ES2541351T3 - Composiciones de minicélulas y procedimientos - Google Patents

Abstract

Una minicélula eubacteriana completamente intacta derivada de una célula progenitora eubacteriana, en la que la minicélula comprende un compuesto biológicamente activo y muestra un anticuerpo o un derivado de anticuerpo, en la que el compuesto biológicamente activo y el anticuerpo o derivado de anticuerpo son exógenos para la célula progenitora y diferentes el uno del otro.

Description

Composiciones de minicélulas y procedimientos

La invención se refiere a composiciones y procedimientos para la producción de células arqueabacterianas, eubacterianas acromosómicas y eucariotas anucleadas que se usan como, por ejemplo, agentes terapéuticos y/o diagnósticos, reactivos en el descubrimiento de fármacos y proteómica funcional, herramientas de investigación, así como en otras aplicaciones.

La siguiente descripción de los antecedentes de la invención se proporciona para ayudar en la comprensión de la invención pero no se admite que describa o constituya técnica anterior a la invención. Los contenidos de los artículos, patentes, y solicitudes de patente, y todos los demás documentos e información disponible electrónicamente mencionada o citada en esta solicitud, se incorporan al presente documento por referencia en su totalidad en la misma medida que si se indicase específica e individualmente que cada publicación se incorpora por referencia. Los solicitantes se reservan el derecho a incorporar físicamente a esta solicitud cualquiera y todos los materiales e información de cualquiera de dichos artículos, patentes, solicitudes de patente, u otros documentos.

Las minicélulas son células acromosómicas que son productos de división celular aberrante, y contienen ARN y proteínas, pero muy poco o ningún ADN cromosómico. Clark-Curtiss y Curtiss III, Analysis of Recombinant DNA Using Escherichia coli Minicells, 101 Methods in Enzymology 347 (1983); Reeve y Mendelson, Minicells of Bacillus subtilis. A new system for transport studies in absence of macromolecular biosynthesis, 352 Biochim. Biophys. Acta 298-305 (1974). Las minicélulas son capaces de la síntesis dirigida por plásmidos de polipéptidos discretos en ausencia de síntesis dirigida por ARNm a partir del cromosoma bacteriano. Meagher y col., Protein Expression in E. coli Minicells by Recombinant Plasmid, 10 Cell 521,523 (1977); Roozen y col., Synthesis of Ribonucleic Acid and Protein in Plasmid-Containing Minicells of Escherichia coli K-12, 107(1) J. of Bacteriology 21 (1971); y Curtiss III, Research on bacterial conjugation with minicells and minicell-producing E. coli strains, En: Microbial Drug Resistance, Editores Susumu Mitsuhashi y Hajime Hashimoto, p. 169 (Baltimore: University Park Press 1976). Las descripciones tempranas de minicélulas incluyen aquellas de Adler y col., Genetic control of cell division in bacteria, 154 Science 417 (1966), y Adler y col. (Miniature Escherichia coli cells deficient in DNA, 57 Proc. Nat. Acad. Sci (Wash.) 321 (1967)). Sin embargo, el descubrimiento de la producción de minicélulas puede seguirse discutiblemente hasta la década de 1930 (Frazer y Curtiss III, Production, Properties and Utility of Bacterial Minicells, 69 Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1-3 (1975)).

Se han usado minicélulas procariotas (también conocidas como eubacterianas) para producir varias proteínas eubacterianas. Véanse, por ejemplo, Michael Gaael, y col., The kdpF Subunit Is Part of the K+-translocating Kdp Complex of Escherichia coli and Is Responsible for Stabilization of the Complex in vitro, 274(53) Jn. of Biological Chemistry 37901 (1999); Harlow, y col., Cloning and Characterization of the gsk Gene Encoding Guanosine Kinase of Escherichia coli, 177(8) J. of Bacteriology 2236 (1995); Carol L. Pickett, y col., Cloning, Sequencing, and Expression of the Escherichia coli Cytolethal Distinding Toxin Genes, 62(3) Infection & Immunity 1046 (1994); Raimund Eck y Jorn Belter, Cloning and characterization of a gene coding for the catechol 1,2 dioxygenase of Arthrobacter sp. mA3, 123 Gene 87 (1993); Andreas Schlossser, y col., Subcloning, Nucleotide Sequence, and Expression of trkG, a Gene That Encodes an Integral Membrane Protein Involved in Potassium Uptake via the Trk System of Escherichia coli, 173(10) J. of Bacteriology 3170 (1991); Mehrdad Jannatipour, y col., Translocation of Vibrio harveyi N, N’-Diacetylchitobiase to the Outer Membrane of Escherichia coli 169(8) J. of Bacteriology 3785 (1987); y Jacobs y col., Expression of Mycobacterium leprae genes from a Streptococcus mutans promoter in Escherichia coli K-12, 83(6) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1926 (1986);

Se han usado varias bacterias, o se ha propuesto su uso, como vectores de administración de genes a células de mamífero. Para revisiones, véase Grillot-Courvalin y col., Bacteria as gene delivery vectors for mammalian cells, 10 Current Opinion in Biotechnology 477 (1999); Johnsen y col., Transfer of DNA from Genetically Modified Organisms (GMOs), Biotechnological Institute, 1-70 (2000); Sizemore y col., Attenuated Shigella as a DNA delivery vehicle for DNA-mediated immunization, 270(5234) Science 299 (1995); Patrice Courvalin, y col., Gene transfer from bacteria to mammalian cells, 318 C. R. Acad. Sci.1207 (1995); Sizemore, y col., Attenuated bacteria as a DNA delivery vehicle for DNA-mediated immunization, 15(8) Vaccine 804 (1997).

La patente de Estados Unidos Nº 4.190.495 que se publicó el 26 de febrero de 1980, de Curtiss se refiere a cepas productoras de minicélulas de E. coli que se afirma que son útiles para la expresión recombinante de proteínas.

La patente de Estados Unidos Nº 4.311.797 que se publicó el 19 de enero de 1982 de Khachatourians afirma que se refiere a una vacuna basada en minicélulas. Se afirma que la vacuna induce la producción de anticuerpos contra células de E. coli enteropatogénica en ganado y se afirma que es eficaz contra la enteritis coliforme.

Se han descrito minicélulas eubacterianas que expresan inmunógenos de otros procariotas. Purcell y col., Molecular cloning and characterization of the 15-kilodalton major immunogen of Treponema pallidum, Infect. Immun. 57:3708, 1989.

En "Biotechnology: Promise... and Peril" (IDRC Reports 9:4-7,1980) los autores, Fleury y Shirkie afirman que George Khachatourians de la Unveristy of Saskatchewan, Canadá "está trabajando en una vacuna contra el cólera usando

minicélulas". Se dice que las minicélulas contienen "genes del agente patógeno", y los "antígenos patógenos son transportados sobre la superficie de las minicélulas" (p. 5, párrafo que hace de puente entre las columnas central y derecha).

Lundstrom y col., Secretion of Semliki Forest virus membrane glycoprotein E1 from Bacillus subtilis, Virus Res. 2:6983, 1985, describen la expresión de la proteína E1 del virus de eucariotas, virus Semliki Forest (VSF), en minicélulas de Bacillus. La proteína E1 de VSF usada en estos estudios no es la proteína E1 nativa. Más bien, es una proteína de fusión en la que la secuencia de señal N-terminal y el dominio transmembrana C-terminal se han eliminado y reemplazado con secuencias de señal de un gen de Bacillus amyloliquefaciens. Los autores afirman que "E1 se transloca a través de la membrana celular y se secreta adecuadamente" (p. 81, I.I. 19-20), e indican que "ha sido difícil expresar proteínas de membrana virales en procariotas" (p. 81, I. 27).

La patente de Estados Unidos Nº 4.237.224 que se publicó el 2 de diciembre de 1980, de Cohen y Boyer, describe la expresión de ADN de X. laevis en minicélulas de E. coli.

La solicitud de Patente de los Estados Unidos con Nº de Serie 60/293.566 (Nº de expedientes del agente 0788530401 y 089608-0201), que tiene por título "Minicell Compositions and Methods", y que se registró el 24 de mayo de 2001, por Sabbadini, Roger A., Berkley, Neil L., y Klepper, Robert E., y se incorpora al presente documento por referencia en su totalidad.

Jespersen y col. describen el uso de "proteoliposomas" para generar anticuerpos para el receptor de AMPA. Jespersen LK, Kuusinen A, Orellana A, Keinanen K, Engberg J. Use of proteoliposomes to generate phage antibodies against native AMPA receptor. Eur J Biochem. Mar. de 2000; 267(5):1382-9

La invención se refiere a composiciones y procedimientos para la producción y uso de minicélulas, incluyendo, pero sin limitación, minicélulas eubacterianas, en aplicaciones tales como agentes diagnósticos, terapéuticos, de investigación, selección de compuestos y descubrimiento de fármacos, así como agentes para la administración de ácidos nucleicos y otros compuestos bioactivos a células.

Las minicélulas son derivados de células que carecen de ADN cromosómico y que en ocasiones se citan como células anucleadas. Debido a que las células eubacterianas y arqueobacterianas, a diferencia de las células eucariotas, no tienen un núcleo (un orgánulo diferenciado que contiene los cromosomas), estas minicélulas no eucariotas se describen con más precisión como "sin cromosomas" o "acromosómicas", en oposición a "anucleadas". Sin embargo, los expertos en la materia a menudo usan el término "anucleada" cuando se refieren a minicélulas bacterianas además de a otras minicélulas. Por consiguiente, en la presente divulgación, el término "minicélulas" abarca derivados de células eubacterianas que carecen de un cromosoma; derivados de células arqueobacterianas que carecen de su cromosoma (o sus cromosomas), y derivados anucleados de células eucariotas. Se entiende, sin embargo, que parte de la técnica relevante puede usar los términos "minicélulas anucleadas" o "células anucleadas" de manera laxa para referirse a cualquiera de los tipos precedentes de minicélulas.

En un aspecto, la invención se refiere a una minicélula eubacteriana que comprende una proteína de membrana que no se encuentra de manera natural en un procariota, es decir, una proteína de membrana de un eucariota o una arqueobacteria. Dichas minicélulas pueden, pero no necesariamente, comprender un elemento de expresión que codifica y expresa la proteína de membrana que comprende. La proteína de membrana puede ser una encontrada en cualquier membrana no eubacteriana, incluyendo, a modo de ejemplo no limitante, una membrana celular, una membrana nuclear, una membrana nucleolar, una membrana del retículo endoplasmático (RE), una membrana del aparato de Golgi, una membrana de un lisosoma, una membrana de un peroxisoma, una membrana caveolar, una membrana externa de una mitocondria o de un cloroplasto, y una membrana interna de una mitocondria o de un cloroplasto. A modo de ejemplo no limitante, una proteína de membrana puede ser un receptor, tal como un receptor acoplado a proteína G; una enzima, tal como una ATPasa o una adenilato ciclasa, un citocromo; un canal; un transportador; o un factor de unión a ácido nucleico unido a membrana, tal como un factor de transcripción y/o traducción; componentes de señalización; componentes de la cadena de transporte electrónico (CTE); o antígenos celulares. Una proteína de fusión de membrana, que se genera in vitro usando técnicas de clonación molecular, no sucede en la naturaleza y es por lo tanto una proteína de membrana que no se encuentra de forma natural en un procariota, incluso si la proteína de fusión se prepara usando secuencias aminoacídicas derivadas de proteínas eubacterianas.

Las minicélulas que se han segregado de células progenitoras carecen de componentes cromosómicos y/o nucleares, pero mantienen el citoplasma y sus componentes, incluyendo la maquinaria celular necesaria para la expresión de proteínas. Aunque los cromosomas no se segregan al interior de las minicélulas, los elementos de expresión genética extracromosómicos y/o episómicos se segregarán, o pueden introducirse en minicélulas después de la segregación a partir de células progenitoras. Por lo tanto, en un aspecto, la invención se refiere a minicélulas que comprenden un elemento de expresión, que puede ser un elemento de expresión inducible, que comprende secuencias de expresión unidas operativamente a un marco de lectura abierto (ORF) que codifica la proteína de membrana no eubacteriana. En un aspecto relacionado, la invención se refiere a células hospedadoras productoras de minicélulas que tienen un elemento de expresión, que puede ser un elemento de expresión inducible, que

comprende secuencias de expresión unidas operativamente a un ORF que codifica una proteína de membrana no eubacteriana. En un aspecto relacionado, la invención se refiere a un procedimiento para preparar una minicélula eubacteriana que comprende una proteína de membrana que no se encuentra de manera natural en un procariota, comprendiendo el procedimiento crecer células hospedadoras productoras de minicélulas, teniendo las células hospedadoras un elemento de expresión, que puede ser un elemento de expresión inducible, que comprende secuencias de expresión unidas operativamente a un ORF que codifica una proteína de membrana no eubacteriana; y preparar minicélulas a partir de las células hospedadoras. Opcionalmente, en cualquier punto del procedimiento, se proporciona un agente inductor para inducir la expresión de un ORF que codifica una proteína de membrana no eubacteriana.

En un aspecto, la invención se refiere a mostrar proteína (o proteínas) asociada a membrana producida sobre la superficie de la minicélula. Para los fines del presente documento, el término "mostrar" se define como la exposición de la estructura de interés en la superficie externa de la minicélula. A modo de ejemplo no limitante, esta estructura puede ser una proteína de membrana o construcción quimérica expresada de manera interna para insertarse o asociarse con la membrana de la minicélula, de tal forma que el dominio extracelular o el dominio de interés está expuesto en la superficie externa de la minicélula (expresada y mostrada sobre la superficie de la minicélula o expresada en la célula progenitora para que se muestre en la superficie de la minicélula segregada). En cualquier escenario, la proteína "mostrada" o el dominio de proteína están disponibles para la interacción con componentes extracelulares. Una proteína asociada a membrana puede tener más de un dominio extracelular, y una minicélula de la invención puede mostrar más de una proteína asociada a membrana.

La proteína de membrana mostrada por las minicélulas puede ser una proteína de fusión, es decir, una proteína que comprende un primer polipéptido que tiene una primera secuencia de aminoácidos y un segundo polipéptido que tiene una segunda secuencia de aminoácidos, en la que la primera y la segunda secuencia no están presentes de manera natural en el mismo polipéptido. Al menos un polipéptido en una proteína de fusión de membrana es un "dominio transmembrana" o un "dominio de anclaje a membrana". Los dominios transmembrana y de anclaje a membrana de una proteína de fusión de membrana puede seleccionarse a partir de proteínas de membrana que suceden de manera natural en eucariotas, tales como un hongo, un eucariota unicelular, una planta y un animal, tal como un mamífero, incluyendo un ser humano. Dichos dominios pueden ser de una proteína de membrana viral encontrada de manera natural en un virus, tal como un bacteriófago o un virus de eucariotas, por ejemplo, un adenovirus o un retrovirus. Dichos dominios pueden ser de una proteína de membrana encontrada de manera natural en una arqueobacteria, tal como una termófila.

El dominio mostrado de una proteína de fusión de membrana puede ser un resto de unión. A modo de ejemplo no limitante, los restos de unión usados para fines particulares pueden ser un resto de unión dirigido a un compuesto o resto mostrado por un tipo celular específico o células encontradas predominantemente en un tipo de tejido, que puede usarse para dirigirse a minicélulas y sus contenidos para tipos celulares o tejidos específicos; o un resto de unión que se dirige a un compuesto o resto mostrado por un patógeno, que puede usarse en procedimientos diagnósticos o terapéuticos; un resto de unión que se dirige a un compuesto no deseado, tal como una toxina, que puede usarse para unirse y preferentemente internalizar y/o neutralizar el compuesto no deseado; una célula enferma; o el resto de unión puede ser un dominio que permite que las minicélulas se unan covalentemente o no covalentemente a un material de soporte, que puede usarse en composiciones y procedimientos para selección de compuestos y descubrimiento de fármacos. Por "célula enferma" se entiende células infectadas por patógenos, células que funcionan mal, y células disfuncionales, por ejemplo, células cancerosas.

En varios aspectos, las minicélulas de la invención comprenden uno o más compuestos biológicamente activos. La expresión "biológicamente activo" (sinónima con "bioactivo") indica que una composición o compuesto en sí tiene un efecto biológico, o que modifica, causa, promueve, potencia, bloquea, reduce o limita la producción o actividad de, o reacciona con o se une a una molécula endógena que tiene un efecto biológico. Un "efecto biológico" puede, pero sin limitación, ser uno que estimula o causa una respuesta inmunorreactiva; uno que tiene impacto en un proceso biológico en un animal; uno que tiene impacto en un proceso biológico en un patógeno o parásito; uno que genera o hace que se genere una señal detectable; y similares. Las composiciones, complejos o compuestos biológicamente activos pueden usarse en procedimientos y composiciones terapéuticas, profilácticas y diagnósticos. Las composiciones, complejos o compuestos biológicamente activos actúan para causar o estimular un efecto deseado en un animal. Los ejemplos no limitantes de efectos deseados incluyen, por ejemplo, prevenir, tratar o curar una enfermedad o afección en un animal que la padece; limitar el crecimiento o eliminar un patógeno en un animal infectado por este; aumentar el fenotipo o genotipo de un animal; estimular una respuesta inmunorreactiva profiláctica en un animal; o diagnosticar una enfermedad o trastorno en un animal.

En el contexto de las aplicaciones terapéuticas de la invención, la expresión "biológicamente activo" indica que la composición, complejo o compuesto tiene una actividad que tiene impacto en un animal que padece una enfermedad

o trastorno en un sentido positivo y/o tiene impacto en un patógeno o parásito en un sentido negativo. Por lo tanto, una composición, complejo o compuesto biológicamente activo puede causar o promover una actividad biológica o bioquímica en un animal que es perjudicial para el crecimiento y/o el mantenimiento de un patógeno o parásito; o de células, tejidos u órganos de un animal que tienen crecimiento o características bioquímicas anormales, tales como células cancerosas.

En el contexto de las aplicaciones diagnósticas de la invención, la expresión "biológicamente activo" indica que la composición, complejo o compuesto puede usarse para procedimientos diagnósticos in vivo o ex vivo y en composiciones y kits diagnósticos. Para fines diagnósticos, una composición o compuesto biológicamente activo preferido es uno que puede detectarse, típicamente (pero no necesariamente) por virtud de que comprende un polipéptido detectable. También pueden usarse anticuerpos para un epítopo encontrado en una composición o compuesto para su detección.

En el contexto de las aplicaciones profilácticas de la invención, la expresión "biológicamente activo" indica que la composición o compuesto induce o estimula una respuesta inmunorreactiva. En algunas realizaciones preferidas, se diseña la respuesta inmunorreactiva para que sea profiláctica, es decir, que previene la infección por un patógeno. En otras realizaciones preferidas, la respuesta inmunorreactiva se diseña para hacer que el sistema inmunitario de un animal reaccione en perjuicio de las células de un animal, tales como células cancerosas, que tienen crecimiento

o características bioquímicas anormales. En esta aplicación de la invención, se formulan composiciones, complejos

o compuestos que comprenden antígenos como una vacuna.

Los expertos en la materia entenderán que una composición, complejo o compuesto dado puede ser biológicamente activo en aplicaciones terapéuticas, diagnósticas y profilácticas. Una composición, complejo o compuesto que se describe como "biológicamente activo en una célula" es uno que tiene actividad biológica in vitro (es decir, en un cultivo celular) o in vivo (es decir, en las células de un animal). Un "componente biológicamente activo" de una composición o compuesto es una porción del mismo que es biológicamente activo una vez que se ha liberado de la composición o compuesto. Cabe destacar, sin embargo, que dicho componente también puede ser biológicamente activo en el contexto de la composición o compuesto.

En un aspecto, las minicélulas de la invención comprenden un agente terapéutico. Dichas minicélulas pueden usarse para administrar agentes terapéuticos. En una realización preferida, una minicélula que comprende un agente terapéutico muestra un resto de unión que se une específicamente a un ligando presente en la superficie de una célula, de tal forma que las minicélulas pueden "dirigirse" a la célula. El agente terapéutico puede ser cualquier tipo de compuesto o resto, incluyendo, sin limitación, moléculas pequeñas, polipéptidos, anticuerpos y derivados de anticuerpos y ácidos nucleicos. El agente terapéutico puede ser un fármaco; un profármaco, es decir, un compuesto se hace biológicamente activo in vivo después de introducirse en un sujeto que necesita tratamiento; o un inmunógeno.

En un aspecto, las minicélulas de la invención comprenden un compuesto o resto detectable. Tal como entienden los expertos en la materia, un compuesto o resto que es "detectable" produce una señal que puede detectarse medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, electromagnéticos, radioquímicos, o químicos, tales como fluorescencia, quimiofluorescencia, o quimioluminiscencia, electroquimioluminiscencia, o cualquier otro medio adecuado. Un compuesto detectable puede ser un polipéptido detectable, y dichos polipéptidos pueden, pero no necesariamente, incorporarse en proteínas de membrana de fusión de la minicélula. Los polipéptidos o secuencias de aminoácidos detectables incluyen, a modo de ejemplo no limitante, una proteína fluorescente verde (GFP), una luciferasa, una beta-galactosidasa, un marcador His, un epítopo, o una proteína de unión a biotina, tal como estreptavidina o avidina. El compuesto o resto detectable puede ser un compuesto radiomarcado o un radioisótopo. Un compuesto o resto detectable puede ser una molécula pequeña, tal como, a modo de ejemplo no limitante, un tinte fluorescente; un isótopo radiactivo; o un compuesto que puede detectarse mediante rayos X o radiación electromagnética. Pueden usarse potenciadores de la imagen como aquellos usados para barridos CAT y PET (por ejemplo, calcio, gadolinio). En otro ejemplo no limitante, los marcadores detectables también pueden incluir pérdida de sustrato catalítico o ganancia de producto catalítico después de la catálisis por una enzima mostrada por minicélulas, citoplasmática disuelta o secretada.

En un aspecto, la invención se refiere a una minicélula que comprende uno o más ácidos nucleicos bioactivos o moldes de los mismos. A modo de ejemplo no limitante, un ácido nucleico bioactivo puede ser un oligonucleótido antisentido, un aptámero, un transcrito antisentido, un ARN ribosomial (ARNr), un ARN transferente (ARNt), un señuelo molecular, o un ácido nucleico enzimáticamente activo, tal como una ribozima. Dichas minicélulas pueden, pero no necesariamente, comprender un polipéptido o proteína mostrada sobre la superficie de la minicélula. El polipéptido o proteína mostrada puede ser un resto de unión dirigido a un compuesto o resto mostrado por un tipo de célula particular, o a un compuesto o resto mostrado por un patógeno. Dichas minicélulas pueden además, pero no necesariamente, comprender un elemento de expresión que tenga secuencias de expresión eubacterianas, arqueales, eucariotas o virales unidas operativamente a una secuencia de nucleótido que sirve como molde para un ácido nucleico bioactivo.

En un aspecto, la invención se refiere a minicélulas inmunogénicas, es decir, minicélulas que muestran un inmunógeno, vacunas que comprenden minicélulas inmunogénicas, anticuerpos y derivados de anticuerpos dirigidos a inmunógenos mostrados en minicélulas inmunogénicas, y a un procedimiento para preparar y usar minicélulas inmunogénicas y anticuerpos y derivados de anticuerpo producidos a partir de estas en aplicaciones profilácticas, diagnósticas, terapéuticas y de investigación. Un inmunógeno preferido mostrado por una minicélula es un polipéptido inmunogénico, que se expresa preferentemente a partir de un elemento de expresión contenido en la minicélula para maximizar la cantidad de inmunógeno mostrado por las minicélulas inmunogénicas. El polipéptido inmunogénico puede derivarse de cualquier organismo, parásito intracelular obligado, orgánulo o virus con la

condición de que, en aplicaciones profilácticas, el polipéptido inmunogénico no se derive de un procariota, incluyendo un virus de eubacterias. El organismo fuente para el inmunógeno puede ser un patógeno. Una minicélula que muestra un inmunógeno derivado de un patógeno se formula en una vacuna y, en una aplicación profiláctica, se usa para tratar o prevenir enfermedades y trastornos causados por o relacionados con el patógeno eucariota o arqueobacteriano.

En un aspecto diferente, la invención se refiere a minicélulas que muestran un inmunógeno derivado de una célula no funcional, disfuncional y/o enferma. A modo de ejemplo no limitante, las minicélulas muestran un polipéptido inmunogénico derivado de una célula hiperproliferativa, es decir, una célula que es tumorigénica, o parte de un tumor

o cáncer. Como otro ejemplo no limitante, una célula que se infecta con un virus o un parásito intracelular obligado (por ejemplo, Rickettsiae) muestra un polipéptido inmunogénico que está codificado por el genoma de la célula infectada pero se expresa de manera aberrante en una célula infectada. Una vacuna que comprende una minicélula que muestra un inmunógeno derivado de una célula no funcional, disfuncional y/o enferma se usa en procedimientos para tratar o prevenir enfermedades o trastornos hiperproliferativos, incluyendo, sin limitación, una célula que comprende un patógeno intracelular.

En un aspecto, la invención se refiere a una minicélula que comprende una proteína de membrana que está unida a un compuesto conjugable (también conocido como "compuesto acoplable"). El compuesto conjugado puede ser de cualquier naturaleza química y tiene uno o más restos terapéuticos o detectables. A modo de ejemplo no limitante, se muestra una proteína que tiene un dominio transmembrana o de anclaje a membrana y tiene la capacidad de reticularse específicamente en su dominio extracelular. Mediante esta estrategia, cualquier compuesto conjugable de interés puede unirse rápida y fácilmente a la superficie externa de minicélulas que contienen este dominio transmembrana expresado. En aspectos de la invención en los que las minicélulas se usan para administración de fármacos in vivo, un compuesto conjugable preferido es polietilenglicol (PEG), que proporciona minicélulas "sigilosas" que no se toman igual de bien y/o igual de rápido por el sistema reticuloendotelial (SRE). Otros compuestos conjugables incluyen polisacáridos, polinucleótidos, lipopolisacáridos, lipoproteínas, proteínas glucosiladas, compuestos químicos sintéticos, y/o combinaciones quiméricas de estos ejemplos listados.

En varios aspectos de la invención, la minicélula muestra un polipéptido u otro compuesto o resto sobre su superficie. A modo de ejemplo no limitante, una proteína de membrana no eubacteriana mostrada por minicélulas eubacterianas puede ser un receptor. Las minicélulas que muestran un receptor pueden, pero no necesariamente, unirse a ligandos del receptor. En aplicaciones terapéuticas de este aspecto de la invención, el ligando es un compuesto no deseado que se une a su receptor y, en algunos aspectos, se internaliza por las minicélulas. La proteína de membrana no eubacteriana mostrada por las minicélulas puede ser una proteína de fusión, es decir, una proteína que comprende un primer polipéptido que tiene una primera secuencia de aminoácidos y un segundo polipéptido que tiene una segunda secuencia de aminoácidos, en la que la primera y la segunda secuencia no están presentes de manera natural en el mismo polipéptido. Al menos un polipéptido en una proteína de fusión de membrana es un "dominio transmembrana" o un "dominio de anclaje a membrana". Los dominios transmembrana y de anclaje a membrana de una proteína de fusión de membrana puede seleccionarse a partir de proteínas de membrana que suceden de manera natural en eucariotas, tales como un hongo, un eucariota unicelular, una planta y un animal, tal como un mamífero, incluyendo un ser humano. Dichos dominios pueden ser de una proteína de membrana viral encontrada de manera natural en un virus, tal como un bacteriófago o un virus de eucariotas, por ejemplo, un adenovirus o un retrovirus. Dichos dominios pueden ser de una proteína de membrana encontrada de manera natural en una arqueobacteria, tal como una termófila.

El dominio mostrado de una proteína de fusión de membrana puede ser un resto de unión. A modo de ejemplo no limitante, los restos de unión usados para fines particulares pueden ser un resto de unión dirigido a un compuesto o resto mostrado por un tipo celular específico o células encontradas predominantemente en un tipo de tejido, que puede usarse para dirigirse a minicélulas y sus contenidos para tipos celulares o tejidos específicos; o un resto de unión que se dirige a un compuesto o resto mostrado por un patógeno, que puede usarse en procedimientos diagnósticos o terapéuticos; un resto de unión que se dirige a un compuesto no deseado, tal como una toxina, que puede usarse para unirse y preferentemente internalizar y/o neutralizar el compuesto no deseado; una célula enferma; o el resto de unión puede ser un dominio que permite que las minicélulas se unan covalentemente o no covalentemente a un material de soporte, que puede usarse en composiciones y procedimientos para selección de compuestos y descubrimiento de fármacos.

En un aspecto, la invención proporciona minicélulas que pueden usarse como herramientas de investigación y/o kits que comprenden dichas herramientas de investigación. Las minicélulas de la invención pueden usarse tal cual, o incorporarse en herramientas de investigación útiles para investigación científica referente a compuestos que comprenden todo aminoácidos incluyendo, pero sin limitación proteínas asociadas a membrana, proteínas de fusión de membrana quiméricas, y proteínas solubles. Dicha investigación científica incluye, a modo de ejemplo no limitante, investigación básica, así como estudios farmacológicos, diagnósticos y farmacogenéticos. Dichos estudios pueden llevarse a cabo in vivo o in vitro.

En otros aspectos, la invención se refiere a procedimientos para preparar las minicélulas, protoplastos y poroplastos™ de la invención para varias aplicaciones, incluyendo, pero sin limitación aplicaciones diagnósticas, terapéuticas, de investigación y de exploración. En un aspecto relacionado, la invención se refiere a composiciones

farmacéuticas, reactivos y kits que comprenden minicélulas.

En cada aspecto y realización de la invención, a menos que se indique lo contrario, existen realizaciones en las que la minicélula es una minicélula eubacteriana, un poroplasto, un esferoplasto o un protoplasto.

En un primer aspecto, la invención proporciona una minicélula que comprende una proteína de membrana seleccionada del grupo que consiste en una proteína de membrana eucariota, una proteína de membrana arqueobacteriana y una proteína de membrana organular. En otra realización, en la que la minicélula comprende un compuesto biológicamente activo. A modo de ejemplo no limitante, el compuesto biológicamente activo es un radioisótopo, un polipéptido, un ácido nucleico o una molécula pequeña.

En otra realización, la minicélula comprende una construcción de expresión, en la que la primera construcción de expresión comprende secuencias de expresión unidas operativamente a un ORF que codifica una proteína. En otra realización, el ORF codifica la proteína de membrana. En otra realización, las secuencias de expresión que están unidas operativamente a un ORF son inducibles y/o represibles.

En otro aspecto, la minicélula comprende una segunda construcción de expresión, en la que la segunda construcción de expresión comprende secuencias de expresión unidas operativamente a un gen. En otra realización, las secuencias de expresión que están unidas operativamente a un gen son inducibles y/o represibles. En una realización relacionada, el producto génico del gen regula la expresión del ORF que codifica la proteína. Un factor que "regula" la expresión de un gen o un producto génico de manera directa o indirecta inicia, potencia, acelera, retrasa, termina, limita o bloquea por completo la expresión de un gen. En diferentes realizaciones, el producto génico del gen es un ácido nucleico o un polipéptido. El polipéptido puede ser de cualquier tipo, incluyendo, pero sin limitación, una proteína de membrana, una proteína soluble o una proteína secretada. Una proteína de membrana puede ser una proteína de fusión de membrana que comprende un primer polipéptido, que comprende al menos un dominio transmembrana o al menos un dominio de anclaje a membrana; y un segundo polipéptido.

En un aspecto, la invención proporciona una minicélula que comprende una proteína de fusión de membrana, comprendiendo la proteína de fusión un primer polipéptido, comprendiendo el primer polipéptido al menos un dominio transmembrana o al menos un dominio de anclaje a membrana; y un segundo polipéptido, en el que el segundo polipéptido no se deriva de una proteína eubacteriana y no es ni un marcador His o un polipéptido de glutatión-S-transferasa. En varias realizaciones, la minicélula es una minicélula eubacteriana, un poroplasto, un esferoplasto o un protoplasto. En una realización, la minicélula comprende un compuesto biológicamente activo.

En un aspecto, la invención proporciona una minicélula que comprende un conjugado de membrana, en el que el conjugado de membrana comprende una proteína de membrana unida químicamente a un compuesto conjugado. En una realización, el compuesto conjugado se selecciona del grupo que consiste en un ácido nucleico, un polipéptido, un lípido y una molécula pequeña.

En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para producir minicélulas que comprende (a) cultivar una célula progenitora que produce minicélulas, en el que la célula progenitora comprende una construcción de expresión, en la que la construcción de expresión comprende un gen unido operativamente a secuencias de expresión que son inducibles o represibles, y en el que la inducción o represión del gen causa o potencia la producción de minicélulas; y (b) separar las minicélulas de la célula progenitora, generando de este modo una composición que comprende minicélulas, en la que está presente un inductor o represor en las células progenitoras durante una o más etapas y/o entre dos o más etapas del procedimiento. En una realización, el procedimiento comprende además (c) purificar las minicélulas de la composición.

Los productos génicos relevantes son factores implicados en o que modulan la replicación del ADN, la división celular, el reparto celular, la separación, la transcripción, la traducción, o el plegamiento de proteínas. Las minicélulas se separan de las células progenitoras mediante procedimientos tales como centrifugación, ultracentrifugación, graduación de densidad, inmunoafinidad, inmunoprecipitación y otras técnicas descritas en el presente documento.

En una realización, la minicélula es un poroplasto, y el procedimiento comprende además (d) tratar a las minicélulas con un agente, o incubar las minicélulas en un conjunto de condiciones que degradan la membrana externa de la minicélula. La membrana externa se degrada mediante tratamiento con un agente seleccionado del grupo que consiste en EDTA, EGTA, ácido láctico, ácido cítrico, ácido glucónico, ácido tartárico, polietilenimina, péptidos policatiónicos, péptidos catiónicos de leucocitos, aminoglucósidos, aminoglucósidos, protamina, cecropinas de insecto, magaininas de reptil, polímeros de aminoácidos básicos, polimixina B, cloroformo, ácido nitriloacético y hexametafosfato de sodio; mediante exposición a condiciones seleccionadas del grupo que consiste en choque osmótico e insonación; y mediante otros procedimientos descritos en el presente documento.

En una realización, comprende además eliminar uno o más contaminantes de la composición. Los contaminantes representativos son LPS y peptidoglucano. En una realización representativa, se elimina el LPS poniendo en contacto la composición con un agente que se une a o degrada el LPS. Al menos aproximadamente un 50%, preferentemente aproximadamente de un 65% a un 75%, más preferentemente un 95%, lo más preferentemente un 99% o > de un 99% de LPS se elimina de una preparación inicial de minicélulas. En una realización relacionada, la

célula progenitora productora de minicélulas comprende una mutación en un gen necesario para la síntesis de lipopolisacárido.

En una realización, la minicélula es un esferoplasto, y el procedimiento comprende además (d) tratar a las minicélulas con un agente, o incubar las minicélulas en un conjunto de condiciones que rompe o degrada la membrana externa; y (e) tratar a las minicélulas con un agente, o incubar las minicélulas en un conjunto de condiciones que rompe o degrada la pared celular. El agente que rompe o degrada la pared celular puede ser, por ejemplo, una lisozima, y el conjunto de condiciones que rompe o degrada la pared celular puede ser, por ejemplo, incubación en una solución hipertónica.

En una realización, la minicélula es un protoplasto, y el procedimiento comprende además (d) tratar a las minicélulas con un agente, o incubar las minicélulas en un conjunto de condiciones que rompen o degradan la membrana externa; (e) tratar a las minicélulas con un agente, o incubar las minicélulas en un conjunto de condiciones que rompen o degradan la pared celular, para generar una composición que comprende protoplastos; y (f) purificar protoplastos a partir de la composición. En una realización, el procedimiento comprende además preparar una minicélula denudada a partir de la minicélula. En una realización, el procedimiento comprende además unir covalentemente o no covalentemente uno o más componentes de la minicélula a un resto conjugado.

En un aspecto, la invención proporciona una minicélula de forma L que comprende (a) cultivar una eubacteria de forma L, en el que la eubacteria comprende uno o más de los siguientes: (i) un elemento de expresión que comprende un gen unido operativamente a secuencias de expresión que son inducibles y/o represibles, en el que la inducción o represión del gen regula el número de copias de una construcción de expresión episómica; (ii) una mutación en un gen endógeno, en la que la mutación regula el número de copias de una construcción de expresión episómica; (iii) un elemento de expresión que comprende un gen unido operativamente a secuencias de expresión que son inducibles y/o represibles, en el que la inducción o represión del gen causa o potencia la producción de minicélulas; y (iv) una mutación en un gen endógeno, en el que la mutación causa o potencia la producción de minicélulas; (b) cultivar la célula progenitora productora de minicélulas de forma L en condiciones en las que se producen las minicélulas; y (c) separar las minicélulas de la célula progenitora, generando de este modo una composición que comprende minicélulas de forma L, en la que está presente un inductor o represor en las minicélulas durante una o más etapas y/o entre dos o más etapas del procedimiento. En una realización, el procedimiento comprende además (d) purificar las minicélulas de forma L de la composición.

En un aspecto, la invención proporciona un soporte sólido que comprende una minicélula, en el que la minicélula muestra una proteína de fusión, comprendiendo la proteína de fusión un primer polipéptido que comprende al menos un dominio transmembrana o al menos un dominio de anclaje a membrana, y un segundo polipéptido. En varias realizaciones, el segundo polipéptido comprende un resto de unión o un resto enzimático.

En un aspecto, la invención proporciona una minicélula eubacteriana que comprende un compuesto biológicamente activo, en la que la minicélula muestra un resto de unión, en el que el resto de unión se selecciona del grupo que consiste en (a) una proteína de membrana eucariota; (b) una proteína de membrana arqueobacteriana; (c) una proteína de membrana organular; y (d) una proteína de fusión, comprendiendo la proteína de fusión un primer polipéptido, comprendiendo el primer polipéptido al menos un dominio transmembrana o al menos un dominio de anclaje a membrana; y un segundo polipéptido, en el que el segundo polipéptido no se deriva de una proteína eubacteriana y no es ni un marcador His o un polipéptido de glutatión-S-transferasa, y en el que el polipéptido comprende un resto de unión.

En una realización, el resto de unión se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un derivado de anticuerpo, un receptor y un sitio activo de un derivado no catalítico de una enzima. En una realización preferida, el resto de unión es un anticuerpo monocatenario. En una realización, uno de los ORF codifica una proteína que comprende el resto de unión.

En una realización, el resto de unión se dirige a un ligando seleccionado del grupo que consiste en un epítopo mostrado en un patógeno, un epítopo mostrado en una célula infectada y un epítopo mostrado en una célula hiperproliferativa.

En una realización, la invención comprende además un primer y un segundo ácido nucleico, en la que el primer ácido nucleico comprende secuencias de expresión de eucariota unidas operativamente a un primer ORF, y un segundo ácido nucleico, en el que el segundo ácido nucleico comprende secuencias de expresión eubacterianas unidas operativamente a un segundo ORF.

En una realización, las secuencias de expresión eubacterianas se inducen y/o desreprimen cuando el resto de unión está en contacto con una célula diana. En una realización variante, las secuencias de expresión eucariotas se inducen y/o desreprimen cuando el ácido nucleico está en el citoplasma de una célula eucariota. En realizaciones relacionadas, la proteína codificada por el primer ORF comprende secuencias de secreción eucariotas y/o la proteína codificada por el segundo ORF comprende secuencias de secreción eubacterianas.

En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para asociar un compuesto radiactivo con una célula, en el que la célula muestra un ligando reconocido específicamente por un resto de unión, que comprende poner en

contacto la célula con una minicélula que comprende el compuesto radiactivo y muestra el resto de unión. En una realización diagnóstica, la cantidad de radiación emitida por el isótopo radiactivo es suficiente para que sea detectable. En una realización terapéutica, la cantidad de radiación emitida por el isótopo radiactivo es suficiente para que sea citotóxica. En una realización, el ligando mostrado por la célula se selecciona del grupo que consiste en un epítopo mostrado en un patógeno, un epítopo mostrado en una célula infectada y un epítopo mostrado en una célula hiperproliferativa. En una realización, el resto de unión se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un derivado de anticuerpo, una proteína de canal y un receptor, y es preferentemente un anticuerpo monocatenario. En otras realizaciones, el resto de unión es un aptámero o una molécula pequeña. En una realización, el ligando se selecciona del grupo que consiste en una citocina, una hormona y una molécula pequeña.

En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para administrar un compuesto biológicamente activo a una célula, en el que la célula muestra un ligando reconocido específicamente por un resto de unión, que comprende poner en contacto la célula con una minicélula que muestra el resto de unión, en el que la minicélula comprende el compuesto biológicamente activo, y en el que los contenidos de la minicélula se administran al interior de la célula a partir de una minicélula unida a la célula. En una realización, el compuesto biológicamente activo se selecciona del grupo que consiste en un ácido nucleico, un lípido, un polipéptido, un compuesto radiactivo, un ion y una molécula pequeña.

En una realización, la membrana de la minicélula comprende un sistema para transferir una molécula del interior de una minicélula al citoplasma de la célula. Un sistema representativo para transferir una molécula del interior de una minicélula al citoplasma de la célula es un sistema de secreción de tipo III.

En una realización, la minicélula comprende además un primer y un segundo ácido nucleico, en la que el primer ácido nucleico comprende secuencias de expresión de eucariota unidas operativamente a un primer ORF, y un segundo ácido nucleico, en el que el segundo ácido nucleico comprende secuencias de expresión eubacterianas unidas operativamente a un segundo ORF. En una realización, uno de los ORF codifica una proteína que comprende el resto de unión. En una realización, las secuencias de expresión eubacterianas se inducen y/o desreprimen cuando el resto de unión está en contacto con una célula diana. En una realización, las secuencias de expresión eucariotas se inducen y/o desreprimen cuando el ácido nucleico está en el citoplasma de una célula eucariota. En una realización, la proteína codificada por el primer ORF comprende secuencias de secreción eucariotas y/o la proteína codificada por el segundo ORF comprende secuencias de secreción eubacterianas. En una realización, el ligando se selecciona del grupo que consiste en una citocina, una hormona y una molécula pequeña.

En un aspecto, la invención proporciona una minicélula que muestra un resto de unión sintético, en el que el resto de unión sintético está unido covalentemente o no covalentemente a un componente de membrana de la minicélula.

En un aspecto, la invención proporciona una minicélula estabilizada estéricamente que comprende un resto mostrado que tiene una semivida in vivo más larga que una minicélula de tipo silvestre, en la que el resto mostrado es un polímero hidrófilo que comprende un resto de PEG, un grupo carboxílico de un polialquilenglicol o estearato de PEG.

En un aspecto, la invención proporciona una minicélula que tiene una membrana que comprende un lípido exógeno, en la que una minicélula que comprende el lípido exógeno tiene una semivida in vivo más larga que una minicélula que carece del lípido exógeno, y en la que la minicélula se selecciona del grupo que consiste en una minicélula eubacteriana, un poroplasto, un esferoplasto y un protoplasto. En una realización, el lípido exógeno es un lípido derivatizado que puede, a modo de ejemplo no limitante, ser fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG, DSPE-PEG, estearato de PEG, fosfolípidos derivatizados con PEG, una ceramida de PEG o DSPE-PEG.

En una realización, el lípido exógeno no está presente en una membrana de tipo silvestre, o está presente en una proporción a la encontrada en las minicélulas que comprenden una membrana de tipo silvestre. El lípido exógeno puede ser un gangliósido, esfingomielina, monosialogangliósido GM1, sulfato de galactocerebrósido, 1,2-sndimiristoilfosfatidilcolina, fosfatidilinositol y cardiolipina.

En una realización, el resto enlazante está unido no covalentemente a la minicélula. En una realización, uno del resto enlazante y el componente de membrana comprende biotina, y el otro comprende avidina o estreptavidina. En una realización, el resto enlazante sintético es un reticulante. En una realización, el reticulante es un reticulante bifuncional.

En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para transferir una proteína de membrana de una membrana de minicélula a una membrana biológica que comprende poner en contacto una minicélula con la membrana biológica, en el que la membrana de la minicélula comprende la proteína de membrana, y permitir que la minicélula y la membrana biológica permanezca en contacto durante un periodo de tiempo suficiente para que suceda la transferencia.

En una realización, la membrana biológica es una membrana citoplasmática o una membrana organular. En una realización, la membrana biológica es una membrana seleccionada del grupo que consiste en una membrana de un patógeno, una membrana de una célula infectada y una membrana de una célula hiperproliferativa. En una realización, la membrana biológica es la membrana citoplasmática de una célula receptora, que puede ser una célula

cultivada y una célula en un organismo. En una realización, la membrana biológica se presenta en una célula que se ha retirado de un animal, el contacto sucede in vitro, tras lo cual la célula se devuelve al organismo.

En una realización, la proteína de membrana es una enzima. En esta realización, la proteína de membrana que tiene actividad enzimática se selecciona del grupo que consiste en un citocromo P450 y una proteína de fusión, comprendiendo la proteína de fusión un primer polipéptido, comprendiendo el primer polipéptido al menos un polipéptido, en el que el segundo polipéptido tiene actividad enzimática.

En una realización, la proteína de membrana es una proteína de fusión de membrana, comprendiendo la proteína de fusión de membrana un primer polipéptido, comprendiendo el primer polipéptido al menos un dominio transmembrana o al menos un dominio de anclaje a membrana; y un segundo polipéptido.

En una realización, el segundo polipéptido es una polipéptido biológicamente activo. En una realización, la minicélula muestra un ligando o un resto de unión.

En un aspecto, la invención proporciona una minicélula que comprende una construcción de expresión que comprende un ORF que codifica una proteína de membrana unida operativamente a secuencias de expresión, en la que las secuencias de expresión se inducen y/o desreprimen cuando la minicélula está en contacto con una célula diana.

En una realización, la membrana biológica es una membrana citoplasmática o una membrana organular. En una realización, la membrana biológica es una membrana seleccionada del grupo que consiste en una membrana de un patógeno, una membrana de una célula infectada y una membrana de una célula hiperproliferativa. En una realización, la minicélula muestra un ligando o un resto de unión seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo, un derivado de anticuerpo, un aptámero y una molécula pequeña. En una realización, la proteína de membrana es una proteína de fusión de membrana, comprendiendo la proteína de fusión de membrana un primer polipéptido, comprendiendo el primer polipéptido al menos un dominio transmembrana o al menos un dominio de anclaje a membrana; y un segundo polipéptido. En una realización, el ligando se selecciona del grupo que consiste en una citocina, una hormona y una molécula pequeña.

En un aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una minicélula, en la que la minicélula muestra una proteína de membrana, en la que la proteína de membrana se selecciona del grupo que consiste en una proteína de membrana eucariota, una proteína de membrana arqueobacteriana y una proteína de membrana organular. En una realización, la proteína de membrana se selecciona del grupo que consiste en un receptor, una proteína de canal, un factor de adhesión celular y una integrina. En una realización, la formulación farmacéutica comprende además un adyuvante. En una realización, la proteína de membrana comprende un epítopo polipeptídico mostrado por una célula hiperproliferativa. En una realización, la proteína de membrana comprende un epítopo mostrado por un patógeno eucariota, un patógeno arqueobacteriano, un virus o una célula infectada.

En un aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una minicélula, en la que la minicélula muestra una proteína de membrana que es una proteína de fusión, comprendiendo la proteína de fusión

(i) un primer polipéptido, comprendiendo el primer polipéptido al menos un dominio transmembrana o al menos un dominio de anclaje a membrana; y (ii) un segundo polipéptido, en el que el segundo polipéptido no se deriva de una proteína eubacteriana. En una realización, la formulación farmacéutica comprende además un adyuvante. En una realización, el segundo polipéptido comprende un epítopo polipeptídico mostrado por una célula hiperproliferativa. En una realización, la proteína de membrana comprende un epítopo mostrado por un patógeno eucariota, un patógeno arqueobacteriano, un virus o una célula infectada.

En un aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una minicélula, en la que la minicélula muestra un conjugado de membrana, en el que el conjugado de membrana comprende un componente de membrana unido químicamente a un compuesto conjugado. En una realización, la proteína de membrana se selecciona del grupo que consiste en un receptor, una proteína de canal, un factor de adhesión celular y una integrina. En una realización, el agente farmacéutico comprende además un adyuvante. En una realización, el componente de membrana es un polipéptido que comprende al menos un dominio transmembrana o al menos un dominio de anclaje a membrana, o un lípido que es parte de una membrana. En una realización, el compuesto conjugado es un polipéptido, y el enlace químico entre el compuesto de membrana y el compuesto conjugado no es un enlace peptídico. En una realización, el compuesto conjugado es un ácido nucleico. En una realización, el compuesto conjugado es un compuesto orgánico. En una realización, el compuesto orgánico se selecciona del grupo que consiste en un narcótico, una toxina, un veneno, un esfingolípido y una proteína soluble.

En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para producir una composición farmacéutica que comprende una minicélula, en la que la minicélula muestra una proteína de membrana, en la que la proteína de membrana se selecciona del grupo que consiste en una proteína de membrana eucariota, una proteína de membrana arqueobacteriana y una proteína de membrana organular. En una realización, el procedimiento comprende además añadir un adyuvante a la formulación farmacéutica. En una realización, el procedimiento comprende además desecar la formulación. En una realización, el procedimiento comprende además añadir un tampón de suspensión a la formulación. En una realización, el procedimiento comprende además efectuar una

modificación química de la proteína de membrana. En una realización, la modificación química se selecciona del grupo que consiste en glucosilación, desglucosilación, fosforilación, desfosforilación y proteolisis. En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para producir una composición farmacéutica que comprende una minicélula, en la que la minicélula muestra una proteína de membrana que es una proteína de fusión, comprendiendo la proteína de fusión (i) un primer polipéptido, comprendiendo el primer polipéptido al menos un dominio transmembrana o al menos un dominio de anclaje a membrana; y (ii) un segundo polipéptido, en el que el segundo polipéptido no se deriva de una proteína eubacteriana.

En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para producir una formulación farmacéutica que comprende una minicélula, en la que la minicélula muestra un conjugado de membrana, en el que el conjugado de membrana comprende un componente de membrana unido químicamente a un compuesto conjugado. En una realización, el procedimiento comprende además añadir un adyuvante a la formulación farmacéutica. En una realización, el componente de membrana es un polipéptido que comprende al menos un dominio transmembrana o al menos un dominio de anclaje a membrana, o un lípido que es parte de una membrana. En una realización, el compuesto conjugado es un polipéptido, y el enlace químico entre el compuesto de membrana y el compuesto conjugado no es un enlace peptídico. En una realización, el compuesto conjugado es un ácido nucleico. En una realización, el compuesto conjugado es un compuesto orgánico. En una realización, el compuesto orgánico se selecciona del grupo que consiste en un narcótico, una toxina, un veneno, y un esfingolípido.

En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para detectar un agente que se une específicamente por un resto de unión, que comprende poner en contacto una minicélula que muestra el resto de unión con una composición en la que se sabe o se sospecha que contiene el agente, y detectar una señal que se modula por la unión del agente al resto de unión. En una realización, el agente se asocia con una enfermedad. En una realización, la minicélula comprende un compuesto detectable. En una realización, el resto de unión es un anticuerpo o derivado de anticuerpo. En una realización, la composición es una muestra ambiental. En una realización, la composición es una muestra biológica. En una realización, la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste en sangre, suero, plasma, orina, saliva, una muestra de biopsia, heces y un parche cutáneo.

En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para obtener imágenes in situ de un tejido u órgano, que comprende administrara a un organismo una minicélula que comprende un agente de obtención de imágenes y un resto de unión y detectar el agente de obtención de imágenes en el organismo.

En una realización, la minicélula es una minicélula eubacteriana, un poroplasto, un esferoplasto o un protoplasto. En una realización, el resto de unión es un anticuerpo o derivado de anticuerpo. En una realización, el resto de unión se une específicamente a un antígeno de superficie celular. En una realización, el antígeno de superficie celular es un antígeno mostrado por una célula tumorigénica, una célula cancerosas, y una célula infectada. En una realización, el antígeno de superficie celular es un antígeno específico de tejido. En una realización, el procedimiento de obtención de imágenes se selecciona del grupo que consiste en obtención de imágenes por resonancia magnética, obtención de imágenes por ultrasonidos; y tomografía axial computerizada (TAC). En un aspecto, la invención proporciona un dispositivo que comprende una microplaca asociada operativamente a un biosensor que comprende una minicélula, en el que la microplaca comprende o pone en contacto la minicélula, y en la que la minicélula muestra un resto de unión.

En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para determinar la velocidad de transferencia de un ácido nucleico de una minicélula a una célula, que comprende (a) poner en contacto la célula con la minicélula, en el que la minicélula comprende el ácido nucleico, durante un periodo de tiempo medido; (b) separar las minicélulas de las células; (c) medir la cantidad de ácido nucleico en las células, en el que la cantidad de ácido nucleico en las células a lo largo del periodo de tiempo establecido es la velocidad de transferencia de un ácido nucleico de una minicélula.

En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para determinar la cantidad de un ácido nucleico transferido a una célula de una minicélula, que comprende (a) poner en contacto la célula con la minicélula, en el que la minicélula comprende un elemento de expresión que tiene secuencias de expresión eucariotas unidas operativamente a un ORF que codifica un polipéptido detectable, en la que la minicélula muestra un resto de unión, y en el que el resto de unión se une a un epítopo de la célula; y (b) detectar una señal del polipéptido detectable, en el que un cambio en la señal corresponde a un aumento en la cantidad de un ácido nucleico transferido a una célula.

En una realización, la célula es una célula eucariota. A modo de ejemplo no limitante, una célula eucariota puede ser una célula vegetal, una célula fúngica, un eucariota unicelular, una célula animal, una célula de mamífero, una célula de rata, una célula de ratón, una célula de primate o una célula humana.

En una realización, el resto de unión es un anticuerpo o derivado de anticuerpo. En una realización, el resto de unión es un anticuerpo monocatenario. En una realización, el resto de unión es un aptámero. En una realización, el resto de unión es un compuesto orgánico. En una realización, el polipéptido detectable es un polipéptido fluorescente.

En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para detectar la expresión de un elemento de expresión en una célula, que comprende (a) poner en contacto la célula con la minicélula, en el que la minicélula comprende un elemento de expresión que tiene secuencias de expresión celular unidas operativamente a un ORF que codifica un

polipéptido detectable, en la que la minicélula muestra un resto de unión, y en el que el resto de unión se une a un epítopo de la célula; (b) incubar la célula y la minicélula durante un periodo de tiempo eficaz para la transferencia de ácido nucleico de la minicélula a la célula; y (c) detectar una señal del polipéptido detectable, en el que un aumento en la señal corresponde a un aumento en la expresión del elemento de expresión.

En una realización, la célula es una célula eucariota y las secuencias de expresión son secuencias de expresión eucariotas. En una realización, la célula eucariota es una célula de mamífero. En una realización, el resto de unión es un anticuerpo o derivado de anticuerpo. En una realización, el resto de unión es un anticuerpo monocatenario. En una realización, el resto de unión es un aptámero. En una realización, el resto de unión es un compuesto orgánico.

En un aspecto, la invención proporciona una minicélula que comprende al menos un ácido nucleico, en el que la minicélula muestra un resto de unión dirigido a un compuesto diana, en el que el resto de unión se selecciona del grupo que consiste en (i) una proteína de membrana eucariota; (ii) una proteína de membrana arqueobacteriana; (iii) una proteína de membrana organular; y (iv) una proteína de fusión, comprendiendo la proteína de fusión un primer polipéptido, comprendiendo el primer polipéptido al menos un dominio transmembrana o al menos un dominio de anclaje a membrana; y un segundo polipéptido, en el que el segundo polipéptido no se deriva de una proteína eubacteriana y no es ni un marcador His o un polipéptido de glutatión-S-transferasa, y en el que el polipéptido comprende un resto de unión.

En una realización, el ácido nucleico comprende una construcción de expresión que comprende secuencias de expresión unidas operativamente a un ORF que codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en (i) la proteína de membrana eucariota, (ii) la proteína de membrana arqueobacteriana; (iii) la proteína de membrana organular; y (iv) la proteína de fusión.

En una realización, el ácido nucleico comprende una construcción de expresión que comprende secuencias de expresión unidas operativamente a un ORF, en el que el ORF codifica un polipéptido terapéutico. En una realización, el polipéptido terapéutico es un polipéptido de membrana. En una realización, el polipéptido terapéutico es un polipéptido soluble. En una realización, el polipéptido soluble comprende una secuencia de secreción celular. En una realización, las secuencias de expresión son inducibles y/o represibles.

En una realización, las secuencias de expresión se inducen y/o desreprimen cuando el resto de unión mostrado por la minicélula se une a su compuesto diana. En una realización, el ácido nucleico comprende una construcción de expresión que comprende secuencias de expresión unidas operativamente a un ORF, en el que el ORF codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que facilita la transferencia celular de un compuesto biológicamente activo contenido en o mostrado por la minicélula. En una realización, la membrana de la minicélula comprende un sistema para transferir una molécula del interior de una minicélula al citoplasma de la célula. En una realización, el sistema para transferir una molécula del interior de una minicélula al citoplasma de la célula es un sistema de secreción de tipo III.

En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para introducir un ácido nucleico en una célula, que comprende poner en contacto la célula con una minicélula que comprende el ácido nucleico, en la que la minicélula muestra un resto de unión, en el que el resto de unión se selecciona del grupo que consiste en (i) una proteína de membrana eucariota; (ii) una proteína de membrana arqueobacteriana; (iii) una proteína de membrana organular; y

(iv) una proteína de fusión, comprendiendo la proteína de fusión un primer polipéptido, comprendiendo el primer polipéptido al menos un dominio transmembrana o al menos un dominio de anclaje a membrana; y un segundo polipéptido, en el que el segundo polipéptido no se deriva de una proteína eubacteriana y no es ni un marcador His o un polipéptido de glutatión-S-transferasa, y en el que el polipéptido comprende un resto de unión; y en el que el resto de unión se une a un epítopo de la célula.

En una realización, el ácido nucleico comprende una construcción de expresión que comprende secuencias de expresión unidas operativamente a un ORF que codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en (i) la proteína de membrana eucariota, (ii) la proteína de membrana arqueobacteriana; (iii) la proteína de membrana organular; y (iv) una proteína de fusión.

En una realización, el ácido nucleico comprende una construcción de expresión que comprende secuencias de expresión unidas operativamente a un ORF, en el que el ORF codifica un polipéptido terapéutico. En una realización, las secuencias de expresión son inducibles y/o desrepresibles. En una realización, las secuencias de expresión se inducen o desreprimen cuando el resto de unión mostrado por la minicélula se une a su compuesto diana. En una realización, las secuencias de expresión se inducen o desreprimen mediante un suceso de transactivación o transrepresión. En una realización, el ácido nucleico comprende una construcción de expresión que comprende secuencias de expresión unidas operativamente a un ORF, en el que el ORF codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que facilita la transferencia celular de un compuesto biológicamente activo contenido en o mostrado por la minicélula.

En un aspecto, la invención proporciona una minicélula que comprende un ácido nucleico, en el que el ácido nucleico comprende secuencias de expresión eucariotas y secuencias de expresión eubacterianas, cada una de las cuales está unida operativamente de manera independiente a un ORF.

En una realización, la minicélula muestra un resto de unión. En una realización, las secuencias de expresión eubacterianas se inducen y/o desreprimen cuando el resto de unión está en contacto con una célula diana. En una realización, las secuencias de expresión eucariotas se inducen y/o desreprimen cuando el ácido nucleico está en el citoplasma de una célula eucariota. En una realización, la proteína codificada por el ORF comprende secuencias de secreción eubacterianas o eucariotas.

En un aspecto, la invención proporciona una minicélula que comprende un primer y un segundo ácido nucleico, en la que el primer ácido nucleico comprende secuencias de expresión de eucariota unidas operativamente a un primer ORF, y un segundo ácido nucleico, en el que el segundo ácido nucleico comprende secuencias de expresión eubacterianas unidas operativamente a un segundo ORF.

En una realización, la minicélula muestra un resto de unión. En una realización, las secuencias de expresión eubacterianas se inducen y/o desreprimen cuando el resto de unión está en contacto con una célula diana. En una realización, las secuencias de expresión eucariotas se inducen y/o desreprimen cuando el ácido nucleico está en el citoplasma de una célula eucariota. En una realización, la proteína codificada por el primer ORF comprende secuencias de secreción eucariotas y/o la proteína codificada por el segundo ORF comprende secuencias de secreción eubacterianas.

En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para introducir y expresar un ácido nucleico en un organismo, que comprende poner en contacto una minicélula con una célula del organismo, en el que la minicélula comprende el ácido nucleico.

En una realización, la minicélula muestra un resto de unión. En una realización, el ácido nucleico comprende una construcción de expresión eucariota, en el que la construcción de expresión eucariota comprende secuencias de expresión eucariotas unidas operativamente a un ORF. En una realización, el ORF codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en una proteína de membrana, una proteína soluble y una proteína que comprende secuencias de señal de secreción eucariotas. En una realización, el ácido nucleico comprende una construcción de expresión eubacteriana, en el que la construcción de expresión eubacteriana comprende secuencias de expresión eubacterianas unidas operativamente a un ORF. En una realización, la minicélula muestra un resto de unión, en el que las secuencias de expresión eubacterianas se inducen y/o desreprimen cuando el resto de unión está en contacto con una célula diana. En una realización, la proteína codificada por el ORF comprende secuencias de secreción eubacterianas.

En una realización, el ligando es una proteína que forma un multímero con la proteína diana, los átomos que interactúan del ligando son átomos en la estructura tridimensional definida que están implicados en interacciones proteína-proteína. En una realización, el ligando es un compuesto que induce un cambio conformacional en la proteína diana, y la estructura tridimensional definida es el sitio del cambio conformacional. En una realización, el procedimiento para identificar ligandos de una proteína diana, comprende además identificar las diferencias químicas en las proteínas variantes en comparación con la proteína diana. En una realización, la invención comprende además mapear las diferencias químicas en la estructura tridimensional definida, y correlacionar el efecto de las diferencias químicas sobre la estructura tridimensional definida. En una realización, la proteína diana es una proteína de tipo silvestre. En un aspecto, la invención proporciona una biblioteca de minicélulas, que comprende dos o más minicélulas, en las que cada minicélula comprende una proteína exógena diferente. En una realización, la minicélula es una minicélula eubacteriana, un poroplasto, un esferoplasto o un protoplasto. En una realización, la proteína exógena es una proteína mostrada. En una realización, la proteína exógena es una proteína de membrana. En una realización, la proteína de membrana es un receptor. En una realización, la proteína es una proteína soluble que está contenida en o se secreta por la minicélula. En una realización, las minicélulas en la biblioteca comprenden un elemento de expresión que comprende secuencias de expresión unidas operativamente a un ácido nucleico que tiene un ORF que codifica la proteína exógena. En una realización, el ácido nucleico que ha mutagenizado; la mutagénesis puede ser dirigida a sitios o al azar. En una realización, un sitio activo de la proteína exógena tiene una estructura tridimensional conocida o predicha, y la una porción del ORF que codifica el sitio activo se ha mutagenizado. En una realización, cada una de las minicélulas comprende una proteína exógena que es una variante de una proteína que tiene una estructura tridimensional conocida o predicha.

En un aspecto, la invención proporciona una célula progenitora productora de minicélulas, en la que la célula progenitora comprende uno o más de los siguientes (a) un elemento de expresión que comprende un gen unido operativamente a secuencias de expresión que son inducibles y/o represibles, en el que la inducción o represión del gen regula el número de copias de una construcción de expresión episómica; (b) una mutación en un gen endógeno, en la que la mutación regula el número de copias de una construcción de expresión episómica; (c) un elemento de expresión que comprende un gen unido operativamente a secuencias de expresión que son inducibles y/o represibles, en el que la inducción o represión del gen causa o potencia la producción de minicélulas; y (d) una mutación en un gen endógeno, en el que la mutación causa o potencia la producción de minicélulas.

En una realización, la invención comprende una construcción de expresión episómica. En una realización, la invención comprende además una construcción de expresión cromosómica. En una realización, las secuencias de expresión de la construcción de expresión son inducibles y/o represibles. En una realización, la célula progenitora productora de minicélulas comprende un compuesto biológicamente activo. En una realización, el gen que causa o

potencia la producción de minicélulas tiene un producto génico que está implicado en o regula la replicación de ADN la división celular, el reparto celular, la separación, la transcripción, la traducción, o el plegamiento de proteínas.

En un aspecto, la invención proporciona una célula progenitora productora de minicélulas, en el que la célula progenitora comprende una construcción de expresión, en la que la construcción de expresión comprende secuencias de expresión unidas operativamente a un ORF que codifica una proteína, y un elemento de expresión regulador, en el que el elemento de expresión regulador comprende secuencias de expresión unidas operativamente a un gen regulador que codifica un factor que regula la expresión del ORF. En una realización, las secuencias de expresión de la construcción de expresión son inducibles y/o represibles. En una realización, las secuencias de expresión de la construcción de expresión reguladora son inducibles y/o represibles. En una realización, uno o más del elemento de expresión o del elemento de expresión regulador está localizado en un cromosoma de la célula progenitora. En una realización, uno o más del elemento de expresión o el elemento de expresión regulador está localizado en una construcción de expresión episómica. En una realización, tanto el elemento de expresión como el elemento de expresión regulador están localizados en una construcción de expresión episómica, y uno o ambos del elemento de expresión y el elemento de expresión regulador se segregan en minicélulas producidas a partir de la célula progenitora. En una realización, la célula progenitora productora de minicélulas comprende un compuesto biológicamente activo. En una realización, el compuesto biológicamente activo se segrega en minicélulas producidas a partir de la célula progenitora. En una realización, el ORF codifica una proteína de membrana o una proteína soluble. En una realización, la proteína comprende secuencias de secreción. En una realización, el producto génico del gen regula la expresión del ORF. En una realización, el producto génico es un factor de transcripción. En una realización, el producto génico es una ARN polimerasa. En una realización, la célula progenitora es MC-T7.

En un aspecto, la invención proporciona una minicélula que comprende un compuesto biológicamente activo, en la que la minicélula muestra un resto de unión, en el que la minicélula absorbe y/o internaliza un compuesto no deseado, y la minicélula es un poroplasto, un esferoplasto o un protoplasto. En una realización, el resto de unión se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un derivado de anticuerpo, un receptor y un sitio activo de un derivado no catalítico de una enzima. En una realización, el resto de unión es un anticuerpo monocatenario. En una realización, el resto de unión se dirige a un ligando seleccionado del grupo que consiste en un epítopo mostrado en un patógeno, un epítopo mostrado en una célula infectada y un epítopo mostrado en una célula hiperproliferativa. En una realización, el compuesto biológicamente activo se selecciona del grupo que consiste en un radioisótopo, un polipéptido, un ácido nucleico y una molécula pequeña. En una realización, un ligando se une y se internaliza por la minicélula o se inactiva de otro modo mediante absorción selectiva. En una realización, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende la minicélula. En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para reducir la concentración libre de una sustancia en una composición, en el que la sustancia muestra un ligando reconocido específicamente por un resto de unión, que comprende poner en contacto la composición con una minicélula que muestra el resto de unión, en el que el resto de unión se une a la sustancia, reduciendo de este modo la concentración libre de la sustancia en la composición. En una realización, la sustancia se selecciona del grupo que consiste en un ácido nucleico, un lípido, un polipéptido, un compuesto radiactivo, un ion y una molécula pequeña. En una realización, el resto de unión se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un derivado de anticuerpo, una proteína de canal y un receptor.

En una realización, la composición está presente en un ambiente que incluye, pero sin limitación, agua, aire o suelo. En una realización, la composición es una muestra biológica de un organismo, incluyendo, pero sin limitación, sangre, suero, plasma, orina, saliva, una muestra de biopsia, heces, tejido y un parche de piel. En una realización, la sustancia se une y se internaliza por la minicélula o se inactiva de otro modo mediante absorción selectiva. En una realización, la muestra biológica se devuelve al organismo después de ponerse en contacto con la minicélula.

Para una mejor comprensión de la presente invención, se hace referencia a la descripción detallada adjunta y su ámbito se indicará en las reivindicaciones adjuntas. Todas las referencias citadas en el presente documento se incorporan al presente documento por referencia.

Por razones de brevedad, se usan en algunos casos en el presente documento las abreviaturas de una letra de los aminoácidos. La Tabla 1 describe la correspondencia entre las abreviaturas de 1 y 3 letras de aminoácidos.

Tabla 1: abreviaturas de una y tres letras para aminoácidos

Aminoácido

Abreviatura de tres letras Símbolo de una letra

Alanina

Ala A

Arginina

Arg R

Asparagina

Asn N

Ácido aspártico

Asp D

Cisteína

Cys C

(continuación)

Aminoácido

Abreviatura de tres letras Símbolo de una letra

Glutamina

Gln Q

Ácido glutámico

Glu E

Glicina

Gly G

Histidina

His H

Isoleucina

Ile I

Leucina

Leu L

Lisina

Lys K

Metionina

Met M

Fenilalanina

Phe F

Prolina

Pro P

Serina

Ser S

Treonina

Thr T

Triptófano

Trp W

Tirosina

Tyr Y

Valina

Val V

Un "compuesto conjugable" o "compuesto acoplable" es capaz de unirse a otro compuesto. Las expresiones "conjugado a" y "reticulado con" indican que el compuesto conjugable está en estado de unirse a otro compuesto. Un 5 "conjugado" es el compuesto formado por el acoplamiento de un compuesto conjugable o resto conjugable a otro compuesto.

"Cultivar" significa incubar una célula u organismo en condiciones en las que la célula u organismo pueden llevar a cabo algunos, si no todos, los procesos biológicos. Por ejemplo, una célula que se cultiva puede crecer o reproducirse, o puede ser no viable pero aún capaz de llevar a cabo procesos biológicos y/o bioquímicos, tales como

10 la replicación, la transcripción, la traducción, etc.

Se dice que un agente se ha "purificado" si su concentración aumenta, y/o la concentración de uno o más contaminantes no deseados disminuye, en una composición en relación a la composición a partir de la cual se ha purificado el agente. La purificación abarca por lo tanto el enriquecimiento de un agente en una composición y/o el aislamiento de un agente a partir de la misma.

15 Un "soporte sólido" es cualquier composición sólida o semisólida en la que puede unirse o contenerse un agente. Las formas comunes de soporte sólido incluyen, pero sin limitación, placas, tubos y perlas, todas las cuales pueden hacerse de vidrio u otro material adecuado, por ejemplo, poliestireno, nailon, acetato de celulosa, nitrocelulosa, y otros polímeros. Los semisólidos y geles en los que se suspenden las minicélulas también se consideran soportes sólidos. Un soporte sólido puede estar en la forma de una varilla, dispositivo de flujo a través, u otra configuración

20 adecuada.

Una "mutación" es un cambio en la secuencia de nucleótidos de un gen en relación a la secuencia de su gen de "tipo silvestre". Las cepas eubacterianas de tipo silvestre de referencia son aquellas que se han cultivado in vitro por los científicos durante décadas; por ejemplo, una cepa de tipo silvestre de Escherichia coli es E. coli K-12. Las mutaciones incluyen, pero sin limitación, mutaciones puntuales, deleciones, inserciones y translocaciones.

25 Un "dominio regulador de acción en trans" es una parte reguladora de una proteína que se expresa a partir de un gen que no está adyacente al sitio de efecto regulador. Los dominios de acción en trans pueden activar o estimular (transactivar), o limitar o bloquear (transreprimir) el gen en cuestión.

Un "gen indicador" se refiere a un gen que está unido operativamente a secuencias de expresión, y que expresa un producto génico, típicamente un polipéptido detectable, cuya producción y detección se usa como medida de la

30 robustez y/o control de la expresión.

Un "compuesto detectable" o "resto detectable" produce una señal que puede detectarse por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, electromagnéticos, radioquímicos, o químicos, tales como fluorescencia, quimiofluorescencia, o quimioluminiscencia, o cualquier otro medio adecuado. Un "compuesto radioactivo" o una "composición radioactiva" tiene una cantidad mayor que la natural (ambiental) de uno o más radioisótopos.

Por "mostrada" se entiende que una porción de la proteína de membrana está presente en la superficie de una célula o minicélula, y por lo tanto está en contacto con el ambiente externo de la célula o minicélula. La porción externa mostrada de una proteína de membrana es un "dominio extracelular" o un "dominio mostrado". Una proteína de membrana puede tener más de un dominio mostrado, y una minicélula de la invención puede mostrar más de una proteína de membrana.

Un "dominio" o "dominio de proteína" es una región de una molécula o estructura que comparte características físicas y/o químicas comunes. Los ejemplos no limitantes de dominios de proteína incluyen regiones de unión transmembrana hidrófobas o de membrana periférica, enzimáticas globulares o regiones receptoras, y/o dominios de unión a ácido nucleico.

Un "dominio transmembrana" atraviesa una membrana, un "dominio de anclaje a membrana" se posiciona en una membrana, pero no la atraviesa. Un dominio "extracelular" o "mostrado" está presente en el exterior de una célula, o minicélula, y por lo tanto está en contacto con el ambiente externo de la célula o minicélula.

Un "eucariota" es como se usa el término en la técnica. Un eucariota puede ser, a modo de ejemplo no limitante, un hongo, un eucariota unicelular, una planta o un animal. Un animal puede ser un mamífero, tal como una rata, un ratón, un conejo, un perro, un gato, un caballo, una vaca, un cerdo, un simio o un ser humano.

Una "membrana eucariota" es una membrana encontrada en un eucariota. Una membrana eucariota puede ser, a modo de ejemplo no limitante, una membrana citoplásmica, una membrana nuclear, una membrana nucleolar, una membrana del retículo endoplasmático (RE), una membrana del aparato de Golgi, una membrana de un lisosoma, una membrana de un peroxisoma, una membrana caveolar, o una membrana interna o externa de una mitocondria, cloroplasto o plástido.

El término "endógeno" se refiere a algo que se encuentran normalmente en una célula en la forma en que esa célula existe en la naturaleza.

El término "exógeno" se refiere a algo que no se encuentran normalmente en una célula en la forma en que esa célula existe en la naturaleza.

Un "gen" comprende (a) secuencias de nucleótido que bien (i) actúan como molde para un producto génico de ácido nucleico, o (ii) que codifica uno o más marcos abiertos de lectura (ORF); y (b) secuencias de expresión unidas operativamente a (1) o (2). Cuando un gen comprende un ORF, es un "gen estructural".

Por "inmunogénico" se entiende que un compuesto provoca la producción de anticuerpos o derivados de anticuerpos y, además o como alternativa, una respuesta mediada por un linfocito T, dirigida al compuesto o a una porción del mismo. El compuesto es un "inmunógeno".

Un "ligando" es un compuesto, composición o resto que es capaz de unirse específicamente por un resto de unión, incluyendo, sin limitación, un receptor y un anticuerpo o derivado de anticuerpo.

Una "proteína de membrana" es una proteína encontrada en la membrana completa o en una parte. Normalmente, una proteína de membrana tiene (1) al menos un dominio de anclaje a membrana, (2) al menos un dominio transmembrana, o (3) al menos un dominio que interactúa con una proteína que tiene (1) o (2).

Un "ORF" o "marco de lectura abierto" es una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos de un polipéptido conocido, predicho o hipotético. Un ORF está unido en su extremo 5' a un codón de inicio (generalmente ATG) y en su extremo 3' a un codón de terminación (es decir, TAA o TGA). Un ORF que codifica una secuencia de 10 aminoácidos comprende 33 nucleótidos (3 para cada uno de los 10 aminoácidos y 3 para un codón de terminación). Los ORF pueden codificar secuencias de aminoácidos que comprenden desde 10, 25, 50, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 o más aminoácidos.

Los términos "eubacteria" y "procariota" se usan en el presente documento del modo que se usan estos términos por los expertos en la materia. Los términos "eubacteriano" y "procariótico" abarcan eubacterias, incluyendo bacterias tanto gram negativas como gram positivas, virus de procariotas (por ejemplo, bacteriófagos), y parásitos intracelulares obligados (por ejemplo, Rickettsia, Chlamydia, etc.).

Un "sitio activo" es cualquier porción o región de una molécula necesario para, o que regula, una actividad de la molécula. En el caso de una proteína, un sitio activo puede ser un sitio de unión para un ligando o un sustrato, un sitio activo de una enzima, un sitio que dirige o sufre cambio conformacional en respuesta a una señal, o un sitio de modificación postraduccional de una proteína.

En un poroplasto, se han eliminado la membrana externa eubacteriana (ME) y el LPS. En un esferoplasto, las porciones de una ME eubacteriana rota y/o pared celular rota pueden mantenerse asociadas con la membrana interna de la minicélula, pero la membrana es igualmente porosa debido a que la permeabilidad de la ME rota ha aumentado. Una membrana es la que se va a "romper" cuando la estructura de la membrana se ha tratado con un agente, o se ha incubado en condiciones que conducen a la degradación parcial de la membrana, aumentando de este modo la permeabilidad de la misma. Por el contrario, una membrana que se ha "degradado" está esencialmente, para las intenciones y fines aplicables, eliminada. En realizaciones preferidas, independientemente de la condición de la ME y de la pared celular, la membrana interna eubacteriana no está rota, y las proteínas de membrana mostradas en la membrana interna están accesibles a compuestos que se ponen en contacto con la minicélula, poroplasto, esferoplasto, protoplasto o poroplasto celular, según sea el caso.

Las células hospedadoras (y/o minicélulas) que portan una construcción de expresión son componentes de sistemas de expresión.

Un "vector de expresión" es una molécula de ácido nucleico artificial en la que puede insertarse un ORF exógeno que codifica una proteína, o un patrón de un ácido nucleico bioactivo de tal modo que está unido operativamente a secuencias de expresión adecuadas que dirigen la expresión del gen exógeno. Los vectores de expresión preferidos son vectores episómicos que pueden replicarse independientemente de la replicación cromosómica.

Por la expresión "unido operativamente" se entiende que los productos génicos codificados por las secuencias de ácido nucleico no de vector se producen a partir de un elemento de expresión in vivo.

La expresión "producto génico" se refiere bien a un ácido nucleico (el producto de transcripción, transcripción inversa, o replicación) o a un polipéptido (el producto de la traducción) que se produce usando las secuencias de ácido nucleico no de vector como molde.

Una "construcción de expresión" es un vector de expresión en el que se ha insertado una secuencia nucleotídica de interés de tal forma que se posiciona para que esté unida operativamente a las secuencias de expresión presentes en el vector de expresión. Las construcciones de expresión preferidas son episómicas.

Un "elemento de expresión" es un ácido nucleico que tiene secuencias de nucleótido que están presentes en una construcción de expresión pero no en su vector de expresión afín. Es decir, un elemento de expresión para un polipéptido es un ácido nucleico que comprende un ORF unido operativamente a secuencias de expresión adecuadas. Un elemento de expresión puede retirarse de su construcción de expresión y ponerse en otros vectores de expresión o en ADN cromosómico.

Las "secuencias de expresión" son secuencias de ácido nucleico que se unen a factores necesarios para la expresión de genes que se han insertado en un vector de expresión. Un ejemplo de una secuencia de expresión es un promotor, una secuencia que se une a ARN polimerasa, que es la enzima que produce moléculas de ARN usando ADN como molde. Un ejemplo de una secuencia de expresión que es tanto inducible como represible es el operón de L-arabinosa (araC). Véase Schleif R. Regulation of the L-arabinose operon of Escherichia coli. Trends Genet. dic. 2000 ;16(12):559-65.

En la presente divulgación, "un ácido nucleico" o "el ácido nucleico" se refiere a una molécula específica de ácido nucleico. Por el contrario, el término "ácido nucleico" se refiere a cualquier colección de diversas moléculas de ácido nucleico, y por lo tanto significa que está presente cualquier número de diferentes tipos de ácido nucleico. A modo de ejemplo no limitante, un ácido nucleico puede ser un ADN, un ARNbc, un ARNt (incluyendo un ARNt de uso de codón raro), un ARNm, un ARN ribosomal (ARNr), un ácido peptidonucleico (APN), un híbrido ADN:ARN, un oligonucleótido antisentido, una ribozima, o un aptámero.

La invención descrita en el presente documento se refiere a composiciones y procedimientos para la producción de células arqueobacterianas y eubacterianas acromosómicas y células eucariotas anucleadas que se usan para aplicaciones diagnósticas y terapéuticas, para el descubrimiento de fármacos, y como herramientas de investigación.

La ventaja general de las minicélulas frente a los sistemas de expresión basados en células (por ejemplo, células eucariotas o sistemas de expresión bacteriana) es que se pueden expresar proteínas heterólogas unidas a membrana o sobreexpresar proteínas endógenas unidas a membrana, proteínas solubles citoplásmicas o secretadas, o moléculas pequeñas en las superficies citoplásmicas o extracelulares de las minicélula que de otro modo serían tóxicas para células vivas. Las minicélulas también son ventajosas para proteínas que requieren un ambiente lipídico particular para el funcionamiento adecuado debido a que es muy manipulable en la naturaleza. Otras ventajas incluyen la estabilidad de las minicélulas debido a la ausencia de toxicidad, el elevado nivel de expresión que puede lograrse en la minicélula, y la naturaleza flexible eficaz del sistema de expresión en minicélulas. Dichas minicélulas pueden usarse para direccionar in vivo o para absorción selectiva (es decir, "esponjas" moleculares) y estas moléculas pueden expresarse y "mostrarse" a altos niveles. Las minicélulas también pueden usarse para mostrar proteínas para exploración de bajo, medio, alto, y ultra alto rendimiento, formación de cristales para determinación de estructura, y para uso en investigación in vitro, solo aplicaciones tales como transfección. Las minicélulas que expresan proteínas o moléculas pequeñas, radioisótopos, reactivos potenciadores de la obtención de imágenes pueden usarse para diagnósticos in vivo y para diagnóstico in vitro y plataformas de ensayo. Asimismo,

los elementos de la cascada de señalización solubles y/o asociados a membrana pueden reconstituirse en minicélulas que producen dispositivos encapsulados para seguir los sucesos de estimulación extracelular usando sucesos indicadores citoplásmicos, por ejemplo, transactivación resultante de la dimerización de la activación o represión transcripcional dependiente de dimerización de dicho indicador.

