JP2023536627A - Ｅｇｆｒを標的とする抗体およびその使用 - Google Patents

Abstract

対合して細胞上にＥＧＦＲを標的とする抗原結合部位を形成することができる抗体の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを有するタンパク質、かかるタンパク質を含む医薬組成物、ならびに、かかるタンパク質および医薬組成物を使用する癌の処置などの治療方法が開示される。癌は、この疾患の処置に関する文献に報告された多大な研究努力および科学的進歩にもかかわらず、重大な健康問題であり続けている。成人において最も頻繁に診断される癌としては、前立腺癌、乳癌、および肺癌が挙げられる。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年８月５日に出願された米国仮特許出願第６３／０６１，５０７号に基づく利益および優先権を主張し、その開示はその全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２１年８月４日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーの名称はＤＦＹ－０８３ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは６１，９７０バイトである。

発明の分野

背景
癌は、この疾患の処置に関する文献に報告された多大な研究努力および科学的進歩にもかかわらず、重大な健康問題であり続けている。成人において最も頻繁に診断される癌としては、前立腺癌、乳癌、および肺癌が挙げられる。血液悪性腫瘍は、固形癌よりも頻度は低いが、生存率が低い。これらの癌の現在の処置選択肢は、すべての患者に有効ではなく、かつ／または相当に有害な副作用を有し得る。他の種類の癌もまた、既存の処置選択肢を使用して処置することは依然として困難である。

上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ－１、ＨＥＲ１）は、細胞外タンパク質リガンドの上皮成長因子ファミリー（ＥＧＦファミリー）のメンバーに対する受容体である膜貫通タンパク質である。上皮成長因子およびトランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦα）などのその特異的リガンドが結合すると、ＥＧＦＲは、不活性な単量体形態から、他のＥｒｂＢファミリー受容体を有する活性なホモ二量体またはヘテロ二量体へ転移する。二量体化は、その固有の細胞内タンパク質－チロシンキナーゼ活性を刺激し、下流のシグナル伝達カスケードを誘発して、ＤＮＡ合成および細胞増殖をもたらす。ＥＧＦＲは、細胞遊走、接着、および増殖などの表現型の調節に関与している。

ＥＧＦＲの過剰発現または過剰活性をもたらす変異は、非小細胞肺癌、肛門癌、神経膠芽腫および頭頸部の上皮腫瘍などのいくつかの癌に関連している。ＥＧＦＲを伴うこれらの体細胞変異は、その絶え間ない活性化をもたらし、無制御な細胞分裂を生じる。神経膠芽腫では、多かれ少なかれＥＧＦＲの特異的な変異（ＥＧＦＲｖＩＩＩと呼ばれる）がしばしば観察される。ＥＧＦＲまたはファミリーメンバーの変異、増幅または誤調節は、結腸直腸癌、腎細胞癌、膀胱癌、子宮頸癌、卵巣癌、膵臓癌、および肝臓癌などの他の固形腫瘍に関与している。

セツキシマブ、パニツムマブ、ネシツムマブ、およびザルツムマブなどの抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体が開発されている。しかしながら、癌の処置に使用するための大きな有効性を有し、有害作用の少ない新規かつ有用な抗体および関連する治療法が依然として必要とされている。

要旨
本出願は、ヒトＥＧＦＲに結合する抗原結合部位を提供する。これらの抗原結合部位は、ＥＧＦＲの細胞外ドメイン中の様々なエピトープに結合する。そのような抗原結合部位を含むタンパク質およびタンパク質コンジュゲート、例えば、抗体、抗体－薬物コンジュゲート、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）および免疫サイトカイン、ならびにそのような抗原結合部位（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ））を含むタンパク質を発現する免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）は、癌などのＥＧＦＲ関連疾患を処置するのに有用である。

したがって、本出願の一態様は、ＥＧＦＲに結合する抗原結合部位であって、（ｉ）それぞれ配列番号２、２３および４の相補性決定領域１（ＣＤＲ１）配列、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）配列および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、それぞれ配列番号６、７および１７のＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含むか、または、（ｉｉ）それぞれ配列番号２、１２および４のＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を含むＶＨと、それぞれ配列番号６、７および８のＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を含むＶＬとを含む、抗原結合部位、を提供する。

いくつかの実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号２、２３および４のＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を含み、ＶＬは、それぞれ配列番号６、７および１７のＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号２、１２および４のＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を含み、ＶＬは、それぞれ配列番号６、７および１７のＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号２、３および４のＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を含み、ＶＬは、それぞれ配列番号６、７および１７のＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号２、１２および４のＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を含み、ＶＬは、それぞれ配列番号６、７および８のＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＶＨは配列番号１１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号１６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは配列番号１１のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号１６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは配列番号３２のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号３３のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＶＨは配列番号１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号１６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは配列番号１のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号１６のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＶＨは配列番号１１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号１３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは配列番号１１のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号１３のアミノ酸配列を含む。

本出願の別の態様は、配列番号１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む抗原結合部位であって、
ＶＨは配列番号１に対してＣｈｏｔｈｉａナンバリングスキームでナンバリングされるＳ６２Ｒ置換を含み、かつ／またはＶＬは配列番号５に対してＣｈｏｔｈｉａナンバリングスキームでナンバリングされるＤ９２Ｒ置換および／またはＦ８７Ｙ置換を含む、抗原結合部位を提供する。

上記の態様のいずれか１つのいくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号１に対してＣｈｏｔｈｉａナンバリングスキームでナンバリングされるＳ６２Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬは、配列番号５に対してＣｈｏｔｈｉａナンバリングスキームでナンバリングされるＤ９２Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号１に対してＣｈｏｔｈｉａナンバリングスキームでナンバリングされるＳ６２Ｒ置換を含み、ＶＬは、配列番号５に対してＣｈｏｔｈｉａナンバリングスキームでナンバリングされるＤ９２Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬは、配列番号５に対してＣｈｏｔｈｉａナンバリングスキームでナンバリングされるＦ８７Ｙ置換を含む。

いくつかの実施形態では、抗原結合部位は、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）として存在し、ｓｃＦｖは、配列番号１４、１８、２０、および２４から選択される配列を含む。

いくつかの実施形態では、抗原結合部位は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した場合に５ｎＭ以下の解離定数（Ｋ_Ｄ）でヒトＥＧＦＲに結合する。いくつかの実施形態では、抗原結合部位は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した場合に６ｎＭ以下の解離定数（Ｋ_Ｄ）でアカゲザルＥＧＦＲに結合する。

本出願の別の態様は、本明細書に開示される抗原結合部位を含むタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本タンパク質は、抗体重鎖定常領域をさらに含む。いくつかの実施形態では、抗体重鎖定常領域はヒトＩｇＧ重鎖定常領域である。いくつかの実施形態では、抗体重鎖定常領域はヒトＩｇＧ１重鎖定常領域である。いくつかの実施形態では、抗体重鎖定常領域の各ポリペプチド鎖は、配列番号２６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、抗体重鎖定常領域の少なくとも１つのポリペプチド鎖は、配列番号２６に対して、ＥＵナンバリングシステムに従ってナンバリングされる、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１、およびＫ４３９から選択される１またはそれを超える位置に１またはそれを超える変異を含む。いくつかの実施形態では、抗体重鎖定常領域の少なくとも１つのポリペプチド鎖は、配列番号２６に対して、ＥＵナンバリングシステムに従ってナンバリングされる、Ｑ３４７Ｅ、Ｑ３４７Ｒ、Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｋ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｗ、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３６０Ｗ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｋ、Ｓ３６４Ｅ、Ｓ３６４Ｈ、Ｓ３６４Ｄ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｆ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｖ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｄ４０１Ｋ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｋ４０９Ｄ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、Ｋ４３９Ｄ、およびＫ４３９Ｅから選択される１またはそれを超える変異を含む。

いくつかの実施形態では、抗体重鎖定常領域の一方のポリペプチド鎖は、配列番号２６に対して、ＥＵナンバリングシステムに従ってナンバリングされる、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１およびＫ４３９から選択される１またはそれを超える位置に１またはそれを超える変異を含み、抗体重鎖定常領域のもう一方のポリペプチド鎖は、配列番号２６に対して、ＥＵナンバリングシステムに従ってナンバリングされる、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１およびＫ４３９から選択される１またはそれを超える位置に１またはそれを超える変異を含む。いくつかの実施形態では、抗体重鎖定常領域の一方のポリペプチド鎖は、配列番号２６に対して、ＥＵナンバリングシステムに従ってナンバリングされる、Ｋ３６０Ｅ置換およびＫ４０９Ｗ置換を含み、抗体重鎖定常領域のもう一方のポリペプチド鎖は、配列番号２６に対して、ＥＵナンバリングシステムに従ってナンバリングされる、Ｑ３４７Ｒ置換、Ｄ３９９Ｖ置換およびＦ４０５Ｔ置換を含む。

いくつかの実施形態では、抗体重鎖定常領域の一方のポリペプチド鎖は、配列番号２６に対して、ＥＵナンバリングシステムに従ってナンバリングされるＹ３４９Ｃ置換を含み、抗体重鎖定常領域のもう一方のポリペプチド鎖は、配列番号２６に対して、ＥＵナンバリングシステムに従ってナンバリングされるＳ３５４Ｃ置換を含む。

本出願の別の態様は、本明細書に開示されるタンパク質と、薬物部分とを含む、抗体－薬物コンジュゲートを提供する。いくつかの実施形態では、薬物部分は、オーリスタチン、Ｎ－アセチル－γカリケアマイシン、メイタンシノイド、ピロロベンゾジアゼピン、およびＳＮ－３８からなる群から選択される。

本出願の別の態様は、本明細書に開示される抗原結合部位と、サイトカインとを含む、免疫サイトカインを提供する。いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＴＮＦおよびＩＦＮαからなる群より選択される。

本出願の別の態様は、本明細書に開示される抗原結合部位と、ＣＤ３に結合する抗原結合部位とを含む二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーを提供する。

本出願の別の態様は、（ａ）本明細書に開示される抗原結合部位と、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２およびＣＤ１５４の膜貫通領域から選択される。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ、共通ＦｃＲガンマ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃガンマＲＩＩａ、ＦｃＲベータ（ＦｃイプシロンＲ１ｂ）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２の機能的シグナリングドメインを含む一次シグナリングドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激受容体の機能的シグナリングドメインを含む共刺激シグナリングドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、共刺激受容体は、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２５８、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳおよび４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）に結合するリガンド、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。

本出願の別の態様は、本明細書に開示されるＣＡＲをコードする単離された核酸を提供する。本出願の別の態様は、本明細書に開示される単離された核酸を含む発現ベクターを提供する。本出願の別の態様は、核酸または発現ベクターを含む免疫エフェクター細胞を提供する。

本出願の別の態様は、本明細書に開示されるＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、またはＮＫＴ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞はＮＫ細胞である。

本出願の別の態様は、本明細書に開示されるタンパク質、本明細書に開示される抗体－薬物コンジュゲート、本明細書に開示される免疫サイトカイン、本明細書に開示される二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、または本明細書に開示される免疫エフェクター細胞と、薬学的に許容され得る担体とを含む、医薬組成物を提供する。

本出願の別の態様は、癌を処置する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本明細書に開示されるタンパク質、本明細書に開示される抗体－薬物コンジュゲート、本明細書に開示される免疫サイトカイン、本明細書に開示される二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、本明細書に開示される免疫エフェクター細胞、または本明細書に開示される医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、癌は固形腫瘍である。いくつかの実施形態では、癌は、肺癌、乳癌、腎臓癌、結腸直腸癌、胃癌、脳癌、神経膠腫、膀胱癌、頭頸部癌、膀胱癌、膵臓癌、および肝臓癌、子宮頸癌、卵巣癌または前立腺癌である。いくつかの実施形態では、癌はＥＧＦＲを発現する。

別の態様では、本出願は、本明細書に開示される精製抗原結合部位、タンパク質、抗体－薬物コンジュゲート、免疫サイトカイン、または二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーを提供する。いくつかの実施形態では、精製された抗原結合部位、タンパク質、抗体－薬物コンジュゲート、免疫サイトカイン、または二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、遠心分離、深層ろ過、細胞溶解、ホモジナイズ、凍結融解、アフィニティー精製、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用交換クロマトグラフィーおよび混合モードクロマトグラフィーからなる群より選択される方法によって精製される。

本出願に記載される抗原結合部位のこれらおよび他の態様ならびに利点は、以下の図、詳細な説明および特許請求の範囲によって示される。

図面の説明
本出願は、以下の図面を参照してより完全に理解することができる。

図１は、ＶＨ中にＳ６２Ｒ置換を有するパニツムマブの構造モデリングを示す図である（Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキームによる、ここでは、このＡｒｇとＶＬの１位のＡｓｐとの間の水素結合がＶＨ－ＶＬ界面の安定化に寄与し得る）。

図２は、ＶＬ中にＦ８７Ｙ置換（Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキームによる）を有するパニツムマブの構造モデリングを示す図であり、ここでは、このＴｙｒとＶＨの位置３９のＧｌｎとの間の水素結合がＶＨ－ＶＬ界面の安定化に寄与し得る。

図３は、ＶＬ中にＤ９２Ｒ置換を有するパニツムマブの構造モデリングを示す図であり、ここでは、（ＣＤＲＬ３中の）このＡｒｇと（ＣＤＲＬ１中の）ＶＬの位置３２のＴｙｒとの間のファンデルワールス接触がパラトープの安定化に寄与し得る。

図４は、ＥＧＦＲ－タンパク質－１のヒトＥＧＦＲへの結合の滴定のためのＳＰＲセンサーグラムである。

図５は、ＥＧＦＲ－タンパク質－２のヒトＥＧＦＲへの結合の滴定のためのＳＰＲセンサーグラムである。

図６は、ＥＧＦＲ－タンパク質－３のヒトＥＧＦＲへの結合の滴定のためのＳＰＲセンサーグラムである。

図７は、ＥＧＦＲ－タンパク質－４のヒトＥＧＦＲへの結合の滴定のためのＳＰＲセンサーグラムである。

図８Ａ、図８Ｂ、図８Ｃおよび図８Ｄは、それぞれ、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）分析によって測定される、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のＥＧＦＲ－タンパク質－１（図８Ａ）、ＥＧＦＲ－タンパク質－２（図８Ｂ）、ＥＧＦＲ－タンパク質－３（図８Ｃ）およびＥＧＦＲ－タンパク質－４（図８Ｄ）についてのサーモグラムを示すプロットである。

図９Ａおよび図９Ｂは、ＤＳＣ分析によって測定された、それぞれ２０ｍＭヒスチジン、２５０ｍＭトレハロース、０．０１％ＰＳ８０（ｐＨ６．０）中のＥＧＦＲ－タンパク質３（図９Ａ）およびＥＧＦＲ－タンパク質４（図９Ｂ）のサーモグラムを示すプロットである。

図１０は、ＥＧＦＲ陽性Ｈ２１７２癌細胞に対する一連の濃度のＥＧＦＲ－タンパク質１（「ＥＧＦＲ１」）、ＥＧＦＲ－タンパク質２（「ＥＧＦＲ２」）、ＥＧＦＲ－タンパク質３（「ＥＧＦＲ３」）およびパニツムマブの結合親和性を示すプロットである。

図１１は、一連の濃度のＥＧＦＲ－タンパク質１（「ＥＧＦＲ１」）、ＥＧＦＲ－タンパク質２（「ＥＧＦＲ２」）、ＥＧＦＲ－タンパク質３（「ＥＧＦＲ３」）、パニツムマブおよびセツキシマブの存在下で７２時間にわたるＥＧＦＲ陽性細胞株の増殖を示すプロットである。

詳細な説明
本出願は、ヒトＥＧＦＲに結合する抗原結合部位を提供する。これらの抗原結合部位は、ＥＧＦＲの細胞外ドメイン中の様々なエピトープに結合する。そのような抗原結合部位を含むタンパク質およびタンパク質コンジュゲート、例えば、抗体、抗体－薬物コンジュゲート、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）および免疫サイトカイン、ならびにそのような抗原結合部位（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ））を含むタンパク質を発現する免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）は、癌などのＥＧＦＲ関連疾患を処置するのに有用である。本出願はまた、そのようなタンパク質、タンパク質コンジュゲート、および免疫エフェクター細胞を含む医薬組成物、ならびにそのようなタンパク質、タンパク質コンジュゲート、免疫エフェクター細胞、および医薬組成物を使用する癌の処置などの処置方法を提供する。本出願に記載される抗原結合部位の様々な態様を以下のセクションに記載するが、１つの特定のセクションに記載される本出願に記載される抗原結合部位の態様は、いかなる特定のセクションにも限定されない。

