JP2019513692A - 核酸キャリア及び治療上の使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
第1及び第2のオリゴヌクレオチドを含み;
ここで、前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドそれぞれの中央部分は互いに相補的であり、二本鎖領域を形成し、
前記第1のオリゴヌクレオチドの2つの末端部分は、前記第2のオリゴヌクレオチドの2つの末端部分と相補的ではなく、4つの末端アームを形成し;
第1単量体の第1の末端アームは第2単量体の末端アームにコンジュゲートされ、第1単量体の第2の末端アームは第3単量体の末端アームにコンジュゲートされ、第1単量体の第3の末端アームは第4単量体の末端アームにコンジュゲートされ、第1単量体の第4の末端アームは第5単量体の末端アームにコンジュゲートされ、12個の周辺末端アームを有する1層の核酸キャリアを形成しており;ならびに
前記単量体は少なくとも1つの周辺末端アームにコンジュゲートされた少なくとも1つの標的薬剤を含み、ここで、前記少なくとも1つの標的薬剤がmiRNAである場合、前記核酸キャリアが少なくとも1つの異なる標的薬剤を含む、前記核酸キャリア。
第1及び第2のオリゴヌクレオチドを含み;
ここで、前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドそれぞれの中央部分は互いに相補的であり、二本鎖領域を形成し、
前記第1のオリゴヌクレオチドの2つの末端部分は、前記第2のオリゴヌクレオチドの2つの末端部分と相補的ではなく、4つの末端アームを形成し;
第1単量体の第1の末端アームは第2単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第1単量体の第2の末端アームは第3単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第1単量体の第3の末端アームは第4単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第1単量体の第4の末端アームは第5単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ;第2単量体の第2の末端アームは第6単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第3単量体の第2の末端アームは第7単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第4単量体の第2の末端アームは第8単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第5単量体の第2の末端アームは第9単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第2単量体の第3の末端アームは第10単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第3単量体の第3の末端アームは第11単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、24個の周辺末端アームを有する1.5層の核酸キャリアを形成しており;ならびに前記単量体は少なくとも1つの周辺末端アームにコンジュゲートされた少なくとも1つの標的薬剤を含み、ここで、前記少なくとも1つの標的薬剤がmiRNAである場合、前記核酸キャリアが少なくとも1つの異なる標的薬剤を含む、前記核酸キャリア。
第1及び第2のオリゴヌクレオチドを含み;
ここで、前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドそれぞれの中央部分は互いに相補的であり、二本鎖領域を形成し、
前記第1のオリゴヌクレオチドの2つの末端部分は、前記第2のオリゴヌクレオチドの2つの末端部分と相補的ではなく、4つの末端アームを形成し;
第1単量体の第1の末端アームは第2単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第1単量体の第2の末端アームは第3単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第1単量体の第3の末端アームは第4単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第1単量体の第4の末端アームは第5単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ;第2単量体の第2の末端アームは第6単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第3単量体の第2の末端アームは第7単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第4単量体の第2の末端アームは第8単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第5単量体の第2の末端アームは第9単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第2単量体の第3の末端アームは第10単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第3単量体の第3の末端アームは第11単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第4単量体の第3の末端アームは第12単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第5単量体の第3の末端アームは第13単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第2単量体の第4の末端アームは第14単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第3単量体の第4の末端アームは第15単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第4単量体の第4の末端アームは第16単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第5単量体の第4の末端アームは第17単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、36個の周辺末端アームを有する2層の核酸キャリアを形成しており;ならびに
前記単量体は少なくとも1つの周辺末端アームにコンジュゲートされた少なくとも1つの標的薬剤を含み、ここで、前記少なくとも1つの標的薬剤がmiRNAである場合、前記核酸キャリアが少なくとも1つの異なる標的薬剤を含む、前記核酸キャリア。
ここで、前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドそれぞれの中央部分は互いに相補的であり、二本鎖領域を形成し、
前記第1のオリゴヌクレオチドの2つの末端部分は、前記第2のオリゴヌクレオチドの2つの末端部分と相補的ではなく、4つの末端アームを形成し;
第1単量体の第1の末端アームは第2単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第1単量体の第2の末端アームは第3単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第1単量体の第3の末端アームは第4単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第1単量体の第4の末端アームは第5単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ;第2単量体の第2の末端アームは第6単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第3単量体の第2の末端アームは第7単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第4単量体の第2の末端アームは第8単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第5単量体の第2の末端アームは第9単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第2単量体の第3の末端アームは第10単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第3単量体の第3の末端アームは第11単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第4単量体の第3の末端アームは第12単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第5単量体の第3の末端アームは第13単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第2単量体の第4の末端アームは第14単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第3単量体の第4の末端アームは第15単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第4単量体の第4の末端アームは第16単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第5単量体の第4の末端アームは第17単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ;
第6単量体の第2の末端アームは第18単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第7単量体の第2の末端アームは第19単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第8単量体の第2の末端アームは第20単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第9単量体の第2の末端アームは第21単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第10単量体の第2の末端アームは第22単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第11単量体の第2の末端アームは第23単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第12単量体の第2の末端アームは第24単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第13単量体の第2の末端アームは第25単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第14単量体の第2の末端アームは第26単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第15単量体の第2の末端アームは第27単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第16単量体の第2の末端アームは第28単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第17単量体の第2の末端アームは第29単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、
第6単量体の第3の末端アームは第30単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第7単量体の第3の末端アームは第31単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第8単量体の第3の末端アームは第32単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第9単量体の第3の末端アームは第33単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第10単量体の第3の末端アームは第34単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第11単量体の第3の末端アームは第35単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、
72個の周辺末端アームを有する2.5層の核酸キャリアを形成しており;ならびに
前記単量体は少なくとも1つの周辺末端アームにコンジュゲートされた少なくとも1つの標的薬剤を含み、ここで、前記少なくとも1つの標的薬剤がmiRNAである場合、前記核酸キャリアが少なくとも1つの異なる標的薬剤を含む、前記核酸キャリア。
第1及び第2のオリゴヌクレオチドを含み;
ここで、前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドそれぞれの中央部分は互いに相補的であり、二本鎖領域を形成し、
前記第1のオリゴヌクレオチドの2つの末端部分は、前記第2のオリゴヌクレオチドの2つの末端部分と相補的ではなく、4つの末端アームを形成し;
