PT1446489E

PT1446489E - Minicélulas intactas, como vectores para a transferência de adn e terapia genética in vitro e in vivo

Info

Publication number: PT1446489E
Application number: PT02783361T
Authority: PT
Inventors: Himanshu Brahmbhatt; Jennifer Macdiarmid
Original assignee: Engeneic Molecular Delivery Pty Ltd
Priority date: 2001-10-15
Filing date: 2002-10-15
Publication date: 2012-04-24
Also published as: JP4458846B2; ATE541940T1; AU2002347426B2; CN102172406B; US20120208866A1; CN1599797A; ES2584305T3; US20080020441A1; EP2302063B1; EP2302063A3; EP1446489A2; JP2005505296A; CA2463631C; EP1446489B1; CN102172406A; WO2003033519A2; DK1446489T3; CA2463631A1; CA2775218A1; PT2302063T

Description

DESCRIÇÃO MINICÉLULAS INTACTAS, COMO VECTORES PARA A TRANSFERENCIA DE ADN Ξ TERAPIA GENÉTICA IN VITRO Ξ

IN VIVO

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A presente invenção tem por objecto a libertação, por meio de minicélulas bacterianas intactas de oligonucleótidos e polinucleótidos, em células hospedeiras, particularmente, mas não exclusivamente, no contexto da terapia genética. A presente invenção também tem por objecto um processo compatível, sob o ponto de vista farmacêutico, para purificar as minicélulas bacterianas intactas.

Uma patente norte-americana U.S. para Salser et al., com o N°. 4.497.796, esclarece várias abordagens anteriores, disponíveis circa 1980, para a transformação de células de mamíferos. Em particular, Salser et al. descrevem a transferência de um di-hidrofolato redutase que codifica um gene, que confere resistência a metotrexato em células L1210 de murganho ou em células de medula óssea, por meio da técnica de co-precipitação de ADN com fosfato de cálcio.

Salser et al. também mencionam um "certo número de outras maneiras... para a inserção de material genético nas células", incluindo, para além dos "vectores virais", algumas técnicas de fusão de células: "fusão de célula com célula envolvendo a fusão de células de um número limitado de cromossomas envolvidos em membranas nucleares;... fusão de minicélulas;... fusão com protoplastos bacterianos contendo ADN de plasmido; e fusão com traços de eritrócitos envolvidos 1 com ADN" (coluna 5, linhas 18 - 30; citações omitidas). Comum a estas técnicas é a utilização de uma estrutura celular contendo ADN, delimitada por uma única membrana, que se faz contactar com uma célula-alvo de mamifero, na presença de um agente de promoção da fusão da membrana, tal como, polietileno-glicol (PEG). A célula de mamifero e a estrutura celular fundida, formando uma célula híbrida e o ADN contido nesta última são libertados no citoplasma da primeira e transportados para o núcleo do híbrido, que expressa assim o ADN. A descrição de Salser menciona "traços de eritrócitos", remanescentes de eritrócitos que estão isentos de conteúdo citoplásmico mas que retêm a morfologia original e "protoplastos bacterianos" ou células bacterianas a partir das quais se retira a membrana externa (parede da célula), normalmente por acção de uma enzima lítica ou de um antibiótico que inibe a síntese de peptidoglicano. Salser et al. também aludem à utilização de um terceiro tipo de estrutura celular simplificada, um protoplasto de minicélula.

Uma minicélula é uma forma anucleada de E. coli ou de outra célula bacteriana, formada por um distúrbio na coordenação, durante a fissão binária da divisão de células com segregação de ADN. A replicação cromossómica procariótica está ligada à fissão binária normal que envolve a formação de um septo no meio da célula. Na E. coli, por exemplo, a mutação de genes min, tal como minCO, pode eliminar a inibição da formação de septos nos polos da células durante a divisão das células, resultando na produção de uma célula-filha normal e de uma minicélula anucleada (de Boer et al., 1992; Raskin e de Boer, 1999; Hu e Lutkenhaus, 1999; Harry, 2001). 2

Para além das mutações dos operão min, as minicélulas anucleadas também são geradas no seguimento de um conjunto de outros rearranjos ou mutações genéticas que afectam a formação do septo, por exemplo, na divIVBl em B. subtilis (Reeve e Cornett, 1975; Levin et al., 1992). As minicélulas também podem ser formadas no seguimento de uma perturbação nos niveis de expressão de genes das proteinas envolvidas na divisão de células/segregação de cromossomas. Por exemplo, a expressão em excesso de minE leva à divisão polar e à produção de minicélulas. Do mesmo modo, as minicélulas com menos cromossomas podem resultar de defeitos na segregação cromossómica, por exemplo, a mutação de smc em Bacillus subtilis (Britton et al., 1998), a eliminação de spoOJ em B. subtilis (Ireton et al., 1994), a mutação de mukB em E. coli (Hiraga et al., 1989) e a mutação de parC em E. coli (Stewart e D'Ari, 1992). Os produtos de genes podem ser fornecidos in trans. Quando expressas em excesso, a partir de um número elevado de cópias de plasmido, por exemplo, CafA, pode aumentar a taxa de divisão das células e/ou inibir a repartição cromossómica após a replicação (Okada et al., 1994), resultando na formação de células encadeadas e minicélulas anucleadas (Wachi et al., 1989; Okada et al., 1993).

As minicélulas são distintas de outras vesiculas pequenas que são geradas e libertadas espontaneamente em certas situações e que, ao contrário das minicélulas, não são devidas a rearranjos genéticos específicos ou à expressão epissómica de genes. Exemplos dessas outras vesículas são bolhas bacterianas que são vesículas pequenas da membrana (Dorward et al., 1989). As bolhas têm sido observadas, por exemplo, em várias espécies bacterianas de Agrobacterium, Bacillus, Bordetella, Escherichia, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella e Shigella. As bolhas bacterianas podem ser 3 produzidas, por exemplo, através da manipulação do ambiente em crescimento (Katsui et al., 1982) e através da utilização de agentes exógenos que desestabilizam a membrana (Matsuzaki et al., 1997).

Existem outros componentes sub-bacterianos, tais como, traços bacterianos (Lubitz et al., 1999), que são envelopes bacterianos vazios formados numa certa variedade de bactérias Gram-negativas quando os genes E da lise de phiX174 são expressos. Os traços bacterianos são formados a partir de uma estrutura em túnel da transmembrana, através de um envelope de células bacterianas. Devido à elevada pressão osmótica dentro da célula, o conteúdo citoplásmico é expelido para o meio que a circunda, levando a um envelope vazio de célula bacteriana.

Como a replicação de plasmidos dentro de células procarióticas é independente da replicação cromossómica, os plasmidos podem segregados tanto em células-filhas normais como em minicélulas, durante a divisão aberrante de células descrita antes. Assim, as minicélulas derivadas de min recombinante de E. coll comportam um número significativo de cópias de plasmido, com todos os componentes celulares bacterianos excepto para os cromossomas e têm sido utilizadas tal qual em estudos da expressão de genes codificados por plasmidos in vitro. Ver, Brahmbhatt (1987), Harlow et al. (1995), e Kihara et al. (1996). Brahmbhatt (1987) demonstrou, por exemplo, que as minicélulas de E. coli podem comportar plasmidos recombinantes com inserções de ADN tão grandes quanto 20 kb, estando ausente qualquer ADN cromossómico e podem expressar nove ou mais proteinas recombinantes simultaneamente. 4

Essas minicélulas intactas, não-reprodutivas, mas activas sob o ponto de vista metabólico têm sido utilizadas para analisar proteinas codificadas por genes com origem em plasmidos. No contexto da "fusão de minicélulas", mencionado por Salser et al., contudo, as minicélulas são expulsas das suas membranas exteriores para originar uma estrutura que, tal como um protoplasto bacteriano, podem sofrer fusão com uma célula-alvo quando ambas são incubadas em conjunto com PEG ou outro agente que promova a fusão das células. Tal como os protoplastos bacterianos, esses protoplastos de minicélulas também podem ser mantidos em condições isotónicas, para prevenir a lise osmótica e são altamente vulneráveis aos ataques enzimáticos. Assim, não são apropriados para a terapia genética. Além disso, com o advento de outras metodologias de transformação mais convenientes, a tecnologia das minicélulas referida por Salser et al., caiu em desuso.

Mais recentemente, o avanço da terapia genética tem sublinhado uma variedade de processos para a introdução de material genético exógeno no genoma de um mamífero receptor. Ver revisões por Romano et al. (1998, 1999), Balicki e Beutler (2002) e Wadhwa et al. (2002). A aplicação clínica destas técnicas, tal como a utilização de vectores de adenovírus ou de retrovírus recombinantes, tem sido retardada por causa de questões sérias de segurança. Ilustrativo dos problemas que apresenta esta metodologia de transformação são agora a recombinação com vírus do tipo selvagem, o potencial de inserção ou oncogénico, a imunossupressão induzida por vírus, a capacidade limitada dos vectores virais para comportarem segmentos grandes de ADN terapêutico, a reversão para a virulência de vírus atenuados, as dificuldades na produção de vírus recombinantes e na sua distribuição, a fraca estabilidade e as reacções adversas, tais como, 5 respostas inflamatórias causadas pela imunidade existente. Uma abordagem que obvie estes problemas vai oferecer um beneficio significativo na utilização de terapias genéticas mais seguras e mais eficazes.

Os vectores bacterianos vivos atenuados também estão a ser explorados como vectores de libertação de genes para a terapia genética humana, incluindo Salmonella (Darji et al., 1997; Paglia et al., 2000; Urashima et al., 2000), Shigella (Sizemore et al., 1995; Grillot-Courvalin et al., 2002), Listeria (Dietrich et al., 1998) e E. coli invasiva (Grillot-Courvalin et al., 1998). Contudo, os vectores bacterianos têm limitações significativas porque a bactéria viva, embora atenuada, pode ser tratada por engenharia genética para comportar mecanismos da lise da membrana fagolisossómica, para permitir que o ADN recombinante suficiente escape para o citosol das células de mamíferos e assim para o núcleo. Essa engenharia genética é difícil e pode ser impossível para muitos agentes patogénicos bacterianos intracelulares. Além disso, as mutações que atenuam os agentes patogénicos bacterianos são conhecidas apenas para um número muito pequeno de espécies bacterianas, por exemplo, mutações nos genes da biossíntese dos aminoácidos aromáticos para Salmonella, E. coli e Shigella.

Como as mutações de atenuação não são conhecidas para muitas espécies bacterianas, um sistema de libertação de genes bacterianos não pode explorar a vasta bateria de agentes patogénicos intracelulares bacterianos. Os vectores bacterianos trazem uma preocupação adicional no que respeita à presença de ADN cromossómico porque partes deste ADN poderiam ser transferidas para outra microflora no hospedeiro humano ou animal que receba a terapia genética. Essa transferência promíscua de ADN entre espécies bacterianas é 6 indesejável devido a um potencial de emergência de novas bactérias virulentas e/ou resistentes a fármacos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Para colmatar estas e outras necessidades, a presente invenção providencia, de acordo com um aspecto, uma composição que compreende (i) minicélulas recombinantes, recombinantes intactas (i), minicélulas bacterianas intactas e (ii) um seu veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, em que as referidas minicélulas bacterianas intactas contêm um plasmido que compreende uma sequência de ADN que codifica um produto de expressão terapêutico de um péptido ou de um polipéptido, por exemplo, interleucina 2 e em que a referida composição está isenta de contaminantes com uma dimensão de 0,2 ym ou menor. Numa modalidade preferida, a composição contém menos do que uma célula parental de contaminação por ΙΟ7, 108 ou 109 minicélulas.

De acordo com outro aspecto, a presente invenção tem por objecto a utilização de minicélulas recombinantes, bacterianas, intactas, na preparação de um medicamento que compreende minicélulas bacterianas intactas contendo um plasmido que compreende uma sequência de ADN que codifica um produto terapêutico de expressão de péptido ou polipéptido, em que o referido medicamento está isento de contaminantes, com uma dimensão de 0,2 ym ou inferior, para ser utilizado num processo de (i) tratamento de uma doença, alergia ou infecção ou (ii) modificação de um traço por administração do referido medicamento a uma célula, tecido ou órgão, em que a referida doença se selecciona entre (1) cancro; (2) uma doença adquirida seleccionada entre SIDA, pneumonia e enfisema; e (3) um estado clinico provocado por um erro de metabolismo no nascimento, sendo a alergia ou infecção 7 tratada por modificação de uma resposta imunitária e o referido traço ser a fertilidade.

Em aspectos relacionados a presente invenção tem por objecto minicélulas bacterianas recombinantes, intactas, contendo um plasmido, que contém uma sequência de ADN que codifica um produto terapêutico de expressão de péptido ou de polipéptido, em que as referidas as minicélulas bacterianas estão isentes de contaminantes com uma dimensão de 0,2 ym ou inferior, para serem utilizadas como um produto farmacêutico.

Um outro aspecto da presente invenção tem por objecto uma composição da presente invenção, tal como descrita antes, para ser utilizada num processo de (i) tratamento de uma doença, alergia ou infecção ou (ii) modificação de um traço por administração da referida composição a uma célula, tecido ou órgão, em que a referida doença se selecciona entre (1) cancro; (2) uma doença adquirida seleccionada entre SIDA, pneumonia e enfisema; e (3) um estado clinico provocado por um erro de metabolismo no nascimento, sendo a alergia ou a infecção tratada por modificação de uma resposta imunitária e o referido traço ser a fertilidade. A presente invenção também tem por objecto, prosseguindo para outro aspecto, um processo de transformação genética que compreende (i) providenciar minicélulas bacterianas recombinantes, intactas, contendo um plasmido compreendendo uma sequência de ADN que codifica um produto terapêutico de expressão de péptido ou de polipéptido, em que as referidas minicélulas bacterianas estão isentas de contaminantes com uma dimensão de 0,2 ym ou inferior e (ii) fazer contactar a referida preparação de minicélulas bacterianas, intactas, in vitro, com células de mamifero não fagociticas, concorrentes com endocitose, de tal modo que as referidas minicélulas bacterianas são engolidas pelas referidas células de mamífero, em que as referidas células de mamífero produzem o referido produto de expressão. 0 plasmido mencionado antes também pode conter um segundo segmento de ácido nucleico, que funciona como um elemento regulador, tal como, um promotor, um terminador, um melhorador ou uma sequência de sinal e que está operacionalmente ligado ao primeiro segmento de ácido nucleico. Além disso, o plasmido pode conter um elemento repórter, tal como um segmento de ácido nucleico que codifica para a proteína fluorescente verde.

Ainda de acordo com outro aspecto da presente invenção, providencia-se um processo de purificação que compreende a passagem de uma amostra contendo as minicélulas bacterianas intactas (i) por uma série de filtros de fluxo cruzado e depois (ii) através de um filtro fechado, em que as referidas minicélulas bacterianas intactas são separadas dos contaminantes na referida amostra para se obter uma preparação purificada de minicélulas. 0 processo inclui, eventualmente, um tratamento da preparação de minicélulas purificadas com um antibiótico. Também opcional é uma etapa preliminar em que se faz uma centrifugação diferencial na amostra contendo as minicélulas. Numa modalidade preferida, as séries de filtros de fluxo cruzado compreendem (A) pelo menos um ou dois filtros que utilizam uma dimensão de poro superior ou igual a cerca de 0,45 ym e (B) pelo menos um filtro que utiliza uma dimensão de poro que é igual ou próximo de 0,2 ym.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A figura 1 mostra uma ilustração esquemática da divisão normal das células numa bactéria e a forma como as 9 mutações nos genes min resultam na formação de minicélulas. A figura 2 mostra um diagrama esquemático da preparação de plasmidos úteis para gerar estirpes bacterianas que produzem minicélulas. Em particular, esta figura mostra uma estrutura de plasmido para gerar uma estirpe que produz minicélulas derivadas de S. typhimurium. Mostram-se os desenhos das linhas dos ADN clonados inseridos e parte dos vectores circulares de plasmido. Os nomes dos plasmidos estão ilustrados a negro à esquerda dos ADN de inserção e dentro dos mapas dos vectores circulares. Quando se utilizam iniciadores de RCP para gerar um clone, o número de iniciadores está indicado ao lado da seta a tracejado. A figura 3 mostra um diagrama esquemático da preparação do plasmido útil para gerar uma estirpe bacteriana que produz minicélulas. Em particular, esta figura mostra a preparação de um plasmido para gerar uma estirpe que produz minicélulas derivadas de Shigella flexneri 2a. A figura 4 mostra um diagrama esquemático da preparação de um plasmido útil para gerar uma estirpe bacteriana que produz minicélulas. Em particular, esta figura mostra uma estrutura de plasmido para gerar uma estirpe que produz minicélulas derivadas de Llsteria monocytogenes. A figura 5 mostra imagens de TEM de células de macrófagos de murganhos transfectadas com minicélulas derivadas de S. typhimurium. Para cada painel, dá-se o tempo após a infecção e a amplificação. As imagens 10 mostram partículas densas de electrões semelhantes a minicélulas (setas) com vacúolos de macrófagos. A figura 6 mostra a administração de genes mediada por minicélulas a células de cancro da mama humana e a expressão de genes heterólogos. 0 painel A mostra a linha de células de controlo do cancro, SK-BR-3, 96 horas após a transfecção com minicélulas não recombinantes e marcadas com o anticorpo anti-HER-2, detectada com o anticorpo secundário conjugado com Alexafluor. 0 painel B mostra a expressão de GFP em células SK-BR-3, 96 horas após a transfecção com minicélulas recombinantes que comportam o plasmido pEGFP-Cl (expressão eucariótica de GFP) . 0 painel C mostra células SK-BR-3 transfectadas com minicélulas/ pEGFP-Cl, marcadas com anticorpo anti-HER-2 e detectadas com o anticorpo secundário conjugado com Alexafluor. As imagens foram visualizadas com microscopia confocal. A figura 7 mostra a resposta anti-GFP do soro em murganhos, 14 dias após a administração intraperitonial de minicélulas recombinantes e células parentais de S. typhimurium mortas comportando o plasmido pEGFP-Cl. Na legenda e nas legendas das figuras 8 - 10, 10*8 e 10*9 representa 108 e 109, respectivamente. A figura 8 mostra a resposta anti-LPS do soro em murganhos, 14 dias após a administração intraperitonial de minicélulas recombinantes e células parentais de S. typhimurium mortas comportando o plasmido pEGFP-Cl. A figura 9 mostra a resposta anti-GFP do soro em murganhos, 14 dias após a administração intraperitonial de minicélulas comportando o plasmido pEGFP-Cl. 11 A figura 10 mostra a resposta anti-LPS do soro em murganhos, 14 dias após a administração intraperitonial de minicélulas comportando o plasmido pEGFP-Cl.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERIDAS

Os requerentes determinaram que minicélulas com paredes de células intactas ("minicélulas Intactas") são vectores eficazes para administrar oligonucleótidos e polinucleótidos (colectivamente, "moléculas de ácidos nucleicos") a células hospedeiras (preferencialmente, células de mamíferos em seres humanos ou animais) in vitro e in vivo. Assim, os requerentes verificaram que uma minicélula intacta é engolida pelas células de mamíferos que, do mesmo modo, engolem a célula bacteriana a partir de qual se obteve a minicélula (a "célula bacteriana parental"). Além disso, verificou-se, surpreendentemente, que os conteúdos de uma minicélula recombinante intacta, quando engolida por uma célula hospedeira, são tratados de tal maneira, que pelo menos algum ADN de plasmido das minicélulas escapa à degradação e é transportado através do citoplasma para o núcleo da célula hospedeira que expressa então o ADN de plasmido.

