TW202146056A - 轉穀胺醯胺酶介導之結合 - Google Patents

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玉山 林
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亨錫 哈
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Abstract

本發明提供抗體-寡核苷酸結合物、其製備方法及其使用方法。亦提供相關化合物、組合物及套組。

Description

轉穀胺醯胺酶介導之結合
本發明大體上係關於用於使寡核苷酸與多肽結合之方法及相關化合物、組合物及套組。
病原體相關分子樣式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)為與各種病原體相關之分子且由鐸樣受體(toll-like receptor，TLR)及其他活化先天性免疫反應之樣式辨識受體(pattern recognition receptor，PRR)識別。PAMP在無病原體存在下募集免疫系統之能力提供經由使用先天性免疫系統反應的涉及細胞破壞(例如抗癌療法)之治療多種疾病的策略。已針對多種治療應用而研究的一類PAMP為免疫刺激聚核苷酸，諸如未甲基化含胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸(CpG)之寡去氧核苷酸(CpG ODN) (例如，阿托莫德(agatolimod))。CpG ODN被認為介導免疫細胞(例如B細胞、單核球及漿細胞樣樹突狀細胞(plasmacytoid dendritic cell，pDC))中之TLR9二聚化以上調細胞介素(例如I型干擾素及介白素)，從而活化自然殺手細胞。
鐸樣受體9 (TLR9)，亦稱為CD289，係表現於包括樹突狀細胞(DC)、B淋巴球、巨噬細胞、自然殺手細胞及其他抗原呈現細胞的免疫系統細胞中之重要受體。TLR9活化觸發胞內信號傳導級聯，引起此等免疫細胞中之活化、成熟、增殖及細胞介素產生，因此橋接先天性及後天性免疫。Martinez-Campos等人, Viral Immunol . 2016, 30, 98-105；Notley等人,Sci. Rep. 2017, 7, 42204。天然TLR-9促效劑包括未甲基化含胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸(CpG)之寡去氧核苷酸(CpG ODN)。
CpG ODN可包括，例如具有聚G尾以及在3'端及5'端處之硫代磷酸酯主鏈及包括磷酸酯主鏈之中心回文序列及其中心回文序列內之CpG的寡去氧核苷酸；或具有完全硫代磷酸酯主鏈及在5'端處用於TLR9活化之序列的寡去氧核苷酸；或具有完全硫代磷酸酯主鏈以及能夠形成雙螺旋體之3'端序列的寡去氧核苷酸。然而，CpG ODN常易在血清中降解，且因此CpG ODN之藥物動力學可能係其作為治療劑研發上之限制因素之一。另外，CpG ODN常常呈現出活體內不均勻組織分佈，其中積聚之主要部位在肝、腎臟及脾臟中。此類分佈可引起與PAMP相關之脫靶活性及局部毒性。
一種溶液為使免疫調節聚核苷酸(例如，CpG ODN)與特異性靶向組織或細胞之靶向部分結合以克服聚核苷酸之不均勻分佈。參見US 2018/0312536。特定言之，轉穀胺醯胺酶介導之反應可用於使含有穀胺醯胺殘基之多肽靶向部分與含有一級胺基之CpG ODN結合。微生物轉穀胺醯胺酶(microbial transglutaminase，mTG)係來自茂源鏈黴菌(Streptomyces mobaraensis )。mTG在pH控制之水性條件(包括生理條件)下催化蛋白質之「反應性」穀胺醯胺與「反應性」離胺酸殘基之間的轉醯胺化反應，而「反應性」離胺酸殘基亦可為簡單的低分子量一級胺，諸如5-胺基戊基。對於待識別為mTG受質之蛋白質上之內源性穀胺醯胺，兩個準則似乎重要：1)肽序列中與穀胺醯胺殘基相鄰之疏水性胺基酸之存在，及2)穀胺醯胺在環上之定位，其中局部鏈柔曲性增強對mTG之反應性。
儘管此等免疫調節聚核苷酸之結合可引起穩定性及分佈之改善，但仍需要具有改善之穩定性及選擇性且具有或不具有與靶向部分之結合的免疫調節聚核苷酸及製備其之方法。
在一個態樣中，本文提供一種包含抗體或其抗原結合片段及一或多種免疫調節寡核苷酸(P)之結合物，其中各免疫調節寡核苷酸經由與抗體或片段之穀胺醯胺殘基(Q)相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接，如式(A)中所示：
Figure 02_image001
， 其中
Figure 02_image003
指示各Q與該抗體或其抗原結合片段(Ab)之連接點。在一些實施例中，穀胺醯胺殘基為連接至抗體，例如連接至抗體Fc區之C端的Q標籤肽之一部分。在一些實施例中，穀胺醯胺殘基為抗體之一部分(例如Fc區之一部分，諸如殘基Q295)。在一些實施例中，抗體進一步包含N297A突變。例示性Q標籤肽序列提供於例如 表 3 中。例示性免疫調節寡核苷酸描述於本文中且提供於例如 表 2 及 表 9-1 2 中。在一些實施例中，使1-4免疫調節寡核苷酸結合於抗體。例示性連接子(L)描述於本文中。在一些實施例中，連接子包含聚乙二醇部分。
在一個態樣中，本文提供一種包含抗體或其抗原結合片段及一或多種免疫調節寡核苷酸(P)之結合物，其中該抗體或抗原結合片段連接至一或多個包含胺基酸序列RPQGF (SEQ ID NO: 47)之Q標籤肽(Q)，其中各免疫調節寡核苷酸經由與Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接至Q標籤肽，如式(A)中所示：
Figure 02_image005
， 其中
Figure 02_image003
指示各Q與該抗體或其抗原結合片段(Ab)之連接點。
在一些實施例中，抗體連接至2個Q標籤肽，且Q標籤肽中之一者連接至免疫調節寡核苷酸。在一些實施例中，抗體連接至2個Q標籤肽，且2個Q標籤肽中之每一者連接至免疫調節寡核苷酸。在一些實施例中，抗體或其片段為單株抗體或其片段。在本發明態樣之另一實施例中，抗體或其片段為Fab、F(ab')2、Fab'-SH、Fv、scFv、單域、單重鏈或單輕鏈抗體或抗體片段。在可與任一前述實施例組合之此態樣之又另一實施例中，抗體或其片段為人類化、人類或嵌合抗體或其片段。在本發明態樣之其他實施例中，抗體或其片段特異性結合腫瘤相關抗原。
在本發明態樣之其他實施例中，抗體或其片段特異性結合人類CD22。在本發明態樣之另一實施例中，抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中VH域包含來自選自由以下組成之群之VH域序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3序列：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSIYDMSWVRQAPGKGLEWVAYISSGGGTTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 64)、QVQLLESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFAFSIYDMNWVRQAPGKGLEWVSAISSGGGTTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 65)、EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYEMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 66)及QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCTVSGFAFSIYDMSWIRQPPGKGLEWIAYISSGGGTTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO:67)。在本發明態樣之又另一實施例中，抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中VH域包含來自表 8 中所示之VH域的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3序列。在本發明態樣之又另一個實施例中，抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中VH域包括包含SEQ ID NO: 113之序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO: 115之序列的CDR-H2及包含SEQ ID NO: 116之序列的CDR-H3；或包含SEQ ID NO: 114之序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO: 189之序列的CDR-H2或包含SEQ ID NO: 116之序列的CDR-H3。在本發明態樣之又另一個實施例中，抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中VH域包括包含SEQ ID NO: 113之序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO: 115之序列的CDR-H2及包含SEQ ID NO: 116之序列的CDR-H3，且VL域包括包含SEQ ID NO: 117之序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO: 119之序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO: 120之序列的CDR-L3。在本發明態樣之又另一個實施例中，抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，且其中VH域包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSIYDMSWVRQAPGKGLEWVAYISSGGGTTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 64)、QVQLLESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFAFSIYDMNWVRQAPGKGLEWVSAISSGGGTTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 65)、EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYEMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 66)及QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCTVSGFAFSIYDMSWIRQPPGKGLEWIAYISSGGGTTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 67)。在本發明態樣之又另一個實施例中，抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中VH域包含SEQ ID NO: 65之序列，且VL域包含SEQ ID NO: 87之序列。在本發明態樣之又另一實施例中，抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中VL域包含來自選自由以下組成之群之VL域序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGNTLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 68)、DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIHGYLAWYQQKPGKAPKLLIYYTSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 69)、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:7 0)、EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDIHGYLNWYQQKPGQAPRLLIYYTSILHSGIPARFSGSGPGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 71)及DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRASQDIHGYLNWYQQKPGQSPQLLIYYTSILHSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 72)。在本發明態樣之又另一實施例中，抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中VL域包含來自選自由SEQ ID NO: 68-91組成之群的VL域序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3序列。在本發明態樣之又另一實施例中，抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中VL域包含來自表 8 中所示之VL域的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3序列。在本發明態樣之又另一實施例中，抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中VL域包括包含SEQ ID NO: 117之序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO: 119之序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO: 120之序列的CDR-L3；或包含SEQ ID NO: 118之序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO: 177之序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO: 120之序列的CDR-L3。在本發明態樣之其他實施例中，VL域進一步包含殘基N92處之胺基酸取代。在其中VL域包含殘基N92處之胺基酸取代的某些實施例中，殘基N92處之胺基酸取代係選自由N92A、N92L及N92S組成之群。在本發明態樣之其他實施例中，抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中VL域為選自由以下組成之群的胺基酸序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGNTLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 68)、DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIHGYLAWYQQKPGKAPKLLIYYTSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 69)、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 70)、EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDIHGYLNWYQQKPGQAPRLLIYYTSILHSGIPARFSGSGPGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 71)及DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRASQDIHGYLNWYQQKPGQSPQLLIYYTSILHSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 72)。在本發明態樣之其他實施例中，抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中VH域包含胺基酸序列QVQLLESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFAFSIYDMNWVRQAPGKGLEWVSAISSGGGTTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 65)，且其中VL域包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGNTLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 68)、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGATLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 73)、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGLTLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 82)及DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGSTLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 87)。
在其他實施例中，抗體或其片段特異性結合人類Her2。在本發明態樣之又另一實施例中，抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中VH域包含選自以下VH域序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:168)及/或其中VL域包含來自以下VL域序列之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:169)。在本發明態樣之又另一實施例中，抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中VH域包含序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:168)及/或其中VL域包含序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:169)。在本發明態樣之又另一實施例中，抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中VH域包含選自以下VH域序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:170)及/或其中VL域包含來自以下VL域序列之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:171)。在本發明態樣之又另一實施例中，抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中VH域包含序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:170)及/或其中VL域包含序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:171)。在一些實施例中，抗Her2抗體為曲妥珠單抗(trastuzumab)或帕妥珠單抗(pertuzumab)。
在可與前述態樣中之任一者組合的本發明態樣之又另一實施例中，抗體包含Fc區。在某些實施例中，Fc區為選自由以下組成之群的人類Fc區：IgG1 Fc區、IgG2 Fc區及IgG4 Fc區。在一些實施例中，Fc區為野生型人類IgG1、IgG2或IgG4 Fc區。在一些實施例中，Fc區為包含一或多個胺基酸取代之人類Fc區，該人類Fc區與缺乏胺基酸取代之人類Fc區的效應功能相比減少一或多個效應功能。在其他實施例中，Fc區為：(a)包含L234A、L235A及/或G237A取代之人類IgG1 Fc區，胺基酸位置係根據EU索引編號；(b)包含A330S及/或P331S取代之人類IgG2 Fc區，胺基酸位置係根據EU索引編號；或(c)包含S228P及/或L235E取代之人類IgG4 Fc區，胺基酸位置係根據EU索引編號。在又另一實施例中，Fc區進一步包含N297A取代，胺基酸位置係根據EU索引編號。在一些實施例中，抗體包含抗體重鏈恆定域，其包含選自由SEQ ID No: 92-107及178組成之群的胺基酸序列。在其中Fc區包含N297A取代之某些實施例中，結合物進一步包含如下式
Figure 02_image007
中所示連接至Fc區之Q295殘基的免疫調節寡核苷酸P，其中L為經由醯胺鍵連接至Q295之連接子部分。在又其他實施例中，Fc區進一步包含D265A取代，胺基酸位置係根據EU索引編號。在一些實施例中，結合物結合於表現於B細胞表面上之人類CD22。在一些實施例中，結合物誘導TLR9之活化。
在本發明態樣之一些實施例中，抗體包含人類λ輕鏈。在本態樣之其他實施例中，抗體包含人類κ輕鏈。在一些實施例中，抗體包含抗體輕鏈恆定域，其包含選自由SEQ ID NO: 108-110組成之群的胺基酸序列。在可與本發明態樣之任何前述實施例組合的其他實施例中，至少一個Q標籤連接至抗體之重鏈。在某些實施例中，至少一個Q標籤與抗體之重鏈之C端融合。在其他實施例中，至少一個Q標籤連接至抗體輕鏈。在其他實施例中，1或2個Q標籤連接至抗體或抗原結合片段。在其他實施例中，結合物之DAR為1。在其他實施例中，結合物之DAR為2。
在本發明態樣之其他實施例中，各免疫調節寡核苷酸P獨立地為
Figure 02_image009
， 其中 b及c各自獨立地為1至25之整數；其限制條件為b及c之總和為至少5；
Figure 02_image011
指示該免疫調節寡核苷酸P與該結合物之其餘部分的連接點； X5 ' 為具有結構
Figure 02_image013
之5'端核苷； X3 ' 為具有結構
Figure 02_image015
之3'端核苷； YPTE 為具有結構
Figure 02_image017
之核苷間磷酸三酯，其中*指示與該寡核苷酸之其餘部分之連接點，且
Figure 02_image019
指示與該連接子L之連接點，或若L不存在，則
Figure 02_image019
指示與該穀胺醯胺殘基處之該Q標籤肽經由醯胺鍵之連接點； Y3 ' 為具有結構
Figure 02_image022
之末端磷酸三酯； 各XN 獨立地為具有結構
Figure 02_image024
之核苷； 各YN 獨立地為具有結構
Figure 02_image026
之核苷間連接子； 其中各BN 獨立地為經修飾或未經修飾之核鹼基； 各RN 獨立地為-H或-O-C1 - 4 烷基，其中該-O-C1 - 4 烷基之該C1 - 4 烷基視情況進一步經-O-C1 -C4 烷基取代； B5 ' 及B3 ' 獨立地為經修飾或未經修飾之核鹼基； R5 ' 及R3 ' 獨立地為-H或-O-C1 -C4 烷基，其中該-O-C1 -4 烷基之C1 - 4 烷基進一步視情況經-O-C1 -4 烷基取代； 各T1 獨立地為O或S； 各T2 獨立地為O- 或S- ；及 T3 為包含寡乙二醇部分之基團；及 R1 為C1 - 4 伸烷基-羥基。
在本發明態樣之某些實施例中，b為3。在本發明態樣之額外實施例中，(i)P包含至少一個經修飾之核苷XN ；(ii)P具有至少一個經修飾之核苷間連接子YN ，其中T1 或T2 中之至少一者為S；或(iii) (i)及(ii)兩者。在一些實施例中，P具有至少一個二硫代磷酸酯或硫代磷酸酯核苷間連接子。在某些實施例中，P包含0、1、2或3個二硫代磷酸酯核苷間連接子。在其他實施例中，P包含選自由以下組成之群的經修飾之核苷：2'-O-烷基核苷、2'-O-烷氧基烷基核苷、2'-去氧核苷及核苷。在某些實施例中，經修飾之核苷係選自由以下組成之群：5-溴-2'-O-甲基尿苷、5-溴-2'-去氧尿苷、2'-O-甲基尿苷、2'-去氧尿苷、2'-O-甲基胸苷、2'-O-甲基胞苷、2'-O-(2-甲氧基乙基)胸苷及8-側氧基-7,8-二氫-2'-去氧鳥苷。在其他實施例中，Y3 ' 或在X5 ' 之3'位置處之YN 包含未經取代或經取代之硫代磷酸酯。
在本發明態樣之其他實施例中，YPTE 為：
Figure 02_image028
， 其中Z為O或S；d為0至95之整數；結構右側之該等兩個
Figure 02_image030
指示與該寡核苷酸P中之該等相鄰核苷XN 的連接點，且該結構左側之該
Figure 02_image019
指示與該連接子L的連接點。在其他實施例中，YPTE 為：
Figure 02_image033
或
Figure 02_image035
， 其中Z為O或S；d為0至95之整數；結構右側之該等兩個
Figure 02_image037
指示與該寡核苷酸P中之該等相鄰核苷XN 的連接點，且該結構左側之該一個
Figure 02_image039
指示與該連接子L的連接點。在某些實施例中，Z為S。在其他實施例中，d為1至25之整數。在可與前述實施例中之任一者組合的額外實施例中，連接子L包含聚乙二醇部分。在又其他實施例中，連接子L係
Figure 02_image041
，其中m為介於約0至約50範圍內之整數，且其中
Figure 02_image043
指示與YPTE 之連接點，且
Figure 02_image045
指示與結合物之其餘部分的連接點。在其他實施例中，P包含一或多個CpG位點。在另一實施例中，P包含至少3個CpG位點。在其他實施例中，各P獨立地包含選自由 表 9 及 表 10 之寡核苷酸組成之群的寡核苷酸序列。
在一些實施例中，結合物包含一或多個、兩個或更多個、三個或更多個、四個或更多個、五個或更多個或十個或更多個Q標籤肽。在一些實施例中，結合物包含兩個Q標籤肽。在一些實施例中，結合物包含一或多種、兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種或十種或更多種免疫調節寡核苷酸。在一些實施例中，結合物包含一種免疫調節寡核苷酸。在某些實施例中，抗體連接至2個Q標籤肽，且其中Q標籤肽中之一者連接至免疫調節寡核苷酸。在一些實施例中，抗體包含兩條抗體輕鏈、兩條抗體重鏈及兩個Q標籤肽；其中Q標籤肽中之每一者連接至抗體重鏈中之一者之C端；且其中Q標籤肽中之一者經由與Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接至免疫調節寡核苷酸(P)，例如如圖 16 中所示。
在又一態樣中，本發明提供一種結合物，其包含抗體或其抗原結合片段(Ab)及一或多種免疫調節寡核苷酸(P)，其中該抗體或抗原結合片段連接至一或多個包含至少一個穀胺醯胺殘基之Q標籤肽(Q)，其中各免疫調節寡核苷酸經由與Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接至Q標籤肽，如式(A)中所示，
Figure 02_image047
， 其中：
Figure 02_image049
指示各Q與該抗體或其抗原結合片段(Ab)之連接點； 各Q獨立地為具有至少一個穀胺醯胺殘基之Q標籤肽序列； 各L獨立地為經由與該穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵連接於Q的一鍵或連接子部分；及 各P獨立地為具有以下結構之免疫調節寡核苷酸：
Figure 02_image051
， 其中
Figure 02_image053
及
Figure 02_image055
指示該寡核苷酸內之連接點； 各T1 獨立地為O或S； 各T2 為S- ； T3 為基團
Figure 02_image057
，其中
Figure 02_image059
指示與L之連接點且其中
Figure 02_image059
指示與該寡核苷酸之其餘部分的連接點； Z為O或S； U5 ' 為-H或鹵素； R5 ' 為-H或甲氧基； Rc1 為-H或甲氧基； Rg1 、Rg2 、Rg3 及Rg4 為H； R3 ' 為甲氧基； R1 為-(CH2 )3 -OH； R2 為-H或甲基；且 n為0至2之整數。
在又一態樣中，本發明提供一種結合物，其包含抗體或其抗原結合片段(Ab)及一或多種免疫調節寡核苷酸(P)，其中該抗體或抗原結合片段連接至一或多個包含至少一個穀胺醯胺殘基之Q標籤肽(Q)，其中各免疫調節寡核苷酸經由與Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接至Q標籤肽，如式(A)中所示，
Figure 02_image062
， 其中：
Figure 02_image064
指示各Q與該抗體或其抗原結合片段(Ab)之連接點； 各Q獨立地為具有至少一個穀胺醯胺殘基之Q標籤肽序列； 各L獨立地為經由與該穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵連接於Q的一鍵或連接子部分；及 各P獨立地為具有以下結構之免疫調節寡核苷酸：
Figure 02_image066
， 其中
Figure 02_image053
及
Figure 02_image069
指示該寡核苷酸內之連接點； 各T1 獨立地為O或S； 各T2 為S- ； T3 為基團
Figure 02_image071
，其中
Figure 02_image073
指示與L之連接點且其中
Figure 02_image075
指示與該寡核苷酸之其餘部分的連接點； Z為O或S； R5 ' 為-H或甲氧基； Rc1 為-H或甲氧基； Rg1 、Rg2 、Rg3 及Rg4 為H； R3 ' 為甲氧基； R1 為-(CH2 )3 -OH； R2 為-H或甲基；且 n為0至2之整數。
在另一態樣中，本文提供一種包含抗體或其抗原結合片段(Ab)及一或多種免疫調節寡核苷酸(P)之結合物，其中該抗體或抗原結合片段連接至一或多個包含Q標籤肽序列RPQGF (SEQ ID NO: 47)之Q標籤肽(Q)，且其中各免疫調節寡核苷酸經由與Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接至Q標籤肽，如式(A)中所示：
Figure 02_image077
， 其中：
Figure 02_image079
指示各Q與抗體或其抗原結合片段(Ab)之連接點 各Q獨立地包含Q標籤肽序列RPQGF (SEQ ID NO:47)； 各L獨立地為一鍵或連接子部分
Figure 02_image081
， 其中m為約0至約50範圍內之整數，且其中
Figure 02_image083
指示與P之連接點，且
Figure 02_image085
指示與經由與該穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵連接於Q的該結合物之其餘部分的連接點；及 各P獨立地為具有以下結構之免疫調節寡核苷酸：
Figure 02_image087
， 其中
Figure 02_image089
及
Figure 02_image091
指示寡核苷酸內之連接點； 各T1 獨立地為O或S； 各T2 為S- ； T3 為基團
Figure 02_image093
，其中
Figure 02_image095
指示與L之連接點且其中
Figure 02_image097
指示與該寡核苷酸之其餘部分的連接點； Z為O或S； U5 ' 為-H或鹵素； R5 ' 為-H或甲氧基； Rc1 為-H或甲氧基； Rg1 、Rg2 、Rg3 及Rg4 為H； R3 ' 為甲氧基； R1 為-(CH2 )3 -OH； R2 為-H或甲基；且 n為0至2之整數， 其中Ab為結合腫瘤相關抗原之抗體或其抗原結合片段。
在又一態樣中，本發明提供一種包含抗體或其抗原結合片段(Ab)及一或多種免疫調節寡核苷酸(P)之結合物，其中該抗體或抗原結合片段連接至一或多個包含Ql標籤肽序列RPQGF (SEQ ID NO: 47)之Q標籤肽(Q)，且其中各免疫調節寡核苷酸經由與Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接至Q標籤肽，如式(A)中所示：
Figure 02_image099
， 其中：
Figure 02_image101
指示各Q與抗體或其抗原結合片段(Ab)之連接點 各Q獨立地包含Q標籤肽序列RPQGF (SEQ ID NO:47)； 各L獨立地為一鍵或連接子部分
Figure 02_image103
， 其中m為約0至約50範圍內之整數，且其中
Figure 02_image105
指示與P之連接點，且
Figure 02_image107
指示與經由與該穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵連接於Q的該結合物之其餘部分的連接點；及 各P獨立地為具有以下結構之免疫調節寡核苷酸：
Figure 02_image109
， 其中
Figure 02_image111
及
Figure 02_image113
指示寡核苷酸內之連接點； 其中Ab為結合腫瘤相關抗原之抗體或其抗原結合片段。
在一些實施例中，腫瘤相關抗原由癌細胞表現。在一些實施例中，腫瘤相關抗原由癌症相關基質細胞表現。在一些實施例中，腫瘤相關抗原係選自由以下組成之群：CD19、CD20、CD22、CD25、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44、CD45R (B220)、CD49、CD52、CD56、CD70、CD74、CD79a、CD79b、CD93、CD123、CD138、CD163、CD205、CD206、CD274、CD303及CD304，葉酸受體α、葉酸受體β、間皮素、PSMA、Her-2、EGFR、CLDN18.2、5T4、CD47、結合蛋白4、運鐵蛋白受體、整合素、畸胎瘤衍化生長因子(cripto)、EphA2、AGS-5、AGS-16、CanAg、EpCAM、IL4受體、IL2受體、Lewis Y、GPNMB、DLL3、GCC、GPA33、組織因子(TF)及Trop2。在一些實施例中，癌症為乳癌、大腸直腸癌、肺癌、頭頸癌、黑素瘤、淋巴瘤或白血病。
在本發明態樣之一些實施例中，抗體或其片段為單株抗體或其片段。在一些實施例中，抗體連接至2個Q標籤肽，且其中Q標籤肽中之一者連接至免疫調節寡核苷酸。在本發明態樣之其他實施例中，抗體或其片段為Fab、F(ab')2、Fab'-SH、Fv、scFv、單域、單重鏈或單輕鏈抗體或抗體片段。在本發明態樣之其他實施例中，抗體或其片段為人類化、人類或嵌合抗體或其片段。
在其他實施例中，抗體或其片段特異性結合人類CD22。在本發明態樣之另一實施例中，抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中VH域包含來自選自由以下組成之群之VH域序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3序列：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSIYDMSWVRQAPGKGLEWVAYISSGGGTTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 64)、QVQLLESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFAFSIYDMNWVRQAPGKGLEWVSAISSGGGTTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 65)、EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYEMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 66)及QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCTVSGFAFSIYDMSWIRQPPGKGLEWIAYISSGGGTTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO:67)。在本發明態樣之又另一實施例中，抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中VH域包含來自表 8 中所示之VH域的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3序列。在本發明態樣之又另一個實施例中，抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，且其中VH域包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSIYDMSWVRQAPGKGLEWVAYISSGGGTTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 64)、QVQLLESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFAFSIYDMNWVRQAPGKGLEWVSAISSGGGTTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 65)、EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYEMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 66)及QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCTVSGFAFSIYDMSWIRQPPGKGLEWIAYISSGGGTTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 67)。在本發明態樣之又另一實施例中，抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中VL域包含來自選自由以下組成之群之VL域序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGNTLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 68)、DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIHGYLAWYQQKPGKAPKLLIYYTSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 69)、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 70)、EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDIHGYLNWYQQKPGQAPRLLIYYTSILHSGIPARFSGSGPGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 71)及DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRASQDIHGYLNWYQQKPGQSPQLLIYYTSILHSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 72)。在本發明態樣之又另一實施例中，抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中VL域包含來自表 8 中所示之VL域的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3序列。在本發明態樣之其他實施例中，VL域進一步包含殘基N92處之胺基酸取代。在其中VL域包含殘基N92處之胺基酸取代的某些實施例中，殘基N92處之胺基酸取代係選自由N92A、N92L及N92S組成之群。在本發明態樣之其他實施例中，抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中VL域為選自由以下組成之群的胺基酸序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGNTLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 68)、DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIHGYLAWYQQKPGKAPKLLIYYTSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 69)、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 70)、EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDIHGYLNWYQQKPGQAPRLLIYYTSILHSGIPARFSGSGPGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 71)、DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRASQDIHGYLNWYQQKPGQSPQLLIYYTSILHSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 72)、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGATLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 73)及DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGLTLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 82)。在本發明態樣之其他實施例中，抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中VH域包含胺基酸序列QVQLLESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFAFSIYDMNWVRQAPGKGLEWVSAISSGGGTTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 65)，且其中VL域包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGNTLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 68)、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGATLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 73)、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGLTLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 82)及DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGSTLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 87)。
在其他實施例中，抗體或其片段特異性結合人類Her2。在本發明態樣之又另一實施例中，抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中VH域包含選自以下VH域序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:168)及/或其中VL域包含來自以下VL域序列之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:169)。在本發明態樣之又另一實施例中，抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中VH域包含序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:168)及/或其中VL域包含序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:169)。在本發明態樣之又另一實施例中，抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中VH域包含選自以下VH域序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:170)及/或其中VL域包含來自以下VL域序列之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:171)。在本發明態樣之又另一實施例中，抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中VH域包含序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:170)及/或其中VL域包含序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:171)。在一些實施例中，抗Her2抗體為曲妥珠單抗或帕妥珠單抗。
在可與前述態樣中之任一者組合的本發明態樣之又另一實施例中，抗體包含Fc區。在某些實施例中，其中Fc區為選自由以下組成之群的人類Fc區：IgG1 Fc區、IgG2 Fc區及IgG4 Fc區。在一些實施例中，Fc區為野生型人類IgG1、IgG2或IgG4 Fc區。在一些實施例中，Fc區為包含一或多個胺基酸取代之人類Fc區，該人類Fc區與缺乏胺基酸取代之人類Fc區的效應功能相比減少一或多個效應功能。在其他實施例中，Fc區為：(a)包含L234A、L235A及/或G237A取代之人類IgG1 Fc區，胺基酸位置係根據EU索引編號；(b)包含A330S及/或P331S取代之人類IgG2 Fc區，胺基酸位置係根據EU索引編號；或(c)包含S228P及/或L235E取代之人類IgG4 Fc區，胺基酸位置係根據EU索引編號。在又另一實施例中，Fc區進一步包含N297A取代，胺基酸位置係根據EU索引編號。在某些實施例中，Fc區進一步包含N297A取代。在一些實施例中，抗體包含抗體重鏈恆定域，其包含選自由SEQ ID No: 92-107及178組成之群的胺基酸序列。在一些實施例中，結合物進一步包含如下式
Figure 02_image115
中所示連接至Fc區之Q295殘基的免疫調節寡核苷酸P，其中L為經由醯胺鍵連接至Q295之連接子部分。在又其他實施例中，Fc區進一步包含D265A取代，胺基酸位置係根據EU索引編號。在一些實施例中，結合物結合於表現於B細胞表面上之人類CD22。在一些實施例中，結合物誘導TLR9之活化。
在本發明態樣之一些實施例中，抗體包含人類λ輕鏈。在本態樣之其他實施例中，抗體包含人類κ輕鏈。在一些實施例中，抗體包含抗體輕鏈恆定域，其包含選自由SEQ ID NO: 108-110組成之群的胺基酸序列。在可與本發明態樣之任何前述實施例組合的其他實施例中，至少一個Q標籤連接至抗體之重鏈。在某些實施例中，至少一個Q標籤與抗體之重鏈之C端融合。在其他實施例中，至少一個Q標籤連接至抗體輕鏈。在某些實施例中，抗體包含兩條重鏈及兩條輕鏈，且至少一個Q標籤與各重鏈之C端融合。
在其他實施例中，至少一個Q標籤位於Fc域內。在其他實施例中，各Q標籤獨立地包含具有5與15個之間的胺基酸殘基的肽序列。在本發明態樣之某些實施例中，Q標籤為天然存在的。在其他實施例中，各Q標籤之肽序列獨立地選自由SEQ ID NO: 39-55組成之群。在某些實施例中，其中Q標籤包含肽序列RPQGF (SEQ ID NO: 47)。在其他實施例中，1或2個Q標籤連接至抗體或抗原結合片段。在其他實施例中，結合物之DAR為1。在其他實施例中，結合物之DAR為2。在可與前述實施例中之任一者組合的額外實施例中，連接子L包含聚乙二醇部分。在又其他實施例中，連接子L為
Figure 02_image117
，其中m為在約0至約50範圍內之整數，且其中
Figure 02_image119
指示與YPTE 之連接點，且
Figure 02_image121
指示與該結合物之其餘部分的連接點。
在一些實施例中，Z為S。在又其他實施例中，寡核苷酸包含至少一對成對T1 及T2 ，其中T1 為S且T2 為S- 。在某些實施例中，寡核苷酸包含至少兩對成對T1 及T2 ，其中T1 為S且T2 為S- 。在可與前述實施例中之任一者組合的其他實施例中，R5 '為H。在其他實施例中，R5 '為甲氧基。在一些實施例中，Rc1 為H。在其他實施例中，Rc1 為甲氧基。在其他實施例中，R2 為甲基。在其他實施例中，R2 為H。在其他實施例中，m為20至25之整數。在本發明態樣之一些實施例中，各P獨立地包含選自由 表 10 之寡核苷酸組成之群的寡核苷酸序列。
在一些實施例中，結合物包含一或多個、兩個或更多個、三個或更多個、四個或更多個、五個或更多個或十個或更多個Q標籤肽。在一些實施例中，結合物包含兩個Q標籤肽。在一些實施例中，結合物包含一或多種、兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種或十種或更多種免疫調節寡核苷酸。在一些實施例中，結合物包含一種免疫調節寡核苷酸。在其他實施例中，抗體連接至2個Q標籤肽，且其中Q標籤肽中之一者連接至免疫調節寡核苷酸。在一些實施例中，抗體包含兩條抗體輕鏈、兩條抗體重鏈及兩個Q標籤肽；其中Q標籤肽中之每一者連接至抗體重鏈中之一者之C端；且其中Q標籤肽中之至少一者經由與Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接至免疫調節寡核苷酸(P)，例如如圖 16A - 16D 中所示。在某些實施例中，兩個Q標籤肽包含肽序列RPQGF (SEQ ID NO: 47)。在其他實施例中，兩個Q標籤肽包含由(Fc區之)N297A突變暴露之Q295殘基。在其他實施例中，結合物之DAR為1或2。
在又一態樣中，本文提供一種包含抗體或其抗原結合片段(Ab)及一或多種免疫調節寡核苷酸(P)之結合物，其中該抗體或抗原結合片段連接至一或多個包含胺基酸序列RPQGF (SEQ ID NO: 47)之Q標籤肽(Q)，其中各免疫調節寡核苷酸經由與Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接至Q標籤肽，如式(A)中所示，
Figure 02_image123
， 其中：
Figure 02_image125
指示各Q與抗體或其抗原結合片段(Ab)之連接點； 各Q包含Q標籤肽序列RPQGF (SEQ ID NO: 47)； 各L獨立地為一鍵或連接子部分
Figure 02_image127
， 其中m為約0至約50範圍內之整數，且其中
Figure 02_image129
指示與P之連接點，且
Figure 02_image131
指示與經由與該穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵連接於Q的該結合物之其餘部分的連接點； 且各P為具有以下結構之免疫調節寡核苷酸：
Figure 02_image133
， 其中
Figure 02_image135
及
Figure 02_image137
指示寡核苷酸內之連接點； 其中Ab包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中該VH域包含來自以下VH域序列之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3序列： QVQLLESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFAFSIYDMNWVRQAPGKGLEWVSAISSGGGTTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 65)或展示於表 8 中之VH域； 其中該VL域包含來自以下VL域序列之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGNTLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:68)或展示於表 8 中之VL域。
在本態樣之一些實施例中，VL域進一步包含胺基酸取代N92A。在其他實施例中，VL域進一步包含胺基酸取代N92L。在其他實施例中，VL域進一步包含胺基酸取代N92S。
在本態樣之其他實施例中，各Q標籤獨立地選自由以下組成之群：RPQGF (SEQ ID NO:47)、RPQGFPP (SEQ ID NO:48)及RPQGFGPP (SEQ ID NO:49)。在某些實施例中，各Q標籤係RPQGFGPP (SEQ ID NO:49)。在一些實施例中，1或2個Q標籤連接至抗體或抗原結合片段。在其他實施例中，Q標籤連接至抗體重鏈之C端。在其他實施例中，抗體包括包含L234A、L235A及/或G237A取代的人類IgG1 Fc區，胺基酸位置係根據EU索引編號。在其他實施例中，m為約20至約25之整數。在某些實施例中，m為24。在其他實施例中，結合物之DAR為1。在其他實施例中，結合物之DAR為2。在其他實施例中，結合物結合於表現於B細胞表面上之人類CD22。
在另一態樣中，本文提供一種包含抗體或其抗原結合片段(Ab)及一或多種免疫調節寡核苷酸(P)之結合物，其中該抗體或抗原結合片段連接至一或多個包含胺基酸序列RPQGF (SEQ ID NO: 47)之Q標籤肽(Q)，其中各免疫調節寡核苷酸經由與Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接至Q標籤肽，如式(A)中所示，
Figure 02_image139
， 其中：
Figure 02_image003
指示各Q與該抗體或其抗原結合片段(Ab)之連接點； 各Q包含Q標籤肽序列RPQGF (SEQ ID NO: 47)； 各L獨立地為一鍵或連接子部分
Figure 02_image142
， 其中m為約0至約50範圍內之整數，且其中
Figure 02_image144
指示與P之連接點，且
Figure 02_image146
指示與經由與該穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵連接至Q的該結合物之其餘部分的連接點； 且各P為具有以下結構之免疫調節寡核苷酸：
Figure 02_image148
， 其中
Figure 02_image150
及
Figure 02_image152
指示寡核苷酸內之連接點； 其中Ab包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中該VH域包含來自以下VH域序列之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3序列： QVQLLESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFAFSIYDMNWVRQAPGKGLEWVSAISSGGGTTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 65)； 其中該VL域包含來自以下VL域序列之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGNTLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:68)。
在本態樣之一些實施例中，VL域進一步包含胺基酸取代N92A。在其他實施例中，VL域進一步包含胺基酸取代N92L。在其他實施例中，VL域進一步包含胺基酸取代N92S。
在本態樣之其他實施例中，各Q標籤獨立地選自由以下組成之群：RPQGF (SEQ ID NO:47)、RPQGFPP (SEQ ID NO:48)及RPQGFGPP。在某些實施例中，各Q標籤係RPQGFGPP (SEQ ID NO:49)。在一些實施例中，1或2個Q標籤連接至抗體或抗原結合片段。在其他實施例中，Q標籤連接至抗體重鏈之C端。在其他實施例中，抗體包括包含L234A、L235A及/或G237A取代的人類IgG1 Fc區，胺基酸位置係根據EU索引編號。在其他實施例中，m為約20至約25之整數。在某些實施例中，m為24。在其他實施例中，結合物之DAR為1。在其他實施例中，結合物之DAR為2。在其他實施例中，結合物結合於表現於B細胞表面上之人類CD22。
在又另一個態樣中，本發明亦提供式(C)之免疫調節寡核苷酸：
Figure 02_image154
， 其中
Figure 02_image156
及
Figure 02_image158
指示該寡核苷酸內之連接點； 各T1 獨立地為O或S； 各T2 為S- ； T3 為基團
Figure 02_image160
，其中m為0至50之整數，且其中
Figure 02_image162
指示與該寡核苷酸之其餘部分的連接點； Z為O或S； U5 ' 為-H或鹵素； R5 ' 為-H或甲氧基； Rc1 為-H或甲氧基； Rg1 、Rg2 、Rg3 及Rg4 為H； R3 ' 為甲氧基； R1 為-(CH2 )3 -OH； R2 為-H或甲基；且 n為0至2之整數， 或一種其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，本發明亦提供式(C')之免疫調節寡核苷酸：
Figure 02_image164
其中
Figure 02_image166
及
Figure 02_image168
指示該寡核苷酸內之連接點； 各T1 獨立地為O或S； 各T2 為S- ； T3 為基團
Figure 02_image170
，其中m為0至50之整數，且其中
Figure 02_image162
指示與該寡核苷酸之其餘部分的連接點； Z為O或S； R5 ' 為-H或甲氧基； Rc1 為-H或甲氧基； Rg1 、Rg2 、Rg3 及Rg4 為H； R3 ' 為甲氧基； R1 為-(CH2 )3 -OH； R2 為-H或甲基；且 n為0至2之整數。
在本發明態樣之一些實施例中，Z為S。在其他實施例中，寡核苷酸包含至少一對成對T1 及T2 ，其中T1 為S且T2 為S- 。在某些實施例中，寡核苷酸包含至少兩對成對T1 及T2 ，其中T1 為S且T2 為S- 。
在一些實施例中，R5 '為H。在其他實施例中，R5 '為甲氧基。在一些實施例中，Rc1 為H。在其他實施例中，Rc1 為甲氧基。在其他實施例中，R2 為甲基。在其他實施例中，R2 為H。在可與前述實施例中之任一者組合的其他額外實施例中，T3 為
Figure 02_image173
。在其他實施例中，T3 為
Figure 02_image175
。在某些實施例中，m為20至25之整數。
在本發明態樣之其他實施例中，寡核苷酸係選自由 表 10 之寡核苷酸組成之群。
在又另一個態樣中，本文提供式(D)之免疫調節寡核苷酸：
Figure 02_image177
， 其中
Figure 02_image179
及
Figure 02_image181
指示該寡核苷酸內之連接點； 各T1 獨立地為O或S； 各T2 為S- ； T3 為基團
Figure 02_image183
，其中
Figure 02_image185
指示與L之連接點且其中
Figure 02_image187
指示與該寡核苷酸之其餘部分的連接點； L為基團
Figure 02_image189
，其中m為0至50之整數，且其中
Figure 02_image191
指示經由T3 與該寡核苷酸之其餘部分的連接點； Z為O或S； U5 ' 為-H或鹵素； R5 ' 為-H或甲氧基； Rc1 為-H或甲氧基； Rg1 、Rg2 、Rg3 及Rg4 為H； R3 ' 為甲氧基； R1 為-(CH2 )3 -OH； R2 為-H或甲基；且 n為0至2之整數。
在一些實施例中，本文提供式(D')之免疫調節寡核苷酸：
Figure 02_image193
其中
Figure 02_image195
及
Figure 02_image197
指示該寡核苷酸內之連接點； 各T1 獨立地為O或S； 各T2 為S- ； T3 為基團
Figure 02_image199
，其中
Figure 02_image201
指示與L之連接點且其中
Figure 02_image203
指示與該寡核苷酸之其餘部分的連接點； L為基團
Figure 02_image205
，其中m為0至50之整數，且其中
Figure 02_image201
指示經由T3 與該寡核苷酸之其餘部分的連接點； Z為O或S； R5 ' 為-H或甲氧基； Rc1 為-H或甲氧基； Rg1 、Rg2 、Rg3 及Rg4 為H； R3 ' 為甲氧基； R1 為-(CH2 )3 -OH； R2 為-H或甲基；且 n為0至2之整數。
在本發明態樣之一些實施例中，Z為S。在其他實施例中，寡核苷酸包含至少一對成對T1 及T2 ，其中T1 為S且T2 為S- 。在某些實施例中，寡核苷酸包含至少兩對成對T1 及T2 ，其中T1 為S且T2 為S- 。
在一些實施例中，R5 '為H。在其他實施例中，R5 '為甲氧基。在一些實施例中，Rc1 為H。在其他實施例中，Rc1 為甲氧基。在其他實施例中，R2 為甲基。在其他實施例中，R2 為H。在某些實施例中，m為20至25之整數。
在本發明態樣之其他實施例中，寡核苷酸係選自由 表 12 之寡核苷酸組成之群。
在又一態樣中，本發明提供一種選自由 表 10 及 表 12 之寡核苷酸組成之群的免疫調節寡核苷酸。
在又另一個態樣中，本發明提供一種結合物，其包含蛋白質、至少一個包含穀胺醯胺殘基之Q標籤肽序列及至少一種免疫調節寡核苷酸，其中該Q標籤肽序列為天然存在或合成的，且其中免疫調節寡核苷酸經由與穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵連接至Q標籤，其中Q標籤肽序列係選自由SEQ ID NO: 39-55組成之群。在本發明態樣之一些實施例中，免疫調節寡核苷酸具有選自由 表 10 及 表 12 之寡核苷酸組成之群的序列。在其他實施例中，抗體包含輕鏈可變域(VL)及重鏈可變域(VH)，且其中VH包含序列SEQ ID NO: 56；且VL包含序列SEQ ID NO: 57。
在又另一個態樣中，本發明提供一種結合物，其包含連接至兩個Q標籤肽(Q)之抗體及免疫調節寡核苷酸(P)；其中該抗體包含兩條抗體輕鏈、兩條抗體重鏈及兩個Q標籤肽；其中Q標籤肽中之每一者連接至抗體重鏈中之一者之C端；且其中Q標籤肽中之一者經由與Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接至免疫調節寡核苷酸，如式(A)中所示：
Figure 02_image208
， 其中
Figure 02_image003
指示各Q與該抗體之連接點。
在一些實施例中，各Q標籤肽包含胺基酸序列RPQGF (SEQ ID NO:47)。在一些實施例中，各L係如本文所描述之連接子。在一些實施例中，各(P)為如本文所述之免疫調節寡核苷酸。在一些實施例中，抗體係如本文所描述之抗體。在一些實施例中，抗體結合於CD22 (例如人類CD22)。
在又一態樣中，本文提供一種包含抗體(Ab)及免疫調節寡核苷酸(P)之結合物，其中該抗體包含兩條抗體輕鏈、兩條抗體重鏈及兩個Q標籤肽；其中Q標籤肽(Q)中之每一者包含胺基酸序列RPQGF (SEQ ID NO:47)；其中Q標籤肽中之每一者連接至抗體重鏈中之一者之C端；其中兩個Q標籤肽中之一者經由與Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接至免疫調節寡核苷酸，如式(A)中所示：
Figure 02_image211
， 其中
Figure 02_image213
指示各Q與該抗體(Ab)之連接點。
在又另一態樣中，本文中提供一種結合物，其包含抗CD22抗體(Ab)及免疫調節寡核苷酸(P)，其中該抗體包含兩條抗體輕鏈、兩條抗體重鏈及兩個Q標籤肽；其中該等Q標籤肽(Q)中之每一者包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列；其中該等Q標籤肽中之每一者連接至抗體重鏈中之一者之C端；其中兩個Q標籤肽中之一者經由與Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接至免疫調節寡核苷酸，其中兩條抗體重鏈包括包含SEQ ID NO: 65之序列的VH域及包含SEQ ID NO: 92之序列的恆定區，其中兩條抗體輕鏈包括包含SEQ ID NO: 87之序列的VL域及包含SEQ ID NO: 108之序列的恆定區，且其中免疫調節寡核苷酸包含SEQ ID NO: 35之序列。在又另一態樣中，本文中提供一種結合物，其包含抗CD22抗體(Ab)及免疫調節寡核苷酸(P)，其中該抗體包含兩條抗體輕鏈、兩條抗體重鏈及兩個Q標籤肽；其中該等Q標籤肽(Q)中之每一者包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列；其中該等Q標籤肽中之每一者連接至抗體重鏈中之一者之C端；其中兩個Q標籤肽中之一者經由與Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接至免疫調節寡核苷酸，其中兩條抗體重鏈包括包含SEQ ID NO: 65之序列的VH域及包含SEQ ID NO: 94之序列的恆定區，其中兩條抗體輕鏈包括包含SEQ ID NO: 87之序列的VL域及包含SEQ ID NO: 108之序列的恆定區，且其中免疫調節寡核苷酸包含SEQ ID NO: 35之序列。在又另一態樣中，本文中提供一種結合物，其包含抗CD22抗體(Ab)及免疫調節寡核苷酸(P)，其中該抗體包含兩條抗體輕鏈、兩條抗體重鏈及兩個Q標籤肽；其中該等Q標籤肽(Q)中之每一者包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列；其中該等Q標籤肽中之每一者連接至抗體重鏈中之一者之C端；其中兩個Q標籤肽中之一者經由與Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接至免疫調節寡核苷酸，其中兩條抗體重鏈包括包含SEQ ID NO: 65之序列的VH域及包含SEQ ID NO: 94之序列的恆定區，其中兩條抗體輕鏈包括包含SEQ ID NO: 73之序列的VL域及包含SEQ ID NO: 108之序列的恆定區，且其中免疫調節寡核苷酸包含SEQ ID NO: 34之序列。在又另一態樣中，本文中提供一種結合物，其包含抗CD22抗體(Ab)及免疫調節寡核苷酸(P)，其中該抗體包含兩條抗體輕鏈、兩條抗體重鏈及兩個Q標籤肽；其中該等Q標籤肽(Q)中之每一者包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列；其中該等Q標籤肽中之每一者連接至抗體重鏈中之一者之C端；其中兩個Q標籤肽中之一者經由與Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接至免疫調節寡核苷酸，其中兩條抗體重鏈包括包含SEQ ID NO: 65之序列的VH域及包含SEQ ID NO: 92之序列的恆定區，其中兩條抗體輕鏈包括包含SEQ ID NO: 73之序列的VL域及包含SEQ ID NO: 108之序列的恆定區，且其中免疫調節寡核苷酸包含SEQ ID NO: 34之序列。在又另一態樣中，本文中提供一種結合物，其包含抗CD22抗體(Ab)及免疫調節寡核苷酸(P)，其中該抗體包含兩條抗體輕鏈、兩條抗體重鏈及兩個Q標籤肽；其中該等Q標籤肽(Q)中之每一者包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列；其中該等Q標籤肽中之每一者連接至抗體重鏈中之一者之C端；其中兩個Q標籤肽中之一者經由與Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接至免疫調節寡核苷酸，其中兩條抗體重鏈包括包含SEQ ID NO: 65之序列的VH域及包含SEQ ID NO: 92之序列的恆定區，其中兩條抗體輕鏈包括包含SEQ ID NO: 73之序列的VL域及包含SEQ ID NO: 108之序列的恆定區，且其中免疫調節寡核苷酸包含SEQ ID NO: 163之序列。在又另一態樣中，本文中提供一種結合物，其包含抗CD22抗體(Ab)及免疫調節寡核苷酸(P)，其中該抗體包含兩條抗體輕鏈、兩條抗體重鏈及兩個Q標籤肽；其中該等Q標籤肽(Q)中之每一者包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列；其中該等Q標籤肽中之每一者連接至抗體重鏈中之一者之C端；其中兩個Q標籤肽中之一者經由與Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接至免疫調節寡核苷酸，其中兩條抗體重鏈包括包含SEQ ID NO: 65之序列的VH域及包含SEQ ID NO: 92之序列的恆定區，其中兩條抗體輕鏈包括包含SEQ ID NO: 87之序列的VL域及包含SEQ ID NO: 108之序列的恆定區，且其中免疫調節寡核苷酸包含SEQ ID NO: 163之序列。在一些實施例中，連接子包含連接子部分
Figure 02_image215
，其中m為整數24，且其中
Figure 02_image217
指示與P之連接點，且
Figure 02_image219
指示與經由與該穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵連接至Q的該結合物之其餘部分的連接點。
在又一態樣中，本發明提供一種結合物，其包含抗Her2抗體(Ab)及免疫調節寡核苷酸(P)，其中該抗體包含兩條抗體輕鏈、兩條抗體重鏈及兩個Q標籤肽；其中該等Q標籤肽(Q)中之每一者包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列；其中該等Q標籤肽中之每一者連接至抗體重鏈中之一者之C端；其中兩個Q標籤肽中之一者經由與Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接至免疫調節寡核苷酸，其中兩條抗體重鏈包括包含SEQ ID NO: 168之序列的VH域及包含SEQ ID NO: 92之序列的恆定區，其中兩條抗體輕鏈包括包含SEQ ID NO: 169之序列的VL域及包含SEQ ID NO: 108之序列的恆定區，且其中免疫調節寡核苷酸包含SEQ ID NO: 35之序列。在又一態樣中，本發明提供一種結合物，其包含抗Her2抗體(Ab)及免疫調節寡核苷酸(P)，其中該抗體包含兩條抗體輕鏈、兩條抗體重鏈及兩個Q標籤肽；其中該等Q標籤肽(Q)中之每一者包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列；其中該等Q標籤肽中之每一者連接至抗體重鏈中之一者之C端；其中兩個Q標籤肽中之一者經由與Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接至免疫調節寡核苷酸，其中兩條抗體重鏈包括包含SEQ ID NO: 168之序列之VH域及包含SEQ ID NO: 104之序列之恆定區，其中兩條抗體輕鏈包括包含SEQ ID NO: 169之序列的VL域及包含SEQ ID NO: 108之序列的恆定區，且其中免疫調節寡核苷酸包含SEQ ID NO: 35之序列。在又一態樣中，本發明提供一種結合物，其包含抗Her2抗體(Ab)及免疫調節寡核苷酸(P)，其中該抗體包含兩條抗體輕鏈、兩條抗體重鏈及兩個Q標籤肽；其中該等Q標籤肽(Q)中之每一者包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列；其中該等Q標籤肽中之每一者連接至抗體重鏈中之一者之C端；其中兩個Q標籤肽中之一者經由與Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接至免疫調節寡核苷酸，其中兩條抗體重鏈包括包含SEQ ID NO: 168之序列的VH域及包含SEQ ID NO: 92之序列的恆定區，其中兩條抗體輕鏈包括包含SEQ ID NO: 169之序列的VL域及包含SEQ ID NO: 108之序列的恆定區，且其中免疫調節寡核苷酸包含SEQ ID NO: 163之序列。在又一態樣中，本發明提供一種結合物，其包含抗Her2抗體(Ab)及免疫調節寡核苷酸(P)，其中該抗體包含兩條抗體輕鏈、兩條抗體重鏈及兩個Q標籤肽；其中該等Q標籤肽(Q)中之每一者包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列；其中該等Q標籤肽中之每一者連接至抗體重鏈中之一者之C端；其中兩個Q標籤肽中之一者經由與Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接至免疫調節寡核苷酸，其中兩條抗體重鏈包括包含SEQ ID NO: 170之序列的VH域及包含SEQ ID NO: 92之序列的恆定區，其中兩條抗體輕鏈包括包含SEQ ID NO: 171之序列的VL域及包含SEQ ID NO: 108之序列的恆定區，且其中免疫調節寡核苷酸包含SEQ ID NO: 35之序列。在又一態樣中，本發明提供一種結合物，其包含抗Her2抗體(Ab)及免疫調節寡核苷酸(P)，其中該抗體包含兩條抗體輕鏈、兩條抗體重鏈及兩個Q標籤肽；其中該等Q標籤肽(Q)中之每一者包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列；其中該等Q標籤肽中之每一者連接至抗體重鏈中之一者之C端；其中兩個Q標籤肽中之一者經由與Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接至免疫調節寡核苷酸，其中兩條抗體重鏈包括包含SEQ ID NO: 170之序列的VH域及包含SEQ ID NO: 104之序列的恆定區，其中兩條抗體輕鏈包括包含SEQ ID NO: 171之序列的VL域及包含SEQ ID NO: 108之序列的恆定區，且其中免疫調節寡核苷酸包含SEQ ID NO: 35之序列。在又一態樣中，本發明提供一種結合物，其包含抗Her2抗體(Ab)及免疫調節寡核苷酸(P)，其中該抗體包含兩條抗體輕鏈、兩條抗體重鏈及兩個Q標籤肽；其中該等Q標籤肽(Q)中之每一者包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列；其中該等Q標籤肽中之每一者連接至抗體重鏈中之一者之C端；其中兩個Q標籤肽中之一者經由與Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接至免疫調節寡核苷酸，其中兩條抗體重鏈包括包含SEQ ID NO: 170之序列之VH域及包含SEQ ID NO: 92之序列之恆定區，其中兩條抗體輕鏈包括包含SEQ ID NO: 171之序列的VL域及包含SEQ ID NO: 108之序列的恆定區，且其中免疫調節寡核苷酸包含SEQ ID NO: 163之序列。在一些實施例中，連接子包含連接子部分
