KR102433719B1 - 약물 로딩된, 이중특이성 리간드-표적화된 미니세포 및 인터페론 감마에 의한 복합 종양 치료 - Google Patents

Abstract

암 치료를 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 상기 방법은 예를 들어 암 환자에게, 다수의 세균 유래된 완전한 미니세포 또는 완전한 죽은 세균 세포를 포함하고 이들 세포가 각각 항-종양제를 포함하며 표면상에 이중특이성 리간드를 갖고 상기 리간드가 포유동물 세포 성분에 대해 특이성을 갖는 제1 조성물, 및 인터페론-감마(IFN-감마) 또는 상기 개체에서 IFN-감마의 발현을 증가시키는 제제를 포함하는 제2 조성물을 투여함을 수반한다. 상기 조성물은 상술한 바와 같은 제1 조성물 및 제2 조성물을, 임의로 추가의 항-종양제와 함께 포함한다.

Description

약물 로딩된, 이중특이성 리간드-표적화된 미니세포 및 인터페론 감마에 의한 복합 종양 치료{COMBINATION TUMOR TREATMENT WITH DRUG-LOADED, BISPECIFIC LIGAND-TARGETED MINICELLS AND INTERFERON-GAMMA}

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 2013년 10월 4일자로 출원된 미국 가 특허출원 제 61/887,258 호로부터 우선권을 주장한다. 상기 출원의 내용은 전체가 본 발명에 참고로 인용된다.

현재, 암 치료에 사용되는 대부분의 약물은 전신적으로 투여된다. 세포독성 항암 약물의 전신 전달은 암 치료법에서 중요한 역할을 하지만, 이는 또한 심각한 문제를 야기한다. 예를 들어, 투여된 약물에의 정상 조직/기관의 전신 노출은 심한 독성을 일으킬 수 있다. 이는 전신적으로 전달된 암 화학요법 약물이 종종 상기 약물의 불충분한 생체이용률 및 환자 내 큰 분배 부피를 극복하기 위해서 매우 고용량으로 전달되어야 한다는 사실에 의해 악화된다. 또한, 전신 약물 투여는 종종 큰 혈관 중에 고정된 카테터의 사용을 요하기 때문에 침습적일 수 있다. 전신 약물 투여는 종종 말초 또는 중심 정맥의 사용을 요하기 때문에 정맥염과 같은 국소 합병증을 야기할 수 있다. 약물의 혈관외 유출이 또한, 예를 들어 빈카 알칼로이드 및 안트라사이클린의 투여시 흔히 관찰되는 바와 같이, 국소 투여 부위에 수포/조직손상의 원인이 될 수 있다.

암 치료법의 또 다른 도전은 면역 감시로부터 종양 세포의 회피이다. 면역계와 악성 세포간의 상호작용은 종양형성에 중요한 역할을 한다. 형질전환된 세포를 검출하고 거부하는 것에 대한 면역계의 실패가 암 발생의 원인이 될 수도 있다. 종양은 면역-매개된 거부로부터 벗어나기 위해서 다수의 기전들을 이용한다. 이러한 기전 중 다수는 현재 세포 및 분자 수준으로 공지되어 있다. 이러한 지식에도 불구하고, 암 면역요법은 임상에서 여전히 확립된 치료가 아니다.

발명의 요약

본 발명자들은 항-종양 약물-로딩된, 이중특이성 항체-표적화된 미니세포에 의해 암 치료 중인 동물이 동반되는 바이러스 감염을 앓고 있을 때 상기 약물에 대해 더 큰 항-종양 반응을 나타냄을 발견하였다. 추가의 연구는 이와 관련하여 항암 약물의 치료 효능에서 관찰된 향상이, 상기 투여된 약물-로딩된, 이중특이성 약물-표적화된 미니세포의 종양-살해 능력과, 그 자체가 상기 바이러스 감염이 촉발시킨 인터페론-감마(IFN-감마 또는 IFNγ)의 증가된 발현에 기인한, 종양 세포에 대한 활성화된 숙주-면역 반응간의 상승작용으로부터 발생함을 밝혀내었다.

IFN-감마 자체는 단독요법 및 다른 항-종양제와의 병용 모두에서 그의 잠재적인 항-종양 용도에 대해 연구되었다. 상기와 같은 연구는 그러나 임상적인 성공에 이르지 못하였다. 예를 들어, IFN-알파 및 IFN-감마의 복합 치료는 IFN-알파 단독에 의한 치료에 비해 개선을 나타내지 못하였다. 예를 들어 문헌[Kloke et al ., Eur. J. Haematol . 48: 93-8 (1992)] 및 문헌[Wandl et al ., Semin . Oncol. 19: 88-94 (1992)]을 참조하시오. 미국 식품의약품 안전청(FDA)에 의해 승인된 유일한 IFN-감마 적응증은 만성 육아종증(CGD) 및 중증 악성 골화석증(골 질환)의 치료하기 위한 것이다.

따라서, 본 명세는 그의 태양들 중 하나에서 개체의 종양 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 개체에게 (A) 다수의 세균 유래된 완전한 미니세포 및/또는 죽은 세균 세포를 포함하는 제1 조성물(상기 미니세포 및 죽은 세포는 각각 항-종양제를 포함하며 상기 미니세포에 부착된 리간드를 통해 종양 세포 표면 수용체에 표적화된다), 및 (B) IFN-감마 또는 상기 개체에서 IFN-감마의 발현 또는 활성을 증가시키는 제제를 포함하는 제2 조성물을 투여함을 수반한다.

일부 태양에서, 상기 제2 조성물은 IFN-감마 단백질, 특히 약학적으로 적합하게 정제된 IFN-감마 단백질을 포함한다. 일부 태양에서, 상기 제2 조성물은 바이러스 백신을 포함한다. 일부 태양에서, 상기 제2 조성물은 IFN-감마를 암호화하는 핵산을 포함한다.

일부 태양에서, 상기 제1 조성물은 약 10⁹ 내지 약 10¹⁰개의 미니세포 또는 죽은 세균 세포를 포함한다.

일부 태양에서, 상기 항-종양제는 방사성핵종이다. 일부 태양에서, 상기 항-종양제는 화학요법 약물이다. 일부 태양에서, 상기 항-종양제는 기능성 핵산 또는 기능성 핵산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 태양에서, 상기 기능성 핵산은 종양세포 증식, 혈관형성 또는 화학요법제에 대한 내성을 촉진하고/하거나 세포사멸 또는 세포주기 정지를 억제하는 유전자를 억제한다. 일부 태양에서, 상기 기능성 핵산은 siRNA, miRNA, shRNA, lincRNA, 안티센스 RNA 및 리보자임 중에서 선택된다.

또한 다수의 세균 유래된 완전한 미니세포 또는 완전한 죽은 세균 세포(이들 세포는 각각 항-종양제를 포함하고 표면상에 리간드를 보유하며, 여기에서 상기 리간드는 비-식세포성 포유동물 세포 표면 수용체에 대해 특이성을 갖는다)를 포함하는 제1 조성물, 및 인터페론-감마(IFN-감마) 또는 개체에서 상기 IFN-감마의 발현을 증가시키는 제제를 포함하는 제2 조성물을 포함하는 패키지, 제품 또는 키트를 제공한다.

또 다른 실시태양에서, (a) 다수의 세균 유래된 완전한 미니세포 또는 완전한 죽은 세균 세포(이들 세포는 각각 항-종양제를 포함하고 표면상에 리간드를 보유하며, 여기에서 상기 리간드는 비-식세포성 포유동물 세포 표면 수용체에 대해 특이성을 갖는다), 및 (b) IFN-감마 또는 개체에서 상기 IFN-감마의 발현을 증가시키는 제제를 포함하는 조성물을 제공한다.

다른 목적, 특징 및 이점들은 하기의 개시로부터 자명하다. 상세한 개시 및 구체적인 실시예들을 단지 예시를 위해 제공하며, 따라서 특정한 실시태양의 진의 및 범위 내의 다양한 변화 및 변형들은 상기 개시로부터 자명하다.

도 1a 내지 1c는 각각 3마리의 개 A, B 및 C에 대한, 상이한 시점(x축, 투여 회수로서 나타냄)에서 측정된 종양 부피(좌측의 y축) 및 혈청 IFN-감마 농도(우측의 y축)의 차트를 나타낸다. 이들 차트는 약물에 대한 종양의 반응이, IFN-감마의 혈청 농도가 상승했을 때 훨씬 더 컸음을 도시한다.
도 2는 약 285 ㎣의 종양 크기를 갖는 6주 된 암컷 무흉선 누드 마우스에서 확립된, 인간 폐포 선암종 종양 이종이식편의, IFN-감마 및 이중특이성 리간드-표적화되고 독소루비신-패키징된 완전한 미니세포에 의한 복합 치료의 효과를 예시한다. 그룹 1 마우스는 염수를 수령하였고, 그룹 2 마우스는 IFN-감마만을 수령하였으며, 그룹 3 마우스는 ^EGFR미니세포_Dox를 수령하였고, 그룹 4 마우스는 ^EGFR미니세포_Dox 및 IFN-감마를 수령하였다. 본 실시예 및 하기의 실시예들에서, x축 아래의 삼각형은 투여 시간을 가리킨다.
도 3은 보통의 종양 크기인 약 145 ㎣를 갖는 6주 된 암컷 무흉선 누드 마우스에서 확립된, 인간 유방 종양 이종이식편의, IFN-감마 및 이중특이성 리간드-표적화되고 독소루비신-패키징된 완전한 미니세포에 의한 복합 치료의 효과를 도시한다. 그룹 1 마우스는 염수를 수령하였고, 그룹 2 마우스는 IFN-감마만을 수령하였으며, 그룹 3 마우스는 ^EGFR미니세포_Dox를 수령하였고, 그룹 4 마우스는 ^EGFR미니세포_Dox 및 IFN-감마를 수령하였다.
도 4는 큰 종양 크기인 약 250 ㎣를 갖는 6주 된 암컷 무흉선 누드 마우스에서 확립된, 인간 유방 종양 이종이식편의, IFN-감마 및 이중특이성 리간드-표적화되고 독소루비신-패키징된 완전한 미니세포에 의한 복합 치료의 효과를 예시한다. 그룹 1 마우스는 염수를 수령하였고, 그룹 2 마우스는 IFN-감마만을 수령하였으며, 그룹 3 마우스는 ^EGFR미니세포_Dox를 수령하였고, 그룹 4 마우스는 ^EGFR미니세포_Dox 및 IFN-감마를 수령하였다.
도 5는 약 265 내지 약 600 ㎣의 매우 큰 종양 크기를 갖는 6주 된 암컷 무흉선 누드 마우스에서 확립된, 인간 유방 종양 이종이식편의, IFN-감마 및 이중특이성 리간드-표적화되고 독소루비신-패키징된 완전한 미니세포에 의한 복합 치료의 효과를 도시한다. 4마리의 마우스는 모두 ^EGFR미니세포_Dox 및 IFN-감마를 수령하였다.
도 6은 약 100 ㎣의 종양 크기를 갖는 6주 된 암컷 무흉선 누드 마우스에서 확립된, 인간 폐포 선암종 종양 이종이식편의, IFN-감마(2개의 상이한 용량) 및 이중특이성 리간드-표적화되고 독소루비신-패키징된 완전한 미니세포에 의한 복합 치료의 효과를 도시한다. 그룹 1 마우스는 염수를 수령하였고, 그룹 2 마우스는 ^EGFR미니세포_Dox를 수령하였고, 그룹 3 마우스는 ^EGFR미니세포_Dox 및 0.75 x 10⁴ IU의 IFN-감마를 주당 2회 수령하였고, 그룹 4 마우스는 ^EGFR미니세포_Dox 및 0.5 x 10⁴ IU의 IFN-감마를 주당 3회 수령하였다.
도 7은 인간 수용체 티로신 키나제들의 20개 아과 및 58개 구성원을 예시한다(문헌[Lemmon and Schlessinger, Cell 141:1117-134(2010)]으로부터 발췌됨).

상기에 나타낸 바와 같이, 발명자들은 항-종양 약물-로딩된, 이중특이성 항체-표적화된 미니세포를 종양이 있는 환자에게, 상기 환자가 상승된 수준의 IFN-감마에 노출된 상황에서 투여한 결과, IFN-감마가 활성화되지 않은 경우, 예를 들어 그의 수준이 검출 한계 아래에 있는 경우 관찰되는 것보다 크게 개선된 항-종양 반응이 생성되는 것으로 판단하였다. 이러한 미니세포-매개된 항-종양 활성과 상승된 IFN-감마간의 상승작용은 증가된 종양 반응의 크기로부터 명백하다. 임의의 특정한 기전(들)에 얽매이려고 하는 것은 아니지만, 발명자들은 본 발명에 개시된 접근법이 숙주 항-종양 반응에 중요한 면역 자극의 중요한 경로들을 이용하는 것으로 생각한다. 상기 세균 유래된 미니세포 및 IFN-감마는 면역 자극에서 상이한 경로들을 이끌어내는데, 이들 경로는 집합적으로, 본 명세에 따라 상기 항-종양 약물이 상기 이중특이성 항체-표적화된 미니세포를 통해 종양 세포로 세포내 전달시 개시하는 항-종양 반응을 증대시킴에 있어서 중요하다.

발명자들은 또한 종양 세포 주변 혈관이 완전성의 상실을 나타냄; 즉 상기 혈관이 큰 천공을 가지며 심지어 혈액뇌 장벽(BBB) 환경에서조차 "누출되기 쉬움"을 발견하였다. 통상적인 이해에 위반하여, 미니세포만큼 큰, 즉 상기-논의된 BBB의 일치하는 기공 크기 한계보다 훨씬 더 큰 입자는, 그럼에도 불구하고 상기 누출되기 쉬운 혈관벽 중의 천공보다 작다; 따라서 상기 입자는 수동적으로 상기 천공을 통해 종양 미세환경내로 일출될 수 있다.

미니세포는 상기 종양 미세환경내로 진입시, 숙주 종양 세포에 의한 수용체-매개된 내면화를 촉발할 수 있으며 상기 세포에 의해 흡수될 수 있다. 따라서, 항-종양제와 함께 패키징된 미니세포는 상기 제제를 상기 종양 세포의 세포질내로 방출시켜 상기 세포를 살해할 것이다.

IFN-감마는 종양 치료법에 사용이 제안되었지만, 그의 임상 적용은 지금까지 적지 않은 부분에서 그의 높은 독성으로 인해 제한되었다. 종양 세포에 대한 면역 반응을 자극하는 IFN-감마의 능력은 또한 그다지 많이 성공하지 못했다. 따라서, 본 발명과 관련하여 IFN-감마에 의해 발휘된 역할은 유리할 뿐만 아니라 진정 놀라운 것이다.

따라서 본 명세는 그의 태양들 중 하나에서, 종양이 있는 환자에게 다수의 완전한, 항-종양제를 보유하는 세균 유래된 미니세포를 포함하는 조성물을 투여하면서 동시에 상기 환자에게 그의 IFN-감마의 수준을 증가시키는 제제를 또한 투여함을 수반하는 종양 치료를 제공한다. 또 다른 태양에 따라, 죽은 세균 세포를 미니세포와 함께 또는 그 대신에 사용할 수 있는데, 그 이유는 상기와 같은 세포도 마찬가지로 표적 종양 세포내에 흡수시 방출되는 항암 약물을 로딩할 수 있기 때문이다. 예를 들어 공개된 국제 출원 WO/2008/012695(이의 내용은 본 발명에 참고로 인용된다)를 참조하시오.

약물-로딩된 미니세포 및/또는 죽은 세균 세포를 함유하는 조성물의 투여는 바람직하게는 전신적이다, 예를 들어 정맥내 또는 동맥내이다. 추가로, 상기 IFN-감마 또는 IFN-감마의 발현을 유도하는 제제를 상이한 경로에 의해, 즉 피하 또는 근육내로 투여할 수 있으나, 필요한 것은 아니다. 상기 미니세포 및/또는 죽은 세균 세포 치료제를 상기 IFN-감마와 동반하여 또는 상이한 시기에 투여할 수 있다.

(A) 정의

달리 정의되지 않는 한, 본 개시에 사용된 모든 기술과학 용어들은 관련 분야의 숙련가들에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.

편의상, 명세서, 실시예 및 첨부된 청구범위에 사용된 몇몇 용어 및 어구들의 의미를 하기에 제공한다. 다른 용어 및 어구들은 명세서 전체를 통해 정의된다.

단수형 "하나의" 및 "상기"는 문맥상 달리 명백히 가리키지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다.

본 발명에서 호환적으로 사용되는 "암", "신생물", "종양", "악성 종양" 및 "암종"은 세포 증식의 현저한 통제 상실을 특징으로 하는 이상 성장 표현형을 나타내는 세포 또는 조직을 지칭한다. 본 명세의 방법 및 조성물을 특히 악성, 전-전이성, 전이성, 및 비-전이성 세포에 적용한다.

