ES2380612T3 - Minicélulas intactas como vectores para transferencia de ADN y terapia génica in vitro e in vivo - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende (i) minicélulas bacterianas intactas recombinantes y (ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable para las mismas, en la que dichas minicélulas bacterianas intactas contienen un plásmido que comprende una secuencia de ADN que codifica un producto de expresión de péptido o polipéptido terapéutico, y en la que dicha composición está libre de contaminantes de 0,2 μm o menos de tamaño

Description

Minicélulas intactas como vectores para transferencia de ADN y terapia génica in vitro e in vivo

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a la administración, por medio de minicélulas bacterianas intactas, de oligonucleótidos y polinucleótidos a células huésped, particularmente, pero no exclusivamente, en el contexto de terapia génica. La invención también se refiere a un procedimiento farmacéuticamente compatible para purificar minicélulas bacterianas intactas.

Una patente de EE.UU. concedida a Salser y col., nº 4.497.796, esclarece diversos enfoques tempranos disponibles en aproximadamente 1980 para transformar células de mamífero. En particular, Salser y col. desvelan la transferencia de un gen que codifica dihidrofolato-reductasa, que confiere resistencia a metrotrexato, a células L1210 de ratón o células de la médula ósea, por la técnica de co-precipitación de ADN con fosfato de calcio.

Salser y col. también mencionan “[otras] varias formas ... para la inserción de materiales genéticos en células” que incluyen, además de “vectores víricos”, ciertas técnicas de fusión de células: “fusión célula-célula que implica la fusión de células de un número limitado de cromosomas envueltos en membranas nucleares;... fusión de minicélulas;...fusión con protoplastos bacterianos que contienen ADN de plásmido; y fusión con fantasmas de eritrocitos encapsidados con ADN” (columna 5, líneas 18 - 30; citas omitidas). Común a estas técnicas es el uso de una estructura celular que contiene ADN, delimitada por una única membrana, es decir, puesta en contacto con una célula diana de mamífero en presencia de un agente promotor de la fusión de membranas tal como polietilenglicol (PEG). La célula de mamífero y la estructura celular se fusionan, formando una célula híbrida, y el ADN contenido en esta última se libera en el citoplasma de la primera y se transporta al núcleo del híbrido, que luego puede expresar el ADN.

La divulgación de Salser menciona “fantasmas de eritrocitos”, restos de eritrocitos que carecen de contenidos citoplásmicos pero que retienen la morfología original, y “protoplastos bacterianos”, o células bacterianas de las que se ha despojado la membrana externa (pared celular), normalmente por la acción de una enzima lítica o un antibiótico que inhibe la síntesis de peptidoglicanos. Salser y col. también aluden el uso de un tercer tipo de estructura celular simplificada, un protoplasto de minicélulas.

Una minicélula es una forma anucleada de una célula de E. coli u otra célula bacteriana, engendrada por una alteración en la coordinación, durante la fisión binaria, de la división celular con segregación de ADN. La replicación cromosómica procariota está ligada a fisión binaria normal, que implica formación de tabique en el centro de la célula. En E. coli, por ejemplo, la mutación de genes min, tales como minCD, puede eliminar la inhibición de la formación de tabique en los polos celulares durante la división celular, produciendo la producción de una célula hija normal y una minicélula anucleada (de Boer y col., 1992; Rapiel & de Boer, 1999; Hu & Lutkenhaus, 1999; Harry, 2001).

Además de las mutaciones del operón min, las minicélulas anucleadas también se generan siguiendo una gama de otras transposiciones o mutaciones genéticas que afectan la formación del tabique, por ejemplo, en divIVB1 en B. subtilis (Reeve y Cornett, 1975; Levin y col., 1992). Las minicélulas también pueden formarse siguiendo una perturbación en los niveles de expresión génica de proteínas implicadas en la división celular/segregación de cromosomas. Por ejemplo, la expresión en exceso de minE conduce a división polar y producción de minicélulas. De manera similar, las minicélulas sin cromosomas pueden resultar de defectos en la segregación de cromosomas, por ejemplo, la mutación smc en Bacillus subtilis (Britton y col., 1998), deleción de spoOJ en B. subtilis (Ireton y col., 1994), mutación mukB en E. coli (Hiraga y col., 1989) y mutación parC en E. coli (Stewart y D'Ari, 1992). Los productos génicos pueden suministrarse en trans. Si se expresan en exceso a partir de un plásmido de alto número de copias, por ejemplo, CafA puede potenciar la tasa de división celular y/o inhibir el reparto de cromosomas después de la replicación (Okada y col., 1994), produciendo la formación de células encadenadas y minicélulas anucleadas (Wachi y col., 1989; Okada y col., 1993).

Las minicélulas son distintas de otras vesículas pequeñas que se generan y se liberan espontáneamente en ciertas situaciones y, a diferencia de las minicélulas, no son debidas a transposiciones genéticas específicas o a expresión génica episómica. A modo de ejemplo de tales otras vesículas son bullas bacterianas, que son vesículas de membrana pequeñas (Dorward y col., 1989). Se han observado bullas en varias especies bacterianas de, por ejemplo, Agrobacterium, Bacillus, Bordetella, Escherichia, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella y Shigella. Las bullas bacterianas pueden producirse, por ejemplo, por manipulación del entorno de crecimiento (Katsui y col., 1982) y mediante el uso de agentes desestabilizantes de membranas exógenas (Matsuzaki y col., 1997).

Existen otros componentes subbacterianos tales como fantasmas bacterianos (Lubitz y col., 1999), que son envueltas bacterianas vacías formadas en una variedad de bacterias Gram-negativas cuando el gen E de lisis phiX174 se expresa. Los fantasmas bacterianos se forman a partir de una estructura en túnel transmembrana mediante una envuelta de la célula bacteriana. Debido a la alta presión osmótica dentro de la célula, el contenido citoplásmico es expulsado al medio circundante, conduciendo a una envoltura de la célula bacteriana vacía.

Debido a que la replicación de plásmidos dentro de células procariotas es independiente de la replicación cromosómica, los plásmidos pueden segregarse tanto en células hija normales como en minicélulas durante la división celular anormal descrita anteriormente. Por tanto, las minicélulas derivadas de min E. coli recombinantes llevan números significativos de copias de plásmidos, con todos los componentes celulares bacterianos excepto los cromosomas, y se han usado como tales en estudiar la expresión génica codificada por plásmidos in vitro. Véase Brahmbhatt (1987), Harlow y col. (1995) y Kihara y col. (1996). Brahmbhatt (1987) demostró, por ejemplo, que las minicélulas de E. coli pueden llevar plásmidos recombinantes con insertos de ADN de hasta el 20 kb, ausente cualquier ADN cromosómico, y pueden expresar nueve o más proteínas recombinantes simultáneamente.

Tales minicélulas intactas no reproductoras, pero metabólicamente activas, se han empleado para analizar proteínas codificadas por genes transmitidos por plásmidos. En el contexto de la “fusión de minicélulas” mencionada por Salser y col., sin embargo, las minicélulas son despojadas de sus membranas externas para dar una estructura que, como un protoplasto bacteriano, puede experimentar fusión con una célula diana cuando ambas se incuban junto con PEG u otro agente que promueva la fusión celular. También al igual que los protoplastos bacterianos, tales protoplastos de minicélulas deben mantenerse bajo condiciones isotónicas con el fin de prevenir la lisis osmótica, y son altamente vulnerables al ataque enzimático. Por tanto, no son adecuados para terapia génica. Además, con la aparición de otra metodología de transformación más conveniente, la tecnología de minicélulas citada por Salser y col. cayó en desuso.

Más recientemente, la aparición de terapia génica ha puesto de relieve una variedad de procedimientos para introducir material genético exógeno en el genoma de un mamífero receptor. Véanse las revisiones por Romano y col. (1998, 1999), Balicki y Beutler (2002) y Wadhwa y col. (2002). La aplicación clínica de estas técnicas, tales como el uso de vectores de adenovirus o de retrovirus recombinantes, se ha retrasado debido a graves problemas de seguridad. Ahora son ilustrativos de los problemas presentados por la metodología de transformación la recombinación con virus naturales, inmunosupresión limitada inducida por virus de inserción y potencial oncogénico de los vectores víricos para llevar grandes segmentos de ADN terapéutico, reversión a virulencia de virus atenuados, dificultades en la preparación y distribución de virus recombinantes, baja estabilidad y reacciones adversas tales como una respuesta inflamatoria, producida por inmunidad existente. Un enfoque que obviara estos problemas ofrecería beneficio significativo en hacer que la terapia génica fuera más segura y más eficaz.

Los vectores bacterianos atenuados vivos también están siendo explotados como vectores de administración génica para terapia génica humana que incluyen Salmonella (Darji y col., 1997; Paglia y col., 2000; Urashima y col., 2000), Shigella (Sizemore y col., 1995; Grillot-Courvalin y col., 2002), Listeria (Dietrich y col., 1998) y E. coli invasiva (Grillot-Courvalin y col., 1998). Sin embargo, los vectores bacterianos tienen limitaciones significativas debido a que las bacterias vivas, aunque están atenuadas, deben manipularse para llevar mecanismos de lisis de la membrana del fagolisosoma, para permitir que suficiente ADN recombinante escape a la célula de mamífero citosol y de ahí al núcleo. Tal manipulación es difícil y puede ser imposible para muchos patógenos bacterianos intracelulares. Además, las mutaciones que atenúan los patógenos bacterianos son conocidas para sólo unos pocas especies bacterianas, por ejemplo, mutaciones en los genes de la biosíntesis de aminoácidos aromáticos para Salmonella, E. coli y Shigella.

Debido a que no se conocen mutaciones atenuantes para muchas especies bacterianas, un sistema de administración de genes bacterianos no puede explotar la amplia batería de patógenos intracelulares bacterianos. Los vectores bacterianos plantean un problema adicional con respecto a la presencia de ADN cromosómico debido a que partes de este ADN podrían transferirse a otra microflora en el huésped humano o animal que recibe la terapia génica. Tal transferencia de ADN promiscua entre especies bacterianas es no deseable debido a una posible emergencia de nuevas bacterias virulentas y/o resistentes a fármacos.

Sumario de la invención

Para tratar estas y otras necesidades, la presente invención proporciona, según un aspecto, una composición que comprende (i) minicélulas bacterianas intactas recombinantes y (ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable para las mismas, en la que dichas minicélulas bacterianas intactas contienen un plásmido que comprende una secuencia de ADN que codifica un producto de expresión de péptido o polipéptido terapéutico, por ejemplo, interleucina 2 y en la que dicha composición está libre de contaminantes de 0,2 µm o menos de tamaño. En una realización preferida, la composición contiene menos de una célula parental contaminante por 107, 108 ó 109 minicélulas.

Según otro aspecto, la presente invención proporciona un uso de minicélulas bacterianas intactas recombinantes en la preparación de un medicamento que comprende minicélulas bacterianas intactas que contienen un plásmido que comprende una secuencia de ADN que codifica un producto de expresión de péptido o polipéptido terapéutico, en el que dicho medicamento está libre de contaminantes de 0,2 µm o menos de tamaño, para su uso en un procedimiento de (i) tratar una enfermedad, alergia o infección o (ii) modificar una característica por administración de dicho medicamento a una célula, un tejido o un órgano, en el que dicha enfermedad se selecciona de (1) cáncer;

(2) una enfermedad adquirida seleccionada de SIDA, neumonía y enfisema; y (3) una afección engendrada por una metabolopatía congénita, la alergia o infección se trata por modificación de una respuesta inmunitaria, y dicha característica es fertilidad.

En aspectos relacionados la invención se refiere a minicélulas bacterianas intactas recombinantes que contienen un plásmido que comprende una secuencia de ADN que codifica un producto de expresión de péptido o polipéptido terapéutico, en las que dichas minicélulas bacterianas están libres de contaminantes de 0,2 µm o menos de tamaño para su uso como un agente farmacéutico.

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición de la invención como se ha descrito anteriormente para su uso en un procedimiento de (i) tratar una enfermedad, alergia o infección o (ii) modificar una característica por administración de dicha composición a una célula, un tejido o un órgano, en la que dicha enfermedad se selecciona de (1) cáncer; (2) una enfermedad adquirida seleccionada de SIDA, neumonía y enfisema; y (3) una afección engendrada por una metabolopatía congénita, la alergia o infección se trata por modificación de una respuesta inmunitaria y dicha característica es fertilidad.

La invención también proporciona, con arreglo a otro aspecto, un procedimiento de transformación genética que comprende (i) proporcionar minicélulas bacterianas intactas recombinantes que contienen un plásmido que comprende una secuencia de ADN que codifica un producto de expresión de péptido o polipéptido terapéutico, en el que dichas minicélulas bacterianas están libres de contaminantes de 0,2 µm o menos de tamaño y (ii) poner dicha preparación de minicélulas bacterianas intactas en contacto in vitro con células de mamífero competentes para endocitosis no fagocíticas, de forma que dichas minicélulas bacterianas sean reabsorbidas por dichas células de mamífero, por lo que dichas células de mamífero producen dicho producto de expresión. El plásmido anteriormente mencionado también puede contener un segundo segmento de ácido nucleico que sirve de elemento regulador tal como un promotor, un terminador, un potenciador o una secuencia señal, y que está operativamente ligado al primer segmento de ácido nucleico. Además, el plásmido puede contener un elemento indicador tal como un segmento de ácido nucleico que codifica proteína verde fluorescente.

Según todavía otro aspecto de la presente invención se proporciona un procedimiento de purificación que comprende pasar una muestra que contiene minicélulas bacterianas intactas (i) sobre una serie de filtros de flujo cruzado y luego (ii) por un filtro frontal, por lo que dichas minicélulas bacterianas intactas se separan de contaminantes en dicha muestra para obtener una preparación de minicélulas purificada. El procedimiento incluye opcionalmente un tratamiento de la preparación de minicélulas purificada con un antibiótico. También es opcional una etapa preliminar de realizar centrifugación diferencial en la muestra que contiene minicélulas. En una realización preferida, la serie de filtros de flujo cruzado comprende (A) al menos uno o dos filtros que emplean un tamaño de poro superior a o igual a aproximadamente 0,45 µm y (B) al menos un filtro que emplea un tamaño de poro inferior a

o igual a aproximadamente 0,2 µm.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra una ilustración esquemática de la división celular normal en una bacteria y cómo las mutaciones en los genes min producen la formación de minicélulas.

La Figura 2 muestra un diagrama esquemático de la preparación de plásmidos útiles para generar una cepa bacteriana productora de minicélulas. En particular, esta figura muestra una construcción de plásmido para generar una cepa productora de minicélulas derivada de S. typhimurium. Se muestran dibujos de líneas de ADN de insertos clonados y partes de vectores de plásmido circulares. Los nombres de los plásmidos se muestran en negrita a la izquierda de los ADN de insertos y dentro de mapas de vectores circulares. Si se usan cebadores de PCR en la generación de un clon, los números de los cebadores se muestran adyacentes a la flecha de guiones.

La Figura 3 muestra un diagrama esquemático de la preparación de plásmidos útiles para generar una cepa bacteriana productora de minicélulas. En particular, esta figura muestra una construcción de plásmido para generar una cepa productora de minicélulas derivada de Shigella flexneri 2a.

La Figura 4 muestra un diagrama esquemático de preparación de plásmidos útiles para generar una cepa bacteriana productora de minicélulas. En particular, esta figura muestra una construcción de plásmido para generar una cepa productora de minicélulas derivada de Listeria monocytogenes.

La Figura 5 muestra imágenes de TEM de células de macrófagos de ratón transfectadas con minicélulas derivadas de S. typhimurium. Para cada panel se proporcionan el tiempo después de la infección y los aumentos. Las imágenes muestran partículas densas en electrones similares a minicélulas (flechas) dentro de vacuolas de macrófagos.

La Figura 6 muestra la administración de genes mediada por minicélulas a células de cáncer de mama humano y expresión génica heteróloga. El panel A muestra la línea celular de cáncer de mama de control SKBR-3 96 horas después de la transfección con minicélulas no recombinantes y anticuerpo anti-HER-2 marcado, detectadas con anticuerpo secundario conjugado con Alexafluor. El panel B muestra la expresión de GFP en células SK-BR-3 96 horas después de la transfección con minicélulas recombinantes que llevan el plásmido pEGFP-C1 (expresión eucariota de GFP). El panel C muestra células SK-BR-3 transfectadas con minicélulas/pEGFP-C1, marcadas con anticuerpo anti-HER-2 y detectadas con anticuerpo secundario conjugado con Alexafluor. Las imágenes se visualizaron con microscopía confocal.

La Figura 7 muestra la respuesta anti-GFP de suero de ratón 14 días después de la administración intraperitoneal de minicélulas recombinantes y células parentales de S. typhimurium muertas que llevan el plásmido pEGFP-C1. En la leyenda y en las leyendas de las Figuras 8 - 10, 10*8 y 10*9 representan 108 y 109, respectivamente.

La Figura 8 muestra la respuesta de anti-LPS de suero de ratón 14 días después de la administración intraperitoneal de minicélulas recombinantes, y células parentales de S. typhimurium muertas que llevan el plásmido pEGFP-C1.

La Figura 9 muestra la respuesta anti-GFP de suero de ratón 14 días después de la administración intraperitoneal de minicélulas recombinantes que llevan el plásmido pEGFP-C1.

La Figura 10 muestra la respuesta de anti-LPS de suero de ratón 14 días después de la administración intraperitoneal de minicélulas recombinantes que llevan el plásmido pEGFP-C1.