Figure 02_image221
，其中m為整數24，且其中
Figure 02_image191
指示與P之連接點，且
Figure 02_image224
指示與經由與該穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵連接至Q的該結合物之其餘部分的連接點。
在又另一態樣中，本文中提供一種結合物，其包含抗CD22抗體(Ab)及免疫調節寡核苷酸(P)，其中該抗體包含兩條抗體輕鏈、兩條抗體重鏈及兩個Q標籤肽；其中該等抗體輕鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 182之胺基酸序列；其中該等抗體重鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 179之胺基酸序列；其中該免疫調節寡核苷酸包含SEQ ID NO: 35之序列；且其中該等兩個Q標籤肽中之至少一者經由與該Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接至該免疫調節寡核苷酸。在又一態樣中，本文提供一種包含抗體(Ab)及免疫調節寡核苷酸(P)之結合物，其中該抗體包含兩條抗體輕鏈、兩條抗體重鏈及兩個Q標籤肽；其中該等抗體輕鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 182之胺基酸序列；其中該等抗體重鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 180之胺基酸序列；其中該免疫調節寡核苷酸包含SEQ ID NO: 35之序列；且其中該等兩個Q標籤肽中之至少一者經由與該Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接至該免疫調節寡核苷酸。在又另一態樣中，本文中提供一種結合物，其包含抗CD22抗體(Ab)及免疫調節寡核苷酸(P)，其中該抗體包含兩條抗體輕鏈、兩條抗體重鏈及兩個Q標籤肽；其中該等抗體輕鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 181之胺基酸序列；其中該等抗體重鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 180之胺基酸序列；其中該免疫調節寡核苷酸包含SEQ ID NO: 34之序列；且其中該等兩個Q標籤肽中之至少一者經由與該Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接至該免疫調節寡核苷酸。在又另一態樣中，本文中提供一種結合物，其包含抗CD22抗體(Ab)及免疫調節寡核苷酸(P)，其中該抗體包含兩條抗體輕鏈、兩條抗體重鏈及兩個Q標籤肽；其中該等抗體輕鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 181之胺基酸序列；其中該等抗體重鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 179之胺基酸序列；其中該免疫調節寡核苷酸包含SEQ ID NO: 34之序列；且其中該等兩個Q標籤肽中之至少一者經由與該Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接至該免疫調節寡核苷酸。在又另一態樣中，本文中提供一種結合物，其包含抗CD22抗體(Ab)及免疫調節寡核苷酸(P)，其中該抗體包含兩條抗體輕鏈、兩條抗體重鏈及兩個Q標籤肽；其中該等抗體輕鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 181之胺基酸序列；其中該等抗體重鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 179之胺基酸序列；其中該免疫調節寡核苷酸包含SEQ ID NO: 163之序列；且其中該等兩個Q標籤肽中之至少一者經由與該Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接至該免疫調節寡核苷酸。在又另一態樣中，本文中提供一種結合物，其包含抗CD22抗體(Ab)及免疫調節寡核苷酸(P)，其中該抗體包含兩條抗體輕鏈、兩條抗體重鏈及兩個Q標籤肽；其中該等抗體輕鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 182之胺基酸序列；其中該等抗體重鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 179之胺基酸序列；其中該免疫調節寡核苷酸包含SEQ ID NO: 163之序列；且其中該等兩個Q標籤肽中之至少一者經由與該Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接至該免疫調節寡核苷酸。在一些實施例中，兩個Q標籤肽中之一者連接至免疫調節寡核苷酸。在一些實施例中，結合物包含兩個免疫調節寡核苷酸，其中兩個Q標籤肽中之每一者連接至兩種免疫調節寡核苷酸中之一者。在一些實施例中，結合物之DAR為1。在一些實施例中，結合物之DAR為2。在一些實施例中，連接子包含連接子部分
Figure 02_image226
，其中m為整數24，且其中
Figure 02_image228
指示與P之連接點，且
Figure 02_image230
指示與經由與該穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵連接至Q的該結合物之其餘部分的連接點。
在又一態樣中，本發明提供一種結合物，其包含抗Her2抗體(Ab)及免疫調節寡核苷酸(P)，其中該抗體包含兩條抗體輕鏈、兩條抗體重鏈及兩個Q標籤肽；其中該等抗體輕鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 185之胺基酸序列；其中該等抗體重鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 184之胺基酸序列；其中該免疫調節寡核苷酸包含SEQ ID NO: 35之序列；且其中該等兩個Q標籤肽中之至少一者經由與該Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接至該免疫調節寡核苷酸。在又一態樣中，本發明提供一種結合物，其包含抗Her2抗體(Ab)及免疫調節寡核苷酸(P)，其中該抗體包含兩條抗體輕鏈、兩條抗體重鏈及兩個Q標籤肽；其中該等抗體輕鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 185之胺基酸序列；其中該等抗體重鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 183之胺基酸序列；其中該免疫調節寡核苷酸包含SEQ ID NO: 35之序列；且其中該等兩個Q標籤肽中之至少一者經由與該Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接至該免疫調節寡核苷酸。在又一態樣中，本發明提供一種結合物，其包含抗Her2抗體(Ab)及免疫調節寡核苷酸(P)，其中該抗體包含兩條抗體輕鏈、兩條抗體重鏈及兩個Q標籤肽；其中該等抗體輕鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 185之胺基酸序列；其中該等抗體重鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 184之胺基酸序列；其中該免疫調節寡核苷酸包含SEQ ID NO: 163之序列；且其中該等兩個Q標籤肽中之至少一者經由與該Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接至該免疫調節寡核苷酸。在又一態樣中，本發明提供一種結合物，其包含抗Her2抗體(Ab)及免疫調節寡核苷酸(P)，其中該抗體包含兩條抗體輕鏈、兩條抗體重鏈及兩個Q標籤肽；其中該等抗體輕鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 188之胺基酸序列；其中該等抗體重鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 187之胺基酸序列；其中該免疫調節寡核苷酸包含SEQ ID NO: 35之序列；且其中該等兩個Q標籤肽中之至少一者經由與該Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接至該免疫調節寡核苷酸。在又一態樣中，本發明提供一種結合物，其包含抗Her2抗體(Ab)及免疫調節寡核苷酸(P)，其中該抗體包含兩條抗體輕鏈、兩條抗體重鏈及兩個Q標籤肽；其中該等抗體輕鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 188之胺基酸序列；其中該等抗體重鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 186之胺基酸序列；其中該免疫調節寡核苷酸包含SEQ ID NO: 35之序列；且其中該等兩個Q標籤肽中之至少一者經由與該Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接至該免疫調節寡核苷酸。在又一態樣中，本發明提供一種結合物，其包含抗Her2抗體(Ab)及免疫調節寡核苷酸(P)，其中該抗體包含兩條抗體輕鏈、兩條抗體重鏈及兩個Q標籤肽；其中該等抗體輕鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 188之胺基酸序列；其中該等抗體重鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 187之胺基酸序列；其中該免疫調節寡核苷酸包含SEQ ID NO: 163之序列；且其中該等兩個Q標籤肽中之至少一者經由與該Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接至該免疫調節寡核苷酸。在一些實施例中，兩個Q標籤肽中之一者連接至免疫調節寡核苷酸。在一些實施例中，結合物包含兩個免疫調節寡核苷酸，其中兩個Q標籤肽中之每一者連接至兩種免疫調節寡核苷酸中之一者。在一些實施例中，結合物之DAR為1。在一些實施例中，結合物之DAR為2。在一些實施例中，連接子包含連接子部分
Figure 02_image232
，其中m為整數24，且其中
Figure 02_image234
指示與P之連接點，且
Figure 02_image236
指示與經由與該穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵連接至Q的該結合物之其餘部分的連接點。
在又另一個態樣中，本文提供一種包含抗體(Ab)及一或多種免疫調節寡核苷酸(P)之結合物，其中該抗體連接至一或多個包含至少一個穀胺醯胺殘基之Q標籤肽(Q)，其中各免疫調節寡核苷酸經由與Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接至Q標籤肽，如式(A)中所示，
Figure 02_image238
， 其中： 其中
Figure 02_image240
指示Q與該抗體(Ab)之連接點； 該抗體包含兩條抗體輕鏈、兩條抗體重鏈及兩條Q標籤肽； 該等Q標籤肽中之每一者連接至該等抗體重鏈中之一者的C端； 兩個Q標籤肽中之一者經由與Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵連接至免疫調節寡核苷酸； 各Q獨立地為具有至少一個穀胺醯胺殘基之Q標籤肽序列； 各L獨立地為經由與該穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵連接於Q的一鍵或連接子部分；及 各P獨立地為具有以下結構之免疫調節寡核苷酸：
Figure 02_image242
， 其中
Figure 02_image244
及
Figure 02_image246
指示該寡核苷酸內之連接點； 各T1 獨立地為O或S； 各T2 為S- ； T3 為基團
Figure 02_image248
，其中
Figure 02_image250
指示與L之連接點且其中
Figure 02_image252
指示與該寡核苷酸之其餘部分的連接點； Z為O或S； U5 ' 為-H或鹵素； R5 ' 為-H或甲氧基； Rc1 為-H或甲氧基； Rg1 、Rg2 、Rg3 及Rg4 為H； R3 ' 為甲氧基； R1 為-(CH2 )3 -OH； R2 為-H或甲基；且 n為0至2之整數。
在又另一個態樣中，本文提供一種包含抗體(Ab)及一或多種免疫調節寡核苷酸(P)之結合物，其中該抗體連接至一或多個包含至少一個穀胺醯胺殘基之Q標籤肽(Q)，其中各免疫調節寡核苷酸經由與Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接至Q標籤肽，如式(A)中所示，
Figure 02_image254
， 其中： 其中
Figure 02_image003
指示Q與該抗體(Ab)之連接點； 該抗體包含兩條抗體輕鏈、兩條抗體重鏈及兩條Q標籤肽； 該等Q標籤肽中之每一者連接至該等抗體重鏈中之一者的C端； 兩個Q標籤肽中之一者經由與Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵連接至免疫調節寡核苷酸； 各Q獨立地為具有至少一個穀胺醯胺殘基之Q標籤肽序列； 各L獨立地為經由與該穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵連接於Q的一鍵或連接子部分；及 各P獨立地為具有以下結構之免疫調節寡核苷酸：
Figure 02_image256
， 其中
Figure 02_image258
及
Figure 02_image260
指示該寡核苷酸內之連接點； 各T1 獨立地為O或S； 各T2 為S- ； T3 為基團
Figure 02_image262
，其中
Figure 02_image264
指示與L之連接點且其中
Figure 02_image266
指示與該寡核苷酸之其餘部分的連接點； Z為O或S； R5 ' 為-H或甲氧基； Rc1 為-H或甲氧基； Rg1 、Rg2 、Rg3 及Rg4 為H； R3 ' 為甲氧基； R1 為-(CH2 )3 -OH； R2 為-H或甲基；且 n為0至2之整數。
在又另一態樣中，本文提供一種包含抗體或其抗原結合片段(Ab)及一或多種免疫調節寡核苷酸(P)之結合物，其中該抗體或抗原結合片段連接至一或多個包含Q標籤肽序列RPQGF (SEQ ID NO: 47)之Q標籤肽(Q)，且其中各免疫調節寡核苷酸經由與Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接至Q標籤肽，如式(A)中所示：
Figure 02_image268
， 其中：
Figure 02_image270
指示各Q與抗體或其抗原結合片段(Ab)之連接點 各Q獨立地包含Q標籤肽序列RPQGF (SEQ ID NO:47)； 各L獨立地為一鍵或連接子部分
Figure 02_image272
， 其中m為約0至約50範圍內之整數，且其中
Figure 02_image274
指示與P之連接點，且
Figure 02_image276
指示與經由與該穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵連接於Q的該結合物之其餘部分的連接點；及 各P獨立地為具有以下結構之免疫調節寡核苷酸：
Figure 02_image278
， 其中
Figure 02_image280
及
Figure 02_image282
指示寡核苷酸內之連接點； 各T1 獨立地為O或S； 各T2 為S- ； 其限制條件為各P包含至少一對成對T1 及T2 ，其中T1 為S且T2為S， T3 為基團
Figure 02_image284
，其中
Figure 02_image286
指示與L之連接點且其中
Figure 02_image288
指示與該寡核苷酸之其餘部分的連接點； Z為O或S； U5 ' 為-H或鹵素； R5 ' 為-H； Rc1 為-H； Rg1 、Rg2 、Rg3 及Rg4 為H； R3 ' 為甲氧基； R1 為-(CH2 )3 -OH； R2 為-甲基；且 n為1， 其中Ab為結合腫瘤相關抗原之抗體或其抗原結合片段。
在一些實施例中，抗體或結合物特異性結合由癌症或癌症相關基質表現之抗原。
在另一態樣中，本文亦提供一種醫藥組合物，其包含如本文所述之結合物。在再一態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含如本文所述之免疫調節寡核苷酸。在又另一態樣中，本文提供一種套組，其包含如本文中所描述之結合物及結合物之使用說明書。
在其他態樣中，本文提供製備如本文所述之結合物的方法。在一個態樣中，本文提供一種製備結合物之方法，該結合物包含抗體或其抗原結合片段(Ab)及一或多種免疫調節寡核苷酸(P)，其中該抗體或抗原結合片段連接至一或多個包含胺基酸序列RPQGF (SEQ ID NO: 47)之Q標籤肽(Q)，其中各免疫調節寡核苷酸經由與Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接至Q標籤肽，如式(A)中所示：
Figure 02_image290
， 其中：
Figure 02_image292
指示各Q與該抗體或其抗原結合片段(Ab)之連接點； 各Q獨立地包含Q標籤肽序列RPQGF (SEQ ID NO:47)； 各L獨立地為經由與該穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵連接於Q的一鍵或連接子部分；及 各P獨立地為免疫調節寡核苷酸； 該製備方法包含在轉穀胺醯胺酶存在下，使下式(B)之化合物與一或多種免疫調節寡核苷酸P接觸：
Figure 02_image294
， 其中Ab及Q如上文針對式(A)所定義，且e為1至20之整數， 其中各P獨立地具有下式：
Figure 02_image296
， 其中 X5 ' 為5'端核苷； X3 ' 為3'端核苷； YPTE 為核苷間磷酸三酯； Y3 ' 為末端磷酸三酯； 各XN 獨立地為核苷； 各YN 獨立地為核苷間連接子； b及c各自獨立地為1至25之整數；其限制條件為b及c之總和為至少5；及 L為具有末端胺之連接子部分。
在另一態樣中，本文提供一種製備結合物之方法，該結合物包含抗體或其抗原結合片段(Ab)及一或多種免疫調節寡核苷酸(P)，其中該抗體或抗原結合片段連接至一或多個包含至少一個穀胺醯胺殘基之Q標籤肽(Q)，其中各免疫調節寡核苷酸經由與Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接至Q標籤肽，如式(A)中所示，
Figure 02_image298
， 其中：
Figure 02_image300
指示各Q與該抗體或其抗原結合片段(Ab)之連接點； 各Q獨立地為具有至少一個穀胺醯胺殘基之Q標籤肽； 各L獨立地為經由與該穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵連接於Q的一鍵或連接子部分；及 各P獨立地為免疫調節寡核苷酸； 該製備方法包含在轉穀胺醯胺酶存在下，使下式(B)之化合物與一或多種免疫調節寡核苷酸P接觸：
Figure 02_image302
， 其中Ab及Q如上文針對式(A)所定義，且e為1至20之整數， 其中各免疫調節寡核苷酸P獨立地為如本文所述之式(C)寡核苷酸或如本文所述之式(D)寡核苷酸。在製備結合物之方法之本發明態樣的一些實施例中，各免疫調節寡核苷酸獨立地為式(C)或式(D)之寡核苷酸，其係選自由 表 10 及 表 12 之寡核苷酸組成之群。
在另其他態樣中，本文提供一種結合於CD22之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或片段包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中該VH域包含選自由SEQ ID NO: 64-67組成之群的VH域序列；且其中該VL域包含選自由SEQ ID NO: 68-91組成之群的VL域序列。在另其他態樣中，本文提供一種結合於CD22之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或片段包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中該VH域包含來自表8中所示之VH域的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且其中該VL域包含來自表8中所示之VL域的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。在一些實施例中，抗體為Fab、F(ab')2、Fab'-SH、Fv、scFv、單域、單重鏈或單輕鏈抗體或抗體片段。在一些實施例中，該抗體包含Fc區。在一些實施例中，Fc區為選自由以下組成之群的人類Fc區：IgG1 Fc區、IgG2 Fc區及IgG4 Fc區。在一些實施例中，Fc區為野生型人類IgG1、IgG2或IgG4 Fc區。在一些實施例中，Fc區為包含一或多個減少與C1q的結合之胺基酸取代的人類Fc區。在一些實施例中，Fc區為包含一或多個胺基酸取代之人類Fc區，該人類Fc區與缺乏胺基酸取代之人類Fc區相比減小效應功能。在一些實施例中，Fc區為：(a)包含L234A、L235A及/或G237A取代之人類IgG1 Fc區，胺基酸位置係根據EU索引編號；(b)包含A330S及/或P331S取代之人類IgG2 Fc區，胺基酸位置係根據EU索引編號；或(c)包含S228P及/或L235E取代之人類IgG4 Fc區，胺基酸位置係根據EU索引編號。在一些實施例中，Fc區進一步包含N297A取代，胺基酸位置係根據EU索引編號。在一些實施例中，抗體進一步包含選自由SEQ ID NO: 92-110組成之群的胺基酸序列。
在另其他態樣中，本文中提供一種結合於人類CD22之抗體，其中該抗體包含抗體重鏈及抗體輕鏈，其中該抗體重鏈包含SEQ ID NO: 179或180之序列，且該抗體輕鏈包含SEQ ID NO: 181或182之序列。在一些實施例中，抗體重鏈包含SEQ ID NO: 179之序列，且抗體輕鏈包含SEQ ID NO: 181之序列。在一些實施例中，抗體重鏈包含SEQ ID NO: 179之序列，且抗體輕鏈包含SEQ ID NO: 182之序列。在一些實施例中，抗體重鏈包含SEQ ID NO: 180之序列，且抗體輕鏈包含SEQ ID NO: 181之序列。在一些實施例中，抗體重鏈包含SEQ ID NO: 180之序列，且抗體輕鏈包含SEQ ID NO: 182之序列。
在另其他態樣中，本文提供一種結合於人類Her2之抗體，其中該抗體包含抗體重鏈及抗體輕鏈，其中該抗體重鏈包含序列SEQ ID NO: 183、184、186或187，且該抗體輕鏈包含序列SEQ ID NO: 185或188。在一些實施例中，抗體重鏈包含SEQ ID NO: 183之序列，且抗體輕鏈包含SEQ ID NO: 185之序列。在一些實施例中，抗體重鏈包含SEQ ID NO: 184之序列，且抗體輕鏈包含SEQ ID NO: 185之序列。在一些實施例中，抗體重鏈包含SEQ ID NO: 186之序列，且抗體輕鏈包含SEQ ID NO: 185之序列。在一些實施例中，抗體重鏈包含SEQ ID NO: 187之序列，且抗體輕鏈包含SEQ ID NO: 185之序列。在一些實施例中，抗體重鏈包含SEQ ID NO: 183之序列，且抗體輕鏈包含SEQ ID NO: 188之序列。在一些實施例中，抗體重鏈包含SEQ ID NO: 184之序列，且抗體輕鏈包含SEQ ID NO: 188之序列。在一些實施例中，抗體重鏈包含SEQ ID NO: 186之序列，且抗體輕鏈包含SEQ ID NO: 188之序列。在一些實施例中，抗體重鏈包含SEQ ID NO: 187之序列，且抗體輕鏈包含SEQ ID NO: 188之序列。
在其他態樣中，本文提供一種醫藥組合物，其包含根據本文實施例中之任一者之結合物或抗體及醫藥學上可接受之載劑。在另一態樣中，本文提供一種醫藥組合物，其包含根據本文實施例中之任一者之免疫調節寡核苷酸及醫藥學上可接受之載劑。在另其他態樣中，本文提供用於治療疾病或病症之方法。在一個態樣中，本文提供一種治療癌症之方法，其包含向個體投與有效量之根據本文實施例中之任一者之結合物、免疫調節寡核苷酸、抗體或醫藥組合物。在一個態樣中，本文提供一種用於治療癌症之方法，其包含向個體投與有效量之：(a)免疫檢查點抑制劑及(b)根據本文實施例中之任一者之結合物或根據本文實施例中之任一者之醫藥組合物；其中當在結合物不存在下投與時癌症為難治性的或對免疫檢查點抑制劑具有抗性；且其中抗體或其抗原結合片段結合於人類CD22。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑為PD-1抑制劑或PD-L1抑制劑。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑為抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體。在一些實施例中，投與使得癌症之生長減緩、其尺寸及/或體積減小。在一個態樣中，本文提供一種用於治療癌症之方法，其包含向個體投與有效量的根據本文實施例中之任一者之結合物或根據本文實施例中之任一者之醫藥組合物；其中投與引起個體之B細胞活化。在一個態樣中，本文提供一種用於治療癌症之方法，其包含向個體投與有效量的根據本文實施例中之任一者之結合物或根據本文實施例中之任一者之醫藥組合物；其中該癌症係選自由以下組成之群：頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)、非小細胞肺癌(NSCLC)、腎細胞癌(RCC)、胃癌、肝細胞癌(HCC)、食道癌、子宮頸癌、子宮頸鱗狀細胞癌、梅克爾細胞癌、子宮內膜癌、卵巢癌、胰臟癌、黑素瘤、皮膚黑素瘤、肉瘤、大腸直腸癌、乳癌、小細胞肺癌(SCLC)、皮膚鱗狀細胞癌及尿道上皮癌。在一個態樣中，本文提供一種治療癌症之方法，其包含向個體投與有效量的根據本文實施例中之任一者之結合物或根據本文實施例中之任一者之醫藥組合物；其中該癌症係選自由以下組成之群：急性淋巴母細胞白血病(ALL)、毛細胞白血病及彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)。在一個態樣中，本文提供一種用於治療癌症之方法，其包含向個體投與有效量的根據本文實施例中之任一者之結合物或根據本文實施例中之任一者之醫藥組合物；其中該癌症係選自由以下組成之群：乳癌、尿道上皮癌及胃癌。在一些實施例中，投與使得癌症之生長減緩、其尺寸及/或體積減小。在另一態樣中，本文提供根據本文實施例中之任一者之用於治療癌症之方法中的結合物、免疫調節寡核苷酸、抗體或醫藥組合物，其中該方法包含向個體投與有效量之結合物、免疫調節寡核苷酸、抗體或醫藥組合物。在一些實施例中，癌症為實體腫瘤。在一些實施例中，癌症為液體腫瘤。在一些實施例中，癌症為B細胞癌。在一些實施例中，癌症係淋巴瘤或白血病。在一些實施例中，癌症為乳癌、大腸直腸癌、肺癌、頭頸癌、黑素瘤、淋巴瘤或白血病。在另一態樣中，本文提供一種用於遞送根據本文實施例中之任一者之免疫調節寡核苷酸的方法，其包含使免疫調節寡核苷酸與細胞接觸。在一些實施例中，免疫調節寡核苷酸經聚乙二醇化。在一些實施例中，將免疫調節寡核苷酸調配於奈米顆粒中。在一些實施例中，免疫調節寡核苷酸與多肽結合。在一些實施例中，抗體或結合物特異性結合由癌症或癌症相關基質表現之抗原。
相關申請案之交叉引用
本申請案主張於2020年2月28日申請之美國臨時專利申請案第62/983,463號及於2020年11月6日申請之美國臨時專利申請案第63/110,854號之優先權及權利，該等美國臨時專利申請案中之每一者之揭示內容以全文引用之方式併入本文中。 以ASCII正文檔案形式提交序列表
以ASCII正文檔案提交之以下內容以全文引用的方式併入本文中：電腦可讀形式(CRF)之序列表(檔案名稱：186492000240SEQLIST.TXT，記錄日期：2021年2月24日，大小：170 KB)。
以下描述闡述例示性方法、參數及其類似者。然而，應認識到此類描述並不意欲限制本發明之範疇，而是經提供作為例示性實施例之描述。
本發明描述係基於以下發現：某些多肽-寡核苷酸結合物提供增強的穩定性及遞送選擇性。該描述亦提供用於製備此等結合物之方法。特定言之，結合可藉由轉穀胺醯胺酶(Tgase)介導之反應進行。該描述亦提供可用於製備此等結合物之中間化合物以及含有此等多肽-寡核苷酸結合物之組合物及套組。I. 定義
除非另有定義，否則本文中所使用之所有技術及科學術語具有與一般熟習本發明所屬技術者通常所理解相同之含義。本文所提及之所有專利、申請案、發表之申請案及其他公開案均以全文引用之方式併入本文中。若此部分中所闡述之定義與以引用之方式併入本文中之專利、申請案或其他公開案中所闡述之定義相反或以其他方式與其不符，則相對於以引用之方式併入本文中之定義，以此部分中所闡述之定義為主。
應理解，出於清晰性在單獨實施例之上下文中所描述的本發明之某些特徵亦可在單一實施例中組合提供。反之，為簡潔起見而在單一實施例之上下文中描述的本發明之各種特徵亦可分開地或以任何適合之子組合提供。特定言之，關於特定方法步驟、試劑或條件的實施例之所有組合由本發明包涵且在本文中揭示，就如同單獨且明確地揭示每一種組合一般。
除非上下文另外明確指示，否則如本文中及所附申請專利範圍中所使用，單數形式「一(a)」、「一個(an)」及「所述」包括複數個指示物。進一步應注意，申請專利範圍可經起草以排除任何視情況存在之要素。因此，此陳述意欲與對所主張要素之敍述結合充當使用諸如「僅僅(solely)」、「僅(only)」及其類似術語之排他性術語或使用「否定性」限制之前提基礎。
在整個本申請案中，除非上下文另外指示，否則提及式(A)-(D)化合物包括離子形式、多晶型物、假多晶型物、非晶形式、溶劑合物、共結晶體、螯合物、異構體、互變異構體、氧化物(例如，N-氧化物、S-氧化物)、酯、前藥、同位素及/或其經保護形式。在一些實施例中，提及式(A)-(D)化合物包括其多晶型物、溶劑合物、共結晶體、異構體、互變異構體及/或氧化物。在一些實施例中，提及式(A)-(D)化合物包括其多晶型物、溶劑合物及/或共結晶體。在一些實施例中，提及式(A)-(D)化合物包括其異構體、互變異構體及/或氧化物。在一些實施例中，提及式(A)-(D)化合物包括其溶劑合物。
「烷基 」涵蓋具有所指示數目個碳原子，例如1至20個碳原子、或1至8個碳原子、或1至6個碳原子之直鏈及分支鏈碳鏈。舉例而言，C1 - 6 烷基涵蓋1至6個碳原子之直鏈與分支鏈烷基。當命名具有特定碳數目之烷基殘基時，意欲涵蓋具有該碳數目之所有分支鏈及直鏈形式；因此，例如，「丙基」包括正丙基及異丙基；且「丁基」包括正丁基、二級丁基、異丁基及三級丁基。烷基的實例包括但不限於甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、二級丁基、三級丁基、戊基、2-戊基、3-戊基、異戊基、新戊基、己基、2-己基、3-己基及3-甲基戊基。
當給出值範圍(例如C1 - 6 烷基)時，包括在該範圍內之各值以及所有中間範圍。舉例而言，「C1 - 6 烷基」包括C1 、C2 、C3 、C4 、C5 、C6 、C1 - 6 、C2 - 6 、C3 - 6 、C4 - 6 、C5 - 6 、C1 - 5 、C2 - 5 、C3 - 5 、C4 - 5 、C1 - 4 、C2 - 4 、C3 - 4 、C1 - 3 、C2 - 3 及C1 - 2 烷基。
「烯基 」係指具有所指示數目個碳原子(例如，2至8個或2至6個碳原子)及至少一個碳-碳雙鍵之不飽和分支鏈或直鏈烷基。基團可呈圍繞雙鍵之順式或反式組態(Z或E組態)。烯基包括但不限於乙烯基、丙烯基(例如丙-1-烯-1-基、丙-1-烯-2-基、丙-2-烯-1-基(烯丙基)、丙-2-烯-2-基)及丁烯基(例如丁-1-烯-1-基、丁-1-烯-2-基、2-甲基-丙-1-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-2-基、丁-1,3-二烯-1-基、丁-1,3-二烯-2-基)。
「炔基 」係指具有指定數目個碳原子(例如2至8或2至6個碳原子)及至少一個碳-碳參鍵之不飽和分支鏈或直鏈烷基。炔基包括但不限於乙炔基、丙炔基(例如，丙-1-炔-1-基、丙-2-炔-1-基)及丁炔基(例如，丁-1-炔-1-基、丁-1-炔-3-基、丁-3-炔-1-基)。
如本文所使用，術語「胺基 」表示-N(RN1 )2 ，其中若胺基未經取代，則RN1 均為H；或若胺基經取代，則各RN1 獨立地為H、-OH、-NO2 、-N(RN2 )2 、-SO2 ORN2 、-SO2 RN2 、-SORN2 、-COORN2 、N-保護基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基、芳基烷基、芳氧基、環烷基、環烯基、雜烷基或雜環基，其限制條件為至少一個RN1 不為H，且其中各RN2 獨立地為H、烷基或芳基。取代基中之每一者本身可未經取代或經本文中所定義用於各相應基團的未經取代之取代基取代。在一些實施例中，胺基為未經取代之胺基(亦即-NH2 )或經取代之胺基(例如，-NHRN1 )，其中RN1 獨立地為-OH、-SO2 ORN2 、-SO2 RN2 、-SORN2 、-COORN2 、視情況經取代之烷基或視情況經取代之芳基，且各RN2 可為視情況經取代之烷基或視情況經取代之芳基。在一些實施例中，經取代之胺基可為烷胺基，其中烷基如本文對於烷基所描述視情況經取代。在某些實施例中，胺基為-NHRN1 ，其中RN1 為視情況經取代之烷基。-NHRN1 之非限制性實例，其中RN1 為視情況經取代之烷基，包括視情況經取代之烷胺基、蛋白型胺基酸、非蛋白型胺基酸、蛋白型胺基酸之C1 - 6 烷基酯及非蛋白型胺基酸之C1 - 6 烷基酯。所用胺基酸視情況呈L型。
如本文所用，術語「免疫調節聚核苷酸 」表示含有總共6至50個連續核苷的聚核苷酸構築體，該等連續核苷由獨立地選自由核苷間磷酸酯及視情況存在之核苷間無鹼基間隔基組成之群的核苷間橋接基團共價結合在一起。免疫調節聚核苷酸在5'端及3'端處分別用5'封端及3'封端基團封端。免疫調節聚核苷酸可調節先天性免疫反應，如藉由以下所測定，例如在免疫調節聚核苷酸被遞送到的免疫細胞(例如抗原呈遞細胞) (相比於免疫調節聚核苷酸不被遞送到的另一免疫細胞(例如抗原呈遞細胞))中，或在與免疫調節聚核苷酸被遞送到的免疫細胞(例如抗原呈遞細胞)相互作用(包括直接細胞間相互作用，以及例如由免疫調節聚核苷酸被遞送到的細胞分泌之一或多種細胞介素直接刺激)之免疫細胞中細胞內信號傳導路徑(包括但不限於NFκB)之活化的變化、活化標記物表現之變化或至少一種發炎性細胞介素或至少一種I型干擾素之分泌的變化。免疫調節聚核苷酸可含有結合基團，或若免疫調節聚核苷酸為結合物之一部分，則含有鍵結至靶向部分且視情況鍵結至一或多個(例如，1至6個)輔助部分(例如，聚乙二醇)之連接子。結合基團或連接子可為磷酸三酯或末端封端基團之一部分。
如本文所使用，術語「免疫刺激聚核苷酸 」表示能夠活化免疫反應之免疫調節聚核苷酸，如藉由以下所測定，在免疫刺激聚核苷酸被遞送到的免疫細胞(例如抗原呈遞細胞) (例如相比於免疫刺激聚核苷酸不被遞送到的另一免疫細胞(例如抗原呈遞細胞))中，或在與免疫調節聚核苷酸被遞送到的免疫細胞(例如抗原呈遞細胞)相互作用(包括直接細胞間相互作用，以及例如由免疫調節聚核苷酸被遞送到的細胞分泌之一或多種細胞介素直接刺激)之免疫細胞中細胞內信號傳導路徑(諸如NFκB)之活化的增加、或活化或功能之細胞表面標記物之含量的增加、或至少一種發炎性細胞介素或至少一種I型干擾素之分泌的增加。在一些實施例中，免疫刺激聚核苷酸含有至少一個胞苷-p-鳥苷(CpG)序列，其中p為核苷間磷酸二酯(例如磷酸酯或硫代磷酸酯)或核苷間磷酸三酯或三硫代磷酸酯。如本文所用，含CpG免疫刺激聚核苷酸可天然存在，諸如細菌或病毒來源之CpG ODN，或為合成的。舉例而言，在一些實施例中，免疫刺激聚核苷酸中之CpG序列含有2'-去氧核糖。在一些實施例中，免疫刺激聚核苷酸中之CpG序列未甲基化。在一些實施例中，免疫刺激聚核苷酸為如本文所提供之式(C)的聚核苷酸。在一些實施例中，免疫刺激聚核苷酸為如本文所提供的式(D)化合物。
如本文所使用，術語「免疫抑制聚核苷酸 」表示能夠拮抗免疫反應之免疫調節聚核苷酸，如藉由以下所測定，在免疫刺激聚核苷酸被遞送到的免疫細胞(例如抗原呈遞細胞) (例如相比於免疫刺激聚核苷酸不被遞送到的另一免疫細胞(例如抗原呈遞細胞))中，或在與免疫調節聚核苷酸被遞送到的免疫細胞(例如抗原呈遞細胞)相互作用(包括直接細胞間相互作用，以及例如由免疫調節聚核苷酸被遞送到的細胞分泌之一或多種細胞介素直接刺激)之免疫細胞中NFκB之活化減少或缺乏活化、或缺乏功能活化之細胞表面標記物之含量的增加、或缺乏至少一種發炎性細胞介素或至少一種I型干擾素之分泌的增加。
應理解，術語「聚核苷酸」及「寡核苷酸」可在本文中互換使用。應進一步理解，術語「免疫調節聚核苷酸」、「免疫刺激聚核苷酸」、「免疫抑制聚核苷酸」及「結合物」分別涵蓋免疫調節聚核苷酸、免疫刺激聚核苷酸、免疫抑制聚核苷酸及結合物之鹽。舉例而言，術語「免疫調節聚核苷酸」、「免疫刺激聚核苷酸」、「免疫抑制聚核苷酸」、及「結合物」涵蓋質子化中性形式(P-XH部分，其中X為O或S)之磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯及去質子化離子形式(P-X部分，其中X為O或S)之磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯兩者。因此，應理解，描述為具有RE1 、RE2 及RE3 中之一或多者作為氫的磷酸酯及磷酸二酯涵蓋鹽，其中磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯以去質子化離子形式存在。另外，本文中可互換地使用涉及免疫調節聚核苷酸、免疫刺激聚核苷酸、免疫抑制聚核苷酸及/或寡核苷酸(例如CpG寡核苷酸)之術語「游離」、「裸」及「未結合」。
如本文所用，術語「磷酸三酯 」係指磷酸酯，其中所有三個價數經非氫取代基取代。磷酸三酯由以下組成：磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯；一或兩個鍵結至核苷或無鹼基間隔基及/或磷醯基之鍵；及一或兩個獨立地選自由以下組成之群的基團：生物可逆基團；非生物可逆基團；輔助部分；結合基團；及鍵結至靶向部分且視情況鍵結至一或多個(例如1至6個)輔助部分的連接子。末端磷酸三酯包括一個與含有核苷之基團連接的鍵及兩個獨立地選自由以下組成之群的基團：生物可逆基團；非生物可逆基團；輔助部分；結合基團；磷醯基；及鍵結至靶向部分且視情況鍵結至一或多個(例如，1至6個)輔助部分之連接子。在一些實施例中，末端磷酸三酯含有鍵結至靶向部分且視情況鍵結至一或多個(例如1至6個)輔助部分之1或0個連接子。核苷間磷酸三酯包括兩個鍵結至含核苷之基團的鍵。磷酸三酯可為以下結構之基團：
Figure 02_image304
其中： XE1 及XE2 中之每一者獨立地為O或S； 各RE1 及RE3 獨立地為鍵結至核苷之鍵；無鹼基間隔基之糖類似物；生物可逆基團；非生物可逆基團；輔助部分；結合基團；鍵結至靶向部分之連接子；鍵結至靶向部分及一或多個(例如1至6個)輔助部分之連接子；或式-P(=XE1 )(-XE2 -RE2 A)-O-之基團中之磷原子， 其中RE2 A為氫；生物可逆基團；非生物可逆基團；輔助部分；結合基團；鍵結至靶向部分之連接子；或鍵結至靶向部分及一或多個(例如1至6個)輔助部分之連接子；及 RE2 為生物可逆基團；非生物可逆基團；輔助部分；結合基團；鍵結至靶向部分之連接子；或鍵結至靶向部分及一或多個(例如1至6個)輔助部分之連接子； 其限制條件為RE1 及RE3 中之至少一者為鍵結至含有至少一個核苷之基團的鍵。 若RE1 及RE3 兩者為鍵結至含有至少一個核苷之基團的鍵，則磷酸三酯為核苷間磷酸三酯。若RE1 及RE3 中有且僅有一個為鍵結至含有核苷之基團之鍵，則磷酸三酯為末端磷酸三酯。
如本文中所用，術語「胺基酸 」係指任何胺基酸(標準胺基酸與非標準胺基酸)，包括但不限於α-胺基酸、β-胺基酸、γ-胺基酸及δ-胺基酸。適合的胺基酸之實例包括但不限於丙胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、穀胺醯胺、甘胺酸、脯胺酸、絲胺酸、酪胺酸、精胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、色胺酸及纈胺酸。適合胺基酸之額外實例包括但不限於鳥胺酸、羥腐胺離胺酸、2-胺基異丁酸、去氫丙胺酸、γ-胺基丁酸、瓜胺酸、β-丙胺酸、α-乙基-甘胺酸、α-丙基-甘胺酸及正白胺酸。
術語「抗體 」、「免疫球蛋白 」及「Ig 」在本文中可互換使用，且在最廣泛意義上使用且特定涵蓋例如個別單株抗體(包括促效劑、拮抗劑、中和抗體、全長或完整單株抗體)、具有多抗原決定基或單抗原決定基特異性之抗體組合物、多株或單價抗體、多價抗體、由至少兩種完整抗體形成之多特異性抗體(例如雙特異性抗體，只要其呈現所需生物活性即可)、單鏈抗體及抗體片段。抗體可為人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體及/或親和力成熟抗體，以及來自其他物種(例如小鼠及兔)的抗體。
術語「抗體 」意欲包括能夠結合於特異性抗原且由兩相同多肽鏈對構成的多肽之免疫球蛋白類別內之B細胞的多肽產物，其中各對具有一條重鏈(約50-70 kDa)及一條輕鏈(約25 kDa)且各鏈之各胺基端部分包括約100至約130個或更多個胺基酸之可變區且各鏈之各羧基端部分包括一個恆定區。參見Borrebaeck (編) (1995) Antibody Engineering, 第二版, Oxford University Press.; Kuby (1997) Immunology, 第三版, W.H. Freeman and Company, New York。抗體亦包括但不限於合成抗體、單株抗體、重組抗體、多特異性抗體(包括雙特異性抗體)、人類抗體、人類化抗體、駱駝化抗體、嵌合抗體、胞內抗體、抗個體基因型(抗Id)抗體及其功能片段，其係指保留衍生出片段之抗體之一些或所有結合活性的抗體重鏈或輕鏈多肽之一部分。抗體之功能片段之非限制性實例包括單鏈Fv (single-chain Fv，scFv) (例如包括單特異性或雙特異性)、Fab片段、F(ab')片段、F(ab)2 片段、F(ab')2 片段、二硫鍵連接Fv (disulfide-linked Fv，sdFv)、Fd片段、Fv片段、scRv-Fc、奈米抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體及微型抗體。在一些實施例中，抗體包含具有減少或消除之效應功能的Fc變異體。特定言之，本文所提供之抗體包括免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子之免疫活性部分，例如含有與抗原結合之抗原結合位點的抗原結合域或分子(例如抗CD56抗體或抗SIRPα抗體之一或多個互補決定區(complementarity determining region，CDR))。此類抗體片段描述於例如Harlow及Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); Myers (編), Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, New York: VCH Publisher, Inc.; Huston等人,Cell Biophysics 1993 ,22 , 189-224; Plückthun及Skerra,Meth. Enzymol. 1989 ,178 , 497-515; 及Day, Advanced Immunochemistry, 第二版, Wiley-Liss, Inc., New York, NY (1990)。本文所提供之抗體可為免疫球蛋白分子之任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、任何類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或任何子類別(例如IgG2a及IgG2b)。
術語「抗原 」係指抗體可選擇性結合之預定目標。目標抗原可為多肽、碳水化合物、核酸、脂質、半抗原或其片段，或其他天然存在或合成化合物。在一個實施例中，目標抗原為多肽。
術語「抗原結合片段 」、「抗原結合域 」及「抗原結合區 」係指抗體之一部分，其包含與抗原(例如多肽、碳水化合物、核酸、脂質、半抗原或其片段，或其他天然存在或合成化合物)相互作用之胺基酸殘基，且賦予結合劑對抗原(例如互補決定區(CDR))之特異性及親和力。
術語「特異性結合 」、「特異性結合於 」特定多肽或特定多肽目標上之抗原決定基或「對 」特定多肽或特定多肽目標上之抗原決定基「具有特異性 」可以例如藉由針對目標具有至少約10- 4 M、至少約10- 5 M、至少約10- 6 M、至少約10- 7 M、至少約10- 8 M、至少約10- 9 M、至少約10- 10 M、至少約10- 11 M或至少約10- 12 M的解離常數(Kd )的分子(例如抗體)呈現。在一個實施例中，術語「特異性結合」係指其中分子結合於特定多肽或特定多肽上之抗原決定基而實質上不結合於任何其他多肽或多肽抗原決定基的結合。
4鏈抗體單元為雜四聚醣蛋白，其由兩條相同輕(L)鏈及兩條相同重(H)鏈構成。在IgG之情況下，該4鏈單元一般係約150,000道爾頓。各L鏈經一個共價二硫鍵連接至H鏈，而兩條H鏈經一或多個二硫鍵彼此連接，此視H鏈同型而定。各H鏈及L鏈亦具有有規律地隔開之鏈內二硫橋鍵。各H鏈在N端具有可變域(VH)，繼之為三個恆定域(CH) (對於α及γ鏈中之每一者而言)以及四個CH域(對於μ及ε同型而言)。各L鏈在N末端具有可變域(VL)，繼之為位於其另一端的恆定域(CL)。VL與VH對準且CL與重鏈之第一恆定域(CH1)對準。咸信特定胺基酸殘基在輕鏈可變域與重鏈可變域之間形成界面。VH與VL對在一起而形成單一抗原結合位點。關於不同類別之抗體的結構及特性，參見例如Basic and Clinical Immunology, 第8版, Stites等人(編), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, 第71頁及第6章。
術語「可變區 」或「可變域 」係指抗體之輕鏈或重鏈之一部分，其通常位於輕鏈或重鏈之胺基端且在重鏈中長度為約120至130個胺基酸且在輕鏈中長度為約100至110個胺基酸，且用於各特定抗體對其特定抗原之結合及特異性。重鏈之可變區可稱為「VH」。輕鏈可變區可稱為「VL」。術語「可變」係指可變區之某些區段在抗體中之序列方面廣泛不同之事實。V區介導抗原結合且定義特定抗體對其特定抗原之特異性。然而，可變性不均勻分佈於可變區之110個胺基酸跨距內。實情為，V區由以下組成：約15-30個胺基酸之弱可變(例如相對恆定)延伸部分(稱為構架區(framework region，FR))，該等延伸部分被較短的可變性更大的(例如極端可變性)區域(稱為「高變區」，各自長度為約9-12個胺基酸)分隔。重鏈及輕鏈之可變區各自包含由三個高變區連接之四個FR，該等FR大體上採用β片層組態，該等高變區形成連接β片層結構之環且在一些情況下形成β片層結構之一部分。各鏈中之高變區藉由FR緊密保持在一起，且與來自另一鏈之高變區一起促成抗體之抗原結合位點的形成(參見例如Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991))。恆定區不直接涉及抗體與抗原之結合，但呈現多種效應功能，諸如使抗體參與抗體依賴性細胞之細胞毒性(antibody dependent cellular cytotoxicity，ADCC)及補體依賴性細胞毒性(complement dependent cytotoxicity，CDC)。可變區在不同抗體之間的序列方面廣泛不同。序列中之可變性集中於CDR中，而可變區中較少可變部分稱為構架區(FR)。輕鏈及重鏈之CDR主要負責抗體與抗原之相互作用。在特定實施例中，可變區係人類可變區。
術語「如 Kabat 中之可變區殘基編號 」或「如 Kabat 中之胺基酸位置編號 」及其變化形式係指用於以下文獻中之抗體彙集之重鏈可變區或輕鏈可變區的編號系統：Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)。使用此編號系統，實際線性胺基酸序列可含有對應於可變域之FR或CDR之縮短或向其中之插入的較少或額外胺基酸。舉例而言，重鏈可變域可包括在H2之殘基52之後的單個胺基酸插入片段(根據Kabat之殘基52a)及在重鏈FR殘基82之後的插入殘基(例如根據Kabat之殘基82a、82b及82c等)。對於既定抗體，可藉由將抗體序列之同源區與「標準」Kabat編號序列比對來確定殘基之Kabat編號。Kabat編號系統一般在提及可變域中之殘基(大致輕鏈之殘基1-107及重鏈之殘基1-113)時使用(例如Kabat等人, Sequences of Immunological Interest.第5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。「EU編號系統」或「EU索引」一般在提及免疫球蛋白重鏈恆定區中之殘基時使用(例如Kabat等人，前述中所報導之EU索引)。「如Kabat中之EU索引」係指人類IgG1 EU抗體之殘基編號。已描述其他編號系統，包括例如由AbM、Chothia、Contact、IMGT及AHon所描述。
「完整 」抗體為包含抗原結合位點以及CL及至少重鏈恆定區CH1、CH2及CH3之抗體。恆定區可包括人類恆定區或其胺基酸序列變異體。較佳完整抗體具有一或多種效應功能。
術語「抗體片段 」係指完整抗體之一部分，較佳完整抗體之抗原結合區或可變區。抗體片段之實例包括但不限於Fab、Fab'、F(ab')2 及Fv片段；雙功能抗體及雙-雙功能抗體(參見例如Holliger等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1993 ,90 , 6444-8; Lu等人, J. Biol. Chem. 2005 ,280 , 19665-72; Hudson等人,Nat. Med. 2003 ,9 , 129-134; WO 93/11161; 及美國專利第5,837,242號及第6,492,123號)；單鏈抗體分子參見例如美國專利第4,946,778號；第5,260,203號；第5,482,858號及第5,476,786號)；雙可變域抗體(參見例如美國專利第7,612,181號)；單可變域抗體(SdAb) (參見例如Woolven等人,Immunogenetics 1999 ,50 , 98-101 Streltsov等人,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A .2004 ,101 , 12444-12449)；及由抗體片段形成的多特異性抗體。
術語抗體之「功能片段 」、「結合片段 」或「抗原結合片段 」係指呈現由完整抗體引起之至少一種生物學功能的分子，該功能包含至少結合於目標抗原。
當參考抗體使用時，術語「重鏈 」係指約50-70 kDa之多肽鏈，其中胺基端部分包括約120至130或更多個胺基酸之可變區及包括恆定區之羧基端部分。基於重鏈恆定區之胺基酸序列，恆定區可為五種不同類型(例如同型)中之一種，稱為阿爾法(α)、德耳塔(δ)、伊普西隆(ε)、伽瑪(γ)及米歐(µ)。不同重鏈之尺寸之不同：α、δ及γ含有約450個胺基酸，而µ及ε含有約550個胺基酸。此等不同類型之重鏈當與輕鏈組合時，產生抗體之五種熟知類別(例如同型)，分別為IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，包括IgG之四個子類別，亦即IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。重鏈可為人類重鏈。
術語「輕鏈 」當參考抗體使用時，係指約25 kDa之多肽鏈，其中胺基端部分包括約100至約110或更多個胺基酸之可變區及包括恆定區之羧基端部分。輕鏈之大致長度係211至217個胺基酸。基於恆定域之胺基酸序列，存在兩種不同類型，稱為卡帕(κ)或拉姆達(λ)。輕鏈胺基酸序列為此項技術中所熟知的。輕鏈可為人類輕鏈。
如本文所用，術語「單株抗體 」係指自實質上均勻抗體群體獲得的抗體，例如構成該群體的個別抗體除可能少量存在之可能天然存在之突變之外其他相同，且各種單株抗體典型地識別抗原上之單一抗原決定基。在特定實施例中，如本文所用之「單株抗體」為由單一融合瘤或其他細胞產生之抗體，其中抗體僅結合於β克羅索抗原決定基(beta klotho epitope)，如例如藉由ELISA或此項技術中已知之其他抗原結合或競爭性結合分析所確定。術語「單株」不限於任何用於製備抗體之特定方法。舉例而言，可用於本發明中之單株抗體可藉由最先由Kohler等人, Nature1975 , 256:495所描述之融合瘤方法製備，或可在細菌、真核動物或植物細胞中使用重組DNA方法製備(參見例如美國專利第4,816,567號)。「單株抗體」亦可使用例如Clackson等人, Nature1991 , 352, 624-628及Marks等人, J. Mol. Biol.1991 , 222, 581-597中所描述之技術，自噬菌體抗體文庫中分離。藉此在此項技術中已熟知其他用於製備所表現之純系細胞株及單株抗體之方法(參見例如Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 第5版, Ausubel等人編, John Wiley and Sons, New York中之第11章)。本文在實例中提供產生單株抗體之例示性方法。
非人類(例如鼠類)抗體之「人類化 」形式為嵌合抗體，其包括其中原生CDR殘基由來自非人類物種(諸如小鼠、大鼠、兔或具有所需特異性、親和力及能力之非人類靈長類動物)之相應CDR (例如供體抗體)之殘基置換的人類免疫球蛋白(例如受體抗體)。在一些實例中，人類免疫球蛋白之一或多個FR區殘基由相應的非人類殘基置換。此外，人類化抗體可包含在受體抗體或供者抗體中未發現之殘基。進行此等修飾以進一步改進抗體效能。人類化抗體重鏈或輕鏈可包含實質上所有至少一或多種可變區，其中所有或實質上所有CDR對應於非人類免疫球蛋白之CDR且所有或實質上所有FR係人類免疫球蛋白序列之FR。在某些實施例中，人類化抗體將包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，通常人類免疫球蛋白之至少一部分。關於其他細節，參見Jones等人,Nature 1986 ,321 , 522-525; Riechmann等人,Nature 1988 ,332 , 323-329; Presta,Curr. Opin. Biotechnol. 1992 ,3 , 394-398; Carter等人,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1992 ,89 , 4285-4289；及美國專利第6,800,738號、第6,719,971號、第6,639,055號、第6,407,213號及第6,054,297號。
「人類抗體 」為擁有以下胺基酸序列者：對應於由人類所產生及/或已使用如本文所揭示之任一製造人類抗體之技術所製造的抗體胺基酸序列。人類抗體之此定義特定排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。人類抗體可使用此項技術中已知之各種技術產生，包括噬菌體展示庫(Hoogenboom及Winter,J. Mol. Biol. 1991 ,227 , 381; Marks等人,J. Mol. Biol .1991 , 222, 581)及酵母展示庫(Chao等人,Nature Protocols 2006 ,1 , 755-768)。另外，可用於製備人類單株抗體之方法描述於Cole等人, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 第77頁 (1985); Boerner等人,J. Immunol. 1991 ,147 , 86-95中。亦參見van Dijk及van de Winkel,Curr. Opin. Pharmacol. 2001 ,5 , 368-374。人類抗體可藉由將抗原投與轉殖基因動物來製備，該轉殖基因動物經修飾以響應於抗原攻擊而產生此類抗體，但內源性基因座已失能，例如小鼠(參見例如Jakobovits,Curr. Opin. Biotechnol. 1995 ,6 , 561-566; Brüggemann及Taussing,Curr. Opin. Biotechnol. 1997 ,8 , 455-458; 及美國專利第6,075,181號及第6,150,584號，關於XENOMOUSETM 技術)。亦參見例如Li等人,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2006 ,103 , 3557-3562，關於經由人類B細胞融合瘤技術產生之人類抗體。
「CDR 」係指免疫球蛋白(Ig或抗體)VH β-片層構架之非構架區內的三個高變區(H1、H2或H3)之一，或抗體VL β-片層構架之非構架區內的三個高變區(L1、L2或L3)之一。因此，CDR為構架區序列內穿插之可變區序列。CDR區為熟習此項技術者所熟知且已由例如Kabat定義為抗體可變(V)域內具有最大高變性之區。Kabat等人,J. Biol. Chem. 1977 ,252 , 6609-6616; Kabat,Adv. Protein Chem. 1978 ,32 , 1-75。CDR區序列亦在結構上由Chothia定義為不為保守β片層構架之一部分且因此能夠適應不同構形的彼等殘基。Chothia及Lesk,J. Mol. Biol .1987 ,196 , 901-917。兩種術語在此項技術中均已充分認知。CDR區序列亦由AbM、Contact及IMGT定義。典型抗體可變區內之CDR位置已藉由比較許多結構來確定。Al-Lazikani等人,J. Mol. Biol .1997 ,273 , 927-948; Morea等人,Methods. 2000 ,20 , 267-279。由於高變區內之殘基數目因抗體不同而不同，因此相對於典型位置的其他殘基習知地緊鄰典型可變區編號方案中之殘基編號以a、b、c等編號(Al-Lazikani等人, 同上(1997))。此類命名法類似地已為熟習此項技術者熟知。
當在本文中使用時，術語「高變區 」、「HVR 」或「HV 」係指抗體可變區中序列具有高變性及/或形成結構上界定之環的區域。通常，抗體包含六個高變區；三個在VH中(H1、H2、H3)，且三個在VL中(L1、L2、L3)。本文中使用且涵蓋多種高變區描繪。Kabat互補決定區(CDR)係基於序列可變性且為最常用的(參見例如Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。而Chothia係指結構環之位置。參見例如Chothia及Lesk,J. Mol. Biol. 1987 ,196 , 901-917。在使用Kabat編號規約進行編號時，Chothia CDR-H1環末端在H32與H34之間變化，此視環的長度而定(此係因為Kabat編號方案將插入置於H35A及H35B處；若既不存在35A，亦不存在35B，則環末端位於32處；若僅存在35A，則環末端位於33處；若35A與35B皆存在，則環末端位於34處)。AbM高變區表示Kabat CDR與Chothia結構環之間的平衡，且由Oxford Molecular's AbM抗體模型化軟體使用(參見例如Martin, Antibody Engineering, 第2卷, 第3章, Springer Verlag)。「接觸」高變區係基於可利用的複雜晶體結構之分析。來自此等高變區或CDR中之每一者之殘基標示於下文中。
在本文中，術語「Fc 區 」用於定義免疫球蛋白重鏈之C端區，包括例如原生序列Fc區、重組型Fc區及變異體Fc區。儘管免疫球蛋白重鏈之Fc區之邊界可變化，但人類IgG重鏈Fc區通常定義為自位置Cys226處之胺基酸殘基或自Pro230延伸至其羧基端。可移除Fc區之C端離胺酸(殘基447，根據EU編號系統)，例如在抗體之製備或純化期間，或藉由以重組方式工程改造編碼抗體之重鏈的核酸。因此，完整抗體之組合物可包含所有K447殘基均被移除之抗體群體、沒有K447殘基被移除之抗體群體及具有含有及不含K447殘基之抗體之混合物的抗體群體。
「環烷基 」指示具有所指示數目個碳原子，例如3至10、或3至8、或3至6個環碳原子之非芳族完全飽和碳環。環烷基可為單環或多環(例如，雙環、三環)。環烷基之實例包括環丙基、環丁基、環戊基及環己基，以及橋環及籠環基團(例如降𦯉烷、雙環[2.2.2]辛烷)。另外，多環烷基之一個環可為芳族，其限制條件為多環烷基經由非芳族碳結合於母結構。舉例而言，1,2,3,4-四氫萘-1-基(其中該部分經由非芳族碳原子鍵結至母結構)為環烷基，而1,2,3,4-四氫萘-5-基(其中該部分經由芳族碳原子鍵結至母結構)不被視為環烷基。下文描述由稠合至芳環的環烷基組成的多環環烷基的實例。
「環烯基 」指示非芳族碳環，其含有所指示數目個碳原子(例如3至10、或3至8、或3至6個環碳原子)及至少一個碳-碳雙鍵。環烯基可為單環或多環的(例如，雙環、三環)。環烯基之實例包括環丙烯基、環丁烯基、環戊烯基、環戊二烯基及環己烯基，以及橋環及籠環基團(例如雙環[2.2.2]辛烯)。另外，多環環烯基的一個環可為芳族的，其限制條件為多環烯基經由非芳族碳原子鍵結至母結構。舉例而言，茚-1-基(其中該部分經由非芳族碳原子鍵結至母結構)被視為環烯基，而茚-4-基(其中該部分經由芳族碳原子鍵結至母結構)不被視為環烯基。由與芳環稠合的環烯基組成的多環環烯基的實例在下文加以描述。
「環炔基 」係指具有至少一個炔系不飽和位點(亦即具有至少一個式C≡C之部分)之環烷基內的不飽和烴基。環炔基可由一個環(諸如環辛炔)或多個環組成。一個環炔基部分為具有5至10個環碳原子之不飽和環烴(「C5 -C10 環炔基」)。實例包括環戊炔、環己炔、環戊炔、環辛炔、環壬炔及其類似者。
「芳基 」指示具有所指示數目個碳原子，例如6至12或6至10個碳原子之芳族碳環。芳基可為單環或多環(例如，雙環、三環)。在一些實例中，多環芳基之兩個環為芳族的(例如萘基)。在其他實例中，多環芳基可包括稠合至芳環之非芳環，其限制條件為多環芳基經由芳環中之原子鍵結至母結構。因此，1,2,3,4-四氫萘-5-基(其中該部分經由芳族碳原子鍵結至母結構)被視為芳基，而1,2,3,4-四氫萘-1-基(其中該部分經由非芳族碳原子鍵結至母結構)不被視為芳基。類似地，1,2,3,4-四氫喹啉-8-基(其中該部分經由芳族碳原子鍵結至母結構)被視為芳基，而1,2,3,4-四氫喹啉-1-基(其中該部分經由非芳族氮原子鍵結至母結構)不被視為芳基。然而，如本文所定義，無論連接點為何(例如喹啉-5-基及喹啉-2-基皆為雜芳基)，術語「芳基」不涵蓋「雜芳基」或與其重疊。在一些實例中，芳基為苯基或萘基。在某些實例中，芳基為苯基。包含稠合至非芳環之芳族碳環的芳基之其他實例在下文加以描述。
術語「DAR 」係指寡核苷酸-抗體結合物之藥物-抗體比率，更特定言之免疫調節聚核苷酸-抗體比率。在一些實例中，例如寡核苷酸-抗體結合物可在本文中描述為具有1之DAR或為DAR1結合物，其中寡核苷酸-抗體比率為1:1。在其他實例中，寡核苷酸-抗體結合物在本文中可描述為具有2之DAR或為DAR2結合物，其中寡核苷酸-抗體比率為2:1。
「雜芳基 」指示含有所指定數目個由選自N、O及S之一或多個雜原子(例如1、2、3或4個雜原子)構成且其餘環原子為碳的原子(例如5至12或5至10員雜芳基)的芳環。雜芳基不含有相鄰S及O原子。在一些實施例中，雜芳基中S及O原子之總數不超過2。在一些實施例中，雜芳基中S及O原子之總數不超過1。除非另外指明，否則在價數允許時，雜芳基可藉由碳或氮原子鍵結至母結構。舉例而言，「吡啶基」包括2-吡啶基、3-吡啶基及4-吡啶基，且「吡咯基」包括1-吡咯基、2-吡咯基及3-吡咯基。
在一些實例中，雜芳基為單環的。實例包括吡咯、吡唑、咪唑、三唑(例如1,2,3-三唑、1,2,4-三唑、1,2,4-三唑)、四唑、呋喃、異㗁唑、㗁二唑(例如1,2,3-㗁二唑、1,2,4-㗁二唑、1,3,4-㗁二唑)、噻吩、異噻唑、噻唑、噻二唑(例如1,2,3-噻二唑、1,2,4-噻二唑)、1,3,4-噻二唑)、吡啶、嗒𠯤、嘧啶、吡𠯤、三𠯤(例如1,2,4-三𠯤、1,3,5-三𠯤)及四𠯤。
在一些情況下，多環雜芳基之兩個環為芳族的。實例包括吲哚、異吲哚、吲唑、苯并咪唑、苯并三唑、苯并呋喃、苯并㗁唑、苯并異㗁唑、苯并㗁二唑、苯并噻吩、苯并噻唑、苯并異噻唑、苯并噻二唑、1H-吡咯并[2,3-b]吡啶、1H-吡唑并[3,4-b]吡啶、3H-咪唑并[4,5-b]吡啶、3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶、1H-吡咯并[3,2-b]吡啶、1H-吡唑并[4,3-b]吡啶、1H-咪唑并[4,5-b]吡啶、1H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶、1H-吡咯并[2,3-c]吡啶、1H-吡唑并[3,4-c]吡啶、3H-咪唑并[4,5-c]吡啶、3H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶、1H-吡咯并[3,2-c]吡啶、1H-吡唑并[4,3-c]吡啶、1H-咪唑并[4,5-c]吡啶、1H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶、呋喃并[2,3-b]吡啶、㗁唑并[5,4-b]吡啶、異㗁唑并[5,4-b]吡啶、[1,2,3]㗁二唑并[5,4-b]吡啶、呋喃并[3,2-b]吡啶、㗁唑并[4,5-b]吡啶、異㗁唑并[4,5-b]吡啶、[1,2,3]㗁二唑并[4,5-b]吡啶、呋喃并[2,3-c]吡啶、㗁唑并[5,4-c]吡啶、異㗁唑并[5,4-c]吡啶、[1,2,3]㗁二唑并[5,4-c]吡啶、呋喃并[3,2-c]吡啶、㗁唑并[4,5-c]吡啶、異㗁唑并[4,5-c]吡啶、[1,2,3]㗁二唑并[4,5-c]吡啶、噻吩并[2,3-b]吡啶、噻唑并[5,4-b]吡啶、異噻唑并[5,4-b]吡啶、[1,2,3]噻二唑并[5,4-b]吡啶、噻吩并[3,2-b]吡啶、噻唑并[4,5-b]吡啶、異噻唑并[4,5-b]吡啶、[1,2,3]噻二唑并[4,5-b]吡啶、噻吩并[2,3-c]吡啶、噻唑并[5,4-c]吡啶、異噻唑并[5,4-c]吡啶、[1,2,3]噻二唑并[5,4-c]吡啶、噻吩并[3,2-c]吡啶、噻唑并[4,5-c]吡啶、異噻唑并[4,5-c]吡啶、[1,2,3]噻二唑并[4,5-c]吡啶、喹啉、異喹啉、㖕啉、喹唑啉、喹喏啉、呔𠯤、㖠啶(例如1,8-㖠啶、1,7-㖠啶、1,6-㖠啶、1,5-㖠啶、2,7-㖠啶、2,6-㖠啶)、咪唑并[1,2-a]吡啶、1H-吡唑并[3,4-d]噻唑、1H-吡唑并[4,3-d]噻唑及咪唑并[2,1-b]噻唑。
在其他實例中，多環雜芳基可包括稠合至雜芳環之非芳環(例如環烷基、環烯基、雜環烷基、雜環烯基)，其限制條件為該多環雜芳基經由芳環中之原子結合於母結構。舉例而言，4,5,6,7-四氫苯并[d]噻唑-2-基(其中該部分經由芳族碳原子結合於母結構)視為雜芳基，而4,5,6,7-四氫苯并[d]噻唑-5-基(其中該部分經由非芳族碳原子結合於母結構)不視為雜芳基。由與非芳族環稠合之雜芳基環組成之多環雜芳基之實例描述於下文中。
如本文中所使用，術語「包括 」、「含有 」及「包含 」以其開放、非限制性意義使用。亦應理解，本文所述之本發明之態樣及實施例可包括「由 」態樣及實施例「組成 」及/或「主要由 」態樣及實施例「組成 」。
應理解，不論是否明確使用術語「約 」，本文所給出之每一數量均意圖指實際給出值，且其亦意圖指基於一般技術者合理推斷之該給出值之近似值，包括由於該給出值之實驗及/或量測條件而獲得之等效值及近似值。
如本文所用，「載劑 」包括醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑，其在所採用之劑量及濃度下對暴露於其中之細胞或哺乳動物無毒。通常生理學上可接受之載劑係水性pH緩衝溶液。生理學上可接受之載劑的非限制性實例包括緩衝液，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、穀胺醯胺、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖醇，諸如甘露糖醇或山梨糖醇；鹽形成相對離子，諸如鈉；及/或非離子界面活性劑，諸如TWEEN™、聚乙二醇(PEG)及PLURONICS™。
如本文所用，術語物質之「有效量 」或「治療有效量 」至少為引起特定病症之可量測改善或預防所要的最小濃度。本文中之有效量可根據諸如以下因素而變化：患者之疾病病況、年齡、性別及體重，及物質在個體中引起所需反應之能力。有效量亦為治療有利效應超過治療之任何毒性或不利效應的量。就癌症而言，有效量包含足以使腫瘤縮小及/或降低腫瘤生長速率((由此遏制腫瘤生長)或者預防或延遲癌症中其他不想要的細胞增殖之量。在一些實施例中，有效量係足以延遲癌症之發展的量。在一些實施例中，有效量為足以預防或延遲復發的量。在一些實施例中，有效量為足以降低個體中之復發率的量。有效量可以一或多次投與投與。藥物或組合物之有效量可：(i)減少癌細胞之數目；(ii)減小腫瘤尺寸；(iii)在一定程度上抑制、延緩、減緩且較佳地停止癌細胞浸潤至周邊器官中；(iv)抑制(亦即在一定程度上減緩且較佳地停止)腫瘤轉移；(v)抑制腫瘤生長；(vi)預防或延遲腫瘤之出現及/或復發；(vii)降低腫瘤之復發率，及/或(viii)在一定程度上緩解一或多種與癌症相關之症狀。有效量可以一或多次投與投與。出於本發明之目的，藥物、化合物或醫藥組合物之有效量為足以直接或間接實現預防性或治療性治療之量。如在臨床情形下所瞭解，藥物、化合物或醫藥組合物之有效量可或不可連同另一藥物、化合物或醫藥組合物一起實現。因此，在投與一或多種治療劑之情形下可考慮“有效劑量”，且若結合一或多種其他藥劑可實現或實現所要結果，則單一藥劑可視為以有效量給藥。
「藥品說明書 」係指通常包括於藥劑之商業包裝中之說明書，其含有關於適應症、用法、劑量、投與、禁忌、待與包裝產品組合之其他藥劑及/或有關使用此類藥劑之警告等的資訊。
術語「蛋白質 」、「多肽 」及「肽 」在本文中用於指具有任何長度胺基酸之聚合物。聚合物可為線性或分支的，其可以包含經修飾之胺基酸，且其可以間雜有非胺基酸。該等術語亦涵蓋經天然修飾或藉由干預修飾之胺基酸聚合物；例如二硫鍵形成、糖基化、脂質化、乙醯化、磷酸化或任何其他操縱或修飾，諸如與標記組分結合。通常，供用於本文中的蛋白質將具有為至少約5-20 kDa，或者至少約20-100 kDa，或至少約100 kDa之分子量。定義內亦包括例如含有胺基酸之一或多種類似物(包括例如非天然胺基酸等)之蛋白質，以及此項技術中已知之其他修飾。
