의 뉴클레오타이드들은 2'-데옥시리보폴리뉴클레오타이드이다. HEG는 헥사에틸렌 글리콜 스페이서 모이어티이고 18-O-다이메톡시트라이틸헥사에틸렌글리콜, 1-((2-시아노에틸)-(N,N-아이소프로필))-포스포라미다이트를 사용하여 통합되었다. 뉴클레오타이드간 결합 및 핵산 모이어티와 스페이서 모이어티 사이의 결합은 모두 포스포로티오에이트 에스테르 결합이다.
표 S1-1: 폴리뉴클레오타이드 (PN) 및 키메릭 화합물 (CC) 구조^
Figure pct00004
^ 다른 언급이 없는 한, SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 27의 폴리뉴클레오타이드 및 키메릭 화합물은 2'-데옥시-리보폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 뉴클레오타이드간 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합이다. 상이한 화합물들은 유일한 차이가 비-핵산 모이어티일 때 동일한 SEQ ID NO로 제공된다.
표 S1-1은 또한 분지된 CC를 생성하기 위하여 분자들을 분지된 운반체(carrier) 모이어티 (예컨대, [말레이미드-PEGn]y-FICOLL)와 공유 결합시키는 데 사용된 단부 연결기 (예컨대, -(CH2)6-SS-(CH2)6-OH, -(CH2)6-SH)를 가진 CC (예컨대, D61-02, D61-03)를 나타낸다 (실시예 S9 참조). 이 연결기들을 포스포로티오에이트 결합으로 스페이서 모이어티를 통해 폴리뉴클레오타이드 또는 CC에 연결시킨다. 3'-C6-이황화 링커를 1-O-다이메톡시트라이틸-헥실-이황화물, 1'-석시닐-고체 지지체를 사용하여 통합시켰다. TriLink Biotechnologies (San Diego, CA, USA) 또는 Nitto Denko Avecia (Milford, MA, USA)에 의해 제조된 폴리뉴클레오타이드 및 키메릭 화합물을 동결 건조된 고체로서 받았다.
실시예 S2: 폴리펩타이드 항원의 구조
표 S2-1는 본원에서 폴리펩타이드 또는 펩타이드로서 상호교환적으로 언급되는 폴리펩타이드 항원의 일차 구조를 나타낸다. 폴리펩타이드는 Bio-Synthesis Inc. (Lewisville, TX, USA) 또는 C S Bio (Menlo Park, CA, USA)로부터 구입하였다.
Figure pct00005
Figure pct00006
^소수성 (Hypb)을 "www.biosyn.com/펩타이드propertycalculatorlanding.aspx"에서 찾은 온라인 펩타이드 특성 계산기를 사용하여 측정하였고, 전체 길이 아미노산 서열의 백분율로서 표시한다. (폴리에틸렌 글리콜)24/PEG24 및 사이클로헥실알라닌은 Hypb 계산에 포함시키지 않았다.
OVApep 항원은 오브알부민 (OVA) 부류 I 에피토프 플러스 펩타이드 절제를 용이하게 하기 위한 OVA로부터의 7개의 N-말단 아미노산 (Cascio et al., 2001 EMBO J, 20:2357-2366) ALC OVA 부류 II 에피토프 (Maecker et al., 1998 J Immunol, 161:6532-6536)를 포함한다. 시스테인 잔기를 컨쥬게이션 목적으로 N-말단에 첨가하였다.
Triple 항원은 융합 폴리펩타이드로서 3개의 부류 I 한정 흑색종 에피토프 (gp100, Trp1, 및 Trp2) 및 인공 Pan 부류 II DR 한정 에피토프 (PADRE), 플러스 PEG24 기를 포함한다. 흑색종 에피토프 (gp100, van Stipdonk et al., 2009 Cancer Res, 69:7784-7792; Trp1, Dyall et al., 1998 J Exp Med, 188:1553-1561; 및 Trp2, Liu et al., 2003 J　Immunother, 26:301-312) 및 인공 에피토프 (Alexander et al., 1994 Immunity, 1:751-761)는 앞서 기술되었다. PEG24 기를 용해도를 보조할 목적으로 소수성을 감소시키기 위하여 아미드 결합을 통해 N-말단에 부착시켰다.
추가적으로, 펩타이드들을, 시스테인의 티올 기를 통해 말레이미드-기능화된 다당에의 공유 결합을 가능하게 하기 위해 N- 또는 C-말단 중 어느 하나에서 단일 시스테인 잔기를 포함하도록 변형시켰다. 펩타이드의 시스테인은 또한, 필요하지는 않지만, 알루미늄 염 복합체에의 비-공유 흡착에 대해 존재할 수 있다.
표 S2-2는 여러 뉴욕 식도 편평 세포 암종 1 (NY-ESO-1 또는 NYESO1) 폴리펩타이드 항원의 일차 구조를 나타낸다. NY-ESO-1은 또한 암/고환 항원 1 (CTAG1)로서도 알려져 있다. 표 S2-2의 일부 항원은 CTAG1 단백질 (UniProtKB 데이터베이스 수탁 번호 P78358, SEQ ID NO:60으로 표시됨)의 하나 이상의 에피토프의 아미노산 서열들을 포함하는 중복하는 긴 펩타이드 (OLP) 항원이다. 하기 열거된 여러 NY-ESO-1 펩타이드 항원이 후보 흑색종 백신의 인간 임상 실험에 사용되어 왔다. CTAG1은 빈약한 예후의 흑색종에서 고도로 발현되고, NY-ESO-1 펩타이드 항원은 항원 제공 세포에 의한 최소 에피토프 서열들의 효율적인 MHC 표시를 촉진하였다 (Slingluff, 2011 Cancer J 17:343; Tsuji et al., 2013 Cancer Immunol Res 1:340; Wada et al., 2014 J Immunother 37:84; Sabbatini et al., 2012 Clin Cancer Res 18:6497 참조).
SEQ ID NO:55 내지 58의 펩타이드 항원들을 고상 펩타이드 합성법을 사용하여 화학적으로 합성한 후, 공지 기법들을 사용하여 정제하고 분석적으로 특성화하였다 (Behrendt et al., 2016 J Pept Sci, 22:4 참조). SEQ ID NO:55 내지 58의 펩타이드 항원들을 Bio-Synthesis Inc. (Lewisville, TX, USA) 또는 C S Bio (Menlo Park, CA, USA)로부터 구입하였다. SEQ ID NO:59의 94개의 아미노산 폴리펩타이드를 종래의 재조합 포유류 발현 방법을 사용하여 발현시킨 후, 공지 기법들을 사용하여 정제하고 분석적으로 특성화하였다 (Fischer et al., 2015 Biotechnol Adv, 33:1878 참조).
표 S2-2: NY-ESO-1 구조
Figure pct00007
^소수성 (Hypb)을 "www.biosyn.com/펩타이드propertycalculatorlanding.aspx"에서 찾은 펩타이드 특성 계산기를 사용하여 측정하였고, 전체 길이 아미노산 서열 중의 소수성 아미노산의 백분율로서 표시한다.
표 S2-3은 여러 흑색종 항원 패밀리 A 단백질 (MAGEA)의 일차 구조, 뿐만 아니라 상응하는 MAGEA 단백질로부터의 하나 이상의 최소 9개 아미노산 에피토프를 함유하는 여러 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 나타낸다. MAGEA 단백질은 비-악성 조직에서의 낮은 발현 및 피부의 편평 세포 암종 (SCC), 식도의 SCC, 두경구 SCC, 자궁경부/항문 SCC, 폐 SCC, 선암종, 방광 요로상피 암종, 난소 암종, 자궁내막 암종, 폐 소세포 암종, 유방 점액 암종, 간세포 암종, 흉선 암종 및 중피종을 포함한 다양한 종양에서의 고수준의 발현으로 인해 유망한 면역요법 표적이다 (예컨대 Kerkar et al., 2016 J Immunother, 39:181; Park et al., 2016 J Immunother 39:1 참조). 여러 MAGEA 단백질, 이를테면 MAGEA3 및 MAGEA10을 후보 흑색종 백신의 인간 임상 실험에서 항원으로서 사용하였다 (예컨대, Vansteenkiste et al., 2016 Lancet Oncol 16:822; ClinicalTrials.gov Identifier NCT02989064 참조). SEQ ID NO: 61 내지 71의 전체 길이 MAGEA 단백질을 종래의 재조합 포유류 발현 방법을 사용하여 발현시킨 후, 공지 기법들을 사용하여 정제하고 특성화한다 (Fischer et al., 2015 Biotechnol Adv, 33:1878 참조). 표 S2-3에 나타낸 전체 길이 단백질 (SEQ ID NO:67 내지 71)의 약 9개의 아미노산 내지 약 60개의 아미노산 범위의 펩타이드들 (예컨대, SEQ ID No: 46 내지 50)이 본 개시의 조성물 및 방법에서 펩타이드 항원으로서 사용하기에 적합하다. 펩타이드 항원들을 고상 펩타이드 합성법을 사용하여 화학적으로 합성한 후, 공지 기법들을 사용하여 정제하고 특성화한다 (Behrendt et al., 2016 J Pept Sci, 22:4 참조).
Figure pct00008
Figure pct00009
실시예 S3: CpG-ODN의 수산화 알루미늄에의 흡착 과정
백신용 보조제로서 사용된 알루미늄 염에는 2가지 주요 유형이 있다: 수산화 알루미늄 [Al(OH)3] 및 알루미늄 포스페이트 [AlPO4] (Lindblad et al., 2004 Immunol Cell Biol, 82:497-505). 백신 제조 중에 정상인 pH 6 내지 8에서, 수산화 알루미늄은 양전하를 가지며 그로써 음전하의 CpG-ODNs 및 음전하의 단백질 및 펩타이드들 (항원들)에 대해 정전기적 인력을 가진다. 역으로, 알루미늄 포스페이트는 pH 6 내지 8에서 음전하를 가지므로 음전하의 CpG-ODN의 흡착에는 적합하지 않다.
수산화 알루미늄, 특히 Brenntag Biosector (Denmark)에 의해 제조되고, Brenntag Nordic A/S (Denmark)에 의해 ALHYDROGEL® 85로서 시판되며, Sergeant Adjuvants (Clifton, NJ, USA)로부터 구입한 수산화 알루미늄 제제를 모든 결합 연구에 사용하였다. ALHYDROGEL® 85는 대략 10 ± 1 mg/ml 농도의 알루미늄 농도로 정제수 중의 현탁액으로서 공급받았고, 실시예들에서 진술된 양은 알루미늄 함량을 기준으로 한다. ALHYDROGEL® 85는 의약 제품에 대한 EU GMP Part I 하에 제조되고 인간에 사용하기에 적합하다. 바람직한 구체예에서, 수산화 알루미늄 염 및 알루미늄 양이온에 대한 포유류 대상체의 노출을 최소화하기 위하여 수산화 알루미늄에 대한 CpG 및 항원의 높은 로딩 비율을 사용한다.
Flow Cam (Particle Characterization Lab, Novato, CA)을 사용한 ALHYDROGEL® 85 수산화 알루미늄 제제의 분석은 대부분의 입자가 크기가 1 마이크론 (μm) 미만이였고, 평균 직경은 0.85 μm였으며 평균 크기 분포 범위는 0.5 μm 내지 24 μm였음을 나타냈다. Flow Cam 분석은 50 μm 모세관 및 20배율 대물렌즈를 사용하였으며, 시스템은 20 μm 라텍스 비드 (Thermo)로 보정하였다.
동적 광 산란 분석 (Malvern Zetasizer Nano-S, Malvern Instruments)을, D61-04 폴리뉴클레오타이드 및 NY-ESO-179 - 108 및 NY-ESO-1142 - 173 펩타이드 항원이 일련의 중량 비율로 ALHYDROGEL® 85 2% 수산화 알루미늄 입자들에뿐만 아니라 ALHYDROGEL® 85 2% 수산화 알루미늄 입자들 단독 상에 공동 흡착되어 있는 일련의 백신 구성물에 대해 수행하였다. 각 샘플의 슬러리를 백신 또는 수산화 알루미늄 입자들을 10 mM NaOAc, 150 mM NaCl, pH 7.0에 희석함으로써 형성하였다. 표 S3-0은 집단 분포 곡선의 기하학적 평균에 있는 입자 직경이 수산화 알루미늄 입자들에 대해 1.3 μm였고 백신의 경우 1.7 내지 2.0 μm 범위에 있는 것을 보여주었고, 이것은 폴리뉴클레오타이드 및 항원의 공동 흡착 후 예상된 더 큰 질량과 일치한다. 데이터는 각각 10회 측정씩 5회의 독립적인 수행으로부터 얻어진 평균이다. 미변형 수산화 알루미늄 입자들의 다분산도 지수는 0.2였고, 다분산도의 중간 정도 수준과 일치한다. 백신 입자들의 다분산도 지수는 0.39 내지 0.46 범위에 있는데, 이것은 입자 크기가 더 분산적인 것임을 나타낸다. 동적 광 산란 기구는 3 μm 폴리스티렌 다이비닐벤젠 비드 (ThermoFisher Scientific)로 보정하였다.
비록 ALHYDROGEL® 85를 예시적인 방법에 사용하였지마, 본 개시는 어떠한 방식으로든 이 브랜드의 수산화 알루미늄 보조제의 사용에 제한되지 않는다. 다른 브랜드의 및 비-브랜드의 수산화 알루미늄 보조제도 또한 본원에 기술된 방법 및 조성물에 사용하기에 적합하며, 따라서 이 제제는 본원에서 일반적으로 "alum", "수산화 알루미늄 현탁액" 또는 "수산화 알루미늄 입자들"로 언급된다.
표 S3-0: 10 mM NaOAc, 150 mM NaCl, pH 7.0 완충액에서 백신 제제 및 수산화 알루미늄 입자들의 동적 광 산란 특성화
Figure pct00010
1 집단 분포 곡선의 기하학적 평균에서 계산된 입자 직경.
2 다분산도 지수는 절반-높이 지점에서 집단 분포 곡선의 폭/평균으로서 규정된다.
CpG-ODN과 혼합되기 전에, 수산화 알루미늄 현탁액을 실온 (20 내지 25℃)에서 10 mM 아세트산 나트륨 (NaOAc), 150 mM 염화 나트륨 (NaCl), pH 7.0, (평형 완충액)으로, 회전식 혼합 (end-over-end mixing)(약 100 내지 150 rpm)에 의해 평형화하였다. 평형화 중에 수산화 알루미늄 현탁액 (즉, 10 ± 1 mg/ml의 알루미늄 함량) 대 완충액의 최소 비율은 대략 1 ml의 수산화 알루미늄 현탁액 대 10　ml의 평형 완충액이었고 10 내지 15분 또는 그 이상 (최대 1 내지 24시간)에 걸쳐 일어났다. 평형화된 수산화 알루미늄을 원심분리 (20 내지 25℃에서 15분 동안 스윙잉 버킷 로터가 장착된 벤치 탑 원심분리기 (Beckman GS-6R)를 사용하여 약 3200 rpm)에 의해 펠릿화하고 용액을 버려서, 수산화 알루미늄 복합체를 보관을 위한 또는 결합 실험에 사용하기 위한 습식 겔 펠릿으로서 얻었다. 대부분의 결합 실험에서, 사용한 수산화 알루미늄의 양은 0.1 ml, 0.5 ml, 1.0 ml이었고, 1 mg, 5 mg 또는 10 mg의 알루미늄과 동등하며, 첨가된 CpG-ODN의 양은 다양하였다.
고체 형태의 CpG-ODN을 이 실시예들에서 수산화 알루미늄에의 결합에 바람직한 완충액인, 10 mM 아세트산 나트륨 (NaOAc), 150 mM 염화 나트륨 (NaCl) 완충액 pH 7.0 중에 약 2 내지 5　mg/mL (w/v)의 공칭 농도로 용해시켰다. 고체 CpG-ODN들이 상당량의 회합된 물을 함유하기 때문에, 용액의 CpG-ODN 농도 (mg/mL)를 베에르 법칙 및 각 CpG-ODN에 대한 250 nm에서의 흡광 계수: D61-01의 경우, 24.84 mg/ml-1cm-1; D61-02의 경우, 22.65 mg/ml-1cm-1 및 D61-04의 경우, 30. 02 mg/ml-1cm-1를 사용하여 UV 분광학에 의해 측정하였다. 규정된 양의 CpG-ODN을 규정된 양의 사전-평형화하여 놓은 수산화 알루미늄 (표 S3-1 및 표 S3-2)에 첨가한 후, 알루미늄 함량을 기준으로 약 1 mg/mL의 최종 농도 (약 0.75 내지 2 mg/mL의 농도 또한 허용되는 것으로 나타나긴 하지만)를 이루기 위하여 추가적으로 완충액을 전형적으로 첨가하였고, 그 결과의 혼합물을 약 100 내지 150 rpm에서 약 2시간 동안 20 내지 25℃에서 회전식으로 혼합하였다. 혼합 후에, 수산화 알루미늄을 펠릿화하기 위하여 샘플들을 상기에서 기술된 것과 같이 원심분리하였다. 세척/원심분리 과정을 10 mM NaOAc, 150 mM NaCl, pH 7.0 완충액으로 2회 이상 반복하였고, 상층액을 UV 분광학에 의하여 분석하여 CpG-ODN 결합을 평가하였다 (실시예 S4 참조). 최종 세척 후 수산화 알루미늄에 흡착된 CpG를 2 내지 8℃에서 습식 펠릿으로서 보관하였다.
실험 S3-1: 10 mM NaOAc, 150 mM NaCl, pH 7.0 완충액에서 수산화 알루미늄에 대한 D61-01 결합
D61-01을 10 mM NaOAc, 150 mM NaCl, pH 7.0 완충액 (표 S3-1)에서 3가지 상이한 규모 (10 mg, 20 mg 및 100 mg의 알루미늄)로 다양한 로딩에 걸쳐 (알루미늄 함량을 기준으로 1.0 mg의 수산화 알루미늄당 0.2 mg 내지 0.9 mg의 D61-01 유입) 상기에서 기술된 것과 같이 수산화 알루미늄에 흡착시켰다. 이 데이터는 모든 조건에 대해, 생리적인 염 농도와 대략적으로 동일한 150 mM NaCl의 존재하에서도, 고효율 (> 71 내지 100%)로 D61-01의 수산화 알루미늄에의 성공적인 비-공유 흡착을 나타낸다.
표 S3-1: 10 mM NaOAc, 150 mM NaCl, pH 7.0 완충액에서 D61-01의 수산화 알루미늄에의 흡착
Figure pct00011
1 표시된 중량은 Al(OH)3 중의 알루미늄의 중량을 반영한다.
2 % 결합 효율 = {D61-01 결합 / D61-01 유입} x 100, UV 분석에 의함 (실시예 S4 참조).
실험 S3-2: 10 mM NaOAc, 150 mM NaCl, pH 7.0 완충액에서 D61-01 및 D61-04 의 수산화 알루미늄에 대한 결합 용량 및 효율의 비교
2가지 상이한 CpG-ODN (D61-01 및 D61-04)의 수산화 알루미늄에 대한 결합 용량 및 효율을, 증가하는 양의 각각의 CpG-ODN (0.25, 0.5, 1.0 및 1.5 mg)을 상기에서 기술된 것과 같이 10 mM NaOAc, 150 mM NaCl 완충액, pH 7.0 중의 고정된 양의 수산화 알루미늄 (알루미늄 함량을 기준으로 1.0 mg)과 독립적으로 혼합함으로써 비교하였다. D61-01 및 D61-04 둘 다에 대해 0.25 mg, 0.5 mg 및 1 mg의 유입량의 경우에, 결합 반응 부피는 1.0 ml이었다. D61-01에 대한 1.5 mg의 유입 조건의 경우, 결합 반응 부피는 1.1 ml이었다. D61-04에 대한 1.5 mg 유입 조건의 경우에, 결합 반응 부피는 1.2 ml이었다. 2개의 CpG-ODN은 상당히 상이한 일차 및 이차 구조를 가졌고, 따라서 수산화 알루미늄에 대해 상이한 결합 용량을 가진 것으로 여겨졌다. D61-01은 HEG (헥사에틸렌 글리콜) 스페이서에 의해 분리된 핵산 헤타머를 함유한 키메릭 화합물 (CC)이고, 용액에서 단일-가닥이다. 대조적으로, D61-04는 긴 회문식 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드이고, 용액에서 우세하게 이중-가닥이다. 이런 조건하에서 1 mg의 수산화 알루미늄은 최대 각각 1.0 mg 및 1.1 mg의 D61-01 및 D61-04에 결합하는 것으로 나타났다 (표 S3-2). 이 데이터들은 CpG-ODN을 수산화 알루미늄에 결합시키는 일반적인 방법이 상이한 이차 구조 (단일-가닥 또는 이중-가닥)를 가진 CpG-ODN 서열들의 다중 유형 (폴리뉴클레오타이드 또는 키메릭 화합물)에도 적용될 수 있음을 나타낸다. 두 가지 유형의 CpG-ODN에 대한 결합 용량은 1 mg의 수산화 알루미늄당 약 1 mg의 CpG-ODN으로 유사하고, 결합 효율은 결합 용량이 도달할 때까지 100%에 가깝다.
표 S3-2: 10 mM NaOAc, 150 mM NaCl, pH 7.0 완충액에서 1 mg의 수산화 알루미늄에 대한 D61-01 및 D61-04의 결합 용량 및 효율1
Figure pct00012
1 수산화 알루미늄의 중량은 알루미늄 함량을 기준으로 한다.
2 결합 효율 (%) = {CpG-ODN 결합 / CpG-ODN 유입} x 100, UV 분석 방법에 의함 (실시예 S4 참조).
실시예 S4: 수산화 알루미늄에 흡착된 CpG-ODN의 정량 과정 및 CpG-ODN: 수산화 알루미늄 비율 (w/w)
수산화 알루미늄에 흡착된 CpG-ODN의 비율 (% 결합 효율)을 260 nm에서의 UV 흡광도에 의해 식 1 및 식 2를 사용하여 정량하였다. 샘플을 10 mM NaOAc, 150 mM NaCl 완충액, pH　7에서의 UV 검출기의 선형 범위로 희석하고, 분광계를 동일한 완충액에 대해 블랭크로 하였다. A260 유입 및 A260 상층액을 실측된 A260 값에 희석 인자 및 희석 전 부피를 곱함으로써 측정하고, 그런 다음 식 1에 사용하였다. 중량/중량 (w/w) CpG-ODN 대 수산화 알루미늄 [Al(OH)3] 비율을 식 2를 사용하여 계산하였다.
식 1:
흡착된 % CpG-ODN (% 결합 효율) = (A 260 유입 - A 260 상층액) x 100
A260 유입
식 2:
CpG-ODN: Al(OH)3 비율 (w/w) = 중량 CpG-ODN 유입 x 흡착된 % CpG-ODN
중량 Al(OH)3 유입 x 100
실험 S4-1: 수산화 알루미늄 입자들에 대한 달라지는 질량의 D61-04의 결합에 미치는 완충액 pH의 영향
6.5 내지 7.5의 완충액 pH가 수산화 알루미늄 입자들에 대한 달라지는 질량의 D61-04 폴리뉴클레오타이드의 결합에 미치는 영향을 평가하였다. 3가지 스톡 용액을 pH가 6.5, 7.0 또는 7.5인 10 mM NaOAc, 150 mM NaCl 완충액에 D61-04 폴리뉴클레오타이드로 5 mg/mL로 만들었다. 정확한 농도를 실시예 S4에서 기술한 UV 흡광도 방법에 의해 측정하였다. 이 스톡 용액들을 그런 다음 필요에 따라 상응하는 완충액으로 추가로 희석하여 적절한 농도의 D61-04 폴리뉴클레오타이드 작업 용액의 범위를 얻었다. 그런 다음, 10 mM NaOAc, 150 mM NaCl, pH 6.5, 7.0 또는 7.5 중에 1.0, 1.5 또는 2.0 mg의 D61-04 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 일련의 1:1 (v/v) 슬러리 및 10 mM NaOAc, 150 mM NaCl, pH 6.5, 7.0 또는 7.5 중에 1.0 mg 수산화 알루미늄 입자들을 함유하는 용액을 회전식 믹서에서 약 15 rpm에서 약 3시간 동안 20 내지 25℃에서 혼합하였다. 미결합 D61-04 폴리뉴클레오타이드를 수산화 알루미늄 입자들로부터 실험 S5-3에서 기술된 것과 같이 원심분리에 의해 분리하였다. 세척/원심분리 과정을 결합에 사용한 것과 동일한 완충액으로 2회 더 반복하였고, 모아진 상층액을 UV 흡광 방법에 의하여 미결합 D61-04 폴리뉴클레오타이드에 대해 분석하였다. Al(OH)3 입자에 결합된 유입 D61-04 폴리뉴클레오타이드의 퍼센트는 Al(OH)3과 인큐베이션된 D61-04 폴리뉴클레오타이드의 1:1 비율에서 최대였다. 이 퍼센트 결합은 약 1.5:1에서 약 15% 감소하였고 추가로 2:1 비율에서 10 내지 15% 감소하였다. 이 효과들은 테스트한 범위에 걸쳐 pH와 무관하였다 (표 S4-1).
표 S4-1: 10 mM NaOAc, 150 mM NaCl, pH 6.5, 7.0 또는 7.5 완충액에서 수산화 알루미늄 입자들에 대한 달라지는 질량의 D61-04의 흡착
Figure pct00013
1 UV 분석 방법에 의한 유입 D61-04 폴리뉴클레오타이드의 질량
2 Al(OH)3의 질량은 유입 알루미늄 함량을 기준으로 한다
3 퍼센트 (%) 결합 = {폴리뉴클레오타이드 결합 / 폴리뉴클레오타이드 유입} x 100, UV 분석 방법에 의한 것임.
