KR20230136070A - 면역세포 표적형 나노입자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생체적합성 중합체; 및 상기 나노입자의 표면에 접합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 면역세포 표적형 나노입자에 관한 것이다. 본 발명의 면역세포 표적형 나노입자는 체내를 순환하는 면역세포에 높은 특이성으로 약물을 전달하므로, 면역치료를 위한 능동형 약물 전달 플랫폼으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

면역세포 표적형 나노입자 및 이의 용도 {Immune Cell-Targeted Nanoparticles and Uses Thereof}

본 발명은 면역세포 표적형 나노입자 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 생체적합성 중합체; 및 나노입자의 표면에 접합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 면역세포 표적형 나노입자에 관한 것이다.

암 치료 및 감염병 치료에 있어, 인체 내 존재하는 면역세포가 최대한의 기능을 발휘하여 질병을 치료하도록 하는 면역치료(immunotherapy)가 활발히 연구되고 있다. 면역치료는 환자의 면역 체계를 활성화시켜 환자의 면역 체계가 스스로 암세포나 감염원을 공격하도록 한다는 점에서 외과적 수술, 또는 항암제 사용으로 인하여 나타나는 부작용이 없다는 장점이 있다. 암이나 감염병의 면역치료 방법으로는, 체내의 능동적인 면역 반응을 유도하는 백신을 통한 치료법과, T 세포, NK 세포(Natural Killer 세포, 자연살해세포), 대식세포 등의 면역세포를 활성화시키는 치료법이 있다. 다만, 면역세포는 다른 세포에 비하여 어려운 배양 및 증식, 면역세포의 자체 방어기작 등으로 인하여 세포 내로의 약물 전달이 어려운 세포로 알려져 있다.

한편, 약물전달시스템(Drug Delivery System, DDS) 기술이란 약리학적 활성을 갖는 물질의 세포, 조직, 장기 및 기관으로의 전달 및 방출을 제어하는 일련의 기술을 총칭하며, 다양한 물리화학적 기술을 이용하여 약리학적 활성을 갖는 물질들이 전달된 세포, 조직, 장기 및 기관에서 최적의 효력을 발휘하도록 하는 것을 목적으로 한다. 현재 약물을 전달하는 다양한 시스템이 개발되고 있으며, 최근에는 효과적인 약물 전달 방법으로서 나노입자가 활발하게 연구 및 개발되고 있다. 나노입자는 약물을 효율적으로 전달하기 위한 약물운반체로서, 소수성 약물의 경우에는 수성 조건(aqueous condition)에서 응집 반응 없이 보관하며, 친수성 약물의 경우에는 다른 외부인자와의 화학적 반응을 차단할 수 있어, 약물을 장기간 보관하며 전달할 수 있는 장점이 있다. 다양한 소재의 생체적합성 나노입자를 이용한 나노 의약품이 임상 승인 상태에 있으나, 대부분 수동형 전달에 의존하기 때문에 전신 부작용의 위험성이 높고, 치료 효용성도 낮다는 한계가 있다.

이에 따라, 본 발명자들은 체내를 순환하는 면역세포에 높은 특이성으로 약물을 전달할 수 있는 능동형 약물 전달 플랫폼을 개발하고자 하였다.

대한민국 등록특허 제10-1003204호 (2010.12.15. 등록)

본 발명자들은 체내를 순환하는 면역세포에 높은 특이성으로 약물을 전달할 수 있는 능동형 약물 전달 플랫폼을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 생체적합성 중합체를 포함하는 나노입자의 표면에 면역세포를 표적화하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 접합하는 경우, 면역세포에 특이적으로 약물을 전달할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 생체적합성 중합체를 포함하는 나노입자; 및 상기 나노입자의 표면에 접합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 면역세포 표적형 나노입자로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 면역세포를 표적화하는 것인, 면역세포 표적형 나노입자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상술한 면역세포 표적형 나노입자 및 약물을 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상술한 면역세포 표적형 나노입자의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 생체적합성 중합체를 포함하는 나노입자; 및 상기 나노입자의 표면에 접합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 면역세포 표적형 나노입자로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 면역세포를 표적화하는 것인, 면역세포 표적형 나노입자를 제공한다.

본 발명자들은 체내를 순환하는 면역세포에 높은 특이성으로 약물을 전달할 수 있는 능동형 약물 전달 플랫폼을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 생체적합성 중합체를 포함하는 나노입자의 표면에 면역세포를 표적화하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 접합하는 경우, 면역세포에 특이적으로 약물을 전달할 수 있음을 규명하였다.

본 명세서에서, 용어 "생체적합성"은 세포에 독성을 띠지 않는 것을 의미한다. "생체적합성" 중합체를 포함하는 나노입자는 시험관내(in vitro)에서 세포에 처리하는 경우 세포 사멸율이 20% 이하, 예컨대 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하 또는 5%이하일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, "생체적합성" 고분자를 포함하는 나노입자는 생체내(in vivo)에 투여하는 경우 염증반응과 같은 부작용을 일으키지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상술한 본 발명의 생체적합성 중합체는 폴리(락트산-co-글라이콜산) [poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA], 폴리(락트산) [poly(lactic acid), PLA], 폴리(글라이콜산) [poly(glycolic acid), PGA], 폴리(락트산-co-글라이콜산)-폴리(에틸렌글라이콜) 공중합체 [poly(lactic-co-glycolic acid)-poly(ethylene glycol) copolymer, PLGA-PEG copolymer], 폴리(락트산)-폴리(에틸렌글라이콜) 공중합체 [poly(lactic acid)-poly(ethylene glycol) copolymer, PLA-PEG copolymer], 폴리(글라이콜산)-폴리(에틸렌글라이콜) [poly(glycolic acid)-poly(ethylene glycol) copolymer, PGA-PEG copolymer] 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이고, 보다 구체적으로는 폴리(락트산-co-글라이콜산)-폴리(에틸렌글라이콜) 공중합체 [poly(lactic-co-glycolic acid)-poly(ethylene glycol) copolymer, PLGA-PEG copolymer]인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 생체적합성 중합체를 포함하는 나노입자의 표면은 작용기화(functionalization)된 것일 수 있다. 후술할 바와 같이, 본 발명에서는 생체적합성 중합체의 작용기와 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 화학적 반응을 통하여 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 나노입자의 표면에 접합시킬 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 생체적합성 중합체를 포함하는 나노입자의 표면은 일차 아민(primary amine), 이차 아민(secondary amine), 싸이올기(thiol group), 하이드록시기(hydroxyl group), 인산기(phosphate group), 실레인(silane), 카복시기(carboxyl group) 또는 말레이미드기(maleimide group)를 포함하도록 작용기화된 것일 수 있고, 보다 구체적으로 카복시기(carboxyl group) 또는 말레이미드기(maleimide group)를 포함하도록 작용기화된 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 나노입자의 표면이 일차 아민, 이차 아민 또는 실레인을 포함하는 경우, 항체 또는 이의 결합 단편에 존재하는 카복시기와의 화학적 반응을 통하여 접합이 가능하다. 나노입자의 표면이 하이드록시기를 포함하는 경우, 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 존재하는 알데하이드기 또는 에폭시기와의 화학적 반응을 통하여 접합이 가능하다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 나노입자 표면에 흡착을 이용한 방법, 공유결합을 형성하는 방법 또는 어댑터 분자를 사용하는 방법을 통하여 접합될 수 있고, 보다 구체적으로는 공유결합을 통하여 접합될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

