JP2011530537A - 長時間作用型dnaデンドリマーおよびその方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図4a
Description
ターゲッティング抗体またはその断片と、ハイブリダイゼーション事象によって非共有結合したsiRNA分子とを含むDNAデンドリマーの製造と使用
DNAデンドリマーは、その各々が、各鎖の中央部分にある配列相補性領域を共有する2つのDNA鎖から作られたDNAモノマーから構築される。2つの鎖がアニールしてモノマーを形成するとき、結果として生じる構造は、4つの一本鎖「アーム」に隣接した中央の二本鎖「ウェスト」を有するものとして記載することができる。このウェスト−プラス−アーム構造は、基本DNAモノマーを含む。5つのモノマータイプの各々の末端にある一本鎖アームは、正確かつ特異的な方法で、互いに相互作用するように設計される。相補的なモノマーのアーム間の塩基対合(水素結合)は、モノマー層の順次付加によるデンドリマーの有向アセンブリを可能にした(図1)。デンドリマーの各層のアセンブリには、DNA鎖が互いに共有結合し、それにより、DNA鎖が互いに共有結合しなければデンドリマー構造の変形を引き起こすことになる変性条件に影響されない完全に共有結合した分子が形成される架橋プロセスが含まれた(図2)。さらに、実施例2に記載されているように、この実施例のために調製されたデンドリマーは、その外面に付着した約120個のビオチン分子(2層デンドリマー)または約720個のビオチン分子(4層デンドリマー)を含んでいた。さらに、キャプチャーオリゴとしての役割を果たす38塩基のオリゴヌクレオチドを、以下のように、簡単なT4 DNAリガーゼ依存的ライゲーション反応によって、利用可能なデンドリマーアームの5’末端に連結した。
細胞内でsiRNAとして働くよう設計された分子を化学合成したが、これは、1)通常19塩基長の、RNAリボヌクレオチドとしての5’部分と、通常0〜33塩基長の、DNAデオキシリボヌクレオチドとしての3’部分とを含み、DNAデンドリマーに連結されたキャプチャーオリゴに相補的であるよう設計された一本鎖「センス」鎖と、2)RNAリボヌクレオチドのみの、通常19塩基長の部分と、2個の3’末端デオキシリボヌクレオチドとを含む、「センス」鎖に相補的な一本鎖「アンチセンス」鎖とを含む。これら2つの鎖を等モル量で組み合わせて、「センス」鎖と「アンチセンス」鎖の間に安定なハイブリッドを形成させ、「センス」鎖の一本鎖DNA部分をDNAデンドリマーのキャプチャーオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに利用できるようにする。
条件#1:リンカーなし
SSB siRNA:
アンチセンス鎖:
RNAアンチセンス鎖:5’−UUAAAGUCUGUUGUCAGCC−3’(配列番号1)
DNAアンチセンス鎖 5’−dGdG−3’
RNAセンス鎖:5’−GGCUGACAACAGACUUUAA−3’(配列番号2)
DNAセンス鎖:5’−dTdT−3’
5’−rGrGrC rUrGrA rCrArA rCrArG rArCrU rUrUrA rA dTdT−3’(配列番号11)
を形成する。
アンチセンス鎖:
RNAアンチセンス鎖:5’−ACGUGACACGUUCGGAGAA−3’(配列番号3)
DNAアンチセンス鎖 5’−dTdT−3’
5’−rArCrG rUrGrA rCrArC rGrUrU rCrGrG rArGrA rA dTdT−3’(配列番号12)
を形成する。
RNAセンス鎖:5’−UUC UCCGAACGUGUCACGU−3’(配列番号4)
DNAセンス鎖:5’−dTdT−3’
5’−rUrUrC rUrCrC rGrArA rCrGrU rGrUrC rArCrG rU dTdT−3’(配列番号13)
を形成する。
アンチセンス鎖:
RNAアンチセンス鎖:5’−UUAAAGUCUGUUGUCAGCC−3’(配列番号1)
DNAアンチセンス鎖 5’−dGdG−3’(配列番号2)
5’−rUrUrA rArArG rUrCrU rGrUrU rGrUrC rArGrC rC dGdG−3’(配列番号10)
を形成する。
RNAセンス鎖:5’−GGCUGACAACAGACUUUAA−3’(配列番号2)
DNAセンス鎖:5’−TTCCGTTGACATCTCGTA−3’(配列番号5)
5’−rGrGrC rUrGrA rCrArA rCrArG rArCrU rUrUrA rA dTdT dCdCdGdTdT dGdAdC dAdTdCdTdC dGdTdA−3’(配列番号16)
を形成する。
アンチセンス鎖:
RNAアンチセンス鎖:5’−ACGUGACACGUUCGGAGAA−3’(配列番号3)
DNAアンチセンス鎖 5’−dGdG−3’
5’−rArCrG rUrGrA rCrArC rGrUrU rCrGrG rArGrA rA dTdT−3’(配列番号17)
を形成する。
RNAセンス鎖:5’−UUCUCCGAACGUGUCACGU−3’(配列番号4)
DNAセンス鎖:5’−TTCCGTTGACATCTCGTA−3’(配列番号5)