"약물"은 동물, 특히 포유동물 및 인간에서 국소 또는 전신 효과를 생성시키는 임의의 생리학적 또는 약물학적 활성 물질을 지칭한다.

본 개시에 호환적으로 사용되는 "개인", "개체", "숙주" 및 "환자"란 용어들은 진단, 치료 또는 치료법을 원하는 임의의 포유동물 개체를 지칭한다. 상기 개인, 개체, 숙주 또는 환자는 인간 또는 비-인간 동물일 수 있다. 따라서, 적합한 개체는 비제한적으로 비-인간 영장류, 소, 말, 개, 고양이, 기니 피그, 토끼, 래트 및 마우스를 포함할 수 있다.

"치료", "치료하는", "치료하다" 등의 용어들은 종양 환자에서 목적하는 약물학적 및/또는 생리학적 효과를 획득함을 지칭한다. 상기 효과는 종양 또는 그의 증상의 완전한 또는 부분적인 방지에 관하여 예방학적이고/이거나, 종양 및/또는 상기 종양에 기인할 수 있는 부작용에 대한 부분적인 또는 완전한 안정화 또는 치유에 관하여 치료학적일 수 있다. 치료는 포유동물, 특히 인간에서 종양의 임의의 치료를 포함한다. 목적하는 효과는 특히 종양 반응이며, 이를 종양 덩어리의 감소 또는 종양 덩어리 증가의 억제로서 측정할 수 있다. 종양 반응 외에, 전체 생존의 증가, 무진행 생존, 또는 종양 재발까지의 시간 또는 부작용의 감소가 또한 목적하는 치료 효과로서 임상적으로 사용될 수 있다.

(B) 치료

본 명세는 상기 발명자의 발견과 일치하여, 세균 유래되고 완전한 미니세포 또는 완전한 죽은 세균 세포가 IFN-감마의 수준을 증가시키는 제제와 함께 종양 환자에게 투여될 때, 상기 미니세포 또는 죽은 세균 세포가 단독으로 투여될 때보다 놀랍게도 더 큰 치료 효능을 성취할 수 있다는 실험적 증거에 의해 입증되고 반영된다.

(C) 항-종양제

"항-종양제"란 어구는 화학적이든 생물학적이든 간에, 종양 세포의 성장, 발달, 성숙화 또는 확산을 예방하거나 억제하는 약물을 나타낸다.

본 명세와 관련하여, 주어진 종양 환자의 치료를 위한 항-종양제의 선택은 통상적인 의학적 관행과 일치하여, 다수의 인자들에 따라 변한다. 이들 인자는 비제한적으로 환자의 연령, 종양의 병기, 및 환자가 수령했을 수도 있는 모든 선행 치료법을 포함한다.

상기 명세에 따라, 약물을 완전한, 세균 유래된 미니세포내로 패키징하기 위해, 하기 상세히 나타낸 부류들 중 하나로부터 선택할 수 있으며, 이어서 이를 종양 치료를 위해 투여한다. 이들 약물은 또한 약물 설계 및 발견 노력으로부터 설계된 합성 유사체일 수 있다.

· 다기능성 알킬화제: 사이클로포스파미드(사이톡산), 메클로르에타민, 멜팔란(알케란), 클로람부실(류케란), 티오페타(티오플렉스), 부설판(마일레란)에 의해 예시된다.

·알킬화 약물: 프로카바진(마툴란), 다카바진(DTIC), 알트레타민(헥살렌), 클로람부실, 시스플라틴(플라티놀), 카보플라틴, 이포사파미드, 옥살리플라틴에 의해 예시된다.

· 대사길항물질 : 메토트렉세이트(MTX), 6-티오퓨린(머캅토퓨린[6-MP], 티오구아닌[6-TG]), 머캅토퓨린(퓨리네톨), 티오구아닌, 플루다라빈 포스페이트, 클라드리빈:(류스타틴), 펜토스타틴, 플루로우라실(5-FU), 시타라빈(ara-C), 아자시티딘에 의해 예시된다.

·식물 알칼로이드, 터페노이드 및 국소이성화효소 억제제: 빈블라스틴(벨반), 빈크리스틴(온코빈), 빈데신, 비노렐빈, 포도필로톡신(에토포시드{VP-16} 및 테니포시드{VM-26}), 캄토테신(토포테칸 및 이리노테칸), 탁산, 예를 들어 패클리탁셀(탁솔) 및 도세탁셀(탁소테레)에 의해 예시된다.

·항생제: 독소루비신(아드리아마이신, 루벡스, 독실), 다우노루비신, 듀오카마이신, 이다루비신, 닥티노마이신(코스메젠), 플리카마이신(미트라마이신), 미토마이신: (뮤타마이신), 블레오마이신(블레녹산)에 의해 예시된다.

·호르몬제: 에스트로젠 및 안드로젠 억제제(타목시펜 및 플루타미드), 고나도트로핀-방출 호르몬 작용물질(류프롤리드 및 고세렐린(졸다덱스)), 아로마타제 억제제(아미노글루테티미드 및 아나스트로졸(아리미덱스))에 의해 예시된다.

· 여러가지 항암 약물: 암사크린, 아스파라기나제(E1-spar), 하이드록시우레아, 미톡산트론(노반트론), 미토탄(라이소드렌), 메이탄시노이드, 레티노산 유도체, 골수 성장 인자(사르그라모스팀 및 필그라스팀), 아미포스틴에 의해 예시된다.

·폴레이트 대사 방해제 : 예를 들어 페메트렉시드.

·DNA 저메틸화제 : 예를 들어 아자시티딘, 데시타빈.

· 폴리 (아데노신 디포스페이트 [ADP]- 리보스 ) 폴리머라제 ( PARP ) 경로 억제제: 예를 들어 이니파립, 올라파립, 벨리파립

· PI3K / Akt / mTOR 경로 억제제: 예를 들어 에베로리무스

·히스톤 데아세틸라제 ( HDAC ) 억제제: 예를 들어 보리노스태트, 엔티노스태트(SNDX-275), 모세티노스태트(MGCD0103), 파노비노스태트(LBH589), 로미뎁신, 발프로산.

· 사이클린 -의존성 키나제 ( CDK ) 억제제: 예를 들어 플라보피리돌, 올로뮤신, 로스코비틴, 켄폴론, AG-024322(화이자), 파스카플리신, 류비딘, 푸르발라놀 A, NU2058, BML-259, SU 9516, PD-0332991, P276-00.

· 열충격 단백질( HSP90 ) 억제제: 예를 들어 젤다나마이신, 타네스피마이신, 알베스피마이신, 라디치콜, 데구엘린, BIIB021.

· 뮤린 미소 쌍염색체 2( MDM2 ) 억제제: 예를 들어 시스-이미다졸린, 벤조디아제핀디온, 스피로-옥스인돌, 아이소퀴놀리논, 티오펜, 5-데아자플라빈, 트립타민.

· 역형성 림프종 키나제 ( ALK ) 억제제: 예를 들어 아미노피리딘, 디아미노피리미딘, 피리도아이소퀴놀린, 피롤로피라졸, 인돌로카바졸, 피롤로피리미딘, 디아닐리노피리미딘.

· 폴리 [ ADP리보스 ] 폴리머라제 ( PARP ) 억제제: 벤즈아미드, 프탈라지논, 삼환상 인돌, 벤즈이미다졸, 인다졸, 피롤로카바졸, 프탈라지논, 아이소인돌리논에 의해 예시됨.

본 명세에 사용될 수 있는 활성제는 상기 열거된 약물 부류 또는 특정 제제들로 제한되지 않는다. 다양한 발견 플랫폼들이 암세포의 독특한 분자 표지를 겨냥하는 새로운 제제들을 계속해서 제공하고 있다; 실제로, 수천 개의 상기와 같은 화학 및 생물학적 약물이 발견되었으며, 이들 중 단지 일부만이 여기에 나열된다. 그러나, 친수성 또는 소수성의 다양한 종류의 활성제들의 패키징을 도모하는 완전한, 세균 유래된 미니세포 및 죽은 세균 세포의 놀라운 능력은, 임의의 상기와 같은 약물이 필수적으로 미니세포 중에 패키징될 때 본 명세의 발견에 따른 암 치료 능력을 가짐을 의미한다.

마찬가지로 항-종양제의 예시적인 부류는 방사성핵종, 화학요법 약물, 및 기능성 핵산, 예를 들어 비제한적으로 조절성 RNA이다.

1. 방사성핵종

"방사성핵종"은 불안정한 핵을 갖는 원자, 즉 상기 핵 내에 새로 생성된 방사선 입자 또는 원자 전자에 이용될 수 있는 과잉의 에너지가 제공된 것이 특징인 원자이다. 따라서, 방사성핵종은 방사성 붕괴를 겪으며 감마선(들) 및/또는 원자구성 입자를 방출한다. 다수의 방사성핵종이 당해 분야에 공지되어 있으며, 이들 중 다수, 예를 들어 이트륨-90, 테크네슘-99m, 요오드-123, 요오드-124, 요오드-125, 요오드-131, 루비듐-82, 탈륨-201, 갈륨-67, 불소-18, 제논-133 및 인듐-111이 의학적 용도에 적합한 것으로 공지되어 있다.

방사성핵종은 특히 종양 세포를 손상시키기 위한 베타-선 방사체로서, 핵의학에서 광범위한 용도가 발견되었다. 따라서 방사성핵종은 적합하게는 본 명세에서 항-종양제로서 사용된다.

방사성핵종은 임의의 공지된 기법에 의해 완전한, 세균 유래된 미니세포와 회합될 수 있다. 따라서, 단백질 또는 다른 미니세포-표면 부분(하기 참조)을 상업적으로 입수할 수 있는 표지 수단, 예를 들어 문헌[Rice et al., Semin. Nucl. Med. 41, 265-282(2011)]에 상세히 개시된 피어스(Pierce) 요오드화 시약[피어스 바이오테크놀로지 인코포레이티드(Pierce Biotechnology Inc.)(미국 일리노이주 록포드 소재)의 제품]을 사용하여 방사성핵종으로 표지할 수 있다. 한편으로, 방사성핵종을 미니세포 내부에 있는 단백질들에 통합시킬 수 있다.

후자의 상황에서, 미니세포-생산 세균 균주를 외래 단백질을 암호화하는 플라스미드 DNA로 형질전환시킨다. 미니세포가 비대칭 세포 분열 중 형성되는 경우, 상기 플라스미드 DNA의 다수 사본은 미니세포 세포질로 분리된다. 상기 생성된 재조합 미니세포를 방사성표지된 아미노산의 존재하에서, 상기 플라스미드 DNA로부터 상기 미니세포 내부에서 발현된 외래 단백질이 상기 방사성핵종-운반 아미노산을 통합하도록 하는 조건하에 항온처리한다. 예를 들어 문헌[Clark-Curtiss and Curtiss, Methods Enzymol. 101:347-362(1983)]의 프로토콜에 따라, 재조합 미니세포를 ³⁵S-메티오닌을 함유하는 최소 생육 배지에서 항온처리하며, 이에 의해 새로 발현된 플라스미드-암호화된 단백질은 상기 ³⁵S-메티오닌을 통합한다. 재조합 미니세포가 원하는 다른 방사성핵종과 패키징되도록 하기 위해서 유사한 접근법을 사용할 수 있다.

상기 미니세포 표면상의 올리고사카라이드를 또한 예를 들어 문헌[Fukuda, Curr. Protocols Molec. Biol.(Suppl. 26), 17.5.1-17.5.8(1994)]에 개시된 충분히-확립된 프로토콜을 사용하여 방사성표지할 수 있다. 미니세포에 고유한 상기와 같은 올리고사카라이드의 예시는 그람-음성 세균으로부터 유래된 미니세포의 표면상에서 발견되는 리포폴리사카라이드(LPS)의 O-폴리사카라이드 성분이다(하기 참조).

이에 관하여 바람직한 방법은 미니세포를 특정 종양에 대해 표적화하는데 사용되는 이중특이성 항체를 방사성 표지하는 것이다. 하기 섹션 G, 및 특허 공보 US 2007/0237744(이의 내용은 본 발명에 참고로 인용된다)를 참조하시오. 즉, 미니세포상에 "코팅된" 상기 이중특이성 항체는 방사성 표지를 위해 상당량의 추가적인 표면 단백질을 노출시킨다. 상응하게, 상기 항체-코팅된 미니세포와 결합된 방사성 표지의 보다 높은 비활성을 성취할 수 있다. 대조적으로, 코팅되지 않은 미니세포의 방사성 표지는, 즉 상기 방사성핵종이 오직 고유 부분만을 표지하는 경우, 보다 약한 표지(보다 낮은 비활성)를 생성시킬 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 보다 약한 표지는 그람-음성 세균으로부터 유래된 미니세포의 외막-결합된 단백질이 LPS(하기에서 추가로 논의되는 바와 같이, 상기 미니세포 표면을 덮고 있는 장쇄의 O-폴리사카라이드를 포함한다)에 의해 가려지기 때문에 발생하는 것으로 생각된다.

종양의 치료를 위해서, 상기 명세의 조성물을, 종양이 완전히 제거되지 않는 경우 적어도 종양 덩어리를 감소시키기에 충분한 수준의 종양-내 조사를 전적으로 제공하는 단일 용량 또는 수회 용량으로 전달할 것이다. 상기 치료의 경과를 사례별로, 상기 라인을 따라 모니터할 수 있다. 그러나, 일반적으로, 상기 조성물 중에 패키징되는 방사능의 양은 전형적으로 약 30 내지 50 Gy의 정도일 것이지만, 본 발명은 또한 보다 높은 방사능량, 즉 약 50 내지 200 Gy를 고려하며, 이는 약 30 Gy 내지 약 200 Gy의 전체 범위를 제공한다.

일부의 경우에, 상기 조성물 중에 패키징되는 방사능의 양은, 종양에 대해 상기 미니세포-매개 방사성핵종의 고도로 효율적이고 특이적인 전달을 제공하는 한, 상기 언급된 양보다 훨씬 더 낮을 수 있다. 상응하게, 하나의 태양에서 상기 조성물은 약 20 내지 40 Gy, 또는 약 10 내지 30 Gy, 또는 약 1 내지 약 20 Gy, 또는 10 Gy 미만을 함유한다.

2. 화학요법 약물

본 명세에 사용되는 항-종양제는 또한 화학요법 약물일 수 있다. 본 개시에서, "화학요법 약물", "화학요법제" 및 "화학요법"은 종양 세포를 살해하거나 붕괴시키는 능력을 갖는 약물을 의미하는데 호환적으로 사용된다. 화학요법제는 하기에 추가로 상세히 나타내는 바와 같은 소분자 약물 또는 생물학적 약물일 수 있다.

상기 "소분자 약물" 하위범주는 (i) 생물학적 과정에 대해 효과를 가지며 (ii) 단백질 또는 중합체성 거대분자에 비해 낮은 분자량을 가짐을 특징으로 하는 화합물을 포함한다. 소분자 약물은 전형적으로 약 194 달톤의 테모달(Temodar)®(테모졸로미드)(다형성 교모세포종 및 다른 유형의 뇌암을 치료하는데 사용된다)에 의해 예시되는 바와 같이, 약 800 달톤 이하이며, 약 150 달톤의 하한을 갖는다. 이와 관련하여 "약"은 한정된 분자량 값이 측정 정밀도의 변동 및 수 달톤 또는 수십 달톤 정도의 실험 오차가 가해짐을 가리킨다. 따라서, 소분자 약물은 약 900 달톤 이하, 약 800 달톤 이하, 약 700 달톤 이하, 약 600 달톤 이하, 약 500 달톤 이하, 또는 약 400 달톤 이하, 예를 들어 약 150 내지 약 400 달톤 범위의 분자량을 가질 수 있다. 보다 구체적으로, 소분자 약물은 약 400 달톤 이상, 약 450 달톤 이상, 약 500 달톤 이상, 약 550 달톤 이상, 약 600 달톤 이상, 약 650 달톤 이상, 약 700 달톤 이상, 또는 약 750 달톤 이상의 분자량을 가질 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 상기 미니세포내로 패키징되는 소분자 약물은 약 400 내지 약 900 달톤, 약 450 내지 약 900 달톤, 약 450 내지 약 850 달톤, 약 450 내지 약 800 달톤, 약 500 내지 약 800 달톤, 또는 약 550 내지 약 750 달톤의 분자량을 갖는다.

