CN116547302A - 靶向egfr的抗体及其用途 - Google Patents

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CN116547302A CN202180068426.9A CN202180068426A CN116547302A CN 116547302 A CN116547302 A CN 116547302A CN 202180068426 A CN202180068426 A CN 202180068426A CN 116547302 A CN116547302 A CN 116547302A
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Abstract

本发明公开了具有可以配对以形成靶向细胞上EGFR的抗原结合位点的抗体重链和轻链可变结构域的蛋白质，包含此类蛋白质的药物组合物，以及使用此类蛋白质和药物组合物的治疗方法，包括用于治疗癌症的方法。

Description

靶向EGFR的抗体及其用途
与相关申请的交叉引用
本申请要求2020年8月5日提交的美国临时专利申请号63/061,507的利益和优先权，所述临时申请的公开内容为所有目的整体通过参考并入本文。
序列表
本申请含有以ASCII格式电子提交并整体通过参考并入本文的序列表。在2021年8月4日生成的所述ASCII副本被命名为DFY-083WO_SL.txt，大小为61,970字节。
背景技术
尽管在文献中已报道了治疗癌症的大量研究尝试和科学进展，但这种疾病依然是重要的健康问题。一些在成年人中最频繁被诊断到的癌症包括前列腺癌、乳腺癌和肺癌。血液恶性肿瘤尽管比实体肿瘤少见，但存活率低。当前用于这些癌症的治疗方案不对所有患者有效和/或可能具有实质性不良副作用。其他类型的癌症对于使用现有治疗方案治疗来说也仍然具有挑战性。
表皮生长因子受体(EGFR；ErbB-1；HER1)是一种跨膜蛋白，是细胞外蛋白配体的表皮生长因子家族(EGF家族)成员的受体。在与其特异性配体包括表皮生长因子和转化生长因子α(TGFα)结合后，EGFR经历从无活性单体形式向有活性的同二聚体或与其他ErbB家族受体的异二聚体的转变。所述二聚化刺激其固有的细胞内蛋白酪氨酸激酶活性并引发下游信号传导级联，导致DNA合成和细胞增殖。EGFR参与诸如细胞迁移、黏附和增殖的表型的调节。
导致EGFR过表达或过度活跃的突变与许多癌症相关，包括非小细胞肺癌、肛门癌、成胶质细胞瘤和头颈部上皮肿瘤。这些涉及EGFR的体细胞突变导致其持续激活，产生不受控制的细胞分裂。在成胶质细胞瘤中，经常观察到EGFR或多或少的特异性突变，被称为EGFRvIII。EGFR或家族成员的突变、扩增或失调与其他实体肿瘤有关，包括结肠直肠癌、肾细胞癌、膀胱癌、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌和肝癌。
已开发了抗EGFR单克隆抗体例如西妥昔单抗、帕尼单抗、耐昔妥珠单抗和扎芦木单抗。然而，对用于治疗癌症、具有更高疗效和更低副作用的新的有用的抗体和相关疗法，仍存在着需求。
发明内容
本申请提供了结合人EGFR的抗原结合位点。这些抗原结合位点结合EGFR的细胞外结构域中的各种表位。含有此类抗原结合位点的蛋白质和蛋白质偶联物例如抗体、抗体-药物偶联物、双特异性T-细胞衔接物(BiTE)和免疫细胞因子以及表达含有此类抗原结合位点的蛋白质(例如嵌合抗原受体(CAR))的免疫效应细胞(例如T细胞)，可用于治疗EGFR相关疾病例如癌症。
因此，本申请的一个方面提供了一种结合EGFR的抗原结合位点，其包含：(i)包含分别为SEQ ID NO：2、23和4的互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)序列的重链可变结构域(VH)，和包含分别为SEQ ID NO：6、7和17的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域(VL)；或(ii)包含分别为SEQ ID NO：2、12和4的CDR1、CDR2和CDR3序列的VH，和包含分别为SEQ ID NO：6、7和8的CDR1、CDR2和CDR3序列的VL。
在某些实施方式中，所述VH包含分别为SEQ ID NO：2、23和4的CDR1、CDR2和CDR3序列，并且所述VL包含分别为SEQ ID NO：6、7和17的CDR1、CDR2和CDR3序列。在某些实施方式中，所述VH包含分别为SEQ ID NO：2、12和4的CDR1、CDR2和CDR3序列，并且所述VL包含分别为SEQ ID NO：6、7和17的CDR1、CDR2和CDR3序列。在某些实施方式中，所述VH包含分别为SEQID NO：2、3和4的CDR1、CDR2和CDR3序列，并且所述VL包含分别为SEQ ID NO：6、7和17的CDR1、CDR2和CDR3序列。在某些实施方式中，所述VH包含分别为SEQ ID NO：2、12和4的CDR1、CDR2和CDR3序列，并且所述VL包含分别为SEQ ID NO：6、7和8的CDR1、CDR2和CDR3序列。
在某些实施方式中，所述VH包含与SEQ ID NO：11具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO：16具有至少90％同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述VH包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述VH包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述VH包含与SEQ ID NO：1具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO：16具有至少90％同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述VH包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述VH包含与SEQ ID NO：11具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO：13具有至少90％同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述VH包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列。
本申请的另一方面提供了一种抗原结合位点，其包含：包含与SEQ ID NO：1具有至少90％同一性的氨基酸序列的VH，和包含与SEQ ID NO：5具有至少90％同一性的氨基酸序列的VL，其中所述VH相对于SEQ ID NO：1包含S62R取代，和/或所述VL相对于SEQ ID NO：5包含D92R取代和/或F87Y取代，根据Chothia编号方案编号。
在任一上述方面的某些实施方式中，所述VH相对于SEQ ID NO：1包含S62R取代，根据Chothia编号方案编号。在某些实施方式中，所述VL相对于SEQ ID NO：5包含D92R取代，根据Chothia编号方案编号。在某些实施方式中，所述VH相对于SEQ ID NO：1包含S62R取代并且所述VL相对于SEQ ID NO：5包含D92R取代，根据Chothia编号方案编号。在某些实施方式中，所述VL相对于SEQ ID NO：5包含F87Y取代，根据Chothia编号方案编号。
在某些实施方式中，所述抗原结合位点作为单链可变片段(scFv)存在，并且其中所述scFv包含选自SEQ ID NO：14、18、20和24的序列。
在某些实施方式中，当通过表面等离子体共振(SPR)测量时，所述抗原结合位点以小于或等于5nM的解离常数(KD)结合人EGFR。在某些实施方式中，当通过表面等离子体共振(SPR)测量时，所述抗原结合位点以小于或等于6nM的解离常数(KD)结合恒河猴EGFR。
本申请的另一方面提供了一种蛋白质，其包含本文所公开的抗原结合位点。在某些实施方式中，所述蛋白质还包含抗体重链恒定区。在某些实施方式中，所述抗体重链恒定区是人类IgG重链恒定区。在某些实施方式中，所述抗体重链恒定区是人类IgG1重链恒定区。在某些实施方式中，所述抗体重链恒定区的每条多肽链包含与SEQ ID NO：26具有至少90％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗体重链恒定区的至少一条多肽链相对于SEQ ID NO：26，在选自Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411和K439的一个或多个位置处包含一个或多个突变，根据EU编号系统编号。在某些实施方式中，所述抗体重链恒定区的至少一条多肽链相对于SEQ ID NO：26包含选自Q347E、Q347R、Y349S、Y349K、Y349T、Y349D、Y349E、Y349C、L351K、L351D、L351Y、S354C、E356K、E357Q、E357L、E357W、K360E、K360W、Q362E、S364K、S364E、S364H、S364D、T366V、T366I、T366L、T366M、T366K、T366W、T366S、L368E、L368A、L368D、K370S、N390D、N390E、K392L、K392M、K392V、K392F、K392D、K392E、T394F、D399R、D399K、D399V、S400K、S400R、D401K、F405A、F405T、Y407A、Y407I、Y407V、K409F、K409W、K409D、T411D、T411E、K439D和K439E的一个或多个突变，根据EU编号系统编号。
在某些实施方式中，所述抗体重链恒定区的一条多肽链相对于SEQ ID NO：26，在选自Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411和K439的一个或多个位置处包含一个或多个突变；并且所述抗体重链恒定区的另一条多肽链相对于SEQ ID NO：26，在选自Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、D401、F405、Y407、K409、T411和K439的一个或多个位置处包含一个或多个突变，根据EU编号系统编号。在某些实施方式中，所述抗体重链恒定区的一条多肽链相对于SEQ ID NO：26包含K360E和K409W取代，并且所述抗体重链恒定区的另一条多肽链相对于SEQ ID NO：26包含Q347R、D399V和F405T取代，根据EU编号系统编号。
在某些实施方式中，所述抗体重链恒定区的一条多肽链相对于SEQ ID NO：26包含Y349C取代，并且所述抗体重链恒定区的另一条多肽链相对于SEQ ID NO：26包含S354C取代，根据EU编号系统编号。
本申请的另一方面提供了一种抗体-药物偶联物，其包含本文所公开的蛋白质和药物部分。在某些实施方式中，所述药物部分选自由澳瑞他汀、N-乙酰-γ-卡奇霉素、美登醇、吡咯并苯二氮卓类和SN-38组成的组。
本申请的另一方面提供了一种免疫细胞因子，其包含本文所公开的抗原结合位点和细胞因子。在某些实施方式中，所述细胞因子选自由IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、IL-15、TNF和IFNα组成的组。
本申请的另一方面提供了一种双特异性T-细胞衔接物，其包含本文所公开的抗原结合位点和结合CD3的抗原结合位点。
本申请的另一方面提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含：(a)本文所公开的抗原结合位点，(b)跨膜结构域，和(c)细胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，所述跨膜结构域选自T-细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、EGFR、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152和CD154的跨膜区。在某些实施方式中，所述细胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域，其包含CD3ζ、共同FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12的功能性信号传导结构域。在某些实施方式中，所述细胞内信号传导结构域还包含共刺激信号传导结构域，其包含共刺激受体的功能性信号传导结构域。在某些实施方式中，所述共刺激受体选自由OX40、CD27、CD28、CD30、CD40、PD-1、CD2、CD7、CD258、NKG2C、B7-H3、与CD83结合的配体、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS和4-1BB(CD137)或其任何组合组成的组。
本申请的另一方面提供了一种分离的核酸，其编码本文所公开的CAR。本申请的另一方面提供了一种表达载体，其包含本文所公开的分离的核酸。本申请的另一方面提供了一种免疫效应细胞，其包含所述核酸或表达载体。
本申请的另一方面提供了一种免疫效应细胞，其表达本文所公开的CAR。在某些实施方式中，所述免疫效应细胞是T细胞。在某些实施方式中，所述T细胞是CD8+T细胞、CD4+T细胞、γδT细胞或NKT细胞。在某些实施方式中，所述免疫效应细胞是NK细胞。
本申请的另一方面提供了一种药物组合物，其包含本文所公开的蛋白质、本文所公开的抗体-药物偶联物、本文所公开的免疫细胞因子、本文所公开的双特异性T-细胞衔接物或本文所公开的免疫效应细胞，以及药学上可接受的载体。
本申请的另一方面提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本文所公开的蛋白质、本文所公开的抗体-药物偶联物、本文所公开的免疫细胞因子、所公开的双特异性T-细胞衔接物、本文所公开的免疫效应细胞或本文所公开的药物组合物。
在某些实施方式中，所述癌症是实体肿瘤。在某些实施方式中，所述癌症是肺癌、乳腺癌、肾癌、结肠直肠癌、胃癌、脑癌、神经胶质瘤、膀胱癌、头颈癌、膀胱癌、胰腺癌、肝癌、宫颈癌、卵巢癌或前列腺癌。在某些实施方式中，所述癌症表达EGFR。
另一方面，本申请提供了纯化的本文所公开的抗原结合位点、蛋白质、抗体-药物偶联物、免疫细胞因子或双特异性T细胞衔接物。在某些实施方式中，所述纯化的抗原结合位点、蛋白质、抗体-药物偶联物、免疫细胞因子或双特异性T细胞衔接物通过选自由离心、深度过滤、细胞裂解、均质化、冻融、亲和纯化、凝胶过滤、离子交换层析、疏水相互作用交换层析和混合模式层析组成的组中的方法纯化。
本申请中描述的抗原结合位点的这些和其他方面及优点通过下面的附图、详细描述和权利要求书进行说明。
附图说明
参考下述附图，可以更完全地理解本申请。
图1是示出了在VH中具有S62R取代(在Chothia编号方案下)的帕尼单抗的结构模型的图，其中该Arg与VL的第1位处的Asp之间的氢键可能有助于VH-VL界面的稳定。
图2是示出了在VL中具有F87Y取代(在Chothia编号方案下)的帕尼单抗的结构模型的图，其中该Tyr与VH的第39位处的Gln之间的氢键可能有助于VH-VL界面的稳定。
图3是示出了在VL中具有D92R取代(在Chothia编号方案下)的帕尼单抗的结构模型的图，其中该Arg(在CDRL3中)与VL的第32位处的Tyr(在CDRL1中)之间的范德华接触可能有助于互补位的稳定。
图4是EGFR-蛋白质-1与人EGFR的结合的滴定的SPR传感图。
图5是EGFR-蛋白质-2与人EGFR的结合的滴定的SPR传感图。
图6是EGFR-蛋白质-3与人EGFR的结合的滴定的SPR传感图。
图7是EGFR-蛋白质-4与人EGFR的结合的滴定的SPR传感图。
图8A、8B、8C和8D是分别示出了EGFR-蛋白质-1(图8A)、EGFR-蛋白质-2(图8B)、EGFR-蛋白质-3(图8C)和EGFR-蛋白质-4(图8D)在pH 7.4的PBS中的热谱图的图，所述热谱图通过差示扫描量热法(DSC)分析来确定。
图9A和9B是分别示出了EGFR-蛋白质-3(图9A)和EGFR-蛋白质-4(图9B)在20mM组氨酸、250mM海藻糖、0.01％PS80、pH6.0中的热谱图的图，所述热谱图通过DSC分析来确定。
图10是示出了一系列浓度的EGFR-蛋白质-1(“EGFR1”)、EGFR-蛋白质-2(“EGFR2”)、EGFR-蛋白质-3(“EGFR3”)和帕尼单抗与EGFR阳性H2172癌细胞的结合亲和性的图。
图11是示出了在一系列浓度的EGFR-蛋白质-1(“EGFR1”)、EGFR-蛋白质-2(“EGFR2”)、EGFR-蛋白质-3(“EGFR3”)、帕尼单抗和西妥昔单抗存在下，EGFR阳性细胞系的72小时增殖的图。
具体实施方式
本申请提供了结合人EGFR的抗原结合位点。这些抗原结合位点结合EGFR的细胞外结构域中的各种表位。含有此类抗原结合位点的蛋白质和蛋白质偶联物例如抗体、抗体-药物偶联物、双特异性T-细胞衔接物(BiTE)和免疫细胞因子以及表达含有此类抗原结合位点的蛋白质(例如嵌合抗原受体(CAR))的免疫效应细胞(例如T细胞)，可用于治疗EGFR相关疾病例如癌症。本申请还提供了包含此类蛋白质、蛋白质偶联物和免疫效应细胞的药物组合物，以及使用此类蛋白质、蛋白质偶联物、免疫效应细胞和药物组合物的治疗方法，包括用于治疗癌症的方法。本申请中描述的抗原结合位点的各个方面在下文分章节阐述；然而，在一个特定章节中描述的本申请中描述的抗原结合位点的方面不应限于任何特定章节。
为了便于本申请的理解，下文定义了许多术语和短语。
如本文所用的，没有具体数目的指称意味着“一个或多个”，并包括复数指称物，除非上下文不适合。
如本文所用的，术语“抗原结合位点”是指免疫球蛋白分子的参与抗原结合的部分。在人类抗体中，抗原结合位点由重(“H”)链和轻(“L”)链的N-端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。在重链和轻链的V区内的三个高度趋异的区段被称为“高变区”，它们插入在被称为“框架区”或“FR”的更保守的侧翼区段之间。因此，术语“FR”是指天然存在于免疫球蛋白中的高变区之间并与其相邻的氨基酸序列。在人类抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中彼此相对排列，以形成抗原结合表面。所述抗原结合表面与被结合的抗原的三维表面互补，并且重链和轻链的三个高变区被称为“互补决定区”或“CDR”。在某些动物例如骆驼和软骨鱼中，抗原结合位点由单一抗体链形成，提供了“单域抗体”。抗原结合位点可以存在于完整抗体中，也可以存在于保留了抗原结合表面的抗原结合片段中，或者存在于重组多肽例如scFv中，所述scFv使用肽接头在单一多肽中将重链可变结构域连接到轻链可变结构域。
抗原结合位点的CDR可以通过下述文献中描述的方法来确定：Kabat等，J.Biol.Chem.252,6609-6616(1977)和Kabat等，《免疫学意义上的蛋白质的序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，(1991)，Chothia等，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)，和MacCallum等，J.Mol.Biol.262:732-745(1996)。在这些定义下确定的CDR在相互比较时常常包括氨基酸残基的重叠或子集。在某些实施方式中，术语“CDR”是由下述文献所定义的CDR：MacCallum等，J.Mol.Biol.262:732-745(1996)，和Martin A.，抗体可变结构域的蛋白质序列和结构分析(Protein Sequence and StructureAnalysis of Antibody Variable Domains)，在《抗体工程》(Antibody Engineering)中，Kontermann和Dubel主编，第31章，pp.422-439，Springer-Verlag，Berlin(2001)。在某些实施方式中，术语“CDR”是由下述文献所定义的CDR：Kabat等，J.Biol.Chem.252,6609-6616(1977)，和Kabat等，《免疫学意义上的蛋白质的序列》(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)，(1991)。在某些实施方式中，抗体的重链CDR和轻链CDR使用不同的惯用法定义。例如，在某些实施方式中，所述重链CDR根据MacCallum(同上)来定义，并且所述轻链CDR根据Kabat(同上)来定义。CDRH1、CDRH2和CDRH3表示重链CDR，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3表示所述轻链CDR。
如本文所用的，术语“受试者”和“患者”是指将要通过本文描述的方法和组合物治疗的生物体。这些生物体优选地包括但不限于哺乳动物(例如鼠科、猿猴、马科、牛科、猪科、犬科、猫科动物等)，更优选地包括人类。
如本文所用的，术语“有效量”是指足以实现有益或所需结果的化合物(例如本申请中描述的化合物)的量。有效量可以在一次或多次施用、施用或剂量中施用，并且不旨在限于特定制剂或施用途径。如本文所用的，术语“治疗”包括导致病症、疾病、障碍等的改善的任何效应例如减轻、降低、调节、改善或消除或改善其症状。
如本文所用的，术语“药物组合物”是指活性剂与惰性或有活性载体的组合，使得所述组合物特别适合于体内或离体诊断或治疗用途。
如本文所用的，术语“药学上可接受的载体”是指任何标准的药物载体，例如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(例如油/水或水/油乳液)和各种类型的润湿剂。所述组合物也可以包括稳定剂和防腐剂。对于载体、稳定剂和佐剂的实例，参见例如Martin，《Remington's制药学》(Remington's Pharmaceutical Sciences)，第15版，Mack Publ.Co.,Easton,PA[1975]。
如本文所用的，术语“药学上可接受的盐”是指本申请中描述的化合物的任何药学上可接受的盐(例如酸或碱式盐)，其在施用到受试者后，能够提供本申请中描述的化合物或其活性代谢物或残留物。正如本领域技术人员所知，本申请中描述的化合物的“盐”可以源自于无机或有机酸和碱。示例性的酸包括但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、延胡索酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等。其他酸例如草酸，尽管本身不是药学上可接受的，但可用于制备在获得本申请中描述的化合物及其药学上可接受的酸加成盐中可用作中间体的盐。