5’−rUrUrC rUrCrC rGrArA rCrGrU rGrUrC rArCrG rU dTdT dCdCdGdTdT dGdAdC dAdTdCdTdC dGdTdA−3’(配列番号18)
を形成する。
アンチセンス鎖:
RNAアンチセンス鎖:5’−UUAAAGUCUGUUGUCAGCC−3’(配列番号1)
DNAアンチセンス鎖 5’−dGdG−3’
5’−rUrUrA rArArG rUrCrU rGrUrU rGrUrC rArGrC rC dGdG−3’(配列番号10)
を形成する。
RNAセンス鎖:5’−GGCUGACAACAGACUUUAA−3’(配列番号4)
DNAセンス鎖:5’−TTCCGTTGACATCTCGTAGATTT−3’(配列番号6)
5’−rUrUrC rUrCrC rGrArA rCrGrU rGrUrC rArCrG rU dTdT dCdCdGdTdT dGdAdC dAdTdCdTdC dGdTdAdGdAdTdTdT−3’(配列番号19)
を形成する。
アンチセンス鎖:
RNAアンチセンス鎖:5’−ACGUGACACGUUCGGAGAA−3’(配列番号3)
DNAアンチセンス鎖 5’−dTdT−3’
5’−rArCrG rUrGrA rCrArC rGrUrU rCrGrG rArGrA rA dTdT−3’(配列番号12)
を形成する。
RNAセンス鎖:5’−UUCUCCGAACGUGUCACGU−3’(配列番号4)
DNAセンス鎖:5’−TTCCGTTGACATCTCGTAGATTT−3’(配列番号6)
5’−rUrUrC rUrCrC rGrArA rCrGrU rGrUrC rArCrG rU dTdT dCdCdGdTdT dGdAdC dAdTdCdTdC dGdTdAdGdAdTdTdT−3’(配列番号19)
を形成する。
アンチセンス鎖:
RNAアンチセンス鎖:5’−UUAAAGUCUGUUGUCAGCC−3’(配列番号1)
DNAアンチセンス鎖 5’−dGdG−3’
5’−rUrUrA rArArG rUrCrU rGrUrU rGrUrC rArGrC rC dGdG−3’(配列番号10)
を形成する。
RNAセンス鎖:5’−GGCUGACAACAGACUUU AA−3’(配列番号2)
DNAセンス鎖:5’−TTCCGTTGACATCTCGTAGATTTGAATT−3’(配列番号7)
5’−rGrGrC rUrGrA rCrArA rCrArG rArCrU rUrUrA rA dTdT dCdCdGdTdT dGdAdC dAdTdCdTdC dGdTdAdGdAdTdTdTdG dAdAdTdT−3’(配列番号14)
を形成する。
アンチセンス鎖:
RNAアンチセンス鎖:5’−ACGUGACACGUUCGGAGAA−3’(配列番号3)
DNAアンチセンス鎖 5’−dTdT−3’
5’−rArCrG rUrGrA rCrArC rGrUrU rCrGrG rArGrA rA dTdT−3’(配列番号12)
を形成する。
RNAセンス鎖:5’−UUCUCCGAACGUGUCACGU−3’(配列番号4)
DNAセンス鎖:5’−TTCCGTTGACATCTCGTAGATTTGAATT−3’(配列番号7)
5’−rUrUrC rUrCrC rGrArA rCrGrU rGrUrC rArCrG rU dTdT dCdCdGdTdT dGdAdC dAdTdCdTdC dGdTdAdGdAdTdTdTdG dAdAdTdT−3’(配列番号15)
を形成する。
「センス」DNA/RNA分子(50μM) 25μL
「アンチセンス」RNA分子(50μM) 25μL
以下の構成要素をマイクロチューブ中で組み合わせた:
抗体を含む2層DNAデンドリマー(10ng/μL) 12.0μL
siRNA二重鎖分子(2μMに希釈) 3.0μL
無血清培地またはPBS 105.0μL
ターゲッティング抗体とハイブリダイズしたsiRNA二重鎖とを含む、DNAデンドリマーを、インビトロトランスフェクションの標的として好適な2,000〜10,000個の生きた細胞を含む組織培養プレートのウェルに導入し、10%血清を含む適切な培地中または無血清培地中で増殖させた。これらの細胞は、1)デンドリマーが結合したターゲッティング抗体の結合標的として好適な表面抗原、2)このデンドリマーに結合したsiRNAアンチセンス分子の適切な標的としての役割を果たすメッセンジャーRNA(mRNA)、3)抗体が媒介する細胞表面結合事象、またはエンドサイトーシス過程を開始させることができる他の事象を介してDNAデンドリマーを内在化させる能力を含むが、これらに限定されない、特定の特徴を含まなければならない。典型的には、上記の処方物を、96ウェルプレート中の100μLの組織培養培地に、ウェルの総容量の10〜25%の範囲の容量(10〜25μl)で添加したが、最良の効果を得るにはより少ないまたはより多い容量が必要となり得る。siRNAの機能は、標的とされたmRNAを内部対照mRNA(18s RNAおよびPPIB mRNA)と比べて検出するように設計されたqRT−PCRアッセイを用いて、デンドリマー−siRNA複合体の添加後に細胞に残存するインタクトなmRNAの量を定量することによって直接的に測定したか、またはsiRNAのトランスフェクションならびにmRNA標的および関連タンパク質の発現のノックダウン後に細胞に残存するタンパク質の量を定量することによって間接的に測定した。