구체적으로, 적합한 소분자 약물은 특히, 비제한적으로 질소 머스터드, 니트로소우레아, 에틸렌이민, 알칸 설포네이트, 테트라진, 백금 화합물, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체, 대사길항물질, 폴레이트 유사체, 안트라사이클린, 탁산, 빈카 알칼로이드, 및 국소이성화효소 억제제를 포함한다. 상응하게, 본 발명에 사용하기 위한 소분자 약물은 특히 하기 중에서 선택될 수 있다: 엔다이인, 예를 들어 다이네미신 A, 유니칼라마이신, 칼리키아미신 γ1 및 칼리키아미신 θ1; 미야미신, FR901464의 합성 유사체; 예를 들어 문헌[Tanpure et al., Bioorg. Med. Chem. 21:8019-32(2013)]에 의해 개시된 바와 같은 벤조수베렌 유도체; 오리스타틴, 예를 들어 오리스타틴 E, 모노-메틸 오리스타틴 E(MMAE), 및 오리스타틴 F(돌라스타틴의 합성 유사체이다); 듀오카마이신, 예를 들어 듀오카마이신 SA 및 CC-1065; 메이탄신 및 그의 유도체(메이탄시노이드), 예를 들어 DM1 및 DM4; 이리노테칸(캄토사(Camptosar)®) 및 다른 국소이성화효소 억제제들, 예를 들어 토포테칸, 에토포시드, 미톡산트론 및 테니포시드; 및 야타케마이신(이의 합성은 문헌[Okano et al., J. Am. Chem. Soc. 128:7136-37(2006)]에 상세히 설명되어 있다).

보다 특히, 본 단락에 상세히 설명된 특정한 소분자 약물들 중 임의의 하나 이상 또는 전부는 본 발명에 사용하기에 적합한 것들을 예시한다: 액티노마이신-D, 알케란, ara-C, 아나스트로졸, BiCNU, 비칼루타미드, 비스안트렌, 블레오마이신, 부설판, 카페시타빈(젤로다(Xeloda)®), 카보플라틴, 카보플라티늄, 카머스틴, CCNU, 클로람부실, 시스플라틴, 클라드리빈, CPT-11, 사이클로포스파미드, 시타라빈, 시토신 아라비노시드, 사이톡산, 다카바진, 닥티노마이신, 다우노루비신, 덱스라족산, 도세탁셀, 독소루비신, DTIC, 에피루비신, 에틸렌이민, 에토포시드, 플록슈리딘, 플루다라빈, 플루오로우라실, 플루타미드, 포테머스틴, 젬시타빈, 헥사메틸아민, 하이드록시우레아, 이다루비신, 이포스파미드, 이리노테칸, 로머스틴, 메클로르에타민, 멜팔란, 머캅토퓨린, 메토트렉세이트, 미토마이신, 미토탄, 미톡산트론, 옥살리플라틴, 패클리탁셀, 파미드로네이트, 펜토스타틴, 플리카마이신, 프로카바진, 스트렙토조신, STI-571, 타목시펜, 테모졸로미드, 테니포시드, 테트라진, 티오구아닌, 티오테파, 토뮤덱스, 토포테칸, 트레오설판, 트리메트렉세이트, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈, 및 VP-16.

상기 개시를 위해서 "생물학적 약물"은 대조적으로 "기능성 핵산"을 제외하고 하기에 논의되는 생물학적 과정에 의해 생성될 수 있는 임의의 생물 활성 거대분자, 및 상기에 정의된 바와 같은, 크기에 의해 소분자 약물로서 한정되는 폴리펩티드를 나타내는 것으로 정의된다. 따라서 "생물학적 약물"의 하위범주는 소분자 약물 및 기능성 핵산 하위범주를 제외하며 이와 중복되지 않는다. 생물학적 약물의 예시는, 천연이든 재조합으로 또는 합성적으로, 예를 들어 의약 화학 및 약물 설계의 도구를 사용하여 제조되든지 간에, 치료 단백질 및 항체이다.

그럼에도 불구하고 화학요법 목적으로 설계되는 몇몇 분자들은 전-임상 또는 임상 시험 중에 허용될 수 없는 독성 또는 다른 안전성 우려로 인해 실패한다. 본 발명자들은 미니세포 중에 화학요법 약물을 패키징한 다음 종양 환자에게 전신 전달하여 상기 약물이 종양 세포로 전달됨을 입증하였다. 더욱이, 상기 종양 세포가 붕괴되고 상기 약물-함유 세포질이 가까운 정상 조직으로 방출된 후에조차도 결과는 정상 조직에 무독성이다. 이는 상기 약물이 이미 종양 세포 구조, 예를 들어 DNA에 결합되어 정상 세포를 더 이상 공격할 수 없기 때문이다. 상응하게, 본 발명은 종양 환자에의, 고도로 독성인 화학요법 약물의 전달에 특히 유용하다.

본 개시에서 "고도로 독성인 화학요법 약물" 및 "맹독성 화학요법 약물"이란 어구는 암세포에 대한 유효 용량에 비해 정상 세포에는 비교적 낮은 치사 용량을 갖는 화학요법 약물을 지칭한다. 따라서, 하나의 태양에서 고도로 독성인 화학요법 약물은 표적암, 예를 들어 (1) 상기 약물의 설계가 의도하는 암 유형, (2) 상기 약물에 대한 전-임상 또는 임상 시험이 실행되는 암 유형, 또는 (3) 상기 약물이 시험된 모든 암에서 최고의 효능을 나타내는 암 유형에 대해 중앙 유효 용량(ED₅₀)보다 낮은 중앙 치사 용량(LD₅₀)을 갖는다. 예를 들어, 고도로 독성인 화학요법 약물은 표적암에 대한 상기 약물의 ED₅₀의 약 500%, 400%, 300%, 250%, 200%, 150%, 120%, 또는 100% 미만의 LD₅₀을 가질 수 있다. 또 다른 태양에서, 고도로 독성인 화학요법 약물은 표적암에 대한 그의 최소 유효 용량, 예를 들어 상기 최소 유효 용량의 약 500%, 400%, 300%, 250%, 200%, 150%, 120%, 100%, 90%, 80%, 70%, 60% 또는 50% 미만의 최대 아치사 용량(즉 심한 또는 비가역적인 독성을 야기하지 않는 최고 용량)을 갖는다.

따라서 본 개시의 하나의 실시태양에 따라, 개체의 종양을 치료 유효량의 다수의 완전한, 세균 유래된 미니세포(이들은 각각 고도로 독성인 화학요법 약물을 포함한다)를 포함하는 조성물을 전신 투여함을 포함하는 방법에 의해 치료한다. 하기에 논의된 메이탄시노이드 및 듀오카마이신이 상기와 같이 사용되는 전형적인 맹독성 화학요법 약물 부류이다.

이러한 상황에서 적합한 암 화학요법 약물은 특히 질소 머스터드, 니트로소우레아, 에틸렌이민, 알칸 설포네이트, 테트라진, 백금 화합물, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체, 대사길항물질, 폴레이트 유사체, 안트라사이클린, 탁산, 빈카 알칼로이드, 국소이성화효소 억제제, 및 호르몬제를 포함한다.

소분자 약물 하위범주의 예시적인 화학요법 약물은 액티노마이신-D, 알케란, ara-C, 아나스트로졸, BiCNU, 비칼루타미드, 블레오마이신, 부설판, 카페시타빈(젤로다®), 카보플라틴, 카보플라티늄, 카머스틴, CCNU, 클로람부실, 시스플라틴, 클라드리빈, CPT-11, 사이클로포스파미드, 시타라빈, 시토신 아라비노시드, 사이톡산, 다카바진, 닥티노마이신, 다우노루비신, 덱스라족산, 도세탁셀, 독소루비신, DTIC, 에피루비신, 에틸렌이민, 에토포시드, 플록슈리딘, 플루다라빈, 플루오로우라실, 플루타미드, 포테머스틴, 젬시타빈, 헥사메틸아민, 하이드록시우레아, 이다루비신, 이포스파미드, 이리노테칸, 로머스틴, 메클로르에타민, 멜팔란, 머캅토퓨린, 메토트렉세이트, 미토마이신, 미토탄, 미톡산트론, 옥살리플라틴, 패클리탁셀, 파미드로네이트, 펜토스타틴, 플리카마이신, 프로카바진, 스트렙토조신, STI-571, 타목시펜, 테모졸로미드, 테니포시드, 테트라진, 티오구아닌, 티오테파, 토뮤덱스, 토포테칸, 트레오설판, 트리메트렉세이트, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈, 및 VP-16이다.

메이탄시노이드(분자량: ∼738 달톤)는 강력한 세포독성을 갖는, 메이탄신의 화학 유도체의 한 그룹이다. 메이탄시노이드는 독성 우려로 인해 인간 환자용으로 안전하지 않은 것으로 간주되지만, 본 발명에 따라 미니세포를 통해 종양 환자에게 전달하기에 적합하다.

듀오카마이신(분자량: ∼588 달톤)은 스트렙토마이세스 박테리아로부터 최초 단리된, 일련의 관련된 천연 산물이다. 상기도 또한 강력한 세포독성을 갖지만 인간용으로는 불안전한 것으로 간주된다. 메이탄시노이드처럼 듀오카마이신도 본 발명에 사용하기에 적합한 화학요법 약물이다.

마찬가지로 국제 특허 출원 WO1998/002446에 개시된 모르폴리닐 안트라사이클린 유도체 부류의 화합물들이 예시된다. 상기와 같은 유도체들 중에는 MMDX로서 알려진 네모루비신(3'-데아미노-3'-[2(S)-메톡시-4-모르폴리닐]독소루비신), 및 그의 주요 대사산물 PNU-159682(3'-데아미노-3"-4'-무수-[2"(S)-메톡시-3"(R)-하이드록시-4"-모르폴리닐]독소루비신)(그의 구조식을 하기에 나타낸다)뿐만 아니라 미국특허 제 8,470,984 호(그의 내용은 본 발명에 참고로 인용된다)에 개시된 4개의 다른 상기와 같은 유도체: 3'-데아미노-3"-4'-무수-[2"(S)-메톡시-3"(R)-하이드록시-4"-모르폴리닐]이다루비신; 3'-데아미노-3"-4'-무수-[2"(S)-메톡시-3"(R)-하이드록시-4"-모르폴리닐]다우노루비신; 3'-데아미노-3"-4'-무수-[2"(S)-메톡시-3"(R)-하이드록시-4"-모르폴리닐]카미노마이신; 및 3'-데아미노-3"-4'-무수-[2"(S)-에톡시-3"(R)-하이드록시-4"-모르폴리닐]독소루비신이 있다.

상기 언급한 유도체들 중 임의의 유도체의 약학적으로 허용 가능한 산 부가염은 자발형광성 모르폴리닐 안트라사이클린 유도체 그룹의, 본 발명에 따른 구성원이다.

생물학적 화학요법 약물의 하위범주는 비제한적으로 아스파라기나제, AIN-457, 바피뉴주맵, 벨리뮤맵, 브렌툭시맵, 브리아키뉴맵, 카나키뉴맵, 세툭시맵, 달로투주맵, 데노슈맵, 에프라투주맵, 에스타페나톡스, 팔레투주맵, 피기투뮤맵, 갈릭시맵, 젬투주맵, 지렌툭시맵(WX-G250), 이브리튜모맵, 이노투주맵, 이필리뮤맵, 메폴리주맵, 뮤로모냅-CD3, 냅튜모맵, 네시튜뮤맵, 니모투주맵, 오크렐리주맵, 오파투뮤맵, 오텔릭시주맵, 오조가미신, 파지박시맵, 파니투뮤맵, 페르투주맵, 라뮤시루맵, 레슬리주맵, 리툭시맵, REGN88, 솔라네주맵, 타네주맵, 테플리주맵, 티욱세탄, 토시튜모맵, 트라스투주맵(헤르셉틴®), 트레멜리뮤맵, 베돌리주맵, 잘루투뮤맵, 및 자놀리뮤맵을 포함한다.

상기 조성물은 기껏해야 약 1 ㎎의 화학요법 약물을 함유할 수 있다. 한편으로, 상기 화학요법 약물의 양은 기껏해야 약 750 ㎍, 500 ㎍, 250　㎍, 100 ㎍, 50 ㎍, 10 ㎍, 5 ㎍, 1 ㎍, 0.5㎍, 또는 0.1 ㎍일 수 있다. 또 다른 태양에서, 상기 조성물은 미니세포내로 패키징되지 않고 사용될 때 화학요법 약물의 치료 유효량의 약 1/1,000 미만, 또는 한편으로 약 1/2,000, 1/5,000, 1/10,000, 1/20,000, 1/50,000, 1/100,000, 1/200,000 또는 1/500,000 미만의 양을 갖는 상기 약물을 함유한다. 상기 명세의 더욱 또 다른 태양에 따라, 상기 조성물은 적어도 약 1 nmol의 화학요법 약물을 함유할 수 있다. 상응하게, 상기 명세는 또한 상기 화학요법 약물의 양이 각각 적어도 약 2 nmol, 약 3 nmol, 약 4 nmol, 약 5 nmol, 약 10 nmol, 약 20 nmol, 약 50 nmol, 약 100 nmol, 및 약 800 nmol인 실시태양들을 포함한다.

3. 기능성 핵산

"기능성 핵산"은 숙주 세포내로 도입시 단백질의 발현을 특이적으로 간섭하는 핵산 분자를 지칭한다. 종양의 치료에 관하여, 상기 명세에 따라 완전한, 세균 유래된 미니세포를 통해 종양 세포로 전달된 기능성 핵산 페이로드(payload)는 종양 세포 증식, 혈관형성 또는 화학요법에 대한 내성을 촉진하고/하거나 세포사멸 또는 세포-주기 정지를 억제하는 유전자, 즉 "종양-촉진 유전자"를 억제하는 것이 바람직하다.

상기는 일반적으로 본 명세에 사용된 기능성 핵산 분자가 단백질에 대한 전사물과 상호작용함으로서 단백질의 발현을 감소시키는 능력을 갖는 경우이다. 상기 명세에 대한 미니세포 페이로드의 범주는 특히 조절 RNA, 예를 들어 siRNA, shRNA, 짧은 RNA(전형적으로 400 염기 미만 길이), 미세-RNA(miRNA), 리보자임 및 디코이 RNA, 안티센스 핵산, 및 LincRNA를 포함한다. 이에 관하여, "리보자임"은 뉴클레오티드 염기 서열-특이적인 방식으로 다른 RNA 분자를 반복적으로 절단할 수 있는 효소 활성을 갖는 RNA 분자를 지칭한다. "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 특정한 유전자 전사물의 일부에 상보성인 핵산 분자를 나타내며, 따라서 상기 분자는 상기 전사물에 하이브리드하여 그의 번역을 차단할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA를 포함할 수 있다. "LincRNA" 또는 "긴 유전자간 비-암호화 RNA" 규정은 200 뉴클레오티드 초과의 비-단백질 암호화 전사물을 포함한다. LincRNA는 예를 들어 문헌[Khalil et al ., Proc Nat'l Acad . USA 106: 11667-72 (2009)]에 논의된 바와 같이, 유전자의 전사, 연접 및/또는 번역을 조절할 수 있다.

조절 RNA의 각각의 유형은 상술한 바와 같은 종양-촉진 유전자를 억제하고 따라서 본 명세에 따라 사용하기에 적합한 기능성 핵산 분자의 공급원일 수 있다. 따라서, 상기 명세의 하나의 바람직한 실시태양에서 상기 완전한 미니세포는 종양-촉진 유전자를 표적화하는데 이용될 수 있는 전사-후, 유전자-침묵 RNA 간섭(RNAi) 기전을 매개하는 siRNA 분자를 운반한다. 예를 들어 문헌[MacDiarmid et al ., Nature Biotech . 27: 645-51 (2009)](항체-제공 미니세포는 화학요법 약물과 함께, 약물에 대해 나타나는 내성을 역전시키는 siRNA를 전달한다) 및 문헌[Oh and Park, Advanced Drug Delivery Rev . 61: 850-62 (2009)](각각 유방, 난소, 경부, 간, 폐 및 전립선암을 치료하기 위한 치료학적 siRNA의 전달)을 참조하시오.

나타낸 바와 같이, "siRNA"는 일반적으로 단백질 발현을 특이적으로 간섭하는 능력으로 인해 명명되는 약 10 내지 약 30 뉴클레오티드 길이의 이중-가닥 RNA 분자를 지칭한다. 바람직하게, siRNA 분자는 12 내지 28 뉴클레오티드 길이, 보다 바람직하게는 15 내지 25 뉴클레오티드 길이, 훨씬 더 바람직하게는 19 내지 23 뉴클레오티드 길이 및 가장 바람직하게는 21 내지 23 뉴클레오티드 길이이다. 따라서, siRNA 분자는 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 28 또는 29 뉴클레오티드 길이일 수 있다.

단일 가닥의 길이는 siRNA 분자의 길이를 나타낸다. 예를 들어, 21 리보뉴클레오티드 길이(21-머)로서 개시되는 siRNA는 19개의 연속적인 염기 짝짓기를 위해 어닐링되는 RNA의 2개의 대향 가닥을 포함할 수 있다. 각 가닥 상에 남아있는 2개의 리보뉴클레오티드는 "돌출부"를 형성할 것이다. siRNA가 상이한 길이의 2개의 가닥을 함유하는 경우, 상기 가닥 중 보다 긴 것이 상기 siRNA의 길이를 나타낸다. 예를 들어, 21 뉴클레오티드 길이의 하나의 가닥 및 20 뉴클레오티드 길이의 제2 가닥을 함유하는 dsRNA는 21-머를 구성한다.

siRNA의 설계를 지원하는 도구인 특이성 및 조절성 RNA는 일반적으로 쉽게 입수될 수 있다. 예를 들어 컴퓨터-기반 siRNA 설계 도구를 인터넷상에서 www.dharmacon.com에서 입수할 수 있다.