De acordo com a presente invenção, faz-se então contactar uma minicélula intacta, que comporta um ADN para o qual se pretende a expressão heteróloga, quer in vitro ou in vivo, com uma célula de mamífero que engula a célula bacteriana parental, do mesmo modo que os agentes patogénicos bacterianos intracelulares. Da mesma forma que a célula de mamífero indicada aqui como "capaz de engolir", engole a minicélula e expressa o ADN em questão. Há uma variedade de mecanismos que podem estar envolvidos na subsjugação das minicélulas intactas de um 12 determinado tipo de células hospedeiras e a presente invenção não depende de qualquer mecanismo particular respeitante a este tema. Por exemplo, a fagocitose é um processo bem documentado, no qual os macrófagos e outras células fagociticas, tais como, neutrófilos, ingerem partículas por meio da extensão da pseudopodia sob a superfície das partículas até a partícula estar totalmente envolvida. Embora descrita como fagocitose "não específica" o envolvimento de receptores específicos no processo já foi demonstrado. Ver Wright & Jong (1986); Speert et al. (1988).

Assim, uma forma de fagocitose envolve a interacção entre os ligandos da superfície e os receptores de ligandos localizados nas membranas da pseudopodia (Shaw e Griffin, 1981) . Esta etapa de ligação, mediada por receptores específicos, pensa-se que está dependente das adesinas da superfície bacteriana. No que respeita a bactérias menos virulentas, tais como, E. coli não enterotoxigénica, a fagocitose também pode ocorrer na ausência de ligandos de superfície para os receptores de fagócitos. Ver, Pikaar et al. (1995). Assim, a presente invenção engloba, mas não se limita à utilização de minicélulas intactas que ou possuem adesinas ou lhes faltam as adesinas da superfície, ao mesmo tempo que mantêm a natureza das suas células bacterianas parentais e são engolidas pelos fagócitos (isto é, células hospedeiras "competentes para a fagocitose") entre os quais os neutrófilos e os macrófagos são os tipos principais nos mamíferos.

Outro processo de absorção é a endocitose, por meio da qual os agentes patogénicos intracelulares exemplificados pelas espécies de Salmonella, Escherichia, Shigella, Helicobacter, Pseudomonas e Lactobacilli entram nas células epiteliais dos mamíferos e replicam-se aí. Relacionado com 13 isto existem dois mecanismos básicos que são a endocitose mediada por receptores dependentes de Clathrin, também conhecida como "endocitose de cavidades revestidas" (Riezman, 1993) e endocitose independente de Clathrin (Sandvig e Deurs, 1994) . Qualquer uma delas ou ambas podem estar envolvidas quando uma célula capaz de engolir actua por endocitose (isto é, uma célula hospedeira "competente para a endocitose") engole minicélulas intactas, recombinantes e expressa o ADN comportado pelas minicélulas, de acordo com a presente invenção. Células competentes para endocitose representativas são as células epiteliais da mama, os enterócitos no tracto gastrointestinal, as células epiteliais do estômago, as células epiteliais do pulmão e as células epiteliais do tracto urinário e da bexiga. A presente invenção é particularmente útil para a introdução, nas células capazes de engolirem outras, de moléculas de ácidos nucleicos que, após transcrição e/ou tradução, funcionam de modo a melhorar ou de alguma forma tratar uma doença ou modificar um traço associado com um tipo particular de célula, tecido ou órgão de um indivíduo. Para os fins da presente descrição, estas moléculas são categorizadas como "moléculas terapêuticas de ácidos nucleicos".

Por exemplo, a transcrição ou a tradução de uma dada molécula terapêutica de ácido nucleico pode ser útil no tratamento do cancro ou em doenças adquiridas, tais como, SIDA, pneumonia, enfisema ou na correcção de deficiências genéticas de metabolismo, tais como, fibrose quística. A transcrição ou a tradução de um ácido nucleico terapêutico pode também efectuar uma esterilização contraceptiva, incluindo a esterilização contraceptiva de animais ferozes. Os distúrbios infecciosos mediados por alergenos e os 14 distúrbios inflamatórios mediados por agentes infecciosos contrariados por administração, por via da presente invenção, de uma molécula terapêutica de ácido nucleico que, após expressão num doente, afecta as respostas imunitárias associadas com o alergeno e o agente infeccioso, respectivamente. Uma molécula terapêutica de ácido nucleico também pode ter um produto de expressão ou pode haver um produto a jusante da modificação pós-tradução do produto de expressão, que reduz as sequelas imunológicas relacionadas com o transplante ou que ajuda a facilitar o crescimento e a regeneração do tecido.

Alternativamente, o produto de expressão ou um produto relacionado, o agente pós-tradução pode ser uma proteína, tipificada pela eritropoietina, um factor de crescimento, tal como, TGA-β, uma citocina, tal como, IL-2, IL-10, IL-12 ou qualquer outra interleucina, um inibidor da leucoproteinase do soro ou um anticorpo, tal como, CTLA4-Ig, que providencia o benefício desejado para o hospedeiro. Outras dessas proteínas são, sem limitação, α-, β- e γ-globina, insulina, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, EPO, FNT, MGF, adenosina desaminase, antigénios associados a tumores, tais como, antigénios virais mutados ou expressos de forma aberrante (CDK4, β-catenina, GnT-V, Casp8), antigénios específicos do cancro, tais como, MAGE, BAGE, GAGE, PRAME e NY-ESO-1, antigénios de diferenciação, tais como, tirosinase, Melan-A/MART-1, gplOO e TRP-l/gp75 e antigénios expressos em excesso, tais como, Her2/neu e CEA. Outros exemplos da classe das moléculas terapêuticas de ácidos nucleicos são os ADN que codificam para o regulador da transmembrana da fibrose quística (RTFQ), factor VIII ou outra proteína do sangue, receptor de lipoproteína de baixa densidade, β-glicocerebrosidase, a- e β-galactosidase, insulina, hormona da paratiróide, oí-1-antitripsina, fasR e fasL, respectivamente. 15

De acordo com a presente invenção, a expressão de uma molécula terapêutica de ácido nucleico por uma célula hospedeira pode fornecer um composto necessário, mediar uma resposta imunitária dirigida ou interromper um processo patológico. Por exemplo, uma molécula terapêutica de ácido nucleico pode estar implicada numa terapia anti-paralela ou de ribozima. No presente contexto, uma terapia anti-paralela envolve a introdução, perseguida pela presente invenção, de uma cópia anti-paralela de uma sequência de polinucleótidos, tal que o transcrito de ARN da cópia híbrida in situ com um transcrito de ARN mensageiro (ARNm) que corresponde à sequência de polinucleótido. Esta hibridação normalmente evita que o transcrito seja traduzido numa proteína ou inicie uma via de degradação que destrói o ARNm. 0 ácido nucleico terapêutico também pode codificar duplexes curtos de ARN de interferência (cARNi) dentro de uma célula de mamífero. Isto é, o cARNi tem demonstrado que suprime genes-alvo em células de mamíferos. Este processo de interferência do ARN (iARN) é um processo de silenciamento de genes, específico da sequência e pós-transcrição em animais, seres humanos e plantas e inicia-se por um ARN de hélice dupla (hd) que é homólogo ao gene silenciado. A libertação de cARNi, mediada por vírus, para reduzir especificamente a expressão dos genes-alvo em vários tipos de células, tem sido demonstrada com sucesso (Haibin et al., 2002).

Para todas estas utilizações e outras diferentes desta, de uma molécula terapêutica de ácido nucleico, a presente descrição utiliza a designação de "terapia genética", que também é referenciada pelas frases "transferência de genes", "libertação de genes" e "vacinas à base de genes", relacionadas com a metodologia ou os com sistemas para a transferência de uma molécula terapêutica de ácido nucleico 16 para células hospedeiras, tanto in vivo como ex vivo, como descrito, por exemplo, na patente U.S. N°. 5.399.346. Assim, uma composição da presente invenção contendo minicélulas pode ser utilizada para se conseguir um efeito terapêutico in situ e para a transformação de células fora do corpo e depois a sua reintrodução num individuo. De acordo com a presente invenção, as células apropriadas tanto para as abordagens in vivo como ex vivo seriam aquelas que são capazes de engolir, tal como os fagócitos e as células epiteliais.

Tal como se fez notar antes, a terapia genética pode ser efectuada para tratar ou prevenir uma doença ou um estado clinico genético ou adquirido. A molécula terapêutica de ácido nucleico codifica um produto, tal como um ARN funcional (por exemplo, anti-paralelo ou cARNi) ou um péptido, polipéptido ou proteina, cuja produção in vivo se pretende. Por exemplo, o material genético de interesse pode codificar uma hormona, receptor, enzima ou (poli)-péptido de valor terapêutico. Esses processos podem resultar na expressão transiente de ADN transferido, não-integrado, na replicação e expressão extra-cromossómica de replicões transferidos, tais como epissomas ou na integração de material genético transferido em ADN genómico das células hospedeiras.

Uma molécula terapêutica de ácido nucleico pode ser a contraparte normal de um gene que expressa uma proteina que funciona de forma anormal ou que está presente em niveis anormais no estado de doença, como é o caso, por exemplo, com o regulador de condutância da transmembrana de fibrose quistica na fibrose quistica (Kerem et al., 1989; Riordan et al., 1989; Rommens et al., 1989), com β-globina na anemia das células falciformes e com a a-globina, β-globina e γ-globina na talassemia. A molécula terapêutica de ácido nucleico pode ter um transcrito de ARN anti-paralelo ou um pequeno ARN de 17 interferência, como mencionado antes. Assim, uma produção em excesso de α-globina, em relação a β-globina, que caracteriza a β-talassemia, pode ser melhorada pela terapia genética, de acordo com a presente invenção, utilizando uma minicélula intacta tratada por engenharia genética, para conter um plasmido que incorpora uma sequência, que tem um transcrito de ARN anti-paralelo, face à sequência-alvo do ARNm de a-globina.

No tratamento do cancro, uma molécula terapêutica de ácido nucleico apropriada para ser utiliza de acordo com a presente invenção pode ter uma sequência que corresponde ou deriva de um gene que está associado com a supressão do tumor, tal como o gene p53, o gene de retinoblastoma e o gene que codifica o factor da necrose do tumor. Uma vasta gama de tumores sólidos- cancros, papilomas e verrugas - podem ser tratados por esta abordagem, de acordo com a presente invenção. Sob este ponto de vista, cancros representativos incluem carcinoma do cólon, cancro da próstata, cancro da mama, cancro do pulmão, cancro da pele, cancro do fígado, cancro dos ossos, cancro do ovário, cancro do pâncreas, cancro do cérebro, cancro da cabeça e do pescoço e linfoma. Papilomas ilustrativos são o papiloma das células escamosas, o papiloma dos duplexes coroidais e o papiloma da laringe. Exemplos de estados clinicos de verrugas são verrugas genitais, verrugas plantares, epidermodisplasia verruciforme e verrugas malignas.

Uma molécula terapêutica de ácido nucleico para a presente invenção também pode incluir um segmento de ADN que codifica para uma enzima, que converte um pró-fármaco inactivo em um ou mais metabólitos citotóxicos de tal maneira que, após a introdução in vivo do pró-fármaco, a célula alvo é, com efeito, compelida, talvez com as células da sua 18 vizinhança a cometer suicídio. As aplicações pré-clínicas e clínicas desse "gene suicida" que pode ser de origem não humana ou de origem humana, estão revistas por Spencer (2000), Shangara et al. (2000) e Yazawa et al. (2002).

Ilustrativos de genes suicidas de origem não humana são os que codificam para HSV-timidina cinase (tk), citosina desaminase (CDA) + uracilo fosforibositransferase, xantina-guanina fosforibosil-transferase (GPT), nitroreductase (NTR), purina nucleósido fosforilase (PNP, DeoD), citocroma P450 (CYP4B1), carboxipeptidase G2 (CPG2) e oxidase de D-aminoácido (DAAO), respectivamente. Os genes suicidas de origem humana são exemplificados pelos genes que codificam carboxipeptidase Al (CPA), desoxicitidina cinase (dCK) , citocroma P450 (CYP2B1.6), LNGFR/FKBP/Fas, FKBP/Caspases e ER/p53, respectivamente.

Uma terapêutica com um gene suicida, de acordo com a presente invenção, poderá ser aplicada ao tratamento da SIDA. Esta estratégia já foi testada com vectores suicidas que expressam um produto de gene tóxico, logo que as células tratadas de mamíferos ficam infectadas pelo VIH-1. Estes vectores utilizam elementos reguladores de VIH-1, Tat e/ou Rev, para induzir a expressão de um gene tóxico, tal como a toxina α-difteria, a citosina desaminase ou o interferão-a2 após infecção por VIH-1 (Curiel et ai., 1993; Dinges et ai., 1995; Harrison et ai., 1992a; Harrison et ai., 1992b; Ragheb et ai., 1999). As células podem ser transduzidas por estes vectores, utilizando a abordagem das minicélulas recombinantes da presente invenção e serão eliminadas mais rapidamente do que as células não transduzidas após a infecção por VIH, prevenindo a replicação virai a custa da morte das células. 19

Uma molécula de ácido nucleico, a ser introduzida por via da abordagem da presente invenção, pode incluir um elemento repórter. 0 elemento repórter confere ao seu hospedeiro recombinante um fenótipo ou uma caracteristica facilmente detectáveis, normalmente pela codificação de um polipéptido, que não é produzido pelo hospedeiro, que pode ser detectado, após expressão, por análises histológicas in situ, tal como por técnicas de imagiologia in vivo. Por exemplo, um elemento repórter libertado por uma minicélula intacta, de acordo com a presente invenção, pode codificar para uma proteina que produz, na célula hospedeira que vai engolir a minicélula, uma alteração colorimétrica ou fluorométrica que é detectável por uma análise in situ e que é uma função quantitativa ou semi-quantitativa da activação transcricional. Ilustrativas destas proteínas são as esterases, fosfatases, proteases e outras enzimas, cuja actividade gera um cromóforo ou um fluoróforo detectáveis.

Exemplos preferidos são β-galactosidase de E. coli, que efectua uma alteração da cor por via da clivagem de um substrato indigogénico, o indolil^-D-galactósido e uma luciferase, que oxida um aldeído de cadeia longa (luciferaase bacteriana) ou um ácido carboxílico heterocíclico (luciferina), com a concomitante libertação de luz. Também é útil, neste contexto, um elemento repórter que codifica a proteína fluorescente verde (PFV) da água-viva, Aequorea victoria, tal como descrito por Prasher et al. (1995) . 0 campo da tecnologia relacionado com a PFV está ilustrado por dois pedidos de patentes PCT publicadas, WO 095/21191 (que descreve uma sequência de polinucleótido que codifica uma apoproteína de PFV do aminoácido 238, contendo um cromóforo formado pelos aminoácidos 65 a 67) e WO 095/21191 (que descreve uma modificação do ADNc para o apopéptido de PFV de A. victoria, providenciando um péptido que tem as 20 propriedades fluorescentes alteradas) e por um repórter de Heim et al. (1994) de uma PFV mutante, caracterizada por um aumento de 4 a 6 vezes no que respeita à amplitude de excitação.

Um outro tipo de elemento repórter está associado com um produto de expressão que torna as minicélulas recombinantes resistentes a uma toxina. Por exemplo, o gene neo protege um hospedeiro contra os niveis tóxicos do antibiótico G418, enquanto um gene que codifica di-hidrofolato redutase confere resistência a metotrexato e o gene de cloranfenicol acetiltransferase (CAT) confere resistência ao cloranfenicol.

Outros genes que se podem utilizar como elementos repórteres incluem os que podem transformar uma minicélula hospedeira para expressar antigénios da superfície da célula que se podem distinguir, por exemplo, as proteínas do envelope virai, tais como, gpl20 de VIH ou gD do herpes, que são facilmente detectáveis por imuno-ensaios.

Uma molécula de ácido nucleico que pode ser introduzida por via da abordagem da presente invenção também pode ter um segmento de codificação desejado, ligado operacionalmente a um elementos regulador, tal como um promotor, um terminador, um melhorador e/ou uma sequência de sinal. Um promotor apropriado pode ser específico do tecido ou específico do tumor, conforme seja ditado pelo contexto terapêutico.