1.両方とも対照未修飾非伸長鎖からなる野生型siRNA二重鎖
2.16塩基のデオキシヌクレオチド伸長を有するセンス鎖からなるsiRNA二重鎖
3.21塩基のデオキシヌクレオチド伸長を有するセンス鎖からなるsiRNA二重鎖
26塩基のデオキシヌクレオチド伸長を有するセンス鎖からなるsiRNA二重鎖
まず、適切な陰性対照オリゴと比較した残存するSSB mRNAの相対量を測定することにより、リポフェクトアミン2000を用いたDNAデンドリマー送達方法とは独立して、siRNA(10nM最終濃度)の各々について、ノックダウン効率を測定した。全ての場合において、本発明者らは、70〜95%のノックダウン効率を観察した。次に、本発明者らは、10nMの最終siRNA濃度と、0.2ng/μlの最終DNAデンドリマー濃度(配列伸長を介してデンドリマーに結合することができるものについて、デンドリマー結合型siRNAとして約2.5〜3nM)とを有するDNAデンドリマーハイブリダイゼーション混合物を調製し、ノックダウン効率を比較した。一般に、おそらくsiRNAの分解のために、血清を含む培地と比較して無血清培地においてより顕著なノックダウン効率が観察された。血清含有培地と無血清培地の両方の比較において、最も長い(26塩基)伸長を含むsiRNA構築物は、2つのより短い3’デオキシヌクレオチド伸長(それぞれ、21塩基と16塩基、および伸長なし)と比較して、最も高い能力を発揮し、標的mRNAのより多いノックダウンをもたらした。血清含有培地では、本発明者らは、26塩基の3’伸長を有するsiRNA二重鎖については約40%のノックダウンで、siRNAにセンス鎖の3’伸長がない場合は、ほとんどまたは全くノックダウンがないところまで低下することを観察した。無血清培地では、本発明者らは、3’なし、16塩基伸長、および21塩基伸長についての、それぞれ0〜5%、10〜20%、および30〜35%のノックダウンと比較して、26塩基の3’伸長siRNAについて約65〜70%のノックダウンを観察した。
siRNA分子がビオチン化siRNA分子のストレプトアビジンに対する結合を介して非共有結合し、その後DNAデンドリマー上のビオチンに結合するターゲッティング抗体とsiRNA分子とを含むDNAデンドリマーの製造と使用
オリゴの合成中に取り込まれた末端標識ビオチンを含むDNAまたはRNAオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションと架橋によってビオチン部分がデンドリマーの「アーム」上に導入されていることを除き、ターゲッティング抗体と結合したDNAデンドリマーを上記のように調製した。典型的なデンドリマービオチン標識反応は、抗体のデンドリマーへの結合前、およびキャプチャー配列のライゲーション中またはライゲーション後に、以下のように行なわれた。
連結されたCap03配列を有する4層DNAデンドリマー(50ng/μL) 50.0μL
c(−)ビオチンオリゴ(500ng/μL) 2.6μL
a(−)ビオチンオリゴ(500ng/μL) 2.6μL
5M NaCl 4.0μL
エタノール中で飽和した2,4,8トリメチルソラーレン 7.0μL
siRNAハイブリダイゼーション処方物:
末端ビオチン標識を有する「センス」DNA/RNA分子(50μM) 25μL
「アンチセンス」RNA分子(50μM) 25μL
末端ビオチン標識を有するハイブリダイズした二重鎖siRNA(50uM) 5.3μL
1×PBS 86.5μL
ストレプトアビジン(1000ng/μL) 8.0μL
5M NaCl 0.2μL
抗体を含む4層ビオチン化DNAデンドリマー(10ng/μL) 50.0μL
「ビオチン化siRNA−ストレプトアビジン」複合体 5.3μL
1×PBS 3.7μL
siRNA分子がジスルフィド架橋結合の使用によって共有結合されているターゲッティング抗体とsiRNA分子とを含むDNAデンドリマーの製造
抗体を含む4層DNAデンドリマー(10ng/μL)を上記の実施例1または2と同様に合成する。細胞内でsiRNAとして働くよう設計された分子を化学合成したが、これは、1)3’末端上の2個以上のDNAヌクレオチドとともに、通常19〜23塩基長の全RNAリボヌクレオチドを含み、かつオリゴヌクレオチド合成時または合成後にこの分子の5’末端に付加されたスルヒドリル(SH)部分を含む一本鎖「センス」鎖と、2)2個の3’末端デオキシヌクレオチドとともに、RNAリボヌクレオチドのみの、通常19塩基長の部分を含む、「センス」鎖に相補的な一本鎖「アンチセンス」鎖とを含んでいた。これら2つの鎖を組み合わせて、「センス」鎖と「アンチセンス」鎖の間に安定なハイブリッドを形成させ、スルフヒドリル部分を、デンドリマーのアームに付加されたキャプチャー配列に相補的なDNAオリゴヌクレオチド上の(「S−S」ジスルフィド結合を形成する)別のスルフヒドリル部分へのコンジュゲーションに利用できるようにする。ジスルフィド処方物に対する典型的なスルフヒドリル−スルフヒドリルコンジュゲーションは以下の通りであった。