Descripción detallada de realizaciones preferidas

Los presentes inventores han determinado que las minicélulas con paredes celulares intactas (“minicélulas intactas”) son vectores eficaces para administrar oligonucleótidos y polinucleótidos (en conjunto, “moléculas de ácidos nucleicos”) a células huésped (preferentemente células de mamífero en seres humanos o animales) in vitro e in vivo. Por tanto, los inventores han encontrado que una minicélula intacta es reabsorbida por células de mamífero que asimismo reabsorben la célula bacteriana de la que se obtuvo la minicélula (la “célula bacteriana parental”). Además, se ha descubierto que, sorprendentemente, el contenido de una minicélula recombinante intacta, cuando es reabsorbida por una célula huésped, se procesa de tal forma que al menos algo del ADN de plásmido de la minicélula escapa de la degradación y es transportado por el citoplasma al núcleo de la célula huésped, que luego puede expresar el ADN de plásmido.

Por tanto, según la presente invención, una minicélula intacta que lleva un ADN para el que se desea la expresión heteróloga, tanto in vitro como in vivo, se pone en contacto con una célula de mamífero que reabsorbe la célula bacteriana parental a manera de los patógenos bacterianos intracelulares. De igual modo, esa célula de mamífero, denotada aquí “competente de reabsorción”, reabsorbe la minicélula y expresa el ADN en cuestión.

Diversos mecanismos puede participar en la reabsorción de las minicélulas intactas por un tipo dado de célula huésped, y la presente invención no depende de ningún mecanismo particular a este respecto. Por ejemplo, la fagocitosis es un procedimiento bien documentado en el que los macrófagos y otras células de fagocito tales como neutrófilos ingieren partículas extendiendo pseudópodos sobre la superficie de la partícula hasta que la partícula es totalmente envuelta. Aunque se describe como fagocitosis “no específica”, se ha demostrado la participación de receptores específicos en el procedimiento. Véase Wright & Jong (1986); Speert y col. (1988).

Por tanto, una forma de fagocitosis implica la interacción entre ligandos de superficie y receptores de ligandos localizados en las membranas de los pseudópodos (Shaw y Griffin, 1981). Se cree que esta etapa de unión, mediada por los receptores específicos, es dependiente de las adhesinas de la superficie bacteriana. Con respecto a bacterias menos virulentas tales como E. coli no enterotoxigénica, la fagocitosis también puede producirse en ausencia de ligandos de superficie para receptores de fagocitos. Véase, por ejemplo, Pikaar y col. (1995). Por tanto, la presente invención engloba, pero no se limita a, el uso de minicélulas intactas que tanto poseen como carecen adhesinas de superficie, de acuerdo con la naturaleza de sus células bacterianas parentales, y son reabsorbidas por fagocitos (es decir, células huésped “competentes para fagocitosis”), de las que los neutrófilos y macrófagos son los tipos primarios en mamíferos.

Otro procedimiento de reabsorción es la endocitosis, por la que patógenos intracelulares ejemplificados por especies de Salmonella, Escherichia, Shigella, Helicobacter, Pseudomonas y Lactobacilli entran en las células epiteliales de mamífero y allí se replican. Dos mecanismos básicos a este respecto son endocitosis mediada por receptor dependiente de clatrina, también conocida como “endocitosis por hoyos recubiertos” (Riezman, 1993), y endocitosis independiente de clatrina (Sandvig & Deurs, 1994). Cualquiera de ellas o ambas pueden participar cuando una célula competente para reabsorción que actúa por endocitosis (es decir, una célula huésped “competente para endocitosis”) reabsorbe minicélulas recombinantes intactas y expresa ADN llevado por las minicélulas, según la invención. Células competentes para endocitosis representativas son células epiteliales de mama, enterocitos en el tracto gastrointestinal, células epiteliales del estómago, células epiteliales de pulmón y células epiteliales de las vías urinarias y vejiga.

La presente invención es particularmente útil para la introducción de moléculas de ácidos nucleicos en células competentes para reabsorción que, tras la transcripción y/o traducción, sirven para mejorar o de otro modo tratar una enfermedad o modificar una característica asociada a un tipo de célula particular, tejido u órgano de un sujeto. Para los fines de la presente descripción, estas moléculas se clasifican como “moléculas terapéuticas de ácidos nucleicos”.

Por ejemplo, la transcripción o traducción de una molécula terapéutica dada de ácido nucleico puede ser útil en el tratamiento de cáncer o una enfermedad adquirida tal como SIDA, neumonía, enfisema, o en la corrección de

metabolopatías congénitas tales como fibrosis quística. La transcripción o traducción de un ácido nucleico terapéutico también puede efectuar la esterilización anticonceptiva, que incluye esterilización anticonceptiva de animales salvajes. Los trastornos inflamatorios mediadas por alérgenos y mediados por agentes infecciosos también pueden contrarrestarse administrando mediante la presente invención una molécula terapéutica de ácido nucleico que, tras la expresión en un paciente, afecta la (s) respuesta(s) inmunitaria(s) asociada(s) al alérgeno y al agente infeccioso, respectivamente. Una molécula terapéutica de ácido nucleico también puede tener un producto de expresión, o aquí puede ser un producto en la dirección 3' después de la modificación traduccional del producto de expresión, que reduce las secuelas inmunológicas relacionadas con trasplante o que ayuda a facilitar el crecimiento y la regeneración de tejido.

Alternativamente, el producto de expresión o un agente de después de la traducción relacionado, puede ser una proteína, tipificada por eritropoyetina, un factor de crecimiento tal como TGA-�, una citocina tal como IL-2, IL-10, IL12 u otra de las interleucinas, un inhibidor de la leucoproteinasa del suero, o un anticuerpo tal como CTLA4-Ig, que proporciona un beneficio deseado para el huésped. Otras proteínas tales son, sin limitación, α-, β- y γ-globina, insulina, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, EPO, TNF, MGF, adenosina-desaminasa, antígenos asociados a tumores tales como antígenos víricos, mutados o expresados anormalmente (CDK4, �-catenina, GnT-V, Casp8), antígenos específicos del cáncer tales como MAGE, BAGE, GAGE, PRAME y NY-ESO-1, antígenos de diferenciación tales como tirosinasa, Melan-A/MART-1, gp100 y TRP-1/gp75, y antígenos expresados en exceso tales como Her2/neu y CEA. Otros ejemplos de la clase de moléculas terapéuticas de ácidos nucleicos son ADN que codifican el regulador transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), factor VIII u otra proteína de la sangre, receptor de la lipoproteína de baja densidad, �-glucocerebrosidasa, α- y �-galactosidasa, insulina, hormona paratiroide, α-1-antitripsina, fasR y fasL, respectivamente.

Según la presente invención, la expresión de una molécula terapéutica de ácido nucleico por una célula huésped puede proporcionar un compuesto necesario, mediar en una respuesta inmunitaria elegida como diana o interrumpir un procedimiento patológico. Por ejemplo, una molécula terapéutica de ácido nucleico puede implicarse en una terapia antisentido o con ribozimas. En el presente contexto, una terapia antisentido implica introducir, con arreglo a la invención, una copia antisentido de una secuencia de polinucleótidos, de forma que el ARN transcrito de la copia se hibride in situ con un transcrito de ARN mensajero (ARNm) que se corresponde con la secuencia de polinucleótidos. Esta hibridación normalmente evita que el transcrito se traduzca en una proteína o inicie una ruta de degradación que destruya el ARNm.

El ácido nucleico terapéutico también puede codificar dúplex de ARN interferente pequeño (ARNip) dentro de una célula de mamífero. Es decir, se ha mostrado que los ARNip suprimen genes diana en células de mamífero. Este procedimiento de ARN interferente (ARNi) es un procedimiento de silenciamiento de genes después de la transcripción específica de secuencia en animales, seres humanos y plantas y se inicia por ARN bicatenario (b) que es homólogo al gen silenciado. Se ha demostrado satisfactoriamente la administración mediada por virus de ARNip para reducir específicamente la expresión de genes elegidos como diana en diversos tipos de células (Haibin y col., 2002).

Para todos estos usos y otros usos diversos de una molécula terapéutica de ácido nucleico, la presente descripción emplea la rúbrica de “terapia génica”, que también es connotada por los términos “transferencia de genes”, “administración de genes” y “vacunas basadas en genes”, en relación con la metodología o sistemas para transferir una molécula terapéutica de ácido nucleico a células huésped, tanto in vivo como ex vivo, como se describe, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 5.399.346. Por tanto, una composición que contiene minicélulas de la presente invención puede usarse para lograr un efecto terapéutico in situ y para transformar células fuera del cuerpo y luego (re)introducirlas a un sujeto. Con arreglo a la presente invención, las células adecuadas para tanto enfoques in vivo como ex vivo serían aquellas que son competentes para la reabsorción tales como fagocitos y células epiteliales.

Como se ha observado anteriormente, la terapia génica puede efectuarse para tratar o prevenir una enfermedad o afección genética o adquirida. La molécula terapéutica de ácido nucleico codifica un producto, tal como ARN funcional (por ejemplo, antisentido o ARNip), o un péptido, polipéptido o proteína cuya producción in vivo se desea. Por ejemplo, el material genético de interés puede codificar una hormona, receptor, enzima o (poli)péptido de valor terapéutico. Tales procedimientos pueden producir expresión transitoria de ADN transferido no integrado, replicación extracromosómica y expresión de replicones transferidos tales como episomas, o integración de material genético transferido en el ADN genómico de células huésped.

Una molécula terapéutica de ácido nucleico puede ser el homólogo normal de un gen que expresa una proteína que funciona anormalmente o que está presente en niveles anormales en un estado de enfermedad, como es el caso, por ejemplo, con el regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística en fibrosis quística (Kerem y col., 1989; Riordan y col., 1989; Rommens y col., 1989), con β-globina en anemia de células falciformes y con cualquiera de α-globina, β-globina y γ-globina en talasemia. La molécula terapéutica de ácido nucleico puede tener una transcrito de ARN antisentido o ARN interferente pequeño, como se han mencionado anteriormente. Por tanto, una producción en exceso de α-globina con respecto a β-globina que caracteriza β-talasemia puede mejorarse por terapia génica, según la presente invención, usando una minicélula intacta manipulada para contener un plásmido que incorpora una secuencia que tiene un transcrito de ARN antisentido con respecto a una secuencia diana del ARNm de α-globina.

En el tratamiento de cáncer, una molécula terapéutica de ácido nucleico adecuada para su uso según la presente invención podría tener una secuencia que se corresponde con o se deriva de un gen que está asociado a supresión tumoral tal como el gen p53, el gen de retinoblastoma y el gen que codifica factor de necrosis tumoral. Una amplia variedad de tumores sólidos - cáncer, papilomas y condilomas - deben ser tratables por este enfoque, con arreglo a la invención. Cánceres representativos a este respecto incluyen carcinoma de colon, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de piel, cáncer de hígado, cáncer de hueso, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer cerebral, cáncer de cabeza y cuello y linfoma. Papilomas ilustrativos son papiloma de células escamosas, papiloma del plexo coroideo y papiloma de laringe. Ejemplos de afecciones de condiloma son condilomas genitales, condilomas plantares, epidermodisplasia verruciforme y condilomas malignos.

Una molécula terapéutica de ácido nucleico para la presente invención también puede comprender un segmento de ADN que codifica una enzima que convierte un profármaco inactivo en uno o más metabolitos citotóxicos de manera que, tras la introducción in vivo del profármaco, la célula diana es en efecto obligada, quizás también con células vecinas, a suicidarse. Las aplicaciones preclínicas y clínicas de un “gen suicida” tal que puede ser de origen no humano o de origen humano son revisadas por Spencer (2000), Shangara y col. (2000) y Yazawa y col. (2002). Genes suicidas de origen no humano ilustrativos son aquellos que codifican HSV-timidina-cinasa (tk), citosinadesaminasa (CDA) + uracil-fosforribositransferasa, xantina-guanina-fosforribosil-transferasa (GPT), nitroreductasa (NTR), purina-nucleósido-fosforilasa (PNP, DeoD), citocromo P450 (CYP4B1), carboxipeptidasa G2 (CPG2) y Daminoácido-oxidasa (DAAO), respectivamente. Genes suicidas de origen humano se ejemplifican por genes que codifican carboxipeptidasa A1 (CPA), desoxicitidina-cinasa (dCK), citocromo P450 (CYP2B1.6), LNGFR/FKBP/Fas, FKBP/caspasas y ER/p53, respectivamente.

Una terapia con genes suicidas según la presente invención podría aplicarse al tratamiento del SIDA. Esta estrategia se ha probado con vectores suicidas que expresan un producto génico tóxico tan pronto como las células de mamífero tratadas se infectan por el VIH-1. Estos vectores usan elementos reguladores del VIH-1, Tat y/o Rev, para inducir la expresión de un gen tóxico tal como la toxina α-diftérica, citosina-desaminasa o interferón-a2 después de la infección por el VIH-1 (Curiel y col., 1993; Dinges y col., 1995; Harrison y col., 1992a; Harrison y col., 1992b; Ragheb y col., 1999). Las células podrían transducirse por estos vectores usando el enfoque de minicélulas recombinantes de la presente invención, y se eliminarían más rápido que las células sin transducir después de la infección por el VIH, previniendo la replicación vírica a expensas de la muerte celular.

Una molécula de ácido nucleico que va a introducirse mediante el enfoque de la presente invención puede incluir un elemento indicador. Un elemento indicador confiere a su huésped recombinante un fenotipo o característica fácilmente detectable, normalmente codificando un polipéptido, no producido de otro modo por el huésped, que puede detectarse tras la expresión por análisis histológico o in situ tal como por técnicas de obtención de imágenes in vivo. Por ejemplo, un elemento indicador administrado por una minicélula intacta, según la presente invención, podría codificar una proteína que produce en la célula huésped en reabsorción un cambio colorimétrico o fluorométrico que es detectable por análisis in situ y que es una función cuantitativa o semi-cuantitativa de activación transcripcional. Ilustrativo de estas proteínas son esterasas, fosfatasas, proteasas y otras enzimas, generando la actividad un cromóforo o fluoróforo detectable.

Ejemplos preferidos son -galactosidasa de E. coli, que produce un cambio de color por escisión de un sustrato indigogénico, indolil--D-galactosida y una luciferasa que oxida un aldehído de cadena larga (luciferasa bacteriana) o un ácido carboxílico heterocíclico (luciferina), con la liberación concomitante de luz. En este contexto también es útil un elemento indicador que codifica la proteína verde fluorescente (GFP) de medusa, Aequorea victoria, como se describe por Prasher y col. (1995). El campo de la tecnología relacionada con GFP se ilustra por dos solicitudes PCT publicadas, WO 095/21191 (desvela una secuencia de polinucleótidos que codifica una apoproteína de GFP de 238 aminoácidos que contiene un cromóforo formado a partir de los aminoácidos 65 a 67) y WO 095/21191 (desvela una modificación del ADNc para el apopéptido de A. victoria GFP, proporcionando un péptido que tiene propiedades fluorescentes alteradas), y por un informe de Heim y col. (1994) de una GFP mutante, caracterizada por una mejora de 4 a 6 veces en la amplitud de excitación.

Otro tipo de elemento indicador está asociado a un producto de expresión que hace que la minicélula recombinante se vuelva resistente a una toxina. Por ejemplo, el gen neo protege un huésped contra niveles tóxicos del antibiótico G418, mientras que un gen que codifica dihidrofolato-reductasa confiere resistencia a metrotrexato, y el gen cloranfenicol-acetiltransferasa (CAT) confiere resistencia a cloranfenicol.

Otros genes para su uso como elemento indicador incluyen aquellos que pueden transformar una minicélula huésped para expresar antígenos de superficie de la célula diferentes, por ejemplo, proteínas de la envuelta vírica tales como gp120 del VIH o gD del herpes, que son fácilmente detectables por inmunoensayos.

Una molécula de ácido nucleico que va a introducirse mediante el enfoque de la presente invención también puede tener un segmento de codificación deseado ligado operativamente a un elemento regulador tal como un promotor, un terminador, un potenciador y/o una secuencia señal. Un promotor adecuado puede ser específico de tejido, o incluso específico de tumor, como dicta el contexto terapéutico.

Un promotor es “específico de tejido” cuando se activa preferencialmente en un tejido dado y, de ahí, que sea eficaz en accionar la expresión en el tejido diana de una secuencia estructural operativamente ligada. La categoría de promotores específicos de tejido incluye, por ejemplo: el promotor específico de hepatocitos para albúmina y a1antitripsina, respectivamente; la región de control del gen de elastasa I, que es activa en células acinares pancreáticas; la región de control del gen de insulina, activa en células beta pancreáticas; la región de control del virus de tumor mamario de ratón, que es activa en células testiculares, de mama, linfoides y mastocitos; la región de control del gen de la proteína básica de mielina, activa en células de oligodendrocito en el cerebro; y la región de control de la hormona liberadora gonadotrópica, que es activa en células del hipotálamo. Véase Frain y col. (1990), Ciliberto y col. (1985), Pinkert y col., (1987), Kelsey y col. (1987), Swift y col. (1984), MacDonald (1987), Hanahan, (1985), Leder y col. (1986), Readhead y col. (1987) y Mason y col. (1986).