실시예 S5: 펩타이드 항원의 수산화 알루미늄에 대한 흡착 과정
CpG-ODN들과 달리, 문제의 많은 펩타이드 항원이 고도로 소수성이고 유용한 농도에서 Alum에 대한 결합에 통상적으로 사용된 수성 완충액에 불용성이다. 상이한 수준의 소수성을 가진 2개의 펩타이드를 수산화 알루미늄에 대한 결합의 초기 연구에 사용하였다: 약 38%의 소수성을 가진 OVApep 및 약 60%의 소수성을 가진 Triple 흑색종 (Triple) (표 S2-1). OVApep은 물, 포스페이트 완충 염수 (PBS) 또는 아세트산 나트륨 (NaOAc) 완충액에서는 인지할 수 있을 정도로 가용성이 아니었지만, 수산화 알루미늄에의 흡착에 적합한 완충액인 0.1 M 중탄산 나트륨, pH 8 완충액에 약 2 내지 4 mg/ml에서 가용성인 것으로 나타났다. 대조적으로, Triple 펩타이드는 0.1 M 중탄산 나트륨, pH 8 완충액, 물, PBS, 중탄산 나트륨 또는 NaOAc 완충액에서 인지할 수 있을 정도로 가용성이 아니었다. Triple 펩타이드는 6M 구아니딘 염산염 (GuHCl)/pH 8.5 또는 20% 아이소프로필 알코올 (IPA)/물 (v/v)에서는 약 1 내지 5 mg/ml에서 가용성이었다. 그러나, 6M GuHCl은 높은 이온 강도로 인해 수산화 알루미늄에 대한 펩타이드의 정전기적 흡착에 적합한 용액이 아니고, 수산화 알루미늄에의 펩타이드 결합에 대한 IPA 효과는 알려진 바가 없다.
수산화 알루미늄을 실시예 S3에서 기술된 것과 같이 10 mM NaOAc, 150 mM NaCl, pH 7.0 완충액에서 평형화하였다. 고체 펩타이드를 표시된 용액에 약 2 내지 4 mg/mL (w/v)의 공칭 농도로 용해시켰다. 규정된 양의 펩타이드를 규정된 양의 사전-평형화되어 있는 수산화 알루미늄에 첨가 (표 S5-1 및 표 S5-2)한 후, 전형적으로 더 많은 양의 동일한 용액을 첨가하여 알루미늄 함량을 기준으로 약 1 mg/mL의 최종 농도를 이룬 다음, 그 결과의 혼합물을 회전식으로 약 100 내지 150 rpm에서 약 2 내지 18시간 동안 20 내지 25℃에서 혼합하였다. 혼합 후, 샘플을 상기에서 기술한 것과 같이 원심분리하여 수산화 알루미늄을 펠릿화하였다. 세척/원심분리 과정을 결합에 사용한 것과 동일한 용액으로 2회 더 반복하였고, 상층액을 UV 분광광도법에 의해 및/또는 아미노산 분석에 의해 분석하여 펩타이드 결합을 평가하였다 (실시예 S6 참조). 최종 세척 후 수산화 알루미늄에 흡착된 펩타이드를 2 내지 8℃에서 습식 겔 펠릿으로서 보관하였다.
실험 S5-1: 0.1 M 중탄산 나트륨, pH 8.0 완충액에서 수산화 알루미늄에 대한 OVApep의 결합
OVApep를 0.1 M 중탄산 나트륨, pH 8.0 완충액에 2가지 상이한 규모 (수산화 알루미늄 중의 10 mg 및 50 mg의 알루미늄)로 2가지 로딩으로 (알루미늄 함량을 기준으로 1.0 mg의 수산화 알루미늄당 0.98 mg 및 0.44 mg 유입) 수산화 알루미늄 (0.1 M 중탄산 나트륨, pH 8.0에 평형화됨)에 흡착시켰다 (표 S5-1). 이 데이터들은 수산화 알루미늄에 대한 OVApep의 성공적인 비-공유 흡착을 나타낸다. 이 조건 하에서, 최대 결합 용량은 알루미늄 함량을 기준으로 1.0 mg의 수산화 알루미늄당 0.3 mg의 OVApep였다.
표 S5-1: 0.1 M 중탄산 나트륨, pH　8.0 완충액에서 수산화 알루미늄에 대한 OVApep의 흡착
Figure pct00014
1 Al(OH)3 의 중량은 알루미늄 함량을 기준으로 한다.
2 결합 효율 (%) = {펩타이드 결합 / 펩타이드 유입} x 100, UV에 의함 (실시예 S6 참조).
실험 S5-2: 아이소프로필 알코올 / 물에서 수산화 알루미늄에 대한 Triple 흑색종 (Triple) 펩타이드의 결합
Triple 펩타이드를 수산화 알루미늄 (NaOAc 완충액에 평형화됨)에, 10 mg 규모로 알루미늄 함량을 기준으로 1.0 mg의 수산화 알루미늄당 0.80 mg 유입의 로딩으로 흡착시켰다 (표 S5-2). Triple 펩타이드를 20% IPA/물 (v/v)에 용해시키고, 10 mM NaOAc, 150 mM NaCl, pH 7.0 완충액에서 수산화 알루미늄과 1:1 (v/v)로 혼합하여 5 mM NaOAc, 75 mM NaCl, pH 7.0 완충액 중의 10% IPA (v/v)의 최종 조성물을 얻었다. 이 데이터는 Triple 펩타이드의 수산화 알루미늄에의 성공적인 비-공유 흡착을 보여준다. 이 조건 하에서 펩타이드는 100% 결합 효율로 수산화 알루미늄에 흡착하였다.
표 S5-2: 5 mM NaOAc, 75 mM NaCl, pH 7.0 완충액 중의 10% IPA (v/v)에서 Triple 흑색종 (Triple) 펩타이드의 수산화 알루미늄에의 흡착
Figure pct00015
1 Al(OH)3의 중량은 알루미늄 함량을 기준으로 한다.
2 결합 효율 (%) = {펩타이드 결합 / 펩타이드 유입} x 100, UV에 의한 것임 (실시예 S6 참조).
실험 S5-3: 달라지는 질량의 수산화 알루미늄 입자들에의 일정한 질량의 NY-ESO-1 OLP 항원의 결합
OLP 항원의 특정 양을 효율적으로 공동 흡착하기 위해 필요한 수산화 알루미늄 입자의 최소량을 측정하기 위하여, 고정된 양의 NY-ESO-179 - 108 및 NY-ESO-1142 - 173 OLP 항원의 흡착에 대한 수산화 알루미늄의 달라지는 질량의 영향을 평가하였다. NY-ESO-179 - 108 및 NY-ESO-1142 - 173 OLP 항원을 20% 아이소프로판올 (IPA)/물 (v/v)에 약 1 mg/ml로 용해시키고 정확한 농도를 아미노산 분석에 의하여 측정하였다. 이 스톡 용액을 그런 다음 추가로 적절한 농도의 작업 용액의 범위를 얻기 위해 필요에 따라 20% (v/v) IPA/물로 희석하였다. 그런 다음, 10 mM NaOAc, 150 mM NaCl, pH 7.0에 0.2 mg의 총 OLP 항원 (0.1 mg의 각각의 OLP 항원) 및 1.0, 0.8, 0.6, 0.4 또는 0.2 mg의 수산화 알루미늄 입자들을 함유한 1:1 (v/v) 용액을 혼합하여 5 mM NaOAc, 75 mM NaCl, pH 7.0 완충액 중의 10% IPA (v/v)의 최종 완충액 조성물을 얻었다. 그 결과의 슬러리를 회전식으로 약 15 rpm에서 약 3시간 동안 20 내지 25℃에서 혼합하고, 수산화 알루미늄-결합된 OLP 항원을 약 3200 rpm에서 15분 동안 20 내지 25℃에서 스윙잉 버킷 로터가 장착된 Beckman GS-6R 원심분리기를 사용한 원심분리에 의해 미결합 펩타이드들로부터 분리하였다. 세척/원심분리 과정을 결합에 사용한 것과 동일한 용액으로 2회 더 반복하였고, 모아진 상층액을 아미노산 분석에 의해 OLP 항원 함량에 대해 분석하여 총 OLP 항원 결합을 평가하였다 (실시예 S6 참조). 이 조건 하에서, 0.2 mg의 NY-ESO-179 - 108 및 NY-ESO-1142 - 173 OLP 항원이 1.0 mg, 0.8 또는 0.6 mg의 수산화 알루미늄 입자들 (표 S5-3)을 사용한 조건하에서의 결합의 85%를 초과하는 비슷한 수준에서 결합하였다. 그러나, NY-ESO-1 항원의 결합은 0.4 및 0.2 mg의 수산화 알루미늄 입자들을 사용한 조건에 대해 73%로 감소하였다.
표 S5-3: 5 mM NaOAc, 75 mM NaCl, pH 7.0 완충액 중의 10% (v/v) IPA에서 수산화 알루미늄 입자들에의 NY-ESO-1 OLP 항원들의 흡착
Figure pct00016
1 Al(OH)3의 질량은 유입 알루미늄 함량을 기준으로 한다.
2 NY-ESO-1 OLP 항원의 질량은 아미노산 분석에 의한 것이다.
3 퍼센트 (%) 결합된 항원 = {결합된 펩타이드 / 펩타이드 유입} x 100, 아미노산 분석 방법에 의한 것임 (실시예 S6 참조).
실험 S5-4: 2가지 질량의 수산화 알루미늄 입자들에의 증가하는 질량의 NY-ESO-1 OLP 항원들의 결합
공동 흡착될 수 있는 항원의 최대량을 측정하기 위하여, 수산화 알루미늄 입자들에의 흡착에 대한 증가하는 질량의 NY-ESO-179 - 108 및 NY-ESO-1142 - 173 OLP 항원의 영향을 평가하였다. NY-ESO-179 - 108 및 NY-ESO-1142 - 173 OLP 항원을 20% IPA/물 (v/v)에 약 1 mg/ml로 용해시키고 정확한 농도를 아미노산 분석에 의하여 측정하였다. 이 스톡 용액을 그런 다음 적절한 농도의 작업 용액의 범위를 얻기 위하여 필요에 따라 20% (v/v) IPA/물로 추가로 희석하였다. 그런 다음, 10 mM NaOAc, 150 mM NaCl, pH 7.0에 0.4, 0.5 및 0.6 mg의 총 OLP 항원 (0.2, 0.25 및 0.3 mg의 각각의 OLP 항원) 및 0.5 및 1.0 mg의 수산화 알루미늄 입자들을 함유한 1:1 (v/v) 용액을 혼합하여 5 mM NaOAc, 75 mM NaCl, pH 7.0 완충액 중의 10% IPA (v/v)의 최종 완충액 조성물을 얻었다. 그 결과의 슬러리를 회전식으로 약 15 rpm에서 약 3시간 동안 20 내지 25℃에서 혼합한 후, 수산화 알루미늄-결합된 OLP 항원을 실험 S5-3에서 기술한 것과 같은 원심분리에 의해 미결합 펩타이드들로부터 분리하였다. 세척/원심분리 과정을 결합에 사용한 것과 동일한 용액으로 2회 더 반복하였고, 모아진 상층액을 아미노산 분석에 의해 OLP 항원 함량에 대해 분석하여 총 OLP 항원 결합을 평가하였다 (실시예 S6 참조). 이 조건 하에서, 증가하는 질량의 모아진 NY-ESO-179 - 108 및 NY-ESO-1142 - 173 OLP가 0.5 또는 1.0 mg의 수산화 알루미늄 입자들 (표 S5-4)과 비슷하게 약 85%의 결합 효율로 결합하였다.
표 S5-4: 5 mM NaOAc, 75 mM NaCl, pH 7.0 완충액 중의 10% (v/v) IPA에서 NY-ESO-1 OLP 항원들의 수산화 알루미늄 입자들에의 흡착
Figure pct00017
1 Al(OH)3의 질량은 유입 알루미늄 함량을 기준으로 한다.
2 NY-ESO-1 OLP 항원의 질량은 아미노산 분석에 의한 것이다.
3 퍼센트 (%) 결합된 OLP 항원 = {결합된 펩타이드 / 펩타이드 유입} x 100, 아미노산 분석 방법에 의한 것임.
실험 S5-5 (파트 1). 등몰량의 3가지 상이한 NY-ESO-1 펩타이드 항원의 수산화 알루미늄 입자들에의 결합
3가지 상이한 NY-ESO-1 펩타이드 항원들, NY-ESO-179 - 108, NY-ESO-1121-150 및 NY-ESO-1142 - 173 (각각 SEQ ID NOs. 55, 57 및 58)의 등몰량의 조합이 0.5 mg의 수산화 알루미늄 입자들 (원소 알루미늄으로서 표시된 질량)에의 그것들의 흡착에 미치는 영향을 평가하여 3개의 펩타이드 각각의 공동 흡착의 효율을 측정하였다. 개별적인 펩타이드 항원을 약 1 mg / mL의 20% 아이소프로판올 (IPA)/ 80%물 (v/v)에 용해시킨 후 혼합물의 정확한 농도를 아미노산 분석에 의하여 측정하였다. 이 실시예의 경우, 규정된 양의 각각의 펩타이드 용액을 혼합하여 NY-ESO-1142 - 173 펩타이드 항원에 비해 각각의 펩타이드의 1.34 μ몰을 이루었다. 3개의 펩타이드의 이 혼합물을 샘플화하고 총 항원 농도를 아미노산 분석에 의하여 측정하였다. 20% IPA/ 80% 물 (v/v) 중의 대략 12.6 mg (유입)의 총 펩타이드 항원들 (약 4.0 mg의 각각의 NY-ESO-1 항원)을 10 mM NaOAc, 150 mM NaCl, pH 7.0 완충액 중의 10 mg의 수산화 알루미늄과 1:1로 혼합하여 5 mM NaOAc, 75 mM NaCl, pH 7.0 완충액 중의 10% IPA (v/v)의 최종 완충액 조성물을 얻었다. 이 용액을 회전 스피너를 사용하여 15 rpm에서 약 3시간 동안 실온에서 혼합하여 펩타이드의 수산화 알루미늄 입자들에의 흡착이 가능하게 하였다. 3시간 후에 수산화 알루미늄-결합된 항원을 약 3200 rpm에서 15분 동안 20 내지 25℃에서 스윙잉 버킷 로터가 장착된 Beckman GS-6R 원심분리기를 사용한 원심분리에 의해 미흡착 항원들로부터 분리하였다. 미결합 항원 분획을 함유한 상층액을 버리고 아미노산 분석을 수행하였다. 수산화 알루미늄-결합된 항원의 습식 겔 펠릿을 20 ml의 10 mM NaOAc, 150 mM NaCl, pH 7.0 완충액에 복원시키고, 간단히 혼합하고 (1 내지 5분), 앞에서와 같이 원심분리하고, 상층액을 버리고 (세척) 아미노산 분석을 수행하였다. 마지막으로, 결합된 항원을 가진 세척된 수산화 알루미늄도 또한 아미노산 분석을 수행하였다. 이 조건 하에서, NY-ESO-179 - 108, NY-ESO-1121 - 150 및 NY-ESO-1142 - 173 펩타이드 항원의 혼합물은 간접적으로 (항원의 유입량을 아미노산 분석에 의한 미결합 및 세척 분획에서 관찰된 항원의 양으로부터 뺌으로써) 및 직접적으로 (수산화 알루미늄 입자들에 결합된 항원의 아미노산 분석에 의해) 측정되는 바, 수산화 알루미늄 입자들에 95 내지 97%의 효율로 결합하였다 (표 S5-5a).
표 S5-5a: 5 mM NaOAc, 75 mM NaCl, pH 7.0 완충액 중의 10% (v/v) IPA에서 3개의 NY-ESO-1 펩타이드 항원의 수산화 알루미늄 입자들에의 공동 흡착
Figure pct00018
1 Al(OH)3 유입의 질량은 알루미늄 함량을 기준으로 한다.
2 조합된 NY-ESO-1 펩타이드 항원의 질량은 아미노산 분석에 의한 것이다. 총 항원 유입은 12.6 mg이었다.
3 퍼센트 (%) 결합된 항원 (간접 방법) = {결합된 펩타이드 / 펩타이드 유입} x 100, 아미노산 분석 방법에 의한 것임. 퍼센트 (%) 결합된 항원 (직접 방법)은 알루미늄-결합된 펩타이드를 가수분해한 후, 이어서 원심분리하여 알루미늄 입자들을 분리한 후 상층액에 대해 아미노산 분석을 수행한다.
실험 S5-5 (파트 2). 상이한 양의 CpG (D61-04)의 고정된 양의 수산화 알루미늄-결합된 NY-ESO-1 펩타이드 항원에의 공동 흡착
3가지 상이한 질량의 D61-04 (SEQ ID NO: 6)를 결합된 NY-ESO-1 펩타이드 항원을 가진 고정된 양의 수산화 알루미늄 입자에 첨가하는 영향을 평가하여 결합된 펩타이드 항원을 가진 수산화 알루미늄 입자에 대한 D-61-04의 결합 용량을 측정하였다. 4, 2 및 1 mg/ml의 D-61-04 용액을 농축된 스톡 용액으로부터 10 mM NaOAc, 150 mM NaCl, pH 7 완충액으로의 희석에 의하여 제조하였다. 다음에, 0.5 ml의 각각의 D61-04 용액을 mg의 수산화 알루미늄당 약 1.2 mg의 총 펩타이드 항원 (약 0.4 mg의 각각의 항원)을 함유한 결합된 펩타이드 항원을 가진 수산화 알루미늄의 슬러리와 1:1 (v/v)로 혼합하였다. 그런 다음 이 3가지 실험 용액 (각각 약 1.0 ml)을 회전 스피너를 사용하여 15 rpm에서 약 3시간 동안 실온에서 혼합하여 결합된 NY-ESO-1 항원을 가진 수산화 알루미늄 입자들에의 D61-04의 흡착을 촉진하였다. 미결합 D61-04를 약 3200 rpm에서 15분 동안 20 내지 25℃에서 스윙잉 버킷 로터가 장착된 Beckman GS-6R 원심분리기를 사용한 원심분리에 의해 분리하였다. D61-04 미결합 분획을 UV 분광학에 의해 분석하고 수산화 알루미늄에 결합된 D61-04의 양을 유입량으로부터 미결합을 뺌으로써 추론하였다. 다음에, D61-04 / 펩타이드 항원-결합된 수산화 알루미늄 입자들을 10 mL의 10 mM NaOAc, 150 mM NaCl, pH 7 완충액에 복원하고, 1 내지 5분 동안 혼합하고, 상기와 같이 원심분리하여 미결합 D61-04와 항원을 분리하였다 (경합하는 포스페이트 리간드 교환 메커니즘으로 인해 D61-04에 의해 교체된 것으로 여겨짐). 미결합 및 세척 분획을 각각 UV 분광학에 의해 분석하여 미결합 D61-04의 총량을 측정하였다. 수산화 알루미늄-결합된 항원에 공동 흡착된 D61-04의 양을 D61-04 유입과 미결합 D61-04 사이의 차이로서 추론하였다 (미결합 + 세척 분획). 이 조건 하에서, D61-04의 결합 용량은 3개의 상이한 공동 흡착 혼합물에 대해 각각, 결합된 항원을 가진 mg의 수산화 알루미늄 입1자들에 대해 1.8, 1.3 및 1.0 mg이었다 (표 S5-5b). 이 관련된 입자들의 다양한 성분들에 대한 최종 양 (mg) 및 결합 비율은 항원들이 과잉 D61-04에 의해 교체되지 않았음을 시사한다 (즉, 결합된 항원의 양은 0.5 mg의 수산화 알루미늄 입자당 대략 0.6 mg의 총 항원에서 일정하게 유지되었다).
표 S5-5b:　10 mM NaOAc, 150 mM NaCl, pH 7.0 완충액에서 수산화 알루미늄-결합된 펩타이드 항원에 대한 D61-04의 공동 흡착의 요약
Figure pct00019
* 3중의 아미노산 분석 측정에 의해 측정된 3개의 흡착된 항원 (NY-ESO-179 - 108, NY-ESO-1121-150 및 NY-ESO-1142 - 173)의 총량 (mg).
실험 S5-6. 등몰량의 2개의 NY-ESO-1 펩타이드 항원 플러스 MAGE A10 펩타이드 항원 및 D61-04 CpG (D64-01)의 수산화 알루미늄 입자들에의 결합
S5-5 파트 1과 유사한 실험에서, NY-ESO-1121-150 펩타이드 항원을 MAGE A10245 - 274 펩타이드 항원으로 치환하였다. 그렇지 않으면 3개의 항원의 이 세트의 수산화 알루미늄 입자들에의 공동 흡착을 위한 모든 다른 실험 조건은 동일하였다. 이 실험의 파트 1에서, 약 14 mg의 총 항원 유입을 나타내는, 조합된 NY-ESO-179 - 108, NY-ESO-1142 - 173 및 MAGE A10 245 - 274 펩타이드 항원 (SEQ ID NO:55, 58 및 50)이 아미노산 분석에 의해 측정되는 바 93%의 전체 결합 효율로 수산화 알루미늄 입자들에 결합하였다 (표 S5-6a).
표 S5-6a:　5 mM NaOAc, 75 mM NaCl, pH 7.0 완충액 중의 10% (v/v) IPA에서 2개의 NY-ESO-1 펩타이드 항원 플러스 MAGE A10의 수산화 알루미늄 입자들에의 공동 흡착
Figure pct00020
1 Al(OH)3 유입의 질량은 알루미늄 함량을 기준으로 한다.
2 NY-ESO-1 및 MAGE 펩타이드 항원의 질량은 아미노산 분석에 의한 것이다. 총 펩타이드 항원 유입은 12.6 mg이었다.
3 퍼센트 (%) 결합된 항원 (간접 방법) = {결합된 펩타이드 / 펩타이드 유입} x 100, 아미노산 분석 방법에 의한 것임. 퍼센트 (%) 결합된 항원 (직접 방법)은 알루미늄-결합된 펩타이드를 가수분해한 후, 이어서 원심분리하여 알루미늄 입자들을 분리한 후 상층액에 대해 아미노산 분석을 수행한다.
이 실험의 파트 2에서, CpG 결합 및 수산화 알루미늄 입자-결합된 펩타이드 항원을 대체하는 D61-04의 잠재력 (수산화 알루미늄 입자들에 대한 이론적인 결합 용량을 초과하여)을 평가하기 위하여 4, 8 및 12 mg/mL의 D61-04 CpG를 3개의 별도의 공동 흡착 반응에 첨가하였다. 다른 실험 조건들은 S5-5, 파트 2에서 기술된 것과 같았다. 이런 조건 하에서, 0.8, 1.1 및 1.7 mg의 D61-04는 수산화 알루미늄 입자-결합된 펩타이드 항원에 흡착되었다 (표 S5-6b). 이에 더불어, 과잉 D61-04의 첨가는 아미노산 분석에 의한 펩타이드 항원의 존재에 대해 미결합 및 세척 분획의 검정에 의해 평가되는 바 수산화 알루미늄 입자-결합된 항원의 대체를 거의 초래하지 않거나 전혀 초래하지 않았다.
표 S5-6b:　10 mM NaOAc, 150 mM NaCl, pH 7.0 완충액에서 Al(OH)3-결합된 펩타이드 항원 (NY-ESO-179 - 108, NY-ESO-1142 - 173 및 MAGE A10 245 - 274)에 대한 D61-04의 공동 흡착
Figure pct00021
* 3중 아미노산 분석 측정에 의해 측정되는 바 3개의 조합된 NY-ESO-1 펩타이드 항원 (NY-ESO-179 - 108, NY-ESO-1142 - 173 및 MAGE A10 245 - 274)의 총량 (mg).
실험 S5-7: NY-ESO-1 펩타이드 항원은 오토클레이빙에 의한 최종 멸균 후에 수산화 알루미늄 입자들에 공동 흡착된 채로 유지된다.
CpG-Alum-펩타이드 컨쥬게이트에 대한 제조 계획을 도 9에 제시한다. 수산화 알루미늄 입자들 (0.5 내지 3 μm 직경 크기 범위)에 공동 흡착된 단백질-기반 항원으로 구성된 알루미늄 약물 제품은 제조시 최종 가공 단계 (최종 멸균)로서 0.2 마이크론 (μm) 여과에 의해 멸균될 수 없다. 따라서, 보다 번거로운 무균성 가공 접근법이 필요하다. 백신에 사용된 수산화 알루미늄 입자들은 오토클레이빙에 의해 최종적으로 멸균되기 때문에, 길이가 약 25 내지 35개의 아미노산의 펩타이드 항원이 오토클레이빙에 의한 최종 멸균 후에 입자에 공동 흡착된 채로 유지될 수 있는지를 평가하였다. 실험 S5-5 파트 1)에서 기술된 것과 같이 제조된, 수산화 알루미늄 입자들 (로트 # BM-012517)에 공동 흡착된 3개의 NY-ESO-1 펩타이드 항원의 슬러리를 121℃에서 15 내지 20분 동안 고압 포화 스팀에 노출시켰다 (오토클레이빙). 동적 광 산란에 의해 평가된 입자들의 크기 분포 및 다분산도 지수는 오토클레이빙 전과 후에 유사하였다. 슬러리 중의 수산화 알루미늄 입자들을 오토클레이빙 전과 후에 원심분리에 의해 제거하였고, 상층액의 펩타이드 항원 함량을 215 nm에서 흡광도를 검출하는 역상 (RP) HPLC 및 215 nm에서의 직접적인 분광광도계에 의한 측정에 의해 정량하였다. 직접적인 분광광도계 분석은 1% 미만의 펩타이드 항원이 오토클레이빙 후에 수산화 알루미늄 입자들로부터 분리되었음을 나타냈다 (표 S5-7). RP-HPLC 분석은 상층액 중의 3개의 펩타이드 항원들이 각각 고유의 보유 시간을 갖고 있기 때문에 각각의 양을 평가한다. 이 분석은 각각의 펩타이드에 대한 통합 피크 값이 분석의 정량 하한선 (>10 μg/ml)에 있거나 그 아래에 있고, 그것은 개별적인 펩타이드 항원의 각각의 유입량의 5% 미만이 오토클레이빙에 의해 탈착되었음을 가리키는 것임을 증명하였다. 두 가지 방법 모두 종래의 오토클레이빙 방법을 사용하는, 수산화 알루미늄 입자들에 공동 흡착된 NY-ESO-1 펩타이드 항원의 최종 멸균이 입자 크기 / 크기 분포를 변경시키지 않고 3개의 NY-ESO-1 펩타이드 항원을 유의미하게 탈착시키지도 않는 것을 나타낸다.
