JP2023515850A - 腫瘍免疫増強剤、その調製方法および適用 - Google Patents

Abstract

腫瘍免疫増強剤、その医薬組成物および調製方法を提供し、当該増強剤は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～９に示される配列をコア構造とする一つまたは複数の種類のポリペプチドを含み、腫瘍ワクチンを調製するために使用されることができる。

Description

発明の詳細な説明

［技術分野］
本発明は、免疫の分野に関し、より具体的には、腫瘍免疫増強剤およびその調製方法と適用に関する。

［背景技術］
腫瘍発生の根本的な原因は、異常な細胞成長を促進する組織細胞の遺伝物質の突然変異である。腫瘍細胞の遺伝子突然変異の数は、数千にもなる可能性があるが、実際に腫瘍発生を開始する突然変異遺伝子（ドライバー遺伝子）は、二つまたは三つしか関与しない可能性がある。一部のドライバー遺伝子は、腫瘍治療薬の設計の標的として使用された。研究によると、このような標的薬の臨床的な治療効果は、腫瘍細胞における他の非ドライバー突然変異遺伝子および非標的ドライバー遺伝子の発現状況に依存するため、このような薬物の臨床的な治療効果は、非常に限られている。腫瘍ワクチンの最新の研究の進歩は、アミノ酸残基のコーディングを変更するあれらの遺伝子突然変異を使用して腫瘍を治療できるワクチンを設計することができることを示し、これは、腫瘍治療における重要なマイルストーンである。

突然変異をコードする遺伝子がタンパク質として発現されると、抗原提示細胞によって分解され、腫瘍新生抗原と呼ばれるＴ細胞によって識別できる腫瘍特異的抗原を産生すことができる。新抗原を識別するＴ細胞は、中枢性免疫寛容によって制限されないため、新抗原は、免疫原性が高く、腫瘍特異的殺傷性ＣＤ８^＋Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を誘発する可能性があると考えられる。臨床研究により、このような新生抗原特異的ＣＴＬは、腫瘍組織に存在することが確認され、また、このようなＣＴＬの活性は、Ｔ細胞成長因子ＩＬ―２、免疫チェックポイント阻害剤（ＰＤ―１およびＣＴＬＡ―４モノクローナル抗体）ならびにインビトロでの拡張ＴＩＬｓの注入等の様々な腫瘍治療方法の治療効果を決定する。

ほとんどの腫瘍の新生抗原は、患者固有であるため、新生抗原に対するワクチンは、各患者の遺伝子突然変異に基づいて調整する必要がある。さらに、単一の腫瘍における遺伝の突然変異は、ポリクローナル特性を有する。腫瘍のこのような異種性に対処するために、腫瘍ワクチンは、マルチ標的設計戦略を採用する必要がある。公表された腫瘍ワクチンの臨床研究で使用された新生抗原Ｔエピトープの数は、２０個以上である。ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞応答の検出により、新生抗原の約１／３のみが抗腫瘍Ｔ細胞応答を誘発することができ、ここで、９０％以上のＴ細胞は、ＣＤ４^＋であることが分かる。腫瘍ワクチンの治療効果を達成する必要があるため、腫瘍特異的殺傷性ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を刺激する必要がある。このような細胞の活性化および記憶の形成、ならびに腫瘍浸潤には、Ｉ型ヘルパーＴ細胞を必要とする。従って、現在癌ワクチンに使用される補トンとの新生抗原は、Ｉ型ヘルパーＴ細胞応答を効果的に誘発することはできないと推測されることができる。

Ｉ型ヘルパーＴ細胞応答を増強するための一つの方法は、外因性Ｔヘルパーポリペプチドを使用することである。例えば、破傷風毒素Ｔヘルパーペプチドおよびｐａｎ―ＤＲペプチド（ＰＡＲＤＥ）は、臨床試験に使用された。その結果、これらのポリペプチドは、抗腫瘍ＣＤ８^＋ＣＴＬ応答を効果的に誘導することはできないことが分かる。

要約すると、当技術分野では、まだ満足できる抗腫瘍免疫増強剤が不足している。従って、当技術分野では、腫瘍免疫応答に対する有効な免疫増強剤を開発する必要がある。

［発明の概要］
［発明が解決しようとする課題］
本発明の目的は、有効な抗腫瘍免疫応答免疫増強剤およびその調製方法と適用を提供することである。

［課題を解決するための手段］
本発明の第１の態様は、腫瘍免疫増強剤を提供し、前記腫瘍免疫増強剤は、式Ｉの構造を有する一つまたは複数の種類のポリペプチド、またはその薬学的に許容される塩を含み、
Ｚ０―Ｚ１―Ｚ２（Ｉ）
式において、
Ｚ０は、なしであるか、または１～１０個のアミノ酸残基からなるペプチドセグメントであり、
Ｚ２は、なしであるか、または１～１０個のアミノ酸残基からなるペプチドセグメントであり、
Ｚ１は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～９に示されるようなポリペプチド、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～９のアミノ酸配列の一つ、二つまたは三つのアミノ酸残基の置換、欠失または付加によって形成され、かつヒトおよびマウスのＩＩ型組織適合性抗原に結合できる誘導ポリペプチドからなる群から選択されるペプチドセグメントである。

別の好ましい例において、前記誘導ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～９に示されるポリペプチドのヒトおよびマウスのＩＩ型組織適合性抗原に対する≧７０％の結合活性を保持する。

別の好ましい例において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～９に示されるポリペプチドに対する前記誘導ポリペプチドの同一性は、≧８０％、好ましくは≧９０％、より好ましくは≧９５％である。

別の好ましい例において、前記組織適合性抗原に結合するＺ１のＩＣ_５０は、５～５０ｎｍである。
別の好ましい例において、Ｚ０とＺ２とが異なる場合、なしである。

別の好ましい例において、Ｚ０およびＺ２は、少なくとも２～８個、好ましくは３～６個の親水性アミノ酸残基を含む。
別の好ましい例において、Ｚ２がなしであり、かつＺ０が２～８個である場合、好ましくは３～６個の親水性アミノ酸残基からなるペプチドセグメントである。

別の好ましい例において、Ｚ０がなしであり、かつＺ２が２～８個である場合、好ましくは３～６個の親水性アミノ酸残基からなるペプチドセグメントである。

別の好ましい例において、前記親水性アミノ酸は、アルギニン、リジンからなる群から選択される。
別の好ましい例において、Ｚ０およびＺ２のうちの少なくとも一つは、（Ａｒｇ）ｎ構造を含み、ここで、ｎは、３～６の正の整数である。

別の好ましい例において、前記式Ｉの構造は、Ｎ末端からＣ末端までの構造である。
別の好ましい例において、前記式Ｉの構造は、Ｃ末端からＮ末端までの構造である。

別の好ましい例において、「―」は、共有結合（例えば、ペプチド結合）であるか、またはＺ０がなしである場合、Ｚ０とＺ１との間の「―」は、存在しないか、またはＺ２がなしである場合、Ｚ１とＺ２との間の「―」は、存在しない。

別の好ましい例において、前記腫瘍免疫増強剤は、腫瘍免疫を増強する活性を有する。
別の好ましい例において、記腫瘍免疫増強剤は、殺傷性Ｔ細胞応答を誘発することができる。

別の好ましい例において、式Ｉの構造を有する前記ポリペプチドは、一つまたは複数のＣＤ４^＋Ｔｈエピトープペプチドを含む。
別の好ましい例において、式Ｉの構造を有する前記ポリペプチドは、ＣＤ４^＋Ｔ細胞抗原受容体リガンドである。

別の好ましい例において、前記腫瘍免疫増強剤は、Ｚ１がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される式Ｉの構造であるポリペプチド、Ｚ１がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される式Ｉの構造であるポリペプチドおよびＺ１がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示される式Ｉの構造であるポリペプチドを含む。

本発明の第２の態様は、多量体を提供し、前記多量体は、直列のｍ個の単量体によって形成され、腫瘍免疫を増強する機能を有し、ここで、ｍは、≧２の正の整数であり、前記各単量体は、それぞれ独立して、式Ｉの構造を有し、
Ｚ０―Ｚ１―Ｚ２（Ｉ）
式において、
Ｚ０は、なしであるか、または１～１０個のアミノ酸残基からなるペプチドセグメントであり、
Ｚ２は、なしであるか、または１～１０個のアミノ酸残基からなるペプチドセグメントであり、
Ｚ１は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～９に示されるようなポリペプチド、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～９のアミノ酸配列の一つ、二つまたは三つのアミノ酸残基の置換、欠失または付加によって形成され、かつ組織適合性抗原に結合できる誘導ポリペプチドからなる群から選択されるペプチドセグメントである。

