EA032740B1 - Способ лечения опухоли у индивидуума и набор для осуществления способа - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к способу лечения опухоли у индивидуума, включающему введение индивидууму первой композиции, содержащей множество полученных из бактерий интактных мини-клеток или интактных убитых бактериальных клеток, каждая из которых содержит противораковое средство и несет лиганд на поверхности, где лиганд обладает специфичностью к рецептору поверхности нефагоцитарных клеток млекопитающего, и второй композиции, содержащей интерферон-гамма (IFN-гамма) или средство, которое увеличивает экспрессию IFN-гамма у индивидуума, а также изобретение относится к набору для осуществления указанного способа.

Description

(57) Изобретение относится к способу лечения опухоли у индивидуума, включающему введение индивидууму первой композиции, содержащей множество полученных из бактерий интактных мини-клеток или интактных убитых бактериальных клеток, каждая из которых содержит противораковое средство и несет лиганд на поверхности, где лиганд обладает специфичностью к рецептору поверхности нефагоцитарных клеток млекопитающего, и второй композиции, содержащей интерферон-гамма (IFN-гамма) или средство, которое увеличивает экспрессию IFNгамма у индивидуума, а также изобретение относится к набору для осуществления указанного способа.

Перекрестная ссылка на связанные заявки

По настоящей заявке испрашивается приоритет на основании предварительной патентной заявки США № 61/887258, поданной 4 октября 2013 г. Содержание заявки включено в настоящий документ в качестве ссылки полностью.

Уровень техники

В настоящее время большинство лекарственных средств вводят системно. Хотя системная доставка цитотоксических противораковых средств играет решающую роль в терапии рака, она также создает серьезные проблемы. Например, системное воздействие на нормальные ткани/органы может вызвать серьезную токсичность. Это отягощено тем фактом, что системно доставленные противораковые химиотерапевтические лекарственные средства следует доставлять в очень высоких дозировках для преодоления слабой биодоступности лекарственных средств и большого объема распределения внутри пациента. Кроме того, системное введение лекарственных средств может быть инвазивным, поскольку оно часто требует применения безопасного катетера в большом кровеносном сосуде. Вследствие того, что системное введение лекарственных средств, как правило, требует использование периферических или центральных вен, оно может вызывать осложнения, такие как флебиты. Экстравазация лекарственного средства также может привести к нарыву/повреждению ткани в локальном месте введения, что, как правило, наблюдают при введении алкалоидов барвинка и антрациклинов.

Другим недостатком противораковой терапии является уклонение опухолевой клетки от иммунного надзора. Взаимодействия между иммунной системой и злокачественными клетками играют важную роль в образовании опухолей. Неспособность иммунной системы определять и отбраковывать трансформированные клетки может привести к развитию рака. Опухоли используют множество механизмов для уклонения от иммунно-опосредованного отторжения.

Многие из этих механизмов в настоящее время известны на клеточном и молекулярном уровнях. Несмотря на это знание иммунотерапия рака является все еще общепринятым лечением в клинике.

Сущность изобретения

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что животное, переносящее терапию с применением противоопухолевых несущих лекарственное средство биспецифических нацеленных на антитело миниклеток, демонстрирует более сильный противоопухолевый ответ на лекарственное средство, когда животное страдает от сопутствующей вирусной инфекции. Дополнительно в ходе исследования было обнаружено, что наблюдаемое повышение терапевтической эффективности противоракового лекарственного средства в этом контексте возникло из синергизма между способностью убивать опухоль вводимыми несущими лекарственное средство биспецифическими антитело-таргетными мини-клетками и активированного иммунного ответа хозяина против опухолевых клеток, который сам по себе происходит вследствие повышенной экспрессии интерферона-гамма (IFN-гамма или IFNy), которую запускает вирусная инфекция.

Сам IFN-гамма исследовали на предмет потенциального противоопухолевого применения как в монотерапии, так и в комбинации с другими противоопухолевыми средствами. Однако такие исследования не увенчались успехом. Например, не удалось продемонстрировать улучшение при комбинированном лечении IFN-альфа и IFN-гамма по сравнению с лечением IFN-альфа в отдельности (см., например, Kloke et al., Eur. J. Haematol. 48: 93-8 (1992) и Wandl et al., Semin. Oncol. 19: 88-94 (1992)). Единственными показаниями применения IFN-гамма, одобренными Управлением США по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA), является лечение хронического гранулематоза (CGD) и тяжелого злокачественного остеопороза (заболевание костей).

Таким образом, в одном из его аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения опухоли у индивидуума. Этот способ влечет за собой введение индивидууму (А) первой композиции, содержащей множество полученных из бактерий интактных мини-клеток и/или убитых бактериальных клеток, каждая из этих мини-клеток и убитых клеток заключает в себе противоопухолевое средство и нацелена на рецептор клеточной поверхности посредством лиганда, прикрепленного к поверхности мини-клетки, и (В) вторую композицию, содержащую IFN-гамма или средство, которое увеличивает экспрессию или активность IFN-гамма у индивидуума.

В некоторых аспектах вторая композиция содержит белок IFN-гамма, конкретно фармацевтически подходящий очищенный белок IFN-гамма. В некоторых аспектах вторая композиция содержит вирусную вакцину. В некоторых аспектах вторая композиция содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую IFNгамма.

В некоторых аспектах первая композиция содержит приблизительно от 10⁹ до приблизительно 10¹⁰ мини-клеток или убитых бактериальных клеток.

В некоторых аспектах противоопухолевое средство является радионуклидом. В некоторых аспектах противоопухолевое средство является лекарственной химиотерапией. В некоторых аспектах противоопухолевое средство является функциональной нуклеиновой кислотой или полинуклеотидом, кодирующим функциональную нуклеиновую кислоту. В некоторых аспектах функциональная нуклеиновая кислота ингибирует ген, который промотирует опухолевую клеточную пролиферацию, ангиогенез или устойчивость к химиотерапии и/или который ингибирует апоптоз или арест клеточного цикла. В некото

- 1 032740 рых аспектах функциональная нуклеиновая кислота выбрана из siRNA, miRNA, кшРНК, lincRNA, антисмысловой RNA или рибозима.

Кроме того, изобретение относится к наборам, содержащим первую композицию, содержащую множество полученных из бактерий интактных мини-клеток или интактных убитых бактериальных клеток, каждая из которых заключает в себе противоопухолевое средство и несет лиганд на поверхности, где лиганд обладает специфичностью к нефагоцитарному поверхностному рецептору клетки млекопитающего, и вторую композицию, содержащую интерферон-гамма (IFN-гамма) или средство, которое увеличивает экспрессию IFN-гамма у индивидуума.

В другом варианте осуществления изобретение относится к композиции, содержащей (а) множество полученных из бактерий интактных мини-клеток или интактных убитых бактериальных клеток, каждая из которых заключает в себе противоопухолевое средство и несет лиганд на поверхности, где лиганд обладает специфичностью к нефагоцитарному поверхностному рецептору клетки млекопитающего, и (b) IFN-гамма или средство, которое повышает экспрессию IFN-гамма у индивидуума.

Другие объекты, признаки и преимущества являются очевидными из следующего описания. Подробное описание и специфические примеры даны только для иллюстрации, поскольку различные изменения и модификации в рамках духа и объема конкретных вариантов осуществления являются очевидными из описания.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1А-1С представлены графики объемов опухолей (ось у слева) и концентрации IFN-гамма в сыворотке (ось у справа), измеренные в различные моменты времени (ось х показана в виде числа доз), для трех собак А, В и С соответственно. Эти графики демонстрируют, что ответ опухоли на лекарственное средство был гораздо больше, когда концентрации IFN-гамма в сыворотке были повышены.

На фиг. 2 проиллюстрированы эффекты комбинированного лечения посредством IFN-гамма и биспецифических нацеленных на лиганд и несущих доксорубицин интактных мини-клеток, на опухолевые ксенотрансплантаты альвеолярной аденокарциномы человека, установленные у 6-недельных самок бестимусных голых мышей с размером опухоли приблизительно 285 мм³. Группа мышей 1 получала физиологический раствор, группа мышей 2 получала только IFN-гамма, группа мышей 3 получала ^EGFR миниклетки Dox и группа мышей 4 получала ^EGFR мини-клетки Dox и IFN-гамма. В данном примере и в следующих примерах треугольники ниже оси х указывают на время дозирования.

На фиг. 3 изображены эффекты комбинированного лечения посредством IFN-гамма и биспецифических нацеленных на лиганды и несущих доксорубицин интактных мини-клеток на ксенотрансплантаты рака молочной железы человека, установленные у 6-недельных самок бестимусных голых мышей с опухолью умеренного размера, приблизительно 145 мм³. Группа мышей 1 получала физиологический раствор, группа мышей 2 получала только IFN-гамма, группа мышей 3 получала ^EGFR мини-клетки Dox, и группа мышей 4 получала ^EGFR мини-клетки Dox и IFN-гамма.

На фиг. 4 проиллюстрированы эффекты комбинированного лечения посредством IFN-гамма и биспецифических нацеленных на лиганд и несущих доксорубицин интактных мини-клеток, на ксенотрансплантаты рака молочной железы человека, установленные у 6-недельных самок бестимусных голых мышей с опухолью большого размера, приблизительно 250 мм³. Группа мышей 1 получала физиологический раствор, группа мышей 2 получала только IFN-гамма, группа мышей 3 получала ^EGFR миниклетки Dox, и группа мышей 4 получала ^EGFR мини-клетки Dox и IFN-гамма.

На фиг. 5 изображены эффекты комбинированного лечения с применением IFN-гамма и биспецифических нацеленных на лиганды и несущих доксорубицин интактных мини-клеток, на ксенотрансплантаты рака молочной железы человека, установленные у 6-недельных самок бестимусных голых мышей с опухолью очень большого размера, приблизительно от 265 до приблизительно 600 мм³. Все четыре мыши получали ^EGFR мини-клетки _Dox и IFN-гамма.

На фиг. 6 изображены эффекты комбинированного лечения с применением IFN-гамма (две различные дозы) и биспецифических нацеленных на лиганды и несущих доксорубицин интактных мини-клеток, на ксенотрансплантаты альвеолярной аденокарциномы человека, установленные у 6-недельных самок бестимусных голых мышей с размером опухоли приблизительно 100 мм³. Группа мышей 1 получала физиологический раствор, группа мышей 2 получала ^EGFR мини-клетки Dox, группа мышей 3 получала ^EGFR мини-клетки Dox и 0,75х 10⁴ IU IFN-гамма два раза в неделю, и группа мышей 4 получала ^EGFR миниклетки _Dox и 0,5х 10⁴ IU IFN-гамма три раза в неделю.

На фиг. 7 проиллюстрировано 20 подсемейств и 58 членов семейства рецептора тирозинкиназы (выбранных из Lemmon and Schlessinger, Cell 141: 1117-134 (2010)).

Подробное описание

Как указано выше, авторами изобретения было определено, что введение противораковых несущих лекарственное средство, биспецифических нацеленных на антитело мини-клеток пациенту с опухолью в ситуации, в которой пациента подвергают воздействию повышенного уровня INF-гамма, вызывает противоопухолевый ответ, который значительно улучшен по сравнению с ответом, который наблюдают, когда IFN-гамма не активирован, например когда его уровень находится ниже пределов детекции. Этот

- 2 032740 синергизм между противоопухолевой активностью, опосредованной мини-клетками, и повышенным IFN-гамма является очевидным из-за величины повышенного противоопухолевого ответа. Не прибегая к каким-то конкретным механизмам, авторы наблюдали, что описанный в настоящем документе подход применяет критические пути иммунной стимуляции, которые в совокупности важны при противоопухолевом ответе хозяина. Полученные из бактерий мини-клетки и IFN-гамма устанавливают различные пути иммунной стимуляции, которые в совокупности являются важными при усилении противоопухолевого ответа, который противораковое лекарственное средство вызывает при внутриклеточной доставке к опухолевым клеткам посредством биспецифических нацеленных на антитело мини-клеток в соответствиии с настоящим изобретением.

Кроме того, авторами обнаружено, что кровеносные сосуды вокруг опухолевых клеток демонстрируют потерю структурной целостности; то есть сосуды обладают большой фенестрацией и являются негерметичными даже в условиях гематоэнцефалического барьера (ВВВ). В противоречии с общепринятым пониманием, таким образом, частицы, которые являются такими же большими как мини-клетки, т.е. гораздо больше, чем ранее обсуждаемые консенсусные ограничения размера пор ВВВ, тем не менее они являются меньшими, чем фенестрации в стенках негерметичных кровеносных сосудов; таким образом, они могут проникать из сосуда в ткани пассивно в микросреду опухоли.

При попадании в микросреду опухоли мини-клетки способны запускать опосредованную рецепторами интернализацию посредством опухолевых клеток хозяина и быть поглощенными ими. Таким образом, мини-клетка, которая нагружена противораковым средством, высвобождает это средство в цитоплазму опухолевой клетки, убивая ее.

Хотя IFN-гамма был предложен для применения в противораковой терапии, в настоящее время его клиническое применение ограничено в немалой степени из-за его высокой токсичности. Способность IFN-гамма стимулировать иммунный ответ на опухолевые клетки также не продемонстрировала большого успеха. В контексте настоящего изобретения, таким образом, роль IFN-гамма является не только перспективной, но и поистине удивительной.

В одном из этих аспектов, таким образом, настоящее изобретение относится к лечению опухоли, которое влечет за собой введение пациенту с опухолью композиции, состоящей из множества интактных полученных из бактерий мини-клеток, несущих противораковое средство, в то же время, кроме того, вводя пациенту средство, которое увеличивает его или ее уровень IFN-гамма. По другому аспекту убитые бактериальные клетки можно использовать с или вместо мини-клеток, так как такие мини-клетки аналогичным образом могут быть нагружены противораковым лекарственным средством для высвобождения при их захвате в таргетные опухолевые клетки (см., например, опубликованную международную заявку WO 2008/012695, содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки).

Введение композиции, содержащей несущую лекарственное средство мини-клетки и/или убитой бактериальной клетки, предпочтительно является системным, например внутривенным или внутриартериальным. Дополнительно IFN-гамма или средство, индуцирующее экспрессию IFN-гамма, можно вводить путем, который является отличным, т.е. подкожным или внутримышечным, но не обязательно. Терапевтическое средство на основе мини-клеток и/или убитых бактериальных клеток можно вводить одновременно с IFN-гамма и в различное время.

(А) Определения.

Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в данном описании, имеют то же самое значение, что и понимают специалисты в данной области.

Для удобства значения определенных терминов и фраз, применяемых в этом описании, примерах и приложенной формуле изобретения, представлены ниже. Другие термины и фразы определены на всем протяжении описания.

Формы единственного числа a, an и the включают отсылку к множеству, если из контекста явно не следует иного.

Рак, новообразование, опухоль, злокачественное образование и карцинома, применяемые взаимозаменяемо в настоящем документе, относятся к клеткам или тканям, которые демонстрируют фенотип аберрантного роста, характеризующийся значительной потерей контроля над клеточной пролиферацией. Способы и композиции данного изобретения конкретно относятся к злокачественным, преметастатическим, метастатическим и неметастатическим клеткам.

Лекарственное средство относится к любому физиологически или фармакологически активному веществу, которое производит местный или системный эффект на животных, конкретно млекопитающих и людей.