Um promotor é "específico do tecido" quando é activado preferencialmente num determinado tecido e, por isso, é eficaz na orientação da expressão, no tecido-alvo, de uma sequência estrutural ligada operacionalmente. A categoria dos promotores específicos do tecido incluem, por exemplo, o promotor específico de hepatócitos para a albumina e a ai- 21 anti-tripsina, respectivamente; a região de controlo do gene de elastase I, que está activa nas células acinares pancreáticas; a região de controlo do gene da insulina, que está activa nas células beta pancreáticas; a região de controlo do vírus do tumor mamário em murganhos, que está activa nas células testiculares, da mama, linfóides e nos mastócitos; a região de controlo do gene da proteína básica da mielina, que está activa em células oligodendrocíticas no cérebro; e a região de controlo do gene da hormona de libertação de gonadotropina, que está actina nas células do hipotálamo. Ver, Frain et al. (1990), Ciliberto et al. (1985), Pinkert et al., (1987), Kelsey et al. (1987), Swift et al. (1984), MacDonald (1987), Hanahan, (1985), Leder et al. (1986), Readhead et al. (1987) e Mason et al. (1986). Há também promotores que expressam, preferencialmente, em certas células de tumores ou em células de tumor per se e que são úteis para tratar diferentes cancros, de acordo com a presente invenção. A classe dos promotores que são específicos para as células de cancro está ilustrada por: o promotor de tirosinase, para atingir melanomas; o promotor MUC1/DÍ3, para atingir o carcinoma da mama; o promotor híbrido de myoD/melhorador de SV40, para atingir a expressão para o rabdomiossarcoma (RMS); o promotor do antigénio carcino-embriónico (CEA), que é específico para as células que expressam CEA, tais como, as células do cancro do cólon e o promotor do gene de hexocinase do tipo II, para atingir os carcinomas do pulmão de células não pequenas. Ver, Hart (1996), Morton & Potter (1998), Kurane et al. (1998) e Katabi et al. (1999).

Pode-se utilizar uma sequência de sinal, de acordo com a presente invenção, para efectuar a secreção de um produto de expressão ou a localização de um produto de expressão para um 22 compartimento particular das células. Assim, uma molécula terapêutica de polinucleótido que é libertada por via de minicélulas intactas pode incluir uma sequência de sinal, no próprio quadro de leitura, tal como, o produto de expressão que interessa é segregado por uma célula que engole ou a sua progenia, influenciando assim as células circundantes, ao mesmo tempo que se conserva o paradigma do tratamento escolhido. As sequências de sinal ilustrativas incluem a sequência de secreção do terminal C de haemolisina, descrita na patente norte-americana U.S. N°. 5.143.830, a sequência de secreção de BAR1, descrita na patente norte-americana U.S. N°. 5.037.743 e a porção da sequência de sinal do polipéptido zsig32, descrito na patente norte-americana U.S. N°. 6.025.197. A capacidade das minicélulas intactas, recombinantes, da presente invenção, para manter a integridade in vivo, torna possível a sua utilização na terapia genética tal como se descreveu antes. As minicélulas intactas também não comportam nenhum ADN genómico bacteriano, que está presente em células bacterianas recombinantes, por exemplo, nas Shigella flexneri, Listeria monocytogenes, Escherichia coli ou Salmonella typhimurium, que outros já utilizaram para transferir plasmidos de expressão eucariótica para as células hospedeiras. Ver, Sizemore et al. (1995); Gentschev et al. (2000); Catic et al. (1999); Dietrich et al. (1998); e Courvalin et al. (1995). De acordo isto, a terapia genética com minicélulas intactas, de acordo com a presente invenção, não corre o risco associado com a utilização de bactérias recombinantes, de transferência inesperada de um gene marcador da resistência bacteriana ou um antibiótico para a flora microbiana que é endógena num determinado doente. Além disso, as bactérias recombinantes devem ser purificadas a partir do próprio paciente por meio da imunidade mediada por 23 células e, a partir dai, não são próprias para a terapia genética de um doente imuno-comprometido que sofra, por exemplo, de cancro ou de SIDA.

As minicélulas podem ser preparadas a partir de qualquer célula bacteriana de origem Gram-positiva ou Gram-negativa. Dado que a presente invenção utiliza minicélulas intactas, em vez de protoplastos de minicélulas, a presente invenção não requer e, preferencialmente, não envolve qualquer antibiótico ou pré-tratamento quimico das minicélulas.

Uma estirpe bacteriana que produz minicélulas pode ser gerada por uma mutação de um gene min, por exemplo, através de uma eliminação parcial de uma sequência de genes minCDE, conforme ilustrado nos exemplos 1 e 2 a seguir. Para se obter minicélulas recombinantes, intactas, de acordo com a presente invenção, as células bacterianas da estirpe escolhida que produz minicélulas são transformadas por meio de uma técnica padrão incluindo, mas não se limitando, à utilização de electroporação (Shigekawa e Dower, 1988), metodologias químicas (Hanahan, 1983), vectores vai-e-vem (Marcil e Higgins, 1992) e conjugação (Firth et al., 1996) ou transdução (Davis et al., 1980). Para esta transformação, a molécula terapêutica de ácido nucleico, de qualquer fonte eucariótica, procariótica ou sintética, é inserida num vector apropriado, disponível comercialmente ou num vector de plasmido da propriedade do utilizador final. Um ADN seleccionado pode ser ligado operacionalmente aos elementos de controlo necessários para a libertação do gene e/ou a expressão do ADN em células que engolem as minicélulas recombinantes in vivo.

As minicélulas recombinantes são analisadas, preferencialmente, in vitro, para assegurar que podem 24 libertar o plasmido recombinante os as sequências do ADN para os núcleos das células-alvo e que a expressão do gene recombinante ocorre na célula-alvo. 0 ensaio para a expressão dependerá da natureza do gene heterólogo. A expressão pode ser monitorizada por meio de uma variedade de processos, incluindo ensaios imunológicos, histoquimicos ou ensaios de actividade. A expressão de um gene marcador fluorescente, pode ser visualizada microscopicamente e isto providencia assim um ensaio particularmente conveniente. Por exemplo, o gene que codifica a proteina fluorescente verde, sob o controlo de um promotor de expressão de um gene eucariótico, tal como o promotor de CMV, pode ser transferido para um plasmido por meio de minicélulas recombinantes para as células-alvo eucarióticas (ver a seguir). Adicionalmente, a análise de "Northern blot" ou RCP de transcriptase inversa (RCP-TI) pode ser utilizada para avaliar a transcrição utilizando sondas apropriadas de ADN ou de ARN. Se estiverem disponíveis anticorpos dos polipéptidos codificados pelo gene heterólogo, pode-se utilizar análises de "Western blot", imuno-histoquímica ou outras técnicas imunológicas para avaliar a produção dos polipéptidos. Podem-se utilizar também ensaios bioquímicos apropriados se o gene heterólogo for uma enzima. Por exemplo, se o gene heterólogo codifica a resistência ao antibiótico, então a determinação da resistência das células infectadas com o antibiótico pode ser utilizada para avaliar a expressão do gene de resistência ao antibiótico. A competência de engolir por parte de uma putativa célula hospedeira ("alvo") pode ser avaliada fazendo uma análise da eficácia de libertação de ADN em cultura. Assim, um tumor atingido pode ser submetido a uma biópsia e a amostra de tecido resultante pode ser utilizada, de uma maneira convencional, para se obter células de tumor 25 representativas, em cultura, para analisar a capacidade para engolir minicélulas recombinantes da presente invenção que comportam, por exemplo, um elemento repórter apropriado. Adicionalmente ou alternativamente às análises dessas culturas de células primárias pode-se aferir a capacidade para engolir as minicélulas por meio da análise de uma linha de células que seja representativa do tipo de tecido ao qual o protocolo terapêutico é dirigido de acordo com a presente invenção. As técnicas de culturas de células estão bem documentadas, por exemplo, por Freshner (1992).

De acordo com a presente invenção, as minicélulas recombinantes podem ser purificadas a partir de células parentais por diversos meios. Uma abordagem utiliza a metodologia do gradiente de sacarose descrita, por exemplo, por Reeve (1979) e por Clark-Curtiss et al. (1983), seguida do tratamento com um antibiótico, tal como, gentamicina (200 pg/mL, 2 horas), para matar as bactérias residuais vivas.

Com a metodologia convencional, a pureza conseguida é de uma célula parental de contaminação por 106 a 107 minicélulas, no máximo. Para aplicações in vivo, de acordo com a presente invenção, podem ser necessárias doses superiores a 106 e podem ser tão altas quanto doses de IO10, o que, com a taxa de contaminação mencionada antes, irá traduzir-se em 10.000 células parentais vivas por dose. Este nivel de contaminação pode ser fatal, particularmente em indivíduos imuno-comprometidos.

Além disso, a tecnologia convencional utiliza meios que contêm um agente de formação de gradiente, tal como, sacarose, glicerol ou Percoll®, cuja presença é indesejável para utilizações in vivo, tal como se considera presentemente. Assim, a toxicidade do Percoll® restringi-o a 26 contextos de "apenas fins de investigação" enquanto a sacarose, para um determinado gradiente, confere uma elevada osmolaridade, que pode causar alterações fisiológicas nas minicélulas.

Para aplicações de terapia genética, de acordo com a presente invenção, é por isso preferível minimizar a contaminação das células parentais e utilizar meios que são mais compatíveis sob o ponto de vista biológico. Para atingir estes objectivos, os requerentes verificaram que era inesperadamente vantajoso combinar uma filtração de fluxos cruzados (o fluxo de alimentação é paralelo a uma superfície da membrana) e uma filtração fechada (o fluxo de alimentação é perpendicular à superfície da membrana). De um modo geral, ver Forbes (1987). Eventualmente, esta combinação pode ser precedida de uma centrifugação diferencial, a uma força centrífuga baixa, para eliminar qualquer porção das células bacterianas e assim enriquecer o sobrenadante para as minicélulas. Também eventualmente, a combinação pode ser seguida de um tratamento com antibiótico para matar as células bacterianas parentais residuais. A filtração por fluxos cruzados, dependente da dimensão do poro do filtro, pode separar minicélulas de contaminantes maiores, tais como, células bacterianas parentais e de contaminantes menores, tais como bolhas bacterianas, endotoxinas livres, resíduos celulares de ácidos nucleicos e líquido em excesso. Para separar as minicélulas de contaminantes maiores, a dimensão nominal do poro dos filtros de fluxo cruzado deve permitir que as minicélulas passem através dos filtros mas não as células bacterianas grandes. Prefere-se uma dimensão do poro de 0,45 ym para esta finalidade, porque as minicélulas têm um diâmetro de aproximadamente de 0,4 ym, enquanto as células bacterianas 27 são maiores. Para separar as minicélulas de outros contaminantes menores, a dimensão nominal do poro dos filtros de fluxo cruzado deve permitir que os contaminantes menores permeiem através dos filtros mas não as minicélulas. Para este fim, prefere-se uma dimensão de poro de 0,2 ym porque as bolhas bacterianas variam o seu diâmetro entre 0,05 ym e 0,2 ym e outros contaminantes menores são inferiores a 0,2 ym. A aplicação eficaz da filtração de fluxo cruzado, neste contexto, normalmente requer pelo menos uma etapa que envolva uma dimensão de poro maior, próxima de 0,45 ym, seguida de pelo menos uma etapa de dimensão de poro menor, próxima de 0,2 ym. Entre ou durante as etapas em série de filtração por fluxo cruzado, pode-se realizar uma diafiltração para maximizar a recuperação das minicélulas. A utilização da filtração de fluxo cruzado acomoda suspensões que comportam cargas pesadas de matéria em partículas, tal como, culturas de bactérias, que podem comportar cargas de 1011 a 1013 populações bacterianas e populações de minicélulas por litro de cultura. Para minimizar as incrustações do filtro e a consequente perda de minicélulas, a cultura bacteriana/minicélulas deve ser diluída, preferencialmente, 5 a 10 vezes. As diluições também permitem a utilização de uma pressão atmosférica baixa e de um fluxo baixo.

Para remover as células bacterianas parentais residuais do filtro, após a filtração por fluxo cruzado, realiza-se a filtração fechada. Para esta finalidade utiliza-se, preferencialmente, uma dimensão de poro de cerca de 0,45 ym.

Geralmente, a filtração providencia uma preparação esterilizada de minicélulas apropriada para os estudos de 28 transferência de genes. Para a transferência de genes in vivo, preferencialmente realiza-se um tratamento com um antibiótico para reduzir ainda mais os riscos de contaminação das células bacterianas. Por exemplo, as minicélulas podem ser novamente suspensas em meio de crescimento que contém um antibiótico ao qual a estirpe bacteriana parental é sensível. A quantidade apropriada de um dado antibiótico, para esta finalidade, pode ser determinada antecipadamente por técnicas convencionais.

Um arranjo em série de filtração em fluxo cruzado/filtração fechada, tal como descrito, não só dispensa a utilização de agentes de formação de gradientes mas também providencia uma pureza que excede 10“7 (isto é, menos do que uma célula parental por 107 minicélulas). Preferencialmente, a pureza excede 10“8 e, mais preferencialmente, é da ordem de 10”9. 0 arranjo em série da filtração por fluxo cruzado/ filtração fechada também providencia um melhor controlo da qualidade. Além disso, não há necessidade de um gene de resistência a ampicilina, ciclosserina ou a outro antibiótico, como é requerido pela técnica de Clarke-Curtiss e de Curtiss (1983). Além disso, a abordagem da purificação em série utiliza uma radiação que não danifica o ADN, ao contrário da metodologia descrita por Sanear et al. (1979); por isso, uma molécula terapêutica de ácido nucleico, libertada com minicélulas preparadas por via de um arranjo em série de filtração em fluxo cruzado/filtração fechada, pode estar isenta de mutações não específicas induzidas pela radiação.

Uma composição que consiste essencialmente em minicélulas recombinantes da presente invenção (isto é, uma composição que inclui essas minicélulas com outros constituintes que não interferem, de forma indevida, com a 29 qualidade de libertação do ADN da composição) pode ser formulada de uma forma convencional, utilizando um ou mais veículos ou excipientes aceitáveis sob o ponto de vista fisiológico. As formulações para injecção podem apresentar-se sob a forma de doses únicas, por exemplo, em ampolas ou frascos ou em recipientes com várias doses, com ou sem a adição de um conservante. A formulação pode ser uma solução, uma suspensão ou uma emulsão em veículos oleosos ou aquosos e pode conter agentes de formulação, tais como, agentes de suspensão, estabilização e/ou dispersantes. Uma solução apropriada é isotónica com o sangue do receptor e pode ser ilustrada por solução salina, solução de Ringer e solução de dextrose. Alternativamente, as minicélulas podem estar sob a forma de um pó liofilizado, para ser reconstituído com um veiculo apropriado, por exemplo, uma solução esterilizada, água isenta de pirogénio ou solução salina fisiológica. As minicélulas também podem ser formuladas como uma preparação sob a forma de um depósito. Essas formulações de actuação prolongada podem ser administradas por implantação (por exemplo, subcutaneamente ou intramuscularmente) ou por injecção intramuscular.

Uma composição da presente invenção contendo minicélulas pode ser administrada por várias vias e em vários sítios no corpo de um mamífero, para se alcançar os efeitos terapêuticos desejados, quer localmente ou sistemicamente. A administração pode ser feita, por exemplo, por administração oral, por aplicação da formulação a uma cavidade do corpo, por inalação ou insuflação ou por administração parentérica, intramuscular, intravenosa, intraportal, intra-hepática, peritoneal, subcutânea, intratumoral ou intradérmica. A natureza da aplicação contemplada irá influenciar (ou será influenciada) pela escolha da fonte bacteriana para as 30 minicélulas recombinantes utilizadas, para administrar uma molécula terapêutica de ácido nucleico. Por exemplo, espécies de Salmonella, Escherichia e Shigella comportam adesinas que são reconhecidos pelos receptores que medeiam a endocitose em enterócitos no tracto intestinal podem ser apropriadas para administração oral, para administrar uma molécula terapêutica de ácido nucleico, que é eficaz para células do cancro do cólon. Do mesmo modo, as minicélulas derivadas de Helicobacter pylori, comportando adesinas especificas para as células epiteliais do estômago, podem ser apropriadas para a administração oral que tem por objecto as células de cancro do estômago. A inalação ou a insuflação podem ser ideais para administração de minicélulas intactas derivadas de uma espécie de Pseudomonas que comporta adesinas reconhecidas por receptores nas células epiteliais do pulmão; isto para administrar, aos pulmões de um doente com fibrose quistica, uma molécula terapêutica de ácido nucleico que codifica, por exemplo, a proteína CFTR. As minicélulas derivadas das bactérias Lactobacilli, que comportam adesinas específicas do tracto urinário e das células epiteliais da bexiga, podem ser bastante bem apropriadas para administração intra-uretral de uma molécula terapêutica de ácido nucleico, ao tracto urinário ou a um cancro da bexiga. A presente invenção pode ainda ser utilizada para administrar uma gama de moléculas de ácidos nucleicos que podem ser ADNc, assim como ADN genómico ou ARN e podem ter uma orientação paralela ou anti-paralela. A molécula de ácido nucleico presente numa minicélula intacta, de acordo com a presente invenção, pode ter a forma de um plasmido, vector de expressão ou outra estrutura genética, mas não é ADN genómico que tenha origem em células bacterianas que dão origem às minicélulas. As células apropriadas para serem utilizadas na presente invenção são qualquer sequência desejada de ADN ou 31 de ARN de uma fonte eucariótica, procariótica ou sintética que possa ser colocada sob o controlo translacional e transcricional de um promotor de expressão de genes eucarióticos ou que possa ser expressa em células de mamíferos utilizando factores de transactivação da célula hospedeira.

Exemplo 1. Geração de minicélulas bacterianas a partir de bactérias Gram negativas, Salmonella typhimurium, Escherichia coli e Shigella flexneri

As estirpes bacterianas que produzem minicélulas a partir de bactérias Gram-negativas foram geradas, tal como se descreve aqui (A, B e C) e estão ilustradas nas figuras 2 e 3.

Materiais e processos gerais

As estirpes bacterianas utilizadas nos exemplos que se seguem estão listadas e referenciadas no quadro 1. Todas as bactérias cresceram a partir de concentrados de glicerol mantidos a -80 °C. As estirpes de Salmonella, E. coli, Shigella e Listeria cresceram em caldo de soja com tripticase (TSB) (da marca BBL comprado nos Bacto Labs, Liverpool, NSW, Austrália). Foram preparadas de acordo com as instruções do fabricante, a 30 g/L e passaram por uma autoclave, a 121 °C, durante 15 minutos. A cultura em liquido cresceu numa incubadora, em agitação, a 37 °C. As estirpes de Shigella foram diferenciadas das de E. coli por meio de uma sementeira em placa de agar XLD (agar xilose-lisina-desoxicolato) para resultar em colónias vermelhas e amarelas, respectivamente. A XLD foi comprada na Oxoid (Melbourne, Austrália). Foi preparada de acordo com as instruções do fabricante, a 53 g/L e depois foram levadas à ebulição, durante 2 minutos. 32

Utilizaram-se antibióticos nas concentrações que se seguem, em meios líquidos e sólidos: ampicilina, 100 yg/mL, cloranfenicol, 30 yg/mL, canamicina, 30 yg/mL.