「醫藥學上可接受之鹽 」為無毒、生物可耐受或以其他方式生物學上適用於向個體投與之鹽形式。一般參見Berge等人(1977) J. Pharm. Sci. 66, 1。特定的醫藥學上可接受之鹽為藥理學上有效且適用於與個體組織接觸而無異常毒性、刺激或過敏反應的鹽。醫藥學上可接受之鹽包括但不限於酸加成鹽，形成有無機酸，諸如氫氯酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸及類似者；或形成有有機酸，諸如乙酸、草酸、丙酸、丁二酸、順丁烯二酸、酒石酸及類似者。此等鹽可來源於無機酸或有機酸。醫藥學上可接受之鹽之非限制性實例包括硫酸鹽、焦硫酸鹽、硫酸氫鹽、亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、磷酸鹽、磷酸單氫鹽、磷酸二氫鹽、偏磷酸鹽、焦磷酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸鹽、丙酸鹽、癸酸鹽、辛酸鹽、丙烯酸鹽、甲酸鹽、異丁酸鹽、己酸鹽、庚酸鹽、丙炔酸鹽、乙二酸鹽、丙二酸鹽、丁二酸鹽、辛二酸鹽、癸二酸鹽、反丁烯二酸鹽、順丁烯二酸鹽、丁炔-1,4-二酸鹽、己炔-1,6-二酸鹽、苯甲酸鹽、氯苯甲酸鹽、甲基苯甲酸鹽、二硝基苯甲酸鹽、羥基苯甲酸鹽、甲氧基苯甲酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、磺酸鹽、甲基磺酸鹽、丙基磺酸鹽、苯磺酸鹽、二甲苯磺酸鹽、萘-1-磺酸鹽、萘-2-磺酸鹽、苯乙酸鹽、苯丙酸鹽、苯丁酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、γ-羥丁酸鹽、乙醇酸鹽、酒石酸鹽及扁桃酸鹽。在一些實施例中，在母體化合物中存在之酸性質子經例如鹼金屬離子、鹼土金屬離子或鋁離子的金屬離子置換；或與有機鹼配位時形成醫藥學上可接受之鹽。來源於醫藥學上可接受之有機無毒鹼之鹽包括但不限於一級胺、二級胺及三級胺、經取代之胺(包括天然存在的經取代之胺)、環狀胺及鹼離子交換樹脂的鹽，諸如異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二乙胺乙醇、緩血酸胺、三甲胺、二環己胺、咖啡鹼、普魯卡因、海卓胺、膽鹼、甜菜鹼、乙二胺、葡糖胺、N-乙基還原葡糖胺、N-甲基還原葡糖胺、可可豆鹼、嘌呤、哌𠯤、哌啶、N-乙基哌啶、多元胺樹脂、胺基酸，諸如離胺酸、精胺酸、組胺酸及類似者。醫藥學上可接受之鹼加成鹽之實例包括來源於無機鹼之鹼加成鹽，諸如鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、銨鹽、鈣鹽、鎂鹽、鐵鹽、鋅鹽、銅鹽、錳鹽、鋁鹽及類似者。在一些實施例中，有機無毒鹼為L-胺基酸(諸如L-離胺酸及L-精胺酸)、緩血酸胺、N-乙基還原葡糖胺及N-甲基還原葡糖胺。可接受之無機鹼包括但不限於氫氧化鋁、氫氧化鈣、氫氧化鉀、碳酸鈉、氫氧化鈉及類似者。其他適合的醫藥學上可接受之鹽之清單見於Remington's Pharmaceutical Sciences, 第17版, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985中。
「溶 劑 合物 」係藉由溶劑與化合物之相互作用形成。適合的溶劑包括例如水及醇(例如乙醇)。溶劑合物包括具有任何化合物與水之比率之水合物，諸如單水合物、二水合物及半水合物。
「個體 ( subject ) 」、「患者 ( patient ) 」或「個體 ( individual ) 」包括哺乳動物，諸如人類或其他動物，且通常為人類。在一些實施例中，被投與治療劑及組合物之個體(例如患者)為哺乳動物，典型地為靈長類動物，諸如人類。在一些實施例中，靈長類動物係猴或猿。個體可為雄性或雌性且可為任何適齡個體，包括嬰兒、幼年、青年、成年及老年個體。在一些實施例中，個體為非靈長類哺乳動物，諸如嚙齒動物、狗、貓、農場動物，諸如牛或馬等。
術語「癌症 」或「腫瘤 」係指存在擁有引起癌症之細胞的典型特徵(諸如不受控增殖、不滅性、轉移潛力、快速生長及增殖速率及某些特殊形態特徵)的細胞。癌細胞通常呈實體腫瘤形式，其可基於腫瘤塊，例如藉由諸如CAT掃描、MR成像、X射線、超音波或觸診之程序而被偵測到，及/或其可由於獲自患者之樣品中一或多種癌症特異性抗原之表現而被偵測到。在一些實施例中，實體腫瘤不需要具有可量測尺寸。癌細胞亦可呈液體腫瘤形式，其癌細胞可單獨存在或在動物體內散播。如本文所用，術語「散播性腫瘤 」及「液體腫瘤 」可互換使用，且包括但不限於白血病及淋巴瘤及其他血細胞癌。
術語「白血病 」係指特徵為不成熟白血球(稱為「母細胞」)異常增加之一類血液或骨髓癌症。白血病為廣義術語，涵蓋一系列疾病。反過來，其又為影響血液、骨髓及淋巴系統之甚至更寬的一組疾病之一部分，該組疾病全被稱為血液贅瘤。白血病可分為四個主要分類：急性淋巴球性(或淋巴母細胞)白血病(ALL)、急性骨髓性(或骨髓或非淋巴性)白血病(AML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)及慢性骨髓性白血病(CML)。其他白血病類型包括毛細胞白血病(HCL)、T細胞前淋巴球性白血病(T-PLL)、大顆粒淋巴球性白血病及成人T細胞白血病。
術語「淋巴瘤 」係指一組自淋巴細胞發展之血細胞腫瘤。淋巴瘤之兩個主要類別為霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin lymphoma，HL)及非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)。淋巴瘤包括淋巴組織之任何贅瘤。主要類別係淋巴球之癌症，一種白血球類型，屬於淋巴以及血液與彌漫兩者。
如本文中所使用，術語「癌症 」包括癌前以及惡性癌症，且亦包括原發性腫瘤(例如，其細胞尚未遷移至除原始腫瘤部位以外的個體身體中之部位的腫瘤)及繼發性腫瘤(例如，起因於癌轉移、腫瘤細胞遷移至不同於原始腫瘤部位之繼發性部位的腫瘤)、復發性癌症及難治性癌症。
術語「癌症復發 ( cancer recurrence ) 」及「癌症復發 ( cancer relapse ) 」可互換使用且係指在緩解之後返回病徵、症狀或疾病。復發性癌細胞可能在原發腫瘤之同一部位或另一部位，諸如在繼發性癌症中再現。癌細胞可以與原發性癌症相同之病變形式或不同病變形式再現。舉例而言，在一些實施例中，原發性癌症為實體腫瘤，且復發性癌症為液體腫瘤。在其他實施例中，原發性癌症為液體腫瘤，且復發性癌症為實體腫瘤。在又其他實施例中，原發性癌症及復發性癌症皆為實體腫瘤，或兩者皆為液體腫瘤。在一些實施例中，復發性腫瘤表現至少一種亦由原發性腫瘤表現之腫瘤相關抗原。
如本文所用，術語「難治性癌症 」係指對治療無反應之癌症，例如在治療(例如用免疫療法治療)開始時具有抗性之癌症或在治療期間可變得具有抗性之癌症。術語「反應 ( respond ) 」、「反應 ( response ) 」或「反應 ( responsiveness ) 」例如在腫瘤尺寸減小或抑制腫瘤生長之意義上，係指抗癌反應。術語亦可指經改善之預後，例如如由增長之復發時間所反映，其為距作為第一次事件之第二原發癌之初次復發檢查或死亡而無復發跡象的時段，或增加之總存活期，其為自治療至任何病因之死亡的時段。反應或具有反應意謂當暴露於刺激時達至有益指標。替代地，負面的或有害症狀在暴露於刺激時最小化、緩解或減弱。應瞭解，評估腫瘤或個體將呈現有利反應的可能性相當於評估腫瘤或個體將不呈現有利反應(亦即，將呈現不足的反應或無反應)的可能性。
如本文所使用，癌症包括但不限於黑素瘤、乳癌、肺癌、支氣管癌、大腸直腸癌、前列腺癌、胰臟癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、腦癌或中樞神經系統癌、周邊神經系統癌、食道癌、子宮頸癌、子宮癌或子宮內膜癌、口腔癌或咽癌、肝癌、腎癌、睪丸癌、膽道癌、小腸癌或闌尾癌、唾液腺癌、甲狀腺癌、腎上腺癌、骨肉瘤、軟骨肉瘤、血液學組織癌、B細胞癌(例如多發性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(Waldenström's macroglobulinemia))、重鏈疾病(諸如α鏈疾病、γ鏈疾病及μ鏈疾病)、良性單株球蛋白症(benign monoclonal qammopathy)及免疫細胞澱粉樣變性及其類似疾病。適用於本發明所涵蓋之方法之癌症類型之其他非限制性實例包括人類肉瘤及癌瘤，例如纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤文氏腫瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、大腸直腸癌、胰臟癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌瘤、皮脂腺癌瘤、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓性癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝癌、膽管癌瘤、肝癌、絨膜癌、精細胞癌、胚胎性瘤、威爾姆斯氏腫瘤(Wilms' tumor)、子宮頸癌、骨癌、腦瘤、睪丸癌、肺臟、癌瘤、小細胞肺臟癌瘤、膀胱癌、上皮癌、神經膠瘤、星形細胞瘤、神經管胚細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、少突神經膠質瘤、脊膜瘤、黑色素瘤、神經母細胞瘤、視網膜胚細胞瘤；白血病，例如急性淋巴球性白血病及急性骨髓細胞性白血病(骨髓母細胞性、前髓細胞性、骨髓單核球性、單核球性及紅白血病)；慢性白血病(慢性骨髓細胞性(顆粒球性)白血病及慢性淋巴球性白血病)；及真性紅細胞增多症、淋巴瘤(霍奇金氏病及非霍奇金氏病)、多發性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症及重鏈疾病。在一些實施例中，癌症在本質上為上皮癌且包括但不限於膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、婦科癌症、腎癌、喉癌、肺癌、口腔癌、頭頸癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌或皮膚癌。在其他實施例中，癌症為乳癌、前列腺癌、肺癌或結腸癌。在又其他實施例中，上皮癌症為非小細胞肺癌、非乳頭狀腎細胞癌、子宮頸癌、卵巢癌瘤(例如漿液性卵巢癌瘤)或乳癌。上皮癌症之特徵可在於各種其他方法，包括但不限於漿液性、子宮內膜樣、黏液性、透明細胞、勃倫那(Brenner)或未分化的。
如本文所用，術語「癌症療法 」或「癌症治療劑 」係指可發揮抗腫瘤作用或具有抗腫瘤活性的彼等療法或藥劑。此類抗腫瘤作用或抗腫瘤活性可呈現為腫瘤細胞增殖速率、存活率或轉移性活性之降低。展示抗腫瘤活性之可能方式為展示在療法期間產生之異常細胞之生長率降低或腫瘤尺寸具穩定性或減小。此類活性可使用所接受的活體外或活體內腫瘤模型評估，包括但不限於異種移植模型、同種移植模型、MMTV模型及此項技術中已知研究抗腫瘤活性的其他已知模型。
術語「治療 ( treat ) 」、「治療 ( treating ) 」及「治療 ( treatment ) 」意謂包括緩解或消除病狀、病症或疾病或與病狀、病症或疾病相關之症狀中之一或多者；或緩解或根除病狀、病症或疾病本身之起因。
術語「預防 ( prevent ) 」、「預防 ( preventing ) 」及「預防 ( prevention ) 」意謂包括實現以下目的之方法：延緩及/或阻止病狀、病症或疾病及/或其伴隨症狀之發作；防止個體罹患病狀、病症或疾病；或降低個體罹患病狀、病症或疾病之風險。
術語「經取代 」意謂指定基團或部分攜帶一或多個取代基，包括但不限於諸如以下之取代基：烷氧基、醯基、醯氧基、烷氧基羰基、羰基烷氧基、醯胺基、胺基、胺基醯基、胺基羰基胺基、胺基羰氧基、環烷基、環烯基、芳基、雜芳基、芳氧基、氰基、疊氮基、鹵基、羥基、硝基、羧基、硫氫基、硫基烷基、烷基、烯基、炔基、雜環基、芳烷基、胺基磺醯基、磺醯基胺基、磺醯基、側氧基及其類似基團。術語「未經取代」意謂指定基團不攜帶取代基。當術語「經取代」用於描述結構系統時，取代意謂發生在系統上之任何價數允許的位置。當基團或部分攜帶超過一個取代基時，應理解，取代基可彼此相同或不同。在一些實施例中，經取代之基團或部分攜帶一至五個取代基。在一些實施例中，經取代之基團或部分攜帶一個取代基。在一些實施例中，經取代之基團或部分攜帶兩個取代基。在一些實施例中，經取代之基團或部分攜帶三個取代基。在一些實施例中，經取代之基團或部分攜帶四個取代基。在一些實施例中，經取代之基團或部分攜帶五個取代基。
「視情況存在 ( optional ) 」或「視情況存在 ( optionally ) 」意謂隨後描述之事件或情況可能發生或可能不發生，且本說明書包括事件或情況發生之實例及其不發生之實例。舉例而言，「視情況經取代之烷基」涵蓋如本文所定義之「烷基」與「經取代之烷基」。熟習此項技術者應理解，關於含有一或多個取代基之任何基團，此類基團並不意欲引入空間上不切實際、合成方式不可行的及/或本質上不穩定的任何取代或取代模式。亦應理解，在基團或部分視情況經取代之情況下，本發明包括其中基團或部分經取代之兩個實施例及其中基團或部分未經取代之實施例。
如本文所用，術語「Q 標籤 」係指含有穀胺醯胺殘基之多肽之一部分，在轉穀胺醯胺酶介導之與含有-NH2 胺之化合物反應後，提供含有多肽部分之結合物，其中穀胺醯胺殘基包括經修飾以包括鍵結至化合物之醯胺的側鏈。Q標籤為此項技術中已知的。Q標籤之非限制性實例為LLQGG (SEQ ID NO:172)及GGGLLQGG (SEQ ID NO:173)。在一些實施例中，Q標籤連接至抗體之重鏈的C端。在一些實施例中，Q標籤連接至抗體輕鏈。在一些實施例中，Q標籤為天然存在的。舉例而言，N297突變至N297A暴露抗體之Q295，其中發生結合(根據EU索引編號，例如，如列於Edelman, G.M.等人, Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85 (1969)及Kabat, E.A.等人, Sequences of proteins of immunological interest. 第5版 - US Department of Health and Human Services, NIH publication n° 91-3242, 第662,680,689頁(1991)中)。在一些實施例中，Q標籤位於抗體之Fc域內。II. 結合物
免疫刺激聚核苷酸已用於多種治療應用中。為改良靶向特異性及活體內分佈，免疫調節聚核苷酸(例如CpG ODN)可與靶向部分(例如多肽)結合。特定言之，轉穀胺醯胺介導之反應歸因於其較高反應速率及適合之位點特異性可用於進行此類結合反應。本發明提供呈現有利活性之寡核苷酸-多肽結合物。在一些實施例中，多肽為抗體，諸如抗體重鏈或輕鏈。
本文中提供寡核苷酸-抗體結合物，其中寡核苷酸及抗體經由連接部分連接在一起。在一些實施例中，一種抗體可與一或多種寡核苷酸結合。在一些實施例中，寡核苷酸-抗體結合物為包含抗體或其抗原結合片段及一或多種免疫調節寡核苷酸(P)之結合物，其中該抗體或抗原結合片段連接至一或多個包含至少一個穀胺醯胺殘基之Q標籤肽(Q)，其中各免疫調節寡核苷酸經由與Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接至Q標籤肽，如式(A)中所示：
Figure 02_image306
， 或其立體異構體、兩種或兩種以上非對映異構體之混合物、互變異構體或兩種或兩種以上互變異構體之混合物；或其醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物或水合物； 其中：
Figure 02_image308
指示各Q與該抗體或其抗原結合片段(Ab)之連接點； 各Q獨立地為包含至少一個穀胺醯胺殘基之Q標籤肽序列； 各L獨立地為經由與該穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵連接於Q的一鍵或連接子部分；及 各P獨立地為免疫調節寡核苷酸。
在一些實施例中，結合物為包含抗體或其抗原結合片段及一或多種免疫調節寡核苷酸(P)之結合物，其中抗體或抗原結合片段連接至一或多個包含胺基酸序列RPQGF (SEQ ID NO: 47)之Q標籤肽(Q)，其中各免疫調節寡核苷酸經由與Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接至Q標籤肽，如式(A)中所示，
Figure 02_image306
， 或其立體異構體、兩種或兩種以上非對映異構體之混合物、互變異構體或兩種或兩種以上互變異構體之混合物；或其醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物或水合物； 其中：
Figure 02_image310
指示各Q與該抗體或其抗原結合片段(Ab)之連接點； 各Q獨立地包括包含肽序列RPQGF (SEQ ID NO: 47)之Q標籤肽； 各L獨立地為經由與該穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵連接於Q的一鍵或連接子部分；及 各P獨立地為免疫調節寡核苷酸。
在其他實施例中，結合物為一種包含抗體或其抗原結合片段及一或多種免疫調節寡核苷酸(P)的結合物，其中該抗體或抗原結合片段連接至一或多個包含至少一個穀胺醯胺殘基之Q標籤肽(Q)，其中各免疫調節寡核苷酸經由與Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接至Q標籤肽，如式(A)中所示，
Figure 02_image306
， 或其立體異構體、兩種或兩種以上非對映異構體之混合物、互變異構體或兩種或兩種以上互變異構體之混合物；或其醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物或水合物； 其中：
Figure 02_image313
指示各Q與該抗體或其抗原結合片段(Ab)之連接點； 各Q獨立地為包含至少一個穀胺醯胺殘基之Q標籤肽； 各L獨立地為經由與該穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵連接於Q的一鍵或連接子部分；及 各P獨立地為選自由表 10 之寡核苷酸組成之群的免疫調節寡核苷酸。
在一個實施例中，寡核苷酸-抗體結合物之DAR在約1至約20、約1至約10、約1至約8、約1至約4或約1至約2範圍內。在另一個實施例中，寡核苷酸-抗體結合物之DAR為約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7或約8。
在一些實施例中，結合物包含一或多個、兩個或更多個、三個或更多個、四個或更多個、五個或更多個、六個或更多個、七個或更多個、八個或更多個、九個或更多個、十個或更多個或二十個或更多個Q標籤肽。在一些實施例中，結合物包含一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或二十個Q標籤肽。在一些實施例中，結合物具有2個Q標籤肽。在一些實施例中，結合物包含一或多種、兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種、六種或更多種、七種或更多種、八種或更多種、九種或更多種、十種或更多種或二十種或更多種免疫調節寡核苷酸。在一些實施例中，結合物包含一種、兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種或二十種免疫調節寡核苷酸。在一些實施例中，結合物具有一種免疫調節寡核苷酸。例示性結合物展示於圖 16A - 16D 中。
在一個態樣中，寡核苷酸-抗體結合物中之寡核苷酸為免疫調節(例如免疫刺激)聚核苷酸。在某些實施例中，免疫調節聚核苷酸包含5-經修飾尿苷或5-經修飾胞苷。在某些實施例中，在免疫調節聚核苷酸之5'端處(例如在兩個5'端核苷當中)包括5-經修飾尿苷(例如5-乙炔基-尿苷)增強聚核苷酸之免疫調節特性。在某些實施例中，免疫調節聚核苷酸比典型的CpG ODN (其長度為18至28個核苷酸)短，例如包含總共約6至約16個核苷酸或約12至約14個核苷酸。在某些實施例中，較短免疫調節聚核苷酸(例如包含總共約6至約16個核苷酸或約12至約14個核苷酸之彼等免疫調節聚核苷酸)保留較長典型CpG ODN之免疫調節活性；或相比於較長CpG ODN，呈現較高免疫調節活性(例如如藉由NFκB活化或藉由活化或功能之細胞表面標記物(諸如CD40、HLADR、CD69或CD80)之表現量的變化或藉由至少一種細胞介素(例如IL-6或IL-10)之含量的變化所量測)。在某些實施例中，免疫調節聚核苷酸包含無鹼基間隔基。在某些實施例中，免疫調節聚核苷酸包含核苷間磷酸三酯。
在某些實施例中，本文所提供之免疫調節聚核苷酸在實質上不犧牲其免疫刺激活性之情況下呈現優於主要含有核苷間磷酸酯(例如超過50%之核苷間磷酸酯)之CpG ODN之穩定性(例如針對核酸酶之穩定性)。此作用可例如藉由併入至少50% (例如至少70%)核苷間硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯或經由納入核苷間磷酸三酯及/或核苷間無鹼基間隔基實現。磷酸三酯及無鹼基間隔基亦方便用於結合於靶向部分。相對於具有完全硫代磷酸酯主鏈之聚核苷酸，基於磷酸酯之磷酸三酯及無鹼基間隔基亦可用於降低脫靶活性。不希望受理論所束縛，此作用可在不妨礙至目標細胞的經靶向部分介導之遞送的情況下藉由減少自遞送來實現。因此，本文所提供之聚核苷酸可包括約15個或更少、約14個或更少、約13個或更少、約12個或更少、約11個或更少、或約10個或更少連續的核苷間硫代磷酸酯。舉例而言，包含總共約12至約16個核苷之免疫刺激聚核苷酸可含有約10個或更少連續核苷間硫代磷酸酯。
本文提供之免疫刺激聚核苷酸可含有總共約50個或更少、約30個或更少、約28個或更少或約16個或更少核苷。免疫刺激聚核苷酸可含有總共至少6個、約10個或更多個，或約12個或更多個核苷。舉例而言，免疫刺激聚核苷酸可含有總共約6至約30個、約6至約28個、約6至約20個、約6至約16個、約10至約20個、約10至約16個、約12至約28個、約12至約20個或約12至約16個核苷。
在某些實施例中，免疫刺激聚核苷酸例如在一或兩個末端(例如在六個5'端核苷或六個3'端核苷內)，包含一或多個磷酸三酯(例如核苷間磷酸三酯)及/或硫代磷酸酯(例如約1至約6或約1至約4)。包括一或多種核苷間磷酸三酯及/或硫代磷酸酯可藉由降低核酸外切酶介導之降解速率來增強聚核苷酸之穩定性。
在某些實施例中，免疫刺激聚核苷酸包含磷酸三酯或末端磷酸二酯，其中磷酸三酯或末端磷酸二酯包含鍵結至靶向部分或結合基團且視情況鍵結至一或多個(例如，約1至約6個)輔助部分的連接子。在某些實施例中，免疫刺激聚核苷酸僅包含一個連接子。在某些實施例中，免疫刺激聚核苷酸僅包含一個結合基團。
本文所提供之聚核苷酸可為混成聚核苷酸，包括股及其部分或完整互補序列。雜交聚核苷酸可具有至少6個互補鹼基對(例如約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22或約23)，直至所包括之較短股中所存在之核苷酸之總數目。舉例而言，混成聚核苷酸之混成部分可含有約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22或約23個鹼基對。
在一個態樣中，寡核苷酸-抗體結合物中之寡核苷酸包含一或多個CpG位點。在一些實施例中，寡核苷酸包含至少1個、至少2個或至少3個CpG位點。在一些實施例中，寡核苷酸為如本文所用之反義寡核苷酸，「經修飾核苷酸」為除核糖核苷酸(2'-羥基核苷酸)以外的核苷酸。在一些實施例中，至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之核苷酸為經修飾核苷酸。如本文所用，經修飾核苷酸包括但不限於：去氧核糖核苷酸、核苷酸模擬物、無鹼基核苷酸、2'-經修飾核苷酸、3'至3'鍵聯(反向)核苷酸、包含非天然鹼基之核苷酸、橋連核苷酸、肽核酸(PNA)、2',3'-斷核苷酸模擬物(解鎖核鹼基類似物)、鎖定核苷酸、3'-O-甲氧基(2'核苷間連接)核苷酸、2'-F-阿糖核苷酸、5'-Me、2'-氟核苷酸、嗎啉基核苷酸、膦酸乙烯酯去氧核糖核苷酸、含有膦酸乙烯酯之核苷酸及含有膦酸環丙酯之核苷酸(cPrpN)。2'-經修飾核苷酸(亦即，在五員糖環之2'位置處具有除羥基外之基團的核苷酸)包括但不限於2'-O-烷基核苷酸、2'-去氧-2'-鹵基核苷酸、2'-去氧核苷酸、2'-甲氧基乙基(2'-O-2-甲氧基乙基)核苷酸、2'-胺基核苷酸、2'胺基烷基核苷酸及2'-烷基核苷酸。在一些實施例中，經修飾核苷酸選自由以下組成之群：5-溴-2'-O-甲基尿苷、5-溴-2'-去氧尿苷、2'-O-甲基尿苷、2'-去氧尿苷、2'-O-甲基胸苷、2'-O-甲基胞苷、2'-O-(2-甲氧基乙基)胸苷及8-側氧基-7,8-二氫-2'-去氧鳥苷。既定化合物之所有位置無需經均一修飾。相反地，可在單一寡核苷酸中或甚至在其單一核苷酸中併入超過一個修飾。寡核苷酸可藉由此項技術中已知之方法合成及/或修飾。一個核苷酸上之修飾獨立於另一個核苷酸上之修飾。
經修飾核鹼基包括合成及天然核鹼基，諸如5-經取代嘧啶、6-氮雜嘧啶及N-2、N-6及O-6經取代嘌呤(例如2-胺基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶或5-丙炔基胞嘧啶)、5-甲基胞嘧啶(5-Me-C)、5羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-胺基腺嘌呤、腺嘌呤及鳥嘌呤之6-烷基(例如6-甲基、6-乙基、6-異丙基或6-正丁基)衍生物、腺嘌呤及鳥嘌呤之2-烷基(例如2-甲基、2-乙基、2-異丙基或2-正丁基)及其他烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、2-硫代胞嘧啶、5-鹵代尿嘧啶(例如5-溴尿嘧啶及5-碘尿嘧啶)、胞嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫脲嘧啶、8-鹵基、8-胺基、8-硫氫基、8-硫代烷基、8-羥基、8-側氧基及其他8-經取代腺嘌呤及鳥嘌呤、5-鹵基(例如5-溴及5-碘)、5-三氟甲基及其他5-經取代尿嘧啶及胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤及7-甲基腺嘌呤、8-氮鳥嘌呤及8-氮腺嘌呤、7-去氮鳥嘌呤、7-去氮腺嘌呤、3-去氮鳥嘌呤及3-去氮腺嘌呤。
在一些實施例中，寡核苷酸之一或多個核苷酸藉由非標準鍵聯或主鏈(例如，經修飾核苷間鍵聯或經修飾主鏈)連接。在一些實施例中，經修飾核苷間鍵聯為含非磷酸酯共價核苷間鍵聯。經修飾之核苷間鍵聯或主鏈包括但不限於5'硫代磷酸酯基、對掌性硫代磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、胺基烷基-磷酸三酯、膦酸烷基酯(例如膦酸甲酯或3'-伸烷基膦酸酯)、對掌性膦酸酯、亞膦酸酯、胺基磷酸酯(例如3'-胺基胺基磷酸酯、胺基烷基胺基磷酸酯或硫羰基胺基磷酸酯)、硫羰基烷基-膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯、N-嗎啉基鍵聯、具有正常3'-5'鍵聯之硼烷磷酸酯、硼烷磷酸酯之2'-5'連接之類似物或具有反向極性之硼烷磷酸酯，其中相鄰核苷單元對使3'-5'連接至5'-3'或使2'-5'連接至5'-2'。在一些實施例中，經修飾之核苷間鍵或主鏈不具有磷原子。不具有磷原子之經修飾之核苷間鍵包括但不限於短鏈烷基或環烷基糖間鍵、混合雜原子及烷基或環烷基糖間鍵，或一或多個短鏈雜原子或雜環糖間鍵。在一些實施例中，經修飾之核苷間主鏈包括但不限於矽氧烷主鏈、硫醚主鏈、亞碸主鏈、碸主鏈、甲醯基及硫甲醯基主鏈、亞甲基甲醯基及硫甲醯基主鏈、含有烯烴之主鏈、胺基磺酸酯主鏈、亞甲基亞胺基及亞甲基肼基主鏈、磺酸酯及磺醯胺主鏈、醯胺主鏈及其他具有混合N、O、S及CH2 組分之主鏈。
在一些實施例中，寡核苷酸包含至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個或至少15個硫代磷酸酯鍵聯。在一些實施例中，寡核苷酸包含至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個或至少15個二硫代磷酸酯鍵聯。在一些實施例中，寡核苷酸包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個硫代磷酸酯鍵聯。在一些實施例中，寡核苷酸包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個二硫代磷酸酯鍵聯。在一些實施例中，硫代磷酸酯核苷間鍵聯或二硫代磷酸酯核苷間鍵聯在自寡核苷酸之5'端之位置1-3、2-4、3-5、4-6、4-5、6-8、7-9、8-10、9-11、10-12、11-13、12-14、13-15、14-16、15-17、16-18、17-19、18-20或19-21處之核苷酸之間。在一些實施例中，寡核苷酸包含一或多個經修飾核苷酸及一或多個經修飾核苷間鍵聯。
在一些實施例中，寡核苷酸包含端帽。在一些實施例中，端帽處於寡核苷酸之3'端。在一些實施例中，端帽處於寡核苷酸之5'端。在一些實施例中，端帽處於寡核苷酸之5'端及3'端。術語「端帽」亦可被稱作「帽」且具有此項技術中大體上所接受的意義。舉例而言，該術語係指部分，其可為可併入一或多個本發明之核酸分子之一或多個末端的經化學修飾之核苷酸或非核苷酸。此等末端修飾可保護核酸分子免於核酸外切酶降解，且可有助於在細胞內遞送及/或定位。在非限制性實例中，帽包括但不限於聚合物；配位體；鎖定核酸(locked nucleic acid，LNA)；甘油基；無鹼基核糖殘基；反向去氧基無鹼基殘基；反向核苷酸；4',5'-亞甲基核苷酸；1-(β-D-赤呋喃醣基)核苷酸；5'-巰基部分；4'-硫代核苷酸；碳環核苷酸；1,5-無水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；經修飾鹼基核苷酸；二硫代磷酸酯鍵聯；蘇-呋喃戊醣基核苷酸；非環狀3',4'-斷核苷酸；非環狀3,4-二羥丁基核苷酸；非環狀3,5-二羥基戊基核苷酸；3'-3'-反向核苷酸部分；3'-3'-反向無鹼基部分；3'-2'-反向核苷酸部分；3'-2'-反向無鹼基部分；1,4-丁二醇磷酸酯；3'-胺基磷酸酯；己基磷酸酯；磷酸胺己酯；3'-磷酸酯；3'-硫代磷酸酯；5'-5'-反向核苷酸部分；5'-5'-反向無鹼基部分；5'-胺基磷酸酯；5'-硫代磷酸酯；1,4-丁二醇磷酸酯；5'-胺基；橋接及/或非橋接5'-胺基磷酸酯；硫代磷酸酯及/或二硫代磷酸酯；或橋接或非橋接甲基磷酸部分。在一些實施例中，寡核苷酸包含一或多個端帽分子。在一些實施例中，[N]為3'端帽。在一些實施例中，3'端帽為O-(3-羥丙基)硫代磷酸酯。
在一些實施例中，寡核苷酸之長度為約10-30個、約10-15個、約15-20個、約20-25個、約25-30個、約15-25個核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸之長度為約18、19、20、21、22、23、24或25個核苷酸。
在另一態樣中，結合物之寡核苷酸為：
Figure 02_image315
， 其中 b及c各自獨立地為1至25之整數；其限制條件為b及c之總和為至少5；
Figure 02_image317
指示該免疫調節寡核苷酸P與該結合物之其餘部分的連接點； X5 ' 為具有結構
Figure 02_image319
之5'端核苷； X3 ' 為具有結構
Figure 02_image321
之3'端核苷； YPTE 為具有結構
Figure 02_image323
之核苷間磷酸三酯，其中*指示與該寡核苷酸之其餘部分之連接點，且
Figure 02_image325
指示與該連接子L之連接點，或若L不存在，則
Figure 02_image191
指示與該穀胺醯胺殘基處之該Q標籤肽經由醯胺鍵之連接點； Y3 ' 為具有結構
Figure 02_image328
之末端磷酸三酯； 各XN 獨立地為具有結構
Figure 02_image330
之核苷； 各YN 獨立地為具有結構
Figure 02_image332
之核苷間連接子； 其中各BN 獨立地為經修飾或未經修飾之核鹼基； 各RN 獨立地為-H或-O-C1 - 4 烷基，其中該-O-C1 - 4 烷基之該C1 - 4 烷基視情況進一步經-O-C1 -4 烷基取代； B5 ' 及B3 ' 獨立地為經修飾或未經修飾之核鹼基； R5 ' 及R3 ' 獨立地為-H或-O-C1 -C4 烷基，其中該-O-C1 -4 烷基之C1 - 4 烷基視情況進一步經-O-C1 -4 烷基取代； 各T1 獨立地為O或S； 各T2 獨立地為O- 或S- ；及 T3 為包含寡乙二醇部分之基團；及 R1 為C1 - 4 伸烷基-羥基。
在某些實施例中，寡核苷酸包含具有經修飾核鹼基之核苷酸。在一些實施例中，B5 ' 為經修飾核鹼基。在其他實施例中，B3 ' 為經修飾核鹼基。在一些實施例中，B5 ' 為未經修飾之核鹼基。在其他實施例中，B3 ' 為未經修飾之核鹼基。在其他實施例中，至少一個BN 為經修飾核鹼基。
在某些實施例中，b為介於約1至約15範圍內之整數。在某些實施例中，b為約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14或約15之整數。在某些實施例中，b為約3、約4、約11或約14之整數。在某些實施例中，b為約3之整數。在某些實施例中，b為約4之整數。在某些實施例中，b為約11之整數。在某些實施例中，b為約14之整數。
在某些實施例中，c為在約0至約10範圍內之整數。在某些實施例中，c為約0、約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9或約10之整數。在某些實施例中，c為約0或約8之整數。在某些實施例中，c為約0之整數。在某些實施例中，c為約8之整數。
在某些實施例中，b為約3之整數，且c為約8之整數。在某些實施例中，b為約4之整數，且c為約8之整數。在某些實施例中，b為約11之整數，且c為約0之整數。在某些實施例中，b為約14之整數，且c為約0之整數。
在某些實施例中，b及c總共在約5至約20範圍內。在某些實施例中，b及c總共在約5至約15範圍內。在某些實施例中，b及c總共為約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14或約15。在某些實施例中，b及c總共為約8、約9、約10、約11、約12、約13或約14。在某些實施例中，b及c總共為約11。在某些實施例中，b及c總共為約12。在某些實施例中，b及c總共為約14。
在某些實施例中，各XN 獨立地為2'-去氧核苷或2'-經修飾核苷。在某些實施例中，各XN 獨立地為2'-去氧腺苷(A)、2'-去氧鳥苷(G)、2'-去氧胞苷(C)、5-鹵基-2'-去氧胞苷、2'-去氧胸苷(T)、2'-去氧尿苷(U)、5-鹵基-2'-去氧尿苷、2'-氟核苷或2'-甲氧基核苷或2'-(2-甲氧基乙氧基)核苷。在某些實施例中，各XN 獨立地為2'-去氧核苷。在某些實施例中，各XN 獨立地為2'-去氧腺苷、2'-去氧鳥苷、2'-去氧胞苷、5-鹵基-2'-去氧胞苷、2'-去氧胸苷、2'-去氧尿苷或5-鹵基-2'-去氧尿苷。在某些實施例中，各XN 獨立地為2'-去氧腺苷、2'-去氧鳥苷、2'-去氧胞苷、2'-去氧胸苷、5-溴-2'-去氧尿苷或5-碘-2'-去氧尿苷。
在某些實施例中，X3 ' 為2'-去氧核苷或2'-經修飾核苷。在某些實施例中，X3 ' 為2'-去氧核苷。在某些實施例中，X3 ' 為2'-去氧腺苷、2'-去氧鳥苷、2'-去氧胞苷、5-鹵基-2'-去氧胞苷、2'-去氧胸苷、2'-去氧尿苷、5-鹵基-2'-去氧尿苷、2'-氟核苷、2'-甲氧基核苷或2'-(2-甲氧基乙氧基)核苷。在某些實施例中，X3 ' 為2'-去氧腺苷、2'-去氧鳥苷、2'-去氧胞苷、5-鹵基-2'-去氧胞苷、2'-去氧胸苷、2'-去氧尿苷或5-鹵基-2'-去氧尿苷。在某些實施例中，X3 ' 為2'-去氧胸苷。在某些實施例中，X3 ' 為具有經取代嘧啶鹼基之2'-去氧核苷。在某些實施例中，X3 ' 為具有5-經取代嘧啶鹼基之2'-去氧核苷。在某些實施例中，X3 ' 為2'-去氧胸苷、5-鹵基-2'-去氧胞苷或5-鹵基-2'-去氧尿苷。在某些實施例中，X3 ' 為2'-去氧胸苷、5-溴-2'-去氧胞苷、5-碘-2'-去氧胞苷、5-溴-2'-去氧尿苷或5-碘-2'-去氧尿苷。在某些實施例中，X3 ' 為2'-去氧胸苷、5-溴-2'-去氧尿苷或5-碘-2'-去氧尿苷。在某些實施例中，X3 ' 為包含3'封端基團之末端核苷酸。在某些實施例中，3'封端基團為末端磷酸酯。在某些實施例中，3'封端基團為3-羥基-丙基磷醯基(亦即，-P(O2 )-OCH2 CH2 CH2 OH)。
在某些實施例中，X5 ' 為2'-去氧核苷或2'-經修飾核苷。在某些實施例中，X5 ' 為2'-去氧核苷。在某些實施例中，X5 ' 為2'-去氧腺苷、2'-去氧鳥苷、2'-去氧胞苷、5-鹵基-2'-去氧胞苷、2'-去氧胸苷、2'-去氧尿苷、5-鹵基-2'-去氧尿苷、2'-氟核苷、2'-甲氧基核苷或2'-(2-甲氧基乙氧基)核苷。在某些實施例中，X5 ' 為2'-去氧腺苷、2'-去氧鳥苷、2'-去氧胞苷、5-鹵基-2'-去氧胞苷、2'-去氧胸苷、2'-去氧尿苷或5-鹵基-2'-去氧尿苷。在某些實施例中，X5 ' 為具有經取代嘧啶鹼基之2'-去氧核苷。在某些實施例中，X5 ' 為具有5-經取代嘧啶鹼基之2'-去氧核苷。在某些實施例中，X5 ' 為2'-去氧胸苷、5-鹵基-2'-去氧胞苷或5-鹵基-2'-去氧尿苷。在某些實施例中，X5 ' 為5-鹵基-2'-去氧胞苷。在一些實施例中，X5 ' 為2'-去氧尿苷、5-鹵基-2'-去氧尿苷、2'-甲氧基尿苷或5-鹵基-2'-甲氧基尿苷。在某些實施例中，X5 ' 為5-鹵基-2'-去氧尿苷。在某些其他實施例中，X5 ' 為2'-去氧尿苷。在某些實施例中，X5 ' 為5-鹵基-2'-甲氧基尿苷。在某些其他實施例中，X5 ' 為2'-甲氧基尿苷。在某些實施例中，X5 ' 為2'-去氧胸苷、5-溴-2'-去氧胞苷、5-碘-2'-去氧胞苷、5-溴-2'-去氧尿苷或5-碘-2'-去氧尿苷。在某些實施例中，X5 ' 為2'-去氧胸苷、5-溴-2'-去氧尿苷或5-碘-2'-去氧尿苷。在某些實施例中，X5 ' 為5-溴-2'-去氧尿苷。在某些實施例中，X5 ' 為5-碘-2'-去氧尿苷。在某些實施例中，X5 ' 具有3'-硫代磷酸酯基。在某些實施例中，X5 ' 具有擁有Rp之對掌性的3'-硫代磷酸酯基。在某些實施例中，X5 ' 具有擁有Sp之對掌性的3'-硫代磷酸酯基。
在某些實施例中，YPTE 為核苷間磷酸三酯。
在一些實施例中，YPTE 為
Figure 02_image334
或
Figure 02_image336
，其中Z為O或S；d為約0至約50範圍內之整數；結構右側之兩個
Figure 02_image338
指示與寡核苷酸P的連接點；且結構左側之
Figure 02_image340
指示與結合物其餘部分的連接點。在某些實施例中，Z為O。在某些實施例中，Z為S。在某些實施例中，d為約0至約10範圍內之整數。在某些實施例中，d為約0至約5範圍內之整數。在某些實施例中，d為約0、約1、約2、約3、約4或約5之整數。在某些實施例中，d為約0、約1或約3之整數。
在一些實施例中，YPTE 為
Figure 02_image342
，其中Z為O或S；d為介於約0至約50範圍內之整數；結構右側之兩個
Figure 02_image011
指示與寡核苷酸P之連接點；且結構左側之
Figure 02_image191
指示與結合物之其餘部分的連接點。在某些實施例中，Z為O。在某些實施例中，Z為S。在某些實施例中，d為約0至約10範圍內之整數。在某些實施例中，d為約0至約5範圍內之整數。在某些實施例中，d為約0、約1、約2、約3、約4或約5之整數。在某些實施例中，d為約0、約1或約3之整數。
在某些實施例中，寡核苷酸包含一種額外核苷間磷酸三酯。在一個實施例中，額外核苷間磷酸三酯為C1 - 6 烷基磷酸三酯。在另一實施例中，額外核苷間磷酸三酯為乙基磷酸三酯。
在某些實施例中，寡核苷酸包含一個5-鹵基-2'-去氧尿苷。在一個實施例中，5-鹵基-2'-去氧尿苷為5-氟-2'-去氧尿苷、5-溴-2'-去氧尿苷或5-碘-2'-去氧尿苷。在另一實施例中，5-鹵基-2'-去氧尿苷為5-溴-2'-去氧尿苷或5-碘-2'-去氧尿苷。在又一實施例中，5-鹵基-2'-去氧尿苷為5-氟-2'-去氧尿苷。在又一實施例中，5-鹵基-2'-去氧尿苷為5-溴-2'-去氧尿苷。在再一實施例中，5-鹵基-2'-去氧尿苷為5-碘-2'-去氧尿苷。
在某些實施例中，寡核苷酸包含三個或更多個2'-去氧胞苷。在某些實施例中，寡核苷酸包含三個2'-去氧胞苷。
在某些實施例中，寡核苷酸包含四個或更多個2'-去氧鳥苷。在某些實施例中，寡核苷酸包含四個2'-去氧鳥苷。
在某些實施例中，寡核苷酸包含三個2'-去氧胞苷及四個2'-去氧鳥苷。在某些實施例中，寡核苷酸包含一個、兩個或三個CG二核苷酸。在某些實施例中，寡核苷酸包含三個CG二核苷酸。
在某些實施例中，寡核苷酸包含三個或更多個2'-去氧胸苷。在某些實施例中，寡核苷酸包含三、四、五、六、七或八個2'-去氧胸苷。在某些實施例中，寡核苷酸包含三個、四個、五個或八個2'-去氧胸苷。
在某些實施例中，寡核苷酸不包含2'-去氧腺苷。在某些實施例中，寡核苷酸包含一或兩個2'-去氧腺苷。
在某些實施例中，寡核苷酸之長度在約5至約20或約6至約15範圍內。在某些實施例中，寡核苷酸之長度為約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14或約15。在某些實施例中，寡核苷酸之長度為約10、約11、約12、約13、約14或約15。
在某些實施例中，寡核苷酸包含一或多種核苷間硫代磷酸酯。在某些實施例中，寡核苷酸中之全部核苷間磷酸酯均為核苷間硫代磷酸酯。在某些實施例中，寡核苷酸包含一或多種對掌性核苷間硫代磷酸酯。
在某些實施例中，包含N1 N2 CGN3 CG(T)x GN4 CGN5 T (SEQ ID NO:174)之序列的寡核苷酸或其立體異構體、兩種或兩種以上非對映異構體之混合物、互變異構體或兩種或兩種以上互變異構體之混合物；或其醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物或水合物如例如WO2018/189382 A1中所描述。
在一個實施例中，寡核苷酸包含N1 N2 CGN3 CG(T)x GN4 CGN5 T (SEQ ID NO:174)之序列，或其立體異構體、兩種或兩種以上非對映異構體之混合物、互變異構體或兩種或兩種以上互變異構體之混合物；或其醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物或水合物；其中： x為介於約1至約4範圍內之整數； N1 不存在或為2'-去氧胸苷； N2 為具有經修飾核鹼基之2'-去氧核糖核苷酸； N3 為2'-去氧腺苷或2'-去氧胸苷，各自視情況包含3'-磷酸三酯； N4 為2'-去氧腺苷或2'-去氧胸苷； N5 為2'-去氧胸苷，視情況包含3'-磷酸三酯；及 C為2'-去氧核苷且G為2'-去氧鳥苷。
在某些實施例中，在N1 N2 CGN3 CG(T)x GN4 CGN5 T (SEQ ID NO:174)中，x為約1、約2、約3或約4之整數。在某些實施例中，在N1 N2 CGN3 CG(T)x GN4 CGN5 T (SEQ ID NO:174)中，x為約1之整數。在某些實施例中，在N1 N2 CGN3 CG(T)x GN4 CGN5 T (SEQ ID NO:174)中，x為約4之整數。
在某些實施例中，在N1 N2 CGN3 CG(T)x GN4 CGN5 T (SEQ ID NO:174)中，N1 不存在。在某些實施例中，在N1 N2 CGN3 CG(T)x GN4 CGN5 T (SEQ ID NO:174)中，N1 為2'-去氧胸苷。
在某些實施例中，在N1 N2 CGN3 CG(T)x GN4 CGN5 T (SEQ ID NO:174)中，N2 為具有經取代嘧啶鹼基之2'-去氧核糖核苷酸。在某些實施例中，在N1 N2 CGN3 CG(T)x GN4 CGN5 T (SEQ ID NO:174)中，N2 為具有5-經取代嘧啶鹼基之2'-去氧核糖核苷酸。在某些實施例中，在N1 N2 CGN3 CG(T)x GN4 CGN5 T (SEQ ID NO:174)中，N2 為5-鹵基-2'-去氧胞苷或5-鹵基-2'-去氧尿苷。在某些實施例中，在N1 N2 CGN3 CG(T)x GN4 CGN5 T (SEQ ID NO:174)中，N2 為5-溴-2'-去氧尿苷或5-碘-2'-去氧尿苷。
在某些實施例中，在N1 N2 CGN3 CG(T)x GN4 CGN5 T (SEQ ID NO:174)中，N3 為包含3'-磷酸三酯的2'-去氧腺苷。在某些實施例中，在N1 N2 CGN3 CG(T)x GN4 CGN5 T (SEQ ID NO:174)中，N3 為2'-去氧胸苷。在某些實施例中，在N1 N2 CGN3 CG(T)x GN4 CGN5 T (SEQ ID NO:174)中，N3 為包含3'-磷酸三酯的2'-去氧胸苷。
在某些實施例中，在N1 N2 CGN3 CG(T)x GN4 CGN5 T (SEQ ID NO:174)中，N4 為2'-去氧腺苷。在某些實施例中，在N1 N2 CGN3 CG(T)x GN4 CGN5 T (SEQ ID NO:174)中，N4 為2'-去氧胸苷。
在某些實施例中，在N1 N2 CGN3 CG(T)x GN4 CGN5 T (SEQ ID NO:174)中，N5 為2'-去氧胸苷。在某些實施例中，在N1 N2 CGN3 CG(T)x GN4 CGN5 T (SEQ ID NO:174)中，N5 為包含3'-磷酸三酯的2'-去氧胸苷。
在某些實施例中，N1 N2 CGN3 CG(T)x GN4 CGN5 T (SEQ ID NO:174)之寡核苷酸包含一或多個核苷間硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯。在某些實施例中，N1 N2 CGN3 CG(T)x GN4 CGN5 T (SEQ ID NO:174)之寡核苷酸包含至少一個對掌性核苷間硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯。在某些實施例中，N1 N2 CGN3 CG(T)x GN4 CGN5 T (SEQ ID NO:174)之寡核苷酸包含至少一種對掌性二硫代磷酸酯。在某些實施例中，N1 N2 CGN3 CG(T)x GN4 CGN5 T (SEQ ID NO:174)之寡核苷酸為如例如WO2018/189382 A1中所描述之寡核苷酸序列。
在某些實施例中，本文提供之寡核苷酸為免疫刺激聚核苷酸。在某些實施例中，本文中提供之寡核苷酸充當PAMS。在某些實施例中，本文提供之寡核苷酸藉由觸發TLR9信號傳導來活化先天性免疫反應或刺激適應性免疫反應。在某些實施例中，本文中提供之寡核苷酸係TLR9促效劑。
在某些實施例中，本文提供之寡核苷酸為CpG寡核苷酸，其包含包括5-鹵尿苷或5-炔基尿苷之修飾或其截短形式(例如包含總共約6至約16個核苷的彼等修飾)。在某些實施例中，本文提供之截短寡核苷酸包含截短寡核苷酸序列，自其消除一或多個3'端核苷酸或切除序列內核苷酸中之一或多者)。
在某些實施例中，本文提供之寡核苷酸包含至少一個免疫刺激序列(immunostimulating sequence，ISS)。在某些實施例中，本文提供之寡核苷酸包含約1、約2、約3或約4個ISS。免疫刺激聚核苷酸中之ISS視靶向生物體而定。用於本文中提供之寡核苷酸中的ISS之共同特徵為胞苷-p-鳥苷序列，其中p為核苷間磷酸二酯(例如磷酸酯或硫代磷酸酯)或核苷間磷酸三酯。在某些實施例中，ISS中之胞苷及鳥苷各自獨立地包含2'-去氧核糖。在某些實施例中，本文中提供之寡核苷酸包含約1、約2或約3個人類ISS。在某些實施例中，人類ISS為CG或NCG，其中N為尿苷、胞苷或胸苷或經修飾尿苷或胞苷；且G為鳥苷或經修飾鳥苷。在某些實施例中，經修飾尿苷或胞苷為5-鹵尿苷(例如5-碘尿苷或5-溴尿苷)、5-炔基尿苷(例如5-乙炔基尿苷或5-丙炔基尿苷)、5-雜芳基尿苷或5-鹵胞苷。在某些實施例中，經修飾鳥苷為7-去氮鳥苷。在某些實施例中，人類ISS為NCG，在一個實施例中，N為5-鹵尿苷。在某些實施例中，人類ISS為UCG，在一個實施例中，U為5-炔基尿苷，且在另一實施例中，U為5-乙炔基尿苷。在某些實施例中，本文提供之靶向人類之寡核苷酸在包括5'端核苷酸之四個連續核苷酸內包含ISS。在某些實施例中，本文提供之靶向人類之寡核苷酸包含5'端ISS。在某些實施例中，本文提供之寡核苷酸包含鼠類ISS。在某些實施例中，鼠類ISS係六聚核苷酸序列：Pu-Pu-CG-Py-Py，其中各Pu獨立地為嘌呤核苷酸，且各Py獨立地為嘧啶核苷酸。
在某些實施例中，本文所提供之寡核苷酸中相對於CpG的5'-側接核苷酸不含2'-烷氧基核糖。在某些實施例中，本文提供之寡核苷酸中相對於CpG之5'-側接核苷酸僅包含2'-去氧核糖作為糖。
在某些實施例中，本文提供之寡核苷酸具有(1)高含量硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯(例如，至少50%、至少60%、至少70%或至少80%核苷可藉由硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯連接)；(2)不存在聚G尾；(3)寡核苷酸中之核苷包含2'-去氧核糖或2'-經修飾核糖(例如2'-鹵基(例如2'-氟、2'-溴或2'-碘)或視情況經取代之2'-烷氧基(例如2'-甲氧基))；及/或(4)包括作為NCG的5'-端ISS，其中N為尿苷、胞苷或胸苷或經修飾尿苷或胞苷，且G為鳥苷或經修飾鳥苷。
在某些實施例中，本文中提供之寡核苷酸藉由減少TLR9信號傳導之活化(例如經由TLR9拮抗作用)來遏制適應性免疫反應。在某些實施例中，本文所提供之免疫抑制聚核苷酸包含至少兩個2'-烷氧基核苷酸，該等核苷酸相對於CpG為5'-側接，如由式N1 -N2 -CG所述，其中N1 及N2 各自獨立地為含有2'-烷氧基核糖(例如2'-甲氧基核糖)之核苷酸。
在一些實施例中，寡核苷酸具有結構
Figure 02_image346
， 其中
Figure 02_image348
及
Figure 02_image350
指示該寡核苷酸內之連接點； 各T1 獨立地為O或S； 各T2 為O- 或S- ； T3 為基團
Figure 02_image352
，其中
Figure 02_image354
指示與L之連接點且其中
Figure 02_image356
指示與該寡核苷酸之其餘部分的連接點； Z為O或S； U5 ' 為-H或鹵素； R5 ' 為-H或甲氧基； Rc1 為-H或甲氧基； Rg1 、Rg2 、Rg3 及Rg4 為H或側氧基，其中 R3 ' 為甲氧基； R1 為C1 - 4 伸烷基-羥基； R2 為-H或甲基；且 n為0至2之整數。
在其他實施例中，寡核苷酸具有結構
Figure 02_image358
， 其中
Figure 02_image360
及
Figure 02_image362
指示該寡核苷酸內之連接點； 各T1 獨立地為O或S； 各T2 為O- 或S- ； T3 為基團
Figure 02_image364
，其中
Figure 02_image191
指示與L之連接點且其中
Figure 02_image367
指示與該寡核苷酸之其餘部分的連接點； Z為O或S； R5 ' 為-H或甲氧基； Rc1 為-H或甲氧基； Rg1 、Rg2 、Rg3 及Rg4 為H或側氧基，其中 R3 ' 為甲氧基； R1 為C1 - 4 伸烷基-羥基； R2 為-H或甲基；且 n為0至2之整數。
在其他實施例中，寡核苷酸具有結構
Figure 02_image369
， 其中
Figure 02_image371
及
Figure 02_image373
指示該寡核苷酸內之連接點； 各T1 獨立地為O或S； 各T2 為O- 或S- ； T3 為基團
Figure 02_image375
，其中
Figure 02_image377
指示與L之連接點且其中
Figure 02_image379
指示與該寡核苷酸之其餘部分的連接點； Z為O或S； R5 ' 為-H或甲氧基； Rc1 為-H或甲氧基； Rg1 、Rg2 、Rg3 及Rg4 為H或側氧基，其中 R3 ' 為甲氧基； R1 為C1 - 4 伸烷基-羥基； R2 為-H或甲基；且 n為0至2之整數。
在一些實施例中，寡核苷酸包含與 表 1 中所示之序列相差0、1、2或3個核鹼基的未經修飾之序列中之一或多者。在一些實施例中，寡核苷酸包含與 表 2 中所示之序列相差0、1、2或3個核鹼基的經修飾之序列中之一或多者。表 1 . 未經修飾之寡核苷酸
SEQ ID NO. 未經修飾之寡核苷酸序列 (5'—＞3')
1 tucgtcgtgacgtt
2 ucgtcgtgtcgtt
129 tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt
表 2 . 經修飾之寡核苷酸
SEQ ID NO. 經修飾之寡核苷酸序列 (5'—＞3') 化合物 #
3 u scsgst scsgstsgstscsgstsT -c3 1.1b
4 u scs g st scsgstsgstscsgsts t -c3 2.1b
5 u scsgst scs g stsgstscsgsts t -c3 2.2b
6 u scsgst scsgsts g stscsgsts t -c3 2.3b
7 u scsgst scsgstsgstscs g sts t -c3 2.4b
8 u scsgst scsgstsgstscsgsts t -c3 3.1b
9 u scsgst scsgstsgstscsgsts t s t -c3 3.2b
10 u scsgst scsgstsgstscsgsts t s t s t -c3 3.3b
11 u scsgst scsgstsgstscsgsts t -c3 4.1b
12 u scsgst scsgstsgstscsgsts t s t -c3 4.2b
13 u s c sgst scsgstsgstscsgsts t s t -c3 4.3b
14 u scs2gs t scsgstsgstscsgsts t -c3 5.1a
15 u scsgs2 t scsgstsgstscsgsts t -c3 5.2a
16 u scsgs t scs2gstsgstscsgsts t -c3 5.3a
17 u scsgs t scsgs2tsgstscsgsts t -c3 5.4a
18 u scsgs t scsgsts2gstscsgsts t -c3 5.5a
19 u scsgs t scsgstsgs2tscsgsts t -c3 5.6a
20 u scsgs t scsgstsgsts2csgsts t -c3 5.7a
21 u scsgs t scsgstsgstscs2gsts t -c3 5.8a
22 u scsgs t scsgstsgstscsgs2ts t -c3 5.9a
23 u scsgs t scsgstsgstscsgsts2 t -c3 5.10a
24 u scsgs t scsgstsgstscsgsts u s2-c3 5.11a
25 u scs2gs t scsgstsgstscsgsts u s2-c3 5.12a
26 u s c sgs2t scsgstsgstscsgsts t s t -c3 6.1b
27 u s c sgst scsgstsgsts2csgsts t s t -c3 6.2b
28 u s c sgs2t scsgstsgsts2csgsts t s t -c3 6.3b
29 u scs2gst scsgstsgstscsgsts t s t -c3 7.1b
30 u scsgst scsgstsgs2tscsgsts t s t -c3 7.2b
31 u scs2gst scsgstsgs2tscsgsts t s t -c3 7.3b
32 u scsgst scs2gstsgstscsgsts t s t -c3 7.4b
33 u scsgst scsgs2tsgstscsgsts t s t -c3 7.5b
34 u scsgst scsgsts2gstscsgsts t s t -c3 7.6b
35 u scsgst scsgstsgsts2csgsts t s t -c3 7.7b
36 u scs2gst scsgstsgsts2csgsts t s t -c3 7.8b
37 u scsgs2t scsgstsgstscsgsts t s t -c3 7.9b
38 u scsgst scsgstsgstscs2gsts t s t -c3 7.10b
130 uscsgst scsgstsgstscsgstsT -c3 8.1b
131 uscs g st scsgstsgstscsgsts t -c3 9.1b
132 uscsgst scs g stsgstscsgsts t -c3 9.2b
133 uscsgst scsgsts g stscsgsts t -c3 9.3b
134 uscsgst scsgstsgstscsgsts t -c3 9.4b
135 uscsgst scsgstsgstscsgsts t -c3 10.1b
136 uscsgst scsgstsgstscsgsts t s t -c3 10.2b
137 uscsgst scsgstsgstscsgsts t s t s t -c3 10.3b
138 u scsgst scsgstsgstscsgsts t -c3 12.1b
139 u scsgst scsgstsgstscsgsts t s t -c3 12.2b
140 u s c sgst scsgstsgstscsgsts t s t -c3 12.3b
141 uscs2gs t scsgstsgstscsgsts t -c3 13.1a
142 uscsgs2 t scsgstsgstscsgsts t -c3 13.2a
143 uscsgs t scs2gstsgstscsgsts t -c3 13.3a
144 uscsgs t scsgs2tsgstscsgsts t -c3 13.4a
145 uscsgs t scsgsts2gstscsgsts t -c3 13.5a
146 uscsgs t scsgstsgs2tscsgsts t -c3 13.6a
147 uscsgs t scsgstsgsts2csgsts t -c3 13.7a
148 uscsgs t scsgstsgstscs2gsts t -c3 13.8a
149 uscsgs t scsgstsgstscsgs2ts t -c3 13.9a
150 uscsgs t scsgstsgstscsgsts2 t -c3 13.10a
151 uscsgs t scsgstsgstscsgsts u s2-c3 13.11a
152 uscs2gs t scsgstsgstscsgsts u s2-c3 13.12a
153 u s c sgs2t scsgstsgstscsgsts t s t -c3 14.1b
154 u s c sgst scsgstsgsts2csgsts t s t -c3 14.2b
155 u s c sgs2t scsgstsgsts2csgsts t s t -c3 14.3b
156 uscs2gst scsgstsgstscsgsts t s t -c3 15.1b
157 uscsgst scsgstsgs2tscsgsts t s t -c3 15.2b
158 uscs2gst scsgstsgs2tscsgsts t s t -c3 15.3b
159 uscsgst scs2gstsgstscsgsts t s t -c3 15.4b
160 uscsgst scsgs2tsgstscsgsts t s t -c3 15.5b
161 uscsgst scsgsts2gstscsgsts t s t -c3 15.6b
162 uscsgs t scsgstsgsts2csgsts t s t -c3 15.7a
163 uscsgst scsgstsgsts2csgsts t s t -c3 15.7b
164 uscs2gst scsgstsgsts2csgsts t s t -c3 15.8b
165 uscsgs2t scsgstsgstscsgsts t s t -c3 15.9b
166 uscsgst scsgstsgstscs2gsts t s t -c3 15.10b
*u ：5-溴-2'-去氧尿苷g ：8-側氧基-7,8-二氫-2'-去氧鳥苷u ：5-溴2'-OMe尿苷 c：2'-OMe-胞苷t ：2'-OMe-胸苷 u ：2'-OMe-尿苷u ：2'-去氧尿苷 T：2'-OMOE胸苷t s：磷酸三酯連接子-PEG24 -NH2 ，
Figure 02_image381
其在胸苷之後； t s： 在胸苷之後的
Figure 02_image383
磷酸三酯連接子； 小寫字母：2'-去氧核苷酸 s：硫代磷酸酯鍵聯 s2：二硫代磷酸酯鍵聯 c3：
Figure 02_image385
s2-c3：
Figure 02_image387
在一些實施例中，寡核苷酸用化學標籤官能化以連接於連接部分。在一些實施例中，化學標籤連接至寡核苷酸之核苷間鍵聯。在一些實施例中，化學標籤連接至5'核苷間鍵聯。在一些實施例中，化學標籤連接至3'核苷間鍵聯。在一些實施例中，核苷間鍵聯為硫代磷酸酯鍵聯。在一些實施例中，核苷間鍵聯為二硫代磷酸酯鍵聯。在一些實施例中，化學標籤相比於寡核苷酸之3'端更接近5'端。在一些實施例中，化學標籤連接至核鹼基。連接部分
在另一態樣中，寡核苷酸經由連接部分結合於多肽。連接部分之長度、剛度及化學組成影響結合反應速率及所得結合物之穩定性。在一些實施例中，連接部分包含聚乙二醇(PEG)。在一些實施例中，PEG含有約10-50個乙二醇單元。在一些實施例中，連接部分為脂族鏈。
對於式(A)，連接部分由L表示。在一些實施例中，連接子L包含寡乙二醇或聚乙二醇部分。在某些實施例中，連接子L為具有結構
Figure 02_image389
之基團，其中
Figure 02_image391
指示與YPTE 之連接點，且
Figure 02_image393
指示與結合物之其餘部分的連接點。
在其他實施例中，連接子L為具有結構
Figure 02_image395
之基團，其中
Figure 02_image191
指示與YPTE 之連接點，且
Figure 02_image398
指示與結合物之其餘部分的連接點。在一些實施例中，L1 不存在。在一些實施例中，L1 為未經取代之烷基。在一些實施例中，L1 獨立地為未經取代之C1 - 6 烷基。在一些實施例中，各L1 為甲基或乙基。在一些實施例中，L1 獨立地為經取代之烷基。在一些實施例中，L1 獨立地為經取代之C1 - 6 烷基。在一些實施例中，L1 係經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代之C1 - 6 烷基：烷氧基、醯基、醯氧基、烷氧基羰基、羰基烷氧基、醯胺基、胺基、胺基醯基、胺基羰胺基、胺基羰氧基、環烷基、環烯基、氰基、疊氮基、鹵基、羥基、硝基、羧基、硫醇、硫代烷基、烷基、烯基、炔基、雜環基、胺基磺醯基、磺醯基胺基、磺醯基及側氧基。
在一些實施例中，L2 不存在。在一些實施例中，L2 為未經取代或經取代之烷基。
在一些實施例中，L3 不存在。在一些實施例中，L3 為連接子部分。在一些實施例中，連接子部分為未經取代或經取代之烷基。在一些實施例中，連接子部分獨立地為未經取代之C1 - 6 烷基。在一些實施例中，連接子部分係甲基或乙基。在一些實施例中，連接子部分獨立地為經取代之烷基。在一些實施例中，連接子部分獨立地為經取代之C1 - 6 烷基。在一些實施例中，連接子部分係經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代之C1 - 6 烷基：烷氧基、醯基、醯氧基、烷氧基羰基、羰基烷氧基、醯胺基、胺基、胺基醯基、胺基羰胺基、胺基羰氧基、環烷基、環烯基、氰基、疊氮基、鹵基、羥基、硝基、羧基、硫醇、硫代烷基、烷基、烯基、炔基、雜環基、胺基磺醯基、磺醯基胺基、磺醯基及側氧基。在一些實施例中，連接子部分為胺基酸殘基。在一些實施例中，胺基酸係選自由甘胺酸、丙胺酸、麩胺酸及脯胺酸組成之群。在一些實施例中，連接子為甲基。在一些實施例中，連接子部分為-R5 C(O)R6 NHR7 -，其中R5 及R7 獨立地不存在或為未經取代或經取代之烷基，且R6 為胺基酸殘基。在一些實施例中，胺基酸係選自由甘胺酸、丙胺酸、麩胺酸及脯胺酸組成之群。在一些實施例中，連接子部分為-R3 C(O)NHR4 -，其中R3 及R4 獨立地不存在或為未經取代或經取代之烷基。在一些實施例中，R3 為亞甲基且R4 為-(CH2 )4 -。在一些實施例中，R3 為亞甲基且R4 不存在。當超過一個寡核苷酸(亦即，p=2)時，兩個L1 可不同或相同，兩個L2 可不同或相同且兩個L3 可不同或相同。
在一些實施例中，m為約3-10、約10-15、約15-20、約20-25、約25-30、約5-16、約15-30、約15-25或約20-30。在一些實施例中，m為20、21、22、23、24或25。蛋白質
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸與多肽或蛋白質(例如抗體)結合。在一些實施例中，寡核苷酸經由一或多個Q標籤與抗體結合。在一些實施例中，Q標籤包含連接至結合物之其餘部分的穀胺醯胺殘基。在可與前述實施例中之任一者組合的本發明態樣之其他實施例中，各Q標籤獨立地包含或係選自由SEQ ID NO: 39-55組成之群的肽序列。在一些實施例中，各Q標籤獨立地包含或係選自由 表 3 之肽序列組成之群的肽序列。在本態樣之其他實施例中，各Q標籤獨立地包含或係選自由SEQ ID NO: 40-55組成之群的肽序列。在其他實施例中，各Q標籤獨立地包含或係選自由SEQ ID NO: 47-49組成之群的肽序列。在一些實施例中，Q標籤包含LLQGG (SEQ ID NO:172)、GGGLLQGG (SEQ ID NO:173)、RPQGF (SEQ ID NO:47)或RPQGFGPP (SEQ ID NO:49)。在一些實施例中，Q標籤包含肽序列RPQGF (SEQ ID NO: 47)。在某些實施例中，包含肽序列RPQGF (SEQ ID NO: 47)之Q標籤係選自由RPQGF (SEQ ID NO:47)、RPQGFPP (SEQ ID NO:48)及RPQGFGPP (SEQ ID NO:49)組成之群。
在一些實施例中，蛋白質為蛋白質片段、肽或Fc融合蛋白。在一些實施例中，蛋白質為選自由以下組成之群的抗體：多株抗體、單株抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體及抗體片段。在一些實施例中，抗體片段係選自由以下組成之群：Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2 、Fv片段、scFv、單域抗體、單重鏈抗體及單輕鏈抗體。在一些實施例中，抗體係人類抗IgG抗體。在一些實施例中，抗體係抗IgG1、抗IgG2或抗IgG4抗體。在一些實施例中，抗體為抗CD22抗體(例如RFB4、EPRA、10F4、m971)。在一些實施例中，抗體包含輕鏈可變域(VL)及重鏈可變域(VH)。在一些實施例中，VH包含序列SEQ ID NO: 56且VL包含序列SEQ ID NO: 57。在一些實施例中，VH包含序列SEQ ID NO: 58且VL包含序列SEQ ID NO: 59。在一些實施例中，VH包含序列SEQ ID NO: 60且VL包含序列SEQ ID NO: 61。在一些實施例中，VH包含序列SEQ ID NO: 62且VL包含序列SEQ ID NO: 63。
在一些實施例中，抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中VH域包含CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3序列，該等序列來自選自由以下組成之群之VH域序列： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSIYDMSWVRQAPGKGLEWVAYISSGGGTTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 64)、QVQLLESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFAFSIYDMNWVRQAPGKGLEWVSAISSGGGTTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 65)、EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYEMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 66)及QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCTVSGFAFSIYDMSWIRQPPGKGLEWIAYISSGGGTTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 67)。
在一些實施例中，抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，且其中VH域包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSIYDMSWVRQAPGKGLEWVAYISSGGGTTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 64)、QVQLLESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFAFSIYDMNWVRQAPGKGLEWVSAISSGGGTTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 65)、EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYEMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 66)及QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCTVSGFAFSIYDMSWIRQPPGKGLEWIAYISSGGGTTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 67)。
在可與前述實施例中之任一者組合的其他實施例中，抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中VL域包含CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3序列，該等序列來自選自由以下組成之群之VL域序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGNTLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 68)、DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIHGYLAWYQQKPGKAPKLLIYYTSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 69)、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 70)、EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDIHGYLNWYQQKPGQAPRLLIYYTSILHSGIPARFSGSGPGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 71)及DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRASQDIHGYLNWYQQKPGQSPQLLIYYTSILHSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 72)。
在可與前述實施例中之任一者組合的一些實施例中，抗體包含Fc區。在某些實施例中，Fc區為選自由以下組成之群的人類Fc區：IgG1 Fc區、IgG2 Fc區及IgG4 Fc區。在一些實施例中，Fc區為野生型人類IgG1、IgG2或IgG4 Fc區。在一些實施例中，相較於缺乏胺基酸取代之人類Fc區之效應功能，該Fc區為包含一或多個減少或消除一或多種效應功能之胺基酸取代的人類Fc區。在又其他實施例中，Fc區為：(a)包含L234A、L235A及/或G237A取代之人類IgG1 Fc區，胺基酸位置係根據EU索引編號；(b)包含A330S及/或P331S取代之人類IgG2 Fc區，胺基酸位置係根據EU索引編號；或(c)包含S228P及/或L235E取代之人類IgG4 Fc區，胺基酸位置係根據EU索引編號。在一些實施例中，相較於缺乏胺基酸取代之人類Fc區之結合，該Fc區為包含一或多個減少或消除與人類C1q之結合的胺基酸取代的人類Fc區。在一些實施例中，相較於缺乏胺基酸取代之人類Fc區之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)，該Fc區為包含一或多種降低或消除ADCC之胺基酸取代的人類Fc區。
目標細胞表面抗原之抗體可觸發免疫刺激性及與免疫細胞上之Fc受體(FcR)接合相關的效應功能。存在多種對特定類別之抗體具有特異性的Fc受體，包括IgG (γ受體)、IgE (η受體)、IgA (α受體)及IgM (μ受體)。細胞表面上Fc區與Fc受體之結合可觸發多種生物反應，包括經抗體塗佈之粒子之吞噬作用(抗體依賴性細胞介導之吞噬作用(antibody-dependent cell-mediated phagocytosis)或ADCP)、免疫複合物之清除、殺手細胞對經抗體塗佈之細胞之溶解(抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)或ADCC)及發炎性介體釋放、胎盤轉移及免疫球蛋白產生之控制。另外，補體之C1組分與抗體之結合可活化補體系統。補體活化對於細胞病原體之溶解可為重要的。然而，補體活化亦可刺激發炎反應且亦可與自體免疫過敏或其他免疫病症有關。結合某些Fc受體之能力降低或消除的變異體Fc區適用於產生藉由靶向、活化或中和配位體功能而不損害或破壞局部細胞或組織來起作用的治療性抗體及Fc融合多肽構築體。
在一些實施例中，Fc域可指具有兩個Fc域單體之二聚體。在野生型Fc域中，兩個Fc域單體藉由兩個CH3抗體恆定域之間的相互作用以及在兩個二聚Fc域單體之鉸鏈域之間形成的一或多個二硫鍵來二聚。在一些實施例中，Fc域突變成缺乏效應功能，例如「死亡Fc域」。在一些實施例中，Fc域中之Fc域單體中之每一者包括CH2抗體恆定域中之胺基酸取代，以減少Fc域與Fc受體(諸如Fcγ受體(FcγR)、Fcα受體(FcαR)或Fcε (FcεR))之間的相互作用或結合。
