CN105734014B - 一种负载广谱抗原的树突状细胞及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种负载广谱抗原的树突状细胞的制备方法，能够制得负载广谱抗原的树突状细胞，且负载广谱抗原的树突状细胞具有较强的免疫原性，能够激发更强的细胞毒T淋巴细胞。

Description

一种负载广谱抗原的树突状细胞及制备方法
技术领域
本发明涉及一种生物医学技术领域，且特别涉及一种负载广谱抗原的树突状细胞及制备方法。
背景技术
肿瘤已经成为人类的第一杀手，全世界每年新发肿瘤病例1270万以上，死亡超过760万，估计在未来的20年，肿瘤发病与死亡人数还要增加。由于肿瘤发病隐匿，早期诊断率不够理想，因而能手术根治的患者比例不高，很多患者又因年老体弱等种种因素，不能承受放化疗或放化疗效果不佳，因此毒副作用轻微、抗瘤谱较广的生物治疗越来越受到关注。树突状细胞(dendritic cell,DC)是体内最强的抗原递呈细胞，是启动、调控并维持免疫应答的中心环节，是目前发现的功能最强、唯一能激活静息型T细胞的抗原递呈细胞。基于抗原递呈细胞的DC肿瘤疫苗被认为是一种有前途的肿瘤生物治疗手段。DC肿瘤疫苗常需要负载肿瘤抗原，用肿瘤特异性抗原(tumor specific antigen,TSA)或肿瘤相关抗原(tumorassociated antigen,TAA)的多肽负载DC是常见的负载方式。由于迄今已发现的TSA少，目前用来负载的多肽分子量小，且没有辅助T细胞(helper T cell,Th)表位，导致抗原的免疫原性弱，激发的细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)有限。
发明内容
本发明的目的在于提供一种负载广谱抗原的树突状细胞，其具有较广以及较强的免疫原性，能够激发更强的细胞毒T淋巴细胞。
本发明的另一目的在于提供一种负载广谱抗原的树突状细胞的制备方法，以得到成熟的负载广谱抗原的树突状细胞，其具有较强免疫原性，能激发更强的细胞毒T淋巴细胞。
本发明解决技术问题是采用以下技术方案实现的：
一种负载广谱抗原的树突状细胞，其由广谱抗原物负载正常树突状细胞制成，广谱抗原物由广谱抗原肽与TLR激动剂偶联得到，广谱抗原肽包括Th表位肽的氨基酸序列和糖基化修饰的MUC1肽的氨基酸序列。
一种负载广谱抗原的树突状细胞的制备方法，其包括：
合成步骤：按照预设的氨基酸序列合成广谱抗原肽，广谱抗原肽包括Th表位肽的氨基酸序列和糖基化修饰的MUC1肽的氨基酸序列；
偶联步骤：将TLR激动剂与广谱抗原肽进行偶联反应，得到广谱抗原物；
负载步骤：将广谱抗原物负载正常树突状细胞，得到成熟的负载广谱抗原的树突状细胞。
本发明提供的负载广谱抗原的树突状细胞及制备方法的有益效果是：由于广谱抗原物包括有Th表位肽序列、经糖基化修饰后的MUC1肽序列以及TLR激动剂结构，因此，负载广谱抗原的树突状细胞具有较广和较强的免疫原性，能够激发更强的细胞毒T淋巴细胞。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例提供的DC分泌细胞因子IL-12p40的检测结果柱状图；
图2为本发明实施例的DC刺激淋巴细胞后特异性CTL的检测结果流式细胞图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例提供的负载广谱抗原树突状细胞及制备方法进行具体说明。