Индивидуум, субъект, хозяин и пациент термины, используемые взаимозаменяемо в этом описании, относятся к любому млекопитающему индивидууму, для которого желательны диагноз, лечение или терапия. Индивидуум, субъект, хозяин или пациент могут быть человеком или животным, не являющимся человеком. Таким образом, подходящие индивидуумы могут в качестве неограничивающих примеров включать не являющихся человеком приматов, крупный рогатый скот, лошадей, собак, кошек, морских свинок, кроликов, крыс и мышей.

Термины лечение, терапия, лечить, и т.п. относятся к получению желаемого фармакологиче

- 3 032740 ского и/или физиологического эффекта у пациента с опухолью. Эффект может быть профилактическим в отношении полностью или частично предотвращенной опухоли или ее симптома и/или может быть терапевтическим в отношении частичной или полной стабилизации или лечения опухоли и/или неблагоприятного воздействия, свойственного опухоли. Лечение охватывает любое лечение опухоли у млекопитающего, конкретно человека. Желаемым эффектом, конкретно, является опухолевый ответ, который можно измерить в качестве уменьшения опухолевой массы или ингибирования увеличения опухолевой массы. В дополнение к опухолевому ответу увеличение общего выживания, выживание без прогрессирования или время до рецидива опухоли или уменьшение неблагоприятного воздействия также можно использовать клинически как желаемый эффект лечения.

(B) Виды терапии.

Настоящее изобретение находит свое отражение и обосновано экспериментальными данными, которые заключаются в том, что в соответствии с открытием авторов изобретения, полученные из бактерий и интактные мини-клетки или интактные убитые бактериальные клетки при введении пациенту с опухолью вместе со средством, которое увеличивает уровень IFN-гамма, можно достичь терапевтической эффективности, которая является поразительно выше, чем при введении мини-клеток или убитых бактериальных клеток в отдельности.

(C) Противораковые средства.

Фраза противораковое средство означает лекарственное средство, или химическое, или биологическое, которое предотвращает или ингибирует рост, развитие, созревание или распространение опухолевых клеток.

В контексте данного изобретения выбор противоракового средства для лечения данного пациента с опухолью зависит от нескольких факторов в соответствии с общепринятой медицинской практикой. Эти факторы включают в качестве неограничивающих примеров возраст пациента, стадию опухоли и то, получал ли пациент какую-либо предварительную терапию.

В соответствии с изобретением лекарственное средство можно выбирать из одного из классов, подробно описанных ниже, для загрузки в интактные полученные из бактерий мини-клетки, когда их вводят для лечения опухоли. Эти лекарственные средства также могут быть синтетическими аналогами, полученными в результате драг-дизайна и усилий исследователей.

Полифункциональные алкилирующие средства, примерами которых являются циклофосфамид (цитоксан), мехлоретамин, мелфалан (алкеран), хлорамбуцил (лейкеран), тиопета (тиоплекс), бусульфан (милеран).

Алкилирующие средства, примерами которых являются прокарбазин (матулэйн), дакарбазин (DTIC), алтретамин (гексален), хлорамбуцил, цисплатин (платинол), карбоплатин, ифосфамид, оксалиплатин.

Антиметаболиты, примерами которых являются метотрексат (МТХ), 6-тиопурины (меркаптопурин [6-МР], тиогуанин [6-TG]), меркаптопурин (пуринтол), тиогуанин, флударабин фосфат, кладрибин (лейстатин), пентостатин, фторурацил (5-FU), цитарабин (ara-C), азацитидин.

Растительные алкалоиды, терпеноиды и ингибиторы топоизомеразы, примерами которых являются винбластин (велбан), винкристин (онковин), виндезин, винорелбин, подофиллотоксины (этопозид {VP16} и тенипозид {VM-26}), камптотецины (топотекан и иринотекан), таксаны, такие как паклитаксел (таксол) и доцетаксел (таксотер).

Антибиотики, примерами которых являются доксорубицин (адриамицин, рубекс, доксил), даунорубицин, дуокармицин, идарубицин, дактиномицин (космеген), пликамицин (митрамицин), митомицин: (мутамицин), блеомицин (бленоксан).

Г ормональные средства, примерами которых являются ингибиторы эстрогена и андрогенов (тамоксифен и флутамид), агонисты гонадотропин-высвобождающего гормона (лейпролид и гозерелин (золадекс)), ингибиторы ароматазы (аминоглутетимид и анастрозол (аримидекс)).

Различные противораковые лекарственные средства, примерами которых являются амсакрин, аспарагиназа (El-spar), гидроксимочевина, митоксантрон (новантрон), митотан (лизодрен), майтанзиноид, производные ретиноевой кислоты, факторы роста костного мозга (сарграмостим и филграстим), амифостин.

Средства, разрушающие метаболизм фолата, например пеметрексед.

Г ипометилирующие ДНК препараты, например азацитидин, децитабин.

Ингибиторы поли(аденозиндифосфат [АЦФ]-рибоза) полимеразного (PARP) пути, такие как инипариб, олапариб, велипариб.

Ингибиторы PI3K/Akt/mTOR пути, например эверолимус.

Ингибиторы деацетилазы гистонов (HDAC), например вориностат, энтиностат (SNDX-275), моцетиностат (MGCD0103), панобиностат (LBH589), ромидепсин, вальпроевая кислота.

Ингибиторы циклинзависимой киназы (CDK), например флавопиридол, оломуцин, росковитин, кенпаулон, AG-024322 (Pfizer), фаскаплисин, риувидин, пурваланол A, NU2058, BML-259, SU 9516, PD0332991, P276-00.

Ингибиторы белка теплового шока (HSP90), например гелданамицин, танеспимицин, алвеспими

- 4 032740 цин, радицикол, дегуелин, BIIB021.

Ингибиторы Murine double minute 2 (MDM2) inhibitors, например цис-имидазолин, бензодиазепиндион, спирооксиндолы, изоксинолинон, тиофен, 5-деазафлавин, триптамин.

Ингибиторы киназы анаплатической лимфомы (ALK), например аминопиридин, диаминопиримидин, пиридоизоксинолин, пирролопиразол, индолокарбазол, пирролопиримидин, дианилинопиримидин.

Ингибиторы поли [АДФрибоза] полимеразы (PARP), примерами которых являются бензамид, фталазинон, трициклический индол, бензимидазол, индазол, пирролокарбазол, фталазинон, изоиндолинон.

Активные средства, применяемые в настоящем изобретении, не ограничены лекарственными классами или конкретными средствами, перечисленными выше. Различные платформы по разработке лекарственных средств продолжают получать новые средства, которые направлены на уникальные молекулярные отличительные свойства злокачественных клеток; действительно, тысячи таких химических и биологических лекарственных средств, и только некоторые из них перечислены в настоящем документе. Однако удивительная способность интактных полученных из бактерий мини-клеток и убитых бактериальных клеток вмещать загрузку большого разнообразия активных средств, гидрофильных или гидрофобных, означает, что, по существу, любое такое лекарственное средство при загрузке в мини-клетки обладает потенциалом лечить рак в соответствии с открытиями настоящего изобретения.

Таким же образом примерами класса противораковых средств являются радионуклиды, химиотерапевтические лекарственные средства и функциональные нуклеиновые кислоты, включая в качестве неограничивающих примеров регуляторные RNAs.

1. Радионуклиды.

Радионуклидом является атом с нестабильным ядром, т.е. атом, характеризующийся избыточной энергией, доступной для передачи только вновь созданной радиочастице внутри ядра или атомного электрона. Таким образом, радионуклид проходит радиоактивный распад и излучает гамма луч(и) и/или субатомные частицы. Многочисленные радионуклиды известны в данной области, и известно, что ряд таких частиц является пригодным для медицинского применения, таких как иттрий-90, технеций-99m, иод-123, иод-124, иод-125, иод-131, рубидий-82, таллий-201, галлий-67, фтор-18, ксенон-133 и индий-111.

Радионуклиды нашли широкое применение в ядерной медицине, конкретно в качестве излучателей бета-лучей для разрушения опухолевых клеток. Таким образом, радионуклиды применяют в качестве противораковых средств в настоящем изобретении.

Радионуклиды можно связывать с интактными полученными из бактерий мини-клетками посредством любой известной методики. Таким образом, белок или другой поверхностный фрагмент молекулы мини-клетки (смотри ниже) может быть помечен посредством радионуклида с применением коммерчески доступных средств мечения, таких как применение реактива иодирования Пирса, продукт Pierce Biotechnology Inc. (Rockford, IL), подробно описанный в Rice et al., Semin. Nucl. Med. 41, 265-282 (2011). Альтернативно, радионуклиды могут быть включены в белки, которые находятся внутри мини-клеток.

В последнем случае бактериальный штамм, продуцирующий мини-клетки, трансформируют посредством DNA плазмиды, кодирующей чужеродный белок. Когда мини-клетки образуются во время ассиметричного клеточного деления, несколько копий плазмидной DNA обособляются в цитоплазме мини-клеток. Полученные рекомбинантные мини-клетки инкубируют в присутствии радиомеченых аминокислот в таких условиях, что чужеродный белок, который экспрессируется внутри мини-клетки из DNA плазмиды, включает радионуклиднесущие аминокислоты. Согласно протоколу Clark-Curtiss и Curtiss, Methods Enzymol. 101: 347-362 (1983), например, рекомбинантные мини-клетки инкубируют в минимальной среде для выращивания, которая содержит Ч-метионин, в то время как заново экспрессируемые плазмидкодирующие белки встраивают Х-метионин. Сходный подход можно использовать для того, чтобы рекомбинантные мини-клетки стали нагружены другими радиометками по желанию.

Олигосахариды на поверхности мини-клеток также могут быть помечены радиометками с применением, например, общепринятых протоколов, описанных Fukuda, Curr. Protocols Molec. Biol. (Suppl. 26), 17.5.1-17.5.8 (1994). Примером таких олигосахаридов, которые являются эндемичными для мини-клеток, является компонент О-полисахарид липополисахарида (LPS), находящийся на поверхности мини-клеток, полученных от грамотрицательных бактерий (смотри ниже).

Предпочтительной методологией в этом отношении является пометить радиометкой биспецифическое антитело, которое применяют для нацеливания на мини-клетки специфических опухолей (см. раздел G, infra и патентную публикацию US 2007/0237744, содержание которой включено в настоящий документ в качестве ссылки). То есть биспецифическое антитело, покрывающее мини-клетку подвергают воздействию значительное количество дополнительного поверхностного белка для радиомечения. Таким образом, возможно достичь более высокой специфической активности радиометки, связанной с покрытой антителами мини-клеткой. В отличие от этого радиомечение непокрытых мини-клеток, т.е. когда только эндемические фрагменты молекул радионуклидных меток могут привести к более слабому мечению (более низкая специфическая активность). В одном из вариантов осуществления предполагают, что это более слабое мечение происходит из-за того, что белки, связанные с наружной мембраной миниклеток, полученных из грамотрицательных бактерий, замаскированы посредством LPS, который, как дополнительно описано далее, содержит длинные цепочки О-полисахарида, покрывающие поверхность

- 5 032740 мини-клеток.

Для лечения опухоли композиция по изобретению будет доставляться в дозировке или в множестве доз, которые in toto допускают уровень внутриопухолевого излучения, которое является достаточным для, по меньшей мере, уменьшения массы опухоли, если не элиминирует эту опухоль совсем. Прогресс лечения можно контролировать в этом направлении в каждом конкретном случае. В общих чертах, однако, количество радиоактивности, заключенной в композиции, как правило, составляет порядка приблизительно от 30 до 50 Gy, хотя изобретение также предусматривает более высокое количество радиоактивности, положим, приблизительно от 50 до 200 Gy, что составляет общий диапазон от приблизительно 30 Gy до приблизительно 200 Gy.

В некоторых случаях количество радиоактивности, заключенное в композиции, может быть даже ниже упомянутого выше, придавая более высокую эффективность и специфическую доставку радионуклидов в составе мини-клеток в опухоль. Таким образом, в одном из аспектов композиция содержит приблизительно от 20 до 40 Gy, или приблизительно от 10 до 30 Gy, или приблизительно от 1 до приблизительно 20 Gy, или менее чем 10 Gy.

2. Химиотерапевтические лекарственные средства.

Противораковое средство, применяемое в настоящем изобретении, также является химиотерапевтическим средством. В этом описании химиотерапевтическое лекарственное средство, химиотерапевтическое средство и химиотерапия применяются взаимозаменяемо для обозначения лекарственного средства, которое обладает способностью убивать или разрушать раковую клетку. Химиотерапевтическое средство может быть низкомолекулярным средством или биологическим средством, как дополнительно подробно описано ниже.

Подкатегория низкомолекулярное лекарственное средство заключает в себе соединения, характеризующиеся обладанием (i) эффекта на биологический процесс и (ii) низкомолекулярной массой по сравнению с белком или полимерной макромолекулой. Низкомолекулярные лекарственные средства, как правило, составляют от приблизительно 800 Да или меньше, с более низким пределом приблизительно 150 Да, как, например, темодар® (темозоламид), приблизительно 194 Да, который применяют для лечения мультиформной глиобластомы и других типов рака мозга. В данном контексте приблизительно означает, что подходящая величина молекулярной массы относится к вариантам при точности измерения и к экспериментальной ошибке порядка нескольких дальтон или десятков дальтон. Таким образом, низкомолекулярное лекарственное средство может обладать молекулярной массой приблизительно 900 Да или менее, приблизительно 800 или менее, приблизительно 700 или менее, приблизительно 600 или менее, приблизительно 500 или менее, или приблизительно 400 Да или менее, например в диапазоне от приблизительно 150 до приблизительно 400 Да. Более конкретно, низкомолекулярное лекарственное средство может иметь молекулярную массу приблизительно 400 Да или более, приблизительно 450 Да или более, приблизительно 500 Да или более, приблизительно 550 Да или более, приблизительно 600 Да или более, приблизительно 650 Да или более, приблизительно 700 Да или более, или приблизительно 750 Да или более. В другом варианте осуществления низкомолекулярное лекарственное средство, заключенное в мини-клетки, обладает молекулярной массой приблизительно от 400 до приблизительно 900 Да, приблизительно от 450 до приблизительно 900 Да, приблизительно от 450 до приблизительно 850 Да, приблизительно от 450 до приблизительно 800 Да, приблизительно от 500 до приблизительно 800 Да или приблизительно от 550 до приблизительно 750 Да.

Конкретно, подходящие низкомолекулярные лекарственные средства в качестве неограничивающих примеров включают азотистые иприты, нитрозомочевины, этиленимин, алкансульфонаты, тетразин, соединения платины, аналоги пиримидина, аналоги пурина, антиметаболиты, аналоги фолата, антрациклины, таксаны, алкалоиды барвинка и ингибиторы топоизомеразы, inter alia. Таким образом, низкомолекулярное лекарственное средство для применения в настоящем изобретении можно выбирать из любого из следующих, inter alia: ендиины, такие как динемицин А, юникаламицин, калихимицин γ1 и калихимицин Θ1; меямицин, синтетический аналог FR 901464; производные бензосуберена, как описано, например, Tanpure et al., Bioorg. Med. Chem. 21: 8019-32 (2013); ауристатины, такие как ауристатин Е, монометил ауристатина Е (ММАЕ) и ауристатин F, которые являются синтетическими аналогами доластатина; дуокармицины, такие как дуокармицин SA и СС-1065; майтансин и его производные (майтанзиноиды), такие как DM1 и DM4; иринотекан (Камптосар®) и другие ингибиторы топоизомеразы, такие как топотекан, этопозид, митоксантрон и тенипозид; и ятакемицин, синтез которых подробно описан Okano et al., J. Am. Chem. Soc. 128: 7136-37 (2006).