末端スルフヒドリルを有する「センス」siRNA鎖(50uM) 10.0μL
スルフヒドリルを有する、キャプチャー配列に相補的なDNAオリゴ(50uM) 9.0μL
2Mジチオスレイトール(DTT)水溶液 20.0μL
ヌクレアーゼフリー水 1.0μL
siRNA分子がNHS−エステル依存的縮合化学反応の使用によって共有結合されているターゲッティング抗体とsiRNA分子とを含むDNAデンドリマーの製造
抗体を含む4層DNAデンドリマー(10ng/uL)は、ビオチンが1級アミンと置き換えられたことを除き、上記の実施例2と同様に合成された。細胞内でsiRNAとして働くよう設計された分子を化学合成したが、これは、1)3’末端上の2個以上のDNAヌクレオチドとともに、通常19〜23塩基長の全RNAリボヌクレオチドを含み、かつオリゴヌクレオチド合成時または合成後にこの分子の5’末端上に付加されるカルボキシル(COOH)部分を含む一本鎖「センス」鎖と、2)2個の3’末端デオキシヌクレオチドとともに、RNAリボヌクレオチドのみの、通常19塩基長の部分を含む、「センス」鎖に相補的な一本鎖「アンチセンス」鎖とを含んでいた。カルボキシルがN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステルに変換され、次に、このエステルが1級アミンと反応して、NHSエステルとアミンの間に共有結合を形成するように、カルボキシルを含むRNA鎖を、市販の試薬を用いて化学修飾した。したがって、1級アミンで標識されたデンドリマーは、siRNAの「センス」鎖と共有結合することができ、このsiRNAの「センス」鎖は、「アンチセンス」RNA鎖とハイブリダイズしたとき、機能的なsiRNA二重鎖を形成する。
超純水中の末端カルボキシルを有する「センス」siRNA鎖(500ng/μL) 1000μL
EDC(1−エチル−3−[3−ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド) 0.4mg
スルホ−NHS試薬(Pierce カタログ番号24510) 1.1mg
siRNA分子がヘテロ二官能性化学架橋剤化学反応の使用によって共有結合されているターゲッティング抗体とsiRNA分子とを含むDNAデンドリマーの製造
抗体を含む4層DNAデンドリマー(10ng/μL)は、ビオチン分子が1級アミンと置き換えられたことを除き、実施例2と同様に合成された。細胞内でsiRNAとして働くよう設計された分子を化学合成したが、これは、1)3’末端上の2個以上のDNAヌクレオチドとともに、通常19〜23塩基長の全RNAリボヌクレオチドを含み、かつオリゴヌクレオチド合成時または合成後にこの分子の5’末端上に付加されるカルボキシル(COOH)部分を含む一本鎖「センス」鎖と、2)2個の3’末端デオキシヌクレオチドとともに、RNAリボヌクレオチドのみの、通常19塩基長の部分を含む、「センス」鎖に相補的な一本鎖「アンチセンス」鎖とを含んでいた。カルボキシルを含むRNA鎖を、カルボキシル部分とアミン部分の間に共有結合を形成させるヘテロ二官能性架橋試薬であるEDC(1−エチル−3−[3−ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド)の存在下で、アミン修飾デンドリマーと組み合わせた。したがって、1級アミンで標識されたDNAデンドリマーは、siRNAの「センス」鎖と共有結合し、このsiRNAの「センス」鎖は、「アンチセンス」RNA鎖とハイブリダイズしたときに、機能的なsiRNA二重鎖を形成した。
超純水中の末端カルボキシルを有する「センス」siRNA鎖(500ng/μL) 100.0μL
1×PBS中の、キャプチャー配列を有する4層アミンデンドリマー(500ng/μL) 100.0μL
EDC(1−エチル−3−[3−ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド) 10mg
siRNA分子がホモ二官能性化学架橋剤化学反応の使用によって共有結合されているターゲッティング抗体とsiRNA分子とを含むDNAデンドリマーの製造
抗体を含む4層DNAデンドリマー(10ng/μL)は、ビオチンが1級アミンと置き換えられたことを除き、実施例2と同様に合成された。細胞内でsiRNAとして働くよう設計された分子を化学合成したが、これは、1)3’末端上の2個以上のDNAヌクレオチドとともに、通常19〜23塩基長の全RNAリボヌクレオチドを含み、かつオリゴヌクレオチド合成時または合成後にこの分子の5’末端上に付加される1級アミン部分を含む一本鎖「センス」鎖と、2)2個の3’末端デオキシヌクレオチドとともに、RNAリボヌクレオチドのみの、通常19塩基長の部分を含む、「センス」鎖に相補的な一本鎖「アンチセンス」鎖とを含んでいた。アミンを含むRNA鎖を、アミン部分の間に共有結合を形成させる試薬であるスルホ−EGS[エチレングリコールビス(スクシニミジルスクシネート)](Pierce カタログ番号21566)などのホモ二官能性架橋剤の存在下で、アミン修飾デンドリマーと組み合わせた。したがって、1級アミンで標識されたDNAデンドリマーは、siRNAの「センス」鎖と共有結合し、このsiRNAの「センス」鎖は、その後、「アンチセンス」RNA鎖とハイブリダイズして、機能的なsiRNA二重鎖を形成した。