本发明实施例提供的负载广谱抗原的树突状细胞，其由广谱抗原物负载正常树突状细胞制成，广谱抗原物由广谱抗原肽与TLR激动剂偶联得到，广谱抗原肽包括Th表位肽的氨基酸序列和糖基化修饰的MUC1肽的氨基酸序列。
其中，Th表位肽的氨基酸序列选自流感病毒血凝素Th表位，Th表位肽氨基酸的序列为PKYVKQNTLKLAT，由于流感病毒大多数人都曾感染，采用感病毒血凝素Th表位能更快地激发记忆的CD4+Th细胞，快速地产生免疫应答。当然，Th表位肽的氨基酸序列也可以选自小儿麻痹病毒的Th表位，其氨基酸序列为KLFAVWKITYKDT。
其中，MUC1粘蛋白是一种高糖基化、高分子量的Ⅰ型跨膜蛋白，它对正常的上皮起润滑和保护作用，同时还介导信号转导和细胞粘附。MUC1肽的氨基酸序列选自肿瘤抗原MUC1粘蛋白的胞外段的可变数目串联重复序列(variable number tandem repeat,VNTR)，该VNTR序列一般重复30～90次，每个VNTR序列由20个氨基酸残基组成，VNTR序列的氨基酸序列为VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG。由于，MUC1粘蛋白在75％～80％的实体瘤中均过量表达。因此，将VNTR序列重复一次作为本发明中的MUC1肽的氨基酸序列，即MUC1肽的氨基酸序列为VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG，能够提高广谱抗原物的广谱性，使得负载广谱抗原的树突状细胞能非MHC限制性或MHC限制性活化CTL激发细胞毒T淋巴细胞，使得激发的细胞毒T淋巴细胞的能够有效地杀死不同类型的肿瘤细胞。当然，也可以将VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG重复2～6次后的序列作为MUC1肽的氨基酸序列。
其中，在MUC1肽的从N端往C端的第7位的苏氨酸残基进行糖基化修饰，作为优选，选用N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)对MUC1肽进行糖基化修饰。GalNAc是与MHC-I类分子结合的一个锚定基团，在MUC1肽引入该糖基化位点能够增强MUC1肽与MHC-Ⅰ类分子的结合能力。
其中，TLR激动剂为TLR2激动剂，具体为脂肽Pam3CSK4，Pam3CSK4其能够增强树突状细胞表面相关分子的表达，促进树突状细胞的成熟，还能使激发的Th反应向Th1偏移。
本发明实施例提供的上述负载广谱抗原的树突状细胞的制备方法，其包括：
步骤S1：合成步骤
采用固相合成技术，按照预设的氨基酸序列合成广谱抗原肽。
具体地，采用Fmoc固相合成技术，在CSBio CS336X型多肽合成仪中，按照操作说明书进行，确定反应罐、树脂、配制罐、沉淀罐、哌啶溶液罐、氨基酸溶解罐和预冷罐等处于正常工作状态，以9-芴甲氧羰基(Fmoc)保护的氨基酸(N-α-Fmoc-Ser、N-α-Fmoc-Lys、N-α-Fmoc-Pro、N-α-Fmoc-Tyr、N-α-Fmoc-Val、N-α-Fmoc-Gln、N-α-Fmoc-Asn、N-α-Fmoc-Thr、N-α-Fmoc-Leu、N-α-Fmoc-Ala、N-α-Fmoc-Asp、N-α-Fmoc-Arg、N-α-Fmoc-Gly、N-α-Fmoc-His)为原料，然后，调节空气压力为0.4Mpa～0.6Mpa，打开氮压瓶阀门,调节氮气瓶出口压力表为0.2～0.5Mpa，在仪器上按照预设的氨基酸序列进行编辑合成的广谱抗原肽的氨基酸序列，控制合成的温度为18～25℃，重复(缩合→洗涤→去保护→中和及洗涤→下一轮缩合)操作，直至合成完所预设的氨基酸序列，从N端往C端依次合成广谱抗原肽，其中，最后一步树脂不洗涤，直接得到结合有广谱抗原肽的树脂，便于后续偶联反应。合成的广谱抗原肽包括有Th表位肽的氨基酸序列和经过糖基化修饰的MUC1肽的氨基酸序列。
