CN113660955A - 免疫调节性多核苷酸缀合物及其使用方法 - Google Patents

免疫调节性多核苷酸缀合物及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本文提供了用于调节天然杀伤细胞或骨髓细胞的缀合物，其包含靶向部分和免疫调节性多核苷酸。本文还提供了用于调节天然杀伤细胞或骨髓细胞的药物组合物，其包含含有靶向部分和免疫调节性多核苷酸的缀合物，以及药学可接受的赋形剂。本文另外提供了其用于调节天然杀伤细胞或骨髓细胞和治疗增生性疾病的方法。

Description

免疫调节性多核苷酸缀合物及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年10月17日提交的美国临时申请序列号 62/747,070和于2018年10月18日提交的美国临时申请序列号 62/747,611的优先权权益，其各自通过引用以其全文并入本文。
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技术领域
本文提供用于调节天然杀伤细胞或骨髓细胞的缀合物，其包含靶向部分和免疫调节性多核苷酸。本文还提供用于调节天然杀伤细胞或骨髓细胞的药物组合物，其包含含有靶向部分和免疫调节性多核苷酸的缀合物以及药学可接受的赋形剂。本文另外提供其用于调节天然杀伤细胞或骨髓细胞和治疗增生性疾病的方法。
背景技术
天然杀伤细胞(NK细胞)是对先天性免疫系统至关重要的细胞毒性淋巴细胞，其中NK细胞在不存在抗体和MHC的情况下快速响应于病毒感染的细胞和肿瘤形成。NK细胞还可以充当适应性免疫反应的界面，并在涉及抗体的肿瘤抗原靶向的癌症免疫治疗中发挥主要作用。在适应性免疫反应中，NK细胞充当免疫系统的效应细胞，并主动裂解具有被特异性抗体标记的其膜表面抗原的靶细胞。细胞介导的免疫防御的这种机制被称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 (ADCC)。Hashimoto等人,J.Infect.Dis.1983,148,785-794。NK 细胞介导的ADCC是许多抗癌抗体治疗功效的主要机制，所述抗体用于治疗各种过表达独特抗原的癌症，例如成神经细胞瘤、乳腺癌和B细胞淋巴瘤。Wang等人,Front.Immunol.2015,6,368；Zahavi 等人,Antibody Therapeut.2018，1，7-12。增强NK细胞活性的方法将增加ADCC并可以增强这种抗癌疗法的功效。此外，NK细胞携带检测肿瘤细胞表面上配体的变化的表达的天然细胞毒性受体，这最终触发NK细胞活化和肿瘤细胞裂解。据报道，NK细胞延长发育并突出对各种抗原的特异性记忆Paust等人,Nat.Immunol.2011,12, 500-508。研究表明，NK细胞在恶性肿瘤患者中经常缺乏并且功能异常，这表明这可能是癌症免疫逃避和进展的关键因素。此外，发现低的癌细胞功能预测发展癌症的风险增加。Berrien-Elliot等人，Curr.Opin.Organ Transplant.2015,20,671-680；Imai等人,Lancet 2000,356,1795-1799。本质上，开发活化和扩增NK细胞的策略在治疗恶性肿瘤中将是有利的。
NK细胞源自产生B和T淋巴细胞的常见淋巴祖细胞。它们在进入循环之前在骨髓、淋巴结、脾、扁桃体和胸腺中分化并成熟。 NK细胞以通常表达CD16和CD56表面标志物的经典和非经典子集形式存在。CD56(也称为神经细胞粘附分子(NCAM))是一种同型结合糖蛋白，其涉及细胞-细胞粘附、神经突增生、突触可塑性以及学习和记忆。对CD56染色呈阳性的正常细胞包括NK细胞、活化的T细胞、脑和小脑以及神经内分泌组织。CD56阳性的肿瘤包括骨髓瘤、髓样白血病、神经内分泌肿瘤、威尔姆氏肿瘤、成年神经母细胞瘤、NK/T细胞淋巴瘤、胰腺腺泡细胞癌、嗜铬细胞瘤和小细胞肺癌。Van Acker等人，Front.Immunol.2017,8,892。
骨髓细胞源自骨髓中的造血干细胞(HSC)产生的连续的骨髓细胞祖细胞。骨髓细胞是机体内最丰富的有核造血细胞，由几种类型的细胞组成，包括嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞(DC)、嗜酸性粒细胞和肥大细胞。病原体入侵后，骨髓细胞通过各种趋化因子受体快速募集入局部组织中，其中它们被激活以进行吞噬作用以及炎症性细胞因子的分泌，从而在先天性免疫中发挥主要作用。巨噬细胞可以通过抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP) 直接杀死肿瘤细胞。骨髓细胞在连接先天性免疫和适应性免疫方面也起关键作用，主要是通过DC和巨噬细胞的抗原呈递以及适应性免疫细胞的募集。骨髓细胞的子集还包括肿瘤相关巨噬细胞(TAM) 和骨髓来源的抑制细胞(MDSC)。TAM是在实体瘤的微环境中大量存在的具有异质功能和表型的组织巨噬细胞。TAM可促进肿瘤细胞的起始和转移、抑制T细胞介导的抗肿瘤免疫反应，并刺激肿瘤血管生成和随后的肿瘤进展。Yang和Zhang,J.Hematol.Oncol.2017, 10,58。此外，TAM有助于抑制进展性癌症中的适应性免疫。包含单核细胞和粒细胞亚群的MDSC有助于通过抑制T细胞适应性免疫而有助于驱动癌症逃逸的免疫抑制网络。MDSC在贯穿癌症进展过程中积累，并与不良的临床结果以及鼠肿瘤系统对化疗、放疗和免疫疗法的耐药性有关。Waight等人,J.Clin.Investig.2013,123, 4464-4478；Alizadeh等人,Cancer Res.2014,74,104-118。调节骨髓细胞活性，例如通过巨噬细胞增加ADCP、通过树突状细胞增强APC 功能、降低TAM和MDSC的免疫抑制活性，可以促进抗肿瘤先天性免疫和适应性免疫并增强其他抗癌药(如检查点抑制剂)、疫苗和T细胞定向免疫疗法的功效。
信号调节蛋白(SIRP)由主要由免疫细胞表达的几种膜糖蛋白组成，包括SIRPα、SIRPβ和SIRPγ。SIRPα主要由骨髓细胞表达。 SIRPα通过其基于胞质免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)结构域充当抑制性受体，并与广泛表达的跨膜蛋白CD47相互作用。这种相互作用负性控制先天性免疫细胞的效应子功能。SIRPα在巨噬细胞膜上横向扩散并在吞噬突触处积累以结合CD47和信号“自身”，这抑制巨噬细胞吞噬细胞骨架密集过程。这类似于MHCI类分子通过 Ig样或Ly49受体为NK细胞提供的自我信号。SIRPα也在其他骨髓细胞中表达，例如嗜中性粒细胞、树突状细胞和MDSC；并可以作为抑制性受体来调节这些细胞群的活化和成熟。与SIRPα相比， SIRPβ在骨髓细胞中具有重叠的表达，但具有不同的胞质结构域，并可能与除CD47以外的不同配体相互作用。SIRPγ在淋巴样细胞如 T细胞和MK细胞中表达。SIRPγ也与CD47相互作用，但具有短的胞质结构域，其不可能具有与SIRPα相似的信号传导特性。Barclay 和Brown,Nat.Rev.Immunol.2006,6,457-64。
Toll样受体(TLR)是先天性免疫的关键模式识别受体，其通过感测源自细菌、病毒、真菌和原生动物的病原体相关分子模式 (PAMP)来识别病原体。Akira等人,Nat.Rev.Immunol.2004,4, 499-511；Zhang等人,Science 2004,303,1522-1526。每个TLR包含跨膜结构域，具有富含亮氨酸重复基序的胞外PAMP结合结构域以及引发信号传导级联的胞内Toll-IL-1受体结构域。Gay和Gangloff, Annu.Rev.Biochem.2007,76,141-165。TLR对微生物入侵者的识别导致下游信号传导级联的激活以分泌细胞因子和趋化因子，并最终导致针对纯净病原体的先天性和适应性免疫反应的激活。Takeda和 Akira,Semin.Immunol.2004,16,3-9；Shi等人,J.Biol.Chem.2016, 291,1243–1250。在人中，已经鉴定了十种TLR，包括TLR-1、TLR-2、 TLR-3、TLR-4、TLR-5、TLR-6、TLR-7/8、TLR-9和TLR-10。D’Arpa 和Leung,Adv.Wound Care 2017,6,330-343。
Toll样受体9(TLR9)，也称为CD289，是在包括树突细胞(DC)、 B淋巴细胞、巨噬细胞、天然杀伤细胞和其他抗原呈递细胞的免疫系统细胞中表达的重要受体。TLR9激活引发胞内信号传导级联，导致这些免疫细胞的激活、成熟、增殖和细胞因子生成，从而桥接先天性免疫和适应性免疫。Martinez-Campos等人,Viral Immunol.2016， 30,98-105；Notley等人,Sci.Rep.2017,7,42204。天然TLR-9激动剂包括含有未甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)的寡脱氧核苷酸(CpG ODN)。
CpG ODN通常分为三类：A类、B类和C类。A类CpG ODN 通常包含在3′-和5′-端具有硫代磷酸酯主链和包括磷酸酯主链的中心回文序列的聚-G尾。A类CpG ODN通常在其中央回文序列中包含 CpG。B类CpG ODN通常包含完整的硫代磷酸酯主链，并且其5′端的序列通常对于TLR9激活至关重要。C类CpG ODN包含具有3′- 端序列的完全硫代磷酸酯主链，从而能够形成双链体。然而，CpG ODN通常容易在血清中降解，因此CpG ODN的药代动力学可能是其发展为治疗剂的限制因素之一。同样，CpG ODN在体内通常表现出不均匀的组织分布，其中主要的积聚位点在肝脏、肾脏和脾脏。这种分布可引起脱靶活性和与PAMP相关的局部毒性。因此，需要有效的方法来稳定和递送用于治疗应用的CpG ODN。
发明概述
本文提供一种用于调节天然杀伤细胞或骨髓细胞的缀合物，其包含靶向部分和免疫调节性多核苷酸。
本文还提供一种用于调节天然杀伤细胞或骨髓细胞的药物组合物，其包含含有靶向部分和免疫调节性多核苷酸的缀合物；和药学可接受的载体。
本文另外提供一种调节天然杀伤细胞或骨髓细胞的方法，其包括使细胞与含有靶向部分和免疫调节性多核苷酸的缀合物接触。
本文进一步提供一种治疗受试者的增生性疾病的方法，其包括向所述受试者施用含有靶向部分和免疫调节性多核苷酸的缀合物。
本文提供式(C)的缀合物：
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或其立体异构体、两种或更多种非对映异构体的混合物、互变异构体、或两种或更多种互变异构体的混合物；或其药学可接受的盐、溶剂化物或水合物；其中：
Ab是抗CD56或抗SIRP抗体；
每个LN独立地是接头；
每个Q独立地是免疫调节性多核苷酸；
每个e独立地是约1、约2、约3或约4的整数；和
f是约1、约2、约3或约4的整数。
附图说明
图1显示通过用抗CD56-CpG核苷酸(SEQ.ID NO:425)缀合物 (抗CD56-CPG)较之对照：单独的CpG核苷酸(p425)、单独的抗CD56抗体(抗CD56)和培养基(水平虚线)24小时处理外周血单核细胞(PBMC)后CD69表达的增加来测量的NK细胞的活化。
图2显示通过用抗CD56-CpG核苷酸(SEQ.ID NO:425)缀合物 (抗CD56-CPG)较之对照：单独的CpG核苷酸(p425)、单独的抗CD56抗体(抗CD56)和培养基(水平虚线)48小时处理PBMC 后CD69表达的增加来测量的NK细胞的活化。
图3显示用抗SIRPα-CpG核苷酸(SEQ.ID NO:425)缀合物(抗 Sirpα1-CpG和抗Sirpα2-CpG)用阻断的抗SIRPα抗体(抗Sirpα1) 或非阻断的抗SIRPα抗体(抗Sirpα2)较之对照：单独的CpG核苷酸(p425)、单独的抗SIRPα抗体(抗Sirpα1和抗Sirpα2)和培养基(水平虚线)处理PBMC后CD14+细胞的增加。
图4显示用抗SIRPα-CpG核苷酸(SEQ.ID NO:425)缀合物(抗 Sirpα1-CpG和抗Sirpα2-CpG)用阻断抗SIRPα抗体(抗Sirpα1)或非阻断抗SIRPα抗体(抗Sirpα2)较之对照：单独的CpG核苷酸 (p425)、单独的抗SIRPα抗体(抗Sirpα1和抗Sirpα2)和培养基 (水平虚线)处理纯化的CD14+细胞后CD14+细胞的增加。
图5显示一系列结构，表明具有相应结构的缩写。缩写是表2 中使用的缩写。
图6显示一系列结构，表明具有相应结构的缩写。缩写是表2 中使用的缩写。
图7A-7D显示抗SIRPα-CpG核苷酸缀合物体内抑制肿瘤生长。 图7A：与PBS对照相比，用间隔三天、给药两次的10mg/kg抗SIRPα1 缀合物(阻断抗体)或间隔三天、给药两次的非缀合抗SIRPα抗体 治疗后随时间的平均CT26肿瘤大小的测量。图7B：与PBS对照相 比，用都是2q3给药的3mg/kg抗SIRPα1缀合物(阻断抗体)或抗 SIRPα2缀合物(非阻断抗体)治疗后随时间的平均CT26肿瘤大小 的测量。图7C：与PBS对照相比，用都是2q3给药的1mg/kg、0.3 mg/kg或0.1mg/kg抗SIRPα1缀合物(阻断抗体)治疗后随时间的 平均CT26肿瘤大小的测量。图7D：与PBS对照相比，用2q3给药 的10mg/kg抗SIRPα1缀合物(阻断抗体)治疗后随时间的平均MC38 肿瘤大小的测量。mpk＝mg/kg。2q3＝2剂，间隔3天。箭头表示施 用缀合物或对照。
图8A和8B显示抗SIRPα-CpG核苷酸缀合物体内抑制肿瘤生长。图8A：与PBS对照相比，用间隔三天、给药两次或间隔七天、给药两次的1mg/kg的抗SIRPα1偶联物(阻断抗体)治疗后随时间的平均CT26肿瘤大小的测量。图8B：如图8A所述剂量给药的CT26 肿瘤模型中的小鼠的存活曲线。mpk＝mg/kg。2q3＝2剂，间隔3天。 2q7＝剂，间隔7天。箭头表示施用缀合物或对照。
发明详述
定义
为了促进对本文阐述的公开的理解，下文定义多个术语。
通常，本文使用的命名法和本文所述的生物学、生物化学、药物化学、有机化学和药理学中的实验室程序是本领域众所周知的和常用的。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语通常具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。
术语“受试者”是指动物，包括但不限于灵长类动物(例如人)、牛、猪、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠和小鼠。术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，例如是指哺乳动物受试者，例如人受试者，在一个实施方案中为人。
如本文所用，术语“无碱基间隔基”表示具有以下结构的二价基团：
R1–L1–[–L2–(L1)n1–]n2–R2,
(I)
其中：
n1是约0或约1的整数，
n2是约1-约6的整数，
R1是与免疫调节性多核苷酸中核苷连接的键，
R2是与免疫调节性多核苷酸中核苷或封端基团连接的键，
每个L1独立地是磷酸二酯或磷酸三酯，和
每个L2是糖类似物，
条件是，
如果无碱基间隔基是核苷间无碱基间隔基，则每个n1为1，并且R2是与核苷连接的键，和
如果无碱基间隔基为末端无碱基间隔基，则每个n1独立地是约 0或约1的整数，并且R2是与封端基团连接的键。
术语“约”或“大约”是指由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差，其部分取决于如何测量或测定该值。在某些实施方案中，术语“约”或“大约”是指在1、2、3或4个标准偏差之内。在某些实施方案中，术语“约”或“大约”是指在给定值或范围的50％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、 2％、1％、0.5％、或0.05％之内。
除非另有说明，否则本文所用的术语“烷烃-四基”表示具有1-16 个碳的四价、无环、直链或支链的饱和烃基。如对于烷基所述，烷烃-四基可任选被取代。
除非另有说明，否则本文所用的术语“烷烃-三基”表示具有1-16 个碳的三价、无环、直链或支链的饱和烃基。如对于烷基所述，烷烃-三基可任选被取代。
本文所用的术语“烷酰基”表示通过羰基连接至母体分子基团的氢或烷基，其示例为甲酰基(即，羧基醛基)、乙酰基、丙酰基、丁酰基和异丁酰基。未取代的烷酰基包含1-7个碳。如本文对于烷基所述，烷酰基可以是未取代或取代的(例如，任选取代的C1-7烷酰基)。可将词缀“-酰基”添加至本文定义的另一个基团，例如芳基、环烷基和杂环基，以定义“芳酰基”、“环烷酰基”和“(杂环) 酰基”。这些基团分别代表连接到芳基、环烷基或杂环基上的羰基。如在“芳基”、“环烷基”或“杂环基”中所定义，“芳酰基”、“环烷酰基”和“(杂环)酰基”中的每一个可任选被取代。
如本文所用，术语“烯基”表示含有一个、两个或三个碳-碳双键的无环单价直链或支链烃基。烯基的非限制性实例包括乙烯基、丙-1-烯基、丙-2-烯基、1-甲基乙烯基、丁-1-烯基、丁-2-烯基、丁-3- 烯基、1-甲基丙-1-烯基、2-甲基丙-1-烯基和1-甲基丙-2-烯基。如本文对于烷基所定义，烯基可任选被取代。
如本文所用，术语“亚烯基”是指除去一个氢从而使该基团为二价的直链或支链烯基。亚烯基的非限制性实例包括乙烯-1,1-二基；乙烯-1,2-二基；丙-1-烯-1,1-二基；丙-2-烯-1,1-二基；丙-1-烯-1,2-二基；丙-1-烯-1,3-二基；丙-2-烯-1,1-二基；丙-2-烯-1，2-二基；丁-1- 烯-1,1-二基；丁-1-烯-1,2-二基；丁-1-烯-1,3-二基；丁-1-烯-1,4-二基；丁-2-烯-1,1-二基；丁-2-烯-1,2-二基；丁-2-烯-1,3-二基；丁-2-烯-1,4- 二基；丁-2-烯-2,3-二基；丁-3-烯-1,1-二基；丁-3-烯-1,2-二基；丁-3- 烯-1,3-二基；丁-3-烯-2,3-二基；丁-1,2-二烯-1,1-二基；丁-1,2-二烯-1,3- 二基；丁-1,2-二烯-1,4-二基；丁-1,3-二烯-1,1-二基；丁-1,3-二烯-1,2- 二基；丁-1,3-二烯-1,3-二基；丁-1,3-二烯-1,4-二基；丁-1,3-二烯-2,3- 二基；丁-2,3-二烯-1,1-二基；和丁-2,3-二烯-1,2-二基。如对于烷基所述，亚烯基可以是未取代的或取代的(例如，任选取代的亚烯基)。
除非另有说明，否则本文所用的术语“烷氧基”表示式-OR的化学取代基，其中R是C1-6烷基。在一些实施方案中，烷基可以如本文所定义被进一步取代。术语“烷氧基”可以与本文定义的其他术语例如芳基、环烷基或杂环基组合以定义“芳基烷氧基”、“环烷基烷氧基”和“(杂环基)烷氧基”基团。这些基团分别代表被芳基、环烷基或杂环基取代的烷氧基。对于每个单独的部分，“芳基烷氧基”、“环烷基烷氧基”和“(杂环基)烷氧基”中的每一个可以任选地如本文所定义地被取代。
如本文所用，术语“烷基”是指无环的直链或支链饱和烃基，除非另有说明，其在未被取代时具有1-12个碳。在某些优选的实施方案中，未取代的烷基具有1-6个碳。烷基的实例有甲基；乙基；正丙基和异丙基；正、仲、异和叔丁基；新戊基等，并且可以在化合价允许的情况下任选地被一个、两个、三个、或者在具有两个或更多个碳的烷基的情况下，被四个或更多个独立选自下组的取代基取代：氨基；芳基；芳基氧基；叠氮基；环烷基；环烷氧基；环烯基；环炔基；卤代；杂环基；(杂环基)氧基；羟基；硝基；硫醇；硅烷基；氰基；＝O；＝S；＝NR’，其中R’是H、烷基、芳基或杂环基。每个取代基本身可以是未取代的，或在化合价允许的情况下，被本文对于各基团所定义的未取代的取代基取代。
如本文所用，术语“烷基氨基”是指具有式–N(RN1)2或–NHRN1的基团，其中RN1为如本文所定义的烷基。如对于烷基所定义，烷基氨基的烷基部分可以任选被取代。取代的烷基氨基上的每个任选的取代基本身可以是未取代的，或在化合价允许的情况下，被本文对于各基团所定义的一个或多个未取代的取代基取代。
如本文所用，术语“烷基亚环烷基”是指作为烷基环烷烃的饱和的二价烃基，其中两个化合价取代两个氢原子。优选地，两个化合价中的至少一个存在于环烷烃部分上。如本文所述的单个基团，烷烃和环烷烃部分可任选被取代。
如本文所用，术语“亚烷基”是指作为直链或支链饱和烃的饱和二价烃基，其中两个化合价取代两个氢原子。本文定义的亚烷基的化合价不包括任选的取代基。亚烷基的非限制性实例包括亚甲基、乙烷-1,2-二基、乙烷-1,1-二基、丙烷-1,3-二基、丙烷-1,2-二基、丙烷 -1,1-二基、丙烷-2，2-二基、丁烷-1,4-二基、丁烷-1,3-二基、丁烷-1,2- 二基、丁烷-1,1-二基和丁烷-2,2-二基、丁烷-2,3-二基。术语“Cx-y亚烷基”表示具有x-y个碳的亚烷基。x的示例性值为1、2、3、4、5 和6，y的示例性值为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12。如本文对于烷基所述，亚烷基可任选被取代。
如本文所用，术语“烷基亚氧硫基”表示式-S-(烷基)的基团。如对于烷基所述，烷基亚氧硫基可任选被取代。
如本文所用，术语“烷基亚磺酰基”表示式-S(O)-(烷基)的基团。如对于烷基所述，烷基亚磺酰基可任选被取代。
如本文所用，术语“烷基磺酰基”表示式-S(O)2-(烷基)的基团。如对于烷基所述，烷基磺酰基可任选被取代。
如本文所用，术语“炔基”表示包含至少一个碳-碳三键的2-6 个碳原子的单价直链或支链烃基，并且实例是乙炔基、1-丙炔基等。如对于烷基所定义，炔基可以是未取代或取代的(例如，任选取代的炔基)。
如本文所用，术语“5-炔基尿苷”表示核苷，其中核碱基为具有以下结构的5-炔基尿嘧啶：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
其中R与核苷的五呋喃糖的异头碳键合，并且X是炔基。在一些实施方案中，X为乙炔基或丙炔基(例如，X为乙炔基)。
如本文所用，术语“亚炔基”是指直链或支链二价取代基，其包含一个或两个碳-碳三键并且在未取代时仅包含C和H。亚炔基的非限制性实例包括乙炔基-1,2-二基；丙-1-炔-1,3-二基；丙-2-炔-1,1- 二基；丁-1-炔-1,3-二基；丁-1-炔-1,4-二基；丁-2-炔-1,1-二基；丁-2- 炔-1,4-二基；丁-3-炔-1,1-二基；丁-3-炔-1,2-二基；丁-3-炔-2,2-二基；和丁-1,3-二炔-1,4-二基。如对于炔基所述，亚炔基可以是未取代的或取代的(例如，任选取代的亚炔基)。
如本文所用，术语“氨基”表示–N(RN1)2，其中如果氨基是未取代的，则两个RN1均为H；或者，如果氨基是取代的，则每个RN1独立地是H、-OH、-NO2、-N(RN2)2、-SO2ORN2、-SO2RN2、-SORN2、-COORN2、N-保护基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基、芳基烷基、芳基氧基、环烷基、环烯基、杂烷基或杂环基，条件是至少一个RN1不是H，并且其中每个RN2独立地是H、烷基或芳基。每个取代基本身可以是未取代的，或被本文为每个相应基团定义的未取代的取代基取代。在一些实施方案中，氨基是未取代的氨基(即，-NH2) 或取代的氨基(例如，-NHRN1)，其中RN1独立地是-OH，-SO2ORN2、 -SO2RN2、-SORN2、-COORN2、任选取代的烷基或任选取代的芳基，并且每个RN2可以是任选取代的烷基或任选取代的芳基。在一些实施方案中，取代的氨基可以是烷基氨基，其中如本文对于烷基所述，烷基任选被取代。在某些实施方案中，氨基是–NHRN1，其中RN1是任选取代的烷基。其中RN1是任选取代的烷基的–NHRN1的非限制性实例包括：任选取代的烷基氨基、蛋白原氨基酸、非蛋白原氨基酸、蛋白原氨基酸的C1-6烷基酯和非蛋白原氨基酸的C1-6烷基酯。
如本文所用，术语“氨基烷基”表示被如本文所定义的一个、两个或三个氨基取代的烷基。如对于烷基所述，氨基烷基可以进一步任选被取代。
如本文所用，术语“芳烃-四基”表示作为芳基的四价基团，其中三个氢原子被化合价取代。如本文对于芳基所述，芳烃-四基可任选被取代。
如本文所用，术语“芳基”表示具有一个或两个芳环的单、双环或多环碳环体系。芳基可包含6-10个碳原子。未取代的碳环芳基内的所有原子均为碳原子。碳环芳基的非限制性实例包括苯基、萘基、1,2-二氢萘基、1,2,3,4-四氢萘基、芴基、茚满基、茚基等。芳基可以是未取代的，或被一个、两个、三个、四个或五个独立选自以下的取代基取代：烷基；烯基；炔基；烷氧基；烷基亚磺酰基；烷基亚氧硫基；烷基磺酰基；氨基；芳基；芳基氧基；叠氮基；环烷基；环烷氧基；环烯基；环炔基；卤代；杂烷基；杂环基；(杂环基)氧基；羟基；硝基；硫醇；甲硅烷基和氰基。每个取代基本身可以是未取代的，或被本文为每个相应基团所定义的一个或多个未取代的取代基取代。
如本文所用，术语“芳基烷基”表示被芳基取代的烷基。如本文所述的单个基团，芳基和烷基部分可任选被取代。
如本文所用，术语“芳基亚烷基”表示其中一个氢原子被化合价取代的芳基烷基。如本文对于芳基烷基所述，芳基亚烷基可任选被取代。
如本文所用，术语“亚芳基”表示其中一个氢原子被化合价取代的芳基。如本文对于芳基所述，亚芳基可任选被取代。
除非另有说明，否则本文所用的术语“芳基氧基”表示式-OR 的化学取代基，其中R为芳基。在任选取代的芳基氧基中，如本文对芳基所述，芳基任选被取代。
如本文所用，术语“辅助部分”表示包含亲水性聚合物、带正电的聚合物或糖醇的单价基团。
如本文所用，术语“任选取代的N”表示二价–N(RN1)–基团或三价-N＝基团。杂氮基可以是未取代的(其中RN1是H或不存在)，也可以是取代的(其中RN1如对于“氨基”所定义)，但RN1不是H。两个杂氮基可以连接以形成“二氮杂”。
如本文所用，术语“任选取代的N-保护的氨基”表示如本文所定义的取代的氨基，其中如果N-保护的氨基是未取代的，则至少一个取代基为N-保护基并且另一个取代基为H，或如果N-保护的氨基是取代的，则至少一个取代基为H以外的取代基。
如本文所用，术语“叠氮基”表示-N3基团。
如本文所用，术语“大体积基团”表示如本文所定义的任何取代基或取代基的组，其中与二硫键键合的基团是碳原子，如果该基团被sp3-杂化，则该碳原子携带一个或更少的氢原子；或如果该基团是sp2-杂化的碳，则该碳原子不携带氢原子。该基团不是sp-杂化碳。大体积基团仅通过碳原子键合至二硫键。
如本文所用，术语“5′-5′封端”表示式R’–Nuc1–O–(LP)n-的基团，其中R’为磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、磷酸二酯、羟基或氢；Nuc1是核苷；每个LP独立地是–P(＝XE1)(–XE2–RE2A)–O–；并且n为1、2或3；
其中每个XE1和每个XE2独立地是O或S，每个RE2A独立地是氢、生物可逆性基团、非生物可逆性基团、辅助部分、共轭基团、键合至靶向部分的接头或键合至靶向部分和一个或多个(例如1-6 个)辅助部分的接头；和
其中R’与核苷的3’-碳键合，并且-O-与核苷的5’-碳键合。
如本文所用，术语“封端基团”表示位于多核苷酸的5’-或3’- 端的单价或二价基团。封端基团是末端磷酸酯；二磷酸酯；三磷酸酯；辅助部分；生物可逆性基团；非生物可逆性基团；5’封端(例如 5’-5’封端)；固体载体；与靶部分和任选与一个或多个(例如1-6) 辅助部分键合的接头；或-OR’基团，其中R’选自氢、生物可逆性基团、非生物可逆性基团、固体载体和O保护基。-OR’基团、二磷酸酯、三磷酸酯、生物可逆性基团、非生物可逆性基团、固体载体和辅助部分是一价封端基团的实例。末端磷酸酯是封端基团的实例，如果末端磷酸酯不包括与靶向部分的接头，则其可以为单价，或者如果末端磷酸酯包括与靶向部分的接头，则其可以为二价。键合至靶向部分(具有或不具有辅助部分)的接头是二价封端基团的实例。
如本文所用，术语“碳环”表示任选取代的C3-16单环、双环或三环结构，其中可以为芳族或非芳族的环由碳原子形成。碳环结构包括环烷基、环烯基、环炔基和某些芳基。
如本文所用，术语“羰基”表示–C(O)–基团。
如本文所用，表述“Cx-y”表示当未取代时，其名称紧接在该表述之后的基团包含总共x-y个碳原子。如果该基团是复合基团(例如芳基烷基)，Cx-y表示当未取代时，其名称紧接在该表述之后的部分包含总共x-y个碳原子。例如，(C6-10-芳基)-C1-6-烷基是如下基团：其中当未取代时，芳基部分包含总共6-10个碳原子，并且当未取代时，烷基部分包含总共1-6个碳原子。
如本文所用，术语“氰基”表示-CN基团。
如本文所用，术语“环加成反应”表示两个组分的反应，其中当不存在活化、通过化学催化剂活化或使用热能活化时，总共[4n +2]π个电子参与键形成，并且n为1、2或3。环加成反应也是两个组分的反应，其中存在光化学活化时，涉及[4n]π个电子，并且n为 1、2或3。理想地，[4n+2]π个电子参与键形成，并且n＝1。代表性的环加成反应包括烯烃与1,3-二烯的反应(Diels-Alder反应)、烯烃与α,β-不饱和羰基的反应(杂Diels-Alder反应)以及炔烃与叠氮基化合物的反应(例如，Hüisgen环加成反应)。
除非另有说明，否则本文所用的术语“环烯基”是指在环中具有至少一个双键并且具有3-10个碳的非芳族碳环基团(例如，C3-C10环烯基)。环烯基的非限制性实例包括环丙-1-烯基、环丙-2-烯基、环丁-1-烯基、环丁-1-烯基、环丁-2-烯基、环戊-1-烯基、环戊-2-烯基、环戊-3-烯基、降冰片烯-1-基、降冰片烯-2-基、降冰片烯-5-基和降冰片烯-7-基。如对于环烷基所述，环烯基可以是未取代的或取代的(例如，任选取代的环烯基)。
如本文所用，术语“环烯基烷基”表示各自被如本文所定义的环烯基取代的烷基。如本文所定义的各个基团，环烯基和烷基部分可被取代。
如本文所用，术语“亚环烯基”表示作为环烯基的二价基团，其中一个氢原子被化合价取代。如本文对于环烷基所述，亚环烯基可任选被取代。亚环烯基的非限制性实例是环烯-1,3-二基。
除非另有说明，否则本文所用的术语“环烷氧基”表示式-OR 的化学取代基，其中R为环烷基。在一些实施方案中，环烷基可以如本文所定义被进一步取代。
除非另有说明，否则本文所用的术语“环烷基”是指具有3-10 个碳的环状烷基(例如，C3-C10环烷基)。环烷基可以是单环或双环的。双环环烷基可以是双环[p.q.0]烷基类型，其中p和q各自独立地是1、2、3、4、5、6或7，条件是p和q之和为2、3、4、5、6、7 或8。或者，双环环烷基可包括桥接的环烷基结构，例如双环[p.q.r] 烷基，其中r为1、2或3，p和q各自独立地是1、2、3、4、5或6，条件是p，q和r的总和为3、4、5、6、7或8。环烷基可以是螺环基，例如，螺[p.q]烷基，其中p和q各自独立地是2、3、4、5、6 或7，条件是p和q之和为4、5、6、7、8或9。环烷基的非限制性实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、1-双环[2.2.1.] 庚基、2-双环[2.2.1.]庚基、5-双环[2.2.1.]庚基、7-双环[2.2.1.]庚基和十氢萘基。环烷基可以是未取代的或被1、2、3、4或5个独立地选自以下的取代基取代(例如，任选取代的环烷基)：烷基；烯基；炔基；烷氧基；烷基亚磺酰基；烷基亚氧硫基；烷基磺酰基；氨基；芳基；芳基氧基；叠氮基；环烷基；环烷氧基；环烯基；环炔基；卤代；杂烷基；杂环基；(杂环基)氧基；羟基；硝基；硫醇；甲硅烷基；氰基；＝O；＝S；＝NR’，其中R’是H、烷基、芳基或杂环基。每个取代基本身可以是未取代的，或被本文为每个相应基团定义的未取代的取代基取代。
如本文所用，术语“环烷基烷基”表示被如本文所定义的环烷基取代的烷基。如本文所述的各个基团，环烷基和烷基部分可任选被取代。
如本文所用，术语“亚环烷基”表示作为环烷基的二价基团，其中一个氢原子被化合价取代。亚环烷基的非限制性实例是环烷 -1,3-二基。如本文对于环烷基所述，亚环烷基可任选被取代。
除非另有说明，本文所用的术语“环炔基”是指具有一个或两个碳-碳三键并且具有8-12个碳的单价碳环基团。环炔基可包含一个跨环键或桥。环炔基的非限制性实例包括环辛炔基、环壬炔基、环癸炔基和环癸二炔基。如对于环烷基所定义，环炔基可以是未取代或取代的(例如，任选取代的环炔基)。
如本文所用，术语“二氢哒嗪基团”表示可通过在1,2,4,5-四嗪基团和应变的环烯基之间环加成而获得的二价基团。
如本文所用，术语“卤代”表示选自溴、氯、碘和氟的卤素。
如本文所用，术语“5-卤代嘧啶核苷”表示核苷，其中核碱基是具有以下结构的5-卤代尿嘧啶：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
其中R与核苷的五呋喃糖的异头碳键合，X是氟、氯、溴或碘。在一些实施方案中，X是溴或碘。
如本文所用，术语“杂烷烃-四基”是指被一个杂原子中断一次；两次，每次独立地被一个杂原子中断；三次，每次独立地被一个杂原子中断；或四次，每次独立地被一个杂原子中断的烷烃-四基。每个杂原子独立地是O、N或S。在一些实施方案中，杂原子为O或N。未取代的CX-Y杂烷烃-四基含有X至Y个碳原子以及本文所定义的杂原子。如对于杂烷基所述，杂烷烃-四基可以是未取代的或取代的 (例如，任选取代的杂烷烃-四基)。
如本文所用，术语“杂烷烃-三基”是指被一个杂原子中断一次；两次，每次独立地被一个杂原子中断；三次，每次独立地被一个杂原子中断；或四次，每次独立地被一个杂原子中断的烷烃-三基。每个杂原子独立地是O、N或S。在一些实施方案中，杂原子为O或N。未取代的CX-Y杂烷烃-三基含有X-Y个碳原子以及本文所定义的杂原子。如对于杂烷基所述，杂烷烃-三基可以是未取代的或取代的(例如，任选取代的杂烷烃-三基)。
如本文所用，术语“杂烷基”是指被一个或两个杂原子中断一次；两次，每次独立地被一个或两个杂原子中断；三次，每次独立地被一个或两个杂原子中断；或四次，每次独立地被一个或两个杂原子中断的烷基、烯基或炔基。每个杂原子独立地是O、N或S。在一些实施方案中，杂原子是O或N。杂烷基基团都不包括两个连续的氧或硫原子。杂烷基可以是未取代的或取代的(例如，任选取代的杂烷基)。当杂烷基是取代的并且取代基与杂原子键合时，根据杂原子的性质和化合价选择取代基。因此，在化合价允许的情况下，键合至杂原子的取代基选自下组：＝O、-N(RN2)2、-SO2ORN3、-SO2RN2、-SORN3、-COORN3、N-保护基、烷基、烯基、炔基、芳基、环烷基、环烯基、环炔基、杂环基或氰基，其中每个RN2独立地是H、烷基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基或杂环基，每个RN3独立地是烷基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基或杂环基。这些取代基中的每一个本身可以是未取代的，也可以被本文为每个相应基团定义的一个或多个未取代的取代基取代。当杂烷基是取代的并且该取代基与碳键合时，该取代基选自对于烷基所述的那些，条件是与杂原子键合的碳原子上的取代基不是Cl、Br或I。应理解，碳原子存在于杂烷基的末端。
如本文所用，术语“杂芳基氧基”是指-OR结构，其中R为杂芳基。如对于杂环基所定义，杂芳基氧基可任选被取代。
如本文所用，术语“杂环基”表示具有稠合或桥接的5-、6-、 7-或8-元环的单环、双环、三环或四环系统，除非另有说明，其包含独立选自氮、氧和硫的1、2、3或4个杂原子。杂环基可以是芳族的或非芳族的。非芳族5元杂环基具有0或1个双键，非芳族6 元和7元杂环基具有0-2个双键，并且非芳族8元杂环基具有0-2个双键和/或0或1个碳-碳三键。除非另有说明，杂环基包括1-16个碳原子。某些杂环基可包含多达9个碳原子。非芳族杂环基包括吡咯啉基、吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、高哌啶基、哌嗪基、哒嗪基、恶唑烷基、异恶唑啉基、吗啉基、硫吗啉基、噻唑啉基、异噻唑啉基、噻唑烷基、四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、二氢噻吩基、二氢吲哚基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、吡喃基、二氢吡喃基、二噻唑基等。如果杂环系统具有至少一个芳族共振结构或至少一个芳族互变异构体，则这种结构为芳族杂环基(即杂芳基)。杂芳基的非限制性实例包括苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并噻唑基、苯并噻吩基、苯并恶唑基、呋喃基、咪唑基、吲哚基、异吲唑基、异喹啉基、异噻唑基、异噻唑基、异恶唑基、恶二唑基、恶唑基、嘌呤基、吡咯基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、喹那唑啉基、喹啉基、噻二唑基(例如1,3,4-噻二唑)、噻唑基、噻吩基、三唑基、四唑基等。术语“杂环基”还表示具有桥接的多环结构的杂环化合物，其中一个或多个碳和/或杂原子桥接单环的两个不相邻的成员，例如奎宁环、托烷或二氮杂双环[2.2.2]辛烷。术语“杂环基”包括双环、三环和四环基团，其中任何上述杂环稠合到一个、两个或三个碳环上，例如芳基环、环己烷环、环己烯环、环戊烷环、环戊烯环或另一个单环杂环。稠合杂环基的实例包括 1,2,3,5,8，8a-六氢吲哚嗪；2，3-二氢苯并呋喃；2,3-二氢吲哚和2,3-二氢苯并噻吩。杂环基可以是未取代的或被1、2、3、4或5个独立选自以下的取代基取代：烷基；烯基；炔基；烷氧基；烷基亚磺酰基；烷基亚氧硫基；烷基磺酰基；氨基；芳基；芳基氧基；叠氮基；环烷基；环烷氧基；环烯基；环炔基；卤代；杂烷基；杂环基；(杂环基)氧基；羟基；硝基；硫醇；甲硅烷基；氰基；＝O；＝S；＝NR’，其中R’是H、烷基、芳基或杂环基。每个取代基本身可以是未取代的，或被本文对于各基团所定义的一个或多个未取代的取代基取代。
如本文所用，术语“杂环基烷基”表示被各自如本文所定义的杂环基取代的烷基。如本文所述的各个基团，杂环基和烷基部分可任选被取代。
如本文所用，术语“(杂环基)氮杂”表示式–N(RN1)(RN2)的化学取代基，其中RN1为杂环基，且RN2为H、-OH、-NO2、-N(RN2)2、 -SO2ORN2、-SO2RN2、SORN2、-COORN2、N-保护基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基、芳基烷基、芳基氧基、环烷基、环烯基、杂烷基或杂环基。优选地，RN2是H。
如本文所用，术语“杂亚环基”表示其中一个氢原子被化合价取代的杂环基。该杂亚环基可以以对于杂环基所述的方式任选被取代。杂亚环基的非限制性实例是杂环-1，3-二基。
除非另有说明，本文所用的术语“(杂环基)氧基”表示式-OR 的化学取代基，其中R为杂环基。(杂环基)氧基可以以对于杂环基所述的方式任选被取代。
如本文可互换使用的术语“氢氧基”和“羟基”表示-OH基团。
如本文所用，术语“免疫调节性多核苷酸”表示多核苷酸构建体，其包含总共6-50个通过独立选自核苷间磷酸酯和任选的核苷间无碱基间隔基的核苷间桥接基团共价结合在一起的连续核苷。免疫调节性多核苷酸分别在5′-和3′-末端分别被5′-和3′-封端基团封端。免疫调节性多核苷酸能够调节先天性免疫应答，如例如通过向其递送免疫调节性多核苷酸的抗原呈递细胞中NFκB的活化变化或至少一种炎性细胞因子或至少一种I型干扰素的分泌变化所测定(例如，与未向其递送免疫调节性多核苷酸的另一种抗原呈递细胞相比)。免疫调节性多核苷酸可以包含缀合基团，或者，如果免疫调节性多核苷酸是缀合物的一部分，其可以包含与靶向部分合任选地与一个或多个(例如1-6个)辅助部分(例如聚乙二醇)键合的接头。缀合基团或接头可以是磷酸三酯或末端封端基团的一部分。
如本文所用，术语“免疫刺激性多核苷酸”表示能够激活先天性免疫应答的免疫调节性多核苷酸，如例如通过向其递送免疫调节性多核苷酸的抗原呈递细胞中NFκB的激活增加或至少一种炎性细胞因子或至少一种I型干扰素的分泌增加所测定(例如，与未向其递送免疫刺激性多核苷酸的另一种抗原呈递细胞相比)。在一些实施方案中，免疫刺激性多核苷酸包含至少一个胞苷-p-鸟苷(CpG)序列，其中p是核苷间磷酸二酯(例如，磷酸酯或硫代磷酸酯)或核苷间磷酸三酯或硫代磷酸三酯。如本文所用，含CpG的免疫刺激性多核苷酸可以天然存在，例如细菌或病毒来源或合成的CpG ODN。例如，在一些实施方案中，免疫刺激性多核苷酸中的CpG序列含有 2’-脱氧核糖。在一些实施方案中，免疫刺激性多核苷酸中的CpG序列是未甲基化的。在一些实施方案中，免疫刺激性多核苷酸是本文提供的式(A)的多核苷酸。在一些实施方案中，免疫刺激性多核苷酸是本文提供的式(B)的化合物。
如本文所用，术语“免疫抑制性多核苷酸”表示能够拮抗先天性免疫应答的免疫调节性多核苷酸，如通过向其递送免疫抑制性多核苷酸的抗原呈递细胞中NFκB的活化减少或至少一种炎性细胞因子或至少一种I型干扰素的分泌减少所测定(例如，与未向其递送免疫抑制性多核苷酸的另一种抗原呈递细胞相比)。
如本文所用，术语“核苷间桥接基团”表示核苷间磷酸酯或核苷间无碱基间隔基。
如本文所用，术语“5-修饰的胞苷”代表核苷，其中核碱基具有以下结构：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
其中R与核苷的五呋喃糖的异头碳键合，并且X是卤素、炔基、烯基、烷基、环烷基、杂环基或芳基。在一些实施方案中，5-修饰的胞苷是5-卤代胞苷(例如5-碘胞苷或5-溴胞苷)。在其他实施方案中，5-修饰的胞苷是5-炔基胞苷。
如本文所用，术语“5-修饰的尿苷”代表核苷，其中核碱基具有以下结构：
Figure DEST_PATH_IMAGE005
其中R与核苷的五呋喃糖的异头碳键合，并且X是卤素、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基或芳基，条件是5-修饰的尿苷不是胸苷。在一些实施方案中，5-修饰的尿苷是5-卤代尿苷(例如5-碘代尿苷或5-溴代尿苷)。在其他实施方案中，5-修饰的尿苷是5-炔基尿苷。在一些实施方案中，5-修饰的尿苷是含有2-脱氧核糖的核苷。
如本文所用，术语“非生物可逆的”是指在核内体内部存在的条件下对降解具有抗性的化学基团。非生物可逆性基团不包含硫酯和/或二硫化物。
如本文所用，术语“核碱基”表示结合至核苷酸或核苷的糖部分的1’位的含氮杂环。核糖核酸酶可以是未修饰的或修饰的。如本文所用，“未修饰的”或“天然的”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A) 和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的核碱基包括其他合成和天然核碱基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C或m5c)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、 2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、 6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代特别是5-碘、5-溴、5-三氟甲基和其他 5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、5-炔基(例如5-乙炔基)尿嘧啶、5-乙酰氨基-尿嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮杂腺嘌呤和3-脱氮鸟嘌呤和3- 脱氮杂腺嘌呤。其他核碱基包括美国专利号3,687,808中公开的那些； The Concise EncyclopediaOf Polymer Science And Engineering,pages 858-859,Kroschwitz,J.I.,ed.JohnWiley&Sons,1990公开的那些； Englisch等人,Angewandte Chemie,InternationalEdition,1991,30, 613公开的那些；和Sanghvi,Y.S.,Chapter15,Antisense Researchand Applications，pages 289 302,(Crooke等人,ed.,CRC Press,1993) 公开的那些。某些核碱基对于增加本发明的杂交多核苷酸的结合亲和力特别有用，所述多核苷酸包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、 N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和 5-丙炔基胞嘧啶。已表明5-甲基胞嘧啶取代将核酸双链体稳定性提高0.6-1.2℃。(Sanghvi等人,eds.,Antisense Research and Applications 1993,CRC Press,BocaRaton,pages 276-278)。在特定的实施方案中，这些可以与2’-O-甲氧基乙基糖修饰结合。教导制备某些这些修饰的核碱基以及其他修饰的核碱基的美国专利包括但不限于上述美国专利号3,687,808；4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066； 5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711； 5,552,540；5,587,469；5,594,121；5,596,091；5,614,617；和5,681,941。为了本公开的目的，本文所用的“修饰的核碱基”还表示天然或非天然的核碱基，其包括一个或多个本文所述的保护基。
如本文所用，术语“核苷”代表五呋喃糖-核碱基的组合。五呋喃糖是2-脱氧核糖或其修饰形式，其中2位被OR、R、卤素(例如 F)、SH、SR，NH2、NHR、NR2或CN取代，其中R是任选取代的 C1-6烷基(例如，C1-6烷基或(C1-6烷氧基)-C1-6-烷基)或任选取代的(C6-14芳基)-C1-4-烷基。在某些实施方案中，2位被OR或F取代，其中R是C1-6烷基或(C1-6-烷氧基)-C1-6-烷基。五呋喃糖在异头碳处键合至核碱基。在一些实施方案中，术语“核苷”是指具有以下结构的二价基团：
Figure DEST_PATH_IMAGE006
其中B1是核碱基；Y为H、卤素(例如F)、羟基、任选取代的C1-6烷氧基(例如甲氧基或甲氧基乙氧基)或保护的羟基；Y1是 H或C1-6烷基(例如甲基)；并且3’和5’的每一个表示与另一个基团键合的位置。
如本文所用，术语“核苷酸”是指与磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键合的核苷。
如本文所用，术语“磷酸酯”表示包含磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯的基团，其中至少一个化合价与非氢取代基共价键合，条件是至少一个非氢取代基是含有至少一个核苷的基团。其中一个且仅有一个化合价与包含核苷的基团共价键合的磷酸酯是末端磷酸酯。其中两个化合价与包含核苷的基团共价键合的磷酸酯是核苷间磷酸酯。磷酸酯可以是具有以下结构的基团：
Figure DEST_PATH_IMAGE007
其中：
XE1和XE2的每一个独立地是O或S；
RE1和RE3的每一个独立地是氢或与核苷键合；无碱基间隔基的糖类似物；生物可逆性基团；非生物可逆性基团；辅助部分；缀合基团；与靶向部分键合的接头；与靶向部分和一个或多个(例如1-6 个)辅助部分键合的接头；或式–P(＝XE1)(–XE2–RE2A)–O–中的磷原子，