Более конкретно, любое одно или несколько или все из специфических низкомолекулярных лекарственных средств, подробно описанные в данном параграфе, являются примерами средств, пригодных для использования в настоящем изобретении: актиномицин-D, алкеран, ара-С, анастрозол, BiCNU, бикалутамид, бизантрен, блеомицин, бусульфан, капецитабин (Кселода®), карбоплатин, карбоплатинит, кармустин, CCNU, хлорамбуцил, цисплатин, кладрибин, СРТ-11, циклофосфамид, цитарабин, цитозинарабинозид, цитоксан, дакарбазин, дактиномицин, даунорубицин, дексразоксан, доцетаксел, доксорубицин, DTIC, эпирубицин, этиленимин, этопозид, флоксуридин, флударабин, фторурацил, флутамид, фотему

- 6 032740 стин, гемцитабин, гексаметиламин, гидроксимочевина, идарубицин, ифосфамид, иринотекан, ломустин, мехлоретамин, мелфалан, меркаптопурин, метотрексат, митомицин, митотан, митоксантрон, оксалиплатин, паклитаксел, памидронат, пентостатин, пликамицин, прокарбазин, стрептозоцин, STI-571, тамоксифен, темозоломид, тенипозид, тетразин, тиогуанин, тиотепа, томудекс, топотекан, треосульфан, триметрексат, винбластин, винкристин, виндезин, винорелбин и VP-16.

Для целей этого описания биологическое средство определяют в отличие от этого, чтобы обозначить любую биологически активную макромолекулу, которая может быть создана посредством биологического процесса, за исключением функциональные нуклеиновые кислоты, описанные ниже, и полипептиды, которые по размеру квалифицируют как низкомолекулярные лекарственные средства, как определено выше. Подкатегория биологическое средство, таким образом, является исключением и не совпадает с низкомолекулярным лекарственным средством и подкатегориями функциональных нуклеиновых кислот. Примерами биологических средств являются терапевтические белки и антитела, как натуральные, так и рекомбинантные, и полученные синтетическим путем, например с применением способов медицинской химии и драг-дизайна.

Некоторые молекулы, которые разработаны для химиотерапевтических целей тем не менее не являются успешными во время преклинических или клинических испытаний из-за неприемлемой токсичности или других проблем безопасности. Авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что загрузка химиотерапевтическим лекарственным средством мини-клетки, за которым следует системная доставка пациенту с опухолью, приводит к доставке лекарственного средства к опухолевым клеткам. Дополнительно, даже после того, как опухолевые клетки разрушены и содержащая лекарственное средство цитоплазма высвобождена в близлежащую нормальную ткань, результатом не является токсичность по отношению к нормальной ткани. Это происходит из-за того, что лекарственное средство уже связано с опухолевыми клеточными структурами, такими как DNA, и не может далее атаковать нормальные клетки. Таким образом, настоящее изобретение является особенно пригодным для доставки высокотоксичных химиотерапевтических лекарственных средств пациенту с опухолью.

Фразы высокотоксичное химиотерапевтическое лекарственное средство и сверхтоксичное химиотерапевтическое лекарственное средство в данном описании относится к химиотерапевтическим лекарственным средствам, которые обладают относительно низкой летальной дозой для нормальных клеток по сравнению с их эффективной дозой для злокачественных клеток. Таким образом, в одном из аспектов высокотоксичное химиотерапевтическое лекарственное средство обладает средней летальной дозой (LD₅₀), которая является ниже, чем ее средняя эффективная доза (ED₅₀) для нацеливания на рак, такой как (1) тип рака, для которого разработано данное лекарственное средство, (2) первый тип рака, при котором преклиническое или клиническое испытание проводят для этого лекарственного средства, или (3) тип рака, при котором лекарственное средство демонстрирует наивысшую эффективность среди всех протестированных типов рака. Например, высокотоксичное химиотерапевтическое лекарственное средство может обладать LD₅₀, которая является ниже чем приблизительно 500, 400, 300, 250, 200, 150, 120 или 100% ED₅₀ лекарственного средства для нацеливания на рак. В другом аспекте высокотоксичное химиотерапевтическое лекарственное средство обладает максимальной сублетальной дозой (т.е. наивысшая доза, которая не вызывает серьезную или необратимую токсичность), которая ниже, чем ее максимальная эффективная доза для выбранного в качестве мишени типа рака, например приблизительно 500, 400, 300, 250, 200, 150, 120, 100, 90, 80, 70, 60 или 50% минимальной эффективной дозы.

В соответствии с одним из вариантов осуществления по настоящему описанию, таким образом, опухоль у индивидуума обрабатывают посредством способа, содержащего систематическое введение терапевтически эффективного количества композиции, содержащей множество интактных мини-клеток, полученных из бактерий, каждая из которых заключает в себе высокотоксичное химиотерапевтическое лекарственное средство. Майтанзиноиды и дуокармицины, описанные ниже, являются представителями класса свертоксичных химиотерапевтических лекарственных средств, используемых таким образом.

Пригодные противораковые химиотерапевтические лекарственные средства в данном контексте включают азотистые иприты, нитрозомочевины, этиленимин, алкансульфонаты, тетразин, соединения платины, аналоги пиримидина, аналоги пурина, антиметаболиты, аналоги фолата, антрациклины, таксаны, алкалоиды барвинка, ингибиторы топоизомеразы и гормональные средства, inter alia.

Химиотерапевтическими лекарственными средствами, которые являются примером субкатегории низкомолекулярных лекарственных средств, являются актиномицин-D, алкеран, ара-С, анастрозол, BiCNU, бикалутамид, блеомицин, бусульфан, капецитабин (Кселода®), карбоплатин, карбоплатина, кармустин, CCNU, хлорамбуцил, цисплатин, кладрибин, СРТ-11, циклофосфамид, цитарабин, цитозинарабинозид, цитоксан, дакарбазин, дактиномицин, даунорубицин, дексразоксан, доцетаксел, доксорубицин, DTIC, эпирубицин, этиленимин, этопозид, флоксуридин, флударабин, фторурацил, флутамид, фотемустин, гемцитабин, гексаметиламин, гидроксимочевина, идарубицин, ифосфамид, иринотекан, ломустин, мехлоретамин, мелфалан, меркаптопурин, метотрексат, митомицин, митотан, митоксантрон, оксалиплатин, паклитаксел, памидронат, пентостатин, пликамицин, прокарбазин, стрептозоцин, STI-571, тамоксифен, темозоломид, тенипозид, тетразин, тиогуанин, тиотепа, томудекс, топотекан, треосульфан, триметрексат, винбластин, винкристин, виндезин, винорелбин и VP-16.

- 7 032740

Майтанзиноиды (молекулярная масса ~738 Да) являются группой химических производных майтанзина, обладающих сильной токсичностью. Согласно настоящему изобретению майтанзиноиды являются пригодными для доставки пациентам с опухолью посредством мини-клеток, хотя это не считается безопасным для применения у человека.

Дуокармицины (молекулярная масса ~588 Да) являются серией относительно натуральных продуктов, впервые выделенных из бактерий стрептомицет. Они также обладают сильной цитотоксичностью, но считаются небезопасными для применения для человека. Подобно майтанзиноидам дуокармицины являются пригодными химиотерапевтическими лекарственными средствами для применения по этому изобретению.

Таким же образом, примерами являются соединения в классе производных морфолинил антрациклина, описанных в международной патентной заявке WO 1998/002446. Среди таких производных есть неморубицин (3'-деамино-3'-[2^)-метокси-4-морфолинил]доксорубицин), a/k/a MMDX, и его главный метаболит PNU-159682 (3'-деамино-3 -4'-ангидро-[2^)-метокси-3 (К)-гидрокси-4-морфолинил]доксорубицин), структурная формула которого представлена ниже, а также эти четыре другие производные, описанные в патенте US № 8470984, содержание которого включено в настоящий документ в качестве ссылки: 3 '-деамино-3''-4'-ангидро- [2^)-метокси-3''(К)-гидрокси-4-морфолинил]идарубицин; 3'деамино-3''-4'-ангидро-[2^)-метокси-3(К)-гидрокси-4-морфолинил]даунорубицин; 3'-деамино-3''-4'ангидро-[2^)-метокси-3''(К)-гидрокси-4''-морфолинил]каминомицин и 3'-деамино-3''-4'-ангидро-[2''^)этокси-3''(К)-гидрокси-4-морфолинил]б-оксорубицин

PNU-159682.

Фармацевтически приемлемая соль присоединения кислоты любого из указанных выше производных также является членом этой группы в соответствии с данным изобретением аутофлуоресцентных морфолинил антрациклиновых производных.

Подкатегория биологических химиотерапевтических лекарственных средств в качестве неограничивающих примеров включает аспаргиназу, AIN-457, бапинейзумаб, белимумаб, брентуксимаб, бриакинумаб, канакинумаб, цетуксимаб, далотозумаб, денозумаб, эпратузумаб, эстафенатокс, фарлетузумаб, фигитумумаб, галиксимаб, гемтузумаб, гирентуксимаб (WX-G250), ибритумомаб, инотузумаб, ипилимумаб, меполизумаб, муромонаб-CD3, наптумомаб, нецитумумаб, нимотузумаб, окрелизумаб, офатумумаб, отеликсизумаб, озогамицин, пагибаксимаб, панитумумаб, пертузумаб, рамуцирумаб, реслизумаб, ритуксимаб, REGN88, соланезумаб, танезумаб, теплизумаб, тиуксетан, тозитумомаб, трастузумаб (Герцептин®), тремелимумаб, ведолизумаб, залутумумаб и занолимумаб.

Композиция может составлять по большей мере приблизительно 1 мг химиотерапевтического лекарственного средства. Альтернативно, количество химиотерапевтического лекарственного средства может составлять по большей мере приблизительно 750, 500, 250, 100, 50, 10, 5, 1, 0.5 или 0,1 мкг. В другом аспекте композиция содержит химиотерапевтическое лекарственное средство, обладающее количеством менее чем приблизительно 1/1,000 или альтернативно менее чем приблизительно 1/2000, 1/5000, 1/10000, 1/20000, 1/50000, 1/100000, 1/200000 или 1/500000 терапевтически эффективного количества лекарственного средства при применении без загрузки в мини-клетки. В соответствии с еще одним аспектом этого изобретения композиция может содержать по меньшей мере приблизительно 1 нмоль химиотерапевтического лекарственного средства. Таким образом, данное изобретение также заключает в себе варианты осуществления, в которых количество химиотерапевтического лекарственного средства составляет по меньшей мере приблизительно 2 нмоль, приблизительно 3 нмоль, приблизительно 4 нмоль, приблизительно 5 нмоль, приблизительно 10 нмоль, приблизительно 20 нмоль, приблизительно 50 нмоль, приблизительно 100 нмоль и приблизительно 800 нмоль соответственно.

3. Функциональные нуклеиновые кислоты.

Функциональная нуклеиновая кислота относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая при введении в клетку-хозяин специфически препятствует экспрессии белка. В отношении лечения опухоли в соответствии с данным изобретением является предпочтительным, что загрузка функциональной нуклеиновой кислотой, доставляемой к опухолевым клеткам посредством интактных полученных из бактерий мини-клеток ингибирует ген, который промотирует пролиферацию опухолевых клеток, ангиогенез или устойчивость к химиотерапии и/или который ингибирует апоптоз или арест клеточного цикла; т.е. опухоль-промотирующий ген.

- 8 032740

Как правило, фактом является, что функциональные молекулы нуклеиновой кислоты, применяемые по этому изобретению, обладают способностью уменьшать экспрессию белка посредством взаимодействия с транскриптом для белка. Эта категория загрузки мини-клетки для этого изобретения включает регуляторные RNAs, такие как siRNA, shRNA, короткие RNAs (как правило, менее чем 400 оснований в длину), микро-RNAs (miRNAs), рибозимы и RNA-ловушку, антисмысловые нуклеиновые кислоты и LincRNA, inter alia. В отношении этого рибозим относится к молекуле RNA, обладающей ферментативной активностью, которая может повторно расщеплять другие молекулы RNA путем, специфичным для нуклеотидной последовательности. Антисмысловой олигонуклеотид обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной к части конкретного транскрипта гена, так что молекула может гибридизоваться с транскриптом и блокировать трансляцию. Антисмысловой олигонуклеотид может содержать RNA или DNA. Категория LincRNA или длинная межгенная некодирующая RNA заключает в себе небелковые кодирующие транскрипты длиннее 200 нуклеотидов. LincRNAs может регулировать транскрипцию, сплайсинг и/или трансляцию генов, как описано, например, Khalil et al., Proc Nat'l Acad. USA 106: 11667-72 (2009).

Каждый из типов регуляторной RNA может быть источником функциональной молекулы нуклеиновой кислоты, которая ингибирует опухоль-промотирующий ген, как описано выше, и, таким образом, является пригодной для использования по настоящему изобретению. Таким образом, в одном предпочтительном варианте осуществления по настоящему изобретению интактные мини-клетки несут молекулы siRNA, опосредующие посттранскрипционный механизм сайленсинга гена RNA-интерференцию (RNAi), который можно применять для нацеливания на опухоль-промотирующие гены. Например, смотри MacDiarmid et al., Nature Biotech. 27: 645-51 (2009) (доставка антитело-презентирующих мини-клеток с химиотерапевтическими лекарственными средствами, siRNAs, которые противодействуют развитию устойчивости к лекарственному средству), и Oh и Park, Advanced Drug Delivery Rev. 61: 850-62 (2009) (доставка терапевтической siRNAs для лечения рака молочной железы, яичников, шейки матки, печени, легких и предстательной железы соответственно).

Как отмечается, siRNA, как правило, относится к молекулам двухцепочечной РНК длиной приблизительно от 10 до приблизительно 30 нуклеотидов, которые так называются на основании их способности специфическим образом препятствовать экспрессии белка. Предпочтительно молекулы siRNA составляют в длину 12-28 нуклеотидов, более предпочтительно 15-25 нуклеотидов в длину, еще более предпочтительно 19-23 нуклеотидов в длину и наиболее предпочтительно 21-23 нуклеотидов в длину. Таким образом, молекулы siRNA могут составлять 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 28 или 29 нуклеотидов в длину.

Длина одной цепочки означает длину молекулы siRNA. Например, siRNA, которую описывают как имеющую длину 21 рибонуклеотид (21-мер) могла содержать две противоположные цепочки RNA, которые соединяют комплементарные нити для 19 смежных пар оснований. Два оставшихся рибонуклеотида на каждой цепочке образуют липкий конец. Когда siRNA содержит две цепочки различной длины, более длинная из цепочек обозначает длину siRNA. Например, dsRNA, содержащая одну цепочку, которая составляет 21 нуклеотид в длину, и вторая цепочка, которая составляет 20 нуклеотидов в длину, образует 21-мер.