超純水中の末端アミンを有する「センス」siRNA鎖(500ng/μL) 100.0μL
1×PBS中の、キャプチャー配列を有する4層アミンデンドリマー(500ng/μL) 100.0μL
スルホ−EGS[エチレングリコールビス(スクシニミジルスクシネート)] 20.0mg
ターゲッティング抗体とsiRNA分子とを含むDNAデンドリマーの製造ならびにデンドリマーの構造物に結合したビオチンおよびトランスフェクションにおける対イオンとして複数の正電荷を有するカチオンの重要性の比較
抗体を含む2層DNAデンドリマーは、デンドリマーの「アーム」を密集させる最大120個のビオチンを付けて合成された。このデンドリマー上の一定数の遊離「アーム」は、ハイブリダイゼーション結合事象を介するsiRNA二重鎖の結合に利用可能である(実施例1および2参照)。
本発明者らは、(実施例1に記載したように)無血清培地中で試験したとき、外面にビオチンを付けて調製されたデンドリマー構築物が65〜80%のノックダウンを示す一方で、ビオチンが付いていないデンドリマーは約35〜40%のノックダウンしかもたらさないことを観察した。血清含有培地では、ビオチンを含むデンドリマーとビオチンを含まないデンドリマーの間に同じような割合の性能が観察され、siRNAノックダウン活性は、そのビオチン化対応物と比較して、ビオチンを含まないデンドリマーについて無血清培地中で観察された活性の約25〜50%であった。同様に、本発明者らは、最終濃度25mMのMg、Ca、およびMnにより、カチオンが除かれたトランスフェクションと比較してより再現性が高くかつ効率的なノックダウンが得られることを観察した。本発明者らはまた、このような種類の実験でデンドリマーを使用するとき、スペルミンやスペルミジンなどの他のカチオンが同様の効果を示すであろうと考えている。
mRNA発現のsiRNAノックダウンのための2層デンドリマーと4層デンドリマーの使用
2層バージョンと4層バージョンの両方の上に抗体を含むDNAデンドリマーは、2層デンドリマーの「アーム」を密集させる最大120個のビオチン、および4層デンドリマーのアームを密集させる最大720個のビオチンを付けて合成され、両方のタイプのデンドリマーは、ハイブリダイゼーション結合事象を介するsiRNA二重鎖の結合に利用可能な一定数の遊離「アーム」を含む(実施例1および7参照)。実施例1に記載されたものと同じsiRNA調製、デンドリマーとsiRNAとの組み合わせ、およびトランスフェクションノックダウン研究のための方法を用いた。2層デンドリマーと4層デンドリマーの結果を比較した。等しい量のsiRNA分子がデンドリマー分子に結合するのを確実にするために、2層構築物と4層構築物の両方に対して最終的なsiRNAとデンドリマーの(質量)濃度を用いた。
これらの結果から、各2層デンドリマーがデンドリマー1つ当たり1/9の量のsiRNA分子を有するにもかかわらず、等しい入力質量の各デンドリマータイプを同じsiRNA最終濃度で用いたとき、2層デンドリマーが4層デンドリマーよりも1.5〜2倍大きいノックダウンを生じさせることが示される。
ヒトおよび動物血清中でのタンパク質ヌクレアーゼへの曝露によるDNAデンドリマーのヌクレアーゼ依存的分解からの保護
未修飾のDNAデンドリマーは、タンパク質DNアーゼを含む溶液に曝露されたとき、ヌクレアーゼ依存的分解を受ける。それゆえ、未修飾であるかまたは様々なハプテン、蛍光、アミン、もしくは他の標識とターゲッティング抗体とで修飾されているかのいずれかの、DNAデンドリマーが、動物供給源に由来する体液(例えば、血清)を含むインビトロまたはインビボ環境に導入されたときに、素早く分解すると仮定するのは理に適っていた。歴史的に見て、こうした仮定のために、つい最近になって(先の実施例1〜8によって調製された)DNAデンドリマーが、少なくとも960分(16時間)、ヌクレアーゼ依存的分解に対して顕著な抵抗性を示すことが予期せず観察されるまで、本発明者らがDNAデンドリマーをインビトロ細胞アッセイや任意のインビボ用途に使用するのは不可能であった。実験を以下のように行なった。
条件:
チューブ1〜4は、以下の添加物をとともに、未修飾の4層DNAデンドリマーを含んでいた。
チューブ1:PBSのみ。
チューブ2:75%新鮮ヒト血清。
チューブ3:1Uの外因性DNアーゼを含むPBS。
チューブ4:1Uの外因性DNアーゼを含む75%新鮮ヒト血清。
チューブ5:PBSのみ。
チューブ6:75%新鮮ヒト血清。
チューブ7:1Uの外因性DNアーゼを含むPBS。
チューブ8:1Uの外因性DNアーゼを含む75%新鮮ヒト血清。
チューブ1:120分後に分解は観察されなかった。
チューブ2:120分後に分解は観察されなかった。
チューブ3:30分の時点で明らかな分解が観察された。
チューブ4:30分の時点で明らかな分解が観察された。
チューブ1:120分後に分解は観察されなかった。
チューブ2:120分後に分解は観察されなかった。
チューブ3:120分後に分解は観察されなかった。
