BR112021007294A2 - imunomodulação de conjugados de polinucleotídeos e métodos de uso - Google Patents

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BR112021007294A2
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Hong I. Wan
Curt W. Bradshaw
Bang Janet Sim
Tracy Chia-Chien Kuo
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Abstract

IMUNOMODULAÇÃO DE CONJUGADOS DE POLINUCLEOTÍDEOS E MÉTODOS DE USO. A presente invenção refere-se a um conjugado para modular uma célula exterminadora natural ou célula mieloide, compreendendo uma porção de direcionamento e um polinucleotídeo imunomodulador. Também é fornecida neste documento uma composição farmacêutica para modular uma célula exterminadora natural ou célula mieloide, compreendendo um conjugado que compreende uma porção de direcionamento e um polinucleotídeo imunomodulador e um excipiente farmaceuticamente aceitável. Além disso, são fornecidos aqui métodos de seu uso para modular uma célula exterminadora natural ou célula mieloide e tratar uma doença proliferativa.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “IMU-
NOMODULAÇÃO DE CONJUGADOS DE POLINUCLEOTÍDEOS E MÉTODOS DE USO”. REFERÊNCIA CRUZADA PARA PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido Provisório Norte-americano No. de Série 62/747.070, depositado em 17 de outubro de 2018, e do Pedido Provisório Norte-americano No. de Série 62/747.611, depositado em 18 de outubro de 2018, cada um dos quais é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
ENVIO DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS NO ARQUIVO DE TEXTO ASCII
[0002] O conteúdo do seguinte envio em arquivo de texto ASCII é incorporado aqui por referência em sua totalidade: uma forma legível por computador (CRF) da Listagem de Sequência (nome do arquivo: 186492000340SEQLIST.TXT, data de registro: 16 de outubro de 2019, tamanho: 346 KB).
CAMPO
[0003] É fornecido neste documento um conjugado para modular uma célula exterminadora natural ou célula mieloide, compreendendo uma porção de direcionamento e um polinucleotídeo imunomodulador. Também é fornecida neste documento uma composição farmacêutica para modular uma célula exterminadora natural ou célula mieloide, compreendendo um conjugado compreendendo uma porção de direci- onamento e um polinucleotídeo imunomodulador e um excipiente far- maceuticamente aceitável. Além disso, são fornecidos aqui métodos de seu uso para modular uma célula exterminadora natural ou célula mieloide e tratar uma doença proliferativa.
ANTECEDENTE
[0004] Células exterminadoras naturais (células NK) são linfócitos citotóxicos críticos para o sistema imune inato, onde as células NK respondem rapidamente a células infectadas por vírus e formação de tumor na ausência de anticorpos e MHC. As células NK também po- dem funcionar como uma interface para a resposta imune adaptativa e desempenhar um papel importante nas imunoterapias contra o câncer que envolvem o direcionamento do antígeno tumoral por anticorpos. Na resposta imune adaptativa, as células NK funcionam como células efetoras do sistema imune e ativam a lise das células alvo que têm seus antígenos de superfície da membrana marcados por anticorpos específicos. Este mecanismo de defesa imune mediada por células é conhecido como citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC). Hashimoto et al., J. Infect. Dis. 1983, 148, 785-
794. A ADCC mediada por células NK é o principal mecanismo de efi- cácia terapêutica de muitos anticorpos anticâncer usados no tratamen- to de vários cânceres que superexpressam antígenos únicos, como neuroblastoma, câncer de mama e linfoma de células B. Wang et al., Front. Immunol. 2015, 6.368; Zahavi et al., Antibody Therapeut. 2018, 1¸ 7-12. Abordagens para realçar a atividade das células NK aumenta- riam a ADCC e podem realçar a eficácia de tais terapêuticas anticân- cer. Além disso, as células NK carregam receptores naturais de citoto- xicidade que detectam a expressão alterada de ligantes na superfície das células tumorais, o que, em última instância, desencadeia a ativa- ção das células NK e a lise das células tumorais. Foi relatado que as células NK desenvolvem prolongada e destacam a memória específica para vários antígenos Paust et al., Nat. Immunol. 2011, 12, 500-508. Estudos indicaram que as células NK são frequentemente deficientes e disfuncionais em pacientes com malignidade, indicando que este po- de ser um fator chave na imunoevasão e progressão do câncer. Além disso, constatou-se que a baixa função das células cancerosas prediz um risco aumentado de desenvolver câncer. Berrien-Elliot et al., Curr. Opin. Organ Transplant. 2015, 20, 671-680; Imai et al., Lancet 2000,
356, 1795-1799. Em essência, o desenvolvimento de estratégias para ativar e expandir as células NK será vantajoso no tratamento de doen- ças malignas.
[0005] As células NK são derivadas do progenitor linfoide comum que gera linfócitos B e T. Eles se diferenciam e amadurecem na medu- la óssea, nódulos linfáticos, baço, amígdalas e timo antes de entrar na circulação. As células NK existem como subconjuntos clássicos e não clássicos que comumente expressam marcadores de superfície CD16 e CD56. CD56 (também conhecido como molécula de adesão de célu- las neurais (NCAM)) é uma glicoproteína de ligação homofílica, que possui sido implicada na adesão célula-célula, crescimento de neuri- tes, plasticidade sináptica e aprendizagem e memória. As células nor- mais que se coram positivamente para CD56 incluem células NK, célu- las T ativadas, cérebro e cerebelo e tecidos neuroendócrinos. Os tu- mores que são CD56-positivos incluem mieloma, leucemia mieloide, tumores neuroendócrinos, tumor de Wilm, neuroblastoma adulto, lin- fomas de células NK/T, carcinoma de células acinar pancreáticas, feo- cromocitoma e carcinoma de pulmão de células pequenas. Van Acker e outros, Front. Immunol. 2017, 8, 892.
[0006] As células mieloides são derivadas de progenitores de célu- las mieloides sequenciais originados de células tronco hematopoiéti- cas (HSCs) na medula óssea. As células mieloides são as células he- matopoéticas nucleadas mais abundantes no corpo, consistindo em vários tipos de células, incluindo neutrófilos, monócitos, macrófagos, células dendríticas (DC), eosinófilos e mastócitos. Após a invasão do patógeno, as células mieloides são rapidamente recrutadas para os tecidos locais por meio de vários receptores de quimiocinas, onde são ativadas para fagocitose e também secreção de citocinas inflamató- rias, desempenhando papéis importantes na imunidade inata. Os ma- crófagos podem matar diretamente as células tumorais por meio da fagocitose celular dependente de anticorpos (ADCP). As células miel- oides também desempenham um papel fundamental na ligação da imunidade inata e adaptativa, principalmente por meio da apresenta- ção de antígenos por DC e macrófagos e recrutamento de células imunes adaptativas. Subconjuntos de células mieloides também inclu- em macrófagos associados a tumor (TAM) e células supressoras deri- vadas de mieloides (MDSC). Os TAMs são macrófagos de tecido com função e fenótipo heterogêneos, presentes em grande número no mi- croambiente de tumores sólidos. Os TAMs podem promover a inicia- ção e metástase de células tumorais, inibir as respostas imunes anti- tumorais mediadas por células T e estimular a angiogênese tumoral e, subsequentemente, a progressão tumoral. Yang e Zhang, J. Hematol. Oncol. 2017, 10, 58. Além disso, os TAMs contribuem para a supres- são da imunidade adaptativa no câncer em progressão. MDSCs, com- preendendo subpopulações monocíticas e granulocíticas, contribuem para uma rede imunossupressora que conduz o escape do câncer ao desativar a imunidade adaptativa das células T. Os MDSCs se acumu- lam ao longo da progressão do câncer e estão ligados a resultados clínicos ruins, bem como à resistência à quimioterapia, radiação e imunoterapia em sistemas tumorais murinos. Waight et al., J. Clin. In- vestig. 2013, 123, 4464-4478; Alizadeh et al., Cancer Res.2014, 74, 104-118. A modulação das atividades das células mieloides, como o aumento de ADCP por macrófago, aumenta a função de APC por célu- las dendríticas, a redução das atividades imunossupressoras de TAMs e MDSCs, pode promover imunidade antitumoral inata e adaptativa e realçar a eficácia de outros agentes anticâncer, como inibidores de ponto de checagem, vacinas e imunoterapêuticos direcionados por cé- lulas T.
[0007] Proteínas reguladoras de sinal (SIRP) constituídas por vá- rias glicoproteínas de membrana expressas principalmente por células imunes, incluindo SIRPα, SIRPβ e SIRPγ. A SIRPα é expressa princi- palmente por células mieloides. A SIRPα atua como receptor inibidor por meio de seu domínio de motivos de inibição baseados em tirosina imunorreceptora citoplasmática (ITIM) e interage com uma proteína transmembrana amplamente expressa CD47. Esta interação controla negativamente a função efetora das células imunes inatas. A SIRPα se difunde lateralmente na membrana do macrófago e se acumula em uma sinapse fagocítica para se ligar ao CD47 e sinalizar "a si mesma", o que inibe o processo intensivo do citoesqueleto de fagocitose pelo macrófago. Isto é análogo aos sinais próprios fornecidos pelas molécu- las MHC de classe I às células NK via receptor do tipo Ig ou Ly49. A SIRPα também é expressa em outras células mieloides, como neutrófi- los, células dendríticas e MDSCs; e pode servir como um receptor ini- bidor para regular a ativação e maturação dessas populações de célu- las. Em comparação com SIRPα, SIRPβ possui expressão sobreposta em células mieloides, mas possui domínio citoplasmático diferente e pode interagir com outros ligantes diferentes de CD47. A SIRP é ex- presso em células linfoides, como células T e células MK. A SIRP também interage com o CD47, mas possui um domínio citoplasmático curto que é improvável que tenha propriedades de sinalização seme- lhantes ao SIRPα. Barclay e Brown, Nat. Rev. Immunol. 2006, 6, 457-
64.
[0008] Receptores toll-like (TLRs) são receptores de reconheci- mento de padrões críticos da imunidade inata, que reconhecem pató- genos através da detecção de padrões moleculares associados a pa- tógenos (PAMPs) derivados de bactérias, vírus, fungos e protozoários. Akira et al., Nat. Rev. Immunol. 2004, 4, 499-511; Zhang et al., Sci- ence 2004, 303, 1522-1526. Cada TLR contém domínio transmembra- nar, domínio de ligação de PAMPs extracelular com motivo de repeti- ções rico em leucina e domínio do receptor Toll-IL-1 intracelular que inicia a cascata de sinalização. Gay e Gangloff, Annu. Rev. Biochem. 2007, 76, 141-165. O reconhecimento de invasores microbianos por TLRs leva à ativação da cascata de sinalização a jusante para secretar citocinas e quimiocinas e, finalmente, resulta na ativação da resposta imune inata e adaptativa para limpar os patógenos. Takeda e Akira, Semin. Immunol. 2004, 16, 3-9; Shi et al., J. Biol. Chem. 2016, 291, 1243–1250. Em humanos, dez TLRs foram identificados, incluindo TLR-1, TLR-2, TLR-3, TLR-4, TLR-5, TLR-6, TLR-7/8, TLR-9 e TLR-
10. D’Arpa e Leung, Adv. Wound Care 2017, 6, 330-343.
[0009] O receptor 9 Toll-like (TLR9), também designado como CD289, é um receptor importante expresso em células do sistema imunológico, incluindo células dendríticas (DCs), linfócitos B, macrófa- gos, células exterminadoras naturais e outras células apresentadoras de antígeno. A ativação de TLR9 desencadeia cascatas de sinalização intracelular, levando à ativação, maturação, proliferação e produções de citocinas nessas células imunes, assim, une a imunidade inata e adaptativa. Martinez-Campos et al., Viral Immunol. 2016, 30, 98-105; Notley et al., Sci. Rep. 2017, 7, 42204. Os agonistas naturais de TLR-9 incluem oligodesoxinucleotídeos (CpG ODNs) conpossuindo dinucleo- tídeo de guanina-citosina não metilada (CpG).
[0010] CpG ODNs são geralmente divididos em três classes: clas- se A, classe B e classe C. Os CpG ODN classe A contém tipicamente caudas poli-G com estruturas de fosforotioato nos terminais 3' e 5' e uma sequência palindrômica central incluindo uma estrutura de fosfa- to. Um CpG ODNs classe A normalmente contém CpG em sua se- quência de palíndromo central. Um CpG ODN classe B normalmente inclui uma estrutura totalmente de fosforotioato e sua sequência na extremidade 5' é muitas vezes crítica para a ativação de TLR9. Um CpG ODN classe C inclui uma estrutura totalmente fosforotioato com uma sequência de extremidade 3' permitindo a formação de um du-
plex. No entanto, CpG ODNs são frequentemente suscetíveis à degra- dação no soro e, portanto, a farmacocinética dos CpG ODNs pode ser um dos fatores limitantes em seu desenvolvimento como terapêutico. Além disso, os CpG ODNs frequentemente exibem distribuição desi- gual nos tecidos in vivo, com sítios primários de acumulação no fígado, rim e baço. Tal distribuição pode provocar atividade fora do alvo e toxi- cidade local associada aos PAMPs. Consequentemente, existe uma necessidade de um método eficaz para estabilizar e liberar um CpG ODN para aplicações terapêuticas.
SUMÁRIO
[0011] É fornecido neste documento um conjugado para modular uma célula exterminadora natural ou célula mieloide, compreendendo uma porção de direcionamento e um polinucleotídeo imunomodulador.
[0012] Também é fornecida aqui uma composição farmacêutica para modular uma célula exterminadora natural ou célula mieloide, compreendendo um conjugado que compreende uma porção de dire- cionamento e um polinucleotídeo imunomodulador; e um transportador farmaceuticamente aceitável.
[0013] Além disso, é fornecido neste documento um método de modulação de uma célula exterminadora natural ou célula mieloide, compreendendo o contato da célula com um conjugado que compre- ende uma porção de direcionamento e um polinucleotídeo imunomo- dulador.
[0014] É fornecido adicionalmente neste documento um método de tratamento de uma doença proliferativa em um sujeito, compreenden- do a administração ao indivíduo de um conjugado compreendendo uma porção de direcionamento e um polinucleotídeo imunomodulador.
[0015] É fornecido neste documento um conjugado de Fórmula (C):
ou um estereoisômero, uma mistura de dois ou mais diastereômeros, um tautômero ou uma mistura de dois ou mais tautômeros dos mes- mos; ou um sal, solvato ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo; em que: Ab é um anticorpo anti-CD56 ou anti-SIRP; cada LN é independentemente um ligante; cada Q é independentemente um polinucleotídeo imuno- modulador; cada e é independentemente um número inteiro de cerca de 1, cerca de 2, cerca de 3 ou cerca de 4; e f é um número inteiro de cerca de 1, cerca de 2, cerca de 3 ou cerca de 4.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0016] A FIG. 1 mostra a ativação de células NK conforme medido por um aumento na expressão de CD69 após tratamento de 24 horas de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) com um con- jugado de nucleotídeo anti-CD56-CpG (SEQ. ID NO: 425) (anti-CD56- CPG) em comparação com os controles: o nucleotídeo CpG (p425) sozinho, o anticorpo anti-CD56 (anti-CD56) sozinho e os meios (a linha tracejada horizontal).
[0017] A FIG. 2 mostra a ativação de células NK conforme medido por um aumento na expressão de CD69 após o tratamento de 48 ho- ras de PBMC com um conjugado de nucleotídeo anti-CD56-CpG (SEQ. ID NO: 425) (anti-CD56-CPG) em comparação com os contro- les: o nucleotídeo CpG (p425) sozinho, o anticorpo anti-CD56 (anti- CD56) sozinho e os meios (a linha tracejada horizontal).
[0018] A FIG. 3 mostra um aumento nas células CD14+ após o tra- tamento de PBMC com conjugados de nucleotídeo anti-SIRPα-CpG (SEQ. ID NO: 425) (anti-Sirpα 1-CpG e anti-Sirpα 2-CpG) com um an- ticorpo anti-SIRPα bloqueador (anti-Sirpα 1) ou um anticorpo anti-
SIRPα não bloqueador (anti-Sirpα 2) em comparação com controles: o nucleotídeo CpG (p425) sozinho, os anticorpos anti-SIRPα (anti-Sirpα 1 e anti-Sirpα 2) sozinhos e meios (a linha tracejada horizontal).
[0019] A FIG. 4 mostra um aumento nas células CD14+ após o tra- tamento de células CD14+ purificadas com conjugados de nucleotídeo anti-SIRPα-CpG (SEQ. ID NO: 425) (anti-Sirpα 1-CpG e anti-Sirpα 2- CpG) com um anti-SIRPα bloqueador anticorpo (anti-Sirpα 1) ou um anticorpo anti-SIRPα não bloqueador (anti-Sirpα 2) em comparação com controles: o nucleotídeo CpG (p425) sozinho, os anticorpos anti- SIRPα (anti-Sirpα 1 e anti-Sirpα 2) sozinho e meios (a linha tracejada horizontal).
[0020] A FIG. 5 mostra uma série de estruturas mostrando abrevi- ações com estruturas correspondentes. As abreviaturas são as utiliza- das na Tabela 2.
[0021] A FIG. 6 mostra uma série de estruturas mostrando abrevi- ações com estruturas correspondentes. As abreviaturas são as utiliza- das na Tabela 2.
[0022] As FIGS. 7A-7D mostram inibição in vivo do crescimento do tumor por conjugados de nucleotídeo anti-SIRPα-CpG. A FIG. 7A: me- dição do tamanho médio do tumor CT26 ao longo do tempo após o tratamento com 10 mg/kg de conjugado anti-SIRPα 1 (anticorpo blo- queador) administrado duas vezes, três dias de intervalo ou anticorpo anti-SIRPα não conjugado administrado duas vezes, três dias de inter- valo, em comparação com o controle de PBS. A FIG. 7B: medição do tamanho médio do tumor CT26 ao longo do tempo após o tratamento com 3 mg/kg de conjugado anti-SIRPα 1 (anticorpo bloqueador) ou conjugado anti-SIRPα 2 (anticorpo não bloqueador), ambos dosados 2q3, em comparação com o controle de PBS. A FIG. 7C: medição do tamanho médio do tumor CT26 ao longo do tempo após o tratamento com 1 mg/kg, 0,3 mg/kg ou 0,1 mg/kg de conjugado anti-SIRPα 1 (an-
ticorpo bloqueador), todos dosados 2q3, em comparação com o con- trole de PBS. A FIG. 7D: medição do tamanho médio do tumor MC38 ao longo do tempo após o tratamento com 10 mg/kg de conjugado an- ti-SIRPα 1 (anticorpo bloqueador) dosado 2q3, em comparação com o controle de PBS. mpk = mg/kg. 2q3 = 2 doses, 3 dias de intervalo. As setas indicam a administração do conjugado ou controle.
[0023] As FIGS. 8A e 8B mostram inibição in vivo do crescimento do tumor por conjugados de nucleotídeo anti-SIRPα-CpG. A FIG. 8A: medição do tamanho médio do tumor CT26 ao longo do tempo após o tratamento com 1 mg/kg de conjugado anti-SIRPα 1 (anticorpo bloque- ador) administrado duas vezes, três dias de intervalo ou administrado duas vezes, sete dias de intervalo, em comparação com o controle de PBS. A FIG. 8B: curva de sobrevivência de camundongos no modelo de tumor CT26 dosado conforme descrito na FIG. 8A. mpk = mg/kg. 2q3 = 2 doses, 3 dias de intervalo. 2q7 = 2 doses, 7 dias de intervalo. As setas indicam a administração do conjugado ou controle.
DESCRIÇÃO DETALHADA Definições
[0024] Para facilitar a compreensão da descrição aqui estabeleci- da, uma série de termos é definida abaixo.
[0025] Geralmente, a nomenclatura usada neste documento e os procedimentos laboratoriais em biologia, bioquímica, química medici- nal, química orgânica e farmacologia descritos neste documento são aqueles bem conhecidos e comumente usados na técnica. A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento geralmente têm o mesmo significado como comumente entendido por alguém versado na técnica à qual esta des- crição pertence.
[0026] O termo "indivíduo" se refere a um animal, incluindo, mas não se limitando a, um primata (por exemplo, humano), vaca, porco,
ovelha, cabra, cavalo, cachorro, gato, coelho, rato e camundongo. Os termos "indivíduo" e "paciente" são usados indistintamente aqui em referência, por exemplo, a um indivíduo mamífero, como um indivíduo humano, em uma modalidade, um ser humano.
[0027] O termo "espaçador abásico", quando aqui usado, repre- senta um grupo divalente da seguinte estrutura: R1–L1–[–L2–(L1)n1–]n2–R2, (I) em que: n1 é um número inteiro de cerca de 0 ou cerca de 1, n2 é um número inteiro de cerca de 1 a cerca de 6, R1 é uma ligação a um nucleosídeo no polinucleotídeo imu- nomodulador, R2 é uma ligação a um nucleosídeo no polinucleotídeo imu- nomodulador ou a um grupo de tamponamento, cada L1 é independentemente um fosfodiéster ou um fosfo- triéster, e cada L2 é um análogo de açúcar, contanto que, se o espaçador abásico for um internucleosídeo, espaçador abásico, cada n1 seja 1 e R2 seja uma ligação a um nucleosídeo, e se o espaçador não básico for um espaçador não básico terminal, cada n1 seja independentemente um número inteiro de cerca de 0 ou cerca de 1 e R2 seja uma ligação a um grupo de tamponamen- to.
[0028] O termo "cerca de" ou "aproximadamente" significa um erro aceitável para um determinado valor, conforme determinado por al- guém versado na técnica, que depende em parte de como o valor é medido ou determinado. Em certas modalidades, o termo "cerca de" ou "aproximadamente" significa dentro de 1, 2, 3 ou 4 desvios padrão.
Em certas modalidades, o termo "cerca de" ou "aproximadamente" significa dentro de 50 %, 20 %, 15 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 % ou 0,05 % de um determinado valor ou in- tervalo.
[0029] O termo “alcano-tetraila”, quando aqui usado, representa um grupo hidrocarboneto saturado tetravalente, acíclico, de cadeia li- near ou ramificada possuindo de 1 a 16 carbonos, a menos que espe- cificado de outra forma. Alcanotetraíla pode ser opcionalmente substi- tuída como descrito para alquila.
[0030] O termo “alcano-triíla”, quando aqui usado, representa um grupo hidrocarboneto saturado trivalente, acíclico, de cadeia linear ou ramificada possuindo de 1 a 16 carbonos, a menos que especificado de outra forma. Alcano-triíla pode ser opcionalmente substituída con- forme descrito para alquila.
[0031] O termo “alcanoíla”, quando aqui usado, representa hidro- gênio ou um grupo alquila que está ligado ao grupo molecular origem através de um grupo carbonila e é exemplificado por formila (isto é, um grupo carboxialdeído), acetila, propionila, butirila, e isobutirila. Os gru- pos alcanoíla não substituídos contêm de 1 a 7 carbonos. O grupo al- canoíla pode ser não substituído ou substituído (por exemplo, C1-7 al- canoíla opcionalmente substituído) como aqui descrito para o grupo alquila. A terminação “-oíla” pode ser adicionada a outro grupo aqui definido, por exemplo, arila, cicloalquila e heterociclila, para definir “ari- loíla”, “cicloalcanoíla” e “(heterociclil)oíla.” Estes grupos representam um grupo carbonila ligado à arila, cicloalquila ou heterociclila, respecti- vamente. Cada um dentre “ariloíla”, “cicloalcanoíla” e “(heterociclil)oíla” pode ser opcionalmente substituído conforme definido para “arila”, “ci- cloalquila” ou “heterociclila”, respectivamente.
[0032] O termo “alquenila”, quando aqui usado, representa grupos hidrocarbonetos de cadeia linear ou ramificada monovalentes acíclicos conpossuindo uma, duas ou três ligações duplas carbono-carbono. Exemplos não limitantes dos grupos alquenila incluem etenila, prop-1- enila, prop-2-enila, 1-metiletenila, but-1-enila, but-2-enila, but-3-enila, 1-metilprop-1-enila, 2-metilprop-1-enila e 1-metilprop-2-enila. Os gru- pos alquenila podem ser opcionalmente substituídos conforme definido neste documento para alquila.
[0033] O termo “alquenileno”, quando aqui usado, refere-se a um grupo alquenila de cadeia linear ou ramificada com um hidrogênio re- movido, tornando assim este grupo divalente. Exemplos não limitantes dos grupos alquenileno incluem eten-1,1-diíla; eten-1,2-diíla; prop-1- en-1,1-diil, prop-2-en-1,1-diíla; prop-1-en-1,2-diil, prop-1-en-1,3-diíla; prop-2-en-1,1-diíla; prop-2-en-1,2-diíla; but-1-en-1,1-diíla; but-1-en-1,2- diíla; but-1-en-1,3-diíla; but-1-en-1,4-diíla; but-2-en-1,1-diíla; but-2-en- 1,2-diíla; but-2-en-1,3-diíla; but-2-en-1,4-diíla; but-2-en-2,3-diíla; but-3- en-1,1-diíla; but-3-en-1,2-diíla; but-3-en-1,3-diíla; but-3-en-2,3-diíla; buta-1,2-dien-1,1-diíla; buta-1,2-dien-1,3-diíla; buta-1,2-dien-1,4-diíla; buta-1,3-dien-1,1-diíla; buta-1,3-dien-1,2-diíla; buta-1,3-dien-1,3-diíla; buta-1,3-dien-1,4-diíla; buta-1,3-dien-2,3-diíla; buta-2,3-dien-1,1-diíla; e buta-2,3-dien-1,2-diila. O grupo alquenileno pode ser não substituído ou substituído (por exemplo, alquenileno opcionalmente substituído) conforme descrito para alquila.
[0034] O termo “alcóxi”, quando aqui usado, representa um substi- tuinte químico de fórmula –OR, onde R é um grupo C1-6 alquila, a me- nos que especificado de outra forma. Em algumas modalidades, o grupo alquila pode ser ainda substituído conforme definido neste do- cumento. O termo “alcóxi” pode ser combinado com outros termos aqui definidos, por exemplo, arila, cicloalquila ou heterociclila, para definir grupos “aril alcóxi”, “cicloalquil alcóxi” e “(heterociclil) alcóxi”. Esses grupos representam um alcóxi que é substituído por arila, cicloalquila ou heterociclila, respectivamente. Cada um dentre “aril alcóxi”, “ciclo-
alquil alcóxi” e “(heterociclil) alcóxi” pode ser opcionalmente substituído conforme definido neste documento para cada porção individual.
[0035] O termo “alquila”, quando aqui usado, refere-se a um grupo hidrocarboneto saturado de cadeia linear ou ramificada acíclica, que, quando não substituído, possui de 1 a 12 carbonos, a menos que es- pecificado de outra forma. Em certas modalidades preferidas, alquila não substituída possui de 1 a 6 carbonos. Os grupos alquila são exemplificados por metila; etila; n- e iso-propila; n-, sec-, iso- e terc- butila; neopentila e similares, e podem ser opcionalmente substituídos, permitindo a valência, com um, dois, três ou, no caso de grupos alquila de dois carbonos ou mais, quatro ou mais substituintes independente- mente selecionados do grupo que consiste em: amino; arila; arilóxi; azido; cicloalquila; cicloalcóxi; cicloalquenila; cicloalquinila; halo; hete- rociclila; (heterociclil) óxi; hidróxi; nitro; tiol; silila; ciano; =O; =S; =NR’, onde R’ é H, alquila, arila ou heterociclila. Cada um dos substituintes pode ser ele próprio não substituído ou, se a valência permitir, substi- tuído com substituinte (s) não substituído (s) aqui definido para cada grupo respectivo.
[0036] O termo “alquilamino”, quando aqui usado, refere-se a um grupo com a fórmula –N(RN1)2 ou –NHRN1, em que RN1 é alquila, conforme definido neste documento. A porção alquila de alquilamino pode ser opcionalmente substituída con- forme definido para alquila. Cada substituinte opcional no alquilamino substituído pode ser ele próprio não substituído ou, se a valência per- mitir, substituído com substituinte (s) não substituído (s) aqui definido (s) para cada grupo respectivo.
[0037] O termo “alquil cicloalquileno”, quando aqui usado, refere- se a um grupo hidrocarboneto divalente saturado que é um alquil ci- cloalcano, no qual duas valências substituem dois átomos de hidrogê- nio. De preferência, pelo menos uma das duas valências está presente na porção de cicloalcano. As porções de alcano e cicloalcano podem ser opcionalmente substituídas como os grupos individuais, conforme descrito neste documento.
[0038] O termo “alquileno”, quando aqui usado, refere-se a um grupo hidrocarboneto divalente saturado que é um hidrocarboneto sa- turado de cadeia linear ou ramificada, em que duas valências substitu- em dois átomos de hidrogênio. A valência do alquileno aqui definida não inclui os substituintes opcionais. Exemplos não limitantes do grupo alquileno incluem metileno, etano-1,2-diíla, etano-1,1-diíla, propano- 1,3-diíla, propano-1,2-diíla, propano-1,1-diíla, propano-2,2-diíla, buta- no-1,4-diíla, butano-1,3-diíla, butano-1,2-diíla, butano-1,1-diíla e buta- no-2,2-diíla, butano-2,3-diíla. O termo “Cx-y alquileno” representa gru- pos alquileno possuindo entre os carbonos x e y. Os valores exempla- res para x são 1, 2, 3, 4, 5 e 6, e os valores exemplares para y são 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 e 12. O alquileno pode ser opcionalmente substituído conforme descrito neste documento para alquila.
[0039] O termo “alquilsulfenila”, quando aqui usado, representa um grupo de fórmula –S-(alquil). Alquilsulfenila pode ser opcionalmente substituída conforme definido para alquila.
[0040] O termo “alquilsulfinila”, quando aqui usado, representa um grupo de fórmula –S(O)-(alquil). Alquilsulfinila pode ser opcionalmente substituída conforme definido para alquila.
[0041] O termo “alquilsulfonila”, quando aqui usado, representa um grupo de fórmula –S(O)2– (alquil). Alquilsulfonila pode ser opcional- mente substituída conforme definido para alquila.
[0042] O termo “alquinila”, quando aqui usado, representa grupos hidrocarbonetos monovalentes de cadeia linear ou ramificada de dois a seis átomos de carbono conpossuindo pelo menos uma ligação tripla carbono-carbono e é exemplificado por etinila, 1-propinila e similares . Os grupos alquinila podem ser não substituídos ou substituídos (por exemplo, alquinila opcionalmente substituída) conforme definido para alquila.
[0043] O termo “5-alquiniluridina”, quando aqui usado, representa um nucleosídeo, no qual a nucleobase é 5-alquiniluracila com a se- guinte estrutura:
[0044] , onde R é uma ligação ao carbono anomérico da pentafuranose do nucleosídeo, e X é alquinila. Em algumas modalida- des, X é etinila ou propinil (por exemplo, X é etinila).
[0045] O termo “alquinileno”, quando aqui usado, refere-se a um substituinte divalente de cadeia linear ou ramificada incluindo uma ou duas ligações triplas carbono-carbono e conpossuindo apenas C e H quando não substituído. Exemplos não limitantes dos grupos alquinile- no incluem etin-1,2-diíla; prop-1-in-1,3-diíla; prop-2-in-1,1-diíla; but-1- in-1,3-diíla; but-1-in-1,4-diíla; but-2-in-1,1-diíla; but-2-in-1,4-diíla; but-3- in-1,1-diíla; but-3-in-1,2-diíla; but-3-in-2,2-diíla; e buta-1,3-diin-1,4-diíla. O grupo alquinileno pode ser não substituído ou substituído (por exemplo, alquinileno opcionalmente substituído) conforme descrito pa- ra os grupos alquinila.
[0046] O termo “amino”, quando aqui usado, representa –N(RN1)2, onde, se amino não for substituído, ambos RN1 são H; ou, se amino for substituído, cada RN1 é independentemente H, -O H, -NO2, -N(RN2)2, - SO2ORN2, -SO2RN2, -SORN2, -COORN2, um grupo protetor de N, alqui- la, alquenila, alquinila, alcóxi, arila, arilalquila, arilóxi, cicloalquila, cicloalquenila, heteroalquila ou heterociclila, desde que pelo menos um RN1 não seja H, e onde cada RN2 é independentemente H, alquila ou arila. Cada um dos substituintes pode ser ele próprio não substituído ou substituído com substituinte (s) não substituído (s) aqui definido pa- ra cada respectivo grupo. Em algumas modalidades, amino é amino não substituído (ou seja, -NH2) ou amino substituído (por exemplo, - NHRN1), onde RN1 é independentemente -O H, -SO2ORN2, -SO2RN2, - SORN2, -COORN2, alquila opcionalmente substituída ou arila opcional- mente substituída, e cada RN2 pode ser alquila opcionalmente sub- stituída ou arila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, o amino substituído pode ser alquilamino, em que os grupos alquila são opcionalmente substituídos como aqui descrito para alquila. Em certas modalidades, um grupo amino é –NHRN1, no qual RN1 é alquila opcionalmente substituída. Exemplos não limitantes de –NHRN1, em que RN1 é alquila opcionalmente substituída, incluem: alquilamino op- cionalmente substituído, um aminoácido proteinogênico, um ami- noácido não proteinogênico, um C1-6 alquil éster de um aminoácido proteinogênico e um C1-6 alquil éster de um aminoácido não proteino- gênico.
[0047] O termo “aminoalquila”, quando aqui usado, representa um alquila substituída com um, dois ou três grupos amino, conforme definido neste documento. A aminoalquila pode ser ainda opcional- mente substituída conforme descrito para os grupos alquila.
[0048] O termo “areno-tetraíla”, quando aqui usado, representa um grupo tetravalente que é um grupo arila, no qual três átomos de hidrogênio são substituídos por valências. Areno-tetraíla pode ser op- cionalmente substituída como aqui descrito para arila.
[0049] O termo “arila”, quando aqui usado, representa um siste- ma de anel carbocíclico mono-, bicíclico ou multicíclico com um ou dois anéis aromáticos. O grupo arila pode incluir de 6 a 10 átomos de carbono. Todos os átomos dentro de um grupo arila carbocíclico não substituído são átomos de carbono. Exemplos não limitantes de grupos arila carbocíclicos incluem fenila, naftila, 1,2-di-hidronaftila, 1,2,3,4-tetra-hidronaftila, fluorenila, indanila, indenila, etc. O grupo arila pode ser não substituído ou substituído por um, dois, três, quatro ou cinco substituintes independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em: alquila; alquenila; alquinila; alcoxila; alquilsulfinila; alquilsulfenila; alquilsulfonila; amino; arila; arilóxi; azido; cicloalquila; cicloalcóxi; cicloalquenila; cicloalquinila; halo; heteroalquila; hetero- ciclila; (heterociclil) óxi; hidróxi; nitro; tiol; silila; e ciano. Cada um dos substituintes pode ser ele próprio não substituído ou substituído com substituinte (s) não substituído (s) aqui definido para cada respectivo grupo.
[0050] O termo “aril alquila”, quando aqui usado, representa um grupo alquila substituído por um grupo arila. As porções arila e alquila podem ser opcionalmente substituídas como os grupos individuais, conforme descrito neste documento.
[0051] O termo “aril alquileno”, quando aqui usado, representa um grupo aril alquila, no qual um átomo de hidrogênio é substituído por uma valência. Aril alquileno pode ser opcionalmente substituído con- forme descrito neste documento para aril alquila.
[0052] O termo “arileno”, quando aqui usado, representa um grupo arila, no qual um átomo de hidrogênio é substituído por uma valência. Arileno pode ser opcionalmente substituído conforme descri- to neste documento para arila.
[0053] O termo “arilóxi”, quando aqui usado, representa um sub- stituinte químico de fórmula –OR, em que R é um grupo arila, a menos que especificado de outra forma. Em arilóxi opcionalmente substituído, o grupo aril é opcionalmente substituído como descrito aqui para arila.
[0054] O termo “porção auxiliar”, quando aqui usado, representa um grupo monovalente conpossuindo um polímero hidrofílico, um pol- ímero carregado positivamente ou um álcool de açúcar.
[0055] O termo “N opcionalmente substituído”, quando aqui usa- do, representa um grupo –N(RN1)- divalente ou um grupo –N= trivalen- te. O grupo aza pode ser não substituído, onde RN1 é H ou ausente, ou substituído, onde RN1 é conforme definido para “amino”, exceto que RN1 não seja H. Dois grupos aza podem ser conectados para formar “diaza”.
[0056] O termo “amino N-protegido opcionalmente substituído”, quando aqui usado, representa amino substituído, tal como aqui definido, em que pelo menos um substituinte é um grupo protetor de N e o outro substituinte é H, se N-protegido amino é não substituído, ou um substituinte diferente de H, se amino N-protegido for substituído.
[0057] O termo “azido”, quando aqui usado, representa um grupo - N3.
[0058] O termo “grupo de carga”, quando aqui usado, representa qualquer substituinte ou grupo de substituintes conforme definido nes- te documento, em que a ligação do radical ao dissulfeto é um átomo de carbono que carrega um átomo de hidrogênio ou menos se o radi- cal for hibridizado com sp3 carbono ou não contém átomos de hidrogê- nio se o radical for carbono hibridizado com sp2. O radical não é car- bono hibridizado com sp. O grupo de carga se liga ao dissulfeto ape- nas por meio de um átomo de carbono.
[0059] O termo “estrutura 5’-5’”, quando aqui usado, representa um grupo de fórmula R'-Nuc1-O-(LP)n-, onde R' é fosfato, fosforotioato, fosforoditioato, fosfotriéster, fosfodiéster, hidroxila ou hidrogênio; Nuc1 é um nucleosídeo; cada LP é independentemente –P(= XE1)(-XE2–RE2A) –O–; e n é 1, 2 ou 3; onde cada XE1 e cada XE2 é independentemente O ou S, e cada RE2A é independentemente hidrogênio, um grupo biorreversível, um grupo não biorreversível, uma porção auxiliar, um grupo de conju- gação, um ligante ligado a uma porção de direcionamento ou um ligan- te ligado a uma porção de direcionamento e uma ou mais (por exem- plo, 1 a 6) porções auxiliares; e onde R' está ligado ao carbono 3' do nucleosídeo, e –O–
está ligado ao carbono 5’ do nucleosídeo.
[0060] O termo “grupo de tamponamento”, quando aqui usado, re- presenta um grupo monovalente ou divalente situado no terminal 5’ ou 3' de um polinucleotídeo. O grupo de tamponamento é um fosfoéster terminal; difosfato; trifosfato; uma porção auxiliar; um grupo biorrever- sível; um grupo não biorreversível; estrutura 5’ (por exemplo, estrutura 5’-5’); suporte sólido; um ligante ligado a uma porção de direcionamen- to e, opcionalmente, a uma ou mais (por exemplo, 1 a 6) porções auxi- liares; ou um grupo –OR’, onde R' é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, um grupo biorreversível, grupo não biorrever- sível, suporte sólido e grupo O-protetor. Grupo –OR’, difosfato, trifosfa- to, grupo biorreversível, grupo não biorreversível, suporte sólido e por- ção auxiliar são exemplos de grupos de tamponamento monovalentes. Um fosfoéster terminal é um exemplo de um grupo de tamponamento que pode ser monovalente, se o fosfoéster terminal não incluir um li- gante para uma porção de direcionamento, ou divalente, se o fosfoés- ter terminal incluir um ligante para uma porção de direcionamento. Um ligante ligado a uma porção de direcionamento (com ou sem porções auxiliares) é um exemplo de um grupo de tamponamento divalente.
[0061] O termo “carbocíclico”, quando aqui usado, representa uma estrutura C3-16 monocíclica, bicíclica ou tricíclica opcionalmente substi- tuída na qual os anéis, que podem ser aromáticos ou não aromáticos, são formados por átomos de carbono. As estruturas carbocíclicas in- cluem cicloalquila, cicloalquenila, cicloalquinila e certos grupos arila.
[0062] O termo “carbonila”, quando aqui usado, representa um grupo -C(O)-.
[0063] A expressão “Cx-y”, quando aqui usada, indica que o grupo, cujo nome segue imediatamente a expressão, quando não substituído, contém um total de x a y átomos de carbono. Se o grupo for um grupo composto (por exemplo, aril alquila), Cx-y indica que a porção, cujo no-
me segue imediatamente a expressão, quando não substituída, con- tém um total de x a y átomos de carbono. Por exemplo, (C6-10-arila)-C1- 6-alquila é um grupo, no qual a porção arila, quando não substituída, contém um total de 6 a 10 átomos de carbono, e a porção alquila, quando não substituída, contém um total de 1 a 6 átomos de carbono.
[0064] O termo “ciano”, quando aqui usado, representa o grupo – CN.
[0065] O termo “reação de cicloadição”, quando aqui usado, repre- senta a reação de dois componentes em que um total de [4n +2] elé- trons π estão envolvidos na formação da ligação quando não há ativa- ção, ativação por um catalisador químico ou ativação usando energia térmica e n é 1, 2 ou 3. Uma reação de cicloadição também é uma re- ação de dois componentes em que [4n] elétrons π estão envolvidos, há ativação fotoquímica e n é 1, 2 ou 3. Desejavelmente, [4n +2] elé- trons π estão envolvidos na formação da ligação, e n = 1. As reações de cicloadição representativas incluem a reação de um alceno com um 1,3-dieno (reação de Diels-Alder), a reação de um alceno com uma carbonil α,β-insaturada (reação de hetero Diels-Alder) e a reação de um alquino com um composto azido (por exemplo, cicloadição de Huisgen).
[0066] O termo “cicloalquenila”, quando aqui usado, refere-se a um grupo carbocíclico não aromático com pelo menos uma ligação dupla no anel e de três a dez carbonos (por exemplo, uma C3-C10 cicloalque- nila), a menos que especificado de outra forma. Exemplos não limitan- tes de cicloalquenila incluem cicloprop-1-enila, cicloprop-2-enila, ciclo- but-1-enila, ciclobut-1-enila, ciclobut-2-enila, ciclopent-1-enila, ciclo- pent-2-enila, ciclopent -3-enila, norbornen-1-ila, norbornen-2-ila, nor- bornen-5-ila e norbornen-7-ila. O grupo cicloalquenila pode ser não substituído ou substituído (por exemplo, cicloalquenila opcionalmente substituída) como descrito para cicloalquila.
[0067] O termo “cicloalquenil alquila”, quando aqui usado, repre- senta um grupo alquila substituído com um grupo cicloalquenila, cada um conforme definido neste documento. As porções cicloalquenila e alquila podem ser substituídas como os grupos individuais aqui defini- dos.
[0068] O termo “cicloalquenileno”, quando aqui usado, representa um grupo divalente que é um grupo cicloalquenila, no qual um átomo de hidrogênio é substituído por uma valência. Cicloalquenileno pode ser opcionalmente substituído conforme descrito neste documento pa- ra cicloalquila. Um exemplo não limitante de cicloalquenileno é cicloal- cen-1,3-diíla.
[0069] O termo “cicloalcóxi”, quando aqui usado, representa um substituinte químico de fórmula –OR, em que R é um grupo cicloalqui- la, a menos que especificado de outra forma. Em algumas modalida- des, o grupo cicloalquila pode ser ainda substituído conforme definido neste documento.
[0070] O termo “cicloalquila”, quando aqui usado, refere-se a um grupo alquila cíclico possuindo de três a dez carbonos (por exemplo, uma C3-C10 cicloalquila), a menos que especificado de outra forma. Os grupos cicloalquila podem ser monocíclicos ou bicíclicos. Os grupos cicloalquila bicíclicos podem ser do tipo biciclo[p.q.0]alquila, em que cada um dentre p e q é, independentemente, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, des- de que a soma de p e q seja 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8. Alternativamente, grupos cicloalquila bicíclicos podem incluir estruturas cicloalquila em ponte, por exemplo, biciclo[p.q.r]alquila, em que r é 1, 2 ou 3, cada um dentre p e q é, independentemente, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, desde que a so- ma de p, q e r seja 3, 4, 5, 6, 7 ou 8. O grupo cicloalquila pode ser um grupo espirocíclico, por exemplo, espiro[p.q]alquila, em que cada um dentre p e q é, independentemente, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, desde que a so- ma de p e q seja 4, 5, 6, 7, 8, ou 9. Exemplos não limitantes de cicloal-
quil incluem ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclohexila, ciclohepti- la, 1-biciclo[2.2.1.]heptila, 2-biciclo[2.2.1.]heptila, 5- biciclo[2.2.1.]heptila, 7-biciclo[2.2.1.]heptila e decalinila. O grupo ciclo- alquila pode ser não substituído ou substituído (por exemplo, cicloal- quila opcionalmente substituída) com um, dois, três, quatro ou cinco substituintes independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em: alquila; alquenila; alquinila; alcoxila; alquilsulfinila; alqui- lsulfenila; alquilsulfonila; amino; arila; arilóxi; azido; cicloalquila; ciclo- alcóxi; cicloalquenila; cicloalquinila; halo; heteroalquila; heterociclila; (heterociclil)óxi; hidróxi; nitro; tiol; silila; ciano; =O; =S; =NR’, onde R’ é H, alquila, arila ou heterociclila. Cada um dos substituintes pode ser ele próprio não substituído ou substituído com substituinte (s) não substituído (s) aqui definido para cada respectivo grupo.
[0071] O termo “cicloalquil alquila”, quando aqui usado, representa um grupo alquila substituído com um grupo cicloalquila, cada um con- forme definido neste documento. As porções cicloalquila e alquila po- dem ser opcionalmente substituídas como os grupos individuais aqui descritos.
[0072] O termo “cicloalquileno”, quando aqui usado, representa um grupo divalente que é um grupo cicloalquila, no qual um átomo de hi- drogênio é substituído por uma valência. Um exemplo não limitante de cicloalquileno é cicloalcano-1,3-diíla. Cicloalquileno pode ser opcio- nalmente substituído conforme descrito neste documento para cicloal- quila.
[0073] O termo “cicloalquinila”, quando aqui usado, refere-se a um grupo carbocíclico monovalente possuindo uma ou duas ligações tri- plas carbono-carbono e possuindo de oito a doze carbonos, a menos que especificado de outra forma. Cicloalquinila pode incluir uma liga- ção ou ponte transanular. Exemplos não limitantes de cicloalquinila incluem ciclo-octinila, ciclonononila, ciclodecinila e ciclodecadiinila. O grupo cicloalquinila pode ser não substituído ou substituído (por exem- plo, cicloalquinila opcionalmente substituída) conforme definido para cicloalquila.
[0074] O termo “grupo di-hidropiridazina”, quando aqui usado, re- presenta um grupo divalente obtido através da cicloadição entre o gru- po 1,2,4,5-tetrazina e uma cicloalquenila deformada.
[0075] O termo “halo”, quando aqui usado, representa um halogê- nio selecionado de bromo, cloro, iodo e flúor.
[0076] O termo “5-halouridina”, quando aqui usado, representa um nucleosídeo, em que a nucleobase é 5-halouracila com a seguinte es- trutura: , onde R é uma ligação ao carbono anomérico da pentafu- ranose do nucleosídeo, e X é flúor, cloro, bromo ou iodo. Em algumas modalidades, X é bromo ou iodo.
[0077] O termo “heteroalcano-tetraíla”, quando aqui usado, refere- se a um grupo alcano-tetraíla interrompido uma vez por um heteroá- tomo; duas vezes, cada vez, independentemente, por um heteroáto- mo; três vezes, a cada vez, independentemente, por um heteroátomo; ou quatro vezes, cada vez, independentemente, por um heteroátomo. Cada heteroátomo é, independentemente, O, N ou S. Em algumas modalidades, o heteroátomo é O ou N. Uma CX-Y heteroalcano tetraíla não substituída contém de X a Y átomos de carbono, bem como os heteroátomos conforme definido neste documento. O grupo heteroal- cano-tetraíla pode ser não substituída ou substituído (por exemplo, he- teroalcano-tetraíla opcionalmente substituída), conforme descrito para heteroalquila.
[0078] O termo “heteroalcano-triíla”, quando aqui usado refere-se a um grupo alcano-triíla interrompido uma vez por um heteroátomo;
duas vezes, cada vez, independentemente, por um heteroátomo; três vezes, a cada vez, independentemente, por um heteroátomo; ou qua- tro vezes, cada vez, independentemente, por um heteroátomo. Cada heteroátomo é, independentemente, O, N ou S. Em algumas modali- dades, o heteroátomo é O ou N. Uma CX-Y heteroalcano-triíla não substituída contém de X a Y átomos de carbono, bem como os hetero- átomos conforme definido neste documento. O grupo heteroalcano- triíla pode ser não substituído ou substituído (por exemplo, heteroalca- no-triíla opcionalmente substituída), conforme descrito para heteroal- quila.
[0079] O termo “heteroalquila”, quando aqui usado, refere-se a um grupo alquila, alquenila ou alquinila interrompido uma vez por um ou dois heteroátomos; duas vezes, cada vez, independentemente, por um ou dois heteroátomos; três vezes, cada vez, independentemente, por um ou dois heteroátomos; ou quatro vezes, cada vez, independente- mente, por um ou dois heteroátomos. Cada heteroátomo é, indepen- dentemente, O, N ou S. Em algumas modalidades, o heteroátomo é O ou N. Nenhum dos grupos heteroalquila inclui dois átomos de oxigênio ou enxofre contíguos. O grupo heteroalquila pode ser não substituído ou substituído (por exemplo, heteroalquila opcionalmente substituída). Quando heteroalquila é substituída e o substituinte está ligado ao hete- roátomo, o substituinte é selecionado de acordo com a natureza e va- lência do heteroátomo. Assim, o substituinte ligado ao heteroátomo, se a valência permitir, é selecionado a partir do grupo que consiste em =O, -N(RN2)2, -SO2ORN3, -SO2RN2, -SORN3, -COORN3, um grupo prote- tor de N, alquila, alquenila, alquinila, arila, cicloalquila, cicloalquenila, cicloalquinila, heterociclila ou ciano, onde cada RN2 é independente- mente H, alquila, cicloalquila, cicloalquenila, cicloalquinila, arila ou he- terociclila, e cada RN3 é independentemente alquila, cicloalquila, arilal- quenila, ou heterociclila. Cada um destes substituintes pode ser ele próprio não substituído ou substituído com substituinte (s) não substi- tuído (s) aqui definido para cada respectivo grupo. Quando heteroalquil é substituído e o substituinte está ligado ao carbono, o substituinte é selecionado daqueles descritos para alquila, desde que o substituinte no átomo de carbono ligado ao heteroátomo não seja Cl, Br ou I. En- tende-se que os átomos de carbono são encontrados nas extremida- des de um grupo heteroalquila.
[0080] O termo “heteroarilóxi”, quando aqui usado, refere-se a uma estrutura –OR, na qual R é heteroarila. Heteroarilóxi pode ser opcio- nalmente substituído conforme definido para heterociclila.
[0081] O termo “heterociclila”, quando aqui usado, representa um sistema de anel monocíclico, bicíclico, tricíclico ou tetracíclico possuin- do anéis fundidos ou em ponte de 5, 6, 7 ou 8 membros, a menos que especificado de outra forma, conpossuindo um, dois, três ou quatro heteroátomos selecionados independentemente do grupo que consiste em nitrogênio, oxigênio e enxofre. Heterociclila pode ser aromático ou não aromático. Heterociclila não aromática de 5 membros possui zero ou uma ligação dupla, grupos heterociclila não aromáticos de 6 e 7 membros têm zero a duas ligações duplas e grupos heterociclila não aromáticos de 8 membros têm zero a duas ligações duplas e/ou zero ou uma ligação tripla carbono-carbono. Os grupos heterociclila incluem de 1 a 16 átomos de carbono, a menos que especificado de outra for- ma. Certos grupos heterociclila podem incluir até 9 átomos de carbo- no. Grupos heterociclila não aromáticos incluem pirrolinila, pirrolidinila, pirazolinila, pirazolidinila, imidazolinila, imidazolidinila, piperidinila, ho- mopiperidinila, piperazinila, piridazinila, oxazolidinila, isoxazolidiniila, morfolinila, tiomorfolinila, tiazolidinila, isotiazolidinila, tiazolidinila, tetra- hidrofuranila, di-hidrofuranila, tetra-hidrotienila, di-hidrotienila, di- hidroindolila, tetra-hidroquinolila, tetra-hidroisoquinolila, piranila, di- hidropiranila, ditiazolila, etc. Se o sistema de anel heterocíclico possui pelo menos uma estrutura de ressonância aromática ou pelo menos um tautômero aromático, tal estrutura é uma heterociclila aromática (isto é, heteroarila). Exemplos não limitantes de grupos heteroarila in- cluem benzimidazolila, benzofurila, benzotiazolila, benzotienila, ben- zoxazolila, furila, imidazolila, indolila, isoindazolila, isoquinolinila, isoti- azolila, isotiazolila, isoxazolila, oxadiazolila, oxazolila, purinila, pirrolila, piridinila, pirazinila, pirimidinila, qunazolinila, quinolinila, tiadiazolil (por exemplo, 1,3,4-tiadiazol), tiazolila, tienila, triazolila, tetrazolila, etc. O termo “heterociclila” também representa um composto heterocíclico com uma estrutura multicíclica em ponte na qual um ou mais carbonos e/ou heteroátomos ligam dois membros não adjacentes de um anel monocíclico, por exemplo, quinuclidina, tropanos ou diaza-biciclo[2.2.2 ]octano. O termo “heterociclila” inclui grupos bicíclicos, tricíclicos e te- tracíclicos nos quais qualquer um dos anéis heterocíclicos acima é fundido a um, dois ou três anéis carbocíclicos, por exemplo, um anel arila, um anel ciclohexano, um anel ciclohexeno, um anel ciclopentano, um anel ciclopenteno ou outro anel heterocíclico monocíclico. Exem- plos de heterociclilos fundidos incluem 1,2,3,5,8,8a-hexa- hidroindolizina; 2,3-di-hidrobenzofurano; 2,3-di-hidroindol; e 2,3-di- hidrobenzotiofeno. O grupo heterociclila pode ser não substituído ou substituído com um, dois, três, quatro ou cinco substituintes indepen- dentemente selecionados a partir do grupo que consiste em: alquila; alquenila; alquinila; alcoxila; alquilsulfinila; alquilsulfenila; alquilsulfoni- la; amino; arila; arilóxi; azido; cicloalquila; cicloalcóxi; cicloalquenila; cicloalquinila; halo; heteroalquila; heterociclila; (heterociclil)óxi; hidróxi; nitro; tiol; silila; ciano; =O; =S; =NR’, onde R’ é H, alquila, arila ou hete- rociclila. Cada um dos substituintes pode ser ele próprio não substituí- do ou substituído com substituinte (s) não substituído (s) aqui definido para cada respectivo grupo.
[0082] O termo “heterociclil alquila”, quando aqui usado, represen-
ta um grupo alquila substituído por um grupo heterociclila, cada um conforme definido neste documento. As porções de heterociclila e al- quila podem ser opcionalmente substituídas como os grupos individu- ais aqui descritos.
[0083] O termo “(heterociclil)aza”, quando aqui usado, representa um substituinte químico de fórmula –N(RN1) (RN2), onde RN1 é um gru- po heterociclila e RN2 é H, -O H, -NO2, - N(RN2)2, -SO2ORN2, -SO2RN2, - SORN2, -COORN2, um grupo protetor de N, alquila, alquenila, alquinila, alcóxi, arila, arilalquila, arilóxi, cicloalquila, cicloalquenila, heteroalquila ou heterociclila. De preferência, RN2 é H.
[0084] O termo “heterociclileno”, quando aqui usado, representa um grupo heterociclila, no qual um átomo de hidrogênio é substituído por uma valência. O heterociclileno pode ser opcionalmente substituí- do de uma maneira descrita para heterociclila. Um exemplo não limi- tante de heterociclileno é heterociclo-1,3-diíla.
[0085] O termo “(heterociclil)óxi”, quando aqui usado, representa um substituinte químico de fórmula –OR, em que R é um grupo hete- rociclila, a menos que especificado de outra forma. (Heterociclil)óxi pode ser opcionalmente substituído de uma maneira descrita para he- terociclila.
[0086] Os termos “hidroxila” e “hidróxi”, conforme usados indistintamente neste documento, representam um grupo -OH.
[0087] O termo “polinucleotídeo imunomodulador”, quando aqui usado, representa um construto de polinucleotídeo conpossuindo um total de 6 a 50 nucleosídeos contíguos covalentemente ligados entre si por grupos de ligação de internucleosídeos independentemente sele- cionados do grupo que consiste em fosfoésteres internucleosídeos e, opcionalmente, espaçadores abásicos internucleosídeos. Os polinu- cleotídeos imunomoduladores são tamponados nos terminais 5’ e 3’ com grupos de tamponamento 5’ e 3’, respectivamente. Os polinucleo-
tídeos imunomoduladores são capazes de modular uma resposta imu- ne inata, conforme determinado por, por exemplo, uma mudança na ativação de NFκB ou uma mudança na secreção de pelo menos uma citocina inflamatória ou pelo menos um interferon tipo I em uma célula apresentadora de antígeno para o qual um polinucleotídeo imunomo- dulador foi liberado (por exemplo, em comparação com outra célula apresentadora de antígeno para a qual um polinucleotídeo imunomo- dulador não foi liberado). O polinucleotídeo imunomodulador pode con- ter um grupo de conjugação ou, se o polinucleotídeo imunomodulador for parte de um conjugado, um ligante ligado a uma porção de direcio- namento e, opcionalmente, a uma ou mais (por exemplo, 1 a 6) por- ções auxiliares (por exemplo, polietilenoglicóis). O grupo de conjuga- ção ou o ligante pode ser parte do fosfotriéster ou do grupo de prote- ção terminal.
[0088] O termo “polinucleotídeo imunoestimulante”, quando aqui usado, representa um polinucleotídeo imunomodulante capaz de ativar uma resposta imune inata, conforme determinado por, por exemplo, um aumento na ativação de NFκB ou um aumento na secreção de pe- lo menos uma citocina inflamatória ou pelo menos um interferon tipo I em uma célula apresentadora de antígeno à qual um polinucleotídeo imunoestimulante foi liberado (por exemplo, em comparação com outra célula apresentadora de antígeno para a qual um polinucleotídeo imu- noestimulante não foi liberado). Em algumas modalidades, o polinu- cleotídeo imunoestimulante contém pelo menos uma sequência de ci- tidina-p-guanosina (CpG), em que p é um fosfodiéster de internucleo- sídeo (por exemplo, fosfato ou fosforotioato) ou um fosfotriéster ou fos- fotiotriéster internucleosídeo. Quando aqui usado, o polinucleótido imunoestimulante conpossuindo CpG pode existir naturalmente, tal como CpG ODNs de origem bacteriana ou viral, ou sintético. Por exemplo, em algumas modalidades, a sequência CpG no polinucleotí-
deo imunoestimulante contém 2'-desoxirribose. Em algumas modali- dades, a sequência CpG no polinucleotídeo imunoestimulante não é metilada. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo imunoestimulan- te é um polinucleotídeo de Fórmula (A), conforme fornecido neste do- cumento. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo imunoestimu- lante é um composto de Fórmula (B), conforme fornecido neste docu- mento.
[0089] O termo “polinucleotídeo imunossupressor”, quando aqui usado, representa um polinucleotídeo imunomodulante capaz de anta- gonizar uma resposta imune inata, conforme determinado, por exem- plo, por uma redução na ativação de NFκB ou uma redução na secre- ção de pelo menos uma citocina inflamatória ou pelo menos um inter- feron tipo I em uma célula apresentadora de antígeno para a qual um polinucleotídeo imunossupressor foi liberado (por exemplo, em compa- ração com outra célula apresentadora de antígeno para a qual um po- linucleotídeo imunossupressor não foi liberado).
[0090] O termo “grupo em ponte de internucleosídeo”, quando aqui usado, representa um fosfoéster de internucleosídeo ou um espaçador abásico de internucleosídeo.
[0091] O termo “citidina modificada em 5”, quando aqui usado, re- presenta um nucleosídeo, no qual a nucleobase possui a seguinte es- trutura: , onde R é uma ligação ao carbono anomérico da pentafu- ranose do nucleosídeo, e X é halogênio, alquinila, alquenila, alquila, cicloalquila, heterociclila ou arila. Em algumas modalidades, a citidina modificada em 5 é 5-halo citidina (por exemplo, 5-iodo citidina ou 5- bromo citidina). Em outras modalidades, a citidina modificada em 5 é 5-alquinil citidina.
[0092] O termo “uridina modificada em 5”, quando aqui usado, re- presenta um nucleosídeo, no qual a nucleobase possui a seguinte es- trutura: , onde R é uma ligação ao carbono anomérico da pentafu- ranose do nucleosídeo, e X é halogênio, alquila, alquenila, alquinila, cicloalquila, heterociclila ou arila, desde que a uridina modificada em 5 não seja timidina. Em algumas modalidades, a uridina modificada em 5 é 5-halouridina (por exemplo, 5-iodouridina ou 5-bromouridina). Em outras modalidades, a uridina modificada em 5 é 5-alquinil uridina. Em algumas modalidades, a uridina modificada em 5 é um nucleosídeo conpossuindo 2-desoxirribose.
[0093] O termo “não biorreversível”, quando aqui usado, refere-se a um grupo químico que é resistente à degradação sob as condições existentes dentro de um endossoma. Os grupos não biorreversíveis não contêm tioésteres e/ou dissulfetos.
[0094] O termo “nucleobase”, quando aqui usado, representa um anel heterocíclico conpossuindo nitrogênio ligado à posição 1 'da fra- ção de açúcar de um nucleotídeo ou nucleosídeo. As nucleobases po- dem ser não modificadas ou modificadas. Quando aqui usado, nucleo- bases “não modificadas” ou “naturais” incluem as bases de purina adenina (A) e guanina (G) e as bases de pirimidina timina (T), citosina (C) e uracila (U). Nucleobases modificadas incluem outras nucleoba- ses sintéticas e naturais, como 5-metilcitosina (5-me-C ou m5c), 5- hidroximetila citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metila e outros derivados de alquila de adenina e guanina, 2- propila e outros derivados de alquila de adenina e guanina, 2-tiouracila, 2-tiotimina e 2- tiocitosina, 5-halouracila e citosina, 5-propinil uracila e citosina, 6-azo uracila, citosina e timina, 5-uracil (pseudouracila), 4-tiouracila, 8-halo,
8-amino, 8-tiol, 8-tioalquila, 8-hidroxila e outras adeninas e guaninas 8- substituídas, 5-halo particularmente 5-iodo, 5-bromo, 5-trifluorometila e outras uracilas e citosinas 5-substituídas, 5-alquinila (por exemplo, 5- etinil) uracila, 5-acetamido-uracila, 7-metilguanina e 7-metiladenina, 8- azaguanina e 8-azaadenina, 7-desazaguanina e 7-desazaadenina e 3- desazaguanina e 3-desazaadenina. Outras nucleobases incluem aque- las descritas na Pat. No. 3.687.808; aquelas descritas em The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, páginas 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990; os descritos por En- glisch et al., Angewandte Chemie, International Edição, 1991, 30, 613; e os descritos por Sanghvi, Y. S., Capítulo 15, Antisense Research and Applications, páginas 289 302, (Crooke et al., ed., CRC Press, 1993). Certas nucleobases são particularmente úteis para aumentar a afinidade de ligação dos polinucleotídeos hibridizados da invenção, incluindo pirimidinas 5-substituídas, 6-azapirimidinas e purinas substi- tuídas por N-2, N-6 e O-6, incluindo 2-aminopropiladenina, 5- propiniluracila e 5-propinilcitosina. As substituições de 5-metilcitosina mostraram realçar a estabilidade do duplex de ácido nucleico em 0,6- 1,2 ° C (Sanghvi et al., Eds., Antisense Research and Applications 1993, CRC Press, Boca Raton, páginas 276-278). Estes podem ser combinados, em modalidades particulares, com modificações de açú- car 2'-O-metoxietila. As patentes dos Estados Unidos que ensinam a preparação de algumas destas nucleobases modificadas, bem como de outras nucleobases modificadas, incluem, mas não estão limitadas às patentes Norte-americanas Nos. 3.687.808; 4.845.205; 5.130.302;
5.134.066; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.272; 5.457.187; 5.459.255;
5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.594.121;
5.596.091; 5.614.617; e 5.681.941 mencionadas acima. Para os fins desta descrição, “nucleobases modificadas”, quando aqui usado, re- presenta ainda nucleobases, naturais ou não naturais, que incluem um ou mais grupos de proteção, conforme descrito neste documento.
[0095] O termo “nucleosídeo”, quando aqui usado, representa uma combinação de pentafuranose-nucleobase. A pentafuranose é 2- desoxirribose ou uma versão modificada do mesmo, em que a posição 2 é substituída por OR, R, halo (por exemplo, F), S H, SR, NH2, NHR, NR2 ou CN, onde R é uma C1-6 alquila opcionalmente substituída (por exemplo, C1-6 alquila ou (C1-6 alcóxi)-C1-6-alquil) ou (C6-14 aril)-C1-4- alquila opcionalmente substituída. Em certas modalidades, a posição 2 é substituída por OR ou F, onde R é C1-6 alquila ou (C1-6-alcóxi)-C1-6- alquila. A pentafuranose está ligada a uma nucleobase no carbono anomérico. Em algumas modalidades, o termo “nucleosídeo” se refere a um grupo divalente com a seguinte estrutura: , em que B1 é uma nucleobase; Y é H, halogênio (por exemplo, F), hidroxila, C1-6 alcóxi opcionalmente substituído (por exemplo, metóxi ou metoxietóxi) ou um grupo hidroxila protegido; Y1 é H ou C1-6 alquila (por exemplo, metila); e cada um dentre 3’ e 5' indica a posição de uma ligação para outro grupo.