第1単量体の第1の末端アームは第2単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第1単量体の第2の末端アームは第3単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第1単量体の第3の末端アームは第4単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第1単量体の第4の末端アームは第5単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ;第2単量体の第2の末端アームは第6単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第3単量体の第2の末端アームは第7単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第4単量体の第2の末端アームは第8単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第5単量体の第2の末端アームは第9単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第2単量体の第3の末端アームは第10単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第3単量体の第3の末端アームは第11単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第4単量体の第3の末端アームは第12単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第5単量体の第3の末端アームは第13単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第2単量体の第4の末端アームは第14単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第3単量体の第4の末端アームは第15単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第4単量体の第4の末端アームは第16単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第5単量体の第4の末端アームは第17単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ;
第6単量体の第2の末端アームは第18単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第7単量体の第2の末端アームは第19単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第8単量体の第2の末端アームは第20単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第9単量体の第2の末端アームは第21単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第10単量体の第2の末端アームは第22単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第11単量体の第2の末端アームは第23単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第12単量体の第2の末端アームは第24単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第13単量体の第2の末端アームは第25単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第14単量体の第2の末端アームは第26単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第15単量体の第2の末端アームは第27単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第16単量体の第2の末端アームは第28単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第17単量体の第2の末端アームは第29単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、
第6単量体の第3の末端アームは第30単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第7単量体の第3の末端アームは第31単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第8単量体の第3の末端アームは第32単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第9単量体の第3の末端アームは第33単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第10単量体の第3の末端アームは第34単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第11単量体の第3の末端アームは第35単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第12単量体の第3の末端アームは第36単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第13単量体の第3の末端アームは第37単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第14単量体の第3の末端アームは第38単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第15単量体の第3の末端アームは第39単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第16単量体の第3の末端アームは第40単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第17単量体の第3の末端アームは第41単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ;
第6単量体の第4の末端アームは第42単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第7単量体の第4の末端アームは第43単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第8単量体の第4の末端アームは第44単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第9単量体の第4の末端アームは第45単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第10単量体の第4の末端アームは第46単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第11単量体の第4の末端アームは第47単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第12単量体の第4の末端アームは第48単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第13単量体の第4の末端アームは第49単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第14単量体の第4の末端アームは第50単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第15単量体の第4の末端アームは第51単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第16単量体の第4の末端アームは第52単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第17単量体の第4の末端アームは第53単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ;
108個の周辺末端アームを有する3層の核酸キャリアを形成しており;ならびに
前記単量体は少なくとも1つの周辺末端アームにコンジュゲートされた少なくとも1つの標的薬剤を含み、ここで、前記少なくとも1つの標的薬剤がmiRNAである場合、前記核酸キャリアが少なくとも1つの異なる標的薬剤を含む、前記核酸キャリア。
HER2に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD64に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
EGFRに対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD64に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
EGFRに対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、PD−1に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
PD−L1に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、OX40に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
CD30に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD16に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
HER2に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD3に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
CD20に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD3に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
EpCAMに対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD3に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
NG2に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD28に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
CD19に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD3に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
CD19に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD16に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
CEAに対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、HSGに対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
MUC−1に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、HSGに対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
CA19−9に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD3に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
CEAに対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD3に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
OCAAに対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD3に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
MAPGに対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD28に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
HER2に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD16に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
神経膠腫に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD3に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