En lo referente a la expresión de proteínas, las minicélulas pueden diseñarse para expresar una o más proteínas recombinantes para producir más proteína por área superficial de la partícula (al menos 10 X más proteína por unidad de área superficial de proteína). Las proteínas o moléculas pequeñas que "se muestran" en las superficies de la minicélula pueden tener un beneficio terapéutico, de descubrimiento o diagnóstico bien cuando se inyectan en un paciente o cuando se usan en un modo de absorción selectiva durante la diálisis. Las proteínas que son normalmente solubles pueden ligarse a dominios de anclaje a membrana o las proteínas de membrana pueden expresarse con el fin de mostrar esas proteínas en las superficies de la partícula de minicélula en modos terapéuticos, de descubrimiento y diagnósticos. Los tipos de proteínas que pueden mostrarse incluyen, pero sin limitación, receptores (por ejemplo, GPCR, receptores de esfingolípidos, receptores de neurotransmisores, receptores sensoriales, receptores de factor de crecimiento, receptores de hormonas, receptores de quimiocinas, receptores de citocinas, receptores inmunológicos, y receptores de complemento, receptores FC), canales (por ejemplo, canales de potasio, canales de sodio, canales de calcio), poros (por ejemplo, proteínas de poro nucleares, canales de agua), bombas de iones y otros (por ejemplo, bombas de calcio, bombas de protones), intercambiadores (por ejemplo, intercambiadores de sodio/potasio, intercambiadores de sodio/hidrógeno, intercambiadores de potasio/hidrógeno), proteínas transportadoras de electrones (por ejemplo, citocromo oxidasa), enzimas y cinasas (por ejemplo, proteínas cinasas, ATPasas, GTPasas, fosfatasas, proteasas), proteínas estructurales/enlazantes (por ejemplo, caveolinas, clatrina), proteínas adaptadoras (por ejemplo, TRAD, TRAP, FAN), proteínas quimiotácticas/de adhesión (por ejemplo, ICAM11, selectinas, CD34, VCAM-1, LFA-1, VLA-1), y proteínas quiméricas/de fusión (por ejemplo, proteínas en las que se une una proteína normalmente soluble a una región transmembrana de otra proteína). Como ejemplo no limitante, las moléculas pequeñas que pueden unirse y mostrarse en las superficies de las minicélulas pueden ser carbohidratos (por ejemplo, monosacáridos), lípidos bioactivos (por ejemplo, lisoesfingolípidos, PAF, lisofosfolípidos), fármacos (por ejemplo, antibióticos, activadores/inhibidores de canales de iones, ligandos para receptores y/o enzimas), ácidos nucleicos (por ejemplo, oligonucleótidos sintéticos), fluoróforos, metales, o moléculas pequeñas orgánicas e inorgánicas encontradas típicamente en bibliotecas de química combinatorias. Las minicélulas pueden bien contener (encapsular) o mostrar o en su superficie radionúclidos o reactivos potenciadores de la obtención de imágenes, ambos de los cuales pueden usarse para beneficio terapéutico y/o diagnóstico in vivo o para ensayos in vitro y plataformas diagnósticas.

Para usos terapéuticos in vivo, las minicélulas pueden expresar proteínas y/o mostrar moléculas pequeñas en sus superficies que pueden promover bien una respuesta inmunitaria y el pase a través del sistema del REL (por ejemplo, para eliminar la minicélula y su diana rápidamente), o para esquivar el REL (por ejemplo, para aumentar la biodisponibilidad de la minicélula). La toxicidad se reduce o elimina debido a que el agente terapéutico no se excreta

o procesa por el hígado, y por lo tanto no daña a los riñones o al hígado, debido a que el agente terapéutico basado en minicélulas no está activado hasta que entra en la célula diana (por ejemplo, en el caso de agentes terapéuticos para el cáncer o para terapia génica). Las minicélulas son del tamaño adecuado (de aproximadamente 0,005, 0,1, 0,15 o 0,2 micras a aproximadamente 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45 o 0,5 micras) para facilitar la penetración profunda en los pulmones en los casos donde la administración del agente terapéutico o diagnóstico basado en minicélulas es mediante un inhalante (Strong, A. A., y col., 1987. An aerosol generator system for inhalation delivery of pharmacological agents. Med. Instrum. 21:189-194). Esto se debe al hecho de que las minicélulas pueden pulverizarse. Sin quedar limitados a los siguientes ejemplos, los usos terapéuticos de inhalante de minicélulas pueden aplicarse al tratamiento del choque anafiláctico, infecciones virales, reacciones inflamatorias, terapia génica para fibrosis cística, tratamiento de cánceres de pulmón, y síndrome de malestar fetal.

Las minicélulas también pueden mostrar proteínas expresadas que son enzimas que pueden tener usos terapéuticos y/o diagnósticos. Las enzimas que se muestran pueden ser enzimas solubles que se expresan como proteínas de fusión con un dominio transmembrana de otra proteína. La presentación de dichas enzimas puede usarse para ensayos in vitro o para beneficio terapéutico.

Las aplicaciones de terapia génica proporcionadas por minicélulas implican generalmente la capacidad de las minicélulas para administrar ADN a células diana (tanto para terapia de reemplazo, modificación de la función celular

o para eliminar células). Pueden administrarse plásmidos de expresión a células diana que pueden codificar proteínas que pueden ser citoplásmicas o que pueden tener secuencias de señal intracelular que pueden dirigir la proteína a un orgánulo concreto (por ejemplo, mitocondria, núcleo, retículo endoplasmático, etc.). En el caso donde las minicélulas se envuelven por la célula diana, las minicélulas en sí pueden tener estas secuencias de direccionamiento intracelular expresadas en sus superficies, de tal forma que las minicélulas pueden "administrarse" a dianas intracelulares.

Las minicélulas usadas para las siguientes aplicaciones terapéuticas, de descubrimiento y diagnósticas pueden prepararse tal como se describe en esta solicitud y después clasificarse y/o empaquetarse por una diversidad de modos, incluyendo, pero sin limitación, liofilización, congelación, mezcla con conservantes (por ejemplo, antioxidantes, glicerol), o almacenarse y envasarse de otro modo de una manera similar a los procedimientos usados para formulaciones de liposomas y proteoliposomas.

El pequeño tamaño de las minicélulas (de aproximadamente 0,005, 0,1, 0,15 o 0,2 micras a aproximadamente 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45 o 0,5 micras) las hace adecuadas para muchas plataformas diagnósticas in vitro, incluyendo los ejemplos no limitantes de flujo lateral, ELISA, HTS, especialmente aquellas aplicaciones que requieren de microesferas o nanoesferas que muestran muchas proteínas diana u otras moléculas. El uso de minicélulas de protoplasto o poroplasto puede ser especialmente útil en este respecto. Las técnicas de ensayo son dependientes del tamaño de la célula o partícula, de la cantidad de proteína (o molécula que se va a ensayar) mostrada en la superficie de la célula o partícula, y de la sensibilidad del ensayo que se esté midiendo. En los sistemas actuales de células completas, la expresión de la proteína de interés es limitante, dando como resultado el requerimiento de mayor número de células para satisfacer la sensibilidad de la mayoría de los ensayos. Sin embargo, el tamaño relativamente grande de las células evita la incorporación de grandes números de células en estos ensayos, por ejemplo, de 96, 384, y formatos de menos pocillos. Por el contrario, las minicélulas, protoplastos y poroplastos son de tamaño menor y pueden manipularse para expresar elevados niveles de la proteína seleccionada previamente, y pueden incorporarse en formatos de ensayo de pocillos pequeños.

I. Tipos de minicélulas

Las minicélulas son derivados de células que carecen de ADN cromosómico y que en ocasiones se citan como células anucleadas. Debido a que las células eubacterianas y arqueobacterianas, a diferencia de las células eucariotas, no tienen un núcleo (un orgánulo diferenciado que contiene los cromosomas), estas minicélulas no eucariotas se describen con más precisión como "sin cromosomas" o "acromosómicas", en oposición a "anucleadas". Sin embargo, los expertos en la materia a menudo usan el término "anucleada" cuando se refieren a minicélulas bacterianas además de a otras minicélulas. Por consiguiente, en la presente divulgación, el término "minicélulas" abarca derivados de células eubacterianas que carecen de un cromosoma; derivados de células arqueobacterianas que carecen de su cromosoma (o sus cromosomas) (Laurence y col., Nucleoid Structure and Partition in Methanococcus jannaschii: An Archaeon With Multiple Copies of the Chromosome, Genetics 152:13151323,1999); y derivados anucleados de células eucariotas. Se entiende, sin embargo, que parte de la técnica relevante puede usar los términos "minicélulas anucleadas" o "células anucleadas" de manera laxa para referirse a cualquiera de los tipos precedentes de minicélulas.

I.A. Minicélulas eubacterianas

Un tipo de minicélula es una minicélula eubacteriana. Para revisiones del ciclo celular eubacteriano y de los procesos de división, véase Rothfield y col., Bacterial Cell Division, Annu. Rev. Genet., 33:423-48,1999; Jacobs y col., Bacterial cell division: A moveable feast, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:5891-5893, mayo de 1999; Koch, The Bacterium’s Way for Safe Enlargement and Division, Appl. and Envir. Microb., Vol. 66, Nº 9, págs. 3657-3663; Bouche y Pichoff, On the birth and fate of bacterial division sites. Mol Microbiol, 1998. 29:19-26; Khachatourians y col., Cell growth and division in Escherichia coli: a common genetic control involved in cell division and minicell formation. J Bacteriol, 1973. 116: 226-229; Cooper, The Escherichia coli cell cycle. Res Microbiol, 1990. 141: 17-29; y Danachie y Robinson, "Cell Division: Parameter Values and the Process", en: Escherichia Coli and Salmonella Typhimurium: Cellular and Molecular Biology, Neidhardt, Frederick C., Editor Jefe, American Society for Microbiology, Washington, DC., 1987, Volumen 2, páginas 1578-1592, y referencias citadas en la misma; y Lutkenhaus y col., "Cell Division", Capítulo 101 en: Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology, 2ª Ed., Neidhardt, Frederick C., Editor Jefe, American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1996, Volumen 2, páginas 1615-1626, y referencias citadas en la misma. Cuando se altera la replicación del ADN y/o el reparto cromosómico, las vesículas unidas a membrana se "quitan" de las células progenitoras antes de que se complete la transferencia del ADN cromosómico. Como resultado de este tipo de división disfuncional, se producen minicélulas que contienen intactas la membrana externa, la membrana interna, la pared celular, y todos los componentes del citoplasma, pero no contienen ADN cromosómico. Véase la Tabla 2.

I.B. Minicélulas eucariotas

El término "eucariota" se define tal como se usa en la técnica, e incluye cualquier organismo clasificado como Eucarya que se clasifican normalmente en cuatro reinos: plantas, animales, hongos y protistas. Los tres primeros de estos corresponden a grupos filogenéticamente coherentes. Sin embargo, los protistas eucariotas no forman un grupo, sino que están comprendidos en muchos grupos filogenéticamente dispares (incluyendo mohos mucilaginosos, múltiples formas de algas, y muchos grupos distintos de protozoos). Véase, por ejemplo, Olsen, G., http://www.bact.wisc.edu/microtextbook/. Un tipo de animal de interés particular es un mamífero, incluyendo, a modo de ejemplo no limitante una rata, un ratón, un conejo, un perro, un gato, un caballo, una vaca, un cerdo, un simio y un ser humano.

Las minicélulas eucariotas acromosómicas (es decir, células anucleadas) se encuentran dentro del alcance de la invención. Las plaquetas son ejemplos no limitantes de minicélulas eucariotas. Las plaquetas son células anucleadas con poca o ninguna capacidad para la síntesis de proteínas de novo. La estrecha regulación de la síntesis de proteínas en plaquetas (Smith y col., Platelets and stroke, Vasc Med 4:165-72, 1999) puede permitir la sobreproducción de proteínas exógenas y, a la vez, la producción menor de proteínas endógenas. Los elementos de expresión activados por trombina, tales como aquellos que se asocian con Bcl-3 (Weyrich y col., Signal-dependent translation of a regulatory protein, Bcl-3, in activated human platelets, Cel Biology 95:5556-5561, 1998) pueden

usarse para modular la expresión de genes exógenos en plaquetas.

Como otro ejemplo no limitante, se generan minicélulas eucariotas a partir de líneas celulares tumorales (Gyongyossy-Issa y Khachatourians, Tumour minicells: single, large vesicles released from cultured mastocytoma cells (1985) Tissue Cell 17:801-809; Melton, Cell fusion-induced mouse neuroblastomas HPRT revertants with variant enzyme and elevated HPRT protein levels (1981) Somatic Cell Genet 7: 331-344).

Las células de levadura se usan para generar minicélulas fúngicas. Véase, por ejemplo, Lee y col., Ibd1p, a possible spindle pole body associated protein, regulates nuclear division and bud separation in Saccharomyces cerevisiae, Biochim Biophys Acta 3:239-253, 1999; Kopecka y col., A method of isolating anucleated yeast protoplasts unable to synthesize the glucan fibrillar component of the wall J Gen Microbiol 81:111-120, 1974; y Yoo y col., Fission yeast Hrp1, a chromodomain ATPase, is required for proper chromosome segregation and its overexpression interferes with chromatin condensation, Nucl Acids Res 28:2004-2011,2000. La división celular en levaduras se revisa por Gould y Simanis, The control of septum formation in fission yeast, Genes & Dev 11:2939-51,1997).

I.C. Minicélulas arqueobacterianas

El término "arqueobacteria" se define tal como se usa en la técnica, e incluye termófilas extremas y otras arqueas. Woese, C.R., L. Magrum. G. Fox. 1978. Archeabacteria. Journal of Molecular Evolution. 11:245-252. Tres tipos de arqueobacterias son las halófilas, las termófilas y las metanógenas. Por definición fisiológica, las Archaea (de manera informal, arqueas) son termófilas unicelulares extremas (incluyendo termoacidófilas), reductoras de sulfato, metanógenas, y halófilas extremas. Los miembros termófilos de las arqueas incluyen los organismos más termófilos cultivados en laboratorio. Las termófilas aerobias también son acidófilas; oxidan azufre en su ambiente a ácido sulfúrico. Las halófilas extremas son aeróbicas o microaerófilas e incluyen los organismos más tolerantes a la sal conocidos. Las arqueas reductoras de sulfato reducen el sulfato a sulfuro en un ambiente extremo. Las metanógenas son anaerobias estrictas, aunque dieron lugar a al menos dos grupos aerobios separados: las halófilas y un linaje termoacidófilo (Olsen, G., http://www.bact.wisc.edu/microtextbookn. Los ejemplos no limitantes de halófilas incluyen Halobacterium cutirubrum y Halogerax mediterranei. Los ejemplos no limitantes de metanógenas incluyen Methanococcus voltae; Methanococcus vanniela; Methanobacterium thermoautotrophicum; Methanococcus voltae; Methanothermus fervidus; y Methanosarcina barkeri. Los ejemplos no limitantes de termófilas incluyen Azotobacter vinelandii, Thermoplasma acidophilum; Pyrococcus horikoshii; Pyrococcus furiosus; y especies de Crenarchaeota (arqueobacterias extremadamente termófilas) tales como Sulfolobus solfataricus y Sulfolobus acidocaldarius.

Las minicélulas arqueobacterianas se encuentran dentro del alcance de la invención. Las arqueobacterias tienen homólogos de genes y proteínas de minicélulas eubacterianas, tales como el polipéptido MinD de Pyrococcus furiosus (Hayashi y col., EMBO J 2001 20:1819-28, Structural and functional studies of MinD ATPase: implications for the molecular recognition of the bacterial cell division apparatus). Por lo tanto, es posible crear minicélulas arqueobacterianas mediante procedimientos tales como, a modo de ejemplo no limitante, sobreexpresar el producto de un gen min aislado a partir de un procariota o una arqueobacteria; o interrumpir la expresión de un gen min en una arqueobacteria de interés mediante, por ejemplo, la introducción de mutaciones en el mismo o moléculas antisentido en este. Véase, por ejemplo, Laurence y col., Nucleoid Structure and Partition in Methanococcus jannaschii: An Archaeon With Multiple Copies of the Chromosome, Genetics 152:1315-1323,1999.

En un aspecto, la invención se refiere a minicélulas de arqueas. Por definición fisiológica, las Archaea (de manera informal, arqueas) son termófilas unicelulares extremas (incluyendo termoacidófilas), reductoras de sulfato, metanógenas, y halófilas extremas. Los miembros termófilos de las arqueas incluyen los organismos más termófilos cultivados en laboratorio. Las termófilas aerobias también son acidófilas; oxidan azufre en su ambiente a ácido sulfúrico. Las halófilas extremas son aeróbicas o microaerófilas e incluyen los organismos más tolerantes a la sal conocidos. Las arqueas reductoras de sulfato reducen el sulfato a sulfuro en un ambiente extremo. Las metanógenas son anaerobias estrictas, aunque dieron lugar a al menos dos grupos aerobios separados: las halófilas y un linaje termoacidófilo (Olsen, G., http://www.bact.wisc.edu/microtextbook/).

II. Producción de minicélulas

Las minicélulas eubacterianas se producen por células progenitoras que tienen una mutación en, y/o que sobreexpresan, o expresan de menos un gen implicado en la división celular y/o en el reparto cromosómico, o a partir de células progenitoras que se han expuesto a determinadas condiciones, que dan como resultado la fisión aberrante de células bacterianas y/o reparto en una segregación cromosómica anormal durante la fisión celular (división). La expresión "células progenitoras" o "células parentales" se refiere a las células a partir de las cuales se producen las minicélulas. Las minicélulas, la mayoría de las cuales carecen de ADN cromosómico (Mulder y col., The Escherichia coli minB mutation resembles gyrB in Defective nucleoid segregation and decreased negative supercoiling of plasmids. Mol Gen Genet, 1990, 221: 87-93), son generalmente, pero no necesariamente, más pequeñas que sus células progenitoras. Normalmente, las minicélulas producidas a partir de células de E. coli son generalmente de forma esférica y tienen un diámetro de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,3 um, mientras que las células de E. coli completas tienen de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 um de diámetro y de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 um de longitud. Las micrografías de E. coli y minicélulas que se han

teñido con DAPI (4:6-diamidino-z-fenilindol), un compuesto que se une al ADN, demuestran que las minicélulas no se tiñen, mientras que las E. coli parentales se tiñen de manera brillante. Dichas micrografías demuestran la ausencia de ADN cromosómico en las minicélulas. (Mulder y col., Mol. Gen. Genet. 221:87-93, 1990).

Tal como se muestra en la Tabla 2, las minicélulas se producen mediante varios mecanismos diferentes, tales como, a modo de ejemplo no limitante, la sobreexpresión de genes implicados en la replicación y reparto cromosómico, mutaciones en dichos genes, y la exposición a varias condiciones ambientales. La "sobreexpresión" se refiere a la expresión de un polipéptido o proteína codificado por un ADN introducido en una célula hospedadora, en el que el polipéptido o proteína no está normalmente en la célula hospedadora, o en el que el polipéptido o proteína está presente en la célula hospedadora a un nivel mayor que aquel expresado normalmente a partir del gen endógeno que codifica el polipéptido o proteína. Por ejemplo, en células de E. coli que sobreexpresan el producto génico FtsZ (el gen FtsZ codifica una proteína que está implicada en la regulación de las divisiones; véase Cook y Rothfield, Early stages in development of the Escherichia coli cell-division site. Mol Microbiol, 1994. 14: p. 485-495; y Lutkenhaus, Regulation of cell division in E. coli. Trends Genet, 1990. 6: p. 22-25), hay un aumento en la formación de minicélulas (Begg y col., Roles of FtsA and FtsZ in the activation of division sites. J. Bacteriology, 1997. 180: 881884). Las minicélulas también se producen por células de E. coli que tienen una mutación en uno o más genes del locus de min, que es un grupo de genes que codifica proteínas que están implicadas en la división celular (de Boer y col., Central role for the Escherichia coli minC gene product in two different cell division-inhibition systems. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990. 87:1129-33; Akerlund y col., Cell division in Escherichia coli minB mutants. Mol Microbiol, 1992. 6: 2073-2083).

Los procariotas que han mostrado producción de minicélulas incluyen especies de Escherichia, Shigella, Bacillus, Lactobacillus, y Campylobacter. Las especies bacterianas productoras de minicélulas de interés particular son E. coli y Bacillus subtilis. E. coli es susceptible de manipulación mediante una serie de procedimientos de genética molecular, con una variedad de sistemas de expresión bien caracterizados, incluyendo muchos sistemas, factores y elementos de expresión episómica útiles en la presente invención. B. subtilis, también susceptible a manipulación genética usando elementos de expresión episómicos, es un organismo industrial importante implicado en la producción de muchas de las enzimas industriales mundiales (proteasas, amilasas, etc.), las cuales produce y secreta de manera eficiente.

En el caso de otras especies eubacterianas, se conocen homólogos de E. coli o B. subtilis que causan producción de minicélulas en estos o pueden identificarse y caracterizarse de manera conocida en la técnica. Por ejemplo, se han caracterizado las regiones min del cromosoma de Streptococcus pneumoniae y de Neisseria gonorrhoeae (Massidda y col., Unconventional organization of the division and cell wall gene cluster of Streptococcus pneumoniae, Microbiology 144:3069-78, 1998; y Ramirez-Arcos y col., Microbiology 147:225-237, 2001 y Szeto y col., Journal of Bacteria 183(21):6253, 2001, respectivamente). Los expertos en la materia serán capaces de aislar mutantes productores de minicélulas (min), o de preparar compuestos inhibidores para genes que inducen una producción de minicélulas (por ejemplo, trascritos antisentido para min).

Tabla 2: Cepas eubacterianas, mutaciones y condiciones que promueven la formación de minicélulas

Especie

Cepa Notas Referencias

Campylobacter jejuni

puede ocurrir de manera natural de manera tardía en el ciclo de crecimiento Brock y col., 1987

Bacillus subtilis

Mutaciones en el locus divlVB (inc. minC, minD Barak y col., 1999

mutaciones de ripX

Sciochetti y col., 1999; Lemon y col., 2001

mutaciones en smc

Moriya y col., 1998; Britton y col., 1998

deleciones en oriC

Moriya y col., 1997; Hassan y col., 1997

mutaciones en prfA

Pederson y Setlow, 2001

Mutaciones en el locus de divlVA

Cha y col., 1997

B.s. 168

mutación de TsB143 en inicio de ts Sargent, 1975

Bacillus cereus

WSBC 10030 Inducida por exposición a polifosfato de cadena larga Maier y col., 1999

(continuación)

Especie

Cepa Notas Referencias

Shigella flexneri (2a)

MC-1 Gemski y col., 1980

S. dysenteriae (1)

MC-V Gemski y col., 1980

Lactobacillus spp.

Cepas productoras de minicélulas variantes aisladas de granos Pidoux y col., 1990

Neisseria gonorrhoeae

deleción o sobreexpresión de homólogos de min Ramirez-Arcos y col., 2001; Szeto y col., 2001

Escherichia coli

mutaciones en MinA Frazer y col., 1975; Cohen y col. 1976

mutaciones y deleciones en MinB

Adler y col., 1967; Davie y col., 1984; Schaumberg y col.; 1983; Jaffe y col., 1988; Akerlund y col., 1992

CA8000

mutaciones en cya, crp Kumar y col.; 1979

mutación en MukA1

Hiraqa y col., 1996

mutaciones en MukE, mukF

Yamanaka y col., 1996

mutación en hns

Kaidow y col., 1995

DS410

Heighway y col., 1989

χ1972, χ1776 y χ2076

Curtiss, 1980

P678-54

Mutaciones de división celular sensible a la temperatura Adler y col. 1967; Allen y col., 1972; Hollenberg y col., 1976

Inducida por la sobreexpresión de proteína minB

De Boer y col., 1988

inducida por la sobreexpresión de proteína minE o derivados

Pichoff y col., 1995

Inducida por la sobreproducción del gen ftsZ

Ward y col., 1985

Inducida por la sobreexpresión del gen sdiA

Wang y col., 1991

Inducida por la sobreexpresión de los genes min de Neisseria gonorrhoeae

Ramirez-Arcos y col., 2001; Szeto y col., 2001

Inducida por la exposición a EGTA

Wachi y col., 1999

Legionella Pneumophila

Inducida por la exposición a ampicilina Elliot y col., 1985

Citas para la Tabla 2: Adler y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 57:321-326 (1967) Akerlund y col., Mol. Microbiol. 6:2073-2083 (1992) Allen y col., Biochem. Biophys. Res. Communi. 47:1074-1079 (1972) Barak y col., J. Bacterial. 180:5237-5333 (1998) Britton y col., Genes Dev. 12:1254-9 (1998) Brock y col., Can. J. Microbiol. 33:465-470 (1987) Cha y col., J. Bacteriol. 179:1671-1683 (1997) Cohen y col., Genetics 56:550-551 (1967) Curtiss, Roy III, Patente de Estados Unidos Nº 4.190.495; publicada el 26 de febrero de 1980 Davie y col., J. Bacteriol. 170:2106-2112 (1988) Elliott y col., J. Med. Microbiol, 19:383-390 (1985) Frazer y col., Curr. Top. Immunol. 69:1-84 (1975) Gemski y col., Infect. Immun. 30:297-302 (1980) Hassan y col., J. Bacteriol. 179:2494-502 (1997) Heighway y col., Nucleic Acids Res. 17:6893-6901 (1989) Hiraga y col., J. Bacteriol. 177:3589-3592 (1995) Hollenberg y col., Gene 1:33-47 (1976) Kumar y col., Mol. Gen. Genet. 176:449-450 (1979) Lemon y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:212-7 (2001) Maier y col., Appl. Environ. Microbiol. 65:3942-3949 (1999) Moriya y col., DNA Res 4:115-26 (1997) Moriya y col., Mol. Microbiol. 29:179-87 (1998) Markiewicz y col., FEMS Microbiol. Lett. 70:119-123 (1992) Pederson Y Setlow, J. Bacteriol. 182:1650-8 (2001) Pichoff y col., Mol. Microbiol. 18:321-329 (1995) Pidoux y col., J. App. Bacterial 69:311-320 (1990) Ramirez-Arcos y col. Microbiol. 147:225-237 (2001) Sargent M.G., J. Bacterial. 123:1218-1234 (1975) Sciochetti y col., J. Bacteriol. 181:6053-62 (1999) Schaumberg y col., J. Bacteriol. 153:1063-1065 (1983) Szeto y col., Jour. of Bacter. 183 (21):6253 (2001) Wachi y col., Biochimie 81:909-913 (1999) Wang y col., Cell 42:941-949 (1985) Yamanaka y col., Mol. Gen. Genet. 250.241-251 (1996)

II.A. Construcción optimizada de minicélulas

Las minicélulas se producen por varias cepas diferentes eubacterianas y mecanismos que incluyen la sobreexpresión de genes endógenos o exógenos implicados en la división celular, la replicación y reparto cromosómico, mutaciones en dichos genes, y la exposición a varias condiciones químicas y/o físicas. Por ejemplo, en células de E. coli que sobreexpresan el producto génico FtsZ (el gen FtsZ codifica una proteína que está implicada en la regulación de la división celular; véase Cook y Rothfield, Early stages in development of the Escherichia coli cell-division site. Mol Microbiol, 1994. 14: p. 485-495; y Lutkenhaus, Regulation of cell division in E. coli. Trends Genet, 1990. 6: p. 22-25), hay un aumento en la formación de minicélulas (Begg y col., Roles of FtsA and FtsZ in the activation of division sites. J. Bacteriology, 1997. 180: 881-884). Las minicélulas también se producen por células de E. coli que tienen una mutación en uno o más genes del locus de min, que es un grupo de genes que codifica proteínas que están implicadas en la división celular (de Boer y col., Central role for the Escherichia coli minC gene product in two different cell division-inhibition systems. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990. 87:1129-33; Akerlund y col., Cell division in Escherichia coli minB mutants. Mol Microbiol, 1992. 6: 2073-2083).

Las células eubacterianas que han demostrado producir minicélulas incluyen, pero sin limitación, especies de Escherichia, Shigella, Bacillus, Lactobacillus, Legionella y Campylobacter. Las especies bacterianas productoras de minicélulas de interés particular son E. coli y Bacillus subtilis. Estos organismos son susceptibles de manipulación mediante una serie de procedimientos genéticos y moleculares, con una variedad de sistemas de expresión bien caracterizados, incluyendo muchos sistemas de expresión episómica y cromosómica, así como otros factores y elementos útiles en la presente invención.

Las siguientes secciones describen genes que pueden manipularse para estimular la producción de minicélulas. La invención puede incluir cualquiera de estos ejemplos no limitantes con el fin de preparar minicélulas. Además, estos genes y productos génicos y condiciones pueden usarse en metodologías para identificar otro gen (u otros genes), productos génicos, sucesos celulares, sucesos bioquímicos, o sucesos fisiológicos que inducen o promueven la producción de minicélulas. Estas metodologías incluyen, pero sin limitación, selección genética, exploración de bibliotecas de proteínas, ácidos nucleicos o combinatorias químicas, análisis de uno o dos híbridos, tecnologías de selección de presentación, por ejemplo, presentación en fago o levadura, estrategias de hibridación, por ejemplo, tecnología de matriz, y otras estrategias de alto o bajo rendimiento.

II.A.1. Homólogos

También pueden usarse homólogos de estos genes y productos génicos de otros organismos. Tal como se usa en el presente documento, un "homólogo" se define como un ácido nucleico o proteína que tiene una secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos, respectivamente, que es "idéntica", "esencialmente idéntica", "sustancialmente idéntica", "homóloga" o "similar" (tal como se describe a continuación) a una secuencia de referencia que puede, a modo de ejemplo no limitante, ser la secuencia de un ácido nucleico o proteína aislados, o una secuencia consenso derivada mediante comparación de dos o más ácidos nucleicos o proteínas relacionados, o un grupo de isoformas de un ácido nucleico o proteína dado. Los ejemplos no limitantes de tipos de isoformas incluyen isoformas de diferentes pesos moleculares que son el resultado de, por ejemplo, el corte y empalme alternativo de ARN o de la escisión proteolítica; e isoformas que tienen diferentes modificaciones postraduccionales, tales como glucosilación; y similares.

II.A.2. Genes de Escherichia coli

Los genes y productos génicos ilustrativos de E. coli, cuya expresión y/o secuencia puede manipularse para estimular la producción de minicélulas en E. coli o cualquier otro organismo, al igual que homólogos de los mismos de cualquier especie, incluyen, pero sin limitación, el gen bolA (Aldea, M., y col., 1988. Identification, cloning, and expression of bolA, an ftsZ-dependent morphogene of Escherichia coli. J. Bacteriol. 170:5196-5176; Aldea, M., y col., 1990. Division genes in Escherichia coli are expressed coordinately to cell septum requirements by gearbox promoters. EMBO J. 9:3787-3794); el gen chpA (Masuda, Y., y col., 1993. chpA and chpB, Escherichia coli chromosomal homologs of the pem locus responsible for stable maintenance of plasmid R100. J. Bacteriol. 175:6850-6856); el gen chpB (Masuda, Y., y col., 1993. chpA and chpB, Escherichia coli chromosomal homologs of the pem locus responsible for stable maintenance of plasmid R100. J. Bacteriol. 175:6850-6856); el gen chpR (chpAI) (Masuda, Y., y col., 1993. chpA and chpB, Escherichia coli chromosomal homologs of the pem locus responsible for stable maintenance of plasmid R100. J. Bacteriol. 175:6850-6856); el gen chpS (chpBI) (Masuda, Y., y col., 1993. chpA and chpB, Escherichia coli chromosomal homologs of the pem locus responsible for stable maintenance of plasmid R100. J. Bacteriol. 175:6850-6856); el gen crg (Redfield, R. J., y A. M. Campbell. 1987. Structurae of cryptic lambda prophages. J. Mol. Biol. 198:393-404); el gen crp (Kumar, S., y col., 1979. Control of minicell producing cell division by cAMP-receptor protein complex in Escherichia coli. Mol. Gen. Genet. 176:449-450); el gen cya (Kumar, S., y col., 1979. Control of minicell producing cell division by cAMP-receptor protein complex in Escherichia coli. Mol. Gen. Genet. 176:449-450); el gen dicA (Labie, C., y col., 1989. Isolation and mapping of Escherichia coli mutations conferring resistance to division inhibition protein DicB. J. Bacteriol. 171:4315-4319); el gen dicB (Labie, C., y col., 1989. Isolation and mapping of Escherichia coli mutations conferring resistance to division inhibition protein DicB. J. Bacteriol. 171:4315-4319; Labie, C., y col., 1990. Minicell-forming mutants of Escherichia coli: suppression of both DicB-and MinD-dependent division inhibition by inactivation of the minC gene product. J. Bacteriol. 1990. 172:5852-5858); el gen dicC (Bejar, S., y col., 1988. Cell division inhibition gene dicB is regulated by a locus similar to lambdoid bacteriophage immunity loci. Mol. Gen. Genet. 212:11-19); el gen dicF (Tetart, F., y J. P. Bouche. 1992. Regulation of the expression of the cell-cycle gene ftsZ by DicF antisense RNA. Division does not require a fixed number of FtsZ molecules. Mol. Microbiol. 6:615-620); el gen dif (Kuempel, P. L., y col., 1991. dif, a recA-independent recombination site in the terminus region of the chromosome of Escherichia coli. New Biol. 3:799811); el gen dksA (Yamanaka, K., y col., 1994. Cloning, sequencing, and characterization of multicopy suppressors of a mukB mutation in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 13:301-312); el gen dnaK (Paek, K. H., y G. C. Walker. 1987. Escherichia coli dnaK null mutants are inviable at high temperature. J. Bacteriol. 169:283-290); el gen dnaJ (Hoffman,

H. J., y col., 1992. Activity of the Hsp70 chaperone complex--DnaK, DnaJ, and GrpE--in initiating phage lambda DNA replication by sequestering and releasing lambda P protein. Proc. Natl. Acad. Sci. 89:12108-12111); el gen fcsA (Kudo, T., y col., 1977. Characteristics of a cold-sensitive cell division mutant Escherichia coli K-12. Agric. Biol. Chem. 41:97-107); el gen fic (Utsumi, R., y col., 1982. Involvement of cyclic AMP and its receptor protein in filamentation of an Escherichia coli fic mutant. J. Bacteriol. 151:807-812; Komano, T., y col., 1991. Functional analysis of the fic gene involved in regulation of cell division. Res. Microbiol. 142:269-277); el gen fis (Spaeny-Dekking, L. y col. 1995. Effects of N-terminal deletions of the Escherichia coli protein Fis on the growth rate, tRNA (2Ser) expression and cell morphology. Mol. Gen. Genet. 246:259-265); el gen ftsA (Bi, E., y J. Lutkenhaus. 1990. Analysis of ftsZ ,mutations that confer resistance to the cell division inhibitor SulA (SfiA). J. Bacterial. 172:5602-5609; Dai, K, y J. Lutkenhaus. 1992. The proper ration of FtsZ to FtsA is required for cell division to occur in Escherichia coli. J. Bacteriol. 174:6145-6151); el gen ftsE (Taschner, P.E. y col. 1988. Division behavior and shape changes in isogenic ftsZ, ftsQ, ftsA, pbpB, and ftsE cell division mutants of Escherichia coli during temperature shift experiments.

J. Bacteriol. 170:1533-1540); el gen ftsH (Ogura, T. y col. 1991. Structure and function of the ftsH gene in Escherichia coli. Res. Microbiol. 142:279-282); el gen ftsI (Begg, K. J., y W. D. Donachie. 1985. Cell shape and division in Escherichia coli: experiments with shape and division mutants. J. Bacteriol. 163:615-622); el gen ftsJ (Ogura, T. y col. 1991. Structure and function of the ftsH gene in Escherichia coli. Res. Microbiol. 142:279-282); el gen ftsL (Guzman, y col., 1992. FtsL, an essential cytoplasmic membrane protein involved in cell division in Escherichia coli. J. Bacteriol. 174:7716-7728); el gen ftsN (Dai, K. y col. 1993. Cloning and characterization of ftsN, an essential cell division gene in Escherichia coli isolated as a multicopy suppressor of ftsA12(Ts). J. Bacteriol. 175:3790-3797); el gen ftsQ (Wang, X. D. y col. 1991. A factor that positively regulates cell division by activating transcription of the major cluster of essential cell division genes of Escherichia coli. EMBO J. 10:3362-3372); el gen ftsW (Khattar, M. M. y col. 1994. Identification of FtsW and characterization of a new ftsW division mutant of

Escherichia coli. J. Bacteriol. 176:7140-7147); el gen ftsX (ftsS) (Salmond, G. P. y S. Plakidou. 1984. Genetic analysis of essential genes in the ftsE region of the Escherichia coli genetic map and identification of a new cell division gene, ftsS. Mol. Gen. Genet. 197:304-308); el gen ftsY (Gill, D. R. y G. P. Salmond. 1990. The identification of the Escherichia coli ftsY gene product: an unusual protein. Mol. Microbiol. 4:575-583); el gen ftsZ (Ward, J. E., y J. Lutkenhaus. 1985. Overproduction of FtsZ induces minicell formation. Cell. 42:941-949; Bi, E., y J. Lutkenhaus. 1993. Cell division inhibitors SulA and MinCD prevent formation of the FtsZ ring. J. Bacteriol. 175:1118-1125); el gen gyrB (Mulder, E., y col., 1990. The lacherichia coli minB mutation resembles gyrB in defective nucleoid segregation and decreased negative supercoiling of plasmids. Mol. Gen. Genet. 221:87-93); el gen hlfB (ftsH) (Herman, C., y col., 1993. Cell growth and lambda phage development controlled by the same essential Escherichia coli gene, ftsH/hflB. Proc. Natl. Acad. Sci. 90:10861-10865); el gen hfq (Takada, A., y col., 1999. Negative regulatory role of the Escherichia coli hfq gene in cell division. Biochem. Biophys. Res. Commun. 266:579-583; el gen hipA (Scherrer, R., y

H. S. Moyed. 1988. Conditional impairment of cell division and altered lethality in hipA mutants of Escherichia coli K

12. J. Bacteriol. 170:3321-3326); el gen hipB (Hendricks, E. C., y col., 2000. Cell division, guillotining of dimer chromosomes and SOS induction in resolution mutants (dif, xerC and xerD) of Escherichia coli. Mol. Microbiol. 36:973-981); el gen hns (Kaidow, A., y col., 1995. Anucleate cell production by Escherichia coli delta hns mutant lacking a histone-like protein, H-NS. J. Bacteriol. 177:3589-3592); el gen htrB (Karow, M., y col., 1991. Complex phenotypes of null mutations in the htr genes, whole products are essential for Escherichia coli growth at elevated temperatures. Res. Microbiol. 142:289-294); el gen IpxC (envA) (Beall, B., y J. Lutkenhaus. 1987. Sequence analysis, transcriptional organization, and insertional mutagenesis of the envA gene of Escherichia coli. J. Bacteriol. 169:5408-5415; Young, K., y col., 1995. The envA permeability/cell division gene of Escherichia coli encodes the second enzyme of lipid A biosynthesis. UDP-3-O-(R-3-hydroxymyristoyl)-N-acetylglucosamine deacetylase. J. Biol. Chem. 270:30384-30391); el gen malE (Pichoff, S., y col., 1997. MinCD-independent inhibition of cell division by a protein that fuses MalE to the topological specificity factor MinE. J. Bacteriol. 179:4616-4619); el gen minA (Davie, E., y col., 1984. Genetic basis of minicell formation in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 158:1202-1203); el gen minB (Davie, E., y col., 1984. Genetic basis of minicell formation in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 158:1202-1203); el gen minC (de Boer, P. A., y col., 1990. Central role for the Escherichia coli minC gene product in two different cell division-inhibition systems. Proc. Natl. Acad. Sci. 87:1129-1133); el gen minD (Labie, C., y col., 1990. Minicellforming mutants of Escherichia coli: suppression of both DicB-and MinD-dependent division inhibition by inactivation of the minC gene product. J. Bacteriol. 172:5852-5855; Hayashi, I., y col., 2001. Structural and functional studies of MinD ATPase: implications for the molecular recognition of the bacterial cell division apparatus. EMBO J. 20:18191828); el gen minE (de Boer, P. A., y col., 1989. A division inhibitor and a topological specificity factor coded for by the minicell locus determine proper placement of the division septum in E. coli. Cell. 56:641-649); el gen mreB (Doi, M., y col., 1988. Determinations of the DNA sequence of the mreB gene and of the gene products of the mre region that function in formation of the rod shape of Escherichia coli cells. J. Bacteriol. 170:4619-4624); el gen mreC (Wachi, M., y col., 1989. New mre genes mreC and mreD, responsible for formation of the rod shape of Escherichia coli cells.

J. Bacteriol. 171:6511-6516); el gen mreD (Wachi, M., y col., 1989. New mre genes mreC and mreD, responsible for formation of the rod shape of Escherichia coli cells. J. Bacteriol. 171:6511-6516); el gen mukA (Hiraga, S., y col., 1989. Chromosome partitioning in Escherichia coli: novel mutants producing anucleate cells. J. Bacteriol. 171:14961505); el gen mukB (Hiraga, S., y col., 1991. Mutants defective in chromosome partitioning in E. coli. Res. Microbiol. 142:189-194); el gen mukE (Yamanaka, K., y col., 1996. Identification of two new genes, mukE and mukF, involved in chromosome partitioning in Escherichia coli. Mol. Gen. Genet. 250:241-251; Yamazoe, M., y col., 1999. Complex formation of MukB, MukE and MukF proteins involved in chromosome partitioning in Escherichia coli. EMBO J. 18:5873-5884); el gen mukF (Yamanaka, K., y col., 1996. Identification of two new genes, mukE and mukF, involved in chromosome partitioning in Escherichia coli. Mol. Gen. Genet. 250:241-251; Yamazoe, M., y col., 1999. Complex formation of MukB, MukE and MukF proteins involved in chromosome partitioning in Escherichia coli. EMBO J. 18:5873-5884); el gen parC (Kato, J., y col., 1988. Gene organization in the region containing a new gene involved in chromosome partition in Escherichia coli. J. Bacteriol. 170:3967-3977); el gen parE (Roberts, R. C., y col., 1994. The parDE operon of the broad-host-range plasmid RK2 specifies growth inhibition associated with plasmid loss. J. Mol. Biol. 237:35-51); el gen pbpA (Rodriguez, M. C., y M. A. de Pedro. 1990. Initiation of growth in pbpAts and rodAts mutants of Escherichia coli. FEMS Microbiol. Lett. 60:235-239); el gen pcnB (Makise, M., y col., 1999. Identification of a high-copy-number plasmid suppressor of a lethal phenotype caused by mutant DnaA protein which has decreased intrinsic ATPase activity. Biol. Pharm. Bull. 22:904-909); el producto génico de parF (plsC en E. coli) de Salmonella (Luttinger, A. L., y col., 1991. A cluster of genes that affects nucleoid segregation in Salmonella typhimurium. New Biol. 3:687-697); el gen rpoS (Cam, K., y col., 1995. Sigma S-dependent overexpression of ftsZ in an Escherichia coli K-12 rpoB mutant that is resistant to the division inhibitors DicB and DicF RNA. Mol. Gen. Genet. 248:190-194); el gen rcsB (Gervais, F. G., y col., 1992. The rcsB gene, a positive regulator of colanic acid biosynthesis in Escherichia coli, is also an activator of ftsZ expression. J. Bacteriol. 174:3964-3971); el gen rcsF (Gervais, F. G., y G. R. Drapeau. 1992. Identification, cloning, and characterization of rcsF, a new regulator gene for exopolysaccharide synthesis that suppresses the division mutation ftsZ84 in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 174:8016-8022); el gen rodA (Rodriguez, M. C., y M. A. de Pedro. 1990. Initiation of growth in pbpAts and rodAts mutants of Escherichia coli. FEMS Microbiol. Lett. 60:235-239); el gen sdiA (sulB, sfiB) (Wang, X. D., y col., 1991. A factor that positively regulates cell division by activating transcription of the major cluster of essential cell division genes of Escherichia coli. EMBO J. 10:3363-3372); el gen sefA (fabZ) (Mohan, S., y col., 1994. An Escherichia coli gene (FabZ) encoding (3R)-hydroxy-myristoyl acyl carrier protein dehydrase. Relation to fabA and suppression of mutations in lipid A biosynthesis. J. Biol Chem. 269:32896-32903); el gen sfiC (D’ Ari, R., y O. Huisman. 1983. Novel mechanism of cell division inhibition associated with the SOS response in Escherichia coli. J. Bacteriol. 156:243-250); el gen sulA (Bi,

E., y J. Lutkenhaus. 1990. Interaction between the min locus and ftsZ. J. Bacteriol. 172:5610-5616; Bi, E., y J. Lutkenhaus. 1993. Cell division inhibitors SulA and MinCD prevent formation of the FtsZ ring. J. Bacteriol. 175:11181125); el gen stfZ (Dewar, S. J., y W. D. Donachie. 1993. Antisense transcription of the ftsZ-ftsA gene junction inhibits cell division in Escherichia coli. J. Bacteriol. 175:7097-7101); el gen tolC (Hiraga, S., y col., 1989. Chromosome partitioning in Escherichia coli: novel mutants producing anucleate cells. J. Bacteriol. 171:1496-1505; Hiraga, S., y col., 1991. Mutants defective in chromosome partitioning in E. coli. Res. Microbiol. 142:189-194); y el gen zipA (Hale, C. A., y P. A. de Boer. 1997. Direct binding of FtsZ to ZipA, an essential component of the septal ring structure that mediates cell division in E. coli. Cell. 88:175-185).

II.A.3. Genes de Bacillus subtilis

Los genes y productos génicos ilustrativos de B. subtilis, cuya expresión y/o secuencia puede manipularse para estimular la producción de minicélulas en B. subtilis o cualquier otro organismo, al igual que homólogos de los mismos de cualquier especie, incluyen, pero sin limitación, el gen divl (divD) (Van Alstyne, D., y M. I. Simon. 1971. Division mutants of Bacillus subtilis: isolation of PBS1 transduction of division-specific markers. J. Bacteriol. 108:1366-1379); el gen divlB (dds, ftsQ) (Harry, E. J., y col., 1993. Characterization of mutations in divlB of Bacillus subtilis and cellular localization of the DivlB protein. Mol. Microbiol. 7:611-621; Hany E. J., y col., 1994. Expression of divlB of Bacillus subtilis during vegetative growth. J. Bacteriol. 176:1172-1179); el producto génico de divIC de B. subtilis u homólogos de este gen o producto génico encontrado en otros miembros de las Eubacteria, Eucarya o Archaea puede usarse para producir minicélulas (Levin, P. A., y R. Losick. 1994. Characterization of a cell division gene from Bacillus subtilis that is required for vegetative and sporulation septum formation. J. Bacteriol. 176:14511459; Katis, V. L. , y col. 1997. The Bacillus subtilis division protein DivIC is a highly abundant membrane-bound protein that localizes to the division site; el gen divlI (divC) (Van Alstyne, D., y M. I. Simon. 1971. Division mutations of Bacillus subtilis: isolation and PBS1 transduction of division-specific markers. J. Bacteriol. 108:1366-1379); el gen divlVA (divD) (Cha, J.-H., y G. C. Stewart. 1997. The divlVA minicell locus of Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 179:16711683); el gen divlVC (divA) (Van Alstyne, D., y M. I. Simon. 1971. Division mutations of Bacillus subtilis: isolation and PBS1 transduction of division-specific markers. J. Bacteriol. 108:1366-1379); el gen divV (divB) (Van Alstyne, D., y

M. I. Simon. 1971. Division mutations of Bacillus subtilis: isolation and PBS1 transduction of division-specific markers.

J. Bacteriol. 108:1366-1379); el gen erzA (ytwP) (Levin, P. A., y col., 1999. Identification and regulation of a negative regulator of FtsZ ring formation in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. 96:9642-9647); el gen ftsA (spollN) (Feucht, A., y col., 2001. Cytological and biochemical characterization of the FtsA cell division protein of Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 40:115-125); el gen ftsE (Yoshida, K., y col., 1994. Cloning and nucleotide sequencing of a 15 kb region of the Bacillus subtilis genome containing the iol operon. Microbiology. 140:2289-2298); el gen ftsH (Deuerling. E., y col., 1995. The ftsH gene of Bacillus subtilis is transiently induced after osmotic and temperature upshift. J. Bacteriol. 177:4105-4112; Wehrl, W., y col., 2000. The FtsH protein accumulates at the septum of Bacillus subtilis during cell division and sporulation. J. Bacteriol. 182:3870-3873); el gen ftsK (Sciochetti, S. A., y col., 2001. Identification and characterization of the dif Site from Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 183:1058-1068); el gen ftsL (yllD) (Daniel, R. A., y col., 1998. Characterization of the essential cell division gene ftsL (ylld) of Bacillus subtilis and its role in the assembly of the division apparatus. Mol. Microbiol. 29:593-604); el gen ftsW (Ikeda, M., y col., 1989. Structural similarity among Escherichia coli FtsW and RodA proteins and Bacillus subtilis SpoVE protein, which function in cell division, cell elongation, and spore formation, respectively. J. Bacteriol. 171:6375-6378); el gen ftsX (Reizer, J., y col., 1998. A novel protein kinase that controls carbon catabolite repression in bacteria. Mol. Microbiol. 27:1157-1169); el gen ftsZ (Beall, B., y J. Lutkenhaus). FtsZ in Bacillus subtilis is required for vegetative septation and for asymmetric septation during sporulation. Genes and Dev. 5:447-45); el gen gcaD (Hove-Jensen, B. 1992. Identification of tms-26 as an allele of the gcaD gene, which encodes N-acetylglucosamine 1-phosphate uri-dyltransferase in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 174:6852-6856); el gen gid (ylyC) (Kunst, F., y col., 1997. The complete genome sequence of the grampositive bacterium Bacillus subtilis. Nature. 390:237-238); el gen gidA (Ogasawara, N., y H. Yoshikawa. 1992. Genes and their organization in the replication origin region of the bacterial chromosome. Mol. Microbiol. 6:629-634; Nakayashiki, T., y H. Inokuchi. 1998. Novel temperature-sensitive mutants of Escherichia coli that are unable to grow in the absence of wild-type tRNA6Leu. J. Bacteriol. 180:2931-2935); el gen gidB (Ogasawara, N., y H. Yoshikawa. 1992. Genes and their organization in the replication origin region of the bacterial chromosome. Mol. Microbiol. 6:629634; Nakayashiki, T., y H. Inokuchi. 1998. Novel temperature-sensitive mutants of Escherichia coli that are unable to grow in the absence of wild-type tRNA6Leu. J. Bacteriol. 180:2931-2935); el gen lytC (cwlB) (Blackman, S. A., y col., 1998. The role of autolysins during vegetative growth of Bacillus subtilis 168. Microbiology. 144:73-82); el gen lytD (cwlG) (Blackman, S. A., y col., 1998. The role of autolysins during vegetative growth of Bacillus subtilis 168. Microbiology. 144:73-82); el gen lytE (cwlF) (Ishikawa, S., y col., 1998. Regulation of a new cell wall hydrolase gene, cwlF, which affects cell separation in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 180:23549-2555); el gen lytF (cwlE, yhdD) (Ohnishi, R., y col., 1999. Peptidoglycan hydrolase lytF plays a role in cell separation with CwlF during vegetative growth of Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 181:3178-1384); el gen maf (Butler, Y. X., y col., 1993. Amplification of the Bacillus subtilis maf gene results in arrested septum formation. J. Bacteriol. 175:3139-3145); el gen minC (Varley, A. W., y G. C. Stewart. 1992. The divlVB region of the Bacillus subtilis chromosome encodes homologs of Escherichia coli septum placement (minCD) and cell shape (mreBCD) determinants. J. Bacteriol. 174:6729-6742; Barak, 1., y col., 1998. MinCD proteins control the septation process during sporulation of Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 180:53275333); el gen minD (Varley, A. W., y G. C. Stewart. 1992. The divlVB region of the Bacillus subtilis chromosome encodes homologs of Escherichia coli septum placement (minCD) and cell shape (mreBCD) determinants. J. Bacteriol. 174:6729-6742; Barak, I., y col., 1998. MinCD proteins control the septation process during sporulation of

Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 180:5327-5333); el gen pbpB (Daniel, R. A., y J. Errington. 2000. Intrinsic instability of the essential cell division protein FtsL of Bacillus subtilis and a role for DivlB protinein FtsL turnover. Mol. Microbiol. 35:278-289); el gen ponA (Pederson, L. B., y col., Septal localization of penicillin-binding protein 1 in Bacillus subtilis.

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II.B. Expresión génica en minicélulas

II.B.1. En general

En algunos aspectos de la invención, puede ser deseable alterar la expresión de un gen y la producción del correspondiente producto génico. Como se conoce en la técnica, y se usa en el presente documento, un "producto génico" puede ser una proteína (polipéptido) o ácido nucleico. Los productos génicos son proteínas que incluyen, sin limitación, enzimas, receptores, factores de transcripción, factores de terminación, factores de expresión, proteínas de unión a ADN, proteínas que afectan a la estructura de ácidos nucleicos, o subunidades de cualquiera de los anteriores. Los productos génicos que son ácidos nucleicos incluyen, pero sin limitación, ARN ribosomiales (ARNr), ARN transferentes (ARNt), ARN antisentido, nucleasas (incluyendo, pero sin limitación, ARN catalíticos, ribonucleasas, y similares).

Dependiendo de la función de un producto génico, y del tipo de aplicación de la invención, puede ser deseable aumentar la producción de proteínas, disminuir la producción de proteínas, aumentar la producción de ácido nucleico de proteínas y/o aumentar la producción de ácidos nucleicos. En el presente documento se proporcionan ejemplos no limitantes de genes y productos génicos que pueden manipularse, individualmente o en combinación, para modular la expresión de productos génicos que se van a incluir en minicélulas o cepas progenitoras a partir de las cuales se derivan las minicélulas. Los elementos de expresión modulados de este modo pueden ser cromosómicos y/o episómicos, y pueden expresarse de manera constitutiva o de manera regulada, es decir, represible y/o inducible. Además, los productos génicos sometidos a regulación pueden ser monocistrónicos o policistrónicos con otros genes o con ellos mismos.

II.B.2. Producción de proteínas

A modo de ejemplo no limitante, la producción aumentada de proteínas puede suceder mediante una dosificación génica aumentada (número de copias aumentado de un gen dado bajo el control del promotor nativo o artificial, donde este gen puede estar en un plásmido o en más de una copia en el cromosoma), modificación de los

elementos reguladores nativos, incluyendo, pero sin limitación al promotor o a región operadora (o regiones operadoras) de ADN, o sitios de unión ribosómica en el ARN, represores/silenciadores relevantes, activadores/potenciadores relevantes, o ácido nucleico antisentido o análogo de ácido nucleico relevantes, clonación en un plásmido bajo el control del promotor nativo o artificial, y producción aumentada o disminuida de elemento regulador (o elementos reguladores) del promotor nativo o artificial que controla la producción del gen o producto génico.

A modo de ejemplo no limitante, la producción disminuida de proteínas puede suceder mediante modificación de los elementos reguladores nativos, incluyendo, pero sin limitación al promotor o a región operadora (o regiones operadoras) de ADN, o sitios de unión ribosómica en el ARN, represores/silenciadores relevantes, activadores/potenciadores relevantes, o ácido nucleico antisentido o análogo de ácido nucleico relevantes, mediante clonación en un plásmido bajo el control de la región reguladora nativa que contiene mutaciones o un promotor artificial, uno o ambos dando como resultado la producción disminuida de proteínas, y mediante producción aumentada o disminuida de elemento regulador (o elementos reguladores) del promotor nativo o artificial que controla la producción del gen o producto génico.

Como se usa en el presente documento en referencia a proteínas, la "actividad intramolecular" se refiere a la función enzimática o a la función dependiente de la estructura. A modo de ejemplo no limitante, puede lograrse la alteración de la actividad intramolecular mediante mutación del gen, modificación de la proteína in vivo o in vitro, moléculas inhibidoras contra la función de la proteína, por ejemplo, inhibidores enzimáticos competitivos, no competitivos o acompetitivos, inhibidores que previenen las interacciones proteína-proteína, proteína-ácido nucleico o proteínalípido, por ejemplo, la expresión o introducción de proteína dominante negativa o dominante positiva u otro fragmento (o fragmentos) de proteína, carbohidrato(s), ácido(s) graso(s), lípido(s), y ácido nucleico (o ácidos nucleicos) que pueden actuar directa o alostéricamente sobre la proteína, y/o modificación de restos de proteína, carbohidrato, ácido graso, lípido, o ácido nucleico que modifican al gen o al producto génico para crear la proteína funcional.

Como se usa en el presente documento en referencia a proteínas, la "función intermolecular" se refiere a los efectos que son el resultado de una interacción intermolecular entre la proteína o ácido nucleico y otra proteína, carbohidrato, ácido graso, lípido, ácido nucleico, u otra molécula (o moléculas) en o sobre la célula o la acción de un producto o productos que sean el resultado de dicha interacción. A modo de ejemplo no limitante, la función intermolecular o intramolecular puede ser el acto o el resultado de la fosforilación, biotinilación, metilación, acilación, glucosilación, y/u otro suceso de señalización intermolecular; esta función puede ser el resultado de un complejo proteína-proteína, proteína-ácido nucleico, o proteína-lípido, y/o función transportadora, por ejemplo, la capacidad para unir, covalentemente o no covalentemente moléculas orgánicas o inorgánicas pequeñas, proteína(s), carbohidrato(s), ácido(s) graso(s), lípido(s), y ácido(s) nucleico(s); esta función puede ser interactuar con la membrana para reclutar otras moléculas a este compartimento de la célula; esta función puede ser para regular la transcripción y/o traducción del gen, otra proteína, o ácido nucleico; y esta función puede ser para estimular la función de otro proceso que aún no se ha descrito o entendido.

II.B.3. Producción de ácido nucleico

A modo de ejemplo no limitante, la producción aumentada de ácido nucleico puede suceder mediante una dosificación génica aumentada (número de copias aumentado de un gen dado bajo el control del promotor nativo o artificial, donde este gen puede estar en un plásmido o en más de una copia en el cromosoma), modificación de los elementos reguladores naturales, incluyendo, pero sin limitación al promotor o a región operadora (o regiones operadoras) de ADN, o sitios de unión ribosómica en el ARN, represores/silenciadores relevantes, activadores/potenciadores relevantes, o ácido nucleico antisentido o análogo de ácido nucleico relevantes, clonación en un plásmido bajo el control del promotor nativo o artificial, y producción aumentada o disminuida de elemento regulador (o elementos reguladores) del promotor nativo o artificial que controla la producción del gen o producto génico.

A modo de ejemplo no limitante, la producción disminuida de ácido nucleico puede suceder mediante modificación de los elementos reguladores nativos, incluyendo, pero sin limitación al promotor o a región operadora (o regiones operadoras) de ADN, o sitios de unión ribosómica en el ARN, represores/silenciadores relevantes, activadores/potenciadores relevantes, o ácido nucleico antisentido o análogo de ácido nucleico relevantes, mediante clonación en un plásmido bajo el control de la región reguladora nativa que contiene mutaciones o un promotor artificial, uno o ambos dando como resultado la producción disminuida de proteínas, y mediante producción aumentada o disminuida de elemento regulador (o elementos reguladores) del promotor nativo o artificial que controla la producción del gen o producto génico.

Como se usa en el presente documento en referencia a ácidos nucleicos, la "actividad intramolecular" se refiere a una función dependiente de estructura. A modo de ejemplo no limitante, puede lograrse la alteración de la actividad intramolecular mediante mutación del gen, modificación del ácido nucleico in vivo o in vitro, moléculas inhibidoras contra la función del ácido nucleico, por ejemplo, inhibidores enzimáticos competitivos, no competitivos o acompetitivos, inhibidores que previenen las interacciones proteína-ácido nucleico, por ejemplo, la expresión o introducción de proteína dominante negativa o dominante positiva u otro fragmento (o fragmentos) de ácido nucleico,

u otro carbohidrato (o carbohidratos), ácido(s) graso(s), y lípido(s) que pueden actuar directa o alostéricamente en el ácido nucleico o complejo ácido nucleico-proteína, y/o modificación de restos de ácido nucleico que modifican al gen

o producto génico para crear el ácido nucleico funcional.

Como se usa en el presente documento en referencia a ácidos nucleicos, la "función intermolecular" se refiere a los efectos que son el resultado de una interacción intermolecular entre el ácido nucleico y otro ácido nucleico, proteína, carbohidrato, ácido graso, lípido, u otra molécula (o moléculas) en o sobre la célula o la acción de un producto o productos que sean el resultado de dicha interacción. A modo de ejemplo no limitante, la función intermolecular puede ser el acto o el resultado de la fosforilación, biotinilación, metilación, acilación, glucosilación, y/u otro suceso de señalización intermolecular o intramolecular; esta función puede ser el resultado una proteína-ácido nucleico, y/o función transportadora, por ejemplo, la capacidad para unirse, covalentemente o no covalentemente moléculas orgánicas o inorgánicas pequeñas, proteína(s), carbohidrato(s), ácido(s) graso(s), lípido(s), y otro(s) ácido(s) nucleico(s); esta función puede ser interactuar con la membrana para reclutar otras moléculas a este compartimento de la célula; esta función puede ser para regular la transcripción y/o traducción del gen, otro ácido nucleico, o proteína; y esta función puede ser para estimular la función de otro proceso que aún no se ha descrito o entendido.

II.C. Genes y productos génicos para la regulación de la expresión

Como se conoce en la técnica, pueden manipularse una variedad de genes, productos génicos y elementos de expresión, individualmente o en combinación, para modular la expresión de genes y/o producción de productos génicos. Estos incluyen, a modo de ejemplo no limitante, ARN polimerasas, ribosomas (proteínas ribosomiales y ARN ribosomiales), ARN transferentes (ARNt), amino transferasas, elementos reguladores y regiones promotoras, transporte de compuestos inducibles e inhibidores, represión de catabolitos, deleciones y modificaciones generales, estado redox citoplásmico, terminadores transcripcionales, mecanismos de direccionamiento ribosomal, proteasas, chaperonas, aparato de exportación y direccionamiento de membrana, y mecanismos para aumentar la estabilidad y la solubilidad. Cada uno de estos se discuten en más detalle en las secciones siguientes.

II.C.1 Elementos reguladores y regiones promotoras

En el diseño de la invención se incluyen técnicas que aumentan la eficacia de la expresión génica y producción de proteínas en minicélulas. A modo de ejemplo no limitante, estas técnicas pueden incluir la utilización y/o modificación de elementos reguladores y regiones promotoras. Dichas manipulaciones pueden dar como resultado producción aumentada o disminuida, y/o cambios en las funciones intramoleculares e intermoleculares, de una proteína en una minicélula segregada o su célula progenitora antes de la formación de minicélulas; este último caso, la proteína puede ser una que se retiene de manera deseable en minicélulas segregadas.

La producción o actividad de un producto génico deseado puede aumentarse aumentando el nivel y/o actividad de un promotor u otra región promotora que actúe para estimular o potenciar la producción del producto génico deseado. La producción o actividad de un producto génico deseado puede aumentarse disminuyendo el nivel y/o actividad de un promotor u otra región reguladora que actúe para estimular o potenciar la producción de un producto génico que actúe para reducir o eliminar el nivel y/o actividad del producto génico deseado.

II.C.1.a. Escherichia coli

Los elementos reguladores, promotores y otros elementos de expresión y factores de expresión de E. coli incluyen, pero sin limitación acrR (Ma, D., y col., 1996. The local repressor AcrR plays a modulating role in the regulation of acrAB genes of Escherichia coli by global stress signals. Mol. Microbiol. 19:101-112); ampD (Lindquist, S., y col., 1989. Signalling proteins in enterobacterial AmpC beta-lactamase regulation. Mol. Microbiol. 3:1091-1102; Holtje, J. V., y col., 1994. The negative regulator of beta-lactamase induction AmpD is a N-acetyl-anhydromuramyl-L-alanine amidase. FEMS Microbiol. Lett. 122:159-164); appR (Diaz-Guerra, L., y col., 1989. appR gene product activates transcription of microcin C7 plasmid genes. J. Bacteriol. 171:2906-2908; Touati, E., y col., 1991. Are appR and katF the same Escherichia coli gene encoding a new sigma transcription initiation factor? Res. Microbiol. 142:29-36); appY (Atlung, T., y col., 1989. Isolation, characterization, and nucleotide sequence of appY, a regulatory gene for growthphase-dependent gene expression in Escherichia coli. J. Bacteriol. 171:1683-1691); araC (Casadaban, M. J., y col., 1976. Regulation of the regulatory gene for the arabinose pathway, araC. J. Mol. Biol. 104:557-566); arcA (luchi, S., y

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II.C.1.b. Bacillus subtilis

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II.C.1.c. Elementos de bacteriófago y trasponibles

Los elementos reguladores, promotores y otros elementos de expresión de elementos de bacteriófago y trasponibles incluyen, sin limitación, el producto génico de cl de bacteriófago lambda mation y/o minicélulas segregadas (Reichardt, L. F. 1975. Control of bacteriophage lambda repressor synthesis: regulation of the maintenance pathway of the cro and cl products. J. Mol. Biol. 93:289-309); (Love, C. A., y col., 1996. Stable high-copy-number bacteriophage lambda promoter vectors for overproduction of proteins in Escherichia coli. Gene. 176:49-53); el producto génico c2 de bacteriófago P22 (Gough, M., y S. Tokuno. 1975. Further structural and functional analogies between the repressor regions of phages P22 and lambda. Mol. Gen. Genet. 138:71-79); el gen cro de bacteriófago lambda (Reichardt, L. F. 1975. Control of bacteriophage lambda repressor synthesis: regulation of the maintenance pathway of the cro and cl products. J. Mol. Biol. 93:289-309); el gen ant de bacteriófago P22 (Youderian, P. y Col. 1982. Sequence determinants of promotor activity. Cell. 30:843-853); el gen mnt de bacteriórfago P22 (Gough, M. 1970. Requirement for a functional int product in temperature inductions of prophage P22 ts mnt. J. Virol. 6:320-325; Prell, H. H. 1978. Ant-mediated transactivation of early genes in Salmonella prophage P22 by superinfecting virulent P22 mutants. Mol. Gen. Genet. 164:331-334); el producto génico de tetR de la familia TetR de reguladores bacterianos u homólogos de este producto génico encontrado en Tn10 y otros miembros de los bacteriórfagos, virus de animales, eubacterias, Eucarya or Archaea pueden emplearse para aumentar la eficacia de la expresión génica y de la producción de proteínas en células progenitoras antes de la formación de minicélulas y/o minicélulas segregadas (Moyed, H. S., y K. P. Bertrand. 1983. Mutations in multicopy Tn10 tet plasmids that confer resistance to inhibitory effects of inducers of tet gene expression. J. Bacteriol. 155:557-564); el producto génico de mnt de bacteriórfago SP6 mation y/o minicélulas segregadas (Mead, D. A., y col., 1985. Single stranded DNA SP6 promoter plasmids for engineering mutant RNAs and proteins: synthesis of a ’stretched’ preproparathyroid hormone. Nucleic Acids Res. 13:1103-1118); y el producto génico de mnt de bacteriórfago T7 mation y/o minicélulas segregadas (Steen, R., y col., 1986. T7 RNA polymerase directed expression of the Escherichia coli rmB operon. EMBO J. 5:1099-1103).

II.C.1.d. Uso de recombinación específica de sitio en sistemas de expresión

En el diseño de la invención se incluyen técnicas que aumentan la eficacia de la expresión génica y producción de proteínas en minicélulas. A modo de ejemplo no limitante, estas técnicas pueden incluir la modificación de elementos reguladores endógenos y/o exógenos responsables de la activación y/o represión de proteínas que se van a expresar a partir de vectores de expresión cromosómicos y/o de plásmidos. A modo de ejemplo no limitante, este sistema puede aplicarse a cualquiera de los anteriores elementos/sistemas reguladores. Específicamente, cada uno de los sistemas reguladores anteriormente mencionados puede construirse de tal modo que las regiones promotoras están orientadas en una dirección alejada del gen que se va a expresar, o cada gene (o genes) anteriormente mencionado que se va a expresar puede construirse de tal forma que el gen (o genes) se orienta en una dirección alejada del promotor de la región reguladora. Una metodología dependiente de la recombinación genética específica de sitio para la inversión e introducción del gen de interés está construida en este sistema (Backman, K., y col., 1984. Use of synchronous site-specific recombination in vivo to regulate gene expression. Bio/Technology 2:10451049; Balakrishnan, R., y col., 1994. A gene cassette for adapting Escherichia coli strains as hosts for att-Intmediated rearrangement and pL expression vectors. Gene 138:101-104; Hasan, N., y W. Szybalaki. 1987. Control of cloned gene expression by promoter inversion in vivo: construction of improved vectors with a multiple cloning site and the Ptac promotor. Gene 56:145-151; Wulfing, C., y A. Pluckthun. 1993. A versatile and highly repressible Escherichia coli expression system based on invertible promoters: expression of a gene encoding a toxic gene product. Gene 136:199-203; Estos promotores invertibles y/o regiones génicas permitirán una regulación estrecha de productos proteicos potencialmente tóxicos. A modo de ejemplo no limitante, estos sistemas pueden derivarse de bacteriófago lambda, bacteriófago Mu, y/o bacteriófago P22. En cualquiera de estos sistemas potenciales, la regulación de la recombinasa puede regularse mediante cualquiera de los sistemas reguladores discutidos en la sección II.C.5 y en otras partes en el presente documento.

Il.C.I.e. Uso de interruptores de control de número de copias

Un procedimiento que puede usarse para aumentar la eficacia de la expresión génica y de la producción de proteínas en minicélulas implica la modificación y/o introducción de sistemas de expresión genética exógenos de tal forma que el número de copias de un gen que codifica una proteína que se va a expresar pueda modularse. Los sistemas de control del número de copias comprenden elementos diseñados para modular el número de copias de manera controlada.

En un modo ejemplar, el número de copias se controla para disminuir los efectos de la expresión "permeable" (no inducida) de productos génicos tóxicos. Esto permite mantener la integridad de un producto génico potencialmente tóxico durante procedimientos tales como la clonación, el mantenimiento de cultivos, y periodos de crecimiento antes de la inducción de minicélulas. Es decir, se espera que disminuir el número de copias de un gen disminuya la posibilidad de que aparezcan mutaciones que afecten a la expresión de proteínas y/o a la función. Inmediatamente antes de, durante y/o después de la formación de minicélulas, el número de copias puede aumentarse para optimizar la dosificación génica en minicélulas según se desee.

La replicación de plásmidos eubacterianos está regulada por una serie de factores, algunos de los cuales están contenidos en el plásmido, y otros están localizados en el cromosoma. Para revisiones, véase del Solar, G., y col., 2000. Plasmid copy number control: an ever-growing story. Mol Microbiol. 37:492-500; del Solar, G., y col., 1998.

Replication and control of circular bacterial plasmids. Microbiol Mol Biol Rev. 62:434-64; y Filutowicz, M., y col., 1987. DNA and protein interactions in the regulation of plasmid replication. J Cell Sci Suppl. 7:15-31.

A modo de ejemplo no limitante, se modula el producto génico de pcnB, la forma de tipo silvestre que promueve el número de copias aumentado de plásmido ColE1 (Soderbom, F., y col., 1997. Regulation of plasmid R1 replication: PcnB and RNase E expedite the decay of the antisense RNA, CopA. Mol. Microbiol. 26:493-504); y/o s introducen formas mutantes del gen pcnB en una célula. En un tipo celular ejemplar que puede usarse en los procedimientos de la invención, se reemplaza el gen cromosómico pcnB de tipo silvestre con un alelo mutante de pcnB80 (Lopilato, J., y col., 1986. Mutations in a new chromosomal gene of Escherichia coli K-12, pcnB, reduce plasmid copy number of pBR322 and its derivatives. Mol. Gen. Genet. 205:285-290). En dichas células, se disminuye el número de copias de un plásmido derivado de ColE1. La célula puede comprender además un elemento de expresión que comprende un promotor inducible unido operativamente a un ORF que codifica el pcnB de tipo silvestre. Debido a que el gen pcnB de tipo silvestre es dominante sobre el gen pcnB80 mutante, y debido a que el producto génico de pcnB de tipo silvestre promueve el número de copias aumentado de plásmido ColE1, la inducción de un pcnB de tipo silvestre en el fondo de pcnB80 aumentará el número de copias del plásmido de plásmidos derivados de ColE1. Dichos sistemas de control del número de copias pueden expresarse a partir del cromosoma y/o del plásmido pata mantener un número de copias bajo o alto en ausencia de inducción. Otros ejemplos no limitantes de genes y/o productos génicos que pueden emplearse en sistemas de control del número de copias para replicones basados en ColE1 incluyen genes u homólogos de genes que codifican ARN I, ARN II, rop, RNasa H, enzimas implicadas en el proceso de poliadenilación, RNasa E, ADN polimerasa I, y ADN polimerasa III.

En el caso de replicones derivados de IncFII, los ejemplos no limitantes de genes y/o productos génicos que pueden emplearse en sistemas de control del número de copias para controlar la copia de plásmidos incluyen genes u homólogos de los genes copA, copB, repA, y repB. Los sistemas de control del número de copias pueden además o como alternativa incluir la manipulación de los genes repC, trfA, dnaA, dnaB, dnaC, seqA, de proteína Pi, de genes que codifican las subunidades de la proteína HU (hupA, hupB) y genes que codifican subunidades de IHF.

También pueden inducirse otros elementos para optimizar estos sistemas de control del número de copias de plásmidos. Dichos elementos adicionales pueden incluir la adición o deleción de secuencias de ácido nucleico de iterón (Chattoraj, D. K. 2000. Control of plasmid DNA replication by iterons: no longer paradoxical. Mol. Microbiol. 37:467-476), y la modificación de proteínas chaperonas implicadas en la replicación de plásmidos (Konieczny, I., y col., 1997. The replication initiation protein of the broad-host-range plasmid RK2 is activated by the ClpX chaperone. Proc Natl Acad Sci USA 94:14378-14382).

II.C.2 Represión de catabolitos

En el diseño de la invención se incluyen técnicas que aumentan la eficacia de la expresión génica y producción de proteínas en minicélulas. A modo de ejemplo no limitante, estas técnicas pueden incluir la utilización y/o modificación de factores y sistemas implicados en la síntesis, degradación o transporte de catabolitos que modulan la expresión genética de una proteína preseleccionada. Dichas manipulaciones pueden dar como resultado producción aumentada o disminuida, y/o cambios en las funciones intramoleculares e intermoleculares, de una proteína en una minicélula o en su célula progenitora; este último caso, la proteína puede ser una que se retiene de manera deseable en minicélulas segregadas.

A modo de ejemplo no limitante, se saben usar en la técnica los promotores de los operones trp, cst-1, y llp de E. coli, que se inducen mediante, respectivamente, niveles reducidos de triptófano, inanición de glucosa, y por lactosa. La manipulación de los catabolitos triptófano, glucosa y lactosa, respectivamente, influenciará el grado de expresión de genes unidos operativamente a estos promotores. (Makrides, Sawas C., Strategies for Achieving High-Level Expression of Genes in Escherichia coli. Microbiological Reviews.1996. 60:512-538).

Como otro ejemplo no limitante, se usan en sistemas de expresión elementos de expresión del operón de Larabinosa (ara) de E. coli. AraC es una proteína que actúa cmo represora de los genes ara en ausencia de arabinosa, y también como un activador de genes ara cuando hay arabinosa presente. La inducción de genes ara también implica AMPc, que modula la actividad de CRP (proteína receptora de AMPc), que a su vez es necesaria para la inducción completa de genes ara (Schleif, Robert, Regulation of the L-arabinose operón of Escherichia coli. 2000. TIG 16:559-564. Por lo tanto, se logra la expresión máxima a partir de un sistema de expresión basado en ara añadiendo AMPc y arabinosa a las células hospedadoras, y optimizando la expresión de CRP en células hospedadoras.

Como ejemplo, la manipulación del gen o producto génico de acpS de E. coli (Pollacco M.L., y J.E. Cronan Jr.1981. A mutant of Escherichia coli conditionally defective in the synthesis of holo-[acyl carrier protein]. J. BioLChem. 256:5750-5754); u homólogos de este gen o su producto génico encontrado en otros procariotas, eucariotas, arqueobacterias u orgánulos (mitocondrias, cloroplastos, plástidos y similares) pueden emplearse para aumentar la eficacia de la expresión génica y la producción de proteínas en células progenitoras antes de la formación de minicélulas y/o en minicélulas segregadas.

Además de acpS, otros genes de E. coli ilustrativos incluyen el gen b2383 (Berlyn y col., "Linkage map of

Escherichia coli K-12, 9ª Edición", Capítulo 109 en: Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology, 2ª Ed., Neidhardt, Frederick C., Editor Jefe, American Society for Microbiology, Washington, DC., 1996, Volumen 2, páginas 1715-1902, y referencias citadas en la misma. el gen b2387; el gen celA (Parker L.L., y

B.G. Hall. 1990. Characterization and nucleotide sequence of the cryptic cel operon of Escherichia coli K12. Genetics. 124:455-471; el gen celB (Cole S.T., y B. Saint-Joanis, y A.P. Pugsley. 1985. Molecular characterisation of the colicin E2 operon and identification of its products. Mol Gen Genet. 198:465-472); el gen celC (Parker L.L., y B.G. Hall. 1990. Characterization and nucleotide sequence of the cryptic cel operon of Escherichia coli K12. Genetics. 124:455-471); el gen cmtB (Ezhova N.M., Zaikina, N.A, Shataeva,L. K., Dubinina, N.I., Ovechkina, T.P. y J.V. Kopylova. [Sorption properties of carboxyl cation exchangers with a bacteriostatic effect]. 1980. Prikl Bioikhim Mikrobiol. 16:395-398); el gen creB (Berlyn y col., "Linkage map of Escherichia coli K-12, 9ª Edición", Capítulo 109 en: Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology, 2ª Ed., Neidhardt, Frederick C., Editor Jefe, American Society for Microbiology, Washington, DC., 1996, Volumen 2, páginas 1715-1902, y referencias citadas en la misma; el gen creC (Wanner B.L. Gene regulation by phosphate in enteric bacteria. 1993. J Cell Biochem. 51:47-54); el gen crp (Sabourn D., y J. Beckwith. Deletion of the Escherichia coli crp gene. 1975. J Bacteriology. 122:338-340); el gen crr (gsr, iex, tgs, treD) (Jones-Mortimer M.C., y H.L. Komberg. y r. Maltby, y P.D. Watts. Role of the crr-gene in glucose uptake by Escherichia coli. 1977. FEBS Lett. 74:17-19); el gen cya (Bachi B., y

H.L.

Komberg. Utilization of gluconate by Escherichia coli. A role of adenosine 3’:5’-cyclic monophosphate in the induction of gluconate catabolism.1975. Biochem J. 150:123-128); el gen fruA (Prior T.I., y H.L. Komberg. Nucleotide sequence of fruA, the gene specifying enzyme lifru of the phosphoenopyruvate-dependent sugar phosphotranssferase system in Escherichia coli K12.1988. J Gen Microbiol. 134:2757-2768); el gen fruB (Bol’shakova T.N. y R.S. Erlagaeva, y Dobrynina Oiu, y V.N. Gershanovich. [Mutation fruB in the fructose regulon affeting beta-galactosidase synthesis and adenylate cyclase activity of E. coli K12]. 1988. Mol Gen Mikrobiol virusol. 3:33-39); el gen fruR (Jahreis K., y P.W. Postma, y J.W. Lengeler. Nucleotide sequence of the ilvH-frR gene region of Escherichia coli K12 and Salmonella typhimurium LT2.1991. Mol Gen Genet. 226:332-336); el gen frvA (Berlyn y col., "Linkage map of Escherichia coli K-12, 9ª Edición", Capítulo 109 en: Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology, 2ª Ed., Neidhardt, Frederick C., Editor Jefe, American Society for Microbiology, Washington, DC., 1996, Volumen 2, páginas 1715-1902, y referencias citadas en la misma); el gen frwB (id.); el gen frvD (id.); el gen gatB (Nobelmann B., y J.W. Lengeler. Molecular analysis of the gat genes from Escherichia coli and of their roles in galactitol transport and metabolism. 1996. J Bacteriol. 178:6790-6795); el gen gatC (Id.); el gen malX (Reidel J., W. Boos. The ma/X malY operon of Escherichia coli encodes a novel enzyme II of the photophotransferase system recognizing glucose and maltose and an enzyme abolishing the endogenous induction of the maltose system. 1991. J Bacteriol. 173:4862-4876); el gen manX (gptB, mpt, ptsL, ptsM, ptsX, manIII) (Plumbridge J., y A. Kolb. CAP and Nag repressor binding to the regulatory regions of the nagE-B and manX genes of Escherichia coli. 1991. J Mol Biol. 217:661-679); el gen manY (pel, ptsM, ptsP, manPII) (Henderson P.J., y R.A. Giddens, y M.C. Jones-Mortimer. Transport of galactose, glucose and their molecular analogues by Escherichia coli K12.1977. Biochem J. 162:309-320); el gen manZ (gptB, mpt, ptsM, prsX) (Williams N., y D.K. Fox, y C. Shea y S. Roseman. Pel, the protein that permits lambda DNA penetration of Escherichia coli, is encoded by a gene in ptsM and is required for mannose utilization by the phosphotransferase system. 1986. Proc Natl Acad Sci USA. 83:89348938); el gen mtlA (Lengeler J. Mutations affecting transport of the hexitols D-mannitol, D-glucitol, and galactitol in Escherichia coli K-12: isolation and mapping. 1975. J Bacteriol. 124:26-38.); el gen nagE (pstN) (Rogers M.J., y T. Ohgi, y J. Plumbridge, y D. Soll. Nucleotide sequences of the Escherichia coli nagE and nagB genes: the structural genes for the N-acetylglucosamine transport protein of the bacterial phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system and for glucosamine-6-phosphate deaminase. 1988. Gene. 62:197-207); el gen pstA (Cox G.B., H. Rosenberg, y J.A. Downie, y S. Silver. Genetic analysis of mutants affected in the Pst inorganic phosphate transport system. 1981. J Bacteriol. 148:1-9); el gen pstB (gutB) (Id.); el gen pstG (Cox G.B., H. Rosenberg, y J.A. Downie, y

S.