本出願の理解を容易にするために、いくつかの用語および語句を以下に定義する。

本明細書で使用される場合、「ａ」および「ａｎ」という用語は、「１またはそれを超える」を意味し、文脈が不適切でない限り、複数を含む。

本明細書で使用される場合、「抗原結合部位」という用語は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の一部を指す。ヒト抗体では、抗原結合部位は、重鎖（「Ｈ」）および軽鎖（「Ｌ」）のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。重鎖および軽鎖のＶ領域内の３つの高度に分岐したストレッチは、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として知られる、より保存された隣接ストレッチの間に介在する「超可変領域」を指す。したがって、「ＦＲ」という用語は、免疫グロブリンの超可変領域の間に隣接して天然に見られるアミノ酸配列を指す。ヒト抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域は、三次元空間において互いに対して配置されて抗原結合表面を形成する。抗原結合表面は、結合した抗原の三次元表面に相補的であり、重鎖および軽鎖のそれぞれの３つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と呼ばれる。ラクダおよび軟骨魚類などの特定の動物では、抗原結合部位は、「単一ドメイン抗体」を提供する単一の抗体鎖によって形成される。抗原結合部位は、インタクトな抗体中、抗原結合表面を保持する抗体の抗原結合フラグメント中、またはペプチドリンカーを使用して重鎖可変ドメインを単一ポリペプチド中の軽鎖可変ドメインに連結するｓｃＦｖなどの組換えポリペプチド中に存在し得る。

抗原結合部位のＣＤＲは、Ｋａｂａｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２，６６０９－６６１６（１９７７）および、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．（１９９１）、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）、および、ＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６）に記載された方法によって決定される。これらの定義の下で決定されるＣＤＲは、典型的には、互いに比較した場合、アミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。特定の実施形態では、「ＣＤＲ」という用語は、ＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６）ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎ Ａ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓ，ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ，ｅｄｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ３１，ｐｐ．４２２－４３９，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（２００１）によって定義されるＣＤＲである。特定の実施形態では、「ＣＤＲ」という用語は、Ｋａｂａｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２，６６０９－６６１６（１９７７）、および、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．（１９９１）によって定義されるＣＤＲである。特定の実施形態では、抗体の重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲは、異なる慣習を用いて定義される。例えば、特定の実施形態では、重鎖ＣＤＲは、ＭａｃＣａｌｌｕｍ（上掲）に従って定義され、軽鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ（上掲）に従って定義される。ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は重鎖ＣＤＲを示し、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は軽鎖ＣＤＲを示す。

本明細書で使用される場合、「対象」および「患者」という用語は、本明細書に記載の方法および組成物によって処置される生物を指す。そのような生物としては、好ましくは哺乳動物（例えば、マウス、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコなど）が挙げられ、より好ましくはヒトが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な化合物（例えば、本出願に記載される化合物）の量を指す。有効量は、１またはそれを超える投与、適用または用量で投与することができ、特定の製剤または投与経路に限定されることを意図しない。本明細書で使用される場合、「処置する」という用語は、症状、疾患、障害などの改善またはそれらの症状の改善をもたらす任意の効果、例えば、軽減、低減、調節、改善または根絶を含む。

本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、活性剤と、組成物をインビボまたはエクスビボでの診断または治療用途に特に適したものにする不活性または活性の担体との組み合わせを指す。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容され得る担体」という用語は、リン酸緩衝生理食塩水、水、エマルジョン（例えば、油／水または水／油エマルジョンなど）、および様々な種類の湿潤剤などの標準的な薬学的担体のいずれかを指す。本組成物はまた、安定剤および保存剤を含むことができる。担体、安定剤およびアジュバントの例については、例えば、Ｍａｒｔｉｎ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１５ｔｈ Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ［１９７５］を参照されたい。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容され得る塩」という用語は、対象に投与したときに、本出願に記載される化合物またはその活性代謝産物もしくは残基を提供することができる、本出願に記載される化合物の任意の薬学的に許容され得る塩（例えば、酸または塩基）を指す。当業者に知られているように、本出願に記載される化合物の「塩」は、無機または有機の酸および塩基から誘導され得る。例示的な酸としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン－ｐ－スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン－２－スルホン酸、ベンゼンスルホン酸などが挙げられるが、これらに限定されない。シュウ酸などの他の酸は、それ自体は薬学的に許容され得るものではないが、本出願に記載の化合物およびそれらの薬学的に許容され得る酸付加塩を得る際の中間体として有用な塩の調製に使用することができる。

例示的な塩基としては、アルカリ金属（例えば、ナトリウム）水酸化物、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）水酸化物、アンモニア、および式ＮＷ_４ ^＋（式中、ＷがＣ_１～４アルキルである）の化合物などが挙げられるが、これらに限定されない。

例示的な塩としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギネート、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、フルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パルモエート、ペクチン酸塩、過硫酸塩、フェニルプロピオン酸塩、ピクレート、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、ウンデカン酸塩などが挙げられるが、これらに限定されない。塩の他の例としては、Ｎａ^＋、ＮＨ_４ ^＋、およびＮＷ_４ ^＋（式中、ＷはＣ_１～４アルキル基である）などの適切なカチオンと配合された本出願に記載の化合物のアニオンなどが挙げられる。

治療的使用のために、本出願に記載される化合物の塩は、薬学的に許容され得ると考えられる。しかしながら、薬学的に許容されない酸および塩基の塩もまた、例えば、薬学的に許容され得る化合物の調製または精製において使用され得る。

本明細書で使用される場合、ＥＧＦＲ（ヒトの上皮増殖因子受容体、ＥｒｂＢ－１、またはＨＥＲ１としても知られている）は、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ００５３３（ヒト）ならびに関連するアイソフォームおよびオルソログのタンパク質を指す。

本明細書全体を通して、組成物が特定の成分を有する、または含む、または備えると記載されている場合、または、プロセスおよび方法が特定の工程を有する、または含む、または備えると記載されている場合、さらに、記載された成分から本質的になる、またはそれらからなる本出願に記載された組成物があり、記載された処理工程から本質的になる、またはそれらからなる本出願によるプロセスおよび方法があることが企図される。

一般的な事項として、パーセンテージを特定する組成物は、特に明記しない限り重量基準である。さらに、変数が定義を伴わない場合、変数の以前の定義が優先する。

本出願に記載される抗原結合部位の様々な特徴および態様は、以下により詳細に説明する。
Ｉ．抗原結合部位

一態様では、本出願は、ヒトＥＧＦＲに結合する抗原結合部位であって、パニツムマブに由来し、ＶＨおよび／またはＶＬに変異を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗原結合部位を提供する。本出願に記載されるＶＨ配列およびＶＬ配列中の単独または組み合わせとして想定される変異としては、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキームに基づく、ＶＨ中のＳ６２Ｒ、ＶＬ中のＤ９２Ｒ、および／またはＶＬ中のＦ８７Ｙが挙げられる。これらの変異は、抗原結合部位の熱安定性を高め、ＥＧＦＲに対する親和性を保持することが知られている。例示的な抗原結合部位のＶＨ配列、ＶＬ配列、ＣＤＲ配列、およびｓｃＦｖ配列を表１に列挙する。ＣＤＲ配列は、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキームに従って同定される。太字の残基は変異した残基を示し、イタリック体の配列はポリペプチドリンカーを示す。

特定の実施形態では、抗原結合部位のアミノ酸配列が、ＶＬ（例えば、配列番号５、１３または１６）のＣ末端にさらなるアルギニン（Ｒ）残基を含む。特定の実施形態では、抗原結合部位はｓｃＦｖとして存在し、ｓｃＦｖは、ＶＬアミノ酸配列のＣ末端にさらなるアルギニン（Ｒ）残基を含むＶＬアミノ酸配列を含む。

特定の実施形態では、抗原結合部位のアミノ酸配列は、パニツムマブの配列に対して、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキームに基づく、ＶＨ中のＳ６２Ｒ、ＶＬ中のＤ９２Ｒ、およびＶＬ中のＦ８７Ｙから選択される１またはそれを超える変異を含む。特定の実施形態では、ＥＧＦＲ（例えば、ヒトＥＧＦＲ）に結合する抗原結合部位は、表１に開示されるＥＧＦＲ－結合剤－１のＶＨと少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、表１に開示されるＥＧＦＲ－結合剤－１のＶＬと少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む。特定の実施形態では、ＥＧＦＲ（例えば、ヒトＥＧＦＲ）に結合する抗原結合部位は、表１に開示されるＥＧＦＲ－結合剤－２、ＥＧＦＲ－結合剤－３、またはＥＧＦＲ－結合剤－４のＶＨと少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、表１に開示されるＥＧＦＲ－結合剤－２、ＥＧＦＲ－結合剤－３、またはＥＧＦＲ－結合剤－４のＶＬと少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａを参照されたい）、Ｃｈｏｔｈｉａ（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ Ｃ＆Ｌｅｓｋ Ａ Ｍ，（１９８７），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７を参照されたい）、ＭａｃＣａｌｌｕｍ（ＭａｃＣａｌｌｕｍ Ｒ Ｍら、（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５）、または当技術分野で公知の任意の他のＣＤＲ決定方法に基づいて決定される、表１に開示されるＥＧＦＲ－結合剤－２、ＥＧＦＲ－結合剤－３、またはＥＧＦＲ－結合剤－４のＶＨおよびＶＬ配列の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、表１に開示されるＥＧＦＲ－結合剤－２、ＥＧＦＲ－結合剤－３またはＥＧＦＲ－結合剤－４の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。

特定の実施形態では、抗原結合部位のアミノ酸配列は、パニツムマブの配列に対して、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキームに基づく、ＶＨ中のＳ６２Ｒ変異およびＶＬ中のＦ８７Ｙ変異を含む。特定の実施形態では、ＥＧＦＲに結合する抗原結合部位は、配列番号１と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号５と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施形態では、ＥＧＦＲに結合する抗原結合部位は、配列番号１１と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号１３と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａを参照されたい）、Ｃｈｏｔｈｉａ（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ Ｃ＆Ｌｅｓｋ Ａ Ｍ，（１９８７），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７を参照されたい）、ＭａｃＣａｌｌｕｍ（ＭａｃＣａｌｌｕｍ Ｒ Ｍら、（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５）、または当技術分野で公知の任意の他のＣＤＲ決定方法に基づいて決定される、表１に開示されるＥＧＦＲ－結合剤－２のＶＨおよびＶＬ配列の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号２、１２および４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号６、７、および８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号２、１２および４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨと、（ｂ）それぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬとを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、このｓｃＦｖは、配列番号１４または１５と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、抗原結合部位はｓｃＦｖとして存在し、ｓｃＦｖは、配列番号１４または１５と同一のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、抗原結合部位はｓｃＦｖとして存在し、このｓｃＦｖは、配列番号１４と同一のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、抗原結合部位はｓｃＦｖとして存在し、このｓｃＦｖは、配列番号１５と同一のアミノ酸配列を含む。

特定の実施形態では、抗原結合部位のアミノ酸配列は、パニツムマブの配列に対して、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキームに基づく、ＶＨ中のＳ６２Ｒ変異、ＶＬ中のＦ８７Ｙ変異、およびＶＬ中のＤ９２Ｒ変異を含む。特定の実施形態では、ＥＧＦＲに結合する抗原結合部位は、配列番号１と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号５と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施形態では、ＥＧＦＲに結合する抗原結合部位は、配列番号１１と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号１６と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａを参照されたい）、Ｃｈｏｔｈｉａ（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ Ｃ＆Ｌｅｓｋ Ａ Ｍ，（１９８７），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７を参照されたい）、ＭａｃＣａｌｌｕｍ（ＭａｃＣａｌｌｕｍ Ｒ Ｍら、（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５）、または当技術分野で公知の任意の他のＣＤＲ決定方法に基づいて決定される、表１に開示されるＥＧＦＲ－結合剤－３のＶＨおよびＶＬ配列の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号２、１２および４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号６、７、および１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号２、１２および４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨと、（ｂ）それぞれ配列番号６、７および１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬとを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、このｓｃＦｖは、配列番号１８または１９と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、抗原結合部位はｓｃＦｖとして存在し、ｓｃＦｖは、配列番号１８または１９と同一のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、抗原結合部位はｓｃＦｖとして存在し、このｓｃＦｖは、配列番号１８と同一のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、抗原結合部位はｓｃＦｖとして存在し、このｓｃＦｖは、配列番号１９と同一のアミノ酸配列を含む。

特定の実施形態では、抗原結合部位のアミノ酸配列は、パニツムマブの配列に対して、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキームに基づく、ＶＬ中のＦ８７Ｙ変異およびＶＬ中のＤ９２Ｒ変異を含む。特定の実施形態では、ＥＧＦＲに結合する抗原結合部位は、配列番号１と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号５と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施形態では、ＥＧＦＲに結合する抗原結合部位は、配列番号１と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号１６と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａを参照されたい）、Ｃｈｏｔｈｉａ（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ Ｃ＆Ｌｅｓｋ Ａ Ｍ，（１９８７），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７を参照されたい）、ＭａｃＣａｌｌｕｍ（ＭａｃＣａｌｌｕｍ Ｒ Ｍら、（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５）、または当技術分野で公知の任意の他のＣＤＲ決定方法に基づいて決定される、表１に開示されるＥＧＦＲ－結合剤－４のＶＨおよびＶＬ配列の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号２、３および４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号６、７、および１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号２、３および４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨと、（ｂ）それぞれ配列番号６、７および１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬとを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、このｓｃＦｖは、配列番号２０または２１と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、抗原結合部位はｓｃＦｖとして存在し、ｓｃＦｖは、配列番号２０または２１と同一のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、抗原結合部位はｓｃＦｖとして存在し、このｓｃＦｖは、配列番号２０と同一のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、抗原結合部位はｓｃＦｖとして存在し、このｓｃＦｖは、配列番号２１と同一のアミノ酸配列を含む。

特定の実施形態では、抗原結合部位のアミノ酸配列は、パニツムマブの配列に対して、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキームに基づく、ＶＬ中のＦ８７Ｙ変異およびＶＬ中のＤ９２Ｒ変異、ならびに必要に応じてＶＨ中のＳ６２Ｒ変異を含む。特定の実施形態では、ＥＧＦＲに結合する抗原結合部位は、配列番号１と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号５と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施形態では、ＥＧＦＲに結合する抗原結合部位は、配列番号２２と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号１６と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａを参照されたい）、Ｃｈｏｔｈｉａ（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ Ｃ＆Ｌｅｓｋ Ａ Ｍ，（１９８７），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７を参照されたい）、ＭａｃＣａｌｌｕｍ（ＭａｃＣａｌｌｕｍ Ｒ Ｍら、（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５）、または当技術分野で公知の任意の他のＣＤＲ決定方法に基づいて決定される、表１に開示されるコンセンサスＶＨおよびＶＬ配列の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号２、２３および４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号６、７、および１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号２、２３および４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨと、（ｂ）それぞれ配列番号６、７および１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬとを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、このｓｃＦｖは、配列番号２４または２５と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、抗原結合部位はｓｃＦｖとして存在し、ｓｃＦｖは、配列番号２４または２５と同一のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、抗原結合部位はｓｃＦｖとして存在し、このｓｃＦｖは、配列番号２４と同一のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、抗原結合部位はｓｃＦｖとして存在し、このｓｃＦｖは、配列番号２５と同一のアミノ酸配列を含む。

あるいは、ＥＧＦＲに結合することができる新規な抗原結合部位は、ＥＧＦＲのアミノ酸配列、そのアイソフォーム、その変異体、その成熟細胞外断片またはＥＧＦＲのドメインを含む断片への結合についてスクリーニングすることによって同定することができる。

いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲに結合することができる新規な抗原結合部位は、配列番号２７～３０によって定義されるアミノ酸配列、その変異体、その成熟細胞外断片、またはＥＧＦＲのドメインを含む断片への結合についてスクリーニングすることによって同定することができる。