チューブ4:30分の時点で明らかな分解が観察された。
未修飾DNAデンドリマーの分解は、PBS条件と75%血清条件の両方において、1Uの外因性DNアーゼの存在下でのみ起こった。修飾DNAデンドリマーの分解は、75%血清の条件のみにおいて、1Uの外因性DNアーゼの存在下でのみ起こった。
条件
チューブ1〜4は、以下の添加物をとともに、未修飾の4層DNAデンドリマーを含んでいた。
チューブ1:PBSのみ。
チューブ2:75%新鮮ヒト血清。
チューブ3:PBSのみ。
チューブ4:75%新鮮ヒト血清。
チューブ1:960分後に分解は観察されなかった。
チューブ2:480分後に分解は観察されず、960分の時点で>80%分解が観察された。
チューブ3:960分後に分解は観察されなかった。
チューブ4:960分後に分解は観察されなかった。
未修飾DNAデンドリマーの分解は、480分の時点の後しばらくして、75%ヒト血清の存在下でのみ起こった。修飾DNAデンドリマーの分解は、PBS条件でも75%血清条件でも、どの時点でも観察されなかった。
ハイブリダイズしたsiRNA分子を有するDNAデンドリマーと市販のリポフェクトアミントランスフェクション試薬との組合せ
この実験の目的は、ターゲッティング抗体から独立しており、かつハイブリダイゼーションによって付着したsiRNA分子を有するDNAデンドリマーを、mRNAノックダウンによって測定されるようなsiRNAの細胞質送達のための別のトランスフェクション試薬とうまく組み合わせることができるかどうかを明らかにすることであった。
1×TE緩衝液中の2層DNAデンドリマー(500ng/μL) 5.4μL(2680ng)
a(−)LIG−BR7架橋オリゴ(14mer)(50ng/μL) 2.7μL(134ng)
10×リガーゼ緩衝液 10.2μL
ヌクレアーゼフリー水 81.7μL
Cap03キャプチャーオリゴ(38mer)(50ng/μL) 4.0μL(200ng)
T4 DNAリガーゼ(1U/μL) 10.0μL(10ユニット)
連結されたCap03配列を含む2層DNAデンドリマー(50ng/μL) 50.0μL
PBSまたは同等物(例えば、Superfreeze(Pierce))中の50%エチレングリコール 25.0μL
1×リン酸緩衝化食塩水(PBS) 57.0μL
5M NaCl 4.3μL
オリゴ−抗体コンジュゲート(抗マウスICAM−1抗体)(オリゴとして7.8ng/μL) 13.7μL
細胞内でsiRNAとして働くよう設計された分子を化学合成するが、これは、1)通常19塩基長の、RNAリボヌクレオチドとしての5’部分と、通常0〜33塩基長の、DNAデオキシリボヌクレオチドとしての3’部分とを含み、DNAデンドリマーに連結されたキャプチャーオリゴに相補的であるよう設計された、一本鎖「センス」鎖と、2)RNAリボヌクレオチドのみの、通常19塩基長の部分と、2個の3’末端デオキシリボヌクレオチドとを含む、「センス」鎖に相補的な一本鎖「アンチセンス」鎖とを含む。これら2つの鎖を等モル量で組み合わせて、「センス」鎖と「アンチセンス」鎖の間に安定なハイブリッドを形成させ、「センス」鎖の一本鎖DNA部分をDNAデンドリマーのキャプチャーオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションに利用できるようにする。
デンドリマー付着配列を含まないsiRNA
SSB siRNA(SSB unmod):
アンチセンス鎖:
RNAアンチセンス鎖:5’−UUAAAGUCUGUUGUCAGCC−3’(配列番号1)
DNAアンチセンス鎖 5’−dGdG−3’
5’−rUrUrA rArArG rUrCrU rGrUrU rGrUrC rArGrC rC dGdG−3’(配列番号10)
を形成する。
RNAセンス鎖:5’−GGCUGACAACAGACUUUAA−3’(配列番号2)
DNAセンス鎖:5’−dTdT−3’
5’−rGrGrC rUrGrA rCrArA rCrArG rArCrU rUrUrA rA dTdT−3’(配列番号11)
を形成する。
アンチセンス鎖:
RNAアンチセンス鎖:5’−ACGUGACACGUUCGGAGAA−3’(配列番号3)
DNAアンチセンス鎖 5’−dTdT−3’
5’−rArCrG rUrGrA rCrArC rGrUrU rCrGrG rArGrA rA dTdT−3’(配列番号12)
を形成する。
RNAセンス鎖:5’−UUCUCCGAACGUGUCACGU−3’(配列番号4)
DNAセンス鎖:5’−dTdT−3’
5’−rUrUrC rUrCrC rGrArA rCrGrU rGrUrC rArCrG rU dTdT−3’(配列番号13)
を形成する。
アンチセンス鎖:
RNAアンチセンス鎖:5’−UUAAAGUCUGUUGUCAGCC−3’(配列番号1)
DNAアンチセンス鎖 5’−dGdG−3’
5’−rUrUrA rArArG rUrCrU rGrUrU rGrUrC rArGrC rC dGdG−3’(配列番号10)
を形成する。
RNAセンス鎖:5’−GGCUGAC AAC AGACUUU AA−3’(配列番号2)