其中RE2A是氢、生物可逆性基团；非生物可逆性基团；辅助部分；缀合基团；与靶向部分键合的接头；与靶向部分和一个或多个 (例如1-6个)辅助部分键合的接头；和
RE2是氢、生物可逆性基团；非生物可逆性基团；辅助部分；缀合基团；与靶向部分键合的接头；与靶向部分和一个或多个(例如 1-6个)辅助部分键合的接头；
条件是RE1和RE3的至少一个与包含至少一个核苷的基团键合。
如果RE1和RE3各自独立地与包含至少一个核苷的基团键合，则磷酸酯为核苷间磷酸酯。如果RE1和RE3之一与不包含核苷的基团键合，则磷酸酯是末端磷酸酯。
如本文所用，术语“磷酸二酯”是指磷酸酯，其中三个化合价中的两个被非氢取代基取代，同时剩余化合价被氢取代。磷酸二酯由以下组成：磷酸盐、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯；与核苷、无碱基间隔基和/或磷酰基键合的一个或两个键；如果磷酸二酯仅包含一个与核苷、无碱基间隔基或磷酰基、独立选自生物可逆性基团；非生物可逆性基团；辅助部分；缀合基团；与靶向部分键合的接头；与靶向部分和一个或多个(例如1-6个)辅助部分键合的接头的一个基团的键。末端磷酸二酯包括与包含核苷的基团键合的一个键和选自生物可逆性基团；非生物可逆性基团；辅助部分；缀合基团；与靶向部分键合的接头；与靶向部分和一个或多个(例如1-6个)辅助部分键合的接头的一个基团。核苷间磷酸二酯包括与包含核苷的基团键合的两个键。磷酸二酯可以是具有以下结构的基团：
Figure DEST_PATH_IMAGE008
其中：
XE1和XE2的每一个独立地是O或S；
RE1和RE3的每一个独立地是氢或与核苷键合；无碱基间隔基的糖类似物；生物可逆性基团；非生物可逆性基团；辅助部分；缀合基团；与靶向部分键合的接头；与靶向部分和一个或多个(例如1-6 个)辅助部分键合的接头；或式–P(＝XE1)(–XE2–RE2A)–O–中的磷原子，
其中RE2A是氢、生物可逆性基团；非生物可逆性基团；辅助部分；缀合基团；与靶向部分键合的接头；与靶向部分和一个或多个 (例如1-6个)辅助部分键合的接头；和
RE2是氢、生物可逆性基团；非生物可逆性基团；辅助部分；缀合基团；与靶向部分键合的接头；与靶向部分和一个或多个(例如 1-6个)辅助部分键合的接头；
条件是RE1、XE2和RE3的一个且仅有一个是氢；和
条件是RE1和RE3的至少一个与包含至少一个核苷的基团键合。
如果RE1和RE3均与包含至少一个核苷的基团键合，则磷酸二酯为核苷间磷酸二酯。如果RE1和RE3的一个且仅有一个与包含核苷的基团键合，则磷酸二酯是末端磷酸二酯。
如本文所用，术语“磷酰基”是指下式的取代基
–P(＝XE1)(–XE2–RE2A)–O–RE3A,
其中：
XE1和XE2的每一个独立地是O或S；
RE2A是氢、生物可逆性基团；非生物可逆性基团；辅助部分；缀合基团；与靶向部分键合的接头；与靶向部分和一个或多个(例如1-6个)辅助部分键合的接头；和
RE3A是氢或开放化合价。
当基团被鉴定为键合至磷酰基时，该基团键合至磷酰基的磷原子。
如本文所用，术语“磷酸三酯”是指其中所有三个化合价均被非氢取代基取代的磷酸酯。磷酸三酯由以下组成：磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯；与一个或多个核苷、或无碱基间隔基和/或磷酰基键合的一个或两个键；独立选自生物可逆性基团；非生物可逆性基团；辅助部分；缀合基团；和与靶向部分和任选与一个或多个 (例如1-6个)辅助部分键合的接头的一个或两个基团。末端磷酸三酯包括与包含核苷的基团键合的一个键和独立选自生物可逆性基团；非生物可逆性基团；辅助部分；缀合基团；和与靶向部分和任选与一个或多个(例如1-6个)辅助部分键合的接头的两个基团。在一些实施方案中，末端磷酸三酯包含与靶向部分以及任选与一个或多个(例如1-6个)辅助部分键合的1或0个接头。核苷间磷酸三酯包括与含核苷基团键合的两个键。磷酸三酯可以是具有以下结构的基团：
Figure DEST_PATH_IMAGE009
其中：
XE1和XE2的每一个独立地是O或S；
RE1和RE3的每一个独立地是氢或与核苷键合；无碱基间隔基的糖类似物；生物可逆性基团；非生物可逆性基团；辅助部分；缀合基团；与靶向部分键合的接头；与靶向部分和一个或多个(例如1-6 个)辅助部分键合的接头；或式–P(＝XE1)(–XE2–RE2A)–O–中的磷原子，
其中RE2A是氢、生物可逆性基团；非生物可逆性基团；辅助部分；缀合基团；与靶向部分键合的接头；与靶向部分和一个或多个 (例如1-6个)辅助部分键合的接头；和
RE2是生物可逆性基团；非生物可逆性基团；辅助部分；缀合基团；与靶向部分键合的接头；与靶向部分和一个或多个(例如1-6 个)辅助部分键合的接头；
条件是RE1和RE3的至少一个与包含至少一个核苷的基团键合。
如果RE1和RE3均与包含至少一个核苷的基团键合，则磷酸三酯为核苷间磷酸三酯。如果RE1和RE3的一个且仅有一个与包含核苷的基团键合，则磷酸三酯是末端磷酸三酯。
如本文所用，术语“吡啶-2-基腙”表示以下结构的基团：
Figure DEST_PATH_IMAGE010
其中每个R’独立地是H或任选取代的C1-6烷基。吡啶-2-基腙可以是未取代的(即每个R’为H)。
如本文所用，术语“立体化学富集的”是指相对于相同基团的相反立体异构构型，对所记载基团的一种立体异构构型的局部立体化学偏好。因此，包含立体化学富集的硫代磷酸酯的多核苷酸是其中预定立体化学的硫代磷酸酯优先于相反立体化学的硫代磷酸酯存在的链。可以使用预定立体化学的硫代磷酸酯的非对映异构体比率以数字表达该偏好。预定的立体化学的硫代磷酸酯的非对映异构体比率是具有预定的立体化学的经鉴定的硫代磷酸酯的非对映异构体相对于具有相反的立体化学的经鉴定的硫代磷酸酯的非对映异构体的摩尔比。预定立体化学的硫代磷酸酯的非对映异构体比率可大于或等于1.1(例如，大于或等于4、大于或等于9、大于或等于19或大于或等于39)。
如本文所用，术语“Q标签”是指包含谷氨酰胺残基的一部分多肽，其在与含–NH2胺的化合物进行转谷氨酰胺酶介导的反应后，提供包含该部分多肽的缀合物，其中谷氨酰胺残基包括经修饰以包括与化合物键合的酰胺的侧链。Q标签是本领域已知的。Q标签的非限制性实例是LLQGG(SEQ ID NO：582)和GGGGLQGG(SEQ ID NO：583)。
如本文所用，术语“应变的环烯基”是指如果开放化合价被H 取代，则环烯基的环应变能为至少16kcal/mol。
如本文所用，术语“糖类似物”表示作为C3-6单糖或C3-6糖醇(例如甘油)的二价或三价基团，其被修饰以取代两个与磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯或封端基团中的氧原子键合的羟基。糖类似物不包含能够与互补链中的核碱基进行氢键键合的核碱基。糖类似物是环状或无环的。糖类似物中包含的进一步任选的修饰是：用H 取代一个、两个或三个其余的羟基或碳键合的氢原子；任选取代的 C1-6烷基；本文定义的–LinkA(–T)p；缀合基团；–(CH2)t1–ORZ，其中 t1是1-6的整数，并且RZ是任选取代的C1-6烷基、任选取代的C2-6烯基、任选取代的C2-6炔基、任选取代的C6-14芳基、任选取代的C3-8环烷基、任选取代的(C1-9杂环基)-C1-6-烷基、任选取代的(C6-10芳基)-C1-6-烷基或任选取代的(C3-8环烷基)-C1-6-烷基；引入一个或两个不饱和键(例如一个或两个双键)；以及如对于烷基、烯基、环烷基、环烯基或杂环基所定义用取代基取代一个、两个或三个氢或羟基。糖类似物的非限制性实例是任选取代的C2-6亚烷基、任选取代的C2-6亚烯基、任选取代的C5环烷-1,3-二基、任选取代的C5环烯-1,3-二基、任选取代的杂环-1,3-二基(例如，任选取代的吡咯烷-2,5-二基、任选取代的四氢呋喃-2,5-二基或任选取代的四氢噻吩 -2,5-二基)、或任选取代的(C1-4烷基)-(C3-8亚环烷基)(例如，任选取代的(C1烷基)-(C3亚环烷基))。
如本文所用，术语“硫化物”表示二价-S-或＝S基团。二硫化物是–S-S-。
如本文所用，术语“靶向部分”表示与结合给定靶细胞群(例如，抗原呈递细胞(APC；例如，专职性APC(例如，B细胞、pDC 或巨噬细胞)))的受体或其他受体部分特异性结合或反应性缔合或复合的部分(例如，小分子，如碳水化合物)。本文提供的缀合物包含靶向部分。靶向部分可以是抗体或其抗原结合片段或其工程化衍生物(例如，Fcab或融合蛋白(例如，scFv))。靶向部分可以是多肽。或者，靶向部分可以是小分子(例如甘露糖)或小分子簇(例如甘露糖簇)。包括靶向部分的本发明的缀合物对于与靶向部分结合的靶标可显示小于100nM的Kd。使用本领域已知的方法，例如使用表面等离振子共振(SPR)，例如使用BIACORETM系统(GE Healthcare,Little Chalfont,英国)来测量Kd。
如本文所用，术语“1,2,4,5-四嗪基”表示具有下式的基团：
Figure DEST_PATH_IMAGE011
其中R’是任选取代的烷基、任选取代的芳基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环基；并且R”为任选取代的亚烷基、任选取代的杂亚烷基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚环烷基、任选取代的杂亚环基或基团–Ra–Rb–，其中Ra和Rb的每一个独立地是任选取代的亚烷基、任选取代的杂亚烷基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚环烷基或任选取代的杂亚环基。
术语“治疗作用”是指由药理活性物质在受试者，特别是哺乳动物，更特别是人中引起的局部或全身作用。因此，该术语是指旨在用于诊断、治愈、缓解、治疗或预防疾病或增强动物或人所需的身体或智力发育和病症的任何物质。如本文所用，术语“治疗有效量”或“治疗有效剂量”表示改善、治疗或至少部分抑制待治疗的疾病的症状所必需的免疫调节性多核苷酸或缀合物的量。对于该用途有效的量取决于疾病的严重程度以及受试者的体重和总体状况。通常，体外使用的剂量可以在用于体内施用药物组合物的量方面提供有用的指导，并且动物模型可以用于测定治疗特定疾病的有效剂量。
如本文所用，术语“硫代羰基”表示C(＝S)基团。
如本文所用，术语“硫杂亚环基”表示基团–S–R–，其中R为杂亚环基。硫杂亚环基可以对于杂环基所述的方式任选被取代。
如本文所用，术语“硫醇基”代表-SH基团。
参照患者的疾病或病症使用的术语“治疗”意欲是指通过向患者施用本发明的多核苷酸或缀合物获得有益或期望的结果，例如临床结果。有益或期望的结果可包括减轻或改善疾病或病症的一种或多种症状；削弱疾病或病症的程度；稳定疾病或病症(即不恶化)；预防疾病或病症的传播；延缓或减缓疾病或病症的进展；减轻疾病或病症；和缓解(无论是部分还是全部)。“减轻”疾病或病症是指，与不用本发明的多核苷酸或缀合物治疗的程度或时程相比，疾病或病症的程度和/或不良临床表现减轻了，和/或进展的时程减慢了。
如本文所用，术语“三唑亚环烯基”是指包含与8元环稠合的 1,2,3-三唑环的杂环烯基，其所有内环原子是碳原子，并且桥头原子是sp2-杂化的碳原子。三唑亚环烯基可以对于杂环基所述的方式任选被取代。
如本文所用，术语“三唑杂亚环基”是指包含与包含至少一个杂原子的8元环稠合的1,2，3-三唑环的杂亚环基。三唑杂亚环基中的桥头原子是碳原子。三唑杂亚环基可以对于杂环基所述的方式任选被取代。
应理解，术语“免疫调节性多核苷酸”、“免疫刺激性多核苷酸”、“免疫抑制性多核苷酸”和“缀合物”分别包括免疫调节性多核苷酸、免疫刺激性多核苷酸、免疫抑制性多核苷酸和缀合物的盐。例如，术语“免疫调节性多核苷酸”、“免疫刺激性多核苷酸”、“免疫抑制性多核苷酸”和“缀合物”涵盖磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯的质子化中性形式(P-XH部分，其中X为O或S)和磷酸、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯的去质子化离子形式(PX-部分，其中X为O或S)。因此，应理解，描述为具有RE1、RE2和RE3的一个或多个作为氢的磷酸酯和磷酸二酯包括盐，其中磷酸盐、硫代磷酸酯或二硫代磷酸盐以去质子化的离子形式存在。
术语“先天性免疫应答”和“先天性免疫”在本领域中是公认的，并且是指机体的免疫系统在识别病原体相关的分子模式时启动的非特异性防御机制，其涉及不同形式的细胞活性，包括通过各种途径产生的细胞因子和细胞死亡。如本文所用，先天免疫应答包括对由Toll样受体9(TLR9)介导的含CpG的免疫刺激性多核苷酸的细胞应答，其包括但不限于增加炎症细胞因子的产生(例如I型干扰素或IL-10产生)、激活NFκB途径、增加免疫细胞的增殖、成熟、分化和/或存活，并且在一些情况下诱导细胞凋亡。可以使用本领域已知的方法来检测先天性免疫的激活，例如测量(NF)-κB的激活。
术语“适应性免疫应答”和“适应性免疫”在本领域中是公认的，并且是指机体免疫系统在识别特定抗原时启动的抗原特异性防御机制，其包括体液应答和细胞介导的应答。如本文所用，适应性免疫应答包括由含CpG的免疫刺激性多核苷酸引发和/或增强的细胞应答。在一些实施方案中，免疫刺激性多核苷酸或其一部分是抗原特异性适应性免疫应答的抗原靶标。在其他实施方案中，免疫刺激性多核苷酸不是抗原特异性适应性免疫应答的抗原靶标，但是仍然增强适应性免疫应答。可以使用本领域已知的方法来检测适应性免疫应答的激活，例如测量抗原特异性抗体的产生或抗原特异性细胞介导的细胞毒性水平。
术语“Toll样受体”(或“TLR”)在本领域中是公认的，并且是指最初被识别为识别微生物病原体的先天性免疫系统的传感器的模式识别受体的家族。TLR识别微生物中的不同结构，通常称为“PAMP”(病原体相关的分子模式)。配体结合TLR激活一系列胞内信号传导途径，从而诱导先天性免疫应答和/或适应性免疫应答。如本文所用，术语“toll样受体”或“TLR”也指细胞表达的toll样受体蛋白的功能片段。在人中，已经鉴定出十种TLR，包括TLR-1、 -2、-3、-4、-5、-6、-7/8、-9和-10。D’Arpa和Leung,Adv.Wound Care, 2017,6,330-343。编码TLR的人基因是已知的。
Toll样受体9(TLR9)，也称为CD289(分化簇289)，是Toll 样受体(TLR)家族的成员。Du等人,Eur.Cytokine Netw.，11:362-371 (2000)。TLR9是在免疫系统细胞(包括树突状细胞(DC)、B淋巴细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞和其他抗原呈递细胞)中表达的重要受体。TLR9激活触发信号传导级联，其桥接先天性免疫和适应性免疫。Martinez-Campos等人,Viral Immunol.,30:98-105(2016)；Notley 等人,Sci.Rep.,7:42204(2017)。天然TLR-9激动剂包括包含未甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)的寡脱氧核苷酸(CpG ODN)。在本公开中使用的TLR-9配体包括但不限于天然存在或合成的CpG ODN，以及本文提供的其他含CpG的免疫刺激性多核苷酸和/或免疫缀合物。可以使用本领域已知的方法检测TLR9信号传导通路的激活，例如测量骨髓分化抗原88(MyD88)的募集、核因子(NF)-κB、 c-Jun N端激酶(JNK)和p38丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信号传导途径的激活、干扰素调节因子-7的激活、一种或多种细胞因子(例如I型干扰素(IFN)、白介素(IL)-6、IL-10和IL-12)、一种或多种免疫细胞群(如NK细胞、自然杀伤T细胞、单核细胞) 的激活，以及细胞毒性淋巴细胞(CTL)和T辅助1(Th1)反应的水平，以及免疫球蛋白的分泌水平。
如本文所用，术语“表达TLR的细胞”是指表达Toll样受体并且能够在Toll样受体与激动剂结合后激活Toll样受体信号传导途径的细胞。Toll样受体可以在细胞表面和/或细胞的一个或多个细胞内区室如核内体或吞噬体的膜上表达。表达TLR的细胞可以进一步表达除Toll样受体以外的一种或多种细胞表面抗原。某些免疫细胞表达TLR，并且免疫细胞中TLR信号传导途径的激活引发先天性免疫应答和/或适应性免疫应答。通过TLR信号传导途径激活的免疫细胞可帮助从机体消除其他患病细胞。某些患病细胞(例如癌细胞或病毒感染的细胞)表达TLR，并且患病细胞中TLR信号传导途径的激活可导致患病细胞死亡，例如通过诱导细胞凋亡。表达TLR9的细胞的实例包括但不限于树突细胞(DC)、B细胞、T细胞、朗格汉斯细胞、角质形成细胞、肥大细胞、内皮细胞、成肌纤维细胞和原代成纤维细胞。可以使用本领域已知的方法来测定细胞是否表达任何 Toll样受体(例如TLR9)，例如检测细胞中Toll样受体的mRNA。
如本文所用，术语“免疫细胞”是本领域公认的，是指参与宿主防御机制的任何细胞，例如产生促炎性细胞因子的细胞和参与组织损伤和/或疾病发病的细胞。免疫细胞的实例包括但不限于T细胞、 B细胞、自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞、巨噬细胞、抗原呈递细胞(APC)、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞。
术语“抗原呈递细胞”或“APC”在本领域中是公认的，并且是指免疫细胞的异质性组，其通过处理和呈递抗原以被某些淋巴细胞(例如T细胞)识别来介导细胞免疫应答。抗原呈递细胞的示例性类型包括但不限于专职性抗原呈递细胞，包括例如B细胞、单核细胞、树突状细胞和朗格汉斯细胞，以及其他抗原呈递细胞，包括例如角质形成细胞、内皮细胞细胞、星形胶质细胞、成纤维细胞和少突胶质细胞。如本文所用，术语“抗原呈递细胞”包括体内发现的抗原呈递细胞和源自体内细胞的体外细胞培养物中发现的抗原呈递细胞。如本文所用，抗原呈递细胞还包括人工修饰的APC，例如经过遗传修饰以表达Toll样受体(例如TLR9)或调节Toll样受体 (例如TLR9)的表达水平的APC。
术语“树突状细胞”或“DC”在本领域中是公认的，并且是指专门的抗原感测和抗原呈递细胞(APC)的异质性组。人DC分为三个主要亚组：浆细胞样DC(pDC)、骨髓DC(mDC)和单核细胞衍生DC(MDDC)。Schraml等人,Curr.Opin.Immunol.,32:13-20 (2015)。可以基于不同的TLR表达模式来识别DC的亚组。举例来说，DC(mDC)的骨髓或“常规”亚组在受刺激时表达TLR 1-8，并且产生一系列激活标志物(例如CD80、CD86、MHC I类和II类、 CCR7)、促炎性细胞因子和趋化因子。这种刺激和产生的表达的结果是抗原特异性CD4+和CD8+T细胞启动。这些DC获得增强的吸收抗原并将其以适当形式呈递给T细胞的能力。DC(pDC)的浆细胞样亚组在激活后表达TLR7和TLR9，导致激活NK细胞和T细胞。
如本文所用，术语“抗原”是指能够引发免疫应答的分子或其抗原片段，所述免疫应答包括先天性免疫应答和适应性免疫应答。如本文所用，抗原可以是蛋白质、肽、多糖、脂质、核酸(尤其是 RNA和DNA)、核苷酸以及其他生物或生化物质。术语“引起免疫应答”是指响应于刺激如抗原而在体内刺激免疫细胞。免疫应答包括细胞免疫应答，例如T细胞和巨噬细胞刺激，以及体液免疫应答，例如B细胞和补体刺激和抗体产生。可以使用本领域众所周知的技术来测量免疫应答，包括但不限于抗体免疫测定、增殖测定等。
术语“抗原片段”和“抗体结合片段”在本文可互换使用。本文所用的抗原性片段能够在特定反应中与抗原结合分子例如抗体复合。本文所指的特异性反应是指抗原或抗原片段将以高度选择性的方式与其相应的抗体反应，而不与可能被其他抗原诱发的多种其他抗体反应。这种反应的特异性由抗原中是否存在一种或多种表位(免疫原性决定簇)来决定。如本文所用，抗原或其抗原性片段可具有一个表位，或具有多于一个的表位。
如本文所用，术语“T细胞表位”是指由T细胞产生的抗原的任何表位。
如本文所用，术语“肿瘤相关抗原”或“TAA”是指由接受本文所提供的治疗或预防性护理的癌症患者中的癌细胞或实体瘤基质表达的抗原(例如，接受治疗剂量的免疫刺激性多核苷酸或CpG-Ab 免疫缀合物)。TAA在本文提供的治疗或预防护理中可被靶向也可不被靶向。TAA不必在癌细胞上过度表达、突变或失调，但可以具有与正常细胞中TAA将具有的相同特征。在一些实施方案中，TAA 可以在癌细胞中过度表达、突变或失调。TAA可以是蛋白质、核酸、脂质或其他抗原。TAA可以是细胞表面表达的TAA、细胞内TAA 或核内TAA。在实体瘤的情况下，TAA可以在实体瘤块的基质中表达。如本文所用，术语“基质”是指除了癌细胞以外的实体瘤块中的组分。例如，基质可以包括成纤维细胞、上皮细胞、其他血管组分或细胞外基质组分。如本文所用，术语“基质”不包括免疫系统的组分，例如免疫细胞(例如，B细胞、T细胞、树突状细胞、巨噬细胞、天然杀伤细胞等)。各种TAA是本领域已知的。可以使用本领域已知的方法来进行TAA的鉴定，例如Zhang等人,Methods Mol. Biol.,520:1-10(2009)中公开的方法。
术语“抗体”、“免疫球蛋白”和“Ig”在本文可互换使用，并且以最广义使用，并且具体涵盖例如单个单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂、中和抗体、全长或完整单克隆抗体)、具有多表位或单表位特异性的抗体组合物、多克隆或单价抗体、多价抗体、由至少两个完整抗体、单链抗体和抗体片段形成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体，只要它们表现出所需的生物学活性)。抗体可以是人、人源化、嵌合和/或亲和力成熟的，以及来自其他物种，例如小鼠和兔子的抗体。
术语“抗体”旨在包括在免疫球蛋白类别的多肽中B细胞的多肽产物，其能够结合特定抗原并且由两对相同的多肽链组成，其中每对具有一条重链(约50-70kDa)和一条轻链(约25kDa)，并且每条链的每个氨基末端部分包含约100-约130个或更多个氨基酸的可变区，并且每条链的每个羧基末端部分包括恒定区。参见 Borrebaeck(ed.)(1995)AntibodyEngineering,SecondEd.,Oxford University Press.；Kuby(1997)Immunology,第三版,W.H.Freeman and Company,New York。抗体还包括但不限于合成抗体、单克隆抗体、重组抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、骆驼化抗体、嵌合抗体、胞内抗体、抗独特型(抗-Id) 抗体及其功能片段，其是指保留衍生该片段的抗体的部分或全部结合活性的抗体重链或轻链多肽的一部分。抗体的功能片段的非限制性实例包括单链Fv(scFv)(例如，包括单特异性或双特异性)、 Fab片段、F(ab’)片段、F(ab)2片段、F(ab’)2片段、二硫键连接的Fv (sdFv)、Fd片段、Fv片段、双抗体、三抗体、四抗体和微抗体。特别地，本文提供的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性部分，例如，抗原结合结构域或包含结合抗原的抗原结合位点的分子(例如，抗CD56抗体或抗SIRPα抗体的一个或多个互补决定区(CDR))。此类抗体片段描述于例如Harlow和Lane, Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(1989)；Myers(ed.),Molec.Biology and Biotechnology:A Comprehensive Desk Reference,New York:VCHPublisher,Inc.； Huston等人,Cell Biophysics1993,22，189-224；Plückthun andSkerra, Meth.Enzymol.1989,178,497-515；以及Day,Advanced Immunochemistry,第二版,Wiley-Liss,Inc.,New York,NY(1990)。本文提供的抗体可以是任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、任何类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2) 或免疫球蛋白分子的任何亚类(例如，IgG2a和IgG2b)。
术语“抗原”是指抗体可以选择性结合的预定抗原。靶抗原可以是多肽、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其他天然存在或合成的化合物。在一个实施方案中，靶抗原是多肽。
术语“抗原结合片段”、“抗原结合结构域”和“抗原结合区”是指包含与抗原相互作用并赋予结合剂其对抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基的抗体的一部分(例如，互补决定区(CDR))。
术语“特异性结合”、“特异性结合于”或“对于…特异性的”特定多肽或特定多肽靶标上的表位例如可以由具有以下针对靶标的解离常数(Kd)的分子(例如抗体)表现：至少约10-4M、至少约 10-5M、至少约10-6M、至少约10-7M、至少约10-8M、至少约10-9M、至少约10-10M、至少约10-11M或至少约10-12M。在一个实施方案中，术语“特异性结合”是指其中分子结合特定多肽或特定多肽上的表位，而基本上不结合任何其他多肽或多肽表位的结合。
4-链抗体单元是由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H) 链组成的异四聚体糖蛋白。就IgG而言，4-链单元通常为约150,000 道尔顿。每条L链通过一个共价二硫键与H链连接，而两条H链则根据H链同种型通过一个或多个二硫键彼此连接。每条H和L链还具有规则间隔的链内二硫键。每条H链在N端具有一个可变结构域 (VH)，然后是对于每条α和γ链的三个恒定结构域(CH)，以及对于μ和ε同种型的四个CH域。每条L链在N端具有可变结构域(VL)，然后在其另一端具有恒定结构域(CL)。VL与VH对齐，并且CL与重链(CH1)的第一恒定结构域对齐。据信特定的氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。VH和VL的配对一起形成单个抗原结合位点。对于不同类别抗体的结构和特性，参见Basic andClinical Immunology,第八版,Stites等人(eds.),Appleton& Lange,Norwalk,CT,1994，第71页和第6章。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体的轻链或重链的一部分，其通常位于轻链或重链的氨基末端并且长度为重链中约 120-130个氨基酸和轻链中约100-110个氨基酸，并且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。重链的可变区可称为“VH”。轻链的可变区可称为“VL”。术语“可变的”是指可变区的某些片段在抗体之间的序列差异极大的事实。V区介导抗原结合并定义特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性并非在可变区的110 个氨基酸跨度上均匀分布。相反，V区由可变性较小(例如，相对不变)的称为约15-30个氨基酸的构架区(FR)的伸长组成，其被可变性较大(例如，极度可变性)的称为“高变区”的较短区域隔开，每个高变区大约9-12个氨基酸长。重链和轻链的可变区各包含四个FR，主要采用β折叠构型，并通过三个高变区连接，所述三个高变区形成连接并在某些情况下形成β折叠结构一部分的环。每条链中的高变区通过FR紧密结合在一起，并且与来自另一条链的高变区一起促进抗体的抗原结合位点的形成(参见，例如，Kabat等人, Sequences ofProteins of Immunological Interest,第五版，Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda,MD，1991)。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，而是表现出多种效应子功能，例如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。可变区在不同抗体之间的序列差异极大。序列的可变性集中在CDR 中，而可变区中的较小可变部分称为构架区(FR)。轻链和重链的 CDR主要负责抗体与抗原的相互作用。在特定的实施方案中，所述可变区是人可变区。
术语“如Kabat中编号的可变区残基”或“如Kabat中编号的氨基酸位置”及其变体是指Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，PublicHealth Service，National Institutes of Health,Bethesda，MD.(1991)中用于抗体汇编的重链可变区或轻链可变区的编号系统。使用该编号系统，实际的线性氨基酸序列可以包含较少或额外的氨基酸，其对应于可变结构域的FR或 CDR的缩短或插入。例如，重链可变结构域可以在H2的残基52之后包括单个氨基酸插入物(根据Kabat的残基52a)和在重链FR残基82之后包括插入的残基(例如，根据Kabat的残基82a、82b和 82c等)。可以通过将抗体的序列同源性区域与“标准”Kabat编号序列进行比对来确定给定抗体的Kabat残基编号。当提及可变结构域中的残基(大约轻链的残基1-107和重链的残基1-113)时，通常使用Kabat编号系统(例如，Kabat等人,Sequences of Immunological Interest.第五版，PublicHealth Service,National Institutes of Health, Bethesda,Md.(1991))。当提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号系统”或“EU索引”(例如，见上文，Kabat等人,报道的EU索引)。“如Kabat中的EU索引”是指人IgG 1 EU 抗体的残基编号。已经描述了其他编号系统，包括例如AbM、 Chothia、Contact、IMGT和AHon。
“完整”抗体是包含抗原结合位点以及CL和至少重链恒定区 CH1、CH2和CH3的抗体。恒定区可以包括人恒定区或其氨基酸序列变体。优选地，完整抗体具有一种或多种效应子功能。
术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2 和Fv片段；双抗体和二-双抗体(例如参见Holliger等人,Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.1993,90,6444-8；Lu等人,J.Biol.Chem.2005,280, 19665-72；Hudson等人,Nat.Med.2003,9,129-134；WO 93/11161；和美国专利号5,837,242号6,492,123)；单链抗体分子(例如参见美国专利号4,946,778；5,260,203；5,482,858和5,476,786)；双可变域抗体(例如参见美国专利号7,612,181)；单可变域抗体(SdAb)(例如参见 Woolven等人，Immunogenetics 1999，50，98-101 Streltsov等人,Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.2004,101,12444-12449)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
抗体的术语“功能片段”、“结合片段”或“抗原结合片段”是指表现出归因于完整抗体的至少一种生物学功能的分子，该功能至少包括结合靶抗原。
当用于抗体时，术语“重链”是指约50-70kDa的多肽链，其中氨基末端部分包括约120-130或更多个氨基酸的可变区，并且羧基末端部分包括恒定区。基于重链恒定区的氨基酸序列，恒定区可以是被称为alpha(α)、delta(δ)、epsilon(ε)、gamma(γ)和mu(μ)的五种不同类型(例如，同种型)之一。不同的重链大小不同：α、δ和γ包含约450个氨基酸，而μ和ε包含约550个氨基酸。当与轻链结合时，这些不同类型的重链分别产生五种众所周知的抗体类别(例如，同种型)IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，包括IgG的四个亚类，即IgG1、 IgG2、IgG3和IgG4。重链可以是人重链。
当用于抗体时，术语“轻链”是指约25kDa的多肽链，其中氨基末端部分包括约100-约110或更多个氨基酸的可变区并且羧基末端部分包括恒定区。轻链的大约长度是211-217个氨基酸。基于恒定结构域的氨基酸序列，存在两种不同的类型，称为kappa(κ)和lambda(λ)。轻链氨基酸序列是本领域众所周知的。轻链可以是人轻链。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群体获得的抗体，例如，除了可以少量存在的可能天然存在的突变以外，包含所述群体的单个抗体是相同的，并且每个单克隆抗体通常将识别抗原上的单个表位。在特定实施方案中，如本文所用，“单克隆抗体”是由单个杂交瘤或其他细胞产生的抗体，其中抗体仅结合β-klotho表位，例如通过ELISA或其他抗原结合或本领域已知的竞争性结合测定来确定。术语“单克隆”不限于制备抗体的任何特定方法。例如，可用于本公开内容的单克隆抗体可通过首先由Kohler 等人,Nature 1975，256，495描述的杂交瘤方法来制备；或者可以使用重组DNA方法在细菌、真核动物或植物细胞中制备(例如参见美国专利号4,816,567)。还可以例如使用Clackson等人，Nature 1991，352， 624-628和Marks等人,J.Mol.Biol.1991，222，581-597中描述的技术从噬菌体抗体文库分离“单克隆抗体”。制备克隆细胞系和由此表达的单克隆抗体的其他方法在本领域中是众所周知的(例如参见， Short Protocols in Molecular Biology，(2002)第五版，第11章，Ausubel等人，eds.，John Wiley and Sons,New York)。本文实施方案中提供了产生单克隆抗体的示例性方法。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是包括人免疫球蛋白(例如受体抗体)的嵌合抗体，其中天然CDR残基被来自非人类物种(例如供体抗体)的相应CDR的残基所代替，所述非人类物种例如为具有所需特异性、亲和力和能力的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物。在一些情况下，人免疫球蛋白的一个或多个FR区残基被相应的非人残基代替。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改进抗体性能。人源化抗体重链或轻链可包含基本上所有的至少一个或多个可变区，其中所有或基本上所有的CDR对应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的那些。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白恒定区。对于进一步详细信息，参见Jones等人，Nature 1986,321, 522-525；Riechmann等人，Nature 1988,332,323-329；Presta，Curr. Opin.Biotechnol.1992，3,394-398；Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.1992,89,4285-4289；和美国专利号6,800,738、6,719,971、 6,639,055、6,407,213和6,054,297。
“人抗体”是具有对应于由人产生的抗体的氨基酸序列和/或已使用本文公开的任何用于制备人抗体的技术制备的氨基酸序列的抗体。人抗体的该定义特别排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可以使用本领域已知的各种技术来产生人抗体，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.1991,227,381；Marks等人,J. Mol.Biol.1991,222,581)和酵母展示文库(Chao等人,Nature Protocols 2006，1,755-768)。还可用于制备人单克隆抗体的方法是描述于Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R. Liss，p.77(1985)；Boerner等人，J.Immunol.1991,147，86-95中的方法。还参见van Dijk and van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol.2001,5, 368-374。可以通过将抗原施用于转基因动物来制备人抗体，所述转基因动物已被修饰以响应抗原攻击而产生这种抗体，但是其内源基因座有缺失，例如小鼠(例如参见Jakobovits,Curr.Opin.Biotechnol.1995,6,561-566；Brüggemann和Taussing，Curr.Opin.Biotechnol. 1997，8，455-458；和美国专利号6,075,181和6,150,584，关于 XENOMOUSETM技术)。关于经由人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体，还例如参见Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2006，103, 3557-3562。
“CDR”是指免疫球蛋白(Ig或抗体)VHβ-折叠框架的非框架区域内的三个高变区(H1、H2或H3)之一，或抗体VLβ-折叠框架的非框架区域内的三个高变区(L1、L2或L3)之一。因此，CDR是散布在框架区序列内的可变区序列。CDR区是本领域技术人员众所周知的，并且已经由例如Kabat定义为抗体可变(V)结构域内最具高变性的区域。Kabat等人,J.Biol.Chem.1977,252,6609-6616；Kabat, Adv.Protein Chem.1978,32,1-75。CDR区序列还由Chothia在结构上定义为不是保守的β-折叠框架的那些残基，因此能够适应不同的构象。Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.1987,196,901-917。两种术语在本领域中是众所周知的。CDR区序列还由AbM、Contact和IMGT 定义。已经通过比较许多结构确定了规范抗体可变区内CDR的位置。 Al-Lazikani等人,J.Mol.Biol.1997,273,927-948；Morea等人,Methods.2000,20,267-279。因为高变区中的残基数在不同的抗体中有变化，所以相对于规范位置的额外残基通常紧挨着标准可变区编号方案中的残基编号用a、b、c等编号。Al-Lazikani等人，同上(1997)。类似地，这种命名对于本领域技术人员是众所周知的。
当在本文中使用时，术语“高变区”、“HVR”或“HV”是指序列高变和/或形成结构上定义的环的抗体可变区的区域。通常，抗体包含六个高变区；VH(H1、H2、H3)中的三个和VL(L1、L2、 L3)中的三个。许多高变区描述可使用，并且在本文中涵盖。基于序列可变性，Kabat互补决定区(CDR)是最常用的(例如参见，Kabat 等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第五版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD.(1991))。相反，Chothia是指结构环的位置。例如参见，Chothia和Lesk，J.Mol. Biol.1987,196901-917。当使用Kabat编号惯例时，Chothia CDR-H1 环的末端在H32和H34之间根据环的长度而变化(这是因为Kabat 编号方案将插入置于H35A和H35B上；如果35A和35B均不存在，则该环在32处终止；如果仅存在35A，则该环在33处终止；如果35A和35B均存在，则该环在34处终止)。AbM高变区代表Kabat CDR和Chothia结构环之间的折衷，并被Oxford Molecular的AbM 抗体建模软件使用(例如参见Martin,in AntibodyEngineering,第2 卷，第3章，Springer Verlag)。“Contact”高变区基于对可用复杂晶体结构的分析。来自这些高变区或CDR的每一个的残基如下所示。
最近，已经开发并广泛采用了通用编号系统，即 ImMunoGeneTics(IMGT)信息系统。Lafranc等人,Dev.Comp. Immunol.2003,27,55-77。IMGT是致力于人和其他脊椎动物的免疫球蛋白(IG)、T细胞受体(TR)和主要组织相容性复合体(MHC) 的集成信息系统。在本文中，CDR是指轻链或重链内的氨基酸序列和位置。由于CDR在免疫球蛋白可变域结构内的“位置”在物种之间是保守的，并存在于称为环的结构中，通过使用根据结构特征比对可变域序列的编号系统，CDR和框架残基是容易鉴定的。该信息可用于将一种物种的免疫球蛋白的CDR残基接枝和替换为通常来自人抗体的受体框架。Honegger和Plückthun,J.Mol.Biol.2001,309, 657-670已开发了一种额外的编号系统(AHon)。包括例如Kabat 编号和IMGT唯一编号系统的编号系统之间的对应关系是本领域技术人员众所周知的(参见例如Kabat，同上；Chothia和Lesk，同上； Martin，同上；Lefranc等人，同上)。本文所示的示例性系统结合了Kabat和Chothia。
高变区可包括如下“扩展高变区”：VL中的24-36或24-34(L1)、 46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)以及VH中的26-35或 26-35A(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102 (H3)。如本文所用，术语“HVR”和“CDR”可互换使用。
示例性 IMGT Kabat AbM Chothia Contact
V<sub>H</sub> CDR1 26-35 27-38 31-35 26-35 26-32 30-35
V<sub>H</sub> CDR2 50-65 56-65 50-65 50-58 53-55 47-58
V<sub>H</sub> CDR3 95-102 105-117 95-102 95-102 96-101 93-101
V<sub>L</sub> CDR1 24-34 27-38 24-34 24-34 26-32 30-36
V<sub>L</sub> CDR2 50-56 56-65 50-56 50-56 50-52 46-55
V<sub>L</sub> CDR3 89-97 105-117 89-97 89-97 91-96 89-96
术语“恒定区”或“恒定结构域”是指轻链和重链的羧基末端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出多种效应子功能，例如与Fc受体相互作用。该术语是指相对于免疫球蛋白的另一部分 (包含抗原结合位点的可变区)具有更保守的氨基酸序列的免疫球蛋白分子的部分。恒定区可以包含重链的CH1、CH2和CH3区域以及轻链的CL区域。
术语“框架”或“FR”残基是在CDR侧翼的那些可变区残基。 FR残基存在于例如嵌合、人源化、人、域抗体、双抗体、线性抗体和双特异性抗体中。FR残基是除高变区残基或CDR残基以外的那些可变域残基。
“亲和力成熟的”抗体是在其一个或多个HVR中具有一个或多个改变(例如，氨基酸序列变化，包括改变、添加和/或缺失)的抗体，所述改变导致与不具有这些改变的亲本抗体相比，抗体的亲和力的改进。优选的亲和力成熟的抗体将对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。亲和力成熟的抗体通过本领域已知的方法产生。参见综述Hudson和Souriau,Nat.Med.2003,9,129-134；Hoogenboom, Nat.Biotechnol.2005,23,1105-1116；Quiroz和Sinclair,Revista Ingenieria Biomedica 2010,4,39-51。
“阻断”抗体或“拮抗剂”抗体是抑制或降低抗原结合的抗体。在某些实施方案中，阻断抗体或拮抗剂抗体基本上或完全阻断抗原的结合。在某些实施方案中，“阻断”抗体或“拮抗剂”抗体是抑制或降低其结合的抗原的生物学活性的抗体。在其他实施方案中，阻断抗体或拮抗剂抗体基本或完全抑制抗原的生物学活性。例如，阻断性抗SIRP抗体基本上或完全阻止SIPRα与CD47之间的相互作用。
“非阻断”抗体是不抑制或降低抗原结合的抗体。在某些实施方案中，“非阻断”抗体是不抑制或降低其结合的抗原的生物学活性的抗体。在其他实施方案中，非阻断抗体结合抗原结合的独特且非重叠的表位。在一些实施方案中，非阻断抗体是激动剂抗体。
“激动剂抗体”是触发应答的抗体，例如模拟目的多肽的至少一种功能活性的应答。激动剂抗体包括作为配体模拟物的抗体，例如，其中配体结合细胞表面受体，并且该结合通过细胞间细胞信号传导途径诱导细胞信号传导或活性，并且其中抗体诱导相似的细胞信号传导或激活。
抗体“效应子功能”是指那些归因于抗体的Fc区(例如，天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)，并且随抗体同种型而变化的生物活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；下调细胞表面受体(例如，B细胞受体)；和B细胞活化。
本文中的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区，包括例如天然序列Fc区、重组Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可以变化，但人IgG重链的Fc区通常被定义为从Cys226位置的氨基酸残基或从Pro230延伸至其羧基末端。Fc区的C端赖氨酸(根据EU编号系统为残基447)可以例如在抗体的生产或纯化期间，或通过重组工程化编码抗体重链的核酸而去除。因此，完整抗体的组合物可包含去除了所有K447残基的抗体群体、没有去除K447残基的抗体群体以及具有带有和不带有K447残基的抗体混合物的抗体群体。
术语“治疗”旨在包括减轻或消除病症、失调或疾病，或与该病症、失调或疾病有关的一种或多种症状；或减轻或消除病症、失调或疾病本身的病因。
术语“预防”旨在包括延迟和/或预防病症、失调或疾病和/或其伴随症状的发作的方法；阻止受试者获得病症、失调或疾病；或降低受试者患病症、失调或疾病的风险。