Quadro 1. Estirpes bacterianas utilizadas

Estirpe de E. coli Genótipo/caracteristicas relevantes Referência ENIhOOl SMlOOpir; F- supE44, thi-1, thr-1, JeuB6, .ZacYl, tonA21, recA:RP4-2-Tc::Mu lambdapir, TnphoA, oriR6K, tra- mob+ Miller e Mekalanos (1988) ENE105 Estirpe ENIhOOl comportando o plasmido pEN060 (fig. 3) A presente descrição ENIh003 JM109; F' traD36 proA+ proB+ _Zaclq _ZacZDM15/recAl endAl gyrA96 (Nalr thi hsdRll supE44 relAl D(Jac-proAB) mcrK Yanisch-Perron et al. (1985) Estirpe de Salmonella ENIh007 Salmonella enterica serovar Typhimurium. Isolado clínico de ovelhas Institute of Medicai and Veterinary Services, Adelaide, SA, Austrália. Estirpe de referência J98/00413 ENSm083 Serotipo de Weldin Salmonella choleraesuis subsp. choleraesuis (Smith) Typhimurium depositado como Salmonella typhimurium ATCC 14028 SL3261 Salmonella typhimurium aroA- Hoiseth et al., (1981) SL5283 Salmonella typhimurium hsdR-, hscM+ Hoiseth et al., (1981) Estirpe de Shigella ENSfOOl Serotipo 2b de S. flexneri ATCC 12022 Estirpe de histeria ENLM001 Monocitogenes de histeria Gibson ATCC 7644 J. Pathol. Bacteriol. 45: 523, (1937) 33

Quando necessário, as estirpes crescem em meio M9 minimo complementado com glicose a 1 %. Adicionaram-se suplementos adicionais consoante a estirpe. Para a estirpe ENIh003 de E. coli, adiciona-se tiamina 1 mM. Para estirpe ENSfOOl de S. flexneri, ο M9 foi complementado com serina 0,4 mM, prolina 0,2 mM, fenilalanina a 0,001 %, triptofano a 0,001 %, tirosina a 0,001 %, histidina a 0,001 %, 0,002 mg/mL de valina, 0,0125 mg/mL de ácido nicotinico, tiamina a 0,001 % e 0,0225 mg/mL de metionina. O ADN do plasmido foi purificado utilizando o estojo Miniprep Spin da Qiaprep (Qiagen Inc., Victoria, Austrália). 0 ADN genómico para as estirpes de Salmonella, Shigella e E. coli foram preparados utilizando o protocolo básico do Current Protocols in Molecular Biology (capitulo 2, secção I, unidade 2.4; John Wiley & Sons, Inc.). Todas as enzimas de restrição e de modificação utilizadas foram compradas na Promega (Madison, WI, EUA) ou na Roche (Castle Hill, NSW, Austrália) , excepto para a polimerase do ADN de Deep Vent, que foi comprada no New England Biolabs (Beverly, MA, EUA). O ADN genómico de L. monocytogenes (ENLM001) foi purificado por processos convencionais (Ausubel et. al., Current Protocols em Molecular Biology, John Wiley and Sons Inc.) com modificações, conforme descrito. Centrifugou-se uma amostra de 1,5 mL de uma cultura feita durante a noite, a 13.200 rpm, durante 3 minutos e descartou-se o sobrenadante. Os peletes das células bacterianas foram novamente suspensos em 1 mL de tampão TE (Tris 10 mM, a pH 8,0; EDTA 1 mM, a pH 8,0) com 2,5 mg/mL de lisozima e incubou-se, a 37 °C, durante 1 hora. Adicionou-se então ARNase A até a uma concentração final de 15 mg/mL e incubou-se a solução, à temperatura ambiente, durante 1 hora. Depois, adicionou-se 100 yg/mL de proteinase K e SDS a 0,5 % e incubou-se novamente a mistura, 34 durante 1 hora, a 37 °C. Em seguida, misturou-se com a solução, cuidadosamente, 200 pL de NaCl 5 M, seguido de 160 pL de uma solução de CTAB/NaCl (CTAB a 10 %, em NaCl 0,7 M). Incubou-se então esta mistura, durante 10 minutos, a 65 °C. Extraiu-se a amostra com um volume igual de clorofórmio/ álcool isoamilico seguido de uma extracção com um volume igual de fenol/clorofórmio/álcool isoamilico. 0 ADN genómico precipitou na solução com 0,6 volumes de isopropanol e um volume 1/10 de acetato de sódio 5 M. Lavou-se o aglomerado de ADN com etanol e secou-se ao ar antes de uma nova suspensão em tampão de TE.

Sintetizaram-se os iniciadores de RCP e compraram-se na Sigma-Genosys (Castle Hill, NSW, Austrália). 0 protocolo básico de RCP foi seguido da seguinte forma. Os componentes da reacção, para todas as RCP de 50 pL, incluiram lx tampão, dNTP 200 pM, 50 pmole de cada iniciador, 1 unidade de polimerase de ADN de Deep Vent, 50 pmoles da matriz de ADN genómico (25 pmoles para os plasmidos), água isenta de nuclease até 50 pL, sendo a RCP realizada em tubos de 0,2 mL num Thermalcycler Express de gradiente de RCP da Thermo Hybaid (Ashford, Middlesex, RU). As condições da RCP, para se obter o aglomerado de genes minCDE, foram as seguintes: 94 °C, durante 4 minutos; seguida de 30 ciclos, a 94 °C, durante 35 segundos, 60 °C, durante 30 segundos, 72 °C, durante 2 ,5 minutos; seguido de um ciclo final, a 0 O durante 35 segundos, 60 °C, durante 35 segundos, 72 °C, durante 5 minutos. As condições da RCP para se obter a cassete de AminCOE foram as seguintes: 94 °C, durante 4 minutos; seguido de 30 ciclos, a 94 °C, durante 35 segundos , 60 °C, durante 30 segundos, 72 °C, durante 2 minutos; seguido de um ciclo final, a 94 °C, durante 35 segundos, o 0 O durante 35 segundos, 72 °C, durante 4 minutos. As condições da RCP para se obter a cassete de àminCOE::Cml foram as seguintes: 94 °C, 35 durante 4 minutos; seguido de 30 ciclos, a 94 °C, durante 35 segundos, 60 °C, durante 30 segundos, 72 °c, durante 3 minutos; seguido de um ciclo final, a 94 °c, durante 35 segundos, 60 °C, durante 35 segundos, 72 °c, durante 6 minutos .

Os protocolos padrão de biologia molecular seguidos foram os descritos em Sambrook et al. (1989) e no CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (John Wiley & Sons, Inc., NJ, EUA) . 0 rendimento de minicélulas foi determinado microscopicamente, utilizando um microscópio de luz do modelo DMLB da Leica, com análise de imagem por meio de uma câmara DC Leica e o programa informático de gestão de imagens IM da Leica. As amostras foram visualizadas utilizando um microscópio Darkfield a 40x ou uma imersão em óleo com uma amplificação de lOOx. As coberturas de vidro das lâminas de vidro foram seladas com agarose a 1,5 %. Determinou-se a pureza de cada lote de minicélulas semeando-as em placas a 10 % em volume, em placas de agar soja e tripticase e fazendo a incubação, durante a noite, a 37 °C. O método utilizado por rotina providenciou uma pureza muito elevada com uma contaminação de células em 109 minicélulas. Fez-se novamente a suspensão das suspensões de minicélulas em TSB com os antibióticos apropriados para os quais se determinou que as bactérias parentais eram sensíveis e fez-se a incubação das culturas, com agitação, a 37 °C, durante 4 horas, para matar qualquer bactéria parental residual. Por exemplo, determinou-se que a estirpe minCOE de S. typhimurium era sensivel à ampicilina e, por isso, incubou-se a suspensão de minicélulas em TSB contendo 50 yg/mL de ampicilina, durante 4 horas, para assegurar que se houvesse qualquer bactéria residual ela seria morta. Depois, recolheram-se as minicélulas por 36 centrifugação a 10.000 g, durante 30 minutos, lavaram-se quatro vezes em tampão lx BSG (para eliminar o meio de crescimento) e fez-se novamente uma suspensão no volume desejado para as experiências a jusante. (A) Geração de estirpes que produzem minicélulas a partir de duas estirpes diferentes de Salmonella typhimurium.

Na figura 2 mostra-se um diagrama esquemático da preparação do plasmido. As estirpes bacterianas, os plasmidos e os iniciadores de RCP utilizados estão indicados nos quadros 1, 2 e 3, respectivamente.

As sequências do gene minCOE de E. coli, ver Mori (1996), foram utilizadas para pesquisar a base-de-dados Genbank sobre sequências homólogas de ADN utilizando o processo de análise FASTA (Pearson e Lipman, 1988). Verificou-se que a sequência do ADN de TYPN3 contig 101 do genoma de S. typhi (CT18) era homóloga das sequências de minCDE de E. coli. Os iniciadores de oligonucleótidos ENOL001 e ENOL002 foram preparados com base nestes dados e foram utilizados para iniciar a sintese dos genes minCDE intactos da estirpe ENIh008 de S. typhimurium, como um fragmento de EcoRI-minCOE-HindlII.

Clonou-se este fragmento nos sitios de EcoRI/HindIII de pNEB193 para criar um plasmido designado como pENOOl, que foi propagado na estirpe JM109 de E. coli para resultar na estirpe ENE001. Os iniciadores ENOL003 e ENOL004 foram preparados de modo a eliminar um total de 1.081 pb de uma sequência da cassete de minCDE em pENOOl, ao mesmo tempo que se inseriam 16 pares de bases (pb) contendo os sítios de restrição únicos Kpnl, Sma 1 e Xbal como localizações para futuras inserções de um ou mais genes marcadores. 37 A sequência eliminada incluiu 386 pares de bases da extremidade 3' do gene minC, os 23 pares de bases que intervinham a jusante da sequência do gene minD e 672 pares de bases da extremidade 5' do gene minD. Isto resultou numa cassete de eliminação de AminCDE (755 pares de bases) no plasmido pEN002 existente na estirpe ENE003. 0 gene de resistência ao cloranfenicol de pHSG415 (fig. 2, quadro 2), 1330 pares de bases do fragmento HaeII/de extremidade cega) foi clonado no sitio Smal de pEN002, para se obter o plasmido pEN003, comportando a cassete de eliminação de AminCDE::CmlR com o gene CmiR clonado numa orientação de acordo com os ponteiros do relógio. Foi designada por estirpe ENE006.

Quadro 2. Plasmidos utilizados neste estudo

Plasmido Caracteristicas relevantes Referência pHSG415 Número de cópias baixo, sensível à temperatura, mobilizável. Hashimotoh-Gotoh et al., (1981) pGP7 04 Derivado de pBR322 em que oriEl foi substituído por oriR6K. A origem de replicação de R6K requer, para a sua função, uma proteína designada por pi, codificada pelo gene pir. A proteína pi de E. coli pode ser fornecida sob a forma trans por um pró-fago (□pir) que comporta uma cópia clonada do gene pir. 0 plasmido também contém um fragmento de BamHI de 1,9 kb codificando a região mob de RP4. Assim, pGP704 pode ser mobilizado em estirpes receptoras por transferência das funções providenciadas por um derivado de RP4 integrado no cromossoma da estirpe SM10 de E. coli. Contudo, uma vez transferido é incapaz de se replicar nos receptores a que falta a proteína pi. AmpR. Miller e Mekalanos (1988) pNEB193 É um derivado de pUC19 que comporta sítios únicos para cortadores de 8 bases únicas: Asei, PacI e Pmel. 0 poliligante Comprado no New England Biolabs, Inc. Beverly, MA 38

Quadro 2. Plasmidos utilizados neste estudo

Plasmido Características relevantes Referência comporta os sítios de restrição únicos EcoRI, Saci, ΚρηI, Smal, AscI, BssHII, SamHI, PacI, Xbal, Sal 1, Pmel, Sbfl, Pst 1, SphI, HindlII. 0 poliligante não interrompe o quadro de leitura lacZ. AmpR. (EUA) pMK4 (5,6 kb) 0 vector vai-e-vem lacZ' de E. coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis (de pUC9), CmlR (de pC194) em Bacillus, AmpR em E. coli. CmlR em Bacillus. Sullivan et al., (1984) pVA838 (9,2 kb) 0 vector vai-e-vem de E. coli e Streptococcus sanguis, resistente a eritromicina (EmR) em S. sanguis, CmlR em E. coli. Macrina et. al., (1982) pRB37 3 (5,8 kb) 0 vector vai-e-vem bla de E. coli e B. subtilis (AmpR) e ori de E. coli derivaram de pBR322. Resistência a canamicina (KmR) , resistência a belomicina (BmR) e ori Gram-positivo derivaram de pUBUO. to (terminador da transcrição) tem origem no fago λ. Bruckner (1992) pEGFP Comporta uma variante vermelha deslocada da proteína fluorescente verde (PFV) de tipo selvagem, que tinha sido optimizada para ter uma fluorescência mais brilhante e uma expressão mais elevada em células de mamíferos (excitação máxima = 488 nm; emissão máxima = 507 nm). As sequências de flanqueio a montante de EGPF tinham sido convertidas com um sítio de iniciação da tradução de consenso Kozak, para aumentar mais a eficácia da tradução em células eucarióticas. 0 gene EGFP foi clonado entre dois MCS do derivado de pUC19, pPD16.43. 0 gene EGFP foi inserido no quadro de leitura com o codão de iniciação lacZ de pUC19 de modo a que a Comprado no Clontech Laboratories, Paio Alto, CA, EUA. 39

Quadro 2. Plasmidos utilizados neste estudo

Plasmido Características relevantes Referência proteína de fusão EGFP seja expressa a partir do promotor lac em E. coli. A estrutura de pUC de EGFP providencia uma origem elevada do número de cópias de replicação e um gene de resistência à ampicilina para a propagação e selecção em E. coli. pEGFP-C EGFP é tal como descrito para o plasmido pEGFP. As sequências de flanqueio de EGFP tinham sido convertidas para um sítio de iniciação de tradução de consenso de Kozak para aumentar a eficácia da tradução em células eucarióticas. 0 gene EGFP é expresso a partir do promotor precoce imediato de citomegalovírus humano e, por isso, o plasmido expressa apenas EGFP em células de mamíferos e não em células bacterianas. 0 MCS em pEGFP-Cl está entre as sequências de codificação de EGFP e o poliA de SV40 (a jusante do gene EGFP) que dirige o processamento apropriado da extremidade 3' do ARNm de EGFP. A estrutura do vector também contém uma origem de SV40, para a replicação em células de mamíferos, que expressa o antigénio T de SV40. Uma cassete de resistência à neomicina (neor) , consistindo no promotor precoce de SV40, o gene de resistência a neomicina/canamicina de Tn5 e os sinais de poliadenilação da timidina cinase do herpes simples (HSV TK) , permite que se seleccionem células eucarióticas, transfectadas de forma estável, utilizando G418. Um promotor bacteriano, a montante desta cassete, expressa a resistência a canamicina em E. coli. A estrutura de pEGFP-Cl também providencia Comprado no Clontech Laboratories, Paio Alto, CA, EUA 40

Quadro 2. Plasmidos utilizados neste estudo

Plasmido Características relevantes Referência uma origem de pUC de replicação para a propagação em E. coli e uma origem de fl para a produção de ADN de hélice simples. A cassete de eliminação de AminCDE::CmIR foi amplificada a partir do plasmido pEN003 por uma reacção em cadeia de polimerase (RCP) utilizando os iniciadores ENOLOOl e ENOL002, tornaram-se as extremidades cegas e foi clonada no sítio de Smal do plasmido suicida pGP704 (fig. 2; quadro 2). 0 plasmido, designado por pEN005, foi transformado na estirpe ENIhOOl (SMlOXpir; quadro 1) para se obter a estirpe número ENE007. Utilizou-se a estirpe ENE007 como estirpe dadora numa experiência de conjugação (conjugada com o filtro), com as estirpes ENIh007 e ENSm083 de S. typhimurium (quadro 1) como receptor. Durante a noite, cresceram culturas estáticas do dador e do receptor em TSB, a 37 °C. Misturaram-se as culturas num filtro associado a uma conjugação em membranas Hybond N+ em placas TSA, numa relação dador:receptor de 1:3 e incubou-se, a 37 °C, durante 8 horas. Recuperaram-se as células e lavaram-se duas vezes numa solução salina esterilizada. Os peletes de células foram novamente suspensos em solução salina e colocou-se em placas de Petri de 150 mm. Incubaram-se as placas durante pelo menos 72 horas, a 37 °C.

Seleccionaram-se os ex-conjugantes num meio mínimo M9 com 1,5 % de glicose e 30 yg/mL de cloranfenicol. A estirpe dadora foi contra-seleccionada nestas condições, devido aos requisitos extra-auxotróficos, dado que a estirpe receptora não pode crescer devido à sua sensibilidade ao cloranfenicol. Por isso, esta experiência seleccionou ex-conjugantes de S. typhimurium comportando a resistência a cloranfenicol codificada por plasmido. As colónias foram rastreadas para o 41 fenótipo desejado em CmlR e Amps por meio do revestimento dos isolados em meio mínimo M9 contendo ampicilina (Amp) ou cloranfenicol (Cml). Dos 79 isolados da conjugação de ENE007 x ENIh007, que exibiram CmlR, verificou-se que um total de 18 isolados eram AmpB. Do mesmo modo, dos 56 isolados da conjugação de ENE007 x ENSm083 verificou-se que 19 eram Amps.

Para determinar se os isolados tinham sido eliminados, do ponto de vista cromossómico, para os genes minCD, as culturas feitas durante a noite foram visualizadas por meio de um microscópio de Darkfield, com uma amplificação de 40x. Visualizaram-se as minicélulas na cultura mista para os 27 isolados. Todos os isolados mostraram a presença de minicélulas enquanto as estirpes parentais de controlo estavam ausentes das minicélulas. Analisaram-se as minicélulas purificadas para avaliar a aglutinação com 4-0 soro de aglutinação somática de Salmonella (coelho) ZC13 (Murex Diagnostics, Norcross, Georgia EUA). A estirpe bacteriana recombinante cresceu em condições laboratoriais que eram óptimas para a produção de minicélulas recombinantes. O crescimento bacteriano é conseguido utilizando meios bacteriológicos padrão, tais como os descritos em Sambrook et al. (1989) e utilizando condições óptimas de crescimento, que podem ser facilmente determinadas por técnicas convencionais.