葉酸または葉酸受容体である第1の標的薬剤と、CD3またはCD16に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;及び
PD−1に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、PDL−1またはPDL−2に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤。
前記がんが乳癌、卵巣癌、または前立腺癌である、HER2に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD64に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;前記がんが固形腫瘍、肺癌、または結腸癌である、EGFRに対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD64に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;前記がんがトリプルネガティブ乳癌である、EGFRに対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、PD−1に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
前記がんが乳癌である、PD−L1に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、OX−40に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
前記がんがホジキン病である、CD30に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD16に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
前記がんが転移性乳癌または前立腺癌である、HER2に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD3に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
前記がんが非ホジキンリンパ腫または多発性骨髄腫である、CD20に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD3に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
前記がんが、卵巣癌、胃癌、結腸癌、結腸直腸癌、乳癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、小細胞肺癌である、EpCAMに対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD3に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
前記がんが黒色腫である、NG2に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD28に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
前記がんが、前駆B細胞急性リンパ性白血病または非ホジキンリンパ腫である、CD19に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD3に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
前記がんが非ホジキンリンパ腫である、CD19に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD16に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
前記がんが、結腸癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、卵巣癌、子宮癌、乳癌、または黒色腫である、CEAに対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、HSGに対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
前記がんが浸潤性膵腺癌である、MUC−1に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、HSGに対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
前記がんがCA19−9陽性腫瘍である、CA19−9に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD3に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
前記がんが卵巣癌である、CEAに対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD3に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
前記がんが卵巣癌である、OCAAに対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD3に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
前記がんが転移性黒色腫である、MAPGに対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD28に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
前記がんがHER−2陽性腫瘍である、HER2に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD16に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
前記がんが神経膠腫である、神経膠腫に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD3に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
及び前記がんが、小細胞肺癌、乳癌、または卵巣癌である、葉酸または葉酸受容体である第1の標的薬剤と、CD3またはCD16に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤を含む、実施形態102〜111のいずれか1つの方法。
以下の合成DNA鎖をポリプロピレンチューブに等量添加して、示した単量体を組み立てた:A単量体:鎖1及び2;B’単量体:鎖3及び4;ならびにB’’単量体:鎖4及び5。適量の生理食塩水緩衝液を単量体調製物に添加した。単量体調製物を70℃超まで加熱し、徐々に室温まで冷却させた。
A単量体の量に対して、それぞれ2.0モル質量のB’単量体及びB’’単量体を添加した。4,5,8トリメチルソラレンを添加して十分に混合し、42℃で30分間インキュベートした。調製物にUVA光を照射した。調製物を4℃で30分間冷却し、4℃、1500xGで10分間遠心分離して、沈殿した4,5,8トリメチルソラレンを除去した。
分画遠心分離法を用いて、取り込まれていない成分及び残留架橋試薬から最終的な1層生成物を分離した。
以下の合成DNA鎖をポリプロピレンチューブに等量添加して、示した単量体を組み立てた:A単量体:鎖1及び2;B’単量体:鎖3及び4;B’’単量体:鎖4及び5;C’単量体:鎖2及び6。適量の生理食塩水緩衝液を単量体調製物に添加した。単量体調製物を70℃超まで加熱し、徐々に室温まで冷却させた。
A単量体の量に対して、それぞれ2.0モル質量のB’単量体及びB’’単量体を添加した。4,5,8トリメチルソラレンを添加して十分に混合し、42℃で30分間インキュベートした。調製物にUVA光を照射した。調製物を4℃で30分間冷却し、4℃、1500xGで10分間遠心分離して、沈殿した4,5,8トリメチルソラレンを除去した。
1層調製物に、1.2モル質量のC’単量体を添加した。4,5,8トリメチルソラレンを添加して十分に混合し、42℃で30分間インキュベートした。調製物にUVA光を照射した。調製物を4℃で30分間冷却し、4℃、1500xGで10分間遠心分離した。
分画遠心分離法を用いて、取り込まれていない成分及び残留架橋試薬から最終的な1.5層生成物を分離した。
以下の合成DNA鎖をポリプロピレンチューブに等量添加して、示した単量体を組み立てた:A単量体:鎖1及び2;B’単量体:鎖3及び4;B’’単量体:鎖4及び5;C’単量体:鎖2及び6;ならびにC’’単量体:鎖2及び7。適量の生理食塩水を単量体調製物に添加した。単量体調製物を70℃超まで加熱し、徐々に室温まで冷却させた。
A単量体の量に対して、それぞれ2.0モル質量のB’単量体及びB’’単量体を添加した。4,5,8トリメチルソラレンを添加して十分に混合し、42℃で30分間インキュベートした。調製物にUVA光を照射した。調製物を4℃で30分間冷却し、4℃、1500xGで10分間遠心分離して、沈殿した4,5,8トリメチルソラレンを除去した。
1層調製物に、それぞれ1.2モル質量のC’単量体及びC’’単量体を添加した。4,5,8トリメチルソラレンを添加して十分に混合し、42℃で30分間インキュベートした。調製物にUVA光を照射した。調製物を4℃で30分間冷却し、4℃、1500x
Gで10分間遠心分離した。
分画遠心分離法を用いて、取り込まれていない成分及び残留架橋試薬から最終的な2層生成物を分離した。
2.5層の核酸キャリアの組み立て:
実施例3で得た2層調製物に、それぞれ1.1モル質量のB’単量体を添加した。4,5,8トリメチルソラレンを添加して十分に混合し、42℃で30分間インキュベートした。調製物にUVA光を照射した。調製物を4℃で30分間冷却し、4℃、1500xGで10分間遠心分離した。実施例1に示すように、2.5層の核酸キャリアの精製を行った。
3層の核酸キャリアの組み立て:
実施例3で得た2層調製物に、それぞれ1.1モル質量のB’単量体及びB’’単量体を添加した。4,5,8トリメチルソラレンを添加して十分に混合し、42℃で30分間インキュベートした。調製物にUVA光を照射した。調製物を4℃で30分間冷却し、4℃、1500xGで10分間遠心分離した。実施例1に示すように、3層の核酸キャリアの精製を行った。
3層の核酸キャリアの組み立て:
最終精製工程を除き、実施例5に記載の工程を実施した。
3層調製物に、それぞれ1.02モル質量のC’単量体及びC’’単量体を添加した。4,5,8トリメチルソラレンを添加して十分に混合し、42℃で30分間インキュベートした。調製物にUVA光を照射した。調製物を4℃で30分間冷却し、4℃、1500xGで10分間遠心分離した。実施例1に示すように、4層の核酸キャリアの精製を行った。
抗EPCAMオリゴヌクレオチドコンジュゲートの調製:
DNA単量体の2種類のオープンssDNA配列に相補的である、チオール末端標識DNAオリゴヌクレオチド(OligoA)と抗EpCAMとのコンジュゲーション:
2つの抗体のそれぞれを含有する緩衝液を、標準緩衝液交換用スピンカラムを使用して1倍PBSに交換する。
DNA OligoAを抗EPCAMに添加して、抗EPCAM−OligoAコンジュゲートを形成する
コンジュゲーションを室温で1時間進行させる。
400mLのポリプロピレンチューブ(または同等品)に以下を入れる:
上記で調製した1.00mgの2層コアデンドリマー試薬;
0.375mgのEpCAMオリゴヌクレオチドコンジュゲート;
末端アーム配列(31量体)に相補的な0.250mgのCy3標識DNAオリゴヌクレオチド;
3mLの10倍PBS、pH7.4(水性);及び
全量30mLにするための水(次の試薬の添加前)。
1ウェルあたり1.0×106のOVCAR細胞を、8ウェル顕微鏡スライドの8ウェルそれぞれに移し、37℃でインキュベートする。標準法に従って、2%パラホルムアルデヒドを使用して細胞を固定する。パラホルムアルデヒドをPBSに置換し、細胞を使用する準備が整うまで4℃で保存する。
工程1:DNA単量体の2種類のオープンssDNA配列に相補的である、チオール末端標識DNAオリゴヌクレオチド(OligoA及びOligoB)と2つの抗体(抗EpCAM及び抗CD3)とのコンジュゲーション
2つの抗体のそれぞれを含有する緩衝液を、標準緩衝液交換用スピンカラムを使用して1倍PBSに交換する。
DNA OligoAを抗EPCAMに添加して、抗EPCAM−OligoAコンジュゲートを形成する
DNA OligoBを抗CD3に添加して、抗CD3−OligoBコンジュゲートを形成する
コンジュゲーションを室温で1時間進行させる。
5つの97量体DNAオリゴヌクレオチドを設計し、民間のDNA合成会社(例えば、IDT)から注文した。オリゴヌクレオチドは、31ヌクレオチドを含む各オリゴヌクレオチドの中央部分に位置する相補的な配列領域を共有するように設計した。2つのオリゴヌクレオチドをアニーリングして単量体を形成することで得られる構造は、2種類の配列の4本の一本鎖アームが隣接する中央の二本鎖領域(すなわち、「くびれ」)を有すると表現することができる。以下の合成DNAオリゴヌクレオチドをポリプロピレンチューブに等量添加して、示した単量体を組み立てた:A単量体:鎖1及び2;B’単量体:鎖3及び4;ならびにB’’単量体:鎖4及び5。適量の生理食塩水緩衝液を単量体調製物に添加した。単量体調製物を70℃超まで加熱し、徐々に室温まで冷却させた。