预设的氨基酸序列从N端往C端为SKKKKPKYVKQNTLKLATVTSAPDTRPAPGSTAPPAHG，因此，广谱抗原肽的氨基酸序列为SKKKKPKYVKQNTLKLAT 其中，单下划线处的PKYVKQNTLKLAT为流感病毒血凝素Th表位肽的氨基酸序列，双下划线处的为MUC1肽的氨基酸序列，此外，广谱抗原肽的N端的SKKK的一个四肽序列主要用于与后续偶联步骤中的芴甲氧羰基-S-二棕榈酰-L-半胱氨酸(R)(Fmoc-Cys(Pam)2–OH(R))偶联反应，以得到TLR2激动剂偶联Th表位肽-糖基化MUC1肽的广谱抗原物。TLR2激动剂为Pam3CSKKKK，也就是脂肽Pam3CSK4。当然，预设的氨基酸序列还可为SKKKKKLFAVWKITYKDTVTSAPDTRPAPGSTAPPAHG，其中，单下划线处的KLFAVWKITYKDT为小儿麻痹病毒的Th表位肽序列。
其中，在合成广谱抗原肽的过程中，当在合成广谱抗原肽的MUC1肽序列的从N端往C端的第7位苏氨酸残基时，还需要以N-乙酰半乳糖胺糖基化修饰的Fmoc保护的苏氨酸(N-α-Fmoc-Thr-(AcO3-α-D-GalNAc))为原料，使得合成的广谱抗原肽包括有糖基化修饰的MUC1肽序列，糖基化修饰的MUC1肽序列为VTSAPDT(α-D-GalNAc)RPAPGSTAPPAHG。因此，合成的广谱抗原肽包括Th表位肽的氨基酸序列和糖基化修饰的MUC1肽的氨基酸序列，根据Th表位肽序列的不同，获得的广谱抗原肽的氨基酸序列为：SKKKKPKYVKQNTLKLATVTSAPDT(α-D-GalNAc)RPAPGSTAPPAHG或SKKKKKLFAVWKITYKDTVTSAPDT(α-D-GalNAc)RPAPGSTAPPAHG。
步骤S2：偶联步骤
将在S1步骤得到的结合有广谱抗原肽与TLR激动剂进行偶联反应，以得到TLR激动偶联广谱抗原肽的广谱抗原物。
具体地，偶联步骤包括：
第一步、洗涤
将步骤S1中得到的结合有广谱抗原肽的树脂置于多肽合成管中，加入二氯甲烷(DCM)/2-吡咯烷酮(NMP)(1:1)溶液，在摇床上常温振荡30min，抽干溶剂后，用二甲基甲酰胺(DMF)、DCM、二甲基酰胺(DMF)依次洗涤结合有广谱抗原肽的树脂。
第二步、偶联
往多肽合成管中依次加入Fmoc-Cys(Pam)2–OH(R)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)和N，N-二异丙基乙胺(DiPEA)，然后再次加入DiPEA，常温振荡四个小时，然后用DCM/NMP(1:1)溶液洗涤结合有广谱抗原肽的树脂。
第三步、脱Fmoc保护基
往多肽合成管中加入适量的哌啶/NMP(1:5)溶液，振荡，再抽干溶剂，然后用DCM/NMP(1:1)溶液洗涤结合有广谱抗原肽的树脂，干燥，然后再往多肽合成管中加入棕榈酰氯溶液、哌啶/NMP(1:1)溶液，常温振荡2.5个小时。
第四步、切割
再利用DCM多次洗涤经过第三步的结合有广谱抗原肽的树脂，例如洗涤六遍，然后抽干，将结合广谱抗原肽的树脂在三氟乙酸(TFA)/三异丙基硅烷(TiS)/H2O(95:2.5:2.5)中振荡2小时，过滤，真空除去大部分溶剂，残留液体滴入乙醚沉淀，10000r/min高速离心，移除上清，将沉淀风干，该沉淀即含有广谱抗原肽。