术语“接触”是指将治疗剂与细胞或组织聚集在一起，使得由于这种接触而发生生理和/或化学作用。接触可以在体外、离体或体内进行。在一个实施方案中，使治疗剂与细胞培养物中的细胞接触 (体外)以确定治疗剂对细胞的作用。在另一个实施方案中，治疗剂与细胞或组织的接触包括向具有待接触的细胞或组织的受试者施用治疗剂。
术语“治疗有效量”是指当施用时，包括足以预防或在某种程度上减轻所治疗的病症、失调或疾病的一种或多种症状的发展的化合物的量。术语“治疗有效量”还指足以引起研究人员、兽医、医生或临床医生正在寻找的生物分子(例如蛋白质、酶、RNA或DNA)、细胞、组织、系统、动物或人的生物学或医学反应的化合物的量。
术语“药学可接受的载体”、“药学可接受的赋形剂”，“生理学上可接受的载体”或“生理学上可接受的赋形剂”是指药学可接受的材料、组合物或媒介物，例如液体或固体填充剂、稀释剂、溶剂或包封材料。在一个实施方案中，每种组分在与药物制剂的其他成分相容的意义上是“药学可接受的”，并且适合与人和动物的组织或器官接触而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应、免疫原性或其他问题或并发症，与合理的获益/风险比相称。参见，Remington: The Science and Practice of Pharmacy,第22版；Allen Ed.:Philadelphia,PA,2012；Handbook of Pharmaceutical Excipients,第7 版；Rowe等人,Eds.；The Pharmaceutical Press and the American Pharmaceutical Association:2012；Handbook of Pharmaceutical Additives,第三版；Ash and Ash Eds.；GowerPublishing Company: 2007；Pharmaceutical Preformulation and Formulation,2nded.；Gibson Ed.；CRC Press LLC:Boca Raton,FL,2009。
本文所用的术语“CpG-Ab免疫缀合物”或“CpG-Ab”是指抗体(Ab)或其抗原结合片段与本文所述的含CpG的免疫刺激性多核苷酸的连接。
如本文所用，术语“T细胞激动剂”是指从混合的起始细胞群中选择性刺激T细胞的增殖、分化和/或存活的任何试剂。因此，与起始细胞群相比，所得细胞群富含增加数量的T细胞。在本公开中发现使用的T细胞激动剂包括但不限于特异性结合T细胞受体(TCR) 的抗原分子，以及T细胞共刺激分子。T细胞共刺激分子的实例包括但不限于OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、 ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、 CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3和CD83 配体。在特定的实施方案中，T细胞激动剂是针对T细胞共刺激分子的抗体。在特定的实施方案中，T细胞激动剂是肿瘤相关抗原 (TAA)。在特定的实施方案中，T细胞激动剂是病原性抗原。
如本文所用，“免疫检查点”或“免疫检查点分子”是免疫系统中调节信号的分子。免疫检查点分子可以是刺激性检查点分子，即调高信号，或抑制性检查点分子，即调低信号。在特定的实施方案中，免疫检查点是由T细胞或由抗原呈递细胞(APC)表达的蛋白质。某些类型的癌细胞表达免疫检查点蛋白来逃避免疫清除。使用免疫检查点调节剂以抑制癌细胞表达的免疫检查点蛋白与T细胞表达的免疫检查点蛋白之间的相互作用已被证明在某些癌症治疗中有效。
如本文所用，“免疫检查点调节剂”是能够改变受试者中免疫检查点的活性的试剂。在某些实施方案中，免疫检查点调节剂改变一种或多种免疫检查点分子的功能，所述分子包括但不限于PD-1、 PD-L1、PD-L2、TIM-3、LAG-3、CEACAM-1、CEACAM-5、VISTA、 BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、CD47、2B4和TGFR。免疫检查点调节剂可以是免疫检查点的激动剂或拮抗剂。在一些实施方案中，免疫检查点调节剂是免疫检查点结合蛋白(例如，抗体、抗体Fab片段、二价抗体、抗体药物缀合物、scFv、融合蛋白、二价抗体或四价抗体)。在其他实施方案中，免疫检查点调节剂是小分子。在特定的实施方案中，免疫检查点调节剂是抗PD1或抗PD-L1抗体。
如本文所用，术语“靶向递送”或动词形式“靶向”是指促进递送的试剂(例如免疫刺激性多核苷酸)到达特定器官、组织、细胞和/或细胞内隔室(称为靶向位置)比任何其他器官、组织、细胞或细胞内隔室(称为非靶位置)更多的过程。可以使用本领域已知的方法来检测靶向递送，例如，通过全身性施用后，将靶向细胞群的递送试剂的浓度与非靶细胞群的递送试剂的浓度相比较。如本文所提供，靶向递送导致在靶向位置的浓度高于非靶位置至少2倍。靶向递送可以通过靶向部分与与靶向细胞相关的接收部分的特异性结合来实现。如本文所用，与靶向细胞相关的接收部分可以位于靶向细胞的表面或细胞溶质内。在一些实施方案中，接收部分是与靶向细胞相关的抗原。
术语“DAR”是指免疫调节性多核苷酸抗体缀合物的药物-抗体比，更具体地，免疫调节性多核苷酸-抗体比。
免疫调节性多核苷酸
在一个实施方案中，本文提供了一种免疫调节性(例如，免疫刺激性)多核苷酸。
在某些实施方案中，免疫调节性多核苷酸包含5-修饰的尿苷或 5-修饰的胞苷。在某些实施方案中，在免疫调节性多核苷酸的5’-末端(例如，在两个5’-末端核苷之中)包含5-修饰的尿苷(例如5- 乙炔基-尿苷)增强多核苷酸的免疫调节特性。在某些实施方案中，免疫调节性多核苷酸短于(例如，包含总共约6-约16个核苷酸或约 12-约14个核苷酸)长度为18-28个核苷酸的典型的CpG ODN。在某些实施方案中，较短的免疫调节性多核苷酸(例如，包含总共约 6-约16个核苷酸或约12-约14个核苷酸的那些)保留了较长的典型 CpGODN的免疫调节活性；或与较长的CpG ODN相比，或具有更高的免疫调节活性(例如，通过NFκB激活或通过至少一种细胞因子(例如，IL-6或IL-10)的表达水平的变化来测量)。在某些实施方案中，免疫调节性多核苷酸包含无碱基间隔子。在某些实施方案中，免疫调节性多核苷酸包含核苷间磷酸三酯，免疫调节性多肽的示例性描述可以在WO2018189382中发现。
在某些实施方案中，本文提供的免疫调节性多核苷酸表现出的稳定性(例如，对核酸酶的稳定性)优于主要包含核苷间磷酸酯(例如，核苷间磷酸酯的50％以上)的CpG ODN的稳定性，而基本上不牺牲其免疫刺激性活性。该作用可以例如通过掺入至少50％(例如，至少70％)的核苷间硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯或通过包含核苷间磷酸三酯和/或核苷间无碱基间隔基来实现。磷酸三酯和无碱基间隔基也方便缀合至靶向部分。相对于具有完全硫代磷酸酯骨架的多核苷酸，基于磷酸盐的磷酸三酯和无碱基间隔基还可用于降低脱靶活性。不希望受理论的束缚，可以通过减少自递送而不破坏靶向部分介导的向靶细胞的递送来实现这种效果。因此，本文提供的多核苷酸可包含约15个或更少、约14个或更少、约13个或更少、约12 个或更少、约11个或更少、或约10个或更少的连续核苷间硫代磷酸酯。例如，包含总共约12-约16个核苷的免疫刺激性多核苷酸可包含约10个或更少的连续核苷间硫代磷酸酯。
本文提供的免疫刺激性多核苷酸可包含总共约50个或更少、约 30个或更少、约28个或更少、或约16个或更少的核苷。免疫刺激性多核苷酸可包含总共至少6个、约10个或更多个、或约12个或更多个核苷。例如，免疫刺激性多核苷酸可包含总共约6-约30、约 6-约28、约6-约20、约6-约16、约10-约20、约10-约16、约12- 约28、约12-约20或约12-约16个核苷。
在某些实施方案中，免疫刺激性多核苷酸在一个或两个末端(例如，在六个5′-末端核苷或六个3′-末端核苷内)包含一个或多个磷酸三酯(例如，核苷间磷酸三酯)和/或硫代磷酸酯(例如，约1-约6 或约1-约4个)。包含一个或多个核苷间磷酸三酯和/或硫代磷酸酯可以通过降低核酸外切酶介导的降解速率来增强多核苷酸的稳定性。
在某些实施方案中，免疫刺激性多核苷酸包含磷酸三酯或末端磷酸二酯，其中磷酸三酯或末端磷酸二酯包含键合至靶向部分或缀合基团以及任选键合至一个或多个(例如，约1-约6个)辅助部分的接头。在某些实施方案中，免疫刺激性多核苷酸仅包含一个接头。在某些实施方案中，免疫刺激性多核苷酸仅包含一个缀合基团。
本文提供的多核苷酸可以是杂交的多核苷酸，其包括链及其部分或全部补体。杂交的多核苷酸可以具有至少6个互补碱基对(例如，约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22或约23 个)，多达所包含的较短链中存在的核苷酸总数。例如，杂交多核苷酸的杂交部分可包含约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22或约23个碱基对。
在一个实施方案中，本文提供式(A)的免疫刺激性多核苷酸：
X5′-(XN)b-YP-(XN)C-X3′ (A)
或其立体异构体、两种或更多种非对映异构体的混合物、互变异构体、或两种或更多种互变异构体的混合物；或其药学可接受的盐、溶剂化物或水合物；其中：
每个XN独立地是核苷酸；
X3’是3’末端核苷酸；
X5’是5’末端核苷酸；
YP是核苷间磷酸三酯；和
b和c分别为约0-约25的整数；条件是其和不小于5。
在某些实施方案中，免疫刺激性多核苷酸包含具有修饰的核碱基的核苷酸。
在某些实施方案中，b是约1-约15的整数。在某些实施方案中， b是约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14或约15的整数。在某些实施方案中，b 是约3、约4、约11或约14的整数。在某些实施方案中，b是约3 的整数。在某些实施方案中，b是约4的整数。在某些实施方案中， b是约11的整数。在某些实施方案中，b是约14的整数。
在某些实施方案中，c是约0-约10的整数。在某些实施方案中， c是约0、约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7，约8、约9或约10的整数。在某些实施方案中，c是约0或约8的整数。在某些实施方案中，c是约0的整数。在某些实施方案中，c是约8的整数。
在某些实施方案中，b是约3的整数并且c是约8的整数。在某些实施方案中，b是约4的整数并且c是约8的整数。在某些实施方案中，b是约11的整数并且c是约0的整数。在某些实施方案中，b 是约14的整数并且c是大约0的整数。
在某些实施方案中，b和c一起总共为约5-约20。在某些实施方案中，b和c一起总共为约5-约15。在某些实施方案中，b和c 一起总共为约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约 13、约14或约15。在某些实施方案中，b和c一起总共为约8、约 9、约10、约11、约12、约13或约14。在某些实施方案中，b和c 一起总共为约11。在某些实施方案中，b和c一起总共为约12。在某些实施方案中，b和c一起总共为约14。
在某些实施方案中，每个XN独立地是2′-脱氧核糖核苷酸或2′- 修饰的核糖核苷酸。在某些实施方案中，每个XN独立地是2′-脱氧腺苷(A)、2′-脱氧鸟苷(G)、2′-脱氧胞苷(C)、5-卤代-2′-脱氧胞苷、2′-脱氧胸苷(T)、2′-脱氧尿苷(U)、5-卤代-2′-脱氧尿苷、 2′-氟核糖核苷酸、2′-甲氧基核糖核苷酸或2′-(2-甲氧基乙氧基)核糖核苷酸。在某些实施方案中，每个XN独立地是2′-脱氧核糖核苷酸。在某些实施方案中，每个XN独立地是2′-脱氧腺苷、2′-脱氧鸟苷、 2′-脱氧胞苷、5-卤代-2′-脱氧胞苷、2′-脱氧胸苷、2′-脱氧尿苷或5-卤代-2′-脱氧尿苷。在某些实施方案中，每个XN独立地是2′-脱氧腺苷、 2′-脱氧鸟苷、2′-脱氧胞苷、2′-脱氧胸苷、5-溴-2′-脱氧尿苷或5-碘-2′- 脱氧尿苷。
在某些实施方案中，X3’是2′-脱氧核糖核苷酸或2′-修饰的核糖核苷酸。在某些实施方案中，X3’是2′-脱氧核糖核苷酸。在某些实施方案中，X3’是2′-脱氧腺苷、2′-脱氧鸟苷、2′-脱氧胞苷、5-卤代-2′-脱氧胞苷、2′-脱氧胸苷、2′-脱氧尿苷、5-卤代-2′-脱氧尿苷、2′-氟核糖核苷酸、2′-甲氧基核糖核苷酸或2′-(2-甲氧基乙氧基)核糖核苷酸。在某些实施方案中，X3’是2′-脱氧腺苷、2′-脱氧鸟苷、2′-脱氧胞苷、5-卤代-2′-脱氧胞苷、2′-脱氧胸苷、2′-脱氧尿苷或5-卤代-2′-脱氧尿苷。在某些实施方案中，X3’是2′-脱氧胸苷。在某些实施方案中，X3’是具有取代的嘧啶碱基的2′-脱氧核糖核苷酸。在某些实施方案中，X3’是具有5-取代的嘧啶碱基的2′-脱氧核糖核苷酸。在某些实施方案中， X3’是2′-脱氧胸苷、5-卤代-2′-脱氧胞苷或5-卤代-2′-脱氧尿苷。在某些实施方案中，X3’是2′-脱氧胸苷、5-溴-2′-脱氧胞苷、5-碘-2′-脱氧胞苷、5-溴-2′-脱氧尿苷或5-碘-2′-脱氧尿苷。在某些实施方案中， X3’是2′-脱氧胸苷、5-溴-2′-脱氧尿苷或5-碘-2′-脱氧尿苷。在某些实施方案中，X3’是包含3′封端基团的末端核苷酸。在某些实施方案中， 3′封端基团是末端磷酸酯。在某些实施方案中，3′封端基团是3-羟基 -丙基磷酰基(即，-P(O2)-OCH2CH2CH2OH)。
在某些实施方案中，X5’是2′-脱氧核糖核苷酸或2′-修饰的核糖核苷酸。在某些实施方案中，X5’是2′-脱氧核糖核苷酸。在某些实施方案中，X5’是2′-脱氧腺苷、2′-脱氧鸟苷、2′-脱氧胞苷、5-卤代-2′-脱氧胞苷、2′-脱氧胸苷、2′-脱氧尿苷、5-卤代-2′-脱氧尿苷、2′-氟核糖核苷酸、2′-甲氧基核糖核苷酸或2′-(2-甲氧基乙氧基)核糖核苷酸。在某些实施方案中，X5’是2′-脱氧腺苷、2′-脱氧鸟苷、2′-脱氧胞苷、5-卤代-2′-脱氧胞苷、2′-脱氧胸苷、2′-脱氧尿苷或5-卤代-2′-脱氧尿苷。在某些实施方案中，X5’是具有取代的嘧啶碱基的2′-脱氧核糖核苷酸。在某些实施方案中，X5’是具有5-取代的嘧啶碱基的2′-脱氧核糖核苷酸。在某些实施方案中，X5’是2′-脱氧胸苷、5-卤代-2′-脱氧胞苷或5-卤代-2′-脱氧尿苷。在某些实施方案中，X5’是5-卤代-2′-脱氧胞苷。在某些实施方案中，X5’是5-卤代-2′-脱氧尿苷。在某些实施方案中，X5’是2′-脱氧胸苷、5-溴-2′-脱氧胞苷、5-碘-2′-脱氧胞苷、5-溴-2′-脱氧尿苷或5-碘-2′-脱氧尿苷。在某些实施方案中，X5’是2′-脱氧胸苷、5-溴-2′-脱氧尿苷或5-碘-2′-脱氧尿苷。在某些实施方案中，X5’是5-溴-2′-脱氧尿苷。在某些实施方案中，X5’是5-碘-2′-脱氧尿苷。在某些实施方案中，X5’具有3′-硫代磷酸酯基团。在某些实施方案中，X5’具有Rp手性的3′-硫代磷酸酯基。在某些实施方案中，X5’具有Sp 手性的3′-硫代磷酸酯基。
在某些实施方案中，YP是核苷间硫代磷酸三酯。
在某些实施方案中，YP是：
Figure DEST_PATH_IMAGE012
其中Z为O或S；并且d是约0-约50的整数。在某些实施方案中，Z是O。在某些实施方案中，Z是S。在某些实施方案中，d是约0-约10的整数。在某些实施方案中，d是约0-约5的整数。在某些实施方案中，d是约0、约1、约2、约3、约4或约5的整数。在某些实施方案中，d是约0、约1或约3的整数。
在某些实施方案中，YP是：
Figure DEST_PATH_IMAGE013
其中Z为O或S；并且d是约0-约50的整数。在某些实施方案中，YP是：
Figure DEST_PATH_IMAGE014
其中Z为O或S；并且d是约0-约50的整数。在某些实施方案中，YP是：
Figure DEST_PATH_IMAGE015
其中Z为O或S；并且d是约0-约50的整数。在某些实施方案中，Z为O。在某些实施方案中，Z为S。在某些实施方案中，d为约0-约10的整数。在某些实施方案中，d为约0-约5的整数。在某些实施方案中，d为约0、约1、约2、约3、约4或约5的整数。在某些实施方案中，d为约0、约1或约3的整数。
在某些实施方案中，式(A)的免疫刺激性多核苷酸包含一个额外的核苷间磷酸三酯。在一个实施方案中，额外的核苷间磷酸三酯是C1-6烷基磷酸三酯。在另一个实施方案中，额外的核苷间磷酸三酯是乙基磷酸三酯。
在某些实施方案中，式(A)的免疫刺激性多核苷酸包含一个 5-卤代-2′-脱氧尿苷。在一个实施方案中，5-卤代-2′-脱氧尿苷是5- 氟-2′-脱氧尿苷、5-溴-2′-脱氧尿苷或5-碘-2′-脱氧尿苷。在另一个实施方案中，5-卤代-2′-脱氧尿苷是5-溴-2′-脱氧尿苷或5-碘-2′-脱氧尿苷。在另一个实施方案中，5-卤代-2′-脱氧尿苷是5-氟-2′-脱氧尿苷。在另一个实施方案中，5-卤代-2′脱氧尿苷是5-溴-2′-脱氧尿苷。在另一个实施方案中，5-卤代-2′-脱氧尿苷是5-碘-2′-脱氧尿苷。
在某些实施方案中，式(A)的免疫刺激性多核苷酸包含三个或更多个2′-脱氧胞苷。在某些实施方案中，式(A)的免疫刺激性多核苷酸包含三个2′-脱氧胞苷。
在某些实施方案中，式(A)的免疫刺激性多核苷酸包含四个或更多个2′-脱氧鸟苷。在某些实施方案中，式(A)的免疫刺激性多核苷酸包含四个2′-脱氧鸟苷。
在某些实施方案中，式(A)的免疫刺激性多核苷酸包含三个 2′-脱氧胞苷和四个2′-脱氧鸟苷。在某些实施方案中，式(A)的免疫刺激性多核苷酸包含一个、两个或三个CG二核苷酸。在某些实施方案中，式(A)的免疫刺激性多核苷酸包含三个CG二核苷酸。
在某些实施方案中，式(A)的免疫刺激性多核苷酸包含三个或更多个2′-脱氧胸苷。在某些实施方案中，式(A)的免疫刺激性多核苷酸包含三、四、五、六，七或八个2′-脱氧胸苷。在某些实施方案中，式(A)的免疫刺激性多核苷酸包含三、四、五或八个2′-脱氧胸苷。
在某些实施方案中，式(A)的免疫刺激性多核苷酸不包含2′- 脱氧腺苷。在某些实施方案中，式(A)的免疫刺激性多核苷酸包含一个或两个2′-脱氧腺苷。
在某些实施方案中，式(A)的免疫刺激多核苷酸的长度为约 5-约20或约6-约15。在某些实施方案中，式(A)的免疫刺激多核苷酸的长度为约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14或约15。在某些实施方案中，式(A)的免疫刺激多核苷酸的长度为约10、约11、约12、约13、约14或约15。
在某些实施方案中，式(A)的免疫刺激性多核苷酸包含一个或多个核苷间硫代磷酸酯。在某些实施方案中，式(A)的免疫刺激性多核苷酸中的所有核苷间磷酸酯是核苷间硫代磷酸酯。在某些实施方案中，式(A)的免疫刺激性多核苷酸包含一个或多个手性核苷间硫代磷酸酯。
在某些实施方案中，式(A)的免疫刺激多核苷酸是p275、p276、 p313或p347。在某些实施方案中，式(A)的免疫刺激性多核苷酸是p236、p238、p243、p246、p308、p361、p362或p425。在某些实施方案中，式(A)的免疫刺激性多核苷酸是p236、p238、p243、 p246、p275、p276、p308、p313、p347、p361、p362、p425、p433、 p434、p435、p436、p437、p438、p477、p478、p479、p480、p481、 p482、p483、p484、p485、p486、p487、p488或p489。
在一个实施方案中，本文提供了具有序列 N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T(SEQ ID NO:586)的免疫刺激性多核苷酸，或其立体异构体、两种或更多种非对映异构体的混合物、互变异构体、或两种或更多种互变异构体的混合物；或其药学可接受的盐、溶剂化物或水合物；其中：
x是约1-约4的整数；
N1不存在或是2′-脱氧胸苷；
N2是具有修饰核碱基的2′-脱氧核糖核苷酸；
N3是2′-脱氧腺苷或2′-脱氧胸苷，各自任选包含3′-磷酸三酯；
N4是2′-脱氧腺苷或2′-脱氧胸苷；
N5是任选包含3′-磷酸三酯的2′-脱氧胸苷；和
C为2′-脱氧胞苷并且G为2′-脱氧鸟苷。
在某些实施方案中，在N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T(SEQ ID NO:586)中，x是约1、约2、约3或约4的整数。在某些实施方案中，在N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T(SEQ ID NO:586)中，x是约1的整数。在某些实施方案中，在N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T(SEQ ID NO:586) 中，x是约4的整数。
在某些实施方案中，在N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T(SEQ ID NO:586)中，N1不存在。在某些实施方案中，在 N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T(SEQ ID NO:586)中，N1是2′-脱氧胸苷。
在某些实施方案中，在N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T(SEQ ID NO:586)中，N2是具有取代的嘧啶碱基的2′-脱氧核糖核苷酸。在某些实施方案中，在N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T(SEQ IDNO:586)中， N2是具有5-取代的嘧啶碱基的2′-脱氧核糖核苷酸。在某些实施方案中，在N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T(SEQ ID NO:586)中，N2是5-卤代-2′-脱氧胞苷或5-卤代-2′-脱氧尿苷。在某些实施方案中，在 N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T(SEQ ID NO:586)中，N2是5-溴-2′-脱氧尿苷或5-碘-2′-脱氧尿苷。
在某些实施方案中，在N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T(SEQ ID NO:586)中，N3是包含3′-磷酸三酯的2′-脱氧腺苷。在某些实施方案中，在N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T(SEQ ID NO:586)中，N3是2′-脱氧胸苷。在某些实施方案中，在N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T(SEQ ID NO:586)中，N3是包含3′-磷酸三酯的2′-脱氧胸苷。
在某些实施方案中，在N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T(SEQ ID NO:586)中，N4是2′-脱氧腺苷。在某些实施方案中，在 N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T(SEQ ID NO:586)中，N4是2′-脱氧胸苷。
在某些实施方案中，在N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T(SEQ ID NO:586)中，N5是2′-脱氧胸苷。在某些实施方案中，在 N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T(SEQ ID NO:586)中，N5是包含3′-磷酸三酯的2′-脱氧胸苷。
在某些实施方案中，N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T(SEQ ID NO:586)的免疫刺激性多核苷酸包含一个或多个核苷间硫代磷酸酯。在某些实施方案中，N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T(SEQID NO:586) 的免疫刺激性多核苷酸包含至少一个手性核苷间硫代磷酸酯。
在某些实施方案中，N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T的免疫刺激性多核苷酸是p275、p276或p313。在某些实施方案中， N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T(SEQ ID NO:586)的免疫刺激性多核苷酸是p236、p238、p243、p246、p308、p361、p362、or p425。在某些实施方案中，N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T的免疫刺激性多核苷酸是p236、p238、p243、p246、p275、p276、p308、p313、p347、p361、 p362、p425、p433、p434、p435、p436、p437、p438、p477、p478、 p479、p480、p481、p482、p483、p484、p485、p486、p487、p488 或p489。
在某些实施方案中，本文提供的免疫刺激性多核苷酸是免疫刺激性多核苷酸。在某些实施方案中，本文提供的免疫刺激性多核苷酸用作PAMS。在某些实施方案中，本文提供的免疫刺激性多核苷酸通过触发TLR9信号传导来激活先天性免疫应答或刺激适应性免疫应答。在某些实施方案中，本文提供的免疫刺激性多核苷酸是 TLR9激动剂。
在某些实施方案中，本文提供的免疫刺激性多核苷酸是B类 CpG多核苷酸或其修饰物，包括5-卤代尿苷或5-炔基尿苷或其截短形式(例如，包含总共约6-约16个核苷的那些)。在某些实施方案中，本文提供的截短的免疫刺激性多核苷酸包含截短的B类CpG多核苷酸序列(例如，B类CpG多核苷酸序列，从中消除一个或多个 3′-末端核苷酸或删除一个或多个序列内核苷酸)。
在某些实施方案中，本文提供的免疫刺激性多核苷酸包含至少一种免疫刺激性序列(ISS)。在某些实施方案中，本文提供的免疫刺激性多核苷酸包含约1、约2、约3或约4个ISS。免疫刺激性多核苷酸中的ISS取决于靶向生物。本文提供的免疫刺激性多核苷酸中使用的ISS的共同特征是胞苷-p-鸟苷序列，其中p是核苷间磷酸二酯(例如，磷酸酯或硫代磷酸酯)或核苷间磷酸三酯。在某些实施方案中，ISS中的胞苷和鸟苷各自独立地包含2′-脱氧核糖。在某些实施方案中，本文提供的免疫刺激性多核苷酸包含约1、约2或约 3个人ISS。在某些实施方案中，人ISS是CG或NCG，其中N是尿苷、胞苷或胸苷，或修饰的尿苷或胞苷；并且G是鸟苷或修饰的鸟苷。在某些实施方案中，修饰的尿苷或胞苷是5-卤代尿苷(例如 5-碘尿苷或5-溴尿苷)、5-炔基尿苷(例如5-乙炔基尿苷或5-丙炔基尿苷)、5-杂芳基尿苷或5-卤代胞苷。在某些实施方案中，修饰的鸟苷是7-脱氮鸟苷。在某些实施方案中，人ISS是NCG，在一个实施方案中，N是5-卤代尿苷。在某些实施方案中，人ISS是UCG，在一个实施方案中，U是5-炔基尿苷，在另一个实施方案中，U是 5-乙炔基尿苷。在某些实施方案中，本文提供的靶向人的免疫刺激性多核苷酸在包含5′末端核苷酸的四个连续核苷酸内包含ISS。在某些实施方案中，本文提供的靶向人的免疫刺激性多核苷酸包含5′-末端 ISS。在某些实施方案中，本文提供的免疫刺激性多核苷酸包含鼠 ISS。在某些实施方案中，鼠ISS是六聚核苷酸序列：Pu-Pu-CG-Py-Py，其中每个Pu独立地是嘌呤核苷酸，并且每个Py独立地是嘧啶核苷酸。
在某些实施方案中，本文提供的免疫刺激性多核苷酸中相对于 CpG的5′-侧翼核苷酸不包含2′-烷氧基核糖。在某些实施方案中，本文提供的免疫刺激性多核苷酸中相对于CpG的5′-侧翼核苷酸仅包含 2′-脱氧核糖作为糖。
在某些实施方案中，本文提供的免疫刺激性多核苷酸具有(1) 高含量的硫代磷酸酯(例如，至少50％、至少60％、至少70％或至少80％的核苷可以通过硫代磷酸酯连接)；(2)不存在聚G尾；(3) 免疫刺激性多核苷酸中的核苷包含2′-脱氧核糖或2′-修饰的核糖(例如2′-卤代(例如2′-氟)或任选取代的2′-烷氧基(例如2′-甲氧基))；和/或(4)包含5′-末端ISS，其是NCG，其中N为尿苷、胞苷或胸苷，或修饰的尿苷或胞苷，并且G为鸟苷或修饰的鸟苷。
在某些实施方案中，本文提供的免疫调节性多核苷酸通过减少 TLR9信号传导的激活(例如，通过TLR9拮抗作用)来抑制适应性免疫应答。在某些实施方案中，本文提供的免疫抑制性多核苷酸包含至少两个相对于CpG为5′-侧翼的2′-烷氧基核苷酸，如式N1-N2-CG所述，其中N1和N2各自独立地是包含2′-烷氧基核糖(例如2′-甲氧基核糖)的核苷酸。
免疫调节性多核苷酸的结构特征
无碱基间隔基
在某些实施方案中，本文提供的免疫调节性多核苷酸包含一个或多个，在一个实施方案中，一个或两个无碱基间隔基，其各自独立地是核苷间无碱基间隔基或末端无碱基间隔基。当免疫调节性多核苷酸包括两个或更多个无碱基间隔基时，无碱基间隔基的结构可以相同或不同。
在一个实施方案中，无碱基间隔基具有式(I)：
R1–L1–[–L2–(L1)n1–]n2–R2,
(I)
其中：
n1是约0或约1的整数，
n2是约1-约6的整数，
R1是与免疫调节性多核苷酸中核苷连接的键，
R2是与免疫调节性多核苷酸中核苷或封端基团连接的键，
每个L1独立地是磷酸二酯或磷酸三酯，和
每个L2是糖类似物。
在某些实施方案中，如果无碱基间隔基是核苷间无碱基间隔基，则n1为约1，并且R2是与核苷连接的键；如果无碱基间隔基为末端无碱基间隔基，则n1为约0或约1，并且R2是与封端基团连接的键。
在某些实施方案中，无碱基间隔基是核苷间无碱基间隔基。在某些实施方案中，无碱基间隔基是3’-末端无碱基间隔基。在某些实施方案中，每两个连续的L2基团被L1基团隔开(例如，对于布置在两个连续的L2基团之间的L1，n1为1)。
在某些实施方案中，本文提供的免疫刺激性多核苷酸包含位于四个连续核苷酸内的ISS，所述四个连续核苷酸包括免疫刺激性多核苷酸的5′-末端核苷酸，其中ISS为NCG，其中N是尿苷、胞苷或胸苷，或在一个实施方案中是修饰的尿苷或胞苷是5-卤代尿苷(例如 5-碘尿苷或5-溴尿苷)、5-炔基尿苷(例如5-乙炔基尿苷或5-丙炔基尿苷)、5-杂芳基尿苷或5-卤代胞苷；并且其中N和C通过磷酸二酯或磷酸三酯彼此连接。
糖类似物
在一个实施方案中，糖类似物是作为C3-6单糖或C3-6糖醇(例如甘油)的二价或三价基团，其经修饰以用(i)与一个磷酸酯中的氧原子连接的键和(ii)与另一个磷酸酯中的氧原子或与封端基团连接的键取代两个羟基。糖类似物是环状或无环的。糖类似物中包含的其他任选修饰是：用H取代一个、两个或三个其余的羟基或碳键合的氢原子；任选取代的C1-6烷基；本文定义的–LinkA(–T)p；缀合基团；–(CH2)t1–ORZ，其中t1是约1-6的整数，并且RZ是任选取代的 C1-6烷基、任选取代的C2-6烯基、任选取代的C2-6炔基、任选取代的 C6-14芳基、任选取代的C3-8环烷基、任选取代的(C1-9杂环基)-C1-6- 烷基、任选取代的(C6-10芳基)-C1-6-烷基或任选取代的(C3-8环烷基)-C1-6-烷基；引入一个或两个不饱和键(例如一个或两个双键)；以及如对于烷基、烯基、环烷基、环烯基或杂环基所定义用取代基取代一个、两个或三个氢或羟基。在一些实施方案中，RZ为任选取代的C1-6氨基烷基(例如，任选取代的含–NH2的C1-6氨基烷基)。
糖类似物的非限制性实例是任选取代的C2-6亚烷基、任选取代的C2-6亚烯基、任选取代的C5环烷-1,3-二基、任选取代的C5环烯-1,3- 二基、任选取代的杂环-1,3-二基(例如，任选取代的吡咯烷-2,5-二基、任选取代的四氢呋喃-2,5-二基或任选取代的四氢噻吩-2,5-二基) 或任选取代的(C1-4烷基)-(C3-8亚环烷基)(例如，任选取代的(C1烷基)-(C3亚环烷基))。糖类似物的非限制性实例是：
Figure DEST_PATH_IMAGE016
其中：
R1和R2的每一个独立地是与磷酸酯中的氧原子连接的键；
R3和R4的每一个独立地为H；任选取代的C1-6烷基；–(CH2)t1–ORZ；或–LinkA–RT；
其中t1是约1-约6的整数；
RZ为任选取代的C1-6烷基、任选取代的C2-6烯基、任选取代的 C2-6炔基，任选取代的C6-14芳基、任选取代的C3-8环烷基、任选取代的(C1-9杂环基)-C1-6-烷基、任选取代的(C6-10芳基)-C1-6-烷基、任选取代的(C3-8环烷基)-C1-6-烷基；
LinkA是接头；和
RT是与靶向部分；缀合部分；任选取代的C1-6烷基、任选取代的C2-6烯基、任选取代的C2-6炔基，任选取代的C6-14芳基、任选取代的C3-8环烷基、任选取代的(C1-9杂环基)-C1-6-烷基、任选取代的 (C6-10芳基)-C1-6-烷基或任选取代的(C3-8环烷基)-C1-6-烷基连接的键。
在一些实施方案中，RZ为任选取代的C1-6氨基烷基(例如，任选取代的含–NH2的C1-6氨基烷基)。
磷酸酯
在某些实施方案中，本文提供的免疫调节性多核苷酸包含一个或多个核苷间磷酸三酯和/或一个或两个末端磷酸二酯和/或磷酸三酯。在某些实施方案中，磷酸三酯包含磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯，其中一个或两个化合价被核苷和/或无碱基间隔基取代，并且其余化合价键合至生物可逆性基团、非生物可逆性基团、与靶向部分键合的接头或缀合基团。在某些实施方案中，核苷间磷酸三酯键合至两个核苷和/或无碱基间隔基，并且其余化合价键合至可逆基团、非生物可逆性基团、与靶向部分键合的接头或缀合基团。在某些实施方案中，核苷间磷酸二酯键合至两个核苷和/或无碱基间隔基。在某些实施方案中，末端磷酸二酯在免疫调节性多核苷酸的5′- 或3′-末端包含磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯，其中两个其余化合价之一键合至生物可逆性基团、非生物可逆性基团、与靶向部分键合的接头或缀合基团。
接头和缀合部分
在某些实施方案中，本文提供的免疫调节性多核苷酸包含键合至靶向部分和任选的一个或多个辅助部分的接头。在某些实施方案中，接头是多价基团，其中第一化合价键合至核苷间或末端磷酸酯、核苷间或末端硫代磷酸酯、核苷间或末端二硫代磷酸酯、无碱基间隔基、封端基团或核碱基，和第二化合价键合至靶向部分。在某些实施方案中，接头进一步包括一个或多个化合价，每个化合价独立地键合至辅助部分。在某些实施方案中(例如，当靶向部分是小分子时)，本文提供的免疫调节性多核苷酸包含与多个靶向部分连接的多个接头。在某些实施方案中(例如，当靶向部分是抗体或其抗原结合片段时)，本文提供的免疫调节性多核苷酸包含一个与靶向部分连接的接头。
在某些实施方案中，本文提供的免疫调节性多核苷酸包含缀合基团。缀合基团是能够进行缀合反应，例如环加成反应(例如，偶极环加成)、酰胺化反应或亲核芳族取代的官能团。一旦与互补反应性基团反应，缀合基团在本文提供的免疫调节性多核苷酸中产生接头。
在某些实施方案中，键合至靶向部分的接头是核苷间磷酸三酯的一部分。在某些实施方案中，键合至靶向部分的接头是无碱基间隔基的一部分。
在某些实施方案中，接头或缀合基团具有式(II)：
–Z1–QA1–Z2–(–QA2–Z3–)k–RT,
(II)
其中：
Z1是二价基团、三价基团、四价基团或五价基团，其中化合价之一与QA1键合，第二个化合价为开环，或如果式(II)用于接头，则与RT键合，并且每个剩余的化合价(如果存在)独立地键合至辅助部分；
Z2不存在、是二价基团、三价基团、四价基团或五价基团，其中化合价之一与QA1键合，第二个化合价与QA2或RT键合，并且每个剩余的化合价(如果存在)独立地键合至辅助部分；
Z3不存在、是二价基团、三价基团、四价基团或五价基团，其中化合价之一与QA2键合，第二个化合价与RT键合，并且每个剩余的化合价(如果存在)独立地键合至辅助部分；
RT不存在或是与靶向部分连接的键；
k是约0或约1的整数。
如果式(II)用于接头，
则QA1和QA2独立地不存在、是任选取代的C2-12杂亚烷基(例如包含–C(O)–N(H)–、–N(H)–C(O)–、–S(O)2–N(H)–或–N(H)–S(O)2–的杂亚烷基)、任选取代的C1-12硫杂亚环基(例如
Figure DEST_PATH_IMAGE017
Figure DEST_PATH_IMAGE018
任选取代的C1-12杂亚环基(例如1，2，3-三唑-1，4-二基或
Figure DEST_PATH_IMAGE019
)、环丁-3- 烯-1，2-二酮-3，4-二基、吡啶-2-基腙、任选取代的C6-16三唑杂亚环基 (例如
Figure DEST_PATH_IMAGE020
)、任选取代的C8-16三唑亚环烯基(例如
Figure DEST_PATH_IMAGE021
)或二氢哒嗪基团(例如反式-
Figure DEST_PATH_IMAGE022
反式-
Figure DEST_PATH_IMAGE023
)；和
RT是与靶向部分连接的键；
条件是存在QA1和QA2的至少一个。
如果式(II)用于缀合基团，则
或者
(i)QA2不存在，并且QA1是缀合部分，例如，任选取代的C2-12炔基、任选取代的N-保护的氨基、叠氮基、N-马来酰亚胺基、S-保护的硫醇，
Figure DEST_PATH_IMAGE024
或其N- 保护的形式、
Figure DEST_PATH_IMAGE025
包含内环碳-碳三键任选取代的C6-16杂环基(例如
Figure DEST_PATH_IMAGE026
)、1，2，4，5-四嗪基团(例如
Figure DEST_PATH_IMAGE027
)或任选取代的C8-16环炔基(例如
Figure DEST_PATH_IMAGE028
)、–NHRN1、任选取代的C4-8应变环烯基(例如，反式环辛烯基或降冰片烯基)或任选取代的含–COOR12或-CHO 的C1-16烷基；和
k是约0的整数；
或者
(ii)QA1为用于接头所限定，并且QA2是缀合部分，例如，任选取代的C2-12炔基、任选取代的N-保护的氨基、叠氮基、N-马来酰亚胺基、S-保护的硫醇、
Figure DEST_PATH_IMAGE029
或其N-保护的形式、
Figure DEST_PATH_IMAGE030
包含内环碳-碳三键任选取代的C6-16杂环基(例如
Figure DEST_PATH_IMAGE031
)，1，2，4，5- 四嗪基团(例如
Figure DEST_PATH_IMAGE032
)或任选取代的 C8-16环炔基(例如
Figure DEST_PATH_IMAGE033
)，–NHRN1、任选取代的C4-8应变环烯基(例如，反式环辛烯基或降冰片烯基)或任选取代的含–COOR12或–CHO的C1-16烷基；和
k是约1的整数；
其中：
RN1是H、N-保护基或任选取代的C1-6烷基；
每个R12独立地是H或任选取代的C1-6烷基；
R13是卤素或F；和
Z3和RT不存在。
在某些实施方案中，Z1具有支链基团和两个二价链段，其中支链基团键合至两个二价链段的每一个，
其中：
二价链段之一与核苷间或末端磷酸酯、核苷间或末端硫代磷酸酯、核苷间或末端二硫代磷酸酯、无碱基间隔基或核碱基键合，并且其余的二价链段与QA1键合。
支链基团是任选取代的C1-12烷烃三基或任选取代的C2-12杂烷烃三基，其中两个化合价被二价链段取代，并且其余化合价被以下取代
Figure DEST_PATH_IMAGE034
其中：
p1是约1、约2或约3的整数；
每个s2独立地是约0-约10的整数；
每个QB和QD独立地不存在、是–CO–、–NH–、–O–、–S–、–SO2–、–OC(O)–、–COO–、–NHC(O)–、–C(O)NH–、–CH2–、–CH2NH–、–NHCH2–、–CH2O–或–OCH2–；
每个QC独立地不存在、是任选取代的C1-12亚烷基、任选取代的 C2-12亚烯基、任选取代的C2-12亚炔基、任选取代的C2-12杂亚烷基、任选取代的C1-9杂亚环基或–P(Z)(OH)–，其中Z为O或S；
每个QG独立地为任选取代的C1-6烷烃三基、任选取代的C1-6烷烃四基、任选取代的C2-6杂烷烃三基或任选取代的C2-6杂烷烃四基；和
每个QH独立地是RM1或–QG[(–QB–QC–QD)s2–RM1]p1，其中每个 RM1独立地是与辅助部分连接的键。
在某些实施方案中，Z2具有支链基团和两个二价链段，其中支链基团键合至两个二价链段的每一个，
其中：
二价链段之一与靶向部分或QA2键合，并且其余的二价链段与 QA1键合。
支链基团是任选取代的C1-12烷烃三基或任选取代的C2-12杂烷烃三基，其中两个化合价被二价链段取代，并且其余化合价被以下取代
Figure DEST_PATH_IMAGE035
其中：
p1是约1、约2或约3的整数；
每个s2独立地是约0-约10的整数；
每个QB和QD独立地不存在、是–CO–、–NH–、–O–、–S–、–SO2–、–OC(O)–、–COO–、–NHC(O)–、–C(O)NH–、–CH2–、–CH2NH–、–NHCH2–、–CH2O–或–OCH2–；
每个QC独立地不存在、是任选取代的C1-12亚烷基、任选取代的 C2-12亚烯基、任选取代的C2-12亚炔基、任选取代的C2-12杂亚烷基、任选取代的C1-9杂亚环基或–P(Z)(OH)–，其中Z为O或S；
每个QG独立地为任选取代的C1-6烷烃三基、任选取代的C1-6烷烃四基、任选取代的C2-6杂烷烃三基或任选取代的C2-6杂烷烃四基；和
每个QH独立地是RM1或–QG[(–QB–QC–QD)s2–RM1]p1，其中每个 RM1独立地是与辅助部分连接的键。
在某些实施方案中，Z3具有支链基团和两个二价链段，其中支链基团键合至两个二价链段的每一个，
其中：
二价链段之一与靶向部分键合，并且其余的二价链段与QA2键合。
支链基团是任选取代的C1-12烷烃三基或任选取代的C2-12杂烷烃三基，其中两个化合价被二价链段取代，并且其余化合价被以下取代
Figure DEST_PATH_IMAGE036
其中：
p1是约1、约2或约3的整数；
每个s2独立地是约0-约10的整数；
每个QB和QD独立地不存在、是–CO–、–NH–、–O–、–S–、–SO2–、–OC(O)–、–COO–、–NHC(O)–、–C(O)NH–、–CH2–、–CH2NH–、–NHCH2–、–CH2O–或–OCH2–；
每个QC独立地不存在、是任选取代的C1-12亚烷基、任选取代的 C2-12亚烯基、任选取代的C2-12亚炔基、任选取代的C2-12杂亚烷基、任选取代的C1-9杂亚环基或–P(Z)(OH)–，其中Z为O或S；
每个QG独立地为任选取代的C1-6烷烃三基、任选取代的C1-6烷烃四基、任选取代的C2-6杂烷烃三基或任选取代的C2-6杂烷烃四基；和
每个QH独立地是RM1或–QG[(–QB–QC–QD)s2–RM1]p1，其中每个 RM1独立地是与辅助部分连接的键。
在某些实施方案中，Z1、Z2或Z3中的二价链段是–(–QB–QC–QD–)s1–，
其中：
每个s1独立地是约1-约50或约1-约30的整数；
每个QB和QD独立地不存在、是–CO–、–NH–、–O–、–S–、–SO2–、 -OC(O)–、–COO–、–NHC(O)–、–C(O)NH–、–CH2–、–CH2NH–、–NHCH2–、–CH2O–或–OCH2-；和
每个QC独立地不存在、是任选取代的C1-12亚烷基、任选取代的 C2-12亚烯基、任选取代的C2-12亚炔基、任选取代的C2-12杂亚烷基、任选取代的C1-9杂亚环基；
条件是存在QB、QC和QD的至少一个。
在某些实施方案中，在二价链段中存在至少一个QC。在某些实施方案中，QC存在于二价链段的每个单体单元中。在某些实施方案中，Z1通过存在的QC键合。在某些实施方案中，Z1的每个单体单元中存在QB和QD中的至少一个。在某些实施方案中，Z2的每个单体单元中存在QB和QD中的至少一个。在某些实施方案中，当存在时， Z1、Z2和Z3中仅一个包含支链基团。
在某些实施方案中，Z1、Z2和Z3中的一个、两个或三个独立地是
–(–QB–QC–QD–)s1–QE–(–QB–QC–QD–)s1–,
(III)
其中：
每个s1独立地是约1-约50或约1-约30的整数；
每个QB和QD独立地不存在、是–CO-、–NH–、–O–、–S–、–SO2–、–OC(O)–、–COO–、–NHC(O)–、–C(O)NH–、–CH2–、–CH2NH–、–NHCH2–、–CH2O–或–OCH2–；
每个QC独立地不存在、是任选取代的C1-12亚烷基、任选取代的 C2-12亚烯基、任选取代的C2-12亚炔基、任选取代的C2-12杂亚烷基、任选取代的C1-9杂亚环基或–P(Z)(OH)–，其中Z为O或S；和
QE不存在或是式(IV)的支链基团：
Figure DEST_PATH_IMAGE037
其中：
p1是约1、约2或约3的整数；
每个s2独立地是约0-约10的整数；
QF是任选取代的C1-12烷烃三基或任选取代的C2-12杂烷烃三基；和
每个QG独立地为任选取代的C1-6烷烃三基、任选取代的C1-6烷烃四基、任选取代的C2-6杂烷烃三基或任选取代的C2-6杂烷烃四基；和
每个QH独立地是RM1或–QG[(–QB–QC–QD)s2–RM1]p1，其中每个 RM1独立地是与辅助部分连接的键。
在式(IV)中，如果p1是约1，则QG不存在；并且如果p1是2或3，则存在至少一个QG。
在某些实施方案中，Z1通过存在的QC键合至核苷间或末端磷酸酯、核苷间或末端硫代磷酸酯、核苷间或末端二硫代磷酸酯、无碱基间隔基、封端基团或核碱基。
在某些实施方案中，在二价链段中存在QB、QC、QD和QE中的至少一个(例如，存在至少一个QC，QE存在或QE不存在)。在某些实施方案中，每个QB和QD独立地不存在、是–CO–、–NH–、–O–、–S–、–SO2–、–NHC(O)–、–C(O)NH–、–CH2–、–CH2NH–、-NHCH2–、 -CH2O–或–OCH2–；
在某些实施方案中，–(–QB–QC–QD–)s1–组合以形成基团：
–QB–(CH2)g1–(CH2OCH2)g2–(CH2)g3–QD–，
其中：
g2是约1-约50的整数；
g1是约1的整数，并且QB是–NHCO–、–CONH–或–O–；或g1 是约0的整数，且QD是–NHCO–；和
g3是约1的整数，并且QB是–NHCO–、–CONH–或–O–；或g3 是约0的整数，且QD是–CONH–。
可以保护缀合部分直到辅助部分与多核苷酸缀合。例如，被保护的缀合部分可以包括–COORPGO或–NHRPGN，其中RPGO是O-保护基(例如，羧基保护基)，且RPGN是N-保护基。
在某些实施方案中，接头A是：
Figure DEST_PATH_IMAGE038
其中：
QA1和QA2独立地不存在、是任选取代的C2-12杂亚烷基(例如包含–C(O)–N(H)–、–N(H)–C(O)–、–S(O)2–N(H)–或–N(H)–S(O)2–的杂亚烷基)、任选取代的C1-12硫杂亚环基(例如
Figure DEST_PATH_IMAGE039
Figure DEST_PATH_IMAGE040
)、任选取代的 C1-12杂亚环基(例如1,2,3-三唑-1,4-二基或
Figure DEST_PATH_IMAGE041
)、环丁-3-烯-1,2-二酮-3,4-二基、吡啶-2-基腙、任选取代的C6-16三唑杂亚环基 (例如
Figure DEST_PATH_IMAGE042
)、任选取代的C8-16三唑亚环烯基(例如