Способы помочь в дизайне конкретно siRNA и, как правило, регуляторной RNA являются легкодоступными. Например, компьютеризированный инструмент разработки siRNA является доступным в интернете на сайте www.dharmacon.com.

В другом предпочтительном варианте осуществления интактные мини-клетки по настоящему изобретению несут miRNAs, которые, наподобие siRNA, способны опосредовать посттранскрипционный механизм сайленсинга гена RNA-интерференцию (RNAi). Кроме того, наподобие siRNA, эффект сайленсинга гена, опосредованный miRNA, может быть использован для нацеливания на опухольпромотирующие гены. Например, смотри Kota et al., Cell 137: 1005-17 (2009) (доставка miRNA посредством трансфекции приводит к ингибированию пролиферации раковых клеток, опухолеспецифичному апоптозу и поразительной защите от прогрессирования заболевания без токсичности в модели рак печени у мыши) и Takeshita, et al., Molec. Ther. 18: 181-87 (2010) (доставка синтетической miRNA посредством временной трансфекции ингибировала рост метастатических опухолевых клеток простаты на костных тканях).

Хотя оба опосредуют RNA-интерференцию, между miRNA и siRNA были отмечены различия. В отношении этого miRNA, как правило, относится к классу от 17- до 27-нуклеотидных одноцепочечных молекул RNA (вместо двухцепочечных, как в случае siRNA). Таким образом, молекулы miRNA могут составлять 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 нуклеотидов в длину. Предпочтительно молекулы miRNA составляют 21-25 нуклеотидов в длину.

Другое различие между miRNAs и siRNAs заключается в том, что первая, как правило, полностью не комплементирует mRNA мишень. С другой стороны, siRNA должна быть полностью комплементарной к mRNA мишени. Следовательно, siRNA, как правило, приводит к сайленсингу единичной специфической мишени, в то время как miRNA является смешанной.

Дополнительно, хотя оба собраны в RISC (RNA-индуцируемый сайленсинг-комплекс), siRNA и

- 9 032740 miRNA различаются в их соответствующем исходном процессинге перед сборкой RISC. Эти различия подробно описаны Chu et al., PLoS Biology 4: 1122-36 (2006) и Gregory et al., Methods in Molecular Biology 342: 33-47 (2006).

Ряд баз данных служит в качестве депозитариев miRNA. Например, смотри miRBase (www.mirbase.org) и tarbase (http://diana.cslab.есе.ntua.gr/DianaToolsNew/index.php?r=tarbase/index). В общепринятом применении miRNAs, как правило, называют с префиксом -mir, в комбинации с последующим номером. Например, новая miRNA, обнаруженная после mir-352 мыши, будет называться mir353 мыши.

И снова, инструменты для помощи проектирования регуляторной RNA, включая miRNA, являются легкодоступными. В отношении этого компьютеризированный инструмент разработки miRNA является доступным в интернете на сайте wmd2.weigelworld.org/cgi-bin/mirnatools.pi.

Как указано выше, функциональная нуклеиновая кислота, применяемая в этом изобретении, может ингибировать ген, который промотирует пролиферацию опухолевых клеток, ангиогенез или устойчивость к химиотерапии. Ингибируемый ген также может сам по себе ингибировать апоптоз или арест клеточного цикла.

Примеры генов, которые могут быть мишенями для функциональной нуклеиновой кислоты, представлены ниже.

Функциональные нуклеиновые кислоты по изобретению предпочтительно нацелены на ген или транскрипт белка, который способствует устойчивости к лекарственному средству, ингибирует апоптоз или способствует злокачественному фенотипу. Успешное применение стратегий на основе функциональных нуклеиновых кислот в этих контекстах был достигнут в данной области, но без преимуществ векторов мини-клеток (см., например, Sioud, Trends Pharmacol. Sci. 25: 22-8 (2004), Caplen, Expert Opin. Biol. Ther. 3: 575-86 (2003), Nieth et al., FEBS Lett. 545: 144-50 (2003), Caplen и Mousses, Ann. NY Acad. Sci. 1002: 56-62 (2003), Duxbury et al., Ann. Surg. 240: 667-74 (2004), Yague et al., Gene Ther. 11: 1170-74 (2004) и Duan et al., Mol. Cancer Ther. 3: 833-8 (2004)).

Белки, которые способствуют устойчивости к лекарственному средству, составляют предпочтительные мишени функциональных нуклеиновых кислот. Белки могут способствовать полученной устойчивости к лекарственному средству или первичной устойчивости к лекарственному средству. Когда пораженные клетки, такие как опухолевые клетки, первоначально отвечают на лекарственные средства, но становятся неподдающимися лечению в последующих лечебных циклах, достигается резистентный фенотип. Пригодные мишени, вовлеченные в полученную устойчивость к лекарственным средствам, включают АТР-связывающие кассетные транспортеры, такие как Р-гликопротеин (P-gp, P-170, PGY1, MDR1, АВСВ1, MDR-связанный белок, белок множественной лекарственной устойчивости 1), MDR-2 и MDR-3. MRP2 (белок, связанный с множественной лекарственной устойчивостью), BCR-ABL (кластерный регион точечного разрыва - протоонкоген Абельсона), STI-571, связанный с устойчивостью белок, белок с устойчивостью, связанный с легкими, циклооксигеназа-2, ядерный фактор каппа, XRCC1 (X-ray crosscomplementing группа 1), ERCC1 (excision cross-complementing gene), GSTP1 (глутатион S-трансфераза), мутантный β-тубулин, и факторы роста, такие как IL-6, являются дополнительными мишенями, связанными с приобретенной устойчивостью к лекарственным средствам.

Конкретно пригодными мишенями, которые вносят вклад в устойчивость к лекарственным средствам, являются АТР-связывающие кассетные транспортеры, такие как Р-гликопротеин, MDR-2, MDR-3, BCRP, APT11a и LRP.

Пригодные мишени также включают белки, которые вызывают устойчивость к апоптозу. Они включают Bcl-2 (B-клеточная лейкемия/лимфома), Bcl-X_L, A1/Bfl 1, киназу фокальной адгезии, дигидродиол дегидрогеназу и мутантный белок р53.

Пригодные мишени дополнительно включают онкогенные и мутантные опухолевые супрессорные белки. Примерами таких белков являются β-катенин, PKC-α (протеинкиназа С), C-RAF, K-Ras (V12), DP97 Dead box RNA геликаза, DNMT1 (DNA метилтрансфераза 1), FLIP (Flice-like inhibitory protein), CSfc, 53BPI, поликомбинированный групповой белок EZH2 (энхансер гомолога zeste), ErbB1, HPV-16 E5 и Е7 (папилломавирус человека ранний 5 и ранний 7), фортилин & MCI1P (белок миелоидноклеточной лейкемии 1), DIP13a (DDC interacting protein 13a), MBD2 (метил CpG связывающий домен), р21, KLF4 (Kruppel-подобный фактор 4), tpt/TCTP (опухолевый белок, контролируемый трансляцией), SPK1 и SPK2 (сфингозин киназа), Р300, PLK1 (Polo-подобная киназа-1), Trp53, Ras, ErbBl, VEGF (фактор роста эндотелия сосудов), BAG-1 (BCL2-связанный атаноген 1), MRP2, BCR-ABL, STI-571 связанный с устойчивостью белок, белок устойчивости, связанный с легкими, циклооксигеназа-2, ядерный фактор каппа, XRCC1, ERCC1, GSTP1, мутантный β-тубулин и факторы роста.

Также пригодными в качестве мишеней являются глобальные регуляторные элементы, примерами которых являются цитоплазматические белки, связывающие элементы полиаденилирования (CEPBs). Например, СЕРВ4 сверхэкспрессирован при глиобластоме и раке поджелудочной железы, где белок активирует сотни генов, связанных с ростом опухоли, и не обнаруживается в здоровых клетках (OritzZapater et al., Nature Medicine, doi: 10.1038/nm.2540 (опубликовано онлайн 4 декабря 2011)). В соответст

- 10 032740 вии с настоящим описанием, таким образом, лечение глиобластомы может быть осуществлено посредством введения композиции, содержащей интактные полученные из бактерий мини-клетки, которые заключают в себе средство, которое препятствует сверхэкспрессии СЕРВ4, такое как siRNA или другая функциональная молекула нуклеиновой кислоты, которая прерывает экспрессию СЕРВ4 опухолевыми клетками.

Дополнительно пригодными функциональными нуклеиновыми кислотами являются те, которые вовлечены в репликацию и репарацию DNA. Примеры включают рибонуклеотид редуктазу (RR), которая является потенциальной терапевтической мишенью для рака, так как она катализирует превращение рибонуклеозид 5'-дифосфатов в соответствующие им 2'-дезоксирибонуклеозид 5'-трифосфаты, которые являются необходимыми для репликации и репарации DNA (см. D'Angiolella et al., Cell: 149:1023-34 (2012)). RR человека содержит две субъединицы, RRM1 и RRM2, и функциональные нуклеиновые кислоты, мишенью которых являются обе субъединицы, пригодные в настоящем изобретении. Дополнительный пример пригодных функциональных нуклеиновых кислот включает участвующий в репликации белок А (RPA), трехмерный комплекс, состоящий из субъединиц размером 70-kDa (RPA1), 32-kDa (RPA2) и 14-kDa (RPA3), которые необходимы для репликации DNA во всех организмах (см. Iftode et al., Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 34: 141-80 (1999)).

(D) Опухоли.

Композиции и методы настоящего изобретения пригодны при лечении разнообразия типов опухолей, не ограничиваясь конкретным типом. Это является следствием того, что мини-клетки или убитые бактериальные клетки могут заключать в себе различные противораковые средства и, в частности, при соединении с биспецифическим лигандом, специфичным к различным опухолевым клеткам, может воздействовать на клетки-мишени различных опухолевых типов. Вдобавок, ожидается, что мини-клетки или убитые бактериальные клетки в комбинации с IFN-гамма будут способны стимулировать иммунный ответ на любые опухолевые клетки.

В соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения настоящие композиции и способы применяют при лечении одного или нескольких типов рака, выбранных из рака надпочечника, рака ануса, апластической анемии, рака желчных протоков, рака мочевого пузыря, рака костей, опухолей мозга/CNS у взрослых, опухолей мозга/CNS у детей, рака молочной железы, рака молочной железы у мужчин, рака у детей, рака с неизвестной первичной локализацией, болезни Кастлемена, рака шейки матки, рака толстого кишечника/прямой кишки, рака эндометрия, рака пищевода, опухоли Юинга, рака глаза, рака желчного пузыря, желудочно-кишечных карциноидных опухолей, желудочно-кишечных стромальных опухолей (gist), гестационного трофобластического заболевания, болезни Ходжкина, саркомы Капоши, рака почки, ларингеального и гипофарингеального рака, лейкемии, острой лимфоцитарной лейкемии (ALL) у взрослых, острой миелоидной лейкемии (AML) у взрослых, хронической лимфоцитарной лейкемии (CLL), хронической миелоидной лейкемии (cml), хронической миеломоноцитарной лейкемии (CMML), лейкемии у детей, рака печени, рака легких, немелкоклеточного рака, мелкоклеточного рака легких, карциноидной опухоли легких, лимфомы, лимфомы кожи, злокачественной мезотелиомы, множественной миеломы, миелодиспластического синдрома, рака носовой полости и придаточных пазух носа, назофарингеального рака, нейробластомы, неходжкинской лимфомы, неходжкинской лимфомы у детей, рака ротовой полости и орофарингеального рака, остеосаркомы, рака яичников, рака поджелудочной железы, рака полового члена, опухоли гипофиза, рака предстательной железы, ретинобластомы, рабдомиосаркомы, рака слюнной железы, саркомы - рака мягких тканей у взрослых, рака кожи, базальноклеточного и плоскоклеточного рака кожи, рака кожи - меланомы, рака тонкого кишечника, рака желудка, рака яичка, рака тимуса, рака щитовидной железы, саркомы матки, рака влагалища, рака вульвы, макроглобулинемия Вальденстрема и опухоли Вильмса.

В одном из вариантов осуществления композиции и способы являются пригодными для лечения опухоли головного мозга.

Насчитывают более 120 типов опухолей головного мозга. Большинство медицинских учреждений применяют систему классификации Всемирной организации здравоохранения (WHO) для идентификации опухолей головного мозга. WHO классифицирует опухоли головного мозга по клеточному происхождению и по тому, как клетки себя ведут, начиная от наименее агрессивных (доброкачественных) до наиболее агрессивных (злокачественных). Некоторым типам опухолей приписывают степень в диапазоне от степени I (наименее злокачественная) до степени IV (наиболее злокачественная), которые обозначают скорость роста. В оценочной шкале существуют вариации в зависимости от типа опухоли. Классификация и степень индивидуальной помощи при раке определяет наиболее соответствующее поведение. Наиболее часто диагностируемые типы включают неврому слухового нерва, астроцитому (включая степень I - пилоцитарная астроцитома, степень II - низкодифференцированная астроцитома, степень III анапластическая астроцитома и степень IV - глиобластома (GBM)), хордому, лимфому CNS, краниофарингеому, другие глиомы (глиома ствола мозга, эпендимома, смешанная глиома, глиома зрительного нерва и субэпендимома), медуллобластому, менингиому, метастатические опухоли головного мозга, олигодендроглиому, опухоли гипофиза, примитивные нейроэктодермальные опухоли (PNET), другие заболевания, связанные с мозгом, и шванному.

- 11 032740

Среди детей эти типы опухолей головного мозга являются наиболее распространенными: глиома ствола головного мозга, краниофарингеома, эпендимома, ювенильная пилоцитарная астроцитома (JPA), медуллобластома, глазного зрительного нерва, пинеальная опухоль, примитивные нейроэктодермальные опухоли (PNET) и рабдоидная опухоль.

(Е) Мини-клетки и убитые бактериальные клетки.

Мини-клетка относится к производной бактериальной клетки, в которой отсутствуют хромосомы (без хромосом) и возникает из-за нарушения в координации во время деления надвое, клеточного деления с разделением DNA. Мини-клетки отличаются от других небольших носителей, таких как так называемые мембранные пузырьки (размером ~0.2 мкм или менее), которые образуются и высвобождаются спонтанно в определенных обстоятельствах, но которые не являются следствием специфических генетических перестроек или эписомальной генной экспрессии гена. Подобным образом, интактные миниклетки отличаются от теней бактерий, которые не образуются вследствие специфических генетических перестановок или эписомальной генной экспрессии. Полученные из бактерий мини-клетки, применяемые в этом изобретении, являются полностью интактными и, таким образом, отличаются от других бесхромосоных форм производных бактериальных клеток, характеризующихся посредством внешней или определяющей мембраны, которая является разорванной или разрушенной, даже удаленной (см. патент US № 7183105 в колонке 111, строках 54 et seq. Интактная мембрана, которая характеризуется миниклетками по настоящему изобретению, обеспечивает удержание терапевтической нагрузки внутри миниклетки пока нагрузка не высвободится после захвата внутри опухолевой клетки.