[B] Geração de minicélulas que produzem estirpes a partir de Shigella flexneri. A figura 3 descreve as etapas relevantes na construção genética de uma estirpe do serotipo 2b de S. flexneri que produz minicélulas. O protocolo de clonagem foi semelhante ao 42 seguido para a produção das estirpes de S. typhimurium que produzem minicélulas, como descrito antes.

Para clonar o agregado de genes minCOE a partir do serotipo 2b de S. flexneri (quadro 1), prepararam-se iniciadores de clonagem de RCP com base na pesquisa da base de dados de um projecto de sequenciação em progresso para a sequência completa do genoma do serotipo 2a de Shigella flexneri. Os iniciadores de RCP ENOL059 e ENOL060, comportando caudas de EcoRI e HindIII, respectivamente (quadro 3), foram utilizados para amplificar o aglomerado de genes de minCDE de 1.808 pb a partir de ADN genómico purificado a partir do serotipo 2b de Shigella flexneri. O fragmento amplificado foi clonado nos sítios de EcoRI e HindiII do plasmido pNEB193 (quadro 2), resultando no plasmido pEN055. O ADN de inserção foi sequenciado e confirmou-se ser ADN de minCDE da bactéria parental de Shigella.

Quadro 3. Oligonucleótidos utilizados neste estudo. Ilustram-se os sítios de enzimas de restrição e as características da sequência de ADN entre parênteses, precedendo o respectivo segmento de ADN. (F) e (R) representam iniciadores de RCP directo e inverso, respectivamente.

Oligonucleótido Sequência Produto ENOLOOl 5' (Cauda) CTC TCA CTG (EcoRI) GAA TTC (minC) ATG TCA AAC ACG CCA ATC GAG C 3' minCDE de S. typhimurium (F) ENOL002 5' (Cauda) CTC CTG GCA (HindIII) AAG CTT (minE) TTA TTT TGA CTC TTC GGC TTC CG 3' minCDE de S. typhimurium (R) ENOL003 5' (Cauda) CTC TGC TAG TCA (Smal-Kpnl) CCC GGG TAC C (minC) GCC GAA CCG CTT TCT CTT TAC C 3' Eliminação de minCDE de S. typhimurium para se obter AminCDE (R) 43 ENOL004 5' (Cauda) CTC TGC TAG TCA (Smal) CCC GGG (Xbal) TCT AGA (minD) GAA CCG GTG ATT CTT GAC GCC A 3' Eliminação de minCDE de S. typhimurium para se obter Δ/ninCDE ENROLO59 5' (Cauda) CTC TCA CT (EcoRI) GAA TTC (minC) ATG TCA AAC ACT CCA ATC GAG CT 3' Clonagem de minCDE 2b de S. flexneri (F) ENOL060 5' (Cauda) CTC CTG GC (HindIII) AAG CTT (minE inclui pelo menos 2 pb a partir de HindIII) ATT TCA GCT CTT CTG CTT CCG 3' Clonagem de minCDE 2b de S. flexneri (R) ENOL062 5' (Cauda) CTC TCA TAA (Smal) CCC GGG (Xbal) TCT AGA (minD) GGC GTG ATC CCA GAG GAT CAA T 3' Eliminação de minCDE 2b de S. typhimurium para se obter Δ/ninCDE (F) ENOL063 5' (Cauda) CTC TCA TTC (Smal-Kpnl) CCC GGG TAC C (minC) TGT GGA GCA TAA ATA CGC TGA CC 3' Eliminação de minCDE 2b de S. typhimurium para se obter AminCDE (R) ENOL038 5' (Cauda) CTC CAG TCT (HindlII) AAG CTT (minD) AGG AGC CGC GCT TAC TAT TAG C 3' minCDE de Listeria monocytogenes (R) ENOL048 5' (Cauda) CTC CAG TCT (Saci) GAG CTC (minC) GAA GAA GAA TGT TCA AAT TAA AGG C 3' minCDE de Listeria monocytogenes (F) ENOL039 5' (Cauda) CTC CAG TCT (BamHI) GGA TCC (Xbal) TCT AGA (minC) ATC CCC TGG AAC CTG AAC AAC 3' Eliminação de minCD de Listeria monocytogenes para se obter AminCD (R) ENOL040 5' (Cauda) CTC CAG TCT (BamHI) GGA TCC (Kpnl.) GGT ACC (minD) CCG GAA ATA TCA GCA GTT CG 3' Eliminação de minCO de Listeria monocytogenes para se obter AminCD (F) ENOL098 5' (Cauda) CTC CAG TCT (Xbal) TCT AGA (CmP) TTT TTG CGC TTA AAA CCA GTC AT 3' Obtém-se Cm' a partir de pMK4 (R) 44 ENOL099 5' (Cauda) CTC CAG TCT (Kpnl) GGT ACC (Cm*) AAA ACC TTC TTC AAC TAA CGG GG 3' Obtém-se Cm' a partir de pMK4 (F) ENOL096 5' (Cauda) CTC CAG TCT (Xbal) TCT AGA (Emr) GAG ATA AGA CGG TTC GTG TTC GT 3' Obtém-se Emr a partir de pVA838 (R) ENOL097 5' (Cauda) CTC CAG TCT (Kpnl) GGT ACC (Enf) AGA ATG CAG AAG ATG AAA GCT GG 3' Obtém-se Emr a partir de pVA838 (F) ENOL092 5' (Cauda) CTC CAG TCT (EcoRI) GAA TTC (Kanr) TGA AGG ATG CTT AGG AAG ACG AG 3' Obtém-se Kan' a partir de pRB373 (F) ENOL093 5' (Cauda) CTC CAG TCT (EcoRI) GAA TTC (Kan1) CGC CAT GAC AGC CAT GAT AA 3' Obtém-se Kan' a partir de pRB373 (R) ENOL094 5' (Cauda) CTC CAG CTC (EcoRI) GAA TTC (Kanr and G+ o ri) AAG GTG CGT TGA AGT GTT GGT AT 3' Obtém-se Kan' e G+ve ori a partir de pRB373 (F)

Obteve-se uma eliminação no aglomerado de genes minCDE utilizando os iniciadores de RCP ENOL062 e ENOL063 (quadro 3) e o plasmido pEN055 como o ADN matriz na reacção de RCP inversa. Isto resultou na eliminação de 271 pb (região do terminal 3' de minC), 23 pb (sequência inter-génica entre minC e rninO) e 608 pb (região do terminal 5' de minO) . Simultaneamente, as sequências do iniciador de RCP inseriram um sitio de clonagem múltipla, comportando os sítios de restrição de Kpnl-Smal-Xbal. O produto de RCP foi digerido com Smal e ligado novamente para criar o plasmido pEN056. O marcador CmlR foi purificado em gel a partir do plasmido pHSG415 (quadro 2), como um fragmento de HaelI de 1330 pb, com extremidade cega, com polimerase de ADN de T4 e clonado no sítio Smal do plasmido ρΕΝ05β. O novo plasmido àminCOE::CmlR foi designado por pEN057. 45 A cassete de Í\minCDECmlR foi obtida por RCP utilizando os iniciadores ENOL059 e ENOL060 (quadro 3) e utilizando o plasmido pEN057 como matriz. 0 fragmento de 2.272 pb foi clonado com as extremidades cegas num sitio EcoRV do plasmido suicida pGP704 (quadro 2) . 0 novo plasmido suicida foi designado por pEN060 e a estirpe SMlOXpir que o comportava foi designado por ENE105.

Utilizou-se uma conjugação emparelhada com um filtro para transferir o plasmido pEN060 de ENE105 para a estirpe ENSfOOl de Shigella flexneri (quadro 1) com uma relação receptor:dador de 5:1 e misturaram-se as culturas nocturnas (crescimento estático) do receptor e do dador em membranas Hybond N+ em placas TSA, a uma taxa calculada e incubaram-se, durante a noite, a 37 °C. Recuperaram-se as células e lavaram-se duas vezes antes de se colocarem em placas, em meio mínimo selectivo contendo suplementos e 30 yg/mL de cloranfenicol. O dador e o receptor não puderam crescer no mesmo meio devido quer aos requisitos auxotróficos (dador) ou à sensibilidade ao antibiótico (receptor) por isso quaisquer colónias encontradas deviam ser rejeitadas. Retiraram-se trinta e dois (32) isolados e revestiram-se em placas de meio fresco mínimo contendo suplementos e 30 yg/mL de cloranfenicol.

Os 32 ex-conjugantes foram incubados, a 37 °C, durante a noite, antes de irem recobrir placas com meio fresco mínimo contendo suplementos e 100 yg/mL de ampicilina e depois foram incubados, a 37 °C, durante 24-48 horas. Os 32 isolados foram capazes de crescer todos em ampicilina indicando a integração

de todo o plasmido. Examinou -se cada isolado com um microscópio de Darkfield (40x) ou numa imersão em óleo (10 0x) . Três dos isolados revelaram a presença de minicélulas. Os isolados foram removidos para placas XLD 46 contendo 30 yg/mL de cloranfenicol para confirmar que o isolado era de Shigella e não o dador de E. coli. Os isolados também exibiram uma forte reacção de aglutinação positiva quando analisados com soros de aglutinação de Shigella flexneri (BIODESIGN International, Saco, Maine, EUA). A purificação do plasmido e a análise em gel electroforético confirmou que o plasmido dador não estava presente nos ex-conjugantes como um epissoma.

[C] Geração de minicélulas que produzem estirpes a partir de Escherichia coli.

Considerando que há uma homologia genética de 98 % entre os genomas de E. coli e Shigella, este estudo tinha por objectivo determinar se as sequências heterólogas do gene AminCOE podiam ser utilizadas para gerar as estirpes produzindo minicélulas, especialmente quando as sequências dos genomas estavam muitíssimo relacionadas. Por isso, utilizou-se uma conjugação com emparelhamento com filtros para transferir o plasmido ρΕΝΟβΟ (comportando AminCDE::CmlR a partir de 2a de S. flexneri; fig. 3) de ENE105 (quadro 1) para a estirpe ENIh003 de E. coli (JM109; quadro 1) com uma relação de receptor:dador de 3:1. Misturaram-se as culturas nocturnas (crescimento estático) do receptor e do dador em membranas Hybond N+, em placas de TSA, a uma taxa calculada e incubaram-se, durante a noite, a 37 °C. Recuperaram-se as células e lavaram-se duas vezes antes de se colocarem em placas, em meio minimo selectivo contendo suplementos e 30 yg/mL de cloranfenicol. O dador e o receptor não puderam crescer no mesmo meio devido quer aos requisitos auxotróficos (dador) ou à sensibilidade ao antibiótico (receptor). Retiraram-se 106 isolados e revestiram-se em placas de meio fresco minimo contendo suplementos e 30 yg/mL de cloranfenicol. Os isolados foram todos incubados, a 37 °C, 47 durante a noite, antes de irem recobrir placas com meio fresco minimo contendo suplementos e 100 yg/mL de ampicilina e depois foram incubados, a 37 °C, durante 24-48 horas. Os 106 isolados foram todos capazes de crescer em ampicilina indicando a integração de todo o plasmido. Vinte e quatro (24) foram examinados num microscópio de Darkfield (40x) ou numa imersão em óleo de lOOx. Seis isolados revelaram a presença de um grande número de minicélulas. Embora se tenham utilizado no passado muitos protocolos diferentes de mutagénese geral e mutagénese dirigida ao sítio para gerar estirpes bacterianas que produzem minicélulas, a presente invenção é a primeira a demonstrar que o único protocolo de clonagem/mutagénese dirigida ao sitio utilizado neste estudo é versátil e pode ser utilizado com fiabilidade para gerar estirpes que produzem minicélulas a partir de uma gama de bactérias Gram-negativas e Gram-positivas (exemplo 2 mostrado a seguir).

Exemplo 2. Geração de minicélulas a partir de Listeria monocytogenes

As estirpes bacterianas que produzem minicélulas a partir de bactérias Gram-positivas podem ser geradas como descrito neste exemplo. Na figura 4 mostra-se um diagrama esquemático da produção do plasmido. As estirpes bacterianas, os plasmidos e os iniciadores de RCP estão listados, respectivamente, nos quadro 1, quadro 2 e quadro 3.

Para clonar os genes minCO a partir de genoma de L. monocytogenes, realizou-se a RCP utilizando os iniciadores ENOL038 e ENOL048 (quadro 3) e purificou-se o ADN genómico de L. monocytogenes como matriz. Realizaram-se as reacções de RCP em volumes de 50 yL utilizando o estojo Platinum® Púx ADN polimerase (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, EUA). As 48 reacções incluíram lx tampão P fx, MgS04 2 mM, dATP 0,2 mM, dTTP, dGTP e dCTP, 50 pmole de cada iniciador e 1 U de Pfx polimerase. As condições dos ciclos incluíram uma etapa de desnaturação, a 94 °C, durante dois minutos; seguida de 35 ciclos, de 94 °C, durante 30 segundos, 55 °C, durante 30 segundos e 68 °C, durante 2 minutos; seguido de uma etapa de extensão final a 68 °C, durante 5 minutos. Visualizou-se uma amostra de 2-5 pL de cada mistura reaccional das RCP num gel de agarose a 1 % corado com brometo de etídio. O fragmento de minCO amplificado foi purificado por excisão do gel de agarose seguido da electro-eluição utilizando o electro-eluidor do modelo 422 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA), de acordo com as especificações do fabricante. O fragmento minCD (1.556 pb) foi dirigido com Saci e HindiII e clonado direccionalmente nos respectivos sítios do plasmido pNEBl93 (quadro 2; fig. 4). Os clones recombinantes, transformados na estirpe ENIh003 (quadro 1) , foram caracterizados por digestão por restrição e análise em gel electroforético. O clone correcto (plasmido designado por pEN045) foi sequenciado para confirmar a identidade dos genes minCD. A eliminação por RCP foi realizada no fragmento de minCD clonado no plasmido pEN045 utilizando os iniciadores ENOL039 e ENOL040 (quadro 3). Os iniciadores comportam os sítios de restrição Xbal e Kpnl, respectivamente, que servem como sítios de inserção para os marcadores de selecção entre AminC e AminD. As condições de reacção para a eliminação de minCD e a visualização de fragmentos foram as descritas antes, mas com uma etapa adicional de 4 minutos, a 68 °C. O fragmento de AminCD foi, em seguida, digerido com Xbal e Kpnl e purificado por electro-eluição num electro-eluidor do modelo 422, como uma preparação para a ligação com os marcadores de selecção. 49

Inseriram-se dois marcadores diferentes de selecção de antibióticos a partir de bactérias Gram-positivas, entre os genes AminC e AminO em pEN045, nos sítios Kpnl e Xfoal. 0 marcador de resistência ao cloranfenicol (CmlR) do plasmido pMK4 de Bacillus subtilis (quadro 2) e um marcador de resistência à eritromicina (EmR) do plasmido pvA838 de Streptomyces sanguis (quadro 2) foram utilizados para preparar, respectivamente, os plasmidos pEN062 e pEN063 (fig. 4). Amplificou-se cada marcador por RCP utilizando os oligonucleótidos listados no quadro 2 e ilustrados na figura 4, que incluem os sítios Xfoal e Kpnl. Realizou-se a RCP de CmR e de EmR utilizando o mesmo volume de reacção e as mesmas concentrações de reagentes já descritas antes. As condições de realização dos ciclos incluíram uma etapa de desnaturação a 94 °C, durante dois minutos, seguida de 35 ciclos, a 94 °C, durante 30 segundos, 55 °C, durante um minuto a 68 °C, durante dois minutos; seguida de uma etapa de extensão, a 68 °C, durante 5 minutos. Os fragmentos de RCP foram purificados em gel utilizando um estojo MinElute (Qiagen Inc, Victoria, Austrália), de acordo com as instruções do fabricante. CmR e EmR foram então digeridos com Kpnl e Xfoal, purificados com uma coluna MinElute e ligados aos respectivos sítios entre os genes AminC e AminO em pEN045. Os recombinantes de JM109 foram caracterizados por digestão de restrição com as enzimas EcoRI e Dde I (CmR) e EcoRI e Aval (EmR) para se obter os isolados das estirpes ENE110 e ENE112, respectivamente.

Com fim de realizar as experiências de conjugação entre L. monocytogenes e SMlOXpir (ENIhOOl) de E. coli, prepararam-se quatro novos plasmidos, utilizando o plasmido conjugativo pGP704. O plasmido pGP704 foi modificado para incluir quer um marcador de resistência a canamicina (KmR) , codificado pelo gene neo, quer KmR assim como o ori para a replicação de plasmidos em bactérias Gram-positivas. O primeiro iria actuar 50 como um plasmido suicida na ausência de uma origem de replicação Gram-positiva com o gene neo (KmR) servindo como um marcador para a presença do plasmido. Pelo contrário, o último actua como um controlo positivo para as experiências de conjugação.

Os segmentos de ADN contendo o gene neo e o gene neo incluindo ori Gram-positivo, foram amplificados por RCP a partir de pRB373 utilizando o conjunto de oligonucleótidos listados no quadro 3. Os volumes das reacções de RCP e as concentrações dos reagentes foram os descritos antes. As condições de realização dos ciclos incluíram uma etapa de desnaturação de 2 minutos, a 94 °C; seguida de 35 ciclos, a 94 °C, durante 30 segundos, 56 °C, durante um minuto e 68 °C, durante 2 minutos e meio; seguida de uma etapa longa de extensão a 68 °C, durante 5 minutos. Os produtos foram purificados num gel de agarose utilizando uma coluna MinElute. Cortaram-se os fragmentos contendo o gene neo e o gene neo mais ori Gram-positivo com EcoRI e ligaram-se no sitio de EcoRI de pGP704 (fig. 4). Isto resultou nos plasmidos designados por pEN064 e pEN066.

Os AminCO::CmlR ou AminCO::EmR fora então excisados como fragmentos de Saci - HindiII a partir de pEN062 e pEN063, respectivamente, as extremidades foram tornadas cegas e ligaram-se no sitio EcoRV dos plasmidos pEN064 e pEN066, para se obter quatro plasmidos diferentes pEN069, pEN071, pEN073 e pEN075, tal como descrito na fig. 4. Transformaram-se os quatro plasmidos em ENIhOOl (SMIOÀpir de E. coli) , para criar as estirpes ENE124, ENE126, ENE128 e ENE130, respectivamente. Assim, ENE124 continha o plasmido com o AminCD::CmR e o gene neo (KmR) , enquanto ENE126 tinha, além disso, o ori Gram-positivo. Do mesmo modo, ENE128 continha o plasmido com 51

AminCO::EmR e o gene neo (KmR) , enquanto ENE13 0 continha adicionalmente o ori Gram-positivo.