Figure DEST_PATH_IMAGE043
)或二氢哒嗪基团(例如反式-
Figure DEST_PATH_IMAGE044
反式-
Figure DEST_PATH_IMAGE045
)，条件是存在QA1和QA2的至少一个；
RT是与靶向部分连接的键；
RP是与核苷间桥接基团、核碱基、封端基团或无碱基间隔基连接的键；
每个QT独立地是–CO–、–NH–、–NH–CH2–或–CO–CH2–；
每个QS独立地是任选取代的C2-12亚烷基、任选取代的C2-12亚烯基、任选取代的C2-12亚炔基或任选取代的(C6-10芳基)-C1-6亚烷基；
每个RM独立地是H、辅助部分、–(CH2)q7–CO–N(RM1)2或–C[–CH2O–(CH2)q7–CO–N(RM1)2]3，其中每个q7独立地是约1-约5 的整数，并且每个RM1独立地是H或辅助部分；
每个X1、X3和X5独立地不存在、是–O–、–NH–、–CH2–NH–、–C(O)–、–C(O)–NH–、–NH–C(O)–、–NH–C(O)–NH–、–O–C(O)–NH–、–NH–C(O)–O–、–CH2–NH–C(O)–NH–、–CH2–O–C(O)–NH–或–CH2–NH–C(O)-O-；
X7不存在、是-O-、–O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、–NH–、–CH2-NH-、-C(O)-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)–、-NH-C(O)-NH-、–O-C(O)–NH–、–NH–C(O)-O-、–CH2-NH-C(O)-NH-、 -CH2–O-C(O)-NH-或-CH2-NH–C(O)–O-；
每个X2、X4和X6独立地不存在、是-O-、-NH-、-C(O)–、–C(O)–NH–、–NH–C(O)–、–NH–C(O)–NH–、–O–C(O)–NH–或–NH–C(O)–O–；
x1和每个x5独立地是约0或约1的整数；
每个x2独立地是约0-约50、约1-约40或约1-约30的整数；
每个x3独立地是约1-约11的整数；
x4是约0、约1或约2的整数；和
每个x6独立地为约0-约10或约1-约6的整数，条件是两个x6 之和为约12或更小。
在某些实施方案中，LinkA是：
Figure DEST_PATH_IMAGE046
Figure DEST_PATH_IMAGE047
其中：
QA1是任选取代的C2-12杂亚烷基(例如包含–C(O)–N(H)–、–N(H)–C(O)–、–S(O)2–N(H)–或–N(H)–S(O)2–的杂亚烷基)、任选取代的C1-12硫杂亚环基(例如
Figure DEST_PATH_IMAGE048
Figure DEST_PATH_IMAGE049
)、任选取代的C1-12杂亚环基(例如1，2，3- 三唑-1，4-二基或
Figure DEST_PATH_IMAGE050
)、环丁-3-烯-1，2-二酮-3,4-二基、吡啶-2-基腙、任选取代的C6-16三唑杂亚环基(例如
Figure DEST_PATH_IMAGE051
Figure DEST_PATH_IMAGE052
)、任选取代的C8-16三唑亚环烯基(例如
Figure DEST_PATH_IMAGE053
) 或二氢哒嗪基团(例如反式-
Figure DEST_PATH_IMAGE054
反式-
Figure DEST_PATH_IMAGE055
Figure DEST_PATH_IMAGE056
)；
每个RM1独立地为H或辅助部分；
每个RT独立地是与靶向部分连接的键；
每个RP独立地是与核苷间桥接基团、核碱基、封端基团或无碱基间隔基连接的键；
每个QT独立地是–CO–、–NH–、–NH–CH2–或–CO–CH2–；
每个QP独立地是–C(O)–N(H)–、–N(H)–C(O)–、–S(O)2–N(H)–或–N(H)–S(O)2–；
每个QS独立地是任选取代的C2-12亚烷基、任选取代的C2-12亚烯基、任选取代的C2-12亚炔基或任选取代的(C6-10芳基)-C1-6亚烷基；
每个q1、q3和q7各自独立地是约0或约1的整数；
每个q2和q8各自独立地是约0-约50、约1-约40或约1-约30 的整数；
每个q4独立地是约0-约10的整数；
每个q5和q6各自独立地是约1-约10或约1-约6的整数；和
每个q9独立地是约1-约10的整数。
在某些实施方案中，LinkA是：
Figure DEST_PATH_IMAGE057
Figure DEST_PATH_IMAGE058
其中：
在每个结构式中，一个
Figure DEST_PATH_IMAGE059
代表单键，并且另一个
Figure DEST_PATH_IMAGE060
代表双键；
每个RM1独立地为H或辅助部分；
每个RT独立地是与靶向部分连接的键；
每个RP独立地是与核苷间桥接基团、核碱基、封端基团或无碱基间隔基连接的键；
每个QT独立地是–CO–、–CO–CH2–、–NH–或–NH–CH2–；
每个QP独立地是–C(O)–N(H)–、–N(H)–C(O)–、–S(O)2–N(H)–或–N(H)–S(O)2–；
每个QS独立地是任选取代的C2-12亚烷基、任选取代的C2-12亚烯基、任选取代的C2-12亚炔基或任选取代的(C6-10芳基)-C1-6亚烷基；
每个q1、q3和q7各自独立地是约0或约1的整数；
每个q2和q8各自独立地是约0-约50、约1-约40或约1-约30 的整数；
每个q4独立地是约0-约10的整数；
每个q5和q6各自独立地是约1-约10或约1-约6的整数；和
每个q9独立地是约1-约10的整数。
在某些实施方案中，q5是0。在某些实施方案中，q5是约2-约 6的整数。
在某些实施方案中，缀合基团是：
Figure DEST_PATH_IMAGE061
其中：
QA1是任选取代的C2-12杂亚烷基(例如包含–C(O)–N(H)–、–N(H)–C(O)–、–S(O)2–N(H)–或–N(H)–S(O)2–的杂亚烷基)、任选取代的C1-12硫杂亚环基(例如
Figure DEST_PATH_IMAGE062
Figure DEST_PATH_IMAGE063
)、任选取代的C1-12杂亚环基(例如1,2,3- 三唑-1,4-二基或
Figure DEST_PATH_IMAGE064
)、环丁-3-烯-1,2-二酮-3,4-二基、吡啶-2-基腙、任选取代的C6-16三唑杂亚环基(例如
Figure DEST_PATH_IMAGE065
Figure DEST_PATH_IMAGE066
)、任选取代的C8-16三唑亚环烯基(例如
Figure DEST_PATH_IMAGE067
) 或二氢哒嗪基团(例如反式-
Figure DEST_PATH_IMAGE068
反式-
Figure DEST_PATH_IMAGE069
Figure DEST_PATH_IMAGE070
)；
QA2是任选取代的C2-12炔基、任选取代的N-保护的氨基、叠氮基、N-马来酰亚胺基、S-保护的硫醇，
Figure DEST_PATH_IMAGE071
Figure DEST_PATH_IMAGE072
或其N-保护的形式、
Figure DEST_PATH_IMAGE073
Figure DEST_PATH_IMAGE074
包含内环碳-碳三键任选取代的C6-16杂环基(例如
Figure DEST_PATH_IMAGE075
)、1，2，4,5-四嗪基团(例如
Figure DEST_PATH_IMAGE076
Figure DEST_PATH_IMAGE077
)或任选取代的C8-16环炔基(例如
Figure DEST_PATH_IMAGE078
)、–NHRN1、任选取代的C4-8应变环烯基(例如，反式环辛烯基或降冰片烯基)或任选取代的含–COOR12或–CHO的C1-16烷基；
RN1是H、N-保护基或任选取代的C1-6烷基；
每个R12独立地为H或任选取代的C1-6烷基；
R13是卤素或F；
RP是与核苷间桥接基团、核碱基、封端基团或无碱基间隔基连接的键；
每个QS独立地是任选取代的C2-12亚烷基、任选取代的C2-12亚烯基、任选取代的C2-12亚炔基或任选取代的(C6-10芳基)-C1-6亚烷基；
每个RM独立地是H、辅助部分、–(CH2)q7–CO–N(RM1)2或–C[–CH2O–(CH2)q7–CO–N(RM1)2]3，其中每个q7独立地是约1-约5 的整数，并且每个RM1独立地是H或辅助部分；
每个X3和X5独立地不存在、是–O–、–NH–、–CH2–NH–、–C(O)–、–C(O)–NH–、–NH–C(O)–、–NH–C(O)–NH–、–O–C(O)–NH–、–NH–C(O)–O–、–CH2–NH–C(O)–NH–、–CH2–O–C(O)–NH–或–CH2–NH–C(O)–O–；
X7不存在、是-O-、–O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、–NH–、–CH2–NH-、-C(O)-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)–、-NH-C(O)-NH-、–O-C(O)–NH–、–NH–C(O)-O-、–CH2-NH-C(O)-NH-、 -CH2–O-C(O)-NH-或-CH2-NH–C(O)–O-；
每个X2、X4和X6独立地不存在、是-O-、-NH-、-C(O)–、–C(O)–NH–、–NH–C(O)–、–NH–C(O)–NH–、–O–C(O)–NH–或–NH–C(O)–O–；
x1和每个x5独立地是约0或约1的整数；
每个x2独立地是0-50的整数(例如1-40或1-30)；
每个x3独立地是1-11的整数；
x4是0、1或2的整数；和
每个x6独立地为0-10的整数(例如1-6)，条件是两个x6之和为约12或更小。
在某些实施方案中，缀合基团是：
Figure DEST_PATH_IMAGE079
其中：
QA1是任选取代的C2-12炔基、任选取代的N-保护的氨基、叠氮基、N-马来酰亚胺基、S-保护的硫醇，
Figure DEST_PATH_IMAGE080
Figure DEST_PATH_IMAGE081
或其N-保护的形式、
Figure DEST_PATH_IMAGE082
Figure DEST_PATH_IMAGE083
包含内环碳-碳三键任选取代的C6-16杂环基(例如
Figure DEST_PATH_IMAGE084
)、1,2，4,5-四嗪基团(例如
Figure DEST_PATH_IMAGE085
Figure DEST_PATH_IMAGE086
)或任选取代的C8-16环炔基(例如
Figure DEST_PATH_IMAGE087
)、–NHRN1、任选取代的C4-8应变环烯基(例如，反式环辛烯基或降冰片烯基)或任选取代的含–COOR12或–CHO的C1-16烷基；
RN1是H、N-保护基或任选取代的C1-6烷基；
每个R12独立地为H或任选取代的C1-6烷基；
R13是卤素(例如F)；
RP是与核苷间桥接基团、核碱基、封端基团或无碱基间隔基连接的键；
每个QS独立地是任选取代的C2-12亚烷基、任选取代的C2-12亚烯基、任选取代的C2-12亚炔基或任选取代的(C6-10芳基)-C1-6亚烷基；
X7不存在、是–O–、–NH–、–O–P(O)(OH)–O–、–O–P(S)(OH)–O–、 -CH2–NH–、–C(O)–、–C(O)–NH–、–NH–C(O)–、–NH–C(O)–NH–、–O–C(O)–NH–、–NH–C(O)–O-、–CH2–NH–C(O)–NH–、–CH2–O–C(O)–NH–或–CH2–NH–C(O)–O–；
X6不存在、是–O–、–NH–、–C(O)–、–C(O)–NH–、–NH–C(O)–、–NH–C(O)–NH–、-O–C(O)–NH–或–NH–C(O)–O–；
x1是0或1；
每个x2独立地是0-50、1-10或1-30的整数；
每个x3独立地是1-11的整数；和
x4是0、1或2。
在某些实施方案中，缀合基团是：
Figure DEST_PATH_IMAGE088
Figure DEST_PATH_IMAGE089
其中：
QA1是任选取代的C2-12炔基、任选取代的N-保护的氨基、叠氮基、N-马来酰亚胺基、S-保护的硫醇，
Figure DEST_PATH_IMAGE090
Figure DEST_PATH_IMAGE091
或其N-保护的形式、
Figure DEST_PATH_IMAGE092
Figure DEST_PATH_IMAGE093
包含内环碳-碳三键任选取代的C6-16杂环基(例如
Figure DEST_PATH_IMAGE094
)、1,2,4,5-四嗪基团(例如
Figure DEST_PATH_IMAGE095
Figure DEST_PATH_IMAGE096
)或任选取代的C8-16环炔基(例如
Figure DEST_PATH_IMAGE097
)、–NHRN1、任选取代的C4-8应变环烯基(例如，反式环辛烯基或降冰片烯基)或任选取代的含–COOR12或-CHO的C1-16烷基；
RN1是H、N-保护基或任选取代的C1-6烷基；
每个R12独立地为H或任选取代的C1-6烷基；
R13是卤素(例如F)；
RP是与核苷间桥接基团、核碱基、封端基团或无碱基间隔基连接的键；
QP是–C(O)–N(H)–、–N(H)–C(O)–、–S(O)2–N(H)–或–N(H)–S(O)2–；
每个QS独立地是任选取代的C2-12亚烷基、任选取代的C2-12亚烯基、任选取代的C2-12亚炔基或任选取代的(C6-10芳基)-C1-6亚烷基；
每个q1和q3独立地是0或1；
q2是0-50、1-10或1-30的整数；
q4是0-10的整数；和
q5是1-10或1-6的整数。
仍然在某些实施方案中，缀合基团是：
Figure DEST_PATH_IMAGE098
其中：
RP是与核苷间桥接基团、核碱基、封端基团或无碱基间隔基连接的键；
QP是–C(O)–N(H)–、–N(H)–C(O)–、–S(O)2–N(H)–或–N(H)–S(O)2–；
每个QS独立地是任选取代的C2-12亚烷基、任选取代的C2-12亚烯基、任选取代的C2-12亚炔基或任选取代的(C6-10芳基)-C1-6亚烷基；
每个q1和q3独立地是0或1；
q2是0-50、1-10或1-30的整数；
q4是0-10的整数；和
q5是1-10或1-6的整数。
在某些示例性实施方案中，缀合基团是：
Figure DEST_PATH_IMAGE099
Figure DEST_PATH_IMAGE100
Figure DEST_PATH_IMAGE101
其中：q2是约1-约50的整数(例如，约1-约24或约1-约8的整数(例如，约2或约3))，q4是约0-约10的整数(例如，约0、约、约2、约3、约4、约5、约6、约7或约8)，q10是约0-约8 的整数(例如约1、约2、约3、约4、约5或约6)，q11是约0或约1，Z是O或S，并且每个RM独立地是H、辅助部分、–(CH2)q7–CO–N(RM1)2或–C[–CH2O–(CH2)q7–CO–N(RM1)2]3，其中每个 q7独立地是约1-约5的整数，并且每个RM1独立地是H或辅助部分。
在某些实施方案中，用于通过金属催化的环加成缀合至靶向部分的缀合基团为：
Figure DEST_PATH_IMAGE102
其中q2是约1-约50的整数(例如，约1-约24或约1-约8的整数(例如，约2或约3))，q4是约0-约10的整数(例如，约0、约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7或约8)，q10是约0-约8 的整数(例如约1、约2、约3、约4、约5或约6)，q11是约0或约1，并且Z是O或S。
在某些实施方案中，用于通过无金属环加成缀合至靶向部分的缀合基团为：
Figure DEST_PATH_IMAGE103
Figure DEST_PATH_IMAGE104
Figure DEST_PATH_IMAGE105
其中：q2是约1-约50的整数(例如，约1-约24或约1-约8的整数(例如，约2或约3))，q4是约0-约10的整数(例如，约0、约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7或约8)，q10是约0-约8 的整数(例如约1、约2、约3、约4、约5或约6)，q11是约0或约1，Z是O或S，并且每个RM独立地是H、辅助部分、–(CH2)q7–CO–N(RM1)2或–C[–CH2O–(CH2)q7–CO–N(RM1)2]3，其中每个 q7独立地是约1-约5的整数，并且每个RM1独立地是H或辅助部分。
在某些实施方案中，通过酰胺形成与靶向部分缀合的缀合基团为：
Figure DEST_PATH_IMAGE106
其中q2是约0-约50的整数(例如，约1-约8的整数(例如，约2或约3))，并且q12是约1-约11的整数(例如，约1-约5的整数(例如，约1、约2、约3、约4或约5)。
生物可逆性基团
在某些实施方案中，生物可逆性基团包含二硫化物(–S–S–)。在某些实施方案中，生物可逆性基团在生理条件下可胞内裂解。
在某些实施方案中，生物可逆性基团具有式(XXII)：
R5–S–S–(LinkB)–,
(XXII)
其中：
LinkB是二价基团，其包含与磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键合的sp3-杂化碳原子和与–S–S–键合的碳原子，并且R5是任选取代的C1-6烷基、任选取代的C6-10芳基或–LinkC(–RM)r，或LinkB是三价接头，其包含与磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键合的sp3- 杂化碳原子和与–S–S–键合的碳原子，其中LinkB的第三化合价与–S–S–和R5结合形成任选取代的C3-9杂亚环基；
LinkC是多价基团；
每个RM独立地是H、辅助部分或–QG[(–QB–QC–QD)s2–RM1]p1，
其中RM1独立地是H、辅助部分，
每个QB和每个QD独立地不存在、是–CO–、–NH–、–O–、–S–、–SO2–、–OC(O)–、–COO–、–NHC(O)–、–C(O)NH–、–CH2–、–CH2NH–、–NHCH2–、–CH2O–或–OCH2–，
每个QC独立地不存在、是任选取代的C1-12亚烷基、任选取代的 C2-12亚烯基、任选取代的C2-12亚炔基、任选取代的C2-12杂亚烷基、任选取代的C1-9杂亚环基；
每个QG独立地为任选取代的C1-6烷烃三基、任选取代的C1-6烷烃四基、任选取代的C2-6杂烷烃三基或任选取代的C2-6杂烷烃四基；和
每个s2独立地是0-10的整数，和
p1是2或3；
和
r是1-6的整数(例如1、2或3)。
在某些实施方案中，LinkB和/或R5包括与–S–S–连接的大体积基团。包含与–S–S–连接的大体积基团可增强硫-硫键的稳定性，例如在多核苷酸合成过程中。
在进一步的实施方案中，LinkB由1、2或3个基团组成，每个基团独立地选自任选取代的C1-12亚烷基、任选取代的C2-12亚烯基、任选取代的C2-12亚炔基、任选取代的C2-12杂亚烷基、任选取代的 C1-9杂亚环基。
在特定实施方案中，LinkB和–S–S–结合以形成选自以下的结构：
Figure DEST_PATH_IMAGE107
其中：
每个R6独立地为C2-7烷酰基；C1-6烷基；C2-6烯基；C2-6炔基； C1-6烷基亚磺酰基；C6-10芳基；氨基(C6-10芳基)-C1-4-烷基；C3-8环烷基；(C3-8环烷基)-C1-4-烷基；C3-8环烯基；(C3-8环烯基)-C1-4- 烷基；卤素；C1-9杂环基；C1-9杂芳基；(C1-9杂环基)氧基；(C1-9杂环基)氮杂；羟基；C1-9硫代烷氧基；-(CH2)qCO2RA，其中q是0-4 的整数，并且RA选自C1-6烷基、C6-10芳基和(C6-10芳基)-C1-4烷基； -(CH2)qCONRBRC，其中q是0-4的整数，并且其中RB和RC独立地选自氢、C1-6烷基、C6-10芳基和(C6-10芳基)-C1-4-烷基；-(CH2)qSO2RD，其中q是0-4的整数，并且RD选自C1-6烷基、C6-10芳基和(C6-10芳基)-C1-4-烷基；-(CH2)qSO2NRERF，其中q为0-4的整数，且RE和 RF各自独立地选自氢、烷基、芳基和(C6-10芳基)-C1-4-烷基；硫醇；芳基氧基；环烷氧基；芳基烷氧基；(C1-9杂环基)-C1-4-烷基；(C1-9杂芳基)-C1-4-烷基；C3-12甲硅烷基；氰基；或-S(O)RH，其中RH选自氢、C1-6烷基、C6-10芳基和(C6-10芳基)-C1-4-烷基；或两个相邻的R6基团与每个R6基团所连接的原子一起形成环基，所述环基选自 C6芳基、C2-5杂环基或C2-5杂芳基，其中环基任选被1、2或3个选自以下的取代基取代：C2-7烷酰基；C1-6烷基；C2-6烯基；C2-6炔基； C1-6烷基亚磺酰基；C6-10芳基；氨基(C6-10芳基)-C1-4-烷基；C3-8环烷基；(C3-8环烷基)-C1-4-烷基；C3-8环烯基；(C3-8环烯基)-C1-4- 烷基；卤素；C1-9杂环基；C1-9杂芳基；(C1-9杂环基)氧基；(C1-9杂环基)氮杂；羟基；C1-6硫代烷氧基；-(CH2)qCO2RA，其中q是0-4 的整数，并且RA选自C1-6烷基、C6-10芳基和(C6-10芳基)-C1-4烷基； -(CH2)qCONRBRC，其中q是0-4的整数，并且其中RB和RC独立地选自氢、C1-6烷基、C6-10芳基和(C6-10芳基)-C1-4-烷基；-(CH2)qSO2RD，其中q是0-4的整数，并且RD选自C1-6烷基、C6-10芳基和(C6-10芳基)-C1-4-烷基；-(CH2)qSO2NRERF，其中q为0-4的整数，且RE和 RF各自独立地选自氢、烷基、芳基和(C6-10芳基)-C1-4-烷基；硫醇；芳基氧基；环烷氧基；芳基烷氧基；(C1-9杂环基)-C1-4-烷基；(C1-9杂芳基)-C1-4-烷基；C3-12甲硅烷基；氰基；或-S(O)RH，其中RH选自氢、C1-6烷基、C6-10芳基和(C6-10芳基)-C1-4-烷基。
m1为0、1或2；和
m2是0、1、2、3或4；
或LinkB、–S–S–和R5组合形成包含
Figure DEST_PATH_IMAGE108
(xx)的基团。
在其他实施方案中，LinkC可包含0-3个多价单体(例如，任选取代的C1-6烷烃三基、任选取代的C1-6烷烃四基或三价氮原子)和一个或多个二价单体(例如1-40)，其中每个二价单体独立地是任选取代的C1-6亚烷基；任选取代的C2-6亚烯基；任选取代的C2-6亚炔基；任选取代的C3-8亚环烷基；任选取代的C3-8亚环烯基；任选取代的C6-14亚芳基；具有1-4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的C1-9杂亚芳基；具有1-4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的C1-9杂亚环基；亚氨基；任选取代的N；O；或S(O)m，其中m是0、 1或2。在一些实施方案中，每个单体独立地是任选取代的C1-6亚烷基；任选取代的C3-8亚环烷基；任选取代的C3-8亚环烯基；任选取代的C6-14亚芳基；具有1-4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的C1-9杂亚芳基；具有1-4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的 C1-9杂亚环基；亚氨基；任选取代的N；O；或S(O)m，其中m是0、 1或2(例如m为2)。在某些实施方案中，每个单体独立地是任选取代的C1-6亚烷基；任选取代的C3-8亚环烷基；任选取代的C3-8亚环烯基；任选取代的C6-14亚芳基；具有1-4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的C1-9杂亚芳基；具有1-4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的C1-9杂亚环基；任选取代的N；O；或S(O)m，其中m 为0、1或2(例如m为2)。将辅助部分连接至缀合部分或其反应产物的非生物可逆性接头可包括2-500个(例如2-300、2-200、2-100或2-50个)这种单体。LinkC可包含一种或多种聚乙二醇(例如，聚乙二醇可具有88Da-1kDa的分子量(例如88Da-500Da)。
本文以及WO 2015/188197中描述了可用于制备式(IIa)中的基团–LinkC(–RM)r的化合物。–LinkC(–RM)r的非限制性实例包括：
Figure DEST_PATH_IMAGE109
Figure DEST_PATH_IMAGE110
其中：
R14是与–S–S–连接的键，
RM是辅助部分或–QG[(–QB–QC–QD)s2–RM1]p1，
每个RM1独立地是H或辅助部分，
每个QB和QD独立地不存在、是–CO–、–NH–、–O–、–S–、–SO2–、–OC(O)–、–COO–、–NHC(O)–、–C(O)NH–、–CH2–、–CH2NH–、–NHCH2–、–CH2O–或–OCH2–；
每个QC独立地不存在、是任选取代的C1-12亚烷基、任选取代的C2-12亚烯基、任选取代的C2-12亚炔基、任选取代的C2-12杂亚烷基、任选取代的C1-9杂亚环基或–P(Z)(OH)–，其中Z为O或S；
每个QG独立地为任选取代的C1-6烷烃三基、任选取代的C1-6烷烃四基、任选取代的C2-6杂烷烃三基或任选取代的C2-6杂烷烃四基；
每个s2独立地是0-10的整数，和
p1是2或3；
每个r4独立地是1-6的整数；和
每个r5独立地是0-10的整数。
在某些实施方案中，RM是辅助部分。在一些实施方案中，至少一个RM1是辅助部分。
在某些实施方案中，生物可逆性接头基团是
Figure DEST_PATH_IMAGE111
其中所述基团的一端连接至多核苷酸，并且另一端连接至靶标部分 (在一个实施方案中，抗体)。
非生物可逆性基团
非生物可逆性基团是一价取代基，其不包含在生理条件下在血清或核内体中可裂解的键(例如，酯、硫酯或二硫化物)。所述非生物可逆性基团可以是任选取代的C2-16烷基；任选取代的C3-16烯基；任选取代的C3-16炔基；任选取代的C3-8环烷基；任选取代的C3-8环烯基；任选取代的(C3-8环烷基)-C1-4-烷基；任选取代的(C3-8环烯基)-C1-4-烷基；任选取代的C6-14芳基；任选取代的(C6-14芳基)-C1-4- 烷基；具有1-4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的C1-9杂芳基；具有1-4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的(C1-9杂芳基)-C1-4- 烷基；具有1-4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的C2-9杂环基，其中所述杂环基不包含S-S键；具有1-4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的(C2-9杂环基)-C1-4-烷基，其中所述杂环基不包含S-S键；或式(XXIII)基团：
Figure DEST_PATH_IMAGE112
其中：
L3为C2-6亚烷基；
R7是任选取代的C2-6烷基；任选取代的C6-14芳基；任选取代的 (C6-14芳基)-C1-4-烷基；任选取代的C3-8环烷基；任选取代的(C3-8环烷基)-C1-4-烷基；具有1-4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的C1-9杂芳基；具有1-4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的 (C1-9杂芳基)-C1-4-烷基；具有1-4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的C2-9杂环基，其中所述杂环基不包含S-S键；具有1-4个选自N、O和S的杂原子的任选取代的(C2-9杂环基)-C1-4-烷基，其中所述杂环基不包含S-S键；以及以-OH、C1-6烷氧基或-COOH封端的聚(乙二醇)；和
R8是H或C1-6烷基。
非生物可逆的磷酸三酯可以是被取代基取代的磷酸酯或硫代磷酸酯，所述取代基为缀合基团、C2-16烷基、
Figure DEST_PATH_IMAGE113
Figure DEST_PATH_IMAGE114
与含叠氮基的底物的环加成反应形成的基团，
其中：
n为1-6的整数；
R9是任选取代的C6芳基；任选取代的C4-5杂芳基，其为含有1 或2个氮原子的六元环；或任选取代的C4-5杂环基，其为含有1或2 个氮原子的六元环；
R10为H或C1-6烷基；
R11为卤素、–COOR11A或–CON(R11B)2，其中R11A和R11B各自独立为H、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C6-14芳基，任选取代的1-9杂芳基或任选取代的C2-9杂环基；和
含叠氮基的底物是
Figure DEST_PATH_IMAGE115
在一些实施方案中，非生物可逆性基团是–LinkD(–RM1)r1，其中LinkD是多价接头，每个RM1独立地是H或辅助部分，并且r1是1-6 的整数。
在一些情况下，–LinkD(–RM1)r1具有式(XXIV)：
–QR–Q3([–Q4–Q5–Q6]r2–Q7–RM1)r1,
(XXIV)
其中：
r1是1-6的整数；
每个r2独立地是0-50(例如0-30)的整数，其中重复单元相同或不同；
QR是[–Q4–Q5–Q6]r2–QL–,其中QL是任选取代的C2-12杂亚烷基 (例如包含–C(O)–N(H)–、–N(H)–C(O)–、–S(O)2–N(H)–或–N(H)–S(O)2–的杂亚烷基)、任选取代的C1-12硫杂亚环基(例如
Figure DEST_PATH_IMAGE116
)、任选取代的C1-12杂亚环基(例如1,2,3-三唑-1,4-二基或
Figure DEST_PATH_IMAGE117
)、环丁-3-烯-1,2-二酮-3,4-二基、吡啶-2-基腙、任选取代的C6-16三唑杂亚环基(例如
Figure DEST_PATH_IMAGE118
)、任选取代的C8-16三唑亚环烯基(例如
Figure DEST_PATH_IMAGE119
)或二氢哒嗪基团(例如反式-
Figure DEST_PATH_IMAGE120
反式-
Figure DEST_PATH_IMAGE121
Figure DEST_PATH_IMAGE122
)；
如果r1是1，则Q3是直链基团(例如[–Q4–Q5–Q6]r2–)，或如果r1 是2-6的整数，则Q3是支链基团(例如 [–Q4–Q5–Q6]s–Q8([–Q4–Q5–Q6]r2–(Q8)r3)r4，其中r3是0或1，r4是0、 1、2或3)；每个r2独立地是0-50(例如0-30)的整数，其中重复单元相同或不同；
每个Q4和每个Q6独立地不存在、是–CO–、–NH–、–O–、–S–、–SO2–、–OC(O)–、–COO–、–NHC(O)–、–C(O)NH–、–CH2–、–CH2NH–、–NHCH2–、–CH2O–或–OCH2–；
每个Q5独立地不存在、是任选取代的C1-12亚烷基、任选取代的 C2-12亚烯基、任选取代的C2-12亚炔基、任选取代的C2-12杂亚烷基、任选取代的C1-9杂亚环基；
每个Q7独立地不存在、是–CO–、–NH–、–O–、–S–、–SO2–、–CH2–、–C(O)O-、–OC(O)-、-C(O)NH-、-NH-C(O)-、-NH-CH(Ra)–C(O)–或–C(O)–CH(Ra)–NH–；
每个Q8独立地是任选取代的C1-6烷烃三基、任选取代的C1-6烷烃四基、任选取代的C2-6杂烷烃三基或任选取代的C2-6杂烷烃四基；和
每个Ra独立地是H或氨基酸侧链；和
每个RM1独立地是H或辅助部分。
在式(XXIV)中，存在Q4、Q5和Q6中的至少一个。在式(XXIV) 中，LinkD可以包含单个分支点(如果每个r3为0)或多个分支点 (如果至少一个r3为1)。在式(XXIV)中，QR可以为–Q5–Q4–QL–，其中Q5是任选取代的C2-12杂亚烷基或任选取代的C1-12亚烷基，并且Q4是–CO–、–NH–或–O–。在式(XXIV)中，QL可以是：
Figure DEST_PATH_IMAGE123
反式-
Figure DEST_PATH_IMAGE124
反式-
Figure DEST_PATH_IMAGE125
在式(XXIV)中，Q3可以是式[–Q4–Q5-Q6]r2-的直链基团，其中Q4、Q5和Q6与式(XXIV)的定义相同。或者，Q3可以是支链基团[-Q4-Q5-Q6]r2-Q8([-Q4-Q5–Q6]r2-(Q8)r3)r4，其中每个Q8独立地是任选取代的C1-6烷烃三基、任选取代的C1-6烷烃四基，任选取代的C2-6杂烷烃三基或任选取代的C2-6杂烷烃四基；
其中：
每个r2独立地是0-50(例如0-30)的整数，其中重复单元相同或不同；
r3是0或1；
r4是0、1、2或3；
其中，
当r3为0时，LinkD是三价或四价基团，和
当r3为1时，LinkD是四价、五价或六价基团。
在某些实施方案中，r3是0。
在某些实施方案中，Q8是：
Figure DEST_PATH_IMAGE126
本文以及WO 2015/188197中描述了可用于制备式(I)中的基团-LinkD(-RM1)p的化合物。
在某些实施方案中，非生物可逆性接头基团是
Figure DEST_PATH_IMAGE127
其中所述基团的一端连接至多核苷酸，并且另一端连接至靶标部分(在一个实施方案中，抗体)。
辅助部分
辅助部分是包含染料或亲水基团或其组合的一价基团(例如，亲水性聚合物(例如，聚(乙二醇)(PEG))、带正电荷的聚合物(例如，聚(乙烯亚胺))、或糖醇(例如葡萄糖醇))。辅助部分的理论分子量可为100Da-2.5kDa(例如350Da-2.5kDa、 100Da-1200Da或1kDa-2.5kDa)。
为了使摄取可视化或监测本发明的缀合物在细胞内的移动(例如，使用光漂白后的荧光回收(FRAP))，可以将染料包括在磷酸酯基团中。可以包括本领域已知的染料作为通过5′-或3′-末端的磷酸酯或硫代磷酸酯或通过将两个连续的核苷结合在一起的磷酸酯或硫代磷酸酯与多核苷酸连接的辅助部分。可用作染料的有用结构的非限制性实例包括FITC、RD1、别藻蓝蛋白(APC)、aCFTM染料 (Biotium,Hayward,CA)、BODIPY(InvitrogenTM10,Life Technologies,Carlsbad,CA)、
Figure DEST_PATH_IMAGE128
(InvitrogenTM,LifeTechnologies,Carlsbad,CA)、DyLight Fluor(Thermo Scientific Pierce ProteinBiology Products，Rockford,IL)、ATTO(ATTO-TEC GmbH, Siegen,德国)、FluoProbe(Interchim SA,
Figure DEST_PATH_IMAGE129
法国)和Abberior Probes(Abberior GmbH,
Figure DEST_PATH_IMAGE130
德国)。
可以在本发明的免疫调节性多核苷酸和本发明的缀合物中用作辅助部分的亲水性聚合物和带正电荷的聚合物是本领域已知的。亲水聚合物的非限制性实例是聚(乙二醇)。带正电的聚合物的非限制性实例是聚(乙烯亚胺)。
基于糖醇的辅助部分可以是例如氨基末端的葡萄糖醇或葡萄糖醇簇。氨基末端的葡萄糖醇辅助部分为：
Figure DEST_PATH_IMAGE131
葡萄糖醇簇的非限制性实例是：
Figure DEST_PATH_IMAGE132
在一个实施方案中，本文提供式(B)的化合物：
Rx-LN-(Q)e (B)
或其立体异构体、两种或更多种非对映异构体的混合物、互变异构体、或两种或更多种互变异构体的混合物；或其药学可接受的盐、溶剂化物或水合物；
其中：
Rx是缀合基团；
LN是接头；
每个Q独立地是包含磷酸三酯的多核苷酸；和
e是1、2、3或4的整数。
在某些实施方案中，在式(B)中，Rx是
Figure DEST_PATH_IMAGE133
在某些实施方案中，在式(B)中，LN是包含聚乙二醇的接头。
在某些实施方案中，在式(B)中，LN是
Figure DEST_PATH_IMAGE134
其中d是约0-约50的整数。在某些实施方案中，d是约0-约10的整数。在某些实施方案中，d是约0-约 5的整数。在某些实施方案中，d是约0、约1或约3的整数。
在某些实施方案中，在式(B)中，e是1的整数。
在某些实施方式中，在式(B)中，每个Q独立地具有式(D) 的结构：
Figure DEST_PATH_IMAGE135
其中各个XN、X3’、X5’、YP、b和c如本文所定义。
靶向部分
在本文提供的缀合物中使用的靶向部分是针对机体中靶特异性细胞和组织的，用于靶向递送缀合的有效载荷多核苷酸。在某些实施方案中，本文提供的缀合物靶向的细胞是天然杀伤细胞。在某些实施方案中，本文提供的缀合物靶向的细胞是骨髓细胞。在某些实施方案中，本文提供的缀合物靶向的细胞是嗜中性粒细胞。在某些实施方案中，本文提供的缀合物靶向的细胞是单核细胞。在某些实施方案中，本文提供的缀合物靶向的细胞是巨噬细胞。在某些实施方案中，本文提供的缀合物靶向的细胞是树突细胞(DC)。在某些实施方案中，本文提供的缀合物靶向的细胞是肥大细胞。在某些实施方案中，本文提供的缀合物靶向的细胞是肿瘤相关巨噬细胞 (TAM)。在某些实施方案中，本文提供的缀合物靶向的细胞是骨髓来源的抑制细胞(MDSC)。
在某些实施方案中，靶向部分是抗原结合部分。在某些实施方案中，靶向部分是抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，本文提供的缀合物中的抗原结合部分是抗体或其抗原结合片段(例如，F(ab)2或Fab)或其工程化的衍生物(例如，Fcab或融合蛋白(例如scFv))。在某些实施方案中，本文提供的缀合物中的抗原结合部分是人或嵌合(例如，人源化)抗体。
抗原结合部分靶向具有被抗原结合部分识别的表面抗原的细胞。
在某些实施方案中，靶向部分是与NK细胞表达的抗原结合的抗体。由NK细胞表达并且可以被本文提供的缀合物靶向的示例性抗原包括但不限于CD11b、CD11c、CD16/32、CD49b、CD56(NCAM)、 CD57、CD69、CD94、CD122、CD158(Kir)、CD161(NK-1.1)、CD244 (2B4)、CD314(NKG2D)、CD319(CRACC)、CD328(Siglec-7)、CD335 (NKp46)、Ly49、Ly108、Vα24-Jα18TCR(iNKT)、粒溶素、粒酶、穿孔素、SIRP-α、LAIR1、SIGLEC-3(CD33)、SIGLEC-7、SIGLEC-9、LIR1(ILT2、LILRB1)、NKR-P1A(KLRB1)、CD94-NKG2A、KLRG1、 KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DS2、 KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、KIR2DS1、 CD94-NKG2C/E、NKG2D、CD160(BY55)、CD16(FcγRIIIA)、NKp46 (NCR1)、NKp30(NCR3)、NKp44(NCR2)、DNAM1(CD226)、CRTAM、 CD2、CD7、CD11a、CD18、CD25、CD27、CD28、NTB-A(SLAMF6)、 PSGL1、CD96(Tactile)、CD100(SEMA4D)、NKp80(KLRF1、 CLEC5C)、SLAMF7(CRACC、CS1、CD319)和CD244(2B4、 SLAMF4)。
在某些实施方案中，靶向部分是与骨髓细胞表达的抗原结合的抗体。由骨髓细胞表达的并且可以被本文提供的缀合物靶向的示例性抗原包括但不限于siglec-3、siglec7、siglec 9、siglec 15、CD200、 CD200R、LILRB1、LILRB2、LILRB3、LILRB4、LILRB5、M-CSF、CSF-1R、GM-CSF R、IL4 R、精氨酸酶、IDO、TDO、MPO、EP2、 COX-2、CCR2、CCR-7、CXCR1、CX3CR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、 CXCR7、c-Kit、CD244、L-selectin/CD62L、CD11b、CD11c、CD68、 CD163、CD204、DEC205、IL-1R、CD31、SIRPα、SIRPβ、PD-L1、 CEACAM-8/CD66b、CD103、BDCA-1、BDCA2.BDCA-4、CD123 和ILT-7。
在某些实施方案中，靶向部分是与由MDSC表达的抗原结合的抗体。由MDSC表达并且可以被本文提供的缀合物靶向的示例性抗原包括但不限于siglec-3、Siglec 7、siglec9、siglec 15、CD200、CD200R、LILRB1、LILRB2、LILRB3、LILRB4、LILRB5、M-CSF、 CSF-1R、GM-CSF R、IL4 R、精氨酸酶、IDO、TDO、MPO、EP2、 COX-2、CCR2、CCR-7、CXCR1、CX3CR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、 CXCR7、c-Kit、CD244、L-选择素/CD62L、CD11b、CD11c、CD68、 CD163、CD204、DEC205、IL-1R、CD31、SIRPα、SIRPβ、PD-L1、 CEACAM-8/CD66b、CD103、BDCA-1、BDCA2.BDCA-4、CD123 和ILT-7。
在某些实施方案中，靶向部分是与TAM表达的抗原结合的抗体。由TAM表达并且可以被本文提供的缀合物靶向的示例性抗原包括但不限于siglec-3、Siglec 7、siglec 9、siglec 15、CD200、CD200R、 LILRB1、LILRB2、LILRB3、LILRB4、LILRB5、M-CSF、CSF-1R、 GM-CSF R、IL4 R、精氨酸酶、IDO、TDO、MPO、EP2、COX-2、 CCR2、CCR-7、CXCR1、CX3CR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR7、 c-Kit、CD244、L-选择素/CD62L、CD11b、CD11c、CD68、CD163、 CD204、DEC205、IL-1R、CD31、SIRPα、SIRPβ、PD-L1、 CEACAM-8/CD66b、CD103、BDCA-1、BDCA2.BDCA-4、CD123 和ILT-7。
在某些实施方案中，靶向部分是结合NK细胞特异性抗原的抗体。在某些实施方案中，抗CD56抗体靶向NK细胞。在某些实施方案中，靶向部分是抗CD56抗体。在某些实施方案中，抗体是单克隆抗CD56抗体。在某些实施方案中，抗体是鼠抗CD56抗体。在某些实施方案中，鼠抗CD56抗体是克隆5.1H11(BioLegend，Cat No: 362502)。在某些实施方案中，鼠抗CD56抗体是克隆 MEM-188(BioLegend，304601)。在某些实施方案中，鼠抗CD56抗体是克隆QA17A16(BioLegend，Cat No:392402)。在某些实施方案中，抗体是人源化的抗CD56抗体。在某些实施方案中，抗体是人抗CD56 抗体。在某些实施方案中，抗体是人源化抗CD56抗体。
在某些实施方案中，靶向部分是结合骨髓细胞特异性抗原的抗体。在某些实施方案中，抗SIRPα抗体靶向骨髓细胞。在某些实施方案中，靶向部分是抗SIRPα抗体。在某些实施方案中，抗体是单克隆抗SIRPα抗体。在某些实施方案中，抗体是鼠抗SIRPα抗体。在某些实施方案中，抗体是人源化的抗SIRPα抗体。在某些实施方案中，该抗体是人抗SIRPα抗体。
在某些实施方案中，抗SIRPα抗体(119或119种系突变)是包含VH和VL的人抗体，其中VH独立选自下列序列：
Figure DEST_PATH_IMAGE136
Figure DEST_PATH_IMAGE137
以及VL独立选自下列序列：
Figure DEST_PATH_IMAGE138
在某些实施方案中，抗SIRPα抗体(119或119种系突变)是包含HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3的人抗体，其每一个独立选自下表。
Figure DEST_PATH_IMAGE139
119人抗体是CD47-阻断剂，其描述于WO 2018/057669 A1的表 P中，其公开通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，抗SIRPα抗体(135或135种系突变)是包含VH和VL的人抗体，其中VH独立选自下列序列：
Figure DEST_PATH_IMAGE140
Figure DEST_PATH_IMAGE141
以及VL独立选自下列序列：
Figure DEST_PATH_IMAGE142
在某些实施方案中，抗SIRPα抗体(135或135种系突变)是包含HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3的人抗体，其每一个独立选自下表。
Figure DEST_PATH_IMAGE143
135人抗体是CD47-阻断剂，其描述于WO 2018/057669 A1的表P中，其公开通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，抗SIRPα抗体(AB21、AB21种系突变或 AB21的人源化形式)是包含VH和VL的抗体，其中VH独立选自下列序列：
Figure DEST_PATH_IMAGE144
以及VL独立选自下列序列：
Figure DEST_PATH_IMAGE145
Figure DEST_PATH_IMAGE146
在某些实施方案中，抗SIRPα抗体(AB21、AB21种系突变或 AB21的人源化形式)是包含HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、 HVR-L2和HVR-L3的人源化抗体，其每一个独立选自下表。
Figure DEST_PATH_IMAGE147
AB21人源化抗体是CD47-阻断剂，其描述于WO 2018/057669 A1的表P中，其公开通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，抗SIRPα抗体(136或136种系突变)是包含VH和VL的人抗体，其中VH独立选自下列序列：
Figure DEST_PATH_IMAGE148
Figure DEST_PATH_IMAGE149
以及VL独立选自下列序列：
Figure DEST_PATH_IMAGE150
在某些实施方案中，抗SIRPα抗体(136或136种系突变)是包含HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3的人抗体，其每一个独立选自下表。
Figure DEST_PATH_IMAGE151