特定の実施形態では、抗原結合部位は、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭまたは４ｎＭ以下のＫ_Ｄ値（１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭまたは４ｎＭ以上の親和性）でヒトＥＧＦＲまたはその細胞外領域に結合する。特定の実施形態では、本出願の抗原結合部位は、ヒトＥＧＦＲまたはその細胞外領域に、４ｎＭ以下のＫ_Ｄ値（４ｎＭ以上の親和性）で結合する。特定の実施形態では、本出願の抗原結合部位は、ヒトＥＧＦＲまたはその細胞外領域に、約２．０ｎＭ、２．１ｎＭ、２．２ｎＭ、２．３ｎＭ、２．４ｎＭ、２．５ｎＭ、２．６ｎＭ、２．７ｎＭ、２．８ｎＭ、２．９ｎＭ、３．０ｎＭ、３．１ｎＭ、３．２ｎＭ、３．３ｎＭ、３．４ｎＭ、３．５ｎＭ、３．６ｎＭ、３．７ｎＭ、３．８ｎＭ、３．９ｎＭ、４．０ｎＭ、４．１ｎＭ、４．２ｎＭ、４．３ｎＭ、４．４ｎＭ、４．５ｎＭ、４．６ｎＭ、４．７ｎＭ、４．８ｎＭ、４．９ｎＭまたは５．０ｎＭ以下のＫ_Ｄ値（約２．０ｎＭ、２．１ｎＭ、２．２ｎＭ、２．３ｎＭ、２．４ｎＭ、２．５ｎＭ、２．６ｎＭ、２．７ｎＭ、２．８ｎＭ、２．９ｎＭ、３．０ｎＭ、３．１ｎＭ、３．２ｎＭ、３．３ｎＭ、３．４ｎＭ、３．５ｎＭ、３．６ｎＭ、３．７ｎＭ、３．８ｎＭ、３．９ｎＭ、４．０ｎＭ、４．１ｎＭ、４．２ｎＭ、４．３ｎＭ、４．４ｎＭ、４．５ｎＭ、４．６ｎＭ、４．７ｎＭ、４．８ｎＭ、４．９ｎＭまたは５．０ｎＭ以上の親和性）で結合する。特定の実施形態では、本出願の抗原結合部位は、ヒトＥＧＦＲまたはその細胞外領域に、約１．０～３．５ｎＭ、１．０～４．０ｎＭ、１．０～４．５ｎＭ、１．０～５．０ｎＭ、１．５～３．５ｎＭ、１．５～４．０ｎＭ、１．５～４．５ｎＭ、１．５～５．０ｎＭ、２．０～３．５ｎＭ、２．０～４．０ｎＭ、２．０～４．５ｎＭ、２．０～５．０ｎＭ、２．５～３．５ｎＭ、２．５～４．０ｎＭ、２．５～４．５ｎＭ、２．５～５．０ｎＭ、３．０～３．５ｎＭ、３．０～４．０ｎＭ、３．０～４．５ｎＭまたは３．０～５．０ｎＭの範囲のＫ_Ｄ値で結合する。これらのＫ_Ｄ値は、標準的な結合アッセイ、例えば、表面プラズモン共鳴またはバイオレイヤー干渉法を用いて測定したものである。特定の実施形態では、抗体は、対象の体液、組織および／または細胞由来のＥＧＦＲに結合する。

特定の実施形態では、抗原結合部位は、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭまたは４ｎＭ以下のＫ_Ｄ値（１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭまたは４ｎＭ以上の親和性）で、アカゲザルＥＧＦＲまたはその細胞外領域に結合する。特定の実施形態では、本出願の抗原結合部位は、アカゲザルＥＧＦＲまたはその細胞外領域に、約１～１０ｎＭ、１～６ｎＭ、２～１０ｎＭ、２～６ｎＭ、３～１０ｎＭ、３～６ｎＭ、４～１０ｎＭ、４～６ｎＭ、５～１０ｎＭまたは５～６ｎＭの範囲のＫ_Ｄ値で結合する。これらのＫ_Ｄ値は、標準的な結合アッセイ、例えば、表面プラズモン共鳴またはバイオレイヤー干渉法を用いて測定したものである。特定の実施形態では、抗体は、対象の体液、組織および／または細胞由来のＥＧＦＲに結合する。

特定の実施形態では、抗原結合部位は、それぞれ配列番号１および５のＶＨ配列およびＶＬ配列を有する対応する抗原結合部位よりも高い熱安定性を有し、抗原結合部位は、ＶＨ中にＧ４４Ｃ変異およびＶＬ中にＧ１００Ｃ変異を含まない。特定の実施形態では、本明細書に開示される抗原結合は、配列番号９または１０のアミノ酸配列を有する対応する抗原結合部位よりも高い熱安定性を有し、抗原結合部位は、それぞれＶＬ－ＶＨまたはＶＨ－ＶＬ配向のｓｃＦｖフォーマットをとる。熱安定性を測定する方法としては、例えば、以下の実施例３に開示されるような示差走査熱量測定（ＤＳＣ）が挙げられるが、これに限定されない。抗原結合部位がＶＬ－ＶＨ配向のｓｃＦｖフォーマットをとる特定の実施形態では、抗原結合部位の融解温度（例えば、ＤＳＣによって測定される、Ｔ_{ｏｎｓｅｔ}またはＴ_ｍ１）は、配列番号９のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖの対応する融解温度より少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、または６℃高い。抗原結合部位がＶＨ－ＶＬ配向のｓｃＦｖフォーマットをとる特定の実施形態では、抗原結合部位の融解温度（例えば、ＤＳＣによって測定される、Ｔ_{ｏｎｓｅｔ}またはＴ_ｍ１）は、配列番号１０のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖの対応する融解温度より少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、または６℃高い。
抗原結合部位を有するタンパク質

本明細書に開示される抗原結合部位は、抗体またはその抗原結合フラグメント中に存在し得る。抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ダイアボディ、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントまたはＦ（ａｂ’）_２フラグメント、Ｆｖ、二重特異性抗体、二重特異性Ｆａｂ２、二重特異性（ｍａｂ）２、ヒト化抗体、人工的に作製されたヒト抗体、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、二重特異性ＮＫ細胞エンゲージャー、一本鎖抗体（例えば、一本鎖ＦｖフラグメントまたはｓｃＦｖ）、トリオーマブ、共通軽鎖を有するノブイントゥホール（ｋｉｈ）ＩｇＧ、ｃｒｏｓｓｍａｂ、ｏｒｔｈｏ－Ｆａｂ ＩｇＧ、ＤＶＤ－Ｉｇ、２ ｉｎ １－ＩｇＧ、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ、ｂｉ－ｓｃＦｖ２－Ｆｃ、ナノボディ、ｔａｎｄＡｂ、二重親和性再標的化抗体（ＤＡＲＴ）、ＤＡＲＴ－Ｆｃ、ｓｃＦｖ－ＨＳＡ－ｓｃＦｖ（ただし、ＨＳＡ＝ヒト血清）、またはドックアンドロック（ＤＮＬ）－Ｆａｂ３であり得る。

特定の実施形態では、本明細書に開示される抗原結合部位は、抗体定常領域、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤおよびＩｇＥの重鎖定常領域、特に、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の（例えば、ヒト）重鎖定常領域から選択される重鎖定常領域と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列に連結される。別の実施形態では、本明細書に開示される抗原結合部位は、例えばカッパまたはラムダの軽鎖定常領域から選択される（例えば、ヒト）軽鎖定常領域に連結され得る。定常領域は、抗体の特性を改変するために（例えば、Ｆｃ受容体結合、抗体グリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞機能、および／または補体機能のうちの１またはそれを超えるものを増加または減少させるために）変更、例えば変異させることができる。一実施形態では、抗体はエフェクター機能を有し、補体を固定することができる。他の実施形態では、抗体はエフェクター細胞を動員せず、または補体を固定しない。別の実施形態では、抗体は、Ｆｃ受容体に結合する能力が低下しているか、またはＦｃ受容体に結合する能力を有していない。例えば、それは、アイソタイプまたはサブタイプ、フラグメントまたは他の変異体であり、Ｆｃ受容体への結合を助けず、例えば、変異したまたは欠失したＦｃ受容体結合領域を有する。

特定の実施形態では、抗原結合部位は、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ１ドメインを含むまたは含まないＩｇＧ定常領域に連結される。いくつかの実施形態では、定常領域のアミノ酸配列は、ヒトＩｇＧ１定常領域、ヒトＩｇＧ２定常領域、ヒトＩｇＧ３定常領域またはヒトＩｇＧ４定常領域などのヒト抗体定常領域と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一である。一実施形態では、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインまたはその一部は、野生型ヒトＩｇＧ１Ｆｃ配列と、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列：

を含む。いくつかの他の実施形態では、定常領域のアミノ酸配列は、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、またはウマなどの別の哺乳動物由来の抗体定常領域と、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一である。例えば、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１および／またはＫ４３９において、ヒトＩｇＧ１定常領域と比較して、１またはそれを超える変異を定常領域に組み込むことができる。例示的な置換としては、例えば、Ｑ３４７Ｅ、Ｑ３４７Ｒ、Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｋ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｗ、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３６０Ｗ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｋ、Ｓ３６４Ｅ、Ｓ３６４Ｈ、Ｓ３６４Ｄ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｆ、Ｔ３９４Ｗ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｖ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｄ４０１Ｋ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｋ４０９Ｄ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、Ｋ４３９Ｄ、およびＫ４３９Ｅが挙げられる。

特定の実施形態では、抗原結合部位は、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインの一部に連結されている。Ｆｃドメイン内で、ＣＤ１６結合はヒンジ領域およびＣＨ２ドメインによって媒介される。例えば、ヒトＩｇＧ１内では、ＣＤ１６との相互作用は、主に、ＣＨ２ドメイン中のアミノ酸残基Ａｓｐ２６５－Ｇｌｕ２６９、Ａｓｎ２９７－Ｔｈｒ２９９、Ａｌａ３２７－Ｉｌｅ３３２、Ｌｅｕ２３４－Ｓｅｒ２３９、および炭水化物残基Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンに集中している（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，４０６（６７９３）：２６７－２７３を参照のこと）。既知のドメインに基づいて、変異を、ファージディスプレイライブラリーまたは酵母表面ディスプレイｃＤＮＡライブラリーを使用するなどして、ＣＤ１６に対する結合親和性を増強または低減するように選択することができ、または相互作用の既知の三次元構造に基づいて設計することができる。

特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣＨ１に組み込まれ得る変異は、アミノ酸Ｖ１２５、Ｆ１２６、Ｐ１２７、Ｔ１３５、Ｔ１３９、Ａ１４０、Ｆ１７０、Ｐ１７１および／またはＶ１７３に存在し得る。特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣκに組み込まれ得る変異は、アミノ酸Ｅ１２３、Ｆ１１６、Ｓ１７６、Ｖ１６３、Ｓ１７４および／またはＴ１６４に存在し得る。

いくつかの実施形態では、抗体定常ドメインは、ＩｇＧ抗体、例えばヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、別の抗体定常ドメインとのヘテロ二量体化を可能にするように変異が抗体定常ドメインに導入される。例えば、抗体定常ドメインがヒトＩｇＧ１の定常ドメインに由来する場合、抗体定常ドメインは、ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４～３３２と、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含み得、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１、およびＫ４３９からなる群より選択される１またはそれを超える位置において異なる。本明細書に開示されるＦｃドメインまたはヒンジ領域におけるすべてのアミノ酸位置は、ＥＵナンバリングに従ってナンバリングされる。

非対称タンパク質の形成を促進するために、Ｆｃドメインヘテロ二量体化が企図される。ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメイン中の変異（例えば、アミノ酸置換）は、例えば、国際公開第２０１９１５７３６６号に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれない。

上記のタンパク質は、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術を使用して作製することができる。例えば、第１の免疫グロブリン重鎖をコードする第１の核酸配列を第１の発現ベクターにクローニングすることができ、第２の免疫グロブリン重鎖をコードする第２の核酸配列を第２の発現ベクターにクローニングすることができ、第１の免疫グロブリン軽鎖をコードする第３の核酸配列を第３の発現ベクターにクローニングすることができ、第２の免疫グロブリン軽鎖をコードする第４の核酸配列を第４の発現ベクターにクローニングすることができ、第１、第２、第３および第４の発現ベクターを一緒に宿主細胞に安定にトランスフェクトして、多量体タンパク質を産生することができる。

タンパク質の最高収率を達成するために、第１、第２、第３および第４の発現ベクターの異なる比率を調べて、宿主細胞へのトランスフェクションのための最適な比率を決定することができる。トランスフェクション後、限定希釈、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、顕微鏡法またはＣｌｏｎｅｐｉｘなどの当技術分野で公知の方法を使用して、細胞バンク生成のために単一クローンを単離することができる。

クローンは、バイオリアクターのスケールアップに適した条件下で培養することができ、本明細書に開示される抗原結合部位を含むタンパク質の発現を維持することができる。タンパク質は、遠心分離、深層濾過、細胞溶解、ホモジナイズ、凍結融解、親和性精製、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用交換クロマトグラフィーおよび混合モードクロマトグラフィーなどの当技術分野で公知の方法を使用して単離および精製することができる。

したがって、別の態様では、本出願は、前述の抗体のいずれか１つの免疫グロブリン重鎖可変領域および／または免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードする配列を含む１またはそれを超える単離された核酸を提供する。本出願は、前述の抗体のいずれか１つの免疫グロブリン重鎖可変領域および／または免疫グロブリン軽鎖可変領域を発現する１またはそれを超える発現ベクターを提供する。同様に、本出願は、前述の発現ベクターおよび／または単離された核酸のうちの１またはそれを超えるものを含む宿主細胞を提供する。

抗体が開示された抗体と同じエピトープに結合するか、または開示された抗体との結合について競合するかどうかを決定するための競合アッセイは、当技術分野で公知である。例示的な競合アッセイとしては、イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＲＩＡアッセイ）、表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ分析）、バイオレイヤー干渉法およびフローサイトメトリーが挙げられる。

典型的には、競合アッセイは、固体表面に結合した、または細胞表面上に発現した抗原（例えば、ヒトＥＧＦＲタンパク質またはその断片）、試験ＥＧＦＲ結合抗体および参照抗体の使用を含む。参照抗体は標識され、試験抗体は標識されない。競合的阻害は、試験抗体の存在下で固体表面または細胞に結合した標識参照抗体の量を求めることによって測定される。通常、試験抗体は過剰に存在する（例えば、１倍、５倍、１０倍、２０倍または１００倍）。競合アッセイによって同定される抗体（例えば、競合抗体）としては、参照抗体と同じエピトープまたは類似の（例えば、重複する）エピトープに結合する抗体、および参照抗体が結合したエピトープに対して立体障害を生じさせるのに十分な近位の隣接エピトープに結合する抗体が挙げられる。

標識の存在が結合を妨害しないか、さもなければ阻害しないことを確実にするために、競合アッセイを両方向で行うことができる。例えば、第１の方向では、参照抗体を標識し、試験抗体は標識せず、第２の方向では、試験抗体を標識し、参照抗体は標識しない。

試験抗体は、過剰の一方の抗体（例えば、１倍、５倍、１０倍、２０倍または１００倍）が他方の抗体の結合を、例えば、競合結合アッセイで測定した場合に、少なくとも５０％、７５％、９０％、９５％または９９％阻害する場合、抗原への特異的結合について参照抗体と競合する。

２つの抗体は、一方の抗体の結合を低減または排除する抗原中の本質的にすべてのアミノ酸変異がもう一方の結合を低減または排除する場合、同じエピトープに結合すると判定することができる。２つの抗体は、一方の抗体の結合を低減または排除するアミノ酸変異のサブセットのみが他方の結合を低減または排除する場合、重複するエピトープに結合すると判定することができる。

本明細書に開示される抗体は、親和性および／または特異性などの生化学的特徴を改善するために、凝集、安定性、沈殿および／または非特異的相互作用などの生物物理学的特性を改善するために、ならびに／あるいは免疫原性を低下させるためにさらに最適化（例えば、親和性成熟）され得る。親和性成熟の手順は当業者の範囲内である。例えば、ＤＮＡシャッフリング、鎖シャッフリング、ＣＤＲシャッフリング、ランダム変異誘発および／または部位特異的変異誘発によって、免疫グロブリン重鎖および／または免疫グロブリン軽鎖に多様性を導入することができる。

特定の実施形態では、単離されたヒト抗体は、１またはそれを超える体細胞変異を含有する。これらの場合、抗体をヒト生殖系列配列に改変して、抗体を最適化することができる（例えば、生殖細胞系列化（ｇｅｒｍｌｉｎｉｎｇ）と呼ばれるプロセスによって）。

一般に、最適化抗体は、それが由来する非最適化（または親）抗体と少なくとも同じまたは実質的に同じ抗原に対する親和性を有する。例えば、特定の実施形態では、最適化された抗体は、親抗体と比較した場合、抗原に対してより高い親和性を有する。

抗体が治療薬として使用するためのものである場合、標準的なインビトロ結合化学を使用して、小分子毒素または放射性核種などのエフェクター剤にコンジュゲートすることができる。エフェクター剤がポリペプチドである場合、抗体は、エフェクターに化学的にコンジュゲートすることができ、または融合タンパク質としてエフェクターに結合することができる。融合タンパク質の構築は、当技術分野の通常の技術の範囲内である。