표 S5-7. 오토클레이빙에 의한 수산화 알루미늄 입자들로부터의 3개의 NY-ESO-1 펩타이드 항원의 탈착
Figure pct00022
* 215 nm에서 UV에 의해 산정된 3개의 모든 펩타이드 항원에 대한 흡광량. 수산화 알루미늄 입자들에 결합되지 않은 3개의 펩타이드 항원의 용액의 흡광도는 18.8의 값을 나타냈다 (아미노산 분석에 의해 확인되는 바, 0.6 mg/mL 농도에 상응함).
** 이 검정에 대한 정량 하한선은 펩타이드 당 약 10 μg/ml이다 (각각의 펩타이드 유입의 5% 미만).
실험 S5-8. 인간 펩타이드 항원의 가용화를 위해 선택된 유기 용매의 평가
대략 1 mg의 4개의 상이한 펩타이드 항원, NY-ESO-179 - 108, NY-ESO-1121 - 150, NY-ESO-1142 - 173, 및 MAGE A10245 - 274를 별도로 중량을 측정하고 붕규산염 유리 테스트 튜브에 넣었다. 펩타이드 항원 가용성을 1 ml의 6개의 상이한 유기 용매, 20% 아이소프로필 알코올 (IPA) / 80% 물 (v/v), 100% 다이메틸 설폭사이드 (DMSO), 20% DMSO / 80% 물 (v/v), 100% 다이메틸포름아미드 (DMF), 20% DMF / 80% 물 (v/v), 및 100% 아세토니트릴 (ACN)을 첨가함으로써 평가하였다. 4개의 항원의 각각에 용매를 첨가한 후에, 그것들을 3 내지 5초 동안 실온에서 간헐적인 와류 혼합에 의해 혼합한 후 시각적 투명도에 대해 1 - 2분 내에 평가하였다. 100% 및 20% DMSO, 및 20% DMF 용매는 4개의 모든 항원을 쉽게 용해시켜서 시각적으로 투명한 용액을 생성하였다 (표 S5-8). 100% DMF 및 20% IPA 용매는 약간 흐릿한 용액 또는 일부 보이는 입자 또는 플레이크 물질이 있는 용액을 생성하였다. 100% 아세토니트릴 용매는 4개의 인간 종양 관련 항원 중 어느 것도 완전하게 용해시키지 못하였고, 용매가 첨가되기 전 물질에서와 비슷한 용해되지 않은 물질의, 눈으로 볼 수 있게 관찰 가능한 플레이크를 남겼다. 이 용해도 관찰은 실온에서 추가로 1 또는 24시간 동안 정착된 후에도 변하지 않았다.
표 S5-8: 다양한 유기 용매를 사용한 선택된 펩타이드 항원들의 가용화
Figure pct00023
* 100% DMSO 중의 샘플을 물로 1:5로 희석하여 20% DMSO/물 용액을 만들었다.
**100% DMF 중의 샘플을 물로 1:5로 희석하여 20% DMF/물 용액을 만들었다.
실험 S5-9. NY-ESO-1 142-173 펩타이드 항원의 가용화 및 수산화 알루미늄 입자들에의 결합을 평가하기 위한 선택된 부류 2 & 3 용매의 평가
부류 3 용매들은 미 식품의약국, 및 다른 규제 기관에 의해, 공지된 안전성 프로파일로 인해 분류된다 (산업 Q3C에 대한 인간 사용 지침에 대한 국제의약품규제조화위원회 - 표 및 목록 [2012. 2. 수정 2]). 독물학 프로파일을 기반으로, 부류 3 용매들은 GMP 조건하에서 제조된 인간 약물 제품에 고작 5000 ppm [0.5% w/w]의 허용되는 불순물 한계를 가진다. 10개의 물-혼합 가능한 부류 3 용매들을, NY-ESO-1142-173 펩타이드 항원을 효과적으로 용해시키는 능력에 대해 (시각적 평가를 사용함, 표 S5-9 각주 * 참조), 및 그런 다음 용해된 펩타이드 항원을 수산화 알루미늄 입자들에 흡착시키는 능력에 대해 조사하였다. 포름산, 에탄올, 아세톤 및 아세트산은 각각 100%에서, 거의 즉시 시각적으로 투명한 용액을 나타냈기 때문에 '1'의 점수를 매겼다. 아이소프로필 알코올 및 2-부탄올은 각각 100%에서, 또한 펩타이드 항원을 용해하는 데 매우 효과적이었고, 단지 소량의 불용성 플레이크만이 관찰되었기 때문에 '1.5'의 점수를 매겼다. 더욱이, 상기 언급된 6개의 용매를 추가로 20% 용매 / 80% 물 (v/v)로 희석하였을 때, NY-ESO-1142-173 펩타이드 항원은 시각적으로 가용성인 채로 유지되었다 (데이터 미도시). 대조적으로, 메틸 아세테이트, 아이소프로필 아세테이트, n-부틸 아세테이트 및 아이소아밀 알코올은 각각 100%에서 이 펩타이드 항원을 용해시키지 못하였다.
NY-ESO-1142-173 펩타이드 항원의 수산화 알루미늄 입자들에의 결합을, 단지 단일 펩타이드 항원을 사용하는 것을 제외하고는 실험 S5-5 (파트 1)에서 기술한 처리 조건을 사용하여, 20% 용매 / 80% 물 (v/v)에 용해된 펩타이드에 대해 평가하였고; 용매는 포름산, 아이소프로필 알코올, 에탄올, 아세톤 및 아세트산 중 어느 하나였다. 결합 효율을 상층액 중의 미결합 펩타이드 항원의 RP-HPLC 측정에 의해 측정하였고, 표 S5-9에서 기술한 것과 같이 계산하였다. NY-ESO-1142-173 펩타이드 항원은 모두 5개의 용매에서 수산화 알루미늄 입자들에 대한 100% 결합 효율을 증명하였다.
표 S5-9. 다양한 부류 3 용매들의 NY-ESO-1142-173 펩타이드 항원을 용해시키고 수산화 알루미늄에의 흡착을 촉진하는 능력에 대한 평가
Figure pct00024
* 1 = 전체적으로 가용성 / 물과 유사한 투명도, 2 = 부분적으로 가용성, 및 3 = 불용성.
** % 결합 = 결합된 % /유입 x 100, 215 nm에서 RP-HPLC 검정을 기준으로 ㅎ함; ND = 약 1 mg/ml에서 가용성이지 않아서 측정되지 않음
실시예 S6: 수산화 알루미늄에 흡착된 펩타이드를 정량하기 위한 과정 및 펩타이드 : 수산화 알루미늄 비율 (w/w)
UV 과정. 수산화 알루미늄에 흡착된 펩타이드의 양 (% 결합 효율)을 식 3 ㅁ및 식 4를 사용하여 5 nm (A215) 및/또는 280 nm (A280)에서의 UV 흡광도에 의하여 정량하였다. 샘플들을 UV 검출기에서 선형 범위가 되도록 적절한 희석제에 희석하고 (OVApep에 대해 Na-중탄산염 및 Triple 펩타이드에 대해 10 mM 아세테이트, 150 mM NaCl, pH 7.0) 분광광도계를 상응하는 희석제에 대해 블랭크로 하였다. 흡광도 유입 (A 유입) 및 흡광도 상층액 (A 상층액), (A 상층액 = 조합된 모든 세척)을 실측 A215 값을 희석 인자 및 희석 전 부피로 곱함으로써 측정한 후, 식 3에서 사용하였다. 중량/중량 (w/w) 펩타이드 대 수산화 알루미늄 [Al(OH)3] 비율을 식 4를 사용하여 계산하였다.
식 3:
% 흡착된 펩타이드 (% 결합 효율) = (A 유입 - A 상층액) x 100
A 유입
식 4:
펩타이드: Al(OH)3 비율 (w/w) = 펩타이드 유입 중량 x % 흡착된 펩타이드
Al(OH)3 유입 중량 x 100
아미노산 분석 과정. 펩타이드 유입 및 펩타이드 상층액 용액의 농도를 Molecular Structure Facility (MSF Proteomics Core, University of California, Davis, USA)에 의해 수행된 것과 같은 표준 과정을 사용하여 아미노산 분석 (AAA)에 의해 측정하였다. 간단히 설명하면, 샘플을 진공 하에서 6N HCl 산에 110℃에서 24시간 동안 넣었다. 그런 다음 샘플을 진공 건조시키고 내부 표준으로서의 노르류신 (NorLeu)을 함유한 정확한 양의 희석물에 넣고, Hitachi 8800 아미노산 분석기 위로 주입하였다. 아미노산들을 트란스제노믹(Transgenomic) 칼럼 및 작동 과정 중에 pH, 이온 강도 및 온도를 증가시키는 Pickering 완충액을 사용하여 강력한 양이온 교환에 의해 분리하였다. 아미노산은 가시광에서의 검출을 위해 이차 반응으로 닌히드린과 반응시킨다. 피크를 확인하고 각각의 아미노산의 양을 샘플과 동일한 서열에서 표준 곡선을 사용하여 정량한다. 그런 다음 존재하는 아미노산의 양 및 공지 서열로부터, 펩타이드의 양을 계산한다.
수산화 알루미늄에 흡착된 % 펩타이드 (% 결합 효율)를 식 5를 사용하여 정량하였다. 중량 유입 (W 유입) 및 중량 상층액 (W 상층액)을 실측 농도를 희석 인자 및 희석 전 부피로 곱함으로써 측정하고, 그런 다음 식 5에 사용하였다. 중량/중량 (w/w) 펩타이드 대 수산화 알루미늄 비율을 상기의 식 4를 사용하여 계산하였다. 용액에서 측정된 펩타이드 농도는 또한 215 nm에서의 UV 흡광도와 상관시켜서 215 nm에서의 펩타이드에 대한 흡광 계수를 측정하였다.
식 5:
% 흡착된 펩타이드 (% 결합 효율) = (W 유입 - W 상층액) x 100
W 유입
실시예 S7: OVApep : 수산화 알루미늄 : D61-01 공동 흡착물의 제조
이 실시예는 다양한 완충액에서 CpG 및 항원의 수산화 알루미늄에의 흡착 방법을 기술한다.
실험 S7-1: 수성 완충액을 사용한 결합
OVApep 및 D61-01의 수산화 알루미늄에 대한 공동 흡착을 두 단계로 이루었다. 제 1 단계에서, 0.1 M Na-중탄산염, pH 8.0에 약 1 mg/ml (w/v)의 농도로 용해된 OVApep (5.4 mg)를 회전식 회전 (100 내지 150 rpm)에 의해 1 ml (알루미늄 기준으로 10 mg)의 수산화 알루미늄 제제 (Na-중탄산염 완충액에 평형화됨)와 2시간 동안 실온에서 혼합하였다. OVApep를 수산화 알루미늄과 소정의 흡착 용량의 대략 50%의 수준으로 혼합함으로써, 수산화 알루미늄 상의 약 50%의 나머지 표면적은 후속 단계에서 D61-01의 흡착에 이용될 수 있었다. 제 2 단계에서, 10 mM NaOAc, 150 mM NaCl, pH 7.0에 약 1 mg/ml의 농도로 용해된 약 3.3 mg의 D61-01을 이미 수산화 알루미늄에 흡착되어 있는 OVApep에 첨가하고 다시 회전식 회전(100 내지 150 rpm)에 의해 2시간 동안 실온에서 혼합하였다. 최종 혼합된 완충액은 대략 50 mM의 Na-중탄산염, 5 mM NaOAc 및 75 mM NaCl로 구성되었다. 과량의 또는 약하게 흡착된 OVApep 및 D61-01을 제거하기 위한 0.1 M Na-중탄산염 및 수산화 알루미늄의 원심분리를 사용한 3 사이클의 세척 후에, 수산화 알루미늄에 흡착된 D61-01 및 OVApep의 최종 양을 각각 실시예 S4 및 실시예 S6 (UV 과정)에서 기술한 것과 같이 측정하였다. 이 실험 (S7-1)에서, OVApep의 결합 효율은 Na-중탄산염에서는 단지 54%였던 한편, 제공된 D61-01은 100%가 결합되었다 (로트 11042015). OVApep : 수산화 알루미늄 : D61-01의 결합 비율은 0.3 : 1 : 0.3 (w/w/w)이었다 (표 S7-1).
실험 S7-2: OVApep : 수산화 알루미늄 : D61-01 공동 흡착물의 제조에서 수성 완충액 또는 아이소프로필 알코올과 수성 완충액의 조합을 사용할 때의 OVApep 결합의 비교
Na-중탄산염 또는 20% IPA/물에 용해된 OVApep의 수산화 알루미늄에 대한 결합을 비교하였다 (표 S7-1). 놀랍게도, 20% IPA/물에 용해된 펩타이드가, 모든 수성 시스템을 사용했을 때보다 더 높은 결합 효율 및 펩타이드의 결합 용량을 나타낸다. 구체적으로, OVApep를 Na-중탄산염 대신 20% 아이소프로필 알코올 (IPA) (로트 1104215-IPA)에 용해시키고 유사하게 처리하였을 때, OVApep의 결합 용량은 54%에서 88%로 증가하였고 (제공된 D61-01은 또한 100% 결합되었음), 이것은 이 조건이 수산화 알루미늄에 대한 펩타이드 흡착에 영향을 주었음을 시사한다. 이 조건의 경우, 관찰된 OVApep : 알루미늄 : D61-01의 결합 비율은 0.7 : 1 : 0.7 (w/w/w)이었다.
표 S7-1: D61-01 및 OVApep의 수산화 알루미늄에의 공동 흡착
Figure pct00025
1 Al(OH)3의 중량은 알루미늄 함량을 기준으로 한다.
2 결합 효율 (%) = {결합된 펩타이드 / 펩타이드 유입} x 100 (실시예 S6 참조)
3 펩타이드 유입은 실시예 S6에서 UV 방법에 의해 정량하였다.
실험 S7-3: 단일 단계로 OVApep 및 D61-01의 수산화 알루미늄에의 결합
OVApep를 20% IPA/물에 용해시키고 수산화 알루미늄 및 D61-01을 둘 다 10 mM NaOAc, 150 mM NaCl, pH 7.0 완충액에 제공하였다. 모든 성분을 표 S7-2에 제시한 비율로 함께 1시간 동안 실온에서 첨가하였다. 성분들을 조합한 후, 결합 용액의 최종 조성은 5 mM NaOAc, 75　mM NaCl, pH 7.0 완충액에 약 10% IPA였다. 이 조건 하에서 펩타이드 결합 효율은 2가지 상이한 펩타이드 유입 수준 (5 및 10 mg)에서의 반응에 대해 이 실험에서 각각 89% 및 98%로 증가하였고, 각각은 10 mg의 수산화 알루미늄 (알루미늄 함량을 기주으로 함)과 반응하였다. 놀랍게도, mg의 수산화 알루미늄당 0.9 mg의 OVApep의 결합은 D61-01의 결합 용량을 유의미하게 감소시키지 않았고, 또한 그것은 실시예 S3, 실험 S3-2에서 D61-01 단독에 대해 관찰된 결합 용량과 유사하게, mg의 수산화 알루미늄당 0.9 mg의 비율로 결합하였다. 펩타이드 및 CpG-ODN이 둘 다 수산화 알루미늄에 고수준으로 결합하는 능력은 그것이 담체로서 최소량의 수산화 알루미늄을 사용하여 펩타이드 및 CpG-ODN의 최대 투약을 하용하기 때문에 유익하다.
표 S7-2: 단일 반응에서 D61-01 및 OVApep의 수산화 알루미늄 위로의 공동 흡착
Figure pct00026
1 Al(OH)3의 중량은 알루미늄 함량을 기준으로 한다.
2 결합 효율 (%) = {결합된 펩타이드 / 펩타이드 유입} x 100, UV 방법에 ㅇ의함thod (see 실시예 S6)
실험 S7-4: 생물학적 연구에서 사용하기 위한 추가적인 OVApep : 수산화 알루미늄 : D61-01 공동 흡착물의 제조
이 2-단계 과정에서 OVApep (2개의 상이한 샘플)를 0.1 M 중탄산 나트륨, pH 8.0 (로트 09292105(3))에 용해시키고 수산화 알루미늄을 중탄산 나트륨, pH 8.0 완충액에 평형화하였다. D61-01을 10 mM NaOAc, 150 mM NaCl, pH　7.0에 용해시켰다. 로트 0331-2015에 대해, 수산화 알루미늄을 아세트산 나트륨에서 평형화하였다. 먼저, 1 내지 2 mg/mL의 OVApep를 수산화 알루미늄 (알루미늄을 기준으로 10 mg)에 첨가하고 2시간 동안 실온에서 회전식으로 혼합하였다. OVApep에 대한 결합 결과는 표 S7-3에서 나타난 것과 같이, 각각 51% 및 56%로 중간이었다. 두 번째로, 2 내지 4 mg/mL의 D61-01을 첨가하고 1시간 동안 실온에서 혼합하였다. 수산화 알루미늄 복합체를 두 개의 로트에 대한 펩타이드 흡착 및 D61-01 흡착의 두 단계 후에 중탄산 나트륨 완충액으로 광범위하게 세척하였다. D61-01 결합 효율은 표　S7-3에서 나타난 것과 같이 로트 0331-2105의 경우 53%였고 로트 09292105(3)에 대해 100%였다.
표 S7-3: OVApep 및 D61-01의 수산화 알루미늄에의 공동 흡착의 요약
Figure pct00027
1 Al(OH)3의 중량은 알루미늄 함량을 기준으로 한다.
2 결합 효율 (%) = 결합된 펩타이드 / 펩타이드 유입 x 100, UV 방법에 의한 것임 (실시예 S6 참조)
실시예 S8: Triple 펩타이드 : 수산화 알루미늄 : D61-01 공동 흡착물의 제조
2-단계 과정을 사용하여 Triple 펩타이드 및 D61-01을 수산화 알루미늄에 흡착시켰다. 먼저, Triple 펩타이드를 20% IPA/물에 1 내지 2 mg/ml로 용해시키고 10% IPA, 5 mM NaOAc, 75 mM NaCl, pH 7.0 완충액에서 수산화 알루미늄에 2시간 동안 20 내지 25℃에서 흡착시켰다. 두 번째로, D61-01을 10　mM NaOAc, 150 mM NaCl, pH 7.0 완충액에 2 내지 4 mg/mL의 농도로 용해시키고 첨가하고 1시간 동안 20 내지 25℃에서 혼합하였다.
Triple 펩타이드 및 D61-01은 표 S8-1에서 나타난 것과 같이, 둘 다 IPA의 존재하에 두가지 상이한 농도에서 수산화 알루미늄에 효율적으로 공동 흡착되었다. 두 리간드에 대한 결합 효율은 높았는데, 즉, 87%보다 컸다. 두 반응 모두 Triple 펩타이드: 수산화 알루미늄 (based on 알루미늄 함량): D61-01 (w/w/w)에 대해 1 : 1 : 1에 가까운 비율을 보였고 과정은 재생 가능한 것으로 증명되었다.
표 S8-1: Triple 펩타이드 및 D61-01의 수산화 알루미늄에의 공동 흡착의 요약
Figure pct00028
1 Al(OH)3의 중량은 알루미늄 함량을 기준으로 한다.
2 결합 효율 (%) = 결합된 펩타이드 / 펩타이드 유입 x 100, UV 방법에 의한 것임 (실시예 S6 참조)
실험 S8-2: 일정한 질량의 D61-04 ODN의 달라지는 질량의 공동 흡착된 NY-ESO-1 OLP 항원 - 수산화 알루미늄 입자들에의 결합, 및 공동 흡착된 OLP 항원의 대체
일정한 질량의 D61-04 폴리뉴클레오타이드가 실험 S5-3으로부터의 다양한 공공 흡착된 NY-ESO-179 - 108 및 NY-ESO-1142 - 173 OLP 항원 - 수산화 알루미늄 입자들에 결합하는 능력을 평가하여 1) D61-04의 결합 및 2) NY-ESO-179 - 108 및 NY-ESO-1142 - 173 OLP 항원 대체의 정도를 측정하였다. 순수한 D61-04 폴리뉴클레오타이드를 10 mM NaOAc, 150 mM NaCl, pH 7.0에 1 mg/mL로 용해시키고 정확한 농도를 실시예 S4에서 기술한 UV 흡광도 방법에 의해 측정하였다. 그런 다음, 1 mg의 D61-04 폴리뉴클레오타이드를 10 mM NaOAc, 150 mM NaCl, pH 7.0에 함유하는 1:1 (v/v) 용액 및 10 mM NaOAc, 150 mM NaCl, pH 7.0에 5개의 상이한 OLP 항원s - 수산화 알루미늄 입자들을 함유한 용액을 회전식 혼합기에서 약 15 rpm에서 약 3시간 동안 20 내지 25℃에서 혼합하였다. 다음에 미결합 D61-04 폴리뉴클레오타이드, 및 대체된 OLP 항원을 공동 흡착된 D61-04 폴리뉴클레오타이드 - OLP 항원 - 수산화 알루미늄 입자들로부터, 실험 S5-3에서 기술한 것과 같이 원심분리에 의하여 분리하였다. 세척/원심분리 과정을 결합에 대해 사용한 것과 동일한 완충액으로 2회 더 반복하였고, 모은 상층액을 미결합 D61-04 폴리뉴클레오타이드에 대해 UV 흡광도 방법에 의해, 및 대체된 OLP 항원에 대해 아미노산 분석에 의해 분석하였다 (실시예 S6 참조). 증가하는 질량의 공동 흡착된 NY-ESO-179 - 108 및 NY-ESO-1142 - 173 OLP 항원 - 수산화 알루미늄 입자들과 D61-04 폴리뉴클레오타이드의 고정된 유입 질량의 % 결합 (표 S5-4) 사이에 선형 관계가 관찰되었다. 대조적으로, NY-ESO-179 - 108 및 NY-ESO-1142 - 173 OLP 항원의 추가의 대체는, 0.6 mg 수산화 알루미늄 입자 조건에서의 약간의 10% 대체를 제외하고는 관찰되지 않았다.
표 S8-2: 10 mM NaOAc, 150 mM NaCl, pH 7.0 완충액에서 항원 - 수산화 알루미늄 입자들에 대한 D61-04의 흡착, 및 입자들로부터의 NY-ESO-1 항원의 대체
Figure pct00029
1 Al(OH)3의 질량은 유입 알루미늄 함량을 기준으로 한다.
2 아미노산 분석에 의한 공동 흡착된 NY-ESO-1 OLP의 수산화 알루미늄 입자들 상에서의 질량
3 UV 분석 방법에 의한 유입 D61-04 폴리뉴클레오타이드의 질량
4 퍼센트 (%) 결합 = {결합된 폴리뉴클레오타이드 / 폴리뉴클레오타이드 유입} x 100, UV 분석 방법에 의한 것임
5 퍼센트 (%) 대체 = (1-{D61-04 결합 후의 결합된 펩타이드 / D61-04 결합 전의 결합된 펩타이드}) x 100, 아미노산 분석 방법에 의한 것임.
실험 S8-3: 일정한 질량의 D61-04의 증가하는 OLP 질량의 공동 흡착된 NY-ESO-1 OLP 항원 - 수산화 알루미늄 입자들에의 결합, 및 공동 흡착된 OLP 항원의 대체
고정된 양의 D61-04 폴리뉴클레오타이드가 실험 S5-5로부터의 다양한 NY-ESO-179 - 108 및 NY-ESO-1142 - 173 OLP - 수산화 알루미늄 입자들에 결합하는 능력을 평가하여 1) D61-04 결합 및 2) NY-ESO-179 - 108 및 NY-ESO-1142 - 173 OLP 대체의 정도를 측정하였다. 순수한 D61-04 폴리뉴클레오타이드를 10 mM NaOAc, 150 mM NaCl, pH 7.0에 용해시키고 정확한 농도를 실시예 S4에서 기술한 UV 흡광도 방법에 의해 측정하였다. 그런 다음, 1:1 (v/v) 비율의 10 mM NaOAc, 150 mM NaCl, pH 7.0에 1 mg의 D61-04 폴리뉴클레오타이드를 함유한 슬러리 및 10 mM NaOAc, 150 mM NaCl, pH 7.0에 6가지 상이한 비율의 수산화 알루미늄 입자들 상의 공동 흡착된 OLP를 함유하는 용액을 회전식 회전기에서 약 15 rpm에서 약 3시간 동안 20 내지 25℃에서 혼합하였다. 다음에, 미결합 D61-04 폴리뉴클레오타이드, 및 대체된 수산화 알루미늄 공동 흡착된 OLP를 상기에서 기술한 것과 같이 원심분리에 의해 분리하였다. 세척/원심분리 과정을 결합에 대해 사용한 것과 동일한 완충액으로 2회 더 반복하였고, 모은 상층액을 미결합 D61-04 폴리뉴클레오타이드에 대해 UV 흡광도 방법에 의해, 및 대체된 OLP 항원에 대해 아미노산 분석에 의해 분석하였다 (실시예 S6 참조). 증가하는 질량의 NY-ESO-179 - 108 및 NY-ESO-1142 - 173 OLP - 수산화 알루미늄 입자들과 증가하는 양의 공동 흡착된 D61-04 질량 (표 S5-3) 사이에 선형 관계가 관찰되었다. 대조적으로, 조합된 NY-ESO-179 - 108 및 NY-ESO-1 142 - 173 OLP의 0.2, 0.25, 0.3, 0.4, 0.5 또는 0.6 mg의 총 OLP (0.1, 0.125, 0.15, 0.2, 0.25 또는 0.3 mg의 각각의 OLP)의 대체는 전혀 관찰되지 않거나 내지는 최소한으로 관찰되었다.