別の好ましい例において、ｍは、２、３、４、５、または６である。
別の好ましい例において、二つの単量体の間は、ペプチド結合、またはペプチドリンカーによって直接結合される。

別の好ましい例において、前記ペプチドリンカーは、柔軟なペプチドリンカー、硬性ペプチドリンカー、またはその組み合わせである。
別の好ましい例において、前記ペプチドリンカーは、３～１０個のアミノ酸のペプチドリンカーである。

本発明の第３の態様は、ポリペプチドをコードする、単離された核酸分子を提供し、前記ポリペプチドは、式Ｉの構造を有するか、または前記ポリペプチドは、直列のｍ個の単量体によって形成される多量体であり、ここで、各単量体は、それぞれ独立して、式Ｉの構造を有し、ｍは、≧２の正の整数である。

別の好ましい例において、前記核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその組み合わせからなる群から選択される。
本発明の第４の態様は、
（ａ）本発明の第１の態様に記載の腫瘍免疫増強剤またはその薬学的に許容される塩、本発明の第２の態様に記載の多量体、本発明の第３の態様に記載の単離された核酸分子、および／または本発明の第４の態様に記載の医薬組成物、および
（ｂ）薬学的に許容されるベクターまたは賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。

別の好ましい例において、前記組成物の剤形は、注射剤である。
別の好ましい例において、前記組成物は、徐放性剤形である。
別の好ましい例において、前記組成物に含まれる本発明の第１の態様に記載の腫瘍免疫増強剤またはその薬学的に許容される塩、または本発明の第２の態様に記載の多量体は、
タンパク質分子（無傷の分子、サブユニット、ドメイン、ポリペプチドおよび組換え操作分子）、脂質、多糖類、脂質と多糖類との複合体からなる群から選択される形態で存在することができる。

別の好ましい例において、前記医薬組成物は、
（ｃ）腫瘍抗原をさらに含む。
別の好ましい例において、前記腫瘍抗原は、腫瘍新生抗原ペプチドである。

別の好ましい例において、前記腫瘍抗原は、元々抗腫瘍免疫応答を効果的に引き出すことができない抗原である。
別の好ましい例において、前記腫瘍抗原は、天然、人工合成、またはその組み合わせである。

別の好ましい例において、前記腫瘍抗原は、短いペプチド、無傷のタンパク質、腫瘍細胞溶解物、不活化腫瘍細胞、またはその組み合わせからなる群から選択される。

別の好ましい例において、前記腫瘍抗原は、悪性黒色腫、乳がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、腸がん、肝臓がん、食道がん、子宮頸がん、膀胱がん、腎細胞がん、多形性神経膠腫を含むがこれらに限定されない、コドン中程度に高い頻度の非同義突然変異を有する悪性腫瘍に由来する。

別の好ましい例において、前記医薬組成物は、
（ｄ）ＤＣ活性化剤をさらに含む。
別の好ましい例において、前記ＤＣ活性化剤は、ｗ／ｏ剤およびｏ／ｗ剤を含むがこれらに限定されない、ナノ製剤である。

別の好ましい例において、前記ＤＣ活性化剤は、自己組織化ナノ製剤である。
別の好ましい例において、前記ＤＣ活性化剤は、リポソーム、ウイルスキャプシド、不活化細菌からなる群から選択される。

別の好ましい例において、前記医薬組成物は、腫瘍ワクチン組成物である。
別の好ましい例において、前記ワクチンは、全細胞ワクチン、細胞溶解物ワクチン、腫瘍組織溶解物ワクチン、腫瘍細胞エクソソームワクチンからなる群から選択される。

本発明の第５の態様は、物質の用途を提供し、前記物質は、本発明の第１の態様に記載の腫瘍免疫増強剤またはその薬学的に許容される塩、本発明の第２の態様に記載の多量体、または本発明の第３の態様に記載の単離された核酸分子からなる群から選択され、また、前記物質は、腫瘍抗原の抗腫瘍活性を改選するための薬物の調製、または抗腫瘍ワクチン（腫瘍ワクチン）組成物の調製に使用される。

別の好ましい例において、前記薬物またはワクチン組成物は、
（ａ）ヘルパーＴ細胞応答、好ましくはＩ型ヘルパーＴ細胞応答の誘発、
（ｂ）ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答、好ましくは腫瘍特異的殺傷性ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答の誘発、
（ｃ）Ｂ細胞応答の誘発、
（ｄ）抗腫瘍細胞治療、
（ｅ）免疫チェックポイント阻害剤等の他の治療手段との併用からなる群から選択される一つまたは複数の種類の用途のためにさらに使用される。

本発明の第６の態様は、薬箱を提供し、前記薬箱は、
（ｉ）第１の容器、および当該第１の容器に盛る本発明の第１の態様に記載の腫瘍免疫増強剤、または前記腫瘍免疫増強剤を含む薬物、
（ｉｉ）第２の容器、および当該第２の容器に盛る腫瘍治療薬、ならびに
（ｉｉｉ）前記腫瘍免疫増強剤および前記腫瘍治療薬を同時に投与することによって癌を治療する説明が記載される説明書を含む。

別の好ましい例において、前記腫瘍治療薬は、免疫チェックポイント阻害剤、化学療法剤、放射線療法剤、温熱療法剤、腫瘍溶解性ウイルス、免疫細胞治療剤を含む。

別の好ましい例において、前記免疫細胞治療剤は、ＣＡＲ―Ｔ細胞、ＣＡＲ―ＮＫ細胞、ＴＣＲ―Ｔ細胞、ＤＣ細胞またはその組み合わせを含む。

本発明の第７の態様は、
（ｉ）必要とする対象に本発明の第１の態様に記載の腫瘍免疫増強剤またはその薬学的に許容される塩、本発明の第２の態様に記載の多量体、本発明の第３の態様に記載の単離された核酸分子または本発明の第４の態様に記載の医薬組成物を投与する段階と、
（ｉｉ）必要とする対象に腫瘍治療薬を投与する段階とを含む、癌を治療する方法を提供する。

別の好ましい例において、前記段階（ｉ）および（ｉｉ）は、同時または連続して実行することができる。
別の好ましい例において、前記必要とする対象は、腫瘍患者を指す。

別の好ましい例において、段階（ｉｉ）において、従来の投与用量および投与頻度に従って前記腫瘍治療薬を投与する。
別の好ましい例において、前記方法は、免疫チェックポイント阻害剤、化学療法、放射線療法、温熱療法、腫瘍溶解性ウイルス等の既存の腫瘍治療手段を、本出願の腫瘍免疫増強剤と併用することである。

別の好ましい例において、前記方法は、細胞治療を本出願の腫瘍免疫増強剤と併用することであり、これらの細胞治療は、ＤＣ細胞治療、ＣＡＲ―Ｔ細胞治療、ＣＡＲ―ＮＫ細胞治療等の既存の細胞治療手段を含むが、これらに限定されない。

本発明の第８の態様は、必要とする対象に本発明の第１の態様に記載の腫瘍免疫増強剤またはその薬学的に許容される塩、本発明の第２の態様に記載の多量体、本発明の第３の態様に記載の単離された核酸分子、または本発明の第４の態様に記載の医薬組成物を投与する段階を含む、哺乳動物の腫瘍を予防および／または治療する方法を提供する。

別の好ましい例において、前記対象は、ヒトである。
別の好ましい例において、前記腫瘍抗原は、黒色腫、膵臓がん、前立腺がん、乳がん、肺がん、腸がん、肝臓がん、食道がん、子宮頸がん、膀胱がん、腎細胞がん、多形性神経膠腫等の、中程度頻度のコドンの非同義突然変異を有する悪性腫瘍に由来する。

別の好ましい例において、前記方法は、必要とする対象に腫瘍抗原を投与する段階をさらに含む。
別の好ましい例において、前記方法は、必要とする対象に腫瘍治療薬を投与する段階をさらに含む。

［発明の効果］
本発明の範囲内で、本発明の上記の各技術的特徴と以下（例えば、実施例）に具体的に説明される各技術的特徴との間を、互いに組み合わせることにより、新しいまたは好ましい技術的解決策を構成することができることに理解されたい。スペースに限りがあるため、ここでは繰り返さない。