또 다른 바람직한 실시태양에서, 본 명세의 완전한 미니세포는, siRNA 처럼 전사-후, 유전자-침묵 RNA 간섭(RNAi) 기전을 매개할 수 있는 miRNA를 운반한다. 또한 siRNA 처럼, 상기 miRNA에 의해 매개된 유전자-침묵 효과를 이용하여 종양-촉진 유전자를 표적화할 수 있다. 예를 들어 문헌[Kota et al., Cell 137: 1005-17 (2009)](뮤린 간암 모델에서 형질감염을 통한 miRNA의 전달은 암세포 증식, 종양-특이성 세포사멸 및 독성 없이 질병 진행으로부터의 극적인 보호를 생성시켰다) 및 문헌[Takeshita, et al ., Molec . Ther . 18: 181-87 (2010)](일시적인 형질감염을 통한 합성 miRNA의 전달은 골 조직상의 전이성 전립선 종양 세포의 성장을 억제하였다)을 참조하시오.

miRNA 및 siRNA는 모두 RNA 간섭을 매개하지만, 주목되는 차이를 갖는다. 이에 관하여, "miRNA"는 일반적으로 17- 내지 27-뉴클레오티드 단일-가닥 RNA 분자(siRNA의 경우에서와 같은 이중-가닥 대신에)의 부류를 지칭한다. 따라서, miRNA 분자는 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 바람직하게, miRNA 분자는 21 내지 25 뉴클레오티드 길이이다.

miRNA와 siRNA 간의 또 다른 차이는, miRNA는 일반적으로 mRNA 표적을 충분히 보완하지 않는다는 것이다. 다른 한편으로, siRNA는 mRNA 표적에 완전히 상보성임에 틀림없다. 결과적으로, siRNA는 일반적으로 단일의 특이적인 표적의 침묵을 생성시키는 반면, miRNA는 그때그때 다르다.

추가로, 상기 둘 다 RISC(RNA-유도된 침묵화 복합체)로 조립되지만, siRNA 및 miRNA는 RISC 조립 전에 그들 각각의 초기 프로세싱이 상이하다. 이러한 차이는 문헌[Chu et al ., PLoS Biology 4: 1122-36 (2006)] 및 문헌[Gregory et al ., Methods in Molecular Biology 342: 33-47 (2006)]에 상세히 개시되어 있다.

다수의 데이터베이스가 miRNA 보관소로서 제공된다. 예를 들어, miRBase(www.mirbase.org) 및 tarbase (http://diana.cslab.ece.ntua.gr/DianaToolsNew/index.php?r=tarbase/index)를 참조하시오. 통상적인 사용에서, miRNA는 전형적으로 일련번호와 함께 접두사 "-mir"를 사용하여 명명된다. 예를 들어, 마우스 mir-352 뒤에 발견된 새로운 miRNA는 마우스 "mir-353"이라 명명될 것이다.

다시, miRNA를 포함한 조절 RNA의 설계를 지원하는 도구들을 쉽게 입수할 수 있다. 이에 관하여, 컴퓨터-기반 miRNA 설계 도구를 인터넷상에서 wmd2.weigelworld.org/cgi-bin/mirnatools.pl에서 입수할 수 있다.

상기에 나타낸 바와 같이, 상기 명세에 사용된 기능성 핵산은 세포 증식, 혈관형성 또는 화학요법에 대한 내성을 촉진하는 유전자를 억제할 수 있다. 상기 억제된 유전자는 또한 자신이 세포사멸 또는 세포주기 정지를 억제할 수 있다. 기능성 핵산에 의해 표적화될 수 있는 유전자의 예를 하기에 제공한다.

상기 명세의 기능성 핵산은 바람직하게는, 약물 내성을 촉진하거나 세포사멸을 억제하거나 또는 종양 표현형을 촉진하는 단백질의 유전자 또는 전사물을 표적화한다. 이와 관련하여 기능성 핵산 전략의 성공적인 적용이 당해 분야에서 성취되었으나, 미니세포 벡터의 이점은 없었다. 예를 들어 문헌[Sioud, Trends Pharmacol . Sci . 25　: 22-8 (2004)], 문헌[Caplen, Expert Opin . Biol . Ther . 3: 575-86 (2003)], 문헌[Nieth et al ., FEBS Lett . 545: 144-50 (2003)], 문헌[Caplen and Mousses, Ann . NY Acad. Sci . 1002: 56-62 (2003)], 문헌[Duxbury et al ., Ann . Surg . 240: 667-74 (2004)], 문헌[Yague et al ., Gene Ther . 11: 1170-74 (2004)], 및 문헌[Duan et al., Mol . Cancer Ther . 3: 833-8 (2004)]을 참조하시오.

약물 내성에 기여하는 단백질은 기능성 핵산의 바람직한 표적을 구성한다. 상기 단백질은 후천적인 약물 내성 또는 본래의 약물 내성에 기여할 수 있다. 병든 세포, 예를 들어 종양 세포가 초기에는 약물에 반응하지만 후속의 치료 주기에 대해서 무반응성으로 되는 경우, 내성 표현형이 획득된다. 후천적인 약물 내성에 관련된 유용한 표적은 ATP 결합 카세트 수송체, 예를 들어 P-당단백질(P-gp, P-170, PGY1, MDR1, ABCB1, MDR-관련 단백질, 다중약물 내성 단백질 1), MDR-2 및 MDR-3을 포함한다. MRP2(다중-약물 내성 관련 단백질), BCR-ABL(중지점 클러스터 영역-아벨슨 원암유전자), STI-571 내성-관련 단백질, 폐 내성-관련 단백질, 사이클로옥시게나제-2, 핵인자 카파, XRCC1(X-선 교차-상보성 그룹 1), ERCC1(절제 교차-상보성 유전자), GSTP1(글루타치온 S-트랜스퍼라제), 돌연변이 β-튜불린, 및 성장 인자, 예를 들어 IL-6이 후천적인 약물 내성에 관련된 추가의 표적들이다.

약물 내성에 기여하는 특히 유용한 표적은 ATP 결합 카세트 수송체, 예를 들어 P-당단백질, MDR-2, MDR-3, BCRP, APT11a 및 LRP를 포함한다.

유용한 표적은 또한 세포사멸 내성을 촉진하는 단백질을 포함한다. 상기는 Bcl-2(B 세포 백혈병/림프종), Bcl-X_L, Al/Bfl 1, 초점 접착 키나제, 디하이드로디올 데하이드로게나제, 및 p53 돌연변이 단백질을 포함한다.

유용한 표적은 발암성 및 돌연변이 종양 억제제 단백질을 추가로 포함한다. 이들의 예시는 β-카테닌, PKC-α(단백질 키나제 C), C-RAF, K-Ras(V12), DP97 데드 박스 RNA 헬리카제, DNMT1(DNA 메틸트랜스퍼라제 1), FLIP(플리스(Flice)-유사 억제 단백질), C-Sfc, 53BP1, 폴리콤(Polycomb) 그룹 단백질 EZH2(제스트(zeste) 동족체의 인헨서), ErbB1, HPV-16 E5 및 E7(인간 파필로마바이러스 초기 5 및 초기 7), 폴틸린(Fortilin) & MCI1P(골수세포 백혈병 1 단백질), DIP13α(DDC 상호작용 단백질 13a), MBD2(메틸 CpG 결합 도메인), p21, KLF4(크루펠(Kruppel)-유사 인자 4), tpt/TCTP(번역 조절된 종양 단백질), SPK1 및 SPK2(스핑고신 키나제), P300, PKL1(폴로(Polo)-유사 키나제-1), Trp53, Ras, ErbB1, VEGF(혈관 내피 성장 인자), BAG-1(BCL2-관련 아타노유전자(athanogene) 1), MRP2, BCR-ABL, ST1-571 내성-관련 단백질, 폐 내성-관련 단백질, 사이클로옥시게나제-2, 핵 인자 카파, XRCC1, ERCC1, GSTP1, 돌연변이 β-튜불린, 및 성장 인자이다.

세포질 폴리아데닐화 요소 결합 단백질(CEPB)에 의해 예시되는 전체적인 조절 요소가 또한 표적으로서 유용하다. 예를 들어, CEPB4는 교모세포종 및 췌장암에서 과발현되며, 이때 상기 단백질은 종양 성장과 관련된 수백 개의 유전자를 활성화하며 건강한 세포에서는 검출되지 않는다(Oritz-Zapater et al ., Nature Medicine, doi: 10.1038/nm.2540(2011년 12월 4일자로 온-라인상에서 공개됨)). 따라서, 본 개시에 따라, 교모세포종의 치료는 CEPB4의 과발현을 역전시키는 제제, 예를 들어 종양 세포에 의한 CEPB4 발현을 방해하는 siRNA 또는 다른 기능성 핵산 분자를 포함하는 완전한, 세균 유래된 미니세포를 함유하는 조성물의 투여를 통해 수행될 수 있었다.

추가의 유용한 기능성 핵산은 DNA 복제 및 수복에 관련된 것들이다. 예로서 리보뉴클레오티드 리덕타제(RR)가 있는데, 이는 리보뉴클레오시드 5'-디포스페이트의 그의 상응하는 2'-데옥시리보뉴클레오시드 5'-트리포스페이트(DNA 복제 및 수복에 필요하다)로의 전환을 촉진하기 때문에 암에 대한 잠재적인 치료 표적이다. 문헌[D'Angiolella et al ., Cell: 149:1023-34 (2012)]을 참조하시오. 인간 RR은 2개의 서브유닛, RRM1 및 RRM2, 및 본 발명에 유용한 상기 두 서브유닛을 모두 표적화하는 기능성 핵산을 포함한다. 유용한 기능성 핵산의 추가의 예는 70-kDa(RPA1), 32-kDa(RPA2) 및 14-kDa(RPA3) 서브유닛으로 구성된 삼량체성 복합체인 복제 단백질 A(RPA)를 포함하며, 이는 모든 유기체에서 DNA 복제에 필수적이다. 문헌[Iftode et al ., Crit . Rev . Biochem . Mol . Biol . 34: 141-80 (1999)]을 참조하시오.

(D) 종양

본 명세의 조성물 및 방법은 특정한 종류에 국한되지 않은 다양한 종양 유형들의 치료에 유용하다. 이는 상기 미니세포 또는 죽은 세균세포가 다양한 항-종양제들을 패키징할 수 있기 때문이며, 특히 다양한 종양 세포에 특이적인 이중특이성 리간드가 함께 부착될 때 다양한 종양 유형의 세포들을 표적화할 수 있다. 또한, IFN-감마와 동반된 미니세포 또는 죽은 세균세포의 능력은 임의의 종양 세포에 대한 면역 반응을 자극할 수 있는 것으로 예상된다.

상기 명세의 하나의 실시태양에 따라, 본 발명의 조성물 및 방법은 부신암, 항문암, 재생불량성 빈혈, 담관암, 방광암, 골암, 성인의 뇌/CNS 종양, 소아의 뇌/CNS 종양, 유방암, 남성 유방암, 소아암, 미지의 원발암, 캐슬맨병, 경부암, 결장/직장암, 자궁내막암, 식도암, 유잉계 종양, 눈암, 담낭암, 위장관 유암종, 위장관 기질 종양(gist), 임신성 융모성 질환, 호지킨병, 카포시 육종, 신장암, 후두 및 하인두암, 백혈병, 성인의 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(cml), 만성 골수단핵구성 백혈병(CMML), 소아 백혈병, 간암, 폐암, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 폐유암종, 림프종, 피부 림프종, 악성 중피종, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 비강 및 부비동암, 비인두암, 신경모세포종, 비호지킨 림프종, 소아 비호지킨 림프종, 구강 및 구강인두암, 골육종, 난소암, 췌장암, 음경암, 뇌하수체 종양, 전립선암, 망막모세포종, 횡문근육종, 침샘암, 육종 - 성인 연조직암, 피부암, 기저 및 편평세포 피부암, 흑색종 피부암, 소장암, 위암, 고환암, 흉선암, 갑상선암, 자궁 육종, 질암, 외음부암, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 및 빌름 종양 중에서 선택된 하나 이상의 암의 치료에 사용된다.

하나의 실시태양에서, 상기 조성물 및 방법은 뇌종양의 치료에 적합하다. 120개가 넘는 유형의 뇌종양이 존재한다. 대부분의 의료기관은 뇌종양의 확인에 세계보건기구(WHO) 분류 체계를 사용한다. WHO는 뇌종양을 세포 기원, 및 최소의 공격성(양성)에서부터 최대의 공격성(악성)까지 세포의 행동양상에 따라 분류한다. 일부 종양 유형은 성장률을 뜻하는 I 등급(최소 악성) 내지 IV 등급(최대 악성) 범위의 등급이 할당된다. 종양 유형에 따라 등급 체계의 변화가 존재한다. 상기 분류 및 개별 종양의 등급은 상기 종양의 있음 직한 행동양상의 예측을 돕는다. 가장 흔하게 진단되는 유형은 청신경종, 성상세포종(I 등급 - 모양세포성 성상세포종, II 등급 - 낮은 등급 성상세포종, III 등급 - 역형성 성상세포종 및 IV 등급 - 교모세포종(GBM)), 척색종, CNS 림프종, 두개인두종, 다른 신경교종(뇌간 신경교종, 상의세포종, 혼합된 신경교종, 시신경 신경교종 및 상의하세포종), 수모세포종, 뇌수막종, 전이성 뇌종양, 핍지교종, 뇌하수체 종양, 원시신경외배엽 종양(PNET), 다른 뇌-관련 질병, 및 슈반종을 포함한다.

소아에서는 뇌간 신경교종, 두개인두종, 상의세포종, 소아 모양세포성 성상세포종(JPA), 수모세포종, 시신경 신경교종, 송과체 종양, 원시신경외배엽 종양(PNET), 및 횡문근양 종양의 뇌종양 유형들이 보다 흔하다.

(E) 미니세포 및 죽은 세균 세포

"미니세포"는 염색체가 없고("무-염색체") 2분열(binary fission) 중에 DNA 분리와 함께 세포 분열의 조화의 장애에 의해 생성되는 세균 세포의 유도체를 지칭한다. 미니세포는, 몇몇 상황에서 자발적으로 생성되어 방출되지만 특이적인 유전자 재배열 또는 에피솜 유전자 발현에 기인하지 않는 다른 작은 소낭들, 예를 들어 소위 "막수포"(∼0.2 ㎛ 이하의 크기)와 다르다. 같은 징표에 의해, 완전한 미니세포는, 특이적인 유전자 재배열 또는 에피솜 유전자 발현에 기인하여 생성되지 않는 세균 고스트와 상이하다. 상기 명세에 사용된 세균 유래된 미니세포는 충분히 완전하며, 따라서 붕괴되거나 분해된, 심지어 제거된 외막 또는 한정 막을 특징으로 하는 다른 무-염색체 형태의 세균 세포 유도체와 구별된다. 미국특허 제 7,183,105 호, 컬럼 111, 라인 54 이하를 참조하시오. 본 명세의 미니세포를 특성화하는 상기 완전한 막은 치료학적 페이로드를, 상기 페이로드가 종양 세포내에 흡수-후 방출될 때까지 상기 미니세포내에 유지되게 한다.