[0096] O termo “nucleotídeo”, quando aqui usado, refere-se a um nucleosídeo que está ligado a um fosfato, fosforotioato ou fosforoditio- ato.
[0097] O termo “fosfoéster”, quando aqui usado, representa um grupo conpossuindo um fosfato, fosforotioato ou fosforoditioato, no qual, pelo menos uma valência é covalentemente ligada a um substi- tuinte não hidrogênio, desde que pelo menos um não hidrogênio subs- tituinte é um grupo conpossuindo pelo menos um nucleosídeo. Um fos- foéster, em que uma e apenas uma valência está covalentemente li- gada a um grupo conpossuindo um nucleosídeo, é um fosfoéster ter- minal. Um fosfoéster, no qual duas valências são covalentemente liga-
das a grupos conpossuindo nucleosídeos, é um fosfoéster internucleo- sídeo. Um fosfoéster pode ser um grupo da seguinte estrutura: , onde: cada um dentre XE1 e XE2 é independentemente O ou S; cada um ou RE1 e RE3 é independentemente hidrogênio ou uma ligação a um nucleosídeo; um análogo de açúcar de um espaça- dor básico; um grupo biorreversível; um grupo não biorreversível; uma porção auxiliar; um grupo de conjugação; um ligante ligado a uma por- ção de direcionamento; um ligante ligado a uma porção de direciona- mento e uma ou mais (por exemplo, 1 a 6) porções auxiliares; ou o átomo de fósforo em um grupo de fórmula –P(=XE1)(-XE2–RE2A)–O–, onde RE2A é hidrogênio, um grupo biorreversível, um grupo não biorreversível, uma porção auxiliar, um grupo de conjugação, um ligante ligado a uma porção de direcionamento ou um ligante ligado a uma porção de direcionamento e um ou mais (por exemplo, 1 a 6) por- ções auxiliares; e
[0098] RE2 é hidrogênio, um grupo biorreversível, um grupo não biorreversível, uma porção auxiliar, um grupo de conjugação, um ligan- te ligado a uma porção de direcionamento ou um ligante ligado a uma porção de direcionamento e um ou mais (por exemplo, 1 a 6) porções auxiliares; desde que pelo menos um dentre RE1 e RE3 seja uma liga- ção a um grupo conpossuindo pelo menos um nucleosídeo.
[0099] Se cada um dentre RE1 e RE3 for independentemente uma ligação a um grupo conpossuindo pelo menos um nucleosídeo, o fos- foéster é um fosfoéster internucleosídeo. Se um dentre RE1 e RE3 for uma ligação a um grupo que não contém um nucleosídeo, o fosfoéster é um fosfoéster terminal.
[00100] O termo “fosfodiéster”, quando aqui usado, refere-se a um fosfoéster, no qual, duas das três valências são substituídas por subs- tituintes não hidrogênio, enquanto a valência restante é substituída por hidrogênio. O fosfodiéster consiste em fosfato, fosforotioato ou fosfo- roditioato; uma ou duas ligações a nucleosídeo (s), espaçador (es) abásico (s) e/ou grupo (s) fosforila; e, se o fosfodiéster contém apenas uma ligação a um nucleosídeo, um espaçador abásico ou um grupo fosforila, um grupo selecionado independentemente do grupo que con- siste em um grupo biorreversível; um grupo não biorreversível; uma porção auxiliar; um grupo de conjugação; um ligante ligado a uma por- ção de direcionamento; e um ligante ligado a uma porção de direcio- namento e uma ou mais (por exemplo, 1 a 6) porções auxiliares. Um fosfodiéster terminal inclui uma ligação a um grupo conpossuindo um nucleosídeo e um grupo selecionado do grupo que consiste em um grupo biorreversível; um grupo não biorreversível; uma porção auxiliar; um grupo de conjugação; um grupo fosforila; e um ligante ligado a uma porção de direcionamento e opcionalmente a uma ou mais (por exem- plo, 1 a 6) porções auxiliares. Um fosfodiéster internucleosídeo inclui duas ligações a grupos conpossuindo nucleosídeos. Um fosfodiéster pode ser um grupo da seguinte estrutura: , onde: cada um dentre XE1 e XE2 é independentemente O ou S; cada um ou RE1 e RE3 é independentemente hidrogênio ou uma ligação a um nucleosídeo; um análogo de açúcar de um espaça- dor básico; um grupo biorreversível; um grupo não biorreversível; uma porção auxiliar; um grupo de conjugação; um ligante ligado a uma por-
ção de direcionamento; um ligante ligado a uma porção de direciona- mento e uma ou mais (por exemplo, 1 a 6) porções auxiliares; ou o átomo de fósforo em um grupo de fórmula –P(=XE1)(-XE2–RE2A)–O–, onde RE2A é hidrogênio, um grupo biorreversível, um grupo não biorreversível, uma porção auxiliar, um grupo de conjugação, um ligante ligado a uma porção de direcionamento ou um ligante ligado a uma porção de direcionamento e um ou mais (por exemplo, 1 a 6) por- ções auxiliares; e RE2 é hidrogênio, um grupo biorreversível, um grupo não biorreversível, uma porção auxiliar, um grupo de conjugação, um ligan- te ligado a uma porção de direcionamento ou um ligante ligado a uma porção de direcionamento e um ou mais (por exemplo, 1 a 6) porções auxiliares; desde que um e apenas um dentre RE1, RE2 e RE3 seja hi- drogênio; e desde que pelo menos um dentre RE1 e RE3 seja uma liga- ção a um grupo conpossuindo pelo menos um nucleosídeo.
[00101] Se RE1 e RE3 são ligações a grupos conpossuindo pelo me- nos um nucleosídeo, o fosfodiéster é um fosfodiéster internucleosídeo. Se um e apenas um dentre RE1 e RE3 for uma ligação a um grupo con- possuindo um nucleosídeo, o fosfodiéster é um fosfodiéster terminal.
[00102] O termo “fosforila”, quando aqui usado, refere-se a um substituinte de fórmula –P(=XE1)(–XE2–RE2A)–O–RE3A, onde: cada um dentre XE1 e XE2 é independentemente O ou S; RE2A é hidrogênio, um grupo biorreversível, um grupo não biorreversível, uma porção auxiliar, um grupo de conjugação, um ligan- te ligado a uma porção de direcionamento ou um ligante ligado a uma porção de direcionamento e um ou mais (por exemplo, 1 a 6) porções auxiliares; e RE3A é hidrogênio ou uma valência aberta.
[00103] Quando um grupo é identificado como estando ligado a um fosforila, o grupo está ligado ao átomo de fósforo do fosforila.
[00104] O termo “fosfotriéster”, quando aqui usado, refere-se a um fosfotriéster, em que todas as três valências são substituídas por subs- tituintes não hidrogênio. O fosfotriéster consiste em fosfato, fosforoti- oato ou fosforoditioato; uma ou duas ligações a nucleosídeo (s), ou espaçador (es) abásico (s) e/ou grupo (s) fosforila; e um ou dois gru- pos independentemente selecionados do grupo que consiste em um grupo biorreversível; um grupo não biorreversível; uma porção auxiliar; um grupo de conjugação; e um ligante ligado a uma porção de direcio- namento e opcionalmente a uma ou mais (por exemplo, 1 a 6) porções auxiliares. Um fosfotriéster terminal inclui uma ligação a um grupo conpossuindo um nucleosídeo e dois grupos independentemente sele- cionados do grupo que consiste em um grupo biorreversível; um grupo não biorreversível; uma porção auxiliar; um grupo de conjugação; um grupo fosforila; e um ligante ligado a uma porção de direcionamento e opcionalmente a uma ou mais (por exemplo, 1 a 6) porções auxiliares. Em algumas modalidades, um fosfotriéster terminal contém 1 ou 0 li- gantes ligados a uma porção de direcionamento e, opcionalmente, a uma ou mais (por exemplo, 1 a 6) porções auxiliares. Um fosfotriéster internucleosídeo inclui duas ligações a grupos conpossuindo nucleosí- deos. Um fosfotriéster pode ser um grupo da seguinte estrutura: onde: cada um dentre XE1 e XE2 é independentemente O ou S; cada um ou RE1 e RE3 é independentemente uma ligação a um nucleosídeo; um análogo de açúcar de um espaçador básico; um grupo biorreversível; um grupo não biorreversível; uma porção auxiliar; um grupo de conjugação; um ligante ligado a uma porção de direcio- namento; um ligante ligado a uma porção de direcionamento e uma ou mais (por exemplo, 1 a 6) porções auxiliares; ou o átomo de fósforo em um grupo de fórmula –P(=XE1)(-XE2–RE2A)–O–, onde RE2A é hidrogênio; um grupo biorreversível; um grupo não biorreversível; uma porção auxiliar; um grupo de conjugação; um ligante ligado a uma porção de direcionamento; ou um ligante ligado a uma porção de direcionamento e uma ou mais (por exemplo, 1 a 6) porções auxiliares; e RE2 é um grupo biorreversível; um grupo não biorreversível; uma porção auxiliar; um grupo de conjugação; um ligante ligado a uma porção de direcionamento; ou um ligante ligado a uma porção de dire- cionamento e uma ou mais (por exemplo, 1 a 6) porções auxiliares; desde que pelo menos um dentre RE1 e RE3 seja uma liga- ção a um grupo conpossuindo pelo menos um nucleosídeo.
[00105] Se RE1 e RE3 são ligações a grupos conpossuindo pelo me- nos um nucleosídeo, o fosfotriéster é um fosfotriéster internucleosídeo. Se um e apenas um dentre RE1 e RE3 for uma ligação a um grupo con- possuindo um nucleosídeo, o fosfotriéster é um fosfotriéster terminal.
[00106] O termo “pirid-2-il hidrazona”, quando aqui usado, represen- ta um grupo da estrutura: , onde cada R’ é independentemente H ou C1-6 alquila opcionalmente substituída. A pirid-2-il hidrazona pode ser não substitu- ída (ou seja, cada R’ é H).
[00107] O termo “estereoquimicamente enriquecido”, quando aqui usado, refere-se a uma preferência estereoquímica local para uma configuração estereoisomérica do grupo recitado em relação à configu-
ração estereoisomérica oposta do mesmo grupo. Assim, um polinucle- otídeo conpossuindo um fosforotioato estereoquimicamente enriqueci- do é uma fita, na qual um fosforotioato de estereoquímica predetermi- nada está presente em preferência a um fosforotioato de estereoquí- mica oposta. Esta preferência pode ser expressa numericamente usando uma razão diastereomérica para o fosforotioato da estereo- química predeterminada. A relação diastereomérica para o fosforotioa- to da estereoquímica predeterminada é a relação molar dos diaste- reômeros possuindo o fosforotioato identificado com a estereoquímica predeterminada em relação aos diastereômeros possuindo o fosforoti- oato identificado com a estereoquímica oposta. A relação diastereomé- rica para o fosforotioato da estereoquímica predeterminada pode ser maior ou igual a 1,1 (por exemplo, maior ou igual a 4, maior ou igual a 9, maior ou igual a 19, ou maior ou igual a 39).
[00108] O termo “marcador Q”, quando aqui usado, refere-se a uma porção de um polipeptídeo conpossuindo resíduo de glutamina que, após a reação mediada por transglutaminase com um composto con- possuindo -NH2 amina, fornece um conjugado conpossuindo a porção do polipeptídeo, em que o resíduo de glutamina inclui uma cadeia late- ral modificada para incluir a amida ligada ao composto. Os marcadores Q são conhecidos na técnica. Exemplos não limitantes de marcadores Q são LLQGG (SEQ ID NO: 582) e GGGLLQGG (SEQ ID NO: 583).
[00109] O termo “cicloalquenila deformado”, quando aqui usado, refere-se a um grupo cicloalquenila que, se a valência aberta for subs- tituída por H, possui uma energia de deformação de anel de pelo me- nos 16 kcal/mol.
[00110] O termo “análogo de açúcar”, quando aqui usado, represen- ta um grupo divalente ou trivalente que é um C 3-6 monossacarídeo ou C3-6 alditol (por exemplo, glicerol), que é modificado para substituir dois grupos hidroxila por ligações ao átomos de oxigênio em fosfato, fosfo-
rotioato ou fosforoditioato, ou um grupo de tamponamento. Um análo- go de açúcar não contém uma nucleobase capaz de se engajar em ligações de hidrogênio com uma nucleobase em uma fita complemen- tar. Um análogo do açúcar é cíclico ou acíclico. Outras modificações opcionais incluídas em um análogo de açúcar são: uma substituição de um, dois ou três dos grupos hidroxila restantes ou átomos de hidro- gênio ligados a carbono por H; C1-6 alquila opcionalmente substituído; –LigaçãoA (–T)p, conforme definido neste documento; um grupo de conjugação; -(CH2)t1–ORZ, onde t1 é um número inteiro de 1 a 6, e RZ é C1-6 alquila opcionalmente substituída, C2-6 alquenila opcionalmente substituída, C2-6 alquinila opcionalmente substituída, C6-14 arila opcio- nalmente substituída, C3-8 cicloalquila opcionalmente substituída, (C1-9 heterociclila)-C1-6-alquila opcionalmente substituída, (C6-10 arila)-C1-6- alquila opcionalmente substituída ou (C3-8 cicloalquila)-C1-6-alquila op- cionalmente substituída; introdução de uma ou duas insaturação (ões) (por exemplo, uma ou duas ligações duplas); e substituição de um, dois ou três grupos hidrogênios ou hidroxila com substituintes confor- me definido para alquila, alquenila, cicloalquila, cicloalquenila ou hete- rociclila. Exemplos não limitantes de análogos de açúcar são C2-6 al- quileno opcionalmente substituído, C2-6 alquenileno opcionalmente substituído, C5 cicloalcano-1,3-diíla opcionalmente substituída, C5 ci- cloalceno-1,3-diíla opcionalmente substituída, heterociclo-1,3-diíla op- cionalmente substituída (por exemplo, pirrolidina-2,5-diíla opcional- mente substituída, tetra-hidrofuran-2,5-diíla opcionalmente substituída ou tetra-hidrotiofeno-2,5-diíla opcionalmente substituída), ou (C1-4 al- quila)-(C3 -8 cicloalquileno) opcionalmente substituído (por exemplo, (C1 alquila)-( C3 cicloalquileno) opcionalmente substituído).
[00111] O termo “sulfeto”, quando aqui usado, representa um grupo divalente –S– ou =S. O dissulfeto é –S–S–.
[00112] O termo “porção de direcionamento”, quando aqui usado,
representa uma porção (por exemplo, uma molécula pequena, por exemplo, um carboidrato) que se liga especificamente ou se associa reativamente ou complexifica com um receptor ou outra porção recep- tiva associada a uma determinada população de célula alvo (por exemplo, uma célula apresentadora de antígeno (APC; por exemplo, um APC profissional (por exemplo, célula B, pDC ou macrófago))). Um conjugado fornecido neste documento compreende uma porção de direcionamento. A porção de direcionamento pode ser um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno ou um derivado modificado do mesmo (por exemplo, Fcab ou uma proteína de fusão (por exemplo, scFv)). A porção de direcionamento pode ser um polipeptídeo. Alterna- tivamente, a porção de direcionamento pode ser uma molécula peque- na (por exemplo, manose) ou um cluster de moléculas pequenas (por exemplo, um cluster de manoses). Um conjugado da invenção que in- clui a porção de direcionamento pode exibir Kd de menos de 100 nM para o alvo, ao qual a porção de direcionamento se liga. Kd é medida usando métodos conhecidos na técnica, por exemplo, usando resso- nância de plasmônio superficial (SPR), por exemplo, usando o sistema BIACORETM (GE Healtcare, Little Chalfont, the United Kingdom).
[00113] O termo “grupo 1,2,4,5-tetrazina”, quando aqui usado, re- presenta um grupo da seguinte fórmula: , onde R’ é alquila opcionalmente substituída, arila opcionalmente substituída, cicloalquila opcionalmente substituída, heterociclila opcionalmente substituída; e R” é alquileno opcionalmente substituído, heteroalquileno opcional- mente substituído, arileno opcionalmente substituído, cicloalquileno opcionalmente substituído, heterociclileno opcionalmente substituído ou um grupo –Ra–Rb–, em que cada um dentre Ra e Rb é independen- temente alquileno opcionalmente substituído, heteroalquileno opcio- nalmente substituído, arileno opcionalmente substituído, cicloalquileno opcionalmente substituído ou heterociclileno opcionalmente substituí- do.
[00114] O termo “efeito terapêutico” refere-se a um efeito local ou sistêmico em um indivíduo, particularmente mamíferos, e mais particu- larmente humanos, causado por uma substância farmacologicamente ativa. O termo, portanto, significa qualquer substância destinada ao uso no diagnóstico, cura, mitigação, tratamento ou prevenção de do- enças ou na melhoria do desenvolvimento físico ou mental desejável e condições em um animal ou humano. O termo “quantidade terapeuti- camente eficaz” ou “dose terapeuticamente eficaz”, quando aqui usa- do, representa a quantidade de um polinucleotídeo imunomodulante ou um conjugado necessário para melhorar, tratar ou pelo menos inter- romper parcialmente os sintomas de uma doença a ser tratada. As quantidades eficazes para este uso dependem da gravidade da doen- ça, do peso e do estado geral do indivíduo. Normalmente, as dosa- gens usadas in vitro podem fornecer orientações úteis nas quantida- des úteis para a administração in vivo da composição farmacêutica, e modelos animais podem ser usados para determinar as dosagens efi- cazes para o tratamento de uma doença particular.
[00115] O termo “tiocarbonila”, quando aqui usado, representa um grupo C(=S).
[00116] O termo “tio-heterociclileno”, quando aqui usado, represen- ta um grupo –S–R–, onde R é heterociclileno. O tio-heterociclileno po- de ser opcionalmente substituído de uma maneira descrita para o he- terociclila.
[00117] O termo “tiol”, quando aqui usado, representa um grupo – SH.
[00118] O termo “tratar”, conforme usado em referência a uma do- ença ou condição em um paciente, destina-se a se referir à obtenção de resultados benéficos ou desejados, por exemplo, resultados clíni-
cos, em um paciente pela administração do polinucleotídeo ou conju- gado da invenção para o paciente. Os resultados benéficos ou deseja- dos podem incluir o alívio ou melhoria de um ou mais sintomas de uma doença ou condição; diminuição da extensão de uma doença ou con- dição; estabilização (isto é, não agravamento) de uma doença ou con- dição; prevenção da propagação de uma doença ou condição; atrasar ou retardar o progresso de uma doença ou condição; paliação de uma doença ou condição; e remissão (parcial ou total). “Paliação” de uma doença ou condição significa que a extensão e/ou manifestações clíni- cas indesejáveis da doença ou condição são diminuídas e/ou o curso de tempo da progressão é retardado, em comparação com a extensão ou curso de tempo na ausência do tratamento com o polinucleotídeo ou conjugado da invenção.
[00119] O termo “triazolocicloalquenileno”, quando aqui usado, refe- re-se aos heterociclilenos conpossuindo um anel 1,2,3-triazol fundido a um anel de 8 membros, todos os átomos endocíclicos dos quais são átomos de carbono, e os átomos de cabeça de ponte são átomos de carbono hibridizados com sp2. Os triazocicloalquenilenos podem ser opcionalmente substituídos de uma maneira descrita para o heteroci- clila.
[00120] O termo “triazolo-heterociclileno”, quando aqui usado, refe- re-se aos heterociclilos conpossuindo um anel 1,2,3-triazol fundido a um anel de 8 membros conpossuindo pelo menos um heteroátomo. Os átomos da cabeça de ponte no triazolo-heterociclileno são átomos de carbono. Os triazolo-heterociclilenos podem ser opcionalmente substi- tuídos de uma maneira descrita para a heterociclila.
[00121] Deve ser entendido que os termos “polinucleotídeo imuno- modulador”, “polinucleotídeo imunoestimulante”, “polinucleotídeo imu- nossupressor” e “conjugado” abrangem sais do polinucleotídeo imu- nomodulador, polinucleotídeo imunoestimulante, polinucleotídeo imu-
nossupressor e conjugado, respectivamente. Por exemplo, os termos “polinucleotídeo imunomodulador”, “polinucleotídeo imunoestimulante”, “polinucleotídeo imunossupressor” e “conjugado” abrangem a forma neutra protonada (porção P-X H, onde X é O ou S) de um fosfato, fos- forotioato, ou fosforoditioato e a forma iônica desprotonada (porção PX-, em que X é O ou S) de um fosfato, fosforotioato ou fosforoditioa- to. Consequentemente, deve ser entendido que os fosfoésteres e fos- fodiésteres descritos como possuindo um ou mais de RE1, RE2 e RE3 como hidrogênio abrangem sais, nos quais o fosfato, fosforotioato ou fosforoditioato está presente em uma forma iônica desprotonada.
[00122] Os termos “resposta imune inata” e “imunidade inata” são reconhecidos na técnica e referem-se ao mecanismo de defesa não específico que o sistema imunológico de um corpo inicia após o reco- nhecimento de padrões moleculares associados a patógenos, que en- volve diferentes formas de atividades celulares, incluindo produção de citocinas e morte celular por várias vias. Quando aqui usado, as res- postas imunes inatas incluem respostas celulares a um polinucleotídeo imunoestimulante conpossuindo CpG mediado pelo receptor toll-like 9 (TLR9), que incluem, sem limitação, aumento da produção de citocinas de inflamação (por exemplo, interferon tipo I ou produção de IL-10 ), ativação da via NFκB, aumento da proliferação, maturação, diferencia- ção e/ou sobrevivência de células imunes e, em alguns casos, indução de apoptose celular. A ativação da imunidade inata pode ser detectada usando métodos conhecidos na técnica, como medir a ativação de (NF)-κB.
[00123] Os termos “resposta imune adaptativa” e “imunidade adap- tativa” são reconhecidos na técnica e referem-se ao mecanismo de defesa específico do antígeno que o sistema imunológico de um corpo inicia após o reconhecimento de um antígeno específico, que inclui resposta humoral e mediada por células respostas. Quando aqui usa-
do, as respostas imunes adaptativas incluem respostas celulares que são desencadeadas e/ou aumentadas por um polinucleotídeo imu- noestimulante conpossuindo CpG. Em algumas modalidades, o poli- nucleotídeo imunoestimulante ou uma porção do mesmo é o antígeno alvo da resposta imune adaptativa específica ao antígeno. Em outras modalidades, o polinucleotídeo imunoestimulante não é o antígeno al- vo da resposta imune adaptativa específica ao antígeno, mas, no en- tanto, aumenta a resposta imune adaptativa. A ativação de uma res- posta imune adaptativa pode ser detectada usando métodos conheci- dos na técnica, como a medição da produção de anticorpos específi- cos do antígeno ou o nível de citotoxicidade mediada por células es- pecíficas do antígeno.
[00124] O termo “receptor Toll-like” (ou “TLR”) é reconhecido na técnica e se refere a uma família de receptores de reconhecimento de padrão que foram inicialmente identificados como sensores do sistema imunológico inato que reconhecem patógenos microbianos. Os TLRs reconhecem estruturas distintas em micróbios, muitas vezes referidas como “PAMPs” (padrões moleculares associados a patógenos). A liga- ção do ligante a TLRs invoca uma cascata de vias de sinalização in- tracelular que induzem uma resposta imune inata e/ou resposta imune adaptativa. Quando aqui usado, o termo “receptor toll-like” ou “TLR” também se refere a um fragmento funcional de uma proteína do recep- tor toll-like expressa por uma célula. Em humanos, dez TLRs foram identificados, incluindo TLR-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7/8, -9 e -10. D’Arpa e Leung, Adv. Wound Care, 2017, 6, 330-343. Genes humanos que codificam TLRs são conhecidos.
[00125] O receptor toll-like 9 (TLR9), também designado como CD289 (cluster de diferenciação 289), é um membro da família do re- ceptor toll-like (TLR). Du et al., Eur. Cytokine Netw., 11: 362-371 (2000). TLR9 é um receptor importante expresso em células do siste-
ma imunológico, incluindo células dendríticas (DCs), linfócitos B, ma- crófagos, células exterminadoras naturais e outras células apresenta- doras de antígenos. A ativação de TLR9 dispara cascatas de sinaliza- ção que unem a imunidade inata e adaptativa. Martinez-Campos et al., Viral Immunol., 30: 98-105 (2016); Notley et al., Sci. Rep., 7: 42204 (2017). Os agonistas naturais de TLR-9 incluem oligodesoxinucleotí- deos não metilados conpossuindo dinucleotídeo guanina-citosina (CpG) (CpG ODNs). O ligante TLR-9 que encontra uso na presente descrição inclui, mas não está limitado a, CpG ODNs naturalmente existentes ou sintéticos e outro polinucleotídeo imunoestimulante con- possuindo CpG e/ou imunoconjugados como fornecido neste docu- mento. A ativação da via de sinalização de TLR9 pode ser detectada usando métodos conhecidos na técnica, como medição do recruta- mento do antígeno de diferenciação mieloide 88 (MiD88), ativação do fator nuclear (NF)-κB, c-Jun cinase N-terminal (JNK), e vias de sinali- zação da proteína cinase ativada por mitogênio p38 (MAPK), ativação do fator regulador de interferon-7, nível de expressão de uma ou mais citocinas, tais como interferons tipo I (IFNs), interleucina (IL)-6, IL-10 e IL-12, ativação de uma ou mais populações de células imunes, como células NK, células T exterminadoras naturais, monócitos e nível de respostas de linfócitos citotóxicos (CTL) e T auxiliar-1 (Th1) e o nível de secreção de imunoglobulina.
[00126] O termo “célula de expressão de TLR”, quando aqui usado, refere-se a uma célula de expressão de um receptor toll-like e é capaz de ativar a via de sinalização do receptor toll-like mediante ligação do receptor toll-like a um agonista. O receptor toll-like pode ser expresso na superfície da célula e/ou na membrana de um ou mais comparti- mentos intracelulares da célula, como o endossoma ou fagossoma. Uma célula de expressão de TLR pode ainda expressar um ou mais antígenos de superfície celular diferentes do receptor toll-like. Certas células imunes expressam TLRs, e a ativação da via de sinalização de TLR nas células imunes induz uma resposta imune inata e/ou uma resposta imune adaptativa. As células imunológicas ativadas pela via de sinalização TLR podem ajudar a eliminar outras células doentes do corpo. Certas células doentes (por exemplo, células cancerosas ou células infectadas por vírus) expressam TLRs e a ativação da via de sinalização de TLR nas células doentes pode resultar na morte da cé- lula doente, como por meio de apoptose induzida. Exemplos de células que expressam TLR9 incluem, mas não estão limitados a células den- dríticas (DCs), células B, células T, células de Langerhans, queratinó- citos, mastócitos, células endoteliais, células miofibroblásticas e fi- broblastos primários. A determinação de se uma célula expressa qual- quer receptor toll-like (por exemplo, TLR9) pode ser realizada usando métodos conhecidos na técnica, como a detecção de mRNA do recep- tor toll-like em uma célula.
[00127] O termo “célula imune” é reconhecido na técnica, quando aqui usado refere-se a qualquer célula envolvida em um mecanismo de defesa do hospedeiro, como células que produzem citocinas pró- inflamatórias e células que participam de danos e/ou doenças tecidu- ais patogênese. Exemplos de células imunes incluem, mas não estão limitados a, células T, células B, células exterminadoras naturais, neu- trófilos, mastócitos, macrófagos, células apresentadoras de antígeno (APC), basófilos e eosinófilos.
[00128] O termo “célula de apresentação de antígeno” ou “APC” é reconhecido na técnica e se refere a um grupo heterogêneo de células imunes que medeiam a resposta imune celular processando e apre- sentando antígenos para reconhecimento por certos linfócitos, como células T. Tipos exemplares de células de apresentação de antígeno incluem, mas não estão limitados a, células de apresentação de antí- geno profissionais, incluindo, por exemplo, células B, monócitos, célu-
las dendríticas e células de Langerhans, bem como outras células de apresentação de antígeno, incluindo, por exemplo, queratinócitos, en- doteliais células, astrócitos, fibroblastos e oligodendrócitos. Conforme usado neste documento, o termo “célula de apresentação de antígeno” inclui células de apresentação de antígeno encontradas in vivo e aque- las encontradas em culturas de células in vitro derivadas de células in vivo. Quando aqui usado, as células de apresentação de antígeno também inclue uma APC que é artificialmente modificado, tal como geneticamente modificado para expressar um receptor toll-like (por exemplo, TLR9) ou para modular o nível de expressão de um receptor toll-like (por exemplo, TLR9).
[00129] O termo “células dendríticas” ou “DC” é reconhecido na técnica e se refere a um grupo heterogêneo de células especializadas de detecção e apresentação de antígenos (APCs). As DC humanas são divididas em três subconjuntos principais: DC plasmocitoide (pDC), DC mieloide (mDC) e DC derivada de monócitos (MDDC). Schraml et al., Curr. Opin. Immunol., 32: 13-20 (2015). Subconjuntos de DCs podem ser identificados com base em padrões de expressão de TLR distintos. A título de exemplo, o subconjunto mieloide ou “con- vencional” de DC (mDC) expressa TLRs 1-8 quando estimulado e uma cascata de marcadores de ativação (por exemplo, CD80, CD86, MHC classe I e II, CCR7), pró citocinas inflamatórias e quimiocinas são pro- duzidas. Um resultado desta estimulação e expressão resultante é a iniciação de células T CD4+ e CD8+ específicas para o antígeno. Es- sas DCs adquirem uma capacidade aprimorada de captar antígenos e apresentá-los de forma adequada às células T. O subconjunto plas- mocitoide de DC (pDC) expressa TLR7 e TLR9 após a ativação, com uma ativação resultante de células NK, bem como de células T.
[00130] O termo “antígeno”, quando aqui usado, refere-se a uma molécula ou um fragmento antigênico do mesmo capaz de desenca-
dear uma resposta imune, incluindo uma resposta imune inata e uma resposta imune adaptativa. Quando aqui usado, os antígenos podem ser proteínas, peptídeos, polissacarídeos, lipídeos, ácidos nucleicos, especialmente RNA e DNA, nucleotídeos e outras substâncias biológi- cas ou bioquímicas. O termo “desencadear uma resposta imune” refe- re-se à estimulação de células imunes in vivo em resposta a um estí- mulo, como um antígeno. A resposta imune consiste em resposta imu- ne celular, por exemplo, estimulação de células T e macrófagos e res- posta imune humoral, por exemplo, estimulação de células B e com- plemento e produção de anticorpos. A resposta imune pode ser medi- da usando técnicas bem conhecidas na técnica, incluindo, mas não se limitando a, imunoensaios de anticorpos, ensaios de proliferação e ou- tros.
[00131] Os termos “fragmento antigênico” e “fragmento de ligação de anticorpo” são usados indistintamente neste documento. Um frag- mento antigênico, quando aqui usado, é capaz de se complexar com uma molécula de ligação ao antígeno, por exemplo, um anticorpo, em uma reação específica. A reação específica aqui referida indica que o antígeno ou fragmento antigênico irá reagir, de uma maneira altamente seletiva, com o seu anticorpo correspondente e não com a multidão de outros anticorpos que podem ser evocados por outros antígenos. A especificidade de tal reação é determinada pela presença de um ou mais epítopos (determinantes imunogênicos) no antígeno. Quando aqui usado, um antígeno ou fragmento antigênico do mesmo pode possuir um epítopo ou possuir mais de um epítopo.
[00132] O termo “epítopo de células T”, quando aqui usado, refere- se a quaisquer epítopos de antígenos produzidos por uma célula T.
[00133] O termo “antígeno associado a tumor” ou “TAA”, quando aqui usado, refere-se a um antígeno expresso por uma célula cance- rosa ou no estroma de um tumor sólido em um paciente com câncer recebendo o tratamento ou cuidado preventivo fornecido neste docu- mento (por exemplo, receber uma dose terapêutica de um polinucleo- tídeo imunoestimulante ou um imunoconjugado CpG-Ab). O TAA pode ou não ser direcionado no tratamento ou cuidados preventivos forneci- do neste documentos. O TAA não precisa ser superexpresso, mutado ou mal regulado na célula cancerosa, mas pode possuir as mesmas características que o TAA teria em uma célula normal. Em algumas modalidades, o TAA pode ser superexpresso, mutado ou desregulado na célula cancerosa. O TAA pode ser uma proteína, ácido nucleico, lipídio ou outro antígeno. O TAA pode ser um TAA expresso na super- fície celular, um TAA intracelular ou um TAA intranuclear. No contexto de um tumor sólido, o TAA pode ser expresso no estroma de uma massa tumoral sólida. O termo “estroma”, quando aqui usado, refere- se a componentes em uma massa tumoral sólida diferente de uma cé- lula cancerosa. Por exemplo, o estroma pode incluir fibroblastos, célu- las epiteliais, outros componentes dos vasos sanguíneos ou compo- nentes da matriz extracelular. Quando aqui usado, o termo “estroma” não inclui componentes do sistema imunológico, tais como células imunológicas (por exemplo, células B, células T, células dendríticas, macrófagos, células exterminadoras naturais e similares)). Vários TAAs são conhecidos na técnica. A identificação de TAA pode ser rea- lizada usando métodos conhecidos na técnica, como descrito em Zhang et al., Methods Mol. Biol., 520: 1-10 (2009).
[00134] Os termos “anticorpo”, “imunoglobulina” e “Ig” são usados indistintamente aqui e são usados no sentido mais amplo e abrangem especificamente, por exemplo, anticorpos monoclonais individuais (in- cluindo agonista, antagonista, anticorpos neutralizantes, anticorpos monoclonais de tamanho natural ou intactos), composições de anticor- pos com especificidade poliepitópica ou monoepitópica, anticorpos po- liclonais ou monovalentes, anticorpos multivalentes, anticorpos multi-
específicos (por exemplo, anticorpos biespecíficos, desde que exibam a atividade biológica desejada), formados a partir de pelo menos dois anticorpos intactos, de cadeia única anticorpos e fragmentos de anti- corpos. Um anticorpo pode ser humano, humanizado, quimérico e/ou maturado por afinidade, bem como um anticorpo de outras espécies, por exemplo, camundongo e coelho.
[00135] O termo “anticorpo” se destina a incluir um produto polipep- tídico de células B dentro da classe de polipeptídeos de imunoglobuli- na que é capaz de se ligar a um antígeno específico e é composto por dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, em que cada par possui um cadeia (cerca de 50-70 kDa) e uma cadeia leve (cerca de 25 kDa) e cada porção amino-terminal de cada cadeia inclui uma região variá- vel de cerca de 100 a cerca de 130 ou mais aminoácidos e cada por- ção carboxil-terminal de cada cadeia inclui uma região constante. Veja, Borrebaeck (ed.) (1995) Antibody Engineering, Segunda Ed., Oxford University Press .; Kuby (1997) Immunology, Terceira Ed., W.H. Free- man and Company, New York. Os anticorpos também incluem, mas não estão limitados a, anticorpos sintéticos, anticorpos monoclonais, anticorpos recombinantes, anticorpos multiespecíficos (incluindo anti- corpos biespecíficos), anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos camelizados, anticorpos quiméricos, intracorpos, anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id) e fragmentos funcionais dos mesmos, que se referem a uma porção de um polipeptídeo de cadeia pesada ou leve de anticorpo que retém parte ou toda a atividade de ligação do anti- corpo a partir do qual o fragmento é derivado. Exemplos não limitantes de fragmentos funcionais de um anticorpo incluem Fvs de cadeia única (scFv) (por exemplo, incluindo monoespecífico ou biespecífico), frag- mentos Fab, fragmentos F(ab'), fragmentos F(ab)2, fragmentos F(ab')2, Fvs ligados por dissulfeto (sdFv), fragmentos Fd, fragmentos Fv, dia- corpo, triacorpo, tetracorpo e minicorpo. Em particular, os anticorpos fornecidos neste documento incluem moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina, por exemplo, domínios de ligação ao antígeno ou moléculas que contêm um sítio de ligação ao antígeno que se liga ao antígeno (por exemplo, uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de um anticorpo anti-CD56 ou um anticorpo anti-SIRPα). Tais fragmentos de anticorpo são descritos em, por exemplo, Harlow e Lane, Antibodi- es: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); Myers (ed.), Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehen- sive Desk Reference, New York: VCH Publisher, Inc .; Huston et al., Cell Biophysics 1993, 22, 189-224; Plücktun e Skerra, Meth. Enzymol. 1989, 178, 497-515; e Day, Advanced Immunochemistry, Segunda Ed., Wiley-Liss, Inc., New York, NY (1990). Os anticorpos fornecidos aqui podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), qualquer classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2), ou qualquer subclasse (por exemplo, IgG2a e IgG2b) de uma molécula de imunoglobulina.
[00136] O termo “antígeno” refere-se a um antígeno predeterminado ao qual um anticorpo pode se ligar seletivamente. Um antígeno alvo pode ser um polipeptídeo, carboidrato, ácido nucleico, lipídeo, hapteno ou outro composto de ocorrência natural ou sintético. Em uma modali- dade, o antígeno alvo é um polipeptídeo.
[00137] Os termos “fragmento de ligação ao antígeno”, “domínio de ligação ao antígeno” e “região de ligação ao antígeno” referem-se a uma porção de um anticorpo que compreende os resíduos de aminoá- cidos que interagem com um antígeno e conferem ao agente de liga- ção sua especificidade e afinidade para o antígeno (por exemplo, regi- ões determinantes de complementaridade (CDRs)).
[00138] O termo “ligação específica”, “liga-se especificamente a” ou “específico para” um determinado polipeptídeo ou um epítopo em um determinado polipeptídeo alvo pode ser exibido, por exemplo, por uma molécula (por exemplo, um anticorpo) possuindo um constante de dis- sociação (Kd) para o alvo de pelo menos cerca de 10-4 M, pelo menos cerca de 10-5 M, pelo menos cerca de 10-6 M, pelo menos cerca de 10- 7 M, pelo menos cerca de 10-8 M, em pelo menos cerca de 10-9 M, pelo menos cerca de 10-10 M, pelo menos cerca de 10-11 M, ou pelo menos cerca de 10-12 M. Em uma modalidade, o termo “ligação específica” refere-se à ligação onde uma molécula se liga a um polipeptídeo ou epítopo particular em um polipeptídeo específico sem ligação substan- cial a qualquer outro polipeptídeo ou epítopo polipeptídico.
[00139] Uma unidade de anticorpo de 4 cadeias é uma glicoproteí- na heterotetramérica composta por duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. No caso de IgGs, a unidade de 4 cadeias é geralmente de cerca de 150.000 daltons. Cada cadeia L es- tá ligada a uma cadeia H por uma ligação dissulfeto covalente, en- quanto as duas cadeias H estão ligadas entre si por uma ou mais liga- ções dissulfeto dependendo do isótipo da cadeia H. Cada cadeia H e L também possui pontes dissulfeto intracadeia regularmente espaçadas. Cada cadeia H possui no terminal N, um domínio variável (VH) segui- do por três domínios constantes (CH) para cada uma das cadeias α e γ e quatro domínios CH para os isótipos μ e ε. Cada cadeia L possui no terminal N, um domínio variável (VL) seguido por um domínio cons- tante (CL) em sua outra extremidade. O VL está alinhado com o VH e o CL está alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesa- da (CH1). Pensa-se que resíduos de aminoácidos particulares formam uma interface entre os domínios variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada. O emparelhamento de um VH e VL juntos forma um único sí- tio de ligação ao antígeno. Para a estrutura e propriedades das dife- rentes classes de anticorpos, ver, por exemplo, Basic e Clinical Immu- nologi, 8ª edição, Stites et al. (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT,
1994, página 71 e Capítulo 6.
[00140] O termo “região variável” ou “domínio variável” refere-se a uma porção das cadeias leves ou pesadas de um anticorpo que está geralmente localizado no terminal amino da cadeia leve ou pesada e possui um comprimento de cerca de 120 a 130 aminoácidos na cadeia pesada e cerca de 100 a 110 aminoácidos na cadeia leve, e são usa- dos na ligação e especificidade de cada anticorpo particular para seu antígeno particular. A região variável da cadeia pesada pode ser refe- rida como “VH”. A região variável da cadeia leve pode ser referida co- mo “VL”. O termo “variável” refere-se ao fato de que certos segmentos das regiões variáveis diferem extensivamente na sequência entre os anticorpos. A região V medeia a ligação ao antígeno e define a especi- ficidade de um determinado anticorpo para seu antígeno particular. No entanto, a variabilidade não é uniformemente distribuída ao longo do intervalo de 110 aminoácidos das regiões variáveis. Em vez disso, as regiões V consistem em estiramentos menos variáveis (por exemplo, relativamente invariantes) chamados regiões de estrutura (FRs) de cerca de 15-30 aminoácidos separados por regiões mais curtas de maior variabilidade (por exemplo, variabilidade extrema) chamadas “regiões hipervariáveis” que são cada cerca de 9-12 aminoácidos de comprimento. As regiões variáveis de cadeias pesadas e leves com- preendem, cada uma, quatro FRs, em grande parte adotando uma configuração de folha β, conectada por três regiões hipervariáveis, que formam alças de conexão e, em alguns casos, formando parte da es- trutura de folha β. As regiões hipervariáveis em cada cadeia são man- tidas juntas em estreita proximidade pelos FRs e, com as regiões hi- pervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação ao antígeno de anticorpos (veja, por exemplo, Kabat et al., Se- quences of Proteins of Immunological Interest, 5t Ed. Public Healt Ser- vice, National Institutes of Healt, Bethesda, MD, 1991)). As regiões constantes não estão envolvidas diretamente na ligação de um anti- corpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras, como a participação do anticorpo na citotoxicidade celular dependente do anti- corpo (ADCC) e na citotoxicidade dependente do complemento (CDC). As regiões variáveis diferem extensivamente na sequência entre dife- rentes anticorpos. A variabilidade na sequência está concentrada nas CDRs, enquanto as porções menos variáveis na região variável são referidas como regiões estruturais (FR). Os CDRs das cadeias leve e pesada são os principais responsáveis pela interação do anticorpo com o antígeno. Em modalidades específicas, a região variável é uma região variável humana.
[00141] O termo “numeração de resíduo de região variável como em Kabat” ou “numeração de posição de aminoácido como em Kabat”, e variações dos mesmos, refere-se ao sistema de numeração usado para regiões variáveis de cadeia pesada ou regiões variáveis de ca- deia leve da compilação de anticorpos em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª. Ed. Public Health Service, Nacional Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991). Usando este sis- tema de numeração, a sequência de aminoácidos linear real pode con- ter menos ou mais aminoácidos correspondentes a um encurtamento ou inserção em um FR ou CDR do domínio variável. Por exemplo, um domínio variável de cadeia pesada pode incluir uma única inserção de aminoácido (resíduo 52a de acordo com Kabat) após o resíduo 52 de H2 e resíduos inseridos (por exemplo, resíduos 82a, 82b e 82c, etc, de acordo com Kabat) após o resíduo de FR de cadeia pesada 82. A nu- meração de Kabat de resíduos pode ser determinada para um deter- minado anticorpo por alinhamento em regiões de homologia da se- quência do anticorpo com uma sequência “padrão” numerada por Ka- bat. O sistema de numeração de Kabat é geralmente usado quando se refere a um resíduo no domínio variável (aproximadamente resíduos 1-
107 da cadeia leve e resíduos 1-113 da cadeia pesada) (por exemplo, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5º Ed. Public Healt Service, National Institutes of Healt, Bethesda, Md. (1991)). O “sistema de numeração EU” ou “índice EU” é geralmente usado quando se refe- re a um resíduo em uma região constante da cadeia pesada de imu- noglobulina (por exemplo, o índice EU relatado em Kabat et al., Su- pra). O “índice EU como em Kabat” refere-se à numeração de resíduos do anticorpo IgG 1 EU humano. Outros sistemas de numeração foram descritos, incluindo, por exemplo, por AbM, Chotia, Contact, IMGT e AHon.
[00142] Um anticorpo “intacto” é aquele que compreende um sítio de ligação ao antígeno, bem como um CL e pelo menos as regiões constantes da cadeia pesada, CH1, CH2 e CH3. As regiões constan- tes podem incluir regiões constantes humanas ou variantes da se- quência de aminoácidos. De preferência, um anticorpo intacto possui uma ou mais funções efetoras.
[00143] O termo “fragmento de anticorpo” refere-se a uma porção de um anticorpo intacto, de preferência a ligação ao antígeno ou regi- ão variável do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, sem limitação, fragmentos Fab, Fab’, F(ab')2 e Fv; diacorpos e di-diacorpos (veja, por exemplo, Holliger et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.1993, 90, 6444-8; Lu et al.,J. Biol. Chem. 2005, 280, 19665-72; Hudson et al., Nat. Med. 2003, 9, 129-134; WO 93/11161; e Pat. Norte- americana Nos. 5.837.242 e 6.492.123); moléculas de anticorpo de cadeia única (veja, por exemplo, Pat. Norte-americana Nos. 4.946.778;
5.260.203; 5.482.858 e 5.476.786); anticorpos de domínio variável du- plo (veja, por exemplo, Patente U.S. No. 7.612.181); anticorpos de domínio variável único (SdAbs) (veja, por exemplo, Woolven et al., Immunogenetics1999, 50, 98-101 Streltsov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2004, 101, 12444-12449); e anticorpos multiespecíficos forma-
dos a partir de fragmentos de anticorpos.
[00144] O termo “fragmento funcional”, “fragmento de ligação” ou “fragmento de ligação ao antígeno” de um anticorpo se refere a uma molécula que exibe pelo menos uma das funções biológicas atribuídas ao anticorpo intacto, a função compreendendo pelo menos a ligação a o antígeno alvo.
[00145] O termo “cadeia pesada”, quando usado em referência a um anticorpo, refere-se a uma cadeia polipeptídica de cerca de 50-70 kDa, em que a porção amino-terminal inclui uma região variável de cerca de 120 a 130 ou mais aminoácidos e um carboxil -porção termi- nal que inclui uma região constante. A região constante pode ser um dos cinco tipos distintos (por exemplo, isótipos) referidos como alfa (α), delta (δ), épsilon (ε), gama (γ) e mu (µ), com base na sequência de aminoácidos da região constante da cadeia pesada. As distintas ca- deias pesadas diferem em tamanho: α, δ e γ contêm aproximadamente 450 aminoácidos, enquanto µ e ε contêm aproximadamente 550 ami- noácidos. Quando combinados com uma cadeia leve, esses tipos dis- tintos de cadeias pesadas dão origem a cinco classes bem conhecidas (por exemplo, isótipos) de anticorpos, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respec- tivamente, incluindo quatro subclasses de IgG, nomeadamente IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Uma cadeia pesada pode ser uma cadeia pesada humana.
[00146] O termo “cadeia leve”, quando usado em referência a um anticorpo, refere-se a uma cadeia polipeptídica de cerca de 25 kDa, em que a porção amino-terminal inclui uma região variável de cerca de 100 a cerca de 110 ou mais aminoácidos e uma porção terminal que inclui uma região constante. O comprimento aproximado de uma ca- deia leve é de 211 a 217 aminoácidos. Existem dois tipos distintos, denominados capa (κ) de lambda (λ), com base na sequência de ami- noácidos dos domínios constantes. As sequências de aminoácidos de cadeia leve são bem conhecidas na técnica. Uma cadeia leve pode ser uma cadeia leve humana.
[00147] O termo “anticorpo monoclonal”, quando aqui usado, refere- se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, por exemplo, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, exceto para possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em pe- quenas quantidades, e cada anticorpo monoclonal irá tipicamente re- conhecer um único epítopo no antígeno. Em modalidades específicas, um “anticorpo monoclonal”, quando aqui usado, é um anticorpo produ- zido por um único hibridoma ou outra célula, em que o anticorpo se liga a apenas um epítopo beta kloto conforme determinado, por exem- plo, por ELISA ou outra ligação ao antígeno ou ensaio de ligação com- petitivo conhecido na técnica. O termo “monoclonal” não está limitado a qualquer método particular para fazer o anticorpo. Por exemplo, os anticorpos monoclonais úteis na presente descrição podem ser prepa- rados pela metodologia de hibridoma primeiro descrita por Kohler et al., Nature1975, 256, 495; ou pode ser feito usando métodos de DNA recombinante em células bacterianas, animais eucarióticas ou de plan- tas (veja, por exemplo, Patente Norte-americana 4.816.567). Os “anti- corpos monoclonais” também podem ser isolados de bibliotecas de anticorpos de fago usando as técnicas descritas em Clackson et al., Nature1991,352, 624-628 e Marks et al., J. Mol. Biol. 1991, 222, 581- 597, por exemplo. Outros métodos para a preparação de linhas celula- res clonais e de anticorpos monoclonais assim expressos são bem co- nhecidos na técnica (veja, por exemplo, Capítulo 11 em: Short Proto- cols in Molecular Biology, (2002) 5a. Ed., Ausubel et al., Eds ., John Wiley e Sons, New York). Métodos exemplares de produção de anti- corpos monoclonais são fornecidos nos Exemplos aqui.
[00148] Formas “humanizadas” de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos) são anticorpos quiméricos que incluem imunoglobu- linas humanas (por exemplo, anticorpo receptor) em que os resíduos de CDR nativos são substituídos por resíduos do CDR correspondente de uma espécie não humana (por exemplo, anticorpo doador), como camundongo, rato, coelho ou primata não humano com a especificida- de, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, um ou mais resíduos da região FR da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Essas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Uma cadeia pesada ou leve de anticorpo humanizado pode compreender substan- cialmente todas de pelo menos uma ou mais regiões variáveis, em que todas ou substancialmente todas as CDRs correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as FRs são aquelas de uma imunoglobulina humana sequência. Em cer- tas modalidades, o anticorpo humanizado compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipica- mente a de uma imunoglobulina humana. Para obter mais detalhes, consulte, Jones et al., Nature 1986, 321, 522-525; Riechmann et al., Nature 1988, 332, 323-329; Presta, Curr. Opin. Biotechnol. 1992, 3, 394-398; Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1992, 89, 4285- 4289; e Pat. Norte-americana Nos: 6.800.738, 6.719.971, 6.639.055,
6.407.213 e 6.054.297.
[00149] Um “anticorpo humano” é aquele que possui uma sequên- cia de aminoácidos que corresponde àquela de um anticorpo produzi- do por um humano e/ou foi feito usando qualquer uma das técnicas para a produção de anticorpos humanos conforme descrito neste do- cumento. Esta definição de um anticorpo humano exclui especifica- mente um anticorpo humanizado compreendendo resíduos de ligação ao antígeno não humano. Os anticorpos humanos podem ser produzi- dos usando várias técnicas conhecidas na técnica, incluindo bibliote- cas de exibição de fago (Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol.1991, 227, 381; Marks et al., J. Mol. Biol. 1991, 222, 581) e bibliotecas de exibição de levedura (Chao et al., Nature Protocols 2006, 1, 755-768). Também estão disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais hu- manos os métodos descritos em Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol. 1991, 147, 86-95. Veja também van Dijk e van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 2001, 5, 368-374. Os anticorpos humanos po- dem ser preparados pela administração do antígeno a um animal transgênico que foi modificado para produzir tais anticorpos em res- posta ao desafio antigênico, mas cujos loci endógenos foram desati- vados, por exemplo, camundongos (veja, por exemplo, Jakobovits, Curr. Opin. Biotechnol . 1995, 6, 561-566; Bruggemann e Taussing, Curr. Opin. Biotechnol. 1997, 8, 455-458; e Patentes Norte-americanas Nos. 6.075.181 e 6.150.584 relativas à tecnologia XENOMOUSETM). Veja, também, por exemplo, Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2006, 103, 3557-3562 a respeito de anticorpos humanos gerados por meio de uma tecnologia de hibridoma de células B humanas.
[00150] Uma “CDR” refere-se a uma das três regiões hipervariáveis (H1, H2 ou H3) dentro da região não estrutural da estrutura da folha β de VH de imunoglobulina (Ig ou anticorpo), ou uma das três regiões hipervariáveis (L1, L2 ou L3) dentro da região não estrutural da estru- tura da folha β do anticorpo VL. Consequentemente, as CDRs são se- quências da região variável intercaladas nas sequências da região es- trutural. As regiões CDR são bem conhecidas por alguém versado na técnica e foram definidas por, por exemplo, Kabat como as regiões de maior hipervariabilidade dentro dos domínios variáveis (V) do anticor- po. Kabat et al., J. Biol. Chem.1977, 252, 6609-6616; Kabat, Adv. Pro-
tein Chem. 1978, 32, 1-75. As sequências da região CDR também fo- ram definidas estruturalmente por Chotia como aqueles resíduos que não fazem parte da estrutura de folha β conservada e, portanto, são capazes de se adaptar a diferentes conformações. Chotia e Lesk, J. Mol. Biol. 1987, 196, 901-917. Ambas as terminologias são bem reco- nhecidas na arte. As sequências da região CDR também foram defini- das por AbM, Contact e IMGT. As posições de CDRs dentro de uma região variável de anticorpo canônico foram determinadas por compa- ração de numerosas estruturas. Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 1997, 273, 927-948; Morea et al., Methods. 2000, 20, 267-279. Como o nú- mero de resíduos dentro de uma região hipervariável varia em diferen- tes anticorpos, os resíduos adicionais em relação às posições canôni- cas são convencionalmente numerados com a, b, c e assim por diante próximo ao número do resíduo no esquema de numeração da região variável canônica. Al-Lazikani et al., Supra (1997). Tal nomenclatura é similarmente bem conhecida pelos versados na técnica.
[00151] O termo “região hipervariável”, “HVR” ou “HV”, quando usa- do neste documento, refere-se às regiões de uma região variável de anticorpo que são hipervariáveis em sequência e/ou formam alças es- truturalmente definidas. Geralmente, os anticorpos compreendem seis regiões hipervariáveis; três no VH (H1, H2, H3) e três no VL (L1, L2, L3). Uma série de delineamentos de região hipervariável está em uso e é aqui englobada. As Regiões Determinantes de Complementarida- de de Kabat (CDRs) são baseadas na variabilidade de sequência e são as mais comumente usadas (veja, por exemplo, Kabat et al., Se- quences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Healt Ser- vice, National Institutes of Healt, Bethesda, MD. (1991)). Chotia se re- fere, em vez disso, à localização dos loops estruturais. Veja, por exemplo, Chotia e Lesk, J. Mol. Biol.1987, 196, 901-917. A extremida- de do loop Chotia CDR-H1 quando numerada usando a convenção de numeração de Kabat varia entre H32 e H34 dependendo do compri- mento do loop (isso ocorre porque o esquema de numeração de Kabat coloca as inserções em H35A e H35B; se nem 35A nem 35B estiver presente, o loop termina em 32; se apenas 35A estiver presente, o loop termina em 33; se ambos 35A e 35B estiverem presentes, o loop termina em 34). As regiões hipervariáveis AbM representam um com- promisso entre as CDRs de Kabat e os loops estruturais de Chotia, e são usadas pelo software de modelagem de anticorpos AbM da Oxford Molecular (veja, por exemplo, Martin, in Antibody Engineering, Vol. 2, Capítulo 3, Springer Verlag). As regiões hipervariáveis de “contato” são baseadas em uma análise das estruturas cristalinas complexas disponíveis. Os resíduos de cada uma dessas regiões hipervariáveis ou CDRs são indicados abaixo.
[00152] Recentemente, um sistema de numeração universal foi de- senvolvido e amplamente adotado, o Sistema de Informação ImMuno- GeneTics (IMGT). Lafranc et al., Dev. Comp. Immunol. 2003, 27, 55-
77. IMGT é um sistema de informação integrado especializado em imunoglobulinas (IG), receptores de células T (TR) e complexo princi- pal de histocompatibilidade (MHC) de humanos e outros vertebrados. Aqui, as CDRs são referidas em termos da sequência de aminoácidos e da localização dentro da cadeia leve ou pesada. Como a “localiza- ção” das CDRs dentro da estrutura do domínio variável da imunoglo- bulina é conservada entre as espécies e está presente em estruturas chamadas loops, usando sistemas de numeração que alinham se- quências de domínio variável de acordo com características estrutu- rais, CDR e resíduos de estrutura e são facilmente identificados. Esta informação pode ser usada no enxerto e substituição de resíduos de CDR de imunoglobulinas de uma espécie em uma estrutura aceptora de, normalmente, um anticorpo humano. Um sistema de numeração adicional (AHon) foi desenvolvido por Honegger e Plucktun, J. Mol. Bi-
ol. 2001, 309, 657-670. A correspondência entre o sistema de numera- ção, incluindo, por exemplo, a numeração de Kabat e o sistema de numeração único IMGT, é bem conhecida por aqueles versados na técnica (veja, por exemplo, Kabat, supra; Chotia e Lesk, supra; Martin, supra; Lefranc et al., supra). Um sistema exemplar, mostrado aqui, combina Kabat e Chotia.
[00153] As regiões hipervariáveis podem compreender “regiões hi- pervariáveis estendidas” como segue: 24-36 ou 24-34 (L1), 46-56 ou 50-56 (L2) e 89-97 ou 89-96 (L3) no VL e 26-35 ou 26-35A (H1), 50-65 ou 49-65 (H2) e 93-102, 94-102 ou 95-102 (H3) no VH. Conforme usa- do neste documento, os termos “HVR” e “CDR” são usados indistintamente. Exemplar IMGT Kabat AbM Chotia Contato CDR1 de VH 26-35 27-38 31-35 26-35 26-32 30-35 CDR2 de VH 50-65 56-65 50-65 50-58 53-55 47-58 CDR3 de VH 95-102 105-117 95-102 95-102 96-101 93-101 CDR1 de VL 24-34 27-38 24-34 24-34 26-32 30-36 CDR2 de VL 50-56 56-65 50-56 50-56 50-52 46-55 CDR3 de VL 89-97 105-117 89-97 89-97 91-96 89-96
[00154] O termo “região constante” ou “domínio constante” refere- se a uma porção do terminal carboxila da cadeia leve e pesada que não está diretamente envolvida na ligação do anticorpo ao antígeno, mas exibe várias funções efetoras, como a interação com o receptor de Fc. Os termos referem-se à porção de uma molécula de imunoglo- bulina possuindo uma sequência de aminoácidos mais conservada em relação à outra porção da imunoglobulina, a região variável, que con- tém o sítio de ligação ao antígeno. A região constante pode conter as regiões CH1, CH2 e CH3 da cadeia pesada e a região CL da cadeia leve.
[00155] O termo resíduos de “estrutura” ou “FR” são aqueles resí- duos da região variável que flanqueiam as CDRs. Os resíduos de FR estão presentes, por exemplo, em anticorpos quiméricos, humaniza- dos, humanos, de domínio, diacorpos, anticorpos lineares e anticorpos biespecíficos. Os resíduos de FR são aqueles resíduos do domínio variável diferentes dos resíduos da região hipervariável ou resíduos de CDR.
[00156] Um anticorpo “amadurecido por afinidade” é aquele com uma ou mais alterações (por exemplo, variações da sequência de aminoácidos, incluindo alterações, adições e/ou deleções) em uma ou mais HVRs das mesmas que resultam em uma melhoria na afinidade do anticorpo para o antígeno, em comparação com um anticorpo ori- gem que não possui essa (s) alteração (ões). Os anticorpos amadure- cidos por afinidade preferidos terão afinidades nanomolares ou mesmo picomolares para o antígeno alvo. Os anticorpos maturados por afini- dade são produzidos por procedimentos conhecidos na técnica. Para revisão, veja, Hudson e Souriau, Nat. Med. 2003, 9, 129-134; Hoogen- boom, Nat. Biotechnol. 2005, 23, 1105-1116; Quiroz e Sinclair, Revista Ingenieria Biomedica 2010, 4, 39-51.
[00157] Um anticorpo de “bloqueio” ou um anticorpo “antagonista” é aquele que inibe ou reduz a ligação do antígeno. Em certas modalida- des, o bloqueio de anticorpos ou anticorpos antagonistas bloqueia substancialmente ou completamente a ligação do antígeno. Em certas modalidades, um anticorpo de “bloqueio” ou um anticorpo “antagonis- ta” é aquele que inibe ou reduz a atividade biológica do antígeno ao qual se liga. Em outras modalidades, os anticorpos bloqueadores ou anticorpos antagonistas inibem substancialmente ou completamente a atividade biológica do antígeno. Por exemplo, um anticorpo anti-SIRP de bloqueio impede substancialmente ou completamente a interação entre SIPRα e CD47.
[00158] Um anticorpo “não bloqueador” é aquele que não inibe ou reduz a ligação do antígeno. Em certas modalidades, um anticorpo “não bloqueador” é aquele que não inibe ou reduz a atividade biológica do antígeno ao qual se liga. Em outras modalidades, um anticorpo não bloqueador se liga a um epítopo distinto e não sobreposto ao qual o antígeno se liga. Em algumas modalidades, um anticorpo não bloque- ador é um anticorpo agonista.
[00159] Um “anticorpo agonista” é um anticorpo que desencadeia uma resposta, por exemplo, um que imita pelo menos uma das ativi- dades funcionais de um polipeptídeo de interesse. Um anticorpo ago- nista inclui um anticorpo que é um ligante mimético, por exemplo, em que um ligante se liga a um receptor de superfície celular e a ligação induz a sinalização celular ou atividades por meio de uma via de sina- lização celular intercelular e em que o anticorpo induz uma sinalização ou ativação celular semelhante.
[00160] As “funções efetoras” do anticorpo referem-se às atividades biológicas atribuíveis à região Fc (por exemplo, uma região Fc de se- quência nativa ou região Fc variante da sequência de aminoácidos) de um anticorpo e variam com o isótipo do anticorpo. Exemplos de fun- ções efetoras de anticorpos incluem: ligação de C1q e citotoxicidade dependente do complemento; Ligação ao receptor Fc; citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC); fagocitose; regulação negativa de receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de células B); e ativação de células B.
[00161] O termo “região Fc” aqui é usado para definir uma região C- terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina, incluindo, por exemplo, regiões Fc de sequência nativa, regiões Fc recombinantes e regiões Fc variantes. Embora os limites da região Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina possam variar, a região Fc da cadeia pesa- da de IgG humano é frequentemente definida para se estender a partir de um resíduo de aminoácido na posição Cys226, ou de Pro230, até o terminal carboxila do mesmo. A lisina C-terminal (resíduo 447 de acor- do com o sistema de numeração EU) da região Fc pode ser removida, por exemplo, durante a produção ou purificação do anticorpo, ou por engenharia recombinante do ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada do anticorpo. Consequentemente, uma composição de anti- corpos intactos pode compreender populações de anticorpos com to- dos os resíduos K447 removidos, populações de anticorpos sem resí- duos K447 removidos e populações de anticorpos possuindo uma mis- tura de anticorpos com e sem o resíduo K447.
[00162] Os termos “tratar”, “tratando” e “tratamento” destinam-se a incluir o alívio ou anulação de uma condição, distúrbio ou doença, ou um ou mais dos sintomas associados à condição, distúrbio ou doença; ou aliviar ou erradicar a (s) causa (s) da condição, distúrbio ou doença em si.
[00163] Os termos “prevenir”, “prevenindo” e “prevenção” destinam- se a incluir um método de retardar e/ou impedir o início de uma condi- ção, distúrbio ou doença e/ou seus sintomas concomitantes; impedir que um indivíduo adquira uma condição, distúrbio ou doença; ou redu- zindo o risco de um indivíduo de adquirir uma condição, distúrbio ou doença.
[00164] O termo “contatar” ou “contato” se refere a reunir um agente terapêutico e uma célula ou tecido de modo que um efeito fisiológico e/ou químico ocorra como resultado de tal contato. O contato pode ocorrer in vitro, ex vivo ou in vivo. Em uma modalidade, um agente te- rapêutico é colocado em contato com uma célula em cultura de células (in vitro) para determinar o efeito do agente terapêutico na célula. Em outra modalidade, o contato de um agente terapêutico com uma célula ou tecido inclui a administração de um agente terapêutico a um indiví- duo com a célula ou tecido a ser contatado.
[00165] O termo “quantidade terapeuticamente eficaz” pretende in- cluir a quantidade de um composto que, quando administrado, é sufi- ciente para prevenir o desenvolvimento de, ou aliviar até certo ponto, um ou mais dos sintomas da condição, distúrbio ou doença sendo tra- tada. O termo “quantidade terapeuticamente eficaz” também se refere à quantidade de um composto que é suficiente para eliciar a resposta biológica ou médica de uma molécula biológica (por exemplo, uma proteína, enzima, RNA ou DNA), célula, tecido, sistema, animal, ou humano, que está sendo procurado por um pesquisador, veterinário, médico ou clínico.
