EA011282B1

EA011282B1 - Бактериальные упаковывающие штаммы, используемые для генерирования и продуцирования рекомбинантных нуклеокапсидов с двухцепочечной рнк, и их применение

Info

Publication number: EA011282B1
Application number: EA200701129A
Authority: EA
Inventors: Дэвид Майкл Хоун; Джон Фулкерсон; Джералд С. Сэдофф; Дэвид Ониэйб; Мишель Стоун
Original assignee: ЭЙРАС ГЛОУБАЛ ТиБи ВЭКСИН ФАУНДЕЙШН
Priority date: 2004-11-30
Filing date: 2005-11-23
Publication date: 2009-02-27
Also published as: WO2006060257A2; PE20061169A1; KR20070101854A; EP1817408B1; EP1817408A2; AU2005310119A1; WO2006060257A3; US8053568B2; EA200701129A1; JP2008521434A; US20060115493A1; BRPI0518109A; TW200631593A; AP2007004020A0; EP1817408A4; CA2587493A1; MX2007006366A

Abstract

Настоящее изобретение относится к бактериальным упаковывающим штаммам, которые могут быть использованы для продуцирования рекомбинантных нуклеокапсидов, содержащих двухцепочечную РНК (rdsRN). Упаковывающие штаммы могут быть использованы для продуцирования РНК-кодирующих вакцинных антигенов, биологически активных белков, иммунорегуляторных белков, антисмысловых РНК и каталитических РНК в эукариотических клетках или тканях. Рекомбинантную ssРНК вводят в штаммы и пакуют до образования rdsRN de novo.

Description

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к бактериальным упаковывающим штаммам, используемым в целях генерирования рекомбинантных нуклеокапсидов, содержащих двухцепочечную РНК, (τ6δΚΝ), для продуцирования РНК, кодирующей вакцинные антигены, биоактивные белки, иммунорегуляторные белки, антисмысловые РНК и каталитические РНК в эукариотических клетках или тканях. В частности, настоящее изобретение относится к бактериальным упаковывающим штаммам, в которые встраивается и упаковывается рекомбинантная 88РНК с образованием рекомбинантных нуклеокапсидов τάδΡΝ бе ηονο, которые реплицируются в указанных упаковывающих штаммах и, в свою очередь, продуцируют представляющую интерес РНК.

Предшествующий уровень техники

Вирусный нуклеокапсид, т.е. нуклепротеиновая сердцевина вирусов, обладает многочисленными свойствами, благодаря которым они могут экспрессировать гетерологичные генные последовательности в биологических системах. Из-за отсутствия внешних мембран и адгезинов, которые присутствуют в полных вирусах, нуклеокапсиды представляет собой неинфекционные частицы, состоящие из белков и генетического материала вирусной сердцевины, которая сохраняет способность образовывать капсид и реплицировать последовательности нуклеиновой кислоты. Таким образом, риск инфицирования или распространения инфекции в окружающую среду может быть уменьшен путем элиминации последовательностей, кодирующих мембраны, адгезины, протеазы и другие инфекционные или цитолитические факторы родительского вируса. Кроме того, РНК-нуклеокапсиды позволяют повышать безопасность таких генных экспрессионных систем путем выбора вирусных предшественников, которые, в своем репликативном цикле, не проходят стадию образования ДНК, что снижает риск включения чужеродной нуклеотидной последовательности в геном клетки или организма, в которую или в который они были введены. Природная нестабильность РНК может быть устранена, если при конструировании таких нуклеокапсидных экспрессионных систем использовать вирусы, содержащие двухцепочечную РНК (обозначаемую здесь бзРНК). Кроме того, элиминация ненуклеокапсидных последовательностей и типичное сегментирование геномов бзРНК-вирусов делает конструирование искусственных геномных сегментов, заменяющих делетированные последовательности и кодирующих гетерологичную РНК, привлекательным способом экспрессии представляющих интерес генов или доставки представляющей интерес РНК в биологические системы. Таким образом, рекомбинантная нуклеокапсидная экспрессионная система может быть сконструирована так, чтобы она могла содержать последовательности, необходимые для кодирования только дополнительных нуклеокапсидов; представляющие интерес гетерологичные последовательности; и последовательности, необходимые для их размножения и продуцирования в клетке.

Фаг, содержащий двухцепочечную РНК, (обозначаемый здесь бзКР) семейства цистовирусов является прототипом бзРНК-вирусов (8шс1а1т е! а1., 1 νίτοί. 16:685; 1975); (Мдгате е! а1., 1 νίτοί. 58:142; 1986); (ΌοΙΙ^ό е! а1., νίτοίομν 163:183; 1988); (ΜίηάίεΗ е! а1., 1 νίτοί. 62:1180; 1988); (ΜίηάίεΗ, Μίετοϋίοί. Μοί. Βίο1. Κ^ν. 63, 149; 1999). Отличительными признаками цистовирусных бзКР является геном, состоящий из трех сегментов двухцепочечной РНК (далее обозначаемой бзРНК) (Мечтает е! а1., см. выше, 1986); (ΌοΙΙ^Ο е! а1., см. выше, 1988); (Μίηάίοΐι е! а1., см. выше, 1988), называемых сегментом-Ь, сегментом-М и сегментом-8, и липидсодержащей мембранной оболочки (8апбз апб Εο\ν1κ1ιΙ Сап. 1. Μίετο6ίο1, 22:154; 1976); (ВатЫМ, апб Рака, ВюсЫт. ВюрНуз. Ас!а, 601:245; 1980). Эти геномные сегменты находятся в нуклеокапсидной сердцевине, которая состоит из белков Р1, Р2, Р4 и Р7 и продуцируется генами, кодируемыми сегментом-Ь бзРНК (например, номер доступа в СепЬапк АР226851). Синтез плюс-цепи РНК (обозначаемой здесь мРНК) происходит в нуклеокапсиде и осуществляется под действием РНКзависимой РНК-полимеразы, кодируемой, частично, геном-2 на сегменте-Ь (ΜΦ6κΗ е! а1., см. выше, 1988); (Уап Е!!еп е! а1., 1 νίτο1, 12:464; 1973); причем в синтезе мРНК определенную роль также играет ген-7 на сегменте-Ь (Μί^κΗ е! а1., см. выше, 1999).

ΌδΚΡ РЫ-6, представляющий собой архетип этого семейства бзРНК-фагов, обычно инфицирует Ρ8еибοтοηа8 зуппдае (ΜΦ6κΗ е! а1., см. выше, 1999), однако, совсем недавно, были выделены бзЕР РЫ8, РЫ-11, РЫ-12 и РЫ-13, которые могут инфицировать и до определенной степени реплицироваться в штамме 1Μ109 ЕзсНепсЫа ^1ί (Американская коллекция типовых тканевых культур (обозначаемая здесь АТСС) # 53323) и в негативных по О-антигену мутантах 8а1тοηе11а еп!епса серотипа ТурЫтитшт (обозначаемого далее 8. 1урЫтипит) (Μίΐ'ΗκΙι е! а1., см. выше, 1999); (ΜΦ6κΗ е! а1., 1. Вас!егю1, 181:4505; 1999); (Ηοοё8ί^а!еη е! а1., νίτο1ο^, 272: 218; 2000); е! а1., νίτο1ο^ 275: 218; 2000).

Жизненный цикл архетипа бзЕР РЫ-6 в бактериях описан в литературе (Μί^κΗ, Α6ν νίταβ Вез, 35:137; 1988); (ΜΦ6κΗ е! а1., см. выше, 1999). РЫ-6 инфицирует клетки-хозяева посредством связывания с пилями, что позволяет ему контактировать с мембраной клетки-хозяина и, тем самым, приводит к слиянию и введению нуклеокапсида в периплазму. Затем этот нуклеокапсид поступает в цитоплазму, причем такое событие требует эндопептидазной активности белка Р5 и наличия транспортных свойств белка Р8. Интересно отметить, что нуклеокапсиды, которые имеют полноразмерный оболочечный белок Р8, способны спонтанно проникать в бактериальные протопласты, что приводит к аутотрансфекции бактериального штамма, из которого были получены протопласты (Οί;·ιο е! а1., νίΐΌ1ομν 227:103; 1997); (ОПкюпеп е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8сй 87: 9173; 1990).

- 1 011282

После проникновения в цитоплазму белок Р8 удаляется, и оставшийся нуклеокапсид, содержащий три сегмента бзРНК и обладающий РНК-зависимой РНК-полимеразной активностью, начинает синтезировать мРНК-копии сегментов Ь, М и 8 бзРНК. Белки, продуцируемые сегментом-Ь, ассоциируются, главным образом, с продуцированием прокапсида; сегмент-М ответственен, главным образом, за синтез белков присоединения, а сегмент-8 продуцирует оболочечный белок прокапсида (Р8), литическую эндопептидазу (Р5) и белки (Р9 и Р12), участвующие в продуцировании липидной оболочки (ΙοΗηδοη апб Мшбюй, 1 Вае1спо1. 176: 4124; 1994). Упаковка бзРНК-сегментов происходит последовательно, где сегмент-8 распознается и поглощается пустыми прокапсидами; при этом прокапсиды, содержащие сегмент8, больше не связываются с этим сегментом, но еще обладают способностью связываться с сегментом-М и поглощать его, а прокапсиды, содержащие сегменты 8 и М, больше не связываются с этими сегментами, но еще обладают способностью связываться с сегментом-Ь и поглощать его, что приводит к продуцированию нуклеокапсида. Как только нуклеокапсид будет содержать все три сегмента одноцепочечной РНК (обозначаемой здесь ззРНК), начнется синтез минус-цепей РНК, в результате чего будут продуцироваться бзРНК-сегменты. Затем нуклеокапсид будет связываться с белками 5 и 8, и наконец, инкапсулироваться в липидной мембране, что будет приводить к завершению сборки фага. Лизис клеткихозяина, очевидно, происходит посредством накопления разрушающего мембрану белка Р10, продукта сегмента-М, и такой лизис требует присутствия эндопептидазы Р5 (Мшбюй с1 а1., см. выше, 1999).

Для сборки и осуществления РНК-полимеразной активности в прокапсидах бзКР не требуется присутствия белков хозяина, поскольку прокапсиды, выделенные из производного штамма 1М10 9 Е.сой, в котором экспрессируется кДНК-копия сегмента-Ь, обладают способностью упаковывать очищенные ззРНК-сегменты Ь, М и 8 (Мшбюй с1 а1., см. выше, 1999); (Οίοο с1 а1., см. выше, 1997). После поглощения ззРНК-сегментов вышеуказанной ίη νίίτο системой, присоединение рибонуклеотидов приводит к синтезу минус-цепи и к продуцированию зрелых бзРНК-сегментов. Кроме того, после завершения синтеза бзРНК, Р8 ассоциируется с нуклеокапсидами, и, как указано выше, полученный продукт приобретает способность проникать в бактериальные протопласты и индуцировать продуктивное заражение (Οίηο с1 а1., см. выше, 1997).

В предыдущих исследованиях было описано продуцирование рекомбинантного бзКР (обозначаемого здесь гбзКР) (Мшбюй, Αбν Униз Кез 53:341; 1999); (О^бета е1 а1., 1 νίτο1 66:190; 1992). Простой гбзКР был сконструирован путем встраивания аллеля устойчивости к канамицину в сегмент-М бзКР Р1н6. КбзКР, содержащий указанный рекомбинантный сегмент, был выделен путем инфицирования штамма 1М109, несущего плазмиду, экспрессирующую рекомбинантный сегмент-М, фагом бзКР Р1н-6 дикого типа. Благодаря такому подходу было установлено, что данные клетки-хозяева являются носителями, в которых инфекционный гбзКР непрерывно продуцируется этим штаммом-носителем (Огюбега е1 а1., см. выше, 1992); (Мшбюй, Αбν Униз Кез 53:341; 1999). Бляшкообразующая способность фага, продуцируемого штаммами-носителями, сохранялась на протяжении трех-пяти пассажей в планшетах, однако, после дополнительных пассажей, растущий фаг больше не образовывал бляшки в штамме-носителе, но при этом еще наблюдалось продуцирование низких уровней инфекционного фага (Огюбега е1 а1., см. выше, 1992). В некоторых случаях, значительное число штаммов-носителей вообще теряли свою способность продуцировать инфекционный фаг; при этом бзРНК таких бактериальных штаммов обнаруживала делеции в одном или нескольких сегментах (Огюбега е1 а1., см. выше, 1992). В одном случае, из одного такого штамма-носителя, не обладающего способностью продуцировать фаг, был выделен мутантный фаг, не содержащий сегмента-8. Ни в одном случае не были сконструированы тбзКЫ, экспрессия которых обеспечивала бы адаптацию этой системы для ее функционирования в эукариотических клетках или тканях. Таким образом, фаги гбзКР, полученные таким методом, по своей природе являются нестабильными и не могут быть использованы для анализа сборки и репликации фага; причем гбзКР, полученный в предыдущих исследованиях, не был пригоден для применения в биотехнологии и для крупномасштабного производства.

Недавно было высказано предположение, что может быть получен гбзКР, который способен экспрессировать мРНК в эукариотических клетках, и что такой гбзКР может быть использован для экспрессии вакцинных антигенов, биологически активных белков, иммурегуляторных белков, антисмысловых РНК и каталитических РНК в эукариотических клетках или тканях (заявка на патент США 20040132678, Ηοικ, которая вводится в настоящее описание посредством ссылки, и которая далее будет упоминаться как 20040132678). В заявке 20040132678 приводится исчерпывающая информация об использовании фага гбзКР, а также описана модель гбзКР и предлагаются методы его получения и использования. Однако, в заявке 20040132678 не дано каких-либо указаний относительно получения гбзКРз бе ηονο или способов продуцирования и выделения стабильных штаммов-носителей, содержащих гбзКРз, способных к репликации. В одном из примеров, приведенных в 20040132678, было высказано предположение, что серии гбзКР могут быть продуцированы путем репликации родительского бзКР в бактериальных трансформантах, несущих плазмиды, которые, в свою очередь, экспрессируют представляющий интерес рекомбинантный сегмент. Однако из этого описания неясно, включает ли такой гбзКР четыре бзРНК-сегмента (т.е. три сегмента дикого типа и рекомбинантный сегмент), либо такой гбзКР включает три бзРНКсегмента, два сегмента дикого типа и рекомбинантный сегмент. В любом случае, остается неясным, ка

- 2 011282 ким образом гбкКР зависит от размножаемого хелперного фага дикого типа, а также неясно, каким образом гб&ИР может быть выделен из ШИР дикого типа. Кроме того, в заявке 20040132678 не описаны конкретные методы стабильного включения рекомбинантных сегментов в б&ИР и имеется лишь беглое упоминание о конкретных способах осуществления последующей репликации и стабильного продуцирования гб&ИР. Более того, в заявке 20040132678 не описано получение стабильных композиций гб&ИР, в которых отсутствуют сегмент-М и сегмент-5 дикого типа. И наконец, в заявке 20040132678 также не описано получение упаковывающих штаммов, экспрессирующих сегмент-Ь и продуцирующих прокапсиды, и поэтому способных генерировать гбкРРк бе ηονο и стабильно продуцировать гбкРРк.

Следовательно, в заявке 20040132678 отсутствует нужная информация, необходимая специалисту в данной области для получения упаковывающих штаммов и стабильного продуцирования гб&ИР. Кроме того, в заявке 20040132678 не обсуждается ни получение новых композиций τά&ΚΝ или упаковывающих штаммов, ни разработка способов создания, стабильного продуцирования и использования фагов τά&ΒΝ, которые являются объектом настоящего изобретения.

Описание сущности изобретения

В соответствии с настоящим изобретением рекомбинантный нуклеокапсид, содержащий двухцепочечную РНК, (τάδΡΝ), включает по меньшей мере один б&РНК-сегмент, кодирующий функциональные б&РНК-вирусные или бактериофаговые нуклеокапсидные белки, и один или несколько рекомбинантных б&РНК-сегментов, которые включают по меньшей мере один ген, кодирующий функциональный продукт, комплементирующий селектируемую фенотипическую мутацию в клетке-хозяине (например, бактериальной), такую как ауксотрофная мутация; мутация в механизме синтеза клеточной стенки; или мутация, предупреждающая рост бактерий при температуре выше температуры замерзания. άδΡΝ-сегменты предпочтительно включают РНК, которая кодирует представляющий интерес гетерологичный ген, такой как иммуноген, в сочетании с адъювантами или без адъювантов, и которая используется в настоящем изобретении в целях изготовления вакцин, вырабатывающих иммунный ответ, хотя функция мРНК, продуцируемой такими τάδΚΝ, не ограничивается одной лишь этой функцией. Продуцируемые таким образом РНК могут кодировать адъюванты, иммуномодуляторные белки, терапевтические белки и другие биологически активные белки, либо указанная РНК сама может функционировать как 81РНК (δίΡΝΛ δΐιοτί йиегГегппд Κ.ΝΚ - короткая интерферирующая РНК) или каталитическая РНК. τάδΚΝ имеют то преимущество, что по сравнению с гб&КР они являются стабильными, легко поддаются обработке, безопасны и т.п. Указанный ίάδΚΝ содержится в клетке бактериального упаковывающего клеточного штамма, который включает селектируемую фенотипическую мутацию, что позволяет проводить отбор и сохранять Γά&ΚΝ в указанном бактериальном упаковывающем штамме.

Иллюстративные варианты осуществления настоящего изобретения схематически представлены на фиг. 1-3. На каждой из фиг. 1-3 10 представляет бактериальную клетку; 20 представляет геномную ДНК бактериальной клетки 10; 30 представляет нуклеокапсид (состоящий из белков, обладающих упаковывающей активностью и РНК-полимеразной активностью); а 31 (три волнистые линии в нуклеокапсиде 30) представляет б&РНК, содержащуюся в нуклеокапсиде 30. Аналогичным образом, на каждой из фиг. 1-3 21 представляет селектируемую фенотипическую мутацию в геномной ДНК 20.

Как можно видеть на каждой из фиг. 1-3, два элемента, 40 и 41, последовательно связаны с б&РНК 31. 40 представляет последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую генный продукт, который комплементирует селектируемую фенотипическую мутацию 21, а 41 представляет последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющую интерес РНК.

Третий элемент, 42, указан на каждой из фиг. 1-3, но его положение варьируется. 42 представляет последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гены, необходимые для продуцирования нуклеокапсида (например, гены, кодирующие белки с упаковывающей и РНК-полимеразной активностью). На фиг. 1 проиллюстрирован вариант осуществления изобретения, в котором последовательности нуклеиновой кислоты 42 локализованы в последовательностях б&РНК 31 внутри нуклеокапсида 30. В другом варианте осуществления изобретения, проиллюстрированном на фиг. 2, последовательности нуклеиновой кислоты 42 локализованы в бактериальной геномной ДНК 20. В еще одном варианте осуществления изобретения, проиллюстрированном на фиг. 3, бактериальная клетка 10 также содержит плазмиду (70), и последовательности нуклеиновой кислоты 42 локализованы на плазмиде 70.