표 S8-3: 10 mM NaOAc, 150 mM NaCl, pH 7.0 완충액에서 수산화 알루미늄 입자들에 대한 D61-04의 공동 흡착, 및 수산화 알루미늄 입자들로부터의 NY-ESO-1 OLP의 대체
Figure pct00030
1 Al(OH)3의 질량은 유입 알루미늄 함량을 기준으로 한다.
2 아미노산 분석에 의한 공동 흡착된 NY-ESO-1 OLP의 수산화 알루미늄 입자들 상에서의 질량
3 UV 분석 방법에 의한 유입 D61-04 폴리뉴클레오타이드의 질량
4 퍼센트 (%) 결합 = {결합된 폴리뉴클레오타이드 / 폴리뉴클레오타이드 유입} x 100, UV 분석 방법에 의한 것임
5 퍼센트 (%) 대체 = (1-{D61-04 결합 후의 결합된 펩타이드 / D61-04 결합 전의 결합된 펩타이드}) x 100, 아미노산 분석 방법에 의한 것임.
실시예 S9: Preparation of CpG-FICOLL-펩타이드 컨쥬게이트
CpG-FICOLL-펩타이드 컨쥬게이트에 대한 제조 계획을 도 1A 내지 1B에 제공한다. 이 실시예에서, 다당 멀티머화제는 GE Healthcare에 의해 시판되는 FICOLL®과 같이 고분자량의, 수크로오스와 에피클로로히드린의 분지된 코폴리머였다. 그러나, 상표없는 버전 또는 바이오시밀러(biosimilar) (브랜드가 없거나 다른 브랜드의)가 또한 사용하기에 적합하다. 다른 CpG-ODN 또는 FICOLL®에의 펩타이드 컨쥬게이트는 동일한 제조 경로에 의해 CpG-ODN 및/또는 펩타이드 서열, 티올 링커를 PN 또는 CC CpG-ODN로, 및/또는 티올을 아민 크로스링커로 교체함으로써 제조될 수 있다.
스테이지 1에서, FICOLL을 여러 단계에서 반응성 말레이미드 기를 포함하도록 변형하여 [말레이미드-PEG6]x-FICOLL을 생성한다. 스테이지 2에서, 예시의 CpG-ODN에서 이황화물, 즉 D61-02 (별칭 (D61-01)-3'-SS)를 티올로 환원하여 D61-03 (별칭 (D61-01)-3'-SH)을 형성한다. 스테이지 3에서, [말레이미드-PEG6]y-FICOLL, D61-03 및 시스테인-변형 펩타이드를 반응시켜서 CpG-FICOLL-펩타이드 (이 경우에 D61-01-FICOLL-펩타이드)를 형성한다. 정제는 각 단계에서 과정 중에 발생한다. 최종 CpG-FICOLL-펩타이드 용액을 멸균 여과하고 특성화한 후에, -60℃ 아래에서 보관한다. CpG-FICOLL-펩타이드 컨쥬게이트에 대해 실시예의 표들에서 제공한 몰 비율 결과들은 평균 몰 비율이다 (몰 기준의 평균 로딩 비율).
도 2는 FICOLL 중간체 카르복시메틸화된 (CM)-FICOLL, 아미노에틸카르바밀메틸화된 [AECM]z-FICOLL, 및 [말레이미드 (Mal)-PEG6]y-FICOLL, 및 최종 생성물 (CpG-ODN-PEG6)x-FICOLL-(PEG6-펩타이드)t의 제조 과정을 개략적으로 보여준다.
A. FICOLL PM400의 조성물.
FICOLL PM400 (FICOLL400)은 나노입자의 현탁액으로서 존재하는 400,000 ± 100,000의 보고된 분자량을 가진 합성의 중성, 고도로-분지된 수크로오스의 폴리머이다. 그것은 에피클로로히드린으로 수크로오스를 코폴리머화함으로써 형성된다. FICOLL PM400을 GE Healthcare (Pittsburgh, PA)로부터 분무 건조된 분말로서 구입하였다.
B. [말레이미드 (Mal)-PEG 6 ] y -FICOLL의 제조.
말레이미드 (Mal)-PEG6]y-FICOLL을 동 2에서 개략적으로 도시된 것과 같이, 그리고 앞서 기술된 것과 같이 제조하였다 (2016년 1월 22일에 출원된 PCT 특허 출원 PCT/US2016/014635 참조).
간단히 설명하면, CM-FICOLL을 Inman의 방법 (J Immunol, 114:704-709, 1975)에 의하여, 단 5 kDa 분자량 컷-오프 (MWCO) 막을 사용하는 투석과 같은 표준 탈염 과정을 사용하는 대신, 100 kDa MWCO 막을 사용한 접선 유동 분획화 (TFF)를 사용하는 정제를 수행한 것을 제외하고, 기본적인 조건하에서 FICOLL PM400 및 클로로아세트산 나트륨으로부터 제조하였다. TFF 정제는 표준 탈염 과정과 유사하게 분자 및 과잉 시약들을 제거하였다.
[AECM]z-FICOLL을 다량의 과잉의 에틸렌다이아민 및 수용성 카르보다이이미드를 사용하여, 100 kDa MWCO 막을 사용한 접선 유동 분획화 (TFF)를 사용하는 정제 단계를 사용하도록 변형한 Inman의 방법 (상기 동일)에 의해 CM-FICOLL로부터 제조하였다.
[말레이미드-PEG6]y-FICOLL을 [AECM]z-FICOLL (100 mM 인산 나트륨 및 150 mM 염화 나트륨, pH 7.5 완충액 중에 20　mg/mL, 아민 대 FICOLL 몰 비율 (z) = 218 내지 224)과 SM-PEG6 (다이메틸설폭사이드 중에 100 mg/mL, 아민당 5 당량)의 40분 동안 실온에서의 반응에 의해 제조하였다. SM-PEG6 (석신이미딜-((N-말레이미도프로피온아미도)-헥스에틸렌글리콜)에스테르)를 Thermo Scientific of Rockford, IL (카탈로그 번호 22105)로부터 얻었다. FICOLL 상의 미반응 아민을 Thermo Scientific으로부터의 설포-N-하이드록시석신이미딜-아세테이트 (Su-NHS-Ac) (다이메틸 설폭사이드 중에 100 mg/mL, 아민당 5 당량)를 사용하여 15분 동안 실온에서 캡핑하였다. 이 캡핑 반응은 FICOLL 상의 미반응 아민을 아세트아미드로 전환시키고, 그것은 결과적으로 생성되는 FICOLL 생성물의 물리화학적 특성에 중요할 수 있다. 미반응 SM-PEG6 및 Su-NHS-Ac를 글리신 (100 mM 인산 나트륨 및 150 mM 염화 나트륨, pH 7.5 완충액 중의 100 mg/mL, 총 SM-PEG6 및 Su-NHS-Ac당 10 당량)으로 15분 동안 실온에서 퀀칭하였다. 미정제 [말레이미드-PEG6]y-FICOLL을 100 kDa MWCO 막으로 TFF에 의하여 컨쥬게이셩 반응과 동일한 날에 정제하였다. 미정제 [말레이미드-PEG6]y-FICOLL을 100 mM 인산 나트륨, 150 mM 염화 나트륨, pH 7.5 완충액을 사용하여 로 희석하였고, 약 5.8 mg/mL로 희석하고, 총 대략 24 내지 29회의 부피 교환동안 투석여과하였다. 각각의 투과물 투석부피의 흡광도를 215 nm에서 측정하고, 투과물의 흡광도가 0.1 AU에 도달하였을 때 투석여과를 중단하였다. 정제한 [말레이미드-PEG6]y-FICOLL을 멸균된 폴리프로필렌 바이알에 부분표본화하여 -80℃에서 보관하였다.
[말레이미드-PEG6]y-FICOLL의 말레이미드 대 FICOLL 몰 비율 (y)을 실시예 S10 및 실시예 S11에서 개략적으로 설명된 과정에 의해 측정하였다. 표 S9-1은 제조된 [말레이미드-PEG6]y-FICOLL 및 그것으로부터 형성된 컨쥬게이트 (섹션 D)의 예시적인 배치를 나타낸다.
표 S9-1: 제조된 [말레이미드-PEG6]y-FICOLL 및 제조된 컨쥬게이트의 예시적인 배치
Figure pct00031
C. D61-03 (별칭 (D61-01)-3'-SH)의 제조.
D61-03을 앞서 기술한 것과 같이 제조하였다 (2016년 1월 22일에 출원된 PCR 특허 출원 PCT/US2016/014635 참조). 간단히 설명하면, D61-02 (별칭 (D61-01)-3'-SS, 활성화 완충액 중에 56 mg/mL)를 TCEP-HCl (Thermo Scientific, Rockford, IL, 활성화 완충액 중에 48 mg/mL, 5 당량)과 약 40℃에서 약 2시간 동안 반응시켰다. 활성화 완충액은 100 mM 인산 나트륨, 150 mM 염화 나트륨, 1　mM 에틸렌다이아민테트라아세트산 (EDTA), pH 7.5이었다. 미정제 D61-03 (별칭 (D61-01)-3'-SH)을 겔 여과에 의하여 제조자의 권장된 과정에 따라 XK50/30 칼럼 (GE Healthcare)에 팩킹된 Sephadex G-25 Fine (GE Healthcare, Pittsburgh, PA)를 사용하고 이동상으로서 100 mM 인산 나트륨, 150 mM 염화 나트륨, 1 mM EDTA, pH 7.5 완충액을 사용하여 정제하였다. 용출액을 215 nm 및 260 nm에서 모니터링하고 정제된 분획을 조합하여 부분표본화하고 -80℃에서 보관하였다.
D. (D61-01)-FICOLL-펩타이드 공동-컨쥬게이트의 제조.
CpG-FICOLL-펩타이드의 전형적인 합성에서, 활성화된 CpG-ODN (예컨대, D61-03, 별칭 (D61-01)-3'-SH)을 첨가하고 Mal-FICOLL과 약 15분 동안 혼합한 후에 펩타이드를 첨가한다. 15분 후에, 고체 구아니딘 염산염 (GuHCl)을 그 혼합물에 첨가하여 약 6 M의 최종 농도를 이룬 다음, 고상 펩타이드를 첨가하였다. GuHCl은 펩타이드를 용해시키기 위하여 필요하고 시스테인 기 (티올)를 통하여 FICOLL 상의 접근 가능한 말레이미드와 공유 결합을 가능하게 한다. 과정의 상세한 예를 다음 문단에서 제공하며 또한 다른 CpG-ODN 및 펩타이드 서열에도 적용할 수 있다.
D61-01-FICOLL-Triple 흑색종 (Triple) 펩타이드 공동-컨쥬게이트, 로트 04142015를 제조하기 위한 예시적인 과정의 상세한 설명. 100 mM 인산 나트륨, 150 mM 염화 나트륨, pH 7.5 완충액 중의 5.4 mg/ml의 FICOLL 농도 (0.00011 mmol FICOLL, FICOLL당 0.017 mmol 말레이미드 또는 155 말레이미드)의 대략 44 밀리그램 (mg), (8.1 ml)의 말레이미드-FICOLL (로트 08252014)을 15 ml의 튜브에 넣고 100 mM 인산 나트륨, 150 mM 염화 나트륨, 1 mM EDTA, pH 7.5 완충액 중의 12.2 mg/ml의 농도의 25.7 mg (2.1 ml, FICOLL당 30 당량)의 3' 티올 D61-01 (로트 02262014)과 반응시켰다. 이 반응 (약 10.3 ml)을 15분 동안 25℃ 인큐베이터에서 진행시켰다. 다음에, 대략 5.9 그램의 고체 GuHCl을 용액에 첨가하여 대략 6 M의 최종 GuHCl 농도를 이루었다. 이 용액을 용액에 GuHCl이 있을 때까지 약 1분 동안 와류 혼합한 후, 28 mg (FICOLL당 40 당량)의 고체 Triple 펩타이드 (로트 P2345-1 from Bio-Synthesis)를 즉시 첨가하고 용해될 때까지 와류혼합하였다. 그 혼합물을 45 내지 60분 동안 25℃에서 반응되도록 놓아두었다. 반응 후에, 잠재적인 미반응 말레이미드를 시스테인 (Thermo; 카탈로그 번호44889)으로 캡핑하였다. 간단히 설명하면, 시스테인의 약 0.21 ml의 100 mg/ml 스톡 용액 (21 mg, 0.17 mmol, 말레이미드당 10 당량)을 첨가하고 실온 (25℃)에서 25분 동안 유지시켰다. 최종 미정제 공동-컨쥬게이트 (약 14.5 ml) 조성물은 대략 2.8 mg/ml의 FICOLL, 1.6 mg/ml의 3'티올 D61-01, 1.8 mg/ml의 Triple 펩타이드 및 1.3 mg/ml의 시스테인을 함유하였고, 정제 전에 밤새 2 내지 8℃에서 보관하였다. 그 결과의 공동-컨쥬게이트를 약 120 ml의 베드 부피를 가진 HiLoad 16/600 mm Superdex 200 예비 등급 칼럼 (GE Healthcare)을 사용하여 크기-축출 크로마토그래피에 의하여 정제하였다. 칼럼을 평형화하고 10 mM 인산 나트륨, 142 mM NaCl, pH7.2에서 1 ml/분의 유량으로 실온에서 등용매적으로 작동시켰다. 정제를 Akta Purifier (GE Healthcare) 크로마토그래피 시스템을 사용하여 조절하였다. 대략 14 ml의 미정제 샘플을 칼럼에 적용하였고 총 작동 시간은 150분이었다. 정제를 215, 260 및 280 nm의 흡광도에서의 UV 검출에 의해 모니터링하였고, 정제된 D61-01-FICOLL-Triple 펩타이드 공동-컨쥬게이트 (로트 04142015)를 약 18 ml의 부피로 분리하고 계속해서 특성화하였다 (표 S9-2). D61-01-FICOLL 컨쥬게이트를 GuHCl 및 펩타이드 용액 을 첨가하지 않을 것을 제외하고 상기에서 기술한 것과 같이 제조하였다.
표 S9-2: 로트 번호에 의한 D61-01-FICOLL 컨쥬게이트 및 V61-01-FICOLL-펩타이드 공동-컨쥬게이트의 특성화
Figure pct00032
1 Ova는 오브알부민 단백질을 나타낸다
2 실시예 S14의 과정에 의해 측정된 SEC-HPLC에 의한 순도
3 실시예 S10의 과정에 의해 측정된 Ficoll 함량
4 실시예 S6의 과정 (AAA)에 의해 측정된 펩타이드 함량
5 실시예 S4의 과정에 의해 측정된 D61-01 함량
추가적인 공동-컨쥬게이트를 상기 기술된 것과 유사한 방식으로 제조하였고, 그것의 결과를 표 S9-3 및 표 S9-4에 제공한다.
표 S9-3: D61-01-FICOLL-Triple 공동-컨쥬게이트의 특성화
Figure pct00033
표 9-4: D61-01-FICOLL-OVApep 공동-컨쥬게이트의 특성화
Figure pct00034
실시예 S10: FICOLL-함유 중간체 및 생성물에서 FICOLL 농도를 측정하기 위한 과정
FICOLL-함유 중간체 및 제품의 FICOLL 농도를 Pierce 당단백질 Carbohydrate Estimation Kit (Product No. 23260, Thermo Scientific, Rockford, IL)를 제조자의 프로토콜을 사용하여 측정하였고, 단 FICOLL PM400을 검정을 위한 표준 곡선을 생성하는 데 사용하였다.
실시예 S11: [말레이미드] y -FICOLL 용액에서 말레이미드 농도 및 말레이미드:FICOLL 몰 비율 (y)을 측정하기 위한 과정
[말레이미드-PEG6]y-FICOLL의 말레이미드 농도를 Ellman 시약 (5,5'-다이티오-비스-(2-니트로벤조산), 제품 번호 22582, Thermo Scientific, Rockford, IL)을 사용하여 측정하였다. [말레이미드-PEG6]y-FICOLL을 제조자의 프로토콜대로 과잉량의 시스테인과 반응시키고, 남아 있는 시스테인을 시스테인 표준 곡선을 사용하여 정량하였다. 말레이미드 농도를 초기 시스테인 농도로부터 남아있는 시스테인 농도를 뺌으로써 측정하였다. 말레이미드:FICOLL 몰 비율 (y)을 말레이미드 농도를 FICOLL 농도로 나눔으로써 계산하였고, 이때 FICOLL 농도를 실시예 S4에서 기술한 것과 같이 측정하였고, 농도는 몰 단위였다.
실시예 S12: 컨쥬게이트에서 CpG 농도 및 CpG:FICOLL 몰 비율 (x)을 측정하기 위한 과정
(D61-01)-FICOLL-펩타이드의 D61-01 농도를 자외선 분광광도계 및 베에르 버 법칙 바정식을 사용하여 측정하였다. 이 스테이지에서는 비록 링커, D61-03을 가진 키메릭 화합물을 이 화합물을 형성하기 위해 사용하였지만, 관례상, FICOLL에 부착된 화합물을 서열 명칭, D61-01로 언급한다. 260 nm에서의 흡광도를 측정하였고 D61-01의 경우 22.65 mg/ml-1 x cm-1의 흡광 계수를 사용하였다. FICOLL, 링커 및 펩타이드는 260 nm에서 흡착하지 않았고, 그러므로 흡광도는 CpG-ODN, D61-01의 흡광도에만 의한 것이다. mg/mL의 F61-01 농도를 D61-01에 대한 유리 산의 분자량을 사용하여 몰 비율로 전환하였다. CpG:FICOLL 몰 비율 (x)을 CpG-ODN 농도를 FICOLL 농도로 나눔으로써 측정하였고, 이때 FICOLL 농도를 실시예 S10에서 기술한 것과 같이 측정하였고, 농도는 몰 단위였다. 다른 CpG-FICOLL 용액에 대한 농도를 흡광 계수 및 필요에 따라 사용한 CpG-ODN에 대한 유리 산 분자량을 사용하여 측정하였다.
실시예 S13: 입자 크기를 측정하기 위한 과정.
FICOLL 샘플 (예컨대, CpG-FICOLL-펩타이드)의 입자 크기 (Z-평균) 및 표준 편차 (SD)를 동적 광 산란 (DLS)에 의해 Malvern Zetasizer 기구를 사용하여 측정하였다. 샘플을 10 mM 인산 나트륨, 142 mM 염화 나트륨, pH 7.2 완충액에 0.5 mg/mL의 FICOLL 농도로 희석하고, 규정된 기구 설정 하에 측정하였다. 보정된 50 nm 폴리스티렌 나노스피어 샘플 (제품 번호 3050A, Thermo Scientific, Rockford, IL)을 시스템 적합성 대조군으로서 분석에 포함시켰고, 그것은 49 ± 6 nm의 입자 크기를 가졌다.
실시예 S14: SEC-HPLC에 의해 순도를 측정하기 위한 과정
HPLC에 의해 백분율 순도 (면적에 의한)를 측정하기 위한 HPLC 파라미터들을 표 S14-1에 제시한다.
표 S14-1: 순도 측정을 위한 SEC-HPLC 방법
Figure pct00035
실시예 S15: HPV16 펩타이드 및 D61-01의 수산화 알루미늄에의 결합
HPV16 펩타이드 (SEQ ID NO: 19)를 20% IPA/물 (약 1 내지 2 mg/ml)에 용해시키고 2시간 동안 수산화 알루미늄 (10 mM NaOAc, 150 mL NaCl, pH 7.0에 평형화됨)과 반응시켰다. 성분들을 조합한 후, 결합 용액의 최종 조성은 5 mM NaOAc, 75 mM NaCl, pH 7.0 중의 약 10% IPA였다. 펩타이드를 수산화 알루미늄 복합체에 흡착시킨 후, 복합체를 10 mM NaOAc, 150 mM NaCl, pH 7.0으로 2회 세척하여 흡착되지 않은 펩타이드를 제거하고, 수분 겔을 밤새 2 내지 8℃에서 유지시켰다. 다음날, 또한 10 mM NaOAc, 150 mL NaCl에 용해시킨 D61-01 (약 1 내지 2 mg/mL)을 이미 수산화 알루미늄에 결합되어 있는 HPV16 펩타이드에 첨가하고, 1시간 동안 회전식 혼합 (100 내지 150 rpm)에 의해 반응시킨 후, 다시 10 mM NaOAc, 150 mL NaCl, pH 7.0으로 2회 세척하였다. 각 반응에 사용한 의 양에 대한 상세한 설명은 결합 효율과 함께 표 S15-1에 제시한다. 이런 조건 하에서, 펩타이드 결합 효율은 높았고, 2개의 결합 반응에 대해 90% 및 83%였다. D61-01 결합 효율은 2개의 반응에 대해 74% 및 80%였다.
표 S15-1: 수산화 알루미늄 위로의 D61-01 및 HPV16 펩타이드의 공동 흡착
Figure pct00036
1 알루미늄 함량을 기준으로 한 Al(OH)3의 중량
2 결합 효율 (%) = {결합된 펩타이드 / 펩타이드 유입} x 100 (실시예 S6, UV에 의함)
실시예 S16: AH1 CII 펩타이드 및 D61-01의 수산화 알루미늄에의 결합
AH1 CII 펩타이드 (SEQ ID NO:26) 및 D61-01의 수산화 알루미늄에의 결합 용량을 표 S16-1에 나타낸 것과 같이, 수산화 알루미늄의 양을 변화시키는 한편 제공된 AH1 CII 펩타이드 및 D61-01의 양은 일정하게 유지함으로써 평가하였다. AH1 CII 펩타이드를 20% IPA/물 (1 내지 2 mg/ml)에 용해시키고 2시간 동안 수산화 알루미늄 (10 mM NaOAc, 150 mL NaCl, pH 7.0에 평형화됨)과 반응시켰다. 성분들을 조합한 후, 결합 용액의 최종 조성은 5 mM NaOAc, 75 mM NaCl, pH 7.0 중의 약 10% IPA였다. 펩타이드를 수산화 알루미늄 복합체에 흡착시킨 후, 복합체를 10 mM NaOAc, 150 mM NaCl, pH 7.0으로 2회 세척하여 흡착되지 않은 펩타이드를 제거하였고, 2 내지 8℃에서 밤새 유지시켰다. 다음날, D61-01을 또한 10 mM NaOAc에 용해시키고, 150 mL NaCl (1 내지 2 mg/mL)을 수산화 알루미늄에 이미 결합되어 있는 AH1CII 펩타이드에 첨가하고, 1시간 동안 회전식 혼합 (100 내지 150 rpm)에 의해 반응시키고, 다시 10 mM NaOAc, 150 mL NaCl, pH 7.0으로 2회 세척하였다. 이 조건 하에서 AH1 CII 펩타이드 결합 효율은 높았고, 84% 내지 89% 범위였으며, D61-01 결합은, 표 S16-1에서 나타난 것과 같이, 5가지 조건 중 4개에서 100%였고, 나머지 조건 (2.5 mg의 알루미늄)에 대해서는 86%였다. 이 데이터들은 광범위한 리간드 결합 분포 (펩타이드 : 수산화 알루미늄 : D61-01 비율)가 쉽게 이루어질 수 있음을 보여준다.
표 S16-1: 수산화 알루미늄 위로의 D61-01 및 AH1 CII 펩타이드의 공동 흡착
Figure pct00037
1 Al(OH)3의 중량은 알루미늄 함량을 기준으로 한다
2 결합 효율 (%) = {결합된 펩타이드 / 펩타이드 유입} x 100 (실시예 S6, UV에 의함)
실시예 B1: 면역원성 조성물의 종양내 대비 종양외 투여의 종양 크기에 미치는 영향
이 실시예는 다당 멀티머화제 단독과 회합된 또는 추가로 종양 항원 (Ag)과 회합되어 있는 TLR9 작용물질 (CpG)을 포함하는 입자들을 포함하는 면역원성 조성물의 투여에 의한 종양 성장의 제어를 기술한다. 이 실시예에서, 다당 멀티머화제는 GE Healthcare에 의해 시판되는 FICOLL®로서 시판되는 수크로오스와 에피클로로히드린의 고분자량, 분지된 코폴리머였다. 그러나, 상표없는 버전 또는 바이오시밀러 (브랜드가 없거나 다른 브랜드의) 또한 사용하기에 적합하고 따라서 이 모이어티는 본원에서 간단히 Fic로 언급한다.
종양 모델. 면역원성 조성물을 3개의 상이한 쥐과의 종양 모델에서 테스트하였다. 3개의 모델은 모두 6 내지 8주령의 암컷 C57BL/6 마우스를 사용하였고, 그것들은 Harlan Laboratories (현재 Envigo)로부터 구입하였다.