본 명세에 사용되는 미니세포를 세균 세포, 예를 들어 에스케리키아 콜라이 및 살모넬라 티피뮤리움으로부터 제조할 수 있다. 원핵생물 염색체 복제는 통상적인 2분열과 연계되며, 상기 분열은 중간-세포 격막 형성을 수반한다. 예를 들어 에스케리키아 콜라이에서, min 유전자, 예를 들어 minCD의 돌연변이는 세포 분열 중에 세포 극에서 격막 형성의 억제를 제거하여, 정상적인 딸 세포 및 무-염색체 미니세포를 생성시킬 수 있다. 문헌[de Boer et al ., J. Bacteriol . 174(1): 63-70 (1992)]; 문헌[Raskin & de Boer, J. Bacteriol . 181: 6419-6424 (1999)]; 문헌[Hu & Lutkenhaus, Mol. Microbio . 34(1): 82-90 (1999)]; 문헌[Harry, Mol . Microbiol . 40(4): 795-803 (2001)]을 참조하시오.

min 오페론 돌연변이 외에, 무-염색체 미니세포는 또한, 예를 들어 바실러스 서브틸리스에서 divIVB1에서 격막 형성에 영향을 미치는 일련의 다른 유전자 재배열 또는 돌연변이에 따라 생성된다. 문헌[Reeve and Cornett, J. Virol. 15: 1308-16 (1975)]을 참조하시오. 미니세포는 또한 세포 분열/염색체 분리에 관련된 단백질들의 유전자 발현 수준의 동요에 따라 형성될 수 있다. 예를 들어, minE의 과-발현은 미니세포의 극성 분열 및 생산을 유도한다. 유사하게, 무-염색체 미니세포는 염색체 분리의 결함, 예를 들어 바실러스 서브틸리스에서 smc 돌연변이(Britton et al ., Genes Dev . 12: 1254-9 (1998)), 바실러스 서브틸리스에서 spoOJ 결실(Ireton et al ., J. Bacteriol . 176: 5320-29 (1994)), 에스케리키아 콜라이에서 mukB 돌연변이(Hiraga et al ., J. Bacteriol . 171: 1496-1505 (1989)), 및 에스케리키아 콜라이에서 parC 돌연변이(Stewart and D'Ari, J. Bacteriol. 174: 4513-6 (1992))로부터 생성될 수 있다. 더욱이, CafA는 복제 후 세포 분열 속도를 증대시키고/시키거나 염색체 분할을 억제하여(Okada et al ., J. Bacteriol . 176: 917-22 (1994)), 연쇄 세포 및 무-염색체 미니세포를 형성시킬 수 있다.

상응하게, 미니세포를 본 명세를 위해 임의의 세균 세포로부터 제조할 수 있으며, 상기 세균 세포는 상기 세균에서 보존된 세균 세포 분열 성질로 인해 그람-양성 또는 그람-음성 기원의 것이다. 더욱 또한, 상기 명세에 사용된 미니세포는 상기에 나타낸 바와 같이 완전한 세포벽을 가져야 하며(즉 "완전한 미니세포"이다), 다른 작은 소낭들, 예를 들어 특이적인 유전자 재배열 또는 에피솜 유전자 발현에 기인할 수 없는 막 수포와 구별되고 분리되어야 한다.

주어진 실시태양에서, 상기 미니세포에 대한 모(원인) 세균은 언급한 바와 같이 그람 양성이거나 또는 그람 음성일 수 있다. 따라서 하나의 태양에서, 상기 모 세균은 테라-/글리도박테리아(BV1), 프로테오박테리아(BV2), BV4, 예를 들어 스피로헤테스, 스핑고박테리아 및 플랑크토박테리아 중에서 선택된 하나 이상이다. 또 다른 태양에 따라, 상기 세균은 퍼미쿠테스(BV3), 예를 들어 바실리, 클로스트리디아 및 테네리쿠테스/몰리쿠테스, 및 액티노박테리아(BV5), 예를 들어 액티노마이세탈레스 및 비피도박테리알레스 중에서 선택된 하나 이상이다.

본 발명에 따라, 죽은 세균 세포는 문헌[BERGEY's MANUAL OF SYSTEMATIC BIOLOGY]의 제2판에 정의된 바와 같이, 박테리아, 시아노박테리아, 유박테리아 및 알카에박테리아의 살아있지 않은 원핵생물 세포이다. 상기와 같은 세포는 완전한 세포벽 및/또는 세포막을 갖고 세균종에 내인성인 유전 물질(핵산)을 함유하는 경우 "완전한" 것으로 생각된다. 죽은 세균 세포의 제조 방법은 예를 들어 미국특허 출원 공보 제 2008/0038296 호(그의 내용은 본 발명에 참고로 인용된다)에 개시되어 있다.

더욱 추가의 태양에서, 상기 세균은 에오박테리아(클로로플렉시, 데이노코커스-써무스), 시아노박테리아, 써모데설포박테리아, 써모필레스(아쿠이피카에, 써모토가에), 알파, 베타, 감마(엔테로박테리아세아에), 델타 또는 입실론 프로테오박테리아, 스피로헤테스, 피브로박테레스, 클로로비/박테로이데테스, 클라미디아에/베루코미크로비아, 플랑크토마이세테스, 애시도박테리아, 크리시오게네테스, 데페리박테레스, 푸소박테리아, 제마티모나데테스, 니트로스피라에, 시너지스테테스, 딕티오글로미, 렌티스파에라에, 바실랄레스, 바실라세아에, 리스테리아세아에, 스타필로코카세아에, 락토바실랄레스, 엔테로코카세아에, 락토바실라세아에, 류코노스토카세아에, 스트렙토코카세아에, 클로스트리디알레스, 할라나에로비알레스, 써모아나에로박테랄레스, 마이코플라스마탈레스, 엔토모플라스마탈레스, 아나에로플라스마탈레스, 아콜레플라스마탈레스, 할로플라스마탈레스, 액티노마이시네아에, 액티노마이세타세아에, 코리네박테리네아에, 노카르디아세아에, 코리네박테리아세아에, 프랑키네아에, 프랑키아세아에, 미크로코시네아에, 브레비박테리아세아에, 및 비피도박테리아세아에 중에서 선택된 하나 이상이다.

약학적 용도를 위해서, 상기 명세의 조성물은 면역원성 성분 및 다른 독성 오염물질로부터 가능한 한 철저히 단리된 미니세포 또는 죽은 세균 세포를 포함해야 한다. 유리 내독소 및 모 세균 세포를 제거하기 위해 세균 유래된 미니세포를 정제하는 방법은 WO 2004/113507(내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)에 개시되어 있다. 간단히, 상기 정제 방법은 (a) 크기가 일반적으로 0.2 ㎛보다 작은 소낭, 예를 들어 막 수포, (b) 세포막으로부터 방출된 유리 내독소, 및 (c) 또한 유리 내독소의 공급원인, 모 세균(살아있던 죽었던 간에) 및 그의 찌꺼기의 제거를 성취한다. 상기와 같은 제거를 특히 0.2 ㎛ 필터로 실행하여 보다 작은 소낭 및 세포 찌꺼기를 제거하고, 0.45 ㎛ 필터로 실행하여 필라멘트를 형성하는 모 세포의 유도에 따른 모세포, 생세균 세포를 살해하기 위한 항생제, 및 유리 내독소에 대한 항체를 제거할 수 있다.

상기 정제 과정은, 세균 공급원의 차이에도 불구하고 모든 완전한 미니세포가 대략 400 ㎚의 크기, 즉 막 수포 및 다른 보다 작은 소낭보다 크지만 모 세균보다는 여전히 작은 크기라는 본 발명자들의 발견이 기초가 된다. 미니세포에 대한 크기 측정을 고체 상태를 사용하여, 예를 들어 전자 현미경검사에 의해, 또는 액체-기반 기법, 예를 들어 동적 광산란에 의해 수행할 수 있다. 각각의 상기와 같은 기법에 의해 제공된 크기값은 오차 범위를 가질 수 있으며, 상기 값은 기법마다 다소 상이할 수 있다. 따라서, 건조된 상태의 미니세포의 크기를 전자 현미경검사를 통해 대략 400 ㎚ ± 50 ㎚로서 측정할 수 있다. 다른 한편으로, 동적 광산란은 같은 미니세포를 대략 500 ㎚ ± 50 ㎚의 크기인 것으로 측정할 수 있다. 또한, 약물-패키징된, 리간드-표적화된 미니세포를 다시 동적 광산란을 사용하여, 대략 400 내지 600 ㎚ ± 50 ㎚인 것으로 측정할 수 있다.

상기 크기 값의 산포는 실제로, 예를 들어 상기에 개시된 바와 같이 면역원성 성분 및 다른 독성 오염물질로부터 미니세포를 단리할 목적으로 쉽게 조정된다. 즉, 완전한, 세균 유래된 미니세포는 단단한 막(이는 상기 미니세포에게 단단한 구형 구조를 제공한다)에 의해 둘러싸인 세포질을 특징으로 한다. 상기 구조는 미니세포의 직경이 상기 미니세포를 가로질러, 상기 단단한 막의 외부 한계들 사이에서 측정되는 투과형 전자 현미경사진에서 자명하다. 상기 측정은 400 ㎚ ± 50 ㎚의 상기 언급된 크기값을 제공한다.

그람-음성 세균으로부터 유래된 죽은 세균 세포 또는 미니세포의 또 다른 구조 요소는 지질 A 앵커를 통해 외막 중에 매몰되어 있는 리포폴리사카라이드(LPS)의 O-폴리사카라이드 성분이다. 상기 성분은 반복되는 탄수화물-잔기 단위의 쇄이며, 쇄당 4 내지 5개 당의 70 내지 100 반복 단위 정도로 많다. 상기 쇄는 생체내와 같은 액체 환경에서 단단하지 않기 때문에, 산호해 환경의 해초의 일반적인 외관을 제공하는 물결치는 가요성 구조를 채용할 수 있다, 즉 상기 쇄는 상기 미니세포막에 고정된 채로 있으면서 상기 액체와 함께 움직인다.

상기 O-폴리사카라이드 성분에 의해 영향을 받은 경우, 동적 광 산란은 상기에 나타낸 바와 같이, 약 500 ㎚ 내지 약 600 ㎚의 미니세포 크기 값을 제공할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 그람-음성 및 그람-양성 세균으로부터의 미니세포는 똑같이 0.45 ㎛ 필터를 쉽게 통과하며, 이는 400 ㎚ ± 50 ㎚의 유효 미니세포 크기를 입증한다. 상기 언급된 크기 산포는 본 발명에 의해 포함되며, 특히 "대략 400 ㎚ 크기" 등의 어구에서 "대략"이란 수식어에 의해 표시된다.

독성 오염물질과 관련하여, 상기 명세의 조성물은 약 350 EU 미만의 유리 장독소를 함유할 수 있다. 이에 관하여 각각 약 250 EU, 약 200 EU, 약 150 EU, 약 100 EU, 약 90 EU, 약 80 EU, 약 70 EU, 약 60 EU, 약 50 EU, 약 40 EU, 약 30 EU, 약 20 EU, 약 15 EU, 약 10 EU, 약 9 EU, 약 8 EU, 약 7 EU, 약 6 EU, 약 5 EU, 약 4 EU, 약 3 EU, 약 2 EU, 약 1 EU, 약 0.9 EU, 약 0.8 EU, 약 0.7 EU, 약 0.6 EU, 약 0.5 EU, 약 0.4 EU, 약 0.3 EU, 약 0.2 EU, 약 0.1 EU, 약 0.05 EU, 및 약 0.01 EU의 유리 장독소 수준이 예시된다.

상기 명세의 조성물은 또한 적어도 약 10⁹, 예를 들어 적어도 약 1 x 10⁹, 적어도 약 2 x 10⁹, 또는 적어도 약 5 x 10⁹의 미니세포 또는 죽은 세균 세포를 함유할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 조성물은 약 10¹¹ 이하, 예를 들어 약 1 x 10¹¹ 이하 또는 약 9 x 10¹⁰ 이하, 또는 약 8 x 10¹⁰ 이하의 미니세포 또는 죽은 세균 세포를 함유한다.

(F) 항-종양제의 미니세포 또는 죽은 세균 세포내로의 패키징

핵산에 의해 암호화될 수 있는 항-종양제, 예를 들어 단백질 및 기능성 핵산을, 모 세균 세포에 상기 항-종양제를 암호화하는 벡터, 예를 들어 플라스미드를 형질전환시킴으로써 미니세포에 도입시킬 수 있다. 미니세포가 상기 모 세균 세포로부터 형성되는 경우, 상기 미니세포는 상기 플라스미드의 몇몇 사본 및/또는 발현 산물, 항-종양제를 유지한다. 발현 산물의 미니세포내로의 패키징에 대한 보다 상세한 내용이 WO 03/033519(이의 내용은 전체가 본 명세에 참고로 인용되어 있다)에 제공되어 있다.

WO 03/033519에 제공된 데이터는 예를 들어 포유동물 유전자 발현 플라스미드를 운반하는 재조합 미니세포가 식세포 및 비-식세포로 전달될 수 있음을 설명하였다. 상기 출원은 또한 에피솜-복제 플라스미드 DNA상에서 운반되는 이종 핵산에 의한 미니세포-생산 모 세균 균주의 유전자 형질전환을 개시하였다. 모 세균 및 미니세포의 분리시, 상기 에피솜 DNA의 일부가 상기 미니세포내로 분리되었다. 생성되는 재조합 미니세포는 포유동물 식세포에 의해 쉽게 삼켜지며 세포내 파고라이소솜내에서 분해되었다. 더욱이, 상기 재조합 DNA의 일부는 상기 파고라이소솜 막을 이탈하여 포유동물 세포 핵으로 수송되며, 여기에서 상기 재조합 유전자가 발현되었다.

핵산을 또한 미니세포에 직접 패키징할 수 있다. 따라서, 핵산을, 다수의 완전한 미니세포를 상기 핵산과 완충제 중에서 공-항온처리 (co-incubating)함으로써 완전한 미니세포에 직접 패키징할 수 있다. 상기 완충제 조성은 상기 완전한 미니세포 중의 상기 핵산의 로딩을 최적화하기 위해, 당해 분야에 주지된 조건의 함수로서 변할 수 있다. 상기 완충제는 또한 상기 미니세포에 로딩되는 핵산의 길이 및 뉴클레오티드 서열에 따라 변할 수 있다. 로딩에 적합한 예시적인 완충제는 비제한적으로 포스페이트 완충 염수(PBS)를 포함한다. 상기 핵산은 일단 패키징되면 상기 미니세포 내부에 남아있고 분해로부터 보호된다. 멸균 염수 중에서 항온처리된 siRNA-패키징된 미니세포를 사용한 연장된 항온처리 연구는 예를 들어 siRNA의 누출이 없음을 입증하였다.

다른 실시태양에서, 다양한 mRNA 표적들에 대한 다수의 핵산을 동일한 미니세포에 패키징할 수 있다. 상기와 같은 접근법을 사용하여 약물 내성 및 세포사멸 내성에 대항할 수 있다. 예를 들어, 암 환자는 통상적으로 화학요법 약물에 대해 내성을 나타낸다. 상기와 같은 내성은 특히 다중-약물 내성(MDR) 펌프 및 세포사멸-억제 유전자와 같은 유전자의 과-발현에 의해 매개될 수 있다. 상기 내성에 대항하기 위해서, 미니세포를 MDR-관련 유전자에 치료학적 유의수준 농도의 기능성 핵산과 함께 패키징하고 화학요법 전에 환자에게 투여할 수 있다. 더욱 또한, 동일한 미니세포내로 다양한 mRNA 표적들에 대한 다수의 기능성 핵산의 패키징은, 대부분의 분자 표적이 돌연변이되기 쉽고 다수의 대립유전자를 갖기 때문에 치료학적 성공을 증대시킬 수 있다. 미니세포내로의 핵산의 직접 패키징에 대한 보다 상세한 내용이 WO 2009/027830 호(이의 내용은 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)에 제공되어 있다.

소분자 약물을 친수성이든 소수성이든 간에, 미니세포를 함유하는 세포외 매질과 상기 미니세포 세포질 사이에 상기 약물의 농도 구배를 생성시킴으로써 상기 미니세포에 패키징할 수 있다. 상기 세포외 매질이 상기 미니세포 세포질보다 더 높은 약물 농도를 함유하는 경우, 상기 약물은 자연히 상기 농도 구배를 상기 미니세포 세포질내로 끌어내린다. 그러나 상기 농도 구배가 역전되는 경우, 상기 약물은 상기 미니세포 밖으로 이동하지 않는다. 약물 로딩 과정 및 그의 놀라운 성질에 대한 보다 상세한 내용은 예를 들어 미국특허 출원 공보 제 2008/0051469 호에서 발견된다.

미니세포에 통상적으로 수용성이 아닌 약물을 로딩하기 위해서, 상기 약물을 먼저 적합한 용매에 용해시킬 수 있다. 예를 들어, 패클리탁셀을 상기 약물이 용액 중에 남아있도록 하기 위해서, 에탄올 및 크레모포어 EL(폴리에톡실화된 피마자유)의 1:1 혼합물에 용해시킨 다음 PBS로 희석하여, 수성 매질 중에 부분적으로 희석되고 최소량의 유기 용매를 갖는 패클리탁셀 용액을 성취할 수 있다. 미니세포를 약물 로딩을 위해 상기 최종 매질 중에서 항온처리할 수 있다. 따라서, 발명자들은 소수성 약물조차 세포질 또는 상기 미니세포의 막내로 확산시켜 높고 치료학적으로 유의수준인 세포질 약물 로드를 성취할 수 있음을 발견하였다. 이는 상기 미니세포막이, 세포질내로의 소수성 분자의 확산을 막을 것으로 예상할 수 있는 소수성 인지질의 이층으로 구성되기 때문에 뜻밖이다.