示例性的碱包括但不限于碱金属(例如钠)氢氧化物、碱土金属(例如镁)氢氧化物、氨和式NW4 +的化合物(其中W是C1-4烷基)等。
示例性的盐包括但不限于乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、双葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸盐、氟代庚酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、苯基丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一烷酸盐等。盐的其他实例包括本申请中描述的化合物的阴离子与适合的阳离子例如Na+、NH4 +和NW4 +(其中W是C1-4烷基)等复合。
对治疗用途来说，设想的本申请中描述的化合物的盐是药学上可接受的。然而，非药学上可接受的酸和碱的盐也可以发现在例如药学上可接受的化合物的制备或纯化中的用途。
如本文所用的，EGFR(也被称为表皮生长因子受体、ErbB-1或人类中的HER1)是指Uniprot登记号P00533(人类)的蛋白质和相关的同种型和直系同源物。
在整个本描述中，在组合物被描述为具有、包括或包含特定组分时，或在过程和方法被描述为具有、包括或包含特定步骤时，设想了另外还存在基本上由所叙述的组分构成或由所叙述的组分构成的本申请中描述的组合物，并且还存在基本上由所叙述的过程步骤构成或由所叙述的过程步骤构成的符合本申请的过程和方法。
一般来说，除非另有规定，否则规定百分率的组成是以重量计的。此外，如果变量不伴有定义，则以所述变量的以前的定义为准。
下面将更详细地讨论本申请中描述的抗原结合位点的各种特征和方面。
I.抗原结合位点
一方面，本申请提供了一种结合人EGFR的抗原结合位点，其中所述抗原结合位点包含源自于帕尼单抗的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，并在所述VH和/或VL中具有突变。所设想的单独或组合存在于本申请中描述的VH和VL序列中的突变包括VH中的S62R、VL中的D92R和/或VL中的F87Y，在Chothia编号方案下编号。已发现，这些突变提高所述抗原结合位点的热稳定性并保留其与EGFR的亲和性。示例性抗原结合位点的VH、VL、CDR和scFv序列列于表1中。所述CDR序列根据Chothia编号方案鉴定。粗体残基指示突变的残基，斜体序列指示多肽接头。
表1：示例性的结合EGFR的抗原结合位点的序列
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在某些实施方式中，所述抗原结合位点的氨基酸序列在VL的C-端处包含额外的精氨酸(R)残基(例如SEQ ID NO：5、13或16)。在某些实施方式中，所述抗原结合位点作为scFv存在，其中所述scFv包含在VL氨基酸序列的C-端处含有额外的精氨酸(R)残基的VL氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗原结合位点的氨基酸序列相对于帕尼单抗的序列包含选自VH中的S62R、VL中的D92R和VL中的F87Y的一个或多个突变，在Chothia编号方案下编号。在某些实施方式中，所述结合EGFR(例如人EGFR)的抗原结合位点包含：抗体重链可变结构域(VH)，其包含与表1中所公开的EGFR-结合物-1的VH具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的氨基酸序列；和抗体轻链可变结构域(VL)，其包含与表1中所公开的EGFR-结合物-1的VL具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述结合EGFR(例如人EGFR)的抗原结合位点包含：抗体重链可变结构域(VH)，其包含与表1中所公开的EGFR-结合物-2、EGFR-结合物-3或EGFR-结合物-4的VH具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的氨基酸序列；和抗体轻链可变结构域(VL)，其包含与表1中所公开的EGFR-结合物-2、EGFR-结合物-3或EGFR-结合物-4的VL具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗原结合位点包含表1中所公开的EGFR-结合物-2、EGFR-结合物-3或EGFR-结合物-4的VH和VL的重链CDR1、CDR2和CDR3和轻链CDR1、CDR2和CDR3，其在Kabat(参见Kabat等，(1991)，《免疫学重要的蛋白质的序列》(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest)，NIH出版号91-3242，Bethesda)、Chothia(参见例如Chothia C&Lesk A M，(1987)，J.Mol.Biol.196:901-917)、MacCallum(参见MacCallum R M等，(1996)J.Mol.Biol.262:732-745)或本领域中已知的任何其他CDR确定方法下确定。在某些实施方式中，所述抗原结合位点包含表1中所公开的EGFR-结合物-2、EGFR-结合物-3或EGFR-结合物-4的重链CDR1、CDR2和CDR3和轻链CDR1、CDR2和CDR3。
在某些实施方式中，所述抗原结合位点的氨基酸序列相对于帕尼单抗的序列包含VH中的S62R和VL中的F87Y突变，在Chothia编号方案下编号。在某些实施方式中，所述结合EGFR的抗原结合位点包含：VH，其包含与SEQ ID NO：1具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的氨基酸序列；和VL，其包含与SEQ ID NO：5具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述结合EGFR的抗原结合位点包含：重链可变结构域(VH)，其包含与SEQ ID NO：11具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列；和轻链可变结构域(VL)，其包含与SEQ ID NO：13具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗原结合位点包含表1中所公开的EGFR-结合物-2的VH和VL序列的重链CDR1、CDR2和CDR3和轻链CDR1、CDR2和CDR3，其在Kabat(参见Kabat等，(1991)，《免疫学重要的蛋白质的序列》(Sequences ofProteins ofImmunological Interest)，NIH出版号91-3242，Bethesda)、Chothia(参见例如Chothia C&Lesk A M，(1987)，J.Mol.Biol.196:901-917)、MacCallum(参见MacCallum RM等，(1996)J.Mol.Biol.262:732-745)或本领域中已知的任何其他CDR确定方法下确定。在某些实施方式中，所述VH包含分别包含SEQ ID NO：2、12和4的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些实施方式中，所述VL包含分别包含SEQID NO：6、7和8的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些实施方式中，所述抗原结合位点包含：(a)VH，其包含分别包含SEQ ID NO：2、12和4的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；和(b)VL，其包含分别包含SEQ ID NO：6、7和8的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些实施方式中，所述抗原结合位点作为scFv存在，其中所述scFv包含与SEQ ID NO：14或15具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗原结合位点作为scFv存在，其中所述scFv包含与SEQ ID NO：14或15相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗原结合位点作为scFv存在，其中所述scFv包含与SEQ ID NO：14相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗原结合位点作为scFv存在，其中所述scFv包含与SEQ ID NO：15相同的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗原结合位点的氨基酸序列相对于帕尼单抗的序列包含VH中的S62R、VL中的F87Y和VL中的D92R突变，在Chothia编号方案下编号。在某些实施方式中，所述结合EGFR的抗原结合位点包含：VH，其包含与SEQ ID NO：1具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的氨基酸序列；和VL，其包含与SEQ ID NO：5具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述结合EGFR的抗原结合位点包含：重链可变结构域(VH)，其包含与SEQ ID NO：11具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列；和轻链可变结构域(VL)，其包含与SEQ ID NO：16具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗原结合位点包含表1中所公开的EGFR-结合物-3的VH和VL序列的重链CDR1、CDR2和CDR3和轻链CDR1、CDR2和CDR3，其在Kabat(参见Kabat等，(1991)，《免疫学重要的蛋白质的序列》(Sequences ofProteins ofImmunologicalInterest)，NIH出版号91-3242，Bethesda)、Chothia(参见例如Chothia C&Lesk A M，(1987)，J.Mol.Biol.196:901-917)、MacCallum(参见MacCallum R M等，(1996)J.Mol.Biol.262:732-745)或本领域中已知的任何其他CDR确定方法下确定。在某些实施方式中，所述VH包含分别包含SEQ ID NO：2、12和4的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些实施方式中，所述VL包含分别包含SEQ ID NO：6、7和17的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些实施方式中，所述抗原结合位点包含：(a)VH，其包含分别包含SEQ ID NO：2、12和4的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；和(b)VL，其包含分别包含SEQ ID NO：6、7和17的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些实施方式中，所述抗原结合位点作为scFv存在，其中所述scFv包含与SEQ ID NO：18或19具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗原结合位点作为scFv存在，其中所述scFv包含与SEQ ID NO：18或19相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗原结合位点作为scFv存在，其中所述scFv包含与SEQ ID NO：18相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗原结合位点作为scFv存在，其中所述scFv包含与SEQ ID NO：19相同的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗原结合位点的氨基酸序列相对于帕尼单抗的序列包含VL中的F87Y和VL中的D92R突变，在Chothia编号方案下编号。在某些实施方式中，所述结合EGFR的抗原结合位点包含：VH，其包含与SEQ ID NO：1具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的氨基酸序列；和VL，其包含与SEQ ID NO：5具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述结合EGFR的抗原结合位点包含：重链可变结构域(VH)，其包含与SEQ ID NO：1具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列；和轻链可变结构域(VL)，其包含与SEQ ID NO：16具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗原结合位点包含表1中所公开的EGFR-结合物-4的VH和VL序列的重链CDR1、CDR2和CDR3和轻链CDR1、CDR2和CDR3，其在Kabat(参见Kabat等，(1991)，《免疫学重要的蛋白质的序列》(Sequences ofProteins ofImmunological Interest)，NIH出版号91-3242，Bethesda)、Chothia(参见例如Chothia C&Lesk A M，(1987)，J.Mol.Biol.196:901-917)、MacCallum(参见MacCallum RM等，(1996)J.Mol.Biol.262:732-745)或本领域中已知的任何其他CDR确定方法下确定。在某些实施方式中，所述VH包含分别包含SEQ ID NO：2、3和4的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些实施方式中，所述VL包含分别包含SEQ IDNO：6、7和17的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些实施方式中，所述抗原结合位点包含：(a)VH，其包含分别包含SEQ ID NO：2、3和4的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；和(b)VL，其包含分别包含SEQ ID NO：6、7和17的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些实施方式中，所述抗原结合位点作为scFv存在，其中所述scFv包含与SEQ ID NO：20或21具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗原结合位点作为scFv存在，其中所述scFv包含与SEQ ID NO：20或21相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗原结合位点作为scFv存在，其中所述scFv包含与SEQ ID NO：20相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗原结合位点作为scFv存在，其中所述scFv包含与SEQ ID NO：21相同的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗原结合位点的氨基酸序列相对于帕尼单抗的序列包含VL中的F87Y和VL中的D92R和任选地VH中的S62R突变，在Chothia编号方案下编号。在某些实施方式中，所述结合EGFR的抗原结合位点包含：VH，其包含与SEQ ID NO：1具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的氨基酸序列；和VL，其包含与SEQ ID NO：5具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述结合EGFR的抗原结合位点包含：重链可变结构域(VH)，其包含与SEQ ID NO：22具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列，和轻链可变结构域(VL)，其包含与SEQ ID NO：16具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗原结合位点包含表1中所公开的共有VH和VL序列的重链CDR1、CDR2和CDR3和轻链CDR1、CDR2和CDR3，其在Kabat(参见Kabat等，(1991)，《免疫学重要的蛋白质的序列》(Sequences ofProteins ofImmunological Interest)，NIH出版号91-3242，Bethesda)、Chothia(参见例如Chothia C&Lesk A M，(1987)，J.Mol.Biol.196:901-917)、MacCallum(参见MacCallum R M等，(1996)J.Mol.Biol.262:732-745)或本领域中已知的任何其他CDR确定方法下确定。在某些实施方式中，所述VH包含分别包含SEQ IDNO：2、23和4的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些实施方式中，所述VL包含分别包含SEQ ID NO：6、7和17的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些实施方式中，所述抗原结合位点包含：(a)VH，其包含分别包含SEQ ID NO：2、23和4的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；和(b)VL，其包含分别包含SEQ ID NO：6、7和17的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些实施方式中，所述抗原结合位点作为scFv存在，其中所述scFv包含与SEQ ID NO：24或25具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗原结合位点作为scFv存在，其中所述scFv包含与SEQ ID NO：24或25相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗原结合位点作为scFv存在，其中所述scFv包含与SEQ ID NO：24相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗原结合位点作为scFv存在，其中所述scFv包含与SEQ IDNO：25相同的氨基酸序列。
可选地，可以通过筛选与EGFR的氨基酸序列、其同种型、其变体、其成熟的细胞外片段或含有EGFR的结构域的片段的结合，来鉴定可以与EGFR结合的新的抗原结合位点。
表2.示例性EGFR同种型的序列
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在某些实施方式中，通过筛选与由SEQ ID NO：27-30所定义的氨基酸序列、其变体、其成熟的细胞外片段或含有EGFR的结构域的片段的结合，来鉴定可以与EGFR结合的新的抗原结合位点。
在某些实施方式中，所述抗原结合位点以小于或等于(亲和性大于或等于)10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM或4nM的KD值结合人EGFR或其细胞外区域。在某些实施方式中，本申请的抗原结合位点以小于或等于(亲和性大于或等于)4nM的KD值结合人EGFR或其细胞外区域。在某些实施方式中，本申请的抗原结合位点以小于或等于(亲和性大于或等于)约2.0nM、2.1nM、2.2nM、2.3nM、2.4nM、2.5nM、2.6nM、2.7nM、2.8nM、2.9nM、3.0nM、3.1nM、3.2nM、3.3nM、3.4nM、3.5nM、3.6nM、3.7nM、3.8nM、3.9nM、4.0nM、4.1nM、4.2nM、4.3nM、4.4nM、4.5nM、4.6nM、4.7nM、4.8nM、4.9nM或5.0nM的KD值结合人EGFR或其细胞外区域。在某些实施方式中，本申请的抗原结合位点以约1.0-3.5nM、1.0-4.0nM、1.0-4.5nM、1.0-5.0nM、1.5-3.5nM、1.5-4.0nM、1.5-4.5nM、1.5-5.0nM、2.0-3.5nM、2.0-4.0nM、2.0-4.5nM、2.0-5.0nM、2.5-3.5nM、2.5-4.0nM、2.5-4.5nM、2.5-5.0nM、3.0-3.5nM、3.0-4.0nM、3.0-4.5nM或3.0-5.0nM范围内的KD值结合人EGFR或其细胞外区域。这些KD值使用标准结合测定法例如表面等离子体共振或生物层干涉法来测量。在某些实施方式中，所述抗体结合来自于受试者的体液、组织和/或细胞的EGFR。
在某些实施方式中，所述抗原结合位点以小于或等于(亲和性大于或等于)10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM或4nM的KD值结合恒河猴EGFR或其细胞外区域。在某些实施方式中，本申请的抗原结合位点以约1-10nM、1-6nM、2-10nM、2-6nM、3-10nM、3-6nM、4-10nM、4-6nM、5-10nM或5-6nM范围内的KD值结合恒河猴EGFR或其细胞外区域。这些KD值使用标准结合测定法例如表面等离子体共振或生物层干涉法来测量。在某些实施方式中，所述抗体结合来自于受试者的体液、组织和/或细胞的EGFR。
在某些实施方式中，所述抗原结合位点与分别具有SEQ ID NO：1和5的VH和VL序列的相应抗原结合位点相比具有更高的热稳定性，其中所述抗原结合位点不包含VH中的G44C突变和VL中的G100C突变。在某些实施方式中，本文公开的抗原结合位点与具有SEQ ID NO：9或10的氨基酸序列的相应抗原结合位点相比具有更高的热稳定性，其中所述抗原结合位点在VL-VH或VH-VL方向分别采取scFv格式。测量热稳定性的方法包括但不限于差示扫描量热法(DSC)，例如在下面的实施例3中所公开的。在某些实施方式中，当所述抗原结合位点采取VL-VH方向的scFv格式时，所述抗原结合位点的熔化温度(例如Tonset或Tm1，其通过DSC测量)比具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的scFv的相应熔化温度高至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃或6℃。在某些实施方式中，当所述抗原结合位点采取VH-VL方向的scFv格式时，所述抗原结合位点的熔化温度(例如Tonset或Tm1，其通过DSC测量)比具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的scFv的相应熔化温度高至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃或6℃。