Целью настоящего изобретения является получение бактериальных упаковывающих штаммов, содержащих последовательности, кодирующие прокапсиды б&ИР в указанном штамме, и мутацию, позволяющую проводить отбор и сохранять Γά&ΚΝ, которые экспрессируют функциональный ген, комплементирующий мутацию в указанном штамме. В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к бактериальному штамму, способному упаковывать, продуцировать и/или осуществлять доставку генов или РНК, где штамм включает: а) геномную ДНК, содержащую по меньшей мере одну селектируемую фекотипическую мутацию; Ь) один или несколько нуклеокапсидов, содержащих белки, обладающие РНК-упаковывающей и РНК-полимеразной активностью; с) последовательности бкРНК, содержащиеся в указанных одном или нескольких нуклеокапсидах, где указанные последовательности РНК кодируют, по меньшей мере: ί) генный продукт, который комплементирует указанную по меньшей мере одну селектируемую фенотипическую мутацию и и) представляющую интерес РНК, функционально связанную с по

- 3 011282 следовательностью инициации трансляции в эукариотах; и б) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гены, необходимые для продуцирования нуклеокапсида.

Другой целью настоящего изобретения является разработка способа генерирования γ6κΡΝ, где рекомбинантные РНК-сегменты встраиваются в бактериальные упаковывающие штаммы и упаковываются с образованием рекомбинантного нуклеокапсида, содержащего экспрессионный кластер для трансляции в эукариотах, что приводит к продуцированию γ6κΡΝ бе ηονο.

Другой целью настоящего изобретения является получение γ6κΡΝ, способных стабильно реплицироваться в бактериальном штамме. В одном из вариантов изобретения, рекомбинантный нуклеокапсид, содержащий двухцепочечную РНК (γ6κΚΝ), включает: а) белки, обладающие РНК-упаковывающей и РНК-полимеразной активностью, и Ь) последовательности бкРНК, кодирующие, по меньшей мере: ί) генный продукт и ίί) представляющую интерес РНК, функционально связанную с последовательностью инициации трансляции в эукариотах.

Еще одной целью настоящего изобретения является получение бактериальных штаммов, стабильно продуцирующих γ6κΡΝ, которые содержат один или несколько гбкРНК-сегментов, кодирующих аллель позитивного отбора и функциональные экспрессионные кластеры для трансляции в эукариотах.

Другой целью настоящего изобретения является получение бактериальных штаммов, стабильно продуцирующих γ6κΡΝ, которые содержат экспрессионные кластеры альфа-вирусов, таких как, но не ограничивающихся ими, вирус лесов Семлики (Вегд1ипб е! а1., Уассше 17:497; 1999) или вирус венесуэльского лошадиного энцефалита (далее обозначаемый УЕЕ) (Όηνίκ е! а1., 1 У1го1 70:3781; 1996); (Са1еу е! а1., 1 Уио1 71:3031; 1997).

Еще одной целью настоящего изобретения является разработка способов введения γ6κΡΝ в эукариотические клетки и ткани и использование γ6κΡΝ для индуцирования иммунного ответа или вырабатывания биологического эффекта у популяции клеток-мишеней.

Другой целью настоящего изобретения является получение живых бактериальных векторов, обладающих гбкКП-упаковывающей способностью.

Еще одной целью настоящего изобретения является получение живых бактериальных векторов, обладающих способностью к стабильному сохранению γ6κΡΝ.

Другой целью настоящего изобретения является получение γ6κΡΝ, способных реплицироваться в бактериальном векторном штамме.

Другой целью настоящего изобретения является разработка способов доставки γ6κΡΝ в клетки и ткани млекопитающих.

Другой целью настоящего изобретения является разработка способов применения указанных бактериальных векторов, несущих γ6κΡΝ, в целях индуцирования иммунного ответа или получения биологического эффекта в клетках или тканях-мишенях.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, селектируемыми фенотипическими мутациями, имеющимися в бактериях-хозяевах согласно изобретению, являются необратимые селектируемые фенотипические мутации.

Другой целью настоящего изобретения является получение среды для электропорации, содержащей указанные бактерии и/или указанные 6κΚΝ. В еще одном своем варианте осуществления, настоящее изобретение относится к различным фторированным РНК, которые кодируют компоненты бкРНК.

Эти и другие цели настоящего изобретения будут очевидны из подробного описания настоящего изобретения. В иллюстративном варианте осуществления изобретения описаны бактериальные упаковывающие штаммы, содержащие последовательности, кодирующие сегмент-Ь бкКР РЫ-8, который экспрессирует прокапсиды в указанном штамме и имеет акб-мутацию, позволяющую проводить отбор и сохранять γ6κΡΝ, которые экспрессируют функциональный ген акб в указанном штамме. Кроме того, описан прототип гбкКЫ, кодирующий вакцинные антигены и репортеры, а также продемонстрирована способность указанного γ6κΡΝ экспрессировать кодируемые антигены и репортеры у млекопитающих.

Подробное описание графического материала

На фиг. 1 схематически представлена бактериальная клетка, содержащая нуклеокапсид, в котором последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гены, необходимые для продуцирования нуклеокапсида, локализованы в последовательностях бкРНК внутри нуклеокапсида.

На фиг. 2 схематически представлена бактериальная клетка, содержащая нуклеокапсид, в котором последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гены, необходимые для продуцирования нуклеокапсида, локализованы в геномной ДНК клетки.

На фиг. 3 схематически представлена бактериальная клетка, содержащая нуклеокапсид, в котором последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гены, необходимые для продуцирования нуклеокапсида, локализованы на плазмиде.

На фиг. 4 показаны экспрессионные кластеры различных рекомбинантных сегментов-8 и -М РЫ-8 (г§, г82 и гМ, соответственно). Как показано ниже в разделе Примеры, аллелем позитивного отбора является ген акб, а представляющие интерес гены кодируют антигены-кандидаты МусоЬас1егшш ЫЬегси1οκΐκ и флуоресцентный белок Нс-Кеб, излучающий в красном диапазоне спектра. г8 и г82 были клонированы в Рк!1-сайт рТ7/Т3-18. гМ был клонирован в виде ΚρηΙ/ΡκΐΙ-фрагмента в соответствующие сайты

- 4 011282 ροΌΝΆ3.1_ΖΕ0. Все рекомбинантные сегменты помещали под транскрипционный контроль промотора Т7.

На фиг. 5 показан г8-экспрессирующий кластер, включающий самоамплифицирующийся репликон альфа-вируса (вируса лесов Семлики) (последовательность связывания с ηφ1-4 и репликазой).

На фиг. 6 схематически представлены получение и функции бактериального упаковывающего штамма.

На фиг. 7 проиллюстрированы инвазивные свойства описанных упаковывающих штаммов и родительских штаммов.

На фиг. 8 показан иммуноблот-анализ лизатов целых клеток МРС51рЬМ2653 8. Пехпеп. который проводили до и после денатурации, где указанные лизаты были зондированы прокапсид-специфической антисывороткой. в целях иллюстрации ίη νίνο сборки прокапсидов.

На фиг. 9 представлена фотография МРС51рЬМ2653 8. Псхпсп. полученная на электронном микроскопе и иллюстрирующая сборку прокапсидов.

На фиг. 10 проиллюстрирована ОТ-ПЦР упакованного МРС51рЬМ2653 8. Псхпсп. несущего ΜδΚΝ. обозначенный Ь8М(Ь4. где указанная ПЦР свидетельствовала о присутствии (-)-цепи и (+)-цепи кДНК. что является показателем синтеза второй цепи.

На фиг. 11 представлена полученная на электронном микроскопе фотография штамма МРС51 8. Псхпсп. несущего самореплицирующийся нуклеокапсид Ь8М1Ь4.

На фиг. 12 представлена полученная на электронном микроскопе фотография бактерии Ркеийотопа§ кугшдае. несущей бактериофаг РЫ-8 дикого типа. реконструированный путем электропорации указанного штамма с использованием РНК. кодирующей сегменты-8. -М и -Ь дикого типа.

На фиг. 13 представлена флуоресцентная фотография клетки НеЬа. которая была сделана через 14 ч после ее инвазии штаммом τάδΚΝ-несущим МРС51 8. Пехпеп. обозначенным Ь8М1Ь4 и зондированным антисывороткой. специфичной для антигена 85А. и которая иллюстрирует экспрессию антигена 85А в эукариотической клетке.

На фиг. 14 представлена флуоресцентная фотография клетки НеЬа. которая была сделана на флуоресцентном микроскопе через 12 ч после инвазии этой клетки ΓάδΚΝ-несущим штаммом МРС51 8. Дехпеп. обозначенным Ь8МНс-Кей. и которая иллюстрирует прямую флуоресценцию белка Нс-Кей. транслируемого из Ь8МНе-Кей-продуцирующей мРНК в эукариотической клетке.

На фиг. 15 представлена флуоресцентная фотография клетки НеЬа. которая была сделана на флуоресцентном микроскопе через 12 ч после ее инвазии штаммом ΓάδΒΝ-несущим МРС51 8. Пехпеп. обозначенным Ь8МНс-Кей и зондированным Нс-Кей-специфической антисывороткой. для подтверждения экспрессии белка Нс-Кей в эукариотической клетке.

Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения

1. Конструирование бактериальных упаковывающих штаммов.

Настоящее изобретение относится к бактериальным упаковывающим штаммам. содержащим ДНКпоследовательности. которые кодируют и экспрессируют фаг. содержащий функциональную двухцепочечную РНК/вирусные прокапсидные белки (й&КР). в указанном штамме. что приводит к сборке прокапсидов и упаковке йкРНК с образованием нуклеокапсидов. содержащих двухцепочечную РНК (йкКЫ) в указанных упаковывающих штаммах. Кроме того. йкРНК может быть генетически сконструирована так. чтобы она содержала последовательности. кодирующие и экспрессирующие представляющий интерес функциональный ген. например. трансген. Таким образом. й&РНК представляет собой рекомбинантную йкРНК (гйкРНК). а нуклеокапсиды представляют собой рекомбинантные йкКИ (ΜδΚΝ). Упаковывающие штаммы также содержат генетическую мутацию. приводящую к селектируемой летальной мутации в данных штаммах. Μ&ΚΝ генетически конструируют так. чтобы они кодировали и экспрессировали функциональный ген. комплементирующий селектируемый дефицит. вызванный мутацией. что позволяет проводить отбор и сохранять ΜδΚΝ в бактериальных упаковывающих штаммах.

В Μ&ΚΝ включены следующие элементы й&РНК-фага: сегмент-Ь; последовательность рас сегмента8; последовательность распознавания РНК-зависимой РНК-полимеразы сегмента-8; последовательность рас сегмента-М; и последовательность распознавания РНК-зависимой РНК-полимеразы сегмента-М. Аллели позитивного отбора могут быть генетически сконструированы в фаге следующим образом: аллель позитивного отбора может быть присоединен. например. к сайту связывания с рибосомой гена-8 на сегменте-8 или к сайту связывания с рибосомой гена-10 на сегменте-М или к тому и другому. Другие представляющие интерес гены могут быть генетически сконструированы в сегментах 8 и/или М путем замены областей сегментов 8 и М. которые не являются необходимыми для продуцирования функциональных ^ΚΝ.

Альтернативно. сегменты 8 и М могут быть полностью удалены и заменены представляющими интерес последовательностями.

Используемый здесь термин рекомбинантные сегменты означает генетически сконструированные сегменты 8 и/или М. или представляющие интерес последовательности. которые заменяют сегменты 8 и/или М.

Хотя описанная здесь система должна функционировать с использованием любого фага или вируса. содержащего двухцепочечную РНК. однако для функционирования иллюстративной системы Μ&ΚΝ РЫ

- 5 011282

8, описанной в разделе Примеры, предпочтительно используются следующие элементы генома(ов) цистовирусов (еуЦоутбас):

(ί) сегмент-Ь и все его гены, (ίί) последовательности рас сегментов 8 и М, (ίίί) З'-концевые последовательности связывания с полимеразой в сегментах-8 и М, (ίν) ген 8 сегмента-8.

Например, в РЫ-8, все кодирующие последовательности на сегментах-8 и М были делетированы, за исключением гена 8, поскольку они не требуются для функционирования системы Γ6&ΚΝ. Кроме того, для экспрессии представляющих интерес генов необходимо или желательно использовать и другие экзогенные последовательности, которые могут быть включены в рекомбинантные сегменты, такие как элементы ΙΚΕ8; последовательность Козака и последовательность Шайна-Дальгарно для инициации трансляции в эукариотах и прокариотах, соответственно; последовательности полиаденилирования; промоторные последовательности; энхансеры, терминаторы транскрипции; лидерные пептидные последовательности; и молекулярные метки для очистки белка, такие как Н15-метка.

В соответствии с настоящим изобретением сегмент-Ь может быть введен в бактериальный упаковывающий штамм либо путем встраивания в внехромосомный экспрессионный вектор, либо посредством интеграции в бактериальную хромосому, а рекомбинантные сегменты вводят в бактериальный упаковывающий штамм путем электропорации, как подробно описано ниже.

Выбор бактериальных штаммов, из которых может быть получен упаковывающий штамм согласно изобретению, не имеет решающего значения для осуществления настоящего изобретения, и такими штаммами могут быть, но не ограничиваются ими, Сатру1оЬас1ег крр, №188епа крр., Наеторййик крр, Аеготоиак крр, РгаиакеИа крр, Уегйша крр, К1еЬ51е11а крр, Вогбе1е11а крр, Ьедюие11а крр, СогуиеЬас1епит крр, СйгоЬас1ег крр, СЫатуШа крр, Вгисе11а крр, Ркеиботоиак крр, НеНсоЬас1ег крр или У1Ьпо крр.

Выбор конкретного штамма Сашру1оЬас1ег для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Сатру1оЬас1ег, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются, но не ограничиваются ими, С. )е)иш (АТСС Νοκ. 43436, 43437, 43438), С. Йуот1ейша1к (АТСС Νθ. 35217), С. Ге1и8 (АТСС Νθ. 19438), С. ГесаЖ (АТСС Νθ. 33709), С. боу1е1 (АТСС Νθ. 49349) и С. сой (АТСС Νοκ. 33559, 43133).

Выбор конкретного штамма Уегйша для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Уегйша, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются Υ. еШегосоййса (АТСС Νο. 9610) или Υ. рекйк (АТСС Νο. 19428), Уе03-Р2 Υ. еШегосоййса (а1-Неибу е1 а1., 1пГес1. 1ттии., 60:870; 1992) или агоА Υ. еШегосоййса (О'Саога е1 а1., Мюго. Ра111.. 9:105; 1990).

Выбор конкретного штамма К1еЬйе11а для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов К1еЬйе11а, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются К. рпеитошае (АТСС Νο. 13884).

Выбор конкретного штамма Вогйе1е11а для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Вогйе1е11а, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются В. рейикйк, В. ЬгоисЫкерйса (АТСС Νο. 19395).

Выбор конкретного штамма №188ейа для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов №188ейа, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются Ν. тешидШбк (АТСС Νο. 13077) и Ν. доиоггйоеае (АТСС Νο. 19424), аго-мутант М811 Ν. доиоггйоеае (СйатЬег1аш е1 а1., Мюго. Ра1й., 15:51-63; 1993).

Выбор конкретного штамма Аеготоиак для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Аеготоиак, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются А. 8а1ш1иос1ба (АТСС Νο. 33658), А. ксйиЬеги (АТСС Νο. 43700), А. йуйгорййа, А. еисгеиорййа (АТСС Νο. 23309).

Выбор конкретного штамма Ггапс18е11а для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Ргаис18е11а, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются Р. 1и1агеиЙ8 (АТСС Νο. 15482).

Выбор конкретного штамма СогуиеЬас1епит для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов СогуиеЬас1епит, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются С. р8еибо1иЬегси1о818 (АТСС Νο. 19410).

Выбор конкретного штамма СйгоЬас1ег для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов С1йоЬас1ег, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются С. Ггеиийи (АТСС Νο. 8090).

Выбор конкретного штамма СЪ1атуй1а для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов СЫашуй1а, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются С. риеитошае (АТСС Νο. УК.1310).

Выбор конкретного штамма Наеторййик для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов НаеторЫ1и8, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются Н. тПнеи/ае (Ьее е1 а1., 1. Вю1. Сйет. 270:27151; 1995), Н. котгшк (АТСС Νο.

- 6 011282

43625).

Выбор конкретного штамма Вгисе11а для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Вгисе11а, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются В. аЬойик (АТСС Νο. 23448).

Выбор конкретного штамма Йедюпе11а для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов й-ед^иеИа, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются й. рпеиторййа (АТСС Νο. 33156), или т1р-мутант й. рпеиторййа (Ой, РЕМ8 Μίсго. Неу., 14:161; 1994).

Выбор конкретного штамма Ркеиботопак для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Ркеиботопак, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются Р. аетидшока (АТСС №. 23267).

Выбор конкретного штамма НейсоЬас!ет для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов НейсоЬас!ет, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются Н. ру1оп (АТСС №. 43504), Н. ти51е1ае (АТСС №. 43772).

Выбор конкретного штамма У1Ьио для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов УЛтю, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются УЛтю с1о1егае (АТСС №. 14035), Уктю стстпайещй (АТСС №. 35912), вирулентный мутант Β8Ι У. с1о1егае (Тау1ог е! а1., 1. 1пГес!. Όίδ., 170:1518-1523; 1994) и с!хА-, асе-, /о!-, сер-мутанты У. с1о1егае (^а1бот 1. е! а1., 1пГес!. Όίδ.,170:278-283; 1994).

В предпочтительном варианте осуществления изобретения бактериальным штаммом, от которого происходит упаковывающий штамм согласно изобретению, является бактерия, которая может служить в качестве упаковывающего штамма и вакцинных векторов, такая как Еп!егоЬас!епасеае, включая, но не ограничиваясь ими, ЕксйейсЫа 5рр, 8Ыде11а 5рр и 8а1топе11а 5рр. Грамположительные и кислотоустойчивые упаковывающие и векторные штаммы могут быть аналогичным образом сконструированы из йй1епа топосу!одепе§ или МусоЬас!еттт врр.

Выбор конкретного штамма ЕксйейсЫа для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов ЕксйейсЫа, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются штаммы ОН5а, НВ 101, Н8-4, 4608-58, 1184-68, 53638-С-17, 13-80 и 6-81 Е§сйейсЫа сой (см., например, 8атЬгоок е! а1., см. выше; Стаи! е! а1., см. выше; 8ап§опе!й е! а1., Апп. МютоЬю1. (Ιηδ!. Ра5!еит), 132А:351; 1982), энтеротоксигенная Е.сой (см., например, Еуапк е! а1., 1пРес!. 1ттип., 12:656; 1975), энтеропатогенная Е.сой (см., например, Эоппепйегд е! а1., 1. 1пРес!. Όίδ., 169:831; 1994), энтероинвазивная Е.сой (см., например, 8та11 е! а1., 1пРес! йтип., 55:1674; 1987) и энтерогеморрагическая Е.сой (см., например, МсКее апб ОВйеп, 1пРес!. 1ттип., 63:2070; 1995).