미니세포내로의, 상이한 크기 및 화학적 성질들을 나타내는 다양한 전형적인 소분자 약물, 즉 독소루비신, 패클리탁셀, 플루오로-패클리탁셀, 시스플라틴, 빈블라스틴, 몬사트롤, 티미딜레이트 신타제(TS) 억제제 OSI-7904, 이리노테칸, 5-플루오로우라실, 젬시타빈 및 카보플라틴의 로딩을 설명한다. 더욱이, 전반에 걸쳐, 상기 생성되는 소분자 약물-패키징된 미니세포는 시험관내 및 생체내에서 현저한 항-종양 효능을 나타낸다. 따라서 여기에 나타낸 데이터는 상기 미니세포 로딩 방법의 유효성 및 다능성을 설명한다.

(G) 특정한 포유동물 세포로의 미니세포 또는 죽은 세균 세포의 지향(directing)

본 명세의 추가의 태양에 따라, 상술한 바와 같은 조성의 미니세포 또는 죽은 세균 세포를 리간드를 통해 표적 포유동물 종양 세포로 향하게 한다. 일부 실시태양에서 상기 리간드는 "이중특이성"이다. 즉, 상기 리간드는 미니세포 및 포유동물(종양) 세포 성분 모두에 대해 특이성을 나타내며, 따라서 주어진 소낭이 표적 세포에 결합되게 하고, 이에 의해 상기 표적 세포는 상기 소낭을 삼켜버린다. 미니세포를 종양 세포에 표적화하기 위한 이중특이성 리간드의 용도가 WO 05/056749 및 WO 05/079854에 추가로 개시되어 있으며, 죽은 세균 세포를 종양 세포에 표적화하기 위한 이중 특이성 리간드의 용도는 미국특허 제 8,591,862 호에 추가로 개시되어 있고, 상기 각각의 내용은 전체가 본 발명에 참고로 인용된다. 일단 상기와 같은 리간드가 소낭에 부착되면, 상기 리간드의 비어있는 특이성("단일특이성")이 상기 표적(종양) 포유동물 세포와 상호작용할 때까지 존재한다.

상기 리간드를 상기 리간드와 상기 세포막상의 성분, 예를 들어 폴리사카라이드, 당단백질 또는 폴리펩티드와의 상호작용에 의해 상기 소낭의 세포막에 부착시킬 수 있다. 발현된 리간드는 상기 소낭과 포유동물 세포가 접촉하게 될 때 상기 리간드의 표면 성분-결합 부분이 상기 표적 포유동물 세포 표면 성분에 결합할 수 있게 상기 부분이 노출되도록 상기 소낭의 표면상에 고정된다.

한편으로, 상기 리간드를 예를 들어 미니세포의 모 세포에 의해 또는 죽은 세포로 되기 전의 세균 세포에 의해, 세균 유래된 소낭의 살아있는 짝에 의해 발현시키고 나타낼 수 있다. 이 경우에 상기 리간드는 상기 소낭에 대한 특이성을 필요로 하지 않고 단지 포유동물 세포의 특징인 성분에 대해서만 특이성을 나타낼 뿐이다. 즉, 상기와 같은 성분은, 종양 세포가 그의 표면상에 상기 성분을 나타내는 한, 종양 세포 자체, 또는 심지어 치료 중인 특정 종류의 종양 세포에조차 유일할 필요는 없다.

정맥내 투여시, 소낭은 종양 미세환경에 급속히 축적된다. 상술한 누출성 종양 맥관구조의 기능으로서 발생하는 상기 축적은 상기 종양 세포로의 소낭-패키징된 치료학적 페이로드의 전달을 수행하고, 이어서 패키징된 소낭을 내면화한다.

발명자들은 상기 전달 접근법을 미니세포의 특이적인 부착 및 세포이물흡수에 통상적으로 무반응성인 세포를 포함하여, 일련의 포유동물 종양 세포에 적용할 수 있음을 발견하였다. 예를 들어, 항-HER2 수용체 또는 항-EGF 수용체에 대한 항체를 포함하는 리간드는 미니세포를 일련의 표적화된 비-식세포, 예를 들어 폐, 난소, 뇌, 유방, 전립선 및 피부암 세포상의 각각의 수용체에 결합시킬 수 있다.

상기와 같이 성취된 결합은 각 유형의 비-식세포에 의한 상기 소낭의 흡수에 선행한다. 즉, 본 발명과 관련하여 적합한 표적 세포는 소낭상의 리간드에 의해 상기 소낭의 세포이물흡수를 유도하는 세포 표면 성분을 제공한다.

보다 구체적으로, 본 발명자들은 (a) 미니세포 또는 죽은 세균 세포상의 리간드와 (b) 포유동물 세포 표면 수용체간의 상호작용이 표적 숙주 세포, 예를 들어 종양 세포의 말기-엔도솜/라이소솜 구획내로의 흡수 경로(여기에서 "수용체-매개된 세포이물흡수"(rME) 경로라 명명한다)를 활성화시킬 수 있음을 발견하였다. 발명자들은 상기 rME 경로에 의해, 세균 유래된 소낭이 초기 엔도솜, 말기 엔도솜 및 라이소솜을 통해 가공되어, 상기 포유동물 숙주 세포의 세포질내로의 그의 페이로드의 방출을 생성시킴을 발견하였다. 더욱이, 핵산인 페이로드는 상기 말기-엔도솜/라이소솜 구획에서 완전한 분해를 모면할 뿐만 아니라 상기 숙주 세포에 의해 발현된다.

상기 전달 접근법을 위한 리간드는 페이로드-운반 소낭 및 표적 세포상의 표면 성분들 각각에 결합하기 때문에 "이중특이성"일 수 있으며, 상기 표적 세포상의 성분과의 상호작용은 상기 소낭을 rME 경로에 흡수되게 한다. 어쨌든, 제공된 표적 세포-표면 성분은, 상기 성분과의 상호작용이 사실상 표적 세포 표면으로부터의 시토솔 내면화를 수반하는 세포이물흡수 경로에 접근하는 경우, 본 발명에 따라 상기 리간드에 의한 결합에 대한 후보일 수 있다. 상기와 같은 후보는, 표면상에 존재하는 세포 유형의 후보 성분을 상기 후보와 결합하고 또한 형광 염료, 또는 예를 들어 시각적으로 공초점 현미경을 통해 검출될 수 있는 다른 마커에 결합하는 리간드를 운반하는 미니세포와 시험관내에서 공-항온처리하는 분석을 통해 본 발명에의 적합성에 대해 쉽게 평가된다. (이러한 종류의 시험관내 분석은 문헌[MacDiarmid et al.(2007)]의 p.436의 도 3의 범례에 개시되어 있다). 따라서, 상기 마커의 관찰된 내면화는 상기 시험된 표적 세포-표면 성분이 본 발명에 적합하다는 상기와 같은 분석에 의해 긍정적 지표를 구성한다.

후보 표적 세포-표면 성분의 예시는 (A) 다른 내재 막 단백질의 경우와 유사한 속도로 구성적 내면화(세포이물흡수)를 겪는 막관통 단백질과인 수용체 티로신 키나제 또는 "RKT"의 구성원이다. 문헌[Goh and Sorkin, Cold Spring Harb . Perspect. Biol . 5: a017459 (2013)]을 참조하시오. 상기 RKT과는 문헌[Lemmon and Schlessinger, Cell 141(7): 1117-134 (2010)]에 개시되어 있다. 하기의 표는 20개의 아과에서 인간 프로테옴 중의 58개 RTK를 모두 나열하며, 이들 중 임의의 하나 이상을 상술한 바와 같이 본 발명에서 적합성에 대해 시험할 수 있다(또한 도 7 참조).

마찬가지로 (B) 폴레이트 및 환원된 폴산 유도체에 결합하고 세포 내부로의 테트라하이드로폴레이트의 전달을 매개하는 막-결합된, 고-친화성 폴레이트 결합 단백질(폴레이트 수용체)의 부류, (C) 동족 사이토카인, 예를 들이 IL13의 내면화에 한 역할을 하는 막-결합된 사이토카인 수용체의 하위 그룹; (D) 몇몇 암세포상에서 발현되고 동족 단클론 항체, 예를 들어 CD20의 경우에 리툭시맵의 내면화를 매개하는 표면 항원, 예를 들어 CD20, CD33, 메소텔린 및 HM1.24; 및 (E) 엔도솜 경로를 통해 수송되고 세포외 기질에의 암세포 부착의 주요 매개체인 부착 수용체(인테그린), 막관통 당단백질과의 구성원들을 예시한다.

본 발명에 따라, 상기 리간드는, 존재할 수 있는 경우, 목적하는 특이성 또는 특이성들을 나타내는 임의의 폴리펩티드 또는 폴리사카라이드일 수 있다. 바람직한 리간드는 항체이다. "항체"란 용어는 그의 현재의 용도에서 면역원 반응의 시험관내 또는 생체내 발생에 의해 획득되는 면역글로불린 분자를 포함한다. 상응하게, 상기 "항체" 범주는 단클론 항체 및 인간화된 항체, 예를 들어 단쇄 항체 단편(scFv), 이중특이성 항체 등을 포함한다. 다수의 상이한 이중특이성 단백질 및 항체-기반 리간드가 문헌[Caravella and Lugovskoy, Curr . Opin . Chem . Biol . 14: 520-28 (2010)](내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)에 입증된 바와 같이 공지되어 있다. 본 명세에 따라 유용한 항체를 공지된 재조합 DNA 기법에 의해 또한 수득할 수 있다.

따라서, 비제한적인 예로서, 표면 성분, 예를 들어 종양 항원에 대한 특이성을 갖는 항체를 사용하여 미니세포를 본 발명에 따라 치료하려는 종양 중의 세포에 표적화할 수 있다. 이에 관하여 예시적인 세포 표면 수용체는 RTK 상피 성장인자 수용체(EGFR), 혈관 내피 성장인자 수용체(VEGFR), 혈소판-유래된 성장인자 수용체(PDGFR) 및 인슐린-유사 성장인자 수용체(IGFR)(이들은 각각 뇌 종양을 포함한 다수의 고형 종양에서 고도로 발현된다), 및 폴레이트 수용체(일부 뇌하수체 선종에서 과발현된다) 중 어느 하나를 포함한다. 상기와 같은 이중특이성 리간드를 돌연변이체 또는 변체 수용체, 예를 들어 IL-13Rα2 수용체[상기 수용체는 인간 다형성 교모세포종 종양의 50% 내지 80%에서 발현되지만(Wykosky et al., Clin Cancer Res . 14: 199-208 (2008), Jarboe et al., Cancer Res . 67: 7983-86 (2007), Debinski et al., J. Neurooncol . 48: 103-11 (2000), 및 Okada et al., J. Bacteriol . 176: 917-22 (1994)), 정상 조직에서 발현되는 그의 생리학적 대응물 IL4R/IL13R과는 상이하다(Hershey, J. Allergy Clin. Immunol. 111: 677-90 (2003)]에 또한 표적화할 수 있다. 따라서, IL13Rα2는 정상 뇌세포에 실질적으로 존재하지 않는다. 문헌[Debinski and Gibo, Mol . Med . 6: 440-49 (2000)]을 참조하시오. 추가로, 뇌로 전이되는 종양은 몇몇 수용체들을 과발현할 수 있는데, 상기 수용체가 또한 적합한 표적일 수 있다. 예를 들어 문헌[Da Silva et al., Breast Cancer Res. 12: R46 (1-13) (2010)]은 유방암의 뇌 전이가 RTK의 HER과의 모든 구성원들을 발현함을 보였다. HER2는 뇌 전이의 20%에서 증폭되고 과발현되었으며, EGFR은 뇌 전이의 21%에서 과발현되었고, HER3은 뇌 전이의 60%에서 과발현되었고, HER4는 뇌 전이의 22%에서 과발현되었다. 흥미롭게도, HER3 발현은 뇌 중에 존재하는 유방암 세포에서 증가되었다.

(H) IFN-감마의 수준을 증가시키는 제제

본 발명의 조성물 및 방법은 환자에서 IFN-감마의 수준(예를 들어 활성 또는 발현 수준)을 증가시키는 제제를 또한 포함할 수 있다.

하나의 실시태양에서, 상기 제제는 IFN-감마 단백질 또는 유사체를 포함한다. IFN-감마의 상업적인 제품, 예를 들어 액티뮨(Actimmune)®을 입수할 수 있거나 또는 입수할 수 있을 것이다. 액티뮨®은 인간 면역계의 자극을 통해 생물학적 반응 변경유전자로서 작용하는 단백질인 인터페론 감마의 유전공학 형태이다. 상기에 나타낸 바와 같이, FDA는 액티뮨®을 만성 육아종병 및 중증의 악성 골화석증에 걸린 소아 및 성인에의 사용에 승인하였다.

IFN-감마 생산은 APC에 의해 분비되는 사이토카인, 가장 현저하게는 인터류킨(IL)-12 및 IL-18에 의해 조절된다. 상기 사이토카인은 감염을, 타고난 면역 반응에서 IFN-감마 생산과 연계시키는 가교로서 작용한다. 다수 병원체의 대식세포 인식은 IL-12 및 케모카인의 분비를 유도한다. 이들 케모카인은 염증 부위로 NK 세포를 유인하고, IL-12는 상기 세포에서 IFN-감마 합성을 촉진한다. 대식세포, NK 및 T 세포에서, IL-12 및 IL-18 자극의 조합은 IFN-감마 생산을 더욱 증가시킨다. 상응하게, 상기 단백질들 및 이들의 조합 중 어느 하나가 본 명세의 목적에 적합한 제제이다.

IFN-감마 생산의 음의 조절제는 IL-4, IL-10, 형질전환 성장 인자-β, 및 글루코코르티코이드를 포함한다. 이들 인자를 억제하는 단백질 또는 핵산은 IFN-감마의 생산을 자극할 수 있을 것이다.

이와 관련하여 INF-감마를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 IFN-감마의 생산 및/또는 분비를 활성화하는 유전자가 또한 사용하기에 적합하다.

IFN-감마의 수준을 증가시키는 제제는 또한 바이러스 백신일 수 있다. 감염 또는 다른 유형의 부작용을 일으키지 않으면서 IFN-감마의 생산을 유도할 수 있는 다수의 바이러스 백신을 입수할 수 있다. 상기 부류의 바이러스-백신제의 예시는 플루(인플루엔자) 백신이다.

상기 데이터는 환자가 약물-로딩된, 이중특이성 항체-표적화된 미니세포 또는 죽은 세균 세포를 수령할 때, 종양 세포에 대한 숙주 면역 반응을 유효하게 활성화시키는데 필요한 IFN-감마의 혈청 농도가 낮음을 보인다. 따라서, 하나의 태양에서 본 발명의 방법은 약 30,000 pg/㎖ 이하의 혈청 IFN-감마 농도의 증가를 생성시킨다. 또 다른 태양에서, 상기 혈청 IFN-감마 농도는 약 5000 pg/㎖, 1000 pg/㎖, 900 pg/㎖, 800 pg/㎖, 700 pg/㎖, 600 pg/㎖, 500 pg/㎖, 400 pg/㎖, 300 pg/㎖, 200 pg/㎖, 또는 100 pg/㎖ 이하로 증가된다. 추가의 태양에서, 상기 생성되는 혈청 IFN-감마 농도는 적어도 약 10 pg/㎖, 또는 적어도 약 20 pg/㎖, 30 pg/㎖, 40 pg/㎖, 50 pg/㎖, 60 pg/㎖, 70 pg/㎖, 80 pg/㎖, 90 pg/㎖, 100 pg/㎖, 150 pg/㎖, 200 pg/㎖, 300 pg/㎖, 400 pg/㎖ 또는 500 pg/㎖이다.

일부 태양에 따라, 상기 제제는 IFN-감마 단백질, 조작된 단백질 또는 유사체이다. 일부 태양에서, 상기 투여는 숙주 혈액 ㎖당 약 0.02 ng 내지 1 마이크로그램의 IFN-감마를 성취한다. 하나의 태양에서, 상기 숙주 혈액 중 성취된 IFN-감마 농도는 약 0.1 ng 내지 약 500 ng/㎖, 또는 약 0.2 ng 내지 약 200 ng/㎖, 또는 약 0.5 ng 내지 약 100 ng/㎖, 또는 약 1 ng 내지 약 50 ng/㎖, 또는 약 2 ng 내지 약 20 ng/㎖이다. 본 명세의 조성물 중 IFN-감마의 치료학적 용량을 상응하게 측정할 수 있다.

(I) 제형 및 투여 경로 및 스케줄

상기 명세의 조성물의 제형을 단위 투여형으로, 예를 들어 보존제의 첨가와 함께 또는 상기 첨가 없이 앰풀 또는 바이알 중에, 또는 다중-용량 용기 중에 제공할 수 있다. 상기 제형은 유성 또는 수성 비히클 중의 용액, 현탁액 또는 유화액일 수 있으며, 제형화제, 예를 들어 현탁제, 안정제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 적합한 용액은 수령자의 혈액과 등장성이며 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액으로 예시된다. 한편으로, 제형은 적합한 비히클, 예를 들어 무균성, 발열원이 없는 수 또는 생리식염수로 재조성되는 동결건조된 분말 형태로 존재할 수 있다. 상기 제형은 또한 데포 제제의 형태로 존재할 수 있다. 상기와 같은 오래 작용하는 제형들을 이식(예를 들어 피하 또는 근육내) 또는 근육내 주사에 의해 투여할 수 있다.