[00166] O termo “transportador farmaceuticamente aceitável”, “ex- cipiente farmaceuticamente aceitável”, “transportador fisiologicamente aceitável” ou “excipiente fisiologicamente aceitável” refere-se a um ma- terial, composição ou veículo farmaceuticamente aceitável, tal como um enchimento líquido ou sólido, diluente, solvente ou material de en- capsulamento. Em uma modalidade, cada componente é “farmaceuti- camente aceitável” no sentido de ser compatível com os outros ingre- dientes de uma formulação farmacêutica e adequado para uso em contato com o tecido ou órgão de humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica, imunogenicidade ou outros pro- blemas ou complicações proporcionais a uma relação risco/benefício razoável. Veja, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd ed.; Allen Ed.: Philadelphia, PA, 2012; Handbook of Pharmaceu- tical Excipients, 7t ed.; Rowe et al., Eds.; O Pharmaceutical Press e a American Pharmaceutical Association: 2012; Handbook of Pharmaceu- tical Additives, 3a. ed.; Ash e Ash Eds.; Gower Publishing Company: 2007; Pharmaceutical Preformulation and Formulation, 2a. ed.; Gibson Ed.; CRC Press LLC: Boca Raton, FL, 2009.
[00167] O termo “CpG-Ab imunoconjugado” ou “CpG-Ab”, quando aqui usado, refere-se à ligação de um anticorpo (Ab) ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com um polinucleotídeo imunoesti- mulante conpossuindo CpG, conforme descrito neste documento.
[00168] O termo “agonista de células T”, quando aqui usado, refere- se a qualquer agente que estimula seletivamente a proliferação, dife- renciação e/ou sobrevivência de células T a partir de uma população mista de células iniciais. Assim, a população de células resultante é enriquecida com um número aumentado de células T em comparação com a população de células inicial. Os agonistas de células T que en- contram uso na presente descrição incluem, mas não estão limitados a moléculas de antígeno que se ligam especificamente a receptores de células T (TCRs), bem como moléculas coestimulatórias de células T. Exemplos de moléculas coestimuladoras de células T incluem, mas não estão limitados ao ligante OX40, CD2, CD27, CDS, ICAM-1, LFA- 1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD30, CD40, BAFFR, HVEM, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7- H3 e CD83. Em modalidades particulares, o agonista de células T é um anticorpo contra uma molécula coestimuladora de células T. Em modalidades particulares, o agonista de células T é um antígeno asso- ciado a tumor (TAA). Em modalidades particulares, o agonista de célu- las T é um antígeno patogênico.
[00169] Conforme usado neste documento, um “ponto de controle imunológico” ou “molécula de ponto de controle imunológico” é uma molécula no sistema imunológico que modula um sinal. Uma molécula de ponto de controle imunológico pode ser uma molécula de ponto de controle estimulador, ou seja, aumentar um sinal, ou molécula de pon- to de controle inibidor, ou seja, diminuir um sinal. Em modalidades es- pecíficas, o ponto de checagem imunológico é uma proteína expressa por células T ou por células apresentadoras de antígeno (APC). Certos tipos de células cancerosas expressam proteínas de ponto de controle imunológico para evitar a depuração imunológica. O uso de modulado- res de ponto de controle imunológico para inibir a interação entre a proteína de ponto de controle imunológico expressa por células cance- rosas e a proteína de ponto de controle imunológico expressa por célu- las T provou ser eficaz em certos tratamentos de câncer.
[00170] Conforme usado neste documento, um “modulador de pon-
to de controle imunológico” é um agente capaz de alterar a atividade de um ponto de controle imunológico em um indivíduo. Em certas mo- dalidades, um modulador de ponto de controle imunológico altera a função de uma ou mais moléculas de ponto de controle imunológico incluindo, mas não se limitando a, PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3, LAG-3, CEACAM-1, CEACAM -5, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, CD47, 2B4 e TGFR. O modulador do ponto de controle imunológico pode ser um agonista ou antagonista do ponto de controle imunológico. Em al- gumas modalidades, o modulador de ponto de controle imunológico é uma proteína de ligação de ponto de controle imunológico (por exem- plo, um anticorpo, fragmento Fab de anticorpo, anticorpo divalente, conjugado de fármaco de anticorpo, scFv, proteína de fusão, anticorpo bivalente ou anticorpo tetravalente). Em outras modalidades, o modu- lador de ponto de checagem imunológico é uma molécula pequena. Em uma modalidade particular, o modulador de ponto de checagem imunológico é um anticorpo anti-PD1 ou anti-PD-L1.
[00171] O termo “liberação direcionada” ou a forma verbal “alvo”, quando aqui usado, refere-se ao processo que promove a chegada de um agente administrado (tal como um polinucleotídeo imunoestimulan- te) em um órgão específico, tecido, célula e/ou intracelular comparti- mento (referido como o local-alvo) mais do que qualquer outro órgão, tecido, célula ou compartimento intracelular (referido como o local não alvo). A distribuição direcionada pode ser detectada usando métodos conhecidos na técnica, por exemplo, comparando a concentração do agente distribuído em uma população de células alvo com a concen- tração do agente distribuído em uma população de células não alvo após a administração sistêmica. Conforme fornecido neste documento, a liberação direcionada resulta em uma concentração pelo menos 2 vezes maior em um local direcionado em comparação com um local não alvo. A liberação direcionada pode ser alcançada por ligação es-
pecífica da porção de direcionamento a uma porção receptora associ- ada a uma célula alvo. Quando aqui usado, uma porção receptora as- sociada a uma célula alvo pode estar localizada na superfície ou den- tro do citosol da célula alvo. Em algumas modalidades, a porção re- ceptora é um antígeno associado à célula alvo.
[00172] O termo “DAR” refere-se a uma relação fármaco-anticorpo de um conjugado de polinucleotídeo-anticorpo imunomodulador, mais especificamente uma relação polinucleotídeo-anticorpo imunomodula- dor. Polinucleotídeos Imunomoduladores
[00173] Em uma modalidade, é fornecido neste documento um poli- nucleotídeo imunomodulador (por exemplo, imunoestimulante).
[00174] Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunomodulador compreende uma uridina modificada em 5 ou citidina modificada em 5. Em certas modalidades, a inclusão de uridina modificada em 5 (por exemplo, 5-etinil-uridina) no terminal 5’ do polinucleotídeo imunomodu- lador (por exemplo, entre os dois nucleosídeos do terminal 5') realça as propriedades de imunomodulação do polinucleotídeo. Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunomodulador é mais curto (por exemplo, compreendendo um total de cerca de 6 a cerca de 16 nu- cleotídeos ou de cerca de 12 a cerca de 14 nucleotídeos) do que um CpG ODN típico, que possui de 18 a 28 nucleotídeos de comprimento. Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunomodulador mais curto (por exemplo, aqueles compreendendo um total de cerca de 6 a cerca de 16 nucleotídeos ou de cerca de 12 a cerca de 14 nucleotídeos) re- tém a atividade imunomoduladora de um CpG ODN típico mais longo; ou exibe maior atividade imunomoduladora (por exemplo, conforme medido pela ativação de NFκB ou pelas alterações nos níveis de ex- pressão de pelo menos uma citocina (por exemplo, IL-6 ou IL-10), em comparação com o CpG ODN mais longo. Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunomodulador compreende um espaçador abásico. Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunomodulador compreen- de um fosfotriéster internucleosídeo. Descrições exemplificativas de polipeptídeos imunomoduladores podem ser encontradas em WO2018189382.
[00175] Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunomodulador fornecido neste documento exibe estabilidade (por exemplo, estabili- dade contra nucleases) que é superior àquela de um CpG ODN con- possuindo principalmente fosfato de internucleosídeo (por exemplo, mais de 50 % de fosfatos de internucleosídeo) sem sacrificar substan- cialmente sua atividade imunoestimulante. Este efeito pode ser alcan- çado, por exemplo, incorporando pelo menos 50 % (por exemplo, pelo menos 70 %) fosforotioatos ou fosforoditioatos de internucleosídeos ou através da inclusão de fosfotriésteres de internucleosídeos e/ou espa- çadores abásicos de internucleosídeos. Fosfotriésteres e espaçadores abásicos também são convenientes para a conjugação a uma porção de direcionamento. Fosfotríteres à base de fosfato e espaçadores abásicos também podem ser usados para a redução da atividade fora do alvo, em relação aos polinucleotídeos com estruturas totalmente fosforotioato. Sem desejar estar limitado pela teoria, este efeito pode ser alcançado reduzindo a autotransmissão sem interromper a distri- buição mediada por porção de direcionamento às células alvo. Conse- quentemente, um polinucleotídeo fornecido neste documento pode in- cluir cerca de 15 ou menos, cerca de 14 ou menos, cerca de 13 ou menos, cerca de 12 ou menos, cerca de 11 ou menos, ou cerca de 10 ou menos fosforotioatos de internucleosídeos contíguos. Por exemplo, um polinucleotídeo imunoestimulante compreendendo um total de cer- ca de 12 a cerca de 16 nucleosídeos pode conter cerca de 10 ou me- nos fosforotioatos de internucleosídeos contíguos.
[00176] O polinucleotídeo imunoestimulante fornecido neste docu-
mento pode conter um total de cerca de 50 ou menos, cerca de 30 ou menos, cerca de 28 ou menos, ou cerca de 16 ou menos nucleosí- deos. O polinucleotídeo imunoestimulante pode conter um total de pelo menos 6, cerca de 10 ou mais, ou cerca de 12 ou mais nucleosídeos. Por exemplo, o polinucleotídeo imunoestimulante pode conter um total de cerca de 6 a cerca de 30, de cerca de 6 a cerca de 28, de cerca de 6 a cerca de 20, de cerca de 6 a cerca de 16, de cerca de 10 a cerca de 20, de cerca de 10 a cerca de 16, de cerca de 12 a cerca de 28, de cerca de 12 a cerca de 20, ou de cerca de 12 a cerca de 16 nucleosí- deos.
[00177] Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunoestimulante compreende um ou mais fosfotriésteres (por exemplo, fosfotriésteres internucleosídeos) e/ou fosforotioatos (por exemplo, de cerca de 1 a cerca de 6 ou de cerca de 1 a cerca de 4), por exemplo, em um ou ambos os terminais (por exemplo, dentro dos seis nucleosídeos do terminal 5’ ou dos seis nucleosídeos do terminal 3'). A inclusão de um ou mais fosfotriésteres internucleosídicos e/ou fosforotioatos pode re- alçar a estabilidade do polinucleotídeo reduzindo a taxa de degrada- ção mediada por exonuclease.
[00178] Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunoestimulante compreende um fosfotriéster ou um fosfodiéster terminal, onde o fosfo- triéster ou o fosfodiéster terminal compreende um ligante ligado a uma porção de direcionamento ou um grupo de conjugação e, opcional- mente, a um ou mais (por exemplo, de cerca de 1 a cerca de 6) por- ções auxiliares. Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunoesti- mulante compreende apenas um ligante. Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunoestimulante compreende apenas um grupo de conjugação.
[00179] O polinucleotídeo fornecido neste documento pode ser um polinucleotídeo hibridizado incluindo uma fita e seu complemento par-
cial ou total. Os polinucleotídeos hibridizados podem possuir pelo me- nos 6 pares de bases complementares (por exemplo, cerca de 6, cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 11, cerca de 12, cerca de 13, cerca de 14, cerca de 15, cerca de 16, cerca de 17, cerca de 18, cerca de 19, cerca de 20, cerca de 21, cerca de 22 ou cerca de 23), até o número total de nucleotídeos presentes na fita mais curta incluída. Por exemplo, a porção hibridizada do polinucleotídeo hibridi- zado pode conter cerca de 6, cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 11, cerca de 12, cerca de 13, cerca de 14, cerca de 15, cerca de 16, cerca de 17, cerca de 18, cerca de 19, cerca de 20, cerca de 21, cerca de 22 ou cerca de 23 pares de bases.
[00180] Em uma modalidade, é fornecido neste documento um poli- nucleotídeo imunoestimulante de Fórmula (A): ou um estereoisômero, uma mistura de dois ou mais diastereômeros, um tautômero ou uma mistura de dois ou mais tautômeros dos mes- mos; ou um sal, solvato ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo; em que: cada XN é independentemente um nucleotídeo; X3’ é um nucleotídeo terminal 3'; X5’ é um nucleotídeo terminal 5'; YP é um fosfotriéster internucleosídico; e b e c são, cada um, um número inteiro variando de cerca de 0 a cerca de 25; com a condição de que sua soma não seja inferior a
5.
[00181] Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunoestimulante compreende um nucleotídeo com uma nucleobase modificada.
[00182] Em certas modalidades, b é um número inteiro que varia de cerca de 1 a cerca de 15. Em certas modalidades, b é um número in-
teiro de cerca de 1, cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 11, cerca de 12, cerca de 13, cerca de 14 ou cerca de 15. Em certas modalidades, b é um número inteiro de cerca de 3, cerca de 4, cerca de 11 ou cerca de 14. Em certas modalidades, b é um número inteiro de cerca de 3. Em certas modalidades, b é um número inteiro de cerca de 4. Em certas modalidades, b é um número inteiro de cerca de 11. Em certas modalidades, b é um número inteiro de cerca de 14.
[00183] Em certas modalidades, c é um número inteiro que varia de cerca de 0 a cerca de 10. Em certas modalidades, c é um número in- teiro de cerca de 0, cerca de 1, cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6, cerca 7, cerca de 8, cerca de 9 ou cerca de 10. Em certas modalidades, c é um número inteiro de cerca de 0 ou cerca de 8. Em certas modalidades, c é um número inteiro de cerca de 0. Em certas modalidades, c é um número inteiro de cerca de 8.
[00184] Em certas modalidades, b é um número inteiro de cerca de 3 e c é um número inteiro de cerca de 8. Em certas modalidades, b é um número inteiro de cerca de 4 e c é um número inteiro de cerca de
8. Em certas modalidades, b é um número inteiro de cerca de 11 e c é um número inteiro de cerca de 0. Em certas modalidades, b é um nú- mero inteiro de cerca de 14 e c é um número inteiro de cerca de 0.
[00185] Em certas modalidades, b e c juntos no total variam de cer- ca de 5 a cerca de 20. Em certas modalidades, b e c juntos no total variam de cerca de 5 a cerca de 15. Em certas modalidades, b e c jun- tos em no total são cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7, cerca de 8, cer- ca de 9, cerca de 10, cerca de 11, cerca de 12, cerca de 13, cerca de 14 ou cerca de 15. Em certas modalidades, b e c juntos no total são cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 11, cerca de 12, cerca de 13 ou cerca de 14. Em certas modalidades, b e c juntos no total são cerca de 11. Em certas modalidades, b e c juntos no total são cerca de
12. Em certas modalidades, bec juntos no total são cerca de 14.
[00186] Em certas modalidades, cada XN é independentemente um 2'-desoxirribonucleotídeo ou um ribonucleotídeo modificado em 2’. Em certas modalidades, cada XN é independentemente 2'- desoxiadenosina (A), 2'-desoxiguanosina (G), 2'-desoxicitidina (C), 5- halo-2'-desoxicitidina, 2'-desoxitimidina (T), 2'-desoxiuridina (U), uma 5-halo-2'-desoxiuridina, um 2'-fluororibonucleotídeo, um 2'- metoxirribonucleotídeo ou um 2’-(2-metoxietóxi)ribonucleotídeo. Em certas modalidades, cada XN é, independentemente, um 2'- desoxirribonucleotídeo. Em certas modalidades, cada XN é indepen- dentemente 2'-desoxiadenosina, 2'-desoxiguanosina, 2'-desoxicitidina, 5-halo-2'-desoxicitidina, 2'-desoxitimidina, 2'-desoxiuridina ou 5-halo-2’- desoxiuridina. Em certas modalidades, cada XN é, independentemente, 2'-desoxiadenosina, 2'-desoxiguanosina, 2'-desoxicitidina, 2'- desoxitimidina, 5-bromo-2'-desoxiuridina ou 5-iodo-2'-desoxiuridina.
[00187] Em certas modalidades, X3’ é um 2'-desoxirribonucleotídeo ou um ribonucleotídeo modificado em 2'. Em certas modalidades, X3’ é um 2'-desoxirribonucleotídeo. Em certas modalidades, X3’ é 2'- desoxiadenosina, 2'-desoxiguanosina, 2'-desoxicitidina, 5-halo-2'- desoxicitidina, 2'-desoxitimidina, 2'-desoxiuridina, 5-halo-2'- desoxiuri- dina, um 2'-fluororibonucleotídeo, um 2'-metoxirribonucleotídeo ou um 2’-(2-metoxietóxi)ribonucleotídeo. Em certas modalidades, X3’ é 2'- desoxiadenosina, 2'-desoxiguanosina, 2'-desoxicitidina, 5-halo-2'- desoxicitidina, 2'-desoxitimidina, 2'-desoxiuridina ou 5-halo-2' - desoxiuridina. Em certas modalidades, X3’ é 2'-desoxitimidina. Em cer- tas modalidades, X3’ é um 2'-desoxirribonucleotídeo com uma base de pirimidina substituída. Em certas modalidades, X3’ é um 2'- desoxirribonucleotídeo com uma base de pirimidina 5-substituída. Em certas modalidades, X3’ é 2'-desoxitimidina, 5-halo-2'-desoxicitidina ou 5-halo-2'-desoxiuridina. Em certas modalidades, X3’ é 2'-
desoxitimidina, 5-bromo-2'-desoxicitidina, 5-iodo-2'-desoxicitidina, 5- bromo-2'-desoxiuridina ou 5-iodo-2'-desoxicitidina. Em certas modali- dades, X3’ é 2'-desoxitimidina, 5-bromo-2'-desoxiuridina ou 5-iodo-2'- desoxiuridina. Em certas modalidades, X3' é um nucleotídeo terminal compreendendo um grupo de tamponamento em 3’. Em certas moda- lidades, o grupo de tamponamento em 3’ é um fosfoéster terminal. Em certas modalidades, o grupo de tamponamento em 3’ é 3-hidroxil- propilfosforil (isto é, -P(O2)-OCH2CH2CH2OH).
[00188] Em certas modalidades, X5’ é um 2'-desoxirribonucleotídeo ou um ribonucleotídeo modificado em 2'. Em certas modalidades, X5’ é um 2'-desoxirribonucleotídeo. Em certas modalidades, X5’ é 2'- desoxiadenosina, 2'-desoxiguanosina, 2'-desoxicitidina, 5-halo-2'- desoxicitidina, 2'-desoxitimidina, 2'-desoxiuridina, 5-halo-2'- desoxiuri- dina, um 2'-fluororibonucleotídeo, um 2'-metoxirribonucleotídeo ou um 2’-(2-metoxietóxi)ribonucleotídeo. Em certas modalidades, X5’ é 2'- desoxiadenosina, 2'-desoxiguanosina, 2'-desoxicitidina, 5-halo-2'- desoxicitidina, 2'-desoxitimidina, 2'-desoxiuridina ou 5-halo-2'- desoxiuridina. Em certas modalidades, X5’ é um 2'- desoxirribonucleotídeo com uma base de pirimidina substituída. Em certas modalidades, X5’ é um 2'-desoxirribonucleotídeo com uma base de pirimidina 5-substituída. Em certas modalidades, X5’ é 2'- desoxitimidina, 5-halo-2'-desoxicitidina ou 5-halo-2'-desoxiuridina. Em certas modalidades, X5’ é uma 5-halo-2'-desoxicitidina. Em certas mo- dalidades, X5’ é uma 5-halo-2'-desoxiuridina. Em certas modalidades, X5’ é 2'-desoxitimidina, 5-bromo-2'-desoxicitidina, 5-iodo-2'- desoxicitidina, 5-bromo-2'-desoxiuridina ou 5-iodo-2'-desoxiuridina. Em certas modalidades, X5’ é 2'-desoxitimidina, 5-bromo-2'-desoxiuridina ou 5-iodo-2'-desoxiuridina. Em certas modalidades, X5’ é 5-bromo-2'- desoxiuridina. Em certas modalidades, X5’ é 5-iodo-2'-desoxiuridina. Em certas modalidades, X5 'possui um grupo 3'-fosforotioato. Em cer-
tas modalidades, X5 'possui um grupo 3'-fosforotioato com uma quira- lidade de Rp. Em certas modalidades, X5' possui um grupo 3'- fosforotioato com uma quiralidade de Sp.
[00189] Em certas modalidades, YP é um fosfotiotriéster internu- cleosídeo.
[00190] Em certas modalidades, YP é: em que Z é O ou S; e d é um número inteiro que varia de cerca de 0 a cerca de 50. Em certas modalidades, Z é O. Em certas modalidades, Z é S. Em certas modalidades, d é um número inteiro que varia de cerca de 0 a cerca de 10. Em certas modalidades, d é um número inteiro que varia de cerca de 0 a cerca de 5. Em certas modalidades, d é um nú- mero inteiro de cerca de 0, cerca de 1, cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4 ou cerca de 5. Em certas modalidades, d é um número inteiro de cerca de 0, cerca de 1 ou cerca de 3.
[00191] Em certas modalidades, YP é: em que Z é O ou S; e d é um número inteiro que varia de cerca de 0 a cerca de 50. Em certas modalidades, YP é: em que Z é O ou S; e d é um número inteiro que varia de cerca de 0 a cerca de 50. Em certas modalidades, YP é:
em que Z é O ou S; e d é um número inteiro que varia de cerca de 0 a cerca de 50. Em certas modalidades, Z é O. Em certas modalidades, Z é S. Em certas modalidades, d é um número inteiro que varia de cerca de 0 a cerca de 10. Em certas modalidades, d é um número inteiro que varia de cerca de 0 a cerca de 5. Em certas modalidades, d é um nú- mero inteiro de cerca de 0, cerca de 1, cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4 ou cerca de 5. Em certas modalidades, d é um número inteiro de cerca de 0, cerca de 1 ou cerca de 3.
[00192] Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunoestimulante de Fórmula (A) compreende um fosfotriéster de internucleosídeo adici- onal. Em uma modalidade, o fosfotriéster de internucleosídeo adicional é um C1-6 alquil fosfotriéster. Em outra modalidade, o fosfotriéster in- ternucleosídeo adicional é etilfosfotriéster.
[00193] Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunoestimulante de Fórmula (A) compreende uma 5-halo-2'-desoxiuridina. Em uma mo- dalidade, a 5-halo-2'-desoxiuridina é 5-fluoro-2'-desoxiuridina, 5- bromo-2'-desoxiuridina ou 5-iodo-2'-desoxiuridina. Em outra modalida- de, a 5-halo-2'-desoxiuridina é 5-bromo-2'-desoxiuridina ou 5-iodo-2'- desoxiuridina. Em ainda outra modalidade, a 5-halo-2'-desoxiuridina é 5-fluoro-2'-desoxiuridina. Em ainda outra modalidade, a 5-halo-2'- desoxiuridina é 5-bromo-2'-desoxiuridina. Em ainda outra modalidade, a 5-halo-2'-desoxiuridina é 5-iodo-2'-desoxiuridina.
[00194] Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunoestimulante de Fórmula (A) compreende três ou mais 2'-desoxicitidinas. Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunoestimulante de Fórmula (A) com- preende três 2'-desoxicitidinas.
[00195] Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunoestimulante de Fórmula (A) compreende quatro ou mais 2'-desoxiguanosinas. Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunoestimulante de Fórmula (A) compreende quatro 2'-desoxiguanosinas.
[00196] Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunoestimulante de Fórmula (A) compreende três 2'-desoxicitidinas e quatro 2'- desoxiguanosinas. Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunoes- timulante de Fórmula (A) compreende um, dois ou três dinucleotídeos CG. Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunoestimulante de Fórmula (A) compreende três dinucleotídeos CG.
[00197] Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunoestimulante de Fórmula (A) compreende três ou mais 2'-desoxitimidinas. Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunoestimulante de Fórmula (A) com- preende três, quatro, cinco, seis, sete ou oito 2'-desoxitimidinas. Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunoestimulante de Fórmula (A) compreende três, quatro, cinco ou oito 2'-desoxitimidinas.
[00198] Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunoestimulante de Fórmula (A) não compreende uma 2'-desoxiadenosina. Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunoestimulante de Fórmula (A) com- preende uma ou duas 2'-desoxiadenosinas.
[00199] Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunoestimulante de Fórmula (A) possui um comprimento que varia de cerca de 5 a cer- ca de 20 ou de cerca de 6 a cerca de 15. Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunoestimulante de Fórmula (A) possui um compri- mento de cerca de 6, cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 11, cerca de 12, cerca de 13, cerca de 14 ou cerca de 15. Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunoestimulante de Fórmula (A) possui um comprimento de cerca de 10, cerca de 11, cerca de 12, cerca de 13, cerca de 14 ou cerca de 15.
[00200] Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunoestimulante de Fórmula (A) compreende um ou mais fosforotioatos de internucleo- sídeos. Em certas modalidades, todos os fosfoésteres de internucleo- sídeos no polinucleotídeo imunoestimulante de Fórmula (A) são fosfo- rotioatos de internucleosídeos. Em certas modalidades, o polinucleotí-
deo imunoestimulante de Fórmula (A) compreende um ou mais fosfo- rotioatos internucleosídeos quirais.
[00201] Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunoestimulante de Fórmula (A) é p275, p276, p313 ou p347. Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunoestimulante de Fórmula (A) é p236, p238, p243, p246, p308, p361, p362 ou p425. Em certas modalidades, o polinucle- otídeo imunoestimulante de Fórmula (A) é p236, p238, p243, p246, p275, p276, p308, p313, p347, p361, p362, p425, p433, p434, p435, p436, p437, p438, p477, p478, p479, p480, p481, p482, p483, p484, p485, p486, p487, p488, ou p489.
[00202] Em uma modalidade, é fornecido neste documento um poli- nucleotídeo imunoestimulante possuindo uma sequência de N1N2CGN3CG (T)xGN4CGN5T (SEQ ID NO: 586), ou um estereoisôme- ro, uma mistura de dois ou mais diastereômeros, um tautômero ou uma mistura de dois ou mais tautômeros dos mesmos; ou um sal, sol- vato ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo; em que: x é um número inteiro variando de cerca de 1 a cerca de 4; N1 está ausente ou 2'-desoxitimidina; N2 é um 2'-desoxirribonucleotídeo com uma nucleobase modificada; N3 é 2'-desoxiadenosina ou 2'-desoxitimidina, cada uma compreendendo opcionalmente um 3'-fosfotriéster; N4 é 2'-desoxiadenosina ou 2'-desoxitimidina; N5 é 2'-desoxitimidina, opcionalmente compreendendo um 3'-fosfotriéster; e C é 2'-desoxicitidina e G é 2'-desoxiguanosina.
[00203] Em certas modalidades, em N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T (SEQ ID NO:586), x é um número inteiro de cerca de 1, cerca de 2, cerca de 3, ou cerca de 4. Em certas modalidades, em N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T (SEQ ID NO:586), x é um número inteiro de cerca de 1. Em certas modalidades, em N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T (SEQ ID NO:586), x é um número inteiro de cerca de 4.
[00204] Em certas modalidades, em N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T (SEQ ID NO:586), N1 está ausente. Em certas modalidades, em N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T (SEQ ID NO:586), N1 é 2’-desoxitimidina.
[00205] Em certas modalidades, em N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T (SEQ ID NO:586), N2 é um 2’-desoxirribonucleotídeo com uma base de pirimidina substituída. Em certas modalidades, em N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T (SEQ ID NO:586), N2 é um 2’- desoxirribonucleotídeo com uma base de pirimidina substituída em 5. Em certas modalidades, em N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T (SEQ ID NO:586), N2 é uma 5-halo-2’-desoxicitidina ou uma 5-halo-2’- desoxiuridina. Em certas modalidades, em N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T (SEQ ID NO:586), N2 é 5-bromo-2’- desoxiuridina ou 5-iodo-2’-desoxiuridina.
[00206] Em certas modalidades, em N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T (SEQ ID NO:586), N3 é 2’-desoxiadenosina compreendendo um 3’- fosfotriéster. Em certas modalidades, em N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T (SEQ ID NO:586), N3 é 2’-desoxitimidina. Em certas modalidades, em N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T (SEQ ID NO:586), N3 é 2’-desoxitimidina compreendendo um 3’-fosfotriéster.
[00207] Em certas modalidades, em N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T (SEQ ID NO:586), N4 é 2’-desoxiadenosina. Em certas modalidades, em N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T (SEQ ID NO:586), N4 é 2’- desoxitimidina.
[00208] Em certas modalidades, em N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T (SEQ ID NO:586), N5 é 2’-desoxitimidina. Em certas modalidades, em N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T (SEQ ID NO:586), N5 é 2’-desoxitimidina compreendendo um 3’-fosfotriéster.
[00209] Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunoestimulante de N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T (SEQ ID NO:586) compreende um ou mais fosforotioatos internucleosídeo. Em certas modalidades, o polinu- cleotídeo imunoestimulante de N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T (SEQ ID NO:586) compreende pelo menos um fosforotioatos internucleosídeo quirais.
[00210] Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunoestimulante de N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T é p275, p276, ou p313. Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunoestimulante de N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T (SEQ ID NO:586) é p236, p238, p243, p246, p308, p361, p362, ou p425. Em certas modalidades, o polinu- cleotídeo imunoestimulante de N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T é p236, p238, p243, p246, p275, p276, p308, p313, p347, p361, p362, p425, p433, p434, p435, p436, p437, p438, p477, p478, p479, p480, p481, p482, p483, p484, p485, p486, p487, p488, ou p489.
[00211] Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunoestimulante fornecido neste documento é um polinucleotídeo imunoestimulante. Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunoestimulante fornecido neste documento funciona como um PAMS. Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunoestimulante fornecido neste documento ativa a resposta imune inata ou estimula a resposta imune adaptativa ao de- sencadear a sinalização de TLR9. Em certas modalidades, o polinu- cleotídeo imunoestimulante fornecido neste documento é um agonista de TLR9.
[00212] Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunoestimulante fornecido neste documento é um polinucleotídeo CpG de classe B, ou sua modificação incluindo 5-halouridina ou 5-alquiniluridina, ou uma versão truncada dos mesmos (por exemplo, aqueles compreendendo um total de cerca de 6 a cerca de 16 nucleosídeos) Em certas modali- dades, o polinucleotídeo imunoestimulante truncado fornecido neste documento compreende uma sequência de polinucleotídeo CpG de classe B truncada (por exemplo, uma sequência de polinucleotídeo CpG de classe B, a partir da qual um ou mais nucleotídeos do terminal 3' são eliminados ou um ou mais dos nucleotídeos intrassequência ex- cisado).
[00213] Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunoestimulante fornecido neste documento compreende pelo menos uma sequência imunoestimulante (ISS). Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunoestimulante fornecido neste documento compreende cerca de 1, cerca de 2, cerca de 3 ou cerca de 4 ISS. A ISS em polinucleotídeos imunoestimulantes é dependente do organismo alvo. A característica comum da ISS usada no polinucleotídeo imunoestimulante fornecido neste documento é a sequência citidina-p-guanosina, em que p é um fosfodiéster internucleosídeo (por exemplo, fosfato ou fosforotioato) ou um fosfotriéster internucleosídeo. Em certas modalidades, a citidina e a guanosina no ISS, cada uma, independentemente, compreende 2'- desoxirribose. Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunoestimu- lante fornecido neste documento compreende cerca de 1, cerca de 2 ou cerca de 3 ISSs humanos. Em certas modalidades, a ISS humana é CG ou NCG, onde N é uridina, citidina ou timidina, ou uma uridina ou citidina modificada; e G é guanosina ou uma guanosina modificada. Em certas modalidades, a uridina ou citidina modificada é uma 5- halouridina (por exemplo, 5-iodouridina ou 5-bromouridina), uma 5- alquiniluridina (por exemplo, 5-etiniluridina ou 5-propiniluridina), 5- heteroariluridina ou 5-halocitidina. Em certas modalidades, a guanosi- na modificada é 7-desazaguanosina. Em certas modalidades, a ISS humana é NCG, em uma modalidade, N é 5-halouridina. Em certas modalidades, a ISS humana é UCG, em uma modalidade, U é 5- alquiniluridina e, em outra modalidade, U é 5-etiniluridina. Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunoestimulante fornecido neste do-
cumento direcionado a humanos compreende uma ISS dentro de qua- tro nucleotídeos contíguos que inclui um nucleotídeo de terminal 5’. Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunoestimulante fornecido neste documento direcionado a humanos compreende uma ISS de terminal 5’. Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunoestimulan- te fornecido neste documento compreende uma ISS murino. Em certas modalidades, a ISS de murino é uma sequência de nucleotídeos he- xaméricos: Pu-Pu-CG-Py-Py, onde cada Pu é independentemente um nucleotídeo de purina e cada Py é independentemente um nucleotídeo de pirimidina.
[00214] Em certas modalidades, os nucleotídeos flanqueadores em 5' em relação a CpG no polinucleotídeo imunoestimulante fornecido neste documento não contém 2'-alcoxirriboses. Em certas modalida- des, os nucleotídeos flanqueadores em 5’ em relação a CpG no poli- nucleotídeo imunoestimulante fornecido neste documento compreende apenas 2'-desoxirriboses como açúcares.
[00215] Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunoestimulante fornecido neste documento possui (1) um alto teor de fosforotioatos (por exemplo, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 % ou pelo menos 80 % dos nucleosídeos podem ser ligados por fosforo- tioatos); (2) ausência de caudas poli-G; (3) nucleosídeos no polinu- cleotídeo imunoestimulante compreende 2'-desoxirriboses ou 2'- riboses modificadas (por exemplo, 2'-halo (por exemplo, 2'-fluoro) ou 2'-alcóxi opcionalmente substituído (por exemplo, 2'-metóxi)) ; e/ou (4) a inclusão de ISS do terminal 5' que é NCG, em que N é uridina, citidi- na ou timidina, ou uma uridina ou citidina modificada, e G é guanosina ou uma guanosina modificada.
[00216] Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunomodulador fornecido neste documento suprime a resposta imune adaptativa redu- zindo a ativação da sinalização de TLR9 (por exemplo, através do an-
tagonismo de TLR9). Em certas modalidades, o polinucleotídeo imu- nossupressor fornecido neste documento compreende pelo menos dois 2'-alcoxinucleotídeos que são flanqueadores em 5’ em relação a CpG, conforme descrito pela fórmula de N1-N2-CG, onde N1 e N2 são, cada um, independentemente, um nucleotídeo conpossuindo 2’- alcoxirribose (por exemplo, 2'-metoxirribose). Características Estruturais de Polinucleotídeos Imunomodulado- res Espaçadores Abásicos
[00217] Em certas modalidades, os polinucleotídeos imunomodula- dores fornecidos aqui compreendem um ou mais, em uma modalidade, um ou dois espaçadores abásicos, cada um dos quais é independen- temente um espaçador abásico internucleosídeo ou espaçador abási- co terminal. Quando o polinucleotídeo imunomodulador inclui dois ou mais dos espaçadores abásicos, as estruturas dos espaçadores não básicos podem ser iguais ou diferentes.
[00218] Em uma modalidade, o espaçador abásico é de fórmula (I): R1–L1–[–L2–(L1)n1–]n2–R2, (I) em que: n1 é um número inteiro de cerca de 0 ou cerca de 1, n2 é um número inteiro de cerca de 1 a cerca de 6, R1 é uma ligação a um nucleosídeo no polinucleotídeo imu- nomodulador, R2 é uma ligação a um nucleosídeo no polinucleotídeo imu- nomodulador ou a um grupo de tamponamento, cada L1 é independentemente um fosfodiéster ou um fosfo- triéster, e cada L2 é um análogo do açúcar.
[00219] Em certas modalidades, se o espaçador abásico for um es-
paçador abásico internucleosídeo, n1 é cerca de 1 e R2 é uma ligação a um nucleosídeo; e se o espaçador abásico for um espaçador abási- co terminal, n1 é cerca de 0 ou cerca de 1, e R2 é uma ligação a um grupo de tamponamento.
[00220] Em certas modalidades, o espaçador abásico é um espa- çador abásico internucleosídeo. Em certas modalidades, o espaçador abásico é um espaçador abásico de terminal 3’. Em certas modalida- des, cada dois grupos L2 contíguos são separados por grupos L1 (por exemplo, n1 é 1 para L1 disposto entre dois grupos L2 contíguos).
[00221] Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunoestimulante fornecido neste documento compreende uma ISS disposta dentro de quatro nucleotídeos contíguos que incluem um nucleotídeo terminal 5’ do polinucleotídeo imunoestimulante, onde a ISS é NCG, onde N é uridina, citidina ou timidina, ou uma uridina ou citidina modificada, em uma modalidade, uma 5-halouridina (por exemplo, 5-iodouridina ou 5- bromouridina), uma 5-alquiniluridina (por exemplo, 5-etiniluridina ou 5- propiniluridina), 5-heteroariluridina, ou 5 -halocitidina; e onde N e C estão ligados um ao outro através de um fosfodiéster ou fosfotriéster. Análogos de Açúcar
[00222] Em uma modalidade, um análogo de açúcar é um grupo divalente ou trivalente que é um C3-6 monossacarídeo ou C3-6 alditol (por exemplo, glicerol), que é modificado para substituir dois grupos hidroxila com ligações (i) a um oxigênio átomo em um fosfoéster e (ii) a um átomo de oxigênio em outro fosfoéster ou a um grupo de tampo- namento. Um análogo do açúcar é cíclico ou acíclico. Outras modifica- ções opcionais incluídas em um análogo de açúcar são: uma substitui- ção de um, dois ou três dos grupos hidroxila restantes ou átomos de hidrogênio ligados a carbono por H; C1-6 alquila opcionalmente substi- tuída; –LigaçãoA(–T)p, conforme definido neste documento; um grupo de conjugação; -(CH2)t1-ORZ, onde t1 é um número inteiro de cerca de
1 a cerca de 6, e RZ é C1-6 alquila opcionalmente substituída, C2-6 al- quenila opcionalmente substituída, C2-6 alquinila opcionalmente substi- tuída, C6-14 arila opcionalmente substituída, C3-8 cicloalquila opcional- mente substituída, (C1-9 heterociclila)-C1-6-alquila opcionalmente substi- tuída, (C6-10 arila)-C1-6-alquila ou (C3-8 cicloalquila)-C1-6-alquila opcio- nalmente substituída; introdução de uma ou duas insaturação (ões) (por exemplo, uma ou duas ligações duplas); e substituição de um, dois ou três grupos hidrogênios ou hidroxila com substituintes confor- me definido para alquila, alquenila, cicloalquila, cicloalquenila ou hete- rociclila. Em algumas modalidades, RZ é C1-6 aminoalquila opcional- mente substituída (por exemplo, C1-6 aminoalquila opcionalmente substituída conpossuindo –NH2).
[00223] Exemplos não limitantes de análogos de açúcar são C2-6 alquileno opcionalmente substituído, C2-6 alquenileno opcionalmente substituído, C5 cicloalcano-1,3-diiía opcionalmente substituída, C5 ci- cloalceno-1,3-diiía opcionalmente substituída, heterocicla-1,3-diíla (por exemplo, pirrolidina-2,5-diiía , tetra-hidrofuran-2,5-diiía opcionalmente substituída, ou tetra-hidrotiofeno-2,5-diíla opcionalmente substituída), ou (C1-4 alquil)-(C3-8 cicloalquileno) (por exemplo, (C1 alquil)-(C3 ciclo- alquileno) opcionalmente substituído). Exemplos não limitantes de análogos de açúcar são: , , , ,e , em que: cada um dentre R1 e R2 é independentemente uma ligação a um átomo de oxigênio em um fosfoéster; cada um dentre R3 e R4 é independentemente H; C1-6 alqui- la opcionalmente substituída; –(CH2)t1–ORZ; ou –LigaçãoA–RT; onde t1 é um número inteiro de cerca de 1 a cerca de 6; RZ é C1-6 alquila opcionalmente substituída, C2-6 alquenila opcionalmente substituída, C2-6 alquinila opcionalmente substituída, C6- 14 arila opcionalmente substituída, C3-8 cicloalquila opcionalmente substituída, (C1-9 heterociclil)-C1-6-alquila opcionalmente substituída, (C6-10 aril)-C1-6-alquila opcionalmente substituída, (C3-8 cicloalquil)-C1-6- alquila opcionalmente substituída; LigaçãoA é um ligante; e RT é uma ligação a uma porção de direcionamento; uma porção de conjugação; C1-6 alquila opcionalmente substituída, C2-6 al- quenila opcionalmente substituída, C2-6 alquinila opcionalmente substi- tuída, C6-14 arila opcionalmente substituída, C3-8 cicloalquila opcional- mente substituída, (C1-9 heterociclil)-C1-6-alquila opcionalmente substi- tuída, (C6-10 aril)-C1-6-alquila opcionalmente substituída ou (C3-8 cicloal- quil)-C1-6-alquila opcionalmente substituída.
[00224] Em certas modalidades, RZ é C1-6 aminoalquila opcional- mente substituída (por exemplo, C1-6 amino alquila conpossuindo – NH2). Fosfoésteres
[00225] Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunomodulador fornecido neste documento compreende um ou mais fosfotriésteres internucleosídeos e/ou um ou dois fosfodiésteres terminais e/ou fosfo- triésteres. Em certas modalidades, um fosfotriéster compreende um fosfato, fosforotioato ou fosforoditioato, em que uma ou duas valências são substituídas por nucleosídeos e/ou espaçadores abásicos e as valências restantes são ligadas a um grupo biorreversível, um grupo não biorreversível, um ligante ligado a uma porção de direcionamento, ou um grupo de conjugação. Em certas modalidades, um fosfotriéster internucleosídeo é ligado a dois nucleosídeos e/ou espaçadores abá- sicos e a valência restante é ligada a um grupo biorreversível, um gru- po não biorreversível, um ligante ligado a uma porção de direciona- mento ou um grupo de conjugação. Em certas modalidades, um fosfo-
diéster internucleosídico é ligado a dois nucleosídeos e/ou espaçado- res abásicos. Em certas modalidades, um fosfodiéster terminal com- preende um fosfato, fosforotioato ou fosforoditioato no terminal 5’ ou 3' do polinucleotídeo imunomodulador, onde uma das duas valências restantes está ligada a um grupo biorreversível, um grupo não biorre- versível, um ligante ligado a uma porção de direcionamento ou um grupo de conjugação. Ligantes e Porções de Conjugação
[00226] Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunomodulador fornecido neste documento compreende um ligante ligado a uma por- ção de direcionamento e, opcionalmente, uma ou mais porções auxilia- res. Em certas modalidades, o ligante é um grupo multivalente, no qual a primeira valência é ligada a um internucleosídeo ou fosfato terminal, um internucleosídeo ou fosforotioato terminal, um internucleosídeo ou fosforoditioato terminal, um espaçador abásico, um grupo de tampo- namento ou uma nucleobase, e uma segunda valência está ligada a uma porção de direcionamento. Em certas modalidades, o ligante in- clui ainda uma ou mais valências, cada uma das quais independente- mente ligada a uma porção auxiliar. Em certas modalidades (por exemplo, quando a porção de direcionamento é uma molécula peque- na), o polinucleotídeo imunomodulador fornecido neste documento compreende vários ligantes para várias porções de direcionamento. Em certas modalidades (por exemplo, quando a porção de direciona- mento é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo), o polinucleotídeo imunomodulador fornecido neste documen- to compreende um ligante para uma porção de direcionamento.
[00227] Em certas modalidades, o polinucleotídeo imunomodulador fornecido neste documento compreende um grupo de conjugação. Um grupo de conjugação é um grupo funcional que é capaz de sofrer uma reação de conjugação, por exemplo, uma reação de cicloadição (por exemplo, cicloadição dipolar), reação de amidação ou substituição nu- cleofílica aromática. Após a reação com um grupo reativo complemen- tar, o grupo de conjugação produz o ligante no polinucleotídeo imuno- modulador fornecido neste documento.
[00228] Em certas modalidades, o ligante ligado a uma porção de direcionamento é uma parte de um fosfotriéster internucleosídeo. Em certas modalidades, o ligante ligado a uma porção de direcionamento é uma parte de um espaçador não básico.
[00229] Em certas modalidades, o ligante ou um grupo de conjuga- ção possui a fórmula (II): –Z1–QA1–Z2–(–QA2–Z3–)k–RT, (II) em que: Z1 é um grupo divalente, um grupo trivalente, um grupo te- travalente ou um grupo pentavalente, no qual um dentre valência está ligado a QA1, a segunda valência é aberta ou, se a fórmula (II) for para o ligante, está ligado a RT, e cada uma das valências restantes, quan- do presentes, está independentemente ligada a uma porção auxiliar; Z2 está ausente, um grupo divalente, um grupo trivalente, um grupo tetravalente ou um grupo pentavalente, em que um dentre valência está ligado a QA1, a segunda valência está ligada a QA2 ou RT, e cada uma das valências restantes, quando presente, está inde- pendentemente ligado a uma porção auxiliar; Z3 está ausente, um grupo divalente, um grupo trivalente, um grupo tetravalente ou um grupo pentavalente, em que um dentre valência está ligado a QA2, a segunda valência está ligada a RT e cada uma das valências restantes, quando presente, é ligado de forma in- dependente a uma porção auxiliar; RT está ausente ou uma ligação a uma porção de direcio- namento;
k é um número inteiro de cerca de 0 ou cerca de 1.
[00230] Se a fórmula (II) for para o ligante, QA1 e QA2 estão independentemente ausentes, C2-12 hetero- alquileno opcionalmente substituído (por exemplo, um heteroalquileno conpossuindo –C(O)–N(H)–, –N(H)–C(O)–, –S(O)2–N(H)–, ou –N(H)– S(O)2–), C1-12 tio-heterociclileno opcionalmente substituído (por exem- plo, , , , , ou ), C1-12 heterociclileno opcionalmente substituído (por exem- plo, 1,2,3-triazol-1,4-diíla ou ), ciclobut-3-eno-1,2- diona-3,4-diiía, pirid-2-il hidrazona, C6-16 triazolo-heterociclileno opcio- nalmente substituído (por exemplo, ou ), C8-16 triazolocicloalquenileno opcionalmente substituído (por exemplo, ), ou um grupo di-hidropiridazina (por exemplo,
trans- , trans- , , ou ); e RT é uma ligação a uma porção de direcionamento; desde que pelo menos um dentre QA1 e QA2 esteja presente.
[00231] Se a fórmula (II) for para um grupo de conjugação, ou (i) QA2 está ausente, e QA1 é uma porção de conjugação, por exemplo, C2-12 alquinila opcionalmente substituída, amino N- protegido opcionalmente substituído, azido, N-maleimido, tiol S- protegido, , , ou uma versão N-protegida dos mesmos, , , , C6-16 heterociclila opcionalmente substituída con- possuindo uma ligação tripla carbono-carbono endocíclica (por exem- plo, ), grupo 1,2,4,5-tetrazina (por exemplo,
ou ), ou C8-16 cicloalquinila opcio-
nalmente substituída (por exemplo, ), –NHRN1, C4-8 ci- cloalquenila opcionalmente substituída deformada (por exemplo, trans- ciclo-octenila ou norbornenila), ou C1-16 alquila opcionalmente substitu- ída conpossuindo –COOR12 ou –CHO; e k é um número inteiro de cerca de 0; ou (ii) QA1 é como definido para o ligante, e QA2 é uma por- ção de conjugação, por exemplo, C2-12 alquinila opcionalmente substi- tuída, amino N-protegido opcionalmente substituído, azido, N-
maleimido, tiol S-protegido, , ,
ou uma versão N-protegida dos mesmos,
, , , C6-16 heterociclila opci- onalmente substituída conpossuindo uma ligação tripla carbono-
carbono endocíclica (por exemplo, ), grupo 1,2,4,5-tetrazina
(por exemplo, ou ), ou C8-16 cicloal-
quinila opcionalmente substituída (por exemplo, ), –NHRN1, C4-8 cicloalquenila opcionalmente substituída deformada (por exemplo, trans-ciclo-octenila ou norbornenila), ou C1-16 alquila opcionalmente substituída conpossuindo –COOR12 ou –CHO; e k é um número inteiro de cerca de 1; onde: RN1 é H, grupo protetor de N, ou C1-6 alquila opcionalmente substituída; cada R12 é independentemente H ou C1-6 alquila opcional- mente substituída; R13 é halogênio ou F; e Z3 e RT estão ausentes.
[00232] Em certas modalidades, Z1 possui um grupo de ramifi- cação e dois segmentos divalentes, onde o grupo de ramificação está ligado a cada um dos dois segmentos divalentes, em que: um dos segmentos divalentes está ligado a um internucleo- sídeo ou fosfato terminal, um internucleosídeo ou fosforotioato termi- nal, um internucleosídeo ou fosforoditioato terminal, um espaçador abásico ou uma nucleobase e o segmento divalente restante é ligado a QA1; o grupo de ramificação é C1-12 alcano-triíla opcionalmente substituída ou C2-12 heteroalcano-triíla opcionalmente substituída, em que duas valências são substituídas com os segmentos divalentes, e a valência restante é substituída com
, em que: p1 é um número inteiro de cerca de 1, cerca de 2, ou cerca de 3; each s2 é independentemente um número inteiro de cerca de 0 a cerca de 10; cada QB e QD são independentemente ausentes, –CO–, – NH–, –O–, –S–, –SO2–, –OC(O)–, –COO–, –NHC(O)–, –C(O)NH–, –CH2–, –CH2NH–, –NHCH2–, –CH2O– , ou –OCH2–; cada QC está independentemente ausente, C1-12 alquileno opcionalmente substituído, C2-12 alquenileno opcionalmente substituí- do, C2-12 alquinileno opcionalmente substituído, C2-12 heteroalquileno opcionalmente substituído, C1-9 heterociclileno opcionalmente substitu- ído, ou –P(Z)(OH)–, onde Z é O ou S; cada QG é C1-6 alcano-triíla independentemente opcional- mente substituída, C1-6 alcano-tetraíla opcionalmente substituída, C2-6 heteroalcano-triíla opcionalmente substituída ou C2-6 heteroalcano- tetraíla opcionalmente substituída; e cada QH é independentemente RM1 ou –QG[(–QB–QC–QD)s2– RM1]p1, onde cada RM1 é independentemente uma ligação a uma por- ção auxiliar.
[00233] Em certas modalidades, Z2 possui um grupo de ramifi- cação e dois segmentos divalentes, onde o grupo de ramificação está ligado a cada um dos dois segmentos divalentes, em que:
um dos segmentos divalentes está ligado a uma porção de direcionamento ou QA2, e o segmento divalente restante está ligado a QA1; o grupo de ramificação é C1-12 alcano-triíla opcionalmente substituída ou C2-12 heteroalcano-triíla opcionalmente substituída, em que duas valências são substituídas com os segmentos divalentes, e a valência restante é substituída com
, em que: p1 é um número inteiro de cerca de 1, cerca de 2, ou cerca de 3; cada s2 é independentemente um número inteiro de cerca de 0 a cerca de 10; cada QB e QD estão independentemente ausentes, –CO–, – NH–, –O–, –S–, –SO2–, –OC(O)–, –COO–, –NHC(O)–, –C(O)NH–, –CH2–, –CH2NH–, –NHCH2–, –CH2O– , ou –OCH2–; cada QC está independentemente ausente, C1-12 alquileno opcionalmente substituído, C2-12 alquenileno opcionalmente substituí- do, C2-12 alquinileno opcionalmente substituído, C2-12 heteroalquileno opcionalmente substituído, C1-9 heterociclileno opcionalmente substitu- ído, ou –P(Z)(OH)–, onde Z é O ou S; cada QG é C1-6 alcano-triíla independentemente opcional- mente substituída, C1-6 alcano-tetraíla opcionalmente substituída, C2-6 heteroalcano-triíla opcionalmente substituída, ou C2-6 heteroalcano- tetraíla opcionalmente substituída; e cada QH é independentemente RM1 ou –QG[(–QB–QC–QD)s2–
RM1]p1, onde cada RM1 é independentemente uma ligação a uma por- ção auxiliar.
[00234] Em certas modalidades, Z3 possui um grupo de ramifi- cação e dois segmentos divalentes, onde o grupo de ramificação está ligado a cada um dos dois segmentos divalentes, em que: um dos segmentos divalentes está ligado a uma porção de direcionamento e o segmento divalente restante está ligado a QA2; o grupo de ramificação é C1-12 alcano-triíla opcionalmente substituída ou C2-12 heteroalcano-triíla opcionalmente substituída, em que duas valências são substituídas com os segmentos divalentes, e a valência restante é substituída com , em que: p1 é um número inteiro de cerca de 1, cerca de 2, ou cerca de 3; cada s2 é independentemente um número inteiro de cerca de 0 a cerca de 10; cada QB e QD estão independentemente ausentes, –CO–, – NH–, –O–, –S–, –SO2–, –OC(O)–, –COO–, –NHC(O)–, –C(O)NH–, –CH2–, –CH2NH–, –NHCH2–, –CH2O– , ou –OCH2–; cada QC está independentemente ausente, C1-12 alquileno opcionalmente substituído, C2-12 alquenileno opcionalmente substituí- do, C2-12 alquinileno opcionalmente substituído, C2-12 heteroalquileno opcionalmente substituído, C1-9 heterociclileno opcionalmente substitu- ído, ou –P(Z)(OH)–, onde Z é O ou S;
cada QG é C1-6 alcano-triíla independentemente opcional- mente substituída, C1-6 alcano-tetraíla opcionalmente substituída, C2-6 heteroalcano-triíla opcionalmente substituída, ou C2-6 heteroalcano- tetraíla opcionalmente substituída; e cada QH é independentemente RM1 ou –QG[(–QB–QC–QD)s2– RM1]p1, onde cada RM1 é independentemente uma ligação a uma por- ção auxiliar.
[00235] Em certas modalidades, o segmento divalente em Z1, Z2, ou Z3 é –(–QB–QC–QD–)s1–, em que: cada s1 é independentemente um número inteiro de cerca de 1 a cerca de 50 ou de cerca de 1 a cerca de 30; cada QB e QD estão independentemente ausentes, –CO–, – NH–, –O–, –S–, –SO2–, –OC(O)–, –COO–, –NHC(O)–, –C(O)NH–, –CH2–, –CH2NH–, –NHCH2–, –CH2O–, ou – OCH2–; e cada QC está independentemente ausente, C1-12 alquileno opcionalmente substituído, C2-12 alquenileno opcionalmente substituí- do, C2-12 alquinileno opcionalmente substituído, C2-12 heteroalquileno opcionalmente substituído ou C1-9 heterociclileno opcionalmente subs- tituído; desde que pelo menos um dentre QB, QC, e QD esteja presente.
[00236] Em certas modalidades, pelo menos um QC está presente no segmento divalente. Em certas modalidades, QC está presente em cada unidade monomérica do segmento divalente. Em certas modali- dades, Z1 é ligado através de um QC que esteja presente. Em certas modalidades, pelo menos um dentre QB e QD está presente em cada unidade monomérica de Z1. Em certas modalidades, pelo menos um dentre QB e QD está presente em cada unidade monomérica de Z2. Em certas modalidades, apenas um dentre Z1, Z2, e Z3, quando presente,
contém um grupo de ramificação.
[00237] Em certas modalidades, um, dois ou três dentre Z1, Z2, e Z3 são independentemente –(–QB–QC–QD–)s1–QE–(–QB–QC–QD–)s1–, (III) em que: cada s1 é independentemente um número inteiro de cerca de 1 a cerca de 50 ou de cerca de 1 a cerca de 30; cada QB e QD estão independentemente ausentes, –CO–, – NH–, –O–, –S–, –SO2–, –OC(O)–, –COO–, –NHC(O)–, –C(O)NH–, –CH2–, –CH2NH–, –NHCH2–, –CH2O–, ou – OCH2–; cada QC está independentemente ausente, C1-12 alquileno opcionalmente substituído, C2-12 alquenileno opcionalmente substituí- do, C2-12 alquinileno opcionalmente substituído, C2-12 heteroalquileno opcionalmente substituído, C1-9 heterociclileno opcionalmente substitu- ído, ou –P(Z)(OH)–, onde Z é O ou S; e QE está ausente ou um grupo de ramificação de fórmula (IV): , (IV) em que: p1 é um número inteiro de cerca de 1, cerca de 2, ou cerca de 3; cada s2 é independentemente um número inteiro de cerca de 0 a cerca de 10; QF é C1-12 alcano-triíla opcionalmente substituída ou C2-12 heteroalcano-triíla opcionalmente substituída; e cada QG é C1-6 alcano-triíla independentemente opcional- mente substituída, C1-6 alcano-tetraíla opcionalmente substituída, C2-6 heteroalcano-triíla opcionalmente substituída, ou C2-6 heteroalcano- tetraíla opcionalmente substituída; e cada QH é independentemente RM1 ou –QG[(–QB–QC–QD)s2– RM1]p1, onde cada RM1 é independentemente uma ligação a uma por- ção auxiliar.
[00238] Na fórmula (IV), QG está ausente, se p1 for cerca de 1; e pelo menos um QG estiver presente, se p1 for 2 ou 3.
[00239] Em certas modalidades, Z1 está ligado a um internucleosí- deo ou fosfato terminal, um internucleosídeo ou fosforotioato terminal, um internucleosídeo ou fosforoditioato terminal, um espaçador abási- co, um grupo de tamponamento ou uma nucleobase através de um QC que está presente.
[00240] Em certas modalidades, pelo menos um dentre QB, QC, QD, e QE está presente (por exemplo, pelo menos um QC está presente, QE está presente, ou QE está ausente) no segmento divalente. Em certas modalidades, cada QB e QD estão independentemente ausentes, –CO– , –NH–, –O–, –S–, –SO2–,–NHC(O)–, –C(O)NH–, –CH2–, –CH2NH–, –NHCH2–, –CH2O–, ou –OCH2–.
[00241] Em certas modalidades, –(–QB–QC–QD–)s1– combina para formar um grupo: –QB–(CH2)g1–(CH2OCH2)g2–(CH2)g3–QD–, em que: g2 é um número inteiro de cerca de 1 a cerca de 50; g1 é um número inteiro de cerca de 1 e QB é –NHCO–, – CONH–, ou –O–; ou g1 é um número inteiro de cerca de 0 e QD é – NHCO–; e g3 é um número inteiro de cerca de 1 e QB é –NHCO–, –
CONH–, ou –O–; ou g3 é um número inteiro de cerca de 0 e QD é – CONH–.
[00242] A porção de conjugação pode ser protegida até uma porção auxiliar ser conjugada ao polinucleotídeo. Por exemplo, uma porção de conjugação que é protegida pode incluir –COORPGO ou –NHRPGN, on- de RPGO é um grupo protetor de O (por exemplo, um grupo protetor de carboxila), e RPGN é um grupo protetor de N.
[00243] Em certas modalidades, a Ligação A é: , (V) em que: QA1 e QA2 estão cada qual independentemente ausentes, C2-12 heteroalquileno (por exemplo, a heteroalquileno conpossuindo – C(O)–N(H)–, –N(H)–C(O)–, –S(O)2–N(H)–, ou –N(H)–S(O)2–), C1-12 tio- heterociclileno opcionalmente substituído (por exemplo, , , , , ou ) C1-12 heterocicli- leno opcionalmente substituído (por exemplo, 1,2,3-triazol-1,4-diíla ou ), ciclobut-3-eno-1,2-diona-3,4-diiía, pirid-2-il hidrazona, C6-16 triazolo-heterociclileno opcionalmente substituído (por exemplo,
ou ) C8-16 triazolocicloalquenileno opcional-
mente substituído (por exemplo, ), ou um grupo di-
hidropiridazina (por exemplo, trans- , trans- ,
, ou ), desde que pelo menos um dentre QA1 e QA2 esteja presente; RT é uma ligação a uma porção de direcionamento; RP é uma ligação a um grupo ponte internucleosídeo, uma nucleobase, um grupo de tamponamento, ou um espaçador abásico; cada QT é independentemente –CO–, –NH–, –NH–CH2–, ou –CO–CH2–; cada QS é C2-12 alquileno independentemente opcionalmen- te substituído, C2-12 alquenileno opcionalmente substituído, C2-12 al- quinileno opcionalmente substituído ou (C6-10 aril)-C1-6-alquileno opcio- nalmente substituído; cada RM é independentemente H, porção auxiliar, –(CH2)q7– CO–N(RM1)2, ou –C[–CH2O–(CH2)q7–CO–N(RM1)2]3, onde cada q7 é independentemente um número inteiro de cerca de 1 a cerca de 5, e cada RM1 é independentemente H ou uma porção auxiliar;
cada X1, X3, e X5 estão independentemente ausentes, –O–, –NH–, –CH2–NH–, –C(O)–, –C(O)–NH–, –NH–C(O)–, –NH–C(O)–NH–, –O–C(O)–NH–, –NH–C(O)–O–, –CH2– NH–C(O)–NH–, –CH2–O–C(O)–NH–, ou –CH2–NH–C(O)–O–; X7 está ausente, –O–, –O–P(O)(OH)–O–, –O–P(S)(OH)–O– , –NH–, –CH2–NH–, –C(O)–, –C(O)–NH–, –NH–C(O)–, –NH–C(O)–NH–, –O–C(O)–NH–, –NH– C(O)–O–, –CH2–NH–C(O)–NH–, –CH2–O–C(O)–NH–, ou –CH2–NH–C(O)–O–; cada um dentre X2, X4, e X6 está independentemente au- sente, –O–, –NH–, –C(O)–, –C(O)–NH–, –NH–C(O)–, –NH–C(O)–NH–, –O–C(O)–NH–, ou –NH–C(O)–O–; x1 e cada x5 são independentemente um número inteiro de cerca de 0 ou cerca de 1; cada x2 é independentemente um número inteiro de cerca de 0 a cerca de 50, de cerca de 1 a cerca de 40, ou de cerca de 1 a cerca de 30; cada x3 é independentemente um número inteiro de cerca de 1 a cer- ca de 11; x4 é um número inteiro de cerca de 0, cerca de 1, ou cerca de 2; e cada x6 é independentemente um número inteiro de cerca de 0 a cerca de 10 ou de cerca de 1 a cerca de 6, desde que a soma de ambos x6 seja cerca de 12 ou menos.
[00244] Em certas modalidades, a LigaçãoA é: , (VI)
, (VII) , (VIII)
, (IX) ou
, (X) em que: QA1 é C2-12 heteroalquileno opcionalmente substituído (por exemplo, um heteroalquileno conpossuindo –C(O)–N(H)–, –N(H)– C(O)–, –S(O)2–N(H)–, ou –N(H)–S(O)2–), C1-12 tio-heterociclileno opci-
onalmente substituído (por exemplo, , ,
, , ou ) C1-12 heterociclileno opcional- mente substituído (por exemplo, 1,2,3-triazol-1,4-diíla ou
), ciclobut-3-eno-1,2-diona-3,4-diiía, ou pirid-2-il hidrazo- na) C6-16 triazolo-heterociclileno opcionalmente substituído (por exem-
plo, ou ) C8-16 triazolocicloalquenileno opcionalmente substituído (por exemplo, ), ou um grupo di-hidropiridazina (por exemplo, trans- , trans- ,
, ou ); cada RM1 é independentemente H ou uma porção auxiliar; cada RT é independentemente uma ligação a uma porção de direcionamento; cada RP é independentemente uma ligação a um grupo ponte internucleosídeo, uma nucleobase, um grupo de tamponamento, ou um espaçador abásico;
cada QT é independentemente –CO–, –NH–, –NH–CH2–, ou –CO–CH2–; cada QP é independentemente –C(O)–N(H)–, –N(H)–C(O)–, –S(O)2–N(H)–, ou –N(H)–S(O)2–; cada QS é C2-12 alquileno independentemente opcionalmen- te substituído, C2-12 alquenileno opcionalmente substituído, C2-12 al- quinileno opcionalmente substituído, ou (C6-10 aril)-C1-6-alquileno opci- onalmente substituído; cada q1, q3, e q7 são independentemente um número intei- ro de cerca de 0 ou cerca de 1; cada q2 e q8 são independentemente um número inteiro de cerca de 0 a cerca de 50, de cerca de 1 a cerca de 40, ou de cerca de 1 a cerca de 30; cada q4 é independentemente um número inteiro de cerca de 0 a cerca de 10; cada q5 e q6 são independentemente um número inteiro de cerca de 1 a cerca de 10 ou de cerca de 1 a cerca de 6; e cada q9 é independentemente um número inteiro de cerca de 1 a cerca de 10.
[00245] Em certas modalidades, a LigaçãoA é: , (XI) , (XII)
, (XIII)
, ou (XIV)
, (XV) em que: em cada fórmula estrutural, um representa uma ligação única, e o outro representa uma ligação dupla; cada RM1 é independentemente H ou uma porção auxiliar; cada RT é independentemente uma ligação a uma porção de direcionamento; cada RP é independentemente uma ligação a um grupo ponte internucleosídeo, uma nucleobase, um grupo de tamponamento, ou um espaçador abásico; cada QT é independentemente –CO–, –CO–CH2–, –NH–, ou –NH–CH2–; cada QP é independentemente –C(O)–N(H)–, –N(H)–C(O)–, –S(O)2–N(H)–, ou –N(H)–S(O)2–; cada QS é C2-12 alquileno independentemente opcionalmen-
te substituído, C2-12 alquenileno opcionalmente substituído, C2-12 al- quinileno opcionalmente substituído, ou (C6-10 aril)-C1-6-alquileno op- cionalmente substituído; cada q1, q3, e q7 são independentemente um número intei- ro de cerca de 0 ou cerca de 1; cada q2 e q8 são independentemente um número inteiro de cerca de 0 a cerca de 50, de cerca de 1 a cerca de 40, de cerca de 1 a cerca de 30; cada q4 é independentemente um número inteiro de cerca de 0 a cerca de 10; cada q5 e q6 são independentemente um número inteiro de cerca de 1 a cerca de 10 ou de cerca de 1 a cerca de 6; e cada q9 é independentemente um número inteiro de cerca de 1 a cerca de 10.