A単量体の量に対して、それぞれ2.0モル質量のB’単量体及びB’’単量体を添加した。4,5,8トリメチルソラレンを添加して十分に混合し、42℃で30分間インキュベートした。調製物にUVA光を照射した。調製物を4℃で30分間冷却し、4℃、1500xGで10分間遠心分離して、沈殿した4,5,8トリメチルソラレンを除去した。
分画遠心分離法を用いて、取り込まれていない成分及び残留架橋試薬から最終的な1層生成物を分離した。
1層アセンブリには、先の抗EPCAM抗体及び抗CD3抗体とのコンジュゲーションに利用したOligoA配列及びOligoB配列に相補的な2種類の配列の2つの外側「アーム」を有する。上記の抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを含む2つの72量体オリゴヌクレオチドとアームとの塩基対形成は、化学量論的濃度の抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを、先に組み立てた1層DNA核酸キャリアに加えることによって成される。
2000ng/μLの1層水溶液 100.0μL(200,000ng)
10倍PBS 30.0μL
ヌクレアーゼフリー水 30.0μL
オリゴ1250ng/μL相当の抗EPCAM−OligoAコンジュゲート 70.0μL(オリゴ87,500ng相当)
オリゴ1250ng/μL相当の抗CD3−OligoBコンジュゲート 70.0μL(オリゴ87,500ng相当)
全反応物を一緒に添加し、37℃で10分間穏やかに加熱した後、徐々に室温まで冷却する。
結合の確認:OVCAR3(EPCAM陽性)、A2780(EPCAM陰性)、及び末梢血単核細胞(PMBC)を用いて抗体結合を測定する。総量1x106個の細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS;137mmol/L NaCl、2.7mmol/L KCl、10mmol/L Na2HPO4、及び2mmol/L KH2PO4)で洗浄し、100μlのEPCAM/CD3 1層(PBS中、抗体100μg/ml相当)と室温で30分間インキュベートした後、PBSで2回洗浄する。ヒトIgGに対するフルオレセインイソチオシアネートコンジュゲート抗体を使用して、EPCAM/CD3 1層を検出する。抗体を1:200に希釈し、室温で30分かけて細胞に添加する。蛍光活性化細胞選別法を用いて細胞を分析する。
工程1:DNA単量体の2種類のオープンssDNA配列に相補的である、チオール末端標識DNAオリゴヌクレオチド(OligoA及びOligoB)と2つの抗体(抗EpCAM及び抗CD3)とのコンジュゲーション
2つの抗体のそれぞれを含有する緩衝液を、標準緩衝液交換用スピンカラムを使用して1倍PBSに交換する。
DNA OligoAを抗EPCAMに添加して、抗EPCAM−OligoAコンジュゲートを形成する
DNA OligoBを抗CD3に添加して、抗CD3−OligoBコンジュゲートを形成する
コンジュゲーションを室温で1時間進行させる。
7つの97量体DNAオリゴヌクレオチドを設計し、民間のDNA合成会社(例えば、IDT)から注文した。オリゴヌクレオチドは、31ヌクレオチドを含む各オリゴヌクレオチドの中央部分に位置する相補的な配列領域を共有するように設計した。2つのオリゴヌクレオチドをアニーリングして単量体を形成することで得られる構造は、2種類の配列の4本の一本鎖アームが隣接する中央の二本鎖領域(すなわち、「くびれ」)を有すると表現することができる。以下の合成DNAオリゴヌクレオチドをポリプロピレンチューブに等量添加して、示した単量体を組み立てた:A単量体:鎖1及び2;B’単量体:鎖3及び4;B’’単量体:鎖4及び5;C’単量体:鎖6及び2;ならびにC’’単量体:鎖7及び2。適量の生理食塩水緩衝液を単量体調製物に添加した。単量体調製物を70℃超まで加熱し、徐々に室温まで冷却させた。
A単量体の量に対して、それぞれ2.0モル質量のB’単量体及びB’’単量体を添加した。4,5,8トリメチルソラレンを添加して十分に混合し、42℃で30分間インキュベートした。調製物にUVA光を照射した。調製物を4℃で30分間冷却し、4℃、1500xGで10分間遠心分離して、沈殿した4,5,8トリメチルソラレンを除去した。
分画遠心分離法を用いて、取り込まれていない成分及び残留架橋試薬から最終的な2層生成物を分離した。
2層アセンブリには、先の抗EPCAM抗体及び抗CD3抗体とのコンジュゲーションに利用したOligoA配列及びOligoB配列に相補的な2種類の配列の2つの外側アームを有する。上記の抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを含む2つの72量体オリゴヌクレオチドとアームとの塩基対形成は、化学量論的濃度の抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを、先に組み立てた2層DNA核酸キャリアに加えることによって成される。
2000ng/μLの2層水溶液 100.0μL(200,000ng)
10倍PBS 30.0μL
ヌクレアーゼフリー水 30.0μL
オリゴ1120ng/μL相当の抗EPCAM−OligoAコンジュゲート 70.0μL(オリゴ78,400ng相当)
オリゴ1120ng/μL相当の抗CD3−OligoBコンジュゲート 70.0μL(オリゴ78,400ng相当)
全反応物を一緒に添加し、37℃で10分間穏やかに加熱した後、徐々に室温まで冷却する。
結合の確認:OVCAR3(EPCAM陽性)、A2780(EPCAM陰性)、及び末梢血単核細胞(PMBC)を用いて抗体結合を測定する。総量1x106個の細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS;137mmol/L NaCl、2.7mmol/L KCl、10mmol/L Na2HPO4、及び2mmol/L KH2PO4)で洗浄し、100μlのEPCAM/CD3 2層(PBS中、抗体100μg/ml相当)と室温で30分間インキュベートした後、PBSで2回洗浄する。ヒトIgGに対するフルオレセインイソチオシアネートコンジュゲート抗体を使用して、EPCAM/CD3 2層を検出する。抗体を1:200に希釈し、室温で30分かけて細胞に添加する。蛍光活性化細胞選別法を用いて細胞を分析する。
工程1:DNA単量体の3種類のオープンssDNA配列に相補的である、チオール末端標識DNAオリゴヌクレオチド(OligoA、OligoB、及びOligoC)と3つの抗体(抗EPCAM、抗CD3、及び抗PD1)とのコンジュゲーション
2つの抗体のそれぞれを含有する緩衝液を、標準緩衝液交換用スピンカラムを使用して1倍PBSに交換する。
DNA OligoAを抗EPCAMに添加して、抗EPCAM−OligoAコンジュゲートを形成する
DNA OligoBを抗CD3に添加して、抗CD3−OligoBコンジュゲートを形成する
DNA OligoCを抗PD−1に添加して、抗CD19−OligoCコンジュゲートを形成する
コンジュゲーションを室温で1時間進行させる。
7つの97量体DNAオリゴヌクレオチドを設計し、民間のDNA合成会社(例えば、IDT)から注文した。オリゴヌクレオチドは、31ヌクレオチドを含む各オリゴヌクレオチドの中央部分に位置する相補的な配列領域を共有するように設計した。2つのオリゴヌクレオチドをアニーリングして単量体を形成することで得られる構造は、2種類の配列の4本の一本鎖アームが隣接する中央の二本鎖領域(すなわち、「くびれ」)を有すると表現することができる。以下の合成DNAオリゴヌクレオチドをポリプロピレンチューブに等量添加して、示した単量体を組み立てた:A単量体:鎖1及び2;B’単量体:鎖3及び4;B’’単量体:鎖4及び5;C’単量体:鎖6及び2;ならびにC’’単量体:鎖7及び2。適量の生理食塩水緩衝液を単量体調製物に添加した。単量体調製物を70℃超まで加熱し、徐々に室温まで冷却させた。
A単量体の量に対して、それぞれ2.0モル質量のB’単量体及びB’’単量体を添加した。4,5,8トリメチルソラレンを添加して十分に混合し、42℃で30分間インキュベートした。調製物にUVA光を照射した。調製物を4℃で30分間冷却し、4℃、1500xGで10分間遠心分離して、沈殿した4,5,8トリメチルソラレンを除去した。
分画遠心分離法を用いて、取り込まれていない成分及び残留架橋試薬から最終的な1.5層生成物を分離した。
1.5層アセンブリには、先の抗EPCAM抗体、抗CD3抗体、及び抗PD−1抗体とのコンジュゲーションに利用したOligoA配列、OligoB配列、及びOligoC配列に相補的な3種類の配列の3つの外側アームを有する。上記の抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを含む2つの72量体オリゴヌクレオチドとアームとの塩基対形成は、化学量論的濃度の抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを、先に組み立てた1.5層DNA核酸キャリアに加えることによって成される。
2000ng/μLの2層水溶液 100.0μL(200,000ng)
10倍PBS 30.0μL
ヌクレアーゼフリー水 20.0μL
オリゴ800ng/μL相当の抗EPCAM−OligoAコンジュゲート 50.0μL(オリゴ40,000ng相当)
オリゴ800ng/μL相当の抗CD3−OligoBコンジュゲート 50.0μL(オリゴ40,000ng相当)
オリゴ800ng/μL相当の抗PD1−OligoCコンジュゲート 50.0μL(オリゴ40,000ng相当)
全反応物を一緒に添加し、37℃で10分間穏やかに加熱した後、徐々に室温まで冷却する。
結合の確認:OVCAR3(EPCAM陽性)、A2780(EPCAM陰性)、及び末梢血単核細胞(PMBC)を用いて抗体結合を測定する。総量1x106個の細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS;137mmol/L NaCl、2.7mmol/L KCl、10mmol/L Na2HPO4、及び2mmol/L KH2PO4)で洗浄し、100μlのEPCAM/CD3/PD−1 1.5層(PBS中、抗体100μg/ml相当)と室温で30分間インキュベートした後、PBSで2回洗浄する。ヒトIgGに対するフルオレセインイソチオシアネートコンジュゲート抗体を使用して、EPCAM/CD3/PD−1 1.5層を検出する。抗体を1:200に希釈し、室温で30分かけて細胞に添加する。蛍光活性化細胞選別法を用いて細胞を分析する。
工程1:DNA単量体の2種類のオープンssDNA配列に相補的である、チオール末端標識DNAオリゴヌクレオチド(OligoA及びOligoB)と抗デクチン−1抗体及びオボアルブミンとのコンジュゲーション
2つの抗体のそれぞれを含有する緩衝液を、標準緩衝液交換用スピンカラムを使用して1倍PBSに交換する。
DNA OligoAを抗デクチン−1に添加して、抗デクチン−1−OligoAコンジュゲートを形成する
DNA OligoBをオボアルブミンに添加して、オボアルブミン−OligoBコンジュゲートを形成する
コンジュゲーションを室温で1時間進行させる。
7つの97量体DNAオリゴヌクレオチドを設計し、民間のDNA合成会社(例えば、IDT)から注文した。オリゴヌクレオチドは、31ヌクレオチドを含む各オリゴヌクレオチドの中央部分に位置する相補的な配列領域を共有するように設計した。2つのオリゴヌクレオチドをアニーリングして単量体を形成することで得られる構造は、2種類の配列の4本の一本鎖アームが隣接する中央の二本鎖領域(すなわち、「くびれ」)を有すると表現することができる。以下の合成DNAオリゴヌクレオチドをポリプロピレンチューブに等量添加して、示した単量体を組み立てた:A単量体:鎖1及び2;B’単量体:鎖3及び4;B’’単量体:鎖4及び5;C’単量体:鎖6及び2;ならびにC’’単量体:鎖7及び2。適量の生理食塩水緩衝液を単量体調製物に添加した。単量体調製物を70℃超まで加熱し、徐々に室温まで冷却させた。
A単量体の量に対して、それぞれ2.0モル質量のB’単量体及びB’’単量体を添加した。4,5,8トリメチルソラレンを添加して十分に混合し、42℃で30分間インキュベートした。調製物にUVA光を照射した。調製物を4℃で30分間冷却し、4℃、1500xGで10分間遠心分離して、沈殿した4,5,8トリメチルソラレンを除去した。
分画遠心分離法を用いて、取り込まれていない成分及び残留架橋試薬から最終的な1.5層生成物を分離した。
1.5層DNA核酸キャリアの第3の利用可能なアーム(oligoC)に相補的な31塩基を有するオリゴヌクレオチドを設計した。CpG含有オリゴヌクレオチド5’−tcgtcgttttgtcgttttgtcgt−3’(配列番号4)の3’末端に31塩基を付加したものを、民間のDNA合成会社(例えば、IDT)から注文した。
1.5層アセンブリには、先の抗デクチン−1、オボアルブミン、及びCpGオリゴヌクレオチド成分とのコンジュゲーションまたは結合に利用したOligoA配列、OligoB配列、及びOligoC配列に相補的な3種類の配列の3つの外側アームを有する。上記のコンジュゲートを含む2つの72量体オリゴヌクレオチドとアームとの塩基対形成は、化学量論的濃度のコンジュゲートまたはCpGオリゴヌクレオチドを、先に組み立てた1.5層DNAデンドリマーに加えることによって成される。
2000ng/μLの2層水溶液 100.0μL(200,000ng)
10倍PBS 30.0μL
ヌクレアーゼフリー水 20.0μL