También hay promotores que se expresan de manera preferencial en ciertas células tumorales o en células tumorales por sí mismas, y que son útiles para tratar diferentes cánceres según la presente invención. La clase de promotores que son específicos para células cancerosas se ilustra por: el promotor de tirosinasa, para elegir como diana melanomas; el promotor MUC1/Df3, para elegir como diana carcinoma de mama; el potenciador de myoD/promotor del SV40 híbrido, que elige como diana la expresión de rabdomiosarcoma (RMS); el promotor del antígeno carcinoembrionario (CEA), que es específico para células que expresan CEA tales como células de cáncer de colon, y el promotor del gen de hexocinasa tipo II, para elegir como diana carcinomas de pulmón de células no pequeñas. Véase Hart (1996), Morton & Potter (1998), Kurane y col. (1998) y Katabi y col. (1999).

Una secuencia señal puede usarse, según la presente invención, para producir la secreción de un producto de expresión o localización de un producto de expresión en un compartimento celular particular. Por tanto, una molécula de polinucleótido terapéutica que es administrada por minicélulas intactas puede incluir una secuencia señal, en marco de lectura adecuado, de forma que el producto de expresión de interés es secretado por una célula de reabsorción o su progenie, influyendo así en las células circundantes, de acuerdo con el paradigma de tratamiento elegido. Secuencias señal ilustrativas incluyen la secuencia de secreción del extremo C de hemolisina, descrita en la patente de EE.UU. nº 5.143.830, la secuencia de secreción de BAR1, desvelada en la patente de EE.UU. nº 5.037.743, y la porción de la secuencia señal del polipéptido zsig32, descrita en la patente de EE.UU. nº

6.025.197.

La capacidad de minicélulas recombinantes intactas de la invención para mantener la integridad in vivo hace posible su uso en terapia génica, como se ha descrito anteriormente. Las minicélulas intactas tampoco llevan nada del ADN genómico bacteriano que está presente en células bacterianas recombinantes, por ejemplo, de Shigella flexneri, Listeria monocytogenes, Escherichia coli o Salmonella typhimurium, que otros han usado para transferir plásmidos de expresión eucariotas en células huésped. Véase Sizemore y col. (1995); Gentschev y col. (2000); Catic y col. (1999); Dietrich y col. (1998); y Courvalin y col. (1995). Por consiguiente, la terapia génica con minicélulas intactas, con arreglo a la presente invención, no entraña el riesgo, asociado a un uso de las bacterias recombinantes, de la transferencia no deliberada de un gen bacteriano o marcador de resistencia a antibióticos a flora microbiana que es autóctona del paciente. Además, las bacterias recombinantes deben sacarse del paciente por medio de inmunidad mediada por célula y, de ahí que no sean adecuadas para terapia génica de un paciente inmunodeprimido que padece, por ejemplo, cáncer o SIDA.

Las minicélulas pueden prepararse a partir de cualquier célula bacteriana de origen Gram-positivo o Gram-negativo. Debido a que la presente invención emplea minicélulas intactas, en vez de protoplastos de minicélulas, la presente invención no requiere y preferentemente no implica ningún antibiótico o pretratamiento químico de minicélulas.

Una cepa bacteriana productora de minicélulas puede generarse por mutación de un gen min, por ejemplo, mediante una deleción parcial de una secuencia génica de minCDE como se ilustra en los Ejemplos 1 y 2 más adelante. Para obtener minicélulas intactas recombinantes según la invención, células bacterianas de la cepa productora de minicélulas elegida se transforman por una técnica convencional que incluye, pero no se limita a, el uso de electroporación (Shigekawa & Dower, 1988), metodología química (Hanahan, 1983), vectores lanzadera (Marcil & Higgins, 1992) y conjugación (Firth y col., 1996) o transducción (Davis y col., 1980). Para esta transformación, una molécula terapéutica de ácido nucleico de cualquier fuente eucariota, procariota o sintética se inserta en un vector de plásmido adecuado, comercialmente disponible o patentado por el usuario final. Un ADN seleccionado puede ligarse operativamente a los elementos de control requeridos para la administración de genes y/o expresión del ADN en las células que reabsorben las minicélulas recombinantes in vivo.

Las minicélulas recombinantes se analizan preferentemente in vitro para garantizar que pueden liberar el plásmido recombinante o secuencias de ADN al núcleo de la célula diana, y que la expresión génica recombinante se produce en la célula diana. El ensayo para la expresión dependerá de la naturaleza del gen heterólogo. La expresión puede monitorizarse mediante una variedad de procedimientos que incluyen ensayos inmunológicos, histoquímicos o de actividad. La expresión de un gen marcador fluorescente puede visualizarse microscópicamente, y esto proporciona un ensayo particularmente conveniente. Por ejemplo, el gen que codifica proteína de fluorescencia verde bajo el control de un promotor de la expresión génica eucariota, tal como el promotor del CMV, puede transferirse sobre un plásmido por minicélulas recombinantes para elegir como diana células eucariotas (véase más adelante). Adicionalmente, puede usarse análisis de transferencia Northern o PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) para evaluar la transcripción usando sondas de ADN o ARN apropiadas. Si los anticuerpos para el polipéptido codificado

por el gen heterólogo están disponibles, el análisis de transferencia Western, la inmunohistoquímica u otras técnicas inmunológicas pueden usarse para evaluar la producción del polipéptido. También pueden usarse ensayos bioquímicos apropiados si el gen heterólogo es una enzima. Por ejemplo, si el gen heterólogo codifica resistencia a antibióticos, entonces puede usarse una determinación de la resistencia de células infectadas al antibiótico para evaluar la expresión del gen de resistencia a antibióticos.

La competencia por reabsorción de una célula huésped putativa (“diana”) puede evaluarse probando la eficacia de la liberación de ADN en cultivo. Por tanto, un tumor elegido como diana podría someterse a biopsia, y la muestra resultante de tejido se usaría, de manera convencional, para obtener células tumorales representativas en cultivo, para probar una capacidad para reabsorber minicélulas recombinantes de la presente invención que llevan, por ejemplo, un elemento indicador adecuado. Adicionalmente o alternativamente para probar un cultivo celular primario tal, puede evaluarse la capacidad para reabsorber minicélulas probando una línea celular que es representativa del tipo de tejido al que el protocolo terapéutico está adaptado, con arreglo a la presente invención. Las técnicas de cultivo celular están bien documentadas, por ejemplo, por Freshner (1992).

Según la invención, las minicélulas recombinantes pueden purificarse a partir de células parentales por varios medios. Un enfoque usa metodología de gradiente de sacarosa descrita, por ejemplo, por Reeve (1979) y por Clark-Curtiss y col. (1983), seguido de tratamiento con un antibiótico, tal como gentamicina (200 µg/ml, 2 horas), para destruir bacterias vivas residuales.

Con la metodología convencional, la pureza alcanzada es una célula parental contaminante por 106 a 107 minicélulas, como mucho. Para aplicaciones in vivo, según la presente invención, pueden requerirse dosis superiores a 106 y pueden ser de hasta 1010 por dosis, que, con la relación de contaminación anteriormente mencionada, se traduciría en 10.000 células parentales vivas por dosis. Un nivel de contaminación tal sería mortal, particularmente en sujetos inmunodeprimidos.

Además, la tecnología convencional emplea medios que contienen un agente de formación en gradiente tal como sacarosa, glicerol o Percoll® cuya presencia es no deseable para usos in vivo, como se ha contemplado actualmente. Por tanto, la toxicidad de Percoll® lo restringe a contextos de “sólo fines de investigación”, mientras que la sacarosa para un gradiente confiere una alta osmolaridad que puede producir cambios fisiológicos en las minicélulas.

Por tanto, para aplicaciones de terapia génica según la presente invención es preferible minimizar la contaminación por células parentales y usar medios que son más biológicamente compatibles. Para lograr estos objetivos, los presentes inventores han encontrado inesperadamente ventajoso combinar filtración de flujo cruzado (el flujo alimentado es paralelo a una superficie de la membrana) y filtración frontal (el flujo alimentado es perpendicular a la superficie de la membrana). Generalmente, véase Forbes (1987). Opcionalmente, esta combinación puede ir precedida de una centrifugación diferencial, a baja fuerza centrífuga para eliminar alguna porción de las células bacterianas y así enriquecer el sobrenadante en minicélulas. También opcionalmente, la combinación puede ir seguida de un tratamiento con antibiótico para destruir células parentales bacterianas residuales.

La filtración de flujo cruzado, dependiendo del tamaño de poro del filtro, puede separar minicélulas de contaminantes mayores tales como células parentales bacterianas, y de contaminantes más pequeños tales como bullas bacterianas, endotoxina libre, residuos celulares de ácidos nucleicos y líquido en exceso. Para separar minicélulas de contaminantes mayores, el tamaño de poro nominal de filtros de flujo cruzado debe permitir que las minicélulas penetren a través de los filtros, pero no células bacterianas grandes. Se prefiere un tamaño de poro de 0,45 µm para este fin debido a que las minicélulas tienen aproximadamente 0,4 µm de diámetro, mientras que las células bacterianas son mayores. Para separar minicélulas de contaminantes más pequeños, el tamaño de poro nominal de los filtros de flujo cruzado debe permitir que penetren contaminantes más pequeños a través de los filtros, pero no minicélulas. Se prefiere un tamaño de poro de 0,2 µm para este fin debido a que las bullas bacterianas oscilan en diámetro de 0,05 µm a 0,2 µm, y los otros contaminantes más pequeños son inferiores a 0,2 µm.

La aplicación eficaz de filtración de flujo cruzado en este contexto normalmente conlleva al menos una etapa que implica un mayor tamaño de poro, aproximadamente 0,45 µm, seguido de al menos una etapa con un menor tamaño de poro, aproximadamente 0,2 µm. Entre o durante las etapas de filtración de flujo cruzado en serie, la diafiltración puede realizarse para maximizar la recuperación de minicélulas.

El uso de filtración de flujo cruzado acomoda suspensiones que llevan cargas pesadas de materia particulada, tal como cultivos bacterianos, que pueden llevar cargas de 1011 a 1013 poblaciones bacterianas y de minicélulas por litro de cultivo. Para minimizar el plegamiento del filtro y la consecuente pérdida de minicélulas, el cultivo bacteriano/de minicélulas puede diluirse, preferentemente de 5 veces a 10 veces. Las diluciones también permiten el uso de presión atmosférica y velocidad de flujo apropiadamente bajas.

Para eliminar células parentales bacterianas residuales que permanecen después de la filtración de flujo cruzado se realiza filtración frontal. Para este fin se prefiere el uso de al menos una filtración frontal, empleando un tamaño de poro de aproximadamente 0,45 µm.

Generalmente, la filtración proporciona una preparación de minicélulas estéril adecuada para estudios de transferencia de genes. Para la transferencia de genes in vivo, un tratamiento con antibiótico se realiza preferentemente adicionalmente para reducir los riesgos de contaminación por células bacterianas. Por ejemplo, las minicélulas pueden resuspenderse en medio de crecimiento que contiene un antibiótico al que es sensible la cepa bacteriana parental. La cantidad apropiada de un antibiótico dado para este fin puede determinarse de antemano por técnicas convencionales.

Una disposición en serie de filtración de flujo cruzado/filtración frontal, como se ha descrito, no sólo prescinde del uso de agentes de formación de gradiente, sino que también proporciona una pureza que supera 10-7 (es decir, menos de una célula parental por 107 minicélulas). Preferentemente, la pureza supera 10-8 y, más preferentemente, está en el orden de aproximadamente 10-9. La disposición en serie de la filtración de flujo cruzado/filtración frontal también proporciona mejor control de calidad. Además, no hay necesidad de un gen de resistencia a ampicilina, cicloserina u otro antibiótico, según se requiera por la técnica de Clarke-Curtiss y Curtiss (1983). Además, el enfoque de purificación en serie no emplea radiación que dañe el ADN, a diferencia de una metodología descrita por Sancar y col. (1979); por tanto, una molécula terapéutica de ácido nucleico administrada con minicélulas preparadas por una disposición en serie de filtración de flujo cruzado/filtración frontal puede estar libre de mutación no específica inducida por radiación.

Una composición que consiste esencialmente en minicélulas recombinantes de la presente invención (es decir, una composición que incluye tales minicélulas con otros constituyentes que no interfieren excesivamente con la calidad de liberación de ADN de la composición) puede formularse de manera convencional usando uno o más vehículos o excipientes fisiológicamente aceptables. Formulaciones para inyección pueden presentarse en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o viales, o en recipientes de múltiples dosis, con o sin un conservante añadido. La formulación puede ser una solución, una suspensión o una emulsión en vehículos aceitosos o acuosos, y puede contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Una solución adecuada es isotónica con la sangre del receptor y se ilustra por solución salina, solución de Ringer y solución de dextrosa. Alternativamente, las minicélulas pueden estar en forma de polvo liofilizado para reconstitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua libre de pirógenos estéril o solución salina fisiológica. Las minicélulas también pueden formularse como una preparación de depósito. Tales formulaciones de acción prolongada pueden administrarse por implantación (por ejemplo, subcutáneamente o intramuscularmente) o por inyección intramuscular.

Una composición que contiene minicélulas de la presente invención puede administrarse por diversas vías y a diversos sitios en un cuerpo de mamífero para lograr el (los) efecto(s) terapéutico(s) deseado(s), tanto localmente como sistémicamente. La administración puede llevarse a cabo, por ejemplo, por administración por vía oral, por administración de la formulación a una cavidad del cuerpo, por inhalación o insuflación, o por administración parenteral, intramuscular, intravenosa, intraportal, intrahepática, peritoneal, subcutánea, intratumoral o intradérmica.

La naturaleza de la administración contemplada influirá asimismo (o será influida por) la elección de la fuente bacteriana para las minicélulas recombinantes empleadas para administrar una molécula terapéutica de ácido nucleico. Por ejemplo, especies de Salmonella, Escherichia y Shigella llevan adhesinas que son reconocidas por receptores que median en la endocitosis sobre enterocitos en el tubo gastrointestinal pueden ser adecuadas para administración por vía oral, para administrar una molécula terapéutica de ácido nucleico que es eficaz para células de cáncer de colon. De manera similar, las minicélulas derivadas de Helicobacter pilori, que llevan adhesinas específicas para células epiteliales del estómago, podrían ser aptas para administración por vía oral que tiene como objetivo las células de cáncer de estómago. La inhalación o insuflación puede ser ideal para administrar minicélulas intactas derivadas de una especie de Pseudomonas que lleva adhesinas reconocidas por receptores sobre células epiteliales de pulmón; esto, por ejemplo, para la administración a los pulmones de un paciente con fibrosis quística de una molécula terapéutica de ácido nucleico que codifica proteína CFTR. Las minicélulas derivadas de bacterias Lactobacilli que llevan adhesinas específicas para las células epiteliales de las vías urinaria y la vejiga podrían ser muy aptas para administración intrauretral de una molécula terapéutica de ácido nucleico a un cáncer de las vías urinarias y o de vejiga.

La presente invención puede usarse para administrar una gama de moléculas de ácidos nucleicos que pueden ser ADNc, además de ADN genómico o ARN, y pueden estar en la orientación sentido o antisentido. La molécula de ácido nucleico presente en una minicélula intacta, con arreglo a la presente invención, puede tomar la forma de un plásmido, vector de expresión u otra construcción genética, pero no es ADN genómico que se origina a partir de la célula bacteriana que dio lugar a la minicélula. Para su uso en la presente invención es adecuada cualquier secuencia de ADN o ARN adecuada de una fuente eucariota, procariota o sintética que pueda colocarse bajo el control de la traducción o transcripción de un promotor de la expresión génica eucariota, o que pueda expresarse en la célula de mamífero usando factores transactivantes de la célula huésped.

Ejemplo 1. Generación de minicélulas bacterianas de bacterias Gram-negativas, Salmonella typhimurium, Escherichia coli y Shigella flexneri

Se generaron cepas bacterianas productoras de minicélulas de bacterias Gram-negativas, como se describe aquí (A, B y C) y se ilustran en las Figuras 2 y 3.

Materiales y procedimientos generales

Las cepas bacterianas usadas en los ejemplos a continuación se enumeran y se aluden en la Tabla 1. Todas las

bacterias se cultivaron a partir de soluciones madre de glicerol mantenidas a -80 ºC. Las cepas de Salmonella, E.

coli, Shigella y Listeria se cultivaron en caldo con tripticasa de soja (TSB) (marca BBL comprado en Bacto Labs,

5 Liverpool, NSW, Australia). Se preparó según las instrucciones del fabricante a 30 g/l, y se esterilizó en autoclave a

121 ºC durante 15 minutos. El cultivo líquido se cultivó en una estufa de incubación con agitación a 37 ºC. Las cepas

de Shigella se diferenciaron de E. coli sembrando en placas de agar XLD (agar de xilosa-lisina-desoxicolato) para

producir colonias rojas y amarillas, respectivamente. XLD se compró en Oxoid (Melbourne, Australia). Se preparó

según las instrucciones del fabricante a 53 gm/l, luego se hirvió durante 2 minutos. Los antibióticos se usaron a las 10 siguientes concentraciones en medios líquidos y sólidos: ampicilina, 100 µg/ml, cloranfenicol, 30 µg/ml, kanamicina,

30 µg/ml.

Tabla 1. Cepas bacterianas usadas

Cepa de E. coli

Genotipo / características relevantes Referencia

ENIh001

SM100pir; F-supE44, thi-1, thr-1, leuB6, lacY1, tonA21, recA:RP4-2-Tc::Mu lambdapir, TnphoA, oriR6K, tra- mob+ Miller y Mekalanos (1988).