흡착을 이용하는 방법은 비-공유결합 방법으로 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 접합하는 것을 의미하며, 물리적 흡착이나 이온 결합을 사용한다. 공유결합을 이용한 방법은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 활성화시킨 뒤, 나노입자 표면과 화학반응을 통하여 공유결합을 형성함을 통하여 접합하는 것으로, 예로는 카보다이이미드 화학(carbodiimide chemistry), 말레이미드 화학(maleimide chemistry), 클릭 화학(click chemistry)이 있다. 클릭 화학이란, 두 분자를 서로 결합하여 단일 분자를 생성하는 반응을 의미하며, 이는 선택적이고 반응성이 우수하다. 클릭 화학의 예로는, copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (구리-촉매 아자이드-알킨 고리화 첨가, CuAAC) 반응, strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC) 반응이 있다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 어댑터 분자(adapter molecules, 예컨대 비오틴-아비딘)의 사용을 통하여도 나노입자 표면에 접합될 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상술한 공유결합은 카보다이이미드 화학(carbodiimide chemistry) 또는 말레이미드 화학(maleimide chemistry)을 통해 생성되는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다. "카보다이이미드 화학(carbodiimide chemistry)"이란 나노입자 표면의 카복시기를 활성화하고 이를 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 아민기와 반응시켜 공유결합을 형성하는 것을 의미하며, "카보다이이미드 커플링 반응"과 상호 교환적으로 사용된다. "말레이미드 화학(maleimide chemistry)"이란 나노입자 표면의 말레이미드기를 활성화하고 이를 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 싸이올기와 반응시켜 공유결합을 형성하는 것을 의미하며, "말레이미드 커플링 반응"과 상호 교환적으로 사용된다.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 면역세포를 표적화하는 전장 항체의 아민기(amine group)와 나노입자 표면의 카복시기가 카보다이이미드 화학을 통하여 공유결합을 형성하고, 면역세포를 표적화하는 F(ab')₂의 싸이올기(thiol group)와 나노입자 표면의 말레이미드기가 말레이미드 화학을 통하여 공유결합을 형성한다(도 1). 후술할 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 나노입자 표면에 면역세포를 표적화하는 전장 항체를 상기 카보다이이미드 화학을 통하여 접합하는 경우 및 면역세포를 표적화하는 F(ab')₂를 상기 말레이미드 화학을 통하여 접합하는 경우 모두, 나노입자의 면역세포 표적능이 증가하였으며, 특히 말레이미드 화학을 통한 경우의 표적능이 더욱 높았다. 이는 전장 항체의 여러 위치에 아민기가 존재하여, 여러 위치에서 카보다이이미드 화학을 통하여 나노입자 표면에 접합될 수 있으며, 이에 따라 전장 항체가 무작위하게 배향되어 접합됨에 기인할 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상술한 나노입자 표면의 카복시기는 1-에틸-3-[3-다이메틸아미노프로필] 카보다이이미드 (1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide, EDC) 및 N-하이드록시설포숙신이미드(N-hydroxysulfosuccinimide, NHS)에 의하여 활성화할 수 있으며, 상술한 나노입자 표면의 말레이미드기는 DTT(dithiothreitol)로 환원하여 활성화할 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "항체(antibody)"는 완전한 항체 형태 뿐 만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편(antigen binding fragment)을 포함한다. 완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(kappa) 및 람다(lambda) 타입을 가진다.

본 명세서에서, 용어 "항원 결합 단편"은 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂, 화학적으로 연결된 F(ab')₂ 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')₂ 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 다이설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')₂ 단편을 얻을 수 있다), 또는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 전장　항체,　Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, 또는 scFv인 것이고, 보다 구체적으로는 전장 항체 또는 F(ab')₂이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 후술할 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 나노입자에 면역세포를 표적화하는 전장 항체 또는 F(ab')₂를 접합하는 경우, 나노입자의 면역세포 표적능이 높아지며, 특히 F(ab')₂를 접합하는 경우 표적능이 더욱 높았다. 이는 화학적 반응을 통하여 전장 항체를 나노입자의 표면에 접합하는 경우, 전장 항체의 여러 위치에 존재하는 작용기로 인하여 전장 항체가 무작위하게 배향되어 접합됨에 기인할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 항원 결합 단편은 항체 분해 효소를 처리함으로써 제조되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항체 분해 효소는 파파인(papain), 펩신(pepsin), 트립신(trypsin), 프로티네이스 K(proteinase K), 엔도프로티네이스 Glu-C(Endoproteinase Glu-C), IdeS 프로테이스, IdeZ 프로테이스 또는 이의 조합일 수 있고, 보다 구체적으로 IdeS 프로테이스, IdeZ 프로테이스 또는 이의 조합일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. IdeS(IgG-Digesting Enzyme S) 프로테이스는 화농연쇄상구균(Streptococcus pyogenes) 유래 재조합 프로테이스로, E. coli에서 과발현시켜 얻는다. IdeS 프로테이스는 면역글로불린 G(Immunoglobulin G, IgG)를 힌지 영역 아래의 단일 부위에서 절단하여 F(ab')₂ 단편 및 Fc 단편을 생성한다. IdeZ 프로테이스는 Streptococcus equi　subspecies　zooepidemicus 유래 재조합 프로테이스로, IdeS와 마찬가지로 IgG를 힌지 영역 아래의 단일 부위에서 절단하여 F(ab')₂ 단편 및 Fc 단편을 생성하나, IdeS 프로테이스에 비하여 마우스 IgG2a 및 IgG3 하위클래스에 대한 활성이 향상되어 있다. IdeS 프로테이스 및 IdeZ 프로테이스는 양(sheep)의 IgG, 토끼(rabbit)의 IgG, 원숭이(monkey)의 IgG, 인간(human)의 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 인간화(humanized) 항체의 IgG, 키메릭(chimeric) 항체의 IgG, 마우스(mouse)의 IgG2a, IgG3 및 랫트(rat)의 IgG2b를 F(ab')₂ 단편 및 Fc 단편으로 전달할 수 있다. 반면, IdeS 프로테이스 및 IdeZ 프로테이스는 IgA, IgM, IgD, IgE와 같은 IgG가 아닌 면역글로불린, 랫트의 IgG2a, IgG1, 마우스의 IgG1, IgG2b, 소의 면역글로불린, 염소의 면역글로불린, 돼지의 면역글로불린은 모두 절단할 수 없다.

후술할 실시예에서 입증된 바와 같이, 면역세포를 표적화하는 항체를 IdeS 프로테이스 또는 IdeZ 프로테이스를 사용하여 분자를 생성하고, 생성된 F(ab')₂를 나노입자 표면에 접합하는 경우, 면역세포 표적능이 매우 우수하여, 표적이 되는 면역세포에 높은 효율로 약물을 전달할 수 있음을 확인하였다.