[00246] Em certas modalidades, q5 é 0. Em certas modalidades, q5 é um número inteiro de cerca de 2 a cerca de 6.
[00247] Em certas modalidades, um grupo de conjugação é: (XVI) em que: QA1 é independentemente C2-12 heteroalquileno opcional- mente substituído (por exemplo, um heteroalquileno conpossuindo – C(O)–N(H)–, –N(H)–C(O)–, –S(O)2–N(H)–, ou –N(H)–S(O)2–), C1-12 tio- heterociclileno opcionalmente substituído (por exemplo, ,
, , , ou ) C1-12 heteroci- clileno opcionalmente substituído (por exemplo, 1,2,3-triazol-1,4-diíla ou ), ciclobut-3-eno-1,2-diona-3,4-diiía, pirid-2-il hidrazo- na, C6-16 triazolo-heterociclileno opcionalmente substituído (por exem-
plo, ou ) C8-16 triazolocicloalquenileno opcio-
nalmente substituído (por exemplo, ), ou um grupo di-
hidropiridazina (por exemplo, trans- , trans- ,
, ou ); QA2 é C2-12 alquinila opcionalmente substituída, amino N-protegido op- cionalmente substituído, azido, N-maleimido, tiol S-protegido,
, , ou uma versão N-
protegida dos mesmos, , , , C6-16 heterociclila opcionalmente substituída conpossuindo uma liga-
ção tripla carbono-carbono endocíclica (por exemplo, ), grupo
1,2,4,5-tetrazina (por exemplo, ou ), ou C8-16 cicloalquinila opcionalmente substituída (por exemplo,
), –NHRN1, C4-8 cicloalquenila opcionalmente substituída deformada (por exemplo, trans-ciclo-octenila ou norbornenila), ou C1-16 alquila opcionalmente substituída conpossuindo –COOR12 ou –CHO; RN1 é H, um grupo protetor de N, ou C1-6 alquila opcional- mente substituída; cada R12 é independentemente H ou C1-6 alquila opcional- mente substituída; R13 é halogênio ou F; RP é uma ligação a um grupo ponte internucleosídeo, uma nucleobase, um grupo de tamponamento, ou um espaçador abásico; cada QS é C2-12 alquileno independentemente opcionalmen- te substituído, C2-12 alquenileno opcionalmente substituído, C2-12 al- quinileno opcionalmente substituído, ou (C6-10 aril)-C1-6-alquileno op- cionalmente substituído; cada RM é independentemente H, porção auxiliar, –(CH2)q7– CO–N(RM1)2, ou –C[–CH2O–(CH2)q7–CO–N(RM1)2]3, onde cada q7 é independentemente um número inteiro de cerca de 1 a cerca de 5, e cada RM1 é independentemente H ou porção auxiliar; cada X3 e X5 estão independentemente ausentes, –O–, – NH–, –CH2–NH–, –C(O)–, –C(O)–NH–, –NH–C(O)–, –NH–C(O)–NH–, –O–C(O)–NH–, –NH–C(O)–O–, –CH2–NH–C(O)–NH–, –CH2–O–C(O)– NH–, ou –CH2–NH–C(O)–O–; X7 está ausente, –O–, –O–P(O)(OH)–O–, –O–P(S)(OH)–O– , –NH–,–CH2–NH–, –C(O)–, –C(O)–NH–, –NH–C(O)–, –NH–C(O)– NH–, –O–C(O)–NH–, –NH–C(O)–O–, –CH2–NH–C(O)–NH–, –CH2–O– C(O)–NH–, ou –CH2–NH–C(O)–O–; cada X2, X4, e X6 estão independentemente ausentes, –O–, –NH–, –O–, –C(O)–, –C(O)–NH–, –NH–C(O)–, –NH–C(O)–NH–, –O– C(O)–NH–, ou –NH–C(O)–O–; x1 e cada x5 são independentemente um número inteiro de cerca de 0 ou cerca de 1; cada x2 é independentemente um número inteiro de 0 a 50 (por exemplo, de 1 a 40 ou de 1 a 30); cada x3 é independentemente um número inteiro de 1 a 11; x4 é 0, 1, ou 2; e cada x6 é independentemente um número inteiro de 0 a 10 (por exemplo, de 1 a 6), desde que a soma de ambos x6 seja 12 ou menos.
[00248] Em algumas modalidades, um grupo de conjugação é: (XVII) onde: QA1 é C2-12 alquinila opcionalmente substituída, amino N- protegido opcionalmente substituído, azido, N-maleimido, tiol S-
protegido, , , ou versão
N-protegida dos mesmos, , , , C6-16 heterociclila opcionalmente substituída conpossuindo uma liga-
ção tripla carbono-carbono endocíclica (por exemplo, ), grupo
1,2,4,5-tetrazina (por exemplo, ou ), ou C8-16 cicloalquinila opcionalmente substituída (por exemplo,
), –NHRN1, C4-8 cicloalquenila opcionalmente substituída deformada (por exemplo, trans-ciclo-octenila ou norbornenila), ou C1-16 alquila opcionalmente substituída conpossuindo –COOR12 ou –CHO; RN1 é H, grupo protetor de N, ou C1-6 alquila opcionalmente substituída; cada R12 é independentemente H ou C1-6 alquila opcional- mente substituída; R13 é halogênio (por exemplo, F); RP é uma ligação a um grupo ponte internucleosídeo, uma nucleobase, um grupo de tamponamento, ou um espaçador abásico; cada QS é C2-12 alquileno independentemente opcionalmen- te substituído, C2-12 alquenileno opcionalmente substituído, C2-12 al- quinileno opcionalmente substituído, ou (C6-10 aril)-C1-6-alquileno opci- onalmente substituído;
X7 está ausente, –O–, –NH–, –O–P(O)(OH)–O–, –O– P(S)(OH)–O–, –CH2–NH–, –C(O)–, –C(O)–NH–, –NH–C(O)–, –NH–C(O)–NH–, –O–C(O)–NH–, –NH– C(O)–O–, –CH2–NH–C(O)–NH–, –CH2–O–C(O)–NH–, ou –CH2–NH–C(O)–O–; X6 está ausente, –O–, –NH–, –O–, –C(O)–, –C(O)–NH–, – NH–C(O)–, –NH–C(O)–NH–, –O–C(O)–NH–, ou –NH–C(O)–O–; x1 é independentemente 0 ou 1; cada x2 é independentemente um número inteiro de 0 a 50, de 1 a 40, ou de 1 a 30; cada x3 é independentemente um número inteiro de 1 a 11; e x4 é 0, 1, ou 2.
[00249] Em certas modalidades, um grupo de conjugação é: (XVIII) ou , (XIX) onde: QA1 é C2-12 alquinila opcionalmente substituída, amino N- protegido opcionalmente substituído, azido, N-maleimido, tiol S- protegido, , , ou versão
N-protegida dos mesmos, , , , C6-16 heterociclila opcionalmente substituída conpossuindo uma ligação tripla carbono-carbono endocíclica (por exemplo, ), grupo
1,2,4,5-tetrazina (por exemplo, ou ), ou C8-16 cicloalquinila opcionalmente substituída (por exemplo,
), –NHRN1, C4-8 cicloalquenila opcionalmente substituída deformada (por exemplo, trans-ciclo-octenila ou norbornenila), ou C1-16 alquila opcionalmente substituída conpossuindo –COOR12 ou –CHO; RN1 é H, grupo protetor de N, ou C1-6 alquila opcionalmente substituída; cada R12 é independentemente H ou C1-6 alquila opcional- mente substituída; R13 é halogênio (por exemplo, F); RP é uma ligação a um grupo ponte internucleosídeo, uma nucleobase, um grupo de tamponamento, ou um espaçador abásico; QP é –C(O)–N(H)–, –N(H)–C(O)–, –S(O)2–N(H)–, ou – N(H)–S(O)2–; cada QS é C2-12 alquileno independentemente opcionalmen- te substituído, C2-12 alquenileno opcionalmente substituído, C2-12 al- quinileno opcionalmente substituído, ou (C6-10 aril)-C1-6-alquileno op- cionalmente substituído; cada um dentre q1 e q3 é independentemente 0 ou 1; q2 é um número inteiro de 0 a 50, de 1 a 40, ou de 1 a 30;
q4 é um número inteiro de 0 a 10; e q5 é um número inteiro de 1 a 10 ou de 1 a 6.
[00250] Em ainda outras modalidades, o grupo de conjugação é: (XX) ou , (XXI) onde: RP é uma ligação a um grupo ponte internucleosídeo, uma nucleobase, um grupo de tamponamento, ou um espaçador abásico; QP é –C(O)–N(H)–, –N(H)–C(O)–, –S(O)2–N(H)–, ou –N(H)–S(O)2–; cada QS é C2-12 alquileno independentemente opcionalmen- te substituído, C2-12 alquenileno opcionalmente substituído, C2-12 al- quinileno opcionalmente substituído, ou (C6-10 aril)-C1-6-alquileno opci- onalmente substituído; cada um dentre q1 e q3 é independentemente 0 ou 1; q2 é um número inteiro de 0 a 50, de 1 a 40, ou de 1 a 30; q4 é um número inteiro de 0 a 10; e q5 é um número inteiro de 1 a 10 ou de 1 a 6.
[00251] Em certas modalidades exemplares, um grupo de conjuga- ção é:
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
, ,
, ,
, ,
, , ,
, , , , ou
, em que: q2 é um número inteiro de cerca de 1 a cerca de 50 (por exemplo, um número inteiro de cerca de 1 a cerca de 24 ou de cerca de 1 a cerca de 8 (por exemplo, cerca de 2 ou cerca de 3)), q4 é um número inteiro de cerca de 0 a cerca de 10 (por exemplo, cerca de 0, cerca de 1, cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7, ou cerca de 8), q10 é um número inteiro de cerca de 0 a cerca de 8 (por exemplo, cerca de 1, cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, ou cerca de 6), q11 é cerca de 0 ou cerca de 1, Z é O ou
S, e cada RM é independentemente H, uma porção auxiliar, –(CH2)q7– CO–N(RM1)2, ou –C[–CH2O–(CH2)q7–CO–N(RM1)2]3, onde cada q7 é independentemente um número inteiro de cerca de 1 a cerca de 5, e cada RM1 é independentemente H ou uma porção auxiliar.
[00252] Em certas modalidades, o grupo de conjugação para conju- gação a uma porção de direcionamento através de uma cicloadição catalisada por metal é: , , , , , , , , , , ou ; onde q2 é um número inteiro de cerca de 1 a cerca de 50 (por exem-
plo, um número inteiro de cerca de 1 a cerca de 24 ou de cerca de 1 a cerca de 8 (por exemplo, cerca de 2 ou cerca de 3)), q4 é um número inteiro de cerca de 0 a cerca de 10 (por exemplo, cerca de 0, cerca de 1, cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7, ou cerca de 8), q10 é um número inteiro de cerca de 0 a cerca de 8 (por exemplo, cerca de 1, cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, ou cerca de 6), q11 é cerca de 0 ou cerca de 1, e Z é O ou S.
[00253] Em certas modalidades, o grupo de conjugação para conju- gação a uma porção de direcionamento através de uma cicloadição sem metal é: , , , , ,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
, , , ou
; em que: q2 é um número inteiro de cerca de 1 a cerca de 50 (por exemplo, um número inteiro de cerca de 1 a cerca de 24 ou de cerca de 1 a cerca de 8 (por exemplo, cerca de 2 ou cerca de 3)), q4 é um número inteiro de cerca de 0 a cerca de 10 (por exemplo, cerca de 0, cerca de 1, cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7, ou cerca de 8), q10 é um número inteiro de cerca de 0 a cerca de 8 (por exemplo, cerca de 1, cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de ou cerca de 6), q11 é cerca de 0 ou cerca de 1, Z é O ou S, e cada RM é independentemente H, uma porção auxiliar, – (CH2)q7–CO–N(RM1)2, ou –C[–CH2O–(CH2)q7–CO–N(RM1)2]3, onde cada q7 é independentemente um número inteiro de cerca de 1 a cerca de 5, e cada RM1 é independentemente H ou uma porção auxiliar.
[00254] Em certas modalidades, o grupo de conjugação para conju- gação a uma porção de direcionamento através da formação de amida é: , , e , em que q2 é um número inteiro de cerca de 0 a cerca de 50 (por exemplo, um nú- mero inteiro de cerca de 1 a cerca de 8 (por exemplo, cerca de 2 ou cerca de 3)), e q12 é um número inteiro de cerca de 1 a cerca de 11 (por exemplo, um número inteiro de cerca de 1 a cerca de 5 (por exemplo, cerca de 1, cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, ou cerca de 5). Gropos Biorreversíveis
[00255] Em certas modalidades, um grupo biorreversível compre- ende um dissulfeto (–S–S–). Em certas modalidades, o grupo biorre- versível é clivável intracelularmente sob condições fisiológicas.
[00256] Em certas modalidades, um grupo biorreversível é de fór- mula (XXII): R5–S–S–(LigaçãoB)–, (XXII)
[1] em que: a LigaçãoB é um grupo divalente conpossuindo um átomo de carbono hibridizado com sp3 ligado a fosfato, fosforotioato ou fosfo- roditioato e um átomo de carbono ligado a –S–S–, e R5 é C1-6 alquila opcionalmente substituída, C6-10 arila opcionalmente substituída, ou – LigaçãoC(–RM)r, ou LigaçãoB é um ligante trivalente conpossuindo um átomo de carbono hibridizado com sp3 ligado a fosfato, fosforotioato ou fosforoditioato e um átomo de carbono ligado a –S–S–, em que a terceira valência de LigaçãoB combina com –S–S– e R5 para formar C3-9 heterociclileno opcionalmente substituído;
a LigaçãoC é um grupo multivalente; cada RM é independentemente H, uma porção auxiliar, ou – QG[(–QB–QC–QD)s2–RM1]p1, onde: cada RM1 é independentemente H ou uma porção auxiliar, cada QB e cada QD está independentemente ausente, – CO–, –NH–, –O–, –S–, –SO2–, –OC(O)–, –COO–, –NHC(O)–, –C(O)NH–, –CH2–, –CH2NH–, – NHCH2–, –CH2O–, ou –OCH2–, cada QC está independentemente ausente, C1-12 alquileno opcionalmente substituído, C2-12 alquenileno opcionalmente substituí- do, C2-12 alquinileno opcionalmente substituído, C2-12 heteroalquileno opcionalmente substituído ou C1-9 heterociclileno opcionalmente subs- tituído, cada QG é C1-6 alcano-triíla independentemente opcional- mente substituída, C1-6 alcano-tetraíla opcionalmente substituída, C2-6 heteroalcano-triíla opcionalmente substituída, ou C2-6 heteroalcano- tetraíla opcionalmente substituída, cada s2 é independentemente um número inteiro de 0 a 10, e p1 é 2 ou 3; e r é um número inteiro de 1 a 6 (por exemplo, 1, 2, ou 3).
[00257] Em certas modalidades, LigaçãoB e/ou R5 inclui um grupo de carga ligado a –S–S–. A inclusão de um grupo de carga ligado a – S–S– pode realçar a estabilidade da ligação súlfur-súlfur, por exemplo, durante a síntese de polinucleotídeo.
[00258] Em outras modalidades, a LigaçãoB consiste em 1, 2, ou 3 grupos, cada um dos grupos sendo independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em C1-12 alquileno opcionalmente substi-
tuído, C2-12 alquenileno opcionalmente substituído, C2-12 alquinileno opcionalmente substituído, C6-10 arileno opcionalmente substituído, C2- 12 heteroalquileno e C1-9 heterociclileno opcionalmente substituído.
[00259] Em modalidades particulares, LigaçãoB e –S–S– combi- nam-se para formar uma estrutura selecionada a partir do grupo que consiste em: (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi), (vii), (viii), (ix), (x), (xi), (xii), (xiii), (xiv), (xv), (xvi), (xvii), (xviii), e (xix), onde: cada R6 é independentemente C2-7 alcanoíla; C1-6 alquila; C2-6 alquenila; C2-6 alquinila; C1-6 alquilsulfinila; C6-10 arila; amino; (C6-10 aril)-C1-4-alquila; C3-8 cicloalquila; (C3-8 cicloalquil)-C1-4-alquila; C3-8 ci-
cloalquenila; (C3-8 cicloalquenil)-C1-4-alquila; halo; C1-9 heterociclila; C1-9 heteroarila; (C1-9 heterociclil)óxi; (C1-9 heterociclil)aza; hidróxi; C1-6 tio- alcóxi; -(CH2)qCO2RA, onde q é um número inteiro de zero a quatro, e RA é selecionado a partir do grupo que consiste em C1-6 alquila, C6-10 arila, e (C6-10 aril)-C1-4-alquila; -(CH2)qCONRBRC, onde q é um número inteiro de zero a quatro e onde RB e RC são independentemente sele- cionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-6 alquila, C6- 10 arila, e (C6-10 aril)-C1-4-alquila; -(CH2)qSO2RD, onde q é um número inteiro de zero a quatro e onde RD é selecionado a partir do grupo que consiste em C1-6 alquila, C6-10 arila, e (C6-10 aril)-C1-4-alquila; - (CH2)qSO2NRERF, onde q é um número inteiro de zero a quatro e onde cada um dentre RE e RF é, independentemente, selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, alquila, arila, e (C6-10 aril)-C1-4- alquila; tiol; arilóxi; cicloalcóxi; arilalcóxi; (C1-9 heterociclil)-C1-4-alquila; (C1-9 heteroaril)-C1-4-alquila; C3-12 silila; ciano; ou -S(O)R H, onde RH é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C6 alqui- la, C6-10 arila, e (C6-10 aril)-C1-4-alquila; ou dois grupos R6 adjacentes, juntamente com os átomos aos quais cada um dos grupos R6 é ligado combinam-se para formar um grupo cíclico selecionado a partir do grupo que consiste em C6 arila, C2-5 heterociclila, ou C2-5 heteroarila, em que o grupo cíclico é opcionalmente substituído com 1, 2, ou 3 substituintes selecionados a partir do grupo que consiste em C2-7 alca- noíla; C1-6 alquila; C2-6 alquenila; C2-6 alquinila; C1-6 alquilsulfinila; C6-10 arila; amino; (C6-10 aril)-C1-4-alquila; C3-8 cicloalquila; (C3-8 cicloalquil)- C1-4-alquila; C3-8 cicloalquenila; (C3-8 cicloalquenil)-C1-4-alquila; halo; C1- 9 heterociclila; C1-9 heteroarila; (C1-9 heterociclil)óxi; (C1-9 heteroci- clil)aza; hidróxi; C1-6 tioalcóxi; -(CH2)qCO2RA, onde q é um número in- teiro de zero a quatro, e RA é selecionado a partir do grupo que consis- te em C1-6 alquila, C6-10 arila, e (C6-10 aril)-C1-4-alquila; - (CH2)qCONRBRC, onde q é um número inteiro de zero a quatro e onde
RB e RC são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-6 alquila, C6-10 arila, e (C6-10 aril)-C1-4- alquila; -(CH2)qSO2RD, onde q é um número inteiro de zero a quatro e onde RD é selecionado a partir do grupo que consiste em C1-6 alquila, C6-10 arila, e (C6-10 aril)-C1-4-alquila; -(CH2)qSO2NRERF, onde q é um número inteiro de zero a quatro e onde cada um dentre RE e RF é, in- dependentemente, selecionado a partir do grupo que consiste em hi- drogênio, alquila, arila, e (C6-10 aril)-C1-4-alquila; tiol; arilóxi; cicloalcóxi; arilalcóxi; (C1-9 heterociclil)-C1-4-alquila; (C1-9 heteroaril)-C1-4-alquila; C3- 12 silila; ciano; e -S(O)RH onde RH é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C6 alquila, C6-10 arila, e (C6-10 aril)-C1-4- alquila; m1 é 0, 1, ou 2; e m2 é 0, 1, 2, 3, ou 4; ou LigaçãoB, –S–S–, e R5 combinam-se para formar um grupo con- possuindo (xx).
[00260] Em ainda outras modalidades, LigaçãoC pode incluir de 0 a 3 monômeros multivalentes (por exemplo, C1-6 alcano-triíla opcional- mente substituída, C1-6 alcano-tetraíla opcionalmente substituída, ou átomo de nitrogênio trivalente) e um ou mais monômeros divalentes (por exemplo, de 1 a 40), onde cada monômero divalente é C 1-6 alqui- leno independentemente opcionalmente substituído; C2-6 alquenileno opcionalmente substituído; C2-6 alquinileno opcionalmente substituído; C3-8 cicloalquileno opcionalmente substituído; C3-8 cicloalquenileno op- cionalmente substituído; C6-14 arileno opcionalmente substituído; C1-9 heteroarileno opcionalmente substituído possuindo 1 a 4 heteroátomos selecionados a partir de N, O, e S; C1-9 heterociclileno opcionalmente substituído possuindo 1 a 4 heteroátomos selecionados a partir de N, O, e S; imino; N; O; ou S(O)m opcionalmente substituído, em que m é
0, 1, ou 2. Em algumas modalidades, cada monômero é C1-6 alquileno independentemente opcionalmente substituído; C3-8 cicloalquileno op- cionalmente substituído; C3-8 cicloalquenileno opcionalmente substituí- do; C6-14 arileno opcionalmente substituído; C1-9 heteroarileno opcio- nalmente substituído possuindo 1 a 4 heteroátomos selecionados a partir de N, O, e S; C1-9 heterociclileno opcionalmente substituído pos- suindo 1 a 4 heteroátomos selecionados a partir de N, O, e S; imino; N; O; ou S(O)m opcionalmente substituído, onde m é 0, 1, ou 2 (por exemplo, m é 2). Em certas modalidades, cada monômero é C1-6 alqui- leno independentemente opcionalmente substituído; C3-8 cicloalquileno opcionalmente substituído; C3-8 cicloalquenileno opcionalmente substi- tuído; C6-14 arileno opcionalmente substituído; C1-9 heteroarileno opcio- nalmente substituído possuindo 1 a 4 heteroátomos selecionados a partir de N, O, e S; C1-9 heterociclileno opcionalmente substituído pos- suindo 1 a 4 heteroátomos selecionados a partir de N, O, e S; N; O; ou S(O)m opcionalmente substituído, onde m é 0, 1, ou 2 (por exemplo, m é 2). O ligante não biorreversível que conecta a porção auxiliar à por- ção de conjugação ou ao produto de reação dos mesmos pode incluir de 2 a 500 (por exemplo, 2 a 300, 2 a 200, 2 a 100, ou 2 a 50) de tais monômeros. A LigaçãoC pode incluir um ou mais polietileno glicóis (por exemplo, os polietileno glicóis podem possuir um peso molecular a partir de 88 Da a 1 kDa (por exemplo, de 88 Da a 500 Da).
[00261] Compostos que podem ser usados na preparação do grupo –LigaçãoC(–RM)r na fórmula (IIa) são aqui descritos bem como em WO 2015/188197. Exemplos não limitantes de –LigaçãoC(–RM)r incluem: , , (xxi) (xxii)
, ,e (xxiii) (xxiv)
, (xxv) onde: R14 é uma ligação a –S–S–, RM é uma porção auxiliar ou –QG[(–QB–QC–QD)s2–RM1]p1, onde: cada RM1 é independentemente H ou uma porção auxiliar, cada QB e cada QD está independentemente ausente, – CO–, –NH–, –O–, –S–, –SO2–, –OC(O)–, –COO–, –NHC(O)–, – C(O)NH–, –CH2–, –CH2NH–, –NHCH2–, –CH2O–, ou –OCH2–, cada QC está independentemente ausente, C1-12 alquileno opcionalmente substituído, C2-12 alquenileno opcionalmente substituí- do, C2-12 alquinileno opcionalmente substituído, C2-12 heteroalquileno opcionalmente substituído ou C1-9 heterociclileno opcionalmente subs- tituído; cada QG é C1-6 alcano-triíla independentemente opcional- mente substituída, C1-6 alcano-tetraíla opcionalmente substituída, C2-6 heteroalcano-triíla opcionalmente substituída, ou C2-6 heteroalcano- tetraíla opcionalmente substituída, cada s2 é independentemente um número inteiro de 0 a 10, e p1 é 2 ou 3;
cada r4 é independentemente um número inteiro de 1 a 6; e cada r5 é independentemente um número inteiro de 0 a 10.
[00262] Em certas modalidades, RM é uma porção auxiliar. Em al- gumas modalidades, pelo menos um RM1 é uma porção auxiliar.
[00263] Em certas modalidades, o grupo ligante biorreversível é , em que uma extremidade do grupo é conectado a um polinucleotídeo e a outra extremidade é conectada a uma porção alvo (em uma modalidade, um anticorpo). Grupos Não Bioreversíveis
[00264] Um grupo não biorreversível é um substituinte monovalente que não contém ligações cliváveis sob condições fisiológicas em soro ou em um endossoma (por exemplo, ésteres, tioésteres, ou dissulfe- tos). O grupo não biorreversível pode ser C2-16 alquila opcionalmente substituída; C3-16 alquenila opcionalmente substituída; C3-16 alquinila opcionalmente substituída; C3-8 cicloalquila opcionalmente substituída; C3-8 cicloalquenila opcionalmente substituída; (C3-8 cicloalquil)-C1-4- alquila opcionalmente substituída; (C3-8 cicloalquenil)-C1-4-alquila opci- onalmente substituída; C6-14 arila opcionalmente substituída; (C6-14 aril)-C1-4-alquila opcionalmente substituída; C1-9 heteroarila opcional- mente substituída possuindo 1 a 4 heteroátomos selecionados a partir de N, O, e S; (C1-9 heteroaril)-C1-4-alquila opcionalmente substituída possuindo 1 a 4 heteroátomos selecionados a partir de N, O, e S; C2-9 heterociclila opcionalmente substituída possuindo 1 a 4 heteroátomos selecionados a partir de N, O, e S, onde a heterociclila não contém uma ligação S-S; (C2-9 heterociclil)-C1-4-alquila opcionalmente substitu- ída possuindo 1 a 4 heteroátomos selecionados a partir de N, O, e S, onde a heterociclila não contém uma ligação S-S; ou um grupo de fór- mula (XXIII):
, (XXIII) onde: L3 é C2-6 alquileno; R7 é C2-6 alquila opcionalmente substituída; C6-14 arila opci- onalmente substituída; (C6-14 aril)-C1-4-alquila opcionalmente substituí- da; C3-8 cicloalquila opcionalmente substituída; (C3-8 cicloalquil)-C1-4- alquila opcionalmente substituída; C1-9 heteroarila opcionalmente subs- tituída possuindo 1 a 4 heteroátomos selecionados a partir do grupo que consiste em N, O, e S; (C1-9 heteroaril)-C1-4-alquila opcionalmente substituída possuindo 1 a 4 heteroátomos selecionados a partir do grupo que consiste em N, O, e S; C2-9 heterociclila opcionalmente substituída possuindo 1 a 4 heteroátomos selecionados a partir do grupo que consiste em N, O, e S, em que a heterociclila não contém uma ligação S-S; (C2-9 heterociclil)-C1-4-alquila opcionalmente substitu- ída possuindo 1 a 4 heteroátomos selecionados a partir de N, O, e S, em que a heterociclila não contém uma ligação S-S; e um poli(etileno glicol) terminado com -O H, C1-6 alcóxi, ou –COOH; e R8 é H ou C1-6 alquila.
[00265] Um fosfotriéster não biorreversível pode ser um fosfato ou um fosforotioato substituído com um substituinte que é um grupo de conjugação, C2-16 alquila, , , , , , , , ou um grupo formado por reação de cicloadição de com um subs-
trato conpossuindo azido, onde: n é um número inteiro de 1 a 6; R9 é C6 arila opcionalmente substituída; C4-5 heteroarila op- cionalmente substituída que é um anel de seis membros conpossuindo 1 ou 2 átomos de nitrogênio; ou C4-5 heterociclila opcionalmente substi- tuída que é um anel de seis membros conpossuindo 1 ou 2 átomos de nitrogênio; R10 é H ou C1-6 alquila; R11 é um halogênio, –COOR11A, ou –CON(R11B)2, onde cada um dentre R11A e R11B é independentemente H, C1-6 alquila opcional- mente substituída, C6-14 arila opcionalmente substituída, C1-9 heteroari- la opcionalmente substituída ou C2-9 heterociclila opcionalmente substi- tuída; e o substrato conpossuindo azido é , , , , , , , , , , , , , , , , , ou .
[00266] Em algumas modalidades, a grupo não biorreversível é – LigaçãoD(–RM1)r1, onde a LigaçãoD é um ligante multivalente, cada RM1 é independentemente H ou uma porção auxiliar, e r1 é um número inteiro de 1 a 6.
[00267] Em alguns exemplos, a –LigaçãoD(–RM1)r1 é de fórmula (XXIV):
–QR–Q3([–Q4–Q5–Q6]r2–Q7–RM1)r1, (XXIV) onde: r1 é um número inteiro de 1 a 6; cada r2 é independentemente um número inteiro de 0 a 50 (por exemplo, de 0 a 30), onde as unidades de repetição são as mes- mas ou diferentes; QR é [–Q4–Q5–Q6]r2–QL–, onde QL é C2-12 heteroalquileno opcionalmente substituído (por exemplo, um heteroalquileno conpos- suindo –C(O)–N(H)–, –N(H)–C(O)–, –S(O)2–N(H)–, ou –N(H)–S(O)2–), C1-12 tio-heterociclileno opcionalmente substituído (por exemplo,
, , , , ou
) C1-12 heterociclileno opcionalmente substituído (por exem-
plo, 1,2,3-triazol-1,4-diíla ou ), ciclobut-3-eno-1,2-diona- 3,4-diiía, pirid-2-il hidrazona, C6-16 triazolo-heterociclileno opcionalmen-
te substituído (por exemplo, ou ) C8-16 triazolo- cicloalquenileno opcionalmente substituído (por exemplo,
), ou um grupo di-hidropiridazina (por exemplo, trans-
, trans- , , ou ); Q3 é um grupo linear (por exemplo, [–Q4–Q5–Q6]r2–), se r1 for 1, ou um grupo ramificado (por exemplo, [–Q4–Q5–Q6]s–Q8([–Q4–Q5–Q6]r2– (Q8)r3)r4, onde r3 é 0 ou 1, r4 é 0, 1, 2, ou 3), se r1 for um número intei- ro de 2 a 6; cada r2 é independentemente um número inteiro de 0 a 50 (por exemplo, de 0 a 30), onde as unidades de repetição são as mes- mas ou diferentes; cada Q4 e cada Q6 está independentemente ausente –CO–, –NH–, –O–, –S–, –SO2–, –OC(O)–, –COO–, –NHC(O)–, –C(O)NH–, – CH2–, –CH2NH–, –NHCH2–, –CH2O–, ou –OCH2–; cada Q5 está independentemente ausente, C1-12 alquileno opcionalmente substituído, C2-12 alquenileno opcionalmente substituí- do, C2-12 alquinileno opcionalmente substituído, C2-12 heteroalquileno opcionalmente substituído ou C1-9 heterociclileno opcionalmente subs- tituído; cada Q7 está independentemente ausente, –CO–, –NH–, – O–, –S–, –SO2–, –CH2–, –C(O)O–, –OC(O)–, –C(O)NH–, –NH–C(O)–, –NH–CH(Ra)–C(O)–, ou –C(O)–CH(Ra)–NH–; cada Q8 é C1-6 alcano-triíla independentemente opcional- mente substituída, C1-6 alcano-tetraíla opcionalmente substituída, C2-6 heteroalcano-triíla opcionalmente substituída, ou C2-6 heteroalcano- tetraíla opcionalmente substituída; e cada Ra é independentemente H ou uma cadeia lateral de aminoácido; e cada RM1 é independentemente H ou uma porção auxiliar.
[00268] Na fórmula (XXIV), pelo menos um dentre Q4, Q5, e Q6 está presente. Na fórmula (XXIV), a LigaçãoD pode incluir um ponto de ra- mificação único, se cada r3 for 0, ou pontos de ramificação múltiplos, se pelo menos um r3 for 1. Na fórmula (XXIV), QR pode ser –Q5–Q4– QL–, onde Q5 é C2-12 heteroalquileno opcionalmente substituído ou C1- 12 alquileno opcionalmente substituído, e Q4 é –CO–, –NH–, ou –O–. Na fórmula (XXIV), QL pode ser: , , , , trans- , trans- , , , , ou .
[00269] Na fórmula (XXIV), Q3 pode ser um grupo linear de fórmula [–Q4–Q5–Q6]r2–, onde Q4, Q5, e Q6 são como definido para a fórmula (XXIV). Alternativamente, Q3 pode ser um grupo ramificado [–Q4–Q5– Q6]r2–Q8([–Q4–Q5–Q6]r2–(Q8)r3)r4, onde cada Q8 é C1-6 alcano-triíla in- dependentemente opcionalmente substituída, C1-6 alcano-tetraíla opci- onalmente substituída, C2-6 heteroalcano-triíla opcionalmente substitu- ída, ou C2-6 heteroalcano-tetraíla opcionalmente substituída; onde: cada r2 é independentemente um número inteiro de 0 a 50 (por exemplo, de 0 a 30), onde as unidades de repetição são as mes- mas ou diferentes; r3 é 0 ou 1; r4 é 0, 1, 2, ou 3;
onde, quando r3 é 0, LigaçãoD é um grupo trivalente ou tetrava- lente, e, quando r3 é 1, LigaçãoD é um grupo tetravalente, pentava- lente, ou hexavalente.
[00270] Em certas modalidades, r3 é 0.
[00271] Em algumas modalidades, Q8 é: , , , ou .
[00272] Compostos que podem ser usados na preparação de grupo –LigaçãoD(–RM1)p na fórmula (I) são aqui descritos bem como em WO 2015/188197.
[00273] Em certas modalidades, o grupo ligante não biorreversível é , em que uma extremidade do grupo está co- nectada a um polinucleotídeo e a outra extremidade está conectada a uma fração alvo (em uma modalidade, um anticorpo). Porções Auxiliares
[00274] Uma porção auxiliar é um grupo monovalente conpossuindo um corante ou um grupo hidrofílico ou uma combinação dos mesmos (por exemplo, um polímero hidrofílico (por exemplo, poli (etileno glicol) (PEG)), um polímero carregado positivamente (por exemplo, poli (eti- leno imina)), ou um álcool de açúcar (por exemplo, glucitol)). Uma por- ção auxiliar pode possuir um peso molecular teórico de 100 Da a 2,5 kDa (por exemplo, de 350 Da a 2,5 kDa, de 100 Da a 1.200 Da, ou de 1 kDa a 2,5 kDa).
[00275] Os corantes podem ser incluídos nos grupos fosfoéster com a finalidade de visualização da absorção ou monitoramento do movi- mento dos conjugados da invenção dentro de uma célula (por exem- plo, usando recuperação de fluorescência após fotobranqueamento (FRAP)). Corantes conhecidos na técnica podem ser incluídos como uma porção auxiliar ligada ao polinucleotídeo por meio de um fosfato ou fosforotioato no terminal 5’ ou 3' ou por meio de um fosfato ou fos- forotioato ligando dois nucleosídeos consecutivos. Exemplos não limi- tantes de estruturas úteis que podem ser usadas como corantes inclu- em FITC, RD1, aloficocianina (APC), corante aCFTM (Biotium, Hai- ward, CA), BODIPY (InvitrogenTM 10 of Life Technologies, Carlsbad, CA), AlexaFluor® (InvitrogenTM of Life Technologies, Carlsbad, CA), DiLight Fluor (Thermo Scientific Pierce Protein Biology Products, Rock- ford, IL), ATTO (ATTO-TEC Gmb H, Siegen, Germany), FluoProbe (In- terchim SA, Motluçon, France), e Abberior Probes (Abberior Gmb H, Göttingen, Germany).
[00276] Polímeros hidrofílicos e polímeros carregados positivamen- te que podem ser usados como porções auxiliares nos polinucleotí- deos imunomoduladores da invenção e nos conjugados da invenção são conhecidos na técnica. Um exemplo não limitante de um polímero hidrofílico é o poli (etileno glicol). Um exemplo não limitante de um po- límero carregado positivamente é poli (etileno imina).
[00277] Uma porção auxiliar à base de álcool de açúcar pode ser, por exemplo, glucitol terminado em amino ou um cluster de glucitol. A porção auxiliar de glucitol terminada em amino é: . Exemplos não limitantes de clusters de glucitol são:
e .
[00278] Em uma modalidade, fornecido neste documento é um composto de Fórmula (B): ou um estereoisômero, uma mistura de dois ou mais diastereômeros, um tautômero, ou uma mistura de dois ou mais tautômeros; ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato, ou hidrato dos mesmos; em que: Rx é um grupo de conjugação; LN é um ligante; cada Q é independentemente um polinucleotídeo compre- endendo um fosfotriéster; e e é um número inteiro de 1, 2, 3, ou 4.
[00279] Em certas modalidades, na Fórmula (B), Rx é .
[00280] Em certas modalidades, na Fórmula (B), LN é um ligante compreendendo um polietileno glicol.
[00281] Em certas modalidades, na Fórmula (B), LN é , em que d é um número inteiro que varia de cerca de 0 a cerca de 50. Em certas modalidades, d é um número inteiro que varia de cerca de 0 a cerca de 10. Em certas mo- dalidades, d é um número inteiro que varia de cerca de 0 a cerca de 5.
Em certas modalidades, d é um número inteiro de cerca de 0, cerca de 1, ou cerca de 3.
[00282] Em certas modalidades, na Fórmula (B), e é um número inteiro de 1.
[00283] Em certas modalidades, na Fórmula (B), cada Q indepen- dentemente possui a estrutura de Fórmula (D): em que XN, X3’, X5’, YP, b, e c são cada como aqui definido. Porções de Direcionamento
[00284] A porção de direcionamento usada no conjugado fornecido neste documento é para uma célula e tecido específico alvo em um corpo para liberação direcionada de um polinucleotídeo de carga útil conjugado. Em certas modalidades, a célula direcionada pelo conjuga- do fornecido neste documento é uma célula exterminadora natural. Em certas modalidades, a célula direcionada pelo conjugado fornecido neste documento é uma célula mieloide. Em certas modalidades, a célula direcionada pelo conjugado fornecido neste documento é um neutrófilo. Em certas modalidades, a célula direcionada pelo conjuga- do fornecido neste documento é um monócito. Em certas modalidades, a célula direcionada pelo conjugado fornecido neste documento é um macrófago. Em certas modalidades, a célula direcionada pelo conju- gado fornecido neste documento é uma célula dendrítica (DC). Em certas modalidades, a célula direcionada pelo conjugado fornecido neste documento é um mastócito. Em certas modalidades, a célula direcionada pelo conjugado fornecido neste documento é um macrófa- go associado a tumor (TAM). Em certas modalidades, a célula direcio- nada pelo conjugado fornecido neste documento é uma célula supres- sora derivada de mieloide (MDSC).
[00285] Em certas modalidades, a porção de direcionamento é uma porção de ligação ao antígeno. Em certas modalidades, a porção de direcionamento é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00286] Em certas modalidades, a porção de ligação ao antígeno no conjugado fornecido neste documento é um anticorpo ou um fragmen- to de ligação ao antígeno do mesmo (por exemplo, F(ab)2 ou Fab) ou um derivado modificado deste (por exemplo, Fcab ou uma proteína de fusão (por exemplo, scFv)). Em certas modalidades, a porção de liga- ção ao antígeno no conjugado fornecido neste documento é um anti- corpo humano ou quimérico (por exemplo, humanizado).
[00287] A porção de ligação ao antígeno possui como alvo a célula com o antígeno de superfície que é reconhecido pela porção de liga- ção ao antígeno.
[00288] Em certas modalidades, a porção de direcionamento é um anticorpo que se liga a um antígeno expresso por uma célula NK. An- tígenos exemplares expressos por uma célula NK e que podem ser direcionados pelo conjugado fornecido neste documento incluem, mas não estão limitados a, CD11b, CD11c, CD16/32, CD49b, CD56 (NCAM), CD57, CD69, CD94, CD122, CD158 (Kir), CD161 (NK-1.1), CD244 (2B4), CD314 (NKG2D), CD319 (CRACC), CD328 (Siglec-7), CD335 (NKp46), Ly49, Ly108, Vα24-Jα18 TCR (iNKT), granulisina, granzima, perforina, SIRP-α, LAIR1, SIGLEC-3 (CD33), SIGLEC-7, SIGLEC-9, LIR1 (ILT2, LILRB1), NKR-P1A (KLRB1), CD94–NKG2A, KLRG1, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5,KIR3DS1, KIR2DS1, CD94– NKG2C/E, NKG2D, CD160 (BY55), CD16 (FcγRIIIA), NKp46 (NCR1), NKp30 (NCR3), NKp44 (NCR2), DNAM1(CD226), CRTAM, CD2, CD7, CD11a, CD18, CD25, CD27, CD28, NTB-A (SLAMF6), PSGL1, CD96 (Tactile), CD100 (SEMA4D), NKp80 (KLRF1, CLEC5C), SLAMF7 (CRACC, CS1, CD319) e CD244 (2B4, SLAMF4).
[00289] Em certas modalidades, a porção de direcionamento é um anticorpo que se liga a um antígeno expresso por uma célula mieloide. Antígenos exemplares expressos por uma célula mieloide e que po- dem ser direcionados pelo conjugado fornecido neste documento in- cluem, mas não estão limitados a, siglec 3, siglec 7, siglec 9, siglec 15, CD200, CD200R, LILRB1, LILRB2, LILRB3, LILRB4, LILRB5, M-CSF, CSF-1R, GM-CSF R, IL4 R, arginase, IDO, TDO, MPO, EP2, COX-2, CCR2, CCR-7, CXCR1, CX3CR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR7, c-Kit, CD244, L-selectina/CD62L, CD11b, CD11c, CD68, CD163, CD204, DEC205, IL-1R, CD31, SIRPα, SIRPβ, PD-L1, CEACAM- 8/CD66b, CD103, BDCA-1, BDCA2. BDCA-4, CD123 e ILT-7.
[00290] Em certas modalidades, a porção de direcionamento é um anticorpo que se liga a um antígeno expresso por uma MDSC. Antíge- nos exemplares expressos por uma MDSC e que podem ser direcio- nados pelo conjugado fornecido neste documento incluem, mas não estão limitados a, siglec-3, Siglec 7, siglec 9, siglec 15, CD200, CD200R, LILRB1, LILRB2, LILRB3, LILRB4, LILRB5, M-CSF, CSF-1R, GM-CSF R, IL4 R, arginase, IDO, TDO, MPO, EP2, COX-2, CCR2, CCR-7, CXCR1, CX3CR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR7, c-Kit, CD244, L-selectina/CD62L, CD11b, CD11c, CD68, CD163, CD204, DEC205, IL-1R, CD31, SIRPα, SIRPβ, PD-L1, CEACAM-8/CD66b, CD103, BDCA-1, BDCA2. BDCA-4, CD123, e ILT-7.
[00291] Em certas modalidades, a porção de direcionamento é um anticorpo que se liga a um antígeno expresso por um TAM. Antígenos exemplares expressos por um TAM e que podem ser direcionados pe- lo conjugado fornecido neste documento incluem, mas não estão limi- tados a, siglec-3, Siglec 7, siglec 9, siglec 15, CD200, CD200R, LILRB1, LILRB2, LILRB3, LILRB4, LILRB5, M-CSF, CSF-1R, GM-CSF R, IL4 R, arginase, IDO, TDO, MPO, EP2, COX-2, CCR2, CCR-7, CXCR1, CX3CR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR7, c-Kit, CD244, L- selectina/CD62L, CD11b, CD11c, CD68, CD163, CD204, DEC205, IL-
1R, CD31, SIRPα, SIRPβ, PD-L1, CEACAM-8/CD66b, CD103, BDCA- 1, BDCA2. BDCA-4, CD123, e ILT-7.
[00292] Em certas modalidades, a porção de direcionamento é um anticorpo que se liga a um antígeno específico para uma célula NK. Em certas modalidades, uma célula NK é direcionada por um anticorpo anti-CD56. Em certas modalidades, a porção de direcionamento é um anticorpo anti-CD56. Em certas modalidades, o anticorpo é um anti- corpo monoclonal anti-CD56. Em certas modalidades, o anticorpo é um anticorpo anti-CD56 de murino. Em certas modalidades, o anticor- po anti-CD56 de murino é o clone 5.1H11 (BioLegend, Cat No: 362502). Em certas modalidades, o anticorpo anti-CD56 de murino é o clone MEM-188 (BioLegend, 304601). Em certas modalidades, o anti- corpo anti-CD56 de murino é o clone QA17A16 (BioLegend, Cat No: 392402). Em certas modalidades, o anticorpo é um anticorpo anti- CD56 humanizado. Em certas modalidades, o anticorpo é um anticor- po anti-CD56 humano. Em certas modalidades, o anticorpo é um anti- corpo anti-CD56 humanizado
[00293] Em certas modalidades, a porção de direcionamento é um anticorpo que se liga a um antígeno específico para uma célula mieloi- de. Em certas modalidades, uma célula mieloide é direcionada por um anticorpo anti-SIRPα. Em certas modalidades, a porção de direciona- mento é um anticorpo anti-SIRPα. Em certas modalidades, o anticorpo é um anticorpo monoclonal anti-SIRPα. Em certas modalidades, o an- ticorpo é um anticorpo anti-SIRPα de murino. Em certas modalidades, o anticorpo é um anticorpo anti-SIRPα humanizado. Em certas modali- dades, o anticorpo é um anticorpo anti-SIRPα humano.
[00294] Em certas modalidades, o anticorpo anti-SIRPα (119 ou mutantes da linha germinativa de 119) é um anticorpo humano que compreende um VH e VL, em que o VH é independentemente selecio- nado a partir das sequências listadas abaixo:
Nome do Anticorpo Fonte Domínio SEQ ID NO: Sequência 119 Humano EVQLLESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFSFSNFAMTWVR- QAPGEGLEWVSTIGSGDTYYADSVKGRFTISRD- VH 490 NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDSTVSWS-
GDFFDYWGLGTLVTVSS AB119 mut Humano EVQLLESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFSFSNFAVTWVR- QAPGKGLEWVSTIGSGDTYYADSVKGRFTIS- (mutantes da linha RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK- VH 491 germinativa D1E, DSTVSWSGDFFDYWGQGTLVTVSS E43K, L112Q, e M34V) 119 VH MutAll_V34M Humano EVQLLESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFSFSNFAMTWVR- QAPGKGLEWVSTIGSGDTYYADSVKGRFTIS- (mutantes da linha VH 492 RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK- germinativa D1E, DSTVSWSGDFFDYWGQGTLVTVSS E43K e L112Q) 119_VH_MutAll_V34L Humano EVQLLESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFSFSNFALTWVR-
QAPGKGLEWVSTI VH 493 (mutantes da linha GSGDTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA- germinativa) VYYCAKDSTVSWSGDFFDYWGQGTLVTVSS 119_M34L Humano DVQLLESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFSFSNFALTWVR-
QAPGEGLEWVSTIGSGDTYYADSVKGRFTISR VH 494 (mutantes da linha DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK- germinativa) DSTVSWSGDFFDYWGLGTLVTVSS 119_M34V Humano DVQLLESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFSFSNFAVTWVR-
QAPGEGLEWVSTIGSGDTYYADSVKGRFTISR VH 495 (mutantes da linha DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK- germinativa) DSTVSWSGDFFDYWGLGTLVTVSS e o VL é independentemente selecionado a partir das sequências lis- tadas abaixo: Nome do Anticorpo Fonte Domínio SEQ ID NO Sequência 119 Humano EIVLTQSPATLSVSPGERATFSCRASQN- VL 496 VKNDLAWYQQRPGQAPRLLIYAARIRETGIPERFSGSGSG-
TEFTLTITSLQSEDFAVYYCQQYYDWPPFTFGGGTKVEIK 119 mut all Humano EIVLTQSPATLSVSPGERATLSCRASQNVKNDLAWYQQK-
PGQAPRLLIYAA (mutantes da linha VL 497 RIRETGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFA- germinativa F21L, VYYCQQYYDWPPFTFGGGTKVEIK R39K, E60A e T76S)
[00295] Em certas modalidades, o anticorpo anti-SIRPα (119 ou mutantes da linha germinativa de 119) é um anticorpo humano que compreende um HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 e HVR- L3, cada um dos quais é independentemente selecionado a partir da tabela abaixo. Anticorpo Domínio SEQ ID NO: Sequência 119 HVR-H1 498 GFSFSNFAMT or 499 GFSFSNFAVT or 500 GFSFSNFALT 119 HVR-H2 501 TIGSGDTYYADSVKG 119 HVR-H3 502 DSTVSWSGDFFDY 119 HVR-L1 503 RASQNVKNDLA 119 HVR-L2 504 AARIRET 119 HVR-L3 505 QQYYDWPPFT anticorpos humanos 119 são bloqueadores de CD47, que são descri-
tos na Tabela P de WO 2018/057669 A1, cuja descrição é incorporada neste documento por referência em sua totalidade.
[00296] Em certas modalidades, o anticorpo anti-SIRPα (135 ou mutantes da linha germinativa de 135) é um anticorpo humano que compreende um VH e VL, em que o VH é independentemente selecio- nado a partir das sequências listadas abaixo: Nome do Fonte Domínio Sequência SEQ ID NO: Anticorpo 135 Humano DVQLVESGGGVVRPGESLRLSCAASGFSFSIYAMS- WVRQAPGEGLEWVSTIGADDTYYADSVKGRFTISRD- VH 506 NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDSTVGWS-
GDFFDYWGLGTLVTVSS AB135 mut Humano EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFSFSIYAVSWVR- QAPGKGLEWVSTIGADDTYYADSVKGRFTIS- RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK- mutações de linha VH 507 DSTVGWSGDFFDYWGQGTLVTVSS germinativa D1E, R13Q, E16G, E43K, L112Q e M34V 135 VH Humano EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFSFSI- Mu- YAMSWVRQAPGKGLEWVSTIGADDTYYADSVKGRFTIS- tAll_V34M mutações de linha VH 508 RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK- germinativa D1E, R13Q, DSTVGWSGDFFDYWGQGTLVTVSS E16G, E43K, e L112Q 135_VH_Mu Humano EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFSFSIYALSWVR- tAll_V34L QAPGKGLEWVSTI Mutações reversas da VH 509 GADDTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAE- linha germinativa e DTAVYYCAKDSTVGWSGDFFDYWGQGTLVTVSS mutação passiva e o VL é independentemente selecionado a partir das sequências lis- tadas abaixo: Nome do Fonte Domínio Sequência SEQ ID NO: Anticorpo 135 Humano EIVLTQSPATLSVSPGERVTFSCRASQNVRSDI- AWYQQKPGQAPRLLIYAASSRDTGIP- VL 510 DRFSGSGSGTDFT-
LTISSLQSEDFGVYYCQQYYDWPPFTFGGGTKVEIK 135 Humano EIVLTQSPATLSVSPGERVTLSCRASQNVRSDI- AWYQQKPGQAPRLLI- VL 511 mutações de linha YAASSRDTGIPARFSGSGSGTDFT- germinativa F21L e D60A LTISSLQSEDFGVYYCQQYYDWPPFTFGGGTKVEIK
[00297] Em certas modalidades, o anticorpo anti-SIRPα (135 ou mutantes da linha germinativa de 135) é um anticorpo humano que compreende um HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 e HVR- L3, cada um dos quais é independentemente selecionado a partir da tabela abaixo. Nome do Anticor- Domínio Sequência SEQ ID NO: po/Fonte 135/Humano HVR-H1 512 GFSFSIYAMS ou 513 GFSFSIYAVS or
514 GFSFSIYALS 135/Humano HVR-H2 515 TIGADDTYYADSVKG 135/Humano HVR-H3 516 DSTVGWSGDFFDY 135/Humano HVR-L1 517 RASQNVRSDIA 135/Humano HVR-L2 518 AASSRDT 135/Humano HVR-L3 519 QQYYDWPPFT
[00298] Anticorpos humanos 135 são bloqueadores de CD47, que são descritos na Tabela P de WO 2018/057669 A1, cuja descrição é incorporada neste documento por referência em sua totalidade.
[00299] Em certas modalidades, o anticorpo anti-SIRPα (AB21, mu- tantes da linha germinativa AB21 ou versão humanizada de AB21) é um anticorpo que compreende um VH e VL, em que o VH é indepen- dentemente selecionado a partir das sequências listadas abaixo: Nome do Fonte Domínio Sequência SEQ ID NO: Anticorpo AB21 Humano DVQLVESGGGVVRPGESLRLSCAASGFTFSSNAMSWVR- QAPGKGLEWLAGISAGGSDTYYPASVKGRFTIS- VH 520 RDNSKNTLYLQMNTLTAEDTAVYYCARETWNHLFDYWGL-
GTLVTVSS AB21 Mut Humano com mutações EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSSNAMSWVR- All reversas da linha germi- QAPGKGLEWVAGISAGGSDTYYPASVKGRFTIS- VH 521 nativa RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA-
RETWNHLFDYWGQGTLVTVSS AB21 Mut Humano com mutações EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSSNAVSWVR- All M34V reversas da linha germi- QAPGKGLEWVAGISAGGSDTYYPASVKGRFTIS- VH 522 nativa e mutação passiva RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA-
RETWNHLFDYWGQGTLVTVSS AB21_HC_ Humano com mutações EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSSNALSWVR- Mu- reversas da linha germi- QAPGKGLEWVAGISAGGSDTYYPASVKGRFTIS- VH 523 tAll_M34L nativa e mutação passiva RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA-
RETWNHLFDYWGQGTLVTVSS e o VL é independentemente selecionado a partir das sequências lis- tadas abaixo: Nome do Fonte Domínio Sequência SEQ ID NO: Anticorpo AB21 Frango ALTQPASVSANPGETVKIACSGGDYYSYYYGWYQQKAPG- VL 524 SALVTVIYSDDKRPSDIPSRFSGSASGSTATLTITGVRAE-
DEAVYYCGGYDYSTYANAFGAGTTLTVL Hum1 Humanizada SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGGSYSSYY- VL 525 YAWYQQKPGQAPVTLIYSDDKRPSNIPERFSGSSSGTTVTLTIS-
GVQAEDEADYYCGGYDQSSYTNPFGGGTKLTVL Hum2 Humanizada QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGGSYSSYYYAWYQQLPGTAP- VL 526 KTLIYSDDKRPSNIPDRFSG-
SKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGGYDQSSYTNPFGTGTKVTVL Hum3 Humanizada SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGGDYYSTY- VL 527 YAWYQQKPGQAPVTVIHSDDKRPSDIPERFSGSSSGTTVTLTIS-
GVQAEDEADYYCGGYDGRTYINTFGGGTKLTVL Hum4 Humanizada QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGGDYYSTYYAWYQQLPGTAP- VL 528 KTVIHSDDKRPSDIPDRFSG-
SKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGGYDGRTYINTFGTGTKVTVL Hum5 Humanizada QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGSYSSYY- VL 529 YAWYQQHPGKAPKTLIYSDDKRPSNVSNRFSGSKSGN-
TASLTISGLQAEDEADYYCGGYDQSSYTNPFGGGTKLTVL Hum6 Humanizada VL 530 QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGGDYYSYYYGWYQQLPGTAP-
Nome do Fonte Domínio Sequência SEQ ID NO: Anticorpo KTVIYSDDKRPSDIPDRFSG-
SKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGGYDYSTYANAFGTGTKVTVL Hum8 Humanizada SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGGAYSSYY- VL 531 YAWYQQKPGQAPVLVIYSDSKRPSGIPERFSGSSSGTTVTLTIS-
GVQAEDEADYYCGGYDQSSYTNPFGGGTKLTVL Hum9 Humanizada SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGGAYSSYY- VL 532 YAWYQQKPGQAPVLVIYSDDKRPSGIPERFSGSSSGTTVTLTIS-
GVQAEDEADYYCGGYDQSSYTNPFGGGTKLTVL
[00300] Em certas modalidades, o anticorpo anti-SIRPα (AB21, mu- tantes da linha germinativa AB21 ou versão humanizada de AB21) é um anticorpo humanizado que compreende um HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2, e HVR-L3, cada um dos quais indepen- dentemente selecionado a partir da tabela abaixo. Nome/Fonte Domínio SEQ ID NO: Sequência AB21/Humano 533 GFTFSSNALS ou HVR-H1 534 GFTFSSNAMS ou 535 GFTFSSNAVS AB21/Humano HVR-H2 536 ISAGGSDT AB21/Humano HVR-H3 537 ARETWNHLFDY AB21/Frango ou human- 538 SGGDYYSYYYG ou ized 539 SGGSYSSYYYA ou HVR-L1 540 SGGDYYSTYYA ou 541 GSYSSYYYA ou 542 SGGAYSSYYYA AB21/Frango ou human- HVR-L2 543 SDDKRPS ized AB21/Frango ou human- 544 GGYDYSTYANA ou ized HVR-L3 545 GGYDQSSYTNP ou 546 GGYDGRTYINT
[00301] Anticorpos humanizados AB21 são bloqueadores de CD47, que são descritos na Tabela P de WO 2018/057669 A1, cuja descrição é incorporada neste documento por referência em sua totalidade.
[00302] Em certas modalidades, o anticorpo anti-SIRPα (136 ou mutantes da linha germinativa de 136) é um anticorpo humano que compreende um VH e VL, em que o VH é independentemente selecio- nado a partir das sequências listadas abaixo: Nome do Fonte Domínio Sequência SEQ ID NO: Anticorpo 136 Humano DVQLVESGGGVVRPGESLRLSCAASGFTFSSYDMNWVR- QAPGEGLEWVSLISGSGEIIYYADSVKGRFTISRD- VH 547 NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKENN-
RYRFFDDWGLGTLVTVSS 136 mut all Humano com D1E, R13Q, EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYDVNWVR- E16R, E43K, mutações QAPGKGLEWVSLISGSGEIIYYADSVKGRFTIS- VH 548 de linha germinativa RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKENN- L111Q, e M34V RYRFFDDWGQGTLVTVSS 136_VH_Mu Humano com mutações EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYDLNWVR- tall_V34L reversas da linha germi- VH 549 QAPGKGLEWVSLI nativa e mutação passiva SGSGEIIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA-
Nome do Fonte Domínio Sequência SEQ ID NO: Anticorpo
VYYCAKENNRYRFFDDWGQGTLVTVSS 136 VH Humano com mutações EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYDMNWVR- Mu- de linha germinativa D1E, QAPGKGLEWVSLISGSGEIIYYADSVKGRFTIS- VH 550 tAll_V34M R13Q, E16R, E43K, e RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKENN- L111Q RYRFFDDWGQGTLVTVSS e o VL é independentemente selecionado a partir das sequências lis- tadas abaixo: Nome do Fonte Domínio Sequência SEQ ID NO: Anticorpo 136 Humano ETVLTQSPGTLTLSPGERATLTCRASQSVYTYLAWYQEK- VL 551 PGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTEFTLTISSLQSE-
DFAVYYCQQYYDRPPLTFGGGTKVEIK 136 mut all Humano com mutações EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVYTYLAWYQQK- de linha germinativa T2I, VL 552 PGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTEFTLTISSLQSE- T12S, T22S e E38Q DFAVYYCQQYYDRPPLTFGGGTKVEIK 136 mut Humano com mutações ETVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVYTYLAWYQQK- all_I2T de linha germinativa VL 553 PGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTEFTLTISSLQSE- T12S, T22S e E38Q DFAVYYCQQYYDRPPLTFGGGTKVEIK
[00303] Em certas modalidades, o anticorpo anti-SIRPα (136 ou mutantes da linha germinativa de 136) é um anticorpo humano que compreende um HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 e HVR- L3, cada um dos quais é independentemente selecionado a partir da tabela abaixo. Nome do Anticorpo/Fonte Domínio SEQ ID NO: Sequência 136/Humano HVR-H1 554 GFTFSSYDMN or 555 GFTFSSYDVN or 556 GFTFSSYDLN 136/Humano HVR-H2 557 LISGSGEIIYYADSVKG 136/Humano HVR-H3 558 ENNRYRFFDD 136/Humano HVR-L1 559 RASQSVYTYLA 136/Humano HVR-L2 560 GASSRAT 136/Humano HVR-L3 561 QQYYDRPPLT
[00304] Anticorpos humanos de 136 são não bloqueadores, que são descritos na Tabela P de WO 2018/057669 A1, cuja descrição é incorporada neste documento por referência em sua totalidade.
[00305] Em certas modalidades, o anticorpo anti-SIRPα (218 ou 218 humanizado) é um anticorpo que compreende um VH e VL, em que o VH possui a sequência de DVQLVESGGGVVRPGESLTLSCTASGFT- FTSSTMNWVRQAPGEGLDWVSSISTSGVITYYADSVKGRATIS- RDNSKNTLYLRLFSLRADDTAIYYCATDTFDHWGPGTLVTVSS (SEQ ID NO: 584); e o VL é independentemente selecionado a partir das se- quências listadas abaixo:
Nome do Anticorpo Fonte Domínio SEQ ID NO: Sequência 218 Frango ALTQPASVSANPGETVKITCF- GSSGNYGWFQQKSPGSAPVTVIHYNNKRPSDIPS- VL 585 RFSGSKSGSTGTLTITGVRAEDEAVYFCGAWETGSATF-
GAGTTLTVL 218_Hum13 (218 VL Humanizada QSALTQPASVSGSPGQSITISCF- com human IGLV2) GSSGNYGLVSWYQQHPGKAPKLMIYYNNKRPSGVSN- VL 562 RFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGAWETGSATF-
GGGTKLTVL 218_Hum14 (218 VL Humanizada SYELTQPPSVSVSPGQTASITCFGSSGNYGWYQQK- com human IGLV3) PGQSPVLVIYYNNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGT- VL 563
QAMDEADYYCGAWETGSATFGGGTKLTVL
[00306] Anticorpos humanos de 218 são não bloqueadores, que são descritos na Tabela P de WO 2018/057669 A1, cuja descrição é incorporada neste documento por referência em sua totalidade.
[00307] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-SIRPα com- preende um domínio variável de cadeia pesada (VH) compreendendo um HVR-H1 compreendendo uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 498-500, um HVR-H2 compreen- dendo a sequência da SEQ ID NO: 501, e um HVR-H3 compreenden- do a sequência da SEQ ID NO: 502; e/ou um domínio variável de ca- deia leve (VL) compreendendo um HVR-L1 compreendendo a sequên- cia da SEQ ID NO: 503, um HVR-L2 compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 504 e um HVR-L3 compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 505. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-SIRPα com- preende um domínio variável de cadeia pesada (VH) compreendendo um HVR-H1 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 498, um HVR-H2 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 501 e um HVR- H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 502; e/ou um domínio variável de cadeia leve (VL) compreendendo um HVR-L1 compreen- dendo a sequência da SEQ ID NO: 503, um HVR-L2 compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 504 e um HVR-L3 compreendendo a se- quência da SEQ ID NO: 505. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-SIRPα compreende um domínio variável de cadeia pesada (VH) compreendendo um HVR-H1 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 499, um HVR-H2 compreendendo a sequência de SEQ ID NO:
501 e um HVR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 502; e/ou um domínio variável de cadeia leve (VL) compreendendo um HVR-L1 compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 503, um HVR-L2 compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 504 e um HVR-L3 com- preendendo a sequência da SEQ ID NO: 505. Em algumas modalida- des, um anticorpo anti-SIRPα compreende um domínio variável de ca- deia pesada (VH) compreendendo um HVR-H1 compreendendo a se- quência de SEQ ID NO: 500, um HVR-H2 compreendendo a sequên- cia de SEQ ID NO: 501 e um HVR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 502; e/ou um domínio variável de cadeia leve (VL) com- preendendo um HVR-L1 compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 503, um HVR-L2 compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 504 e um HVR-L3 compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 505.