Выбор конкретного штамма 8а1топе11а для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов 8а1топе11а, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются 8. 1ур1й (см., например, АТСС №. 7251), 8. 1ур1йпшпит (см., например, АТСС №. 13311), 8а1топе11а дайпагит (АТСС №. 9184), 8а1топе11а егИепбйй (см., например, АТСС №. 4931) и 8а1топе11а 1ур1йпшпит (см., например, АТСС №. 6994), двойной агоС-, агоЭ-мутант 8. 1ур1й (см., например, Нопе е! а1., Уасс, 9:810-816; 1991), агоА-мутант 8. 1ур1йпшпит (см., например, Макйоеш е! а1., Мкго. Ра!йо1., 13:477-491; 1992).

Выбор конкретного штамма 8Ыде11а для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов 8Ыде11а, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются 8Ыде11а Пехпеп (см., например, АТСС №. 29903), СУЭ1203 8Ыде11а Пехпеп (см., например, №педа е! а1., 1пРес!. 1ттип. 62:5168; 1994), 15Ό 8Ыде11а Пехпеп (см., например, 8|/етоге е! а1., 8с1епсе 270:299; 1995), 8Ыде11а 5оппе1 (см., например, АТСС №. 29930) и 8Ыде11а бу8еп!епае (см., например, АТСС №. 13313).

Выбор конкретного штамма МусоЬас!етшт для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов МусоЬас!етшт, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются штамм СОС1551 М. !иЬегси1о8Щ (см., например, СпГГйй е! а1., Ат. 1. Ве^рй. Стй. Саге Меб. Аид;152 (2):808; 1995), штамм Бейджинга М. ТпЬегсп1о515 (8оо1шдеп е! а1., 1995), штамм Н37Ву (АТСС # 25618), ауксотрофный по пантотенату штамм М. !иЬегси1ощ8 (8атЬапбатиййу, №1. Меб. 2002 8(10):1171; 2002), гроУ- мутантный штамм М. 1иЬегси1о515 (СоШпк е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8сг И8А. 92(17):8036; 1995), ауксотрофный по лейцину штамм М. !иЬегси1о8Щ (Нопба1и5 е! а1., 1пГес!. 1ттип. 68(5):2888; 2000), ВСС штамм Дания (АТСС # 35733), ВСС штамм Япония (АТСС # 35737), ВСС штамм Чикаго (АТСС # 27289), ВСС штамм Копенгаген (АТСС # 27290), ВСС штамм Пастер (АТСС # 35734), ВСС штамм С1ахо (АТСС # 35741), ВСС штамм Коннахт (АТСС # 35745), ВСС штамм Монреаль (АТСС # 35746).

Выбор конкретного штамма йй1епа топосу!одепе§ для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов йй1епа топосу!одепе§, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются штамм 104038 й. топосу!одепе§ (например, 8!еуеп§ е! а1., 1. Уйо1 78:8210-8218; 2004) или мутантные штаммы й. топосу!одепе§, такие как (ί) двойной ас!А-р1сВмутант (Ре!ет5 е! а1., РЕМ8 1ттппо1оду апб Мебюа1 МюгоЬю1о§у 35: 243-253; 2003); (Апде1акорои1ои5 е!

- 7 011282 а1., 1пГес1 апб 1штипйу 70: 3592-3601; 2002); (ίί) двойной ба1-ба!-мутант гена аланин-рацемазы и гена Όаминокислота-аминотрансферазы (Тботрзоп е! а1., 1пГсс1 апб ΙιηιηιιπίΙν 66: 3552-3561; 1998).

После отбора штамма, который должен служить родительским штаммом для упаковывающего штамма, этот штамм подвергают генетической модификации для встраивания в указанный штамм ДНКпоследовательностей, экспрессирующих прокапсиды бзКР, и для введения мутации, позволяющей проводить отбор и сохранять ΜδΡΝ, экспрессирующие функциональный ген, который комплементирует мутацию в указанном штамме.

В общих чертах, гены в сегменте-Ь кодируют белки, необходимые для генерирования полностью функциональных прокапсидов, включая ген-8, кодирующий оболочечный белок. Однако в фаге РЫ-8, ген 8 локализован на сегменте 8, и хотя для сборки прокапсида РЫ-8, продукт гена-8, в основном, не требуется, но тем не менее, этот функциональный продукт гена-8 необходим для эффективной саморепликации нуклеокапсидов РЫ-8. Таким образом, если в настоящем изобретении используется фаг РЫ-8, то в указанную конструкцию, предпочтительно, включать ген-8 сегмента 8. Для другого фага, активность гена 8 кодируется на сегменте-Ь, и таким образом, способность к экспрессии мРНК сегмента-Ь является достаточной для продуцирования функциональных нуклеокапсидов. Выбор конкретного бзКР, из которого получают сегмент-Ь, не играет решающей роли для осуществления настоящего изобретения, и такими сегментами бзКР являются, но не ограничиваются ими, один из сегментов-Ь, а именно, сегмент-Ь РЫ-6 (номер доступа в ОепЬапк М17461), сегмент-Ь РЫ-13 (номер доступа в ОепЬапк ΆΤ261668) или сегмент-Ь РЫ-8 (номер доступа в ОепЬапк ΆΤ226851), и такие сегменты были получены у Иг. Ь. Мшбкб на Кафедре микробиологии Научно-исследовательского Института Общественного Здравоохранения, Нью-Йорк.

Альтернативно, последовательности кДНК, кодирующие сегмент-Ь, могут быть синтезированы на ДНК-синтезаторе (Аррйеб Вю8у81еш8 ΑΒΙ™ 3900 Шдб-ТЫоидбрЫ ΌΝΑ 8уп1бе81/ег) (Роз1ег Сйу, СА 94404 И.8.А.) в соответствии с инструкциями производителей. Для синтеза копий кДНК сегментов-Ь и рекомбинантных сегментов-8 и/или -М получают серии неполных сегментов полноразмерной последовательности с помощью ПЦР, и эти сегменты лигируют с получением полноразмерного сегмента в соответствии с процедурами, хорошо известными специалистам в данной области (Аи8иЬе1 е! а1., см. выше, 1990). Вкратце, синтетические олигонуклеотиды длиной в 100-200 нуклеотидов (т.е., предпочтительно, олигонуклеотиды, у которых 5'- и 3'-концевые последовательности соответствуют 5'- и 3'-концевым олигонуклеотидам, кодирующим смежную последовательность) получают на автоматическом ДНКсинтезаторе (например, АррНеб Вю8у81еш8 АВ1™ 3900 Шдб-ТЫоидйрЫ ^NΑ 8уп1бе51/ег (Ро81ег Сйу, СА 94404 и.8.А.)). Аналогичным способом синтезируют комплементарные олигонуклеотиды, а затем их отжигают с комплементарными партнерами с образованием двухцепочечных олигонуклеотидов. Пары двухцепочечных олигонуклеотидов (т.е. олигонуклеотидов, кодирующих смежные последовательности) соединяют путем лигирования с образованием более крупного фрагмента. Эти более крупные фрагменты очищают с помощью электрофореза в агарозном геле и выделяют с использованием набора для гельочистки (например, системы для гель-экстракции О1АЕХ® II Ое1 Ехйасбоп 8у81еш, 01адеп. 8аЫа Сгих. СА, С’аЕ №. 12385). Эту процедуру повторяют до тех пор, пока не будет получена полноразмерная молекула ДНК. После проведения каждого раунда лигирования, фрагменты могут быть амплифицированы с помощью ПЦР для увеличения выхода. Процедуры конструирования синтетического гена бе поуо хорошо известны специалистам в данной области и описаны в литературе (Апбге е! а1., см. выше, 1998); (Нааз е1 а1., см. выше, 1996); либо, альтернативно, синтетические гены могут быть закуплены у коммерческих фирм, например, у фирмы М1б1апб Сегййеб КеадеЫ Со. (М1б1апб, ТХ).

Хотя в настоящем изобретении подробно описано использование немодифицированных последовательностей сегмента-Ь, однако, для специалиста в данной области очевидно, что в настоящее изобретение могут быть внесены модификации, которые приводят к образованию усеченных или мутантных производных указанных последовательностей, но не предотвращают образование функциональных прокапсидов, и такие модификации не должны, по существу, выходить за рамки объема настоящего изобретения.

Выбор какого-либо конкретного промотора, используемого для экспрессии сегмента-Ь, не имеет важного значения для осуществления настоящего изобретения, и таким промотором может быть любой промотор, функционирующий в нужном штамме, такой как, но не ограничивающийся ими, индуцибельные промоторы, такие как Р_ВАП (номер доступа в ОепЬапк Х81838) и Р_радС (номер доступа в ОепЬапк М55546), или конститутивные промоторы, такие как Р_1рр (номер доступа в ОепЬапк У00302) и Р_отрА (номер доступа в ОепЬапк Х02006).

Сегмент-Ь может быть введен в упаковывающий штамм в экспрессионном векторе, таком как рТ7/Т3-18 (АтЬюп, Аизйп, ТХ, Са1. №. 7201), либо он может быть интегрирован в хромосому путем аллельного обмена с применением методов, известных специалистам в данной области (например, ПЦР, очистки ДНК, расщепления рестриктирующей эндонуклеазой, электрофореза в агарозном геле и лигирования). Сайт интеграции в хромосоме не имеет решающего значения для осуществления настоящего изобретения, хотя в предпочтительном варианте осуществления изобретения, ДНК, кодирующую кластер,

- 8 011282 экспрессирующий сегмент-Ь, подвергают интеграции в хромосому для инактивации гена и для генерирования селектируемого фенотипа в целях отбора в определенных условиях культивирования (например, гена агоА (номер доступа в СеиЬаик Х00557), агоС (номер доступа в СеиЬаик ΑΥ142231), 1еЭ (номер доступа в СеиЬаик ЬОбббб), акб (номер доступа в СеиЬаик У002б2), тиг1 (номер доступа в СеиЬаик ΑΥ520970), кб§А (номер доступа в СеиЬаик ΑΥ174101) и 111гВ (номер доступа в СеиЬаик ΑΒ401529). Процедуры хромосомного интегрирования и методы культивирования указанных мутантов хорошо описаны в литературе (НатШои е! а1., 1. Вас!епо1. 171: 4617; 1989); (В1отйе1б е! а1., Мо1. М1сгоЬю1. 5: 1447; 1991).

Конкретная мутация, вводимая в упаковывающий штамм, не имеет решающего значения для осуществления настоящего изобретения, и такой мутацией может быть любая мутация, способная генерировать селектируемый фенотип для отбора при определенных условиях культивирования, такая как, но не ограничивающаяся ими, рестриктированные ауксотрофные мутации, например, агоА (номер доступа в СеиЬаик Х00557), агоС (номер доступа в СеиЬаик ΑΥ142231), 1еиО (номер доступа в СеиЬаик Ь06ббб), или мутации в генах, необходимых для синтеза клеточной стенки, таких как акб (номер доступа в СепЬапк У002б2) или тиг1 (номер доступа в СепЬапк ΑΥ520970), или мутации, предотвращающие рост при температурах выше 32°С, такие как П(гВ (номер доступа в СепЬапк ΑΕ401529).

Мутации могут быть введены в бактерии любым хорошо известным методом генной инженерии. Такими методами являются, но не ограничиваются ими, неспецифический мутагенез, проводимый с использованием химических веществ, таких как Х-метил-Х'-нитро-Х-нитрозогуанидин, акридиновый оранжевый, этидийбромид; или нелетальная обработка ультрафиолетовым излучением (МШег (Еб), 1991, Α к1юг1 соигке ш Ьас1епа1 депебск, Со1б 8рппд НагЬог Ргекк, Со1б 8рппд НагЬог, ΧΥ). Альтернативно, мутации могут быть введены стандартными методами генной инженерии, такими как Тп10-мутагенез; опосредуемая бактериофагом трансдукция; аллельный обмен, опосредуемый фагом лямбда; или конъюгационный перенос (МШег (Еб), см. выше, 1991); (Нопе е! а1., 1. 1пГес!. П1к.15б:1б7; 1987); (Хопеда е! а1., 1пГес!. 1ттип., б2:51б8; 1994); (Нопе е! а1., Уассте, 9:810; 1991); (Сйабге1б е! а1., Уассте 10:53; 1992); (Рюкагб е! а1., 1пГес!. 1ттип., б2:3984; 1994); (Обедаагб е! а1., 1 Вю1 Сйет 272:19б88; 1997); (Ьее е! а1., 1. Вю1. Сйет., 270:27151; 1995); (Саггеб е! а1., 1. Вю1. Сйет., 273:12457; 1998). Указанными мутациями могут быть точковая мутация, мутация с заменой кодонов, или, предпочтительно, необратимая делеционная мутация. Делеционными мутациями могут быть мутация с делецией от одного нуклеотида до всей кодирующей последовательности. Делеционные мутации предпочтительны при проведении крупномасштабных мутаций, поскольку такие мутации делают полученный продукт более стабильным.

Мутации могут быть экспрессированы либо конститутивно, либо под контролем индуцибельных промоторов, таких как термочувствительные промоторы генов семейства белков теплового шока или анаэробно индуцируемый промотор шгВ (НагЬогпе е! а1., Мо1. Мюго., б:2805; 1992), либо репрессируемые промоторы, такие как нарЛ (Согйик1е1 е! а1., 1. Вю1. Сйет., 2б8:2337б; 1993) или дсг (81аиГГег е! а1., 1. Вас!., 17б:б159; 1994). Выбор соответствующего метода зависит от нужного штамма, и такие методы хорошо известны специалистам в данной области.

Конкретные условия культивирования бактериальных векторных штаммов, которые включают стабильные гбкРХ. не имеют решающего значения для осуществления настоящего изобретения. Так, например, мутанты могут быть культивированы в жидкой среде, такой как среда Т8 (Эбсо, Пебоб, М1, Са!. Хо. 244б20), питательный бульон (Эбсо, Пе!гой, М1, Са!. Хо. 233000), соевый бульон с трипсином (Эбсо, Пе!гой, М1, Са!. Хо. 211822), в соответствии со стандартными методами культивирования, которые являются подходящими для роста бактериального штамма (МШег, см. выше, 1991). Альтернативно, бактерии могут быть культивированы на твердой среде, такой как питательный агар (ЭгГсо, Пебой, М1, Са!. Хо. 212000), соевый агар с трипсином (Эйсо, Пе!гой, М1, Са!. Хо. 23б920) или минимальный агар М9 (ЭгГсо, Пе!гой, М1, Са!. Хо. 248510).

Вакцинные векторные штаммы МусоЬас!ебцт культивируют в жидкой среде, такой как среда Миддлбрука 7Н9 (ЭгГсо, Пебой, М1, Са!. Хо. 271310) или синтетическая среда Солтон, предпочтительно, при 37°С. Эти штаммы могут храниться в виде стационарной или перемешиваемой культуры. Кроме того, скорость роста МусоЬас!ейит может быть увеличена путем добавления олеиновой кислоты (0,0б% об./об.; Векеагсй П1адпокбск Са!. Хо. 01257) и детергентов, таких как тилоксапол (0,05% об./об.; Векеагсй Э|адпокбск Са!. Хо. 70400). Чистота культур МусоЬас!ейит может быть оценена путем равномерного посева 100 мкл аликвот культуры МусоЬас!епит, серийно разведенной (например, 10-кратно разведенной чистой культуры (Хеа!) - 10^-8) в забуференном фосфатом физиологического растворе (далее обозначаемом РВ8), на 3,5-дюймовых планшетах, содержащих 25-30 мл твердой среды, такой как среда 7Н10 Миддлбрука (ВЭ МюгоЬю1оду, СоскеуекуШе, МЭ, Са!. Хо. 221174).

Оптическая плотность при б00 нм, при которой собирают эти бактерии, не имеет решающего значения и может варьироваться в пределах от 0,1 до 5,0 в зависимости от конкретно используемых штаммов, сред и условий культивирования.

2. Конструирование сегментов гбкРНК.

Как указывалось ранее, заявка 20040132б78 США основана на использовании хелперного фага (т.е. бкРР дикого типа) для инициации продуцирования гбкРРк. При этих условиях методы, описанные в заяв

- 9 011282 ке 20040132678, позволяют продуцировать τ6&ΡΡ, который содержит либо сегмент-8 дикого типа, либо сегмент-М дикого типа. Если учесть, что литические функции б&РБ присутствуют в сегментах-8 и -М, то неясно, могут ли такие конфигурации оставаться стабильными при крупномасштабном продуцировании. Также остается неясным, каким образом с помощью такой методики можно отделять бкРБ дикого типа от тбкРБ. Кроме того, в заявке 20040132678 не описаны ни способы получения τάδΚΝ бе ηονο, ни способы продуцирования и выделения стабильных штаммов-носителей, содержащих τ6&ΡΡ, способных к репликации. В отличие от этого, настоящее изобретение относится к стабильному продуцированию гб&РИ.

Обычно, допустимое изменение размера вирусного генома составляет примерно 10 процентов, что обеспечивает определенную степень гибкости генома в рекомбинантных вирусных векторах (Όοιηίημο апб Ηο11αη6, Аппи. Реу. МюгоЬю1. 51:151; 1997). В соответствии с настоящим изобретением, размер сегмента тб&РНК в τ6§ΡΝ равен сумме сегментов-8, -М и -Ь плюс/минус приблизительно 10%. Для иллюстрации этого, в качестве примера может быть использован ΡΗί-8. Для генерирования стабильных τ6&ΚΝ в упаковывающих штаммах, экспрессирующих сегмент-Ь ΡΗί-8. размер генома ΡΒί-8 должен составлять 14984 п.н., соответственно, а размер рекомбинантного(ых) сегмента(ов) в указанных τ6&ΚΝ должен составлять приблизительно 7933±1500 п.н.

Как показано ниже, это правило точно не соблюдается, поскольку можно получить τ6&ΚΝ, происходящие от фага ΡΗί-8, содержащего только сегмент-Ь и 4,5 т.п.н. сегмента-8 тбкРНК (8ип е! а1., ΥίΓοΙομν. 308:354; 2003). Это позволяет предположить, что τ6&ΚΝ способны обнаруживать неожиданно высокую степень гибкости генома. В вышеописанном примере, рекомбинантный сегмент-8 состоит из последовательностей, происходящих от сегмента-8 дикого типа и сегмента-М дикого типа. В этом конкретном примере, описанном в литературе, термин происходит от (например, происходит от сегмента-8 дикого типа) относится к последовательностям, присутствующим в этой рекомбинантной конструкции тбкРНК, происходящей от геномной последовательности фага дикого типа и реаранжированной из ее гена дикого типа, либо кодирующей отличительный признак определенного типа. Такие последовательности могут быть амплифицированы из фага дикого типа с помощью ОТ-ПЦР и клонированы, либо они могут быть химически синтезированы на основе известных последовательностей, присутствующих в фаге дикого типа.

Могут быть также получены композиции, содержащие геном, размер которого приближается к размеру генома дикого типа. В одном из вариантов такого метода был генерирован рекомбинантный сегмент-8, который имеет размер 7933±1500 п.н. В другом методе использовали два тб&РНК-сегмента, один из которых содержал последовательность, упаковывающую сегмент-8, и другой содержал последовательность, упаковывающую сегмент-М, где общий размер рекомбинантных сегментов составлял 7933±1500 п.н. (фиг. 4). В обоих методах по меньшей мере один сегмент содержит аллель позитивного отбора, и один или оба рекомбинантных сегмента содержат эукариотические экспрессионные кластеры.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, компоненты сегментов тб&РНК могут быть собраны, например, путем соединения нижеследующих последовательностей кДНК и ДНК (фиг. 4).