136人抗体是非阻断剂，其描述于WO 2018/057669 A1的表P 中，其公开通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，抗SIRPα抗体(218或人源化218)是包含 VH和VL的抗体，其中VH具有序列 DVQLVESGGGVVRPGESLTLSCTASGFTFTSSTMNWVRQAPGEGL DWVSSISTSGVITYYADSVKGRATISRDNSKNTLYLRLFSLRADDT AIYYCATDTFDHWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO:584)；以及VL独立选自下列序列：
Figure DEST_PATH_IMAGE152
Figure DEST_PATH_IMAGE153
218人抗体是非阻断剂，其描述于WO 2018/057669 A1的表P 中，其公开通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含重链可变(VH)结构域和/或轻链可变(VL)结构域，所述重链可变(VH)结构域包含含有选自SEQ ID NO：498-500的序列的HVR-H1、含有序列SEQ ID NO：501的HVR-H2、以及含有序列SEQ ID NO：502的HVR-H3；所述轻链可变(VL)结构域包含含有序列SEQ ID NO：503的 HVR-L1、含有序列SEQ ID NO：504的HVR-L2和含有序列SEQ ID NO：505的HVR-L3。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含重链可变(VH)结构域和/或轻链可变(VL)结构域，所述重链可变(VH) 结构域包含含有序列SEQ ID NO：498的HVR-H1、含有序列SEQ ID NO：501的HVR-H2和含有序列SEQ ID NO：502的HVR-H3；所述轻链可变(VL)结构域包含含有序列SEQ ID NO：503的HVR-L1、含有序列SEQ ID NO：504的HVR-L2和含有序列SEQ ID NO：505 的HVR-L3。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含重链可变(VH) 结构域和/或轻链可变(VL)结构域，所述重链可变(VH)结构域包含含有序列SEQ ID NO：499的HVR-H1、含有序列SEQ ID NO： 501的HVR-H2和含有序列SEQ ID NO：502的HVR-H3；所述轻链可变(VL)结构域包含含有序列SEQ ID NO：503的HVR-L1、含有序列SEQ ID NO：504的HVR-L2和含有序列SEQ ID NO：505的 HVR-L3。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含重链可变(VH)结构域和/或轻链可变(VL)结构域，所述重链可变(VH)结构域包含含有序列SEQ ID NO：500的HVR-H1、含有序列SEQ ID NO： 501的HVR-H2和含有序列SEQ ID NO：502的HVR-H3；所述轻链可变(VL)结构域包含含有序列SEQ ID NO：503的HVR-L1、含有序列SEQ ID NO：504的HVR-L2和含有序列SEQ ID NO：505的 HVR-L3。
在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含含有选自SEQ ID NO： 490-495的序列的VH结构域和/或含有SEQ ID NO：496或497的序列的VL结构域。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含含有SEQ ID NO：490的序列的VH结构域和/或含有SEQ ID NO：496的序列的 VL结构域。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含含有SEQ ID NO： 491的序列的VH结构域和/或含有SEQ ID NO：496的序列的VL结构域。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含含有SEQ IDNO：492 的序列的VH结构域和/或含有SEQ ID NO：496的序列的VL结构域。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含含有SEQ ID NO：493的序列的VH结构域和/或含有SEQ ID NO：496的序列的VL结构域。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含含有SEQ ID NO：494的序列的VH结构域和/或含有SEQ ID NO：496的序列的VL结构域。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含含有SEQ ID NO：495的序列的 VH结构域和/或含有SEQ ID NO：496的序列的VL结构域。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含含有SEQ ID NO：490的序列的VH 结构域和/或含有SEQ ID NO：497的序列的VL结构域。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含含有SEQ ID NO：491的序列的VH 结构域和/或含有SEQ ID NO：497的序列的VL结构域。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含含有SEQ ID NO：492的序列的VH 结构域和/或含有SEQ ID NO：497的序列的VL结构域。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含含有SEQ ID NO：493的序列的VH 结构域和/或含有SEQ ID NO：497的序列的VL结构域。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含包含SEQ ID NO：494的序列的VH 结构域和/或包含SEQ ID NO：497的序列的VL结构域。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含含有SEQ ID NO：495的序列的VH 结构域和/或含有SEQ ID NO：497的序列的VL结构域。
在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含重链可变(VH)结构域和/或轻链可变(VL)结构域，所述重链可变(VH)结构域包含含有选自SEQ ID NO：512-514的序列的HVR-H1、含有序列SEQ ID NO：515的HVR-H2、以及含有序列SEQ ID NO：516的HVR-H3；所述轻链可变(VL)结构域包含含有序列SEQ ID NO：517的 HVR-L1、含有序列SEQ ID NO：518的HVR-L2和含有序列SEQ ID NO：519的HVR-L3。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含重链可变(VH)结构域和/或轻链可变(VL)结构域，所述重链可变(VH) 结构域包含含有序列SEQ ID NO：512的HVR-H1、含有序列SEQ ID NO：515的HVR-H2和含有序列SEQ ID NO：516的HVR-H3；所述轻链可变(VL)结构域包含含有序列SEQ ID NO：517的HVR-L1、含有序列SEQ ID NO：518的HVR-L2和含有序列SEQ ID NO：519 的HVR-L3。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含重链可变(VH) 结构域和/或轻链可变(VL)结构域，所述重链可变(VH)结构域包含含有序列SEQ ID NO：513的HVR-H1、含有序列SEQ ID NO： 515的HVR-H2和含有序列SEQ ID NO：516的HVR-H3；所述轻链可变(VL)结构域包含含有序列SEQ ID NO：517的HVR-L1、含有序列SEQ ID NO：518的HVR-L2和含有序列SEQ ID NO：519的 HVR-L3。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含重链可变(VH)结构域和/或轻链可变(VL)结构域，所述重链可变(VH)结构域包含含有序列SEQ ID NO：514的HVR-H1、含有序列SEQ ID NO： 515的HVR-H2和含有序列SEQ ID NO：516的HVR-H3；所述轻链可变(VL)结构域包含含有序列SEQ ID NO：517的HVR-L1、含有序列SEQ ID NO：518的HVR-L2和含有序列SEQ ID NO：519的 HVR-L3。
在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含含有选自SEQ ID NO： 506-509的序列的VH结构域和/或含有SEQ ID NO：510或511的序列的VL结构域。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含含有SEQ ID NO：506的序列的VH结构域和/或含有SEQ ID NO：510的序列的 VL结构域。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含含有SEQ ID NO： 507的序列的VH结构域和/或含有SEQ ID NO：510的序列的VL结构域。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含含有SEQ IDNO：508 的序列的VH结构域和/或含有SEQ ID NO：510的序列的VL结构域。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含含有SEQ ID NO：509的序列的VH结构域和/或含有SEQ ID NO：510的序列的VL结构域。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含含有SEQ ID NO：506的序列的VH结构域和/或含有SEQ ID NO：511的序列的VL结构域。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含含有SEQ ID NO：507的序列的 VH结构域和/或含有SEQ ID NO：511的序列的VL结构域。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含含有SEQ ID NO：508的序列的VH 结构域和/或含有SEQ ID NO：511的序列的VL结构域。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含含有SEQ ID NO：509的序列的VH 结构域和/或含有SEQ ID NO：511的序列的VL结构域。
在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含重链可变(VH)结构域和/或轻链可变(VL)结构域，所述重链可变(VH)结构域包含含有选自SEQ ID NO：533-535的序列的HVR-H1、含有序列SEQ ID NO：536的HVR-H2、以及含有序列SEQ ID NO：537的HVR-H3；所述轻链可变(VL)结构域包含含有选自SEQ ID NO：538-542的序列的HVR-L1、含有序列SEQ ID NO：543的HVR-L2和含有选自 SEQ ID NO：544-546的序列的HVR-L3。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含重链可变(VH)结构域和/或轻链可变(VL)结构域，所述重链可变(VH)结构域包含含有序列SEQID NO：534的HVR-H1、含有序列SEQ ID NO：536的HVR-H2和含有序列SEQ ID NO：537 的HVR-H3；所述轻链可变(VL)结构域包含含有序列SEQ ID NO： 539的HVR-L1、含有序列SEQ IDNO：543的HVR-L2和含有序列 SEQ ID NO：545的HVR-L3。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含重链可变(VH)结构域和/或轻链可变(VL)结构域，所述重链可变(VH)结构域包含含有序列SEQ ID NO：533的HVR-H1、含有序列SEQ ID NO：536的HVR-H2和含有序列SEQ ID NO：537的HVR-H3；所述轻链可变(VL)结构域包含含有序列SEQ ID NO： 542的HVR-L1、含有序列SEQID NO：543的HVR-L2和含有序列 SEQ ID NO：546的HVR-L3。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含重链可变(VH)结构域和/或轻链可变(VL)结构域，所述重链可变(VH)结构域包含含有序列SEQ ID NO：498的HVR-H1、含有序列SEQ ID NO：501的HVR-H2和含有序列SEQ ID NO：502 的HVR-H3；所述轻链可变(VL)结构域包含含有序列SEQ ID NO： 503的HVR-L1、含有序列SEQ ID NO：504的HVR-L2和含有序列 SEQ ID NO：505的HVR-L。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含重链可变(VH)结构域和/或轻链可变(VL)结构域，所述重链可变(VH)结构域包含含有序列SEQ ID NO：554的HVR-H1、含有序列SEQ ID NO：557的HVR-H2和含有序列SEQID NO：558 的HVR-H3；所述轻链可变(VL)结构域包含含有序列SEQ ID NO： 559的HVR-L1、含有序列SEQ ID NO：560的HVR-L2和含有序列 SEQ ID NO：561的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含含有选自SEQ ID NO： 520-523的序列的VH结构域和/或含有选自SEQ ID NO：525-532的序列的VL结构域。
在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含重链可变(VH)结构域和/或轻链可变(VL)结构域，所述重链可变(VH)结构域包含含有选自SEQ ID NO：554-556的序列的HVR-H1、含有序列SEQ ID NO：557的HVR-H2、以及含有序列SEQ ID NO：558的HVR-H3；所述轻链可变(VL)结构域包含序列SEQ ID NO：559的HVR-L1、含有序列SEQ ID NO：560的HVR-L2和含有序列SEQID NO：561 的HVR-L3。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含重链可变(VH) 结构域和/或轻链可变(VL)结构域，所述重链可变(VH)结构域包含含有序列SEQ ID NO：554的HVR-H1、含有序列SEQ ID NO： 557的HVR-H2和含有序列SEQ ID NO：558的HVR-H3；所述轻链可变(VL)结构域包含含有序列SEQ ID NO：559的HVR-L1、含有序列SEQ ID NO：560的HVR-L2和含有序列SEQ ID NO：561的 HVR-L3。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含重链可变(VH) 结构域和/或轻链可变(VL)结构域，所述重链可变(VH)结构域包含含有序列SEQ ID NO：555的HVR-H1、含有序列SEQ ID NO： 557的HVR-H2和含有序列SEQ ID NO：558的HVR-H3；所述轻链可变(VL)结构域包含含有序列SEQ ID NO：559的HVR-L1、含有序列SEQ ID NO：560的HVR-L2和含有序列SEQ ID NO：561的 HVR-L3。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含重链可变(VH) 结构域和/或轻链可变(VL)结构域，所述重链可变(VH)结构域包含含有序列SEQ ID NO：556的HVR-H1、含有序列SEQ ID NO： 557的HVR-H2和含有序列SEQ ID NO：558的HVR-H3；所述轻链可变(VL)结构域包含含有序列SEQ ID NO：559的HVR-L1、含有序列SEQ ID NO：560的HVR-L2和含有序列SEQ ID NO：561的 HVR-L3。
在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含含有选自SEQ ID NO： 547-550的序列的VH结构域和/或含有选自SEQ ID NO：551-553的序列的VL结构域。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含含有SEQ ID NO：547的序列的VH结构域和/或含有SEQ ID NO：551的序列的VL结构域。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含含有SEQ ID NO：548的序列的VH结构域和/或含有SEQ ID NO：551的序列的 VL结构域。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含含有SEQ ID NO：549的序列的VH结构域和/或含有SEQ ID NO：551的序列的VL结构域。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含含有SEQ ID NO：550 的序列的VH结构域和/或含有SEQ ID NO：551的序列的VL结构域。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含含有SEQ ID NO：547的序列的VH结构域和/或含有SEQ ID NO：552的序列的VL结构域。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含含有SEQID NO：548的序列的VH结构域和/或含有SEQ ID NO：552的序列的VL结构域。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含含有SEQ ID NO：549的序列的 VH结构域和/或含有SEQ ID NO：552的序列的VL结构域。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含含有SEQ ID NO：550的序列的VH结构域和/或含有SEQ ID NO：552的序列的VL结构域。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含含有SEQ ID NO：547的序列的VH 结构域和/或含有SEQ ID NO：553的序列的VL结构域。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含含有SEQ ID NO：548的序列的VH 结构域和/或含有SEQ IDNO：553的序列的VL结构域。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含含有SEQ ID NO：549的序列的VH 结构域和/或含有SEQ ID NO：553的序列的VL结构域。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含含有SEQ ID NO：550的序列的VH 结构域和/或含有SEQ ID NO：553的序列的VL结构域。
在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含含有SEQ ID NO：584 的序列的VH结构域和/或含有选自SEQ ID NO：585、562和563的序列的VL结构域。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含含有SEQ ID NO：584的序列的VH结构域和/或含有SEQ ID NO：585的序列的VL结构域。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含含有SEQ ID NO：584的序列的VH结构域和/或含有SEQID NO：562的序列的 VL结构域。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含含有SEQ ID NO： 584的序列的VH结构域和/或含有SEQ ID NO：563的序列的VL结构域。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含含有SEQ ID NO：584 的序列的三个HVR的VH结构域和/或含有SEQ ID NO：585的序列的三个HVR的VL结构域。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含含有含SEQ ID NO：584的序列的三个HVR的VH结构域和/或含有 SEQ ID NO：562的序列的三个HVR的VL结构域。在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包含含有SEQ ID NO：584的序列的三个HVR 的VH结构域和/或含有SEQ ID NO：563的序列的三个HVR的VL 结构域。
其他抗SIRP抗体公开于US 2018/0037652 A1；WO 2016/205042 A1；WO 2017/178653 A2； WO2018/107058 A1和WO 2018/057669 A1；其每一个的公开通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含人Fc区，例如人IgG1、 IgG2或IgG4 Fc区。
在一些实施方案中，本文提供的抗体的Fc区包含一个或多个影响一种或多种抗体性质的突变，所述抗体性质例如稳定性、糖基化或其他修饰模式、效应细胞功能、药代动力学等。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有降低或最小化的糖基化。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有消除或降低的效应子功能。示例性的Fc突变包括但不限于(i)人IgG1 Fc区突变L234A、L235A、G237A和 N297A；(ii)人IgG2 Fc区突变A330S、P331S和N297A；(iii) 人IgG4 Fc区突变S228P、E233P、F234V、L235A、delG236和N297A (EU编号)。在一些实施方案中，人IgG2 Fc区包含A330S和P331S 突变。在一些实施方案中，人IgG4 Fc区包含S288P突变。在一些实施方案中，人IgG4 Fc区包含S288P和L235E突变。
在一些实施方案中，根据EU编号，本文提供的抗体包含含有 L234A、L235A和G237A突变的人IgG1Fc区。在一些实施方案中，根据EU编号，本文提供的抗体包含含有L234A、L235A、G237A和 N297A突变的人IgG1 Fc区。在一些实施方案中，根据EU编号，本文提供的抗体包含含有N297A突变的人IgG1 Fc区。在一些实施方案中，根据EU编号，本文提供的抗体包含含有D265A突变的人IgG1 Fc区。在一些实施方案中，根据EU编号，本文提供的抗体包含含有D265A和N297A突变的人IgG1 Fc区。在一些实施方案中，根据 EU编号，本文提供的抗体包含含有A330S和P331S突变的人IgG2 Fc 区。在一些实施方案中，根据EU编号，本文提供的抗体包含含有 A330S、P331S和N297A突变的人IgG2 Fc区。在一些实施方案中，根据EU编号，本文提供的抗体包含含有N297A突变的人IgG2 Fc 区。在一些实施方案中，根据EU编号，本文提供的抗体包含含有 S228P突变的人IgG4 Fc区。在一些实施方案中，根据EU编号，本文提供的抗体包含含有S228P和D265A突变的人IgG4 Fc区。在一些实施方案中，根据EU编号，本文提供的抗体包含含有S228P和 L235E突变的人IgG4 Fc区。在一些实施方案中，根据EU编号，本文提供的抗体包含含有S228P和N297A突变的人IgG4 Fc区。在一些实施方案中，根据EU编号，本文提供的抗体包含含有S228P、 E233P、F234V、L235A、delG236和N297A突变的人IgG4 Fc区。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含含有选自SEQ ID NO： 564-578的序列的Fc区。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含人κ轻链恒定结构域，例如包含SEQ IDNO：579的序列的Fc区。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含人λ轻链恒定结构域，例如IGLC1或IGLC2(如分别显示于SEQ ID No：580和581的示例性Fc区序列)。
靶向细胞表面抗原的抗体可触发与免疫细胞上的Fc受体(FcR) 结合相关的免疫刺激和效应子功能。存在许多对特定类别的抗体具有特异性的Fc受体，包括IgG(γ受体)、IgE(eta受体)、IgA(α受体)和IgM(mu受体)。Fc区与细胞表面Fc受体的结合可触发许多生物学反应，包括抗体包被颗粒的吞噬作用(抗体依赖性细胞介导的吞噬作用或ADCP)、免疫复合物的清除、抗体包被细胞被杀伤细胞裂解(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性或ADCC)以及炎症介质的释放、胎盘转移和免疫球蛋白产生的控制。另外，补体的 C1组分与抗体的结合可激活补体系统。补体的激活对于细胞病原体的裂解可能很重要。但是，补体的激活也可刺激炎症反应，也可参与自身免疫性超敏反应或其他免疫系统疾病。具有降低的或消融的结合某些Fc受体的能力的变体Fc区可用于开发治疗性抗体和Fc融合多肽构建体，其通过靶向、激活或中和配体功能而起作用，而不损害或破坏局部细胞或组织。
在一些实施方案中，Fc结构域单体是指包括第二和第三抗体恒定结构域(例如，CH2和CH3)的多肽链。在一些实施方案中，Fc 结构域单体还包括铰链结构域。在一些实施方案中，Fc结构域单体具有任何免疫球蛋白抗体同种型，包括IgG、IgE、IgM、IgA和IgD。另外，在一些实施方案中，Fc结构域单体具有任何IgG亚型(例如， IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3和IgG4)。在一些实施方案中，Fc结构域单体包括与野生型Fc结构域单体序列的多达十个变化(例如1-10、1-8、1-6、1-4个氨基酸取代、添加或插入、缺失、或其组合)，其改变Fc结构域与Fc受体之间的相互作用。
在一些实施方案中，免疫球蛋白的Fc结构域单体或Fc结构域单体的片段能够与另一Fc结构域单体形成Fc结构域。在一些实施方案中，免疫球蛋白的Fc结构域单体或Fc结构域单体的片段不能与另一Fc结构域单体形成Fc结构域。在一些实施方案中，将Fc结构域单体或Fc结构域的片段与本公开的多肽融合以增加多肽的血清半衰期。在一些实施方案中，与本公开的多肽融合的Fc结构域单体或Fc结构域单体的片段与第二Fc结构域单体二聚以形成结合Fc受体的Fc结构域，或者，Fc结构域单体结合Fc受体。在一些实施方案中，与多肽融合以增加多肽的血清半衰期的Fc结构域或Fc结构域的片段不诱导任何免疫系统相关的应答。Fc结构域包括两个通过 CH3抗体恒定结构域之间的相互作用而二聚的Fc结构域单体。
野生型Fc结构域形成结合Fc受体的最小结构(例如FcγRI、 FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIb和FcγRIV)。在一些实施方案中，本公开抗体中的Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代、添加或插入、缺失或其任何组合，其导致效应子功能降低，例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)降低、补体依赖性细胞溶解(CDC) 减少、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)减少或其任何组合。例如，本公开抗体可表现出与人Fc受体的结合减少(例如，最小结合或不存在结合)和与补体蛋白C1q的结合减少(例如，最小结合或不存在结合)；与人FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIB、FcγRIIIB 或其任何组合的结合降低(例如最小结合或不存在结合)；抗体依赖性效应子功能的改变或降低，例如ADCC、CDC、ADCP或其任何组合；等。示例性突变包括但不限于在E233、L234、L235、G236、 G237、D265、D270、N297、E318、K320、K322、A327、A330、P331 或P329处的一个或多个氨基酸取代(根据Kabat的EU索引编号 ((Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。
在一些实施方案中，本公开抗体与CD16a、CD32a、CD32b、CD32c 和CD64 Fcγ受体的结合降低或消除。在一些实施方案中，与包含野生型Fc区的抗体相比，具有本文所述的非天然Fc区的抗体的C1q 结合降低至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在一些实施方案中，与包含野生型Fc区的抗体相比，具有本文所述的非天然Fc区的抗体CDC降低至少5％、10％、 15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。
在一些实施方案中，相对于野生型序列，本文的Fc变体被最低程度地糖基化或具有降低的糖基化。在一些实施方案中，通过N297A 的突变或通过将N297突变为非N的任何氨基酸来完成去糖基化。
在一些实施方案中，抗体IgG恒定区的变体(例如，Fc变体) 具有降低的特异性结合Fcγ受体的能力或具有降低的诱导吞噬作用的能力。在一些实施方案中，抗体IgG恒定区的变体(例如，Fc变体)具有降低的特异性结合Fcγ受体的能力并且具有降低的诱导吞噬作用的能力。例如，在一些实施方案中，Fc结构域被突变为缺乏效应子功能，典型的“死的”Fc结构域。例如，在一些实施方案中， Fc结构域包括已知使Fc结构域和Fcγ受体之间的相互作用最小化的特定氨基酸取代。在一些实施方案中，Fc结构域单体来自IgG1抗体，并且包括氨基酸取代L234A、L235A、G237A和N297A的一个或多个(如根据Kabat等人，1991的EU编号系统指定)。在一些实施方案中，Fc结构域单体来自IgG1抗体，并且包括氨基酸取代L234A、L235A和G237A的一个或多个(如根据Kabat等人，1991的EU编号系统指定)。在一些实施方案中，Fc结构域单体来自IgG1抗体并且包括N297A(如根据Kabat等人，1991的EU编号系统指定)。在一些实施方案中，Fc结构域单体来自IgG1抗体并且包括D265A (如根据Kabat等人，1991的EU编号系统指定)。在一些实施方案中，Fc结构域单体来自IgG1抗体并且包含氨基酸取代D265A和 N297A的一个或多个(如根据Kabat等人，1991的EU编号系统指定)。在一些实施方案中，这种IgG1Fc变体包括一种或多种其他突变。人IgG1Fc变体的此类其他突变的非限制性实例包括E318A和 K322A。在一些情况下，与野生型人IgG1序列相比，人IgG1 Fc变体总共具有多达12、11、10、9、8、7、6、5或4个或更少的突变。在一些实施方案中，这种IgG1 Fc变体包括一个或多个其他缺失。例如，在一些实施方案中，当在细菌或哺乳动物细胞中产生多肽时， Fc IgG1重链恒定区的C-末端赖氨酸被缺失，例如以增加多肽的同质性。在一些情况下，与野生型人IgG1序列相比，人IgG1Fc变体总共具有多达12、11、10、9、8、7、6、5或4个或更少的缺失。
在一些实施方案中，Fc结构域单体来自IgG2抗体，并且包括氨基酸取代A330S、P331S或A330S和P331S两者。前述氨基酸位置根据Kabat等人(1991)定义。可以通过在抗体的序列的同源性区域与“标准”Kabat编号的序列进行比对来确定给定抗体的氨基酸残基的Kabat编号。在一些实施方案中，Fc变体包含含有A330S、P331S 和N297A氨基酸取代的一个或多个的人IgG2 Fc序列(如根据Kabat 等人(1991)的EU编号系统指定)。在一些实施方案中，Fc变体包含含有D265A和N297A氨基酸取代的一个或多个的人IgG2Fc序列(如根据Kabat等人(1991)的EU编号系统指定)。在一些实施方案中，Fc变体包含含有N297A氨基酸取代的人IgG2 Fc序列(如根据Kabat等人(1991)的EU编号系统指定)。在一些实施方案中，此类IgG2 Fc变体包括一个或多个其他突变。用于人IgG2 Fc变体的这种其他突变的非限制性实例包括V234A、G237A、P238S、V309L 和H268A(根据Kabat等人(1991)的EU编号系统指定)。在一些情况下，与野生型人IgG2序列相比，人IgG2 Fc变体总共具有多达10、9、8、7、6、5、4、3个或更少的突变。在一些实施方案中，这种IgG2 Fc变体中包括一个或多个其他缺失。
当Fc变体是IgG4 Fc变体时，在一些实施方案中，此类Fc变体包含S228P、E233P、F234V、L235A、L235E或delG236突变(如根据Kabat等人(1991)所指定)。在其他情况下，此类Fc变体包含S228P和L235E突变(如根据Kabat等人(1991)所指定)。在一些情况下，与野生型人IgG4序列相比，人IgG4 Fc变体总共具有多达12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个突变。
在一些实施方案中，与野生型人IgG Fc区相比，Fc变体表现出与受试者的Fc受体的减少的结合。在一些实施方案中，与野生型人 IgG Fc区相比，Fc变体表现出与受试者的Fc受体的消融的结合。在一些实施方案中，与野生型人IgG Fc区相比，Fc变体表现出吞噬作用的降低。在一些实施方案中，与野生型人IgG Fc区相比，Fc变体表现出消融的吞噬作用。
在本文中也称为ADCC的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性是指细胞毒性的一种形式，其中分泌的Ig与某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞和嗜中性粒细胞)上存在的Fc受体(FcR)结合，从而使这些细胞毒性效应细胞特异性结合携带抗原的靶细胞并随后杀死靶细胞。在本文中也称为ADCP的抗体依赖性细胞介导的吞噬作用是指细胞毒性的一种形式，其中分泌的Ig与某些吞噬细胞(例如巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)结合，从而使这些吞噬效应细胞特异性结合携带抗原的靶细胞并随后吞噬和消化靶细胞。针对靶细胞表面的配体特异性高亲和力IgG抗体可刺激细胞毒性或吞噬细胞，并可用于这种杀伤作用。在一些实施方案中，与包含野生型 Fc区的多肽构建体相比，包含本文所述的Fc变体的多肽构建体表现出降低的ADCC或ADCP。在一些实施方案中，与包含野生型Fc区的多肽构建体相比，包含如本文所述的Fc变体的多肽构建体的 ADCC或ADCP降低至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、 60％、70％、80％、90％或更大。在一些实施方案中，与包含野生型Fc区的多肽构建体相比，包含本文所述的Fc变体的抗体表现出消融的ADCC或ADCP。
在本文中也称为CDC的补体定向的细胞毒性是指其中补体级联被结合抗体Fc的补体组分C1q激活的一种细胞毒性形式。在一些实施方案中，与包含野生型Fc区的多肽构建体相比，包含本文所述的 Fc变体的多肽构建体的C1q结合降低至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。在一些情况下，与包含野生型Fc区的多肽构建体相比，包含本文所述的Fc变体的多肽构建体表现出降低的CDC。在一些实施方案中，与包含野生型 Fc区的多肽构建体相比，包含如本文所述的Fc变体的多肽构建体的 CDC降低至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、 80％、90％或更大。在一些情况下，与包含野生型Fc区的多肽构建体相比，包含本文所述的Fc变体的抗体表现出可忽略的CDC。
本文的Fc变体包括与野生型人IgGFc区相比显示出与Fcγ受体的结合减少的那些。例如，在一些实施方案中，Fc变体与Fcγ受体的结合小于野生型人IgGFc区与Fcγ受体的结合。在某些情况下， Fc变体与Fcγ受体的结合降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(完全消融效应子功能)。在一些实施方案中，减少的结合是针对任何一种或多种Fcγ受体，例如CD16a、CD32a、CD32b、CD32c或CD64。
在一些情况下，与其野生型人IgG Fc区相比，本文公开的Fc 变体表现出吞噬作用的降低。与野生型人IgG Fc区相比，此类Fc 变体表现出吞噬作用的降低，其中吞噬作用活性的减少为例如10％、 20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些情况下，与其野生型人IgG Fc区相比， Fc变体表现出消融的吞噬作用。
在一些实施方案中，本文公开的Fc变体与一种或多种融合伴侣偶联。在某些情况下，融合伴侣是治疗部分，例如本发明的细胞毒性剂。在某些情况下，选择融合伴侣以启动表达蛋白质的靶向、纯化、筛选、展示等。在一些实施方案中，融合伴侣还影响与Fc受体的结合程度或吞噬作用降低的程度。
在某些实施方案中，靶向部分是双特异性抗体。在某些实施方案中，双特异性抗体包含结合人CD56多肽的胞外结构域的第一抗原结合结构域和结合癌细胞表达的抗原的第二抗原结合结构域。在某些实施方案中，双特异性抗体包含结合人SIRP-α多肽的胞外结构域的第一抗原结合结构域和结合癌细胞表达的抗原的第二抗原结合结构域。在某些实施方案中，癌细胞表达的抗原选自下组：CD19、 CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD52、CD56、CD70、CD74、 CD79b、CD123、CD138、CS1/SLAMF7、Trop-2、5T4、EphA4、BCMA、粘液素1、粘液素16、PD-L1、PTK7、STEAP1、内皮素B受体、间皮素、EGFRvIII、ENPP3、SLC44A4、GNMB、连接素4、NaPi2b、LIV-1A、鸟苷酸环化酶C、DLL3、EGFR、HER2、VEGF、VEGFR、整合素αVβ3、整合素α5β1、MET、IGF1R、TRAILR1、TRAILR2、 RANKL、FAP、肌腱蛋白、Ley、EpCAM、CEA、gpA33、PSMA、 TAG72、粘蛋白、CAIX、EPHA3、叶酸受体α、GD2、GD3和包含来自NY-ESO-1/LAGE的MHC/肽复合物、SSX-2、MAGE家族蛋白、 MAGE-A3、gp100/pmel17、Melan-A/MART-1、gp75/TRP1、酪氨酸酶、TRP2、CEA、PSA、TAG-72、未成熟层粘连蛋白受体、 MOK/RAGE-1、WT-1、SAP-1、BING-4、EpCAM、MUC1、PRAME、生存素、BRCA1、BRCA2、CDK4、CML66、MART-2、p53、Ras、β-连环蛋白、TGF-βRII、HPV E6或HPV E7。在某些实施方案中，抗体包含结合人CD56多肽的胞外结构域的第一抗原结合结构域和结合免疫细胞表达的抗原的第二抗原结合结构域。在某些实施方案中，抗体包含结合人SIRP-α多肽的胞外结构域的第一抗原结合结构域和结合免疫细胞表达的抗原的第二抗原结合结构域。在一些实施方案中，免疫细胞表达的抗原选自下组：BDCA2、BDCA4、ILT7、LILRB1、LILRB2、LILRB3、LILRB4、CSF-1R、CD40、CD40L、 CD163、CD206、DEC205、CD47、CD123、IDO、TDO、41BB、CTLA4、PD1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、BTLA、VISTA、LAG-3、CD28、OX40、 GITR、CD137、CD27、HVEM、CCR4、CD25、CD103、KIrg1、Nrp1、 CD278、Gpr83、TIGIT、CD154、CD160、PVRIG、DNAM和ICOS。
在某些实施方案中，抗体包含选自下表的恒定区序列。
Figure DEST_PATH_IMAGE154
Figure DEST_PATH_IMAGE155
Figure DEST_PATH_IMAGE156
在某些实施方案中，靶向部分是多肽。在某些实施方案中，靶向部分是RGD肽、狂犬病毒糖蛋白(RVG)或DC3肽。在某些实施方案中，靶向部分是适配子。在某些实施方案中，靶向部分包含小分子。在某些实施方案中，靶向部分包含叶酸、甘露糖或PSMA 配体。
缀合物
在一个实施方案中，本文提供的缀合物包含靶向部分和一个或多个免疫调节性多核苷酸，在某些实施方案中，为约1-约6或约1- 约4、约1或约2个免疫调节性多核苷酸。在某些实施方案中，缀合物包含将靶向部分与免疫调节性多核苷酸共价连接的接头。在某些实施方案中，接头与免疫调节性多核苷酸中的核碱基、无碱基间隔基、磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键合。
在一个实施方案中，本文提供式(C)的缀合物：
Figure DEST_PATH_IMAGE157
或其立体异构体、两种或更多种非对映异构体的混合物、互变异构体、或两种或更多种互变异构体的混合物；或其药学可接受的盐、溶剂化物或水合物；其中Ab是靶向部分；f是1、2、3或4的整数；并且LN、Q和e各自如本文所定义。
在某些实施方案中，在式(C)中，Ab是抗体。在某些实施方案中，在式(C)中，Ab是单克隆抗体。
在某些实施方案中，在式(C)中，f是1或2的整数。在某些实施方式中，在式(C)中，f是1的整数。
在某些实施方案中，在式(C)中，e和f均各自为1的整数。
在一个实施方案中，CpG抗体缀合物的DAR为约1-约20、约 1-约10、约1-约8、约1-约4或约1-约2。在另一个实施方案中， CpG抗体缀合物的DAR为约1、约2、约3、约4、约5、约6、约 7或约8。
制备缀合物
缀合
用于将靶向部分缀合至免疫调节性多核苷酸的反应是本领域已知的，包括但不限于叠氮基与基于炔烃的缀合基团(例如，含有环碳-碳三键的任选取代的C6-16杂亚环基或任选取代的C8-16环炔基) 之间的Hüisgen环加成反应(金属催化或无金属)以形成三唑部分；亲二烯体与二烯/杂二烯之间的Diels-Alder反应；通过周环反应如烯烃反应形成键；酰胺或硫代酰胺键的形成；磺酰胺键的形成(例如与叠氮基化合物)；醇或酚烷基化(例如Williamson烷基化)、缩合反应以形成肟、腙或氨基脲基；通过亲核试剂(例如胺和硫醇) 的共轭加成反应；二硫键的形成；和在羰基(例如在活化的羧酸酯，如五氟苯基(PFP)酯或四氟苯基(TFP)酯)或在亲电芳烃(例如，在低氟化芳烃、氟苄腈基或氟硝基苯基上的SNAr)处的亲核取代(例如，被胺、硫醇或羟基亲核试剂取代)。
在某些实施方案中，所述缀合反应是偶极环加成，并且所述缀合部分包括叠氮基、含有内环碳-碳三键的任选取代的C6-16杂亚环基或任选取代的C8-16环炔基。针对其相互互补性选择互补的反应性基团和缀合基团。例如，在共轭基团和互补反应性基团的一个中使用叠氮化物，而在共轭基团和互补反应性基团的另一个中使用炔烃。
制备免疫调节性多核苷酸
本文提供的免疫调节性多核苷酸可以根据多核苷酸的化学合成领域中已知的方法来制备，例如，从核苷亚磷酰胺制备。亚磷酰胺可包括与亚磷酰胺的磷原子共价连接的缀合基团。
制备靶向部分
可以通过在免疫调节性多核苷酸中的缀合基团和与靶向部分键合的互补反应性基团之间形成键而使靶向部分与免疫调节性多核苷酸缀合。在某些实施方案中，靶向部分固有地具有互补反应性基团 (例如，Q标签(例如，QQ标签(例如，抗体或抗原结合片段或抗原结合片段或其工程化衍生物中的LLQGG(SEQ ID NO:582)或 GGGLLQGG(SEQ ID NO:583))。在某些实施方案中，将靶向部分修饰为包括互补反应性基团(例如，通过将互补反应性基团连接至Q 标签)。将此类互补反应性基团引入靶向部分的方法是本领域已知的。
在某些实施方案中，互补反应性基团是任选取代的C2-12炔基、任选取代的N-保护的氨基、叠氮基、N-马来酰亚胺基、S-保护的硫醇、
Figure DEST_PATH_IMAGE158
或其N-保护的形式、
Figure DEST_PATH_IMAGE159
包含内环碳- 碳三键任选取代的C6-16杂环基(例如
Figure DEST_PATH_IMAGE160
)、1,2,4,5-四嗪基团 (例如
Figure DEST_PATH_IMAGE161
)或任选取代的C8-16环炔基(例如
Figure DEST_PATH_IMAGE162
)、-NHRN1、任选取代的C4-8应变环烯基(例如，反式环辛烯基或降冰片烯基)或任选取代的含–COOR12或-CHO 的C1-16烷基；
其中：
RN1是H、N-保护基或任选取代的C1-6烷基；
每个R12独立地是H、任选取代的C1-6烷基、O-保护基(例如羧基保护基)；和
R13是卤素(例如F)。
在某些实施方案中，保护互补反应性基团直到缀合反应。例如，被保护的互补反应基团可包括-COORPGO或-NHRPGN，其中RPGO是O-保护基(例如，羧基保护基)，且RPGN是N-保护基。
在某些实施方案中，互补反应性基团是-Z3-QA3，
其中：
Z3是二价，三价，四价或五价基团，其中一个化合价被QA3取代，一个化合价是开放的，并且每个剩余的化合价(如果存在)独立地被辅助部分取代；
QA3是任选取代的C2-12炔基、任选取代的N-保护的氨基、叠氮基、N-马来酰亚胺基、S-保护的硫醇、
Figure DEST_PATH_IMAGE163
Figure DEST_PATH_IMAGE164
或其N-保护的形式、
Figure DEST_PATH_IMAGE165
Figure DEST_PATH_IMAGE166
包含内环碳-碳三键任选取代的C6-16杂环基(例如
Figure DEST_PATH_IMAGE167
)、1,2,4,5-四嗪基团(例如
Figure DEST_PATH_IMAGE168
Figure DEST_PATH_IMAGE169
)或任选取代的C8-16环炔基(例如
Figure DEST_PATH_IMAGE170
)、–NHRN1、任选取代的C4-8应变环烯基(例如，反式环辛烯基或降冰片烯基)或任选取代的含-COOR12或-CHO的C1-16烷基；