[00308] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-SIRPα com- preende um domínio VH compreendendo uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 490-495 e/ou um do- mínio VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 496 ou 497. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-SIRPα compreende um do- mínio VH que compreende a sequência da SEQ ID NO: 490 e/ou um domínio VL que compreende a sequência da SEQ ID NO: 496. Em al- gumas modalidades, um anticorpo anti-SIRPα compreende um domí- nio VH que compreende a sequência da SEQ ID NO: 491 e/ou um domínio VL que compreende a sequência da SEQ ID NO: 496. Em al- gumas modalidades, um anticorpo anti-SIRPα compreende um domí- nio VH que compreende a sequência da SEQ ID NO: 492 e/ou um domínio VL que compreende a sequência da SEQ ID NO: 496. Em al- gumas modalidades, um anticorpo anti-SIRPα compreende um domí- nio VH que compreende a sequência da SEQ ID NO: 493 e/ou um domínio VL que compreende a sequência da SEQ ID NO: 496. Em al- gumas modalidades, um anticorpo anti-SIRPα compreende um domí-
nio VH que compreende a sequência da SEQ ID NO: 494 e/ou um domínio VL que compreende a sequência da SEQ ID NO: 496. Em al- gumas modalidades, um anticorpo anti-SIRPα compreende um domí- nio VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 495 e/ou um do- mínio VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 496. Em algu- mas modalidades, um anticorpo anti-SIRPα compreende um domínio VH compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 490 e/ou um domínio VL compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 497. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-SIRPα compreende um domínio VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 491 e/ou um domínio VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 497. Em algumas moda- lidades, um anticorpo anti-SIRPα compreende um domínio VH com- preendendo a sequência da SEQ ID NO: 492 e/ou um domínio VL compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 497. Em algumas moda- lidades, um anticorpo anti-SIRPα compreende um domínio VH com- preendendo a sequência da SEQ ID NO: 493 e/ou um domínio VL compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 497. Em algumas moda- lidades, um anticorpo anti-SIRPα compreende um domínio VH com- preendendo a sequência da SEQ ID NO: 494 e/ou um domínio VL compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 497. Em algumas moda- lidades, um anticorpo anti-SIRPα compreende um domínio VH que compreende a sequência da SEQ ID NO: 495 e/ou um domínio VL que compreende a sequência da SEQ ID NO: 497.
[00309] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-SIRPα com- preende um domínio variável de cadeia pesada (VH) compreendendo um HVR-H1 compreendendo uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 512-514, um HVR-H2 compreen- dendo a sequência da SEQ ID NO: 515, e um HVR-H3 compreenden- do a sequência da SEQ ID NO: 516; e/ou um domínio variável de ca- deia leve (VL) compreendendo um HVR-L1 compreendendo a sequên-
cia da SEQ ID NO: 517, um HVR-L2 compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 518 e um HVR-L3 compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 519. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-SIRPα com- preende um domínio variável de cadeia pesada (VH) compreendendo um HVR-H1 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 512, um HVR-H2 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 515 e um HVR- H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 516; e/ou um domínio variável de cadeia leve (VL) compreendendo um HVR-L1 compreen- dendo a sequência da SEQ ID NO: 517, um HVR-L2 compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 518 e um HVR-L3 compreendendo a se- quência da SEQ ID NO: 519. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-SIRPα compreende um domínio variável de cadeia pesada (VH) compreendendo um HVR-H1 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 513, um HVR-H2 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 515 e um HVR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 516; e/ou um domínio variável de cadeia leve (VL) compreendendo um HVR-L1 compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 517, um HVR-L2 compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 518 e um HVR-L3 com- preendendo a sequência da SEQ ID NO: 519. Em algumas modalida- des, um anticorpo anti-SIRPα compreende um domínio variável de ca- deia pesada (VH) compreendendo um HVR-H1 compreendendo a se- quência de SEQ ID NO: 514, um HVR-H2 compreendendo a sequên- cia de SEQ ID NO: 515 e um HVR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 516; e/ou um domínio variável de cadeia leve (VL) com- preendendo um HVR-L1 compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 517, um HVR-L2 compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 518 e um HVR-L3 compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 519.
[00310] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-SIRPα com- preende um domínio VH compreendendo uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 506-509 e/ou um do-
mínio VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 510 ou 511. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-SIRPα compreende um do- mínio VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 506 e/ou um domínio VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 510. Em al- gumas modalidades, um anticorpo anti-SIRPα compreende um domí- nio VH compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 507 e/ou um do- mínio VL compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 510. Em algu- mas modalidades, um anticorpo anti-SIRPα compreende um domínio VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 508 e/ou um domínio VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 510. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-SIRPα compreende um domínio VH compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 509 e/ou um domínio VL compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 510. Em algumas moda- lidades, um anticorpo anti-SIRPα compreende um domínio VH com- preendendo a sequência da SEQ ID NO: 506 e/ou um domínio VL compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 511. Em algumas moda- lidades, um anticorpo anti-SIRPα compreende um domínio VH com- preendendo a sequência da SEQ ID NO: 507 e/ou um domínio VL compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 511. Em algumas moda- lidades, um anticorpo anti-SIRPα compreende um domínio VH com- preendendo a sequência de SEQ ID NO: 508 e/ou um domínio VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 511. Em algumas moda- lidades, um anticorpo anti-SIRPα compreende um domínio VH com- preendendo a sequência da SEQ ID NO: 509 e/ou um domínio VL compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 511.
[00311] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-SIRPα com- preende um domínio variável de cadeia pesada (VH) compreendendo um HVR-H1 compreendendo uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 533-535, um HVR-H2 compreen- dendo a sequência da SEQ ID NO: 536, e um HVR-H3 compreenden-
do a sequência da SEQ ID NO: 537; e/ou um domínio variável de ca- deia leve (VL) compreendendo um HVR-L1 compreendendo uma se- quência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 538-542, um HVR-L2 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 543 e um HVR -L3 compreendendo uma sequência selecionada a partir do gru- po que consiste em SEQ ID NOs: 544-546. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-SIRPα compreende um domínio variável de cadeia pesada (VH) compreendendo um HVR-H1 compreendendo a sequên- cia de SEQ ID NO: 534, um HVR-H2 compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 536, e um HVR-H3 compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 537; e/ou um domínio variável de cadeia leve (VL) compreen- dendo um HVR-L1 compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 539, um HVR-L2 compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 543 e um HVR-L3 compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 545. Em algu- mas modalidades, um anticorpo anti-SIRPα compreende um domínio variável de cadeia pesada (VH) compreendendo um HVR-H1 compre- endendo a sequência de SEQ ID NO: 533, um HVR-H2 compreenden- do a sequência de SEQ ID NO: 536 e um HVR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 537; e/ou um domínio variável de cadeia leve (VL) compreendendo um HVR-L1 compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 542, um HVR-L2 compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 543 e um HVR-L3 compreendendo a sequência da SEQ ID NO:
546. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-SIRPα compreende um domínio variável de cadeia pesada (VH) compreendendo um HVR- H1 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 498, um HVR-H2 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 501 e um HVR-H3 com- preendendo a sequência de SEQ ID NO: 502; e/ou um domínio variá- vel de cadeia leve (VL) compreendendo um HVR-L1 compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 503, um HVR-L2 compreendendo a se- quência da SEQ ID NO: 504 e um HVR-L3 compreendendo a sequên-
cia da SEQ ID NO: 505. Em algumas modalidades, um anticorpo anti- SIRPα compreende um domínio variável de cadeia pesada (VH) com- preendendo um HVR-H1 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 554, um HVR-H2 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 557 e um HVR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 558; e/ou um domínio variável de cadeia leve (VL) compreendendo um HVR-L1 compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 559, um HVR-L2 com- preendendo a sequência da SEQ ID NO: 560 e um HVR-L3 compre- endendo a sequência da SEQ ID NO: 561.
[00312] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-SIRPα com- preende um domínio VH que compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 520-523 e/ou um domínio VL que compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 525-532.
[00313] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-SIRPα com- preende um domínio variável de cadeia pesada (VH) compreendendo um HVR-H1 compreendendo uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 554-556, um HVR-H2 compreen- dendo a sequência da SEQ ID NO: 557, e um HVR-H3 compreenden- do a sequência da SEQ ID NO: 558; e/ou um domínio variável de ca- deia leve (VL) compreendendo um HVR-L1 compreendendo a sequên- cia da SEQ ID NO: 559, um HVR-L2 compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 560 e um HVR-L3 compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 561. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-SIRPα com- preende um domínio variável de cadeia pesada (VH) compreendendo um HVR-H1 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 554, um HVR-H2 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 557 e um HVR- H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 558; e/ou um domínio variável de cadeia leve (VL) compreendendo um HVR-L1 compreen- dendo a sequência da SEQ ID NO: 559, um HVR-L2 compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 560 e um HVR-L3 compreendendo a se- quência da SEQ ID NO: 561. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-SIRPα compreende um domínio variável de cadeia pesada (VH) compreendendo um HVR-H1 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 555, um HVR-H2 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 557 e um HVR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 558; e/ou um domínio variável de cadeia leve (VL) compreendendo um HVR-L1 compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 559, um HVR-L2 compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 560 e um HVR-L3 com- preendendo a sequência da SEQ ID NO: 561. Em algumas modalida- des, um anticorpo anti-SIRPα compreende um domínio variável de ca- deia pesada (VH) compreendendo um HVR-H1 compreendendo a se- quência de SEQ ID NO: 556, um HVR-H2 compreendendo a sequên- cia de SEQ ID NO: 557 e um HVR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 558; e/ou um domínio variável de cadeia leve (VL) com- preendendo um HVR-L1 compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 559, um HVR-L2 compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 560 e um HVR-L3 compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 561.
[00314] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-SIRPα com- preende um domínio VH compreendendo uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 547-550 e/ou um do- mínio VL compreendendo uma sequência selecionada a partir do gru- po que consiste em SEQ ID NOs: 551-553. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-SIRPα compreende um domínio VH que compreen- de a sequência da SEQ ID NO: 547 e/ou um domínio VL que compre- ende a sequência da SEQ ID NO: 551. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-SIRPα compreende um domínio VH que compreende a sequência da SEQ ID NO: 548 e/ou um domínio VL que compreende a sequência da SEQ ID NO: 551. Em algumas modalidades, um anticor- po anti-SIRPα compreende um domínio VH que compreende a se-
quência da SEQ ID NO: 549 e/ou um domínio VL que compreende a sequência da SEQ ID NO: 551. Em algumas modalidades, um anticor- po anti-SIRPα compreende um domínio VH que compreende a se- quência da SEQ ID NO: 550 e/ou um domínio VL que compreende a sequência da SEQ ID NO: 551. Em algumas modalidades, um anticor- po anti-SIRPα compreende um domínio VH que compreende a se- quência da SEQ ID NO: 547 e/ou um domínio VL que compreende a sequência da SEQ ID NO: 552. Em algumas modalidades, um anticor- po anti-SIRPα compreende um domínio VH que compreende a se- quência da SEQ ID NO: 548 e/ou um domínio VL que compreende a sequência da SEQ ID NO: 552. Em algumas modalidades, um anticor- po anti-SIRPα compreende um domínio VH que compreende a se- quência da SEQ ID NO: 549 e/ou um domínio VL que compreende a sequência da SEQ ID NO: 552. Em algumas modalidades, um anticor- po anti-SIRPα compreende um domínio VH que compreende a se- quência da SEQ ID NO: 550 e/ou um domínio VL que compreende a sequência da SEQ ID NO: 552. Em algumas modalidades, um anticor- po anti-SIRPα compreende um domínio VH que compreende a se- quência da SEQ ID NO: 547 e/ou um domínio VL que compreende a sequência da SEQ ID NO: 553. Em algumas modalidades, um anticor- po anti-SIRPα compreende um domínio VH que compreende a se- quência da SEQ ID NO: 548 e/ou um domínio VL que compreende a sequência da SEQ ID NO: 553. Em algumas modalidades, um anticor- po anti-SIRPα compreende um domínio VH que compreende a se- quência da SEQ ID NO: 549 e/ou um domínio VL que compreende a sequência da SEQ ID NO: 553. Em algumas modalidades, um anticor- po anti-SIRPα compreende um domínio VH que compreende a se- quência da SEQ ID NO: 550 e/ou um domínio VL que compreende a sequência da SEQ ID NO: 553.
[00315] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-SIRPα com-
preende um domínio VH que compreende a sequência da SEQ ID NO: 584 e/ou um domínio VL que compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 585, 562 e 563. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-SIRPα compreende um domínio VH que compreende a sequência da SEQ ID NO: 584 e/ou um domínio VL que compreende a sequência da SEQ ID NO: 585. Em algumas moda- lidades, um anticorpo anti-SIRPα compreende um domínio VH que compreende a sequência da SEQ ID NO: 584 e/ou um domínio VL que compreende a sequência da SEQ ID NO: 562. Em algumas modalida- des, um anticorpo anti-SIRPα compreende um domínio VH compreen- dendo a sequência de SEQ ID NO: 584 e/ou um domínio VL compre- endendo a sequência de SEQ ID NO: 563. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-SIRPα compreende um domínio VH compreendendo três HVRs da sequência da SEQ ID NO: 584 e/ou um domínio VL compreendendo três HVRs da sequência da SEQ ID NO: 585. Em al- gumas modalidades, um anticorpo anti-SIRPα compreende um domí- nio VH compreendendo três HVRs da sequência de SEQ ID NO: 584 e/ou um domínio VL compreendendo três HVRs da sequência de SEQ ID NO: 562. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-SIRPα com- preende um domínio VH compreendendo três HVRs da sequência de SEQ ID NO: 584 e/ou um domínio VL compreendendo três HVRs da sequência de SEQ ID NO: 563.
[00316] Anticorpos anti-SIRP adicionais são descritos em US 2018/0037652 A1; WO 2016/205042 A1; WO 2017/178653 A2; WO 2018/107058 A1; e WO 2018/057669 A1; a descrição de cada um dos quais é incorporada neste documento por referência em sua totalida- de.
[00317] Em algumas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento compreende uma região Fc humana, por exemplo, uma região Fc de IgG1, IgG2 ou IgG4 humana.
[00318] Em algumas modalidades, a região Fc do anticorpo forneci- do neste documento inclui uma ou mais mutações que influenciam uma ou mais propriedades do anticorpo, como estabilidade, padrão de glicosilação ou outras modificações, função da célula efetora, farma- cocinética e assim por diante. Em algumas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento possui glicosilação reduzida ou mínima. Em algumas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento ablacionou ou reduziu a função efetora. Mutações de Fc exemplares incluem, sem limitação (i) mutações da região Fc de IgG1 humano L234A, L235A, G237A e N297A; (ii) mutações da região Fc de IgG2 humano A330S, P331S e N297A; e (iii) mutações da região Fc de IgG4 humana S228P, E233P, F234V, L235A, delG236 e N297A (nu- meração EU). Em algumas modalidades, a região Fc de IgG2 humano compreende mutações A330S e P331S. Em algumas modalidades, a região Fc de IgG4 humana compreende uma mutação S288P. Em al- gumas modalidades, a região Fc de IgG4 humana compreende muta- ções S288P e L235E.
[00319] Em algumas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento compreende uma região Fc de IgG1 humano compreen- dendo mutações L234A, L235A e G237A, de acordo com a numeração EU. Em algumas modalidades, um anticorpo fornecido neste docu- mento compreende uma região Fc de IgG1 humano compreendendo mutações L234A, L235A, G237A e N297A, de acordo com a numera- ção EU. Em algumas modalidades, um anticorpo fornecido neste do- cumento compreende uma região Fc de IgG1 humano compreendendo uma mutação N297A, de acordo com a numeração EU. Em algumas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento compreende uma região Fc de IgG1 humano compreendendo uma mutação D265A, de acordo com a numeração EU. Em algumas modalidades, um anti- corpo fornecido neste documento compreende uma região Fc de IgG1 humano compreendendo mutações D265A e N297A, de acordo com a numeração EU. Em algumas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento compreende uma região Fc de IgG2 humano com- preendendo mutações A330S e P331S, de acordo com a numeração EU. Em algumas modalidades, um anticorpo fornecido neste docu- mento compreende uma região Fc de IgG2 humano compreendendo mutações A330S, P331S e N297A, de acordo com a numeração EU. Em algumas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento compreende uma região Fc de IgG2 humano compreendendo uma mutação N297A, de acordo com a numeração EU. Em algumas moda- lidades, um anticorpo fornecido neste documento compreende uma região Fc de IgG4 humana compreendendo uma mutação S228P, de acordo com a numeração EU. Em algumas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento compreende uma região Fc de IgG4 hu- mana compreendendo mutações S228P e D265A, de acordo com a numeração EU. Em algumas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento compreende uma região Fc de IgG4 humana com- preendendo as mutações S228P e L235E, de acordo com a numera- ção EU. Em algumas modalidades, um anticorpo fornecido neste do- cumento compreende uma região Fc de IgG4 humana compreendendo mutações S228P e N297A, de acordo com a numeração EU. Em al- gumas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento com- preende uma região Fc de IgG4 humana compreendendo S228P, E233P, F234V, L235A, delG236 e mutações N297A, de acordo com a numeração EU. Em algumas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento compreende uma região Fc que compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 564-
578.
[00320] Em algumas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento compreende um domínio constante de cadeia leve capa humana, por exemplo, uma região Fc compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 579. Em algumas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento compreende um domínio constante de cadeia leve lambda humana, por exemplo, IGLC1 ou IGLC2 (tal como as sequên- cias da região Fc exemplares mostradas em SEQ ID Nos: 580 e 581, respectivamente).
[00321] Anticorpos que visam antígenos de superfície celular po- dem desencadear funções imunoestimulatórias e efetoras que estão associadas ao engajamento do receptor Fc (FcR) em células imunes. Existem vários receptores Fc que são específicos para classes particu- lares de anticorpos, incluindo IgG (receptores gama), IgE (receptores eta), IgA (receptores alfa) e IgM (receptores mu). A ligação da região Fc aos receptores Fc nas superfícies das células pode desencadear uma série de respostas biológicas, incluindo fagocitose de partículas revestidas com anticorpo (fagocitose mediada por células dependente de anticorpo ou ADCP), eliminação de complexos imunes, lise de célu- las revestidas com anticorpo por células exterminadoras (citotoxicida- de mediada por células dependentes de anticorpos, ou ADCC) e libe- ração de mediadores inflamatórios, transferência placentária e controle da produção de imunoglobulinas. Além disso, a ligação do componen- te C1 do complemento aos anticorpos pode ativar o sistema do com- plemento. A ativação do complemento pode ser importante para a lise de patógenos celulares. No entanto, a ativação do complemento tam- bém pode estimular a resposta inflamatória e também pode estar en- volvida na hipersensibilidade autoimune ou em outros distúrbios imu- nológicos. As regiões Fc variantes com capacidade reduzida ou abla- cionada para se ligar a certos receptores Fc são úteis para o desen- volvimento de anticorpos terapêuticos e construtos polipeptídicos de fusão Fc que atuam direcionando, ativando ou neutralizando funções de ligante, embora não danifiquem ou destruam células ou tecidos lo-
cais.
[00322] Em algumas modalidades, um monômero de domínio Fc refere-se a uma cadeia polipeptídica que inclui o segundo e o terceiro domínios constantes de anticorpo (por exemplo, CH2 e CH3). Em al- gumas modalidades, um monômero de domínio Fc também inclui um domínio de dobradiça. Em algumas modalidades, o monômero de do- mínio Fc é de qualquer isótipo de anticorpo de imunoglobulina, incluin- do IgG, IgE, IgM, IgA e IgD. Além disso, em algumas modalidades, um monômero de domínio Fc é de qualquer subtipo de IgG (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgG3 e IgG4). Em algumas modali- dades, os monômeros de domínio Fc incluem até dez alterações de uma sequência de monômero de domínio Fc tipo selvagem (por exemplo, 1-10, 1-8, 1-6, 1-4 substituições de aminoácidos, adições ou inserções, deleções, ou combinações dos mesmos) que alteram a inte- ração entre um domínio Fc e um receptor Fc.
[00323] Em algumas modalidades, um monômero de domínio Fc de uma imunoglobulina ou um fragmento de um monômero de domínio Fc é capaz de formar um domínio Fc com outro monômero de domínio Fc. Em algumas modalidades, um monômero de domínio Fc de uma imunoglobulina ou um fragmento de um monômero de domínio Fc não é capaz de formar um domínio Fc com outro monômero de domínio Fc. Em algumas modalidades, um monômero de domínio Fc ou um fragmento de um domínio Fc é fundido a um polipeptídeo da descrição para aumentar a meia-vida sérica do polipeptídeo. Em algumas moda- lidades, um monômero de domínio Fc ou um fragmento de um monô- mero de domínio Fc fundido a um polipeptídeo da descrição se dimeri- za com um segundo monômero de domínio Fc para formar um domí- nio Fc que se liga a um receptor Fc ou, alternativamente, um monôme- ro de domínio Fc se liga a um receptor Fc. Em algumas modalidades, um domínio Fc ou um fragmento do domínio Fc fundido a um polipep-
tídeo para aumentar a meia-vida sérica do polipeptídeo não induz qualquer resposta relacionada ao sistema imunológico. Um domínio Fc inclui dois monômeros de domínio Fc que são dimerizados pela intera- ção entre os domínios constantes do anticorpo CH3.
[00324] Um domínio Fc tipo selvagem forma a estrutura mínima que se liga a um receptor Fc, por exemplo, FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa, FcγRIIIb e FcγRIV. Em algumas modalidades, o domínio Fc em um anticorpo da presente descrição compreende uma ou mais substituições de aminoácidos, adições ou inserções, deleções ou quaisquer combinações dos mesmos que levam à diminuição da fun- ção efetora, tal como diminuição da citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC), diminuição da citólise dependente do complemento (CDC), diminuição da fagocitose mediada por células dependente de anticorpos (ADCP) ou quaisquer combinações dos mesmos. Por exemplo, um anticorpo da presente descrição pode exibir ligação diminuída (por exemplo, ligação mínima ou ausência de liga- ção) a um receptor Fc humano e ligação diminuída (por exemplo, liga- ção mínima ou ausência de ligação) para complementar a proteína C1q; ligação diminuída (por exemplo, ligação mínima ou ausência de ligação) o FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIB, FcγRIIIB ou quaisquer combinações dos mesmos, e C1q; função efetora dependente de anti- corpo alterada ou reduzida, como ADCC, CDC, ADCP ou qualquer combinação dos mesmos; e assim por diante. Mutações exemplares incluem, sem limitação, uma ou mais substituições de aminoácidos em E233, L234, L235, G236, G237, D265, D270, N297, E318, K320, K322, A327, A330, P331 ou P329 (numeração de acordo com o índice EU de Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª. Ed. Public Healt Service, National Institutes of Healt, Bethesda, MD. (1991)).
[00325] Em algumas modalidades, um anticorpo da presente des-
crição reduziu ou eliminou a ligação aos receptores CD16a, CD32a, CD32b, CD32c e CD64 Fcγ. Em algumas modalidades, um anticorpo com uma região Fc não nativa aqui descrita exibe pelo menos 5 %, 10%, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mai- or redução na ligação de C1q em comparação com um anticorpo com- preendendo uma região Fc tipo selvagem. Em algumas modalidades, um anticorpo com uma região Fc não nativa, conforme descrito neste documento, exibe pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais de redução no CDC em comparação com um anticorpo que compreende uma região Fc tipo selvagem.
[00326] Em algumas modalidades, as variantes de Fc aqui são mi- nimamente glicosiladas ou têm glicosilação reduzida em relação a uma sequência tipo selvagem. Em algumas modalidades, a desglicosilação é realizada com uma mutação de N297A ou por mutação de N297 em qualquer aminoácido que não seja N.
[00327] Em algumas modalidades, as variantes das regiões cons- tantes do anticorpo IgG (por exemplo, variantes Fc) possuem uma ca- pacidade reduzida para ligar especificamente os receptores Fcγ ou têm uma capacidade reduzida para induzir a fagocitose. Em algumas modalidades, as variantes das regiões constantes do anticorpo IgG (por exemplo, variantes Fc) possuem uma capacidade reduzida para se ligar especificamente aos receptores Fcγ e têm uma capacidade reduzida para induzir a fagocitose. Por exemplo, em algumas modali- dades, um domínio Fc é mutado para não possuir funções efetoras, típicas de um domínio Fc “morto”. Por exemplo, em algumas modali- dades, um domínio Fc inclui substituições de aminoácidos específicas que são conhecidas por minimizar a interação entre o domínio Fc e um receptor Fcγ. Em algumas modalidades, um monômero de domínio Fc é de um anticorpo IgG1 e inclui uma ou mais das substituições de aminoácidos L234A, L235A, G237A e N297A (conforme designado de acordo com o sistema de numeração EU por Kabat et al., 1991). Em algumas modalidades, um monômero de domínio Fc é de um anticor- po IgG1 e inclui uma ou mais das substituições de aminoácidos L234A, L235A e G237A (conforme designado de acordo com o siste- ma de numeração EU por Kabat et al., 1991). Em algumas modalida- des, um monômero de domínio Fc é de um anticorpo IgG1 e inclui N297A (conforme designado de acordo com o sistema de numeração EU por Kabat et al., 1991). Em algumas modalidades, um monômero de domínio Fc é de um anticorpo IgG1 e inclui D265A (conforme de- signado de acordo com o sistema de numeração EU por Kabat et al., 1991). Em algumas modalidades, um monômero de domínio Fc é de um anticorpo IgG1 e inclui uma ou mais das substituições de aminoá- cidos D265A e N297A (conforme designado de acordo com o sistema de numeração EU por Kabat et al., 1991). Em algumas modalidades, uma ou mais mutações adicionais estão incluídas em tal variante Fc de IgG1. Exemplos não limitantes de tais mutações adicionais para variantes Fc de IgG1 humano incluem E318A e K322A. Em alguns ca- sos, uma variante Fc de IgG1 humano possui até 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 ou 4 ou menos mutações no total em comparação com a sequência de IgG1 humano tipo selvagem. Em algumas modalidades, uma ou mais deleções adicionais são incluídas em tal variante Fc de IgG1. Por exemplo, em algumas modalidades, a lisina C-terminal da região cons- tante da cadeia pesada Fc IgG1 é deletada, por exemplo, para aumen- tar a homogeneidade do polipeptídeo quando o polipeptídeo é produ- zido em células bacterianas ou de mamíferos. Em alguns casos, uma variante Fc de IgG1 humano possui até 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 ou 4 ou menos deleções no total em comparação com a sequência de IgG1 humano tipo selvagem.
[00328] Em algumas modalidades, um monômero de domínio Fc é de um anticorpo IgG2 e inclui substituições de aminoácidos A330S,
P331S ou A330S e P331S. As posições de aminoácidos acima menci- onadas são definidas de acordo com Kabat, et al. (1991). A numera- ção de Kabat de resíduos de aminoácidos pode ser determinada para um determinado anticorpo por alinhamento em regiões de homologia da sequência do anticorpo com uma sequência numerada por Kabat “padrão”. Em algumas modalidades, a variante Fc compreende uma sequência Fc de IgG2 humano compreendendo uma ou mais das substituições de aminoácidos A330S, P331S e N297A (conforme de- signado de acordo com o sistema de numeração EU por Kabat, et al. (1991). Em algumas modalidades, o A variante Fc compreende uma sequência Fc de IgG2 humano compreendendo uma ou mais das substituições de aminoácidos D265A e N297A (conforme designado de acordo com o sistema de numeração EU por Kabat, et al. (1991). Em algumas modalidades, a variante Fc compreende uma Fc de IgG2 humano sequência compreendendo substituições de aminoácidos N297A (conforme designado de acordo com o sistema de numeração EU por Kabat, et al. (1991). Em algumas modalidades, uma ou mais mutações adicionais estão incluídas em tais variantes Fc de IgG2. Exemplos não limitantes de tais mutações adicionais para a variante Fc de IgG2 humano incluem V234A, G237A, P238S, V309L e H268A (conforme designado de acordo com o sistema de numeração EU por Kabat et al. (1991)). Em alguns casos, uma variante Fc de IgG2 hu- mano possui até 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 ou menos mutações no total em comparação com a sequência de IgG2 humano tipo selva- gem. Em algumas modalidades, uma ou mais deleções adicionais são incluídas em tal variante Fc de IgG2.
[00329] Quando a variante Fc é uma variante Fc de IgG4, em algu- mas modalidades, essa variante Fc compreende uma mutação S228P, E233P, F234V, L235A, L235E ou delG236 (conforme designado de acordo com Kabat, et al. (1991)). Em outros casos, essa variante Fc compreende uma mutação S228P e L235E (conforme designado de acordo com Kabat, et al. (1991)). Em alguns casos, uma variante Fc de IgG4 humana possui até 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 muta- ção (ões) no total em comparação com a sequência de IgG4 humana tipo selvagem.
[00330] Em algumas modalidades, a variante Fc exibe ligação re- duzida a um receptor Fc do indivíduo em comparação com a região Fc de IgG humano tipo selvagem. Em algumas modalidades, a variante Fc exibe ligação ablacionada a um receptor Fc do indivíduo em com- paração com a região Fc de IgG humano tipo selvagem. Em algumas modalidades, a variante Fc exibe uma redução da fagocitose em com- paração com a região Fc de IgG humano tipo selvagem. Em algumas modalidades, a variante Fc exibe fagocitose ablacionada em compara- ção com a região Fc de IgG humano tipo selvagem.
[00331] Citotoxicidade mediada por células dependentes de anti- corpos, que também é aqui referida como ADCC, refere-se a uma for- ma de citotoxicidade na qual Ig secretada ligada a receptores Fc (FcRs) presentes em certas células citotóxicas (por exemplo, células Exterminadoras Naturais (NK) e neutrófilos) permitindo que essas cé- lulas efetoras citotóxicas se liguem especificamente a uma célula alvo com antígeno e, subsequentemente, matem a célula alvo. Fagocitose mediada por células dependente de anticorpos, que também é referida aqui como ADCP, refere-se a uma forma de citotoxicidade na qual Ig secretada ligada a receptores Fc (FcRs) presentes em certas células fagocíticas (por exemplo, macrófagos) permitindo que essas células efetoras fagocíticas se ligem especificamente a uma célula alvo com antígeno e, subsequentemente, envolver e digerir a célula alvo. Os an- ticorpos IgG de alta afinidade específicos para ligantes direcionados à superfície das células alvo podem estimular as células citotóxicas ou fagocíticas e podem ser usados para tal morte. Em algumas modalida-
des, os construtos polipeptídicos compreendendo uma variante Fc, conforme descrito neste documento, exibem ADCC ou ADCP reduzido em comparação com um construto polipeptídico compreendendo uma região Fc tipo selvagem. Em algumas modalidades, os construtos poli- peptídicos que compreendem uma variante Fc, conforme descrito nes- te documento, exibem pelo menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou maior redução em ADCC ou ADCP em comparação com um construto polipeptídico compreendendo uma re- gião Fc tipo selvagem. Em algumas modalidades, os anticorpos que compreendem uma variante Fc, conforme descrito neste documento, exibem ADCC ou ADCP ablacionado em comparação com um cons- truto polipeptídico que compreende uma região Fc tipo selvagem.
[00332] Citotoxicidade direcionada ao complemento, que também é referida aqui como CDC, refere-se a uma forma de citotoxicidade na qual a cascata do complemento é ativada pela ligação do componente do complemento C1q ao anticorpo Fc. Em algumas modalidades, os construtos polipeptídicos que compreendem uma variante Fc, confor- me descrito neste documento, exibem pelo menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou maior redução na ligação de C1q em comparação com um construto de polipeptídeo compreendendo uma região Fc tipo selvagem. Em alguns casos, os construtos polipeptídicos compreendendo uma variante Fc, conforme descrito neste documento, exibem CDC reduzido em comparação com um construto polipeptídico compreendendo uma região Fc tipo selva- gem. Em algumas modalidades, os construtos polipeptídicos que com- preendem uma variante Fc, conforme descrito neste documento, exi- bem pelo menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70%, 80 %, 90 % ou maior redução no CDC em comparação com um construto polipeptídico compreendendo uma região Fc tipo selvagem. Em alguns casos, os anticorpos que compreendem uma variante Fc,
conforme descrito neste documento, exibem CDC desprezível em comparação com um construto polipeptídico que compreende uma re- gião Fc tipo selvagem.
[00333] Variantes de Fc aqui incluem aquelas que exibem ligação reduzida a um receptor Fcγ em comparação com a região Fc de IgG humano tipo selvagem. Por exemplo, em algumas modalidades, uma variante Fc exibe ligação a um receptor Fcγ que é menor do que a li- gação exibida por uma região Fc de IgG humano tipo selvagem a um receptor Fcγ. Em alguns casos, uma variante Fc reduziu a ligação a um receptor Fcγ por um fator de 10 %, 20 % 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % (função efetora totalmente ablacionada). Em algumas modalidades, a ligação reduzida é para qualquer um ou mais receptores Fcγ, por exemplo, CD16a, CD32a, CD32b, CD32c ou CD64.
[00334] Em alguns casos, as variantes de Fc descritas neste docu- mento exibem uma redução da fagocitose em comparação com sua região Fc de IgG humano tipo selvagem. Tais variantes Fc exibem uma redução na fagocitose em comparação com sua região Fc de IgG humano tipo selvagem, em que a redução da atividade de fagocitose é, por exemplo, por um fator de 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %. Em al- guns casos, uma variante Fc exibe fagocitose ablacionada em compa- ração com sua região Fc de IgG humano tipo selvagem.
[00335] Em algumas modalidades, as variantes de Fc descritas neste documento são acopladas a um ou mais parceiros de fusão. Em alguns casos, o parceiro de fusão é uma fração terapêutica, como um agente citotóxico da presente descrição. Em alguns casos, o parceiro de fusão é selecionado para permitir o direcionamento de uma proteí- na expressa, purificação, triagem, exibição e similares. Em algumas modalidades, o parceiro de fusão também afeta o grau de ligação aos receptores Fc ou o grau de redução da fagocitose.
[00336] Em certas modalidades, a porção de direcionamento é um anticorpo biespecífico. Em certas modalidades, o anticorpo biespecífi- co compreende um primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga a um domínio extracelular de um polipeptídeo CD56 humano e um segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno expresso por uma célula cancerosa. Em certas modalidades, o anti- corpo biespecífico compreende um primeiro domínio de ligação ao an- tígeno que se liga a um domínio extracelular de um polipeptídeo SIRP- α humano e um segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno expresso por uma célula cancerosa. Em certas modalida- des, o antígeno expresso pela célula cancerosa é selecionado do gru- po que consiste em CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, CD52, CD56, CD70, CD74, CD79b, CD123, CD138, CS1/SLAMF7, Trop- 2, 5T4, EfA4, BCMA, Mucina 1, Mucina 16, PD-L1, PTK7, STEAP1, Re- ceptor de endotelina B, mesotelina, EGFRvIII, ENPP3, SLC44A4, GNMB, nectina 4, NaPi2b, LIV-1A, Guanilila ciclase C, DLL3, EGFR, HER2, VEGF, VEGFR, integrina αVβ3, integrina α5β1, MET, IGF1R, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, Tenascina, Ley, EpCAM, CEA, gpA33, PSMA, TAG72, um receptor de mucina, CAIX, EPHA3, folato α, GD2, GD3 e um complexo MHC/peptídeo compreendendo um pep- tídeo de NY-ESO-1/LAGE, SSX-2, uma proteína da família MAGE, MAGE-A3, gp100/pmel17, Melan-A/MART-1, gp75/TRP1, tirosinase, TRP2, CEA, PSA, TAG-72, receptor de laminina imaturo, MOK/RAGE- 1, WT-1, SAP-1, BING-4, EpCAM, MUC1, PRAME, survivina, BRCA1, BRCA2, CDK4, CML66, MART-2, p53, Ras, β-catenina, TGF-βRII, HPV E6 ou HPV E7. Em certas modalidades, o anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga a um domínio extracelular de um polipeptídeo CD56 humano e um segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno expresso por uma célula imune. Em certas modalidades, o anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga a um domínio ex- tracelular de um polipeptídeo SIRP-α humano e um segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno expresso por uma célula imune. Em algumas modalidades, o antígeno expresso pela cé- lula imune é selecionado do grupo que consiste em BDCA2, BDCA4, ILT7, LILRB1, LILRB2, LILRB3, LILRB4, CSF-1R, CD40, CD40L, CD163, CD206, DEC205, CD47, CD123, IDO, TDO, 41BB, CTLA4, PD1, PD-L1, PD-L2, TIM-3, BTLA, VISTA, LAG-3, CD28, OX40, GITR, CD137, CD27, HVEM, CCR4, CD25, CD103, KIrg1, Nrp1, CD278, Gpr83, TIGIT, CD154, CD160, PVRIG, DNAM, e ICOS.
[00337] Em certas modalidades, o anticorpo compreende uma se- quência de região constante selecionada da tabela abaixo. Nome SEQ ID NO: Sequência IgG1 tipo selvagem ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA- VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEL- LGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE- 564
QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK IgG1_AAA_N297A ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA- VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA- GAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE- 565 QYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS- REEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR-
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK IgG1_AAA ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA- VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA- GAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- 566 TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT- KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN-
VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK IgG1_N297A ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA- VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEL- LGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE- 567
QYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK IgG1_D265A ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA- VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEL- LGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE- 568
QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK IgG1_N297A/D265A ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA- VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEL- 569 LGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE-
QYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
Nome SEQ ID NO: Sequência
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK IgG2 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDIFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG
LISLSSVVTVPSSNFGTQTITCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFL
FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWIVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRV 570
VSVLTVVHQDWLNGKEIKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVITLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFIPSDIAVEWESNGQPENNIKTTPPMLDSDGSFFLISKLTVDKSRWQQGNV
FSCSVMHEALHNHITQKSLSLSPGK IgG2Da ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA- VLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAG- PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNST- 571 FRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN- QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN-
VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK IgG2Da_N297A ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA- VLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAG- PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFAST- 572 FRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN- QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN-
VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK IgG2_N297A ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDIFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG
LISLSSVVTVPSSNFGTQTITCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFL
FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWIVDGVEVHNAKTKPREEQFASTFRV 573
VSVLTVVHQDWLNGKEIKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVITLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFIPSDIAVEWESNGQPENNIKTTPPMLDSDGSFFLISKLTVDKSRWQQGNV
FSCSVMHEALHNHITQKSLSLSPGK IgG2Da_D265A ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA- VLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAG- PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNST- 574 FRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN- QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN-
VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK IgG4_S228P ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA- VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG- PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNS- 575 TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMT- KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN-
VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK IgG4_S228P_D265A ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA- VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG- PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNS- 576 TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMT- KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN-
VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK IgG4_S228P, L235E ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA- VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGG- PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNS- 577 TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMT- KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN-
VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK IgG4_S228P,N297A ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA- VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG- PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFAS- 578 TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMT- KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN-
VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK Humano Capa RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK- 579
DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC Humano Lambda IGLC1 GQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTK- 580
PSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS Humano Lambda IGLC2 GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAW- 581
KADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
[00338] Em certas modalidades, a porção de direcionamento é um polipeptídeo. Em certas modalidades, a porção de direcionamento é um peptídeo RGD, uma glicoproteína do vírus da raiva (RVG) ou um peptídeo DC3. Em certas modalidades, a porção de direcionamento é um aptâmero. Em certas modalidades, a porção de direcionamento compreende uma molécula pequena. Em certas modalidades, a por- ção de direcionamento compreende folato, manose ou um ligante de PSMA. Conjugados
[00339] Em uma modalidade, um conjugado fornecido neste docu- mento compreende uma porção de direcionamento e um ou mais poli- nucleotídeos imunomoduladores, em certas modalidades, de cerca de 1 a cerca de 6 ou de cerca de 1 a cerca de 4, cerca de 1 ou cerca de 2 polinucleotídeos imunomoduladores. Em certas modalidades, o conju- gado compreende um ligante que liga a porção de direcionamento co- valentemente aos polinucleotídeos imunomoduladores. Em certas mo- dalidades, o ligante é ligado a uma nucleobase, espaçador abásico, fosfato, fosforotioato ou fosforoditioato no polinucleotídeo imunomodu- lador.
[00340] Em uma modalidade, é fornecido neste documento um con- jugado de Fórmula (C): ou um estereoisômero, uma mistura de dois ou mais diastereômeros, um tautômero ou uma mistura de dois ou mais tautômeros dos mes- mos; ou um sal, solvato ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo; em que Ab é uma porção de direcionamento; f é um número inteiro de 1, 2, 3 ou 4; e LN, Q e e são, cada um, conforme definido neste documento.
[00341] Em certas modalidades, na Fórmula (C), Ab é um anticorpo. Em certas modalidades, na Fórmula (C), Ab é um anticorpo monoclo-
nal.
[00342] Em certas modalidades, na Fórmula (C), f é um número in- teiro de 1 ou 2. Em certas modalidades, na Fórmula (C), f é um núme- ro inteiro de 1.
[00343] Em certas modalidades, na Fórmula (C), ambos e e f são, cada um, um número inteiro de 1.
[00344] Em uma modalidade, o conjugado de anticorpo CpG possui um DAR variando de cerca de 1 a cerca de cerca de 20, de cerca de 1 a cerca de 10, de cerca de 1 a cerca de 8, de cerca de 1 a cerca de 4, ou de cerca de 1 a cerca de 2. Em outra modalidade, o conjugado de anticorpo CpG possui um DAR de cerca de 1, cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7 ou cerca de 8. Preparação de Conjugados Conjugação
[00345] As reações úteis para conjugar uma porção de direciona- mento a um polinucleotídeo imunomodulador são conhecidas na técni- ca, incluindo, mas não se limitando a cicloadição de Huisgen (catalisa- da por metal ou sem metal) entre um azido e um grupo de conjugação com base em alquino (por exemplo, C6-16 heterociclileno opcionalmen- te substituído conpossuindo uma ligação tripla carbono-carbono endo- cíclica ou C8-16 cicloalquinila opcionalmente substituída) para formar uma porção triazol; a reação de Diels-Alder entre um dienófilo e um dieno/hetero-dieno; formação de ligações por meio de reações pericí- clicas, como a reação eno; formação de ligação amida ou tioamida; formação de ligações sulfonamida (por exemplo, com compostos azi- do); alquilação de álcool ou fenol (por exemplo, alquilação de William- son), reações de condensação para formar o grupo oxima, hidrazona ou semicarbazida; reações de adição de conjugado por nucleófilos (por exemplo, aminas e tióis); formação de ligações dissulfeto; e subs- tituição nucleofílica (por exemplo, por uma amina, tiol ou hidroxila nu-
cleófila) em um carbonila (por exemplo, em um éster de ácido carboxí- lico ativado, tal como éster pentafluorofenila (PFP) ou éster de tetraflu- orofenila (TFP)) ou em um areno eletrofílico (por exemplo, SNAr em um areno oligofluorado, um grupo fluorobenzonitrila ou grupo fluoroni- trobenzeno).
[00346] Em certas modalidades, a reação de conjugação é uma ci- cloadição dipolar e a porção de conjugação inclui azido, C 6-16 heteroci- clileno opcionalmente substituído conpossuindo uma ligação tripla car- bono-carbono endocíclica ou C8-16 cicloalquinila opcionalmente substi- tuída. O grupo reativo complementar e o grupo de conjugação são se- lecionados por sua complementaridade mútua. Por exemplo, uma azi- da é usada em um do grupo de conjugação e no grupo reativo com- plementar, enquanto um alquino é usado no outro do grupo de conju- gação e no grupo reativo complementar. Preparação de Polinucleotídeos Imunomoduladores
[00347] O polinucleotídeo imunomodulador fornecido neste docu- mento pode ser preparado de acordo com métodos conhecidos na técnica de síntese química de polinucleotídeos, por exemplo, a partir de fosforamiditas de nucleosídeo. A fosforamidita pode incluir um gru- po de conjugação covalentemente ligado ao átomo de fósforo da fosfo- ramidita. Preparação de uma Fração de Porção de direcionamento
[00348] [00386] Uma porção de direcionamento pode ser conjugada a um polinucleotídeo imunomodulador, formando uma ligação entre um grupo de conjugação no polinucleotídeo imunomodulador e um grupo reativo complementar ligado à porção de direcionamento. Em certas modalidades, a porção de direcionamento possui intrinseca- mente um grupo reativo complementar (por exemplo, um marcador Q (por exemplo, LLQGG (SEQ ID NO: 582) ou GGGLLQGG (SEQ ID NO: 583)) em um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno ou um derivado modificado do mesmo). Em certas modalidades, a porção de direcionamento é modificada para incluir um grupo reativo comple- mentar (por exemplo, anexando um grupo reativo complementar a um marcador Q). Os métodos de introdução de tais grupos reativos com- plementares em uma porção de direcionamento são conhecidos na técnica.
[00349] Em certas modalidades, o grupo reativo complementar é C2- 12 alquinila opcionalmente substituída, amino N-protegido opcional- mente substituído, azido, N-maleimido, tiol S-protegido, , , ou uma porção N- protegida do mesmo, , , , C6-16 heterociclila opcionalmente substituída conpossuindo uma ligação tripla carbono-carbono endocíclica (por exemplo, ), grupo 1,2,4,5-tetrazina (por exemplo, ou ), C8-16 cicloalquinila opcionalmente substituída (por exemplo, ), –NHRN1, C4-8 cicloalquenila opcionalmente substituída deformada (por exemplo, trans-ciclo-octenila ou norborne-
nila), ou C1-16 alquila opcionalmente substituída conpossuindo - COOR12 ou –CHO; em que: RN1 é H, grupo protetor de N ou C1-6 alquila opcionalmente substituída; cada R12 é independentemente H, C1-6 alquila opcionalmen- te substituída ou grupo de proteção de O (por exemplo, um grupo de proteção de carboxila); e R13 é halogênio (por exemplo, F).
[00350] Em certas modalidades, o grupo reativo complementar é protegido até a reação de conjugação. Por exemplo, um grupo reativo complementar que é protegido pode incluir –COORPGO ou – NHRPGN, onde RPGO é um grupo protetor de O (por exemplo, um gru- po protetor de carboxila) e RPGN é um grupo protetor de N.
[00351] Em certas modalidades, um grupo reativo complementar é –Z3–QA3, em que: Z3 é um grupo divalente, trivalente, tetravalente ou pentava- lente, em que uma das valências é substituída por QA3, uma das va- lências é aberta e cada uma das valências restantes, se presente, é independentemente substituída por uma porção auxiliar;
[00352] QA3 é C2-12 alquinila opcionalmente substituída, amino N- protegido opcionalmente substituído, azido, N-maleimido, tiol S- protegido, , , ou versão N-protegida dos mesmos, , ,
, C6-16 heterociclila opcionalmente substituída conpos- suindo uma ligação tripla carbono-carbono endocíclica (por exemplo, ), grupo 1,2,4,5-tetrazina (por exemplo, ou ) C8-16 cicloalquinila opcionalmente substituída (por exemplo, ), –NHRN1, C4-8 cicloalquenila opcionalmente substituída deformada (por exemplo, trans-ciclo-octenila ou norborne- nila), ou C1-16 alquila opcionalmente substituída conpossuindo – COOR12 ou –CHO; em que: RN1 é H, grupo protetor de N, ou C1-6 alquila opcionalmente substituída; cada R12 é independentemente H, C1-6 alquila, grupo prote- tor de O, ou um grupo protetor de carboxila; e R13 é halogênio ou F.
[00353] Em certas modalidades, Z3 compreende um grupo de rami- ficação e dois segmentos divalentes, em que o grupo de ramificação está ligado a cada um dos dois segmentos divalentes, em que um dos segmentos divalentes possui uma valência aberta e o segmento diva- lente restante está ligado a QA3; e o grupo de ramificação compreende um ou dois monômeros independentemente selecionados do grupo que consiste em C1-12 alcano-triíla opcionalmente substituída, C1-12 al- cano-tetraíla opcionalmente substituída, C2-12 heteroalcano-triíla opcio-
nalmente substituída e C2-12 heteroalcano-tetraíla opcionalmente subs- tituída, onde duas valências do grupo de ramificação estão ligadas aos dois segmentos divalentes, e cada uma das valências restantes é in- dependentemente substituída por uma porção auxiliar.
[00354] Em certas modalidades, o segmento divalente em Z3 é –(– QB–QC–QD–)s1–, em que: s1 é um número inteiro de cerca de 1 a cerca de 50 ou de cerca de 1 a cerca de 30; cada QB e QD estão independentemente ausentes, –CO–, – NH–, –O–, –S–, –SO2–, –OC(O)–, –COO–, –NHC(O)–, –C(O)NH–, –CH2–, –CH2NH–, –NHCH2–, –CH2O–, ou – OCH2–; e cada QC está independentemente ausente, C1-12 alquileno opcionalmente substituído, C2-12 alquenileno opcionalmente substituí- do, C2-12 alquinileno opcionalmente substituído, C2-12 heteroalquileno opcionalmente substituído ou C1-9 heterociclileno opcionalmente subs- tituído.
[00355] Em certas modalidades, pelo menos um dentre QB e QD es- tá presente em cada unidade monomérica de Z3.
[00356] Em certas modalidades, –Z3–QA3 é –(–QB–QC–QD–)s1–QE–(–QB–QC–QD–)s1–QA3, (Vb) em que: cada s1 é independentemente um número inteiro de cerca de 1 a cerca de 50 ou de cerca de 1 a cerca de 30; QA3 é como descrito neste documento; cada QB e QD estão independentemente ausentes, –CO–, – NH–, –O–, –S–, –SO2–, –OC(O)–, –COO–, –NHC(O)–, –C(O)NH–, –CH2–, –CH2NH–, –NHCH2–, –CH2O–, ou –
OCH2–; e cada QC está independentemente ausente, C1-12 alquileno opcionalmente substituído, C2-12 alquenileno opcionalmente substituí- do, C2-12 alquinileno opcionalmente substituído, C2-12 heteroalquileno opcionalmente substituído ou C1-9 heterociclileno opcionalmente subs- tituído; e QE está ausente ou um grupo de ramificação de fórmula (IV) como descrito neste documento.
[00357] Em certas modalidades, –(–QB–QC–QD–)s1– é um grupo: –QB–(CH2)g1–(CH2OCH2)g2–(CH2)g3–QD–, em que: (i) g2 é um número inteiro de cerca de 1 a cerca de 50, de cerca de 1 a cerca de 40, ou de cerca de 1 a cerca de 30; (ii) g1 é 1 e QB é –NHCO–, –CONH–, ou –O–; ou g1 é 0 e QD é –NHCO–; e (iii) g3 é 1 e QB é –NHCO–, –CONH–, ou –O–; ou g3 é 0 e QD é –CONH–.
[00358] Em certas modalidades, o grupo reativo complementar é: (XXIX) ou , (XXX) em que:
QA2 está ausente, C2-12 heteroalquileno opcionalmente substituído (por exemplo, um heteroalquileno conpossuindo –C(O)– N(H)–, –N(H)–C(O)–, –S(O)2–N(H)–, ou –N(H)–S(O)2–), C1-12 tio-
heterociclileno opcionalmente substituído (por exemplo, ,
, , , ou ) C1-12 heteroci- clileno opcionalmente substituído (por exemplo, 1,2,3-triazol-1,4-diíla ou ), ciclobut-3-eno-1,2-diona-3,4-diiía, pirid-2-il hidrazo- na, C6-16 triazolo-heterociclileno opcionalmente substituído (por exem-
plo, ou ) C8-16 triazolocicloalquenileno opcio-
nalmente substituído (por exemplo, ), ou um grupo di-hidropiridazina (por exemplo, trans- , trans- ,
, ou );
cada QA3 é independentemente C2-12 alquinila opcionalmente substituí- da, amino N-protegido opcionalmente substituído, azido, N-maleimido,
tiol S-protegido, , , ou uma versão N-protegida dos mesmos, , ,
, C6-16 heterociclila opcionalmente substituída conpos- suindo uma ligação tripla carbono-carbono endocíclica (por exemplo,
), grupo 1,2,4,5-tetrazina (por exemplo,
ou ), ou C8-16 cicloalquinila opcionalmente substituída
(por exemplo, ), –NHRN1, C4-8 cicloalquenila opcionalmen- te substituída deformada (por exemplo, trans-ciclo-octenila ou norbor- nenila), ou C1-16 alquila opcionalmente substituída conpossuindo – COOR12 ou –CHO; RN1 é H, grupo protetor de N, ou C1-6 alquila opcionalmente substituída; cada R12 é independentemente H ou C1-6 alquila opcional- mente substituída; R13 é halogênio ou F; cada RT é independentemente uma ligação a uma porção de direcionamento; cada QT é independentemente –CO–, –NH–, –NH–CH2–, ou –CO–CH2–; cada X1, X3, e X5 estão independentemente ausentes, –O–, –NH–, –CH2–NH–, –C(O)–, –C(O)–NH–, –NH–C(O)–, –NH–C(O)–NH– , –O–C(O)–NH–, –NH–C(O)–O–, –CH2–NH–C(O)–NH–, –CH2–O– C(O)–NH–, ou –CH2–NH–C(O)–O–; cada X2 e X4 estão independentemente ausentes, –O–, – NH–, –C(O)–, –C(O)–NH–, –NH–C(O)–, –NH–C(O)–NH–, –O–C(O)– NH–, ou –NH–C(O)–O–; cada x2 é independentemente um número inteiro de cerca de 0 a cerca de 50, de cerca de 1 a cerca de 40, ou de cerca de 1 a cerca de 30; cada x3 é independentemente um número inteiro de cerca de 1 a cerca de 11; e cada x5 é independentemente um número inteiro de cerca de 0 ou cerca de 1; e cada x6 é independentemente um número inteiro de cerca de 0 a cerca de 10 ou de cerca de 1 a cerca de 6, desde que a soma de ambos x6 seja cerca de 12 ou menos.
[00359] Em certas modalidades, o grupo reativo complementar é: , (XXXI) , (XXXII)
, (XXXIII) (XXXIV) , (XXXV)
, (XXXVI) ou
, (XXXVII) em que: cada QA3 é independentemente C2-12 alquinila opcionalmen- te substituída, amino N-protegido opcionalmente substituído, azido, N-
maleimido, tiol S-protegido, , ,
ou uma versão N-protegida dos mesmos,
, , , C6-16 heterociclila opcio- nalmente substituída conpossuindo uma ligação tripla carbono-
carbono endocíclica (por exemplo, ), grupo 1,2,4,5-tetrazina
(por exemplo, ou ), ou C8-16 cicloal-
quinila opcionalmente substituída (por exemplo, ), –NHRN1, C4-8 cicloalquenila opcionalmente substituída deformada (por exemplo, trans-ciclo-octenila ou norbornenila), ou C1-16 alquila opcio- nalmente substituída conpossuindo –COOR12 ou –CHO; cada RM1 é independentemente H ou uma porção auxiliar; cada RN1 é independentemente H, grupo protetor de N, ou C1-6 alquila opcionalmente substituída; cada R12 é independentemente H ou C1-6 alquila opcional- mente substituída; cada R13 é independentemente halogênio ou F; cada QT é independentemente –CO–, –NH–, –NH–CH2–, ou –CO–CH2–; cada RT é independentemente uma ligação a uma porção de direcionamento; cada q5 e q6 são independentemente um número inteiro de cerca de 1 a cerca de 10 ou de cerca de 1 a cerca de 6; cada q7 é independentemente um número inteiro de cerca de 0 ou cerca de 1; cada q8 é independentemente um número inteiro de cerca de 0 a cerca de 50, de cerca de 1 a cerca de 40, ou de cerca de 1 a cerca de 30; e cada q9 é independentemente um número inteiro de cerca de 1 a cer- ca de 10.
[00360] Em certas modalidades, o grupo reativo complementar é: , (XXXVIII) , (XXXIX) , (XL) , (XLI)
, (XLII) , (XLIII) ou , (XLIV) em que: cada RM1 é independentemente H ou uma porção auxiliar; cada QT é independentemente –CO–, –NH–, –NH–CH2–, ou –CO– CH2–; cada RT é independentemente uma ligação a uma porção de direcio- namento; cada q5 e q6 são independentemente um número inteiro de cerca de 1 a cerca ou de cerca de 1 a cerca de 6; cada q7 é independentemente um número inteiro de cerca de 0 ou cerca de 1; cada q8 é independentemente um número inteiro de cerca de 0 a cerca de 50, de cerca de 1 a cerca de 40 ou de cerca de 1 a cerca de 30; e cada q9 é independentemente um número inteiro de cerca de 1 a cerca de 10. Composições Farmacêuticas
[00361] A liberação de um conjugado fornecido neste documento pode ser alcançada pelo contato de uma célula com o conjugado usando uma variedade de métodos conhecidos pelos versados na téc- nica. Em certas modalidades, o conjugado fornecido neste documento é formulado como uma composição farmacêutica incluindo um excipi- ente farmaceuticamente aceitável. Em certas modalidades, a composi- ção farmacêutica é um líquido ou sólido (por exemplo, liofilizado).
[00362] O conjugado fornecido neste documento pode ser adminis- trado sozinho ou em mistura com um excipiente farmaceuticamente aceitável selecionado em relação à via de administração pretendida e à prática farmacêutica padrão. As composições farmacêuticas para uso assim podem ser formuladas de uma maneira convencional usan- do um ou mais veículos, excipientes e auxiliares fisiologicamente acei- táveis que facilitam o processamento do conjugado em preparações que podem ser usadas farmaceuticamente.
[00363] Transportadores ou excipientes frequentemente usados incluem açúcares (por exemplo, lactose, manitol), proteína do leite, gelatina, amido, vitaminas, celulose e seus derivados, poli (etileno gli- col) e solventes, tais como água estéril, alcoóis, glicerol, e alcoóis poli- hídricos. Os veículos intravenosos podem incluir reforçadores de flui- dos e nutrientes. Outros transportadores farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções aquosas, excipientes não tóxicos, incluindo sais, conservantes, tampões e similares, conforme descrito, por exemplo, em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., Gen- naro, Ed., Lippencott Williams & Wilkins (2005), e The United States Pharmacopeia: The National Formulary (USP 36 NF31), publicado em
2013. O pH e a concentração exata dos vários componentes da com- posição farmacêutica podem ser ajustados de acordo com as práticas de rotina na técnica. Veja, Goodman e Gilman's, o Pharmacological Basis for Therapeutics.
[00364] Na preparação das composições farmacêuticas, o ingredi- ente ativo é tipicamente misturado com um excipiente (por exemplo, em formulações liofilizadas) ou diluído por um excipiente. Quando o excipiente serve como um diluente, pode ser um material sólido, se-
missólido ou líquido (por exemplo, solução salina tamponada com fos- fato), que atua como um veículo, transportador ou meio para o ingredi- ente ativo. Assim, as composições podem estar na forma de compri- midos, pós, elixires, suspensões, emulsões, soluções e xaropes. Co- mo é conhecido na técnica, o tipo de diluente pode variar dependendo da via de administração pretendida. As composições resultantes po- dem incluir agentes adicionais, por exemplo, conservantes. As formu- lações podem incluir adicionalmente: agentes lubrificantes, por exem- plo, talco, estearato de magnésio e óleo mineral; agentes umectantes; agentes emulsionantes e de suspensão; agentes conservantes, por exemplo, metil- e propilhidroxibenzoatos; agentes adoçantes; e agen- tes aromatizantes. Outros excipientes exemplares são descritos em Handbook of Pharmaceutical Excipients, 6ª. Edição, Rowe et al., Eds., Pharmaceutical Press (2009). Os conservantes podem incluir agentes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes e gases inertes.
[00365] Estas composições farmacêuticas podem ser fabricadas de uma maneira convencional, por exemplo, por processos convencionais de mistura, dissolução, granulação, fabricação de drágeas, levigação, emulsificação, encapsulação, aprisionamento ou liofilização. Métodos bem conhecidos na técnica para fazer formulações são encontrados, por exemplo, em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21ª. Ed., Gennaro, Ed., Lippencott Williams & Wilkins (2005), e Ency- clopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick e J. C. Boy- lan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York. A formulação adequada depende da via de administração escolhida. A formulação e prepara- ção de tais composições são bem conhecidas por alguém versado na técnica de formulação farmacêutica. Na preparação de uma formula- ção, um conjugado pode ser moído para fornecer o tamanho de partí- cula apropriado antes de combinar com os outros ingredientes. Via de Administração
[00366] As composições farmacêuticas podem ser administradas localmente ou sistemicamente. As quantidades terapeuticamente efi- cazes irão variar de acordo com fatores, tais como a extensão da pro- gressão da doença em um indivíduo, a idade, sexo e peso do indiví- duo. Os regimes de dosagem podem ser ajustados para fornecer a resposta terapêutica ideal. Por exemplo, várias doses divididas podem ser administradas diariamente ou a dose pode ser reduzida proporcio- nalmente conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica.
[00367] As composições farmacêuticas podem ser administradas a um paciente em uma variedade de formas, dependendo da via de ad- ministração selecionada, como será entendido por aqueles versados na técnica. Os conjugados usados nos métodos descritos neste docu- mento podem ser administrados, por exemplo, por administração pa- renteral. A administração parenteral inclui as vias de administração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intracraniana, subcutânea, intraorbital, intraventricular, intraespinhal, intratecal, intraperitoneal, retal e tópica. A via de administração tópica inclui as vias de adminis- tração transdérmica, intradérmica, bucal e sublingual. As composições farmacêuticas são formuladas de acordo com a via de administração selecionada. A administração parenteral pode ser por infusão contínua durante um período de tempo selecionado. Formulações para Administração Parenteral
[00368] Um conjugado fornecido neste documento pode ser admi- nistrado a um paciente em necessidade do mesmo em uma formula- ção parenteral farmaceuticamente aceitável (por exemplo, intravenosa, intramuscular ou subcutânea), conforme descrito neste documento. A formulação farmacêutica também pode ser administrada por via paren- teral (por exemplo, por via intravenosa, intramuscular ou subcutânea) em formas de dosagem ou formulações conpossuindo veículos e adju- vantes convencionais, não tóxicos e farmaceuticamente aceitáveis. Em particular, as formulações adequadas para administração parentérica incluem soluções de injeção estéreis aquosas e não aquosas que po- dem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que tor- nam a formulação isotônica com o sangue do paciente; e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de sus- pensão e agentes espessantes. Por exemplo, para preparar tal com- posição, um conjugado fornecido neste documento pode ser dissolvido ou suspenso em um veículo líquido parenteralmente aceitável. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser usados estão água, água ajustada a um pH adequado pela adição de uma quantidade apropriada de ácido clorídrico, hidróxido de sódio ou um tampão ade- quado (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato), 1,3- butanodiol, solução de Ringer e solução isotônica de cloreto de sódio. A formulação aquosa também pode conter um ou mais conservantes, por exemplo, p-hidroxibenzoato de metila, etila ou n-propila. Informa- ções adicionais sobre as formulações parenterais podem ser encon- tradas, por exemplo, no United States Pharmacopeia-National Formu- lary (USP-NF), aqui incorporado por referência.
[00369] A formulação parenteral do conjugado fornecida neste do- cumento pode ser qualquer um dos quatro tipos gerais de preparações identificadas pelo USP-NF como adequadas para administração pa- renteral: (1) “Fármaco para injeção”: uma substância de fármaco (por exemplo, um conjugado fornecido neste documento) como um sólido seco (por exemplo, liofilizado) que será combinada com o veícu- lo estéril apropriado para administração parenteral como uma injeção de fármaco; (2) “Emulsão injetável de fármaco”: uma preparação líquida da substância de fármaco (por exemplo, um conjugado fornecido neste documento) que é dissolvida ou dispersa em um meio de emulsão adequado; (3) “Suspensão injetável de fármaco”: uma preparação lí- quida da substância de fármaco (por exemplo, um conjugado fornecido neste documento) suspensa em um meio líquido adequado; e (4) “Fármaco para suspensão injetável”: a substância de fármaco (por exemplo, um conjugado fornecido neste documento) co- mo um sólido seco que será combinado com o veículo estéril apropria- do para administração parenteral como uma suspensão injetável de fármaco.
[00370] Formulações exemplares para administração parenteral in- cluem soluções de um conjugado fornecido neste documento, prepa- rado em água adequadamente misturada com um tensoativo, por exemplo, hidroxipropilcelulose. As dispersões também podem ser pre- paradas em glicerol, poli (etileno glicol) líquido, DMSO e suas misturas com ou sem álcool, e em óleos. Em condições normais de armazena- mento e uso, essas preparações podem conter um conservante para prevenir o crescimento de microorganismos. Os procedimentos e in- gredientes convencionais para a seleção e preparação de formulações adequadas são descritos, por exemplo, em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21ª. Ed., Gennaro, Ed., Lippencott Williams & Wilkins (2005) e The United States Pharmacopeia: National Formu- lary (USP 36 NF31), publicado em 2013.
[00371] Polímero de lactídeo biocompatível e biodegradável, copo- límero de lactídeo/glicolídeo ou copolímeros de polioxietileno- polioxipropileno podem ser usados para controlar a liberação de um conjugado fornecido neste documento. Outros sistemas de distribuição parenteral potencialmente úteis para um conjugado fornecido neste documento incluem partículas de copolímero de etileno-acetato de vi- nila, bombas osmóticas ou sistemas de infusão implantáveis. A formu- lação parentérica pode ser formulada para liberação imediata ou para liberação sustentada/prolongada dos polinucleotídeos e/ou conjuga- dos. Formulações exemplares para liberação parenteral de um conju- gado aqui fornecidas incluem: soluções aquosas, pós para reconstitui- ção, soluções de cossolvente, emulsões de óleo/água, suspensões, microesferas e géis poliméricos. Métodos de Uso
[00372] Em uma modalidade, é fornecido neste documento um mé- todo para tratar, prevenir ou melhorar um ou mais sintomas de uma doença proliferativa em um indivíduo, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um conju- gado descrito neste documento.