EG7-OVA 림프종 모델. EG7-OVA 세포주를 ATCC® (American Type Culture Collection, Manassas, VA)로부터 얻었다. EG7-OVA (카탈로그 번호 CRL-2113TM)는 쥐과 림프종 세포주 EL4의 유도체이고, 그것을 모델 항원, 닭의 오브알부민 (OVA)을 발현하도록 변형시켰다 (Moore et al., Cell, 54:777-785, 1988 참조). 약 1 x 106개의 EG7-OVA 세포를 마우스의 옆구리에 100 μl PBS로 피하로 (SC) 주사하여 종양 형성이 시작되게 하였다. 일단 종양이 10 내지 20 mm3의 크기에 도달하면, D61-01-Fic (보조제 단독) 또는 D61-01-Fic-Ag (백신) 나노입자를 투여하였다.
B16-F10 및 B16-OVA 흑색종 모델. B16-F10 세포주를 ATCC® (American Type Culture Collection, Manassas, VA)로부터 얻었다. B16-F10 (카탈로그 번호 CRL-6475TM)은 쥐과의 흑색종 세포주이다 (Fidler, Cancer Res, 35:218-224, 1975). B16-OVA 세포주는 B16-F10의 유도체로, 그것은 OVA를 발현하도록 변형되었다. B16-OVA 및 B16-F10에 대해, 약 1 x 105개의 세포를 마우스의 옆구리에 100 μl PBS로 SC 주사하여 종양 형성이 시작되게 하였다. 일단 종양이 직경이 4 내지 7 mm의 크기에 도달하면, D61-01-Fic (보조제 단독) 또는 Ag (백신) 나노입자에 공유 결합된 D61-01-Fic를 투여하였다.
면역원성 조성물 및 치료 양생법. 3개의 상이한 유형의 D61-01-Fic-Ag (백신) 나노입자를 테스트하였다. D61-01은 5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:5)와 같이, 3개의 핵산 모이어티 및 2개의 비-핵산 모이어티를 가지는 선형 키메릭 화합물이다. D61-01-Fic-OVA 입자들을 오브알부민 단백질을 포함한다. D61-01-Fic-OVApep 입자들은 오브알부민 폴리펩타이드: CSGLEQLESIINFEKLTEWTSSNVMEERKIKV (SEQ ID NO:11)을 포함한다. D61-01-Fic-Triple 입자들은 3개의 부류 I 한정 흑색종 에피토프 (Trp1, Trp2 및 gp100) 및 인공 PAn 부류 II DR 한정 에피토프 (PADRE)를 융합 폴리펩타이드: VGALEGPRNQDWLAKXVAAWTLKAAATAYRYHLLSSVYDFFVWLSC (여기서 X는 L-사이클로헥실알라닌임) (SEQ ID NO:14)로서 포함한다. 면역원성 조성물을 종양내 주사에 의해 (IT) 또는 종양외 주사에 의해 투여하였고, 종양외 주사는 이 실시예에서 피하 (SC) 주사를 포함하였다. D61-01-Fic-OVA 입자들을 150 μl의 부피에 50　μg의 D61-01 및 39　μg의 OVA를 함유하는 용량으로서 전달하였다. D61-01-Fic-OVApep 입자들을 150 μl의 부피에 50　μg의 D61-01 및 56　μg의 OVApep를 함유하는 용량으로서 전달하였다. D61-01-Fic-Triple 입자들을 150 μl의 부피에 55　μg의 D61-01 및 50　μg의 Triple을 함유하는 용량으로서 전달하였다. D61-01-Fic 입자들을 150 μl의 부피에 50　μg의 D61-01을 함유하는 용량으로서 전달하였다.
종양 성장의 측정. 종양 크기를 3차원 (길이; L, 폭; W 및 깊이; D)의 마이크로캘리퍼 측정에 의해 측정하고 부피를 다음 식 : (L x W x D / 2)을 사용하여 계산하였다.
결과. 도 3A 내지 D의 결과는 종양내 경로에 의한 면역원성 조성물의 투여가 종양으로부터 떨어져 있는 부위에 피하 주사를 통한 종양외 투여와 비교하였을 때 월등한 항-종양 반응을 유도하였음을 증명한다. 추가적으로, D61-01-Fic 입자들에 공유 부착된 종양 항원을 포함하는 면역원성 조성물의 종양내 투여는 종양 항원의 부재시에 (보조제 단독) D61-01-Fic 입자들의 종양내 투여와 비교하여 월등한 항-종양 반응을 유도하였다. 종양내 백신접종의 효능은 성장 억제가 기원 조직이 상이한 (EG7 림프종 및 B16 흑색종) 종양 모델에서 관찰된 것과 같이 종양 유형에 의해 영향을 받지 않았다. 실제로, B16 흑색종은 빈약한 면역원성 종양인 것으로 널리 알려져 있고 (Celik et al., Cancer Res, 43:3507-3510, 1983; Ashman, Immunol Cell Biol, 65:271-77, 1987; 및 Dezfouli et al., Immunol Cell Biol, 81:459-71, 2003), 그로 인해 치료 결과를 평가하기 위한 이상적인 모델리 된다. 요약하면, 예시의 D61-01-Fic 플랫폼에 의해 증명되는 것과 같이, 고분자량 다당 (10 내지 1000 kDa)은 상이한 물리화학적 특성을 가진 전체 단백질 항원 (D61-01-Fic-OVA) 또는 폴리펩타이드 항원 (D61-01-Fic-OVApep 또는 D61-01-Fic-Triple)을 대상체에게 효과적으로 전달하기 위해 사용될 수 있다.
실시예 B2: 동일하거나 상이한 입자들에 컨쥬게이트된 CpG 및 종양 항원을 포함하는 면역원성 조성물의 종양내 투여의 종양 크기에 미치는 영향
이 실시예는 동일하거나 상이한 다당 분자에 공유 결합된 TLR9 작용물질 (CpG) 및 종양 항원 (Ag)을 포함하는 면역원성 조성물에 의한 종양 성장의 조절을 기술한다. 이 실시예에서, 다당 멀티머화제는 GE Healthcare에 의해 시판되는 FICOLL®로서 시판되는 수크로오스와 에피클로로히드린의 고분자량, 분지된 코폴리머였다. 그러나, 상표없는 버전 또는 바이오시밀러 (브랜드가 없거나 다른 브랜드의) 또한 사용하기에 적합하고 따라서 이 모이어티는 본원에서 간단히 Fic로 언급한다.
종양 모델. 면역원성 조성물을 실시예 B1에서 기술한 EG7-OVA 림프종 모델에서 테스트하였다.
면역원성 조성물 및 치료 양생법. D61-01-Fic-OVApep 및 D61-01-Fic 입자들은 5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:5)와 같이 3개의 핵산 모이어티와 2개의 비-핵산 모이어티를 가지는 선형 키메릭 화합물을 포함한다. D61-01-Fic-OVApep 입자들 및 Fic-OVApep 입자들은 오브알부민 폴리펩타이드: CSGLEQLESIINFEKLTEWTSSNVMEERKIKV (SEQ ID NO:11)을 포함한다. D61-01-Fic-OVApep 입자들 또는 D61-01-Fic와 Fic-OVApep 입자들의 조합을 150 μl의 부피에 50 μg의 D61-01 및 39 μg의 OVApep를 함유하는 용량으로서 종양내 (IT) 주사로 전달하였다.
종양 성장의 측정. 종양 크기를 3차원 (길이; L, 폭; W 및 깊이; D)의 마이크로캘리퍼 측정에 의해 측정하고 부피를 다음 식 : (L x W x D / 2)을 사용하여 계산하였다.
결과. 도 4는 최대 치료 효능은 CpG 및 종양 항원이 동일한 입자에 공유 결합될 것을 필요로 하는 것을 증명한다. 구체적으로, 동일한 Fic 나노입자에 공유 부착된 D61-01 및 OVApep의 종양내 투여는 D61-01 및 OVApep가 상이한 Fic 나노입자에 컨쥬게이트된 면역원성 조성물의 투여와 비교할때 종양 성장의 68%의 감소를 초래하였다 (568 vs 181 mm3; p = 0.04). 통계학적 유의미성을 쌍을 이루지 않은 학생 t-테스트 및 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 계산하고, 이때 0.05보다 작은 p 값을 유의미한 것으로 간주하였다.
실시예 B3: 국소 종양 항원-특이적 면역 반응에 미치는 면역원성 조성물의 종양내 투여의 영향
이 실시예는 다당 멀티머화제 단독과 회합된 또는 추가로 종양 항원 (Ag)과 회합되어 있는 TLR9 작용물질 (CpG)을 포함하는 입자들을 포함하는 면역원성 조성물의 투여에 의한 종양 항원-특이적 세포 T 세포 반응의 유도를 기술한다. 이 실시예에서, 다당 멀티머화제는 GE Healthcare에 의해 시판되는 FICOLL®로서 시판되는 수크로오스와 에피클로로히드린의 고분자량, 분지된 코폴리머였다. 그러나, 상표없는 버전 또는 바이오시밀러 (브랜드가 없거나 다른 브랜드의) 또한 사용하기에 적합하고 따라서 이 모이어티는 본원에서 간단히 Fic로 언급한다.
종양 모델. 면역원성 조성물을 실시예 B1에서 기술한 EG7-OVA 림프종 및 B16-OVA 흑색종 모델에서 테스트하였다.
면역원성 조성물 및 치료 양생법. D61-01은 5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:5)와 같이 3개의 핵산 모이어티와 2개의 비-핵산 모이어티를 가지는 선형 키메릭 화합물이다. D61-01-Fic-OVApep 입자들은 오브알부민 폴리펩타이드: CSGLEQLESIINFEKLTEWTSSNVMEERKIKV (SEQ ID NO:11)을 포함한다. D61-01-Fic-Triple 입자들은 융합 폴리펩타이드: VGALEGPRNQDWLAKXVAAWTLKAAATAYRYHLLSSVYDFFVWLSC (X는 L-사이클로헥실알라닌임)(SEQ ID NO:14)로서 3개의 에피토프를 포함한다. 면역원성 조성물을 종양내 주사에 의해 (IT) 또는 종양외 주사에 의해 투여하였고, 종양외 주사는 이 실시예에서 피하 (SC) 주사를 포함하였다. D61-01-Fic-OVApep 입자들을 150 μl의 부피에 50　μg의 D61-01 및 56　μg의 OVApep를 함유하는 용량으로서 전달하였다. D61-01-Fic-Triple 입자들을 150 μl의 부피에 55　μg의 D61-01 및 50　μg의 Triple을 함유하는 용량으로서 전달하였다. D61-01-Fic 입자들을 150 μl의 부피에 50　μg의 D61-01을 함유하는 용량으로서 전달하였다. 수립된 EG7 종양 또는 B16-OVA 종양을 가진 마우스들을 제 0, 7 및 10일에 주사하였다.
침윤 백혈구의 추출을 위한 종양 프로세싱. 마지막 주사 후 3일 후에, 종양을 수집하였다. 종양을 메스날을 사용하여 작은 조각으로 절단하고 5% 소태아 혈청 (FCS)이 포함된 10 ml의 RPMI-1640 세포 배양 배지를 함유하고 있는 gentleMACSTM 튜브 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA)에 옮겼다. 50 mg/mL 콜라게나제　4 (Clostridium histolyticum으로부터의 Sigma-Aldrich C5138-100MG 콜라게나제) 및 2 mg/mL의 DNase　I (소의 췌장으로부터의 Sigma-Aldrich DN25-100MG 데옥시리보뉴클레아제 I)을 함유한 100 마이크로리터의 100X 종양 소화 효소 혼합물을 종양 단편을 함유하고 있는 gentleMACSTM 튜브 (Miltenyi Biotec)에 첨가하였다. 종양을 37℃ 가열 부착기구가 달린 gentleMACSTM Octo 분리기 (Miltenyi Biotec) 상에서 m_LDK_1 프로그램을 사용하여 단일 세포 현탁액으로 분리하였다. 샘플을 70 μm 필터를 통하여 여과하였다. 샘플을 1400 rpm에서 7분 동안 실온에서 원심분리하고 종양의 크기에 따라 RPMI 중의 5% FCS의 1 내지 5 부피에 재현탁하였다.
종양 침윤 백혈구의 분리 (TIL). LYMPHOLYTE® 포유류 세포 현탁액 배지 (CEDARLANE® Corporation, Burlington, NC)를 사용하여 종양 세포로부터 종양 침윤 백혈구 (TIL)를 분리하였다. 종양으로부터 얻어진 세포 현탁액을 5% FCS / RPMI의 첨가에 의해 7, 14 또는 21 mL의 총 부피로 만들었다. 이것을 펠릿의 크기 및 TIL과 종양 세포의 적당한 분리를 확실하게 하기 위해 세포 현탁액을 다중 튜브에 나누기 위한 필요조건에 의해 측정하였다. 15 mL의 원뿔형 튜브를 먼저 7 mL의 LYMPHOLYTE®-포유류 세포 분리 배지 (카탈로그 번호 CL5120)로 채우고, 이어서 그 위에 조심스럽게 7 mL의 세포 현탁액으로 층을 이루었다. 세포를 800 x g에서 20분 동안 실온 (RT)에서 제동(braking) 없이 원심분리하였다. 분리 배지와 세포 배양 배지 사이의 계면에서 형성되는 층을 50 mL 튜브에 옮기고, 그 튜브를 5% FCS / RPMI 배지로 총 부피가 50 mL이 되도록 채웠다. 세포를 1800 rpm에서 7분 동안 실온에서, 최대 가속 및 최대 제동 하에 펠릿화하였다. 배지를 흡인제거하고 TIL-함유 펠릿을 RPMI 배지 중의 1 mL의 5% FACS에 재현탁하였다.
골수-유도된 수지상 세포 (BMDC)의 생성. 골수를 수득하고 3마리의 C57BL/6 마우스의 대퇴골로부터 정제 완충액 (0.5 % BSA, 2 mM EDTA / PBS)으로의 플러싱에 의해 모았다. 적혈구를 5 mL의 적색 세포 용해 완충액 (Sigma 카탈로그 번호 R7757)으로 5분 동안 실온에서 용해시키고 반응을 10 mL의 정제 완충액의 첨가에 의해 중화시켰다. 샘플을 5분 동안 1500 rpm에서 원심분리하고 20 ng / mL의 GM-CSF (Peprotech 카탈로그 번호 315-03) 및 10 ng / mL의 IL4 (Peprotech 카탈로그 번호 214-14)가 보충되어 있는 선구세포 배지 μ(RPMI, 10% FCS, 50 U / mL 페니실린, 50 μg / mL 스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민, 10 mM HEPES, 1 mM 피루브산 나트륨 및 55 μM 2-β-메르캅토에탄올)에 1 x 106 세포 / mL의 최종 농도로 재현탁하였다. 비-조직 배양된 처리된 페트리 디쉬 (BD Falcon 카탈로그 번호 351029)당 10 mL의 세포 현탁액을 첨가하고 플레이트를 5% CO2 및 37℃에서 인큐베이션하였다. 배양 3일째에, 사이토카인을 각각의 디쉬에, 5 mL의 배지를 제거하고 40 ng / mL의 GM-CSF 및 20 ng / mL의 IL4를 함유한 5 mL의 신선한 선구세포 배지를 첨가함으로써 보충하였다. 배양을 추가로 사용 전 3일 동안 인큐베이션하였다.
BMDC의 펩타이드-펄싱. CD11c+ 수지상 세포 (DCs)를 골수 수지상 세포 (BMDC) 배양으로부터 pan-DC 마이크로비드 (Miltenyi Biotec, 카탈로그 번호 130-100-875)와 함께 인큐베이션함으로써 풍부하게 하고 제조자의 지시에 따라 자기 분리하였다. 일단 분리되면, BMDC를 선구세포 배지에서 10 x 106 세포 / mL의 농도로 재현탁하였다. 10 μg/mL 최종 농도의 OVA 부류 I 한정 펩타이드 (SIINFEKL, SEQ ID NO:12로서 표시됨)를 첨가하고 세포를 5% CO2 37℃ 인큐베이터에 30분 동안 놓아두었다. 펩타이드-펄스된 DC를 10 mL의 선구세포 배지로 2회 세척하고 후속 검정을 위해 1 mL의 선구세포 배지에 재현탁하였다.
종양 침윤 백혈구의 펩타이드-펄스된 수지상 세포로의 시험관내 자극. LYMPHOLYTE® 포유류 세포 분리 배지 (CEDARLANE® Corporation, Burlington, NC)를 사용하여 분리한 대략 250,000개의 TIL을 96-웰 U-형 바닥 플레이트 (Corning Costar 카탈로그 번호 3799)의 각 웰에 첨가하고 1600 rpm에서 5분 동안 실온에서 원심분리하였다. 펩타이드-펄스된 DC를 3 μg/mL의 브레펠딘 A (BFA)를 400,000개 세포 / mL의 농도로 함유한 선구세포 배지에 재현탁하였다. 그런 다음, 200 μL의 DC 세포 현탁액을 펠릿화된 TIL을 함유한 각 웰에 첨가하고 세포를 위아래로 피펫팅함으로써 의해 재현탁하였다. TIL-DC 공동 배양을 1600 rpm에서 1분 동안 원심분리하여 세포 대 세포 접촉이 발생하는 것을 확실하게 하였고, 4시간 동안 5% CO2 37℃에서 인큐베이션하였다. 샘플을 사이토카인 생성에 대해 세포내 염색 및 유동 세포분석에 의하여 석하였다.
유동 세포분석을 위한 세포내 및 세포 표면 염색. 모든 시약을 4℃에서 유지하였고 모든 세척을 200 μL의 FACS 완충액 (PBS, 10% FCS, 0.1% 아지드화 나트륨)을 첨가하고, 이어서 플레이팅된 세포 현탁액을 아래 위로 피펫팅하고, 1600 rpm에서 5분 동안 4℃에서 원심분리함으로써 수행하였다. 4시간 동안 인큐베이션한 후에, TIL-DC 공동 배양을 펠릿화하고 5 μL의 H-2Kb / SIINFEKL-APC (Immudex 카탈로그 번호 JD2163) 또는 H-2Kb / TAYRYHLL-APC (Immudex 카탈로그 번호 JD4138) 덱스트라머를 함유한 45 μL의 염색 완충액에 재현탁하였다. SIINFEKL은 OVA 부류 I 펩타이드 (SEQ ID NO:12)이고 TAYRYHLL은 Trp1 부류 I 펩타이드 (SEQ ID NO:15)이다. 염색 완충액은 BD Horizon BRILLIANTTM 바이올렛 염색 완충액 (Becton, Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ)과 2 μL/100 μL의 Fc 블록이 보충된 FACS 완충액의 1:1 혼합물이었다. 샘플을 10분 동안 4℃에서 인큐베이션한 후 세포 표면 마커에 대한 항체들을 함유한 50 μL의 염색 완충액을 첨가하였다. 샘플을 추가로 20분 동안 4℃에서 인큐베이션하고, 3회 세척하고 200 μL의 고정 완충액 (0.5% 파라포름알데하이드를 함유한 FACS 완충액)에 재현탁하였다. 샘플을 밤새 4℃에서 밤새 고정시키고 빛을 차단하였다.
세포내 사이토카인 염색을 위해서, 4℃에서 밤새 보관했던 샘플을 BD PHARMINGENTM 전사 인자 완충액 세트 (카탈로그 번호 562725)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 사용하여 고정하고 투과성이 되도록 하였다. 간단히 설명하면, 세포를 펠릿화하고 100 μL의 1X Fix / Perm 완충액에 재현탁하고 40분 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 샘플을 200 μL의 1X Perm / 세척 완충액으로 2회 세척하고 2.5 μL의 항-마우스 IFN-γ-PE (BD Biosciences 카탈로그 번호 554412), 및 1.5 μL의 항-마우스 TNF-α-APC-Cy7 (BD Biosciences 카탈로그 번호 560658)을 함유한 100 μL의 1X Perm / 세척 완충액에 재현탁하였다. 4℃에서의 추가적인 40분 인큐베이션에 이어서, 샘플을 200 μL의 1X Perm / 세척 완충액으로 2회 세척하고 분석을 위해 300 μL의 FACS 완충액에 재현탁하였다. 데이터를 BD Biosciences (San Jose, CA)로부터의 LSRII 유동 세포분석기를 사용하여 즉시 획득하였다.
ELISA에 의한 IFN-γ 측정을 위한 림프절 처리. 마지막 주사 후 3일 후에 종양 누출 림프절을 수집하였다. 단일-세포 현탁액을 70 μM 필터를 통한 5 mL의 5% FCS / RPMI에서의 림프절의 통과 및 3 mL 주사기 플런저를 사용한 균질화에 의해 생성하였다. 필터에 남아 있는 임의의 조직을 수득하고 균질화된 림프절을 함유한 튜브에 첨가하였다. 조직 분해 효소를 첨가하고 샘플을 37℃에서 20분 동안 때때로 튜브를 도치(inversion)시킴으로써 혼합하면서 인큐베이션하였다. 반응을 10 mL의 5% FCS / RPMI의 첨가에 의해 중화시켰다. 샘플을 원심분리하고 후속 검정을 위해 2 mL의 선구세포 배지에 재현탁하였다.
약 500,000개의 림프절 세포를 100 μL의 선구세포 배지 중의 96-웰 U-자형 바닥 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 2X 농도의 펩타이드의 연속적인 희석액을 만들었고 100 μL를 각 웰에 첨가하였다. IFN-γ를 조직 배양 상층액에서 상업적으로 이용 가능한 ELISA 키트 (R & D Systems 카탈로그 번호 DY485)를 사용하여 제조자의 설명서를 따라 측정하였다. 만약 샘플의 광학 밀도가 표준 곡선의 선형 범위 내에 떨어지게 되면 검정을 타당한 것으로 간주하였다. 값을 배경 농도 수준을 뺌으로써 계산하였고, 배경 농도 수준은 자발적인 사이토카인 생성의 수준을 측정하기 위해 펩타이드의 부재시에 인큐베이션된 대조군과 관련하여 측정하였다.
결과. 표 B3-1 및 B3-2는 IT 또는 SC 주사에 의해 투여된 D61-01-Fic-OVApep 또는 D61-01-Fic-Triple로 치료된 마우스의 TIL에 의한 항원-특이적 사이토카인 생성의 크기를 보여준다. 치료되지 않은 채로 남겨지거나 IT 주사에 의해 (보조제 단독) 투여된 D61-01-Fic로 치료된 대조군 마우스의 TIL에 의한 항원-특이적 사이토카인 생성 또한 보여진다. 데이터는 사이토카인 TNF-α 및 IFN-γ를 동시에 생성하는 항원-특이적 TIL의 백분율 +/- SEM의 평균 백분율을 나타낸다. 통계학적 유의미성을 쌍을 이루지 않은 학생 t-테스트 및 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 계산하였다. 0.05보다 작은 값을 유의미한 것으로 간주하였다.
표 B3-1: 다-기능적 항원-특이적 (OVA 부류 I 펩타이드-특이적) 림프구인 EG7-OVA 림프종 TIL의 백분율^
Figure pct00038
^ p = D61-01-Fic-OVApep (SC) 대비 D61-01-Fic-OVApep (IT)에 대해 0.04.
표 B3-2: 다-기능적 항원-특이적 (Trp1 부류 I 펩타이드-특이적) 림프구인 B16-OVA 흑색종 TIL의 백분율^
Figure pct00039
^ p = D61-01-Fic-Triple (SC) 대비 D61-01-Fic-Triple (IT)에 대해 0.01.
도 5는 IT 또는 SC 주사에 의해 투여된 D61-01-Fic-OVApep로 치료된 마우스의 종양 누출 림프절의 림프구에 의힌 항원-특이적 사이토카인 생성의 크기를 보여준다. 치료되지 않은 채로 남겨지거나 IT 주사에 의해 (보조제 단독) 투여된 D61-01-Fic로 치료된 대조군 마우스의 TIL에 의한 항원-특이적 사이토카인 생성 또한 보여진다.
월등한 세포독성 기능을 가진 항원-특이적 CD8+ T 세포의 특징은 다중 사이토카인의 동시 분비이다. 이 표현형의 획득은 종양을 거부하는 향상된 능력과 관련된다 (Yuan et al., Proc Natl Acad Sci USA, 105:20410-15, 2008; Aranda et al., Cancer Res, 71:3214, 2011; Mandl et al., J Immunother Cancer, 2:34, 2014; Imai et al., Eur J Immunol, 39:241-53, 2009; 및 Marshall et al., Cancer Res, 72:581-91, 2012). 2개의 원형적인 Th1 사이토카인인 TNF-α 및 IFN-γ의 분비를 동족의 펩타이드로의 재자극 후에 세포내 FACS 분석에 의해 평가하였다. D61-01-Fic-Ag의 종양내 주사는 D61-01-Fic-Ag의 피하 주사 또는 D61-01-Fic 단독의 종양내 주사에 대해 관찰되었던 것 이상으로 두 개의 사이토카인을 모두 발현하는 항원-특이적 세포의 비율을 증가시켰다.