Fc域不直接參與抗體與其目標之結合，但可參與各種效應功能，諸如抗體參與抗體依賴性細胞毒性。在一些實施例中，本發明之抗體或結合物中之Fc域包含引起效應功能降低之一或多個胺基酸取代、添加或插入、缺失或其任何組合，該等降低之效應功能為諸如抗抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)降低、補體依賴性細胞溶解度(complement-dependent cytolysis，CDC)降低、抗體依賴性細胞介導之吞噬作用(ADCP)降低或其任何組合。在一些實施例中，本發明之抗體或結合物之特徵在於與人類Fc受體之結合減少(例如最小結合或不存在結合)且與補體蛋白C1q之結合減少(例如最小結合或不存在結合)。在一些實施例中，本發明之抗體或結合物之特徵在於與人類FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIB、FcγRIIIB或其任何組合及C1q之結合減少(例如，最小結合或不存在結合)。在一些實施例中，為改變或減弱抗體依賴性效應功能，諸如ADCC、CDC、ADCP或其任何組合，本發明之抗體或結合物中之Fc域屬於IgG類別且在E233、L234、L235、G236、G237、D265、D270、N297、E318、K320、K322、A327、A330、P331或P329 (根據Kabat之EU索引(Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))編號)處包含一或多個胺基酸取代。
在一些實施例中，包含本文所述之非天然Fc區的抗體或結合物相比於包含天然Fc區之多肽構築體，呈現出與Fcγ受體CD16a、CD32a、CD32b、CD32c及CD64中之至少一者減少或消除之結合。在一些情況下，本文所述之抗體或結合物呈現出與CD16a、CD32a、CD32b、CD32c及CD64 Fcγ受體之減少或消除的結合。
CDC係指細胞毒性形式，其中補體級聯藉由與抗體Fc結合之補體組分C1q活化。在一些實施例中，與包含野生型Fc區之抗體或結合物相比，包含本文所述之非天然Fc區之抗體或結合物的C1q結合呈現減少至少5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。在一些情況下，與包含野生型Fc區的抗體或結合物相比，包含如本文所述之非天然Fc區的抗體或結合物呈現出降低的CDC。在一些實施例中，與包含野生型Fc區之抗體或結合物相比，包含如本文所述之非天然Fc區之抗體或結合物的CDC呈現降低至少5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。在一些情況下，相比於包含野生型Fc區之抗體或結合物，包含如本文所述之非天然Fc變異體之抗體或結合物呈現可忽略的CDC。
在一些實施例中，本文中的Fc變異體相對於野生型序列經最低限度地糖基化或糖基化降低。在一些實施例中，經由N297A突變或藉由使N297突變為非N之任何胺基酸實現去糖基化。在一些實施例中，去糖基化藉由破壞模體N-Xaa1-Xaa2-Xaa3 (SEQ ID NO:175)實現，其中N=天冬醯胺；Xaa1=除P (脯胺酸)外之任何胺基酸；Xaa2=T (蘇胺酸)、S (絲胺酸)或C (半胱胺酸)；且Xaa3=除P (脯胺酸)外之任何胺基酸。在一個實施例中，N-Xaa1-Xaa2-Xaa3 (SEQ ID NO:175)模體係指如根據Kabat等人, 1991所指定之殘基297-300。在一些實施例中，N、Xaa1、Xaa2或Xaa3中之任何一或多者之突變使Fc變異體去糖基化。
在一些實施例中，抗體IgG恆定區之變異體(例如Fc變異體)擁有降低的特異性結合Fcγ受體之能力或具有降低的誘導吞噬作用之能力。在一些實施例中，抗體IgG恆定區之變異體(例如Fc變異體)具有降低之特異性結合Fcγ受體之能力且具有降低之誘導吞噬作用之能力。舉例而言，在一些實施例中，Fc域突變成缺乏效應功能，成為典型的「死亡」Fc域。舉例而言，在一些實施例中，Fc域包括已知使Fc域與Fcγ受體之間的相互作用降至最低的特異性胺基酸取代。在一些實施例中，Fc域單體來自IgG1抗體且包括一或多個胺基酸取代L234A、L235A、G237A及N297A (如根據EU編號系統根據Kabat等人, 1991所指定)。在一些實施例中，此類IgG1 Fc變異體中包括一或多種額外突變。人類IgG1 Fc變異體之此類額外突變的非限制性實例包括E318A及K322A。在一些實例中，相比於野生型人類IgG1序列，人類IgG1 Fc變異體總共具有至多12、11、10、9、8、7、6、5或4個或更少突變。在一些實施例中，此類IgG1 Fc變異體中包括一或多個額外缺失。舉例而言，在一些實施例中，刪除Fc IgG1重鏈恆定區之C端離胺酸，例如以在多肽在細菌或哺乳動物細胞中產生時增加多肽之均勻性。在一些實例中，相比於野生型人類IgG1序列，人類IgG1 Fc變異體總共具有至多12、11、10、9、8、7、6、5或4個或更少的缺失。
在一些實施例中，Fc域單體來自IgG2或IgG4抗體且包括胺基酸取代A330S、P331S，或A330S及P331S兩者。前述胺基酸位置係根據Kabat等人(1991)定義。對於給定抗體，可藉由在抗體序列之同源區與「標準」Kabat編號序列比對來確定胺基酸殘基之Kabat編號。在一些實施例中，Fc變異體包含人類IgG2 Fc序列，其包含A330S、P331S及N297A胺基酸取代中之一或多者(如根據EU編號系統根據Kabat等人(1991)所指定)。在一些實施例中，此類IgG2 Fc變異體中包括一或多個額外突變。人類IgG2 Fc變異體之此類額外突變之非限制性實例包括V234A, G237A, P238S, V309L及H268A (如根據EU編號系統根據Kabat等人(1991)所指定)。在一些實例中，相較於野生型人類IgG2序列，人類IgG2 Fc變異體總共具有至多12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或更少的突變。在一些實施例中，此類IgG2 Fc變異體中包括一或多個額外的缺失。舉例而言，在一些實施例中，刪除Fc IgG2重鏈恆定區之C端離胺酸，例如以在多肽在細菌或哺乳動物細胞中產生時提高多肽之均質性。在一些實例中，相較於野生型人類IgG2序列，人類IgG2 Fc變異體總共具有至多12、11、10、9、8、7、6、5或4個或更少的缺失。
在一些實施例中，當Fc變異體為IgG4 Fc變異體時，此類Fc變異體包含S228P突變(如根據Kabat等人(1991)所指定)，例如如表 7 中之SEQ ID NO: 104中所表示。在一些實例中，相比於野生型人類IgG4序列，人類IgG4 Fc變異體總共具有至多12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個突變。
在一些實施例中，Fc變異體包括IgG1 Fc區之突變L234A、L235A、G237A或N297A中之至少一者或IgG2 Fc區之突變A330S、P331S或N297A中之至少一者。在一些實施例中，Fc變異體包括IgG1 Fc區之突變L234A、L235A、G237A或N297A中至少兩者或IgG2 Fc區之突變A330S、P331S或N297A中至少兩者。在一些實施例中，Fc變異體包括IgG1 Fc區之L234A、L235A、G237A或N297A中至少三個突變或由IgG2 Fc區之突變A330S、P331S及N297A組成。在一些實施例中，Fc變異體由突變L234A、L235A、G237A及N297A組成。
在一些實施例中，相比於野生型人類IgG Fc區，Fc變異體呈現減少與個體之Fc受體的結合。在一些實施例中，相比於野生型人類IgG Fc區，Fc變異體呈現消除與個體之Fc受體的結合。在一些實施例中，相較於野生型人類IgG Fc區，Fc變異體呈現降低之吞噬作用。在一些實施例中，相較於野生型人類IgG Fc區，Fc變異體呈現消除之吞噬作用。
在本文中亦稱為ADCC之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性係指一種細胞毒性形式，其中所分泌Ig結合於某些細胞毒性細胞(例如天然殺手(NK)細胞及嗜中性白血球)上所存在之Fc受體(FcR)上，使得此等細胞毒性效應細胞能夠特異性地結合於攜帶抗原之目標細胞且隨後殺死目標細胞。在本文中亦稱作ADCP之抗體依賴性細胞介導之吞噬作用係指一種細胞毒性形式，其中分泌之Ig結合於存在於某些吞噬細胞(例如巨噬細胞)上之Fc受體(FcR)上，使得此等吞噬效應細胞能夠特異性地結合於攜帶抗原之目標細胞且隨後吞噬及消化目標細胞。針對目標細胞表面之配位體特異性高親和力IgG抗體可刺激細胞毒性細胞或吞噬細胞且可用於此類殺死。在一些實施例中，相比於包含野生型Fc區之抗體或結合物，包含如本文所述之Fc變異體之抗體或結合物呈現出降低的ADCC或ADCP。在一些實施例中，相比於包含野生型Fc區之抗體或結合物，包含如本文所述之Fc變異體之抗體或結合物的ADCC或ADCP呈現降低至少5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。在一些實施例中，相比於包含野生型Fc區之抗體或結合物，包含如本文所述之Fc變異體之抗體或結合物呈現出消除的ADCC或ADCP。
在本文中亦稱為CDC之補體定向細胞毒性係指細胞毒性形式，其中補體級聯藉由結合於抗體Fc之補體組分C1q活化。在一些實施例中，相比於包含野生型Fc區之抗體或結合物，包含如本文所述之Fc變異體之抗體或結合物的C1q結合呈現減少至少5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。在一些情況下，與包含野生型Fc區之抗體或結合物相比，包含如本文所述之Fc變異體之抗體或結合物呈現降低的CDC。在一些實施例中，相比於包含野生型Fc區之抗體或結合物，包含如本文所述之Fc變異體之抗體或結合物的CDC呈現降低至少5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。在一些情況下，相比於包含野生型Fc區之抗體或結合物，包含如本文所述之Fc變異體之抗體或結合物呈現可忽略的CDC。
與野生型人類IgG Fc區相比，本文中之Fc變異體包括呈現與Fcγ受體結合減少的變異體。舉例而言，在一些實施例中，Fc變異體呈現與Fcγ受體之結合，該結合小於由野生型人類IgG Fc區與Fcγ受體所呈現之結合，如實例中所述。在一些實例中，Fc變異體與Fcγ受體之結合減少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之因數(完全消除效應功能)。在一些實施例中，減少之結合係針對任一或多個Fcγ受體，例如CD16a、CD32a、CD32b、CD32c或CD64。
在一些實例中，本文所揭示之Fc變異體與其野生型人類IgG Fc區相比呈現吞噬作用之降低。相較於其野生型人類IgG Fc區，此類Fc變異體呈現吞噬作用之降低，其中吞噬作用活性降低例如10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之因數。在一些實例中，Fc變異體相較於其野生型人類IgG Fc區，呈現消除之吞噬作用。
在一些實施例中，本發明之Q標籤連接至抗體、多肽、小分子(例如小分子促效劑或拮抗劑)、天然產物、DNA分子、RNA分子(例如RNA、siRNA、反義寡核苷酸、CRISPR引導RNA等)、其他核酸、CRISPR複合物或碳水化合物。
在一些實施例中，Q標籤連接至抗體之重鏈。在一些實施例中，Q標籤經由連接子(例如胺基酸或其他化學連接子)連接至抗體之重鏈。在一些實施例中，Q標籤連接至抗體之重鏈(例如與重鏈同框融合)。在一些實施例中，Q標籤連接在抗體重鏈之C端。在一些實施例中，Q標籤與抗體重鏈之C端融合(例如與C端之胺基酸序列同框且相鄰)。在一些實施例中，Q標籤係在抗體之Fc域內。在一些實施例中，Q標籤為天然存在的。舉例而言，N297突變至N297A暴露抗體之Q295，其中可能發生結合。在其中Fc區包含N297A取代之某些實施例中，結合物進一步包含如式
Figure 02_image400
中所示連接至Q295殘基之免疫調節寡核苷酸P，其中L為經由醯胺鍵連接至Q295之連接子部分。
在一些實施例中，Q標籤包含 表 3 中所示之一或多個序列。表 3 . Q 標籤肽序列
SEQ ID NO. 肽序列
39                                LSLSPGLLQ GG-OH
40    WPAQ GPT
41       WPQ GPT
42     WAPQ GPT
43       WAQ GPT
44       TPGQ APW
45     PNPQ LPF
46      RPQ QF
47      RPQ GF
48          RPQ GFPP
49             RPQ GFGPP
50 RPRPQ QF
51              LSQ SKVLG
52 WGGQ LL
53                                     WALQ RPHYSYPD
54                                      WALQ RPYTLTES
55                                      WALQ GPYTLTES
在一些實施例中，本文提供之結合物係針對體內目標特異性細胞及組織，以用於靶向遞送經結合之有效負載聚核苷酸。在某些實施例中，由本文提供之結合物靶向之細胞為自然殺手細胞。在某些實施例中，由本文提供之結合物靶向之細胞係骨髓細胞。在某些實施例中，由本文提供之結合物靶向之細胞為B細胞或T細胞。在某些實施例中，由本文提供之結合物靶向之細胞為嗜中性白血球。在某些實施例中，藉由本文所提供之結合物靶向之細胞係單核球。在某些實施例中，由本文提供之結合物靶向之細胞係巨噬細胞。在某些實施例中，由本文提供之結合物靶向之細胞為樹突狀細胞(DC)。在某些實施例中，由本文提供之結合物靶向之細胞為肥大細胞。在某些實施例中，由本文所提供之結合物靶向之細胞係腫瘤相關之巨噬細胞(tumor‐associated macrophage，TAM)。在某些實施例中，由本文所提供之結合物靶向之細胞為骨髓源抑制細胞(myeloid-derived suppressor cell，MDSC)。
在一些實施例中，本發明之抗體或結合物可以裸蛋白質-藥物結合物形式，或以蛋白質-藥物結合物調配以載劑之形式遞送，及例如以囊封形式或作為奈米載劑、奈米粒子、脂質體、聚合物囊泡或病毒包膜之一部分遞送。在一些實施例中，本發明之抗體或結合物可例如藉由與蛋白質轉導域或模擬物結合而胞內遞送。在一些實施例中，本發明之抗體或結合物可藉由電穿孔或顯微注射遞送。
在一些實施例中，本發明結合物靶向超過一種細胞群或細胞類型，例如來自上文所述之細胞群或細胞類型。在一些實施例中，本發明結合物靶向B細胞及單核球。在一些實施例中，本發明結合物靶向B細胞、單核球及/或DC。在一些實施例中，本發明結合物靶向NK與DC。
在某些實施例中，本文提供之結合物中之抗原結合部分為抗體或其抗原結合片段(例如F(ab)2 或Fab)或其經工程改造之衍生物(例如Fcab或融合蛋白(例如scFv))。在某些實施例中，本文提供之結合物中之抗原結合部分為人類或嵌合(例如人類化)抗體。
在一些實施例中，抗體或結合物靶向選自以下之一或多種類型之正常細胞：T細胞、B細胞、自然殺手細胞、嗜中性白血球、肥大細胞、巨噬細胞、抗原呈現細胞(antigen-presenting cell，APC)、嗜鹼性球及嗜酸性球。在一些實施例中，抗體或結合物靶向正常APC。在一些實施例中，抗體或結合物靶向一或多種類型之選自以下的正常APC：B細胞、單核球、樹突狀細胞、朗格罕氏細胞(Langerhans cell)、角質細胞、內皮細胞、星形膠質細胞、纖維母細胞及寡樹突神經膠質細胞。在一些實施例中，抗體或結合物靶向正常B細胞。在一些實施例中，抗體或結合物靶向正常樹突狀細胞。在一些實施例中，抗體或結合物靶向正常巨噬細胞。在一些實施例中，靶向一或多種類型之正常細胞的抗體或結合物不靶向異常細胞，諸如癌細胞。
在一些實施例中，本發明之抗體或結合物可包含多特異性(例如雙特異性)抗體。舉例而言，在一些實施例中，本發明之抗體為包含2個結合B細胞上表現之不同目標的抗原結合域的雙特異性抗體。在一些實施例中，本發明之抗體係雙特異性抗體，其包含結合B細胞上表現之目標的抗原結合位點及結合另一細胞(例如單核球)上表現之目標的抗原結合位點。在一些實施例中，本發明之抗體為雙特異性抗體，其包含結合免疫細胞上表現之目標的抗原結合位點及結合癌細胞表面上表現之目標的抗原結合位點。
在某些實施例中，抗體結合於由B細胞表現之抗原。由可由本發明提供之結合物靶向的B細胞表現之例示性抗原包括但不限於：B220/CD45R、B7-1/CD80、B7-2/CD86、BCMA/TNFRSF17、BLIMP1/PRDM1、C1q R1/CD93、CD117/c-kit、CD11b/整合素α M、CD19、CD1c/BDCA-1、CD1d、CD20、CD21、CD23/Fcε RII、CD24、CD25/IL-2 Rα、CD27/TNFRSF7、CD34、CD37、CD38、CD40/TNFRSF5、CD43、CD5、CD69、CD72、CD83、CXCR4、CXCR5、DEP-1/CD148、EMMPRIN/CD147、FCRL3/FcRH3、Flt-3/Flk-2、HLA-DR、IgM、IL-10、IL-12 Rβ 2、IL-12/IL-35 p35、IL-21、IL-21 R、IL-27 Rα/WSX-1/TCCR、IL-27/IL-35 EBI3次單元、IL-3 Rα/CD123、IL-4 Rα、IL-6受體、IL-7 Rα/CD127、IRF4、II類MHC (I-A/I-E)、腦啡肽酶/CD10、Pax5/BSAP、Sca-1/Ly6、Siglec-2/CD22、STAT1、STAT3、多配位體蛋白聚糖-1/CD138、TACI/TNFRSF13B、TGF-β、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TLR4。在特定實施例中，B細胞特異性抗原係選自CD1、CD2、CD5、CD9、CD11、CD17、CD18、CD19、CD20、CD21/CD35、CD22、CD23、CD24、CD25、CD27、CD30、CD38、CD40、CD45R/B220、CD69、CD70、CD78、CD79a (Igα)、CD79b (Igβ)、CD80、CD86、CD93 (C1Rqp)、CD137/4-1BB、CD138、CD180、CD252/OX40L、CD267、CD268/BAFF-R、CD279/PD1、CD319、PDL-2、Pax-5、IgD、IgM、Notch 2及TLR4。
在某些實施例中，抗體結合於由T細胞表現之抗原(例如，在T細胞之表面上)。可藉由本文所提供之結合物靶向的由T細胞表現之例示性抗原包括但不限於T細胞共刺激分子、OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1/CD11a/CD18、ICOS/CD278、4-1BB/CD137、GITR、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3、CD83、BLIMP1/PRDNM1、SIRPγ、TNFR2、B7-H4、A2AR、STING及TIGIT。
在某些實施例中，抗體結合於由樹突狀細胞表現之抗原。可由本文所提供之結合物靶向之樹突狀細胞表現的例示性抗原包括但不限於B220/CD45R、BATF3、BST-2/Tetherin、CD11b/整合素α M、CD11c、CD14、CD163、CD19、CD1c/BDCA-1、CD1d1、CD20、CD3、CD4、CD8、CLEC9a、CX3CR1、DC-SIGN/CD209、DEC-205/CD205、DLEC/CLEC4C/BDCA-2、E-鈣黏蛋白、EpCAM/TROP1、F4/80、Fc ε RIα、Fcγ RI/CD64、Fcγ RIA/CD64、Fcγ RIB/CD64、Fcγ RIII (CD16), Fcγ RIIIA/CD16a、Fcγ RIIIB/CD16b、FLT3、GFI-1、HLA-DR、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IGSF4A/SynCAM1、A2AR、Ikaros、IL-1β/IL-1F2、IL-10、IL-12、IL-2、IL-23、IL-3 Rα/CD123、IL-6、iNOS、整合素αE/CD103、IRF4、IRF8、蘭格素(Langerin)/CD207、Ly-6G (Gr-1)、Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)、II類MHC (I-A/I-E)、MMR/CD206、NCAM-1/CD56、神經纖毛蛋白-1、NFIL3/E4BP4、氧化氮、PU.1/Spi-1、SIRPα/CD172a、Spi-B、凝血調節蛋白/BDCA-3、TLR7、TLR9、TNF-α、TREM2及XCR1。在特定實施例中，樹突狀細胞特異性抗原係選自CD1a、CD1b/c、CD4、CD8、CD11b、CD11c、CD40、CD45R/B220、CD49d、CD80、CD83、CD85a、CD85f、CD85g/ILT7、CD85i、CD85j、CD86、CD123、CD180、CD197/CCR7、CD205、CD206、CD207、CD208、CD209、CD273/B7-DC/PD-L2、CD303/BDCA-2、CD304/神經纖毛蛋白-1、DC標記物/33D1、F4/80、I類MHC、成束蛋白(fascin)、HLA-DR、STING及Siglec H。在特定實施例中，樹突狀細胞特異性抗原為選自以下之漿細胞樣樹突狀細胞：CD1a、CD1b、CD1c、CD4、CD8、CD11b、CD11c、CD40、CD45R/B220、CD49d、CD80、CD83、CD85g/ILT7、CD86、CD123、CD197 (CCR7)、CD273 (B7-DC、PD-L2)、CD303 (BDCA-2)、CD304 (神經纖毛蛋白-1)、DC標記物(33D1)、F4/80、HLA-DR、II類MHC及Siglec H。
在某些實施例中，抗體與由巨噬細胞表現之抗原結合。由可藉由本發明提供之結合物靶向的巨噬細胞表現之例示性抗原包括但不限於活化素A、AIF-1/Iba1、精胺酸酶1/ARG1、A2AR、B7-1/CD80、B7-2/CD86、降鈣素R、CCL1/I-309/TCA-3、CCL11/伊紅趨素、CCL14/HCC-1/HCC-3、CCL15/MIP-1δ、CCL16/HCC-4、CCL17/TARC、CCL18/PARC、CCL19/MIP-3β、CCL2/JE/MCP-1、CCL20/MIP-3α、CCL22/MDC、CCL23/Ckβ 8-1、CCL23/MPIF-1、CCL24/伊紅趨素-2/MPIF-2、CCL26/伊紅趨素-3、CCL3/CCL4、CCL3/MIP-1α、CCL4/MIP-1β、CCL5/RANTES、CCL8/MCP-2、CCR2、CCR5、CD11b/整合素α M、CD11c、CD15/路易斯(Lewis) X、CD163、CD200 R1、CD200R1L、CD36/SR-B3、CD43、CD45、CD68/SR-D1、CLEC10A/CD301、COX-2、CX3CL1/人趨化介素(Fractalkine)、CX3CR1、CXCL1/GRO α/KC/CINC-1、CXCL10/IP-10/CRG-2、CXCL11/I-TAC、CXCL13/BLC/BCA-1、CXCL16、CXCL2/GROβ/MIP-2/CINC-3、CXCL3/GROγ/CINC-2/DCIP-1、CXCL5/ENA-70、CXCL5/ENA-74、CXCL5/ENA-78、CXCL9/MIG、CXCR1/IL-8 RA、CXCR2/IL-8 RB、DC-SIGN/CD209、DEC-205/CD205、Dectin-1/CLEC7A、Dectin-2/CLEC6A、EMR1、F4/80、Fcε RIα、Fcγ RI/CD64、Fcγ RIA/CD64、Fcγ RIB/CD64、Fcγ RII/CD32、Fcγ RIII (CD16)、FIZZ1/RELMα、半乳糖凝集素-3、GATA-6、G-CSF、GITR配位體/TNFSF18、GM-CSF、HLA-DR、ID2、IFN-γ、IFN-γ R1/CD119、IL-1β/IL-1F2、IL-1 RII、IL-10、IL-15、IL-17/IL-17A、IL-18/IL-1F4、IL-1ra/IL-1F3、IL-23、IL-4 Rα、IL-6、IL-8/CXCL8、iNOS、整合素α L/CD11a、IRF4、IRF5、LAMP-2/CD107b、蘭格素/CD207、LILRB4/CD85k/ILT3、L-選擇蛋白/CD62L、LXRα/NR1H3、Ly-6G (Gr-1)、Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)、MARCO、M-CSF R/CD115、Mer、MERTK、MFG-E8、II類MHC (I-A/I-E)、MMR/CD206、NFATC1、NGFI-Bα/Nur77/NR4A1、PPARδ/NR1C2、PPARγ/NR1C3、RANK/TNFRSF11A、RUNX3/CBFA3、Siglec-1/CD169、Siglec-3/CD33、Siglec-F、SIGNR1/CD209b、SIRPα/CD172a、SLAM/CD150、SOCS-3、神經鞘胺醇激酶1/SPHK1、神經鞘胺醇激酶2/SPHK2、SR-AI/MSR、SR-BI、STAT1、STAT6、STING、TGF-β、TIM-4、TLR1、TLR2、TLR4、TLR8、TNF-α、TRACP/PAP/ACP5、TREM1、VCAM-1/CD106、VEGF及YM1/殼質酶3樣3。在特定實施例中，巨噬細胞特異性抗原係選自CD11a、CD11b、CD11c、CD14、CD15 (SSEA-1)、CD16/32、CD33、CD64、CD68、CD80、CD85k (ILT3)、CD86、CD105 (內皮因子(Endoglin))、CD107b、CD115、CD163、CD195 (CCR5)、CD282 (TLR2)、CD284 (TLR4)、F4/80、GITRL、HLA-DR、Mac-2 (半乳糖凝集素-3)及II類MHC。
在某些實施例中，抗體結合於由NK細胞表現之抗原。由可由本文所提供之結合物靶向之NK細胞表現的例示性抗原包括但不限於CD11b、CD11c、CD16/32、CD49b、CD56 (NCAM)、CD57、CD69、CD94、CD122、CD158 (Kir)、CD161 (NK-1.1)、CD180、CD244 (2B4)、CD314 (NKG2D)、CD319 (CRACC)、CD328 (Siglec-7)、CD335 (NKp46)、A2AR、Ly49、Ly108、Vα24-Jα18 TCR (iNKT)、顆粒溶素、顆粒酶、穿孔蛋白、SIRP-α、LAIR1、SIGLEC-3 (CD33)、SIGLEC-7、SIGLEC-9、LIR1 (ILT2、LILRB1)、NKR-P1A (KLRB1)、CD94-NKG2A、KLRG1、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、KIR2DS1、CD94-NKG2C/E、NKG2D、CD160 (BY55)、CD16 (FcγRIIIA)、NKp46 (NCR1)、NKp30 (NCR3)、NKp44 (NCR2)、DNAM1 (CD226)、CRTAM、CD2、CD7、CD11a、CD18、CD25、CD27、CD28、NTB-A (SLAMF6)、PSGL1、CD96 (Tactile)、CD100 (SEMA4D)、NKp80 (KLRF1、CLEC5C)、SLAMF7 (CRACC、CS1、CD319)、STING及CD244 (2B4、SLAMF4)。
在某些實施例中，抗體結合於由骨髓細胞表現之抗原。由骨髓細胞表現且可由本文所提供之結合靶向之例示性抗原包括但不限於siglec-3、siglec 7、siglec 9、siglec 10、siglec 15、CD200、CD200R、LILRB1、LILRB2、LILRB3、LILRB4、LILRB5、M-CSF、CSF-1R、GM-CSF R、IL4 R、精胺酸酶、IDO、TDO、MPO、EP2、COX-2、CCR2、CCR-7、CXCR1、CX3CR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR7、c-Kit、CD244、L-選擇蛋白/CD62L、CD11b、CD11c、CD68、CD163、CD180、CD204、DEC205、IL-1R、CD31、SIRPα、SIRPβ、PD-L1、CEACAM-8/CD66b、CD103、BDCA-1、BDCA2. BDCA-4、CD123、STING及ILT-7。
在某些實施例中，抗體結合於由MDSC表現之抗原。由MDSC表現且可由本文所提供之結合靶向的例示性抗原包括但不限於siglec-3、Siglec 7、siglec 9、siglec 10、siglec 15、CD200、CD200R、LILRB1、LILRB2、LILRB3、LILRB4、LILRB5、M-CSF、CSF-1R、GM-CSF R、IL4 R、精胺酸酶、IDO、TDO、MPO、EP2、COX-2、CCR2、CCR-7、CXCR1、CX3CR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR7、c-Kit、CD244、L-選擇蛋白/CD62L、CD11b、CD11c、CD68、CD163、CD180、CD204、DEC205、IL-1R、CD31、SIRPα、SIRPβ、PD-L1、CEACAM-8/CD66b、CD103、BDCA-1、BDCA2. BDCA-4、CD123及ILT-7。
在某些實施例中，抗體結合於由TAM表現的抗原。由TAM表現且可由本文所提供之結合靶向之例示性抗原包括但不限於siglec-3、Siglec 7、siglec 9、siglec 10、siglec 15、CD200、CD200R、神經菲林蛋白(nerophilin) 2 (NRP2)、B7-H3、B7-H4、LILRB1、LILRB2、LILRB3、LILRB4、LILRB5、M-CSF、CSF-1R、GM-CSF R、IL4 R、精胺酸酶、IDO、TDO、MPO、EP2、COX-2、CCR2、CCR-7、CXCR1、CX3CR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR7、c-Kit、CD244、L-選擇蛋白/CD62L、CD11b、CD11c、CD68、CD163、CD204、DEC205、IL-1R、CD31、MARCO、TREM2、CD81、APOE、SIRPα、SIRPβ、PD-L1、CEACAM-8/CD66b、CD103、BDCA-1、BDCA2. BDCA-4、CD123及ILT-7。
在某些實施例中，抗體結合於對NK細胞具有特異性之抗原。在某些實施例中，NK細胞由抗CD56抗體靶向。在某些實施例中，抗體為抗CD56抗體。在某些實施例中，抗體為單株抗CD56抗體。在某些實施例中，抗體為鼠類抗CD56抗體。在某些實施例中，鼠類抗CD56抗體為純系5.1H11 (BioLegend，目錄號：362502)。在某些實施例中，鼠類抗CD56抗體為純系MEM-188 (BioLegend，304601)。在某些實施例中，鼠類抗CD56抗體為純系QA17A16 (BioLegend，目錄號：392402)。在某些實施例中，抗體為人類化抗CD56抗體。在某些實施例中，抗體係人類抗CD56抗體。在某些實施例中，抗體為人類化抗CD56抗體。
B細胞可由抗CD38、抗CD79b、抗CD30、抗CD22或抗CD20、抗CD19抗體或其抗原結合片段或其工程化衍生物靶向。漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)可藉由抗DEC205、抗CD304 (BDCA4)、抗CD303 (BDCA2)、抗CD40、抗CD74或抗CD123抗體或其抗原結合片段或其經工程改造之衍生物靶向。巨噬細胞可由抗CD163、抗CD40、抗CD74、抗CD206或抗CD123抗體或其抗原結合片段或其經工程改造之衍生物靶向。在一些實施例中，本發明之結合物包含結合於多肽、碳水化合物或與本文所述之目標抗原(例如CD22、B細胞抗原、巨噬細胞抗原等)締合或結合之其他化合物的如本文所述之免疫調節寡核苷酸。
抗CD38抗體之非限制性實例為達雷木單抗(daratumumab)、SAR650984、MOR202或WO 2012/092616中所揭示之抗體Ab79、Ab19、Ab43、Ab72及Ab110中之任一者，此等抗體之揭示內容以引用的方式併入本文中。抗CD79b抗體之非限制性實例為WO 2014/011521中所揭示之huMA79b v28。抗CD22抗體之非限制性實例為US 2014/0127197中所揭示之10F4。抗CD20抗體之非限制性實例為利妥昔單抗(rituximab)。抗DEC205抗體之非限制性實例提供於US 2010/0098704中，其抗體以引用的方式併入本文中。抗CD40抗體之非限制性實例係魯卡木單抗(lucatumumab)及達西珠單抗(lucatumumab)。抗CD304抗體之非限制性實例為韋森庫單抗(vesencumab)。
在一些實施例中，抗體係選自由以下組成之群：抗CD20抗體、抗CD22抗體、抗CD30抗體、抗CD37抗體、抗CD38抗體、抗CD40抗體、抗CD74抗體、抗CD79b抗體、抗CD205抗體、抗CD274抗體、抗CD303抗體、抗CD304抗體、抗CD19抗體、抗CD1抗體、抗CD2抗體、抗CD3抗體、抗CD5抗體、抗CD6抗體、抗CD9抗體、抗CD11抗體、抗CD18抗體、抗CD21抗體、抗CD23抗體、抗CD24抗體、抗CD25抗體、抗CD26抗體、抗CD44抗體、抗CD45R抗體、抗CD49抗體、抗CD66 (癌胚抗原(Carcinoembrionic antigen，CEA))抗體、抗CD93抗體、抗CD52抗體、抗CD56抗體、抗CD123抗體、抗CD138抗體、抗CD163抗體、抗SLAMF7抗體、抗CD180抗體、抗DEC205抗體及抗CD206抗體。在一些實施例中，抗體為抗CD20抗體。在一些實施例中，抗體為抗CD22抗體。
在一些實施例中，CpG-Ab免疫結合物特異性結合於正藉由本發明方法治療之癌症的腫瘤相關抗原。可藉由本發明之CpG-Ab免疫結合物靶向之腫瘤相關抗原(tumor associated antigen，TAA)之實例包括但不限於包含以下之序列的全部或部分的序列：DLL3、GCC、GPA33、組織因子(TF)、TEM8、FOLR1、CEACAM5、LRRC15、緊密連接蛋白18.2、AXL、CA9、CD155、AMHR2、NTSE、FLT1、結合蛋白4、5T4 MT-1/MMP-14、DKK1、肌肉抑制素、sema4D、Trop-2、HER3、Her2、Her2/neu、HER1、VWF、IGF-1、GRP78、CXCR4、cMET、波形蛋白(vitmentin)、VEGFR2、VEGFR1、VEGF、VEGF-A、TYRP1 (醣蛋白75)、TWEAK受體、腫瘤抗原CTAA16.88、TRAIL-R2、TRAIL-R1、TNF-α、TGF-β、TGFβ 2、TGFβ 1、TFPI、肌腱蛋白C、TEM1、TAG-72、STEAP1、神經鞘胺醇-1-磷酸酯、SOST、SLAMF7、BCL-2、選擇蛋白P、SDC1、硬骨素、RTN4、RON、恆河猴因子、RHD、呼吸道合胞病毒、RANKL、狂犬病病毒醣蛋白、PDGF-Rβ、磷脂醯絲胺酸、磷酸酯-鈉共轉運體、PDGF-Rα、PDCD1、PD-1、PD-L1、PCSK9、oxLDL、OX-40、NRP1、Notch受體4、Notch受體3、Notch受體2、Notch受體1、NOGO-A、NGF、神經細胞凋亡調節蛋白酶1、NCA-90 (顆粒球抗原)、NARP-1、N-羥乙醯神經胺酸、肌肉抑制素、髓鞘相關醣蛋白、黏蛋白CanAg、MSLN、MS4A1、MIF、MCP-1、LTA、LOXL2、脂磷壁酸、LINGO-1、LFA-1 (CD11a)、路易斯-Y抗原、L-選擇蛋白(CD62L)、KIR、KIR配位體、ITGB2 (CD18)、ITGA2、干擾素受體、干擾素γ-誘導之蛋白質、整合素醰αvβ3、整合素酙αIIβ3、整合素α7β7、整合素α5β1、整合素α4β7、整合素α4、類胰島素生長因子I受體、A型流感紅血球凝集素、ILGF2、IL9、IL6、IL4、IL3 IRA、IL23、ILI 7A、IL-6受體、IL-6、IL-S、IL-4、IL-23、IL-22、IL-I、IL-I 7A、IL-I 7、IL-13、IL-I 2、IL-I、IL 20、IGHE、IGF-I、IGF-I受體、IgE Fc區、IFN-γ、IFN-α、ICAM-1 (CD54)、人類TNF、人類分散因子受體激酶、Hsp90、HNGF、HLA-DR、HIV-1、組蛋白複合物、HHGFR、HGF、B型肝炎表面抗原、GUCY2C、GPNMB、GMCSF受體α鏈、磷脂肌醇聚糖3 (glypican 3)、GD3神經節苷脂、GD2、神經節苷脂GD2、捲曲受體、葉酸受體1、葉酸羥化酶、纖維結合蛋白額外結構域-B、纖維蛋白II、β鏈、FAP、呼吸道合胞病毒之F蛋白質、ERBB3、上皮唾蛋白(episialin)、EpCAM、內毒素、EGFR、EGFL7、大腸桿菌志賀氏毒素(E. coli shiga toxin)類型-2、大腸桿菌志賀氏毒素類型-I、DRS、DPP4、DLL4、達比加群(dabigatran)、巨細胞病毒醣蛋白B、CTLA-4、CSF2、CSF1R、凝集因子A、CLDN6、CLDN18.1、CLDN18.2、ch4DS、CFD、CEA相關抗原、CEA、CD80、CD79B、CD74、CD73、CD70、CD6、CD56、CD52、CD51、CD5、CD44 v6、CD41、CD40配位體、CD40、CD47、CD4、CD39、CD38、CD37、CD33、CD30 (TNFRSF8)、CD123、CD138、CD3ε、CD3、CD28、CD274、CD27、CD2S (IL-2受體)、CD23 (IgE受體)、CD221、CD22、CD200、CD20、CD2、CD19、CD137、CD142、CD154、CD152、CD15、CD147 (基礎免疫球蛋白)、CD140a、CD125、CD11、CD-18、CCR5、CCR4、CCL11 (伊紅趨素-I)、心臟肌凝蛋白、碳酸酐酶9 (CA-IX)、家犬IL31、CA-125、C5、C242抗原、C-X-C趨化介素受體類型4、β-澱粉狀蛋白、BAFF、B7-H3、B-淋巴瘤細胞、AOC3 (VAP-I)、炭疽毒素、保護抗原、血管生成素3、血管生成素2、α-胎蛋白、AGS-22M6、腺癌抗原、ACVR2B、活化素受體類激酶I、5T4、5AC、4-IBB、1-40-β-澱粉狀蛋白、EGFR、EGFRvIII、gp100或Pmel17、CEA、MART-1/Melan-A、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MUC-1、GPNMB、HMW-MAA、TIM1、ROR1、CD19、gp100、二肽基肽酶IV (DPPIV)、腺苷去胺酶結合蛋白(ADAbp)、親環蛋白b、大腸直腸相關抗原(CRC)-C017-1A/GA733、癌胚抗原(Carcinoembryonic Antigen，CEA)及其免疫原性抗原決定基CAP-1及CAP-2、etv6、aml1、前列腺特異性抗原(Prostate Specific Antigen，PSA)及其免疫原性抗原決定基PSA-1、PSA-2及PSA-3、前列腺特異性薄膜抗原(PSMA)、T細胞受體/CD3-zeta鏈、MAGE之腫瘤抗原家族(例如MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2 (MAGE-B2)、MAGE-Xp3 (MAGE-B3)、MAGE-Xp4 (MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-05)、GAGE之腫瘤抗原家族(例如GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9)、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、酪胺酸酶、p53、MUC家族(例如MUC1、MUC16等；參見例如美國專利第6,054,438號；第WO98/04727號；或第WO98/37095號)、p21ras、RCAS1、α-胎蛋白、E-鈣黏蛋白、α-連環蛋白、β-連環蛋白及γ-連環蛋白、p120ctn、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、結腸腺瘤息肉病蛋白質(APC)、胞襯蛋白(fodrin)、接合素37、Ig-個體基因型、p15、gp75、GM2及GD2神經節苷脂、Smad腫瘤抗原家族腦糖原磷酸化酶、SSX-1、SSX-2 (HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1及CT-7及c-erbB-2及病毒抗原，諸如HPV-16及HPV-18 E6及E7抗原及EBV編碼核抗原(EBNA)-1、βhCG、WT1、TRP-2、NY-BR-1、NY-CO-58、MN (gp250)、端粒酶及生殖細胞衍生之腫瘤抗原。腫瘤相關抗原亦包括血型抗原，例如Lea、Leb、LeX、LeY、H-2、B-1、B-2抗原。腫瘤相關抗原可使用此項技術中已知之方法，諸如Zhang 等人前述中所揭示。
特定言之，在一些實施例中，CpG-Ab免疫結合物特異性結合於選自以下之腫瘤相關抗原：CD19、CD20、CD22、CD25、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44、CD45R (B220)、CD49、CD52、CD56、CD70、CD74、CD79a、CD79b、CD93、CD123、CD138、CD163、CD205、CD206、CD274、CD303及CD304，葉酸受體α、葉酸受體β、間皮素、PSMA、Her-2、EGFR、CLDN18.2、5T4、CD47、結合蛋白4、運鐵蛋白受體、整合素、畸胎瘤衍化生長因子(cripto)、EphA2、AGS-5、AGS-16、CanAg、EpCAM、IL4受體、IL2受體、Lewis Y、GPNMB、DLL3、GCC、GPA33、組織因子(TF)及Trop2。在一些實施例中，腫瘤相關抗原由腫瘤細胞表現。在一些實施例中，腫瘤相關抗原由基質細胞，例如腫瘤基質之一部分表現。
本發明之某些態樣係關於CD22及抗CD22抗體。在一些實施例中，CD22係指人類CD22，且抗體結合人類CD22。CD22亦稱為Siglec-2，且CD22基因及多肽序列(例如人類基因及多肽序列)為此項技術中已知的。參見例如NCBI基因ID編號933及NCBI參考序列寄存編號NP_001172028。在某些實施例中，抗CD22抗體為如下表 4 . 抗 CD22 抗體序列 中所示之包含VH及VL之抗體。表 4 . 抗 CD22 抗體序列
名稱 結構域 SEQ ID NO: 序列
RFB4 VH 56 EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSIYDMSWVRQTPEKRLEWVAYISSGGGTTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHSGYGSSYGVLFAYWGQGTLVTVSS
RFB4 VL 57 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDFATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK
依帕珠單抗(epratuzumab) VH 58 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSYWLHWVRQAPGQGLEWIGYINPRNDYTEYNQNFKDKATITADESTNTAYMELSSLRSEDTAFYFCARRDITTFYWGQGTTVTVSS
依帕珠單抗 VL 59 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTMSCKSSQSVLYSANHKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDIATYYCHQYLSSWTFGGGTKLEIK
m971 VH 60 QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSS
m971 VL 61 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIK
10F4 VH 62 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYEFSRSWMNWVRQAPGKGLEWVGRIYPGDGDTNYSGKFKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGSSWDWYFDVWGQGTLVTVSS
10F4 VL 63 MDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSIVHSVGNTFLEWYQQKPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCFQGSQFPYTFGQGTKVEIK
RH1 VH 64 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSIYDMSWVRQAPGKGLEWVAYISSGGGTTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS
RH2 VH 65 QVQLLESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFAFSIYDMNWVRQAPGKGLEWVSAISSGGGTTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS
RH3 VH 66 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYEMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS
RH4 VH 67 QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCTVSGFAFSIYDMSWIRQPPGKGLEWIAYISSGGGTTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS
RL1 VL 68 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGNTLPWTFGQGTKLEIK
RL2 VL 69 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIHGYLAWYQQKPGKAPKLLIYYTSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKLEIK
RL3 VL 70 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKLEIK
RL4 VL 71 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDIHGYLNWYQQKPGQAPRLLIYYTSILHSGIPARFSGSGPGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK
RL5 VL 72 DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRASQDIHGYLNWYQQKPGQSPQLLIYYTSILHSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK
表 5 . 抗 CD22 抗體 VH 序列 .
名稱 序列 SEQ ID NO
RH1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSIYDMSWVRQAPGKGLEWVAYISSGGGTTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS 64
RH2 QVQLLESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFAFSIYDMNWVRQAPGKGLEWVSAISSGGGTTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS 65
RH3 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYEMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS 66
RH4 QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCTVSGFAFSIYDMSWIRQPPGKGLEWIAYISSGGGTTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS 67
表 6 . 抗 CD22 抗體 VL 序列 .
名稱 序列 SEQ ID NO
RL1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGNTLPWTFGQGTKLEIK 68
RL2 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIHGYLAWYQQKPGKAPKLLIYYTSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKLEIK 69
RL3 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKLEIK 70
RL4 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDIHGYLNWYQQKPGQAPRLLIYYTSILHSGIPARFSGSGPGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK 71
RL5 DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRASQDIHGYLNWYQQKPGQSPQLLIYYTSILHSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK 72
RL1 N92A DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGATLPWTFGQGTKLEIK 73
RL1 N92C DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGCTLPWTFGQGTKLEIK 74
RL1 N92D DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGDTLPWTFGQGTKLEIK 75
RL1 N92E DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGETLPWTFGQGTKLEIK 76
RL1 N92F DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGFTLPWTFGQGTKLEIK 77
RL1 N92G DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGGTLPWTFGQGTKLEIK 78
RL1 N92H DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGHTLPWTFGQGTKLEIK 79
RL1 N92I DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGITLPWTFGQGTKLEIK 80
RL1 N92K DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGKTLPWTFGQGTKLEIK 81
RL1 N92L DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGLTLPWTFGQGTKLEIK 82
RL1 N92M DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGMTLPWTFGQGTKLEIK 83
RL1 N92P DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGPTLPWTFGQGTKLEIK 84
RL1 N92Q DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGQTLPWTFGQGTKLEIK 85
RL1 N92R DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGRTLPWTFGQGTKLEIK 86
RL1 N92S DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGSTLPWTFGQGTKLEIK 87
RL1 N92T DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGTTLPWTFGQGTKLEIK 88
RL1 N92V DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGVTLPWTFGQGTKLEIK 89
RL1 N92W DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGWTLPWTFGQGTKLEIK 90
RL1 N92Y DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGYTLPWTFGQGTKLEIK 91
表 13 . 抗 CD22 抗體序列
重鏈 輕鏈
QVQLLESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFAFSIYDMNWVRQAPGKGLEWVSAISSGGGTTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGRPQGFGPP (SEQ ID NO:179) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGATLPWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:181)
QVQLLESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFAFSIYDMNWVRQAPGKGLEWVSAISSGGGTTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGRPQGFGPP (SEQ ID NO:180) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGSTLPWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:182)
在一些實施例中，抗CD22抗體或結合物包括包含SEQ ID NO: 179或180之序列的重鏈及包含SEQ ID NO: 181或182之序列的輕鏈。
本發明之某些態樣係關於Her2及抗Her2抗體。在一些實施例中，Her2係指人類Her2且抗體結合人類Her2。Her2亦稱為erb-b2受體酪胺酸激酶2 (ERBB2)、Neu、NGL、TKR1、CD340及MLN19。Her2基因及多肽序列(例如，人類基因及多肽序列)為此項技術中已知的。參見例如NCBI基因ID編號2064及NCBI參考序列寄存編號NP_001005862。在一些實施例中，CpG-Ab免疫結合物特異性結合於Her2多肽，例如人類Her2多肽。在一些實施例中，CpG-Ab免疫結合物特異性結合於Her2多肽(例如人類Her2多肽)之細胞外結構域。在一些實施例中，CpG-Ab免疫結合物特異性結合於在其細胞表面上表現Her2多肽(例如人類Her2多肽)之細胞(例如腫瘤細胞)。結合Her2多肽(例如人類Her2多肽)之抗體為此項技術中已知的。在一些實施例中，抗體包含VH域及/或VL域，該VH域包含來自抗Her2抗體曲妥珠單抗之VH域的1、2或3個CDR序列，該VL域包含來自抗Her2抗體曲妥珠單抗之VL域的1、2或3個CDR序列。在一些實施例中，抗體包含VH域，其包含1、2或3個來自包含以下之胺基酸序列之VH域的CDR序列：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:168)，及/或VL域，其包含1、2或3個來自包含以下之胺基酸序列之VL域的CDR序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:169)。在一些實施例中，抗體包含抗Her2抗體曲妥珠單抗之VH域及/或抗Her2抗體曲妥珠單抗之VL域。在一些實施例中，抗體包含VH域，其包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:168)之胺基酸序列，及/或VL域，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:169)之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含VH域，其包含來自抗Her2抗體帕妥珠單抗之VH域的1、2或3個CDR序列，及/或VL域，其包含來自抗Her2抗體帕妥珠單抗之VL域的1、2或3個CDR序列。在一些實施例中，抗體包含VH域，其包含1、2或3個來自包含以下之胺基酸序列之VH域的CDR序列：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:170)，及/或VL域，其包含1、2或3個來自包含以下之胺基酸序列之VL域的CDR序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:171)。在一些實施例中，抗體包含抗Her2抗體帕妥珠單抗之VH域及/或抗Her2抗體帕妥珠單抗之VL域。在一些實施例中，抗體包含VH域，其包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:170)之胺基酸序列，及/或VL域，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:171)之胺基酸序列。在一些實施例中，抗Her2抗體為曲妥珠單抗。在一些實施例中，抗Her2抗體為帕妥珠單抗。在一些實施例中，抗Her2抗體具有一或多種效應功能，包括但不限於ADCC及/或ADCP。在一些實施例中，抗Her2抗體包含人類Fc區，例如人類IgG Fc區。在一些實施例中，抗Her2抗體包含野生型人類IgG1、IgG2或IgG4 Fc區。在一些實施例中，抗Her2抗體包含SEQ ID NO: 178之抗體恆定域序列。表 14 ： 抗 Her2 抗體序列
重鏈 輕鏈
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGRPQGFGPP(SEQ ID NO:183) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:185)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGRPQGFGPP(SEQ ID NO:184) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:188)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGRPQGFGPP(SEQ ID NO:186)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGRPQGFGPP(SEQ ID NO:187)
在一些實施例中，抗Her2抗體或結合物包括包含SEQ ID NO:183、184、186或187之序列的重鏈；及包含SEQ ID NO: 185或188之序列的輕鏈。
在一些實施例中，本發明之抗體(例如抗CD22抗體或抗Her2抗體)包含抗體恆定域。在一些實施例中，本發明之抗體(例如抗CD22抗體或抗Her2抗體)包含表 7 中所列之抗體重鏈恆定域及/或抗體輕鏈恆定域。在一些實施例中，本發明之抗體(例如抗CD22抗體或抗Her2抗體)包含選自由SEQ ID No: 92-107及178組成之群的抗體重鏈恆定域。在一些實施例中，本發明之抗體(例如抗CD22抗體或抗Her2抗體)包含在Fc區之C端處具有Q標籤之抗體重鏈恆定域，例如如SEQ ID NO: 95或178中所示。在一些實施例中，本發明之抗體(例如抗CD22抗體或抗Her2抗體)包含兩條抗體重鏈，其各自具有恆定域，其中兩條抗體重鏈中之每一者在Fc區之C端處包含Q標籤，例如如SEQ ID NO: 95或178中所示。在一些實施例中，本發明之抗體(例如抗CD22抗體或抗Her2抗體)包含兩條抗體重鏈，其各自具有恆定域，其中兩條抗體重鏈中僅一者在Fc區之C端處包含Q標籤，例如如SEQ ID NO: 95或178中所示。在一些實施例中，本發明之抗體(例如抗CD22抗體或抗Her2抗體)包含選自由SEQ ID NO: 108s: 110組成之群的抗體輕鏈恆定域。表 7 . 抗體恆定域序列
名稱 SEQ ID NO: 序列
IgG1野生型 92 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
IgG1_AAA_N297A 93 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
IgG1_AAA 94 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
IgG1_AAA + S標籤 95 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGRPQGFGPP
IgG1_N297A 96 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
IgG1_D265A 97 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
IgG1_N297A/D265A 98 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
IgG2 99 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRV VSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
IgG2Da 100 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
IgG2Da_N297A 101 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFASTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
IgG2_N297A 102 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFASTFRV VSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
IgG2Da_D265A 103 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
IgG4_S228P 104 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
IgG4_S228P_D265A 105 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
IgG4_S228P, L235E 106 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
IgG4_S228P,N297A 107 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
IgG1_wt + S標籤 178 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGRPQGFGPP
人類κ 108 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
人類λIGLC1 109 GQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
人類λIGLC2 110 GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
在一些實施例中，本發明之抗體或結合物包含VH域，其包含表 8 中所示之單一抗體之1、2或3個CDR。在一些實施例中，本發明之抗體或結合物包含VH域，其包含表 8 中所示之單一抗體之3個CDR。在一些實施例中，本發明之抗體或結合物包含VL域，其包含表 8 中所示之單一抗體之1、2或3個CDR。在一些實施例中，本發明之抗體或結合物包含VL域，其包含表 8 中所示之單一抗體之3個CDR。在一些實施例中，本發明之抗體或結合物包括包含表 8 中所示之單一抗體之1、2或3個CDR的VH域；及包含表 8 中所示之單一抗體之1、2或3個CDR的VL域。在一些實施例中，本發明之抗體或結合物包括包含表 8 中所示之單一抗體之3個CDR的VH域；及包含表 8 中所示之單一抗體之3個CDR的VL域。在一些實施例中，本發明之抗體或結合物包括包含SEQ ID NO: 113之序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO: 115之序列的CDR-H2及包含SEQ ID NO: 116之序列的CDR-H3。在一些實施例中，本發明之抗體或結合物包含VH域，其包括包含SEQ ID NO: 114之序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO: 189之序列的CDR-H2及包含SEQ ID NO: 116之序列的CDR-H3。在一些實施例中，本發明之抗體或結合物包含VL域，其包括包含SEQ ID NO: 117之序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO: 119之序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO: 120之序列的CDR-L3。在一些實施例中，本發明之抗體或結合物包含VL域，其包括包含SEQ ID NO: 118之序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO: 177之序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO: 120之序列的CDR-L3。表 8 . 抗CD22抗體CDR序列
抗體 CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3 CDR-L1 CDR-L2 CDR-L3
RH1 GFAFSIYD (SEQ ID NO:113) ISSGGGTT (SEQ ID NO:115) ARHSGYGTHWGVLFAY (SEQ ID NO:116) -- -- --
RH2 GFAFSIYD (SEQ ID NO:113) ISSGGGTT (SEQ ID NO:115) ARHSGYGTHWGVLFAY (SEQ ID NO:116) -- -- --
RH3 GFTFSSYE (SEQ ID NO:114) ISSSGSTI (SEQ ID NO:189) ARHSGYGTHWGVLFAY (SEQ ID NO:116) -- -- --
RH4 GFAFSIYD (SEQ ID NO:113) ISSGGGTT (SEQ ID NO:115) ARHSGYGTHWGVLFAY (SEQ ID NO:116) -- -- --
RL1 -- -- -- QDIHGY (SEQ ID NO:117) YTS (SEQ ID NO:119) QQGNTLPWT (SEQ ID NO:120)
RL2 -- -- -- QDIHGY (SEQ ID NO:117) YTS (SEQ ID NO:119) QQGNTLPWT (SEQ ID NO:120)
RL3 -- -- -- QSISSY (SEQ ID NO:118) AAS (SEQ ID NO:177) QQGNTLPWT (SEQ ID NO:120)
RL4 -- -- -- QDIHGY (SEQ ID NO:117) YTS (SEQ ID NO:119) QQGNTLPWT (SEQ ID NO:120)
RL5 -- -- -- QDIHGY (SEQ ID NO:117) YTS (SEQ ID NO:119) QQGNTLPWT (SEQ ID NO:120)
在本發明之又另一個態樣中，本文提供一種包含抗體或其抗原結合片段及一或多種免疫調節寡核苷酸(P)之結合物，其中該抗體或抗原結合片段連接至包含胺基酸序列RPQGF (SEQ ID NO: 47)之一或多種Q標籤肽(Q)，其中各免疫調節寡核苷酸經由與Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接至Q標籤肽，如式(A)中所示，
Figure 02_image402
， 其中： 各Q獨立地包含Q標籤肽序列RPQGF (SEQ ID NO:47)； 各L獨立地為一鍵或連接子部分
Figure 02_image404
， 其中m為約0至約50範圍內之整數，且其中
Figure 02_image406
指示與P之連接點，且
Figure 02_image408
指示與經由與該穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵連接至Q的該結合物之其餘部分的連接點； 且各P獨立地為具有以下結構之免疫調節寡核苷酸：
Figure 02_image410
， 其中
Figure 02_image011
及
Figure 02_image413
指示該寡核苷酸內之連接點，且其中
Figure 02_image191
指示與L之連接點； 其中Ab包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中該VH域包含來自以下VH域序列之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3序列： QVQLLESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFAFSIYDMNWVRQAPGKGLEWVSAISSGGGTTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 65)； 其中該VL域包含來自以下VL域序列之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGNTLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 68)。
在前述之一些實施例中，VL域進一步包含N92殘基處之胺基酸取代(以VL域序列之N端開始編號)。在其中VL域包含N92處之胺基酸取代的某些實施例中，VL域包含胺基酸取代N92A。在其中VL域包含N92處之胺基酸取代的某些其他實施例中，VL域包含胺基酸取代N92L。在其中VL域包含N92處之胺基酸取代之再某些其他實施例中，VL域包含胺基酸取代N92S。在前述之一些實施例中，VL域包含表6中所示之VL域序列，例如SEQ ID No: 73-91。
在其他態樣中，本文提供一種結合物，其包含蛋白質、至少一個包含穀胺醯胺殘基之Q標籤肽序列及至少一個免疫調節寡核苷酸，其中該Q標籤肽序列為天然存在或合成的，且其中免疫調節寡核苷酸經由與穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵連接至Q標籤，其中至少一個Q標籤肽序列係選自由SEQ ID NO: 39-55組成之群。
在一些實施例中，免疫調節寡核苷酸具有選自由 表 10 及 表 12 之寡核苷酸組成之群的序列。
在一些實施例中，抗CD22結合物中之較佳免疫調節劑為選自TLR1促效劑、TLR2促效劑、TLR3促效劑、TLR4促效劑、TLR5促效劑、TLR6促效劑、TLR7促效劑、TLR8促效劑及TLR10促效劑之鐸樣受體促效劑。在一些實施例中，免疫調節劑為選自TLR7促效劑、TLR8促效劑、TLR7/TLR8促效劑之鐸樣受體促效劑。