Сегмент-8 тбкРНК.

1. Последовательность рас сегмента-8 φ-8 и ген 8 (ΗοοβδΙπιΝη е! а1., см. выше, 2000).

2. Аллель позитивного отбора, присоединенный к сайту связывания с рибосомой гена 8 сегмента-8 дикого типа. Ген 8 кодирует мембранный белок, который может оставаться связанным с нуклеокапсидом, и представляет собой первую открытую рамку считывания сегмента-8 дикого типа.

3. Последовательность ΙΡΕ8, содержащая сайты рестриктирующих эндонуклеаз Нра1, ЕотРЕ 8аб и ΝοίΙ (РЕ), локализованных со стороны 3'-конца от последовательности ΙΡΕ8, так, чтобы Нра1-сайт (затупленный по концам РЕ-сайт) обеспечивал присутствие стартового кодона АТС, функционально связанного с ΙΡΕ8.

4. Бычья последовательность полиаденилирования (полученная из рсПЫА3.1 (Ιηνίίτο^η, СаткЬаб, СА, Са!. Νο. У860-20)).

5. Последовательность распознавания РНК-зависимой РНК-полимеразы для сегмента-8 φ-8 (Ηοομ51га1ег1 е! а1., см. выше, 2000).

Сегмент-М тбкРНК.

6. Последовательность рас сегмента-М (ΗοοβδΙηΝη е! а1., см., выше, 2000).

7. Аллель позитивного отбора, присоединенный к сайту связывания с рибосомой гена 10. Ген 10 представляет собой первую открытую рамку считывания сегмента-М дикого типа и кодирует мембранный белок φ-8.

8. Последовательность ΙΡΕ8, содержащая сайты рестриктирующих эндонуклеаз Нра!, ΕοοΡΙ, 8аб и ΝοίΙ (РЕ), локализованных со стороны 3'-конца от последовательности ΙΡΕ8, так, чтобы НраЪсайт (затупленный по концам РЕ-сайт) обеспечивал присутствие стартового кодона АТС, функционально связанного с ΙΡΕ8.

9. Бычья последовательность полиаденилирования (полученная из рсЭкА3.1 (Ιηνίίτο^η, СаткЬаб, СА, Са!. Νο. У860-20)).

10. Последовательность распознавания РНК-зависимой РНК-полимеразы для сегмента-М φ-8

- 10 011282 (Ноодк!га!еп е! а1., см. выше, 2000).

Не ограничивая объем изобретения какой-либо конкретной теорией, можно лишь отметить, что, если размер сегмента-8 гбкРНК превышает 7900±1500 п.н., то сегмент-М гбкРНК, вероятно, не будет упаковываться, поскольку сегмент-8 гбкРНК, превышающий 7900±1500 п.н, будет индуцировать изменение конформации в прокапсиде, что, в свою очередь, будет приводить к распознаванию и поглощению сегмента-Ь и к генерированию τά&ΚΝ с геномом, размер которого составляет ±10% от генома дикого типа.

Последовательности кДНК, кодирующие сегменты гбкРНК, могут быть синтезированы на ДНКсинтезаторе Аррйеб Вюкук!етк ΑΒΙ™ 3900 Шдй-Тйгоидйри! ΌΝΆ 8уп!йек1/ег (Рок!ег Сйу, СА) в соответствии с инструкциями производителей. Для синтеза копий кДНК сегментов-Ь и рекомбинантных сегментов-8 и/или -М, получают серии неполных сегментов полноразмерной последовательности с помощью ПЦР, и эти сегменты лигируют с получением полноразмерного сегмента в соответствии с процедурами, хорошо известными специалистам в данной области (АикиЬе1 е! а1., см. выше, 1990). Вкратце, синтетические олигонуклеотиды длиной в 100-200 нуклеотидов (т.е., предпочтительно, олигонуклеотиды, имеющие 5'- и З'-концевые последовательности, соответствующие 5'- и З'-концам олигонуклеотидов, кодирующих смежную последовательность) получают на автоматическом ДНК-синтезаторе (например, Арр11еб Вюкук!етк ΑΒΙ™ 3900 Шдй-Тйгоидйри! ΌΝΑ 8уп!йек1/ег (Рок!ег Сйу, СА). Аналогичным способом синтезируют комплементарные олигонуклеотиды, которые затем отжигают с комплементарными партнерами с образованием двухцепочечных олигонуклеотидов. Пары из двухцепочечных олигонуклеотидов (т.е. олигонуклеотидов, кодирующих смежные последовательности) соединяют путем лигирования с образованием более крупного фрагмента. Эти более крупные фрагменты очищают с помощью электрофореза в агарозном геле и выделяют с использованием набора для гель-очистки (например, системы для гель-экстракции Ц1АЕХ® II Се1 Ех!тас!юп 8ук!ет, 01адеп. 8ап!а Сгих. СА, Са!. №. 12385). Эту процедуру повторяют до тех пор, пока не будет получена полноразмерная молекула ДНК. После проведения каждого раунда лигирования, фрагменты могут быть амплифицированы с помощью ПЦР для увеличения выхода. Процедуры конструирования синтетического гена бе поуо хорошо известны специалистам в данной области и описаны в литературе (Апбге е! а1., см. выше, 1998); (Наак е! а1., см. выше, 1996); и альтернативно, синтетические гены могут быть закуплены у коммерческих фирм, например у М1б1апб Сетбйеб Кеадеп! Со. (М1б1апб, ТХ).

Аллели позитивного отбора.

Конкретный аллель позитивного отбора, вводимый в сегмент гбкРНК, не имеет решающего значения для осуществления настоящего изобретения, и таким аллелем может быть любой аллель, способный восстанавливать доминантную негативную мутацию в упаковывающем штамме, например, такой как, но не ограничивающийся ими, гены, комплементирующие ауксотрофные мутации, такие как агоА (номер доступа в СепЬапк Х00557), агоС (номер доступа в СепЬапк АУ142231), 1еиО (номер доступа в СепЬапк Б06666), или гены, комплементирующие мутации в генах, ответственных за синтез клеточной стенки, такие как акб (номер доступа в СепЬапк У00262), или тиг1 (номер доступа в СепЬапк АУ520970), или гены, комплементирующие мутации в генах, ответственных за деление клеток, такие как Ε!κΖ (номер доступа в СепЬапк АР221946).

Источник последовательностей 1КЕ8.

Молекулы мРНК, не содержащие 5'-кэп-модификатор, который обычно присоединяют к ядерным мРНК-транскриптам в ядре и для стимуляции распознавания рибосомы, плохо транслируются в эукариотических клетках, если только последовательность 1КЕ8 не находится выше от представляющего интерес гена. Использование какого-либо конкретного 1КЕ8 не имеет важного значения для осуществления настоящего изобретения, и он может быть выбран из любых коммерчески доступных векторов, содержащих последовательности 1КЕ8, или из любых имеющихся легко доступных последовательностей. Таким образом, последовательности 1КЕ8 имеют широкое применение и могут быть получены промышленным способом из плазмиды р1КЕ82-ЕСРР (С1оп!есй, Ра1о А1!о, СА, Са!. №. 63206) посредством ПЦР с использованием праймеров, специфичных для 5'- и 3'-концов 1КЕ8, локализованной в положении нуклеотидов 665-1251 в р1КЕ82-ЕСРР.

Последовательности в плазмиде р1КЕ8-ЕСРР могут быть закуплены у производителей (см. \\л\лт.с1оп!ес11.сот). Аналогичные 1КЕ8 могут быть также получены из плазмиды рС1ТЕ4а (№уадеп, Маб1коп, У1, Са!. №. 69913; см. также патент США № 4937190) посредством ПЦР с использованием праймеров, специфичных для 5'- и 3'-концов С1ТЕ в положениях от нуклеотида 16 до нуклеотида 518 в плазмиде рС1ТЕ4а (полноразмерную последовательность рС1ТЕ4а можно найти на \теЬ-сайте поуадеп.сош/боск^П18/69913-000.НТМ); из плазмид рС1ТЕ4а-с; (патент США № 4937190); р8Ь1КЕ811 (номер доступа: АР171227); рРУ (номер доступа Υ07702); р8У1КЕ8^ (номер доступа: А1000156); (Сгеаиает е! а1., 1. Се11 Вю1., 10: 275-281; 2000); (Каток апб Мат!шех-8а1а, ^А, 10:1374-1383; 1999); (Могдап е! а1., №с1ею Ас1бк Кек., 20:1293-1299; 1992); (ТкиИуата-Койата е! а1., 1. У1то1., 66: 1476-1483; 1992); (1апд апб ХУпшпег е! а1., Сепек Эеу., 4: 1560-1572; 1990), или из дицистронного ретровирусного вектора (номер доступа: Ό88622); либо в эукариотических клетках, таких как клетки, содержащие 1КЕ8 фактора роста фибробластов 2 для строгой тканеспецифической регуляции (Стеапает е! а1., см. выше, 2000) или

- 11 011282 внутренний сайт связывания с рибосомой З'-нетранслируемой области мРНК для бета-субъединицы митохондриальной Н⁺-АТР-синтазы (1хс.|шсгбо апб Снсхуа. Вюсйет. 1., 346:849; 2000). Поскольку ΙΡ отсутствует на ΙΚΕ8 НСУ. то в качестве источника ΙΚΕ8 может служить плазмида ρΙΚΕδ-6 (НоЬЬк. 8.М. СКС Сеп!ге Тот Сапсег Тйегареибск. 1п81йи1е οί Сапсег Кекеатсй. В1оск Р. 15. Со1к\уо1б Коаб. Ве1топ!. 8и!!оп. 8штеу 8М2 5ΝΟ. ИК). последовательность которой является доступной (номер доступа в СепеЬапк Υ11034).

Кроме того. поиск в Интернете с использованием нуклеотидной базы данных NСВI. имеющейся на сайте псЬ1.п1т.шй.доу. и с использованием параметра поиска ΙΚΕ8 по! ра!еп!. дал 140 файлов. содержащих последовательности ΙΚΕ8. И наконец. кДНК ΙΚΕ8 может быть синтезирована на ДНКсинтезаторе АррКеб Вюкук!етк ΑΒΙ™ 3900 Шдй-Тйтоидйри! ΌΝΑ 8уп111ек1/ег (Рок!ег Сйу. СА). в соответствии с инструкциями производителя. Для синтеза крупных последовательностей ΙΚΕ8. таких как 502 п.н. ΙΚΕ8 в рСПВИа. с помощью ПЦР генерировали серии сегментов. которые затем лигировали с получением полноразмерной последовательности в соответствии с процедурами. хорошо известными специалистам в данной области (АикиЬе1 е! а1.. см. выше. 1990). Менее крупные последовательности ΙΚΕ8. такие как 53 п.н. ΙΚΕ8 в вирусе гепатита С (номер доступа в СепеЬапк 1КН6А). могут быть синтезированы за один раунд на ДНК-синтезаторе АррНеб Вюкук!етк АВТ™ 3900 Шдй-Тйгоидйри! ^NΑ 8уп111ек1/ег (Рок!ег С1!у. СА) в соответствии с инструкциями производителя.

Примеры представляющих гетерологичных генов. которые могут быть встроены в τ6κΚΝ.

В соответствии с настоящим изобретением представляющий интерес ген. вводимый в τ6κΚΝ в экспрессионном кластере для трансляции в эукариотах. может кодировать иммуноген. а поэтому τ6κΚΝ может действовать как вакцина. вырабатывающая иммунный ответ против этого иммуногена. Таким иммуногеном может быть либо чужеродный иммуноген. происходящий от вирусных. бактериальных и паразитарных патогенов. либо эндогенный иммуноген. такой как. но не ограничивающийся ими. аутоиммунный антиген или опухолевый антиген. Такими иммуногенами могут быть. например. полноразмерный нативный белок. химерные гибриды. состоящие из чужеродного иммуногена и эндогенного белка или миметика. или фрагмент или фрагменты иммуногена. происходящего от вирусных. бактериальных и паразитарных патогенов.

Используемый здесь термин чужеродный иммуноген означает белок или его фрагмент. которые обычно не экспрессируются в клетках или тканях животного-реципиента. такие как. но не ограничивающиеся ими. вирусные белки. бактериальные белки. паразитарные белки. цитокины. хемокины. иммунорегуляторные агенты или терапевтические средства.

Термин эндогенный иммуноген означает белок или его часть. которые обычно присутствуют в клетках или тканях животного-реципиента. такие как. но не ограничивающиеся ими. эндогенный клеточный белок. иммунорегуляторный агент или терапевтическое средство.

Апоптоз представляет собой запрограммированную клеточную гибель. которая. по характеру и по последствиям ее индуцирования. значительно отличается от некротической клеточной гибели. Апоптоз клеток. содержащих чужеродные антигены. представляет собой известный мощный стимулятор вырабатывания клеточного иммунитета против таких антигенов. Механизм. посредством которого апоптоз антигенсодержащих клеток приводит к вырабатыванию клеточного иммунитета. иногда называют перекрестным примированием (Неа!й. ν.Κ. е! а1.. Iттиηο1. Кее. 199:9; 2004. Са11исс1. 8.М. е! а1.. №11иге Вю!есйпо1оду. 5:1249; 1999. А1Ьег!. М.Ь. е! а1.. №!иге 392:86; 1988). Существует несколько механизмов индуцирования апоптоза. который приводит к усилению антигенспецифического клеточно-опосредуемого иммунитета. Апоптоз. опосредуемый каспазой 8. приводит к вырабатыванию антигенспецифического клеточного иммунитета (Неа!й. ν.Κ. е! а1.. Iттипο1 Кее 199:9; 2004). гбкК№экспрессия каспазы-8 в цитоплазме является эффективным методом индуцирования запрограммированной гибели клеток в присутствии чужеродных антигенов. экспрессируемых гбкК№ что приводит к вырабатыванию высоких уровней антигенспецифического клеточного иммунитета. Рецептор-5 гибели клеток (ИК-5). также известный как ТКАТЬ-КЦ (рецептор 2 ТКАТЬ) или ΤΝΡΚ-δΡ-ЮВ (член суперсемейства факторов некроза опухоли 10В). также индуцирует апоптоз. опосредуемый каспазой 8 (8йет1бап. ЕР. е! а1.. 8аепсе 277:818; 1997). Индуцируемый реовирусом апопотоз опосредуется ΤКΑI^-^К5 и приводит к последующему выведению вируса (С1агке. Р.8. е! а1.. 1. У1то1; 2000). гбкК№экспрессия ИК-5 должна обеспечивать сильное стимулирующее действие. направленное на индуцирование антигенспецифического клеточного иммунитета против тбкК№экспрессируемых антигенов. Апоптоз антигенэкспрессирующих клеток может быть также индуцирован посредством присоединения Рак. который является сильным стимулятором индуцирования антигенспецифических клеточных иммунных ответов (Сйа!!етдооп. М.А. е! а1.. №11 Вю!есйпо1оду; 18:974. 2000). гбкК№ экспрессирующие Рак или гибридный белок. содержащий цитоплазматический домен Рак/эктодомен СИ4. индуцирует апопотоз и антигенспецифические клеточные иммунные ответы против антигенов. экспрессируемых τ6κΚΝ.

Усиление клеточного иммунитета посредством гбкК№опосредуемого апоптоза. как описано выше. не ограничивается только действием антигенов. специфически кодируемых самим τ6κΚΝ. и оно может быть также вызвано действием любого антигена. присутствующего в клетке. в которой τ6κΚΝ экспресси

- 12 011282 рует специфические медиаторы апоптоза. Так, например, если τάδΚΝ доставляется в опухолевые клетки, апоптоз которых он индуцирует, то это будет приводить к вырабатыванию клеточного иммунитета против важных опухолевых антигенов с последующим уничтожением опухоли и/или метастазов, либо подавлением или предупреждением развития опухоли и/или возникновения метастазов.

В другом варианте настоящего изобретения, если τάδΚΝ, обладающие или не обладающие способностью индуцировать апоптоз и обладающие способностью кодировать и продуцировать чужеродные антигены, против которых будут вырабатываться сильные клеточные иммунные ответы, доставляются вовнутрь опухоли или других клеток, то они будут продуцировать сильные клеточные ответы против этих клеток. Такие клеточные ответы будут приводить к иммуноопосредуемой деструкции опухолевых клеток, а также к перекрестному примированию и индуцированию клеточного иммунного ответа против опухолевых или других важных антигенов с последующим уничтожением опухоли и/или метастазов или подавлением или предупреждением развития опухоли и/или метастазов. Примером такого чужеродного антигена является антиген НЬЛ, отличающийся от НЬЛ клеток-хозяев, против которого вырабатывается сильный гетерологичный клеточный ответ.

Рекомбинантные τάδΡΝ, способные индуцировать апоптоз и доставлять специфические опухолевые антигены, будут индуцировать сильные антигенспецифические клеточные ответы против этих опухолевых антигенов, включая подавление, до некоторой степени, толерантности к этим антигенам, что будет приводить к уничтожению опухоли и/или метастазов или к подавлению или предупреждению развития опухоли и/или метастазов, и не требует прямой доставки τάδΡΝ в саму опухоль.

Апоптоз, вызываемый разрушением ДНК или действием каспазы 9, индуцирует толерантность к некоторым антигенам (Нидиек, 8. с1 а1., ΙιηιηιιπίΙν 16:169). Индуцирование толерантности играет важную роль в лечении или предупреждении аутоиммунных заболеваний, таких как, но не ограничивающихся ими, диабет, ревматоидный артрит, болезнь Крона, воспалительное заболевание кишечника и рассеянный склероз. Продуцирование нуклеокапсидом τάδΚΝ каспазы 9 или других белков, индуцирующих опосредуемую апоптозом толерантность, в клетках, таких как, но не ограничивающихся ими, панкреатические β-клетки, клетки ободочной кишки и нервные клетки, будет приводить к ограниченному апоптозу, который будет индуцировать толерантность к антигенам-мишеням, продуцирующим аутоиммунитет в этих клетках, и тем самым, способствовать лечению или предупреждению аутоиммунных заболеваний. Идентификация специфических антигенов, участвующих в аутоиммунных реакциях, позволяет индуцировать толерантность к этим аутоиммунным антигенам-мишеням посредством гбкЯН-продуцирования этих антигенов и каспазы 9 или других молекул, способных индуцировать опосредуемую апоптозом толерантность, которая будет приводить к лечению и/или предупреждению указанных аутоиммунных заболеваний.