Мини-клетку, применяемую по данному изобретению, можно получать из бактериальных клеток, таких как Е. coli и S. typhymurium. Прокариотическая хромосомная репликация связана с нормальным делением надвое, которое включает образование поперечной перегородки. В Е. coli, например, мутация генов min, таких как minCD, может удалить ингибирование образования перегородки на клеточных полюсах во время клеточного деления, приводя к созданию нормальной дочерней клетки и бесхромосомной мини-клетки (см. de Boer et al., J. Bacteriol. 174(1): 63-70 (1992); Raskin & de Boer, J. Bacteriol. 181: 6419-6424 (1999); Hu & Lutkenhaus, Mol. Microbio. 34(1): 82-90 (1999); Harry, Mol. Microbiol. 40(4): 795803 (2001)).

В дополнение к мутациям оперона min бесхромосомные мини-клетки также получают следуя диапазону других генетических перестановок или мутаций, которые влияют на образование перегородки, например, в divIVB1 в B. Subtilis (см. Reeve и Cornett, J. Virol. 15: 1308-16 (1975)). Мини-клетки также могут образовываться после отклонения в уровнях генной экспрессии белков, вовлеченных в клеточное деление/хромосомную сегрегацию. Например, сверхэкспрессия minE ведет к полярному делению и образованию мини-клеток. Сходным образом, бесхромосомные мини-клетки могут получаться из дефектов при разделении хромосом, например smc мутации в Bacillus subtilis (Britton et al., Genes Dev. 12: 1254-9 (1998)), делеция spoOJ в B. subtilis (Ireton et al., J. Bacteriol. 176: 5320-29 (1994)), мутация mukB в E. coli (Hiraga et al., J. Bacteriol. 171: 1496-1505 (1989)) и parC мутация в Е. coli (Stewart и D'Ari, J. Bacteriol. 174: 4513-6 (1992)). Дополнительно CafA может увеличивать скорость клеточного деления и/или ингибировать хромосомное разделение после репликации (Okada et al., J. Bacteriol. 176: 917-22 (1994)), приводя к образованию формирующих цепь клеток и бесхромосомных мини-клеток.

Таким образом, мини-клетки можно получать для настоящего изобретения из любой бактериальной клетки, будь она грамположительного или грамотрицательного происхождения благодаря консервативной природе бактериального клеточного деления в этих бактериях. Кроме того, мини-клетки, используемые в данном изобретении, должны обладать интактными клеточными стенками (т.е. являться интактными мини-клетками), как указано выше, и должны отличаться и отделяться от других небольших носителей, таких как мембранные пузырьки, которые не являются присущими специфическим генетическим перестановкам или эписомальной генной экспрессии.

В данном варианте осуществления родительские (исходные) бактерии для мини-клеток могут быть грамположительными или они могут быть грамотрицательными, как упоминалось. В одном из аспектов, таким образом, родительские бактерии являются одним или несколькими выбранными из Terra/Glidobacteria (BV1), Proteobacteria (BV2), BV4, включая Spirochaetes, Sphingobacteria и Planctobacteria. В соответствии с другим аспектом бактерии являются одним или несколькими, выбранными из Firmicutes (BV3) таких как Bacilli, Clostridia или Tenericutes/Mollicutes, или Actinobacteria (BV5), таких как Actinomycetales или Bifidobacteriales.

В соответствии с изобретением убитые бактериальные клетки являются неживыми прокариотическими клетками бактерий, цианобактерий, эубактерий и архебактерий, как определено во 2-м издании Bergey's Manual of Systematic Biology. Такие клетки считаются интактными, если они обладают интактной клеточной стенкой и/или клеточной мембраной и содержат генетический материал (нуклеиновую кислоту), которая является эндогенной для бактериальных видов. Способы получения убитых бактериальных клеток описаны, например, в патентной заявке US № 2008/0038296, содержание которой включено в настоящий документ в качестве ссылки.

В еще одном дополнительном аспекте бактерии являются одним или несколькими выбранными из Eobacteria (Chlorflexi, Deinococcus-Thermus), Cyanobacteria, Thermodesulfobacteria, thermophiles

- 12 032740 (Aquificae, Thermotogae), Alpha, Beta, Gamma (Enterobacteriaceae), Delta или Epsilon Proteobacteria, Spirochaetes, Fibrobacteres, Chlorobi/Bacteroidetes, Chlamydiae/Verrucomicrobia, Planctomycetes, Acidobacteria, Chrysiogenetes, Deferribacteres, Fusobacteria, Gemmatimonadetes, Nitrospirae, Synergistetes, Dictyoglomi, Lentisphaerae Bacillales, Bacillaceae, Listeriaceae, Staphylococcaceae, Lactobacillales, Enterococcaceae, Lactobacillaceae, Leuconostocaceae, Streptococcaceae, Clostridiales, Halanaerobiales, Thermoanaerobacterales, Mycoplasmatales, Entomoplasmatales, Anaeroplasmatales, Acholeplasmatales, Haloplasmatales, Actinomycineae, Actinomycetaceae, Corynebacterineae, Nocardiaceae, Corynebacteriaceae, Frankineae, Frankiaceae, Micrococcineae, Brevibacteriaceae и Bifidobacteriaceae.

Для фармацевтического применения композиция по изобретению должна содержать мини-клетки или убитые бактериальные клетки, которые выделены настолько тщательно насколько возможно из иммуногенных компонентов и других токсических примесей. Методология очистки полученных из бактерий мини-клеток для удаления свободного эндотоксина и родительских бактериальных клеток описана в WO 2004/113507, который включен полностью в данный документ в качестве ссылки. В кратком изложении процесс очистки достигает удаление (а) небольших носителей, таких как мембранные пузырьки, которые, как правило, имеют размер менее 0.2 мкм, (b) свободных эндотоксинов, высвободившихся из клеточных мембран, и (с) родительских бактерий, как живых, так и мертвых, и их дебрис, который также является источником свободных эндотоксинов. Такое удаление может быть применено с inter alia с применением 0.2 мкм фильтра для удаления более мелких пузырьков и клеточного дебриса, 0.45 мкм фильтра для удаления родительских клеток после индуцирования родительских клеток для образования филаментов, антибиотиков для уничтожения живых бактериальных клеток и антител против свободных эндотоксинов.

Лежащая в основе процедура очистки является открытием, как считают авторы настоящего изобретения, так как несмотря на различие бактериальных источников все интактные мини-клетки имеют размер приблизительно 400 нм, т.е. больше чем мембранные пузырьки и другие небольшие носители и при этом меньше чем родительские бактерии. Определение размера мини-клеток может быть совершено с применением методов на основе твердого состояния, таких как электронная микроскопия, или на основе жидкостей, например, динамическое светорассеяние. Величина размера, полученного с применением каждого такого метода, может иметь диапазон ошибок, и величины могут различаться некоторым образом в зависимости от метода. Таким образом, размер мини-клеток в высушенном состоянии можно измерять посредством электронной микроскопии как приблизительно 400±50 нм. С другой стороны, динамическое светорассеяние может измерять те же мини-клетки размером приблизительно 500±50 нм. Кроме того, загруженные лекарственным средством нацеленные на лиганды мини-клетки можно измерять опять же с применением динамического светорассеяния и составляют приблизительно от 400 до 600±50 нм.

Это рассеяние величин размеров легко применяется на практике, например, с целью выделить мини-клетки из иммуногенных компонентов и других токсических примесей, как описано выше. Другими словами, интактная полученная из бактерии мини-клетка характеризуется цитоплазмой, окружено жесткой мембраной, которая придает мини-клетке жесткую сферическую структуру. Эта структура является очевидной в микроизображениях, полученных с помощью трансмиссионного электронного микроскопа, в которых измеряют диаметр мини-клеток, поперек мини-клетки, между наружными границами жесткой мембраны. Это измерение представляет указанную выше величину размера 400±50 нм.

Другим структурным элементом убитых бактериальных клеток или мини-клеток, полученных из грамотрицательных бактерий, является компонент О-полисахарид липополисахарида (LPS), который закреплен на наружной мембране посредством якорного липида А. Этот компонент является цепью повторяющихся углеводных остатков, от 70 до 100 повторяющихся единиц от четырех до пяти сахаров на цепь. Вследствие того, что эти цепи не являются жесткими в жидкой среде, такой как in vivo, они могут принимать волнообразную гибкую структуру, которая придает обычный вид водоросли в среде кораллового моря; т.е. цепи двигаются с жидкостью, в то же время оставаясь прикрепленными якорями к мембране мини-клеток.

Под влиянием компонента О-полисахарид динамическое светорассеяние может представлять величину размера мини-клетки от приблизительно 500 нм до приблизительно 600 нм, как указано выше. Тем не менее, мини-клетки из грамотрицательных и грамположительных бактерий похоже легко проходят через 0.45 мкм фильтр, который устанавливает эффективный размер мини-клетки от 400±50 нм. Указанное выше рассеяние в размерах находится в объеме настоящего изобретения и, конкретно, обозначается определителем приблизительно во фразе приблизительно 400 нм в размере и т.п.

В отношении токсических примесей композиция по изобретению может содержать менее чем приблизительно 350 EU свободного эндотоксина. Примерами в отношении этого являются уровни свободного эндотоксина, составляющие приблизительно 250 EU, приблизительно 200 EU, приблизительно 150 EU, приблизительно 100 EU, приблизительно 90 EU, приблизительно 80 EU, приблизительно 70 EU, приблизительно 60 EU, приблизительно 50 EU, приблизительно 40 EU, приблизительно 30 EU, приблизительно 20 EU, приблизительно 15 EU, приблизительно 10 EU, приблизительно 9 EU, приблизительно 8 EU, приблизительно 7 EU, приблизительно 6 EU, приблизительно 5 EU, приблизительно 4 EU, приблизи

- 13 032740 тельно 3 EU, приблизительно 2 EU, приблизительно 1 EU, приблизительно 0.9 EU, приблизительно 0.8 EU, приблизительно 0.7 EU, приблизительно 0.6 EU, приблизительно 0.5 EU, приблизительно 0.4 EU, приблизительно 0.3 EU, приблизительно 0.2 EU, приблизительно 0.1 EU, приблизительно 0.05 EU и приблизительно 0.01 EU соответственно.

Композиция по изобретению может содержать по меньшей мере приблизительно 10⁹ мини-клеток или убитых бактериальных клеток, например по меньшей мере приблизительно 1х10⁹, по меньшей мере приблизительно 2х10⁹ или по меньшей мере приблизительно 5х10⁹ В некоторых вариантах осуществления композиция содержит не более чем приблизительно 10¹¹ мини-клеток или убитых бактериальных клеток, например не более чем приблизительно 1х 10¹¹, или не более чем приблизительно 9х10¹⁰, или не более чем приблизительно 8х10¹⁰ (F) Загрузка противораковых средств в мини-клетки или убитые бактериальные клетки.

Противораковые средства, такие как белки и функциональные нуклеиновые кислоты, которые могут кодироваться нуклеиновой кислотой, могут быть введены в мини-клетки посредством трансформации в родительскую бактериальную клетку вектора, такого как плазмида, которая кодирует противораковое средство. Когда мини-клетка образуется из родительской бактериальной клетки, мини-клетка сохраняет определенные копии плазмиды и/или продукта экспрессии, противоопухолевого средства. Более подробная информация об упаковке продукта экспрессии в мини-клетку представлена в WO 03/033519, содержание которого включено в настоящее изобретение полностью в качестве ссылки.

Данные, представленные в WO 03/033519, продемонстрировали, например, что рекомбинантные мини-клетки, несущие плазмиду экспрессии генов млекопитающих, могут быть доставлены к фагоцитирующим клеткам и нефагоцитирующим клеткам. В этой заявке также описана генетическая трансформация бактериальных штаммов, продуцирующих мини-клетки с гетерологичными нуклеиновыми кислотами, находящимися на эписомально реплицирующихся плазмидных DNAs. При отделении родительских бактерий и мини-клеток некоторая часть эписомальной DNA отделялась в мини-клетки. Полученные рекомбинантные мини-клетки были легко поглощены фагоцитарными клетками млекопитающих и разрушались внутри внутриклеточных фаголизосом. Кроме того, часть рекомбинантной ДНК избегала фаголизосомальной мембраны и была транспортирована в ядро клетки млекопитающего, где были экспрессированы рекомбинантные гены.

Нуклеиновые кислоты также можно упаковывать непосредственно в мини-клетки. Таким образом, нуклеиновую кислоту можно упаковывать непосредственно в интактные мини-клетки посредством совместного инкубирования множества интактных мини-клеток с нуклеиновой кислотой в буфере. Композиция буфера может варьировать как функция условий, хорошо известных в данной области, чтобы оптимизировать загрузку нуклеиновой кислоты в интактные мини-клетки. Кроме того, буфер может варьировать в зависимости от нуклеотидной последовательности и длины нуклеиновой кислоты, предназначенной для загрузки в мини-клетки. Примерный буфер, пригодный для загрузки, в качестве неограничивающего примера включает фосфатно-солевой буфер (PBS). После загрузки нуклеиновая кислота остается в мини-клетке и защищена от разрушения. Исследования продолжительной инкубации с siRNAзагруженными мини-клетками, инкубированными в стерильном физиологическом растворе, продемонстрировали, например, отсутствие утечки siRNAs.

В других вариантах осуществления многочисленные нуклеиновые кислоты, направленные на различные мишени mRNA, можно упаковывать в ту же мини-клетку. Такой подход можно использовать для противодействия устойчивости к лекарственным средствам и апоптозу. Например, пациенты с раком регулярно демонстрируют устойчивость к химиотерапевтическим лекарственным средствам. Такая устойчивость может быть опосредована посредством сверхэкспрессии генов, таких как гены эффлюксных насосов, обеспечивающих множественную лекарственную устойчивость (MDR) и антиапоптотических генов, наряду с другими. Для противодействия этой устойчивости мини-клетки можно упаковывать с применением терапевтически значимых концентраций функциональной нуклеиновой кислоты с MDRсвязанными генами и введены пациенту перед химиотерапией. Кроме того, упаковка в те же мини-клетки многофункциональной нуклеиновой кислоты, направленной на различные mRNA мишени, может повысить терапевтический успех, так как большинство молекулярных мишеней являются предметом мутаций и имеют множество аллелей. Больше подробностей непосредственной упаковки нуклеиновой кислоты в мини-клетку представлено в WO 2009/027830, содержание которой включено в настоящее изобретение полностью в качестве ссылки.

Низкомолекулярные лекарственные средства, гидрофильные или гидрофобные, можно упаковывать в мини-клетки посредством создания градиента концентрации лекарственного средства между внеклеточной средой, содержащей мини-клетки, и цитоплазмой мини-клеток. Когда внеклеточная среда содержит более высокую концентрацию лекарственного средства, чем цитоплазма мини-клетки, лекарственное средство естественным образом движется вниз этого градиента концентрации внутрь цитоплазмы мини-клетки. Когда градиент концентрации перевернут, однако лекарственное средство не выходит за пределы мини-клеток. Более подробно процесс загрузки лекарственного средства и его поразительной природы обнаружен, например, в патентной заявке US № 2008/0051469.