本発明の一実施例において、ＵＴｈＥがマウス黒色腫の弱い新生抗原の抗腫瘍免疫応答を増強することを示す。 本発明の別の実施例において、ＵＴｈＥがマウス黒色腫の弱い新生抗原の抗腫瘍免疫応答（腫瘍予防）を増強することを示す。図２Ａおよび図２Ｂは、それぞれ腫瘍注射後の日数の関数としての腫瘍体積の変化を示す。 本発明の別の実施例において、ＵＴｈＥがマウス黒色腫に対する治療効果を効果的に増強することを示す。 一実施例において、ワクチン免疫後のマウス血清サンプルにおける抗ＵＴｈＥ抗体の検出結果を示す。 別の実施例において、ワクチン免疫後のマウス血清サンプルにおける抗ＵＴｈＥ抗体の検出結果を示す。 別の実施例において、ワクチン免疫後のマウス血清サンプルにおける抗新生抗原抗体の検出結果を示す。 別の実施例において、ワクチン免疫後のマウス血清サンプルにおける抗新生抗原抗体の検出結果を示す。 別の実施例において、ワクチン免疫後のマウス脾臓における腫瘍特異的ＣＤ８^＋ＣＴＬの検出結果を示す。 別の実施例において、免疫化されたマウス脾臓における腫瘍特異的ＣＤ８^＋ＣＴＬの検出結果を示す。 別の実施例において、腫瘍標的細胞に対する殺傷性ＣＤ８^＋ＣＴＬの効果的な殺傷作用を示す。 別の実施例において、ＵＴｈＥがマウス肺がん（ＬＬＣ）の弱い抗原の免疫原性および腫瘍に対する阻害効果を効果的に増強することを示す。 別の実施例において、ＵＴｈＥがマウス黒色腫（Ｂ１６Ｆ１０）の弱い抗原の免疫原性および腫瘍に対する阻害効果を効果的に増強することを示す。 別の実施例において、ＵＴｈＥがマウス前立腺がん（ＲＭ―１）の弱い抗原の免疫原性および腫瘍に対する阻害効果を効果的に増強することを示す。 別の実施例において、ＵＴｈＥがマウス膵臓がん（ＰａｎＣ―０２）の弱い抗原の免疫原性および腫瘍に対する阻害効果を効果的に増強することを示す。 別の実施例において、腫瘍細胞の殺傷に対するＵＴｈＥの用量効果関係および安全性（マウスの体重は安定する）を示す。 別の実施例において、Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＢａｌｂ／ＣマウスにおけるＵＴｈＥ候補ペプチド、即ち、ＵＴｈＥ１―７の腫瘍阻害効果を示す。

本発明者らは、広範囲にわたる詳細な研究の後、腫瘍新生抗原ワクチン特異的ＣＤ８^＋ＣＴＬ免疫応答を増強することができる、ジフテリアおよび破傷風毒素タンパク質に由来する一般的なＴｈエピトープペプチドを初めて発見した。実験は、本発明のこのようなポリペプチドが腫瘍ワクチンの抗腫瘍免疫応答効果を増強することができることを示す。これに基づいて、本発明を完成した。

具体的には、本発明は、１５～２１個のアミノ酸残基からなるポリペプチド分子であり、マウスＩＩ型組織適合性抗原分子と中程度の親和性を有し、ＩＣ_５０が５～５０ｎｍである、ＵＴｈＥ１―ＵＴｈＥ９を提供する。これらのポリペプチド分子は、疎水性が強すぎるため、合成中に、Ｎ末端またはＣ末端に複数の親水性アミノ酸残基（例えば、アルギニン残基またはリジン残基）を付加する必要がある。これらのポリペプチド分子は、すべて一つまたは複数のＴｈエピトープを有し、８０％を超える人々でヘルパーＴ細胞応答を誘発する機能を支持することができる。

活性ポリペプチド
本発明において、「本発明のポリペプチド」、「ＵＴｈＥポリペプチド」、「Ｔｈエピトープペプチド」または「ＵＴｈＥ１――ＵＴｈＥ９」という用語は、交換可能に使用され、すべて式Ｉの構造を有するポリペプチドを指し、
Ｚ０―Ｚ１―Ｚ２（Ｉ）
式において、
Ｚ０は、なしであるか、または１～１０個のアミノ酸残基からなるペプチドセグメントであり、
Ｚ２は、なしであるか、または１～１０個のアミノ酸残基からなるペプチドセグメントであり、
Ｚ１は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～９に示されるようなポリペプチド、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～９のアミノ酸配列の一つ、二つまたは三つのアミノ酸残基の置換、欠失または付加によって形成され、かつＩＩ型組織適合性抗原に結合できる誘導ポリペプチドからなる群から選択されるペプチドセグメントである。

本発明のポリペプチドは、腫瘍免疫を増強する機能を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～９の配列の突然変異形態を含む。これらの突然変異形態は、１～４個（好ましくは１～３個、より好ましくは１～２個、最も好ましくは１個）のアミノ酸の欠失、挿入および／または置換、ならびにＣ末端および／またはＮ末端での一つまたは複数（通常は、４個以下、好ましくは３個以下、より好ましくは２個以下）のアミノ酸の付加または欠失を含む（これらに限定されない）。例えば、当技術分野において、性能が同様または類似なアミノ酸で置換する場合、通常タンパク質の機能を変更しない。例えば、Ｃ末端および／またはＮ末端での一つまたは複数のアミノ酸の付加または欠失も、通常タンパク質の構造および機能を変更しない。さらに、前記用語は、本発明のポリペプチドの単量体および多量体形態をさらに含む。当該用語は、線形および非線形のポリペプチド（例えば、環状ペプチド）をさらに含む。

本発明のポリペプチド分子の疎水性が過度に強いため、合成中に、Ｎ末端またはＣ末端に複数の親水性アミノ酸残基（例えば、アルギニン残基またはリジン残基）を付加する必要がある。本発明の典型的なポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～９に示されるポリペプチドのＮ末端またはＣ末端への３～６個のアルギニンの付加である。

本発明は、ＵＴＨＥポリペプチドの活性フラグメント、誘導体および類似体をさらに含む。本明細書で使用されるように、「フラグメント」、「誘導体」および「類似体」という用語は、腫瘍免疫を増強する機能または活性を実質的に保持するポリペプチドを指す。本発明のポリペプチドフラグメント、誘導体または類似体は、（ｉ）一つまたは複数の保存的または非保存的アミノ酸残基（好ましくは保存的アミノ酸残基）が置換されたポリペプチド、または（ｉｉ）一つまたは複数のアミノ酸残基には置換基を有するポリペプチド、または（ｉｉｉ）ＤＴＨＥポリペプチドと別の化合物（例えば、ポリエチレングリコール等のポリペプチドの半減期を延長する化合物）との融合によって形成されたポリペプチド、または（ｉｖ）追加のアミノ酸配列とこのポリペプチド配列との融合によって形成されたポリペプチド（リーダー配列、分泌配列または６Ｈｉｓ等のタグ配列と融合によって形成されるタンパク質）であり得る。本明細書の教示に従って、これらのフラグメント、誘導体および類似体は、当業者によく知られている範囲に属する。

好ましいクラスの活性誘導体とは、式Ｉのアミノ酸配列と比較して、最大４個、好ましくは最大３個、より好ましくは最大２個、最も好ましくは１個のアミノ酸が類似または同様の性質のアミノ酸に置き換えられることによってポリペプチドを形成する。これらの保存的に変異したポリペプチドは、好ましくは、表Ａによるアミノ酸の置き換えによって生成される。

本発明は、ＤＴＨＥポリペプチドの類似体をさらに提供する。これらの類似体は、天然ＤＴＨＥポリペプチドとの違いは、アミノ酸配列の違い、配列に影響を与えない修飾形態での違い、またはその両方であり得る。類似体は、天然Ｌ―アミノ酸とは異なる残基（例えば、Ｄ―アミノ酸）を有する類似体、および非天然または合成アミノ酸（例えば、β、γ―アミノ酸）を有する類似体をさらに含む。本発明のポリペプチドは、上記で例示された代表的なポリペプチドに限定されないことを理解されたい。

修飾（一般に一次構造を変更しない）形態は、インビボまたはインビトロでのポリペプチドのアセチル化またはカルボキシル化等の化学的に誘導された形態を含む。修飾は、例えば、ポリペプチドの合成およびプロセシングまたはさらなるプロセシング段階におけるグリコシル化修飾によって生成されるポリペプチド等の、グリコシル化をさらに含む。このような修飾は、ポリペプチドを、グリコシル化を行う酵素（例えば、哺乳動物のグリコシラーゼまたは脱グリコシラーゼ）に曝露することによって達成することができる。修飾形態は、リン酸化アミノ酸残基（例えば、ホスホチロシン、ホスホセリン、ホスホスレオニン）を有する配列をさらに含む。修飾されることにより、その抗タンパク質の加水分解性能を向上させるか、または溶解性能を最適化するポリペプチドをさらに含む。