具有抗原结合位点的蛋白质
本文公开的抗原结合位点可以存在于抗体或其抗原结合片段中。所述抗体可以是单克隆抗体、嵌合抗体、双体抗体、Fab片段、Fab’片段或F(ab’)2片段、Fv、双特异性抗体、双特异性Fab2、双特异性(mab)2、人源化抗体、人工产生的人类抗体、双特异性T-细胞衔接物、双特异性NK细胞衔接物、单链抗体(例如单链Fv片段或scFv)、三功能抗体、具有共同轻链的杵臼结构(kih)IgG、crossmab、ortho-Fab IgG、DVD-Ig、二合一IgG(2in 1-IgG)、IgG-scFv、scFv2-Fc、双纳米抗体、串联抗体(tandAb)、双特异性重新靶向抗体(DART)、DART-Fc、scFv-HSA-scFv(其中HSA＝人血清白蛋白)或停靠锁定(DNL)-Fab3。
在某些实施方式中，本文公开的抗原结合位点被连接到与抗体恒定区具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列，所述抗体恒定区例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE的重链恒定区，特别地选自例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的(例如人类)重链恒定区。在另一个实施方式中，本文公开的抗原结合位点可以连接到选自例如κ或λ轻链恒定区的(例如人类)轻链恒定区。所述恒定区可以被改变例如突变，以修饰所述抗体的性质(例如提高或降低下述一者或多者：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基的数目、效应细胞功能、和/或补体功能)。在一个实施方式中，所述抗体具有效应功能并且可以固定补体。在其他实施方式中，所述抗体不招募效应细胞或固定补体。在另一个实施方式中，所述抗体具有降低的或不具备结合Fc受体的能力。例如，它是不支持与Fc受体结合的同种型或亚型、片段或其他突变体，例如它具有突变或缺失的Fc受体结合区。
在某些实施方式中，所述抗原结合位点连接到IgG恒定区，所述恒定区包括铰链、CH2和CH3结构域，并含有或不含CH1结构域。在某些实施方式中，所述恒定区的氨基酸序列与人类抗体恒定区例如人类IgG1恒定区、人类IgG2恒定区、人类IgG3恒定区或人类IgG4恒定区具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性。在一个实施方式中，所述抗体Fc结构域或其足以结合CD16的部分包含与野生型人类IgG1 Fc序列具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列，所述野生型人类IgG1 Fc序列是：DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO：26)。在某些其他实施方式中，所述恒定区的氨基酸序列与来自于另一种哺乳动物例如兔、狗、猫、小鼠或马的抗体恒定区具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一性。与人类IgG1恒定区相比可以在所述恒定区内并入一个或多个突变，例如在Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411和/或K439处。示例性的取代包括例如Q347E、Q347R、Y349S、Y349K、Y349T、Y349D、Y349E、Y349C、T350V、L351K、L351D、L351Y、S354C、E356K、E357Q、E357L、E357W、K360E、K360W、Q362E、S364K、S364E、S364H、S364D、T366V、T366I、T366L、T366M、T366K、T366W、T366S、L368E、L368A、L368D、K370S、N390D、N390E、K392L、K392M、K392V、K392F、K392D、K392E、T394F、T394W、D399R、D399K、D399V、S400K、S400R、D401K、F405A、F405T、Y407A、Y407I、Y407V、K409F、K409W、K409D、T411D、T411E、K439D和K439E。
在某些实施方式中，所述抗原结合位点连接到抗体Fc结构域的足以结合CD16的部分。在所述Fc结构域内，CD16结合由铰链区和CH2结构域介导。例如，在人类IgG1内，与CD16的相互作用主要聚焦于氨基酸残基Asp 265-Glu 269、Asn 297-Thr 299、Ala 327-Ile332、Leu 234-Ser 239和CH2结构域中的糖残基N-乙酰基-D-葡萄糖胺(参见Sondermann等，Nature,406(6793):267-273)。在所述已知结构域的基础上，可以选择突变以提高或降低与CD16的结合亲和性，例如通过使用噬菌体展示文库或酵母表面cDNA文库，或者可以在相互作用的已知三维结构的基础上设计突变。
在某些实施方式中，可以并入到人类IgG1恒定区的CH1中的突变可以在氨基酸V125、F126、P127、T135、T139、A140、F170、P171和/或V173处。在某些实施方式中，可以并入到人类IgG1恒定区的Cκ中的突变可以在氨基酸E123、F116、S176、V163、S174和/或T164处。
在某些实施方式中，所述抗体恒定结构域包含IgG抗体例如人类IgG1抗体的CH2结构域和CH3结构域。在某些实施方式中，在所述抗体恒定结构域中引入突变以便能够与另一个抗体恒定结构域异二聚化。例如，如果所述抗体恒定结构域源自于人类IgG1的恒定结构域，则所述抗体恒定结构域可以包含与人类IgG1抗体的第234-332位氨基酸具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列，并在选自由Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411和K439组成的组中的一个或多个位置处不同。本文公开的Fc结构域或铰链区中的所有氨基酸位置按照EU编号方式编号。
为了促进不对称蛋白质的形成，设想了Fc结构域异二聚化。在所述Fc结构域中促进异二聚化的突变(例如氨基酸取代)被描述在例如国际申请公布号WO2019157366中，其不通过参考并入本文。
上述蛋白质可以使用本领域技术人员公知的重组DNA技术来制造。例如，可以将编码所述第一免疫球蛋白重链的第一核酸序列克隆到第一表达载体中；可以将编码所述第二免疫球蛋白重链的第二核酸序列克隆到第二表达载体中；可以将编码所述第一免疫球蛋白轻链的第三核酸序列克隆到第三表达载体中；可以将编码所述第二免疫球蛋白轻链的第四核酸序列克隆到第四表达载体中；可以将所述第一、第二、第三和第四表达载体一起稳定转染到宿主细胞中，以产生所述多聚体蛋白。
为了获得所述蛋白质的最高产量，可以探索所述第一、第二、第三和第四表达载体的不同比率，以确定用于转染到所述宿主细胞中的最佳比率。在转染后，可以使用本领域中已知的方法例如有限稀释法、ELISA、FACS、显微术或Clonepix来分离单一克隆，用于细胞库产生。
可以将克隆在适合于生物反应器规模放大的条件下培养，并维持包含本文公开的抗原结合位点的蛋白质的表达。所述蛋白质可以使用本领域中已知的方法包括离心、深度过滤、细胞裂解、匀浆、冻融、亲和纯化、凝胶过滤、离子交换层析、疏水相互作用交换层析和混合模式层析来分离和纯化。
因此，另一方面，本申请提供了一种或多种分离的核酸，其包含编码前述任何一种抗体的免疫球蛋白重链和/或免疫球蛋白轻链可变区的序列。本申请提供例如一种或多种表达载体，其表达前述任何一种抗体的免疫球蛋白重链和/或免疫球蛋白轻链可变区。类似地，本申请提供了宿主细胞，其包含前述表达载体和/或分离的核酸中的一者或多者。
用于确定一种抗体是否与所公开的抗体结合同一表位或与之竞争结合的竞争试验在本领域中是已知的。示例性的竞争试验包括免疫测定(例如ELISA测定、RIA测定)、表面等离子体共振(例如BIAcore分析)、生物层干涉法和流式细胞术。
通常，竞争试验包括使用结合到固体表面或在细胞表面上表达的抗原(例如人EGFR蛋白或其片段)、测试EGFR结合抗体和参比抗体。所述参比抗体被标记，所述测试抗体未被标记。通过确定在测试抗体存在下结合到固体表面或细胞的标记的参比抗体的量来测量竞争性抑制。通常，所述测试抗体过量存在(例如1x、5x、10x、20x或100x)。通过竞争试验鉴定的抗体(例如竞争抗体)包括与参比抗体结合相同表位或相似(例如重叠)表位的抗体，以及结合与所述参比抗体结合的表位足够邻近以允许空间位阻发生的相邻表位的抗体。
竞争试验可以在两个方向上进行，以确保标记物的存在不干扰或以其他方式抑制结合。例如，在第一方向上，所述参比抗体被标记并且所述测试抗体未被标记，而在第二方向上，所述测试抗体被标记并且所述参比抗体未被标记。
如果当在竞争性结合试验中测量时过量的一种抗体(例如1x、5x、10x、20x或100x)将另一种抗体的结合抑制例如至少50％、75％、90％、95％或99％，则测试抗体与参比抗体竞争与抗原的特异性结合。
如果抗原中减少或消除一种抗体的结合的基本上所有的氨基酸突变均降低或消除另一种抗体的结合，则可以确定两种抗体结合到同一表位。如果减少或消除一种抗体的结合的仅仅一部分氨基酸突变减少或消除另一种抗体的结合，则可以确定两种抗体结合到重叠表位。
本文公开的所述抗体可以被进一步优化(例如亲和力成熟)以改善包括亲和性和/或特异性在内的生物化学特征，改善包括聚集、稳定性、沉淀和/或非特异性相互作用在内的生物物理特性，和/或降低免疫原性。亲和力成熟程序在本领域的普通技术范围之内。例如，通过DNA改组、链改组、CDR改组、随机突变形成和/或定点突变形成，可以将多样性引入到免疫球蛋白重链和/或免疫球蛋白轻链中。
在某些实施方式中，分离的人类抗体含有一个或多个体细胞突变。在这些情况下，可以将抗体修饰成人类种系序列以优化所述抗体(例如通过被称为种系化的过程)。
通常，优化的抗体与其来源的未优化(或亲本)抗体对抗原至少具有相同或基本上相同的亲和性。例如在某些实施方式中，优化的抗体与亲本抗体相比具有更高的对抗原的亲和性。
如果所述抗体用于治疗，则可以使用标准的体外偶联化学将它偶联到效应剂例如小分子毒素或放射性核素。如果所述效应剂是多肽，则可以将所述抗体化学偶联到所述效应物或作为融合蛋白联结到所述效应物。融合蛋白的构建在本领域的普通技术范围之内。
可以使用标准的体外偶联化学将所述抗体偶联到效应部分例如小分子毒素或放射性核素。如果所述效应部分是多肽，则可以将所述抗体化学偶联到所述效应物或作为融合蛋白连接到所述效应物。融合蛋白的构建在本领域的普通技术范围之内。
CAR T细胞、EGFR/CD3定向的双特异性T-细胞衔接物、免疫细胞因子、抗体-药物偶联物和免疫毒素
本申请的另一方面提供了一种分子或复合物，其包含本文所公开的结合EGFR的抗原结合位点。示例性的分子或复合物包括但不限于嵌合抗原受体(CAR)、T-细胞衔接物(例如EGFR/CD3定向的双特异性T-细胞衔接物)、免疫细胞因子、抗体-药物偶联物和免疫毒素。
可以使用本文所公开的任何结合EGFR的抗原结合位点。在某些实施方式中，所述结合EGFR的抗原结合位点的VH、VL和/或CDR序列提供在表1中。在某些实施方式中，所述结合EGFR的抗原结合位点是scFv。在某些实施方式中，所述scFv包含与选自由SEQ ID NO：14、15、18、19、20、21、24和25组成的组中的氨基酸序列具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述scFv包含选自由SEQ ID NO：14、15、18、19、20、21、24和25组成的组中的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分子或复合物(例如CAR、T-细胞衔接物、免疫细胞因子、抗体-药物偶联物或免疫毒素)中结合EGFR的抗原结合位点相对于帕尼单抗包含VH中的S62R、VL中的F87Y和VL中的D92R突变，在Chothia编号方案下编号。在某些实施方式中，所述结合EGFR的抗原结合位点包含：VH，其包含与SEQ ID NO：1具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的氨基酸序列；和VL，其包含与SEQ ID NO：5具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述分子或复合物(例如CAR、T-细胞衔接物、免疫细胞因子、抗体-药物偶联物或免疫毒素)中结合EGFR的抗原结合位点包含：重链可变结构域，其包含分别由SEQ ID NO：2、12和4的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列；和轻链可变结构域，其包含分别由SEQ ID NO：6、7和17的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列。在某些实施方式中，所述抗原结合位点包含：重链可变结构域，其氨基酸序列与SEQ ID NO：11的氨基酸序列具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一性；和轻链可变结构域，其氨基酸序列与SEQ IDNO：16的氨基酸序列具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一性。在某些实施方式中，所述抗原结合位点包含：重链可变结构域，其具有包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列；和轻链可变结构域，其具有包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗原结合位点包含scFv，其包含与SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗原结合位点包含scFv，其包含与SEQ ID NO：18具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗原结合位点包含scFv，其包含与SEQ ID NO：18或19相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗原结合位点包含scFv，其包含与SEQ ID NO：18相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗原结合位点包含scFv，其包含与SEQ ID NO：19相同的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分子或复合物(例如CAR、T-细胞衔接物、免疫细胞因子、抗体-药物偶联物或免疫毒素)中结合EGFR的抗原结合位点相对于帕尼单抗包含VL中的F87Y和人D92R突变，在Chothia编号方案下编号。在某些实施方式中，所述结合EGFR的抗原结合位点包含：VH，其包含与SEQ ID NO：1具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的氨基酸序列；和VL，其包含与SEQ ID NO：5具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述分子或复合物(例如CAR、T-细胞衔接物、免疫细胞因子、抗体-药物偶联物或免疫毒素)中结合EGFR的抗原结合位点包含：重链可变结构域，其包含分别由SEQ ID NO：2、3和4的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列；和轻链可变结构域，其包含分别由SEQID NO：6、7和17的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列。在某些实施方式中，所述抗原结合位点包含：重链可变结构域，其氨基酸序列与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一性；和轻链可变结构域，其氨基酸序列与SEQ ID NO：16的氨基酸序列具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一性。在某些实施方式中，所述抗原结合位点包含scFv，其包含与SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗原结合位点包含scFv，其包含与SEQ ID NO：20具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗原结合位点包含scFv，其包含与SEQ ID NO：20或21相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗原结合位点包含scFv，其包含与SEQ ID NO：20相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗原结合位点包含scFv，其包含与SEQ ID NO：21相同的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分子或复合物(例如CAR、T-细胞衔接物、免疫细胞因子、抗体-药物偶联物或免疫毒素)中结合EGFR的抗原结合位点相对于帕尼单抗包含VH中的S62R和VL中的F87Y突变，在Chothia编号方案下编号。在某些实施方式中，所述结合EGFR的抗原结合位点包含：VH，其包含与SEQ ID NO：1具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的氨基酸序列；和VL，其包含与SEQ ID NO：5具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述分子或复合物(例如CAR、T-细胞衔接物、免疫细胞因子、抗体-药物偶联物或免疫毒素)中结合EGFR的抗原结合位点包含：重链可变结构域，其包含分别由SEQ ID NO：2、12和4的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列；和轻链可变结构域，其包含分别由SEQID NO：6、7和8的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列。在某些实施方式中，所述抗原结合位点包含：重链可变结构域，其氨基酸序列与SEQ ID NO：11的氨基酸序列具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一性；和轻链可变结构域，其氨基酸序列与SEQ ID NO：13的氨基酸序列具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一性。在某些实施方式中，所述抗原结合位点包含scFv，其包含与SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗原结合位点包含scFv，其包含与SEQ ID NO：14具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗原结合位点包含scFv，其包含与SEQ ID NO：14或15相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗原结合位点包含scFv，其包含与SEQ ID NO：14相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗原结合位点包含scFv，其包含与SEQ ID NO：15相同的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分子或复合物(例如CAR、T-细胞衔接物、免疫细胞因子、抗体-药物偶联物或免疫毒素)中结合EGFR的抗原结合位点相对于帕尼单抗包含VL中的F87Y、VL中的D92R和任选地VH中的S62R突变，在Chothia编号方案下编号。在某些实施方式中，所述结合EGFR的抗原结合位点包含：VH，其包含与SEQ ID NO：1具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的氨基酸序列；和VL，其包含与SEQ ID NO：5具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述分子或复合物(例如CAR、T-细胞衔接物、免疫细胞因子、抗体-药物偶联物或免疫毒素)中结合EGFR的抗原结合位点包含：重链可变结构域，其包含分别由SEQ ID NO：2、23和4的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列；和轻链可变结构域，其包含分别由SEQ ID NO：6、7和17的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列。在某些实施方式中，所述抗原结合位点包含：重链可变结构域，其氨基酸序列与SEQ ID NO：22的氨基酸序列具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一性；和轻链可变结构域，其氨基酸序列与SEQ ID NO：16的氨基酸序列具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一性。在某些实施方式中，所述抗原结合位点包含scFv，其包含与SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗原结合位点包含scFv，其包含与SEQ ID NO：24具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗原结合位点包含scFv，其包含与SEQ ID NO：24或25相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗原结合位点包含scFv，其包含与SEQ ID NO：24相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗原结合位点包含scFv，其包含与SEQ ID NO：25相同的氨基酸序列。