第五步、纯化
用适量水/乙腈(1:1)混合溶剂溶解上述沉淀，用0.2μm孔径滤膜过滤，采用高效液相色谱(HPLC)纯化(C18色谱柱，流动相A：80％乙腈/水溶液，含有0.06％(v/v)TFA；流动相B：水，含有0.06％(v/v)TFA)，得到TLR激动剂偶联Th表位肽-糖基化MUC1肽的广谱抗原物，根据Th表位肽序列序列的不同，其氨基酸序列为： PKYVKQNTLKLAT
KLFAVWKITYKDT 其中波浪形下划线处的为TLR2激动剂，也就是脂肽单下划线处的KLFAVWKITYKDT为流感病毒血凝素Th表位肽序列，单下划线处的PKYVKQNTLKLAT为流感病毒血凝素Th表位肽序列，双下划线处的为糖基化修饰的MUC1肽序列。
步骤S3：负载步骤
将在S2步骤中得到的广谱抗原物负载正常树突状细胞，得到成熟的负载广谱抗原的树突状细胞。
具体地，负载步骤包括以下步骤：
第1步、培养
从外周血、脐带血或骨髓中获得单个核细胞，得到含有单个核细胞(PBMC)的分离液，再将分离液接种于细胞培养瓶，置于37℃、5％CO2培养箱中，培养90min，洗去未贴壁细胞。
第2步、诱导分化
于培养瓶内加入含GM-CSF和IL-4的完全培养液，在第3天半量更换培养液。得到未成熟的正常树突状细胞。
第3步、诱导成熟
在第5天往培养瓶中加入在S2步骤中得到的广谱抗原物，并加入TNF-α、IL-1β以及PGE-2，诱导未成熟的正常树突状细胞成为成熟的负载广谱抗原的树突状细胞。置于37℃、5％CO2培养箱共同培育48h，其中，控制TNF-α在培养液中的终浓度为20ng/ml，IL-1β的终浓度为10ng/ml，PGE-2的终浓度为10μg/ml。得到成熟的负载广谱抗原的树突状细胞。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
首先，合成步骤
采用Fmoc固相合成技术，按照预设的氨基酸序列合成广谱抗原肽。
预设的氨基酸序列从N端往C端为SKKKKPKYVKQNTLKLAT 其中，单下划线处的PKYVKQNTLKLAT为流感病毒血凝素Th表位肽的氨基酸序列，双下划线处的为MUC1肽的氨基酸序列，此外，预设的氨基酸序列的N端的SKKK的四肽序列用于与后续步骤中的Fmoc-Cys(Pam)2–OH(R)偶联，以得到TLR2激动剂偶联Th表位肽-糖基化MUC1肽的广谱抗原物。
其中，在合成广谱抗原肽的过程中，当在合成广谱抗原肽的MUC1肽序列的从N端往C端的第7位苏氨酸残基时，需要以N-α-Fmoc-Thr-(AcO3-α-D-GalNAc)为原料，使得合成的广谱抗原肽包括有糖基化修饰的MUC1肽序列，糖基化修饰的MUC1肽序列为VTSAPDT(α-D-GalNAc)RPAPGSTAPPAHG。使得合成的广谱抗原肽的氨基酸序列为SKKKKPKYVKQNTLKLATVTSAPDT(α-D-GalNAc)RPAPGSTAPP AHG，其包括有Th表位肽的氨基酸序列(PKYVKQNTLKLAT)和经过糖基化修饰的MUC1肽的氨基酸序列(VTSAPDT(α-D-GalNAc)RPAPGSTAPPAHG)。