本発明のポリペプチドは、薬学的にまたは生理学的に許容される酸または塩基に由来する塩の形態で使用されることができる。これらの塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、クエン酸、酒石酸、リン酸、乳酸、ピルビン酸、酢酸、コハク酸、シュウ酸、フマル酸、マレイン酸、オキサロ酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、またはイセチオン酸等の酸と形成される塩を含む（これらに限定されない）。他の塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウムまたはマグネシウム）と形成された塩、ならびにエステル、カルバメートまたは他の従来の「プロドラッグ」の形態を含む。

腫瘍免疫増強剤
本発明は、式Ｉの構造を有する一つまたは複数の種類のポリペプチドを含む、腫瘍免疫増強剤を提供する。

本発明の腫瘍免疫増強剤は、腫瘍新生抗原ワクチンの特異的ＣＤ８^＋ＣＴＬ免疫応答を増強することができ、腫瘍ワクチンの抗腫瘍免疫応答を増強する活性を有する。

好ましい実施形態において、本発明の腫瘍免疫増強剤は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１～３に示されるポリペプチドまたはその誘導ポリペプチドを含む。

腫瘍新生抗原ポリペプチド
遺伝子変異に基づいて癌細胞によって生成される特異的アミノ酸配列変異を有するタンパク質は、「新生抗原」（ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ、ＮｅｏＡｇ）と呼ばれる。これは、アミノ酸配列の変更がなければ、これらのタンパク質は、抗原性がないはずである。変異が発生すると、これらのタンパク質は、自己免疫細胞の注意を引き付け、一連の免疫応答を引き起こす。

本発明の腫瘍免疫増強剤は、腫瘍新生抗原、特に元々抗腫瘍免疫応答を効果的に誘発できない抗原の免疫応答を増強することができる。前記腫瘍抗原は、天然、人工合成、またはその組み合わせであり得る。前記腫瘍抗原は、短いペプチド、無傷のタンパク質、腫瘍細胞溶解物、またはその組み合わせであり得る。

好ましい実施形態において、四つの異なる黒色腫細胞Ｂ１６Ｆ１０新生抗原ペプチド（ＮｅｏＡｇ）がワクチンとして使用されるが、単独で投与される場合、抗原特異的抗腫瘍ＣＴＬを生成することはできない。

本発明に言及される細胞溶解物は、細胞を等体積のリン酸緩衝液に懸濁し、凍結融解法により細胞を破砕し、１００００ｇで１０分間遠心分離して、上清を細胞溶解物として使用して沈殿物除去する。

コード配列
本発明は、ＤＴＨＥポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにさらに関する。好ましいコード配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～９に示される短いペプチドをコードする。

本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ形態またはＲＮＡ形態であり得る。ＤＮＡは、コード鎖または非コード鎖であり得る。本発明のポリヌクレオチドの全長配列またはそのフラグメントは、通常、ＰＣＲ増幅法、組換え法または人工合成法によって得られることができる。現在、化学合成によって、本発明のポリペプチド（またはそのフラグメント、またはその誘導体）をコードするＤＮＡ配列を得ることができる。次に、当該ＤＮＡ配列を、当技術分野で知られている様々な既存のＤＮＡ分子（またはベクター等）および細胞に導入することができる。

本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、ならびに本発明のベクターまたはＵＴＨＥポリペプチドのコード配列で遺伝子操作された宿主細胞にも関する。

ＵＴｈＥポリペプチドの調製
本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチドまたは合成ポリペプチドであり得る。本発明のポリペプチドは、化学的に合成されることができるか、または組換えされることができる。対応的に、本発明のポリペプチドは、従来の方法によって人工的に合成することができるか、または組換え法によって生成することができる。

好ましい実施形態において、化学合成法によって、末端に６個のＡｒｇを有するＵＴｈＥポリペプチドを合成することができ、ＨＰＬＣ精製収率は、２０％を超え、純度は、９９．９％を超える。

好ましい方法は、液相合成技術または例えば、Ｂｏｃ固相法、Ｆｍｏｃ固相法または両方の方法の併用等の固相合成技術を使用することである。固相合成によりサンプルを迅速に得ることができ、標的ペプチドの配列特徴に応じて、適切なレジンベクターおよび合成システムを選択することができる。例えば、Ｆｍｏｃシステムにおいて好ましい固相ベクターは、ペプチドのＣ末端アミノ酸に結合したＷａｎｇレジンであり、Ｗａｎｇレジンの構造は、ポリスチレンであり、アミノ酸の間のアームは、４―アルコキシベンジルアルコールであり、２５％ヘキサヒドロピリジン／ジメチルホルムアミドで室温下で２０分間処理して、Ｆｍｏｃ保護基を除去し、所定のアミノ酸配列に従って、Ｃ末端からＮ末端に一つずつ伸長させる。合成完了後、４％ｐ―クレゾールを含むトリフルオロ酢酸を使用して、合成されたプロインスリン関連ペプチドをレジンから切断し、かつ保護基を除去し、ろ過してレジンを除去した後、エーテルで沈殿させることによって粗ペプチドを得ることができる。得られた生成物の溶液を凍結乾燥した後、ゲルろ過および逆相高圧液体クロマトグラフィーによって必要とするペプチドを精製する。Ｂｏｃシステムを使用して固相合成する場合、好ましくは、レジンは、ペプチドのＣ末端アミノ酸が結合しているＰＡＭレジンであり、ＰＡＭレジンの構造は、ポリスチレンであり、アミノ酸の間のアームは、４―ヒドロキシメチルフェニルアセトアミドであり、Ｂｏｃ合成システムにおいて、脱保護、中和、カップリングのサイクルにおいて、ＴＦＡ／ジクロロメタン（ＤＣＭ）を使用して保護基Ｂｏｃを除去し、かつジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ／ジクロロメタン）で中和する。ペプチド鎖の凝縮完了後、ｐ―クレゾール（５～１０％）を含むフッ化水素（ＨＦ）を使用して０℃下で１時間処理する場合、レジンからペプチド鎖を切断し、同時に保護基を除去する。５０～８０％酢酸（少量のメルカプトエタノールを含む）でペプチドを抽出し、溶液を凍結乾燥した後、モレキュラーシーブＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１０またはＴｓｋ―４０ｆを使用してさらに単離および精製し、次に高圧液相で精製して、必要とするペプチドを得る。ペプチド化学の分野で知られている様々なカップリング剤およびカップリング方法を使用して各アミノ酸残基をカップリングすることができ、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）または１，１，３，３―テトラ尿素ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）等を使用して、直接カップリングすることができる。合成された短いペプチドの純度および構造は、逆相高速液体クロマトグラフィーおよび質量分析によって確認されることができる。

別の方法は、組換え技術を使用して本発明のポリペプチドを生成することである。従来の組換えＤＮＡ技術によって、組換えＤＴＨＥポリペプチドを発現または産生するために本発明のポリヌクレオチドを使用することができる。一般に次のような段階がある：
（１）本発明のＤＴＨＥポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（または変異体）を使用するか、または当該ポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターで適切な宿主細胞を形質転換または形質導入する段階、
（２）適切な培地で宿主細胞を培養する段階、
（３）培地または細胞からタンパク質を単離および精製する段階。

組換えポリペプチドは、細胞内でまたは細胞膜で発現されることができるか、または細胞外に分泌されることができる。必要に応じて、その物理的、化学的および他の特性を使用して、様々な単離方法によって組換えタンパク質を単離および精製することができる。これらの方法は、当業者によく知られている。これらの方法の例としては、従来の再生処理、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧滅菌、超処理、超遠心分離、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、他の様々な液体クロマトグラフィー技術、およびこれらの方法の組み合わせを含むが、これらに限定されない。

本発明のポリペプチドは、短いため、複数のポリペプチドを直列に接続し、組換え発現後、多量体の形態の発現産物を得、酵素切断等の方法によって、必要とする小さなペプチドを形成すると考えられることができる。

医薬組成物および投与方法
本発明は、治療的または予防的（例えば、ワクチン）であり得る、医薬組成物をさらに提供する。本発明の医薬組成物は、（ａ）安全かつ有効量の本発明のポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩、および（ｂ）薬学的に許容されるベクターまたは賦形剤を含む。

本発明の目的のために、有効な投与量は、個体に投与される本発明のポリペプチドの約１０μｇ―１００ｍｇ／剤、好ましくは１００～１０００μｇ／剤である。さらに、本発明のポリペプチドは、単独で、または他の治療剤とともに使用することができる（例えば、同じ医薬組成物に調製される）。