As quatro estirpes ENE124, ENE126, ENE128 e ENE130 foram utilizadas como estirpes dadoras para as experiências de conjugação com L. monocytogenes (ENLM001). Realizaram-se as conjugações praticamente tal como descrito em Trieu-Cuot et al. (1991) . Todas as estirpes cresceram até à fase semi-logarítmica e foram misturadas numa proporção de 2:1 (receptor: dador) até a um volume de 1 mL. Lavaram-se duas vezes as misturas de conjugação em BHI antes de se fazer uma nova suspensão em 1 mL de BHI. Colocaram-se em placas, volumes de 200 pL em filtros de membranas de nitrocelulose de 0,45 μΜ (Millipore) em placas BHI e incubaram-se, durante 18 horas, a 37 °C. No seguimento da incubação, as membranas de nitrocelulose foram cortadas em tiras e colocadas em 3 mL de BHI. Aplicou-se uma rotação vigorosa em vórtice para desalojar as células bacterianas das membranas do filtro. Colocaram-se em placas amostras com um volume de 300 pL em placas grandes contendo BHI, ácido nalidixico (Nal; 50 pg/mL), colistina (Col; polimixina E) (10 pg/mL) e quer cloranfenicol (10 pg/mL) ou eritromicina (10 pg/mL). Incubaram-se as placas, durante 48 horas, a 37 °C, antes de se retirarem as colónias.

As colónias foram revestir placas de BHI/Nal/Col que continham canamicina (15 pg/mL), assim como, placas com BHI/Nal/Col e ainda cloranfenicol (10 pg/mL) ou eritromicina (10 pg/mL), para avaliar a sensibilidade ao antibiótico. Todos os ex-conjugantes demonstraram um perfil antibiótico que sugeriu a integração cromossómica da eliminação de minCO sem a integração do plasmido. Isto é, todos os ex-conjugantes cresceram em placas de antibiótico contendo o marcador interno eritromicina ou cloranfenicol e nenhum dos ex- 52 conjungantes cresceu em placas contendo canamicina (KmR codificada pelo gene neo nos plasmidos do dador).

Examinaram-se mais de cem ex-conjugantes no gue respeita ao fenótipo de minicélulas, utilizando o microscópio de campos escuro (40x) e uma imersão de óleo (lOOx) . Todos os isolados exibiram um número variável de estruturas de minicélulas entre a população de hastes parentais de L. monocytogenes, quando comparados com as células parentais ao microscópio (ENIhOOl e ENLmOOl). Este resultado também é consistente com a integração da eliminação de minCO e o desmembramento da divisão pericentral normal.

Escolheram-se trinta ex-conjugantes e fez-se uma sub-cultura para analisar a manutenção do fenótipo das minicélulas. Após a confirmação da manutenção, armazenaram-se os isolados como concentrados em glicerol para experiências futuras.

Exemplo 3. Purificação de minicélulas a partir de espécies bacterianas

Purificaram-se as minicélulas pelo processo da presente invenção que se segue. Este exemplo detalha a purificação de minicélulas derivadas de minCDE de S. typhimurium. Utilizou-se o mesmo processo para purificar minicélulas de estirpes mutantes adicionais de min, incluindo dois mutantes de S. typhimurium e um mutante de cada uma de E. coli, S. flexneri e L. monocytogenes. 0 processo foi optimizado e repetido mais de 50 vezes para gerar minicélulas purificadas. É um processo fiável e realizou-se por rotina e originou 108 a 109 minicélulas purificadas a partir de uma cultura bacteriana de 10 L. 53

Estabeleceu-se uma cultura de minCOE de S. typhimurium/pEGFP-Cl a partir de um concentrado em glicerol em 50 mL de TSB contendo os antibióticos de cloranfenicol e canamicina (concentração final de 50 ug/mL). Incubou-se a cultura, com agitação, a 37 °C, durante a noite. Utilizou-se uma aliquota de 2,5 mL da cultura nocturna para inocular 1 L (num frasco cónico de 2 L com um deflector) de TSB contendo os antibióticos mencionados antes e cinco frascos foram incubados, com agitação, a 37 °C, durante a noite. (A) Pré-preparação (Etapa I)

Encheu-se um saco de 100 L da Bioprocess com água do tipo 1 (MQ) por meio de um tubo esterilizado e por via de um filtro de 0,2 pm. Transferiu-se para 2 balões de vidro de vinte litros, previamente passados por uma autoclave, que continham 2 L de 10c BSG, 18 L da água de processo esterilizada, por meio de uma bomba peristáltica. Um dos balões de vidro foi utilizado para diluir a suspensão de minicélulas e outro foi utilizado na diafiltração. (B) Centrifugação diferencial e pré-preparação (etapa 2)

Centrifugou-se a cultura bacteriana a 2.000 g, durante 10 minutos (Sorvall Legend T/RT; rotor TTH 750) . Decantou-se o sobrenadante para um balão de vidro esterilizado de 5 L que se ligou a um filtro de respiração de 0,2 pm e uma ligação de desconexão rápida. O processo de decantação foi realizado num compartimento de risco biológico da classe II. Selou-se o balão de vidro, ligou-se uma tubagem esterilizada ao balão de vidro de 5 L e a outra extremidade da tubagem foi ligada a um balão de vidro de 20 L pré-cheio, contendo 20 L de 1 x BSG, tal como descrito antes. Bombeou-se a suspensão contendo as 54 minicélulas do balão de vidro de 5 L para o balão de vidro de 20 L, para se obter uma diluição de 1:5. (C) Sistema de purificação continua de minicélulas

Ligaram-se em série três sistemas de fluxos cruzados da Sartorius. Em duplicado, ligaram-se filtros de cassetes de lâminas da Sartocon de 0,45 ym nos primeiros dois suportes de lâminas e ligou-se uma cassete de filtro de lâminas da

Sartocon de 0,2 ym no último suporte. A torção de cada unidade de filtro foi apertada até 20 Nm (metros de Newton) , utilizando uma chave de torção. Ligou-se cada unidade a uma bomba por via de um elemento sanitário. Ligaram-se as linhas de alimentação, retenção e permeação. Antes da ligação dos balões de vidro, todo o sistema foi lavado internamente com 6 L de NaOH 1 N, a uma pressão de 2 bar, durante 15 minutos. Esta etapa esterilizou internamente as várias ligações e filtros. O sistema foi drenado do NaOH por reversão da direcção da bomba do fluxo de liquido e realizou-se um ensaio de velocidade de fluxo com água para assegurar a limpeza apropriada do filtro. O ensaio foi realizado de acordo com as instruções da fabricante (manual da Sartorius). As velocidades de fluxo aceitáveis de 3.000 a 3.600 mL por minuto para o concentrado e 600 a 800 mL por minuto para o permeado foram asseguradas antes da realização da filtração das minicélulas. O sistema funcionou ainda a um pH elevado e isto foi neutralizado pela inundação e recirculação através de cada sistema com 1 x SBF esterilizado (pH 7,4) até que o pH medido do conjunto do SPB estivesse no intervalo de 7,0 a 8,0. Ligaram-se então os balões de vidro (20 L). Realizou-se uma suspensão de minicélulas (25 L) num primeiro balão de vidro, que se ligou, por via de uma tubagem, à primeira cassete de filtros de 0,45 ym. Para evitar incrustações no filtro, diluiu-se a suspensão das minicélulas à medida que 55 era executada a etapa de filtração (isto é, a diafiltração) . 0 diluente (20 L de 1 x BSG) foi levado para um segundo balão de vidro. Por isso, na primeira etapa de filtração de fluxo cruzado, filtrou-se a suspensão de minicélulas através de um volume de 45 L. A válvula do permeado foi inicialmente fechada e a suspensão de minicélulas foi bombeada sobre a superfície do filtro de 0,45 pm, a uma pressão de 2 bar, durante 5 minutos. Isto condicionou o filtro para o meio de suspensão das minicélulas. Abriu-se então a válvula do permeado e a suspensão das minicélulas atravessou (pressão de 2 bar, 600 mL por minuto) através do filtro de 0,45 pm e recolheu-se o permeado num terceiro balão de vidro. À medida que decrescia o volume no primeiro balão de vidro, aumentava a quantidade de sólidos não filtrados e, por isso, a diafiltração foi ligada quando o volume no primeiro balão de vidro caiu para 15 L. Isto fez diluir os sólidos no primeiro balão de vidro, impedindo incrustações no filtro e maximizando a recuperação de minicélulas no terceiro balão de vidro. Quando o volume de permeado no terceiro balão de vidro atingiu aproximadamente 12,5 L, o segundo filtro de fluxo cruzado de 0,45 pm foi condicionado para a suspensão das minicélulas encontradas no terceiro balão de vidro. Quando o volume no terceiro balão de vidro atingiu a marca de 15 L, abriu-se a válvula do permeado, permitindo a permeação da suspensão de minicélulas para um quarto balão de vidro.

Nesta etapa, removeu-se a maior parte da contaminação das células bacterianas parentais da suspensão de minicélulas. A etapa seguinte consistiu na eliminação de contaminantes menores da suspensão, tais como, bolhas bacterianas, endotoxina livre, ácidos nucleicos, residuos celulares e liquido em excesso. Fez-se isto por meio da filtração através de um filtro de fluxo cruzado de 0,2 pm. As minicélulas tinham um diâmetro de, aproximadamente, 0,4 pm e, por isso, não puderam passar através de uma dimensão de poros 56 de 0,2 μιη. Por outro lado, as bolhas bacterianas, com uma dimensão (diâmetro) entre 0,05 ym e 0,2 ym, foram filtradas. Outros contaminantes também eram menores do que 0,2 ym e por isso apenas os constituintes retidos nesta etapa de filtração eram as minicélulas e quaisquer resíduos de células bacterianas parentais.

Quando o volume no quarto balão de vidro atingiu, aproximadamente, 15 L, o filtro de fluxo cruzado de 0,2 ym foi preparado para a suspensão de minicélulas presente no quarto balão de vidro. Abriu-se então a válvula do permeado permitindo que atravessasse para um quinto balão de vidro para resíduos enquanto as minicélulas ficavam retidas e concentradas no quarto balão de vidro. Devido à incorporação do sistema de diafiltração, as minicélulas estavam continuamente a ser diluídas e filtradas, o que assegurava uma completa eliminação de contaminantes no fim do processo. Por isso a etapa de concentração reduziu o volume da suspensão de minicélulas para, aproximadamente, 4 L do volume inicial de 45 L. (D) Permuta de tampão para a suspensão de minicélulas

Os sais residuais, os componentes do meio e os resíduos de baixo peso molecular na suspensão de minicélulas foram eliminados por diafiltração com 1 x BSG. O aparelho foi montado e equilibrado tal como se descreveu antes. Colocou-se a suspensão de minicélulas num primeiro balão de vidro de 4 L e colocou-se 20 L de 1 x BSG esterilizado (meio de diafiltração) num segundo balão de vidro. A unidade de fluxo cruzado foi montada com duas cassetes de filtros de 0,1 ym para assegurar que as minicélulas eram incapazes de passar através deles mas todos os contaminantes com menos os de 0,1 ym foram eliminados. Ligou-se a bomba e ajustou-se a 57 velocidade para dar uma pressão de 0,5 bar. Abriu-se a válvula do permeado e a suspensão de minicélulas fluiu através da linha de alimentação para o filtro de 0,1 ym. As minicélulas voltaram ao primeiro balão de vidro por via da linha de concentrado. Os resíduos fluíram através da linha de permeado e foram recolhidos num terceiro balão de vidro. Isto reduziu o volume da suspensão de minicélulas e o sistema de diafiltração foi ligado para bombear 1 x BSG para o primeiro balão de vidro. Esta etapa repunha continuamente o volume da suspensão de minicélulas para a manter em 4 L. O processo continuou até o segundo balão de vidro estar vazio, resultando em cinco mudanças do tampão da suspensão de minicélulas. (E) Filtração e esterilização da suspensão de minicélulas

Nesta etapa, a suspensão de minicélulas ainda tinha alguma contaminação bacteriana parental por causa dos filtros de fluxo cruzado de 0,45 ym não serem filtros esterilizados. Por isso, foi importante eliminar quaisquer bactérias parentais residuais para se obter uma suspensão de minicélulas que fosse óptima para utilização in vitro e in vivo. A suspensão de minicélulas de 4 L da etapa anterior foi inicialmente diluída para 20 L em 1 x BSG esterilizado e foi mantida num primeiro balão de vidro. Fez-se a pré-molhagem de uma unidade de filtro fechado comportando um filtro de 0,45 ym com uma grande área de superfície (500 cm2) , com 2 L de 1 x BSG esterilizado e foi integralmente testado de acordo com as instruções do fabricante. A suspensão de minicélulas foi bombeada a uma velocidade de fluxo de 700 mL/min (isto é, uma velocidade de fluxo lenta para prevenir a passagem forçada das células bacterianas parentais através do filtro de 0,45 ym) através do filtro fechado. As células bacterianas ficaram 58 retidas no filtro enquanto as minicélulas fluiram através de um segundo balão de vidro por via da linha de filtrado. (F) Concentração das minicélulas purificadas

Concentraram-se as minicélulas purificadas, numa suspensão de 20 L, para um volume menor. Esta etapa não é facilmente realizada por uma centrifugação padrão e por técnicas de nova suspensão dos peletes, contudo, como os volumes eram grandes, na prática, não eram manuseáveis por técnicas de centrifugação. A etapa de concentração foi então realizada nas quatro etapas que se seguem.

Etapa 1: Bombeou-se a suspensão de minicélulas, à pressão de 0,5 bar, de um primeiro balão de vidro e através de um filtro de fluxo cruzado de 100 kDa, por meio de um elemento sanitário. As minicélulas voltaram ao primeiro balão de vidro por via de uma tubagem de concentrado e o permeado liquido foi recolhido num segundo balão de vidro por via de uma linha de resíduos de permeado.

Etapa 2: Quando o volume da suspensão de minicélulas se tinha reduzido para 4 L, parou-se o processo e a suspensão foi transferida para um terceiro balão de vidro esterilizado de 4 L. Ligou-se este último com tubagens com 6,4 mm em comparação com as tubagens de 12,5 mm utilizadas para manusear os volumes maiores de que se falou antes. Isto reduziu o volume vazio na tubagem. Como as linhas de alimentação e de retenção tinham um diâmetro da tubagem de 12,5 mm, concebeu-se um adaptador para ligar a tubagem na tampa de fecho. Do mesmo modo, concebeu-se um adaptador para ligar a tubagem mais larga das linhas de alimentação e de 59 concentrado. Esta segunda etapa de concentração foi realizada como na etapa anterior até o volume das minicélulas ter sido reduzido para aproximadamente 200 mL.

Etapa 3: Transferiu-se a suspensão de 200 mL de minicélulas para uma garrafa de Schott modificada, que continha tubagens internas de vidro esterilizadas para a alimentação e o concentrado. A tubagem de vidro foi atravessada através da tampa da garrafa de Schott e foi selada com uma tubagem de Marprene e silicone. Na tampa, a garrafa também estava equipada com um filtro de respiração (0,2 ym) . Para reduzir ainda mais o volume vazio, substituiu-se a carga utilizada previamente, o elemento sanitário da tubagem de concentrado por tubos Marprene esterilizados de 6,4 mm e substituiu-se a bomba utilizada previamente por uma menor. Realizou-se o processo de concentração tal como antes (filtro de fluxo cruzado de 100 kDA) até a o volume das minicélulas ser reduzido para 50 mL.

Etapa 4: A suspensão de minicélulas altamente purificada foi transferida, em condições de esterilização, para um tubo de Falcon de 50 mL.

Exemplo 4. Caracterização das minicélulas de estirpes de minCD Gram-negativas e Gram-positivas por meio de um rastreio feito com um microscópio electrónico

As micrografias electrónicas por rastreio (SEM) e por transmissão (TEM) das minicélulas derivadas de S. typhimurium, E. coli, S. flexnieri, L. monocytogenes e das células parentais correspondentes foram realizadas para determinar a morfologia e as dimensões das várias minicélulas. Em resumo, as culturas bacterianas que comportavam as minicélulas foram centrifugadas a 13.200 rpm, durante 20 60 minutos e foram novamente suspensas em SBF contendo 2,5 % de glutaraldeído e fixou-se, à temperatura ambiente, durante 40 minutos. Centrifugaram-se as amostras e lavaram-se, três vezes, em água destilada. Para a TEM, realizou-se o seguinte procedimento. Para mudar as soluções, as células foram centrifugadas a 10.000 rpm, durante 1 minuto, pipetou-se o sobrenadante e depois voltou a fazer-se uma suspensão das células num novo reagente utilizando um misturador de vórtice. A sequência dos reagentes foi a seguinte: (a) tetróxido de ósmio em tampão de cacodilato 0,1 M, a pH 7,2 -10 minutos, (b) acetato de sódio a 4 % em água destilada - 1 minuto, (c) acetato de uranilo a 4 % em água destilada - 5 minutos, (d) etanol a 70 % - 5 minutos, (e) etanol a 100 % -5 minutos, (f) acetona a 100 % - 5 minutos, (g) acetona e monómero de resina de epoxi de Spurr a 1:1 - 30 minutos, (h) resina epoxi de Spurr pura - curada durante 48 horas, a 60 °C. Cortaram-se as secções dos blocos de resina curada com uma faca de diamante utilizando um ultramicrótomo Ultracut E da Reichert. Coraram-se as secções com acetato de uranilo, durante, 10 minutos, seguido de citrato de chumbo, durante 2 minutos. Examinaram-se as secções utilizando um microscópio electrónico de transmissão H-7000 da Hitachi, operado com um feixe de energia de 75 quilovolts (Universidade de New South Wales, NSW, Austrália). Registaram-se as imagens digitais utilizando uma câmara CCD de largo espectro MegaView II da AnalySis.