具体地，在CSBio CS336X型多肽合成仪中，按照操作说明书进行相关参数的设定，先确定反应罐、配制罐、沉淀罐、哌啶溶液罐、氨基酸溶解罐和预冷罐等各种设备处于正常状态，确保所用树脂和溶剂等储量充足，以Fmoc保护的各种氨基酸(N-α-Fmoc-Ser、N-α-Fmoc-Lys、N-α-Fmoc-Pro、N-α-Fmoc-Tyr、N-α-Fmoc-Val、N-α-Fmoc-Gln、N-α-Fmoc-Asn、N-α-Fmoc-Thr、N-α-Fmoc-Leu、N-α-Fmoc-Ala、N-α-Fmoc-Asp、N-α-Fmoc-Arg、N-α-Fmoc-Gly、N-α-Fmoc-His、N-α-Fmoc-Thr-(AcO3-α-D-GalNAc))为原料，然后，调节空气压力为0.5Mpa，打开氮压瓶阀门，调节氮气瓶出口压力表为0.3Mpa，在仪器上按照预设的氨基酸序列进行编辑需要合成的广谱抗原肽的氨基酸序列，控制合成的温度为20℃，重复(缩合→洗涤→去保护→中和及洗涤→下一轮缩合)操作，从N端往C端依次合成广谱抗原肽，其中，最后一步树脂不洗涤，直接得到结合有广谱抗原肽的树脂。
接着，偶联步骤
将广谱抗原肽与TLR激动剂进行偶联反应，以得到TLR激动偶联广谱抗原肽的广谱抗原物。具体地，包括如下步骤：
第一步、洗涤
将100mg结合广谱抗原肽的树脂置于多肽合成管中，并加入0.5mL DCM/NMP(1:1)溶液，在摇床上常温振荡30min，抽干溶剂，再用DMF、DCM、DMF依次洗涤结合有广谱抗原肽的树脂。
第二步、偶联
往多肽合成管中加入Fmoc-Cys(Pam)2–OH(R)(26.7mg、30μmol)、PyBOP(16mg、30μmol)和DiPEA(2.8μL)，30min后再次往多肽合成管中加入DiPEA(2.3μL)，常温振荡四个小时，然后，用DCM/NMP(1:1)溶液洗涤结合有广谱抗原肽的树脂。
第三步、脱Fmoc保护基
往多肽合成管中加入1mL哌啶/NMP(1:5)溶液，振荡5min，再抽干溶剂，然后用DCM/NMP(1:1)溶液洗涤结合有广谱抗原肽树脂，干燥，然后加入46μL棕榈酰氯溶液和1mL哌啶/NMP(1:1)溶液，常温振荡2.5个小时。
第四步、切割
再次用DCM多次洗涤经过第三步的结合有广谱抗原肽的树脂，例如洗涤六遍，然后抽干，往多肽合成管中加入4mL TFA/TiS/H2O(95:2.5:2.5)溶液，振荡2小时，然后过滤，在真空中除去大部分溶剂，残留液体滴入2mL乙醚沉淀，10000r/min离心，移除上清，得到的沉淀风干。
第五步、纯化
往多肽合成管中加入6mL水/乙腈(1:1)混合溶剂溶解上述沉淀，用0.2μm孔径滤膜过滤，再用HPLC进行纯化(C18色谱柱，流动相A：80％乙腈/水溶液，含有0.06％(v/v)TFA；流动相B：水，含有0.06％(v/v)TFA)，收集组分，冷冻干燥，得到TLR激动剂偶联Th表位肽-糖基化MUC1肽的广谱抗原物，其氨基酸序列为 PKYVKQNTLKLAT 其中波浪形下划线处的为TLR2激动剂，也就是脂肽单下划线处的PKYVKQNTLKLAT为流感病毒血凝素Th表位肽的氨基酸序列，双下划线处的为糖基化修饰的MUC1肽序列。
然后，负载步骤
将上述得到的广谱抗原物负载正常的树突状细胞，得到成熟的负载广谱抗原的树突状细胞。具体地，包括如下步骤：
第1步、培养
采用Ficoll法从100mL外周血中获得50mL的含有单个核细胞的分离液(单个核细胞的密度为2*106/mL)，再将分离液接种于细胞培养瓶，置于37℃、5％CO2培养箱中，培养90min，洗去未贴壁细胞。
第2步、诱导分化
再往培养瓶中加入含有100ng/mL的GM-CSF、50ng/mL的IL-4以及5％自体血清的1640培养液20mL，第3天，进行半量换液，得到未成熟的正常树突状细胞。