ENE105

Cepa ENIh001 que lleva el plásmido pEN060 (Fig. 3) La presente divulgación

ENIh003

JM109; F' traD36 proA+ proB+ laclq lacZDM15/recA1 endA1 gyrA96 (Nalr thi hsdR17 supE44 relA1 D(lacproAB) mcrA Yanisch-Perron y col. (1985)

Cepa de Salmonella

ENIh007

Salmonella enterica serovar Typhimurium. Cepa aislada clínica de oveja. Institute of Medical and Veterinary Services, Adelaida, SA, Australia. Cepa de referencia J98/00413

ENSm083

Salmonella choleraesuis subsp. choleraesuis (Smith) serotipo Weldin. Typhimurium depositada como Salmonella typhimurium ATCC 14028

SL3261

Salmonella typhimurium aroA- Hoiseth y col., (1981)

SL5283

Salmonella typhimurium hsdR-, hsdM+ Hoiseth y col., (1981)

Cepa de Shigella

ENSf001

S. flexneri serotipo 2b ATCC 12022

Cepa de Listeria

ENLM001

Listeria monocytogenes Gibson ATCC 7644 J. Pathol. Bacteriol. 45: 523, (1937)

Cuando se requirió, las cepas se cultivaron en medio mínimo M9 complementado con el 1 % de glucosa. Se

15 añadieron complementos adicionales dependiendo de la cepa. Para la cepa ENIh003 de E. coli se añadió tiamina 1 mM. Para la cepa ENSf001 de S. flexneri, M9 se complementó con serina 0,4 mM, prolina 0,2 mM, 0,001 % de fenilalanina, 0,001 % de triptófano, 0,001 % de tirosina, 0,001 % de histidina, 0,002 mg/ml de valina, 0,0125 mg/ml de ácido nicotínico, 0,001 % de tiamina y 0,0225 mg/ml de metionina.

El ADN de plásmido se purificó usando el kit Qiaprep Spin Miniprep (Qiagen Inc., Victoria, Australia). El ADN

20 genómico para las cepas de Salmonella, Shigella y E. coli se preparó usando el protocolo básico de Current Protocols in Molecular Biology (Capítulo 2, Sección I, unidad 2.4; John Wiley & Sons, Inc.). Todas las enzimas de restricción y modificación usadas se compraron en Promega (Madison, WI, EE.UU.) o Roche (Castle Hill, NSW, Australia), excepto la ADN polimerasa Deep Vent, que se compró en New England Biolabs (Beverly, MA, EE.UU.).

El ADN genómico de L. monocytogenes (ENLM001) se purificó mediante procedimientos convencionales (Ausubel y 25 col., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons Inc.) con modificaciones como se han descrito.

Una muestra de 1,5 ml de un cultivo durante la noche se centrifugó a 13.200 rpm durante 3 minutos y el sobrenadante se desechó. El sedimento de células bacterianas se resuspendió en 1 ml de tampón TE (Tris 10 mM a pH 8,0; EDTA 1 mM a pH 8,0) con 2,5 mg/ml de lisozima y se incubó a 37 ºC durante 1 hora. Entonces se añadió RNAsa A a una concentración final de 15 mg/ml, y la solución se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Entonces se añadieron 100 µg/ml de proteinasa K y 0,5 % de SDS y la mezcla se incubó adicionalmente durante una hora a 37 ºC. Posteriormente, 200 µl de NaCl 5 M se mezclaron rigurosamente en la solución, seguido de 160 µl de solución de CTAB/NaCl (10 % de CTAB en NaCl 0,7 M). Entonces, esta mezcla se incubó durante 10 minutos a 65 ºC. La muestra se extrajo con un volumen igual de cloroformo/alcohol isoamílico seguido de una extracción con un volumen igual de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico. El ADN genómico se precipitó en disolución con 0,6 volúmenes de isopropanol y 1/10 de volumen de acetato sódico 5 M. El sedimento de ADN se lavó con etanol y se secó al aire antes de la resuspensión en tampón TE.

Los cebadores de PCR se sintetizaron y se compraron en Sigma-Genosys (Castle Hill, NSW, Australia). El protocolo de PCR básico seguido fue del siguiente modo. Los componentes de reacción para todas las PCR de 50 µl incluyeron 1X tampón, dNTP 200 µM, 50 pmoles de cada cebador, 1 unidad de ADN polimerasa Deep Vent, 50 pmoles de molde de ADN genómico (25 pmoles para plásmidos), agua libre de nucleasas hasta 50 µl, con PCR realizada en tubos de 0,2 ml en un ciclador térmico rápido para PCR en gradiente de Thermo Hybaid (Ashford, Middlesex, RU). Las condiciones de PCR para obtener la agrupación de genes minCDE fueron del siguiente modo: 94 ºC durante 4 minutos; seguido de 30 ciclos a 94 ºC durante 35 segundos, 60 ºC durante 30 segundos, 72 ºC durante 2,5 minutos; seguido de un ciclo final a 94 ºC durante 35 segundos, 60 ºC durante 35 segundos, 72 ºC durante 5 minutos. Las condiciones de PCR para obtener el casete LminCDE fueron del siguiente modo: 94 ºC durante 4 minutos; seguido de 30 ciclos a 94 ºC durante 35 segundos, 60 ºC durante 30 segundos, 72 ºC durante 2 minutos; seguido de un ciclo final a 94 ºC durante 35 segundos, 60 ºC durante 35 segundos, 72 ºC durante 4 minutos. Las condiciones de PCR para obtener el casete LminCDE::Cml fueron del siguiente modo: 94 ºC durante 4 minutos; seguido de 30 ciclos a 94 ºC durante 35 segundos, 60 ºC durante 30 segundos, 72 ºC durante 3 minutos; seguido de un ciclo final a 94 ºC durante 35 segundos, 60 ºC durante 35 segundos, 72 ºC durante 6 minutos.

Los protocolos de biología molecular convencionales fueron como se describen en Sambrook y col. (1989) y en CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (John Wiley & Sons, Inc., NJ, EE.UU.).

El rendimiento de minicélulas se determinó microscópicamente usando un microscopio óptico Leica modelo DMLB con análisis de imágenes por medio de una cámara Leica DC y software de gestión de imágenes Leica IM. Las muestras se visualizaron usando microscopía de campo oscuro a 40X o inmersión en aceite a 100X aumentos. Los cubreobjetos sobre portaobjetos de vidrio se sellaron con el 1,5 % de agarosa. La pureza de cada lote de minicélulas se determinó sembrando un 10 % del volumen sobre placas de agar con tripticasa de soja e incubación durante la noche a 37 ºC. El procedimiento proporcionó rutinariamente una pureza muy alta con una célula contaminante en 109 minicélulas. Las suspensiones de minicélulas se resuspendieron en TSB con los antibióticos apropiados para los que se determinó que las bacterias parentales eran sensibles y los cultivos se incubaron con agitación a 37 ºC durante 4 horas para matar todas las bacterias parentales residuales. Por ejemplo, se determinó que la cepa minCDE de S. typhimurium era sensible a ampicilina y de ahí que la suspensión de minicélulas se incubara en TSB que contenía 50 µg/ml de ampicilina durante 4 horas para garantizar que si hubiera cualquier bacteria residual entonces serían matadas. Entonces, las minicélulas se recogieron por centrifugación a 10.000 g durante 30 minutos, se lavaron cuatro veces en 1 x tampón BSG (para eliminar el medio de crecimiento) y se resuspendieron en el volumen deseado para experimentos aguas abajo.

[A] Generación de cepas productoras de minicélulas a partir de dos cepas diferentes de Salmonella typhimurium.

Un diagrama esquemático de construcción de plásmido se muestra en la Figura 2. Las cepas bacterianas, plásmidos y cebadores de PCR usados se muestran en la Tablas 1, 2 y 3 respectivamente.

Las secuencias de genes minCDE de E. coli, véase Mori (1996), se usaron para buscar en la base de datos Genbank secuencias de ADN homólogas usando el procedimiento de análisis FASTA (Pearson y Lipman, 1988). Se encontró que secuencia de ADN del contigo de TYPN3 101 del genoma de S. typhi (CT18) era homóloga a las secuencias de minCDE de E. coli. Los cebadores de oligonucleótidos ENOL001 y ENOL002 se diseñaron basándose de estos datos y se usaron para cebar la síntesis de los genes minCDE intactos a partir de la cepa ENIh008 de S. typhimurium como un fragmento de EcoRI-minCDE-HindIII.

Este fragmento se clonó en los sitios EcoRI/HindIII de pNEB193 para crear un plásmido designado pEN001, que se propagó en la cepa JM109 de E. coli para producir la cepa ENE001. Los cebadores ENOL003 y ENOL004 se diseñaron para delecionar un total de 1081 pb de la secuencia del casete de minCDE en pEN001, a la vez que simultáneamente se insertaban 16 pares de bases (pb) que contenían los sitios de restricción KpnI, SmaI y XbaI únicos como localizaciones para la futura inserción de uno o más genes marcadores.

La secuencia delecionada incluyó 386 pares de bases a partir del extremo 3' del gen minC, la secuencia interviniente de 23 pares de bases en la dirección 5' del gen minD y 672 pares de bases a partir del extremo 5' del gen minD. Esto produjo el casete de deleción LminCDE (755 pares de bases) en el plásmido pEN002 alojado en la cepa ENE003. El gen de resistencia a cloranfenicol de pHSG415 (Fig. 2, Tabla 2), fragmento HaeII de 1330 pares de bases/de extremos romos, se clonó en el sitio SmaI de pEN002 para obtener el plásmido pEN003, que lleva el casete de deleción LminCDE::CmlR con el gen CmlR clonado en la orientación de las agujas del reloj. Ésta se designó la cepa ENE006.

Tabla 2. Plásmidos usados en este estudio.

Plásmido

Características relevantes Referencia

pHSG415

Número de copias bajo, sensible a la temperatura, movilizable Hashimotoh-Gotoh y col., (1981)

pGP704

Derivado de pBR322 en el que oriE1 se ha sustituido con oriR6K. El origen de replicación R6K requiere para su función una proteína llamada pi, codificada por el gen pir. En E. coli, la proteína pi puede ser suministrada en trans por un profago (opir) que lleva una copia clonada del gen pir. El plásmido también contiene un fragmento BamHI de 1,9 kb que codifica la región mob de RP4. Por tanto, pGP704 puede movilizarse en cepas receptoras por funciones de transferencia proporcionadas por un derivado de RP4 integrado en el cromosoma de la cepa SM10 de E. coli. Sin embargo, una vez transferido, es incapaz de replicarse en receptores que carecen de la proteína pi. AmpR Miller y Mekalanos (1988)

pNEB193

Es un derivado de pUC 19 que lleva sitios únicos para los cortadores de 8 bases únicos: Asc I, Pac I y Pme I. El poliligador lleva los sitios de restricción únicos EcoRI, SacI, KpnI, SmaI, AscI, BssHII, BamHI, PacI, XbaI, SalI, PmeI, SbfI, PstI, SphI, HindIII. El poliligador no interrumpe el marco de lectura lacZ. AmpR Comprado en New England Biolabs, Inc. Beverly, MA, EE.UU.

pMK4 (5,6 kb)

Vector lanzadera de E. coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, lacZ' (de pUC9), CmlR (de pC194) en Bacillus, AmpR en E. coli. CmlR en Bacillus Sullivan y col., (1984)

pVA838 (9,2 kb)

Vector lanzadera de E. coli y Streptococcus sanguis, resistente a eritromicina (EmR) en S. sanguis, CmlR en E. coli. Macrina y col., (1982)

pRB373

Vector lanzadera de E. coli y B. subtilis, bla (AmpR) y E. coli ori se derivaron de Brückner (1992)

(5,8 kb)

pBR322. ori con resistencia a kanamicina (KmR), resistencia a bleomicina (BmR) y Gram-positivas se derivaron de pUB110. to (terminador de la transcripción) es del fago λ.

pEGFP

Lleva una variante desplazada hacia el rojo de proteína verde fluorescente (GFP) natural que se ha optimizado para fluorescencia más brillante y mayor expresión en células de mamífero (máximo de excitación = 488 nm; máximo de emisión = 507 nm). Las secuencias en la dirección 5' que flanquean EGFP se han convertido en un sitio de iniciación de la traducción consenso de Kozak para aumentar adicionalmente la eficiencia de traducción en células eucariotas. El gen EGFP se clonó entre las dos MCS del derivado de pUC19 pPD16.43. El gen EGFP se insertó en marco con el codón de iniciación lacZ de pUC 19 de manera que una proteína de fusión de EGFP se expresara a partir del promotor lac en E. coli. El esqueleto de pUC de EGFP proporciona un origen de replicación de número de copias alto y un gen de resistencia a ampicilina para la propagación y selección en E. coli. Comprado en Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, EE.UU.

(continuación)

Plásmido

Características relevantes Referencia

pEGFP-C

EGFP es como se ha descrito para el plásmido pEGFP. Las secuencias que flanquean EGFP se han convertido en un sitio de iniciación de la traducción consenso de Kozak para aumentar adicionalmente la eficiencia de traducción en células eucariotas. El gen EGFP se expresa a partir del promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano y de ahí que el plásmido sólo exprese EGFP en células de mamífero y no en células bacterianas. La MCS en pEGFP-C1 está entre las secuencias codificantes de EGFP y el poli A del SV40 (en la dirección 3' del gen EGFP) que dirige el procesamiento apropiado del extremo 3' del ARNm de EGFP. El esqueleto del vector también contiene un origen de SV40 para la replicación en células de mamífero que expresan el antígeno T de SV40 T. Un casete de resistencia a neomicina (neor), que consiste en el promotor temprano del SV40, el gen de resistencia a neomicina/kanamicina de Tn5 y las señales de poliadenilación del gen timidina-cinasa (TK del VHS) del herpes simple permite que células eucariotas establemente transfectadas se seleccionen usando G418. Un promotor bacteriano en la dirección 5' de este casete expresa resistencia a kanamicina en E. coli. El esqueleto de pEGFP-C1 también proporciona un origen de replicación pUC para la propagación en E. coli y un origen f1 para la producción de ADN monocatenario. Comprado en Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, EE.UU.

El casete de deleción LminCDE::CmlR se amplificó a partir del plásmido pEN003 por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando los cebadores ENOL001 y ENOL002, se hicieron romos los extremos y se clonaron en el sitio SmaI del plásmido suicida pGP704 (Fig. 2; Tabla 2). El plásmido, designado pEN005, se transformó en la cepa ENIh001 (SM10λpir; Tabla 1) para dar el número de cepa ENE007. La cepa ENE007 se usó como cepa donante en un experimento de conjugación (acoplamiento de filtros) con las cepas ENIh007 y ENSm083 de S. typhimurium (Tabla 1) como receptor. Durante la noche, los cultivos estáticos del donante y el receptor se cultivaron en TSB a 37 ºC. Los cultivos se mezclaron en una conjugación por acoplamiento de filtros sobre membranas Hybond N+ sobre placas de TSA a una relación de donante:receptor de 1:3 y se incubaron a 37 ºC durante 8 horas. Las células se recuperaron y se lavaron dos veces en una solución salina estéril. El sedimento de células se resuspendió en solución salina y se sembró en placas de Petri de 150 mm. Las placas se incubaron durante hasta 72 horas a 37 ºC.

Los exconjugantes se seleccionaron sobre medio mínimo M9 con el 1,5 % de glucosa y 30 µg/ml de cloranfenicol. La cepa donante se contra-selecciona bajo estas condiciones, debido a requisitos auxotróficos adicionales, mientras que la cepa receptora no puede crecer debido a su sensibilidad al cloranfenicol. Por tanto, este experimento seleccionó exconjugantes de S. typhimurium que llevan la resistencia a cloranfenicol codificada por plásmido. Las colonias se cribaron para el fenotipo deseado de CmlR y Amps parcheando cepas aisladas sobre el medio mínimo M9 que contenía ampicilina (Amp) o cloranfenicol (Cml). De las 79 cepas aisladas de la conjugación ENE007 x ENIh007 que presentó CmlR, se encontró que un total de 18 cepas aisladas eran Amps. De manera similar, de las 56 cepas aisladas de la conjugación ENE007 x ENSm083, se encontró que 19 eran Amps.

Para determinar si las cepas aisladas fueron cromosómicamente delecionadas para los genes minCD, los cultivos durante la noche se visualizaron por microscopía de campo oscuro a 40X aumentos. Las minicélulas se visualizaron en el cultivo mixto para las 27 cepas aisladas. Todas las cepas aisladas mostraron la presencia de minicélulas, mientras que las cepas de control parentales estuvieron ausentes para minicélulas. Las minicélulas purificadas se probaron para aglutinación con suero aglutinante somático 4-0 Salmonella (conejo) ZC13 (Murex Diagnostics, Norcross, Georgia, EE.UU.).

La cepa bacteriana recombinante se cultivó bajo condiciones de laboratorio que son óptimas para la producción de minicélulas recombinantes. El crecimiento bacteriano se lleva a cabo usando medios bacteriológicos convencionales tales como aquellos descritos en Sambrook y col. (1989), y usando condiciones de crecimiento óptimas que pueden determinarse fácilmente por técnica convencional.

[B] Generación de cepa productora de minicélulas a partir de Shigella flexneri.

La Figura 3 representa las etapas relevantes en la construcción genética de una cepa productora de minicélulas de

S. flexneri serotipo 2b. El protocolo de clonación fue similar al seguido para la construcción de cepas de S. typhimurium productoras de minicélulas, detallado anteriormente.