Поэтому в другом варианте своего осуществления, настоящее изобретение относится к τάδΚΝ, содержащему по меньшей мере один ген, который экспрессирует белок, индуцирующий апопотоз, такой как, но не ограничивающийся ими, 8орЕ 8а1топе11а (номер доступа в СеиЬаик ΑΑΌ54239, ААВ51429 или ААС02071), 1раВ 8Ыде11а (номер доступа в СеиЬаик ΑΑΜ89553 или ААМ89536), каспаза-8 (номер доступа в СеиЬаик ΑΑΌ24962 или ААН06737) и т.п. в цитоплазме клеток-хозяев, и такая экспрессии является эффективным методом индуцирования запрограммированной гибели клеток в присутствии антигенов, экспрессиируемых указанным τάδΚΝ, и, тем самым, вырабатывания высокого уровня Т-клеточноопосредуемого иммунитета к антигенами-мишеням. Альтернативно, может быть продуцирован τάδΚΝ, содержащий по меньшей мере один ген, экспрессирующий ИЯ-5, такой как ИЯ-5 человека (номер доступа в СеиЬаик ΒΑΑ33723), герпесвирус-6 (ННУ-6), гомолог человеческий ИЯ-5 (номер доступа в СеиЬаик СЛЛ58423) и т.п., и обладающий сильным адъювантным действием, направленным на индуцирование антигенспецифического клеточного иммунного ответа против антигенов-мишеней.

Альтернативно или дополнительно, такой иммуноген может кодироваться синтетическим геном и может быть сконструирован стандартными методами рекомбинантных ДНК (см. выше).

Чужеродным иммуногеном может быть любая молекула, которая экспрессиируется любым вирусным, бактериальным или паразитарным патогеном, до или в процессе его инвазии или колонизации организма животного-хозяина или репликации в этом организме. гбкЯИ может экспрессировать иммуногены или их части, происходящие от вирусных, бактериальных и паразитарных патогенов. Такие патогены могут быть инфекционными для человека, домашних животных или диких животных.

Вирусными патогенами, от которых происходят вирусные антигены, являются, но не ограничиваются ими, ортомиксовирусы, такие как вирус гриппа (Тахоиоту ΙΌ: 59771); ретровирусы, такие как Я8У, НТЬУ-1 (Тахоиоту ΙΌ: 39015) и НТЬУ-П (Тахоиоту ΙΌ: 11909); папиломавирусы, такие как НРУ (Тахоиоту ΙΌ: 337043), герпесвирусы, такие как ЕВУ (Тахоиоту ΙΌ: 10295); СМУ (Тахоиоту ΙΌ: 10358) или вирус простого герпеса (АТСС # УЯ-1487); лентивирусы, такие как ВИЧ-1 (Тахоиоту ΙΌ: 12721) и ВИЧ2 (Тахоиоту ΙΌ: 11709); рабдовирусы, такие как вирус бешенства; пикорновирусы, такие как полиовирус (Тахоиоту ΙΌ: 12080); поксвирусы, такие как вирус коровьей оспы (Тахоиоту ΙΌ: 10245); ротавирус (Тахоиоту ΙΌ: 10912); и парвовирусы, такие как аденоассоциированный вирус 1 (Тахоиоту ΙΌ: 85106).

Примерами вирусных антигенов могут служить антигены группы, включающей, но не ограничивающейся ими, антигены вируса иммунодефицита человека Не! (Найоиа1 ИъШШе о! Α1Κ^ аиб ИчГесбош

- 13 011282

ЭГеаке Ηΐν Верокйогу Са!. # 183; номер доступа в СепЬапк АР238278), Сад, Εην (Ναΐίοηαΐ ΙηκΙίΙυΙο оГ А11егду апб ШГесбоик ЭГеаке Ηΐν Верокйогу Са!. # 2433; номер доступа в СепЬапк И39362), Та! (Ναΐίοηαΐ ШкШШе оГ А11егду апб ШГесБоик ЭГеаке Ηΐν Верокйогу Са!. # 827; номер доступа в СепЬапк М13137), мутантные производные Та!, такие как Та1-А31-45 (Адтеа1е е! а1. Ргос. N311. Асаб. 8с1. И8А 99:10037, 2002), Веν (№Шопа1 1пкй!и!с оГ А11егду апб ШГесБоик ЭГеаке Ηΐν Верокйогу Са!. # 2088; номер доступа в СепЬапк Ь14572) и Ро1 (№1Бопа1 1пк!йи!с оГ А11егду апб 1пГссйоик ЭГеаке Ηΐν Верокйогу Са!. # 238; номер доступа в СепЬапк А1237568), и Т- и В-клеточные эпитопы др120 (Иапке апб МсМюйае1, АЮ8 Iттиηο1 Ьей., 66:177; 1999); Щипке е! а1., Уасс1пе, 17:589; 1999; Ра1кег е! а1., 1. 1щщипо1., 142:3612-3619; 1989), химерные производные Εην и др 120 ВИЧ-1, такие как, но не ограничивающиеся ими, гибриды белков др120 и СЭ4 (Еои!к е! а1., 1. Упо1. 2000, 74:11427-11436; 2000); усеченные или модифицированные производные еп\^г ВИЧ-1, такие как, но не ограничивающиеся ими, др140 (81ата1ок е! а1. 1 Уйок 72:9656-9667; 1998) или производные Εην и/или др140 ВИЧ-1 (В1п1еу е! а1. 1 Упо1, 76:2606-2616; 2002); (8апбегк е! а1. 1 Упо1, 74:5091-5100; 2000; Вш1еу е! а1. 1 Уйо1, 74:627-643; 2000), поверхностный антиген вируса гепатита В (номер доступа в СепЬапк АЕ043578); (Уи е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8ск, И8А, 86:4726-4730; 1989); ротавирусные антигены, такие как УР4 (номер доступа в СепЬапк А1293721); (Маскоте е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8ск, И8А, 87:518-522; 1990) и УР7 (номер доступа в СепЬапк АУ003871); (Сгееп е! а1., 1. У1ю1., 62:18191823; 1988), антигены вируса гриппа, такие как гемаглютинин (номер доступа в СепЬапк А1404627); (Рейтег апб ВоЬткоп, У1го1оду, 257:406; 1999); нуклеопротеин (номер доступа в СепЬапк А1289872); (Ып е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8ск, 97: 9654-9658; 2000), антигены вируса простого герпеса, такие как тимидинкиназа (номер доступа в СепЬапк АВ047378); (Уйй1еу е! а1., ΐη: №те Сепегайоп Уассшек, стр. 825-854).

Бактериальными патогенами, от которых происходят бактериальные антигены, являются, но не ограничиваются ими, МусоЬас!егшт крр., Ие11соЬас1ег ру1оп, 8а1топе11а крр., 8Шде11а крр., Е.сой, Вюкейыа крр., Ь1к!ег1а крр., ЬедюпеПа рпеитошае, Ркеиботопак крр., У1Ьпо крр., ВасШик апШгаак и ВогеШа ЬигдбогГеп.

Примерами протективных антигенов бактериальных патогенов являются соматические антигены энтеротоксигенных бактерий Е.со11, такие как антиген фимбрий СЕА/ΐ (Уатато!о е! а1., ШГеск ΐттиη., 50:925-928; 1985) и нетоксическая В-субъединица термолабильного токсина (К11рк!еш е! а1., 1пГсс!. 1штип., 40:888-893; 1983); пертактин Вогбе!е11а рейиккШ (ВоЬейк е! а1., Уасс, 10:43-48; 1992), аденилатциклаза-гемолизин В. рейикак (Сшко е! а1., М1сго. РаШ., 11:423-431; 1991), фрагмент С столбнячного токсина С1ок!пбшт !е!ат (ЕшгтееаШег е! а1., 1пГсс!. ΐттиη., 58:1323-1326; 1990), ОкрА ВогеШа ЬигдбогГеп (81капб е! а1., Реб1айтск, 108:123-128; 2001); (АУаШсН е! а1., 1пГсс! ΐттиη, 69:2130-2136; 2001), протективные паракристаллические поверхностные белки Вюкейиа рготеа/екб и Вккейыа 1ур1и (Саг1 е! а1., Ргос. N111. Асаб. 8ск И8А, 87:8237-8241; 1990), листериолизин (также известный как Ь1о и Шу) и/или супероксиддисмутаза (также известная как 8ΟΌ апб р60) Ык!епа топосу!одепек Щекк, 1. е! а1., 1пГсс!. ΐттиη. 65:1286-92; 1997); Щекк, 1. е! а1., Ргос. Асаб. 8ск 93:1458-1463; 1996); (Воитеег е! а1., 1. Ехр. Меб. 175:1467-71; 1992), уреаза Ηе1^сοЬас!е^ ру1оп (Сотех-Оиайе е! а1., УассШс 16, 460-71; 1998); (СогШекуТ11еи1ах е! а1., 1пГссйоп & ΐттиηйу 66, 581-6; 1998), протективный антиген ВасШик апШгаик и связывающийся с рецептором домен летального токсина (Рпсе е! а1., ШГеск ΐιηιηιιη. 69, 4509-4515; 2001).

Паразитарными патогенами, от которых происходят паразитарные антигены, являются, но не ограничиваются ими, Р1актобшт крр., такие как Р1актобшт ГаШрагит (АТСС # 30145); Тгурапокоте крр., такие как Тгурапокота сги/ί (АТСС # 50797); С1агб1а крр., такие как С1агб1а т!ек!ша11к (АТСС# 30888Ό); ВоорЫШк крр., ВаЬек1а крр., такие как ВаЬеиа ткгой (АТСС # 30221); Еп!атоеЬа крр., такие как Еп!атоеЬа Шк!о1уйса (АТСС # 30015); Е1тепа крр., такие как Е1тепа тах1та (АТСС # 40357); ЬетЬташа крр. (Тахопоту ΐΌ: 38568); 8сШк!окоте крр., Вгид1а крр., Еакшба крр., ОйоП1апа крр., Уисйегепа крр. и Опсйосегса крр.

Примерами протективных антигенов паразитарных патогенов являются антигены круглого спорозоита Р1актоб1ит крр. (8абоГГ е! а1., 8с1епсе, 240:336-337; 1988), такие как антиген круглого спорозоита Р. Ьегдегл или антиген круглого спорозоита Р. ГаШрагит; поверхностный антиген мерозоита Р1актобшт крр. (8ре1х1ег е! а1., ΐη!. 1. Рер!. Рго!. Век., 43:351-358; 1994); галактозо-специфический лектин Еп!атоеЬа Ык!о1у!юа (Мапп е! а1., Ргос. N111. Асаб. 8ск, И8А, 88:3248-3252; 1991), др63 ЬеШЬтата крр. (Викке11 е! а1., 1. 1щщипо1., 140:1274-1278; 1988; Хи апб Шете, 1щщипо1., 84: 173-176; 1995), др46 ЬеШЬташа та)ог (Ηаηбтаη е! а1., Уассте, 18: 3011-3017; 2000), парамиозин Вгид1а та1ау1 (Ь1 е! а1., Мо1. Вюсйет. РагакБ !о1., 49:315-323; 1991), триозо-фосфат-изомераза 8сШк!окота тапкоп (8йоетакег е! а1., Ргос. N111. Асаб. 8ск, И8А, 89:1842-184 6; 1992); секретируемый глобин-подобный белок Тпсйокйопду1ик соШЬпГотик (Егепке1 е! а1., Мо1. Вюсйет. Рагакйок, 50:27-36; 1992); глутатион-8-трансфераза Егаксю1а йерайса ЩШуег е! а1., Ехр. Рагакйок, 75:176-186; 1992), 8сШк!окота Ьоу1к и 8. )арошсит (ВакШг е! а1., Тгор. Сеод. Меб., 46:255-258; 1994); и ΚΕΗ 8сШк!окота ^νΐδ и 8. _)арошсит (ВакШг е! а1., см. выше, 1994).

Как было упомянуто выше, гбкВКвакцины могут кодировать эндогенный иммуноген, которым может быть любой клеточный белок, иммунорегуляторный агент или терапевтическое средство, или их части, которые могут экспрессироваться в клетке реципиента, включая, но не ограничиваясь ими, опухолевые иммуногены, иммуногены трансплантатов и аутоиммунные иммуногены или их фрагменты и производные. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением, бкВР может кодировать опухоле

- 14 011282 вые иммуногены, иммуногены трансплантатов или аутоиммунные иммуногены, или их части или производные. Альтернативно, б&РР может содержать синтетические гены (полученные, как описано выше), кодирующие опухолеспецифические антигены, антигены трансплантантов или аутоиммунные антигены или их части.

Примерами опухолеспецифических антигенов являются специфический для предстательной железы антиген (Сайико е1 а1., Нитап Ра11ю1.. 26:123-126; 1995), ТЛС-72 и СЕА (Сиабадш е1 а1., Ιηΐ. 1. ΒίοΙ. Магкегк, 9:53-60; 1994), МАСЕ-1 и тирозиназа (ΟοπΠό е1 а1., 1. Iттиηοΐйе^а., 14:104-109; 1993). Недавно было обнаружено, что у мышей, которые были иммунизованы незлокачественными клетками, экспрессирующими опухолевый антиген, наблюдается вакцинный эффект, а также вырабатывается иммунный ответ, способствующий выведению злокачественных опухолевых клеток, несущих тот же самый антиген (Кдерреп е1 а1., Апа1. Ν.Υ. Асаб. 8ск, 690:244-255; 1993).

Примером антигенов трансплантатов является молекула СЭ3 на Т-клетках (А1едге е1 а1., ЭщеЧ. Όίδ. 8ск, 40:58-64; 1995). Было показано, что обработка антителом против рецептора СЭ3 способствует быстрому выведению циркулирующих Т-клеток и предотвращению клеточно-опосредуемого отторжения трансплантата (А1едге е1 а1., см. выше, 1995).

Примером аутоиммунных антигенов является β-цепь 1А5 (Шрйат е1 а1., Ргас. №111. Асаб. 8ск, И8А, 91:8005-8009; 1994). Было продемонстрировано, что вакцинация мышей пептидом β-цепи 1АЗ, состоящим из 18 аминокислот, вызывает у мышей с экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелитом вырабатывание иммунитета к указанному заболеванию и подавление такого заболевания (^рйат е1 а1., см. выше, 1994).

Кроме того, могут быть сконструированы сегменты гб&РНК, которые кодируют адъювант и могут быть использованы для усиления иммунных ответов на иммуногены у хозяина. Выбор конкретного адъюванта, кодируемого гбкРНК, не имеет важного значения для осуществления настоящего изобретения, и такими адъювантами могут быть субъединица А холерного токсина (т.е. ОхА; номер доступа в СепЬапк Х00171, АР175708, Ό30053, Ό30052) или ее части и/или мутантные производные (например, домен А1 субъединицы А Ох (т.е. ОхА1; номер доступа в СепЬапк К02679)), происходящие от любого классического штамма А1Ьгю с1ю1егае (например, штамма V. сМетае 395, АТСС # 39541) или штамма Е1 Τογ V. с1ю1егае (например, штамма V. с1ю1егае 2125, АТСС # 39050). Альтернативно, вместо ОхА может быть использован любой бактериальный токсин, который является членом семейства бактериальных аденозин-дифосфат-рибозилирующих экзотоксинов (Кгиедег апб ВагЫег, С1ш. МюгоЬю1. Иет., 8:34; 1995), например, субъединица А термолабильного токсина (обозначаемая далее Е11А) энтеротоксигенной бактерии ЕксйепсШа той (номер доступа в СепЬапк М35581), субъединица З1 коклюшного токсина (например, р!хЗ1, номер доступа в СепЬапк А1007364, А1007363, А1006159, А1006157 и т.п.); а в качестве другой альтернативы, таким адъювантом может быть один из аденилатциклаза-гемолизинов бактерий Βογ6όΙό11ι рейи8818 (АТСС # 8467), Βογ6όΙό11ι ЬгопсЫкерйса (АТСС # 7773) или Βογ6όΙό11ι рагарейиккЦ (АТСС # 15237), например, гены суаА В. рейикык (номер доступа в СепЬапк Х14199), В. рагарейикык (номер доступа в СепЬапк А124 9835) или В. ЬгопсЫкерйса (номер доступа в СепЬапк Ζ37112).

Могут быть также сконструированы цитокинкодирующие сегменты гб&РНК. Выбор какого-либо конкретного цитокина, кодируемого гбкРНК, не имеет решающего значения для осуществления изобретения, и такими цитокинами являются, но не ограничиваются ими, интерлейкин-4 (обозначаемый далее 1Ь-4; номер доступа в СепЬапк АР352783 (мышиный 1Ь-4) или NМ_000589 (человеческий 1Ь-4)), 1Ь-5 (номер доступа в СепЬапк NМ_010558 (мышиный 1Ь-5) или NМ_000879 (человеческий 1Ь-5)), 1Ь-6 (номер доступа в СепЬапк М20572 (мышиный 1Ь-6) или М29150 (человеческий 1Ь-6)), 1Ь-10 (номер доступа в СепЬапк NМ_010548 (мышиный 1Ь-10) или АР418271 (человеческий 1Ь-10)), 11-12_р40 (номер доступа в СепЬапк NМ_008352 (мышиный 1Ь-12 р40) или АΥ008847 (человеческий 1Ь-12 р40)), 1Ь-12_р70 (номер доступа в СепЬапк NМ_008351/NМ_008352 (мышиный 1Ь-12 р35/40) или АΕ093065/АΥ008847 (человеческий 1Ь-12 р35/40)), ТСЕв (номер доступа в СепЬапк NМ_011577 (мышиный ТСЕв1) или М60316 (человеческий ТСЕв1)), и ΤΝΕα номер доступа в СепЬапк Х02611 (мышиный ΤΝΕα) или М2 6331 (человеческий ΤΝΕα)).

Кроме того, для регуляции экспрессии белка в тканях-мишенях в сегменты гб&РНК может быть также включена небольшая ингибирующая РНК или антисмысловая РНК.

Методы рекомбинантных ДНК и РНК, осуществляемые в целях введения функциональных экспрессионных кластеров для генерирования гб&РНК, способной экспрессировать иммунорегуляторный агент в эукариотических клетках или тканях, описаны выше.

Иллюстративные вакцинные конструкции, кодируемые в эукариотических экспрессионных кластерах, т.е. вирусоподобные частицы (обозначаемые здесь АВР), могут быть сконструированы для индуцирования вырабатывания протективных иммунных ответов против вирусных патогенов. Было показано, что АЕР вируса гриппа подвергаются самосборке после экспрессии в плазмиде генных последовательностей, кодирующих гемаглютинин (НА), нейраминидазу ^А) и матриксные белки (М1 и М2) (ЬаШат е1 а1., I. νίτο1, 75:6154-6165; 2001). Сконструированные таким образом АЬ-Р также могут подвергаться слиянию с мембраной и бадингу, что будет способствовать потенцированию антитело-продуцирующих

- 15 011282 иммунных ответов и протективного иммунитета у животных-моделей (Рикйко е! а1., Уассте. 2005 8ер 2; [Электронная публикация, предшествующая печати]). УЬР ВИЧ могут быть аналогичным образом собраны из минимальных последовательностей, кодирующих аминокислоты 146-231 капсидного белка, последовательности миристоилирования из шести аминокислот, последовательности, кодирующей пептид Р2, домена лейциновой молнии ССЫ4, и предшественника оболочечного белка др 160 (Ассо1а е! а1., 1. У1го1, 74:5395-5402; 2000). Было показано, что основной белок Ь1 НРУ способен подвергаться самосборке с образованием УЬР в различных клеточных линиях и продуцировать гуморальный и клеточный иммунитет, что делает ген, кодирующий указанный белок, привлекательным иммуногеном (81н е! а1., 1 Уйо1., 75 (21):10139-10148; 2001).