抗体は、標準的なインビトロ結合化学を使用して、小分子毒素または放射性核種などのエフェクター部分にコンジュゲートすることができる。エフェクター部分がポリペプチドである場合、抗体は、エフェクターに化学的にコンジュゲートすることができ、または融合タンパク質としてエフェクターに結合することができる。融合タンパク質の構築は、当技術分野の通常の技術の範囲内である。
ＣＡＲ Ｔ細胞、ＥＧＦＲ／ＣＤ３指向二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、免疫サイトカイン、抗体－薬物コンジュゲートおよび免疫毒素

本出願の別の態様は、本明細書に開示されるＥＧＦＲに結合する抗原結合部位を含む分子または複合体を提供する。例示的な分子または複合体としては、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞エンゲージャー（例えば、ＥＧＦＲ／ＣＤ３指向二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）、免疫サイトカイン、抗体－薬物コンジュゲートおよび免疫毒素が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書に開示されるＥＧＦＲに結合する任意の抗原結合部位を使用することができる。特定の実施形態では、ＥＧＦＲに結合する抗原結合部位のＶＨ配列、ＶＬ配列、および／またはＣＤＲ配列を表１に示す。特定の実施形態では、ＥＧＦＲに結合する抗原結合部位は、ｓｃＦｖである。特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１４、１５、１８、１９、２０、２１、２４および２５からなる群より選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１４、１５、１８、１９、２０、２１、２４および２５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。

特定の実施形態では、分子または複合体（例えば、ＣＡＲ、Ｔ細胞エンゲージャー、免疫サイトカイン、抗体－薬物コンジュゲートまたは免疫毒素）中のＥＧＦＲに結合する抗原結合部位は、パニツムマブに対して、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキームに基づく、ＶＨ中のＳ６２Ｒ変異、ＶＬ中のＦ８７Ｙ変異、およびＶＬ中のＤ９２Ｒ変異を含む。特定の実施形態では、ＥＧＦＲに結合する抗原結合部位は、配列番号１と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号５と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施形態では、分子または複合体（例えば、ＣＡＲ、Ｔ細胞エンゲージャー、免疫サイトカイン、抗体－薬物コンジュゲートまたは免疫毒素）中のＥＧＦＲに結合する抗原結合部位は、配列番号２、１２、および４のアミノ酸配列によってそれぞれ表されるＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号６、７および１７のアミノ酸配列によってそれぞれ表されるＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインと、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインとを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、配列番号３２を含むアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインと、配列番号３３を含むアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインとを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、配列番号１８または配列番号１９と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、配列番号１８と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、配列番号１８または１９と同一のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、配列番号１８と同一のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、配列番号１９と同一のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む。

特定の実施形態では、分子または複合体（例えば、ＣＡＲ、Ｔ細胞エンゲージャー、免疫サイトカイン、抗体－薬物コンジュゲートまたは免疫毒素）中のＥＧＦＲに結合する抗原結合部位は、パニツムマブに対して、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキームに基づく、ＶＬ中のＦ８７Ｙ変異およびＤ９２Ｒ変異を含む。特定の実施形態では、ＥＧＦＲに結合する抗原結合部位は、配列番号１と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号５と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施形態では、分子または複合体（例えば、ＣＡＲ、Ｔ細胞エンゲージャー、免疫サイトカイン、抗体－薬物コンジュゲートまたは免疫毒素）中のＥＧＦＲに結合する抗原結合部位は、配列番号２、３および４のアミノ酸配列によってそれぞれ表されるＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号６、７および１７のアミノ酸配列によってそれぞれ表されるＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインと、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインとを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、配列番号２０または配列番号２１と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、配列番号２０と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、配列番号２０または２１と同一のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、配列番号２０と同一のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、配列番号２１と同一のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む。

特定の実施形態では、分子または複合体（例えば、ＣＡＲ、Ｔ細胞エンゲージャー、免疫サイトカイン、抗体－薬物コンジュゲートまたは免疫毒素）中のＥＧＦＲに結合する抗原結合部位は、パニツムマブに対して、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキームに基づく、ＶＨ中のＳ６２Ｒ変異、およびＶＬ中のＦ８７Ｙ変異を含む。特定の実施形態では、ＥＧＦＲに結合する抗原結合部位は、配列番号１と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号５と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施形態では、分子または複合体（例えば、ＣＡＲ、Ｔ細胞エンゲージャー、免疫サイトカイン、抗体－薬物コンジュゲートまたは免疫毒素）中のＥＧＦＲに結合する抗原結合部位は、配列番号２、１２および４のアミノ酸配列によってそれぞれ表されるＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号６、７および８のアミノ酸配列によってそれぞれ表されるＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインと、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインとを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、配列番号１４または配列番号１５と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、配列番号１４と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、配列番号１４または１５と同一のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、配列番号１４と同一のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、配列番号１５と同一のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む。

特定の実施形態では、分子または複合体（例えば、ＣＡＲ、Ｔ細胞エンゲージャー、免疫サイトカイン、抗体－薬物コンジュゲートまたは免疫毒素）中のＥＧＦＲに結合する抗原結合部位は、パニツムマブに対して、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキームに基づく、ＶＬ中のＦ８７Ｙ変異、ＶＬ中のＤ９２Ｒ変異、および必要に応じてＶＨ中のＳ６２Ｒ変異を含む。特定の実施形態では、ＥＧＦＲに結合する抗原結合部位は、配列番号１と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号５と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施形態では、分子または複合体（例えば、ＣＡＲ、Ｔ細胞エンゲージャー、免疫サイトカイン、抗体－薬物コンジュゲートまたは免疫毒素）中のＥＧＦＲに結合する抗原結合部位は、配列番号２、２３および４のアミノ酸配列によってそれぞれ表されるＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号６、７および１７のアミノ酸配列によってそれぞれ表されるＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインと、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインとを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、配列番号２４または配列番号２５と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、配列番号２４と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、配列番号２４または２５と同一のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、配列番号２４と同一のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、配列番号２５と同一のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）

特定の実施形態では、本出願は、本明細書に開示されるようなＥＧＦＲに結合する抗原結合部位を含むＥＧＦＲ標的化ＣＡＲを提供する（例えば、表１を参照されたい）。ＥＧＦＲ標的化ＣＡＲは、ＦａｂフラグメントまたはｓｃＦｖを含み得る。特定の実施形態では、ＣＡＲ中のＥＧＦＲに結合する抗原結合部位は、パニツムマブに対して、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキームに基づく、ＶＨ中のＳ６２Ｒ、ＶＬ中のＦ８７Ｙ、およびＶＬ中のＤ９２Ｒから選択される１またはそれを超える変異を含む。特定の実施形態では、ＣＡＲ中のＥＧＦＲに結合する抗原結合部位は、配列番号１４、１５、１８、１９、２０、２１、２４および２５からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。

「キメラ抗原受容体」または代替的に「ＣＡＲ」という用語は、少なくとも細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメイン（本明細書では「一次シグナル伝達ドメイン」とも呼ばれる）を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む組換えポリペプチド構築物を指す。

したがって、特定の実施形態では、ＣＡＲは、本明細書に開示されるＥＧＦＲに結合する細胞外抗原結合部位、膜貫通ドメイン、および一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。特定の実施形態では、ＣＡＲは、少なくとも１つの共刺激分子に由来する１またはそれを超える機能的シグナル伝達ドメイン（「共刺激シグナル伝達ドメイン」とも呼ばれる）をさらに含む。

特定の実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインとしての本明細書に開示されるＥＧＦＲに結合する抗原結合部位（例えば、ＥＧＦＲ結合ｓｃＦｖ）、膜貫通ドメイン、および一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。特定の実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインとして本明細書に開示されるＥＧＦＲに結合する抗原結合部位（例えば、ＥＧＦＲ結合ｓｃＦｖ）、膜貫通ドメイン、ならびに共刺激シグナリングドメインおよび一次シグナリングドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。特定の実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインとして本明細書に開示されるＥＧＦＲに結合する抗原結合部位（例えば、ＥＧＦＲ結合ｓｃＦｖ）、膜貫通ドメイン、ならびに２つの共刺激シグナル伝達ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。特定の実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインとして本明細書に開示されるＥＧＦＲに結合する抗原結合部位（例えば、ＥＧＦＲ結合ｓｃＦｖ）、膜貫通ドメイン、ならびに少なくとも２つの共刺激シグナル伝達ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。

膜貫通ドメインに関して、様々な実施形態では、ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインに融合された膜貫通ドメインを含むように設計される。一実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＡＲ中のドメインの１つと天然に会合するものである。場合によって、膜貫通ドメインは、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのそのようなドメインの結合を回避して、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、アミノ酸置換によって選択または改変され得る。別の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＡＲ Ｔ細胞表面上の別のＣＡＲとホモ二量体化することができる。別の実施形態では、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、同じＣＡＲ Ｔ細胞中に存在する天然の結合パートナーの結合ドメインとの相互作用を最小限に抑えるように改変または置換され得る。

膜貫通ドメインは、任意の天然に存在する膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。一実施形態では、膜貫通領域は、ＣＡＲが標的に結合したときはいつでも細胞内ドメインにシグナル伝達することができる。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４からなる群より選択される１またはそれを超えるタンパク質の膜貫通領域を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫＧ２Ｄ、およびＮＫＧ２Ｃからなる群より選択される１またはそれを超えるタンパク質の膜貫通領域を含む。

細胞外ＥＧＦＲ結合ドメイン（例えば、ＥＧＦＲ結合ｓｃＦｖドメイン）ドメインは、ヒンジ領域によって膜貫通ドメインに連結され得る。限定するものではないが、ヒトＩｇ（免疫グロブリン）ヒンジ（例えば、ＩｇＧ４ヒンジ、ＩｇＤヒンジ）、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカー、（Ｇ_４Ｓ）_４リンカー（配列番号３１）、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジ、およびＣＤ８αヒンジなどの様々なヒンジを使用することができる。

本出願に記載されるＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが配置されている免疫細胞（例えば、Ｔ細胞の細胞溶解活性またはヘルパー活性（サイトカインの分泌を含む））の特殊な機能の少なくとも１つの活性化を担う。したがって、本明細書で使用される場合、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、特殊な機能を果たすように細胞に指示するタンパク質の部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を使用することができるが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分が使用される限り、そのような切断部分は、それがエフェクター機能シグナルを伝達する限り、インタクトな鎖の代わりに使用され得る。したがって、細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の切断部分を含むことを意味する。

ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン（すなわち、刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメイン）および１またはそれを超える共刺激シグナル伝達ドメイン（すなわち、少なくとも１つの共刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメイン）を含む。

本明細書で使用される場合、「刺激分子」という用語は、免疫細胞シグナル伝達経路の少なくともいくつかの態様の刺激方法で免疫細胞の活性化を調節する細胞質シグナル伝達配列を提供する、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＢ細胞によって発現される分子を指す。一実施形態では、シグナルは、例えば、ペプチドを負荷したＭＨＣ分子とＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合によって開始され、限定するものではないが、増殖、活性化、分化などのＴ細胞応答の媒介をもたらす一次シグナルである。

刺激的に作用する一次シグナル伝達ドメインは、免疫受容活性化チロシンモチーフまたはＩＴＡＭとして公知のシグナル伝達モチーフを含み得る。本出願において特に有用なＩＴＡＭ含有細胞質シグナル伝達配列の例としては、ＣＤ３ゼータ、共通ＦｃＲガンマ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃガンマＲＩＩａ、ＦｃＲベータ（ＦｃイプシロンＲ１ｂ）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２に由来するものが挙げられる。一実施形態では、本出願に記載される１またはそれを超えるＣＡＲのいずれかにおける一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３－ゼータに由来する細胞質シグナル伝達配列を含む。

いくつかの実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ６６ｄ、４－１ＢＢおよび／またはＣＤ３－ゼータの機能的シグナル伝達ドメインである。一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ、コモンＦｃＲガンマ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃガンマＲＩＩａ、ＦｃＲベータ（ＦｃイプシロンＲ１ｂ）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０、および／またはＤＡＰ１２の機能的シグナリングドメインを含む。特定の実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞受容体複合体に関連するゼータ鎖の機能的シグナル伝達ドメインである。

本明細書で使用される場合、「共刺激分子」という用語は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによってＴ細胞による共刺激応答、例えば、限定するものではないが、増殖を媒介するＴ細胞上の同族結合パートナーを指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要な抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。そのような分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２５８（ＬＩＧＨＴ）、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、およびリガンドであってＣＤ８３と特異的に結合するものなどが挙げられる。そのような共刺激分子のさらなる例としては、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、およびリガンドであってＣＤ８３と特異的に結合するものが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの共刺激シグナル伝達ドメインは、本明細書に記載の共刺激分子の機能的シグナル伝達ドメイン、例えば、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２５８、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、リガンドであってＣＤ８３に結合するもの、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳおよび４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、またはそれらの任意の組み合わせである。

本明細書で使用される場合、「シグナル伝達ドメイン」という用語は、細胞内で情報を伝達することによって作用し、二次メッセンジャーを生成することによって、またはそのようなメッセンジャーに応答することによってエフェクターとして機能することによって、定義されたシグナル伝達経路を介して細胞活性を調節するタンパク質の機能的部分を指す。

本出願に記載されるＣＡＲの細胞質シグナル伝達部分内の細胞質シグナル伝達配列は、ランダムにまたは指定された順序で互いに連結され得る。必要に応じて、短い（例えば、２～１０アミノ酸長の）オリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカーが連結を形成し得る。

本出願の別の態様は、本明細書に開示されるＥＧＦＲ標的化ＣＡＲをコードする核酸を提供する。本核酸は、当該核酸をエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）に導入することにより当該細胞にＣＡＲを発現させるのに有用である。

例えば、コドン縮重表に従って１またはそれを超えるコドンを変更することによって配列に改変を行って、同等のまたは改善された変異体を作製することができる。ＤＮＡコドン縮重表を表３に示す。

特定の実施形態では、核酸はＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ分子）である。特定の実施形態では、核酸は、ＣＡＲコード配列に作動可能に連結された発現制御配列（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）をさらに含む。特定の実施形態では、本出願は、核酸を含むベクターを提供する。ベクターは、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター、レンチウイルスベクター、またはアデノウイルスベクター）または非ウイルスベクター（例えば、プラスミド）であり得る。

特定の実施形態では、核酸はＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ分子）である。トランスフェクションに使用するためのｍＲＮＡを作製するための方法は、特別に設計されたプライマーを用いて鋳型をインビトロ転写し、続いてポリＡを付加して、３’および５’非翻訳配列、５’キャップおよび／または配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、発現させる核酸、ならびにポリＡテール（典型的には５０～２０００塩基長）を含有するＲＮＡ構築物を作製することを含み得る。ＲＮＡ分子は、例えば、米国特許第８，２７８，０３６号、同第８，８８３，５０６号、および同第８，７１６，４６５号に開示されているように、翻訳効率および／または安定性を増加させるようにさらに修飾することができる。このようにして産生されたＲＮＡ分子は、様々な種類の細胞を効率的にトランスフェクトすることができる。

一実施形態では、核酸は、ＣＡＲのアミノ末端にシグナルペプチドを含むアミノ酸配列をコードする。そのようなシグナルペプチドは、ＣＡＲがエフェクター細胞で発現される際にＣＡＲの細胞表面局在化を促進することができ、細胞プロセシング中にＣＡＲから切断される。一実施形態では、核酸は、細胞外ＥＧＦＲ結合ドメイン（例えば、ＥＧＦＲ結合ｓｃＦｖドメイン）のＮ末端にシグナルペプチドを含むアミノ酸配列をコードする。

ＲＮＡまたはＤＮＡは、いくつかの様々な方法のいずれかを使用して、例えば、限定するものではないが、エレクトロポレーション、リポフェクションを使用したカチオン性リポソーム媒介トランスフェクション、ポリマーカプセル化、ペプチド媒介トランスフェクション、または「遺伝子銃」（例えば、Ｎｉｓｈｉｋａｗａら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１２（８）：８６１－７０（２００１）を参照されたい）などの生物学的粒子送達系などの商業的に利用可能な方法を使用して標的細胞に導入することができる。

別の態様では、本出願は、ＥＧＦＲ標的化ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞を提供する。ＥＧＦＲ標的化ＣＡＲをコードする核酸を含む免疫エフェクター細胞も提供される。免疫エフェクター細胞としては、Ｔ細胞およびＮＫ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、およびＮＫＴ細胞から選択される。Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、初代細胞または細胞株であり得る。

免疫エフェクター細胞は、当技術分野で公知の方法によって、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍などの多数の供給源から得ることができる。免疫エフェクター細胞は、多能性または多分化能細胞（例えば、造血幹細胞）からインビトロで分化させることもできる。いくつかの実施形態では、本出願は、ＥＧＦＲ標的化ＣＡＲを発現する（例えば、ＣＡＲを原形質膜上に発現する）か、または本明細書に開示される核酸を含む多能性または多分化能細胞（例えば、造血幹細胞）を提供する。