在一些實施例中，抗CD22結合物中之免疫調節劑為調節STING之上游酶的STING路徑促效劑或調節劑(例如ENPP1抑制劑，一種負調節STING路徑之磷酸二酯酶)。干擾素基因刺激劑(stimulator of interferon genes，STING，亦稱為TMEM173、MITA、ERIS及MPYS)係侷限於ER之跨膜蛋白，ER響應於環二核苷酸(cyclic dinucleotide，CDN)之直接結合而發生構形改變，引起下游信號級聯，包括TBK1活化、IRF-3磷酸化及IFN-β及其他細胞介素之產生。腫瘤駐留型宿主抗原呈現細胞中之STING路徑參與誘導針對腫瘤相關抗原之自發性CD8+ T細胞反應。此路徑之活化及IFN-β之後續產生亦有助於抗腫瘤作用。在一些實施例中，STING路徑促效劑為ADU-S100。額外STING促效劑及其用途描述於例如US20180028553、US20170319680、US20170298139、US20060040887、US20080286296、US20120041057、US20140205653、WO2014179335、WO 2014179760、US20150056224、WO 2016096174、WO 2017011444、WO 2017027645及WO 2017027646中。
在一些實施例中，抗CD22結合物中之免疫調節劑為RIG-I路徑促效劑。視黃酸誘導性基因-I (RIG-I)為起始宿主先天免疫系統在感染早期階段防禦病原微生物之圖案識別受體的成員。存在(RIG-I)樣受體家族之三個成員：RIG-I、黑素瘤分化因子5 (melanoma differentiation factor 5，MDA5)及遺傳學及生理學實驗室2 (laboratory of genetics and physiology 2，LGP2)，其表現於大部分細胞及組織類型中。RIG-I充當用於識別各種RNA病毒及後續活化下游信號傳導以驅動I型IFN產生及抗病毒基因表現之細胞質感測器。活化之RIG-I經由CARD-CARD介導之相互作用募集下游承接分子MAVS (亦稱為IPS-1、CARDIF及VISA)。寡聚RIG-I CARD組裝及MAVS之聚合形成一起充當蛋白質複合物之信號傳導平台，該信號傳導平台介導信號傳導至兩個分支中之分叉點。一個分支募集腫瘤壞死因子受體相關因子(tumor necrosis factor receptor-associated factor，TRAF)-2/6及受體相互作用蛋白1以隨後活化IKK複合物，從而引起NF-κB活化。另一分支經由TRAF3信號傳導且活化TANK/IKKγ/IKKϵ/TBK1複合物，引起干擾素調節因子(interferon regulator factor，IRF)-3及IRF-7發生磷酸化及二聚化。Liu等人,Front Immunol. 2017, 7:662。此路徑之活化有助於抗腫瘤作用。在一些實施例中，RIG-I路徑促效劑為RGT100。RIG-I促效劑及其用途描述於例如US20170057978、US20170258897、US9381208、US9738680、US9650427、WO2017173427及WO2017011622中。III . 具有 Q 標籤之蛋白
在一個態樣中，本文提供一種蛋白質，其包含至少一個包含穀胺醯胺殘基之Q標籤肽序列。在一些實施例中，Q標籤肽序列為天然存在或合成的。在某些實施例中，Q標籤肽序列為藉由胺基酸取代暴露之內在反應性穀胺醯胺。在其他實施例中，Q標籤與蛋白質之重鏈的C端融合。在其他實施例中，至少一個Q標籤肽序列中之至少一者選自由SEQ ID NO: 39-55組成之群。
在一些實施例中，蛋白質為抗體或其抗原結合片段。在某些實施例中，抗體包含輕鏈可變域(VL)及重鏈可變域(VH)，且其中VH包含序列SEQ ID NO: 56；且VL包含序列SEQ ID NO: 57。
在本發明之另一態樣中，本文提供式(B)抗體
Figure 02_image416
， 其中： 各Q獨立地為包含具有至少一個穀胺醯胺殘基之肽序列的Q標籤； Ab為抗體或其抗原結合片段；且 e為1至20之整數。
式(B)之抗體可為如上文所描述之式(A)之抗體-寡核苷酸結合物的前驅體。因此，如先前式(A)態樣中所描述之抗體的特性及實施例可與式(B)抗體之特性及/或實施例相同或不同。
在本發明態樣之一些實施例中，抗體或其片段為單株抗體或其片段。在某些實施例中，抗體或其片段為Fab、F(ab')2、Fab'-SH、Fv、scFv、單域、單重鏈或單輕鏈抗體或抗體片段。在其他實施例中，抗體或其片段為人類化抗體、人類化抗體或嵌合抗體或其片段。在某些實施例中，其可與任何前述實施例組合，抗體或其片段特異性結合人類CD22。
在一些實施例中，其中抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中VH域包含CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3序列，該等序列來自選自由以下組成之群之VH域序列：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSIYDMSWVRQAPGKGLEWVAYISSGGGTTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 64)、QVQLLESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFAFSIYDMNWVRQAPGKGLEWVSAISSGGGTTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 65)、EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYEMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 66)及QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCTVSGFAFSIYDMSWIRQPPGKGLEWIAYISSGGGTTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 67)。
如實施例87至90中任一項之抗體，其中該抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，且其中該VH域包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSIYDMSWVRQAPGKGLEWVAYISSGGGTTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 64)、QVQLLESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFAFSIYDMNWVRQAPGKGLEWVSAISSGGGTTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 65)、EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYEMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 66)及QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCTVSGFAFSIYDMSWIRQPPGKGLEWIAYISSGGGTTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 67)。
如實施例87至93中任一項之抗體，其中該抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中該VL域包含來自選自由以下組成之群的VL域序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGNTLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:68)、DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIHGYLAWYQQKPGKAPKLLIYYTSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:69)、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:70)、EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDIHGYLNWYQQKPGQAPRLLIYYTSILHSGIPARFSGSGPGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 71)及DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRASQDIHGYLNWYQQKPGQSPQLLIYYTSILHSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 72)。
在前述之一些實施例中，VL域進一步包含殘基N92處之胺基酸取代。在前述之某些實施例中，VL域包含選自由N92A、N92L及N92S組成之群的殘基N92處之胺基酸取代。
在一些實施例中，抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中VL域為選自由以下組成之群的胺基酸序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGNTLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 68)、DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIHGYLAWYQQKPGKAPKLLIYYTSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 69)、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 70)、EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDIHGYLNWYQQKPGQAPRLLIYYTSILHSGIPARFSGSGPGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 71)及DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRASQDIHGYLNWYQQKPGQSPQLLIYYTSILHSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:72)。
在一些實施例中，該抗體包含Fc區。在其中抗體包含Fc區之某些實施例中，Fc區為選自由以下組成之群的人類Fc區：IgG1 Fc區、IgG2 Fc區及IgG4 Fc區。
在本發明態樣之某些實施例中，Fc區為： (a)包含L234A、L235A及/或G237A取代的人類IgG1 Fc區，胺基酸位置係根據EU索引編號； (b)包含A330S及/或P331S取代之人類IgG2 Fc區，胺基酸位置係根據EU索引編號；或 (c)包含S228P及/或L235E取代的人類IgG4 Fc區，胺基酸位置係根據EU索引編號。
在一些實施例中，Fc區進一步包含N297A取代，胺基酸位置係根據EU索引編號。在其他實施例中，Fc區進一步包含D265A取代，胺基酸位置係根據EU索引編號。在又其他實施例中，抗體包含人類λ輕鏈。在其他實施例中，抗體包含人類κ輕鏈。
在一些實施例中，至少一個Q標籤連接至抗體之重鏈。在某些實施例中，至少一個Q標籤與抗體之重鏈之C端融合。在其他實施例中，至少一個Q標籤連接至抗體輕鏈。在其他實施例中，至少一個Q標籤位於Fc域內。
在本發明態樣之一些實施例中，抗體連接至1至20個Q標籤Q。在某些實施例中，連接至抗體/結合物之Q標籤之數目為約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19或約20之整數。在某些其他實施例中，1或2個Q標籤連接至抗體或抗原結合片段。在又其他實施例中，連接至抗體/結合物之Q標籤數目為1至10、10至20、5至10、10至15、15至20或1至5之整數。
在可與前述實施例中之任一者組合的本發明態樣之其他實施例中，各Q標籤獨立地包含或係選自由SEQ ID NO: 39-55組成之群的肽序列。在一些實施例中，各Q標籤獨立地包含或係選自由表3之肽序列組成之群的肽序列。在本態樣之其他實施例中，各Q標籤獨立地包含或係選自由SEQ ID NO: 40-55組成之群的肽序列。在其他實施例中，各Q標籤獨立地包含或係選自由SEQ ID NO: 47-49組成之群的肽序列。在一些實施例中，Q標籤包含LLQGG (SEQ ID NO:172)、GGGLLQGG (SEQ ID NO:173)、RPQGF (SEQ ID NO:47)或RPQGFGPP (SEQ ID NO:49)。在本發明態樣之一些實施例中，各Q獨立地為包含肽序列RPQGF (SEQ ID NO: 47)之Q標籤。在某些實施例中，包含肽序列RPQGF (SEQ ID NO: 47)之各Q標籤係選自由RPQGF (SEQ ID NO: 47)、RPQGFPP (SEQ ID NO: 48)及RPQGFGPP (SEQ ID NO: 49)組成之群。在某些實施例中，各Q標籤獨立地包含或係肽序列RPQGFGPP (SEQ ID NO: 49)。IV . 免疫調節聚核苷酸
在又另一態樣中，本文提供式(C)之免疫調節聚核苷酸，
Figure 02_image418
， 其中
Figure 02_image011
及
Figure 02_image413
指示該寡核苷酸內之連接點； 各T1 獨立地為O或S； 各T2 為S- ； T3 為基團
Figure 02_image421
，其中
Figure 02_image003
指示與寡核苷酸之其餘部分的連接點； Z為O或S； U5 ' 為-H或鹵素； R5 ' 為-H或甲氧基； Rc1 為-H或甲氧基； Rg1 、Rg2 、Rg3 及Rg4 係H或側氧基，其限制條件為Rg1 、Rg2 、Rg3 及Rg4 中之至少一者係側氧基且其中側氧基所附接之碳在7位置處具有與環氮相連之單鍵)； R3 ' 為甲氧基或2-甲氧基乙氧基； R1 為-(CH2 )3 -OH； R2 為-H或甲基；且 n為0至2之整數， 或一種其醫藥學上可接受之鹽。
在本發明態樣之一些實施例中，U5 ' 為-H。在其他實施例中，U5 ' 為鹵素。在某些實施例中，U5 ' 係碘或溴。在本發明態樣之一些實施例中，式(C)之免疫調節寡核苷酸為式(C')之免疫調節寡核苷酸。在本發明態樣之其他實施例中，式(C)之免疫調節寡核苷酸為式(C'')之免疫調節寡核苷酸。
在本發明態樣之一些實施例中，本文提供式(C')之免疫調節寡核苷酸
Figure 02_image424
， 其中
Figure 02_image011
及
Figure 02_image413
指示該寡核苷酸內之連接點； 各T1 獨立地為O或S； 各T2 為S- ； T3 為基團
Figure 02_image428
，其中
Figure 02_image003
指示與寡核苷酸之其餘部分的連接點； Z為O或S； R5 ' 為-H或甲氧基； Rc1 為-H或甲氧基； Rg1 、Rg2 、Rg3 及Rg4 係H或側氧基，其限制條件為Rg1 、Rg2 、Rg3 及Rg4 中之至少一者係側氧基且其中側氧基所附接之碳在7位置處具有與環氮相連之單鍵)； R3 ' 為甲氧基或2-甲氧基乙氧基； R1 為-(CH2 )3 -OH； R2 為-H或甲基；且 n為0至2之整數， 或一種其醫藥學上可接受之鹽。
在本發明態樣之其他實施例中，本文提供式(C'')之免疫調節寡核苷酸
Figure 02_image431
， 其中
Figure 02_image011
及
Figure 02_image413
指示該寡核苷酸內之連接點； 各T1 獨立地為O或S； 各T2 為S- ； T3 為基團
Figure 02_image435
，其中
Figure 02_image003
指示與寡核苷酸之其餘部分的連接點； Z為O或S； R5 ' 為-H或甲氧基； Rc1 為-H或甲氧基； Rg1 、Rg2 、Rg3 及Rg4 係H或側氧基，其限制條件為Rg1 、Rg2 、Rg3 及Rg4 中之至少一者係側氧基且其中側氧基所附接之碳在7位置處具有與環氮相連之單鍵)； R3 ' 為甲氧基或2-甲氧基乙氧基； R1 為-(CH2 )3 -OH； R2 為-H或甲基；且 n為0至2之整數， 或一種其醫藥學上可接受之鹽。
在本發明態樣之一些實施例中，本文提供式(C')之免疫調節寡核苷酸
Figure 02_image437
， 其中：
Figure 02_image011
及
Figure 02_image413
指示該寡核苷酸內之連接點； 各T1 獨立地為O或S； 各T2 為S- ； T3 為基團
Figure 02_image441
，其中
Figure 02_image003
指示與寡核苷酸之其餘部分的連接點； Z為O或S； R5 ' 為-H或甲氧基； Rc1 為-H或甲氧基； Rg1 、Rg2 、Rg3 及Rg4 為H； R3 ' 為甲氧基； R1 為-(CH2 )3 -OH； R2 為-H或甲基；且 n為0至2之整數， 或一種其醫藥學上可接受之鹽。
在本發明態樣之其他實施例中，本文提供式(C'')之免疫調節寡核苷酸
Figure 02_image443
， 其中：
Figure 02_image011
及
Figure 02_image413
指示該寡核苷酸內之連接點； 各T1 獨立地為O或S； 各T2 為S- ； T3 為基團
Figure 02_image446
，其中
Figure 02_image003
指示與寡核苷酸之其餘部分的連接點； Z為O或S； R5 ' 為-H或甲氧基； Rc1 為-H或甲氧基； Rg1 、Rg2 、Rg3 及Rg4 為H； R3 ' 為甲氧基； R1 為-(CH2 )3 -OH； R2 為-H或甲基；且 n為0至2之整數， 或一種其醫藥學上可接受之鹽。
在本發明態樣之一些實施例中，Z為S。在其他實施例中，寡核苷酸包含至少一對成對T1 及T2 ，其中T1 為S且T2 為S- 。在某些實施例中，寡核苷酸包含至少兩對成對T1 及T2 ，其中T1 為S且T2 為S- 。成對T1 及T2 (其中T1 為S且T2 為S- )亦可描述為二硫代磷酸酯鍵聯。
應認識到，在一些情況下，其中寡核苷酸具有至少一對成對T1 及T2 ，其中T1 為S且T2 為S- ，就鍵聯在寡核苷酸內所處位置而言，可進一步描述該(等)二硫代磷酸酯鍵聯。鍵聯之位置可表徵為例如在兩個核苷殘基之間，例如在如自寡核苷酸之5'端計數的第一及第二核苷殘基之間(或核苷殘基1與2之間)。替代地，鍵聯位置可描述為位於既定核苷殘基之3'位置處，例如位於緊隨指定核苷殘基之核苷間連接子或'3端殘基之3'位置處。
在其中寡核苷酸包含至少一對成對T1 及T2 (其中T1 為S且T2 為S- )且其中n為0之一些實施例中，至少一個二硫代磷酸酯鍵聯在核苷殘基1與2之間、核苷殘基2與3之間、核苷殘基3與4之間、核苷殘基5與6之間、核苷殘基6與7之間、核苷殘基7與8之間、核苷殘基8與9之間、核苷殘基9與10之間、核苷殘基10與11之間或核苷殘基11與12之間。在其中寡核苷酸包含至少一對成對T1 及T2 (其中T1 為S且T2 為S- )且其中n為0之一些實施例中，該至少一個二硫代磷酸酯鍵聯位於核苷殘基1、核苷殘基2、核苷殘基3、核苷殘基5、核苷殘基6、核苷殘基7、核苷殘基8、核苷殘基9、核苷殘基10、核苷殘基11、核苷殘基12或核苷殘基13之3'位置處。
在其中寡核苷酸包含至少一對成對T1 及T2 (其中T1 為S且T2 為S- )且其中n為1之一些實施例中，至少一個二硫代磷酸酯鍵聯在核苷殘基1與2之間、核苷殘基2與3之間、核苷殘基3與4之間、核苷殘基5與6之間、核苷殘基6與7之間、核苷殘基7與8之間、核苷殘基8與9之間、核苷殘基9與10之間、核苷殘基10與11之間、核苷殘基11與12之間或核苷殘基12與13之間。在其中寡核苷酸包含至少一對成對T1 及T2 (其中T1 為S且T2 為S- )且其中n為0之一些實施例中，該至少一個二硫代磷酸酯鍵聯位於核苷殘基1、核苷殘基2、核苷殘基3、核苷殘基5、核苷殘基6、核苷殘基7、核苷殘基8、核苷殘基9、核苷殘基10、核苷殘基11、核苷殘基12、核苷殘基13或核苷殘基14之3'位置處。
在其中寡核苷酸包含至少一對成對T1 及T2 (其中T1 為S且T2 為S- )且其中n為1之一些實施例中，至少一個二硫代磷酸酯鍵聯在核苷殘基1與2之間、核苷殘基2與3之間、核苷殘基3與4之間、核苷殘基5與6之間、核苷殘基6與7之間、核苷殘基7與8之間、核苷殘基8與9之間、核苷殘基9與10之間、核苷殘基10與11之間、核苷殘基11與12之間或核苷殘基12與13之間。在其中寡核苷酸包含至少一對成對T1 及T2 (其中T1 為S且T2 為S- )且其中n為1之一些實施例中，該至少一個二硫代磷酸酯鍵聯位於核苷殘基1、核苷殘基2、核苷殘基3、核苷殘基5、核苷殘基6、核苷殘基7、核苷殘基8、核苷殘基9、核苷殘基10、核苷殘基11、核苷殘基12、核苷殘基13或核苷殘基14之3'位置處。
在其中寡核苷酸包含至少一對成對T1 及T2 (其中T1 為S且T2 為S- )且其中n為2之一些實施例中，至少一個二硫代磷酸酯鍵聯在核苷殘基1與2之間、核苷殘基2與3之間、核苷殘基3與4之間、核苷殘基5與6之間、核苷殘基6與7之間、核苷殘基7與8之間、核苷殘基8與9之間、核苷殘基9與10之間、核苷殘基10與11之間、核苷殘基11與12之間、核苷殘基12與13之間或核苷殘基13與14之間。在其中寡核苷酸包含至少一對成對T1 及T2 (其中T1 為S且T2 為S- )且其中n為2之一些實施例中，該至少一個二硫代磷酸酯鍵聯位於核苷殘基1、核苷殘基2、核苷殘基3、核苷殘基5、核苷殘基6、核苷殘基7、核苷殘基8、核苷殘基9、核苷殘基10、核苷殘基11、核苷殘基12、核苷殘基13、核苷殘基14或核苷殘基15之3'位置處。
在又其他實施例中，其中寡核苷酸具有至少兩個二硫代磷酸酯鍵聯或包含至少兩對成對T1 及T2 ，其中T1 為S且T2 為S- ，可指定一個或兩個二硫代磷酸酯鍵聯或T1 及T2 對之位置。應認識到，一個或兩個二硫代磷酸酯鍵聯之位置可獨立地變化。
在本發明態樣之一些實施例中，本文提供式(C')之免疫調節寡核苷酸
Figure 02_image448
， 其中：
Figure 02_image011
及
Figure 02_image413
指示該寡核苷酸內之連接點； 各T1 獨立地為O或S； 各T2 為S- ； T3 為基團
Figure 02_image450
，其中
Figure 02_image003
指示與寡核苷酸之其餘部分的連接點； Z為O或S； R5 ' 為-H或甲氧基； Rc1 為-H或甲氧基； Rg1 、Rg2 、Rg3 及Rg4 為H； R3 ' 為甲氧基； R1 為-(CH2 )3 -OH； R2 為-H或甲基；且 n為0至2之整數， 或一種其醫藥學上可接受之鹽。
在本發明態樣之其他實施例中，本文提供式(C'')之免疫調節寡核苷酸
Figure 02_image452
， 其中：
Figure 02_image011
及
Figure 02_image413
指示該寡核苷酸內之連接點； 各T1 獨立地為O或S； 各T2 為S- ； T3 為基團
Figure 02_image454
，其中
Figure 02_image003
指示與寡核苷酸之其餘部分的連接點； Z為O或S； R5 ' 為-H或甲氧基； Rc1 為-H或甲氧基； Rg1 、Rg2 、Rg3 及Rg4 為H； R3 ' 為甲氧基； R1 為-(CH2 )3 -OH； R2 為-H或甲基；且 n為0至2之整數， 或一種其醫藥學上可接受之鹽。
在本發明態樣之一些實施例中，Z為S。在其他實施例中，寡核苷酸包含至少一對成對T1 及T2 ，其中T1 為S且T2 為S- 。在某些實施例中，寡核苷酸包含至少兩對成對T1 及T2 ，其中T1 為S且T2 為S- 。
在本發明態樣之又另一實施例中，本文提供一種式(C)寡核苷酸
Figure 02_image457
， 其中
Figure 02_image011
及
Figure 02_image413
指示寡核苷酸內之連接點； 各T1 獨立地為O或S； 各T2 為S- ； 其限制條件為該寡核苷酸包含至少一對成對T1 及T2 ，其中T1 為S且T2 為S， T3 為基團
Figure 02_image460
，其中
Figure 02_image003
指示與寡核苷酸之其餘部分的連接點； Z為O或S； U5 ' 為-H或鹵素； R5 ' 為-H； Rc1 為-H； Rg1 、Rg2 、Rg3 及Rg4 為H； R3 ' 為甲氧基； R1 為-(CH2 )3 -OH； R2 為-甲基；且 n為1， 或一種其醫藥學上可接受之鹽。
在前述任一者之一些實施例中，其中T1 為S且T2 為S之至少一對成對T1 及T2 在核苷殘基2與3之間、核苷殘基3與4之間、核苷殘基5與6之間、核苷殘基6與7之間、核苷殘基7與8之間、核苷殘基8與9之間、核苷殘基9與10之間或核苷殘基10與11之間。在前述其他實施例中，寡核苷酸包含至少兩對成對T1 及T2 ，其中T1 為S且T2 為S，且其中該至少兩對成對T1 及T2 (其中T1 為S且T2 為S)在核苷殘基2與3之間、核苷殘基3與4之間、核苷殘基5與6之間、核苷殘基6與7之間、核苷殘基7與8之間、核苷殘基8與9之間、核苷殘基9與10之間或核苷殘基10與11之間。
在一些實施例中，寡核苷酸包含一對或兩對成對T1 及T2 ，其中T1 為S且T2 為S，且該一對或兩對成對T1 及T2 在核苷殘基2與3之間、核苷殘基3與4之間、核苷殘基5與6之間、核苷殘基6與7之間、核苷殘基7與8之間、核苷殘基8與9之間、核苷殘基9與10之間或核苷殘基10與11之間。在某些實施例中，寡核苷酸包含一對成對T1 及T2 ，其中T1 為S且T2 為S，且其中該對成對T1 及T2 位於核苷殘基2與3之間、核苷殘基3與4之間、核苷殘基5與6之間、核苷殘基6與7之間、核苷殘基7與8之間、核苷殘基8與9之間、核苷殘基9與10之間或核苷殘基10與11之間。在某些其他實施例中，寡核苷酸包含兩對成對T1 及T2 ，其中T1 為S且T2 為S，且其中兩對成對T1 及T2 (其中T1 為S且T2 為S)在核苷殘基2與3之間、核苷殘基3與4之間、核苷殘基5與6之間、核苷殘基6與7之間、核苷殘基7與8之間、核苷殘基8與9之間、核苷殘基9與10之間或核苷殘基10與11之間。
在一些實施例中，R5 '為H。在其他實施例中，R5 '為甲氧基。在一些實施例中，Rc1 為H。在其他實施例中，Rc1 為甲氧基。在其他實施例中，R2 為甲基。在其他實施例中，R2 為H。在可與前述實施例中之任一者組合的其他額外實施例中，T3 為
Figure 02_image462
。在其他實施例中，T3 為
Figure 02_image464
。在某些實施例中，m為20至25之整數。
在另一態樣中，式(C)之免疫調節寡核苷酸為選自由以下組成之群的寡核苷酸： 表 9 及 表 10 之寡核苷酸或其醫藥學上可接受之鹽。在又其他實施例中，式(C)之免疫調節寡核苷酸為選自由以下組成之群的寡核苷酸： 表 10 之寡核苷酸或其醫藥學上可接受之鹽。表 9 . 經修飾之寡核苷酸結構 ( 用 PEG3 NH2 )
化合物# 結構
1.1a
Figure 02_image466
2.1a
Figure 02_image468
2.2a
Figure 02_image470
2.3a
Figure 02_image472
2.4a
Figure 02_image474
表 10 . 經修飾之寡核苷酸結構 ( 用 - PEG3 NH2 )
化合物# 結構
3.1a
Figure 02_image476
3.2a  
Figure 02_image478
3.3a
Figure 02_image480
4.1a
Figure 02_image482
4.2a
Figure 02_image484
4.3a
Figure 02_image486
5.1a
Figure 02_image488
5.2a
Figure 02_image490
5.3a
Figure 02_image492
5.4a
Figure 02_image494
5.5a
Figure 02_image496
5.6a
Figure 02_image498
5.7a
Figure 02_image500
5.8a
Figure 02_image502
5.9a
Figure 02_image504
5.10a
Figure 02_image506
5.11a
Figure 02_image508
5.12a
Figure 02_image510
6.1a
Figure 02_image512
6.2a
Figure 02_image514
6.3a
Figure 02_image516
7.1a
Figure 02_image518
7.2a
Figure 02_image520
7.3a
Figure 02_image522
7.4a
Figure 02_image524
7.5a
Figure 02_image526
7.6a
Figure 02_image528
7.7a
Figure 02_image530
7.8a
Figure 02_image532
7.9a
Figure 02_image534
7.10a
Figure 02_image536
15.7a
Figure 02_image538
在一些實施例中，式(C)之免疫調節寡核苷酸可在不與抗體或其抗原結合片段結合之情況下使用或可用作製備包含抗體或其抗原結合片段及一或多種經由Q標籤連接之式(C)之免疫調節寡核苷酸的結合物，如由本文所述之式(A)之結構所示。
在一個態樣中，本文提供式(C)之免疫調節寡核苷酸，其中寡核苷酸不與任何遞送形態(諸如奈米粒子或蛋白質)或靶向部分(諸如抗體或其抗原片段)結合。此類寡核苷酸可進一步稱為「裸」寡核苷酸或「裸」CpG。
在另一態樣中，本文提供式(C)之免疫調節寡核苷酸，其中免疫調節寡核苷酸係經聚乙二醇化。在另一態樣中，本文提供式(C)之免疫調節寡核苷酸，其中免疫調節寡核苷酸固定於珠粒上。在又一態樣中，本發明提供式(C)之免疫調節寡核苷酸，其中免疫調節寡核苷酸調配於奈米粒子中。在又另一態樣中，本發明提供式(C)之免疫調節寡核苷酸，其中免疫調節寡核苷酸囊封於脂質體中。在又一態樣中，本發明提供式(C)之免疫調節寡核苷酸，其中免疫調節寡核苷酸結合於多肽。
在另一態樣中，本文提供一種用於遞送根據本文實施例中之任一者之免疫調節寡核苷酸的方法，其包含使免疫調節寡核苷酸與細胞接觸。在一些實施例中，免疫調節寡核苷酸經聚乙二醇化。在其他實施例中，將免疫調節寡核苷酸固定於珠粒上。在一些實施例中，將免疫調節寡核苷酸調配於奈米顆粒中。在其他實施例中，將免疫調節寡核苷酸囊封於脂質體中。在一些實施例中，免疫調節寡核苷酸與多肽結合。
在其他實施例中，式(C)之免疫調節寡核苷酸可經修飾以將連接子部分L連接至式(C)中之端基T3 ，以提供式(D)之免疫調節寡核苷酸。在另一態樣中，本文提供式(D)之免疫調節寡核苷酸
Figure 02_image540
， 其中
Figure 02_image011
及
Figure 02_image413
指示該寡核苷酸內之連接點； 各T1 獨立地為O或S； 各T2 為S- ； T3 為基團
Figure 02_image543
，其中
Figure 02_image191
指示與L之連接點且其中
Figure 02_image367
指示與該寡核苷酸之其餘部分的連接點； L為基團
Figure 02_image547
，其中m為0至50之整數，且其中
Figure 02_image191
指示經由T3 與該寡核苷酸之其餘部分的連接點； Z為O或S； U5 ' 為-H或鹵素； R5 ' 為-H或甲氧基； Rc1 為-H或甲氧基； Rg1 、Rg2 、Rg3 及Rg4 係H或側氧基，其限制條件為Rg1 、Rg2 、Rg3 及Rg4 中之至少一者係側氧基且其中側氧基所附接之碳在7位置處具有與環氮相連之單鍵； R3 ' 為甲氧基或2-甲氧基乙氧基； R1 為-(CH2 )3 -OH； R2 為-H或甲基；且 n為0至2之整數， 或一種其醫藥學上可接受之鹽。
在本發明態樣之一些實施例中，U5 ' 為H。在其他實施例中，U5 ' 為鹵素。在某些實施例中，U5 ' 係碘或溴。在本發明態樣之一些實施例中，式(D)之免疫調節寡核苷酸為式(D')之免疫調節寡核苷酸。在本發明態樣之其他實施例中，式(D)之免疫調節寡核苷酸為式(D'')之免疫調節寡核苷酸。
在本發明態樣之一些實施例中，本文提供式(D')之免疫調節寡核苷酸
Figure 02_image550
， 其中
Figure 02_image011
及
Figure 02_image413
指示該寡核苷酸內之連接點； 各T1 獨立地為O或S； 各T2 為S- ； T3 為基團
Figure 02_image554
，其中
Figure 02_image191
指示與L之連接點且其中
Figure 02_image367
指示與該寡核苷酸之其餘部分的連接點； L為基團
Figure 02_image557
，其中m為0至50之整數，且其中
Figure 02_image191
指示經由T3 與該寡核苷酸之其餘部分的連接點； Z為O或S； R5 ' 為-H或甲氧基； Rc1 為-H或甲氧基； Rg1 、Rg2 、Rg3 及Rg4 係H或側氧基，其限制條件為Rg1 、Rg2 、Rg3 及Rg4 中之至少一者係側氧基且其中側氧基所附接之碳在7位置處具有與環氮相連之單鍵； R3 ' 為甲氧基或2-甲氧基乙氧基； R1 為-(CH2 )3 -OH； R2 為-H或甲基；且 n為0至2之整數， 或一種其醫藥學上可接受之鹽。
在本發明態樣之其他實施例中，本文提供式(D'')之免疫調節寡核苷酸
Figure 02_image560
， 其中
Figure 02_image011
及
Figure 02_image413
指示該寡核苷酸內之連接點； 各T1 獨立地為O或S； 各T2 為S- ； T3 為基團
Figure 02_image562
，其中
Figure 02_image191
指示與L之連接點且其中
Figure 02_image367
指示與該寡核苷酸之其餘部分的連接點； L為基團
Figure 02_image564
，其中m為0至50之整數，且其中
Figure 02_image191
指示經由T3 與該寡核苷酸之其餘部分的連接點； Z為O或S； R5 ' 為-H或甲氧基； Rc1 為-H或甲氧基； Rg1 、Rg2 、Rg3 及Rg4 係H或側氧基，其限制條件為Rg1 、Rg2 、Rg3 及Rg4 中之至少一者係側氧基且其中側氧基所附接之碳在7位置處具有與環氮相連之單鍵； R3 ' 為甲氧基或2-甲氧基乙氧基； R1 為-(CH2 )3 -OH； R2 為-H或甲基；且 n為0至2之整數， 或一種其醫藥學上可接受之鹽。
在本發明態樣之一些實施例中，本發明亦提供式(D')之免疫調節寡核苷酸：
Figure 02_image566
， 其中
Figure 02_image011
及
Figure 02_image413
指示該寡核苷酸內之連接點； 各T1 獨立地為O或S； 各T2 為S- ； T3 為基團
Figure 02_image569
，其中
Figure 02_image191
指示與L之連接點且其中
Figure 02_image367
指示與該寡核苷酸之其餘部分的連接點； L為基團
Figure 02_image571
，其中m為0至50之整數，且其中
Figure 02_image191
指示經由T3 與該寡核苷酸之其餘部分的連接點； Z為O或S； R5 ' 為-H或甲氧基； Rc1 為-H或甲氧基； Rg1 、Rg2 、Rg3 及Rg4 為H； R3 ' 為甲氧基； R1 為-(CH2 )3 -OH； R2 為-H或甲基；且 n為0至2之整數， 或一種其醫藥學上可接受之鹽。
在本發明態樣之又其他實施例中，本文提供式(D'')之免疫調節寡核苷酸
Figure 02_image574
， 其中
Figure 02_image011
及
Figure 02_image413
指示該寡核苷酸內之連接點； 各T1 獨立地為O或S； 各T2 為S- ； T3 為基團
Figure 02_image576
，其中
Figure 02_image191
指示與L之連接點且其中
Figure 02_image367
指示與該寡核苷酸之其餘部分的連接點； L為基團
Figure 02_image578
，其中m為0至50之整數，且其中
Figure 02_image191
指示經由T3 與該寡核苷酸之其餘部分的連接點； Z為O或S； R5 ' 為-H或甲氧基； Rc1 為-H或甲氧基； Rg1 、Rg2 、Rg3 及Rg4 為H； R3 ' 為甲氧基； R1 為-(CH2 )3 -OH； R2 為-H或甲基；且 n為0至2之整數， 或一種其醫藥學上可接受之鹽。
在本發明態樣之一些實施例中，Z為S。在其他實施例中，寡核苷酸包含至少一對成對T1 及T2 ，其中T1 為S且T2 為S- 。在某些實施例中，寡核苷酸包含至少兩對成對T1 及T2 ，其中T1 為S且T2 為S- 。
在本發明態樣之又另一實施例中，本文提供一種式(D)寡核苷酸
Figure 02_image580
， 其中
Figure 02_image011
及
Figure 02_image413
指示寡核苷酸內之連接點； 各T1 獨立地為O或S； 各T2 為S- ； 其限制條件為該寡核苷酸包含至少一對成對T1 及T2 ，其中T1 為S且T2 為S， T3 為基團
Figure 02_image584
，其中
Figure 02_image191
指示與L之連接點且其中
Figure 02_image367
指示與該寡核苷酸之其餘部分的連接點； L為基團
Figure 02_image586
，其中m為0至50之整數，且其中
Figure 02_image191
指示經由T3 與該寡核苷酸之其餘部分的連接點； Z為O或S； U5 ' 為-H或鹵素； R5 ' 為-H； Rc1 為-H； Rg1 、Rg2 、Rg3 及Rg4 為H； R3 ' 為甲氧基； R1 為-(CH2 )3 -OH； R2 為-甲基；且 n為1， 或一種其醫藥學上可接受之鹽。
在前述任一者之一些實施例中，其中T1 為S且T2 為S之至少一對成對T1 及T2 在核苷殘基2與3之間、核苷殘基3與4之間、核苷殘基5與6之間、核苷殘基6與7之間、核苷殘基7與8之間、核苷殘基8與9之間、核苷殘基9與10之間或核苷殘基10與11之間。在前述其他實施例中，寡核苷酸包含至少兩對成對T1 及T2 ，其中T1 為S且T2 為S，且其中該至少兩對成對T1 及T2 (其中T1 為S且T2 為S)在核苷殘基2與3之間、核苷殘基3與4之間、核苷殘基5與6之間、核苷殘基6與7之間、核苷殘基7與8之間、核苷殘基8與9之間、核苷殘基9與10之間或核苷殘基10與11之間。
在一些實施例中，寡核苷酸包含一對或兩對成對T1 及T2 ，其中T1 為S且T2 為S，且該一對或兩對成對T1 及T2 在核苷殘基2與3之間、核苷殘基3與4之間、核苷殘基5與6之間、核苷殘基6與7之間、核苷殘基7與8之間、核苷殘基8與9之間、核苷殘基9與10之間或核苷殘基10與11之間。在某些實施例中，寡核苷酸包含一對成對T1 及T2 ，其中T1 為S且T2 為S，且其中該對成對T1 及T2 位於核苷殘基2與3之間、核苷殘基3與4之間、核苷殘基5與6之間、核苷殘基6與7之間、核苷殘基7與8之間、核苷殘基8與9之間、核苷殘基9與10之間或核苷殘基10與11之間。在某些其他實施例中，寡核苷酸包含兩對成對T1 及T2 ，其中T1 為S且T2 為S，且其中兩對成對T1 及T2 (其中T1 為S且T2 為S)在核苷殘基2與3之間、核苷殘基3與4之間、核苷殘基5與6之間、核苷殘基6與7之間、核苷殘基7與8之間、核苷殘基8與9之間、核苷殘基9與10之間或核苷殘基10與11之間。
在一些實施例中，R5 '為H。在其他實施例中，R5 '為甲氧基。在一些實施例中，Rc1 為H。在其他實施例中，Rc1 為甲氧基。在其他實施例中，R2 為甲基。在其他實施例中，R2 為H。在可與前述實施例中之任一者組合的其他額外實施例中，T3 為
Figure 02_image588
。在其他實施例中，T3 為
Figure 02_image590
。在某些實施例中，m為20至25之整數。
在另一態樣中，式(D)之免疫調節寡核苷酸為選自由以下組成之群的寡核苷酸： 表 11 及 表 12 之寡核苷酸或其醫藥學上可接受之鹽。在本發明態樣之其他實施例中，式(D)之寡核苷酸係選自由以下組成之群： 表 12 之寡核苷酸或其醫藥學上可接受之鹽。表 11 . 經修飾之寡核苷酸結構 ( 用 - PEG3 NHCOPEG24 NH2 )
化合物# 結構
1.1b
Figure 02_image592
2.1b
Figure 02_image594
2.2b
Figure 02_image596
2.3b
Figure 02_image598
2.4b
Figure 02_image600
表 12 . 經修飾之寡核苷酸結構 ( 用 -PEG3 NHCOPEG24 NH2 )
化合物# 結構
3.1b
Figure 02_image602
3.2b
Figure 02_image604
3.3b
Figure 02_image606
4.1b
Figure 02_image608
4.2b
Figure 02_image610
4.3b
Figure 02_image612
5.1b
Figure 02_image614
5.2b
Figure 02_image616
5.3b
Figure 02_image618
5.4b
Figure 02_image620
5.5b
Figure 02_image622
5.6b
Figure 02_image624
5.7b
Figure 02_image626
5.8b
Figure 02_image628
5.9b
Figure 02_image630
5.10b
Figure 02_image632
5.11b
Figure 02_image634
5.12b
Figure 02_image636
6.1b
Figure 02_image638
6.2b
Figure 02_image640
6.3b
Figure 02_image642
7.1b
Figure 02_image644
7.2b
Figure 02_image646
7.3b
Figure 02_image648
7.4b
Figure 02_image650
7.5b
Figure 02_image652
7.6b
Figure 02_image654
7.7b
Figure 02_image656
7.8b
Figure 02_image658
7.9b
Figure 02_image660
7.10b
Figure 02_image662
15.7b
Figure 02_image664
如同式(C)之寡核苷酸，式(D)之免疫調節寡核苷酸可在不與抗體或其抗原結合片段結合之情況下使用或可用作製備包含抗體或其抗原結合片段及一或多種經由Q標籤連接之式(D)之免疫調節寡核苷酸的結合物，如由本文所述之式(A)之結構所示。
在一個態樣中，本文提供式(D)之免疫調節寡核苷酸，其中寡核苷酸不與任何遞送形態(諸如奈米粒子或蛋白質)或靶向部分(諸如抗體或其抗原片段)結合。此類寡核苷酸可進一步稱為「裸」寡核苷酸或「裸」CpG。
在另一態樣中，本文提供式(D)之免疫調節寡核苷酸，其中免疫調節寡核苷酸係經聚乙二醇化。在另一態樣中，本文提供式(D)之免疫調節寡核苷酸，其中免疫調節寡核苷酸固定於珠粒上。在又一態樣中，本發明提供式(D)之免疫調節寡核苷酸，其中免疫調節寡核苷酸調配於奈米粒子中。在又另一態樣中，本發明提供式(D)之免疫調節寡核苷酸，其中免疫調節寡核苷酸囊封於脂質體中。在又一態樣中，本發明提供式(D)之免疫調節寡核苷酸，其中免疫調節寡核苷酸結合於多肽。
在另一態樣中，本文提供一種用於遞送根據本文實施例中之任一者之免疫調節寡核苷酸的方法，其包含使免疫調節寡核苷酸與細胞接觸。在一些實施例中，免疫調節寡核苷酸經聚乙二醇化。在其他實施例中，將免疫調節寡核苷酸固定於珠粒上。在一些實施例中，將免疫調節寡核苷酸調配於奈米顆粒中。在其他實施例中，將免疫調節寡核苷酸囊封於脂質體中。在一些實施例中，免疫調節寡核苷酸與多肽結合。
如本文所述之式(C)及(D)之免疫調節寡核苷酸可根據此項技術中已知之方法製備。下文描述用於製備免疫調節寡核苷酸之通用方法，包括本發明中所提供之彼等方法。 一般聚核苷酸合成： 一般流程 ：
Figure 02_image666
實驗細節：
用以下試劑及溶劑在MerMade 6或12上進行自動化聚核苷酸合成(1 µmol規模)： 氧化劑-0.02 M含I2 之THF/吡啶/H2 O (每週期60 s氧化)， 硫化試劑II-二噻唑衍生物/吡啶/乙腈(0.05 M，在6:4吡啶:乙腈中) (每週期60 s) 去嵌段劑-3%三氯乙酸(每週期2×40 s去嵌段)， Cap Mix A-THF/2,6-二甲基吡啶/Ac2 O (每週期60 s封端)，及 Cap Mix B-16%含甲基咪唑之THF (每週期60 s封端)
標準聚核苷酸合成條件之例外如下： -   使用具有稱為Uny連接子之非核苷連接子的CPG載體。 -   在合成之前，除了一些經修飾之2'-去氧-亞胺基磷酸酯在THF/乙腈混合物(1:4)中溶解至100 mM以外，視起始物質之溶解度而定，所有2'-去氧核糖-亞胺基磷酸酯在100%無水乙腈中再懸浮至100 mM。 -   亞胺基磷酸酯活化係用2.5倍莫耳濃度過量之5-苯甲硫基-1H-四唑(BTT)進行。活化2'-去氧核糖-亞胺基磷酸酯以每次插入為偶合2×1分鐘而偶合，且經修飾之亞胺基磷酸酯以每次插入為偶合2×3分鐘而偶合。 用0.05 M含硫化試劑II之吡啶/乙腈(6:4)對主鏈進行硫化1分鐘。脫除聚核苷酸保護基及純化方案 ：
在自動化聚核苷酸合成之後，固體載體及鹼基保護基(諸如A-Bz、C-Ac、G-iBu等)及磷酸三酯之甲酯在室溫下在1 mL AMA (1:1比率之36%氨水溶液及40%甲胺之甲醇溶液)中裂解且脫除保護基2小時或更久，隨後進行離心蒸發。
將粗聚核苷酸離心塊再懸浮於100 μL之50%乙腈中，短暫加熱至65℃且充分渦旋。
對於聚核苷酸純化，將100 μL粗聚核苷酸以下列緩衝液/梯度注射至RP-HPLC上： - 緩衝液A=50 mM TEAA之水溶液； - 緩衝液B=90%乙腈；及 - 流動速率=1 mL/min； - 梯度： o 0-2分鐘(100%緩衝液A/0%緩衝液B)， o 2-42分鐘(0%至60%緩衝液B)，及 o 42-55分鐘(60%至100%緩衝液B)。DBCO 結合及純化方案：
DBCO NHS酯與如本文所述之粗2'-去氧DMT-聚核苷酸結合。將粗產物聚核苷酸離心塊懸浮於45 μL DMSO中，短暫加熱至65℃且充分渦旋。添加5 μL DIPEA，接著添加DBCO-NHS酯(30當量)，將其預先溶解於DMSO (1 M)中。使反應物靜置10分鐘或直至藉由MALDI確認產物形成。將總計80 μL粗聚核苷酸樣品以以下緩衝液/梯度注射至RP-HPLC上： - 緩衝液A=50 mM TEAA/水 - 緩衝液B=90%乙腈 - 流動速率=1 mL/min - 梯度： o 0-2分鐘(90%緩衝液A/10%緩衝液B) o 2-42分鐘(0%至60%緩衝液B) o 42-55分鐘(60%至100%緩衝液B)。
跨越主要RP-HPLC峰，收集0.5 mL溶離份且藉由MALDI-TOF質譜分析以確認所需質量之存在。將所選質量之經純化溶離份冷凍且凍乾。乾燥後，將溶離份再懸浮，與相應溶離份組合，冷凍且凍乾。
DMT裂解：將凍乾離心塊懸浮於20 μL之50%乙腈中且添加80 μL乙酸，使樣品在室溫下保持靜置1小時，冷凍且凍乾。將乾燥樣品再溶解於20%乙腈中且經由NAP 10 (SephadexTM -G25 DNA級)管柱去鹽。進行收集，冷凍且凍乾純溶離份用於最終產物。 使寡核苷酸連接至連接部分之方法 經 Cu 催化之點擊反應 銅 - THPTA 錯合物製劑
將5 mM五水合硫酸銅(CuSO4 -5H2 O)之水溶液及10 mM參(3-羥丙基三唑基甲基)胺(THPTA)之水溶液以1:1 (v/v) (1:2莫耳濃度比)混合且使其在室溫下靜置1小時。此錯合物可用於催化胡伊斯根環加成(Huisgen cycloaddition)，例如如以下通用結合流程中所示。通用程序 ( 100 nM 規模 ) ：
向1.7 mL埃彭道夫管(Eppendorf tube)中之710 μL水及100 μL三級丁醇(10%最終體積)之溶液中添加60 μL銅-THPTA錯合物，繼之以50 μL 2 mM寡核苷酸溶液；60 μL 20 mM抗壞血酸鈉水溶液；及20 μL 10 mM靶向部分-疊氮化物之溶液。在充分混合之後，使溶液在室溫下靜置1小時。藉由凝膠分析確認反應之完成。將反應混合物添加至含有5-10倍莫耳濃度過量之SiliaMetS® TAAcONa (樹脂結合EDTA鈉鹽)之螺帽小瓶中。將混合物攪拌1小時。此混合物隨後經由illustra™Nap™-10管柱Sephadex™溶離。接著冷凍所得溶液且凍乾隔夜。經由醯胺鍵聯之連接：
經由醯胺化之結合可在此項技術中已知之醯胺化反應條件下進行。參見例如Aaronson等人,Bioconjugate Chem. 22:1723-1728, 2011。
Figure 02_image668
Figure 02_image670
， 其中 各q為0或1； 各m為0至5之整數； Z為O或S； RO 為鍵結至聚核苷酸中之核苷之鍵； R為鍵結至H (聚核苷酸中之核苷)、至固體載體或至封端基團(例如-(CH2 )3 -OH)之鍵； 各R'獨立地為H、-Q1 -QA1 、生物可逆基團或非生物可逆基團； 各R''獨立地為H、-Q1 -QA -Q1 -T、生物可逆基團或非生物可逆基團； 各RA 獨立地為H或-ORC ，其中RC 為-Q1 -QA1 、生物可逆基團或非生物可逆基團； 各RB 獨立地為H或-ORD ，其中RD 為-Q1 -QA -Q2 -T、生物可逆基團或非生物可逆基團； 其中 各Q1 獨立地為二價、三價、四價或五價基團，其中一個價鍵結至QA 或QA1 ，第二價為開放的，且其餘價中之每一者(若存在)獨立地鍵結至輔助部分； 各Q2 獨立地為二價、三價、四價或五價基團，其中一個價數鍵結至QA ，第二價鍵結至T，且其餘價數中之每一者(若存在)獨立地鍵結至輔助部分； QA 為視情況含有-C(O)-N(H)-或-N(H)-C(O)-之經取代之C2 - 12 伸雜烷基； QA1 為-NHRN1 或-COOR12 ，其中RN1 為H，N-保護基或視情況經取代之C1 - 6 烷基，且R12 為H、視情況經取代之C1 - 6 烷基或O -保護基；且 T為連接部分， 其限制條件為起始物質含有至少一種-Q1 -QA1 ，且產物含有-Q1 -QA -Q2 -T。
溶液相連接：
Figure 02_image672
， 其中 m為0至5之整數； Z為O或S； RO 為鍵結至聚核苷酸中之核苷之鍵； R為鍵結至H (聚核苷酸中之核苷)或至封端基團之鍵； 各R'獨立地為H、-Q1 -NH2 、生物可逆基團或非生物可逆基團； 各R''獨立地為H、-Q1 -NH-CO-Q2 -T、生物可逆基團或非生物可逆基團； 各RA 獨立地為H或-ORC ，其中RC 為-Q1 -NH2 、生物可逆基團或非生物可逆基團； 各RB 獨立地為H或-ORD ，其中RD 為-Q1 -NH-CO-Q2 -T、生物可逆基團或非生物可逆基團； 其中 各Q1 獨立地為二價、三價、四價或五價基團，其中一個價鍵結至-NH-CO-或-NH2 ，第二價為開放的，且其餘價中之每一者(若存在)獨立地鍵結至輔助部分； 各Q2 獨立地為二價、三價、四價或五價基團，其中一個價鍵結至-NH-CO-，第二價為鍵結至T，且其餘價中之每一者(若存在)獨立地鍵結至輔助部分；且 T為連接部分， 其限制條件為起始物質含有-Q1 -NH2 ，且產物含有-Q1 -NH-CO-Q2 -T。
載體上連接：
Figure 02_image674
其中 Z為O或S； RO 為鍵結至聚核苷酸中之核苷之鍵； 各Q2 獨立地為二價、三價、四價或五價基團，其中一個價鍵結至-NH-CO-，第二價為鍵結至T，且其餘價中之每一者(若存在)獨立地鍵結至輔助部分；且 T為連接部分。
Figure 02_image676
其中 n為1至8之整數； A為O或-CH2 -； Z為O或S； RO 為鍵結至聚核苷酸中之核苷之鍵； 各Q2 獨立地為二價、三價、四價或五價基團；其中一個價數鍵結至疊氮化物或三唑，第二價鍵結至T，且其餘價數中之每一者(若存在)獨立地鍵結至輔助部分； T為連接部分。
Figure 02_image678
其中 n為1至8之整數； A為O或-CH2 -； Z為O或S； RO 為鍵結至聚核苷酸中之核苷之鍵； 各Q2 獨立地為二價、三價、四價或五價基團；其中一個價數鍵結至疊氮化物或三唑，第二價鍵結至T，且其餘價數中之每一者(若存在)獨立地鍵結至輔助部分； T為連接部分。
Figure 02_image680
其中 n為1至8之整數； A為O或-CH2 -； Z為O或S； RO 為鍵結至聚核苷酸中之核苷之鍵； 各Q2 獨立地為二價、三價、四價或五價基團；其中一個價數鍵結至疊氮化物或三唑，第二價鍵結至T，且其餘價數中之每一者(若存在)獨立地鍵結至輔助部分； 各T獨立地為連接部分。脫除磷酸三酯之 Fmoc 保護基之代表性實例 ：
使包括具有Fmoc保護胺之磷酸三酯的聚核苷酸經受脫除保護基狀況，從而在未觀測到磷酸三酯轉化成磷酸二酯的情況下引起脫除Fmoc保護基。 TCCATGACGT T CCTGACGTT (SEQ ID NO:176)
Figure 02_image682
與 TCCATGACGTTCCTGACGTT ( SEQ ID NO : 176 ) 結合之 DBCO - NHS—— 代表性實例 ：
在室溫下在10分鐘內完成DBCO-NHS與磷酸三酯中之胺基的結合，如質譜分析所證明。
Figure 02_image684
使用以下條件進行含有DBCO結合基團之TCCATGACGTTCCTGACGTT (SEQ ID NO:176)之RP-HPLC純化： - 緩衝液A=50 mM TEAA/水； - 緩衝液B=90%乙腈；及 - 流動速率=1 mL/min； - 梯度： o 0-2分鐘(100%緩衝液A/0%緩衝液B)， o 2-22分鐘(0%至100%緩衝液B)，及 o 22-25分鐘(100%緩衝液B)。
利用例如2'-經修飾核苷亞胺基磷酸酯，可使用類似程序(諸如本文所描述之彼等程序)製備聚核苷酸。此類程序提供於國際專利申請案PCT/US2015/034749中；PCT/US2015/034749中之二硫化物磷酸三酯寡核苷酸合成之揭示內容以引用的方式併入本文中。 V.結合方法
本文提供用於製備包含經由一或多種如式(A)結構中所示之Q標籤肽連接的抗體或其抗原結合片段及一或多種免疫調節寡核苷酸之結合物的方法。在一些實施例中，該等方法包含在足以誘導結合(亦即，CpG與Q標籤之間發生醯胺化反應)之條件下，將包含至少一個Q標籤肽序列之抗體與至少一個暴露之穀胺醯胺殘基及寡核苷酸組合。在其他實施例中，該等方法包含在足以誘導結合之化學條件下，使包含至少一個Q標籤肽序列之抗體與至少一個暴露之穀胺醯胺殘基及寡核苷酸反應。在其他實施例中，該等方法包含在足以誘導結合之酶促條件下(例如與轉穀胺醯胺酶)，使包含至少一個Q標籤肽序列之抗體與至少一個暴露之穀胺醯胺殘基及寡核苷酸反應。 轉穀胺醯胺酶介導之結合反應條件
在一個態樣中，本文提供一種製備式(A)之結合物之方法，其包含將一或多種免疫調節寡核苷酸(P)與包含一或多個穀胺醯胺殘基之抗體組合。在一個態樣中，本文提供一種製備結合物之方法，該結合物包含抗體或抗原結合片段(Ab)及一或多種免疫調節寡核苷酸(P)，其中該抗體或抗原結合片段連接至一或多個包含胺基酸序列RPQGF (SEQ ID NO: 47)之Q標籤肽(Q)，且其中各免疫調節寡核苷酸經由與Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接至Q標籤肽，如式(A)中所示，
Figure 02_image686
， 其中：
Figure 02_image162
指示各Q與該抗體或其抗原結合片段(Ab)之連接點； 各Q獨立地包含Q標籤肽序列RPQGF (SEQ ID NO: 47)； 各L獨立地為經由與該穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵連接於Q的一鍵或連接子部分；及 各P獨立地為免疫調節寡核苷酸； 該製備方法包含在轉穀胺醯胺酶存在下，使下式(B)之化合物與一或多種免疫調節寡核苷酸P接觸：
Figure 02_image689
， 其中Ab及Q如上文針對式(A)所定義，且e為1至20之整數， 其中各P獨立地具有下式：
Figure 02_image691
， 其中 X5 ' 為5'端核苷； X3 ' 為3'端核苷； YPTE 為核苷間磷酸三酯； Y3 ' 為末端磷酸三酯； 各XN 獨立地為核苷； 各YN 獨立地為核苷間連接子； b及c各自獨立地為1至25之整數；其限制條件為b及c之總和為至少5；及 L為具有末端胺之連接子部分。
在另一態樣中，製備包含抗體或抗原結合片段(Ab)及一或多種免疫調節寡核苷酸(P)之結合物的方法，其中抗體或抗原結合片段連接至一或多個包含至少一個穀胺醯胺殘基之Q標籤肽(Q)，且其中各免疫調節寡核苷酸經由與Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接至Q標籤肽，如式(A)中所示，
Figure 02_image693
， 其中：
Figure 02_image003
指示各Q與該抗體或其抗原結合片段(Ab)之連接點； 各Q獨立地為具有至少一個穀胺醯胺殘基之Q標籤肽； 各L獨立地為經由與該穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵連接於Q的一鍵或連接子部分；及 各P獨立地為免疫調節寡核苷酸； 該製備方法包含在轉穀胺醯胺酶存在下，使下式(B)之化合物與一或多種免疫調節寡核苷酸P接觸：
Figure 02_image696
， 其中Ab及Q如上文針對式(A)所定義，且e為1至20之整數， 其中各寡核苷酸P獨立地為式(C)或式(D)之免疫調節寡核苷酸。
在一些實施例中，結合物包含一或多個、兩個或更多個、三個或更多個、四個或更多個、五個或更多個、六個或更多個、七個或更多個、八個或更多個、九個或更多個、十個或更多個或二十個或更多個Q標籤肽。在一些實施例中，結合物包含一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或二十個Q標籤肽。在一些實施例中，結合物具有2個Q標籤肽。在一些實施例中，結合物包含一或多種、兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種、六種或更多種、七種或更多種、八種或更多種、九種或更多種、十種或更多種或二十種或更多種免疫調節寡核苷酸。在一些實施例中，結合物包含一種、兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種或二十種免疫調節寡核苷酸。在一些實施例中，結合物具有一種免疫調節寡核苷酸。
在另一態樣中，該方法包含在轉穀胺醯胺酶存在下將式(C)化合物與包含一或多個穀胺醯胺殘基之式(B)抗體組合。在一些實施例中，該方法包含使式(D)化合物與包含一或多個穀胺醯胺殘基之式(B)抗體在轉穀胺醯胺酶存在下接觸。在一些實施例中，式(C)或式(D)之化合物之最終濃度在約1-100 µM之範圍內。在一些實施例中，包含抗體之Q標籤之最終濃度在約1-500 µM之範圍內。在一些實施例中，轉穀胺醯胺酶之最終濃度在約1-500 µM之範圍內。在一些實施例中，轉穀胺醯胺酶之最終濃度在以下範圍內：約1-50 µM、約50-100 µM、約100-150 µM、約150-200 µM、約200-250 µM、約250-300 µM、約300-400 µM、約400-500 µM、約100-125 µM、約125-150 µM、約150-175 µM、約175-200 µM、約200-225 µM、約225-250 µM、約250-275 µM、約275-300 µM、約300-325 µM或約325-350 µM。
在一些實施例中，包含抗體及式(C)或式(D)化合物之Q標籤的比率以重量計在以下範圍內：約1:1-250:1、約1:1-5:1、約5:1-10:1、約10:1-20:1、約20:1-30:1、約30:1-40:1、約40:1-50:1、約50:1-75:1、約75:1-100:1、約100:1-150:1、約150:1-200:1、約200:1-250:1、約1:1-25:1、約25:1-50:1、約50:1-75:1、約75:1-100:1或約100:1-250:1。在一些實施例中，式(C)或式(D)之化合物與抗體之比率以莫耳濃度計為約1:1、約2:1、約3:1、約4:1、約5:1、約6:1、約7:1、約8:1、約9:1、約10:1、約11:1、約12:1、約13:1、約14:1、約15:1、約16:1、約17:1、約18:1或約20:1。
在一些實施例中，包含抗體及轉穀胺醯胺酶之Q標籤的比率以重量計在約1:1-500:1、約1:1-5:1、約5:1-10:1、約10:1-20:1、約20:1-30:1、約30:1-40:1、約40:1-50:1、約50:1-75:1、約75:1-100:1、約100:1-150:1、約150:1-200:1、約200:1-250:1、約1:1-25:1、約25:1-50:1、約50:1-75:1、約75:1-100:1、約100:1-150:1、約150:1-200:1、約200:1-250:1、約250:1-300:1、約300:1-400:1或約400:1-500:1。在一些實施例中，肽及轉穀胺醯胺酶之比率以莫耳濃度計為約15:1、約16:1、約17:1、約18:1、約20:1、約21:1、約22:1、約23:1、約24:1、約25:1、約26:1、約27:1、約28:1、約29:1、約30:1、約31:1、約32:1、約33:1、約34:1、約35:1、約36:1、約37:1、約38:1、約39:1、約40:1、約41:1、約42:1、約43:1、約44:1、約45:1、約46:1、約47:1、約48:1、約49:1或約50:1。
在一些實施例中，Q標籤:CpG:轉穀胺醯胺酶之比率為約1:1.3:10。在一些實施例中，Q標籤:CpG:轉穀胺醯胺酶之比率為約1:1.5:10。在一些實施例中，Q標籤:CpG:轉穀胺醯胺酶之比率為約1:1.3:15。
在一些實施例中，在大於15℃、大於20℃、大於25℃、大於30℃、大於35℃、大於40℃、大於45℃或大於50℃下培育反應物。在一些實施例中，在約室溫下培育反應物。在一些實施例中，將反應物培育至少10分鐘、20分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、15小時、20小時、25小時、30小時、35小時、40小時、45小時、50小時或60小時。
在一些實施例中，本文所述之方法產生相比於肽約5%、大於約10%、大於約15%、大於約20%、大於約25%、大於約30%、大於約35%、大於約40%、大於約45%、大於約50%、大於約60%、大於約70%、大於約80%、大於約90%、大於約95%、大於約97%或大於約99%的式(A)化合物。
在一些實施例中，反應之pH在約4-10範圍內。在一些實施例中，反應之pH在約4-6、約6-8或約8-10範圍內。在一些實施例中，反應之pH在約7-8範圍內。
在另一態樣中，適用於將連接部分連接至寡核苷酸之反應為此項技術中已知的，包括但不限於疊氮基與基於炔烴之結合基團(例如，含有內環碳-碳參鍵之視情況經取代之C6 - 16 伸雜環基或視情況經取代之C8 - 16 環炔基)之間的胡伊斯根環加成(經金屬催化或無金屬)以形成三唑部分；親二烯物與二烯/雜二烯之間的狄爾斯-阿德反應(Diels-Alder reaction)；經由諸如烯反應之周環反應形成鍵；醯胺或硫代醯胺鍵形成；磺醯胺鍵形成(例如用疊氮基化合物)；醇或酚烷基化(例如威廉森烷基化(Williamson alkylation))、形成肟、腙或胺脲基團之縮合反應；藉由親核試劑(例如胺及硫醇)之結合加成反應；二硫鍵形成；及在羰基處(例如在經活化羧酸酯，諸如五氟苯基(PFP)酯或四氟苯基(TFP)酯處)或在親電子芳烴處(例如在寡氟化芳烴、氟苯甲腈基團或氟硝基苯基團處之SNAr)之親核取代(例如藉由胺、硫醇或羥基親核試劑)。
在某些實施例中，連接反應為偶極環加成，且結合部分包括疊氮基、含有內環碳-碳參鍵之視情況經取代之C6 - 16 伸雜環基，或視情況經取代之C8 - 16 環炔基。互補反應性基團及結合基團係針對其互補性選擇。舉例而言，疊氮基用於結合基團及互補反應性基團中之一者中，而炔烴用於結合基團及互補反應性基團中之另一者中。連接部分與寡核苷酸之連接
連接部分可藉由在寡核苷酸中之連接基團與鍵結至連接部分之互補反應性基團之間形成鍵來連接至寡核苷酸。在某些實施例中，連接部分經修飾以包括互補反應性基團。將此類互補反應性基團引入鍵聯部分中之方法為此項技術中已知的。
在某些實施例中，互補反應性基團為視情況經取代之C2 - 12 炔基、視情況經取代之N-保護胺基、疊氮基、N-順丁烯二醯亞胺基、S-保護硫醇、
Figure 02_image698
、
Figure 02_image700
、
Figure 02_image702
或其N-保護部分、
Figure 02_image704
、
Figure 02_image706
、
Figure 02_image708
、含有內環碳-碳參鍵之視情況經取代之C6 - 16 雜環基(例如
Figure 02_image710
)、1,2,4,5-四𠯤基(例如
Figure 02_image712
或
Figure 02_image714
)，視情況經取代之C8 - 16 環炔基(例如
Figure 02_image716
)、-NHRN1 、視情況經取代之C4 - 8 應變環烯基(例如反-環辛烯基或降𦯉烯基)或含有-COOR12 或-CHO之視情況經取代之C1 - 16 烷基； 其中： RN1 為H,N-保護基，或視情況經取代之C1 - 6 烷基； 各R12 獨立地為H、視情況經取代之C1 - 6 烷基或O-保護基(例如羧基保護基)；且 R13 為鹵素(例如F)。
在某些實施例中，在結合反應之前互補反應性基團受保護。舉例而言，受保護之互補反應性基團可包括-COORPGO 或-NHRPGN ，其中RPGO 為O-保護基(例如羧基保護基)，且RPGN 為N-保護基。 VI. 醫藥組合物
本發明之化合物及結合物，諸如包含式(A)結構之結合物、式(B)抗體及式(C)、(C')、(C'')、(D)、(D')及(D'')之免疫調節寡核苷酸或前述任一者之醫藥學上可接受之鹽或其任何子組，可調配成用於投與目的之各種醫藥形式。作為適當組合物，可引用通常用於全身性投與藥物之所有組合物。為了製備本發明之醫藥組合物，將作為活性成分的有效量之特定化合物(視情況呈加成鹽形式)與醫藥學上可接受之載劑混合時組合，該載劑可視投與所需之製劑形式而呈多種形式。此等呈單位劑型之醫藥組合物為合乎需要的，特別適用於經口、經直腸、經皮或藉由非經腸注射投與。舉例而言，在製備呈口服劑型之組合物中，常用醫藥介質中之任一種可諸如為所採用之：在諸如懸浮液、糖漿、酏劑、乳液及溶液之口服液體製劑之情況下，水、乙二醇、油、醇及其類似物；或在散劑、丸劑、膠囊及錠劑之情況下，諸如澱粉、糖、高嶺土、潤滑劑、黏合劑、崩解劑及其類似物之固體載劑。因為錠劑及膠囊容易投與，所以其代表最有利之口服單位劑型，在此情況下採用固體醫藥載劑。對於非經腸組合物而言，載劑將通常包含無菌水，其至少占大部分，但例如為有助於溶解度，可包括其他成分。舉例而言，可製備可注射溶液，其中載劑包含鹽水溶液、葡萄糖溶液或鹽水與葡萄糖溶液之混合物。亦可製備可注射懸浮液，在此情況下，可採用適當液體載劑、懸浮劑及其類似物。亦包括欲在使用前不久轉化為液體形式製劑之固體形式製劑。在適用於經皮投與之組合物中，該載劑視情況包含滲透增強劑及/或適合的濕潤劑，視情況與較小比例之任何性質之適合添加劑組合，該等添加劑不會對皮膚造成顯著有害影響。本發明化合物亦可以溶液、懸浮液或乾粉形式使用任何公知遞送系統經由經口吸入或吹入來投與。
就投與之容易性及劑量之均勻性而言，將醫藥組合物調配成單位劑型尤其有利。如本文所用之單位劑型係指適合作為單位劑量之物理離散單位，各單元含有預定量之活性成分，其經計算以與所需醫藥載劑一起產生所需治療效果。此類單位劑型之實例為錠劑(包括刻痕錠劑或包衣錠劑)、膠囊、丸劑、栓劑、散劑包、粉片、可注射溶液或懸浮液及其類似物，以及其分開的多個。
投與可為(但不限於)靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內、真皮下(例如經由植入裝置)及腦實質內投與。在一些實施例中，藉由皮下注射投與本文中所描述之醫藥組合物。
包括本文所述結合物之醫藥組合物可使用此項技術中已知之遞送技術遞送至細胞、細胞群、腫瘤、組織或個體。一般而言，此項技術中公認用於遞送核酸-蛋白質結合物(活體外或活體內)之任何適合方法可適於與本文所述之組合物一起使用。舉例而言，遞送可藉由以下實現：局部投與(例如直接注射、植入或表面投與)、全身性投與或皮下、靜脈內、腹膜內或非經腸途徑，包含顱內(例如室內、腦實質內及鞘內)、肌肉內、經皮、呼吸道(氣霧劑)、經鼻、經口、經直腸或表面(包含經頰及舌下)投與。在某些實施例中，組合物藉由皮下或靜脈內輸注或注射投與。
因此，在一些實施例中，本文中描述之醫藥組合物可包含一或多種醫藥學上可接受之賦形劑。在一些實施例中，本文所描述之醫藥組合物可經調配以用於投與個體。
如本文中所使用，醫藥組合物或藥劑包括藥理學有效量之所描述之治療性化合物或結合物中之至少一者及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑。醫藥學上可接受之賦形劑(賦形劑)為有意包括於藥物遞送系統中之除活性醫藥成分(API，治療性產品)外之物質。賦形劑在預定劑量下不發揮或不意欲發揮治療效果。賦形劑可用於a)在製造期間輔助加工藥物遞送系統，b)保護、支持或增強API之穩定性、生物可用性或患者接受性，c)有助於產品鑑別，及/或d)在儲存或使用期間增強API遞送之總體安全性、有效性之任何其他屬性。醫藥學上可接受之賦形劑可為或可不為惰性物質。
賦形劑包括但不限於：吸收增強劑、抗黏劑、抗起泡劑、抗氧化劑、黏合劑、緩衝劑、載劑、包衣劑、顏料、遞送增強劑、遞送聚合物、葡聚糖、右旋糖、稀釋劑、崩解劑、乳化劑、增量劑、填充劑、調味劑、滑動劑、保濕劑、潤滑劑、油狀物、聚合物、防腐劑、生理食鹽水、鹽、溶劑、糖類、懸浮劑、持續釋放型基質、甜味劑、增稠劑、張力劑、媒劑、驅水劑及濕潤劑。
適於可注射使用之醫藥組合物包括無菌水溶液(在水溶性情況下)或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。對於靜脈內投與，適合之載劑包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, N.J.)或磷酸鹽緩衝鹽水。其應在製造及儲存條件下穩定，且應保護其免遭微生物(諸如細菌及真菌)之污染作用。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇及液體聚乙二醇)及其適合混合物之溶劑或分散介質。適當流動性可例如藉由使用諸如卵磷脂之包衣、藉由在分散液之情況下維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持。在許多情況下，組合物中將較佳包括等張劑(例如糖)、多元醇(諸如甘露醇、山梨醇)及氯化鈉。可藉由使組合物中包括延遲吸收之試劑(例如，單硬脂酸鋁及明膠)實現可注射組合物之延長吸收。
無菌可注射溶液可藉由以下方法來製備：將所需量之活性化合物與上文所列舉之成分中之一者或組合併入適當溶劑中，並視需要隨後進行過濾滅菌。一般而言，藉由將活性化合物併入至含有鹼性分散介質及自上文所列舉之彼等成分之所需其他成分的無菌媒劑中來製備分散液。在用於製備無菌可注射溶液之無菌散劑之情況下，製備方法包括真空乾燥及冷凍乾燥，其產生活性成分加來自其先前無菌過濾溶液之任何額外所需成分的散劑。
適用於關節內投與之調配物可呈藥物之無菌水性製劑形式，其可呈微晶形式，例如呈水性微晶懸浮液形式。脂質調配物或可生物降解聚合物系統亦可用於使藥物用於關節內及經眼投與。
活性化合物可用將防止化合物自體內快速排除之載劑製備，諸如控制釋放型調配物，包括植入物及微囊封遞送系統。可使用可生物降解的生物相容性聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。用於製備此類調配物之方法為熟習此項技術者顯而易見的。脂質體懸浮液亦可用作醫藥學上可接受之載劑。其可根據熟習此項技術者已知之方法製備，例如如美國專利第4,522,811號中所述。
化合物或結合物可以單位劑型調配於組合物中以便於投與及劑量均勻性。單位劑型係指適合作為單位劑量用於待治療之個體的物理離散單元；各單元含有預定量之活性化合物，其經計算以與所需醫藥載劑一起產生所需治療效果。本發明之單位劑型之規格由以下因素規定且直接取決於以下因素：活性化合物之獨特特徵及欲實現之治療效果，以及混配此類用於治療個體之活性化合物之領域中固有之限制。
醫藥組合物可含有通常見於醫藥組合物中之其他額外組分。此類額外組分包括但不限於：止癢劑、收斂劑、局部麻醉劑或抗炎劑(例如，抗組胺劑、苯海拉明(diphenhydramine)等)。
一般而言，有效量之活性化合物將在每天每公斤體重約0.1至約100 mg，例如每天每公斤體重約1.0至約50 mg範圍內。在一些實施例中，活性化合物之有效量將在每劑量每公斤體重約0.25至約5 mg範圍內。在一些實施例中，活性化合物之有效量將在每1-18週或1-6個月25-400 mg範圍內。在一些實施例中，活性化合物之有效量將在每4週或每月50-125 mg範圍內。在一些實施例中，活性成分之有效量將在每劑量每公斤體重約0.5至約3 mg範圍內。在一些實施例中，活性成分之有效量將在每劑量約25-400 mg範圍內。在一些實施例中，活性成分之有效量將在每劑量約50-125 mg範圍內。投與量亦將可能視諸如患者之整體健康狀況、所遞送之化合物之相關生物學功效、藥物之調配物、調配物中賦形劑之存在及類型及投與途徑等變數而定。此外，應理解，可提高所投與之初始劑量使其超出以上上限含量以快速獲得所需血液含量或組織含量，或初始劑量可小於最佳值。