DNAセンス鎖:5’−TTCCGTTGACATCTCGTAGATTTGAATT−3’(配列番号7)
5’−rGrGrC rUrGrA rCrArA rCrArG rArCrU rUrUrA rA dTdT dCdCdGdTdT dGdAdC dAdTdCdTdC dGdTdAdGdAdTdTdTdG dAdAdTdT−3’(配列番号14)
を形成する。
アンチセンス鎖:
RNAアンチセンス鎖:5’−ACGUGACACGUUCGGAGAA−3’(配列番号3)
DNAアンチセンス鎖 5’−dTdT−3’
5’−rArCrG rUrGrA rCrArC rGrUrU rCrGrG rArGrA rA dTdT−3’(配列番号12)
を形成する。
RNAセンス鎖:5’−UUCUCCGAACGUGUCACGU−3’(配列番号4)
DNAセンス鎖:5’−TTCCGTTGACATCTCGTAGATTTGAATT−3’(配列番号7)
5’−rUrUrC rUrCrC rGrArA rCrGrU rGrUrC rArCrG rU dTdT dCdCdGdTdT dGdAdC dAdTdCdTdC dGdTdAdGdAdTdTdTdG dAdAdTdT−3’(配列番号15)
を形成する。
「センス」DNA/RNA分子(50μM) 25μL
「アンチセンス」RNA分子(50μM) 25μL
リポフェクトアミン2000(Invitrogen,Carlsbad,CA)を製造元に従って使用し、2倍濃縮物となるように無血清培地中でまず希釈して、2×リポフェクトアミン溶液を調製した。
以下の構成要素をマイクロチューブ中で組み合わせた:
siRNA二重鎖分子(2μMに希釈) 3.0μL
無血清培地またはPBS 51.0μL
以下の構成要素をマイクロチューブ中で組み合わせた:
抗体を含むまたは含まない4層DNAデンドリマー(10ng/μL) 12.0μL
siRNA二重鎖分子(2μMに希釈) 3.0μL
無血清培地またはPBS 39.0μL
トランスフェクション混合物を、インビトロトランスフェクションの標的として好適な2,000〜10,000個の生きた細胞を含む組織培養プレートのウェルに導入し、10%血清を含む適切な培地中または無血清培地中で増殖させた。5μlの適当な上記の処方物を、プレーティングされた細胞を含む96ウェルプレート中の120uLの組織培養培地に添加した。siRNAの最終濃度は、2nMであった。siRNAの機能は、標的とされたmRNA(ssb)を内部対照mRNA(18s RNAおよびPPIB mRNA)と比べて検出するように設計されたqRT−PCRアッセイを用いて、リポフェクトアミンsiRNAまたはリポフェクトアミンデンドリマー−siRNA複合体の添加後に細胞に残存するインタクトなmRNAの量を定量することによって直接的に測定した。
リポフェクトアミン+「SSB unmod」デンドリマーなし(#1)、リポフェクトアミン+「Neg unmod」デンドリマーなし(#2)、リポフェクトアミン+「SSB+26」デンドリマーなし(#3)、リポフェクトアミン+「Neg+26」デンドリマーなし(#4)、リポフェクトアミン+Abを含まないデンドリマー+「SSB unmod」(#5)、リポフェクトアミン+Abを含まないデンドリマー+「Neg unmod」(#6)、リポフェクトアミン+Abを含まないデンドリマー+「SSB+26」(#7)、リポフェクトアミン+Abを含まないデンドリマー+「Neg+26」(#8)、リポフェクトアミン+720個のビオチンを含み、Abを含まないデンドリマー+「SSB unmod」(#9)、リポフェクトアミン+720個のビオチンを含み、Abを含まないデンドリマー+「Neg unmod」(#10)、リポフェクトアミン+720個のビオチンを含み、Abを含まないデンドリマー+「SSB+26」(#11)、リポフェクトアミン+720個のビオチンを含み、Abを含まないデンドリマー+「Neg+26」(#12)、リポフェクトアミン+720個のビオチンを含み、Abを含むデンドリマー+「SSB unmod」(#13)、リポフェクトアミン+720個のビオチンを含み、Abを含むデンドリマー+「Neg unmod」(#14)、リポフェクトアミン+720個のビオチンを含み、Abを含むデンドリマー+「SSB+26」(#15)、リポフェクトアミン+720個のビオチンを含み、Abを含むデンドリマー+「Neg+26」(#16)。
「SSB unmod」のノックダウン効率を「SSB+26」を比較した全ての場合において、siRNAがデンドリマーと組み合わされているかどうかにかかわらず、2つのsiRNA構築物の間にはほとんど違いが見られず、26塩基の伸長が、結果に対して良くも悪くも影響を及ぼさないことが示された。さらに、siRNAをデンドリマーに付着させたとき、このsiRNAはハイブリダイズしていないsiRNAと同じくらい良く機能し、ハイブリダイズしたsiRNAがデンドリマーsiRNA構築物から効率的に放出されることが示唆された。
Claims (32)
- siRNA分子に付着したDNAデンドリマーを含む組成物。
- タンパク質、ポリエチレングリコール(PEG)部分を含む分子、ビオチンもしくはビオチン誘導体、フルオレセインもしくはフルオレセイン誘導体、またはその任意の組合せが、前記DNAデンドリマーにさらに付着している、請求項1に記載の組成物。