Para clonar la agrupación de genes minCDE a partir de S. flexneri serotipo 2b (Tabla 1), los cebadores de clonación de PCR se diseñaron basándose en una búsqueda de base de datos del proyecto de secuenciación en progreso para la secuencia del genoma de Shigella flexneri completa, serotipo 2a. Los cebadores de PCR ENOL059 y ENOL060 que llevan colas de EcoRI y HindIII respectivamente (Tabla 3) se usaron para amplificar la agrupación de genes minCDE de 1808 pb de ADN genómico purificado a partir de Shigella flexneri, serotipo 2b. El fragmento amplificado se clonó en los sitios EcoRI y HindIII del plásmido pNEB193 (Tabla 2), produciendo el plásmido pEN055. El ADN de inserto se secuenció y se confirmó que era el ADN de minCDE de la bacteria Shigella parental.

Tabla 3. Oligonucleótidos usados en este estudio. Los sitios de enzimas de restricción y las características de secuencias de ADN se muestran entre paréntesis precediendo al segmento de ADN respectivo. (F) y (R) representan cebadores de PCR directos e inversos, respectivamente. 5

Oligonucleótido

Secuencia Producto

ENOL001

5' (cola) CTC TCA CTG (EcoRI) GAA TTC (minC) ATG TCA AAC ACG CCA ATC GAG C 3' (F) minCDE de S. typhimurium

ENOL002

5' (cola) CTC CTG GCA (HindIII) AAG CTT (minE) TTA TTT TGA CTC TTC GGC TTC CG 3' (R) minCDE de S. typhimurium

ENOL003

5' (cola) CTC TGC TAG TCA (SmaI-KpnI) CCC GGG TAC C (minC) GCC GAA CCG CTT TCT CTT TAC C 3' (R) deleción de S. typhimurium de minCDE para obtener LminCDE

ENOL004

5' (cola) CTC TGC TAG TCA (SmaI) CCC GGG (XbaI) TCT AGA (minD) GAA CCG GTG ATT CTT GAC GCC A 3' (F) deleción de S. typhimurium de minCDE para obtener LminCDE

ENROL059

5' (cola) CTC TCA CT (EcoRI) GAA TTC (minC) ATG TCA AAC ACT CCA ATC GAG CT 3' (F) clonación de minCDE de S. flexneri 2b

ENOL060

5' (cola) CTC CTG GC (HindIII) AAG CTT (minE, incluye los 2 últimos pb para HindIII) ATT TCA GCT CTT CTG CTT CCG 3' (R) S clonación de minCDE de S. flexneri 2b

ENOL062

5' (cola) CTC TCA TAA (SmaI) CCC GGG (XbaI) TCT AGA (minD) GGC GTG ATC CCA GAG GAT CAA T 3' (F) deleción de S. flexneri 2b de minCDE para obtener LminCDE

ENOL063

5' (cola) CTC TCA TTC (SmaI-KpnI) CCC GGG TAC C (minC) TGT GGA GCA TAA ATA CGC TGA CC '3 (R) deleción de S. flexneri 2b de minCDE para obtener LminCDE

ENOL038

5' (cola) CTC CAG TCT (HindIII) AAG CTT (minD) AGG AGC CGC GCT TAC TAT TAG C 3' (R) minCD de Listeria monocytogenes

ENOL048

5' (cola) CTC CAG TCT (SacI) GAG CTC (minC) GAA GAA GAA TGT TCA AAT TAA AGG C 3' (F) minCD de Listeria monocytogenes

ENOL039

5' (cola) CTC CAG TCT (BamHI) GGA TCC (XbaI) TCT AGA (minC) ATC CCC TGG AAC CTG AAC AAC 3' (R) deleción de Listeria monocytogenes de minCD para obtener LminCD

ENOL040

5' (cola) CTC CAG TCT (BamHI) GGA TCC (KpnI) GGT ACC (minD) CCG GAA ATA TCA GCA GTT CG 3' (F) deleción de Listeria monocytogenes de minCD para obtener LminCD

ENOL098

5' (cola) CTC CAG TCT (XbaI) TCT AGA (CmR) TTT TTG CGC TTA AAA CCA GTC A 3' (R) obtener Cm' a partir de pMK4

ENOL099

5' (cola) CTC CAG TCT (KpnI) GGT ACC (CmR) AAA ACC TTC TTC AAC TAA CGG GG 3' (F) obtener Cm' a partir de pMK4

ENOL096

5' (cola) CTC CAG TCT (XbaI) TCT AGA (Emr) GAG ATA AGA CGG TTC GTG TTC GT 3' (R) obtener Emr a partir de pVA838

ENOL097

5' (cola) CTC CAG TCT (KpnI) GGT ACC (Emr) AGA ATG CAG AAG ATG AAA GCT GG 3' (F) obtener Em' a partir de pVA838

ENOL092

5' (cola) CTC CAG TCT (EcoRI) GAA TTC (Kanr) TGA AGG ATG CTT AGG AAG ACG AG 3' (F) obtener Kan' a partir de pRB373

ENOL093

5' (cola) CTC CAG TCT (EcoRI) GAA TTC (Kanr) CGC CAT GAC AGC CAT GAT AA 3' (R) obtener Kan' a partir de pRB373

(continuación)

Oligonucleótido

Secuencia Producto

ENOL094

5' (cola) CTC CAG CTC (EcoRI) GAA TTC (Kanr y G+ ori) AAG GTG CGT TGA AGT GTT GGT A 3' (F) obtener Kan' y ori G+va a partir de pRB373

Se obtuvo una deleción en la agrupación de genes minCDE usando los cebadores de PCR ENOL062 y ENOL063 (Tabla 3) y el plásmido pEN055 como ADN mensajero en una reacción de PCR inversa. Esto produjo la deleción de 271 pb (región del extremo 3' de minC), 23 pb (secuencia intergénica entre minC y minD) y 608 pb (región del extremo 5' de minD). Simultáneamente, las secuencias de cebadores de PCR insertaron un sitio de clonación múltiple que llevaba sitios de restricción KpnI-SmaI-XbaI. El producto de PCR se digirió con SmaI y se religó para crear el plásmido pEN056.

El marcador de CmlR se purificó en gel a partir del plásmido pHSG415 (Tabla 2) como una fragmento HaeII de 1330 pb, se hicieron romos los extremos con T4 ADN polimerasa y se clonaron en el sitio SmaI del plásmido pEN056. El nuevo plásmido de LminCDE::CmlR se designó pEN057.

El casete LminCDE::CmlR se obtuvo por PCR usando los cebadores ENOL059 y ENOL060 (Tabla 3) y usando el plásmido pEN057 como molde. El fragmento de 2.272 pb se clonó en los extremos romos en el sitio EcoRV del plásmido suicida pGP704 (Tabla 2). El nuevo plásmido suicida se designó pEN060 y la cepa SM10λpir que llevaba se designó ENE105.

Se usó una conjugación con acoplamiento de filtros para el plásmido de transferencia pEN060 de ENE105 con la cepa ENSf001 de Shigella flexneri (Tabla 1) con una relación de receptor:donante de 5:1, los cultivos durante la noche (crecimiento estático) del receptor y el donante se mezclaron sobre membranas Hybond N+ sobre placas de TSA a la relación calculada y se incubaron durante la noche a 37 ºC. Las células se recuperaron y se lavaron dos veces antes de sembrar en medio mínimo selectivo que contenía suplementos y 30 µg/ml de cloranfenicol. El donante y el receptor no pueden crecer en este medio debido a tanto requisitos auxotróficos (donante) como a sensibilidad a antibióticos (receptor), de manera que cualquier colonia encontrada sería exconjugantes. Se recogieron treinta y dos (32) cepas aisladas y se parchearon sobre placas de medio mínimo fresco que contenían suplementos y 30 µg/ml de cloranfenicol.

Los 32 exconjugantes se incubaron a 37 ºC durante la noche antes de parchearse sobre placas de medio mínimo fresco que contenían suplementos y 100 µg/ml de ampicilina y luego se incubaron a 37 ºC durante 24-48 horas. Las 32 cepas aisladas pudieron cultivarse en ampicilina que indica la integración del plásmido completo. Cada cepa aislada se examinó bajo microscopía de campo oscuro (40X) o bajo inmersión en aceite (100X). Tres de las cepas aisladas revelaron la presencia de minicélulas. Las cepas aisladas se cultivaron en línea sobre placas de XLD que contenían 30 µg/ml de cloranfenicol para confirmar que la cepa aislada era Shigella y no el donante de E. coli. Las cepas aisladas también mostraron una fuerte reacción de aglutinación positiva cuando se probaron con sueros aglutinantes de Shigella flexneri (BIODESIGN International, Saco, Maine, EE.UU.). La purificación de plásmidos y los análisis electroforéticos en gel confirman que el plásmido de donante no estaba presente en los exconjugantes como episoma.

[C] Generación de cepa productora de minicélulas a partir de Escherichia coli.

Dado que hay un 98 % de homología genética entre los genomas de E. coli y Shigella, este estudio tuvo como objetivo determinar si secuencias heterólogas del gen de LminCDE podían usarse para generar cepas productoras de minicélulas especialmente cuando las secuencias de genoma estaban estrechamente relacionadas. Por tanto, se usó una conjugación con acoplamiento de filtros para el plásmido de transferencia pEN060 (lleva LminCDE::CmlR de

S. flexneri 2a; Fig. 3) de ENE105 (Tabla 1) a la cepa ENIh003 de E. coli (JM109; Tabla 1) con una relación de receptor:donante de 3:1. Cultivos durante la noche (crecimiento estático) del receptor y donante se mezclaron sobre membranas Hybond N+ sobre placas TSA a la relación calculada y se incubaron durante la noche a 37 ºC. Las células se recuperaron y se lavaron dos veces antes de sembrarse sobre medio mínimo selectivo que contenía suplementos y 30 µg/ml de cloranfenicol. El donante y receptor no pueden cultivarse en este medio debido a tanto requisitos auxotróficos (donante) como a sensibilidad a antibióticos (receptor). Se recogieron 106 cepas aisladas y se parchearon sobre placas de medio mínimo fresco que contenían suplementos y 30 µg/ml de cloranfenicol. Después de la incubación durante la noche a 37 ºC, las cepas aisladas se parchearon sobre placas de medio mínimo fresco que contenían suplementos y 100 µg/ml de ampicilina y se incubaron a 37 ºC durante 24-48 horas. Las 106 cepas aisladas pudieron cultivarse en ampicilina sugiriendo la integración del plásmido completo. Veinticuatro (24) cepas aisladas se visualizaron bajo microscopía de campo oscuro (40X) y 100 X inmersión en aceite. Seis cepas aisladas mostraron la presencia de números grandes de minicélulas. Aunque en el pasado se han empleado muchos protocolos de mutagénesis y mutagénesis dirigida a sitio generales diferentes para generar cepas bacterianas productoras de minicélulas, la presente invención es la primera que demuestra que el único protocolo de clonación/mutagénesis dirigida a sitio empleado en este estudio es versátil y puede usarse de forma fidedigna para

generar cepas productoras de minicélulas a partir de una gama de bacterias Gram-negativas y Gram-positivas (Ejemplo 2 mostrado a continuación).

Ejemplo 2. Generación de minicélulas a partir de Listeria monocytogenes

Pueden generarse cepas bacterianas productoras de minicélulas a partir de bacterias Gram-positivas como se describe en este ejemplo. Un diagrama esquemático de construcción de plásmido se muestra en la Figura 4. Las cepas bacterianas, plásmidos y cebadores de PCR se enumeran respectivamente en la Tabla 1, Tabla 2 y la Tabla

3.

Para clonar los genes minCD a partir del genoma de L. monocytogenes se realizó PCR usando los cebadores ENOL038 y ENOL048 (Tabla 3) y se purificó ADN genómico de L. monocytogenes como molde. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en volúmenes de 50 µl usando el kit de ADN polimerasa Platinum® Pfx (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, EE.UU.). Las reacciones incluyeron 1X tampón Pfx, MgSO4 2 mM, dATP 0,2 mM, dTTP, dGTP y dCTP, 50 pmoles de cada cebador, y 1U de Pfx polimerasa. Las condiciones de ciclado incluyeron una etapa desnaturalizante a 94 ºC durante dos minutos; seguido de 35 ciclos de 94 ºC durante 30 segundos, 55 ºC durante 30 segundos y 68 ºC durante dos minutos; seguido de una etapa de extensión final a 68 ºC durante cinco minutos. Una muestra de 2-5 µl de cada mezcla de reacción de PCR se visualizó sobre un 1 % de gel de agarosa teñido con bromuro de etidio. El fragmento de minCD amplificado se purificó por escisión del gel de agarosa, seguido de electroelución usando el electroeluidor modelo 422 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.) según las especificaciones del fabricante.

El fragmento de minCD (1.556 pb) se digirió con SacI y HindIII, y direccionalmente se clonó en los sitios respectivos del plásmido pNEB193 (Tabla 2; Fig. 4). Los clones recombinantes transformados en la cepa ENIh003 (Tabla 1) se caracterizaron por digestión con restricción y se analizaron por electroforesis en gel. El clon correcto (plásmido designado pEN045) se secuenció para confirmar la identidad de los genes minCD.

La deleción por PCR se realizó en el fragmento de minCD clonado en el plásmido pEN045 usando los cebadores ENOL039 y ENOL040 (Tabla 3). Los cebadores llevan sitios de restricción XbaI y KpnI, respectivamente, que sirven de sitios de inserción para marcadores de selección entre LminC y LminD. Las condiciones de reacción para la deleción de minCD, y la visualización de fragmentos, fueron como se han descrito anteriormente, pero con una etapa de extensión a 68 ºC de 4 minutos. El fragmento de LminCD se digirió posteriormente con XbaI y KpnI, y se purificó por electroelución con el electroeluidor modelo 422 como preparación para la ligación con marcadores de selección.

Dos marcadores de selección de antibióticos diferentes de bacterias Gram-positivas se insertaron entre los genes LminC y LminD en pEN045 en los sitios KpnI y XbaI. El marcador de resistencia a cloranfenicol (CmlR) del plásmido pMK4 de Bacillus subtilis (Tabla 2) y el marcador de resistencia a eritromicina (EmR) del plásmido pVA838 de Streptomyces sanguis (Tabla 2) se usaron para construir los plásmidos pEN062 y pEN063, respectivamente (Fig. 4). Cada marcador se amplificó por PCR usando los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 2 y mostrados en la Fig. 4, que incluían sitios XbaI y KpnI. La PCR de CmR y EmR se llevó a cabo usando el mismo volumen de reacción y concentraciones de reactivo como se han descrito anteriormente. Las condiciones de ciclado incluyeron una etapa de desnaturalización a 94 ºC durante dos minutos; seguido de 35 ciclos de 94 ºC durante 30 segundos, 55 ºC durante un minuto y 68 ºC durante dos minutos; seguido de una etapa de extensión a 68 ºC durante cinco minutos. Los fragmentos de PCR se purificaron en gel usando el kit MinElute (Qiagen Inc, Victoria, Australia) según las instrucciones del fabricante. Entonces, CmR y EmR se digirieron con KpnI y XbaI, se purificaron con un columna MinElute y se ligaron a los sitios respectivos entre los genes LminC y LminD en pEN045. Los recombinantes de JM109 se caracterizaron por digestión con restricción con las enzimas EcoRI y DdeI (CmR) y EcoRI y AvaI (EmR) para dar las cepas aisladas ENE110 y ENE112, respectivamente.

Con fines de experimentos de conjugación entre SM10λpir de L. monocytogenes y E. coli (ENIh001) se construyeron cuatro nuevos plásmidos usando el plásmido conjugativo pGP704. El plásmido pGP704 se modificó para incluir tanto el marcador de resistencia a kanamicina (KmR), codificado por el gen neo, como KmR, además de ori para la replicación de plásmidos en bacterias Gram-positivas. El último actuaría en un plásmido suicida en ausencia de un origen de replicación Gram-positivo, sirviendo el gen neo (KmR) de marcador para la presencia de plásmidos. A diferencia, el último actuaría de control positivo para los experimentos de conjugación.

Los segmentos de ADN que contienen el gen neo y ori Gram-positiva que incluye el gen neo se amplificaron por PCR a partir de pRB373 usando el conjunto de oligonucleótidos enumerados en la Tabla 3. Los volúmenes de reacción de PCR y las concentraciones de reactivo fueron como se ha descrito anteriormente. Las condiciones de ciclado incluyeron una etapa de desnaturalización de 2 minutos a 94 ºC; seguido de 35 ciclos de 94 ºC durante 30 segundos, 56 ºC durante un minuto, y 68 ºC durante 2 minutos y medio; seguido de una larga etapa de extensión de 68 ºC durante 5 minutos. Los productos se purificaron a partir de un gel de agarosa usando la columna MinElute. Los fragmentos que contenían el gen neo y el gen neo más ori Gram-positiva se cortaron con EcoRI y se ligaron en el sitio EcoRI de pGP704 (Fig. 4). Esto produjo plásmidos designados pEN064 y pENO66.

Entonces, LminCD::CmlR o LminCD::EmR se escindieron como fragmentos SacI - HindIII a partir de pEN062 y pEN063, respectivamente, se hicieron romos los extremos y se ligaron en el sitio EcoRV de los plásmidos pEN064 y pEN066 para dar los cuatro plásmidos diferentes pEN069, pEN071, pEN073 y pEN075 como se representa en la Fig. 4. Los cuatro plásmidos se transformaron en ENIh001 (SM10λpir de E. coli) para crear las cepas ENE124, ENE126, ENE128 y ENE130, respectivamente. Por tanto, ENE124 contuvo el plásmido con LminCD::CmR y el gen neo (KmR), mientras que ENE126 tiene, además, ori Gram-positiva. De manera similar, ENE128 contuvo el plásmido con LminCD::EmR y el gen neo (KmR), mientras que ENE130 contuvo adicionalmente ori Gram-positiva.