Silver. Genetic analysis of mutants affected in the Pst inorganic phosphate transport system. 1981. J Bacteriol. 148:1-9); el gen pstH (Id.); el gen pstI (Id.); el gen pstN (Id.); el gen pstO (Id.); el gen ptxA (yifU) (Berlyn y col., "Linkage map of Escherichia coli K-12, 9ª Edición", Capítulo 109 en: Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology, 2ª Ed., Neidhardt, Frederick C., Editor Jefe, American Society for Microbiology, Washington, DC., 1996, Volumen 2, páginas 1715-1902, y referencias citadas en la misma); el gen sgcA (yjhL) (Id.); el gen sgcC (yjhN) (Id.); el gen treB (Boos W., U. Ehmann, H. Forkl, W. Klein, M. Rimmele, y P. Postma. Trehalose transport and metabolism in Escherichia coli. 1990. J. Bacteriol. 172:3450-3461); el gen usg (Arps P.J., y M.E. Winkler ME. Structural analysis of the Escherichia coli K-12 hisT operon by using a kanamycin resistance cassette. 1987. J Bacteriol. 169:1061-1070); el gen wcaD (Mao Y., y M.P. Doyle, y J. Chen. Insertion mutagenisis of wca reduces acide and heat tolerance of enterohemorrhagic Escherichia coli_O157:H7. 2001. J Bacteriol. 183:38113815); el gen yadI (Berlyn y col., "Linkage map of Escherichia coli K-12, 9ª Edición", Capítulo 109 en: Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology, 2ª Ed., Neidhardt, Frederick C., Editor Jefe, American Society for Microbiology, Washington, DC., 1996, Volumen 2, páginas 1715-1902, y referencias citadas en la misma), y el gen ycgC (Gutknecht R., y R. Beutler, y L.F. Garcia-Alles, y U. Baumann, y B. Emi. The dihydroxyacetone kinase of Escherichia coli utilizes a phosphoprotein instead of ATP as phosphoryl donor. 2001. EMBO J. 20:2480-2486).

II.C.3. Deleciones y modificaciones generales

En el diseño de la invención se incluyen técnicas que aumentan la eficacia de la expresión génica y producción de proteínas en minicélulas. A modo de ejemplo no limitante, estas técnicas pueden incluir la modificación o eliminación de genes endógenos a partir de los cuales su producto génico respectivo disminuye la eficacia de la inducción y

expresión de una proteína deseada en la célula progenitora antes de la formación de minicélulas y/o segregación de minicélulas. A modo de ejemplo no limitante, estos componentes proteicos pueden ser enzimas que degradan inductores químicos de la expresión, proteínas que tienen un efecto negativo dominante sobre elementos reguladores positivos, proteínas que tienen actividad proteolítica contra la proteína que se va a expresar, proteínas que tienen un efecto negativo contra una chaperona que es necesaria para la actividad adecuada de la proteína expresada, y/o esta proteína puede tener un efecto positivo sobre una proteína que bien degrada o previene la función adecuada de la proteína expresada. Estos productos génicos que necesitan deleción o modificación para la expresión y/o función óptima de proteínas también pueden ser ácidos nucleicos antisentido que tienen un efecto negativo sobre la expresión génica.

II.C.4. Terminadores transcripcionales

En el diseño de la invención se incluyen técnicas que aumentan la eficacia de la expresión génica y de la producción de proteínas en el citoplasma de la célula progenitora antes de la formación de minicélulas y/o en el citoplasma de la minicélula segregada. A modo de ejemplo no limitante, estas técnicas pueden incluir la modificación de regiones terminadoras de moldes de ADN o transcritos de ARN de tal forma que la transcripción y/o traducción de estas regiones de ácido nucleico termine con una mayor eficacia. A modo de ejemplo no limitante, estas técnicas pueden incluir estructuras de tallo-bucle, terminadores traduccionales consecutivos, secuencias de poliadenilación, o aumentar la eficiencia de la terminación dependiente de rho. Las estructuras de tallo-bucle pueden incluir, pero sin limitación, repeticiones invertidas que contienen cualquier combinación moléculas de ácido desoxirribonucleico o de ácido ribonucleico, más de una de dichas repeticiones, o repeticiones invertidas variables, de tal forma que la velocidad de terminación transcripcional/traduccional pueda moderarse dependiendo de la concentración de ácido nucleico y/o aminoácidos, por ejemplo, el mecanismo de la atenuación reguladora (Oxdender y col., Attenuation in the Escherichia coli tryptophan operon: role of RNA secondary structure involving the tryptophan codon region, Proc. Natl. Acad. Sci. 76:5524-5528, 1979). Véase también, Yager y von Hippel, "Transcript Elongation and Termination in

e. Col. And Landick and Yanofsky, "Transcriptional Attenuation", Chapters 76 and 77, respectivamente en: Escherichia Coli and Salmonella Typhimurium: Cellular and Molecular Biology, Neidhardt, Frederick C., Editor Jefe, American Society for Microbiology, Washington, DC., 1987, Volumen 1, páginas 1241-1275 y 1276-1301, respectivamente, y referencias citadas en la misma.

II.C.5. Proteasas

En el diseño de la invención se incluyen técnicas que aumentan la eficacia de la expresión génica y producción de proteínas en minicélulas. A modo de ejemplo no limitante, estas técnicas pueden incluir la utilización y/o modificación de proteasas endógenas y/o exógenas. Dichas manipulaciones pueden dar como resultado producción aumentada o disminuida, y/o cambios en las funciones intramoleculares e intermoleculares, de una proteína en una minicélula o en su célula progenitora; este último caso, la proteína puede ser una que se retiene de manera deseable en minicélulas segregadas.

La producción o actividad de un producto génico de proteína deseado puede aumentarse disminuyendo el nivel y/o actividad de una proteasa que actúa sobre la proteína deseada. La producción o actividad de un producto génico de proteína deseado puede aumentarse aumentando el nivel y/o actividad de una proteasa que actúa sobre una proteína que inhibe la producción o función de la proteína deseada.

La producción o actividad de un producto génico de ácido nucleico puede aumentarse aumentando el nivel y/o actividad de una proteasa que actúa sobre una proteína que inhibe la producción o función del producto génico de ácido nucleico. La producción o actividad de un producto génico de ácido nucleico deseado puede aumentarse disminuyendo el nivel y/o actividad de una proteasa que actúa sobre una proteína que estimula o potencia la producción o función del producto génico de ácido nucleico deseado.

Como ejemplo, la manipulación del gen o del producto génico de alpA de E. coli (Kirby J.E., y J.E. Trempy, y S. Gottesman. Excision of a P4-like cryptic prophage leads to Alp protease expression in Escherichia coli. 1994. J Bacteriol. 176:2068-2081), u homólogos de este gen o producto génico encontrado en otros miembros de los procariotas, eucariotas o arqueobacterias, pueden emplearse para aumentar la eficacia de la expresión génica y de la producción de proteína en células progenitoras antes de la formación de minicélulas y/o las minicélulas segregadas postparto.

Además de alpA, otros genes y productos génicos de E. coli incluyen el gen y el producto génico de clpA de E. coli (Katayama Y., y S. Gottesman, y J. Pumphrey, y S. Rudikoff, y W.P. Clark, y M.R. Maurizi. The two-component, ATPdependent Clp protease of Escherichia coli. Purification, cloning, and mutational analysis of the ATP-binding component. 1988, J Biol Chem. 263-15226-15236); el producto génico de clpB de E. coli (Kitagawa M., y C. Wada, y

S. Yoshioka, y T. Yura. Expression of ClpB, an analog of the ATP-dependent proteas regulatory subunit in Escherichia coli, is controlled by a heat shock sigma factor (sigma 32). J Bacteriol. 173:4247-4253); el producto génico de clpC de E. coli (Msadek T., y F. Kunst, y G. Rapoport. MecB of Bacillus subtilis, a member of the ClpC ATPase family, is a pleiotropic regulator controlling competence gene expression and growth at high temperature. 1994. Proc Natl Acad Sci USA 91:5788-5792); el producto génico de clpP de E. coli (Maurizi M.R., y W.P. Clark, y Y. Katayama, y S. Rudikoff, y J. Pumphrey, y B. Bowers, y S. Gottesman. Sequence and structure of ClpP, the

proteolytic component of the ATP-dependent Clp protease of Escherichia coli. 1990. J biol Chem. 265:12536-12545); el producto génico de clpX de E. coli (Gottesman S., y W.P. Clark, y V. de Crecy-Lagard, y M.R. Maurizi. ClpX, an alternative subunit for the ATP-dependent Clp protease of Escherichia coli. Sequence and in vivo activities. 1993. J Biol Chem. 268:22618-22626); el producto génico de clpY de E. coli (Missiakas D., y F. Schwager, J.M., Betton, y C. Georgopoulos, S. Raina. Identification and characterization of HsIV HsIU (ClpQ ClpY) proteins involved in overall proteolysis of misfolded proteins in Escherichia coli. 1996. EMBO J. 15:6899-6909); el producto génico de dcp de E. coli (Becker S., y Plapp R. Location of the dcp gene on the physical map of Escherichia coli. 1992. J Bacteriol. 174:1698-1699); el producto génico de degP (htrA) de E. coli (Lipinska B., y M. Zylicz, y C. Georgopoulos. The HtrA (DegP) protein, essential for Escherichia coli survival at high temperatures, is an endopeptidase. 1990. J Bacteriol. 172:1791-1797); el producto génico de ggt de E. coli (Finidori J., y Y. Laperche, y R. Haguenauer-Tsapis, y R. Barouki, y G. Guellaen, y J. Hanoune. In vitro biosynthesis and membrane insertion of gamma-glutamyl transpeptidase. 1984. J Biol Chem. 259:4687-4690); el producto génico de hfl de E. coli (Cheng H. H., y H. Echols. A class of Escherichia coli proteins controlled by the hflA locus. 1987. J Mol Biol. 196:737-740); el producto génico de hflB de E. coli (Banuett F., y M.A. Hoyt, y L. McFarlane, y H. Echols, y I. Herskowitz. HflB, a new Escherichia coli locus regulating lysogeny and the level of bacteriophage lambda c11 protein. 1986. J Mol Biol. 187:213-224); el producto génico de hflC de E. coli (Noble J.A., y M.A. Innis, y E.V. Koonin, y K.E. Rudd, y F. Banuett, y I. Herskowitz, The Escherichia coli hflA locus encodes a putative GTP-binding protein and two membrane proteins, one of which contains a protease-like domain. 1993. Proc Natl Acad Sci USA. 90:10866-10870); el producto génico de hflK de E. coli (Id.); el producto génico de hftX de E. coli (Noble J.A., y M.A. Innis, y E.V. Koonin, y K.E. Rudd, y F. Banuett, y I. Hertzskowitz. The Escherichia coli hflA locus encodes a putative GTP-binding protein and two membrane proteins, one of which contains a protease-like domain. 1993. Proc Natl Acad Sci U S A. 90:10866-10870); el producto génico de hopD de E. coli (Whitchurch C.B., y J.S. Mattick Escherichia coli contains a set of genes homologous to those involved in protein secretion, DNA uptake and the assembly of type-4 fimbriae in other bacteria. 1994. Gene.150:915); el producto génico de htrA de E. coli (Lipinska B., y S. Sharma, y C. Georgopoulos. Sequence analysis and regulation of the htrA gene of Escherichia coli: a sigma 32-independent mechanism of heat-inducible transcription. 1988. Nucleicc Acids Res. 16:10053-10067); el producto génico de hycl de E. coli (Rossmann R., y T. Maier, y F. Lottspeich, y A. Bock. Characterisation of a proteas from Escherichia coli involved in hydrogenase maturation. 1995. Eur J Biochem. 227:545-550); el producto génico de iap de E. coli (Nakata A., y M. Yamaguchi, y K. Isutani, y M. Amemura. Escherichia coli mutants deficient in the production of alkaline phosphatase isoszymes. 1978. J Bacteriol. 134:287-294); el producto génico de lep de E. coli (Silver P., y W. Wickner. Genetic mapping of the Escherichia coli leader (signal) peptidase gene (lep): a new approach for determining the map position of a cloned gene. 1983. J Bacteriol. 54:659-572); el producto génico de Ion de E. coli (Donch J., y J. Greenberg. Genetic analysis of Ion mutants of strain K-12 of Escherichia coli. 1968. Mol Gen Genet. 103:105-115); el producto génico de lsp de E. coli (Regue M., y J. Remenick, y M. tokunaga, y G.A. Mackie, y H.C. Wu. Mapping of the lipoprotein signal peptidase gene (lsp). 1984. J Bacteriol. 1984158:632-635); el producto génico de ompT de E. coli (Akiyama Y., y K. SecY protein, a membrane-embedded secretion factor of E. coli, is cleaved by the ompT proteas in vitro. 1990. Biochem Biophys Res Commun. 167:711-715); el producto génico de opdA de E. coli (Conllin C.A., y C.G. Miller. Location of the prlC (opdA) gene on the physical map of Escherichia coli. 1993. J Bacterilol. 175:5731-5732); el producto génico de orfX de E. coli (Berlyn, M.K.B., y col., 1996. Linkage map of Escherichia coli K-12, 9ª Edición, En F.C. Neidhardt,

R. Curtiss, J.L. Ingraham, E.C.C. Lin, K.B. Low, B. Magasanik, W.S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter, y H.E. Umbarger (eds.). Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology, 2ª ed. American Society for Microbiology, Washington D.C.); el producto génico de pepA de E. coli (Stirling C.J., y S.D. Colloms, y

J.F.

Collins, y G. Szatmari, y D.J. Sherratt. XerB, an Escherichia coli gene required for plasmid ColE1 site-specific recombination, is identical to pepA, encoding aminopepti-daseA, a protein with substantial similarity to bovine lens leucine aminopeptidase. 1989. EMBO J. 8:1623-1627); el producto génico de pepD de E. coli (Henrich B., y U. Schroeder, y R.W. Frank, y R. Plapp. Accurate mapping of the Escherichia coli pepD gene by sequence analysis of its 5’ flanking region. 1989. Mol Gen Genet. 215:369-373); el producto génico de pepE de E. coli (Conlin C.A., y T.M. Knox, y C.G. Miller. Cloning and physical map position of an alpha-aspartyl depeptidase gene, pepE, from Escherichia coli. 1994. J Bacteriol. 176:1552-1553); el producto génico de pepN de E. coli (Miller C.G., y G. Schwartz. Peptidase-deficient mutants of Escherichia coli. 1978. J Bacteriol. 135:603-611); el producto génico de pepP de E. coli (Id.); el producto génico de pepQ de E. coli (Id.); el producto génico de pepT de E. coli (Miller G.G., y

G.

Schwartz. Peptidase-deficient mutants of Escherichia coli. 1978. J Bacteriol. 135:603-611); el producto génico de pilD de E. coli (Francetic O., y S. Lory, y A.P. Pugsley. A second prepilin peptidase gene in Escherichia coli K-12. 1998, Mol Microbiol. 27:763-775); el producto génico de pinA de E. coli (Hilliard J.J., y L. D. Simon, y L. Van Melderen, y M.R. Maurizi. PinA inhibits ATP hydrolysis and energy-dependent protein degradation by Lon protease. 1998. J Biol Chem. 273:524-527); el producto génico de prc(tsp) de E. coli (Nagasawa H., y Y. Sakagami, y A. Suzuki, y H. Suzuki, y H. Hara, y Y. Hirota. Determination of the cleavage site involved in C-terminal processing of penicillin-binding proein 3 of Escherichia coli. 1989. J Bacteriol. 171:5890-5893); el producto génico de prlC de E. coli (Jiang X., y M. Zhang, y Y. Ding, y J. Yao, y H. Chen, y D. Zhu, y M. Muramatu. Escherichia coli prlC gene encodes a trypsin-like proteinase regulating the cell cycle. 1998. J Biochem (Tokyo) 128:980-985); el producto génico de la proteasa V de E. coli (Berlyn, M.K.B. y col., 1996. Linkage map of Escherichia coli K-12, 9ª Edición, En F.C. Neidhardt, R. Curtiss, J.L. Ingraham, E.C.C. Lin, K.B. Low, B. Magasanik, W.S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter, y

H.E. Umbarger (eds.). Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology, 2ª ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C.); el producto génico de la proteasa VI de E. coli (Id.); el producto génico de la proteasa In de E. coli (Id.); el producto génico de la proteasa Fa de E. coli u homólogos (Id.); el producto génico de la proteasa Mi de E. coli (Id.); el producto génico de la proteasa So de E. coli (Id.); el producto génico de ptrA de

E. coli (Id.); el producto génico de ptrB de E. coli (Id.); el producto génico de sypB de E. coli (Barends S., y A.W. Karzai, y R.T. Sauer, y J. Wower, y B. Kraal. Simultaneous an functional binding of SmpB and EF-Tu-TP to the analyl acceptor arm of tmRNA. 2001. J Mol Biol. 314:9-21); el producto génico de sohB de E. coli (Baird L., y B. Lipinska, y

S. Raina, y C. Georgopoulos. Identification of the Escherichia coli sohB gene, a multicopy suppressor of the HtrA (DegP) null phenotype. 1991. J Bacteriol. 173-5763-5770); el producto génico de sspA de E. coli (Ichihara S., y T. Suzuki, y M. Suzuki, y C. Mizushima. Molecular cloning and sequencing of the sppA gene and characterization of the encoded proteas IV, a signal peptide peptidase of Escherichia coli. 1986. J Biol Chem. 261;9405-9411); el producto génico de tesA de E. coli (Cho H., y J.E. Cronan Jr. Escherichia coli thioesterase I, molecular cloning and sequencing of the structural gene and identification as a periplasmic enzyme. 1993 J Biol Chem. 268:9238-9245); el producto génico de tufA de E. coli (Ang., y J.S. Lee, y J.D. Friesen. Evidence for an internal promoter preceding tufA in the str operon of Escherichia coli. J Bacteriol. 149:548-553); el producto génico de tufB de E. coli (Mihajima A., y M.Shibuya, y Y. Kaziro. Construction and characterization of the two hybrid Col1E1 plasmids carrying Escherichia coli tufB gene. 1979. FEBS Lett. 102:207-210); el producto génico de ybaU de E. coli (Berlyn, M.K.B., y col., 1996. Linkage map of Escherichia coli K-12, 9ª Edición, En F.C. Neidhardt, R. Curtiss, J.L. Ingraham, E.C.C. Lin, K.B. Low, B. Magasanik,

W.S. Resnikoff, M. Riley, M. Schaechter, y H.E. Umbarger (eds.). Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology, 2ª ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C.); el producto génico de ssrA (ARNmt, ARN 10sA) de E. coli (Oh B.K., y A.K. Chauhan, y K. Isono, y D. Apirion. Location of a gene (ssrA) for a small, stable RNA 910Sa RNA) in the Escherichia coli chromosome. 1990. J Bacteriol. 172:4708-4709); y el gen ssrB de E. coli (Berlyn, M.K.B., y col., 1996. Linkage map of Escherichia coli K-12, 9ª Edición, En F.C. Neidhardt, R. Curtiss. J.L. Ingraham, E.C.C. Lin, K.B. Low, B. Magasanik, W.S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter, y H.E. Ummbarger 9ª Ed.). Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology, 2ª ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C.).

II.C.6. Chaperonas

En el diseño de la invención se incluyen técnicas que aumentan la eficacia de la expresión génica y producción de proteínas funcionales en minicélulas. A modo de ejemplo no limitante, estas técnicas pueden incluir la modificación de chaperonas y chaperoninas, es decir, componentes de proteínas endógenos y/o exógenos que controlan el estado no plegado de las proteínas traducidas, permitiendo el plegado y/o la secreción adecuada, la inserción en membranas, o el ensamblaje multimérico soluble de proteínas expresadas en la célula progenitora antes de la formación de minicélulas y/o el citoplasma, la membrana, el periplasma de la minicélula segregada, y/o el ambiente extracelular. Véase Gottesman y col., Protein folding and unfolding by Escherichia coli chaperones and chaperonins, Current Op. Microbiol. 3:197-202, 2000; y Mayhew y col., "Molecular Chaperone Proteins", Capítulo 61 en: Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology, 2ª Ed., Neidhardt, Frederick C., Editor Jefe, American Society for Microbiology, Washington, DC., 1996, Volumen 1, páginas 922-937, y referencias citadas en la misma.

Estas aplicaciones pueden, pero no están limitadas a aumentar o disminuir la producción de chaperonas, aumentar o disminuir la actividad intramolecular de una chaperona, aumentar o disminuir la función fisiológica de una chaperona,

o la deleción, sustitución, inversión, translocación o inserción en, o mutación de, un gen que codifica una chaperona. A modo de ejemplo no limitante, la producción aumentada de una chaperona puede suceder mediante una dosificación génica de chaperonas aumentada (número de copias aumentado de un gen dado bajo el control del promotor nativo o artificial donde este gen puede estar en un plásmido o en más de una copia en el cromosoma), modificación de los elementos reguladores naturales, incluyendo, pero sin limitación al promotor o a región operadora (o regiones operadoras) de ADN, o sitios de unión ribosómica en el ARN, represores/silenciadores relevantes, activadores/potenciadores relevantes, o ácido nucleico antisentido o análogo de ácido nucleico relevantes, clonación en un plásmido bajo el control del promotor nativo o artificial, y producción aumentada o disminuida de elemento regulador (o elementos reguladores) del promotor nativo o artificial que controla la producción del gen o producto génico de chaperona. A modo de ejemplo no limitante, la producción disminuida de una chaperona puede suceder mediante modificación de los elementos reguladores nativos, incluyendo, pero sin limitación al promotor o a región operadora (o regiones operadoras) de ADN, o sitios de unión ribosómica en el ARN, represores/silenciadores relevantes, activadores/potenciadores relevantes, o ácido nucleico antisentido o análogo de ácido nucleico relevantes, mediante clonación en un plásmido bajo el control de la región reguladora nativa que contiene mutaciones o un promotor artificial, uno o ambos dando como resultado la producción disminuida de chaperonas, y mediante producción aumentada o disminuida de elemento regulador (o elementos reguladores) del promotor nativo o artificial que controla la producción del gen o producto génico de chaperona. Por definición, la actividad intramolecular se refiere a la función enzimática, a la función dependiente de la estructura, por ejemplo, la capacidad de una chaperona de interactuar en un complejo proteína-proteína, proteína-ácido nucleico o proteínalípido y/o función transportadora, por ejemplo, la capacidad para unirse, covalentemente o no covalentemente moléculas orgánicas o inorgánicas pequeñas, proteína(s), carbohidrato(s), ácido(s) graso(s), lípido(s), y ácido(s) nucleico(s). A modo de ejemplo no limitante, puede lograrse la alteración de la actividad intramolecular mediante mutación del gen de chaperona, la modificación química in vivo o in vitro de la chaperona, moléculas inhibidoras contra la función de la chaperona, por ejemplo, inhibidores enzimáticos competitivos, no competitivos o acompetitivos, inhibidores que evitan interacciones proteína-proteína, proteína-ácido nucleico o proteína-lípido, por ejemplo, la expresión o introducción de proteína dominante negativa o dominante positiva u otro fragmento (o fragmentos) de chaperona, u otro carbohidrato (o carbohidratos), ácido(s) graso(s), lípido(s), y ácido nucleico (o

ácidos nucleicos) que pueden actuar directa o alostéricamente sobre la chaperona, y/o la modificación de restos de proteína, carbohidrato, ácido graso, lípido, o ácido nucleico que modifican el gen o producto génico de chaperona para crear la proteína funcional. Por definición, la función fisiológica se refiere a los efectos que son el resultado de una interacción intramolecular entre la chaperona y otra proteína, carbohidrato, ácido graso, lípido, ácido nucleico, u otra molécula (o moléculas) en o sobre la célula o la acción de un producto o productos que sean el resultado de dicha interacción. A modo de ejemplo no limitante, la función fisiológica puede ser el acto o el resultado de una fosforilación, biotinilación, metilación, acilación, glucosilación, y/o otro evento de señalización intermolecular; esta función puede ser el resultado de una interacción proteína-proteína, proteína-ácido nucleico o proteína-lípido que dé como resultado un resto funcional; esta función puede ser interactuar con la membrana para reclutar otras moléculas a este compartimento de la célula; esta función puede ser para regular la transcripción y/o traducción de la chaperona, otra proteína, o ácido nucleico; y esta función puede ser para estimular la función de otro proceso que aún no se ha descrito o entendido.

A modo de ejemplo no limitante, los genes de chaperona pueden ser cualquiera de los genes de E. coli listados a continuación, así como homólogos de los mismos de procariotas, exukariutes, arqueobacterias, u orgánulos (mitocondria, cloroplastos, plástidos, etc.). Los genes de E. coli ilustrativos que codifican chaperonas incluyen, a modo de ejemplo no limitante, el gen cbpA (Shiozawa T., y C. Ueguchi, y T. Mizuno. The rpoD gene functions as a multicopy suppressor for mutations in the chaperones, CbpA, DnaJ and DnaK, in Escherichia coli. (1996) FEMS Microbiol Lett. 138:245-250): el gen clpB (Squires C. L., y S. Pedersen, y B. M. Ross, y C. Squires. ClpB is the Escherichia coli heat shock protein F84.1. 1991. J Bacteriol. 173:4254-4262); el gen dnaK (Kroczynska B., y S. Y. Blond. Cloning and characterization of a new soluble murine J-domain protein that stimulates BiP, Hsc70 and DnaK ATPase activity with different efficiencies. 2001. Gene. 273:267-274); el gen dnaJ (Kedzierska S., y E. Matuszewska. The effect of co-overproduction of DnaK/DnaJ/GrpE and ClpB proteins on the removal of heat-aggregated proteins from Escherichia coli Delta clpB mutant cells-new insight into the role of Hsp70 in a functional cooperation with Hsp100. 2001. FEMS Microbiol Lett. 204:355-360); el gen ecpD (Raina S., y D. Missiakas, y L. Baird, y S. Kumar, y

C. Georgopoulos. Identification and transcriptional analysis of the Escherichia coli htrE operon which is homologous to pap and related pilin operons. 1993. J Bacteriol. 175:5009-5021); el gen ffh (Muller, M., y col., 1002. Protein traffic in bacteria: multiple routes from the ribosome to and across the membrane. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 66:107-157); ARN 4.5S (Muller, M., y col., 1002. Protein traffic in bacteria: multiple routes from the ribosome to and across the membrane. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 66:107-157); el gen FtsY (Muller, M., y col., 1002. Protein traffic in bacteria: multiple routes from the ribosome to and across the membrane. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 66:107-157);el gen fimC (Klemm P., y B. J. Jorgensen, y I. van Die, y H. de Ree, y H. Bergmans. The fim genes responsible for synthesis of type 1 fimbriae in Escherichia coli, cloning and genetic organization. 1985. Mol Gen Genet. 199:410-414); el gen groE (Burton Z. F., y D. Eisenberg. A procedure for rapid isolation of both groE protein and glutamine synthetase from E coli. 1980. Arch Biochem Biophys. 205:478-488); el gen groL (Berlyn, M. K. B., y col., 1996. Linkage map of Escherichia coli K-12, 9ª Edición, En F. C. Neidhardt, R. Curtiss, J. L. Ingraham, E. C. C. Lin, K. B. Low, B. Magasanik, W. S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter, y H. E. Umbarger (eds.). Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology, 2ª ed. American Society for Microbiology, Washington D. C.); el gen groS (Berlyn, M. K. B., y col., 1996. Linkage map of Escherichia coli K-12, 9ª Edición, En F. C. Neidhardt, R. Curtiss, J. L. Ingraham, E. C. C. Lin, K. B. Low, B. Magasanik, W. S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter, y H. E. Umbarger (eds.). Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology, 2ª ed. American Society for Microbiology, Washington D. C.); el gen hptG (Berlyn, M. K. B., y col., 1996. Linkage map of Escherichia coli K-12, 9ª Edición, En F. C. Neidhardt, R. Curtiss, J. L. Ingraham, E. C. C. Lin, K. B. Low, B. Magasanik, W. S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter, y H. E. Umbarger (eds.). Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology, 2ª ed. American Society for Microbiology, Washington D. C.); el gen hscA (Takahashi Y., y M. Nakamura. Functional assignment of the ORF2-iscS-iscU-iscA-hscB-hscA-fdx-ORF3 gene cluster involved in the assembly of Fe-S clusters in Escherichia coli.1999. J Biochem (Tokyo). 126:917-926); el gen ibpA (Lund P. A. Microbial molecular chaperones. 2001. Adv Microb Physiol. 44:93-140); el gen papJ (Tennent, J. M., y col., 1990. Integrity of Escherichia coli P pili during biogenesis: properties and role of PapJ. Mol. Microbiol. 4:747-758); el gen secB (Lecker, S., y col., 1989. Three pure chaperone proteins of Escherichia coli--SecB, trigger factor and GroEL-form soluble complexes with precursor proteins in vitro. EMBO J. 8:2703-2709); y el gen tig (Lecker, S., y col., 1989. Three pure chaperone proteins of Escherichia coli--SecB, trigger factor and GroEL--form soluble complexes with precursor proteins in vitro. EMBO J. 8:2703-2709); el gen secE (Muller, M., y col., 1002. Protein traffic in bacteria: multiple routes from the ribosome to and across the membrane. Prog. Nucleic Add Res. Mol. Biol. 66:107-157); y el gen secY (Muller, M., y col., 1002. Protein traffic in bacteria: multiple routes from the ribosome to and across the membrane. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 66:107-157).

II.C.7. Aparato de exportación y direccionamiento de membrana

Se incluyen en el diseño de la invención técnicas que aumentan la eficacia de la expresión génica y de la producción de proteínas en células progenitoras antes de la formación de minicélulas y/o en las minicélulas segregadas. A modo de ejemplo no limitante, estas técnicas pueden incluir la construcción de proteínas quiméricas incluyendo, pero sin limitación, acoplamiento de la proteína de interés expresada con secuencias líder nativas eubacterianas, de eucariotas, arqueobacterianas u organulares para dirigir la inserción en membrana o la secreción de la proteína de interés al periplasma o ambiente extracelular. Además de usar secuencias líder nativas, estas construcciones de expresión de minicélulas también pueden incluir sitios de escisión proteolítica para eliminar la secuencia líder

después de la inserción en la membrana o la secreción. Estos sitios de escisión proteolítica pueden ser nativos para el organismo del que se deriva la minicélula o no nativos. En el último ejemplo, también se incluyen en el sistema las proteasas no nativas que reconocen al sitio de escisión proteolítica no nativo.

Los ejemplos no limitantes de estas secuencias líder pueden ser el líder de la proteína STII (Voss, T., y col., 1994. Periplasmic expression of human interferon-alpha 2c in Escherichia coli results in a correctly folded molecule. Biochem. J. 298:719-725), la proteína de unión a maltosa (malE) (Ito, K. 1982. Purification of the precursor form of maltose-binding protein, a periplasmic protein of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 257:9895-9897), phoA (Jobling, M. G., y col., 1997. Construction and characterization of versatile cloning vectors for efficient delivery of native foreign proteins to the periplasm of Escherichia coli. Plasmid. 38:158-173), IamB (Wong, E. Y., y col., 1988. Expression of secreted insulin-like growth factor-1 in Escherichia coli. Gene. 68:193-203), ompA (Loo, T., y col., 2002. Using secretion to solve a solubility problem: high-yield expression in Escherichia coli and purification of the bacterial glycoamidase PNGase F. Protein Expr. Purif. 24:90-98), o pelB (Molloy, P. E., y col., 1998. Production of soluble single-chain T-cell receptor fragments in Escherichia coli trxB mutants. Mol. Immunol. 35:73-81).

Además de estas secuencias líder, las mutaciones en la maquinaria de exportación celular pueden emplearse para aumentar la promiscuidad de la exportación para mostrar o exportar secuencias con secuencias líder no optimizadas. Los ejemplos no limitantes de genes que pueden alterarse para aumentar la promiscuidad de exportación son mutaciones en secY (prlA4) (Derman, A. I., y col., 1993. A signal sequence is not required for protein export in prlA mutants of Escherichia coli. EMBO J. 12:879-888), y secE (Harris, C. R., y T. J. Silhavy. 1999. Mapping an interface of SecY (PrlA) and SecE (PrlG) by using synthetic phenotypes and in vivo cross-linking. J. Bacteriol. 181:3438-3444).

II.C.8. Aumento de la estabilidad y solubilidad

Se incluyen en el diseño de la invención técnicas que aumentan la eficacia de la expresión génica y de la producción de proteínas en células progenitoras antes de la formación de minicélulas y/o en las minicélulas segregadas. A modo de ejemplo no limitante, estas técnicas pueden incluir la construcción de proteínas quiméricas/de fusión, incluyendo, pero sin limitación, acoplamiento de la proteína de interés expresada con secuencias líder nativas eubacterianas, de eucariotas, arqueobacterianas o secuencias de solubilización organular. Tal como se usa en el presente documento, las "secuencias solubilizantes" son secuencias de aminoácidos completas o truncadas que aumentan la solubilidad de la proteína de membrana de interés expresada. Esta solubilidad aumentada puede usarse para aumentar el tiempo de vida del estado soluble hasta que pueda tener lugar una inserción en membrana adecuada. A modo de ejemplo no limitante, estas proteínas quiméricas de fusión pueden ser ubiquitina (Power, R. F., y col., 1990. High level expression of a truncated chicken progesterone receptor in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 265:1419-1424), tiorredoxina (LaVallie, E. R., y col., 1993. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N. Y.) 11:187-193; Kapust, R. B., y D. S. Waugh. 1999. Escherichia coli maltose-binding protein is uncommonly effective at promoting the solubility of polypeptides to which it is fused. Protein Sci. 8:1668-1674), el producto génico de dsbA (Winter, J., y col., 2001. Increased production of human proinsulin in the periplasmic space of Escherichia coli by fusion to DsbA. J. Biotechnol. 84:175-185), la proteína SPG (Murphy, J. P., y col., 1992. Amplified expression and large-scale purification of protein G’. Bioseparation 3:63-71), el producto génico de malE (proteína de unión a maltosa) (Hampe, W., y col., 2000. Engineering of a proteolytically stable human beta 2-adrenergic receptor/maltose-binding protein fusion and production of the chimeric protein in Escherichia coli and baculovirus-infected insect cells. J. Biotechnol. 77:219-234; Kapust y col., Escherichia coli maltose-binding protein is uncommonly effective at promoting the solubility of polypeptides to which it is fused, Protein Sci. 8:1668-1674, 1999), glutatión-s-transferasa (GST); y/o nucleasa A (Meeker y col., A fusion protein between serum amyloid A and staphylococcal nuclease-synthesis, purification, and structural studies, Proteins 30:381-387,1998). Además de estas proteínas, la proteína A estafilocócica, la betagalactosidasa, el péptido S, la cadena pesada de miosina, la dihidrofolato reductasa, T4 p55, el extremo N-terminal de la hormona de crecimiento, la hemolisina A de E. coli, la proteína cll de bacteriófago lambda, y las proteínas Trp y TrpLE pueden usarse también como proteínas de fusión para aumentar la expresión y/o solubilidad de proteínas (Makrides, Strategies for Achieving High-Level Expression of Genes in Escherichia coli, Microbiol. Rev. 60:512-538).

III. Preparación de minicélulas

III.A. Mutaciones de la célula progenitora

Aunque se ha comunicado que relativamente pocas moléculas de ARN polimerasa endógena se segregan en las minicélulas (Shepherd y col., Cytoplasmic RNA Polymerase in Escherichia coli, J Bacteriol 183:2527-34, 2001), otros informes y resultados indican que muchas moléculas de ARN polimerasa siguen a los plásmidos en las minicélulas (Funnell y Gagnier, Partition of P1 plasmids in Escherichia cole mukB chromosomal partition mutants, J Bacteriol 177:2381-6, 1995). En cualquier caso, los solicitantes han descubierto que la introducción de una ARN polimerasa exógena en células productoras de minicélulas potencia la expresión de elementos episómicos en las minicélulas. Dicha expresión potenciada puede permitir la expresión exitosa de proteínas en las minicélulas, en la que dichas proteínas se expresan poco o en absoluto en minicélulas no modificadas. Para maximizar la cantidad de transcripción de ARN a partir de elementos episómicos en minicélulas, pueden usarse líneas celulares productoras de minicélulas que expresan una ARN polimerasa específica para determinados elementos de expresión episómica.

Un ejemplo de una cepa de E. coli de este tipo, denominada MC-T7, se creó y usó como se describe en los Ejemplos. Los expertos en la materia serán capaces de producir y usar cepas equivalentes basándose en la presente divulgación y en su conocimiento de la materia.

Las células productoras de minicélulas comprenden mutaciones que aumentan etapas preparativas. Por ejemplo, la síntesis de lipopolisacárido (LPS) en E. coli incluye la ruta biosintética de lípido A. Actualmente se han identificado y secuenciado cuatro de los genes en esta ruta, y tres de ellos se localizan en un operón complejo que también contiene genes implicados en la síntesis de ADN y fosfolípidos. El grupo de genes rfa, que contiene muchos de los genes para la síntesis del núcleo de LPS, incluye al menos 17 genes. El grupo de genes rfb codifica la proteína implicada en la síntesis de antígeno O, y los genes rfb se han secuenciado a partir de una serie de serotipos y muestran el polimorfismo genético anticipado basándose en la complejidad química de los antígenos O. Véase Schnaitman y Klena, Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis in enteric bacteria, Microbiol. Rev. 57:655-82; 1993. Cuando están presentes, solas, o en combinación, las mutaciones rfb y oms causan alteraciones en la membrana eubacteriana que la hacen más sensible a las lisozimas y otros agentes usados para procesar minicélulas. De igual forma, las mutaciones rfa (Chen, L., y W. G. Coleman Jr. 1993. Cloning and characterization of the Escherichia coli K-12 rfa-2 (rfaC) gene, a gene required for lipopolysaccharide inner core synthesis. J. Bacteriol. 175:2534-2540), IpcA (Brooke, J. S., y M. A. Valvano. 1996. Biosynthesis of inner core lipopolysaccharide in enteric bacteria identification and characterization of a conserved phosphoheptose isomerase. J. Biol. Chem. 271:3608-3614), e IpcB (Kadrman, J. L., y col., 1998. Cloning and overexpression of glycosyltransferases that generate the lipopolysaccharide core of Rhizobium leguminosarum. J. Biol. Chem. 273:26432-26440), cuando están presentes solas o en combinación, causan alteraciones en los lipopolisacáridos de la membrana externa que hacen que las células sean más sensibles a lisozimas y agentes usados para procesar minicélulas. Además, pueden usarse dichas mutaciones para reducir la antigenicidad y/o toxicidad potencial de las minicélulas.

III.B. Condiciones de cultivo

Se incluyen en el diseño de la invención las condiciones para crecer células progenitoras a partir de las cuales se producirán las minicélulas. Los ejemplos no limitantes en el presente documento se refieren a condiciones para crecer células progenitoras de E. coli para producir minicélulas derivadas de células progenitoras de E. coli. Los ejemplos no limitantes de medio de crecimiento pueden incluir medio rico, por ejemplo, caldo Luria (LB), medio mínimo definido, por ejemplo, sales M63 con niveles definidos de carbono, nitrógeno, fosfato magnesio, y sulfato, y medio mínimo complejo, por ejemplo, medio mínimo definido con suplemento de casaminoácido. Este crecimiento puede efectuarse en tubos de cultivo, matraces de agitación (usando un incubador de aire convencional, o una fijación de matraz de agitación de biorreactor modificado), o biorreactor. El crecimiento de células progenitoras puede incluir adiciones suplementadas para asistir a la regulación de las construcciones de expresión listadas en las secciones anteriores. Estos suplementos pueden incluir, pero sin limitación, dextrosa, fosfato sales inorgánicas, ácidos ribonucleicos, ácidos desoxirribonucleicos, agentes tamponadores, tiamina, u otro agente químico que estimule el crecimiento, que estabilice el crecimiento, que sirva como osmo-protector, que regule la expresión génica, y/o que aplique presión selectiva a la mutación, y/o selección de marcadores. Estas mutaciones pueden incluir una auxotrofia de aminoácido o nucleótido, mientras que el marcador de selección incluye elementos transponibles, plásmidos, bacteriófagos, y/o marcadores auxotróficos o de resistencia a antibióticos. Las condiciones de crecimiento también pueden necesitar ajustes de temperatura, alteraciones de carbono, y/o modificaciones del nivel de oxígeno para estimular las mutaciones sensibles a la temperatura encontradas en productos génicos diseñados para un fenotipo dado deseado y optimizar las condiciones de cultivo.

A modo de ejemplo no limitante, la producción de minicélulas y la producción de proteínas pueden ocurrir usando cualquiera de dos estrategias generales o cualquier combinación de cada una. En primer lugar, las minicélulas se pueden formar, purificar, y después puede estimularse a los elementos de expresión contenidos para producir sus productos génicos codificados. En segundo lugar, las células progenitoras, a partir de las cuales se derivan las minicélulas, pueden estimularse para que expresen la proteína de interés y segreguen minicélulas simultáneamente. Finalmente, puede usarse cualquier variable de sincronización de formación de minicélulas y producción de proteínas para optimizar la producción de minicélulas y proteínas para servir mejor a la aplicación deseada. Las dos estrategias generales se muestran en las secciones a continuación.

III.C. Manipulación de la expresión genética en la producción de minicélulas

En el diseño de la invención se incluyen procedimientos que aumentan la eficacia, la velocidad y/o el nivel de expresión génica y producción de proteínas en células progenitoras y/o minicélulas. Dichos procedimientos incluyen, pero sin limitación, los siguientes.

A modo de ejemplo no limitante, las células progenitoras se crecen durante toda la noche en el medio adecuado. A partir de este cultivo, se subcultivan las células en el mismo medio y se controla su crecimiento. A la densidad celular adecuada, se induce la producción de minicélulas en los cultivos usando cualquiera de los mecanismos de cambio discutidos en la sección II.B. que regulan cualquier construcción discutida en la sección II.A. Los ejemplos no limitantes de este mecanismo de cambio inductor de minicélulas puede ser el producto génico de ileR que regula la producción del producto génico inductor de minicélulas hns o el producto génico de melR que regula la producción del producto génico inductor de minicélulas minB. Después de la inducción de minicélulas, se deja continuar el

crecimiento del cultivo hasta que se obtiene la concentración de minicélulas deseada. En ese momento, se separan las minicélulas de las células progenitoras tal como se describe en la sección II.E. Se induce la producción de proteínas en las minicélulas purificadas activando los mecanismos de cambio genético que se segregaron en la minicélula tras la separación de la célula progenitora. A modo de ejemplo no limitante, este mecanismo de cambio genético puede ser cualquiera de aquellos discutidos en la sección I.B. que regulan la producción de cualquier proteína de interés. Además, en ese momento o durante la producción de minicélulas, puede activarse la expresión génica periférica, la producción, y la maquinaria de ensamblaje discutida en la sección II.C. para asistir en este proceso. A modo de ejemplo no limitante, puede activarse el complejo groEL usando el sistema inducible lambda cl sensible a la temperatura a partir de un plásmido segregado de manera conjunta para asistir al ensamblaje correcto de la proteína de interés expresada.

III.D. Separación de minicélulas a partir de células progenitoras

Se usan una diversidad de procedimientos para separar las minicélulas de las células progenitoras (es decir, las células a partir de las cuales se producen las minicélulas) de una mezcla de células progenitoras y minicélulas. En general, dichos procedimientos son físicos, bioquímicos y genéticos, y pueden usarse en combinación.

III.D.1. Separación física de minicélulas a partir de células progenitoras

A modo de ejemplo no limitante, las minicélulas se separan de las células progenitoras mediante filtración en fibra de vidrio (Christen y col., Gene 23:195-198, 1983), y centrifugación diferencial y zonal (Barker y col., J. Gen. Microbiol. 111:387-396, 1979), cromatografía de exclusión por tamaño, por ejemplo, filtración en gel, sonicación diferencial (Reeve, J. N., y N. H. Mendelson. 1973. Pronase digestion of amino acid binding components on the surface of Bacillus subtilis cells and minicells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 53:1325-1330), e irradiación UV (Tankersley,

W. G., y J. M. Woodward. 1973. Induction and isoloation of non-replicative minicells of Salmonella typhimuium and their use as immunogens in mice. Bacteriol. Proc. 97).

Algunas técnicas implican diferentes técnicas de centrifugación, por ejemplo, centrifugación diferencial y zonal. A modo de ejemplo no limitante, las minicélulas pueden purificarse mediante la técnica de purificación de doble gradiente de glucosa descrita por Frazer y Curtiss, Curr. Topics Microbiol. Immunol. 69:1-84, 1975. La primera centrifugación implica centrifugación diferencial, que separa a las células progenitoras de las minicélulas basándose en las diferencias de tamaño y/o densidad. El porcentaje de sacarosa (graduado desde aproximadamente un 5 hasta aproximadamente un 20 %), Ficol o glicerol en el gradiente se diseña para permitir que solo las células progenitoras pasen a través del gradiente.

El sobrenadante, que está enriquecido en minicélulas, se separa del precipitado y se centrifuga a una velocidad mucho más alta (por ejemplo, ≥ 11.000 g). Esto precipita las minicélulas y cualquier célula progenitora que no precipitase en la primera centrifugación. Después se resuspende el precipitado y se lamina en una gradiente de sacarosa.

Se recoge la banda que contiene minicélulas, se precipita mediante centrifugación, y se carga en otro gradiente. Este procedimiento se repite hasta que la preparación de minicélulas está esencialmente libre de células progenitoras, o tiene una concentración de células progenitoras que es lo suficientemente baja como para no interferir con una aplicación o actividad seleccionada de las minicélulas. A modo de ejemplo no limitante, los tampones y medios usados en estas etapas de gradiente y resuspensión pueden ser LB, medio mínimo definido, por ejemplo, sales M63 con niveles definidos de carbono, nitrógeno, fosfato magnesio, y sulfato, medio mínimo complejo, por ejemplo, medio mínimo definido con suplemento de casaminoácido, y/o otro tampón o medio que sirva como osmo-protector, agente estabilizante, y/o fuente de energía, o puede contener agentes que limiten el crecimiento de células progenitoras contaminantes, por ejemplo, azida, atibiótico, o carencia de un requerimiento de suplemento auxotrófico, por ejemplo, tiamina.

También pueden usarse otros procedimientos físicos para eliminar células progenitoras de las preparaciones de minicélulas. A modo de ejemplo no limitante, las mezclas de células progenitoras y minicélulas se congelan a -20 °C y después se descongelan lentamente (Frazer y Curtiss, Curr. Topics Microbiol. Immunol. 69:1-84,1975).

III.D.2. Separación bioquímica de minicélulas a partir de células progenitoras

Las células progenitoras contaminantes pueden eliminarse de las preparaciones de minicélulas mediante incubación en presencia de un agente, o en una serie de condiciones, que elimina de manera selectiva a las células en división. Debido a que las minicélulas no pueden ni crecer ni dividirse, son resistentes a dichos tratamientos.

Los ejemplos de condiciones bioquímicas que evitan o eliminan a las células progenitoras en división es el tratamiento con un agente antibacteriano, tal como penicilina o derivados de la penicilina. La penicilina tiene dos efectos potenciales. En primer lugar, la penicilina evita la formación de la pared bacteriana y da lugar a la lisis de las células en división. En segundo lugar, antes de la lisis, las células en división forman filamentos que pueden asistir en las etapas de separación física descritas en la sección III.E.1. Además de la penicilina y sus derivados, pueden usarse otros agentes para evitar la división de las células progenitoras. Dichos agentes pueden incluir la azida. La azida es un inhibidor reversible del transporte de electrones, y de este modo evita la división celular. Como otro

ejemplo, también pueden servir la D-cicloserina o la proteína de lisis del fago MS2 como estrategia bioquímica para eliminar o inhibir a las células progenitoras en división. (Markiewicz y col., FEMS Microbiol. Lett. 70:119-123,1992). Khachatourians (Patente de los Estados Unidos Nº 4.311.797) afirma que puede ser deseable incubar las mezclas de minicélulas/células progenitoras en caldo de infusión de cerebro-corazón a de 36 °C a 38 °C antes de la adición de penicilina G y posteriores incubaciones.

III.D.3. Separación genética de minicélulas a partir de células progenitoras

Como alternativa o adicionalmente, pueden usarse varias técnicas para eliminar de manera selectiva, preferentemente lisar, las células progenitoras. Por ejemplo, aunque las minicélulas pueden retener internamente fago M13 en la etapa de plásmido del ciclo vital de M13, son refractarias a la infección y lisis mediante fago M13 (Staudenbauer y col., Mol. Gen. Genet. 138:203-212, 1975). Por el contrario, las células progenitoras se infectan y lisan mediante M13 y por lo tanto se eliminan de manera selectiva de una mezcla que comprende células progenitoras y minicélulas. Se trata una mezcla que comprende células progenitoras y minicélulas con fago M13 a un M.O.I. = 5 (fago:células). Se deja continuar la infección hasta un punto donde ≥ 50 % de las células progenitoras se lisan, preferentemente ≥ 75 %, más preferentemente ≥ 95 % lo más preferentemente ≥ 99 %; y ≤ 25 % de las minicélulas se lisan o eliminan, preferentemente ≤ 15 %, lo más preferentemente ≤ 1 %.

Como otro ejemplo no limitante de un procedimiento mediante el cual pueden eliminarse selectivamente las células progenitoras, y preferiblemente lisarse, un cromosoma de una célula progenitora puede incluir un gen condicionalmente letal. La inducción del gen cromosómico letal dará como resultado la destrucción de células progenitoras, pero no afectarán a las minicélulas, ya que carecen del cromosoma que porta el gen condicionalmente letal. Como ejemplo, una célula puede contener un bacteriófago integrado cromosomial que comprende un gen condicionalmente letal. Un ejemplo de dicho bacteriófago es un fago lambda integrado que tiene un gen represor sensible a la temperatura (por ejemplo, lambda cl857). La introducción de este fago, que da como resultado la destrucción de las células progenitoras pero no de las minicélulas acromosómicas, se logra solamente elevando la temperatura del medio de crecimiento. Un bacteriófago preferido para su uso en este procedimiento es uno que elimina y/o lisa las células progenitoras pero que no produce partículas infecciosas. Un ejemplo no limitante de este tipo de fago es uno que lisa una célula pero que se ha diseñado para que no produzca proteínas de la cápsida que rodea y protege al ADN del fago en partículas infecciosas. Es decir, las proteínas de la cápsida son necesarias para la producción de partículas infecciosas.

Como otro ejemplo no limitante de un procedimiento mediante el cual pueden eliminarse o lisarse selectivamente las células progenitoras, pueden expresarse proteínas tóxicas que dan lugar a la lisis de células progenitoras. A modo de ejemplo no limitante, estas construcciones inducibles pueden emplear un sistema descrito en la sección II.B. para controlar la expresión de un gen de holina de fago. Los genes de holina se encuentran dentro de al menos 35 familias diferentes sin relaciones ortólogas detectables (Grundling, A., y col., 2001. Holins kill without warning. Proc. Natl. Acad. Sci. 98:9348-9352) de los cuales todos y cada uno pueden usarse para lisar células progenitoras para mejorar la pureza de las preparaciones de minicélulas.

Las células eubacterianas gram negativas y las minicélulas están unidas por una membrana interna, que está rodeada de una pared celular, en la que la pared celular está en sí misma encerrada en una membrana externa. Es decir, procediendo del ambiente externo al citoplasma de una minicélula, una molécula se encuentra primero con la membrana externa (ME), después con la pared celular y finalmente, con la membrana interna (MI). En diferentes aspectos de la invención, se prefiere alterar o degradar la ME, la pared celular o la MI de una minicélula eubacteriana. Dichos tratamientos se usan, a modo de ejemplo no limitante, para aumentar o disminuir la inmunogenicidad, y/o para alterar las características de permeabilidad de una minicélula.

Las células eubacterianas y las minicélulas con membranas y/o paredes celulares alteradas se llaman "poroplasts™", "esferoplastos" y "protoplastos". En el presente documento, los términos "esferoplasto" y "protoplasto" se refieren a esferoplastos y protoplastos preparados a partir de minicélulas. Por el contrario, los "esferoplastos celulares" y los "protoplastos celulares" se refieren a esferoplastos y protoplastos preparados a partir de células. Asimismo, tal como se usa en el presente documento, el término "minicélula" abarca no solo minicélulas per se, sino que también abarca poroplasts™, esferoplatos y protoplastos.

En un poroplasto, se han eliminado la membrana externa eubacteriana (ME) y el LPS. En un esferoplasto, las porciones de una ME eubacteriana rota y/o pared celular rota pueden mantenerse asociadas con la membrana interna de la minicélula, pero la membrana y la pared celular son sin embargo porosas debido a que la permeabilidad de la ME alterada y de la pared celular se ha aumentado. Se dice que se va a "alterar" una membrana cuando la estructura de la membrana se ha tratado con un agente, o se ha incubado en condiciones que conducen a la degradación parcial de la membrana, aumentando de este modo la permeabilidad de la misma. Por el contrario, una membrana que se ha "degradado" es esencialmente, para las intenciones y fines aplicables, eliminada. En realizaciones preferidas, independientemente de la condición de la ME y de la pared celular, la membrana interna eubacteriana no está rota, y las proteínas de membrana mostradas en la membrana interna están accesibles a compuestos que se ponen en contacto con la minicélula, poroplasto, esferoplasto, protoplasto o poroplasto celular, según sea el caso.

IV. Ensayos con minicélulas

IV.A. Eficacia de la producción de minicélulas

El nivel de producción de minicélulas variará y puede evaluarse usando procedimientos descritos en el presente documento. Se prefieren generalmente niveles de producción de minicélulas relativamente altos. Se han comunicado condiciones en las cuales aproximadamente un 40 % de las células son acromosómicas (véase, por ejemplo, Hassan y col., Suppression of initiation defects of chromosome replication in Bacillus subtilis dnaA and oriC-deleted mutants by integration of a plasmid replicon into the chromosomes, J Bacteriol 179:2494-502,1997). Se conocen en la técnica procedimientos para identificar cepas que dan producciones elevadas de minicélulas; véase, por ejemplo, Clark-Curtiss y Curtiss III, Analysis of Recombinant DNA Using Escherichia coli Minicells, Meth. Enzol. 101:347-362, 1983.

La producción de minicélulas puede evaluarse mediante examen microscópico de cultivos en fase log tardía. La proporción de minicélulas a células normales y la frecuencia de las células produciendo minicélulas de manera activa son parámetros que aumentan con el aumento de la producción de minicélulas.

IV.B. Detección de síntesis de proteínas en minicélulas

Se conocen en la técnica procedimientos para detectar y ensayar la producción de proteínas. Véase, por ejemplo, Clark-Curtiss y Curtiss III, Meth Enzol 101:347-362, 1983. A modo de procedimiento ilustrativo, se crecen células de

E. coli transformadas productoras de minicélulas en caldo LB con el antibiótico adecuado durante toda la noche. Al día siguiente se diluyen los cultivos de toda la noche a 1:50 en medio fresco, y se crecen a 37 °C hasta la mitad de la fase log. Si se desea eliminar células completas, puede usarse un antibiótico que elimina células en crecimiento (completas) pero no células quiescentes (minicélulas). Por ejemplo, en el caso de células que no son resistentes a la ampicilina, se añade ampicilina (100 mg por ml), y se deja continuar la incubación durante aproximadamente 2 horas más. Los cultivos se centrifugan entonces dos veces a baja velocidad para precipitar la mayor parte de las células grandes. Las minicélulas se precipitan centrifugando durante 10 min a 10.000 rpm, y después se resuspenden en medio mínimo M63 suplementado con casaminoácidos al 0,5 %, y AMPc 0,5 mM, o medio mínimo M9 suplementado con MgSO4 1 mM, CaCl2 0,1 mM, NaCl al 0,05 %, glucosa al 0,2 %, y 1 ng por ml de tiamina. Se añade metionina marcada (35S) a las minicélulas durante aproximadamente 15 a aproximadamente 90 minutos, y se recogen inmediatamente las minicélulas después mediante centrifugación durante 10 min a 4 °C y 14.000 rpm. Las células se resuspenden en 50 a 100 µg de Laemmeli-tampón, y se rompen hirviendo y agitando vorticialmente (2 min para cada etapa). La incorporación de 35S-metionina se determinó midiendo la cantidad de radioactividad contenida en 1 µl del lisado después de la precipitación de proteínas con ácido tricloroacético (TCA). Los lisados de minicélulas (50.000 a

100.000 cpm por carril) se someten a PAGE en, por ejemplo, geles de poliacrilamida al 10 % en los cuales también se corren proteínas de tamaño conocido como patrones de peso molecular. Los geles se fijan y se generan imágenes de los mismos mediante, por ejemplo, autorradiografía o cualquier otro sistema de detección adecuado.

IV. C. Evaluación del potencial terapéutico de las minicélulas

Se usan varios procedimientos en diversas etapas del desarrollo de una composición de minicélulas terapéuticas para estimar su potencial terapéutico. Como ejemplo no limitante, el potencial terapéutico de minicélulas que muestran un receptor se examina como se indica a continuación.

V. Expresión genética en minicélulas

Varias minicélulas de la invención usan sistemas de expresión de ADN recombinante para producir una proteína no eubacteriana, que puede ser una proteína de membrana que se "muestra" preferentemente en la superficie de las minicélulas, una proteína de membrana que proyecta porciones no asociadas con una membrana hacia el interior de una minicélula, o una proteína soluble presentada en el exterior de las minicélulas. Por "mostrada" se entiende que una proteína está presente sobre la superficie de una célula (o minicélula) y por lo tanto está en contacto con el ambiente externo de la célula. Los ejemplos no limitantes de proteínas exógenas mostradas de la invención incluyen receptores de mamífero y proteínas de fusión que comprenden uno o más dominios transmembrana. En otros aspectos de la invención, las minicélulas usan elementos de expresión para producir ácidos nucleicos bioactivos a partir de moldes de los mismos.

V.A. Sistemas de expresión

Los sistemas de expresión de proteínas in vivo e in vitro proporcionan una variedad de técnicas que permiten a los científicos transcribir y traducir aminoácidos, polipéptidos y proteínas a partir de moldes de ADN recombinante (Kaufman, Overview of vector design for mammalian gene expression. Mol Biotechnol, 2001,16:151-160; y Kozak, Initiation of translation in prokaryotes and eukaryotes. Gene, 1999. 234: 187-208).

Aunque las minicélulas están virtualmente vacías de ADN cromosómico (Tudor y col., Presence of nuclear bodies in some minicells of Escherichia coli. J Bacteriol, 1969. 98: 298-299), se ha comunicado que las minicélulas tienen todos los elementos necesarios para expresar secuencias de nucleótidos que están presentes en elementos de expresión episómicos en ellas (Levy, Very stable prokaryote messenger RNA in chromosomeless Escherichia coli

minicells. Proc Natl Acad Sci USA, 1975. 72: 2900-2904; Hollenberg y col., Synthesis of high molecular weight polypeptides in Escherichia coli minicells directed by cloned Saccharomyces cerevisiae 2-micron DNA. Gene, 1976.

1: 33-47; Crooks y col., Transcription of plasmid DNA in Escherichia coli minicells. Plasmid, 1983. 10: 66-72; Clark-Curtiss, Analysis of recombinant DNA using Escherichia coli minicells. Methods Enzymol, 1983. 101: 347-362).

Los vectores y construcciones de expresión preferidos de acuerdo con la invención son elementos genéticos episómicos. Por "episómico" se entiende que la construcción de expresión no está siempre unida al cromosoma de una célula, pero en cambio puede estar retenida o mantenida en células hospedadoras como una entidad molecular distinta. Las minicélulas pueden retener, mantener y expresar construcciones de expresión episómicas, tales como, por ejemplo, plásmidos, bacteriófagos, virus y similares (Crooks y col., Plasmin 10:66-72, 1983; Clark-Curtiss, Methods Enzymology 101:347-62, 1983; Witkiewicz y col., Acta. Microbiol. Pol. A 7:21-24, 1975; Ponta y col., Nature 269:440-2, 1977). Por "retenida" se entiende que la construcción de expresión episómica está al menos temporalmente presente y expresada en una célula progenitora y/o minicélula hospedadora; por "mantenida" se entiende que la construcción de expresión episómica es capaz de replicación autónoma en una célula progenitora y/o minicélula hospedadora. En el contexto de los elementos episómicos, el término "contenido" abarca tanto "retenido" como "mantenido." Un tipo preferido de un elemento episómico de acuerdo con la invención es uno que siempre es un elemento extracromosómico, o que es parte de un cromosoma pero que se convierte en un elemento extracromosómico antes o durante la producción de minicélulas.

El hecho de que las minicélulas no contengan ADN cromosómico pero que contengan elementos de expresión episómicos, tales como plásmidos, que pueden usarse como moldes para la síntesis de ARN significa que las únicas proteínas que se producen de manera activa en las minicélulas son aquellas codificadas por los elementos de expresión que estas contienen. Las células de E. coli productoras de minicélulas pueden hacerse competentes y transformarse con elementos de expresión que dirigen la expresión de proteínas codificadas por los elementos de expresión. Un elemento de expresión se segrega en las minicélulas a medida que se produce. En las minicélulas aisladas que contienen elementos de expresión, hay un solo molde de ADN para la transcripción de ARN. Por lo tanto, los únicos ácidos nucleicos y proteínas que se producen (expresan) de manera activa por las minicélulas son aquellos codificados por secuencias en el vector de expresión. En el contexto de la invención, las secuencias que codifican secuencias de aminoácidos se denominan "marcos abiertos de lectura" u "ORF". Una característica de los sistemas de expresión de minicélulas de interés en lo referente a la presente invención es que los genes endógenos (es decir, localizados cromosomalmente) no están presentes y por lo tanto no se expresan, mientras que los genes presentes en el elemento episómico se expresan (preferentemente sobreexpresan) en las minicélulas. Como resultado, la cantidad de proteínas endógenas, incluyendo proteínas de membrana, disminuye a medida que las minicélulas continúan expresando genes localizados en construcciones de expresión episómicas.

El sistema de minicélulas puede reducir o eliminar características no deseadas asociadas con la transcripción y traducción de proteínas endógenas del cromosoma de E. coli. Por ejemplo, la expresión de proteínas en sistemas de minicélulas da como resultado una baja señal de fondo ("ruido") cuando se producen proteínas radiomarcada usando tecnología de ADN recombinante (Jannatipour y col., Translocation of Vibrio Harveyi N,N’-Dlacetylchitobiase to the outer membrane of Escherichia coli. J. Bacteriol, 1987. 169: 3785-3791). Una señal de fondo elevada puede hacer dificil detectar una proteína de interés. En sistemas de células de E. coli completas, se marcan las proteínas endógenas (codificadas por el cromosoma bacteriano) así como la proteína (o proteínas) codificada por el elemento de expresión, mientras que, en sistemas de minicélulas, solo se marcan las proteínas codificadas por el elemento de expresión en las minicélulas.

V.B. Modulación de la expresión genética en minicélulas

La expresión génica en minicélulas, y/o células (progenitoras) productoras de minicélulas, implica la actividad coordinada de una variedad de factores de expresión, elementos reguladores y secuencias de expresión. Cualquiera de estas puede modificarse para alterar el alcance, la sincronización o la regulación de la expresión de un gen de interés en las minicélulas y/o sus células progenitoras. A menudo, el objetivo de las manipulaciones es aumentar la eficacia de la producción de proteínas en minicélulas. Sin embargo, la expresión aumentada puede, en algunos casos, incluir de manera deseable regulación aumentada o negativa "estrecha". Esto puede reducir o eliminar la presión selectiva creada por los productos génicos tóxicos, y permitir la expresión funcional de manera controlada eliminado la regulación negativa y/o induciendo la expresión del producto génico en un momento preseleccionado. A modo de ejemplo no limitante, estas técnicas pueden incluir la modificación o eliminación de genes endógenos a partir de los cuales su producto génico respectivo disminuye la eficacia de la inducción y expresión de una proteína deseada en la célula progenitora antes de la formación de minicélulas y/o segregación de minicélulas. A modo de ejemplo no limitante, estos componentes proteicos pueden ser enzimas que degradan inductores químicos de la expresión, proteínas que tienen un efecto negativo dominante sobre elementos reguladores positivos, proteínas que tienen actividad proteolítica contra la proteína que se va a expresar, proteínas que tienen un efecto negativo contra una chaperona que es necesaria para la actividad adecuada de la proteína expresada, y/o esta proteína puede tener un efecto positivo sobre una proteína que bien degrada o previene la función adecuada de la proteína expresada. Estos productos génicos que necesitan deleción o modificación para la expresión y/o función óptima de proteínas también pueden ser ácidos nucleicos antisentido que tienen un efecto negativo sobre la expresión génica.

VI. Proteínas de fusión (quiméricas)

En determinados aspectos de la invención, una proteína de fusión se expresa y muestra por las minicélulas. Una clase de proteínas de fusión de particular interés son aquellas que se muestran en la superficie de las minicélulas, por ejemplo, proteínas de fusión que comprenden uno o más dominios transmembrana. Los tipos de proteínas de fusión mostradas de interés particular son, a modo de ejemplo no limitante, aquellas que tienen un dominio extracelular que es un resto de unión o un resto enzimático. A modo de ejemplo no limitante, la proteína de fusión ToxR-PhoA se ha expresado en y mostrado sobre la superficie de minicélulas. La proteína de fusión ToxR-PhoA comprende un polipéptido correspondiente a la enzima normalmente soluble, la fosfatasa alcalina, anclada a la membrana de la minicélula por el único dominio transmembrana de ToxR (véanse los Ejemplos). La proteína de fusión retiene la actividad de la enzima en el contexto de la membrana de la minicélula a la que está unida. Prácticamente toda la proteína de fusión se orienta de tal forma que el dominio catalítico de la enzima se muestra en la superficie externa de la minicélula.

VI.A. Generación de proteínas de fusión

Los polipéptidos, que son polímeros de aminoácidos, están codificados por otra clase de moléculas, conocidas como ácidos nucleicos, que son polímeros de unidades estructurales conocidas como nucleótidos. En particular, las proteínas se codifican pro ácidos nucleicos conocidos como ADN y ARN (ácido desoxirribonucleico y ácido ribonucleico, respectivamente).

La secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico contiene los "planos" para una proteína. Los ácidos nucleicos son polímeros de nucleótidos, cuatro tipos de los cuales están presentes en un ácido nucleico dado. Los nucleótidos en el ADN son adenina, citosina, guanina y timina, (representados por A, C, G, y T respectivamente); en el ARN, la timina (T) se sustituye por uracilo (U). Las estructuras de los ácidos nucleicos se representan por la secuencia de sus nucleótidos dispuestos en una dirección 5' ("5 prima") a 3' ("3 prima"), The structures of nucleic acids are represented by the sequence of its nucleotides arranged in a 5’ ("5 prime") to 3’ ("3 prime") direction, por ejemplo.

En sistemas biológicos, las proteínas se producen típicamente del siguiente modo. Una molécula de ADN que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de una proteína se usa como molde para guiar la producción de un ARN mensajero (ARNm) que también codifica la proteína; este proceso se conoce como transcripción. En un proceso posterior llamado traducción, el ARNm se "lee" y dirige la síntesis de una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos particular.

Cada aminoácido en una proteína está codificado por una serie de tres nucleótidos contiguos, cada uno de los cuales se conoce como un codón. En el "código genético", algunos aminoácidos están codificados por varios codones, teniendo cada codón una secuencia diferente; mientras que otros aminoácidos están codificados por una sola secuencia codónica. Una proteína completa (es decir, una secuencia completa de aminoácidos) está codificada por una secuencia de ácido nucleico denominada marco de lectura. Un marco de lectura es una secuencia de nucleótidos continua que codifica la secuencia de aminoácidos de una proteína; los límites de un marco de lectura se definen por sus codones de inicio y terminación.

El proceso mediante el cual se produce una proteína a partir de un ácido nucleico puede esquematizarse del modo

siguiente:

ADN

(A-T-G)-(A-A-G)-(C-C-G)-(C-T-C)-(C-C-T)-... (etc.)

↓Transcripción

ARN

(A-U-G)-(A-A-G)-(C-C-G)-(GU-C)-(C-C-U)-... (etc.)

↓Traducción

Proteína Met -Pro -Lys -Ala -Ala -... (etc.)

Un marco de lectura quimérico que codifica una proteína de fusión se prepara del modo siguiente. Un "marco de lectura quimérico" es un marco de lectura diseñado genéticamente que es el resultado de la fusión de dos o más marcos de lectura normalmente distintos, o fragmentos de los mismos, cada uno de los cuales codifica normalmente un polipéptido separado. Usando técnicas de ADN recombinante, se une un primer marco de lectura que codifica una primera secuencia de aminoácidos a un segundo marco de lectura que codifica una segunda secuencia de aminoácidos para generar un marco de lectura quimérico. Los marcos de lectura quiméricos también pueden incluir secuencias nucleotídicas que codifican elementos de proteínas de fusión opcionales (véase más adelante).

Un ejemplo hipotético de un marco de lectura quimérico creado a partir de dos marcos de lectura normalmente

separados se ilustra en el siguiente diagrama de flujo. Primer marco de lectura abierto y "Proteína-1":

ADN-1

(A-T-G)-(A-A-G)-(C-C-G)-(C-T-C)-(C-C-T)-... (etc.)

↓Transcripción

ARN-1

(A-U-G)-(A-A-G)-(C-C-G)-(C-U-C)-(C-C-U)-... (etc.)

↓Traducción

Proteína-1

Met -Pro -Lys -Ala -Ala --... (etc.)

Segundo marco de lectura abierto y "Proteína-2":

ADN-2 (T-G-G)-(G-T-T)-(A-C-7)-(C-A-C)-(T-C-A)-... (etc.)

↓Transcripción

ARN-2 (U-G-G)-(G-U-U)-(A-C-U)-(C-A-C)-(U-C-A)-... (etc.)

↓Traducción

Proteína-2 Trp -Val-Thr -His -Ser-... (etc.)

Marco de lectura quimérico que codifica una proteína de fusión que tiene secuencias de la Proteína-1 y la Proteína

2:

Quimera de ADN (A-T-G)-(A-A-G)-(C-C-G)-(C-A-C)-(T-C-A)-(etc.)

↓Transcripción

Quimera de ARN (A-U-G)-(A-A-G)-(C-C-G)-(C-A-C)-(U-C-A)-(etc.)

↓Traducción

Proteína de fusión Met -Pro -Lys -His -Ser -(etc.)

Para que un marco de lectura quimérico sea funcional, cada marco de lectura normalmente distinto en este tiene que fusionarse con todos los otros marcos de lectura normalmente distintos de tal modo que todos los demás marcos de lectura se encuentren en marco entre sí. Por "en marco entre sí" se entiende que, en un marco de lectura quimérico, se une covalentemente un primer ácido nucleico que tiene un primer marco de lectura a un segundo ácido nucleico que tiene un segundo marco de lectura de tal modo que los dos marcos de lectura se "lean" (traduzcan) en registro con el otro. Como resultado, el marco de lectura quimérico codifica una secuencia de aminoácidos extendida que incluye las secuencias de aminoácidos codificadas por cada uno de los marcos de lectura normalmente separados. Por lo tanto se codifica una proteína de fusión por un marco de lectura quimérico.

Las proteínas de fusión de la invención se usan para mostrar polipéptidos en las minicélulas. Las proteínas de fusión comprenden (1) al menos un polipéptido que se desea expresar por las minicélulas (un "polipéptido mostrado") y (2) al menos un polipéptido de membrana, por ejemplo, un dominio transmembrana o de anclaje a membrana. Para varios aspectos de la invención, los elementos de proteína de fusión opcionales, tal como se definen en el presente documento, también pueden incluirse si se necesita o desea.

VI.B. Elementos de proteína de fusión opcionales

Las proteínas de fusión de la invención pueden comprender opcionalmente una o más secuencias de aminoácidos no activas biológicamente, es decir, elementos de proteína de fusión opcionales. Dichos elementos incluyen, pero sin limitación, los siguientes elementos de proteína de fusión opcionales. Se entiende que un marco de lectura quimérico incluirá secuencias de nucleótidos que codifican dichos elementos de proteína de fusión opcionales, y que estas secuencias de nucleótidos se posicionarán de tal forma que estén en marco con el marco de lectura que codifica la proteína de fusión. Los elementos opcionales de proteína de fusión pueden insertarse entre el polipéptido mostrado y el polipéptido de membrana, cadena arriba o cadena abajo (amino proximal y carboxi proximal,

respectivamente) de estos y otros elementos, o entre el polipéptido mostrado y el polipéptido de membrana. Un experto en la materia será capaz de determinar qué elemento opcional (o elementos opcionales) debe incluirse en una proteína de fusión de la invención, y en qué orden, basándose en el procedimiento de producción deseado o en el uso previsto de la proteína de fusión.

Los polipéptidos detectables son elementos de proteína de fusión opcionales que bien generan una señal detectable

o se reconocen específicamente por un agente marcado de manera detectable. Un ejemplo de la clase anterior de polipéptido detectable es la proteína fluorescente verde (GFP). Los ejemplos de la última clase incluyen epítopos, tales como el "marcador His" (6 restos de His contiguos, también conocido como 6xHis), el "marcador FLAG" y el epítopo c-myc. Estos y otros epítopos pueden detectarse usando anticuerpos marcados que son específicos para el epítopo. Varios de dichos anticuerpos están comercialmente disponibles.

Los elementos de acoplamiento (que soportan la unión) se incluyen opcionalmente en proteínas de fusión y pueden usarse para unir minicélulas que muestran una proteína de fusión a una superficie o soporte preseleccionado. Los ejemplos de dichos elementos incluyen un "marcador His", que se une a superficies que se han recubierto con níquel; estreptavidina o avidina, que se unen a superficies que se han recubierto con biotina o que se han "biotinilado" (véase la Patente de Estados Unidos 4.839.293 y Airenne y col., Protein Expr. Purif. 17:139-145,1999); y la glutatión-s-transferasa (GST), que se une a superficies recubiertas con glutatión (Kaplan y col., Protein Sci. 6:399406, 1997; Patente de Estados Unidos 5.654.176). También se han descrito polipéptidos que se unen a iones de plomo (Patente de Estados Unidos 6.111.079).

Los espaciadores (también conocidos como enlazantes) son secuencias de aminoácidos incluidas en una proteína de fusión entre otras porciones de una proteína de fusión (por ejemplo, entre el polipéptido de membrana y el polipéptido mostrado, o entre un elemento de proteína de fusión opcional y el resto de la proteína de fusión). Los espaciadores pueden incluirse por una variedad de razones. Por ejemplo, un espaciador puede proporcionar cierta separación física entre dos partes de una proteína que podría de otro modo interferir entre sí mediante, por ejemplo, impedancia estérica. La capacidad para manipular la distancia entre el polipéptido de membrana y el polipéptido mostrado permite extender el polipéptido mostrado a varias distancias desde la superficie de las minicélulas.

VI. C. Interacciones con células receptoras

Muchos patógenos Gram-negativos usan una máquina de secreción de tipo III para traslocar proteínas de toxinas a través de la envuelta celular bacteriana (para una revisión, véase Cheng LW, Schneewind O. Type III machines of Gram-negative bacteria: delivering the goods. Trends Microbiol 2000 May;8(5):214-20). Por ejemplo, las Yersinia spp. patogénicas exportan más de una docena de proteínas Yop a través de un mecanismo de tipo III, que reconoce sustratos de secreción mediante señales codificadas en ARNm de yop o chaperonas unidas a proteínas Yop no plegadas. Se encuentra un plásmido de virulencia de 70 kb en Yersinia spp. patogénicas para sobrevivir y multiplicarse en los tejidos linfoides del hospedador. El plásmido de virulencia codifica en virulón de Yop, un sistema integrado que permite a la bacteria extracelular inyectar proteínas bacterianas en las células. El virulón de Yop comprende una variedad de proteínas de Yop y un aparato de secreción de tipo III dedicado, denominado Ysc (para una revisión, véase Cornelis GR, Boland A, Boyd AP, Geuijen C, Iriarte M, Neyt C, Sory MP, Stainier I. The virulence plasmid of Yersinia, an antihost genome. Microbiol Mol Biol Rev 1998 62(4): 1315-52).

En una realización relacionada no limitante de la invención, las minicélulas que expresan un antígeno particular (por ejemplo, proteína, carbohidrato, molécula pequeña, lípido) en sus superficies (descritas en otras partes de esta solicitud) se usan para generar una respuesta inmunogénica. Las ventajas de presentar un antígeno sobre las superficies de minicélulas son que las minicélulas en sí pueden ser un adyuvante que estimula la respuesta inmune, particularmente si se administran por vía subcutánea (SC) o intramuscular (IM). Además, las minicélulas no se eliminan fácilmente por el sistema renal y están presentes en el sistema circulatorio de un animal inmunizado durante un tiempo más largo. Además, pueden anclarse moléculas pequeñas a la minicélula de tal modo que presenta el resto deseado de la molécula. Los inmunógenos basados en minicélulas se presentan en los animales, y los anticuerpos producidos en los animales se preparan y usan en aplicaciones terapéuticas, diagnósticas de investigación y de exploración. Aunque este aspecto de la invención puede usarse para producir anticuerpos para cualquier molécula mostrada en su superficie, los dominios extracelulares de proteínas de membrana son de particular interés.

VII. Aptámeros

Tradicionalmente, las técnicas para detectar y purificar moléculas diana han usado polipéptidos, tales como anticuerpos, que se unen específicamente a dichas dianas. Aunque se sabe desde hace tiempo que los ácidos nucleicos se unen específicamente a otros ácidos nucleicos (por ejemplo, aquellos que tienen secuencias complementarias), se han desvelado aptámeros (es decir, ácidos nucleicos que se unen a moléculas diana no nucleicas). Véase, por ejemplo, Blackwell y col., Science (1990) 250:1104-1110; Blackwell y col., Science (1990) 250:1149-1152; Tuerk y col., Science (1990) 249:505-510; Joyce, Gene (1989) 82:83-87; y la Patente de Estados Unidos 5.840.867 titulada "Aptamer analogs specific for biomolecules".

Según se aplica a los aptámeros, el término "unión" excluye específicamente las interacciones de unión de tipo

"Watson-Crick"(es decir, emparejamiento de bases A:T y G:C) tradicionalmente asociado con la doble hélice de ADN. El término "aptámero" se refiere por lo tanto a un ácido nucleico o derivado de ácido nucleico que se une específicamente a una molécula diana, en el que la molécula diana bien (i) no es un ácido nucleico, o bien (ii) es un ácido nucleico o elemento estructural del mismo que está unido mediante mecanismos distintos al emparejamiento de base de tipo dúplex o triplete. Dicha molécula se llama "molécula no nucleica" en el presente documento.

VII.A. Estructuras de ácidos nucleicos

Los "ácidos nucleicos", tal como se usan en el presente documento, se refieren a ácidos nucleicos que están aislados de una fuente natural; se preparan in vitro, usando técnicas tales como amplificación por la PCR o síntesis química; se preparan in vivo, por ejemplo, mediante tecnología de ADN recombinante; o mediante cualquier procedimiento adecuado. Los ácidos nucleicos pueden tener cualquier forma (lineal, circular etc.) o topología (monocatenario, bicatenario, superenrollado, etc.). La expresión "ácidos nucleicos" también incluye sin limitación derivados de ácidos nucleicos, tales como ácidos peptidonucleicos (APN) y conjugados de polipéptido-ácido nucleico; ácidos nucleicos que tienen al menos un resto de azúcar, estructura, engarce internucleótido, base, nucleósido o análogo de nucleótido químicamente modificado; así como ácidos nucleicos que tienen extremos 5' o 3' químicamente modificados; y ácidos nucleicos que tienen dos o más de dichas modificaciones. No todos los engarces en un ácido nucleico tienen por qué ser idénticos.

Los ácidos nucleicos que son aptámeros a menudo, pero no necesariamente, se preparan como oligonucleótidos. Los oligonucleótidos incluyen, sin limitación, ARN, ADN y moléculas mixtas de ARN-ADN que tienen secuencias de longitudes que tienen longitudes mínimas de 2, 4, 6, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24 o 25 nucleótidos, y longitudes máximas de aproximadamente 100, 75, 50, 40, 25, 20 o 15 o más nucleótidos, independientemente. En general, es necesario un mínimo de 6 nucleótidos, preferentemente 10 nucleótidos, más preferentemente de 14 a 20 nucleótidos, para efectuar unión específica.

En general, los oligonucleótidos pueden ser ADN o ARN monocatenario (ss) o bicatenario (ds), o conjugados (por ejemplo, moléculas de ARN que tienen "abrazaderas" de ADN 5' y 3') o híbridos (por ejemplo, moléculas de ARN:ADN emparejados), o derivados (formas químicamente modificadas de los mismos). Sin embargo, se prefiere el ADN monocatenario, ya que el ADN es a menudo menos lábil que el ARN. De igual forma, se prefieren las modificaciones químicas que potencian la especificidad o estabilidad de un aptámero.