第3步、诱导成熟
在第5天往培养瓶中加入在偶联步骤中的广谱抗原物，每1mL培养液中加入100ng广谱抗原物，并加入TNF-α、IL-1β以及PGE-2，诱导未成熟的正常树突状细胞成为成熟的负载广谱抗原的树突状细胞。控制TNF-α的终浓度为20ng/mL，IL-1β的终浓度为10ng/mL，PGE-2的终浓度为10μg/ml，置于37℃、5％CO2培养箱共同培育48h，得到成熟的负载广谱抗原的树突状细胞，即负载TLR激动剂偶联Th表位肽-糖基化MUC1肽的树突状细胞。同时保存外周血淋巴细胞(PBL)，用磁珠分选法分选出CD3+T细胞。
对经上述制作方法制作的负载广谱抗原的树突状细胞的激发细胞毒T淋巴细胞能力的检测实验，具体实验过程如下。
负载未糖基化MUC1肽的树突状细胞，即用未糖基化的MUC1肽负载正常树突状细胞得到成熟的负载未糖基化MUC1肽的树突状细胞，其中未糖基化的MUC1肽的氨基酸序列为VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG。
(1)树突状细胞表面分子的检测及分泌细胞因子的检测
采用流式细胞法检测树突状细胞表面的功能分子HLA-DR、CD11c、CD80、CD83以及CD86等分子，采用ELISA检测树突状细胞分泌IL-12p40的水平，以负载未糖基化MUC1肽的树突状细胞作为对照组，以负载广谱抗原的树突状细胞为实验组。实验结果以平均值±标准差表示，检测结果如表1和图1所示。
表1：树突状细胞表面功能分子表达情况
项目 实验组 对照组 P
HLA-DR+CD11c+ 90.1±3.5 89.1±4.2 0.2419
CD80+CD11c+ 83.0±3.5 72.9±2.2 0.0312
CD86+CD11c+ 86.8±1.8 74.8±2.9 0.0439
CD83+CD11c+ 63.4±5.0 47.9±5.0 0.0006
从表1可知，实验组的CD80、CD83以及CD86的表达水平均明显高于对照组(P<0.05)。
从图1可知，实验组的IL-12p40分泌水平(63.33±7.64)ng/mL明显高于对照组(16.67±2.69)ng/mL(P<0.01)。
由此表明，负载广谱抗原的树突状细胞表面的功能分子的表达水平以及分泌细胞因子IL-12p40的水平均高于负载未糖基化MUC1肽的树突状细胞。
(2)树突状细胞刺激淋巴细胞增殖能力的检测
将上述分选得到的CD3+T细胞与树突状细胞按不同比例共同孵育，然后检测树突状细胞刺激淋巴细胞增殖的能力大小。按CD3+T:DC(树突状细胞)＝1000:100、1000:30、1000:10和1000:3分别接种于96孔细胞培养板共培养，每组6个复孔，每个孔加入200μL。共育4天后，每孔加20μL MTT溶液(5mg/mL)继续孵育4小时。进行MTT检测，检测各比例下的DC刺激指数(stimulate index,SI)，SI＝(样品OD值－空白OD值)/(阴性对照OD值－空白OD值)，SI值可反映树突状细胞刺激淋巴细胞增殖能力的大小，SI值越大，表示树突状细胞刺激淋巴细胞增殖能力越强。以负载未糖基化MUC1肽的树突状细胞作为对照组，以负载广谱抗原的树突状细胞作为实验组。检测结果如表2所示。
表2：CD3+T:DC为不同比例下的SI值
CD3+T:DC 实验组 对照组 P
1000:100 27.0±2.5 10.9±1.2 0.008516
1000:30 13.6±1.7 7.5±0.9 0.051193