3. Конструирование сегментов гб&РНК, несущих альфа-вирусные экспрессионные кластеры.

Как указывалось выше, гб&РЫ могут содержать экспрессионный кластер для трансляции у млекопитающих, состоящий из самоамплифицирующегося репликона плазмиды р8РУ1 (1иуйгодеи 1пс., СагкЬаб, СА) вируса лесов Семлики (обозначаемого здесь 8РУ), функционально присоединенного к представляющему интерес гену. Гены, кодирующие неструктурный белок 8РУ 1-4 (обозначаемый здесь п§р1-4) и сайт распознавания репликазы в р8РУ1, амплифицировали с помощью ПЦР и встраивали путем лигирования в затупленный по концам НраТсайт, локализованный непосредственно ниже последовательности ΙΚΕ8 и функционально присоединенный к этой последовательности в г8ед-8 с получением г8ед8::8РУ1 (фиг. 5). Сайт рестриктирующей эндонуклеазы 8та1 в плазмиде г8ед-8::8РУ1 может служить в качестве сайта инсерции для любого представляющего интерес чужеродного или эндогенного гена, таких как гены, описанные выше.

Следует отметить, что в τά&ΚΝ, включающих сегмент-8 гб&РНК, содержащий аллель позитивного отбора, п§р1-4 альфа-вируса и ампликон размером примерно 8100 п.н., поглощение сегмента-Ь не сможет осуществляться, если размер представляющего интерес гена превышает 800 п.н. (т.е., если размер генома более чем на 10% превышает размер генома дикого типа). Следует также отметить, что во всех случаях, τά&ΚΝ, включающие сегмент-8 гбкРНК, содержащий аллель позитивного отбора, и п§р1-4 альфавируса и ампликон, не требуют присутствия сегмента-М гб&РНК.

Такое ограничение емкости может быть устранено путем продуцирования упаковывающих штаммов, экспрессирующих модифицированные производные сегмента-Ь, не содержащего 5'последовательность рас. Эти последовательности будут экспрессировать белки, необходимые для продуцирования прокапсида, но они не будут упаковываться в нуклеокапсид, в результате чего τάδΡΝ, генерируемый в указанном штамме, будет иметь дополнительную емкость 7000 п.н.

Модифицированный сегмент-Ь в таких конструкциях может быть введен в упаковывающий штамм в экспрессионном векторе, таком как рТ7/Т3-18 (АтЬюп, Аийш, ТХ, Са!. №. 7201), либо он может быть интегрирован в хромосому посредством аллельного обмена методами, известными специалистам в данной области (НатШоп е! а1., см. выше, 1989); (В1отйе1б е! а1., см. выше, 1991). Сайт интеграции в хромосоме на имеет решающего значения для осуществления настоящего изобретения, хотя в предпочтительном варианте осуществления изобретения, ДНК, кодирующую экспрессионный кластер сегмента-Ь, интегрируют в хромосому для инактивации гена и для генерирования селектируемого фенотипа для отбора в определенных условиях культивирования (например, агоА (номер доступа в СепЬапк Х00557), агоС (номер доступа в СепЬапк АУ142231), 1еиИ (номер доступа в СепЬапк Ь06666), а§б (номер доступа в СепЬапк У00262), тиг1 (номер доступа в СепЬапк АУ520970), кб§А (номер доступа в СепЬапк АУ174101) и й!гВ (номер доступа в СепЬапк АР401529). Процедуры интегрирования в хромосому и методы культивирования указанных мутантов хорошо описаны в литературе (НатШоп е! а1., 1. Вас!епо1. 171: 4617; 1989); (В1отйе1б е! а1., Мо1. МюгоЬю1. 5: 1447; 1991).

4. Методы генерирования Γ6δΡΝ бе поуо.

τ6&ΚΝ были продуцированы в упаковывающих штаммах путем введения РНК, кодирующей всю генетическую информацию, необходимую для продуцирования гб&РНК после поглощения прокапсидом. Указанная рРНК может быть введена прямым методом, либо она может кодироваться на нереплицирующихся плазмидах, которые могут быть совместно введены в упаковывающий штамм. Гены, кодирующие сегмент-Ь, а следовательно, и прокапсид, могут присутствовать в упаковывающем штамме на плазмиде, либо они могут интегрироваться в хромосому упаковывающего штамма. В другом варианте, плюс-цепь РНК, кодирующая сегмент-Ь, может быть введена в упаковывающий штамм в комбинации с плюс-цепью РНК, кодирующей рекомбинантные сегменты-8 и -М. После включения в прокапсид рекомбинантных сегментов-8 и -М одноцепочечной РНК (далее обозначаемой 8&РНК), которые должны иметь достаточный размер и содержать соответствующие упаковывающие последовательности для продуцирования сигнала поглощения сегмента-Ь мРНК, включается этот сегмент-Ь, и все упакованные 8&РНК превращаются в бкРНК, что приводит к продуцированию гбШК На этой стадии, Γ6δΡΝ способен генерировать рекомбинантные сегменты-8 и -М мРНК и сегмент-Ь мРНК; при этом последний экспрессиирует белки, составляющие указанный прокапсид, который включает рекомбинантный сегмент и сегмент-Ь мРНК, которая затем превращается в бкРНК, что, тем самым, приводит к продуцированию дополнительных γ65ΡΝ (фиг. 6).

Синтезированный ίπ νί!ΐΌ рекомбинантный сегмент мРНК вводят в упаковывающие штаммы путем

- 16 011282 электропорации. РНК, предпочтительно, транскрибируют ίη νίΐτο из линейных ДНК-матриц посредством фторированных τΝΤΡ ЩитакспЬе, Ер1сеп!ге, Маб1коп, XVI) с получением фторированной РНК, которая представляет собой устойчивую к нуклеазе РНК. Фторированные бИТР и бСТР вводят в реакционную смесь при конечной концентрации 5 мМ каждого. Хотя предпочтительными являются ШТР, однако, в настоящем изобретении могут быть использованы любые модифицированные тЫТР, которые сообщают устойчивость к нуклеазе, такие как тиол- или аминогексилзамещенные тЫТР. Таким образом, специалист в данной области может вместо фторированного ЫТР использовать любой модифицированный ЫТР, сообщающий устойчивость к нуклеазе.

РНК или, предпочтительно, фторированная РНК кодирует, по меньшей мере, генный продукт, который комплементирует указанную по меньшей мере одну селектируемую фенотипическую мутацию, и представляющую интерес РНК, функционально связанную с последовательностью инициации трансляции в эукариотах. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, фторированная РНК кодирует, по меньшей мере, генный продукт, который комплементирует указанную по меньшей мере одну селектируемую фенотипическую мутацию, депе-8 (8Е0 Ш 7), для стабилизации продуцирования нуклеокапсида; и представляющую интерес РНК, функционально связанную с последовательностью инициации трансляции в эукариотах.

Для запуска синтеза гбкЯЫ в указанном упаковывающем штамме получают среду для электропорации, состоящую из:

ί) электрокомпетентного бактериального штамма при плотности 10⁸-10¹¹ к.о.е./мл для упаковки, запуска синтеза и продуцирования гбкКЫ, содержащего:

a) геномную ДНК, включающую по меньшей мере одну необратимую селектируемую фенотипическую мутацию;

b) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гены, необходимые для продуцирования прокапсида; и

c) один или несколько прокапсидов, содержащих белки, обладающие РНК-упаковывающей и РНКполимеразной активностью;

ίί) 1 нг-1 мг, предпочтительно 1-100 мкг, а более предпочтительно 5-40 мкг РНК, кодирующей, по меньшей мере, генный продукт, комплементирующий указанную по меньшей мере одну селектируемую фенотипическую мутацию; и представляющую интерес РНК, функционально связанную с последовательностью инициации трансляции в эукариотах.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, в указанном упаковывающем штамме индуцируют синтез гбкКЫ с использованием среды для электропорации, состоящей из:

ίί) 1 нг-1 мг, предпочтительно 1-100 мкг, а более предпочтительно 5-40 мкг РНК, кодирующей, по меньшей мере, генный продукт, комплементирующий указанную по меньшей мере одну селектируемую фенотипическую мутацию, ген-8 (ЬЕО Ш ΝΟ: 7) для стабилизации продуцирования нуклеокапсида; и представляющую интерес РНК, функционально связанную с последовательностью инициации трансляции в эукариотах.

Альтернативно, в указанном упаковывающем штамме индуцируют синтез ιύδΚΝ с использованием среды для электропорации, состоящей из:

ί) электрокомпетентного бактериального штамма при плотности 10⁸-10¹¹ к.о.е./мл для упаковки, запуска синтеза и продуцирования МкКИ, содержащего:

а) геномную ДНК, включающую по меньшей мере одну необратимую селектируемую фенотипическую мутацию;

ίί) 1 нг-1 мг, предпочтительно 1-100 мкг, а более предпочтительно 5-40 мкг РНК, кодирующей, по меньшей мере, генный продукт, комплементирующий указанную по меньшей мере одну селектируемую фенотипическую мутацию, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гены, необходимые для продуцирования прокапсида; ген-8 (ЬЕО Ш ΝΟ: 7) для стабилизации продуцирования нуклеокапсида; и представляющую интерес РНК, функционально связанную с последовательностью инициации трансляции в эукариотах.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, в указанном упаковывающем штамме индуцируют синтез τάδΚΝ с использованием среды для электропорации, состоящей из:

ί) электрокомпетентного бактериального штамма при плотности 10⁸-10 к.о.е./мл для упаковки, запуска синтеза и продуцирования гбкКМ, содержащего:

а) геномную ДНК, включающую по меньшей мере одну необратимую селектируемую фенотипиче

- 17 011282 скую мутацию;

ίί) 1 нг-1 мг, предпочтительно 1-100 мкг, а более предпочтительно 5-40 мкг фторированной РНК, кодирующей, по меньшей мере, генный продукт, комплементирующий указанную по меньшей мере одну селектируемую фенотипическую мутацию; ген-8 (8ЕО ΙΌ ΝΌ: 7) для стабилизации продуцирования нуклеокапсида; и представляющую интерес РНК, функционально связанную с последовательностью инициации трансляции в эукариотах.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения, в указанном упаковывающем штамме индуцируют синтез гбзКЫ с использованием среды для электропорации, состоящей из:

ί) электрокомпетентного бактериального штамма при плотности 10⁸-10¹¹ к.о.е./мл для упаковки, запуска синтеза и продуцирования гбзКЫ, содержащего:

ίί) 1 нг-1 мг, предпочтительно 1-100 мкг, а более предпочтительно 5-40 мкг фторированной РНК, кодирующей, по меньшей мере, генный продукт, комплементирующий указанную по меньшей мере одну селектируемую фенотипическую мутацию; последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гены, необходимые для продуцирования прокапсида; ген-8 (8ЕО ΙΌ ΝΌ: 7) для стабилизации продуцирования нуклеокапсида; и представляющую интерес РНК, функционально связанную с последовательностью инициации трансляции в эукариотах.

Метод электропорации указанной РНК или, предпочтительно, фторированной РНК в указанный упаковывающий штамм не имеет решающего значения для осуществления настоящего изобретения, и такая электропорация может быть осуществлена в соответствии со стандартными процедурами, хорошо известными специалистам в данной области (АизиЬе1 е1 а1., см. выше, 1990; 8атЬ^οοк, см. выше). После электропорации среду для электропорации смешивали с восстанавливающей средой, описанной в литературе (АизиЬе1 е1 а1., см. выше, 1990; 8атЬ^οοк, см. выше), и инкубировали при 37°С в течение 30 мин-4 ч, а предпочтительно в течение 2 ч.

Электротрансформанты выделяли на твердой среде в условиях, которые обеспечивали лишь рост штаммов, содержащих и экспрессирующих аллель позитивного отбора в рекомбинантном сегменте (например, на соевом агаре с трипсином (обозначаемом далее Т8А), Όίίοο, Пейсй, М1).

Бактериальные изоляты, содержащие гбзКЫ, культивировали при температуре в пределах от 25 до 44°С в течение 16-96 ч, однако сначала эти трансформанты предпочтительно культивировать при 28°С в течение 48 ч. Затем колонии, которые росли на селектируемой твердой среде, выделяли и очищали стандартными методами (АизиЬе1 е1 а1., см. выше, 1990); (8атЬ^οοк, см. выше). Для подтверждения того, что выбранные изоляты содержали нужный функциональный гбзКЫ, отдельные изоляты скринировали с помощью ОТ-ПЦР с использованием праймеров, сконструированных для специфической амплификации плюс- и минус- (второй) цепи последовательностей РНК, включая, но не ограничиваясь ими, цепьспецифические упаковывающие последовательности, аллель позитивного отбора, 1КЕ8 и представляющий интерес ген. Методы получения РНК для анализа хорошо известны специалистам в данной области, и такими методами являются методы, описанные ниже. Отдельные изоляты могут быть культивированы в жидкой среде (например, в соевом бульоне с трипсином (обозначаемом далее Т8В), ΌίΓοο, МО), и полученные культуры могут быть собраны после достижения оптической плотности при 600 нм (ОЭ₆₀₀), составляющей 0,001-4,0, по сравнению с ОЭ₆₀₀ стерильного Т8В-контроля. Нуклеокапсиды выделяли из таких культур методами, описанными в литературе и хорошо известными специалистам в данной области (6οй1^еЬ е1 а1., ί. Вас1егю1 172:5774; 1990); (8υη е1 а1., см. выше, 2003). ПЦР-праймеры для проведения такого анализа конструировали с помощью компьютерной программы Ο1οικ Маηаде^®, версия 4.1 (8с1еШПс амб Ебисаΐ^οηа1 8οΠ\νηΐΌ 1пс., Эиткат, ЫС), или компьютерной программы для анализа праймеров ОЬЮО 4.0 Ρορ\τϊ§1ιΙ \νο)^Οι КусШк). Эта программа позволяет конструировать ПЦР-праймеры, совместимые со специфическими ДНК-фрагментами, подвергаемыми модификации. ОТ-ПЦР проводили в термоячейке Βίο Каб 1Сус1ег, (Негси1ез, СА), и время отжига, удлинения и денатурации праймеров в ОТПЦР устанавливали в соответствии со стандартными процедурами (АизиЬе1 е1 а1., см. выше). Затем ОТПЦР-продукты анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле в соответствии со стандартными процедурами (АизиЬе1 е1 а1., см. выше, 1990); (8атЬ^οοк, см. выше). Позитивный клон определяли как клон, имеющий соответствующую ОТ-ПЦР-картину, которая указывает на то, что сегмент гбзРНК стабильно сохранялся в указанном штамме. ОТ-ПЦР-продукты могут быть затем проанализированы стандартными методами секвенирования ДНК, описанными ниже.

После идентификации нужных трансформантов, отдельные штаммы хранили в среде для хранения, которая представляет собой среду Т8, содержащую 10-30% (об./об.) глицерин. Бактериальные изоляты собирали с твердой среды с помощью стерильного ватного тампона и суспендировали в среде для хранения при плотности 10⁸-10⁹ к.о.е./мл, и полученные суспензии затем хранили при -80°С.

- 18 011282

Партии очищенных Μ&ΚΝ выделяли из указанных штаммов-носителей методами. хорошо известными специалистам в данной области и очень подробно описанными в литературе (МшйкЬ е! а1.. ί У1го1 66. 2605-10; 1992); (МшйкЬ е! а1.. У1го1оду 212:213-217; 1995); (Мшйюй е! а1.. 1 Вас!епо1 181:4505-4538; 1999); (01ао е! а1.. У1го1оду 275:218-224; 2000); (фао е! а1.. У1го1о§у 227:103-110; 1997); (01ккопеп е! а1.. Ргос №!1 Асай 8с И8А 87:9173-9177; 1990); (Опойега е! а1.. 1 У1го1 66. 190-196; 1992).

5. Использование гй&КЫ для индуцирования биологического эффекта ш νί\Ό.

Выбор какого-либо конкретного метода. применяемого для получения новых гйкВРэкспрессирующих систем. описанных в настоящем изобретении. не имеет решающего значения для его осуществления. и такой метод может быть выбран из методов. проводимых с использованием физиологического буфера (Ре1дпег е! а1.. патент США № 5589466 (1996); фосфата алюминия или гидроксифосфата алюминия (например. И1тег е! а1.. Уассше. 18:18; 2000). монофосфорил-липида А (также обозначаемого МРЬ или МРЬА; 8сйпеегкоп е! а1.. 1. 1ттипо1.. 147: 2136-2140; 1991); (например. 8акак1 е! а1.. 1пР. 1ттипо1.. 65: 3520-3528; 1997); (Ьойте11 е! а1.. Уассше. 18:1059-1066; 2000); сапонина Р8-21 (например. 8акак1 е! а1.. 1. Уно1.. 72:4931; 1998); дексаметазона (например. Ма1опе е! а1.. 1. Вю1. СРет. 269:29903; 1994); ДНК-последовательности СрС (Όηνίκ е! а1.. Р 1ттипо1.. 15:870; 1998); или антагониста липополисахарида (ЛПС) (Нопе е! а1.. см. выше. 1997).

гй&КЫ может быть введен непосредственно в эукариотические клетки. ткани животных или человеческие ткани путем внутривенной. внутримышечной. внутрикожной. внутрибрюшинной. интраназальной и пероральной инокуляции. Выбор какого-либо конкретного метода введения описанных здесь гйкВ№ конструкций в клетку- или ткань-мишень не имеет решающего значения для осуществления настоящего изобретения. и такие методы могут быть выбраны из ранее описанных методов вакцинации (\Уо1ГГ е! а1.. Вю!есРшдиек 11:474-85; 1991); (1оРпк!оп апй Тапд. Ме!Ройк Се11 Вю1 43:353-365; 1994); (Уапд апй 8ип. Ν! Мей 1:481-483; 1995); ^ш е! а1.. Сепе ТРег. 3:262-8; 1996); (Ьагкеп е! а1.. 1. У1го1. 72:1704-8; 1998); (8Ра!а апй Нопе. 1. У1го1. 75:9665-9670; 2001); (8Ра!а е! а1.. Уассше 20:623-629; 2001); (Одга е! а1.. 1 У1го1 71:3031-3038; 1997); (Виде е! а1.. 1. УРо1. 71:8531-8541; 1997); (Ве1уакоу е! а1.. №!. Мей. 7. 1320-1326; 2001); (ЬатЬей е! а1.. Уассше 19:3033-3042; 2001); (Капеко е! а1.. У1го1оду 267: 8-16; 2000); (Ве1уакον е! а1.. Ргос №Й Асай 8ш И8А 96:4512-4517; 1999).