特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞を単離および／または精製する。例えば、制御性Ｔ細胞は、ＣＤ２５結合リガンドを使用してＴ細胞集団から取り出すことができる。チェックポイントタンパク質（例えば、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３またはＴＩＭ－３）を発現するエフェクター細胞は、同様の方法によって取り出すことができる。特定の実施形態では、エフェクター細胞は、正の選択工程によって単離される。例えば、Ｔ細胞の集団は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８コンジュゲートビーズとのインキュベーションによって単離することができる。ＩＦＮ－７、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、グランザイムＢおよびパーフォリンなどの他の細胞表面マーカーも正の選択に使用することができる。

免疫エフェクター細胞は、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号、同第６，５３４，０５５号、同第６，９０５，６８０号、同第６，６９２，９６４号、同第５，８５８，３５８号、同第６，８８７，４６６号、同第６，９０５，６８１号、同第７，１４４，５７５号、同第７，０６７，３１８号、同第７，１７２，８６９号、同第７，２３２，５６６号、同第７，１７５，８４３号、同第５，８８３，２２３号、同第６，９０５，８７４号、同第６，７９７，５１４号、同第６，８６７，０４１号、および米国特許出願公開第２００６／０１２１００５号および同第２０１６／０３４０４０６号に記載されているように、当技術分野で公知の方法を一般的に使用して活性化および増殖させることができる。例えば、特定の実施形態では、Ｔ細胞は、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適切な条件下で、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触することによって増殖および／または活性化することができる。これらの細胞は、数時間（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、１８、２１時間）から約１４日間（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４日間）にわたって培養液中で増殖させることができる。一実施形態では、細胞を４から９日間にわたって増殖させる。長時間の細胞培養（例えば、６０日間またはそれを超える培養）のためには、複数サイクルの刺激が望ましい場合がある。特定の実施形態では、細胞培養物は、血清（例えば、ウシ胎児血清またはヒト胎児血清）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インスリン、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＴＧＦβ、ＴＮＦ－α、またはそれらの組み合わせを含む。当業者に公知の細胞増殖のための他の添加剤、例えば、界面活性剤、プラスマネート、ならびにＮ－アセチル－システインおよび２－メルカプトエタノールなどの還元剤も細胞培養物に含めることができる。特定の実施形態では、本出願の免疫エフェクター細胞は、インビトロ増殖から得られる細胞である。

ＥＧＦＲ（例えば、調節可能なＣＡＲ）に結合する抗原結合部位、ＣＡＲをコードする核酸、およびＣＡＲを発現するまたは核酸を含むエフェクター細胞を含み得るＣＡＲ構築物のさらなる設計は、米国特許第７，４４６，１９０号および同第９，１８１，５２７号、米国特許出願公開第２０１６／０３４０４０６号および同第２０１７／００４９８１９号、ならびに国際公開第２０１８／１４０７２５号に示されている。
ＥＧＦＲ／ＣＤ３指向二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー

特定の実施形態では、本出願は、本明細書に開示されるＥＧＦＲに結合する抗原結合部位を含むＥＧＦＲ／ＣＤ３指向二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーを提供する。特定の実施形態では、ＥＧＦＲ／ＣＤ３指向二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー中のＥＧＦＲに結合する抗原結合部位は、パニツムマブに対して、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキームに基づく、ＶＨ中のＳ６２Ｒ、ＶＬ中のＦ８７Ｙ、およびＶＬ中のＤ９２Ｒから選択される１またはそれを超える変異を含む。特定の実施形態では、ＥＧＦＲ／ＣＤ３指向二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、配列番号１４、１５、１８、１９、２０、２１、２４および２５からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、サイトカインは、Ｆｃドメインに直接またはリンカーを介して連結されている。

特定の実施形態では、ＥＧＦＲ／ＣＤ３指向二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、ＣＤ３に結合する抗原結合部位をさらに含む。ＣＤ３に結合する例示的な抗原結合部位は、国際公開第２０１４／０５１４３３号および国際公開第２０１７／０９７７２３号に開示されている。

本出願の別の態様は、ＥＧＦＲ／ＣＤ３指向二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーの少なくとも１つのポリペプチドをコードする核酸であって、当該ポリペプチドがＥＧＦＲに結合する抗原結合部位を含む、核酸を提供する。特定の実施形態では、この核酸は、発現されると、ＥＧＦＲ／ＣＤ３指向二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーのポリペプチドの１またはそれを超えるＮ末端にあるシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。核酸を含むベクター（例えば、ウイルスベクター）、核酸またはベクターを含むプロデューサー細胞、およびＥＧＦＲ／ＣＤ３指向二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーを発現するプロデューサー細胞も提供される。
免疫サイトカイン

特定の実施形態では、本出願は、本明細書に開示されるＥＧＦＲに結合する抗原結合部位およびサイトカインを含む免疫サイトカインを提供する。限定するものではないが、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＴＮＦα、ＩＦＮα、ＩＦＮγおよびＧＭ－ＣＳＦなどの、当技術分野で公知の任意のサイトカイン（例えば、炎症促進性または抗炎症性サイトカイン）を使用することができる。より例示的なサイトカインは、米国特許第９，５６７，３９９号に開示されている。特定の実施形態では、抗原結合部位は、化学的コンジュゲーション（例えば、共有結合性または非共有結合性の化学的コンジュゲーション）によってサイトカインに接続される。特定の実施形態では、抗原結合部位は、ポリペプチド鎖の融合によってサイトカインに連結される（すなわち、ペプチド結合）。免疫サイトカインは、ＥＧＦＲに結合する抗原結合部位に結合したＦｃドメインをさらに含み得る。特定の実施形態では、免疫サイトカイン中のＥＧＦＲに結合する抗原結合部位は、パニツムマブに対して、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキームに基づく、ＶＨ中のＳ６２Ｒ、ＶＬ中のＦ８７Ｙ、およびＶＬ中のＤ９２Ｒから選択される１またはそれを超える変異を含む。特定の実施形態では、免疫サイトカインは、配列番号１４、１５、１８、１９、２０、２１、２４および２５からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、サイトカインは、Ｆｃドメインに直接またはリンカーを介して連結されている。

別の態様では、本出願は、免疫サイトカインの少なくとも１つのポリペプチドをコードする核酸であって、当該ポリペプチドがＥＧＦＲに結合する抗原結合部位を含む、核酸を提供する。特定の実施形態では、この核酸は、発現されると、免疫サイトカインのポリペプチドの１またはそれを超えるＮ末端にあるシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。核酸を含むベクター（例えば、ウイルスベクター）、核酸またはベクターを含むプロデューサー細胞、および免疫サイトカインを発現するプロデューサー細胞も提供される。
抗体－薬物コンジュゲート

特定の実施形態では、本出願は、本明細書に開示されるＥＧＦＲと結合する抗原結合部位および細胞傷害性薬物部分を含む抗体－薬物コンジュゲートを提供する。例示的な細胞傷害性薬物部分は、国際公開第２０１４／１６０１６０号および国際公開第２０１５／１４３３８２号に開示されている。特定の実施形態では、細胞傷害性薬物部分は、オーリスタチン、Ｎ－アセチル－γカリケアマイシン、メイタンシノイド、ピロロベンゾジアゼピン、およびＳＮ－３８から選択される。抗原結合部位は、化学的コンジュゲーション（例えば、共有結合性または非共有結合性の化学的コンジュゲーション）によって細胞傷害性薬物部分に接続することができる。特定の実施形態では、抗体－薬物コンジュゲートは、ＥＧＦＲに結合する抗原結合部位に結合したＦｃドメインをさらに含む。特定の実施形態では、抗体－薬物コンジュゲート中のＥＧＦＲに結合する抗原結合部位は、パニツムマブに対して、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキームに基づく、ＶＨ中のＳ６２Ｒ、ＶＬ中のＦ８７Ｙ、およびＶＬ中のＤ９２Ｒから選択される１またはそれを超える変異を含む。特定の実施形態では、抗体－薬物コンジュゲートは、配列番号１４、１５、１８、１９、２０、２１、２４および２５からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、細胞傷害性薬物部分は、Ｆｃドメインに直接またはリンカーを介して結合している。
免疫毒素

特定の実施形態では、本出願は、本明細書に開示されるＥＧＦＲに結合する抗原結合部位および細胞傷害性ペプチド部分を含む免疫毒素を提供する。限定するものではないが、リシン、ジフテリア毒素およびシュードモナス外毒素Ａなどの当該分野で公知の任意の細胞傷害性ペプチド部分を使用することができる。より例示的な細胞傷害性ペプチドは、国際公開第２０１２／１５４５３０号および国際公開第２０１４／１６４６８０号に開示されている。特定の実施形態では、細胞傷害性ペプチド部分は、化学的コンジュゲーション（例えば、共有結合性または非共有結合性の化学的コンジュゲーション）によってタンパク質に連結される。特定の実施形態では、細胞傷害性ペプチド部分は、ポリペプチドの融合によってタンパク質に連結される。免疫毒素は、ＥＧＦＲに結合する抗原結合部位に連結されたＦｃドメインをさらに含み得る。特定の実施形態では、免疫毒素中のＥＧＦＲに結合する抗原結合部位は、パニツムマブに対して、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキームに基づく、ＶＨ中のＳ６２Ｒ、ＶＬ中のＦ８７Ｙ、およびＶＬ中のＤ９２Ｒから選択される１またはそれを超える変異を含む。特定の実施形態では、免疫毒素は、配列番号１４、１５、１８、１９、２０、２１、２４および２５からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、細胞傷害性ペプチド部分は、直接またはリンカーを介してＦｃドメインに接続される。

別の態様では、本出願は、免疫毒素の少なくとも１つのポリペプチドをコードする核酸であって、当該ポリペプチドがＥＧＦＲに結合する抗原結合部位を含む、核酸を提供する。特定の実施形態では、この核酸は、発現されると、免疫毒素のポリペプチドの１またはそれを超えるＮ末端にあるシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。核酸を含むベクター（例えば、ウイルスベクター）、核酸またはベクターを含むプロデューサー細胞、および免疫毒素を発現するプロデューサー細胞も提供される。
ＩＩ．治療用組成物およびその使用

本出願は、本明細書に開示される抗原結合部位を含むタンパク質、コンジュゲート、または細胞および／または本明細書に記載される医薬組成物を使用して癌を処置する方法を提供する。本方法は、本明細書に開示される抗原結合部位を含むタンパク質、コンジュゲートまたは細胞の治療有効量をそれを必要とする患者に投与することによって、ＥＧＦＲを発現する様々な癌を処置するために使用され得る。

本治療方法は、処置される癌によって特徴付けることができる。処置される癌は、癌細胞の表面上に発現される特定の抗原の存在によって特徴付けることができる。

ＥＧＦＲの発現を特徴とする癌としては、固形腫瘍癌が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、特定の実施形態では、癌は、頭頸部癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、腎細胞癌、膀胱癌、子宮頸癌、卵巣癌、膵臓癌、または肝臓癌である。特定の実施形態では、癌は、肺癌（限定するものではないが、小細胞肺癌または肺腺癌など）、乳癌、乳癌浸潤性乳管癌、腎臓癌、従来の多形性膠芽腫、結腸癌、結腸腺癌、胃癌、脳癌、神経膠芽腫、膀胱癌、頭頸部癌、卵巣癌または前立腺癌である。

本明細書に記載のタンパク質、コンジュゲート、細胞および／または医薬組成物は、様々な癌を、限定するものではないが、癌細胞または癌微小環境中の細胞がＥＧＦＲを発現する癌を処置するために使用することができると考えられる。

特定の実施形態では、癌は固形腫瘍である。特定の他の実施形態では、癌は、脳癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、白血病、肺癌、肝臓癌、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎臓癌、胃癌、精巣癌、または子宮癌である。さらに他の実施形態では、癌は、血管新生腫瘍、扁平上皮癌、腺癌、小細胞癌、黒色腫、神経膠腫、神経芽腫、肉腫（例えば、血管肉腫または軟骨肉腫）、喉頭癌、耳下腺癌、胆道癌、甲状腺癌、先端黒子型黒色腫、光線性角化症、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、腺様嚢胞癌、腺腫、腺肉腫、腺扁平上皮癌、肛門管癌、肛門癌、肛門直腸癌、星状膠細胞性腫瘍、バルトリン腺癌、基底細胞癌、胆管癌、骨癌、骨髄癌、気管支癌、気管支腺癌、カルチノイド、胆管癌、軟骨肉腫、脈絡叢乳頭腫／癌腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、明細胞癌、結合組織癌、嚢胞腺腫、消化器系癌、十二指腸癌、内分泌系癌、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜過形成、子宮内膜間質肉腫、類内膜腺癌、内皮細胞癌、上衣癌、上皮細胞癌、ユーイング肉腫、眼および眼窩癌、女性生殖器癌、限局性結節性過形成、胆嚢癌、胃前庭癌、胃底癌、ガストリノーマ、神経膠芽腫、グルカゴノマ、心臓癌、血管芽腫、血管内皮腫、血管腫、肝腺腫、肝腺腫症、肝腺腫症、肝胆道癌、肝細胞癌、ホジキン病、回腸癌、インスリノーマ、上皮内新生物、上皮内扁平上皮細胞新生物、肝内胆管癌、浸潤性扁平上皮癌、空腸癌、関節癌、カポジ肉腫、骨盤癌、大細胞癌、大腸癌、平滑筋癌、悪性黒子黒色腫、リンパ腫、男性生殖器癌、悪性黒色腫、悪性中皮腫、髄芽腫、髄上皮腫、髄膜癌、中皮癌、転移性癌腫、口腔癌、粘膜表皮癌、多発性骨髄腫、筋肉癌、鼻道癌、神経系癌、神経上皮腺癌、結節性黒色腫、非上皮性皮膚癌、非ホジキンリンパ腫、オーツ細胞癌、乏突起膠癌、口腔癌、骨肉腫、乳頭状漿液腺癌、陰茎癌、咽頭癌、下垂体腫瘍、形質細胞腫、偽肉腫、肺芽腫、直腸癌、腎細胞癌、呼吸器系癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、漿液性癌腫、洞癌、皮膚癌、小細胞癌、小腸癌、平滑筋癌、軟部組織癌、ソマトスタチン分泌腫瘍、脊椎癌、扁平上皮癌、横紋筋癌、中皮下癌、表在型黒色腫、Ｔ細胞白血病、舌癌、未分化癌、尿管癌、尿道癌、膀胱癌、泌尿器系癌、子宮頸癌、子宮体癌、ブドウ膜黒色腫、膣癌、疣贅癌、ビポーマ、外陰癌、高分化癌、またはウィルムス腫瘍である。

特定の他の実施形態では、癌は、Ｂ細胞リンパ腫またはＴ細胞リンパ腫などの非ホジキンリンパ腫である。特定の実施形態では、非ホジキンリンパ腫は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、縦隔原発Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節外辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、または原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫などのＢ細胞リンパ腫である。特定の他の実施形態では、非ホジキンリンパ腫は、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、節外ナチュラルキラー細胞／Ｔ細胞リンパ腫、腸症型Ｔ細胞リンパ腫、皮下脂腺炎様Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、または末梢Ｔ細胞リンパ腫などのＴ細胞リンパ腫である。

処置される癌は、癌細胞の表面上に発現される特定の抗原の存在によって特徴付けることができる。特定の実施形態では、癌細胞は、ＥＧＦＲに加えて、ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ３０、ＣＤ７０、ＩＧＦ１Ｒ、ＨＥＲ３／ＥＲＢＢ３、ＨＥＲ４／ＥＲＢＢ４、ＭＵＣ１、ＴＲＯＰ２、ｃＭＥＴ、ＳＬＡＭＦ７、ＰＳＣＡ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＣＴＬＡ４およびＰＤ１のうちの１またはそれを超えるものを発現し得る。
ＩＩＩ．併用療法

別の態様では、本出願は併用療法を提供する。本明細書に記載の抗原結合部位を含むタンパク質、コンジュゲート、および細胞は、癌を処置するためのさらなる治療剤と組み合わせて使用することができる。