嵌合抗原受体(CAR)
在某些实施方式中，本申请提供了一种靶向EGFR的CAR，其包含本文所公开的结合EGFR的抗原结合位点(参见例如表1)。所述靶向EGFR的CAR可以包含Fab片段或scFv。在某些实施方式中，所述CAR中结合EGFR的抗原结合位点相对于帕尼单抗包含选自VH中的S62R、VL中的F87Y和VL中的D92R的一个或多个突变，在Chothia编号方案下编号。在某些实施方式中，所述CAR中结合EGFR的抗原结合位点包含与选自由SEQ ID NO：14、15、18、19、20、21、24和25组成的组中的氨基酸序列具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列。
术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指至少包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含源自于刺激分子的功能性信号传导结构域(在本文中也被称为“初级信号传导结构域”)的细胞内信号传导结构域的重组多肽构建物。
因此，在某些实施方式中，所述CAR包含本文所公开的结合EGFR的细胞外抗原结合位点、跨膜结构域和包含初级信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，所述CAR还包含一个或多个源自于至少一种共刺激分子的功能性信号传导结构域(也被称为“共刺激信号结构域”)。
在某些实施方式中，所述CAR包含一种嵌合融合蛋白，其包含作为细胞外抗原结合结构域的本文所公开的结合EGFR的抗原结合位点(例如结合EGFR的scFv)、跨膜结构域和包含初级信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，所述CAR包含一种嵌合融合蛋白，其包含作为细胞外抗原结合结构域的本文所公开的结合EGFR的抗原结合位点(例如结合EGFR的scFv)、跨膜结构域和包含共刺激信号传导结构域和初级信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，所述CAR包含一种嵌合融合蛋白，其包含作为细胞外抗原结合结构域的本文所公开的结合EGFR的抗原结合位点(例如结合EGFR的scFv)、跨膜结构域和包含两个共刺激信号传导结构域和初级信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，所述CAR包含嵌合融合蛋白，其包含作为细胞外抗原结合结构域的本文所公开的结合EGFR的抗原结合位点(例如结合EGFR的scFv)、跨膜结构域和包含至少两个共刺激信号传导结构域和初级信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。
对于跨膜结构域来说，在各种实施方式中，所述CAR被设计成包含与所述CAR的细胞外结构域融合的跨膜结构域。在一个实施方式中，所述跨膜结构域是与所述CAR中的结构域之一天然相关的跨膜结构域。在某些情况下，所述跨膜结构域可以通过氨基酸取代被选择或进行修饰，以避免此类结构域与同一或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而最大限度地减少与受体复合物的其他成员的相互作用。在另一个实施方式中，所述跨膜结构域能够与CAR T细胞表面上的另一个CAR同二聚化。在另一个实施方式中，所述跨膜结构域的氨基酸序列可以被修饰或取代，以便最大限度地减少与同一CAR T细胞中存在的天然结合配偶体的结合结构域相互作用。
所述跨膜结构域可以源自于任何天然存在的膜结合或跨膜蛋白。在一个实施方式中，所述跨膜区能够在所述CAR结合到靶标时向细胞内结构域传导信号。在某些实施方式中，所述跨膜结构域包含选自由TCRα链、TCRβ链、TCRζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、EGFR、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154组成的组中的一种或多种蛋白质的跨膜区。在某些实施方式中，所述跨膜结构域包含选自由KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D和NKG2C组成的组中的一种或多种蛋白质的跨膜区。
所述结合EGFR的细胞外结构域(例如结合EGFR的scFv结构域)可以通过铰链区连接到所述跨膜结构域。可以使用各种铰链，包括但不限于人类Ig(免疫球蛋白)铰链(例如IgG4铰链、IgD铰链)、Gly-Ser接头、(G4S)4接头(SEQ ID NO：31)、KIR2DS2铰链和CD8α铰链。
本申请中描述的CAR的细胞内信号传导结构域负责活化被放置所述CAR的免疫细胞的至少一种特定功能(例如T细胞的溶细胞活性或辅助细胞活性，包括细胞因子的分泌)。因此，如本文所用的，术语“细胞内信号传导结构域”是指蛋白质的传导效应功能信号并指导细胞执行特定功能的部分。尽管通常可以使用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下不必使用整个链。就使用所述细胞内信号传导结构域的截断部分而言，这种截断部分可用于代替完整链，只要它转导效应功能信号即可。因此，术语细胞内信号传导结构域包括足以传导效应功能信号的所述细胞内信号传导结构域的任何截短部分。
所述CAR的细胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域(即源自于刺激分子的功能性信号传导结构域)和一个或多个共刺激信号传导结构域(即源自于至少一个共刺激分子的功能性信号传导结构域)。
如本文所用的，术语“刺激分子”是指一种由免疫细胞例如T细胞、NK细胞或B细胞表达的分子，其提供胞质信号传导序列，所述胞质信号传导序列以刺激性的方式调节所述免疫细胞的活化，至少用于所述免疫细胞信号传导途径的某些方面。在一个实施方式中，所述信号是初级信号，由例如TCR/CD3复合物与装载有肽的MHC分子的结合引发，并导致T细胞应答包括但不限于增殖、活化、分化等。
以刺激性方式起作用的初级信号传导结构域可以含有被称为免疫受体酪氨酸激活基序或ITAM的信号传导基序。在本申请中特别有用的含有ITAM的胞质信号传导序列的实例包括源自于CD3ζ、共同FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12的信号传导序列。在一个实施方式中，本申请中描述的任一个或多个CAR中的初级信号传导结构域包含源自于CD3-ζ的胞质信号传导序列。
在某些实施方式中，所述初级信号传导结构域是TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、4-1BB和/或CD3-ζ的功能性信号传导结构域。在实施方式中，所述细胞内信号传导结构域包含CD3ζ、共同FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10和/或DAP12的功能性信号传导结构域。在特定实施方式中，所述初级信号传导结构域是与T细胞受体复合物相关的ζ链的功能性信号传导结构域。
如本文所用的，术语“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合，由此介导T细胞的共刺激应答例如但不限于增殖。共刺激分子是一种不同于为淋巴细胞对抗原的高效应答所需的抗原受体或其配体之外的细胞表面分子。此类分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1、CD11a/CD18)、CD2、CD7、CD258(LIGHT)、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体等。此类共刺激分子的其他实例包括CD5、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp和与CD83特异性结合的配体。在某些实施方式中，所述CAR的共刺激信号传导结构域是本文描述的共刺激分子例如OX40、CD27、CD28、CD30、CD40、PD-1、CD2、CD7、CD258、NKG2C、B7-H3、与CD83结合的配体、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS和4-1BB(CD137)或其任何组合的功能性信号传导结构域。
如本文所用的，术语“信号传导结构域”是指蛋白质的功能性部分，其作用是通过在细胞内传递信息而通过产生第二信使或通过对此类信使做出响应充当效应物而经由确定的信号通路来调节细胞活动。
本申请中描述的CAR的胞质信号传导部分中的胞质信号传导序列可以以随机或特定顺序彼此连接。任选地，长度在例如2至10个氨基酸之间的短的寡肽或多肽接头可以形成所述连接。
本申请的另一方面提供了一种编码本文公开的靶向EGFR的CAR的核酸。通过将核酸引入到细胞中，所述核酸可用于在效应细胞(例如T细胞)中表达所述CAR。
可以在序列中做出修饰，以产生等效或改进的变体，例如通过根据密码子简并表改变一个或多个密码子。DNA密码子简并表提供在表3中。
在某些实施方式中，所述核酸是DNA分子(例如cDNA分子)。在某些实施方式中，所述核酸还包含可操作连接到CAR编码序列的表达控制序列(例如启动子和/或增强子)。在某些实施方式中，本申请提供了一种包含所述核酸的载体。所述载体可以是病毒载体(例如AAV载体、慢病毒载体或腺病毒载体)或非病毒载体(例如质粒)。
在某些实施方式中，所述核酸是RNA分子(例如mRNA分子)。产生用于转染的mRNA的方法可以包括用特殊设计的引物将模板体外转录，然后添加polyA，以产生含有3'和5'非翻译序列、5'帽子和/或内部核糖体进入位点(IRES)、待表达的核酸和polyA尾的RNA结构，通常长度为50-2000个碱基。所述RNA分子可以被进一步修饰以提高翻译效率和/或稳定性，例如在美国专利号8,278,036、8,883,506和8,716,465中所公开的。如此产生的RNA分子可以高效转染不同种类的细胞。
在一个实施方式中，所述核酸编码在CAR的氨基端处包含信号肽的氨基酸序列。这种信号肽当在效应细胞中表达时可以促进所述CAR的细胞表面定位，并在细胞加工期间从所述CAR上切掉。在一个实施方式中，所述核酸编码在胞外EGFR结合结构域(例如结合EGFR的scFv结构域)的N-端处包含信号肽的氨基酸序列。
RNA或DNA可以使用许多不同方法中的任一种引入到靶细胞中，例如可商业获得的方法，其包括但不限于电穿孔、使用脂质转染的阳离子脂质体介导的转染、聚合物包封、肽介导的转染或生物弹道颗粒递送系统例如“基因枪”(参见例如Nishikawa等，Hum GeneTher.,12(8):861-70(2001))。
另一方面，本申请提供了一种表达所述靶向EGFR的CAR的免疫效应细胞。还提供了包含编码所述靶向EGFR的CAR的核酸的免疫效应细胞。所述免疫效应细胞包括但不限于T细胞和NK细胞。在某些实施方式中，所述T细胞选自CD8+T细胞、CD4+T细胞、γδT细胞和NKT细胞。所述T细胞或NK细胞可以是原代细胞或细胞系。
所述免疫效应细胞可以通过本领域中已知的方法从许多来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自于感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。所述免疫效应细胞也可以在体外从全能或多能细胞(例如造血干细胞)分化。在某些实施方式中，本申请提供了表达所述靶向EGFR的CAR(例如在质膜上表达所述CAR)或包含本文公开的核酸的全能或多能细胞(例如造血干细胞)。
在某些实施方式中，所述免疫效应细胞被分离和/或纯化。例如，可以使用结合CD25的配体从T细胞群体中去除调节性T细胞。表达检查点蛋白(例如PD-1、LAG-3或TIM-3)的效应细胞可以通过类似的方法去除。在某些实施方式中，所述效应细胞通过正向选择步骤分离。例如，T细胞群体可以通过与抗CD3/抗CD28抗体偶联的珠子温育来分离。其他细胞表面标志物例如IFN-7、TNF-α、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、颗粒酶B和穿孔蛋白，也可用于正向选择。
免疫效应细胞通常可以使用本领域中已知的方法活化和扩增，例如在美国专利号6,352,694、6,534,055、6,905,680、6,692,964、5,858,358、6,887,466、6,905,681、7,144,575、7,067,318、7,172,869、7,232,566、7,175,843、5,883,223、6,905,874、6,797,514、6,867,041和美国专利申请公布号2006/0121005和2016/0340406中所公开的。例如，在某些实施方式中，T细胞可以通过与抗CD3抗体和抗CD28抗体在适合于刺激T细胞增殖的条件下接触来扩增和/或活化。所述细胞可以在培养基中扩增几小时(例如约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、18、21小时)至约14天(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天)。在一个实施方式中，将所述细胞扩增4至9天。对于长期细胞培养(例如为期60天或更多天的培养)来说，多个周期的刺激可能是合乎需要的。在某些实施方式中，所述细胞培养物包含血清(例如胎牛血清或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ、TNF-α或其组合。专业技术人员已知的用于细胞生长的其他添加剂例如表面活性剂、人血浆蛋白粉和还原剂例如N-乙酰-半胱氨酸和2-巯基乙醇，也可包括在细胞培养物中。在某些实施方式中，本申请的免疫效应细胞是从体外扩增获得的细胞。
CAR构建物的进一步设计可包含结合EGFR的抗原结合位点(例如可调节CAR)、编码所述CAR的核酸和表达所述CAR或包含所述核酸的效应细胞，提供在美国专利号7,446,190和9,181,527、美国专利申请公布号2016/0340406和2017/0049819以及国际专利申请公布号WO2018/140725中。
EGFR/CD3定向的双特异性T-细胞衔接物
在某些实施方式中，本申请提供了一种EGFR/CD3定向的双特异性T-细胞衔接物，其包含本文公开的结合EGFR的抗原结合位点。在某些实施方式中，所述EGFR/CD3定向的双特异性T-细胞衔接物中的结合EGFR的抗原结合位点相对于帕尼单抗包含选自VH中的S62R、VL中的F87Y和VL中的D92R的一个或多个突变，在Chothia编号方案下编号。在某些实施方式中，所述EGFR/CD3定向的双特异性T-细胞衔接物包含与选自由SEQ ID NO：14、15、18、19、20、21、24和25组成的组的氨基酸序列具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述细胞因子被直接或通过接头连接到所述Fc结构域。
在某些实施方式中，所述EGFR/CD3定向的双特异性T-细胞衔接物还包含结合CD3的抗原结合位点。示例性的结合CD3的抗原结合位点公开在国际专利申请公布号WO2014/051433和WO2017/097723中。
本申请的另一方面提供了一种核酸，其编码所述EGFR/CD3定向的双特异性T-细胞衔接物的至少一个多肽，其中所述多肽包含结合EGFR的抗原结合位点。在某些实施方式中，所述核酸还包含编码信号肽的核苷酸序列，其在表达时位于所述EGFR/CD3定向的双特异性T-细胞衔接物的一个或多个多肽的N-端。还提供了包含所述核酸的载体(例如病毒载体)，包含所述核酸或载体的生产细胞，以及表达所述EGFR/CD3定向的双特异性T-细胞衔接物的生产细胞。
免疫细胞因子
在某些实施方式中，本申请提供了一种免疫细胞因子，其包含本文公开的结合EGFR的抗原结合位点和细胞因子。可以使用本领域中已知的任何细胞因子(例如促炎性或抗原性细胞因子)，包括但不限于IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、IL-15、TNFα、IFNα、IFNγ和GM-CSF。更多示例性细胞因子公开在美国专利号9,567,399中。在某些实施方式中，所述抗原结合位点通过化学偶联(例如共价或非共价化学偶联)连接到所述细胞因子。在某些实施方式中，所述抗原结合位点通过多肽链的融合(即肽连接)连接到所述细胞因子。所述免疫细胞因子还可以包含连接到所述结合EGFR的抗原结合位点的Fc结构域。在某些实施方式中，所述免疫细胞因子中的结合EGFR的抗原结合位点相对于帕尼单抗包含选自VH中的S62R、VL中的F87Y和VL中的D92R的一个或多个突变，在Chothia编号方案下编号。在某些实施方式中，所述免疫细胞因子包含与选自由SEQ ID NO：14、15、18、19、20、21、24和25组成的组的氨基酸序列具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述细胞因子通过接头连接到所述Fc结构域。
另一方面，本申请提供了一种编码所述免疫细胞因子的至少一个多肽的核酸，其中所述多肽包含结合EGFR的抗原结合位点。在某些实施方式中，所述核酸还包含编码信号肽的核苷酸序列，其在表达时位于所述免疫细胞因子的一个或多个多肽的N-端。还提供了包含所述核酸的载体(例如病毒载体)，包含所述核酸或载体的生产细胞，以及表达所述免疫细胞因子的生产细胞。
抗体-药物偶联物
在某些实施方式中，本申请提供了一种抗体-药物偶联物，其包含本文公开的结合EGFR的抗原结合位点和细胞毒性药物部分。示例性的细胞毒性药物部分被公开在国际专利申请公布号WO2014/160160和WO2015/143382中。在某些实施方式中，所述细胞毒性药物部分选自澳瑞他汀、N-乙酰-γ-卡奇霉素、美登醇、吡咯并苯二氮卓类和SN-38。所述抗原结合位点可以通过化学偶联(例如共价或非共价化学偶联)连接到所述细胞毒性药物部分。在某些实施方式中，所述抗体-药物偶联物还包含连接到所述结合EGFR的抗原结合位点的Fc结构域。在某些实施方式中，所述抗体-药物偶联物中的结合EGFR的抗原结合位点相对于帕尼单抗包含选自VH中的S62R、VL中的F87Y和VL中的D92R的一个或多个突变，在Chothia编号方案下编号。在某些实施方式中，所述抗体-药物偶联物包含与选自由SEQ ID NO：14、15、18、19、20、21、24和25组成的组中的氨基酸序列具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述细胞毒性药物部分直接或通过接头连接到所述Fc结构域。
免疫毒素
在某些实施方式中，本申请提供了一种免疫毒素，其包含本文公开的结合EGFR的抗原结合位点和细胞毒性肽部分。可以使用本领域中已知的任何细胞毒性肽部分，包括但不限于蓖麻毒素、白喉毒素和假单胞菌外毒素A。更多示例性细胞毒性肽公开在国际专利申请公布号WO2012/154530和WO2014/164680中。在某些实施方式中，所述细胞毒性肽部分通过化学偶联(例如共价或非共价化学偶联)连接到所述蛋白质。在某些实施方式中，所述细胞毒性肽部分通过多肽的融合连接到所述蛋白质。所述免疫毒素还可以包含与所述结合EGFR的抗原结合位点相连的Fc结构域。在某些实施方式中，所述免疫毒素中的结合EGFR的抗原结合位点相对于帕尼单抗包含选自VH中的S62R、VL中的F87Y和VL中的D92R的一个或多个突变，在Chothia编号方案下编号。在某些实施方式中，所述免疫毒素包含与选自由SEQID NO：14、15、18、19、20、21、24和25组成的组中的氨基酸序列具有至少90％(例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述细胞毒性肽部分直接或通过接头连接到所述Fc结构域。
另一方面，本申请提供了一种编码所述免疫毒素的至少一个多肽的核酸，其中所述多肽包含结合EGFR的抗原结合位点。在某些实施方式中，所述核酸还包含编码信号肽的核苷酸序列，其在表达时位于所述免疫毒素的一个或多个多肽的N-端。还提供了包含所述核酸的载体(例如病毒载体)，包含所述核酸或载体的生产细胞，以及表达所述免疫毒素的生产细胞。
II.治疗性组合物及其用途
本申请提供了使用包含本文公开的抗原结合位点的蛋白质、偶联物或细胞和/或本文描述的药物组合物治疗癌症的方法。所述方法可用于治疗表达EGFR的各种癌症，其包括向有需要的患者施用治疗有效量的包含本文公开的抗原结合位点的蛋白质、偶联物或细胞。
所述治疗方法可以根据待治疗的癌症来表征。所述待治疗的癌症可以根据癌细胞表面上表达的特定抗原的存在来表征。
以EGFR的表达为特征的癌症包括但不限于实体肿瘤癌症。例如，在某些实施方式中，所述癌症是头颈癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、肾细胞癌、膀胱癌、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌或肝癌。在某些实施方式中，所述癌症是肺癌(包括但不限于小细胞肺癌或肺腺癌)、乳腺癌、乳腺侵袭性导管癌、肾癌、常规多形性成胶质细胞瘤、结肠癌、结肠腺癌、胃癌、脑癌、成胶质细胞瘤、膀胱癌、头颈癌、卵巢癌或前列腺癌。
设想了本文描述的蛋白质、偶联物、细胞和/或药物组合物可用于治疗各种癌症，不限于其中癌细胞或癌微环境中的细胞表达EGFR的癌症。