1000:10 9.7±0.9 6.4±0.8 0.059603
1000:3 5.2±0.4 4.7±0.4 0.059898
从表2可知，实验组的SI值在各比例下均高于对照组，表明负载广谱抗原的树突状细胞刺激淋巴细胞增殖的能力强于负载未糖基化MUC1肽的树突状细胞；其中，实验组在CD3+T:DC＝1000:100比例下，其SI值最高，表明在CD3+T与负载广谱抗原的树突状细胞比例为1000:100时，负载广谱抗原的树突状细胞具有较强的刺激CD3+T细胞增殖的能力。
(3)树突状细胞刺激淋巴细胞后淋巴细胞分泌细胞因子的检测
将上述分选的CD3+T细胞与树突细胞(CD3+T：DC＝10:1)加入到24孔细胞培养板上共同孵育，每组作3个复孔，每个孔加入200μL。其中，培养基中加入有终浓度为500IU/mL的IL-2和终浓度为50ng/mL的IL-7。第7天和第14天再次往孔中加入树突状细胞刺激。分别于第0、7、14、21天采用ELISA法检测淋巴细胞活化后的上清液中细胞因子TNF-α、IL-2以及IFN-γ的水平。以负载未糖基化MUC1肽的树突状细胞作为对照组，以负载广谱抗原的树突状细胞作为实验组。检测结果如表3～表5所示。
表3：DC刺激淋巴细胞后淋巴细胞分泌细胞因子TNF的检测结果
时间 实验组 对照组 P
0天 0 0 *
7天 15±3.0 10.0±2.0 *
14天 27.7±2.5 20.0±2.0 0.001885
21天 41.7±3.5 23.0±2.6 0.029566
注：表中“*”表示相应项目未计算。
表4：DC刺激淋巴细胞后淋巴细胞分泌细胞因子IL-2的检测结果
时间 实验组 对照组 P
0天 0 0 *
7天 10.0±2.0 7.3±1.2 *
14天 20.0±2.0 15.0±1.0 0.03775
21天 34.7±2.5 18.0±2.0 0.019042
注：表中“*”表示相应项目未计算。
表5：DC刺激淋巴细胞后淋巴细胞分泌细胞因子IFN的检测结果
时间 实验组 对照组 P
0天 0 * *
7天 6.3±1.5 5.3±1.2 *
14天 16.3±1.2 8.0±2.0 0.006339
21天 23.7±1.5 10.0±2.0 0.004138
注：表中“*”表示相应项目未计算。
从表3～表5可知，在第14天和第21天，实验组刺激CD3+T细胞分泌TNF-α、IL-2以及IFN-γ的水平显著高于对照组(P<0.05)。由此表明，本实施例的负载广谱抗原的树突状细胞刺激淋巴细胞分泌细胞因子TNF-α、IL-2以及IFN-γ的水平强于负载未糖基化MUC1肽的树突状细胞。
(4)树突状细胞刺激淋巴细胞后特异性细胞毒T淋巴细胞的检测
将上述分选的CD3+T细胞与树突细胞(CD3+T：DC＝10:1)加入到24孔细胞培养板上共同孵育，每组作3个复孔，每个孔加入200μL，采用胞内染色法检测IFN-γ+CD8+T的频率。收集刺激前后的T淋巴细胞，收获细胞前4小时加入BDGolgiStop，共育4小时后收集洗涤细胞，用CD8、CD3的流式抗体进行标记；Cytofix/CytoPerm溶液重悬，室温避光孵育30min，离心细胞，清洗两次，IFN-γ的流式抗体染色洗涤后进行流式细胞分析，检测IFN-γ+CD8+T的频率。以负载未糖基化MUC1肽的树突状细胞作为对照组，以负载广谱抗原的树突状细胞作为实验组。检测结果如图2所示。