其中：
RN1是H、N-保护基或任选取代的C1-6烷基；
每个R12独立地是H、任选取代的C1-6烷基、O-保护基或羧基保护基；和
R13是卤素或F。
在某些实施方案中，Z3包含支链基团和两个二价链段，其中支链基团键合至两个二价链段的每一个，其中二价链段之一具有开放化合价，且其余的二价链段键合至QA3；并且所述支链基团包含一个或两个独立选自以下的基团：任选取代的C1-12烷烃三基、任选取代的C1-12烷烃四基、任选取代的C2-12杂烷烃三基或任选取代的C2-12杂烷烃四基，其中支链基团的两个化合价键合到两个二价链段上，并且每个剩余的化合价独立地被辅助部分取代。
在某些实施方案中，Z3中的二价链段是-(-QB-QC-QD-)s1-，
其中：
s1是约1-约50或约1-约30的整数；
每个QB和QD独立地不存在、是–CO-、–NH–、–O–、–S–、–SO2–、–OC(O)–、–COO–、–NHC(O)–、–C(O)NH–、–CH2–、–CH2NH–、–NHCH2–、–CH2O–或–OCH2–；和
每个QC独立地不存在、是任选取代的C1-12亚烷基、任选取代的 C2-12亚烯基、任选取代的C2-12亚炔基、任选取代的C2-12杂亚烷基、任选取代的C1-9杂亚环基。
在某些实施方案中，QB和QD的至少一个存在于Z3的每个单体单元中。
在某些实施方案中，–Z3–QA3是
–(–QB–QC–QD–)s1–QE–(–QB–QC–QD–)s1–QA3,
(Vb)
其中：
每个s1独立地是约1-约50或约1-约30的整数；
QA3如本文所述；
每个QB和QD独立地不存在、是–CO–、–NH–、–O–、–S–、–SO2–、–OC(O)–、–COO–、–NHC(O)–、–C(O)NH–、–CH2–、–CH2NH–、–NHCH2–、–CH2O–或–OCH2–；和
每个QC独立地不存在、是任选取代的C1-12亚烷基、任选取代的 C2-12亚烯基、任选取代的C2-12亚炔基、任选取代的C2-12杂亚烷基、任选取代的C1-9杂亚环基，和
QE不存在或是如本文所述的式(IV)的支链基团。
在某些实施方案中，–(–QB–QC–QD–)s1–是基团：
–QB–(CH2)g1–(CH2OCH2)g2–(CH2)g3–QD–，
其中：
(i)g2是约1-约50、约1-约40或约1-约30的整数；
(ii)g1是1，并且QB是–NHCO–、–CONH–或–O–；或g1是0，且QD是–NHCO–；和
(iii)g3是1，并且QB是–NHCO–、–CONH–或–O–；或g3是0，且QD是–CONH–。
在某些实施方案中，互补反应性基团是：
Figure DEST_PATH_IMAGE171
其中：
QA2不存在、是任选取代的C2-12杂亚烷基(例如包含–C(O)–N(H)–、–N(H)–C(O)–、–S(O)2–N(H)–或–N(H)–S(O)2–的杂亚烷基)、任选取代的C1-12硫杂亚环基(例如
Figure DEST_PATH_IMAGE172
Figure DEST_PATH_IMAGE173
)、任选取代的 C1-12杂亚环基(例如1，2,3-三唑-1，4-二基或
Figure DEST_PATH_IMAGE174
)、环丁-3-烯-1，2-二酮-3，4-二基、吡啶-2-基腙、任选取代的C6-16三唑杂亚环基(例如
Figure DEST_PATH_IMAGE175
)、任选取代的C8-16三唑亚环烯基(例如
Figure DEST_PATH_IMAGE176
)或二氢哒嗪基团(例如反式-
Figure DEST_PATH_IMAGE177
反式-
Figure DEST_PATH_IMAGE178
)；
每个QA3独立地是任选取代的C2-12炔基、任选取代的N-保护的氨基、叠氮基、N-马来酰亚胺基、S-保护的硫醇，
Figure DEST_PATH_IMAGE179
Figure DEST_PATH_IMAGE180
或其N-保护的形式、
Figure DEST_PATH_IMAGE181
Figure DEST_PATH_IMAGE182
包含内环碳-碳三键任选取代的C6-16杂环基(例如
Figure DEST_PATH_IMAGE183
)、1，2，4，5-四嗪基团(例如
Figure DEST_PATH_IMAGE184
Figure DEST_PATH_IMAGE185
)或任选取代的C8-16环炔基(例如
Figure DEST_PATH_IMAGE186
)、–NHRN1、任选取代的C4-8应变环烯基(例如，反式环辛烯基或降冰片烯基)或任选取代的含–COOR12或–CHO的C1-16烷基；
RN1是H、N-保护基或任选取代的C1-6烷基；
每个R12独立地是H或任选取代的C1-6烷基；
R13是卤素或F；
每个RT独立地是与靶向部分连接的键；
每个QT独立地是–CO–、–CO–CH2–、–NH–或–NH–CH2–；
每个X1、X3和X5独立地不存在、是–O–、–NH–、–CH2–NH–、–C(O)–、–C(O)–NH–、–NH–C(O)–、–NH–C(O)–NH–、–O–C(O)–NH–、–NH–C(O)–O–、–CH2–NH–C(O)–NH–、–CH2–O–C(O)–NH–或–CH2–NH–C(O)–O–；
每个X2和X4独立地不存在、是–O–、–NH–、–C(O)–、–C(O)–NH–、–NH–C(O)–、–NH–C(O)–NH–、–O–C(O)–NH–或–NH–C(O)–O–；
每个x2独立地是约0-约50、约1-约40或约1-约30的整数；
每个x3独立地是约1-约11的整数；
每个x5独立地是约0或约1的整数；
每个x6独立地为约0-约10或约1-约6的整数，条件是两个x6 之和为约12或更小。
在某些实施方案中，互补反应性基团是：
Figure DEST_PATH_IMAGE187
Figure DEST_PATH_IMAGE188
其中：
每个QA3独立地是任选取代的C2-12炔基、任选取代的N-保护的氨基、叠氮基、N-马来酰亚胺基、S-保护的硫醇，
Figure DEST_PATH_IMAGE189
Figure DEST_PATH_IMAGE190
或其N-保护的形式、
Figure DEST_PATH_IMAGE191
Figure DEST_PATH_IMAGE192
包含内环碳-碳三键任选取代的C6-16杂环基(例如
Figure DEST_PATH_IMAGE193
)、1，2，4，5-四嗪基团(例如
Figure DEST_PATH_IMAGE194
Figure DEST_PATH_IMAGE195
)或任选取代的C8-16环炔基(例如
Figure DEST_PATH_IMAGE196
)、–NHRN1、任选取代的C4-8应变环烯基(例如，反式环辛烯基或降冰片烯基)或任选取代的含–COOR12或–CHO的C1-16烷基；
每个RM1独立地为H或辅助部分；
每个RN1独立地是H、N-保护基或任选取代的C1-6烷基；
每个R12独立地是H或任选取代的C1-6烷基；
每个R13独立地是卤素或F；
每个QT独立地是–CO–、–NH–、–NH–CH2–或–CO–CH2–；
每个RT独立地是与靶向部分连接的键；
每个q5和q6独立地是约1-约10或约1-约6的整数
每个q7独立地是约0或约1的整数；
每个q8独立地是约0-约50、约1-约40或约1-约30的整数；和
每个q9独立地是约1-约10的整数。
在某些实施方案中，互补反应性基团是：
Figure DEST_PATH_IMAGE197
Figure DEST_PATH_IMAGE198
其中：
每个RM1独立地为H或辅助部分；
每个QT独立地是–CO–、–NH–、–NH–CH2–或–CO–CH2–；
每个RT独立地是与靶向部分连接的键；
每个q5和q6独立地是约1-约10或约1-约6的整数
每个q7独立地是约0或约1的整数；
每个q8独立地是约0-约50、约1-约40或约1-约30的整数；和
每个q9独立地是约1-约10的整数。
药物组合物
本文提供的缀合物的递送可以通过使用本领域技术人员已知的多种方法使细胞与缀合物接触来实现。在某些实施方案中，将本文提供的缀合物配制为包含药学可接受的赋形剂的药物组合物。在某些实施方案中，药物组合物是液体或固体(例如冻干的)。
本文提供的缀合物可以单独施用或与根据预期施用途径和标准药学实践选择的药学可接受的赋形剂混合施用。因此，可以使用一种或多种生理上可接受的载体、赋形剂和助剂以常规方式配制所使用的药物组合物，所述载体、赋形剂和助剂有助于将缀合物加工成可药用的制剂。
常用的载体或赋形剂包括糖(例如乳糖、甘露醇)、牛奶蛋白、明胶、淀粉、维生素、纤维素及其衍生物、聚乙二醇和溶剂，例如无菌水、乙醇、甘油和多元醇。静脉内媒介物可以包括液体和营养补充剂。其他药学可接受的载体包括水溶液、无毒的赋形剂，包括盐、防腐剂、缓冲剂等，例如在Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版,Gennaro,Ed.,Lippencott Williams&Wilkins (2005),和The United StatesPharmacopeia:The National Formulary (USP 36 NF31),published in 2013所述。可以根据本领域的常规实践来调节药物组合物的各种组分的pH和确切浓度。参见Goodman和Gilman′s,the Pharmacological Basis for Therapeutics。
在制备药物组合物中，通常将活性成分与赋形剂混合(例如，在冻干制剂中)或用赋形剂稀释。当赋形剂用作稀释剂时，它可以是固体、半固体或液体材料(例如磷酸盐缓冲盐水)，其充当活性成分的媒介物、载体或介质。因此，组合物可以是片剂、粉末、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液和糖浆的形式。如本领域中已知的，稀释剂的类型可以根据预期的施用途径而变化。所得组合物可包含其他试剂，例如防腐剂。所述制剂可以另外包括：润滑剂，例如滑石、硬脂酸镁和矿物油；润湿剂；乳化剂和助悬剂；防腐剂，例如，苯甲酸甲酯和羟基苯甲酸丙酯；甜味剂；和调味剂。其他示例性的赋形剂描述于Handbook of PharmaceuticalExcipients,第6版,Rowe等人,Eds.,Pharmaceutical Press(2009)。防腐剂可以包括抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体。
这些药物组合物可以以常规方式制备，例如通过常规混合、溶解、制粒、制糖衣丸、浸提、乳化、包封、包埋或冻干方法。本领域众所周知的制备制剂的方法例如可见于Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版,Gennaro,Ed.,LippencottWilliams &Wilkins(2005),和Encyclopedia of Pharmaceutical Technology,eds.J.Swarbrick and J.C.Boylan,1988-1999,Marcel Dekker,New York。正确的制剂取决于所选的施用途径。这种组合物的制剂和制备是药物制剂领域技术人员众所周知的。在制备制剂时，可以在与其他成分结合之前将缀合物研磨以提供合适的粒度。
施用途径
药物组合物可以局部或全身给药。治疗有效量将根据多种因素而变化，例如受试者的疾病进展程度、个体的年龄、性别和体重。可以调整剂量方案以提供最佳的治疗反应。例如，如治疗情况的紧急状态所指示，可以每天施用数个分开的剂量或可以成比例减少剂量。
如本领域技术人员将理解的，取决于所选择的施用途径，药物组合物可以多种形式向患者施用。本文所述方法中使用的缀合物可以例如通过肠胃外施用来施用。肠胃外施用包括肌内、静脉内、动脉内、颅内、皮下、眶内、心室内、脊柱内、鞘内、腹膜内、直肠和局部施用途径。局部施用途径包括透皮、皮内、经颊和舌下施用途径。根据选择的施用途径配制药物组合物。肠胃外施用可以通过在选定的时间段内连续输注来进行。
用于肠胃外施用的制剂
本文提供的缀合物可以本文所述的药学可接受的肠胃外(例如、静脉内、肌内或皮下)制剂的形式向有需要的患者施用。药物制剂还可以以包含常规无毒的药学可接受的载体和佐剂的剂型或制剂经肠胃外(例如静脉内、肌内或皮下)施用。特别地，适合于肠胃外施用的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，其可以包含使得制剂与患者的血液等渗的抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质；和可包括悬浮剂和增稠剂的水性和非水性无菌悬浮液。例如，为了制备这样的组合物，可以将本文提供的缀合物溶解或悬浮于肠胃外可接受的液体媒介物中。可以使用的可接受的媒介物和溶剂是水、通过添加适量的盐酸、氢氧化钠或适当的缓冲液(例如，磷酸盐缓冲盐水) 调节至适当的pH值的水、1,3-丁二醇、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。水性制剂还可以包含一种或多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸甲酯、乙酯或正丙酯。关于肠胃外制剂的其他信息可以在例如United States Pharmacopeia-NationalFormulary(USP-NF)中找到，其通过引用并入本文。
本文提供的缀合物的肠胃外制剂可以是通过USP-NF鉴定为适于肠胃外施用的制剂中的四种一般类型的任一种：
(1)“注射用药物”：作为干(例如冻干)固体的药物物质(例如，本文提供的缀合物)，其将与用于肠胃外施用如药物注射的适当的无菌媒介物结合；
(2)“药物注射乳剂”：将药物物质(例如，本文提供的缀合物)溶解或分散于合适的乳剂介质中的液体制剂；
(3)“药物可注射悬浮液”：药物物质(例如，本文提供的缀合物)悬浮于合适的液体介质的液体制剂；和
(4)“用于可注射悬浮液的药物”：作为干固体的药物物质(例如，本文所提供的缀合物)，其将与用于肠胃外施用如药物注射悬浮液的适当的无菌媒介物结合。
用于肠胃外施用的示例性制剂包括适当地与表面活性剂例如羟丙基纤维素混合的在水中制备的本文提供的缀合物的溶液。分散体也可以在有或没有乙醇的情况下在甘油、液体聚(乙二醇)、DMSO 及其混合物中以及在油中制备。在正常的储存和使用条件下，这些制剂可包含防腐剂以防止微生物的生长。用于选择和制备合适制剂的常规程序和成分例如描述于Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Ed.,Gennaro,Ed.,Lippencott Williams&Wilkins(2005) 和2013年出版的美国药典：The NationalFormulary(USP 36 NF31)。
生物相容性、可生物降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可用于控制本文提供的缀合物的释放。本文提供的用于缀合物的其他潜在有用的肠胃外递送系统包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵或可植入的输注系统。可以将肠胃外制剂配制成用于多核苷酸和/或缀合物的快速释放或持续/延长释放。本文提供的用于肠胃外释放缀合物的示例性制剂包括：水溶液、用于重构的粉末、助溶剂溶液、油/水乳液、悬浮液、微球和聚合物凝胶。
使用方法
在一个实施方案中，本文提供了一种用于治疗、预防或缓解受试者的增生性疾病的一种或多种症状的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本文公开的缀合物。
在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在某些实施方案中，受试者是人。在某些实施方案中，所述受试者是除人以外的灵长类动物，动物诸如牛、运动动物或宠物诸如马、狗或猫。
在某些实施方案中，增生性疾病是肿瘤。在某些实施方案中，增生性疾病是液体或血液肿瘤。在某些实施方案中，增生性疾病是实体瘤。在某些实施方案中，增生性疾病是肿瘤性疾病。
在某些实施方案中，增生性疾病是癌症。在某些实施方案中，所述癌症是复发性癌症。在某些实施方案中，癌症是耐药性癌症。在某些实施方案中，癌症是复发的耐药性癌症。在某些实施方案中，所述癌症是多药耐药性癌症。在某些实施方案中，癌症是复发的多药耐药性癌症。
在某些实施方案中，可以用本文提供的缀合物治疗的癌症包括但不限于(1)白血病，包括但不限于急性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病如成幼粒细胞性、早幼粒细胞性、单核细胞性、单核细胞性、红血球性白血病和骨髓增生异常综合症或其症状(例如贫血、血小板减少症、中性粒细胞减少症、双核细胞减少症或全血细胞减少症)、难治性贫血(RA)、RA伴环状铁粒幼细胞(RARS)、RA伴过量原始细胞(RAEB)、转化中的RAEB(RAEB-T)、白血病前期和慢性粒细胞单核细胞白血病(CMML)， (2)慢性白血病，包括但不限于慢性粒细胞性(粒细胞性)白血病、慢性淋巴细胞性白血病和毛细胞白血病；(3)真性红细胞增多症； (4)淋巴瘤，包括但不限于霍奇金氏病和非霍奇金氏病；(5)多发性骨髓瘤，包括但不限于阴燃多发性骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤、硬化性骨髓瘤、浆细胞白血病、孤立性浆细胞瘤和骨髓浆细胞瘤； (6)沃尔登斯特伦巨球蛋白血症；(7)意义不明的单克隆丙种球蛋白病；(8)良性单克隆丙种球蛋白病；(9)重链疾病；(10) 骨和结缔组织肉瘤，包括但不限于骨肉瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、尤因氏肉瘤、恶性巨细胞瘤、骨纤维肉瘤、脊索瘤、骨膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤(血管内皮瘤)、纤维肉瘤、卡波济肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、转移性癌、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤和滑膜肉瘤；(11)脑肿瘤，包括但不限于神经胶质瘤、星形细胞瘤、脑干神经胶质瘤、室间隔膜瘤、少突胶质细胞瘤、非神经胶质瘤、听神经瘤、颅咽管瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、皮细胞瘤、皮母细胞瘤和原发性脑淋巴瘤；(12)乳腺癌，包括但不限于腺癌、小叶(小细胞)癌、导管内癌、髓乳腺癌、粘液性乳腺癌、管式乳腺癌、乳头状乳腺癌、原发癌、Paget病和炎症性乳腺癌癌症；(13) 肾上腺癌，包括但不限于嗜铬细胞瘤和肾上腺皮质癌；(14)甲状腺癌，包括但不限于乳头状或滤泡性甲状腺癌、甲状腺髓样癌和甲状腺未分化癌；(15)胰腺癌，包括但不限于胰岛素瘤、胃泌素瘤、胰高血糖素瘤、葡萄膜瘤、分泌生长抑素的肿瘤以及类癌或胰岛细胞瘤；(16)垂体癌，包括但不限于Cushing病、分泌催乳素的肿瘤、肢端肥大症和尿崩症；(17)眼癌，包括但不限于眼部黑素瘤，例如虹膜黑素瘤、脉络膜黑素瘤、睫状体黑素瘤和成视网膜细胞瘤； (18)阴道癌，包括但不限于鳞状细胞癌、腺癌和黑色素瘤；(19) 外阴癌，包括但不限于鳞状细胞癌、黑色素瘤、腺癌、基底细胞癌、肉瘤和Paget病；(20)子宫颈癌，包括但不限于鳞状细胞癌和腺癌； (21)子宫癌，包括但不限于子宫内膜癌和子宫肉瘤；(22)卵巢癌，包括但不限于卵巢上皮癌、交界性肿瘤、生殖细胞瘤和间质瘤； (23)食道癌，包括但不限于鳞状癌、腺癌、腺样囊性癌、粘液表皮样癌、腺鳞癌、肉瘤、黑素瘤、浆细胞瘤、疣状癌和燕麦细胞(小细胞)癌；(24)胃癌，包括但不限于腺癌、真菌性(息肉状)、溃疡性、浅表性扩散、弥散性扩散、恶性淋巴瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和癌肉瘤；(25)结肠癌；(26)直肠癌；(27)肝癌，包括但不限于肝细胞癌和肝母细胞瘤；(28)胆囊癌，包括但不限于腺癌；(29)胆管癌，包括但不限于乳头状、结节状和弥漫性；(30) 肺癌，包括但不限于非小细胞肺癌、鳞状细胞癌(表皮样癌)、腺癌、大细胞癌和小细胞肺癌；(31)睾丸癌，包括但不限于生发肿瘤、精原细胞瘤，间变性经典(典型)性精母细胞性非精原细胞瘤、胚胎癌、畸胎瘤和绒毛膜癌(卵黄囊癌)；(32)前列腺癌，包括但不限于腺癌、平滑肌肉瘤和横纹肌肉瘤；(33)刑事癌症；(34) 口腔癌，包括但不限于鳞状细胞癌；(35)基底癌；(36)唾液腺癌，包括但不限于腺癌、粘液表皮样癌和腺样囊性癌；(37)咽癌，包括但不限于鳞状细胞癌和疣状癌；(38)皮肤癌，包括但不限于基底细胞癌、鳞状细胞癌和黑色素瘤、浅表扩散性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、扁桃体恶性黑色素瘤和手足性慢性黑色素瘤；(39) 肾癌，包括但不限于肾细胞癌、腺癌、肾上腺样瘤、纤维肉瘤和移行细胞癌(肾盂和/或子宫)；(40)Wilms瘤；(41)膀胱癌，包括但不限于移行细胞癌、鳞状细胞癌、腺癌和癌肉瘤；和其他癌症，包括但不限于粘肉瘤、成骨肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管内皮细胞肉瘤、间皮瘤、滑膜瘤、成血管细胞瘤、上皮癌、囊腺癌、支气管癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌和乳头状腺癌(参见Fishman等人,1985, Medicine,第2版,J.B.Lippincott Co.,Philadelphia和Murphy等人,1997,Informed Decisions:The Complete Book of Cancer Diagnosis, Treatment,andRecovery,Viking Penguin,PenguinBooksU.S.A.,Inc., United States of America)。
在某些实施方案中，可以用本文提供的缀合物治疗的癌症包括但不限于B细胞癌如多发性骨髓瘤、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链疾病如α链疾病、γ链疾病和mu链疾病、良性单克隆丙种球蛋白病和免疫细胞淀粉样变性病、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、支气管癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、脑或中枢神经系统癌、周围神经系统癌、食道癌、宫颈癌、子宫或子宫内膜癌、口腔癌或咽癌、肝癌、肾癌、睾丸癌、胆道癌、小肠或阑尾癌、唾液腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤和血液学组织癌。
在某些实施方案中，可以用本文提供的缀合物治疗的癌症包括但不限于人肉瘤和癌，例如纤维肉瘤、粘肉肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、血管内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管肉瘤滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、结肠直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞癌、胆管癌、肝癌、绒毛膜癌，精原细胞瘤、胚胎癌、Wilms瘤、宫颈癌、骨癌、脑肿瘤、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤；白血病，例如急性淋巴细胞白血病和急性粒细胞白血病(粒细胞性、早粒细胞性、粒单核细胞性、单核细胞性和红白血病)；慢性白血病(慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞性白血病)；和真性红细胞增多症，淋巴瘤(霍奇金氏病和非霍奇金氏病)、多发性骨髓瘤、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症和重链疾病。
在某些实施方案中，癌症本质上是上皮性的，包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、妇科癌症、肾癌、喉癌、肺癌、口腔癌、头颈癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和皮肤癌。在某些实施方案中，所述癌症是乳腺癌、前列腺癌、肺癌或结肠癌。在某些实施方案中，上皮癌是非小细胞肺癌、非乳头状肾细胞癌、子宫颈癌、卵巢癌(例如浆液性卵巢癌)或乳腺癌。
在某些实施方案中，增生性疾病是炎性疾病。在某些实施方案中，增生性疾病是免疫疾病。在某些实施方案中，增生性疾病是感染性疾病。在某些实施方案中，增生性疾病是病毒感染。
在另一个实施方案中，本文提供了调节受试者中的天然杀伤细胞的方法，其包括向受试者施用有效量的本文公开的缀合物。
在另一个实施方案中，本文提供了调节受试者中的骨髓细胞的方法，其包括向受试者施用有效量的本文公开的缀合物。
取决于待治疗的失调、疾病或病症以及受试者的条件，本文提供的缀合物或药物组合物可以通过经口、肠胃外(例如，肌内、腹膜内、静脉内、ICV、脑池内注射或输注、皮下注射或植入)、吸入、经鼻、阴道、直肠、舌下或局部(例如，透皮或局部)的施用途径施用，并且可以单独或与药学可接受的赋形剂、载体、佐剂和适合每种施用途径的媒介物一起配制。还提供了以储库制剂施用本文提供的缀合物或药物组合物，其中活性成分在预定的时间段内释放。
在治疗、预防或改善本文所述的失调、疾病或病症的一种或多种症状中，合适的剂量水平通常为每天每千克受试者体重约 0.001-100mg(mg/kg每天)、约0.01-约75mg/kg每天、约0.1-约50 mg/kg每天、约0.5-约25mg/kg每天或约1-约20mg/kg perday，其可以单剂量或多剂量施用。在该范围内，剂量可为约0.005-约0.05、约0.05-约0.5、约0.5-约5.0、约1-约15、约1-约20或约1-约20 或约1-约50mg/kg每天。
然而，应理解，任何特定患者的具体剂量水平和剂量频率可以变化，并且取决于多种因素，包括所用具体化合物的活性、代谢稳定性和化合物作用时长、年龄、体重、总体健康状况、性别、饮食、施用方式和时间、排泄率、药物组合，特定病症的严重程度以及接受治疗的宿主。
本文提供的缀合物也可以与可用于治疗、预防或改善本文提供的缀合物有用的一种或多种病症、失调或疾病的症状的其他药剂或疗法组合或组合使用。
合适的其他治疗剂还可包括但不限于：(1)α-肾上腺素能药； (2)抗心律失常药；(3)抗动脉粥样硬化剂，如ACAT抑制剂；(4) 抗生素，例如蒽环类抗生素、博来霉素、丝裂霉素、放线菌素和普卡霉素；(5)抗癌剂和细胞毒性剂，例如烷基化剂如氮芥子、烷基磺酸盐、亚硝基脲、亚乙基亚胺和三氮烯；(6)抗凝剂，例如乙酰香豆酚、阿加曲班、比伐卢定、重组水蛭素、磺达肝癸钠、肝素、苯茚二酮、华法林和希美加群；(7)抗糖尿病药，例如双胍类药物(例如二甲双胍)、葡糖苷酶抑制剂(例如阿卡波糖)、胰岛素、美格替尼类药物(例如瑞格列奈)、磺酰脲类(例如格列美脲、格列本脲和格列吡嗪)、硫唑烷二酮(例如曲格列酮、罗格列酮和吡格列酮)和PPAR-γ激动剂；(8)抗真菌药，如阿莫罗芬、两性霉素B、阿尼芬净、联苯苄唑、布替萘芬、布康唑、卡泊芬净、环匹罗司、克霉唑、益康唑、芬替康唑、非律平、氟康唑、异康唑、伊曲康唑、酮康尼唑、米卡芬净、咪康唑、萘替芳、纳他霉素、制霉菌素、奥西康唑、拉伏康唑、泊沙康唑，龟裂霉素、舍他康唑，舒康唑、特比萘芬、特康唑、噻康唑和伏立康唑；(9)抗炎药，例如非甾体类抗炎药，例如醋氯芬酸、醋甲酰胺、阿莫西林、阿司匹林、阿扎丙宗、贝诺酯、溴芬酸、卡洛芬、塞来昔布、胆碱水杨酸镁，双氯芬酸、二氟尼柳、依托度酸、依托昔布、法沙明、苯布芬、芬诺洛芬、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、氯诺昔康、洛索洛芬、鲁美昔布、甲氯芬那酸、甲芬那酸、美洛昔康、安乃近、水杨酸甲酯、水杨酸镁、萘丁美酮、萘普生、尼美舒利、羟基保泰松、帕瑞考昔、苯基丁氮酮、吡罗昔康、水杨基水杨酸、舒林酸，磺吡酮、舒洛芬，替诺昔康，噻洛芬酸和托美汀；(10)抗代谢物，例如叶酸拮抗剂、嘌呤类似物和嘧啶类似物；(11)抗血小板药，例如GPIIb/IIIa阻滞剂(例如阿昔单抗、依替巴肽和替罗非班)、P2Y(AC)拮抗剂(例如氯吡格雷、噻氯匹定和CS-747)、西洛他唑、双嘧达莫和阿司匹林；(12)抗增殖药，例如甲氨蝶呤、 FK506(他克莫司)和霉酚酸酯；(13)抗TNF抗体或可溶性TNF 受体，例如依那西普、雷帕霉素和来氟米特；(14)aP2抑制剂；(15) β-肾上腺素能药物，例如卡维地洛和美托洛尔；(16)胆汁酸螯合剂，例如考来烯胺；(17)钙通道阻滞剂，如苯磺酸氨氯地平；(18) 化疗剂；(19)环氧合酶2(COX-2)抑制剂，例如塞来昔布和罗非昔布；(20)环孢菌素；(21)细胞毒性药物，例如硫唑嘌呤和环磷酰胺；(22)利尿剂，如氯噻嗪、氢氯噻嗪、氟甲酰肼、氢氟甲酰肼、苯并氟甲酰肼、甲基氯噻嗪、三氯甲酰肼、聚噻嗪、苯并噻嗪、依他尼酸、替尼酸、氯噻酮、呋喃苯胺酸、莫唑胺、布美他尼、氨苯蝶啶、阿米洛利、安体舒通；(23)内皮素转化酶(ECE)抑制剂，例如膦酰二肽；(24)酶，例如L-天冬酰胺酶；(25)VIIa因子抑制剂和Xa因子抑制剂；(26)法呢基蛋白转移酶抑制剂；(27) 贝特类；(28)生长因子抑制剂，例如PDGF活性的调节剂；(29) 生长激素促分泌素；(30)HMG CoA还原酶抑制剂，例如普伐他汀、洛伐他汀、阿托伐他汀、辛伐他汀、NK-104(又称伊伐他汀、尼伐他汀或尼巴他汀)和ZD-4522(也称为瑞舒伐他汀、阿伐他汀或米沙他汀)；中性内肽酶(NEP)抑制剂；(31)激素药，例如糖皮质激素(如可的松)、雌激素/抗雌激素、雄激素/抗雄激素、孕激素和黄体生成素释放激素拮抗剂以及醋酸奥曲肽；(32)免疫抑制剂； (33)盐皮质激素受体拮抗剂，例如螺内酯和依普利酮；(34)微管破坏剂，例如海鞘素(ecteinascidins)；(35)微管稳定剂，例如紫杉醇、多西他赛和埃坡霉素A-F；(36)MTP抑制剂；(37)烟酸； (38)磷酸二酯酶抑制剂，例如PDEIII抑制剂(例如西洛他唑)和 PDEV抑制剂(例如西地那非、他达拉非和伐地那非)；(39)植物来源的产品，例如长春花生物碱、表鬼臼毒素和紫杉烷；(40) 血小板活化因子(PAF)拮抗剂；(41)铂配位复合物，例如顺铂，沙铂和卡铂；(42)钾通道开放剂；(43)异戊二烯蛋白转移酶抑制剂；(44)蛋白酪氨酸激酶抑制剂；(45)肾素抑制剂；(46) 角鲨烯合成酶抑制剂；(47)类固醇，例如醛固酮、倍氯米松、倍他米松、醋酸脱氧皮质酮、氟可的松、氢化可的松(皮质醇)、泼尼松龙、泼尼松、甲基泼尼松龙、地塞米松和曲安奈德；(48)TNF-α抑制剂，例如替尼达普；(49)凝血酶抑制剂，例如水蛭素；(50) 血栓溶解剂，例如阿尼曲普酶、瑞替普酶、替奈普酶、组织纤溶酶原激活物(tPA)、重组tPA、链激酶、尿激酶、原尿激酶和异化纤溶酶原链激酶激活物复合物(APSAC)；(51)血栓素受体拮抗剂，如伊非曲班；(52)拓扑异构酶抑制剂；(53)血管肽酶抑制剂(双重NEP-ACE抑制剂)，例如奥帕曲拉和格莫曲拉；(54)其他杂剂，例如羟基脲、丙卡巴肼、米托烷、六甲基三聚氰胺和金化合物。
在某些实施方案中，可以与本文提供的缀合物组合使用的其他疗法包括抗癌剂和细胞毒性剂，例如烷基化剂，如氮芥、烷基磺酸盐、亚硝基脲、亚乙基亚胺和三氮烯；例如，烷基化剂、例如氮芥、烷基磺酸盐、亚硝基脲、亚乙基亚胺和三氮烯。
在某些实施方案中，可以与本文提供的缀合物组合使用的其他疗法包括但不限于免疫检查点调节剂。在某些实施方案中，免疫检查点调节剂是PD-1抑制剂。在某些实施方案中，免疫检查点调节剂是PD-L1抑制剂。在某些实施方案中，PD-1抑制剂是抗PD-1抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，PD-L1抑制剂是抗PD-L1 抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，免疫检查点调节剂阻断PD-1和PD-L1之间的相互作用。
在某些实施方案中，可以与本文提供的缀合物组合使用的其他疗法包括但不限于T细胞共刺激分子和免疫检查点调节剂。在某些实施方案中，T细胞共刺激分子是OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、 LFA-1/CD11a/CD18、ICOS/CD278、4-1BB/CD137、GITR、CD30、 CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、 CD160、B7-H3或CD83或其配体。在某些实施方案中，T细胞共刺激分子是抗OX40抗体、抗ICOS/CD278抗体或抗4-1BB/CD137抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，免疫检查点调节剂是选自PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、LAG-3、CEACAM-1、CEACAM-5、 CLTA-4、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD47、CD160、2B4、 CD172a和TGFR的免疫检查点分子的抑制剂。在某些实施方案中，免疫检查点调节剂是抗CD47抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，可以与本文提供的缀合物组合使用的其他疗法包括但不限于外科手术、内分泌疗法、生物反应调节剂(例如，干扰素、白介素和肿瘤坏死因子(TNF))、高温和冷冻疗法以及可减轻任何不良影响的试剂(例如止吐药)。
此类其他试剂或药物可以与本文提供的缀合物同时或相继通过其通常使用的途径和量施用。当本文提供的缀合物与一种或多种其他药物同时使用时，除本文提供的缀合物外，还可以使用含有此类其他药物的药物组合物，但不是必需的。因此，本文提供的药物组合物包括除本文提供的缀合物外还包含一种或多种其他活性成分或治疗剂的那些。
在某些实施方案中，本文提供的缀合物与第二抗体，例如结合由癌症表达的抗原的抗体(例如，有效量的第二抗体)联合施用。由癌症表达的示例性抗原是本领域已知的，并且包括但不限于： CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD52、CD56、CD70、 CD74、CD79b、CD123、CD138、CS1/SLAMF7、Trop-2、5T4、EphA4、 BCMA、粘液素1、粘液素16、PD-L1、PTK7、STEAP1、内皮素B 受体、间皮素、EGFRvIII、ENPP3、SLC44A4、GNMB、连接素4、 NaPi2b、LIV-1A、鸟苷酸环化酶C、DLL3、EGFR、HER2、VEGF、 VEGFR、整合素αVβ3、整合素α5β1、MET、IGF1R、TRAILR1、 TRAILR2、RANKL、FAP、肌腱蛋白、Ley、EpCAM、CEA、gpA33、 PSMA、TAG72、粘蛋白、CAIX、EPHA3、叶酸受体α、GD2、GD3 和包含来自NY-ESO-1/LAGE的MHC/肽复合物、SSX-2、MAGE家族蛋白、MAGE-A3、gp100/pmel17、Melan-A/MART-1、gp75/TRP1、酪氨酸酶、TRP2、CEA、PSA、TAG-72、未成熟层粘连蛋白受体、 MOK/RAGE-1、WT-1、SAP-1、BING-4、EpCAM、MUC1、PRAME、生存素、BRCA1、BRCA2、CDK4、CML66、MART-2、p53、Ras、β-连环蛋白、TGF-βRII、HPV E6或HPVE7。在某些实施方案中，本文提供的缀合物与结合CD123(也称为IL-3受体α)的单克隆抗体，例如塔妥珠单抗(也称为CSL362和JNJ-56022473)联合施用。在某些实施方案中，本文提供的缀合物与结合EGFR的单克隆抗体 (例如西妥昔单抗)组合施用。在某些实施方案中，第二抗体包括一种或多种效应子功能，例如与免疫细胞上的Fc受体(FcR)结合相关的效应子功能，包括但不限于ADCC或ADCP，和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。不希望受理论的束缚，认为将这种抗体与本文提供的缀合物组合是特别有利的，例如，引导表达FcR的白细胞靶向与第二抗体结合的肿瘤细胞，同时调节NK或骨髓细胞的活性。
在某些实施方案中，本文提供的缀合物与免疫治疗剂(例如有效量的免疫治疗剂)联合施用。免疫治疗剂可以是指靶向免疫系统并促进免疫系统的治疗性重定向的任何治疗剂，例如共刺激途径的调节剂、癌症疫苗、重组修饰的免疫细胞等。下文描述了示例性和非限制性的免疫治疗剂。不希望受理论的束缚，认为由于互补的作用机制，例如在激活巨噬细胞和其他免疫细胞(例如T效应子细胞)以靶向肿瘤细胞方面，本文提供的缀合物适合与免疫治疗剂一起使用。
在某些实施方案中，免疫治疗剂包含抗体。免疫治疗性抗体的示例性抗原是本领域已知的，包括但不限于BDCA2,BDCA4,ILT7, LILRB1,LILRB2,LILRB3,LILRB4,CSF-1R,CD40,CD40L,CD163, CD206,DEC205,CD47,CD123,IDO,TDO,41BB,CTLA4,PD1, PD-L1,PD-L2,TIM-3,BTLA,VISTA,LAG-3,CD28,OX40,GITR, CD137,CD27,HVEM,CCR4,CD25,CD103,KIrg1,Nrp1,CD278, Gpr83,TIGIT,CD154,CD160,PVRIG,DNAM和ICOS。批准的或在后期临床测试中的免疫治疗剂包括但不限于伊立木单抗、派姆单抗、尼古拉单抗、阿佐单抗、阿维单抗、德瓦鲁单抗等。在某些实施方案中，本公开的抗体与PD-L1/PD-1途径的抑制剂例如抗PD-L1或抗 PD-1抗体联合施用。如本文所证实，本发明的抗SIRP-α抗体与 PD-L1/PD-1途径的抑制剂的联合施用可以导致协同的抗肿瘤活性。
在某些实施方案中，免疫治疗剂包括疫苗、溶瘤病毒、过继细胞疗法、细胞因子或小分子免疫治疗剂。此类免疫治疗剂的实例是本领域已知的。例如，过继性细胞疗法和治疗剂可包括但不限于嵌合抗原受体T细胞疗法(CAR-T)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、TCR 工程化的NK细胞和巨噬细胞产品。疫苗可包括但不限于多核苷酸疫苗、多肽疫苗或基于细胞的(例如基于肿瘤或树突细胞的)疫苗。可用于治疗癌症的各种细胞因子是已知的，并且包括但不限于IL-2、 IL-15、IL-7、IL-10和IFN。小分子免疫治疗剂可包括但不限于 IDO/TDO抑制剂、精氨酸酶抑制剂、A2aR抑制剂、TLR激动剂、 STING激动剂和Rig-1激动剂。
在某些实施方案中，本文提供的缀合物与治疗剂组合施用，所述治疗剂包括但不限于甲氨蝶呤(
Figure DEST_PATH_IMAGE199
氨甲喋呤)、环磷酰胺
Figure DEST_PATH_IMAGE200
沙利度胺
Figure DEST_PATH_IMAGE201
吖啶甲酰胺、
Figure DEST_PATH_IMAGE202
放线菌素、17-N-烯丙氨基-17-去甲氧基格尔德霉素、氨蝶呤、安吖啶、蒽环霉素、抗肿瘤药、抗肿瘤物质、5-氮杂胞苷、硫唑嘌呤、BL22、苯达莫司汀、比立考达、博来霉素、硼替佐米、苯丁抑制素、白消安、花萼海绵诱癌素、喜树碱、卡培他滨、卡铂、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯法拉滨、阿糖胞苷、达卡巴嗪、达沙替尼、柔红霉素、地西他滨、二氯乙酸、discode olide、多西他赛、多柔比星、表柔比星、埃博霉素、艾日布林、雌氮芥、依托泊汀、依喜替康、依昔舒林、弥罗松酚、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、磷雌酚、替莫司汀、更昔洛韦、吉西他滨、羟基脲、IT-101、伊达比星、异环磷酰胺、咪喹莫特、伊立替康、伊洛福芬、伊沙匹隆、laniquidar、拉帕替尼、来那度胺、洛莫司汀、卢托替康、莫夫酰胺、马索普洛尔、氮芥、美法仑、巯基嘌呤、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、奈拉西滨、尼洛替尼、奥利默森、奥沙利铂、PAC-1、紫杉醇、培美曲塞、喷司他丁、哌泊溴烷、匹克生琼、普卡霉素、甲基苄肼、蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米)、雷替曲昔、雷贝卡霉素、
Figure DEST_PATH_IMAGE203
rubite-can、SN-38、salinosporamideA、赛特铂、链脲霉素、苦马豆素、tariquidar、紫杉烷，优福定、替莫唑胺、睾内酯、thioTEPA、硫鸟嘌呤、托泊替康、曲贝替定、维甲酸、四硝酸三铂、三(2-氯乙基)胺、曲沙他滨、尿嘧啶芥子、戊柔比星、长春花碱、长春新碱、长春瑞滨、伏立诺他或zozoquidar。
在某些实施方案中，本文提供的缀合物与治疗剂组合施用，所述治疗剂包括但不限于3F8、8H9、阿巴伏单抗、阿昔单抗、阿比妥单抗、阿利鲁单抗、阿妥昔单抗、阿达木单抗、阿德木单抗、阿杜卡单抗、阿非莫单抗、阿托单抗、培阿赛珠单抗、ALD518，阿仑单抗、阿利库单抗、喷替酸阿妥莫单抗、阿莫昔单抗、麻安莫单抗、雷星-阿奈妥单抗、阿尼富路单抗、kinzumab(IMA-638)、阿泊珠单抗、阿西莫单抗、阿伐苏单抗、阿塞珠单抗、阿特朱单抗、阿缇努单抗、阿特立单抗(托珠单抗)、阿托木单抗、巴匹珠单抗、巴利昔单抗、巴土昔单抗、贝妥莫单抗、贝戈洛单抗、贝利木单抗、 Benralizumab、柏替莫单抗、贝索单抗、贝伐单抗、贝茨罗特斯单抗、比西单抗、比玛格鲁单抗、比美吉珠单抗、比伐单抗、兰妥莫单抗、布鲁宗津单抗、伯考赛珠单抗、布妥昔单抗、贝伐珠单抗、布达路单抗、布洛赛珠单抗、Brontictuzumab、卡那单抗、美坎珠单抗、莫坎妥珠单抗、卡普兰珠单抗、卡罗单抗喷地妆、卡鲁单抗、卡妥索单抗、cBR96-多柔比星免疫偶联物、CC49、西利珠单抗、培舍珠单抗、西妥昔单抗、Ch.14.18、泊西他珠单抗、西妥木单抗、克莱赞珠单抗、克立昔单抗、克莱维足单抗、考曲妥珠单抗、雷星-考妥昔单抗、可那木单抗、可那足单抗、克雷内治单抗、CR6261、达西珠单抗、达克珠单抗、达罗土珠单抗、培戈-达匹利珠单抗、达拉土姆单抗、Dectrekumab、地莫米佐单抗、Denintuzumab mafodotin、地舒单抗、地洛妥单抗生物素、地莫单抗、达妥昔单抗、地利伏单抗、阿托度单抗、德罗图单抗、杜力戈图单抗、杜丕璐单抗、得瓦鲁单抗、杜氏图单抗、依美昔单抗、依库珠单抗、埃巴单抗、依决洛单抗、依法珠单抗、Engumab、依德鲁单抗、Elgemtumab、埃罗妥珠单抗、艾西莫单抗、依米妥珠单抗、依玛妥珠单抗、埃文单抗、恩福单抗凡酯、培戈赖莫单抗、Enoblituzumab、艾诺克单抗、艾诺提克单抗、埃斯托西单抗、西依匹莫单抗、依帕珠单抗、厄利珠单抗、厄马索单抗、埃达珠单抗、埃图力珠单抗、依维苏单抗、艾沃单抗、艾韦单抗、法索单抗、法拉莫单抗、法拉图组单抗、法希姆单抗、FBTA05、非维珠单抗、非扎奴单抗、费希腊妥单抗、芬妥木单抗、Firivumab、弗兰托单抗、夫来库单抗、芳妥珠单抗、弗罗鲁单抗、福拉韦单抗、夫苏木单抗、弗兰单抗、弗图希单抗、加利昔单抗、盖尼塔单抗、盖坦德单抗、加维莫单抗、吉妥珠单抗奥佐米星、加沃坦珠单抗、吉仁土希单抗、维德汀单抗、戈利木单抗、戈利昔单抗、古谢夫单抗、替伊立珠单抗、替伊莫单抗、依库单抗、依达赛珠单抗、伊戈伏单抗、IMAB362、伊玛鲁单抗、英西单抗、英戈土珠单抗、英克拉库单抗、依坦希单抗、Indusatumabvedotin、Iniximab、英妥木单抗、伊诺莫单抗、伊珠单抗奥佐米星、英妥木单抗、英妥木单抗、 Isatuximab、依拓珠单抗、希凯珠单抗、凯利昔单抗、拉贝珠单抗、拉姆布罗力珠单抗、拉姆帕力珠单抗、来金珠单抗、来马索单抗、 Lenzilumab,乐地单抗、来沙木单抗、利韦单抗、维汀-利法妥珠单抗、利格利珠单抗、Lilotomab satetraxetan、林妥珠单抗、立鲁单抗、罗德希珠单抗、洛吉维单抗、劳乌土珠单抗、鲁卡木单抗、培戈-鲁利珠单抗、鲁昔单抗、鲁妥珠单抗、马帕木单抗、马格土希单抗、马司莫单抗、美力姆单抗、马妥珠单抗、美泊利单抗、美替木单抗、米拉珠单抗、明瑞莫单抗、米妥莫单抗、莫格穆里单抗、莫罗木单抗、莫他珠单抗、莫希土姆单抗、莫罗单抗-CD3、他那可单抗、纳米路单抗、他那莫单抗、纳瑞特单抗、那他珠单抗、奈巴库单抗、奈昔木单抗、奈莫利珠单抗、奈瑞莫单抗、耐西维单抗、尼妥珠单抗、妮威禄单抗、巯诺莫单抗、奥托萨昔单抗、奥卡土珠单抗、奥瑞珠单抗、奥度莫单抗、奥法木单抗、奥拉图单抗、奥鲁凯珠单抗、奥马珠单抗、欧那土珠单抗、欧土希珠单抗、奥匹努单抗、莫奥珠单抗、奥戈伏单抗、奥泰单抗、奥昔珠单抗、奥特乐土珠单抗、欧西鲁单抗、欧赞尼珠单抗、欧咗立珠单抗、帕昔单抗、帕利珠单抗、帕利珠单抗、帕尼库单抗、帕诺库单抗、帕萨土珠单抗、帕考珠单抗、帕妥昔珠单抗、帕特立珠单抗、帕图单抗、帕尼单抗、帕尼单抗、培拉凯珠单抗、培妥珠单抗、培克珠单抗、皮地利珠单抗、平尼土珠单抗、平妥莫单抗、普拉库鲁单抗、普拉土珠单抗、珀珠单抗、普立昔单抗、普陀希单抗、普立木单抗、PRO 140、坤立珠单抗、雷库图单抗、雷德图单抗、Ravirumab、雷泮赛珠单抗、雷莫芦单抗、雷珠单抗、雷昔库单抗、瑞法奈珠单抗、瑞加韦单抗、瑞利珠单抗、利妥木单抗、利妥昔单抗、罗妥木单抗、罗勒杜单抗、罗姆苏珠单抗、罗利珠单抗、罗维珠单抗、鲁利珠单抗、沙玛立珠单抗、沙鲁单抗、沙妥莫单抗、司库钦单抗、司瑞斑图单抗、斯图希单抗、司韦单抗、西罗珠单抗、SGN-CD19A、SGN-CD33A、西法木单抗、西图希单抗、西姆土珠单抗、西利珠单抗、希瑞库单抗、Sotuzumabvedotin、苏兰珠单抗、苏力图单抗、松普希珠单抗、松妥珠单抗、司他芦单抗、硫索单抗、索维单抗、他贝鲁单抗、他珠单抗、他度珠单抗、他利珠单抗、他尼珠单抗、帕他莫单抗、他瑞妥单抗、Te bazumab、阿替莫单抗、替妥莫单抗、替奈昔单抗、替利珠单抗、替普单抗、Tesidolumab、TGN1412、替西木单抗(Ticilimumab)(曲美木单抗(tremelimumab))、替加珠单抗(Tildrakizumab Tigatuzumab)、 TNX-650、托珠单抗(Tocilizumab)(atlizumab)、托利珠单抗、 Tosatoxumab,托西莫单抗、托维图单抗、曲洛青木单抗、曲妥珠单抗、 TRBS07、曲加立珠、曲美木单抗、西莫白介素单抗、妥韦单抗、乌波利土西单抗、Ulocuplumab、乌瑞鲁单抗、乌珠单抗、优特克单抗、维汀-万多妥珠单抗、伐提克图单抗、伐努赛珠单抗、伐利昔单抗、 Varlilumab、维特立珠单抗、维多珠单抗、维妥珠单抗、维帕莫单抗、维西库单抗、维西珠单抗、伏洛昔单抗、伏妥土珠单抗、伏妥昔单抗、扎芦木单抗、扎木单抗、扎土希单抗、齐拉木单抗或阿佐莫单抗。