Конкретными биологическими эффектами. входящими в объем настоящего изобретения. являются. но не ограничиваются ими. протективные или модулирующие иммунные ответы. терапевтические ответы и ингибирование экспрессии (например. К1РНК) или стимуляция экспрессии (например. экспрессии цитокина) белков хозяина. Сначала гйкВЫ вводят в дозе 10²-10⁹ нуклеокапсидных частиц. и такое введение проводят соответствующим способом. таким как пероральное введение. интраназальное введение. подкожное введение. внутримышечное введение или введение посредством инвазивных бактериальных векторов (81/етоге е! а1.. 8с1епсе. 1995 Ос! 13; 270 (5234):299-302). Число доз варьируется в зависимости от эффективности отдельных гйкВЫ. и могут быть введены одна. две или три дозы с интервалами в 2-4 недели.

Каждая оценка уровня экспрессии включает использование гй&КЫ. не содержащего нужного гена. в качестве негативного контроля. и использование вакцинного ДНК-вектора. кодирующего нужный ген. в качестве позитивного контроля.

Методы измерения биологических эффектов экспрессии гена. содержащегося в гйкВЫ. в биологических системах. хорошо известны специалистам в данной области. Так. например. для определения уровней сывороточных 1дС- и 1дА-ответов на др120. сыворотку собирали до вакцинации и через 10. 20. 30. 40. 50. 60. 70 и 80 дней после вакцинации. Примерно 400-500 мкл крови брали из хвостовой вены каждой мыши и собирали в отдельные пробирки. а затем кровь инкубировали в течение 4 ч на льду для ее свертывания. После центрифугирования в микроцентрифуге в течение 5 мин. сыворотку переносили в свежие пробирки и хранили при -80°С. Уровни 1дС- и 1дА-ответов на антигены в слизистой. экспрессируемые нужными генами. определяли с использованием фекальных гранул и вагинальных промывок. которые собирали до вакцинации и через определенные интервалы времени после вакцинации (8пштакап е! а1.. В1о1. Вергой. 53: 462; 1995); (8!аа!к е! а1.. 1. 1ттипо1. 157: 462; 1996). Для количественной оценки 1дС- и 1дА-ответов на др120 в пробах сыворотки и в образцах слизистой проводили стандартные ЕЬ18А (АЬасюд1и е! а1.. ΛΙΌ8 Век. Нит. Вейотй. 10: 371; 1994); (Ршсик е! а1.. ΛΙΌ8 Век. Нит. Вейотй. 12: 1041; 1996). В каждый ЕЫ8А-анализ в качестве антигена негативного контроля может быть включен овальбумин. Кроме того. каждый ЕЬ18А-анализ может включать сыворотку. используемую в качестве позитивного контроля. фекальные гранулы или образец вагинальной промывки. если это необходимо. Образцы для позитивного контроля брали у животных. интраназально вакцинированных 10 мкг антигена. экспрессируемого нужным геном. вместе с 10 мкг холерного токсина. как описано в литературе (Уашато!о е! а1.. Ргос. №111. Асай. 8сг 94: 52 67; 1997). Титр в конечной точке вычисляли как обратную величину последнего серийного разведения. которое продуцирует увеличение оптической плотности при 490 нм до значения. превышающего среднее значение. полученное для ряда лунок негативного контроля. плюс три величины стандартной ошибки.

Для оценки клеточного иммунитета клеточные суспензии обогащенных СЭ4'- и СЭ 8'-Т-клеток лимфоидной ткани использовали для измерения антигенспецифических Т-клеточных ответов с помощью

- 19 011282 цитокин-специфического анализа ЕЫ8РОТ (№и е! а1., ΑΙΌ8 Вез. Нит. Ее1гоуй. 13:1187; 1997). Этот анализ позволяет определять число антигенспецифических Т-клеток, которые секретируют 1Ь-2, 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-6, 1Ь-10 и ΙΕΝ-γ. Все анализы ЕЫ8РОТ проводили с использованием коммерчески доступных тАЬ для захвата и детекции (Β&Ό 8уз!етз апб РНагттдеп), как описано в литературе (№и е! а1., 1пГес!. 1ттип. 63:4933; 1995) и как применялось ранее (Хи-Атагю е! а1., I Ехр. Μеб. 178:1309; 1993); (ОкайазЫ е! а1., 1пГес!. 1ттип. 64: 1516; 1996). В каждом анализе, в качестве контроля использовали митоген (Соп А) и овальбумин.

6. Использование бактериальных векторов, несущих гбзВ№, для индуцирования иммунного ответа или для продуцирования биологического эффекта в клетках- или тканях-мишенях.

Доставка гбзВ№ в эукариотические клетки-, ткани- или организмы-мишени и экспрессия кодируемых последовательностей в этих клетках, тканях или организмах могут быть осуществлены путем инокуляции нуклеокапсидами гбзВ№, присутствующими в непатогенном или в аттенюированном бактериальном вакцинном векторе. Представляющими интерес биологическими ответами являются, но не ограничиваются ими, протективные или модулирующие иммунные ответы, терапевтические ответы и ингибирование экспрессии (например, з1РНК) или индуцирование экспрессии (например, экспрессии цитокинов) белков хозяина.

Выбор бактериальных штаммов, из которых может быть получен бактериальный вакцинный вектор согласно изобретению, не имеет решающего значения для осуществления настоящего изобретения, и такими штаммами являются, но не ограничиваются ими, СатруЫЬаЫег зрр, №е1ззепа зрр., Наетοрй^1из зрр, Аегоптопаз зрр, Егапс1зе11а зрр, Уегзйиа зрр, К1еЬз1е11а зрр, Βο^Ή1ι зрр, Ьедюпейа зрр, С.огупеЬас1егшт зрр, СйгоЬас!ег зрр, Сй1атуб1а зрр, Вгисе11а зрр, Ρзеибοтοηаз зрр, Ней^Ьа^ег зрр или νίόπο зрр.

Выбор конкретного штамма СатрукЬасВг для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов СатруЫЬаЫег, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются, но не ограничиваются ими, С. _)е_)иш (АТСС Νο8. 43436, 43437, 43438), С. Ηуο^η!ез!^ηа1^з (АТСС Νο. 35217), С. Ге!из (АТСС Νο. 19438) С. Гесайз (АТСС Νο. 33709) С. бοу1е^ (АТСС Νο. 49349) и С. οο1ΐ (АТСС Νοϋ. 33559, 43133).

Выбор конкретного штамма Уегзйиа для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Уегз1ша, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются Υ. е^его^НШа (АТСС Νο. 9610) или Υ. резйз (АТСС Νο. 19428), Υе03-В2 Υ. еп!егоссШса (а1-Непбу е! а1., 1пГес!. 1ттип., 60:870; 1992) или агаА Υ. е^его^НШа (ΌΎ-ιοπι е! а1., Μκτο. Ра!й., 9:105; 1990).

Выбор конкретного штамма К1еЬз1е11а для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов К1еЬз1е11а, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются К. рпеипюшае (АТСС Νο. 13884).

Выбор конкретного штамма Βο^ΒΉ для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Βο^бе!е11а, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются В. рейизз1з и В. ЬгопсЫзерйса (АТСС Νο. 19395).

Выбор конкретного штамма №1ззепа для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов №1ззепа, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются Ν. тешпдй1б1з (АТСС Νο. 13077) и Ν. дοηο^^Ηοеае (АТСС Νο. 19424), ага-мутант Μ811 Ν. дοηο^^Ηοеае (СйатЬейат е! а1., Μκτο. Ра!й., 15:51-63; 1993).

Выбор конкретного штамма Аегонюпаз для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Аегонющ^, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются А. за^псаба (АТСС Νο. 33658), А. зсНиЬеги (АТСС Νο. 43700), А. Нубгорййа, А. еис^еηοрй^1а (АТСС Νο. 23309).

Выбор конкретного штамма Егапазе11а для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Егапазе11а, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются Е. !и1агепз1з (АТСС Νο. 15482).

Выбор конкретного штамма Сο^νηеЬас!е^^ит для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Сο^νηеЬас!е^^ит, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются С. рзеибο!иЬе^си1οз^з (АТСС Νο. 19410).

Выбор конкретного штамма СйгоЬас!ег для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов СйгоЬас!ег, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются С. Ггеипби (АТСС Νο. 8090).

Выбор конкретного штамма Сй1атуб1а для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Сй1атуб1а, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются С. рпеипюшае (АТСС Νο. νΒ1310).

Выбор конкретного штамма Наетοрй^1из для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Наетοрй^1из, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются Н. шПиепхае (Ьее е! а1., см. выше) и Н. зοтηиз (АТСС Νο. 43625).

Выбор конкретного штамма Вгисе11а для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Вгисе11а, которые могут быть использованы в настоящем изо

- 20 011282 бретении, являются В. аЬойик ^ТСС Но. 23448).

Выбор конкретного штамма Ьедюиейа для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Ьедюие11а, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются Ь. риеиторМа ^ТСС Но. 33156) или пир-мутант Ь. риеиторМа (Ой, ЕЕМ8 Μίсго. Ясу., 14:161; 1994).

Выбор конкретного штамма Ркеиботоиак для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Ркеиботоиак, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются Р. аегидшока ^ТСС Но. 23267).

Выбор конкретного штамма Не11соЬас!ег для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Не11соЬас!ег, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются Н. ру1оп ^ТСС Но. 43504), Н. тпк1е1ае ^ТСС Но. 43772).

Выбор конкретного штамма У1Ьгю для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов У1Ьгю, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются У1Ьгю с1ю1егае (АТСС Но. 14035), У1Ьгю с^ис^иηа!^еи8^к (АТСС Но. 35912), вирулентный мутант Я8I V. с1ю1егае (Тау1ог е! а1., 1. Мес1. Όίκ., 170:1518-1523; 1994) и ^Α-, асе-, /о!-, сер-мутанты V. с1ю1егае (\Уа1бог е! а1., Мес1. Όίκ.,170:278-283; 1994).

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, бактериальными штаммами, от которых происходит бактериальный вакцинный вектор согласно изобретению, являются аттенюированные производные описанных ранее бактерий, которые могут служить в качестве вакцинных векторов, такие как Еи!егоЬас!ег1асеае, включая, но не ограничиваясь ими, ЕксНепсЫа крр, 8Ыде11а крр и 8а1тоие11а крр. Грамположительные и кислотоустойчивые упаковывающие и векторные штаммы могут быть аналогичным образом сконструированы из Ык1епа тоиосу!одеиек или МусоЬас!егшт крр.

Выбор конкретного штамма ЕксНепсЫа для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов ЕксНепсЫа. которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются штаммы ИН5а, НВ 101, Н8-4, 4608-58, 1184-68, 53638-С-17, 13-80 и 6-81 ЕксНепсЫа сой (8атЬгоок е! а1., см. выше; 2001) (8аикоие!й е! а1., Αηη. М1сгоЪю1. (МЕ Рак!еиг), 132Α:351; 1982), энтеротоксигенная Е.сой (Еуаик е! а1., МесЕ Iттии., 12:656; 1975), энтеропатогенная Е.соН (ЭоииеиЬегд е! а1., ί. МесЕ Όίκ., 169:831; 1994) и энтерогеморрагическая Е.сой (МсКее аиб О'Вгки, МесЕ Мтии., 63:2070; 1995).

Выбор конкретного штамма 8а1тоие11а для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов 8а1тоие11а, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются 8. 1ур1н (АТСС Но. 7251), 8. (урНшшппт (АТСС Но. 13311), 8а1тоие11а дайиагит (АТСС Но. 9184), 8а1тоие11а еи!ег1бй1к (АТСС Но. 4 931) и 8а1тоие11а (урНшшппт (АТСС Но. 6994), двойной агоС-, агоИ-мутант 8. 1ур1н (см., например, Ноие е! а1., Уасс, 9:810-816; 1991), агсА-мутант 8. (урНшшппт (Макйоеш е! а1., Мкго. Ра!1о1., 13:477-491; 1992).

Выбор конкретного штамма 8Ыде11а для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов 8Ыде11а, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются 8Ыде11а Пехиеп (АТСС Но. 29903), СУЭ1203 8Ыде11а Пехиеп (Нопеда е! а1., МесЕ Iттии. 62:5168; 1994), 15Ό 8Ыде11а Пехиеп (Уесшо е! а1., 1. Мтиио1. Ьей. 82:197; 2002), 8Ыде11а когте! (АТСС Но. 29930) и 8Ыде11а букеикйае (АТСС Но. 13313).

Выбор конкретного штамма МусоЬас!егшт для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов МусоЬас!егшт, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются штамм СЭС1551 М. !иЬегси1ок1к (СйЕГйй е! а1., Αт. ί. Яекрй. Сгй. Саге Меб. Αιΐβ; 152(2):808; 1995), штамм Бейджинга М. ТиЬегси1ок1к (8оо11идеи е! а1., 1995), штамм Н37Яу (АТСС # 25618), ауксотрофный по пантотенату штамм М. ТиЬегси1ок1к (8атЬаηбати^ίйу, На!. Меб. 2002 8(10):1171; 2002), гроУ-мутантный штамм М. !иЬегси1ок1к (СоШик е! а1., Ргос. НаЙ. Αсаб. 8сЕ υ8Α. 92(17):8036; 1995), ауксотрофный по лейцину штамм М. !иЬегси1ок1к (Ноиба1ик е! а1., МесЕ Бишип. 68(5):2888; 2000), ВСС штамм Дания (ДТОС # 35733), ВСС штамм Япония (ДТОС # 35737), ВСС штамм Чикаго (АТСС # 27289), ВСС штамм Копенгаген (АТСС # 27290), ВСС штамм Пастер (АТСС # 35734), ВСС штамм С1ахо (АТСС # 35741), ВСС штамм Коннахт (АТСС # 35745), ВСС штамм Монреаль (АТСС # 35746).

Выбор конкретного штамма Ь1к!ег1а тоиосу!одеиек для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Ь1к!ег1а тоиосу!одеиек, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются штамм 104038 Ь. тоиосу!одеиек (например, 8!еуеик е! а1., ί. У1го1 78:8210-8218; 2004) или мутантные штаммы Ь. тоиосу!одеиек, такие как (ί) двойной ас^-ркВмутант (Ре!егк е! а1., ЕЕМ8 Iшшиио1оду аиб Мебка1 МкгоЬюкду 35: 243-253; 2003); ^^е^оронк^ е! а1., Мес! аиб Iшшишίу 70: 3592-3601; 2002); (й) двойной ба1-ба!-мутант гена аланин-рацемазы и гена (Όаминокислота)-аминотрансферазы (Тйотркои е! а1., Мес! аиб МтиМу 66: 3552-3561; 1998).

Методы аттенюирования Е.сой, 8а1тоие11а, МусоЬаскйа, 8Ыде11а и Ь1к!епа не имеют решающего значения для осуществления в данной области настоящего изобретения и хорошо известны специалистам в данной области (Еуаик е! а1., см. выше, 1975); (Нопеда е! а1., см. выше, 1994); (Ноие е! а1., см. выше, 1991).

- 21 011282

После отбора непатогенных или аттенюированных бактериальных штаммов, содержащих вакцинный вектор, каждый штамм модифицировали так, чтобы он служил в качестве гб&РЫ-упаковывающего штамма. Такая процедура может быть осуществлена в соответствии со стратегиями, которые подробно описаны выше и которые позволяют вводить последовательности сегмента-Ь, экспрессирующие бкРБпрокапсиды в каждом штамме, и вводить мутацию для отбора и сохранения нуклеокапсидов гб&РЫ, экспрессирующих функциональный ген, комплементирующий дефицит, создаваемый такой мутацией в указанном штамме.

Для генерирования штаммов, упаковывающих и стабильно поддерживающих нужный гб&РЫ, синтезированный ίη νίίτο рекомбинантный сегмент РНК вводили в упаковывающие штаммы путем электропорации и трансформанты выделяли на твердой среде в условиях, которые обеспечивали рост лишь тех штаммов, которые содержат и экспрессируют аллель позитивного отбора в рекомбинантном сегменте (например, на соевом агаре с трипсином, который обеспечивает рост только акб- и тий-мутантов, если ген дикого типа комплементирует такой геномный дефект, Όίίεο, Пе!го1!, ΜΙ, Са!. Νο. 244520). Все методы продуцирования гб&РНК-сегментов, методы синтеза ίη νί!το мРНК и методы электропорации описаны выше. Для подтверждения того, что данные изоляты содержат представляющий интерес гб^РИ отдельные изоляты культивировали в жидкой среде (например, Т8, Όίεο, Пе!гой, ΜΙ, Са!. Νο. 244620) и из указанных культур выделяли нуклеокапсиды методами, описанными в литературе и хорошо известными специалистам в данной области (^^еЬ е! а1., см. выше, 1990); (8ип е! а1., см. выше, 2003). бкРНК выделяли из нуклеокапсидов с использованием коммерчески доступных наборов для экстракции РНК и скринировали с помощью ОТ-ПЦР с использованием праймеров, амплифицирующих определенные фрагменты в рекомбинантных сегментах, включая, но не ограничиваясь ими, ПЦР-праймеры, амплифицирующие аллель позитивного отбора, ГРЕ8 и представляющий интерес ген, как подробно обсуждается выше. Позитивный клон определяли как клон, который обнаруживает соответствующий ОТ-ПЦР-профиль, указывающий на то, что сегмент гбкРНК стабильно сохраняется в указанном штамме. ОТ-ПЦР-продукты могут быть также оценены в соответствии со стандартными процедурами секвенирования ДНК, описанными ниже.

Конкретные условия культивирования штаммов, содержащих бактериальный вакцинный вектор и включающих стабильные гб^РИ не имеют решающего значения для осуществления настоящего изобретения. В иллюстративных целях, указанные мутанты могут быть культивированы в жидкой среде, такой как среда ЬВ (Όίίοο, Пе!гой, ΜΙ, Са!. Νο. 244620), питательный бульон (Όίίυο, Пе!гой, ΜΙ, Са!. Νο. 233000) или соевый бульон с трипсином (Όίίεο, Пе!гой, ΜΙ, Са!. Νο. 211822), в соответствии со стандартными условиями культивирования, которые являются подходящими для роста бактериальных штаммов (^Ш11ег, см. выше, 1991). В качестве альтернативы, бактерии могут быть культивированы на твердой среде, такой как питательный агар (Όίίοο, Пе!гой, ΜΙ, Са!. Νο. 212000), соевый агар с трипсином (Όίίοο, Эе!γοϊ!, ΜΙ, Са!. Νο. 236920) или минимальный агар М9 (Όίίοο, Пе!гой, ΜΙ, Са!. Νο. 248510).

Штаммы ΜусοЬас!е^^ит, содержащие вакцинные векторы, культивировали в жидкой среде, такой как среда Миддлбрука 7Н9 (Όίίεο, Пе!гой, ΜΙ, Са!. Νο. 271310) или синтетическая среда Солтон, предпочтительно при 37°С. Эти штаммы могут храниться в виде стационарной или перемешиваемой культуры. Кроме того, скорость роста Μ\Όο^κ^πι.ιιη может быть увеличена путем добавления олеиновой кислоты (0,06% об./об.; РекеагсН ^^адηο8ί^С8 Са!. Νο. 01257) и детергентов, таких как тилоксапол (0,05% об./об.; РекеагсН ^^адηο8ί^С8 Са!. Νο.70400). Чистота культур ΜусοЬас!е^^ит может быть оценена путем равномерного посева 100 мкл аликвот культуры ΜусοЬас!е^^ит, серийно разведенной (например, 10кратно разведенной чистой культуры (№а!) - 10^-8) в забуференном фосфатом физиологическом растворе (далее обозначаемом ΡΒ8), на 3,5-дюймовых планшетах, содержащих 25-30 мл твердой среды, такой как среда 7Н10 Миддлбрука (ΒΌ ΜκτοΜο1ο^, Сοскеуе8ν^11е, ΜΌ, Са!. Νο. 221174).