Las cuatro cepas ENE124, ENE126, ENE128 y ENE130 se usaron como cepas donante para los experimentos de conjugación con L. monocytogenes (ENLM001). Las conjugaciones se llevaron a cabo esencialmente como se describe en Trieu-Cuot y col. (1991). Todas las cepas se cultivaron a fase semilogarítmica y se mezclaron en una relación 2:1 (receptor:donante) a un volumen de 1 ml. Las mezclas de conjugación se lavaron dos veces en BHI antes de resuspenderse en 1 ml de BHI. Se sembraron volúmenes de 200 µl en filtros de membrana de nitrocelulosa 0,45 µM (Millipore) sobre placas BHI y se incubaron durante 18 horas a 37 ºC. Tras la incubación, las membranas de nitrocelulosa se rebanaron en tiras y se dispusieron en 3 ml de BHI. Se aplicó agitación con vórtex vigorosa para desplazar células bacterianas de las membranas de filtración. Se sembraron muestras de 300 µl de volumen en placas grandes que contenían BHI, ácido nalidíxico (Nal; 50 µg/ml), colistina (Col; polimixina E) (10 µg/ml) y tanto cloranfenicol (10 µg/ml) como eritromicina (10 µg/ml). Las placas se incubaron durante 48 horas a 37 ºC antes de recogerse las colonias.

Las colonias se parchearon sobre placas de BHI/Nal/Col que contenían kanamicina (15 µg/ml), además de sobre placas con BHI/Nal/Col y tanto cloranfenicol (10 µg/ml) como eritromicina (10 µg/ml), para la prueba de sensibilidad a antibióticos. Todos los exconjugantes demostraron un perfil antibiótico que sugirió la integración cromosómica de la deleción de minCD sin integración del plásmido. Es decir, todos los exconjugantes se cultivaron sobre placas de antibiótico que contenían el marcador interno eritromicina o cloranfenicol y no exconjugantes se cultivaron sobre placas que contenían kanamicina (KmR codificada por el gen neo sobre plásmidos de donante).

Se examinaron más de cien exconjugantes para el fenotipo de minicélulas usando microscopía de campo oscuro (40x) e inmersión en aceite (100x). Todas las cepas aisladas demostraron un número variable de estructuras de minicélulas entre la población de bacilos parentales de L. monocytogenes cuando se compararon con células parentales bajo el microscopio (ENIh001 y ENLm001). Este resultado también está de acuerdo con la integración de la deleción de minCD y la disrupción de la división pericentral normal.

Se eligieron treinta exconjugantes y se subcultivaron para probar el mantenimiento del fenotipo de minicélulas. Tras la confirmación del mantenimiento, las cepas aisladas se almacenaron como soluciones madre en glicerol para futuros experimentos.

Ejemplo 3. Purificación de minicélulas a partir de especies bacterianas

Se purificaron minicélulas por el siguiente procedimiento inventivo. Este ejemplo detalla la purificación de minicélulas derivadas de minCDE de S. typhimurium. El mismo procedimiento se usó para purificar minicélulas a partir de cepas mutantes de min adicionales que incluyen dos mutantes de S. typhimurium, y un mutante cada uno de E. coli, S. flexneri y L. monocytogenes. El procedimiento se optimizó y se repitió más de 50 veces para generar minicélulas purificadas. Fue fidedigno, y rutinariamente dio 108 a 109 minicélulas purificadas a partir de un cultivo bacteriano de10 l.

Se estableció un cultivo de minCDE-/pEGFP-C1 de S. typhimurium a partir de una solución madre de glicerol en 50 ml de TSB que contenía los antibióticos cloranfenicol y kanamicina (50 ug/ml de concentración final). El cultivo se incubó con agitación a 37 ºC durante la noche. Se usó una alícuota de 2,5 ml del cultivo durante la noche para inocular 1 l (en un matraz cónico de 2 l con deflectores) de TSB que contenía los antibióticos anteriormente mencionados, y se incubaron cinco matraces con agitación a 37 ºC durante la noche.

(A) Preparación previa (etapa I)

Una bolsa BioProcess de 100 l se llenó con agua de tipo 1 (MQ) por un manguito estéril mediante un filtro de 0,2 µm. A dos bidones de 20 litros, previamente esterilizados en autoclave, que contenían 2 l de 10X BSG, se transfirieron 18 l de agua de procedimiento estéril por bomba peristáltica. Un bidón fue para diluir la minisuspensión de células y el otro fue para su uso en diafiltración.

(B) Centrifugación diferencial y preparación previa (etapa 2)

El cultivo bacteriano se centrifugó a 2000 g durante 10 minutos (Sorvall Legend T/RT; TTH 750 rotor). El sobrenadante se decantó en un bidón de 5 l estéril que se dotó de un filtro de ventilación de 0,2 µm y un accesorio de rápida desconexión. El procedimiento de decantación se realizó en una vitrina de riesgo biológico de clase II. El bidón se cerró, un tubo estéril se conectó al bidón de 5 l, y el otro extremo del tubo se conectó al bidón de 20 l previamente llenado que contenía 20 l de 1 x BSG como se ha descrito anteriormente. La suspensión que lleva minicélulas se bombeó del bidón de 5 l al bidón de 20 l para dar una dilución de 1:5.

(C) Sistema de purificación de minicélulas continuo

Se conectaron en serie tres sistemas de flujo cruzado de Sartorius. Por duplicado, filtros modulares de rodajas Sartocon de 0,45 µm se ajustaron en los dos primeros soportes de rodajas y un módulo de filtro de rebanadas Sartocon de 0,2 µm se ajustó en el último soporte. La torsión sobre cada unidad de filtración se apretó a 20 Nm (Newton-metros) usando una llave de torsión. Cada unidad se unió a una bomba mediante un elemento sanitario. Se conectaron las líneas de alimentación, concentrado y permeado. Antes de la unión de los bidones, todo el sistema se lavó internamente con 6 l de NaOH 1 N a presión de 2 bar (0,2 MPa) durante 15 minutos. Esta etapa esterilizó internamente los diversos manguitos y filtros. El sistema se drenó de NaOH invirtiendo la dirección de la bomba de flujo de líquido y se realizó una prueba de velocidad de flujo del agua para garantizar la apropiada limpieza del filtro. La prueba se realizó según las instrucciones del fabricante (manual de Sartorius). Se garantizaron velocidades de flujo aceptables de 3.000 a 3.600 ml por minuto para el concentrado y 600 a 800 ml por minuto para el permeado antes de realizarse la filtración de minicélulas. El sistema todavía llevaba un alto pH y de ahí que éste se neutralizara lavando y recirculando por cada sistema con 1 x PBS estéril (pH 7,4) hasta que el pH medido del conjunto de PBS estuviera en el intervalo de 7,0 a 8,0. Entonces se conectaron los bidones (20 l). La suspensión de minicélulas (25 l) se transportó a un primer bidón, que se conectó por un manguito al primer módulo de filtro de 0,45 µm. Para evitar la incrustación del filtro, la suspensión de minicélulas se diluyó a medida que avanzó la etapa de filtración (es decir, diafiltración). El diluyente (20 l de 1 x BSG) se transportó a un segundo bidón. Por tanto, en la primera etapa de filtración de flujo cruzado, la suspensión de minicélulas se filtró a un volumen de 45 l. La válvula de permeado se cerró inicialmente y la suspensión de minicélulas se bombeó sobre la superficie del filtro de 0,45 µm a una presión de 2 bar (0,2 MPa) durante 5 minutos. Esto acondicionó el filtro para el medio de suspensión de minicélulas. Entonces, la válvula de permeado se abrió y la suspensión de minicélulas penetró (una presión de 2 bar (0,2 MPa), 600 ml por min) a través del filtro de 0,45 µm y el permeado se recogió en un tercer bidón. A medida que disminuyó el volumen en el primer bidón, la cantidad de sólidos no filtrados aumentó, y de ahí que se cambiara a diafiltracióncuando el volumen en el primer bidón descendió a 15 l. Éste diluye los sólidos en el primer bidón, previene la incrustación del filtro y maximiza la recuperación de minicélulas en el tercer bidón. Una vez el volumen de permeado en el tercer bidón alcanzó aproximadamente 12,5 l, el segundo filtro de flujo cruzado de 0,45 µm se acondicionó para la suspensión de minicélulas encontrada en el tercer bidón. Cuando el volumen en el tercer bidón alcanzó la marca de 15 l, la válvula de permeado se abrió, permitiendo la penetración de la suspensión de minicélulas en un cuarto bidón.

En esta etapa se eliminó la mayor contaminación de células parentales bacterianas en la suspensión de minicélulas. La siguiente etapa fue eliminar contaminantes menores en la suspensión tal como bullas bacterianas, endotoxina libre, ácidos nucleicos, restos celulares y líquido en exceso. Esto se llevó a cabo por filtración a través de un filtro de flujo cruzado de 0,2 µm. Las minicélulas tienen aproximadamente 0,4 µm de diámetro y de ahí que no penetren a través de un tamaño de poro de 0,2 µm. Por otra parte, las bullas bacterianas oscilan en tamaño (diámetro) de 0,05 µm a 0,2 µm y de ahí que se filtren. Otros contaminantes también son inferiores a 0,2 µm y de ahí que los únicos constituyentes retenidos en esta etapa de filtración fueran las minicélulas y cualquier célula parental bacteriana residual.

Cuando el volumen en el cuarto bidón alcanzó aproximadamente 15 l, el filtro de flujo cruzado de 0,2 µm se acondicionó para la suspensión de minicélulas presentes en el cuarto bidón. Entonces, la válvula de permeado se abrió, permitiendo que el permeado fuera a residuos en un quinto bidón mientras que las minicélulas se retuvieron y se concentraron en el cuarto bidón. Debido a la incorporación del sistema de diafiltración, las minicélulas se diluyeron continuamente y se filtraron, lo que garantizó la eliminación completa de contaminantes al final del procedimiento. Por tanto, la etapa de concentración redujo el volumen de suspensión de minicélulas a aproximadamente 4 l a partir del volumen de partida de 45 l.

(D) Intercambio de tampón para la suspensión de minicélulas

Las sales residuales, los componentes de medios y los residuos de bajo peso molecular en la suspensión de minicélulas se eliminaron por diafiltración con 1 x BSG. El aparato se ensambló y se equilibró como se ha descrito antes. La suspensión de minicélulas se dispuso en un primer bidón de 4 l, y 20 l de 1 x BSG estéril (medio de diafiltración) se dispusieron en un segundo bidón. La unidad de flujo cruzado se ensambló con dos módulos de filtro de 0,1 µm para garantizar que las minicélulas no pudieran pasar a través, pero que se eliminaran todos los contaminantes inferiores a 0,1 µm. la bomba se encendió y la velocidad se ajustó para proporcionar 0,5 bar (0,05 MPa) de presión. La válvula de permeado se abrió y la suspensión de minicélulas circuló por la línea de alimentación, sobre el filtro de 0,1 µm. Las minicélulas se devolvieron al primer bidón por la línea de concentrado. El residuo circuló por la línea de permeado y se recogió en un tercer bidón. Esto redujo el volumen de la suspensión de minicélulas y de ahí que el sistema de diafiltración se encendiera para bombear 1 x BSG al primer bidón. Esta etapa repuso continuamente el volumen de la suspensión de minicélulas para mantenerlo a 4 l. El procedimiento continuó hasta que el segundo bidón se vació, produciendo cinco cambios del tampón de suspensión de minicélulas.

(E) Esterilización por filtración de la suspensión de minicélulas

En esta etapa, la suspensión de minicélulas todavía llevaba algo de contaminación bacteriana parental debido a que los filtros de flujo cruzado de 0,45 µm no fueron filtros de esterilización. Por tanto, fue importante eliminar cualquier

bacteria parental residual para obtener una suspensión de minicélulas que fuera óptima para uso in vitro e in vivo. La suspensión de minicélulas de 4 l de la etapa previa se diluyó inicialmente a 20 l en 1 x BSG estéril y se mantuvo en un primer bidón. Una unidad de filtro frontal que lleva un filtro de 0,45 µm con un gran área superficial (500 cm2) se humedeció previamente con 2 l de 1 x BSG estéril y la integridad se probó según las instrucciones del fabricante. La suspensión de minicélulas se bombeó a una velocidad de flujo de 700 ml/min (es decir, velocidad de flujo lenta para evitar forzar que las células parentales bacterianas pasaran a través del filtro de 0,45 µm) a través del filtro frontal. Las células bacterianas fueron retenidas por el filtro, mientras que las minicélulas circularon a un segundo bidón por la línea de filtrado.

(F) Concentración de minicélulas purificadas

Las minicélulas purificadas, en una suspensión de 20 l, se concentraron a un volumen menor. Esta etapa no se realizó fácilmente por técnica de centrifugación y resuspensión de suspensiones convencional, sin embargo, debido a que los volúmenes fueron grandes y, en la práctica, no conductores a la técnica de centrifugación.

La etapa de concentración se realizó en las cuatro siguientes etapas.

Etapa 1: La suspensión de minicélulas se bombeó a 0,5 bar (0,05 MPa) de presión de un primer bidón y sobre un filtro de flujo cruzado de 100 kDa mediante un elemento sanitario. Las minicélulas se devolvieron al primer bidón por una línea de concentrado, y el permeado líquido se recogió en un segundo bidón por una línea de residuos de permeado.

Etapa 2: Una vez el volumen de la suspensión de minicélulas se redujo a 4 l, el procedimiento se detuvo y la suspensión se transfirió a un tercer bidón estéril de 4 l. Este último se ajustó con manguitos de 6,4 mm de diámetro en comparación con los manguitos de 12,5 mm usados para manipular los mayores volúmenes anteriores. Esto redujo el volumen vacío del tubo. Debido a que las líneas de alimentación y de concentrado fueron tubos de 12,5 mm de diámetro, se diseñó un adaptador para ajustar el manguito en el cierre de tapa. De manera similar, se diseñó un adaptador para ajustar el tubo de mayor taladro de las líneas de alimentación y de concentrado. Esta segunda etapa de concentración se realizó como en la etapa previa hasta que el volumen de minicélulas se redujo adicionalmente a aproximadamente 200 ml.

Etapa 3: La suspensión de minicélulas de 200 ml se transfirió a una botella Schott modificada que contenía un tubo de vidrio interno estéril para la alimentación y el concentrado. El tubo de vidrio taladró la tapa de la botella Schott y se cerró con tubo de Marprene y silicona. Sobre la tapa, la botella también llevaba un filtro de ventilación (0,2 µm). Para reducir más el volumen vacío, la línea de alimentación, de elemento sanitario y de concentrado previamente usada se sustituyó con tubos de Marprene de 6,4 mm estériles y la bomba previamente usada se sustituyó con una más pequeña. El procedimiento de concentración se realizó como antes (filtro de flujo cruzado de 100 kDA) hasta que el volumen de minicélulas se redujo a 50 ml.

Etapa 4: La suspensión de minicélulas altamente purificada se transfirió bajo condiciones estériles a un tubo Falcon de 50 ml.

Ejemplo 4. Caracterización por microscopía electrónica de barrido de minicélulas a partir de cepas de minCD Gram-negativas y Gram-positivas

Se tomaron micrografías electrónicas de barrido (SEM) y de transmisión (TEM) de minicélulas derivadas de S. typhimurium, E. coli, S. flexnieri, L. monocytogenes y células parentales correspondientes para determinar la morfología y las dimensiones de las diversas minicélulas. Brevemente, cultivos bacterianos que llevan minicélulas se centrifugaron a 13.200 rpm durante 20 minutos y se resuspendieron en PBS que contenía un 2,5 % de glutaraldehído y se fijaron a temperatura ambiente durante 40 minutos. Las muestras se centrifugaron y se lavaron tres veces en agua destilada. Para TEM se siguió el siguiente procedimiento. Para cambiar las soluciones, las células se centrifugaron a 10.000 rpm durante 1 minuto, el sobrenadante se separó pipeteando, luego las células se resuspendieron en el nuevo reactivo usando una mezcladora de agitación con vórtex. La secuencia de reactivos fue:

(a) tetróxido de osmio en tampón cacodilato 0,1 M a pH 7,2 - 10 minutos, (b) acetato sódico al 4 % en agua destilada

-

1 minuto, (c) acetato de uranilo al 4 % en agua destilada - 5 minutos, (d) etanol al 70 % - 5 minutos, (e) etanol al 100 % - 5 minutos, (f) acetona al 100 % - 5 minutos, (g) 1:1 de acetona y monómero de resina epoxídica Spurr - 30 minutos, (h) resina epoxídica Spurr pura - cura durante 48 horas a 60 ºC. La secciones se cortaron a partir de los bloques de resina curados con una cuchilla de diamante usando un ultramicrotomo Reichert Ultracut E. Las secciones se tiñeron con acetato de uranilo durante 10 minutos seguido de citrato de plomo durante 2 minutos. Las secciones se examinaron usando un microscopio electrónico de transmisión Hitachi H-7000 operado con una energía del haz de 75 kilovoltios (Universidad de Nueva Gales del Sur, NSW, Australia). Se registraron imágenes digitales usando una cámara CCD de campo ancho AnalySis MegaView II.