可包括本领域已知的任何癌症类型，例如但不限于癌，肉瘤、淋巴瘤、白血病、淋巴瘤和母细胞瘤。此类癌症的更具体实例包括但不限于肺癌、鳞状细胞癌、脑瘤、成胶质细胞瘤、头颈癌、肝细胞癌、结肠直肠癌(例如结肠癌或直肠癌)、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、泌尿道癌、乳腺癌、腹膜癌、子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肛门癌、阴茎癌、黑色素瘤、多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤(包括非霍奇金淋巴瘤(NHL))；急性淋巴细胞白血病(ALL)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性髓细胞性白血病(AML)；默克尔细胞癌；慢性粒细胞性白血病(CML)；和相关的转移。
本文提供的缀合物也可以使用本领域技术人员众所周知的包装材料作为制品提供。参见例如，美国专利号5,323,907；5,052,558；和5,033,252。药物包装材料的实例包括但不限于泡罩包装、瓶、管、吸入器、泵、袋、小瓶、容器、注射器以及适合于选定制剂和预期施用和治疗方式的任何包装材料。
本文还提供试剂盒，当由执业医师使用时，试剂盒可以简化适当量的活性成分向受试者的施用。在某些实施方案中，本文提供的试剂盒包括容器和本文提供的缀合物的剂型。
在某些实施方案中，试剂盒在包含一种或多种本文所述的一种或多种其他治疗剂的容器中包括包含本文提供的缀合物剂型的容器。
本文提供的试剂盒可进一步包括用于施用活性成分的装置。这种装置的实例包括但不限于注射器、无针注射器、滴剂袋、贴剂和吸入器。本文提供的试剂盒还可包括用于施用活性成分的橡皮套。
本文提供的试剂盒可进一步包括可用于施用一种或多种活性成分的药学可接受的媒介物。例如，如果活性成分以必须重构以用于肠胃外施用的固体形式提供，则试剂盒可以包括合适媒介物的密封容器，活性成分可以溶于其中以形成适用于肠胃外施用的不含颗粒的无菌溶液。药学可接受的赋形剂的实例包括但不限于：水性媒介物，包括但不限于注射用水USP、氯化钠注射液、林格注射液、右旋糖注射液、右旋糖和氯化钠注射液以及乳酸林格氏注射液；与水混溶的媒介物，包括但不限于乙醇、聚乙二醇和聚丙二醇；以及非水媒介物，包括但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯。
通过以下非限制性实施例将进一步理解本公开。
具体实施方式
实施例1.核苷酸和多核苷酸的合成和纯化
免疫调节性多核苷酸及其前体的示例性合成描述如下。
前体
用于制备本发明多核苷酸的前体提供于WO 2015/188197(例如亚磷酰胺、靶向部分和含有PEG链的生物可逆性基团)。
亚磷酰胺和其他单体
可用于合成本发明多核苷酸的含核苷的中间体公开于WO 2015/188197(例如WO2015/188197中的化合物U1-U54、A1-A15、 C1-9和G1-G12)。
可商购亚磷酰胺购自Glen Research(Sterling,VA)或ChemGenes (Wilmington,MA)。需要时，可使用本文或他处所述的标准反应条件，从经适当保护的核苷制备其他亚磷酰胺。
化合物S61B
Figure DEST_PATH_IMAGE204
向S61(0.48g,2.0mmol)的DCM(5.0mL)溶液中添加S61A (0.60g，2.0mmol)和ETT(乙腈中0.25M，4.8mL，1.2mmol)。将混合物搅拌2小时。蒸发挥发物得到残余物，使用乙酸乙酯/己烷 (在Combi Flash Rf仪器上0-30％梯度)将其进行快速硅胶柱纯化以得到无色油状化合物S61B(0.49g,55％)。31P NMR(202MHz,CDCl3； ppm):δ147.83(s)。
化合物S108
Figure DEST_PATH_IMAGE205
向2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙醇(S108A，25.0g，167mmol) 和N-甲基吗啉(21.0mL，191mmol)的二恶烷(100mL)的搅拌混合物中滴加Fmoc-OSu(62.2g，184mmol)的二恶烷(50mL)溶液。搅拌过夜后，将反应真空浓缩以得到浅黄色油。将粗产物再溶于 EtOAc中，并用饱和NaHCO3(aq.)和盐水洗涤。真空去除有机层以得到油状物，将其通过SiO2色谱法纯化以得到 FmocNH-PEG2-OH(S108,55g,88％产率).ESI+m/z计算值371.4, 实测值372.2[M+H]+。
X1和X2无碱基间隔基合成-通用方案：
Figure DEST_PATH_IMAGE206
化合物S110
Figure DEST_PATH_IMAGE207
在氩气下于0℃下向NaH(13.2g，矿物油中60％，230.0mmol) 在THF(40mL)中的悬浮液中滴加二醇(S109，4.92g，22.0mmol) 的THF(20mL)溶液；将得到的混合物温热至室温并搅拌1h。将反应混合物冷却至0℃，缓慢添加炔丙基溴(18.6g，158.4mmol)的 THF(25mL)溶液，并将所得混合物加热至室温并在40℃搅拌过夜。通过TLC观察，产物耗尽后，通过在0℃下滴加水淬灭反应，并将所得混合物用二氯甲烷(50mL×2)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，用无水Na2SO4,干燥、过滤并蒸发以得到残余物，将其使用ISCO 伴侣(己烷/乙酸乙酯，0-30％)通过快速硅胶柱纯化以得到5.92g (89.5％)油状化合物S110。1H NMR(500MHz,CDCl3；ppm): δ7.49-7.47(dd,J8.0,1.5Hz,2H),7.38-7.34(m,3H),5.43(s,1H),4.21 (d,J2.5Hz,2H),4.12(t,J2.5Hz,4H),4.10(s,1H),3.91(s,1H),3.89 (s,1H),3.37(s,2H)；C18H20O4的ESIMS计算值300.34,观察值 [M+H]+301.3。
化合物S111
Figure DEST_PATH_IMAGE208
将双炔丙基化合物S110(5.9g，19.64mmol)溶于乙酸/水混合物(60mL，75：25)中，并在50℃下继续反应2小时。反应完成后，将溶液蒸发并与甲苯(2x20mL)共蒸发。使用快速硅胶柱，使用ISCO 伴侣(己烷/乙酸乙酯，20-80％)将残余物直接纯化而无需任何处理以得到3.02g(72.5％)油状化合物S111。1H NMR(500MHz,CDCl3； ppm):δ4.15(d,J 2.5Hz，4H),3.68(s,4H),3.59(s,4H),2.44(t,J 2.5 Hz,2H),2.30-2.40(br,2H)；C11H16O4的ESI MS计算值212.24,观察值[M+H]+213.2。
化合物S112
Figure DEST_PATH_IMAGE209
在0℃下向二醇S111(3.0g，14.2mmol)、N,N-二异丙基乙胺 (3.15mL，17.0mmol)和DMAP(0.36g，2.83mmol)的二氯甲烷 (25mL)溶液中滴加二甲氧基三苯甲基氯(4.8g，14.2mmol)的二氯甲烷(40mL)溶液，并且反应在室温下继续过夜。将混合物用二氯甲烷稀释，先后用水和盐水洗涤，有机层经无水Na2SO4干燥、过滤并蒸发。将所得残余物使用ISCO伴侣(己烷/乙酸乙酯，0-40％) 通过快速硅胶柱纯化以得到5.29g(73％)的单DMT保护的白色固体状化合物S112。1H NMR(500MHz,CDCl3；ppm):δ7.4-7.42(m,2H), 7.32-7.31(m,4H),7.28-7.25(m,2H),6.84-6.81(m,4H),4.09(d,J2.5 Hz,4H),3.79(s,6H),3.67(d,J6.0Hz,2H),3.64-3.56(m,4H),3.13(s, 2H),2.39(t,J2.5Hz,2H)；C32H34O6的ESI MS计算值514.6,观察值 [M+Na]+537.4。
化合物S113
Figure DEST_PATH_IMAGE210
室温下向DMT保护的化合物S112(0.5g，0.98mmol)的二氯甲烷(4mL)溶液中滴加2′-氰基乙基-N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰胺(0.58 g,1.95mmol)的二氯甲烷(3mL)溶液，然后在氩气气氛下添加5- 苄硫基-1H-四唑(BTT；乙腈中0.25M，0.78mL，0.18mmol)。继续反应直至起始原料消失(2h)，并将粗混合物用20mL二氯甲烷稀释，依次用饱和NaHCO3溶液(10mL)和盐水(10mL)洗涤，并用无水Na2SO4干燥。真空蒸发溶剂，并使用具有3％三乙胺的乙酸乙酯/己烷作为共溶剂(在Combi Flash Rf仪器上0-30％梯度)将粗混合物通过硅胶柱色谱法纯化以得到0.53g油状化合物S113(75％)。ESI MS：C41H51N2O7P计算值714.82,观察值715.6[M+H]+；31P NMR (202MHz,CDCl3):δ147.89。
化合物S114
Figure DEST_PATH_IMAGE211
在氩气气氛下向DMT保护的化合物S112(0.98g，1.9mmol) 和N,N-二异丙基乙胺(0.39mL，2.09mmol)在8.0mL无水二氯甲烷的-78℃溶液中滴加双-(N,N-二异丙基氨基)-氯膦(0.56g， 2.09mmol)的二氯甲烷(4.0mL)溶液。使反应混合物温热至室温，同时保持搅拌1h。在室温下添加3-丁炔-1-醇(0.14g，1.9mmol)的 2.0mL无水二氯甲烷溶液；将所得混合物搅拌10分钟，此时添加 0.25M ETT的乙腈溶液(4.6mL，1.15mmol)，并继续再搅拌3h。反应完成后，如通过TLC消失的起始原料所观察，将粗混合物用20mL 二氯甲烷稀释，并依次用饱和NaHCO3溶液(10mL)和盐水(10mL) 洗涤，并用无水Na2SO4干燥。真空蒸发挥发物，并使用乙酸乙酯/ 己烷和3％三乙胺作为溶剂系统(在Combi Flash Rf仪器上0-40％梯度)将粗混合物通过硅胶柱色谱法纯化，以得到0.33g油状化合物 S114(25％)。ESI MS：C42H52NO7P计算值713.83,观察值714.7 [M+H]+；31P NMR(202MHz,CDCl3):δ146.89。
X3和X4无碱基间隔基合成-通用方案：
Figure DEST_PATH_IMAGE212
化合物S116
Figure DEST_PATH_IMAGE213
使用针对化合物S110所述的方案制备油状化合物S116，产率为 91％。1H NMR(500MHz,CDCl3；ppm):δ7.51(d,J 7.5Hz,2H), 7.37-7.32(m,3H),5.56(s,1H),3.37-3.35(m,4H),4.10-4.07(dd,J 13.0 Hz,J 2.5Hz，2H),3.65-3.64(m,1H),2.43-2.42(t,J6.5Hz，1H)；ESI MS：C13H14O3计算值218.24,观察值[M+H]+219.2。
化合物S117
Figure DEST_PATH_IMAGE214
使用针对化合物S111所述的方案制备油状化合物S117，产率为 91％。1H NMR(500MHz,CDCl3；ppm):δ4.33(s,2H),3.83-3.70(m, 5H),2.48(s,1H),2.04(br,2H)；ESIMS：C6H10O3计算值130.14,观察值[M+Na]+153.0。
化合物S118
Figure DEST_PATH_IMAGE215
使用针对化合物S112所述的方案制备白色固体状化合物S118，产率为54％。1HNMR(500MHz,CDCl3；ppm):δ7.43(d,J7.5Hz,2H), 7.37-7.27(m,5H),7.23-7.16(m,2H),6.83(d,J9.0Hz,3H),6.78-6.76 (ddJ 8.5Hz,1H),4.35-4.22(m,2H),3.77(s,6H)3.76-3.72(m,2H), 3.71-3.64(m,1H),3.27-3.19(m,2H),2.48(t,J4.5Hz，1H),2.03-1.96 (m,1H)；ESIMS：C27H28O5计算值432.50,观察值[M+Na]+455.4。
化合物S119
Figure DEST_PATH_IMAGE216
使用针对化合物S113所述的方案制备油状化合物S119，产率为 86％。ESI MS：C36H45N2O6P计算值432.72,观察值433.5[M+H]+；31P NMR(202MHz,CDCl3):δ149.05,148.96。
化合物S120
Figure DEST_PATH_IMAGE217
使用针对化合物S114所述的方案制备油状化合物S120，产率为 47％。ESI MS：C37H46NO6P计算值431.73,观察值432.5[M+H]+；31P NMR(202MHz,CDCl3):δ147.80,147.71。
X5和X6无碱基间隔基合成-通用方案：
Figure DEST_PATH_IMAGE218
化合物S121
Figure DEST_PATH_IMAGE219
向S116(4.0g，22.2mmol)的二恶烷(25mL)溶液中添加溶解在最少量水中的KOH(0.12g，2.2mmol)溶液，并将所得混合物在室温下搅拌至少30分钟。将混合物冷却至0℃，滴加丙烯腈(2.35g，44.4mmol)的二恶烷(15mL)溶液，并将所得混合物在室温下反应过夜。真空蒸发挥发物，将残余物用水稀释，并将pH调节至接近中性。粗产物用乙酸乙酯(2×50mL)萃取，并且将合并的有机层用盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥、过滤、蒸发以得到残余物，使用ISCO 伴侣(二氯甲烷/甲醇，0-5％)将其通过快速硅胶柱纯化以得到3.1g (60％)白色固体状化合物S121。1H NMR(500MHz,CDCl3；ppm): δ7.49(d,J 7.0Hz,2H),7.36-7.34(m,3H),5.56(s,1H),3.36(d,J 13.0 Hz 2H),4.10-4.07(dd,J 13.0Hz,J 2.0Hz,2H),3.84(t,J6.5Hz,2H), 3.42(m,1H),3.69(t,J 6.5Hz，2H)；ESIMS：C13H15NO3计算值233.2, 观察值[M+Na]+256.3。
化合物S122
Figure DEST_PATH_IMAGE220
在0℃下向氢化铝锂(0.83g，4.0mmol)在THF(10mL)中的悬浮液中滴加化合物S121(1.28g，5.5mmol)的THF(15mL)溶液，将所得混合物温热至室温，并继续搅拌3h。反应完成后，将反应混合物冷却至0℃，并根据需要通过滴加水(约2-3mL)淬灭。添加额外的8mL水，并将粗产物萃取至乙酸乙酯(2×25mL)中。将合并的有机层用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥、过滤并蒸发以得到化合物S122，其无需进一步纯化用于随后的步骤。1H NMR(500MHz, CDCl3；ppm):δ7.49(d,J 7.0Hz,2H),7.40-7.32(m,3H),5.55(d,J 5.0 Hz,1H),4.34(d,J 13.0Hz,1H),4.20-4.11(dd,J 12.0Hz4H), 4.05-4.03(d,J 13.0Hz,J 2.0Hz,1H),3.66-3.62(m,2H),3.27(m,1H), 2.86(t,J 6.5Hz,1H),2.16(br,2H)；ESI MS：C13H19NO3计算值237.2, 观察值[M+H]+238.2。
化合物S123
Figure DEST_PATH_IMAGE221
在0℃下向化合物S122(1.0g，4.2mmol)和N,N-二异丙基乙胺 (2.3mL，12.6mmol)的二氯甲烷(8mL)溶液中滴加Fmoc-OSu(1.7g， 5.0mmol)溶液，并将所得混合物在室温下反应3小时。完成后，将将反应混合物用二氯甲烷(10mL)稀释，并且用水和然后用盐水洗涤。将有机层分离，用无水Na2SO4干燥、过滤、蒸发以得到残余物。使用ISCO伴侣(己烷/乙酸乙酯，0-50％)将残余物通过快速硅胶柱纯化以得到0.65g(35％)白色固体状化合物S123。1H NMR(500MHz, CDCl3；ppm):δ7.75(d,J 7.5Hz,2H),7.58(d,J 7.5Hz,2H),7.51(d,J 7.5Hz,2H),7.37(t,J 7.5Hz,2H),7.31-7.26(m,5H),5.57(s,1H),5.48 (br,1H),4.46-4.32(m,4H),4.15(d,J 7.0Hz,1H),4.06(t,J 12.5Hz 2H),3.67(m,2H),3.54(m,2H),3.41(s,1H),1.88(t,J 6.0Hz,2H)； ESIMS：C28H29NO5计算值459.5,观察值[M+Na]+482.5。
化合物S124
Figure DEST_PATH_IMAGE222
使用针对化合物S111所述的方案制备油状化合物S124，具有定量产率。1H NMR(500MHz,CDCl3；ppm):δ7.76(d,J 7.5Hz,2H),7.58 (d,J 7.5Hz，2H),7.39(t,J 7.5Hz，2H),7.32(t,J 7.5Hz,2H),5.18(br， 1H),4.44(d,J 6.5Hz,2H),4.21(t,J 6.5Hz,1H),4.76-4.73(dd,J 11.5, 3.5Hz 2H),3.67-60(m,4H),3.42(m,1H),3.37(br,2H),2.07(m,2H), 1.75(br,2H)；ESI MS：C21H25NO5计算值371.4,观察值[M+Na]+ 394.3。
化合物S125
Figure DEST_PATH_IMAGE223
使用针对化合物S112所述的方案制备白色固体状化合物S125，产物(S125)产率为48％。1H NMR(500MHz,CDCl3；ppm):δ7.75(t,J 7.5Hz,2H),7.58(t,J 7.5Hz,2H),7.40-7.38(m,3H),7.32-27(m,7H), 7.18-7.16(m,3H),6.83(t,J 7.0Hz,4H),5.16(br,1H),4.44(d,J6.5 Hz,2H),4.20(m,1H),3.80(s,3H),3.79(m,1H),3.76(s,3H),3.74(m, 2H),3.66-3.62(m,4H),3.43-3.37(m,2H),2.31(br,1H),1.76(br,2H)； C42H43NO7的ESI MS计算值673.7,观察值[M+Na]+696.7。
化合物S126
Figure DEST_PATH_IMAGE224
使用针对化合物S113所述的方案制备油状化合物S126，产物 (S126)产率为78％。ESI MS：C51H60N3O8P计算值874.0,观察值896.9 [M+Na]+,913.0[M+K]+；31P NMR(202MHz,CDCl3；ppm):δ148.90, 148.76。
无碱基间隔基S131的合成-通用方案：
Figure DEST_PATH_IMAGE225
化合物S127
Figure DEST_PATH_IMAGE226
在氩气下向S109(2.56g，11.4mmol)的二氯甲烷(50mL)溶液中加入溴乙腈(3.01g，25.1mmol)、氧化银(I)(5.28g，22.8mmol) 和四丁基碘化铵(0.84g，2.28mmol)，并将得到的混合物搅拌过夜。将混合物通过
Figure DEST_PATH_IMAGE227
过滤，并将滤液蒸发以得到黑色残余物，将其在ISCO伴侣上进行快速硅胶柱纯化(己烷/乙酸乙酯，15-90％)以得到1.34g(39％)粘性油状物所需化合物S127。ESI MS：C16H18N2O4计算值302.3,观察值[M+H]+303.3。
化合物S128
Figure DEST_PATH_IMAGE228
在氩气下向化合物S127(1.34g，4.43mmol)的THF(30mL) 溶液中添加LiAlH4的THF(2M，8.9mL，17.7mmol)溶液，并将混合物加热至55℃4小时。添加另一份LiAlH4的THF溶液(2M， 4mL，8.0mmol)，并继续搅拌4小时。反应完成后，将混合物冷却至室温，并用Na2SO4.10H2O淬灭。将固体滤出并用乙酸乙酯洗涤。将滤液经无水Na2SO4干燥。将混合物过滤并蒸发以得到残余物，将其溶于二氯甲烷(20mL)。向该溶液添加Fmoc-OSu(1.5g，4.43mmol)和DIEA(0.87mL，5.0mmol)。将混合物搅拌1小时，然后蒸发以得到残余物，将其在ISCO伴侣上进行快速硅胶柱纯化(己烷/乙酸乙酯，20-90％)，得到1.04g(31％)白色泡沫状化合物S128。1H NMR (500MHz,CDCl3；ppm):δ7.75(4H，dd,J 7.5,4.5Hz)，7.58(4H,t,J 7.0 Hz),7.48(2H,d,J7.0Hz),7.41-7.34(7H,m),7.32-7.26(4H,m),5.44 (1H,s),5.15-5.05(2H,m),4.44(2H,d,J5.5Hz),4.38(2H,d,J6.0Hz), 4.25-4.15(2H,m),4.10(2H,d,J11.5Hz),3.82(2H,d,J 11.5Hz),3.78 (2H,s),3.53(2H,s),3.42(2H,s),3.36-3.27(4H，m),3.25(2H,s)；ESI MS：C46H46N2O8计算值754.9,观察值[M+H]+755.3。
化合物S129
Figure DEST_PATH_IMAGE229
将化合物S128(1.1g，1.51mmol)溶于AcOH/H2O混合物(10mL, 3:1)，并在55℃下继续反应5小时。反应完成后，将挥发物蒸发并与甲苯(2x20mL)共蒸发，并将残余物在ISCO伴侣(己烷/乙酸乙酯， 30-100％)上进行快速硅胶柱纯化以得到0.54g(54％)白色泡沫状化合物S129。1H NMR(500MHz,CDCl3；ppm):δ7.75(4H,d,J 7.5Hz), 7.58(4H,d,J 7.5Hz),7.39(4H,t,J 7.5Hz),7.30(4H,t,J 7.5Hz), 5.20-5.05(2H,m),4.41(4H,d，J 6.5Hz),4.21(4H,t,J 6.5Hz),3.64 (4H,s),3.48(8H,s),3.36(4H,s)；ESI MS：C39H42N2O8计算值666.7,观察值[M+H]+667.3。
化合物S130
Figure DEST_PATH_IMAGE230
在0℃下向二醇S129(0.73g，1.1mmol)、DIPEA(0.19mL， 1.1mmol)和DMAP(0.013g，0.11mmol)的二氯甲烷(6mL)溶液中滴加DMTrCl(0.34g，0.99mmol)的二氯甲烷(1mL)溶液。将所得混合物温热至室温并搅拌过夜。蒸发混合物以得到残余物，将其在ISCO(己烷/乙酸乙酯，20-100％)上进行快速硅胶柱纯化以得到0.47g(44％)白色泡沫状单二甲氧基三苯甲基保护的化合物S130。1H NMR(500MHz，CDCl3；ppm):δ7.75(4H,d,J 7.5Hz),7.58(4H,d,J7.5Hz),7.39(4H,t,J 7.5Hz),7.32-7.25(8H,m),7.17(4H,d,J 6.5Hz), 6.83(4H,d,J6.5Hz),5.20-5.05(2H,m),4.41(4H,d,J 6.5Hz),4.21 (4H,t,J 6.5Hz),3.82(6H,s),3.64(4H,s),3.48(8H,s),3.36(4H,s)； ESI MS：C60H60N2O10计算值969.1,观察值[M+Na]+991.3。
化合物S131
Figure DEST_PATH_IMAGE231
在-78℃下3-Fmoc-氨基-丙烷-1-醇(0.090g,0.30mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.18mL，1.05mmol)的无水CH2Cl2(3.0mL)溶液中滴加双-(N,N-二异丙基氨基)-氯膦(0.085g，0.32mmol)的无水CH2Cl2 (1.0mL)溶液。将反应混合物温热至室温并搅拌1.5小时。添加化合物S130(0.30g，0.30mmol)的1.0mL无水CH2Cl2溶液，并将所得混合物搅拌10分钟。向反应混合物添加ETT(0.72mL，乙腈中0.25M， 0.18mmol)溶液，并将所得混合物搅拌3h。将混合物用CH2Cl2(20mL) 稀释，并用饱和碳酸氢钠水溶液(20mL)和盐水(20mL)洗涤。将有机层经无水硫酸钠干燥，并将滤液真空蒸发以得到残余物，使用乙酸乙酯/己烷和3％三乙胺作为共溶剂(0-30％梯度)将其在ISCO 伴侣上进行快速硅胶柱纯化以得到0.12g白色泡沫状产物S131 (32％)。ESIMS：C84H91N4O13P计算值1395.6,观察值1395.7[M]+；31P NMR(202MHz,CDCl3):δ146.41。
化合物dT4
Figure DEST_PATH_IMAGE232
FmocNH-PEG2-羟基-二异丙基氨基-dT(5′-DMT)亚磷酰胺(dT4) 的合成。在氩气下将5’-DMT-脱氧胸苷(4.30g，7.89mmol)和DIEA (1.51mL，8.68mmol)在CH2Cl2(40mL)中的搅拌悬浮液冷却至-78 ℃。滴加双(二异丙基氨基)氯膦(2.32g，8.68mmol)的CH2Cl2(10mL) 溶液。将混合物从冷却浴中移出并搅拌1h。向反应混合物中添加在 CH2Cl2(15mL)中的FmocNH-PGE2-OH(S108,2.93g,7.89mmol)，然后添加ETT(乙腈中0.25M，18.9mL)溶液。搅拌过夜后，将混合物真空浓缩，再溶解于EtOAc，并用饱和NaHCO3(aq.)和盐水洗涤。真空除去有机层以得到白色泡沫。将该粗物质通过SiO2色谱法纯化以提供标题亚磷酰胺(dT4，4.1g，50％产率)。
上述合成方案用于合成不同三酯的其他亚磷酰胺前体。
化合物dU6
Figure DEST_PATH_IMAGE233
在室温下在Ar(g)下在搅拌下向dU1(3.3g，5.0mmol)、1-甲基咪唑(1.2mL，15.0mmol)和碘(1.9g，15.0mmol)的THF(10 mL)溶液中滴加叔丁基二甲基甲硅烷基氯(0.8g，5.5mmol)的THF (5mL)溶液。将反应在室温下搅拌1小时。TLC证实反应完成。真空除去溶剂，将粗品溶于乙酸乙酯中并用浓缩NaHCO3水溶液洗涤。将有机相经Na2SO4干燥、过滤并蒸发液体。使用ISCO伴侣(己烷/乙酸乙酯，0-50％)将粗品通过快速硅胶柱纯化，以定量产率提供固体状dU2。NMR与已公布的一致。Nucleic Acids Research,2011, Vol.39，No.9,3962-3971。
将溶解在具有三异丙基硅烷(1.0mL，5.0mmol)的80％乙酸水溶液(40mL)中的dU2(3.9g，5.0mmol)溶液在室温下搅拌1小时。TLC证实反应完成。真空除去溶剂。使用ISCO伴侣(己烷/乙酸乙酯，0-60％)将粗品通过快速硅胶柱纯化以得到1g(43％)固体状所需化合物dU3。ESI MS：C15H25IN2O5Si计算值468.4,观察值 [M+Na]+491.0。
在Ar(g)下向在冰水浴中冷却至0℃的dU3(1.0g，2.2mmol) 的THF(20mL)溶液添加氢化钠(60％分散体，0.2g，4.7mmol)。将反应在0℃下搅拌30分钟。滴加碘甲烷(0.7mL，10.8mmol)，并将反应在0℃下搅拌3小时。RP-HPLC/MS证实反应完成。在0℃下用20mL甲醇淬灭反应并温热至室温。添加饱和NaHCO3水溶液，并将混合物用CH2Cl2萃取。将有机相经Na2SO4干燥、过滤并将液体真空浓缩。通过硅胶柱色谱法(己烷/乙酸乙酯，0-50％)纯化以得到固体dU4(0.6g，58％产率)。ESI MS：C16H27IN2O5Si计算值482.4, 观察值[M+H]+483.1。
在搅拌下在Ar(g)下向冷却的dU4(0.6g，1.3mmol)的THF(20 mL)溶液中滴加叔丁基氟化铵(1M THF，3mL，3.0mmol)。将冷却的溶液搅拌30分钟，然后温热至室温。3.5小时后，RP-HPLC/MS 证实反应完成。将粗产物通过硅胶柱色谱法(二氯甲烷/甲醇，0-10％) 纯化以得到固体dU5(0.4g，92％产率)。ESIMS：C10H13IN2O5计算值368.1,观察值[M+H]+369.0。
在室温下在Ar(g)下在搅拌下向dU5(0.4g，1.2mmol)的二氯甲烷(5mL)溶液中滴加2′-氰基乙基-N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰胺(0.4mL，1.3mmol)的二氯甲烷(5mL)溶液。将反应在室温下搅拌30分钟。然后添加乙硫基四唑(ACN中的0.25M溶液，2.9mL， 0.7mmol)，并使反应继续过夜。TLC证实反应完成。真空除去溶剂，并将粗混合物用20mL二氯甲烷稀释，依次用饱和NaHCO3溶液 (10mL)和盐水(10mL)洗涤。将有机相经Na2SO4干燥、过滤并蒸发液体。将粗制混合物溶于乙酸乙酯，并使用Isco伴侣(己烷/乙酸乙酯，0-100％)通过硅胶柱纯化以得到0.3g(49.9％)固体状所需化合物dU6。ESIMS：C19H30N4O6P计算值568.3,观察值567.3[M-H]-；31P NMR(202MHz,CDCl3,ppm):δ149.25。
化合物dU9
通过在以下所示的标准反应条件下使dU3反应来制备标题化合物。31P-NMR(202mHz,CDCl3,ppm):δ149.42,149.31；MSESI-m/z 实测值667.1[M-H].MSESI+m/z实测值669.2[M+H],691.3 [M+Na]。
Figure DEST_PATH_IMAGE234
制备键合至辅助部分的接头：
化合物PP2、PP3和PP4
Figure DEST_PATH_IMAGE235
制备(5-叠氮戊酰基)-N-Boc赖氨酸(PP1)。将ε-N-Boc赖氨酸 (9.46g，38.4mmol)和K2CO3(2.67g,19.3mmol)溶于1:1 THF:H2O (60mL)中。添加在THF(10mL)中的五氟苯基-5-叠氮戊酸酯(10.8g， 34.9mmol)，并将反应在室温下搅拌过夜。通过RP-HPLC-MS,394.2 [M+Na]观察所需产物。通过用1N HCl(水溶液)滴定将反应酸化至pH 5，并将产物用EtOAc(3×100mL)萃取。将有机层依次用H2O(50 mL)和盐水(50mL)洗涤。将有机层经MgSO4干燥，并真空浓缩成浓浆。将粗产物通过硅胶柱色谱法纯化以得到期望的白色针状物产物PP2(8.1g，62％产率)。ESI MS+质量计算值C16H29N5O5:371.4, 实测值:394.2[M+Na]+。
用于PP1的聚乙二醇化的通用方案：制备(5-叠氮基戊酰基)- ε-N-(NH-BocPEG24)赖氨酸(PP4)。用HCl(2mL，二恶烷中4N) 处理PP1(0.74g，2.0mmol)4小时。HPLC-MS显示完全脱保护， 272.2[M+H]+。用1:1 H2O:乙腈(10mL)稀释反应，冷冻并冻干过夜，以定量产率得到白色固体状PP2。用HATU(0.34g，0.88mmol)、 HOBt(0.14g，0.88mmol)和DIEA(0.7mL，4.0mmol)将DMF (3mL)中的NHBoc-PEG24酸(1.1g，0.88mmol)活化，然后用 PP2(0.24g，0.8mmol)处理2小时。RP-HPLCMS显示形成所需的 PP4。将粗产物通过RP-HPLC纯化以得到白色固体状PP4(0.55g， 46％产率)。ESI MS+质量计算值C67H130N6O30:1499.77,实测值:1499.9[M+H]+,1400.8[M-Boc]+。
Figure DEST_PATH_IMAGE236
使用WO2015/188197所述的程序，由可商购的起始原料制备 BisPegX-NH2和TrisPegX-NH2(其中X＝各种PEG长度)。
PP2、PP3和PP4的聚乙二醇化的一般方案：用HATU(37mg， 0.1mmol)、N,N-二异丙基乙胺(49mL,0.3mmol)和mPEG48-NH2 (200mg,0.09mmol)处理溶于DMF(1mL)中的赖氨酸PP1(38mg， 0.1mmol)。RP-HPLC-MS显示将PEG48完全添加到PP1中。将粗产物通过RP-HPLC纯化以得到白色固体状NHBoc PP7(97mg，42％产率)。ESI MS+质量计算值C113H224N6O52:2499.03,实测值:833.7 [M+3H]3+,625.6[M+4H]4+。将PP7用HCl(2mL，二恶烷中4N)脱保护4小时。HPLC-MS显示完全脱保护，如通过具有起始原料质量的峰的消失所观察。用1:1 H2O:乙腈(10mL)稀释反应，冷冻，并冻干过夜，以定量得到白色固体PP8。ESI MS+质量计算值C108H216N6O50:2398.88,实测值:1199.8[M+2H]2+,800.3[M+3H]3+, 600.5[M+4H]4+,480.6[M+5H]5+。
Figure DEST_PATH_IMAGE237
在该方案中，条件是：
A)6-甲基四嗪-OSu、HATU、Hünig碱、DMF；和
B)DBCO-CpG、乙腈/H2O；
其中6-甲基四嗪-OSu具有下式：
Figure DEST_PATH_IMAGE238
并且
DBCO-CpG具有下式：
Figure DEST_PATH_IMAGE239
制备加载有多核苷酸(PP28和PP30)的接头的一般方案。
PP12和PP16的四嗪缀合处理：将PP12(43mg，0.12mmol) 溶于DMF(0.5mL)中，用HATU(4.6mg，0.12mmol)、DIEA(12.7 μL，0.73mmol)和5分钟后用6-甲基-四嗪-OSu(19.9mg，0.61mmol) 处理。将粗反应在室温下搅拌30分钟，RP-HPLCMS显示6-甲基- 四嗪羧酸盐与PP12完全偶联。通过RP-HPLC纯化粗产物，并将合并的级分冻干以得到紫色固体状PP27(39mg，85％产率)。ESI MS+ 质量计算值：C170H325N11O76:3739.47,实测值:833.7[M+3H]3+,625.6 [M+4H]4。将纯PP27在乙腈:水(1:1)中的DBCO-CpG中处理，并在37℃下孵育1-2小时，然后在室温下再孵育1小时以得到PP28。将PP28通过制备型AEX(20mM磷酸盐和20mM磷酸盐-1M溴化钠)纯化。
CpG加载的接头PP28和PP30的另一种一锅法路线。将PP12 (400nmol)用乙腈:水(1:1)中的DBCO-CpG(420nmol)处理，并在37℃下孵育1-2小时，然后在室温下再孵育1小时。将DMSO 储备溶液中的四嗪-OSu(4000nmol)添加到粗PP12-DBCO-CpG溶液中，并将紫色溶液在室温下反应3小时和1-2小时以得到PP28。将PP28粗品通过制备型RP-HPLC(水和10％乙腈:水中50mM TEAA)或制备型AEX(20mM磷酸盐和20mM磷酸盐-1M溴化钠) 纯化。
Figure DEST_PATH_IMAGE240
四嗪-PEG24-OPFP(PP32)的制备。在Ar(g)下在搅拌下向氨基 -PEG24-甲酸(1.0g，0.9mmol)和二异丙基乙胺(0.8mL，4.4mmol) 的DMF/水(1:1，12mL)溶液中滴加DMF(3mL)中的甲基四嗪苯基乙酰基琥珀酰亚胺酯(370mg,1.1mmol)。将反应在室温下搅拌2 小时。RP-HPLC/MS表明形成产物。真空除去溶剂，并将粗产物通过RP-HPLC(TFA改性剂)纯化以得到1.1g(80％)的PP31。 C62H111N5O27的ESI MS计算值1358.56,观察值[M+H]+1358.8。在 Ar(g)下向PP31(109mg，0.08mmol)的二氯甲烷(3mL)溶液中添加无水吡啶(32mg，0.4mmol)和五氟苯基三氟乙酸酯(67mg， 0.24mmol)。将反应在室温下搅拌过夜。真空除去溶剂。将粗产物重新溶于EtOAc中，并用NaHCO3(5％w/v)(3x)水溶液和盐水(1x) 洗涤。将有机相经Na2SO4干燥、过滤、并真空浓缩以定量得到PP32。无需进一步纯化用于下一步。ESIMS：C68H110F5N5O27计算值1524.61, 观察值[M+2H]2+763.0。
Figure DEST_PATH_IMAGE241
制备PP34。在Ar(g)下向mPEG48-胺(2.15g，1.00mmol)和二异丙基乙胺(0.87mL，5.00mmol)的DMF/水(1:1，10mL)溶液中滴加DMF(5mL)中的Cbz-Ne-Boc-L-赖氨酸琥珀酰亚胺酯 (570mg，1.2mmol)。将反应混合物在室温搅拌2小时。RP-HPLC/MS 表明形成产物PP33。将反应混合物真空浓缩并通过硅胶色谱法 (CH2Cl2:MeOH 0-10％)纯化。回收的PP33直接用于下一步反应。ESI MS：C116H223N3O53计算值2508.0,观察值[M+3H]3+836.7,[M+4H]4+ 627.9。用氮气(g)鼓气PP33(1.00mmol)的MeOH溶液，并添加活性炭上的钯(10％wt，催化的)。将溶液交替抽真空并用氢气(g) (3X)吹扫。2小时后，RP-HPLC/MS显示形成PP34。将不均匀混合物通过硅藻土床过滤，并用大量甲醇洗涤。真空除去溶剂，得到 PP34(2.0g，84％产率，经2步骤)。ESIMS：C108H217N3O51计算值2373.87,观察值[M+3H]3+792.0。
Figure DEST_PATH_IMAGE242
制备PP37。在Ar(g)下在搅拌下向PP32(124mg，0.08mmol) 和二异丙基乙胺(31mg，0.24mmol)的DMF/水(1:1，10mL)溶液中滴加DMF/水(1:1,10mL)中的PP34(230mg，0.1mmol)。将反应在室温搅拌2小时，并且RP-HPLC/MS表明形成产物PP35。真空除去溶剂，PP35无需进一步纯化用于下一步。ESI MS： C170H326N8O77计算值3714.4,观察值[M+4H]4+929.5,[M+5H]5+743.8。在Ar(g)下用HCl(二恶烷中4N，5mL)处理粗制PP35(0.08 mmol)。将反应在室温下搅拌2小时，并且RP-HPLC/MS表明完全去除Boc保护基。真空除去溶剂，并将胺用双-Peg3-PFP酯(230mg， 0.4mmol)的DMF(5mL)和二异丙基乙胺(140uL，0.8mmol)溶液酰化。2小时后，RP-HPLC/MS表明形成产物PP37。真空除去溶剂，并将粗产物通过RP-HPLC(TFA改性剂)纯化，以四TFA盐的形式提供PP37，31mg，产率8.7％。ESI MS：C181H333F5N8O81计算值4012.56,观察值[M+3H]3+1338.3,[M+4H]4+1004.0,[M+5H]5+803.4, [M+6H]6+669。
包含辅助部分的接头列表：
Figure DEST_PATH_IMAGE243
Figure DEST_PATH_IMAGE244
Figure DEST_PATH_IMAGE245
在上表中，标识为Y或Z的基团具有以下结构：
Figure DEST_PATH_IMAGE246
在上表中，标识为“p313+N3-戊酰胺”的基团Z是指p313与具有N3-戊酰胺作为Z的接头之间的环加成反应的产物。
使用本文和WO 2015/188197描述的标准合成程序合成表1中所示的亚磷酰胺单体。
用于手性硫代磷酸酯寡核苷酸合成的双环氧杂氮杂膦酰基单体使用Wada,J.Am.Chem.Soc.130:16031-16037,2008报道的文献方案制备。
表1
Figure DEST_PATH_IMAGE247
Figure DEST_PATH_IMAGE248
Figure DEST_PATH_IMAGE249
Figure DEST_PATH_IMAGE250
Figure DEST_PATH_IMAGE251
Figure DEST_PATH_IMAGE252
Figure DEST_PATH_IMAGE253
Figure DEST_PATH_IMAGE254
手性无碱基间隔基–化合物X7、X8、X9和X10：
Figure DEST_PATH_IMAGE255
X7和X8合成：
Figure DEST_PATH_IMAGE256
X9和X10合成：
Figure DEST_PATH_IMAGE257
以下是可以使用本领域已知的方法和本文所述的方法制备的其他亲水性核苷亚磷酰胺：
Figure DEST_PATH_IMAGE258
其中R为OH、任选取代的氨基或–CO2R1(R1为H或抗衡离子)，且n为1-4的整数；
Figure DEST_PATH_IMAGE259
其中R为OH、OAc、OMe、任选取代的氨基或CO2R1(R1为H 或抗衡离子)，n为1-51的整数。
以下是可以使用本领域已知的方法和本文所述的方法制备的进一步取代的核苷亚磷酰胺：
Figure DEST_PATH_IMAGE260
其中R和R1各自独立地为H或任选取代的C1-6烷基(例如， Me、Et、i-Pr或n-Bu)。
以下亚磷酰胺购自Glen Research(Sterling，VA)或ChemGenes (Wilmington，MA)或使用本文所述的标准方案制备：
Figure DEST_PATH_IMAGE261
这些中间体可用于制备本发明的多核苷酸(例如，含有5′-末端修饰的核苷的多核苷酸)。5′-末端修饰的核苷的非限制性实例是5- 卤代尿苷、5-炔基尿苷、5-杂芳基尿苷和5-卤代胞苷。
5’-封端
a)5’-5’-封端
Figure DEST_PATH_IMAGE262
b)5′-磷酸或硫代磷酸酯封端：
Figure DEST_PATH_IMAGE263
基于小分子的靶向部分的合成
用于制备基于小分子的靶向部分的示例性化合物描述于WO 2015/188197(例如，WO 2015/188197中描述的化合物M1-M30)。
葡萄糖醇辅助部分的合成
用于制备基于葡萄糖醇的辅助部分的示例性化合物描述于WO 2015/188197(例如，WO 2015/188197中描述的化合物 POH1-POH10)。
通用多核苷酸合成：
一般方案
Figure DEST_PATH_IMAGE264
实验细节：
使用以下试剂和溶剂在MerMade 6或12上进行自动化的多核苷酸合成(1μmol规模)：
氧化剂–THF/吡啶/H2O中的0.02MI2(每循环60s氧化)，
硫化试剂II–二噻唑衍生物/吡啶/乙腈(0.05M，在6:4吡啶: 乙腈中)(每循环60s)
解封–3％三氯乙酸(每循环2x40s解封)，
封端混合物A–THF/2,6-二甲基吡啶/Ac2O(每循环60s封端)，和
封端混合物B–THF中的16％甲基咪唑(每循环60s封端)
标准多核苷酸合成条件的例外如下：
-使用称为Uny-接头的具有非核苷接头的CPG支持物。
-合成之前，将所有2′-脱氧核糖-磷酰胺重悬于100mM的100％无水乙腈中，除了取决于原料的溶解度，将一些修饰的2′-脱氧-磷酰胺溶于100mM的THF/乙腈混合物(1:4)中。
-用2.5倍摩尔过量的5-苄硫基-1H-四唑(BTT)进行亚磷酰胺的活化。每次插入将活化的2′-脱氧核糖-磷酰胺偶联2x1分钟，并且每次插入将修饰的亚磷酰胺偶联2x3分钟。
-用0.05M吡啶/乙腈(6:4)中的硫化试剂II进行主链硫化1分钟。
多核苷酸脱保护和纯化方案：
在自动多核苷酸合成后，在室温下将固体支持物和碱保护基(例如A-Bz、C-Ac、G-iBu等)和脱保护磷酸三酯的甲酯在1mL AMA 中裂解和去保护(1:1比例的甲醇中的36％氨水和40％甲胺)2h或更长时间，然后离心蒸发。
将粗制的多核苷酸沉淀重悬于100μL的50％乙腈中，短暂加热至65℃并充分涡旋。
为了纯化多核苷酸，用以下缓冲液/梯度将100μL粗制多核苷酸注射到RP-HPLC上：
-缓冲液A＝水中的50mM TEAA；
-缓冲液B＝90％的乙腈；和
-流速＝1mL/min；
-梯度：
o 0-2分钟(100％缓冲液A/0％缓冲液B)，
o 2-42分钟(0％-60％缓冲液B)，和
o 42-55分钟(60％-100％缓冲液B)。
DBCO缀合和纯化方案：
如本文所述，将DBCONHS酯缀合至粗制的2’-脱氧DMT-多核苷酸。将粗制的多核苷酸沉淀悬浮于45μLDMSO中，短暂加热至65 ℃，并充分涡旋。添加5μL DIPEA，然后添加预先溶解在DMSO(1M) 中的DBCO-NHS酯(30eq)。使反应静置10分钟或直至通过MALDI 确认产物形成。用以下缓冲液/梯度将总共80μL的粗制多核苷酸样品注入RP-HPLC：
-缓冲液A＝水中的50mM TEAA
-缓冲液B＝90％的乙腈
-流速＝1mL/min；
-梯度：
o 0-2分钟(90％缓冲液A/10％缓冲液B)
o 2-42分钟(0％-60％缓冲液B)
o 42-55分钟(60％-100％缓冲液B)。
在主要的RP-HPLC峰上，收集0.5mL级分并通过MALDI-TOF 质谱分析以确认所需质量的存在。将质量选择的纯化级分冷冻并冻干。一旦干燥，将级分重悬、与相应的级分合并、冷冻并冻干。
DMT裂解：将冻干的沉淀悬浮于20μL的50％乙腈中，并添加 80μL的乙酸，将样品在室温下静置1h，冷冻并冻干。将干燥的样品重新溶于20％乙腈中，并通过NAP 10(SephadexTM-G25 DNA Grade) 柱脱盐。将收集的纯级分冷冻并冻干以得到最终产物。
使用无碱基间隔基的一般缀合方案：
链接反应–一般方案：
Figure DEST_PATH_IMAGE265
其中：
每个q为0或1；
每个m为0-5的整数；
Z为O或S；
RO是多核苷酸中与核苷连接的键；
R是与H、多核苷酸中的核苷、固体支持物或封端基团(例如-(CH2)3-OH)连接的键；
每个R’独立地为H、–Q1–QA1、生物可逆基团或非生物可逆基团；
每个R”独立地为H、–Q1–QA–Q2–T、生物可逆基团或非生物可逆基团；
每个RA独立地为H或–ORC，其中RC为–Q1–QA1、生物可逆基团，非生物可逆基团或与固体支持物连接的键；
每个RB独立为H或–ORD，其中RD为–Q1–QA–Q2–T、生物可逆基团或非生物可逆基团；
其中：
每个Q1独立地为二价、三价、四价或五价基团，其中一个化合价与QA或QA1键合；第二化合价是开放的，并且当存在时，每个其余化合价独立地键合至辅助部分；
每个Q2独立地为二价、三价、四价或五价基团，其中一个化合价与QA键合；第二化合价与T键合，并且当存在时，每个其余化合价独立地键合至辅助部分；
QA是1,2,3-三唑-1,4-二基、任选取代的C6-16三唑杂亚环基(例如
Figure DEST_PATH_IMAGE266
)、任选取代的C8-16三唑亚环烯基(例如
Figure DEST_PATH_IMAGE267
)或二氢哒嗪基团(例如反式-
Figure DEST_PATH_IMAGE268
或反式 -
Figure DEST_PATH_IMAGE269
)；
QA1是任选取代的C2-12炔基、包含内环碳-碳三键任选取代的C6-16杂环基(例如
Figure DEST_PATH_IMAGE270
)、任选取代的C8-16环炔基(例如
Figure DEST_PATH_IMAGE271
)或任选取代的C4-8应变环烯基(例如，反式环辛烯基)；和
T是靶向部分
条件是起始原料至少包含一个–Q1–QA1，并且产物包含–Q1–QA–Q2–T；和
条件是起始原料和产物包含0或1个与固体支持物连接的键。
缀合方法
Cu-催化的链接反应
铜-THPTA络合物制备