オリゴ800ng/μL相当の抗デクチン−1−OligoAコンジュゲート 50.0μL(オリゴ40,000ng相当)
オリゴ800ng/μL相当のオボアルブミン−OligoBコンジュゲート 50.0μL(オリゴ40,000ng相当)
オリゴ600ng/μL相当のCpG−OligoC 50.0μL(オリゴ30,000ng相当)
全反応物を一緒に添加し、37℃で10分間穏やかに加熱した後、徐々に室温まで冷却する。
PO単量体の調製:
以下の合成PO−DNA鎖をポリプロピレンチューブに等量添加して、示した単量体を組み立てた:A単量体−PO:PO鎖1及び2;B’単量体−PO:PO鎖3及び4;ならびにB’’単量体−PO:PO鎖4及び5。適量の生理食塩水緩衝液を単量体調製物に添加した。単量体調製物を70℃超まで加熱し、徐々に室温まで冷却させた。
A単量体−POの量に対して、それぞれ2.0モル質量のB’−PO単量体及びB’’−PO単量体を添加した。4,5,8トリメチルソラレンを添加して十分に混合し、42℃で30分間インキュベートした。調製物にUVA光を照射した。調製物を4℃で30分間冷却し、4℃、1500xGで10分間遠心分離して、沈殿した4,5,8トリメチルソラレンを除去した。
分画遠心分離法を用いて、取り込まれていない成分及び残留架橋試薬から最終的な1層生成物を分離した。
以下の合成PS−DNA鎖をポリプロピレンチューブに等量添加して、示した単量体を組み立てた:C’単量体−PS:PS鎖2及び6;ならびにC’’単量体−PS:PS鎖2及び7。適量の生理食塩水を単量体調製物に添加した。単量体調製物を70℃超まで加熱し、徐々に室温まで冷却させた。
1層PO調製物に、それぞれ1.2モル質量のC’−PS単量体及びC’’−PS単量体を添加した。4,5,8トリメチルソラレンを添加して十分に混合し、42℃で30分間インキュベートした。調製物にUVA光を照射した。調製物を4℃で30分間冷却し、4℃、1500xGで10分間遠心分離した。
分画遠心分離法を用いて、取り込まれていない成分及び残留架橋試薬から最終的な2層生成物を分離した。
PO単量体の調製:
以下の合成PO−DNA鎖をポリプロピレンチューブに等量添加して、示した単量体を組み立てた:A単量体−PO:PO鎖1及び2;B’単量体−PO:PO鎖3及び4;ならびにB’’単量体−PO:PO鎖4及び5。適量の生理食塩水緩衝液を単量体調製物に添加した。単量体調製物を70℃超まで加熱し、徐々に室温まで冷却させた。
A単量体−POの量に対して、それぞれ2.0モル質量のB’−PO単量体及びB’’−PO単量体を添加した。4,5,8トリメチルソラレンを添加して十分に混合し、42℃で30分間インキュベートした。調製物にUVA光を照射した。調製物を4℃で30分間冷却し、4℃、1500xGで10分間遠心分離して、沈殿した4,5,8トリメチルソラレンを除去した。
分画遠心分離法を用いて、取り込まれていない成分及び残留架橋試薬から最終的な1層生成物を分離した。
1つおきに塩基がホスホロチオエートである合成DNA鎖(PSEO)を合成する。以下の合成PSEO−DNA鎖をポリプロピレンチューブに等量添加して、示した単量体を組み立てた:C’単量体−PSEO:PSEO鎖2及び6;ならびにC’’単量体−PSEO:PSEO鎖2及び7。適量の生理食塩水を単量体調製物に添加した。単量体調製物を70℃超まで加熱し、徐々に室温まで冷却させた。
1層PO調製物に、それぞれ1.2モル質量のC’−PSEO単量体及びC’’−PSEO単量体を添加した。4,5,8トリメチルソラレンを添加して十分に混合し、42℃で30分間インキュベートした。調製物にUVA光を照射した。調製物を4℃で30分間冷却し、4℃、1500xGで10分間遠心分離した。
この物質は上記のように調製した。
各2層の核酸キャリア(PO及びPO/PSEO)5μgをPBSと混合した後、25μlのマウス血清を入れたマイクロ遠心管に加え、全容量を最大100μlにする。最初の開始点を4時間時点とし、それから2時間後を2時間時点とし、それから1時間後を1時間時点とするなどにより、4時間後に全時点が適切な時間間隔で同時に終了するようにした。Qiagenミニプレップキット(P/N 12381)製の緩衝液を用いて全試料に直ちにアルカリ溶解工程を実施し、緩衝液1(100μl)、緩衝液2(200μl)、及び緩衝液3(350μl)の各緩衝液を添加後すぐにチューブを反転させた。緩衝液を順次添加し、緩衝液を3つすべて添加した後、チューブを10秒間ボルテックスした。次いで、チューブを65℃で5分間インキュベートした。チューブを12,000gで3分間遠心分離し、白濁した物質を除去して、上清を新しいチューブに移した。1倍量のホルムアミド(約700μl)を各チューブに添加した。適切に混合されるようにチューブを数回反転させた。次いで、チューブを65℃でさらに5分間インキュベートした。1倍量のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコールを各試料に添加した。チューブを30秒間ボルテックスした後、12,000gで5分間遠心分離し、水層を取り出して、新しいチューブに移した。次に、酢酸ナトリウム(NaOAc)エタノール沈殿を、1/10容量の3M NaOAc、続いて2.5容量のエタノールを添加することにより実施した。試料を4℃、12,000gで30分間遠心分離し、ごくわずかな小さいペレットが無傷の状態を保つように液体を注意深く除去した。ペレットを70%エタノール(100μl)で洗浄し、12,000gで5分間遠心分離した。70%エタノール洗浄液を注意深く除去し、キャップを開いたままチューブを37℃のインキュベーターに入れ、試料を約10分間乾燥させた。ペレットを30μlのPBSに再懸濁させ、DNA濃度をNanoDropで測定し、各時点の試料約2μlをLonza Pre−cast Fast 1.2%アガロースゲルにロードした。
EGFR−MMAE抗体薬物コンジュゲート(ADC)の調製:
モノメチルアウリスタチン(MMAE)は、チューブリンの重合を阻害する抗有糸分裂剤である。MMAEは、マレイミド結合によって抗体のシステインと結合されており、いったん細胞に送達されると細胞内のプロテアーゼによって切断される。MMAEを、上皮細胞接着分子(EPCAM)を認識する抗体と結合した。EPCAMモノクローナル抗体(mAb)はBioXCellから入手し、Amicon Spinフィルター(100kD MWCO、Millipore)を使用してPBS(pH7.4)、1mM EDTA緩衝液で10mg/mlに濃縮/緩衝液交換する。遊離スルフヒドリルを生成するため、EGFR抗体を、抗体より2.75倍モル過剰のTCEPを加えた10mM TCEP溶液(Thermo Fisher)を使用して還元する。TCEPを添加し、短時間ボルテックスし、37℃で2時間インキュベートする。例えば、0.067mMのAbを使用すると、TCEPを最終濃度0.18mMまで添加する。調製した抗体に薬物をコンジュゲートするため、マレイミド−MMAE(val−cit切断可能リンカーを含む、MC−Val−Cit−PAB−MMAE、ALB Technology Limited)をDMSOで最終濃度10mMに希釈する。次いで、薬物が抗体より10倍モル過剰で(例えば、0.067mMのAbの場合、薬物を最終濃度0.67mMまで添加する)、薬物を調製(還元)したEPCAM抗体に添加する。MMAEを添加し、短時間ボルテックスし、10℃で30分間インキュベートする。インキュベーション後、過剰の薬物を除去し、Zeba Spin脱塩カラム(ThermoFisher)を使用してADCをPBS pH7.4に緩衝液交換する。次いで、EPCAM−MMAE ADCをフィルター滅菌し(0.22μフィルター、Millipore)、BGG標準物質(ThermoFisher)を使用してBCAアッセイを実施し、タンパク質濃度を測定する。
EGFR−MMAEをデンドリマーに結合させるため、DNAデンドリマーの1つ以上の外側アームに相補的なオリゴヌクレオチドを調製する。EPCAM−MMAE−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを調製するにあたり、まず、50mM TCEPを用いて3’チオールを含むDNAデンドリマー結合オリゴヌクレオチド(DBO)を1時間還元する。還元後、エタノール沈殿によりTCEPを除去し、オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼフリー水に再懸濁させ、A260により濃度を得る。コンジュゲーションするADCを調製するために、1倍PBS pH7.4中のEPCAM ADC(DAR=2−4の抗体+薬物分子)2.0mgを15.0mlコニカルチューブに入れる。ADCに、ADCに対する架橋剤のモル比12.5倍でLC−SMCC架橋剤を加え、混合物を室温で1時間反応させる。過剰の架橋剤をZebaゲル濾過カラムを使用してADC反応混合物から除去する。次に、TCEP還元オリゴ及びLC−SMCC修飾ADCを1:1.2の抗体対オリゴ比で混合し、室温で1時間反応させた後、4℃で一晩置く。コンジュゲートされていない過剰のオリゴヌクレオチドを、チオ親和性吸着クロマトグラフィーを使用して除去する。不純なADC−オリゴコンジュゲートを緩衝液A(5.0mMリン酸ナトリウムpH7.0、500mM硫酸カリウム)で10倍(容積)に希釈し、緩衝液Aで平衡化したTACカラムに充填する。TACカラムを10CVの緩衝液Aで洗浄した後、ADC−オリゴコンジュゲートを10CVの緩衝液B(5.0mMリン酸ナトリウムpH7.0)で溶出する。TACカラムを5CVのヌクレアーゼフリー水でさらに洗浄する。カラム画分を10%天然TBEゲル電気泳動により分析し、ゲルをSyber goldで染色する。オリゴが混入していないADCコンジュゲートを含んだ画分をプールし、Amiconスピン濃縮装置(10000MWCO)により濃縮する。濃縮の最後に、PBS pH7.4緩衝液を添加し、最終0.2倍PBSにする。コンジュゲートされていないオリゴの残存量を10%天然TBEゲル電気泳動により測定し、既知量の未修飾オリゴの標準曲線と比較して、デンシトメトリーにより算出する。最後に、ADC−オリゴコンジュゲートのタンパク質濃度を、BGGをタンパク質標準として用いてBCAアッセイにより測定する。
EPCAM−MMAEオリゴヌクレオチドコンジュゲートを2層DNAデンドリマーと混合し、最終濃度1倍のPBS(pH7.4)中、1mg/mlのEPCAM−MMAE濃度でEPCAM−MMAE ADC−DNAデンドリマー(DNAデンドリマーあたり12個の抗体)を配合する。
in vivo異種移植マウスモデル試験:in vivo実験は、6〜10週齢の雌免疫不全NOD/SCIDマウス(The Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)で実施する。マウスは滅菌標準環境条件下(室温20+/−℃、相対湿度50+/−10%、明暗リズム12時間)で飼育する。動物ごとに、5×106のOVCAR3卵巣癌細胞をPBSで最終容積0.2mLにする。細胞を各NOD/SCIDマウスの右側腹部に皮下注射する。定着腫瘍モデルでは、OVCAR3腫瘍の皮下増殖が発現するまで(50〜200mm3)治療の開始を遅らせる。腫瘍が適切なサイズ範囲に成長したら、動物をランダムな群に分ける。1群あたり8匹の動物に、それぞれ4日目、8日目、及び12日目から、DNAデンドリマー結合及び非結合両方のEPCAM−MMAE ADCに対して1mg/kg相当のEPCAM MMAE mAbを使用して治療を開始する。治療は4日ごとに合計1〜3回繰り返す。対照として、薬物を含まない抗体を使用する。指定日に、腫瘍の直交する2方向の寸法をキャリパーで測定し、腫瘍体積を次式により算出する:腫瘍体積=[(幅2×長さ)/2]。
Claims (17)
- 5つの単量体を含む1層の核酸キャリアであって、各単量体は、
第1及び第2のオリゴヌクレオチドを含み;
ここで、前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドそれぞれの中央部分は互いに相補的であり、二本鎖領域を形成し、
前記第1のオリゴヌクレオチドの2つの末端部分は、前記第2のオリゴヌクレオチドの2つの末端部分と相補的ではなく、4つの末端アームを形成し;
第1単量体の第1の末端アームは第2単量体の末端アームにコンジュゲートされ、第1単量体の第2の末端アームは第3単量体の末端アームにコンジュゲートされ、第1単量体の第3の末端アームは第4単量体の末端アームにコンジュゲートされ、第1単量体の第4の末端アームは第5単量体の末端アームにコンジュゲートされ、12個の周辺末端アームを有する1層の核酸キャリアを形成しており;ならびに
前記単量体は少なくとも1つの周辺末端アームにコンジュゲートされた少なくとも1つの標的薬剤を含み、ここで、前記少なくとも1つの標的薬剤がmiRNAである場合、前記核酸キャリアが少なくとも1つの異なる標的薬剤を含む、前記核酸キャリア。 - 11個の単量体を含む1.5層の核酸キャリアであって、各単量体は、
第1及び第2のオリゴヌクレオチドを含み;
ここで、前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドそれぞれの中央部分は互いに相補的であり、二本鎖領域を形成し、
前記第1のオリゴヌクレオチドの2つの末端部分は、前記第2のオリゴヌクレオチドの2つの末端部分と相補的ではなく、4つの末端アームを形成し;