从图2可知，实验组的IFN-γ+CD8+T的频率((3.76±0.30)％)极显著地高于对照组((0.55±0.12)％)(P<0.01)。由此表明，负载广谱抗原的树突状细胞的刺激淋巴细胞后激发的细胞毒T淋巴细胞的特异性强于负载未糖基化MUC1肽的树突状细胞。
综上所述，本发明实施例提供的负载广谱抗原的树突状细胞的制备方法能够制得负载广谱抗原的树突状细胞，所得到负载广谱抗原的树突状细胞的细胞表面具有高表达水平的功能分子，如CD80、CD83以及CD86等，其刺激淋巴细胞增殖的能力较强，且其刺激淋巴细胞后淋巴细胞分泌的细胞因子如细胞因子TNF-α、IL-2以及IFN-γ的水平也较高，以及特异性的细胞毒T淋巴细胞数量也较多。总之，通过本发明提供负载广谱抗原肽的树突状细胞的制备方法，得到的负载广谱抗原肽的树突状细胞，具有较强的免疫原性，且能够激发更强的细胞毒T淋巴细胞，为提高肿瘤相关抗原的免疫原性找到一种有效的方法以及为肿瘤的免疫治疗提供了新的策略。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (4)

1.一种负载广谱抗原的树突状细胞，其特征在于，其由广谱抗原物负载正常树突状细胞制成，所述广谱抗原物由广谱抗原肽与TLR激动剂偶联得到，所述广谱抗原肽的氨基酸序列由Th表位肽的氨基酸序列和糖基化修饰的MUC1肽的氨基酸序列组成；
所述Th表位肽包括多个氨基酸残基，所述Th表位肽的所述氨基酸序列为PKYVKQNTLKLAT；
所述MUC1肽包括多个氨基酸残基，所述MUC1肽的所述氨基酸序列为VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG；
所述MUC1肽的糖基化修饰位点为从所述MUC1肽的N端往C端的第7位的苏氨酸残基，对所述MUC1肽的进行糖基化修饰的糖为N-乙酰半乳糖胺；
所述TLR激动剂为脂肽Pam3CSK4。
2.一种负载广谱抗原的树突状细胞的制备方法，其特征在于，其包括：
合成步骤：按照预设的氨基酸序列合成广谱抗原肽，所述广谱抗原肽的氨基酸序列由Th表位肽的氨基酸序列和糖基化修饰的MUC1肽的氨基酸序列组成；
偶联步骤：将TLR激动剂与所述广谱抗原肽进行偶联反应，得到广谱抗原物；
负载步骤：将所述广谱抗原物负载正常树突状细胞，得到成熟的负载广谱抗原的树突状细胞；
在所述合成步骤中，所述Th表位肽包括多个氨基酸残基，所述Th表位肽的所述氨基酸序列为PKYVKQNTLKLAT，所述MUC1肽包括多个氨基酸残基，所述MUC1肽的所述氨基酸序列为VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG；
在所述合成步骤中，利用N-乙酰半乳糖胺在所述MUC1肽的从其N端往C端的第7位的苏氨酸残基进行糖基化修饰；
所述TLR激动剂为脂肽Pam3CSK4。
3.根据权利要求2所述的负载广谱抗原树突状细胞的制备方法，其特征在于，所述负载步骤包括：
从外周血、脐带血或骨髓中获得单个核细胞；
在培养液中，诱导所述单个核细胞向树突状细胞分化，得到未成熟的正常树突细胞；
诱导未成熟的所述正常树突状细胞成为成熟树突状细胞，并往所述培养液中加入所述广谱抗原物，并加入TNF-α、IL-1β以及PGE-2，得到成熟的所述负载广谱抗原的树突状细胞。
4.根据权利要求3所述的负载广谱抗原树突状细胞的制备方法，其特征在于，所述TNF-α在所述培养液中的终浓度为20ng/ml，所述IL-1β的终浓度为10ng/ml，所述PGE-2的终浓度为10μg/ml。
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