将5mM的五水合硫酸铜水溶液(CuSO4-5H2O)和10mM的三(3- 羟丙基三唑基甲基)胺(THPTA)水溶液以1:1(v/v)(1:2摩尔比) 混合并使其在室温下静置1小时。该络合物可用于催化Huisgen环加成反应，例如，如下文一般缀合方案所示。
一般方案(100nM规模)
向1.7mL Eppendorf管中的710μL水和100μL叔丁醇(最终体积的10％)的溶液中添加60μL铜-THPTA络合物，然后添加50μL 2mM的寡核苷酸、60μL 20mM抗坏血酸钠水溶液和20μL 10mM 靶向叠氮化物部分的溶液。充分混合后，使溶液在室温下静置1小时。通过凝胶分析确认反应完成。将反应混合物添加到包含5-10倍摩尔过量的
Figure DEST_PATH_IMAGE272
TAAcONa(树脂结合的EDTA钠盐)的螺帽瓶中。将混合物搅拌1小时。然后将该混合物通过illustraTMNapTM-10 柱SephadexTM洗脱。然后将所得溶液冷冻并冻干过夜。
通过酰胺键缀合：
通过酰胺化的缀合可以在本领域已知的酰胺化反应条件下进行。例如参见Aaronson等人,Bioconjugate Chem.22:1723-1728,2011。
Figure DEST_PATH_IMAGE273
其中：
每个q为0或1；
每个m为0-5的整数；
Z为O或S；
RO是多核苷酸中与核苷连接的键；
R是与H、多核苷酸中的核苷、固体支持物或封端基团(例如-(CH2)3-OH)连接的键；
每个R’独立地为H、–Q1–QA1、生物可逆基团或非生物可逆基团；
每个R”独立地为H、–Q1–QA–Q2–T、生物可逆基团或非生物可逆基团；
每个RA独立地为H或–ORC，其中RC为–Q1–QA1、生物可逆基团或非生物可逆基团；
每个RB独立为H或–ORD，其中RD为–Q1–QA–Q2–T、生物可逆基团或非生物可逆基团；
其中：
每个Q1独立地为二价、三价、四价或五价基团，其中一个化合价与QA或QA1键合；第二化合价是开放的，并且当存在时，每个其余化合价独立地键合至辅助部分；
每个Q2独立地为二价、三价、四价或五价基团，其中一个化合价与QA键合；第二化合价与T键合，并且当存在时，每个其余化合价独立地键合至辅助部分；
QA是任选取代的包含–C(O)–N(H)–或–N(H)–C(O)–的C2-12杂亚烷基；
QA1is–NHRN1或–COOR12，其中RN1为H、N-保护基或任选取代的C1-6烷基，并且R12为H、任选取代的C1-6烷基或O-保护基；和
T是靶向部分，
条件是起始材料包含至少一个–Q1–QA1，并且产物包含–Q1–QA–Q2–T。
溶液相缀合
Figure DEST_PATH_IMAGE274
其中：
m为0-5的整数；
Z为O或S；
RO是多核苷酸中与核苷连接的键；
R是与H、多核苷酸中的核苷或封端基团连接的键；
每个R’独立地为H、–Q1–NH2、生物可逆基团或非生物可逆基团；
每个R”独立地为H、–Q1–NH–CO–Q2–T、生物可逆基团或非生物可逆基团；
每个RA独立地为H或–ORC，其中RC为–Q1–NH2、生物可逆基团或非生物可逆基团；
每个RB独立为H或–ORD，其中RD为–Q1–NH–CO–Q2–T、生物可逆基团或非生物可逆基团；
其中：
每个Q1独立地为二价、三价、四价或五价基团，其中一个化合价与–NH–CO–或–NH2键合；第二化合价是开放的，并且当存在时，每个其余化合价独立地键合至辅助部分；
每个Q2独立地为二价、三价、四价或五价基团，其中一个化合价与–NH–CO–键合；第二化合价与T键合，并且当存在时，每个其余化合价独立地键合至辅助部分；
T是靶向部分，
条件是起始材料包含–Q1–NH2，并且产物包含–Q1–NH–CO–Q2–T。
支持物上的缀合：
Figure DEST_PATH_IMAGE275
其中：
Z为O或S；
RO是多核苷酸中与核苷连接的键；
每个Q2独立地为二价、三价、四价或五价基团，其中一个化合价与–NH–CO–键合；第二化合价与T键合，并且当存在时，每个其余化合价独立地键合至辅助部分；和
T是靶向部分。
Figure DEST_PATH_IMAGE276
其中：
n是1-8的整数；
A是O或–CH2–；
Z为O或S；
RO是多核苷酸中与核苷连接的键；
每个Q2独立地为二价、三价、四价或五价基团，其中一个化合价与叠氮化物或三唑键合；第二化合价与T键合，并且当存在时，每个其余化合价独立地键合至辅助部分；和
T是靶向部分。
Figure DEST_PATH_IMAGE277
其中：
n是1-8的整数；
A是O或–CH2–；
Z为O或S；
RO是多核苷酸中与核苷连接的键；
每个Q2独立地为二价、三价、四价或五价基团，其中一个化合价与叠氮化物或三唑键合；第二化合价与T键合，并且当存在时，每个其余化合价独立地键合至辅助部分；和
T是靶向部分。
Figure DEST_PATH_IMAGE278
其中：
n是1-8的整数；
A是O或–CH2–；
Z为O或S；
RO是多核苷酸中与核苷连接的键；
每个Q2独立地为二价、三价、四价或五价基团，其中一个化合价与叠氮化物或三唑键合；第二化合价与T键合，并且当存在时，每个其余化合价独立地键合至辅助部分；和
每个T独立地是靶向部分。
磷酸三醋的Fmoc脱保护的代表性实例:
使包含具有Fmoc-保护的胺的磷酸三酯的多核苷酸经历脱保护条件，导致Fmoc脱保护，而没有观察到磷酸三酯向磷酸二酯的转化。
TCCATGACGTTCCTGACGTT(p68；参见表2；SEQ ID NO:68)
Figure DEST_PATH_IMAGE279
DBCO-NHS与p68缀合-代表性实例:
通过质谱分析证明，室温下DBCO-NHS与磷酸三酯中的氨基的缀合在10分钟内完成。
Figure DEST_PATH_IMAGE280
使用以下条件进行包含DBCO缀合基团的p68(参见表2)的 RP-HPLC纯化：
-缓冲液A＝水中的50mM TEAA；
-缓冲液B＝90％的乙腈；和
-流速＝1mL/min；
-梯度：
o 0-2分钟(100％缓冲液A/0％缓冲液B)，
o 2-22分钟(0％-100％缓冲液B)，和
o 22-25分钟(100％缓冲液B)。
可以使用类似的程序，使用例如2’-修饰的核苷亚磷酰胺，如本文所述的那些，来制备多核苷酸。这种程序提供于国际专利申请 PCT/US2015/034749。PCT/US2015/034749中的二硫化物磷酸三酯寡核苷酸合成的公开通过引用并入本文。
遵循本文所述的一般程序以制备表2中所列的免疫调节性多核苷酸。
Figure DEST_PATH_IMAGE281
Figure DEST_PATH_IMAGE282
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Figure DEST_PATH_IMAGE285
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Figure DEST_PATH_IMAGE291
Figure DEST_PATH_IMAGE292
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Figure DEST_PATH_IMAGE295
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Figure DEST_PATH_IMAGE297
Figure DEST_PATH_IMAGE298
Figure DEST_PATH_IMAGE299
Figure DEST_PATH_IMAGE300
Figure DEST_PATH_IMAGE301
Figure DEST_PATH_IMAGE302
Figure DEST_PATH_IMAGE303
Figure DEST_PATH_IMAGE304
Figure DEST_PATH_IMAGE305
Figure DEST_PATH_IMAGE306
在表2中，A栏提供DB-6细胞中IL-6表达(EC50，nM)；B栏提供DB细胞中IL-10表达(EC50， nM)；C栏提供Ramos蓝细胞中NFκB活化(EC50，nM)；D栏提供Hela-hTLR9-NFκB-luc细胞的NFκB 活化(EC50，nM)；E栏提供Hela-mTLR9-NFκB-luc细胞的NFκB活化(EC50，nM)；F栏提供小鼠脾细胞中IL-6分泌(EC50，nM)；G栏提供在95％小鼠血浆中预孵育24小时后小鼠脾细胞中IL-6分泌(EC50， nM)；H栏提供小鼠骨髓分化的DC中IL-6分泌(EC50，nM)；I栏提供用RNAiMax转染2h后小鼠 HEK-Blue细胞中的NFκB激活；J栏提供用RNAiMax转染2h后人HEK-Blue细胞中的NFκB激活(EC50， nM)。
本文包括的所有表中提供的序列的关键描述符如下：小写＝核苷3′-硫代磷酸酯；大写＝核苷3′-磷酸酯；斜体小写＝具有3′tBuDS-Ph(邻位)三酯的核苷(PS)；斜体大写＝具有3′tBuDS-Ph(邻位)三酯的核苷(PO)；dt＝dT(DBCO)；粗体双下划线t＝DBCO-C6-dT；粗体小写＝具有3′正丁基三酯(PS) 的核苷；粗体大写＝具有3′正丁基三酯的核苷(PO)；斜体粗体小写＝具有3′均炔丙基三酯(hPro)的核苷(PS)；斜体下划线小写＝具有3′DBCO-NH-PEG2三酯(N1)的核苷(PS)；斜体下划线大写＝具有 3′DBCO-NH-PEG2三酯(N1)的核苷(PO)；双下划线t＝dT PEG2-NH2三酯(PS)；双下划线T＝dT PEG2-NH2三酯(PO)；斜体双下划线小写＝具有3’PEG2-NH2三酯(N1)的核苷(PS)；斜体双下划线大写＝具有3’PEG2-NH2三酯(N1)的核苷(PO)；粗体斜体下划线大写U＝5-碘-2′-脱氧尿苷(PO)；粗体斜体下划线小写u＝5-碘-2′-脱氧尿苷(PS)；粗体下划线＝2′-氟核苷酸(PO)；撇号表示由撇号左侧字母标识的核苷酸包含2′-OMe修饰的核糖；带下划线的ng＝7-脱氮-2′-脱氧鸟苷(PS)；带下划线的 pT＝PEG4dT三酯(PO)；带下划线的pt＝PEG4 dT三酯(PS)；fT＝5-三氟甲基胸苷(PO)；fU＝5- 氟-2′-脱氧尿苷(PO)；bU＝5-溴-2′-脱氧尿苷(PO)；ft＝5-三氟甲基胸苷(PS)；fu＝5-氟-2′-脱氧尿苷(PS)；bu＝5-溴-2′-脱氧尿苷(PS)；C3＝C3间隔基(-(CH2)3-OH)(PO)；c3＝C3间隔基(-(CH2)3-OH) (PS)；C6＝己烷-1，6-二基；NH2C6＝6-氨基己-1-基；Te＝具有3′乙基三酯的胸苷(PO)；Ge＝具有3′乙基三酯的鸟苷(PO)；Ce＝具有3′乙基三酯的胞苷(PO)；Ue＝具有3′乙基三酯的5-碘尿苷(PO)； ue＝具有3′乙基三酯的5-碘尿苷(PS)；iu＝基于5-碘-2′-脱氧尿苷(PS)的5′-5′封端；iU＝基于5-碘-2′- 脱氧尿苷(PO)的5′-5′封端；X5＝X5-DBCO(PO)；x5＝x5-DBCO(PS)；X3＝X3无碱基间隔基(PO)；和 IR700是染料。在这里，描述符(PO)代表3′-磷酸；和(PS)代表3′-硫代磷酸酯；od＝5′-原二硫化物磷酸二酯；o＝5′-磷酸(PO)；ods＝5′-原二硫化硫代磷酸酯；s＝5′-硫代磷酸酯(PS)；上标“r”＝Rp PS；上标“s”＝Sp PS；Af＝2′-氟代腺苷(PO)；Csi＝dC O-甲硅烷基三酯(PO)；Tsi＝dT O-甲硅烷基三酯(PO)；tm＝2′-OMe胸苷(PS)；t(m)＝2′-OMOE胸苷(PS)。结构显示于图5和6中。
双链CpG:
退火和凝胶分析：
用DPBS(24.7mL)将多核苷酸p88(1mL，5mM储备液)添加到p144(3.3mL，2mM储备液)中。用p145以类似方式处理多核苷酸p88。将混合物加热至65℃10分钟。TBE尿素凝胶分析表明p88 完全退火(参见图2)。取出1μL的每个样品，添加到5μL的甲酰胺上样缓冲液中，并在200伏的电压下每孔上样到15％TBE-脲凝胶上40分钟，然后进行溴化乙锭(EtBr)染色。p88、p144和p145的结构参见表2。
使用p88/p144的双链CpG–代表性实施例(1)：
TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO:234)
AGCAGCAAAACAGCAAAACAGCAA(SEQ ID NO:468)
使用p88/p145的双链CpG–代表性实施例(2)：
TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO:467)
AGCAGCAAAACAGCAAAACAGCAA(SEQ ID NO:468)
实施例2：制备抗体-CpG缀合物
A.制备抗SIRPα抗体-CpG核苷酸缀合物
选择两种抗SIRPα抗体。一种抗SIRPα抗体阻断CD47的结合，其表位与CD47结合位点重叠(阻断)。另一种抗SIRPα抗体结合不同于CD47结合位点的表位(非阻断)。参见WO2018/057669，其公开通过引用整体并入本文。通过转谷氨酰胺酶(“mTGase”)反应缀合抗SIRPα抗体。
选择用于缀合的阻断抗体抗SIRPα1的VH和VL分别为 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSSNAMSWVRQAPGKG LEWVAGISAGGSDTYYPASVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARETWNHLFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:521)和 SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGGSYSS YYYAWYQQKPGQAPVT LIYSDDKRPSNIPERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYCGGYDQSSYTNPFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:525)。
选择用于缀合的非阻断抗体抗SIRPα2的VH和VL分别为 EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYDVNWVRQAPGKG LEWVSLISGSGEIIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKENNRYRFFDDWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:548)和 ETVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVYTYLAWYQQKPGQAPR LLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYYDRPPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:553)。
使用脱盐柱将在人IgG1中携带N297A突变的抗SIRPα抗体缓冲液交换为25mMTris，150mM NaCl，pH 8。向SIRPα抗体溶液中添加mTGase和具有N3-CH2CH2(OCH2CH2)23-NH2结构的 N3-PEG23-NH2接头。考虑到N297A突变，可以通过谷氨酰胺295 (EU编号)的侧链发生缀合。将所得混合物在室温下放置过夜。在 mTGase反应混合物中，最终抗体浓度为50μM；抗体与mTGase之比为约10，并且接头与抗体之比为约5。通过蛋白A纯化去除mTGase 和游离PEG接头。使用脱盐柱将修饰的抗体缓冲液交换为1xPBS。随后在修饰的抗体中具有叠氮基的SEQ ID NO：425的CpG核苷酸中炔烃的Hüisgen环加成反应，提供了具有式(D)或(E)结构的抗SIRPα-CpG核苷酸缀合物：
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其中Ab是阻断或非阻断抗SIRPα抗体；c是2’-脱氧胞苷；g是 2’-脱氧鸟苷；t是胸苷；X是5-溴-2′-脱氧尿苷；并且Z是
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B.制备抗CD56抗体-CpG核苷酸缀合物
鼠单克隆抗CD56抗体(克隆5.1H11)可商购获得。抗CD56 抗体通过活化的五氟苯基(PFP)酯缀合。向抗CD56抗体的Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水(DPBS)缓冲液(～2.5μg/μL)溶液中添加具有 N3-CH2CH2(OCH2CH2)8-CH2CO-PFP结构的叠氮基-PEG8-PFP酯，其中接头与抗体之比为20。将所得混合物在室温下放置过夜，以形成含叠氮基的抗体。然后通过使用DPBS作为洗脱液通过Amicon 30kD 旋转浓缩器交换缓冲液来去除过量的叠氮基-PEG8-PFP。随后在修饰的抗体中具有叠氮基的SEQ ID NO：425的CpG核苷酸中炔烃的 Hüisgen环加成反应，提供了具有式(F)或(G)结构的抗CD56-CpG 核苷酸缀合物：
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其中Ab是抗CD56抗体；s是约3或约4的整数；c是2’-脱氧胞苷；g是2’-脱氧鸟苷；t是胸苷；X是5-溴-2’-脱氧尿苷；并且Z 是
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实施例3:抗体-CpG核苷酸缀合物的生物学评估
从Blood Centers of the Pacific接收Trima残留物，并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)以1:4稀释。将稀释的血液分成四管，并用15mL
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Paque密度梯度培养基(GEHealthcare Life Sciences)支撑。将试管以400×g离心30分钟。将PBMC从界面收集，并重悬于FACS 缓冲液(含0.5％牛血清白蛋白的PBS)中。根据生产商的方案，使用单核细胞分离试剂盒II(Miltenyi Biotec)和LS柱(Miltenyi Biotec) 通过阴性选择纯化CD14+单核细胞。
将PBMC或CD14+细胞立即铺板于完全Roswell Park Memorial Institute培养基(RPMI)中的96孔形式(500K/孔)中。在5％CO2下向来自100nM-6.4pM的抗体和抗体-CpG核苷酸缀合物以及 1μM-64pM的SEQ ID NO：425的CpG多核苷酸的细胞中添加五倍系列稀释液24或48小时。通过以400xg离心五分钟沉淀细胞，并在4℃下在PBS中以1:2000稀释的100μLFixable Viability Dye eFluor 780(Thermo Fisher)中染色。将细胞离心，并在4℃下于100μL FACS缓冲液中染色30分钟，所述缓冲液包含2μLFcγR阻断试剂、 1.25μL抗CD14、抗CD3、抗CD19(用于抗SIRPα分析)和抗CD56、抗CD16、抗CD69、抗CD14、抗CD3和抗CD19(用于抗CD56分析)。将细胞离心，并在200μL FACS缓冲液中洗涤两次，并固定于100μL 0.5％多聚甲醛中。将CountBright绝对计数珠添加到每个孔中以计数细胞数量。在Attune NxT流式细胞仪上分析细胞，然后通过Flowjo 10.7进行数据分析。通过对eFluor 780阴性群体进行门控来排除死细胞。在门控CD14+细胞之前排除谱系特异性细胞 (CD19、CD3)，并且在门控CD56+CD16+细胞之前排除(CD19、 CD3、CD14)。
如图1和2所示，与分别在24小时和48小时时单独的CpG核苷酸和抗CD56相比，抗CD56-CpG核苷酸缀合物增强了NK细胞的活化。如通过CD69表达所确定，抗CD56-CpG核苷酸缀合物能够诱导NK细胞活化。
如图3和图4所示，抗SIRPα-CpG核苷酸与阻断抗体(抗SIRPα1) 或非阻断抗体(抗SIRPα2)的缀合物诱导整个PBMC和纯化的CD14+群体中CD14+单核细胞的增殖。使用计数珠来确定CD14+单核细胞的绝对数量，与单独的CpG核苷酸和抗SIRPα抗体相比，抗 SIRPα-CpG核苷酸与阻断抗体(anti-SIRPα1)或非阻断抗体 (anti-SIRPα2)的缀合物诱导了增殖。使用纯化的CD14+单核细胞的实验表明，细胞数量的增加是通过抗SIRP抗体将CpG核苷酸递送到细胞中的结果。这些数据共同表明，与不同表位结合的抗SIRPα抗体(阻断和非阻断)已显示将CpG核苷酸递送至CD14+单核细胞并导致其细胞数量扩增。
实施例4:测定KD
根据以下方案，使用两种方法直接固定抗体(通过GLC芯片) 分析了抗SIRPα抗体与来自各种物种(人v1、人v2、食蟹猴、小鼠 129、BL6、BALBc、NOD)的SIPRα、SIRPβ和SIRPγ的相互作用。使用配备有GLC或NLC传感器芯片的基于SPR的ProteOn XPR36 生物传感器(BioRad，Inc.，Hercules，CA)在25℃下进行所有实验。使用FREESTYLETM 293-FS细胞(Thermo Fisher)表达抗体。通过标准蛋白A亲和柱色谱法进行纯化，并将洗脱的抗体储存在PBS缓冲液中。
运行缓冲液是具有0.01％TWEEN-20的PBS pH7.4(PBST+)。所有分析物均以通过A280吸光度测定的标称浓度并使用其摩尔计算的消光系数使用。如所述以“一次性”动力学模式注射分析物(例如参见Bravman等人,Anal.Biochem.2006,358,281-288)。
对于使用GLC芯片的方法，将分析物注入，并使用蛋白胺偶联试剂盒流过固定(～1000RUs)在GLC芯片上的抗SIRPα抗体。对于固定步骤，将GLC芯片用稀释为1/100的EDAC/Sulpho-NHS 1:1(Biorad) 以25μL/min活化300s。将抗SIRPα抗体在10mM乙酸钠缓冲液pH4.5中稀释至80nM浓度，并以30μL/min在芯片上固定50秒。用乙醇胺以25μL/min灭活芯片300秒。将分析物(例如，来自不同物种的SIRP-α、SIRP-β、SIRP-γ)以“一次性”动力学模式以标称浓度 100、33、11、3.7、1.2和0nM注射。以100uL/min监测缔合时间 90s，并监测离解时间1200s。用Pierce IgG洗脱缓冲液/4M NaCl的 2:1v/v共混物再生所述表面。
通过从反应点数据(固定的蛋白质)减去点间数据(不包含固定的蛋白质)，然后从分析物注射的响应减去缓冲液“空白”分析物注射的响应，来对生物传感器数据进行双参考。将双参考数据全局拟合到简单的Langmuir模型，并根据表观动力学速率常数的比率计算KD值(KD＝kd/ka)。
测定阻断剂119、135和非阻断剂136人抗体与来自不同物种的各种SIRP-α、SIRP-β、SIRP-γ的结合动力学。这些抗体以高亲和力结合来自人v1、人v2和食蟹猴的SIRP-α。它们不结合各种小鼠 SIRP-α。但是，它们与人SIRP-β和人SIRP-γ表现出高亲和力结合。因此，这些抗体对于缀合和递送CpG免疫调节性多核苷酸以调节各种骨髓细胞群的活性将是有用的泛抗SIRP。结果总结于表3中。
测定人源化的AB21阻断抗体与来自不同物种的各种SIRP-α、 SIRP-β、SIRP-γ的结合动力学。AB21抗体以高亲和力结合来自人v1、人v2、食蟹猴、各种小鼠SIRP-α(NOD、BL6和BALBc)、人SIRP-β和SIRP-γ。因此，AB21阻断抗体对于缀合和递送CpG免疫调节性多核苷酸以调节各种骨髓细胞群的活性将是有用的泛抗SIRP。结果总结于表4中。
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实施例5:抗体-CpG核苷酸缀合物的体内评估
将CT26和MC38细胞分别以RPMI 1640(对于CT26)或DMEM (对于MC38)中2×106个细胞/小鼠的浓度注射到BALB/c和C57BL/6雌性小鼠的右侧。监测肿瘤直至肿瘤的平均大小达到75-300 mm3(取决于研究)。将小鼠随机分为PBS对照组、具有阻断抗体的抗SIRPα-CpG核苷酸缀合物(抗SIRPα1)组和具有非阻断抗体的抗SIRPα-CpG核苷酸缀合物(抗SIRPα2)组，其中取决于研究每组 5-7只小鼠。抗SIRPα抗体的序列描述于实施例2；CpG对应于p313。抗SIRPα-CpG核苷酸缀合物处理的小鼠给药0.1-10mg/kg，共两次，间隔三天。两种药物均腹膜内给药。用卡尺以两个维度测量肿瘤，并且肿瘤体积计算为：长×宽×宽×0.5，其中长度是两次测量值的较大者。
测量携带CT26肿瘤的小鼠，并通过肿瘤体积将其随机化。在第 4天，每组5只小鼠的平均肿瘤大小为75mm3。用10mg/kg抗SIRPα1 缀合物给药两次、间隔3天处理的小鼠显示肿瘤消除(4/5小鼠)，而与PBS相比，用10mg/kg非缀合的对照抗SIRPa抗体给药两次、间隔3天处理的小鼠显示次佳的肿瘤抑制(图7A)。测量携带CT26 肿瘤的小鼠，并通过肿瘤体积将其随机化。在第8天，每组7只小鼠的肿瘤的平均肿瘤大小为100mm3，用3mg/kg抗SIRPα1缀合物和抗SIRPα2缀合物间隔3天的两次处理显示完全肿瘤消除(图7B)。在第24天，用抗SIRPα1缀合物(抗SIRPα阻断抗体缀合物)处理的7只小鼠中的7只和用抗SIRPα2缀合物(抗SIRPα非阻断抗体缀合物)治疗的7只小鼠中的6只具有完整的肿瘤消除。如图7C所示，用0.1、0.3和1mg/kg抗SIRPα1缀合物处理平均肿瘤大小为300mm3的携带CT26肿瘤的小鼠(且每组5只小鼠)两次，间隔三天。观察到抑制肿瘤的剂量反应，其中最有效的是1mg/kg。在用1mg/kg抗SIRPα1缀合物处理的组中，在第21天，五只小鼠中的四只显示肿瘤消除。如图7D所示，间隔三天用两剂10mg/kg抗SIRPα1缀合物处理的平均155mm3肿瘤体积的携带MC38肿瘤的小鼠显示在第21 天完全消除肿瘤。总的来说，这些数据表明在多种肿瘤模型中的肿瘤消除，与未缀合SIRPa抗体相比SIRPa-CpG的比活性，使用SIRPa 阻断和非阻断抗体CpG缀合物消除肿瘤以及用低至1mg/kg的抗 SIRPα1缀合物处理小鼠时的肿瘤消除。
监测肿瘤直到肿瘤的平均大小达到300mm3。将小鼠随机分为 PBS对照和具有阻断抗体(抗SIRPα1)的抗SIRPα-CpG核苷酸缀合物，其中每组5只小鼠。抗SIRPα抗体的序列描述于实施例2。CpG 对应于p313。对于CT26模型，用1mg/kg给药抗SIRPα-CpG核苷酸缀合物处理的小鼠共2次，间隔3或7天。腹膜内施用抗SIRPα-CpG 核苷酸缀合物。用卡尺以两个维度测量肿瘤，并且肿瘤体积计算为：长×宽×宽×0.5，其中长度是两次测量值的较大者。
测量携带CT26肿瘤的小鼠，并通过肿瘤体积将其随机化。在第 10天，肿瘤的平均肿瘤大小为300mm3，并且用两剂1mg/kg抗 SIRPα1缀合物间隔三天或七天处理显示出肿瘤消除(图8A)。在第 25天，两组中五只小鼠中的四只无肿瘤。在第63天，间隔三天处理的四只存活小鼠中，所有小鼠均无肿瘤，而间隔七天处理的小鼠也具有四只存活小鼠，但仅两只仍无肿瘤(图8B)。
提供以上阐述的实施例以使本领域技术人员获得如何制备和使用所要求保护的实施方案的完整公开和描述，并且不意欲限制本文公开的内容的范围。对于本领域技术人员显而易见的修改旨在落入所附权利要求的范围内。本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，犹如每个这样的出版物、专利或专利申请都被具体地和单独地指出通过引用并入本文。
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Claims (126)

1.包含靶向部分、免疫调节性多核苷酸和接头的缀合物，其中所述靶向部分结合由NK细胞或骨髓细胞表达的抗原；并且所述接头将靶向部分与免疫调节性多核苷酸共价连接。
2.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述免疫调节性多核苷酸包含核苷间磷酸三酯。
3.根据权利要求1或2所述的缀合物，其中所述免疫调节性多核苷酸包含具有修饰的核碱基的核苷酸。
4.根据权利要求1-3任一项所述的缀合物，其中所述缀合物具有式(C)的结构：
Figure FDA0003110709380000011
或其立体异构体、两种或更多种非对映异构体的混合物、互变异构体、或两种或更多种互变异构体的混合物；或其药学可接受的盐、溶剂化物或水合物；
其中：
Ab是靶向部分；
每个LN独立地是接头；
每个Q独立地是免疫调节性多核苷酸；
每个e独立地是约1、约2、约3或约4的整数；和
f是约1、约2、约3或约4的整数。
5.根据权利要求4所述的缀合物，其中f是约1的整数。
6.根据权利要求4或5所述的缀合物，其中LN是包含聚乙二醇的接头。
7.根据权利要求6所述的缀合物，其中LN是
Figure FDA0003110709380000012
其中d是约0-约50的整数。
8.根据权利要求6所述的缀合物，其中LN是
Figure FDA0003110709380000021
其中d是约0-约50的整数。
9.根据权利要求7或8所述的缀合物，其中d是约0-约10的整数。
10.根据权利要求7或8所述的缀合物，其中d是约0-约5的整数。
11.根据权利要求7或8所述的缀合物，其中d是约0、约1、或约3的整数。
12.根据权利要求4-11任一项所述的缀合物，其中e是约1的整数。
13.根据权利要求4-12任一项所述的缀合物，其中每个Q独立地具有式(D)的结构：
Figure FDA0003110709380000022
其中：
每个XN独立地是核苷酸；
X3’是3’末端核苷酸；
X5’是5’末端核苷酸；
YP是核苷间磷酸三酯的残基；和
b和c分别为约0-约25的整数；条件是其和不小于5。
14.根据权利要求13所述的缀合物，其中b是约1-约15的整数。
15.根据权利要求13所述的缀合物，其中b是约3、约4、约11或约14的整数。
16.根据权利要求13所述的缀合物，其中b是约3的整数。
17.根据权利要求13所述的缀合物，其中b是约4的整数。
18.根据权利要求13所述的缀合物，其中b是约11的整数。
19.根据权利要求13所述的缀合物，其中b是约14的整数。
20.根据权利要求13-19任一项所述的缀合物，其中c是约0-约10的整数。
21.根据权利要求20所述的缀合物，其中c是约0-约8的整数。
22.根据权利要求20所述的缀合物，其中c是约0的整数。
23.根据权利要求20所述的缀合物，其中c是约8的整数。
24.根据权利要求13-23任一项所述的缀合物，其中b和c之和为约5-约20。
25.根据权利要求24所述的缀合物，其中b和c之和为约5-约15。
26.根据权利要求24所述的缀合物，其中b和c之和为约8、约9、约10、约11、约12、约13或约14。
27.根据权利要求13-26任一项所述的缀合物，其中每个XN独立地是2'-脱氧核糖核苷酸。
28.根据权利要求27所述的缀合物，其中每个XN独立地是2'-脱氧腺苷、2'-脱氧鸟苷、2'-脱氧胞苷、5-卤代-2'-脱氧胞苷、2'-脱氧胸苷、2'-脱氧尿苷或5-卤代-2'-脱氧尿苷。
29.根据权利要求27所述的缀合物，其中每个XN独立地是2'-脱氧腺苷、2'-脱氧鸟苷、2'-脱氧胞苷、2'-脱氧胸苷、5-溴-2'-脱氧尿苷或5-碘-2'-脱氧尿苷。
30.根据权利要求13-29任一项所述的缀合物，其中X3’是2'-脱氧核糖核苷酸。
31.根据权利要求30所述的缀合物，其中X3’是2'-脱氧腺苷、2'-脱氧鸟苷、2'-脱氧胞苷、5-卤代-2'-脱氧胞苷、2'-脱氧胸苷、2'-脱氧尿苷或5-卤代-2'-脱氧尿苷。
32.根据权利要求30所述的缀合物，其中X3’是2'-脱氧胸苷。
33.根据权利要求30所述的缀合物，其中X3’是2'-修饰的核糖核苷酸。
34.根据权利要求30所述的缀合物，其中X3’是2'-甲氧基核糖核苷酸或2'-乙氧基甲氧基核糖核苷酸。
35.根据权利要求13-34任一项所述的缀合物，其中X5’是2'-脱氧核糖核苷酸。
36.根据权利要求35所述的缀合物，其中X5’是2'-脱氧腺苷、2'-脱氧鸟苷、2'-脱氧胞苷、5-卤代-2'-脱氧胞苷、2'-脱氧胸苷、2'-脱氧尿苷或5-卤代-2'-脱氧尿苷。
37.根据权利要求35所述的缀合物，其中X5’是具有取代的嘧啶碱基的2'-脱氧核糖核苷酸。
38.根据权利要求35所述的缀合物，其中X5’是具有5-取代的嘧啶碱基的2'-脱氧核糖核苷酸。
39.根据权利要求35所述的缀合物，其中X5’是2'-脱氧胸苷、5-卤代-2'-脱氧胞苷或5-卤代-2'-脱氧尿苷。
40.根据权利要求35所述的缀合物，其中X5’是2'-脱氧胸苷、5-溴-2'-脱氧胞苷、5-碘-2'-脱氧胞苷、5-溴-2'-脱氧尿苷或5-碘-2'-脱氧尿苷。
41.根据权利要求35所述的缀合物，其中X5’是2'-脱氧胸苷、5-溴-2'-脱氧尿苷或5-碘-2'-脱氧尿苷。
42.根据权利要求13-41任一项所述的缀合物，其中X5’是3'-硫代磷酸酯基团。
43.根据权利要求42所述的缀合物，其中所述3'-硫代磷酸酯是手性的。
44.根据权利要求43所述的缀合物，其中所述3'-硫代磷酸酯具有Rp手性。
45.根据权利要求43所述的缀合物，其中所述3'-硫代磷酸酯具有Sp手性。
46.根据权利要求13-43任一项所述的缀合物，其中X5’具有Rp手性的3'-硫代磷酸酯基团并且X3’是2'-甲氧基核糖核苷酸或2'-乙氧基甲氧基核糖核苷酸。
47.根据权利要求13-43任一项所述的缀合物，其中X5’具有Sp手性的3'-硫代磷酸酯基团并且X3’是2'-甲氧基核糖核苷酸或2'-乙氧基甲氧基核糖核苷酸。
48.根据权利要求13-47任一项所述的缀合物，其中YP是：
Figure FDA0003110709380000051
其中Z为O或S；并且d是约0-约50的整数。
49.根据权利要求48所述的缀合物，其中YP是：
Figure FDA0003110709380000052
其中Z为O或S；并且d是约0-约50的整数。
50.根据权利要求48或49所述的缀合物，其中Z为O。
51.根据权利要求48或49所述的缀合物，其中Z为S。
52.根据权利要求48-51任一项所述的缀合物，其中d是约0-约10的整数。
53.根据权利要求52所述的缀合物，其中d是约0-约5的整数。
54.根据权利要求52所述的缀合物，其中d是约0、约1或约3的整数。
55.根据权利要求1-54任一项所述的缀合物，其中所述免疫调节性多核苷酸包含额外的核苷间磷酸三酯。
56.根据权利要求55所述的缀合物，其中所述额外的核苷间磷酸三酯是烷基磷酸三酯。
57.根据权利要求55所述的缀合物，其中所述额外的核苷间磷酸三酯是乙基磷酸三酯。
58.根据权利要求1-57任一项所述的缀合物，其中所述免疫调节性多核苷酸包含一个5-卤代-2’-脱氧尿苷。
59.根据权利要求58所述的缀合物，其中所述5-卤代-2’-脱氧尿苷是5-溴-2’-脱氧尿苷或5-碘-2’-脱氧尿苷。
60.根据权利要求1-59任一项所述的缀合物，其中所述免疫调节性多核苷酸包含三个或更多个2'-脱氧胞苷。
61.根据权利要求60所述的缀合物，其中所述免疫调节性多核苷酸包含三个2'-脱氧胞苷。
62.根据权利要求1-61任一项所述的缀合物，其中所述免疫调节性多核苷酸包含四个或更多个2'-脱氧鸟苷。
63.根据权利要求62所述的缀合物，其中所述免疫调节性多核苷酸包含四个2'-脱氧鸟苷。
64.根据权利要求1-63任一项所述的缀合物，其中所述免疫调节性多核苷酸包含三个2'-脱氧胞苷和四个2'-脱氧胞苷。
65.根据权利要求1-63任一项所述的缀合物，其中所述免疫调节性多核苷酸包含三个或更多个2'-脱氧胸苷。
66.根据权利要求65所述的缀合物，其中所述免疫调节性多核苷酸包含三个、四个、五个、六个、七个或八个2'-脱氧胸苷。
67.根据权利要求65所述的缀合物，其中所述免疫调节性多核苷酸包含三个、四个、五个或八个2'-脱氧胸苷。
68.根据权利要求1-67任一项所述的缀合物，其中所述免疫调节性多核苷酸包含0个、一个或两个2'-脱氧腺苷。
69.根据权利要求1-68任一项所述的缀合物，其中所述免疫调节性多核苷酸包含一个或多个核苷间硫代磷酸酯。
70.根据权利要求69所述的缀合物，其中所述免疫调节性多核苷酸包含约12个核苷间硫代磷酸酯。
71.根据权利要求1-70任一项所述的缀合物，其中所述靶向部分是针对NK细胞上表达的抗原的抗体。
72.根据权利要求1-70任一项所述的缀合物，其中所述靶向部分是针对骨髓细胞上表达的抗原的抗体。
73.根据权利要求1-72任一项所述的缀合物，其中所述靶向部分是人抗体。
74.根据权利要求1-73任一项所述的缀合物，其中所述靶向部分是人抗CD56抗体。
75.根据权利要求74所述的缀合物，其中所述抗体是衍生自克隆5.1H11的人抗CD56抗体。
76.根据权利要求1-73任一项所述的缀合物，其中所述抗体是抗SIRPα抗体。
77.根据权利要求76所述的缀合物，其中所述靶向部分是阻断性抗SIRPα抗体。
78.根据权利要求77所述的缀合物，其中所述阻断性抗SIRPα抗体包含重链可变(VH)结构域和轻链可变(VL)结构域，所述重链可变(VH)结构域包含含有选自SEQ ID NO：498-500的序列的HVR-H1、含有序列SEQ ID NO：501的HVR-H2、以及含有序列SEQ ID NO：502的HVR-H3；所述轻链可变(VL)结构域包含含有序列SEQ ID NO：503的HVR-L1、含有序列SEQ ID NO：504的HVR-L2和含有序列SEQ ID NO：505的HVR-L3。
79.根据权利要求78所述的缀合物，其中所述阻断性抗SIRPα抗体包含含有选自SEQ IDNO：490-495的序列的VH结构域和含有SEQ ID NO：496或497的序列的VL结构域。
80.根据权利要求77所述的缀合物，其中所述阻断性抗SIRPα抗体包含重链可变(VH)结构域和轻链可变(VL)结构域，所述重链可变(VH)结构域包含含有选自SEQ ID NO：512-514的序列的HVR-H1、含有序列SEQ ID NO：515的HVR-H2、以及含有序列SEQ ID NO：516的HVR-H3；所述轻链可变(VL)结构域包含含有序列SEQ ID NO：517的HVR-L1、含有序列SEQ ID NO：518的HVR-L2和含有序列SEQ ID NO：519的HVR-L3。
81.根据权利要求80所述的缀合物，其中所述阻断性抗SIRPα抗体包含含有选自SEQ IDNO：506-509的序列的VH结构域和含有SEQ ID NO：510或511的序列的VL结构域。
82.根据权利要求77所述的缀合物，其中所述阻断性抗SIRPα抗体包含重链可变(VH)结构域和轻链可变(VL)结构域，所述重链可变(VH)结构域包含含有选自SEQ ID NO：533-535的序列的HVR-H1、含有序列SEQ ID NO：536的HVR-H2、以及含有序列SEQ ID NO：537的HVR-H3；所述轻链可变(VL)结构域包含含有选自SEQ ID NO：538-542的序列的HVR-L1、含有序列SEQ ID NO：543的HVR-L2和含有选自SEQ ID NO：544-546的序列的HVR-L3。
83.根据权利要求82所述的缀合物，其中所述阻断性抗SIRPα抗体包含含有选自SEQ IDNO：520-523的序列的VH结构域和含有选自SEQ ID NO：525-532的序列的VL结构域。
84.根据权利要求76所述的缀合物，其中所述靶向部分是非阻断性抗SIRPα抗体。
85.根据权利要求84所述的缀合物，其中所述非阻断性抗SIRPα抗体包含重链可变(VH)结构域和轻链可变(VL)结构域，所述重链可变(VH)结构域包含含有选自SEQ ID NO：554-556的序列的HVR-H1、含有序列SEQ ID NO：557的HVR-H2、以及含有序列SEQ ID NO：558的HVR-H3；所述轻链可变(VL)结构域包含序列SEQ ID NO：559的HVR-L1、含有序列SEQ ID NO：560的HVR-L2和含有序列SEQ ID NO：561的HVR-L3。
86.根据权利要求85所述的缀合物，其中所述非阻断性抗SIRPα抗体包含含有选自SEQID NO：547-550的序列的VH结构域和含有选自SEQ ID NO：551-553的序列的VL结构域。
87.根据权利要求84所述的缀合物，其中所述非阻断性抗SIRPα抗体包含含有SEQ IDNO：584的序列的VH结构域和含有选自SEQ ID NO：585、562和563的序列的VL结构域。
88.根据权利要求1-73任一项所述的缀合物，其中所述抗体是抗SIRPβ抗体。
89.根据权利要求88所述的缀合物，其中所述靶向部分是阻断性抗SIRPβ抗体。
90.根据权利要求88所述的缀合物，其中所述靶向部分是非阻断性抗SIRPβ抗体。
91.根据权利要求1-73任一项所述的缀合物，其中所述抗体是抗SIRPγ抗体。
92.根据权利要求91所述的缀合物，其中所述靶向部分是阻断性抗SIRPγ抗体。
93.根据权利要求91所述的缀合物，其中所述靶向部分是非阻断性抗SIRPγ抗体。
94.根据权利要求71-93任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含人Fc区。
95.根据权利要求94所述的缀合物，其中所述Fc区是人IgG1、IgG2或IgG4 Fc区。
96.根据权利要求94所述的缀合物，其中所述Fc区是：
(i)根据EU编号包含L234A、L235A和G237A突变的人IgG1Fc区；
(ii)根据EU编号包含L234A、L235A、G237A和N297A突变的人IgG1 Fc区；
(iii)根据EU编号包含N297A突变的人IgG1 Fc区；
(iv)根据EU编号包含D265A突变的人IgG1 Fc区；
(v)根据EU编号包含D265A和N297A突变的人IgG1 Fc区；
(vi)根据EU编号包含A330S和P331S突变的人IgG2 Fc区；
(vii)根据EU编号包含A330S、P331S和N297A突变的人IgG2Fc区；
(viii)根据EU编号包含N297A突变的人IgG2 Fc区；
(ix)根据EU编号包含S228P突变的人IgG4 Fc区；
(x)根据EU编号包含S228P和D265A突变的人IgG4 Fc区；
(xi)根据EU编号包含S228P和L235E突变的人IgG4 Fc区；
(xii)根据EU编号包含S228P和N297A突变的人IgG4 Fc区；或
(xiii)根据EU编号包含S228P、E233P、F234V、L235A、delG236和N297A突变的人IgG4 Fc区。
97.根据权利要求94所述的缀合物，其中所述Fc区包含选自SEQ ID NO:564-578的序列。
98.根据权利要求71-97任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含人κ轻链恒定结构域。
99.根据权利要求98所述的缀合物，其中所述抗体包含含有序列SEQ ID NO：579的轻链恒定结构域。
100.根据权利要求71-97任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含人λ轻链恒定结构域。
101.根据权利要求100所述的缀合物，其中所述抗体包含含有序列SEQ ID NO：580或581的轻链恒定结构域。
102.根据权利要求1-101任一项所述的缀合物，其中所述接头具有结构：
Figure FDA0003110709380000101
其中每个q独立地是约0-约50的整数；每个r独立地是约0-约50的整数；氨基与靶向部分上的氨基酸残基连接；并且羟基与免疫调节性多核苷酸的核苷间硫代磷酸酯连接。
103.根据权利要求102所述的缀合物，其中每个q独立地是约0-约25的整数。
104.根据权利要求102所述的缀合物，其中每个q独立地是约20-约25的整数。
105.根据权利要求102-104任一项所述的缀合物，其中每个r独立地是约0-约5的整数。
106.根据权利要求1-101任一项所述的缀合物，其中所述接头具有结构：
Figure FDA0003110709380000111
其中每个q独立地是约0-约50的整数；每个r独立地是约0-约50的整数；羰基与靶向部分上的氨基酸残基连接；并且羟基与免疫调节性多核苷酸的核苷间硫代磷酸酯连接。
107.根据权利要求106所述的缀合物，其中每个q独立地是约0-约25的整数。
108.根据权利要求106所述的缀合物，其中每个q独立地是约5-约10的整数。
109.根据权利要求106-108任一项所述的缀合物，其中每个r独立地是约0-约5的整数。
110.根据权利要求1-101任一项所述的缀合物，其中所述接头具有结构：
Figure FDA0003110709380000112
其中q是约0-约50的整数；r是约0-约50的整数；氨基与靶向部分上的氨基酸残基连接；并且羟基与免疫调节性多核苷酸的核苷间硫代磷酸酯连接。
111.根据权利要求1-101任一项所述的缀合物，其中所述接头具有结构：
Figure FDA0003110709380000121
其中q是约0-约50的整数；r是约0-约50的整数；羰基与靶向部分上的氨基酸残基连接；并且羟基与免疫调节性多核苷酸的核苷间硫代磷酸酯连接。
112.根据权利要求1-111任一项所述的缀合物，其中所述抗体-核苷酸缀合物的DAR为约1-约8。
113.根据权利要求112所述的缀合物，其中所述抗体-核苷酸缀合物的DAR为约1。
114.根据权利要求112所述的缀合物，其中所述抗体-核苷酸缀合物的DAR为约3-约4。
115.根据权利要求1-114任一项所述的缀合物，其具有结构：
Figure FDA0003110709380000122
其中c是2’-脱氧胞苷；g是2’-脱氧鸟苷；t是胸苷；X是5-溴-2′-脱氧尿苷；并且Z是
Figure FDA0003110709380000131
116.根据权利要求1-114任一项所述的缀合物，其具有结构：
Figure FDA0003110709380000132
其中s是约3或约4的整数；c是2’-脱氧胞苷；g是2’-脱氧鸟苷；t是胸苷；X是5-溴-2’-脱氧尿苷；并且Z是
Figure FDA0003110709380000133
117.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-116任一项所述的缀合物和药学可接受的赋形剂。
118.根据权利要求117所述的药物组合物，其中将所述组合物配制用于肠胃外施用。
119.根据权利要求117或118所述的药物组合物，其中将所述组合物配制成单剂型。
120.根据权利要求117-119任一项所述的药物组合物，其中将所述组合物配制成静脉内剂型。
121.根据权利要求117-120任一项所述的药物组合物，其进一步与包含第二治疗剂。
122.一种用于治疗、预防或缓解受试者的增生性疾病的一种或多种症状的方法，其包括向所述受试者施用根据权利要求1-116任一项所述的缀合物。
123.根据权利要求122所述的方法，其中所述增生性疾病是癌症。
124.一种在受试者中调节天然杀伤细胞的方法，其包括向所述受试者施用根据权利要求1-116任一项所述的缀合物。
125.一种在受试者中调节骨髓细胞的方法，其包括向所述受试者施用根据权利要求1-116任一项所述的缀合物。
126.根据权利要求125所述的方法，其中所述骨髓细胞是单核细胞。
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