- siRNA分子と抗体とに付着したDNAデンドリマーを含む、請求項2に記載の組成物。
- siRNA分子とビオチンとに付着したDNAデンドリマーを含む、請求項2に記載の組成物。
- siRNA分子とフルオレセインまたはフルオレセインイソチオシアネート(FITC)を含む、フルオレセイン誘導体とに付着したDNAデンドリマーを含む、請求項2に記載の組成物。
- ヒトまたは動物の血清、血漿、血液、リンパ液、および任意の数の他の体液をさらに含む、請求項2に記載の組成物。
- 前記組成物が血清中で少なくとも0.5時間安定である、請求項2に記載の組成物。
- DNAデンドリマーとsiRNA分子とを含む組成物を調製する方法であって、(a)ジスルフィド架橋結合によって;(b)NHSエステル依存的縮合反応の使用によって;(c)二官能性架橋反応の使用によって;(d)siRNAのDNAデンドリマー配列への直接的もしくは間接的ハイブリダイゼーションによって;または(e)電荷−電荷相互作用を介してsiRNA分子を前記DNAデンドリマーに架橋するポリカチオン性化合物の使用によって、前記siRNAを前記DNAデンドリマーに付着させる工程を含む方法。
- 前記DNAデンドリマーに、タンパク質、フルオレセインもしくはフルオレセイン誘導体、ジゴキシゲニン、コレステロール、1級アミン、3〜120炭素長の炭化水素スペーサー、ポリエチレングリコール(PEG)部分を含む分子、ビオチンもしくはビオチン誘導体、またはその任意の組合せを付着させる工程をさらに含む、請求項8に記載の方法。
- 抗体またはその断片をさらに付着させる、請求項9に記載の方法。
- ビオチンをさらに付着させる、請求項9に記載の方法。
- フルオレセインまたはフルオレセイン誘導体をさらに付着させる、請求項9に記載の方法。
- siRNA分子を分解から保護する方法であって、(a)前記siRNA分子と(b)タンパク質、ジゴキシゲニン、コレステロール、1級アミン、3〜120炭素長の炭化水素スペーサー、PEG分子、ビオチン、ビオチン誘導体、フルオレセインもしくはフルオレセイン誘導体、またはその任意の組合せとをDNAデンドリマーに付着させ、それにより、siRNA分子を分解から保護する工程を含む方法。
- 前記分解が体液中で起こる分解である、請求項13に記載の方法。
- 前記体液が血清を含む、請求項14に記載の方法。
- 前記タンパク質が抗体またはその断片である、請求項13に記載の方法。
- 前記ビオチンを前記DNAデンドリマーに付着させる工程を含む、請求項13に記載の方法。
- 前記フルオレセインまたはフルオレセイン誘導体を前記DNAデンドリマーに付着させる工程を含む、請求項13に記載の方法。
- DNAデンドリマーを体液中での分解から保護する方法であって、前記DNAデンドリマーに、タンパク質、ジゴキシゲニン、コレステロール、1級アミン、3〜120炭素長の炭化水素スペーサー、PEG部分を含む分子、ビオチンもしくはビオチン誘導体、フルオレセインもしくはフルオレセイン誘導体、またはその任意の組合せを付着させ、それにより、DNAデンドリマーを体液中でのヌクレアーゼ分解から保護する工程を含む方法。
- 前記体液が血清を含む、請求項19に記載の方法。
- 前記タンパク質が抗体またはその断片である、請求項19に記載の方法。
- 前記ビオチンを前記DNAデンドリマーに付着させる工程を含む、請求項19に記載の方法。
- 前記フルオレセインまたはフルオレセイン誘導体を前記DNAデンドリマーに付着させる工程を含む、請求項19に記載の方法。
- 前記DNAデンドリマーに、DNA分子、RNA分子、タンパク質、化学療法剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、静菌剤、向精神剤、スタチン、神経障害因子、ホルモン、ACE阻害剤、抗凝固因子、鎮痛剤、抗血管新生剤、血管形成剤、増殖因子、増殖因子阻害剤、または任意のその組合せを含む分子を付着させる工程をさらに含む、請求項19に記載の方法。
- DNAデンドリマーを体液中に送達する方法であって、前記DNAデンドリマーに、タンパク質、PEG部分を含む分子、ビオチンもしくはビオチン誘導体、フルオレセインもしくはフルオレセイン誘導体、またはその組合せを付着させ、それにより、DNAデンドリマー体液中に送達する工程を含む方法。
- 前記体液が血清である、請求項25に記載の方法。
- 前記送達がインビボ送達である、請求項25に記載の方法。
- 前記DNAデンドリマーに核酸分子を付着させる工程をさらに含む、請求項25に記載の方法。
- 前記核酸分子がsiRNA分子である、請求項28に記載の方法。
- 前記タンパク質が抗体またはその断片である、請求項25に記載の方法。
- 前記ビオチンまたはビオチン誘導体を前記DNAデンドリマーに付着させる工程を含む、請求項25に記載の方法。
- 前記フルオレセインまたはフルオレセイン誘導体を前記DNAデンドリマーに付着させる工程を含む、請求項25に記載の方法。
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