VII.B. Modificaciones químicas de ácidos nucleicos

Las modificaciones químicas que pueden incorporarse en los aptámeros y otros ácidos nucleicos incluyen, sin limitación ni exclusividad, modificaciones de bases, modificaciones de azúcares, y modificaciones de estructura.

Modificaciones de bases: Los restos de bases en los aptámeros pueden ser distintos de las bases de origen natural (por ejemplo, A, G, C, T, U, 5MC, y similares). Se conocen en la técnica derivados de purinas y pirimidinas; una lista ilustrativa pero no exhaustiva incluye aziridinilcitosina, 4-aceticitosina, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-carboximetilaminometiluracilo, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilseudouracilo, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3metilcitosina, 5-metilcitosina (5MC), N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminoetil-2tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N-6-isopenteniladenina, metiléster del ácido uracil-5oxiacético, seudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, ácido uracil-5-oxiacético, y 2,6-diaminopurina. Además de ácidos nucleicos que incorporan uno o más de dichos derivados de base, también pueden incluirse en los aptámeros ácidos nucleicos que tienen restos de nucleótidos que carecen de una base de purina o de pirimidina.

Modificaciones de azúcares: Los restos de azúcar en los aptámeros pueden ser distintos de los restos convencionales de ribosa y desoxirribosa. A modo de ejemplo no limitante, la sustitución en la posición 2' del resto de furanosa potencial la estabilidad a nucleasas. Una lista ilustrativa pero no exhaustiva de restos de azúcar modificados incluye azúcares 2' sustituidos, tales como 2'-O-metil-, 2’-O-alquil, 2’-O-alil, 2’-S-alquil, 2’-S-alil, 2’-fluoro, 2’-halo, o 2’-azido-ribosa, análogos de azúcar carbocíclicos, azúcares alfa-anoméricas, azúcares epiméricos, tales como arabinosa, xilosas or lixosas, azúcares de piranosa, azúcares de furanosa, seudoheptulosas, análogos acíclicos y análogos de nucleósidos abásicos, tales como metil ribósido, etil ribósido o propilribósido.

Modificaciones de estructura: Las estructuras químicamente modificadas incluyen, a modo de ejemplo no limitante, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, fosfonatos de metilo y otros de alquilo incluyendo fosfonatos de 3'-alquileno y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos, incluyendo fosforamidato de 3’-amino y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres, y boranofosfatos que tienen engarces 3’-5’ normales, análogos engarzados en 2’-5’ de estos, y aquellos que tienen polaridad invertida en los que los pares adyacentes de unidades de nucleósido están engarzadas de 3’-5’ a 5’-3’ o de 2’-5’ a 5’-2’. Las estructuras químicamente modificadas que no contienen un átomo de fósforo tienen estructuras que se forman mediante engarces internucleótidos de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, de heteroátomo mixto y engarces internucleósido de alquilo o cicloalquilo, o uno o más engarces inernucleósido heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta, incluyendo sin limitación engarces morfolino;

estructuras de siloxano; estructuras de sulfuro, sulfóxido y sulfona; estructuras de formacetilo y tioformacetilo; estructuras de formacetilo y tioformacetilo de metileno; estructuras que contienen alqueno; estructuras de sulfamato; estructuras de metilenimino y metilenhidrazino; estructuras de sulfonato y sulfonamida; y estructuras de amida.

VIII. Restos de unión polipeptídicos

Pueden unirse una variedad de restos de unión a una minicélula de la invención con una variedad de fines. En una realización preferida, el resto de unión se dirige a un ligando que se muestra por una célula en la que se desea administrar el contenido terapéutico de una minicélula.

VIII.A. Anticuerpos y derivados de anticuerpos

El término "anticuerpo" pretende abarcar una molécula de inmunoglobulina obtenida mediante la generación de una respuesta inmunogénica in vitro o in vivo, e incluye anticuerpos policlonales, monoespecíficos y monoclonales, así como derivados de anticuerpos, por ejemplo, fragmentos de anticuerpo monocatenarios (scFv). Una "respuesta inmunogénica" es una que da como resultado la producción de anticuerpos dirigidos a una o más proteínas después de que las células adecuadas se hayan puesto en contacto con dichas proteínas, o derivados polipeptídicos de las mismas, de tal modo que una o más porciones de la proteína funcionen como epítopos. Un epítopo es un solo determinante antigénico en una molécula. En las proteínas, en particular en las proteínas desnaturalizadas, un epítopo se define y representa típicamente mediante una secuencia de aminoácidos contiguos. Sin embargo, en el caso de proteínas no desnaturalizadas, los epítopos también incluyen estructuras, tales como sitios activos, que se forman mediante el plegamiento tridimensional de una proteína de tal modo que los aminoácidos de porciones separadas de la secuencia de aminoácidos de la proteína se ponen en contacto físico estrecho entre sí.

Los anticuerpos de tipo silvestre tienen cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas. Ambos tipos de cadenas de polipéptido tienen regiones constantes, que no varían o varían mínimamente entre anticuerpos de la misma clase (es decir, IgA, IgM, etc.), y regiones variables. Las regiones variables son únicas para un anticuerpo particular y comprenden un "dominio de unión a antígeno" que reconoce a un epítopo específico. Por lo tanto, la especificidad de un anticuerpo se determina por las regiones variables localizadas en las regiones amino terminales de las cadenas ligeras y pesadas.

Tal como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" abarca derivados de anticuerpos, tales como fragmentos de anticuerpos que mantienen la capacidad de unirse específicamente a antígenos. Dichos fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab (es decir, un fragmento de anticuerpo que contiene el dominio de unión a antígeno y comprende una cadena ligera y parte de una cadena pesada puenteada mediante un enlace disulfuro); Fab’ (un fragmento de anticuerpo que contienen un solo dominio de unión anti que comprenden un Fab y una porción adicional de la cadena mesada a través de la región bisagra); F(ab’)2 (dos moléculas de Fab' unidas mediante enlaces disulfuro intercadena en las regiones bisagra de las cadenas pesadas; las moléculas Fab' pueden dirigirse hacia el mismo o hacia distintos epítopos); un Fab biespecífico (una molécula de Fab que tiene dos dominios de unión a antígeno, cada uno de los cuales puede dirigirse a un epítopo diferente); una cadena de Fab monocatenario que comprende una región variable, también conocido como un sFv (la región variable determinante de la unión a antígeno de una sola cadena ligera y una cadena pesada de un anticuerpo unidas juntas mediante una cadena de aproximadamente 10 a aproximadamente 25 aminoácidos).

El término "anticuerpo" incluye anticuerpos y derivados de anticuerpo que se producen mediante técnicas de ADN recombinante y anticuerpos "humanizados". Los anticuerpos humanizados se han modificado, mediante manipulación genética y/o tratamiento in vitro para ser más humanos, en cuanto a secuencia de aminoácidos, patrón de glucosilación, etc., para reducir la antigenicidad del anticuerpo o fragmento de anticuerpo en un animal al cual se pretende administrar el anticuerpo (Gussow y col., Methods Enz. 203:99-121, 1991).

Un anticuerpo monocatenario (scFc) es un ejemplo no limitante de un resto de unión que puede mostrarse sobre minicélulas. Los anticuerpos monocatenarios se producen mediante tecnología de ADN recombinante y pueden incorporarse en proteínas de fusión. El término "monocatenario" indica el hecho de que los scFv se encuentran en un solo polipéptido. Por el contrario, los anticuerpos de tipo silvestre tienen cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas. Ambos tipos de cadenas de polipéptido tienen regiones constantes, que no varían o varían mínimamente entre anticuerpos de la misma clase (es decir, IgA, IgM, etc.), y regiones variables. La especificidad de un anticuerpo se determina por las regiones variables localizadas en las regiones amino terminales de las cadenas ligeras y pesadas. Las regiones variables de una cadena ligera y la cadena pesada asociada forman un "dominio de unión a antígeno" que reconoce a un epítopo específico. En un anticuerpo monocatenario, las secuencias de aminoácidos de las regiones variables ligera y pesada de un anticuerpo están presentes en un polipéptido contiguo. Los procedimientos para producir anticuerpos monocatenarios se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos 4.946.778, 5.260.203; 5.455.030; 5.518.889; 5.534.621; 5.869.620; 6.025.165; 6.027.725 y 6.121.424.

Los derivados de anticuerpos y otros polipéptidos que son restos de unión pueden aislarse a partir de bibliotecas de presentación de proteínas, en las que una biblioteca de agentes de unión candidatos se presenta en un fago u otro agente que comprende un a´cido nucleico que codifica la proteína que presenta. Por lo tanto, puede aislarse un

agente que se une al compuesto diana, y prepararse ácido nucleico a partir de este, proporcionando el aislamiento rápido de restos de unión y ácidos nucleicos que pueden usarse para producirlos. Para revisiones, véase Benhar I. Biotechnological applications of phage and cell display. Biotechnology Adv. 2001 (19):1-33; FitzGerald K. In vitro display technologies -new tools for drug discovery. Drug Discov Today. 2000 5(6):253-258; y Hoogenboom HR, Chames P. Natural and designer binding sites made by phage display technology. Immunol Today. 2000 Aug;21(8):371-8.

Se conocen en la técnica una diversidad de sistemas de presentación de proteínas e incluyen diversos sistemas de presentación de fagos, tales como aquellos descritos en Jung S, Arndt K, Muller K, Pluckthyn A. Selectively infective phage (SIP) technology: scope and limitations. J Immunol Methods. 1999 (231):93-104; Katz B. Structural and mechanistic determinants of affinity and specificity of ligands discovered or engineered by phage display. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 1997 (26):27-45; Forrer P, Jung S, Pluckthun A. Beyond binding: using phage display to select for structure, folding and enzymatic activity in proteins. Curr Opin Struct Biol. 1999 Aug;9(4):514-20; Rondot S, Koch J, Breitling F, Dubel S. A helper phage to improve single-chain antibody presentation in phage display. Nat Biotechnol. 2001 Jan;19(1):75-8. Giebel LB, Cass RT, Milligan DL, Young DC, Arze R, Johnson CR. Screening of cyclic peptide phage libraries identifies ligands that bind streptavidin with high affinities. [Biochemistry, nov. 1995 28;34(47):15430-5; de Kruif J, Logtenberg T. Leucine zipper dimerized bivalent and bispecific scFv antibodies from a semisynthetic antibody phage display library. J Biol Chem. 29 de mar de 1996; 271(13):7630-4; Hoogenboom HR, Henderikx P, de Haard H. Creating and engineering human antibodies for immunotherapy. Adv Drug Deliv Rev. 6 de abr. de 1998; 31(1-2):5-31; Helfrich W, Haisma HJ, Magdolen V, Luther T, Bom VJ, Westra J, van der Hoeven R, Kroesen BJ, Molema G, de Leij L. A rapid and versatile method for hamessing scFv antibody fragments with various biological effector functions. J Immunol Methods. 3 de abr de 2000; 237(1-2):131-45; Hoess RH. Bacteriophage lambda as a vehicle for peptide and protein display. Curr Pharm Biotechnol mar de 2002; 3(1):23-8; Baek H, Suk KH, Kim YH, Cha S. An improved helper phage system for efficient isolation of specific antibody molecules in phage display. Nucleic Acids Res. 1 de mar de 2002; 30(5):e18; y Rondot S, Koch J, Breitling F, Dubel S. A helper phage to improve single-chain antibody presentation in phage display. Nat Biotechnol. 2001 Jan;19(1):75-8.

Otros sistemas de presentación incluyen sin limitación "Yeast Display" (Curr Opin Biotechnol oct de 1999;10(5):422

7. Applications of yeast in biotechnology: protein production and genetic analysis. Cereghino GP, Cregg JM.); "Baculovirus Display" (Kost TA, Condreay JP. Recombinant baculoviruses as Vector de expresións for insect and mammalian cells. Curr Opin Biotechnol. oct de 1999;10(5):428-33; y Liang M, Dubel S, Li D, Queitsch I, Li W, Bautz EK. Baculovirus expression cassette vectors for rapid production of complete human IgG from phage display selected antibody fragments. J Immunol Methods. 1 de ene. de 2001; 247(1-2):119-30); "Ribosome Display" (Hanes J, Schaffitzel C, Knappik A, Pluckthun A. Picomolar affinity antibodies from a fully synthetic naive library selected and evolved by ribosome display. Nat Biotechnol. dic. 2000; 18(12):1287-92; Hanes J, Jermutus L, Pluckthun A. Selecting and evolving functional proteins in vitro by ribosome display. Methods Enzymol. 2000;328:404-30; Schaffitzel C, Hanes J, Jermutus L, Pluckthun A. Ribosome display: an in vitro method for selection and evolution of antibodies from libraries. J Immunol Methods. 10 de dic. de 1999; 231 (1-2):119-35; Hanes J, Jermutus L, Weber-Bomhauser S, Bosshard HR, Pluckthun A. Ribosome display efficiently selects and evolves high-affinity antibodies in vitro from immune libraries. Proc Natl Acad Sci USA. nov. 1998 24;95(24):14130-5; Hanes J, Pluckthun A In vitro selection and evolution of functional proteins by using ribosome display. Proc Natl Acad Sci USA. 13 de mayo de 1997; 94(10):4937-42; Coia G, Pontes-Braz L, Nuttall SD, Hudson PJ, Irving RA. Panning and selection of proteins using ribosome display. J Immunol Methods. 1 de ago. de 2001; 254( 1-2):191-7.; Irving RA, Coia G, Roberts A, Nuttall SD, Hudson PJ. Ribosome display and affinity maturation: from antibodies to single V-domains and steps towards cancer therapeutics. J Immunol Methods. 1 de feb. de 2001; 248(1-2):31-45); y "Bacterial Display" (Hoischen C, Fritsche C, Gumpert J, Westermann M, Gura K, Fahnert B. Novel bacterial membrane surface display system using cell wall-less L-forms of Proteus mirabilis and Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. feb. de 2002; 68(2):525-31; Etz H, Minh DB, Schellack C, Nagy E, Meinke A. Bacterial phage receptors, versatile tools for display of polypeptides on the cell surface. J Bacteriol. dic. 2001; 183(23):6924-35; Patel D, Vitovski S, Senior HJ, Edge MD, Hockney RC, Dempsey MJ, Sayers JR. Continuous affinity-based selection: rapid screening and simultaneous amplification of bacterial surface-display libraries. Biochem J. 1 de ago de 2001; 357(Pt 3):779-85; Lang H. Outer membrane proteins as surface display systems. Int J Med Microbiol. dic. 2000; 290(7):579-85; Earhart CF. Use of an Lpp-OmpA fusion vehicle for bacterial surface display. Methods Enzymol. 2000;326:506-16; Benhar I, Azriel R, Nahary L, Shaky S, Berdichevsky Y, Tamarkin A, Wels W. Highly efficient selection of phage antibodies mediated by display of antigen as Lpp-OmpA’ fusions on live bacteria. J Mol Biol. 25 de ago. de 2000; 301(4):893-904; Xu Z, Lee SY. Display of polyhistidine peptides on the Escherichia coli cell surface by using outer membrane protein C as an anchoring motif. Appl Environ Microbiol. Nov. de 1999; 65(11):5142-7; Daugherty PS, Olsen MJ, Iverson BL, Georgiou G. Development of an optimized expression system for the screening of antibody libraries displayed on the Escherichia coli surface. Protein Eng. Jul. de 1999;12(7):613-21; Chang HJ, Sheu SY, Lo SJ. Expression of foreign antigens on the surface of Escherichia coli by fusion to the outer membrane protein traT. J Biomed Sci. ene. 1999; 6(1):64-70; Maurer J, Jose J, Meyer TF. Autodisplay: one-component system for efficient surface display and release of soluble recombinant proteins from Escherichia coli. J Bacteriol. feb. de 1997; 179(3):794-804.

Los anticuerpos, particularmente los anticuerpos monocatenarios, dirigidos a antígenos de superficie específicos para un tipo celular particular también pueden usarse como elementos de direccionamiento específicos de célula o tejido. Las secuencias de aminoácidos de anticuerpos monocatenarios se han incorporado a una variedad de

proteínas de fusión, incluyendo aquellos con dominios transmembrana y/o dominios de anclaje a membrana. Véase, por ejemplo, Kuroki y col., "Specific Targeting Strategies of Cancer Gene Therapy Using a Single-Chain Variable Fragment (scFv) with a High Affinity for CEA", Anticancer Res., págs. 4067-71,2000; Patente de Estados Unidos 6.146.885, de Dornburg, titulada "Cell-Type Specific Gene Transfer Using Retroviral Vectors Containing Antibody-Envelope Fusion Proteins"; Jiang y col., "In Vivo Cell Type-Specific Gene Delivery With Retroviral Vectors That Display Single Chain Antibodies", Gene Ther. 1999, 6:1982-7; Engelstadter y col., "Targeting Human T Cells By Retroviral Vectors Displaying Antibody Domains Selected From A Phage Display Library", Hum. Gene Ther. 2000,11:293-303; Jiang y col., "Cell-Type-Specific Gene Transfer Into Human Cells With Retroviral Vectors That Display Single-Chain Antibodies", J. Virol 1998,72:10148-56; Chu y col., "Toward Highly Efficient Cell-Type-Specific Gene Transfer With Retroviral Vectors Displaying Single-Chain Antibodies", J. Virol 1997, 71:720-5; Chu y col., "Retroviral Vector Particles Displaying The AntigenBinding Site Of An Antibody Enable Cell-Type-Specific Gene Transfer", J. Virol 1995, 69:2659-63; Chu y col., "Cell Targeting With Retroviral Vector Particles Containing Antibody-Envelope Fusion Proteins", Gene Ther. 1994, 1:292-9; Esshar y col., "Specific activation and targeting of cytotoxic lymphocytes through chimeric single chains consisting of antibody-binding domains and the 0 or 0 subunits of the immunoglobulin and T-cell receptors", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, Vol. 90:720-724; Einfeld y col., "Construction of a Pseudoreceptor That Mediates Transduction by Adenoviruses Expressing a Ligand in Fiber or Penton Base", J. Virol. 1999, 73:9130-9136; Marin y col., "Targeted Infection of Human Cells via Major Histocompatibility Complex Class I Molecules by Moloney Murine Leukemia Virus-Derived Viruses Displaying Single-Chain Antibody Fragment-Envelope Fusion Proteins", J. Virol., 1996, 70:2957-2962; Somia y col., "Generation of targeted retroviral vectors by using single-chain variable fragment: An approach to in vivo gene delivery", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92:7570-7574; Liu y col., "Treatment of B-Cell Lymphoma With Chimeric IgG and Single-Chain Fv AntibodyInterleukin-2 Fusion Proteins", Blood, 1998, 92:2103-2112; Martin y col., "Retrovirus Targeting by Tropism Restriction to Melanoma Cells", J. Virol., 1999, 73:6923-6929; Ramjiawan y col., "Noninvasive Localization of Tumors by Immunofluorescence Imaging Using a Single Chain Fv Fragment of a Human Monoclonal Antibody with Broad Cancer Specificity", Amer. Cancer Society, 2000, 89:1134-1144; Snitkovsky y col., "A TVA-Single-Chain Antibody Fusion Protein Mediates Specific Targeting of a Subgroup A Avian Leukosis Virus Vector to Cells Expressing a Tumor-Specific Form of Epidermal Growth Factor Receptor", J. Virol., 2000, 74:9540-9545; Chu y col., "Toward Highly Efficient Cell-Type-Specific Gene Transfer With Retroviral Vectors Displaying Single-Chain Antibodies", J. Virol 1997, 1997, 71:720-725; Kulkami y col., Programmed cell death signaling via cell-surface expression of a singlechain antibody transgene, Transplantation, 27 de mar. de 2000; 69(6):1209-17.

VIII.C. Dominios de unión a ácidos nucleicos

Los dominios polipeptídicos de unión a ácido nucleico pueden unirse a ácidos nucleicos de manera dependiente de secuencia o independiente de secuencia y/o de una manera que es específica para varios ácidos nucleicos que tienen diferentes estructuras químicas (por ejemplo, ADN o ARN mono o bicatenario, moléculas híbridas de ADN:ARN, etc.). Los ejemplos no limitantes de factores de transcripción basados en membrana y proteínas de unión a ADN incluyen proteínas Smad (Miyazono y col., TGF-beta signaling by Smad proteins (Revisión), Adv Immunol 75:115-57, 2000); SREBPs (proteínas de unión a elemento regulador de esterol) (Ye y col., Asparagine-proline sequence within membrane-spanning segment of SREBP triggers intramembrane cleavage by site-2 protease, Proc Natl Acad Sci USA 97:5123-8, 2000; Shimomura y col., Cholesterol feeding reduces nuclear forms of sterol regulatory element binding proteins in hamster liver, Proc Natl Acad Sci USA 94:12354-9,1997; Brown y Goldstein, The SREBP pathway: regulation of cholesterol metabolism by proteolysis of a membrane-bound transcription factor (Review), Cell 89:331-40,1997; Scheek y col., Sphingomyelin depletion in cultured cells blocks proteolysis of sterol regulatory element binding proteins at site 1, Proc Natl Acad Sci USA 94:11179-83, 1997); proteínas de membrana de unión a ADN mitocondrial, por ejemplo, Abf2p y YhmZp (Cho y col., A novel DNA-binding protein bound to the mitochondrial inner membrane restores the null mutation of mitochondrial histone Abf2p in Saccharomyces cerevisiae, Mol Cell Biol 18:5712-23,1998); y proteínas de membrana de unión a ADN bacteriano (Smith y col., Transformation in Bacillus subtilis: purification and partial characterization of a membrane-bound DNA-binding protein., J Bacteriol 156:101-8, 1983).

VIII.D. Unión de restos de unión, u otros compuestos, a minicélulas

Los compuestos o restos de unión pueden unirse químicamente (conjugarse) a minicélulas a través de proteínas de membrana que se muestran sobre las minicélulas. El compuesto que se va a conjugar a las minicélulas (el "compuesto acoplable") puede ser de cualquier composición química, es decir, una molécula pequeña, un ácido nucleico, un radioisótopo, un lípido o un polipéptido. Un tipo de compuesto acoplable que puede unirse covalentemente a minicélulas es un resto de unión, por ejemplo, un anticuerpo o un derivado de anticuerpo. Otro ejemplo no limitante de compuesto acoplable es el polietilenglicol ("PEG"), que disminuye la captación in vivo de minicélulas por el sistema reticuloendotelial (SRE). Otro ejemplo no limitante de creación de minicélulas sigilosas para evitar el SRE es expresar proteínas u otras moléculas en las superficies de las minicélulas cuya composición lipídica se ha modificado, tal como minicélulas ricas en lípidos aniónicos.

A modo de ejemplo no limitante, es posible preparar minicélulas que expresan proteínas transmembrana con restos de cisteína en dominios extracelulares. La unión de la proteína de membrana puede lograrse mediante grupos cisteinilo superficiales mediante, por ejemplo, reducción con restos cisteinilo en otros compuestos para formar puentes disulfuro (S=S). Si los restos de cisteinilo adecuados no están presentes en la proteína de membrana

pueden introducirse mediante manipulación genética. La sustitución de cisteína por otro aminoácido puede lograrse mediante procedimientos bien conocidos para los expertos en la materia, por ejemplo, usando procedimientos descritos en Maniatis, Sambrook, y Fritsch (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Como ejemplo no limitante, los lisoesfingolípidos bioactivos (por ejemplo, esfingosina, esfingosina-1fosfato, esfingosilfosforil colina) se unen covalentemente a proteínas expresdaas en las superficies de las minicélulas de tal forma que estos lípidos bioactivos se encuentran en la superficie de las minicélulas y están accesibles para usos terapéuticos o diagnósticos in vivo o in vitro.

Cuando tanto el resto acoplable como la proteína de membrana tienen un grupo sulfhidrilo reducido, puede usarse un reticulante homobifuncional que contiene maleimida, disulfuro de piridilo, o grupos beta-alfa-haloacetilo para la reticulación. Los ejemplos de dichos reactivos reticulantes incluyen, pero sin limitación, bismaleimidohexano (BMH) o 1,4-Di-[3’-(2’-piridilditio)propionamido]butano (DPDPB). Como alternativa, puede usarse un reticulante heterobifuncional que contiene una combinación de maleimida, disulfuro de piridilo, o grupos beta-alfa-haloacetilo para la reticulación.

Como otro ejemplo no limitante, pueden conjugarse químicamente restos acoplables usando aminas primarias. En estos casos, puede usarse un reticulante homobifuncional que contiene grupos éster, imidoéster, acilazida, o isocianato de succinimida para la reticulación. Los ejemplos de dichos reactivos reticulantes incluyen, pero sin limitación: Bis[2-(succinimidooxicarboniloxi)etil]sulfona (BSOCOES); Bis[2-(sulfosuccinimidooxicarboniloxi)etil]sulfona (sulfo-BSCOCOES); Suberato de Disucanimidilo (DSS); Suberato de bis-(Sulfosuccinimidilo) (BS3); Glucarato de disuccinimidilo (DSG); Ditiobis(succinimidilpropionato) (DSP); Ditiobis(sulfosuccinimidil propionato) (DTSSP); Tartrato de disulfosuccinimidilo (sulfo-DST); Ditiobismaleimidoetano (DTME); Tartrato de disuccinimidilo (DST); Etilenglicolbis(sulfosuccinimidilsuccinato) (sulfo-EGS); Dimetil malonimidato•2 HCI (DMM); Etilenglicolbis(succinimidilsuccinato) (EGS); Dimetil succinimidato•2 HCI (DMSC); Dimetil adipimidato•2 HCI (DMA); Dimetil pimelimidato•2 HCI (DMP); y Dimetil suberimidato•2•HCI (DMS), y Dimetil 3,3’-ditiobispropionimidato•2 HCI (DTBP). También pueden usarse para la reticulación reticulantse heterobifuncionales que contienen una combinación de grupos imidoéster o éster de succinimida.

Como otro ejemplo no limitante, los restos acoplables pueden conjugarse químicamente usando grupos sulfhidrilo y de amina primaria. En estos casos, se usan preferentemente reactivos reticulantes heterobifuncionales. Los ejemplos de dichos reactivos reticulantes incluyen, pero sin limitación: 3-(2-piridiltio)propionato de N-succinimidilo (DPDP); 6-[3’-(2-piridiltio)-propionamido]hexanoato de N-succinimidilo (sulfo-LC-SPDP); éster de mmaleimidobenzoil-N-hidroxisucanimida (MBS); éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-MBS); 4-[P-maleimidofenil]butirato de succinimidilo (SMPB); 4-[p-maleimidofenil]butirato de de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMPB); éster de N-[γ-Maleimidobutiriloxi]succinimida (GMBS), éster de N-[s-maleimidobutiriloxi]sulfosuccinimida (sulfo-GMBS); éster de N-[γ-maleimidocaproiloxi]succinimida (EMCS); éster de N-[smaleimidocaproiloxi]sulfosuccinimida (sulfo-EMCS); N-succinimidil(4-yodoacetil)aminobenzoato (SIAB); sulfosuccinimidil(4-yodoacetil)amidobenzoato (sulfo-SIAB); 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC); 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMCC); succiminidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxi-(6-amido-caproato) (LC-SMCC); 4-succinimidiloxicarbonilmetil-(2-piridiltio)tolueno (SMPT); y sulfo-LC-SMPT.

A modo de protocolo ilustrativo, se prepara una suspensión de minicélulas. Se añaden EDTNPBS 5 mM, y una solución reductora de 2-mercaptoetilamina en EDTA/PBS 5 mM a las minicélulas. La mezcla se incuba durante 90 minutos a 37 °C. Las minicélulas se lavan con EDTA/PBS para eliminar el exceso de 2-mercaptoetilamina. El resto acoplable se disuelve en PBS, pH 7,2. Se añade a la solución un reticulante de maleimida, que después se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. El exceso de maleimida se elimina mediante cromatografía en columna.

Las minicélulas con grupos sulfhidrilo reducidos se mezclan con los compuestos derivatizados que tienen un resto acoplable. La mezcla se deja incubar a 4 °C durante 2 horas o durante toda la noche para permitir un acoplamiento máximo. Las minicélulas conjugadas se lavan para eliminar compuestos no reaccionados (no unidos) que tienen el resto acoplable. Se usan protocolos similares para proteínas de membrana expresadas con otros grupos reactivos (por ejemplo, carboxilo, amina) que pueden conjugarse a un resto acoplable.

VIII. E. Procedimientos no genéticos para dirigir compuestos a membranas

Se incluyen en el alcance de la invención compuestos que pueden insertarse en la membrana de minicélulas segregadas. Dichos compuestos incluyen restos acoplables que se conjugan químicamente a la superficie de una minicélula, y compuestos que se asocian con y/o se insertan en una membrana "espontáneamente", es decir, por virtud de su naturaleza química. A modo de ejemplo no limitante, las proteínas que se insertan "espontáneamente" en las membranas incluyen, pero sin limitación, proteínas de membrana de tilacoide (Woolhead y col., J. Biol. Chem. 276:14607-14613, 2001), el traslocador de nucleótidos de adenina mitocondrial (Jacotot y col., J. Exp. Med. 193:509519, 2001), y polipéptidos obtenidos usando los procedimientos de Hunt y col. (Spontaneous, pH-dependent membrane insertion of a transbilayer alpha-helix, Biochem 36:15177-15192,1997). Los lípidos, gangliósidos, esfinfomielinas, plasmalógenos de diacilgliceroles de glucosilo, y esteroles también pueden incorporarse en las membranas de las minicélulas segregadas.

IX. Proteínas de membrana

En determinados aspectos de la invención, las proteínas de membrana de organismos no eubacterianos se expresan y muestran por las minicélulas. La membrana celular (también conocida como "membrana plasmática") es una bicapa lipídica que forma el límite entre el interior de una célula y su ambiente externo. La expresión "proteínas

5 de membrana" se refiere a proteínas que se encuentran en membranas, incluyendo, sin limitación, membranas celulares y organulares.

IX.A. Tipos de proteínas de membrana

IX.A.1. En general

Las proteínas de membrana consisten en general, en dos tipos, proteínas periféricas de membrana y proteínas 10 integrales de membrana.

Las proteínas integrales de membrana pueden atravesar ambas capas (o "películas") de una bicapa lipídica. Por lo tanto, dichas proteínas pueden tener dominios extracelulares, transmembrana, e intracelulares. Los dominios extracelulares están expuestos al ambiente externo de la célula, mientras que los dominios intracelulares están orientados hacia el citosol de la célula. La porción de una proteína integral de membrana que atraviesa la membrana

15 es el "dominio transmembrana". Los dominios transmembrana atraviesan la membrana celular a menudo mediante una o más regiones que comprenden de 15 a 25 aminoácidos hidrófobos que se predice que adoptan una conformación alfa-helicoidal.

Las proteínas integrales de membrana se clasifican como bitópicas y politópicas (Singer, (1990) Annu. Rev. Cell Biol. 6:247-96). Las proteínas bitópicas atraviesan la membrana una vez, mientras que las proteínas politópicas contienen

20 múltiples segmentos transmembrana.

Una proteína periférica de membrana es una proteína de membrana que está unida a la superficie de la membrana y no se integra en la capa hidrófoba de una región de membrana. Las proteínas periféricas no atraviesan la membrana, sino que están unidas a la superficie de una membrana, a una capa de la bicapa lipídica que forma una membrana, o al dominio extracelular de una proteína integral de membrana.

25 La invención puede aplicarse a cualquier proteína de membrana, incluyendo, pero sin limitación, a los siguientes receptores y proteínas de membrana ilustrativas. Las proteínas incluyen, pero sin limitación, receptores (por ejemplo, GPCR, receptores de esfingolípidos, receptores de neurotransmisores, receptores sensoriales, receptores de factor de crecimiento, receptores de hormonas, receptores de quimiocinas, receptores de citocinas, receptores inmunológicos, y receptores de complemento, receptores FC), canales (por ejemplo, canales de potasio, canales de

30 sodio, canales de calcio), poros (por ejemplo, proteínas de poro nucleares, canales de agua), bombas de iones y otros (por ejemplo, bombas de calcio, bombas de protones), intercambiadores (por ejemplo, intercambiadores de sodio/potasio, intercambiadores de sodio/hidrógeno, intercambiadores de potasio/hidrógeno), proteínas transportadoras de electrones (por ejemplo, citocromo oxidasa), enzimas y cinasas (por ejemplo, proteínas cinasas, ATPasas, GTPasas, fosfatasas, proteasas), proteínas estructurales/enlazantes (por ejemplo, caveolinas, clatrina),

35 proteínas adaptadoras (por ejemplo, TRAD, TRAP, FAN), proteínas quimiotácticas/de adhesión (por ejemplo, ICAM11, selectinas, CD34, VCAM-1, LFA-1, VLA-1), y fosfolipasas, tales como PLC específica de PI y otras fosfolipasas.

IX.A.2. Receptores

Se encuentra dentro del alcance de la invención cualquier receptor, incluyendo, sin limitación:

40 Los receptores nucleares, por ejemplo, el receptor de las exportaciones nucleares;

El receptor de benzodiacepinas periférico (mitocondrial) (Gavish y col., "Enigma of the Peripheral Benzodiazephine Receptor", Pharmacological Reviews, Vol. 51, Nº 4);

Receptores adrenérgicos y muscarínicos (Brodde y col., "Adrenergic and Muscarinic Receptors in the Human Heart", Pharmacological Review, Vol. 51, Nº 4);

45 Receptores de ácido gamma-aminobutíricoA (Barnard y col., "International Union of Pharmacology. IV. Subtypes of γ-Aminobutyric AcidA Receptors: Classification on the Basis of Submit Structure and Receptor Function", Pharmacological Reviews, Vol. 50, Nº 2);

receptores de quinina B1 (Marceau y col., "The B1 Receptors for Kinins", Pharmacological Reviews, Vol. 50, Nº 3); Receptores de quimiocinas (Murphy y col., "International Union of Pharmacology. XXII. Nomenclature for

50 Chemokine Receptors" Pharmacological Reviews, Vol. 52, Nº 1);

Receptores de glicina y NMDA (Danysz y col., "Glycine and N-Methyl-D-Aspartate Receptors: Physiological Significance and Possible Therapeutic Applications", Pharmacological Reviews, Vol. 50, Nº 4);

canales de iones del receptor de glutamato (Dingledine y col., "The Glutamate Receptor Ion Channels", Pharmacological Reviews, Vol. 51, Nº 1);

Receptores de purina y pirimidina incluyendo receptores purinérgicos (por ejemplo, P2) (Ralevic y col., "Receptors for Purines and Pyrimidines", Pharmacological Reviews, Vol. 50, Nº 3); Receptores del SNC y transportadores de membrana (E. Sylvester Vizi, "Role of High-Affinity Receptors and Membrane Transporters in Nonsynaptic Communication and Drug Action in the Central Nervous System", Pharmacological Reviews, Vol. 52, Nº 1);

Receptores de opioides, incluyendo, sin limitación el receptor -opioide (Quock y col., "The -Opioid Receptor: Molecular Pharmacology, Signal Transduction and the Determination of Drug Efficacy", Pharmacological Review, Col. 51, Nº 3);

Receptores de angiotensina II (Gasparo y col., "International Union of Pharmacology. XXIII. The Angiotensin II Receptors" Pharmalogical Review, Vol. 52, Nº 3);

Receptores de colecistoquininas (Noble y col., "International Union of Pharmacology. XXI. Structure, Distribution, and Functions of Cholecystokinin Receptors", Pharmacological Reviews, Vol. 51, Nº 4);

Receptores de hormonas, incluyendo, pero sin limitación, el receptor de estrógenos; el receptor de glucocorticoides; y el receptor de insulina;

Receptores encontrados predominantemente en el sistema nervioso central, incluyendo, pero sin limitación, receptores de acetilcolina nicotínicos neuronales; el receptor de dopamina D2/D3; receptores de GABA; receptor CB1 cannabinoide central; receptores de opioides, por ejemplo, el receptor kappa opioide, y el receptor opioide específico de metadona; receptores de acetilcolina nicotínicos; receptores de serotonina, por ejemplo, el receptor de serotonina 5-HT3, el receptor de serotonina 5-HT4, y el receptor de serotonina-2; y receptores de dopamina, por ejemplo, el receptor de dopamina D2/D3; y el receptor de neurotensina;

Receptores para factores de crecimiento, incluyendo, pero sin limitación, el receptor de eritropoyetina; el receptor de FGF; el receptor de EGF; el receptor de VEGF; la proteína receptora-2 de VEGF; la proteína receptora de VEGF (KDR); el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos; el receptor del factor de crecimiento nervioso p75; el receptor del factor de crecimiento epidérmico; el receptor de IGF-1; el receptor de factor-4 de plaquetas; el receptor de factor de crecimiento alfa derivado de plaquetas; el receptor del factor de crecimiento de hepatocitos; y el receptor de factor de crecimiento de fibroblastos humanos;

Receptores para esfingolípidos y lisofosfolípidos, tales como la famila Edg de GPCR;

Receptores para interleucinas, por ejemplo, receptores para interleucina-1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, y siguientes; y

Varios receptores, incluyendo a modo de ejemplo no limitante, receptores descritos en las Patentes de Estados Unidos 6.210.967 (DNA encoding a mammalian LPA receptor and uses thereof); 6.210.921 (CAR: a novel coxsackievirus and adenovirus receptor; 6.211.343 (Lactoferrin receptor protein; 6.218.509 (LH/CG receptor, DNA and use thereof; 6.214.972 (DNA encoding prostaglandin receptor DP); 6.221.613 (DNA encoding a human melanin concentrating hormone receptor (MCH1) and uses thereof); 6.221.660 (DNA encoding SNORF25 receptor); 6.225.080 (Mu-subtype opioid receptor); 6.222.015 (Estrogen receptor); 6.228.610 (Human metabotropic glutamate receptor subtypes (hmR4, hmR6, hmR7) and related DNA compounds); 6.235.496 (Nucleic acid encoding mammalian mu opioid receptor); 6.258.556 (cDNA and genomic clones encoding human .mu. opiate receptor and the purified gene product); 6.245.531 (Polynucleotide encoding insect ecdysone receptor); 6.225.531 Glucan elicitor receptor, DNA molecule coding therefor, fungus-resistant plants transformed with the DNA molecule and method for creating the plants); 6.245.893 (Receptor that binds anti-convulsant compounds); 6.248.712 (Urokinase-type plasminogen activator receptor; 6.248.554 (DNA sequence coding for a BMP receptor); 6.248.520 (Nucleic acid molecules encoding nuclear hormone receptor coactivators and uses thereof); 6.242.251 (Rhesus neuropeptide Y5 receptor); 6.252.056 (Human lysophosphatidic acid receptor and use thereof); 6.255.472 (Isolated nucleic acid molecule encoding a human skeletal muscle-specific receptor);

6.291.207 (Herpes virus entry receptor protein); 6.291.206 (BMP receptor proteins); 6.291.195 (DNA encoding a human melanin concentrating hormone receptor (MCH1) and uses thereof); 6.344.200 (Lactoferrin receptor protein); 6.335.180 (Nucleic acid sequences encoding capsaicin receptor and uses thereof); 6.265.184 (Polynucleotides encoding chemokine receptor 88C); 6.207.799 (Neuropeptide Y receptor Y5 and nucleic acid sequences); 6.290.970 (Transferrin receptor protein of Moraxella); 6.326.350 (Transferrin receptor subunit proteins of Neisseria meningitidis); 6.313.279 (Human glutamate receptor and related DNA compounds);

6.313.276 (Human endothelin receptor); 6.307.030 (Androgen receptor proteins, recombinant DNA molecules coding for such, and use of such compositions); 6.306.622 (cDNA encoding a BMP type II receptor); 6.300.087 (DNA encoding a human serotonin receptor (5-HT4B) and uses thereof); 6.297.026 (Nucleic acids encoding the C140 receptor); 6.297.026 (Or-1, an orphan receptor belonging to the nuclear receptor family); 6.297.026 (Mouse interleukin-11 receptor); 6.271.347 (Eosinophil eotaxin receptor); 6.262.016 (Transferrin receptor genes);

6.261.838 (Rat melanocortin receptor MC3-R); 6.258.943 (Human neurokinin-3 receptor); 6.284.870 (Gamma retinoic acid receptor); 6.258.944 (OB receptor isoforms and nucleic acids encoding them); 6.261.801 (Nucleic acids encoding tumor necrosis factor receptor 5); 6.261.800 (Luteinizing hormone/choriogonadotropin (LH/CG) receptor); 6.265.563 (Opioid receptor genes); 6.268.477 (Chemokine receptor 88-C); 6.316.611 (Human Nmethyl-D-aspartate receptor subunits, nucleic acids encoding same and uses therefor); 6.316.604 (Human C3b/C4b receptor (CR1)); 6.287.855 (Nucleic acid encoding rat galanin receptor (GALR2)); 6.268.221 (Melanocyte stimulating hormone receptor and uses); y 6.268.214 (Vectors encoding a modified low affinity nerve growth factor receptor).

IX.B. Dominios de anclaje a membrana

Puede incorporarse un dominio de anclaje a membrana en una proteína de fusión de la invención. Los ejemplos no limitantes de dominios de anclaje a membrana incluyen aquellos derivados de Prostaglandina H2 sintasas (PGHS-1 y -2) (Nina y col., Anchoring of a monotopic membrane protein: the binding of prostaglandin H2 synthase-1 to the surface of a phospholipid bilayer, Eur. Biophys. J. 29:439-54, 2000; Otto y Smith, Photolabeling of prostaglandin endoperoxide H synthase-1 with 3-trifluoro-3-(m-[125I]iodophenyl)diazirine as a probe of membrane association and the cyclooxygenase active site, J Biol Chem 271:9906-10, 1996; y Otto y Smith, The orientation of prostaglandin endoperoxide synthases-1 and -2 in the endoplasmic reticulum, J Biol Chem 269:19868-75,1994; aquellos derivados de carboxipeptidasa E (EC 3.4.17.10) (Fricker y col., Identification of the pH-dependent membrane anchor of carboxypeptidase E (EC 3.4.17.10), J. Biol. Chem., 265, 2476-2482,1990); y convertasa 3 de péptidos (PC3) (Smeekens y col., Identification of a cDNA encoding a second putative prohormone convertase related to PC2 in AtT20 cells and islets of Langerhans, Proc Natl Acad Sci USA 88, 340-344, 1990).

IX.C. Dominios transmembrana

Se conocen una diversidad de tipos y ejemplos de dominio transmembrana. Se conocen proteínas con hasta 12 dominios transmembrana (Fujiwara y col., Identification of thyroid hormone transporters in humans: different molecules are involved in a tissue-specific manner, Endocrinology 2001 142:2005-12; Sharina y col., Mutational analysis of the functional role of conserved arginine and lysine residues in transmembrane domains of the murine reduced folate carrier, Mol Pharmacol 2001 59:1022-8). Sin embargo, la invención no se limita a cualquier número concreto de dominios transmembrana.

Los dominios monotrópicos ("de un solo paso"), que atraviesan a la membrana una vez, incluyen a modo de ejemplo no limitante, aquellos encontrados en receptores para el factor de crecimientoe pidérmico (EGF), receptores para el factor de necrosis tumoral (TNF) y similares. Las proteínas politrópicas ("multipase") atraviesan a la membrana dos o más veces. Los ejemplos no limitantes de proteínas politrópicas son los siguientes.

Las proteínas biotrópicas ("2 pases") de membrana incluyen, pero sin limitación: EnvZ de E. coli; la proteína de membrana peroxisómica Pex11-1p (Anton y col., ARF-and coatomer-mediated peroxisomal vesiculation, Cell Biochem Biophys 2000;32 Spring:27-36); transportadores ABC de fármacos pleiotrópicos de S. cervisiae (Rogers y col., The pleitropic drug ABC transporters from Saccharomyces cerevisiae, J Mol Microbiol Biotechnol 2001 3:20714); y los transportadores de urato hUAT humano y rUAT de rata (Lipkowitz y col., Functional reconstitution, membrane targeting, genomic structure, and chromosomal localization of a human urate transporter, J Clin Invest 2001 107:1103-15).

Las proteínas de membrana tritrópicas ("3 pases") incluyen, pero sin limitación: el receptor de etileno ETR1 de Arabidopsis; la proteína CARD de expresión CC1 de coliflor (Palmer y col., A Brassica oleracea Gene Expressed in a Variety-Specific Manner May Encode a Novel Plant Transmembrane Receptor, Plant Cell Physiol 200142:404-413); y una variante de corte y empalme de la proteína de membrana mitocondrial hMRS3/4 (Li y col., Characterization of a novel human putative mitochondrial transporter homologous to the yeast mitochondrial RNA splicing proteins 3 and 4, FEBS Lett 2001494:79-84).

Las tetraspaninas o tetraspanos son ejemplos no limitantes de proteínas de membrana con cuatro dominios transmembrana. (Levy y col., J. Biol. Chem, 226:14597-14602,1991; Tomlinson y col., J. Immol. 23:136-40, 1993; y Barclay y col., (In) The Leucocyte antigen factbooks, Academic Press, Londres, 1993). Estas proteínas se conocen colectivamente como la "superfamilia 4 transmembrana" (TM4) debido a que atraviesan la membrana plasmática cuatro veces. Las proteínas que se sabe que pertenecen a esta familia incluyen, pero sin limitación: antígeno CD9 de mamífero (MIC3), una proteína implicada en la activación y agregación de plaquetas; antígeno leucocitario CD37 de mamífero, expresado en linfocitos B; antígeno leucocitario CD53 de mamífero (OX-44), que puede estar implicado en la regulación del crecimiento en células hematopoyéticas; proteína de membrana CD63 lisosomal de mamífero (antígeno ME491 asociado al melanoma; antígeno AD1); antígeno CD81 de mamífero (proteína de superficie TAPA1), que pueden jugar un papel importante en la regulación del crecimiento de las células de linfoma; antígeno de mamífero CD82 (proteína R2; antígeno C33; Kangai 1 (KAI1)), que se asocia con CD4 o CD8 y envía señales coestimuladoras para la ruta de TCR/CD3; antígeno de mamífero CD151 (SFA-1); antígeno tetraspán 3 endotelial de plaquetas (PETA-3); TM4SF2 de mamífero (glucoproteína A15 de superficie celular; TALLA-1; MXS1); TM4SF3 de mamífero (antígeno CO-029 asociado a tumores); TM4SF6 de mamífero (Tspan-6; TM4-D); TM4SF7 de mamífero (Antígeno Novel 2 (NAG-2); Tspan-4); Tspan-2 de mamífero; Tspan-3 de mamífero (TM4-A); Tetraspan NET-5 de

mamífero; y el antígeno de superficie de 23 kd de Schistosoma mansoni y japonicum (SM23/SJ23).

Los ejemplos no limitantes de proteínas de membrana con seis dominios transmembrana incluyen la proteína integral de membrana del VEB, LMP-1, y una variante de corte y empalme de la proteína mitocondrial hMRS3/4 (Li y col., Characterization of a novel human putative mitochondrial transporter homologous to the yeast mitochondrial RNA splicing proteins 3 and 4, FEBS Lett 2001 Apr 6;494(1-2):79-84). Las proteínas con seis dominios transmembrana también incluyen proteínas STEAP (seis antígenos epiteliales transmembrana de la próstata) (Afar y col., Patente de Estados Unidos 6.329.503). El miembro prototípico de la familia de STEAP, STEAP-1, parece ser una proteína de membrana de tipo IIIa expresada predominantemente en células de la próstata en tejidos humanos normales. Estructuralmente, STEAP-1 es una proteína de 339 aminoácidos caracterizada por una topología molecular de seis dominios transmembrana y extremos N-y C-terminales intracelulares, lo que sugiere que se pliega a modo de "serpentina" en tres bucles extracelulares y dos bucles intracelulares.

Se conocen literalmente cientos de proteínas de membrana de 7 pases. Los receptores acoplados a proteínas G (GPCR), incluyendo, sin limitación, beta-adreno receptores, receptores adrenérgicos, receptores de EDG, receptores de adenosina, receptores B para quininas, receptores de angiotensina, y receptores de opioides son de particular interés. Los GPCR se describen en más detalle en otras partes del presente documento.

Un ejemplo no limitante de una proteína con 9 dominios transmembrana es el receptor de membrana que interactúa con Lipocalina-1 (Wojnar y col., Molecular cloning of a novel Lipocalin-1 interacting human cell membrane receptor (LIMR) using phage-display, J Biol Chem 20013; [Publicación electrónica pendiente de impresión];

Se conocen proteínas con dominios transmembrana y de anclaje. Por ejemplo, las subunidades del receptor AMPA tienen dominios transmembrana y un dominio de anclaje a membrana.

Los expertos en la materia tienen a su disposición una serie de bases de datos que describen dominios de anclaje a membrana y dominios transmembrana y programas informáticos que los predicen. Véase, por ejemplo, Gcrdb.dba GCRDb [Base de datos de receptor acoplado a proteína G], Tmbase.dba Tmbase [base de datos de dominios transmembrana], Prodom.srv ProDom [Dominios de proteínas], Tmap.srv TMAP [Predicción de segmentos transmembrana de proteínas], Tm7.srv TM7 [Recuperación de datos de receptores acoplados a proteína G], y Memsat.sof MEMSAT [programa de predicción de estructura transmembrana].

Quentin Y Fichant (J Mol Microbiol Biotechnol 2000 2:501-4, ABCdb: an ABC transporter database) han descrito una base de datos dedicada a dominios de proteína del casete de unión a ATP (ABC) (ABCdb), la mayoría de los cuales energizan el transporte de compuestos a través de las membranas. En bacterias, los transportadores ABC están implicados en la captación de una amplia variedad de moléculas y en mecanismos de virulencia y de resistencia a antibióticos. En eucariotas, la mayoría de los transportadores ABC están implicados en la resistencia a fármacos, y muchos se asocian con enfermedades. Se puede acceder a ABCdb a través de la World Wide Web (http://ir2lcb.cnrs-mrs.fr/ABCdb/). Véase también Sanchez-Femandez y col., The Arabidopsis thaliana ABC protein superfamily: a complete inventory, J Biol Chem 9 de mayo de 2001; [Publicación electrónica pendiente de impresión]; y Rogers y col., The pleitropic drug ABC transporters from Saccharomyces cerevisiae, J Mol Microbiol Biotechnol abr. de 2001; 3(2):207-14.

X. Expresión de ADN recombinante

Para lograr la expresión recombinante de una proteína de fusión, se introduce en una célula hospedadora adecuada un casete o construcción de expresión capaz de expresar un marco de lectura quimérico para generar un sistema de expresión. Los casetes y construcciones de expresión de la invención pueden introducirse en una célula receptora eubacteriana o eucariota bien como un ADN no replicante o como una molécula de ARN, que puede ser una molécula lineal o, más preferentemente, una molécula circular covalente cerrada. Ya que dichas moléculas no son capaces de replicarse autónomamente, la expresión del gen puede suceder mediante la expresión transitoria de la secuencia introducida. Como alternativa, la expresión permanente puede suceder mediante la integración de la secuencia de ADN introducida en el cromosoma del hospedador.

X.A. Sistemas de expresión de ADN recombinante

Puede usarse una diversidad de sistemas eubacterianos de expresión de ADN recombinante para producir las proteínas de fusión de la invención. Las células hospedadoras que pueden usarse en los sistemas de expresión de la presente invención no están estrictamente limitadas, siempre que sean adecuadas para su uso en la expresión de la proteína de fusión de interés y puedan producir minicélulas. Los ejemplos no limitantes de hospedadores eubacterianos reconocidos que pueden usarse en la presente invención incluyen bacterias tales como E. coli, Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas, Salmonella, Serratia, y similares.

Los sistemas de expresión eubacterianos utilizan plásmidos y vectores de expresión virales (de bacteriófago) que contiene sitios de replicación y pueden usarse secuencias de control derivadas de una especie compatible con el hospedador. Los vectores de fago o bacteriófago adecuados incluyen λgt10, λgt11 y similares. Los vectores de virus adecuados pueden incluir pMAM-neo, pKRC y similares. Los vectores plasmídicos eubacterianos adecuados incluyen aquellos capaces de replicación en E. coli (tales como, a modo de ejemplo no limitante, pBR322, pUC118, pUC119, ColEl, pSC101, pACYC 184, nVX. Véase "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 1989). Los plásmidos de Bacillus incluyen pC194, pC221, pT127, y similares (Gryczan, En: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, NY, págs. 307-329, 1982). Los plásmidos de Streptomyces adecuados incluyen p1J101 (Kendall y col., J. Bacteriol. 169:4177-4183, 1987), y bacteriófagos de Streptomyces tales como C31 (Chater y col., En: Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology, Akademiai Kaido, Budapest, Hungría, págs. 45-54,1986). Los plásmidos de Pseudomonas se revisan por John y col. (Rev. Infect. Dis. 8:693-704,1986), e Izaki (Jpn. J. Bacteriol. 33:729-742, 1978). Véase también Brent y col., "Vectors Derived From Plasmids", Sección II, y Lech y col. "Vectors derived from Lambda and Related Bacteriophages" Sección III, en el Capítulo 1 de Short Protocols in Molecular Biology, 2ª Ed., Ausubel y col., eds., John Wiley And Sons, Nueva York, 1992, páginas 1-13 a 1-27; Lech y col. "Vectors derived from Lambda and Related Bacteriophages" Sección III y Id. páginas 1-28 a página 1-52.

Para expresar una proteína, incluyendo, pero sin limitación, una proteína de fusión, en una célula eubacteriana, es necesario unir operativamente el ORF que codifica la proteína a un promotor funcional eubacteriano o viral. Dichos promotores pueden ser constitutivos o, más preferentemente, regulables (es decir, inducibles o desreprimibles). Los ejemplos de promotores constitutivos incluyen el promotor int de bacteriófago lambda, el promotor bla de la secuencia génica de beta-lactamasa de pBR322, y el promotor cat de la secuencia génica de cloranfenicol acetil transferasa de pPR325, y similares. Los ejemplos de promotores eubacterianos inducibles incluyen los promotores principales derecho e izquierdo de bacteriófago lambda (PL y PR), los promotores trp, recA, lacZ, lacI, y gal de E. coli, la alfa-amilasa (Ulmanen y col., J. Bacteriol. 162:176-182, 1985) y los promotores específicos de sigma-28 de B. subtilis (Gilman y col., Gene Sequence 32:11-20, 1984), los promotores de los bacteriófagos de Bacillus (Gryczan, en: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, Inc., NY, 1982), y promotores de Streptomyces (Ward y col., Mol. Gen. Genet. 203:468-478, 1986). Los promotores eubacterianos se revisan por Glick (Ind. Microbiot. 1:277282, 1987), Cenatiempo (Biochimie 68:505-516, 1986), y Gottesman (Ann. Rev. Genet., 18:415-442, 1984).

La expresión adecuada también requiere la presencia de un sitio de unión a ribosoma cadena arriba de la secuencia génica que codifica el gen. Dichos sitios de unión a ribosomas se desvelan, por ejemplo, por Gold y col. Ann. Rev. Microbiol. 35:365-404, 1981). La selección de secuencias de control, vectores de expresión, procedimientos de transformación, y similares, depende del tipo de célula hospedadora usada para expresar el gen. Tal como se usa en el presente documento, "célula", "línea celular", y "cultivo celular" pueden usarse intercambiablemente y todas estas denominaciones incluyen a la descendencia. Por lo tanto, las palabras "transformantes" o "células transformadas" incluyen a la célula objeto primaria y a los cultivos derivados a partir de esta, independientemente del número de transferencias. También se entiende que toda la descendencia no tiene por qué ser precisamente idéntica en cuanto a contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Sin embargo, tal como se ha definido, la descendencia mutante tiene la misma funcionalidad que aquella de la célula transformada originalmente.

Los sistemas de expresión de mamífero utilizan células hospedadoras, tales como células HeLa, células de origen de fibroblasto, tales como VERO o CHO-K1, o células de origen linfoide y sus derivados. Las células hospedadoras de mamífero preferidas incluyen SP2/0 y J558L, así como líneas celulares de neuroblastoma, tales como IMR 332, que pueden proporcionar mejores capacidades para el correcto procesamiento postraduccional. Los ejemplos no limitantes de vectores de expresión extracromosómicos de mamífero incluyen pCR3.1 y pcDNA3.1, y derivados de los mismos, incluyendo, sin limitación, aquellos que se describen y están disponibles comercialmente a través de Invitrogen (Carlsbad, CA).

Hay disponibles varios vectores de expresión para la expresión de polipéptidos en células hospedadoras de mamífero. Pueden emplearse una amplia variedad de secuencias reguladores de la transcripción y de la traducción, dependiendo de la naturaleza del hospedador. Las señales reguladoras de la transcripción y de la traducción pueden derivarse de fuentes virales, tales como adenovirus, virus del papiloma bovino, citomegalovirus (CMV), virus de simio, o similares, donde las señales reguladores se asocian con una secuencia génica particular que tiene un nivel elevado de expresión. Como alternativa, pueden emplearse promotores de productos de expresión de mamífero, tales como actina, colágeno, miosina, y similares. Pueden seleccionarse señales reguladoras de la iniciación transcripcional que permiten la represión o la activación, de tal forma que pueda modularse la expresión de las secuencias génicas. Las señales reguladoras que son sensibles a la temperatura son de interés ya que, al variar la temperatura, puede reprimirse o iniciarse la expresión, o se someten a regulación química (cal como metabolito).

Los plásmidos eucariotas preferidos incluyen, por ejemplo, VPB, Vaccinia, SV40, círculo de 2 micras, y similares, o sus derivados. Dichos plásmidos se conocen bien en la técnica (Botstein y col., Miami Wntr. Symp.19:265-274, 1982; Discusión, en: The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, p. 445-470, 1981; Discusión, Cell 28:203-204, 1982; Bollon y col., J. Clin. Hematol. Oncol. 10:39-48,1980; Maniatis, En: Cell Biology: A Comprehensive Treatise, Vol. 3, Gene Sequence Expression, Academic Press, NY, págs. 563-608,1980).

La expresión de polipéptidos en hospedadores eucariotas implica generalmente el uso de regiones reguladoras eucariotas. Dichas regiones, en general, incluirán una región promotora suficiente para dirigir la iniciación de la síntesis de ARN. Los promotores eucariotas preferidos incluyen, por ejemplo, el promotor de la secuencia génica de metalotioneina I de ratón (Hamer y col., J. Mol. Appl. Gen. 1:273-288,1982); el promotor TK de Herpes virus (McKnight, Cell 31:355-365,1982); el promotor temprano de SV40 (Benoist y col., Nature (Londres) 290:30431,1981); y el promotor de la secuencia génica gal4 de levadura (Johnston y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.)

79:6971-6975, 1982; Silver y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 81:5951-5955,1984).

También se necesitan secuencias y elementos de expresión para la expresión eficaz. Los ejemplos no limitantes incluyen los elementos Kozak e IRES en eucariotas, y las secuencias de Shine-Delgarno en procariotas, que dirigen la iniciación de la traducción (Kozak, Initiation of translation in prokaryotes and eukaryotes. Gene, 1999. 234: 187208; Martinez-Salas y col., Functional interactions in internal translation initiation directed by viral and cellular IRES elements, Jour. of Gen. Virol. 82:973-984, 2001); secuencias potenciadoras; sitios opcionales para que se unan represores e inductores; y sitios de reconocimiento para enzimas que escinden el ADN o el ARN de manera específica de sitio. La traducción del ARNm se inicia generalmente en el codon que codifica la primera metionina; en ese caso, es preferible asegurar que el enlace entre un promotor eucariota y un ORF preseleccionado no contiene codones intervinientes que codifican una metionina (es decir, AUG). La presencia de dichos codones da como resultado bien la formación de una proteína de fusión con una extensión N-terminal no caracterizada (si el codon AUG está en el mismo marco de lectura que el ORF) o una mutación de desplazamiento de marco (si el codon AUG no está en el mismo marco de lectura que el ORF).

X.B. Expresión de proteínas de membrana

Actualmente, los sistemas de expresión usados de manera más común para la expresión de proteínas integrales de membrana son sistemas de expresión eucariotas o eubacterianos de células completas. Aunque se han usado las minicélulas para expresar varias proteínas de membrana eubacteriana, no se ha comunicado la producción de proteínas de membrana no eubacterianas. Un aspecto de la invención es el descubrimiento de que puede producirse el sistema de expresión en minicélulas para expresar y preferentemente mostrar proteínas integrales de membrana de organismos no eubacterianos.

Un "sistema de expresión recombinante" (o simplemente un "sistema de expresión") es uno que dirige la producción de productos génicos exógenos en una célula hospedadora o minicélula de elección. Por "expresado" se entiende que un producto génico de interés (que puede ser una proteína o un ácido nucleico) se produce en el sistema de expresión de elección.

Las células hospedadoras (y/o minicélulas) que portan una construcción de expresión son componentes de sistemas de expresión. Un "vector de expresión" es una molécula de ácido nucleico artificial en la que puede insertarse un ORF exógeno que codifica una proteína, o un patrón de un ácido nucleico bioactivo de tal modo que está unido operativamente a secuencias de expresión adecuadas que dirigen la expresión del gen exógeno. Por la expresión "unido operativamente" se entiende que la parte de un gen que se transcribe está alineada y posicionada correctamente respecto de las secuencias de expresión que promueven, son necesarias y/o regulan esta transcripción. La expresión "producto génico" se refiere bien a un ácido nucleico (el producto de transcripción, transcripción inversa, o replicación) o a un polipéptido (el producto de la traducción) que se produce usando las secuencias de ácido nucleico no de vector como molde.

En algunas aplicaciones, es preferible usar una construcción de expresión que sea un elemento episómico. Si la construcción de expresión episómica expresa (o, preferentemente en algunas aplicaciones, sobreexpresa) un ORF que se ha incorporado en la construcción de expresión episómica, las minicélulas dirigirán la producción del polipéptido codificado por el ORF. Al mismo tiempo, cualquier molécula de ARNm transcrita a partir de un gen cromosómico antes de la formación de minicélulas que se haya transferido a la minicélula se degrada mediante RNasas endógenas sin reemplazarse por nueva transcripción del cromosoma bacteriano (ausente).

Los ARNm codificados cromosomalmente no se producirán en las minicélulas y se "diluirán" a medida que se generan cantidades crecientes de ARNm transcritos a partir del elemento episómico. Se espera que un efecto de dilución similar aumente la cantidad relativa de proteínas generadas episómicamente en relación a cualquier proteína codificada cromosomalmente presente en las minicélulas. Por lo tanto, es posible generar minicélulas que están enriquecidas en proteínas codificadas por y expresadas a partir de construcciones de expresión episómicas.

Aunque no de manera exhaustiva, se presenta en la Tabla 3 una lista de vectores de expresión episómicos que se han expresado en minicélulas eubacterianas.

También es posible transformar minicélulas con ADN exógeno después de que se hayan preparado o separado de sus células progenitoras. Por ejemplo, el ARN de fago se produce en las minicélulas después de la infección mediante fago lambda (Witkiewicz y Taylor, Ribonucleic acid synthesis after adsorption of the bacteriophage lambda on Escherichia coli minicells, Acta Microbiol Pol A 7:21-4,1975), aunque no puede tener lugar la replicación del fago lambda en las minicélulas (Witkiewicz y Taylor, The fate of phage lambda DNA in lambda-infected minicells, Biochim Biophys Acta 564:31-6,1979).

Debido a que es la especie productora de minicélulas más caracterizada, muchos de estos elementos episómicos se han examinado en minicélulas derivadas de E. coli. Los expertos en la materia entienden, sin embargo, que muchos elementos episómicos que se expresan en E. coli también funcionan en otras especies eubacterianas, y que hay disponibles elementos de expresión episómica para sistemas de minicélulas en otras especies para su uso en la invención desvelada en el presente documento.

Como alternativa, en un aspecto de la invención, se preparan minicélulas bacterianas que contienen elementos de

expresión que se preparan a partir de vectores lanzadera. Un "vector lanzadera" tiene secuencias necesarias para

su replicación y mantenimiento en células de dos especies distintas de organismos, así como elementos de

expresión, al menos uno de los cuales es funcional en células bacterianas. y al menos uno de los cuales es funcional

5 en células de levadura. Por ejemplo, se conocen vectores lanzadera de E. coli-levadura en la materia e incluyen, a

modo de ejemplo no limitante, aquellos derivados de Yip, Yrp, Ycp y Yep. Los vectores lanzadera de E. coli-levadura

preferidos son elementos episómicos que pueden segregarse en minicélulas de levadura (es decir, Yrp, Ycp y Yep.

Se prefieren particularmente vectores de expresión de la clase Yep (plásmido episómico de levadura), y otros

derivados del plásmido de levadura de origen natural conocido como el círculo de 2 µm. Los últimos vectores tienen 10 frecuencias de transformación relativamente elevadas y se mantienen de manera estable mediante mitosis y meiosis

en un elevado número de copias.

Tabla 3: Elementos episómicos que se segregan en minicélulas de Escherichia coli

ELEMENTO EPISÓMICO

REFERENCIAS

Plásmidos

R6K, R1DRD19

Nesvera y col., Folia Microbiol. (Praga) 23:278-285 (1978)

PSC101

Fox y col., Blood 69:1394-1400 (1987)

PBR322

Fox y col., Blood 69:1394-1400 (1987)

Elemento F

Cohen y col.,, Proc. Natl. Acad. Sci. 61:61-68 (1968); Khachatourians G.G., Biochim. Biophys. Acta. 561:294-300 (1979)

NR1

Hochmannova y col., Folia Microbiol. (Praga) 26:270-276

R6δ1

Hochmannova y col., Folia Microbiol. (Praga) 26:270-276

PTTQ18

Rigg y col., Arch. Oral. Biol. 45:41-52 (2000)

PGPR2.1

Rigg y col., Arch. Oral. Biol. 45:41-52 (2000); expresa antígeno de superficie celular de P. gingivalis

derivado de "mini-plásmido" de RK2

Firshein y col., J. Bacteriol. 150:1234-1243 (1982)

ColEI

Rashtchian y col., J. Bacteriol. 165:82-87 (1986); Witkiewicz y col., Acta. Microbiol. Pol. A 7:21-24 (1975)

PSC101

Rashtchian y col., J. Bacteriol. 165:82-87 (1986); Curtiss, Roy, III, Patente de Estados Unidos Nº 4.190.495; publicada el 26 de febrero de 1980

pACYCI84

Chang y col., J. Bacteriol. 134:1,141-1156 (1978); Rose, Nucleic Acids Res 16:355 (1988)

Collb, Collb7 DRD&

Skorupska y col., Acta. Microbiol. Pol.A 8:17-26 (1976)

pUCI9

Heighway y col., Nucleic Acids Res. 17:6893-6901 (1989)

plásmido R

Hochmannova y col., Folia Microbiol. (Praga) 25:11-15 (1980)

PCR1

Hollenberg y col., Gene 1:33-47 (1976); Vector lanzadera de levadura

Bacteriófago

Lambda

Witkiewicz y col., Acta. Microbiol. Pol. A 7:21-24 (1975)

M13

Staudenbauer y col., Mol. Gen. Genet. 138:203-212 (1975)

T7

Libby, Mech Ageing Dev. 27:197-206 (1984)

P1

Curtiss, Roy, III. Patente de Estados Unidos Nº 4.190.495; publicada el 26/02/1980; J Bacteriol 1995;177:2381-6, Partition of P1 plasmids in Escherichia coli mukB chromosomal partition mutants, Funnell y Gagnier.

Para la expresión de proteínas de membrana, y/u otras proteínas de interés en la célula receptora, los ORF que codifican dichas proteínas se unen operativamente a secuencias de expresión eucariotas que son adecuadas para la célula receptora. Por ejemplo, en el caso de vectores lanzadera de E. coli-levadura, los ORF se unen operativamente a secuencias de expresión que funcionan en células y/o minicélulas de levadura. Para evaluar la eficacia de un vehículo de dispensación de genes, o de un elemento de expresión de terapia génica, se usa un ORF que codifica un polipéptido detectable (por ejemplo, GFP, beta-galactosidasa). Debido a que el polipéptido detectable está unido operativamente a elementos de expresión de eucariotas, no se expresa a menos que se haya transferido a su célula receptora (eucariota). La señal del polipéptido detectable se correlaciona, por lo tanto, con la eficacia de la transferencia génica por un agente de administración de genes, o con el grado de expresión de un elemento de expresión de eucariotas.

Gyuris y Duda (High-efficiency transformation of Saccharoymces cells by bacterial minicell protoplast fusion, Mol Cel Biol 6:329507, 1986) supuestamente demostraron la transferencia de moléculas de plásmido fusionando protoplastos de minicélulas con protopastos de levadura. Gyuris y Duda afirman que se descubrió que el 10 % de células de Saccharomyces cerevisiae contienen secuencias de ADN transformante. Sin embargo, los plásmidos no contenían elementos de expresión de eucariotas, no eran vectores lanzadera, y la expresión genética de los plásmidos en células de levadura no se examinó.

XI. Usos de minicélulas en investigación

Los productos de investigación se diseñan para cualquier tipo específico de aplicación. Estos productos pueden envasarse y distribuirse en forma de, a modo de ejemplo no limitante, kits, agentes químicos, soluciones, tampones, polvos, sólidos, filtros, columnas, geles, matrices, emulsiones, aglomerados, cápsulas, y aerosoles. Las agencias reguladoras pueden exigir que los kits y reactivos para determinadas aplicaciones de investigación estén marcados como de "uso solo en investigación" para indicar que los reactivos no están previstos para su uso en seres humanos.

XI.B. Transfección

La transfección es el proceso de introducción de material genético en células eucariotas y arqueobacterianas usando procedimientos biológicos, bioquímicos o físicos. Este procedimiento permite a los investigadores expresar y estudiar proteínas diana en células cultivadas (uso de investigación) así como para administrar material genético a células en sistemas in vivo o ex vivo (terapia génica). Existe una diversidad de técnicas que prmiten la introducción y expresión de proteínas en células diana. Estas incluyen transfección mecánica (partículas biolísticas y electroporación), fosfato de calcio, DEAE-dextrano/polibreno, técnicas basadas en virus y técnicas basadas en lípidos.

El material genético y/o el ácido nucleico que se va a administrar puede ser, a modo de ejemplo no limitante, ácidos nucleicos que reparan genes dañados o ausentes, ácidos nucleicos para aplicaciones de investigación, ácidos nucleicos que eliminan una célula disfuncional, tal como una célula cancerosa, oligonucleótidos antisentido para reducir o inhibir la expresión de un producto génico, material genético que aumenta la expresión de otro gen, nucleótidos y análogos de nucleótidos, ácidos peptidonucleicos (APN), ARNt, ARNr, ARN catalíticos, moléculas híbridas de ADN:ARN, y combinaciones de las mismas.

El material genético puede comprender un gen que expresa una proteína, las proteínas ilustrativas incluyen, pero sin limitación, receptores (por ejemplo, GPCR, receptores de esfingolípidos, receptores de neurotransmisores, receptores sensoriales, receptores de factor de crecimiento, receptores de hormonas, receptores de quimiocinas, receptores de citocinas, receptores inmunológicos, y receptores de complemento, receptores FC), canales (por ejemplo, canales de potasio, canales de sodio, canales de calcio), poros (por ejemplo, proteínas de poro nucleares, canales de agua), bombas de iones y otros (por ejemplo, bombas de calcio, bombas de protones), intercambiadores (por ejemplo, intercambiadores de sodio/potasio, intercambiadores de sodio/hidrógeno, intercambiadores de potasio/hidrógeno), proteínas transportadoras de electrones (por ejemplo, citocromo oxidasa), enzimas y cinasas (por ejemplo, proteínas cinasas, ATPasas, GTPasas, fosfatasas, proteasas), proteínas estructurales/enlazantes (por ejemplo, caveolinas, clatrina), proteínas adaptadoras (por ejemplo, TRAD, TRAP, FAN), proteínas quimiotácticas/de adhesión (por ejemplo, ICAM11, selectinas, CD34, VCAM-1, LFA-1, VLA-1), y proteínas quiméricas/de fusión (por ejemplo, proteínas en las que se une una proteína normalmente solube a una región transmembrana de otra proteína).

Una minicélula que se usa para administrar agentes terapéuticos puede comprender y mostrar un resto de unión. A modo de ejemplo no limitante, los restos de unión usados para fines particulares pueden ser un resto de unión dirigido a un compuesto o resto mostrado por un tipo celular específico o células encontradas predominantemente en un tipo de tejido, que pueden usarse, entre otras cosas, para dirigirse a minicélulas y sus contenidos a tipos celulares o tejidos específicos; Un resto de unión preferido es un anticuerpo o derivado de anticuerpo. Otros restos de unión incluyen, pero sin limitación, receptores, enzimas, ligandos, péptidos de unión, proteínas de fusión, moléculas pequeñas conjugadas a proteínas transmembrana, ligandos conjugados a proteínas transmembrana, proteínas de fusión viral, y proteínas de fusión/quiméricas.

Una minicélula que contiene material genético puede administrarse a una célula diana mediante procedimientos que incluyen, pero sin limitación, endocitosis mediada por receptor, fusión celular, o fagocitosis (Aderem y col.,

Mechanism of Phagocytosis in Macrophages, Annu. Rev. Immunol. 17:593-623, 1999). El sistema de administración génica a minicélulas se usa para administrar material genético en cultivo para aplicaciones de investigación así como a células in vivo como parte de la terapia génica u otras aplicaciones terapéuticas.

A modo de ejemplo no limitante, una minicélula puede expresar una proteína, tal como una invasina, para inducir una endocitosis mediada por receptor (Pepe y col., "Yersinia enterocolitica invasin: A primary role in the initiation of infection", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6473-6477, 1993; Alrutz y col., "Involvement of focal adhesion kinase in invasin-mediated uptake", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 95:13658-13663, 1998). La invasina interactúa con la proteína integrina beta2 y hace que se dimerice. Tras la dimerización, las integrina beta2 señaliza un evento endocitótico. Por lo tanto, una minicélula que expresa la proteína de invasina se captará por células que expresan integrina beta2 mediante endocitosis.

Otro ejemplo no limitante del sistema de administración génica y transfección de minicélulas usando invasina implica la expresión de invasina después de un evento de direccionamiento. En este ejemplo, una minicélula expresa una proteína de direccionamiento que es capaz de poner en contacto la minicélula con una célula diana específica. Tras el contacto con la minicélula, se inducirá a la minicélula para transcribir y traducir invasina. La inducción se logra mediante eventos de señalización o con un evento de dimerización de factor de transcripción. Las minicélulas pueden diseñarse por ingeniería genética para contener proteínas de direccionamiento que inducen la expresión de proteínas solo tras el contacto con una célula diana específica. A modo de ejemplo no limitante, la invasina se expresa solo en la célula diana donde induce la endocitosis, evitando de este modo que la minicélula entre en cualquier otra célula que no sea la célula diana.

Las proteínas pueden inducirse y expresarse después del contacto con células diana, incluyendo, sin limitación anticuerpos y derivados de anticuerpo, receptores, enzimas, ligandos, péptidos de unión, proteínas de fusión, moléculas pequeñas conjugadas a proteínas transmembrana, ligandos conjugados a proteínas transmembrana, proteínas de fusión viral, antibióticos, proteínas apoptóticas, hormonas, toxinas, venenos, y proteínas de fusión/quiméricas.

Otro ejemplo no limitante de administración génica o transfección usando la minicélula implica el uso del aparato de secreción de tipo III de bacterias. El aparato de secreción de tipo III de bacterias se expresa en la minicélula y se usa para transferir material genético a una célula diana.

Otro ejemplo no limitante de administración génica y transfección usando minicélulas implica minicélulas que se han diseñado por ingeniería genética para contener lípidos anioónicos o lípidos catiónicos (Axel y col., "Toxicity, Uptake Kinetics and Efficacy of New Transfection Reagents: Increase of Oligonucleotide Uptake", Jour. of Vasc. Res. 040:114, 2000). Se ha demostrado que muchos tipos de lípidos inducen o potencial la transfección y la administración de genes en una diversidad de tipos celulares. Las minicélulas que contienen dichos lípidos podrían usarse para transferir material genético a tipos celulares específicos. También pueden diseñarse por ingeniería genética las minicélulas para que expresan proteínas de direccionamiento que puedan permitir a la minicélula asociarse estrechamente con una célula diana, lo que facilitaría las interacciones entre lípidos y la transferencia genética.

Otro ejemplo no limitante de administración génica o transfección usando minicélulas implica el uso de ligandos para inducir la endocitosis mediada por receptor. A modo de ejemplo no limitante, el ligando se expresa en la superficie de la minicélula, o se une a la superficie de la minicélula. Una minicélula que contiene material genético es entonces capaz de asociarse con una célula diana que expresa el receptor diana para el ligando. La interacción receptor/ligando dará como resultado la endocitosis de la minicélula al interior de la célula diana donde la minicélula liberará y administrará el material genético.

Otro ejemplo no limitante de administración génica o transfección usando minicélulas implica el uso de proteínas de fusión, tales como, pero sin limitación, proteínas de cápsida viral. En este ejemplo, la proteína de fusión se expresaría o uniría al exterior de la minicélula. La proteína de fusión podría entonces inducir la fusión de una célula diana con la minicélula tras el contacto. El contacto se iniciaría mediante sucesos no de direccionamiento al azar o mediante el uso de proteínas de direccionamiento específicas. En ambos casos, el resultado final sería la fusión de la minicélula con una célula diana y la administración del material genético.

XII. Administración basada en minicélulas de agentes biológicamente activos

XII.A. Consideraciones generales

Las minicélulas de la invención son capaces de encapsular y/o cargar en una membrana una diversidad de sustancias, incluyendo, sin limitación, agentes biológicamente activos, incluyendo, sin limitación, agentes diagnósticos y terapéuticos. Los agentes biológicamente activos incluyen, pero sin limitación, ácidos nucleicos, por ejemplo, ADN, ARN, construcciones para terapia génica, ribozimas, oligonucleótidos antisentido u otros sintéticos, incluyendo aquellos con modificaciones químicas, ácidos peptidonucleicos (APN); proteínas; oligopéptidos sintéticos; peptomiméticos; moléculas pequeñas; radioisótopos; antibióticos; anticuerpos y derivados de anticuerpos; y combinaciones y/o profármacos de cualquiera de los anteriores.

La superficie de una minicélula puede alterarse químicamente para tener determinadas propiedades que son deseables para su uso como agentes de administración. A modo de ejemplo no limitante, las minicélulas pueden conjugarse químicamente a polietilenglicol (PEG), que proporciona minicélulas "sigilosas" que no se toman igual de bien y/o igual de rápido por el sistema reticuloendotelial (SRE). Otros compuestos que pueden acoplarse a minicélulas incluyen, sin limitación, polisacáridos, polinucleótidos, lipopolisacáridos, lipoproteínas, proteínas glucosiladas, compuestos químicos sintéticos, y/o combinaciones de cualquiera de los anteriores.

Una minicélula que se usa para administrar agentes terapéuticos puede comprender y mostrar un resto de unión. A modo de ejemplo no limitante, los restos de unión usados para fines particulares pueden ser un resto de unión dirigido a un compuesto o resto mostrado por un tipo celular específico o células encontradas predominantemente en un tipo de tejido, que pueden usarse, entre otras cosas, para dirigirse a minicélulas y sus contenidos a tipos celulares o tejidos específicos; Un resto de unión preferido es un anticuerpo o derivado de anticuerpo, que se describen en detalle en otras partes del presente documento. Otros restos de unión incluyen, pero sin limitación, receptores, enzimas, ligandos, péptidos de unión, proteínas de fusión, moléculas pequeñas conjugadas a proteínas transmembrana, ligandos conjugados a proteínas transmembrana, proteínas de fusión viral, y proteínas de fusión/quiméricas.

XII.B. Captación celular

Además de restos de unión, las proteínas y otros compuestos que inducen o potencian la captación o fusión de la minicélula con el gen diana pueden mostrarse sobre la superficie de una minicélula para aplicaciones que implican la administración de agentes terapéuticos, terapia génica, y/o transfección u otras aplicaciones de investigación. Véase, en general, Adhesion Protein Protocols, Vol. 96, Dejana, E. y Corada, M., eds., Humana Press, 1999.

XII.B.1. Secuencias de captación celular de células eucariotas

Los receptores de adhesión de eucariotas, que median la adhesión intercelular, pueden usarse como agentes o dianas para captación celular. Hay al menos tres clases distintas de moléculas adhesivas que emplean los leucocitos durante sus interacciones adhesivas (a) integrinas, incluyendo, sin limitación LEC-CAMS/Selectinas (ELAM-1, LAM1/Leu8/TQ1, y GMP140/PADGEM); (b) aquellas que pertenecen a la superfamilia de las inmunoglobulinas, incluyendo, sin limitación, CD2(LFA-2), CD3/TCR, CD4, CD8, CD28, CD44, CD54 (ICAM-1), ICAM-2, CD58 (LFA-3), VCAM-1, B7; y (c) antígenos del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) de clase I y II.