在某些实施方式中，所述癌症是实体肿瘤。在某些其他实施方式中，所述癌症是脑癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食管癌、白血病、肺癌、肝癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、胃癌、睾丸癌或子宫癌。在其他实施方式中，所述癌症是血管化肿瘤、鳞状细胞癌、腺癌、小细胞癌、黑素瘤、神经胶质瘤、成神经细胞瘤、肉瘤(例如血管肉瘤或软骨肉瘤)、喉癌、腮腺癌、胆管癌、甲状腺癌、肢端雀斑痣样黑素瘤、光化性角化病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、腺样囊性癌、腺瘤、腺肉瘤、腺鳞癌、肛管癌、肛门癌、肛门直肠癌、星形胶质细胞瘤、巴氏腺癌、基底细胞癌、胆管癌、骨癌、骨髓癌、支气管癌、支气管腺体癌、类癌瘤、胆管癌、软骨肉瘤、脉络丛乳头状瘤/癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓系白血病、透明细胞癌、结缔组织癌、囊腺瘤、消化系统癌症、十二指肠癌、内分泌系统癌症、内胚窦瘤、子宫内膜增生、子宫内膜间质肉瘤、子宫内膜样腺癌、内皮细胞癌、室管膜癌、上皮细胞癌、尤文氏肉瘤、眼和眼眶癌、女性生殖器癌、局灶性结节性增生、胆囊癌、胃窦癌、胃底癌、胃泌素瘤、成胶质细胞瘤、胰高血糖素瘤、心脏癌症、成血管细胞瘤、血管内皮瘤、血管瘤、肝腺瘤、肝腺瘤病、肝胆管癌、肝细胞癌、霍奇金氏病、回肠癌、胰岛细胞瘤、上皮内瘤变、上皮内鳞状细胞瘤变、肝内胆管癌、侵入性鳞状细胞癌、空肠癌、关节癌、卡波斯肉瘤、盆腔癌、大细胞癌、大肠癌、平滑肌肉瘤、恶性雀斑样痣黑素瘤、淋巴瘤、男性生殖器癌、恶性黑素瘤、恶性间皮肿瘤、成神经管细胞瘤、髓上皮瘤、脑膜癌、间皮癌、转移性癌、口腔癌、粘液表皮样癌、多发性骨髓瘤、肌肉癌、鼻道癌、神经系统癌症、神经上皮腺癌、结节性黑素瘤、非上皮性皮肤癌、非霍奇金氏淋巴瘤、燕麦细胞癌、少突神经胶质癌、口腔癌、骨肉瘤、浆液性乳头状腺癌、阴茎癌、舌咽癌、垂体肿瘤、浆细胞瘤、假性肉瘤、肺母细胞瘤、直肠癌、肾细胞癌、呼吸系统癌症、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、浆液性癌、窦癌、皮肤癌、小细胞癌、小肠癌、平滑肌癌、软组织癌、分泌生长抑素的肿瘤、脊椎癌、鳞状细胞癌、横纹肌癌、间皮下癌、浅表扩散性黑素瘤、T细胞白血病、舌癌、未分化癌、输尿管癌、尿道癌、尿道膀胱癌、泌尿系统癌症、宫颈癌、宫体癌、葡萄膜黑素瘤、阴道癌、疣状癌、血管活性肠肽瘤、外阴癌、高分化癌或肾母细胞瘤。
在某些其他实施方式中，所述癌症是非霍奇金氏淋巴瘤例如B-细胞淋巴瘤或T-细胞淋巴瘤。在某些实施方式中，所述非霍奇金氏淋巴瘤是B-细胞淋巴瘤，例如弥漫性大B-细胞淋巴瘤、原发性纵隔B-细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B-细胞淋巴瘤、淋巴结外边缘区B-细胞淋巴瘤、淋巴结边缘区B-细胞淋巴瘤、脾边缘区B-细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、毛细胞白血病或原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤。在某些其他实施方式中，所述非霍奇金氏淋巴瘤是T-细胞淋巴瘤，例如前T淋巴母细胞淋巴瘤、外周T-细胞淋巴瘤、皮肤T-细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞T-细胞淋巴瘤、淋巴结外自然杀伤细胞/T-细胞淋巴瘤、肠病型T-细胞淋巴瘤、皮下脂膜炎样T-细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤或外周T-细胞淋巴瘤。
所述待治疗的癌症可以根据在癌细胞的表面上表达的特定抗原的存在来表征。在某些实施方式中，除了EGFR之外，所述癌细胞可以表达下述一者或多者：CD2，CD19，CD38，CD40，CD52，CD30，CD70，IGF1R，HER3/ERBB3，HER4/ERBB4，MUC1，TROP2，cMET，SLAMF7，PSCA，MICA，MICB，TRAILR1，TRAILR2，MAGE-A3，B7.1，B7.2，CTLA4和PD1。
III.联合疗法
另一方面，本申请提供了联合疗法。包含本文描述的抗原结合位点的蛋白质、偶联物和细胞可以与其他治疗剂组合使用以治疗癌症。
可以在治疗癌症中用作联合疗法的一部分的示例性治疗剂包括例如辐射、丝裂霉素、维A酸、盐酸苯达莫司汀、吉西他滨、长春新碱、依托泊苷、克拉屈滨、二溴甘露醇、甲氨蝶呤、多柔比星、卡波醌、喷司他丁、二胺硝吖啶、净司他丁、西曲瑞克、来曲唑、雷替曲塞、柔红霉素、法倔唑、福莫司汀、胸腺法新、索布佐生、奈达铂、阿糖胞苷、比卡鲁胺、长春瑞滨、维司力农、氨鲁米特、安吖啶、丙谷胺、依利醋铵、酮色林、去氧氟尿苷、依曲替酯、异维甲酸、链脲佐菌素、尼莫司汀、长春地辛、氟他米特、氟他胺、甘氨硫嘌呤、卡莫氟、雷佐生、西佐喃、卡铂、二溴卫矛醇、替加氟、异环磷酰胺、泼尼莫司汀、毕西巴尼、左旋咪唑、替尼泊苷、英丙舒凡、依诺他滨、麦角乙脲、羟甲烯龙、他莫昔芬、孕酮、美雄烷、环硫雄醇、福美司坦、干扰素-α、干扰素-2α、干扰素-β、干扰素-γ、集落刺激因子-1、集落刺激因子-2、地尼白介素、白介素-2、黄体生成激素释放因子和可能表现出对同源受体的差异结合并增加或减少的血清半衰期的上述制剂的变体。
可以在治疗癌症中用作联合疗法的一部分的另一类制剂是免疫检查点抑制剂。示例性的免疫检查点抑制剂包括抑制下述一者或多者的制剂：(i)细胞毒性T-淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)，(ii)程序化细胞死亡蛋白1(PD1)，(iii)PDL1，(iv)LAG3，(v)B7-H3，(vi)B7-H4，和(vii)TIM3。CTLA4抑制剂伊匹单抗已被美国食品和药品监督管理局(United StatesFood and Drug Administration)批准用于治疗黑素瘤。
可以在治疗癌症中用作联合疗法的一部分的另一类制剂是靶向非检查点靶的单克隆抗体(例如赫赛汀)和非细胞毒性制剂(例如酪氨酸激酶抑制剂)。
另一类抗癌制剂包括例如：(i)选自ALK抑制剂、ATR抑制剂、A2A拮抗剂、碱基切除修复抑制剂、Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂、布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂、CDC7抑制剂、CHK1抑制剂、周期蛋白依赖性激酶抑制剂、DNA-PK抑制剂、DNA-PK和mTOR两者的抑制剂、DNMT1抑制剂、DNMT1抑制剂加2-氯-脱氧腺苷、HDAC抑制剂、刺猬信号传导途径抑制剂、IDO抑制剂、JAK抑制剂、mTOR抑制剂、MEK抑制剂、MELK抑制剂、MTH1抑制剂、PARP抑制剂、磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂、PARP1和DHODH两者的抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶-II抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、VEGFR抑制剂和WEE1抑制剂的抑制剂；(ii)OX40、CD137、CD40、GITR、CD27、HVEM、TNFRSF25或ICOS的激动剂；和(iii)选自IL-12、IL-15、GM-CSF和G-CSF的细胞因子。
本申请中描述的蛋白质也可用作原发性病灶的手术去除的辅助物。
为了实现所需的联合治疗效果，可以选择本文公开的蛋白质、偶联物或细胞和其他治疗剂的量和施用的相对时间。例如，当向需要这种施用的患者联合疗法施用时，所述组合物的治疗剂或包含所述治疗剂的一种或多种药物组合物可以以任何顺序施用，例如依次、共同、一起、同时施用等。此外，例如，本文公开的蛋白质、偶联物或细胞可以在所述其他治疗剂发挥其预防或治疗效果的时间内施用，或与之相反。
IV.药物组合物
本公开还描述了含有治疗有效量的本文描述的蛋白质、蛋白质偶联物或免疫效应细胞的药物组合物。所述组合物可以被配制成用于各种药物递送系统。对于适合的制剂来说，一种或多种生理上可接受的赋形剂或载体也可以包含在所述组合物中。适合在本文公开的组合物中使用的制剂参见《Remington's制药学》(Remington's PharmaceuticalSciences,Mack Publishing Company,Philadelphia,Pa.,17th ed.,1985)。对于用于药物递送的方法的简要综述，参见例如Langer(Science249:1527-1533,1990)。
一方面，本公开提供了一种蛋白质制剂，其含有本文描述的EGFR结合位点和药学上可接受的载体。
所述组合物可以被配制成用于各种药物递送系统。对于适合的制剂来说，一种或多种生理上可接受的赋形剂或载体也可以包含在所述组合物中。适合在本文公开的组合物中使用的制剂可以在《Remington's制药学》(Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Philadelphia,Pa.,17th ed.,1985)中找到。对于用于药物递送的方法的简要综述，参见例如Langer(Science 249:1527-1533,1990)。
在某些实施方式中，所述组合物可以是药物递送制剂。本文描述的静脉内药物递送制剂可以包含在袋子、笔或注射器中。在某些实施方式中，所述袋子可以被连接到包含管和/或针头的通道。在某些实施方式中，所述制剂可以是冷冻干燥制剂或液体制剂。在某些实施方式中，所述制剂可以被冷冻干燥(冻干)并包含在约12-60个小瓶中。在某些实施方式中，所述制剂可以被冷冻干燥，并且可以将45mg所述冷冻干燥的制剂包含在一个小瓶中。在某些实施方式中，可以将约40mg至约100mg所述冷冻干燥的制剂包含在一个小瓶中。在某些实施方式中，将来自于12、27或45个小瓶的冷冻干燥的制剂合并，以获得所述蛋白质在静脉内药物制剂中的治疗剂量。在某些实施方式中，所述制剂可以是液体制剂，并以约250mg/小瓶至约1000mg/小瓶储存。在某些实施方式中，所述制剂可以是液体制剂并以约600mg/小瓶储存。在某些实施方式中，所述制剂可以是液体制剂并以约250mg/小瓶储存。
这些组合物可以通过常规的灭菌技术灭菌，或者可以无菌过滤。得到的水性溶液可以原样包装以备使用，或者可以被冷冻干燥，所述冷冻干燥的制剂在施用之前与无菌水性载体合并。所述制剂的pH通常在3至11之间，例如5至9之间或6至8之间，并且在某些实施方式中在7至8之间，例如7至7.5。所述得到的固体形式的组合物可以被包装在多个单一剂量单元中，各自含有固定量的上述一种或多种制剂。所述固体形式的组合物也可以以灵活的量包装在容器中。
在某些实施方式中，本公开提供了具有延长的储存期限的制剂，其包含本公开中描述的蛋白质与甘露醇、单水柠檬酸、柠檬酸钠、二水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠、氯化钠、聚山梨醇酯80、水和氢氧化钠的组合。
在某些实施方式中，在pH缓冲溶液中制备包含括本公开中描述的蛋白质的水性制剂。本申请的缓冲液可以具有约4至约8，例如约4.5至约6.0或约4.8至约5.5范围内的pH，或者可以具有约5.0至约5.2的pH。在上述pH之间的范围也旨在作为本公开的一部分。例如，旨在包括使用上述任何值的组合作为上限和/或下限的值范围。将pH控制在这个范围之内的缓冲剂的实例包括乙酸盐(例如乙酸钠)、琥珀酸盐(例如琥珀酸钠)、葡萄糖酸盐、组氨酸、柠檬酸盐和其他有机酸缓冲剂。
在某些实施方式中，所述制剂包括含有柠檬酸盐和磷酸盐的缓冲系统，以将pH维持在约4至约8的范围内。在某些实施方式中，所述pH范围可以是约4.5至约6.0或约4.8至约5.5，或在约5.0至约5.2的pH范围内。在某些实施方式中，所述缓冲系统包括单水柠檬酸、柠檬酸钠、二水磷酸氢二钠和/或二水磷酸二氢钠。在某些实施方式中，所述缓冲系统包括约1.3mg/mL柠檬酸(例如1.305mg/mL)、约0.3mg/mL柠檬酸钠(例如0.305mg/mL)、约1.5mg/mL二水磷酸氢二钠(例如1.53mg/mL)、约0.9mg/mL二水磷酸二氢钠(例如0.86mg/mL)和约6.2mg/mL氯化钠(例如6.165mg/mL)。在某些实施方式中，所述缓冲系统包括约1至约1.5mg/mL柠檬酸、约0.25至约0.5mg/mL柠檬酸钠、约1.25至约1.75mg/mL二水磷酸氢二钠、约0.7至约1.1mg/mL二水磷酸二氢钠和约6.0至约6.4mg/mL氯化钠。在某些实施方式中，所述制剂的pH用氢氧化钠调节。
在所述制剂中也可以包含多元醇，其充当等渗剂并且可以使抗体稳定。所述多元醇以可能根据制剂的所需等渗性而改变的量添加到所述制剂。在某些实施方式中，所述水性制剂可以是等渗的。所述添加的多元醇的量也可能根据所述多元醇的分子量而改变。例如，与二糖(例如海藻糖)相比，可以添加较低量的单糖(例如甘露糖醇)。在某些实施方式中，可以在所述制剂中用作等渗剂的多元醇是甘露糖醇。在某些实施方式中，甘露糖醇的浓度可以是约5至约20mg/mL。在某些实施方式中，甘露糖醇的浓度可以是约7.5至约15mg/mL。在某些实施方式中，甘露糖醇的浓度可以是约10至约14mg/mL。在某些实施方式中，甘露糖醇的浓度可以是约12mg/mL。在某些实施方式中，多元醇山梨糖醇可以包含在所述制剂中。
也可以向所述制剂添加去污剂或表面活性剂。示例性的去污剂包括非离子型去污剂例如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20、80等)或泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)。添加的去污剂的量是使得它减少所述配制的抗体的聚集和/或将所述制剂中颗粒物的形成降至最低和/或减少吸附。在某些实施方式中，所述制剂可以包含作为表面活性剂的聚山梨醇酯。在某些实施方式中，所述制剂可以含有去污剂聚山梨醇酯80或吐温80。吐温80是用于描述聚氧乙烯(20)山梨糖醇单油酸酯的术语(参见Fiedler,Lexikon der Hifsstoffe,EditioCantor Verlag Aulendorf,4th ed.,1996)。在某些实施方式中，所述制剂可以含有约0.1mg/mL至约10mg/mL之间或约0.5mg/mL至约5mg/mL之间的聚山梨醇酯80。在某些实施方式中，可以在所述制剂中添加约0.1％聚山梨醇酯80。
在实施方式中，本文描述的蛋白质产品被配制成液体制剂。所述液体制剂可以以10mg/mL的浓度存在于USP/Ph Eur I型50R小瓶中，用橡胶塞封闭并用铝制压合密封盖密封。所述橡胶塞可以由符合USP和Ph Eur的弹性体制成。在某些实施方式中，小瓶可以装有61.2mL所述蛋白质产品溶液，以便允许可抽出体积为60mL。在某些实施方式中，可以将所述液体制剂用0.9％生理盐水溶液稀释。
在某些实施方式中，本文公开的液体制剂可以与糖组合制备成稳定水平的10mg/mL浓度的溶液。在某些实施方式中，所述液体制剂可以在水性载体中制备。在某些实施方式中，稳定剂可以以不超过可能产生对静脉内施用来说不理想或不适合的黏度的量添加。在某些实施方式中，所述糖可以是二糖例如蔗糖。在某些实施方式中，所述液体制剂也可以包括一种或多种缓冲剂、表面活性剂和防腐剂。
在某些实施方式中，所述液体制剂的pH可以通过添加药学上可接受的酸和/或碱来设定。在某些实施方式中，所述药学上可接受的酸可以是盐酸。在某些实施方式中，所述碱可以是氢氧化钠。
除了聚集之外，脱酰胺是肽和蛋白质在发酵、收获/细胞澄清、纯化、药物物质/药物制品储存期间和样品分析期间可能发生的常见产品变异。脱酰胺是从蛋白质失去NH3，形成可水解的琥珀酰亚胺中间体。所述琥珀酰亚胺中间体引起母体肽的质量减少17道尔顿。随后的水解导致质量增加18道尔顿。由于在水性条件下不稳定，所述琥珀酰亚胺中间体的分离是困难的。因此，脱酰胺通常可检测为质量增加1道尔顿。天冬酰胺的脱酰胺产生天冬氨酸或异天冬氨酸。影响脱酰胺速率的参数包括pH、温度、溶剂介电常数、离子强度、一级序列、局部多肽构象和三级结构。在肽链中与Asn相邻的氨基酸残基影响脱酰胺速率。蛋白质序列中Asn之后的Gly和Ser导致对脱酰胺更高的易感性。
在某些实施方式中，本文描述的液体制剂可以在防止所述蛋白质产品脱酰胺的pH和湿度条件下保存。
本文中感兴趣的水性载体是药学上可接受的(对于向人类施用来说安全且无毒)并且可用于制备液体制剂的水性载体。说明性载体包括无菌注射用水(SWFI)、抑菌注射用水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液或葡萄糖溶液。
防腐剂可以任选地添加到本发明的制剂以减少细菌作用。防腐剂的添加可以例如便于生产多次使用(多剂)制剂。
在特定情况下静脉内(IV)递送可能是施用途径，例如当患者在医院中在移植后通过IV途径接受所有药物时。在某些实施方式中，在施用前将所述液体制剂用0.9％氯化钠溶液稀释。在某些实施方式中，所述稀释的注射用药物产品是等渗的，并适合于通过静脉内输注施用。
在某些实施方式中，盐或缓冲剂组分可以以10mM-200mM的量添加。所述盐和/或缓冲剂是药学上可接受的的，并源自于各种已知酸(无机和有机酸)和“成碱”金属或胺。在某些实施方式中，所述缓冲剂可以是磷酸盐缓冲剂。在某些实施方式中，所述缓冲剂可以是甘氨酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐缓冲剂，在所述情况下，钠、钾或铵离子可以充当平衡离子。
防腐剂可以任选地添加到本发明的制剂以减少细菌作用。防腐剂的添加可以例如便于生产多次使用(多剂)制剂。
本文中感兴趣的水性载体是药学上可接受的(对于向人类施用来说安全且无毒)并且可用于制备液体制剂的水性载体。说明性载体包括无菌注射用水(SWFI)、抑菌注射用水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液或葡萄糖溶液。
本文描述的蛋白质可以以冷冻干燥制剂的形式存在，其包括所述蛋白质和冻干保护剂。所述冻干保护剂可以是糖例如二糖。在某些实施方式中，所述冻干保护剂可以是蔗糖或麦芽糖。所述冷冻干燥制剂也可以包括一种或多种缓冲剂、表面活性剂、填充剂和/或防腐剂。
可用于稳定的所述冷冻干燥的药物制品的蔗糖或麦芽糖的量可以是蛋白质与蔗糖或麦芽糖至少1:2的重量比。在某些实施方式中，所述蛋白质与蔗糖或麦芽糖的重量比可以为1:2至1:5。
在某些实施方式中，在冷冻干燥之前，所述制剂的pH可以通过添加药学上可接受的酸和/或碱来设定。在某些实施方式中，所述药学上可接受的酸可以是盐酸。在某些实施方式中，所述药学上可接受的碱可以是氢氧化钠。
在冷冻干燥之前，含有本文描述的蛋白质的溶液的pH可以被调整到6至8之间。在某些实施方式中，用于所述冷冻干燥的药物制品的pH范围可以是7至8。
在某些实施方式中，盐或缓冲剂组分可以以10mM-200mM的量添加。所述盐和/或缓冲剂是药学上可接受的，并源自于各种已知酸(无机和有机酸)和“成碱”金属或胺。在某些实施方式中，所述缓冲剂可以是磷酸盐缓冲剂。在某些实施方式中，所述缓冲剂可以是甘氨酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐缓冲剂，在所述情况下，钠、钾或铵离子可以充当平衡离子。
在某些实施方式中，可以添加“填充剂”。“填充剂”是为冻干混合物增添质量并对冻干饼的物理结构有贡献(例如便于生产维持开放孔隙结构的基本上均匀的冻干饼)的化合物。说明性的填充剂包括甘露糖醇、甘氨酸、聚乙二醇和山梨糖醇。本申请的冷冻干燥制剂可以含有这些填充剂。
防腐剂可以任选地添加到本发明的制剂以减少细菌作用。防腐剂的添加可以例如便于生产多次使用(多剂)制剂。
在某些实施方式中，所述冷冻干燥的药物制品可以用水性载体复水。本文中感兴趣的水性载体是药学上可接受的(例如对于向人类施用来说安全且无毒)并且可用于在冷冻干燥后制备液体制剂的水性载体。说明性的水性载体包括无菌注射用水(SWFI)、抑菌性射用水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液或葡萄糖溶液。
在某些实施方式中，本文公开的冷冻干燥的药物制品用USP级无菌注射用水(SWFI)或USP级0.9％氯化钠注射液复水。在复水期间，将所述冷冻干燥的粉剂溶解在溶液中。
在某些实施方式中，本文公开的冷冻干燥的蛋白质产品用约4.5mL注射用水复水，并用0.9％盐水溶液(氯化钠溶液)稀释。
本文描述的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以改变，以便获得对特定患者、组合物和施用方式来说有效实现所需治疗反应并且对所述患者无毒的活性成分的量。
具体剂量可以是对每位患者来说统一的剂量，例如50-5000mg蛋白质。或者，患者的剂量可以根据所述患者的近似体重或表面积调整。确定适合剂量的其他因素可以包括待治疗或预防的疾病或病症、疾病的严重性、施用途径和患者的年龄、性别和身体状况。确定用于治疗的适合剂量所必需的计算的进一步细化由本领域技术人员按常规进行，特别是根据本文中公开的剂量信息和测定法。所述剂量也可以通过使用用于确定使用剂量的已知测定法并联合适合的剂量响应数据来确定。随着对疾病进展的监测，个体患者的剂量可以进行调整。可以测量患者中可靶向构建物或复合物的血液水平，以观察是否需要调整剂量来达到或维持有效浓度。可以使用药物基因组学来确定哪些可靶向构建物和/或复合物及其剂量最可能对给定个体有效(Schmitz等，Clinica Chimica Acta 308:43-53,2001；Steimer等，Clinica Chimica Acta 308:33-41,2001)。
一般来说，基于体重的剂量是每kg体重约0.01μg至约100mg，例如约0.01μg至约100mg/kg体重、约0.01μg至约50mg/kg体重、约0.01μg至约10mg/kg体重、约0.01μg至约1mg/kg体重、约0.01μg至约100μg/kg体重、约0.01μg至约50μg/kg体重、约0.01μg至约10μg/kg体重、约0.01μg至约1μg/kg体重、约0.01μg至约0.1μg/kg体重、约0.1μg至约100mg/kg体重、约0.1μg至约50mg/kg体重、约0.1μg至约10mg/kg体重、约0.1μg至约1mg/kg体重、约0.1μg至约100μg/kg体重、约0.1μg至约10μg/kg体重、约0.1μg至约1μg/kg体重、约1μg至约100mg/kg体重、约1μg至约50mg/kg体重、约1μg至约10mg/kg体重、约1μg至约1mg/kg体重、约1μg至约100μg/kg体重、约1μg至约50μg/kg体重、约1μg至约10μg/kg体重、约10μg至约100mg/kg体重、约10μg至约50mg/kg体重、约10μg至约10mg/kg体重、约10μg至约1mg/kg体重、约10μg至约100μg/kg体重、约10μg至约50μg/kg体重、约50μg至约100mg/kg体重、约50μg至约50mg/kg体重、约50μg至约10mg/kg体重、约50μg至约1mg/kg体重、约50μg至约100μg/kg体重、约100μg至约100mg/kg体重、约100μg至约50mg/kg体重、约100μg至约10mg/kg体重、约100μg至约1mg/kg体重、约1mg至约100mg/kg体重、约1mg至约50mg/kg体重、约1mg至约10mg/kg体重、约10mg至约100mg/kg体重、约10mg至约50mg/kg体重、约50mg至约100mg/kg体重。
制剂可以每日、每周、每月或每年施用一次或多次，或甚至每2至20年施用一次。本领域普通技术人员可以根据测量到的停留时间和可靶向构建物或复合物在体液或组织中的浓度，容易地估算施用的重复率。本文描述的组合物的施用可以是静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、胸膜内、鞘内、腔内、通过导管灌注或通过直接病灶内注射。这可以施用每日一次或多次、每周一次或多次、每月一次或多次或每年一次或多次。