본 명세서에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 전장 또는 원래 그대로의 폴리클로날 또는 모노클로날 항체뿐만 아니라, 이의 항원 결합 단편들(예를 들어, Fab, Fab', F(ab')₂, Fab3, Fv 및 이의 변이체들), 하나 또는 그 이상의 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 인간항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 미니바디, 다이아바디, 트리아바디, 테트라바디, 선형 항체, 단일 체인 항체(scFv), scFv-Fc, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 필요한 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 면역 글로불린 분자의 다른 변형된 배열형태로서 항체의 글리코실화 변이체, 항체의 아미노산 서열 변이체 및 공유결합으로 변형된 항체를 포함한다. 변형된 항체 및 이의 항원 결합 단편의 구체적인 예에는 나노바디, AlbudAbs, DARTs(dual affinity re-targeting), BiTEs(bispecific T-cell engager), TandAbs(tandem diabodies), DAFs(dual acting Fab), two-in-one antibodies, SMIPs(small modular immunopharmaceuticals), FynomAbs(fynomers fused to antibodies), DVD-Igs(dual variable domain immunoglobulin), CovX-bodies(peptide modified antibodies), 듀오바디 및 triomAbs이 포함된다. 이와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편들의 목록은 상기에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서, "항체 또는 이의 항원 결합 단편이 면역세포를 표적화"한다는 것은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 표적이 되는 물질과 우선적으로 또는 특이적으로 결합하는 것을 의미한다. 후술할 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 면역세포 표적형 나노입자의 표면에 접합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표적인 면역세포와 특이적으로 결합하고, 이를 통하여 본 발명의 나노입자가 표적 면역세포에 특이적으로 전달될 수 있도록 한다.

본 명세서에서, "나노입자가 면역세포를 표적화"한다는 것은 본 발명의 나노입자가 면역세포와 결합하거나, 면역세포 내에 내재화(internalization)하는 것을 의미하거나, 핵막도 투과할 수 있어 핵 내부에 내재화하는 것을 의미한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상술한 면역세포는 NK 세포(Natural Killer 세포, 자연살해세포), T 세포, 대식세포, 수지상 세포, 킬러 수지상 세포, 비만세포, B 세포 및 이들의 전구세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상술한 T 세포는 염증성 T 세포, 세포독성 T 세포(CD8⁺ T 세포), 조절 T 세포 또는 헬퍼 T 세포(CD4⁺ T 세포)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상술한 면역세포는 NK 세포 또는 세포독성 T 세포(CD8⁺ T 세포)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 면역세포를 표적화하는 전장항체는 면역세포의 표면에 발현되는 단백질에 대한 항체일 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 면역세포를 표적화하는 전장항체는 항-CD45 항체, 항-CD3 항체, 항-CD4 항체, 항-CD19 항체, 항-CD25 항체, 항-CD8 항체, 항-CD14 항체, 항-CD40 항체, 항-CD56 항체, 항-CD94 항체, 항-γ/δ TCR 항체, 항-Vα24Jα18 TCR 항체, 항-L-selectin/CD62L 항체, 항-CCR7 항체, 항-CD25/IL-2Rα 항체, 항-NCAM-1/CD56 항체, 항-Fc Gamma R III(CD16) 항체, 항-CD11b 항체, 항-F4/80 항체, 항-CD161 항체, 항-GR-1 항체, 항-CD161a 항체, 항-NK1.1(CD161b) 항체, 항-CD49b 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 항체일 수 있고, 더욱 구체적으로, 면역세포를 표적화하는 전장항체는 항-CD8 항체, 항-CD56 항체, 항-CD69 항체, 항-CD16 항체, 항CD-161 항체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상술한 본 발명의 면역세포 표적형 나노입자의 평균 지름은 10 nm 내지 500 nm일 수 있고, 보다 구체적으로는, 10 nm 내지 500 nm, 10 nm 내지 450 nm, 10 nm 내지 400 nm, 10 nm 내지 400 nm, 10 nm 내지 350 nm, 10 nm 내지 300 nm, 10 nm 내지 250 nm, 10 nm 내지 210 nm, 50 nm 내지 500 nm, 50 nm 내지 450 nm, 50 nm 내지 400 nm, 50 nm 내지 400 nm, 50 nm 내지 350 nm, 50 nm 내지 300 nm, 50 nm 내지 250 nm, 50 nm 내지 210 nm, 100 nm 내지 500 nm, 100 nm 내지 450 nm, 100 nm 내지 400 nm, 100 nm 내지 400 nm, 100 nm 내지 350 nm, 100 nm 내지 300 nm, 100 nm 내지 250 nm, 100 nm 내지 210 nm, 150 nm 내지 500 nm, 150 nm 내지 450 nm, 150 nm 내지 400 nm, 150 nm 내지 400 nm, 150 nm 내지 350 nm, 150 nm 내지 300 nm, 150 nm 내지 250 nm, 150 nm 내지 210 nm, 190 nm 내지 500 nm, 190 nm 내지 450 nm, 190 nm 내지 400 nm, 190 nm 내지 400 nm, 190 nm 내지 350 nm, 190 nm 내지 300 nm, 190 nm 내지 250 nm, 또는 190 nm 내지 210 nm일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 면역세포 표적형 나노입자; 및 약물을 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서, 용어 "약물"은 동물 또는 사람의 체내에서 생리적인 기능을 촉진 또는 억제하여 목적하는 생물학적 또는 약리학적 효과를 유도할 수 있는 물질로서, 동물 또는 사람에게 투여하기 적합한 화학적 또는 생물학적 물질 또는 화합물을 의미한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상술한 약물은 화학 약물, 단백질, 펩타이드, 종양 항원, 사이토카인, 화학항암제, 방사성핵종, 소분자 신호 전달 억제제, 효소, 항생제, 항바이러스제, 항기생충제, 성장 인자, 성장 억제제, 호르몬, 호르몬 길항제, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항원, 백신 제형, 항염증제, 염료, 조영제, 핵산, 면역조절물질 또는 이들의 조합일 수 있고, 더욱 구체적으로는 핵산, 면역조절물질 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 핵산은 DNA, 상보성 DNA(complementary DNA, cDNA), RNA, 메신저 RNA(messenger RNA, mRNA), 운반 RNA(transfer RNA, tRNA), 라이보좀 RNA(rRNA), 마이크로 RNA(micro RNA), 작은 간섭 RNA(small interference RNA, siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA, shRNA), 앱타머(aptamer), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 리보자임(ribozyme), 펩타이드 핵산(Peptide nucleic acid, PNA), DNAzyme, 단일 가이드 RNA(single guide RNA, sgRNA) 또는 이들의 조합으로 이루어진 핵산일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서, 용어 "면역조절물질(immunomodulator)"은 면역 자극 반응을 증가시키거나 강화하는 물질, 예컨대 NK 세포 또는 T 세포의 반응을 강화하거나, NK 세포 또는 T 세포의 활성 또는 증식을 증가시키거나, NK 세포 또는 T 세포 억제신호를 감소시키거나, 사이토카인의 생산을 강화하거나, NK 세포 또는 T 세포의 분화 또는 효과 기능을 자극하거나, NK 세포 또는 T 세포의 생존을 촉진하는 물질일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 구체적으로, 상술한 면역조절물질은 사이토카인(예컨대 인터루킨, 인터페론), 케모카인, 항체, 잔틴계 화합물, TCR 작용제(Toll-like receptor agonist), 백신이나 면역치료에서 면역 반응을 향상시킬 수 있는 어주번트, 면역 체크포인트 억제제(예컨대 PD-1 억제제, CTLA-4 억제제), 코르티코스테로이드 또는 사이클로스포린과 같은 소분자 약물, 면역억제제, 올리고디옥시뉴클레오타이드, 글루칸, 성장 인자, 호르몬, 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상술한 약물은 상기 면역세포 표적형 나노입자 내부에 봉입되어 있는 것이다.