Para a microscopia electrónica de varrimento de alta resolução utilizou-se o seguinte método. Para mudar as soluções, centrifugaram-se as células a 13.000 rpm, durante 20 minutos. Pipetou-se o sobrenadante para fora e voltaram a suspender-se as células num novo reagente utilizando um misturador de vórtice. A intenção foi lavar todos os iões e os biomateriais das células e deixá-las suspensas num volume 61 mais pequeno de água destilada. A sequência dos reagentes foi a seguinte (a) 1 mL de água destilada - impermeabilizante, (b) 1 mL de água destilada - novamente suspensa, (c) depósito de 250 yL numa placa de amostragem limpa, de latão, (d) secagem, durante a noite, a 30 °c, (e) revestimento imediatamente antes da microscopia com 2 nm de metal de crómio depositado num equipamento de revestimento, por pulverização catódica em vácuo limpo Xenosput. As amostras revestidas foram examinadas utilizando um microscópio electrónico de varrimento de emissão de campo S-900 da Hitachi, utilizando um feixe de energia de 3 quilovolts (Universidade de New South Wales, NSW, Austrália). As imagens digitais, nas suas diferentes amplificações foram registadas utilizando um digitalizador ImageSlave.

Os resultados mostraram que as minicélulas derivadas tanto de bactérias Gram-negativas como Gram-positivas, tinham cerca de 400 nm de diâmetro e, excepto para a L. monocytogenes, apresentavam uma superfície ondulada, como foi observada por SEM, presumivelmente devido às estruturas da superfície das células dos lipopolissacáridos. Não houve diferenças aparentes na ultra-estrutura da superfície das minicélulas em comparação com as bactérias parentais, para todas as espécies. Os resultados da TEM mostraram que as minicélulas de L. monocytogenes tinham uma estrutura da parede das células rígida, esperada para membranas de células bacterianas Gram-positivas. As membranas de Salmonella, S. flexneri e E. coli colapsaram mais rapidamente sob o feixe electrónico do microscópio. O evento de formação de minicélulas, isto é, a divisão assimétrica das células, foi observado em todas as amostras. 62

Exemplo 5. Absorção das minicélulas por células de mamíferos, tais como, macrófagos

Para demonstrar a absorção das minicélulas recombinantes pelos macrófagos foi necessário incorporar primeiro um traçador, tal como, GFP, de modo a que as minicélulas recombinantes pudessem ser vistas, de uma forma distinta, em relação às células de mamíferos. Para isso, transformou-se o plasmido pEGFP em estirpes que produzem minicélulas de minCOE de S. typhimurium, E. coli e S. flexneri para determinar se as minicélulas comportavam de forma estável EGFP e verde de fluorescência. 0 plasmido pEGFP (quadro 2) é um plasmido de expressão bacteriana, que expressa uma variante da proteína fluorescente verde, de tipo selvagem, com o vermelho deslocado (EGFP; excitação máxima: 488 nm; emissão máxima: 507 nm) a partir do promotor lac. A estrutura do plasmido é um derivado de pUC19, o pPD16.43 (Fire et al., 1990), que origina uma origem de replicação com um elevado número de cópias e o gene de resistência à ampicilina para a propagação e selecção em células bacterianas. O plasmido foi transferido para estirpes de minCOE de S. typhimurium, E. coli e S. flexneri e a bactéria recombinante cresceu num caldo de infusão de cérebro e coração (BHI; Difco Laboratories, Detroit, Michigan EUA) até ser atingida uma DC>6oo de 0,6. Isolaram-se as minicélulas e purificaram-se a partir da cultura mista e visualizaram-se por microscopia de fluorescência (microscópio de fluorescência DMLM, Leica Microsystems). Os resultados revelaram que todas as minicélulas floresceram com um verde brilhante, enquanto as minicélulas purificadas a partir das estirpes de minCOE de S. typhimurium, E. coli r S. flexneri não recombinantes (controlos) não exibiram qualquer fluorescência verde. As 63 minicélulas armazenadas (4 °C e temperatura ambiente) foram visualizadas por microscopia de fluorescência, a intervalos de tempo de 30 minutos, 1 hora, 6 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 2 dias, 1 semana e 2 semanas. Os resultados mostraram que as minicélulas estavam intactas e continuaram a florescer com um verde brilhante ao longo de todo o estudo. O plasmido pEGFP providenciou assim um traçador (minicélulas fluorescentes com a cor verde) através do qual se seguiu a absorção das minicélulas recombinantes por células de mamífero, tais como, macrófagos e outras células, tais como, as células de cancro. Estes resultados indicam que as proteínas recombinantes, uma vez expressas ou segregadas nas minicélulas, são estáveis durante um período de tempo significativo (provavelmente até a integridade celular das minicélulas estar comprometida) devido à ausência de proteases codificadas por cromossomas.

As células da linha de células de macrófagos de murganhos RAW264.7 (Ralph & Nakoinz, 1977), obtidas da American Type Culture Collection (ATCC) , foram postas numa cultura in vitro, a uma densidade de células de 105 por poço e foram infectadas com minicélulas recombinantes purificadas, comportando o plasmido pEGFP, que tinha sido derivado de S. typhimurium, E. coli, e S. flexneri, a uma taxa entre minicélulas: macrófagos de 50:1 e 100:1.

Antes da infecção dos macrófagos, as minicélulas purificadas foram visualizadas através do microscópio de fluorescência para confirmar que a maior parte das minicélulas comportavam EGFP e, assim, exibiam um verde brilhante de fluorescência. Como controlo positivo, também se utilizou a estirpe aroA de S. typhimurium SL3261 (quadro 1) comportando o mesmo plasmido para transfectar as células de macrófagos na mesma relação entre bactéria e macrófagos. O 64 controlo negativo (macrófagos não infectados) foi também tratado da mesma maneira que as células experimentais infectadas. Centrifugaram-se as placas de cultura a 1.000 g, durante 10 minutos, a 37 °C. Para o estudo de transfecção das minicélulas, adicionaram-se os antibióticos gentamicina (100 yg/ml) e ampicilina (200 yg/mL) para matar quaisquer células residuais, bacterianas, parentais, vivas. O controlo positivo de salmonelas também foi morto com o mesmo tratamento com os antibióticos. Incubaram-se as placas, a 37 °C, durante 30 minutos, numa atmosfera de CO2 a 5 %, seguido de três lavagens em SBF. Para a experiencia das minicélulas derivadas de S. typhimurium/macrófaqos, fixaram-se as lâminas com formaldeído a 4 %, durante 40 minutos e depois permeabilizaram-se com Triton X-100 a 0,2 %. Depois de se bloquear a coloração não específica com soro normal de cabra a 5 % (SNC) em tampão de fosfato contendo ASB a 5 %, as lâminas recobertas foram incubadas com anticorpo anti-lipopolissacárido (LPS) (soro de aglutinação somática de Salmonella 4-0 de coelho; diluição a 1:200; Murex Biotech, Dartford, Inglaterra), durante quatro horas, à temperatura ambiente. Lavaram-se as células três vezes em SBF e incubaram-se com anticorpo secundário (1:1000), Alexa Fluor 594 (Molecular Probes, Eugene, OR, EUA; conjugado de IgG anti-murganho de cabra, excitação: 590 nm, emissão: 617 nm) em SBF-ASB. Incubaram-se as placas com anticorpo secundário, durante 1 hora, no escuro e depois lavaram-se, três vezes, com SBF, durante 5 minutos para cada uma. Montaram-se as coberturas das lâminas com glicerol e visualizaram-se por meio de microscopia confocal.

Os resultados mostraram que as minicélulas derivadas de S. typhimurium, E. coli e S. flexneri que estavam todas absorvidas por aproximadamente 20 % a 30 % das células de macrófagos da cultura. As minicélulas apresentaram uma 65 fluorescência verde brilhante e estavam associadas aos macrófagos. As minicélulas não recombinantes de controlo, derivadas de S. typhimurium, E. coli e S. flexneri não revelaram pontos de fluorescência verde associados com os macrófagos para além de uma fluorescência de fundo menor e não especifica. A estirpe de controlo aroA recombinante de S. typhimurium também deu um resultado semelhante ao visto com ambas as minicélulas recombinantes.

Para confirmar que os pontos de fluorescência verde estavam dentro das células de macrófagos, isto é, tratava-se de minicélulas absorvidas e não só aderentes à superfície das células, fizeram-se imagens tridimensionais (utilizando secções sagitais e coronais) para a interacção das minicélulas derivadas de S. typhimurium e macrófagos. Tanto nas secções coronais como nas sagitais, as minicélulas estavam localizadas dentro dos macrófagos indicando que as minicélulas tinham sido absorvidas pelos macrófagos. Adicionalmente, uma marcação com LPS anti-04 dos pontos fluorescentes verdes (fluorescência amarela no seguimento do anticorpo secundário Alexa Fluor 594) mostrou que os pontos de fluorescência verde, de facto, eram minicélulas que expressavam EGFP e não fluorescência de fundo de qualquer outro elemento. Observou-se um resultado semelhante com o controlo positivo de salmonelas, demonstrando que as estruturas da superfície das bactérias requerem uma absorção das células pelos macrófagos mediada por receptores, que estavam conservados na superfície das minicélulas.

Exemplo 6. Absorção das minicélulas e rompimento dos fagolisossomas de macrófagos

Para demonstrar o destino intracelular das minicélulas dentro dos macrófagos, realizaram-se estudos de TEM em 66 macrófagos de murganhos infectados com minicélulas derivadas de S. typhimurium.

Em resumo, fez-se crescer uma linha de células de macrófagos de murganho, RAW 246.7, até a uma confluência de 50 %, em frascos T25, em meio de cultura padrão. Adicionaram-se minicélulas na ordem de 107, em 100 yL, directamente ao meio, nos frascos e o processo de infecção dos macrófagos foi realizado tal como descrito no exemplo 5. Utilizou-se uma proporção aproximadamente de minicélulas:macrófagos de 10:1. Recolheram-se as células em vários momentos correspondendo a 30 minutos, 60 minutos e 2 horas após a infecção. Incluiu-se um outro frasco com controlo negativo, que não recebeu minicélulas. As células foram tripsinadas e recolheram-se as suspensões e fixaram-se em glutaraldeido a 4 % (500 yL) . Trataram-se as amostras e analisaram-se por meio de TEM (Universidade de New South Wales, Sydney, Austrália).

Os resultados mostraram que tão cedo quanto 30 minutos após a infecção, as partículas desses electrões, aproximadamente com a dimensão das minicélulas (400 nm) , eram observadas dentro dos vacúolos dos macrófagos (figura 5, painéis A-F) . Com a progredir do tempo (60 minutos e 2 horas), as partículas densas de electrões pareciam menos intactas com uma irregularidade da superfície e perda da densidade electrónica.

Para confirmar que as partículas densas de electrões intra-vacuolares eram minicélulas absorvidas, repetiu-se a experiência anterior com a diferença de que depois de vários intervalos de tempo após a infecção, as células foram fixadas (paraformaldeído a 4 %, glutaraldeido a 0,1 %) , durante 30 minutos, à temperatura ambiente, lavadas com SBF e recolhidas em 1,5 mL de SBF por meio de uma raspagem ligeira das 67 células. As amostras foram tratadas por TEM de imuno-ouro (EM Unit, ICPMR, Westmead Hospital, Sydney, Austrália). As amostram foram ligeiramente transformadas em peletes e tratadas pelo processo da substituição por congelação. Em resumo, marcaram-se as células com anticorpo primário (lipopolissacárido anti-S. typhimurium [especificidade factor 4, grupo B] ; Abbott Murex, EUA) a uma diluição de 1:200, seguido de anticorpo secundário conjugado com ouro (10 nm). Visualizaram-se as amostras utilizando um microscópio electrónico CM-120 BioTWIN da Philips a 80 kV. Capturaram-se as imagens num filme de emulsão EM do tipo 4489 da Kodak.

Os resultados mostraram gue as minicélulas estavam claramente identificadas pelo anticorpo anti-04-LPS marcadas com ouro e que as partículas densas de electrões observadas nos vacúolos dos macrófagos eram minicélulas derivadas de S. typhimurium. Não se observou nenhuma marcação de ouro nos macrófagos de controlo que não tinham sido infectados com as minicélulas. Estes dados revelam também que, em momentos mais tardios, as partículas de ouro não associadas com as minicélulas foram observadas nos vacúolos. Houve um significativo aumento das partículas de ouro isentas de minicélulas nos momentos mais tardios e isto estava também associado com um aumento do número de minicélulas que tinham perdido a integridade da parede celular e a densidade electrónica celular. Estes dados indicam que as minicélulas seguem o modelo clássico da absorção do antigénio e o processamento exibido pelos macrófagos que inclui a ingestão de partículas estranhas nos endossomas precoces seguida da fusão do endossoma-lisossoma e a quebra do antigénio em fagolisossoma ácido. As partículas de ouro isentas de minicélulas, nos estados tardios de infecção, podem indicar que o LPS se liberta das minicélulas processadas ou digeridas. 68

Estes resultados mostram que as minicélulas recombinantes não só são absorvidas pelas células dos mamíferos, tais como macrófagos, mas também que se degradam nos vacúolos intracelulares, provavelmente nos fagolisossomas.

Exemplo 7. Expressão de proteína heteróloga por macrófagos transfectados com minicélulas

Para determinar se as minicélulas recombinantes comportam um plasmido de expressão de genes de mamífero que codifica EGFP (não expresso em células ou minicélulas bacterianas) podem libertar o plasmido para os núcleos de células de mamífero e conseguir a expressão de EGFP na célula de mamífero, realizou-se a seguinte experiência.

As células da linha de células de macrófagos de murganho, RAW-264.7, foram postas em cultura in vitro e infectadas com minicélulas purificadas, recombinantes derivadas de S. typhimurium, E. coli e S. flexneri portadoras do plasmido pEGFP-Cl (quadro 2), tal como descrito no exemplo 5. Quarenta e oito horas após a transfecção, visualizaram-se as células infectadas por meio de microscopia confocal tridimensional.

Os resultados mostraram que aproximadamente 20 % dos macrófagos exibiam uma fluorescência verde, sugerindo que as minicélulas recombinantes se tinham rompido dentro dos macrófagos, presumivelmente em fagolisossomas e pelo menos algum do ADN do plasmido libertado tinha sido absorvido pelo núcleo da célula, antes da expressão da proteína fluorescente verde. Os macrófagos de controlo, isto é, os macrófagos transfectados com minicélulas não recombinantes não revelaram a fluorescência verde. A expressão de EGFP em células 69 experimentais levou pelo menos 48 horas. Este resultado foi semelhante ao observado com os macrófagos de controlo positivo transfectados com o plasmido pEGFP-Cl utilizando electroporação com um impulsionador de genes da BioRad.

Para confirmar ainda que a expressão de EGFP dentro dos macrófagos transfectados com as minicélulas não era um fundo fluorescente, repetiu-se esta experiência para as minicélulas derivadas de S. typhimurium. Neste caso, após a fixação com formaldeido, incubaram-se as lâminas cobertas com anticorpo monoclonal anti-GFP (Clontech Laboratories, Paio Alto, CA, EUA; diluição a 1:300) e incubou-se, durante a noite, a 4 °C. Lavaram-se as lâminas, três vezes, com SBF (5 minutos por lavagem) e incubaram-se com soro normal de cabra a 2 % em SBF/ASB, durante 20 minutos. Lavaram-se as lâminas, duas vezes com SBF e trataram-se com um conjugado de anticorpo secundário Alexa Fluor 594 e IgG anti-murganho, em SBF (diluição a 1:1.000). Incubou-se a mistura reaccional no escuro, durante 1 hora e lavou-se duas vezes com SBF. Os vidros das lâminas foram visualizados por microscopia confocal, utilizando filtros de visualização de fluorescência vermelhos (570 nm) e verdes (488 nm). Os resultados mostraram que os pontos de fluorescência verde (excitação a laser a 488 nm) observados dentro dos macrófagos eram idênticos aos pontos da fluorescência vermelha (excitação a laser a 570 nm) . Quando se utilizaram ambos os lasers, os sinais de fluorescência verdes e vermelhos foram co-localizados e apareceram como uma fluorescência amarela. Adicionalmente, quando se construíram imagens em 3D utilizando o programa informático de imagens 3D da Leica, verificou-se que a fluorescência estava dentro dos macrófagos. Estes resultados mostram que as manchas de fluorescência verde observadas eram devidas à expressão de macrófagos da proteina EGFP dado que 70 se identificaram as mesmas manchas por meio do anticorpo monoclonal anti-GFP (fluorescência vermelha).

Os resultados confirmam que as minicélulas recombinantes se rompem dentro de células hospedeiras de mamíferos, tais como macrófagos, libertando o ADN do plasmido e este ADN é capaz de expressar a proteína estranha dentro da célula de mamífero. Isto demonstra a viabilidade da terapia genética in vitro por meio das minicélulas recombinantes intactas.

Após as minicélulas recombinantes terem sido introduzidas num doente, pode-se monitorizar ou avaliar a presença do produto dos genes heterólogos por meio de um ensaio apropriado para o produto do gene no doente, por exemplo, nos glóbulos vermelhos do sangue periférico do doente, quando a expressão é específica das células eritróides. Tal como se descreveu antes, a escolha do ensaio é, parcialmente, uma função do produto de genes heterólogo e pode ser facilmente determinada.