第1単量体の第1の末端アームは第2単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第1単量体の第2の末端アームは第3単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第1単量体の第3の末端アームは第4単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第1単量体の第4の末端アームは第5単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ;
第2単量体の第2の末端アームは第6単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第3単量体の第2の末端アームは第7単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第4単量体の第2の末端アームは第8単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第5単量体の第2の末端アームは第9単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第2単量体の第3の末端アームは第10単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第3単量体の第3の末端アームは第11単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、24個の周辺末端アームを有する1.5層の核酸キャリアを形成しており;ならびに
前記単量体は少なくとも1つの周辺末端アームにコンジュゲートされた少なくとも1つの標的薬剤を含み、ここで、前記少なくとも1つの標的薬剤がmiRNAである場合、前記核酸キャリアが少なくとも1つの異なる標的薬剤を含む、前記核酸キャリア。 - 17個の単量体を含む2層の核酸キャリアであって、各単量体は、
第1及び第2のオリゴヌクレオチドを含み;
ここで、前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドそれぞれの中央部分は互いに相補的であり、二本鎖領域を形成し、
前記第1のオリゴヌクレオチドの2つの末端部分は、前記第2のオリゴヌクレオチドの2つの末端部分と相補的ではなく、4つの末端アームを形成し;
第1単量体の第1の末端アームは第2単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第1単量体の第2の末端アームは第3単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第1単量体の第3の末端アームは第4単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第1単量体の第4の末端アームは第5単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ;
第2単量体の第2の末端アームは第6単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第3単量体の第2の末端アームは第7単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第4単量体の第2の末端アームは第8単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第5単量体の第2の末端アームは第9単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第2単量体の第3の末端アームは第10単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第3単量体の第3の末端アームは第11単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第4単量体の第3の末端アームは第12単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第5単量体の第3の末端アームは第13単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第2単量体の第4の末端アームは第14単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第3単量体の第4の末端アームは第15単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第4単量体の第4の末端アームは第16単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第5単量体の第4の末端アームは第17単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、36個の周辺末端アームを有する2層の核酸キャリアを形成しており;ならびに
前記単量体は少なくとも1つの周辺末端アームにコンジュゲートされた少なくとも1つの標的薬剤を含み、ここで、前記少なくとも1つの標的薬剤がmiRNAである場合、前記核酸キャリアが少なくとも1つの異なる標的薬剤を含む、前記核酸キャリア。 - 35個の単量体を含む2.5層の核酸キャリアであって、各単量体は、
第1及び第2のオリゴヌクレオチドを含み;
ここで、前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドそれぞれの中央部分は互いに相補的であり、二本鎖領域を形成し、
前記第1のオリゴヌクレオチドの2つの末端部分は、前記第2のオリゴヌクレオチドの2つの末端部分と相補的ではなく、4つの末端アームを形成し;
第1単量体の第1の末端アームは第2単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第1単量体の第2の末端アームは第3単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第1単量体の第3の末端アームは第4単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第1単量体の第4の末端アームは第5単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ;
第2単量体の第2の末端アームは第6単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第3単量体の第2の末端アームは第7単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第4単量体の第2の末端アームは第8単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第5単量体の第2の末端アームは第9単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第2単量体の第3の末端アームは第10単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第3単量体の第3の末端アームは第11単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第4単量体の第3の末端アームは第12単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第5単量体の第3の末端アームは第13単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第2単量体の第4の末端アームは第14単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第3単量体の第4の末端アームは第15単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第4単量体の第4の末端アームは第16単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第5単量体の第4の末端アームは第17単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ;
第6単量体の第2の末端アームは第18単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第7単量体の第2の末端アームは第19単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第8単量体の第2の末端アームは第20単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第9単量体の第2の末端アームは第21単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第10単量体の第2の末端アームは第22単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第11単量体の第2の末端アームは第23単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第12単量体の第2の末端アームは第24単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第13単量体の第2の末端アームは第25単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第14単量体の第2の末端アームは第26単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第15単量体の第2の末端アームは第27単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第16単量体の第2の末端アームは第28単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第17単量体の第2の末端アームは第29単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、
第6単量体の第3の末端アームは第30単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第7単量体の第3の末端アームは第31単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第8単量体の第3の末端アームは第32単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第9単量体の第3の末端アームは第33単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第10単量体の第3の末端アームは第34単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第11単量体の第3の末端アームは第35単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ;
72個の周辺末端アームを有する2.5層の核酸キャリアを形成しており;ならびに
前記単量体は少なくとも1つの周辺末端アームにコンジュゲートされた少なくとも1つの標的薬剤を含み、ここで、前記少なくとも1つの標的薬剤がmiRNAである場合、前記核酸キャリアが少なくとも1つの異なる標的薬剤を含む、前記核酸キャリア。 - 53個の単量体を含む3層の核酸キャリアであって、各単量体は、
第1及び第2のオリゴヌクレオチドを含み;
ここで、前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドそれぞれの中央部分は互いに相補的であり、二本鎖領域を形成し、
前記第1のオリゴヌクレオチドの2つの末端部分は、前記第2のオリゴヌクレオチドの2つの末端部分と相補的ではなく、4つの末端アームを形成し;
第1単量体の第1の末端アームは第2単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第1単量体の第2の末端アームは第3単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第1単量体の第3の末端アームは第4単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第1単量体の第4の末端アームは第5単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ;
第2単量体の第2の末端アームは第6単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第3単量体の第2の末端アームは第7単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第4単量体の第2の末端アームは第8単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第5単量体の第2の末端アームは第9単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第2単量体の第3の末端アームは第10単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第3単量体の第3の末端アームは第11単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第4単量体の第3の末端アームは第12単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第5単量体の第3の末端アームは第13単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第2単量体の第4の末端アームは第14単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第3単量体の第4の末端アームは第15単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第4単量体の第4の末端アームは第16単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第5単量体の第4の末端アームは第17単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ;