[00373] Em certas modalidades, o indivíduo é um mamífero. Em certas modalidades, o indivíduo é um humano. Em certas modalida- des, o indivíduo é um primata que não seja humano, um animal de fa- zenda, como gado, um animal esportivo ou um animal de estimação, como um cavalo, cachorro ou gato.
[00374] Em certas modalidades, a doença proliferativa é um tumor. Em certas modalidades, a doença proliferativa é um tumor líquido ou hematológico. Em certas modalidades, a doença proliferativa é um tu- mor sólido. Em certas modalidades, a doença proliferativa é uma do- ença neoplásica.
[00375] Em certas modalidades, a doença proliferativa é o câncer. Em certas modalidades, o câncer é câncer recidivante. Em certas mo- dalidades, o câncer é um câncer resistente a fármacos. Em certas mo- dalidades, o câncer é um câncer resistente a fármacos em recidiva. Em certas modalidades, o câncer é um câncer multirresistente. Em certas modalidades, o câncer é um câncer multirresistente em recidiva.
[00376] Em certas modalidades, o câncer tratável com um conjuga- do fornecido neste documento inclui, mas não está limitado a, (1) leu- cemias, incluindo, mas não se limitando a, leucemia aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, como leucemias mielo- blásticas, promielocíticas, mielomonocíticas, monocíticas, eritroleucê- micas e síndrome mielodisplásica ou um sintoma dos mesmos (como anemia, trombocitopenia, neutropenia, bicitopenia ou pancitopenia), anemia refratária (RA), RA com sideroblastos em anel (RARS), RA com excesso de blastos (RAEB), RAEB em transformação (RAEB-T), pré-leucemia e leucemia mielomonocítica crônica (CMML), (2) leuce- mias crônicas, incluindo, mas não se limitando a, leucemia mielocítica (granulocítica) crônica, leucemia linfocítica crônica e leucemia de célu- las pilosas; (3) policitemia vera; (4) linfomas, incluindo, mas não se li- mitando a, doença de Hodgkin e doença não Hodgkin; (5) mielomas múltiplos, incluindo, mas não se limitando a, mieloma múltiplo latente, mieloma não secretor, mieloma osteosclerótico, leucemia de células plasmáticas, plasmocitoma solitário e plasmocitoma extramedular; (6) macroglobulinemia de Waldenström; (7) gamopatia monoclonal de sig- nificado indeterminado; (8) gamopatia monoclonal benigna; (9) doença de cadeia pesada; (10) sarcoma ósseo e de tecido conjuntivo, incluin- do, mas não se limitando a, sarcoma ósseo, osteossarcoma, condros- sarcoma, sarcoma de Ewing, tumor maligno de células gigantes, fi- brossarcoma ósseo, cordoma, sarcoma periosteal, sarcoma de tecido mole, angiossarcoma (hemangiossarcoma), fibrossarcoma, sarcoma de Kaposi, leiomiossarcoma, lipossarcoma, linfangiossarcoma, cânce- res metastáticos, neurilemmoma, rabdomiossarcoma e sarcoma sino- vial; (11) tumores cerebrais, incluindo, mas não se limitando a, glioma, astrocitoma, glioma do tronco cerebral, ependimoma, oligodendroglio- ma, tumor não glial, neurinoma acústico, craniofaringioma, medulo- blastoma, meningioma, pinocitoma, pinoblastoma e linfoma cerebral primário; (12) câncer de mama, incluindo, mas não limitado a, adeno- carcinoma, carcinoma lobular (células pequenas), carcinoma intraduc- tal, câncer de mama medular, câncer de mama mucinoso, câncer de mama tubular, câncer de mama papilar, cânceres primários, doença de Paget e câncer de mama inflamatório; (13) câncer adrenal, incluin- do, mas não se limitando a feocromocitoma e carcinoma adrenocorti- cal; (14) câncer da tireoide, incluindo, mas não se limitando a, câncer papilar ou folicular da tireoide, câncer medular da tireoide e câncer anaplásico da tireoide; (15) câncer pancreático, incluindo, mas não se limitando a, insulinoma, gastrinoma, glucagonoma, vipoma, tumor se- cretor de somatostatina e tumor carcinoide ou de células das ilhotas; (16) câncer de hipófise, incluindo, mas limitado a, doença de Cushing, tumor secretor de prolactina, acromegalia e diabetes insipius; (17) câncer de olho, incluindo, mas não se limitando a melanoma ocular, como melanoma de íris, melanoma de coroide e melanoma de corpo ciliar e retinoblastoma; (18) câncer vaginal, incluindo, mas não se limi- tando a, carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma e mela- noma; (19) câncer vulvar, incluindo, mas não se limitando a, carcinoma de células escamosas, melanoma, adenocarcinoma, carcinoma de cé- lulas basais, sarcoma e doença de Paget; (20) cânceres cervicais, in- cluindo, mas não se limitando a, carcinoma de células escamosas e adenocarcinoma; (21) câncer uterino, incluindo, mas não se limitando a, carcinoma endometrial e sarcoma uterino; (22) câncer de ovário, incluindo, mas não se limitando a, carcinoma epitelial de ovário, tumor limítrofe, tumor de células germinativas e tumor estromal; (23) câncer de esôfago, incluindo, mas não se limitando a, câncer escamoso, ade- nocarcinoma, carcinoma adenoide cístico, carcinoma mucoepidermoi- de, carcinoma adenoescamoso, sarcoma, melanoma, plasmacitoma, carcinoma verrucoso e carcinoma de células de aveia (células peque- nas); (24) câncer de estômago, incluindo, mas não se limitando a, adenocarcinoma, fungante (polipoide), ulcerativo, disseminação super- ficial, disseminação difusa, linfoma maligno, lipossarcoma, fibrossar- coma e carcinossarcoma; (25) câncer de cólon; (26) câncer retal; (27)
câncer de fígado, incluindo, mas não se limitando a, carcinoma hepa- tocelular e hepatoblastoma; (28) câncer da vesícula biliar, incluindo, mas não se limitando a, adenocarcinoma; (29) colangiocarcinomas, incluindo, mas não se limitando a, papilar, nodular e difuso; (30) cân- cer de pulmão, incluindo, mas não se limitando a, câncer de pulmão de células não pequenas, carcinoma de células escamosas (carcinoma epidermoide), adenocarcinoma, carcinoma de células grandes e cân- cer de pulmão de células pequenas; (31) câncer testicular, incluindo, mas não se limitando a, tumor germinativo, seminoma, anaplásico, clássico (típico), espermatocítico, não seminoma, carcinoma embrioná- rio, carcinoma de teratoma e coriocarcinoma (tumor do saco vitelino); (32) câncer de próstata, incluindo, mas não se limitando a, adenocar- cinoma, leiomiossarcoma e rabdomiossarcoma; (33) câncer penal; (34) câncer oral, incluindo, mas não se limitando a, carcinoma de células escamosas; (35) câncer basal; (36) câncer de glândula salivar, incluin- do, mas não se limitando a, adenocarcinoma, carcinoma mucoepider- moide e carcinoma adenoidcístico; (37) câncer de faringe, incluindo, mas não se limitando a, câncer de células escamosas e verrucoso; (38) câncer de pele, incluindo, mas não se limitando a, carcinoma de células basais, carcinoma de células escamosas e melanoma, mela- noma de disseminação superficial, melanoma nodular, melanoma len- tigo maligno e melanoma lentiginoso acral; (39) câncer renal, incluindo, mas não se limitando a, câncer de células renais, adenocarcinoma, hipernefroma, fibrossarcoma e câncer de células transicionais (pelve renal e/ou útero); (40) tumor de Wilms; (41) câncer de bexiga, incluin- do, mas não se limitando a, carcinoma de células transicionais, câncer de células escamosas, adenocarcinoma e carcinossarcoma; e outro câncer, incluindo, não se limitando a, mixossarcoma, sarcoma osteo- gênico, endoteliossarcoma, linfangio-endoteliossarcoma, mesotelioma, sinovioma, hemangioblastoma, carcinoma epitelial, cistadenocarcino-
ma, carcinoma broncogênico, carcinoma das glândulas sudoríparas, carcinoma das glândulas sebáceas, carcinoma papilar e adenocarci- nomas papilares (Veja, Fishman et al., 1985, Medicine, 2d Ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia and Murphy et al., 1997, Informed Decisi- ons: The Complete Book of Cancer Diagnosis, Treatment, and Reco- very, Viking Penguin, Penguin Books U.S.A., Inc., United States of America).
[00377] Em certas modalidades, o câncer tratável com um conjuga- do fornecido neste documento inclui, mas não está limitado a, câncer de células B, por exemplo, mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenström, as doenças da cadeia pesada, como, por exemplo, do- ença da cadeia alfa, doença da cadeia gama e doença da cadeia mu, qammopatia monoclonal benigna e amiloidose imunocítica, melano- mas, câncer de mama, câncer de pulmão, câncer de brônquio, câncer colorretal, câncer de próstata, câncer de pâncreas, câncer de estôma- go, câncer de ovário, câncer de bexiga urinária, câncer do sistema nervoso central ou cerebral, câncer do sistema nervoso periférico, câncer de esôfago, câncer cervical, câncer uterino ou endometrial, câncer da cavidade oral ou faringe, câncer de fígado, câncer de rim, câncer testicular, câncer do trato biliar, câncer de intestino delgado ou apêndice, câncer de glândula salivar, câncer da glândula tireoide, cân- cer da glândula adrenal, osteossarcoma, condrossarcoma e câncer de tecidos hematológicos.
[00378] Em certas modalidades, o câncer tratável com um conjuga- do fornecido neste documento inclui, mas não está limitado a, sarco- mas e carcinomas humanos, por exemplo, fibrossarcoma, mixossar- coma, lipossarcoma, condrossarcoma, sarcoma osteogênico, cordo- ma, angiossarcoma, endoteliossarcoma, linfangiossarcoma, linfangio- endoteliossarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomi- ossarcoma, rabdomiossarcoma, carcinoma de cólon, câncer colorretal,
câncer de pâncreas, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células ba- sais, adenocarcinoma, carcinoma de glândula sudorípara, carcinoma de glândula sebácea, carcinoma papilar, cistadenocarcinoma, carci- noma medular, carcinoma broncogênico, carcinoma de células renais, hepatoma, carcinoma do ducto biliar, câncer de fígado, coriocarcino- ma, sominoma, carcinoma embrionário, tumor de Wilms, câncer cervi- cal, câncer ósseo, tumor cerebral, câncer testicular, carcinoma de pulmão, carcinoma de células pequenas do pulmão, carcinoma da be- xiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, cranio- faringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma; leucemias, por exemplo, leucemia linfocítica aguda e leucemia mielocítica aguda (mieloblástica, promielocítica, mielomono- cítica, monocítica e eritroleucemia); leucemia crônica (leucemia mielo- cítica crônica (granulocítica) e leucemia linfocítica crônica); e policite- mia vera, linfoma (doença de Hodgkin e doença não Hodgkin), mielo- ma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom e doença da cadeia pesada.
[00379] Em certas modalidades, o câncer é de natureza epitelial, incluindo, mas não se limitando a, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer cervical, câncer de cólon, cânceres ginecológicos, câncer renal, câncer de laringe, câncer de pulmão, câncer oral, câncer de cabeça e pescoço, câncer de ovário, câncer de pâncreas, câncer de próstata e câncer de pele. Em certas modalidades, o câncer é câncer de mama, câncer de próstata, câncer de pulmão ou câncer de cólon. Em certas modalidades, o câncer epitelial é câncer de pulmão de células não pe- quenas, carcinoma de células renais não papilares, carcinoma cervi- cal, carcinoma de ovário (por exemplo, carcinoma de ovário seroso) ou carcinoma de mama.
[00380] Em certas modalidades, a doença proliferativa é uma doen- ça inflamatória. Em certas modalidades, a doença proliferativa é um distúrbio imunológico. Em certas modalidades, a doença proliferativa é uma doença infecciosa. Em certas modalidades, a doença proliferativa é uma infecção viral.
[00381] Em outra modalidade, é fornecido neste documento um mé- todo de modulação de uma célula exterminadora natural em um indiví- duo, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um conjugado descrito neste documento.
[00382] Em ainda outra modalidade, é fornecido neste documento um método de modulação de uma célula mieloide em um indivíduo, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade efi- caz de um conjugado descrito neste documento.
[00383] Dependendo do distúrbio, doença ou condição a ser tratada e da condição do indivíduo, o conjugado ou composição farmacêutica aqui fornecida pode ser administrado por via oral, parenteral (por exemplo, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, ICV, injeção in- tracistemal ou infusão, injeção subcutânea ou implante), vias de admi- nistração por inalação, nasal, vaginal, retal, sublingual ou tópica (por exemplo, transdérmica ou local) e podem ser formuladas, sozinhas ou em conjunto, em unidade de dosagem adequada com excipientes far- maceuticamente aceitáveis, transportadores, adjuvantes e veículos apropriados para cada via de administração. Também é fornecida a administração do conjugado ou composição farmacêutica fornecida neste documento em uma formulação de depósito, na qual o ingredi- ente ativo é liberado ao longo de um período de tempo predefinido.
[00384] No tratamento, prevenção ou melhoria de um ou mais sin- tomas dos distúrbios, doenças ou condições aqui descritos, um nível de dosagem apropriado geralmente está variando de cerca de 0,001 a 100 mg por kg de peso corporal do indivíduo por dia (mg/kg por dia),
de cerca de 0,01 a cerca de 75 mg/kg por dia, de cerca de 0,1 a cerca de 50 mg/kg por dia, de cerca de 0,5 a cerca de 25 mg/kg por dia, ou de cerca de 1 a cerca de 20 mg/kg por dia, que pode ser administrado em doses únicas ou múltiplas. Dentro desta faixa, a dosagem pode variar de cerca de 0,005 a cerca de 0,05, de cerca de 0,05 a cerca de 0,5, de cerca de 0,5 a cerca de 5,0, de cerca de 1 a cerca de 15, de cerca de 1 a cerca de 20, ou de cerca de 1 a cerca de 50 mg/kg por dia.
[00385] Será entendido, no entanto, que o nível de dose específica e a frequência de dosagem para qualquer paciente em particular po- dem ser variados e dependerão de uma variedade de fatores, incluin- do a atividade do composto específico usado, a estabilidade metabóli- ca e a duração da ação desse composto, a idade, peso corporal, saú- de geral, sexo, dieta, modo e tempo de administração, taxa de excre- ção, combinação de fármacos, a gravidade da condição particular e o hospedeiro em terapia.
[00386] O conjugado fornecido neste documento também pode ser combinado ou usado em combinação com outros agentes ou terapias úteis no tratamento, prevenção ou melhoria de um ou mais sintomas das condições, distúrbios ou doenças para as quais o conjugado for- necido neste documento é útil .
[00387] Outros agentes terapêuticos adequados também podem incluir, mas não estão limitados a, (1) agentes alfa-adrenérgicos; (2) agentes antiarrítmicos; (3) agentes antiateroscleróticos, tais como ini- bidores ACAT; (4) antibióticos, tais como antraciclinas, bleomicinas, mitomicina, dactinomicina e plicamicina; (5) agentes anticancerígenos e agentes citotóxicos, por exemplo, agentes alquilantes, tais como mostardas de nitrogênio, alquil sulfonatos, nitrosoureias, etileniminas e triazenos; (6) anticoagulantes, tais como acenocumarol, argatroban, bivalirudina, lepirudina, fondaparinux, heparina, fenindiona, varfarina e ximelagatran; (7) agentes antidiabéticos, como biguanidas (por exem- plo, metformina), inibidores da glicosidase (por exemplo, acarbose), insulinas, meglitinidas (por exemplo, repaglinida), sulfonilureias (por exemplo, glimepirida, gliburida e glipizida), tiozolidinadionas (por exemplo, troglitazona, rosiglitazona e pioglitazona) e agonistas de PPAR-gama; (8) agentes antifúngicos, tais como amorolfina, anfoteri- cina B, anidulafungina, bifonazol, butenafina, butoconazol, caspofungi- na, ciclopirox, clotrimazol, econazol, fenticonazol, filipina, fluconazol, isoconazol, itraconazol, cetoconazol, micafungina, miconazol, naftifina, natamicina, nistatina, oxiconazol, ravuconazol, posaconazol, rimocidi- na, sertaconazol, sulconazol, terbinafina, terconazol, tioconazol e vori- conazol; (9) antiinflamatórios, por exemplo, agentes antiinflamatórios não esteroidais, como aceclofenaco, acemetacina, amoxiprina, aspiri- na, azapropazona, benorilato, bronfenaco, carprofeno, celecoxibe, co- lina salicilato de magnésio, diclofenaco, diflunisal, etodolaco, etoricoxi- be, faislamina, fenbufeno, fenoprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, in- dometacina, cetoprofeno, cetorolaco, lornoxicam, loxoprofeno, lumira- coxibe, ácido meclofenâmico, ácido mefenâmico, meloxicam, metami- zol, salicilato de metila, salicilato de magnésio, nabumetona, naproxe- no, nimesulida, salicil salicilato, sulindaco, sulfinpirazona, suprofeno, tenoxicam, ácido tiaprofênico e tolmetina; (10) antimetabólitos, tais como antagonistas de folato, análogos de purina e análogos de pirimi- dina; (11) agentes antiplaquetários, tais como bloqueadores GPIIb/IIIa (por exemplo, abciximabe, eptifibatida e tirofibano), antagonistas P2Y (AC) (por exemplo, clopidogrel, ticlopidina e CS-747), cilostazol, dipiri- damol e aspirina; (12) antiproliferativos, tais como metotrexato, FK506 (tacrolimo) e micofenolato de mofetila; (13) anticorpos anti-TNF ou re- ceptor solúvel de TNF, tais como etanercepte, rapamicina e leflunimi- da; (14) inibidores de aP2; (15) agentes beta-adrenérgicos, como car- vedilol e metoprolol; (16) sequestrantes de ácidos biliares, como ques-
tran; (17) bloqueadores dos canais de cálcio, como besilato de amlodi- pina; (18) agentes quimioterapêuticos; (19) inibidores da ciclooxige- nase-2 (COX-2), tais como celecoxibe e rofecoxibe; (20) ciclosporinas; (21) fármacos citotóxicos, como azatioprina e ciclofosfamida; (22) diu- réticos, tais como clorotiazida, hidroclorotiazida, flumetiazida, hidroflu- metiazida, bendroflumetiazida, metilclorotiazida, triclorometiazida, poli- tiazida, benzotiazida, ácido etacrínico, ticrinafeno, clortalidona, furose- nida, muzolimina, bumetanida, triantereno, amilorida e espironolacto- na; (23) inibidores da enzima de conversão da endotelina (ECE), como o fosforamidona; (24) enzimas, como L-asparaginase; (25) Inibidores do Fator VIIa e Inibidores do Fator Xa; (26) inibidores da farnesil- proteína transferase; (27) fibratos; (28) inibidores do fator de cresci- mento, como moduladores da atividade de PDGF; (29) secretagogos do hormônio do crescimento; (30) inibidores da HMG CoA redutase, como pravastatina, lovastatina, atorvastatina, sinvastatina, NK-104 (também conhecido como itavastatina, nisvastatina ou nisbastatina) e ZD-4522 (também conhecido como rosuvastatina, atavastatina ou vi- sastatina); inibidores da endopeptidase neutra (NEP); (31) agentes hormonais, tais como glicocorticoides (por exemplo, cortisona), estro- gênios/antiestrogênios, androgênios/antiandrogênios, progestinas e antagonistas do hormônio liberador de hormônio luteinizante e acetato de octreotida; (32) imunossupressores; (33) antagonistas do receptor mineralocorticoide, como espironolactona e eplerenona; (34) agentes de ruptura de microtúbulos, tais como ecteinascidinas; (35) agentes estabilizadores de microtúbulos, tais como pacitaxel, docetaxel e epoti- lonas A-F; (36) Inibidores de MTP; (37) niacina; (38) inibidores de fos- fodiesterase, tais como inibidores de PDE III (por exemplo, cilostazol) e inibidores de PDE V (por exemplo, sildenafila, tadalafila e vardenafi- la); (39) produtos derivados de plantas, tais como vinca alcaloides, epipodofilotoxinas e taxanos; (40) antagonistas do fator ativador de plaquetas (PAF); (41) complexos de coordenação de platina, como cisplatina, satraplatina e carboplatina; (42) abridores de canais de po- tássio; (43) inibidores da prenil-proteína transferase; (44) inibidores da proteína tirosina cinase; (45) inibidores de renina; (46) inibidores de esqualeno sintetase; (47) esteroides, como aldosterona, beclometaso- na, betametasona, acetato de desoxicorticosterona, fludrocortisona, hidrocortisona (cortisol), prednisolona, prednisona, metilprednisolona, dexametasona e triancinolona; (48) inibidores de TNF-alfa, como teni- dape; (49) inibidores de trombina, como hirudina; (50) agentes trombo- líticos, tais como anistreplase, reteplase, tenecteplase, ativador de plasminogênio tecidual (tPA), tPA recombinante, estreptocinase, uroci- nase, prourocinase e complexo ativador de estreptocinase de plasmi- nogênio anisoilado (APSAC); (51) antagonistas do receptor de trombo- xano, como ifetroban; (52) inibidores da topoisomerase; (53) inibidores da vasopeptidase (inibidores duplos NEP-ACE), como omapatrilate e gemopatrilate; e (54) outros agentes heterogênios, tais como, hidroxiu- reia, procarbazina, mitotano, hexametilmelamina e compostos de ouro.
[00388] Em certas modalidades, as outras terapias que podem ser usadas em combinação com o conjugado fornecido neste documento incluem, agentes anticâncer e agentes citotóxicos, por exemplo, agen- tes alquilantes, tais como mostardas de nitrogênio, alquil sulfonatos, nitrosoureias, etileniminas e triazenos; por exemplo, agentes alquilan- tes, tais como mostardas de nitrogênio, alquil sulfonatos, nitrosoureias, etileniminas e triazenos.
[00389] Em certas modalidades, as outras terapias que podem ser usadas em combinação com o conjugado fornecido neste documento incluem, mas não estão limitados a, um modulador de ponto de che- cagem imunológico. Em certas modalidades, o modulador de ponto de checagem imunológico é um inibidor de PD-1. Em certas modalidades, o modulador de ponto de checagem imunológico é um inibidor de PD-
L1. Em certas modalidades, o inibidor de PD-1 é um anticorpo anti-PD- 1 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em certas mo- dalidades, o inibidor de PD-L1 é um anticorpo anti-PD-L1 ou um frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo. Em certas modalidades, o modulador de ponto de checagem imunológico bloqueia a interação entre PD-1 e PD-L1.
[00390] Em certas modalidades, as outras terapias que podem ser usadas em combinação com o conjugado fornecido neste documento incluem, mas não estão limitadas a, uma molécula coestimuladora de células T e um modulador de ponto de controle imunológico. Em certas modalidades, a molécula coestimuladora de células T é OX40, CD2, CD27, CDS, ICAM-1, LFA-1/CD11a/CD18, ICOS/CD278, 4- 1BB/CD137, GITR, CD30, CD40, BAFFR, HVEM, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3 ou CD83, ou um ligante do mesmo. Em certas modalidades, a molécula coestimuladora de células T é um anticorpo anti-OX40, anticorpo anti-ICOS/CD278 ou anticorpo anti-4-1BB/CD137, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mes- mo. Em certas modalidades, o modulador de ponto de controle imuno- lógico é um inibidor de moléculas de ponto de controle imunológico selecionadas de PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3, LAG-3, CEACAM-1, CEACAM-5, CLTA-4, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD47, CD160, 2B4, CD172a e TGFR. Em certas modalidades, o modulador de ponto de checagem imunológico é um anticorpo anti-CD47, anticorpo anti-PD-1, anticorpo anti-PD-L1 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00391] Em certas modalidades, as outras terapias que podem ser usadas em combinação com o conjugado fornecido neste documento incluem, mas não estão limitadas a, cirurgia, terapia endócrina, modifi- cadores de resposta biológica (por exemplo, interferons, interleucinas e fator de necrose tumoral (TNF)), hipertermia e crioterapia e agentes para atenuar quaisquer efeitos adversos (por exemplo, antieméticos).
[00392] Esses outros agentes ou fármacos podem ser administra- dos por uma via e em uma quantidade comumente usada para o mesmo, simultaneamente ou sequencialmente com o conjugado for- necido neste documento. Quando um conjugado fornecido neste do- cumento é usado simultaneamente com um ou mais outros fármacos, uma composição farmacêutica conpossuindo tais outros fármacos além do conjugado fornecido neste documento pode ser utilizada, mas não é necessária. Por conseguinte, as composições farmacêuticas fornecidas neste documento incluem aquelas que também contêm um ou mais outros ingredientes ativos ou agentes terapêuticos, além de um conjugado fornecido neste documento.
[00393] Em certas modalidades, um conjugado fornecido neste do- cumento é administrado em combinação com um segundo anticorpo, por exemplo, um anticorpo que se liga a um antígeno expresso pelo câncer (por exemplo, uma quantidade eficaz do segundo anticorpo. Antígenos exemplares expressos por cânceres são conhecidos na técnica e incluem, sem limitação: CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, CD52, CD56, CD70, CD74, CD79b, CD123, CD138, CS1/SLAMF7, Trop-2, 5T4, EfA4, BCMA, Mucina 1, Mucina 16, PTK7, PD-L1, STEAP1, Receptor de Endotelina B, mesotelina, EGFRvIII, ENPP3, SLC44A4, GNMB, nectina 4, NaPi2b, LIV-1A, Guanilila ciclase C, DLL3, EGFR, HER2, VEGF, VEGFR, integrina αVβ3, integrina α5β1, MET, IGF1R, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, Tenascina, Ley, EpCAM, CEA, gpA33, PSMA, TAG72, uma mucina, CAIX, EPHA3, re- ceptor α de folato, GD2, GD3, e um complexo de MHC/peptídeo com- preendendo um peptídeo de NY-ESO-1/LAGE, SSX-2, uma proteína da família MAGE, MAGE-A3, gp100/pmel17, Melan-A/MART- 1, gp75/TRP1, tirosinase, TRP2, CEA, PSA, TAG-72, receptor de la- minina imatura, MOK/RAGE-1, WT-1, SAP-1, BING-4, EpCAM, MUC1,
PRAME, survivina, BRCA1, BRCA2, CDK4, CML66, MART-2, p53, Ras, β-catenina, TGF-βRII, HPV E6, ou HPV E7. Em certas modalida- des, um conjugado fornecido neste documento é administrado em combinação com um anticorpo monoclonal que se liga a CD123 (tam- bém conhecido como receptor alfa de IL-3), como talacotuzumabe (também conhecido como CSL362 e JNJ-56022473). Em certas moda- lidades, um conjugado fornecido neste documento é administrado em combinação com um anticorpo monoclonal que se liga a EGFR (como cetuximabe). Em certas modalidades, o segundo anticorpo inclui uma ou mais funções efetoras, por exemplo, funções efetoras que estão associadas ao engajamento do receptor Fc (FcR) em células imunes, incluindo, sem limitação, ADCC ou ADCP e/ou citotoxicidade depen- dente do complemento (CDC). Sem desejar se limitar à teoria, pensa- se que combinar tal anticorpo com um conjugado fornecido neste do- cumento é particularmente vantajoso, por exemplo, para direcionar leucócitos que expressam FcR para direcionar uma célula tumoral à qual o segundo anticorpo está ligado enquanto modula as atividades de células NK ou mieloides.
[00394] Em certas modalidades, um conjugado fornecido neste do- cumento é administrado em combinação com um agente imunotera- pêutico (por exemplo, uma quantidade eficaz do agente imunoterapêu- tico. Um agente imunoterapêutico pode referir-se a qualquer agente terapêutico que visa o sistema imunológico e promove um redirecio- namento terapêutico do sistema imunológico, tal como um modulador de uma via coestimulatória, vacina contra o câncer, célula imune modi- ficada de forma recombinante, etc. Agentes imunoterapêuticos exem- plares e não limitantes são descritos infra. Sem desejar estar vinculado à teoria, pensa-se que um conjugado fornecido neste documento é adequado para uso com agentes imunoterapêuticos devido a meca- nismos de ação complementares, por exemplo, na ativação de macró-
fagos e outras células imunes, como células de T efetoras, para células tumorais alvo.
[00395] Em certas modalidades, o agente imunoterapêutico com- preende um anticorpo. Antígenos exemplares de anticorpos imunote- rapêuticos são conhecidos na técnica e incluem, sem limitação BDCA2, BDCA4, ILT7, LILRB1, LILRB2, LILRB3, LILRB4, CSF-1R, CD40, CD40L, CD163, CD206, DEC205, CD47, CD123, IDO, TDO, 41BB, CTLA4, PD1, PD-L1, PD-L2, TIM-3, BTLA, VISTA, LAG-3, CD28, OX40, GITR, CD137, CD27, HVEM, CCR4, CD25, CD103, KIrg1, Nrp1, CD278, Gpr83, TIGIT, CD154, CD160, PVRIG, DNAM, e ICOS. Os agentes imunoterapêuticos que são aprovados ou em teste clínico em estágio avançado incluem, sem limitação, ipilimumabe, pembrolizumabe, nivolumabe, atezolizumabe, avelumabe, durvaluma- be e similares. Em certas modalidades, um anticorpo da presente des- crição é administrado em combinação com um inibidor da via PD- L1/PD-1, por exemplo, um anticorpo anti-PD-L1 ou anti-PD-1. Como demonstrado aqui, a administração combinada de um anticorpo anti- SIRP-α da presente descrição e um inibidor da via PD-L1/PD-1 pode resultar em atividade antitumoral sinérgica.
[00396] Em certas modalidades, o agente imunoterapêutico com- preende uma vacina, vírus oncolítico, terapia celular adotiva, citocina ou agente imunoterapêutico de molécula pequena. Exemplos de tais agentes imunoterapêuticos são conhecidos na técnica. Por exemplo, terapias celulares adotivas e terapêuticas podem incluir, sem limitação, terapia de células T do receptor de antígeno quimérico (CAR-T), linfó- citos infiltrantes de tumor (TILs), células NK modificadas por TCR e produtos de células de macrófagos. As vacinas podem incluir, sem li- mitação, vacinas polinucleotídicas, vacinas polipeptídicas ou vacinas baseadas em células (por exemplo, baseadas em células dendríticas ou tumor). Várias citocinas úteis para o tratamento do câncer são co-
nhecidas e incluem, sem limitação, IL-2, IL-15, IL-7, IL-10 e IFN. Os agentes imunoterapêuticos de moléculas pequenas podem incluir, sem limitação, inibidores de IDO/TDO, inibidores de arginase, inibidores de A2a R, agonistas de TLR, agonistas de STING e agonistas de Rig-1.
[00397] Em certas modalidades, um conjugado fornecido neste do- cumento é administrado em combinação com um agente terapêutico incluindo e não se limitando a metotrexato (RHEUMATREX®, Ametop- terina), ciclofosfamida (CYTOXAN®), talidomida (THALIDOMID®), acridina carboxamida, Actimid®, actinomicina, 17-N-alilamino-17- desmetoxigeldanamicina, aminopterina, ansacrina, antra-ciclina, anti- neoplásico, antineoplastona, 5-azacitidina, azatioprina, BL22, benda- mustina, biricodarotina, bleomicina, bortezabulomibe, bostatina, caliba- tinulfano, cetuximabe, clorambucila, cisplatina, cladribina, clofarabina, citarabina, dacarbazina, dasatinibe, daunorrubicina, decitabina, ácido dicloroacético, discodeolida, docetaxel, doxorrubicina, epirrubicina epotilona, eribulina, estramustina, etoposídeo, exatecano, exisulinda, ferruginol, floxuridina, fludarabina, fluorouracila, fosfestrol, fotemustina, ganciclovir, gencitabina, hidroxiureia, IT-101, idarubicina, ifosfamida, imiquimode, irinotecano, irofulveno, ixabepilona, laniquidar, lapatinibe, lenalidomida, lomustina, lurtotecano, mafosfamida, masoprocol, meclo- retamina, melfalano, mercaptopurina, mitomicina, mitotano, mitoxan- trona, nelarabina, nilotinibe, oblimerseno, oxaliplatina, PAC-1, paclita- xel, pemetrexede, pentostatina, pipobromano, pixantrona, plicamicina, procarbazina, inibidores de proteassoma (por exemplo, bortezomibe), raltitrexede, rebecamicina, Revlimid®, rubitecano, SN-38, salinospo- ramida A, satraplatina, estreptozotocina, swainsonina, tariquidar, taxa- no, tegafur-uracila, temozolo- mida, testolactona, tioTEPA, tioguanina, topotecano, trabectedina, tretinoína, tetranitrato de triplatina, tris(2- cloroetil)amina, troxacitabina, mostarda de uracila, valrubicina, vim- blastina, vincristina, vinorrelbina, vorinostate ou zosuquidar.
[00398] Em certas modalidades, um conjugado fornecido neste do- cumento é administrado em combinação com um agente terapêutico, incluindo e não se limitando a 3F8, 8H9, Abagovomabe, Abciximabe, Abituzumabe, Abrilumabe, Actoxumabe, Adalimumabe, Adecatumu- mabe, Aducanumabe, Afelimomabe, Afutuzumabe, Alacizumabe pe- gol, ALD518, Alentuzumabe, Alirocumabe, Pentetato de Altumomabe, Amatuximabe, Anatumomabe mafenatox, Anetumabe ravtansina, Ani- frolumabe, cinzumabe (IMA-638), Apolizumabe, Arcitumomabe, As- crinvacumabe, Aselizumabe, Atezolizumabe, Atinumabe, Atlizumabe (tocilizumabe), Atorolimumabe, Bapineuzumabe, Basiliximabe, Bavitu- ximabe, Bectumomabe, Begelomabe, Belimumabe, Benralizumabe, Bertilimumabe, Besilesomabe, Bevacizumabe, Bezlotoxumabe, Bici- romabe, Bimagrumabe, Bimecizumabe, Bivatuzumabe mertansina, Blinatumomabe, Blosozumabe, Bococizumabe, Brentuximabe vedoti- na, Briacinumabe, Brodalumabe, Brolucizumabe, Brontictuzumabe, Canacinumabe, Cantuzumabe mertansina, Cantuzumabe ravtansina, Caplacizumabe, Capromabe pendetida, Carlumabe, Catumaxomabe, imunoconjugado de cBR96-doxorrubicina, CC49, Cedelizumabe, Cer- tolizumabe pegol, Cetuximabe, Ch.14.18, Citatuzumabe bogatox, Cixu- tumumabe, Clazacizumabe, Clenoliximabe, Clivatuzumabe tetraxetan, Codrituzumabe, Coltuximabe ravtansina, Conatumumabe, Concizuma- be, Crenezumabe, CR6261, Dacetuzumabe, Daclizumabe, Dalotuzu- mabe, Dapi- rolizumabe pegol, Daratumumabe, Dectrecumabe, Denci- zumabe, Denintuzumabe mafodotina, Denosumabe, Derlotuximabe biotina, Detumomabe, Dinutuximabe, Diridavumabe, Dorlimomabe ari- tox, Drozitumabe, Duligotumabe, Dupilumabe, Durvalumabe, Dusigi- tumabe, Ecromeximabe, Eculizumabe, Edobacomabe, Edrecolomabe, Efalizumabe, Engumabe, Eldelumabe, Elgentumabe, Elotuzumabe, Elsilimomabe, Emactuzumabe, Emibetuzumabe, Enavatuzumabe, En- fortumabe vedotin, Enlimomabe pegol, Enoblituzumabe, Enocizumabe,
Enoticumabe, Ensituximabe, Epitumomabe cituxetano, Epratuzumabe, Erlizumabe, Ertumaxomabe, Etaracizumabe, Etrolizumabe, Evinacu- mabe, Evolocumabe, Exbivirumabe, Fanolesomabe, Faralimomabe, Farletuzumabe, Fasinumabe, FBTA05, Felvizumabe, Fezacinumabe, Ficlatuzumabe, Figitumumabe, Firivumabe, Flanvotumabe, Fleticuma- be, Fontolizumabe, Foralumabe, Foravirumabe, Fresolimumabe, Ful- ranumabe, Futuximabe, Galiximabe, Ganitumabe, Gantenerumabe, Gavilimomabe, Gentuzumabe ozogamicin, Gevocizumabe, Girentuxi- mabe, Glembatumumabe vedotina, Golimumabe, Gomiliximabe, Gu- selcumabe, Ibalizumabe, Ibritumomabe tiuxetano, Icrucumabe, Idaru- cizumabe, Igovomabe, IMAB362, Imalumabe, Imciromabe, Imgatuzu- mabe, Inclacumabe, Indatuximabe ravtansina, Indusatumabe vedotina, Iniximabe, Intetumumabe, Inolimomabe, Inotuzumabe ozogamicina, Ipilimumabe, Iratumumabe, Isatuximabe, Itolizumabe, Ixecizumabe, Celiximabe, Labetuzumabe, Lambrolizumabe, Lampalizumabe, Lebri- cizumabe, Lemalesomabe, Lenzilumabe, Lerdelimumabe, Lexatumu- mabe, Libivirumabe, Lifastuzumabe vedotina, Ligelizumabe, Lilotoma- be satetraxetan, Lintuzumabe, Lirilumabe, Lodelcizumabe, Locivetma- be, Lorvotuzumabe mertansina, Lucatumumabe, Lulizumabe pegol, Lumiliximabe, Lumretuzumabe, Mapatumumabe, Margetuximabe, Maslimomabe, Mavrilimumabe, Matuzumabe, Mepolizumabe, Mete- limumabe, Milatuzumabe, Minretumomabe, Mitumomabe, Mogamuli- zumabe, Morolimumabe, Motavizumabe, Moxetumomabe pasudotox, Muromonabe-CD3, Nacolomabe tafenatox, Namilumabe, Naptumoma- be estafenatox, Namatumabe, Natalizumabe, Nebacumabe, Necitu- mumabe, Nemolizumabe, Nerelimomabe, Nesvacumabe, Nimotuzu- mabe, Nivolumabe, Nofetumomabe me entan, Obiltoxaximabe, Ocara- tuzumabe, Ocrelizumabe, Odulimomabe, Ofatumumabe, Olaratumabe, Olocizumabe, Omalizumabe, Onartuzumabe, Ontuxizumabe, Opicinu- mabe, Oportuzumabe monatox, Oregovomabe, Orticumabe, Oteli-
xizumabe, Otlertuzumabe, Oxelumabe, Ozanezumabe, Ozoralizuma- be, Pagibaximabe, Palivizumabe, Panitumumabe, Pancomabe, Pa- nobacumabe, Parsatuzumabe, Pascolizumabe, Pasotuxizumabe, Pa- teclizumabe, Patritumabe, Pembrolizumabe, Pentumomabe, Peraci- zumabe, Pertuzumabe, Pexelizumabe, Pidilizumabe, Pinatuzumabe vedotin, Pintumomabe, Placulumabe, Polatuzumabe vedotina, Po- nezumabe, Priliximabe, Pritoxaximabe, Pritumumabe, PRO 140, Quili- zumabe, Racotumomabe, Radretumabe, Ravirumabe, Ralpancizuma- be, Ramucirumabe, Ranibizumabe, Raxibacumabe, Refanezumabe, Regavirumabe, Reslizumabe, Rilotumumabe, Rinucumabe, Rituxima- be, Robatumumabe, Roledumabe, Romosozumabe, Rontalizumabe, Rovelizumabe, Ruplizumabe, Samalizumabe, Sarilumabe, Satumoma- be pendetide, Secucinumabe, Seribantumabe, Setoxaximabe, Seviru- mabe, Sibrotuzumabe, SGN-CD19A, SGN-CD33A, Sifalimumabe, Sil- tuximabe, Sintuzumabe, Siplizumabe, Sirucumabe, Sotuzumabe vedo- tina, Solanezumabe, Solitomabe, Sonepcizumabe, Sontuzumabe, Stamulumabe, Sulesomabe, Suvizumabe, Tabalumabe, Tacatuzuma- be tetraxetano, Tadocizumabe, Talizumabe, Tanezumabe, Taplitu- momabe paptox, Tarextumabe, Tebazumabe, Telimomabe aritox, Te- natumomabe, Teneliximabe, Teplizumabe, Teprotumumabe, Tesido- lumabe, TGN1412, Ticilimumabe (tremelimumabe), Tildracizumabe, Tigatuzumabe, TNX650, Tocilizumabe (atlizumabe), Toralizumabe, Tosatoxumabe, Tositumomabe, Tovetumabe, Tralocinumabe, Tras- tuzumabe, TRBS07, Tregalizumabe, Tremelimumabe, Tucotuzumabe celmoleucina, Tuvirumabe, Ublituximabe, Ulocuplumabe, Urelumabe, Urtoxazumabe, Ustecinumabe, Vandortuzumabe vedotin, Vantictuma- be, Vanucizumabe, Vapaliximabe, Varlilumabe, Vatelizumabe, Vedoli- zumabe, Veltuzumabe, Vepalimomabe, Vesencumabe, Visilizumabe, Volociximabe, Vorsetuzumabe mafodotin, Votumumabe, Zalutumuma- be, Zanolimumabe, Zatuximabe, Ziralimumabe ou Zolimomabe aritox.
[00399] Qualquer tipo de câncer conhecido na técnica pode ser in- cluído, tal como, mas não se limitando a, carcinoma, sarcoma, linfoma, leucemia, linfoma e blastoma. Exemplos mais específicos de tais cân- ceres incluem, mas não estão limitados a, câncer de pulmão, câncer de células escamosas, tumores cerebrais, glioblastoma, câncer de ca- beça e pescoço, câncer hepatocelular, câncer colorretal (por exemplo, câncer de cólon ou reto), câncer de fígado, câncer de bexiga, câncer gástrico ou de estômago, câncer de pâncreas, câncer cervical, câncer de ovário, câncer do trato urinário, câncer de mama, câncer peritoneal, câncer uterino, câncer de glândula salivar, câncer renal ou renal, cân- cer de próstata, câncer de vulva, câncer de tireoide, carcinoma anal, carcinoma peniano, melanoma, mieloma múltiplo e linfoma de células B (incluindo linfomas não Hodgkin (NHL)); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia linfocítica crônica (CLL); leucemia mieloide aguda (AML); Carcinoma de células de Merkel; leucemia de células cabelu- das; leucemia mieloblástica crônica (CML); e metástases associadas.
[00400] O conjugado fornecido neste documento também pode ser fornecido como um artigo de fabricação usando materiais de embala- gem bem conhecidos pelos versados na técnica. Veja, por exemplo, Patente U.S. Nos. 5.323.907; 5.052.558; e 5.033.252. Exemplos de materiais de embalagem farmacêutica incluem, mas não estão limita- dos a, embalagens blister, garrafas, tubos, inaladores, bombas, bol- sas, frascos, recipientes, seringas e qualquer material de embalagem adequado para uma formulação selecionada e modo pretendido de administração e tratamento.
[00401] São fornecidos aqui também kits que, quando usados pelo médico, podem simplificar a administração de quantidades apropriadas de ingredientes ativos a um indivíduo. Em certas modalidades, o kit fornecido neste documento inclui um recipiente e uma forma de dosa- gem de um conjugado fornecido neste documento.
[00402] Em certas modalidades, o kit inclui um recipiente que com- preende uma forma de dosagem de um conjugado fornecido neste do- cumento em um recipiente que compreende um ou mais outros agen- tes terapêuticos aqui descritos.
[00403] Os kits fornecidos neste documento podem incluir ainda dispositivos que são usados para administrar os ingredientes ativos. Exemplos de tais dispositivos incluem, mas não estão limitados a, se- ringas, injetores sem agulha, sacos de gotejamento, adesivos e inala- dores. Os kits fornecidos neste documento também podem incluir pre- servativos para a administração dos ingredientes ativos.
[00404] Os kits fornecidos neste documento podem incluir ainda veículos farmaceuticamente aceitáveis que podem ser usados para administrar um ou mais ingredientes ativos. Por exemplo, se um ingre- diente ativo é fornecido em uma forma sólida que deve ser reconstituí- do para administração parenteral, o kit pode compreender um recipien- te selado de um veículo adequado no qual o ingrediente ativo pode ser dissolvido para formar uma solução estéril sem partículas que é ade- quado para administração parentérica. Exemplos de veículos farma- ceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a: veículos aquosos, incluindo, mas não limitados a, Água para Injeção USP, Inje- ção de Cloreto de Sódio, Injeção de Ringer, Injeção de Dextrose, Inje- ção de Dextrose e Cloreto de Sódio e Injeção de Ringer Lactado; veí- culos miscíveis em água, incluindo, mas não se limitando a, álcool etí- lico, polietileno glicol e polipropileno glicol; e veículos não aquosos, incluindo, mas não se limitando a, óleo de milho, óleo de semente de algodão, óleo de amendoim, óleo de gergelim, oleato de etila, miristato de isopropila e benzoato de benzila.
[00405] A descrição será melhor compreendida pelos seguintes exemplos não limitantes. Exemplos
Exemplo 1. Síntese e Purificação dos Nucleotídeos e Polinucleo- tídeos
[00406] Sínteses exemplares de polinucleotídeos imunomodu- ladores e seus precursores são descritos abaixo. Precursores
[00407] Precursores úteis na preparação dos polinucleotídeos da invenção são fornecidos em WO 2015/188197 (por exemplo, fosforamiditas, porções de direcionamento e grupos biorreversíveis conpossuindo cadeias de PEG). Fosforamiditas e Outros Monômeros
[00408] Intermediários conpossuindo nucleosídeos úteis na sínte- se de polinucleotídeos da invenção são descritos em WO 2015/188197 (por exemplo, compostos U1-U54, A1-A15, C1-9 e G1-G12 em WO 2015/188197).
[00409] Fosforamiditas comercialmente disponíveis foram adquiri- dos de Glen Research (Sterling, VA) ou ChemGenes (Wilmington, MA). Quando necessário, outras fosforamiditas foram preparadas a partir de nucleosídeos adequadamente protegidos usando as con- dições de reação padrão descritas aqui estão em outro lugar. Composto S61B
[00410] A uma solução de S61 (0,48 g, 2,0 mmol) em DCM (5,0 mL) foram adicionados S61A (0,60 g, 2,0 mmol) e ETT (0,25 M em acetoni- trila, 4,8 mL, 1,2 mmol). A mistura foi agitada durante 2 h. A evapora- ção dos voláteis proporcionou um resíduo, que foi submetido à purifi- cação em coluna em sílica gel flash usando acetato de etila/hexano (gradiente 0-30 % no instrumento Combi Flash Rf) para produzir o 31 composto S61B como óleo incolor (0,49 g, 55 %). P RMN (202 MHz,
CDCl3; ppm): δ 147,83 (s). Composto S108 dioxano S108A S108
[00411] A uma mistura em agitação de 2-[2-(2- aminoetóxi)etóxi]etanol (S108A, 25,0 g, 167 mmol) e N-metil morfolina (21,0 mL, 191 mmol) em dioxano (100 mL) foi adicionado gota a gota uma solução de Fmoc-OSu (62,2 g, 184 mmol) em dioxano (50 mL). Após agitação durante a noite, a reação foi concentrada em vácuo pa- ra produzir um óleo amarelo claro. O produto cru foi redissolvido em EtOAc e lavado com NaHCO3 (aq.) e salmoura. A camada orgânica foi removida em vácuo para proporcionar um óleo, que foi purificado por cromatografia em SiO2 para fornecer o FmocNH-PEG2-OH (S108, 55 g, 88% de rendimento). ESI+ m/z calcd 371,4, encontrado 372,2 [M+H]+. Síntese do Espaçador Abásico X1 e X2 – Esquema Geral: Resina Composto S110
[00412] A uma suspensão de NaH (13,2 g, 60% em óleo mineral, 230,0 mmol) em THF (40 mL) sob argônio a 0°C foi adicionada uma solução de diol (S109, 4,92 g, 22,0 mmol) em THF (20 mL) gota a go- ta; a mistura resultante foi aquecida em temperatura ambiente e agita- da durante 1 h.
A mistura de reação foi resfriada a 0 °C, uma solução de brometo de propargila (18,6 g, 158,4 mmol) em THF (25 mL) foi adicionada lentamente e a mistura resultante foi aquecida em tempera- tura ambiente e agitada durante a noite a 40 °C.
Depois que o produto foi consumido, conforme observado por TLC, a reação foi extinta por adição gota a gota de água a 0 °C, e a mistura resultante foi extraída com diclorometano (50 mL x 2). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura e secadas em Na2SO4 anidroso, filtradas e evaporadas para produzir um resíduo, que foi purificado por coluna em sílica gel flash usando ISCO companheira (hexano/acetato de etila, 0 - 30 %) para produzir 5,92 g (89,5 %) do composto S110 como um óleo. 1H RMN (500 MHz, CDCl3; ppm): δ 7,49-7,47 (dd, J 8,0, 1,5 Hz, 2 H), 7,38-7,34 (m, 3 H), 5,43 (s, 1 H), 4,21 (d, J 2,5 Hz, 2 H), 4,12 (t, J 2,5 Hz, 4 H), 4,10 (s, 1 H), 3,91 (s, 1 H), 3,89 (s, 1 H), 3,37 (s, 2H); ESI MS para C18H20O4 calculado 300.34, observado [M+H]+ 301.3. Composto S111
[00413] O composto de bis-propargila S110 (5,9 g, 19,64 mmol) foi dissolvido em uma mistura de ácido acético/água (60 mL, 75:25) e a reação foi continuada a 50°C durante 2h. Após a conclusão da reação, a solução foi evaporada e coevaporada com tolueno (2 x 20 mL). O resíduo foi purificado diretamente sem qualquer processamento usan- do a coluna em sílica gel flash usando ISCO companheira (hexa- no/acetato de etila, 20-80 %) para produzir 3,02 g (72,5 %) do compos- to S111 como um óleo. 1H RMN (500 MHz, CDCl3; ppm): δ 4,15 (d, J 2,5 Hz, 4 H), 3,68 (s, 4 H), 3,59 (s, 4 H), 2,44 (t, J 2,5 Hz, 2 H), 2,30- 2,40 (br, 2H); ESI MS para C11H16O4 calculado 212.24, observado [M+H]+ 213,2. Composto S112
[00414] A uma solução de diol S111 (3,0 g, 14,2 mmol), N,N- diisopropiletilamina (3,15 mL, 17,0 mmol) e DMAP (0,36 g, 2,83 mmol) em diclorometano (25 mL) a 0°C foi adicionado gota a gota uma solu- ção de cloreto de dimetoxitritila (4,8 g, 14,2 mmol) em diclorometano (40 mL) e a reação continuou em temperatura ambiente durante a noi- te. A mistura foi diluída com diclorometano e lavada com água seguida de salmoura, e as camadas orgânicas foram secadas em Na 2SO4 ani- droso, filtradas e evaporadas. O resíduo resultante foi purificado por coluna em sílica gel flash usando ISCO companheira (hexano/acetato de etila, 0 - 40%) para produzir 5,29 g (73 %) do composto protegido por mono DMT S112 como um sólido branco. 1H RMN (500 MHz, CDCl3; ppm): δ 7,4-7,42 (m, 2 H), 7,32-7,31 (m, 4 H), 7,28-7,25 (m, 2 H), 6,84-6,81 (m, 4 H), 4,09 (d, J 2,5 Hz, 4 H), 3,79 (s, 6 H), 3,67 (d, J
6,0 Hz, 2 H), 3,64-3,56 (m, 4 H), 3,13 (s, 2 H), 2,39 (t, J 2,5 Hz, 2H); ESI MS para C32H34O6 calculado 514,6, observado [M+Na]+ 537,4. Composto S113
[00415] A uma solução de composto S112 protegido por DMT (0,5 g, 0,98 mmol) em diclorometano (4 mL) foi adicionada gota a gota uma solução de 2'-cianoetil-N,N,N’,N'-tetraisopropil fosforamidita (0,58 g, 1,95 mmol) em diclorometano (3 mL) em temperatura ambiente segui- do por 5-benziltio-1H-tetrazol (BTT; solução 0,25 M em acetonitrila, 0,78 mL, 0,18 mmol) sob atmosfera de argônio. A reação foi continua- da até o material de partida desaparecer (2h) e a mistura crua foi diluí- da com 20 mL de diclorometano, lavada sequencialmente com solução saturada de NaHCO3 (10 mL) e salmoura (10 mL) e secada em Na2SO4 anidroso. O solvente foi evaporado em vácuo, e a mistura crua foi purificada por cromatografia em coluna em sílica gel usando aceta- to de etila/hexano com 3% de trietilamina como cossolvente (gradiente de 0-30% no Instrumento Combi Flash Rf) para produzir 0,53 g do composto S113 (75%) como um óleo. ESI MS para C41H51N2O7P Cal- culado 714,82, Observado 715,6 [M+H]+; 31 P RMN (202 MHz, CDCl3): δ147,89. Composto S114
[00416] A uma solução de -78°C de composto S112 protegido por DMT (0,98 g, 1,9 mmol) e N,N-diisopropiletilamina (0,39 mL, 2,09 mmol) em 8,0 mL de diclorometano seco sob atmosfera de argônio foi adicionado gota a gota uma solução de diclorometano (4,0 mL) de bis- (N,N-diisopropilamino)-clorofosfina (0,56 g, 2,09 mmol). A mistura de reação foi deixada aquecer até a temperatura ambiente enquanto a agitação foi mantida durante 1 h. Uma solução de 3-butino-1-ol (0,14 g, 1,9 mmol) em 2,0 mL de diclorometano seco foi adicionada em tem- peratura ambiente; a mistura resultante foi agitada durante 10 minutos, altura em que foi adicionada uma solução 0,25 M de ETT em acetoni- trila (4,6 mL, 1,15 mmol) e a agitação continuou durante mais 3 h. Após a conclusão da reação, conforme observado pelo desapareci- mento do material de partida por TLC, a mistura crua foi diluída com 20 mL de diclorometano e lavada sequencialmente com solução satu- rada de NaHCO3 (10 mL) e salmoura (10 mL) e secada em Na2SO4 anidroso. Os voláteis foram evaporados em vácuo, e a mistura crua foi purificada por cromatografia em coluna em sílica gel usando acetato de etila/hexano com 3% de trietilamina como sistema de solvente (gradiente de 0-40% em Instrumento Combi Flash Rf) para produzir 0,33 g de composto S114 (25%) como um óleo. ESI MS para C42H52NO7P Calculado 713,83, Observado 714,7 [M+H]+; 31
P RMN (202 MHz, CDCl3): δ146.89. Síntese do Espaçador Abásico X3 e X4 – Esquema Geral:
Resina Composto S116
[00417] O composto S116 foi preparado usando o protocolo des- crito para o composto S110 em 91% de rendimento como óleo. 1H RMN (500 MHz, CDCl3; ppm): δ 7,51 (d, J 7,5 Hz, 2 H), 7,37-7,32 (m, 3 H), 5,56 (s, 1 H), 3,37-3,35 (m, 4 H), 4,10-4,07 (dd, J 13,0 Hz, J 2,5 Hz, 2 H), 3,65-3,64 (m, 1 H), 2,43-2,42 (t, J 6,5 Hz, 1H); ESI MS para C13H14O3 calculado 218.24, observado [M+H]+ 219.2. Composto S117
[00418] O Composto S117 foi preparado usando o protocol descrito para o composto S111 em 91 % de rendimento como um óleo. 1H RMN (500 MHz, CDCl3; ppm): δ 4,33 (s, 2 H), 3,83-3,70 (m, 5 H), 2,48 (s, 1 H), 2,04 (br, 2H); ESI MS para C6H10O3 calculado 130,14, obser-
vado [M+Na]+ 153,0. Composto S118
[00419] O Composto S118 foi preparado usando o protocol descrito para o composto S112 em 54 % de rendimento como um sólido bran- co. 1H RMN (500 MHz, CDCl3; ppm): δ 7,43 (d, J 7,5 Hz, 2 H), 7,37- 7,27 (m, 5 H), 7,23-7,16 (m, 2 H), 6,83 (d, J 9,0 Hz, 3 H), 6,78-6,76 (dd J 8,5 Hz, 1 H), 4,35-4,22 (m, 2 H), 3,77 (s, 6H) 3,76-3,72 (m, 2 H), 3,71-3,64 (m, 1 H), 3,27-3,19 (m, 2 H), 2,48 (t, J 4,5 Hz, 1 H), 2,03- 1,96 (m, 1H); ESI MS para C27H28O5 calculado 432,50, observado [M+Na]+ 455,4. Composto S119
[00420] O Composto S119 foi preparado usando o protocol descrito para o composto S113 em 86 % de rendimento como um óleo. ESI MS para C36H45N2O6P Calculado 432.72, Observado 433.5 [M+H]+; 31
P RMN (202 MHz, CDCl3): δ149,05, 148,96. Composto S120
[00421] O Composto S120 foi preparado usando o protocol descrito para o composto S114 em 47 % de rendimento como um óleo. ESI MS para C37H46NO6P Calculado 431,73, Observado 432,5 [M+H]+; 31
P RMN (202 MHz, CDCl3): δ147,80, 147,71. Síntese do Espaçador Abásico X5 e X6 – Esquema Geral: Redução Desproteção proteção de proteção de DMT
FMOC Resina Composto S121
[00422] A uma solução de S116 (4,0 g, 22,2 mmol) em dioxano (25 mL) foi adicionada uma solução de KOH (0,12 g, 2,2 mmol) dissolvida em uma quantidade mínima de água, e a mistura resultante foi agitada por pelo menos 30 minutos em temperatura ambiente. A mistura foi resfriada a 0°C, uma solução de acrilonitrila (2,35 g, 44,4 mmol) em dioxano (15 mL) foi adicionada gota a gota, e a mistura resultante foi deixada reagir em temperatura ambiente durante a noite. Os voláteis foram evaporados em vácuo, o resíduo foi diluído com água e o pH foi ajustado para quase neutro. O produto em cru foi extraído com acetato de etila (2 x 50 mL) e as camadas orgânicas combinadas foram lava- das com salmoura e secadas em Na2SO4 anidroso, filtradas e evapo-
radas para produzir um resíduo, que foi purificado por coluna em sílica gel flash usando ISCO companheira (diclorometano/metanol, 0 - 5 %) para produzir 3,1 g (60 %) do composto S121 como um sólido branco. 1 H RMN (500 MHz, CDCl3; ppm): δ 7,49 (d, J 7,0 Hz, 2 H), 7,36-7,34 (m, 3 H), 5,56 (s, 1 H), 3,36 (d, J 13,0 Hz 2 H), 4,10-4,07 (dd, J 13,0 Hz, J 2,0 Hz, 2 H), 3,84 (t, J 6,5 Hz, 2 H), 3,42 (m, 1 H), 3,69 (t, J 6,5 Hz, 2H); ESI MS para C13H15NO3 calculado 233,2, observado [M+Na]+ 256,3. Composto S122
[00423] A uma suspensão de hidreto de alumínio e lítio (0,83 g, 4,0 mmol) em THF (10 mL) a 0°C foi adicionada gota a gota uma solução do composto S121 (1,28 g, 5,5 mmol) em THF (15 mL), a mistura foi aquecida em temperatura ambiente e a agitação continuou durante 3 h. Após a conclusão da reação, a mistura de reação foi resfriada a 0 °C e extinta por adição gota a gota de água conforme necessário (aproximadamente, 2-3 mL). Aproximadamente mais 8 mL de água foram adicionados, e o produto cru foi extraído com acetato de etila (2 x 25 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com sal- moura, secadas em Na2SO4 anidroso, filtradas e evaporadas para pro- duzir o composto S122, que foi usado na etapa subsequente sem puri- ficação adicional. 1H RMN (500 MHz, CDCl3; ppm): δ 7,49 (d, J 7,0 Hz, 2 H), 7,40-7,32 (m, 3 H), 5,55 (d, J 5,0 Hz, 1 H), 4,34 (d, J 13,0 Hz, 1 H), 4,20-4,11 (dd, J 12,0 Hz 4 H), 4,05-4,03 (d, J 13,0 Hz, J 2,0 Hz, 1 H), 3,66-3,62 (m, 2 H), 3,27 (m, 1 H), 2,86 (t, J 6,5 Hz, 1 H), 2,16 (br, 2H); ESI MS para C13H19NO3 calculado 237,2, observado [M+H]+ 238,2.
Composto S123
[00424] Ao composto S122 (1,0 g, 4,2 mmol) e N,N- diisopropiletilamina (2,3 mL, 12,6 mmol) em diclorometano (8 mL) a 0 °C foi adicionado gota a gota uma solução de Fmoc-OSu (1,7 g, 5,0 mmol), e a mistura resultante foi deixada reagir em temperatura ambi- ente durante 3 h. Após a conclusão, a mistura de reação foi diluída com diclorometano (10 mL) e lavada com água seguida de salmoura. A camada orgânica foi separada, secada em Na2SO4 anidroso, filtrada e evaporada para produzir um resíduo. O resíduo foi purificado por co- luna em sílica gel flash usando ISCO companheira (hexano/acetato de etila, 0 - 50 %) para produzir 0,65 g (35 %) do composto S123 como um sólido branco. 1H RMN (500 MHz, CDCl3; ppm): δ 7,75 (d, J 7,5 Hz, 2 H), 7,58 (d, J 7,5 Hz, 2 H), 7,51 (d, J 7,5 Hz, 2 H), 7,37 (t, J 7,5 Hz, 2 H), 7,31-7,26 (m, 5 H), 5,57 (s, 1 H), 5,48 (br, 1 H), 4,46-4,32 (m, 4 H), 4,15 (d, J 7,0 Hz, 1 H), 4,06 (t, J 12,5 Hz 2 H), 3,67 (m, 2 H), 3,54 (m, 2 H), 3,41 (s, 1 H), 1,88 (t, J 6,0 Hz, 2H); ESI MS para C28H29NO5 calcu- lado 459,5, observado [M+Na]+ 482,5. Composto S124
[00425] O Composto S124 foi preparado usando o protocol descrito para o composto S111 com rendimentos quantitativos como um óleo. 1 H RMN (500 MHz, CDCl3; ppm): δ 7,76 (d, J 7,5 Hz, 2 H), 7,58 (d, J
7,5 Hz, 2 H), 7,39 (t, J 7,5 Hz, 2 H), 7,32 (t, J 7,5 Hz, 2 H), 5,18 (br, 1 H), 4,44 (d, J 6,5 Hz, 2 H), 4,21 (t, J 6,5 Hz, 1 H), 4,76-4,73 (dd, J 11,5, 3,5 Hz 2 H), 3,67-60 (m, 4 H), 3,42 (m, 1 H), 3,37 (br, 2 H), 2,07 (m, 2 H), 1,75 (br, 2H); ESI MS para C21H25NO5 calculado 371,4, observado [M+Na]+ 394,3. Composto S125
[00426] O Composto S125 foi preparado usando o protocol descrito para o composto S112 com rendimento de 48% de produto (S125) como um sólido branco. 1H RMN (500 MHz, CDCl3; ppm): δ 7,75 (t, J 7,5 Hz, 2 H), 7,58 (t, J 7,5 Hz, 2 H), 7,40-7,38 (m, 3 H), 7,32-27 (m, 7 H), 7,18-7,16 (m, 3 H), 6,83 (t, J 7,0 Hz, 4 H), 5,16 (br, 1 H), 4,44 (d, J 6,5 Hz, 2 H), 4,20 (m, 1 H), 3,80 (s, 3 H), 3,79 (m, 1 H), 3,76 (s, 3 H), 3,74 (m, 2 H), 3,66-3,62 (m, 4 H), 3,43-3,37 (m, 2 H), 2,31 (br, 1 H), 1,76 (br, 2H); ESI MS para C42H43NO7 calculado 673,7, observado [M+Na]+ 696,7. Composto S126
[00427] O Composto S126 foi preparado usando o protocol descrito para o composto S113 com rendimento de 78 % de produto (S126) como um óleo. ESI MS para C51H60N3O8P Calculado 874,0, Observado 896,9 [M+Na]+, 913,0 [M+K]+; 31 P RMN (202 MHz, CDCl3; ppm): δ148,90, 148,76.