Exemplo 8. Libertação de genes mediada por minicélulas e expressão de genes em células humanas de cancro da mama

Utilizaram-se minicélulas purificadas a partir da estirpe minCOE recombinante de S. typhimurium portadora do plasmido pEGFP-Cl (apenas expressão de genes eucarióticos; quadro 2) para infectar células humanas de cancro da mama (SK-BR-3). Quarenta e oito horas e 96 horas após a transfecção visualizaram-se as células por via de microscopia confocal. Como controlo negativo, utilizaram-se minicélulas não recombinantes para transfectar as células SK-BR-3 e visualizaram-se do mesmo modo que para as células experimentais. 71

As células SK-BR-3, de cancro da mama (fonte ATCC, N°. de referência HTB-30), foram postas em cultura, em lâminas, em placas de 6 poços e cresceram até a uma confluência de, aproximadamente, 50 %. Adicionaram-se as minicélulas portadoras do plasmido de expressão de GFP eucariótico, pEGFP-Cl, às células e centrifugaram-se durante 10 minutos, a 1.000 g, para permitir o contacto entre as minicélulas/as células SK-BR-3. Fez-se a cultura das células durante 48 horas, tempo ao fim do qual se adicionou G-418 (400 mg/mL) em que alguns poços não receberam G-418. Após um periodo de incubação de mais 48 horas, fixaram-se todas as lâminas com formaldeido a 40 %, durante 1 hora. Incubaram-se as lâminas com SBF-ASB (ASB a 2 % em SBF), durante 20 minutos e lavaram-se uma vez, com SBF. Incubaram-se as lâminas, durante a noite, a 4 °C, com anticorpo anti-Her-2 (Serotec, IgG monoclonal de murganho anti-humana; diluição a 1:100). Lavaram-se as células três vezes com SBF, durante 5 minutos de cada vez e incubaram-se, durante 1 hora, no escuro, com anticorpo secundário conjugado com Alexa Fluor 594 (Molecular Probe, conjugado de IgG de cabra anti-murganho, excitação: 590 nm, emissão: 617 nm; diluição a 1 : 1.000, em SBF-ASB). Lavaram-se as células, três vezes, com SBF, durante 5 minutos por cada lavagem e trataram-se as lâminas com um meio anti-desvanecimento (Molecular Probe). Visualizaram-se todas as lâminas por meio de microscopia confocal a tri-dimensional (excitação com comprimentos de onda para o filtro vermelho: 568 nm e para o filtro verde: 488 nm).

Os resultados revelaram que aproximadamente 10 % das células de cancro da mama expressavam claramente a proteína de fluorescência verde, que estava localizada no citosol (ver figura 6, painéis A-C). Isto foi claramente visível sob um fundo normal de auto-fluorescência exibido pelas células de 72 controlo. As células identificaram-se claramente com o anticorpo anti-Her-2 (fluorescência vermelha).

Este resultado demonstra que as minicélulas re-combinantes são capazes de libertar o ADN do plasmido de expressão de genes de mamíferos para células não fagocíticas, exemplificadas pelas células epiteliais do cancro da mama, de uma forma que leva à expressão heteróloga dentro das células.

Exemplo 9. Libertação de genes mediada por minicélulas e expressão de genes in vivo em ratos Balb/c

Para determinar se as minicélulas recombinantes podem libertar um gene estranho para as células do sistema imunitário, in vivo, vacinaram-se murganhos, intra-peritonealmente, com minicélulas recombinantes derivadas de minCOE de S. typhimurium portadoras do plasmido pEGFP-Cl (apenas a expressão de genes eucarióticos; quadro 2) e compararam-se com ratos vacinados com a estirpe AaroA de S. typhimurium comportando o mesmo plasmido.

Purificaram-se as minicélulas recombinantes tal como no exemplo 3. Preparou-se S. typhimurium (estirpe SL3261 AaroA, quadro 1) como se segue. Inoculou-se cinco (5) mL de caldo de soja e tripticase (TSB, Becton Dickinson, Paio Alto, CA, EUA) com um inoculo a 1:100, de uma cultura nocturna de S. typhimurium em TSB e fez-se crescer, a 37 °C, com agitação, até a densidade óptica (D.O.), medida a 600 nm, atingir 0,5. Incubaram-se então as bactérias com gentamicina (Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Austrália) , a 150 pg/mL e ampicilina (Roche), a 150 pg/mL, durante mais 2 horas, a 37 °C, com agitação. 73

As bactérias mortas e as minicélulas foram peletizadas por centrifugação, a 8.000 rpm, novamente suspensas e lavadas mais três vezes em BSG (solução salina tamponada com fosfato [STF; hidrogeno-f osf ato dissódico 1,44 g, 0,24 g de di-hidrogeno-fosfato de potássio, 0,2 g de cloreto de potássio, 8,0 g de cloreto de sódio, a pH 7,4, em 1 litro de água destilada], contendo gelatina a 2 %).

Inocularam-se, intraperitonealmente, grupos de murganhos Balb/c com 6 semanas de idade, com 100 μΐ de minicélulas recombinantes ou S. typhimurium recombinante morta, de acordo com o esquema do quadro 4. Um grupo de 8 ratos permaneceu sem vacina para servir como controlo negativo. Os ratos foram sangrados por hemorragia intraocular antes da inoculação e 14 dias após a vacinação primária. No dia 23, todos os animais foram anestesiados com uma injecção intraperitoneal de 12 mg de fenobarbitona sódica e recolheu-se 1 mL de sangue por punção cardíaca antes de os ratos serem sacrificados. Centrifugou-se o sangue a 3.000 rpm durante 10 minutos, numa microcentrifugadora (Eppendorf, Hamburg, Alemanha) e recolheu-se o soro para os ensaios de ELISA. Ao longo da experiência, pesaram-se os animais semanalmente e observaram-se diariamente quanto aos sinais de toxicidade.

Quadro 4. Alocação do tratamento para a libertação dos genes in vivo em ratos Balb/c N2 . do Grupo Ne. do Animal Tratamento Dose (injecção de 100 uL IP) Dias de dosagem Dias de hemorragia 1 1-8 Nenhum controlo - - 1, 14, 23 2 9-16 Minicélulas recombinantes 108 minicélulas por dose 1, 5 14,23 3 17-24 S. typhimurium recombinante morta 108 bactérias por dose 1, 5 14,23 4 25-32 S. typhimurium recombinante morta 108 bactérias por dose 1, 5, 8 14, 23 74

Quadro 4. Alocação do tratamento para a libertação dos genes in vivo em ratos Balb/c N2 . do Grupo N2. do Animal Tratamento Dose (injecção de 100 uL IP) Dias de dosagem Dias de hemorragia 5 33-40 S. typhimurium recombinante morta 109 bactérias por dose 1, 5 14, 23 6 41-48 S. typhimurium recombinante morta 109 bactérias por dose 00 LO \—1 14, 23

Realizaram-se ensaios por ELISA para determinar se tinha sido gerado o anticorpo contra GFP, isto é, se as minicélulas recombinantes eram capazes de libertar, in vivo, o plasmido pEGFP-Cl de expressão de mamifero. Também se determinaram, para todos os grupos, os níveis de anticorpos de lipopolissacáridos (LPS) de S. typhimurium. 0 processo por ELISA indirecto foi realizado como se segue.

Revestiram-se placas microtituladoras com noventa e seis (96) poços (Greiner GMBH, NYrtingen, Alemanha) com 50 yL por poço de 0,5 yg/mL de rEGFP (Clontech, Paio Alto, CA, EUA) ou antigénio de LPS (Sigma). Revestiram-se as placas com ASB a 1 % (Sigma) como controlo negativo. Selaram-se as placas e incubaram-se, durante a noite, a 4 °C. Inverteram-se as placas para eliminar a solução de antigénio e adicionou-se, a cada poço, 200 yl de tampão de bloqueio (Tween-20 a 0,05 % [Sigma] , ASB a 1 % em SBF) antes da incubação que durou 2 horas, à temperatura ambiente. Retirou-se o tampão de bloqueio e lavaram-se as placas, duas vezes, durante 5 minutos com tampão de lavagem (Tween-20 a 0,05 %, SBF).

Diluíram-se as amostras de soro a 1 em 80 e 1 em 300 para EGFP e LPS, respectivamente, no tampão de bloqueio. Em seguida, adicionou-se, a cada poço, 100 yL da amostra e incubou-se, durante 1 hora, à temperatura ambiente, com agitação. Lavaram-se então as placas com tampão de lavagem, três vezes, durante 5 minutos. Diluíram-se os anticorpos 75 secundários, nomeadamente imunoglobulina anti-rato conjugada com fosfatase alcalina (cadeias pesadas e leves; Chemicon, Temicula, CA, EUA) ou anticorpo monoclonal anti-LPS conjugado com AP (isótipo de IgGl, Biodesign International, Saco, Maine, EUA) em tampão de bloqueio e adicionou-se, a cada poço, 100 yL, seguido de 1 hora de incubação, à temperatura ambiente, com agitação. Lavaram-se os poços, três vezes, com tampão de lavagem e adicionou-se 100 μΐ de PNPP (substrato de fosfato de p-nitrofenilo; Zymed, San Francisco, CA, EUA) . Leu-se a densidade óptica a 405 nm após um periodo de incubação de 30 minutos, à temperatura ambiente. A reacção terminou pela adição de 30 μΐ de NaOH 0,5 Μ. A significância dos dados da análise por ELISA foi determinada pelo teste t de Student (p).

Os resultados estão ilustrados na figura 7. Catorze (14) dias após a vacinação, observou-se uma resposta do anticorpo forte e significativa (p < 0,02 quando comparado com os controlos) à EGFP, em ratos a que se tinha administrado, intraperitonealmente, 108 minicélulas recombinantes e observou-se que a resposta ao anticorpo era maior do que a obtida com a dose mais elevada de S. typhimurium morta. Os anticorpos das proteinas EGFP só foram observados se as minicélulas recombinantes forem portadoras do vector de expressão de mamiferos pEGFP-Cl não estavam absorvidas pelos macrófagos peritoneais mas também estavam degradadas nos vacúolos intracelulares (presumivelmente, fagolisossomas) e que, pelo menos, algumas cópias do ADN do plasmido tinham escapado dos fagolisossomas e entrado nos núcleos das células dos mamiferos. A partir dos núcleos, seria produzido o ARNm de EGFP e EGFP foi expressa no citoplasma. A EGFP seria uma proteina estranha num macrófago e, por isso, seria de esperar que fosse transformada e que os péptidos tivessem presentes por via de MHC. Este processo iria resultar numa resposta do 76 anticorpo aos péptidos de EGFP. Comparado com o controlo de S. typhimurium morta, a resposta do anticorpo anti-EGFP foi maior com as minicélulas recombinantes. A resposta anti-LPS também foi medida para determinar a reposta imunitária ao vector de libertação da terapêutica genética, as minicélulas recombinantes. Os resultados mostraram que a resposta do anticorpo anti-LPS foi significativa e similar à das minicélulas recombinantes (p = 0,0004) e S. typhimurium morta (p = 0,001). Ver figura 8. Este resultado indicou que as minicélulas tinham retido, pelo menos, a estrutura de LPS encontrada na superfície das células bacterianas parentais. Ao dia 23, a resposta do anticorpo anti-EGFP não foi diferente da dos controlos não imunizados (tanto para as minicélulas recombinantes como para S. typhimurium morta). Isto não foi surpreendente porque não tinha sido administrada nenhuma imunização de reforço para suster a resposta do anticorpo. A resposta anti-LPS, no 23° dia, foi similar à observada no 14° dia. Isto também não é inesperado porque sabe-se que o LPS é um agente imunogénico potente que induz titulos de anticorpo elevados e sustentados.

Exemplo 10. Libertação de genes mediada por minicélulas e expressão de genes, in vivo, em ratos Balb/c com diferentes regimes de dosagem

Prepararam-se minicélulas recombinantes como no exemplo 3. Inocularam-se grupos de oito ratos Balb/c, com 6 semanas de idade, intraperitonealmente, com 100 pL de minicélulas recombinantes (contendo o plasmido pEGFP-Cl; quadro 2) de acordo com o esquema ilustrado no quadro 5. Um grupo de oito ratos permaneceu sem ser vacinados, como controlos negativos. Sangraram-se os ratos por hemorragia intraocular antes da 77 inoculação e 14 dias após a vacinação primária e recolheu-se o soro como no exemplo 9.

Quadro 5. Alocação do tratamento para a libertação dos genes in vivo com diferentes regimes de dosagem de minicélulas recombinantes em ratos Balb/c Ne . do Grupo N2. do Animal Tratamento Dose (injecção de 100 uL IP) Dias de dosagem Dias de hemorragia 1 1-8 Nenhum controlo - - 1,14 2 9-16 Minicélulas recombinantes 108 minicélulas por dose 1, 4 14 3 17-24 Minicélulas recombinantes 108 minicélulas por dose co ^r1 \—1 14 4 25-32 Minicélulas recombinantes 109 minicélulas por dose 1, 4 14 5 33-40 Minicélulas recombinantes 109 minicélulas por dose CO \—1 14

Realizaram-se ensaios por ELISA, como descrito previamente, para determinar se o anticorpo tinha sido gerado contra GFP e se doses mais elevadas de minicélulas recombinantes, ou três em vez de duas doses, permitiam que o animal construísse uma resposta mais alargada ao anticorpo. Também se determinaram os níveis de anticorpo de lipopolissacárido (LPS) de S. typhimurium para todos os grupos.

Os resultados estão ilustrados na figura 9. Catorze (14) dias após a vacinação, observou-se uma resposta do anticorpo muito significativa a EGFP (p <0,001 quando comparada com os controlos), em ratos a que se tinha administrado, intraperitonealmente, 108 minicélulas recombinantes. Os ratos, inoculados com 109 minicélulas, exibiraram uma resposta do anticorpo ainda maior a EGFP (p = 0,0006 comparada com os controlos) e esta dose deu níveis de 78 anticorpos significativamente mais elevados do que a dose menor de 108 (p = 0,004). Não houve diferença significativa na resposta do anticorpo à proteína EGFP quando se deram aos ratos duas doses ou três doses de minicélulas recombinantes, sugerindo que duas doses podem ser suficientes para conseguir a terapia de genes neste exemplo.

Também se mediu a resposta anti-LPS, para se determinar a resposta imunitária às minicélulas recombinantes. Os resultados mostraram que a resposta do anticorpo anti-LPS era significativa (p = 0,0004). Ver figura 10.

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Lisboa, 13 de Abril de 2012. 90

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Composição caracterizada pelo facto de compreender (i) minicélulas bacterianas, intactas, recombinantes e (ii) um seu veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, em que as referidas minicélulas bacterianas intactas contêm um plasmido que compreende uma sequência de ADN, que codifica um péptido terapêutico ou um produto de expressão de um polipéptido e em que a referida composição está isenta de contaminantes com uma dimensão de 0,2 ym ou inferior.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de a referida composição conter menos do que cerca de 1 célula bacteriana, parental, contaminante por 101 2 3 minicélulas.
3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de a referida composição conter menos do que cerca de 1 célula bacteriana, parental, contaminante por 104 minicélulas.
4. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de a referida composição conter cerca de 1 célula bacteriana, parental, contaminante por 105 minicélulas. 1 1 Composição, caracterizada pelo facto de consistir 2 essencialmente em minicélulas bacterianas intactas 3 recombinantes, que contêm um plasmido que compreendendo 4 uma sequência de ADN, que codifica um péptido terapêutico ou um produto de expressão de um polipéptido 5 e em que a referida composição está isenta de contaminantes com uma dimensão de 0,2 ym ou inferior. 6. Processo de transformação genética, caracterizado pelo facto de compreender (i) providenciar minicélulas bacterianas, intactas, recombinantes que contêm um plasmido que compreende uma sequência de ADN, que codifica um péptido terapêutico ou um produto de expressão de polipéptido, em que as referidas minicélulas bacterianas estão isentas de contaminantes com uma dimensão de 0,2 ym ou inferior e (ii) por a referida preparação de minicélulas bacterianas intactas em contacto, in vitro, com células de mamifero não fagociticas concorrentes com endocitose, de tal modo que as referidas minicélulas bacterianas sejam absorvidas pelas referidas células de mamifero, em que as referidas células de mamifero produzem o referido produto de expressão.
7. Processo de purificação, caracterizado pelo facto de compreender a passagem de uma amostra contendo minicélulas bacterianas intactas (i) sobre uma série de filtros de fluxo cruzado e, depois (ii) através de um filtro fechado, em que as referidas minicélulas bacterianas intactas são separadas dos contaminantes, na referida amostra, para se obter uma preparação de minicélulas purificadas.
8. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de compreender ainda a etapa de tratamento da referida preparação de minicélulas purificadas com um antibiótico.
9. Processo, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo facto de compreender ainda uma etapa preliminar de realização de uma centrifugação diferencial na referida amostra contendo as minicélulas bacterianas. 2
10. Processo, de acordo com uma qualquer das reivindicações 7-9, caracterizado pelo facto de as referidas séries de filtros de fluxo cruzado compreenderem pelo menos um filtro que utiliza uma dimensão de poros superior ou igual a cerca de 0,45 ym e pelo menos um filtro que utiliza uma dimensão de poro inferior ou igual a cerca de 0,2 ym.
11. Processo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto do referido filtro fechado utilizar uma dimensão de poros de 0,45 ym.
12. Processo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de as referidas séries de filtros de fluxo cruzado compreenderem pelo menos dois filtros que utilizam uma dimensão de poros de cerca de 0,45 ym e pelo menos um filtro que utiliza uma dimensão de poros de cerca de 0,2 ym.
13. Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto de compreender ainda a etapa de tratamento da referida preparação de minicélulas purificadas com um antibiótico.
14. Utilização de minicélulas bacterianas intactas, recombinantes, na preparação de um medicamento, caracterizado pelo facto de compreender as minicélulas bacterianas intactas contendo um plasmido que contém uma sequência de ADN que codifica um péptido terapêutico ou um produto de expressão de polipéptido, em que o referido medicamento está isento de contaminantes com uma dimensão de 0,2 ym ou inferior, para ser utilizado num processo de (i) tratamento de uma doença, alergia ou infecção ou (ii) modificação de um traço, por administração do referido medicamento a uma célula, tecido ou órgão, em que a referida doença se selecciona 3 entre (1) cancro; (2) uma doença adquirida seleccionada entre SIDA, pneumonia e enfisema; e (3) um estado clinico provocado por um erro genético de metabolismo, sendo a alergia ou a infecção tratada por modificação de uma resposta imunitária e o referido traço ser a fertilidade.
15. Minicélulas bacterianas intactas, recombinantes, contendo o plasmido, caracterizado pelo facto de compreender uma sequência de ADN que codifica um péptido terapêutico ou um produto de expressão de polipéptido, em que as referidas células bacterianas estão isentas de contaminantes com uma dimensão de 0,2 μιη ou inferior, para serem utilizadas como um produto farmacêutico.
16. Composição, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo facto de ser utilizada como um produto farmacêutico.
17. Composição, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo facto de ser utilizada num processo de (i) tratamento de uma doença, alergia ou infecção ou (ii) modificação de um traço, por administração do referido medicamento a uma célula, tecido ou órgão, em que a referida doença se selecciona entre (1) cancro; (2) uma doença adquirida seleccionada entre SIDA, pneumonia e enfisema; e (3) um estado clinico provocado por um erro genético de metabolismo, sendo a alergia ou a infecção tratadas por modificação de uma resposta imunitária e o referido traço ser a fertilidade. Lisboa, 13 de Abril de 2012. 4