Son particularmente interesantes los receptores de adhesión que pertenecen a la familia de integrina y controlan las interacciones intercelulares. Se han definido al menos diez moléculas heterodiméricas (complejos alfa y beta) de superficie celular estructuralmente relacionadas como integrinas y se han clasificado adicionalmente en subfamilias (Springer T. A., 1990, Nature 346:425-434; Hynes, R. O., 1987, Cell 48:549-554; Moller, G. Editor, 1990, Immunol. Rev. 114.:1-217). Cada subfamilia tiene una subunidad beta única, denominada integrina beta1 (CD29), integrina beta2 (CD18), e integrina beta3 (CD61), cada una de las cuales puede asociarse con múltiples subunidades alfa, cada una con al menos un sitio de unión catiónico divalente. La familia de integrinas incluye receptores para componentes de la matriz extracelular, tales como fibronectina, laminina, vitronectina, y colágeno que reconocen a Arg-Gly-Asp en sus ligandos y utilizan las subunidades beta1 o beta3 (Springer T. A., 1990, Nature 346:425-434; Hynes, R. O., 1987, Cell 48:549-554; Hemler, M. E., 1988, Immunol. Today 9:109-113; Patarroyo, M., y Makgoba, M. W., 1989, Scand. J. Immunol. 30:129-164; Moller, G. Editor, 1990, Immunol. Rev. 11,4:1-217). Hay al menos seis subunidades alfa distintas, alfa1 (CD49a), alfa2 (CD49b), alfa3 (CD49c), alfa4 (CD49d), alfa5 (CD49e), y alfa6 (CD49f) capaces de asociarse con beta1 (CD29). Las integrinas beta1 se expresan en muchos tipos celulares no hematopoyéticos y leucocitarios y se cree que juegan un papel activo en la organización tisular uniéndose a componentes de la matriz extracelular encontrados en muchos tejidos y en las membranas basales subyacentes a los músculos, sistema nervioso, epitelio y endotelio. Aunque la expresión de muchas integrinas beta1 en leucocitos requiere activación constante, su expresión en células no hematopoyéticas no (Hemler, M. E., 1988, Immunol. Today 9:109-113; Patarroyo, M., y Makgoba, M. W., 1989, Scand. J. Immunol. 30:129-164). La complejidad de la familia de integrinas se ha aumentado mediante el descubrimiento de nuevas subunidades beta, beta3 (CD61), beta4 y beta5 que pueden asociarse con subunidades alfa 4, alfa 6, y alfa V (Springer T. A., 1990, Nature 346:425-434; Hemler, M. E., 1988, Immunol. Today 9:109-113). Este uso combinatorio de subunidades alfa y beta confiere una diversidad considerable en el reconocmiento de ligandos y también ayuda a regular las comunicaciones entre el interior y el exterior de la célula.

A modo de ejemplo no limitante, una minicélula muestra un receptor de adhesión, o una proteína de fusión que tiene un dominio transmembrana unido a una porción funcional de un receptor de adhesión. Dichas minicélulas se unirán a células que muestren el ligando para el receptor de adhesión.

XII.B.2. Secuencias de captación celular de procariotas

Las proteínas de adhesión bacterianas son otra fuente de polipéptidos que se usa para estimular la captación de minicélulas. Véase, en general, Handbook of Bacterial Adhesion: Priniciples, Methods, and Applications, Yuehuei H. An; Richard J. Friedman, eds., Humana Press, 2000; y Hultgren y col., "Bacterial Adhesions and Their Assembly", Capítulo 150 en: Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology, 2ª Ed., Neidhardt, Frederick C., Editor Jefe, American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1996, Volumen 2, páginas 19031999, y referencias citadas en la misma.

A modo de ejemplo no limitante, una minicélula puede expresar una proteína, tal como una invasina, para inducir una endocitosis mediada por receptor (Pepe y col., Yersinia enterocolitica invasin: A primary role in the initiation of infection, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6473-6477, 1993; Alrutz y col., Involvement of focal adhesion kinase in invasin-mediated uptake, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:13658-13663,1998). La invasina interactúa con la proteína integrina beta2 y hace que se dimerice. Tras la dimerización, las integrina beta2 señaliza un evento endocitótico. Por lo tanto, una minicélula que expresa la proteína de invasina se captará por células que expresan integrina beta2 mediante endocitosis.

Como otro ejemplo no limitante, la proteína adhesina neumocócica CpbA interactúa con el receptor de poliinmunoglobulina humano (hplgR) bien como una parte de la superficie externa de una célula bacteriana o como una molécula libre Zhang y col. (Cell 102:827-837, 2000). Las regiones de las interacciones CpbA:hpIgR se mapearon usando una serie de grandes fragmentos peptídicos derivados de CpbA. CpbA (Nº de referencia de Swiss-Prot 030874) contiene un dominio de unión a colina que contiene los restos 454-663 y dos regiones repetitivas N-terminales denominadas R1 y R2 que están contenidas en los restos 97-203 y 259-365, respectivamente. Los polipéptidos que contienen R1 t R2 interactúan con hpIgR, mientras que los polipéptidos que contienen otras secuencias de CpbA no se unen a hpIgR. Las secuencias de R1 y/o R2 del polipéptido CpbA, y/o secuencias de aminoácidos esencialmente idénticas, sustancialmente idénticas, u homólogas, se usan para facilitar la captación de minicélulas por parte de las células.

Otro ejemplo no limitante de administración génica o transfección usando la minicélula implica el uso del aparato de secreción de tipo III de bacterias. El aparato de secreción de tipo III de bacterias se expresa en la minicélula y se usa para transferir material genético a una célula diana.

Otros ejemplos no limitantes de un resto de direccionamiento de administración y transfección génica de minicélulas son el elemento de administración de ETA (exotoxina a detoxificada) descrito en la Patente de Estados Unidos Nº

6.086.900 de Draper; internalina y proteínas relacionadas de especies de Listeria (Galan, Alternative Strategies for Becoming an Insider: Lessons from the Bacterial World, Cell 103:363-366,2000); intimina de cepas patogénicas de

E. coli (Frankel y col., Intimin and the host cell -is it bound to end in Tir(s)? Trends in Microbiology 9:214-218); y SpeB, exotoxina B pirogénica estreptocócica (Stockbauer y col., A natural variant of the cysteine protease virulence factor of group A Streptococcus with an arginine-glycine-aspartic acid (RGD) motif preferentially binds human integrins αvβ3 and αllbβ3 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:242-247,1999).

XII.B.3. Secuencias de captación celular de virus

Las secuencias de captación celular de virus incluyen, pero sin limitación, el elemento de administración de la proteína VP22 derivada del virus herpes simplex -1 y hay disponibles comercialmente vectores que contienen secuencias que codifican el elemento de administración de la proteína VP22 a través de Invitrogen (Carlsbad, CA; véase también la Patente de Estados Unidos Nº 6.017.735 de Ohare y col.); y el elemento de administración de la proteína Tat derivado de la secuencia de aminoácidos de la proteína Tat del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Véanse las Patente de Estados Unidos Nº 5.804.604; 5.747.641; y 5.674.980.

XII.B.4. Lípidos

Otro ejemplo no limitante de administración génica y transfección usando minicélulas implica minicélulas que se han diseñado por ingeniería genética para contener lípidos anioónicos o lípidos catiónicos (Axel y col., Toxicity, Uptake Kinetics and Efficacy of New Transfection Reagents: Increase of Oligonucleotide Uptake, Jour. of Vasc. Res. 040:114, 2000). Se ha demostrado que muchos tipos de lípidos inducen o potencial la transfección y la administración de genes en una diversidad de tipos celulares. Las minicélulas que contienen dichos lípidos podrían usarse para transferir material genético a tipos celulares específicos. También pueden diseñarse por ingeniería genética las minicélulas para que expresan proteínas de direccionamiento que puedan permitir a la minicélula asociarse estrechamente con una célula diana, lo que facilitaría las interacciones entre lípidos y la transferencia genética.

Otro ejemplo no limitante de administración génica o transfección usando minicélulas implica el uso de ligandos para inducir la endocitosis mediada por receptor. A modo de ejemplo no limitante, el ligando se expresa en la superficie de la minicélula, o se une a la superficie de la minicélula. Una minicélula que contiene material genético es entonces capaz de asociarse con una célula diana que expresa el receptor diana para el ligando. La interacción receptor/ligando dará como resultado la endocitosis de la minicélula al interior de la célula diana donde la minicélula liberará y administrará el material genético.

Otro ejemplo no limitante de administración génica o transfección usando minicélulas implica el uso de proteínas de fusión, tales como, pero sin limitación, proteínas de cápsida viral. En este ejemplo, la proteína de fusión se expresaría o uniría al exterior de la minicélula. La proteína de fusión podría entonces inducir la fusión de una célula diana con la minicélula tras el contacto. El contacto se iniciaría mediante sucesos no de direccionamiento al azar o mediante el uso de proteínas de direccionamiento específicas. En ambos casos, el resultado final sería la fusión de la minicélula con una célula diana y la administración del material genético.

XII.C. Expresión después de direccionamiento de secuencias de captación celular

Otro ejemplo no limitante del sistema de administración génica y transfección de minicélulas usando invasina implica la expresión de invasina después de un evento de direccionamiento. En este ejemplo, una minicélula expresa una proteína de direccionamiento que es capaz de poner en contacto la minicélula con una célula diana específica. Tras el contacto con la minicélula, se inducirá a la minicélula para transcribir y traducir invasina. La inducción se logra mediante eventos de señalización o con un evento de dimerización de factor de transcripción. Las minicélulas pueden diseñarse por ingeniería genética para contener proteínas de direccionamiento que inducen la expresión de proteínas solo tras el contacto con una célula diana específica. A modo de ejemplo no limitante, la invasina se expresa solo en la célula diana donde induce la endocitosis. evitando de este modo que la minicélula entre en cualquier otra célula que no sea la célula diana.

Las proteínas pueden inducirse y expresarse después del contacto con células diana, incluyendo, sin limitación anticuerpos y derivados de anticuerpo, receptores, enzimas, ligandos, péptidos de unión, proteínas de fusión, moléculas pequeñas conjugadas a proteínas transmembrana, ligandos conjugados a proteínas transmembrana, proteínas de fusión viral, antibióticos, proteínas apoptóticas, hormonas, toxinas, venenos, y proteínas de fusión/quiméricas.

XII.D. Direccionamiento intracelular y administración organular

Después de la administración a y la entrada en una célula diana, puede diseñarse una minicélula para que se degrade, liberando de este modo el agente terapéutico que encapsula en el citoplasma de la célula. La minicélula y/o el agente terapéutico puede incluir uno o más elementos de administración organular, que dirigen a una proteína al interior o exterior de un orgánulo u orgánulos específicos. Por ejemplo, puede incluirse la cadena A de ricina en una proteína de fusión para mediar su administración del endosoma al citosol. Además o como alternativa, se incluyen elementos de administración para los orgánulos o espacios subcelulares, tales como el núcleo, nucleolo, mitocondria, el aparato de Golgi, el retículo endoplasmático (RE), el citoplasma, etc. Hay disponibles comercialmente construcciones de expresión de mamífero que incorporan elementos de administración a través de Invitrogen (Carlsbad, CA: vectores pShooter™). Puede incorporarse un H/KDEL (es decir, una secuencia His /Lys-Asp-Glu-Leu) en una proteína de fusión de la invención, preferentemente en el extremo carboxilo, para dirigir una proteína de fusión al RE (véase Andres y col., J. Biol. Chem. 266:14277-142782,1991; y Pelham, Trends Bio. Sci. 15:483-486, 1990).

Otro tipo de elemento de administración organular es uno que dirige la proteína de fusión a la membrana celular y que puede incluir un elemento de anclaje a membrana. Dependiendo de la naturaleza del elemento de anclaje, puede escindirse en la cara interna o externa de la membrana, administrando de este modo la proteína de fusión al compartimento intracelular o extracelular, respectivamente. Por ejemplo, se ha demostrado que las proteínas de mamífero pueden unirse a i) ácido mirístico mediante un enlace de amida a un resto de glicina N-terminal, a ii) un ácido graso o un diacilglicerol mediante un elnace de amida o de tioéter de una cisteína N-terminal, respectivamente,

o covalentemente a iii) una molécula de fosfatidilinositol (PI) mediante un aminoácido C-terminal de una proteína (para una revisión, véase Low, Biochem. J. 244:1-13,1987). En el último caso, la molécula de PI se une al extremo C-terminal de la proteína mediante una estructura interviniente de glucano, y el PI se embebe en la bicapa de fosfolípidos; de aquí el término ancla de "GPI". Se han comunicado ejemplos específicos de proteínas que se sabe que tienen anclas de GPI y sus secuencias de aminiácidos C-terminaels (véase la Tabla 1 y la Figura 4 en Low, Biochemica et Biophysica Acta, 988:427-454,1989; y la Tabla 3 en Ferguson, Ann. Rev. Biochem., 57:285-320, 1988). La incorporación de anclas de GPI y de otros elementos de direccionamiento a membrana en el extremo amino o carboxilo de una proteína de fusión puede dirigir a la molécula quimérica a la superficie celular.

XII.E. Terapia génica basada en minicélulas

La administración de ácidos nucleicos para tratar enfermedades o trastornos se conoce como terapia génica (Kay y col., Gene Therapy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12744-12746. 1997). Se ha propuesto el uso de la terapia génica para tratar trastornos genéticos así como enfermedades patogénicas. Para revisiones, véase Desnick y col., Gene Therapy for Genetic Diseases, Acta Paediatr. Jpn. 40:191-203, 1998; y Bunnell y col., Gene Therapy for Infectious Diseases, Clinical Microbiology Reviews 11:42-56,1998).

Los sistemas de administracón génica usan vectores que contienen o se unen a ácidos nucleicos terapéuticos. Estos vectores facilitan la captación del ácido nucleico a la célula y pueden ayudar además a dirigir el ácido nucleico a un sitio de acción preferido, por ejemplo, el núcleo o el citoplasma (Wu y col., "Delivery Systems for Gene Therapy", Biotherapy 3:87-95, 1991). Los diferentes vectores de administración de genes varían respecto a varias propiedades, y las diferentes propiedades son deseables dependiendo del uso previsto de dichos vectores. Sin embargo, determinadas propiedades (por ejemplo, seguridad, facilidad de preparación, etc.) son deseables generalmente en la mayoría de las circunstancias.

Las minicélulas de la invención pueden usarse como agentes de administración para cualquier agente terapéutico o diagnóstico, incluyendo, sin limitación, construcciones de terapia génica. Las minicélulas que se usan como agentes de administración para construcciones de terapia génica pueden, pero no necesariamente, dirigirse a células específicas, tejidos, organos o sistemas de un organismo, de un patógeno del mismo, usando restos de unión, tal como se describe detalladamente en otras partes del presente documento.

para potenciar la efectividad de los vectores de administración génica en, a modo de ejemplo no limitante, terapia génica y transfección, es deseable en algunas aplicaciones de la invención dirigir células específicas o tejidos de interés (células o tejidos diana, respectivamente). Esto aumenta la dosis eficaz (la cantidad de ácido nucleico terapéutico presente en las células o tejidos diana) y miniza los efectos secundarios debido a la distribución del ácido nucleico terapéutico a otras células. Para revisiones, véase Peng y col., "Viral Vector Targeting", Curr. Opin. Biotechnol. 10:454-457, 1999; Gunzburg y col., "Retroviral Vector Targeting for Gene Therapy", Cytokines Mol. Ther. 2:177-184, 1996.; Wickham, "Targeting Adenovirus", Gene Ther. 7:110-114, 2000; Dachs y col., "Targeting Gene Therapy to Cancer: A Review", Oncol. Res. 9:313-325,1997; Curiel, "Strategies to Adapt Adenoviral Vectors for Targeted Delivery", Ann NY Acad. Sci. 886:158-171, 1999; Findeis y col., "Targeted Delivery of DNA for Gene Therapy via Receptors", Trends Biotechnol. 11:202-205,1993.

Algunas estrategias de direccionamiento hacen uso en su totalidad o en parte de receptores celulares y sus ligandos naturales. Véase, por ejemplo, Cristiano y col., "Strategies to Accomplish Gene Delivery Via the Receptor-Mediated Endocytosis Pathway", Cancer Gene Ther., Vol. 3, Nº 1, págs. 49-57, Ene.-Feb. de 1996.; S.C. Philips, "Receptor-Mediated DNA Delivery Approaches to Human Gene Therapy", Biologicals, Vol. 23, Nº 1, págs. 13-6, Marzo de 1995; Michael y col., "Strategies to Achieve Targeted Gene Delivery Via the Receptor-Mediated Endocytosis Pathway", Gene Ther., Vol. 1, Nº 4, págs. 223-32, Julio de 1994; Un y col., "Antiangiogenic Gene Therapy Targeting The Endothelium-Specific Receptor Tyrosine Kinase Tie2", Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Vol. 95, págs. 8829-8834,1998. Sudimack y col., "Targeted Drug Delivery Via the Folate Receptor", Adv. Drug Deliv., págs. 147-62, Marzo de 2000; Fan y col., "Therapeutic Application of Anti-Growth Factor Receptor Antibodies", Curr. Opin. Oncol., Vol. 10, Nº 1, págs. 67-73, Enero de 1998; Wadhwa y col., "Receptor Mediated Glycotargeting", J. Drug Target, Vol. 3, Nº 2, págs. 111-27, 1995; Perales y col., "An Evaluation of Receptor-Mediated Gene Transfer Using Synthetic DNA-Ligand Complexes", Eur. J. Biochem, Vol. 1, Nº 2, págs. 226, 255-66, Diciembre de 1994; Smith y col., "Hepatocyte-Directed Gene Delivery by Receptor-Mediated Endocytosis", Semin Liver Dis., Vol. 19, Nº 1, págs. 83-92,1999.

Los anticuerpos, particularmente los anticuerpos monocatenarios, para antígenos de superficie específicos para un tipo celular particular también pueden usarse como elementos de direccionamiento. Véase, por ejemplo, Kuroki y col., "Specific Targeting Strategies of Cancer Gene Therapy Using a Single-Chain Variable Fragment (scFv) with a High Affinity for CEA", Anticancer Res., págs. 4067-71,2000; Patente de Estados Unidos 6.146.885, de Dornburg, titulada "Cell-Type Specific Gene Transfer Using Retroviral Vectors Containing Antibody-Envelope Fusion Proteins"; Jiang y col., "In Vivo Cell Type-Specific Gene Delivery With Retroviral Vectors That Display Single Chain Antibodies", Gene Ther. 1999, 6:1982-7; Engelstadter y col., "Targeting Human T Cells By Retroviral Vectors Displaying Antibody Domains Selected From A Phage Display Library", Hum. Gene Ther. 2000, 11:293-303; Jiang y col., "Cell-Type-Specific Gene Transfer Into Human Cells With Retroviral Vectors That Display Single-Chain Antibodies", J. Virol 1998,72:10148-56; Chu y col., "Toward Highly Efficient Cell-Type-Specific Gene Transfer With Retroviral Vectors Displaying Single-Chain Antibodies", J. Virol 1997, 71:720-5; Chu y col., "Retroviral Vector Particles Displaying The Antigen-Binding Site Of An Antibody Enable Cell-Type-Specific Gene Transfer", J. Virol 1995, 69:2659-63; y Chu y col., "Cell Targeting With Retroviral Vector Particles Containing Antibody-Envelope Fusion Proteins", Gene Ther. 1994, 1:292-9.

Las minicélulas se usan para administrar terapia génica basada en ADN para células y tejidos diana. Las minicélulas dobles transformantes se usan no solo para dirigirse a un tipo celular/de tejido concreto (por ejemplo, linfocitos T infectados por VIH) sino que también se diseñan por ingeniería genética para fusionarse con y entrar en células diana y administrar una toxina basada en proteínas (por ejemplo, atibiótico, o un gen proapoptótico, como Bax), una construcción de expresión antisentido (por ejemplo, antisentido para un factor de transcripción), u oligonucleótidos antisentido (por ejemplo, antisentido para un gen anti-apoptótico, tal como Bcl-2. Las minicélulas doblemente transformadas expresan no solo estos promotores de la muerte celular, sino que también se dirigen únicamente a células/tejidos concretos, minimizando de este modo la toxicidad y carencia de especificidad de los vectores de terapia génica. Por "doblemente tranformada" se entiende que la minicélula comprende 2 elementos de expresión, uno eubacteriano y el otro eucariota. Como alternativa, pueden usarse vectores lanzadera, que comprenden elementos de expresión eubacterianos y eucariotas en un vector.

La terapia génica basada en minicélulas se usa para administrar plásmidos de expresión que pueden corregir deficiencias o anomalías en la expresión de proteínas. Como ejemplo no limitante, los inhalantes de minicélulas se dirigen a células alveolares pulmonares y se usan para administrar transportadores de cloro que son deficientes o de otro modo materiales en la fibrosis cística. Las deficiencias de proteínas hormonales (por ejemplo, enanismo) se corrigen mediante sistemas de expresión de minicélulas (por ejemplo, expresión de hormona del crecimiento en células de la pituitaria). La distrofia muscular de Duchenne está caracterizada por una mutación en el gen de la distrofina; esta afección se corrige mediante terapia génica basada en minicélulas. El tratamiento de la angiogénesis para pacientes cardíacos se hace eficaz mediante minicélulas productoras de FGF o VEGF dirigidas al corazón. En este caso, se prefiere la sobreexpresión dirigida por plásmidos de estos factores de crecimiento.

XIII. Usos terapéuticos de minicélulas

Además de la terapia génica basada en minicélulas, pueden usarse minicélulas en una variedad de modalidades terapéuticas. Los ejemplos no limitantes de estas modalidades incluyen las aplicaciones siguientes.

XIII.A. Enfermedades y trastornos

Las enfermedades y trastornos a los cuales se puede aplicar la invención incluyen, a modo de ejemplo no limitante, los siguientes.

Enfermedades y trastornos que implican al sistema respiratorio, tales como fibrosis cística, cáncer y tumores de pulmón, asma, infecciones patogénicas, enfermedades y trastornos relacionados con alergias, tales como asma; aspergilosis broncopulmonar alérgica; neumonía por hipersensibilidad, neumonía eosinofílica; enfisema; bronquitis; bnquiectasias por bronquitis alérgica; fibrosis cística; neumonitis por hipersensibilidad; asma ocupacional; síndrome de la enfermedad de las vías respiratorias reactivas por sarcoidosis, enfermedad pulmonar intersticial, síndrome hipereosinofílico, enfermedad pulmonar parasítica y cáncer de pulmón, asma, síndrome de dificultad respiratoria del adulto, y similares; Las enfermedades y trastornos del sistema digestivo, tales como aquellas del tracto gastrointestinal, incluyendo cánceres, tumores, infecciones patogénicas, colitis; colitis ulcerosa, diverticulitis, enfermedad de Crohn, gastroenteritis, enfermedad inflamatoria del intestino, ulceración del duodeno por cirugía intestinal, una enfermedad de las vellosidades intestinales incluyendo, pero sin limitación, enfermedad celíaca, atrofia de las vellosidades intestinales por infecciones anteriores y síndromes del intestino corto, pancreatitis, trastornos relacionados con hormonas gastrointestinales, enfermedad de Crohn, y similares; Enfermedades y trastornos del sistema esquelético, tales como atrofia muscular espinal, artritis reumatoide, artrosis, osteoporosis, trastorno óseo relacionado con el mieloma múltiple, degeneración cortical-estriada-espinal, y similares; Enfermedades autoinmunes, tales como artritis reumatoide (AR), esclerosis múltiple (EM), síndrome de Sjögren, sarcoidosis, diabetes mellitus insulino dependiente (DMID), tiroiditis autoinmune, artritis reactiva, espondilitis anquilosante, escleroderma, polimiositis, dermatomiositis, psoriasis, vasculitis, granulomatosis de Wegener, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, gastritis autoinmune, lupus eritematoso sistémico, anemia hemolítica autoinmune, neutropenia autoinmune, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de injerto contra hospedador, injerto de médula ósea, algunos casos de diabetes de tipo I, y similares; Enfermedades y trastornos neurológicos, tales como depresión, trastorno bipolar, esquizofrenia, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, temblores familiares, síndrome de Gilles de la Tourette, trastornos alimentarios, demencia por cuerpos de Lewy, dolor crónico y similares; Enfermedades patológicas y trastornos resultantes, tales como infecciones bacterianas, tales como infección por Escherichia, Shigella, Salmonella, septicemia, choque séptico, y bacteriemia; infecciones por un virus, tal como VIH, adenovirus, virus de la viruela, hepatovirus, y similares; y encefalitis relacionada con SIDA, encefalitis relacionada con VIH, hepatitis crónica activa, y similares; Enfermedades y trastornos proliferativos, tales como leucemia linfobástica aguda, leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, melanoma metastásico, sarcoma de Kaposi, mieloma múltiple, cáncer de mama, cáncer anal, cáncer vulvar, y similares; y Varias enfermedades, trastornos y traumatismos incluyendo, pero sin limitación, enfermedades mediadas por apoptosis, inflamación, isquemia cerebral, isquemia de miocardio, envejecimiento, sarcoidosis, colitis granulomatosa, escleroderma, enfermedades degenerativas, enfermedades necróticas, alopecia, daño neurológico causado por ictus, atrofia cortical cerebral difusa, enfermedad de Pick, demencia mesolimbocortical, degeneración talámica, corea de Huntington, degeneración ganglionar cortical-basal, degeneración cerebrocerebelar, demencia familiar con paraparesis espástica, enfermedad de cuerpos poliglucosanos, síndrome de Shy-Drager, atrofia olivopontocerebelar, parálisis supranuclear progresiva, distonía muscular deformante, enfermedad de Haller-vorden-Spatz, síndrome de Meige, corea acantocítica, ataxia de Friedreich, atrofia cerebelar cortical familiar de Holmes, enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker, atrofia muscular espinal progresiva, parálisis balbar progresiva, esclerosis lateral primaria, atrofia muscular hereditaria, paraplegia espástica, glomerulonefritis, tiroiditis crónica, enfermedad de Grave, trombocitopenia, miastenia grave, psoriasis, atrofia muscular peroneal, polineuropatía intersticial hipertrófica, heredopatia ataxica polineuritiforme, neuropatía óptica, y oftalmoplegia.

Pueden tratarse una diversidad de enfermedades y trastornos causados o exacerbados por patógenos usando la invención. Para una descripción exhaustiva de patígenos y enfermedades y trastornos relacionados, véase Zinsser Microbiology, 20ª Ed., Joklik, ed., Appelton-Century-Crofts, Norwalk, CT, 1992, y referencias citadas en la misma.

Las minicélulas también pueden usarse para terapia de reemplazo (mediante terapia génica) en una diversidad de afecciones que se sabe que están causadas por una proteína o proteínas que están ausentes (por ejemplo, distrofia muscular de Duchenne), reducidas en nivel (enanismo) o aberrantes (anemia de células faciformes).

Para una descripción exhaustiva de enfermedades y trastornos que pueden tratarse usando la invención, véase The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 17ª Ed., Beers y col., Eds. edición publicada, Merck and Co., Rahway, N.J. 1999; edición on-line, Medical Services, Usmedsa, USHH, http://www.merck.com/pubs/mmanual/, y referencias citadas en la misma.

XIII.B. Aplicaciones antibacterianas y antiparasíticas

Las minicélulas pueden usarse para eliminar bacterias patógenas, protozoos, levaduras y otros hongos, gusanos parasíticos, virus y otros patógenos mediante mecanismos que o se basan o no en la absorción selectiva. Los antibióticos pueden administrarse a organismos patógenos después de ser primeramente la diana de las proteínas o moléculas pequeñas en las superficies de las minicélulas que promueven la unión de las minicélulas a las superficies del patógeno. La fusión o inyección de los contenidos de las minicélulas en la célula patógena puede dar como resultado la muerte o la incapacitación del patógeno y por lo tanto disminuir la dosis eficaz de un antibiótico o agente terapéutico genético. La administración de antibióticos anclados o encapsulados en las minicélulas reducirá la dosis eficaz de un antibiótico y reducirá su eliminación por el sistema renal. En el caso de administrar moléculas encapsuladas (por ejemplo, antibióticos), pueden incubarse minicélulas purificadas/aisladas que expresan proteínas unidas a membrana para direccionamiento con las moléculas in vivo antes de su administración. Esto puede ser particularmente aplicable al uso de minicélulas de protoplastos o minicélulas de poroplastos a los que solo se les ha eliminado su membrana externa y la pared celular o la membrana interna, respectivamente, facilitando de este modo la difusión de la molécula pequeña en la minicélula intacta.

Sin quedar limitados al siguiente ejemplo, las minicéluas pueden usarse como agentes antibacterianos expresando en las superficies de las minicélulas antígenos, receptores, anticuerpos, u otros elementos de direccionamiento que dirigirán a la minicélula al organismo patógeno y facilitarán la entrada de plásmidos, proteínas, moléculas pequeñas para obtener acceso a la entrada en el organismo. Pueden encapsularse antibióticos en minicélulas después del aislamiento de la cepa progenitora de tal forma que el antibiótico no será eficaz contra la bacteria productora de minicélulas en sí. Ya que las minicélulas no son capaces de reproducirse, el antibiótico no será letal para el vehículo de administración de la minicélula, sino solo para el patógeno diana. En otro ejemplo no limitante, pueden expresarse factores lisogénicos, por ejemplo, complemento en las superficies de las minicélulas o encapsularse por las mismas para promover la lisis del patógeno.

También pueden diseñarse las minicélulas para expresar proteínas tóxicas u otros elementos tras la unión al patógeno. La inducción de la expresión de proteínas de las minicélulas puede ser un suceso que sea coincidente con el direccionamiento o se active por la unión de la minicélula al patógeno diana, haciendo que las minicélulas sean tóxicas solo cuando se efectúa el contacto con el organismo patogénico. Las minicélulas pueden diseñarse para expresar proteínas de fusión/quiméricas que se acoplan a la membrana mediante dominios transmembrana que tienen restos de señalización en las superficies citoplásmicas de las minicélulas, tales como cinasas o factores de transcripción. En un ejemplo no limitante, una proteína de fusión unida a membrana puede expresarse conteniendo un dominio extracelular con un receptor, scFv, u otra proteína de direccionamiento que se une al patógeno. El segundo segmento de la quimera podría ser un dominio transmembrana de una proteína, tal como el receptor de EFG o ToxR (que podría unir la proteína de fusión a la membrana). Cabe destacar que, el dominio citoplásmico de la proteína de fusión pued ser una cinasa que fosforila un factor de transcripción bacteriano presente en la minicélula o puede fusionarse con un factor de transcripción que se expresaría en la superficie citoplásmica de la minicélula. El plásmido de expresión que se había introducido previamente en las minicélulas se activaría entonces mediante promotores que utilizan el factor de transcripción bacteriano activado preexistente en las minicélulas o que puede introducirse en la minicélula. Sin quedar limitados al siguiente ejemplo, el suceso de unión puede señalizarse mediante una proteína de fusión que contiene elementos de un receptor (por ejemplo, EGF) o por una proteína de adhesión (por ejemplo, una integrina) que requiere oligomerización. En el ejemplo de uso de integrinas, los factores de transcripción bacterianos u otros que también necesitan dimerización pueden clonarse como proteínas de fusión de tal modo que el suceso de unión se señalizaría mediante una dimerización de dos o más proteínas quiméricas recombinantes idénticas que tienen factores de transcripción dependientes de asociación asociados al extremo Cterminal de la proteína de fusión. Las minicélulas solo serían tóxicas cuando se produce el contacto con el patógeno.

El mecanismo propuesto de inducción coincidente con el direccionamiento no está limitado a los usos antiparasíticos de las minicélulas, sino que pueden usarse en otras situaciones terapéuticas donde se usan las minicélulas para expresar proteínas de beneficio terapéutico cuando se dirigen contra células eucariotas del organismo (por ejemplo, eliminar células cancerosas con toxinas proteicas expresadas solo después de la unión de la minicélula a la célula cancerosa).

La transferencia de plásmidos que contienen ADN u otro elemento de expresión, ADN antisentido, etc., puede usarse para expresar proteínas tóxicas en las células diana o de otro modo mostrar transcripción y/o traducción en el organismo patógeno o sería de otro modo tóxico para la célula. Sin quedar limitados al siguiente ejemplo, las minicélulas pueden usarse para transferir plásmidos que expresan represores del crecimiento, DNasas, u otras proteínas o péptidos (por ejemplo, pro-apoptóticas) que podrían ser tóxicas para el patógeno.

XIII. C. Terapia contra el cáncer

Las proteínas de fusión expresadas en minicélulas se usan para la terapia contra el cáncer. En un ejemplo no limitante, se usan bibliotecas de anticuerpos de presentación en fagos para clonar anticuerpos monocatenarios contra antígenos asociados a tumores (específicos de tumor), tales como MUCH-1 o EGFvIII. Las proteínas de fusión que expresan estos anticuerpos, y que además comprenden un dominio transmembrana de un solo pase de una proteína integral de membrana, se usan para "presentar" el anticuerpo a la superficie de las minicélulas. Las minicélulas inyectadas recubiertas con anticuerpos antitumor se dirigen al tumor y administran genes pro-apoptóticos u otras sustancias tóxicas al tumor. Las minicélulas son atrapadas por las células tumorales mediante procesos tales como la endocitosis mediada por receptor (mediante, por ejemplo, macrófagos). A modo de ejemplo no limitante, puede expresarse toxR-invasina en las superficies de las minicélulas para promover la endocitosis mediante la interacción entre la invasina y las beta2-integrinas en las superficies de las células diana..

Las proteínas de fusión que poseen proteínas promotoras de la fusión viral facilitan la entrada de la minicélula a la célula tumoral para la terapia génica o para la administración de proteínas bioactivas de quimioterapia y ácidos nucleicos. En estas y similares aplicaciones, la minicélula puede contener elementos de expresión eucariotas y eubacterianos separados, o pueden combinarse los elementos de expresión eun solo "vector lanzadera".

XIV. Usos diagnósticos de minicélulas

Las minicélulas se transforman con plásmidos que expresan proteínas unidas a membrana, tales como receptores, que se unen a moléculas específicas en una muestra biológica particular, tal como sangre, orina, heces, sudor, saliva o un tejido tal como hígado o corazón. Las minicélulas también pueden usarse para la administración de agentes terapéuticos a través de la barrera hematoencefálica al cerebro. Esta modalidad se usa, a modo de ejemplo no limitante, con fines de obtención de imágenes, y para la administración de agentes terapéuticos, por ejemplo, antidepresivos, y agentes para el tratamiento del cáncer, la obesidad, el insomnio, esquizofrenia, trastornos compulsivos y similares. Los sistemas de expresión recombinantes se incorporan en minicélulas donde la construcción de expresión de proteínas dirigida por plásmido puede producir un solo producto génico o una proteína de fusión, tal como una proteína soluble para el ligando particular fusionado con un dominio transmembrana de un gen diferente. La proteína de fusión actúa entonces como un receptor unido a membrana para un ligando o molécula concreta en la muestra. Las técnicas de clonación convencional (por ejemplo, PCR) se usan para identificar genes para proteínas de unión, o se usa presentación en fagos para identificar un gen para un gen de anticuerpo variable monocatenario que expresa una proteína de unión para un ligando particular. El producto proteico es preferentemente una proteína soluble. Al construir un plásmido que contiene este gen más el dominio transmembrana de una proteína de membrana de un solo pase conocida, tal como el receptor de EGF, puede expresarse una proteína de fusión en las superficies de las minicélulas como una proteína integral de membrana con un dominio extracelular que es preferentemente capaz de unirse a un ligando.

En otro tipo de proteína de fusión, se fusiona el dominio transmembrana del receptor de EFG a un receptor soluble conocido para un ligando particular, tal como LBP (proteína de unión a lipopolisacárido) o el dominio extracelular de la proteína receptora CD14, de los cuales ambos se unen a la endotoxina bacteriana, LPS (lipopolisacárido). La proteína de fusión LBP/EGF o CD14/EGF se usa para medir LPS en suero de los pacientes que se sospecha que padecen septicemia.

El sistema de minicélula se usa para expresar receptores, tales como aquellos de la familia de EDG (gen de diferenciación celular endotelial) (por ejemplo, EDG 1-9) que reconocen esfingolípidos, tales como esfingosina-1fosfato (S1P), esfingosilfosforil colina (SPC) y el lisofosfolípido, ácido lisofosfatídico (LPA). Ya que estas proteínas son proteínas integrales de membrana de 7 pases, no se necesitan dominios transmembrana adicionales de otra proteína, y la proteína receptora no es, por lo tanto, una proteína de fusión.

Las formas truncadas o mutantes de una proteína de interés son útiles en un ensayo diagnóstico. Por ejemplo, una proteína que es una enzima de unión a ligando puede alterarse para unirse a su sustrato de interés pero ya no puede convertir el sustrato en producto. Un ejemplo de esta aplicación de tecnología de minicélulas es la expresión de una deshidrogenasa láctica truncada o mutante que es capaz de unirse al ácido láctico, pero no es capaz de convertir el ácido láctico en piruvato. De igual forma, los derivados de hexocinasa se usan en minicélulas para controlar la glucosa.

Las minicélulas pueden usarse como herramientas diagnósticas in vitro o in vivo. En el contexto in vitro, las minicélulas se usan en un formato ELISA o en una plataforma diagnóstica de flujo lateral para detectar la presencia y nivel de un analito deseado. Se recoge una muestra (muestra de tejido, célula o fluido corporal) y después se ensaya in vitro. Una ventaja del sistema de minicélulas en la detección de sustancias en tejido, células o en fluidos corporales es que las minicélulas pueden usarse en ensayos in vitro donde la minicélula se marca con un compuesto radioactivo o fluorescente para ayudar en su detección en un formato ELISA o en una plataforma de flujo lateral. Por lo tanto, se obvía el uso de sistemas de detección de anticuerpo secundario.

Como en un diagnóstico in vivo, las minicélulas pueden radiomarcarse. Un procedimiento para marcar es incubar las minicélulas durante un periodo corto (aproximadamente 8 h) con un trazador T1/2 (por ejemplo, Tn99M) que es útil para detectar metástasis tumorales. El Tn99M se acumula en las células y se carga en las minicélulas después del aislamiento o en la bacteria progenitora durante la fase de crecimiento. A medida que se oxida el Tn99M por la cepa de E. coliprogenitora o por las minicélulas después del aislamiento, el Tn99M se retiene por la célula. también pueden usarse proteínas marcadas con yodo (Krown y col., TNF-alpha receptor expression in rat cardiac myocytes: TNF-alpha inhibition of L-type Ca2+ transiets, FEBS Letters 376:24-30, 1995).

Un ejemplo no limitante de detección in vivo del cáncer usando minicélulas radiomarcadas es el uso de las minicélulas para expresar anticuerpos quiméricos monocatenarios unidos a membrana contra antígenos específicos de tumor (TSA) expresados en el melanoma maligno u otras células transformadas. Dichos TSA incluyen, pero sin limitación, el antígeno MUC1 asociado con el cáncer de mama y formas variantes del EGFR (EGFvIII). A modo de ejemplo no limitante, pueden inyectarse (IV) células que expresan anticuerpos para células de melanoma a un paciente y después someterlo a un TAC del drenaje linfático para determinar si ha aparecido una metástasis. Esta técnica diagnóstica obvia la necesidad de disección de los nódulos linfáticos.

Otro ejemplo de un diagnóstico in vivo es usar el sistema de minicélulas para expresar anticuerpos contra lipoproteínas de baja densidad (LDL) oxidadas. Las LDL oxidadas se asocian con las placas aterogénicas. Las minicélulas radiomarcadas (preparadas igual que antes) se inyectan por vía IV a una persona antes de la obtención de imágenes nucleares para mejorar la imagen. La mejora del contraste de la resonancia magnética se lleva a cabo preparando minicélulas complejadas (cargadas) con potenciadores del contraste, tales como agentes relajantes paramagnéticos y agentes de susceptibilidad magnética.

En diagnósticos así como en otras aplicaciones, las minicélulas detectan preferentemente un marcador diagnóstico, es decir, un marcador asociado con una enfermedad o trastorno. Es estadísticamente más probable que haya un marcador diagnóstico en individuos que padecen una enfermedad que en aquellos que no están enfermos. Preferentemente, un marcador diagnóstico causa una enfermedad directamente o se produce durante esta; sin embargo, la asociación puede no ser más que una correlación.

XV. Composiciones farmacéuticas

Otro aspecto de la invención se refiere a composiciones, incluyendo, pero sin limitación, composiciones farmacéuticas. De acuerdo con la invención, una "composición" se refiere a una mezcla que comprende al menos un vehículo, preferentemente un vehículo fisiológicametne aceptable, y una o más composiciones de minicélulas. El término "vehículo" define un compuesto químico que no inhibe o previene la incorporación del péptido o péptidos biológicamente activos en las células o tejidos. Un vehículo es típicamente una sustancia inerte que permite que se formule o prepare una composición de un principio activo en una forma de dosificación adecuada (por ejemplo, una píldora, una cápsula, un gel, una película, un comprimido, una micropartícula (por ejemplo, una microesfera), una solución; una pomada; una pasta, un aerosol, una gota, un coloide o una emulsión, etc.). Un "vehículo fisiológicamente aceptable" es un vehículo adecuado para su uso en condiciones fisiológicas que no anula (reduce, inhibe, o previene) la actividad biológica y las propiedades del compuesto. Por ejemplo, el dimetilsulfóxido (DMSO) es un vehículo, ya que facilita la captación de muchos compuestos orgánicos en las células o tejidos de un organismo. Preferentemente, el vehículo es un vehículo fisiológicamente aceptable, preferentemente, un vehículo farmacéuticamente o veterinariamente aceptable, en el que se dispone la composición de minicélulas.

Una "composición farmacéutica" se refiere a una composición en la que el vehículo es un vehículo farmacéuticamente aceptable, mientras que una "composición veterinaria" es una en la que el vehículo es un vehículo veterinariamente aceptable. La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" o "vehículo veterinariamente aceptable" incluye cualquier medio o material que no es no deseable biológicamente o de otro modo, es decir, el vehículo puede administrarse a un organismo junto con una composición de minicélulas sin causar ningún efecto biológico no deseado o sin interactuar de manera perjudicial con el complejo o cualquiera de sus componentes o con el organismo. Los ejemplos de reactivos farmacéuticamente aceptable se proporcionan en la Farmacopea de los Estados Unidos, The National Formulary, United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Md. 1990, incorporada a la presente solicitud por referencia. Las expresiones "cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad farmacéuticamente eficaz" significan una cantidad suficiente para inducir o efectuar una respuesta medible en la célula diana, tejido, o cuerpo de un organismo. Lo que constituye una cantidad terapéuticamente eficaz dependerá de una diversidad de factores, los cuales tendrá en cuenta el experto en la materia para lograr la pauta de dosificación deseada.

Las composiciones de la invención pueden comprender además otros componentes químicos, tales como diluyentes y excipientes. Un "diluyente" es un compuesto químico diluido en un disolvente, preferentemente un disolvente acuoso, que facilita la disolución de la composición en el disolvente, y también puede servir para estabilizar la forma biológicamente activa de la composición o de uno o más de sus componentes. Las sales disueltas en soluciones tamponadas se usan como diluyentes en la técnica. Por ejemplo, los diluyentes preferidos son soluciones tamponadas que contienen una o más sales diferentes. Una solución tamponada preferida es suero salino tamponado con fosfato (particularmente junto con composiciones previstas para administración farmacéutica), ya que imita las condiciones salinas de la sangre humana. Ya que las sales de tampón pueden controlar el pH de una solución a bajas concentraciones, un diluyente tamponado modifica rara vez la actividad biológica de un péptido biológicamente activo.

Un "excipiente" es una sustancia más o menos inerte que puede añadirse a una composición para conferirle una propiedad adecuada, por ejemplo, una consistencia adecuada o para formar un fármaco. Los excipientes y vehículos adecuados incluyen, en particular, cargas, tales como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol, o sorbitol, preparaciones de celulosa, tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, agar, pectina, goma xantana, goma guar, goma de algarroba, ácido hialurónico, almidón de patata de caseína, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, poliacrilato, carboximetilcelulosa sódica, y/o polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, también pueden incluirse agentes disgregantes, tales como polivinilpirrolidona reticulada, agar, o ácido algínico o una sal del mismo, tal como alginato de sodio. Otros excipientes y vehículos adecuados incluyen hidrogeles, hidrocoloides gelificables, y quitosano. Las microesferas y microcápsulas de quitosano pueden usarse como vehículos. Véase el documento WO 98/52547 (que describe formulaciones de microesferas para dirigir compuestos al estómago, comprendiendo las formulaciones un núcleo interno (que incluye opcionalmente un hidrocoloide gelificado) que contiene uno o más principios activos, una membrana compuesta de un polímero insoluble en agua (por ejemplo, etilcelulosa) para controlar la velocidad de liberación del principio activo

o principios activos, y una capa exterior compuesta de un polímero catiónico bioadhesivo, por ejemplo, un polisacárido catiónico, una proteína catiónica, y/o un polímero catiónico sintético; Patente de Estados Unidos Nº

4.895.724. Normalmente, el quitosano se reticula usando un agente adecuado, por ejemplo, glutaraldehído, glioxal, epiclorohidrina, y succinaldehído. Las composiciones que emplean quitosano como vehículo pueden formularse en una diversidad de formas de dosificación, incluyendo píldoras, comprimidos, micropartículas, y microesferas, incluyendo aquellas que proporcionan liberación controlada del principio activo (o principios activos). Otros polímeros catiónicos bioadhesivos adecuados incluyen gelatina ácida, poligalactosamina, poliaminoácidos, tales como polilisina, polihistidina, poliornitina, compuestos policuaternarios, prolamina, poliimina, dietilaminoetildextrano (DEAE), DEAE-imina, DEAE-metacrilato, DEAE-acrilamida, DEAE-dextrano, DEAE-celulosa, poli-p-aminoestireno, polioxetano, copolimetacrilatos, poliamidoaminas, almidones catiónicos, polivinilpiridina, y politiodietilaminometiletileno.

Las composiciones de la invención pueden formularse de cualquier manera adecuada. Las composiciones de minicélulas pueden dispersarse de manera uniforme (homogénea) o de manera no uniforme (heterogénea) en el vehículo. Las formulaciones adecuadas incluyen formulaciones secas y líquidas. Las formulaciones secas incluyen polvos criodesecados y liofilizados, que son particularmente adecuados para la administración en aerosol a los senos o al pulmón, o para almacenamiento a largo plazo seguido de reconstitución en un diluyente adecuado antes de la administración. Otras formulaciones secas preferidas incluyen aquellas en las que una composición de acuerdo con la invención se comprimen en forma de comprimido o píldora adecuada para administración oral o se preparan en una formulación de liberación sostenida. Cuando la composición está prevista para administración oral pero se va a administrar al epitelio intestinal, se prefiere que la formulación se encapsule con un recubrimiento entérico para proteger la formulación y evitar la liberación prematura de las composiciones de minicélulas incluidas en esta. Como apreciarán los expertos en la materia, las composiciones de la invención pueden ponerse en cualquier forma de dosificación adecuada. Las píldoras y los comprimidos representan algunas de dichas formas de dosificación. Las composiciones también pueden encapsularse en cualquier cápsula adecuada u otro material de recubrimiento, por ejemplo, mediante compresión, inmersión, recubrimiento en bandeja, secado por pulverización, etc. Las cápsulas adecuadas incluyen aquellas preparadas a partir de gelatina y almidón. A su vez, dichas cápsulas pueden recubrirse con uno o más materiales adicionales, por ejemplo, un recubrimiento entérico, si se desea. Las formulaciones líquidas incluyen formulaciones acuosas, geles, y emulsiones.

Algunas realizaciones preferidas se refieren a composiciones que comprenden un bioadhesivo, preferentemente un recubrimiento mucoadhesivo. Un "recubrimiento bioadhesivo" es un recubrimiento que permite que una sustancia (por ejemplo, una composición de minicélulas) se adhiera a una superficie o sustancia biológica mejor que si el recubrimiento estuviese ausente. Un "recubrimiento mucoadhesivo" es un recubrimiento bioadhesivo preferido que permite que una sustancia, por ejemplo, una composición de acuerdo con la invención, se adhiera a la mucosa mejor que si el recubrimiento estuviese ausente. Por ejemplo, las partículas micronizadas (por ejemplo, partículas que tienen un diámetro medio de 5, 10, 25, 50, o 100 µm) pueden recubrirse con un mucoadhesivo. Las partículas recubiertas pueden ensamblarse entonces en una forma de dosificación adecuada para administración a un organismo. Preferentemente, y dependiendo de la localización donde se exprese el resto de transporte diana de la superficie celular, la forma de dosificación se recubre con otro recubrimiento para proteger a la formulación hasta que alcance la localización deseada, donde el mucoadhesivo permite la retención de la formulación mientras que la composición interactúa con el resto de transporte diana de la superficie celular.

Las composiciones de la invención pueden administrarse a cualquier organismo, preferentemente a un animal, preferentemente a un mamífero, ave, pez, insecto, o arácnido. Los mamíferos preferidos incluyen animales bovinos, caninos, equinos, felinos, ovinos, y porcinos, y primates no humanos. Se prefieren particularmente los seres humanos. Existen en la técnica múltiples técnicas para administrar o dispensar un compuesto incluyendo, pero sin limitación, administración oral, rectal (por ejemplo, un enema o supositorio), en aerosol (por ejemplo, para administración pulmonar o nasal), parenteral, y tópica. Preferentemente, se administran cantidades suficientes del péptido biológicamente activo para lograr el efecto previsto. La cantidad particular de composición que se va a administrar dependerá de diversos factores, incluyendo el efecto que se quiere lograr, el tipo de organismo al que se le va a administrar la composición, la ruta de administración, la pauta de dosificación, y la edad, salud, y sexo del organismo. Como tal, la dosificación particular de una composición incorporada en una formulación dada se deja al criterio del experto habitual en la materia.

Los expertos en la materia apreciarán que cuando las composiciones de la presente invención se administran como agentes para lograr un resultado biológico concreto deseado, que puede incluir efectos terapéuticos o protectores (incluyendo la vacunación), puede ser necesario combinar las proteínas de fusión de la invención con un vehículo farmacéutico aceptable. La elección del vehículo farmacéutico y la preparación de la proteína de fusión como agente terapéutico o agente protector dependerá del uso previsto y del modo de administración. Las formulaciones y procedimientos adecuados de administración de agentes terapéuticos incluyen aquellos para administración oral, pulmonar, nasal, bucal, ocular, dermal, rectal, o vaginal.

Dependiendo del modo de administración empleado, la entidad funcional dependiente de contexto puede administrarse en una variedad de formas farmacéuticamente aceptables. Por ejemplo, la entidad funcional dependiente de contexto puede administrarse en forma de un sólido, solución, emulsión, dispersión, micela, liposoma, y similares, incorporarse a una píldora, capsula, comprimido, supositorio, areosol, gota, o pulverizador. Las píldoras, comprimidos, supositorios, areosoles, polvos, gotas, y pulverizadores pueden tener estructuras complejas, multicapa y tienen un intervalo amplio de tamaños. Los aerosoles, polvos, gotas, y pulverizadores pueden tener un tamaño desde pequeño (1 micra) hasta grande (200 micras).

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden usarse en formad e sólido, polvo liofilizado, solución, emulsión, dispersión, micela, liposoma, y similares, en las que la composición resultante contiene uno o más de los compuestos de la presente invención, como principio activo, mezclado con un vehículo o excipiente orgánico o inorgánico adecuado para aplicaciones entéricas o parenterales. El principio activo puede prepararse, por ejemplo, con los vehículos habituales no tóxicos farmacéuticamente aceptables para comprimidos, aglomerados, cápsulas, supositorios, soluciones, emulsiones, suspensiones, y cualquier otra forma adecuada para su uso. Los vehículos que pueden usarse incluyen glucosa, lactosa, manosa, goma arábiga, gelatina, manitol, pasta de almidón, trisilicato de magnesio, talco, almidón de maíz, queratina, sílice coloidal, almidón de patata, urea, triglicéridos de cadena media, dextranos y otros vehículos adecuados para su uso en la fabricación de preparaciones en forma sólida,, semisólida, o líquida. Además, pueden usarse agentes auxiliares, estabilizantes, espesantes y colorantes y perfumes. Los ejemplos de un agente estabilizante seco incluyen triulosa, preferentemente a concentraciones del 0,1% o mayores (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.314.695). El principio activo se incluye en la composición farmacéutica en una cantidad suficiente para producir el efecto deseado en el proceso de la enfermedad o afección.

XVI. Moléculas pequeñas

La expresión "molécula pequeña" incluye cualquier resto químico u otro que pueda actuar para afectar a procesos biológicos. Las moléculas pequeñas pueden incluir cualquier número de agentes terapéuticos conocidos y usados actualmente, o pueden ser moléculas pequeñas sintetizadas en una biblioteca de dichas moléculas con el fin de seleccionar funciones biológicas. Las moléculas pequeñas se distinguen de las macromoléculas por el tamaño. Las moléculas pequeñas de la presente invención tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 5.000 dalton (Da), preferentemente menos de aproximadamente 2.500 Da, más preferentemente menos de 1.000 Da, lo más preferentemente de menos de aproximadamente 500 Da.

Las moléculas pequeñas incluyen, sin limitación, compuestos orgánicos, peptidomiméticos y conjugados de los mismos. Tal como se usa en el presente documento, la expresión "compuesto orgánico" se refiere a cualquier compuesto basado en carbono distinto de macromoléculas, tales como ácidos nucleicos y polipéptidos. Además de carbono, los compuestos orgánicos pueden contener calcio, cloro, flúor, cobre, hidrógeno, hierro, potasio, nitrógeno, oxígeno, azufre y otros elementos. Un compuesto orgánico puede estar en forma aromática o alifática. Los ejemplos no limitantes de compuestos orgánicos incluyen acetonas, alcoholes, anilinas, carbohidratos, monosacáridos, oligosacáridos, polisacáridos, aminoácidos, nucleósidos, nucleótidos, lípidos, retinoides, esteroides, proteoglucanos, cetonas, aldehídos, grasas, aceites y ceras, alquenos, ésteres, éteres, tioles, sulfuros, compuestos cíclicos, compuestos heterocíclicos, imidazoles y fenoles saturados, insaturados y poliinsaturados. Un compuesto orgánico, tal como se usa en el presente documento, incluye compuestos orgánicos nitrogenados y compuestos orgánicos halogenados (por ejemplo, clorados). Los procedimientos para preparar peptidomiméticos se describen más adelante. Las colecciones de moléculas pequeñas, y las moléculas pequeñas identificadas de acuerdo con la invención se caracterizan mediante técnicas, tales como espectrometría en acelerador de masas (EAM; véase T urteltaub y col., Curr Pharm Des 2000 6(10):991-1007, Bioanalytical applications of accelerator mass spectrometry for pharmaceutical research; y Enjalbal y col., Mass Spectrom Rev 200019(3):139-61, Mass spectrometry in combinatorial chemistry.)

Las moléculas pequeñas preferidas se fabrican, formulan o de otro modo preparan de manera relativamente más fácil y menos costosa. Las moléculas pequeñas preferidas son estables en una diversidad de condiciones de almacenamiento. Las moléculas pequeñas preferidas pueden ponerse en asociación estrecha con macromoléculas para formar moléculas que son biológicamente activas y que tienen propiedades farmacéuticas mejoradas. Las propiedades farmacéuticas mejoradas incluyen cambios en el tiempo de circulación, distribución, metabolismo, modificación, excreción, secreción, eliminación, y estabilidad que son favorables para la actividad biológica deseada. Las propiedades farmacéuticas mejoradas incluyen cambios en las características toxicológicas y de eficacia de la entidad química.

XVII. Polipéptidos y derivados

XVII.A. Polipéptidos

Tal como se usa en el presente documento, el término "polipéptido" incluye proteínas, proteínas de fusión, oligopéptidos y derivados polipeptídicos, con la excepción de peptidomiméticos que se consideran como moléculas pequeñas en el presente documento. Aunque son polipéptidos, los anticuerpos y sus derivados se describen en una sección separada. Los anticuerpos y derivados de anticuerpos se describen en una sección separada, pero los anticuerpos y derivados de anticuerpos, para los fines de la invención, se tratan como una subclase de polipéptidos y derivados.

Una "proteína" es una molécula que tiene una secuencia de aminoácidos que están unidos entre sí en una molécula lineal mediante enlaces peptídicos. El término proteína se refiere a un polipéptido que se aísla de una fuente natural,

o que se produce a partir de un ADNc aislado usando tecnología de ADN recombinante; y tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una longitud de al menos 200 aminoácidos.

Una "proteína de fusión" es un tipo de proteína recombinante que tiene una secuencia de aminoácidos que es el resultado del engarce de las secuencias de aminoácidos de dos o más polipéptidos normalmente separados.

Un "fragmento de proteína" es un fragmento proteolítico de un polipéptido mayor, que puede ser una proteína o una proteína de fusión. Un fragmento proteolítico puede prepararse mediante escisión proteolítica in vivo o in vivo de un polipéptido más grande, y generalmente es demasiado grande como para producirse mediante síntesis química. Los fragmentos proteolítcos tienen secuencias de aminoácidos que tienen una longitud de desde aproximadamente 200 a aproximadamente 1.000 aminoácidos.

Un "oligopéptido" es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos corta (es decir, de 2 a aproximadamente 200 aminoácidos). Un oligopéptido se prepara generalmente mediante síntesis química.

Aunque los oligopéptidos y los fragmentos de proteína pueden prepararse de otro modo, es posible usar tecnología de ADN recombinante y/o manipulaciones bioquímicas in vitro. Por ejemplo, un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos puede prepararse y usarse como molde para reacciones de transcripción/traducción in vitro. En dichas reacciones, se introduce un ácido nucleico exógeno que codifica un polipéptido preseleccionado en una mezcla que está esencialmente libre de ácidos nucleicos exógenos que contiene todos los componentes celulares necesarios para la transcripción y la traducción. Se añaden uno o más aminoácidos radiomarcados antes de o con el ADN exógeno, y se dejan proceder la transcripción y la traducción. Debido a que el único ácido nucleico presente en la mezcla de reacción es el ácido nucleico exógeno añadido a la reacción, solo se producen los polipéptidos codificados por este, y se incorporan los aminoácidos radiomarcados. De este modo, los polipéptidos codificados por un ácido nucleico exógeno preseleccionado están radiomarcados. Aunque estén presentes otras proteínas en la mezcla de reacción, el polipéptido preseleccionado es el único que se produce en presencia de los aminoácidos radiomarcados y por lo tanto está marcado de manera única.

Tal como se explica en detalle más adelante, los "derivados de polipéptido" incluyen, sin limitación, polipéptidos mutantes, polipéptidos químicamente modificados y peptidomiméticos.

Los polipéptidos de la presente invención, que incluyen los análogos y otras variantes modificadas, pueden prepararse generalmente siguiendo técnicas conocidas. Preferentemente, la producción sintética del polipéptido de la invención puede ser de acuerdo con el procedimiento sintético en fase sólida. Por ejemplo, la síntesis en fase sólida se entiende bien ya que es un procedimiento común para la preparación de polipéptidos, al igual que lo son una diversidad de modificaciones de esta técnica [Merrifield (1964), J. Am. Chem. Soc., 85: 2149; Stewart y Young (1984), Solid Phase polypeptide Synthesis, Pierce Chemical Company, Rockford, III.; Bodansky y Bodanszky (1984), The Practice of polypeptide Synthesis, Springer-Verlag, Nueva York; Atherton y Sheppard (1989), Solid Phase polypeptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Nueva York). Véase, asimismo, el procedimiento específico descrito en el Ejemplo 1 más adelante.

Como alternativa, los polipéptidos de la presente invención pueden prepararse en sistemas recombinantes usando secuencias polinucleotídicas que codifican a los polipéptidos. Por ejemplo, las proteínas de fusión se preparan típicamente usando tecnología de ADN recombinante.

XVII.B. Derivados de polipéptidos

Un "derivado" de un polipéptido es un compuesto que no es, por definición, un polipéptido, es decir, contiene al menos un engarce químico que no es un enlace peptídico. Por lo tanto, los derivados de polipéptidos incluyen, sin limitación, proteínas que se someten de manera natural a modificaciones postraduccionales, tales como, por ejemplo, glucosilación. Se entiende que un polipéptido de la invención puede contener más de una de las siguientes modificaciones en el mismo polipéptido. Los derivados de polipéptidos preferidos mantienen un atributo deseable, que puede ser la actividad biológica; más preferentemente, un derivado de polipéptido está potenciado en referencia a uno o más atributos deseables, o tiene uno o más atributos deseables no encontrados en el polipéptido progenitor. Aunque se describen en esta sección, los peptidomiméticos se consideran como moléculas pequeñas en la presente divulgación.

XVII.C. Derivados de polipéptidos mutantes

Un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a aquella encontrada en una proteína preparada a partir de una fuente natural es un polipéptido de "tipo silvestre". Los oligopéptidos mutantes pueden prepararse mediante síntesis química, incluyendo, sin limitación, síntesis combinatoria.

Los polipéptidos mutantes mayores que los oligopéptidos pueden prepararse usando tecnología de ADN recombinante alterando la secuencia nucleotídica de un ácido nucleico que codifica un polipéptido. Aunque algunas alteraciones en la secuencia nucleotídica no alterarán la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por esta (mutaciones "silentes"), muchas darán como resultado un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos alterada que se altera en relación a la secuencia progenitora. Dichas secuencias de aminoácidos alteradas pueden comprender sustituciones, eliminaciones y adiciones de aminoácidos, a condición de que dichos aminoácidos sean aminoácidos de origen natural.

Por lo tanto, someter a un ácido nucleico que codifica un polipéptido a mutagénesis es una técnica que puede usarse para preparar polipéptidos mutantes, particularmente aquellos que tienen sustituciones de aminoácidos pero no eliminaciones o inserciones de los mismos. Se conocen una diversidad de técnicas de mutagénesis que pueden usarse in vitro o in vivo, incluyendo, sin limitación mutagénesis química y mutagénesis mediada por la PCR. Dichas mutagénesis pueden dirigirse al azar (es decir, las mutaciones pueden aparecer en cualquier parte del ácido nucleico) o dirigidas a una sección del ácido nucleico que codifica una serie de aminoácidos de particular interés. Usando dichas técnicas, es posible preparar bibliotecas, agrupaciones y mezclas aleatorizadas, combinatorias o centradas de compuestos.

Los polipéptidos que tienen elminaciones o inserciones de aminoácidos de origen natural pueden ser oligopéptidos sintéticos que sean el resultado de la síntesis química de secuencias de aminoácidos que se basan en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido progenitor pero que tienen uno o más aminoácidos insertados o eliminados en relación a la secuencia del polipéptido progenitor. Las inserciones y eliminaciones de restos de aminoácidos en los polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos más largas pueden prepararse mediante mutagénesis dirigida.

XVII.D. Polipéptidos químicamente modificados

Tal como se contempla por esta invención, el término "polipéptido" incluye aquellos que tienen una o más modificaciones químicas en relación a otro polipéptido, es decir, polipéptidos químicamente modificados. El polipéptido a partir del cual se deriva un polipéptido químicamente modificado puede ser una proteína de tipo silvestre, una proteína mutante o un polipéptido mutante, o fragmentos polipeptídicos de los mismos; un anticuerpo u otro ligando polipeptídico de acuerdo con la invención incluyendo, sin limitación, anticuerpos monocatenarios, proteínas bacterianas y derivados polipeptídicos de las mismas; o ligandos polipeptídicos preparados de acuerdo con la divulgación. Preferentemente, la modificación química (o las modificaciones químicas) confiere(n) o mejora(n) atributos deseables del polipéptido, pero no altera sustancialmente o comprometen la actividad biológica del mismo. Los atributos deseables incluyen, pero sin limitación, vida útil aumentada; estabilidad en suero o in vivo potenciada; resistencia a proteasas; y similares. Dichas modificaciones incluyen, a modo de ejemplo no limitante, acetilación Nterminal, glucosilación, y biotinilación.

XVII.D.1. Polipéptidos con grupos químicos N-terminales o C-terminales

Una estrategia eficaz para conferir resistencia a peptidasas que actúan en los restos N-terminales o C-terminales de un polipéptido es añadir grupos químicos en el extremo del polipéptido, de tal forma que el polipéptido modificado deja de ser un sustrato para la peptidasa. Una de dichas modificaciones químicas es la glucosilación de los polipéptidos en uno o ambos extremos. Determinadas modificaciones químicas, en particular la glucosilación Nterminal, han demostrado aumentar la estabilidad de los polipéptidos en suero humano (Powell y col., (1993), Pharma. Res. 10: 1268-1273). Otras modificaciones químicas que potencian la estabilidad en suero incluyen, pero sin limitación, la adición de un grupo alquilo N-terminal, que consiste en un alquilo inferior de 1 a 20 átomos de carbono, tal como un grupo acetilo, y/o la adición de una amida o grupo amida sustituido C-terminal.

XVII.D.2. Polipéptidos con un D-aminoácido terminal

La presencia de un D-aminoácido N-terminal aumenta la estabilidad en suero de un polipéptido que por lo demás contiene L-aminoácidos, debido a que las exopeptidasas que actúan en el resto N-terminal no pueden utilizar un Daminoácido como sustrato. De igual forma, la presencia de un D-aminoácido C-terminal también estabiliza al polipéptido, debido a que las exopeptidasas en suero que actúan en el resto C-terminal no pueden utilizar un Daminoácido como sustrato. Con la excepción de estas modificaciones terminales, las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos con D-aminoácidos N-terminales y/o C-terminales son normalmente idénticas a las secuencias del polipéptido de L-aminoácidos progenitor.

XVII.D.3. Polipéptidos con sustitución de aminoácidos naturales por aminoácidos no naturales

La sustitución de aminoácidos naturales con aminoácidos no naturales eun una subsecuencia de un polipéptido puede conferir o potenciar atributos deseables, incluyendo la actividad biológica. Dicha sustitución puede, por ejemplo, conferir resistencia a la proteolisis por exopeptidasas que actúan en el extremo N-terminal. La síntesis de polipéptidos con aminoácidos no naturales es rutinaria y conocida en la técnica (véase, por ejemplo, Coller, y col., (1993), citado anteriormente).

XVII.E. Peptidomiméticos

En general, un polipéptido mimético ("peptidomimético") es una molécula que imita la actividad biológica de un polipéptido, pero no es peptídico en cuanto a su naturaleza química. Por estricta definición, un peptidomimético es una molécula que no contiene enlaces peptídicos (es decir, enlaces amida entre aminoácidos). Sin embargo, el término peptidomimético se usa en ocasiones para describir moléculas que dejan de ser de naturaleza completamente peptídica, tales como seudopéptidos, semipéptidos y peptoides. Los ejemplos de algunos peptidomiméticos según la definición más amplia (donde parte de un polipéptido se sustituye por una estructura que carece de enlaces peptídicos) se describen más adelante. Ya sean parcial o totalmente no peptídicos, los peptidomiméticos de acuerdo con la presente invención proporcionan una disposición espacial de restos químicos reactivos que se asemeja estrechamente a la disposición tridimensional de grupos activos en el polipéptido en el que se basa el peptidomimético. Como resultado de esta geometría de sitio activo similar, el peptidomimético tiene efectos en sistemas biológicos que son similares a la actividad biológica del polipéptido.

Hay varias ventajas potenciales para usar un mimético de un polipéptido dado en vez del polipéptido en sí. Por ejemplo, los polipéptidos pueden mostrar dos atributos no deseados, es decir, poca biodisponibilidad y una duración de la acción corta.. Los peptidomiméticos a menudo son lo suficientemente pequeños como para ser oralmente activos y para tener una larga duración de acción. También hay problemas asociados con la estabilidad, almacenamiento e inmunorreactividad para los polipéptidos que no se experimentan con los peptidomiméticos.

Los polipéptidos candidatos, líderes y otros que tienen una actividad biológica deseada pueden usarse en el desarrollo de peptidomiméticos con actividades biológicas similares. Se conocen técnicas para desarrollar peptidomiméticos a aprtir de polipéptidos. Los enlaces peptídicos pueden sustituirse por enlaces no peptídicos que permiten al peptidomimético adoptar una estructura similar, y por lo tanto actividad biológica, a la del polipéptido original. También pueden efectuarse modificaciones adicionales sustituyendo grupos químicos de los aminoácidos con otros grupos de estructura similar. El desarrollo de peptidomiméticos puede ayudarse mediante la determinación de la estructura terciaria del polipéptido original, bien libre o unido a un ligando, mediante espectroscopía RMN, cristalografía y/o modelado molecular asistido por ordenador. Estas técnicas ayudan al desarrollo de nuevas composiciones de mayor potencia y/o mayor biodisponibilidad y/o mayor estabilidad que el polipéptido original (Dean (1994), BioEssays, 16: 683-687; Cohen y Shatzmiller (1993), J. Mol. Graph., 11: 166-173; Wiley y Rich (1993), Med. Res. Rev., 13: 327-384; Moore (1994), Trends Pharmacol. Sci., 15: 124-129; Hruby (1993), Biopolymers, 33: 10731082; Bugg y col. (1993), Sci. Am., 269: 92-98, todos incorporados al presente documento por referencia].

Por lo tanto, mediante el uso de los procedimientos descritos anteriormente, la presente invención proporciona compuestos que muestran actividad terapéutica potenciada en comparación con los polipéptidos descritos anteriormente. Los compuestos peptidomiméticos obtenidos mediante los procedimientos anteriores, que tienen la actividad biológica de los polipéptidos anteriormente nombrados y una estructura tridimensional similar, están abarcados por la presente invención. Será fácilmente evidente para un experto en la materia que un peptidomimético puede generarse a partir de cualqueira de los polipéptidos modificados descritos en la sección anterior o a partir de un polipéptido que porta más de una de las modificaciones descritas en la sección anterior. Será además evidente que los peptidomiméticos de la presente invención pueden usarse además para el desarrollo de compuestos no peptídicos aún más potentes, además de su utilidad como compuestos terapéuticos.

Los ejemplos específicos de peptidomiméticos derivados a partir de los polipéptidos descritos en la sección anterior se presentan a continuación. Estos ejemplos son ilustrativos y no limitantes en cuanto a otras modificaciones adicionales.

XVII.E.1. Péptidos con un enlace isóstero seudopeptídico reducido

Las proteasas actúan en los enlaces peptídicos. Por lo tanto, se deduce que la sustitución de enlaces peptídicos por enlaces seudopeptídicos confiere resistencia a la proteolisis. Se ha descrito una serie de enlaces seudopeptídicos que en general no afectan a la estructura polipeptídica y a la actividad biológica. El enlace seudopeptídico isóstero reducido es un enlace seudopeptídico adecuado que se sabe que potencia la estabilidad a la escisión enzimática con ninguna o poca pérdida de actividad biológica (Couder, y col., (1993), Int. J. Polypeptide Protein Res. 41:181184, incorporado en el presente documento por referencia). Por lo tanto, las secuencias de aminoácidos de estos compuestos pueden ser idénticas a las secuencias de sus polipéptidos de L-aminoácidos progenitores, excepto en que uno o más de los enlaces peptídicos se sustituyen por un enlace seudopeptídico isóstero. Preferentemente se sustituye el enlace peptídico más N-terminal, ya que dicha sustitución podría conferir resistencia a la proteolisis por exopeptidasas que actúan en el extremo N-terminal.

XVII.E.2. Péptidos con un enlace seudopeptídico retro-inverso

Para conferir resistencia a la proteolisis, los enlaces peptídicos también pueden sustituirse por enlaces seudopeptídicos retro-inversos (Dalpozzo, y col., (1993), Int. J. Polypeptide Protein Res. 41:561-566, incorporado en el presente documento por referencia). De acuerdo con esta modificación, las secuencias de aminoácidos de los compuestos pueden ser idénticas a las secuencias de sus polipéptidos progenitores de L-aminoácidos, excepto en que uno o más de los enlaces peptídicos se sustituyen por un elnace seudopeptídico retro-inverso. Preferentemente se sustituye el enlace peptídico más N-terminal, ya que dicha sustitución conferirá resistencia a la proteolisis por exopeptidasas que actúan en el extremo N-terminal.

XVII.E.3. Derivados peptoides

Los derivados peptoides de los polipéptidos representan otra forma de polipéptidos modificados que mantienen los determinantes estructurales importantes para la actividad biológica, aunque eliminan los enlaces peptídicos, confiriendo de este modo resistencia a la proteolisis (Simon, y col., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:9367-9371 e incorporado al presente documento por referencia). Los peptoides son oligómeros de glicinas N-sustituidas. Se ha descrito una serie de grupos N-alquilo, correspondiendo cada uno a la cadena lateral de un aminoácido natural.

XVIII. Kits

La invención proporciona kits diagnósticos y terapéuticos relacionados útiles para aplicaciones terapéuticas, diagnósticas y de investigación. Se desvelan kits ilustrativos en las Patentes de Estados Unidos 5.773.024; 6.017.721; y 6.232.127 B1. Los kits de la invención incorporan minicélulas y/o incluyen procedimientos para usar las minicélulas descritas en el presente documento.

XVIII.A. Componentes de kit de uso diagnóstico y de investigación

En una realización, la invención se refiere a kits para determinar el diagnóstico o pronóstico de un paciente. Estos kits comprenden preferentemente dispositivos y reactivos para medir los niveles de uno o más marcadores en una muestra de ensayo de un paciente, e instrucciones para llevar a cabo el ensayo. Opcionalmente, los kits pueden contener uno o más medios para convertir el nivel (o los niveles) del marcador en un pronóstico. Dichos kits contienen preferentemente reactivos suficientes como para llevar a cabo una o más de dichas determinaciones.

Más específicamente, un kit diagnóstico de la invención comprende cualquiera de los siguientes reactivos y/o componentes en cualquier combinación.

(1)

Un primer reactivo detectable o marcado detectablemente que se une a un ligando de interés. El reactivo de unión puede, pero no necesariamente, ser un anticuerpo o derivado de anticuerpo que comprende un resto detectable. El reactivo de unión a esfingolípidos se almacena en un contenedor del kit que puede abrirse, o está unido a una superficie de un sustrato que es accesible para otros reactivos. Los ejemplos del último incluyen tiras de ensayo.

(2)

Si el primer reactivo no es ni detectable ni está marcado detectablemente, el kit puede comprender un segundo reactivo detectable o marcado detectablemente que se une al primer reactivo (por ejemplo, un anticuerpo secundario) o que produce una señal detectable cuando está en estrecha proximidad con el primer reactivo (por ejemplo, como resultado de la transferencia de energía de resonancia fluorescente, FRET). En cualquiera de los casos, la señal producida por el segundo reactivo se correlaciona con la cantidad de ligando en la muestra.

(3)

Uno o más reactivos de control positivo. Normalmente, estos reactivos comprenden un compuesto que se sabe que produce una señan en el ensayo. En una realización, los reactivos de control positivo son patrones, es decir, comprenden una cantidad conocida de un compuesto detectable o marcado detectablemente, cuya señal puede compararse con la señal de una muestra de ensayo. Además de servir como reactivos de control positivo, pueden usarse para desarrollar curvas de calibración que relacionen la cantidad de señal con la concentración conocida de un compuesto detectable o marcado detectablemente. La señal de una muestra de ensayo se compara con la curva de calibración para determinar qué concentración de compuesto detectable o marcado detectablemente se corresponde a la señal de la muestra de ensayo. En esta realización, el kit proporciona medidas cuantitativas de la cantidad de un ligando en una muestra de ensayo.

(4)

Uno o más reactivos de control negativo. Normalmente, estos reactivos de control pueden comprender tampón u otra solución que no contenga ninguno del primer o segundo reactivo detectable o marcado detectablemente y por lo tanto no deben producir una señal detectable. Cualquier señal que se detecte refleja el nivel de fondo de "ruido" en el ensayo. Otro tipo de reactivo de control negativo contiene la mayoría de los componentes necesarios para que se produzca la señal del ensayo, pero carece de al menos uno de dichos componentes y por lo tanto no debe producir una señal. Otro tipo más de reactivo de control negativo contiene todos los componentes necesarios para que se produzca la señal del ensayo, pero también contiene un inhibidor del proceso que produce la señal.

(5)

Uno o más reactivos auxiliares para su uso en los ensayos diagnósticos del kit, por ejemplo, tampones, alcoholes, soluciones ácidas, etc. Estos reactivos están disponibles generalmente en las instalaciones médicas y por lo tanto son componentes opcionales del kit. Sin embargo, se incluyen preferentemente estos reactivos en el kit para asegurarse de que se usan reactivos de pureza y esterilidad suficientes, ya que los conjugados de proteína resultantes se van a administrar a mamíferos, incluyendo seres humanos, con fines médicos, y para proporcionar kits que pueden usarse en situaciones donde las instalaciones médicas no estén fácilmente disponibles, por ejemplo, durante travesías a lugares alejados de instalaciones médicas, o en situaciones donde la presencia de estos reactivos auxiliares permita el tratamiento inmediato de un paciente fuera de una instalación médica en oposición al tratamiento que llega en un momento tardío).

(6)

Instrucciones de uso para una persona que use el kit. Las instrucciones pueden presentarse en uno o más de

los componentes del kit, en el embalaje del kit y/o en un prospecto.

XVIII.B. Componentes terapéuticos del kit

Un kit terapéutico de la invención comprende cualquiera de los siguientes reactivos y/o componentes en cualquier combinación.

(1)

Uno o más agentes terapéuticos.

(2)

Si el agente terapéutico (o agentes terapéuticos9 no se formula para administración a través del canal alimentario, que incluye, pero sin limitación, la administración sublingual, un dispositivo capaz de administrar el agente terapéutico a través de otras rutas. Un tipo de dispositivo para administración parenteral es una jeringa que se usa para inyectar el agente terapéutico al cuerpo de un animal que necesite el agente terapéutico. También pueden usarse dispositivos para inhalación.

(3)

Envases separados, comprendiendo cada uno uno o más reactivos del kit. En una realización preferida, los envases son viales que contienen formulaciones liofilizadas estériles o una composición terapéutica que es adecuada para su reconstitución. Otros envases incluyen, pero sin limitación, una bolsa, bandeja, caja, tubo, o similares. Los componentes del kit pueden envasarse y mantenerse estériles en los envases.

(4)

Instrucciones de uso para una persona que use el kit. Las instrucciones pueden presentarse en uno o más de los componentes del kit, en el embalaje del kit y/o en un prospecto. Dichas instrucciones incluyen, a modo de ejemplo no limitante, instrucciones para el uso del kit y sus reactivos, para reconstituir reactivos liofilizados o de otro modo preparar reactivos.

Un kit preferido de la presente invención comprende los elementos útiles para llevar a cabo un inmunoensayo. Un kit de la presente invención puede comprender una o más muestras experimentales (es decir, formulaciones de la presente invención) y una o más muestras de control unidas a al menos una varilla o placa de elisa preempaquetada, y los medios necesarios para detectar la formación de inmunocomplejos (por ejemplo, anticuerpos secundarios marcados u otros compuestos de unión y cualquier solución necesaria para resolver dichos marcadores, tal como se describe detalladamente anteriormente) entre los anticuerpos contenidos en el fluido corporal del animal que se está ensayando y las proteínas unidas a la varilla o placa de ELISA. Se encuentra dentro del ámbito de la invención que el kit pueda comprender solamente una formulación de la presente invención y que los medios de detección puedan proporcionarse de otro modo.

Un kit alternativo preferido de la presente invención comprende elementos útiles para llevar a cabo un ensayo en la piel. Un kit de la presente invención puede comprender al menos un aparato de jeringa y aguja preempaquetado que contenga una o más muestras experimentales y/o una o más muestras de control. Un kit de acuerdo con la invención puede diseñarse para aplicaciones tanto diagnósticas como terapéuticas. Puede usarse cualquier combinación de los elementos XVIII.A.(1)-(6) y XVIII.B.(1)-(4) anteriores en un kit, opcionalmente con reactivos adicionales, patrones, envases para muestras, y similares.

XIX Minicélulas inmunogénicas

XIX.A. En general,

Las minicélulas se usan para inmunizar sujetos. Se dice que un organismo está "inmunizado" cuando, después del contacto con un inmunógeno, el organismo produce anticuerpos dirigidos contra el inmunógeno, o tiene una proliferación o actividad aumentada de linfocitos T citotóxicos y/o colaboradores, o ambos. La proliferación o actividad aumentada de linfocitos T puede ser particularmente deseable en el caso de parásitos que causan una disminución en la proliferación de linfocitos T.

El uso de minicélulas para presentar antígenos tiene varias ventajas potenciales. Una proteína de membrana intacta puede presentarse en su forma nativa sobre la superficie de una minicélula inmunogénica, en vez de como una proteína desnaturalizada o como oligopéptidos derivados de la secuencia de aminoácidos de una proteína de membrana, lo que permite que se desarrollen anticuerpos que se dirigen a epítopos que, debido al plegamiento de las proteínas, aparecen solo en la proteína nativa. La superficie de la minicélula puede ser de manera natural, o puede modificarse para que sea, un adyuvante. Además, las propiedades farmacocinéticas de las minicélulas, tal como se discute en otras partes del presente documento, pueden mejorarse en relación a otras formas de administración.

Las aplicaciones de las minicélulas inmunogénicas incluyen, pero sin limitación, de investigación, aplicaciones profilácticas, diagnósticas y terapéuticas.

En plicaciones de investigación, las minicélulas inmunogénicas se usan para generar anticuerpos para un antígeno mostrado sobre una minicélula. Dichos anticuerpos se usan para detectar un antígeno, que puede ser un resto químico, una molécula, virus, orgánulo, célula, tejido, órgano, u organismo que se desea estudiar. Clásicamente, dichos anticuerpos se han preparado inmunizando a un animal, generalmente una rata o un conejo, y recogiendo los antisueros de estos. Pueden usarse técnicas de biología molecular par apreparar anticuerpos y fragmentos de anticuerpo, tal como se describe en otras partes del presente documento. Los fragmentos de anticuerpos monocatenarios (scFv) también se pueden identificar, purificar, y caracterizar usando minicélulas que muestran una proteína de membrana o una proteína soluble unida a membrana.

En aplicaciones profilácticas, las minicélulas inmunogénicas se usan para estimular a un sujeto para producir anticuerpos y/o para activar linfocitos T, de tal forma que el sujeto está "pre-inmunizado" antes del contacto con un patógeno o célula hiperproliferativa. Por lo tanto, en el caso de patógenos, el sujeto está protegido por anticuerpos y/o linfocitos T que se dirigen específicamente al patógeno antes de la infección.