本発明において、本発明のポリペプチドおよび腫瘍抗原を含み、通常「薬学的に許容されるベクター」と組み合わせる、予防的医薬組成物は、ワクチン組成物であり得る。

「薬学的に許容されるベクター」という用語は、治療剤の投与に使用されるベクターを指す。当該用語は、それ自体が当該組成物を受け取る個体に有害な抗体の生成を誘発せず、投与後に過度の毒性を有さない等のような医薬ベクターを指す。これらのベクターは、当業者によく知られている。レミントンの薬物科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ． Ｃｏ．、Ｎ．Ｊ．１９９１））で、薬学的に許容される賦形剤の十分な議論を見つかることができる。このようなベクターは、生理食塩水、緩衝液、グルコース、水、グリセロール、エタノール、アジュバントおよびその組み合わせ含む（これらに限定されない）。さらに、これらのベクターには、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質等の補助性物質が存在することができる。

さらに、本発明の（ワクチン）組成物は、追加のアジュバントをさらに含むことができる。代表的なワクチンアジュバントは、例えば、水酸化アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム無水等の無機アジュバント、例えば、人工的に合成された二本鎖ポリヌクレオチド（二本鎖ポリアデニル酸、ウリジル酸）、レバミゾール、イソプロリノシン等の合成アジュバント、例えば、フロイントアジュバント、落花生油乳化アジュバント、鉱油、植物油等の油剤等の種類を含む（これらに限定されない）
アジュバントは、現在およびこの後の研究において、ワクチンアジュバントに有用であると考えられる様々な新規アジュバントおよびアジュバント成分をさらに含む。

通常、ワクチン組成物または免疫原性組成物を液体溶液または懸濁液等の注射剤に調製することができ、注射前に溶液または懸濁液、液体賦形剤に適した固体形態に調製することもできる。当該製剤は、リポソームに乳化またはカプセル化して、アジュバント効果を増強することができる。

組成物は、単一または多成分の剤形に調製することができる。各剤形は、所望の治療効果を生み出すために計算された所定量の活性物質、および適切な医薬賦形剤を含む。

本発明の組成物が調製されると、静脈内、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、皮内、癌の付近、または局所投与を含むがこれらに限定されない、従来の経路によって投与することができる。予防または治療される対象は、動物、とくに人間であり得る。

本発明の組成物が実際の治療に使用される場合、使用状況に応じて異なるサイケの様々な医薬組成物を使用することができる。これらの医薬組成物は、従来の方法に基づいて混合、希釈または溶解することによって処方されることができ、また、場合によって、例えば、賦形剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、希釈剤、緩衝剤、等張剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃｉｔｉｅｓ）、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定剤および共溶媒剤等の適切な薬物添加剤を加え、当該調製プロセスは、剤形に従って、通常の方法で実施することができる。

本発明の医薬組成物は、徐放剤の形態で投与することができる。例えば、短いペプチドＤＴＨＥまたはその塩は、ベクターとして徐放性ポリマーを有するピルまたはマイクロカプセルに組み込まれることができ、次に当該ピルまたはマイクロカプセルを、手術を通じて、治療される組織に移植する。徐放性ポリマーの例として、エチレン―酢酸ビニルコポリマー（ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｖｉｎｙｌ ａｃｅｔａｔｅ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）、ポリヒドロメタアクリレート（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｍｅｔａａｃｒｙｌａｔｅ）、ポリアクリルアミド（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）、ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）、メチルセルロース（ｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、乳酸ポリマー、乳酸―グリコール酸コポリマー等を含み、好ましくは、例えば、乳酸ポリマーおよび乳酸―グリコール酸コポリマー等の生分解性ポリマーを含む。

本発明の医薬組成物が実際の治療に使用される場合、有効成分としての短いペプチドＤＴＨＥまたはその薬学的に許容される塩の投与量は、治療される各患者の体重、年齢、性別、症状の程度に応じて合理的に決定することができる。

本発明の主な利点は、次のとおりである。
（ａ）本発明は、複合抗原ベクター技術を使用して、腫瘍新生抗原を最大限に識別する。

（ｂ）本発明のポリペプチドを使用することによって調製されたワクチンの純度および品質は、制御がより容易であり、安全性が高く、毒性および副作用が少ない。

（ｃ）ヒトの免疫応答率は、高く、より効果的である。
（ｅ）本発明のポリペプチドは、インビトロで免疫細胞の活性化効率を改善することができる。

以下、本発明は、具体的実施例と併せてされに説明される。これらの実施例は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。以下の実施例において、具体的条件を示さない実験方法は、通常、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験マニュアル（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）に記載される条件等の従来の条件、またはメーカーによって提案された条件に従う。特に明記されない限り、パーセンテージおよび部数は、重量パーセンテージおよび重量部数で計算される。

調製実施例１．ＵＴｈＥの合成
本調製実施例において、化学合成法を使用して、以下の表にアミノ酸配列を示すＵＴｈＥポリペプチドを合成し、そのうちの＃１、＃２、＃３の組み合わせを以下の実施例に使用する。

調製実施例２．Ｂ１６Ｆ１０腫瘍新生抗原ペプチドの調製
本調製実施例において、化学合成法を使用して、以下のアミノ酸配列を有する新生抗原ペプチド（ｎｅｏＡｇ）を合成する。
四つの新生抗原ペプチド（ｎｅｏＡｇ）のアミノ酸配列は、次のとおりである。

調製実施例３．腫瘍細胞溶解物の調製
細胞を等体積のリン酸緩衝液に懸濁し、凍結融解して細胞を破壊した後、１００００ｇで１０分間遠心分離して沈殿物を除去した後に上清を細胞溶解物として使用する。腫瘍抗原として、それぞれＢ１６Ｆ１０細胞溶解物、ＬＬＣ細胞溶解物、およびＨｅｐａ１―６細胞溶解物を調製する。

実施例１．ＵＴｈＥによる黒色腫の弱い新生抗原の抗腫瘍免疫応答の増強
前臨床研究でマウスの抗腫瘍免疫応答の誘導に効果がないことが示されるＢ１６Ｆ１０細胞系からの四つの新生抗原ペプチド（ｎｅｏＡｇ）を選択する。Ｂ１６Ｆ１０は、マウスの黒色腫細胞である。
四つのｎｅｏＡｇペプチド（＃１、＃２、＃３および＃４）を１：１：１：１の重量比で混合し、ＵＴｈＥペプチドおよびアジュバントと一緒にワクチンに調製し、マウスを免疫した後、その抗腫瘍効果を検出する。具体的な方法は次のとおりである。

Ｃ５７ＢＬ６マウス（６週齢、各実験群に７匹）を１週間間隔で３回免疫する。マウス１匹あたりの免疫化ごとに２００μＬのワクチンを使用し、それぞれ四肢近くの外側部位に５０μＬを皮下注射する。２００μＬのワクチンの各成分の投与量は、ｎｅｏＡｇ５０μｇ、ＤＴｈＥ５０μｇ、Ａｌｕｍ３００μｇおよびＣｐＧ２０μｇである。ワクチン注射液は、ＰＢＳで調製する。実験群は、（１）ＰＢＳ群（Ａｌｕｍ＋ＣｐＧ＋ＰＢＳ）、（２）ｎｅｏＡｇ群（ｎｅｏＡｇ＋Ａｌｕｍ＋ＣｐＧ＋ＰＢＳ）、（３）ｎｅｏＡｇ＋ＵＴｈＥ群（ｎｅｏＡｇ＋ＵＴｈＥ＋Ａｌｕｍ＋ＣｐＧ＋ＰＢＳ）である。３回目の免疫後３日目に、マウスの右脇の下に１０^５個のＢ１６Ｆ１０細胞を皮下接種する。細胞を１００μＬのＰＢＳに懸濁する。次に腫瘍の成長状況を観察して記録する。
結果は、図１および表１に示されたとおりである。接種後７日目に、マウスは腫瘍を発症し始める。１５日目に、ＰＢＳ、ＮｅｏＡｇおよびＮｅｏＡｇ＋ＵＴｈＥの各群のマウスの腫瘍の平均体積（ｍｅａｎ±ＳＥＭ）は、それぞれ７８５±１５３ｍｍ^３、８９０±８０ｍｍ^３および３２８±６５ｍｍ^３である。

結果は、ＰＢＳ群と比較して、ＮｅｏＡｇ群において、ｎｅｏＡｇおよびアジュバント（Ａｌｕｍ＋ＣｐＧ）の投与は、腫瘍形成を阻害することはできなことを示す。ＮｅｏＡｇ＋ＵＴｈ群において、腫瘍成長は、大幅に阻害された。