Síntese de Espaçador Abásico S131 – Esquema Geral: Composto S127
[00428] A uma solução de S109 (2,56 g, 11,4 mmol) em diclorome- tano (50 mL) sob argônio foram adicionados bromoacetonitrila (3,01 g, 25,1 mmol), óxido de prata (I) (5,28g, 22,8 mmol) e iodeto de tetrabuti- lamônio (0,84 g, 2,28 mmol), e a mistura resultante foi agitada durante a noite. A mistura foi filtrada em Celite®, e o filtrado foi evaporado para produzir um resíduo preto, que foi submetido à purificação em coluna em sílica gel flash em ISCO companheira (hexano/acetato de etila, 15- 90 %) para produzir 1,34 g (39 %) do composto desejado S127 como um óleo viscoso. ESI MS para C16H18N2O4 calculado 302,3, observado [M+H]+ 303,3. Composto S128
[00429] A uma solução do composto S127 (1,34 g, 4,43 mmol) em THF (30 mL) foi adicionada uma solução de LiAlH4 em THF (2 M, 8,9 mL, 17,7 mmol) sob argônio, e a mistura foi aquecida a 55 °C por 4 h. Outra porção de LiAlH4 em THF (2 M, 4 mL, 8,0 mmol) foi adicionada, e a agitação continuou por 4 h. Após a conclusão da reação, a mistura foi resfriada em temperatura ambiente e extinta com Na2SO4.10H2O. O sólido foi removido por filtração e lavado com acetato de etila. O filtra- do foi secado em Na2SO4 anidroso. A mistura foi filtrada e evaporada para produzir um resíduo, que foi dissolvido em diclorometano (20 mL). A esta solução foram adicionados Fmoc-OSu (1,5 g, 4,43 mmol) e DIEA (0,87 mL, 5,0 mmol). A mistura foi agitada durante 1 h, em se- guida evaporada para produzir um resíduo, que foi submetido à purifi- cação em coluna em sílica gel flash em uma ISCO companheira (he- xano/acetato de etila, 20-90 %) para produzir 1,04 g (31 %) do com- posto S128 como uma espuma branca. 1H RMN (500 MHz, CDCl3; ppm): δ 7,75 (4 H, dd, J 7,5, 4,5 Hz), 7,58 (4 H, t, J 7,0 Hz), 7,48 (2 H, d, J 7,0 Hz), 7,41-7,34 (7 H, m), 7,32-7,26 (4 H, m), 5,44 (1 H, s), 5,15- 5,05 (2 H, m), 4,44 (2 H, d, J 5,5 Hz), 4,38 (2 H, d, J 6,0 Hz), 4,25-4,15 (2 H, m), 4,10 (2 H, d, J 11,5 Hz), 3,82 (2 H, d, J 11,5 Hz), 3,78 (2 H, s), 3,53 (2 H, s), 3,42 (2 H, s), 3,36-3,27 (4 H, m), 3,25 (2 H, s); ESI MS para C46H46N2O8 calculado 754,9, observado [M+H]+ 755,3. Composto S129
[00430] Composto S128 (1,1 g, 1,51 mmol) foi dissolvido na mistura AcOH/H2O (10 mL, 3:1), e a reação foi continuada a 55oC por 5 h. Após a conclusão da reação, os voláteis foram evaporados e coevapo- rados com tolueno (2x 20 mL), e o resíduo foi submetido à purificação em coluna de sílica gel flash em uma ISCO companheira (hexa- no/acetato de etila, 30-100 %) para produzir 0,54 g (54 %) do compos- to S129 como espuma branca. 1H RMN (500 MHz, CDCl3; ppm): δ 7,75 (4H, d, J 7,5 Hz), 7,58 (4H, d, J 7,5 Hz), 7,39 (4H, t, J 7,5 Hz), 7,30 (4H, t, J 7,5Hz), 5,20-5,05 (2H, m), 4,41 (4H, d, J 6,5 Hz), 4,21 (4H, t, J 6,5 Hz), 3,64 (4H, s), 3,48 (8H, s), 3,36 (4H, s); ESI MS for C 39H42N2O8 calculado 666,7, observado [M+H]+ 667,3. Composto S130
[00431] A uma solução de diol S129 (0,73g, 1,1 mmol), DIPEA (0,19 mL, 1,1 mmol) e DMAP (0,013 g, 0,11 mmol) em diclorometano (6 mL) a 0°C foi adicionada uma solução de DMTrCl (0,34 g, 0,99 mmol) em diclorometano (1 mL) gota a gota. A mistura resultante foi aquecida à temperatura ambiente e agitada durante a noite. A mistura foi evapo- rada para produzir um resíduo, que foi submetido à purificação em co- luna de sílica gel flash em uma ISCO (hexano/acetato de etila, 20-100 %) para produzir 0,47 g (44 %) do composto mono dimetoxitritila pro- tegido S130 como uma espuma branca. 1H RMN (500 MHz, CDCl3; ppm): δ 7,75 (4H, d, J 7,5 Hz), 7,58 (4H, d, J 7,5 Hz), 7,39 (4H, t, J 7,5 Hz), 7,32-7,25 (8H, m), 7,17 (4H, d, J 6,5 Hz), 6,83 (4H, d, J 6,5 Hz), 5,20-5,05 (2H, m), 4,41 (4H, d, J 6,5 Hz), 4,21 (4H, t, J 6,5 Hz), 3,82 (6H, s), 3,64 (4H, s), 3,48 (8H, s), 3,36 (4H, s); ESI MS para C60H60N2O10 calculado 969,1, observado [M+Na]+ 991,3. Composto S131
[00432] Uma solução de bis-(N, N-disiopropilamino)-clorofosfina (0,085 g, 0,32 mmol) em CH2Cl2 seco (1,0 mL) foi adicionada gota a gota a uma solução de 3-Fmoc-amino-propan-1-ol (0,090 g, 0,30 mmol) e N, N-diisopropiletilamina (0,18 mL, 1,05 mmol) em CH2Cl2 se- co (3,0mL) a -78°C. A mistura de reação foi aquecida à temperatura ambiente e agitada durante 1,5 h. Uma solução do composto S130 (0,30 g, 0,30 mmol) em 1,0 mL de CH2Cl2 seco foi adicionada e a mis- tura resultante foi agitada durante 10 min. Uma solução de ETT (0,72 mL, 0,25 M em acetonitrila, 0,18 mmol) foi adicionada à mistura de re- ação e a mistura resultante foi agitada durante 3 h. A mistura foi diluí- da com CH2Cl2 (20mL) e lavada com bicarbonato de sódio aquoso sa- turado (20 mL) e salmoura (20 mL). A camada orgânica foi secada so- bre sulfato de sódio anidroso, e o filtrado foi evaporado em vácuo para produzir um resíduo, que foi submetido à purificação em coluna de síli- ca gel flash em uma ISCO companheira usando acetato de eti- la/hexano com trietilamina 3 % como um sistema de cossolvente (Gra- diente de 0-30 %) para produzir 0,12 g de produto S131 (32 %) como uma espuma branca. ESI MS para C84H91N4O13P Calculado 1395,6, Observado 1395,7[M]+; 31P RMN (202MHz, CDCl3): δ 146,41. Composto dT4
1. DMT-dT, DIEA cloreto de fosfina S108 dT4
[00433] Síntese de FmocNH-PEG2-hidroxil-diisopropilamino-dT (5'- DMT) fosforamidita (dT4). Uma suspensão em agitação de 5'-DMT-
desoxitimidina (4,30 g, 7,89 mmol) e DIEA (1,51 mL, 8,68 mmol) em CH2Cl2 (40 mL) foi resfriada a -78°C sob argônio. Uma solução de bis(diisopropilamino)clorofosfina (2,32 g, 8,68 mmol) em CH2Cl2 (10 mL) foi adicionada gota a gota. A mistura foi removida do banho de resfriamento e agitada durante 1 h. FmocNH-PGE2-OH (S108, 2,93 g, 7,89 mmol) em CH2Cl2 (15 mL) foi adicionado à mistura de reação se- guido por uma solução de ETT (0,25 M em acetonitrila, 18,9 mL). Após agitação durante a noite, a mistura foi concentrada em vácuo, redis- solvida em EtOAc e lavada com NaHCO3 (aq.) e salmoura. A camada orgânica foi removida em vácuo para produzir uma espuma branca. Este material cru foi purificado por cromatografia em SiO2 para forne- cer a fosforamidita título (dT4, 4,1 g, rendimento de 50 %).
[00434] O protocolo sintético descrito acima foi usado para a sínte- se de outros precursores de fosforamidita de vários triésteres. Composto dU6
[00435] A uma solução de dU1 (3,3 g, 5,0 mmol), 1-metilimidazol (1,2 mL, 15,0 mmol) e iodo (1,9 g, 15,0 mmol) em THF (10 mL) sob Ar (g) à temperatura ambiente foi adicionada uma solução de cloreto de terc-butildimetilsilila (0,8 g, 5,5 mmol) em THF (5 mL) gota a gota com agitação. A reação foi agitada à temperatura ambiente durante 1 hora. TLC confirmou a conclusão da reação. O solvente foi removido em vá-
cuo, o produto cru foi dissolvido em acetato de etila e lavado com Na2S2O3 (conc). A fase orgânica seca sobre Na2SO4, filtrada e licor evaporado. O produto cru foi purificado por coluna de sílica gel flash usando uma ISCO companheira (hexanos/acetato de etila, 0-50 %) para produzir dU2 como um sólido em rendimento quantitativo. RMN consistente com o publicado. Nucleic Acids Research, 2011, vol. 39, No. 9, 3962-3971.
[00436] Uma solução de dU2 (3,9 g, 5,0 mmol) dissolvido em uma solução aquosa de ácido acético 80 % (40 mL) com triisopropilsilano (1,0 mL, 5,0 mmol) foi agitada à temperatura ambiente durante 1 hora. TLC confirmou a conclusão da reação. Remover o solvente em vácuo. O produto cru foi purificado por uma coluna de sílica gel flash usando uma ISCO companheira (hexanos/acetato de etila, 0-60 %) para pro- duzir 1 g (43 %) do composto desejado dU3 como um sólido. ESI MS para C15H25IN2O5Si calculado 468,4, observado [M+Na]+ 491,0.
[00437] A uma solução de dU3 (1,0 g, 2,2 mmol) em THF (20 mL) sob Ar (g) e resfriado a 0°C em um banho de água gelada foi adicio- nado hidreto de sódio (60% de dispersão, 0,2 g, 4,7 mmol). A reação foi agitada durante 30 minutos a 0°C. Iodometano (0,7 mL, 10,8 mmol) foi adicionado gota a gota e a reação foi agitada a 0°C durante 3 ho- ras. RP-HPLC/MS confirmou a conclusão da reação. A reação foi inter- rompida bruscamente com 20 mL de metanol a 0°C e aquecida à tem- peratura ambiente. NaHCO3 (sat.) aq. foi adicionado e a mistura foi extraída com CH2Cl2. A fase orgânica foi secada sobre Na2SO4, filtrada e o licor concentrado em vácuo. A purificação por cromatografia de coluna em sílica gel (hexanos/acetato de etila, 0-50 %) produziu dU4 sólido (0,6 g, 58% de rendimento). ESI MS para C16H27IN2O5Si calcu- lado 482,4, observado [M+H]+ 483,1.
[00438] Fluoreto de terc-butilamônio (THF 1 M, 3 mL, 3,0 mmol) foi adicionado gota a gota com agitação a uma solução resfriada (0°C) de dU4 (0,6 g, 1,3 mmol) dissolvido em THF (20 mL) sob Ar (g). A solu- ção resfriada foi agitada durante 30 minutos e depois aquecida à tem- peratura ambiente. Após 3,5 horas, RP-HPLC/MS confirmou a conclu- são da reação. O produto cru foi purificado por cromatografia de colu- na em sílica gel (diclorometano/metanol, 0-10%) para produzir dU5 sólido (0,4 g, rendimento de 92%). ESI MS para C10H13IN2O5 calculado 368,1, observado [M+H]+ 369,0.
[00439] A uma solução dU5 (0,4 g, 1,2 mmol) em diclorometano (5 mL) sob Ar (g) à temperatura ambiente foi adicionada uma solução de 2'-cianoetil-N,N,N’,N’-tetraisopropil fosforamidita (0,4 mL, 1,3 mmol) em diclorometano (5 mL) gota a gota com agitação. A reação foi agita- da por 30 minutos em temperatura ambiente. Etiltiotetrazol (solução 0,25 M em ACN, 2,9 mL, 0,7 mmol) foi, então, adicionado e a reação foi continuada durante a noite. TLC confirmou a conclusão da reação. O solvente foi removido em vácuo e a mistura crua foi diluída com 20 mL de diclorometano, lavada sequencialmente com uma solução satu- rada de NaHCO3 (10 mL) e salmoura (10 mL). A fase orgânica seca sobre Na2SO4, filtrada e licor evaporado. A mistura crua foi dissolvida em acetato de etila e purificada por coluna de sílica gel usando uma companheira Isco (hexanos/acetato de etila, 0-100 %) para produzir 0,3 g (49,9 %) do composto desejado dU6 como um sólido. ESI MS para C19H30N4O6P Calculado 568,3, Observado 567,3 [M-H]-; 31
P RMN (202 MHz, CDCl3, ppm): δ149,25. Composto dU9
[00440] O composto título foi preparado pela reação de dU3 sob as 31 condições de reação padrão mostradas abaixo. P-RMN (202 mHz, CDCl3, ppm): δ 149,42, 149,31; MS ESI- m/z encontrado 667,1 [M-H]. MS ESI+ m/z encontrado 669,2 [M+H], 691,3 [M+Na].
Preparação de Ligantes Ligados às Porções Auxiliares: Compostos PP2, PP3, e PP4 dioxano
[00441] Preparação de (5-Azidovaleril)-ɛ-N-Boc lisina (PP1). ɛ-N- Boc lisina (9,46 g, 38,4 mmol) e K2CO3 (2,67 g, 19,3 mmol) foram dis- solvidos em 1:1 de THF:H2O (60 mL). Pentafluorofenil-5-azidovalerato (10,8 g, 34,9 mmol) em THF (10 mL) foi adicionado e a reação foi agi- tada durante a noite à temperatura ambiente. O produto desejado foi observado por RP-HPLC-MS, 394,2 [M+Na]. A reação foi acidificada em pH 5 por titulação com HCl 1N (aq.), E o produto foi extraído com EtOAc (3 x 100 mL). A camada orgânica foi lavada sequencialmente com H2O (50 mL) e salmoura (50 mL). A camada orgânica foi secada sobre MgSO4 e concentrada em vácuo até um xarope espesso. O pro- duto cru foi purificado por cromatografia de coluna em sílica gel para se obter o produto desejado PP2 como agulhas brancas (8,1 g, 62 % de rendimento). ESI MS+ massa calculada C16H29N5O5: 371,4, encon- trado: 394,2 [M+Na]+.
[00442] Protocolo geral para peguilação de PP1: preparação de (5- Azidovaleril)-ɛ-N-(NH-Boc PEG24) lisina (PP4). PP1 (0,74 g, 2,0 mmol) foi tratado com HCl (2 mL, 4N em dioxano) durante 4 h. HPLC-MS mostrou desprotecção completa, 272,2 [M+H] +. A reação foi diluída com 1:1 de H2O:acetonitrila (10 mL), congelada e liofilizada durante a noite para fornecer PP2 como um sólido branco em rendimento quanti- tativo. O ácido NHBoc-PEG24 (1,1 g, 0,88 mmol) em DMF (3 mL) foi ativado com HATU (0,34 g, 0,88 mmol), HOBt (0,14 g, 0,88 mmol) e DIEA (0,7 mL, 4,0 mmol) e depois tratado com PP2 (0,24 g, 0,8 mmol) durante 2 horas. RP-HPLCMS mostrou a formação do PP4 desejado. O produto cru foi purificado por RP-HPLC para produzir PP4 como um sólido branco (0,55 g, 46 % de rendimento). ESI MS+ massa calculada C67H130N6O30: 1499,77, encontrado: 1499,9 [M+H]+, 1400,8 [M-Boc]+.
HCl 1M em dioxano HCl 1M em dioxano HCl 1M em dioxano
[00443] BisPegX-NH2 e TrisPegX-NH2 (onde X = vários compri- mentos de PEG) foram preparados a partir de materiais de partida dis- poníveis comercialmente usando procedimentos descritos em WO2015/188197.
[00444] Protocolo geral para peguilação de PP2, PP3 e PP4: Lisina PP1 (38 mg, 0,1 mmol) dissolvida em DMF (1 mL) foi tratada com HATU (37 mg, 0,1 mmol), N,N-diisopropiletilamina (49 mL, 0,3 mmol) e mPEG48-NH2 (200 mg, 0,09 mmol). RP-HPLC-MS mostrou adição completa de PEG48 em PP1. O produto cru foi purificado por RP- HPLC para proporcionar NHBoc PP7 como um sólido branco (97 mg,
rendimento de 42%). ESI MS+ massa calculada C113H224N6O52: 2499,03, encontrado: 833,7 [M+3H]3+, 625,6 [M+4H]4+. PP7 foi despro- tegido com HCl (2 mL, 4N em dioxano) durante 4 h. HPLC-MS mostrou desprotecção completa, conforme observado pelo desaparecimento do pico com uma massa do material de partida. A reação foi diluída com 1:1 de H2O:acetonitrila (10 mL), congelada e liofilizada durante a noite para fornecer quantitativamente um sólido branco PP8. ESI MS+ mas- sa calculada C108H216N6O50: 2398,88, encontrado: 1199,8 [M+2H]2+, 800,3 [M+3H]3+, 600,5 [M+4H]4+, 480,6 [M+5H]5+.
polinucleotídeo
[00445] Neste esquema, as condições são: A) 6-metitetrazina-OSu, HATU, base de Hunig, DMF; e B) DBCO-CpG, acetonitrila/H2O; onde 6-metil tetrazina-OSu é da seguinte fórmula:
, e DBCO-CpG é do following formula: polinucleotídeo . Protocolo geral para preparação de ligantes carregados com polinu- cleotídeos (PP28 e PP30).
[00446] Alça de conjugação de tetrazina de PP12 e PP16: PP12 (43 mg, 0,12 mmol) foi dissolvido em DMF (0,5 mL), tratado com HATU (4,6 mg, 0,12 mmol), DIEA (12,7 µL, 0,73 mmol), e, após 5 min, com 6- metil-tetrazina-OSu (19,9 mg, 0,61 mmol). A reação crua foi agitada durante 30 min à temperatura ambiente. RP-HPLCMS mostrou aco- plamento completo de carboxilato de 6-metil-tetrazina em PP12. O produto cru foi purificado por RP-HPLC e as frações reunidas foram liofilizadas para proporcionar PP27 como um sólido roxo (39 mg, 85 % de rendimento). ESI MS+ massa calculada C170H325N11O76: 3739,47, encontrado: 833,7 [M+3H]3+, 625,6 [M+4H]4. PP27 puro foi tratado em DBCO-CpG em acetonitrila:água (1:1) e incubado a 37 °C por 1-2 ho- ras e mais 1 hora à temperatura ambiente para produzir PP28. PP28 foi purificado por AEX preparativo (fosfato 20 mM e fosfato 20 mM- brometo de sódio 1M).
[00447] Rotina de um pote alternativa para ligantes carregados com CpG PP28 e PP30. PP12 (400 nmol) é tratado com DBCO-CpG (420 nmol) em acetonitrila:água (1:1) e incubada a 37 °C durante 1-2 horas e depois mais 1 hora à temperatura ambiente. Tetrazina-OSu (4000 nmol) em solução de matéria-prima de DMSO é adicionada à solução de PP12-DBCO-CpG cru e a solução roxa é reagida por 3 horas à temperatura ambiente por 1-2 horas para produzir PP28. O PP28 cru foi purificado por RP-HPLC preparativa (TEAA 50 mM em água e 10 % de acetonitrila:água) ou AEX preparativa (fosfato 20 mM e fosfato 20 mM-brometo de sódio 1M).
[00448] Preparação de Tetrazina-PEG24-OPFP (PP32). A uma so- lução de ácido amino-PEG24-carboxílico (1,0 g, 0,9 mmol) e diisopro- piletilamina (0,8 mL, 4,4 mmol) em DMF/água (1:1, 12 mL) sob Ar (g) foi adicionado metiltetrazinafenilacetil succinimidil éster (370 mg, 1,1 mmol) em DMF (3 mL) gota a gota com agitação. A reação foi agitada à temperatura ambiente durante 2 horas. RP-HPLC/MS indicou a for- mação do produto. O solvente foi removido em vácuo e o produto cru foi purificado por RP-HPLC (modificador de TFA) para fornecer PP31, 1,1 g (80 %). ESI MS para C62H111N5O27 calculado 1358,56, observado [M+H]+ 1358,8. A uma solução de PP31 (109 mg, 0,08 mmol) em di- clorometano (3 mL) sob Ar (g) foi adicionada piridina anidrosa (32 mg, 0,4 mmol) e trifluoroacetato de pentafluorofenila (67 mg, 0,24 mmol). A reação foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. O solvente foi removido em vácuo. O produto cru foi redissolvido em EtOAc e la- vado com NaHCO3 aq. (5 % em p/v) (3x) e salmoura (1x). A fase orgâ-
nica foi secada sobre Na2SO4, filtrada e concentrada em vácuo para produzir PP32 quantitativamente. Usado na próxima etapa sem purifi- cação adicional. ESI MS para C68H110F5N5O27 calculado 1524,61, ob- servado [M+2H]2+ 763,0.
[00449] Preparação de PP34. A uma solução de mPEG48-amina (2,15 g, 1,00 mmol) e diisopropiletilamina (0,87 mL, 5,00 mmol) em DMF/água (1:1, 10 mL) sob Ar (g) foi adicionado Nα-Cbz-N-Boc-L- Lisina succinimidil éster (570 mg, 1,2 mmol) em DMF (5 mL) gota a gota com agitação. A mistura de reação foi agitada à temperatura am- biente durante 2 horas. RP-HPLC/MS indicou a formação do produto, PP33. A mistura de reação foi concentrada em vácuo e purificada por cromatografia em sílica gel (CH2Cl2:MeOH 0-10 %). O PP33 recupera- do foi usado diretamente na próxima reação. ESI MS para C116H223N3O53 calculado 2508,0, observado [M+3H]3+ 836,7, [M+4H]4+ 627,9. Uma solução de PP33 (1,00 mmol) em MeOH foi lavada com nitrogênio (g), e Paládio sobre carvão ativado (10 % em peso, catalíti- co) foi adicionado. A solução foi alternadamente evacuada e purgada com hidrogênio (g) (3X). RP-HPLC/MS após 2 horas mostrou a forma- ção de PP34. A mistura heterogênea foi filtrada através de um leito de Celite e lavada com grandes quantidades de metanol. A remoção do solvente em vácuo, produziu PP34, (2,0 g, 84 % de rendimento, ao longo de 2 etapas). ESI MS para C108H217N3O51 calculado 2373,87, ob- servado [M+3H]3+ 792,0.
(dioxano 1M)
[00450] Preparação de PP37. A uma solução de PP32 (124 mg, 0,08 mmol) e diisopropiletilamina (31 mg, 0,24 mmol) em DMF/água (1:1, 10 mL) sob Ar (g) foi adicionado PP34 (230 mg, 0,1 mmol) em DMF/água (1:1, 10 mL) gota a gota com agitação. A reação foi agitada à temperatura ambiente durante 2 horas e RP-HPLC/MS indicou a formação do produto PP35. O solvente foi removido em vácuo e PP35 utilizado na etapa seguinte sem purificação adicional. ESI MS para C170H326N8O77 calculado 3714,4, observado [M+4H]4+ 929,5, [M+5H]5+ 743,8. PP35 cru (0,08 mmol) tratado com HCl (4 N em dioxano, 5 mL) sob Ar (g). A reação foi agitada à temperatura ambiente durante 2 ho- ras e RP-HPLC/MS indicou a remoção completa do grupo protetor Boc. O solvente foi removido em vácuo e a amina foi acilada com uma solução de bis-Peg3-PFP éster (230 mg, 0,4 mmol) em DMF (5 mL) e diisopropiletilamina (140 uL, 0,8 mmol). Após 2 horas, RP-HPLC/MS indicou a formação do produto PP37. O solvente foi removido em vá- cuo e o produto cru foi purificado por RP-HPLC (modificador de TFA) para fornecer PP37 como um sal de tetra-TFA, 31 mg em 8,7 % de rendimento. ESI MS para C181H333F5N8O81 calculado 4012.56, obser- vado [M+3H]3+ 1338,3, [M+4H]4+ 1004,0,[M+5H]5+ 803,4, [M+6H]6+ 669. Lista dos Ligantes que Contêm Porções Auxiliares:
, , Ligante Valência X Y Z Fórmula MS calc, MS encontrado (limite) (ESI+) PP6 mono 24 H N3-valeramida C60H120N6O26 1341,62 1341,7, 671,5 PP8 mono 48 H N3-valeramida C108H216N6O50 2398,88 1199,8, 800,3, 600,5, 480,6 PP10 mono 48 CO-PEG08-NH2 N3-valeramida C127H253N7O59 2822,38 1412,0, 941,7, 706,5, 565,4, 471,4 PP12 mono 48 CO-PEG24-NH2 N3-valeramida C159H317N7O75 3527,21 1176,5, 882,6, 706,3 PP14 bis 24 CO-PEG08-NH2 N3-valeramida C134H265N9O61 2978,56 1490,1, 993,7, 745,6, 596,7, 497,4 PP16 bis 24 CO-PEG24-NH2 N3-valeramida C166H329N9O77 3683,39 1228,6, 921,7, 737,6, 615,0 PP18 bis 48 CO-PEG08-NH2 N3-valeramida C230H457N9O109 5093,08 1247,2, 1019,6, 849,8, 728,6, 637,7 PP20 bis 48 CO-PEG24-NH2 N3-valeramida C262H521N9O125 5797,93 1450,3, 1160,4, 967,1, 829,1, 725,8 PP22 tris 24 H N3-valeramida C171H339N9O80 3801,52 1268,0, 951,2, 761,2 PP24 tris 24 CO-PEG08-NH2 N3-valeramida C190H376N10O89 4225,02 1409,3, 1057,0, 846,0, 705,2, 604,6 PP26 tris 24 CO-PEG24-NH2 N3-valeramida C222H440N10O105 4929,87 1233,3, 968,8 PP27 mono 48 CO-PEG24- N3-valeramida C170H325N11O76 3739,47 1247,2, 935,7, 748,8, Tetrazina 624,1, 535,3 PP28 mono 48 CO-PEG24- p313 + N3- 8893,7 8891, deconvoluted Tetrazina valeramida ESI- PP29 bis 24 CO-PEG24- N3-valeramida C177H337N13O78 3895,66 974,8, 780,0 Tetrazina PP30 bis 24 CO-PEG24- p313 + N3- 9049,9 9046, deconvoluted Tetrazina valeramida ESI- PP37 mono 48 PFP-PEG3 CO-PEG24- C181H333F5N8O81 4012,56 1338,3, 1004,0, Tetrazina 803,4, 669,6 PP38 bis 48 CO-PEG24- p313 + N3- 11163,2 11159, deconvoluted Tetrazina valeramida ESI- PP39 tris 24 CO-PEG24- p313 + N3- 10281,1 10292, deconvoluted Tetrazina valeramida ESI-
[00451] Na tabela acima, os grupos identificados como Y ou Z têm as seguintes estruturas: , , CO-PEG08-NH2 (y = 8) CO-PEG08-Tetrazina (y = 8)
CO-PEG24-NH2 (y = 24) CO-PEG24-Tetrazina (y = 24) , e . PFP-PEG3 N3-valeramida
[00452] Na tabela acima, o grupo Z identificado como “p313 + N3- valeramida” refere-se a um produto de uma reação de cicloadição en- tre p313 e um ligante possuindo N3-valeramida como Z.
[00453] Os monômeros de fosforamidita mostrados na Tabela 1 fo- ram sintetizados usando os procedimentos sintéticos padrão descritos neste documento e em WO 2015/188197.
[00454] Os monômeros de oxazafosfolidina bicíclicos usados na síntese de oligonucleotídeos de fosforotioato quirais foram preparados usando protocolo de literatura, conforme relatado por Wada, J. Am. Chem. Soc. 130:16031-16037, 2008. Tabela 1 Composto # Estrutura 31 P RMN (δ em ppm) e/ou ESI MS Rendimento ( %) dT1 ESI MS calculado 747,8, observado 746,9 [M-H] 31 P RMN (202 MHz, CDCl3): δ147,50, 147,00 dC1 - dA1 ESI MS calculado 860,97, observado 859,9 [M-H], 862,0 [M+H] 31 P RMN (202 MHz, CDCl3): δ147,47, 147,35
Composto # Estrutura 31 P RMN (δ em ppm) e/ou ESI MS Rendimento ( %) dG1 ESI MS calculado 842,96, observado 841,7 [M-H], 843,9 [M+H] 31 P RMN (202 MHz, CDCl3): δ147,05, 147,93 dT2 ESI MS calculado 743,8, observado 742,8 [M-H], 744,7 [M+H] 31 P RMN (202 MHz, CDCl3): δ148,26, 147,77 dC2 -
- dA2 dG2 -
dT3 ESI MS calculado 916,1, observado 915,6 [M-H] 31 P RMN (202 MHz, CDCl3): δ147,72, 147,21
Composto # Estrutura 31 P RMN (δ em ppm) e/ou ESI MS Rendimento ( %)
- dC3 dA3 -
dG3 -
dT4 ESI MS calculado 1045,2, observado 1046,3 [M+H] 31 P RMN (202 MHz, CDCl3): δ148,38, 148,27 dC4 ESI MS calculado 1088,2, observado 1089,0 [M+H] 31 P RMN (202 MHz, CDCl3): δ149,29, 148,66 dA4 ESI MS calculado 1158,3, observado 1157,5 [M-H], 1159,0 [M+H] 31 P RMN (202 MHz, CDCl3): δ148,38
Composto # Estrutura 31 P RMN (δ em ppm) e/ou ESI MS Rendimento ( %) dG4 ESI MS calculado 1140,3, observado 1139,1 [M-H], 1141,2 [M+H] 31 P RMN (202 MHz, CDCl3): δ147,76 dT5 ESI MS calculado 1011,2, observado 978,6 [M-H] 31 P RMN (202 MHz, CDCl3): δ147,51, 147,32
- dC5 dA5 -
dG5 -
- dT6
Composto # Estrutura 31 P RMN (δ em ppm) e/ou ESI MS Rendimento ( %) dC6 -
dA6 -
- dG6 dT7 P RMN (202 MHz, CDCl3): δ 31 42 147,05 (d, J 8,08 Hz), 146,58 (d, J 8,08 Hz) ESI MS calculado 992,45, observado 994,3 (M+H), 992,0 (M-H)
dT8 P RMN (202 MHz, CDCl3): δ 31 14 147,80 ESI MS calculado 881,99, observado 880,9 (M-H), 904,9 (M+Na)
31 dU7 (Rp) P RMN (202 MHz, CDCl3): 31 δ156,19 (s)
Composto # Estrutura P RMN (δ em ppm) e/ou ESI MS 31 Rendimento ( %)
31 dU8 (Sp) P RMN (202 MHz, CDCl3): 27 δ155,78 (s)
31 dC7 (Rp) P RMN (202 MHz, CDCl3): 21 δ156,75 (s)
31 dC8 (Sp) P RMN (202 MHz, CDCl3): 25 δ156,08 (s)
Espaçadores Abásicos Quirais– Compostos X7, X8, X9 e X10:
Síntese de X7 e X8:
Legenda das figuras: - imidazol - brometo de propargila - álcool homopropargílico - rt = temperatura ambiente
Síntese de X9 e X10: Legenda das figuras: - imidazol - brometo de propargila - álcool homopropargílico - rt = temperatura ambiente
[00455] A seguir estão outras fosforamiditas de nucleosídeos hidro- fílicos que podem ser preparadas usando métodos conhecidos na téc- nica e métodos aqui descritos: , , , fenila ou , em que R é OH, amino opcionalmente substituído ou –CO2R1 (R1 é H ou um contra-íon) e n é um número inteiro de 1 a 4;
, , fenila , ou , em que R é OH, OAc, OMe, amino opcionalmente substituído ou CO2R1 (R1 é H ou um contra-íon) e n é um número inteiro de 1 a 51.
[00456] A seguir estão outras fosforamiditas de nucleosídeos subs- tituídos que podem ser preparadas usando métodos conhecidos na técnica e métodos aqui descritos: , , fenila , ou , onde cada um dentre R e R1 é independentemente H ou C1-6 alquila opcionalmente substituída (por exemplo, Me, Et, i-Pr ou n-Bu).
[00457] As seguintes fosforamiditas são adquiridas de Glen Rese- arch (Sterling, VA) ou ChemGenes (Wilmington, MA) ou preparadas usando protocolos padrão aqui descritos: .
[00458] Estes intermediários podem ser usados na preparação de polinucleotídeos da invenção (por exemplo, polinucleotídeos conpos- suindo um nucleosídeo modificado no terminal 5'). Exemplos não limi- tantes de nucleosídeos modificados no terminal 5' são 5-halouridina, 5- alquiniluridina, 5-heteroariluridina e 5-halocitidina. 5 ’- Tamponamento: a) 5’-5’-Tamponamento:
Legenda das figuras: - X = OH, SH, ou um sal do mesmo - 5’-tamponamento - PG = Grupo N-protetor b) Tamponamento de 5’-Fosfato ou fosforotioato:
Legenda das figuras: - X = OH, SH, ou um sal do mesmo - 5’-tamponamento - Redução Química - OR = OU - Clivagem Intracelular
Síntese de Porções de Direcionamento com Base em Pequenas Molé- culas
[00459] Compostos exemplares úteis para a preparação de pe- quenas porções de direcionamento com base em moléculas são descritos em WO 2015/188197 (por exemplo, compostos M1-M30 descritos em WO 2015/188197). Síntese de Porções Auxiliares de Glucitol
[00460] Compostos exemplares úteis para a preparação de por- ções auxiliares com base em glucitol são descritos em WO 2015/188197 (por exemplo, compostos POH1-POH10 descritos em WO 2015/188197). Síntese de Polinucleotídeos Geral: Esquema Geral: Legenda das figuras: - Base - Remoçaõ de DMT - Acoplamento de 2’-Desóxi fosforamidita - Clivagem de resina - Purificação Detalhes Experimentais:
[00461] A síntese automatizada de polinucleotídeos (escala de 1 µmol) foi realizada no MerMade 6 ou 12 com os seguintes reagentes e solventes:
Oxidante - I2 0,02M em THF/piridina/H2O (oxidação de 60 s por ciclo), Reagente de Sulfurização II - derivado de ditiazol/piridina/acetonitrila (0,05 M, em 6:4 piridina:acetonitrila) (60 s por ciclo) Desbloqueio - ácido tricloroacético 3 % (2 x 40 s de desbloqueio por ciclo), Mistua de Tampão A - THF/2,6-lutidina/Ac2O (60 s de tamponamento por ciclo), e Mistura B - metil imidazol 16 % em THF (60 s de tamponamento por ciclo)
[00462] As exceções às condições de síntese de polinucleotídeo padrão foram as seguintes: - CPG suporta com um ligante não nucleosídico chamado Uny-ligante foi usado. - Todos 2'-desoxirribose-fosforamiditas foram ressuspensos a 100 mM em acetonitrila anidrosa 100% antes da síntese, exceto alguns dos 2'- desóxi-fosforamiditas modificadas foram dissolvidos a 100 mM na mis- tura de THF/acetonitrila (1:4) dependendo da solubilidade do material de partida. - A ativação da fosforamidita foi realizada com um excesso molar de 2,5 vezes de 5-benziltio-1H-tetrazol (BTT). 2'-desoxirribose- fosforamiditas ativadas foram acopladas para acoplamento de 2x 1 minuto por inserção e as fosforamiditas modificadas foram acopladas para acoplamento de 2x 3 minutos por inserção. - Súlfurização da cadeia principal foi realizada com Reagente de Sulfu- rização II 0,05 M em piridina/acetonitrila (6:4) por 1 min. Protocolo de Desproteção & Purificação de Polinucleotídeos:
[00463] Após a síntese automatizada de polinucleotídeos, suporte sólido e grupos de proteção de base (tais como A-Bz, C-Ac, G-iBu, etc.) e ésteres metílicos de fosfotriésteres foram clivados e desprotegi- dos em 1 mL de AMA (relação 1:1 de amônia aquosa 36% e metilami-
na 40% em metanol) por 2 h ou mais à temperatura ambiente seguida por evaporação centrífuga.
[00464] Péletes de polinucleotídeo cru foram ressuspensos em 100 μL de acetonitrila 50%, brevemente aquecidas a 65 oC e submetidas a vórtice completamente.
[00465] Para purificação de polinucleotídeo, 100 μL de polinucleotí- deos crus foram injetados em RP-HPLC com os seguintes tam- pões/gradiente: - Tampão A = TEAA 50 mM em Água; - Tampão B = Acetonitrila 90 %; e - Taxa de Fluxo = 1 mL/min; - Gradiente:  0 - 2 min (Tampão A 100 %/Tampão B 0 %),  2 - 42 min (0 % a 60 % de Tampão B), e  42 - 55 min (60 % a 100 % de Tampão B). Protocolo de conjugação e purificação de DBCO:
[00466] O DBCO NHS éster foi conjugado ao 2’-desóxi DMT- polinucleotídeo cru, conforme descrito aqui. O pélete de polinucleotí- deo cru foi suspenso em 45 μL de DMSO, brevemente aquecido a 65°C e completamente agitado em vórtice. 5 μL de DIPEA foram adici- onados seguidos por DBCO-NHS éster (30 eq), que foi pré-dissolvido em DMSO (1M). A reação foi deixada repousar durante 10 minutos ou até a formação do produto ser confirmada por MALDI. Um total de 80 μL de amostras de polinucleotídeo cru foi injetado em RP-HPLC com os seguintes tampões/gradiente: - Tampão A = TEAA 50 mM em água - Tampão B = Acetonitrila 90 % - Taxa de Fluxo = 1 mL/min - Gradiente:  0 - 2 min (Tampão A 90 %/Tampão B 10 %)
 2 - 42 min (Tampão B 0 % a 60 %)  42 - 55 min (Tampão B 60 % a 100 %).
[00467] Entre os picos dominantes de RP-HPLC, frações de 0,5 mL foram coletadas e analisadas por espectrometria de massa MALDI- TOF para confirmar a presença da massa desejada. As frações purifi- cadas selecionadas em massa foram congeladas e liofilizadas. Uma vez secas, as frações foram ressuspensas, combinadas com as fra- ções correspondentes, congeladas e liofilizadas.
[00468] Clivagem de DMT: péletes liofilizados foram suspensos em 20 μL de acetonitrila 50 % e adicionados 80 μL de ácido acético, as amostras foram mantidas em temperatura ambiente por 1 h, congela- das e liofilizadas. As amostras secas foram redissolvidas em acetonitri- la 20 % e dessalinizadas através de colunas NAP 10 (SefadexTM-G25 DNA Grade). As frações recolhidas, puras foram congeladas e liofiliza- das para o produto final. Esquemas Conjugação Gerais Usando Espaçadores Abásicos: Reação Click - Esquema Geral: , onde: cada q é 0 ou 1; cada m é um número inteiro de 0 a 5; Z é O ou S; RO é uma ligação a um nucleosídeo em um polinucleotídeo;
R é uma ligação a H, um nucleosídeo em um polinucleotí- deo, a um suporte sólido ou a um grupo de tamponamento (por exem- plo, -(CH2)3-OH); cada R’ é independentemente H, -Q1-QA1, um grupo biorre- versível ou um grupo não biorreversível; cada R” é independentemente H, –Q1–QA–Q2–T, um grupo biorreversível ou um grupo não biorreversível; cada RA é independentemente H ou –ORC, onde RC é –Q1– QA1, um grupo biorreversível, um grupo não biorreversível ou uma liga- ção a um suporte sólido; cada RB é independentemente H ou –ORD, onde RD é –Q1– QA–Q2–T, um grupo biorreversível ou um grupo não biorreversível; onde: cada Q1 é independentemente um grupo divalente, trivalen- te, tetravalente ou pentavalente, no qual uma valência está ligada a QA ou QA1; uma segunda valência é aberta, e cada uma das valências res- tantes, quando presente, é ligada de forma independente a uma por- ção auxiliar; cada Q2 é independentemente um grupo divalente, trivalen- te, tetravalente ou pentavalente, no qual uma valência está ligada a QA; uma segunda valência está ligada a T, e cada uma das valências restantes, quando presente, está independentemente ligada a uma porção auxiliar; QA é 1,2,3-triazol-1,4-diila, C6-16 triazolo-heterociclileno op-
cionalmente substituído (por exemplo, ou ) C8-16 triazolocicloalquenileno opcionalmente substituído (por exemplo,
), ou um grupo di-hidropiridazina (por exemplo, trans- ou trans- ); QA1 é C2-12 alquinila opcionalmente substituída, C6-16 hete- rociclila opcionalmente substituída conpossuindo uma ligação tripla carbono-carbono endocíclica (por exemplo, ), C8-16 cicloalquinila opcionalmente substituída (por exemplo, ), ou C4-8 ci- cloalquenila deformada opcionalmente substituída (por exemplo, trans- ciclo-octenila); e T é uma porção de direcionamento, desde que os materiais iniciais contenham pelo menos um –Q1–QA1 e os produtos contenham –Q1–QA–Q2–T; e desde que os materiais e produtos de partida contenham 0 ou 1 liga- ção a um suporte sólido. Métodos de conjugação Reação Click catalisada por Cu Preparação do complexo cobre-THPTA
[00469] Uma solução aquosa 5 mM de penta-hidrato de sulfato de cobre (CuSO4-5H2O) e uma solução aquosa 10 mM de tris(3- hidroxipropiltriazolilmetil)amina (THPTA) foram misturadas 1:1 (v/v) (relação molar de 1:2) e deixado em repouso à temperatura ambiente por 1 hora. Este complexo pode ser usado para catalisar a cicloadição de Huisgen, por exemplo, como mostrado nos esquemas gerais de conjugação abaixo. Procedimento geral (escala de 100 nM):
[00470] A uma solução de 710 µL de água e 100 µL de terc-butanol (10% do volume final) em um tubo Eppendorf de 1,7 mL foram adicio- nados 60 µL do complexo cobre-THPTA seguido por 50 µL de uma solução 2mM do oligo, 60 µL de uma solução aquosa de ascorbato de sódio 20 mM e 20 µL de uma solução 10 mM de porção de direciona- mento-azida. Após mistura completa, a solução foi deixada repousar à temperatura ambiente durante 1 hora. A conclusão da reação foi con- firmada por análise de gel. A mistura de reação é adicionada a um frasco com tampa de rosca conpossuindo excesso molar de 5-10 ve- zes de SiliaMetS® TAAcONa (sal sódico de EDTA ligado à resina). A mistura é agitada durante 1 hora. Esta mistura é, então, eluída através de uma coluna ilustra™Nap™-10 Sefadex™. A solução resultante é, então, congelada e liofilizada durante a noite. Conjugação através da ligação amida:
[00471] A conjugação por meio de amidação pode ser realizada sob as condições de reação de amidação conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Aaronson et al., Bioconjugate Chem. 22:1723-1728, 2011.
, onde: cada q é 0 ou 1; cada m é um número inteiro de 0 a 5;
Z é O ou S; RO é uma ligação a um nucleosídeo em um polinucleotídeo; R é uma ligação a H, um nucleosídeo em um polinucleotí- deo, ao suporte sólido, ou a um grupo de tamponamento (por exemplo, -(CH2)3-OH); cada R’ é independentemente H, –Q1–QA1, um grupo bior- reversível, ou um grupo não biorreversível; cada R” é independentemente H, –Q1–QA–Q1–T, um grupo biorreversível, ou um grupo não biorreversível; cada RA é independentemente H ou –ORC, onde RC é –Q1– QA1, um grupo biorreversível, ou um grupo não biorreversível; cada RB é independentemente H ou –ORD, onde RD é –Q1– QA–Q2–T, um grupo biorreversível, ou um grupo não biorreversível; onde: cada Q1 é independentemente um grupo divalente, trivalen- te, tetravalente ou pentavalente, em que uma valência está ligada a Q A ou QA1, a segunda valência é aberta e cada uma das valências restan- tes, quando presente, é independentemente ligada a uma porção auxi- liar; cada Q2 é independentemente um grupo divalente, trivalen- te, tetravalente ou pentavalente, em que uma valência está ligada a QA, a segunda valência está ligada a T e cada uma das valências res- tantes, quando presentes, é independentemente ligada a uma porção auxiliar; QA é C2-12 heteroalquileno opcionalmente substituído con- possuindo –C(O)–N(H)– ou –N(H)–C(O)–; QA1 é –NHRN1 ou –COOR12, onde RN1 é H, grupo protetor de N, ou C1-6 alquila opcionalmente substituída, e R12 é H opcional- mente substituído, C1-6 alquila, ou grupo protetor de O; e T é uma porção de direcionamento,
desde que os materiais de partida contenham pelo menos um –Q1– QA1, e os produtos contenham–Q1–QA–Q2–T.
Conjugação de fase de solução:
, onde: m é um número inteiro de 0 a 5; Z é O ou S; RO é uma ligação a um nucleosídeo em um polinucleotídeo; R é uma ligação a H, um nucleosídeo em um polinucleotí- deo, ou a um grupo de tamponamento; cada R’ é independentemente H, –Q1–NH2, um grupo bior- reversível, ou um grupo não biorreversível; cada R” é independentemente H, –Q1–NH–CO–Q2–T, um grupo biorreversível, ou um grupo não biorreversível; cada RA é independentemente H ou –ORC, onde RC é –Q1– NH2, um grupo biorreversível, ou um grupo não biorreversível; cada RB é independentemente H ou –ORD, onde RD é –Q1– NH–CO–Q2–T, um grupo biorreversível ou um grupo não biorreversí- vel; onde: cada Q1 é independentemente um grupo divalente, trivalen- te, tetravalente ou pentavalente, em que uma valência está ligada a – NH–CO– ou –NH2, a segunda valência é aberta e cada uma das va- lências restantes, quando presentes, é independentemente ligada a uma porção auxiliar; cada Q2 é independentemente um grupo divalente, trivalen- te, tetravalente ou pentavalente, no qual uma valência é ligada a –NH– CO–, a segunda valência é uma ligação a T, e cada uma das valências restantes, quando presentes, é ligada independentemente a uma por- ção auxiliar; e T é uma porção de direcionamento, desde que o material inicial contenha –Q1–NH2 e o produto contenha – Q1–NH–CO–Q2–T.
Conjugação em Suporte:
Legenda das figuras: - Piperidina - Suporte - Clivagem onde: Z é O ou S; RO é uma ligação a um nucleosídeo em um polinucleotídeo; cada Q2 é independentemente um grupo divalente, trivalen- te, tetravalente ou pentavalente, no qual uma valência é ligada a –NH– CO–, a segunda valência é uma ligação a T, e cada uma das valências restantes, quando presentes, é ligada independentemente a uma por- ção auxiliar; e T é uma porção de direcionamento.
Legenda das figuras: - Piperidina - Suporte - Clivagem onde: n é um número inteiro de 1 a 8; A é O ou –CH2–; Z é O ou S; RO é uma ligação a um nucleosídeo em um polinucleotídeo; cada Q2 é independentemente um grupo divalente, trivalen- te, tetravalente ou pentavalente; em que uma valência é ligada à azida ou triazol, uma segunda valência é ligada a T, e cada uma das valên- cias restantes, quando presentes, é independentemente ligada a uma porção auxiliar; e T é uma porção de direcionamento.
Legenda das figuras: - Piperidina - Suporte - Clivagem onde: n é um número inteiro de 1 a 8; A é O ou –CH2–; Z é O ou S; RO é uma ligação a um nucleosídeo em um polinucleotídeo; cada Q2 é independentemente um grupo divalente, trivalen- te, tetravalente ou pentavalente; em que uma valência é ligada à azida ou triazol, uma segunda valência é ligada a T, e cada uma das valên- cias restantes, quando presentes, é independentemente ligada a uma porção auxiliar; e
T é uma porção de direcionamento.
Legenda das figuras: - piperidina - Suporte - Clivagem onde: n é um número inteiro de 1 a 8; A é O ou –CH2–; Z é O ou S; RO é uma ligação a um nucleosídeo em um polinucleotídeo; cada Q2 é independentemente um grupo divalente, trivalen- te, tetravalente ou pentavalente; em que uma valência é ligada à azida ou triazol, uma segunda valência é ligada a T, e cada uma das valên- cias restantes, quando presentes, está independentemente ligada a uma porção auxiliar; e cada T é independentemente uma porção de direcionamen- to.
Exemplo Representativo de Desproteção de Fmoc de um Fosfotri- éster:
[00472] Um polinucleotídeo incluindo um fosfotriéster com amina protegida por Fmoc foi submetido a condições de desprotecção re- sultando em desproteção de Fmoc sem conversão observável do fosfotriéster em um fosfodiéster. TCCATGACGTTCCTGACGTT (p68; veja Tabela 2; SEQ ID NO:68) Conjugação de DBCO-NHS para p68 - Exemplo representativo:
[00473] A conjugação de DBCO-NHS ao grupo amino no fosfotriés- ter foi concluída em 10 min à temperatura ambiente, conforme eviden- ciado por análise de espectrometria de massa.
Legenda das figuras: - em DMSO - Relação de ~3:1 de Ligante/Polinucleotídeo - 10 min a temperatura ambiente
[00474] A purificação por RP-HPLC de p68 (veja Tabela 2) conpos- suindo um grupo de conjugação DBCO foi realizada usando as seguin- tes condições: - Tampão A = TEAA 50 mM em Água; - Tampão B = Acetonitrila 90 %; e - Taxa de Fluxo = 1 mL/min; - Gradiente:
 0 - 2 min (Tampão A 100 %/Tampão B 0 %),  2 - 22 min (0 % a 100 % Tampão B), e  22 - 25 min (Tampão B 100 %).
[00475] Um procedimento similar pode ser usado para preparar um polinucleotídeo usando, por exemplo, fosforamiditas de nucleosídeo modificado em 2’, como aqueles descritos neste documento. Tal pro- cedimento é fornecido no Pedido de Patente Internacional PCT/US2015/034749; a descrição da síntese de oligonucleotídeo do dissulfeto fosfotriéster em PCT/US2015/034749 é aqui incorporada por referência.
[00476] O procedimento geral aqui descrito foi seguido para prepa- rar os polinucleotídeos imunomoduladores listados na Tabela 2.
Tabela 2 Composto # Sequência (5’ a 3') A B C D E F G H I J p1 tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt 1 120 110 175 50 >1000 p2 NH2-C6-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt 2 p3 NH2-C6-S-S-C6-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt 3 p4 DBCO-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt 4 >1000 >1000 p5 DBCO-C6-S-S-C6-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt 5 p6 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 6 >1000 >1000 >1000 DBCO-C6-S-S-C6- 7 p7
TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT p8 tgctgcttttgtgcttttgtgctt 8 >1000 >1000 >1000 p9 DBCO-C6-S-S-C6-tgctgcttttgtgcttttgtgctt 9 p10 tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt 10 p11 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 11 p12 DBCO-C6-S-S-C6-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt 12 DBCO-C6-S-S-C6- 13 p13
TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT p14 DBCO-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt 14 p15 DBCO-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 15 265/289 p16 DBCO-tccatgacgttcctgacgtt 16 p17 DBCO-TCCATGACGTTCCTGACGTT 17 p18 tccatgacgttcctgacgtt 18 1000 >1000 40 22,6 24,4 26 p19 DBCO-tccatgacgttcctgacgtt 19 >1000 >1000 p20 TCCATGACGTTCCTGACGTT 20 >1000 >1000 >1000 p21 DBCO-TCCATGACGTTCCTGACGTT 21 p22 tccatgagcttcctgagctt 22 >1000 >1000 p23 DBCO-tccatgagcttcctgagctt 23 p24 dtcgtcgttttgtcgttttgtcgtt 24 500 >1000 p25 tcgtcgttdttgtcgttttgtcgtt 25 >1000 800 p26 tcgtcgttttgdtcgttttgtcgtt 26 >1000 >1000 p27 tcgtcgttttgtcgttdttgtcgtt 27 500 800 p28 tcgtcgttttgtcgttttgtcgtdt 28 300 800 p29 tcgcgacgttcgcccgacgttcggta 29 300 >1000 >1000 92,8 58 p30 DBCO-tcgcgacgttcgcccgacgttcggta 30 183,7 28 p31 tccatgacgttcctgatgct 31 1000 >1000 40 29,6 27 p32 DBCO-tccatgacgttcctgatgct 32 >1000 >1000 p33 tcgacgttcgtcgttcgtcgttc 33 450 103,2 275 p34 DBCO-tcgacgttcgtcgttcgtcgttc 34 p35 tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt 35 p36 DBCO-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt 36 p37 tccatgacgttcctgacgtt 37 164,3 180 28,3 p38 DBCO-tccatgacgttcctgacgtt 38 p39 tccatgacgttcctgacgtt-C3 39 122,2 130,8 p40 TCCATGACGTTCCTGACGTT 40 >1000 p41 TCCATGACGTTCCTGACGTT-C3 41 >1000 p42 tccatgacgttcctgacgtt 42 22,6 25,6 p43 tccatgacgttcctgacgtt-C3 43 19,2 p44 TCCATGACGTTCCTGACGTT 44 >1000 p45 TCCATGACGTTCCTGACGTT-C3 45 p46 tccatgacgttcctgacgtt 46 876 p47 tccatgacgttcctgacgtt 47 615 p48 tccatgacgttcctgacgtt 48 197,2 p49 tccatgacgttcctgacgtt 49 75,2 p50 tccatgacgttcctgacgtt 50 71,3 p51 tccatgacgttcctgacgtt 51 9,3 p52 tccatgacgttcctgacgtt 52 29,1 p53 GGgggacgatcgtcGGGGGG 53 p54 tcgtcgtcgttcgaacgacgttgat 54 816 p55 tcgtcgttttcggcgcgcgccg 55 31,4 p56 tcgcgaacgttcgccgcgttcgaacgcgg 56 45,5 p57 tcgtcgacgatcggcgcgcgccg 57 p58 tccatgacgttcctgacgtt 58 p59 tccatgacgttcctgacgtt 59 p60 tccatgacgttcctgacgtt 60 p61 tccatgacgttcctgacgtt 61
266/289 p62 tccatgacgttcctgacgtt 62 p63 tccatgacgttcctgacgtt 63 p64 tccatgacgttcctgacgtt 64 p65 TCCATGACGTTCCTGACGTT 65 p66 TCCATGACGTTCCTGACGTT 66 p67 TCCATGACGTTCCTGACGTT 67 p68 TCCATGACGTTCCTGACGTT 68 p69 TCCATGACGTTCCTGACGTT 69 p70 TCCATGACGTTCCTGACGTT 70 p71 TCCATGACGTTCCTGACGTT 71 p72 tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt 72 p73 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 73 p74 tccatgacgttcctgatgct 74 p75 TCCATGACGTTCCTGATGCT 75 p76 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 76 p77 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 77 p78 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 78 p79 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 79 p80 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 80 p81 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 81 p82 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 82 p83 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 83 p84 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 84 p85 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 85 p86 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 86 p87 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 87 p88 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 88 p89 tccatGACGTTCCTGACGTT 89 >1000 p90 tccatgacgtTCCTGACGTT 90 1000 p91 tccatgacgttcctgACGTT 91 49 p92 tccatGACGTTCCTGACGTT 92 >1000 p93 tccatgacgtTCCTGACGTT 93 >1000 p94 tccatgacgttcctgACGTT 94 145 p95 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 95 p96 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 96 p97 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 97 p98 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 98 p99 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 99 p100 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 100 p101 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 101 p102 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 102 p103 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 103 p104 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 104 p105 TCCATGACGTTCCTGACGTT 105 p106 TCCATGACGTTCCTGACGTT 106 p107 TCCATGACGTTCCTGACGTT 107 p108 TCCATGACGTTCCTGACGTT 108 p109 TCCATGACGTTCCTGACGTT 109 p110 TCCATGACGTTCCTGACGTT 110
267/289 p111 TCCATGACGTTCCTGACGTT 111 p112 TCCATGACGTTCCTGACGTT 112 p113 TCCATGACGTTCCTGACGTT 113 p114 TCCATGACGTTCCTGACGTT 114 p115 TCCATGACGTTCCTGACGTT 115 p116 TCCATGACGTTCCTGACGTT 116 p117 TCCATGACGTTCCTGACGTT 117 p118 TCCATGACGTTCCTGACGTT 118 p119 TCCATGACGTTCCTGACGTT 119 p120 TCCATGACGTTCCTGACGTT 120 p121 TCCATGACGTTCCTGACGTT 121 p122 TCCATGACGTTCCTGACGTT 122 p123 IR700-tccatgacgttcctgacgtt 123 p124 IR700-TCCATGACGTTCCTGACGTT 124 p125 tcgtcgtttcgtcgttttgtcgtt 125 p126 DBCO-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 126 p127 DBCO-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 127 p128 TGCTGCTTTTGTGCTTTTGTGCTT 128 p129 tcattgGAAAACGTTCTTCGGGGCGTTctt 129 p130 tcattgGAAAAGCTTCTTGCGGGGCTTctt 130 p131 TCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGTTCTT 131 p132 AAGAACGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGA 132 p133 TCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGTTCTT 133 p134 AAGAACGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGA 134 p135 TCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGTTCTT 135 p136 AAGAACGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGA 136 p137 TCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGTTCTT 137 p138 AAGAACGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGA 138 p139 tccatGACGTTCCTGAcgtt 139 p140 TCCATGACGTTCCTGAcgtt 140 p141 tccatGACGTTCCTGACGtt 141 p142 tccatGACGTTCCTGACGTT 142 p143 tccatGACGTTCCTGACGTT 143 p144 AACGACAAAACGACAAAACGACGA 144 p145 AACGACAAAACGACAAAACGACGA 145 p146 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGtT 146 p147 TCGTCGTTTTGTCGTTTTgtcgtT 147 p148 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGtT 148 p149 TCGTCGTTTTGTCGTTTTgtcgtT 149 p150 tcgtcGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 150 p151 tcgtcgttttgtcgttttgtcgtT 151 p152 tcgtcGTTTTGTCGTTTTGTCGtT 152 p153 tcgtcGTTTTGTCGTTTTGTCGtt 153 p154 tcgtcGTTTTGTCGTTTTGTCGTt 154 p155 TTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 155 p156 TTTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 156
268/289 p157 GTTTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 157 p158 GTTTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 158 p159 GTTTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 159 p160 GTTTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 160 p161 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-C3 161 p162 TCGTCGTTTTGTCGTTTT 162 p163 UCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGtt-C3 163 p164 C3-UCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-C3 164 p165 TCGUCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-C3 165 p166 C3-TCGUCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-C3 166 p167 UCGUCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-C3 167 p168 C3-UCGUCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-C3 168 p169 UCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-C3 169 p170 C3-UCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-C3 170 p171 TCGTCGTTTTGTCGTTTT 171 p172 TCGTCGTTTTGTCGTT 172 p173 TCGTCGTTTTGTCG 173 p174 TCGTCGTTTTGT 174 p175 UCGTCGTTTTGTCGTTTT 175 p176 UTCGTCGTTTTGTCGTT 176 p177 UCGTCGTTTTGTCG 177 p178 UCGTCGTTTTGT 178 p179 UCGUCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-C3 179 p180 UCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-C3 180 p181 UCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-C3 181 p182 UCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-C3 182 p183 UCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-C3 183 p184 TCCATGACGTTCCTGATGCT-C3 184 p185 tccatgacgttcctgatgct-C3 185 p186 tccatgacgttcctgatgct-C3 186 p187 UCGTCGTTTGTCGTT-C3 187 p188 UCGTCGTTGTCGTT-C3 188 p189 UCGTCGTGTCGTT-C3 189 p190 UCGTCGTTCGTT-C3 190 p191 UCGTCGTCGTT-C3 191 p192 UGCTGCTTTTGTGCTTTTGTGCTT 192 p193 TCCATGACGTTCCTGACGTT-C3 193 p194 tccatgacgttcctgacgtt-C3 194 p195 TCCATGACGTTCCTGACGTT-C3 195 p196 tccatgacgttcctgacgtt-C3 196 p197 TAACGACAAAACGACAAAACGACGA 197 p198 AACGACAAAACGACAAAACGACGAT-C3 198 p199 UCGTCGttttgtCGTT-C3 199 p200 UCGTCGttttgtCGTT-C3 200 p201 UCGTCGttTTGTCGTT-C3 201 p202 UCGTCGTTttGTCGTT-C3 202 p203 UCGTCGTTTTgtCGTT-C3 203 p204 UCGTCGTTTTGTCGTT-C3 204 p205 UCGTCGTTTTGTCGTT-C3 205 UCGTCGTTTTGTCGTT-C3
269/289 p206 206 p207 UCGTCGTTTTGTCGTT-C3 207 p208 UCGTCGTTTTGTCGTT-C3 208 p209 UCGTCGTT-C3 209 p210 UCGTCGTT-C3 210 p211 UCGTTT-C3 211 p212 UCGTTT-C3 212 p213 UCGTCGTGTCGTT-C3 213 p214 UCGTCGTGTTTTT-C3 214 p215 UCGTTTTGTCGTT-C3 215 p216 UCGTTTGTCGTT-C3 216 p217 UCGTTGTCGTT-C3 217 p218 UCGTGTCGTT-C3 218 p219 UGCTGCTTTTGTGCTT-C3 219 p220 UCGTCGTTTTGTCGTT-C3 220 p221 UCGTCGTTTTGTCGTT-C3 221 p222 GGGACGATCGTCT 222 p223 ggGACGATCGTCTgg 223 p224 ggGACGATCGTCTgg 224 p225 UCGTCGTGTCGTT-C3 225 p226 UCGTCGTGTCGTT-C3 226 p227 UCGTCGTGTCGTT-C3 227 p228 UCGTCGTGTCGTT-C3 228 p229 UCGTCGTGTCGTT-C3 229 p230 UCGTCGTGTCGTT-C3 230 p231 UCGTCgtgtCGTT-C3 231 p232 tcgtcgttttgtcgttttgtcgtT-C3 232 p233 ucgtcgttttgtcgttttgtcgtT-C3 233 p235 tcgtcgttttgtcgtT-C3 235 p236 ucgtcgttttgtcgtT-C3 236 p237 tcgtcgtgtcgtT-C3 237 p238 ucgtcgtgtcgtT-C3 238 p239 UCgtCgtgtCgTT-C3 239 p240 UCgtCgtgtCgtt-C3 240 p241 UCgtcgtgtcgtt-C3 241 p242 Ucgtcgtgtcgtt-C3 242 p243 ucgtcgtgtcgtt-C3 243 p244 UCgtcgtgtcgtt-C3 244 p245 Ucgtcgtgtcgtt-C3 245 p246 ucgtcgtgtcgtt-C3 246 p247 UCgtcgttttgtcgttttgtcgtt-C3 247 p248 Ucgtcgttttgtcgttttgtcgtt-C3 248 p249 ucgtcgttttgtcgttttgtcgtt-C3 249 p250 UCGTCgtgtCGTT-C3 250 p251 UCGTCgtgtCgtt-C3 251 p252 UCgTCgtgtCgtt-C3 252 p253 UCG’TCgtgtCGTT-C3 253 p254 UCGTCgtgtCG’TT-C3 254
270/289 p255 UCGTCgtgtCGT’T-C3 255 p256 UCGTCgtgtCGTT’-C3 256 p257 UCGTCgtgtCGT’T’-C3 257 p258 UCGTCgtgtCG’T’T’-C3 258 p259 UCGT’CgtgtCGTT-C3 259 p260 UCGTCgtgtCGTT’-C3 260 p261 UCGT’CgtgtCGTT’-C3 261 p262 Ucgucgtgtcgtt-C3 262 p263 Ucgtcgtgucgtt-C3 263 p264 TAACGACACGACGA 264 p265 AACGACACGACGAT 265 p266 ucgtcgtgucgtt-C3 266 p267 cgtcgtgtcgtt-C3 267 p268 cgtcgtgucgtt-C3 268 p269 Tcgtcgtgtcgtt-C3 269 p270 tcgtcgtgtcgtt-C3 270 p271 Ucgtcgtgtcgtt-C3 271 p272 ucgtcgtgtcgtt-C3 272 p273 ugctgctgtgctt-C3 273 p274 ucgagctgtcgtt-C3 274 p275 ucgtcgtgacgtt-C3 275 p276 ucgacgtgacgtt-C3 276 p277 acgacgtgacgtt-C3 277 p278 acgacgtgacgtt-C3 278 p279 ucngtcgtgtcgtt-C3 279 p280 ucgtcngtgtcgtt-C3 280 p281 ucgtcgtgtcngtt-C3 281 p282 ucngtcngtgtcngtt-C3 282 p283 acngacngtgacngtt-C3 283 p284 acngacngtgacngtt-C3 284 p285 ucgtcgtgtcgtT-OH 285 p286 ucgtcgtgtcgtt-C3 286 p287 ucgtcgtgtcgtT 287 p288 ucgtcgtgtcgtt-C3 288 p289 ucgtcgtgtcgtT 289 p290 tcgtcgtgtcgtt-C3 290 p291 tcgtcgtgtcgtT 291 p292 ucgtcgtgacgtt-C3 292 p293 ucgacgtgacgtt-C3 293 p294 tccatgucgttccttgatt-C3 294 p295 tccatgucgttccttt-C3 295 p296 tccatgucgttctt-C3 296 p297 tccatgucgtt-C3 297
271/289 p298 tucgtcgtgtcgtt-C3 298 p299 uucgtcgtgtcgtt-C3 299 p300 uucgtcgtgtcgtt-C3 300 p301 tcgucgtgtcgtt-C3 301 p302 tcgUcgtgtcgtt-C3 302 p303 tcgUcgtgtcgtt-C3 303 p304 ucgtcgtgacgtt-C3 304 p305 ucgacgtgacgtt-C3 305 p306 C3-PO-ucgtcgtgtcgtt-C3 306 p307 fucgtcgtgtcgtt-C3 307 p308 bucgtcgtgtcgtt-C3 308 p309 C3-PS-ucgtcgtgtcgtt-C3 309 p310 ucgtcgtgtcgtt-C3 310 p311 ucgtcgtgtcgtt-C3 311 p312 tcgucgtgtcgtt-C3 312 p313 tucgtcgtgacgtt-C3 313 p314 uucgtcgtgacgtt-C3 314 p315 NH2C6-ucgtcgtgacgtt-C3 315 p316 C3-uucgtcgtgacgtt-C3 316 p317 tcgacgtgucgtt-C3 317 p318 tcgacgtgacgtt-C3 318 p319 ucgacgtgucgtt-C3 319 p320 ucgtccatgacgtt-C3 320 p321 ucgtccatgucgtt-C3 321 p322 tcgtccatgucgtt-C3 322 p323 bucgtcgtgacgtt-C3 323 p324 catgucgttccttt-C3 324 p325 tgucgttccttt-C3 325 p326 tatgucgttccttt-C3 326 p327 tccatgacgttccttt-C3 327 p328 ugctgctgagctt-C3 328 p329 ugcagctgagctt-C3 329 p330 fTcgtcgtgtcgtt-C3 330 p331 ftcgtcgtgtcgtt-C3 331 p332 ucgtcgtgtcgtt-C3 332 p333 ucgtcgtgtcgtt-C3 333 p334 ucgtcgtgtcgtt-C3 334 p335 ucgtcgtgtcgtt-C3 335 p336 ucgtcgtgtcgtt-C3 336 p337 ucgtcgtgtcgtt-C3 337 p338 tatgugcttccttt-C3 338 p339 bucgtcgptgtcgptt-C3 339 p340 bucgtcgtgptcgtpt-C3 340 p341 bucgtcgtgtcgtpt-C3 341 p342 bucgtcgtgptcgtt-C3 342 p343 bucgtcgptgtcgtt-C3 343
272/289 p344 bucgtcgtgtcgptpt-C3 344 p345 tugctgctgagctt-C3 345 p346 tugctgctgagctt-C3 346 p347 tugctgctgagctt-C3 347 p348 ucgtcgtgtcgtt-C3 348 p349 ucgtcgtgtcgtt-C3 349 p350 ucgtcgtgtcgtt-C3 350 p351 ucgtcgtgtcgtt-C3 351 p352 ucgtcgtgtcgtt-C3 352 p353 tucgtcgtgacgtt-C3 353 p354 tugctgctgagctt-C3 354 p355 ucgTcgtgtcgTt-C3 355 p356 ucgTcgtgtcgtt-C3 356 p357 ucgTcgtgtcgTt-C3 357 p358 ucgtcgtgtcgtt-C3 358 p359 ucgTcgtgtcgtt-C3 359 p360 ucgtcgtgtcgTt-C3 360 p361 ucgTcgtgtcgtt-C3 361 102 p362 ucgTcgtgtcgTet-C3 362 175 p363 ucgTcgtgtcGett-C3 363 365 p364 ucgTcgtgtCegtt-C3 364 523 p365 ucgTcgtgTecgtt-C3 365 260 p366 ucgTcgtGetcgtt-C3 366 390 p367 ucgTcgTegtcgtt-C3 367 287 p368 ucgTcGetgtcgtt-C3 368 223 p369 ucgTCegtgtcgtt-C3 369 242 p370 ucGeTcgtgtcgtt-C3 370 158 p371 uCegTcgtgtcgtt-C3 371 160 p372 ucgTecgtgtcgTt-C3 372 194 p373 tucgtcgtgacgttX5-C3 373 p374 tucgtcgtgacgtX5t-C3 374 p375 tucgtcgtgacgX5tt-C3 375 p376 tucgtcgtgacX5gtt-C3 376 p377 tucgtcgtgaX5cgtt-C3 377 p378 tucgtcgtgX5acgtt-C3 378 p379 tucgtcgtX5gacgtt-C3 379 p380 tucgtcgX5tgacgtt-C3 380 p381 tucgtcX5gtgacgtt-C3 381 p382 tucgtX5cgtgacgtt-C3 382 p383 tucgX5tcgtgacgtt-C3 383 p384 tucX5gtcgtgacgtt-C3 384 p385 tuX5cgtcgtgacgtt-C3 385 p386 tX5ucgtcgtgacgtt-C3 386 p387 X5tucgtcgtgacgtt-C3 387 p388 tucgx5cgtgacgtt-C3 388 p389 tucgx5cgtgacgtt-C3 389 p390 UecgTcgtgtcgtt-C3 390 533 p391 UeCegTcgtgtcgtt-C3 391 1080 p392 UeCeGeTcgtgtcgtt-C3 392 1691 p393 ucgTcgtgtCeGeTeTe-C3 393 2211 p394 UeCeGeTcgtgtCeGeTeTe-C3 394 inat. p395 UeCeGeTCeGeTeGeTeCeGeTeTe-C3 395
273/289 p396 uCegTCegtgtCegtt-C3 396 704 p397 ucgTcGetGetcGett-C3 397 3494 p398 ucgTcgTegTecgTet-C3 398 2423 p399 uCegTcgTegTecgTet-C3 399 4261 p400 ucgTecgTegTecgTt-C3 400 1805 p401 uCegTecgTegTecgTt-C3 401 2509 p402 uCegTcgtgtcGett-C3 402 356 p403 uCegTcgtgtCegtt-C3 403 482 p404 uCegTcgttgtcgTet-C3 404 203 p405 uCegTcgtTegtcgTet-C3 405 809 p406 uCegTcgTetgtcgTet-C3 406 510 p407 uCegTcgtX3gtcgTet-C3 407 286 p408 uCegTcgX3tgtcgTet-C3 408 266 p409 uCegTcgtTegtcgTet-C3 409 875 p410 uCegTcgtX3gtcgTet-C3 410 193 p411 X3ucgTcgtgtcgtt-C3 411 124 p412 uX3cgTcgtgtcgtt-C3 412 inat. p413 ucX3gTcgtgtcgtt-C3 413 225 p414 ucgX3Tcgtgtcgtt-C3 414 131 p415 ucgTX3cgtgtcgtt-C3 415 124 p416 ucgTcX3gtgtcgtt-C3 416 85 p417 ucgTcgX3tgtcgtt-C3 417 92 p418 ucgTcgtX3gtcgtt-C3 418 93 p419 ucgTcgtgX3tcgtt-C3 419 189 p420 ucgTcgtgtX3cgtt-C3 420 227 p421 ucgTcgtgtcX3gtt-C3 421 95 p422 ucgTcgtgtcgX3tt-C3 422 135 p423 ucgTcgtgtcgtX3t-C3 423 202 p424 ucgTcgtgtcgttX3-C3 424 113 p425 bucgTcgtgtcgtt-C3 425 p426 ccgTcgtgtcgtt-C3 426 p427 iucgTcgtgtcgtt-C3 427 p428 iUcgTcgtgtcgtt-C3 428 p429 oducgTcgtgtcgtt-c3 429 p430 oucgTcgtgtcgtt-c3 430 p431 odsucgTcgtgtcgtt-c3 431 p432 sucgTcgtgtcgtt-c3 432 p433 burcgTcgtgtcgtt-C3 433 96 p434 buscgTcgtgtcgtt-C3 434 125 r p435 buc gTcgtgtcgtt-C3 435 148 p436 bucsgTcgtgtcgtt-C3 436 112 p437 buscrgTcgtgtcgtt-C3 437 p438 buscsgTcgtgtcgtt-C3 438 p439 buCegTcgtgtcgtt-C3 439 p440 buCegTcgtgtCegtt-C3 440 p441 buCegTCegtgtCegtt-C3 441 p442 buCegTcgtgtcgTet-C3 442
274/289 p443 buCegTcgTegtcgTet-C3 443 p444 Biotin-AfAfCfGfAfCfAfCfGfAfCfGfAf 444 p445 buCsigTcgtgtcgtt-c3 445 p446 bucgTcgtgtcgTsit-c3 446 p447 buCsigTCsigtgtCsigtt-c3 447 p448 buCsigTcgtgtcgTsit-c3 448 p449 buCsigTcgTsigtcgTsit-c3 449 p450 tucgtcgtgacgtt-c3 450 p451 tucgacgtgacgtt-c3 451 60 18 100 p452 tucgacgtt-c3 452 inat. 100 inat. p453 tuacgtt-c3 453 inat. inat. inat. p454 tacgtt-c3 454 inat. inat. inat. p455 tucgtt-c3 455 inat. inat. inat. p456 tacgt-c3 456 inat. inat. inat. p457 tucgt-c3 457 inat. inat. inat. p458 tucgucgtgacgtt-c3 458 36 119 p459 tucgucgtt-c3 459 132 inat. p460 tuacgut-c3 460 inat. inat. p461 tacgut-c3 461 inat. inat. p462 tucgut-c3 462 223 inat. p463 gucgtt-c3 463 inat. inat. p464 gacgtt-c3 464 inat. inat. p465 gucgut-c3 465 inat. inat. p466 gacgut-c3 466 inat. inat.