為治療疾病或為形成用於治療疾病之藥劑或組合物，包括化合物或結合物之本文所描述之醫藥組合物可與賦形劑或第二治療劑或療法組合，包括但不限於：第二結合物或其他結合物、小分子藥物、抗體、抗體片段及/或疫苗。
所描述之化合物或結合物在添加至醫藥學上可接受之賦形劑或佐劑時可封裝於套組、容器、封裝或分配器中。本文所描述之醫藥組合物可封裝於預填充針筒或小瓶中。 VII.套組
本文亦提供一種套組，其包含如上文所描述之結合物。
在另一態樣中，套組進一步包含藥品說明書，其包括但不限於用於製備及投與調配物之適當說明書、調配物之副作用及任何其他相關資訊。說明書可呈任何適合之格式，包括但不限於印刷品、錄影帶、電腦可讀磁碟、光碟或對基於網際網路之說明書的指示。
在另一態樣中，提供用於治療罹患或易患本文所描述之病狀之個體的套組，其包含含有給藥量之如本文所揭示之組合物或調配物的第一容器及藥品說明書。容器可為此項技術中已知且適合於儲存及遞送靜脈內調配物之容器中之任一者。在某些實施例中，套組進一步包含第二容器，其包含醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑、佐劑等以用於製備待向個體投與之調配物。
在另一態樣中，亦可提供含有足夠劑量之本文中所描述之組合物(包括其醫藥組合物)的套組以在持續延長的時段內，諸如1-3天、1-5天、一週、2週、3週、4週、6週、8週、1個週期、2個週期、3個週期、4個週期、5個週期、6個週期、7個週期、8個週期或更長時段內提供個體有效治療。
在一些實施例中，套組亦可包括多個劑量且可以足以供藥房(例如醫院藥房及混配藥房)儲存及使用之量封裝。在某些實施例中，套組可包括給藥量之如本文中所揭示之至少一種組合物。VIII. 治療方法
本文亦提供用於治療個體之疾病或病症之方法，其包含向有需要之個體投與有效量的本文所述之化合物或結合物。本文亦提供本文所述之化合物或結合物之用途，其係用於製備用於治療需要用結合物中之寡核苷酸治療之患者的藥物。亦提供如本文中所描述之用於治療需要用化合物或結合物中之寡核苷酸治療之個體的疾病或病症的化合物或結合物。亦提供如本文所描述之用於治療患者之化合物或結合物，該治療包含向患者投與有效量之化合物或結合物。在一些實施例中，個體患有癌症或處於罹患癌症之風險下。在一些實施例中，疾病或病症為病毒感染。在一些實施例中，疾病或病症為免疫缺乏，例如其中免疫活化可為有利的。在一些實施例中，疾病或病症為自體免疫及/或發炎疾病或病症，例如其中免疫遏制及/或調節可為有利的。
在如本文所描述之治療癌症之方法的一些實施例中，用本文所揭示之方法治療之癌症為實體腫瘤。在一些實施例中，用本文所揭示之方法治療的癌症係液體腫瘤。在一些實施例中，用本文所揭示之方法治療之癌症為實體腫瘤。在特定實施例中，用本文所揭示之方法治療的癌症為乳癌、大腸直腸癌、肺癌、頭頸癌、黑素瘤、淋巴瘤或白血病。在一些實施例中，癌症包括但不限於B細胞癌(例如多發性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症)、重鏈疾病(諸如α鏈疾病、γ鏈疾病及μ鏈疾病)、良性單株球蛋白症及免疫細胞澱粉樣變性及其類似疾病、黑素瘤、乳癌、肺癌、支氣管癌、大腸直腸癌、前列腺癌、胰臟癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、腦癌或中樞神經系統癌、周邊神經系統癌、食道癌、子宮頸癌、子宮癌或子宮內膜癌、口腔癌或咽癌、肝癌、腎癌、睪丸癌、膽道癌、小腸癌或闌尾癌、唾液腺癌、甲狀腺癌、腎上腺癌、骨肉瘤、軟骨肉瘤、血液學組織癌及其類似疾病。適用於本發明所涵蓋之方法之癌症類型之其他非限制性實例包括人類肉瘤及癌瘤，例如纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤文氏腫瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、大腸直腸癌、胰臟癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌瘤、皮脂腺癌瘤、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓性癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝癌、膽管癌瘤、肝癌、絨膜癌、精細胞癌、胚胎性瘤、威爾姆斯氏腫瘤、子宮頸癌、骨癌、腦瘤、睪丸癌、肺臟、癌瘤、小細胞肺臟癌瘤、膀胱癌、上皮癌、神經膠瘤、星形細胞瘤、神經管胚細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、少突神經膠質瘤、脊膜瘤、黑色素瘤、神經母細胞瘤、視網膜胚細胞瘤；白血病，例如急性淋巴球性白血病及急性骨髓細胞性白血病(骨髓母細胞性、前髓細胞性、骨髓單核球性、單核球性及紅白血病)；慢性白血病(慢性骨髓細胞性(顆粒球性)白血病及慢性淋巴球性白血病)；及真性紅細胞增多症、淋巴瘤(霍奇金氏病及非霍奇金氏病)、多發性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症及重鏈疾病。在一些實施例中，癌症在本質上為上皮癌且包括但不限於膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、婦科癌症、腎癌、喉癌、肺癌、口腔癌、頭頸癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌或皮膚癌。在其他實施例中，癌症為乳癌、前列腺癌、肺癌或結腸癌。在又其他實施例中，上皮癌症為非小細胞肺癌、非乳頭狀腎細胞癌、子宮頸癌、卵巢癌瘤(例如漿液性卵巢癌瘤)或乳癌。上皮癌症之特徵可在於各種其他方法，包括但不限於漿液性、子宮內膜樣、黏液性、透明細胞、勃倫那(Brenner)或未分化的。在特定實施例中，用本文所揭示之方法治療的癌症係選自由以下組成之清單：套細胞淋巴瘤(MCL)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、伯基特淋巴瘤(Burkitts lymphoma)、多發性黑素瘤(MM)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、小型淋巴球性淋巴瘤(SLL)、毛細胞白血病(HCL)、淋巴漿細胞淋巴瘤(LPL)、骨胳肌淋巴瘤(SML)、脾邊緣區淋巴瘤(SMZL)、濾泡中心淋巴瘤(FCL)、大腸直腸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、頭頸癌、乳癌、胰臟癌、神經膠母細胞瘤(GBM)、前列腺癌、食道癌、腎細胞癌、肝癌、膀胱癌及胃癌。
在一些實施例中，本文提供治療個體之疾病或病症的方法，其包含向有需要之個體投與有效量之本文所述之CpG-Ab免疫結合物，其中CpG-Ab免疫結合物結合於CD22，諸如包含抗CD22抗體或其抗原結合片段之CpG-Ab免疫結合物，且其中所治療之疾病或病症係以腫瘤浸潤性B細胞為特徵之癌症。在一些實施例中，此類癌症包括頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)、非小細胞肺癌(NSCLC)、腎細胞癌(RCC)、胃癌、肝細胞癌(HCC)、食道癌、子宮頸癌、梅克爾細胞癌(Merkle cell carcinoma)、子宮內膜癌、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、毛細胞白血病及彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)。在一些實施例中，此類癌症包括卵巢癌、胰臟癌、黑素瘤、皮膚黑素瘤、肉瘤、大腸直腸癌、乳癌、子宮頸鱗狀細胞癌、小細胞肺癌(SCLC)、皮膚鱗狀細胞癌及尿道上皮癌。在一些實施例中，CpG-Ab免疫結合物列於表2及表9-12中之一者中。
在一些實施例中，治療方法包括投與結合於B細胞表面上表現之CD22的CpG-Ab免疫結合物，且該治療引起B細胞活化、B細胞分化、T細胞效應功能增加、T細胞增殖、分泌細胞介素及趨化介素、誘導免疫球蛋白分泌及調節所治療個體之腫瘤微環境內的抑制骨髓細胞中之一或多者。在一些實施例中，治療方法包括投與結合於B細胞表面上表現之CD22的CpG-Ab免疫結合物且治療產生記憶免疫反應。在一些實施例中，此類治療經由先天性及適應性免疫反應產生抗腫瘤活性。
在一些實施例中，治療方法包括投與結合於存在於腫瘤細胞上之HER2的CpG-Ab免疫結合物且治療引起腫瘤細胞之殺死或損傷，使得腫瘤之體積、尺寸減小及/或生長減緩或使得腫瘤之體積、尺寸及/或生長被抑制。在一些實施例中，本文提供用於治療個體之疾病或病症的方法，其包含向有需要之個體投與有效量的本文所述之CpG-Ab免疫結合物，其中該CpG-Ab免疫結合物結合於HER2，諸如包含抗HER2抗體或其抗原結合片段的CpG-Ab免疫結合物，且其中所治療之疾病或病症係以表現HER2之腫瘤細胞為特徵之癌症。在一些實施例中，所治療之疾病或病症為腫瘤細胞過度表現HER2之癌症。在一些實施例中，癌症為乳癌、尿道上皮癌或胃癌。
在一些實施例中，用本文所揭示之方法治療之癌症對至少一種免疫療法具有抗性。在一些實施例中，用本文所揭示之方法治療之癌症對選自由化療、輻射、靶向療法、疫苗療法及CAR-T療法組成之群的至少一種癌症療法具有抗性。在一些實施例中，治療癌症之方法包含向患有癌症之個體共投與(i)治療有效量之含CpG之免疫刺激聚核苷酸或CpG抗體免疫結合物；及(ii)所治療之癌症在單獨用免疫治療劑治療癌症時，已展示出抗性或不反應的免疫治療劑。
在特定實施例中，用本文所提供之方法治療的癌症已展示出不對免疫檢查點調節劑治療起反應。在特定實施例中，免疫檢查點調節劑係PD-1之抑制劑。在特定實施例中，免疫檢查點調節劑係PD-L1抑制劑。在一些實施例中，治療癌症之方法包含向患有癌症之個體共投與(i)治療有效量之含CpG之免疫刺激聚核苷酸或CpG-Ab免疫結合物；及(ii)治療有效量之PD-1抑制劑。在一些實施例中，治療癌症之方法包含向患有癌症之個體共投與(i)治療有效量之含CpG之免疫刺激聚核苷酸或CpG-Ab免疫結合物；及(ii)治療有效量之PD-L1抑制劑。特定言之，在一些實施例中，PD-1之抑制劑為抗PD-1抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，PD-L1之抑制劑係抗PD-L1抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，治療係針對對PD-1或PD-L1抑制劑無反應或對其具有抗性之個體，且此類個體用結合CD22之CpG-Ab免疫結合物，諸如包含抗CD22抗體或其抗原結合片段之CpG-Ab免疫結合物治療。
在某些態樣中，本文提供預防易罹患癌症之個體之癌症的方法，其包含投與個體治療有效量之如本文所描述之TLR促效劑。在一些實施例中，該方法包含向該個體投與治療有效量之本文所述之含CpG之免疫刺激聚核苷酸或CpG-Ab免疫結合物。在特定實施例中，CpG-Ab免疫結合物靶向如本文所述之免疫細胞。在特定實施例中，CpG-Ab免疫結合物靶向如本文所述之表現TLR之細胞。在特定實施例中，CpG-Ab免疫結合物特異性結合於與如本文所述之免疫細胞相關的抗原。在特定實施例中，CpG-Ab免疫結合物特異性結合於與免疫細胞相關之抗原，不結合於所預防之癌症的腫瘤相關抗原。在特定實施例中，CpG-Ab免疫結合物特異性結合於與如本文所述之表現TLR之細胞相關的抗原。在特定實施例中，CpG-Ab免疫結合物特異性結合於與表現TLR之細胞相關的抗原且不結合於所預防之癌症的腫瘤相關抗原。在特定實施例中，CpG-Ab免疫結合物特異性結合於如本文所述之所預防之癌症的腫瘤相關抗原，例如在腫瘤細胞表面上表現之抗原。在特定實施例中，所預防之癌症的腫瘤相關抗原亦與免疫細胞或表現TLR之細胞相關。在特定實施例中，CpG-Ab免疫結合物不特異性結合於選自CD19、CD20、CD22、STAT3、輸出蛋白7、Her2、Src、EGFR、CD52、CXCR-4及Muc-1之抗原。
在一些實施例中，預防癌症之方法進一步包含向易罹患癌症之個體投與(i)治療有效量之CpG-Ab免疫結合物及(ii)所預防之癌症之腫瘤相關抗原。在一些實施例中，腫瘤相關抗原不與CpG-Ab免疫結合物結合。在特定實施例中，腫瘤相關抗原調配為癌症疫苗。在特定實施例中，CpG-Ab免疫結合物調配為癌症疫苗之佐劑。
在一些實施例中，使用本文所提供之方法預防或治療之癌症為先前癌症之部分或完全緩解之個體的癌症復發發作。在特定實施例中，先前癌症為液體癌症且所預防或治療的復發性癌症為液體癌症。在特定實施例中，先前癌症為實體癌症且所預防或治療的復發性癌症為實體癌症。在特定實施例中，先前癌症為液體癌症且所預防或治療的復發性癌症為實體癌症。在特定實施例中，先前癌症為實體癌症，且所預防或治療的復發性癌症為液體癌症。
在一些實施例中，使用本文所提供之方法預防或治療之癌症係個體在該個體展示部分或完全緩解之後的初次癌症復發發作。在一些實施例中，使用本文所提供之方法預防或治療之癌症係個體在該個體展示部分或完全緩解之後的第二次癌症復發發作。在一些實施例中，使用本文所提供之方法預防或治療之癌症係個體在該個體展示部分或完全緩解之後的第三次癌症復發發作。在一些實施例中，使用本文所提供之方法預防或治療之癌症係個體在該個體展示部分或完全緩解之後的第三次癌症復發發作之後的癌症復發發作。
在某些態樣中，本文提供誘導有需要之個體的適應性免疫反應之方法，其中方法包含投與個體治療有效量之如本文所描述之TLR促效劑。在特定實施例中，誘導適應性免疫反應之方法包含向有需要之個體投與治療有效量之本文所述之含CpG之免疫刺激聚核苷酸或CpG-Ab免疫結合物。在特定實施例中，CpG-Ab免疫結合物靶向如本文所述之正常免疫細胞。在特定實施例中，CpG-Ab免疫結合物靶向如本文所述之表現TLR之細胞。在特定實施例中，CpG-Ab免疫結合物靶向選自癌細胞或感染病原體之細胞的病變細胞。在特定實施例中，CpG-Ab免疫結合物特異性結合於與如本文所述之正常免疫細胞相關的抗原。在特定實施例中，CpG-Ab免疫結合物特異性結合於與正常免疫細胞相關之抗原，不結合於疾病抗原。在特定實施例中，CpG-Ab免疫結合物特異性結合於與如本文所述之表現TLR之細胞相關的抗原。在特定實施例中，CpG-Ab免疫結合物特異性結合於與表現TLR之細胞相關的抗原，不結合於疾病抗原。在特定實施例中，CpG-Ab免疫結合物特異性結合於如本文所述之疾病抗原。在特定實施例中，病變抗原亦與正常免疫細胞或表現TLR之細胞相關。在特定實施例中，病變抗原為腫瘤相關抗原或病原性抗原。在特定實施例中，CpG-Ab免疫結合物不特異性結合於選自CD19、CD20、CD22、STAT3、輸出蛋白7、Her2、Src、EGFR、CD52、CXCR-4及Muc-1之抗原。在一些實施例中，抗體或結合物特異性結合由癌症或癌症相關基質表現之抗原。
在本文所述之方法及用途的一些實施例中，以足以活化個體中之TLR9介導之信號傳導路徑的劑量向有需要之個體投與含CpG之免疫刺激聚核苷酸。在一些實施例中，以足以活化由CpG-Ab免疫結合物靶向之細胞群中的TLR9介導之信號傳導路徑的劑量向有需要之個體投與CpG-Ab免疫結合物。如本文所述，在一些實施例中，CpG-Ab免疫結合物靶向的細胞群表現TLR9。在一些實施例中，由CpG-Ab免疫結合物靶向之細胞群可在目標細胞之細胞表面上、在目標細胞之核內體膜(endosomal membrane)上或在目標細胞之細胞表面及在目標細胞之核內體膜兩者上表現TLR9。
特定言之，在本文所述之方法及用途的一些實施例中，以有效誘導選自以下之作用中之一或多者的劑量向有需要之個體投與含CpG之免疫刺激聚核苷酸：(a)藉由目標細胞上之含CpG之免疫刺激聚核苷酸特異性結合於TLR9受體；(b)藉由目標細胞有效內化CpG-Ab免疫結合物或含CpG之免疫刺激聚核苷酸部分；(c)活化目標細胞中之一或多個信號傳導路徑；(d)藉由目標細胞誘導一或多種發炎性細胞介素分泌；(e)藉由目標細胞遏制一或多種發炎性細胞介素分泌；(f)上調目標細胞之一或多種基因之表現；(g)遏制目標細胞之一或多種基因之表現；(h)活化所靶向之正常免疫細胞，(i)誘導使得疾病(例如癌細胞)消除的免疫反應，(j)誘導所靶向之癌細胞之細胞凋亡，及(k)誘導所靶向之癌細胞之壞死。
特定言之，在本文所述之方法及用途的一些實施例中，其中在投與CpG-Ab免疫結合物後，含CpG之免疫刺激聚核苷酸特異性結合於目標細胞之TLR9受體。特定言之，在一些實施例中，CpG-Ab免疫結合物與目標細胞相關之抗原的結合促進含CpG之免疫刺激聚核苷酸與TLR9受體之特異性結合。在一些實施例中，CpG-Ab免疫結合物之目標抗原位於TLR9受體附近。在特定實施例中，目標抗原及TLR9受體均位於目標細胞之細胞膜上。在特定實施例中，目標抗原及TLR9受體均位於目標細胞之細胞內膜上。在特定實施例中，目標抗原及TLR9受體均位於目標細胞之核內體膜或吞噬體膜上。在一些實施例中，目標抗原位於細胞膜上且在結合於CpG-Ab免疫結合物時促進CpG-Ab免疫結合物內化至細胞溶質中。
特定言之，在本文所述之方法及用途的一些實施例中，該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之靶向正常免疫細胞之CpG-Ab免疫結合物，其中在投與CpG-Ab免疫結合物後，目標細胞中之一或多個免疫原性信號傳導路徑經活化。在特定實施例中，活化信號傳導路徑為選自核因子(NF)-kB信號傳導路徑、c-Jun N端激酶(JNK)信號傳導路徑、AP1信號傳導路徑、IRF3/7路徑及p38有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號傳導路徑之一或多者。細胞信號傳導路徑之活化可使用此項技術中已知之方法偵測，諸如(但不限於)偵測分子標記之存在，該分子標記之表現在活化相關信號傳導路徑後特異性誘導。
特定言之，在本文所述之方法及用途的一些實施例中，該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之靶向正常免疫細胞之CpG-Ab免疫結合物，其中在投與CpG-Ab免疫結合物後，一或多種發炎性細胞介素之分泌經誘導。在特定實施例中，一或多種發炎性細胞介素係選自I型干擾素(IFN)、介白素(IL)-6、IL10、IL-12、IL-18及腫瘤壞死因子(TNF)。
特定言之，在本文所述之方法及用途的一些實施例中，該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之靶向正常免疫細胞之CpG-Ab免疫結合物，其中在投與CpG-Ab免疫結合物後，一或多種額外蛋白質之表現上調。在特定實施例中，經上調之蛋白質為選自以下之一或多者：抗原呈現分子(例如，I類及II類MHC)、細胞介素受體(例如，IL-6受體、IL-10受體、IL-12受體、TNF-α受體、TNF-β受體、IFN-α受體、IFN-β受體、IFN-γ)、趨化介素受體(例如，趨化介素受體7)、共刺激分子(例如CD3、CD28、CD27、CD30、CD40、CD69、CD80/B7-1、CD86/B7-2、CD134/OX-40、OX-40L、CD137/4-1BB、4-1BBL、CD278/ICOS、B7-H3、B7h/B7RP-1、LIGHT等)、HLA-DR及T細胞成熟調控蛋白(例如吲哚胺2,3-二氧酶)。
特定言之，在本文所述之方法及用途的一些實施例中，該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之靶向正常免疫細胞之CpG-Ab免疫結合物，其中在投與CpG-Ab免疫結合物之後，一或多個正常免疫細胞群之增殖、分化、成熟及/或存活提高。在特定實施例中，一或多種增加之正常免疫細胞群係選自CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、自然殺手細胞、T輔助細胞、B細胞及骨髓細胞(包括mDC及pDC)。在本文所述之方法及用途的一些實施例中，該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之靶向正常免疫細胞之CpG-Ab免疫結合物，其中在投與該CpG-Ab免疫結合物之後，一或多個正常免疫細胞群之增殖、分化、成熟及/或存活減少。在特定實施例中，一或多個減少的正常免疫細胞群係選自B-reg細胞、T-reg細胞及MDSC。
在特定實施例中，在投與CpG-Ab免疫結合物後，個體中之APC中的抗原呈現活性增加。在一些實施例中，APC係選自B細胞、單核球、樹突狀細胞及朗格罕氏細胞、角質細胞、內皮細胞、星形膠質細胞、纖維母細胞及寡樹突神經膠質細胞。在特定實施例中，APC為B細胞。在特定實施例中，APC為樹突狀細胞。在特定實施例中，APC係巨噬細胞。在一些實施例中，樹突狀細胞為pDC。在特定實施例中，增加之抗原呈現活性使得活化APC更有效地呈現腫瘤相關抗原。
在特定實施例中，在投與CpG-Ab免疫結合物後，針對所治療或預防之癌症之一或多種腫瘤相關抗原的抗原特異性CD4+ T細胞介導之免疫性增加。在特定實施例中，在投與CpG-Ab免疫結合物後，CD4+ T細胞之腫瘤浸潤增加。在特定實施例中，在投與CpG-Ab免疫結合物後，針對所治療或預防之癌症之一或多種腫瘤相關抗原的抗原特異性CD8+ T細胞介導之免疫性增加。在特定實施例中，在投與CpG-Ab免疫結合物後，CD8+ T細胞之腫瘤浸潤增加。在特定實施例中，在投與CpG-Ab免疫結合物後，特異性針對所治療或預防之癌症之一或多種腫瘤相關抗原的B細胞免疫球蛋白分泌增加。
特定言之，在本文所述之方法及用途的一些實施例中，該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之靶向病變細胞之CpG-Ab免疫結合物，其中在投與CpG-Ab免疫結合物後，一或多種細胞凋亡信號傳導路徑經誘導，觸發靶向病變細胞之細胞凋亡。在一些實施例中，病變細胞為癌細胞。
在本文所述之方法及用途的一些實施例中，CpG-Ab免疫結合物係以不能有效活化個體中之補體系統的量投與有需要之個體。在一些實施例中，含CpG之免疫刺激聚核苷酸以不能有效活化個體之補體C1的量投與有需要之個體。在一些實施例中，含CpG之免疫刺激聚核苷酸以不能有效活化個體中之補體C3的量投與有需要之個體。補體活化可使用此項技術中已知之方法偵測。在一些實施例中，CpG-Ab免疫結合物以CpG-Ab免疫結合物之抗體部分不能有效誘導個體之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性的量投與有需要之個體。
如本文中所描述，包含含CpG之聚核苷酸的治療劑、結合物或組合物可與至少一種用於預防或治療癌症之額外治療劑組合使用。在一些實施例中，此類組合療法呈現出比任一單獨治療劑之各別作用更好的協同治療效果。在一些實施例中，此類組合療法呈現出比單獨治療劑之各別作用之總和更好的協同治療效果。
因此，在某些態樣中，本文提供使用含CpG之免疫刺激聚核苷酸與至少一種額外癌症治療劑之組合來預防或治療癌症的方法。此類方法包含向有需要之個體投與(i)治療有效量之含CpG之免疫刺激聚核苷酸及(ii)治療有效量之至少一種額外癌症治療劑。在特定實施例中，含CpG之免疫刺激聚核苷酸以獨立聚核苷酸形式投與。在特定實施例中，含CpG之免疫刺激聚核苷酸以CpG-Ab免疫結合物形式投與。在特定實施例中，含CpG之免疫刺激聚核苷酸及額外治療劑調配於同一組合物中。在其他實施例中，含CpG之免疫刺激聚核苷酸及額外治療劑調配於各別組合物中。
在一些實施例中，至少一種額外癌症治療劑係選自T細胞促效劑、免疫檢查點調節劑、STING促效劑、RIG-I促效劑、其他鐸樣受體促效劑。
在一些實施例中，額外癌症治療劑為T細胞共刺激分子。在一些實施例中，T細胞共刺激分子係選自OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1/CD11a/CD18、ICOS/CD278、4-1BB/CD137、GITR、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3及CD83或其配位體。在一些實施例中，共刺激分子之配位體為特異性結合於共刺激分子之抗體。在特定實施例中，額外癌症治療劑係選自抗OX40抗體、抗OX40L抗體、抗ICOS抗體、抗CTLA4抗體、抗CD40L抗體、抗CD28抗體、抗LFA1抗體、抗TIM1/TIM3抗體、抗LAG3抗體、抗Siglec-15抗體、抗PD1抗體、抗PD-L1抗體、抗CD27抗體及抗4-1BB抗體。
在一些實施例中，額外癌症治療劑為由用該方法預防或治療之癌症產生的腫瘤相關抗原。在一些實施例中，所預防或治療之癌症為白血病、淋巴瘤、黑素瘤、大腸直腸癌、乳癌、前列腺癌、腎癌、胰臟癌、頭頸癌、皮膚癌及腦癌、肺癌，且腫瘤相關抗原係選自CD19、CD20、CD22、CD38、CD138、CD30、CD52、CD56、CD79、CD123、CD206、CD303、CD304、EGFR、葉酸受體α、葉酸受體β、間皮素、Her2、運鐵蛋白受體及PSMA。在一些實施例中，額外癌症治療劑為選自PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、LAG-3、CEACAM-1、CEACAM-5、CLTA-4、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD47、SIRP-α、CD160、2B4、CD172a及TGFR之抑制劑的免疫檢查點調節劑。在特定實施例中，額外癌症治療劑為PD-1抑制劑。在特定實施例中，額外癌症治療劑為PD-L1抑制劑。在特定實施例中，額外癌症治療劑為CD47抑制劑。在一些實施例中，額外癌症治療劑為特異性結合於免疫檢查點調節劑之抗體。在特定實施例中，額外癌症治療劑為抗PD-1抗體或其抗原結合片段。在特定實施例中，額外癌症治療劑為抗PD-L1抗體或其抗原結合片段。在特定實施例中，額外癌症治療劑係抗CD47抗體或其抗原結合片段。在特定實施例中，額外癌症治療劑為抗CD172a抗體或其抗原結合片段，在特定實施例中，額外癌症治療劑為抗OX40抗體或其抗原結合片段，在特定實施例中，額外癌症治療劑為抗TIM3抗體或其抗原結合片段，在特定實施例中，額外癌症治療劑為抗LAG3抗體或其抗原結合片段。抗PD-1及抗PD-L1抗體及其用途描述於例如US20180030137、US9815898、US20170313776、US20170313774、US20170267762、WO2017019846、WO2018013017、US20180022809、US20180002423、WO2017220990、WO2017218435、WO2017215590、US9828434及WO2017196867中。抗CD47抗體及其用途描述於例如US9663575、US9803016、US20170283498、US20170369572、WO2017215585、WO2017196793及WO2017049251中。
在一些實施例中，其他癌症治療劑為STING路徑促效劑。干擾素基因刺激劑(stimulator of interferon genes，STING，亦稱為TMEM173、MITA、ERIS及MPYS)係侷限於ER之跨膜蛋白，ER響應於環二核苷酸(cyclic dinucleotide，CDN)之直接結合而發生構形改變，引起下游信號級聯，包括TBK1活化、IRF-3磷酸化及IFN-β及其他細胞介素之產生。腫瘤駐留型宿主抗原呈現細胞中之STING路徑參與誘導針對腫瘤相關抗原之自發性CD8+ T細胞反應。此路徑之活化及IFN-β之後續產生亦有助於抗腫瘤作用。在一些實施例中，STING路徑促效劑為ADU-S100。額外STING促效劑及其用途描述於例如US20180028553、US20170319680、US20170298139、US20060040887、US20080286296、US20120041057、US20140205653、WO2014179335、WO 2014179760、US20150056224、WO 2016096174、WO 2017011444、WO 2017027645及WO 2017027646中。
在一些實施例中，額外癌症治療劑為RIG-I路徑促效劑。視黃酸誘導性基因-I (RIG-I)為起始宿主先天免疫系統在感染早期階段防禦病原微生物之圖案識別受體的成員。存在(RIG-I)樣受體家族之三個成員：RIG-I、黑素瘤分化因子5 (MDA5)及遺傳學及生理學實驗室2 (LGP2)，其表現於大部分細胞及組織類型中。RIG-I充當用於識別各種RNA病毒及後續活化下游信號傳導以驅動I型IFN產生及抗病毒基因表現之細胞質感測器。活化之RIG-I經由CARD-CARD介導之相互作用募集下游承接分子MAVS (亦稱為IPS-1、CARDIF及VISA)。寡聚RIG-I CARD組裝及MAVS之聚合形成一起充當蛋白質複合物之信號傳導平台，該信號傳導平台介導信號傳導至兩個分支中之分叉點。一個分支募集腫瘤壞死因子受體相關因子(TRAF)-2/6及受體相互作用蛋白1以隨後活化IKK複合物，從而引起NF-κB活化。另一分支經由TRAF3信號傳導且活化TANK/IKKγ/IKKϵ/TBK1複合物，引起干擾素調節因子(IRF)-3及IRF-7發生磷酸化及二聚化。Liu等人,Front Immunol. 2017, 7:662。此路徑之活化有助於抗腫瘤作用。在一些實施例中，RIG-I路徑促效劑為RGT100。RIG-I促效劑及其用途描述於例如US20170057978、US20170258897、US9381208、US9738680、US9650427、WO2017173427及WO2017011622中。
在一些實施例中，額外癌症治療劑為選自TLR1促效劑、TLR2促效劑、TLR3促效劑、TLR4促效劑、TLR5促效劑、TLR6促效劑、TLR7促效劑、TLR8促效劑及TLR10促效劑之鐸樣受體促效劑。
在其他實施例中，關於一種治療癌症之方法，含CpG之免疫刺激聚核苷酸與一或多種額外治療劑或程序組合投與(呈獨立形式或呈CpG-Ab免疫結合物形式)，例如其中額外治療劑或程序係選自由以下組成之群：化療、靶向抗癌療法、溶瘤藥物、細胞毒性劑、基於免疫之療法、細胞介素、手術程序、輻射程序、共刺激分子之活化劑、抑制性分子之抑制劑、疫苗、細胞免疫療法、基於細胞之療法(例如CAR-T、TIL、TCR-T、CAR-NK及CAR巨噬細胞療法)及溶瘤病毒療法。 實例
參考以下實例將更好地理解本發明之主題，該等實例係作為本發明之例示性而非作為限制性實例提供。物質
原型肽內部製成，但可在定製肽供應商(例如CPC Scientific)處購買。寡核苷酸內部或藉由LGC製成。此等實例中使用之轉穀胺醯胺酶自各種細菌鏈黴菌菌株(例如Ajinomoto)分離。Q標籤mAb在ino Biologicals處或內部生產。寡核苷酸之生產
寡核苷酸一般根據下文所示之固相合成流程製備，開始於針對寡核苷酸合成的固體載體之初始脫除保護基，隨後使固體載體與第一核苷酸偶合，硫醇化，得到硫代磷酸酯，且重複脫除保護基及偶合，得到整個寡核苷酸序列。
如本文所提供之寡核苷酸之通用合成描述於下文中。
脫除保護基 ：使受二甲氧基三苯甲基-1,3-丙二醇乙醇酸鹽保護的受控微孔玻璃固體載體(DMTO-C3-CPG，1000Å，容積密度0.26-0.36 g/cc，裝載30-40 µmol/g)與3%二氯乙酸/甲苯(v/v)在25℃下反應，得到脫除保護基的CPG載體。量測反應混合物等分試樣之UV吸收以鑑別反應指標(使用固定錶命令設置，波長350 nm，目標最小吸光度0.25 OD)且確認移除二甲氧基三苯甲基保護基。
活化 / 偶合 ：為得到3'端，得到待合成之相應寡核苷酸，藉由在活化劑5-乙硫基-1H-四唑(0.5 M於ACN中)存在下在60%核苷酸濃度下，在25℃下在5分鐘內添加所需3'核苷酸(3當量)至含有脫除保護基之CPG載體的反應器中並使其混合，來使脫除保護基之CpG載體與第一核苷酸亞胺基磷酸酯前驅體偶合。
硫醇化 / 硫化 ：在偶合步驟之後，所添加之核苷酸前驅體的鍵聯亞磷酸三酯部分藉由添加0.15 M於無水ACN中的Polyorg Sulfa (3-苯基1,2,4-二噻唑啉-5-酮)而硫醇化(或硫化)，得到硫代磷酸酯。
封端 ：在硫化之後，用兩種封端組合物(封端組合物A：20% N-甲基咪唑/ACN；封端B組合物B：20%乙酸酐、30%吡啶、50% ACN)處理CPG載體及所連接之核苷酸，以阻斷未反應之核苷酸反應物。
重複合成 ：採用適當的溶液中之亞胺基磷酸酯前驅體，藉由重複如上文所描述之脫除保護基、活化/偶合、硫醇化/硫化及封端之步驟，依序自3'端至5'端添加其餘核苷酸，以獲得呈受保護形式之所需寡核苷酸序列。除混合15分鐘之dT-硫代亞胺基磷酸酯以外，所有亞胺基磷酸酯前驅體在偶合步驟期間與CPG載體混合5分鐘。
合成中使用之所選亞胺基磷酸酯前驅物展示如下。亞胺基磷酸酯前驅體與溶劑一起在溶液中且以分別展示待用於偶合步驟中之濃度製備。
亞胺酸酯 結構 濃度
DMT-dC(Ac)亞胺酸酯
Figure 02_image718
 0.1 M於無水ACN中：
DMT-dG(dmf)亞胺酸酯
Figure 02_image720
 0.1 M於無水ACN中：
DMT-dT亞胺基磷酸酯
Figure 02_image722
 0.1 M於無水ACN中：
Fmoc保護DMT- dT PEG2 NH2亞胺酸酯
Figure 02_image724
 0.1 M於無水ACN中
5-Br-dU-CE亞胺基磷酸酯
Figure 02_image726
 0.1 M於無水ACN中
dT-硫代亞胺基磷酸酯
Figure 02_image728
 0.15M於無水10% (v/v) DCM/ACN中
2'-O-甲基5-甲基尿苷 CED亞胺基磷酸酯
Figure 02_image730
 0.1 M於無水ACN中
dG-硫代亞胺基磷酸酯
Figure 02_image732
 0.1 M於無水ACN中
獲自上文所描述之合成步驟的例示性Fmoc保護寡核苷酸化合物6.1a、6.2a及6.3a展示如下。以下進一步描述化合物6.1a脫除保護基、純化及偶合以製備化合物6.1b。
Figure 02_image734
Fmoc 保護 CPG 負載化合物 6 . 1a
Figure 02_image736
Fmoc 保護 CPG 負載化合物 6 . 2a
Figure 02_image738
Fmoc 保護 CPG 負載化合物 6 . 3a
獲自以上合成之Fmoc保護CPG負載寡核苷酸化合物6.1a自載體同時裂解，且藉由使CPG載體與20 mM含二硫蘇糖醇之氫氧化銨:甲胺1:1 (v/v)在室溫下反應2小時脫除保護基，得到粗化合物6.1a。粗產物藉由離子對逆相HPLC (IP-RP-HPLC)純化且其身分藉由ESI-MS確認。粗化合物6.1a藉由HPLC純化且去鹽。
隨後使化合物6.1a與O -[2-(Fmoc-胺基)-乙基]-O '-[3-(N-丁二醯亞胺基)-3-側氧基丙基]聚乙二醇(Fmoc-N -醯胺基-dPEG24 -NHS酯)在碳酸氫鈉緩衝劑中反應，得到Fmoc保護化合物6.1b。使Fmoc保護化合物6.1b與20 mM含二硫蘇糖醇之氫氧化銨:甲胺1:1(v/v)中在室溫下反應2小時，得到粗化合物6.1b。粗產物藉由離子對逆相HPLC (IP-RP-HPLC)純化且其身分藉由ESI-MS確認。粗化合物6.1b藉由HPLC純化，去鹽，且凍乾，得到經純化之寡核苷酸6.1b。製造抗體
根據製造商手冊，內部產生之抗體通常於Expi293系統(ThermoFisher)之懸浮培養物中表現。經由蛋白A捕獲使用MabSelectLX層析(GE)純化所表現之抗體，用0.1 M檸檬酸鹽(pH 3.3)溶離且在1×PBS (磷酸鹽緩衝鹽水，pH 7.4)之最終緩衝液組合物中透析。經由 mTG 進行之單步結合方法 ( 微生物轉穀胺醯胺酶 )
具有序列RPQGFGPP (SEQ ID NO: 49)之Q標籤經基因連接至抗體重鏈之C端。為進行結合，首先將經純化之抗體(在重鏈C端含有經工程改造之Q標籤)緩衝交換成25 mM Tris、150 mM NaCl pH 8。含Ab-Q標籤之部分及CpG以1:1.3之莫耳濃度比添加且在室溫下與最終濃度之1% mTG (w/v) (Ajinomoto)一起培育隔夜。用於結合之抗體的最終濃度一般為約20-25 μM。將混合物裝載至在20%緩衝液B (40 mM Tris、2 M NaCl pH 8)及80%緩衝液A (40 mM Tris，pH 8)中平衡之Q瓊脂糖HP (GE)中。管柱用5管柱體積之20%緩衝液B洗滌。在30個管柱體積中藉由使用20% B至60% B之線性梯度實現分離。彙集DAR1峰溶離份(Q標籤與一個CpG部分結合)且濃縮，繼而使用S200 (GE)進行凝膠過濾步驟。彙集單體峰溶離份且濃縮。CpG 核苷酸及抗體 - CpG 核苷酸結合物之生物學評估
自Vitalant接收Trima殘餘物且用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS，Gibco)以1:4稀釋。將稀釋血液分入兩個試管中且緩緩注入15 mL菲科爾-帕克(Ficoll-Paque) (GE Healthcare)。使試管在400×g下離心30分鐘。自界面收集PBMC且再懸浮於FACS緩衝液(具有0.5%牛血清白蛋白之PBS (Gibco))中。根據製造商方案，使用B細胞分離套組II、人類(Miltenyi Biotec)及LS管柱(Miltenyi Biotec)藉由負向選擇純化B細胞。
緊接著將PBMC塗鋪於完全RPMI (RPMI+10% FBS)中之96孔格式(500K/孔)上。在37℃下在5% CO2下將五倍連續稀釋液自100 nM至6.4 pM抗體及結合抗體及1 µM至64 pM CpG聚核苷酸添加至細胞中48至96小時。藉由在400×g下離心五分鐘使細胞集結，且在4℃下在以1:4000稀釋於PBS中之Fixable Viability Dye eFluor 780 (Thermo Fisher)中染色。細胞在FACS緩衝液中在4℃下離心且染色30分鐘，該緩衝液含有FcR阻斷試劑(Miltenyi Biotec)、抗CD19、抗CD20、抗CD40、抗HLADR及抗CD80用於B細胞檢定，及抗CD14、抗CD3、抗CD19、抗CD14、抗CD123、抗CD11c及抗CD86用於pDC檢定。細胞經離心且在FACS緩衝液中洗滌兩次且固定於0.5%多聚甲醛中。將CountBrightTM 絕對計數珠粒(Thermo Fisher)添加至各孔中以計數細胞數。在Attune NxT流式細胞儀(Thermo Fisher)上分析細胞，隨後藉由Flowjo 10.7 (Treestar)進行資料分析。藉由對eFluor 780陰性群體閘控排除死細胞。在閘控CD123+ CD11c- 細胞以鑑別pDC及閘控CD19+ 、CD20+ 或CD19+ CD20+ 細胞以鑑別B細胞之前，首先排除譜系特異性細胞(CD19、CD3、CD14)。實例 1 ：游離免疫調節寡核苷酸 ( CpG ) 在人類 PBMC 中之活性
人類PBMC用游離CpG (SEQ ID NO: 3及26-28)處理以評估其相應活性，如藉由CD19陽性B細胞上之HLADR及CD40表現所觀測(如圖 1A - 1B 中所示)。CpG (SEQ ID NO: 26-28)與CpG (SEQ ID NO: 3)相比均展示增強之活性。 實例2：免疫調節聚核苷酸及其相應抗體結合物之活性
測試各種CpG聚核苷酸(SEQ ID NO: 3-25)對B細胞之增殖及/或活化的作用。圖 2A - 2C 展示單獨的選擇CpG之相應活性。所測試之所有CpG聚核苷酸在培育48小時之後增強B細胞之活化。如藉由計數珠粒計算絕對B細胞數及CD40表現所測定，所有CpG增加B細胞數及CD40表現。所測試CpG聚核苷酸之選擇數目相較於CpG (SEQ ID NO: 3)展示對B細胞增殖及活化的增強作用。
如藉由CD80表現所測定，作為與抗CD22抗體(SEQ ID NO: 56及SEQ ID NO: 57)的抗體-CpG結合物(圖 2D )，相較於CpG (SEQ ID NO: 3)及裸CpG (SEQ ID NO: 3)之相應結合物，經修飾之CpG之所有相應結合物(SEQ ID NO: 9、12、13、15及20)的B細胞活化增加。實例 3 ：轉穀胺醯胺酶介導之結合
轉穀胺醯胺酶介導之結合使用與聚乙二醇化連接子(-NH-C(=O)-PEG23 -NH2 ，如下所示之結構)及Q標籤肽序列SEQ ID NO: 39-47及50-52配位之寡核苷酸A (具有序列：tu cgtcgtgacgtt，SEQ ID NO: 1)測試。
Figure 02_image740
在PBS中在0.04 nmol轉穀胺醯胺酶存在下，將2 nmol Q標籤添加至1 nmol連接子中。連接子之最終濃度為50 µM。將反應保持在室溫下且在1小時時用8 M甲醯胺淬滅。在60℃下在10分鐘內使用具有Xbridge C18管柱(4.6×150 mm)之逆相HPLC，使用溶劑A (50 mM TEAA/水)及溶劑B (乙腈)，以20%至60%溶劑B之梯度分析反應溶液。替代地，在50℃下在10分鐘內，使用具有Luna 3µ C18管柱(4.6×50 mm)之逆相HPLC，使用溶劑A (0.1% TFA/水)及溶劑B (0.1% TFA/乙腈)，以10%至70%溶劑B梯度分析反應溶液。
圖 3 展示用各種Q標籤進行轉穀胺醯胺酶介導之結合及肽脫醯胺化的產量。RPQGF (SEQ ID NO: 47)、RPQQF、RPRPQQF展示較高結合百分比及適當較低脫醯胺化。
圖 4A - 4B 展示隨時間推移由具有SEQ ID NO: 39及47之Q標籤製備的兩種結合物之結合及去結合。RPQGF (SEQ ID NO: 47)與所有Q標籤具有較高的結合百分比：經16小時之持續時間，測試連接子+CpG比率。此外，RPQGF (SEQ ID NO: 47)之去結合速率亦比LSLSPGLLQGG (SEQ ID NO: 39)慢。實例 4 ： 抗 CD22 及抗 BDCA2 抗體 / CpG 結合物之活性
具有序列RPQGFGPP (SEQ ID NO: 49)之Q標籤經基因連接至抗體重鏈之C端。為進行結合，首先將經純化之抗體(在重鏈C端含有經工程改造之Q標籤)緩衝交換成25 mM Tris、150 mM NaCl pH 8。將以1:1.3之莫耳濃度比添加之Ab-(Q標籤):CpG部分混合且在室溫下與最終濃度之1% mTG (w/v) (Ajinomoto)一起培育隔夜。用於結合之抗體的最終濃度一般為約20-25 μM。將混合物裝載至在20%緩衝液B (40 mM Tris、2 M NaCl pH 8)及80%緩衝液A (40 mM Tris，pH 8)中平衡之Q瓊脂糖HP (GE)中。管柱用5管柱體積之20%緩衝液B洗滌。在30個管柱體積中藉由使用20% B至60% B之線性梯度實現分離。收集DAR1峰溶離份(Q標籤與一個CpG部分結合)且濃縮，繼而使用S200 (GE)進行凝膠過濾步驟。彙集單體峰溶離份且濃縮。
自Vitalant接收Trima殘餘物且用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS，Gibco)以1:4稀釋。將稀釋血液分入兩個試管中且緩緩注入15 mL菲科爾-帕克(GE Healthcare)。使試管在400×g下離心30分鐘。自界面收集PBMC且再懸浮於FACS緩衝液(具有0.5%牛血清白蛋白之PBS (Gibco))中。
緊接著將PBMC塗鋪於完全RPMI (RPMI+10% FBS)中之96孔格式(500K/孔)上。在37℃下在5% CO2下將五倍連續稀釋液自100 nM至6.4 pM抗體及結合抗體及1 μM至64 pM CpG聚核苷酸添加至細胞中48至96小時。藉由在400×g下離心五分鐘使細胞集結，且在4℃下在以1:4000稀釋於PBS中之Fixable Viability Dye eFluor 780 (Thermo Fisher)中染色。細胞在FACS緩衝液中在4℃下離心且染色30分鐘，該緩衝液含有FcR阻斷試劑(Miltenyi Biotec)、抗CD19、抗CD20、抗CD40、抗HLADR及抗CD80用於B細胞分析，及抗CD14、抗CD3、抗CD19、抗CD14、抗CD123、抗CD11c及抗CD86用於pDC分析。細胞經離心且在FACS緩衝液中洗滌兩次且固定於0.5%多聚甲醛中。將CountBright絕對計數珠粒(Thermo Fisher)添加至各孔中以計數細胞數。在Attune NxT流式細胞儀(Thermo Fisher)上分析細胞，隨後藉由Flowjo 10.7 (Treestar)進行資料分析。藉由對eFluor 780陰性群體閘控排除死細胞。在閘控CD123+ CD11c- 細胞以鑑別pDC及閘控CD19+ 、CD20+ 或CD19+ CD20+ 細胞以鑑別B細胞之前，首先排除譜系特異性細胞(CD19、CD3、CD14)。
使用LegendPlex人類發炎組1 (Biolegend)分析干擾素α含量。在集結細胞之後收集來自pDC檢定之上清液。
各種B細胞及pDC特異性抗體經由轉穀胺醯胺酶反應在其C端重鏈Q標籤(RPQGFGPP) (SEQ ID NO: 49)處與CpG 12070 (SEQ ID NO: 3)、CpG (SEQ ID NO: 9、12、20、27及28) (全部具有DAR1組態)結合。隨後測試結合之抗體對增殖及/或活化之作用。與CpG結合之抗CD22抗體為RFB4 (SEQ ID NO: 56及57)。如圖 5A - 5D 中所示，在96小時之後，抗CD22-CpG抗體相較於裸CpG聚核苷酸12070 (SEQ ID NO: 3)及人類IgG對照抗體，增強B細胞之活化。如藉由CD19、CD40、CD69、CD86及HLADR表現所測定，僅抗CD22-CpG及單獨CpG誘導B細胞活化。藉由靶向抗體直接遞送CpG相比於單獨CpG引起較高活化。此外，與CpG (SEQ ID NO: 9及20)結合之抗CD22相比於與CpG (SEQ ID NO: 3)結合之抗CD22具有增強的活性。
pDC靶向抗體抗BDCA2 (對於VH及VL序列分別為SEQ ID NO: 111及112)，與CpG 12070 (SEQ ID NO: 3)、CpG (SEQ ID NO: 9、12、20、27及28) (全部具有DAR1組態)類似地結合，且在48小時之後藉由CD86、CD40及HLADR表現(圖 6A - 6C )且藉由單核球及mDC中之CD40表現以及CD19、CD40、CD3及CD69表現(圖 7A - 7D )，測試其與未結合抗體相當的對活化之作用。CpG 12070:抗BDCA2結合物亦誘導人類PBMC中之IFNα表現(圖 6D )。
相較於單獨抗體，結合之抗pDC-CpG抗體及單獨的CpG誘導HLADR表現。 BDCA VH序列：
Figure 02_image742
BDCA-VL序列：
Figure 02_image744
實例 5 ：人類化抗 CD22 抗體之研發
此實例描述人類化抗CD22抗體之產生。親本抗體為小鼠抗CD22抗體(對於VH及VL序列分別為SEQ ID No: 56及57)。 小鼠抗CD22 VH序列
Figure 02_image746
小鼠抗CD22 VL序列
Figure 02_image748
設計VH域之4種變異體(分別為RH1、RH2、RH3及RH4；SEQ ID No: 64-67)及VL域之5種變異體(分別為RL1、RL2、RL3、RL4及RL5；SEQ ID No: 68-72)。相應VH及VL域之比對展示於圖 8A - 8B 中。各變異體所用之構架序列如下：RH1-人類IGHV3；具有一些突變之RH2-人類IGHV3；具有FW4作為親代小鼠之基於IGHV3-48*03之RH3 - FW1-3；RH4-人類IGHV4；RL1-人類IGLV1；具有一些突變之RL2-人類IGLV1；具有FW4作為親代小鼠之基於IGKV1-39*01之RL3 - FW1-3；RL4 - IGKV3；RL5 - IGVK2 (FW1及FW2側接CDR1；FW3及FW3側接CDR2，及FW4在CDR3之後)。如下文所示，藉由組合各VH域與各VL域，且使用在抗體重鏈恆定域(SEQ ID NO: 95)中具有C端Q標籤(RPQGFGPP) (SEQ ID NO: 49)之人類IgG1 AAA Fc區產生總共20種抗體構築體。IgG1 AAA Fc含有L234A、L235A及G237A取代，胺基酸位置係根據EU索引編號。
構築體名稱 輕鏈 + 重鏈
TNT69 RL1_hκ + RH1_hIgG1_AAA_Q標籤
TNT70 RL1_hκ + RH2_hIgG1_AAA_Q標籤
TNT71 RL1_hκ + RH3_hIgG1_AAA_Q標籤
TNT72 RL1_hκ + RH4_hIgG1_AAA_Q標籤
TNT73 RL2_hκ + RH1_hIgG1_AAA_Q標籤
TNT74 RL2_hκ + RH2_hIgG1_AAA_Q標籤
TNT75 RL2_hκ + RH3_hIgG1_AAA_Q標籤
TNT76 RL2_hκ + RH4_hIgG1_AAA_Q標籤
TNT77 RL3_hκ + RH1_hIgG1_AAA_Q標籤
TNT78 RL3_hκ + RH2_hIgG1_AAA_Q標籤
TNT79 RL3_hκ + RH3_hIgG1_AAA_Q標籤
TNT80 RL3_hκ + RH4_hIgG1_AAA_Q標籤
TNT81 RL4_hκ + RH1_hIgG1_AAA_Q標籤
TNT82 RL4_hκ + RH2_hIgG1_AAA_Q標籤
TNT83 RL4_hκ + RH3_hIgG1_AAA_Q標籤
TNT84 RL4_hκ + RH4_hIgG1_AAA_Q標籤
TNT85 RL5_hκ + RH1_hIgG1_AAA_Q標籤
TNT86 RL5_hκ + RH2_hIgG1_AAA_Q標籤
TNT87 RL5_hκ + RH3_hIgG1_AAA_Q標籤
TNT88 RL5_hκ + RH4_hIgG1_AAA_Q標籤
TNT89 對照_hRFB4_LC_hκ + 對照_hRFB4_HC_hIgG1_AAA_Q標籤
TNT90 對照_hRFB4+mutCDRL1_LC_hκ + 對照_hRFB4+mutCDRH3_HC_hIgG1_AAA_Q標籤
TNT31 小鼠RFB4
對於抗體選擇，考慮以下因素：CD22結合親和力、CD22生物活性、與食蟹獼猴CD22之結合、CHO或Expi293細胞中之表現、結合產率、SEC-HPLC概況(例如聚集、峰形狀)、VH/VL對、序列可靠性及穩定性測試(例如凍融及熱穩定性)。
各構築體在293FS細胞株中表現。如圖 9 中所示，具有RL4及RL5之抗體具有最低整體表現量。RH4亦降低各輕鏈對中之整體表現量。
人類化抗CD22抗體與人類CD22之結合係藉由表面電漿子共振(surface plasmon resonance，SPR)量測。為了藉由SPR評定結合，使生物素化蛋白A (15 µg/mL)固定於NLC晶片表面。將30 µL mAb上清液添加至150 µL PBS-T中且於蛋白A表面上捕獲。將人類CD22-gly之連續稀釋液(300 nM，3×稀釋)注射於mAb塗佈之晶片上，且測定結合動力學。使用4:1 v/v Pierce IgG溶離脂/4M NaCl使晶片再生。下文提供結合資料。
樣品名稱 ka kd KD
   1/Ms 1/s M
           
TNT69 2.01E+05 1.26E-04 6.24E-10
TNT70 2.35E+05 1.03E-04 4.39E-10
TNT72 2.23E+05 1.46E-04 6.55E-10
TNT71 2.81E+05 1.46E-03 5.20E-09
TNT73 1.58E+05 2.30E-03 1.45E-08
RFB4 2.97E+05 8.22E-04 2.77E-09
           
TNT74 1.86E+05 2.89E-03 1.56E-08
TNT76 1.99E+05 6.01E-03 3.02E-08
TNT75 2.80E+05 8.40E-03 3.00E-08
TNT77 2.03E+05 2.07E-03 1.02E-08
TNT78 1.95E+05 4.85E-03 2.49E-08
TNT80 2.23E+05 5.19E-03 2.33E-08
           
TNT79 2.70E+05 6.29E-03 2.33E-08
TNT81 1.69E+05 1.17E-04 6.92E-10
TNT82 1.67E+05 1.56E-04 9.37E-10
TNT84 2.71E+05 6.67E-04 2.46E-09
TNT83 2.69E+05 1.60E-03 5.94E-09
RFB4 3.06E+05 8.02E-04 2.62E-09
           
TNT85 1.35E+05 1.69E-04 1.25E-09
TNT86 1.30E+05 1.41E-04 1.09E-09
TNT88 2.15E+05 2.89E-04 1.34E-09
TNT87 2.50E+05 1.71E-03 6.85E-09
TNT89 3.59E+05 1.29E-03 3.60E-09
TNT90 3.55E+05 5.23E-05 1.47E-10
所有人類化RFB4變異體以約30 nM與約0.1 nM之間的親和力結合於人類CD22 (根據NP_001762.2，d1至d7域)。親本RFB4抗體與人類CD22之結合親和力為約3 nM。TNT71、TNT84、TNT83、TNT85、TNT86、TNT88、TNT89及TNT90具有與RFB4等效的親和力。TNT69、TNT70、TNT72、TNT81、TNT82、TNT90的親和力(約0.1 nM)高於RFB4。
人類化抗CD22抗體與人類或食蟹獼猴PBMC之結合藉由流式細胞量測術量測。自Vitalant接收Trima殘餘物且自BioIVT接收食蟹獼猴全血。兩者用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS，Gibco) 1:4稀釋。將稀釋血液分入兩個試管中且緩緩注入15 mL菲科爾-帕克(GE Healthcare)。使試管在400×g下離心30分鐘。自界面收集PBMC，洗滌且再懸浮於FACS緩衝液(具有0.5%牛血清白蛋白之PBS (Gibco))中。將來自人類及食蟹獼猴之100K PBMC塗鋪於96孔盤中，且藉由在400×g下離心五分鐘集結，且在4℃下在以1:4000稀釋於PBS中之100 µl Fixable Viability Dye eFluor 780 (Thermo Fisher)中染色。細胞在4℃下在100 µl FACS緩衝液中離心且染色30分鐘，該緩衝液含有FcR阻斷試劑(Miltenyi Biotec)、抗CD20及Alexa Fluor 647結合之CD22結合抗體，其根據製造商方案使用Molecular Probes Alexa Fluor 647蛋白質標記套組(Molecular Probes)標記。細胞經離心且在200 µl FACS緩衝液中洗滌兩次且固定於100 µl 0.5%多聚甲醛中。在Attune NxT流式細胞儀(Thermo Fisher)上分析細胞，隨後藉由Flowjo 10.7 (Treestar)進行資料分析。藉由對eFluor 780陰性群體閘控排除死細胞。閘控CD20+ 細胞以鑑別B細胞且測定CD22之中值螢光強度。
評估人類化RFB4抗體與來自人類及食蟹獼猴之B細胞的結合。下表展示當與人類及食蟹獼猴中CD20+ 及CD20- 細胞上之RFB4人類化抗體結合時CD22之中值螢光強度。藉由計算CD20+ 相對於CD20- 細胞上CD22中值螢光強度之比率來測定結合之倍數增加。所有人類化抗體均結合人類B細胞上之CD22，類似於親本RFB4，但在食蟹獼猴B細胞上具有變化性。如藉由人類CD20+ 及CD20- 細胞上之CD22中值螢光強度所測定，相比於親本RFB4之22倍，人類化抗體之CD22之結合的倍數增加在19-26倍範圍內。人類化抗體之食蟹獼猴CD20+ 及CD20- 上之CD22中值螢光強度的倍數增加與母RFB4之8.3倍相比在1-16倍範圍內。
   人類    食蟹獼猴
   CD20+ CD20-       CD20+ CD20-   
樣品 ID CD22中值螢光強度 CD22中值螢光強度 CD22: CD20+ /CD20-    CD22中值螢光強度 CD22中值螢光強度 CD22: CD20+ /CD20-
TNT 69 1610 63.4 25.4    1412 94.9 14.9
TNT 70 1555 65.9 23.6    1291 115 11.2
TNT 72 1555 62.1 25.0    1368 109 12.6
TNT 71 1457 65.9 22.1    1420 101 14.1
TNT 73 1413 70.9 19.9    216 114 1.9
TNT 74 1313 67.1 19.6    185 105 1.8
TNT 76 1193 58.4 20.4    140 85.4 1.6
TNT 75 1628 60.9 26.7    588 88.4 6.7
TNT 77 1324 63.4 20.9    236 90.1 2.6
TNT 78 1206 60.9 19.8    112 90.4 1.2
TNT 80 1211 59.6 20.3    159 86 1.8
TNT 79 1301 60.9 21.4    349 90.1 3.9
TNT 82 1515 63.4 23.9    1174 93.2 12.6
TNT 83 1489 64.6 23.0    1401 130 10.8
TNT 85 1579 68.4 23.1    1375 143 9.6
TNT 86 1572 65.9 23.9    1428 131 10.9
TNT 88 1531 58.4 26.2    1274 86.7 14.7
TNT 87 1444 60.9 23.7    1368 85.4 16.0
RFB4 1353 60.9 22.2    960 115 8.3
為了評定CpG結合是否影響相應人類化抗CD22與人類CD22之結合，進行SPR分析。人類化抗CD22抗體(TNT70、TNT71、TNT72及TNT74)與具有DAR1組態之CpG (SEQ ID NO: 3)結合且與其相應裸抗體進行比較。簡言之，使生物素化蛋白A (15 µg/mL)固定於NLC晶片表面。30 nM含純化裸mAb或CpG結合之mAb溶液之PBS-T用於在蛋白質A表面上捕獲。人類CD22 (300 nM，3×稀釋)之連續稀釋液注射於mAb塗佈之晶片上，且測定結合動力學。使用4:1 v/v Pierce IgG溶離脂/4M NaCl使晶片再生。下文提供結合資料。
樣品名稱 ka kd KD
   1/Ms 1/s M
TNT70 DAR1 1.25E+05 6.29E-05 5.02E-10
TNT71 DAR1 8.17E+04 3.14E-05 3.84E-10
TNT72 DAR1 2.01E+05 6.59E-05 3.28E-10
TNT74 DAR1 1.14E+05 2.10E-03 1.85E-08
TNT71 8.84E+04 2.33E-05 2.63E-10
TNT72 3.51E+05 3.23E-09 9.22E-10
TNT70 1.40E+05 5.62E-05 4.00E-10
TNT74 1.10E+05 1.99E-03 1.82E-08
CpG結合之mAb (TNT70、TNT71、TNT72及TNT74)以與對應裸mAb類似的親和力結合於人類CD22，指示CpG結合不改變結合動力學。
接著，人類化抗CD22抗體與CpG 12070結合，且分析抗體結合物之活性(DAR1)。抗體結合物藉由層析在以下條件下純化：MonoQ 5/50 GL；緩衝液A：50mM Tris，pH8；緩衝液B：50mM Tris，2M NaCl，pH8；2 mL/min，0-100% B/200 CV，1 mL溶離份。對於分別與TNT70、TNT71、TNT72及TNT74之結合物，結果展示於圖 10A - 10D 中。為進行純化，僅將DAR1峰彙集，將緩衝交換至PBS中且濃縮。亦藉由SDS-PAGE以還原或非還原形式分析起始物質及結合物(圖 10E )。
SPR之結合分析展示裸抗體及CpG結合物以類似親和力結合於CD22。
如圖 11 中所示，與各種人類化抗CD22抗體之結合物均能夠活化B細胞。觀測到與CD22之親和力及B細胞活化之間無關係。
CpG:抗體結合物亦藉由尺寸排阻層析(size exclusion chromatography，SEC)剖析，如圖 12A - 12D 中所示。併入RH1 VH域之抗體結合物展示寬或雙SEC峰(圖 12A )。基於SEC分析，併入RH2 VH域之抗體結合物表現良好(圖 12B )。基於SEC分析，併入RH3 VH域之抗體結合物易於聚集(圖 12C )。基於SEC分析，併入RH4 VH域之抗體結合物表現良好，但其以較低總體表現為特徵(圖 12D )。
分析特定VH及VL域對。已知一般而言，IGHV3與IGKV1及IGKV3頻繁配對。較佳配對包括TNT69、TNT70、TNT71、TNT73、TNT74、TNT75、TNT77、TNT78、TNT79、TNT81、TNT82及TNT83。亦檢查潛在序列可靠性，包括潛在地經受甲硫胺酸氧化、脫醯胺及異構化之殘基。
所測試之結合物之所選特徵概述於圖 13A 中。具有RH1之抗體通常藉由SEC-HPLC表現。具有RH4、RL4及RL5之抗體具有較低表現量(圖 13B )。特定言之，具有RL4之抗體(IGKV3)在CHO細胞中具有較低表現，如在Expi293細胞中。具有RH3之抗體一般傾向於高度聚集。使RH4及RL5配對一般為非較佳的。基於所有特徵，包括表現量及潛在序列不可靠性，使RH2 VH域與RL1、RL2或RL3 VL域配對為較佳的。選擇TNT70、TNT74、TNT78及TNT82進行進一步研究。
為評估熔融溫度，使用差示掃描熱量測定(DSC)。使用MicroCal VP Capillary DSC (Malvern)進行DSC。認為DSC量測隨溫度而變之熱容量。認為熔點(Tm)為熱穩定性之良好指示及長期穩定性之預測因子，其中更穩定之蛋白質具有較高的Tm。所選CpG:抗體結合物之DSC測試結果展示於下文。
樣品 T 起始 Tm 1 Tm 2
TNT70 61.41 71.71 79.26
TNT70 DAR1 64.23 71.71 78.09
TNT72 62.64 71.17 86.37
TNT72 DAR1 62.54 70.80 86.00
TNT72之Tm2高於TNT70。認為此轉變對應於Fab/CH3去摺疊。觀測到裸抗體與結合抗體之間的Tm之微小差異。DSC曲線圖展示於圖 14 中。實例 6 ：突變以移除潛在序列可靠性的人類化抗 CD22 變異體之分析
接著分析實例5中所述之人類化抗CD22抗體之潛在序列不可靠性。潛在Asn脫胺位點存在於所有人類化變異體之CDR-L3 (N92)中(圖 8B )。此位點在RL1 VH域中經突變以產生抗體變異體，測試其突變對與CD22之結合親和力的影響。對於工程改造變異體，N92突變成所有可能的胺基酸。突變成A、C、D、E、F、G、H、L、P、S、T、V或W之資料展示如下。
在還原或非還原(圖 15A )條件下將各變異體之表現與TNT70進行比較(圖 15B )。突變體之結合特性概述於下文及圖 15C - 15F 中。所有N92取代相對於與CD22之結合親和力看起來為可容許的。特定言之，N92A、N92D、N92E及N92F看起來與親本抗體相當，但所有變異體之KD看起來在分析之誤差內。
   ka kd KD
樣品 1/Ms 1/s M
TNT70 1.55E+05 3.72E-05 2.40E-10
TNT70 1.45E+05 7.30E-05 5.04E-10
N92A 1.51E+05 4.45E-05 2.95E-10
N92C 1.11E+05 7.13E-05 6.43E-10
N92D 1.46E+05 5.05E-05 3.46E-10
N92E 1.47E+05 4.29E-05 2.93E-10
N92F 1.55E+05 4.58E-05 2.95E-10
N92G 1.51E+05 6.80E-05 4.52E-10
N92H 1.49E+05 6.08E-05 4.09E-10
N92K 1.45E+05 6.25E-05 4.31E-10
N92P 1.12E+05 7.24E-05 6.44E-10
N92S 1.52E+05 7.14E-05 4.68E-10
N92T 1.49E+05 7.85E-05 5.29E-10
N92V 1.45E+05 8.32E-05 5.73E-10
N92W 1.43E+05 7.87E-05 5.49E-10
實例 7 ： CpG - 抗體結合物之藥物動力學
方法 ： Balb/c小鼠獲自查爾斯河(Charles River)且用於單劑量PK研究。以2 mg/mL之工作劑量調配與RFB4抗體(對於VH及VL域序列，分別SEQ ID NO: 56及SEQ ID NO: 57)之各化合物結合物，且各小鼠給予200 mg，但其中化合物4.2b (SEQ ID NO:12) 與RFB4結合，其給以170 mg。RFB4結合物經由小鼠尾部靜脈靜脈內投與。對三隻小鼠給藥各RFB4結合物。在給藥後，小鼠在以下七個時間點抽取血液：0.5、6、24、48、72、144及192小時。藉由軌道式放血將大致100 µl全血收集於微量採血管中。全血樣品靜置30分鐘以允許血清分離。隨後將樣品在10000xg下以4度離心10分鐘。將血清轉移至1.5 ml管中且在分析前冷凍。Immulon 96孔ELISA盤(Thermo Fisher Scientific，目錄號3855)針對抗人類IgG抗體捕獲，用1 µg/ml 100 µl/孔含綿羊抗人類IgG抗體(The Binding Site，目錄號AU003.M)之PBS，或針對抗BrdU捕獲，用2 µg/ml 100 µl/孔含中性抗生物素蛋白生物素結合蛋白(NeutrAvidin Biotin Binding Protein) (Thermo Fisher Scientific，目錄號31050)之PBS塗佈隔夜。培養盤用Tris緩衝鹽水Tween-20 (TBST，25 mM Tris，0.15 M NaCl，0.05% Tween-20，pH 7.5)洗滌，且針對抗人類IgG抗體捕獲，用分析緩衝液(PBS，1% BSA，0.05% Tween-20，0.25% CHAPS，5 mM EDTA，0.35 M NaCl)，且針對抗BrdU捕獲，用酪蛋白阻斷劑(Thermo Fisher Scientific，目錄號37528)阻斷1小時。培養盤用TBST洗滌。將1 µg/ml 100 µl/孔之含生物素化的抗BrdU小鼠單株抗體(BioLegend，目錄號317904)之分析緩衝液(PBS，1% BSA，0.05% Tween-20，0.25% CHAPS，5 mM EDTA，0.35 M NaCl) + 20%酪蛋白阻斷劑添加至培養盤中，且在室溫下，在培養盤振盪器上在420 rpm之緩慢震盪下培育1小時。培養盤用TBST洗滌。血清樣品以1:50之最小值在分析緩衝劑+20%酪蛋白阻斷劑(Thermo Scientific，目錄號37528)中稀釋，或在室溫下，在培養盤振盪器上在420 rpm之緩慢震盪下將具有及不具有各種連接之CpG的RFB4標準曲線蛋白質(自100至0.2 ng/ml之兩倍連續稀釋，以1:50稀釋於分析緩衝液 + 20%酪蛋白阻斷劑中之普通小鼠血清)添加至阻斷培養盤中1小時。培養盤用TBST洗滌。在室溫下，在培養盤振盪器上在420 rpm之緩慢震盪下，標準曲線及樣品針對抗人類IgG抗體捕獲，與0.2 µg/ml山羊抗人類IgG-HRP (Bethyl，目錄號A80-319P)，或針對抗BrdU，與0.4 µg/ml山羊抗人類IgG-HRP一起培育1小時。培養盤用TBST洗滌。所有培養盤與1步驟Ultra TMB ELISA溶液(Thermo Fisher Scientific，目錄號34028)一起培育，且用0.16 M硫酸溶液(Thermo Fisher Scientific，目錄號N600)停止反應。在SpectraMax i3盤式讀取器上(Molecular Devices)在450 nm之O.D.處讀取培養盤，其中背景參考讀數在570 nm處。使用4參數擬合曲線及Prism軟體(GraphPad)，自具有及不具有各種連接之CpG的RFB4抗體標準曲線中插入血清樣品之蛋白質濃度。
如圖 17A 中所示，當量測全部抗體時，與化合物1.1b (SEQ ID NO: 3)、化合物3.2b (SEQ ID NO: 9)、化合物4.2b (SEQ ID NO: 12)、化合物4.3b (SEQ ID NO: 13)、化合物5.2a (SEQ ID NO: 15)或化合物5.7a (SEQ ID NO: 20)結合之RFB4的半衰期與裸RFB4類似。此展示RFB4與相應CpG寡核苷酸之結合不影響抗體之PK。圖 17B 藉由捕捉具有抗BrdU抗體之化合物來展示RFB4結合物之PK。出人意料地，當RFB4結合物之半衰期藉由使用抗BrdU抗體捕獲CpG之5'區評估時，化合物3.2b (SEQ ID NO: 9)、化合物4.2b (SEQ ID NO:12)、化合物4.3b (SEQ ID NO:13、化合物5.2a (SEQ ID NO:15)及化合物5.7a (SEQ ID NO:20)與化合物1.1b (SEQ ID NO:3)相比具有增加之半衰期。實例 8 ： 食蟹獼猴 PBMC 中藉由 CpG 寡核苷酸之 B 細胞活化
藉由菲科爾(GE)分離自食蟹獼猴全血分離周邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。將300,000個PBMC細胞塗鋪於96孔圓底培養盤的RPMI 10% FBS (Life Technologies)中。細胞用12070 (化合物1.1b，SEQ ID NO: 3)、CpG 7-7 (化合物7.7b；SEQ ID NO: 35)或僅培養基在1 µM之起始濃度下處理，接著1:5向下滴定。將細胞培育72小時，隨後染色用於流動式細胞量測術。細胞在400 G下離心5分鐘，隨後移除培養基。細胞隨後在4℃下與固定活性死染料eFluor780 (eBioscience)一起培育30分鐘。向孔中添加FACS緩衝液(PBS + 2% FBS)，隨後在400 G下離心5分鐘。細胞隨後在人類FcR阻斷試劑(Miltenyi Biotec)中培育且用針對以下之螢光物標記抗體在4℃下染色1小時：CD3 (純系SP34，Biolegend)、CD14 (純系M5E2，Biolegend)、CD16 (純系3G8，Biolegend)、HLADR (純系G46-6，Biolegend)、CD1c (純系L161，Biolegend)、CD20 (純系2H7，Biolegend)、CD69 (純系FN50、eBioscience)、CD8 (純系RPAT8，Biolegend)、CD40 (純系5C3，Biolegend)及CD86 (純系IT2.2，Biolegend)。細胞隨後在FACS緩衝液中洗滌兩次，隨後固定於0.5%多聚甲醛中。在Attune流式細胞儀(Thermofisher)上獲取細胞,藉由使用FlowJo軟體進行後續分析，且使用Prism軟體列表。
食蟹獼猴PBMC在7-7 CpG、12070 CpG或僅培養基存在下在1 µM之起始濃度下刺激72小時，接著1:5向下滴定。接著將細胞染色且藉由流式細胞量測術分析。在單峰及死細胞排除之後，對CD20+ B細胞進行閘控，隨後對CD86標記物進行中值螢光強度。用7-7誘導之優良CD86處理上調(圖 18 )，展現與12070相比增強的B細胞活化。實例 9 ： 使用抗 CD22 : CpG 寡核苷酸結合物誘導 IL6 表現
自Trima殘餘物(Vitalant)分離人類周邊血液單核細胞(PBMC)且用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS，Gibco) 1:4稀釋。將稀釋血液分入試管中且緩緩注入15 mL菲科爾-帕克(GE Healthcare)。使試管在400×g下離心30分鐘。自界面收集PBMC且再懸浮於完全RPMI (RPMI+10% FBS)中。將一百萬PBMC塗鋪在96個圓孔培養盤的完全RPMI中，且以100 nM之濃度開始，用未結合之抗CD22抗體或與12070 CpG (化合物1.1b，SEQ ID NO: 3)結合之抗CD22處理，接著1:5向下滴定。將細胞培育48小時，隨後以400×g旋轉5分鐘，接著收集上清液。所收集上清液中之IL6使用基於珠粒之免疫分析套組(LegendPlex, Biolegend)根據製造商建議評定純淨度。在Attune流式細胞儀(Thermofisher)上獲取樣品,藉由使用FlowJo軟體進行後續分析，且使用Prism軟體列表。
在未結合抗CD22抗體或與12070 CpG結合之抗CD22存在下，刺激人類PBMC 48小時，接著收穫上清液且藉由基於珠粒之免疫分析評定IL6。與用未結合之抗CD22抗體處理後相比，與12070 CpG結合之抗CD22誘導穩固IL6表現(圖 19 )，表明與12070結合之抗CD22可穩固地誘導自目標細胞類型之IL6表現。 實例10：使用抗SIRP-α:CpG寡核苷酸結合物活化非靶向T及B細胞
自Trima殘餘物(Vitalant)分離人類周邊血液單核細胞(PBMC)且用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS，Gibco) 1:4稀釋。將稀釋血液分入試管中且緩緩注入15 mL菲科爾-帕克(GE Healthcare)。使試管在400×g下離心30分鐘。自界面收集PBMC且再懸浮於完全RPMI (RPMI+10% FBS)中。將一百萬PBMC塗鋪在96個圓孔盤的完全RPMI中，且用抗SIRP-α抗體或與12070 CpG (化合物1.1b，SEQ ID NO: 3)結合之抗SIRP-α處理，以100 nM之濃度開始，接著1:5向下滴定。抗SIRP α抗體之VH及VL域序列提供於下文。 抗SIRP α VH域：
Figure 02_image750
抗SIRP-α VL域：
Figure 02_image752
隨後在流動染色之前培育細胞48小時。細胞在培養基移除之前在400×g下離心5分鐘。細胞隨後在4℃下與固定活性死染料eFluor780 (eBioscience)一起培育30分鐘。在400×g下離心5分鐘之前，向孔中添加FACS緩衝液(PBS + 2% FBS)。細胞隨後在人類FcR阻斷試劑(Miltenyi Biotec)中培育且在4℃下用針對CD3、CD14、CD16、HLADR、CD11c、CD69、CD40及CD86之螢光物標記抗體染色1小時。細胞隨後在FACS緩衝液中洗滌兩次，隨後固定於0.5%多聚甲醛中。在Attune流式細胞儀(Thermofisher)上獲取細胞,藉由使用FlowJo軟體進行後續分析，且使用Prism軟體列表。