上面的描述描述了包含本申请中描述的抗原结合位点的蛋白质的多个方面和实施方式。本申请具体来说设想了所述方面和实施方式的所有组合和排列。
在整个本描述中，在组合物被描述为具有、包括或包含特定组分的情况下，或者在过程和方法被描述为具有、包括或包含特定步骤的情况下，设想了另外还存在基本上由所叙述的组分构成或由所叙述的组分构成的包含本申请中描述的抗原结合位点的蛋白质的组合物，并且还存在基本上由所叙述的过程步骤构成或由所叙述的过程步骤构成的符合本申请的过程和方法。
在本申请中，在要素或组分被称为是包括在所叙述的要素或组分的列表中和/或选自所述列表的情况下，应该理解所述要素或组分可以是所叙述的要素或组分中的任一者，或者所述要素或组分可以选自两个或更多个所述叙述的要素或组分。
此外应该理解，本文描述的组合物或方法的要素和/或特点可以已各种方式组合，而不背离本申请的精神和范围，不论在本文中是明示还是暗示。例如，在指称特定化合物的情况下，除非从上下文另有理解，否则该化合物可用于包含本申请中描述的抗原结合位点的蛋白质的组合物的各种实施方式中和/或包含本申请中描述的抗原结合位点的蛋白质的方法中。换句话说，在本申请中，实施方式以能够书写和绘制清晰简明的申请的方式描述和描绘，但旨在并且将会认识到，实施方式可以进行各种组合或分离，而不背离本发明的教导。此外应该认识到，本文中描述和描绘的所有特点均可适用于包含本文描述和描绘的抗原结合位点的蛋白质的所有方面。
应该理解，表述“……中的至少一者”分别地包括在所述表述之后的每个叙述的对象和两个或更多个所述叙述的对象的各种组合，除非从上下文和使用中另有理解。与三个或更多个叙述的对象相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。
术语“包括”、“具有”或“含有”、包括其语法等同语的使用，通常应该被理解为是开放性而非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。
在定量值之前使用术语“约”的情况下，除非另有具体陈述，否则本申请还包括所述特定定量值本身。如本文所用的，除非另有指明或推断，否则术语“约”是指标称值的±10％的变动。
应该理解，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要，只要包含本申请中描述的抗原结合位点的蛋白质保持可操作即可。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。
本文中任何和所有实例或示例性语言例如“例如”或“包括”的使用仅旨在更好地说明包含本申请中描述的抗原结合位点的蛋白质，并且除非要求保护，否则不对包含本申请中描述的抗原结合位点的蛋白质的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应该被解释为表明任何未要求保护的要素对于本申请的实践来说是必不可少的。
实施例
下面的实施例仅仅是说明性的，并且不旨在以任何方式限制本申请的范围或内容。
实施例1.使用SPR和DSC分析选择EGFR结合界面
本实施例被设计用于开发源自于帕尼单抗且与帕尼单抗相比具有提高的热稳定性的EGFR结合位点。简单来说，设计了25种各自含有单个点突变的构建物，它们在与EGFR的D3结构域复合的帕尼单抗Fab的晶体结构(PDB ID：5SX4)的基础上选择。除了表达不好的三种构建物之外，生产了所述EGFR结合位点以评估所述突变对结合亲和性和热稳定性的影响。每种scFv构建物还含有VH中的G44C取代和VL中的G100C取代。使用表面等离子体共振(SPR)评估人类和恒河猴EGFR的动力学和亲和性。结果示出在表4中。考虑到每个突变的影响是微小的，将那些引起亲和性显著降低的突变排除在考虑之外。使用实施例3中描述的方法，通过差示扫描荧光法(DSF)进一步评估了8种构建物的热稳定性。结果示出在表5中。
表4. 22种带有单个点突变的抗EGFR构建物的SPR分析。*-H-表示重链中的突变；-L-表示轻链中的突变；PANI表示帕尼单抗框架。
/>
表5.具有单个点突变的8种抗EGFR构建物的DSF分析。*-H-表示重链中的突变；-L-表示轻链中的突变；PANI表示帕尼单抗框架。
/>
在这些结果的基础上，确定了下述突变最有效地提高/保持亲和性和热稳定性：
·重链：S62R(在Chothia编号方案下)
·轻链：F87Y，D92R(在Chothia编号方案下)
这些突变的结构建模示出在图1-3中。如图1中所示，根据建模发现，帕尼单抗的VH链的S62R突变引入了与VL的D1的额外的氢键，并且有助于VH/VL界面的稳定性。如图2中所示，根据建模发现，帕尼单抗的VL链的F87Y突变引入了与VH的Q39的额外的氢键，并且有助于VH/VL界面的稳定性。如图3中所示，根据建模发现，帕尼单抗的VL链的CDR3处最初被设计用于提高亲和性(用于与EGFR的N449结合)的D92R突变出人意料地与CDRL1的Y32形成额外的范德华接触，并使互补位稳定。
随后，使用SPR和差示扫描量热法(DSC)分别评估了突变的组合对亲和性和热稳定性的影响。每个构建物还含有VH中的G44C取代和VL中的G100C取代。来自于SPR分析的结果示出在表6中，来自于DSC分析的结果示出在表7中。
表6.组合突变的SPR分析。*-H表示重链中的突变；L-表示轻链中的突变；PANI表示帕尼单抗框架。
/>
表7.具有单个点突变的12种抗EGFR构建物的DSC分析。
*-H表示重链中的突变；-L表示轻链中的突变；PANI表示帕尼单抗框架。
**在峰1与峰2之间观察到额外的峰。
表6和7中的PANI-H_S62R-L_F87Y-L_D92R(在后文中被称为“EGFR-scFv-3”)和PANI-H_S62R-L_F87Y(在后文中被称为“EGFR-scFv-2”)表现出最好的亲和性和热稳定性。L：G100C和H：G44C突变促进二硫键的形成，以增强VL和VH链的配对。
实施例2.多特异性结合蛋白的表面等离子体共振分析
本实施例被设计用于评估某些帕尼单抗衍生的EGFR结合位点与EGFR的结合亲和性。构建了4种多特异性结合蛋白，即EGFR-蛋白质-1、EGFR-蛋白质-2、EGFR-蛋白质-3和EGFR-蛋白质-4。这些蛋白质含有scFv，其分别具有表1中所公开的EGFR-scFv-1、EGFR-scFv-2、EGFR-scFv-3和EGFR-scFv-4的氨基酸序列。每个所述多特异性结合蛋白还含有结合与EGFR无关的抗原的Fab片段和抗体Fc区。使用Biacore 8K仪器，通过SPR测量了结合EGFR的构建物对重组人类和恒河猴EGFR的动力学和亲和性。将样品捕获在抗hFc IgG芯片上，并将多种浓度的人类或恒河猴重组EGFR-His进样到捕获的测试品上。实验在37℃的生理温度下进行。使用Biacore 8K Insight评估软件(GE Healthcare)分析数据。
来自于SPR分析的结合传感图示出在图4-7中，并且从所述分析计算的参数示出在表8中。图4示出了EGFR-蛋白质-1的SPR分析，图5示出了EGFR-蛋白质-2的SPR分析，图6示出了EGFR-蛋白质-3的SPR分析，并且图7示出了EGFR-蛋白质-4的SPR分析。结果证实，感兴趣的突变对所述多特异性结合蛋白与EGFR的亲和性没有实质性影响。
表8.SPR分析：人EGFR结合(N＝4)
实施例3.多特异性结合蛋白的差示扫描量热法(DSC)分析
本实施例被设计用于使用DSC分析来评估实施例2中描述的多特异性结合蛋白构建物的热稳定性。简单来说，使用Thermo Scientific Zeba离心脱盐柱将测试品在所选缓冲液中进行缓冲液交换。然后将洗脱液用相同的缓冲液稀释至0.5mg/mL。将325μL样品装入到带有相应的缓冲液空白的96孔深孔板中，并使用Microcal PEAQ-DSC仪器(MalvernPanalytical)进行分析。将温度以60℃/hr的速率从20-25℃匀变升温至100℃。在分析物之前将缓冲液背景运行一式三份。在分析之前从每个分析物扫描中减去最具代表性的缓冲液空白。数据使用DSC分析软件和非双状态模型进行拟合，并报告Tonset和Tm。
将EGFR-蛋白质-1用于获得作为基线的熔化曲线并确定拐点，特别是T-onset(分子开始熔化的温度)以及与scFv的稳定性相关的Tm1。随后，使用相同的方法分析EGFR-蛋白质-2、EGFR-蛋白质-3和EGFR-蛋白质-4。
表9和图8A-8D示出了在pH 7.4的PBS缓冲液中测试的DSC分析结果。图8A示出了EGFR-蛋白质-1在pH 7.4的PBS缓冲液中的DSC分析。图8B示出了EGFR-蛋白质-2在pH 7.4的PBS缓冲液中的DSC分析。图8C示出了EGFR-蛋白质-3在pH 7.4的PBS缓冲液中的DSC分析。图8D示出了EGFR-蛋白质-4在pH 7.4的PBS缓冲液中的DSC分析。表10和图9A和9B示出了在20mM组氨酸，250mM海藻糖，0.01％PS80，pH 6.0中测试的DSC分析结果。图9A示出了EGFR-蛋白质-3在20mM组氨酸，250mM海藻糖，0.01％PS80，pH 6.0缓冲液中的DSC分析。图9B示出了EGFR-蛋白质-4在20mM组氨酸，250mM海藻糖，0.01％PS80，pH 6.0缓冲液中的DSC分析。所述DSC分析揭示出EGFR-蛋白质-3(图8C)相对于EGFR-蛋白质-2(图8B)具有提高的热稳定性，后者相对于EGFR-蛋白质-1(图8A)具有提高的热稳定性。结果还显示EGFR-蛋白质-3(图9A)和EGFR-蛋白质-4(图9B)具有相近的热稳定性。然而，EGFR-蛋白质-4在加速热稳定性研究(40℃4周，数据未示出)下更易于降解，这突出了S62R重链突变对稳定性的益处。
表9.pH 7.4的PBS缓冲液中的DSC分析
表10.20mM组氨酸，250mM海藻糖，0.01％PS80，pH 6.0中的DSC分析
实施例4.多特异性结合蛋白与EGFR阳性细胞的结合的评估
本实施例被设计用于评估实施例2中描述的靶向EGFR的多特异性结合蛋白与细胞表面上表达的EGFR的结合亲和性。使用源自于非小细胞肺癌的H2172人类癌细胞系。简单来说，将H2172细胞与EGFR-蛋白质-1、EGFR-蛋白质-2、EGFR-蛋白质-3或帕尼单抗在4℃温育0.5小时。在温育后，使用荧光团偶联的抗人类IgG第二抗体检测多特异性结合蛋白和帕尼单抗与EGFR+细胞的结合模式。通过流式细胞术分析所述多特异性结合蛋白与所述细胞的结合水平。
图10示出了EGFR阳性细胞在与EGFR-蛋白质-1、EGFR-蛋白质-2、EGFR-蛋白质-3或帕尼单抗温育后的结合。这些靶向EGFR的多特异性结合蛋白以低于nM的浓度结合所述细胞，并且与帕尼单抗相比具有相近或更高的最大结合。
实施例5.EGFR细胞增殖测定
本实施例被设计用于评估EGFR多特异性结合蛋白对表达EGFR的人类癌细胞系H292的增殖的影响。简单来说，将EGFR-多特异性结合蛋白和抗EGFR-mAbs西妥昔单抗和帕尼单抗稀释，并与H292细胞温育72小时。在温育后，使用Cell-titer Glo，按照制造商的说明书测量细胞增殖。
图11示出了在EGFR-多特异性结合蛋白或抗EGFR mAbs存在下的H292细胞增殖。用抗EGFR mAbs处理的细胞与用EGFR-多特异性结合蛋白处理的细胞相比显示出较少的增殖。这被归因于所述多特异性结合蛋白与mAb的价数的差异，所述多特异性结合蛋白是单价的，而mAb是二价的，并且考虑到EGFR靶向与已在mAb中观察到的皮肤相关毒性的关联，证实了使用具有较低价数的靶向EGFR的蛋白质的益处。
通过参考并入
除非另有相反记载，否则本文中提到的每个专利文献和科学论文的整个公开内容为所有目的通过参考并入本文。
等同性
本申请中描述的抗原结合位点可以以其他特定形式体现而不背离其精神或本质特征。因此，前述实施方式应该在所有情况下被认为是说明性的而不是限制本文描述的抗原结合位点。因此，本申请的范围由随附的权利要求书而不是上面的描述指明，并且旨在将进入权利要求书的意义和等同性范围之内的所有变化涵盖在其中。
序列表
<110> 蜻蜓疗法股份有限公司
<120> 靶向EGFR的抗体及其用途
<130> P230154CN1-P
<150> 63/061,507
<151> 2020-08-05
<160> 33
<170> PatentIn version 3.5
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1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly
20 25 30
Asp Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Cys Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly His Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Arg
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Thr Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
85 90 95
Cys Val Arg Asp Arg Val Thr Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
145 150 155 160
Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn
180 185 190
Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr
210 215 220
Tyr Tyr Cys Gln His Phe Arg His Leu Pro Leu Ala Phe Gly Cys Gly
225 230 235 240
Thr Lys Val Glu Ile Lys
245
<210> 20
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 20
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Arg His Leu Pro Leu
85 90 95
Ala Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
115 120 125
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr
130 135 140
Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly Asp
145 150 155 160
Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp
165 170 175
Ile Gly His Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
180 185 190
Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Thr Gln Phe Ser
195 200 205
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
210 215 220
Val Arg Asp Arg Val Thr Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Met Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 21
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 21
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly
20 25 30
Asp Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Cys Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly His Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Thr Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
85 90 95
Cys Val Arg Asp Arg Val Thr Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
145 150 155 160
Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn
180 185 190
Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr
210 215 220
Tyr Tyr Cys Gln His Phe Arg His Leu Pro Leu Ala Phe Gly Cys Gly
225 230 235 240
Thr Lys Val Glu Ile Lys
245
<210> 22
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (64)..(64)
<223> Arg或Ser
<400> 22
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly
20 25 30
Asp Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly His Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Xaa
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Thr Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
85 90 95
Cys Val Arg Asp Arg Val Thr Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 23
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> Arg或Ser
<400> 23
His Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Xaa Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 24
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (191)..(191)
<223> Arg或Ser
<400> 24
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Arg His Leu Pro Leu
85 90 95
Ala Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
115 120 125
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr
130 135 140
Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly Asp
145 150 155 160
Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp
165 170 175
Ile Gly His Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Xaa Leu
180 185 190
Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Thr Gln Phe Ser
195 200 205
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
210 215 220
Val Arg Asp Arg Val Thr Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Met Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 25
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (64)..(64)
<223> Arg或Ser
<400> 25
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly
20 25 30
Asp Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Cys Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly His Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Xaa
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Thr Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
85 90 95
Cys Val Arg Asp Arg Val Thr Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
145 150 155 160
Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn
180 185 190
Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr
210 215 220
Tyr Tyr Cys Gln His Phe Arg His Leu Pro Leu Ala Phe Gly Cys Gly
225 230 235 240
Thr Lys Val Glu Ile Lys
245
<210> 26
<211> 226
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 26
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly
225
<210> 27
<211> 1210
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 27
Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln
20 25 30
Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe
35 40 45
Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn
50 55 60
Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys
65 70 75 80
Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val
85 90 95
Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr
100 105 110
Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn
115 120 125
Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu
130 135 140
His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu
145 150 155 160
Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met
165 170 175
Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro
180 185 190
Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln
195 200 205
Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg
210 215 220
Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys
225 230 235 240
Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp
245 250 255
Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro
260 265 270
Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly
275 280 285
Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His
290 295 300
Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu
305 310 315 320
Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val
325 330 335
Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn
340 345 350
Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp
355 360 365
Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr
370 375 380
Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu
385 390 395 400
Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp
405 410 415
Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln
420 425 430
His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu
435 440 445
Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser
450 455 460
Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu
465 470 475 480
Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu
485 490 495
Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro
500 505 510
Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn
515 520 525
Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly
530 535 540
Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro
545 550 555 560
Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro
565 570 575
Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val
580 585 590
Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp
595 600 605
Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys
610 615 620
Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly
625 630 635 640
Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu
645 650 655
Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg His
660 665 670
Ile Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln Glu Arg Glu Leu
675 680 685
Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn Gln Ala Leu Leu
690 695 700
Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys Ile Lys Val Leu Gly Ser
705 710 715 720
Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Leu Trp Ile Pro Glu Gly Glu
725 730 735
Lys Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser
740 745 750
Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Ser
755 760 765
Val Asp Asn Pro His Val Cys Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser
770 775 780
Thr Val Gln Leu Ile Thr Gln Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu Asp
785 790 795 800
Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn Ile Gly Ser Gln Tyr Leu Leu Asn
805 810 815
Trp Cys Val Gln Ile Ala Lys Gly Met Asn Tyr Leu Glu Asp Arg Arg
820 825 830
Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Thr Pro
835 840 845
Gln His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Leu Gly Ala
850 855 860
Glu Glu Lys Glu Tyr His Ala Glu Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp
865 870 875 880
Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu His Arg Ile Tyr Thr His Gln Ser Asp
885 890 895
Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ser
900 905 910
Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala Ser Glu Ile Ser Ser Ile Leu Glu
915 920 925
Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr
930 935 940
Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Ala Asp Ser Arg Pro Lys
945 950 955 960
Phe Arg Glu Leu Ile Ile Glu Phe Ser Lys Met Ala Arg Asp Pro Gln
965 970 975
Arg Tyr Leu Val Ile Gln Gly Asp Glu Arg Met His Leu Pro Ser Pro
980 985 990
Thr Asp Ser Asn Phe Tyr Arg Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Met Asp
995 1000 1005
Asp Val Val Asp Ala Asp Glu Tyr Leu Ile Pro Gln Gln Gly Phe
1010 1015 1020
Phe Ser Ser Pro Ser Thr Ser Arg Thr Pro Leu Leu Ser Ser Leu
1025 1030 1035
Ser Ala Thr Ser Asn Asn Ser Thr Val Ala Cys Ile Asp Arg Asn
1040 1045 1050
Gly Leu Gln Ser Cys Pro Ile Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gln Arg
1055 1060 1065
Tyr Ser Ser Asp Pro Thr Gly Ala Leu Thr Glu Asp Ser Ile Asp
1070 1075 1080
Asp Thr Phe Leu Pro Val Pro Glu Tyr Ile Asn Gln Ser Val Pro
1085 1090 1095
Lys Arg Pro Ala Gly Ser Val Gln Asn Pro Val Tyr His Asn Gln
1100 1105 1110
Pro Leu Asn Pro Ala Pro Ser Arg Asp Pro His Tyr Gln Asp Pro
1115 1120 1125
His Ser Thr Ala Val Gly Asn Pro Glu Tyr Leu Asn Thr Val Gln
1130 1135 1140
Pro Thr Cys Val Asn Ser Thr Phe Asp Ser Pro Ala His Trp Ala
1145 1150 1155
Gln Lys Gly Ser His Gln Ile Ser Leu Asp Asn Pro Asp Tyr Gln
1160 1165 1170
Gln Asp Phe Phe Pro Lys Glu Ala Lys Pro Asn Gly Ile Phe Lys
1175 1180 1185
Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Val Ala Pro Gln
1190 1195 1200
Ser Ser Glu Phe Ile Gly Ala
1205 1210
<210> 28
<211> 405
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 28
Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln
20 25 30
Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe
35 40 45
Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn
50 55 60
Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys
65 70 75 80
Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val
85 90 95
Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr
100 105 110
Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn
115 120 125
Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu
130 135 140
His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu
145 150 155 160
Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met
165 170 175
Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro
180 185 190
Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln
195 200 205
Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg
210 215 220
Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys
225 230 235 240
Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp
245 250 255
Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro
260 265 270
Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly
275 280 285
Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His
290 295 300
Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu
305 310 315 320
Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val
325 330 335
Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn
340 345 350
Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp
355 360 365
Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr
370 375 380
Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu
385 390 395 400
Ile Thr Gly Leu Ser
405
<210> 29
<211> 705
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 29
Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln
20 25 30
Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe
35 40 45
Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn
50 55 60
Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys
65 70 75 80
Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val
85 90 95
Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr
100 105 110
Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn
115 120 125
Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu
130 135 140
His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu
145 150 155 160
Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met
165 170 175
Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro
180 185 190
Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln
195 200 205
Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg
210 215 220
Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys
225 230 235 240
Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp
245 250 255
Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro
260 265 270
Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly
275 280 285
Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His
290 295 300
Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu
305 310 315 320
Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val
325 330 335
Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn
340 345 350
Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp
355 360 365
Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr
370 375 380
Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu
385 390 395 400
Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp
405 410 415
Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln
420 425 430
His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu
435 440 445
Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser
450 455 460
Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu
465 470 475 480
Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu
485 490 495
Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro
500 505 510
Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn
515 520 525
Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly
530 535 540
Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro
545 550 555 560
Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro
565 570 575
Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val
580 585 590
Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp
595 600 605
Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys
610 615 620
Thr Tyr Gly Pro Gly Asn Glu Ser Leu Lys Ala Met Leu Phe Cys Leu
625 630 635 640
Phe Lys Leu Ser Ser Cys Asn Gln Ser Asn Asp Gly Ser Val Ser His
645 650 655
Gln Ser Gly Ser Pro Ala Ala Gln Glu Ser Cys Leu Gly Trp Ile Pro
660 665 670
Ser Leu Leu Pro Ser Glu Phe Gln Leu Gly Trp Gly Gly Cys Ser His
675 680 685
Leu His Ala Trp Pro Ser Ala Ser Val Ile Ile Thr Ala Ser Ser Cys
690 695 700
His
705
<210> 30
<211> 628
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 30
Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln
20 25 30
Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe
35 40 45
Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn
50 55 60
Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys
65 70 75 80
Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val
85 90 95
Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr
100 105 110
Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn
115 120 125
Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu
130 135 140
His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu
145 150 155 160
Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met
165 170 175
Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro
180 185 190
Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln
195 200 205
Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg
210 215 220
Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys
225 230 235 240
Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp
245 250 255
Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro
260 265 270
Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly
275 280 285
Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His
290 295 300
Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu
305 310 315 320
Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val
325 330 335
Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn
340 345 350
Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp
355 360 365
Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr
370 375 380
Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu
385 390 395 400
Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp
405 410 415
Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln
420 425 430
His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu
435 440 445
Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser
450 455 460
Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu
465 470 475 480
Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu
485 490 495
Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro
500 505 510
Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn
515 520 525
Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly
530 535 540
Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro
545 550 555 560
Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro
565 570 575
Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val
580 585 590
Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp
595 600 605
Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys
610 615 620
Thr Tyr Gly Ser
625
<210> 31
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 31
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 32
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 32
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly
20 25 30
Asp Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Cys Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly His Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Arg
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Thr Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
85 90 95
Cys Val Arg Asp Arg Val Thr Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 33
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 33
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Arg His Leu Pro Leu
85 90 95
Ala Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105

Claims (53)

1.一种结合EGFR的抗原结合位点，其包含：
(i)包含分别为SEQ ID NO：2、23和4的互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)序列的重链可变结构域(VH)，和包含分别为SEQ ID NO：6、7和17的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域(VL)；或
(ii)包含分别为SEQ ID NO：2、12和4的CDR1、CDR2和CDR3序列的VH，和包含分别为SEQID NO：6、7和8的CDR1、CDR2和CDR3序列的VL。
2.根据权利要求1所述的抗原结合位点，其中所述VH包含分别为SEQ ID NO：2、23和4的CDR1、CDR2和CDR3序列，并且所述VL包含分别为SEQ ID NO：6、7和17的CDR1、CDR2和CDR3序列。
3.根据权利要求2所述的抗原结合位点，其中所述VH包含分别为SEQ ID NO：2、12和4的CDR1、CDR2和CDR3序列，并且所述VL包含分别为SEQ ID NO：6、7和17的CDR1、CDR2和CDR3序列。
4.根据权利要求2所述的抗原结合位点，其中所述VH包含分别为SEQ ID NO：2、3和4的CDR1、CDR2和CDR3序列，并且所述VL包含分别为SEQ ID NO：6、7和17的CDR1、CDR2和CDR3序列。
5.根据权利要求1所述的抗原结合位点，其中所述VH包含分别为SEQ ID NO：2、12和4的CDR1、CDR2和CDR3序列，并且所述VL包含分别为SEQ ID NO：6、7和8的CDR1、CDR2和CDR3序列。
6.一种抗原结合位点，其包含：包含与SEQ ID NO：1具有至少90％同一性的氨基酸序列的VH，和包含与SEQ ID NO：5具有至少90％同一性的氨基酸序列的VL，
其中所述VH相对于SEQ ID NO：1包含S62R取代，和/或所述VL相对于SEQ ID NO：5包含D92R取代和/或F87Y取代，根据Chothia编号方案编号。
7.根据权利要求6所述的抗原结合位点，其中所述VH相对于SEQ ID NO：1包含S62R取代，根据Chothia编号方案编号。
8.根据权利要求6所述的抗原结合位点，其中所述VL相对于SEQ ID NO：5包含D92R取代，根据Chothia编号方案编号。
9.根据权利要求6所述的抗原结合位点，其中所述VH相对于SEQ ID NO：1包含S62R取代并且所述VL相对于SEQ ID NO：5包含D92R取代，根据Chothia编号方案编号。
10.根据权利要求1-9中的任一项所述的抗原结合位点，其中所述VL相对于SEQ ID NO：5包含F87Y取代，根据Chothia编号方案编号。
11.根据权利要求1-3和6-10中的任一项所述的抗原结合位点，其中所述VH包含与SEQID NO：11具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO：16具有至少90％同一性的氨基酸序列。
12.根据权利要求1-3和6-11中的任一项所述的抗原结合位点，其中所述VH包含SEQ IDNO：11的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列，或者所述VH包含SEQ IDNO：32的氨基酸序列并且所述VL包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列。
13.根据权利要求1、2、4、6、8和10中的任一项所述的抗原结合位点，其中所述VH包含与SEQ ID NO：1具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO：16具有至少90％同一性的氨基酸序列。
14.根据权利要求1、2、4、6、8、10和13中的任一项所述的抗原结合位点，其中所述VH包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列。
15.根据权利要求1、5-7和10中的任一项所述的抗原结合位点，其中所述VH包含与SEQID NO：11具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO：13具有至少90％同一性的氨基酸序列。
16.根据权利要求1、5-7、10和15中的任一项所述的抗原结合位点，其中所述VH包含SEQID NO：11的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列。
17.根据权利要求1-16中的任一项所述的抗原结合位点，其中所述抗原结合位点作为单链可变片段(scFv)存在，并且其中所述scFv包含选自SEQ ID NO：14、18、20和24的序列。
18.根据权利要求1-17中的任一项所述的抗原结合位点，其中当通过表面等离子体共振(SPR)测量时，所述抗原结合位点以小于或等于5nM的解离常数(KD)结合人EGFR。
19.根据权利要求1-18中的任一项所述的抗原结合位点，其中当通过表面等离子体共振(SPR)测量时，所述抗原结合位点以小于或等于6nM的解离常数(KD)结合恒河猴EGFR。
20.一种蛋白质，其包含权利要求1-19中的任一项所述的抗原结合位点。
21.根据权利要求20所述的蛋白质，其还包含抗体重链恒定区。
22.根据权利要求21所述的蛋白质，其中所述抗体重链恒定区是人类IgG重链恒定区。
23.根据权利要求22所述的蛋白质，其中所述抗体重链恒定区是人类IgG1重链恒定区。
24.根据权利要求22或23所述的蛋白质，其中所述抗体重链恒定区的每条多肽链包含与SEQ ID NO：26具有至少90％同一性的氨基酸序列。
25.根据权利要求22-24中的任一项所述的蛋白质，其中所述抗体重链恒定区的至少一条多肽链相对于SEQ ID NO：26，在选自Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411和K439的一个或多个位置处包含一个或多个突变，根据EU编号系统编号。
26.根据权利要求22-25中的任一项所述的蛋白质，其中所述抗体重链恒定区的至少一条多肽链相对于SEQ ID NO：26包含选自Q347E、Q347R、Y349S、Y349K、Y349T、Y349D、Y349E、Y349C、L351K、L351D、L351Y、S354C、E356K、E357Q、E357L、E357W、K360E、K360W、Q362E、S364K、S364E、S364H、S364D、T366V、T366I、T366L、T366M、T366K、T366W、T366S、L368E、L368A、L368D、K370S、N390D、N390E、K392L、K392M、K392V、K392F、K392D、K392E、T394F、D399R、D399K、D399V、S400K、S400R、D401K、F405A、F405T、Y407A、Y407I、Y407V、K409F、K409W、K409D、T411D、T411E、K439D和K439E的一个或多个突变，根据EU编号系统编号。
27.根据权利要求22-26中的任一项所述的蛋白质，其中所述抗体重链恒定区的一条多肽链相对于SEQ ID NO：26，在选自Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411和K439的一个或多个位置处包含一个或多个突变；并且所述抗体重链恒定区的另一条多肽链相对于SEQ ID NO：26，在选自Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、D401、F405、Y407、K409、T411和K439的一个或多个位置处包含一个或多个突变，根据EU编号系统编号。
28.根据权利要求27所述的蛋白质，其中所述抗体重链恒定区的一条多肽链相对于SEQID NO：26包含K360E和K409W取代，并且所述抗体重链恒定区的另一条多肽链相对于SEQ IDNO：26包含Q347R、D399V和F405T取代，根据EU编号系统编号。
29.根据权利要求27或28所述的蛋白质，其中所述抗体重链恒定区的一条多肽链相对于SEQ ID NO：26包含Y349C取代，并且所述抗体重链恒定区的另一条多肽链相对于SEQ IDNO：26包含S354C取代，根据EU编号系统编号。
30.一种抗体-药物偶联物，其包含权利要求20-29中的任一项所述的蛋白质和药物部分。
31.权利要求30所述的抗体-药物偶联物，其中所述药物部分选自由澳瑞他汀、N-乙酰-γ-卡奇霉素(N-acetyl-γcalicheamicin)、美登素类(maytansinoid)、吡咯并苯二氮卓类和SN-38组成的组。
32.一种免疫细胞因子，其包含权利要求1-19中的任一项所述的抗原结合位点和细胞因子。
33.根据权利要求32所述的免疫细胞因子，其中所述细胞因子选自由IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、IL-15、TNF和IFNα组成的组。
34.一种双特异性T-细胞衔接物，其包含权利要求1-19中的任一项所述的抗原结合位点和结合CD3的抗原结合位点。
35.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含：
(a)权利要求1-19中的任一项所述的抗原结合位点；
(b)跨膜结构域；和
(c)细胞内信号传导结构域。
36.根据权利要求35所述的CAR，其中所述跨膜结构域选自T-细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、EGFR、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152和CD154的跨膜区。
37.根据权利要求35或36所述的CAR，其中所述细胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域，其包含CD3ζ、共同FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12的功能性信号传导结构域。
38.根据权利要求35-37中的任一项所述的CAR，其中所述细胞内信号传导结构域还包含共刺激信号传导结构域，其包含共刺激受体的功能性信号传导结构域。
39.根据权利要求38所述的CAR，其中所述共刺激受体选自由OX40、CD27、CD28、CD30、CD40、PD-1、CD2、CD7、CD258、NKG2C、B7-H3、与CD83结合的配体、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS和4-1BB(CD137)或其任何组合组成的组。
40.一种分离的核酸，其编码权利要求35-39中的任一项所述的CAR。
41.一种表达载体，其包含权利要求40所述的分离的核酸。
42.一种免疫效应细胞，其包含权利要求40所述的核酸或权利要求41所述的表达载体。
43.一种免疫效应细胞，其表达权利要求35-39中的任一项所述的CAR。
44.根据权利要求42或43所述的免疫效应细胞，其中所述免疫效应细胞是T细胞。
45.根据权利要求44所述的免疫效应细胞，其中所述T细胞是CD8+T细胞、CD4+T细胞、γδT细胞或NKT细胞。
46.根据权利要求42或43所述的免疫效应细胞，其中所述免疫效应细胞是NK细胞。
47.一种药物组合物，其包含权利要求20-29中的任一项所述的蛋白质、权利要求30或31所述的抗体-药物偶联物、权利要求32或33所述的免疫细胞因子、权利要求34所述的双特异性T-细胞衔接物或权利要求42-46中的任一项所述的免疫效应细胞，以及药学上可接受的载体。
48.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的权利要求20-29中的任一项所述的蛋白质、权利要求30或31所述的抗体-药物偶联物、权利要求32或33所述的免疫细胞因子、权利要求34所述的双特异性T-细胞衔接物、权利要求42-46中的任一项所述的免疫效应细胞或权利要求47所述的药物组合物。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述癌症是实体肿瘤。
50.根据权利要求48或49所述的方法，其中所述癌症是肺癌、乳腺癌、肾癌、结肠直肠癌、胃癌、脑癌、神经胶质瘤、膀胱癌、头颈癌、膀胱癌、胰腺癌、肝癌、宫颈癌、卵巢癌或前列腺癌。
51.根据权利要求48-50中的任一项所述的方法，其中所述癌症表达EGFR。
52.根据权利要求1-9中的任一项所述的抗原结合位点、权利要求20-29中的任一项所述的蛋白质、权利要求30或权利要求31所述的抗体-药物偶联物、权利要求32或权利要求33所述的免疫细胞因子或权利要求34所述的双特异性T细胞衔接物，其中所述抗原结合位点、蛋白质、抗体-药物偶联物、免疫细胞因子或双特异性T细胞衔接物是纯化的抗原结合位点、蛋白质、抗体-药物偶联物、免疫细胞因子或双特异性T细胞衔接物。
53.根据权利要求52所述的抗原结合位点、蛋白质、抗体-药物偶联物、免疫细胞因子或双特异性T细胞衔接物，其中所述抗原结合位点、蛋白质、抗体-药物偶联物、免疫细胞因子或双特异性T细胞衔接物通过选自由离心、深度过滤、细胞裂解、均质化、冻融、亲和纯化、凝胶过滤、离子交换层析、疏水相互作用交换层析和混合模式层析组成的组中的方法纯化。
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