実施例２．ＵＴｈＥによる黒色腫の弱い新生抗原の抗腫瘍免疫応答の増強
本実施例の方法は、実施例１の方法と基本的に同じであり、違いは、腫瘍抗原としてＢ１６Ｆ１０細胞溶解物またはｎｅｏＡｇを使用するワクチンの調製および免疫化の回数である。方法は、次のとおりである。
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６週齢、各実験群に５匹）を１週間間隔で４回免疫する。各マウスの四肢近くの四つの外側部位に、１部位あたり５０μＬのワクチンを注射する。１回目および２回目の各２００μＬのワクチンの成分の投与量は、ｎｅｏＡｇまたはＢ１６Ｆ１０細胞溶解物２５μｇ、ＵＴｈＥ２５μｇアジュバント（ａｄｊ）２５μｇおよびＭＦ５９１００μＬである。アジュバントは、１２．５ｕｇのＣｐＧ，１２．５μｇのＰｏｌｙＩ：Ｃを含み、ＰＢＳで調製する。３回目および４回目の各２００μＬのワクチンの各成分の投与量は、ｎｅｏＡｇまたはＢ１６Ｆ１０細胞溶解物１２．５μｇ、ＵＴｈＥ１２．５μｇ、アジュバント（ａｄｊ）１２．５μｇおよびＭＦ５９μＬである。アジュバントは、６．２５μｇのＣｐＧ、および６．２５μｇのＰｏｌｙＩ：Ｃを含み、ＰＢＳで調製する。各群の投与状況は、次のとおりである。

４回目の免疫後３日目に、マウスの右脇の下に１０^５個のＢ１６Ｆ１０細胞を皮下接種する。細胞を１００μＬのＰＢＳに懸濁する。次に腫瘍の成長状況を観察して記録する。腫瘍が見える場合、１日間隔で腫瘍体積を測定する。

結果は、図２および表２に示されたとおりである。腫瘍細胞の注射から１９日目まで、腫瘍の成長速度および体積の大きさの順序は、ａｄｊ群＞ＵＴｈＥ＋ａｄｊ群＞ｎｅｏ＋ａｄｊ群＞ｎｅｏ＋ＵＴｈＥ＋ａｄｊ群＞Ｌｙｓ＋ＵＴｈＥ＋Ａｄｊ群である。ここで、Ｌｙｓ＋ＵＴｈＥ＋Ａｄｊ群のマウスは、１９日目にも腫瘍が発症しない。さらに、Ｎｅｏ＋ＵＴｈＥ＋Ａｄｊ群のマウスの腫瘍体積も、小さく、かつ成長が遅い（図２Ａ）。

１９日目に、ａｄｊ群、ＵＴＥｈ＋ａｄｊ群、ｎｅｏ＋ａｄｊ群、ｎｅｏ＋ＵＴｈＥ＋ａｄｊ群およびＬｙｓ＋ＵＴｈＥ＋Ａｄｊ群の腫瘍体積の平均（ｍｅａｎ±ＳＥＭ）は、それぞれ８０１．１±８２１．７ｍｍ^３、５１７．４±６１５．５ｍｍ^３、４３１．８±８８６．７ｍｍ^３、３１７．８±３１４．４ｍｍ^３である（図２Ｂ）。

上記結果は、免疫応答がない抗原ペプチド（ＮｅｏＡｇまたはＢ１６Ｆ１０細胞溶解物）をＵＴｈＥペプチドと併用する場合、ワクチン接種マウスで腫瘍成長が有意に阻害され、腫瘍細胞溶解物＋ＵＴｈＥペプチドを使用する場合、腫瘍成長を完全に阻害することができることを示す。

実施例３．黒色腫Ｂ１６Ｆ１０に対するＵＴｈＥによる治療効果の効果的な増強
実施例１～３において、ＵＴｈＥペプチドの事前投与は、免疫増強剤として作用し、腫瘍抗原ペプチドの抗腫瘍効果を増強することができることが確認された。本実施例において、担癌マウスへの腫瘍免疫増強剤ＵＴｈＥペプチドの投与が、腫瘍に対する治療効果を増強できるかどうかをさらに検証する。

方法は、次のとおりである。腫瘍治療をシミュレートし、まず腫瘍細胞を接種し、次にＵＴｈＥ免疫増強剤で治療する。
１×１０^５個のＢ１６Ｆ１０細胞をマウスの脇の下近くの右前肢に接種し、５日後に、マウスを免疫する。各マウスに、後肢近くの二つの外側の注射部位に１００μＬのワクチンを１部位あたり５０μＬを接種する。各２００μＬのワクチンの各成分の投与量は、ＵＴｈＥ２５μｇ、アジュバントＡｄｊ、ＭＦ５９ １００μＬである。アジュバントは、１２．５μｇのＣｐＧ、および２５μｇのＰｏｌｙＩ：Ｃを含み、ＰＢＳで調製する。１週間隔で１回、合計４回の免疫を行う。腫瘍が発症し始めた後、腫瘍サイズおよびマウスの体重を秤量する。
結果は、図３および表３に示されたとおりである。

結果は、担癌マウスにおいて、ＵＴｈＥの投与が、マウスの細胞免疫を効果的に増強し、腫瘍細胞の成長を阻害することができることを示す。

実施例４．ＥＬＩＳＡ法によるＵＴｈＥ増強新生抗原ペプチドＮｅｏＡｇによる体液性免疫応答の検出
マウスの免疫後の血清を、０．１％ＢＳＡのＰＢＳで１：１００の体積比で希釈する。９６ウェルプレートに１００μＬの新生抗原ペプチド溶液（１０μｇ／ｍＬのｐＨ９．５炭酸緩衝液）を加え、４℃下で一晩コーティングする。次に、９６ウェルプレートを０．１％ＢＳＡのＰＢＳで室温下で２時間ブロックする。ブロッキング溶液を吸引した後、１００μＬの希釈血清を加え、室温下で１時間インキュベートし、その後血清を吸引し、９６ウェルプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０ ＰＢＳで３回洗浄し（毎回５分間インキュベートする）、１：５０００希釈ＨＲＰ―カップリングヤギ抗マウスＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂを加える。室温下で１時間インキュベートした後抗体溶液を吸引する。９６ウェルプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０ ＰＢＳで３回洗浄し、再蒸留水で１回洗浄し、説明書に従ってＴＭＢで発色させる。マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を読み取る。

結果は、図４～図７に示されたとおりである。
図４は、免疫化されたマウスの血清サンプル中のＵＴｈＥ抗体のＥＬＩＳＡ検出結果を示す。マウスをＤＴｈＥ＋ＣｐＧ＋ｐｏｌｙＩ：Ｃ＋ＭＦ５９ワクチンで１週間間隔で４回免疫し、免疫１０日後に７．５×１０^４個のＢ１６Ｆ１０細胞を接種し、マウスの腫瘍体積は、１５００ｍｍ^３に達するか、または腫瘍接種後３０日目に、マウスを犠牲にし、血液を採取する。ＩｇＧ１およびＩｇＧ２が同時に存在し、かつその濃度比が１より大きいため、Ｔヘルパー細胞応答は、Ｉ型＋ＩＩ型の混合型であり、ＩＩ型応答は、より強い。

図５は、免疫化されたマウスの血清サンプル中のＵＴｈＥ抗体のＥＬＩＳＡ検出結果を示す。マウスをｎｅｏＡｇ＋ＵＴｈＥ＋ＣｐＧ＋ｐｏｌｙＩ：Ｃ＋ＭＦ５９ワクチンで１週間間隔で４回免疫し、免疫１０日後に７．５×１０^４個のＢ１６Ｆ１０細胞を接種し、マウスの腫瘍体積は、１５００ｍｍ^３に達するか、または腫瘍接種後３０日目に、マウスを犠牲にし、血液を採取する。ＩｇＧ１およびＩｇＧ２が同時に存在し、かつその濃度比が１より大きいため、Ｔヘルパー細胞応答は、Ｉ型＋ＩＩ型の混合型であり、ＩＩ型応答は、より強い。

図６は、免疫化されたマウスの血清サンプル中のｎｅｏＡｇ抗体のＥＬＩＳＡ検出結果を示す。マウスをｎｅｏＡｇ＋ＣｐＧ＋ｐｏｌｙＩ：Ｃ＋ＭＦ５９ワクチンで１週間間隔で４回免疫し、免疫１０日後に７．５×１０^４個のＢ１６Ｆ１０細胞を接種し、マウスの腫瘍体積は、１５００ｍｍ^３に達するか、または腫瘍接種後３０日目に、マウスを犠牲にし、血液を採取する。産生された抗体は、主にＩｇＧ２であり、従って、Ｔヘルパー細胞応答は、Ｉ型である。