일단 종양-미세환경 내에서 활성화되면, 수지상 세포 (DC)는 종양 누출 림프절로 이동하고, 그곳에서 그 세포들은 CD8+ T 세포와 상호작용하여 종양을 파괴할 수 있는 세포독성 T 림프구 (CTL)로의 성숙을 촉진한다. 그 결과, 림프절 세포의 종양 항원-특이적 리콜 반응의 평가는 종양 미세환경이 종양 항원-특이적 CTL 의 팽창을 촉진하는 능력의 판독을 제공한다. D61-01-Fic-Ovapep의 종양내 주사는 EG7-OVA 및 B16-OVA 모델 둘 다에서 종양 누출 림프절로부터의 IFN-γ의 생성을 크게 향상시켰다. 종양 항원-특이적 CD8+ T 세포는 배양 상층액에서 검출된 IFN-γ의 양이 자극에 사용된 OVA 부류 I 펩타이드의 양에 정비례했기 때문에 이 사이토카인 반응의 주요 구동요인이었다. 이들 결과는, 함께 취하면, 종양내 백신접종이 멀리 떨어진 부위에서의 피하 백신접종 또는 항원의 부재시에 종양내 백신접종와 비교할 때 증가된 기능성을 가진 항원-특이적 CD8+ T 세포의 차별화를 촉진하는 것을 증명한다.
실시예 B4: 전신적인 종양 항원-특이적 면역 반응에 미치는 면역원성 조성물의 종양내 투여의 영향
이 실시예는 다당 멀티머화제와 단독으로 회합되거나 또는 추가로 종양 항원 (Ag)과 회합되어 있는 TLR9 작용물질 (CpG)을 포함하는 입자들을 포함하는 면역원성 조성물의 투여에 의한 종양 항원-특이적 세포의 T 세포 반응을 기술한다. 이 실시예에서, 다당 멀티머화제는 GE Healthcare (Sweden)에 의해 시판된 FICOLL®로서 시판된 수크로오스와 에피클로로히드린의 고분자량의, 분지된 코폴리머였다. 그러나, 상표없는 버전 또는 바이오시밀러 (브랜드가 없거나 다른 브랜드의) 또한 사용하기에 적합하고 따라서 이 모이어티는 본원에서 간단히 Fic로 언급한다.
종양 모델. 면역원성 조성물을 실시예 B1에서 기술한 EG7-OVA 림프종 및 B16-OVA 흑색종 모델에서 테스트하였다. 반대쪽 종양에서의 TIL의 생체외 분석을 위해, 종양 세포를 동일한 날에 우측 및 좌측 옆구리에 모두 접종하였다. 전이에 미치는 면역원성 조성물의 영향의 분석을 위해, 폐 종양을 B16-OVA 세포를 정맥내 경로에 의해 주사함으로써 수립하는 한편, 피하 종양을 B16-OVA 세포를 피하 경로에 의해 주사함으로써 수립하였다.
면역원성 조성물 및 치료 양생법. D61-01은 5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:5)와 같이 3개의 핵산 모이어티 및 2개의 비-핵산 모이어티를 가지는 선형 키메릭 화합물이다. D61-01-Fic-OVApep 입자들은 오브알부민 폴리펩타이드: CSGLEQLESIINFEKLTEWTSSNVMEERKIKV (SEQ ID NO:11)을 포함한다. 면역원성 조성물을 종양내 주사 (IT)에 의해 또는 종양외 주사에 의해 투여하였고, 종양외 주사는 이 실시예에서는 피하 (SC) 주사를 포함하였다. D61-01-Fic-OVApep 입자들을 150 μl의 부피에 50 μg의 D61-01 및 56 μg의 OVApep를 함유한 용량으로서 전달하였다. 비장의 림프구의 분석을 위해, 수립된 EG7 종양s 또는 B16-OVA 종양을 포함한 마우스에게 제 0, 3 및 7일에 주사를 주었다. 반대쪽 TIL의 분석을 위하여, 우측 및 좌측 옆구리에 모두 수립된 B16-OVA 종양을 포함한 마우스에게 우측 종양에 IT 주사를 또는 우측 및 좌측 종양 둘 다로부터 멀리 떨어진 부위에서 SC 주사를 제 11, 14 및 18일에 (연구 1) 또는 제 10, 13 및 17일에 (연구 2) 주었다. 면역원성 조성물의 전이에 미치는 영향의 분석을 위해, 부수적인 피하 및 페 종양을 포함한 마우스에게 피하 종양의 이식 후 제 8, 12, 15 및 18일에 면역원성 조성물을 주사하였다.
비장 처리 및 IFN-γ ELISA. 마지막 면역화 후 3일 후에, 비장을 수집하고 비장세포를 분리하였다. 단일-세포 현탁액을 비장을 5 mL의 5% FCS / RPMI에서 70 μM 필터를 통해 통과시킴으로써 생성하였다. 샘플을 원심분리하고 5 mL의 적색 세포 용해 완충액에 5분 동안 실온에서 재현탁하였다 반응을 10 mL의 5% FCS / RPMI의 첨가에 의해 중화하고 샘플을 계속해서 원심분리하고 2 mL의 선구세포 배지에 재현탁하였다. 약 500,000개의 비장세포를 100 μL의 선구세포 배지 중의 96-웰 U-자형 바닥 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 2X 농도의 펩타이드의 연속적인 희석액을 만들고 웰당 100 μL를 첨가하였다. IFN-γ를 실시예 B3에서 기술한 것과 같이 조직 배양 상층액에서 측정하였다.
종양 침윤 백혈구 (TIL)의 분리. 종양을 수집하고 TIL을 분리하고 실시예 B3에서 기술한 것과 같이 자극하였다.
유동 세포분석을 위한 세포내 및 세포 표면 염색. TIL 샘플을 5 μL의 H-2Kb / SIINFEKL-APC (Immudex 카탈로그 번호 JD2163) 덱스트라머를 함유한 45 μL의 FACS 염색 완충액 (PBS, 10% FCS, 0.1% 아지드화 나트륨)에 재현탁하였다. 샘플을 10분 동안 4℃에서 인큐베이션한 후 CD107a-PerCP-eFluor710 (eBiosciences 카탈로그 번호 46-1071-82)과 같은 세포 표면 마커에 대한 항체 (50 μL 당 1.5 μL)를 함유한 50 μL의 염색 완충액을 첨가하였다. 샘플을 추가로 20분 동안 4℃에서 인큐베이션하고, 3회 세척하고 200 μL의 고정 완충액 (0.5% 파라포름알데하이드를 함유한 FACS 완충액)에 재현탁하였다. 샘플을 빛으로부터 보호된 4℃에서 밤새 고정시켰다. 세포내 염색을 위해, 4℃에서 밤새 보관한 샘플을 BD PHARMINGENTM 전사 인자 완충액 세트 (카탈로그 번호 562725)를 사용하여 제조자의 설명서에 따라 고정하고 투과성이 되도록 하였다. 간단히 설명하면, 세포를 펠릿화하고 100 μL의 1X Fix / Perm 완충액에 재현탁하고 40분 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 샘플을 200μL의 1X Perm / 세척 완충액으로 2회 세척하고 2 μL의 Granzyme B-FITC (Biolegend 카탈로그 번호 515403) 또는 1.5 μL의 Ki67-PE (Biolegend 카탈로그 번호 652404)를 함유한 100 μL의 1X Perm / 세척 완충액에 재현탁하였다. 추가적인 40분 동안 4℃에서 인큐베이션한 후에, 샘플을 200 μL의 1X Perm / 세척 완충액으로 2회 세척하고 분석을 위해 300 μL의 FACS 완충액에 재현탁하였다. 데이터를 유동 세포분석기 (BD Bioscience로부터의 LSRII)를 사용하여 즉시 획득하였다. 모든 시약을 4℃에서 유지하였고 모든 세척을 200 μL의 완충액을 첨가하고, 플레이팅된 세포 현탁액을 아래위로 피펫팅하고 1600 rpm에서 5분 동안 4℃에서 원심분리함으로써 수행하였다.
유전자 발현. RNA를 종양으로부터 RNEasy® 미니 키트 (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 제조자의 설명서를 따라 분리하였다. 유전자 발현 분석을 전체 종양으로부터 추출된 RNA에 대하여 nCounter® PanCancer Immune Profiling Panel (NanoString Technologies, Seattle, WA)를 사용하여 수행하였다. 데이터 분석을 nSolverTM 분석 소프트웨어 (NanoString Technologies, Seattle, WA)을 사용하여 시행하였다.
결과. 도 6A는 IT 또는 SC 주사에 의해 투여된 D61-01-Fic-OVApep로 치료된 마우스들의 비장세포에 의한 항원-특이적 사이토카인 생성의 크기를 보여준다. 치료되지 않은 채로 남겨지거나 IT 주사에 의해 (보조제 단독) 투여된 D61-01-Fic로 치료된 대조군 마우스의 비장세포에 의한 항원-특이적 사이토카인 생성 또한 보여진다.
도 6B는 양쪽의 B16-OVA 흑색종 종양의 수립 및 후속되는 TLR9 작용물질-함유 나노입자로의 치료를 위한 개략적인 스케줄을 제공한다. 도 6C는 반대쪽의 주사되지 않은 좌측 종양 및 주사된 우측 종양의 종양 부피의 변화를 나타낸 성장 곡선을 보여준다.
표 B4-1, B4-2 및 B4-3은 IT 또는 SC 주사에 의해 투여된 D61-01-Fic-OVApep로 치료된 마우스의 반대쪽 (주사되지 않은) 종양의 TIL의 특징들을 나타낸다. 치료되지 않은 채로 남겨지거나 IT 주사에 의해 (보조제 단독) 투여된 D61-01-Fic로 치료된 대조군 마우스의 TIL의 특징들 또한 보여진다. 데이터는 2 내지 4개의 독립적인 종양의 풀로 구성되는 군당 2 또는 3개의 생물학적 복제물의 백분율 +/-를 나타낸다. 통계학적 유의미성을 쌍을 이루지 않은 학생 t-테스트 및 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 계산하였고, 0.05보다 작은 값을 유의미한 것으로 간주하였다.
표 B4-1: 항원-특이적 (OVA 부류 I 펩타이드-특이적) 림프구인 반대쪽 종양으로부터의 B16-OVA 흑색종 TIL의 백분율^
Figure pct00040
표 B4-2: 세포독성인 반대쪽 종양으로부터의 B16-OVA 흑색종 TIL의 백분율^
Figure pct00041
^ p = D61-01-Fic-OVApep (IT) 대비 D61-01-Fic (IT)에 대해 0.01.
표 B4-3: 증식성인 반대쪽 종양으로부터의 B16-OVA 흑색종 TIL의 백분율^
Figure pct00042
^ p = D61-01-Fic-OVApep (IT) 대비 D61-01-Fic (IT)에 대해 0.03.
반대쪽 종양으로부터의 TIL의 면역표현형을 측정하였다. 표 B4-1은 CpG-Fic-Ag 나노입자의 종양내 주사가 반대쪽 종양으로의 종양 항원-특이적 CD8+ T 세포의 월등한 왕래(trafficking)를 촉진하는 것을 보여준다. 항원 특이성을 OVA 부류 I 펩타이드에 대한 결합을 측정함으로써 평가하였다. 표 B4-2는 CpG-Fic-Ag 나노입자의 종양내 주사가 반대쪽 종양에서 CD8+ T 세포의 세포독성을 향상시키는 것을 보여준다. 세포독성을 Granzyme B 세린 프로테아제 및 탈과립화 마커 CD107a (LAMP-1)의 발현에 대한 염색에 의해 평가하였다. 표 B4-3은 CpG-Fic-Ag 나노입자의 종양내 주사가 반대쪽 종양에서 CD8+ T 세포의 증식 능력을 향상시키는 것을 보여준다. 증식 능력을 Ki67+ 발현에 대한 염색에 의해 평가하였다.
도 7A는 양쪽의 B16-OVA 흑색종 종양의 수립 및 후속되는 TLR9 작용물질-함유 나노입자로의 치료를 위한 개략적인 스케줄을 제공한다. 도 7B는 종양내 경로에 의한 면역원성 조성물 (D61-01-Fic-OVApep)의 투여가 피하 주사를 통한 종양외 투여와 비교하여 멀리 떨어진 부위에서의 종양 성장 / 주사되지 않은 종양 (반대쪽)의 더 강력한 억제를 유도하였음을 보여준다. 도 7C는 CD8+ T 세포, 세포독성 세포, Th1 세포 및 NK 세포의 징후들이 SC로 백신접종된 마우스로부터의 주사되지 않은 종양, IT 경로에 의해 단독으로 D61-01-Fic로 주사된 마우스 (IT 대조군)로부터의 주사되지 않은 종양, 또는 백신접종되지 않은 마우스로부터의 종양과 비교하여, IT로 백신접종된 마우스로부터의 주사되지 않은 종양에서 상당히 상향조절된 것을 보여준다.
유전자 발현 분석을 NanoString Technologies, Inc. (Seattle, WA)로부터의 nCounter® PanCancer Immune Profiling Panel 및 nSolverTM 분석 소프트웨어를 사용하여 종양 조직에 대해 수행하였다. 지시된 전반적인 유의미성 점수를 측정하였는데, 그것은 면역 반응-관련 유전자의 큰 세트에서의 차등적인 발현의 누적 척도이다. 면역 반응의 상향 조절을 나타내는, 상승된 지시된 전반적인 유의미성 점수는 1.0보다 크다. 면역 반응의 하향 조절을 나타내는, 감소된 지시된 전반적인 유의미성 점수는 1.0보다 작다.
표 B4-4는 지시된 전반적인 유의미성 점수가 D61-01-Fic-OVApep로 IT 대비 SC로 백신접종된 마우스로부터의 주사되지 않은 종양, 또는 IT 경로에 의해 D61-01-Fic만을 받은 마우스 (IT 대조군)로부터의 주사되지 않은 종양에서, 백신접종되지 않은 마우스로부터의 종양과 관련하여, 상승된 것을 보여준다. 이 데이터들은 IT로 백신접종된 마우스로부터의 주사되지 않은 종양의 모든 면역 기능 징후들은 백신접종되지 않은 마누스로부터의 종양과 대비하여 상향조절되는 것을 보여준다. 이에 더불어, IT로 백신접종된 마우스로부터의 주사되지 않은 종양의 모든 면역 기능 징후들은 SC로 백신접종된 마우스로부터의 주사되지 않은 종양 또는 IT 경로에 의해 D61-01-Fic를 단독으로 받은 마우스 (IT 대조군)로부터의 종양과 비교하여 보다 강력하게 상향조절된다.
표 B4-4: 상대적인 지시된 전반적인 유의미성 점수
Figure pct00043
도 8A는 마우스의 피하 영역 및 폐 둘 다에서 의 수립을 보여주는 그림을 제공한다. 공존하는 피하 종양 및 폐 종양을 가지고 있는 마우스들을 피하에서 성장하는 종양에서 (IT) 또는 멀리 떨어진 부위에서 (SC) D61-01-Fic-OVApep로 백신접종하였다. IT로 제공된 D61-01-Fic 보조제 단독을 대조군으로서 사용하였다.
도 8B 내지 8D는 종양내 경로에 의한 면역원성 조성물 (D61-01-Fic-OVApep)의 투여가 종양으로부터 멀리 떨어진 부위로의 피하 주사를 통한 종양외 투여와 비교하여, 멀리 떨어진 부위 폐 전이에서 월등한 항-종양 반응을 유도하였음을 증명한다.
암으로부터의 사망률은 예외없이 일차 종양 세포의 신체에서 멀리 떨어진 부위로의 전이성 확산에 의해 유발된다. 암에 대한 백신접종의 원칙적인 목표는 일차 종양을 근절할 수 있을뿐만 아니라 산재하는 질환 (멀리 떨어진 부위의 종양)을 제거할 수 있는 면역 반응을 유도하는 것이다. 종양 누출 림프절은 종양으로부터 직접적으로 세포 왕래를 받는 한편, 비장은 말초 순환을 통해 전신적으로 왕래하는 세포의 저장소를 제공한다. 전신성 항원-특이적 면역력의 발생을 EG7 및 B16-OVA 모델에서 모두 모든 백신접종된 그룹으로부터 분리된 비장세포로부터의 IFN-γ의 용량-의존성 유도에 의해 확인하였다. 가장 강력한 유도는 CpG-Fic-Ag로 백신접종된 종양내 그룹에서 관찰되었고, 이것은 종양내 백신접종이 월등한 종양 항원-특이적, 전신성 면역 반응을 유도하는 것을 증명한다.
CpG-Fic-Ag로 종양내로 백신접종된 마우스에서의 반대쪽 종양은 피하로 백신접종된 마우스 또는 CpG-Fic 만으로 종양내로 백신접종된 마우스에서의 성장과 비교하여 더 느린 속도로 성장하였다. 따라서, 더 큰 비율의 항원-특이적 CD8+ T 세포를 CpG-Fic-Ag로 종양내로 백신접종된 마우스들의 반대쪽 종양에서 발견하였다 (표 B4-1).
Th1-분극화된 미세환경 내에서 IFN-γ에 노출된 항원-특이적 CD8+ T 세포는 용해 효소인 GranzymeB의 발현을 상향조절하는 CpG의 종양내 투여에 의해 생성되었다. GranzymeB-발현 세포는 MHC 부류 I의 맥락에서 동족 펩타이드를 제공하는 세포의 인식에 대비한 채로 유지된다. 일단 이 펩타이드가 인식되면, CD8+ T 세포의 활성화-유도된 탈과립화가 발생하고, 이것은 세포용해의 필요한 선구자이다. 탈과립화 마커 CD107a의 세포 표면 노출은 이 과정을 확인하기 위한 널리 수립된 방법이다. 고도로 세포독성인 GranzymeB+ CD107a+ 항원-특이적 CD8+ T 세포의 존재를 반대쪽 종양에서 모니터링하였다. CpG-Fic-Ag로 종양내로 백신접종된 마우스로부터의 더 큰 비율의 CD8+ T 세포가 이런 고도로 세포독성인 표현형을 획득한 것으로 관찰되었다 (표 B4-2). 이에 더불어, 더 큰 비율의 CD8+ T 세포가 증식 마커 Ki67을 발현하였기 때문에 증식 능력의 증가가 있었다 (표 B4-3).
CpG-Fic-Ag의 종양내 투여는 일차 종양의 성장을 유의미하게 억제하는 작용을 할뿐만 아니라, 또한 CpG-Fic-Ag의 피하 투여 또는 Ag가 없을 때 CpG-Fic의 종양내 투여에 의해 유도된 것보다 월등한 전신성 면역반응을 유도한다. 전신성 면역 반응은 향상된 세포독성 및 증식 능력을 가진 CD8+ T 세포의 유도를 특징으로 하였고, 이 두 가지 특징은 멀리 떨어진 부위에서 종양 성장의 효과적인 제어를 제공하기 위해 필요하다.
실시예 B5: 종양 크기 및 전이에 미치는 면역원성 조성물의 종양내 대비 종양외 투여의 영향
이 실시예는 알루미늄 염 멀티머화제 단독과 회합된 또는 추가로 종양 항원 (Ag)과 회합된 TLR9 작용물질 (CpG)을 포함하는 입자들을 포함하는 면역원성 조성물의 투여에 의한 종양 성장의 제어를 기술한다. 이 실시예에서, 알루미늄 염 멀티머화제는 Brenntag Nordic A/S (Denmark)에 의해 ALHYDROGEL®로서 시판된 수산화 알루미늄 (alum) 제제였다. 그러나, 상표없는 버전 또는 바이오시밀러 (브랜드가 없거나 다른 브랜드의) 또한 사용하기에 적합하고 따라서 이 제제는 본원에서 간단히 Alum으로 언급한다.
종양 모델. 면역원성 조성물을 실시예 B1에서 기술한 EG7-OVA 림프종 및 B16-OVA 흑색종 모델에서 테스트하였다. 전이에 미치는 면역원성 조성물의 영향의 분석을 위해, 폐 종양을, B16-OVA 세포를 정맥내 경로에 의해 주사함으로써 수립하는 한편, 피하 종양을, B16-OVA 세포를 피하 경로에 의해 주사함으로써 수립하였다.
면역원성 조성물 및 치료 양생법. D61-01은 5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:5)와 같이 3개의 핵산 모이어티 및 2개의 비-핵산 모이어티를 가지는 선형 키메릭 화합물이다. D61-04는 폴리뉴클레오타이드: 5'-TCG AAC GTT CGA ACG TTC GAA CGT TCG AAT-3' (SEQ ID NO:6)이다. D61-01-Alum-OVApep 및 D61-04-Alum-OVApep 입자들은 오브알부민 폴리펩타이드: CSGLEQLESIINFEKLTEWTSSNVMEERKIKV (SEQ ID NO:11)을 포함한다. D61-01-Alum-Triple 입자들은 융합 폴리펩타이드: VGALEGPRNQDWLAKXVAAWTLKAAATAYRYHLLSSVYDFFVWLSC (X는 L-사이클로헥실알라닌임) (SEQ ID NO:14)로서 3개의 에피토프를 포함한다. 면역원성 조성물을 종양내 주사 (IT)에 의해 또는 종양외 주사에 의해 투여하였고, 종양외 주사는 이 실시예에서는 피하 (SC) 주사를 포함하였다. D61-01-Alum-OVApep 입자들을 150 μl의 부피에 50 μg의 D61-01 및 35 μg의 OVApep를 함유한 용량으로서 전달하였다. D61-01-Alum-Triple 입자들을 150 μl의 부피에 50 μg의 D61-01 및 35 μg의 Triple을 함유한 용량으로서 전달하였다. D61-01-Alum 입자들을 150 μl의 부피에 50 μg의 D61-01을 함유한 용량으로서 전달하였다. D61-04-Alum-OVApep 입자들을 150 μl의 부피에 45 μg의 D61-01 및 45.6 μg의 OVApep를 함유한 용량으로서 전달하였다. D61-01 연구에서, 수립된 B16-OVA 흑색종 또는 EG7-OVA 림프종 종양을 포함하는 마우스들에게 제 8, 11 및 15일에 주사를 주었다. D61-04 연구에서, 수립된 B16-OVA 흑색종 종양을 가진 마우스들에게 피하 종양의 이식 후 제 11, 14, 18 및 21일에 주사를 주었다.
종양 성장의 측정. 종양 크기를 3차원 (길이; L, 폭; W 및 깊이; D)의 마이크로캘리퍼 측정에 의해 측정하고 부피를 다음 식 : (L x W x D / 2)을 사용하여 계산하였다.
결과. 도 10A 내지 C의 결과는 종양내 경로에 의한 면역원성 조성물의 투여가 종양으로부터 멀리 떨어진 부위로의 피하 주사를 통한 생체외 투여와 비교할 때 월등한 항-종양 반응을 유도하였음을 증명한다.
고출력 서열분석 기술의 진보로 CD8+ T 세포에 의한 인식을 위해 신규한 에피토프를 생성할 수 있는 환자-특이적 종양 점 돌연변이의 확인에서의 관심이 촉진되었다. 항원의 공급원으로서 이런 환자-특이적 네오-에피토프를 추구하고자 하는 근거는 이들 에피토프가 드노보로 발생하고, 그것들은 CT 반응의 강도를 약하게 하는 면역 조절 메커니즘의 지배를 받지 않기 때문이다. 암 백신의 맞춤화(개인화)는 보조제 및 환자-특이적 네오-항원을 동일한 세포에 동시에 전달하는 신속하고 효율적인 방법을 필요로 한다.
Fic 플랫폼에 대한 대안으로서 Alum의 사용은, Alum 미립자 제제의 제조가 CpG 및/또는 종양 항원에 부착하기 위해 다단계 화학적 컨쥬게이션을 필요로 하지 않기 때문에 탐색되었다. CpG-Fic 플랫폼에 대해 관찰된 것과 유사하게, D61-01-Alum-OVApep 또는 D61-01-Alum-Triple 마이크로입자들의 종양내 투여는 피하 투여 또는 Ag가 없을 때 D61-01-Alum의 종양내 투여와 비교하여 월등한 항-종양 반응을 생성하였다 (도 10A 및 10B). Alum 단독의 종양내 투여는 항-종양 효과를 나타내지 않았으며, 이때 종양은 백신접종되지 않은 대조군과 동일한 속도로 성장하였다. 종양내로 투여될 때, Alum-OVApep 또는 D61-01-Alum은 D61-01-Alum-OVApep 공동 흡착물과 동일한 종양 성장의 감소를 이루지 못하였다 (도 10C). 이것은 최대 항-종양 활성을 위해 CpG 및 항원 둘 다의 Alum에 대한 공동 흡착을 필요로 하는 것을 확인해주었다. 이것들을 함께 고려하면, 이 결과들은 미립자 제제로서의 Alum이 CpG 보조제와 함께 종양내로 동시 전달될 때 월등한 항-종양 반응을 이룰 수 있음을 증명한다.
도 11A 및 11B의 결과는 종양내 경로에 의한 면역원성 조성물 (D61-04-Alum-OVApep)의 투여가 종양으로부터 멀리 떨어진 부위로의 피하 주사를 통한 종양외 투여와 비교하여 멀리 떨어진 부위 폐 전이의 종양 부피 및 수 둘 다와 관련하여 월등한 항-종양 반응을 유도하였음을 증명한다. 즉, TLR9-alum-종양 항원 입자들을 포함하는 예시적인 면역원성 조성물은 종양 부피를 감소시킬 수 있고 공격적인 먼거리 부위의 폐 전이를 제거할 수 있는 전신성 면역 반응을 유도하는 데 효과적이다. 더욱이, 항-종양 반응의 효력은 조성물이 종양내 경로에 의해 투여될 때 유의미하게 증가된다.