En aplicaciones terapéuticas, las minicélulas inmunogénicas se usan en inmunoterapia.

Determinados aspectos de la invención implican inmunoterapia activa, en la que el tratamiento se basa en la estimulación in vivo del sistema inmunitario endógeno del hospedador para que reaccione contra patógenos o tumores debido a la administración de agentes que provocan, potencian o modulan una respuesta inmune. Dichos agentes incluyen, pero sin limitación, inmunógenos, adyuvantes, citocinas y quimiocinas.

Otras aplicaciones terapéuticas implican la inmunoterapia pasiva, en la que el tratamiento implica la administración de agentes (tales como anticuerpos o células efectoras) que se dirigen específicamente a un inmunógeno o un patógeno o una célula hiperproliferativa, y no depende necesariamente de un sistema inmune intacto del hospedador. Los ejemplos de células efectoras incluyen células T; linfocitos T, tales como linfocitos T citotóxicos CD8+ y linfocitos T colaboradores CD4+ que se infiltran en tumores; células eliminadoras, tales como linfocitos citolíticos naturales (NK) y células eliminadoras activadas por linfocinas.

XIX.B. Trastornos hiperproliferativos

Las minicélulas inmunogénicas de la invención pueden usarse para tratar trastornos hiperproliferativos induciendo una respuesta inmune para un antígeno asociado con estos. La expresión "trastorno hiperproliferativo" se refiere a trastornos caracterizados por una proliferación anormal o patológica de células, por ejemplo, cáncer, psoriasis, hiperplasia y similares.

Para una reivisón de la inmunoterapia aplicada a trastornos hiperproliferativos, véase Armstrong y col., Cellular immunotherapy for cancer, BMJ 323:1289-1293, 2001; Evans, Vaccine therapy for cancer -fact or fiction?, Proc R Cell Physicians Edinb 31:9-16, 2001; Ravindranath y Morton, "Active Specific Immunotherapy with Vaccines", Capítulo 61 en: Holland-Frei Cancer Medicine, Quinta edición, Bast, Robert C., y col., editores, B.C. Decker, Inc., Hamilton, 2000, páginas 800-814.

Los tipos de cánceres incluyen, sin limitación, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de ovarios, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de las glándulas sudoríparas, carcinoma de las glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma del conducto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, cáncer de cuello de útero, tumor testicular, carcinoma de pulmón, carcinoma microcítico de pulmón, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, leucemia, linfoma, mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, y la enfermedad de la cadena pesada.

Los antígenos específicos de tumor (TSA), antígenos de diferenciación asociados a tumor (TADA) y otros antígenos asociados con cánceres y otros trastornos hiperproliferativos incluyen, pero sin limitación, C1 IAC, una humana asociada con el cáncer (Osther, Patente de Estados Unidos 4.132.769); el antígeno CA125, un antígeno asociado con el cistadenocarcinoma de ovario, (Hanisch y col., Carbohydr. Res. 178:29-47,1988; O’Brien, la Patente de Estados Unidos Nº 4.921.790); CEA, un antígeno presente en muchos adenocarcinomas (Horig y col., Strategies for cancer therapy using carcinembryonic antigen vaccines, Expert Reviews in Molecular Medicine, http://wwwermm.cbcu.cam.ac.uk: 1,2000); CORA (antígeno relacionado con carcinoma u orosomucoide) descrito por Toth y col. Patente de Estados Unidos Nº 4.914.021); antígeno DF3 de carcinoma de mama humano (Kufe, en las patentes de los Estados Unidos Nº 4.963.484 y 5.053.489); DU-PAN-2, un antígeno de carcinoma de páncreas (Lan y col., Cancer Res. 45:305-310,1985); HCA, un antígeno de carcinoma humano (Codington y col., Patente de Estados Unidos 5.693.763); Her2, un antígeno de cáncer de mama (Fendly y col., The Extracellular Domain of HER2/neu Is a Potential Immunogen for Active Specific Immunotherapy of Breast Cancer, Journal of Biological Response Modifiers 9:449-455,1990); MSA, una glucoproteína de carcinoma de mama (Tjandra y col., Br. J. Surg. 75:811-817, 1988); MFGM, un antígeno de carcinoma de mama (Ishida y col., Tumor Biol. 10:12-22,1989); PSA, antígeno específico de próstata (Nadji y col., Prostatic-specific-antigen, Cancer 48:1229-1232,1981); proteínas STEAP (seis antígenos epiteliales transmembrana de la próstata) (Afar y col., Patente de Estados Unidos 6.329.503); TAG-72, una glucoproteína de carcinoma de mama (Kjeldsen y col., Cancer Res. 48:2214-2220,1988); YH206, un antígeno de carcinoma de pulmón (Hinoda y col., Cancer J. 42:653-658, 1988); el antígeno p97 de melanoma humano (Estin y col., Recombinant Vaccinia Virus Vaccine Against the Human Melanoma Antigen p97 for Use in Immunotherapy, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 85:1052-1056, 1988); y el antígeno específico de melanoma descrito por Pfreundschuh en la Patente de Estados Unidos 6.025.191);

XIX.C. Patógenos intracelulares

En determinados aspectos de la invención, se usan vacunas que comprenden minicélulas inmunogénicas para prevenir o tratar enfermedades causadas por patógenos intracelulares. Pueden prepararse vacunas que estimulan las respuestas de linfocitos T citotóxicos contra células infectadas con virus incluyendo, pero sin limitación, hepatitis tipo A, hepatitis tipo B, hepatitis tipo C, gripe, varicela, adenovirus, herpes simple tipo I (VHS-I), herpes simple tipo II (VHS-II), peste bovina, rinovirous, ecovirus, rotavirus, virus sincitial respiratorio, virus del papiloma, virus papova, citomegalovirus, equinovirus, arbovirus, hantavirus, virus de coxackie, virus de las paperas, virus del sarampión, virus de la rubeola, virus de la polio, virus de la inmunodeficiencia humana tipo I (VIH-I), y virus de la inmunodeficiencia humana tipo II (VIH-II). También pueden prepararse vacunas que estimulan las respuestas de linfocitos T citotóxicos contra células infectadas con obligados intracelulares, incluyendo, pero sin limitación, clamidia, micobacterias y Rickettsia. También pueden prepararse vacunas que estimulan las respuestas de linfocitos T citotóxicos contra células infectadas con protozoos intracelulares, incluyendo, pero sin limitación, leishmania, kokzidioa, y tripanosoma.

El agente causante de la enfermedad de Lyme, la esproqueta Borrelia burgdorfei, también es de interés. Las proteínas de la superficie externa (Osp) A, B y C de B. burgdorfei son antígenos conocidos que son lipoproteínas que se asocian con las membranas. Los restos de cisteína amino-terminales en las proteínas Osp son los sitios de modificaciones de lípidos de triacilo que sirven como restos de anclaje a membrana. Las porciones N-terminales de las proteínas Osp están elevadamente conservados y son porciones preferidas para presentación en minicélulas inmunogénicas.

XIX.D. Patógenos eucariotas

Además de los patógenos intracelulares, existen otros patógenos eucariotas y también pueden tratarse usando minicélulas inmunogénicas usando antígenos presentados a partir de estas. Se ha usado una serie de antígenos para desarrollar vacunas anti-parasíticas, por ejemplo, la proteína recombinante 45w de Taenia ovis; proteínas de oncoesfera EG95 de Echinococcus granulosis; antígeno L de catepsina de trematodos hepáticos, Fasciola hepatica; y el antígeno H11 de Haemonchus contortus (Dalton y col., Parasite vaccines-a reality?, Vet Parasitol 98:149-167, 2001. Otros patógenos eucariotas incluyen, pero sin limitación:

protozoos, incluyendo, pero sin limitación, Entamoeba histolytica, una ameba patógena que causa la disentería amébica y en ocasiones digiere el camino a través de la pared intestinal para invadir otros órganos, lo que puede causar morbilidad; Balantinium coli, un ciliado que causa diarrea en seres humanos; Giardia lamblia, un flagelado que causa diarrea y dolor abdominal, junto con un síndrome de fatiga crónica que de otro modo es asintomático y difícil de diagnosticar; Trypanosoma brucei, un hemoflagelado que causa la enfermedad del sueño; y Trypanosoma cruzi, la causa de la enfermedad de Chagas); Los plasmodios, esporozoos parasíticos intracelulares obligados del hígado y de los glóbulos rojos, que incluyen, sin limitación, P. falciparum, el agente causante de la malaria. Se han identificado docenas de antígenos de P. falciparum, por ejemplo, CSP-1, STARP, SALSA, SSP-2, LSA-1, EXP-1, LSA-3, RAP-1, RAP-2, SERA-1, MSP-1, MSP-2, MSP-3, MSP-4, MSP-5, AMA-1, EBA-175, RESA, GLURP, EMP-1, Pfs25, Pfg27, Pf35, Pf55, Pfs230, Pfg27, Pfs16, Pfs28 y Pfs45/48. Helmintos, incluyendo Ascaris lumbricoides (áscaris); Enterobius vermicularis (lombriz intestinal); Trichuris trichiuria (triquina); y Fasciola hepatica (tremátodos hepáticos); Taenia sp. (tenias y cestodos); Schistosoma (trematodos), tales como Schistoma mansoni, que comprende el antígeno Sm32 (asparaginil endopeptidasa), que puede inducir la formación de anticuerpos en ratones (Chlichlia y col., DNA vaccination with asparaginyl endopeptidase (Sm32) from the parasite Schistosoma mansoni: anti-fecundity effect induced in mice, Vaccine 20:439-447, 2001); y acetilcolinesterasa (Arnon y col., Acetylcholinesterase of Schistoma mansoni-Functional correlates, Protein Science 8:2553-2561, 1999); y Pulgas y otros invertebrados, incluyendo, sin limitación, insectos, arácnidos, etc. Por ejemplo, se ha descrito una vacuna contra la pulga del ganado, Boophilus microplus (Valle y col., The evaluation of yeast derivatives as adjuvants for the immune response to the Bm86 antigen in cattle, BMC Biotechnol.1:2, 2001)

XIX.E. Formulación y administración de minicélulas inmunogénicas

Las formulaciones de vacunas de minicélulas inmunogénicas incluyen un vehículo adecuado. Debido a que las minicélulas pueden destruirse mediante digestión, o prevenirse su acción debido a la secreción de anticuerpos en el intestino, se administran preferentemente por vía parenteral, incluyendo, por ejemplo, administración que es subcutánea, intramuscular, intravenosa, o intradérmica. Las formulaciones que son adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones estériles acuosas y no acuosas para inyección que pueden contener antioxidantes, tampones, y solutos que hacen que la solución sea isotónica con el fluido corporal, preferentemente la sangre, del individuo; y suspensiones acuosas y no acuosas estériles que pueden incluir agentes de suspensión o agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en contenedores monodosis o multidosis, por ejemplo, ampollas y viales sellados y pueden almacenarse en estado criodesecado, lo que requiere únicamente la adición del vehículo líquido estéril inmediatamente antes de su uso. La formulación de vacuna también puede incluir sistemas adyuvantes para potenciar la inmunogenicidad de la formulación. Los adyuvantes son sustancias que pueden usarse para aumentar una respuesta inmune específica. Normalmente, el adyuvante y la composición se mezclan antes de la presentación al sistema inmune, o presentarse por separado, pero en el mismo sitio del animal que está siendo inmunizado. Los ejemplos de materiales adecuados para su uso en composiciones de vacunas se proporcionan en Osol, A., ed., Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co, Easton, Pa. (1980), págs. 1324-1341, cuya referencia se incorpora al presente documento en su totalidad por referencia.

Las composiciones que comprenden minicélulas inmunogénicas se inyectan a un ser humano o animal a una dosificación de 1-1000 ug por kg de peso corporal. Los títulos de anticuerpo contra factor de crecimiento se determinan mediante ELISA, usando la proteína recombinante e inmunoglobulinas de cabra anti-ser humano o animal conjugadas a peroxidasa de rábano picante u otras técnicas serológicas (por ejemplo, ELISA tipo sándwich). Se administran inyecciones de refuerzo según sea necesario para lograr los niveles deseados de anticuerpos protectores y/o linfocitos T.

Las rutas y la frecuencia de administración, así como la dosificación, variarán de un individuo a otro individuo. Pueden administrarse entre 1 y 10 dosis durante un periodo de 52 semanas. Preferentemente, se administran 6 dosis, a intervalos de 1 mes, y pueden administrarse vacunaciones de refuerzo posteriormente de manera periódica. Los protocolos alternativos pueden ser adecuados para pacientes individuales. En la inmunoterapia de trastornos hiperproliferativos, una dosis adecuada es una cantidad de un compuesto que, cuando se administra tal y como se describe anteriormente, es capaz de promover una respuesta inmunitaria anti-tumoral. Dicha respuesta puede controlarse midiendo los anticuerpos anti-tumor en un paciente o mediante generación dependiente de vacuna de células efectoras citolíticas capaces de eliminar las células tumorales del paciente in vitro. Dichas vacunas también deben ser capaces de causar una respuesta inmunitaria que de lugar a un resultado clínico mejorado (por ejemplo, remisiones más frecuentes, supervivencia sin enfermedad completa o parcial o más larga) en los pacientes vacunados en comparación con pacientes no vacunados.

La vacuna de acuerdo con la invención puede contener una sola especie de minicélulas inmunogénicas de acuerdo con la invención o una diversidad de minicélulas inmunogénicas, cada una de las cuales muestra un inmunógeno diferente. Además o como alternativa, las minicélulas inmunogénicas pueden cada una mostrar y/o expresar más de un inmunógeno.

El resumen de la invención descrita anteriormente no es limitante y otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de la invención, y a partir de las reivindicaciones.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es una transferencia de Western en la que las proteínas Edg-1-6xHis y Edg-3-6xHis se expresan en minicélulas producidas a partir de células MC-T7. La Figura 2 muestra la inducción de MalE(L)-NTR en minicélulas aisladas.

Ejemplos

Ejemplo 1: creación de una línea celular bacteriana productora de minicélulas (MC-T7) que expresa una arn polimerasa exógena

Para maximizar la cantidad de transcripción de ARN a partir de elementos episómicos en minicélulas, se creó una línea celular productora de minicélulas que expresa una ARN polimerasa específica para determinados elementos de expresión episómica. Esta cepa de E. coli, denominada MC-T7, se creó del modo siguiente.

La cepa P678-54 de E. coli contiene mutaciones que influencian la división celular e inducen la producción de minicélulas (Adler y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 57:321-326 (1967), Allen y col., Biochem. Biophys. Res. Communi. 47:1074-1079 (1972), Hollenberg y col., Gene 1:33-47 (1976)). La cepa P678-54 es resistente al fago Lambda debido a una mutación en el gen malT (Gottesman, Bacteriophage Lambda: The Untold Story. J. Mol. Biol. 293:177180,1999; Friedman, Interactions Between Bacteriophage Lambda and its Escherichia Coli Host. Curr. Opin. Genet. Dev. 2:727-738,1992). Por lo tanto, como etapa inicial, la cepa P678-54 se alteró para que fuese sensible al fago Lambda para poder formar lisógenos de Lambda-DE3 (véase más adelante). Las secuencias codificantes de MaIT de tipo silvestre se restauraron mediante un protocolo de conjugación HFR (recombinación de alta frecuencia) usando la cepa G43 de E. coli (CGSC cepa 4928).

Las cepas receptora (P678-54) y donante (G43:BW6169) se cultivaron durante toda la noche en 10 ml de medio LB (NaCl 10 g, 10 g de peptona 140 seleccionada, y 5 g de extracto de levadura en un litro de H2Odd). Las muestras se centrifugaron y después concentraron en aproximadamente 0,2 ml de medio LB. Las muestras concentradas se combinaron e incubaron con rotación lenta durante 30 minutos a 30 °C, y después se emplacaron en placas de LB agar que contenían estreptomicina (50 µg/ml) y tetraciclina (50 µg/ml). (La ampicilina, estreptomicina, tetraciclina, y todos los demás agentes químicos se compraron a Sigma Chemical (St. Louis, MO) a menos que se indique lo contrario). Las células receptoras eran resistentes a la estreptomicina y las células donantes eran resistentes a la tetraciclina; solo los conjugados, que contenían ambos genes de resistencia, fueron capaces de crecer en las placas de LB agar que contenían estreptomicina (50 µg/ml) y tetraciclina (50 µg/ml).

Se se exploró la sensibilidad de los conjugados putativos al fago lambda usando una técnica de estriado cruzado, en la que las colonias putativas se aplicaron en estriado cruzado sobre una placa de LB agarosa (estreptomicina, 50 µg/ml, y tetraciclina, 50 µg/ml) que habían sido estriadas con fago lambda vivo. Las colonias conjugadas estriadas se estriaron perpendiculares a la estría de fago lambda; si un conjugado era sensible a la infección por fago lambda entonces, tras el contacto con la estría de fago lambda, había lisis celular y por lo tanto menor o ningún crecimiento bacteriano. Por lo tanto, en el caso de los conjugados que eran sensibles al fago lambda, había un crecimiento bacteriano disminuido "hacia abajo de la estría" de la estría del fago.

Los conjugados de E. coli que se descubrió que eran sensibles a la infección por fago lambda se usaron entonces para crear lisógenos de lambda. La lisogenización es un proceso durante el cual el fago lambda incorpora su genoma, incluyendo los genes exógenos añadidos a este, en un sitio específico del cromosoma de su célula hospedadora de E. coli.

El gen DE3, que está presente en el genoma del fago lambda usado para crear lisógenos, codifica ARN polimerasa del bacteriófago T7. La lisogenización se llevó a cabo usando el kit de lisogenización DE3 (Novagen, Madison, WI) esencialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usó un fago de prueba dependiente de polimerasa T7 para confirmar la presencia y expresión del gen DE3 en el cromosoma bacteriano. El fago de prueba dependiente de T7 solo puede formar placas bacterianas conocidas en presencia de polimerasa T7. El fago usa un promotor de T7 para la expresión de sus genes esenciales. Por lo tanto, en un ensayo de formación de placa solo las células que expresan polimerasa T7 pueden lisarse por el fago de prueba y solo esas células permitirán la formación de placas. Tal como se describe en más detalle en el presente documento, los elementos de expresión episómica que se usan en las minicélulas pueden diseñarse de tal forma que la transcripción y traducción de un gen clonado se dirige por T7 ARN polimerasa utilizando secuencias de expresión específicas para la T7 ARN polimerasa.

Ejemplo 2: clonación de Edg-1 de rata en el vector de expresión pCAL-c

Materiales

La polimerasa Taq, los tampones de PCR, y los reactivos de PRC se compraron a través de Roche Molecular Biochemicals (Indianapolis, IN). Todas las enzimas de restricción se compraron a través de Gibco BRL (Grand Island, NY) y Stratagene (La Jolla, CA). Los kits QIAprep mini y maxi, los kits de purificación de PCR, los kits RNeasy miniprep, y el kit One Step RT-PCR se compraron a través de QIAGEN (Valencia, CA). El kit Geneclean se compró a través de BIO 101 (Carlsbad, CA). El IPTG (iso-propi-beta-D-tiogalactopiranósido), la T4 ADN ligasa, los componentes del medio LB y la agarosa se compraron a través de Gibco BRL. El vector de expresión de procariotas pCAL-c y las células competentes se compraron a través de Stratagene.

El vector de expresión pCAL-c tiene una estructura en la que puede unirse operativamente un ORF a un promotor de alto nivel (pero dependiente de T7 ARN polimerasa), secuencias que se unen al represor de Lac de E. coli, y el sitio de unión a ribosoma (RBS) del gen 10 de T7 fuerte. El represor de Lacl también está codificado por una forma expresada del vector pCAL-c. A medida que se une a sus secuencias de reconocimiento en el elemento de expresión de pCAL-c, el represor lac bloquea la transcripción a partir del promotor de T7. Cuando se añade un agente inductor, tal como IPTG, el represor lac se libera de sus sitios de unión y la transcripción tiene lugar a partir del promotor de T7, siempre que esté presente la T7 ARN polimerasa. Después de la inducción, la proteína clonada y expresada puede constituir la mayoría de las proteínas celulares nuevas expresadas debido a los procesos de transcripción y traducción eficaces del sistema.

Amplificación

La primera etapa en la clonación de Edg-1 de rata (rEDG-1) en un vector de expresión fue diseñar cebadores para la amplificación mediante la PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Los cebadores de la PCR se diseñaron usando la secuencia de Edg-1 de rata (Nakajima y col., Biophy, J. 78:319A, 2000) de tal modo que contenían sitios para Nhel (GCTAGC) o BamHI (GGATCC) en sus extremos cinco prima. El cebador cadena arriba tenía la secuencia de SEC ID Nº: 31. El cebador cadena abajo tres prima (SEC ID Nº: 32) también contenía un codon de terminación, ya que el vector pCAL-c contiene un "marcador" de proteína de unión a calmodulina (CBP) en su extremo caboxilo que no pretendía incorporarse al polipéptido de Edg-1 de rata en esta construcción de expresión. El cebador y los productos de la PCR resultantes se diseñaron de tal modo que el extremo cinco prima del ORF del Edg-1 de rata estaba en marco con el codon de inicio de metionina encontrado en el vector pCAL-c.

SECUENCIAS DE CEBADOR OLIGONUCLEOTÍDICO PARA CLONAR EN PCAL-C:

Cebadores de la construcción Edg1/pCAL-c:

Cebador cadena arriba (SEC ID Nº: 31)

Cebador cadena abajo (SEC ID Nº: 32)

Cebadores de la construcción de fusión Edg1/CBP:

Cebador cadena arriba (SEC ID Nº: 31)

Cebador cadena abajo (SEC ID Nº: 33)

Cebadores de la construcción Edg1/His6:

Cebador cadena arriba (SEC ID Nº: 31)

Cebador cadena abajo (SEC ID Nº: 34)

Cebadores de Edg3/rtPCR:

Cebador cadena arriba (SEC ID Nº: 35)

Cebador cadena abajo (SEC ID Nº: 36)

Cebadores de la construcción Edg3/pCAL-c:

Cebador cadena arriba (SEC ID Nº: 37)

Cebador cadena abajo (SEC ID Nº: 38)

10 Cebadores de la construcción Edg3/His6: Cebador cadena arriba (SEC ID Nº: 39)

Cebador cadena abajo (SEC ID Nº: 16)

Cebadores de la construcción GFP/pCAL-c:

Cebador cadena arriba (SEC ID Nº: 40)

Cebador cadena abajo (SEC ID Nº: 41)

Cebadores de la construcción GFP/CBP:

Cebador cadena arriba (SEC ID Nº: 42)

Cebador cadena abajo (SEC ID Nº: 43)

Notas:

5 Los sitios de restricción de endonucleasa están subrayados Los codones de terminación están doblemente subrayados

Los cebadores se usaron para amplificar el ORF de ADN de rEdg-1 usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El molde usado para la amplificación fue ARNm aislado de tejido muscular de rata usando el kit RNeasy Miniprep (Qiagen) y se llevó a cabo esencialmente de acuerdo con el protocolo del fabricante. Tanto la rtPCR como

10 las etapas de amplificación de la PCR se llevaron a cabo en una sola reacción usando el kit One Step RT-PCR (Qiagen). El fragmento de PCR de Edg-1 de rata resultante se purificó usando el kit PCR Purification (Qiagen). La secuencia de ADN de rEdg-1 bicatenario contenía el sitio de Nhel en el extremo 5 prima y el sitio de BamHI en el extremo 3 prima. Este fragmento amplificado de rEdg-1 se usó para clonación en el vector de expresión pCAL-c.

El vector de expresión pCAL-c contiene los sitios de restricción de NcoI, Nhel, y BamHI en su sitio de clonación

15 múltiple. Para insertar la secuencia codificante de rEdg-1 en el vector de expresión, el fragmento de PCR de rEdg-1 y el vector de expresión pCAL-c se digirieron con las enzimas de restricción Nhel y BamHI durante una hora a 37 °C. La mezcla de reacción para la etapa de digestión consistía en 1 µg de ADN, tampón de restricción 1x, y 1 µl de cada enzima. La mezcla de reacción se enrasó a un volumen final de 20 µl con H2Odd (dd, doblemente destilada). Después de 45 minutos, se añadió 1 µl de fosfatasa alcalina de intestino de ternero (CIAP) a la mezcla de reacción

20 de pCAL-c para eliminar los fosfatos terminales del plásmido de ADN digerido. Las reacciones se incubaron durante 15 minutos adicionales a 37 °C. Las muestras de ADN diferidas se hicieron correr en un gel de agarosa de TAE al 1 % (tampón de electroforesis Tris-acetato/EDTA) a 130 voltios durante 45 minutos. Las bandas se visualizaron con luz UV después de teñir el gel con bromuro de etidio.

Las bandas adecuadas se cortaron del gen para su purificación usando el kit Geneclean (BIO101). Los fragmentos

25 de ADN purificados se cuantificaron entonces en un gel de agarosa de TAE al 1 %. Para la reacción de ligamiento, se usaron proporciones de inserción a vector de 6:1 y 3:1. También se incluyó un control negativo que comprendía solo vector en las reacciones de ligamiento. Las mezclas de reacción contenían ADN de inserción y de vector, 4 µl de tampón de ligasa, y 2 µl de ligasa. La reacción se enrasó a un volumen final de 20 µl con H2Odd. El ligamiento se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 2 horas. Se usaron diez (10) µl de la reacción de ligamiento para las

30 etapas posteriores de transformación.

El ADN ligado se intodujo en células competentes de Epicurian Coli XL1-Blue usando la técnica de transformación de choque por calor del modo siguiente. La mezcla de ligamiento se añadió a 100 µl de células competentes, se emplacaron sobre hielo, y se incubaron durante aproximadamente 30 minutos. Después se sometió a las células a choque térmico a 37°C durante 1 minuto y se pusieron de nuevo sobre hielo durante 2 minutos. Después del choque 35 térmico, se añadieron 950 µl de medio LB a temperatura ambiente a las células y se agitaron las células a 37°C durante 1 hora. Después de 1 hora de agitación, se precipitaron las células a 12000 rpm en una microcentrífuga Eppendorf 5417C. El sobrenadante se vertió cuidadosamente de tal forma que quedaron aproximadamente 200 µl. Entonces se resuspendieron las células en el medio LB restante y se dispersaron en placas de LB agarosa de 100 x 15 mm que contenían ampicilina 50 µg/ml. Las placas se incubaron durante toda la noche a 37°C. Al día siguiente se 40 contaron las colonias, y se determinó la proporción de colonias entre el control negativo y las muestras ligadas. Se usó una proporción alta del número de colonias cuando la mezcla de ligamiento para transformar células, contrastada con el número de colonias de control negativo que indicaron que la clonación fue satisfactoria. Las colonias transformadas se identificaron, aislaron, y crecieron durante toda la noche en medio LB en presencia de ampicilina. Se exploró la presencia de construcción de expresión Edg-1-pCAL-c en las poblaciones bacterianas

45 resultantes.

El ADN de plásmido se aisló de las células usando el kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen). Las construcciones de Edg-1-pCAL-c aisladas se exploraron usando la enzima de restricción Apal, que digiere a la construcción Edg-1pCAL-c en dos sitios diferentes: uno en la secuencia codificante de Edg-1 y otro en el vector pCAL-c en sí. Las preparaciones de plásmido se digirieron con Apal, se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa de TAE al 1% y se visualizaron usando luz UV y tinción de bromuro de etidio. Los tamaños predichos de los fragmentos de ADN expresados fueron 2065 pb y 4913 pb. Tal como se muestra en la Figura 3, las bandas del tamaño predicho estaban presentes en el gel. La construcción Edg-1-pCAL-c completa se secuenció para confirmar su estructura. Esta construcción de expresión, un derivado de pCAL-c que contiene el ORF de Edg-1 de rata unido operativamente a un promotor de T7 y a sitios de unión de represión de lac, se denomina en el presente documento "prEDG-1".

Ejemplo 3: construcción de proteína de fusión Edg.1.CBP de rata

Para detectar la expresión proteica de Edg-1 de rata, se clonaron las secuencias codificantes de rEdg-1 en el vector pCAL-c en marco con un marcador de fusión CBP. La estrategia de clonación para la construcción de rEdg-1-CBP se llevó a cabo esencialmente como se ha descrito para la construcción Edg-1-pCAL-c con las siguientes diferencias. Los cebadores de la PCR (las SEC ID Nº: 3 y 5) fueron como se desciben para la clonación de Edg-1-pCAL-c a excepción de la omisión del codon de terminación en el cebador cadena abajo (SEC ID Nº: 33). La retirada del codon de terminación es necesaria para la construcción de la proteína de fusión Edg-1-CBP. El vector pCAL-c se diseña de tal forma que, cuando se usa el sitio de BamHI para clonación insercional, y no está presente un codon de terminación en un ORF insertado en el vector de expresión pCAL-c, el ORF clonado estará en marco con el marcador de fusión CBP. Debido a que el cebador cadena abajo tres prima no contenía un codon de terminación, pudo clonarse un marcador de fusión de CBP en marco con el ORF de Edg-1. Otras etapas de clonación se llevaron a cabo esencialmente como se describe anteriormente. El plásmido resultante, un derivado de pCAL-c que comprende un ORF que codifica una proteína de fusión Edg-1-CBP de rata unida operativamente a un promotor de T7 y a sitios de unión de represor de lac, se denomina en el presente documento "prEDG-1-CBP".

Ejemplo 4: clonación de un Edg-1 de rata marcado con His en el vector de expresión pCAL-c

Se manipuló la proteína rEdg-1 para generar una proteína de fusión que tuviese un marcador 6xHis en su extremo carboxilo. Un "marcador 6xHis" o "marcador His" es una secuencia de aminoácidos que consiste en seis restos de histidina contigos que pueden usarse como epítopo para la unión de anticuerpos anti-6xHis, o como ligando para la unión de átomos de níquel. La proteína de fusión rEdg-1 marcada con His se usa para detectar la expresión de la proteína rEdg-1 en el ambiente del sistema de expresión de minicélulas.

La construcción rEdg-1-6xHis se clonó usando la estrategia descrita anteriormente para la construcción de la construcción de expresión rEdg-1-pCAL-c (prEDG-1), teniendo el cebador cadena arriba la secuencia de SEC ID Nº: 3, pero con la salvedad de que el cebador cadena abajo tres prima (SEC ID Nº: 34) se diseñó para que contuviese seis codones de histidina seguidos de un codon de terminación. El marcador 6xHis de 18 pares de bases se incorporó en el extremo carboxilo de la proteína Edg-1 expresada a partir del vector pCAL-c. Los procedimientos posteriores de clonación (PCR, digestión de restricción, purificación en gel, ligamiento, transformación, etc.) se llevaron a cabo tal como se ha descrito anteriormente para la construcción Edg-1-pCAL-c (prEDG-1). El plásmido resultante, un derivado de pCAL-c que comprende un ORF que codifica una proteína de fusión Edg-1-CBP de rata marcada con His en el carboxilo terminal unida operativamente a un promotor de T7 y a sitios de unión de represor de lac, se denomina en el presente documento "prEDG-1-6xHis".

Ejemplo 5: amplificación y clonación de secuencias de Edg-3 de rata

La secuencia codificante completa de Edg-3 se amplificó mediante PCR a partir de ARNm de músculo esquelético de rata usando cebadores (las SEC ID Nº: 35 y 36) diseñados a partir de la secuencia de ratón conocida (Referencia de Genbank NM_010101). El ARNm usado como molde para la reacción de amplificación se aisló usando el kit RNeasy Miniprep (Qiagen). Tanto la rtPCR como las etapas de amplificación de la PCR se llevaron a cabo en una sola reacción usando el kit One Step RT-PCR (Qiagen). Los productos de PCR de rEdg-3 se visualizaron con UV después de la electroforesis en gel de agarosa de TAE al 1% y tinción de bromuro de etidio.

El tamaño predicho de los productos de PCR amplificados es de 1145 pares de bases. Se aisló una banda de ADN del tamaño adecuado del gen del TAE y se purificó usando el kit Geneclean (BIO101). La banda purificada se ligó al vector pCR3.1 usando el kit TA-cloning (Invitrogen). Las otras etapas de clonación se llevaron a cabo tal como se describe para la clonación de la construcción rEdg-1-pCAL-c (prEDG-1) con la excepción de que las muestras se exploraron usando la enzima de restricción EcoRI. Los tamaños esperados de las bandas digeridas fueron 1145 pares de bases y 5060 pares de bases. Los clones positivos se analizaron mediante secuenciación automática. Las secuencias nucleotídicas se analizaron usando búsquedas BLAST a través de la página web del NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/). La secuencia de aminoácidos de Edg-3 de rata de longitud completa predicha se ensambló a partir de los datos de secuenciación de nucleótidos usando traducción por ordenador. El vector pCR3.1 que comprendía el ORF de Edg-3 de rata se denomina en el presente documento "pCR-rEDG-3".

Ejemplo 6: clonación de secuencias codificantes de Edg-3 de rata en el vector de expresión pCAL-c

Para expresarlo en el sistema de expresión en minicélulas, el ORF de Edg-3 de rata se clonó en el vector de expresión pCAL-c. La estrategia de clonación usada fue como se ha descrito anteriormente para la clonación del gen Edg-1 de rata en el vector pCAL-c con las siguientes excepciones. Los cebadores usados para la amplificación PCR se diseñaron a partir de la secuencia de Edg-3 de rata y contenían sitios para las enzimas de restricción Nhel y Kpnl (GGTACC). El sitio de Nhel se añadió al cebador cadena arriba cinco prima (SEC ID Nº: 37) y el sitio de Kpnl se añadió al cebador cadena abajo tres prima; (SEC ID Nº: 38). Se usaron las enzimas de restricción Nhel y Kpnl para la reacción de digestión. La mezcla de reacción para la etapa de digestión consistía en 1 µg de ADN, tampón de restricción 1x (proporcionado con la enzima), y 1 µl de cada enzima. Las preparaciones de plásmido se exploraron mediante digestión con NheI y Kpnl. El ADN de plásmido digerido se sometió a electroforesis en un gel de agarosa de TAE y se visualizó mediante UV después de la tinción con bromuro de etidio. Se predijo que los tamaños de banda resultantes serían 1145 pares de bases y 5782 pares de bases. Los clones de plásmido positivos se analizaron con secuenciación automática. El plásmido resultante, un derivado de pCAL-c que comprende un ORF que codifica una proteína Edg-3 de rata unida operativamente a un promotor de T7 y a sitios de unión de represor de lac, se denomina en el presente documento "pEDG-3".

Ejemplo 7: clonación de un Edg-3 de rata marcado con his en el vector de expresión pCAL-c

Para detectar la expresión de la proteína Edg-3 de rata en el sistema de expresión en minicélulas, se manipuló la secuencia codificante de Edg-3 de rata para que contuviese un marcador 6xHis en el extremo carboxilo de la proteína. La estrategia de clonación usada para crear esta construcción fue esencialmente la misma a la descrita anteriormente para la clonación de la construcción rEdg-3-pCAL-c (prEDG-3), teniendo el cebador cadena arriba la secuencia de SEC ID Nº: 37, con la salvedad de que el cebador cadena abajo tres prima (SEC ID Nº: 18) se diseñó para que contuviese una secuencia codificante de 6xHis seguida de un codon de terminación, lo que permitió la incorporación de la secuencia de aminoácidos 6xHis en el extremo carboxilo de la proteína receptora Edg-3. Las otras etapas de clonación y exploración se llevaron a cabo tal como se ha descrito anteriormente. El plásmido resultante, un derivado de pCAL-c que comprende un ORF que codifica una proteína de fusión Edg-3 de rata marcada con His en el carboxilo terminal unida operativamente a un promotor de T7 y a sitios de unión de represor de lac, se denomina en el presente documento "prEDG-3-6xHis".

Ejemplo 8: clonación de GFP en una construcción de expresión pCAL-c

La clonación de secuencias nucleotídicas que codifican GFP en el vector pCAL-c se llevó a cabo para producir una construcción de expresión que tuviese un gen indicador que se pudiese usar para detectar expresión de proteínas (GFP, proteína fluorescente verde). La estrategia de clonación empleada fue esencialmente la misma que la estrategia de clonación descrita anteriormente con las siguientes excepciones. El molde usado para la amplificación PCR fue la "construcción" de plásmido peGFP (construcción de GFP comercializada por ClonTech). Los cebadores usados para la amplificación se diseñaron a partir de la secuencia codificante de GFP y contenían sitios para las enzimas de restricción Ncol y BamHI. El sitio de Ncol se añadió al cebador cadena arriba cinco prima (SEC ID Nº: 40) y el sitio de BamHI se añadió al cebador cadena abajo tres prima; (véase la SEC ID Nº: 41). Se usaron las enzimas de restricción Ncol y BamHI para la reacción de digestión. La mezcla de reacción para la etapa de digestión consistía en 1 µg de ADN, tampón de restricción 1x (proporcionado con la enzima), y 1 µl de cada enzima. La exploración de las preparaciones de plásmido se llevó a cabo usando Ncol y BamHI. Las preparaciones de plásmido digeridas se sometieron a electroforesis y se visualizaron en gel de agarosa de TAE con UV después de la tinción con bromuro de etidio. Se observaron productos de restricción que tenían los tamaños de 797 y 5782 pares de bases predichos. Los clones de plásmido positivos se secuenciaron usando un secuenciador automático. El plásmido resultante, un derivado de pCAL-c que comprende un ORF que codifica una proteína de fusión rEdg-3-GFP unida operativamente a un promotor de T7 y a sitios de unión de represor de lac, se denomina en el presente documento "prEDG-3-GFP".

Ejemplo 9: diseño de construcción de elementos de control de la expresión

Se propusieron elementos de control de la expresión usados para detectar y cuantificar la expresión de proteínas en minicélulas. Estos controles dirigen la expresión de proteínas detectables. Un elemento de expresión usado como control positivo es pPTC12, que se suministra con el vector de expresión pCAL-c de Stratagene. Esta construcción contiene un ORF que codifica una proteína de fusión que comprende beta-galactosidasa unida a CBP. La inducción de la expresión de pTC12 debe dar como resultado la producción de una proteína de aproximadamente 120 kD, y esta proteína se detecta a través de su actividad enzimática o usando anticuerpos dirigidos a epítopos en la betagalactosidasa o en el polipéptido de CBP.

Se creó una construcción de fusión de GFP y se usó como control positivo para el kit de detección de CBP. Esta construcción fue un control positivo para la inducción de la expresión de proteínas en el sistema de expresión de minicélulas. La estrategia de clonación usada para crear la construcción fue esencialmente la misma que aquella usada para la clonación de la GFP en el vector de expresión pCAL-c, con la excepción de que el cebador cadena abajo tres prima no contenía un codon de terminación; esto permitió la incorporación en marco del marcador de fusión CBP en la proteína GFP. El cebador cadena arriba tenía la secuencia de SEC ID Nº: 42, y el cebador cadena abajo tenía la ssecuencia de SEC ID Nº: 43. La secuencia nucleotídica del elemento de expresión se confirmó usando un secuenciador automático. El plásmido resultante, un derivado de pCAL-c que comprende un ORF que codifica una GFP unida operativamente a un promotor de T7 y a sitios de unión de represor de lac, se denomina en el presente documento "pGFP-CBP".

Ejemplo 10: introducción de construcciones de expresión de pCAL-c en la cepa MC-T7 de escherichia coli

La cepa MC-T7 de E. coli se hizo competente usando la técnica de CaCl2. En resumen, las células se crecieron en 40 ml de medio LB hasta una DO600 de 0,6 a 0,8, y después se centrifugaron a 8000 rpm (7.700 g) durante 5 min a 4 °C. El precipitado se resuspendió en 20 ml de CaCl2 frío y se dejó sobre hielo durante cinco minutos. Entonces se centrifugaron las células a 8000 rpm (7.700 g) durante 5 min a 4 °C. El precipitado de células se resuspendió en 1 ml de CaCl2 frío y se incubó sobre hielo durante 30 min. Después de esta incubación se añadió 1 ml de glicerol al 25 % a las células y se distribuyeron y congelaron en alícuotas de 200 µl. Se usó nitrógeno líquido para congelar las células. Estas células se usaron posteriormente para la transformación de construcciones de expresión.

Ejemplo 11: preparación de minicélulas

Hasta cierto punto, la preparación de minicélulas varía de acuerdo con el tipo de estrategia de expresión que se emplea. En general, hay dos de dichas estrategias, aunque cabe destacar desde el principio que estas estrategias no son ni limitantes ni mutuamente excluyentes. Una estrategia está diseñada para aislar minicélulas que ya contienen una proteína terapéutica expresada o ácido nucleico. Otra estrategia está diseñada para aislar minicélulas que expresarán la proteína o el ácido nucleico en la minicélula después de aislarlas.

Se inoculan E. coli en medio de crecimiento bacteriano (por ejemplo, caldo Luria) y se dejan crecer durante toda la noche. Después de esto, el protocolo general varía dependiendo de los procedimientos de inducción de la expresión. Los cultivos productores de minicélulas usados para expresar proteína después del aislamiento se diluyen y crecen hasta la DO600 o DO450 deseada, típicamente en la fase de crecimiento logarítmico de cultivos bacterianos. Entonces se inducen los cultivos con IPTG y después se aislan. La concentración y exposición a IPTG dependía de la construcción que se estuviese usando, pero normalmente era de 500 µM final durante un corto periodo de tiempo, típicamente aproximadamente 4 horas. Este tratamiento da como resultado la producción de la T7 polimerasa, que se encuentra bajo el control del promotor LacUVR5, que se reprime mediante la proteían represora LacI. IPTG libera la represión de LacI y por lo tanto induce la expresión a partir del promotor LacUVR5 que controla la expresión de la T7 polimerasa del cromosoma. Este promotor es "permeable", es decir, siempre hay un nivel basal de T7 polimerasa que puede seleccionarse a favor o en contra de tal modo que no sea necesaria la inducción antes del aislamiento. (Esta etapa de inducción no es necesaria si se usa un sistema de expresión no de T7, ya que la razón de esta etapa es expresar la T7 ARN polimerasa en las células productoras de minicélulas de tal forma que la polimerasa y las moléculas se segregan con la minicélula).

Los cultivos de E. coli que producen minicélulas que contienen una proteína o ácido nucleico terapéutico tienen protocolos de inducción diferentes. Los cultivos de toda la noche se diluyen como se ha descrito anteriormente; sin embargo, en el caso de proteínas que no son tóxicas para las células progenitoras, el medio usado para la dilución en esta ocasión ya contiene IPTG. Entonces se crecen los cultivos hasta crecimiento semilogarítmico y se aislan las minicélulas. Estos cultivos producen la proteína o el ácido nucleico terapéutico a medida que crecen, y las minicélulas derivadas de estos contienen la proteína o ácido nucleico terapéutico.

Como alternativa o adicionalmente, se añade IPTG y se induce la expresión después del aislamiento de las minicélulas. En el caso de proteínas o ácidos nucleicos no tóxicos que se expresan a partir de elementos de expresión en minicélulas, este tratamiento potencia la producción del producto génico codificado episómicamente. En el caso de productos génicos tóxicos, se prefiere la inducción después del aislamiento.

Ejemplo 12: aislamiento de minicélulas

Las minicélulas se aislaron a partir de la cepa MC-T7 de E. coli productora de minicélulas usando técnicas de centrifugación. El protocolo que se usó es esencialmente aquel de Jannatipour y col. (Translocation of Vibrio Harveyi N,N’-Diacetylchitobiase to the Outer Membrane of Escherichia Coli, J. Bacteriol.169: 3785-3791,1987) y Matsumura y col. (Synthesis of Mot and Che Products of Escherichia coli Programmed by Hybrid ColEI Plasmids in Minicells, J. Bacteriol. 132:996-1002, 1977).

En resumen, se crecieron las células MC-T7 durante toda la noche a 37 °C en de 2 a 3 ml de medio LB que contenía ampicilina (50 µg/ml), estreptomicina (50 µg/ml), y tetraciclina (50 µg/ml) (la ampicilina solo se usó cuando se crecieron células MC-T7 que contenían una construcción de expresión de pCAL-c). Las células se diluyeron a 1:100 en un volumen total de 100 a 200 ml de medio LB con antibióticos, y se crecieron a 37 °C hasta que alcanzaron una DO600 de 0,4 a 0,6, que es prácticamente el comienzo de la fase de crecimiento logarítmico prara la E. coli de MC-T7. Durante esta incubación, se exploró la presencia de la construcción de expresión correcta en el resto del cultivo de toda la noche usando las técnicas descritas anteriormente. Cuando los cultivos alcanzaron la DO600 adeucada se transfirieron a botellas de centrifugación GS3 de 250 ml y se centrifugaron (centrifugadora Beckman) a 4500 rpm

(3.500 g) durante 5 min. En este momento, el sobrenadante contiene principalmente minicélulas, aunque puede haber algunas células completas relativamente pequeñas.

El sobrenadante se transfirió a una botella de centrifugación GS3 de 250 ml limpia y se centrifugó a 8000 rpm

(11.300 g) durante 10 min. El precipitado se resuspendió en 2 ml de BSG 1x (BSG 10x: NaCl 85 g, KH2PO4 3 g, Na2HPO4 6 g y gelatina 1 g en 1 l de H2Odd) y se vertió sobre un gradiente de sacarosa del 5 al 20 % continuo de 32 ml. El gradiente de sacarosa se elaboró con sacarosa disuelta en BSG 1x.

Entonces se cargó el gradiente de sacarosa en un rotor Beckman SW24 y se centrifugó en una ultracentrifugadora Beckman a 4500 rpm (9.000 g) durante 14 min. Después de la ultracentrifugación solo estaba presente una banda difusa de minicélulas. Se aspiraron los dos tercios superiores de esta banda usando una pipeta de 10 ml y se transfirieron a un tubo Oakridge de 30 ml que contenía 10 ml de BSG 1x. Entonces se centrifugó la muestra a 13.000

5 rpm (20.400 g) durante 8 min. Después de la centrifugación, se resuspendió el precipitado en 2 ml de BSG 1x, y las células resuspendidas se cargaron en otro gradiente de sacarosa del 5 al 20 %. Este gradiente de sacarosa se centrifugó y las minicélulas se recogieron como se describió anteriormente. El procedimiento del gradiente de sacarosa se repitió un total de tres veces.

Después de la última etapa del gradiente de sacarosa se recogió la banda de minicélulas completa del gradiente de

10 sacarosa y se añadieron a un tubo Oakridge de 30 ml que contenía 10 ml de tampón MMM (200 ml, sales M9 1x, 2 ml de glucosa al 20 %, y 2,4 ml de medio de ensayo de metionina DIFCO). Esta solución de minicélulas se centrifugó a 13.000 rpm (20.400 g) durante 8 min. El precipitado se resuspendió en 1 ml de tampón MMM.

La concentración de minicélulas se determinó usando un espectrofotómetro. La DO450 se obtuvo leyendo una muestra de minicélulas que se había diluido a 1:100.

15 Ejemplo 13: otros procedimientos para preparar y aislar minicélulas

A modo de ejemplo no limitante, la inducción de células progenitoras de E. coli para formar minicélulas puede suceder mediante la sobreexpresión del gen ftsZ de E. coli. Para lograr esto se crearon construcciones de expresión basadas en plásmido y cromosómicas que ponen al gen ftsZ bajo el control de varios elementos reguladores (Tabla 4).

20 Tabla 4. Construcciones reguladoras que controlan la expresión de ftsZ.

Región reguladora

Inductor [Inductor] SEC ID Nº:

Para::ftsZ

Arabinosa 10 mM 1, 3

Prha::ftsZ

Ramnosa 1 mM 2, 4

Ptac::ftsZ

IPTG 30 µM 5, Garrido y col.a

a. Garrido, T. y col. 1993. Transcription of ftsZ oscillates during the cell cycle of Escherichia coli.

Los nombres de los oligonucleótidos y las reacciones de la PCR usan el siguiente formato:

•

"gen-1" es N-terminal, oligo de homología al 100 % para amplificación cromosómica o de ADNc

•

"gen-2" es C-terminal, oligo de homología al 100 % para amplificación cromosómica o de ADNc

25 • "sitio de gen-1-RE" es la misma secuencia que el gen-1 con restos adicionales para el resto de la secuencia, sitios de RE, y/o fusiones quiméricas.

• "sitio de gen-2-RE" es la misma secuencia que el gen-1 con restos adicionales para el resto de la secuencia, sitios de RE, y/o fusiones quiméricas.

Se usa la combinación "gen-1,2" para amplificación cromosómica/de ADNc y "sitio de gen-1 RE, sitio de gen-2-RE" 30 para amplificar la secuencia madura del producto purificado en gel de "gen-1,2".

Tabla 5: secuencias de cebadores oligonucleotídicos para las construcciones de la tabla 6

SEC ID Nº:

Nombre del cebador secuencia de 5' a 3'

44

FtsZ-1

45

FtsZ-2

46

FtsZ-1-PstI

47

FtsZ-2-XbaI

Las secuencias de oligoucleótidos de la Tabla 5 son para su uso en la clonación de ftsZ en las SEC ID Nº: 1 y 2 (inserciones de ftsZ detrás del promotor de arabinosa (SEC ID Nº: 1) y del promotor de ramnosa (SEC ID Nº: 2).

Tabla 6: secuencias de cebadores oligonucleotídicos para la duplicación cromosómica de ftsZconstrucciones

SEC ID Nº:

Nombre del cebador secuencia de 5' a 3'

48

Kan-1

49

Kan-2

50

Kan-1-X-frt

51

Kan-2-intD-frt

52

AraC-1

53

RhaR-1

54

Laclq-1

55

Ara-1-intD

56

RhaR-1-intD

57

Laclq-1-intD

58

FtsZ-1-X

De igual modo, se amplificó el gen ftsZ a partir de las SEC ID Nº: 1, 2 y del plásmido Ptac::ftsZ (Garrido, T. y col. 1993. Transcription of ftsZ oscillates during the cell cycle of Escherichia coli. EMBO J. 12:3957-3965) y construcciones cromosómicas, respectivamente, usando los siguientes oligonucleótidos:

5 Para la amplificación de araC mediante ftsZ de SEC ID Nº: 1 se usan los oligonucleótidos: AraC-1 FtsZ-2

Para la amplificación de rhaR mediante ftsZ de SEC ID Nº: 2 se usan los oligonucleótidos: RhaR-1 10 FtsZ-2

Para la amplificación de laclq mediante ftsZ de Ptac::ftsZ (Garrido, T., y col.) se usan los oligonucleótidos: laclq-1 ftsZ-2

Las regiones de ADN anteriormente amplificadas se purificaron en gel y se usaron como molde para la segunda

15 ronda de PCR usando oligonucleótidos que contenían homología con el gen cromosómico intD de E. coli y en el otro extremo con una secuencia al azar denominada "X". Los oligonucleótidos usados en esta ronda de PCR se muestran a continuación:

Para la amplificación de araC mediante ftsZ a partir de la SEC ID Nº: 1 para que contuviese homología con intD y la X al azar se usan los oligonucleótidos: 20 AraC-1-intD FtsZ-1-X

Para la amplificación de rhaR mediante ftsZ a partir de la SEC ID Nº: 2 para que contuviese homología con intD y la X al azar se usan los oligonucleótidos: RhaR-1-intD FtsZ-1-X 5 Para la amplificación de laclq mediante ftsZ a partir de Ptac::ftsZ para que contenga homología con intD y la X al azar se usan los oligonucleótidos: Laclq-1-intD FtsZ-1-X Los productos de la PCR a partir de estas reacciones PCR se muestran a continuación: 10 intD -araC -promotor de Ara -ftsZ -"X" intD -rhaRS -promotor de Rha -ftsZ -"X"

intD -laclq -promotor de Ptac -ftsZ -"X" Para amplificar los complejos maduros, se mezclaron las siguientes regiones y se amplificaron con los cebadores de secuencia oligonucleotídica emparejada:

15 SEC ID Nº: 3 se produjo usando:

SEC ID Nº: 4 se produjo usando:

SEC ID Nº: 5 se produjo usando:

Estas construcciones de expresión pueden expresarse a partir del plásmido, puesto en una sola copia, sustituyendo a la copia de ftsZ nativa en el cromosoma de E. coli (Garrido, T., y col., 1993. Transcription of ftsZ oscillates during the cell cycle of Escherichia coli. EMBO J. 12:3957-3965), o en copia duplicada manteniendo la copia de ftsZ nativa a la vez que se inserta una de las construcciones de expresión de la Tabla 4 en el gen intD en el mismo cromosoma. 25 Las duplicaciones cromosómicas se construyeron usando el sistema de recombinasa RED (Katsenko, K. A., y B. L. Wanner. One-Step Inactivation of Chromosomal Genes in Escherichia coli K-12 Using PCR Products. Proc. Natl. Acad. Sci. 97:6640-6645. 2000) y se muestran en las SEC ID Nº: 3-5. Las últimas construcciones permiten la replicación nativa durante las condiciones de no producción de minicélulas, evitando de este modo la presión selectiva durante la construcción y mantenimiento de la cepa. Además, estas cepas proporcionan puntos definidos 30 de inducción de minicélulas que mejoran la purificación de minicélulas a la vez que se crean condiciones que

permiten la manipulación de la cepa antes de, durante, y después de la producción de minicélulas. A modo de ejemplo no limitante, estas manipulaciones pueden ser producción de proteínas, estado redox citoplásmico, modificación del número de copias de plásmido, y/o producción de proteínas chaperonas.

Para la producción de minicélulas, se crece durante toda la noche una cepa productora de minicélulas descrita en la sección anterior en caldo Luria (LB) suplementado con dextrosa al 0,1 %, 100 µg/ml de ampicilina, y cuando se usa la construcción de ftsZ de una sola copia, 15 µM de IPTG. Todas las incubaciones se llevaron a cabo a 37 °C. Para la inducción únicamente de minicélulas, las cepas de toda una noche se subcultivan a 1/1000 en el mismo medio. Si se va a emparejar la inducción de minicélulas con la coexpresión de otras proteínas que están controladas por un regulador sensible a la represión de catabolitos, se excluye la dextrosa. La inducción de minicélulas es sensible al aireamiento y a las fuerzas mecánicas. Por lo tanto, el tamaño del matraz, el volumen de medio y la velocidad de agitación son críticos para obtener rendimientos óptimos. Igualmente, las condiciones del biorreactor tienen que regularse de manera adecuada para optimizar estas condiciones de producción.

En los cultivos de matraz de agitación, las cepas se crecen hasta la fase exponencial (logarítmica) temprana controlado mediante densidad óptica (DO)a 600 nm (DO600 de 0,05-0,20). (Las condiciones de biorreactor pueden diferir significativamente dependiendo de la aplicación y rendimiento deseados). Solo para la inducción de minicélulas, los cultivos en fase logarítmica temprana se inducen con la concentración de inductor adecuada mostrada en la Tabla 4. Para la expresión conjunta acoplada, estos cultivos se inducen tal como se muestra en la Tabla 4 para el regulador de minicélulas adecuado, mientras que las proteínas emparejadas se inducen con el inductor adecuado para el regulador que controla la síntesis de esa proteína. Los cultivos se crecen en las condiciones adecuadas y se recogen durante la etapa logarítmica tardía (DO600 de 0,8-1,2). Dependiendo de la aplicación, los cultivos inducidos por minicélulas pueden enfriarse inmediatamente sobre hielo antes de la purificación, o mantenerse a temperatura ambiente durante el proceso de recogida.

Para separar las minicélulas de las células progenitoras viables, los cultivos se someten a centrifugación diferencial (Voros, J., y R. N. Goodman. 1965. Filamentous forms of Erwinia amylovora. Phytopathol. 55:876-879). Brevemente, los cultivos se centrifugan a 4.500 rpm en un rotor GSA durante 5 min. Los sobrenadantes se retiran a una botella nueva y se centrifugan a 8.000 rpm durante 10 min adicionales para precipitar las minicélulas. Las minicélulas precipitadas (que contienen células progenitoras contaminantes) se resuspenden en 2 ml de LB, LBD (LB suplementado con dextrosa al 0,1 %), Min (medio de sal M63 mínimo) (Roozen, K. J., y col., 1971. Synthesis of ribonucleic acid and protein in plasmid-containing minicells of Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 107:21-23), suplementado con casaminiácidos al 0,5%) o MDT (medio de sal M63 mínimo, suplementado con casaminoácidos al 0,5%, dextrosa al 0,1%, y tiamina). Las células resuspendidas se separan a continuación usando gradientes de densidad lineal. A modo de ejemplo no limitante, estos gradientes pueden contener sacarosa (Cohen A., y col., 1968. The properties of DNA transferred to minicells during conjugation. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 33:635-641), ficol, o glicerol. Por ejemplo, los gradientes lineales de sacarosa están en el intervalo del 5-20 %y se vierten en LB, LBD, MDT menor. Usando un rotor de cubeta alterna SW28, los gradientes se centrifugan a 4.500 rpm durante 14 min. Se retiran las bandas de minicélulas, se mezclan con LB, LBD, MDT menor, y usando un rotor JA-20 se centrifugan a 13.000 rpm durante 12 min. Después de la centrifugación, los precipitados se resuspenden en 2 ml de LB, LBD , MDT menor y se someten a un segundo gradiente de densidad. Después de la segunda separación por densidad, las bandas de minicélulas se retiran del gradiente, se precipitan del modo descrito, y se resuspenden en LB, LBD , MDT menor para su uso y/o almacenamiento.

Las minicélulas purificadas se cuantifican usando una medida de DO600 en comparación con una curva patrón que incorpora la cantidad de LPS, el tamaño de minicélulas, y el volumen de minicélulas. Las mezclas de minicélulas cuantificadas se analizan para células progenitoras viables contaminantes mediante siembra en el medio de crecimiento adecuado (Tabla 7).

Tabla 7: purificación de minicélulas y cuantificación de células progenitoras

Purificación

Células totales Células progenitoras totales Proporción MC / PC Veces de purificación

Antes

4,76 X 1011 3,14 X 1011 0,25/1 -

Después

1,49 X 1011 6,01 X 104 2,48 X 106/1 5,23 X 106

Ejemplo 14: inducción de la expresión dependiente de T7

La expresión a partir del vector pCAL-c se dirige a partir de un promotor de T7 de bacteriófago que está representado por el producto génico de Lacl. La transcripción del ADN en ARNm, y la posterior traducción del ARNm en proteínas, no sucede en tanto que el represor de Lacl esté unido al promotor de T7. Sin embargo, en presencia de IPTG, el represor de Lacl no se une al promotor de T7. Por lo tanto, la inducción de la expresión a partir de secuencias de pCAL-c es dependiente de la presencia de IPTG. Se usaron protocolos ligeramente diferentes para la inducción Escherichia coli completas y para la inducción de minicélulas. También están presentes ligeras diferencias en los protocolos para la inducción de minicélulas para el marcado de proteínas con 35S-metionina a diferencia de aquellos para la inducción de minicélulas para análisis de transferencia de Western. Estos protocolos de inducción se describen a continuación.

Para la expresión en células completas de E. coli, primero se crecieron las células durante toda la noche en 3 ml de LB y antibióticos. Se exploró la presencia en los cultivos del elemento de expresión deseado tal como se ha descrito anteriormente. Los cultivos que contenían los elementos de expresión deseados se diluyeron a 1:100 y se crecieron hasta una DO600 de entre 0,4 a 0,6. El tamaño del cultivo varió dependiendo del uso previsto de las células. Entonces se añadió IPTG a una concentración final de 200 µg/ml, y las células se agitaron a 30 °C durante 4 horas. Después de la inducción, las células se recogieron para su análisis.

La inducción de las minicélulas se llevó a cabo del modo siguiente. Las minicélulas se diluyeron en tampón MMM a un volumen total de 1 ml de acuerdo con la concentración obtenida a partir del procedimiento de aislamiento (DO450 de aproximadamente 0,5). Entonces se trataron las células con 50 µg/ml de cicloserina durante 30 minutos a 37 °C para detener el crecimiento de células completas. Después del tratamiento con cicloserina, se proporcionó un aminoácido a las minicélulas, metionina, que no contiene el tampón MMM. Para la inducción de proteínas marcadas con 35S, se añadió 35S-metionina a la muestra de minicélulas mientras que, para la inducción de proteínas no marcadas, se añadió metionina no marcada. Se añadieron quince (15) µCi de 35S-metionina (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) a las muestras para el radiomarcado y se añadieron 5 µmol de metionina a las muestras de minicélulas no marcadas. También se añadieron doscientos (200) µg/ml de IPTG a las muestras de minicélulas, que se agitaron entonces a 30 °C durante aproximadamente 4 horas. Después de la inducción, se recogieron las minicélulas para su posterior preparación o análisis.

Ejemplo 15: procedimientos para inducir la expresión

La expresión en minicélulas puede proceder después de la purificación de minicélulas y/o protoplastos de minicélulas a partir de células progenitoras y constituyentes de LPS, respectivamente. Sin embargo, para algunas aplicaciones es adecuado expresar conjuntamente proteínas de interés con la inducción de minicélulas. Para estas estrategias, puede usarse el protocolo descrito en el EJEMPLO 13 para la expresión de las construcciones de phoA. A modo de ejemplo no limitante, puede lograrse cualquiera de estas estrategias usando una o más de las siguientes construcciones de expresión (Tabla 8).

Tabla 8: construcciones de expresión

Plásmido

Elemento(s) regulador(es) Inductor Plásmido SEC ID Nº:

pMPX-5

rhaRS Ramnosa pUC-18 6

pMPX-7

uidR β-glucoronato pUC-18 10

pMPX-8

melR Melibiosa pUC-18 11

pMPX-18

araC Arabinosa pUC-18 12

pMPX-6

araC Arabinosa pUC-18 13

Tabla 14: secuencias de cebadores oligonucleotídicos para las construcciones de la tabla 13

SEC ID Nº:

Nombre del cebador secuencia de 5' a 3'

69

Rha-1

70

Rha-2

(continuación)

SEC ID Nº:

Nombre del cebador secuencia de 5' a 3'

71

Rha-1-HindIII

72

Rha-2-PstI

73

Uid-1

74

Uid-2

75

Uid-1-HindIII

76

Uid-2-PstI

77

Mel-1

78

Mel-2

79

Mel-l-HindIII

80

Mel-2-SaII

81

Ara-1

82

Ara-2

83

Ara-1-HindIII

84

Ara-2-PstI

85

Ara-1-XhoI

86

Ara-2-SstI

Los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 69, 70, 71 y 72 se usaron para amplificar los genes rhaRS y su región divergente de control del cromosoma de E. coli. Una vez amplificada, esta región se introdujo en pUC18 usando 5 HindIII y PstI para crear la SEC ID Nº: 6.

Los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 73, 74, 75 y 76 se usaron para amplificar la región de control de uidR, el gen uidR y la región de control para la expresión a partir del cromosoma de E. coli. Una vez amplificada, esta región se introdujo en pUC18 usando HindIII y PstI para crear la SEC ID Nº: 10.

Los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 77, 78, 79 y 80 se usaron para amplificar el gen melR y su región divergente

10 de control del cromosoma de E. coli. Una vez amplificada, esta región se introdujo en pUC18 usando HindIII y Sall para crear la SEC ID Nº: 11.

Los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 81,82, 83 y 84 se usaron para amplificar el gen araC y su región divergente de control del cromosoma de E. coli. Una vez amplificada, esta región se introdujo en pUC18 usando HindIII y PstI para crear la SEC ID Nº: 12.

15 Los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 81,82, 85 y 86 se usaron para amplificar el gen araC y su región divergente de control se amplificó por PCR a partir de pBAD-24. Una vez amplificada, esta región se insertó en pEGFP (Clontech) usando XhoI y Sstl para crear la SEC ID Nº: 13.

Excepto en pMPX-6, estas construcciones de expresión contienen el mismo sitio de clonación múltiple. Por lo tanto, cualquier proteína de interés puede insertarse en cada construcción de expresión modular para una exploración y

20 optimización sencilla.

A modo de ejemplo no limitante, otras proteínas que pueden expresarse se listan en la Tabla 9.

Tabla 9: otras proteínas expresadas

Proteína

Origen Construcción Fin SEC ID Nº:

Edg3

Rata nativa GPCR 14

β2AR

Ser humano nativa GPCR 15

TNFR-1a (humana)

Ser humano restos 29-455 Receptor 18

TNFR-1b (humana)

Ser humano restos 41-455 Receptor 17

TNF (humana)

Ser humano nativa Transferencia génica 19

T-EGF

Ser humano Quimera Transferencia génica 20

T-Invasina

Y. pseudotuberculosis Quimera Transferencia génica 21

Tabla 10: secuencias de cebadores oligonucleotídicos para la tabla 9

SEC ID Nº:

Nombre del cebador secuencia de 5' a 3'

87

Edq-1

88

Edg-2

89

Edg-1-SalI

90

Edg-2-KpnI

91

β2AR-1

92

β2AR-2

93

β2AR-1-SalI

94

β2AR-2-BamHI

95

TNFR(29)-1

96

TNFR(29)-2

97

TNFR(29)-1-SalI

98

TNFR(29)-2-KpnI

99

TNFR(41)-1

100

TNFR(41)-2

101

TNFR(41)-1-NcoI

102

TNFR(41)-2-XbaI

103

TNF-1

104

TNF-2

105

TNF-1-EcoRI

(continuación)

SEC ID Nº:

Nombre del cebador secuencia de 5' a 3'

106

TNF-2-HindIII

107

T-EGF-1

108

T-EGF-2

109

T-EGF-3

110

T-EGF-4

111

Inv-1

112

Inv-2

113

Inv-1-ToxR-EcoRI

114

Inv-2-PstI

Los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 87, 88, 89 y 90 se usaron para amplificar Edg3 de rata a partir de ADNc de rata. Una vez amplificada, esta región se insertó en la SEC ID Nº: 6 (pMPX-5) usando SalI y KpnI para crear la SEC 5 ID Nº: 14.

Los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 91,92, 93 y 94 se usaron para amplificar receptor β2 adrenérgico humano (β2AR) a partir de ADNc de corazón humano. Una vez amplificada, esta región se insertó en la SEC ID Nº: 6 (pMPX5) usando Sall y BamHI para crear la SEC ID Nº: 15.

Los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 95, 96, 97 y 98 se usaron para amplificar receptor de factor de necrosis

10 tumoral humano (TNFR restos 29-455) a partir de ADNc de Jurkat CL71 humano. Una vez amplificada, esta región se insertó en la SEC ID Nº: 12 (pMPX-18) usando SalI y Kpnl para crear la SEC ID Nº: 18.

Los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 99, 100, 101 y 102 se usaron para amplificar receptor de factor de necrosis tumoral humano (TNFR restos 41-455) a partir de ADNc de Jurkat CL71 humano. Una vez amplificada, esta región se insertó en pBAD24 usando NcoI y Xbal para crear la SEC ID Nº: 17.

15 Los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 103, 104, 105 y 106 se usaron para amplificar factor de necrosis tumoral (TNF) humano a partir de ADNc de Jurkat CL71 humano. Una vez amplificada, esta región se insertó en la SEC ID Nº: 13 (pMPX-6) usando EcoRI y HindIII para crear la SEC ID Nº: 19.

Tabla 11: programa para hibridar pcr de gradiente con pFX polimerasa

Etapa

Temp (°C) Tiempo (min)

1

95 2,0

2

95 0,5

3

64 0,5

4

68 2,5

5

Goto 2, 2X

30 (continuación)

Etapa

Temp (°C) Tiempo (min)

6

95 0,5

7

62 0,5

8

68 2,5

9

Goto 6, 4X

10

95 0,5

11

60 0,5

12

68 2,5

13

Goto 10, 6X

14

95 0,5

15

58 0,5

16

68 2,5

17

Goto 14, 24X

18

4 retener

19

fin

Los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 107, 108, 109 y 110 se mezclaron y amplificaron mediante la PCR usando PCR de gradiente de hibridación (Tabla 11) para formar factor de crecimiento epidérmico humano para (EGF) (restos 971-1023) fusionados traduccionalmente al dominio transmembrana de toxR de Vibrio cholerae. Una vez amplificada, esta región se insertó en la SEC ID Nº: 13 (pMPX-6) usando KpnI y HindIII para crear la SEC ID Nº: 20.

Usando PFX polimerasa (Invitrogen) los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 111, 112, 113 y 114 para amplificar los restos 490-986 de invasina (inv) de ADN cromosómico de Yersinia pseudotuberculosis y formar una fusión traduccional con el dominio transmembrana de toxR de Vibrio cholerae. Una vez amplificada, esta región se insertó en la SEC ID Nº: 13 (pMPX-6) usando EcoRI y PstI para crear la SEC ID Nº: 21.

Estas proteínas eran construcciones de prueba de principio usadas para evaluar la plataforma de minicélulas. Para los fines de esta evaluación inicial, todas las proteínas a excepción de TNF, T-EGF y T-Invasina se clonaron en pMPX-5, clonándose estas últimas proteínas en pMPX-6 para experimentos de transferencia génica.

Sea la estrategia para la expresión de proteínas la coexpresión con inducción de minicélulas o la expresión después del aislamiento de las minicélulas y/o protoplastos, el procedimiento para transformar las construcciones de expresión es el mismo. Para lograr esto, las construcciones de proteínas se clonaron inicialmente en E. coli MG1655 y después en la cepa productora de minicélulas de interés. Los sucesos de transformación se seleccionaron antes de la inducción de minicélulas. Para la inducción conjunta de proteínas y minicélulas, véase el protocolo para la expresión de phoA anterior. Para los experimentos de inducción después de la purificación de minicélulas y/o protoplastos,, después de la purificación de minicélulas y/o la preparación y purificación de protoplastos, se indujo la producción de proteínas en estos cuerpos celulares bien con LBD o bien con MDT a una proporción de minicélulas o protoplastos / volumen de 1 X 109 minicélulas o protoplastos /1 ml de medio. El medio se suplementó con la concentración adecuada de inductor (véase la Tabla 4). La inducción de proteínas es sensible a una diversidad de factores incluyendo, pero sin limitación aireación y temperatura, por lo tanto, la relación de volumen a área superficial es importante, al igual que lo es el procedimiento de agitación y temperatura de inducción. Por lo tanto, cada proteína tiene que tratarse según sea necesario para optimizar la expresión. Además de los parámetros de expresión, las minicélulas protoplástadas son sensibles a fuerzas osmóticas y mecánicas. Por lo tanto, las reacciones de inducción de proteínas de protoplastos también tienen que contener sacarosa al 10% con relaciones de volumen a área superficial mayores de los necesarios para que las minicélulas intactas logren una aireación similar a menores revoluciones.

Usando el T-PhoA como ejemplo no limitante, la expresión de proteínas se llevó a cabo durante y después del aislamiento de minicélulas. Para lograr esta tarea, t-phoA coexpresado con inducción de minicélulas se comparó con t-phoA expresado después del aislamiento de minicélulas. En ambos casos, las cepas progenitoras productoras de minicélulas durante toda la noche que contenían pMPX-5::t-phoA se subcultivaron en LBD suplementado con el

antibiótico adecuado. Los cultivos se crecieron hasta una DO600 de 0,1 y se indujeron para producción solo de minicélulas o para la producción de minicélulas y proteína. Ambos cultivos se recogieron a una DO600 de 1,0 y las minicélulas producidas se recogieron tal como se describe anteriormente. Las minicélulas que se iban a inducir para producción de T-phoA después de la producción se indujeron introduciendo 1 X 109 minicélulas purificadas en un 5 tubo de cultivo de 15 ml que contenía 1 ml de MDT con 1 mM de L-ramnosa. Se dejó proceder la inducción de proteínas de minicélulas durante hasta 14 horas y se comparó con la producción de proteínas obtenidas usando la estrategia de coexpresión. Para cada estrategia, se fraccionaron las minicélulas y se analizaron para asociación de membrana, proteína total, y actividad enzimática dependiente de asociación de membrana. Estas observaciones se compararon con las mezclas de células progenitoras/minicélulas postinducción, pre-aislamiento (PC/MC) de las

10 reacciones co-expresadas. La primera observación fue que la co-expresión de minicélulas e inducción de proteínas fue superior a la inducción después de la purificación de minicélulas (Tabla 12). Sin embargo, aunque las cinéticas son más lentas para el protocolo de inducción después de la purificación de minicélulas, el resultado final es equivalente.

Tabla 12. expresión comparativa: coexpresión frente a inducción después de purificación de minicélulas

Tiempo de inducción

Inducción de minicélulas purificadas a Inducción de coexpresión a

1,0

8,0 -

2,0

- 812,2

4,0

70,0 -

14,0

445,0 -

a. Nanogramos de T-PhoA expresados por 1 X 109 minicélulas.

Usando el procedimiento de inducción de la coexpresión, la cantidad de T-PhoA asociado a membrana se midió y comparó tanto para células progenitoras como para minicélulas. Brevemente, después de la inducción de la coexpresión de T-PhoA y minicélulas, las minicélulas se purificaron y se aislaron sus membranas. Para el aislamiento de membranas, las minicélulas que contenían T-PhoA expresado se sometieron a tres ciclos de lisis por 20 congelación-descongelación en presencia de lisozima 10 µg/ml. Después del ciclado de congelacióndescongelación, la reacción se sometió a sonicación. El material sonicado se centrifugó a 6.000 rpm en una microcentrifugadora durante 5 min a temperatura ambiente. Los sobrenadantes se transfirieron a un tubo Eppendorf nuevo y se centrifugó a 70.000 rpm usando un rotor TLA-100. Después de la centrifugación, el precipitado se resuspendió en tampón y se analizó para proteína T-Phoa total (Tabla 13) y actividad enzimática de T-PhoA (Tabla

25 14).

Tabla 13: T-PhoA asociado a membrana: células progenitoras frente a minicélulas

Tipo celular a

Proteína total a T-PhoA total b % de T-PhoA total Proteína asociada a membrana a T-PhoA asociado a membrana b % de proteína de membrana T-PhoA total

Células progenitoras

107,5 5,3 4,9 10,7 3,1 29,0

Minicélulas

4,6 0,8 17,5 1,0 0,5 50,0

Minicélulas EQ b

25,2 4,4 - 5,5 2,7 -

a. Proteína total determinada por ensayo BCA (Pierce) b. Microgramos de T-PhoA expresada por 1 X 109 minicélulas determinados mediante Western usando un anticuerpo anti-PhoA (Sigma) frente a una curva patrón de PhoA (determinada por BCA). c. Lípido de membrana equivalente a célula parental

Tabla 14: actividad enzimática de PhoA a (unidades relativas): células progenitoras frente a minicélulas.

Tipo celular b

No lisadas, Lisadas, total Lisadas, membrana

Célula progenitora

- 358 240

Minicélula

275 265 211

Minicélulas EQc

1.504 1.447 1.154

a. Actividad determinada colorimétricamente usando PNPP midiendo la densidad óptica a 405 nm b. Basado en 1 X 109 células progenitoras o minicélulas por reacción c. Lípido de membrana equivalente a célula parental

Estos resultados sugieren que la inducción de la coexpresión de T-PhoA y minicélulas juntas da como resultado minicélulas que contienen una cantidad equivalente de T-PhoA producido tanto en células progenitoras como en minicélulas. Sin embargo, el porcentaje de T-PhoA comparado con la proteína total es 3,5 X mayor en minicélulas 5 que en células progenitoras. Además, de las proteínas producidas, T-PhoA constituye el 50 % de la proteína de membrana total en minicélulas, mientras que es solo del 29 % en células progenitoras. Cabe destacar que la proteína T-PhoA asociada con la membrana puede eliminarse fácilmente mediante tratamiento con detergente suave no iónico, lo que sugiere que la T-PhoA presente en el sedimento de membrana está de hecho asociada con la membrana y no es un precipitado insoluble sedimentado conjuntamente (datos no mostrados). Finalmente, PhoA es 10 una enzima periplásmica que necesita exportación al espacio periplasmático para un plegamiento y formación de enlaces disulfuro adecuados. Ambos son necesarios para la actividad enzimática. En el trascurso de tiempo de este experimento, la expresión de APhoA que carece de una secuencia líder no demuestra actividad enzimática. Además, no hay diferencia entre las minicélulas lisadas y no lisadas que contienen T-PhoA expresado (Tabla 14) demostrando también que el dominio enzimático de PhoA de la quimera T-PhoA tiene que estar presente en el 15 espacio periplasmático. Por lo tanto, la construcción de T-PhoA tiene que asociarse a membrana y el dominio PhoA tiene que orientarse al espacio periplasmático para la actividad enzimática. Por lo tanto, cuando se comparan cantidades equivalentes de lípido de membrana entre células progenitoras y minicélulas en la Tabla 20, la actividad de T-PhoA dependiente de asociación a membrana es prácticamente 5 X mayor que en las células progenitoras. Teniendo en cuenta los datos en la Tabla 13, donde el 50 % de T-PhoA está en la membrana en comparación con el 20 20 % en las células progenitoras, la diferencia en la asociación de T-PhoA a membrana no es suficiente para explicar el aumento de prácticamente 5 X en la actividad en minicélulas. Estas observaciones sugieren que las minicélulas contienen una capacidad para soportar más proteína expresada en membrana que las células progenitoras, y que la proteína que se asocia con la membrana es más activa. Esta actividad puede ser simplemente el resultado de que las minicélulas permitan una mayor eficacia de plegado y formación de puentes disulfuro para 25 esta proteína concreta. Sin embargo, debido al hecho de que las minicélulas no contienen cromosoma, también es posible que la sobreexpresión de esta proteína encuentre fácilmente sitios de unión a membrana en ausencia de competidores producidos cromosomalmente presentes en las células progenitoras. Además, la sobreexpresión de proteínas a menudo da lugar a mayor expresión de proteasas. Debido a que las minicélulas no contienen cromosoma, se le da la oportunidad a este exceso de T-PhoA que de otro modo se degradaría de insertarse y 30 plegarse adecuadamente en la membrana, un atributo que puede favorecer la sobreexpresión de proteínas de

membrana más complejas.

Ejemplo 16: procedimientos ilustrativos para inducir y estudiar proteínas de membrana complejas

La expresión de proteínas de membrana complejas no nativas (exógenas) en sistemas bacterianos puede ser difícil.

Usando el sistema de minicélulas, se es capaz de eliminar los problemas de toxicidad. Sin embargo, sigue habiendo 35 problemas con la traducción correcta, con la compartimentalización en la membrana, con la inserción en la

membrana y con el plegado adecuado para la actividad nativa. Para tener en cuenta estos problemas potenciales se

ha construido un sistema quimérico modular que incorpora secuencias líder y dominios solubles reconocidos por

chaperona que son nativos para este sistema de minicélulas bacterianas. Además, se crearon construcciones

modulares que sobreexpresan las chaperonas nativas goESL y el factor de activación (tig). Finalmente, se han 40 construido cepas productoras de minicélulas que contienen mutaciones que efectúan la exportación de proteínas y la

formación de enlaces disulfuro. Para ejemplos no limitantes de estas construcciones véase la Tabla 15.

Tabla 15: herramientas no limitantes para la síntesis y la función de proteínas exógenas complejas

Herramienta

Ref. Restos de secuencia Fin SEC ID Nº

líder pMPX-5::phoA

- 1-48 Direccionamiento a membrana 22

líder pMPX-5::phoA

- 1-494 Direccionamiento a membrana 23

líder pMPX-5::malE

1 1-28 Direccionamiento a membrana 24

líder pMPX-5::malE

1 1-370 Direccionamiento a membrana 25

pMPX-17 (groESL, tig)

- - Chaperona 26

pMPX-5::trxA::FLAG

2 2-109a Solubilidad 27

a. Los restos no incluyen la secuencia FLAG. Referencias de la Tabla 15. 1. Grisshammer, R., y col., 1993. Expression of a rat neurotensin receptor in Escherichia coli. Biochem. J. 295:571576. 2. Tucker, J., y R. Grisshammer. 1996. Purification of a rat neurotensin receptor expressed in Escherichia coli. Biochem. J. 317:891-899.

Tabla 16: secuencias de cebadores oligonucleotídicos para las construcciones de la tabla 15

SEC ID Nº:

Nombre del cebador secuencia de 5' a 3'

115

PhoA líder-1

116

PhoA líder-2

117

PhoA líder-1-PstI

118

PhoA líder-2-XbaI

119

PhoA completa

120

PhoA completa-2-XbaI

121

MalE líder-1

122

MalE líder-2

123

MaIE-1

124

MaIE-2

125

MaIE-1-PstI

126

MaIE-2-XbaI

(continuación)

SEC ID Nº:

Nombre del cebador secuencia de 5' a 3'

127

Tig-1

128

Tig-2

129

Tig-1-NarI

130

Tig-2-Xbal

131

Gro-1

132

Gro-2

133

Gro-1-XbaI

134

Gro-2-HindIII

135

TrxA-1

136

TrxA-2

137

TrxA-1-Fxa-PstI

138

TrxA-2-FLAG-BamHI

Los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 115, 116, 117 y 118 se usaron para amplificar el líder de phoA (restos 1-49) de ADN cromosómico de E. coli. Una vez amplificada, esta región se insertó en la SEC ID Nº: 6 (pMPX-5) usando 5 PstI y Xbal para crear la SEC ID Nº: 22.

Los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 115, 117, 119 y 120 se usaron para amplificar el gen completo de phoA a partir de ADN cromosómico de E. coli. Una vez amplificada, esta región se insertó en la SEC ID Nº: 6 (pMPX-5) usando PstI y Xbal para crear la SEC ID Nº: 23.

Los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 121 y 122 se usaron para construir la secuencia líder de malE (restos 1-28).

10 Una vez hibridada, esta construcción se insertó en la SEC ID Nº: 6 (pMPX-5) usando PstI y Xbal para crear la SEC ID Nº: 24.

Los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 123, 124, 125 y 126 se usaron para amplificar el líder expandido de malE (restos 1-370) de ADN cromosómico de E. coli. Una vez amplificada, esta región se insertó en la SEC ID Nº: 6 (pMPX-5) usando PstI y XbaI para crear la SEC ID Nº: 25.