図７は、免疫化されたマウスの血清サンプル中のｎｅｏＡｇ抗体のＥＬＩＳＡ検出結果を示す。マウスをｎｅｏＡｇ＋ＵＴｈＥ＋ＣｐＧ＋ｐｏｌｙＩ：Ｃ＋ＭＦ５９ワクチンで１週間間隔で４回免疫し、免疫１０日後に７．５×１０^４個のＢ１６Ｆ１０細胞を接種し、マウスの腫瘍体積は、１５００ｍｍ^３に達するか、または腫瘍接種後３０日目に、マウスを犠牲にし、血液を採取する。ＩｇＧ１およびＩｇＧ２が同時に存在し、かつその濃度比が１より大きいため、Ｔヘルパー細胞応答は、Ｉ型＋ＩＩ型の混合型であり、ＩＩ型応答は、より強い。

図４～図７の結果は、ＵＴｈＥペプチドが腫瘍免疫増強剤として、腫瘍新生抗原に対する体液性免疫応答を有意に増強させることができることを示す。

実施例５．ＵＴｈＥポリペプチドによるｎｅｏ―Ａｇ特異的ＣＤ８^＋ＣＴＬ細胞応答の促進
本実施例において、ＵＴｈＥポリペプチドがｎｅｏＡｇ特異的ＣＴＬ細胞応答を促進するかどうかを検証する。

方法は、次のとおりである。免疫したマウス脾臓リンパ球をＵＴｈＥまたはｎｅｏＡｇ抗原提示細胞と五日間インキュベートした後、Ｔリンパ球またはＣＤ８^＋Ｔ単離キットを使用して、リンパ球を精製する。ＩＮＦ―γ捕捉抗体でコーティングされたイムノスポット９６ウェルプレートに、１０^４の精製リンパ球を含む１００μＬの培地を加える。３７℃下で、５％ＣＯ_２で１６時間培養する。次に、イムノスポットキットでＩＮＦ―γを分泌するＴ細胞の数を検出し、Ｔエフェクター細胞を腫瘍標的細胞と２０：１の比率で共培養した後、ＬＤＨで細胞殺傷を検出する。

ＵＴｈＥまたはｎｅｏＡｇ抗原提示細胞樹状細胞の調製方法：同じ系統の健康なマウスを安楽死させた後、皮質を分離し、前脚および後脚の骨を取り、ハサミで脚の骨の両端を切り取り、ＰＢＳ（１％ＦＢＳを含む）が含まれる１ｍｌの注射器を使用して、針を脚の骨の一端にあるある赤い点に向け、その中の骨髄細胞を洗い流す。ストローで組織片を穏やかに吹きながら分散させ、２００メッシュのふるいを通して５０ｍｌの遠心分離管に移し、４００ｇで１０分間遠心分離する。ＰＢＳで細胞を再懸濁し、赤血球溶解液を加え、４００ｇで１５分間遠心分離する。細胞をカウントし、２４ウェルプレートに接種し（５×１０^５～１×１０^６個／ｍｌが最適である）、ＩＬ―４を加えて培養を７日間維持し、２５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦａを加え、４時間後に１０μｇ／ｍｌの対応する抗原（ＵＴｈＥおよびＮｅｏＡｇ）を加える。

マウス脾臓リンパ球の調製方法：実験群のマウスの脾臓を採取し、研磨および粉砕後に培地を２００メッシュのふるいで４００ｇ、８分間洗浄し、遠心分離して上清を除去し、赤血球溶解液から赤血球を除去し、ＰＢＳで細胞を再懸濁しかつカウントし、培地にＩＬ２（２０ｎｇ／ｍｌ）を加えて培養し続ける。

ＥＬＩｓｐｏｔ実験結果は、図８および図９に示されたとおりである。腫瘍標的細胞（２０：１）に対するＣＴＬエフェクター細胞の殺傷効果は、図１０に示されたとおりである。結果は、ＵＴｈＥペプチドが腫瘍免疫増強剤として、腫瘍新生抗原特異的ＣＤ８^＋ＣＴＬ細胞応答を有意に増強できるため、腫瘍ワクチンの免疫効果を効果的に増強することができることを示す。

実施例６．ＵＴｈＥによる腫瘍溶解物の抗腫瘍免疫応答の増強
本実施例の方法は、実施例１および実施例２の方法と基本的に同じであり、違いは、元の黒色腫細胞Ｂ１６Ｆ１０の実験に基づいて、肺がん細胞ＬＬＣ、前立腺がん細胞ＲＭ―１、膵臓がん細胞ＰａｎＣ―０２を増加することであり、ワクチンの調製および免疫の回数は、基本的に同じであり、各細胞の溶解物腫瘍抗原を使用する。方法は、次のとおりである。

Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６週齢、各実験群に４～６匹）を１週間間隔で４回免疫する。各マウスの後肢の基部の二つの部位に、１部位あたり５０μＬのワクチンを皮下注射する。四つの免疫化投与量は、同じであり、各５０μＬのワクチン成分の投与量は、細胞溶解物２５μｇおよびＵＴｈＥ２５μｇであり、アジュバントは、２５μＬのＭＦ５９、２５ｕｇのＣｐＧ、１２．５μｇのＰｏｌｙＩ：Ｃを含み、ＰＢＳで調製する。

各群の投与状況は、次のとおりである。
４回目の免疫後３日目に、マウスの右脇の下の近くに皮下接種し、ここで、Ｂ１６Ｆ１０細胞の接種量は、７．５×１０^４であり、ＬＬＣ細胞の接種量は、１×１０^５であり、ＲＭ―１細胞の接種量は、１×１０^５である。細胞を１００μＬのＰＢＳに懸濁する。次に、腫瘍の成長状況を観察して記録する。腫瘍が見える場合、１日間隔で腫瘍体積を測定する。

肺がんＬＬＣ細胞接種の結果は、図１１および表４に示されたとおりである。腫瘍細胞の注射から１７日目まで、腫瘍の成長速度および体積の大きさの順序は、Ｌｙｓ＋ａｄｊ群＞Ｌｙｓ＋Ｔｈ＋Ａｄｊ群である。１７日目の腫瘍の大きさは、図１１に示されたとおりであり、腫瘍の平均重量（ｍｅａｎ±ＳＥＭ）は、それぞれ０．４４７５±０．０４２１１ｇ、および０．２３５±０．０２９５８ｇである。

黒色腫Ｂ１６Ｆ１０細胞の接種結果は、図１２および表５に示されたとおりである。腫瘍細胞の注射から２４日までに、腫瘍の成長速度および体積の大きさの順序は、Ｌｙｓ＋ａｄｊ群＞Ｌｙｓ＋Ｔｈ＋Ａｄｊ群である。１７日目の腫瘍の大きさは、図１２に示されたとおりであり、腫瘍の平均体積（ｍｅａｎ±ＳＥＭ）は、それぞれ４１９．９±１６５ｍｍ^３、および１５４．９±１１１．６ｍｍ^３である。

前立腺がんＲＭ―１細胞の接種結果は、図１３および表６に示されたとおりである。腫瘍細胞の注射から２４日までに、腫瘍の成長速度および体積の大きさの順序は、Ａｄｊ群＞Ｔｈ＋Ａｄｊ群＞Ｌｙｓ＋Ａｄｊ群＞Ｌｙｓ＋Ｔｈ＋Ａｄｊ群である。２４日目の腫瘍の大きさは、図１３に示されたとおりであり、腫瘍の平均体積（ｍｅａｎ±ＳＥＭ）は、それぞれ１４７６±４３６．９ｍｍ^３、１４５７±３７７．１ｍｍ^３、１３３５±３８４．６ｍｍ^３、および８８１．３±３０１．３ｍｍ^３である。

膵臓がんＰａｎＣ―０２細胞の結果は、図１４および表７に示されたとおりである。腫瘍細胞の注射から２７日までに、腫瘍体積の大きさの順序は、Ｌｙｓ＋ａｄｊ群＞Ｔｈ＋ａｄｊ群＞Ｌｙｓ＋Ｔｈ＋Ａｄｊ群である。腫瘍の平均体積（ｍｅａｎ±ＳＥＭ）は、それぞれ０．４４７５±０．０４２１１ｍｍ^３、および０．２３５±０．０２９５８ｍｍ^３である。

結果は、免疫増強剤ＵＴｈＥが様々な腫瘍に対して阻害効果を有することを示し、実験室の現在の腫瘍種類に限定すると、ＵＴｈＥは、様々な腫瘍に対して、全部阻害効果を有し、つまり、広域スペクトルの腫瘍阻害が高いと推測することができる。