SEQUENCE LISTING <110> GUIDUCCI, Cristiana NAIK, Edwina MILLEY, Robert CHIPMAN, Stewart <120> INTRATUMORAL ADMINISTRATION OF PARTICLES CONTAINING A TOLL-LIKE RECEPTOR 9 AGONIST AND A TUMOR ANTIGEN FOR TREATING CANCER <130> 377882006140 <140> PCT/US2017/027788 <141> 2017-04-14 <150> US 62/439,438 <151> 2016-12-27 <150> US 62/323,622 <151> 2016-04-15 <160> 74 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 <223> n = any nucleoside and up to 43 can be present or absent <400> 1 tcgnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 50 <210> 2 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> 4, 5, 6, 7, 8 <223> n = any nucleoside and up to 5 can be present or absent <220> <221> misc_feature <222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 <223> can be present in repeat of up to 4 <220> <221> misc_feature <222> 9, 10 <223> n = any nucleoside and up to 2 can be present or absent <220> <221> misc_feature <222> 11, 16 <223> n = any nucleoside, and position 11 and 16 are self-complementary <220> <221> misc_feature <222> 12, 15 <223> n = any nucleoside, and position 12 and 15 are self-complementary <220> <221> misc_feature <222> 17, 18 <223> can be present or absent <220> <221> misc_feature <222> 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 <223> can be present in repeat of up to 4 <220> <221> misc_feature <222> 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 <223> n = any nucleoside and up to 41 can be present or absent <400> 2 tcgnnnnnnn nncgnncgnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnn 59 <210> 3 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> 4, 5, 6, 7, 8 <223> n = any nucleoside and up to 5 can be present or absent <220> <221> misc_feature <222> 9, 14 <223> n = any nucleoside, and position 9 and 14 are self-complementary <220> <221> misc_feature <222> 10, 13 <223> n = any nucleoside, and position 10 and 13 are self-complementary <220> <221> misc_feature <222> 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 <223> can be present in repeat of up to 4 <220> <221> misc_feature <222> 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55 <223> n = any nucleoside and up to 38 can be present or absent <400> 3 tcgnnnnnnn cgnncgnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 55 <210> 4 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> 4, 5, 6, 7, 8 <223> n = any nucleoside and up to 5 can be present or absent <220> <221> misc_feature <222> 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55 <223> n = any nucleoside and up to 29 can be present or absent <400> 4 tcgnnnnnaa cgttcgaacg ttcgaannnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 55 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> 7, 8 <223> positions 7 and 8 are linked by a hexa-(ethylene glycol) moiety <220> <221> misc_feature <222> 14, 15 <223> positions 14 and 15 are linked by a hexa-(ethylene glycol) moiety <400> 5 tcggcgcaac gttctcggcg c 21 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 tcgaacgttc gaacgttcga acgttcgaat 30 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 7 tcgttcgaac gttcgaacgt tcgaa 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 8 tcgaacgttc gaacgttcga atttt 25 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 9 tcgtaacgtt cgaacgttcg aacgtta 27 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 10 tcgtaacgtt cgaacgttcg aac 23 <210> 11 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 11 Cys Ser Gly Leu Glu Gln Leu Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5 10 15 Thr Glu Trp Thr Ser Ser Asn Val Met Glu Glu Arg Lys Ile Lys Val 20 25 30 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 12 Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5 <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 13 Thr Glu Trp Thr Ser Ser Asn Val Met Glu Glu Arg Lys Ile Lys Val 1 5 10 15 <210> 14 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> attached to (polyethylene glycol)24 <220> <221> VARIANT <222> 16 <223> Xaa = L-cyclohexylalanine <400> 14 Val Gly Ala Leu 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Ile Trp Glu Glu 210 215 220 Leu Ser Val Leu Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser Ile Phe Gly 225 230 235 240 Asp Pro Lys Lys Leu Leu Thr Gln Tyr Phe Val Gln Glu Asn Tyr Leu 245 250 255 Glu Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala Cys Tyr Glu Phe Leu 260 265 270 Trp Gly Pro Arg Ala Leu Ile Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu His 275 280 285 His Met Val Lys Ile Ser Gly Gly Pro Arg Ile Ser Tyr Pro Leu Leu 290 295 300 His Glu Trp Ala Leu Arg Glu Gly Glu Glu 305 310 <210> 67 <211> 318 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Met Leu Leu Gly Gln Lys Ser Gln Arg Tyr Lys Ala Glu Glu Gly Leu 1 5 10 15 Gln Ala Gln Gly Glu Ala Pro Gly Leu Met Asp Val Gln Ile Pro Thr 20 25 30 Ala Glu Glu Gln Lys Ala Ala Ser Ser Ser Ser Thr Leu Ile Met Gly 35 40 45 Thr Leu Glu Glu Val Thr Asp Ser Gly Ser Pro Ser Pro Pro Gln Ser 50 55 60 Pro Glu Gly Ala Ser Ser Ser Leu Thr Val Thr Asp Ser Thr Leu Trp 65 70 75 80 Ser Gln Ser Asp Glu Gly Ser Ser Ser Asn Glu Glu Glu Gly Pro Ser 85 90 95 Thr Ser Pro Asp Pro Ala His Leu Glu Ser Leu Phe Arg Glu Ala Leu 100 105 110 Asp Glu Lys Val Ala Glu Leu Val Arg Phe Leu Leu Arg Lys Tyr Gln 115 120 125 Ile Lys Glu Pro Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Glu Ser Val Ile Lys 130 135 140 Asn Tyr Lys Asn His Phe Pro Asp Ile Phe Ser Lys Ala Ser Glu Cys 145 150 155 160 Met Gln Val Ile Phe Gly Ile Asp Val Lys Glu Val Asp Pro Ala Gly 165 170 175 His Ser Tyr Ile Leu Val Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu 180 185 190 Leu Gly Asp Asp Gln Ser Thr Pro Lys Thr Gly Leu Leu Ile Ile Val 195 200 205 Leu Gly Met Ile Leu Met Glu Gly Ser Arg Ala Pro Glu Glu Ala Ile 210 215 220 Trp Glu Ala Leu Ser Val Met Gly Leu Tyr Asp Gly Arg Glu His Ser 225 230 235 240 Val Tyr Trp Lys Leu Arg Lys Leu Leu Thr Gln Glu Trp Val Gln Glu 245 250 255 Asn Tyr Leu Glu Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Ser Asp Pro Val Arg Tyr 260 265 270 Glu Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Ala Glu Thr Ser Tyr Val Lys 275 280 285 Val Leu Glu His Val Val Arg Val Asn Ala Arg Val Arg Ile Ser Tyr 290 295 300 Pro Ser Leu His Glu Glu Ala Leu Gly Glu Glu Lys Gly Val 305 310 315 <210> 68 <211> 315 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Met Ser Leu Glu Gln Arg Ser Pro His Cys Lys Pro Asp Glu Asp Leu 1 5 10 15 Glu Ala Gln Gly Glu Asp Leu Gly Leu Met Gly Ala Gln Glu Pro Thr 20 25 30 Gly Glu Glu Glu Glu Thr Thr Ser Ser Ser Asp Ser Lys Glu Glu Glu 35 40 45 Val Ser Ala Ala Gly Ser Ser Ser Pro Pro Gln Ser Pro Gln Gly Gly 50 55 60 Ala Ser Ser Ser Ile Ser Val Tyr Tyr Thr Leu Trp Ser Gln Phe Asp 65 70 75 80 Glu Gly Ser Ser Ser Gln Glu Glu Glu Glu Pro Ser Ser Ser Val Asp 85 90 95 Pro Ala Gln Leu Glu Phe Met Phe Gln Glu Ala Leu Lys Leu Lys Val 100 105 110 Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu His Lys Tyr Arg Val Lys Glu Pro 115 120 125 Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Glu Ser Val Ile Lys Asn Tyr Lys Arg 130 135 140 Tyr Phe Pro Val Ile Phe Gly Lys Ala Ser Glu Phe Met Gln Val Ile 145 150 155 160 Phe Gly Thr Asp Val Lys Glu Val Asp Pro Ala Gly His Ser Tyr Ile 165 170 175 Leu Val Thr Ala Leu Gly Leu Ser Cys Asp Ser Met Leu Gly Asp Gly 180 185 190 His Ser Met Pro Lys Ala Ala Leu Leu Ile Ile Val Leu Gly Val Ile 195 200 205 Leu Thr Lys Asp Asn Cys Ala Pro Glu Glu Val Ile Trp Glu Ala Leu 210 215 220 Ser Val Met Gly Val Tyr Val Gly Lys Glu His Met Phe Tyr Gly Glu 225 230 235 240 Pro Arg Lys Leu Leu Thr Gln Asp Trp Val Gln Glu Asn Tyr Leu Glu 245 250 255 Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala His Tyr Glu Phe Leu Trp 260 265 270 Gly Ser Lys Ala His Ala Glu Thr Ser Tyr Glu Lys Val Ile Asn Tyr 275 280 285 Leu Val Met Leu Asn Ala Arg Glu Pro Ile Cys Tyr Pro Ser Leu Tyr 290 295 300 Glu Glu Val Leu Gly Glu Glu Gln Glu Gly Val 305 310 315 <210> 69 <211> 369 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Met Pro Arg Ala Pro Lys Arg Gln Arg Cys Met Pro Glu Glu Asp Leu 1 5 10 15 Gln Ser Gln Ser Glu Thr Gln Gly Leu Glu Gly Ala Gln Ala Pro Leu 20 25 30 Ala Val Glu Glu Asp Ala Ser Ser Ser Thr Ser Thr Ser Ser Ser Phe 35 40 45 Pro Ser Ser Phe Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Cys Tyr 50 55 60 Pro Leu Ile Pro Ser Thr Pro Glu Glu Val Ser Ala Asp Asp Glu Thr 65 70 75 80 Pro Asn Pro Pro Gln Ser Ala Gln Ile Ala Cys Ser Ser Pro Ser Val 85 90 95 Val Ala Ser Leu Pro Leu Asp Gln Ser Asp Glu Gly Ser Ser Ser Gln 100 105 110 Lys Glu Glu Ser Pro Ser Thr Leu Gln Val Leu Pro Asp Ser Glu Ser 115 120 125 Leu Pro Arg Ser Glu Ile Asp Glu Lys Val Thr Asp Leu Val Gln Phe 130 135 140 Leu Leu Phe Lys Tyr Gln Met Lys Glu Pro Ile Thr Lys Ala Glu Ile 145 150 155 160 Leu Glu Ser Val Ile Arg Asn Tyr Glu Asp His Phe Pro Leu Leu Phe 165 170 175 Ser Glu Ala Ser Glu Cys Met Leu Leu Val Phe Gly Ile Asp Val Lys 180 185 190 Glu Val Asp Pro Thr Gly His Ser Phe Val Leu Val Thr Ser Leu Gly 195 200 205 Leu Thr Tyr Asp Gly Met Leu Ser Asp Val Gln Ser Met Pro Lys Thr 210 215 220 Gly Ile Leu Ile Leu Ile Leu Ser Ile Val Phe Ile Glu Gly Tyr Cys 225 230 235 240 Thr Pro Glu Glu Val Ile Trp Glu Ala Leu Asn Met Met Gly Leu Tyr 245 250 255 Asp Gly Met Glu His Leu Ile Tyr Gly Glu Pro Arg Lys Leu Leu Thr 260 265 270 Gln Asp Trp Val Gln Glu Asn Tyr Leu Glu Tyr Arg Gln Val Pro Gly 275 280 285 Ser Asp Pro Ala Arg Tyr Glu Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala His Ala 290 295 300 Glu Ile Arg Lys Met Ser Leu Leu Lys Phe Leu Ala Lys Val Asn Gly 305 310 315 320 Ser Asp Pro Arg Ser Phe Pro Leu Trp Tyr Glu Glu Ala Leu Lys Asp 325 330 335 Glu Glu Glu Arg Ala Gln Asp Arg Ile Ala Thr Thr Asp Asp Thr Thr 340 345 350 Ala Met Ala Ser Ala Ser Ser Ser Ala Thr Gly Ser Phe Ser Tyr Pro 355 360 365 Glu <210> 70 <211> 429 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Met Glu Thr Gln Phe Arg Arg Gly Gly Leu Gly Cys Ser Pro Ala Ser 1 5 10 15 Ile Lys Arg Lys Lys Lys Arg Glu Asp Ser Gly Asp Phe Gly Leu Gln 20 25 30 Val Ser Thr Met Phe Ser Glu Asp Asp Phe Gln Ser Thr Glu Arg Ala 35 40 45 Pro Tyr Gly Pro Gln Leu Gln Trp Ser Gln Asp Leu Pro Arg Val Gln 50 55 60 Val Phe Arg Glu Gln Ala Asn Leu Glu Asp Arg Ser Pro Arg Arg Thr 65 70 75 80 Gln Arg Ile Thr Gly Gly Glu Gln Val Leu Trp Gly Pro Ile Thr Gln 85 90 95 Ile Phe Pro Thr Val Arg Pro Ala Asp Leu Thr Arg Val Ile Met Pro 100 105 110 Leu Glu Gln Arg Ser Gln His Cys Lys Pro Glu Glu Gly Leu Gln Ala 115 120 125 Gln Glu Glu Asp Leu Gly Leu Val Gly Ala Gln Ala Leu Gln Ala Glu 130 135 140 Glu Gln Glu Ala Ala Phe Phe Ser Ser Thr Leu Asn Val Gly Thr Leu 145 150 155 160 Glu Glu Leu Pro Ala Ala Glu Ser Pro Ser Pro Pro Gln Ser Pro Gln 165 170 175 Glu Glu Ser Phe Ser Pro Thr Ala Met Asp Ala Ile Phe Gly Ser Leu 180 185 190 Ser Asp Glu Gly Ser Gly Ser Gln Glu Lys Glu Gly Pro Ser Thr Ser 195 200 205 Pro Asp Leu Ile Asp Pro Glu Ser Phe Ser Gln Asp Ile Leu His Asp 210 215 220 Lys Ile Ile Asp Leu Val His Leu Leu Leu Arg Lys Tyr Arg Val Lys 225 230 235 240 Gly Leu Ile Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Ile Lys Asn Tyr 245 250 255 Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Ile Phe Arg Glu Ala Ser Val Cys Met Gln 260 265 270 Leu Leu Phe Gly Ile Asp Val Lys Glu Val Asp Pro Thr Ser His Ser 275 280 285 Tyr Val Leu Val Thr Ser Leu Asn Leu Ser Tyr Asp Gly Ile Gln Cys 290 295 300 Asn Glu Gln Ser Met Pro Lys Ser Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu Gly 305 310 315 320 Val Ile Phe Met Glu Gly Asn Cys Ile Pro Glu Glu Val Met Trp Glu 325 330 335 Val Leu Ser Ile Met Gly Val Tyr Ala Gly Arg Glu His Phe Leu Phe 340 345 350 Gly Glu Pro Lys Arg Leu Leu Thr Gln Asn Trp Val Gln Glu Lys Tyr 355 360 365 Leu Val Tyr Arg Gln Val Pro Gly Thr Asp Pro Ala Cys Tyr Glu Phe 370 375 380 Leu Trp Gly Pro Arg Ala His Ala Glu Thr Ser Lys Met Lys Val Leu 385 390 395 400 Glu Tyr Ile Ala Asn Ala Asn Gly Arg Asp Pro Thr Ser Tyr Pro Ser 405 410 415 Leu Tyr Glu Asp Ala Leu Arg Glu Glu Gly Glu Gly Val 420 425 <210> 71 <211> 314 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Met Pro Leu Glu Gln Arg Ser Gln His Cys Lys Pro Glu Glu Gly Leu 1 5 10 15 Glu Ala Gln Gly Glu Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Gln Ala Pro Ala 20 25 30 Thr Glu Glu Gln Glu Thr Ala Ser Ser Ser Ser Thr Leu Val Glu Val 35 40 45 Thr Leu Arg Glu Val Pro Ala Ala Glu Ser Pro Ser Pro Pro His Ser 50 55 60 Pro Gln Gly Ala Ser Thr Leu Pro Thr Thr Ile Asn Tyr Thr Leu Trp 65 70 75 80 Ser Gln Ser Asp Glu Gly Ser Ser Asn Glu Glu Gln Glu Gly Pro Ser 85 90 95 Thr Phe Pro Asp Leu Glu Thr Ser Phe Gln Val Ala Leu Ser Arg Lys 100 105 110 Met Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu 115 120 125 Pro Phe Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Ile Arg Asn Phe Gln 130 135 140 Asp Phe Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys Ala Ser Glu Tyr Leu Gln Leu 145 150 155 160 Val Phe Gly Ile Glu Val Val Glu Val Val Arg Ile Gly His Leu Tyr 165 170 175 Ile Leu Val Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly Asp 180 185 190 Asn Gln Ile Val Pro Lys Thr Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu Ala Ile 195 200 205 Ile Ala Lys Glu Gly Asp Cys Ala Pro Glu Glu Lys Ile Trp Glu Glu 210 215 220 Leu Ser Val Leu Glu Ala Ser Asp Gly Arg Glu Asp Ser Val Phe Ala 225 230 235 240 His Pro Arg Lys Leu Leu Thr Gln Asp Leu Val Gln Glu Asn Tyr Leu 245 250 255 Glu Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala Cys Tyr Glu Phe Leu 260 265 270 Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu His 275 280 285 His Leu Leu Lys Ile Ser Gly Gly Pro His Ile Ser Tyr Pro Pro Leu 290 295 300 His Glu Trp Ala Phe Arg Glu Gly Glu Glu 305 310 <210> 72 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> 7, 8 <223> positions 7 and 8 are linked by a hexa-(ethylene glycol) moiety <220> <221> misc_feature <222> 14, 15 <223> positions 14 and 15 are linked by a hexa-(ethylene glycol) moiety <400> 72 tcgccggaac gttctcgccg g 21 <210> 73 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 <223> n = any nucleoside and up to 43 can be present or absent <400> 73 aacgttnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 50 <210> 74 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 74 Gly His Gly His Ser Tyr Thr Thr Ala Glu Glu Leu Ala Gly Ile Gly 1 5 10 15 Ile Leu Thr Val Ile Leu Gly Val Leu 20 25

Claims (112)

  1. 포유류 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 유효량의 면역원성 조성물을 종양내 전달에 의하여 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서:
    면역원성 조성물은 각각이 생체에 적합한 멀티머화제와 회합되어 있는 TLR9 작용물질 및 종양 항원을 포함하는 입자를 포함하고;
    멀티머화제는 약 10 내지 약 25,000 나노미터의 직경 및/또는 약 10,000 내지 약 1,000,000 달톤의 분자량을 가지며;
    TLR9 작용물질은 서열 5'-TCGNs-3' (SEQ ID NO:1)을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 각각의 N은 독립적으로 선택된 뉴클레오사이드이며 s는 4 내지 47이고;
    종양 항원은 약 9 내지 약 1000개의 아미노산의 폴리펩타이드를 포함하며;
    TLR9 작용물질과 종양 항원은 각각 하나 이상의 공유 결합에 의해 멀티머화제와 회합되거나, 또는 각각 흡착에 의해 멀티머화제와 회합되는, 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 멀티머화제는 약 0.5 내지 약 25 마이크로미터의 직경을 가지는 수산화 알루미늄 복합체를 포함하고, TLR9 작용물질 및 종양 항원은 각각 흡착에 의해 동일한 복합체와 회합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 수산화 알루미늄 복합체는 약 0.5 내지 약 5.0 마이크로미터의 직경을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 멀티머화제는 약 10 내지 약 1,000 나노미터의 직경 및/또는 약 10,000 내지 약 1,000,000 달톤의 분자량을 가지는 다당을 포함하고, TLR9 작용물질 및 종양 항원은 각각 하나 이상의 공유 결합에 의해 다당의 동일한 분자와 회합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 다당은 수크로오스와 에피클로로히드린, 덱스트란, 만난, 키토산, 아가로오스, 및 전분의 분지된 코폴리머로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 다당은 약 100,000 내지 약 700,000 달톤의 분자량을 가지는, 수크로오스와 에피클로로히드린의 분지된 코폴리머인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, TLR9 작용물질은
    5'-(TCG(Nq))iNw(X1X2CGX2'X1'(CG)p)jNv-3' (SEQ ID NO:2)로 구성되는 폴리뉴클레오타이드이고,
    여기서 각각의 N은 독립적으로 선택된 뉴클레오사이드이며;
    p는 0 또는 1이고;
    q는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이며;
    v는 0 내지 41이고;
    w는 0, 1 또는 2이며;
    i는 1, 2, 3 또는 4이고;
    j는 1, 2, 3 또는 4이며;
    X1 및 X1'는 자기-상보성 뉴클레오사이드이고; 및
    X2 및 X2'는 자기-상보성 뉴클레오사이드이며;
    폴리뉴클레오타이드는 길이가 9 내지 50개의 뉴클레오타이드인
    것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, TLR9 작용물질은
    5'-TCGNq(X1X2CGX2'X1'CG)jNv-3' (SEQ ID NO:3)으로 구성되는 폴리뉴클레오타이드이고,
    여기서 각각의 N은 독립적으로 선택된 뉴클레오사이드이며;
    q는 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고;
    v는 1 내지 39이며;
    j는 1, 2, 3 또는 4이고;
    X1 및 X1'는 자기-상보성 뉴클레오사이드이며; 및
    X2 및 X2'는 자기-상보성 뉴클레오사이드이고;
    폴리뉴클레오타이드는 길이가 12 내지 50개의 뉴클레오타이드인
    것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, TLR9 작용물질은
    5'-TCGNqAACGTTCGAACGTTCGAANr-3' (SEQ ID NO:4)로 구성되는 폴리뉴클레오타이드이고,
    여기서 각각의 N은 독립적으로 선택된 뉴클레오사이드이며; q　=　0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고; r은 0 내지 29인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, TLR9 작용물질은
    5'-TCG AAC GTT CGA ACG TTC GAA CGT TCG AAT-3'(SEQ ID NO:6);
    5'-TCG TTC GAA CGT TCG AAC GTT CGA A-3' (SEQ ID NO:7);
    5'-TCG AAC GTT CGA ACG TTC GAA TTT T-3' (SEQ ID NO:8);
    5'-TCG TAA CGT TCG AAC GTT CGA ACG TTA-3' (SEQ ID NO:9); 및
    5'-TCG TAA CGT TCG AAC GTT CGA AC-3' (SEQ ID NO:10)으로 구성되는 군으로부터 선택된 서열로 구성된 폴리뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, TLR9 작용물질은 5'-TCG AAC GTT CGA ACG TTC GAA CGT TCG AAT-3'(SEQ ID NO:6)으로 구성되는 폴리뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, TLR9 작용물질은 식 Nu1-Sp1-Nu2-Sp2-Nu3의 키메릭 화합물이고,
    식에서 Nu1, Nu2 및 Nu3은 길이가 7 내지 50개의 뉴클레오타이드로부터 독립적으로 선택된 핵산 모이어티이며, Nu1은 서열 5'-TCGNs-3'로 구성되고, 이때 s는 4 내지 47이며,
    Sp1 및 Sp2는 헥사에틸렌 글리콜 (HEG), 트라이에틸렌 글리콜 (TEG), 프로필, 부틸 및 헥실로 구성되는 군의 적어도 하나의 구성원을 포함하는 동일하거나 상이한 비핵산 스페이서 모이어티이고,
    Sp1은 Nu1 및 Nu2에 공유 결합되며, Sp2는 Nu2 및 Nu3에 공유 결합되는
    것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, TLR9 작용물질은
    5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:5) 또는
    5'-TCGCCGG-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGCCGG-3' (SEQ ID NO:72)와 같이 3개의 핵산 모이어티 및 2개의 헥사에틸렌 글리콜 (HEG) 스페이서를 포함하는 키메릭 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 또는 키메릭 화합물의 뉴클레오타이드들 사이 및/또는 뉴클레오타이드와 키메릭 화합물의 스페이서 사이의 하나 이상의 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 뉴클레오타이드들 사이 및 뉴클레오타이드와 스페이서 사이의 결합은 모두 포스포로티오에이트 에스테르 결합인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 4 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 TLR9 작용물질 대 다당의 평균 몰 비율 및 항원 대 다당의 평균 몰 비율이 각각 약 10 내지 약 120의 범위 내에 있는 입자들의 불균일한 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 2 항, 제 3 항 및 제 7 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 TLR9 작용물질 대 수산화 알루미늄 복합체의 비율 및 항원 대 수산화 알루미늄 복합체의 비율이 각각 약 0.1 내지 약 1 (중량/중량)의 범위 내에 있는 입자들의 불균일한 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 항원은 길이가 약 10 내지 약 100개의 아미노산의 폴리펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 종양 항원은 2개 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질이고, 각각의 폴리펩타이드는 상이한 종양 항원으로부터의 아미노산 서열 또는 동일한 종양 항원으로부터의 비연속성 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 융합 단백질은 제 1 폴리펩타이드 및 제 2 폴리펩타이드를 포함하고, 각각의 폴리펩타이드는 동일한 종양 항원으로부터의 비연속성 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 18 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 항원은 포유류 대상체로부터의 정상 세포에 존재하는 유전자에 비해 돌연변이를 포함하는 유전자에 의해 암호화된 네오항원을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 18 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 항원은 종양에 의해 발현된 바이러스 항원을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 18 항에 있어서, 종양 항원은 인간 암/고환 항원 1 (CTAG1) 단백질 또는 그것의 단편의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 18 항에 있어서, 종양 항원은 SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, 및 그것들의 조합으로 구성되는 군 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류 대상체는 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 종양내 전달은 면역원성 조성물의 적어도 하나의 종양으로의 주사를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 암을 치료하는 것은 주사된 종양에서 종양 항원-특이적 T 세포의 축적을 유도하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 26 항에 있어서, 암을 치료하는 것은 전신성 종양 항원-특이적 T 세포 반응을 이끌어내는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 26 항에 있어서, 암을 치료하는 것은 주사된 종양에서 CD4+ FoxP3+ 조절 T 세포의 수를 감소시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 26 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 주사된 종양에 더불어 하나 이상의 주사되지 않은 종양을 가지며, 암을 치료하는 것은 다음 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 주사되지 않은 종양의 수를 감소시키는 것;
    (b) 주사되지 않은 종양의 부피를 감소시키는 것; 및
    (c) 주사되지 않은 종양의 성장을 지연시키는 것.