Para la microscopía electrónica de barrido de alta resolución se siguió el siguiente procedimiento. Para cambiar soluciones, las células se centrifugaron a 13.000 rpm durante 20 minutos, el sobrenadante se separó pipeteando y las células se resuspendieron en el nuevo reactivo usando una mezcladora de agitación con vórtex. La intención era lavar todos los iones y biomateriales de las células y dejarlos suspendidas en un pequeño volumen de agua destilada. La secuencia de reactivos fue (a) 1 ml de agua destilada - resuspender, (b) 1 ml de agua destilada

resuspender, (c) depositar 250 µl sobre una placa de especímenes de latón limpia, (d) secar durante la noche a 30 ºC, (e) recubrir justo antes de la microscopía con 2 nm de metal de cromo depositado en una recubridora por pulverización a vacío limpia Xenosput. Los especímenes recubiertos se examinaron usando un microscopio electrónico de barrido de emisión de campo Hitachi S-900 usando una energía del haz de 3 kilovoltios (Universidad de Nueva Gales del Sur, NSW, Australia). Se registraron imágenes digitales a diferentes aumentos usando un digitalizador ImageSlave.

Los resultados mostraron que las minicélulas derivadas de tanto las bacterias Gram-negativas como Gram-positivas fueron de aproximadamente 400 nm de diámetro, y excepto L. monocytogenes, pareció que tenían una superficie arrugada como se observó por SEM, supuestamente debido a las estructuras de la superficie celular del lipopolisacárido. No hubo diferencia evidente en la ultraestructura superficial de las minicélulas y las bacterias parentales para todas las especies. Los resultados de TEM mostraron que las minicélulas de L. monocytogenes tenían una estructura de la pared celular rígida esperada de una membrana celular de bacterias Gram-positivas. Las membranas de Salmonella, S. flexneri y E. coli colapsaron más fácilmente bajo el haz electrónico del microscopio. En todas las muestras se observó el acontecimiento de formación de minicélulas, es decir, división celular asimétrica.

Ejemplo 5. Captación de minicélulas por células de mamífero tales como macrófagos

Para demostrar la captación de minicélulas recombinantes por macrófagos, primero fue necesario incorporar un trazador tal como GFP con el fin de que las minicélulas recombinantes pudieran verse distintas de las células de mamífero. Por tanto, el plásmido pEGFP se transformó en las cepas productoras de minicélulas de minCDE de S. typhimurium, E. coli y S. flexneri para determinar si las minicélulas llevaban establemente EGFP y fluorescían en verde.

El plásmido pEGFP (Tabla 2) es un plásmido de expresión bacteriano que expresa una variante desplazada hacia el rojo de proteína verde fluorescente natural (EGFP; máximo de excitación: 488 nm; máximo de emisión: 507 nm) a partir del promotor lac. El esqueleto de plásmido es el derivado de pUC19, pPD16.43 (Fire y col., 1990), que proporciona un origen de replicación de alto número de copias y un gen de resistencia a ampicilina para la propagación y selección en células bacterianas. El plásmido se transformó en cepas minCDE de S. typhimurium, E. coli y S. flexneri y las bacterias recombinantes se cultivaron en caldo de infusión de cerebro-corazón (BHI; Difco Laboratories, Detroit, Michigan, EE.UU.) hasta que se alcanzó una DO600 de 0,6. Las minicélulas se aislaron y se purificaron a partir del cultivo mixto y se visualizaron por microscopía fluorescente (microscopio de fluorescencia DMLM, Leica Microsystems). Los resultados revelaron que todas las minicélulas fluorescieron en verde brillante, mientras que las minicélulas purificadas a partir de cepas minCDE de S. typhimurium, E. coli y S. flexneri (controles) no recombinantes no mostraron ninguna fluorescencia verde. Las minicélulas guardadas (4 ºC y temperatura ambiente) se visualizaron por microscopía de fluorescencia a intervalos de tiempo de 30 minutos, 1 hora, 6 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 2 días, 1 semana y 2 semanas. Los resultados mostraron que las minicélulas estaban intactas y continuaron fluoresciendo en verde brillante durante todo el estudio. Por tanto, el plásmido pEGFP proporcionó un trazador (minicélulas que fluorescen en verde) con el que seguir la captación de minicélulas recombinantes por células de mamífero tales como macrófagos y otras células tales como células cancerosas. Estos resultados indican que proteínas recombinantes, una vez expresadas o segregadas en minicélulas, son estables durante un periodo de tiempo significativo (probablemente hasta que se compromete la integridad de las minicélulas celulares) debido a la ausencia de proteasas cromosómicamente codificadas.

Células de la línea celular de macrófagos de ratón RAW264.7 (Ralph & Nakoinz, 1977) obtenidas de la Colección americana de cultivos tipo (ATCC) se cultivaron in vitro a una densidad de células de 105 por pocillo y se infectaron con minicélulas purificadas recombinantes que llevaban el plásmido pEGFP, que se derivaron de S. typhimurium, E. coli y S. flexneri a una relación de minicélulas:macrófagos de 50:1 y 100:1.

Antes de la infección por macrófagos, las minicélulas purificadas se visualizaron por microscopio de fluorescencia para confirmar que la mayoría de las minicélulas llevaban EGFP y de ahí que fluorescieran en verde brillante. Como control positivo también se usó la cepa SL3261 de S. typhimurium aroA- (Tabla 1) que llevaba el mismo plásmido para transfectar las células de macrófago a la misma relación de bacterias:macrófagos. El control negativo (macrófagos sin infectar) también se procesó de la misma forma que las células infectadas experimentales. Las placas de cultivo se centrifugaron a 1000 g durante 10 minutos a 37 ºC. Para el estudio de transfección de minicélulas, los antibióticos gentamicina (100 µg/ml) y ampicilina (200 µg/ml) se añadieron para matar cualquier célula bacteriana parental viva residual. Las salmonelas de control positivo también se destruyeron con el mismo tratamiento con antibiótico. Las placas se incubaron a 37 ºC durante 30 minutos en 5 % de CO2, seguido de tres lavados en PBS. Para el experimento de minicélulas/macrófagos derivados de S. typhimurium, los portaobjetos se fijaron con 4 % de formaldehído durante 40 minutos y luego se permeabilizaron con 0,2 % de Triton X-100. Después de bloquear la tinción no específica con 5 % de suero de cabra normal (NGS) en tampón fosfato que contenía 5 % de BSA, los cubreobjetos se incubaron con anticuerpo anti-lipopolisacárido (LPS) (suero aglutinante somático 4-O de Salmonella de conejo; dilución 1:200; Murex Biotech, Dartford, Inglaterra) durante cuatro horas a temperatura ambiente. Las células se lavaron tres veces en PBS y se incubaron con anticuerpo secundario (1:1000), Alexa Fluor 594 (Molecular Probes, Eugene, OR, EE.UU.; conjugado de cabra dirigido contra IgG de ratón, excitación: 590 nm, emisión: 617 nm) en PBS-BSA. Las placas se incubaron con el segundo anticuerpo durante 1 hora en la oscuridad y

se lavaron tres veces con PBS durante 5 minutos cada uno. Los cubreobjetos se montaron con glicerol y se visualizaron por microscopía confocal.

Los resultados mostraron que las minicélulas derivadas de S. typhimurium, E. coli y S. flexneri fueron todas reabsorbidas por aproximadamente del 20 % al 30 % de las células de macrófago en cultivo. Las minicélulas fluorescieron en verde brillante y se asociaron a los macrófagos. Las minicélulas derivadas de S. typhimurium, E. coli y S. flexneri no recombinantes de control no revelaron puntos fluorescentes verdes asociados a macrófagos distintos de fluorescencia de fondo no específica secundaria. La cepa aroA-de S. typhimurium recombinante de control también dio un resultado similar al observado con ambas minicélulas recombinantes.

Para confirmar que los puntos fluorescentes verdes estuvieron dentro de las células de macrófagos, es decir, eran minicélulas reabsorbidas, y no sólo adheridos a la superficie celular, se tomaron imágenes tridimensionales (usando secciones sagitales y coronales) para la interacción de minicélulas-macrófagos derivados de S. typhimurium. En tanto secciones coronales como sagitales, las minicélulas se localizaron dentro de los macrófagos, que indica que las minicélulas habían sido reabsorbidas por los macrófagos. Adicionalmente, el marcado de anti-O4 LPS de los puntos fluorescentes verdes (fluorescencia amarilla tras el anticuerpo secundario Alexa Fluor 594) mostró que los puntos fluorescentes verde fueron de hecho minicélulas que expresaban EGFP y no fluorescencia de fondo del artefacto. Se observó un resultado similar con la salmonela de control positivo, demostrando que las estructuras de la superficie bacteriana requeridas para la captación mediada por receptor de las células por macrófagos se conservaron sobre la superficie de la minicélula.

Ejemplos 6. Captación y rotura de minicélulas en fagolisosomas macrófagos

Para demostrar el destino intracelular de minicélulas dentro de macrófagos se llevaron a cabo estudios de TEM sobre macrófagos de ratón infectados por minicélulas derivadas de S. typhimurium.

Brevemente, la línea celular RAW 246.7 de macrófagos de ratón se cultivó al 50 % de confluencia en matraces T25 en medio de cultivo convencional. Las minicélulas en el orden de 107, en 100 µl, se añadieron directamente al medio en matraces, y el procedimiento de infección por macrófagos se llevó a cabo como se ha descrito en el Ejemplo 5. Se usó una relación aproximada de minicélula:macrófago de 10:1. Las células se recogieron para momentos de tiempo correspondientes a 30 minutos, 60 minutos y 2 horas después de la infección. También se incluyó un matraz adicional como control negativo, no recibiendo minicélulas. Las células se tripsinaron y las suspensiones se recogieron y se fijaron en 4 % de glutaraldehído (500 µl). Las muestras se procesaron y se analizaron por TEM (Universidad de Nueva Gales del Sur, Sidney, Australia).

Los resultados mostraron que ya 30 minutos después de la infección las partículas densas en electrones de aproximadamente el tamaño de minicélulas (400 nm) se observaron dentro de vacuolas de macrófagos (Figura 5, paneles A-F). Con la progresión de tiempo (60 minutos y 2 horas), las partículas densas en electrones parecieron menos intactas con irregularidad superficial y pérdida de densidad electrónica.

Para confirmar que las partículas densas en electrones intravacuolares eran minicélulas reabsorbidas, el experimento anterior se repitió con un diferencia que era que después de los diversos intervalos de tiempo después de la infección, las células se fijaron (4 % de paraformaldehído, 0,1 % de glutaraldehído) durante 30 minutos a temperatura ambiente, se lavaron con PBS y se recogieron en 1,5 ml de PBS por un suave raspado de células. Las muestras se procesaron para inmuno-oro-TEM (unidad de EM, ICPMR, Hospital Westmead, Sidney, Australia). Las muestras se suspendieron suavemente y se procesaron por el procedimiento de congelación-sustitución. Brevemente, las muestras se marcaron con anticuerpo primario (lipopolisacárido anti-S. typhimurium [factor 4, especificidad por el grupo B]; Abbott Murex, EE.UU.) a dilución 1:200, seguido de anticuerpo secundario conjugado con oro (10 nm). Las muestras se visualizaron usando un microscopio electrónico Philips CM-120 BioTWIN a 80 kV. Las imágenes fueron capturadas sobre película en emulsión tipo 4489 Kodak EM.

Los resultados mostraron que las minicélulas fueron claramente identificadas por el anticuerpo anti-O4-LPS marcado con oro y que las partículas densas en electrones observadas en las vacuolas de macrófagos fueron las minicélulas derivadas de S. typhimurium. No se observó marcado con oro en macrófagos de control que no habían sido infectados por minicélulas. Estos datos también revelaron que en momentos de tiempo posteriores, las partículas de oro no asociadas a minicélulas se observaron en las vacuolas. Hubo un marcado aumento en las partículas de oro libres de minicélulas en momentos de tiempo posteriores y esto también se asoció a un aumento de los números de minicélulas que habían perdido la integridad de la pared celular y la densidad electrónica celular. Estos datos indican que las minicélulas siguen la ruta clásica de captación de antígenos y procesamiento presentada por los macrófagos, que incluye ingestión de partículas extrañas en endosomas tempranos seguida de fusión endosomalisosoma y rotura del antígeno en el fagolisosoma ácido. Las partículas de oro libres de minicélulas en las etapas posteriores de infección pueden indicar que los LPS han sido liberados de minicélulas procesadas o digeridas.

Estos resultados muestran que las minicélulas recombinantes no sólo son reabsorbidas por células de mamífero tales como macrófagos, sino que también son degradadas en vacuolas intracelulares, supuestamente fagolisosomas.

Ejemplo 7. Expresión de proteína heteróloga por macrófagos transfectados con minicélulas

El siguiente experimento se realizó para determinar si las minicélulas recombinantes que llevan un plásmido de expresión génica de mamífero que codifica EGFP (no expresada en células bacterianas o minicélulas) podría liberar el plásmido al núcleo de la célula de mamífero y conseguir la expresión de EGFP en la célula de mamífero.

Células de la línea celular RAW-264.7 de macrófagos de ratón se cultivaron in vitro y se infectaron con minicélulas derivadas de S. typhimurium, E. coli y S. flexneri recombinantes purificadas que llevaban el plásmido pEGFP-C1 (Tabla 2) como se ha descrito en el Ejemplo 5. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células infectadas se visualizaron por microscopía confocal tridimensional.

Los resultados mostraron que aproximadamente el 20 % de los macrófagos fluorescieron en verde, sugiriendo que las minicélulas recombinantes se degradaron dentro de los macrófagos, supuestamente en fagolisosomas, y que al menos algo del ADN de plásmido liberado fue recogido por el núcleo de la célula antes de la expresión de la proteína verde fluorescente. Los macrófagos de control, es decir, macrófagos transfectados con minicélulas no recombinantes, no revelaron la fluorescencia verde. La expresión de EGFP en las células experimentales duró al menos 48 horas. Este resultado fue similar al observado con macrófagos positivos de control transfectados con el plásmido pEGFP-C1 usando electroporación con un BioRad Genepulser.

Para confirmar adicionalmente que la expresión de EGFP dentro de los macrófagos transfectados con minicélulas no era fluorescencia de fondo, este experimento se repitió para células derivadas de S. typhimurium. En este caso, después de la fijación con formaldehído, los cubreobjetos se incubaron con anticuerpo monoclonal anti-GFP (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, EE.UU.; dilución 1:300) y se incubaron durante la noche a 4 ºC. Los cubreobjetos se lavaron tres veces con PBS (5 minutos por lavado) y se incubaron con 2 % de suero de cabra normal en PBS/BSA durante 20 minutos. Los cubreobjetos se lavaron dos veces con PBS y se trataron con anticuerpo secundario dirigido contra IgG de ratón conjugado con Alexa Fluor 594 en PBS (dilución 1:1000). La reacción se incubó en la oscuridad durante 1 hora y se lavó dos veces en PBS. Los cubreobjetos se visualizaron por microscopía confocal usando filtros de visualización de fluorescencia rojos (570 nm) y verdes (488 nm). Los resultados revelaron que los puntos de fluorescencia verde (excitación láser a 488 nm) observados dentro del macrófago fueron idénticos a los puntos de fluorescencia roja (excitación láser a 570 nm). Cuando se usaron ambos láser, las señales verde y roja se co-localizaron, y aparecieron como una fluorescencia amarilla. Adicionalmente, cuando la imagen 3D se construyó usando el software de imágenes Leica 3D, se encontró que la fluorescencia estaba dentro del macrófago. Estos resultados muestran que los puntos fluorescentes verdes observados fueron debidos a la expresión de macrófagos de la proteína EGFP ya que los mismos puntos se identificaron por anticuerpo monoclonal anti-GFP (fluorescencia roja).

Los resultados confirman que las minicélulas recombinantes se descomponen en células de mamífero huésped tales como macrófagos, liberando ADN de plásmido y que este ADN puede expresar proteína extraña dentro de la célula de mamífero. Esto demuestra la viabilidad de la terapia génica in vitro por medio de minicélulas intactas recombinantes.

Después de introducirse minicélulas recombinantes en un paciente, la presencia del producto génico heterólogo puede monitorizarse o evaluarse por un ensayo apropiado para el producto génico en el paciente, por ejemplo, en glóbulos rojos periféricos del paciente cuando la expresión es específica de células eritroides. Como se ha descrito anteriormente, la elección del ensayo es parcialmente una función del producto génico heterólogo y puede determinarse fácilmente.

Ejemplo 8. Liberación de genes mediada por minicélulas y expresión génica en células de cáncer de mama humano

Se usaron minicélulas purificadas de la cepa minCDE de S. typhimurium recombinante que lleva el plásmido pEGFP-C1 (sólo expresión génica eucariota; Tabla 2) para infectar células de cáncer de mama humano (SK-BR-3). Cuarenta y ocho horas y 96 horas después de la transfección, las células se visualizaron por microscopía confocal. Como control negativo, las minicélulas no recombinantes se usaron para transfectar células SK-BR-3 y se visualizaron de manera similar a las células experimentales.

Células de cáncer de mama SK-BR-3 (fuente ATCC, referencia nº HTB-30) se cultivaron sobre cubreobjetos en placas de 6 pocillos y se cultivaron a aproximadamente el 50 % de confluencia. Las minicélulas que llevan el plásmido de expresión de GFP eucariota pEGFP-C1 se añadieron a las células y se centrifugaron durante 10 minutos, 1000 g, para permitir el contacto minicélula / célula SK-BR-3. Las células se cultivaron durante 48 horas después de que se añadiera G-418 (400 mg/ml), no recibiendo algunos pocillos G-418. Después de otra incubación de 48 horas, todos los cubreobjetos se fijaron con 4 % de formaldehído durante 1 hora. Los cubreobjetos se incubaron con PBS-BSA (2 % de BSA en PBS) durante 20 minutos y se lavaron una vez con PBS. Los cubreobjetos se incubaron durante la noche a 4 ºC con anticuerpo anti-Her-2 (Serotec, monoclonal de ratón dirigido contra IgG humana; dilución 1:100). Las células se lavaron tres veces con PBS durante 5 minutos cada lavado y se incubaron durante 1 hora en la oscuridad con anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 594 (Molecular Probe, de cabra dirigido contra IgG de ratón conjugado, excitación: 590 nm, emisión: 617 nm; dilución 1:1000 en PBS-BSA).