癌の処置において併用療法の一部として使用され得る例示的な治療剤としては、例えば、放射線、マイトマイシン、トレチノイン、リボムスチン、ゲムシタビン、ビンクリスチン、エトポシド、クラドリビン、ミトブロニトール、メトトレキサート、ドキソルビシン、カルボコン、ペントスタチン、ニトラクリン、ジノスタチン、セトロレリクス、レトロゾール、ラルチトレキセド、ダウノルビシン、ファドロゾール、フォテムスチン、チマルファシン、ソブゾキサン、ネダプラチン、シタラビン、ビカルタミド、ビノレルビン、ベスナリノン、アミノグルテチミド、アムサクリン、プログルミド、酢酸エリプテニウム、ケタンセリン、ドキシフルリジン、エトレチネート、イソチノイン、ストレプトゾシン、ニムスチン、ビンデシン、フルタミド、ドロゲニル、ブトシン、カルモフル、ラゾキサン、シゾフィラン、カルボプラチン、ミトラクトール、テガフール、イホスファミド、プレドニムスチン、ピシバニル、レバミソール、テニポシド、イプロスルファン、エノシタビン、リスリド、オキシメトロン、タモキシフェン、プロゲステロン、メピチオスタン、エピチオスタノール、ホルメスタン、インターフェロン－アルファ、インターフェロン－２アルファ、インターフェロン－ベータ、インターフェロン－ガンマ、コロニー刺激因子－１、コロニー刺激因子－２、デニロイキンジフチトックス、インターロイキン－２、ルテイン化ホルモン放出因子、ならびに、その同族受容体への示差的結合および血中半減期の増加または減少を示し得る上述の薬剤のバリエーションが挙げられる。

癌の処置において併用療法の一部として使用され得るさらなるクラスの薬剤は、免疫チェックポイント阻害剤である。例示的な免疫チェックポイント阻害剤としては、（ｉ）細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）、（ｉｉ）プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）、（ｉｉｉ）ＰＤＬ１、（ｉｖ）ＬＡＧ３、（ｖ）Ｂ７－Ｈ３、（ｖｉ）Ｂ７－Ｈ４、および（ｖｉｉ）ＴＩＭ３のうちの１またはそれを超えるものを阻害する薬剤が挙げられる。ＣＴＬＡ４阻害剤イピリムマブは、黒色腫の処置に関して米国食品医薬品局によって承認されている。

癌の処置において併用療法の一部として使用され得るさらに他の薬剤は、非チェックポイント標的（例えば、ハーセプチン）および非細胞傷害性薬剤（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤）を標的とするモノクローナル抗体薬剤である。

抗癌剤のさらに他のカテゴリーとしては、例えば、（ｉ）ＡＬＫ阻害剤、ＡＴＲ阻害剤、Ａ２Ａアンタゴニスト、塩基除去修復阻害剤、Ｂｃｒ－Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害剤、ブルトン型チロシンキナーゼ阻害剤、ＣＤＣ７阻害剤、ＣＨＫ１阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤、ＤＮＡ－ＰＫおよびｍＴＯＲの両方の阻害剤、ＤＮＭＴ１阻害剤、ＤＮＭＴ１阻害剤＋２－クロロ－デオキシアデノシン、ＨＤＡＣ阻害剤、ヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤、ＩＤＯ阻害剤、ＪＡＫ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＭＥＬＫ阻害剤、ＭＴＨ１阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、ホスホイノシチド３－キナーゼ阻害剤、ＰＡＲＰ１およびＤＨＯＤＨの両方の阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼ－ＩＩ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、およびＷＥＥ１阻害剤、（ｉｉ）ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＴＮＦＲＳＦ２５またはＩＣＯＳのアゴニスト、ならびに、（ｉｉｉ）ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＧＭ－ＣＳＦおよびＧ－ＣＳＦから選択されるサイトカインが挙げられる。

本出願に記載されるタンパク質はまた、原発病変の外科的除去の補助として使用することができる。

本明細書に開示されるタンパク質、コンジュゲートまたは細胞およびさらなる治療薬の量および投与の相対的なタイミングは、所望の併用治療効果を達成するように選択され得る。例えば、併用療法をそのような投与を必要とする患者に投与する場合、併用する治療薬、またはその治療薬を含む医薬組成物もしくは組成物群は、任意の順序で、例えば、連続的に、並行して、一緒に、同時に、といった具合に投与され得る。さらに、例えば、本明細書に開示されるタンパク質、コンジュゲートまたは細胞は、さらなる治療剤がその予防効果または治療効果を発揮する期間中に投与されてもよく、またはその逆もしかりである。
ＩＶ．医薬組成物

本開示はまた、治療有効量の本明細書に記載のタンパク質、タンパク質コンジュゲート、または免疫エフェクター細胞を含有する医薬組成物を特徴とする。本組成物は、様々な薬物送達系での使用のために製剤化することができる。適切な製剤化のために、１またはそれを超える生理学的に許容され得る賦形剤または担体を本組成物に含めることもできる。本明細書に開示される組成物に使用するのに適した製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，１７ｔｈ ｅｄ．，１９８５に見られる。薬物送達のための方法の簡潔な説明については、例えば、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３，１９９０）を参照されたい。

一態様では、本開示は、本明細書に記載のＥＧＦＲ結合部位を含有するタンパク質と、薬学的に許容され得る担体との製剤を提供する。

本組成物は、様々な薬物送達系での使用のために製剤化することができる。適切な製剤化のために、１またはそれを超える生理学的に許容され得る賦形剤または担体を本組成物に含めることができる。本明細書に開示される組成物に使用するのに適した製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，１７ｔｈ ｅｄ．，１９８５に見られる。薬物送達のための方法の簡潔な説明については、例えば、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３，１９９０）を参照されたい。

特定の実施形態では、本組成物は薬物送達製剤であり得る。本明細書に記載の静脈内薬物送達製剤は、バッグ、ペン、またはシリンジに収容され得る。特定の実施形態では、バッグは、チューブおよび／または針を含むチャネルに接続されてもよい。特定の実施形態では、本製剤は、凍結乾燥製剤または液体製剤であり得る。特定の実施形態では、本製剤を凍結乾燥し、約１２～６０バイアルに入れることができる。特定の実施形態では、本製剤は凍結乾燥してもよく、１つのバイアルに４５ｍｇの凍結乾燥製剤を入れてもよい。特定の実施形態では、１つのバイアルに約４０ｍｇから約１００ｍｇの凍結乾燥製剤を入れてもよい。特定の実施形態では、１２、２７または４５バイアルからの凍結乾燥製剤を組み合わせて、静脈内製剤中のタンパク質の治療用量を得る。特定の実施形態では、本製剤は液体製剤であり得、約２５０ｍｇ／バイアルから約１０００ｍｇ／バイアルで保存され得る。特定の実施形態では、本製剤は液体製剤であり得、約６００ｍｇ／バイアルで保存され得る。特定の実施形態では、本製剤は液体製剤であり得、約２５０ｍｇ／バイアルで保存され得る。

これらの組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌してもよく、または滅菌濾過してもよい。得られた水溶液は、そのまま使用するために包装してもよく、または凍結乾燥してもよく、凍結乾燥調製物は、投与前に滅菌水性担体と組み合わされる。この調製物のｐＨは、典型的には３～１１、例えば５～９または６～８、特定の実施形態では７～８、例えば７～７．５である。得られた固体形態の組成物は、各々が固定量の１またはそれを超える上述の薬剤を含有する複数の単回用量単位で包装することができる。固体形態の本組成物は、量の融通がきく容器に包装することもできる。

特定の実施形態では、本開示は、マンニトール、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、リン酸二水素ナトリウム二水和物、塩化ナトリウム、ポリソルベート８０、水および水酸化ナトリウムと組み合わせた、本開示に記載のタンパク質を含む長い貯蔵寿命を有する製剤を提供する。

特定の実施形態では、ｐＨ緩衝溶液中に本開示に記載のタンパク質を含む水性製剤が調製される。本出願の緩衝液は、約４から約８、例えば約４．５から約６．０、または約４．８から約５．５の範囲のｐＨを有し得るか、または約５．０から約５．２のｐＨを有し得る。上に記載されたｐＨの中間の範囲も、本開示の一部であることが意図されている。例えば、上に記載された値のいずれかの組み合わせを上限および／または下限として使用する値の範囲が含まれることが意図される。ｐＨをこの範囲内に制御する緩衝液の例としては、酢酸塩（例えば、酢酸ナトリウム）、コハク酸塩（例えば、コハク酸ナトリウム）、グルコン酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩および他の有機酸緩衝液が挙げられる。

特定の実施形態では、製剤は、ｐＨを約４から約８の範囲に維持するためにクエン酸塩およびリン酸塩を含有する緩衝系を含む。特定の実施形態では、ｐＨ範囲は、約４．５から約６．０、または約ｐＨ４．８から約５．５、または約５．０から約５．２のｐＨ範囲であり得る。特定の実施形態では、緩衝系は、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム二水和物および／またはリン酸二水素ナトリウム二水和物を含む。特定の実施形態では、緩衝系は、約１．３ｍｇ／ｍＬのクエン酸（例えば、１．３０５ｍｇ／ｍＬ）、約０．３ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム（例えば、０．３０５ｍｇ／ｍＬ）、約１．５ｍｇ／ｍＬのリン酸二ナトリウム二水和物（例えば、１．５３ｍｇ／ｍＬ）、約０．９ｍｇ／ｍＬのリン酸二水素ナトリウム二水和物（例えば、０．８６ｍｇ／ｍＬ）、および約６．２ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム（例えば、６．１６５ｍｇ／ｍＬ）を含む。特定の実施形態では、緩衝系は、約１から約１．５ｍｇ／ｍＬのクエン酸、約０．２５から約０．５ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム、約１．２５から約１．７５ｍｇ／ｍＬのリン酸二ナトリウム二水和物、約０．７から約１．１ｍｇ／ｍＬのリン酸二水素ナトリウム二水和物および約６．０から約６．４ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウムを含む。特定の実施形態では、製剤のｐＨを水酸化ナトリウムで調整する。

等張化剤として作用し、抗体を安定化し得るポリオールも製剤に含まれ得る。ポリオールは、製剤の所望の等張性に関して変化し得る量で製剤に添加される。特定の実施形態では、水性製剤は等張性であり得る。添加されるポリオールの量はまた、ポリオールの分子量に関して変更され得る。例えば、二糖（トレハロースなど）と比較して、より少量の単糖（例えば、マンニトール）を添加することができる。特定の実施形態では、等張剤として製剤に使用され得るポリオールはマンニトールである。特定の実施形態では、マンニトールの濃度は、約５から約２０ｍｇ／ｍＬであり得る。特定の実施形態では、マンニトールの濃度は、約７．５から約１５ｍｇ／ｍＬであり得る。特定の実施形態では、マンニトールの濃度は、約１０から約１４ｍｇ／ｍＬであり得る。特定の実施形態では、マンニトールの濃度は、約１２ｍｇ／ｍＬであり得る。特定の実施形態では、ポリオールソルビトールは製剤に含まれ得る。

洗剤または界面活性剤を製剤に加えてもよい。例示的な洗剤としては、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０、８０など。）またはポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）などの非イオン性洗剤が挙げられる。添加される界面活性剤の量は、製剤化された抗体の凝集を減少させ、かつ／または製剤中の微粒子の形成を最小にし、かつ／または吸着を減少させるような量である。特定の実施形態では、本製剤は、ポリソルベートである界面活性剤を含み得る。特定の実施形態では、本製剤は、洗剤ポリソルベート８０またはＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を含有し得る。Ｔｗｅｅｎ８０は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートを表すために使用される用語である（Ｆｉｅｄｌｅｒ，Ｌｅｘｉｋｏｎ ｄｅｒ Ｈｉｆｓｓｔｏｆｆｅ，Ｅｄｉｔｉｏ Ｃａｎｔｏｒ Ｖｅｒｌａｇ Ａｕｌｅｎｄｏｒｆ，４ｔｈ ｅｄ．，１９９６を参照されたい）。特定の実施形態では、本製剤は、約０．１ｍｇ／ｍＬ～約１０ｍｇ／ｍＬ、または約０．５ｍｇ／ｍＬ～約５ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含有し得る。特定の実施形態では、約０．１％のポリソルベート８０が製剤に添加され得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質産物は、液体製剤として製剤化される。液体製剤は、ゴム栓で閉鎖され、アルミニウムクリンプシールクロージャで密封されたＵＳＰ／Ｐｈ ＥｕｒタイプＩ ５０Ｒバイアルのいずれかの中に１０ｍｇ／ｍＬの濃度で提供され得る。ストッパは、ＵＳＰおよびＰｈ Ｅｕｒに準拠するエラストマー製のものであり得る。特定の実施形態では、６０ｍＬの抽出可能な体積を可能にするために、バイアルに６１．２ｍＬのタンパク質産物溶液を充填することができる。特定の実施形態では、液体製剤は、０．９％生理食塩水で希釈され得る。

特定の実施形態では、本明細書に開示される液体製剤は、安定化レベルの糖と組み合わせて１０ｍｇ／ｍＬ濃度の溶液として調製され得る。特定の実施形態では、液体製剤は、水性担体中で調製され得る。特定の実施形態では、安定剤は、静脈内投与に望ましくないまたは不適切な粘度をもたらし得る量以下の量で添加され得る。特定の実施形態では、糖は二糖、例えば、スクロースであり得る。特定の実施形態では、液体製剤はまた、緩衝剤、界面活性剤、および防腐剤のうちの１またはそれを超えるものを含み得る。

特定の実施形態では、液体製剤のｐＨは、薬学的に許容され得る酸および／または塩基の添加によって設定され得る。特定の実施形態では、薬学的に許容され得る酸は塩酸であり得る。特定の実施形態では、塩基は水酸化ナトリウムであり得る。

凝集に加えて、脱アミド化は、発酵中、収穫／細胞の清澄化中、精製中、原薬／製剤の保管中および試料分析中に起こり得るペプチドおよびタンパク質の一般的な生成物変異体である。脱アミドは、加水分解を受けることができるスクシンイミド中間体を形成するタンパク質からのＮＨ_３の損失である。スクシンイミド中間体は、親ペプチドの１７ダルトンの質量減少をもたらす。その後の加水分解は、１８ダルトンの質量増加をもたらす。スクシンイミド中間体の単離は、水性条件下での不安定性のために困難である。したがって、脱アミド化は、典型的には、１ダルトンの質量増加として検出可能である。アスパラギンの脱アミドは、アスパラギン酸またはイソアスパラギン酸のいずれかをもたらす。脱アミド速度に影響を及ぼすパラメータとしては、ｐＨ、温度、溶媒誘電率、イオン強度、一次配列、局所的ポリペプチド配座および三次構造が挙げられる。ペプチド鎖中のＡｓｎに隣接するアミノ酸残基は、脱アミド速度に影響を及ぼす。タンパク質配列中のＡｓｎに続くＧｌｙおよびＳｅｒは、脱アミドに対するより高い感受性をもたらす。

特定の実施形態では、本明細書に記載の液体製剤は、タンパク質産物の脱アミノ化を防ぐｐＨおよび湿度の条件下で保存され得る。

本明細書における目的の水性担体は、薬学的に許容され得るもの（ヒトへの投与に安全かつ非毒性）であり、液体製剤の調製に有用なものである。例示的な担体としては、滅菌注射用水（ＳＷＦＩ）、静菌注射用水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンゲル液またはデキストロース溶液が挙げられる。

細菌作用を低減するために、本明細書の製剤に必要に応じて防腐剤を添加してもよい。防腐剤の添加は、例えば、多目的（複数回投与）製剤の製造を促進し得る。

静脈内（ＩＶ）送達は、患者が移植後に病院でＩＶ経路を介してすべての薬物を投与されるときなどの特定の例における投与経路であり得る。特定の実施形態では、液体製剤は、投与前に０．９％塩化ナトリウム溶液で希釈される。特定の実施形態では、注射用希釈製剤は等張性であり、静脈内注入による投与に適している。

特定の実施形態では、塩または緩衝液成分は、１０ｍＭ～２００ｍＭの量で添加され得る。塩および／または緩衝液は薬学的に許容され得るものであり、「塩基形成」金属またはアミンを有する様々な既知の酸（無機および有機）から誘導される。特定の実施形態では、緩衝液はリン酸緩衝液であり得る。特定の実施形態では、緩衝液は、グリシネート、カーボネート、シトレート緩衝液であってもよく、その場合、ナトリウム、カリウムまたはアンモニウムイオンが対イオンとして機能し得る。

細菌作用を低減するために、本明細書の製剤に必要に応じて防腐剤を添加してもよい。防腐剤の添加は、例えば、多目的（複数回投与）製剤の製造を促進し得る。

本明細書における目的の水性担体は、薬学的に許容され得るもの（ヒトへの投与に安全かつ非毒性）であり、液体製剤の調製に有用なものである。例示的な担体としては、滅菌注射用水（ＳＷＦＩ）、静菌注射用水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンゲル液またはデキストロース溶液が挙げられる。