- 14 032740

Для загрузки мини-клеток лекарственными средствами, которые обычно не являются растворимыми в воде, лекарственные средства сначала могут быть растворены в подходящем растворителе. Например, паклитаксел может быть растворен в смеси этанола и кремофора EL (полиэтоксилированное касторовое масло) 1:1 с последующим растворением в PBS для достижения раствора паклитаксела, который является частично растворенным в водной среде и несет минимальные количества органического растворителя для обеспечения того, чтобы лекарственное средство оставалось в растворе. Мини-клетки можно инкубировать в этой конечной среде для загрузки лекарственного средства. Таким образом, авторы открыли, что даже гидрофобные лекарственные средства могут диффундировать в цитоплазму или мембрану мини-клеток для достижения высокой и терапевтически значимой цитоплазматической загрузки лекарственного средства. Это является неожиданным, потому что мембрана мини-клетки составлена из гидрофобного бислоя фосфолипидов, который, как ожидается, предотвратит диффузию гидрофобных молекул в цитоплазму.

Продемонстрировано, что загрузка в мини-клетки разнообразия репрезентативных низкомолекулярных лекарственных средств, являющихся примерами различных размеров и химических свойств: доксорубицин, паклитаксел, фтор-паклитаксел, цисплатин, винбластин, монсатрол, ингибитор тимидилатсинтазы (TS) OSI-7904, иринотекан, 5-фторурацил, гемцитабин и карбоплатин. Кроме того, без исключений, полученные мини-клетки, загруженные низкомолекулярным лекарственным средством, демонстрируют значительную противоопухолевую эффективность in vitro и in vivo. Эти данные, представленные здесь, таким образом демонстрируют эффективность и универсальность методологии загрузки миниклеток.

(G) Нацеливание мини-клеток или убитых бактериальных клеток на конкретные клетки млекопитающих.

В соответствии с дополнительным аспектом данного изобретения мини-клетки или убитые бактериальные клетки композиции, как описано выше, направлены на опухолевую клетку млекопитающего посредством лиганда. В некоторых вариантах осуществления лиганд является биспецифическим. То есть лиганд демонстрирует специфичность как для мини-клеток, так и для компонентов клеток (опухоли) млекопитающих, таким образом, что это вызывает связывание данной везикулы с клеткой-мишенью, в то время как последняя поглощает первую. Применение биспецифичных лигандов для нацеливания миниклетки на опухолевую клетку дополнительно описано в WO 05/056749 и WO 05/079854, и применение биспецифических лигандов для нацеливания убитой бактериальной клетки на опухолевую клетку дополнительно описано в патенте US № 8591862, соответствующее содержание которой включено в настоящее изобретение полностью в качестве ссылки. Когда такой лиганд присоединяется к везикуле, незанятая специфичность (моноспецифичность) лиганда сохраняется пока он взаимодействует с таргетной клеткой (опухоли) млекопитающего.

Лиганд может быть присоединен к клеточной мембране везикул посредством взаимодействия между лигандом и компонентом на клеточной мембране, таким как полисахарид, гликопротеин или полипептид. Экспрессированный лиганд присоединен якорем на поверхности везикулы, так что часть, связанная с поверхностным компонентом лиганда, подвергается воздействию, так что эта часть может связывать таргетный компонент поверхности клетки млекопитающего, когда везикула и клетка млекопитающего приходят в соприкосновение.

Альтернативно, лиганд может быть экспрессирован и продемонстрирован посредством живой копии везикулы, полученной из бактерии, например, посредством родительской клетки мини-клетки или посредством бактериальной клетки перед тем, как она станет убитой клеткой. В этом случае лиганд не требует специфичности к везикуле и только отражает специфичность к компоненту, который является характеристикой клеток млекопитающих. То есть такой компонент не должен быть уникальным для опухолевых клеток, per se, или даже для конкретного вида опухолевых клеток, подвергающихся лечению, при условии, что опухолевые клетки представляют компонент на своей поверхности.

При внутривенном введении везикулы быстро аккумулируются в опухолевой микросреде. Эта аккумуляция, происходящая в качестве функции вышеописанной негерметичной сосудистой сети опухоли, приводит к доставке везикулы, нагруженной терапевтическим средством, к клеткам опухоли, которые затем интернализуют загруженные везикулы.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что этот способ доставки является применимым к целому ряду опухолевых клеток млекопитающего, включая клетки, которое в норме устойчивыми к специфической адгезии и эндоцитозу мини-клеток. Например, лиганды, которые содержат антитело, направленное против анти-HER2 рецептора или анти-EGF рецептора, могут соединять мини-клетки с соответствующими рецепторами в целом ряде таргетных нефагоцитирующих клеток, таких как раковые клетки легких, яичника, головного мозга, молочной железы, предстательной железы и кожи.

Связывание, полученное таким образом, предшествует захвату везикул каждым типом нефагоцитирующих клеток. То есть в контексте настоящего изобретения пригодная клетка-мишень представляет компонент клеточной поверхности, связывание которого посредством лиганда на везикуле вызывает эндоцитоз этой везикулы.

Более конкретно, авторы настоящего изобретения обнаружили, что взаимодействие между (а) ли

- 15 032740 гандом на мини-клетке или убитой бактериальной клетке и (b) поверхностным рецептором клетки млекопитающего может активировать путь захвата, называемый здесь путь рецептор-опосредованного эндоцитоза (rME), в поздний-эндосомальный/лизосомальный компартмент таргетной клетки-хозяина, такой как опухолевая клетка. Посредством этого пути rME авторы настоящего изобретения обнаружили, что полученные из бактерий везикулы обрабатываются посредством ранней эндосомы, поздней эндосомы и лизосомы, что приводит к высвобождению загруженных в них веществ в цитоплазму клетки млекопитающего. Кроме того, загруженное вещество, которое является нуклеиновой кислотой, не только избегает полного разрушения в позднем эндосомальном/лизосомальном компартменте, но также экспрессируется клеткой-хозяином.

Лиганд для данного подхода к доставке может быть биспецифическим, как описано выше, так как он связывается с поверхностными компонентами на несущей загруженное лекарственное вещество везикуле и в клетке-мишени соответственно, и его взаимодействие с последним компонентом приводит к захвату везикулы в rME пути. В любом случае данный компонент поверхности клетки-мишени может быть кандидатом для связывания лигандом в соответствии с данным изобретением, если взаимодействие с компонентом в сущности задействует эндоцитозный путь, который ведет к цитозольной интернализации с таргетной клеточной поверхности. Такие кандидаты легко оцениваются за их пригодность в изобретении посредством анализа, в котором тип клеток, который представляет на своей поверхности кандидатный компонент, коинкубируется in vitro с мини-клетками, несущими лиганд, который связывает кандидата и который также присоединен к флуоресцентному красителю или другому маркеру, поддающемуся детекции, например, визуально посредством конфокальной микроскопии (in vitro анализ такого сорта описан MacDiarmid et al. (2007), в подписи к фиг. 3 на с. 436.) Таким образом, наблюдаемая интернализация маркера представляет собой позитивную индикацию посредством такого анализа, когда тестируемый компонент поверхности клетки-мишени является пригодным по настоящему изобретению.

Примерами кандидатных компонентов поверхности клетки-мишени являются члены (А) рецептора тирозин киназы или RKTs, семейства трансмембранных белков, которые проходят конститутивную интернализацию (эндоцитоз) на скорости, сходной со скоростью других интегральных мембранных белков (см. Goh и Sorkin, Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5: a017459 (2013)). Семейство RKTs описано Lemmon и Schlessinger, Cell 141(7): 1117-134 (2010). В таблице ниже перечислены в 20 семействах все 58 RTKs в протеоме человека, любой один или несколько из которых могут быть протестированы на предмет пригодности по изобретению, как описано выше (см. также фиг. 7).__________

Подсемейства RTK	Примеры RTKs
ЕгЬВ	EGFR, ErbB2, ЕгЬВЗ, ErbB4
Ins	InsR, IGF1R, InsRR
PDGF	PDGFRa, PDGFRp, CSFIR/Fms, Kit/SCFR, Fit3/Flk2
VEGF	VEGFRl/Fitl, VEGFR2/KDR, VEGFR3/Fit4
FGF	FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4
РТК7	PTK7/CCK4
Trk	TrkA, TrkB, TrkC
Ro г	Rorl, Ror2
MuSK	MuSK
Met	Met, Ron
Axl	Axl, Мег, ТугоЗ
Tie	Tiel, Tie2
Eph	EphAl-8, EphAlO, EphBl-4, EphB6
Ret	Ret
Ryk	Ryk
DDR	DDR1, DDR2
Ros	Ros
LMR	LMR1, LMR2, LMR3
ALK	ALK, LTK
STYK1	SuRTKl06/STYK1

Подобным образом примерами являются члены: (В) класс мембрансвязанных высокоаффинных фолат связывающих белков (фолатный рецептор), которые связывают фолат и восстановленные производные фолиевой кислоты и которые опосредуют доставку тетрагидрофолата во внутреннюю часть клеток, (С) подгруппа мембрансвязанных цитокиновых рецепторов, которые играют роль в интернализации когнатного цитокина, такого как IL13; (D) поверхностные антигены, такие как CD20, CD33, мезотелин и НМ1.24, которые экспрессируются на определенных раковых клетках и которые опосредуют интернализацию когнатных моноклональных антител, например ритуксимаб в случае CD20; и (Е) семейство рецепторов адгезии (интегрины), трансмембранные гликопротеины, которые перемещаются посредством эндосомального пути и являются более важными посредниками адгезии злокачественной клетки к внекле

- 16 032740 точному матриксу.

В соответствии с изобретением лиганд может быть любым полипептидом или полисахаридом, который демонстрирует желаемую специфичность или специфичности, в зависимости от случая. Предпочтительными лигандами являются антитела. В его настоящем применении термин антитело охватывает молекулу иммуноглобулина, полученную посредством in vitro или in vivo формирования иммуногенного ответа. Таким образом, категория антитело включает моноклональные антитела и гуманизированные антитела, такие как одноцепочечные фрагменты антител (scFv), биспецифические антитела и т.д. Большое количество различных биспецифических белков и лигандов на основе антител известны, как представлено в обзорной статье Caravella и Lugovskoy, Curr. Opin. Chem. Biol. 14: 520-28 (2010), которые включены в настоящий документ полностью в качестве ссылки. Антитела, пригодные в соответствии с настоящим изобретением, можно также получать посредством известных технологий рекомбинантной ДНК.

В качестве неограничивающего примера, таким образом, антитело, которое обладает специфичностью для поверхностного компонента, такого как опухолевый антиген, можно использовать, чтобы нацеливать мини-клетки на клетки в опухоли, на которые необходимо воздействовать, в соответствии с изобретением. Примеры рецепторов клеточной поверхности в отношении этого включают любой RTKs рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), рецептор фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR), рецептор фактора роста, выделенного из тромбоцитов (PDGFR), и рецептор инсулиноподобного фактора роста (IGFR), каждый из которых сильно экспрессируется в нескольких солидных опухолях, включая опухоли головного мозга и фолатный рецептор, который сверхэкспрессирован в некоторых гипофизарных аденомах. Такие биспецифичные лиганды могут быть нацелены также на мутантные или вариантные рецепторы, например рецептор IL-13Ra2, который экспрессируется в от 50 до 80% случаев мультиформной глиобластомы человека (см. Wykosky et al., Clin Cancer Res. 14:199-208 (2008), Jarboe et al., Cancer Res. 67: 7983-86 (2007), Debinski et al., J. Neurooncol. 48: 103-11 (2000) и Okada et al., J. Bacteriol. 176: 91722 (1994)), но который отличается от его физиологической копии IL4R/IL13R, экспрессируемой на нормальных тканях (см. Hershey J. Allergy Clin. Immunol. Ill: 677-90 (2003)). Таким образом, IL13Ra2, по существу, отсутствует на нормальных клетках головного мозга (см. Debinski и Gibo, Mol. Med. 6: 440-49 (2000)). Дополнительно опухоли, которые метастазируют в головной мозг, могут сверхэкспрессировать определенные рецепторы, которые также могут быть пригодными мишенями. Например, Da Silva et al., Breast Cancer Res. 12: R46 (1-13) (2010), продемонстрировал, что метастазы в головной мозг из рака молочной железы экспрессировали все члены HER семейства RTKs. HER2 был амплифицирован и сверхэкспрессирован в 20% метастазов в головном мозге, EGFR был сверхэкспрессирован в 21% метастазов в головном мозге, HER3 был сверхэкспрессирован в 60% метастазов в головном мозге и HER4 был сверхэкспрессирован в 22% метастазов в головном мозге. Интересно, что HER3 экспрессия была увеличена в злокачественных клетках молочной железы, находящихся в мозге.

(Н) Средства для увеличения уровней IFN-гамма.

Настоящие композиции и способы могут дополнительно включать средство, которое увеличивает уровень (например, уровень активность или экспрессии) IFN-гамма у пациента.

В одном из вариантов осуществления средство включает белок IFN-гамма или его аналог. Коммерческие продукты IFN-гамма, такие как Actimmune®, являются или будут доступными. Actimmune® является биоинженерной формой интерферона гамма, белок, который действует в качестве модификатора биологического ответа посредством стимуляции иммунной системы человека. Как указано выше, FDA одобрило Actimmune® для применения у детей и взрослых с хронической гранулематозной болезнью и тяжелым злокачественным остеопетрозом.

Продукция IFN-гамма контролируется посредством цитокинов, секретируемых посредством APCs, в первую очередь интерлейкина (IL)-12 и IL-18. Эти цитокины служат в качестве моста, соединяющего инфекцию и продукцию IFN-гамма при врожденном иммунном ответе. Распознавание макрофагами многих патогенов вызывает секрецию IL-12 и хемокинов. Эти хемокины привлекают NK клетки к участку воспаления, и IL-12 способствует синтезу IFN-гамма в этих клетках. В макрофагах, NK и Т клетках, комбинация стимуляции IL-12 и IL-18 дополнительно увеличивает продуцирование IFN-гамма. Таким образом, любой из этих белков или их комбинаций являются пригодными средствами для целей этого изобретения.

Отрицательные регуляторы продукции IFN-гамма включают IL-4, IL-10, трансформирующий фактор роста-β, и глюкокортикоиды. Белки или нуклеиновые кислоты, которые ингибируют эти факторы способны стимулировать продуцирование IFN-гамма.

Также пригодными для использования в этом контексте являются полинуклеотиды, которые кодируют IFN-гамма или гены, которые активируют продуцирование и/или секрецию IFN-гамма.

Средство, которое увеличивает уровень IFN-гамма, также может быть вирусной вакциной. Доступными является ряд вирусных вакцин, которые могут вызывать продуцирование IFN-гамма не вызывая инфекции или других типов неблагоприятных воздействий. Примерами такого класса вирусной вакцины является вакцина против гриппа.

- 17 032740

Полученные данные демонстрируют, что концентрация IFN-гамма в сыворотке, требуемая для эффективной активации иммунного ответа хозяина на опухолевые клетки, является низкой, когда пациент также получает загруженные лекарственным средством нацеленные с применением биспецифических антител мини-клетки или убитые бактериальные клетки. Таким образом, в одном из аспектов методология изобретения вызывает увеличивает концентрации IFN-гамма в сыворотке, которая составляет не больше чем приблизительно 30,000 пг/мл. В другом аспекте концентрация IFN-гамма в сыворотке увеличена до уровня не выше чем приблизительно 5000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 или 100 пг/мл. В дополнительном аспекте полученная концентрация IFN-гамма в сыворотке составляет по меньшей мере приблизительно 10 пг/мл или по меньшей мере приблизительно 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400 или 500 пг/мл.