15 Los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 127, 128, 129 y 130 se usaron para la región de control y génica de tig de ADN cromosómico de E. coli. Una vez amplificada, esta región se ligó a la región amplificada de groESL a continuación usando Xbal antes de la inserción en la SEC ID Nº: 6 (pMPX-5) usando Narl (de la región tig) y HindIII (de la región groESL) para crear la SEC ID Nº: 26.

Los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 131, 132, 133 y 134 se usaron para amplificar la región de control y génica

20 de groESL de ADN cromosómico de E. coli. Una vez amplificada, esta región se ligó a la región amplificada de tig anterior usando XbaI antes de la inserción en la SEC ID Nº: 6 (pMPX-5) usando Narl (de la región tig) y HindIII (de la región groESL) para crear la SEC ID Nº: 26.

Los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 135.136, 137 y 138 se usaron para amplificar trxA (restos 2-109) de ADN cromosómico de E. coli e insertar las secuencias FLAG y de Factor Xa. Una vez amplificada, esta región se insertó

25 en la SEC ID Nº: 6 (pMPX-5) usando PstI y BamHI para crear la SEC ID Nº: 27.

A modo de ejemplo no limitante, las construcciones del líder de pMPX-5::phoA (restos 1-48), del líder de pMPX-5::phoA (restos 1-094), del líder de pMPX-5::malE (restos 1-28), y del líder de pMPX-5::malE (restos 1-370) se diseñan para dirigir proteínas de membrana exógenas expresadas a la membrana citoplásmica de la minicélula.

Además de estas construcciones, A modo de ejemplo no limitante, las mutaciones en los genes secA y secY de E. coli, específicamente la mutación prIA4 (Strader, J., y col., 1986. Kinetic analysis of lamB mutants suggests the signal sequence plays multiple roles in protein export. J. Biol. Chem. 261:15075-15080), permite el direccionamiento promiscuo a la membrana. Estas mutaciones, al igual que las construcciones anteriores están integradas en el sistema de expresión de minicélulas. Para complementar estas mutaciones, también se han incorporado el complejo de chaperona groESL y el factor de activación en el sistema de expresión. A modo de ejemplo no limitante, pMPX-5::trxA: :FLAG se usará para crear una fusión carboxi-terminal con la proteína de interés para aumentar la eficacia de la inserción en membrana de la proteína de membrana de interés (Tucker, J., y R. Grisshammer. 1996. Purification of a rat neurotensin receptor expressed in Escherichia coli. Biochem. J. 317:891-899). También a modo de ejemplo no limitante, las construcciones pMPX-5::FLAG::toxR y pMPX-5::FLAG::λcl se prepararán para crear una fusión carboxi-terminal con la proteína de interés para su uso en un ensayo basado en indicador para interacciones proteína-proteína. A modo de ejemplo no limitante, la proteína de interés para este sistema es un GPCR. También a modo de ejemplo no limitante, este GPCR puede ser el receptor de neurotensina de rata (Grisshammer, R., y col., 1993. Expression of a rat neurotensin receptor in Escherichia coli. Biochem. J. 295:571-576.), o el receptor β2 adrenérgico de seres humanos (Freissmuth, M., y col., 1991. Expression of two β-adrenergic receptors in Escherichia coli: functional interaction with two forms of the stimulatory G protein. Proc. Natl. Acad. Sci. 88:85488552). La inserción de un GPCR en una de estas construcciones indicadoras crea una fusión carboxi-terminal entre el GPCR de interés y el dominio regulador de unión a ADN del activador positivo de ToxR, el represor λcl, o el activador positivo AraC, para completar este sistema indicador. A modo de ejemplo no limitante, se usarán pMPX-5::(X)::toxR o pMPX-5::(X)::λcl para crear una fusión carboxi-terminal con la proteína de interés para su uso en un ensayo basado en indicador para interacciones proteína-proteína, donde (X) puede ser cualquier proteína o molécula implicada en una interacción intermolecular o intramolecular. A modo de ejemplo no limitante, esta molécula de interés puede ser una proteína G. Esta proteína G puede ser la proteína Gαi1 de rata (Grisshammer, R., y E. Hermans. 2001. Functional coupling with Gαq and Gαi1 protein subunits promotes high-affinity agonist binding to the neurotensin receptor NTS-1 expressed in Escherichia coli. FEBS Lett. 493:101-105), o la proteína Gsα de ser humano (Freissmuth, M., y col., 1991. Expression of two β-adrenergic receptors in Escherichia coli: functional interaction with two forms of the stimulatory G protein. Proc. Natl. Acad. Sci. 88:8548-8552). Al igual que el GPCR, La inserción de una proteína G en una de estas construcciones indicadoras crea una fusión carboxi-terminal entre la proteína G de interés y el dominio regulador de unión a ADN del activador positivo de ToxR, el represor λcl, u otra proteína reguladora. Finalmente, estas construcciones de plásmido contienen el dominio de unión a ADN de cada regulador; la región reguladora ctx de Vibrio cholerae (Russ, W. P., y D. M. Engelman. 1999. TOXCAT: a measure of transmembrane helix association in a biological membrane. 96:863-868), o la región PR1OR1 de bacteriófago lambda (Hu, J. C., y col., 1990. Sequence requirements for coiled-coils: analysis with lambda repressor-GCN4 leucine zipper fusions. Science. 250:1400-1403), respectivamente. A modo de ejemplo no limitante, cada dominio de unión se acopla a una secuencia indicadora que codifica luciferasa (Dunlap, P. V., y E. P. Greenberg. 1988. Control of Vibrio fischeri lux gene transcription by a cyclic AMP receptor protein-luxR protein regulatory circuit. J. Bacteriol. 170:40404046), proteína fluorescente verde (GFP) (Yang, T. T., y col., 1996. Dual color microscopic imagery of cells expressing the green fluorescent protein and a red-shifted variant. Gene. 173:19-23; Matthysse, A. G., y col., 1996. Construction of GFP vectors for use in gram-negative bacteria other than Escherichia coli. FEMS Microbiol. Lett. 145:87-94), u otro indicador. La coexpresión de estos GPCR y quimeras de proteína G creará un sistema que mide la interacción entre un GPCR y proteína G en una minicélula intacta. Este sistema se diseña para usarse como ensayo de lectura positiva o negativa y puede usarse para detectarse pérdida o ganancia de función de GPCR. Aunque la interacción GPCR-proteína G se proporciona a modo de ejemplo, este sistema modular puede emplearse con cualquier sistema de proteína soluble o de membrana que mida interacción proteína-proteína u otra interacción molecular.

Ejemplo 17: procedimientos ilustrativos para transferencia génica usando minicélulas o protoplastos de minicélulas

En el diseño de la invención se incluye el uso de minicélulas para transferir información genética a una célula receptora. A modo de ejemplo no limitante, esta transferencia génica puede suceder entre una minicélula y una célula de mamífero in vitro, o in vivo, y esta transferencia génica puede suceder mediante interacciones específicas de células, mediante interacciones generales, o una combinación de cada una. Para lograr esta tarea se crearon tres construcciones básicas. Cada una de estas construcciones se crea en pMPX-6 que contiene un promotor de CMV que controla la síntesis de GFP. El plásmido pMPX-6 se construyó clonando el araC a través del sitio de clonación múltiple de pBAD24 en pEGFP (Clontech). Esta construcción proporcionó un regulador bacteriano así como un procedimiento para controlar el éxito de la transferencia génica usando expresión de GFP a partir del promotor de CMV. En su diseño, la proteína expresada usando el promotor bacteriano dirigirá la interacción célula-célula, mientras que la transferencia exitosa de ADN de la minicélula a la célula receptora iniciará la producción de GFP. A modo de ejemplo no limitante, las proteínas que dirigirán la interacción célula-célula pueden ser proteína invasina de Yersinia pseudotuberculosis, que estimula los eventos endocíticos dependientes de integrina β1. Para mostrar adecuadamente la proteína invasina sobre la superficie de minicélulas, el dominio de invasina que estimula estos eventos (restos 490-986) (Dersch, P., y R. R. Isberg. 1999. A region of the Yersinia pseudotuberculosis invasin protein enhances integrin-mediated uptake into mammalian cells and promotes self-association. EMBO J. 18:11991213) se fusionó al dominio transmembrana de ToxR. La expresión de esta construcción a partir de pMPX-6 mostrará T-Inv sobre la superficie de la minicélula y estimulará la endocitosis con cualquier célula que muestra una integrina β1. Por lo tanto, la presentación de T-Inv proporcionará un mecanismo general de transferencia génica de minicélulas para proporcionar especificidad. A modo de ejemplo no limitante, la porción de ligando del factor de crecimiento epidérmico (EGF) puede fusionarse con el dominio transmembrana de ToxR, creando de este modo una proteína que interactuará con células que muestran el receptor de EGF (EGFR). Igualmente, el factor de necrosis tumoral (TNF) también puede cumplir este fin estimulando interacciones célula-célula entre minicélulas que muestran TNF y células que muestran receptor de TNF (TNFR). Aunque las interacciones EGF-EGFR y TNF-TNFR pueden estimular la fusión célula-célula entre minicélulas y células receptoras, o la captación de minicélulas, solo esto puede no ser suficiente para transferir información genética de manera eficaz a partir de minicélulas. Por lo tanto, una estrategia genética para aumentar la transferencia genética célula-célula puede ser el desarrollo de un interruptor genético que sea sensible a la interacción específica, por ejemplo, interacción EGF-EGFR, y activa la producción de un segundo producto génico, por ejemplo, invasina, que estimula el suceso endocítico. A modo de ejemplo no limitante, este activador genético puede ser similar al sistema indicador de la interacción GPCR-proteína G anterior, en que un suceso extracelular estimula la dimerización de un regulador activo transcripcional, activando de este modo la producción de invasina o de proteína similar a invasina. En cualquier estrategia, el sistema de presentación para estimular la transferencia de información genética a partir de minicélulas a células receptoras también puede ser aplicable a la transferencia de sustancias distintas de información genética, por ejemplo, fármacos terapéuticos presintetizados.

Para ensayar esta metodología de direccionamiento, se transformarán construcciones de pMPX-6 que contienen cada una proteínas generales o específicas de interacción célula-célula en una cepa productora de minicélulas y bien mediante la inducción de coexpresión de minicélulas, mediante inducción después de la purificación de minicélulas, o mediante inducción después de la formación de protoplastos, se producirán las minicélulas que muestren la proteína de direccionamiento. Cuando se usa la inducción de la coexpresión y la inducción después de la purificación de minicélulas de las estrategias de proteína de direccionamiento, es necesario convertir en protoplastos a las minicélulas purificadas después de la inducción de proteínas. Una vez que se ha mostrado la proteína de direccionamiento en la superficie de un protoplasto de minicélula, estos protoplastos están listos para exponerse a células diana. Para los experimentos preliminares, estas interacciones se controlarán usando cultivo celular de células Cos en comparación con lipofectamina (Invitrogen), electroporación, y otras técnicas de transfección. Los experimentos iniciales expondrán protoplastos que muestran T-Inv a células Cos y compararán la eficacia de la transfección a protoplastos que contienen pMPX-6::t-inv en ausencia de expresión de t-inv, solo pMPX6::t-inv desnudo, y pMPX-6::t-inv des nudo con lipofectamina. Cada uno de estos sucesos se controlará usando microscopía de fluorescencia y/o citometría de flujo. A partir de estos resultados se ensayarán las proteínas de aparato de direccionamiento específicas. Usando las líneas celulares A-431 (que muestra EGFR) y K-562 (sin EGFR), se ensayarán las construcciones pMPX-6::t-egf. Usando las mismas estrategias que para el estudio de t-inv, se medirá el nivel de transfección entre líneas celulares A-431 y K-562 y se comparará con los logrados usando lipofectamina. De igual forma, se estudiará la capacidad del TNF para estimular la transferencia génica usando células L-929. En todos los casos, se comparará la capacidad de estas construcciones de proteína de direccionamiento generales y específicas para técnicas de transfección estándar. Tras obtener resultados positivos, se ensayarán estas metodologías en líneas celulares de difícil transfección, por ejemplo, cardiomiocitos adultos. La base de estos resultados creará una base para que aparezcan aplicaciones de transferencia génica in vivo.

Ejemplo 18: procedimientos adicionales y optimizados para expresión genética

La expresión en minicélulas puede suceder después de la purificación de minicélulas y/o protoplastos de minicélulas a partir de células progenitoras y constituyentes de LPS, respectivamente. Sin embargo, para algunas aplicaciones se prefiere expresar conjuntamente proteínas de interés con la inducción de minicélulas. Para estas estrategias, puede usarse el protocolo descrito en el Ejemplo 13 para la expresión de las construcciones de phoA. Puede lograrse cualquiera de estas estrategias usando una o más de las siguientes construcciones de expresión (Tabla 17) y/o construcciones de expresión optimizadas (Tabla 18).

El plásmido de expresión pCGV1 contiene un represor lambda cl sensible a temperatura (cl857) y ambos promotores lambda PR y PL (Guzman, C. A., y col., 1994. A novel Escherichia coli expression-export vector containing alkaline phosphatase as an insertional inactivation screening system. Gene. 148:171-172) con una región de iniciación atpE (Schauder, B., y col., 1987. Inducible expression vectors incorporating the Escherichia coli atpE translational initiation region. Gene. 52:279-283). En el diseño de la invención se incluye la modificación de este vector de expresión para alinear mejor el sitio de unión ribosomal de Shine-Delgarno con sitios de clonación. Además, el vector de expresión pCGVI se modificó para incorporar una estructura de tallo-bucle en el extremo 3-prima del transcrito para proporcionar una secuencia de finalización transcripcional fuerte (Tabla 23).

El plásmido de expresión pCL478 contiene un represor lambda cl sensible a temperatura (cl857) y ambos promotores lambda PR y PL (Love, C. A., y col., 1996. Stable high-copy bacteriophage promoter vectors for overproduction of proteins in Escherichia coli. Gene. 176:49-53). En el diseño de la invención se incluye la modificación de este vector de expresión para alinear mejor el sitio de unión ribosomal de Shine-Delgarno con sitios de clonación. Además, el vector de expresión pCL478 se modificó para incorporar una estructura de tallo-bucle en el extremo 3-prima del transcrito para proporcionar una secuencia de finalización transcripcional fuerte (Tabla 23).

Tabla 17. modificaciones de vector de expresión lambda cI857

Nuevo plásmido

Plásmido progenitor Región eliminada Región añadida a SEC ID Nº

pMPX-84

pCGV1 Ndel -BamHI Ndel, SD -PstI, Xbal, KpnI, Tallo bucle, BamHI 139

pMPX-85

pCGV1 NdeI -BamHI NdeI, SD -SalI, Xbal, KpnI, Tallo bucle, BamHI 140

pMPX-86

pCL478 BamHI -XhoI BamHI, SD -Pstl, Xbal, Kpnl, Tallo bucle, Xhol 141

pMPX-87

pCL478 BamHI -XhoI BamHI, SD -SalI, Xbal, KpnI, Tallo bucle, Xhol 142

a. "SD" se refiere a una secuencia de unión a ribosoma de Shine-Delgarno; "Tallo-bucle" se refiere a una estructura de tallo-bucle que funciona como sitio de finalización transcripcional.

Tabla 18. secuencias de cebadores oligonucleotídicos para la tabla 17

SEC ID Nº

Nombre del cebador secuencia de 5' a 3'

143

CGV1-1-SalI

144

CGV1-2-SalI

145

CGV1-1-PstI

146

CGV1-2-PstI

147

CL478-1-Sall

148

CL478-2-SalI

149

CL478-1-PstI

150

CL478-2-PstI

5 Los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 143 y 144 se hibridaron entre sí para generar una molécula de ADN con un saliente 5’ en ambos extremos. Los salientes se diseñan de tal forma que el ADN puede clonarse directamente en corte de pCGVI con Ndel (el saliente 5’ es TA) y BamHI (el saliente 5’ es GATC). La inserción del ADN hibridado en pCGVI crea la SEC ID Nº: 139, pMPX-84.

Los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 145 y 146 se hibridaron entre sí para generar una molécula de ADN con un

10 saliente 5’ en ambos extremos. Los salientes se diseñan de tal forma que el ADN puede clonarse directamente en corte de pCGVI con Ndel (el saliente 5’ es TA) y BamHI (el saliente 5’ es GATC). La inserción del ADN hibridado en pCGVI crea la SEC ID Nº: 140, pMPX-85.

Los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 147 y 148 se hibridaron entre sí para generar una molécula de ADN con un saliente 5’ en ambos extremos. Los salientes se diseñan de tal forma que el ADN puede clonarse directamente en

15 corte de pCL478 con BamHI (el solapamiento 5' es GATC) y Xhol (el saliente es TCGA). La inserción del ADN hibridado en corte de pCL578 con BamHI y Xhol crea la SEC ID Nº: 141, pMPX-86.

Los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 149 y 150 se hibridaron entre sí para generar una molécula de ADN con un saliente 5’ en ambos extremos. Los salientes se diseñan de tal forma que el ADN puede clonarse directamente en corte de pCL578 con BamHI (el solapamiento 5' es GATC) y Xhol (el saliente es TCGA). La inserción del ADN hibridado en corte de pCL478 con BamHI y Xhol crea la SEC ID Nº: 142, pMPX-87.

Las construcciones de expresión optimizadas en la Tabla 19 se crearon a partir de las SEC ID Nº: 6, 11, y 12 (véase la Tabla 8). Se efectuaron modificaciones para optimizar el alineamiento de los sitios de clonación Sall o Pstl con el sitio de unión a ribosoma de Shine-Delgarno. Además, las secuencias de terminación transcripcional de tallo-bucle se añadieron al extremo 3’ de la región de clonación.

Tabla 19: construcciones de expresión

Plásmido

Elemento(s) regulador(es) Inductor Plásmido SEC ID Nº:

pMPX-67

RhaRS Ramnosa PUC-18 151

pMPX-72

RhaRS Ramnosa PUC-18 152

pMPX-66

AraC Arabinosa PUC-18 153

pMPX-71

AraC Arabinosa PUC-18 154

pMPX-68

MelR Melibiosa PUC-18 155

Tabla 20. secuencias de cebadores oligonucleotídicos para las construcciones de la tabla 25

SEC ID Nº:

Nombre del cebador secuencia de 5' a 3'

69

Rha-1

156

Rha-SD

71

Rha-1-HindMI

157

Rha-SD SalI KpnI

158

Rha-SD KpnI KpnI

81

Ara-1

159

Ara-SD

83

Ara-1-HindIII

160

Ara-SD SalI Kpnl

161

Ara-SD PstI Kpnl

77

Mel-1

162

Mel-SD

79

Mel-1-HindIII

163

Mel-SD-Sall Kpnl

Los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 69, 156, 72, y 157 se usaron para amplificar los genes rhaRS y su región de control divergente del cromosoma de E. coli y la inserción de un alineamiento de unión a ribosoma de SalI-Shine-Delgamo optimizada y una secuencia de terminación transcripcional de tallo-bucle. Una vez amplificada, esta región se insertó en pUC18 usando HindIII y KpnI para crear pMPX67, SEC ID Nº: 151.

Los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 69.156, 72, y 158 se usaron para amplificar los genes rhaRS y su región de control divergente del cromosoma de E. coli y la inserción de un alineamiento de unión a ribosoma de Pstl-Shine-Delgamo optimizada y una secuencia de terminación transcripcional de tallo-bucle. Una vez amplificada, esta región se insertó en pUC18 usando HindIII y KpnI para crear pMPX-72, SEC ID Nº: 152.

Los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 81, 159, 81, y 160 se usaron para amplificar los genes araC y su región de control divergente del cromosoma de E. coli y la inserción de un alineamiento de unión a ribosoma de SalI-Shine-Delgamo optimizada y una secuencia de terminación transcripcional de tallo-bucle. Una vez amplificada, esta región se insertó en pUC18 usando HindIII y KpnI para crear pMPX-66, SEC ID Nº: 153.

Los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 81, 159, 81, 161 se usaron para amplificar los genes de araC y su región de control divergente del cromosoma de E. coli y la inserción de un alineamiento de sitio de unión a ribosoma y la inserción de un alineamiento de unión a ribosoma de PstI-Shine-Delgamo y una secuencia de terminación de tallobucle. Una vez amplificada, esta región se insertó en pUCI8 usando HindIII y KpnI para crear pMPX-71, SEC ID Nº:

154.

Los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 77.162, y 79.163 se usaron para amplificar los genes meIR y su región de control divergente del cromosoma de E. coli y la inserción de un alineamiento de unión a ribosoma de SalI-Shine-Delgamo optimizada y una secuencia de terminación transcripcional de tallo-bucle. Una vez amplificada, esta región se insertó en pUC18 usando HindIII y KpnI para crear pMPX-68, SEC ID Nº: 155.

Ejemplo 19: optimización de la expresión de receptor de neurotensina de rata (NTR)

La expresión de proteínas GPCR específicas en minicélulas puede necesitar de fusiones de dominio quimérico para estabilizar la proteína expresada y/o para dirigir la proteína sintetizada a la membrana. La proteína NTR de rata se clonó en varias combinaciones quiméricas para asistir en la expresión y asociación a membrana de NTR (Grisshammer, R., y col., 1993. Expression of a rat neurotensin receptor in Escherichia coli. Biochem. J. 295:571576; Tucker, J., y Grisshammer, R. 1996. Purification of a rat neurotensin receptor expressed in Escherichia coli. Biochem. J. 317:891-899). Los procedimientos para la construcción se muestran en las tablas a continuación.

Tabla 21. construcciones que facilitan la expresión de receptor de neurotensina

Proteína a

Construcción b SEC ID Nº

MaIE(L)

SalI-MaIE (1-370)-Factor Xa-homología de NTR 164

NTR

Factor Xa-NTR (43-424)-NotI-FLAG-KpnI 165

MaIE(L)-NTR

SalI-MaIE(1-370)-Factor Xa-NTR(43-424)-NotI-FLAG-KpnI 166

MaIE(S)-NTR

SalI-MaIE(1-28)-Factor Xa-NTR(43-424)-NotI-FLAG-KpnI 167

TrxA

NotI-TrxA(2-109)-NotI 168

MaIE(L)-NTR-TrxA

SalI-MaIE(1-370)-Factor Xa-NTR(43-424)-NotI-TrxA(2-109)-FLAG KpnI 169

MaIE(S)-NTR-TrxA

SalI-MaIE(1-28)-Factor Xa-NTR(43-424)-NotI-TrxA(2-109)-FLAGKpnI 170

a. (L) se refiere a los restos 1-370 de MalE, y (S) se refiere a los restos 1-28 de MalE. b. Todas las construcciones maduras se clonaron en sitios Sall y KpnI de las SEC ID Nº: 140, 142, 151 y 153.

Tabla 22. secuencias de cebadores oligonucleotídicos para la tabla 27

SEC ID Nº:

Nombre del cebador secuencia de 5' a 3'

171

MaIE-1

172

MaIE-2

173

MaIE-1-Sall

(continuación)

SEC ID Nº:

Nombre del cebador secuencia de 5' a 3'

174

MaIE-2-XaNTR

175

NTR-1

176

NTR-2

177

NTR-1-Xa

178

NTR-2-Flag

179

NTR-2-Finalización KpnI

180

líder de NTR-1-Xa

181

NTR-2-Lead2 SalI

182

TrxA-1

183

TrxA-2

184

TrxA-1-NotI

185

TrxA-2-NotI

Los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 171, 172, 173 y 174 se usaron para amplificar los restos 1-370 de malE del cromosoma de E. coli para crear la SEC ID Nº: 164. Usando PCR solapante con la homología de NTR extendida, se

5 preparó una fusión traduccional quimérica entre los restos de MalE (1-370) y de NTR 43-424 (SEC ID Nº: 165) para crear la SEC ID Nº: 166. La SEC ID Nº: 166 se clonó en los plásmidos pMPX-85, pMPX-87, pMPX-66 y pMPX-67 (respectivamente, Las SEC ID Nº: 140, 142, 151 y 153) usando SalI y KpnI.

Se usó PCR en tres etapas con los oligonucleótidos Las SEC ID Nº: 175 y 176 como cebadores para amplificar los restos 43-424 de NTR de ADNc de cerebro de rata. Las SEC ID Nº: 177 y 178 se usaron entonces con el molde de

10 NTR (43-424) para añadir el factor Xa y la secuencia FLAG. Finalmente, Las SEC ID Nº: 177 y 179 se usaron para añadir un sitio de Kpnl para crear la SEC ID Nº: 165. Usando PCR solapante con malE (1-370) que contenía homología extendida con NTR, se preparó una fusión traduccional quimérica entre los restos de NTR (43-424) y de MalE (1-370) (SEC ID Nº: 164) para crear la SEC ID Nº: 166. SEC ID Nº: 166 se clonó en las SEC ID Nº: 140, 142, 151 y 153 usando SalI y Kpnl.

15 Usando PCR en tres etapas, se utilizaron por vez primera los oligonucleótidos con SEC ID Nº: 175 y 176 para amplificar los restos NTR 43-424 procedentes del ADNc de ratón. Las SEC ID Nº: 178 y 180 se usaron entonces con el molde de NTR (43-424) para añadir el factor Xa y la secuencia FLAG. Finalmente, Las SEC ID Nº: 179 y 181 se usaron para añadir un sitio de Kpnl para crear la SEC ID Nº: 167. SEC ID Nº: 167 se clonó en las SEC ID Nº:

140.142.151 y 153 usando SalI y Kpnl.

20 Los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 182.183.184 y 185 se usaron para amplificar los restos 2-109 de TrxA del cromosoma de E. coli para crear la SEC ID Nº: 168. Usando Notl, los restos 2-109 de TrxA se clonaron en las SEC ID Nº: l166 y 167 para crear las SEC ID Nº: 169 y 170, respectivamente. Las SEC ID Nº: 169 y 170 se clonaron en las SEC ID Nº: 140, 142, 151 y 153 usando SalI y KpnI.

Ejemplo 20: procedimientos para el ensayo funcional GPCR

25 Los ensayos de unión del receptor acoplado a proteína G funcional (GPCR) en minicélulas requiere la expresión de un GPCR de interés en la bicapa de la membrana de la minicélula y la expresión citoplásmica de la proteína Grequerida. Con este fin se crearon construcciones que expresaban simultáneamente tanto un GPCR como una proteína G. Para regular la relación entre GPCR y la proteína G, se crearon fusiones transcripcionales. En dichas construcciones, el GPCR y la proteína G se transcriben simultáneamente como un ARNm bicistrónico. Para medir la

30 interacción GPCR-proteína G en la minicélula intacta, cada proteína se creó como una quimera con un dominio de transactivación. Para estos estudios en el extremo N de la unión al ADN, el dominio de activación de la proteína ToxR procedente de V. cholerae se fusionó con el extremo C de GPCR y de la proteína G. Finalmente, para medir la interacción GPCR-proteína G, la región promotora ctx activada por ToxR se clonó frente a lacZ. La dimerización de la región de unión al ADN de ToxR se unirá y activará el promotor ctx. En esta construcción, la heterodimerización del GPCR y de la proteína G estimulará la dimerización de ToxR que se controlará mediante la expresión de LacZ. Los detalles de estas construcciones se muestran en la Tabla 23.

a.

“SD” se refiere a la secuencia de unión Shine-Delgamo ribosoma y “ToxR" se refiere a la transactivación, dominio de unión a ADN de la proteína ToxR (restos 5-141).

b.

Todas las construcciones maduras se clonaron en sitios Sall y KpnI de las SEC ID Nº: 140, 142, 151 y

153.

Los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 209, 210, 211 y 212 se usaron para amplificar D2AR humano a partir de ADNc humano para crear la SEC ID Nº: 186. Mediante Sall y Xhol se creó una fusión traduccional entre D2AR y el GS10 humano (SEC ID Nº: 187) para crear la SEC ID Nº: 188. SEC ID Nº: 188 se clonó en las SEC ID Nº: 140, 142, 151 y 153 usando Sall y Xbal.

Los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 213, 214, 215 y 216 se usaron para amplificar GS1h humano a partir de ADNc humano para crear la SEC ID Nº: 187. Mediante Xhol y Xbal se creó una fusión traduccional entre GS1h y el D2AR humano (SEC ID Nº: 186) para crear la SEC ID Nº: 188. La SEC ID Nº: 188 se clonó en las SEC ID Nº: 140, 142, 151 y 153 usando Sall y Xbal.

Los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 213, 214, 215 y 217 se usaron para amplificar GS1h humano a partir de ADNc humano para crear la SEC ID Nº: 192. Mediante Xhol y Xbal se creó una fusión traduccional con los restos 5141 de Vibrio chloreae (SEC ID Nº: 191) para crear la SEC ID Nº: 197. Para usarse para crear una fusión transcripcional con quimeras D2AR-ToxR tal como se muestra en la SEC ID Nº: 205 y las futuras quimeras GPCR-ToxR.

Los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 218, 219, 220 y 221 se usaron para amplificar Glh12/13 humano a partir de ADNc humano para crear la SEC ID Nº: 196. Mediante Xhol y Xbal se creó una fusión traduccional con los restos 5141 de Vibrio chloreae (SEC ID Nº: 191) para crear la SEC ID Nº: 201. Para usarse para crear fusiones transcripcionales futuras con quimeras GPRC-ToxR tal como se muestra en la SEC ID Nº: 205.

Los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 222, 223, 224 y 225 se usaron para amplificar hq humano a partir de ADNc humano para crear la SEC ID Nº: 194. Mediante Xhol y Xbal se creó una fusión traduccional con los restos 5-141 de Vibrio chloreae (SEC ID Nº: 191) para crear la SEC ID Nº: 199. Para usarse para crear fusiones transcripcionales futuras con quimeras GPRC-ToxR tal como se muestra en la SEC ID Nº: 205.

Los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 226, 227, 228 y 229 se usaron para amplificar Ghi humano a partir de ADNc humano para crear la SEC ID Nº: 195. Mediante Xhol y Xbal se creó una fusión traduccional con los restos 5-141 de Vibrio chloreae (SEC ID Nº: 191) para crear la SEC ID Nº: 200. Para usarse para crear fusiones transcripcionales futuras con quimeras GPRC-ToxR tal como se muestra en la SEC ID Nº: 205.

Los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 230, 231.232 y 233 se usaron para amplificar GS2h humano a partir de ADNc humano para crear la SEC ID Nº: 193. Mediante Xhol y Xbal se creó una fusión traduccional con los restos 5141 de Vibrio chloreae (SEC ID Nº: 191) para crear la SEC ID Nº: 198. Para usarse para crear fusiones transcripcionales futuras con quimeras GPRC-ToxR tal como se muestra en la SEC ID Nº: 205.

Los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 209, 210, 211 y 234 se usaron para amplificar D2AR humano a partir de ADNc humano para crear la SEC ID Nº: 189. Mediante Sall y Xhol se creó una fusión transcripcional entre D2AR y el GS10 humano (SEC ID Nº: 187) para crear la SEC ID Nº: 190. SEC ID Nº: 190 se clonó en las SEC ID Nº: 140, 142, 151 y 153 usando Sall y Xbal.

Los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 236, 237, 238 y 239 se usaron para amplificar bases coincidentes con los restos 5-141 de ToxR procedentes de Vibrio Cholerae para crear la SEC ID Nº: 202. Mediante Pstl y Xhol se creó una fusión traduccional entre ToxR y el D2AR humano (SEC ID Nº: 203) para crear la SEC ID Nº: 204.

Los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 209, 210, 211 y 235 se usaron para amplificar D2AR humano a partir de ADNc humano para crear la SEC ID Nº: 203. Mediante Sall y Pstl se creó una fusión traduccional entre D2AR y ToxR (SEC ID Nº: 202) para crear la SEC ID Nº: 204.

Usando los oligonucleótidos con las SEC ID Nº: 197 y 204 se crearon fusiones transcripcionales entre la fusión traduccional D2AR-ToxR (SEC ID Nº: y la fusión traduccional GS1h-ToxR (SEC ID Nº: 197) para crear la SEC ID Nº:

205.

Los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 240, 241, 242 y 243 se usaron para amplificar la región promotora ctx (Pctx) de Vibrio cholerae para crear la SEC ID Nº: 206. Combinando este producto de PCR junto con la SEC ID Nº: 207 del producto PCR y amplificando en presencia de las SEC ID Nº: 242, 247, se creó la SEC ID Nº: 208. Mediante Xbal, la construcción indicadora de SEC ID Nº: 208 se clonó posteriormente en .pACYC184 para transformación simultánea con las construcciones de fusión GPCR-proteína G anteriores.

Los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 244, 245, 246 y 247 se usaron para amplificar el lacZ de E. coli para crear la SEC ID Nº: 207. Combinando este producto de PCR junto con la SEC ID Nº: 206 del producto PCR y amplificando en presencia de las SEC ID Nº: 242 y 247, se creó la SEC ID Nº: 208. Mediante Xbal, la construcción indicadora 208 se clonó posteriormente en .pACYC184 para transformación simultánea con las fusiones GPCR-proteína G anteriores.

Ejemplo 21. direccionamiento de membrana modular y solubilización de construcciones de expresión

Para producir proteínas de membrana de forma eficaz en minicélulas puede ser necesario crear fusiones quiméricas

con la proteína de membrana de interés. En este Ejemplo se han clonado varias regiones de la proteína MalE en un

sistema de expresión modular diseñado para crear fusiones quiméricas con proteínas de membrana difíciles de

5 convertir en diana para producir dominios líder que dirijan las proteínas hacia la membrana citoplasmática ( Miller, K.,

W., y col., 1998. Production of active chimeric pediocin AcH in Escherichia coli in the absence of processing and

secretion genes from the Pediococcus pap operon. Appl. Environ. Microbiol. 64:14-20). De igual forma, también se

ha clonado una versión modificada de la proteína TrxA en este sistema de expresión modular para crear fusiones

quiméricas con proteínas que son difíciles de mantener en una conformación soluble (LaVallie, E. R., y col., 1993. A 10 thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm.

Biotechnology (N. Y.) 11:187-193). La Tabla 25 describe cada una de estas construcciones modulares.

Tabla 25. direccionamiento de membrana modular y solubilización de construcciones de expresión

Proteína a

Construcción a SEC ID Nº

MalE (1-28)

NsiI-MalE(1-28)-Factor Xa-PstI, SalI, XbaI-FLAG, NheI 248

MalE (1-370, del 354-364)

NsiI-MalE(1-370, del 354-364)-Factor Xa-PstI, SalI, XbaI-FLAG, Nhel 249

TrxA (2-109, del 103-107)

PstI, SalI, XbaI-TrxA(2-109, del 103-107)-FLAG-NheI 250

MalE (1-28)-TrxA (2-109, del 103107)

NsiI-MalE(1-28)-Factor Xa-PstI, SalI, XbaI-TrxA (2-109 del 103-107)-FLAG, Nhel 251

MalE (1-370, del 354-364)-TrxA (2-109, del 103-107)

NsiI-MalE(1-370, del 354-364)-Factor Xa-PstI, SalI, XbaI-TrxA (2-109 del 103-107)-FLAG, NheI 252

a. El término "del" se refiere a una deleción en la que los restos de aminoácidos posteriores al término "del" se han eliminado de la secuencia.

Tabla 26. secuencias de cebadores oligonucleotídicos para la tabla 31.

SEC ID Nº:

Nombre del cebador secuencia de 5' a 3'

253

MalE-1-NsiI

254

MalE-2-middle

255

MalE-3s-NheI

256

MalE-4-NheI

257

MalE-1a

258

MalE-2a

259

MalE-1-NsiI

260

MalE-2-NheI

35 (continuación)

SEC ID Nº:

Nombre del cebador secuencia de 5' a 3'

261

MalE-3L-NheI

262

TrxA-1a

263

TrxA-2a

264

TrxA-1a-PstI

265

TrxA-2-NheI

Los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 253, 254, 255 y 256 solapan entre sí para formar un molde estructural para amplificar malE (1-28) mediante PCR para crear la SEC ID Nº: 248. Tras la amplificación mediante PCR, la SEC ID Nº:248 se digirió con Nsil y Nhel y se clonó en las SEC ID Nº:152, 154, 139 y 141 digeridas con Pstl y Xbal. Los productos resultantes crean las SEC ID Nº: 266, 267, 268 y 269, respectivamente, que pierden tanto el sitio de restricción Pstl en 5 prima como el sitio de restricción Xbal en 3 prima y retienen los sitios de restricción Pstl, Sall, y Xbal situados entre MalE (1-28) y la secuencia FLAG. La inserción de una proteína alineada con estos sitios da como resultado una proteína quimérica que contiene un MalE (1-28) en el extremo amino y una FLAG en el extremo carboxi.

Los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 257, 258, 259 y 260 se usaron para amplificar malE (1-370 con una deleción que elimina los restos 354-364) para crear la SEC ID Nº: 249. Tras la amplificación mediante PCR, la SEC ID Nº:249 se digirió con Nsil y Nhel y se clonó en las SEC ID Nº: 152, 154, 139 y 141 digeridas con Pstl y Xbal. Los productos resultantes crean las SEC ID Nº: 270, 271, 272 y 273, respectivamente, que pierden tanto el sitio de restricción Pstl en 5 prima como el sitio de restricción Xbal en 3 prima y retienen los sitios de restricción Pstl, SalI, y Xbal situados entre MalE (1-370, del 354-364) y la secuencia FLAG. La inserción de una proteína alineada con estos sitios da como resultado una proteína quimérica que contiene un MalE en el extremo amino (1-370, del 354-364) y una FLAG en el extremo carboxi.

Los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 262, 263, 264 y 265 se usaron para amplificar txrA (2-109 con una deleción que elimina los restos 103-107) para crear la SEC ID Nº: 250. Tras la amplificación mediante PCR, la SEC ID Nº:250 se digirió con Pstl y Nhel y se clonó en las SEC ID Nº: 152, 154, 139 y 141 digeridas con PstI y XbaI. para crear las SEC ID Nº:: 274, 275.276 y 277, respectivamente. Usando estas combinaciones de digestión con restricción se consigue la pérdida del sitio de inserción Xbal con SEC ID Nº: 249.

Los productos resultantes crean las SEC ID Nº: 274, 275, 276 y 277, respectivamente, que pierden el sitio de restricción Xbal en 3 prima y retienen los sitios de restricción Pstl, Sall, Xbal en el extremo 3 prima de la secuencia TrxA (1-109, del 103-107) . La inserción de una proteína alineada con estos sitios da como resultado una proteína quimérica que contiene un TrxA en el extremo carboxi (1-109, del 103-107)-FLAG.

La SEC ID Nº:248 se digirió con Nsil y Xbal y se clonó en las SEC ID Nº: 274, 275, 276 y 277 digeridas con Pstl y Xbal. Los productos resultantes crean las SEC ID Nº: 278, 279, 280 y 281, respectivamente, que pierden el sitio de restricción Pstl en 5 prima y retienen los sitios de restricción Pstl, Sall, y Xbal situados entre MalE (1-28) y TxrA (1109, del 103-107). La inserción de una proteína alineada con estos sitios da como resultado una proteína quimérica que contiene un MalE (1-28) en el extremo amino y una TxrA en el extremo carboxi (1-109, del 103-107)-FLAG.

La SEC ID Nº:249 se digirió con Nsil y Xbal y se clonó en las SEC ID Nº: 274, 275, 276 y 277 digeridas con Pstl y Xbal. Los productos resultantes crean las SEC ID Nº: 282, 283, 284 y 285, respectivamente, que pierden el sitio de restricción Pstl en 5 prima y retienen los sitios de restricción Pstl, Sall, y Xbal situados entre MalE (1-370, del 354364) y TrxA (1-109, del 103-107). La inserción de una proteína alineada con estos sitios da como resultado una proteína quimérica que contiene un MalE en el extremo amino (1-370, del 354-364) y TrxA en el extremo carboxi (1109, del 103-107)-FLAG.

Los contenidos de los artículos, patentes, y solicitudes de patente, y todos los demás documentos e información disponible electrónicamente mencionada o citada en el presente documento, se incorporan al presente documento por referencia en su totalidad en la misma medida que si se indicase específica e individualmente que cada publicación se incorpora por referencia. Los solicitantes se reservan el derecho a incorporar físicamente a esta solicitud cualquiera y todos los materiales e información de cualquiera de dichos artículos, patentes, solicitudes de patente, u otros documentos.

La invención descrita ilustrativamente en el presente documento se puede realizar de forma adecuada en ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones, no descritos específicamente en el presente documento. Por lo tanto, por ejemplo, las expresiones "que comprende", "que incluye", "que contiene", etc. deben tomarse de forma amplia y sin limitación. Además, los términos y expresiones usados en el presente documento se han usado como términos de descripción y no de limitación, y no existe intención de que el uso de dichos términos y expresiones excluya cualquier equivalente o equivalentes de las características mostradas y descritas o en partes de las mismas, aunque se reconoce que son posibles varias modificaciones comprendidas en el ámbito de la invención reivindicada. Por lo tanto, se entenderá que aunque la presente invención se haya descrito específicamente de acuerdo con realizaciones preferidas y características opcionales, un experto en la materia puede imaginar modificaciones y variaciones en las invenciones realizadas en las mismas descritas en el presente documento, y dichas modificaciones y variaciones se consideran comprendidas en el ámbito de la presente invención.

La invención se ha descrito de forma amplia y genérica en el presente documento. Cada una de las especies más restringidas y agrupaciones subgenéricas comprendidas en la descripción genérica también forman parte de la invención. Esto incluye la descripción general de la invención con una eliminación de condiciones o limitaciones negativas sobre ninguna materia sujeto del género, sin tener en cuenta si el material completo o incompleto se ha citado específicamente en el presente documento.

Otras realizaciones se encuentran incluidas en las siguientes reivindicaciones. Además, cuando las características o aspectos de la invención se han descrito en términos de grupos de Markush, los expertos en la materia reconocerán que la invención también queda descrita, por tanto, en términos de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo de Markush.

Los aspectos de la invención son

1.

Una minicélula que comprende una proteína de membrana seleccionada del grupo que consiste en una proteína de membrana eucariota, una proteína de membrana arqueobacteriana y una proteína de membrana organular.

2.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 1, en el que dicha minicélula se selecciona del grupo que consiste en una minicélula eubacteriana, un poroplasto, un esferoplasto y un protoplasto.

3.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 1, el que dicha minicélula comprende un compuesto biológicamente activo.

4.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 1, en el que dicha minicélula comprende una construcción de expresión, en la que dicha primera construcción de expresión comprende secuencias de expresión unidas operativamente a un ORF que codifica una proteína.

5.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 4, en el que dicho ORF codifica dicha proteína de membrana.

6.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 4, en el que dichas secuencias de expresión que están unidas operativamente a un ORF son inducibles y/o represibles.

7.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 4, en el que dicha minicélula comprende una segunda construcción de expresión, en la que dicha segunda construcción de expresión comprende secuencias de expresión unidas operativamente a un gen.

8.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 7, en el que dichas secuencias de expresión que están unidas operativamente a un gen son inducibles y/o represibles.

9.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 7, en el que el producto génico de dicho gen regula la expresión del ORF que codifica dicha proteína.

10.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 7, en el que el producto génico de dicho gen es un ácido nucleico.

11.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 7, en el que el producto génico de dicho gen es un polipéptido.

12.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 11, en el que dicho polipéptido es una proteína de membrana, una proteína soluble o una proteína secretada.

13.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 12, en el que dicha proteína de membrana es una proteína de fusión de membrana, comprendiendo dicha proteína de fusión de membrana un primer polipéptido, comprendiendo

dicho primer polipéptido al menos un dominio transmembrana o al menos un dominio de anclaje a membrana; y un segundo polipéptido.

14.

Una minicélula que comprende una proteína de fusión de membrana, comprendiendo dicha proteína de fusión un primer polipéptido, comprendiendo dicho primer polipéptido al menos un dominio transmembrana o al menos un dominio de anclaje a membrana; y un segundo polipéptido, en el que dicho segundo polipéptido no se deriva de una proteína eubacteriana y no es ni un marcador His o un polipéptido de glutatión-S-transferasa,

15.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 14, en el que dicha minicélula se selecciona del grupo que consiste en una minicélula eubacteriana, un poroplasto, un esferoplasto y un protoplasto.

16.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 14, el que dicha minicélula comprende un compuesto biológicamente activo.

17.

Una minicélula que comprende un conjugado de membrana, en el que dicho conjugado de membrana comprende una proteína de membrana unida químicamente a un compuesto conjugado.

18.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 17, en el que dicha minicélula se selecciona del grupo que consiste en una minicélula eubacteriana, un poroplasto, un esferoplasto y un protoplasto.

19.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 17, el que dicha minicélula comprende un compuesto biológicamente activo.

20.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 17, en el que dicho compuesto conjugado se selecciona del grupo que consiste en un ácido nucleico, un polipéptido, un lípido y una molécula pequeña.

21.

Un procedimiento para producir minicélulas, que comprende (a) cultivar una célula progenitora que produce minicélulas, en el que dicha célula progenitora comprende una construcción de expresión, en la que dicha construcción de expresión comprende un gen unido operativamente a secuencias de expresión que son inducibles o represibles, y en el que la inducción o la represión de dicho gen causa o potencia la producción de minicélulas; y (b( separar dichas minicélulas de dicha célula progenitora, generando de este modo una composición que comprende minicélulas, en la que está presente dicho inductor o represor en las células progenitoras durante una o más etapas y/o entre dos o más etapas de dicho procedimiento.

22.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 21, que además comprende (c) purificar dichas minicélulas a partir de dicha composición.

23.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 21, en el que dicha minicélula se selecciona del grupo que consiste en una minicélula eubacteriana, un poroplasto, un esferoplasto y un protoplasto.

24.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 21, en el que dicho gen expresa un producto génico que es un factor que está implicado en o modula la replicación de ADN, la división celular, el reparto celular, la separación, la transcripción, la traducción, o el plegamiento de proteínas.

25.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 21, en el que dichas minicélulas se separan de dichas células progenitoras mediante un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en centrifugación, ultracentrifugación, graduación de densidad, inmunoafinidad e inmunoprecipitación.

26.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 22, en el que dicha minicélula es un poroplasto, comprendiendo dicho procedimiento además (d) tratar dichas minicélulas con un agente, o incubar dichas minicélulas en un conjunto de condiciones que degradan la membrana externa de dicha minicélula.

27.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 26, en el que dicha membrana externa se degrada mediante tratamiento con un agente seleccionado del grupo que consiste en EDTA, EGTA, ácido láctico, ácido cítrico, ácido glucónico, ácido tartárico, polietilenimina, péptidos policatiónicos, péptidos catiónicos de leucocitos, aminoglucósidos, aminoglucósidos, protamina, cecropinas de insecto, magaininas de reptil, polímeros de aminoácidos básicos, polimixina B, cloroformo, ácido nitrilotriacético y hexametafosfato de sodio y/o mediante exposición a condiciones seleccionadas del grupo que consiste en choque osmótico e insonación.

28.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 26, comprende además eliminar uno o más contaminantes de dicha composición.

29.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 28, en el que dicho contaminante es LPS o peptidoglucano.

30.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 29, en el que se elimina dicho LPS poniendo en contacto dicha composición con un agente que se une a o degrada el LPS.

31.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 21, en el que dicha célula progenitora productora de minicélulas comprende una mutación en un gen necesario para la síntesis de lipopolisacárido.

32.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 22, en el que dicha minicélula es un esferoplasto, comprendiendo dicho procedimiento además (d) tratar dichas minicélulas con un agente, o incubar dichas minicélulas en un conjunto de condiciones que rompe o degrada la membrana externa; y (e) tratar a dichas minicélulas con un agente, o incubar dichas minicélulas en un conjunto de condiciones que rompe o degrada la pared celular.

33.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 32, en el que dicho agente que rompe o degrada la pared celular es una lisozima, y dicho conjunto de condiciones que rompe o degrada la pared celular es incubación en una solución hipertónica.

34.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 22, en el que dicha minicélula es un protoplasto, comprendiendo dicho procedimiento además (d) tratar dichas minicélulas con un agente, o incubar dichas minicélulas en un conjunto de condiciones que rompen o degradan la membrana externa; (e) tratar a dichas minicélulas con un agente, o incubar dichas minicélulas en un conjunto de condiciones que rompen o degradan la pared celular, para generar una composición que comprende protoplastos; y purificar protoplastos a partir de dicha composición.

35.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 22, que además comprende preparar una minicélula denudada a partir de dicha minicélula.

36.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 22, que además comprende enlazar covalentemente o no covalentemente uno o más componentes de dicha minicélula a un resto conjugado.

37.

Un procedimiento para preparar una minicélula de forma L que comprende:

(a)

cultivar una eubacteria de forma L, en el que dicha eubacteria comprende uno o más de los siguientes:

(i)

un elemento de expresión que comprende un gen unido operativamente a secuencias de expresión que son inducibles y/o represibles, en el que la inducción o represión de dicho gen regula el número de copias de una construcción de expresión episómica;

(ii)

una mutación en un gen endógeno, en la que dicha mutación regula el número de copias de una construcción de expresión episómica;

(iii) un elemento de expresión que comprende un gen unido operativamente a secuencias de expresión que son inducibles y/o represibles, en el que la inducción o represión de dicho gen causa o potencia la producción de minicélulas; y

(iv)

una mutación en un gen endógeno, en el que dicha mutación causa o potencia la producción de minicélulas.

(b)

cultivar dicha célula progenitora productora de minicélulas de forma L en condiciones en las que se producen las minicélulas; y (c) separar dichas minicélulas de dicha célula progenitora, generando de este modo una composición que comprende minicélulas de forma L, en la que está presente dicho inductor o represor en dichas minicélulas durante una o más etapas y/o entre dos o más etapas de dicho procedimiento.

38.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 37, que además comprende (d) purificar dichas minicélulas de forma L a partir de dicha composición.

39.

Un procedimiento para producir una proteína, que comprende: (a) transformar una célula progenitora productora de minicélulas con un elemento de expresión que comprende secuencias de expresión unidas operativamente a un ácido nucleico que tiene un ORF que codifica dicha proteína; (b) cultivar dicha célula progenitora productora de minicélulas en condiciones en las que se producen minicélulas; y (c) purificar las minicélulas de dicha célula progenitora, (d) purificar dicha proteína de dichas minicélulas, en el que dicho ORF se expresa durante la etapa (b), entre las etapas (b) y (c), y durante la etapa (c).

40.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 39, en el que dichos elementos de expresión se segregan en dichas minicélulas, y dicho ORF se expresa entre las etapas (c) y (d).

41.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 39, en el que dicha proteína es una proteína de membrana.

42.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 39, en el que dicha proteína es una proteína soluble contenida en dichas minicélulas, que además comprende: (e) lisar al menos parcialmente dichas minicélulas.

43.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 39, en el que dicha proteína es una proteína secretada, en el que dicho procedimiento comprende además (e) recoger una composición en la que dichas minicélulas están suspendidas o con la que dichas minicélulas están en contacto.

44.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 39, en el que las secuencias de expresión a las que está unido

operativamente dicho ORF son inducibles, en el que dicho procedimiento comprende además añadir un agente inductor entre las etapas (a) y (b); durante la etapa (b); y entre las etapas (b) y (c).

45.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 39, en el que las secuencias de expresión a las que está unido operativamente dicho ORF son inducibles, en el que dichos elementos de expresión se segregan en dichas minicélulas, dicho procedimiento comprende además añadir un agente inductor después de la etapa (c).

46.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 39, que además comprende: (e) preparar poroplastos a partir de dichas minicélulas, en el que dicho ORF se expresa durante la etapa (b); entre las etapas (b) y (c); durante la etapa (c); entre la etapa (c) y la etapa (d) cuando dichos elementos de expresión se segregan en dichas minicélulas; y/o después de la etapa (d) cuando dichos elementos de expresión se segregan en dichas minicélulas.

47.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 46, que además comprende: purificar dicha proteína de dichos poroplastos.

48.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 39, que además comprende (e) preparar esferoplastos a partir de dichas minicélulas, en el que dicho ORF se expresa durante la etapa (b), entre las etapas (b) y (c), durante la etapa (c), entre las etapas (c) y (d) y/o después de la etapa (d).

49.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 48, que además comprende: purificar dicha proteína de dichos esferoplastos.

50.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 39, que además comprende (e) preparar protoplastos a partir de dichas minicélulas, en el que dicho ORF se expresa durante la etapa (b), entre las etapas (b) y (c), durante la etapa (c), entre las etapas (c) y (d) y/o después de la etapa (d).

51.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 50, que además comprende: (f) purificar dicha proteína a partir de dichos protoplastos.

52.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 39, que además comprende (e) preparar preparaciones de membrana a partir de dichas minicélulas, en el que dicho ORF se expresa durante la etapa (b), entre las etapas

(b) y (c), durante la etapa (c), entre las etapas (c) y (d) y/o después de la etapa (d).

53.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 48, que además comprende: purificar dicha proteína de dichas preparaciones de membrana.

54.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 39, en el que dicha célula progenitora productora de minicélulas es una bacteria de forma L.

55.

Un procedimiento para producir una proteína, que comprende: (a) transformar minicélula con un elemento de expresión que comprende secuencias de expresión unidas operativamente a un ácido nucleico que tiene un ORF que codifica dicha proteína; y (b) incubar dichas minicélulas en condiciones en las que se expresa dicho ORF.

56.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 55, que además comprende: (c) purificar dicha proteína a partir de dichas minicélulas.

57.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 55, en el que dicha minicélula se selecciona del grupo que consiste en una minicélula eubacteriana, un poroplasto, un esferoplasto y un protoplasto.

58.

Un procedimiento para producir una proteína, que comprende: (a) transformar una célula progenitora productora de minicélulas con un elemento de expresión que comprende secuencias de expresión unidas operativamente a un ácido nucleico que tiene un ORF que codifica una proteína de fusión que comprende dicha proteína y un polipéptido; en el que se sitúa una secuencia de aminoácidos sensible a proteasas entre dicha proteína y dicho polipéptido; (b) cultivar dicha célula progenitora productora de minicélulas en condiciones en las que se producen minicélulas; (c) purificar minicélulas a partir de dicha célula progenitora, en el que dicho ORF se expresa durante la etapa (b); entre las etapas (b) y (c); y/o después de la etapa (c) cuando dichos elementos de expresión se segregan en dichas minicélulas; y (d) tratar dichas minicélulas con una proteasa que escinde dicha secuencia de aminoácidos sensible, separando de este modo dicha proteína de dicho polipéptido.

59.

Un poroplasto, comprendiendo dicho poroplasto una vesícula, unida mediante una membrana, en la que dicha membrana es una membrana interna eubacteriana, en la que dicha vesícula está rodeada por una pared celular eubacteriana, y en la que dicha membrana interna eubacteriana está accesible para un compuesto en solución con dicho poroplasto.

60.

El poroplasto de acuerdo con el aspecto 59, en el que dicho poroplasto es un poroplasto celular.

61.

El poroplasto de acuerdo con el aspecto 59, en el que dicho compuesto tiene un peso molecular de al menos 1 kD.

62.

El poroplasto de acuerdo con el aspecto 59, en el que dicho poroplasto comprende un ácido nucleico exógeno.

63.

El poroplasto de acuerdo con el aspecto 62, en el que dicho ácido nucleico exógeno es una construcción de expresión.

64.

El poroplasto de acuerdo con el aspecto 63, en el que dicha construcción de expresión comprende un ORF que codifica una proteína exógena, en el que dicho ORF está unido operativamente a secuencias de expresión.

65.

El poroplasto de acuerdo con el aspecto 64, en el que dicho poroplasto comprende una proteína exógena.

66.

El poroplasto de acuerdo con el aspecto 59, en el que dicho poroplasto comprende una proteína exógena.

67.

El poroplasto de acuerdo con el aspecto 66, en el que dicha proteína exógena es una proteína de fusión, una proteína soluble o una proteína secretada.

68.

El poroplasto de acuerdo con el aspecto 66, en el que dicha proteína exógena es una proteína de membrana.

69.

El poroplasto de acuerdo con el aspecto 68, en el que dicha proteína de membrana está accesible a compuestos en solución con dicho poroplasto.

70.

El poroplasto de acuerdo con el aspecto 68, en la que dicha proteína de membrana se selecciona del grupo que consiste en una proteína de membrana eucariota, una proteína de membrana arqueobacteriana; y una proteína de membrana organular.

71.

El poroplasto de acuerdo con el aspecto 68, en el que dicha proteína de membrana es una proteína de fusión, comprendiendo dicha proteína de fusión un primer polipéptido, comprendiendo dicho primer polipéptido al menos un dominio transmembrana o al menos un dominio de anclaje a membrana; y un segundo polipéptido, en el que dicho segundo polipéptido se muestra por dicho poroplasto.

72.

El poroplasto de acuerdo con el aspecto 71, en el que dicho segundo polipéptido se muestra sobre el lado externo de dicha membrana interna eubacteriana.

73.

El poroplasto de acuerdo con el aspecto 59, en el que dicho poroplasto comprende un componente de membrana que está unido químicamente a un compuesto conjugado.

74.

El poroplasto de acuerdo con el aspecto 64, en el que dicha construcción de expresión comprende uno o más fragmentos de ADN de un genoma o ADNc.

75.

El poroplasto de acuerdo con el aspecto 64, en el que dicha proteína exógena tiene una secuencia de aminoácidos primaria que se predice mediante la traducción asistida por ordenador de una secuencia de ácidos nucleicos.

76.

Un procedimiento para preparar poroplastos o poroplastos celulares, que comprende tratar minicélulas o células eubacterianas con un agente, o incubar dichas minicélulas o células en un conjunto de condiciones que degradan la membrana externa de dichas minicélulas o células.

77.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 76, que comprende además purificar dichos poroplastos o poroplastos celulares para eliminar contaminantes.

78.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 76, que además comprende poner dichos poroplastos en una solución hipertónica, en el que el 90 % o más de dichas células o minicélulas usadas para preparar dichos poroplastos se lisarán en dicha solución en las mismas condiciones.

79.

Un soporte sólido que comprende una minicélula.

80.

El soporte sólido de acuerdo con el aspecto 79, en el que dicha minicélula se selecciona del grupo que consiste en una minicélula eubacteriana, un poroplasto, un esferoplasto y un protoplasto.

81.

El soporte sólido de acuerdo con el aspecto 79, en el que dicho soporte sólido es una varilla.

82.

El soporte sólido de acuerdo con el aspecto 79, en el que dicho soporte sólido es una perla.

83.

El soporte sólido de acuerdo con el aspecto 79, en el que dicho soporte sólido es una placa multipocillo de microtitulación.

84.

El soporte sólido de acuerdo con el aspecto 79, en el que dicha minicélula comprende un compuesto detectable.

85.

El soporte sólido de acuerdo con el aspecto 84, en el que dicho compuesto detectable es un compuesto

fluorescente.

86.

El soporte sólido de acuerdo con el aspecto 79, en el que dicha minicélula muestra un componente de membrana.

87.

El soporte sólido de acuerdo con el aspecto 86, en el que dicho componente de membrana se selecciona del grupo que consiste en (i) una proteína de membrana eucariota, (ii) una proteína de membrana arqueobacteriana,

(iii) una proteína de membrana organular, (iv) una proteína de fusión que comprende al menos un dominio transmembrana o al menos un dominio de anclaje a membrana, y (v) un conjugado de membrana que comprende un componente de membrana unido químicamente a un compuesto conjugado.

88.

El soporte sólido de acuerdo con el aspecto 86, en el que dicho componente de membrana es un receptor.

89.

El soporte sólido de acuerdo con el aspecto 87, en el que dicho soporte sólido comprende además un coreceptor.

90.

El soporte sólido de acuerdo con el aspecto 79, en la que dicha minicélula muestra un resto de unión.

91.

Un soporte sólido que comprende una minicélula, en el que dicha minicélula muestra una proteína de fusión, comprendiendo dicha proteína de fusión un primer polipéptido que comprende al menos un dominio transmembrana o al menos un dominio de anclaje a membrana, y un segundo polipéptido.

92.

El soporte sólido de acuerdo con el aspecto 91, en el que dicha minicélula se selecciona del grupo que consiste en una minicélula eubacteriana, un poroplasto, un esferoplasto y un protoplasto.

93.

El soporte sólido de acuerdo con el aspecto 91, en el que dicho segundo polipéptido comprende un resto de unión.

94.

El soporte sólido de acuerdo con el aspecto 91, en el que dicho segundo polipéptido comprende un resto enzimático.

95.

Un soporte sólido que comprende una minicélula, en el que dicha minicélula comprende un conjugado de membrana que comprende un componente de membrana unido químicamente a un compuesto conjugado.

96.

El soporte sólido de acuerdo con el aspecto 95, en el que dicho compuesto conjugado es un espaciador.

97.

El soporte sólido de acuerdo con el aspecto 96, en el que dicho espaciador está unido covalentemente a dicho soporte sólido.

98.

El soporte sólido de acuerdo con el aspecto 95, en el que dicho compuesto conjugado está unido covalentemente a dicho soporte sólido.

99.

Una minicélula que comprende un compuesto biológicamente activo, en la que dicha minicélula muestra un resto de unión, en la que dicho resto de unión es parte de una proteína de fusión que comprende un primer polipéptido que comprende al menos un dominio transmembrana o al menos un dominio de anclaje a membrana y un segundo polipéptido que comprende un resto de unión, y dicha minicélula es un poroplasto, un esferoplasto

o un protoplasto.

100.

Una minicélula eubacteriana que comprende un compuesto biológicamente activo, en la que dicha minicélula muestra un resto de unión, en el que dicho resto de unión se selecciona del grupo que consiste en (a) una proteína de membrana eucariota; (b) una proteína de membrana arqueobacteriana; (c) una proteína de membrana organular; y (d) una proteína de fusión, comprendiendo dicha proteína de fusión un primer polipéptido, comprendiendo dicho primer polipéptido al menos un dominio transmembrana o al menos un dominio de anclaje a membrana; y un segundo polipéptido, en el que el segundo polipéptido no se deriva de una proteína eubacteriana y no es ni un marcador His o un polipéptido de glutatión-S-transferasa, y en el que dicho polipéptido comprende un resto de unión.

101.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 99, en el que dicho resto de unión se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un derivado de anticuerpo, un receptor y un sitio activo de un derivado no catalítico de una enzima.

102.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 99, en el que dicho resto de unión es un anticuerpo monocatenario.

103.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 99, en el que dicho resto de unión se dirige a un ligando seleccionado del grupo que consiste en un epítopo mostrado en un patógeno, un epítopo mostrado en una célula infectada y un epítopo mostrado en una célula hiperproliferativa.

104.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 99, en el que dicho compuesto biológicamente activo se selecciona del grupo que consiste en un radioisótopo, un polipéptido, un ácido nucleico y una molécula pequeña.

105.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 99, que además comprende un primer y un segundo ácido nucleico, en la que dicho primer ácido nucleico comprende secuencias de expresión de eucariota unidas operativamente a un primer ORF, y un segundo ácido nucleico, en el que dicho segundo ácido nucleico comprende secuencias de expresión eubacterianas unidas operativamente a un segundo ORF.

106.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 105, en la que uno de dichos ORF codifica una proteína que comprende el resto de unión.

107.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 105, en la que dichas secuencias de expresión en eubacterias se inducen y/o

desreprimen cuando dicho resto de unión se pone en contacto con una célula diana.

108.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 105, en la que dichas secuencias de expresión eucariotas se inducen y/o desreprimen cuando dicho ácido nucleico está en el citoplasma de una célula eucariota.

109.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 105, en la que la proteína codificada por dicho primer ORF comprende secuencias de secreción eucariotas y/o la proteína codificada por dicho segundo ORF comprende secuencias de secreción eubacterianas.

110.

Un procedimiento para asociar un compuesto radiactivo con una célula, en el que dicha célula muestra un ligando reconocido específicamente por un resto de unión, que comprende poner en contacto dicha célula con una minicélula que comprende dicho compuesto radiactivo y muestra dicho resto de unión.

111.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 110, en el que dicha minicélula se selecciona del grupo que consiste en una minicélula eubacteriana, un poroplasto, un esferoplasto y un protoplasto.

112.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 110, en el que la cantidad de radiación emitida por dicho isótopo radiactivo es suficiente para que sea detectable.

113.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 110, en el que la cantidad de radiación emitida por dicho isótopo radiactivo es suficiente para que sea citotóxico.

114.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 110, en el que dicho ligando mostrado por dicha célula se selecciona del grupo que consiste en un epítopo mostrado en un patógeno, un epítopo mostrado en una célula infectada y un epítopo mostrado en una célula hiperproliferativa.

115.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 110, en el que dicho resto de unión se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un derivado de anticuerpo, una proteína de canal y un receptor.

116.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 110, en el que dicho resto de unión es un anticuerpo monocatenario.

117.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 110, en el que dicho resto de unión se selecciona del grupo que consiste en un aptámero y una molécula pequeña,

118.

Un procedimiento para administrar un compuesto biológicamente activo a una célula, en el que dicha célula muestra un ligando reconocido específicamente por un resto de unión, que comprende poner en contacto dicha célula con una minicélula que muestra el resto de unión, el que dicha minicélula comprende dicho compuesto biológicamente activo. y en el que los contenidos de dicha minicélula se administran al interior de dicha célula a partir de una minicélula unida a dicha célula.

119.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 118, en el que dicha minicélula se selecciona del grupo que consiste en una minicélula eubacteriana, un poroplasto, un esferoplasto y un protoplasto.

120.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 118, en el que dicho compuesto biológicamente activo se selecciona del grupo que consiste en un ácido nucleico, un lípido, un polipéptido, un compuesto radiactivo, un ion y una molécula pequeña.

121.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 118, en el que la membrana de dicha minicélula comprende un sistema para transferir una molécula del interior de una minicélula al citoplasma de dicha célula.

122.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 121, en el que dicho sistema para transferir una molécula del interior de una minicélula al citoplasma de dicha célula es un sistema de secreción de tipo III.

123.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 118, en el que dicha minicélula comprende además un primer y un segundo ácido nucleico, en la que dicho primer ácido nucleico comprende secuencias de expresión de eucariota unidas operativamente a un primer ORF, y un segundo ácido nucleico, en el que dicho segundo ácido nucleico comprende secuencias de expresión eubacterianas unidas operativamente a un segundo ORF.

124.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 123, en la que uno de dichos ORF codifica una proteína que comprende el resto de unión.

125.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 123, en el que dichas secuencias de expresión eubacterianas se inducen y/o desreprimen cuando el resto de unión está en contacto con dicha célula diana.

126.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 123, en la que dichas secuencias de expresión eucariotas se inducen y/o desreprimen cuando dicho ácido nucleico está en el citoplasma de una célula eucariota.

127.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 123, en la que la proteína codificada por dicho primer ORF comprende secuencias de secreción eucariotas y/o la proteína codificada por dicho segundo ORF comprende secuencias de secreción eubacterianas.

128.

Una minicélula que muestra un resto de unión sintético, en la que dicho resto de unión sintético está unido covalentemente o no covalentemente a un componente de membrana de dicha minicélula.

129.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 128, en el que dicha minicélula se selecciona del grupo que consiste en una minicélula eubacteriana, un poroplasto, un esferoplasto y un protoplasto.

130.

Una minicélula estabilizada estéricamente que comprende un resto mostrado que tiene una semivida in vivo más larga que una minicélula de tipo silvestre, en la que dicho resto mostrado es un polímero hidrófilo que comprende un resto de PEG, un grupo carboxílico de un polialquilenglicol o estearato de PEG.

131.

Una minicélula que tiene una membrana que comprende un lípido exógeno, en la que dicha minicélula que comprende el lípido exógeno tiene una semivida in vivo más larga que dicha minicélula que carece del lípido exógeno, y en la que dicha minicélula se selecciona del grupo que consiste en una minicélula eubacteriana, un poroplasto, un esferoplasto y un protoplasto.

132.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 131, en la que dicho lípido exógeno es un lípido derivatizado.

133.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 132, en el que dicho lípido derivatizado se selecciona del grupo que consiste en fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG, DSPE-PEG, estearato de PEG, fosfolípidos derivatizados con PEG, y ceramidas de PEG es DSPE-PEG.

134.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 131, en el que dicho lípido exógeno no está presente en una membrana de tipo silvestre, o está presente en una proporción a la encontrada en las minicélulas que comprenden una membrana de tipo silvestre. 135. La minicélula de acuerdo con el aspecto 134, en el que dicho lípido exógeno se selecciona del grupo que consiste en gangliósido, esfingomielina, monosialogangliósido GM1, sulfato de galactocerebrósido, 1,2-sn-dimiristoilfosfatidilcolina, fosfatidilinositol y cardiolipina.

136.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 128, en el que dicho resto enlazante está unido no covalentemente a la minicélula.

137.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 136, en el que uno de dicho resto enlazante y dicho componente de membrana comprende biotina, y el otro comprende avidina o estreptavidina.

138.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 128, en el que dicho resto enlazante sintético es un reticulante.

139.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 128, en la que dicho reticulador es un reticulador bifuncional.

140.

Un procedimiento para transferir una proteína de membrana de una membrana de minicélula a una membrana biológica que comprende poner en contacto una minicélula con dicha membrana biológica, en el que dicha membrana de la minicélula comprende dicha proteína de membrana, y permitir que dicha minicélula y dicha membrana biológica permanezca en contacto durante un periodo de tiempo suficiente para que suceda dicha transferencia.

141.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 140, en el que dicha minicélula se selecciona del grupo que consiste en una minicélula eubacteriana, un poroplasto, un esferoplasto y un protoplasto.

142.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 140, en el que la membrana biológica es una membrana citoplasmática o una membrana organular.

143.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 140, en el que dicha la membrana biológica es una membrana seleccionada del grupo que consiste en una membrana de un patógeno, una membrana de una célula infectada y una membrana de una célula hiperproliferativa.

144.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 140, en el que dicha membrana biológica es la membrana citoplasmática de una célula receptora.

145.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 144, en el que dicha célula receptora se selecciona entre el grupo que consiste de una célula cultivada y una célula de un organismo.

146.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 140, en el que la membrana biológica se presenta en una célula que se ha retirado de un animal, dicho contacto sucede in vitro, tras lo cual dicha célula se devuelve a dicho organismo.

147.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 144, en el que dicha proteína de membrana es una enzima.

148.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 147, en el que dicha proteína de membrana que tiene actividad enzimática se selecciona del grupo que consiste en un citocromo P450 y una proteína de fusión, comprendiendo dicha proteína de fusión un primer polipéptido, comprendiendo dicho primer polipéptido al menos un polipéptido, en el que dicho segundo polipéptido tiene actividad enzimática.

149.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 140, en el que dicha proteína de membrana es una proteína de fusión de membrana, comprendiendo dicha proteína de fusión de membrana un primer polipéptido, comprendiendo dicho primer polipéptido al menos un dominio transmembrana o al menos un dominio de anclaje a membrana; y un segundo polipéptido.

150.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 149, en el que dicho segundo polipéptido es una polipéptido biológicamente activo.

151.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 140, en la que dicha minicélula muestra un resto de unión.

152.

Una minicélula que comprende una construcción de expresión que comprende un ORF que codifica una proteína de membrana unida operativamente a secuencias de expresión, en la que dichas secuencias de expresión se inducen y/o desreprimen cuando dicha minicélula está en contacto con una célula diana.

153.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 152, en el que dicha minicélula se selecciona del grupo que consiste en una minicélula eubacteriana, un poroplasto, un esferoplasto y un protoplasto.

154.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 152, en el que la membrana biológica es una membrana citoplasmática o una membrana organular.

155.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 152, en el que dicha la membrana biológica es una membrana seleccionada del grupo que consiste en una membrana de un patógeno, una membrana de una célula infectada y una membrana de una célula hiperproliferativa.

156.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 152, en la que dicha minicélula muestra un resto de unión.

157.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 156, en el que dicho resto de unión se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un derivado de anticuerpo, un aptámero y una molécula pequeña.

158.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 152, en el que dicha proteína de membrana es una proteína de fusión de membrana, comprendiendo dicha proteína de fusión de membrana un primer polipéptido, comprendiendo dicho primer polipéptido al menos un dominio transmembrana o al menos un dominio de anclaje a membrana; y un segundo polipéptido.

159.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 152, en el que dicha proteína de membrana que tiene actividad enzimática se selecciona del grupo que consiste en un citocromo P450 y una proteína de fusión, comprendiendo dicha proteína de fusión un primer polipéptido, comprendiendo dicho primer polipéptido al menos un polipéptido, en el que dicho segundo polipéptido tiene actividad enzimática.

160.

Una composición farmacéutica que comprende una minicélula, en la que dicha minicélula muestra una proteína de membrana, en la que dicha proteína de membrana se selecciona del grupo que consiste en una proteína de membrana eucariota, una proteína de membrana arqueobacteriana y una proteína de membrana organular.

161.

La composición farmacéutica de acuerdo con el aspecto 160, en el que dicha minicélula se selecciona del grupo que consiste en una minicélula eubacteriana, un poroplasto, un esferoplasto y un protoplasto.

162.

La composición farmacéutica de acuerdo con el aspecto 160, en la que dicha proteína de membrana se selecciona del grupo que consiste en un receptor, una proteína de canal, un factor de adhesión celular y una integrina.

163.

La formulación farmacéutica de acuerdo con el aspecto 162, en la que dicha formulación farmacéutica comprende además un adyuvante.

164.

La formulación farmacéutica de acuerdo con el aspecto 162, en la que dicha proteína de membrana

comprende un epítopo polipeptídico mostrado por una célula hiperproliferativa.

165.

La formulación farmacéutica de acuerdo con el aspecto 162, en la que dicha proteína de membrana comprende un epítopo mostrado por un patógeno eucariota, un patógeno arqueobacteriano, un virus o una célula infectada.

166.

Una composición farmacéutica que comprende una minicélula, en la que dicha minicélula muestra una proteína de membrana que es una proteína de fusión, comprendiendo dicha proteína de fusión un primer polipéptido, comprendiendo dicho primer polipéptido al menos un dominio transmembrana o al menos un dominio de anclaje a membrana; y (ii) un segundo polipéptido, en el que dicho segundo polipéptido no se deriva de una proteína eubacteriana.

167.

La composición farmacéutica de acuerdo con el aspecto 166, en el que dicha minicélula se selecciona del grupo que consiste en una minicélula eubacteriana, un poroplasto, un esferoplasto y un protoplasto.

168.

La formulación farmacéutica de acuerdo con el aspecto 167, en la que dicha formulación farmacéutica comprende además un adyuvante.

169.

La formulación farmacéutica de acuerdo con el aspecto 167, en la que dicho segundo polipéptido comprende un epítopo polipeptídico mostrado por una célula hiperproliferativa.

170.

La formulación farmacéutica de acuerdo con el aspecto 169, en la que dicha proteína de membrana comprende un epítopo mostrado por un patógeno eucariota, un patógeno arqueobacteriano, un virus o una célula infectada.

171.

Una composición farmacéutica que comprende una minicélula, en la que la minicélula muestra un conjugado de membrana, en el que dicho conjugado de membrana comprende un componente de membrana unido químicamente a un compuesto conjugado.

172.

La composición farmacéutica de acuerdo con el aspecto 171, en el que dicha minicélula se selecciona del grupo que consiste en una minicélula eubacteriana, un poroplasto, un esferoplasto y un protoplasto.

173.

La composición farmacéutica de acuerdo con el aspecto 171, en la que dicha proteína de membrana se selecciona del grupo que consiste en un receptor, una proteína de canal, un factor de adhesión celular y una integrina.

174.

La composición farmacéutica de acuerdo con el aspecto 171, en la que dicha formulación farmacéutica comprende un adyuvante.

175.

La composición farmacéutica de acuerdo con el aspecto 171, en la que dicho componente de membrana es un polipéptido que comprende al menos un dominio transmembrana o al menos un dominio de anclaje a membrana, o un lípido que es parte de una membrana.

176.

La composición farmacéutica de acuerdo con el aspecto 171, en el que dicho compuesto conjugado es un polipéptido. y el enlace químico entre dicho compuesto de membrana y dicho compuesto conjugado no es un enlace peptídico.

177.

La composición farmacéutica de acuerdo con el aspecto 171, en el que dicho compuesto conjugado es un ácido nucleico.

178.

La composición farmacéutica de acuerdo con el aspecto 171, en la que dicho compuesto conjugado es un compuesto orgánico.

179.

La composición farmacéutica de acuerdo con el aspecto 176, en la que dicho compuesto orgánico se selecciona del grupo que consiste en un narcótico, una toxina, un veneno, un esfingolípido y una proteína soluble.

180.

Un procedimiento para producir una composición farmacéutica que comprende una minicélula, en la que dicha minicélula muestra una proteína de membrana, en el que dicha proteína de membrana se selecciona del grupo que consiste en una proteína de membrana eucariota, una proteína de membrana arqueobacteriana y una proteína de membrana organular.

181.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 1, en el que dicha minicélula se selecciona del grupo que consiste en una minicélula eubacteriana, un poroplasto, un esferoplasto y un protoplasto.

182.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 180, en el que dicho procedimiento comprende además añadir un adyuvante a la formulación farmacéutica.

183.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 180, en el que dicho procedimiento comprende además

desecar dicha formulación.

184.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 183, en el que dicho procedimiento comprende además añadir un tampón de suspensión a dicha formulación.

185.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 180, en el que dicho procedimiento comprende además efectuar una modificación química de dicha proteína de membrana.

186.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 185, en el que dicha modificación química se selecciona del grupo que consiste en glucosilación, desglucosilación, fosforilación, desfosforilación y proteolisis.

187.

Un procedimiento para producir una composición farmacéutica que comprende una minicélula, en la que dicha minicélula muestra una proteína de membrana que es una proteína de fusión, comprendiendo dicha proteína de fusión un primer polipéptido, comprendiendo dicho primer polipéptido al menos un dominio transmembrana o al menos un dominio de anclaje a membrana; y (ii) un segundo polipéptido, en el que dicho segundo polipéptido no se deriva de una proteína eubacteriana.

188.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 187, en el que dicho procedimiento comprende además añadir un adyuvante a la formulación farmacéutica.

189.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 187, en el que dicho procedimiento comprende además desecar dicha formulación farmacéutica.

190.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 189 en el que dicho procedimiento comprende además añadir un tampón de suspensión a dicha formulación farmacéutica.

191.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 187, en el que dicho procedimiento comprende además efectuar una modificación química de dicha proteína de membrana.

192.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 191, en el que dicha modificación química se selecciona del grupo que consiste en glucosilación, desglucosilación, fosforilación, desfosforilación y proteolisis.

193.

Un procedimiento para producir una formulación farmacéutica que comprende una minicélula, en la que la minicélula muestra un conjugado de membrana, en el que dicho conjugado de membrana comprende un componente de membrana unido químicamente a un compuesto conjugado.

194.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 193, en el que dicho procedimiento comprende además añadir un adyuvante a la formulación farmacéutica.

195.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 193, en la que dicho componente de membrana es un polipéptido que comprende al menos un dominio transmembrana o al menos un dominio de anclaje a membrana,

o un lípido que es parte de una membrana.

196.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 193, en el que dicho compuesto conjugado es un polipéptido. y el enlace químico entre dicho compuesto de membrana y dicho compuesto conjugado no es un enlace peptídico.

197.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 193, en el que dicho compuesto conjugado es un ácido nucleico.

198.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 193, en la que dicho compuesto conjugado es un compuesto orgánico.

199.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 186, en la que dicho compuesto orgánico se selecciona del grupo que consiste en un narcótico, una toxina, un veneno, y un esfingolípido.

200.

Un procedimiento para detectar un agente que se une específicamente por un resto de unión, que comprende poner en contacto dicha minicélula que muestra el resto de unión con una composición en la que se sabe o se sospecha que contiene dicho agente, y detectar una señal que se modula por la unión de dicho agente a dicho resto de unión.

201.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 200, en el que dicha minicélula es una minicélula eubacteriana, un poroplasto, un esferoplasto o un protoplasto.

202.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 200, en el que dicho agente se asocia con una enfermedad.

203.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 200, en el que dicha minicélula comprende un compuesto detectable.

204.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 200, en el que dicho resto de unión es un anticuerpo o derivado de anticuerpo.

205.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 200, en el que dicha composición es una muestra ambiental.

206.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 200, en el que dicha composición es una muestra biológica.

207.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 206, en el que dicha muestra biológica se selecciona del grupo que consiste en sangre, suero, plasma, orina, saliva, una muestra de biopsia, heces y un parche de piel.

208.

Un procedimiento para obtener imágenes in situ de un tejido u órgano, que comprende administrar a un organismo una minicélula que comprende un agente de obtención de imágenes y un resto de unión y detectar dicho agente de obtención de imágenes en dicho organismo.

209.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 208, en el que dicha minicélula es una minicélula eubacteriana, un poroplasto, un esferoplasto o un protoplasto.

210.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 208, en el que dicho resto de unión es un anticuerpo o derivado de anticuerpo.

211.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 208, en el que dicho resto de unión se une específicamente a un antígeno de superficie celular.

212.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 211, en el que dicho antígeno de superficie celular es un antígeno mostrado por una célula tumorigénica, una célula cancerosas, y una célula infectada.

213.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 211, en el que dicho antígeno de superficie celular es un antígeno específico de tejido.

214.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 208, en el que dicho procedimiento de obtención de imágenes se selecciona del grupo que consiste en obtención de imágenes por resonancia magnética, obtención de imágenes por ultrasonidos; y tomografía axial computerizada (TAC).

215.

Un dispositivo que comprende una microplaca asociada operativamente a un biosensor que comprende una minicélula, en el que dicha microplaca comprende o pone en contacto la minicélula, y en la que dicha minicélula muestra un resto de unión.

216.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 215, en el que dicha minicélula es una minicélula eubacteriana, un poroplasto, un esferoplasto o un protoplasto.

217.