第6単量体の第2の末端アームは第18単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第7単量体の第2の末端アームは第19単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第8単量体の第2の末端アームは第20単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第9単量体の第2の末端アームは第21単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第10単量体の第2の末端アームは第22単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第11単量体の第2の末端アームは第23単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第12単量体の第2の末端アームは第24単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第13単量体の第2の末端アームは第25単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第14単量体の第2の末端アームは第26単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第15単量体の第2の末端アームは第27単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第16単量体の第2の末端アームは第28単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第17単量体の第2の末端アームは第29単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、
第6単量体の第3の末端アームは第30単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第7単量体の第3の末端アームは第31単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第8単量体の第3の末端アームは第32単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第9単量体の第3の末端アームは第33単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第10単量体の第3の末端アームは第34単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第11単量体の第3の末端アームは第35単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第12単量体の第3の末端アームは第36単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第13単量体の第3の末端アームは第37単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第14単量体の第3の末端アームは第38単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第15単量体の第3の末端アームは第39単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第16単量体の第3の末端アームは第40単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第17単量体の第3の末端アームは第41単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ;
第6単量体の第4の末端アームは第42単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第7単量体の第4の末端アームは第43単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第8単量体の第4の末端アームは第44単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第9単量体の第4の末端アームは第45単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第10単量体の第4の末端アームは第46単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第11単量体の第4の末端アームは第47単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第12単量体の第4の末端アームは第48単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第13単量体の第4の末端アームは第49単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第14単量体の第4の末端アームは第50単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第15単量体の第4の末端アームは第51単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第16単量体の第4の末端アームは第52単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ、第17単量体の第4の末端アームは第53単量体の第1の末端アームにコンジュゲートされ;
108個の周辺末端アームを有する3層の核酸キャリアを形成しており;ならびに
前記単量体は少なくとも1つの周辺末端アームにコンジュゲートされた少なくとも1つの標的薬剤を含み、ここで、前記少なくとも1つの標的薬剤がmiRNAである場合、前記核酸キャリアが少なくとも1つの異なる標的薬剤を含む、前記核酸キャリア。 - 前記少なくとも1つの標的薬剤が、抗原、ペプチド、抗体もしくはその断片、抗体−薬物コンジュゲート、非抗体足場、標識、アジュバント、RNA分子、DNA分子、ビタミン、タンパク質、融合タンパク質、融合ペプチド、炭水化物、脂質、多糖類、リポ多糖類、ポリマー、ウイルス粒子、もしくはウイルス様粒子、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項1〜5のいずれか1項に記載の核酸キャリア。
- 前記ポリマーが、ヒアルロン酸、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリエチレンイミン(PEI)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリグリコール酸(PGA)、ポリ乳酸(PLA)、または乳酸−グリコール酸共重合体(PLGA)であり;
前記非抗体足場が、アフィボディ、アフィリン、アンチカリン、アトリマー、アビマー、二環式ペプチド、シスノット、DARPin、FN3、フィノマー、kunitzドメイン、またはO−ボディであり;
前記抗原が、細菌抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、酵母抗原、原虫抗原、またはプリオンであり;
前記抗体断片が、Fab、F(ab’)2、scFv、タンデムscFv、BiTE、単一ドメイン(sdAb)抗体、ダイアボディ、一本鎖ダイアボディ、ミニボディ、融合タンパク質、またはscFv−Fcであり;
前記抗体またはその断片が、4−1BB、5AC、5T4、A2aR、アクチビン受容体様キナーゼ1、AGS−22M6、AKAP4、アルファ−フェトプロテイン、アンジオポエチン2、B7−H3、BAFF、BAGE、BCR−ABL、BORIS、CA−125、CA19−9、C242抗原、炭酸脱水酵素9(CA−IX)、CCR4、CD19、CD20、CD22、CD23(IgE受容体)、CD24、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD33、CD37、CD38(サイクリックADPリボースヒドロラーゼ)、CD40、CD44 v6、CD51、CD56、CD70、CD71、CD73、CD74、CD79B、CD80、CD137、CD140a、CD152、CD200、CD221、CD274、CEA、ch4D5、CLDN18.2、CS1、CSF1R、CTLA−4、C−X−Cケモカイン受容体4型、DLL4、DR5、EBAG9、EGF、EGFR、EGFL7、EpCAM、ERBB2、ERBB3、FAP、フィブロネクチンのエキストラドメイン−B、葉酸受容体1、葉酸受容体アルファ、葉酸ヒドロラーゼ、Frizzled受容体、GAGE、GD2ガングリオシド、GD3ガングリオシド、神経膠腫、グリピカン3、GPNMB、gp100、GUCY2C、HER1、HER2/neu、HER3、HGF、HHGFR、ヒストン複合体、HLA−DR、ヒト分散因子受容体キナーゼ、HPV−16、HSP105、IDH1、IDO1、IGF−I、IGF−1受容体、ILGF2、IL−6、IL−13、インテグリンαvβ3、インテグリンα5β1、KIR、LAG−3、ルイス−Y抗原、LY6K、MAGE−1、MAGE−A3、MAGE−C2、MAGE−D4、MAPG、MART−1、Melan−A、MET、MCP−1、メソテリン、MIF、MSLN、MS4A1、ムチンCanAg、MUC1、MUC4、MUC16、NG2、N−グリコリルノイラミン酸、Notch受容体PD−1、NY−ESO−1、OCAA、PAP、PDGF−R α、PDCD1、PD1、PD−L1、リン酸−ナトリウム共輸送体、ホスファチジルセリン、PRAME、PSA、RANKL、RON、ROR1、SDC1、シアリルTn、SLAMF7、SPAG−9、SSX1、STEAP1、サバイビン、TAG−72、テロメラーゼ、TEM1、テネイシンC、TGF−β、TIM−3、TLR、TAM、TIM−3、TRAIL−R2、TRAIL−R1、TWEAK受容体、腫瘍特異的グリコシル化MUC1、腫瘍関連カルシウムシグナル伝達転写因子2、腫瘍抗原CTAA16.88、TYRP1(糖タンパク質75)、VEGF−A、VEGFR2、VEGFR−1、ビメンチン、VISTA、WT1、及びXAGE−1bから選択される腫瘍関連抗原である疾患関連抗原を標的とし;
前記抗体またはその断片が、1−40−β−アミロイド、AOC3(VAP−1)、ACVR2B、アンジオポイエチン3、ベータアミロイド、C5、CCL11(エオタキシン−1)、CCR5、CD2、CD3、CD4、CD5、CD11、CD18、CD20、CD23(IgE受容体)、CD25(IL−2受容体のα鎖)、CD28、CD41(インテグリンアルファ−IIb)、CD52、CD125、CD147(ベイシジン)、CD154(CD40L)、CEA関連抗原、クランピング因子A、エンドトキシン、GMCSF受容体α鎖、成長分化因子8、ヘマグルチニン、HNGF、Hsp90、IGHE、IgE Fc領域、IL−1β、IL−4、IL−5、IL−6、IL−9、IL−12、IL−13、IL−17、IL−17A、IL−20、IL−22、IL−23、IL−6受容体、インテグリンα4β7、インテグリンα7β7、インテグリンα4、インテグリンαIIbβ3、インターフェロンα/β受容体、インターフェロンガンマ誘導タンパク質、IFN−γ、IFN−α、ITGB2(CD18)、LFA−1(CD11a)、LINGO−1、リポタイコ酸、LOXL2、ミエリン関連糖タンパク質、ミオスタチン、神経アポトーシス制御プロテイナーゼ1、NGF、NOGO−A、Oryctolagus cuniculus、OX−40、PCSK9、ホスファチジルセリン、血小板由来増殖因子受容体ベータ、RANKL、アカゲザル因子、スクレロスチン、SOST、スフィンゴシン−1−リン酸、TFPI、TGF−β、TGFベータ2、TGFベータ1、TNF−α、VEGF−A、及びVWFから選択される疾患関連抗原を標的とし;
前記抗体またはその断片が、T細胞、B細胞、NK細胞、マクロファージ、TIL、樹状細胞、好中球、好酸球、好塩基球、及びマスト細胞から選択される免疫細胞の細胞表面マーカーを標的とし;
あるいは、前記RNA分子が、siRNA、miRNA、mRNA、snRNA、dsRNA、ncRNA、snoRNA、またはアプタマーである、請求項6に記載の核酸キャリア。 - 以下の1つまたは2つを含む、請求項6に記載の核酸キャリア:
HER2に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD64に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