В соответствии с некоторыми аспектами средство является белком IFN-гамма, сконструированным белком или его аналогом. В некоторых аспектах введение достигает приблизительно от 0.02 нг до 1 мкг IFN-гамма на мл крови хозяина. В одном из аспектов полученная концентрация IFN-гамма в крови хозяина составляет приблизительно от 0.1 нг до приблизительно 500 нг на мл, или приблизительно от 0.2 нг до приблизительно 200 нг на мл, или приблизительно от 0.5 нг до приблизительно 100 нг на мл, или приблизительно от 1 нг до приблизительно 50 нг на мл, или приблизительно от 2 нг до приблизительно 20 нг на мл. Терапевтическую дозу IFN-гамма в композиции по настоящему изобретению можно определять таким образом.

(I) Составы и способы введения и распорядок введения.

Составы композиции по изобретению могут быть представлены в стандартной лекарственной форме, например в ампулах, или флаконах, или в многодозных контейнерах, с или без введения консерванта. Состав может быть раствором, суспензией или эмульсией в масляном или водном носителях и может содержать вспомогательные вещества, такие как суспендирующее, стабилизирующее и/или диспергирующее средства. Пригодный раствор является изотоничным с кровью реципиента, и его примерами являются физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Альтернативно, составы могут быть в форме лиофилизированного порошка для растворения с применением пригодного носителя, например стерильной, апирогенной воды или физиологического раствора. Составы также могут быть в форме препаратов замедленного всасывания. Только длительно действующие составы можно вводить посредством имплантации (например, подкожно или внутримышечно) или посредством внутримышечной инъекции.

В некоторых аспектах представлена композиция, содержащая мини-клетки или убитые бактериальные клетки, которая включает терапевтически эффективное количество противоракового средства. Терапевтически эффективное количество противоракового средства является дозой обсуждаемого средства, например siRNA или химиотерапевтического лекарственного средства, которое вызывает фармакологический ответ при введении индивидууму, в соответствии с настоящим изобретением.

В некоторых аспектах представлена композиция, которая включает терапевтически эффективное количество средства, которое увеличивает уровень IFN-гамма. В некоторых аспектах представлен набор, который включает и мини-клетку, и убитую бактериальную клетку, как описано, и средство, которое увеличивает уровень IFN-гамма.

В отношении настоящего изобретения, таким образом, терапевтически эффективное количество, которое может быть измерено посредством эталонной величины для предотвращения или уменьшения интенсивности опухоли или симптома опухоли, или в модели на животных, или у человека, когда миниклетки или убитые бактериальные клетки, несущие терапевтическое средство, вводят, как дополнительно описано ниже. Количество, которое является терапевтически эффективным количеством в данном примере для конкретного индивидуума, может не быть эффективным для 100% индивидуумов, сходным образом получавших лечение от этой опухоли, даже хотя такая дозировка признана терапевтически эффективным количеством квалифицированными врачами. Подходящая дозировка в этом отношении также будет варьировать в качестве функции, например типа, стадии и тяжести опухоли. Подобно этому когда термин терапевтически эффективный применяют в отношении числа мини-клеток в фармацевтической композиции, количество может быть установлено на основе того, что противораковое средство упаковывают в мини-клетки и эффективности этого средства при лечении опухоли. Терапевтический эффект в отношении этого можно измерять с применением клинических или патологических параметров, таких как масса опухоли. Снижение или сниженное увеличение массы опухоли, таким образом, можно использовать для измерения терапевтических эффектов.

В отношении средства, которое увеличивает уровень IFN-гамма, терапевтически эффективное количество может относиться к количеству средства, которое при введении достигает желаемой концентрации в крови хозяина, как представлено supra.

Составы по изобретению можно вводить посредством различных путей и в различные участки тела млекопитающего для достижения желаемого терапевтического эффекта(ов) или местно, или системно. В конкретном аспекте путь введения является внутривенной инъекцией.

В основном составы по изобретению можно использовать в соответствующих дозировках, определенных посредством стандартного тестирования, для достижения оптимального физиологического эф- 18 032740 фекта, в то же время минимизируя потенциальную токсичность. Режим дозирования можно выбирать в соответствии с различными факторами, включая возраст, вес, пол, состояние здоровья пациента; тяжесть или степень опухоли, путь введения и функцию почек и печени пациента.

Оптимальная точность достижения концентрации мини-клеток, убитых бактериальных клеток и терапевтического средства в диапазоне, который обеспечивает максимальную эффективность с минимальными побочными эффектами может и, как правило, будет требовать схемы введения на основе кинетики доступности средства для нацеливания на участки и клетки-мишени. Распределение, равновесие и элиминация мини-клеток или средства может рассматриваться при определении оптимальной концентрации для схемы лечения. Дозировка мини-клеток и терапевтического средства соответственно может быть приспособлена для достижения желаемых эффектов.

Кроме того, введение доз составов может быть оптимизировано с применением фармакокинетической/фармакодинамической моделирующей системы.

Таким образом, один или несколько режимов дозирования может быть выбран, и фармакокинетическую/фармакодинамическую модель можно использовать для определения фармакокинетического/фармакодинамического профиля одного или нескольких режимов дозирования. На основе такого конкретного профиля можно выбирать один из режимов дозирования для введения, при котором достигается желаемый фармакокинетический/фармакодинамический ответ (например, см. WO 00/67776).

Мини-клетки или убитые бактериальные клетки, загруженные противораковым средством и средством, которое увеличивает уровень IFN-гамма, можно вводить одновременно, или в комбинации с составом или в качестве отдельных композиций, или последовательно одно за другим. При последовательном введении мини-клетки или убитые бактериальные клетки можно вводить до средства, которое увеличивает уровень IFN-гамма, или после. В одном из аспектов, когда мини-клетки или убитые бактериальные клетки достигают максимального уровня в плазме или эффективного уровня в плазме после введения, хозяин получает или сохраняет минимальный уровень IFN-гамма. Такой минимальный уровень является таким, который требуется для возникновения синергизма между композициями. Это может быть достигнуто посредством введения средства, которое увеличивает уровень IFN-гамма перед введением мини-клеток или убитых бактериальных клеток, или посредством введения средства сразу же после того как ввели мини-клетки или убитые бактериальные клетки, конкретно в относительно высокой дозе. Следует отметить, что введение обеих композиций может быть последовательным. В этом отношении введение вызывает постоянное воздействие на хозяина и мини-клеток или убитых бактериальных клеток, и средства, которое увеличивает IFN-гамма.

Состав или комбинацию составов по изобретению можно вводить по меньшей мере раз в неделю пациенту с опухолью в течение курса в несколько недель. Таким образом, состав можно вводить по меньшей мере раз в неделю в течение периода от нескольких недель от нескольких месяцев.

Более конкретно, составы по изобретению можно вводить по меньшей мере раз в день в течение приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или 31 суток. Альтернативно, составы можно вводить приблизительно один раз ежесуточно или приблизительно один раз каждые 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или 31 суток или более.

В другом варианте осуществления по изобретению составы можно вводить приблизительно один раз еженедельно или приблизительно один раз каждые 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 недель или более. Альтернативно, составы можно вводить по меньшей мере один раз еженедельно в течение приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 недель или более.

Альтернативно, составы можно вводить приблизительно один раз каждый месяц или приблизительно один раз каждые 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев или более.

Составы можно вводить в однократной суточной дозе. Альтернативно, общую суточную дозу можно вводить в дробных дозах два, три или четыре раза ежесуточно.

Следующие примеры приводятся в качестве иллюстрации, скорее чем в качестве ограничивающих примеров и представляют более полное понимание этого изобретения.

Пример 1. Уменьшение размера опухоли коррелировало с уровнем интерферона-гамма.

Этот пример демонстрирует, что уменьшение объемов опухолей в головном мозге у собак, проходящих лечение с загруженными лекарственным средством мини-клетками, коррелировало с уровнем экспрессии интерферона-гамма (IFNy). Этот пример однако позволяет предположить, что IFN-гамма увеличивает эффективность загруженных лекарственным средством мини-клеток. Предоставляя низкие количества необходимого IFN-гамма, этот пример дополнительно предполагает синергизм между IFNгамма и загруженными лекарственным средством, нацеленными с применением биспецифических антител мини-клетками.

Материалы и способы.

Получение и дозировка доксорубицинзагруженных мини-клеток, нацеленных на EGFR собак.

Мини-клетки получали из мутантов Salmonella enterica серовар Typhimurium с хромосомной делецией minCDE, очищенных S. typhimurium, загруженных доксорубицином (dox) и нацеленных посредст

- 19 032740 вом присоединения биспецифического моноклонального антитела (MAb), имеющих специфичности поверхностного O-полисахарида против мини-клеток и против EGFR собаки (спроектированные ^EGFR миниклетки Dox).

Собаки в этом исследовании были домашними собаками, являвшимися пациентами Veterinary Specialist Centre (VSC) или Small Animal Specialist Hospital (SASH), в Сиднее, Австралия. Пациентам предлагали участие в исследовании, когда владелец собаки отказывался от стандартной терапии, в случае запущенного заболевания, где не существовало никакой значимой стандартной терапии. Собак лечили в соответствии с рекомендациями, опубликованными Советом по медицинским исследованиям и общественному здравоохранению (Австралия) для здравоохранения и использования лабораторных животных, и с одобрения комитета по этике отношения к животным EnGeneIC. От всех владельцев получали подписанное информированное согласие.

Все опухоли головного мозга были диагностированы посредством гистологии или цитологии при возможности. Прижизненный диагноз основывался на комбинации характерных признаков на магнитнорезонансной томографии (MRI) и клинических признаках. Г истологический диагноз был признан слишком инвазивным в этих случаях опухолей головного мозга, и диагноз был подтвержден некропсией.

Лечение с применением 1x10^{10 EGFR} мини-клетки _Dox на дозу проводили на еженедельной основе. Препарат вводили посредством асептически установленного катетера на периферической вене (левая цефалическая) в объеме 2 мл в течение 2-минутной инфузии.

MRI опухоли.

Получение изображений опухоли проводили методом магнитно-резонансной томографии с применением сканера Philips 1. 5Т Achieva. Протокол исследования был выполнен на 8-канальной катушке для головы или на 8-канальной катушке для колена в зависимости от размера собаки (для маленьких собак использовалась катушка для колена).

Последовательности получали в режимах: сагиттальном Т1, аксиальном Т2, режиме градиентного эхо в коронарной проекции, режиме диффузно-взвешенных изображений (DWI) в аксиальной проекции до контрастного усиления, волюметрическом режиме с подавлением сигнала от свободной жидкости (FLAIR) в коронарной проекции, режиме Т1 взвешенных изображений после контрастного усиления (гадолинием) в трех проекциях.

IFN-гамма твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA).

Кровь забирали до введения дозы мини-клеток, и сыворотку получали непосредственно из ветеринарной клиники.

Измерение IFN-гамма производили в двух повторениях с применением набора Canine IFN-gamma DuoSet ELISA Kit от Development System (#DY781B) в соответствии с инструкцией производителя.

Результаты.

Результаты в отношении изменения объема опухоли у трех собак, получавших лечение миниклетками, представлены на фиг. 1А-1С. Линейные графики представляют измерение опухоли (левая ось у=объем в (мм³) или самый длинный диаметр (мм)) в качестве функции числа доз мини-клеток (ось х). Крестики отражают дозы, при которых опухоли были визуализированы и измерены посредством магнитно-резонансной томографии (MRI).

Во время лечения две собаки продемонстрировали резкое сокращение объемов опухолей в определенные периоды лечения (собаки А и В на фиг. 1А и 1В). Было неожиданно обнаружено, что собаки страдали от вирусных инфекций во время этих периодов. Среди ряда параметров, проверенных на предмет связи с вирусной инфекцией, было выявлено, что концентрация IFN-гамма в сыворотке сильно коррелировала со скоростью уменьшения объема опухоли.

На каждой из фиг. 1А-1С треугольные метки отражают уровни интерферона гамма (IFNy) в сыворотке, измеренные в указанных дозах посредством ELISA. Ось у справа обозначает уровни IFN-гамма в пг/мл. Когда проводили анализ, но IFN-гамма был ниже предела детекции анализа (<56 пг/мл), измерительные точки представлены посредством треугольных меток при 0 пг/мл. Когда были сделаны измерения длины (l), ширины (w) и высоты (h) опухоли, объем опухоли (V) рассчитывали с применением эллипсоидной формулы (V=(n/6)xlxwxh).

Эти фигуры, таким образом, продемонстрировали сильную корреляцию между уровнями IFN-гамма сыворотки и скоростью уменьшения объема опухоли головного мозга. Что также является удивительным, это то, что любые детектируемые уровни IFN-гамма привели к увеличению противоопухолевого ответа. Самый низкий уровень IFN-гамма составлял приблизительно 500 пг/мл при дозе 41 у собак В (фиг. 1В). Такой сильнодействующий эффект IFN-гамма на лечение опухоли загруженными лекарственным средством мини-клетками является сильным показателем синергизма между ними.

Пример 2. Значительная регрессия опухоли в ксенотрансплантатах (альвеолярная аденокарцинома человека) у мыши после лечения с применением ^EGFR мини-клетки _Dox и IFN-гамма.

Этот пример демонстрирует, что комбинированное лечение с применением нацеленных с применением биспецифических лигандов и загруженных доксорубицином интактных мини-клеток с IFN-гамма может действовать на регрессию ксенотрансплантатов альвеолярной аденокарциномы человека, уста

- 20 032740 новленных у 6-недельных самок бестимусных голых мышей.

Как описано выше, мини-клетки получали из штамма S. typhimurium с мутацией minCDE и очищали с применением градиентного центрифугирования/филаментации/фильтрации/процедуры удаления эндотоксинов, предварительно описанного в MacDiarmid et al. (2007). Очищенные мини-клетки загружали химиотерапевтическим лекарственным средством доксорубицином, так же как у MacDiarmid et al. (2007).

Биспецифическое антитело (BsAb) являлось единичным полипептидом, обладавшим специфичностью связывания соответственно для О-полисахарида S. typhimurium, присутствующего на мини-клетках, и для EGFR человека, сверхэкспрессированных на клетках альвеолярной аденокарциномы. Специфичность О-полисахарида была получена из моноклонального антитела мыши, для которого вариабельные области выделяли из гибридомной клеточной линии и была представлена в качестве одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv). Гибридомную клеточную линию получали посредством имммунизации мышей с применением очищенных LPS и слияния лимфоцитов с опухолевыми клетками. Следовательно, клоны были скринированы на предмет способности антител связывать О-полисахарид. EGFR специфичность, также представленная в качестве scFv, была получена из коммерческого антитела Эрбитукс® (Bristol Myers Squibb, USA). Два компонента scFv разделяли посредством гибкого линкера и 6xHis маркера, включенных в N-конец, чтобы усилить очистку посредством металл-аффинной хроматографии, и c-myc маркер на С-конце, чтобы достичь дополнительной детекции. Линкеры, соединяющие scFv компоненты, хорошо известны, о чем свидетельствует Gall et al., Protein Engineering, Design and Selection 17: 357-66 (2004), например.

Экспрессирующий вектор, кодирующий BsAb, содержит hCMV промотор для высокоуровневой экспрессии и сигнальный пептид для секреции BsAb в среду для культивирования клеток. Экспрессирующий вектор, кодирующий BsAb, стабильно трансфицировался в суспензию адаптированных клеток яичника китайского хомячка (СНО) в среде с определенным химическим составом, свободной от белка и веществ животного происхождения, и белок экспрессируется в течение 10 дней в культуре.