일부 태양에서, 치료 유효량의 항-종양제를 포함하는 미니세포- 또는 죽은 세균 세포-함유 조성물을 제공한다. 항-종양제의 "치료 유효량"은 본 명세에 따라 개체에게 투여시 약물학적 반응을 일으키는 문제의 제제, 예를 들어 siRNA 또는 화학요법 약물의 투여량이다.

일부 태양에서, 치료 유효량의, IFN-감마의 수준을 증가시키는 제제를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 태양에서, 개시된 바와 같은 미니세포 또는 죽은 세균 세포, 및 IFN-감마의 수준을 증가시키는 제제를 모두 포함하는 조성물, 키트, 패키지 또는 제품을 제공한다.

따라서 본 명세와 관련하여, 치료 유효량을 하기에 추가로 개시하는 바와 같이, 치료학적 페이로드를 운반하는 미니세포 또는 죽은 세균 세포 투여시의 동물 모델 또는 인간 개체에서의 종양 또는 종양 증상의 예방 또는 개선을 참고로 측정할 수 있다. 특정 개체에 대해서, 주어진 상황에서 "치료 유효량"을 입증하는 양은, 상기와 같은 투여량이 숙련가에 의해 "치료 유효량"인 것으로 간주됨에도 불구하고, 상기 종양에 대해 유사하게 치료된 100%의 개체에 대해 유효하지 않을 수도 있다. 이에 관하여 적합한 투여량은 또한 예를 들어 종양의 유형, 병기 및 중증도의 함수로서 변할 것이다. 마찬가지로, "치료 유효"가 약학 조성물 중의 미니세포의 수를 언급하기 위해 사용될 때, 상기 수는 상기 미니세포내에 패키징된 항-종양제 및 종양 치료시 상기 제제의 효능을 근거로 확인될 수 있다. 이에 관하여 치료 효과를 임상 또는 병리학적 매개변수, 예를 들어 종양 질량에 의해 측정할 수 있다. 상응하게 종양 질량의 감소 또는 감소된 증가를 사용하여 치료 효과를 측정할 수 있다.

IFN-감마의 수준을 증가시키는 제제에 관하여, "치료 유효량"은 위에서 제공된 바와 같이, 투여시 목적하는 숙주 혈액 농도를 성취하는 상기 제제의 양을 지칭할 수 있다.

상기 명세 내의 제형을 다양한 경로를 통해 포유동물 신체 중 다양한 부위에 투여하여 목적하는 치료 효과(들)를 국소적으로 또는 전신적으로 성취할 수 있다. 특정한 태양에서, 상기 투여 경로는 정맥내 주사이다.

일반적으로, 상기 명세의 제형을 통상적인 시험에 의해 한정된 적합한 투여량으로 사용하여, 임의의 잠재적인 독성은 최소로하면서 최적의 생리학적 효과를 획득할 수 있다. 상기 투여량 요법(regime)을 환자의 연령, 체중, 성별, 의학적 상태; 종양의 중증도 또는 병기, 투여 경로, 및 환자의 신장 및 간기능을 포함한 다양한 인자들에 따라 선택할 수 있다.

최소의 부작용으로 최대의 효능을 제공하는 범위 내의 미니세포, 죽은 세균 세포 및 치료제의 농도를 성취함에 있어서 최적의 정확성은 표적 부위 및 표적 세포에의 제제 이용도의 동역학에 기반한 요법을 요구할 수 있으며 전형적으로는 요구할 것이다. 미니세포 또는 제제의 분배, 평형 및 제거는 치료 요법에 최적인 농도를 측정할 때 고려될 수 있다. 미니세포 및 치료제 각각의 투여량을 목적하는 효과를 성취하기 위해 조절할 수 있다.

더욱이, 상기 제형의 투여량 투여를 약동학적/약역학적 모델링 시스템을 사용하여 최적화할 수 있다. 따라서, 하나 이상의 투여량 요법을 선택하고 약동학적/약역학적 모델을 사용하여 하나 이상의 투여량 요법의 약동학적/약역학적 프로파일을 측정할 수 있다. 특정한 상기와 같은 프로파일을 근거로, 투여를 위한 투여량 요법 중 하나를 목적하는 약동학적/약역학적 반응이 성취되도록 선택할 수 있다. 예를 들어 WO 00/67776을 참조하시오.

항-종양제 및 상기 IFN-감마의 수준을 증가시키는 제제와 패키징된 미니세포 또는 죽은 세균 세포를 복합 제형 중에서 또는 별도의 조성물로서 동시에, 또는 교대로 연속적으로 투여할 수 있다. 연속적으로 투여시, 상기 미니세포 또는 죽은 세균 세포를 IFN-감마 수준을 증가시키는 제제 전에 또는 그 후에 투여할 수 있다. 하나의 태양에서, 상기 미니세포 또는 죽은 세균 세포가 투여에 이어서 최대 혈장 수준 또는 유효 혈장 수준에 도달할 때, 상기 숙주는 최소 수준의 IFN-감마를 성취하거나 유지하고 있다. 상기와 같은 최소 수준은 상기 조성물들 간의 상승작용을 생성시키기에 필요한 수준이다. 이는 상기 미니세포 또는 죽은 세균 세포의 투여 전에 상기 IFN-감마 수준을 증가시키는 제제를 투여함으로써 또는 상기 미니세포 또는 죽은 세균 세포를, 특히 비교적 높은 용량으로 투여한 직후에 상기 제제를 투여함으로써 성취될 수 있다. 상기 두 조성물의 투여가 연속적으로 일어날 수 있음에 유의한다. 상기 태양에서, 상기 투여는 상기 숙주의, 상기 미니세포 또는 죽은 세균 세포 및 IFN-감마를 증가시키는 제제에의 연속적인 노출을 생성시킨다.

상기 명세의 제형 또는 제형들의 조합을 수 주일의 과정에 걸쳐 1주일에 적어도 1회 종양 환자에게 투여할 수 있다. 따라서, 상기 제형을 수 주일 내지 수 개월의 기간에 걸쳐 적어도 1주일에 1회 투여할 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명의 제형을 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31일 동안 적어도 하루에 한 번 투여할 수 있다. 한편으로, 상기 제형을 매일 약 1회 또는 매 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31일 이상 마다 약 1회 투여할 수 있다.

상기 명세의 또 다른 실시태양에서, 제형을 매주 약 1회 또는 매 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20주 이상 마다 약 1회 투여할 수 있다. 한편으로, 상기 제형을 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20주 이상 동안 1주일에 적어도 1회 투여할 수 있다.

한편으로, 상기 제형을 매달 약 1회 또는 매 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개월 이상마다 약 1회 투여할 수 있다.

상기 제형을 1회 1일 용량으로 투여할 수 있다. 한편으로, 총 1일 용량을 하루에 2, 3 또는 4회의 분할 용량으로 투여할 수 있다.

하기의 실시예들은 제한이기보다는 단지 예시적인 것이며, 상기 명세의 보다 완전한 이해를 제공한다.

실시예 1. 인터페론-감마 수준과 상관된 종양 크기 감소

본 실시예는 약물-로딩된 미니세포에 의해 치료받고 있는 개에서 뇌 종양 부피의 감소가 인터페론-감마(IFNγ)의 발현 수준과 상관있음을 설명한다. 따라서 본 실시예는 IFN-감마가 약물-로딩된 미니세포의 효능을 증가시킴을 암시한다. 낮은 량의 IFN-감마가 필요하였기 때문에, 본 실시예는 IFN-감마와 약물 로딩된, 이중특이성 항체-표적화된 미니세포간의 상승작용을 추가로 암시한다.

물질 및 방법

독소루비신 - 패키징된 , 개 EGFR - 표적화된 미니세포의 제조 및 투여

미니세포는 살모넬라 엔테리카 혈청형변이주 티피뮤리움, 살모넬라 티피뮤리움의 minCDE-염색체 결실 돌연변이체로부터 유래되었으며, 정제되었고, 독소루비신(dox)과 패키징되었고, 항-미니세포 표면 O-폴리사카라이드 및 항-개 EGFR 특이성을 포함하는 이중특이성 단클론 항체(MAb)의 부착을 통해 표적화되었다(^EGFR미니세포_DOX로 표시됨).

본 연구에서 개는 호주 시드니 소재의 수의학 전문 센터(VSC) 또는 소동물 전문 병원(SASH)에 환자로서 제공된 애완견이었다. 표준 치료법이 개 소유주에 의해 거부되거나, 또는 의미있는 표준 치료법이 존재하지 않는 진행된 질병의 경우, 환자에게 연구 참여를 제공하였다. 개를 실험동물의 보호 및 사용에 대한 국립 보건의료 연구위원회(호주)에 의해 공표된 지침 및 EnGeneIC 동물 윤리 위원회 승인에 따라 치료하였다. 모든 소유주로부터 사전 동의를 얻었다.

모든 뇌종양을 조직학 또는 적합한 경우 세포학에 의해 진단하였다. 죽기 전 진단은 자기 공명 영상(MRI)상의 특징적인 외관과 임상 징후의 조합에 근거하였다. 조직학적 진단은 상기 뇌종양 사례의 경우 너무 침습적인 것으로 생각되었으며 진단을 부검에 의해 확인하였다.

용량당 1 x 10^{10 EGFR}미니세포_Dox에 의한 치료를 매주 수행하였다. 치료제를 2분 주입에 걸쳐 2 ㎖로 무균 배치된 말초 정맥 카테터(좌측 두부)를 통해 투여하였다.

MRI 종양 영상화

종양 영상을 필립스(Philips) 1.5T 아치바(Achieva) 스캐너를 사용하여 전문 자기공명 영상화로 수행하였다. 상기 프로토콜은 개의 크기에 따라 8-채널 헤드 코일 또는 8-채널 무릎 코일(작은 동물은 무릎 코일을 사용하였다)을 사용하였다.

3개 면에서 획득된 시상 T1, 축상 T2, 관상 구배 에코, 축상 확산 강조영상(DWI) 프리 콘트라스트, 관상 체적 유체-감소된 전도 복구(FLAIR) 및 가돌리듐 후 T1 강조 영상으로부터 서열을 획득하였다.

IFN -감마 효소-결합 면역흡수 분석(ELISA)

혈액을 미니세포 투여 전에 채혈하고 동물병원으로부터 혈청을 직접 수령하였다. IFN-감마 측정을 제조사의 설명에 따라 디벨로프먼트 시스템(Development System)(#DY781B)으로부터 개 IFN-감마 듀오세트(DouSet) ELISA 키트를 사용하여 중복 수행하였다.

결과

상기 미니세포 치료를 받은 3마리의 개에서 종양 부피 변화에 의한 결과를 도 1a 내지 1c에 제공한다. 선 그래프는 미니세포 용량수(x축)의 함수로서 종양 치수(좌측 y축 = 부피(㎣) 또는 최장 직경(㎜))를 나타낸다. 십자표시는 종양이 자기 공명 영상화(MRI)에 의해 가시화되고 측정된 용량을 나타낸다.

상기 치료 중에, 상기 개들 중 2마리는 일정 치료 기간들에서 종양 부피의 극적인 감소를 보였다(도 1a 및 1b에서 개 A 및 B). 뜻밖에도 상기 개들은 상기 기간 중에 바이러스 감염을 앓고 있었다. 바이러스 감염과 관련될 수도 있는 다수의 매개변수들을 검사하던 중에, IFN-감마의 혈청 농도가 종양 부피 감소율과 상관됨을 발견하였다.

도 1a 내지 1c 각각에서, 삼각형 마커는 혈청 인터페론 감마(IFNγ) 수준을 나타내며; 이는 ELISA에 의해 지시된 용량에서 측정되었다. 우측의 y축은 pg/㎖의 IFN-감마 수준을 가리킨다. 분석을 수행했지만 IFN-감마가 상기 분석의 검출 한계 미만(<56 pg/㎖)인 경우, 데이터 점을 0 pg/㎖에서 삼각형 마커에 의해 나타낸다. 종양 길이(l), 너비(w) 및 높이(h) 측정을 수행한 경우, 상기 종양 부피(V)를 타원 방정식

을 사용하여 계산하였다.

따라서 상기 도면들은 혈청 IFN-감마 수준과 뇌 종양 부피 감소율간의 강한 상관성을 설명한다. 또한 놀라운 것은 임의의 검출 가능한 IFN-감마 수준이 증가된 항-종양 반응을 도출했다는 것이다. 지시된 최저 IFN-감마 수준은 개 B에서 용량 41에서 약 500 pg/㎖이었다. 약물-로딩된 미니세포의 종양 치료에 대한 IFN-감마의 상기와 같은 극적인 효과는 이들간의 상승작용에 대한 강한 표시이다.

실시예 2. ^EGFR 미니세포 _Dox 및 IFN -감마에 의한 처리에 따른 마우스 이종이식 편(인간 폐포 선암종)에서의 현저한 종양 퇴화

본 실시예는 IFN-감마와 함께 이중특이성 리간드-표적화되고 독소루비신-패키징된 완전한 미니세포의 복합 치료가 6주된 암컷 무흉선 누드 마우스에서 인간 폐포 선암종 종양 이식편의 퇴화에 영향을 미칠 수 있음을 설명한다.

상술한 바와 같이, 미니세포를 살모넬라 티피뮤리움 minCDE-돌연변이 균주로부터 생성시키고 앞서 문헌[MacDiarmid et al.(2007)]에 개시된 구배 원심분리/섬유화/여과/장독소 제거 과정을 사용하여 정제하였다. 상기 정제된 미니세포를 또한 문헌[MacDiarmid et al.(2007)]에 따라 화학요법 약물 독소루비신과 패키징하였다.

상기 이중특이성 항체(BsAb)는 미니세포상에 존재하는 살모넬라 티피뮤리움 O-폴리사카라이드에 대해서 및 폐포 선암종 세포상에서 과발현된 인간 EGFR에 대해서 각각 결합 특이성을 함유하는 단일 폴리펩티드였다. 상기 O-폴리사카라이드 특이성은 마우스 단클론 항체로부터 유래하였으며, 상기 항체에 대한 가변 영역은 하이브리도마 세포주로부터 단리되었고 단쇄 가변 단편(scFv)으로서 존재하였다. 상기 하이브리도마 세포주는 마우스를 정제된 LPS로 면역시키고 림프구를 종양 세포와 융합시킴으로써 제조되었다. 후속으로, 상기 O-폴리사카라이드와 결합할 수 있는 항체에 대해서 클론을 선별하였다. 또한 sdFv로서 존재하는 EGFR 특이성은 상업적인 항체 에르비툭스(Erbitux)®(브리스톨 마이어스 스큅(Bristol Myers Squibb), 미국 소재)로부터 유래되었다. 상기 두 scFv 성분을 N-말단에 통합된 6x His 태그 및 가요성 링커에 의해 분리시켜 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피에 의한 정제를 촉진하고, C-말단의 c-myc 태그는 추가적인 검출을 도왔다. 상기 scFv 성분들을 연결하는 링커는 예를 들어 문헌[Gall et al., Protein Engineering , Design and Selection 17: 357-66 (2004)]에 입증된 바와 같이 주지되어 있다.

상기 BsAb를 암호화하는 발현 벡터는 높은-수준의 발현을 위해 hCMV 프로모터를, 상기 BsAb의 세포 배양 배지내로의 분비를 위해 단일 펩티드를 함유한다. 상기 BsAb를 암호화하는 발현 벡터를 화학적으로 한정된, 단백질 및 동물 기원없는 배지에서 현탁액 적응된 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에 안정하게 형질감염시키고 상기 단백질을 배양물 중에서 10일에 걸쳐 발현시킨다.

2개의 크로마토그래피 컬럼, 즉 고정화된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 컬럼(IMAC-HisTrap Excel) 및 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 컬럼(BioRad CHT 1)을 사용하여 상기 항체를 정제시켰다. 이러한 접근법은 >98%의 항체 순도를 성취하였다. 생성물의 바이러스 안전성을 위해서, 상기 항체를 TNBP/트윈을 사용하여 용매/세제 불활성화시키고 바이러스 여과시켰다. 항체의 최종 수율은 1L의 세포 배양 상등액으로부터 10 ㎎이었다.

본 실시예에 사용된 마우스는 동물 자원 센터(호주 퍼스 소재)에서 구입하였으며, 모든 동물 실험은 실험 동물 보호 및 사용 지침(제8판, National Academies Press, 2011)에 따라서 동물 윤리 위원회 승인 하에 수행되었다. 상기 실험을 EnGeneIC Ltd(호주 시드니 소재)의 NSW 농무부 인가된 소동물 시설에서 수행하였다.