本明細書に記載のタンパク質は、本タンパク質および凍結保護剤を含む凍結乾燥製剤の形で存在し得る。凍結保護剤は、糖、例えば二糖であり得る。特定の実施形態では、凍結保護剤はスクロースまたはマルトースであり得る。凍結乾燥製剤はまた、緩衝剤、界面活性剤、増量剤および／または保存剤のうちの１またはそれを超えるものを含み得る。

凍結乾燥製剤の安定化に有用なスクロースまたはマルトースの量は、スクロースまたはマルトースに対するタンパク質の重量比が少なくとも１：２であり得る。特定の実施形態では、スクロースまたはマルトースに対するタンパク質の重量比は、１：２から１：５であり得る。

特定の実施形態では、本製剤のｐＨは、凍結乾燥前に、薬学的に許容され得る酸および／または塩基の添加によって設定され得る。特定の実施形態では、薬学的に許容され得る酸は塩酸であり得る。特定の実施形態では、薬学的に許容され得る塩基は、水酸化ナトリウムであり得る。

凍結乾燥の前に、本明細書に記載のタンパク質を含有する溶液のｐＨを６～８に調整することができる。特定の実施形態では、凍結乾燥製剤のｐＨ範囲は、７から８であり得る。

特定の実施形態では、塩または緩衝成分は、１０ｍＭ～２００ｍＭの量で添加され得る。塩および／または緩衝液は薬学的に許容され得るものであり、「塩基形成」金属またはアミンを有する様々な既知の酸（無機および有機）から誘導される。特定の実施形態では、緩衝液はリン酸緩衝液であり得る。特定の実施形態では、緩衝液は、グリシネート、カーボネート、シトレート緩衝液であってもよく、その場合、ナトリウム、カリウムまたはアンモニウムイオンが対イオンとして機能し得る。

特定の実施形態では、「増量剤」を添加することができる。「増量剤」は、凍結乾燥混合物に質量を加え、凍結乾燥ケーキの物理的構造に寄与する（例えば、開放細孔構造を維持する本質的に均一な凍結乾燥ケーキの製造を容易にする）化合物である。例示的な増量剤としては、マンニトール、グリシン、ポリエチレングリコールおよびソルビトールが挙げられる。本出願の凍結乾燥製剤は、そのような増量剤を含有し得る。

細菌作用を低減するために、本明細書の製剤に必要に応じて防腐剤を添加してもよい。防腐剤の添加は、例えば、多目的（複数回投与）製剤の製造を促進し得る。

特定の実施形態では、凍結乾燥製剤を水性担体で再構成することができる。本明細書における目的の水性担体は、薬学的に許容され得るもの（例えば、ヒトへの投与に安全かつ非毒性）であり、凍結乾燥後の液体製剤の調製に有用なものである。例示的な水性担体としては、滅菌注射用水（ＳＷＦＩ）、静菌注射用水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンゲル液またはデキストロース溶液が挙げられる。

特定の実施形態では、本明細書に開示される凍結乾燥製剤は、滅菌注射用水、ＵＳＰ（ＳＷＦＩ）または０．９％塩化ナトリウム注射液、ＵＳＰのいずれかで再構成される。再構成中、凍結乾燥粉末は溶液に溶解する。

特定の実施形態では、本明細書に開示される凍結乾燥タンパク質製品は、注射用水約４．５ｍＬに再構成され、０．９％生理食塩水（塩化ナトリウム溶液）で希釈される。

本明細書に記載される医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、特定の患者、組成物、および投与様式に対して所望の治療応答を達成するのに有効であり、患者に毒性がない活性成分の量を得るように変動し得る。

特定の用量は、各患者に対して均一な用量、例えば、５０～５０００ｍｇのタンパク質であり得る。あるいは、患者の用量は、患者のおおよその体重または表面積に合わせて調整することができる。適切な投与量を決定する際の他の要因としては、処置または予防される疾患または状態、疾患の重症度、投与経路、ならびに患者の年齢、性別および医学的状態が挙げられる。処置のための適切な投与量を決定するために必要な計算のさらなる改良は、当業者によって、特に本明細書に開示される投与量情報およびアッセイに照らして、日常的に行われる。投与量は、適切な用量反応データと併せて使用される投与量を決定するための公知のアッセイの使用によって決定することもできる。個々の患者の投薬量は、疾患の進行をモニターしながら調節することができる。患者における標的化可能な構築物または複合体の血中レベルを測定して、有効濃度に達するかまたは有効濃度を維持するために投与量を調整する必要があるかどうかを調べることができる。薬理ゲノミクスを使用して、どの標的化可能な構築物および／または複合体、ならびにその投与量が所与の個体に最も有効である可能性が高いかを調べることができる（Ｓｃｈｍｉｔｚら、Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ、３０８：４３～５３、２００１、Ｓｔｅｉｍｅｒら、Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ３０８：３３－４１，２００１）。

一般に、体重に基づく投与量は、約０．０１μｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、約０．０１μｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇから約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇから約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇから約１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇから約１００μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇから約５０μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇから約１０μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇから約１μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇから約０．１μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇから約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇから約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇから約１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇから約１００μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇから約１０μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇから約１μｇ／ｋｇ体重、約１μｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇから約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇから約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇから約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇから約１００μｇ／ｋｇ体重、約１μｇから約５０μｇ／ｋｇ体重、約１μｇから約１０μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇから約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇから約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇから約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇから約１００μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇから約５０μｇ／ｋｇ体重、約５０μｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇから約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇから約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇから約１ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇから約１００μｇ／ｋｇ体重、約１００μｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇから約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇから約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇから約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇから約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇから約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇから約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０ｍｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重である。

用量は、１日に１回またはそれを超える回数、週に１回、月に１回もしくは年に１回、またはさらに２から２０年に１回で与えられ得る。当業者は、測定された滞留時間および体液または組織中の標的化可能な構築物または複合体の濃度に基づいて、投与の繰り返し率を容易に推定することができる。本明細書に記載の組成物の投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、髄腔内、腔内、カテーテルによる灌流または直接病巣内注射によるものであり得る。これは、１日１回またはそれを超える回数、週１回またはそれを超える回数、月１回またはそれを超える回数、毎年１回またはそれを超える回数投与してもよい。

上記の説明は、本出願に記載される抗原結合部位を含むタンパク質の複数の態様および実施形態を説明している。本特許出願は、これらの態様および実施形態のすべての組み合わせおよび置換を特に企図している。

本明細書全体を通して、組成物が特定の成分を有する、または含む、または備えると記載されている場合、または、プロセスおよび方法が特定の工程を有する、または含む、または備えると記載されている場合、さらに、記載された成分から本質的になる、またはそれらからなる本出願に記載の抗原結合部位を含むタンパク質の組成物があり、記載された処理工程から本質的になる、またはそれらからなる本出願によるプロセスおよび方法があることが企図される。

本出願では、要素もしくは成分が記載された要素もしくは成分のリストに含まれ、かつ／または記載された要素もしくは成分のリストから選択されると言われ、要素もしくは成分は記載された要素もしくは成分のいずれか１つであり得、または要素もしくは成分は記載された要素もしくは成分の２つ以上からなる群から選択され得ることを理解されたい。

さらに、本明細書に記載の組成物または方法の要素および／または特徴は、本出願の趣旨および範囲から逸脱することなく様々な方法で組み合わせることが、本明細書においてそのことが明示的であるか暗示的であるかにかかわらず、可能であることを理解されたい。例えば、特定の化合物に言及する場合、その化合物は、文脈からそうでないことが理解されない限り、本出願に記載の抗原結合部位を含むタンパク質の組成物の様々な実施形態および／または本出願に記載の抗原結合部位を含むタンパク質の方法で使用することができる。換言すれば、本出願では、出願書類が明確かつ簡潔に記述および描画される方法で実施形態を説明および図示してきたが、本教示から逸脱することなく実施形態を様々に組み合わせたり分離したりできることを意図しており、そのことは理解されるであろう。例えば、本明細書に記載および図示されるすべての特徴は、本明細書に記載および図示される抗原結合部位を含むタンパク質のすべての態様に適用可能であり得ることが理解されよう。

「～のうちの少なくとも１つ」という表現は、文脈および使用からそうでないことが理解されない限り、表現後の記載された対象のそれぞれ、および記載された対象のうちの２またはそれを超えるものからなる様々な組み合わせを個別に含むことを理解されたい。３またはそれを超えるもの記載された対象に関連する「および／または」という表現は、文脈からそうでないことが理解されない限り、同じ意味を有すると理解されるべきである。

「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｅ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語、であって、その文法上の等価語を含む用語の使用は、一般に、制限のない非限定的なものとして理解されるべきであり、例えば、そうでないことが特に明記されない限り、または文脈から理解されない限り、記載されていないさらなる要素または工程を排除するものではない。

「約」という用語の使用が定量的値の前にある場合、そうでないことが特に明記されない限り、本出願はその特定の定量的値それ自体も含む。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、そうでないことが指示または推論されない限り、公称値から±１０％の変動を指す。

本出願に記載される抗原結合部位を含むタンパク質が使用可能である限りにおいて、工程の順序または特定の動作を実行する順序は重要ではないことを理解されたい。さらに、２またはそれを超える工程または動作が同時に行われてもよい。

本明細書におけるありとあらゆる例または例示的な文言、例えば「など（ｓｕｃｈ ａｓ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、単に本出願に記載の抗原結合部位を含むタンパク質をよりよく説明することを意図しており、そのように主張しない限り、本出願に記載の抗原結合部位を含むタンパク質の範囲を限定するものではない。本明細書のいかなる言語も、特許請求されていない要素が本出願の実施に不可欠であると示しているかのように解釈されるべきではない。

以下の実施例は単なる例示であり、いかなる形であれ、本出願の範囲または内容を限定することを意図するものではない。
実施例１．ＳＰＲ分析およびＤＳＣ分析を用いたＥＧＦＲ結合界面の選択

この実施例は、パニツムマブよりも改善された熱安定性を有するパニツムマブ由来のＥＧＦＲ結合部位を発現させるように設計された。簡潔に説明すると、それぞれがＥＧＦＲ（ＰＤＢ ＩＤ：５ＳＸ４）のＤ３ドメインと複合体を形成したパニツムマブＦａｂの結晶構造に基づいて選択された単一の点変異を含む２５個の構築物を設計した。うまく発現しなかった３つの構築物を除き、ＥＧＦＲ結合部位が産生され、結合親和性および熱安定性に対する変異の影響を評価した。各ｓｃＦｖ構築物はまた、ＶＨ中のＧ４４Ｃ置換およびＶＬ中のＧ１００Ｃ置換を含んでいた。ヒトＥＧＦＲおよびアカゲザルＥＧＦＲに対する動態および親和性を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて評価した。結果を表４に示す。各変異の影響が微小であることを考慮して、親和性の著しい低下を引き起こしたものを検討から外した。８つの構築物の熱安定性を、実施例３に記載の方法を使用して示差走査蛍光測定（ＤＳＦ）によってさらに評価した。結果を表５に示す。

これらの結果に基づいて、以下の変異が親和性および熱安定性を最も効果的に改善／保持することが確認された。
・重鎖：Ｓ６２Ｒ（Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキームに基づく）
・軽鎖：Ｆ８７Ｙ、Ｄ９２Ｒ（Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキームに基づく）

これらの変異の構造モデリングを図１～図３に示す。図１に示すように、パニツムマブのＶＨ鎖のＳ６２Ｒ変異は、ＶＬのＤ１とのさらなる水素結合を導入し、モデル化によるＶＨ／ＶＬ界面の安定性に寄与することが分かった。図２に示すように、パニツムマブのＶＬ鎖のＦ８７Ｙ変異は、ＶＨのＱ３９とのさらなる水素結合を導入し、モデル化によるＶＨ／ＶＬ界面の安定性に寄与することが分かった。図３に示すように、元々（ＥＧＦＲのＮ４４９への結合について）親和性を改善するように設計されたパニツムマブのＶＬ鎖のＣＤＲ３におけるＤ９２Ｒ変異は、予想外にも、モデル化に従って、ＣＤＲＬ１のＹ３２とさらなるファンデルワールス接触を形成し、パラトープを安定化することが見出された。

その後、親和性および熱安定性に対する変異の組み合わせの影響を、それぞれＳＰＲおよび示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を使用して評価した。各構築物はまた、ＶＨ中にＧ４４Ｃ置換およびＶＬ中にＧ１００Ｃ置換を含有していた。ＳＰＲ分析の結果を表６に、ＤＳＣ分析の結果を表７に示す。

表６および表７のＰＡＮＩ－Ｈ＿Ｓ６２Ｒ－Ｌ＿Ｆ８７Ｙ－Ｌ＿Ｄ９２Ｒ（以下、「ＥＧＦＲ－ｓｃＦｖ－３」）およびＰＡＮＩ－Ｈ＿Ｓ６２Ｒ－Ｌ＿Ｆ８７Ｙ（以下、「ＥＧＦＲ－ｓｃＦｖ－２」）は、最良の親和性および熱安定性を示した。Ｌ：Ｇ１００Ｃ変異およびＨ：Ｇ４４Ｃ変異は、ジスルフィド結合を促進してＶＬ鎖およびＶＨ鎖の対合を増強する。
実施例２．多重特異性結合タンパク質の表面プラズモン共鳴分析

この実施例は、ＥＧＦＲに対する特定のパニツムマブ由来ＥＧＦＲ結合部位の結合親和性を評価するように設計された。４つの多重特異性結合タンパク質、すなわち、ＥＧＦＲ－タンパク質－１、ＥＧＦＲ－タンパク質－２、ＥＧＦＲ－タンパク質－３およびＥＧＦＲ－タンパク質－４を構築した。これらのタンパク質は、表１に開示されるように、それぞれＥＧＦＲ－ｓｃＦｖ－１、ＥＧＦＲ－ｓｃＦｖ－２、ＥＧＦＲ－ｓｃＦｖ－３、およびＥＧＦＲ－ｓｃＦｖ－４のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖを含む。それぞれの多重特異性結合タンパク質は、ＥＧＦＲとは無関係の抗原に結合するＦａｂフラグメントと、抗体Ｆｃ領域とをさらに含む。組換えヒトおよびアカゲザルＥＧＦＲに対するＥＧＦＲ結合構築物の動態および親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ機器を使用してＳＰＲによって測定した。試料を抗ｈＦｃ ＩｇＧチップ上に捕捉し、捕捉した試験物上に様々な濃度のヒトまたはアカゲザル組換えＥＧＦＲ－Ｈｉｓを注入した。実験は、３７℃の生理学的温度で行った。Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してデータを分析した。

ＳＰＲ分析からの結合センサーグラムを図４～図７に示し、解析から算出したパラメータを表８に示す。図４は、ＥＧＦＲ－タンパク質１のＳＰＲ分析を示し、図５は、ＥＧＦＲ－タンパク質２のＳＰＲ分析を示し、図６は、ＥＧＦＲ－タンパク質３のＳＰＲ分析を示し、図７は、ＥＧＦＲ－タンパク質１のＳＰＲ分析を示す。これらの結果は、目的の変異がＥＧＦＲに対する多重特異性結合タンパク質の親和性に実質的な影響を及ぼさないことを示した。

実施例３．多重特異性結合タンパク質の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）分析

この実施例は、ＤＳＣ分析を使用して、実施例２に記載された多重特異性結合タンパク質構築物の熱安定性を評価するように設計された。簡潔に説明すると、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎｓを使用して、試験品を選択した緩衝液に緩衝液交換した。次いで、溶出液を同じ緩衝液で０．５ｍｇ／ｍＬに希釈した。３２５μＬの試料を、対応する緩衝ブランクと共に９６ウェル深ウェルプレートに入れ、Ｍｉｃｒｏｃａｌ ＰＥＡＱ－ＤＳＣ装置（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を用いて分析した。温度を６０℃／時間の速度で２０～２５℃から１００℃まで上昇させた。分析物の前に緩衝液バックグラウンドを３回実行した。分析前に、最も代表的な緩衝液ブランクを各分析物のスキャンから差し引いた。非２状態モデルを有するＤＳＣ分析ソフトウェアを使用してデータを当てはめ、Ｔ_{ｏｎｓｅｔ}およびＴ_ｍを報告した。

ＥＧＦＲ－タンパク質－１を使用して、ベースラインとして融解曲線を得て、変曲点、特にＴ－ｏｎｓｅｔ（分子が融解を開始する温度）ならびにｓｃＦｖの安定性に関連するＴｍ１を同定した。その後、同様の方法で、ＥＧＦＲ－タンパク質－２、ＥＧＦＲ－タンパク質－３、ＥＧＦＲ－タンパク質－４を分析した。