본 명세서에서, 용어 "봉입(encapsulation)" 은 전달의 대상이 되는 물질을 둘러싸서 효율적으로 생체 내로 함입시키기 위해 캡슐화하는 것을 의미한다.

본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 상술한 면역세포 표적형 나노입자 또는 상술한 약물 전달용 조성물을 유효성분으로 포함하는 암 또는 감염의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

상술한 본 발명의 상술한 면역세포 표적형 나노입자 또는 상술한 약물 전달용 조성물을 대상에 투여함으로써, 암 또는 감염병을 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상술한 암은 비소세포성 폐암, 소세포성 폐암, 간암, 골암, 뇌암, 설암, 후두암, 신세포암, 직결장암, 난소암, 유방암, 췌장암, 위 암종, 방광암, 식도암, 중피종, 흑색종, 두경부암, 갑상선암, 육종, 전립선암, 교모세포종, 자궁경부암, 흉선 암종, 백혈병, 림프종, 골수종, 메르켈 세포 암 및 혈액 악성종양으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상술한 감염은 바이러스　감염, 박테리아　감염, 균류　감염　또는　기생충에 의한　감염일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.0001-1000 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물이 체내를 순환하는 면역세포를 표적화하여 약물을 전달하는 나노입자를 유효성분으로 포함되는 점을 감안하면, 투여는 정맥내 주입을 통해 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는, 면역세포 표적형 나노입자 제조방법을 제공한다:

(a) 생체적합성 중합체를 포함하는 나노입자를 제조하는 단계; 및

(b) 상기 나노입자의 표면에 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 접합하는 단계.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 생체적합성 중합체는 폴리(락트산-co-글라이콜산) [poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA], 폴리(락트산) [poly(lactic acid), PLA], 폴리(글라이콜산) [poly(glycolic acid), PGA], 폴리(락트산-co-글라이콜산)-폴리(에틸렌글라이콜) 공중합체 [poly(lactic-co-glycolic acid)-poly(ethylene glycol) copolymer, PLGA-PEG copolymer], 폴리(락트산)-폴리(에틸렌글라이콜) 공중합체 [poly(lactic acid)-poly(ethylene glycol) copolymer, PLA-PEG copolymer], 폴리(글라이콜산)-폴리(에틸렌글라이콜) [poly(glycolic acid)-poly(ethylene glycol) copolymer, PGA-PEG copolymer] 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 생체적합성 중합체를 포함하는 나노입자의 표면은 작용기화(functionalization)된 것이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상술한 단계 (b)의 생체적합성 중합체를 포함하는 나노입자의 표면에 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 접합하는 단계는 상기 나노입자의 표면에 포함된 작용기와 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 접합하는 단계이다. 보다 구체적으로, 상기 작용기는 카복시기(carboxyl group) 또는 말레이미드기(maleimide group)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상술한 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 분해 효소를 처리함으로써 제조되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상술한 항체 분해 효소는 파파인(papain), 펩신(pepsin), 트립신(trypsin), 프로티네이스 K(proteinase K), 엔도프로티네이스 Glu-C(Endoproteinase Glu-C), IdeS 프로테이스, IdeZ 프로테이스 또는 이의 조합일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. IdeS(IgG-Digesting Enzyme S) 프로테이스는 화농연쇄상구균(Streptococcus pyogenes) 유래 재조합 프로테이스로, E. coli에서 과발현시켜 얻는다. IdeS 프로테이스는 면역글로불린 G(Immunoglobulin G, IgG)를 힌지 영역 아래의 단일 부위에서 절단하여 F(ab')₂ 단편 및 Fc 단편을 생성한다. IdeZ 프로테이스는 Streptococcus equi　subspecies　zooepidemicus 유래 재조합 프로테이스로, IdeS와 마찬가지로 IgG를 힌지 영역 아래의 단일 부위에서 절단하여 F(ab')₂ 단편 및 Fc 단편을 생성하나, IdeS 프로테이스에 비하여 마우스 IgG2a 및 IgG3 하위클래스에 대한 활성이 향상되어 있다. IdeS 프로테이스 및 IdeZ 프로테이스는 양(sheep)의 IgG, 토끼(rabbit)의 IgG, 원숭이(monkey)의 IgG, 인간(human)의 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 인간화(humanized) 항체의 IgG, 키메릭(chimeric) 항체의 IgG, 마우스(mouse)의 IgG2a, IgG3 및 랫트(rat)의 IgG2b를 F(ab')₂ 단편 및 Fc 단편으로 전달할 수 있다. 반면, IdeS 프로테이스 및 IdeZ 프로테이스는 IgA, IgM, IgD, IgE와 같은 IgG가 아닌 면역글로불린, 랫트의 IgG2a, IgG1, 마우스의 IgG1, IgG2b, 소의 면역글로불린, 염소의 면역글로불린, 돼지의 면역글로불린은 모두 절단할 수 없다.

후술할 실시예에서 입증된 바와 같이, 면역세포를 표적화하는 항체를 IdeS 프로테이스 또는 IdeZ 프로테이스를 사용하여 분자를 생성하고, 생성된 F(ab')₂를 나노입자 표면에 접합하는 경우, 면역세포 표적능이 매우 우수하여, 표적이 되는 면역세포에 높은 효율로 약물을 전달할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 면역세포 표적형 나노입자 제조방법은 면역세포 표적형 나노입자를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 중복되는 내용을 원용하며, 이 둘 사이에 공통된 내용은 그 기재를 생략한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 생체적합성 중합체; 및 상기 나노입자의 표면에 접합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 면역세포 표적형 나노입자를 제공한다.

(b) 본 발명은 상기 면역세포 표적형 나노입자나노입자를 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다.