인간 폐포 선암종 세포(A549, ATCC)를 37 ℃에서 95% 공기 및 5% CO₂의 습한 분위기에서 T-75 플라스크 중의 5% 송아지 혈청 및 글루타민이 보충된 GIBCO®-RPMI 1640 배지[라이프 테크놀로지스(Life Technologies)(미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)의 제품]에서 충분한 세포밀집도로 조직 배양액 중에서 증식시켰다. 이어서 50 ㎕ 성장 인자 감소된 매트리젤®[BD 바이오사이언시즈(미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재) 제품]이 있는 50 ㎕ 무혈청 배지 중의 세포(1 x 10⁶)를 23-게이지 바늘을 사용하여 각 마우스의 견갑골 사이에 피하 주사하였다.

생성 종양을 전자 디지털 캘리퍼스(미츠토요(Mitutoyo)(일본 소재), +/-0.001 인치의 측정 정밀도를 갖는다)를 사용하여 1주일에 2회 측정하고, 평균 종양 부피를 식: 길이(㎜) x 너비(㎟) x 0.5 = 부피(㎣)을 사용하여 계산하였다.

상기 처리를 종양이 ∼285 ㎣의 평균에 도달했을 때 개시하였으며, 마우스를 그룹당 마우스 7마리씩 4개의 상이한 그룹으로 무작위화하였다. 모든 치료제는 총 100 ㎕의 부피로 정맥내(i.v.) 투여하였다. 모든 미니세포 용량은 1 x 10⁹의 각 유형의 미니세포를 함유하였다.

실험 설계에 관하여, 그룹 1(대조군)은 멸균 생리식염수를 수령하지 않았다. 그룹 2(대조군)는 용량당 IFN-감마(0.5 x 10⁴ IU)를 수령하였다. 그룹 3(대조군)은 ^EGFR미니세포_Dox를 수령하였다. 그룹 4(실험)는 용량당 ^EGFR미니세포_Dox 및 IFN-감마(0.5 x 10⁴ IU)를 수령하였다.

결과(도 2)는 ^EGFR미니세포_Dox(그룹 3)로 처리된 마우스가 종양 안정화를 성취함을 밝혀내었다. 대조적으로, ^EGFR미니세포_Dox 및 IFN-감마로 처리된 마우스(그룹 4)는 총 6회 용량 후에 43일까지 매우 현저한 종양 퇴화를 보였다. IFN-감마만으로 처리된 마우스(그룹 2)는 항-종양 효능을 보이지 않았으며, 종양이 염수 처리된 그룹(그룹 1)에서와 같이 성장하였다.

실시예 3. ^EGFR 미니세포 _Dox 및 IFN -감마 처리 후 마우스 이종이식편 (인간 유방암 - 보통 크기의 종양 ∼145 ㎣)에서 현저한 종양 퇴화

본 실시예는 IFN-감마와 함께 이중특이성 리간드-표적화되고 독소루비신-패키징된 완전한 미니세포의 복합 치료가 6주된 암컷 무흉선 누드 마우스에서 인간 유방 종양 이종이식편의 퇴화에 영향을 미칠 수 있음을 설명한다.

상술한 바와 같이, 미니세포를 정제하고, 독소루비신과 함께 패키징하고, 항-O-폴리사카라이드 및 항-EGFR 특이성을 갖는 단쇄 이중특이성 항체를 사용하여 표적화하였다. 추가로, 인간 유방암 세포(MDA-MB-468; ATCC)를 nu/nu 마우스에서 이종이식편으로서 확립시켰으며, 종양 부피를 또한 개시된 바와 같이 측정하였다.

상기 처리를 종양이 ∼145 ㎣의 평균에 도달했을 때 개시하였으며, 마우스를 그룹당 마우스 7마리씩 4개의 상이한 그룹으로 무작위화하였다. 모든 치료제는 총 100 ㎕의 부피로 i.v. 투여하였다. 모든 미니세포 용량은 1 x 10⁹의 각 유형의 미니세포를 함유하였다.

실험을 하기와 같이 설계하였다: 그룹 1(대조군)은 멸균 생리식염수만을 수령하였다. 그룹 2(대조군)는 용량당 IFN-감마(0.5 x 10⁴ IU)를 수령하였다. 그룹 3(대조군)은 ^EGFR미니세포_Dox를 수령하였다. 그룹 4(실험)는 용량당 ^EGFR미니세포_Dox 및 IFN-감마(0.5 x 10⁴ IU)를 수령하였다.

도 3에 도시된 바와 같은 결과는 ^EGFR미니세포_Dox(그룹 3)로 처리된 마우스가 종양 안정화를 성취하였으나, 약 25일까지 상기 종양이, 추정상 독소루비신에 대한 내성의 발생으로 인해 다시 성장하기 시작함을 밝혀내었다. 대조적으로, ^EGFR미니세포_Dox 및 IFN-감마로 처리된 마우스(그룹 4)는 매우 현저한 종양 퇴화를 보였으며, 30일까지 상기 종양은 총 6회 용량 후에 좀 더 흉터 조직같았다. IFN-감마만으로 처리된 마우스(그룹 2)는 항-종양 효능을 보이지 않았으며, 종양이 염수 처리된 그룹(그룹 1)에서와 같이 성장하였다.

실시예 4. ^EGFR 미니세포 _Dox 및 IFN -감마 처리 후 마우스 이종이식편 (인간 유방암 - 큰 종양 ∼250 ㎣)에서 현저한 종양 퇴화

본 실시예는 IFN-감마와 함께 이중특이성 리간드-표적화되고 독소루비신-패키징된 완전한 미니세포의 복합 치료가 6주된 암컷 무흉선 누드 마우스에서 확립된 인간 유방 종양 이종이식편의 큰 크기 종양(∼250 ㎣)에서조차 퇴화에 영향을 미칠 수 있음을 설명한다.

상술한 바와 같이, 미니세포를 정제하고, 독소루비신과 함께 패키징하고, 항-O-폴리사카라이드 및 항-EGFR 특이성을 갖는 단쇄 이중특이성 항체를 사용하여 표적화하였다. 인간 유방암 세포(MDA-MB-468)를 nu/nu 마우스에서 이종이식편으로서 확립시켰으며, 종양 부피를 또한 개시된 바와 같이 측정하였다.

상기 처리를 종양이 ∼250 ㎣의 평균에 도달했을 때 개시하였다. 상기와 같이, 마우스를 그룹당 마우스 7마리씩 4개의 상이한 그룹으로 무작위화하였다. i.v. 투여 및 미니세포 용량도 또한 상기와 같았다.

실험을 하기와 같이 설계하였다: 그룹 1(대조군)은 멸균 생리식염수만을 수령하였다. 그룹 2(대조군)는 용량당 IFN-감마(0.5 x 10⁴ IU)를 수령하였다. 그룹 3(대조군)은 ^EGFR미니세포_Dox를 수령하였다. 그룹 4(실험)는 용량당 ^EGFR미니세포_Dox 및 IFN-감마(0.5 x 10⁴ IU)를 수령하였다.

도 4에 도시된 바와 같은 결과는 ^EGFR미니세포_Dox(그룹 3)로 처리된 마우스가 종양 퇴화를 성취하였으나, 약 23일까지 상기 종양이 다시 성장하기 시작하였음을 밝혀내었으며; 이전과 같이, 독소루비신 내성의 발생이 원인인 듯하였다. 다른 한편으로, ^EGFR미니세포_Dox 및 IFN-감마로 처리된 마우스(그룹 4)는 매우 현저한 종양 퇴화를 보였으며, 총 3개 용량 후에(즉 28일까지) 상기 종양은 좀 더 흉터 조직같았다. IFN-감마만으로 처리된 마우스(그룹 2)는 항-종양 효능을 보이지 않았으며, 종양이 염수 처리된 그룹(그룹 1)에서와 같이 성장하였다.

실시예 5. ^EGFR 미니세포 _Dox 및 IFN -감마 처리 후 마우스 이종이식편(인간 유방 암 - 매우 큰 종양 ∼250 ㎣ 내지 600 ㎣)에서 종양 퇴화

본 실시예는 IFN-감마와 함께 이중특이성 리간드-표적화되고 독소루비신-패키징된 완전한 미니세포의 복합 치료가 6주된 암컷 무흉선 누드 마우스에서 확립된 인간 유방 종양 이종이식편의 매우 큰 크기 종양(∼250 ㎣ 내지 600 ㎣)에서조차 퇴화에 영향을 미칠 수 있음을 설명한다.

상술한 바와 같이, 미니세포를 정제하고, 독소루비신과 함께 패키징하고, 항-O-폴리사카라이드 및 항-EGFR 특이성을 갖는 단쇄 이중특이성 항체를 사용하여 표적화하였다. 또한 개시된 바와 같이, 인간 유방암 세포(MDA-MB-468)를 nu/nu 마우스에서 이종이식편으로서 확립시켰으며, 종양 부피를 측정하였다.

상기 처리를 종양이 ∼250 ㎣ 내지 600 ㎣에 도달했을 때 개시하였다. 개별적인 마우스를 용량당 ^EGFR미니세포_Dox 및 IFN-감마(0.5 x 10⁴ IU)로 처리하였다. 모든 치료제는 총 100 ㎕의 부피로 i.v. 투여하고 모든 미니세포 용량은 1 x 10⁹의 각 유형의 미니세포를 함유하였다.

결과는 도 5에 묘사된다. 상기 종양의 큰 크기에도 불구하고, 4마리의 마우스는 모두 종양 퇴화를 성취하였다. 이는 매우 큰 종양(∼600 ㎣)(이 경우 마우스를 통상적으로 안락사시킬 것이다)조차도 ^EGFR미니세포_Dox 및 IFN-감마(0.5 x 10⁴ IU)의 조합에 의해 유효하게 치료될 수 있음을 보인다.

실시예 6. ^EGFR 미니세포 _Dox 및 2개 용량 수준의 IFN -감마 처리 후 마우스 이종 이식편(인간 폐포 선암종)에서 현저한 종양 퇴화

본 실시예는 2개의 상이한 용량 수준의 IFN-감마와 함께 이중특이성 리간드-표적화되고 독소루비신-패키징된 완전한 미니세포의 복합 치료가 6주된 암컷 무흉선 누드 마우스에서 확립된 인간 폐포 선암종 이종이식편의 퇴화에 영향을 미칠 수 있음을 설명한다.

상술한 바와 같이, 미니세포를 정제하고, 독소루비신과 함께 패키징하고, 항-O-폴리사카라이드 및 항-EGFR 특이성을 갖는 단쇄 이중특이성 항체를 사용하여 표적화하였다. 인간 폐포 선암종(A549) 세포를 nu/nu 마우스에서 이종이식편으로서 확립시켰으며, 종양 부피를 또한 개시된 바와 같이 측정하였다.

상기 처리를 종양이 ∼100 ㎣의 평균에 도달했을 때 개시하였으며, 마우스를 그룹당 마우스 7마리씩 4개의 상이한 그룹으로 무작위화하였다. 모든 치료제는 총 100 ㎕의 부피로 i.v. 투여하였다. 모든 미니세포 용량은 1 x 10⁹의 각 유형의 미니세포를 함유하였다.

그룹 1(대조군)은 멸균 생리 식염수를 수령하지 않았다. 그룹 2(대조군)는 ^EGFR미니세포_Dox(주당 2회)를 수령하였다. 그룹 3(실험)은 용량당 ^EGFR미니세포_Dox 및 IFN-감마(0.75 x 10⁴ IU)를 주당 2회 수령하였다. 그룹 4(실험)는 용량당 ^EGFR미니세포_Dox 및 IFN-감마(0.5 x 10⁴ IU)를 주당 3회 수령하였다.

도 6에 도시된 바와 같이, 2개 용량(0.5 x 10⁴ IU 및 0.75 x 10⁴ IU; 그룹 3 및 4)의 IFN-감마 및 ^EGFR미니세포_Dox로 처리된 마우스가 종양 안정화를 성취하였다. 대조적으로, ^EGFR미니세포_Dox로 처리된 마우스(그룹 2)는 항-종양 효능을 보이지 않았으며, 종양이 염수 처리된 그룹(그룹 1)에서와 같이 성장하였다. 이들 데이터는 IFN-감마와 ^EGFR미니세포_Dox와의 병용이 상기 두 IFN-감마 용량 수준 모두에서, IFN-감마 처리 단독 또는 ^EGFR미니세포_Dox 처리 단독에 일반적으로 내성인 종양의 치료에서 종양 안정화를 성취하는데 필수적이었음을 설명한다.

Claims (16)

1. 개체에서 종양 크기를 감소시키기 위한 약학적 조성물로서,
   (a) 다수의 세균 유래된 완전한 미니세포 또는 완전한 죽은 세균 세포를 포함하는 제1 조성물로서, 이들 세포가 각각 항-종양제(anti-neoplastic agent)를 포함하고 표면상에 이중특이적 항체를 보유하며, 여기서 세균 유래된 완전한 미니세포 및 완전한 죽은 세균 세포 둘 다가 완전한 세포막 또는 세포벽을 갖고, 이중특이적 항체가 종양 세포 표면 수용체에 대해 특이성을 갖고, 상기 항-종양제가 화학요법 약물인, 제1 조성물, 및
   (b) 인터페론-감마(IFN-감마) 또는 개체에서 IFN-감마의 발현을 증가시키는 제제를 포함하는 제2 조성물로서, 상기 IFN-감마의 발현을 증가시키는 제제가 IFN-감마를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 IFN-감마를 암호화하는 핵산인, 제2 조성물을 포함하고,
   상기 제1 조성물 및 제2 조성물이 동시에 또는 연속적으로 투여되는, 약학적 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   제2 조성물이 정제된 IFN-감마 단백질을 포함하는, 약학적 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   제2 조성물이 IFN-감마를 암호화하는 핵산을 포함하는, 약학적 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   제1 조성물이 10⁹ 내지 10¹⁰개의 미니세포 또는 죽은 세균 세포를 포함하는, 약학적 조성물.
5. 제1항에 있어서,
   화학요법 약물이 독소루비신인, 약학적 조성물.
6. 제1항에 있어서,
   화학요법 약물이 900 달톤 미만의 분자량을 갖는 소분자 약물인, 약학적 조성물.
7. 제6항에 있어서,
   소분자 약물이 세포독성인, 약학적 조성물.
8. 제7항에 있어서,
   소분자 약물이 모르폴리닐 안트라사이클린 유도체인, 약학적 조성물.
9. 제8항에 있어서,
   소분자 약물이 PNU-159682인, 약학적 조성물.
10. 개체에서 종양 크기를 감소시키기 위한 키트로서,
    (a) 다수의 세균 유래된 완전한 미니세포 또는 완전한 죽은 세균 세포를 포함하는 제1 조성물로서, 이들 세포가 각각 항-종양제(anti-neoplastic agent)를 포함하고 표면상에 이중특이적 항체를 보유하며, 여기서 세균 유래된 완전한 미니세포 및 완전한 죽은 세균 세포 둘 다가 완전한 세포막 또는 세포벽을 갖고, 이중특이적 항체가 종양 세포 표면 수용체에 대해 특이성을 갖고, 상기 항-종양제가 화학요법 약물인, 제1 조성물, 및
    (b) 인터페론-감마(IFN-감마) 또는 개체에서 IFN-감마의 발현을 증가시키는 제제를 포함하는 제2 조성물로서, 상기 IFN-감마의 발현을 증가시키는 제제가 IFN-감마를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 IFN-감마를 암호화하는 핵산인, 제2 조성물을 포함하고,
    상기 제1 조성물 및 제2 조성물이 동시에 또는 연속적으로 투여되는, 키트.
11. 인간을 제외한 개체에서 종양 크기를 감소시키기 위한 방법으로서,
    (a) 다수의 세균 유래된 완전한 미니세포 또는 완전한 죽은 세균 세포로서, 이들 세포가 각각 항-종양제(anti-neoplastic agent)를 포함하고 표면상에 이중특이적 항체를 보유하며, 여기서 세균 유래된 완전한 미니세포 및 완전한 죽은 세균 세포 둘 다가 완전한 세포막 또는 세포벽을 갖고, 이중특이적 항체가 종양 세포 표면 수용체에 대해 특이성을 갖고, 상기 항-종양제가 화학요법 약물인, 세포, 및
    (b) 인터페론-감마(IFN-감마) 또는 개체에서 IFN-감마의 발현을 증가시키는 제제로서, 상기 IFN-감마의 발현을 증가시키는 제제가 IFN-감마를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 IFN-감마를 암호화하는 핵산인, 제제를 개체에 투여함을 포함하고,
    여기서 상기 (a) 및 (b)가 동시에 또는 연속적으로 투여되는, 방법.
12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 조성물이 다수의 세균 유래된 완전한 미니세포를 포함하는, 약학적 조성물.
13. 제10항에 있어서, 제1 조성물이 다수의 세균 유래된 완전한 미니세포를 포함하는, 키트
14. 제11항에 있어서, (a)의 세포가 다수의 세균 유래된 완전한 미니세포인, 방법.
    
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