実施例７．ＵＴｈＥの投与量とその腫瘍阻害効果との関係
本実施例の方法は、実施例１、実施例２および実施例６の方法と基本的に同じである。違いは、当該試験方案がＢ１６Ｆ１０腫瘍治療モデルであり、アジュバントＡｄｊと組み合わせた低投与量から高投与量のＵＴｈＥのみがマウスの腫瘍治療に使用されることである。各マウスの後肢の基部の二つの部位に、１部位あたり５０μＬのワクチンを皮下注射する。四つの免疫化投与量は、同じであり、各５０μＬのワクチン成分は、アジュバント（２５μＬのＭＦ５９、２５ｕｇのＣｐＧ、１２．５μｇのＰｏｌｙＩ：Ｃを含む）およびＵＴｈＥであり、ＵＴｈＥの投与量は、それぞれ３０μｇ、５０ｕｇおよび８０ｕｇである。
治療された各群の腫瘍発症結果は、図１５および表８に示されたとおりである。腫瘍細胞の注射から２３日までに、各群のマウスの体重は、正常であり、かつ着実に増加していることを示し、腫瘍の成長速度および体積の大きさの順序は、ＰＢＳ群＞Ａｄｊ群＞Ａｄｊ＋Ｔｈ―３０ｕｇ群＞Ａｄｊ＋Ｔｈ―５０ｕｇ群＞Ａｄｊ＋Ｔｈ―８０ｕｇ群である。１８日目の腫瘍の平均体積（ｍｅａｎ±ＳＥＭ）は、それぞれ４８０．４±１１８．６ｍｍ^３、３０９．９±１３９．６ｍｍ^３、２５３．３±７０．５９ｍｍ^３、１１５．８±４５．０５ｍｍ^３、および５．７５３±５．７４３ｍｍ^３である。

結果は、適切なアジュバントと組み合わせたＵＴｈＥが腫瘍阻害効果を達成できることを示し、このような阻害効果は、ＵＴｈＥの含有量が８０ｕｇに増加するまでに、ＵＴｈＥの投与量の増加とともに増強され、マウスの体重に影響せず、毒性が見られず、８０ｕｇの場合の腫瘍阻害率は、９８．８％に達する。ＵＴｈＥが体内に入った後、体内に存在する腫瘍抗原を積極的に取得し、抗原特異的ＣＴＬを生成して、腫瘍殺傷を実現し、腫瘍阻害効果を達成できることが示唆される。

実施例８．異なる系統のマウスの腫瘍に対するＵＴｈＥの阻害効果
投与方法は、実施例７の方法と同じであり、ＵＴｈＥの用量効果関係を調査する実施例７とは異なる。実施例８の目的は、異なる系統のマウスの腫瘍に対する同じ投与量の５０ｕｇでの各ポリペプチドの阻害効果を調査することである。ＤＴｈＥ１―７の各ペプチドの投与量は、５０ｕｇであり、アジュバントの使用量は、実施例７と同じである。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１０^５個のＢ１６Ｆ１０細胞を接種し、Ｂａｌｂ／Ｃマウスに１０^４の４Ｔ１細胞を接種し、腫瘍接種後３日目に免疫氏、各群のマウスの腫瘍成長は、図１６に示されたとおりである。各ポリペプチドに対する２種類のマウスの腫瘍阻害効果は異なり、これは、２系統のマウスのＭＨＣ ＩＩ種類に関連する可能性があり、後の投与でまずＭＨＣ関連種類を考慮して、標的免疫を行うことができることが示唆される。

本発明で言及されたすべての文書は、あたかも各文書が個別に参照として引用されたかのように、本出願における参照として引用される。さらに、本発明の上記の教示内容を読んだ後、当業者は本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの同等の形態も、本出願の添付の請求範囲によって定義される範囲に含まれる。

Claims (13)

1. 腫瘍免疫増強剤であって、
   前記腫瘍免疫増強剤は、式Ｉの構造を有する一つまたは複数の種類のポリペプチド、またはその薬学的に許容される塩を含み、
   Ｚ０―Ｚ１―Ｚ２（Ｉ）
   式において、
   Ｚ０は、なしであるか、または１～１０個のアミノ酸残基からなるペプチドセグメントであり、
   Ｚ２は、なしであるか、または１～１０個のアミノ酸残基からなるペプチドセグメントであり、
   Ｚ１は、
   （ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～９に示されるようなポリペプチド、
   （ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～９のアミノ酸配列の一つ、二つまたは三つのアミノ酸残基の置換、欠失または付加によって形成され、かつヒトおよびマウスのＩＩ型組織適合性抗原に結合できる誘導ポリペプチドからなる群から選択されるペプチドセグメントであることを特徴とする、前記腫瘍免疫増強剤。
2. Ｚ０およびＺ２は、少なくとも２～８個、好ましくは３～６個の親水性アミノ酸残基を含むことを特徴とする
   請求項１に記載の腫瘍免疫増強剤。
3. Ｚ０およびＺ２のうちの少なくとも一つは、（Ａｒｇ）ｎ構造を含み、ここで、ｎは、３～６の正の整数であることを特徴とする
   請求項１に記載の腫瘍免疫増強剤。
4. 前記腫瘍免疫増強剤は、腫瘍免疫を増強する活性を有することを特徴とする
   請求項１に記載の腫瘍免疫増強剤。
5. 多量体であって、
   前記多量体は、直列のｍ個の単量体によって形成され、腫瘍免疫を増強する機能を有し、ここで、ｍは、≧２の正の整数であり、前記各単量体は、それぞれ独立して、式Ｉの構造を有し、
   Ｚ０―Ｚ１―Ｚ２（Ｉ）
   式において、
   Ｚ０は、なしであるか、または１～１０個のアミノ酸残基からなるペプチドセグメントであり、
   Ｚ２は、なしであるか、または１～１０個のアミノ酸残基からなるペプチドセグメントであり、
   Ｚ１は、
   （ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～９に示されるようなポリペプチド、
   （ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～９のアミノ酸配列の一つ、二つまたは三つのアミノ酸残基の置換、欠失または付加によって形成され、組織適合性抗原に結合できる誘導ポリペプチドからなる群から選択されるペプチドセグメントであることを特徴とする、前記多量体。
6. 単離された核酸分子であって、
   ポリペプチドをコードし、前記ポリペプチドは、式Ｉの構造を有するか、または前記ポリペプチドは、直列のｍ個の単量体によって形成される多量体であり、ここで、各単量体は、それぞれ独立して、式Ｉの構造を有し、ｍは、≧２の正の整数であることを特徴とする、前記単離された核酸分子。
7. 医薬組成物であって、
   それは、
   （ａ）請求項１に記載の腫瘍免疫増強剤またはその薬学的に許容される塩、請求項５に記載の多量体、および／または請求項６に記載の単離された核酸分子、および
   （ｂ）薬学的に許容されるベクターまたは賦形剤を含むことを特徴とする、前記医薬組成物。
8. 前記医薬組成物は、
   （ｃ）腫瘍抗原をさらに含むことを特徴とする
   請求項７に記載の医薬組成物。
9. 前記医薬組成物は、
   （ｄ）ＤＣ活性化剤をさらに含むことを特徴とする
   請求項７に記載の医薬組成物。
10. 前記医薬組成物は、腫瘍ワクチン組成物であることを特徴とする
    請求項７または８に記載の医薬組成物。
11. 物質の用途であって、
    前記物質は、請求項１に記載の腫瘍免疫増強剤またはその薬学的に許容される塩、請求項５に記載の多量体、請求項６に記載の単離された核酸分子からなる群から選択され、また、前記物質は、腫瘍抗原の抗腫瘍活性を改善するための薬物の調製、または抗腫瘍ワクチン組成物の調製に使用されることを特徴とする、前記用途。
12. 薬箱であって、
    前記薬箱は、
    （ｉ）第１の容器、および当該第１の容器に盛る請求項１に記載の腫瘍免疫増強剤、または前記腫瘍免疫増強剤を含む薬物、
    （ｉｉ）第２の容器，以及当該第２の容器に盛る腫瘍治療薬、ならびに
    （ｉｉｉ）前記腫瘍免疫増強剤および前記腫瘍治療薬を同時に投与することによって癌を治療する説明が記載される説明書を含むことを特徴とする、前記薬箱。
13. 癌を治療する方法であって、
    （ｉ）必要とする対象に請求項１に記載の腫瘍免疫増強剤またはその薬学的に許容される塩、請求項５に記載の多量体、請求項６に記載の単離された核酸分子または請求項７に記載の医薬組成物を投与する段階と、および
    （ｉｉ）必要とする対象に腫瘍治療薬を投与する段階とを含むことを特徴とする、前記癌を治療する方法。

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