Un procedimiento para detectar una sustancia que se une específicamente por un resto de unión, que comprende poner en contacto el dispositivo de acuerdo con el aspecto 215 con una composición en la que se sabe o se sospecha que contiene dicho sustancia, y detectar una señal desde dicho dispositivo, en el que dicha señal cambia en función de la cantidad de dicha sustancia presente en dicha composición.

218.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 217, en el que dicha composición es una muestra biológica o una muestra ambiental.

219.

Un método para identificar un agente que se une específicamente a un compuesto diana, que comprende poner en contacto una minicélula que presenta dicho compuesto diana con una biblioteca de compuestos, e identificar un agente en dicha biblioteca que se una con dicho compuesto diana.

220.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 219, en el que dicha minicélula es una minicélula eubacteriana, un poroplasto, un esferoplasto o un protoplasto.

221.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 219, en el que dicha biblioteca de compuestos es una biblioteca de proteínas.

222.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 221, en el que dicha biblioteca de proteínas se selecciona del grupo que consiste en una biblioteca de presentación de fagos, una biblioteca de presentación de fagémidos, una biblioteca de baculovirus, una biblioteca de presentación de levaduras, y una biblioteca de presentación ribosomal.

223.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 219, en el que dicha librería de compuestos se selecciona del grupo que consiste en una biblioteca de aptámeros, una biblioteca de péptidos sintéticos y una biblioteca de moléculas pequeñas.

224.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 219, en el que dicho compuesto diana es un polipéptido diana.

225.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 224, en el que dicha minicélula comprende una construcción de expresión que comprende secuencias de expresión unidas operativamente con un ORF que codifica dicho polipéptido diana.

226.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 224, en el que dicho polipéptido diana es una proteína de membrana.

227.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 226, en el que dicha proteína de membrana es una proteína de un receptor o de un canal.

228.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 226, en el que dicha proteína de membrana es una enzima.

229.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 219, en el que dicho compuesto diana es una proteína de fusión de membrana. comprendiendo dicha proteína de fusión de membrana un primer polipéptido, en el que dicho primer polipéptido comprende al menos un dominio transmembrana o al menos un dominio de anclaje a membrana; y un segundo polipéptido, en el que dicho segundo polipéptido comprende secuencias de aminoácidos derivadas de un polipéptido diana.

230.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 219, en el que dicho procedimiento comprende además comparar la actividad de dicho compuesto diana en presencia de dicho agente con la actividad de dicho compuesto diana en ausencia de dicho agente.

231.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 230, en el que dicha actividad de dicho compuesto diana es una actividad enzimática.

232.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 231, en el que dicha enzima se selecciona del grupo que consiste en una oxidorreductasa, una transferasa, una hidrolasa, una liasa, una isomerasa, una ligasa y una sintetasa.

233.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 230, en el que dicha actividad de dicho compuesto diana es una actividad de unión.

234.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 233, que comprende además compara la unión de dicho agente a dicho compuesto diana con la unión de un ligando conocido de dicho compuesto diana.

235.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 234, en el que se usa un ensayo de competición para dicha comparación.

236.

Un dispositivo que comprende microplacas asociadas operativamente con un biosensor que comprende un conjunto de minicélulas en un patrón previamente ordenado, en el que cada una de dichas microplacas comprende o pone en contacto una minicélula, en el que cada una de dichas minicélulas presenta un compuesto diana diferente, y en el que la unión de un ligando a un compuesto diana da como resultado un aumento o una disminución en la señal.

237.

Un método para identificar un agente que se une específicamente a un compuesto diana, que comprende poner en contacto el dispositivo de acuerdo con el aspecto 236 con una biblioteca de compuestos, y detectar una señal desde dicho dispositivo, en el que dicha señal cambia en función de la unión de un agente a dicha diana.

238.

Un procedimiento para identificar un agente que bloquea específicamente la unión de un compuesto diana con su ligando, que comprende poner en contacto el dispositivo de acuerdo con el aspecto 236 con una biblioteca de compuestos, y detectar una señal desde dicho dispositivo, en el que dicha señal cambia en función de la unión de un agente a dicha diana.

239.

Un método para preparar un anticuerpo que se une específicamente a un dominio de proteína, en el que dicho dominio está en su conformación natural, en el que dicho dominio está incluido en una proteína presentada en una minicélula, que comprende poner en contacto dicha minicélula con una célula, en el que dicha célula es competente para producir anticuerpos contra un antígeno con el que entra en contacto dicha célula, para generar una respuesta inmunógena en la que dicha célula produce dicho anticuerpo.

240.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 239, en el que dicha minicélula es una minicélula eubacteriana, un poroplasto, un esferoplasto o un protoplasto.

241.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 239, en el que dicha proteína mostrada en una minicélula es una proteína de membrana.

242.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 241, en el que dicha proteína de membrana es una proteína de un receptor o de un canal.

243.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 239, en el que dicho dominio se encuentra comprendido dentro del segundo polipéptido de una proteína de fusión de la membrana, en el que dicha proteína de fusión de membrana comprende un primer polipéptido, en el que dicho primer polipéptido comprende al menos un dominio transmembrana o al menos un dominio de anclaje a membrana.

244.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 239, en el que dicho contacto sucede in vivo,

245.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 244, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal.

246.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 244, en el que dicha puesta en contacto sucede en un animal que comprende un adyuvante.

247.

El procedimiento para preparar un derivado de anticuerpo que se une específicamente a un dominio de proteína, en el que dicho dominio está en su conformación natural, en el que dicho dominio se presenta en una minicélula, que comprende poner en contacto dicha minicélula con una biblioteca de proteínas, e identificar un derivado de anticuerpo de dicha biblioteca de proteínas que se une específicamente a dicho dominio de proteína.

248.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 247, en el que dicha biblioteca de proteínas se selecciona del grupo que consiste en una biblioteca de presentación de fagos, una biblioteca de presentación de fagémidos, y una biblioteca de presentación ribosomal.

249.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 247 en el que dicho derivado de anticuerpo es un anticuerpo monocatenario.

250.

Un método para preparar un anticuerpo o derivado de anticuerpo que se une específicamente a un epítopo, en el que dicho epítopo se selecciona del grupo que consiste de (i) un epítopo compuesto por aminoácidos que se encuentran en una proteína de membrana, (ii) un epítopo presente en una interfase entre una proteína de membrana y un componente de la membrana, (iii) un epítopo presente en una interfase entre una proteína de membrana y una o más proteínas adicionales y (iv) un epítopo de una proteína de fusión, comprendiendo dicha proteína de fusión un primer polipéptido, comprendiendo dicho primer polipéptido al menos un dominio transmembrana o al menos un dominio de anclaje a membrana, y un segundo polipéptido, comprendiendo dicho segundo polipéptido dicho epítopo; que comprende poner en contacto una minicélula que presenta dicho epítopo con una biblioteca de proteínas, o con una célula, en el que dicha célula es competente para producir anticuerpos contra un antígeno con el que entra en contacto dicha célula, para generar una respuesta inmunógena en la que dicha célula produce dicho anticuerpo.

251.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 250, en el que dicha minicélula es una minicélula eubacteriana, un poroplasto, un esferoplasto o un protoplasto.

252.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 250, en el que dicha célula se pone en contacto in vivo.

253.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 252, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo policlonal.

254.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 252, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

255.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 250, en el que dicha biblioteca de proteínas se pone en contacto in vivo.

256.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 255, en el que dicha biblioteca de proteínas se selecciona del grupo que consiste en una biblioteca de presentación de fagos, una biblioteca de presentación de fagémidos, y una biblioteca de presentación ribosomal.

257.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 256, en el que dicho derivado de anticuerpo es un anticuerpo monocatenario.

258.

Un procedimiento para determinar la velocidad de transferencia de un ácido nucleico de una minicélula a una célula, que comprende (a) poner en contacto dicha célula con dicha minicélula, en el que dicha minicélula comprende dicho ácido nucleico, durante un periodo de tiempo establecido; (b) separar las minicélulas de dichas células; (c) medir la cantidad de ácido nucleico en dichas células, en el que la cantidad de ácido nucleico en dichas células a lo largo de dicho periodo de tiempo establecido es la velocidad de transferencia de un ácido nucleico de una minicélula.

259.

Un procedimiento para determinar la cantidad de un ácido nucleico transferido a una célula de una minicélula, que comprende (a) poner en contacto dicha célula con dicha minicélula, en el que dicha minicélula comprende un elemento de expresión que tiene secuencias de expresión eucariotas unidas operativamente a un ORF que codifica un polipéptido detectable, en la que dicha minicélula muestra un resto de unión, y en el que dicho resto de unión se une a un epítopo de dicha célula. y (b) detectar una señal de dicho polipéptido detectable, en el que un cambio en dicha señal corresponde a un aumento en la cantidad de un ácido nucleico transferido a una célula.

260.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 258, en el que dicha minicélula se selecciona del grupo que consiste en una minicélula eubacteriana, un poroplasto, un esferoplasto y un protoplasto.

261.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 258, en el que dicha célula es una célula eucariota.

262.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 258, en el que dicho resto de unión es un anticuerpo o derivado de anticuerpo.

263.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 258, en el que dicho resto de unión es un anticuerpo monocatenario.

264.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 258, en el que dicho resto de unión es un aptámero.

265.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 258, en el que dicho resto de unión es un compuesto orgánico.

266.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 258, en el que dicho polipéptido detectable es un polipéptido fluorescente.

267.

Un procedimiento para detectar la expresión de un elemento de expresión en una célula, que comprende

(a)

poner en contacto dicha célula con dicha minicélula, en el que dicha minicélula comprende un elemento de expresión que tiene secuencias de expresión celular unidas operativamente a un ORF que codifica un polipéptido detectable, en la que dicha minicélula muestra un resto de unión, y en el que dicho resto de unión se une a un epítopo de dicha célula.

(b)

incubar dicha célula y dicha minicélula durante un periodo de tiempo eficaz para la transferencia de ácido nucleico de dicha minicélula a dicha célula; y (c) detectar una señal de dicho polipéptido detectable, en el que un aumento en dicha señal corresponde a un aumento en la expresión de dicho elemento de expresión.

268.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 267, en el que dicha minicélula se selecciona del grupo que consiste en una minicélula eubacteriana, un poroplasto, un esferoplasto y un protoplasto.

269.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 267, en el que dicha célula es una célula eucariota y dichas secuencias de expresión son secuencias de expresión eucariotas.

270.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 269, en el que dicha célula eucariota es una célula de mamífero.

271.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 267, en el que dicho resto de unión es un anticuerpo o derivado de anticuerpo.

272.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 267, en el que dicho resto de unión es un anticuerpo monocatenario.

273.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 267, en el que dicho resto de unión es un aptámero.

274.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 267, en el que dicho resto de unión es un compuesto orgánico.

275.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 267, en el que dicho polipéptido detectable es un polipéptido fluorescente.

276.

Un procedimiento para detectar la transferencia de una proteína de fusión desde el citosol a un orgánulo de una célula eucariota, que comprende

(a)

poner en contacto dicha célula con dicha minicélula, en el que (i) dicha minicélula comprende un elemento de expresión que tiene secuencias de expresión eucariotas unidas operativamente a un ORF que codifica una proteína de fusión, en el que dicha proteína de fusión comprende un primer polipéptido que comprende secuencias de administración en los orgánulos, y un segundo polipéptido que comprende un polipéptido detectable; y (ii) dicha minicélula presenta un resto de unión que se une a un epítopo de dicha célula, o un epítopo de un orgánulo;

(b)

incubar dicha célula y dicha minicélula durante un periodo de tiempo eficaz para transferir ácido nucleico desde dicha minicélula a dicha célula y producción de dicha proteína de fusión; y (c) detectar una señal procedente de polipéptido detectable, en el que un cambio en la señal corresponde a un aumento en la cantidad de la proteína de fusión transferida a dicho orgánulo.

277.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 276, en el que dicho orgánulo es una mitocondria, un cloroplasto o un cinetoplasto.

278.

Una minicélula que comprende al menos un ácido nucleico, en la que dicha minicélula muestra un resto de unión dirigido a un compuesto diana, en la que dicho resto de unión se selecciona del grupo que consiste en (i) una proteína de membrana eucariota; (ii) una proteína de membrana arqueobacteriana; (iii) una proteína de membrana organular; y (iv) una proteína de fusión, comprendiendo dicha proteína de fusión un primer polipéptido, comprendiendo dicho primer polipéptido al menos un dominio transmembrana o al menos un dominio

de anclaje a membrana; y un segundo polipéptido, en la que dicho segundo polipéptido no se deriva de una proteína eubacteriana y no es ni un marcador His o un polipéptido de glutatión-S-transferasa, y en el que dicho polipéptido comprende un resto de unión.

279.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 278, en la que dicha minicélula se selecciona del grupo que consiste en una minicélula eubacteriana, un poroplasto, un esferoplasto y un protoplasto.

280.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 278, en la que dicho ácido nucleico comprende una construcción de expresión que comprende secuencias de expresión unidas operativamente a un ORF que codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en (i) dicha proteína de membrana eucariota, (ii) dicha proteína de membrana arqueobacteriana, (iii) dicha proteína de membrana organular; y (iv) dicha proteína de fusión.

281.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 280, en la el que dicho ácido nucleico comprende una construcción de expresión que comprende secuencias de expresión unidas operativamente a un ORF, en el que dicho codifica un polipéptido terapéutico.

282.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 281, en la que dicho polipéptido terapéutico es un polipéptido de membrana.

283.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 281, en la que dicho polipéptido terapéutico es un polipéptido soluble.

284.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 283, en la que dicho polipéptido soluble comprende una secuencia de secreción celular.

285.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 281, en la que dichas secuencias de expresión son inducibles y/o represibles.

286.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 2858, en la que dichas secuencias de expresión se inducen y/o desreprimen cuando el resto de unión mostrado por la minicélula se une a su compuesto diana.

287.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 278 en la el que dicho ácido nucleico comprende una construcción de expresión que comprende secuencias de expresión unidas operativamente a un ORF, en la que dicho ORF codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que facilita la transferencia celular de un compuesto biológicamente activo contenido en o mostrado por dicha minicélula.

288.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 278 en la que dicha minicélula comprende un sistema para transferir una molécula del interior de una minicélula al citoplasma de dicha célula.

289.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 278 en la que dicho sistema para transferir una molécula del interior de una minicélula al citoplasma de dicha célula es un sistema de secreción de tipo III.

290.

Un procedimiento para introducir un ácido nucleico en una célula, que comprende poner en contacto dicha célula con una minicélula que comprende dicho ácido nucleico, en la que dicha minicélula muestra un resto de unión, en la que dicho resto de unión se selecciona del grupo que consiste en (i) una proteína de membrana eucariota; (ii) una proteína de membrana arqueobacteriana; (iii) una proteína de membrana organular; y (iv) una proteína de fusión, comprendiendo dicha proteína de fusión un primer polipéptido, comprendiendo dicho primer polipéptido al menos un dominio transmembrana o al menos un dominio de anclaje a membrana; y un segundo polipéptido, en el que el segundo polipéptido no se deriva de una proteína eubacteriana y no es ni un marcador His o un polipéptido de glutatión-S-transferasa, y en el que el polipéptido comprende un resto de unión; y en el que dicho resto de unión se une a un epítopo de dicha célula.

291.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 290, en la que dicha minicélula se selecciona del grupo que consiste en una minicélula eubacteriana, un poroplasto, un esferoplasto y un protoplasto.

292.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 290, en la que dicho ácido nucleico comprende una construcción de expresión que comprende secuencias de expresión unidas operativamente a un ORF que codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en

(i)

dicha proteína de membrana eucariota,

(ii)

dicha proteína de membrana arqueobacteriana, (iii) dicha proteína de membrana organular; y (iv) dicha proteína de fusión.

293.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 290, en la el que dicho ácido nucleico comprende una construcción de expresión que comprende secuencias de expresión unidas operativamente a un ORF, en el que dicho codifica un polipéptido terapéutico.

294.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 293, en la que dichas secuencias de expresión son inducibles y/o desrepresilbles.

295.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 294, en la que dichas secuencias de expresión se inducen o desreprimen cuando el resto de unión mostrado por la minicélula se une su compuesto diana.

296.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 294, en el que dichas secuencias de expresión se inducen o desreprimen mediante un suceso de transactivación o transrepresión.

297.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 292, en la el que dicho ácido nucleico comprende una construcción de expresión que comprende secuencias de expresión unidas operativamente a un ORF, en el que dicho

ORF codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que facilita la transferencia celular de un compuesto biológicamente activo contenido en o mostrado por la minicélula.

298.

Una minicélula que comprende un ácido nucleico, en el que dicho ácido nucleico comprende secuencias de expresión eucariotas y secuencias de expresión eubacterianas, cada una de las cuales está unida operativamente de manera independiente a un ORF.

299.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 298, en la que dicha minicélula se selecciona del grupo que consiste en una minicélula eubacteriana, un poroplasto, un esferoplasto y un protoplasto.

300.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 298, en la que dicha minicélula muestra un resto de unión.

301.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 300, en el que dichas secuencias de expresión eubacterianas se inducen y/o desreprimen cuando el resto de unión está en contacto con dicha célula diana.

302.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 300, en la que dichas secuencias de expresión eucariotas se inducen y/o desreprimen cuando dicho ácido nucleico está en el citoplasma de una célula eucariota.

303.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 301, en la que la proteína codificada por dicho ORF comprende secuencias de secreción eubacterianas o eucariotas.

304.

Una minicélula que comprende un primer y un segundo ácido nucleico, en la que dicho primer ácido nucleico comprende secuencias de expresión de eucariota unidas operativamente a un primer ORF, y un segundo ácido nucleico, en el que dicho segundo ácido nucleico comprende secuencias de expresión eubacterianas unidas operativamente a un segundo ORF.

305.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 304, en la que dicha minicélula se selecciona del grupo que consiste en una minicélula eubacteriana, un poroplasto, un esferoplasto y un protoplasto.

306.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 304, en la que dicha minicélula muestra un resto de unión.

307.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 306, en el que dichas secuencias de expresión eubacterianas se inducen y/o desreprimen cuando el resto de unión está en contacto con dicha célula diana.

308.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 306, en la que dichas secuencias de expresión eucariotas se inducen y/o desreprimen cuando dicho ácido nucleico está en el citoplasma de una célula eucariota.

309.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 304, en la que la proteína codificada por dicho primer ORF comprende secuencias de secreción eucariotas y/o la proteína codificada por dicho segundo ORF comprende secuencias de secreción eubacterianas.

310.

Un procedimiento para introducir y expresar un ácido nucleico en un organismo, que comprende poner en contacto una minicélula con una célula de dicho organismo, en el que dicha minicélula comprende dicho ácido nucleico.

311.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 310, en la que dicha minicélula se selecciona del grupo que consiste en una minicélula eubacteriana, un poroplasto, un esferoplasto y un protoplasto.

312.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 310, en la que dicha minicélula muestra un resto de unión.

313.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 310, en el que dicho ácido nucleico comprende una construcción de expresión eucariota, en el que dicha construcción de expresión eucariota comprende secuencias de expresión eucariotas unidas operativamente a un ORF.

314.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 310, en el que dicho ORF codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en una proteína de membrana, una proteína soluble y una proteína que comprende secuencias de señal de secreción eucariotas.

315.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 310, en el que dicho ácido nucleico comprende una construcción de expresión eubacteriana, en el que dicha construcción de expresión eubacteriana comprende secuencias de expresión eubacterianas unidas operativamente a un ORF.

316.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 315, en la que dicha minicélula muestra un resto de unión, en el que dichas secuencias de expresión eubacterianas se inducen y/o desreprimen cuando el resto de unión está en contacto con dicha célula diana.

317.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 316, en la que la proteína codificada por dicho ORF comprende secuencias de secreción eubacterianas.

318.

Una minicélula que comprende un cristal de una proteína de membrana.

319.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 318, en el que dicha minicélula es una minicélula eubacteriana, un poroplasto, un esferoplasto o un protoplasto.

320.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 318, en el que dicha proteína de membrana es un receptor.

321.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 320, en el que dicho receptor es un receptor acoplado a proteína

G.

322.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 318, en la que se presenta dicho cristal.

323.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 318, en el que dicha proteína de membrana es una proteína de fusión, comprendiendo dicha proteína de fusión un primer polipéptido, comprendiendo dicho primer polipéptido al menos un dominio transmembrana o al menos un dominio de anclaje a membrana, y un segundo polipéptido.

324.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 323, en la que dicho cristal es un cristal de dicho segundo polipéptido.

325.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 323, en la que se presenta dicho cristal.

326.

Un procedimiento para determinar la estructura tridimensional de una proteína de membrana, que comprende preparar un cristal de dicha proteína de membrana en una minicélula, y determinar la estructura tridimensional de dicho cristal.

327.

Un procedimiento para identificar los átomos que interactúan con el ligando en una estructura tridimensional definida de una proteína diana, que comprende (a) preparar una o más proteínas variantes de una proteína diana que tiene una estructura tridimensional conocida o prevista, en la que dicha proteína diana se une a un ligando preseleccionado; (b) expresar y presentar una proteína variante en una minicélula; y (c) determinar si una minicélula que presenta dicha proteína variante se une a dicho ligando preseleccionado con una afinidad mayor o menor comparada con la unión de dicho ligando preseleccionado a dicha proteína diana.

328.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 327, en el que dicho ligando es una proteína que forma un multímero con la proteína diana, y dichos átomos que interactúan con el ligando son átomos de dicha estructura tridimensional definida que son átomos que están implicados en interacciones proteína-proteína.

329.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 327, en el que dicho ligando es un compuesto que induce un cambio conformacional en dicha proteína diana, y dicha estructura tridimensional definida es el sitio de dicho cambio conformacional.

330.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 327, adoptado con un procedimiento, dicho procedimiento para identificar ligandos de una proteína diana, comprende además identificar las diferencias químicas en dichas proteínas variantes en comparación con dicha proteína diana.

331.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 330, que comprende además mapear dichas diferencias químicas en dicha estructura tridimensional definida, y correlacionar el efecto de dichas diferencias químicas sobre dicha estructura tridimensional definida.

332.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 331, en el que dicha proteína diana es una proteína de tipo silvestre.

333.

Una biblioteca de minicélulas, que comprende dos o más minicélulas, en las que cada minicélula comprende una proteína exógena diferente.

334.

La biblioteca de minicélulas de acuerdo con el aspecto 333, en el que dicha minicélula es una minicélula eubacteriana, un poroplasto, un esferoplasto o un protoplasto.

335.

La biblioteca de minicélulas de acuerdo con el aspecto 333, en la que dicha proteína exógena es una proteína de presentación.

336.

La biblioteca de minicélulas de acuerdo con el aspecto 333, en el que dicha proteína exógena es una proteína de membrana.

337.

La biblioteca de minicélulas de acuerdo con el aspecto 336, en el que dicha proteína de membrana es un receptor.

338.

La biblioteca de minicélulas de acuerdo con el aspecto 333, en el que dicha proteína es una proteína soluble contenida o secretada de dicha minicélula.

339.

La biblioteca de minicélulas de acuerdo con el aspecto 333, en la que las minicélulas de dicha biblioteca comprenden un elemento de expresión que comprende secuencias de expresión unidas operativamente a un ácido nucleico que tiene un ORF que codifica dicha proteína exógena.

340.

La biblioteca de minicélulas de acuerdo con el aspecto 339, en la que dicho ácido nucleico ha sido mutagenizado;

341.

La biblioteca de minicélulas de acuerdo con el aspecto 339, en la que un sitio activo de dicha proteína exógena tiene una estructura tridimensional conocida o predicha, y dicha una porción de dicho ORF que codifica dicho sitio activo se ha mutagenizado.

342.

La biblioteca de minicélulas de acuerdo con el aspecto 333, en la que cada una de dichas minicélulas comprende una proteína exógena que es una variante de una proteína que tiene una estructura tridimensional conocida o predicha.

343.

Una biblioteca de minicélulas, que comprende dos o más minicélulas, en las que cada minicélula comprende una proteína de fusión diferente. comprendiendo cada una de dichas proteínas de fusión un primer polipéptido que es un polipéptido constante, en el que dicho polipéptido constante comprende al menos un dominio transmembrana o al menos un dominio de anclaje a membrana, y un segundo polipéptido, en la que dicho segundo polipéptido es una secuencia de aminoácidos variable que es diferente en cada proteínas de fusión.

344.

La biblioteca de minicélulas de acuerdo con el aspecto 343, en la que las minicélulas de dicha biblioteca comprenden un elemento de expresión que comprende secuencias de expresión unidas operativamente a un ácido nucleico que tiene un ORF que codifica dicha proteína de fusión.

345.

La biblioteca de minicélulas de acuerdo con el aspecto 344, en la que dicho segundo polipéptido de dicha proteína de fusión está codificada por un ácido nucleico que ha sido clonado.

346.

La biblioteca de minicélulas de acuerdo con el aspecto 344, en la que cada uno de dicho segundo polipéptido de dichas proteínas de fusión comprende una variante de una secuencia de aminoácidos procedente de una proteína que tienen una estructura tridimensional conocida o predicha.

347.

Una biblioteca de minicélulas, que comprende dos o más minicélulas, en la que cada minicélula comprende una proteína constante que está presente en cada minicélula y una proteína variable que difiere de una minicélula a otra.

348.

La biblioteca de minicélulas de acuerdo con el aspecto 347, en la que una de dichas proteínas constantes y variables es un receptor, y que la otra de dichas proteínas constantes y variables es un coreceptor.

349.

La biblioteca de minicélulas de acuerdo con el aspecto 347, en la que cada una de dichas proteínas constantes y variables es diferente de otra y es un factor en una ruta de transducción de la señal.

350.

La biblioteca de minicélulas de acuerdo con el aspecto 347, en la que una de dichas proteínas constantes y variables es una proteína G, y la otra de dichas proteínas constantes y variables es un receptor acoplado a una proteína G.

351.

La biblioteca de minicélulas de acuerdo con el aspecto 347, en la que una de dichas proteínas comprende un primer dominio de transrepresión, y la otra de dichas proteínas constantes y variables comprende un segundo dominio de transrepresión, en la que dichos dominios de transrepresión limitan o bloquean la expresión de un gen indicador cuando dichas proteínas constantes y variables se asocian entre sí.

352.

La biblioteca de minicélulas de acuerdo con el aspecto 347, en la que una de dichas proteínas comprende un primer dominio de transactivación, y la otra de dichas proteínas constantes y variables comprende un segundo dominio de transactivación, en la que dichos dominios de transactivación estimulan la expresión de un gen indicador cuando dichas proteínas constantes y variables se asocian entre sí.

353.

Un procedimiento para identificar un ácido nucleico que codifica una proteína que se une o altera químicamente un ligando preseleccionado, que comprende: (a) poner en contacto independientemente dicho ligando con elementos individuales de una biblioteca de minicélulas, en el que las minicélulas de dicha biblioteca

comprenden elementos de expresión, en el que dichos elementos de expresión comprenden inserciones de ADN, en el que un ORF de dicha inserción de ADN está unido operativamente a las secuencias de expresión, para generar una serie de mezclas de reacción, comprendiendo cada mezcla de reacción un elemento diferente de dicha biblioteca de minicélulas; (b) incubar dichas mezclas de reacción, permitiendo de esta forma que una proteína que se une o altera químicamente dichos ligandos preseleccionado, (c) detectar un cambio en una señal procedente de las mezclas de reacción en las que dicho ligando se ha unido o alterado químicamente; (d) preparar ADN procedente de las mezclas de reacción en las que dicho ligando se ha unido o alterado químicamente; en el que dicho ADN es un ácido nucleico que codifica una proteína que se une o altera químicamente dicho ligando preseleccionado.

354.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 353, en el que dicha minicélula es una minicélula eubacteriana, un poroplasto, un esferoplasto o un protoplasto.

355.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 353, en el que dicho ligando preseleccionado es un compuesto biológicamente activo.

356.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 353, en el que dicho ligando preseleccionado es un fármaco terapéutico.

357.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 353, en el que la proteína que se une o altera químicamente dicho ligando preseleccionado es una proteína diana de compuestos que son terapéuticos para una enfermedad que se trata mediante la administración de dicho fármaco a un organismo que lo necesita.

358.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 353, en el que dicho ligando preseleccionado es un fármaco marcado de forma detectable, dicha minicélula comprende un compuesto detectable, y/o un derivado químicamente alterado de dicha proteína está marcado de forma detectable.

359.

Un procedimiento para determinar la secuencia de ácido nucleico de una proteína que se une o altera químicamente un ligando preseleccionado, que comprende:

(a) poner en contacto dicho ligando con una biblioteca de minicélulas, en el que las minicélulas de dicha biblioteca comprenden elementos de expresión, en el que dichos elementos de expresión comprenden inserciones de ADN, en el que un ORF de dicha inserción de ADN está unido operativamente a las secuencias de expresión; (b) incubar dicha mezcla de ligando y minicélulas, en condiciones que permitan la formación de complejos entre ligandos y minicélulas y/o que se produzcan reacciones químicas; (c) aislar o identificar dichos complejos de dicho ligando y dicha mezcla de ligando y minicélulas; (d) preparar ADN a partir de un elemento de expresión encontrado en uno o más de dichos complejos, o en una de sus minicélulas; (e) determinar la secuencia de nucleótidos de dicho ORF en dicho ADN; y (f) generar una secuencia de aminoácidos mediante traducción en silicio, en el que dicha secuencia de aminoácidos es, o se deriva de, una proteína que se une o altera químicamente un ligando preseleccionado.

360.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 359, en el que dicha minicélula es una minicélula eubacteriana, un poroplasto, un esferoplasto o un protoplasto.

361.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 359, en el que dicho ADN se prepara por aislamiento del ADN a partir de dichos complejos, o en una de sus minicélulas.

362.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 359, en el que dicho ADN se prepara por amplificación del ADN a partir de dichos complejos, o en una de sus minicélulas.

363.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 359, en el que dicha proteína es una proteína de fusión.

364.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 359, en el que dicha proteína es una proteína de membrana o una proteína soluble.

365.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 364, en el que dicha proteína comprende secuencias de secreción.

366.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 359, en el que dicho ligando preseleccionado es un compuesto biológicamente activo.

367.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 359, en el que dicho ligando preseleccionado es un fármaco terapéutico.

368.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 359, en el que dicho ligando preseleccionado es un fármaco terapéutico, y dicha proteína que se une a dicho ligando preseleccionado es una proteína diana para compuestos que son terapéuticos para una enfermedad que se trata mediante la administración de dicho fármaco a un organismo que lo necesita.

369.

Un procedimiento para identificar un ácido nucleico que codifica una proteína que inhibe o bloquea un agente para unirse o alterar químicamente un ligando preseleccionado, que comprende: (a) poner en contacto independientemente dicho ligando con elementos individuales de una biblioteca de minicélulas, en el que las minicélulas de dicha biblioteca comprenden elementos de expresión, en el que dichos elementos de expresión comprenden inserciones de ADN, en el que un ORF de dicha inserción de ADN está unido operativamente a las secuencias de expresión, para generar una serie de mezclas de reacción, comprendiendo cada mezcla de reacción un elemento diferente de dicha biblioteca de minicélulas; (b) incubar dichas mezclas de reacción, permitiendo de esta forma que una proteína que se une o altera químicamente dichos ligandos preseleccionado,

(c)

detectar un cambio en una señal procedente de las mezclas de reacción en las que dicho ligando se ha unido

o alterado químicamente; (d) preparar ADN procedente de las mezclas de reacción en las que dicho cambio en la señal indica que el ligando se ha unido o alterado químicamente; en el que dicho ADN es un ácido nucleico que codifica una proteína que inhibe o bloquea dicho agente para unirse o alterar químicamente dicho ligando preseleccionado,

370.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 369, en el que dicha minicélula es una minicélula eubacteriana, un poroplasto, un esferoplasto o un protoplasto.

371.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 369, en el que dicho ADN tiene una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de dicha proteína que inhibe o bloquea dicho agente para unirse o alterar químicamente dicho ligando preseleccionado.

372.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 369, en el que la proteína que se une o altera químicamente dicho ligando preseleccionado es una proteína diana de compuestos que son terapéuticos para una enfermedad que se trata mediante la administración de dicho fármaco a un organismo que lo necesita.

373.

Un procedimiento para identificar un agente que realiza la actividad de una proteína, que comprende poner en contacto una biblioteca de dos o más agentes candidatos con una minicélula que comprende dicha proteína o un polipéptido derivado de dicha proteína, ensayar el efecto de los agentes candidatos sobre la actividad de dicha proteína, e identificar agentes que realizan la actividad de dicha proteína.

374.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 373, en la que dicha minicélula se selecciona del grupo que consiste en una minicélula eubacteriana, un poroplasto, un esferoplasto y un protoplasto.

375.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 373, en el que dicha proteína o dicho polipéptido derivado de dicha proteína se presenta en la superficie de dicha minicélula.

376.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 373, en el que dicha proteína es una proteína de membrana.

377.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 376, en la que dicha proteína de membrana se selecciona del grupo que consiste en un receptor, una proteína de canal y una enzima.

378.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 373, en el que dicha actividad de una proteína es una actividad de unión o una actividad enzimática.

379.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 373, en el que dicha biblioteca de compuestos es una biblioteca de proteínas.

380.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 379, en el que dicha biblioteca de proteínas se selecciona del grupo que consiste en una biblioteca de presentación de fagos, una biblioteca de presentación de fagémidos, y una biblioteca de presentación ribosomal.

381.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 373, en el que dicha biblioteca de compuestos es una biblioteca de aptámeros.

382.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 373, en el que dicha biblioteca de compuestos es una biblioteca de moléculas pequeñas.

383.

Un procedimiento para identificar un agente que realiza la actividad de una dominio de proteína que incluye una biblioteca de dos o más agentes candidatos con una minicélula que presenta una proteína de fusión de membrana, comprendiendo dicha proteína de fusión un primer polipéptido, comprendiendo dicho primer polipéptido al menos un dominio transmembrana o al menos un dominio de anclaje a membrana, y un segundo polipéptido, en el que dicho segundo polipéptido comprende dicho dominio de proteína.

384.

Un procedimiento para identificar efectos secundarios indeseables de un compuesto biológicamente activo que se producen como resultado de la unión de dicho compuesto a una proteína, en el que se sable que la unión de dicho compuesto a dicha proteína da como resultado efectos secundarios indeseables, que comprende poner en contacto una minicélula que comprende dicha proteína con dicho compuesto biológicamente activo.

385.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 384, en la que dicha minicélula se selecciona del grupo que

consiste en una minicélula eubacteriana, un poroplasto, un esferoplasto y un protoplasto.

386.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 384, que comprende además caracterizar la unión de dicho compuesto biológicamente activo con dicha proteína.

387.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 384, que comprende además caracterizar el efecto de dicho compuesto biológicamente activo sobre la actividad de dicha proteína.

388.

Un procedimiento para identificar un agente que realiza la interacción de un primera proteína de señalización con una segunda proteína de señalización, que comprende (a) poner en contacto una biblioteca de compuestos con una minicélula, en el que dicha minicélula comprende: (i) una primera proteína que comprende dicha primera proteína de señalización y un primer dominio de regulación de transactuación; (ii) una segunda proteína que comprende dicha proteína de señalización y un segundo dominio de regulación de transactuación; y

(iii) un gen indicador, cuya expresión está modulada mediante la interacción entre dicho primer dominio de regulación de transactuación y dicho segundo dominio de regulación de transactuación; y (b) detectar el producto génico de dicho gen indicador.

389.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 388, en la que dicha minicélula se selecciona del grupo que consiste en una minicélula eubacteriana, un poroplasto, un esferoplasto y un protoplasto.

390.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 388, en el que dichos dominios de regulación de transactuación son dominios de transactivación.

391.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 388, en el que dichos dominios de regulación de transactuación son dominios de transexpresión.

392.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 388, en el que dicho gen indicador está inducido mediante la interacción de dicho primer dominio de regulación de transactuación y dicho segundo dominio de regulación de transactuación.

393.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 388, en el que dicho agente que realiza la interacción de dicha primera proteína de señalización con dicha segunda proteína de señalización es un agente que ocasiona o promueve dicha interacción.

394.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 388, en el que dicho gen indicador está reprimido por la interacción de dicho primer dominio de regulación de transactuación y dicho segundo dominio de regulación de transactuación.

395.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 394, en el que dicho agente que realiza la interacción de dicha primera proteína de señalización con dicha segunda proteína de señalización es un agente que inhibe o bloquea dicha interacción.

396.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 388, en el que dicha primera proteína de señalización es un GPCR.

397.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 396, en el que dicho GPCR es un receptor Edg o un SCAMPER.

398.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 396, en el que dicha segunda proteína de señalización es una proteína G.

399.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 398, en la que dicha proteína G se selecciona del grupo que consiste en un G-alfa-i, G-alfa-s, G-alfa-q, G-alfa-12/13 y Go.

400.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 388, en el que dicha biblioteca de compuestos es una biblioteca de proteínas.

401.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 400, en el que dicha biblioteca de proteínas se selecciona del grupo que consiste en una biblioteca de presentación de fagos, una biblioteca de presentación de fagémidos, y una biblioteca de presentación ribosomal.

402.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 388, en el que dicha biblioteca de compuestos es una biblioteca de aptámeros.

403.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 388, en el que dicha biblioteca de compuestos es una biblioteca de moléculas pequeñas.

404.

Un procedimiento para identificar un agente que realiza la interacción de un primera proteína de señalización con una segunda proteína de señalización, que comprende poner en contacto una biblioteca de dos

o más agentes candidatos con una minicélula, en el que dicha minicélula comprende: (a) una primera proteína de fusión que comprende dicha primera proteína de señalización y un primer dominio detectable; y (b) una segunda proteína de fusión que comprende dicha segunda proteína de señalización y un segundo dominio detectable; en el que se genera un señal cuando dichas primera y segunda proteínas de señalización están muy cerca una de otra, y detectar dicha señal.

405.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 404, en el que dicha señal es fluorescente.

406.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 404, en el que dicho primer dominio detectable y dicho segundo dominio detectable son fluorescentes y dicha señal se genera mediante FRET.

407.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 406, en el que dichos primer y segundo dominios detectables se seleccionan independientemente del grupo que consiste en proteína fluorescente verde, proteína fluorescente verde con desplazamiento del azul, proteína fluorescente verde con desplazamiento del cian, proteína fluorescente verde con desplazamiento del rojo, proteína fluorescente verde con desplazamiento del amarillo, y una proteína fluorescente roja, en el que dicho primer dominio fluorescente y dicho segundo dominio fluorescente no son idénticos.

408.

Un procedimiento de biorremediación, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto una composición que comprende una sustancia indeseable con una minicélula, en el que dicha minicélula altera la estructura química y/o se une a dicha sustancia indeseable.

409.

Un procedimiento de biorremediación, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto una composición que comprende una sustancia indeseable con una minicélula, en el que dicha minicélula comprende un agente que altera la estructura química de dicha sustancia indeseable.

410.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 409, en el que dicho agente que altera la estructura química de dicha sustancia indeseable es un catalizador inorgánico.

411.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 409, en el que dicho agente que altera la estructura química de dicha sustancia indeseable es una enzima.

412.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 411, en el que dicha enzima es una proteína soluble contenida en dicha minicélula,

413.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 412, en la que dicha proteína soluble se selecciona del grupo que consiste en una oxidorreductasa, una transferasa, una hidrolasa, una liasa, una isomerasa, una ligasa y una sintetasa.

414.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 411, en el que dicha enzima es una proteína secretada.

415.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 414, en la que dicha proteína secretada se selecciona del grupo que consiste en una oxidorreducatasa, una transferasa, una hidrolasa, una liasa, una isomerasa, una ligasa y una sintetasa.

416.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 411, en el que dicha enzima es una proteína de membrana.

417.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 416, en la que dicha enzima de membrana se selecciona del grupo que consiste en un citocromo p450, una oxidorreductasa, una transferasa, una hidrolasa, una liasa, una isomerasa, una ligasa y una sintetasa.

418.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 409, en el que dicho agente que altera la estructura química de dicha sustancia indeseable es una proteína de fusión que comprende un primer polipéptido que comprende un dominio transmembrana o al menos un dominio de anclado a la membrana, y un segundo polipéptido, en el que dicho segundo polipéptido es un resto enzimático.

419.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 418, en el que dicho segundo polipéptido es un polipéptido derivado de una proteína seleccionada del grupo que consiste de una oxidorreductasa, una transferasa, una hidrolasa, una liasa, una isomerasa, una ligasa y una sintetasa.

420.

Un procedimiento de biorremediación, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto una composición que comprende una sustancia indeseable con una minicélula, en el que dicha minicélula comprende un agente que se une a una sustancia indeseable.

421.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 420, en el que dicha sustancia indeseable se une y se internaliza por dicha minicélula o se inactiva de otro modo mediante absorción selectiva.

422.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 420, en el que dicho agente que se une a dicha sustancia indeseable es una proteína soluble secretada.

423.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 422, en el que dicha proteína secretada es una proteína de transporte auxiliar.

424.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 420, en el que dicho agente que se une a dicha sustancia indeseable es una proteína de membrana.

425.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 420, en el que dicha sustancia indeseable se selecciona del grupo que consiste en una toxina, un contaminante y un patógeno.

426.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 420, en el que dicho agente que se une a dicha sustancia indeseable es una proteína de fusión que comprende un primer polipéptido que comprende un dominio transmembrana o al menos un dominio de anclado a la membrana, y un segundo polipéptido, en el que dicho segundo polipéptido es un resto de unión.

427.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 426, en el que dicho resto de unión se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un derivado de anticuerpo, el sitio activo de una enzima mutante no enzimáticamente activa, un anticuerpo monocatenario y un aptámero.

428.

Una célula progenitora que produce una minicélula, en el que dicha célula progenitora comprende uno o más de los siguientes: (a) un elemento de expresión que comprende un gen unido operativamente a secuencias de expresión que son inducibles y/o represibles, en el que la inducción o represión de dicho gen regula el número de copias de una construcción de expresión episómica; (b) una mutación en un gen endógeno, en la que dicha mutación regula el número de copias de una construcción de expresión episómica, (c) un elemento de expresión que comprende un gen unido operativamente a secuencias de expresión que son inducibles y/o represibles, en el que la inducción o represión de dicho gen causa o potencia la producción de minicélulas; y (d) una mutación en un gen endógeno, en el que dicha mutación causa o potencia la producción de minicélulas.

429.

La célula progenitora productora de minicélulas de acuerdo con el aspecto 428, que comprende además una construcción de expresión episómica.

430.

La célula progenitora productora de minicélulas de acuerdo con el aspecto 428, que comprende además una construcción de expresión cromosómica.

431.

La célula progenitora productora de minicélulas de acuerdo con el aspecto 429, en la que dichas secuencias de expresión de dicha construcción de expresión son inducibles y/o represibles.

432.

La célula progenitora productora de minicélulas de acuerdo con el aspecto 428, en la que dicha célula progenitora productora de minicélulas comprende un compuesto biológicamente activo.

433.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 428 en la que dicho gen que causa o potencia la producción de minicélulas tiene un producto génico que está implicado en o regula la replicación de ADN la división celular, el reparto celular, la separación, la transcripción, la traducción, o el plegamiento de proteínas.

434.

Una célula progenitora que produce una minicélula, en el que dicha célula progenitora comprende una construcción de expresión, en la que dicha construcción de expresión comprende secuencias de expresión unidas operativamente a un ORF que codifica una proteína. Y un elemento de expresión regulador, en la que dicho elemento de expresión regulador comprende secuencias de expresión unidas operativamente a un gen regulador que codifica un factor que regula la expresión de dicho ORF.

435.

La célula progenitora productora de minicélulas de acuerdo con el aspecto 434, en la que dichas secuencias de expresión de dicha construcción de expresión son inducibles y/o represibles.

436.

La célula progenitora productora de minicélulas de acuerdo con el aspecto 434, en la que dichas secuencias de expresión de dicha construcción de expresión reguladora son inducibles y/o represibles.

437.

La célula progenitora productora de minicélulas de acuerdo con el aspecto 434, en la que uno o más de dicho elemento de expresión o dicho elemento de expresión regulador está localizado en un cromosoma de dicha célula progenitora.

438.

La célula progenitora productora de minicélulas de acuerdo con el aspecto 434, en el que uno o más de dicho elemento de expresión o dicho elemento de expresión regulador está localizado en una construcción de expresión episómica.

439.

La célula progenitora productora de minicélulas de acuerdo con el aspecto 438, en el que tanto dicho elemento de expresión como dicho elemento de expresión regulador están localizados en una construcción de expresión episómica, y uno o ambos de dicho elemento de expresión y dicho elemento de expresión regulador se segrega en minicélulas producidas a partir de dicha célula progenitora.

440.

La célula progenitora productora de minicélulas de acuerdo con el aspecto 434, en la que dicha célula

progenitora productora de minicélulas comprende un compuesto biológicamente activo.

441.

La célula progenitora productora de minicélulas de acuerdo con el aspecto 440, en la que dicho compuesto biológicamente activo se segrega en minicélulas producidas a partir de dicha célula progenitora.

442.

La célula progenitora productora de minicélulas de acuerdo con el aspecto 434, en la que dicho ORF codifica una proteína de membrana o una proteína soluble.

443.

La célula progenitora productora de minicélulas de acuerdo con el aspecto 434, en el que dicha proteína comprende secuencias de secreción.

444.

La célula progenitora productora de minicélulas de acuerdo con el aspecto 434, en la que el producto génico de dicho gen regula la expresión de dicho ORF.

445.

La célula progenitora productora de minicélulas de acuerdo con el aspecto 444, en la que dicho producto génico es un factor de transcripción.

446.

La célula progenitora productora de minicélulas de acuerdo con el aspecto 440, en la que dicho producto génico es una ARN polimerasa.

447.

La célula progenitora productora de minicélulas de acuerdo con el aspecto 446, en la que dicha célula progenitora es MC-T7.

448.

Una minicélula que comprende un compuesto biológicamente activo, en la que dicha minicélula muestra un resto de unión, en la que dicha minicélula absorbe y/o internaliza un compuesto no deseado, y dicha minicélula es un poroplasto, un esferoplasto o un protoplasto.

449.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 448, en el que dicho resto de unión se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un derivado de anticuerpo, un receptor y un sitio activo de un derivado no catalítico de una enzima.

450.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 458, en el que dicho resto de unión es un anticuerpo monocatenario.

451.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 458, en el que dicho resto de unión se dirige a un ligando seleccionado del grupo que consiste en un epítopo mostrado en un patógeno, un epítopo mostrado en una célula infectada y un epítopo mostrado en una célula hiperproliferativa.

452.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 458, en el que dicho compuesto biológicamente activo se selecciona del grupo que consiste en un radioisótopo, un polipéptido, un ácido nucleico y una molécula pequeña.

453.

La minicélula de acuerdo con el aspecto 448, en la que un ligando se une y se internaliza por dicha minicélula o se inactiva de otro modo mediante absorción selectiva.

454.

Una composición farmacéutica que comprende la minicélula de acuerdo con el aspecto 448.

455.

Un procedimiento para reducir la concentración libre de una sustancia en una composición, en el que dicha sustancia muestra un ligando reconocido específicamente por un resto de unión, que comprende poner en contacto dicha composición con una minicélula que muestra el resto de unión, en la que dicho resto de unión se une a dicha sustancia, reduciendo de este modo la concentración libre de dicha sustancia en dicha composición.

456.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 455, en la que dicha minicélula se selecciona del grupo que consiste en una minicélula eubacteriana, un poroplasto, un esferoplasto y un protoplasto.

457.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 455, en el que dicha sustancia se selecciona del grupo que consiste en un ácido nucleico, un lípido, un polipéptido, un compuesto radiactivo, un ion y una molécula pequeña.

458.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 455, en el que dicho resto de unión se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un derivado de anticuerpo, una proteína de canal y un receptor.

459.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 455, en el que dicha composición está presente en un entorno.

460.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 459, en el que dicho entorno es agua, aire o suelo.

461.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 455, en el que dicha composición es una muestra biológica de un organismo.

462.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 461, en el que dicha muestra biológica se selecciona del grupo que consiste en sangre, suero, plasma, orina, saliva, una muestra de biopsia, heces, tejido y un parche de piel.

463.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 461, en el que dicha sustancia se une y se internaliza por dicha minicélula o se inactiva de otro modo mediante absorción selectiva.

464.

El procedimiento de acuerdo con el aspecto 463, en el que dicha muestra biológica se devuelve a dicho organismo después de ponerse en contacto con dicha minicélula.

LISTADOS DE SECUENCIAS:

SEC ID Nº: 1 pMPX-23 (ftsZ completo clonado en pMPX-18 usando PstI y Xbal introducidos mediante PCR)

La secuencia contiene el ftsZ de longitud completa amplificado mediante PCR procedente de E. coli MG 1655 usando oligos que contienen los sitios de restricción Pstl y Xbal. SEC ID Nº: 2 La secuencia contiene el ftsZ de longitud completa amplificado mediante PCR procedente de E. coli MG 1655 usando oligos que contienen los sitios de restricción Pstl y Xbal. SEC ID Nº: 3 araC::Para::ftsZ insertado mediante recombinación RED en E. coli MG1655 intD Negrita, cursiva representa homología entre el producto de la PCR mostrado a continuación e intD. araC::Para::ftsZ::FRT::kan::Frt Tras la recombinación RED en intD, el casete de kanamicina se eliminó con recombinasa flp dando como resultado una única cicatriz FRT como se ha representado gráficamente antes. La negrita sola representa la cicatriz FRT tras la reacción flp. SEC ID Nº: 4 rhaRS::Prha::ftsZ insertado mediante recombinación RED en E. coli MG1655 intD Negrita, cursiva representa homología entre el producto de la PCR mostrado a continuación e intD. rhaRS::Prha::flsZ::FRT::kan::Frt Tras la recombinación RED en intD, el casete de kanamicina se eliminó con recombinasa flp dando como resultado una única cicatriz FRT como se ha representado gráficamente antes. La negrita sola representa la cicatriz FRT tras la reacción flp. SEC ID Nº: 5 lacl::Ptac::flsZ insertado mediante recombinación RED en E. coli MG1655 intD

Negrita, cursiva representa homología entre el producto de la PCR mostrado a continuación eintD. lacl::Ptac:: ftsZ ::FRT:: kan ::Frt Tras la recombinación RED en intD, el casete de kanamicina se eliminó con recombinasa flp dando como resultado una única cicatriz FRT como se ha representado gráficamente antes. Garrido, T., y col., 1993. Transcription of ftsZ oscillates during the cell cycle of Escherichia coli. EMBO J. 12:3957-3965). SEC ID Nº: 6 Vector de expresión pMPX-5

El segmento rhaR hasta la región de control Prha se tomó del cromosoma de E. coli MG1655 usando los sitios de restricción HindIII y PstI añadidos mediante PCR. Este fragmento se cortó con HindIII y PstI y se clonó en pUC-18 cortado con las mismas enzimas. La secuencia en cursiva constituye tanto rhaSR como la proteína a expresarse en la región promotora. SEC ID Nº: 10 Vector de expresión pMPX-7

MG1655 usando los sitios de restricción HindIII y PstI añadidos mediante PCR. Este fragmento se cortó con HindIII y PstI y se clonó en pUC-18 cortado con las mismas enzimas. La secuencia subrayada constituye la región reguladora uidR mientras que la secuencia en cursiva constituye la proteína a expresar en la región promotora bajo el control de uidR. SEC ID Nº: 11 Vector de expresión pMPX-8 El segmento melR hasta la región de control Pmel se tomó del cromosoma de E. coli MG1655 usando los sitios de restricción HindIII y PstI añadidos mediante PCR. Este fragmento se cortó con HindIII y PstI y se clonó en pUC-18 cortado con las mismas enzimas. La secuencia en cursiva constituye tanto melR como la proteína a expresarse en la región promotora. SEC ID Nº: 12 Vector de expresión pMPX-18 El segmento araC hasta la región de control Para se tomó de pBAD24 usando los sitios de restricción HindIII y PstI añadidos mediante PCR. Este fragmento se cortó con HindIII y PstI y se clonó en pUC-18 cortado con las mismas enzimas. La secuencia en cursiva constituye tanto araC como la proteína a expresarse en la región promotora.

El segmento araC hasta SstII tras la región de control Para se tomó de pBAD24 usando un sitio de restricción Xhol añadido mediante PCR. Este fragmento se cortó con Xhol y SstIIy se clonó en pEGFP-C1 (Clontech) cortado con las mismas enzimas. Las secuencias en cursiva y subrayadas constituyen la región promotora CMV mientras que la región en cursiva solamente constituye tanto araC como la proteína a expresar en la región promotora. SEC ID Nº: 14

SEC ID Nº: 15 pMPX-57 (receptor adrenérgico β2 (β2AR) clonado en pMPX-5 usando Sail y BamHI introducidos mediante PCR)

SEC ID Nº: 16

SEC ID Nº: 17 pMPX-1 (restos 41-455 del receptor del factor de necrosis tumoral humano (TNFR-1) clonados en pBAD-24 usando NcoI y XbaI introducidos mediante PCR) SEC ID Nº: 18 pMPX-22 (restos 29-455 del receptor del factor de necrosis tumoral humano (TNFR-1) clonados en pMPX-18 usando Sall y Kpnl introducidos mediante PCR) SEC ID Nº: 19

SEC ID Nº: 20 pMPX-52 (toxR-EGF clonado en pMPX-6 usando Kpnl y Hindlll introducidos mediante PCR)

La secuencia subrayada sin negrita es el dominio transmembrana toxR que constituye los restos toxR 178-198. El resto de la secuencia procede de EGF humano que constituye los restos EGF 971-1023. SEC ID Nº: 21 pMPX-27 (toxR-invasina clonada en pMPX-6 usando EcoRI y PstI introducida por PCR)

La secuencia subrayada sin negrita es el dominio transmembrana toxR que constituye los restos toxR 178-198. El resto de la secuencia procede de la invasina de Yersinia pseudotuberculosis que constituye los restos 490

986. SEC ID Nº: 22 pMPX-59 (líder de phoA clonado en pMPX-5 usando PstI y Xbal introducidas por PCR)

Líder PhoA (restos 1-48) de E. coli MG1655 clonada en pMPX-5. Crea fusiones quiméricas con la líder phoA por clonación en XbaI e introducción de una secuencia de detención. SEC ID Nº: 23 pMPX-60 (phoA completa clonada en pMPX-5 usando PstI y Xbal introducidas por PCR)

PhoA completa a partir de E. coli MG1655 clonada en pMPX-5. Crea fusiones quiméricas con phoA por clonación en XbaI e introducción de una secuencia de detención. SEC ID Nº: 24 pMPX-62 (restos 1-28 de MalE clonados en pMPX-5 usando PstI y Xbal intoducidas por PCR)

Restos MalE 1-28 procedentes de E. coli MG1655 clonada en pMPX-5. Crea fusiones quiméricas con malE por clonación en XbaI e introducción de una secuencia de detención. SEC ID Nº: 25 pMPX-61 (restos 1-370 de MalI clonados en pMPX-5 usando PstI y Xbal introducidas por PCR)

Restos MalE 1-370 procedentes de E. coli MG1655 clonada en pMPX-5. Crea fusiones quiméricas con malE por clonación en XbaI e introducción de una secuencia de detención. SEC ID Nº: 26 pMPX-17 (tig completa y groESL, ambas con la región de control nativa completa clonada en pMPX-5 usando NarI y HindIII introducidos mediante PCR. Las regiones tig y groESL se unieron con Xbal). Construcción a utilizar en el mismo vector que la proteína a expresar o como molde para su inserción en pACYC184.

SEC ID Nº: 27 pMPX-63 (extremo C de fusión con los restos 2-109 de TrxA del Factor Xa con FLAG clonado en pMPX-5 usando PstI y BamHI introducidos mediante PCR) Gen trxA (2-109) de E. coli MG1655 clonado en pMPX-5. Crea fusiones quiméricas con trxA por clonación en PstI y XbaI. Puede eliminar trxA usando Xhol. Secuencia FLAG mostrada en cursiva solamente. SEC ID Nº: 28

SEC ID Nº: 29 Secuencia de aminoácidos de Edg-3 de rata

SEC ID Nº: 153 Vector de expresión pMPX-66 inducible por arabinosa

El segmento araC a Para se tomó de pBAD24 usando HindIII añadido mediante PCR y secuencia Shine-Delgamo (SD) alineada modificada con Sall seguido de Xbal, una secuencia de finalización transcripcional de tallo-bucle, y Kpnl. El producto de la PCR se clonó en pUC18 usando HindIII y KpnI. SEC ID Nº: 152

El segmento rhaR a Prha se tomó del cromosoma de E. coli usando HindIII añadido mediante PCR y secuencia Shine-Delgamo (SD) alineada modificada con PstI seguido de Sall, XbaI, una secuencia de finalización transcripcional de tallo-bucle, y Kpnl. El producto de la PCR se clonó en pUC18 usando HindIII y KpnI. SEC ID Nº: 151

El segmento rhaR a Prha se tomó del cromosoma de E. coli usando HindIII añadido mediante PCR y secuencia Shine-Delgamo (SD) alineada modificada con Sall seguido de XbaI, una secuencia de finalización transcripcional de tallo-bucle, y Kpnl. El producto de la PCR se clonó en pUC18 usando HindIII y KpnI. SEC ID Nº: 154

El segmento araC a Para se tomó de pBAD24 usando HindIII añadido mediante PCR y secuencia Shine-Delgamo (SD) alineada modificada con PstI seguido de Sall, Xbal, una secuencia de finalización transcripcional de tallo-bucle, y Kpnl. El producto de la PCR se clonó en pUC18 usando HindIII y KpnI. SEC ID Nº: 155

SEC ID Nº: 166 MalE (1-370) Factor Xa NTR (43-424) FLAG Sail +1 MalE (1-370)

SEC ID Nº: 167 MalE (1-28) Factor Xa NTR (43-424) FLAG Sail +1 líder MalE (1-28)

SEC ID Nº: 169 MalE (1-370) Factor Xa NTR (43-424) TrxA (2-109) FLAG Sail +1 MalE (1-370)

SEC ID Nº: 170 MalE (1-28) Factor Xa NTR (43-424) TrxA (2-109) FLAG Sail +1 líder MalE (1-28)

SEC ID Nº: 188 Fusión quimérica D2AR GS1h humano Sail +1 B2AR

SEC ID Nº: 190 Fusión transcripcional 02AR humana con detención GS10 PstI +1 B2AR

SEC ID Nº: 192 GS10 XhoI humano

SEC ID Nº: 193 GS20 XhoI humano SEC ID Nº: 194 Ghq XhoI humano

SEC ID Nº: 195 Gih XhoI humano

SEC ID Nº: 196 G12/13 Xhol humano

SEC ID Nº: 205 Quimera O2AR-ToxR (5-141) con detención GS1-ToxR (5-141) quimera de fusión transcripcional Sail +1 B2AR

SEC ID Nº: 208 Construcción con el gen indicador Pctx::IacZ de Vibrio cholerae

SEC ID Nº: 266 Vector de fusión pMPX-74 MalE (1-28)

SEC ID Nº: 267 Vector de fusión pMPX-75 MalE (1-28)

pMPX-71::malE(1-28)::FXa::PstI, SalI, XbaI::FLAG inducible mediante arabinosa, clonado en PstI, SalI, XbaI Realizado mediante corte TOPO NsiI-malE (1-28)::FXa::PstI, SalI, Inserción XbaI::FLAG-NheI con Nsil & NheI y clonación en pMPX-71 cortado con PstI y Xbal. SEC ID Nº: 268 Vector de fusión pMPX-78 (1-28) pMPX-84::malE(l-28)::FXa::PstI, Sail, Xbal::FLAG inducible mediante temperatura, clonado en PstI, Sail, Xbal Realizado mediante corte TOPO NsiI-malE (1-28)::FXa::PstI, Sail, Inserción Xbal::FLAG-Nhel con Nsil & Nhel y clonación en pMPX-84 cortado con Pstl y Xbal. SEC ID Nº: 269

pMPX-86::malE(1-28)::FXa::PstI, Sall, Xbal::FLAG inducible mediante temperatura, clonado en PstI, Sall, Xbal Realizado mediante corte TOPO NsiI-malE (1-28)::FXa::PstI, Sall, Inserción Xbal::FLAG-Nhel con Nsil & Nhel y clonación en pMPX-86 cortado con Pstl y Xbal. SEC ID Nº: 270 Vector de fusión pMPX-77 MalE (1-370 del 354-364)

pMPX-72::malE(1-370 del 354-364)::FXa::PstI, Sail, Xbal::FLAG inducible mediante ramnosa, clonado en PstI, Sail, Xbal Realizado mediante corte TOPO NsiI-malE (1-370 del 354-364)::FXa::PstI, Sail, Inserción Xbal::FLAG-Nhel con Nsil & Nhel y clonación en pMPX-72 cortado con Pstl y Xbal. SEC ID Nº: 271 pMPX-71::malE(1-370 del 354-364)::FXa::Pstl, Sail, Xbal::FLAG inducible mediante arabinosa, clonado en PstI, Sail, Xbal Realizado mediante corte TOPO NsiI-malE (1-370 del 354-364)::FXa::PstI, Sail, Inserción XbaI::FLAG-NheI con Nsil & NheI y clonación en pMPX-71 cortado con PstI y

Xbal. SEC ID Nº: 272 Vector de fusión pMPX-89 MalE (1-370 del 354-364)

pMPX-84::malE(1-370 del 354-364)::FXa::PstI, Sail, Xbal::FLAG inducible mediante temperatura, clonado en PstI, Sail, Xbal Realizado mediante corte TOPO NsiI-malE (1-370 del 354-364)::FXa::PstI, Sail, Inserción Xbal::FLAG-Nhel con Nsil & Nhel y clonación en pMPX-84 cortado con Pstl y Xbal. SEC ID Nº: 273

pMPX-86::malE(1-370 del 354-364)::FXa::PstI, Sail, Xbal::FLAG inducible mediante temperatura, clonado en PstI, Sail, Xbal Realizado mediante corte TOPO NsiI-malE (1-370 del 354-364)::FXa::PstI, Sail, Inserción Xbal::FLAG-Nhel con Nsil & Nhel y clonación en pMPX-86 cortado con Pstl y Xbal. SEC ID Nº: 274

10 pMPX-7l::Pstl, Sall, Xbal:trxA (2-109 del 103-107)::FLAG inducible mediante arabinosa, clonado en PstI, Sall, Xbal + 1 Met necesario para que la proteína se fusione, Realizado mediante corte TOPO Pstl, Sall, Inserción Xbal:trxA (2-109 del 103-107::FLAG-Nhel con Pstl & Nhel y clonación en pMPX-71 cortado con Pstl y Xbal. SEC ID Nº: 275

15 Vector de fusión pMPX-78 TrxA (2-109 del 103-107) Xbal perdido GCTAGAGG (detención transcripcional) pMPX-72::PstI, Sail, Xbal:trxA (2-109 del 103-107)::FLAG inducible mediante ramnosa, clonado en PstI, SalI, Xbal + 1 Met necesario para que la proteína se fusione, Realizado mediante corte TOPO Pstl, SalI, Inserción XbaI:trxA (2-109 del 103-107)::FLAG-NheI con PstI y NheI y clonación en pMPX-72 cortado con PstI y XbaI. SEC ID Nº: 276 Vector de fusión pMPX-90 TrxA (2-109 del 103-107)

pMPX-84::PstI, Sail, Xbal:trxA (2-109 del 103-107)::FLAG inducible mediante temperatura, clonado en PstI, Sail, Xbal + 1 Met necesario para que la proteína se fusione, Realizado mediante corte TOPO Pstl, Sail, Inserción Xbal:trxA (2-109 del 103-107::FLAG-Nhel con Pstl & Nhel y clonación en pMPX-84 cortado con Pstl y Xbal. SEC ID Nº: 277

pMPX-86::PstI, Sail, Xbal:trxA (2-109 del 103-107)::FLAG inducible mediante temperatura, clonado en PstI, Sail, Xbal + 1 Met necesario para que la proteína se fusione, Realizado mediante corte TOPO Pstl, Sail, Inserción Xbal:trxA (2-109 del 103-107::FLAG-Nhel con Pstl & Nhel y clonación en pMPX-86 cortado con Pstl y Xbal. SEC ID Nº: 278

pMPX-72::malE(l-28)::FXa::PstI, Sail, XbaI::TrxA(1-109 del 103-107)::FLAG inducible mediante ramnosa, clonado en PstI, Sail, Xbal Realizado mediante corte TOPO NsiI-malE (1-28)::FXa::PstI, Sail, Inserción Xbal::FLAG-Nhel con Nsil y Xbal y clonación en pMPX-78 cortado con Pstl y Xbal. SEC ID Nº: 279

pMPX-71::malE(1-28)::FXa::PstI, Sail, Xbal:TrxA (1-109 del 103-107)::FLAG inducible mediante arabinosa, clonado en PstI, Sail, Xbal

Realizado mediante corte TOPO NsiI-malE (1-28)::FXa::PstI, Sail, Inserción Xbal::FLAG-Nhel con Nsil y Xbal y clonación en pMPX-79 cortado con Pstl y Xbal. SEC ID Nº: 280

pMPX-84::malE(1-28)::FXa::Pstl, Sall, Xbal:TrxA (1-109 del 103-107)::FLAG inducible mediante temperatura, clonado en PstI, Sall, Xbal Realizado mediante corte TOPO NsiI-malE (1-28)::FXa::PstI, Sail, Inserción Xbal::FLAG-Nhel con Nsil y Xbal y clonación en pMPX-90 cortado con Pstl y Xbal. SEC ID Nº: 281 Vector de fusión pMPX-96 MalE (1-28) MCS TrxA (2-109 del 103-107)

pMPX-86::malE(l-28)::FXa::PstI, Sail, Xbal:TrxA (1-109 del 103-107)::FLAG inducible mediante temperatura, clonado en PstI, Sail, Xbal Realizado mediante corte TOPO NsiI-malE (1-28)::FXa::PstI, Sail, Inserción Xbal::FLAG-Nhel con Nsil y Xbal y clonación en pMPX-95 cortado con Pstl y Xbal. SEC ID Nº: 282 Vector de fusión pMPX-83 MalE (1-370 del 354-364) MCS TrxA (2-109 del 103-107)

pMPX-72::malE(1-320 del 354-364)::FXa::PstI, Sail, XbaI::TrxA(1-109 del 103-107)::FLAG inducible mediante ramnosa, clonado en PstI, Sail, Xbal Realizado mediante corte TOPO NsiI-malE (1-370 del 354-364)::FXa::PstI, Sall, Inserción Xbal::FLAG-Nhel con Nsil y Xbal y clonación en pMPX-78 cortado con Pstl y Xbal. SEC ID Nº: 283

Vector de fusión pMPX-83 MalE (1-370 del 354-364) MCS TrxA (2-109 del 103-107)

SD Pstl +1 malE (1-370 del 352-362) perdido

Xbal perdido CTAGAGG (detención transcripcional) pMPX-71::malE(1-370 del 354-364)::FXa::PstI, Sail, Xbal:TrxA (1-109 del 103-107)::FLAG inducible mediante arabinosa, clonado en PstI, Sail, Xbal Realizado mediante corte TOPO NsiI-malE (1-370 del 354-364)::FXa::PstI, Sall, Inserción Xbal::FLAG-Nhel con Nsil y Xbal y clonación en pMPX-79 cortado con Pstl y Xbal. SEC ID Nº: 284 Vector de fusión pMPX-92 MalE (1-370 del 354-364) MCS TrxA (2-109 del 103-107)

Xbal perdido CTAGAGGTACC (detención transcripcional) pMPX-84::malE(1-370 del 354-364)::FXa::PstI, Sail, Xbal:TrxA (1-109 del 103-107)::FLAG inducible mediante temperatura, clonado en PstI, Sail, Xbal Realizado mediante corte TOPO NsiI-malE (1-370 del 354-364)::FXa::PstI, Sall, Inserción Xbal::FLAG-Nhel con Nsil y Xbal y clonación en pMPX-90 cortado con Pstl y Xbal. SEC ID Nº: 285 Vector de fusión pMPX-97 MalE (1-370 del 354-364) MCS TrxA (2-109 del 103-107)

Xbal perdido CTAGAGGTACC (detención transcripcional) pMPX-86::malE(1-370 del 354-364)::FXa::PstI, Sail, Xbal:TrxA (1-109 del 103-107)::FLAG inducible mediante temperatura, clonado en PstI, Sail, Xbal Realizado mediante corte TOPO NsiI-malE (1-370 del 354-364)::FXa::PstI, Sall, Inserción Xbal::FLAG-Nhel con Nsil y Xbal y clonación en pMPX-95 cortado con Pstl y Xbal. SEC ID Nº: 151 Vector de expresión pMPX-66 inducible por arabinosa

El segmento araC a Para se tomó de pBAD24 usando HindIII añadido mediante PCR y secuencia Shine-Delgamo (SD) alineada modificada con Sall seguido de Xbal, una secuencia de finalización transcripcional de tallo-bucle, y Kpnl. El producto de la PCR se clonó en pUC18 usando HindIII y KpnI. SEC ID Nº: 152 Vector de expresión pMPX-72 inducible por ramnosa El segmento rhaR a Prha se tomó del cromosoma de E. coli usando HindIII añadido mediante PCR y secuencia Shine-Delgamo (SD) alineada modificada con PstI seguido de Sall, Xbal, una secuencia de finalización transcripcional de tallo-bucle, y Kpnl. El producto de la PCR se clonó en pUC18 usando HindIII y KpnI. SEC ID Nº: 153 Vector de expresión pMPX-67 inducible por ramnosa

El segmento rhaR a Prha se tomó del cromosoma de E. coli usando HindIII añadido mediante PCR y secuencia Shine-Delgamo (SD) alineada modificada con Sall seguido de XbaI, una secuencia de finalización transcripcional de tallo-bucle, y Kpnl. El producto de la PCR se clonó en pUC18 usando HindIII y KpnI. SEC ID Nº: 154 El segmento araC a Para se tomó de pBAD24 usando HindIII añadido mediante PCR y secuencia Shine-Delgamo (SD) alineada modificada con PstI seguido de Sall, XbaI, una secuencia de finalización transcripcional de tallo-bucle, y Kpnl. El producto de la PCR se clonó en pUC18 usando HindIII y KpnI. SEC ID Nº: 155 Vector de expresión pMPX-68 inducible por melibiosa

SEC ID Nº: 166 MalE (1-370) Factor Xa NTR (43-424) FLAG SEC ID Nº: 162 MalE (1-28) Factor Xa NTR (43-424) FLAG SEC ID Nº: 169 MalE (1-370) Factor Xa NTR (43-424) TrxA (2-109) FLAG SEC ID Nº: 170 MalE (1-28) Factor Xa NTR (43-424) TrxA (2-109) FLAG SEC ID Nº: 188 Fusión quimérica 2AR GS1□ humano SEC ID Nº: 190 Fusión transcripcional 2AR con detención GS1□

SEQ ID NO.:192 GS1□ humano

SEC ID Nº: 193 GS2

□ humano

SEC ID Nº: 194 Gq humano

SEC ID Nº: 195 Gi□ humano

SEC ID Nº: 196 G12/13 humano

SEC ID Nº: 205 Quimera de fusión transcripcional 2AR-ToxR (5-141) con detención GS1-ToxR (5-141)

SEC ID Nº: 208 Construcción con el gen indicador Pctx::IacZ de Vibrio cholerae

SEC ID Nº: 266 Vector de fusión pMPX-74 MalE (1-28)

pMPX-72::malE(1-28)::FXa::Pstl, SalI, Xbal::FLAG inducible mediante ramnosa, clonado en PstI, SalI, XbaI Realizado mediante corte TOPO NsiI-malE (1-28)::FXa::PstI, SalI, Inserción XbaI::FLAG-NheI con Nsil & NheI y clonación en pMPX-72 cortado con PstI y Xbal. SEC ID Nº: 267

pMPX-71::malE(1-28)::FXa::PstI, Sail, Xbal::FLAG inducible mediante arabinosa, clonado en PstI, Sail, Xbal Realizado mediante corte TOPO NsiI-malE (1-28)::FXa::PstI, Sail, Inserción Xbal::FLAG-Nhel con Nsil & Nhel y clonación en pMPX-71 cortado con Pstl y Xbal. SEC ID Nº: 268 Vector de fusión pMPX-78 (1-28) pMPX-84::malE(1-28)::FXa::Pstl, Sall, Xbal::FLAG inducible mediante temperatura, clonado en PstI, Sall, Xbal Realizado mediante corte TOPO NsiI-malE (1-28)::FXa::PstI, Sall, Inserción Xbal::FLAG-Nhel con Nsil & Nhel y clonación en pMPX-84 cortado con Pstl y Xbal. SEC ID Nº: 269

pMPX-86::malE(1-28)::FXa::Pstl, Sall, Xbal::FLAG inducible mediante temperatura, clonado en PstI, Sall, Xbal Realizado mediante corte TOPO NsiI-malE (1-28)::FXa::PstI, Sall, Inserción Xbal::FLAG-Nhel con Nsil & Nhel y clonación en pMPX-86 cortado con Pstl y Xbal. SEC ID Nº: 270 Vector de fusión pMPX-77 MalE (1-370 del 354-364) pMPX-72::malE(1-370 del 354-364)::FXa::PstI, Sail, Xbal::FLAG inducible mediante ramnosa, clonado en PstI, Sail, Xbal Realizado mediante corte TOPO NsiI-malE (1-370 del 354-364)::FXa::PstI, Sall, Inserción Xbal::FLAG-Nhel con Nsil & Nhel y clonación en pMPX-72 cortado con Pstl y Xbal. SEC ID Nº: 271 pMPX-71::malE(1-370 del 354-364)::FXa::PstI, Sail, Xbal::FLAG inducible mediante arabinosa, clonado en PstI, Sail, Xbal Realizado mediante corte TOPO NsiI-malE (1-370 del 354-364)::FXa::PstI, Sail, Inserción Xbal::FLAG-Nhel con Nsil & Nhel y clonación en pMPX-71 cortado con Pstl y Xbal. SEC ID Nº: 272 pMPX-84::malE(1-370 del 354-364)::FXa::PstI, Sail, Xbal::FLAG inducible mediante temperatura, clonado en PstI, Sail, Xbal Realizado mediante corte TOPO NsiI-malE (1-370 del 354-364)::FXa::PstI, Sall, Inserción Xbal::FLAG-Nhel con Nsil & Nhel y clonación en pMPX-84 cortado con Pstl y Xbal. SEC ID Nº: 273 Vector de fusión pMPX-94 MalE (1-370 del 354-364) pMPX-86::malE(1-370 del 354-364)::FXa::PstI, Sail, Xbal::FLAG inducible mediante temperatura, clonado en PstI, Sail, Xbal Realizado mediante corte TOPO NsiI-malE (1-370 del 354-364)::FXa::PstI, Sall, Inserción Xbal::FLAG-Nhel con

5 Nsil & Nhel y clonación en pMPX-86 cortado con Pstl y Xbal. SEC ID Nº: 274 Vector de fusión pMPX-79 TrxA (2-109 del 103-107)

pMPX-71::Pstl, Sall, Xbal:trxA (2-109 del 103-107)::FLAG inducible mediante arabinosa, clonado en PstI, Sall,

10 Xbal + 1 Met necesario para que la proteína se fusione, Realizado mediante corte TOPO Pstl, Sall, Inserción Xbal:trxA (2-109 del 103-107::FLAG-Nhel con Pstl & Nhel y clonación en pMPX-71 cortado con Pstl y Xbal. SEC ID Nº: 275

pMPX-72::PstI, Sail, Xbal:trxA (2-109 del 103-107)::FLAG inducible mediante ramnosa, clonado en PstI, Sail, Xbal + 1 Met necesario para que la proteína se fusione, Realizado mediante corte TOPO Pstl, Sall, Inserción Xbal:trxA (2-109 del 103-107::FLAG-Nhel con Pstl & Nhel y clonación en pMPX-72 cortado con Pstl y Xbal. SEC ID Nº: 276 Vector de fusión pMPX-90 TrxA (2-109 del 103-107)

pMPX-84::Pstl, Sall, Xbal:trxA (2-109 del 103-107)::FLAG inducible mediante temperatura, clonado en PstI, Sall, Xbal +1 Met necesario para que la proteína se fusione, Realizado mediante corte TOPO Pstl, Sall, Inserción Xbal:trxA (2-109 del 103-107::FLAG-Nhel con Pstl & Nhel y clonación en pMPX-84 cortado con Pstl y Xbal. SEC ID Nº: 277

10 pMPX-86::PstI, Sail, Xbal:trxA (2-109 del 103-107)::FLAG inducible mediante temperatura, clonado en PstI, Sail, Xbal + 1 Met necesario para que la proteína se fusione, Realizado mediante corte TOPO Pstl, Sail, Inserción Xbal:trxA (2-109 del 103-107::FLAG-Nhel con Pstl & Nhel y clonación en pMPX-86 cortado con Pstl y Xbal. SEC ID Nº: 278

15 Vector de fusión pMPX-80 MalE (1-28) MCS TrxA (2-109 del 103-107) pMPX-72::malE(1-28)::FXa::Pstl, Sall, Xbal:TrxA (1-109 del 103-107)::FLAG inducible mediante ramnosa, clonado en PstI, Sall, Xbal Realizado mediante corte TOPO NsiI-malE (1-28)::FXa::PstI, Sall, Inserción Xbal::FLAG-Nhel con Nsil y Xbal y clonación en pMPX-78 cortado con Pstl y Xbal. SEC ID Nº: 279

10 pMPX-71::malE(1-28)::FXa::PstI, Sail, Xbal:TrxA (1-109 del 103-107)::FLAG inducible mediante arabinosa, clonado en PstI, Sail, Xbal Realizado mediante corte TOPO NsiI-malE (1-28)::FXa::PstI, Sail, Inserción Xbal::FLAG-Nhel con Nsil y Xbal y clonación en pMPX-79 cortado con Pstl y Xbal. SEC ID Nº: 280

15 Vector de fusión pMPX-91 MalE (1-28) MCS TrxA (2-109 del 103-107) pMPX-84::malE(1-28)::FXa::Pstl, Sall, Xbal:TrxA (1-109 del 103-107)::FLAG inducible mediante temperatura, clonado en PstI, Sall, Xbal Realizado mediante corte TOPO NsiI-malE (1-28)::FXa::PstI, Sall, Inserción Xbal::FLAG-Nhel con Nsil y Xbal y clonación en pMPX-90 cortado con Pstl y Xbal. SEC ID Nº: 281

10 pMPX-86::malE(l-28)::FXa::PstI, Sail, Xbal:TrxA (1-109 del 103-107)::FLAG inducible mediante temperatura, clonado en PstI, Sail, Xbal Realizado mediante corte TOPO NsiI-malE (1-28)::FXa::PstI, Sail, Inserción XbaC::FLAG-Nhel con Nsil y Xbal y clonación en pMPX-95 cortado con Pstl y Xbal. SEC ID Nº: 282

15 Vector de fusión pMPX-83 MalE (1-370 del 354-364) MCS TrxA (2-109 del 103-107) pMPX-72::malE(1-320 del 354-364)::FXa::Pstl, Sail, XbaI::TrxA(1-109 del 103-107)::FLAG inducible mediante ramnosa, clonado en PstI, Sail, Xbal Realizado mediante corte TOPO NsiI-malE (1-370 del 354-364)::FXa::PstI, Sall, Inserción Xbal::FLAG-Nhel con Nsil y Xbal y clonación en pMPX-78 cortado con Pstl y Xbal. SEC ID Nº: 283

Vector de fusión pMPX-83 MalE (1-370 del 354-364) MCS TrxA (2-109 del 103-107)

pMPX-71::malE(1-370 del 354-364)::FXa::PstI, Sail, Xbal:TrxA (1-109 del 103-107)::FLAG inducible mediante arabinosa, clonado en PstI, Sail, Xbal Realizado mediante corte TOPO NsiI-malE (1-370 del 354-364)::FXa::PstI, Sall, Inserción Xbal::FLAG-Nhel con Nsil y Xbal y clonación en pMPX-79 cortado con Pstl y Xbal. SEC ID Nº: 284 Vector de fusión pMPX-92 MalE (1-370 del 354-364) MCS TrxA (2-109 del 103-107) pMPX-84::malE(1-370 del 354-364)::FXa::PstI, Sail, Xbal:TrxA (1-109 del 103-107)::FLAG inducible mediante temperatura, clonado en PstI, Sail, Xbal Realizado mediante corte TOPO NsiI-malE (1-370 del 354-364)::FXa::PstI, Sall, Inserción Xbal::FLAG-Nhel con Nsil y Xbal y clonación en pMPX-90 cortado con Pstl y Xbal. SEC ID Nº: 285

Vector de fusión pMPX-97 MalE (1-370 del 354-364) MCS TrxA (2-109 del 103-107)

pMPX-86::malE(1-370 del 354-364)::FXa::PstI, Sail, Xbal:TrxA (1-109 del 103-107)::FLAG inducible mediante temperatura, clonado en PstI, Sail, Xbal Realizado mediante corte TOPO NsiI-malE (1-370 del 354-364)::FXa::PstI, Sall, Inserción Xbal::FLAG-Nhel con Nsil y Xbal y clonación en pMPX-95 cortado con Pstl y Xbal.

Claims (3)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Una minicélula eubacteriana completamente intacta derivada de una célula progenitora eubacteriana, en la que la minicélula comprende un compuesto biológicamente activo y muestra un anticuerpo o un derivado de anticuerpo, en la que el compuesto biológicamente activo y el anticuerpo o derivado de anticuerpo son exógenos para la célula progenitora y diferentes el uno del otro.

2. 2.

   La minicélula de la reivindicación 1, en la que dicho anticuerpo o derivado de anticuerpo es un anticuerpo.

3. 3.

   La minicélula de la reivindicación 1, en la que dicho anticuerpo o derivado de anticuerpo es un anticuerpo, derivado.

   Figura 2