在未經結合之抗SIRP-α或與12070結合之抗SIRP-α存在下，以100nM之濃度開始，將人類PBMC刺激48小時，接著1:5向下滴定。接著將細胞染色且藉由流式細胞量測術分析。在單峰及死細胞排除之後，CD20+ B細胞(圖 20B )或CD3+ T細胞(圖 20A )經閘控，隨後CD69(活化標記物)之中值螢光強度。與12070 CpG結合之抗SIRP α相比於在用未結合的抗SIRP α處理之後，誘導非目標細胞(諸如T細胞及B細胞)之穩固活化，如在CD69上調之情況下所顯而易見的(圖 20A 及 20B )。實例 11 ：用抗體 : CpG 寡核苷酸結合物處理引起對腫瘤之穩固免疫記憶反應
將MC38細胞以DMEM中每隻小鼠2×106 個細胞之濃度注射至C57BL/6雌性小鼠之右側腹中。監測腫瘤直至腫瘤之平均尺寸達至150-155 mm3 。小鼠以每組5個小鼠隨機分至PBS對照組、抗SIRP-α-4523 CpG或抗mCD22-4523 CpG中。4523鼠類CpG寡核苷酸之序列為tu cgt cgtgacgtt-c3，其中小寫字母指示硫代磷酸酯鍵聯，粗體指示碘-尿苷，且加下劃線指示磷酸三酯連接子(SEQ ID NO: 121)。抗mCD22抗體之VH及VL域序列提供於下文。 抗mCD22 VH域：
Figure 02_image754
抗mCD22 VL域：
Figure 02_image756
抗SIRP-α-4523及抗mCD22-4523以總計兩次10 mg/kg，相隔三天給藥。兩種藥物均腹膜內投與。在第88天，腫瘤經根除之小鼠用MC38 (左側腹)以DMEM中每隻小鼠2×106 個細胞再攻擊。包括尚未植入MC38小鼠之未處理小鼠作為腫瘤生長之對照。用測徑規以二維量測腫瘤，且腫瘤體積計算為：長度×寬度×寬度×0.5，其中長度為兩個量測結果中之較大者。
在第88天，對於經10 mg/kg抗SIRP-α 4523 CpG或抗mCD22-4523 CpG處理之組中之每一者，有5隻腫瘤經根除之小鼠。在再攻擊之後，先前經根除之小鼠早在腫瘤再植入後三天展示有效腫瘤排斥反應，表明用結合於4523 CpG之抗SIRP α及抗mCD22兩者處理引起針對植入腫瘤的穩定免疫記憶反應，其未在首次遭遇MC38腫瘤之未處理小鼠中發現(圖 21A - 21C )。實例 12 ： 用抗 Her2 : CpG 寡核苷酸結合物治療引起持久腫瘤根除
將曲妥珠單抗抗原決定基整合於小鼠Her2基因中以產生小鼠/人類(m/h) Her2。m/h Her2表現MC38細胞係藉由慢病毒轉導產生且分選以獲得表現m/h Her2之細胞。將m/h Her2-MC38細胞以DMEM中每隻小鼠2×106 個細胞之濃度注射至C57BL/6雌性小鼠之右側腹中。監測腫瘤直至腫瘤之平均尺寸達至70 mm3 為止。將小鼠隨機分至PBS對照、TNT149a (抗Her2 mIgG2a)及TNT150a(抗Her2 mIgG1)，每組5隻小鼠。經抗Her2-CpG核苷酸結合物處理之小鼠用1、3及10 mg/kg總計三次，相隔三天給予。兩種藥物均腹膜內投與。抗Her2抗體之重鏈及輕鏈序列提供於下文。 抗Her2 mIgG2a重鏈：
Figure 02_image758
抗Her2 mIgG1重鏈：
Figure 02_image760
抗Her2輕鏈：
Figure 02_image762
量測負載有m/h Her2 MC38腫瘤之小鼠且根據腫瘤體積隨機分組。在第4天，5隻小鼠之各組具有70 mm3 之平均腫瘤尺寸。小鼠用PBS或1、3及10 mg/kg TNT149a或TNT150a處理。截至第60天，相隔三天給與三次的經1、3及10 mg/kg TNT149a處理之小鼠展示腫瘤根除(分別1/5、5/5及5/5小鼠；圖 22A 及 22C )，而用1、3及10 mg/kg TNT150a處理之小鼠展示腫瘤經根除之小鼠的數目較低(分別為0/5、3/5及5/5；圖 22B 及 22D )。用PBS對照處理之小鼠直至第24天實現指標，且用TNT149a或TNT150a處理之所有組相比於PBS對照展示延遲的腫瘤生長。此等資料展示用抗HER2-CpG mIgG1及mIgG2a兩者進行之腫瘤根除的耐久性及在用含有Fc效應功能之抗Her2-CpG核苷酸結合物治療的小鼠中的優良活性。
在第81天，對於用10 mg/kg TNT150a、3及10 mg/kg TNT149a處理之組，存在5隻腫瘤經根除之小鼠，對於用3 mg/kg TNT150a處理之組，存在3隻腫瘤經根除之小鼠。在第81天，用m/h Her2 MC38(右下側腹)、親本MC38(左下側腹)、m/h Her2 B16F10(右上側腹)及親本B16F10(左上側腹)以DMEM中每隻小鼠2×106 個細胞(m/h Her2 MC38及MC38細胞)及1×106 個細胞(m/h Her2 B16F10及B16F10細胞)再攻擊腫瘤經根除之小鼠(圖 23A )。包括尚未植入有m/h Her2 MC38小鼠之未處理小鼠。用測徑規以二維量測腫瘤，且腫瘤體積計算為：長度×寬度×寬度×0.5，其中長度為兩個量測結果中之較大者。
如圖 23B - 23I 中所示，未處理小鼠展示所有植入細胞之生長。m/h Her2 B16F10、MC38及m/h Her2 MC38展示相比於未處理小鼠，腫瘤經根除或腫瘤生長顯著延遲。除在一種情況下，即來自10 mg/kg Her2 mIgG2a組之小鼠之一者未展示生長以外，在所有處理組中，母B16F10腫瘤生長。截至第99天，所有小鼠用m/h Her2 MC38細胞均展示完全根除。除對於先前用TNT149a處理MC38母細胞之3及10 mg/kg小鼠的一隻小鼠及所有先前經3及10 mg/kg處理之組的1-3隻小鼠以外，MC38母細胞與m/h Her2 B16F10細胞兩者均展示腫瘤根除。此等資料展示，在用抗Her2 mIgG1及mIgG2a處理之後腫瘤經根除之m/h Her2 MC38攜帶小鼠對m/h Her2 MC38、親本MC38及m/h B16F10但不對親本B16F10腫瘤具有強效且持久的抗腫瘤反應。此等結果展現抗原決定基展開以根除MC38親本及表現Her2之B16F10細胞，在較高劑量下可見略微較佳的持久性。實例 13 ： 用抗 mCD22 : CpG 寡核苷酸結合物處理引起與干擾素信號傳導、抗原呈現及細胞毒性相關之基因表現特徵的增加
將CT26細胞以RPMI中每隻小鼠2×106 個細胞之濃度注射至BALB/C雌性小鼠之右側腹中。監測腫瘤直至腫瘤之平均尺寸達至270-295 mm3 。將小鼠隨機分為PBS對照、抗mCD22及抗mCD22-CpG，每組4隻小鼠。以10 mg/kg腹膜內投與抗mCD22及抗mCD22_CpG。處理後8小時收集腫瘤且處理RNA。所有樣品均使用小鼠PanCaner 360圖(NanoString Technologies)根據製造商方案藉由Canopy Biosciences (St. Louis, MO)處理及定量。用nSolver及nCounter高級分析軟體分析規範化表現資料且展現為特徵分數。結合於抗mCD22之CpG為4523鼠類CpG寡核苷酸，其序列為tu cgt cgtgacgtt-c3，其中小寫字母指示硫代磷酸酯鍵聯，粗體指示碘-尿苷，且加下劃線指示磷酸三酯連接子(SEQ ID NO: 121)。
用nSolver及nCounter高級分析軟體分析腫瘤之正規化表現資料以獲得如由NanoString定義之基因表現特徵。相比於單獨的PBS對照物及抗mCD22，用抗mCD22 CpG處理之CT26攜帶小鼠展示腫瘤中干擾素信號傳導(圖 24A )、抗原呈現(圖 24B )及細胞毒性(圖 24C )之較高特徵分數。實例 14 ： 在具有活性或非活性 Fc 區之抗 Her2 : CpG 結合物存在下共培養鼠類骨髓來源之巨噬細胞及 Her2 陽性腫瘤細胞
CSFE標記之目標細胞，Her2pos (MC38)或Her2neg (C1498)腫瘤，與小鼠來源之巨噬細胞以1:2比率(目標:效應子)在未結合Her2、TNT149a、TNT150a或4523 CpG存在下以100 nM開始1:2稀釋(6pts)下共培養。細胞培育24小時，以400×g旋轉以移除上清液。接著用PBS洗滌細胞且將PBS與細胞一起轉移至新培養盤中。初始培養盤中之剩餘細胞與TrypLE一起培育10分鐘，隨後刮擦細胞且用PBS及細胞轉移至相同培養盤中。接著使經收集細胞旋轉且用固定活性死染料染色，接著用螢光染料標記之抗體對小鼠MHCII及CD11b進行染色。在Attune流式細胞儀(Thermofisher)上獲取樣品,藉由使用FlowJo軟體進行後續分析，且使用Prism軟體列表。
骨髓來源之小鼠巨噬細胞在Her2pos (MC38)或Her2neg (C1498)腫瘤存在下共培養且用抗Her2、TNT149a、TNT150a或4523 CpG處理24小時。藉由流式細胞量測術評定中值MHCII。當與Her2pos 腫瘤在活性Her2-CpG結合物(TNT149a)存在下而非Her2neg 腫瘤培養時，在鼠類巨噬細胞上觀測到MHCII活化標記物之上調，表明需要Her2之存在用於巨噬細胞活化，如MHCII誘導所證明(圖 25 )。另外，如藉由缺乏具有較少活性Fc之MHCII誘導所證明(TNT149a)，活體外活性Fc (TNT150a)似乎為鼠類巨噬細胞活化所需。實例 15 ： 藉由抗 CD22 : CpG 寡核苷酸結合物誘導人類 PBMC 中之 B 細胞活化
自Trima殘餘物(Vitalant)分離人類周邊血液單核細胞(PBMC)且用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS，Gibco) 1:4稀釋。將稀釋血液分入試管中且緩緩注入15 mL菲科爾-帕克(GE Healthcare)。使試管在400×g下離心30分鐘。自界面收集PBMC且再懸浮於完全RPMI (RPMI+10% FBS)中。將一百萬PBMC塗鋪在完整RPMI之96個圓孔培養盤中，且用與7-7 CpG、TNT52 (與12070結合之RFB4抗CD22)、7-7、12070或僅培養基結合之具有RH2 VH域及RL1 N92S VL域(分別為SEQ ID No: 65及87)的抗CD22抗體處理，針對結合抗體以100 nM或針對游離CpG以1 µM濃度開始，接著以1:5向下滴定。隨後在流動染色之前培育細胞48小時。細胞在培養基移除之前在400×g下離心5分鐘。細胞隨後在4℃下與固定活性死染料eFluor780 (eBioscience)一起培育30分鐘。在400×g下離心5分鐘之前，向孔中添加FACS緩衝液(PBS + 2% FBS)。細胞隨後在人類FcR阻斷試劑(Miltenyi Biotec)中培育且在4℃用針對CD19、CD40、CD80及CD86之經螢光染料標記之抗體染色1小時。細胞隨後在FACS緩衝液中洗滌兩次，隨後固定於0.5%多聚甲醛中。在Attune NxT細胞計數儀(Thermofisher)上獲取細胞,藉由使用FlowJo軟體進行後續分析，且使用Prism軟體列表。
人類PBMC在抗CD22抗體存在下刺激48小時，其中RH2 VH域及RL1 N92S VL域(分別為SEQ ID NO: 65及87)與化合物7.7b (7-7) CpG、TNT52a (RFB4與12070結合)、化合物7.7b (7-7) CpG、12070 CpG或僅培養基結合。接著將細胞染色且藉由流式細胞量測術分析。在單峰及死細胞排除之後，閘控CD20+ B細胞，隨後CD40 (圖 26A )、CD80 (圖 26B )及CD86 (圖 26C )活化標記物之中值螢光強度。具有與化合物7.7b (7-7 CpG)結合之RH2 VH域及RL1 N92S VL域的抗CD22抗體顯示出對閘控B細胞上的所有活化標記物之更高誘導，該誘導優於與12070結合之RFB4的誘導。另外，與12070 CpG相比，游離7.7b CpG誘導所有經研究標記物之優良活化。實例 16 ： 評估 CD19 + B 細胞對 CD40 表現之游離 CpG 活性 物質及方法
自Vitalant接收Trima殘餘物且用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS，Gibco)以1:2稀釋。將稀釋血液分入兩個試管中且緩緩注入15 mL菲科爾-帕克(GE Healthcare)。使試管在400×g下離心30分鐘。自界面收集PBMC，於FACS緩衝液(具有0.5%牛血清白蛋白之PBS (Gibco))中再懸浮且洗滌。在一次洗滌之後，將PBMC再懸浮於完全RPMI(RPMI + 10% FBS)中。
緊接著將PBMC塗鋪於完全RPMI中之96孔格式(500 K/孔)上。在37℃下在5% CO2下將固定連續稀釋液自1 µM至64 pM之CpG聚核苷酸添加至細胞中48小時。藉由在400×g下離心五分鐘使細胞集結，且在4℃下在以1:4000稀釋於PBS中之Fixable Viability Dye eFluor 780 (Thermo Fisher)中染色。細胞在FACS緩衝液中在4℃下離心且染色30分鐘，含有FcR阻斷試劑(Miltenyi Biotec)、抗CD19、抗CD20、抗CD40、抗HLADR及抗CD80。細胞經離心且在FACS緩衝液中洗滌兩次且固定於0.5%多聚甲醛中。在Attune NxT流式細胞儀(Thermo Fisher)上分析細胞，隨後藉由Flowjo 10.7 (Treestar)進行資料分析。藉由對eFluor 780陰性群體閘控排除死細胞。B細胞鑑別為CD19+CD20+細胞且活化標記物之水準藉由中值螢光強度評定。
關於Ramos NFkb報導基因分析，Ramos-Blue細胞NF-kB/AP-1報導基因B淋巴球購自Invivogen。細胞生長且保持於補充有2 mM L-穀胺醯胺、10% FBS、100 µg/mL Normacin、青黴素-鏈黴素(Pen-Strep)、100 µg/mL吉歐黴素(Zeocin)之完整DMEM中。執行Ramos-Blue細胞之刺激。簡言之，在不具有抗生素之生長培養基中沖洗細胞。將細胞計數且以2×106 個細胞/毫升之密度再懸浮於新鮮完全DMEM中而無選擇抗生素。將以1:5滴定的20 µL 10 µM CpG 7-7、CpG 12070及ODN2006添加至平底96孔培養盤，將180 µL細胞懸浮液添加至1 µM至64 pM CpG之最終濃度。培養盤在5% CO2培育箱中在37℃下培育24小時。在分析當天，在臨限值之前將QB試劑及QB緩衝液解凍。藉由在無菌玻璃瓶中將1 mL QB試劑及1 mL的1 mL QB緩衝液添加至98 mL無菌水中來製備Quanti-Blue溶液。每孔分配180 µL Quanti-Blue溶液至新的平底96孔培養盤中。隨後將經處理之Ramos-Blue細胞之20 µL上清液添加至96孔培養盤中。培養盤6小時培育。使用盤讀取器(Molecular Devices)在OD655下量測光密度，且資料列於GraphPad Prism 9.0中。結果
人類PBMC用游離CpG處理以評估其相應活性，如藉由CD19陽性B細胞上之CD40表現所觀測。如圖 27 中所示，系列7 CpG (SEQ ID NO: 29、30及32-36)與CpG 12070 (SEQ ID NO: 3)相比皆展示增強之活性。
在NFkb報導基因分析中比較CpG寡核苷酸7-7、12070以及ODN2006(5'-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3'；SEQ ID NO: 167)。如圖 28 中所示，CpG 7-7與12070及ODN2006相比展示顯著較高的活性。實例 17 ：評估來自不同供體之 PBMC 上之 CpG 活性
比較CpG寡核苷酸7-6、7-7及12070在來自三個不同供體品系(D559、D804及D643)的PBMC細胞中之活性，如藉由CD40表現所觀測。CpG寡核苷酸之活性評估係使用與以上實例16相同的方法進行。
結果展示，與12070相比，7-6及7-7之較高活性不視供體而定(圖 29A - 29C )。實例 18 ： 5 ' 溴 2 ' 去氧尿苷及 PEG 鍵聯對 CpG 活性的貢獻
為了評估人類PBMC中之CpG寡核苷酸，自活體外接收Trima殘基且用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS，Gibco)以1:4稀釋。將稀釋血液分入兩個試管中且緩緩注入15 mL菲科爾-帕克(GE Healthcare)。使試管在400×g下離心30分鐘。自界面收集PBMC且再懸浮於FACS緩衝液(具有0.5%牛血清白蛋白之PBS (Gibco))中。緊接著將PBMC塗鋪於完全RPMI (RPMI+10% FBS)中之96孔格式(500K/孔)上。在37℃下在5% CO2下將固定連續稀釋液自1 µM至64 pM之CpG聚核苷酸添加至細胞中48至96小時。細胞藉由在400×g下離心五分鐘而集結，且在4℃下在以1:4000稀釋於PBS中之Fixable Viability Dye eFluor 780 (Thermo Fisher)中染色。細胞在4℃下在FACS緩衝液中離心且染色30分鐘，該緩衝液含有FcR阻斷試劑(Miltenyi Biotec)、抗CD19、抗CD40及抗CD86。細胞經離心且在FACS緩衝液中洗滌兩次且固定於0.5%多聚甲醛中。在Attune NxT流式細胞儀(Thermo Fisher)上分析細胞，隨後藉由Flowjo 10.7 (Treestar)進行資料分析。藉由對eFluor 780陰性群體閘控排除死細胞。閘控CD19+、CD20+或CD19+CD20+細胞以鑑別B細胞。使用GraphPad Prism 9.0將資料製成表。
如圖 30 中所示，在5'尿苷處無溴修飾的CpG寡核苷酸9-9及9-10活化CD86表現。此暗示溴修飾不為相應寡核苷酸之必需組分。實例 19 ： CpG - 核苷及抗體 - CpG 核苷酸結合物之生物學評估
自Vitalant接收Trima殘餘物且用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS，Gibco)以1:2稀釋。將稀釋血液分入兩個試管中且緩緩注入15 mL菲科爾-帕克(GE Healthcare)。使試管在400×g下離心30分鐘。自界面收集PBMC，於FACS緩衝液(具有0.5%牛血清白蛋白之PBS (Gibco))中再懸浮且洗滌。在一次洗滌之後，將PBMC再懸浮於完全RPMI(RPMI + 10% FBS)中。緊接著將PBMC塗鋪於完全RPMI中之96孔格式(500 K/孔)上。在37℃下在5% CO2下將五倍連續稀釋液自100 nM至6.4 pM結合之抗體添加至細胞中48小時。藉由在400×g下離心五分鐘使細胞集結，且在4℃下在以1:4000稀釋於PBS中之Fixable Viability Dye eFluor 780 (Thermo Fisher)中染色。細胞在FACS緩衝液中在4℃下離心且染色30分鐘，含有FcR阻斷試劑(Miltenyi Biotec)、抗CD19、抗CD20、抗CD40、抗HLADR及抗CD80。細胞經離心且在FACS緩衝液中洗滌兩次且固定於0.5%多聚甲醛中。在Attune NxT流式細胞儀(Thermo Fisher)上分析細胞，隨後藉由Flowjo 10.7 (Treestar)進行資料分析。藉由對eFluor 780陰性群體閘控排除死細胞。B細胞鑑別為CD19+CD20+細胞且活化標記物之水準藉由中值螢光強度評定。 TNT127 = RL1_hκ N92A + RH2_hIgG1_AAA + S-標籤(分別SEQ ID No: 73及65) TNT130a=TNT127，其中N92A突變與CpG 12070 (DAR1)結合 TNT133a=TNT127，其中N92A突變與CpG 7-6 (DAR1)結合 TNT134a=TNT127，其中N92A突變與CpG 7-7 (DAR1)結合
當抗體TNT127與CpG 7-6、7-7及12070結合時，比較其活性。如圖 31 中所示，如藉由CD40表現所觀測，與CpG 7-6 (SEQ ID NO: 34)及7-7 (SEQ ID NO: 35)之抗體結合物展現與12070 (SEQ ID NO: 3)結合物相比實質上較好的活性。實例 20 ：抗 CD22 抗體 : CpG 寡核苷酸結合物之比較
比較CD22抗體-CpG結合物DAR1及DAR2之活性的活性。在所有所測試情況下，在結合物之較低濃度範圍下，DAR2結合物相較於DAR1結合物顯示較高活性(圖 32A - 32C )。然而，DAR1與7-6及7-7 CpG之結合物顯示更類似於DAR2之較高活性。方法如實例19中所描述。 TNT135b = TNT127，其中N92A突變與CpG 12070 (DAR2)結合 TNT136b = TNT127，其中N92A突變與CpG 7-6 (DAR2)結合 TNT137b = TNT127，其中N92A突變與CpG 7-7 (DAR2)結合 TNT130a = TNT127，其中N92A突變與CpG 12070 (DAR1)結合 TNT133a = TNT127，其中N92A突變與CpG 7-6 (DAR1)結合 TNT134a = TNT127，其中N92A突變與CpG 7-7 (DAR1)結合實例 21 ： 在活性 Fc 域不存在下 ， 抗 CD22 抗體 : CpG 寡核苷酸結合物介導腫瘤殺死
使用小鼠IgG1 N297A Fc，在腫瘤攜帶同基因型模型中使用包含無活性Fc之抗CD22 CpG寡核苷酸測試免疫細胞介導之抗腫瘤反應。在37℃及5% CO2下，將CT26小鼠結腸癌細胞(ATCC)培養在完全RPMI 1640 (RPMI1640 + 10% FBS (Gibco))中。一旦細胞匯合80%，細胞用胰蛋白酶0.25% (Gibco)剝離且用RPMI 1640 (Gibco)洗滌兩次。細胞以20E6/mL再懸浮於RPMI 1640中且保持在冰上直至使用。將100 µL懸浮細胞皮下植入6週齡雌性BALB/c小鼠(查爾斯河)之右側腹。在植入7天後開始直至研究持續時間，大致27天後，用測徑規一週量測腫瘤尺寸且記錄兩次。腫瘤體積使用下式估算：(長度×寬度×寬度)/2。一旦腫瘤達至120或250 mm3，大致植入後7天，根據腫瘤尺寸對小鼠進行隨機分組且開始處理。以10 mg/kg，每3天靜脈內投與結合物1至3次劑量。根據IACUC批准動物方案，在研究期間對任何時間腫瘤超出2,000 mm3 或呈現出任何痛苦跡象之小鼠進行人道殺死。
如圖 33 中所示，抗腫瘤活性在所有給藥方案下觀測到，在抗CD22-4523結合物(非活性Fc)每3天以10 mg/kg靜脈內投與1-3次劑量時具有最有效抗腫瘤活性。實例 22 ： TLR9 藉由抗 CD22 抗體 : CpG 寡核苷酸結合物之活化
對於CpG-寡核苷酸及抗體-CpG寡核苷酸結合物之生物學評估，Trima殘基自Vitalant接收且用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS，Gibco)以1:2稀釋。將稀釋血液分入兩個試管中且緩緩注入15 mL菲科爾-帕克(GE Healthcare)。使試管在400×g下離心30分鐘。自界面收集PBMC，於FACS緩衝液(具有0.5%牛血清白蛋白之PBS (Gibco))中再懸浮且洗滌。在一次洗滌之後，將PBMC再懸浮於完全RPMI(RPMI + 10% FBS)中。緊接著將PBMC塗鋪於完全RPMI中之96孔格式(500 K/孔)上。在37℃下在5% CO2下，將五倍連續稀釋液自1 µM至64 pM之CpG聚核苷酸或100 nM至6.4 pM之結合抗體添加至細胞中18小時。藉由在400×g下離心五分鐘使細胞集結，且在4℃下在以1:4000稀釋於PBS中之Fixable Viability Dye eFluor 780 (Thermo Fisher)中染色。細胞在FACS緩衝液中在4℃下離心且染色30分鐘，該緩衝液含有FcR阻斷試劑(Miltenyi Biotec)、抗CD19、抗CD20、抗CD40、抗HLADR、抗CD80、抗CD86、抗CD3、抗CD14、抗CD11c、抗CD69及抗CD56。細胞經離心且在FACS緩衝液中洗滌兩次且固定於0.5%多聚甲醛中。在Attune NxT流式細胞儀(Thermo Fisher)上分析細胞，隨後藉由Flowjo 10.7 (Treestar)進行資料分析。藉由用eFluor 780陰性群體閘控排除死細胞。B細胞鑑別為CD19+CD20+細胞，T細胞鑑別為CD3+CD56-，DC鑑別為CD11chiHLADR+，且單核球鑑別為CD14+，且活化標記物含量藉由中值螢光強度評定。 TNT138a=具有與化合物7.7b (7-7) CpG結合之RH2 VH域及RL1 N92S VL域(分別為SEQ ID NO: 65及87)的抗CD22抗體(SEQ ID NO: 35)
藉由觀測CD40、CD80及CD69表現，比較CpG (7-7b；SEQ ID NO: 35)、CD22抗體(未結合)及CD22抗體-CpG結合物(TNT138a，如上文所述)用於TLR9陽性及TLR9陰性免疫細胞兩者中之TLR9活化。CD22-CpG結合物活化TLR9陽性/CD22陽性B細胞，而CpG單獨不能活化此等細胞，但在較高濃度寡核苷酸下除外(圖 34A )。CD22-CpG結合物不活化缺乏由結合物靶向之CD22的TLR9陽性細胞，展現使用RFB4抗體及結合物將CpG寡核苷酸活化功能遞送至僅具有CD22標靶之細胞的特異性(圖 34B - 34D )。未結合之CD22在任何TLR9陽性免疫細胞中未呈現出活化。CpG、抗體及結合物不活化TLR9陰性免疫細胞，如T細胞中CD69之活化缺乏所展現。實例 23 ：抗 Her2 抗體 : CpG 寡核苷酸結合物之生物學評估 物質及方法
使用來源於Balbc同基因型小鼠(完整免疫系統)或來源於NODSCID免疫功能不全小鼠(無B、T、功能異常DC、NK) (兩者均來自(查爾斯河))之脾臟的脾細胞產生小鼠脾臟共培養物，各培養物在人類乳房腫瘤細胞株SKBR3 (Her2+++) (ATCC)存在下分開培養。共培養物與CpG結合物或對照物一起培育。如下評定藉由觀測單核球、巨噬細胞及樹突狀細胞之活化對共培養分析中之CpG-核苷酸及抗體-CpG結合物的生物學評估。
SKBR3與TryplE (Thermo Scientific)非酶促剝離且以1E6/mL再懸浮於PBS (Gibco)中。在37℃下添加300 nM羧基螢光素丁二醯亞胺基酯(Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester，CFSE (Thermo Scientific))持續20分鐘。藉由用完全RPMI (RPMI1640 + 10%胎牛血清(Gibco))洗滌自細胞移除過量染料。CFSE標記之SKBR3細胞緊接著以96孔格式(100k/孔)接種在完全RPMI中。
自小鼠收集新鮮脾臟且使用3 mL推桿(Falcon)之橡膠末端，使其通過70 µm過濾器(Fisher Scientific)進入50 mL試管(Falcon)中。將經分離脾臟再懸浮於15 mL FAC緩衝液(PBS+0.5%牛血清白蛋白(Gibco)中且以400×g離心10分鐘。藉由添加1 mL ACK溶解緩衝液(Gibco) 2分鐘自脾細胞移除紅血球，隨後與15 mL FAC緩衝液中和。細胞在400×g下離心10分鐘且經由新的70 µM過濾器繼代。脾細胞再懸浮於完全RPMI中且立即與CFSE標記之SKBR3細胞以10:1比率塗鋪(1E6/孔)。
在37℃下在5% CO2下將五倍連續稀釋液自100 nM至6.4 pM抗體及結合抗體及1 μM至64 pM CpG聚核苷酸添加至細胞中48小時。藉由在400×g下離心五分鐘使細胞集結，且在4℃下在以1:4000稀釋於PBS中之Fixable Viability Dye eFluor 780 (Thermo Fisher)中染色30分鐘。將細胞在FACS緩衝液中在室溫下離心且用FcR阻斷試劑(Biolegend)染色5分鐘，且隨後在4℃下額外染色40分鐘，該試劑含有抗CD45、抗CD49b、抗CD3、抗B220、抗CD11b、抗MHCII、抗CD86、抗CD40、抗GR1、抗F480及抗CD11c。細胞經離心且在FACS緩衝液中洗滌兩次且固定於0.5%多聚甲醛中。在Attune NxT流式細胞儀(Thermo Fisher)上分析細胞，隨後藉由Flowjo 10.7 (Treestar)進行資料分析。藉由對eFluor 780陰性群體閘控排除死細胞。在閘控CD11b+GR1midF480+ 細胞以鑑別單核細胞巨噬細胞及F480-CD11c+MHCII+細胞以鑑別DC細胞之前，首先排除譜系特異性細胞(CD3、B220、CD49b)。 在mIgG1或mIgG2a Fc域之上下文中測試未結合或與4523鼠類CpG寡核苷酸(SEQ ID NO: 121)結合的抗huHer2抗體(SEQ ID No: 126-128)。結果
此共培養模型提供所測試CpG結合物在較寬免疫調節系統存在下之活性的評定。結果展示，使用來自BALBc小鼠之脾細胞，與具有mIgG1 Fc域之CpG結合物相比，具有mIgG2a Fc域之CpG結合物在更大程度上活化單核球、巨噬細胞及樹突狀細胞(圖 35A 及 35B )。實例 24 ： 評估免疫檢查點抑制劑難治性模型中之 CD22 Ab - CpG 結合物
在37℃及5% CO2下，在完全RPMI 1640 (RPMI1640 + 10% FBS (Gibco))中培養EMT6小鼠乳房癌細胞(ATCC)。細胞用胰蛋白酶0.25% (Gibco)剝離且用RPMI 1640 (Gibco)洗滌兩次。細胞以20E6/mL再懸浮於RPMI 1640中且保持在冰上直至使用。將100 µL懸浮細胞皮下植入6週齡雌性BALB/c小鼠(查爾斯河)之右側腹。在植入3天後開始直至研究持續時間，大致35天後，用測徑規一週量測腫瘤尺寸且記錄兩次。腫瘤體積使用下式計算：(長度×寬度×寬度)/2。一旦腫瘤達至平均75 mm3 ，則植入後大致3天，根據腫瘤尺寸對小鼠進行隨機分組且開始處理。在此研究中，小鼠用TNT50a，即與DAR1組態之小鼠CpG 4523 (SEQ ID NO: 121)結合的抗小鼠CD22抗體(SEQ ID NO: 124及SEQ ID NO: 125)處理。以10 mg/kg，每3、5或7天腹膜內投與2次劑量之TNT50a結合物。根據IACUC批准動物方案，在研究期間任何時間腫瘤超出2,000 mm3 或呈現出任何痛苦跡象之小鼠進行人道處死。
如圖 36 中所示，TNT50a在所有三種給藥方案中顯示抗腫瘤功效。EMT6乳房模型一般難以用抗PD1及抗PD-L1治療來治療。因此，資料展示，抗CD22 Ab-CpG結合物在檢查點抑制劑難治性模型中展示出強效單一藥劑活性。實例 25 ：瘤內投與
在37℃及5% CO2下，在完全RPMI 1640 (RPMI1640 + 10% FBS (Gibco))中培養EMT6小鼠乳房癌細胞(ATCC)。細胞用胰蛋白酶0.25% (Gibco)剝離且用RPMI 1640 (Gibco)洗滌兩次。細胞以20E6/mL再懸浮於RPMI 1640中且保持在冰上直至使用。將100 µL懸浮細胞皮下植入6週齡雌性BALB/c小鼠(查爾斯河)之右側腹。在植入7天後開始直至研究持續時間，大致25天後，用測徑規一週量測腫瘤尺寸且記錄兩次。腫瘤體積使用下式計算：(長度×寬度×寬度)/2。一旦腫瘤達至平均180 mm3 ，則植入後大致7天，根據腫瘤尺寸對小鼠進行隨機分組且開始處理。在此研究中，小鼠用TNT50a，即與DAR1組態之小鼠CpG 4523 (SEQ ID NO: 121)結合的抗小鼠CD22抗體(SEQ ID NO: 124及SEQ ID NO: 125)處理。在24 µM下每3天腫瘤內投與TNT50a結合物2次劑量。根據IACUC批准動物方案，在研究期間任何時間腫瘤超出2,000 mm3 或呈現出任何痛苦跡象之小鼠進行人道處死。
如圖 37 中所示，CD22 Ab-CpG結合物當腫瘤內投與時展示如游離CpG (CpG-4253)之抗腫瘤效能。實例 26 ：免疫表型分型
進行與TNT50a一起投與之多個同基因型模型的免疫表型分型。TNT50a，一種與DAR1組態之小鼠CpG 4523 (SEQ ID NO: 121)結合之抗小鼠CD22抗體(SEQ ID NO: 124及SEQ ID NO: 125)。A20 B細胞淋巴瘤、CT26結腸癌、EMT6小鼠乳癌細胞(ATCC)在37℃及5% CO2下在完全RPMI 1640 (RPMI1640 + 10% FBS (Gibco))中培養。細胞用胰蛋白酶0.25% (Gibco)剝離且用RPMI 1640 (Gibco)洗滌兩次。細胞以20E6/mL再懸浮於RPMI 1640中且保持在冰上直至使用。將100 µL懸浮細胞皮下植入6週齡雌性BALB/c小鼠(查爾斯河)之右側腹。用測徑規量測腫瘤尺寸。腫瘤體積使用下式計算：(長度×寬度×寬度)/2。一旦腫瘤達至平均200-300 mm3 ，小鼠根據腫瘤尺寸隨機分組且開始處理。每3天以10 mg/kg腹膜內投與1或2次劑量之結合物。根據IACUC批准動物方案，在研究期間任何時間腫瘤超出2,000 mm3 或呈現出任何痛苦跡象之小鼠進行人道處死。
最後注射後兩天或三天收集脾臟及腫瘤用於免疫表型。將脾臟在冰冷的PBS中處理成單細胞懸浮液，用ACK溶解緩衝液(Gibco)溶解，洗滌兩次且再懸浮於補充有2% FBS之PBS中。使用膠原蛋白酶A (Roche)、膠原蛋白酶D (Roche)及DNA酶(Roche)之混合液在37℃下製備腫瘤衍生之單細胞懸浮液45分鐘。細胞計數使用ViCell計數器(Beckman Coulter)進行脾臟及錐蟲藍排除，用血球計進行腫瘤。1-2×106 個細胞之等分試樣用於細胞表面抗原染色或刺激用於細胞介素評定。對於表面染色，細胞用LIVE/DEAD可固定染料(Thermo Fisher)染色，接著小鼠Fc阻斷(Bio- legend)染色，且隨後在4℃下用根據細胞類型特異性抗體組之抗體染色至少30分鐘。使用以下抗體：IgD、CD19、CD95、CD3、CD11b、IL-10、Cd1d、CD5、CD138、CD44、CD4、CD8、CD45、CD62L、IFNg、TNFa、CD25、FOXP3、KI67、CD11c、MHCII、Ly6C、CD64。所有流動抗體均購自Biolegend或Thermofisher。
如圖 38 - 40 中所示，CD22 Ab-CpG結合物促進B細胞分化、Breg減少、T細胞效應功能增加及抑制骨髓細胞之調節。圖 38A - 38D 展示在投與CD22-CpG結合物後，脾臟中B細胞分化之增加及B調節細胞之減少。圖 39A - 39D 展示在投與CD22-CpG結合物後，脾臟中CD4及CD8 T效應細胞之增加及功能。圖 40A - 40D 展示在投與CD22-CpG結合物後腫瘤中B細胞浸潤之增加及抑制微環境之調節。實例 27 ：來源於人類 B 細胞之細胞介素表現之生物學評估
自Vitalant接收Trima殘餘物且用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS，Gibco)以1:2稀釋。將稀釋血液分入兩個試管中且緩緩注入15 mL菲科爾-帕克(GE Healthcare)。使試管在400×g下離心30分鐘。自界面收集PBMC，於FACS緩衝液(具有0.5%牛血清白蛋白之PBS (Gibco))中再懸浮且洗滌。在一次洗滌之後，將PBMC再懸浮於完全RPMI(RPMI + 10% FBS)中。緊接著將PBMC塗鋪於完全RPMI中之96孔格式(1e6/孔)上。在37℃下在5% CO2下將固定連續稀釋液自1 µM至64 pM之CpG聚核苷酸添加至細胞中48小時。藉由在400×g下離心五分鐘使細胞集結，且在4℃下在以1:4000稀釋於PBS中之Fixable Viability Dye eFluor 780 (Thermo Fisher)中染色。細胞在4℃下在FACS緩衝液中離心且染色30分鐘，該緩衝液含有FcR阻斷試劑(Miltenyi Biotec)、抗CD19、抗CD40、抗CD86、抗CD25。細胞經離心且在FACS緩衝液中洗滌兩次。接著使用轉錄因子固定/滲透濃縮物及稀釋劑(eBioscience)處理細胞以用於細胞內染色。
簡言之，藉由將1份固定/滲透濃縮物與3份固定滲透稀釋劑混合來在新鮮固定緩衝液中培育細胞。在4℃下避光培育樣品30-60分鐘。樣品接著在室溫下以600 g離心5分鐘。用1×滲透緩衝液再懸浮離心塊，繼而兩輪洗滌且在室溫下在600 g下離心5分鐘。離心塊再懸浮於100 µL滲透緩衝液中且在室溫下用抗CCL3、抗IL2及抗IL6染色60分鐘。細胞經離心且在FACS緩衝液中洗滌兩次且固定於0.5%多聚甲醛中。在Attune NxT流式細胞儀(Thermo Fisher)上分析細胞，隨後藉由Flowjo 10.7 (Treestar)進行資料分析。藉由對eFluor 780陰性群體閘控排除死細胞。B細胞鑑別為CD19+細胞，活化標記物含量藉由中值螢光強度評定且細胞介素/趨化介素表現評定為CD19+細胞%。在此等實驗中，測試非結合抗人類CD22抗體(SEQ ID NO: 65及SEQ ID NO: 87)、游離CpG (SEQ ID NO: 35、7-7b)及與CpG 7-7 (SEQ ID NO: 35)結合之非人類CD22抗體(SEQ ID NO: 65及SEQ ID NO: 87)。
圖 41A - 41C 展示在人類B細胞中CD22介導之TLR9接合後，B細胞介素及趨化介素之穩固誘導。 實例28：在用抗mCD22-CpG結合物重複給藥後鼠類血清細胞介素含量之生物學評估
在37℃及5% CO2下，將CT26結腸癌細胞(ATCC)培養在完全RPMI 1640 (RPMI1640 + 10% FBS (Gibco))中。細胞用胰蛋白酶0.25% (Gibco)剝離且用RPMI 1640 (Gibco)洗滌兩次。細胞以20E6/mL再懸浮於RPMI 1640中且保持在冰上直至使用。將100 µL懸浮細胞皮下植入6週齡雌性BALB/c小鼠(查爾斯河)之右側腹。當腫瘤達至平均值300 mm3 時，將小鼠隨機分為兩組且腹膜內給與10mg/kg TNT50a、抗mCD22-CpG或PBS兩次，相隔3天。各給藥後八小時，且最後一次給藥後9天抽血至血清微量採血管(BD)中。在離心之後收集血清且儲存在-80℃下使用Isoplexis平台進行細胞介素評估。簡言之，在室溫下將血清樣品以及小鼠CodePlex Seretome晶片(Isoplexis)一起解凍。純一式兩份地將血清樣品加載至晶片室中。裝載校準晶片之後，將Codeplex Secretome晶片負載至Isolight中以用於分析。16種評估之細胞介素及趨化介素之靈敏度範圍係5-5000 pg/mL。此研究中所用之抗mCD22結合物TNT50a為與小鼠CpG 4523 (SEQ ID NO: 121)結合之抗小鼠CD22抗體(SEQ ID NO: 124及SEQ ID NO: 125)。
圖 42A 及 42B 展示用抗mCD22-CpG在重複給小鼠給藥後在邊緣中無明顯積聚情況下之各種細胞介素及趨化介素之穩固誘導。實例 29 ： PD1 無反應者中之腫瘤殺死
在腫瘤攜帶同基因型模型中使用TNT50a測試免疫細胞介導之抗腫瘤反應，該模型為與小鼠CpG 4523 (SEQ ID NO: 121)結合之抗小鼠CD22抗體(SEQ ID NO: 124及SEQ ID NO: 125)。在37℃及5% CO2下，將CT26小鼠結腸癌細胞(ATCC)培養在完全RPMI 1640 (RPMI1640 + 10% FBS (Gibco))中。一旦細胞匯合80%，細胞用胰蛋白酶0.25% (Gibco)剝離且用RPMI 1640 (Gibco)洗滌兩次。細胞以20E6/mL再懸浮於RPMI 1640中且保持在冰上直至使用。將100 µL懸浮細胞皮下植入6週齡雌性BALB/c小鼠(查爾斯河)之右側腹。在植入後5天開始直至研究持續時間，大致30天後，用測徑規一週量測腫瘤尺寸且記錄兩次。腫瘤體積使用下式估算：(長度×寬度×寬度)/2。在腫瘤達至50-200 mm3 後，植入後大約5天，根據腫瘤尺寸隨機分組小鼠且開始用抗PD1 (純系RPMI14 BioXCell)及PBS處理。以10 mg/kg每3天3次劑量及每3天2次劑量分別經口投與抗PD1及PBS (Gibco)。植入後大致11天，量測經抗PD1處理之小鼠且根據腫瘤尺寸再隨機分組。腫瘤自初始尺寸進展且量測大於200 mm3 之小鼠視為抗PD1無反應者。抗PD1無反應者組內之小鼠根據腫瘤尺寸再隨機分組且開始結合物處理。以10 mg/kg，每3天靜脈內投與結合物2次劑量。對於組合及單組對照，藉由每3天以10 mg/kg腹膜內給藥持續2個劑量之抗PD1處理。根據IACUC批准動物方案，在研究期間任何時間腫瘤超出2,000 mm3 或呈現出任何痛苦跡象之小鼠進行人道處死。圖 43 展示用結合物TNT50a處理之小鼠及用結合物TNT50a與抗PD1抗體之組合處理之小鼠中腫瘤體積減少，而用抗PD1抗體處理之小鼠未經歷腫瘤體積之顯著減少。實例 30 ：肺轉移性負荷減少
BALB/C小鼠植入有4T1細胞，在第5天開始當腫瘤為約60 mm3 時，用TNT50a以10 mg/kg每3天3次劑量處理。TNT50a，一種與具有DAR1組態之小鼠CpG 4523 (SEQ ID NO: 121)結合之抗小鼠CD22抗體(SEQ ID NO: 124及SEQ ID NO: 125)。最後注射後8-9天收集肺以進行轉移性節結定量。簡言之，將肺收集於冰冷1×PBS中，切碎成小塊，隨後轉移至由2 mg/mL補充有50 µg/mL DNA酶(Sigma)之膠原蛋白酶類型V (Worthington)組成之消化溶液中，且在底蓋翻轉之37℃保溫箱中培育2小時。將懸浮液轉移至70 µm過濾器中，在1×PBS中洗滌一次，接著轉移至10 mL由補充有10% FBS之RMPI 1640、青黴素-鏈黴素及10 µg/mL 6-硫代鳥嘌呤組成之選擇培養基中。將三至四個1:10連續稀釋液塗鋪於6孔培養盤中或10 cm培養皿中且在37℃、5% CO2下培養10-14天。接著在室溫下將轉移性溶菌斑固定在甲醇中5分鐘，在蒸餾水中復水，接著在室溫下用0.03%亞甲基藍染色5分鐘。隨後捨棄染料，用蒸餾水輕輕地沖洗培養盤且使其風乾，隨後計數溶菌斑。
如圖 44 中所示，相比於對照，CD22 Ab-CpG結合物中之轉移性溶菌斑之數目顯著減少。
可參考結合隨附圖式進行之以下描述理解本申請。
圖 1A 及 1B 基於所觀測到之(a) HLADR及(b) CD40之增加表現，單獨描繪人類PBMC中免疫調節寡核苷酸之活性。
圖 2A - 2D 展示免疫調節聚核苷酸及其抗體結合物對增加B細胞數目及活化之作用。圖 2A 描繪觀測到的各種免疫調節多肽單獨對B細胞數目之作用。圖 2B - 2C 描繪觀測到的由免疫調節聚核苷酸單獨產生之B細胞的活化(經由偵測CD40表現)。圖 2D 描繪觀測到的抗體-寡核苷酸與RFB4 (抗CD22)之結合物的活性(DAR1)。
圖 3 展示轉穀胺醯胺介導之與聚乙二醇連接子(-NH-C(=O)-PEG23 -NH2 )及各種Q標籤之結合及去結合的產率。展示SEQ ID NO: 39-47及49-52。
圖 4A 及圖 4B 展示兩個Q標籤肽之轉穀胺醯胺酶結合過程中結合及不結合隨時間推移之變化百分比(LSLSPGLLQGG，SEQ ID NO:39；及RPQGF，SEQ ID NO:47)。
圖 5A - 5D 描繪RBF4與各種寡核苷酸之結合物的活性，如藉由其B細胞活化所示，如藉由(a) CD40、(b) CD86、(c) HLADR及(d) CD69之表現所評定。
圖 6A - 6D 描繪BDCA2與各種寡核苷酸之結合物的活性，如藉由其pDC活化所示，如藉由(a) CD86、(b) CD40、(c) HLADR或(d) IFN α之表現所評定。
圖 7A - 7D 展示BDCA2與各種寡核苷酸之結合物的活性，如藉由其(a)單核球；(b) mDC；(c) CD19+ B細胞；或(d) CD3+ T細胞之活化所示。
圖 8A 展示小鼠及人類化抗CD22可變重鏈(VH)域序列之比對。CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3描繪於框中。序列對應於SEQ ID No: 56及64-67 (頂部至底部)。
圖 8B 展示小鼠與人類化抗CD22可變輕鏈(VL)域序列之比對。CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3描繪於框中。序列對應於SEQ ID No: 57及68-72 (頂部至底部)。
圖 9 展示如所指示的人類化抗CD22重鏈及輕鏈之各組合之相對表現量。
圖 10A - 10E 展示抗體:CpG結合物之純化。展示使用抗體TNT70純化結合物(圖 10A )、TNT71 (圖 10B )、TNT72 (圖 10C )及TNT74 (圖 10D )來純化結合物。圖 10E 展示如所指示的對呈還原(reduced，r)或非還原(non-reduced，n.r.)形式之起始物質及CpG結合物的分析。
圖 11 展示如所指示的藉由不同濃度之各種人類化抗CD22抗體:CpG結合物之B細胞活化。
圖 12A - 12D 展示所指示的CpG:抗CD22結合物之概況，如藉由尺寸排阻層析法HPLC (HPLC-SEC)所測定。結合物使用RH1 (圖 12A )、RH2 (圖 12B )、RH3 (圖 12C )、及RH4 (圖 12D )VH域進行分組。
圖 13A 概述所指示的CpG:抗CD22結合物之所選特性，包括Expi293或CHO細胞中之表現量、藉由SEC-HPLC之高分子量(high molecular weight，HMW)或單體物種%、VH/VL對、對人類CD22之結合親和力及與食蟹獼猴CD22之結合。圖 13B 展示CHO細胞之所指示CpG:抗CD22結合物之表現量。
圖 14 展示藉由差示掃描熱量測定(differential scanning calorimetry，DSC)對所指示抗體及抗體結合物之熱穩定性進行之分析的結果。
圖 15A 及圖 15B 展示RL1 VL域之N92取代變異體在非還原(圖 15A )或還原(圖 15B )條件下之表現。
圖 15C - 15F 展示抗體之結合動力學，包括RL1 VL域之N92取代變異體與CD22之結合動力學，包括如藉由SPR所測定的KD (圖 15C )、Ka (圖 15D )、Kd (圖 15E )及捕獲量(圖 15F )。
圖 16A - 16E 展示根據一些實施例之例示性結合物之示意圖。經工程改造之Q標籤(RPQGF；SEQ ID NO: 47)與重鏈C端融合的例示性抗體:CpG結合物展示於圖 16A 及圖 16E 中(其中，DAR 1)及圖 16B 中(其中，DAR 2)。天然存在之Q標籤(Q295)經暴露以藉由N297A突變而結合的例示性抗體:CpG結合物展示於圖 16C 中(其中，DAR 1)且在圖 16D 中(其中，DAR 2)。
圖 17A - 17B 描繪CpG-抗體結合物之藥物動力學特性。圖 17A 展示化合物1.1b (SEQ ID NO: 3)、化合物3.2b (SEQ ID NO: 9)、化合物4.2b (SEQ ID NO: 12)、化合物4.3b (SEQ ID NO: 13)、化合物5.2a (SEQ ID NO: 15)或化合物5.7a (SEQ ID NO: 20)與RFB4 (SEQ ID NO: 56及57)之CpG-抗體結合物相比於裸RFB4的半衰期。圖 17B 展示RFB4結合物之半衰期，如藉由使用抗BrdU抗體捕獲CpG之5'區所評估；RFB4與化合物3.2b (SEQ ID NO: 9)、化合物4.2b (SEQ ID NO: 12)、化合物4.3b (SEQ ID NO: 13)、化合物5.2a (SEQ ID NO: 15)及化合物5.7a (SEQ ID NO: 20)之結合物相比於RFB4與化合物1.1b (SEQ ID NO: 3)之結合物增加了半衰期。
圖 18 展示來自食蟹獼猴PBMC之B細胞藉由CpG寡核苷酸之活化，如藉由CD86表現所量測。用化合物7.7b (7-7)處理誘導的CD86上調優於由化合物1.1b (12070)誘導的，表明B細胞活化增強。
圖 19 展示在用抗CD22:CpG寡核苷酸結合物對人類PBMC進行處理之後的IL6誘導。結合於化合物1.1b (12070)之抗CD22誘導之IL6表現未藉由未結合之抗CD22抗體實現。
圖 20A 及圖 20B 展示相比於用未結合之抗SIRP-α處理，T細胞(圖 20A )及B細胞(圖 20B )藉由結合於化合物1.1b (12070)之抗SIRP-α之非靶向活化。
圖 21A - 21C 展示小鼠中之腫瘤免疫再攻擊分析之結果。將MC38細胞以DMEM中每隻小鼠2×106 個細胞之濃度注射至C57BL/6雌性小鼠之右側腹中。監測腫瘤直至腫瘤之平均尺寸達至150-155 mm3 。小鼠以每組5個小鼠隨機分至PBS對照組、抗SIRP-α-4523 CpG或抗mCD22-4523 CpG中。抗SIRP-α-4523及抗mCD22-4523以總計兩次10 mg/kg，相隔三天給藥。兩種藥物均腹膜內投與。在第88天，腫瘤經根除之小鼠用MC38 (左側腹)以DMEM中每隻小鼠2×106 個細胞再攻擊。包括尚未植入MC38小鼠之未處理小鼠(naïve mice)作為腫瘤生長之對照組。用測徑規以二維量測腫瘤，且腫瘤體積計算為：長度×寬度×寬度×0.5，其中長度為兩個量測結果中之較大者。在再攻擊之後，先前經根除之小鼠早在腫瘤再植入後三天展示有效腫瘤排斥反應，表明用結合於4523 CpG的抗SIRP-α (圖 21B )及抗mCD22 (圖 21C )兩者處理引起針對植入腫瘤的穩固免疫記憶反應，其未在首次遭遇MC38腫瘤之未處理小鼠中發現(圖 21A )。
圖 22A - 22D 展示活性Fc區(圖 22A 及 22C )相比於較少活性Fc區(圖 22B 及 22D )對於用抗HER2:CpG寡核苷酸結合物靶向腫瘤而言係優良的。m/h Her2表現MC38細胞係藉由慢病毒轉導產生且分選以獲得表現m/h Her2之細胞。將m/h Her2-MC38細胞以DMEM中每隻小鼠2×106 個細胞之濃度注射至C57BL/6雌性小鼠之右側腹中。監測腫瘤直至腫瘤之平均尺寸達至70 mm3 為止。將小鼠隨機分至PBS對照、TNT149a阻斷(抗Her2 mIgG2a)及TNT150a (抗Her2 mIgG1)，每組5隻小鼠。經抗Her2-CpG核苷酸結合物處理之小鼠用1、3及10 mg/kg總計三次，相隔三天(圖 22A 及 22B )給藥。兩種藥物均腹膜內投與。箭頭指示投與。截至第60天，相隔三天給藥三次的經1、3及10 mg/kg TNT149a處理之小鼠展示腫瘤根除(分別1/5、5/5及5/5小鼠；圖 22C )，而用1、3及10 mg/kg TNT150a處理之小鼠展示腫瘤經根除之小鼠的數目較低(分別為0/5、3/5及5/5；圖 22D )。用PBS對照處理之小鼠直至第24天實現指標，且用TNT149a或TNT150a處理之所有組相比於PBS對照展示延遲的腫瘤生長。
圖 23A - 23I 展示MC38 m/h Her2小鼠免疫再攻擊分析之結果。圖 23A 展示分析之圖式。在第81天，用m/h Her2 MC38 (右下側腹)、親本MC38 (左下側腹)、m/h Her2 B16F10 (右上側腹)及母B16F10 (左上側腹)以DMEM中每隻小鼠2×106 個細胞(m/h Her2 MC38及MC38細胞)及1×106 個細胞(m/h Her2 B16F10及B16F10細胞)再攻擊腫瘤經根除之小鼠。在第81天，對於用10 mg/kg TNT150a、3及10 mg/kg TNT149a處理之組，存在5隻腫瘤經根除之小鼠，對於用3 mg/kg TNT150a處理之組，存在3隻腫瘤經根除之小鼠。未處理小鼠展示所有植入細胞之生長。m/h Her2 B16F10、MC38及m/h Her2 MC38展示相比於未處理小鼠，腫瘤經根除或腫瘤生長顯著延遲。在所有組中，母B16F10腫瘤生長，其中一隻小鼠在10 mg/kg mIgG2a組中展示無生長。截至第99天，所有小鼠用m/h Her2 MC38細胞均展示完全根除。除對於先前用TNT149a處理MC38母細胞之3及10 mg/kg小鼠的一隻小鼠及所有先前經3及10 mg/kg處理之組的1-3隻小鼠以外，MC38母細胞與m/h Her2 B16F10細胞兩者均展示腫瘤根除。此等資料展示，在用抗Her2 mIgG1及mIgG2a處理之後腫瘤經根除之m/h Her2 MC38攜帶小鼠對m/h Her2 MC38、親本MC38及m/h B16F10但不對親本B16F10腫瘤具有強效且持久的抗腫瘤反應。圖 23B - 23I 分別展示再攻擊組B16F10、MC38、m/h Her2 B6F10及m/h Her2 MC38腫瘤中個別小鼠之結果。
圖 24A - 24C 展示在IP投與抗mCD22:CpG寡核苷酸結合物之後8小時內的NanoString基因表現分析之結果。用nSolver及nCounter高級分析軟體分析腫瘤之正規化表現資料以獲得如由NanoString定義之基因表現特徵。相比於單獨的PBS對照物及抗mCD22，用抗mCD22 CpG處理之CT26攜帶小鼠展示腫瘤中干擾素信號傳導(圖 24A )、抗原呈現(圖 24B )及細胞毒性(圖 24C )之較高特徵分數。
圖 25 展示在具有活性或非活性Fc區之抗Her2:CpG結合物存在下，與Her2陽性或Her2陰性腫瘤細胞共培養鼠類骨髓來源之巨噬細胞的結果。
圖 26A - 26C 展示相比於裸CpG，藉由抗CD22:CpG寡核苷酸結合物誘導人類PBMC中之B細胞活化。展示CD40 (圖 26A )、CD80 (圖 26B )及CD86 (圖 26C )在用與化合物7.7b (7-7) CpG、TNT52a (RFB4與12070結合)、化合物7.7b (7-7) CpG、12070 CpG或僅培養基結合的具有RH2 VH域及RL1 N92S VL域(分別為SEQ ID No: 65及87)的抗CD22抗體處理人類PBMC之後的表現。
圖 27 展示人類PBMC上所指示游離CpG寡核苷酸之活性，如藉由CD19+ B細胞上之CD40表現所分析。
圖 28 展示人類PBMC上所指示之游離CpG寡核苷酸之活性，如藉由Ramos NFkb報導基因分析所分析。
圖 29A - 29C 展示來自三種不同供體株(D559、D804及D643)之人類PBMC上所指示游離CpG寡核苷酸之活性，如藉由CD40表現所觀測。
圖 30 展示人類PBMC上所指示游離CpG寡核苷酸之活性，如藉由CD19+ B細胞上之CD40表現所分析。
圖 31 展示人類PBMC上CpG:抗體結合物之活性，如藉由CD19+ B細胞上之CD40表現所分析。
圖 32A - 32C 展示人類PBMC上所指示抗CD22抗體:CpG寡核苷酸結合物之活性，如藉由CD19+ B細胞上之CD40表現所分析。
圖 33 展示與PBS相比，在用具有「死亡」Fc域的抗CD22抗體:CpG寡核苷酸結合物以所指示給藥次數處理之後隨時間推移的腫瘤體積。利用使用CT26小鼠結腸癌細胞之腫瘤攜帶同基因型模型。以10 mg/kg，每3天靜脈內投與結合物1至3次劑量。
圖 34A - 34D 展示用未結合之CpG寡核苷酸、未結合之抗CD22抗體或抗CD22抗體:CpG寡核苷酸結合物處理對不同類型之免疫細胞的作用。使用CD40活化標記物分析對B細胞之影響(圖 34A )，使用CD80活化標記物分析對樹突狀細胞之作用(圖 34B )，使用CD86活化標記物分析對CD14+骨髓細胞之影響(圖 34C )，且使用CD69活化標記物分析對T細胞之影響(圖 34D )。
圖 35A 及 35B 展示在用具有mIgG1或mIgG2a Fc域、與小鼠CpG寡核苷酸未結合或結合的抗huHer2抗體處理之後的單核球、巨噬細胞及樹突狀細胞之活化。圖 35A 展示來自Balbc同基因型小鼠(完整免疫系統)之脾細胞在人類乳房腫瘤細胞株SKBR3 (Her2+++)存在下的共培養，對單核球/巨噬細胞(Lin-CD11b+、F480+、GR1mid)進行閘控，且分析CD40表現。圖 35B 展示來自Balbc同基因型小鼠(完整免疫系統)之脾細胞在人類乳房腫瘤細胞株SKBR3 (Her2+++)存在下的共培養，對樹突狀細胞(lin-、F480-、CD11c+、MHCII+)進行閘控，且分析CD40表現。
圖 36 展示在EMT6乳癌模型中根據3個給藥方案與CpG寡核苷酸結合之抗CD22抗體之抗腫瘤功效，該模型通常難以用抗PD1/PD-L1治療。
圖 37 展示當腫瘤內投與時，在EMT6乳癌模型中與CpG寡核苷酸或游離CpG寡核苷酸結合之抗CD22抗體的抗腫瘤功效。
圖 38A - 38D 展示在投與抗CD22 Ab-CpG結合物後，脾中B細胞分化增加且B調控細胞減少。
圖 39A - 39D 展示在投與抗CD22 Ab-CpG結合物後，脾中CD4及CD8 T效應細胞及功能增加。
圖 40A - 40D 展示在投與抗CD22 Ab-CpG結合物後腫瘤中B細胞浸潤之增加及抑制微環境之調節。
圖 41A - 41C 展示在人類B細胞中CD22介導之TLR9接合後，細胞介素及趨化介素之穩固誘導。
圖 42A 及 42B 展示用抗mCD22-CpG在重複給小鼠給藥後在邊緣中無明顯積聚情況下之各種細胞介素及趨化介素(如所指示)之穩固誘導。
圖 43 展示CT26同基因型小鼠組中之抗腫瘤反應，該等小鼠為對抗PD1抗體處理之無反應者。使用結合於小鼠CpG 4523 (SEQ ID NO: 121)之抗小鼠CD22抗體(SEQ ID NO: 124及SEQ ID NO: 125)進行治療。用結合物或結合物與抗PD1抗體之組合處理之小鼠的腫瘤體積減小，而僅用抗PD1抗體處理之相應小鼠未經歷腫瘤體積之顯著減小。
圖 44 展示用與小鼠CpG 4523 (SEQ ID NO: 121)結合之抗小鼠CD22抗體(SEQ ID NO: 124及SEQ ID NO: 125)處理之作用，其中在植入有4T1細胞之BALB/C小鼠中具有DAR1組態。相比於對照，CD22 Ab-CpG結合物中之轉移性溶菌斑之數目顯著減少。
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Figure 12_A0101_SEQ_0099
Figure 12_A0101_SEQ_0100

Claims (287)

  1. 一種結合物，其包含抗體或其抗原結合片段及一或多種免疫調節寡核苷酸(P)，其中該抗體或抗原結合片段連接於一或多個包含至少一個穀胺醯胺殘基之Q標籤肽(Q)，且其中各免疫調節寡核苷酸經由與Q標籤肽之該穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接於該Q標籤肽，如式(A)中所示：
    Figure 03_image764
    ； 其中
    Figure 03_image003
    指示各Q與該抗體或其抗原結合片段(Ab)之連接點； 其中各P獨立地為具有以下結構之免疫調節寡核苷酸：
    Figure 03_image767
    ， 其中
    Figure 03_image011
    及
    Figure 03_image413
    指示該寡核苷酸內之連接點，且其中
    Figure 03_image191
    指示與該連接子L之連接點； 各T1 獨立地為O或S； 各T2 為S- ； T3 為基團
    Figure 03_image772
    ，其中
    Figure 03_image191
    指示與L之連接點且其中
    Figure 03_image367
    指示與該寡核苷酸之其餘部分的連接點； Z為O或S； U5 ' 為-H或鹵素； R5 ' 為-H或甲氧基； Rc1 為-H或甲氧基； Rg1 、Rg2 、Rg3 及Rg4 為H； R3 ' 為甲氧基； R1 為-(CH2 )3 -OH； R2 為-H或甲基；及 n為0至2之整數。
  2. 如請求項1之結合物，其中該抗體或其片段為單株抗體或其片段。
  3. 如請求項1或請求項2之結合物，其中該抗體或其片段為Fab、F(ab')2、Fab'-SH、Fv、scFv、單域、單重鏈或單輕鏈抗體或抗體片段。
  4. 如請求項1至3中任一項之結合物，其中該抗體或其片段為人類化、人類或嵌合抗體或其片段。
  5. 如請求項1至4中任一項之結合物，其中該抗體或其片段特異性結合人類CD22。
  6. 如請求項1至5中任一項之結合物，其中該抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中： (a)該VH域包含來自選自由SEQ ID NO: 64-67組成之群的VH域序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3序列； (b)該VH域包括包含SEQ ID NO: 113之序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO: 115之序列的CDR-H2及包含SEQ ID NO: 116之序列的CDR-H3；或 (c)該VH域包括包含SEQ ID NO: 114之序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO: 189之序列的CDR-H2及包含SEQ ID NO: 116之序列的CDR-H3。
  7. 如請求項1至6中任一項之結合物，其中該抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，且其中該VH域包含選自由SEQ ID NO: 64-67組成之群的胺基酸序列。
  8. 如請求項1至7中任一項之結合物，其中該抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中： (a)該VL域包含來自選自由SEQ ID NO: 68-91組成之群的VL域序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3序列； (b)該VL域包括包含SEQ ID NO: 117之序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO: 119之序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO: 120之序列的CDR-L3；或 (c)該VL域包括包含SEQ ID NO: 118之序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO: 177之序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO: 120之序列的CDR-L3。
  9. 如請求項8之結合物，其中該VL域進一步包含殘基N92 (自該VL域序列之N端開始編號)處之胺基酸取代。
  10. 如請求項9之結合物，其中該VL域包含選自由N92A、N92L及N92S組成之群的胺基酸取代。
  11. 如請求項1至7中任一項之結合物，其中該抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，且其中該VL域包含選自由SEQ ID NO: 68-91組成之群的胺基酸序列。
  12. 如請求項1至7中任一項之結合物，其中該抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中該VH域包含胺基酸序列QVQLLESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFAFSIYDMNWVRQAPGKGLEWVSAISSGGGTTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 65)，且其中該VL域包含胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGNTLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 68)。
  13. 如請求項1至7中任一項之結合物，其中該抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中該VH域包含胺基酸序列QVQLLESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFAFSIYDMNWVRQAPGKGLEWVSAISSGGGTTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 65)，且其中該VL域包含胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGATLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 73)。
  14. 如請求項1至7中任一項之結合物，其中該抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中該VH域包括包含SEQ ID NO: 113之序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO: 115之序列的CDR-H2及包含SEQ ID NO: 116之序列的CDR-H3；且該VL域包括包含SEQ ID NO: 117之序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO: 119之序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO: 120之序列的CDR-L3。
  15. 如請求項1至7中任一項之結合物，其中該抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中該VH域包含胺基酸序列QVQLLESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFAFSIYDMNWVRQAPGKGLEWVSAISSGGGTTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 65)，且其中該VL域包含胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGSTLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 87)。
  16. 如請求項1至4中任一項之結合物，其中該抗體或其片段特異性結合人類Her2。
  17. 如請求項16之結合物，其中該抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，且其中該VH域包含來自VH域序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:168)的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3序列。
  18. 如請求項17之結合物，其中該VH域包含序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:168)。
  19. 如請求項17或請求項18之結合物，其中該抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，且其中該VL域包含來自VL域序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:169)的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3序列。
  20. 如請求項19之結合物，其中該VL域包含序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:169)。
  21. 如請求項16之結合物，其中該抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，且其中該VH域包含來自VH域序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:170)的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3序列。
  22. 如請求項21之結合物，其中該VH域包含序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:170)。
  23. 如請求項21或請求項22之結合物，其中該抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，且其中該VL域包含來自VL域序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:171)的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3序列。
  24. 如請求項21至23中任一項之結合物，其中該VL域包含序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:171)。
  25. 如請求項1至24中任一項之結合物，其中該抗體包含Fc區。
  26. 如請求項25之結合物，其中該Fc區為選自由以下組成之群的人類Fc區：IgG1 Fc區、IgG2 Fc區及IgG4 Fc區。
  27. 如請求項26之結合物，其中該Fc區為野生型人類IgG1、IgG2或IgG4 Fc區。
  28. 如請求項26之結合物，其中該Fc區為包含一或多個減少與C1q的結合之胺基酸取代的人類Fc區。
  29. 如請求項26之結合物，其中該Fc區為包含一或多個胺基酸取代之人類Fc區，其使得效應功能比缺乏該(等)胺基酸取代之人類Fc區降低。
  30. 如請求項26之結合物，其中該Fc區為： (a)包含L234A、L235A及/或G237A取代的人類IgG1 Fc區，胺基酸位置係根據EU索引編號； (b)包含A330S及/或P331S取代之人類IgG2 Fc區，胺基酸位置係根據EU索引編號；或 (c)包含S228P及/或L235E取代的人類IgG4 Fc區，胺基酸位置係根據EU索引編號。
  31. 如請求項25、26及28至30中任一項之結合物，其中該Fc區進一步包含N297A取代，胺基酸位置係根據EU索引編號。
  32. 如請求項31之結合物，其中該結合物進一步包含如下式
    Figure 03_image776
    中所示連接於Fc區殘基之Q295的免疫調節寡核苷酸P，其中L為經由醯胺鍵連接於該Fc區之Q295的連接子部分。
  33. 如請求項26及28至32中任一項之結合物，其中該Fc區進一步包含D265A取代，胺基酸位置係根據EU索引編號。
  34. 如請求項1至24中任一項之結合物，其中該抗體包含抗體重鏈恆定域，其包含選自由SEQ ID No: 92-107及178組成之群的胺基酸序列。
  35. 如請求項1至34中任一項之結合物，其中該抗體包含人類λ輕鏈。
  36. 如請求項1至34中任一項之結合物，其中該抗體包含人類κ輕鏈。
  37. 如請求項1至34中任一項之結合物，其中該抗體包含抗體輕鏈恆定域，其包含選自由SEQ ID NO: 108-110組成之群的胺基酸序列。
  38. 如請求項1至37中任一項之結合物，其中該抗體包含兩條抗體重鏈及兩條抗體輕鏈，且其中一個Q標籤連接於該抗體之一條或兩條重鏈。
  39. 如請求項38之結合物，其中該Q標籤與該(等)抗體之重鏈之C端融合。
  40. 如請求項1至37中任一項之結合物，其中該抗體包含兩條抗體重鏈及兩條抗體輕鏈，且其中一個Q標籤連接於該抗體之一條或兩條輕鏈。
  41. 如請求項38之結合物，其中該Q標籤在該Fc域內。
  42. 如請求項1至15及25至41中任一項之結合物，其中該結合物結合於表現於B細胞之表面上的人類CD22。
  43. 如請求項1至42中任一項之結合物，其中該結合物誘發TLR9之活化。
  44. 如請求項1至43中任一項之結合物，其中各Q標籤獨立地包含具有5與15個之間的胺基酸殘基的肽序列。
  45. 如請求項1至44中任一項之結合物，其中該Q標籤為天然存在的。
  46. 如請求項1至42中任一項之結合物，其中各Q標籤之該肽序列獨立地選自由SEQ ID NO : 39 - 55 組成之群。
  47. 如請求項1至42中任一項之結合物，其中該Q標籤包含肽序列RPQGF (SEQ ID NO: 47)。
  48. 如請求項1至47中任一項之結合物，其中各Q標籤獨立地包含RPQGF (SEQ ID NO: 47)、RPQGFPP (SEQ ID NO: 48)或RPQGFGPP (SEQ ID NO: 49)。
  49. 如請求項1至48中任一項之結合物，其中1或2個Q標籤連接於該抗體或抗原結合片段。
  50. 如請求項1至49中任一項之結合物，其中該結合物之DAR為1或2。
  51. 如請求項1至50中任一項之結合物，其中該連接子L包含聚乙二醇部分。
  52. 如請求項1至51中任一項之結合物，其中該連接子L為：
    Figure 03_image778
    ， 其中m為介於約0至約50範圍內之整數，且其中
    Figure 03_image191
    指示與T3 之連接點，且
    Figure 03_image224
    指示與該結合物之其餘部分的連接點。
  53. 如請求項1至52中任一項之結合物，其中Z為S。
  54. 如請求項1至53中任一項之結合物，其中該寡核苷酸P包含至少一對成對T1 及T2 ，其中T1 為S且T2 為S- 。
  55. 如請求項54之結合物，其中該至少一對其中T1 為S且T2 為S的成對T1 及T2 位於核苷殘基1之3'位置。
  56. 如請求項54之結合物，其中該至少一對其中T1 為S且T2 為S的成對T1 及T2 位於核苷殘基2之3'位置。
  57. 如請求項54之結合物，其中該至少一對其中T1 為S且T2 為S的成對T1 及T2 位於核苷殘基3之3'位置。
  58. 如請求項54之結合物，其中該至少一對其中T1 為S且T2 為S的成對T1 及T2 位於核苷殘基5之3'位置。
  59. 如請求項54之結合物，其中該至少一對其中T1 為S且T2 為S的成對T1 及T2 位於核苷殘基6之3'位置。
  60. 如請求項54之結合物，其中該至少一對其中T1 為S且T2 為S的成對T1 及T2 位於核苷殘基7之3'位置。
  61. 如請求項54之結合物，其中該至少一對其中T1 為S且T2 為S的成對T1 及T2 位於核苷殘基8之3'位置。
  62. 如請求項54之結合物，其中該至少一對其中T1 為S且T2 為S的成對T1 及T2 位於核苷殘基9之3'位置。
  63. 如請求項54之結合物，其中該至少一對其中T1 為S且T2 為S的成對T1 及T2 位於核苷殘基10之3'位置。