(c) 본 발명의 상기 면역세포 표적형 나노입자의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 면역세포 표적형 나노입자는 체내를 순환하는 면역세포에 높은 특이성으로 약물을 전달하므로, 면역치료를 위한 능동형 약물 전달 플랫폼으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 말레이미드기 또는 카복시기가 포함된 PLGA 나노입자에 항체 또는 항체의 F(ab')₂를 접합시키는 방법을 나타낸 것이다.
도 2a 및 도 2b는 전장 CD8a 항체 및 전장 NK1.1 항체의 단편화를 SDS-PAGE를 통하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2c는 전장 CD8a 항체 접합 전후 PLGA-PEG-COOH 나노입자의 SEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 2d는 CD8a 항체의 F(ab')₂ 접합 전후 PLGA-PEG-Mal 나노입자의 SEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 3a는 전장 CD8a 항체 접합 나노입자와 C8a 항체의 F(ab')₂ 접합 나노입자의 CD8+ T 세포 표적능을 유세포 분석으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3b는 NK1.1 항체의 F(ab')₂ 접합 나노입자의 NK 세포 표적능을 유세포 분석으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3c는 공배양 시간 별 DiD-발현 CD8⁺ T 세포의 비율을 분석한 결과를 나타낸 것이다. (n=3, *P=0.0332, **P=0.0021, ***P=0.0002, ****P < 0.0001)
도 3d는 공배양 시간 별 DiD-발현 NK 세포 비율을 분석한 결과를 나타낸 것이다. (n=3, *P=0.0332, **P=0.0021, ***P=0.0002, ****P < 0.0001)
도 3e는 전장 CD8a 항체 접합 나노입자 및 C8a 항체의 F(ab')₂ 접합 나노입자의 CD4⁺ T 세포 결합을 유세포 분석으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3f는 공배양 시간 별 DiD-발현 CD4⁺ T 세포의 비율을 분석한 결과를 나타낸 것이다. (n=3, *P=0.0332, **P=0.0021, ***P=0.0002, ****P < 0.0001)
도 4a는 마우스 비장과 혈액에서 전장 CD8a 항체 접합 나노입자 및 C8a 항체의 F(ab')₂ 접합 나노입자의 CD8⁺ T 세포에 대한 결합 정도를 유세포 분석으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4b는 마우스 비장과 혈액에서 NK1.1 항체의 F(ab')₂ 접합 나노입자의 NK 세포에 대한 결합 정도를 유세포 분석으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4c는 나노입자 주사 후 시간에 따른 CD8⁺ T 세포의 형광 신호를 추적한 결과를 나타낸 것이다. (n=3, **P=0.0021, ****P < 0.0001)
도 4d는 나노입자 주사 후 시간에 따른 NK 세포의 형광 신호를 추적한 결과를 나타낸 것이다. (n=3, **P=0.0021, ****P < 0.0001)
도 4e는 나노입자 주사 후 시간에 따른 CD4⁺ T 세포의 형광 신호를 추적한 결과를 나타낸 것이다. (n=3, **P=0.0021, ****P < 0.0001)

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

(본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는(중량/부피) %, 그리고 액체/액체는(부피/부피) %이다.)

실시예

<실험재료 및 실험방법>

1. 면역세포 표적형 나노입자의 제조

1-1. 나노입자의 제조

F(ab')₂ 접합을 위한 나노입자는 다음과 같은 방법으로 제조하였다. 22.5 mg의 PLGA(Poly(lactic-co-glycolic acid)(중량 평균 분자량(M_W): 10,000-15,000 Da, LG 50:50, PolySciTech, NH, USA) 및 7.5 mg의 PLGA-PEG-Mal(PLGApoly(ethylene glycol)maleimide)(Mw: 10,000:5000 Da, LG 50:50, PolySciTech, NH, USA)를 다이클로로메테인(DCM) 1 mL에 용해하고, 차가운 2%(w/v) PVA(poly(vinyl alcohol)) 용액 10 mL에 가하였다. 생성된 중합체 용액을 one sec-on and one sec-off sequence에 따라 20 %(140 W) 진폭으로 10 분 동안 초음파 처리하였다(Qsonica, CT, USA). 생성된 에멀젼을 실온에서 4 시간 동안 교반하여 DCM을 완전히 증발시키고, 17,000 rpm에서 20 분 동안 원심분리하여 PLGA-PEG-Mal 나노입자를 수집하였다. 수집한 나노입자 펠릿을 탈이온수(Deionized water, DI)로 3 회 세척하였다.

전장 항체 접합을 위한 나노입자는 PLGA-PEG-Mal 대신 PLGA-PEG-COOH (PLGA-poly(ethylene glycol)-COOH)(Mw: 10,000:5000 Da, LG 50:50, Ruixibiotech, Shannxi, China)를 사용한 점을 제외하고는 상술한 방법과 동일한 방법으로 제조하였다.

1 mg의 나노입자에 5 μg의 DiD (DiIC18(5); 1 mg의 나노입자에 5 μg의 DiD (DiIC18(5); 1,1′-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate salt)(λEx/λEm: 644/663, Biotium, CA, USA)을 첨가하여 나노입자를 추적하였다. 나노입자의 크기(지름)는 동적 광 산란(dynamic light scattering, DLS) 분석을 통하여, 나노입자의 형태는 주사전자현미경(Scanning electron microscope, SEM)(JEM-7500 F, Akishima, 일본)을 사용하여 확인하였다.

1-2. 나노입자와 전장 항체 및 F(ab') ₂ 의 접합

CD8⁺ T 세포를 표적으로 하는 항체인 CD8a 항체(Clone: 2.43; BioXcell, NH, USA) 및 자연살해세포(Natural killer cell)를 표적으로 하는 항체인 NK1.1 항체(Clone: PK136; BioXcell, NH, USA)를 실험에 사용하였다.

전장 CD8a 항체 및 전장 NK1.1 항체를 다음과 같이 카보다이이미드(carbodiimide) 결합을 이용하여 PLGA-PEG-COOH 나노입자에 접합하였다. 200 mM, 240 μL의 N-하이드록시설포숙신이미드(N-hydroxysulfosuccinimide, NHS) 및 200 mM, 24 μL의 1-에틸-3-[3-다이메틸아미노프로필] 카보다이이미드(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide, EDC)를 5 mg/mL, 1 mL의 PLGA-PEG-COOH 나노입자에 첨가하여 나노입자의 카복시기를 활성화하였다. 활성화된 PLGA-PEG-COOH 나노입자를 1 Х PBS로 3 회 세척하였다. 각 전장 항체를 PLGA-PEG-COOH 나노입자에 1 mg당 50 μg의 항체 비율로 첨가하였다.

CD8a 항체의 F(ab')₂ 및 NK1.1 항체의 F(ab')₂는 다음과 같은 방법으로 PLGA-PEG-Mal 나노입자에 접합하였다. 프로테이스 IdeS(Promega, WI, USA)를 사용하여 전장 CD8a 항체를 F(ab')₂로 절단하였으며, 프로테이스 IdeZ(Promega, WI, USA)를 사용하여 전장 NK1.1 항체를 F(ab')₂로 절단하였다.

각 항체가 성공적으로 절단되었는지는 SDS-PAGE를 통하여 확인하였다. 구체적으로, 전장 항체 샘플 1 μL(4 mg/mL), F(ab')₂와 Fc로 잘린 항체 1 μL(4 mg/mL)를 6.5 μL의 DPBS 및 2.5 μL의 4 Х 로딩 버퍼와 혼합하여 총 부피 10 μL로 만들었다. 만들어진 샘플과 Ladder 5 μL를 각각 SDS-PAGE 겔에 로딩하였다. 샘플을 50 V로 stacking 겔 끝까지 내린 후, 120 V로 상승시켜 겔 끝까지 내렸다. Coomassie blue로 염색한 후, 밴드를 확인하였다.

이후 각 F(ab')₂를 항체 100 μg 당 10 mM, 2.5 μL의 DTT(dithiothreitol)로 환원하여 힌지 영역에서 유리 싸이올기를 만들었다. 환원 후 7 kDa MWCO 탈염 컬럼(Thermo Scientific, MA, USA)을 사용하여 유리 DTT를 F(ab')₂에서 제거하였다. 이어서 8 mg/mL, 1 mg의 PLGA-PEG-Mal 나노입자에 12.5 μg의 F(ab')₂ 또는 25 μg의 F(ab')₂를 첨가하고 진탕 조건(2 시간, 25℃)에서 인큐베이션하였다. 후술할 나노입자의 시험관내(in vitro) 면역세포 표적능 평가 실험에서는 12.5 μg의 F(ab')₂를 첨가하여 제조한 나노입자를, 후술할 나노입자의 생체내(in vivo) 면역세포 표적능 평가 실험에서는 25 μg의 CD8a 항체의 F(ab')₂를 첨가하여 제조한 나노입자를 사용하였다.