Две хроматографические колонки применяли для очищения антитела: колонка для металлаффинной хроматографии (IMAC- HisTrap Excel) и колонка для гидроксиапатитной хроматографии (BioRad CHT I). Этот подход достигал >98% очистки антител. Для вирусной безопасности продукта антитело было подвергали инактивации растворителем/детергентом с применением TNBP/твин и вирусной фильтрации. Конечный выход антител составлял 10 мг из 1 л супернатанта клеточной культуры.

Мыши, применяемые в этом примере, приобретали в Animal Resources Centre (Перт, Австралия), и все эксперименты на животных проводили в соответствии с руководством по уходу за и применению лабораторных животных, 8^th ed. (National Academies Press, 2011) и с одобрения комитета по этике отношения к животным. Эксперименты проводили в NSW Agriculture-accredited small animal facility в EnGeneIC Ltd. (Сидней, Австралия).

Клетки альвеолярной аденокарциномы человека (А549, АТСС) выращивали в тканевой культуре до полной конфлюэнтности в Т-75 флаконах в среде GIBCO®-RPMI 1640, продукт Life Technologies (Carlsbad, CA, USA), с добавлением 5%-ной телячьей сыворотки и глутамина, во увлажненной атмосфере 95% воздуха и 5% CO₂ при 37°C. Клетками (1x10⁶) в 50 мкл бессывороточной среды с 50 мкл фактора роста заполняли Matrigel®, продукт BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ). Клетки затем инъецировали подкожно с применением иглы 23-размера между лопатками каждой мыши.

Полученные опухоли измеряли дважды в неделю с применением цифрового штангенциркуля (Mitutoyo, Japan, с точностью измерений +/-0.001 дюйм), и средний объем опухоли рассчитывали по формуле

Лечение, начатое когда опухоли достигли среднего значения ~285 мм³, и мыши были рандомизированы на четыре различные группы по семь мышей на группу. Все препараты вводили внутривенно (i.v.) в общем объеме 100 мкл. Все дозы мини-клеток содержали 1x10⁹ мини-клеток соответствующего типа.

В отношении экспериментального дизайна группа 1 (контрольная) не получала стерильного физиологического раствора. Группа 2 (контрольная) получала IFN-гамма (0,5x10⁴ IU) на дозу. Группа 3 (контрольная) получала ^EGFR мини-клетки Dox. Группа 4 (экспериментальная) получала ^EGFR мини-клетки Dox и IFN-гамма (0,5 x10⁴ IU) на дозу.

Результаты (фиг. 2) продемонстрировали, что мыши, получавшие лечение ^EGFR мини-клетками Dox (группа 3), достигли стабилизации опухоли. В отличие от этого мыши, получавшие лечение ^EGFR миниклетками Dox и IFN-гамма (группа 4), продемонстрировали высокозначимую регрессию опухоли к 43 дню, всего после 6 доз. Мыши, получавшие лечение только IFN-гамма (группа 2), не продемонстрировали противоопухолевую эффективность, и опухоли росли в группе, получавшей лечение физиологическим раствором (группа 1).

Пример 3. Значительная регрессия опухолевых ксенотрансплантатов у мышей (рак молочной железы человека - средний размер опухоли ~145 мм³) после лечения ^EGFR мини-клетками _Dox и IFN-гамма.

Этот пример демонстрирует, что комбинированное лечение нацеленных с применением биспецифических лигандов и загруженных доксорубицином интактных мини-клеток с IFN-гамма может оказать

- 21 032740 воздействие на регрессию ксенотрансплантатов рака молочной железы человека, установленных у 6недельных самок бестимусных голых мышей.

Как описано выше, мини-клетки очищали, загружали доксорубицином и нацеливали с применением одноцепочечного биспецифического антитела со специфичностями против O-полисахарида и против EGFR. Дополнительно клетки рака молочной железы человека (MDA-MB-468; АТСС) были установлены в качестве ксенотрансплантатов у мышей nu/nu, и объемы опухолей измеряли, так же как описано.

Лечение, начатое когда опухоли достигли средней величины ~145 мм³, и мышей рандомизировали на четыре различные группы по семь мышей в группе. Все препараты вводили i.v. в общем объеме 100 мкл. Все дозы мини-клеток содержали 1 х 10⁹ мини-клеток соответствующего типа.

Эксперимент был спланирован следующим образом: группа 1 (контрольная) получала только стерильный физиологический раствор, группа 2 (контрольная) получала IFN-гамма (0,5х10⁴ IU) на дозу, группа 3 (контрольная) получала ^EGFR мини-клетки Dox, группа 4 (экспериментальная) получала ^EGFR миниклетками Dox и IFN-гамма (0,5х 10⁴ IU) на дозу.

Результаты, представленные на фиг. 3, продемонстрировали, что мыши, получавшие лечение с применением ^EGFR мини-клеток Dox (группа 3), достигли стабилизации опухоли, но приблизительно к 25 суткам опухоли начали расти опять, возможно из-за развития устойчивости к доксорубицину. В отличие от этого мыши, получавшие лечение с применением ^EGFR мини-клеток Dox и IFN-гамма (группа 4), продемонстрировали высокозначимую регрессию опухоли, и к 30 суткам эти опухоли всего после 6 доз были более похожи на рубцы на тканях. Мыши, получавшие лечение с применением только IFN-гамма (группа 2), не продемонстрировали противоопухолевую эффективность, и опухоли росли как в группе, получавшей лечение физиологическим раствором (группа 1).

Пример 4. Значительная регрессия опухоли в ксенотрансплантатах у мыши (рак молочной железы человека - большие опухоли ~250 мм³) после лечения ^EGFR мини-клетками _Dox и IFN-гамма.

Этот пример демонстрирует, что комбинированное лечение нацеленными с применением биспецифических лигандов и загруженных доксорубицином интактных мини-клеток с IFN-гамма может воздействовать на регрессию даже опухолевые ксенотрансплантаты рака молочной железы человека большого размера (~250 мм³), установленные у 6-недельных самок бестимусных голых мышей.

Как описано выше, мини-клетки очищали, загружали доксорубицином и нацеливали с применением одноцепочечных биспецифических антител со специфичностями против О-полисахарида и против EGFR. Клетки рака молочной железы человека (MDA-MB-468) были установлены в качестве ксенотрансплантатов у мышей nu/nu, и объемы опухолей измеряли, так же как описано выше.

Лечение начинали когда опухоли достигали в среднем ~250 мм³. Как указано выше, мышей рандомизировали на четыре различные группы по семь мышей в группе, i.v. введение и дозы мини-клеток были такими же, как указано выше.

Эксперимент был спланирован следующим образом.

Группа 1 (контрольная) получала только стерильный физиологический раствор. Группа 2 (контрольная) получала IFN-гамма (0,5х10⁴ IU) на дозу. Группа 3 (контрольная) получала ^EGFR мини-клетки Dox. Группа 4 (экспериментальная) получала ^EGFR мини-клетки Dox и IFN-гамма (0,5х 10⁴ IU) на дозу.

Результаты, представленные на фиг. 4, продемонстрировали, что мыши, получавшие лечение ^EGFR мини-клетками Dox (группа 3), достигали регрессии опухоли, но на ~23 сутки опухоли стали расти снова; как и ранее, развитие устойчивости к доксорубицину было наиболее вероятной причиной. С другой стороны, мыши, получавшие лечение ^EGFR мини-клетками Dox и IFN-гамма (группа 4), продемонстрировали высокозначимую регрессию опухоли, и после всего 3 доз (т.е. на 28 сутки) эти опухоли были больше похожи на рубцы на ткани. Мыши, получавшие лечение только IFN-гамма (группа 2), продемонстрировали отсутствие противоопухолевой эффективности, и опухоли росли как в группе, получавшей физиологический раствор (группа 1).

Пример 5. Регрессия опухоли в ксенотрансплантатах мыши (рак молочной железы человека - очень большие опухоли ~от 250 до 600 мм³) после лечения с применением ^EGFR мини-клеток _Dox и IFN-гамма.

Этот пример демонстрирует, что комбинированное лечение нацеленными с применением биспецифических лигандов и загруженных доксорубицином интактных мини-клеток с IFN-гамма может воздействовать на регрессию даже при очень большом размере опухолевых ксенотрансплантатов рака молочной железы человека (~от 250 до 600 мм³), установленных у 6-недельных самок бестимусных голых мышей.

Как описано выше, мини-клетки очищали, загружали доксорубицином и нацеливали с применением одноцепочечного биспецифического антитела со специфичностями против O-полисахарида и против EGFR. Так же как описано, клетки рака молочной железы человека (MDA-MB-468) устанавливали в качестве ксенотрансплантатов у мышей nu/nu, и измеряли объемы опухолей.

Препараты вводили, когда опухоли достигали ~от 250 до 600 мм³. Отдельным мышам вводили ^EGFR мини-клетки _Dox и IFN-гамма (0,5х10⁴ IU) на дозу. Все препараты вводили i.v. в общем объеме 100 мкл, и все дозы мини-клеток содержали 1 х 10⁹ мини-клеток соответствующего типа.

Результаты изображены на фиг. 5. Невзирая на большой размер опухоли все четыре мыши достигли

- 22 032740 регрессии опухоли. Это демонстрирует что даже очень большие опухоли (~600 мм³), где мыши будут подвергнуты эвтаназии, могут быть эффективно вылечены с применением комбинации ^EGFR мини-клеток _Dox и IFN-гамма (0,5х10⁴ IU).

Пример 6. Значительная регрессия опухоли в ксенотрансплантатах мыши (альвеолярной аденокарциномы человека) после лечения ^EGFR мини-клетками _Dox и двух уровней доз IFN-гамма.

Этот пример демонстрирует, что комбинированное лечение нацеленными с применением биспецифических лигандов и загруженных доксорубицином интактных мини-клеток с IFN-гамма в двух различных уровнях доз может повлиять на регрессию ксенотрансплантатов альвеолярной аденокарциномы человека, установленных у 6-недельных самок бестимусных голых мышей.

Как описано выше, мини-клетки очищали, загружали доксорубицином и нацеливали с применением одноцепочечного биспецифического антитела со специфичностями против O-полисахарида и против EGFR. Клетки альвеолярной аденокарциномы (А549) были установлены в качестве ксенотрансплантатов у мышей nu/nu, и объемы опухолей измеряли, так же как описано выше.

Препараты вводили когда опухоли достигали в среднем ~100 мм³, и мышей рандомизировали на четыре различные группы по семь мышей в группе. Все препараты вводили i.v. в общем объеме 100 мкл. Все дозы мини-клеток содержали 1 х 10⁹ мини-клеток соответствующего типа.

Группа 1 (контрольная) не получала никакого стерильного физиологического раствора. Группа 2 (контрольная) получала ^EGFR мини-клетками Dox (два раза в неделю). Группа 3 (экспериментальная) получала ^EGFR мини-клетки Dox и IFN-гамма (0,75х10⁴ IU) на дозу два раза в неделю. Группа 4 (экспериментальная) получала ^EGFR мини-клетки _Dox и IFN-гамма (0,5х 10⁴ IU) на дозу три раза в неделю.

Как продемонстрировано на фиг. 6, мыши, получавшие лечение с применением ^EGFR мини-клеток Dox и IFN-гамма в обоих дозах (0,5х10⁴ IU и 0,75х10⁴ IU; группы 3 и 4), достигли стабилизации опухоли. В отличие от этого мыши, получавшие лечение ^EGFR мини-клетками Dox (группа 2), не продемонстрировали никакой противоопухолевой эффективности, и опухоли росли как в группе, получавшей физиологический раствор (группа 1). Эти данные демонстрируют, что комбинирование IFN-гамма с ^EGFR миниклетками _Dox было существенным для обоих уровней доз IFN-гамма для достижения стабилизации опухоли при лечении опухолей, которые в норме являются устойчивыми как при лечении IFN-гамма в отEGFR дельности, так и при лечении мини-клетки Dox в отдельности.

Claims (15)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ лечения опухоли у индивидуума, включающий введение индивидууму:

   a) первой композиции, содержащей множество полученных из бактерий интактных мини-клеток или интактных убитых бактериальных клеток, каждая из которых содержит противораковое средство и несет лиганд на поверхности, где лиганд обладает специфичностью к рецептору поверхности нефагоцитарных клеток млекопитающего, и

   b) второй композиции, содержащей интерферон-гамма (IFN-гамма) или средство, которое увеличивает экспрессию IFN-гамма у индивидуума.
2. 2. Способ по п.1, где вторая композиция содержит очищенный белок IFN-гамма.
3. 3. Способ по п.1, где вторая композиция содержит вирусную вакцину.
4. 4. Способ по п.1, где вторая композиция содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую IFN-гамма.
5. 5. Способ по любому из пп.1-4, где первая композиция содержит приблизительно от 10⁹ до приблизительно 10¹⁰ мини-клеток или убитых бактериальных клеток.
6. 6. Способ по любому одному из пп.1-5, где противоопухолевым средством является радионуклид.
7. 7. Способ по любому одному из пп.1-6, где противоопухолевым средством является химиотерапевтическое лекарственное средство.
8. 8. Способ по п.7, где химиотерапевтическое лекарственное средство является низкомолекулярным лекарственным средством, имеющим молекулярную массу менее чем приблизительно 900 Да.
9. 9. Способ по п.8, где низкомолекулярное лекарственное средство является цитотоксическим.
10. 10. Способ по п.9, где низкомолекулярное лекарственное средство является производным морфолинил антрациклина.
11. 11. Способ по п.10, где низкомолекулярное лекарственное средство является PNU-159682.
12. 12. Способ по любому одному из пп.1-7, где указанное противораковое средство является функциональной нуклеиновой кислотой или полинуклеотидом, из которого транскрибируется функциональная нуклеиновая кислота, где функциональная нуклеиновая кислота выбрана из группы, состоящей из siRNA, miRNA, shRNA, lincRNA, антисмысловой RNA и рибозима.
13. 13. Способ по п.12, где указанная функциональная нуклеиновая кислота ингибирует ген, который способствует пролиферации клеток, ангиогенезу или устойчивости к химиотерапии опухоли и/или который ингибирует апоптоз или арест клеточного цикла.
14. 14. Набор для осуществления способа по пп.1-13, содержащий первую композицию, содержащую множество полученных из бактерий интактных мини-клеток или интактных убитых бактериальных клеток, каждая из которых содержит противораковое средство и несет лиганд на поверхности, где лиганд

    - 23 032740 обладает специфичностью к рецептору на поверхности нефагоцитарной клетки млекопитающего, и вторую композицию, содержащую интерферон-гамма (IFN-гамма) или средство, которое увеличивает экспрессию IFN-гамма у индивидуума.
15. 15. Композиция для лечения опухоли у индивидуума, содержащая: (а) множество полученных из бактерий интактных мини-клеток или интактных убитых бактериальных клеток, каждая из которых содержит противораковое средство и несет лиганд на поверхности, где лиганд обладает специфичностью к рецептору поверхности нефагоцитарной клетки млекопитающего, и (b) интерферон-гамма (IFN-гамма) или средство, которое повышает экспрессию IFN-гамма у индивидуума.