  64. 如請求項54之結合物，其中該至少一對其中T1 為S且T2 為S的成對T1 及T2 位於核苷殘基11之3'位置。
  65. 如請求項54之結合物，其中該至少一對其中T1 為S且T2 為S的成對T1 及T2 位於核苷殘基12之3'位置。
  66. 如請求項54之結合物，其中該至少一對其中T1 為S且T2 為S的成對T1 及T2 位於核苷殘基13之3'位置。
  67. 如請求項54之結合物，其中該至少一對其中T1 為S且T2 為S的成對T1 及T2 位於核苷殘基14之3'位置。
  68. 如請求項54之結合物，其中該至少一對其中T1 為S且T2 為S的成對T1 及T2 位於核苷殘基15之3'位置。
  69. 如請求項1至68中任一項之結合物，其中該寡核苷酸P包含至少兩對成對T1 及T2 ，其中T1 為S且T2 為S- 。
  70. 如請求項1至69中任一項之結合物，其中R5 '為H。
  71. 如請求項1至69中任一項之結合物，其中R5 '為甲氧基。
  72. 如請求項1至71中任一項之結合物，其中Rc1 為H。
  73. 如請求項1至71中任一項之結合物，其中Rc1 為甲氧基。
  74. 如請求項1至73中任一項之結合物，其中R2 為甲基。
  75. 如請求項1至73中任一項之結合物，其中R2 為H。
  76. 如請求項1至75中任一項之結合物，其中m為20至25之整數。
  77. 如請求項76之結合物，其中m為24。
  78. 如請求項1至77中任一項之結合物，其中U5 ' 為溴基。
  79. 如請求項1至77中任一項之結合物，其中U5 ' 為-H。
  80. 如請求項1至53中任一項之結合物，其中各P獨立地包含選自 表 10 之寡核苷酸。
  81. 一種結合物，其包含抗體或其抗原結合片段(Ab)及一或多種免疫調節寡核苷酸(P)， 其中該抗體或抗原結合片段連接於一或多個包含胺基酸序列RPQGF (SEQ ID NO: 47)之Q標籤肽(Q)， 且其中各免疫調節寡核苷酸(P)經由與Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接於該Q標籤肽，如式(A)中所示：
    Figure 03_image782
    ， 其中
    Figure 03_image003
    指示各Q與該抗體或其抗原結合片段(Ab)之連接點。
  82. 如請求項81之結合物，其中該抗體包含兩條重鏈及兩條輕鏈，其中該抗體之各重鏈連接於Q標籤肽，且其中該等Q標籤肽中之一或二者連接於免疫調節寡核苷酸P。
  83. 如請求項81之結合物，其中該抗體或其片段為單株抗體或其片段。
  84. 如請求項81至83中任一項之結合物，其中該抗體或其片段為Fab、F(ab')2、Fab'-SH、Fv、scFv、單域、單重鏈或單輕鏈抗體或抗體片段。
  85. 如請求項81至84中任一項之結合物，其中該抗體或其片段為人類化、人類或嵌合抗體或其片段。
  86. 如請求項81至85中任一項之結合物，其中該抗體或其片段特異性結合人類CD22。
  87. 如請求項86之結合物，其中該抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中： (a)該VH域包含來自選自由SEQ ID NO: 64-67組成之群的VH域序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3序列； (b)該VH域包括包含SEQ ID NO: 113之序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO: 115之序列的CDR-H2及包含SEQ ID NO: 116之序列的CDR-H3；或 (c)該VH域包括包含SEQ ID NO: 114之序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO: 189之序列的CDR-H2及包含SEQ ID NO: 116之序列的CDR-H3。
  88. 如請求項86或請求項87之結合物，該抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，且其中該VH域包含選自由SEQ ID NO: 64-67組成之群的胺基酸序列。
  89. 如請求項81至88中任一項之結合物，其中該抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，且其中： (a)該VL域包含來自選自由SEQ ID NO: 68-91組成之群的VL域序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3序列； (b)該VL域包括包含SEQ ID NO: 117之序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO: 119之序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO: 120之序列的CDR-L3；或 (c)該VL域包括包含SEQ ID NO: 118之序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO: 177之序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO: 120之序列的CDR-L3。
  90. 如請求項89之結合物，其中該VL域進一步包含殘基N92 (自該VL域序列之N端開始編號)處之胺基酸取代。
  91. 如請求項90之結合物，其中該VL域包含選自由N92A、N92L及N92S組成之群的胺基酸取代。
  92. 如請求項81至88中任一項之結合物，其中該抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，且其中該VL域包含選自由SEQ ID NO: 68-91組成之群的胺基酸序列。
  93. 如請求項86之結合物，其中該抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中該VH域包含胺基酸序列QVQLLESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFAFSIYDMNWVRQAPGKGLEWVSAISSGGGTTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 65)，且其中該VL域包含胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGNTLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 68)。
  94. 如請求項86之結合物，其中該抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中該VH域包含胺基酸序列QVQLLESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFAFSIYDMNWVRQAPGKGLEWVSAISSGGGTTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 65)，且其中該VL域包含胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGATLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 73)。
  95. 如請求項86之結合物，其中該抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中該VH域包括包含SEQ ID NO: 113之序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO: 115之序列的CDR-H2及包含SEQ ID NO: 116之序列的CDR-H3；且該VL域包括包含SEQ ID NO: 117之序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO: 119之序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO: 120之序列的CDR-L3。
  96. 如請求項86之結合物，其中該抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中該VH域包含胺基酸序列QVQLLESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFAFSIYDMNWVRQAPGKGLEWVSAISSGGGTTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 65)，且其中該VL域包含胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHGYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQGSTLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 87)。
  97. 如請求項81至85中任一項之結合物，其中該抗體或其片段特異性結合人類Her2。
  98. 如請求項97之結合物，其中該抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，且其中該VH域包含來自VH域序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:168)的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3序列。
  99. 如請求項98之結合物，其中該VH域包含序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:168)。
  100. 如請求項98或請求項99之結合物，其中該抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，且其中該VL域包含來自VL域序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:169)的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3序列。
  101. 如請求項99或請求項100之結合物，其中該VL域包含序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:169)。
  102. 如請求項97至101中任一項之結合物，其中該抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，且其中該VH域包含來自VH域序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:170)的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3序列。
  103. 如請求項102之結合物，其中該VH域包含序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:170)。
  104. 如請求項102或請求項103之結合物，其中該抗體包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，且其中該VL域包含來自VL域序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:171)的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3序列。
  105. 如請求項102至104中任一項之結合物，其中該VL域包含序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:171)。
  106. 如請求項81至105中任一項之結合物，其中該抗體包含Fc區。
  107. 如請求項106之結合物，其中該Fc區為選自由以下組成之群的人類Fc區：IgG1 Fc區、IgG2 Fc區及IgG4 Fc區。
  108. 如請求項107之結合物，其中該Fc區為野生型人類IgG1、IgG2或IgG4 Fc區。
  109. 如請求項107之結合物，其中該Fc區為包含一或多個胺基酸取代之人類Fc區，其使得效應功能比缺乏該(等)胺基酸取代之人類Fc區降低。
  110. 如請求項107之結合物，其中該Fc區為包含一或多個減少與C1q的結合之胺基酸取代的人類Fc區。
  111. 如請求項107之結合物，其中該Fc區為： (a)包含L234A、L235A及/或G237A取代的人類IgG1 Fc區，胺基酸位置係根據EU索引編號； (b)包含A330S及/或P331S取代之人類IgG2 Fc區，胺基酸位置係根據EU索引編號；或 (c)包含S228P及/或L235E取代的人類IgG4 Fc區，胺基酸位置係根據EU索引編號。
  112. 如請求項106、107及109至111中任一項之結合物，其中該Fc區進一步包含N297A取代，胺基酸位置係根據EU索引編號。
  113. 如請求項112之結合物，其中該結合物進一步包含如下式
    Figure 03_image784
    中所示連接於該Fc區之Q295殘基的免疫調節寡核苷酸P，其中L為經由醯胺鍵連接於該Fc區之Q295的連接子部分。
  114. 如請求項108及110至113中任一項之結合物，其中該Fc區進一步包含D265A取代，胺基酸位置係根據EU索引編號。
  115. 如請求項81至105中任一項之結合物，其中該抗體包含抗體重鏈恆定域，其包含選自由SEQ ID No: 92-107及178組成之群的胺基酸序列。
  116. 如請求項81至115中任一項之結合物，其中該抗體包含人類λ輕鏈。
  117. 如請求項81至115中任一項之結合物，其中該抗體包含人類κ輕鏈。
  118. 如請求項111至115中任一項之結合物，其中該抗體包含抗體輕鏈恆定域，其包含選自由SEQ ID NO: 108-110組成之群的胺基酸序列。
  119. 如請求項81至96及106至118中任一項之結合物，其中該結合物結合於表現於B細胞之表面上的人類CD22。
  120. 如請求項81至119中任一項之結合物，其中該結合物誘發TLR9之活化。
  121. 如請求項81至120中任一項之結合物，其中該抗體包含兩條抗體重鏈及兩條抗體輕鏈，且其中一個Q標籤連接於該抗體之一條或兩條重鏈。
  122. 如請求項121之結合物，其中該Q標籤與該抗體之該(等)重鏈之C端融合。
  123. 如請求項121之結合物，其中該Q標籤係在該抗體之該(等)重鏈之Fc域內。
  124. 如請求項81至120中任一項之結合物，其中該抗體包含兩條抗體重鏈及兩條抗體輕鏈，且其中一個Q標籤連接於該抗體之一條或兩條輕鏈。
  125. 如請求項81至124中任一項之結合物，其中各Q標籤獨立地包含序列RPQGF (SEQ ID NO: 47)、RPQGFPP (SEQ ID NO: 48)或RPQGFGPP (SEQ ID NO: 49)。
  126. 如請求項81至125中任一項之結合物，其中1或2個Q標籤連接於該抗體或抗原結合片段。
  127. 如請求項81至126中任一項之結合物，其中該結合物之DAR為1或2。
  128. 如請求項81至127中任一項之結合物，其中各免疫調節寡核苷酸P獨立地為：
    Figure 03_image786
    ， 其中 b及c各自獨立地為1至25之整數；其限制條件為b及c之總和為至少5；
    Figure 03_image011
    指示該免疫調節寡核苷酸P與該結合物之其餘部分的連接點； X5 ' 為具有結構
    Figure 03_image789
    之5'端核苷； X3 ' 為具有結構
    Figure 03_image791
    之3'端核苷； YPTE 為具有結構
    Figure 03_image793
    之核苷間磷酸三酯，其中*指示與該寡核苷酸之其餘部分之連接點，且
    Figure 03_image191
    指示與該連接子L之連接點，或若L不存在，則
    Figure 03_image191
    指示在該穀胺醯胺殘基處經由醯胺鍵與該Q標籤肽之連接點； Y3 ' 為具有結構
    Figure 03_image796
    之末端磷酸三酯； 各XN 獨立地為具有結構
    Figure 03_image798
    之核苷； 各YN 獨立地為具有結構
    Figure 03_image800
    之核苷間連接子； 其中各BN 獨立地為經修飾或未經修飾之核鹼基； 各RN 獨立地為-H或-O-C1 - 4 烷基，其中該-O-C1 - 4 烷基之C1 - 4 烷基視情況進一步經-O-C1 -C4 烷基取代； B5 ' 及B3 ' 獨立地為經修飾或未經修飾之核鹼基； R5 ' 及R3 ' 獨立地為-H或-O-C1 -C4 烷基，其中該-O-C1 - 4 烷基之C1 - 4 烷基視情況進一步經-O-C1 - 4 烷基取代； 各T1 獨立地為O或S； 各T2 獨立地為O- 或S- ；及 T3 為包含寡乙二醇部分之基團；及 R1 為C1 - 4 伸烷基-羥基。
  129. 如請求項128之結合物，其中b為3。
  130. 如請求項128或請求項129之結合物，其中 (i) P包含至少一個經修飾之核苷XN ； (ii) P具有至少一個經修飾之核苷間連接子YN ，其中T1 或T2 中之至少一者為S；或 (iii) (i)及(ii)兩者。
  131. 如請求項128至130中任一項之結合物，其中P具有至少一個二硫代磷酸酯或硫代磷酸酯核苷間連接子。
  132. 如請求項128至131中任一項之結合物，其中P包含0、1、2或3個二硫代磷酸酯核苷間連接子。
  133. 如請求項128至132中任一項之結合物，其中P包含選自由以下組成之群的經修飾之核苷：2'-O-烷基核苷、2'-O-烷氧基烷基核苷、2'-去氧核苷及核糖核苷。
  134. 如請求項133之結合物，其中該經修飾之核苷係選自由以下組成之群：5-溴-2'-O-甲基尿苷、5-溴-2'-去氧尿苷、2'-O-甲基尿苷、2'-去氧尿苷、2'-O-甲基胸苷、2'-O-甲基胞苷、2'-O-(2-甲氧基乙基)胸苷及8-側氧基-7,8-二氫-2'-去氧鳥苷。
  135. 如請求項128至134中任一項之結合物，其中X5 '為5-溴-2'-O-甲基尿苷、5-溴-2'-去氧尿苷、2'-O-甲基尿苷或2'-去氧尿苷。
  136. 如請求項128至135中任一項之結合物，其中Y3 ' 或在X5 ' 之3'位置處之YN 包含未經取代或經取代之硫代磷酸酯。
  137. 如請求項128至136中任一項之結合物，其中YPTE 為：
    Figure 03_image802
    ， 其中Z為O或S；d為0至95之整數；結構右側之該等兩個
    Figure 03_image011
    指示與該寡核苷酸P中之相鄰核苷XN 的連接點，且該結構左側之該
    Figure 03_image191
    指示與該連接子L的連接點。
  138. 如請求項128至136中任一項之結合物，其中YPTE 為：
    Figure 03_image806
    或
    Figure 03_image808
    ， 其中Z為O或S；d為0至95之整數；結構右側之該等兩個
    Figure 03_image011
    指示與該寡核苷酸P中之該等相鄰核苷XN 的連接點，且該結構左側之該一個
    Figure 03_image191
    指示與該連接子L的連接點。
  139. 如請求項137或138之結合物，其中Z為S。
  140. 如請求項137至139中任一項之結合物，其中d為1至25之整數。
  141. 如請求項81至140中任一項之結合物，其中該連接子L包含聚乙二醇部分。
  142. 如請求項81至141中任一項之結合物，其中該連接子L為：
    Figure 03_image810
    ， 其中m為在約0至約50範圍內之整數，且其中
    Figure 03_image191
    指示與YPTE 之連接點，且
    Figure 03_image224
    指示與該結合物之其餘部分的連接點。
  143. 如請求項81至142中任一項之結合物，其中P包含一或多個CpG位點。
  144. 如請求項81至143中任一項之結合物，其中P包含至少3個CpG位點。
  145. 如請求項81至144中任一項之結合物，其中各P獨立地包含選自 表 9 或 表 10 之寡核苷酸。
  146. 如請求項81至145中任一項之結合物，其中該抗體包含兩條抗體輕鏈、兩條抗體重鏈及兩個Q標籤肽；其中該等Q標籤肽中之每一者連接於該等抗體重鏈中之一者之C端；且其中該等Q標籤肽中之一者經由與該Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接於免疫調節寡核苷酸(P)。
  147. 一種結合物，其包含抗體或其抗原結合片段(Ab)及一或多種免疫調節寡核苷酸(P)，其中該抗體或抗原結合片段連接於一或多個Q標籤肽(Q)，且其中各免疫調節寡核苷酸經由與Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接於該Q標籤肽，如式(A)中所示：
    Figure 03_image813
    ， 其中：
    Figure 03_image003
    指示各Q與該抗體或其抗原結合片段(Ab)之連接點 各Q    獨立地包含Q標籤肽序列RPQGF (SEQ ID NO:47)； 各L    獨立地為一鍵或連接子部分
    Figure 03_image816
    ， 其中m為約0至約50範圍內之整數，且其中
    Figure 03_image191
    指示與P之連接點，且
    Figure 03_image224
    指示與經由與該穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵連接於Q的該結合物之其餘部分的連接點；及 各P獨立地為具有以下結構之免疫調節寡核苷酸：
    Figure 03_image818
    ， 其中
    Figure 03_image011
    及
    Figure 03_image413
    指示該寡核苷酸內之連接點，且其中
    Figure 03_image191
    指示與該連接子L之連接點； 其中Ab包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域。
  148. 如請求項147之結合物，其中各Q標籤獨立地包含RPQGF (SEQ ID NO:47)、RPQGFPP (SEQ ID NO:48)或RPQGFGPP (SEQ ID NO:49)。
  149. 如請求項148之結合物，其中各Q標籤為RPQGFGPP (SEQ ID NO:49)。
  150. 如請求項147至149中任一項之結合物，其中1或2個Q標籤連接於該抗體或抗原結合片段。
  151. 如請求項147至150中任一項之結合物，其中該Q標籤連接於該抗體之重鏈之C端。
  152. 如請求項147至151中任一項之結合物，其中： (a)該抗體包括包含L234A、L235A及/或G237A取代的人類IgG1 Fc區，胺基酸位置係根據EU索引編號； (b)該抗體包含野生型人類IgG1 Fc區； (c)該抗體包括包含N297A取代的人類IgG1 Fc區，胺基酸位置係根據EU索引編號； (d)該抗體包括包含D265A取代的人類IgG1 Fc區，胺基酸位置係根據EU索引編號； (e)該抗體包含野生型人類IgG2 Fc區； (f)該抗體包括包含N297A取代的人類IgG2 Fc區，胺基酸位置係根據EU索引編號；或 (g)該抗體包括包含S228P取代的人類IgG4 Fc區，胺基酸位置係根據EU索引編號。
  153. 如請求項147至152中任一項之結合物，其中m為約20至約25之整數。
  154. 如請求項153之結合物，其中m為24。
  155. 如請求項147至154中任一項之結合物，其中該結合物之DAR為1或2。
  156. 如請求項147至155中任一項之結合物，其中該結合物結合於表現於B細胞表面上之人類CD22。
  157. 如請求項156之結合物，其中： (a)該VH域包括包含SEQ ID NO: 113之序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO: 115之序列的CDR-H2及包含SEQ ID NO: 116之序列的CDR-H3，且該VL域包括包含SEQ ID NO: 117之序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO: 119之序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO: 120之序列的CDR-L3； (b)該VH域包括包含SEQ ID NO: 114之序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO: 189之序列的CDR-H2及包含SEQ ID NO: 116之序列的CDR-H3，且該VL域包括包含SEQ ID NO: 117之序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO: 119之序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO: 120之序列的CDR-L3； (c)該VH域包括包含SEQ ID NO: 113之序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO: 115之序列的CDR-H2及包含SEQ ID NO: 116之序列的CDR-H3，且該VL域包括包含SEQ ID NO: 118之序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO: 177之序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO: 120之序列的CDR-L3；或 (d)該VH域包括包含SEQ ID NO: 114之序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO: 189之序列的CDR-H2及包含SEQ ID NO: 116之序列的CDR-H3，且該VL域包括包含SEQ ID NO: 118之序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO: 177之序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO: 120之序列的CDR-L3。
  158. 如請求項156或請求項157之結合物，其中： (a)該VH域包含SEQ ID NO: 65之序列，且該VL域包含SEQ ID NO: 87之序列；或 (b)該VH域包含SEQ ID NO: 65之序列，且該VL域包含SEQ ID NO: 73之序列。
  159. 如請求項156至158中任一項之結合物，其中： (a)該抗體包括包含SEQ ID NO: 179之序列的重鏈及包含SEQ ID NO: 181之序列的輕鏈； (b)該抗體包括包含SEQ ID NO: 180之序列的重鏈及包含SEQ ID NO: 181之序列的輕鏈； (c)該抗體包括包含SEQ ID NO: 179之序列的重鏈及包含SEQ ID NO: 182之序列的輕鏈；或 (d)該抗體包括包含SEQ ID NO: 180之序列的重鏈及包含SEQ ID NO: 182之序列的輕鏈。
  160. 如請求項147至155中任一項之結合物，其中該結合物結合於表現於腫瘤細胞表面上的人類Her2。
  161. 如請求項160之結合物，其中： (a)該VH域包含SEQ ID NO: 168之序列，且該VL域包含SEQ ID NO: 169之序列；或 (b)該VH域包含SEQ ID NO: 170之序列，且該VL域包含SEQ ID NO: 171之序列。
  162. 如請求項161之結合物，其中： (a)該抗體包括包含SEQ ID NO: 184之序列的重鏈及包含SEQ ID NO: 185之序列的輕鏈； (b)該抗體包括包含SEQ ID NO: 183之序列的重鏈及包含SEQ ID NO: 185之序列的輕鏈； (c)該抗體包括包含SEQ ID NO: 187之序列的重鏈及包含SEQ ID NO: 188之序列的輕鏈；或 (d)該抗體包括包含SEQ ID NO: 186之序列的重鏈及包含SEQ ID NO: 188之序列的輕鏈。
  163. 一種結合物，其包含抗體或其抗原結合片段(Ab)及一或多種免疫調節寡核苷酸(P)，其中該抗體或抗原結合片段連接於一或多個Q標籤肽(Q)，且其中各免疫調節寡核苷酸經由與Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接於該Q標籤肽，如式(A)中所示：
    Figure 03_image822
    ， 其中：
    Figure 03_image003
    指示各Q與該抗體或其抗原結合片段(Ab)之連接點 各Q    獨立地包含Q標籤肽序列RPQGF (SEQ ID NO:47)； 各L    獨立地為一鍵或連接子部分
    Figure 03_image825
    ， 其中m為約0至約50範圍內之整數，且其中
    Figure 03_image191
    指示與P之連接點，且
    Figure 03_image224
    指示與經由與該穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵連接於Q的該結合物之其餘部分的連接點；及 各P獨立地為具有以下結構之免疫調節寡核苷酸：
    Figure 03_image827
    ， 其中
    Figure 03_image011
    及
    Figure 03_image413
    指示該寡核苷酸內之連接點，且其中
    Figure 03_image191
    指示與該連接子L之連接點； 其中Ab包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域。
  164. 如請求項163之結合物，其中各Q標籤獨立地包含RPQGF (SEQ ID NO:47)、RPQGFPP (SEQ ID NO:48)或RPQGFGPP (SEQ ID NO:49)。
  165. 如請求項164之結合物，其中各Q標籤為RPQGFGPP (SEQ ID NO:49)。
  166. 如請求項163至165中任一項之結合物，其中1或2個Q標籤連接於該抗體或抗原結合片段。
  167. 如請求項163至166中任一項之結合物，其中該Q標籤連接於該抗體之重鏈之C端。
  168. 如請求項163至167中任一項之結合物，其中： (a)該抗體包括包含L234A、L235A及/或G237A取代的人類IgG1 Fc區，胺基酸位置係根據EU索引編號； (b)該抗體包含野生型人類IgG1 Fc區； (c)該抗體包括包含N297A取代的人類IgG1 Fc區，胺基酸位置係根據EU索引編號； (d)該抗體包括包含D265A取代的人類IgG1 Fc區，胺基酸位置係根據EU索引編號； (e)該抗體包含野生型人類IgG2 Fc區； (f)該抗體包括包含N297A取代的人類IgG2 Fc區，胺基酸位置係根據EU索引編號；或 (g)該抗體包括包含S228P取代的人類IgG4 Fc區，胺基酸位置係根據EU索引編號。
  169. 如請求項163至168中任一項之結合物，其中m為約20至約25之整數。
  170. 如請求項169之結合物，其中m為24。
  171. 如請求項163至170中任一項之結合物，其中該結合物之DAR為1或2。
  172. 如請求項163至171中任一項之結合物，其中該結合物結合於表現於B細胞表面上之人類CD22。
  173. 如請求項172之結合物，其中： (a)該VH域包括包含SEQ ID NO: 113之序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO: 115之序列的CDR-H2及包含SEQ ID NO: 116之序列的CDR-H3，且該VL域包括包含SEQ ID NO: 117之序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO: 119之序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO: 120之序列的CDR-L3； (b)該VH域包括包含SEQ ID NO: 114之序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO: 189之序列的CDR-H2及包含SEQ ID NO: 116之序列的CDR-H3，且該VL域包括包含SEQ ID NO: 117之序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO: 119之序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO: 120之序列的CDR-L3； (c)該VH域包括包含SEQ ID NO: 113之序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO: 115之序列的CDR-H2及包含SEQ ID NO: 116之序列的CDR-H3，且該VL域包括包含SEQ ID NO: 118之序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO: 177之序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO: 120之序列的CDR-L3；或 (d)該VH域包括包含SEQ ID NO: 114之序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO: 189之序列的CDR-H2及包含SEQ ID NO: 116之序列的CDR-H3，且該VL域包括包含SEQ ID NO: 118之序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO: 177之序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO: 120之序列的CDR-L3。
  174. 如請求項172或請求項173之結合物，其中： (a)該VH域包含SEQ ID NO: 65之序列，且該VL域包含SEQ ID NO: 87之序列；或 (b)該VH域包含SEQ ID NO: 65之序列，且該VL域包含SEQ ID NO: 73之序列。
  175. 如請求項172至174中任一項之結合物，其中： (a)該抗體包括包含SEQ ID NO: 179之序列的重鏈及包含SEQ ID NO: 181之序列的輕鏈； (b)該抗體包括包含SEQ ID NO: 180之序列的重鏈及包含SEQ ID NO: 181之序列的輕鏈； (c)該抗體包括包含SEQ ID NO: 179之序列的重鏈及包含SEQ ID NO: 182之序列的輕鏈；或 (d)該抗體包括包含SEQ ID NO: 180之序列的重鏈及包含SEQ ID NO: 182之序列的輕鏈。
  176. 如請求項163至171中任一項之結合物，其中該結合物結合於表現於腫瘤細胞表面上的人類Her2。
  177. 如請求項176之結合物，其中： (a)該VH域包含SEQ ID NO: 168之序列，且該VL域包含SEQ ID NO: 169之序列；或 (b)該VH域包含SEQ ID NO: 170之序列，且該VL域包含SEQ ID NO: 171之序列。
  178. 如請求項177之結合物，其中： (a)該抗體包括包含SEQ ID NO: 184之序列的重鏈及包含SEQ ID NO: 185之序列的輕鏈； (b)該抗體包括包含SEQ ID NO: 183之序列的重鏈及包含SEQ ID NO: 185之序列的輕鏈； (c)該抗體包括包含SEQ ID NO: 187之序列的重鏈及包含SEQ ID NO: 188之序列的輕鏈；或 (d)該抗體包括包含SEQ ID NO: 186之序列的重鏈及包含SEQ ID NO: 188之序列的輕鏈。
  179. 一種結合物，其包含抗體(Ab)及免疫調節寡核苷酸(P)，其中該抗體包含兩條抗體輕鏈、兩條抗體重鏈及兩個Q標籤肽；其中該等Q標籤肽(Q)中之每一者包含胺基酸序列RPQGF (SEQ ID NO:47)；其中該等Q標籤肽中之每一者連接於該等抗體重鏈中之一者之C端；其中該等兩個Q標籤肽中之一者經由與該Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接於該免疫調節寡核苷酸，如式(A)中所示：
    Figure 03_image831
    ， 其中
    Figure 03_image003
    指示Q與該抗體(Ab)之連接點。
  180. 一種包含抗體(Ab)之結合物，其中該抗體包含兩條抗體輕鏈、兩條抗體重鏈及兩個包含肽序列RPQGF (SEQ ID NO:47)之Q標籤肽；其中該等Q標籤肽中之每一者連接於該等抗體重鏈中之一者之C端；且其中該等Q標籤肽中之至少一者經由與該Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接於免疫調節寡核苷酸(P)，如圖 16A 或圖 16B 中所示。
  181. 一種結合物，其包含抗體或其抗原結合片段(Ab)及一或多種免疫調節寡核苷酸(P)，其中該抗體或抗原結合片段連接於一或多個包含Q標籤肽序列RPQGF (SEQ ID NO:47)之Q標籤肽(Q)，且其中各免疫調節寡核苷酸經由與Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接於該Q標籤肽，如式(A)中所示：
    Figure 03_image833
    ， 其中：
    Figure 03_image003
    指示各Q與該抗體或其抗原結合片段(Ab)之連接點 各Q獨立地包含Q標籤肽序列RPQGF (SEQ ID NO:47)； 各L    獨立地為一鍵或連接子部分
    Figure 03_image835
    ， 其中m為約0至約50範圍內之整數，且其中
    Figure 03_image191
    指示與P之連接點，且
    Figure 03_image224
    指示與經由與該穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵連接於Q的該結合物之其餘部分的連接點；及 各P獨立地為具有以下結構之免疫調節寡核苷酸：
    Figure 03_image839
    ， 其中
    Figure 03_image011
    及
    Figure 03_image413
    指示該寡核苷酸內之連接點，且其中
    Figure 03_image191
    指示與該連接子L之連接點； 各T1 獨立地為O或S； 各T2 為S- ； 其限制條件為各P包含一對或兩對成對T1 及T2 ，其中T1 為S且T2 為S，且該一對或兩對成對T1 及T2 在核苷殘基2與3之間、核苷殘基3與4之間、核苷殘基5與6之間、核苷殘基6與7之間、核苷殘基7與8之間、核苷殘基8與9之間、核苷殘基9與10之間或核苷殘基10與11之間； T3 為基團
    Figure 03_image842
    ，其中
    Figure 03_image191
    指示與L之連接點且其中
    Figure 03_image367
    指示與該寡核苷酸之其餘部分的連接點； Z為O或S； U5 ' 為-H或鹵素； R5 ' 為-H； Rc1 為-H； Rg1 、Rg2 、Rg3 及Rg4 為H； R3 ' 為甲氧基； R1 為-(CH2 )3 -OH； R2 為-甲基；及 n為1， 其中Ab為結合腫瘤相關抗原之抗體或其抗原結合片段。
  182. 如請求項181之結合物，其中該腫瘤相關抗原由癌細胞表現。
  183. 如請求項181之結合物，其中該腫瘤相關抗原由癌症相關基質細胞表現。
  184. 如請求項181之結合物，其中該腫瘤相關抗原係選自由以下組成之群：CD19、CD20、CD22、CD25、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44、CD45R (B220)、CD49、CD52、CD56、CD70、CD74、CD79a、CD79b、CD93、CD123、CD138、CD163、CD205、CD206、CD274、CD303及CD304，葉酸受體α、葉酸受體β、間皮素、PSMA、Her-2、EGFR、CLDN18.2、5T4、CD47、結合蛋白4、運鐵蛋白受體、整合素、畸胎瘤衍化生長因子(cripto)、EphA2、AGS-5、AGS-16、CanAg、EpCAM、IL4受體、IL2受體、Lewis Y、GPNMB、DLL3、GCC、GPA33、組織因子(TF)、PD-L1及Trop2。
  185. 如請求項181至184中任一項之結合物，其中該癌症為乳癌、大腸直腸癌、肺癌、頭頸癌、黑素瘤、淋巴瘤或白血病。
  186. 如請求項181至185中任一項之結合物，其中各Q標籤獨立地包含RPQGF (SEQ ID NO:47)、RPQGFPP (SEQ ID NO:48)或RPQGFGPP (SEQ ID NO:49)。
  187. 如請求項181至186中任一項之結合物，其中各Q標籤係RPQGFGPP (SEQ ID NO:49)。
  188. 如請求項181至187中任一項之結合物，其中該抗體包含兩條抗體重鏈及兩條抗體輕鏈，且其中一個Q標籤連接於該抗體之一條或兩條重鏈。
  189. 如請求項181至188中任一項之結合物，其中該Q標籤連接於該抗體之重鏈之C端。
  190. 如請求項181至188中任一項之結合物，其中該Q標籤在該Fc域內。
  191. 如請求項181至190中任一項之結合物，其中： (a)該抗體包括包含L234A、L235A及/或G237A取代的人類IgG1 Fc區，胺基酸位置係根據EU索引編號； (b)該抗體包含野生型人類IgG1 Fc區； (c)該抗體包括包含N297A取代的人類IgG1 Fc區，胺基酸位置係根據EU索引編號； (d)該抗體包括包含D265A取代的人類IgG1 Fc區，胺基酸位置係根據EU索引編號； (e)該抗體包含野生型人類IgG2 Fc區； (f)該抗體包括包含N297A取代的人類IgG2 Fc區，胺基酸位置係根據EU索引編號；或 (g)該抗體包括包含S228P取代的人類IgG4 Fc區，胺基酸位置係根據EU索引編號。
  192. 如請求項181至191中任一項之結合物，其中m為約20至約25之整數。
  193. 如請求項181至192中任一項之結合物，其中m為24。
  194. 如請求項181至193中任一項之結合物，其中該結合物之DAR為1或2。
  195. 一種式(C)之免疫調節寡核苷酸：
    Figure 03_image844
    ， 其中
    Figure 03_image011
    及
    Figure 03_image413
    指示該寡核苷酸內之連接點； 各T1 獨立地為O或S； 各T2 為S- ； T3 為基團
    Figure 03_image847
    ，其中m為0至50之整數，且其中
    Figure 03_image003
    指示與該寡核苷酸之其餘部分的連接點； Z為O或S； U5 ' 為-H或鹵素； R5 ' 為-H或甲氧基； Rc1 為-H或甲氧基； Rg1 、Rg2 、Rg3 及Rg4 為H； R3 ' 為甲氧基； R1 為-(CH2 )3 -OH； R2 為-H或甲基；及 n為0至2之整數； 或其醫藥學上可接受之鹽。
  196. 如請求項195之免疫調節寡核苷酸，其中Z為S。
  197. 如請求項195或請求項196之免疫調節寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含至少一對成對T1 及T2 ，其中T1 為S且T2 為S- 。
  198. 如請求項195至197中任一項之免疫調節寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含至少兩對成對T1 及T2 ，其中T1 為S且T2 為S- 。
  199. 如請求項195至198中任一項之免疫調節寡核苷酸，其中R5 '為H。
  200. 如請求項195至198中任一項之免疫調節寡核苷酸，其中R5 '為甲氧基。
  201. 如請求項195至200中任一項之免疫調節寡核苷酸，其中Rc1 為H。
  202. 如請求項195至200中任一項之免疫調節寡核苷酸，其中Rc1 為甲氧基。
  203. 如請求項195至202中任一項之免疫調節寡核苷酸，其中R2 為甲基。
  204. 如請求項195至202中任一項之免疫調節寡核苷酸，其中R2 為H。
  205. 如請求項195至204中任一項之免疫調節寡核苷酸，其中T3 為
    Figure 03_image849
    。
  206. 如請求項195至205中任一項之免疫調節寡核苷酸，其中U5 ' 為鹵素。
  207. 如請求項206之免疫調節寡核苷酸，其中U5 ' 為溴基。
  208. 如請求項195至205中任一項之免疫調節寡核苷酸，其中U5 ' 為-H。
  209. 如請求項195之免疫調節寡核苷酸，其中該寡核苷酸為：
    Figure 03_image851
    。
  210. 如請求項195之免疫調節寡核苷酸，其中該寡核苷酸為：
    Figure 03_image853
    。
  211. 如請求項195之免疫調節寡核苷酸，其中該寡核苷酸為：
    Figure 03_image855
    。
  212. 如請求項195之免疫調節寡核苷酸，其中該寡核苷酸選自由以下組成之群： 表 10 之寡核苷酸或其醫藥學上可接受之鹽。
  213. 一種式(D)之免疫調節寡核苷酸：
    Figure 03_image857
    ， 其中
    Figure 03_image011
    及
    Figure 03_image413
    指示該寡核苷酸內之連接點； 各T1 獨立地為O或S； 各T2 為S- ； T3 為基團
    Figure 03_image859
    ，其中
    Figure 03_image191
    指示與L之連接點且其中
    Figure 03_image367
    指示與該寡核苷酸之其餘部分的連接點； L為基團
    Figure 03_image861
    ，其中m為0至50之整數，且其中
    Figure 03_image191
    指示經由T3 與該寡核苷酸之其餘部分的連接點； Z為O或S； U5 ' 為-H或鹵素； R5 ' 為-H或甲氧基； Rc1 為-H或甲氧基； Rg1 、Rg2 、Rg3 及Rg4 為H； R3 ' 為甲氧基； R1 為-(CH2 )3 -OH； R2 為-H或甲基；及 n為0至2之整數； 或其醫藥學上可接受之鹽。
  214. 如請求項213之免疫調節寡核苷酸，其中Z為S。
  215. 如請求項213或請求項214之免疫調節寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含至少一對成對T1 及T2 ，其中T1 為S且T2 為S- 。
  216. 如請求項213至215中任一項之免疫調節寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含至少兩對成對T1 及T2 ，其中T1 為S且T2 為S- 。
  217. 如請求項213至216中任一項之免疫調節寡核苷酸，其中R5 '為H。
  218. 如請求項213至216中任一項之免疫調節寡核苷酸，其中R5 '為甲氧基。
  219. 如請求項213至218中任一項之免疫調節寡核苷酸，其中Rc1 為H。
  220. 如請求項213至218中任一項之免疫調節寡核苷酸，其中Rc1 為甲氧基。
  221. 如請求項213至220中任一項之免疫調節寡核苷酸，其中R2 為甲基。
  222. 如請求項213至220中任一項之免疫調節寡核苷酸，其中R2 為H。
  223. 如請求項213至222中任一項之免疫調節寡核苷酸，其中m為20至25之整數。
  224. 如請求項213至223中任一項之免疫調節寡核苷酸，其中U5 ' 為鹵素。
  225. 如請求項224之免疫調節寡核苷酸，其中U5 ' 為溴基。
  226. 如請求項213至223中任一項之免疫調節寡核苷酸，其中U5 ' 為-H。
  227. 如請求項213之免疫調節寡核苷酸，其中該寡核苷酸為：
    Figure 03_image863
    。
  228. 如請求項213之免疫調節寡核苷酸，其中該寡核苷酸為：
    Figure 03_image865
    。
  229. 如請求項213之免疫調節寡核苷酸，其中該寡核苷酸為：
    Figure 03_image867
    。
  230. 如請求項213之免疫調節寡核苷酸，其中該寡核苷酸係選自由以下組成之群： 表 12 之寡核苷酸或其醫藥學上可接受之鹽。
  231. 一種免疫調節寡核苷酸，其係選自由 表 10 及 表 12 之寡核苷酸或其醫藥學上可接受之鹽組成之群。
  232. 一種結合物，其包含蛋白質、至少一種包含穀胺醯胺殘基之Q標籤肽序列及至少一種免疫調節寡核苷酸，其中該Q標籤肽序列為天然存在或合成的，且其中各免疫調節寡核苷酸經由與該穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵而連接於Q標籤，其中至少一種Q標籤肽序列係選自由SEQ ID NO: 40-55組成之群。
  233. 如請求項232之結合物，其中該免疫調節寡核苷酸具有選自由 表 10 及 表 12 之寡核苷酸組成之群的序列。
  234. 如請求項232或233之結合物，其中該蛋白質為包含輕鏈可變域(VL)及重鏈可變域(VH)之抗體，且其中VH包含序列SEQ ID NO: 56；且VL包含序列SEQ ID NO: 57。
  235. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至194中任一項或請求項232至234中任一項之結合物。
  236. 一種醫藥組合物，其包含如請求項195至231中任一項之免疫調節寡核苷酸。
  237. 一種套組，其包含如請求項1至194中任一項或請求項232至234中任一項之結合物及該結合物之使用說明書。
  238. 一種製備包含抗體或其抗原結合片段(Ab)及一或多種免疫調節寡核苷酸(P)之結合物的方法，其中該抗體或抗原結合片段連接於一或多個包含胺基酸序列RPQGF (SEQ ID NO:47)之Q標籤肽(Q)，且其中各免疫調節寡核苷酸經由與Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接於該Q標籤肽，如式(A)中所示，
    Figure 03_image869
    ， 其中：
    Figure 03_image003
    指示各Q與該抗體或其抗原結合片段(Ab)之連接點； 各Q    獨立地包含Q標籤肽序列RPQGF (SEQ ID NO:47)； 各L    獨立地為經由與該穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵連接於Q的一鍵或連接子部分；及 各P    獨立地為免疫調節寡核苷酸； 該製備方法包含在轉穀胺醯胺酶存在下，使下式(B)之化合物：
    Figure 03_image872
    ， 其中Ab及Q如上文針對式(A)所定義，且e為1至20之整數， 與一或多種免疫調節寡核苷酸P接觸，其中各P獨立地具有下式：
    Figure 03_image874
    ， 其中 X5 ' 為5'端核苷； X3 ' 為3'端核苷； YPTE 為核苷間磷酸三酯； Y3 ' 為末端磷酸三酯； 各XN 獨立地為核苷； 各YN 獨立地為核苷間連接子； b及c各自獨立地為1至25之整數；其限制條件為b及c之總和為至少5；及 L為具有末端胺之連接子部分。
  239. 一種製備包含抗體或其抗原結合片段(Ab)及一或多種免疫調節寡核苷酸(P)之結合物之方法，其中該抗體或抗原結合片段連接於一或多個Q標籤肽(Q)，且其中各免疫調節寡核苷酸經由與Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接於該Q標籤肽，如式(A)中所示，
    Figure 03_image876
    ， 其中：
    Figure 03_image003
    指示各Q與該抗體或其抗原結合片段(Ab)之連接點； 各Q    獨立地為具有至少一個穀胺醯胺殘基之Q標籤肽； 各L    獨立地為經由與該穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵連接於Q的一鍵或連接子部分；及 各P    獨立地為免疫調節寡核苷酸； 該製備方法包含在轉穀胺醯胺酶存在下，使下式(B)之化合物：
    Figure 03_image878
    ， 其中Ab及Q如上文針對式(A)所定義，且e為1至20之整數， 與一或多種免疫調節寡核苷酸P接觸，其中各寡核苷酸P獨立地為如請求項195至212中任一項之式(C)之免疫調節寡核苷酸或如請求項213至231中任一項之式(D)之免疫調節寡核苷酸。
  240. 如請求項238或請求項239之方法，其中各免疫調節寡核苷酸獨立地為式(C)或式(D)之寡核苷酸，其係選自由 表 10 及 表 12 之寡核苷酸組成之群。
  241. 一種結合於CD22之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或片段包含重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域，其中該VH域包含選自由SEQ ID NO: 64-67組成之群的VH域序列；及 其中該VL域包含選自由SEQ ID NO: 68-91組成之群的VL域序列。
  242. 如請求項241之抗體，其中該抗體為Fab、F(ab')2、Fab'-SH、Fv、scFv、單域、單重鏈或單輕鏈抗體或抗體片段。
  243. 如請求項241之抗體，其中該抗體包含Fc區。
  244. 如請求項243之抗體，其中該Fc區為選自由以下組成之群的人類Fc區：IgG1 Fc區、IgG2 Fc區及IgG4 Fc區。
  245. 如請求項244之抗體，其中該Fc區為野生型人類IgG1、IgG2或IgG4 Fc區。
  246. 如請求項244之抗體，其中該Fc區為包含一或多個減少與C1q的結合之胺基酸取代的人類Fc區。
  247. 如請求項244之抗體，其中該Fc區為包含一或多個胺基酸取代之人類Fc區，其使得效應功能比缺乏該(等)胺基酸取代之人類Fc區降低。
  248. 如請求項244之抗體，其中該Fc區為： (a)包含L234A、L235A及/或G237A取代的人類IgG1 Fc區，胺基酸位置係根據EU索引編號； (b)包含A330S及/或P331S取代之人類IgG2 Fc區，胺基酸位置係根據EU索引編號；或 (c)包含S228P及/或L235E取代的人類IgG4 Fc區，胺基酸位置係根據EU索引編號。
  249. 如請求項247或請求項248之抗體，其中該Fc區進一步包含N297A取代，胺基酸位置係根據EU索引編號。
  250. 如請求項243之抗體，其中該抗體進一步包含選自由SEQ ID NO: 92-110組成之群的胺基酸序列。
  251. 一種結合物，其包含抗體(Ab)及免疫調節寡核苷酸(P)，其中該抗體包含兩條抗體輕鏈、兩條抗體重鏈及兩個Q標籤肽；其中該等抗體輕鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 182之胺基酸序列；其中該等抗體重鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 179之胺基酸序列；其中該免疫調節寡核苷酸包含SEQ ID NO: 35之序列；其中該等Q標籤肽(Q)中之每一者包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列；且其中該等兩個Q標籤肽中之至少一者經由與該Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連的醯胺鍵及連接子(L)而連接於該免疫調節寡核苷酸。
  252. 一種結合物，其包含抗體(Ab)及免疫調節寡核苷酸(P)，其中該抗體包含兩條抗體輕鏈、兩條抗體重鏈及兩個Q標籤肽；其中該等抗體輕鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 182之胺基酸序列；其中該等抗體重鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 180之胺基酸序列；其中該免疫調節寡核苷酸包含SEQ ID NO: 35之序列；其中該等Q標籤肽(Q)中之每一者包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列；且其中該等兩個Q標籤肽中之至少一者經由與該Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連的醯胺鍵及連接子(L)而連接於該免疫調節寡核苷酸。
  253. 一種結合物，其包含抗體(Ab)及免疫調節寡核苷酸(P)，其中該抗體包含兩條抗體輕鏈、兩條抗體重鏈及兩個Q標籤肽；其中該等抗體輕鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 181之胺基酸序列；其中該等抗體重鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 180之胺基酸序列；其中該免疫調節寡核苷酸包含SEQ ID NO: 34之序列；其中該等Q標籤肽(Q)中之每一者包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列；且其中該等兩個Q標籤肽中之至少一者經由與該Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接於該免疫調節寡核苷酸。
  254. 一種結合物，其包含抗體(Ab)及免疫調節寡核苷酸(P)，其中該抗體包含兩條抗體輕鏈、兩條抗體重鏈及兩個Q標籤肽；其中該等抗體輕鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 181之胺基酸序列；其中該等抗體重鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 179之胺基酸序列；其中該免疫調節寡核苷酸包含SEQ ID NO: 34之序列；其中該等Q標籤肽(Q)中之每一者包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列；且其中該等兩個Q標籤肽中之至少一者經由與該Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接於該免疫調節寡核苷酸。
  255. 一種結合物，其包含抗體(Ab)及免疫調節寡核苷酸(P)，其中該抗體包含兩條抗體輕鏈、兩條抗體重鏈及兩個Q標籤肽；其中該等抗體輕鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 181之胺基酸序列；其中該等抗體重鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 179之胺基酸序列；其中該免疫調節寡核苷酸包含SEQ ID NO: 163之序列；其中該等Q標籤肽(Q)中之每一者包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列；且其中該等兩個Q標籤肽中之至少一者經由與該Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接於該免疫調節寡核苷酸。
  256. 一種結合物，其包含抗體(Ab)及免疫調節寡核苷酸(P)，其中該抗體包含兩條抗體輕鏈、兩條抗體重鏈及兩個Q標籤肽；其中該等抗體輕鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 182之胺基酸序列；其中該等抗體重鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 179之胺基酸序列；其中該免疫調節寡核苷酸包含SEQ ID NO: 163之序列；其中該等Q標籤肽(Q)中之每一者包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列；且其中該等兩個Q標籤肽中之至少一者經由與該Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接於該免疫調節寡核苷酸。
  257. 一種結合物，其包含抗體(Ab)及免疫調節寡核苷酸(P)，其中該抗體包含兩條抗體輕鏈、兩條抗體重鏈及兩個Q標籤肽；其中該等抗體輕鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 185之胺基酸序列；其中該等抗體重鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 184之胺基酸序列；其中該免疫調節寡核苷酸包含SEQ ID NO: 35之序列；其中該等Q標籤肽(Q)中之每一者包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列；且其中該等兩個Q標籤肽中之至少一者經由與該Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連的醯胺鍵及連接子(L)而連接於該免疫調節寡核苷酸。
  258. 一種結合物，其包含抗體(Ab)及免疫調節寡核苷酸(P)，其中該抗體包含兩條抗體輕鏈、兩條抗體重鏈及兩個Q標籤肽；其中該等抗體輕鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 185之胺基酸序列；其中該等抗體重鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 183之胺基酸序列；其中該免疫調節寡核苷酸包含SEQ ID NO: 35之序列；其中該等Q標籤肽(Q)中之每一者包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列；且其中該等兩個Q標籤肽中之至少一者經由與該Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連的醯胺鍵及連接子(L)而連接於該免疫調節寡核苷酸。
  259. 一種結合物，其包含抗體(Ab)及免疫調節寡核苷酸(P)，其中該抗體包含兩條抗體輕鏈、兩條抗體重鏈及兩個Q標籤肽；其中該等抗體輕鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 185之胺基酸序列；其中該等抗體重鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 184之胺基酸序列；其中該免疫調節寡核苷酸包含SEQ ID NO: 163之序列；其中該等Q標籤肽(Q)中之每一者包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列；且其中該等兩個Q標籤肽中之至少一者經由與該Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接於該免疫調節寡核苷酸。
  260. 一種結合物，其包含抗體(Ab)及免疫調節寡核苷酸(P)，其中該抗體包含兩條抗體輕鏈、兩條抗體重鏈及兩個Q標籤肽；其中該等抗體輕鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 188之胺基酸序列；其中該等抗體重鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 187之胺基酸序列；其中該免疫調節寡核苷酸包含SEQ ID NO: 35之序列；其中該等Q標籤肽(Q)中之每一者包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列；且其中該等兩個Q標籤肽中之至少一者經由與該Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連的醯胺鍵及連接子(L)而連接於該免疫調節寡核苷酸。
  261. 一種結合物，其包含抗體(Ab)及免疫調節寡核苷酸(P)，其中該抗體包含兩條抗體輕鏈、兩條抗體重鏈及兩個Q標籤肽；其中該等抗體輕鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 188之胺基酸序列；其中該等抗體重鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 186之胺基酸序列；其中該免疫調節寡核苷酸包含SEQ ID NO: 35之序列；其中該等Q標籤肽(Q)中之每一者包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列；且其中該等兩個Q標籤肽中之至少一者經由與該Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連的醯胺鍵及連接子(L)而連接於該免疫調節寡核苷酸。
  262. 一種結合物，其包含抗體(Ab)及免疫調節寡核苷酸(P)，其中該抗體包含兩條抗體輕鏈、兩條抗體重鏈及兩個Q標籤肽；其中該等抗體輕鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 188之胺基酸序列；其中該等抗體重鏈中之每一者包含SEQ ID NO: 187之胺基酸序列；其中該免疫調節寡核苷酸包含SEQ ID NO: 163之序列；其中該等Q標籤肽(Q)中之每一者包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列；且其中該等兩個Q標籤肽中之至少一者經由與該Q標籤肽之穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵及連接子(L)而連接於該免疫調節寡核苷酸。
  263. 如請求項251至262中任一項之結合物，其中該等兩個Q標籤肽中之一者連接於該免疫調節寡核苷酸。
  264. 如請求項251至262中任一項之結合物，其包含兩種免疫調節寡核苷酸，其中該等兩個Q標籤肽中之每一者連接於該等兩種免疫調節寡核苷酸中之一者。
  265. 如請求項261至264中任一項之結合物，其中該連接子包含連接子部分
    Figure 03_image880
    ，其中m為整數24，且其中
    Figure 03_image191
    指示與P之連接點，且
    Figure 03_image882
    指示與經由與該穀胺醯胺殘基相連之醯胺鍵連接於Q的該結合物之其餘部分的連接點。
  266. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至194中任一項或如請求項232至234及251至265中任一項之結合物、或如請求項241至250中任一項之抗體，及醫藥學上可接受之載劑。
  267. 一種治療癌症之方法，其包含向個體投與有效量之如請求項1至194中任一項或如請求項232至234及251至265中任一項之結合物、如請求項241至250中任一項之抗體、或如請求項235或請求項266之醫藥組合物。
  268. 一種醫藥組合物，其包含如請求項195至231中任一項之免疫調節寡核苷酸及醫藥學上可接受之載劑。
  269. 一種治療癌症之方法，其包含向個體投與有效量之如請求項195至231中任一項之免疫調節寡核苷酸或如請求項236或請求項268之醫藥組合物。
  270. 如請求項267或請求項269之方法，其中該癌症係B細胞癌。
  271. 如請求項267或請求項269之方法，其中該癌症為乳癌、大腸直腸癌、肺癌、頭頸癌、黑素瘤、淋巴瘤或白血病。
  272. 如請求項267及269至271中任一項之方法，其中該抗體或結合物特異性結合由該癌症或癌症相關基質表現之抗原。
  273. 一種結合於人類CD22之抗體，其中該抗體包含抗體重鏈及抗體輕鏈，其中該抗體重鏈包含SEQ ID NO: 179或180之序列，且該抗體輕鏈包含SEQ ID NO: 181或182之序列。
  274. 如請求項273之抗體，其中： (a)該抗體重鏈包含SEQ ID NO: 179之序列，且該抗體輕鏈包含SEQ ID NO: 181之序列；或 (b)該抗體重鏈包含SEQ ID NO: 179之序列，且該抗體輕鏈包含SEQ ID NO: 182之序列。
  275. 如請求項273之抗體，其中： (a)該抗體重鏈包含SEQ ID NO: 180之序列，且該抗體輕鏈包含SEQ ID NO: 181之序列；或 (b)該抗體重鏈包含SEQ ID NO: 180之序列，且該抗體輕鏈包含SEQ ID NO: 182之序列。
  276. 一種結合於人類Her2之抗體，其中該抗體包含抗體重鏈及抗體輕鏈，其中該抗體重鏈包含SEQ ID NO: 183、184、186或187之序列，且該抗體輕鏈包含SEQ ID NO: 185或188之序列。
  277. 如請求項276之抗體，其中： (a)該抗體重鏈包含SEQ ID NO: 183之序列，且該抗體輕鏈包含SEQ ID NO: 185之序列； (b)該抗體重鏈包含SEQ ID NO: 184之序列，且該抗體輕鏈包含SEQ ID NO: 185之序列； (c)該抗體重鏈包含SEQ ID NO: 186之序列，且該抗體輕鏈包含SEQ ID NO: 185之序列；或 (d)該抗體重鏈包含SEQ ID NO: 187之序列，且該抗體輕鏈包含SEQ ID NO: 185之序列。
  278. 如請求項276之抗體，其中： (a)該抗體重鏈包含SEQ ID NO: 183之序列，且該抗體輕鏈包含SEQ ID NO: 188之序列； (b)該抗體重鏈包含SEQ ID NO: 184之序列，且該抗體輕鏈包含SEQ ID NO: 188之序列； (c)該抗體重鏈包含SEQ ID NO: 186之序列，且該抗體輕鏈包含SEQ ID NO: 188之序列；或 (d)該抗體重鏈包含SEQ ID NO: 187之序列，且該抗體輕鏈包含SEQ ID NO: 188之序列。
  279. 一種治療癌症之方法，其包含向個體投與有效量的：(a)免疫檢查點抑制劑及(b)如請求項1至15、25至96、106至159、162至175、及179至194中任一項或如請求項232至234及251至265中任一項之結合物，或如請求項235或請求項266之醫藥組合物；其中當在無該結合物存在下投與時，該癌症對於該免疫檢查點抑制劑為難治性或耐藥性的；且其中該抗體或其抗原結合片段結合於人類CD22。
  280. 如請求項279之方法，其中該免疫檢查點抑制劑為PD-1抑制劑或PD-L1抑制劑。
  281. 如請求項280之方法，其中該免疫檢查點抑制劑為抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體。
  282. 如請求項279至281中任一項之方法，其中該投與造成降低該癌症之生長、尺寸及/或體積。
  283. 一種治療癌症之方法，其包含向個體投與有效量的如請求項1至15、25至96、106至159、162至175、及179至194中任一項或如請求項232至234及251至265中任一項之結合物，或如請求項235或請求項266之醫藥組合物；其中該投與造成該個體中B細胞活化。
  284. 如請求項283之方法，其中該投與造成降低該癌症之生長、尺寸及/或體積。
  285. 一種用於治療癌症之方法，其包含向個體投與有效量的如請求項1至15、25至96、106至159、162至175、及179至194中任一項或如請求項232至234及251至265中任一項之結合物，或如請求項235或請求項266之醫藥組合物；其中該癌症係選自由以下組成之群：頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)、非小細胞肺癌(NSCLC)、腎細胞癌(RCC)、胃癌、肝細胞癌(HCC)、食道癌、子宮頸癌、子宮頸鱗狀細胞癌、梅克爾細胞癌(Merkle cell carcinoma)、子宮內膜癌、卵巢癌、胰臟癌、黑素瘤、皮膚黑素瘤、肉瘤、大腸直腸癌、乳癌、小細胞肺癌(SCLC)、皮膚鱗狀細胞癌及尿道上皮癌。
  286. 一種治療B細胞相關癌症之方法，其包含向個體投與有效量的如請求項1至15、25至96、106至159、162至175、及179至194中任一項或如請求項232至234及251至265中任一項之結合物，或如請求項235或請求項266之醫藥組合物；其中該癌症係選自由急性淋巴母細胞白血病(ALL)、毛細胞白血病及彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)組成之群。
  287. 一種治療癌症之方法，其包含向個體投與有效量的如請求項1至4、16至85、97至155、160至171、及176至194中任一項或如請求項251至265中任一項之結合物，或如請求項235或請求項266之醫藥組合物；其中該癌症係選自由乳癌、尿道上皮癌及胃癌組成之群。
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