2. 실험동물

실험은 성균관대학교 의과대학 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 승인을 받은 프로토콜에 따라 수행되었다(IACUC 번호: SKKU IACUC2021-01-33-3). 실험 시작 전, 6 내지 7 주령의 C57BL/6 수컷 마우스(18 g 내지 20 g, 오리엔트바이오, 대한민국)에게 7 일간의 적응 기간을 제공하였다. 20℃ 내지 26℃의 온도, 40% 내지 60%의 습도로 자동 제어된 각 케이지에 5 마리의 마우스를 12:12 시간의 명암 주기로 사육하였다. 마우스에게는 표준 설치류 펠릿 사료를 먹이고(standard rodent pellet diet) 물을 무제한으로 공급하였다.

3. 나노입자의 면역세포 표적능 시험관내( in vitro ) 평가

본 발명의 나노입자가 면역세포에 결합하는 정도를 알아보기 위하여, 마우스 비장 세포를 사용하여 나노입자의 시험관 내(in vitro) 면역세포 표적능을 조사하였다. 6 주령 C57BL/6 마우스의 비장을 적출하고, 1 mL 주사기의 플런저 후단을 사용하여 70 μm 세포 스트레이너(cell strainer)에서 삼투하였다. 수집된 세포를 1500 rpm에서 5 분간 원심분리하였다. 펠릿을 5 mL의 ACK 용해 버퍼(Gibco, MA, USA)에 3 분 동안 재현탁하여 적혈구를 제거하였다. 세포를 1500 rpm에서 5 분간 원심분리한 후 비장세포(splenocyte)를 수집하였다. DiD(DiIC18(5))-로드된(loaded) 나노입자를 96 웰 플레이트에서 마우스 비장세포(2Х10⁶ 세포)와 공배양하고 DPBS(Dulbecco'sphosphatebuffered saline)에 현탁하였다. 세포를 10 분에서 90 분까지 다양한 시간 동안, 10 μg의 DiD-로드된 나노입자로 처리하였다. 세포는 공배양 후 DPBS로 3 회 세척하였다. 그 후, 유세포 분석을 통하여 CD8⁺ T 세포, NK 세포 및 CD4⁺ T 세포의 DiD 신호를 평가하였다. CD8⁺ T 세포 및 CD4⁺ T 세포를 게이팅하는 데 사용된 항체로는 Live/Dead 염색을 위한 Zombie Violet(Biolegend, CA, USA), PE-TCR β Chain(Clone: H57-597, Biolegend, CA, USA), PE/Cy7-CD4(Clone: GK 1.5, Biolegend, CA, USA), FITC-CD8a(Clone: 53-6.7, Biolegend, CA, USA)를 사용하였다.

4. 나노입자의 생체내( in vi vo) 면역세포 표적능 평가

본 발명의 면역세포 표적형 나노입자가 생체내에서도 높은 효율로 면역세포에 결합하고 약물을 전달할 수 있는지를 알아보기 위하여, 다음과 같은 실험을 수행하였다. CD8a 항체의 F(ab')₂를 접합한 나노입자 2 mg당 10 μg의 DiD를 첨가한 후, C57BL/6 마우스의 미정맥에 주입하였다. 사전에 설정된 시점(1, 3 또는 6시간)에 마우스를 안락사시킨 후 후속 분석을 위하여 마우스의 혈액 및 비장 샘플을 채취하였다. 유세포 분석을 통하여 CD8⁺ T 세포 및 CD4⁺ T 세포의 DiD 신호를 평가하였다.

5. 통계분석

통계 분석은 Graphpad Prism 소프트웨어를 통해 2-way ANOVA와 Sidak의 다중 비교 검정을 사용한 1-way ANOVA를 사용하여 수행하였다. 데이터는 '평균±표준오차(mean±standard error of the mean)' 또는 '평균±표준편차(SD)'로 형식화하였으며 유의수준은 P <0.05로 설정하였다.

<실험결과>

1. PLGA-PEG-COOH 나노입자 및 PLGA-PEG-Mal 나노입자의 제조 및 특성화

1-1. 전장 항체의 F(ab') ₂ 로의 단편화 확인

전장 CD8a 항체 및 전장 NK1.1 항체를 각각 프로테이스 IdeS 및 IdeZ를 사용하여 F(ab')₂ 및 Fc로 절단하고, 성공적으로 절단되었는지를 SDS-PAGE를 통하여 확인하였다. 도 2a 및 도 2b에 나타난 바와 같이, 고유한 밴드가 나타남을 통하여 CD8a 항체 및 NK1.1 항체가 성공적으로 단편화되었음을 확인할 수 있었다.

1-2. 나노입자의 지름 측정 및 나노입자의 형태 관찰

나노입자에 전장 CD8a 항체 및 CD8a 항체의 F(ab')₂가 각각 접합되기 전후의 평균 크기(지름)를 DLS로 측정하고, 형태를 SEM으로 관찰하였다. 그 결과, CD8a 항체의 F(ab')₂가 접합되지 않은 PLGA-PEG-Mal 나노입자와 CD8a 항체의 F(ab')₂가 접합된 나노입자의 평균 지름은 각각 193 nm와 201 nm로 나타났고, 전장 CD8a 항체가 접합되지 않은 PLGA-PEG-COOH 나노입자와 전장 CD8a 항체가 접합된 나노입자의 평균 지름은 각각 195 nm와 205 nm로 나타났다. 이와 같이, PLGA 나노입자의 크기를 결정하는 주된 요인은 표면 작용기가 아니라, 중합체의 농도와 분자량임을 알 수 있었다. 또한, 전장 CD8a 항체의 크기는 약 10 nm이므로, 전장 항체 또는 F(ab')₂ 접합 후 나노입자의 크기가 약간 증가한 것은 접합된 표면 항체의 존재에 기인한 것임을 알 수 있었다. C8a 항체의 F(ab')₂가 접합된 나노입자가 전장 C8a 항체가 접합된 나노입자보다 크기가 약간 작은 것은 Fc 영역이 부재함에서 기인한다.

전장 CD8a 항체 접합 전후 PLGA-PEG-COOH 나노입자와 CD8a 항체의 F(ab')₂ 접합 전후 PLGA-PEG-Mal 나노입자의 SEM 이미지를 각각 도 2c 및 도 2d에 나타냈다. 도 2c 및 도 2d에 나타난 바와 같이, 항체 및 F(ab')₂의 접합 전후 나노입자의 구형 형태와 크기 사이에 큰 차이가 없음을 확인할 수 있었다.