p469 tbucgtcgtgacgtt-c3 469 p470 bucgTcgtgtcg-c3 470 p471 bucgTcgtgt-c3 471 p472 bucgtcgtgT-c3 472 p473 bucgTcgt-c3 473 p474 bucgtcgT-c3 474 p475 bucgTt-c3 475 p476 bucgtT-c3 476 p477 tucgtcgtgacgtmtm-c3 477 p478 tmtmucgtcgtgacgtt-c3 478 p479 tmtmucgtcgtgacgtmtm-c3 479 p480 tucgtcgtgacgt(m)t(m)-c3 480 p481 t(m)t(m)ucgtcgtgacgtt-c3 481 p482 tucrgtcgtgacgtt-c3 482 399 p483 tucsgtcgtgacgtt-c3 483 577 r p484 tu cgtcgtgacgtt-c3 484 410 p485 tuscgtcgtgacgtt-c3 485 245 p486 t(m)t(m)ucgtcgtgacgt(m)t(m)-c3 486 p487 bucgtcgtgtcgtt(m)-c3 487 p488 bucgtcgtgtcgt(m)t(m)-c3 488 p489 bucgtcgtgtcgt(m)T-c3 489
275/289 Na tabela 2, a coluna A fornece a expressão de IL-6 em células DB (EC50, nM); a coluna B fornece a expressão de IL-10 em células DB (EC50, nM); a coluna C fornece ativação de NFκB em células azuis Ramos (EC 50, nM); a coluna D fornece células Hela- hTLR9-NFκB-luc de ativação de NFκB (EC50, nM); a coluna E fornece células Hela-mTLR9-NFκB-luc de ativação de NFκB (EC50, nM); a coluna F fornece secreção de IL-6 em esplenócitos de camundongo (EC50, nM); a coluna G fornece secreção de IL-6 em esplenócitos de camundongo após 24 h de pré-incubação em 95 % de plasma de camundongo (EC 50, nM); a coluna H fornece secreção de IL-6 em DC diferenciadas de medula óssea de camundongo (EC 50, nM); a coluna I fornece ativação de NFκB em células HEK-Blue de camundongo após 2h de transfecção com RNAiMax (EC50, nM); e a coluna J fornece ativação de NFκB em células HEK-Blue humanas após 2h de transfecção com RNAiMax (EC50, nM). Os descritores-chave para as sequências fornecidas ao longo das Tabelas incluídas neste documento são os seguintes: minúsculas = nucleosídeo-3'-fosforotioato; CAIXA SUPERIOR = nucleosídeo-3’-fosfato; itálico minúsculas = nucleosídeo possuindo um 3 ’tBuDS-Ph (orto) triéster (PS); ITÁLICOS MAIÚSCULAS = nucleosídeo possuindo um 3 ’tBuDS-Ph (orto) triéster (PO); dt = dT (DBCO); negrito com negrito duplo sublinhado t = DBCO-C6-dT; minúsculas em negrito = nucleosídeo possuindo um 3’ n- butil triéster (PS); MAIÚSCULAS EM NEGRITO = nucleosídeo possuindo um 3 ’n-butil triéster (PO); minúsculas em negrito itálico = nucleosídeo possuindo um 3’ homopropargil triéster (hPro) (PS); minúsculas sublinhadas em itálico = nucleosídeo pos- suindo um 3’ DBCO-NH-PEG2 triéster (N1) (PS); MAIÚSCULAS SUBLINHADAS EM ITÁLICO = nucleosídeo possuindo um 3’ DBCO-NH-PEG2 triéster (N1) (PO); sublinhado duplo t = dT PEG2-NH2 triéster (PS); sublinhado duplo T = dT PEG2-NH2 triéster (PO); minúsculas com sublinhado duplo em itálico = nucleosídeo possuindo um 3’ PEG2-NH2 triéster (N1) (PS); MAIÚSCULA COM SUBLINHADO DUPLO EM ITÁLICO = nucleosídeo possuindo um 3’ PEG2-NH2 triéster (N1) (PO); MAIÚSCULA COM SUBLINHADO EM ITÁLICO NEGRITO U = 5-iodo-2’-desoxiuridina (PO); minúscula sublinhado em itálico negrito u = 5-iodo-2’-desoxiuridina (PS); NEGRITO SUBLINHADO = 2’-fluoronucleotídeo (PO); um apóstrofo indica que o nucleotídeo identificado por uma letra à esquerda do apóstrofo contém uma ribose modificada por 2'-OMe; ng sublinhado = 7-desaza-2’-desoxiguanosina (PS); pT sublinhado = PEG4 dT triéster (PO); sublinhado pt = PEG4 dT triéster (PS); fT = 5-trifluorometil-timidina (PO); fU = 5- fluoro-2’-desoxiuridina (PO); bU = 5-bromo-2’-desoxiuridina (PO); ft = 5-trifluorometil-timidina (PS); fu = 5-fluoro-2'-desoxiuridina (PS); bu = 5-bromo-2’-desoxiuridina (PS); C3 = espaçador C3 (-(CH2)3-OH) (PO); c3 = espaçador C3 (-(CH2)3-OH) (PS); C6 = hexano-1,6-di-ila; NH2C6 = 6-amino-hex-1-ila; Te = timidina possuindo um 3’ etil triéster (PO); Ge = guanosina possuindo um 3’ etil triéster (PO); Ce = citidina possuindo um 3’ etil triéster (PO); Ue = 5-iodouridina possuindo um 3’ etil triéster (PO); ue = 5- iodouridina possuindo um 3’ etil triéster (PS); iu = tampão 5’-5’ com base em 5-iodo-2'-desoxiuridina (PS); iU = tampão 5’-5’ com base em 5-iodo-2'-desoxiuridina (PO); X5 = X5-DBCO (PO); x5 = x5-DBCO (PS); X3 = espaçador abásico X3 (PO); e IR700 é um corante.
Aqui, o descritor (PO) representa 3'-fosfato; e (PS) representa 3'-fosforotioato; od = 5’-ortodissulfeto fosfodiéster; o = 5'-fosfato (PO); ods = fosforotioato de 5’-ortodissulfeto; s = 5’-fosforotioato (PS); sobrescrito “r” = Rp PS; sobrescrito “s” = Sp PS; Af = 2’-fluoro-adenosina (PO); Csi = dC O-sililtriéster (PO); Tsi = dT O-sililtriéster (PO); tm = 2’-OMe timidina (PS); t(m) = 2’-OMOE timidina (PS). As estruturas são mostradas nas FIGS. 5 e 6.
CpGs de fita dupla: Anelamento e análise de gel:
[00477] O polinucleotídeo p88 (1 mL, matéria-prima 5 mM) foi adici- onado a p144 (3,3 mL, matéria-prima 2 mM) com DPBS (24,7 mL). O polinucleotídeo p88 foi tratado com p145 de um modo semelhante. As misturas foram aquecidas a 65°C durante 10 min. A análise por gel de TBE ureia mostrou o anelamento completo de p88 (veja, Figura 2). 1 µL de cada amostra foi removido, adicionado a 5 µL de tampão de car- regamento de formamida e carregado por cavidade em um gel de TBE-ureia 15 %, 200 volts por 40 min seguido por manchamento com brometo de etídio (EtBr). Veja, Tabela 2 para as estruturas de p88, p144 e p145.
[00478] CpG de fita dupla usando p88/p144 - Exemplo representati- vo (1): TCGTCGTTTTTGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 234) AGCAGCAAAACAGCAAAACAGCAA (SEQ ID NO: 468)
[00479] CpG de fita dupla usando p88/p145 - Exemplo representati- vo (2): TCGTCGTTTTTGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 467) AGCAGCAAAACAGCAAAACAGCAA (SEQ ID NO: 468) Exemplo 2: Preparação de Conjugados Anticorpo-CpG A. Preparação de Conjugados de Anticorpo- Nucleotídeo CpG Anti-SIRPα
[00480] Dois anticorpos anti-SIRPα foram selecionados. Um dos anticorpos anti-SIRPα bloqueia a ligação de CD47 e seu epítopo se sobrepõe ao sítio de ligação de CD47 (bloqueio). O outro anticorpo anti-SIRPα liga-se a um epítopo distinto do sítio de ligação de CD47 (sem bloqueio). Veja, WO 2018/057669, cuja descrição é incorporada neste documento por referência em sua totalidade. Os anticorpos anti- SIRPα foram conjugados por meio de uma reação de transglutaminase
(“mTGase”).
[00481] As VH e VL do anticorpo de bloqueio, anti-SIRPα 1, seleci- onado para conjugação são EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASG- FTFSSNAMSWVRQAPGKGLEWVAGISAGGSDTYYPASVKGRFTIS- RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARETWNHLFDYWGQG- TLVTVSS (SEQ ID NO:521) e SYELTQPPSVSVSPGQTA- RITCSGGSYSSYYYAWYQQKPGQAPVTLIYSDDKRPSNIPER- FSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYCGGYDQSSYTNPFGGGT- KLTVL (SEQ ID NO:525), respectivamente.
[00482] As VH e VL do anticorpo de não bloqueio, anti-SIRPα 2, selecionado para conjugação são EVQLVESGGGVVQPGRSLRLS- CAASGFTFSSYDVNWVRQAPGKGLEWVSLISGSGEIIY- YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKENN- RYRFFDDWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:548) e ETVLTQSPGTLS- LSPGERATLSCRASQSVYTYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASS- RATGIPDRFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYYDRPPLTF- GGGTKVEIK (SEQ ID NO:553), respectivamente.
[00483] Um anticorpo anti-SIRPα carregando uma mutação N297A em IgG1 humana foi trocado por tampão para Tris 25 mM, NaCl 150 mM, pH 8 usando uma coluna de dessalinização. À solução de anti- corpo SIRPα foi adicionado mTGase e ligante N3-PEG23-NH2 pos- suindo a estrutura de N3-CH2CH2(OCH2CH2)23-NH2. Dada a mutação N297A, a conjugação pode ocorrer através da cadeia lateral da gluta- mina 295 (numeração EU). A mistura resultante foi deixada à tempera- tura ambiente durante a noite. Na mistura de reação de mTGase, a concentração final de anticorpo foi de 50 μM; a relação do anticorpo para mTGase foi de cerca de 10, e a relação do ligante para o anticor- po foi de cerca de 5. A mTGase e o ligante de PEG livre foram removi- dos por purificação de Proteína A. O anticorpo modificado foi trocado por tampão em 1xPBS usando uma coluna de dessalinização. A ciclo-
adição de Huisgen subsequente de uma Alcina em um nucleotídeo CpG de SEQ ID NO: 425 com um grupo azido no anticorpo modificado forneceu um conjugado anti-SIRPα-nucleotídeo CpG possuindo a estrutura da Fórmula (D) ou (E).
O
NH 5' X c g O N O
O N N
H Ab N N O
O O 23 N O N O P O c g t g t c g t Z 3'
H O O (D) O
NH N N 5' X c g O N O
H O Ab N N
O 23 O
O
N O N O P O c g t g t c g t Z 3'
H
O O ou; (E) em que Ab é um anticorpo anti-SIRPα bloqueador ou de não bloqueio; c é 2'-desoxicitidina; g é 2’-desoxiguanosine; t é timidina; X é 5-bromo- 2’-desoxiuridina; e Z é . B. Preparação de um Conjugado Anticorpo Anti-CD56-Nucleotídeo CpG
[00484] O anticorpo anti-CD56 monoclonal de murino (clone
5.1H11) foi obtido comercialmente. O anticorpo anti-CD56 foi conjuga- do através de um pentafluorofenil (PFP) éster ativado. A uma solução do anticorpo anti-CD56 em tampão de solução salina tamponado com fosfato de Dulbecco (DPBS) (~2,5 µg/µL) foi adicionado um azido- PEG8-PFP éster possuindo a estrutura de N3-CH2CH2(OCH2CH2)8- CH2CO-PFP com uma relação do ligante para o anticorpo de 20. A mistura resultante foi deixada durante a noite à temperatura ambiente para formar um anticorpo conpossuindo azido. O excesso de azido- PEG8-PFP foi, então, removido por troca de tampão através de um concentrador de rotação Amicon 30kD usando DPBS como eluente. A cicloadição de Huisgen subsequente de uma alcina em um nucleotídeo CpG de SEQ ID NO: 425 com um grupo azido no anticorpo modificado forneceu um conjugado anti-CD56-nucleotídeo CpG possuindo a estru- tura de Fórmula (F) ou (G):
O NH
N O 5' X c g O O
O N N
O N O Ab O O 7 N O N O P O c g t g t c g t Z 3'
H
O O s (F) ou em que Ab é um anticorpo anti-CD56; s é um número inteiro de cerca de 3 ou cerca de 4; c é 2'-desoxicitidina; g é: 2’-desoxiguanosina; t é timidina; X é 5-bromo-2’-desoxiuridina; e Z é . Exemplo 3. Avaliação Biológica de Conjugados de Anticorpo- Nucleotídeo CpG
[00485] Resíduos Trima foram recebidos de Centros de Sangue do Pacífico e diluídos 1:4 com Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS). O sangue diluído foi dividido em quatro tubos e subestimado com 15 mL de meio de gradiente de densidade Ficoll® Paque (GE Healtcare Life Sciences). Os tubos foram centrifugados por 30 minutos em 400 x g: PBMCs foram coletadas da interface e ressuspensas em um tampão FACS (PBS com Albumina de Soro Bovino 0,5 %). Monóci- tos CD14+ foram purificados por seleção negativa usando o Kit II Mo- nocite Isolation (Miltenii Biotec) e colunas LS (Miltenyi Biotec) de acor- do com o protocolo do fabricante.
[00486] Células PBMCs ou CD14+ foram imediatamente semeadas em um formato de 96 cavidades (500 K/cavidade) em meio completo do Roswell Park Memorial Institute (RPMI). Diluições em série de cinco vezes foram adicionadas às células de 100 nM a 6,4 pM de um anti- corpo e um conjugado anticorpo-nucleotídeo CpG e 1 µM a 64 pM de polinucleotídeo CpG de SEQ ID NO: 425 a 37 °C sob 5 % de CO2 por 24 ou 48 horas. As células foram sedimentadas por centrifugação du- rante cinco minutos em 400 x g e coradas a 4 °C em 100 µL de Fixable Viability Dye eFluor 780 (Thermo Fisher) diluído 1:2000 em PBS. As células foram centrifugadas e coradas a 4 °C por 30 minutos em 100 µL de tampão FACS por 30 minutos conpossuindo 2 µL de Reagente de Bloqueio FcγR, 1,25 µL de anti-CD14, anti-CD3, anti-CD19 para ensaios anti-SIRPα e anti-CD56, anti-CD16, anti-CD69, anti-CD14, an- ti-CD3 e anti-CD19 para ensaios anti-CD56. As células foram centrifu-
gadas e lavadas duas vezes em 200 µL de tampão FACS e fixadas em 100 µL de paraformaldeído 0,5 %. Contas de Contagem Absoluta CountBright foram adicionadas a cada cavidade para contar o número de células. As células foram analisadas em Citômetro de Fluxo Attune NxT com subsequente análise de dados por Flowjo 10.7. As células mortas foram excluídas por controle na população eFluor 780- negativa. As células específicas de linhagem foram primeiro excluídas (CD19, CD3) antes do controle da célula CD14+ e (CD19, CD3, CD14) antes do controle das células CD56+CD16+.
[00487] Como mostrado nas FIGS. 1 e 2, o conjugado de nucleotí- deo anti-CD56-CpG realçaou a ativação de células NK em compara- ção com o nucleotídeo CpG e anti-CD56 sozinho em 24 e 48 horas, respectivamente. Conforme determinado pela expressão de CD69, o conjugado anti-CD56-nucleotídeo CpG foi capaz de induzir a ativação de células NK.
[00488] Como mostrado nas FIGS. 3 e 4, os conjugados anti- SIRPα-nucleotídeo CpG com um anticorpo bloqueador (anti-SIRPα1) ou anticorpo de não bloqueio (anti-SIRPα 2) induziram a proliferação de monócitos CD14+ dentro de populações de PBMC e de CD14+ puri- ficada inteiras. Usando contas de contagem para determinar o número absoluto de monócitos CD14+, os conjugados anti-SIRPα-nucleotídeo CpG com um anticorpo bloqueador (anti-SIRPα 1) ou anticorpo de não bloqueio (anti-SIRPα2) induziu a proliferação em comparação com o nucleotídeo CpG e anticorpos anti-SIRPα sozinhos. Os experimentos usando monócitos CD14+ purificados mostram que o aumento no nú- mero de células é o resultado da liberação do nucleotídeo CpG nas células pelo anticorpo anti-SIRP. Esses dados indicam coletivamente que os anticorpos anti-SIRPα se ligam a diferentes epítopos, bloquea- dor e de não bloqueio, são mostrados para liberar o nucleotídeo CpG em monócitos CD14+ e resulta em sua expansão no número de célu-
las. Exemplo 4: Determinação de KD
[00489] As interações de anticorpos anti-SIRPα com SIPRα de vá- rias espécies (v1 humano, v2 humano, cinomolgo, camundongo 129, BL6, BALBc, NOD), SIRPα e SIRP foram analisadas usando dois mé- todos, imobilização direta dos anticorpos (via um chip GLC) de acordo com os seguintes protocolos. Todas as experiências foram realizadas a 25 °C usando um biossensor SPR-based ProteOn XPR36 (BioRad, Inc., Hercules, CA) equipado com chips sensores GLC ou NLC. Os anticorpos foram expressos usando células FREESTYLE™ 293-FS (Thermo Fisher). A purificação foi realizada por cromatografia de colu- na de afinidade de proteína A padrão e os anticorpos eluídos foram armazenados em um tampão PBS.
[00490] O tampão fluente foi PBS pH 7,4 com TWEEN-20 0,01 % (PBST+). Todos os analisados foram usados em suas concentrações nominais conforme determinado pela absorbância A280 e usando seu coeficiente de extinção calculado molar. Os analisados foram injetados em um modo cinético “one-shot”, conforme descrito (veja, por exem- plo, Bravman et al., Anal. Biochem. 2006, 358, 281-288).
[00491] Para o método usando um chip GLC, os analisados foram injetados e fluidos sobre anticorpos anti-SIRPα imobilizados (~ 1000 RUs) em chips GLC usando o kit Proteon Amine Coupling. Para a eta- pa de imobilização, o chip GLC foi ativado com EDAC/Sulfo-NHS 1:1 (Biorad) diluído 1/100 por 300s a 25 μL/min. Anticorpos anti-SIRPα fo- ram diluídos para concentração de 80 nM em tampão de acetato de sódio 10 mM pH 4,5 e imobilizados no chip a 30 μL/min por 50s. O chip foi inativado com etanolamina por 300s a 25 μL/min. Os analisa- dos (por exemplo, SIRP-α de diferentes espécies, SIRP-β, SIRP-) fo- ram injetados em um modo cinético “one-shot” em concentrações no- minais de 100, 33, 11, 3,7, 1,2 e 0 nM. Os tempos de associação fo-
ram monitorados por 90s a 100uL/min, e os tempos de dissociação foram monitorados por 1200s. As superfícies foram regeneradas com uma mistura 2:1 em v/v de tampão de eluição Pierce IgG/NaCl 4M.
[00492] Os dados do biossensor foram duplamente referenciados subtraindo os dados interspot (sem nenhuma proteína imobilizada) dos dados do local da reação (proteína imobilizada) e, em seguida, subtra- indo a resposta de uma injeção de analisado “em branco” de tampão daquela de uma injeção de analisado. Os dados de referência dupla foram ajustados globalmente a um modelo de Langmuir simples e o valor de KD foi calculado a partir da relação das constantes de taxa ci- nética aparente (KD = kd/ka).
[00493] A cinética de ligação dos anticorpos bloqueadores 119, 135 e de não bloqueioes 136 para vários SIRP-α de diferentes espécies, SIRP-β, SIRP-) foi determinada. Estes anticorpos se ligam com alta afinidade ao SIRP-α de v1 humano, v2 humano e macaco cinomólogo. Eles não se ligam a vários SIRP-α de camundongo, no entanto, eles exibiram ligação de alta afinidade para SIRP-β humano e SIRP- hu- mano. Portanto, esses anticorpos serão pan anti-SIRPs úteis para a conjugação e distribuição de polinucleotídeo imunomodulador CpG para modular as atividades de várias populações de células mieloides. Os resultados estão resumidos na Tabela 3.
[00494] A cinética de ligação de anticorpos bloqueadores AB21 humanizados para vários SIRP-α de diferentes espécies, SIRP-β, SIRP-) foi determinada. Os anticorpos AB21 se ligam com alta afini- dade ao SIRP-α de v1 humano, v2 humano, macaco cinomólogo, vá- rios SIRP-α de camundongo (NOD, BL6 e BALBc), SIRP-β humano e SIRP- humano. Portanto, os anticorpos bloqueadores AB21 serão pan anti-SIRPs úteis para conjugação e distribuição de polinucleotídeo imunomodulador CpG para modular as atividades de várias popula- ções de células mieloides. Os resultados estão resumidos na Tabela 4.
Tabela 3. Afinidades da Linha Germinativa de Anticorpo Anti-SIRP-α/Mutação de Responsabilidade KD (nM) Anticorpo Cadeia Leve Cadeia Pesada Camundongo Camundongo Camundongo v1 Humano v2 Humano Cino SIRPβ Humano SIRPγ Humano Humana Humana Tipo de Ligação NOD BL6 BALBc
119 wt wt B 0,18 0,068 0,11 NLB NLB NLB 0,34 0,27
119 Mut wt B 021 0,086 0,14 NLB NLB NLB NT 0,23
119 wt Mut B 0,25 0,069 0,16 NLB NLB NLB NT NT
119 Mut Mut B 0,32 0,088 0,20 NLB NLB NLB 0,46 0,34
119 Mut Mut_V34M B 0,22 0,069 0,12 NLB NLB NLB 0,34 0,26
284/289 135 wt wt B 0,15 0,029 0,097 NLB NLB NLB 0,54
135 Mut wt B 0,15 0,027 0,10 NLB NLB NLB 0,52
135 wt Mut B 0,18 0,02 0,13 NLB NLB NLB 0,78 0,19 135 Mut Mut B 0,19 0,018 0,13 NLB NLB NLB 0,73 0,16
135 wt Mut_V34M B 0,15 0,016 0,080 NLB NLB NLB 0,53
4,4
136 wt wt NB 0,46 1,6 2,2 0,55 13 0,35 24
136 Mut wt NB 7,3 17 11 4,1 33 2,8 20 3,5 136 wt Mut NB 0,56 1,7 2,3 0,68 23 0,42 17
136 Mut Mut NB 7,3 20 13 5,2 32 3,1 1,7 3,2
136 Mut_I2T Mut NB 0,72 1,8 2,3 0,68 15 0,42 40
136 Mut_S12T Mut NB 4,9 11 8,0 2,9 16 2,1 67
136 Mut_S22T Mut NB 5,0 8,3 6,8 2,4 13 1,6 62
136 Mut_Q38E Mut NB 6,2 13 10 6,0 33 3,0 19 2,2 136 Mut_I2T Mut_V34M NB 0,55 17 2,1 0,60 14 0,36 34
B = bloqueador; NB = de não bloqueio.
NT ou em branco = não testado; NA = não aplicável (os anticorpos não reagem cruzado); NLB = sem ligação 119 mut de mut de cadeia pesada = D1E, E43K, L112Q, M34V 119 mut de cadeia leve = F21L, R39K, E60A, T76S 135 mut de cadeia pesada = D1E, R13Q, E16G, M34V, E43K, L112Q
285/289 135 mut de cadeia leve = F21L, D60A 136 mut de cadeia pesada = D1E, R13Q, E16R, M34V, E43K, L111Q 136 mut de cadeia leve = T2I, T12S, T22S, E38Q
Tabela 4. Afinidades de Anticorpo Anti-SIRP-α
KD Designação do Anticorpo VL VH V1 V2 Camun- Camundongo Camundongo SIRPβ SIRPγ Cino Humana Humana dongo NOD BL6 BALBc Humano Humano Hum1 Humano (AB21_HC_ Hum1/AB21_HC_Mutall 5,3 pM 4,6 pM 29 pM 3,7 nM 9,5 nM 7,9 nM 6,7 pM 1,0 pM Humanizado Mutall) Hum8 Humano (AB21_HC_ Hum8/AB21_HC_Mutall 20 pM NT NT 28 nM 0,42 mM 71 nM NT NT Humanizado Mutall) Hum9 Humano (AB21_HC_ Hum9/AB21_HC_Mutall 12 pM 0,12 nM 0,22 nM 24 nM 0,53 mM 0,14 µM 57 pM 35 pM Humanizado Mutall) NT = não testado.
286/289
Exemplo 5: Avaliação In vivo de Conjugados de Nucleotídeo- An- ticorpo CpG
[00495] Células CT26 e MC38 foram injetadas no flanco direito de camundongos BALB/ce C57BL/6 fêmeas, respectivamente, a uma concentração de 2 x 106 células por camundongo em RPMI 1640 (para CT26) ou DMEM (para MC38). Os tumores foram monitorados até que o tamanho médio dos tumores atingisse entre 75-300 mm3, dependen- do do estudo. Os camundongos foram randomizados em controle PBS, conjugado anti-SIRPα-nucleotídeo CpG com anticorpo bloquea- dor (anti-SIRPα1) e conjugado anti-SIRPα-nucleotídeo CpG com gru- pos de anticorpo de não bloqueio (anti-SIRPα 2) com 5-7 camundon- gos por coorte dependendo do estudo. As sequências de anticorpos anti-SIRPα são descritas no Exemplo 2; CpG correspondeu a p313. Os camundongos tratados com conjugado anti-SIRPα-nucleotídeo CpG receberam doses de 0,1 - 10 mg/kg duas vezes no total, com três dias de intervalo. Ambos os fármacos foram administrados por via intraperi- toneal. Os tumores foram medidos em duas dimensões com calibrado- res, e o volume do tumor foi calculado como: comprimento x largura x largura x 0,5, sendo o comprimento a maior das duas medições.
[00496] Camundongos com tumor CT26 foram medidos e randomi- zados pelo volume do tumor. No dia 4, cada coorte de 5 camundongos tinha um tamanho médio do tumor de 75 mm3. Camundongos tratados com conjugado de 10 mg/kg de anti-SIRPα 1 administrados duas ve- zes, três dias de intervalo mostraram erradicação do tumor (4/5 ca- mundongos), enquanto camundongos tratados com dose de anticorpo anti-SIRPa de controle não conjugado de 10 mg/kg duas vezes, três dias de intervalo mostraram inibição de tumor subideal em compara- ção com PBS (FIG. 7A). Camundongos com tumor CT26 foram medi- dos e randomizados pelo volume do tumor. No dia 8, os tumores ti- nham um tamanho tumoral médio de 100 mm3 com 7 camundongos por grupo, e dois tratamentos com 3 mg/kg de conjugado anti-SIRPα 1 e conjugado anti-SIRPα 2, com três dias de intervalo, mostraram erra- dicação completa do tumor (FIG. 7B). No dia 24, 7 de 7 camundongos tratados com conjugado anti-SIRPα 1 (conjugado de anticorpo bloque- ador anti-SIRPα) e 6 de 7 camundongos tratados com conjugado anti- SIRPα 2 (conjugado de anticorpo anti-SIRPα de não bloqueio) apre- sentaram completa erradicação do tumor. Conforme mostrado na FIG. 7C, camundongos com tumor CT26 com um tamanho médio de tumor de 300 mm3 e coorte de 5 camundongos foram tratados com 0,1, 0,3 e 1 mg/kg de conjugado anti-SIRPα 1 duas vezes, com três dias de in- tervalo. Uma resposta à dose na inibição do tumor foi observada com 1 mg/kg sendo o mais potente. 4 de 5 camundongos apresentaram erradicação do tumor no dia 21 para o grupo tratado com 1 mg/kg de conjugado anti-SIRPα 1. Conforme mostrado na FIG. 7D, camundon- gos com tumor MC38 com uma média de volume tumoral de 155 mm3 tratados com duas doses de 10 mg/kg de conjugado anti-SIRPα 1 com três dias de intervalo mostraram a erradicação completa do tumor no dia 21. Coletivamente, esses dados mostram a erradicação de tumo- res em múltiplos modelos de tumor, atividade específica de SIRPa- CpG em comparação com o anticorpo SIRPa não conjugado, erradica- ção do tumor igualmente com conjugados bloqueador e de não blo- queio de SIRPa CpG e erradicação de tumores quando camundongos são tratados com conjugado anti-SIRPα 1 tão baixo quanto 1 mg /kg.
[00497] Os tumores foram monitorados até que o tamanho médio dos tumores atingiu 300 mm3. Os camundongos foram randomizados em controle PBS e conjugado anti-SIRPα-nucleotídeo CpG com anti- corpo bloqueador (anti-SIRPα 1) com 5 camundongos por coorte. As sequências de anticorpos anti-SIRPα são descritas no Exemplo 2; CpG correspondeu a p313. Camundongos tratados com conjugado anti-SIRPα-nucleotídeo CpG foram dosados com 1 mg/kg para o mo-
delo CT26 duas vezes no total, três ou 7 dias de intervalo. O conjuga- do anti-SIRPα-nucleotídeo CpG foi administrado por via intraperitoneal. Os tumores foram medidos em duas dimensões com calibradores, e o volume do tumor foi calculado como: comprimento x largura x largura x 0,5, sendo o comprimento a maior das duas medições.
[00498] Camundongos com tumor CT26 foram medidos e randomi- zados pelo volume do tumor. No dia 10, os tumores tinham um tama- nho médio de tumor de 300 mm3 e o tratamento com 1 mg/kg de con- jugado anti-SIRPα 1, duas doses, três ou sete dias de intervalo, mos- trou a erradicação do tumor (FIG. 8A). No dia 25, quatro em cinco ca- mundongos estavam sem tumor em ambos os grupos. No dia 63, dos quatro camundongos sobreviventes tratados com três dias de interva- lo, todos estavam sem tumor, enquanto os camundongos tratados com sete dias de intervalo também tinham quatro camundongos sobrevi- ventes, porém, apenas dois ainda estavam sem tumor (FIG. 8B). *****
[00499] Os exemplos apresentados acima são fornecidos para pro- duzir aos versados na técnica uma divulgação e descrição completas de como fazer e usar as modalidades reivindicadas e não se destinam a limitar o escopo do que é descrito neste documento. As modificações que são óbvias para os versados na técnica devem estar dentro do escopo das seguintes reivindicações. Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes citados nesta especificação são incorporados aqui por referência, como se cada publicação, patente ou pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicado para ser in- corporado aqui por referência.

Claims (126)

REIVINDICAÇÕES
1. Conjugado, caracterizado pelo fato de que compreende uma porção de direcionamento, um polinucleotídeo imunomodulador e um ligante; em que a porção de direcionamento se liga a um antígeno expresso por uma célula NK ou uma célula mieloide; e o ligante conec- ta a porção de direcionamento covalentemente ao polinucleotídeo imunomodulador.
2. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zado pelo fato de que o polinucleotídeo imunomodulador compreende um fosfotriéster de internucleosídeo.
3. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, carac- terizado pelo fato de que o polinucleotídeo imunomodulador compre- ende um nucleotídeo com uma nucleobase modificada.
4. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o conjugado possui a estru- tura da Fórmula (C): ou um estereoisômero, uma mistura de dois ou mais diastereômeros, um tautômero ou uma mistura de dois ou mais tautômeros dos mes- mos; ou um sal, solvato ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo; em que: Ab é uma porção de direcionamento; cada LN é independentemente um ligante; cada Q é independentemente um polinucleotídeo imuno- modulador; cada e é independentemente um número inteiro de cerca de 1, cerca de 2, cerca de 3 ou cerca de 4; e f é um número inteiro de cerca de 1, cerca de 2, cerca de 3 ou cerca de 4.
5. Conjugado, de acordo com a reivindicação 4, caracteri- zado pelo fato de que f é um número inteiro de cerca de 1.
6. Conjugado, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, carac- terizado pelo fato de que LN é um ligante que compreende um polieti- leno glicol.
7. Conjugado, de acordo com a reivindicação 6, caracteri- zado pelo fato de que LN é , em que d é um número inteiro que varia de cerca de 0 a cerca de 50.
8. Conjugado de acordo com a reivindicação 6, caracteri- zado pelo fato de que LN é , em que d é um número inteiro que varia de cerca de 0 a cerca de 50.
9. Conjugado de acordo com a reivindicação 7 ou 8, ca- racterizado pelo fato de que d é um número inteiro que varia de cerca de 0 a cerca de 10.
10. Conjugado de acordo com a reivindicação 7 ou 8, ca- racterizado pelo fato de que d é um número inteiro que varia de cerca de 0 a cerca de 5.
11. Conjugado de acordo com a reivindicação 7 ou 8, ca- racterizado pelo fato de que d é um número inteiro de cerca de 0, cer- ca de 1, ou cerca de 3.
12. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 4 a 11, caracterizado pelo fato de que e é um número inteiro de cerca de 1.
13. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 4 a 12, caracterizado pelo fato de que cada Q independente- mente possui a estrutura de Formula (D): em que:
cada XN é independentemente um nucleotídeo; X3’ é um nucleotídeo 3’ terminal; X5’ é um nucleotídeo 5’ terminal; YP é um resíduo de um fosfotriéster internucleosídeo; e b e c são, cada um, um número inteiro que varia de cerca de 0 a cerca de 25; com a condição de que sua soma não seja inferior a 5.
14. Conjugado, de acordo com a reivindicação 13, caracte- rizado pelo fato de que b é um número inteiro que varia de cerca de 1 a cerca de 15.
15. Conjugado, de acordo com a reivindicação 13, caracte- rizado pelo fato de que b é um número inteiro de cerca de 3, cerca de 4, cerca de 11 ou cerca de 14.
16. Conjugado, de acordo com a reivindicação 13, caracte- rizado pelo fato de que b é um número inteiro de cerca de 3.
17. Conjugado, de acordo com a reivindicação 13, caracte- rizado pelo fato de que b é um número inteiro de cerca de 4.
18. Conjugado, de acordo com a reivindicação 13, caracte- rizado pelo fato de que b é um número inteiro de cerca de 11.
19. Conjugado, de acordo com a reivindicação 13, caracte- rizado pelo fato de que b é um número inteiro de cerca de 14.
20. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 13 a 19, caracterizado pelo fato de que c é um número inteiro que varia de cerca de 0 a cerca de 10.
21. Conjugado, de acordo com a reivindicação 20, caracte- rizado pelo fato de que c é um número inteiro de cerca de 0 ou cerca de 8.
22. Conjugado, de acordo com a reivindicação 20, caracte- rizado pelo fato de que c é um número inteiro de cerca de 0.
23. Conjugado, de acordo com a reivindicação 20, caracte-
rizado pelo fato de que c é um número inteiro de cerca de 8.
24. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 13 a 23, caracterizado pelo fato de que a soma de b e c varia de cerca de 5 a cerca de 20.
25. Conjugado, de acordo com a reivindicação 24, caracte- rizado pelo fato de que a soma de b e c varia de cerca de 5 a cerca de
15.
26. Conjugado, de acordo com a reivindicação 24, caracte- rizado pelo fato de que a soma de b e c é cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 11, cerca de 12, cerca de 13 ou cerca de 14.
27. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 13 a 26, caracterizado pelo fato de que cada XN é independen- temente um 2'-desoxirribonucleotídeo.
28. Conjugado, de acordo com a reivindicação 27, caracte- rizado pelo fato de que cada XN é independentemente 2'- desoxiadenosina, 2'-desoxiguanosina, 2'-desoxicitidina, 5-halo-2'- desoxicitidina, 2'-desoxitimidina, 2'-desoxiuridina ou uma 5-halo-2'- desoxiuridina.
29. Conjugado, de acordo com a reivindicação 27, caracte- rizado pelo fato de que cada XN é independentemente 2'- desoxiadenosina, 2'-desoxiguanosina, 2'-desoxicitidina, 2'- desoxitimidina, 5-bromo-2'-desoxiuridina ou 5-iodo-2'- desoxiuridina.
30. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 13 a 29, caracterizado pelo fato de que X3’ é um 2'- desoxirribonucleotídeo.
31. Conjugado, de acordo com a reivindicação 30, caracte- rizado pelo fato de que X3’ é 2'-desoxiadenosina, 2'-desoxiguanosina, 2'-desoxicitidina, 5-halo-2'-desoxicitidina, 2'-desoxitimidina, 2'- desoxiuridina ou 5 -halo-2'-desoxiuridina.
32. Conjugado, de acordo com a reivindicação 30, caracte-
rizado pelo fato de que X3’ é 2'-desoxitimidina.
33. Conjugado, de acordo com a reivindicação 30, caracte- rizado pelo fato de que X3’ é um ribonucleotídeo modificado em 2'.
34. Conjugado, de acordo com a reivindicação 30, caracte- rizado pelo fato de que X3’ é um 2'-metóxi ribonucleotídeo ou 2'- etoximetóxi ribonucleotídeo.
35. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 13 a 34, caracterizado pelo fato de que X5’ é um 2'- desoxirribonucleotídeo.
36. Conjugado, de acordo com a reivindicação 35, caracte- rizado pelo fato de que X5’ é 2'-desoxiadenosina, 2'-desoxiguanosina, 2'-desoxicitidina, 5-halo-2'-desoxicitidina, 2'-desoxitimidina, 2'- desoxiuridina ou 5-halo -2'-desoxiuridina.
37. Conjugado, de acordo com a reivindicação 35, caracte- rizado pelo fato de que X5’ é um 2'-desoxirribonucleotídeo com uma base de pirimidina substituída.
38. Conjugado, de acordo com a reivindicação 35, caracte- rizado pelo fato de que X5’ é um 2'-desoxirribonucleotídeo com uma base de pirimidina 5-substituída.
39. Conjugado, de acordo com a reivindicação 35, caracte- rizado pelo fato de que X5’ é 2'-desoxitimidina, 5-halo-2'-desoxicitidina ou 5-halo-2'-desoxiuridina.
40. Conjugado, de acordo com a reivindicação 35, caracte- rizado pelo fato de que X5’ é 2'-desoxitimidina, 5-bromo-2'- desoxicitidina, 5-iodo-2'-desoxicitidina, 5-bromo-2'-desoxiuridina ou 5- iodo-2’-desoxiuridina.
41. Conjugado, de acordo com a reivindicação 35, caracte- rizado pelo fato de que X5’ é 2'-desoxitimidina, 5-bromo-2'- desoxiuridina ou 5-iodo-2'-desoxiuridina.
42. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindi-
cações 13 a 41, caracterizado pelo fato de que X5' possui um grupo 3'- fosforotioato.
43. Conjugado, de acordo com a reivindicação 42, caracte- rizado pelo fato de que o 3'-fosforotioato é quiral.
44. Conjugado, de acordo com a reivindicação 43, caracte- rizado pelo fato de que o 3'-fosforotioato possui uma quiralidade de Rp.
45. Conjugado, de acordo com a reivindicação 43, caracte- rizado pelo fato de que o 3'-fosforotioato possui uma quiralidade de Sp.
46. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações de 13 a 43, caracterizado pelo fato de que X5' possui um grupo 3'-fosforotioato possuindo uma quiralidade de Rp e X3' é um 2'-metóxi ribonucleotídeo ou 2'-etoximetóxi ribonucleotídeo.
47. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 13 a 43, caracterizado pelo fato de que X5’ possui um grupo 3'- fosforotioato possuindo uma quiralidade de Sp e X3' é um 2'-metóxi ri- bonucleotídeo ou 2'-etoximetóxi ribonucleotídeo.
48. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 13 a 47, caracterizado pelo fato de que YP é: em que Z é O ou S; e d é um número inteiro que varia de cerca de 0 a cerca de 50.
49. Conjugado, de acordo com a reivindicação 48, caracte- rizado pelo fato de que YP é: em que Z é O ou S; e d é um número inteiro que varia de cerca de 0 a cerca de 50.
50. Conjugado, de acordo com a reivindicação 48 ou reivin- dicação 49, caracterizado pelo fato de que Z é O.
51. Conjugado, de acordo com a reivindicação 48 ou reivin- dicação 49, caracterizado pelo fato de que Z é S.
52. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 48-51, caracterizado pelo fato de que d é um número inteiro que varia de cerca de 0 a cerca de 10.
53. Conjugado, de acordo com a reivindicação 52, caracte- rizado pelo fato de que d é um número inteiro que varia de cerca de 0 a cerca de 5.
54. Conjugado, de acordo com a reivindicação 52, caracte- rizado pelo fato de que d é um número inteiro de cerca de 0, cerca de 1 ou cerca de 3.
55. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 54, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo imu- nomodulador compreende um fosfotriéster internucleosídeo adicional.
56. Conjugado, de acordo com a reivindicação 55, caracte- rizado pelo fato de que o fosfotriéster internucleosídeo adicional é um alquilfosfotriéster.
57. Conjugado, de acordo com a reivindicação 55, caracte- rizado pelo fato de que o fosfotriéster internucleosídeo adicional é etil- fosfotriéster.
58. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 57, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo imu- nomodulador compreende uma 5-halo-2'-desoxiuridina.
59. Conjugado, de acordo com a reivindicação 58, caracte- rizado pelo fato de que 5-halo-2'-desoxiuridina é 5-bromo-2'- desoxiuridina ou 5-iodo-2'-desoxiuridina.
60. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 59, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo imu-
nomodulador compreende três ou mais 2'-desoxicitidinas.
61. Conjugado, de acordo com a reivindicação 60, caracte- rizado pelo fato de que o polinucleotídeo imunomodulador compreende três 2'-desoxicitidinas.
62. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 61, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo imu- nomodulador compreende quatro ou mais 2'-desoxiguanosinas.
63. Conjugado, de acordo com a reivindicação 62, caracte- rizado pelo fato de que o polinucleotídeo imunomodulador compreende quatro 2'-desoxiguanosinas.
64. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 63, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo imu- nomodulador compreende três 2'-desoxicitidinas e quatro 2'- desoxicitidinas.
65. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 63, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo imu- nomodulador compreende três ou mais 2'-desoxitimidinas.
66. Conjugado, de acordo com a reivindicação 65, caracte- rizado pelo fato de que o polinucleotídeo imunomodulador compreende três, quatro, cinco, seis, sete ou oito 2'-desoxitimidinas.
67. Conjugado, de acordo com a reivindicação 65, caracte- rizado pelo fato de que o polinucleotídeo imunomodulador compreende três, quatro, cinco ou oito 2'-desoxitimidinas.
68. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 67, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo imu- nomodulador compreende zero, um ou duas 2'-desoxiadenosinas.
69. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 68, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo imu- nomodulador compreende um ou mais fosforotioatos internucleosí- deos.
70. Conjugado, de acordo com a reivindicação 69, caracte- rizado pelo fato de que o polinucleotídeo imunomodulador compreende cerca de 12 fosforotioatos internucleosídeos.
71. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 70, caracterizado pelo fato de que a porção de direciona- mento é um anticorpo para um antígeno expresso na célula NK.
72. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 70, caracterizado pelo fato de que a porção de direciona- mento é um anticorpo para um antígeno expresso na célula mieloide.
73. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 72, caracterizado pelo fato de que a porção de direciona- mento é um anticorpo humano.
74. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 73, caracterizado pelo fato de que a porção de direciona- mento é um anticorpo anti-CD56 humano.
75. Conjugado, de acordo com a reivindicação 74, caracte- rizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo anti-CD56 humano derivado do clone 5.1H11.
76. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 73, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anti- corpo anti-SIRPα.
77. Conjugado, de acordo com a reivindicação 76, caracte- rizado pelo fato de que a porção de direcionamento é um anticorpo anti-SIRPα bloqueador.
78. Conjugado, de acordo com a reivindicação 77, caracte- rizado pelo fato de que o anticorpo anti-SIRPα bloqueador compreen- de um domínio variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma HVR-H1 que compreende uma sequência selecionada a partir do gru- po que consiste em SEQ ID NOs: 498-500, uma HVR-H2 que compre- ende a sequência da SEQ ID NO: 501 e uma HVR-H3 que compreen-
de a sequência da SEQ ID NO: 502; e um domínio variável de cadeia leve (VL) que compreende uma HVR-L1 que compreende a sequência da SEQ ID NO: 503, uma HVR-L2 que compreende a sequência da SEQ ID NO: 504 e uma HVR-L3 que compreende a sequência da SEQ ID NO: 505.
79. Conjugado, de acordo com a reivindicação 78, caracte- rizado pelo fato de que o anticorpo anti-SIRPα bloqueador compreen- de um domínio VH que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 490-495 e um domínio VL que compreende a sequência de SEQ ID NO: 496 ou 497.
80. Conjugado, de acordo com a reivindicação 77, caracte- rizado pelo fato de que o anticorpo anti-SIRPα bloqueador compreen- de um domínio variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma HVR-H1 que compreende uma sequência selecionada a partir do gru- po que consiste em SEQ ID NOs: 512-514, uma HVR-H2 que compre- ende a sequência da SEQ ID NO: 515, e uma HVR-H3 que compreen- de a sequência da SEQ ID NO: 516; e um domínio variável de cadeia leve (VL) que compreende uma HVR-L1 que compreende a sequência da SEQ ID NO: 517, uma HVR-L2 que compreende a sequência da SEQ ID NO: 518 e uma HVR-L3 que compreende a sequência da SEQ ID NO: 519.
81. Conjugado, de acordo com a reivindicação 80, caracte- rizado pelo fato de que o anticorpo anti-SIRPα bloqueador compreen- de um domínio VH que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 506-509 e um domínio VL que compreende a sequência de SEQ ID NO: 510 ou 511.
82. Conjugado, de acordo com a reivindicação 77, caracte- rizado pelo fato de que o anticorpo anti-SIRPα bloqueador compreen- de um domínio variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma HVR-H1 que compreende uma sequência selecionada a partir do gru-
po que consiste em SEQ ID NOs: 533-535, uma HVR-H2 que compre- ende a sequência da SEQ ID NO: 536, e uma HVR-H3 que compreen- de a sequência da SEQ ID NO: 537; e um domínio variável de cadeia leve (VL) que compreende uma HVR-L1 compreendendo uma se- quência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 538-542, uma HVR-L2 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 543 e uma HVR-L3 que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 544-546.
83. Conjugado, de acordo com a reivindicação 82, caracte- rizado pelo fato de que o anticorpo anti-SIRPα de bloqueio compreen- de um domínio VH que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 520-523 e um domínio VL que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 525-532.
84. Conjugado, de acordo com a reivindicação 76, caracte- rizado pelo fato de que a porção de direcionamento é um anticorpo anti-SIRPα de não bloqueio.
85. Conjugado, de acordo com a reivindicação 84, caracte- rizado pelo fato de que o anticorpo anti-SIRPα de não bloqueio com- preende um domínio variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma HVR-H1 compreendendo uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 554-556, uma HVR-H2 que com- preende a sequência de SEQ ID NO: 557, e uma HVR-H3 que com- preende a sequência de SEQ ID NO: 558; e um domínio variável de cadeia leve (VL) que compreende uma HVR-L1 que compreende a se- quência da SEQ ID NO: 559, uma HVR-L2 que compreende a sequên- cia da SEQ ID NO: 560 e uma HVR-L3 que compreende a sequência da SEQ ID NO: 561.
86. Conjugado, de acordo com a reivindicação 85, caracte- rizado pelo fato de que o anticorpo anti-SIRPα de não bloqueio com-
preende um domínio VH que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 547-550 e um domínio VL que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 551-553.
87. Conjugado, de acordo com a reivindicação 84, caracte- rizado pelo fato de que o anticorpo anti-SIRPα de não bloqueio com- preende um domínio VH que compreende a sequência da SEQ ID NO: 584 e um domínio VL que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 585, 562, e 563.
88. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 73, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anti- corpo anti-SIRPβ.
89. Conjugado, de acordo com a reivindicação 88, caracte- rizado pelo fato de que a porção de direcionamento é um anticorpo anti-SIRPβ de bloqueio.
90. Conjugado, de acordo com a reivindicação 88, caracte- rizado pelo fato de que a porção de direcionamento é um anticorpo anti-SIRPβ de não bloqueio.
91. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 73, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anti- corpo anti-SIRPγ.
92. Conjugado, de acordo com a reivindicação 91, caracte- rizado pelo fato de que a porção de direcionamento é um anticorpo anti-SIRPγ de bloqueio.
93. Conjugado, de acordo com a reivindicação 91, caracte- rizado pelo fato de que a porção de direcionamento é um anticorpo anti-SIRPγ de não bloqueio.
94. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 71 a 93, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreen- de uma região Fc humana.
95. Conjugado, de acordo com a reivindicação 94, caracte- rizado pelo fato de que a região Fc é uma região Fc de IgG1, IgG2 ou IgG4 humana.
96. Conjugado, de acordo com a reivindicação 94, caracte- rizado pelo fato de que a região Fc é: (i) uma região Fc de IgG1 humana compreendendo muta- ções L234A, L235A e G237A, de acordo com a numeração EU; (ii) uma região Fc de IgG1 humana compreendendo muta- ções L234A, L235A, G237A e N297A, de acordo com a numeração EU; (iii) uma região Fc de IgG1 humana compreendendo uma mutação N297A, de acordo com a numeração EU; (iv) uma região Fc de IgG1 humana compreendendo uma mutação D265A, de acordo com a numeração EU; (v) uma região Fc de IgG1 humana compreendendo muta- ções D265A e N297A, de acordo com a numeração EU; (vi) uma região Fc de IgG2 humana compreendendo muta- ções A330S e P331S, de acordo com a numeração EU; (vii) uma região Fc de IgG2 humana compreendendo as mutações A330S, P331S e N297A, de acordo com a numeração EU; (viii) uma região Fc de IgG2 humana compreendendo uma mutação N297A, de acordo com a numeração EU; (ix) uma região Fc de IgG4 humana compreendendo uma mutação S228P, de acordo com a numeração EU; (x) uma região Fc de IgG4 humana compreendendo muta- ções S228P e D265A, de acordo com a numeração EU; (xi) uma região Fc de IgG4 humana compreendendo as mu- tações S228P e L235E, de acordo com a numeração EU; (xii) uma região Fc de IgG4 humana compreendendo muta- ções S228P e N297A, de acordo com a numeração EU; ou
(xiii) uma região Fc de IgG4 humana compreendendo mu- tações S228P, E233P, F234V, L235A, delG236 e N297A, de acordo com a numeração EU.
97. Conjugado, de acordo com a reivindicação 94, caracte- rizado pelo fato de que a região Fc compreende uma sequência sele- cionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 564-578.
98. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 71 a 97, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreen- de um domínio constante de cadeia leve capa humana.
99. Conjugado, de acordo com a reivindicação 98, caracte- rizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio constante de cadeia leve que compreende a sequência de SEQ ID NO: 579.
100. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 71 a 97, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreen- de um domínio constante de cadeia leve lambda humana.
101. Conjugado, de acordo com a reivindicação 100, carac- terizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio cons- tante de cadeia leve que compreende a sequência de SEQ ID NO: 580 ou 581.
102. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 101, caracterizado pelo fato de que o ligante possui a es- trutura de: ou ; em que cada q é independentemente um número inteiro que varia de cerca de 0 a cerca de 50; cada r é independentemente um número in- teiro que varia de cerca de 0 a cerca de 50; o grupo amino está conec- tado a um resíduo de aminoácido na porção de direcionamento; e o grupo hidroxila está ligado a um fosforotioato internucleosídeo do poli- nucleotídeo imunomodulador.
103. Conjugado, de acordo com a reivindicação 102, carac- terizado pelo fato de que cada q é independentemente um número in- teiro que varia de 0 a cerca de 25.
104. Conjugado, de acordo com a reivindicação 102, carac- terizado pelo fato de que cada q é independentemente um número in- teiro que varia de cerca de 20 a cerca de 25.
105. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 102 a 104, caracterizado pelo fato de que cada r é indepen- dentemente um número inteiro que varia de 0 a cerca de 5.
106. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 101, caracterizado pelo fato de que o ligante possui a es- trutura de: ou ; em que cada q é independentemente um número inteiro que varia de cerca de 0 a cerca de 50; cada r é independentemente um número in- teiro que varia de cerca de 0 a cerca de 50; o grupo carbonila está co- nectado a um resíduo de aminoácido na porção de direcionamento; e o grupo hidroxila está ligado a um fosforotioato internucleosídeo do polinucleotídeo imunomodulador.
107. Conjugado, de acordo com a reivindicação 106, carac- terizado pelo fato de que cada q é independentemente um número in- teiro que varia de 0 a cerca de 25.
108. Conjugado, de acordo com a reivindicação 106, carac- terizado pelo fato de que cada q é independentemente um número in- teiro que varia de cerca de 5 a cerca de 10.
109. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 106 a 108, caracterizado pelo fato de que cada r é indepen- dentemente um número inteiro que varia de 0 a cerca de 5.
110. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 101, caracterizado pelo fato de que o ligante possui a es- trutura de: ; em que q é um número inteiro que varia de cerca de 0 a cerca de 50; r é um número inteiro que varia de cerca de 0 a cerca de 50; o grupo amino está conectado a um resíduo de aminoácido na porção de dire- cionamento; e o grupo hidroxila está ligado a um fosforotioato internu- cleosídeo do polinucleotídeo imunomodulador.
111. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 101, caracterizado pelo fato de que o ligante possui a es- trutura de: ; em que q é um número inteiro que varia de cerca de 0 a cerca de 50; r é um número inteiro que varia de cerca de 0 a cerca de 50; o grupo carbonila está conectado a um resíduo de aminoácido na porção de direcionamento; e o grupo hidroxila está ligado a um fosforotioato in-
ternucleosídeo do polinucleotídeo imunomodulador.
112. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 111, caracterizado pelo fato de que o conjugado anticorpo- nucleotídeo possui um DAR que varia de cerca de 1 a cerca de 8.
113. Conjugado, de acordo com a reivindicação 112, carac- terizado pelo fato de que o conjugado anticorpo-nucleotídeo possui um DAR de cerca de 1.
114. Conjugado, de acordo com a reivindicação 112, carac- terizado pelo fato de que o conjugado anticorpo-nucleotídeo possui um DAR que varia de cerca de 3 a cerca de 4.
115. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindi-
O
NH N N 5' X c g O N O
H O Ab N N
O 23 O
O
N O N O P O c g t g t c g t Z 3'
H
O O cações 1 a 114, caracterizado pelo fato de que possui a estrutura de: ou
O
NH N N 5' X c g O N O
H O Ab N N O t 23 O
O
N O N O P O c g t g t c g t Z 3'
H
O O ; em que c é 2’-desoxicitidina; g é 2’-desoxiguanosina; t é timidina; X é
5-bromo-2’-desoxiuridina; e Z é .
116. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 114, caracterizado pelo fato de que possui a estrutura de: ou em que s é um número inteiro de cerca de 3 ou cerca de 4; c é 2’- desoxicitidina; g é 2’-desoxiguanosine; t é timidina; X é 5-bromo-2’- desoxiuridina; e Z é .
117. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o conjugado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 116, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
118. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 117, caracterizada pelo fato de que a composição é formulada para administração parenteral.
119. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 117 ou 118, caracterizada pelo fato de que a composição é for- mulada como uma forma de dosagem única.
120. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 117 a 119, caracterizada pelo fato de que a composição é formulada como uma forma de dosagem intravenosa.
121. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 117 a 120, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um segundo agente terapêutico.
122. Método para tratar, prevenir ou melhorar um ou mais sintomas de uma doença proliferativa em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao indivíduo do conju- gado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 116.
123. Método, de acordo com a reivindicação 122, caracteri- zado pelo fato de que a doença proliferativa é o câncer.
124. Método de modulação de uma célula exterminadora natural em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao indivíduo do conjugado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 116.
125. Método para modular uma célula mieloide em um indi- víduo, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao indivíduo do conjugado, como definido em qualquer uma das reivindi- cações 1 a 116.
126. Método, de acordo com a reivindicação 125, caracteri- zado pelo fato de que a célula mieloide é um monócito.
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