EGFRに対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD64に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
EGFRに対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、PD−1に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
PD−L1に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、OX40に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
CD30に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD16に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
HER2に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD3に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
CD20に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD3に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
EpCAMに対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD3に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
NG2に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD28に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
CD19に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD3に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
CD19に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD16に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
CEAに対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、HSGに対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
MUC−1に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、HSGに対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
CA19−9に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD3に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
CEAに対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD3に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
OCAAに対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD3に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
MAPGに対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD28に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
HER2に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD16に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
神経膠腫に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD3に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
葉酸または葉酸受容体である第1の標的薬剤と、CD3またはCD16に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;及び
PD−1に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、PDL−1またはPDL−2に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤。 - 前記標的薬剤が、抗原、抗体、または抗体の断片であり、前記標的部分を前記少なくとも1つの一本鎖アームにコンジュゲートする前記オリゴヌクレオチドリンカーが、CpG含有オリゴヌクレオチドである、請求項1〜5のいずれか1項に記載の核酸キャリア。
- 前記核酸キャリアが、少なくとも1つの抗原、免疫細胞に対する少なくとも1つの抗体またはその断片、及び少なくとも1つのアジュバントを含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の核酸キャリア。
- 化学療法剤、サイトカイン、またはケモカインをさらに含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の核酸キャリア。
- 請求項1〜11のいずれか1項の核酸キャリアと、薬学的に許容されるビヒクルとを含む医薬組成物。
- 哺乳動物の免疫応答を誘導する方法であって、請求項1〜11のいずれか1項に記載の核酸キャリア、または請求項1〜11のいずれか1項に記載の核酸キャリアを含む医薬組成物を前記哺乳動物に投与することを含み、前記核酸キャリアが、抗原、ペプチド、抗体またはその断片、及びアジュバントから選択される少なくとも2つの標的薬剤を含む、前記方法。
- 前記抗体断片が、Fab、F(ab’)2、scFv、タンデムscFv、BiTE、単一ドメイン(sdAb)抗体、ダイアボディ、一本鎖ダイアボディ、ミニボディ、融合タンパク質、またはscFv−Fcである、請求項13に記載の方法。
- がんを有する哺乳動物を治療する方法であって、請求項1〜11のいずれか1項に記載の核酸キャリア、または請求項1〜11のいずれか1項に記載の核酸キャリアを含む医薬組成物を前記哺乳動物に投与することを含み、前記核酸キャリアが、抗体またはその断片、及び標識から選択される少なくとも2つの標的薬剤を含む、前記方法。
- 前記抗体断片が、Fab、F(ab’)2、scFv、タンデムscFv、BiTE、単一ドメイン(sdAb)抗体、ダイアボディ、一本鎖ダイアボディ、ミニボディ、融合タンパク質、またはscFv−Fcである、請求項15に記載の方法。
- 前記核酸キャリアが、
前記がんが乳癌、卵巣癌、または前立腺癌である、HER2に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD64に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
前記がんが固形腫瘍、肺癌、または結腸癌である、EGFRに対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD64に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
前記がんがトリプルネガティブ乳癌である、EGFRに対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、PD−1に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
前記がんが乳癌である、PD−L1に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、OX−40に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
前記がんがホジキン病である、CD30に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD16に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
前記がんが転移性乳癌または前立腺癌である、HER2に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD3に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
前記がんが非ホジキンリンパ腫または多発性骨髄腫である、CD20に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD3に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
前記がんが、卵巣癌、胃癌、結腸癌、結腸直腸癌、乳癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、小細胞肺癌である、EpCAMに対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD3に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
前記がんが黒色腫である、NG2に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD28に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
前記がんが、前駆B細胞急性リンパ性白血病または非ホジキンリンパ腫である、CD19に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD3に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
前記がんが非ホジキンリンパ腫である、CD19に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD16に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
前記がんが、結腸癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、卵巣癌、子宮癌、乳癌、または黒色腫である、CEAに対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、HSGに対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
前記がんが浸潤性膵腺癌である、MUC−1に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、HSGに対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
前記がんがCA19−9陽性腫瘍である、CA19−9に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD3に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
前記がんが卵巣癌である、CEAに対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD3に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
前記がんが卵巣癌である、OCAAに対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD3に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
前記がんが転移性黒色腫である、MAPGに対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD28に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
前記がんがHER−2陽性腫瘍である、HER2に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD16に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
前記がんが神経膠腫である、神経膠腫に対する抗体またはその断片である第1の標的薬剤と、CD3に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤;
及び前記がんが、小細胞肺癌、乳癌、または卵巣癌である、葉酸または葉酸受容体である第1の標的薬剤と、CD3またはCD16に対する抗体またはその断片である第2の標的薬剤を含む、請求項15または請求項16に記載の方法。
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