2. 나노입자의 시험관내( in vitro ) 면역세포 표적능

2-1. 전장 항체 접합 나노입자 및 항체의 F(ab') ₂ 접합 나노입자의 면역세포 표적능

본 발명의 나노입자가 면역세포에 결합하는 정도를 알아보기 위하여, 마우스 비장세포에 10 μg의 DiD-로드된 나노입자를 10 분간 처리한 후, 표적 면역세포에 대한 결합 효율을 유세포 분석 방법으로 분석하였다. 전장 CD8a 항체 접합 나노입자와 C8a 항체의 F(ab')₂ 접합 나노입자의 CD8⁺ T 세포 표적능을 분석한 결과를 도 3a에 나타냈으며, NK1.1 항체의 F(ab')₂ 접합 나노입자의 NK 세포 표적능을 분석한 결과를 도 3b에 나타냈다. 그 결과, 각 전장 항체 접합 나노입자와 각 항체의 F(ab')₂ 접합 나노입자 모두 항체를 접합하지 않은 대조군 나노입자에 비하여 높은 효율인 67 ± 3 %(전장 C8a 항체 접합), 90 ± 2 %( C8a 항체의 F(ab')₂ 접합) 및 22.34 %(NK1.1 항체의 F(ab')₂ 접합 나노입자)로 각 표적 면역세포에 결합하여, 본 발명의 면역세포 표적형 나노입자가 성공적으로 대상 면역세포를 표적화할 수 있음을 확인할 수 있었다. 특히, C8a 항체의 F(ab')₂ 접합 나노입자를 사용하는 경우, 각 전장 C8a 항체 접합 나노입자를 사용하는 경우보다 표적 세포에 대한 결합 효율이 높아, 표적능이 더 높았음을 확인할 수 있었다. 이는 전장 CD8a 항체의 경우, 항체를 나노입자의 표면에 접합할 때 PLGA-PEG-COOH의 카복시기가 전장 항체의 여러 위치에 존재하는 아민기와 반응하여 전장 항체가 무작위하게 배향(oriented)되어 접합됨에 기인할 수 있다.

2-2. 공배양 시간에 따른 면역세포 표적능

공배양 시간에 따른 나노입자의 면역세포 표적능을 확인하기 위하여, 마우스 비장세포를 10 분 이상 DiD-로드된 나노입자와 공배양한 후 시간 별 DiD-발현 CD8⁺ T 세포 및 DiD-발현 NK 세포 비율을 분석하고, 결과를 각각 도 3c 및 도 3d에 나타냈다. 그 결과, 공배양 시간이 길어질수록 각 표적세포의 DiD-발현율이 높아짐을 알 수 있었다. 특히, 도 3c에서 전장 CD8a 항체 접합 나노입자는 90 분 배양 후 약 80 %의 결합 효율을, F(ab')₂ 접합 나노입자는 90 분 배양 후 약 100 %의 결합 효율을 달성하여, F(ab')₂ 접합 나노입자의 면역세포 표적능이 더욱 높음을 확인할 수 있었다.

2-3. CD4 ⁺ T 세포와의 비특이적 결합 여부 확인

전장 CD8a 항체 접합 나노입자와 C8a 항체의 F(ab')₂ 접합 나노입자가 표적으로 하고자 하는 CD8⁺ T 세포에만 특이적으로 결합하는지를 확인하기 위하여, 상기 나노입자의 CD4⁺ T 세포에 대한 비특이적 결합을 확인하였다. CD4⁺ T 세포 및 CD8⁺ T 세포는 각 세포 표면의 TCRβ, CD4 및 CD8a 마커의 발현에 따라 분류하였다. 전장 CD8a 항체 접합 나노입자 및 C8a 항체의 F(ab')₂ 접합 나노입자의 CD4⁺ T 세포 결합을 유세포 분석한 결과를 도 3e에 나타냈다. 마우스 비장세포를 10 분 이상 DiD-로드된 나노입자와 공배양한 후 시간 별 DiD-발현 CD4⁺ T 세포 비율을 분석한 결과는 도 3f에 나타냈다. 도 3f에 나타난 바와 같이, 전장 CD8a 항체 접합 나노입자 및 C8a 항체의 F(ab')₂ 접합 나노입자는 항체를 접합하지 않은 대조군 나노입자와 유사하게, 매우 낮은 수준의 결합 효율로 CD4⁺ T 세포에 결합하였다. 이러한 결과로부터 본 발명의 면역세포 표적형 나노입자는 불필요한 비특이적 결합 없이 특정 세포를 성공적으로 표적화할 수 있어, 약물 전달을 위한 효과적인 플랫폼으로 활용될 수 있음을 알 수 있었다.

3. 나노입자의 생체내( in vi vo) 면역세포 표적능

3-1. 전장 항체 접합 나노입자 및 항체의 F(ab') ₂ 접합 나노입자의 면역세포 표적능

본 발명의 면역세포 표적형 나노입자가 생체내에서도 높은 효율로 면역세포에 결합하고 약물을 전달할 수 있는지를 알아보기 위하여, 마우스 미정맥에 전장 CD8a 항체 접합 나노입자, C8a 항체의 F(ab')₂ 접합 나노입자 및 NK1.1 항체의 F(ab')₂ 나노입자 주사 후, 마우스 비장과 혈액 샘플을 각기 다른 시점(1 시간, 3 시간, 6 시간)에 채취하였다. 1 시간 후 채취한 샘플에서 각 나노입자의 각 표적 면역세포에 대한 결합 정도를 유세포 분석법을 통해 분석하고, 그 결과를 도 4a 및 도 4b에 나타냈다. 도 4a에 나타난 바와 같이, CD8a 항체의 F(ab')₂가 접합된 나노입자를 주사한 경우 비장 및 혈액에서 DiD⁺ CD8⁺ T 세포의 비율은 각각 89.14% 및 96.17%로, CD8a 항체의 F(ab')₂ 접합 나노입자의 CD8⁺ T 세포 표적능이 매우 우수함을 알 수 있었다. 또한, 도 4b에 나타난 바와 같이, NK1.1 항체의 F(ab')₂ 접합 나노입자를 주사한 경우, 비장 및 혈액에서 DiD⁺ NK 세포의 비율은 각각 60.06 %, 95.24 %로 항체를 접합하지 않은 경우에 비하여 NK 세포 표적능이 매우 우수함을 알 수 있었다.

3-2. 시간 경과에 따른 생체내 형광 신호 추적

나노입자 주사 후 시간에 따른 CD8⁺ T 세포 및 NK 세포의 형광 신호를 추적한 결과를 도 4c 및 도 4d에 나타냈다. 주사된 나노입자와 관계없이, 생체내 순환 1시간 후 DiD⁺CD8⁺ T 세포 수 및 DiD+NK 세포 수가 급격히 감소하는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 DiD 신호의 감소를 통하여, 3 시간 후 및 6 시간 후 비장과 혈액에서 본 발명의 면역세포 표적형 나노입자가 활발한 전신적 클리어런스(active systematic clearance)를 거쳤음을 알 수 있었다.

3-3. CD4 ⁺ T 세포와의 비특이적 결합 여부 확인

전장 CD8a 항체 접합 나노입자와 C8a 항체의 F(ab')₂ 접합 나노입자가 표적으로 하고자 하는 CD8⁺ T 세포에만 특이적으로 결합하는지를 생체내에서도 확인하기 위하여, 상기 나노입자의 CD4⁺ T 세포에 대한 비특이적 결합을 확인하였다. 마우스 비장과 혈액 샘플을 각기 다른 시점(1 시간, 3 시간, 6 시간)에 채취하여 주사한 나노입자 별로 DiD⁺ CD4⁺ T 세포 수를 측정한 결과를 도 4e에 나타냈다. 도 4e에 나타난 바와 같이, DiD⁺ CD4⁺ T 세포 비율은 혈액에서는 10% 미만, 비장에서도 20% 미만으로, 매우 낮은 수준의 결합 효율로 CD4⁺ T 세포에 결합함을 알 수 있었으며, 이러한 결과를 통하여 생체내에서도 전장 CD8a 항체 접합 나노입자와 C8a 항체의 F(ab')₂ 접합 나노입자는 불필요한 비특이적 결합 없이, CD8⁺ T 세포를 표적화함을 알 수 있었다.