  31. 제 26 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 암을 치료하는 것은 다음 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (d) 대상체의 생존 시간을 증가시키는 것;
    (e) 주사된 종양의 부피를 감소시키는 것; 및
    (f) 주사된 종양의 성장을 지연시키는 것.
  32. 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 종양은 육종 또는 암종인 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 종양은 림프종인 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 암은 유방암, 전립선암, 폐암, 대장암, 자궁암, 방광암, 흑색종, 비-호지킨 림프종, 신장암, 및 갑상선암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 암은 구강, 소화계, 호흡계, 피부, 유방, 생식계, 비뇨기계, 안과계, 신경계, 내분비계 및 림프종으로 구성되는 군으로부터 선택된 부위의 원발성 암인 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 1 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량의 제 2 치료제를 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 36 항에 있어서, 제 2 치료제는 악티노마이신, 아파티닙, 알렉티닙, 아스파라기나제, 아자시티딘, 아자티오프린, 비칼루타미드, 블레오마이신, 보르테조밉, 캄프토테신, 카르보플라틴, 카페시타빈, 세르티닙, 시스플라틴, 클로람부실, 크리조티닙, 사이클로포스파미드, 시타라빈, 다우노루비신, 도세탁셀, 독시플루리딘, 독소루비신, 에를로티닙, 에피루비신, 에포틸론, 에토포시드, 플루다라빈, 플루타민, 플루오로우라실, 게피티닙, 겜시타빈, 하이드록시우레아, 이다루비신, 이포스파미드, 이마티닙, 이리노테칸, 라파티닙, 레트로졸, 메클로르에타민, 메르캅토퓨린, 메토트렉세이트, 미토마이신, 미토크산트론, 옥트레오티드, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 페메트렉세드, 랄티트렉세드, 소라페닙, 수니티닙, 타목시펜, 테모졸로미드, 테니포시드, 티오구아닌, 토포테칸, 발루비신, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈, 및 그것들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 화학요법제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 36 항에 있어서, 제 2 치료제는 억제성 면역 체크포인트 분자의 길항물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 38 항에 있어서, 억제성 면역 체크포인트 분자는 PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4 (CD152), LAG-3, TIM-3, TIGIT, IL-10, 및 TGF-베타로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 38 항에 있어서, 억제성 면역 체크포인트 분자는 인돌아민 2,3-다이옥시게나제 (IDO) 또는 트립토판 2,3-다이옥시게나제 (TDO)인 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제 36 항에 있어서, 제 2 치료제는 면역 조절 분자의 작용물질인 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 41 항에 있어서, 면역 조절 분자는 CD27, CD40, OX40 (CD134), GITR, CD137, CD28 및 ICOS (CD278)로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 36 항, 제 38 항, 제 39 항, 제 41 항 및 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 치료제는 항체, 그것의 단편 또는 유도체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제 1 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서, 방사선 요법을 투여하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제 36 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량의 면역원성 조성물 및 유효량의 제 2 치료제는 함께 종양에 대한 협력 효과 또는 더 나은 효과를 초래하는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제 36 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량의 면역원성 조성물 및 유효량의 제 2 치료제는 함께 종양에 대한 부가 효과 또는 더 나은 효과를 초래하는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제 36 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량의 면역원성 조성물 및 유효량의 제 2 치료제는 함께 종양에 대한 상조 효과를 초래하는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제 1 항 내지 제 47 항 중 어느 한 항에 있어서, 암을 치료하는 것은 면역원성 조성물의 반복된 투여가 금지된 그런 심각한 독감-유사 증상의 발생을 초래하지 않고, 이때 독감-유사 증상은 열, 두통, 오한, 근육통 및 피로로 구성되는 군의 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 각각이 생체에 적합한 멀티머화제와 회합되어 있는 TLR9 작용물질 및 종양 항원을 포함하는 입자를 포함하는 면역원성 조성물로서,
    멀티머화제는 10 내지 10,000 나노미터의 직경 및/또는 약 10,000 내지 약 1,000,000 달톤의 분자량을 가지며;
    TLR9 작용물질은 서열 5'-TCGNs-3' (SEQ ID NO:1)을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 각각의 N은 독립적으로 선택된 뉴클레오사이드이며, s는 4 내지 47이고;
    종양 항원은 약 9 내지 약 1000개의 아미노산의 폴리펩타이드를 포함하며;
    TLR9 작용물질 및 종양 항원은 각각 하나 이상의 공유 결합에 의해 멀티머화제와 회합되거나, 또는 각각 흡착에 의해 멀티머화제와 회합되는, 조성물.
  50. 제 49 항에 있어서, 멀티머화제는 약 500 내지 약 10,000 마이크로미터의 직경을 가지는 수산화 알루미늄 복합체이고, TLR9 작용물질 및 종양 항원은 각각 흡착에 의해 동일한 복합체와 회합되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  51. 제 50 항에 있어서, 수산화 알루미늄 복합체는 약 0.5 내지 약 5.0 마이크로미터의 직경을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  52. 제 49 항에 있어서, 멀티머화제는 다당이고, TLR9 작용물질 및 종양 항원은 각각 하나 이상의 공유 결합에 의해 다당의 동일한 분자와 회합되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  53. 제 52 항에 있어서, 다당은 수크로오스와 에피클로로히드린, 덱스트란, 만난, 키토산, 아가로오스, 및 전분의 분지된 코폴리머로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  54. 제 53 항에 있어서, 다당은 약 100,000 내지 약 700,000 달톤의 분자량을 가지는, 수크로오스와 에피클로로히드린의 분지된 코폴리머인 것을 특징으로 하는 조성물.
  55. 제 52 항 내지 제 54 항 중 어느 한 항에 있어서, 입자는 식 (I)의 화합물인 것을 특징으로 하는 조성물:
    [D-L1-L2-(PEG)-L3]x-F-[L3-(PEG)-L2-A]t (I),
    식에서,
    D는 TLR9 작용물질이고;
    L1은 알킬티오 기를 포함하는 제 1 링커이며;
    L2는 석신이미드 기를 포함하는 제 2 링커이고;
    L3은 아미드 기를 포함하는 제 3 링커이며;
    PEG는 폴리에틸렌 글리콜 (예컨대, -(OCH2CH2)n-, 여기서 n은 2 내지 80의 정수임)이고;
    t 및 x는 독립적으로 3 내지 200의 정수이며;
    A는 종양 항원이고; 및
    F는 다당으로, 에테르 기를 통해 L3에 연결된다.
  56. 제 49 항 내지 제 55 항 중 어느 한 항에 있어서, TLR9 작용물질은 5'-TCGNqAACGTTCGAACGTTCGAANr-3' (SEQ ID NO:4)로 구성되는 폴리뉴클레오타이드이고, 여기서 각각의 N은 독립적으로 선택된 뉴클레오사이드이며, q는　0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고, r은 0 내지 29인 것을 특징으로 하는 조성물.
  57. 제 56 항에 있어서, TLR9 작용물질은 5'-TCG AAC GTT CGA ACG TTC GAA CGT TCG AAT-3' (SEQ ID NO:6)으로 구성되는 폴리뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 조성물.
  58. 제 49 항 내지 제 55 항 중 어느 한 항에 있어서, TLR9 작용물질은 식 Nu1-Sp1-Nu2-Sp2-Nu3의 키메릭 화합물이고,
    식에서 Nu1, Nu2 및 Nu3은 길이가 7 내지 50개의 뉴클레오타이드인 독립적으로 선택된 핵산 모이어티이며, Nu1은 서열 5'-TCGNs-3'로 구성되고, 여기서 s는 4 내지 47이며;
    Sp1 및 Sp2는 헥사에틸렌 글리콜 (HEG), 트라이에틸렌 글리콜 (TEG), 프로필, 부틸 및 헥실로 구성되는 군의 적어도 하나의 구성원을 포함하는 동일하거나 상이한 비 핵산 스페이서 모이어티이고;
    Sp1은 Nu1 및 Nu2에 공유 결합되며, Sp2는 Nu2 및 Nu3에 공유 결합되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  59. 제 58 항에 있어서, TLR9 작용물질은
    5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:5) 또는
    5'-TCGCCGG-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGCCGG-3' (SEQ ID NO:72)와 같이 3개의 핵산 모이어티 및 2개의 헥사에틸렌 글리콜 (HEG) 스페이서를 포함하는 키메릭 화합물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  60. 제 49 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 항원은 길이가 약 10 내지 약 100개의 아미노산인 폴리펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  61. 제 60 항에 있어서, 종양 항원은 2개 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질이고, 각각의 폴리펩타이드는 상이한 종양 항원으로부터의 아미노산 서열 또는 동일한 종양 항원으로부터의 비연속성 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  62. 제 61 항에 있어서, 융합 단백질은 제 1 폴리펩타이드 및 제 2 폴리펩타이드를 포함하고, 각각의 폴리펩타이드는 동일한 종양 항원으로부터의 비연속성 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  63. 제 60 항 내지 제 62 항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 항원은 포유류 대상체로부터의 정상 세포에 존재하는 유전자에 비해 돌연변이를 포함하는 유전자에 의해 암호화된 네오항원을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  64. 제 60 항 내지 제 62 항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 항원은 종양에 의해 발현된 바이러스 항원을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  65. 제 60 항에 있어서, 종양 항원은 인간 암/고환 항원 1 (CTAG1) 단백질 또는 그것의 단편의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  66. 제 60 항에 있어서, 종양 항원은 SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, 및 그것들의 조합으로 구성되는 군 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  67. 식 (I)의 화합물의 제조 방법으로서:
    [D-L1-L2-(PEG)-L3]x-F-[L3-(PEG)-L2-A]t (I),
    식에서,
    D는 TLR9 작용물질이고;
    L1은 알킬티오 기를 포함하는 제 1 링커이며;
    L2는 석신이미드 기를 포함하는 제 2 링커이고;
    L3은 아미드 기를 포함하는 제 3 링커이며;
    PEG는 폴리에틸렌 글리콜 (예컨대, -(OCH2CH2)n-, 여기서 n은 2 내지 80의 정수임)이고;
    t 및 x는 독립적으로 3 내지 200의 정수이며;
    A는 약 9 내지 약 1000개의 아미노산의 폴리펩타이드를 포함하는 종양 항원이고; 및
    F는 약 10,000 내지 약 1,000,000 달톤의 분자량을 가지는 다당이고, 에테르 기를 통해 L3에 연결되며,
    TLR9 작용물질은 서열 5'-TCGNs-3'를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 s는 4 내지 47이며, 각각의 N은 뉴클레오사이드이고, 뉴클레오타이드들 사이의 및 3'-말단 뉴클레오타이드와 L1 사이의 하나 이상의 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합이며, 및
    A는 약 9 내지 약 1000개의 아미노산의 폴리펩타이드를 포함하는 종양 항원이고 적어도 하나의 티올 기를 포함하며,
    상기 방법은
    식 D-L1a-SH (식에서 D는 식 (I)에 대해 규정된 것과 같고 L1a는 (CH2)m이며, 이때 m은 2 내지 9의 정수임)의 화합물을 식 (II)의 화합물과 반응시키는 단계, 및 식 A의 화합물을 식 (II)의 화합물과 반응시키는 단계를 포함한다:
    [L2a-(PEG)-L3]y-F (II)
    식에서, L3, PEG 및 F는 식 (I)에 대해 규정된 것과 같고;
    L2a는
    Figure pct00044
    이며;
    y는 3 내지 350의 정수이고; 단 y는 t와 x의 합보다 적지 않다.
  68. 제 67 항에 있어서, 방법은 식 D-L1a-SH의 화합물을, 중간체를 형성하기 위하여 식 (II)의 화합물과 반응시키는 단계, 및 계속해서 식 A의 화합물을 중간체와 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  69. 제 67 항에 있어서, 방법은 식 D-L1a-SH의 화합물 및 식 A의 화합물을 식 (II)의 화합물과 동시에 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  70. 제 67 항 내지 제 69 항 중 어느 한 항에 있어서, 반응은 구아니딘 염산염을 포함한 매질에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  71. 제 67 항 내지 제 70 항 중 어느 한 항에 있어서, D는 식 Nu1-Sp1-Nu2-Sp2-Nu3의 키메릭 화합물이고,
    식에서 Nu1, Nu2 및 Nu3은 길이가 7 내지 50개의 뉴클레오타이드인 독립적으로 선택된 핵산 모이어티이며, Nu1은 서열 5'-TCGNs-3'로 구성되고, 이때 s는 4 내지 47이며;
    Sp1 및 Sp2는 헥사에틸렌 글리콜 (HEG), 트라이에틸렌 글리콜 (TEG), 프로필, 부틸 및 헥실로 구성되는 군의 적어도 하나의 구성원을 포함하는 동일하거나 상이한 비 핵산 스페이서 모이어티이고;
    Sp1은 Nu1 및 Nu2에 공유 결합되며, Sp2는 Nu2 및 Nu3에 공유 결합되는
    것을 특징으로 하는 방법.
  72. 제 71 항에 있어서, Nu2는 서열 5'-AACGTTNm-3' (여기서 m은 1 내지 44임) (SEQ ID NO:73)으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  73. 제 72 항에 있어서, Nu3은 서열 5'-AACGTTNm-3' (여기서 m은 1 내지 44임) (SEQ ID NO:73)으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  74. 제 73 항에 있어서, D는
    5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:5), 또는
    5'-TCGCCGG-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGCCGG-3' (SEQ ID NO:72)인 것을 특징으로 하는 방법.
  75. 제 67 항 내지 제 74 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  76. 제 75 항에 있어서, 적어도 하나의 시스테인 잔기는 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  77. 제 67 항 내지 제 76 항 중 어느 한 항에 있어서, 다당은 수크로오스와 에피클로로히드린, 덱스트란, 만난, 키토산, 아가로오스, 및 전분의 분지된 코폴리머로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  78. 제 77 항에 있어서, 다당은 약 100,000 내지 약 700,000 달톤의 분자량을 가지는, 수크로오스와 에피클로로히드린의 분지된 코폴리머인 것을 특징으로 하는 방법.
  79. 각각이 흡착에 의하여 생체에 적합한 멀티머화제와 회합되어 있는 TLR9 작용물질 및 종양 항원을 포함하는 입자의 제조 방법으로서,
    멀티머화제는 약 0.5 내지 약 25 마이크로미터의 직경을 가지는 수산화 알루미늄 복합체이고,
    TLR9 작용물질은 서열 5'-TCGNs-3' (SEQ ID NO:1)을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 이때 s는 4 내지 47이고 각각의 N은 뉴클레오사이드이며,
    종양 항원은 약 9 내지 약 1000개의 아미노산의 폴리펩타이드를 포함하고,
    상기 방법은
    약 5% 내지 약 30% 아이소프로판올을 함유한 수용액에 용해된 종양 항원을 완충액에 평형화된 수산화 알루미늄 복합체에 첨가하는 단계, 및 TLR9 작용물질을 완충액에 평형화된 수산화 알루미늄 복합체에 첨가하는 단계를 포함하며,
    여기서 완충액은 약 6 내지 약 9의 pH 범위에 있고 완충액은 포스페이트 완충액이 아닌, 방법.
  80. 제 79 항에 있어서, 수산화 알루미늄 복합체는 약 0.5 내지 약 5.0 마이크로미터의 직경을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  81. 제 80 항에 있어서, 완충액은 약 7 내지 약 8의 pH 범위에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  82. 제 79 항 내지 제 81 항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 항원은 약 10% 내지 약 20%의 아이소프로판올을 함유한 수용액에 용해되는 것을 특징으로 하는 방법.
  83. 제 79 항 내지 제 82 항 중 어느 한 항에 있어서, TLR9 작용물질은 약 7의 pH를 가지는 아세테이트 완충액에 용해되는 것을 특징으로 하는 방법.
  84. 제 79 항 내지 제 83 항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 항원 및 TLR9 작용물질은 동시에 수산화 알루미늄 복합체에 흡착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  85. 제 79 항 내지 제 83 항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 항원이 먼저 수산화 알루미늄 복합체에 흡착되고 이어서 TLR9 작용물질이 흡착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  86. 제 79 항 내지 제 83 항 중 어느 한 항에 있어서, TLR9 작용물질이 먼저 수산화 알루미늄 복합체에 흡착되고 이어서 종양 항원이 흡착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  87. 제 79 항 내지 제 86 항 중 어느 한 항에 있어서, TLR9 작용물질은 5'-TCGNqAACGTTCGAACGTTCGAANr-3' (SEQ ID NO:4)로 구성되는 폴리뉴클레오타이드이고, 이때 각각의 N은 독립적으로 선택된 뉴클레오사이드이며, q는　0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고, r은 0 내지 29인 것을 특징으로 하는 방법.
  88. 제 87 항에 있어서, TLR9 작용물질은 5'-TCG AAC GTT CGA ACG TTC GAA CGT TCG AAT-3' (SEQ ID NO:6)으로 구성되는 폴리뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 방법.
  89. 제 79 항 내지 제 86 항 중 어느 한 항에 있어서, TLR9 작용물질은 식 Nu1-Sp1-Nu2-Sp2-Nu3의 키메릭 화합물이고,
    식에서 Nu1, Nu2 및 Nu3은 길이가 7 내지 50개의 뉴클레오타이드인 독립적으로 선택된 핵산 모이어티이며, Nu1은 서열 5'-TCGNs-3'로 구성되고, 이때 s는 4 내지 47이며,
    Sp1 및 Sp2는 헥사에틸렌 글리콜 (HEG), 트라이에틸렌 글리콜 (TEG), 프로필, 부틸 및 헥실로 구성되는 군의 적어도 하나의 구성원을 포함하는 동일하거나 상이한 비 핵산 스페이서 모이어티이고,
    Sp1은 Nu1 및 Nu2에 공유 결합되며, Sp2는 Nu2 및 Nu3에 공유 결합되는
    것을 특징으로 하는 방법.
  90. 제 89 항에 있어서, Nu2는 서열 5'-AACGTTNm-3' (m은 1 내지 44임) (SEQ ID NO:73)으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  91. 제 90 항에 있어서, Nu3은 서열 5'-AACGTTNm-3' (m은 1 내지 44임) (SEQ ID NO:73)으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  92. 제 89 항에 있어서, TLR9 작용물질은
    5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:5), 또는
    5'-TCGCCGG-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGCCGG-3' (SEQ ID NO:72)인 것을 특징으로 하는 방법.
  93. 제 67 항 내지 제 92 항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 항원은 길이가 약 10 내지 약 100개의 아미노산의 폴리펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  94. 제 93 항에 있어서, 종양 항원은 2개 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질이고, 각각의 폴리펩타이드는 상이한 종양 항원으로부터의 아미노산 서열 또는 동일한 종양 항원으로부터의 비연속성 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  95. 제 94 항에 있어서, 융합 단백질은 제 1 폴리펩타이드 및 제 2 폴리펩타이드를 포함하고, 각각의 폴리펩타이드는 동일한 종양 항원으로부터의 비연속성 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  96. 제 93 항 내지 제 95 항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 항원은 포유류 대상체로부터의 정상 세포에 존재하는 유전자에 비해 돌연변이를 포함하는 유전자에 의해 암호화된 네오항원을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  97. 제 93 항 내지 제 95 항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 항원은 종양에 의해 발현된 바이러스 항원을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  98. 제 93 항에 있어서, 종양 항원은 인간 암/고환 항원 1 (CTAG1) 단백질 또는 그것의 단편의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  99. 제 93 항에 있어서, 종양 항원은 SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, 및 그것들의 조합으로 구성되는 군 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  100. 멸균된 면역원성 조성물의 제조 방법으로서,
    (a) 유기 용매를 포함한 수용액에 하나 이상의 펩타이드 항원을 용해시켜서 수성 펩타이드 용액을 제조하는 단계;
    (b) 수성 펩타이드 용액을 수산화 알루미늄 복합체를 포함한 슬러리와 접촉시켜서 수산화 알루미늄 복합체에 흡착된 펩타이드 항원을 포함하는 입자들을 제조하는 단계;
    (c) 펩타이드-수산화 알루미늄 입자를 분리하여 중성 완충액에 복원시켜서 완충된 펩타이드-수산화 알루미늄 입자 용액을 제조하는 단계;
    (d) 완충된 펩타이드-수산화 알루미늄 입자 용액을 오토클레이빙하여 멸균된 입자 용액을 제조하는 단계;
    (e) TLR9 작용물질을 중성 완충액에 용해시켜서 완충된 TLR9 작용물질 용액을 제조하는 단계;
    (f) 완충된 TLR9 작용물질 용액을 약 0.2 마이크로미터 필터를 통해 통과시켜서 멸균된 TLR9 작용물질 용액을 제조하는 단계; 및
    (g) 멸균된 입자 용액과 멸균된 TLR9 작용물질 용액을 접촉시켜서 각각이 수산화 알루미늄 복합체에 흡착된 TLR9 작용물질 및 펩타이드 항원을 포함하는 입자들을 포함하는 멸균된 면역원성 용액을 제조하는 단계를 포함하고;
    여기서 하나 이상의 펩타이드 항원은 각각 길이가 약 9 내지 2000개의 아미노산인 폴리펩타이드를 포함하는 종양 항원이고,
    수산화 알루미늄 복합체는 약 500 내지 약 5,000 나노미터의 직경을 가지며,
    TLR9 작용물질은 길이가 12 내지 50개의 뉴클레오타이드의 CpG-함유 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
  101. 제 100 항에 있어서, 유기 용매는 아이소프로필 알코올, 다이메틸 설폭사이드, 다이메틸포름아미드, 포름산, 에탄올, 2-부탄올, 아세톤, 아세트산, 및 그것들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  102. 제 100 항 또는 제 101항에 있어서, 종양 항원은 각각 길이가 약 8 내지 약 60개의 아미노산의 폴리펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  103. 제 100 항 내지 제 102항 중 어느 한 항에 있어서,중성 완충액은 약 6 내지 약 9의 pH 범위에 있고 완충액은 포스페이트 완충액이 아닌 것을 특징으로 하는 방법.
  104. 제 100 항 내지 제 103항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 내지 (d)는 단계 (e) 및 (f) 전에 또는 동시에 일어나는 것을 특징으로 하는 방법.
  105. 제 100 항 내지 제 104항 중 어느 한 항에 있어서, 멸균된 면역원성 조성물은 각각의 펩타이드 항원 대 수산화 알루미늄 복합체의 비율 및 TLR9 작용물질 대 수산화 알루미늄 복합체의 비율이 약 0.1 내지 약 5.0 (중량/중량)[펩타이드 : alum : TLR9 = 0.1 내지 5.0 : 1:0 : 0.1 내지 5.0]의 범위 내에 있는 입자들의 불균일한 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  106. 제 100 항 내지 제 105항 중 어느 한 항에 있어서, TLR9 작용물질은 서열 5'-TCGNs-3' (SEQ ID NO:1) (s는 4 내지 47이고 각각의 N은 뉴클레오사이드임)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  107. 제 106 항에 있어서, TLR9 작용물질은 TCGNqAACGTTCGAACGTTCGAANr-3' (SEQ ID NO:4)로 구성되는 폴리뉴클레오타이드이고, 여기서 각각의 N은 독립적으로 선택된 뉴클레오사이드이며, q는　0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고, r은 0 내지 29인 것을 특징으로 하는 방법.
  108. 제 107 항에 있어서, TLR9 작용물질은 5'-TCG AAC GTT CGA ACG TTC GAA CGT TCG AAT-3' (SEQ ID NO:6)으로 구성되는 폴리뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 방법.
  109. 제 108 항에 있어서, 멸균된 면역원성 조성물은 각각의 펩타이드 항원 대 수산화 알루미늄 복합체의 비율이 약 0.6 내지 1.2 : 1.0 (w/w)의 범위에 있고, TLR9 작용물질 대 수산화 알루미늄 복합체의 비율이 약 1.7 내지 3.4 : 1.0 (w/w)의 범위에 있는 입자들의 불균일한 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  110. 제 109 항에 있어서, 각각의 펩타이드 항원 대 수산화 알루미늄 복합체의 비율은 약 1.2 : 1.0 (w/w)이고, TLR9 작용물질 대 수산화 알루미늄 복합체의 비율은 약 3.4 : 1.0 (w/w)인 것을 특징으로 하는 방법.
  111. 제 100 항 내지 제 105항 중 어느 한 항에 있어서, TLR9 작용물질은 식 Nu1-Sp1-Nu2-Sp2-Nu3의 키메릭 화합물이고,
    식에서 Nu1, Nu2 및 Nu3은 길이가 7 내지 50개의 뉴클레오타이드인 독립적으로 선택된 핵산 모이어티이며, Nu1은 서열 5'-TCGNs-3'로 구성되고, 이때 s는 4 내지 47이며,
    Sp1 및 Sp2는 헥사에틸렌 글리콜 (HEG), 트라이에틸렌 글리콜 (TEG), 프로필, 부틸 및 헥실로 구성되는 군의 적어도 하나의 구성원을 포함하는 동일하거나 상이한 비 핵산 스페이서 모이어티이고,
    Sp1은 Nu1 및 Nu2에 공유 결합되며, Sp2는 Nu2 및 Nu3에 공유 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  112. 제 111 항에 있어서, TLR9 작용물질은
    5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:5) 또는
    5'-TCGCCGG-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGCCGG-3' (SEQ ID NO:72)와 같이 3개의 핵산 모이어티 및 2개의 헥사에틸렌 글리콜 (HEG) 스페이서를 포함하는 키메릭 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
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