Las células se lavaron tres veces con PBS durante 5 minutos por lavado, y los cubreobjetos se trataron con medio de pérdida de intensidad (Molecular Probes). Todos los cubreobjetos se visualizaron por microscopía confocal tridimensional (excitación con longitudes de onda para el filtro rojo: 568 nm y filtro verde: 488 nm).

Los resultados revelaron que aproximadamente el 10 % de las células de cáncer de mama expresaron claramente la proteína de fluorescencia verde que se localizó en el citosol (véase la Figura 6, paneles A-C). Esto fue claramente visible con respecto a la autofluorescencia de fondo normal presentada por las células de control. Las células se identificaron claramente con el anticuerpo anti-Her-2 (fluorescencia roja).

Este resultado demuestra que las minicélulas recombinantes pueden liberar ADN de plásmido de expresión génica de mamífero a células de no fagocito, ejemplificadas por células de cáncer de mama epiteliales, de un modo que conduce a la expresión heteróloga dentro de las células.

Ejemplo 9. Liberación de genes mediada por minicélulas y expresión génica in vivo en ratones Balb/c

Para determinar que las minicélulas recombinantes podrían liberar un gen extraño para células del sistema inmunitario in vivo, los ratones se vacunaron intraperitonealmente con minicélulas derivadas de minCDE de S. typhimurium recombinantes que llevaban el plásmido pEGFP-C1 (sólo expresión génica eucariota; Tabla 2) y se compararon con ratones vacunados con la cepa LaroA de S. typhimurium que llevaba el mismo plásmido.

Se purificaron minicélulas recombinantes como en el Ejemplo 3. Se preparó S. typhimurium (cepa SL3261 LaroA, Tabla 1) del siguiente modo. Se inocularon cinco (5) ml de caldo de soja con tripticasa (TSB, Becton Dickinson, Palo Alto, CA, EE.UU.) con un inóculo 1:100 de un cultivo durante la noche de S. typhimurium en TSB, y se cultivaron a 37 ºC con agitación hasta que la densidad óptica (D.O.) medida a 600 nm alcanzó 0,5. Entonces, las bacterias se incubaron con gentamicina (Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australia) a 150 µg/ml y ampicilina (Roche) a 150 µg/ml durante otras 2 horas a 37 ºC con agitación.

Las bacterias muertas y las minicélulas se sedimentaron por centrifugación a 8000 rpm, se resuspendieron y se lavaron otras tres veces en BSG (solución salina tamponada con fosfato [PBS; 1,44 g de hidrogenofosfato de disodio, 0,24 g de dihidrogenofosfato de potasio, 0,2 g de cloruro de potasio, 8,0 g de cloruro sódico, pH 7,4 en 1 litro de agua destilada], que contenía 2 % de gelatina).

Los grupos de ocho ratones Balb/c de 6 semanas de edad se inocularon intraperitonealmente con 100 µl de minicélulas recombinantes o S. typhimurium muertas recombinantes según el programa en la Tabla 4. Un grupo de 8 ratones permaneció sin vacunar como controles negativos. Los ratones se sangraron por sangrado intraocular antes de la inoculación y en el día 14 después de la vacunación primaria. En el día 23, todos los animales se anestesiaron con una inyección intraperitoneal de 12 mg de fenobarbitona de sodio y 1 ml de sangre se recogió por punción cardíaca antes de sacrificarse los ratones. La sangre se centrifugó a 3000 rpm durante 10 minutos en una microcentrífuga (Eppendorf, Hamburgo, Alemania) y se recogió el suero para los ensayos de ELISA. Durante todo el experimento, los animales se pesaron semanalmente y se observaron diariamente para signos de toxicidad.

Tabla 4. Asignación a tratamiento para la administración in vivo de genes en ratones Balb/c

Número de grupo

Número de animal Tratamiento Dosis (100 ul de inyección IP) Días de dosificación Días de sangrado

1

1-8 Ninguno - control - - 1, 14, 23

2

9-16 Minicélulas recombinantes 108 minicélulas por dosis 1, 5 14, 23

3

17-24 S. typhimurium muertas recombinantes 108 bacterias por dosis 1, 5 14, 23

4

25-32 S. typhimurium muertas recombinantes 108 bacterias por dosis 1,5,8 14, 23

5

33-40 S. typhimurium muertas recombinantes 109 bacterias por dosis 1, 5 14, 23

6

41-48 S. typhimurium muertas recombinantes 109 bacterias por dosis 1,5,8 14, 23

Los ensayos de ELISA se realizaron para determinar si el anticuerpo había sido generado contra GFP, es decir, si las minicélulas recombinantes pudieron liberar el plásmido de expresión de mamífero pEGFP-C1 in vivo. Los niveles de anticuerpo para lipopolisacárido (LPS) de S. typhimurium también se determinaron para todos los grupos. El procedimiento de ELISA indirecto se llevó a cabo del siguiente modo.

Placas de microtitulación de noventa y seis (96) pocillos (Greiner GMBH, Nürtingen, Alemania) se recubrieron con 50 µl por pocillo de 0,5 µg/ml de rEGFP (Clontech, Palo Alto, CA, EE.UU.) o antígeno de LPS (Sigma). Las placas se recubrieron con 1 % de BSA (Sigma) como control negativo. Las placas se cerraron y se incubaron durante la noche a 4 ºC. Las placas se invirtieron para eliminar la solución de antígeno, y se añadieron 200 µl de tampón de bloqueo (0,05 % de Tween-20 [Sigma], 1 % de BSA en PBS) a cada pocillo antes de incubar durante 2 horas a temperatura ambiente. El tampón de bloqueo se eliminó y las placas se lavaron dos veces durante 5 minutos con tampón de lavado (0,05 % de Tween-20, PBS). Las muestras de suero se diluyeron 1 en 80 y 1 en 300 para EGFP y LPS, respectivamente, en tampón de bloqueo. A continuación, 100 µl de muestra se añadieron a cada pocillo y se incubaron 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Entonces, las placas se lavaron con tampón de lavado 3 veces durante 5 minutos. Los anticuerpos secundarios, concretamente anticuerpo monoclonal dirigido contra inmunoglobulina de ratón conjugada con fosfatasa alcalina (cadenas ligeras y- &; Chemicon, Temicula, CA, EE.UU.)

o anti-LPS conjugado con AP (isotipo IgG1, Biodesign International, Saco, Maine, EE.UU.) se diluyeron en tampón de bloqueo y se añadieron 100 µl por pocillo, seguido de una incubación de 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Los pocillos se lavaron tres veces con tampón de lavado y se añadieron 100 µl de PNPP (sustrato de fosfato de p-nitrofenilo; Zymed, San Francisco, CA, EE.UU.). La absorbancia a 405 nm se leyó después de una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente. La reacción se terminó mediante la adición de 30 µl de NaOH 0,5

M.

La significancia de los datos de ELISA se determinó por la prueba de la t de Student (p).

Los resultados se muestran en la Figura 7. 14 días después de la vacunación se observó una respuesta fuerte y significativa de anticuerpos (p < 0,02 cuando se comparó con controles) para EGFP en ratones a los que se les había administrado 108 minicélulas recombinantes intraperitonealmente, y la respuesta de anticuerpos observada fue superior a la obtenida con la mayor dosis de S. typhimurium muertas. Los anticuerpos para la proteína EGFP sólo serían observados si las minicélulas recombinantes que llevan el vector de expresión de mamífero pEGFP-C1 no sólo fueran reabsorbidas por macrófagos peritoneales, sino también degradadas en vacuolas intracelulares (supuestamente fagolisosomas), y que al menos algunas copias del ADN de plásmido escaparan de los fagolisosomas y entraran en el núcleo de la célula de mamífero. A partir del núcleo se produciría ARNm de EGFP y la EGFP se expresaría en el citoplasma. La EGFP sería una proteína extraña en el macrófago y de ahí que se esperara que se procesase y que los péptidos se presentaran por MHC. Este procedimiento produciría una respuesta de anticuerpos a los péptidos de EGFP. En comparación con S. typhimurium muertas de control, la respuesta de anticuerpos anti-EGFP fue mayor con las minicélulas recombinantes.

También se midió la respuesta anti-LPS para determinar la respuesta inmunitaria al vector de administración de terapia génica, las minicélulas recombinantes. Los resultados mostraron que la respuesta de anticuerpos anti-LPS fue significativa y similar para minicélulas recombinantes (p = 0,0004) y S. typhimurium muertas (p = 0,001). Véase la Figura 8. Este resultado indicó que las minicélulas habían retenido al menos la estructura de LPS encontrada sobre la superficie de la célula bacteriana parental. En el día 23, la respuesta de anticuerpos anti-EGFP no fue diferente de los controles inmunizados (para tanto minicélulas recombinantes como S. typhimurium muertas). Esto no fue sorprendente debido a que no se habían administrado inmunizaciones de refuerzo para sostener la respuesta de anticuerpos. La respuesta anti-LPS en el día 23 fue similar a la observada en el día 14. Esto no es inesperado debido a que se sabe que LPS es un potente inmunógeno que induce títulos de anticuerpos altos y sostenidos.

Ejemplo 10. Liberación de genes mediada por minicélulas y expresión génica in vivo en ratones Balb/c con diferentes pautas de dosificación

Se prepararon minicélulas recombinantes como en el Ejemplo 3. Grupos de ocho ratones Balb/c de 6 semanas de edad se inocularon intraperitonealmente con 100 µl de minicélulas recombinantes (que contenían el plásmido pEGFP-C1; Tabla 2) según el programa mostrado en la Tabla 5. Un grupo de ocho ratones permaneció sin vacunas, como controles negativos. Los ratones se sangraron por sangrado intraocular antes de la inoculación y en el día 14 después de la vacunación primaria y el suero se recogió como en el Ejemplo 9.

Tabla 5. Asignación a tratamiento para la administración de genes in vivo con diferentes pautas de dosis de minicélulas recombinantes en ratones Balb/c

Número de grupo

Número de animal Tratamiento Dosis (100 ul inyección IP) de Días de dosificación Días de sangrado

1

1-8 Ninguno - control - - 1, 14

2

9-16 Minicélulas recombinantes 108 minicélulas dosis por 1,4 14

3

17-24 Minicélulas recombinantes 108 minicélulas dosis por 1,4,8 14

4

25-32 Minicélulas recombinantes 109 minicélulas dosis por 1,4 14

(continuación)

Número grupo

de Número animal de Tratamiento Dosis (100 ul inyección IP) de Días de dosificación Días de sangrado

5

33-40 Minicélulas recombinantes 109 minicélulas dosis por 1, 4, 8 14

Se realizaron ensayos de ELISA como se ha descrito previamente para determinar si se había generado el anticuerpo contra GFP, y si dosis mayores de minicélulas recombinantes o tres en vez de dos dosis permitían que el animal organizara una mayor respuesta de anticuerpos. Los niveles de anticuerpo para lipopolisacárido (LPS) de S. typhimurium también se determinaron para todos los grupos.

Los resultados se muestran en la Figura 9. 14 días después de la vacunación se observó una respuesta de anticuerpos muy significativa (p < 0,001 cuando se comparó con controles) para EGFP en ratones a los que se les habían administrado 108 minicélulas recombinantes intraperitonealmente. Los ratones inoculados con 109 minicélulas mostraron una respuesta de anticuerpos incluso mayor para EGFP (p = 0,0006 en comparación con controles), y esta dosis dio niveles de anticuerpo significativamente mayores que la dosis inferior de 108 (p = 0,004). No hubo diferencia significativa en la respuesta de anticuerpos para la proteína EGFP cuando a los ratones se les administraron tanto dos dosis como tres dosis de minicélulas recombinantes, sugiriendo que dos dosis podían ser suficientes para lograr terapia génica en este caso.

También se midió la respuesta anti-LPS para determinar la respuesta inmunitaria a las minicélulas recombinantes. Los resultados mostraron que la respuesta de anticuerpos anti-LPS fue significativa (p = 0,0004). Véase la Figura 10.

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Claims (17)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Una composición que comprende (i) minicélulas bacterianas intactas recombinantes y (ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable para las mismas, en la que dichas minicélulas bacterianas intactas contienen un plásmido que comprende una secuencia de ADN que codifica un producto de expresión de péptido o polipéptido terapéutico, y en la que dicha composición está libre de contaminantes de 0,2 µm o menos de tamaño.

2. 2.

   Una composición según la reivindicación 1, en la que dicha composición contiene menos de aproximadamente 1 célula parental contaminante bacteriana por 107 minicélulas.

3. 3.

   Una composición según la reivindicación 1, en la que dicha composición contiene menos de aproximadamente 1 célula parental contaminante bacteriana por 108 minicélulas.

4. 4.

   Una composición según la reivindicación 1, en la que dicha composición contiene aproximadamente 1 célula parental contaminante bacteriana por 109 minicélulas.

5. 5.

   Una composición que consiste esencialmente en minicélulas bacterianas intactas recombinantes que contienen un plásmido que comprende una secuencia de ADN que codifica un producto de expresión de péptido o polipéptido terapéutico, en la que dicha composición está libre de contaminantes de 0,2 µm o menos de tamaño.

6. 6.

   Un procedimiento de transformación genética que comprende (i) proporcionar minicélulas bacterianas intactas recombinantes que contienen un plásmido que comprende una secuencia de ADN que codifica un producto de expresión de péptido o polipéptido terapéutico, en el que dichas minicélulas bacterianas están libres de contaminantes de 0,2 µm o menos de tamaño y (ii) poner dicha preparación de minicélulas bacterianas intactas en contacto in vitro con células de mamífero competentes para endocitosis no fagocíticas, de forma que dichas minicélulas bacterianas son reabsorbidas por dichas células de mamífero, por lo que dichas células de mamífero producen dicho producto de expresión.

7. 7.

   Un procedimiento de purificación que comprende pasar una muestra que contiene minicélulas bacterianas intactas

   (i) sobre una serie de filtros de flujo cruzado y luego (ii) por un filtro frontal, por el que dichas minicélulas bacterianas intactas se separan de los contaminantes en dicha muestra para obtener una preparación de minicélulas purificadas.

8. 8.

   Un procedimiento según la reivindicación 7 que comprende además la etapa de tratar dicha preparación de minicélulas purificadas con un antibiótico.

9. 9.

   Un procedimiento según la reivindicación 7 u 8 que comprende además una etapa preliminar de realizar centrifugación diferencial sobre dicha muestra que contiene minicélulas bacterianas.

10. 10.

    Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en el que dichas series de filtros de flujo cruzado comprenden al menos un filtro que emplea un tamaño de poro superior a o igual a aproximadamente 0,45 µm, y al menos un filtro que emplea un tamaño de poro inferior a o igual a aproximadamente 0,2 µm.

11. 11.

    Un procedimiento según la reivindicación 10, en el que dicho filtro frontal emplea un tamaño de poro de aproximadamente 0,45 µm.

12. 12.

    Un procedimiento según la reivindicación 11, en el que dichas series de filtros de flujo cruzado comprenden al menos dos filtros que emplean un tamaño de poro de aproximadamente 0,45 µm, y al menos un filtro que emplea un tamaño de poro de aproximadamente 0,2 µm.

13. 13.

    Un procedimiento según la reivindicación 12 que comprende además la etapa de tratar con un antibiótico dicha preparación de minicélulas purificadas.

14. 14.

    Uso de minicélulas bacterianas intactas recombinantes en la preparación de un medicamento que comprende minicélulas bacterianas intactas que contienen un plásmido que comprende una secuencia de ADN que codifica un producto de expresión de péptido o polipéptido terapéutico, en el que dicho medicamento está libre de contaminantes de 0,2 µm o menos de tamaño para su uso en un procedimiento de (i) tratar una enfermedad, alergia

    o infección o (ii) modificar una característica, por administración de dicho medicamento a una célula, un tejido o un órgano, en el que dicha enfermedad se selecciona de (1) cáncer; (2) una enfermedad adquirida seleccionada de SIDA, neumonía y enfisema; y (3) una afección engendrada por una metabolopatía congénita, la alergia o infección se trata por modificación de una respuesta inmunitaria y dicha característica es fertilidad.

15. 15.

    Minicélulas bacterianas intactas recombinantes que contienen un plásmido que comprende una secuencia de ADN que codifica un producto de expresión de péptido o polipéptido terapéutico, en donde dichas minicélulas bacterianas están libres de contaminantes de 0,2 µm o menos de tamaño para su uso como un agente farmacéutico.

16. 16.

    Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para su uso como agente farmacéutico.

17. 17.

    Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para su uso en un procedimiento de (i) tratar una enfermedad, alergia o infección o (ii) modificar una característica por administración de dicha composición a una

    célula, un tejido o un órgano, en la que dicha enfermedad se selecciona de (1) cáncer; (2) una enfermedad adquirida seleccionada de SIDA, neumonía y enfisema; y (3) una afección engendrada por una metabolopatía congénita, la alergia o infección se trata por modificación de una respuesta inmunitaria y dicha característica es fertilidad.