Claims (21)

1. 생체적합성 중합체를 포함하는 나노입자; 및
   상기 생체적합성 중합체를 포함하는 나노입자의 표면에 접합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 면역세포 표적형 나노입자로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 면역세포를 표적화하는 것인, 면역세포 표적형 나노입자.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 생체적합성 중합체는 폴리(락트산-co-글라이콜산) [poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA], 폴리(락트산) [poly(lactic acid), PLA], 폴리(글라이콜산) [poly(glycolic acid), PGA], 폴리(락트산-co-글라이콜산)-폴리(에틸렌글라이콜) 공중합체 [poly(lactic-co-glycolic acid)-poly(ethylene glycol) copolymer, PLGA-PEG copolymer], 폴리(락트산)-폴리(에틸렌글라이콜) 공중합체 [poly(lactic acid)-poly(ethylene glycol) copolymer, PLA-PEG copolymer], 폴리(글라이콜산)-폴리(에틸렌글라이콜) [poly(glycolic acid)-poly(ethylene glycol) copolymer, PGA-PEG copolymer] 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 면역세포 표적형 나노입자.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 생체적합성 중합체를 포함하는 나노입자의 표면은 작용기화(functionalization)된 것인, 면역세포 표적형 나노입자.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 생체적합성 중합체를 포함하는 나노입자의 표면은 카복시기(carboxyl group) 또는 말레이미드기(maleimide group)를 포함하도록 작용기화된 것인, 면역세포 표적형 나노입자.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 생체적합성 중합체를 포함하는 나노입자 표면에 공유결합을 통하여 접합된 면역세포 표적형 나노입자.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 공유결합은 카보다이이미드 화학(carbodiimide chemistry) 또는 말레이미드 화학(maleimide chemistry)을 통해 생성되는 것인, 면역세포 표적형 나노입자.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 전장　항체,　Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, 또는 scFv인 것인, 면역세포 표적형 나노입자.
   
8. 제1항에 있어서, 상기 면역세포는 NK 세포(Natural Killer 세포, 자연살해세포), T 세포, 대식세포, 수지상 세포, 킬러 수지상 세포, 비만세포, B 세포 및 이들의 전구세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 면역세포 표적형 나노입자.
   
9. 제8항에 있어서, 상기 T 세포는 염증성 T 세포, 세포독성 T 세포(CD8⁺ T 세포), 조절 T 세포 또는 헬퍼 T 세포(CD4⁺ T 세포)인, 면역세포 표적형 나노입자.
   
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 면역세포 표적형 나노입자; 및
    약물을 포함하는, 약물 전달용 조성물.
    
11. 제10항에 있어서, 상기 약물은 화학 약물, 단백질, 펩타이드, 종양 항원, 사이토카인, 화학항암제, 방사성핵종, 소분자 신호 전달 억제제, 효소, 항생제, 항바이러스제, 항기생충제, 성장 인자, 성장 억제제, 호르몬, 호르몬 길항제, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항원, 백신 제형, 항염증제, 염료, 조영제, 핵산, 면역조절물질(immunomodulator), 또는 이들의 조합인 것인, 약물 전달용 조성물.
    
12. 제11항에 있어서, 상기 핵산은 DNA, 상보성 DNA(complementary DNA, cDNA), RNA, 메신저 RNA(messenger RNA, mRNA), 운반 RNA(transfer RNA, tRNA), 라이보좀 RNA(rRNA), 마이크로 RNA(micro RNA), 작은 간섭 RNA(small interference RNA, siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA, shRNA), 앱타머(aptamer), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 리보자임(ribozyme), 펩타이드 핵산(Peptide nucleic acid, PNA), DNAzyme, 단일 가이드 RNA(single guide RNA, sgRNA) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산인 것인, 약물 전달용 조성물.
    
13. 제11항에 있어서, 상기 면역조절물질은 사이토카인, 케모카인, 항체, 잔틴계 화합물, TCR 작용제(Toll-like receptor agonist), 어주번트, 면역 체크포인트 억제제, 소분자 약물, 면역억제제, 올리고디옥시뉴클레오타이드, 글루칸, 성장 인자, 호르몬, 또는 이들의 조합인 것인, 약물 전달용 조성물.
    
14. 제10항에 있어서, 상기 약물은 상기 면역세포 표적형 나노입자 내부에 봉입되어 있는 것인, 약물 전달용 조성물.
    
15. 다음의 단계를 포함하는, 면역세포 표적형 나노입자 제조방법:
    (a) 생체적합성 중합체를 포함하는 나노입자를 제조하는 단계; 및
    (b) 상기 생체적합성 중합체를 포함하는 나노입자의 표면에 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 접합하는 단계.
    
16. 제15항에 있어서, 상기 생체적합성 중합체는 폴리(락트산-co-글라이콜산) [poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA], 폴리(락트산) [poly(lactic acid), PLA], 폴리(글라이콜산) [poly(glycolic acid), PGA], 폴리(락트산-co-글라이콜산)-폴리(에틸렌글라이콜) 공중합체 [poly(lactic-co-glycolic acid)-poly(ethylene glycol) copolymer, PLGA-PEG copolymer], 폴리(락트산)-폴리(에틸렌글라이콜) 공중합체 [poly(lactic acid)-poly(ethylene glycol) copolymer, PLA-PEG copolymer], 폴리(글라이콜산)-폴리(에틸렌글라이콜) [poly(glycolic acid)-poly(ethylene glycol) copolymer, PGA-PEG copolymer] 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 면역세포 표적형 나노입자 제조방법.
    
17. 제15항에 있어서, 상기 생체적합성 중합체를 포함하는 나노입자의 표면은 작용기화(functionalization)된 것인, 면역세포 표적형 나노입자 제조방법.
    
18. 제15항에 있어서, 상기 단계 (b)의 생체적합성 중합체를 포함하는 나노입자의 표면에 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 접합하는 단계는 상기 나노입자의 표면에 포함된 작용기(functional group)와 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 접합하는 단계인 것인, 면역세포 표적형 나노입자 제조방법.
    
19. 제18항에 있어서, 상기 작용기는 카복시기(carboxyl group) 또는 말레이미드기(maleimide group)인, 면역세포 표적형 나노입자 제조방법.
    
20. 제15항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 항체 분해 효소를 처리함으로써 제조되는 것인, 면역세포 표적형 나노입자 제조방법.
    
21. 제20항에 있어서, 상기 항체 분해 효소는 파파인(papain), 펩신(pepsin), 트립신(trypsin), 프로티네이스 K(proteinase K), 엔도프로티네이스 Glu-C(Endoproteinase Glu-C), IdeS 프로테이스, IdeZ 프로테이스 또는 이의 조합인 것인, 면역세포 표적형 나노입자 제조방법.