表９および図８Ａ～図８Ｄは、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中で試験したＤＳＣ分析結果を示す。図８Ａは、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中のＥＧＦＲ－タンパク質－１のＤＳＣ分析を示す。図８Ｂは、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中のＥＧＦＲ－タンパク質－２のＤＳＣ分析を示す。図８Ｃは、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中のＥＧＦＲ－タンパク質－３のＤＳＣ分析を示す。図８Ｄは、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中のＥＧＦＲ－タンパク質－４のＤＳＣ分析を示す。表１０および図９Ａおよび図９Ｂは、２０ｍＭのヒスチジン、２５０ｍＭのトレハロース、０．０１％ＰＳ８０（ｐＨ６．０）で試験したＤＳＣ分析結果を示す。図９Ａは、２０ｍＭのヒスチジン、２５０ｍＭのトレハロース、０．０１％ＰＳ８０緩衝液（ｐＨ６．０）中のＥＧＦＲ－タンパク質－３についてのＤＳＣ分析を示す。図９Ｂは、２０ｍＭのヒスチジン、２５０ｍＭのトレハロース、０．０１％ＰＳ８０緩衝液（ｐＨ６．０）中のＥＧＦＲ－タンパク質－３についてのＤＳＣ分析を示す。ＤＳＣ分析により、ＥＧＦＲ－タンパク質－３（図８Ｃ）が、ＥＧＦＲ－タンパク質－２（図８Ｂ）と比較して改善された熱安定性を有し、同様に、ＥＧＦＲ－タンパク質－１（図８Ａ）と比較して改善された熱安定性を有することが明らかになった。これらの結果はまた、ＥＧＦＲ－タンパク質－３（図９Ａ）およびＥＧＦＲ－タンパク質－４（図９Ｂ）の同様の熱安定性を示した。しかしながら、ＥＧＦＲ－タンパク質－４は、加速熱安定性実験（４０℃で４週間、データは示さず）の下ではより分解しやすく、このことは安定性に関するＳ６２Ｒ重鎖変異の利点を強調している。

実施例４．ＥＧＦＲ陽性細胞への多重特異性結合タンパク質結合の評価

この実施例は、細胞表面上に発現されたＥＧＦＲに対する実施例２に記載のＥＧＦＲ標的化多重特異性結合タンパク質の結合親和性を評価するように設計された。非小細胞肺癌に由来するＨ２１７２ヒト癌細胞株を使用した。簡潔に説明すると、Ｈ２１７２細胞を、ＥＧＦＲ－タンパク質１、ＥＧＦＲ－タンパク質２、ＥＧＦＲ－タンパク質３またはパニツムマブと共に４℃で０．５時間インキュベートした。インキュベーション後、多重特異性結合タンパク質およびパニツムマブのＥＧＦＲ^＋細胞への結合パターンを、フルオロフォア結合抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して検出した。細胞への多重特異性結合タンパク質の結合レベルをフローサイトメトリーによって分析した。

図１０は、ＥＧＦＲ－タンパク質１、ＥＧＦＲ－タンパク質２、ＥＧＦＲ－タンパク質３、またはパニツムマブとのインキュベーション後のＥＧＦＲ陽性細胞への結合を示す。これらのＥＧＦＲ標的化多重特異性結合タンパク質は、ｎＭ未満の濃度かつパニツムマブと同様またはより高い最大結合で細胞に結合した。
実施例５．ＥＧＦＲ細胞増殖アッセイ

この実施例は、ＥＧＦＲ発現ヒト癌細胞株Ｈ２９２の増殖に対するＥＧＦＲ多重特異性結合タンパク質の影響を評価するために設計された。簡潔に説明すると、ＥＧＦＲ－多重特異性結合タンパク質ならびに抗ＥＧＦＲ ｍＡｂであるセツキシマブおよびパニツムマブを希釈し、Ｈ２９２細胞と７２時間インキュベートした。インキュベーション後、製造者の説明書に従ってＣｅｌｌ－ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏを使用して細胞増殖を測定した。

図１１は、ＥＧＦＲ－多重特異性結合タンパク質または抗ＥＧＦＲ ｍＡｂの存在下でのＨ２９２細胞増殖を示す。抗ＥＧＦＲ ｍＡｂで処理した細胞は、ＥＧＦＲ多重特異性結合タンパク質で処理した細胞よりも増殖が少なかった。これは、多重特異性結合タンパク質およびｍＡｂの結合価の差に起因し（多重特異性結合タンパク質は一価であるが、ｍＡｂは二価である）、ｍＡｂで観察された皮膚関連毒性とＥＧＦＲ標的化との関連を考えると、より低い結合価を有するＥＧＦＲ標的化タンパク質を使用する利点が示された。
参照による組み込み

特段の記載がない限り、本明細書で言及される特許文献および科学論文のそれぞれの開示全体が、あらゆる目的のために参照により組み込まれる。
均等物

本出願に記載される抗原結合部位は、その趣旨または本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具体化され得る。したがって、前述の実施形態は、本明細書に記載の抗原結合部位を限定するものではなく、あらゆる点で例示的なものと見なされるべきである。したがって、本出願の範囲は、上記の説明ではなく添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲に入るあらゆる変更が含まれることが意図される。

Claims (53)

1. ＥＧＦＲに結合する抗原結合部位であって、
   （ｉ）それぞれ配列番号２、２３および４の相補性決定領域１（ＣＤＲ１）配列、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）配列および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、それぞれ配列番号６、７および１７のＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含むか、または、
   （ｉｉ）それぞれ配列番号２、１２および４のＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を含むＶＨと、それぞれ配列番号６、７および８のＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を含むＶＬとを含む、抗原結合部位。
2. 前記ＶＨが、それぞれ配列番号２、２３および４のＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を含み、前記ＶＬが、それぞれ配列番号６、７および１７のＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を含む、請求項１に記載の抗原結合部位。
3. 前記ＶＨが、それぞれ配列番号２、１２および４のＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を含み、前記ＶＬが、それぞれ配列番号６、７および１７のＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を含む、請求項２に記載の抗原結合部位。
4. 前記ＶＨが、それぞれ配列番号２、３および４のＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を含み、前記ＶＬが、それぞれ配列番号６、７および１７のＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を含む、請求項２に記載の抗原結合部位。
5. 前記ＶＨが、それぞれ配列番号２、１２および４のＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を含み、前記ＶＬが、それぞれ配列番号６、７および８のＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を含む、請求項１に記載の抗原結合部位。
6. 配列番号１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む抗原結合部位であって、
   前記ＶＨが配列番号１に対してＣｈｏｔｈｉａナンバリングスキームでナンバリングされるＳ６２Ｒ置換を含み、かつ／または前記ＶＬが配列番号５に対してＣｈｏｔｈｉａナンバリングスキームでナンバリングされるＤ９２Ｒ置換および／もしくはＦ８７Ｙ置換を含む、抗原結合部位。
7. 前記ＶＨが、配列番号１に対して、ＣｈｏｔｈｉａナンバリングスキームでナンバリングされるＳ６２Ｒ置換を含む、請求項６に記載の抗原結合部位。
8. 前記ＶＬが、配列番号５に対して、ＣｈｏｔｈｉａナンバリングスキームでナンバリングされるＤ９２Ｒ置換を含む、請求項６に記載の抗原結合部位。
9. 前記ＶＨが、配列番号１に対して、ＣｈｏｔｈｉａナンバリングスキームでナンバリングされるＳ６２Ｒ置換を含み、前記ＶＬが、配列番号５に対して、ＣｈｏｔｈｉａナンバリングスキームでナンバリングされるＤ９２Ｒ置換を含む、請求項６に記載の抗原結合部位。
10. 前記ＶＬが、配列番号５に対して、ＣｈｏｔｈｉａナンバリングスキームでナンバリングされるＦ８７Ｙ置換を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗原結合部位。
11. 前記ＶＨが、配列番号１１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号１６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１～３および６～１０のいずれか一項に記載の抗原結合部位。
12. 前記ＶＨが、配列番号１１のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＬが、配列番号１６のアミノ酸配列を含むか、または前記ＶＨが、配列番号３２のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＬが、配列番号３３のアミノ酸配列を含む、請求項１～３および６～１１のいずれか一項に記載の抗原結合部位。
13. 前記ＶＨが、配列番号１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号１６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１、２、４、６、８および１０のいずれか一項に記載の抗原結合部位。
14. 前記ＶＨが、配列番号１のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号１６のアミノ酸配列を含む、請求項１、２、４、６、８、１０および１３のいずれか一項に記載の抗原結合部位。
15. 前記ＶＨが、配列番号１１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号１３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１、５～７、および１０のいずれか一項に記載の抗原結合部位。
16. 前記ＶＨが、配列番号１１のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号１３のアミノ酸配列を含む、請求項１、５～７、１０および１５のいずれか一項に記載の抗原結合部位。
17. 前記抗原結合部位が、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）として存在し、前記ｓｃＦｖが、配列番号１４、１８、２０および２４から選択される配列を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の抗原結合部位。
18. 表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した場合に５ｎＭ以下の解離定数（Ｋ_Ｄ）でヒトＥＧＦＲに結合する、請求項１～１７のいずれか一項に記載の抗原結合部位。
19. 表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した場合に６ｎＭ以下の解離定数（Ｋ_Ｄ）でアカゲザルＥＧＦＲに結合する、請求項１～１８のいずれか一項に記載の抗原結合部位。
20. 請求項１～１９のいずれか一項に記載の抗原結合部位を含むタンパク質。
21. 抗体重鎖定常領域をさらに含む、請求項２０に記載のタンパク質。
22. 前記抗体重鎖定常領域がヒトＩｇＧ重鎖定常領域である、請求項２１に記載のタンパク質。
23. 前記抗体重鎖定常領域がヒトＩｇＧ１重鎖定常領域である、請求項２２に記載のタンパク質。
24. 前記抗体重鎖定常領域の各ポリペプチド鎖が、配列番号２６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２２または２３に記載のタンパク質。
25. 前記抗体重鎖定常領域の少なくとも１つのポリペプチド鎖が、配列番号２６に対して、ＥＵナンバリングシステムに従ってナンバリングされる、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１、およびＫ４３９から選択される１またはそれを超える位置に１またはそれを超える変異を含む、請求項２２～２４のいずれか一項に記載のタンパク質。
26. 前記抗体重鎖定常領域の少なくとも１つのポリペプチド鎖が、配列番号２６に対して、ＥＵナンバリングシステムに従ってナンバリングされる、Ｑ３４７Ｅ、Ｑ３４７Ｒ、Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｋ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｗ、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３６０Ｗ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｋ、Ｓ３６４Ｅ、Ｓ３６４Ｈ、Ｓ３６４Ｄ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｆ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｖ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｄ４０１Ｋ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｋ４０９Ｄ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、Ｋ４３９Ｄ、およびＫ４３９Ｅから選択される１またはそれを超える変異を含む、請求項２２～２５のいずれか一項に記載のタンパク質。
27. 前記抗体重鎖定常領域の一方のポリペプチド鎖が、配列番号２６に対して、ＥＵナンバリングシステムに従ってナンバリングされる、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１およびＫ４３９から選択される１またはそれを超える位置に１またはそれを超える変異を含み、前記抗体重鎖定常領域のもう一方のポリペプチド鎖が、配列番号２６に対して、ＥＵナンバリングシステムに従ってナンバリングされる、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１およびＫ４３９から選択される１またはそれを超える位置に１またはそれを超える変異を含む、請求項２２～２６のいずれか一項に記載のタンパク質。
28. 前記抗体重鎖定常領域の一方のポリペプチド鎖が、配列番号２６に対して、ＥＵナンバリングシステムに従ってナンバリングされる、Ｋ３６０Ｅ置換およびＫ４０９Ｗ置換を含み、前記抗体重鎖定常領域のもう一方のポリペプチド鎖が、配列番号２６に対して、ＥＵナンバリングシステムに従ってナンバリングされる、Ｑ３４７Ｒ置換、Ｄ３９９Ｖ置換およびＦ４０５Ｔ置換を含む、請求項２７に記載のタンパク質。
29. 前記抗体重鎖定常領域の一方のポリペプチド鎖が、配列番号２６に対して、ＥＵナンバリングシステムに従ってナンバリングされるＹ３４９Ｃ置換を含み、前記抗体重鎖定常領域のもう一方のポリペプチド鎖が、配列番号２６に対して、ＥＵナンバリングシステムに従ってナンバリングされるＳ３５４Ｃ置換を含む、請求項２７または２８に記載のタンパク質。
30. 請求項２０～２９のいずれか一項に記載のタンパク質と、薬物部分とを含む、抗体－薬物コンジュゲート。
31. 前記薬物部分が、オーリスタチン、Ｎ－アセチル－γカリケアマイシン、メイタンシノイド、ピロロベンゾジアゼピン、およびＳＮ－３８からなる群から選択される、請求項３０に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
32. 請求項１～１９のいずれか一項に記載の抗原結合部位と、サイトカインとを含む、免疫サイトカイン。
33. 前記サイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＴＮＦおよびＩＦＮαからなる群より選択される、請求項３２に記載の免疫サイトカイン。
34. 請求項１～１９のいずれか一項に記載の抗原結合部位と、ＣＤ３に結合する抗原結合部位とを含む、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー。
35. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
    （ａ）請求項１～１９のいずれか一項に記載の抗原結合部位と、
    （ｂ）膜貫通ドメインと、
    （ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、
    を含む、ＣＡＲ。
36. 前記膜貫通ドメインが、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、およびＣＤ１５４の膜貫通領域から選択される、請求項３５に記載のＣＡＲ。
37. 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ、共通ＦｃＲガンマ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃガンマＲＩＩａ、ＦｃＲベータ（ＦｃイプシロンＲ１ｂ）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０、およびＤＡＰ１２の機能的シグナリングドメインを含む一次シグナリングドメインを含む、請求項３５または３６に記載のＣＡＲ。
38. 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、共刺激受容体の機能的シグナリングドメインを含む共刺激シグナリングドメインをさらに含む、請求項３５～３７のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
39. 前記共刺激受容体が、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２５８、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳおよび４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）に結合するリガンド、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項３８に記載のＣＡＲ。
40. 請求項３５～３９のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードする、単離された核酸。
41. 請求項４０に記載の単離された核酸を含む、発現ベクター。
42. 請求項４０に記載の核酸または請求項４１に記載の発現ベクターを含む、免疫エフェクター細胞。
43. 請求項３５～３９のいずれか一項に記載のＣＡＲを発現する、免疫エフェクター細胞。
44. Ｔ細胞である、請求項４２または４３に記載の免疫エフェクター細胞。
45. 前記Ｔ細胞が、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、またはＮＫＴ細胞である、請求項４４に記載の免疫エフェクター細胞。
46. ＮＫ細胞である、請求項４２または４３に記載の免疫エフェクター細胞。
47. 請求項２０～２９のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項３０もしくは３１に記載の抗体－薬物コンジュゲート、請求項３２もしくは３３に記載の免疫サイトカイン、請求項３４に記載の二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、または請求項４２～４６のいずれか一項に記載の免疫エフェクター細胞と、薬学的に許容され得る担体とを含む、医薬組成物。
48. 癌を処置する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の請求項２０～２９のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項３０もしくは３１に記載の抗体－薬物コンジュゲート、請求項３２もしくは３３に記載の免疫サイトカイン、請求項３４に記載の二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、請求項４２～４６のいずれか一項に記載の免疫エフェクター細胞、または請求項４７に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
49. 前記癌が固形腫瘍である、請求項４８に記載の方法。
50. 前記癌が、肺癌、乳癌、腎臓癌、結腸直腸癌、胃癌、脳癌、神経膠腫、膀胱癌、頭頸部癌、膀胱癌、膵臓癌、および肝臓癌、子宮頸癌、卵巣癌または前立腺癌である、請求項４８または４９に記載の方法。
51. 前記癌がＥＧＦＲを発現する、請求項４８～５０のいずれか一項に記載の方法。
52. 前記抗原結合部位、タンパク質、抗体－薬物コンジュゲート、免疫サイトカイン、または二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーが、精製された抗原結合部位、タンパク質、抗体－薬物コンジュゲート、免疫サイトカイン、または二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーである、請求項１～１９のいずれか一項に記載の抗原結合部位、請求項２０～２９のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項３０もしくは請求項３１に記載の抗体－薬物コンジュゲート、請求項３２もしくは請求項３３に記載の免疫サイトカイン、または請求項３４に記載の二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー。
53. 前記抗原結合部位、タンパク質、抗体－薬物コンジュゲート、免疫サイトカイン、または二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーが、遠心分離、深層濾過、細胞溶解、均質化、凍結融解、親和性精製、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用交換クロマトグラフィーおよび混合モードクロマトグラフィーからなる群から選択される方法によって精製される、請求項５２に記載の抗原結合部位、タンパク質、抗体－薬物コンジュゲート、免疫サイトカイン、または二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー。

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