Количество бактериального вакцинного вектора, вводимого с гб^РН согласно изобретению, может варьироваться в зависимости от вида индивидуума, а также от заболевания или состояния, подвергаемого лечению. Обычно, используемые дозы составляют примерно 10³-10¹¹ жизнеспособных микроорганизмов, а предпочтительно, примерно 10³-10⁹ жизнеспособных микроорганизмов.

Бактериальный вектор, содержащий гб&РИ обычно вводят в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. Выбор какого-либо конкретного фармацевтически приемлемого носителя или разбавителя не имеет решающего значения для осуществления настоящего изобретения. Примерами разбавителей являются забуференный фосфатом физиологический раствор, буфер для забуферивания против действия кислоты желудочного сока, образующегося в желудке, такой как цитратный буфер (рН 7,0), содержащий сахарозу; отдельно взятый бикарбонатный буфер (рН 7,0) (Ьеуте е! а1., ί. С1ш. ΙηνΌδΙ., 79: 888-902; 1987); (В1аск е! а1., 1. ИтГес!. Όίδ., 155:1260-1265; 1987) или бикарбонатный буфер (рН 7,0), содержащий аскорбиновую кислоту, лактозу и, необязательно, аспартам (Ьеуте е! а1., Еансе!, ΙΙ: 467-470; 1988). Примерами носителей являются белки, например, содержащиеся в сепарированном молоке, сахара, например, сахароза или поливинилпирролидон. Обычно эти носители используются в концентрации, составляющей примерно 0,1-90% (мас./об.), а предпочтительно в пределах 1-10% (мас./об.).

Биологическую активность векторных штаммов оценивали у соответствующего животного-модели

- 22 011282 (например, у мышей ВАТ8/с1, кроликов, морских свинок или макак-резусов). Сначала гбзК№векторые штаммы вводили в дозах 10²-10⁹ к.о.е. соответствующим способом (например, Е.соб, 8а1топе11а и 8б1де11а могут быть введены внутрижелудочно или интраназально, а гВСО-векторы вводят подкожно). Число доз может варьироваться в зависимости от эффективности отдельного векторного штамма и валентности представляющего интерес кодируемого рекомбинантного продукта.

Методы измерения уровней иммунных и других биологических ответов на продукты, кодируемые ΜδΕΝ, хорошо известны специалистам в данной области. Для определения уровней сывороточных 1дО- и 1дА-ответов на др120 сыворотку собирали до вакцинации и через 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 и 80 дней после вакцинации. Примерно 400-500 мкл крови брали из хвостовой вены каждой мыши и собирали в отдельные пробирки, а затем кровь инкубировали в течение 4 ч на льду для ее свертывания. После центрифугирования в микроцентрифуге в течение 5 мин, сыворотку переносили в свежие пробирки и хранили при 80°С. Уровни 1дО- и 1дА-ответов на антигены в слизистой, экспрессируемые нужными генами, определяли с использованием фекальных гранул и вагинальных промывок, которые собирали до вакцинации и через определенные интервалы времени после вакцинации (8пшуазап е! а1., Вю1. Кергоб. 53: 462; 1995); (8!аа!з е! а1., I. 1ттипо1. 157: 462; 1996). Для количественной оценки 1дО- и 1дА-ответов на др120 в пробах сыворотки и в образцах слизистой проводили стандартные ЕЫ8А (АЬасюд1ц е! а1., АЮ8 Кез. Нит. Ке1гоу1г. 10: 371; 1994); (Ртсиз е! а1., АЮ8 Кез. Нит. Ке1гоу1г. 12: 1041; 1996). В каждый ЕЫ8А-анализ, в качестве антигена негативного контроля может быть включен овальбумин. Кроме того, каждый ЕЫ8Аанализ может включать сыворотку, используемую в качестве позитивного контроля, фекальные гранулы или образец вагинальной промывки, если это необходимо. Образцы позитивного контроля брали у животных, интраназально вакцинированных 10 мкг антигена, экспрессируемого нужным геном, вместе с 10 мкг холерного токсина, как описано в литературе (Уатато1о е! а1., Ргос. №1!1. Асаб. 8сг 94: 5267; 1997). Титры в конечной точке вычисляли как обратную величину последнего серийного разведения, которое продуцировало увеличение оптической плотности при 490 нм до значения, превышающего среднее значение, полученное для ряда лунок негативного контроля, плюс три величины стандартной ошибки.

Клеточный иммунитет может быть измерен путем окрашивания внутриклеточных цитокинов (также называемого цитометрией внутриклеточных цитокинов) или с помощью ЕЬ18РОТ (Ее!зсб А. е! а1., Ме!бобз 31:143-49; 2003). Оба эти метода позволяют количественно оценивать антигенспецифические иммунные ответы, хотя для фенотипической характеризации антигенспецифических СЭ4'- и СЭ8'-Тклеток может быть также одновременно использована импульсная система 1С8. С помощью таких анализов можно определять число антигенспецифических Т-клеток, секретирующих 1Ь-2, 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-6, 1Ь10 и ΙΕΝ-γ (№и е! а1., АЮ8 Кез. Нит. Ке!гоу1г. 13:1187; 1997). Анализы ЕЫ8РОТ проводили с использованием коммерчески доступных тАЬ для захвата и детекции (К&И 8уз!етз апб Рбагттдеп), как описано в литературе (№и е! а1., 1пГес!. 1ттип. 63:4933; 1995) и как применялось ранее (Хи-Атапо е! а1., I. Ехр. Меб. 178:1309; 1993); (ОкабазЫ е! а1., 1пГес!. 1ттип. 64: 1516; 1996). В каждом анализе использовали митоген (Соп А) и овальбумин в качестве контроля.

7. Методы рекомбинантных ДНК.

Методы рекомбинантных ДНК, применяемые для конструирования упаковывающих штаммов, бактериальных векторов и гбзКК включают, но не ограничиваются ими, ПЦР, гидролиз рестриктирующей эндонуклеазой (обозначаемой далее КЕ), лигирование ДНК, электрофорез в агарозном геле, очистка ДНК и дидезокси-секвенирование, описанные в литературе (МШег, А 8бог! Соигзе ш Вас!епа1 Сепе!1сз, Со1б 8ргтд НагЬог ЬаЬога!огу Ргезз, Со1б 8ргтд НагЬог, ΝΥ; 1992); (Во!б^е11 е! а1., см. выше); (АизиЬе1 е! а1., см. выше), опосредуемую бактериофагом трансдукцию (бе Воег, см. выше); (МШег, см. выше, 1992) и (АизиЬе1 е! а1., см. выше) или химические методы (Во!б\ге11 е! а1., см. выше); (АизиЬе1 е! а1., см. выше); (Ее1дпег е! а1., см. выше); и (Еагбооб, см. выше), электропорацию (Во!б\ге11 е! а1., см. выше); (АизиЬе1 е! а1., см, выше); (8атЬгоок, Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога1огу Мапиа1, Со1б 8ргтд НагЬог ЬаЬога1огу Ргезз, Со1б 8ргтд НагЬог, ΝΥ; 1992) и методы физической трансформации ДобпзЮп е! а1., см. выше); (Во!б\ге11 е! а1., см. выше). Гены могут быть введены в фаг (бе Воег е! а1., Се11, 56:641-649; 1989), в плазмидные векторы (Сигбзз е! а1., см. выше), или они могут быть сплайсированы в хромосому нужного штамма (Нопе е! а1., см. выше).

Генные последовательности могут быть синтезированы на ДНК-синтезаторе Аррбеб Вюзуз!етз АВ1™ 3900 Н1дб-Тбгоидбри1 ^NΑ 8уп!без1/ег (Роз!ег Сбу, СА 94404 И.8.А.) в соответствии с инструкциями производителей. Для синтеза крупных последовательностей, т. е. составляющих более чем 200 п.н., с помощью ПЦР генерировали серии сегментов полноразмерной последовательности и эти сегменты лигировали с получением полноразмерной последовательности в соответствии с процедурами, хорошо известными специалистам в данной области. Однако, менее крупные последовательности, т. е. составляющие менее чем 200 п.н., могут быть синтезированы за один раунд на ДНК-синтезаторе Аррбеб Вюзуз!етз АВ1™ 3900 Н1дб-Тбгоидбри1 ^NΑ 8уп!без1/ег (Роз!ег Сбу, СА) в соответствии с инструкциями производителя.

Рекомбинантные плазмиды вводили в бактериальные штаммы путем электропорации с использованием импульсного устройства ВюКаб Оепе-Ри1зег® при 200 Ом, 25 мкФ и 2,5 кВ (ВюКаб ЬаЬогаФпез,

- 23 011282

Негси1ек, СА) [38]. Секвенирование нуклеотидов для подтверждения последовательностей кДНК осуществляли стандартными методами автоматического секвенирования (на автоматическом секвенаторе Арркеб Вюкук!етк, тобе1 373А). ДНК-праймеры для секвенирования ДНК и для проведения полимеразной цепной реакции (далее обозначаемой ПЦР) синтезировали на ДНК-синтезаторе Аррйеб Вюкук!етк АВ1™ 3900 Н1дй-Тйгоидйри! ΌΝΛ 8уп111ек1/ег (Рок!ег Сйу, СА 94404).

Нижеследующие примеры приводятся лишь в целях иллюстрации настоящего изобретения и не должны рассматриваться как ограничение его осуществления.

Примеры

Пример 1. Методы рекомбинантных ДНК.

Рестриктирующие эндонуклеазы (обозначаемые здесь КЕ); (№\у Епд1апб Вю1аЬк, Веνе^1у, МА), ДНК-лигазу Т4 (№\у Епд1апб Вю1аЬк, Веνе^1у, МА) и полимеразу Тад (Ьйе Тесйпо1од1ек, ОаййегкЬигд, МО) использовали в соответствии с инструкциями производителей; плазмидную ДНК получали с использованием наборов для лабораторной (набор О|адеп М1шргер^К, 8ап!а С1агйа, СА) или крупномасштабной (набор О|адеп М1б1ргер^К, 8ап!а С1ап!а, СА) очистки плазмидной ДНК в соответствии с инструкциями производителей О^щеп, 8ап1а С1агйа, СА); деионизованную воду с биологической чистотой, не содержащую нуклеазы, Трис-НС1 (рН 7,5), ЕОТА рН 8,0; 1М МдС1₂, 100% (об./об.) этанол, сверхчистую агарозу и буфер для электрофореза на агарозном геле закупали у Ьйе Тесйпо1од1ек, ОаййегкЬигд, МО. Реакции КЕ-гидролиза, ПЦР, ДНК-лигирования и электрофорез на агарозном геле проводили в соответствии с хорошо известными процедурами (8атЬгоок е! а1., см. выше, 1989); (АикиЬе1 е! а1., см. выше, 1990). Нуклеотидное секвенирование для подтверждения последовательности ДНК каждой рекомбинантной плазмиды, описанной в нижеследующих примерах, осуществляли стандартными методами секвенирования ДНК на автоматическом секвенаторе АррНеб Вюкук!етк, модель 373 А).

ПЦР-праймеры закупали у фирмы 1п1едга1еб ΟΝΛ Тес1то1од1ек (СогаМ11е, 1А) или в биополимерной лаборатории Мэрилендского Университета (ВаШтоге, МО) и синтезировали на синтезаторе ДНК АррНеб ВюкукЮтк (модель 373А). ПЦР-праймеры использовали при концентрации 200 мкМ и температуру отжига для проведения ПЦР-реакций определяли с помощью компьютерной программы С1опе Мападег®, версия 4.1 (8с1епййс апб ЕбисаНопа1 8оП\уаге 1пс., ОигНат, ΝΟ) или компьютерной программы для анализа праймеров ОЫ6О 4.0. ПЦР проводили в термоячейке В1о Каб 1Сус1ег, (Негси1ек, СА). ПЦРпраймеры для амплификации конструировали с помощью компьютерной программы С1опе Мападег®, \'ег№п 4.1 (8с1еп11Пс апб Ебиса!юпа1 8оП\уаге 1пс., ОигНат, ΝΟ) или компьютерной программы для анализа праймеров ОЬЮО 4.0. Указанная программа позволяет конструировать ПЦР-праймеры и идентифицировать КЕ-сайты, которые являются совместимыми со специфическими ДНК-фрагментами, подвергаемыми модификации. ПЦР проводили в термоячейке В1о Каб 1Сус1ег, (Негси1ек, СА) и время отжига, удлинения и денатурации праймеров в ПЦР устанавливали в соответствии со стандартными процедурами (АикиЬе1 е! а1., см. выше). Затем КЕ-гидролизаты и ПЦР-продукты анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле в соответствии со стандартными процедурами (АикиЬе1 е! а1., см. выше, 1990); (8атЬгоок, см. выше). Позитивный клон определяли как клон, имеющий соответствующий КЕпрофиль и/или ПЦР-профиль. Плазмиды, идентифицированные с помощью такой процедуры, могут быть также проанализированы стандартными методами секвенирования ДНК, описанными ниже.

Штаммы Тор10 и ОН5</. ЕксНепсЫа со11 закупали у НгсНгодеп (Саг1кЬаб, СА), а штамм 8С8110 закупали у 81га1адепе (Ьа 1о11а, СА). Эти штаммы служили в качестве хозяев рекомбинантных плазмид, описанных ниже в примерах. Рекомбинантные плазмиды вводили в Е.соН путем электропорации с помощью импульсного устройства Оепе-Ри1кег (ВюКаб ЬаЬога!ог1ек, Негси1ек, СА) при 200 Ом, 25 мкФ и 1,8 кВ или путем химической трансформации, описанной в литературе (АикиЬе1 е! а1., см. выше).

Бактериальные штаммы культивировали на соевом агаре с трипсином (ОНсо, ^еΐ^ο^!, М1) или в соевом бульоне с трипсином (ОНсо, ^еΐ^ο^!, М1), если это не оговорено особо, при соответствующей температуре. В среды, если это необходимо, добавляли 100 мкг/мл ампициллина, 50 мкг/мл канамицина и/или 20 мкг/мл хлорамфеникола (81дта, 81. Ьошк, МО). Бактериальные штаммы, суспендированные в соевом бульоне с трипсином (Ойсо), содержащем 30% (об./об.) глицерина (81дта, 8ΐ Ьошк, МО) при плотности примерно 10⁹ колониеобразующих единиц (далее обозначаемых к.о.е.) на мл, хранили при -80°С.

Список реагентов.

Крп1 (№\у Епд1апб В1о1аЬк, Веνе^1у, МА, Са!. Νϋ8. К01428), РкН (№\у Епд1апб В1о1аЬк, Веνе^1у, МА, Са!. №. К01408), соевый бульон с трипсином (О|Гсо, ^е!^ο^!, М1, Са!. №. 211822), соевый агар с трипсином (Ойсо, ^е!^ο^!, М1, Са!. №. 236920), набор для очистки плазмидной ДНК М1шргер® Оадеп, Уа1епс1а, Са, Са!. №. 27106), глицерин (81дта, 8!. Ьошк, МО, Са!. №. 05516), Нра1 (№\у Епд1апб В1о1аЬк, ВетНу, МА, Са!. №. К01058), телячья кишечная щелочная фосфатаза (№\у Епд1апб Вю1аЬк, Веνе^1у, МА, Са!. №. М02908), ДНК-полимераза Уеп!_К® (№\у Епд1апб В1о1аЬк, Са!. №. М02548), набор для ПЦРочистки О1Ас.|шск (О|адеп, Са!. №. 28106, Уа1епс1а, СА), диаминопимелиновая кислота (81дта-А1бпсИ, 8!. Ьошк, МО, Са!. №. 01377), Вд111 (№\у Епд1апб Вю1аЬк, Веνе^1у, МА, Са! №. К01448), 1РТО (НгсЦгодеп, Саг1кЬаб, СА, Са!. №. 15529-019), реагент для лизиса клеточнной культуры (Рготеда, Мабкоп, VI, Са!. №. Е1531), лизоцим (81дта, 8!. Ьошк, МО, Са!. №. Б6876), фосфат калия (81дта, 8!. Ьошк, МО, Са!.

- 24 011282

№. Р5379), хлорид магния (81дта, 8!. Ьошк, МО, Са!. №. М1028) ЭгаШ (№\ν Епд1апб Вю1аЬк, Веуег1у, МА, Са!. №. К05108), РкП (№\ν Епд1апб Вю1аЬк, Веуег1у, МА, Са!. №. У02798), протеиназа К (АтЫоп, Аикйп, ТХ, Са!. №. 2542-2548), набор для транскрипции ЭигакспЬе Т7 (Ер1сеп!ге, Маб1коп, У1), набор для транскрипции ЭигакспЬе 8Р6 (ЕркепЫе, Маб1коп, У1), набор для транскрипции МЕСАкспр!® Т7 (АтЫоп, Аикйп, ТХ, Са!. №. 1334), набор для транскрипции МЕСАкспр!® 8Р6 (АтЫоп, Аик!ш, ТХ, Са! №. 1330), колонки МЕСАс1еаг (АтЫоп, Аикйп, ТХ, Са! №. 1908), маркер биотинилированной РНК ВпдЫ8!ат МШепЫит (АтЫоп, Аик!ш, ТХ, Са!. №. 7170), найлоновая мембрана ВпдЫ8!аг (АтЫоп, Аик!т, ТХ, Са!. №. 10102), набор для биодетекции ВпдЫ8!ат (АтЫоп, Аикйп, ТХ, Са!. №. 1930), трис-НС1буфер (ОнаШу Вю1одка1, СаййегкЬигд, МО, Са!. №. 351-007-100), хлорид магния (81дта-А1бпсй, 8!. Ьошк, МО, Са!. №. М1787), ацетат аммония (81дта-А1бпск 8!. Ьошк, МО, Са!. №. А2706), хлорид натрия (81дта-А1бпсй, 8!. Ьошк, МО, Са!. №. 87653), хлорид калия (81дта-А1бпсй, 8!. Ьошк, МО, Са!. №. Р3911), дитиотреитол (81дта-А1бпск 8!. Ьошк, МО, Са!. №. Ό9779), ЕЭТА (81дта-А1бпсй, 8!. Ьошк, МО, Са!. №. Е8008), полиэтиленгликоль 4000 (Р1ика, Висйк, 8теЙ7ег1аиб, Са!. №. 95904), ингибитор РНКазы 8ИРЕКаке (АтЫоп, Аикйп, ТХ, са!. № 2694), биотин-14-СТР (1пуйгодеп, Саг1кЬаб, СА, Са!. №. 19519016), рибонуклеаза КЫаке О№ (Рготеда, Маб1коп, У1, Са!. №. М4261).

Пример 2. Конструирование сегментов гбкРНК, которые комплементируют акб-мутацию и экспрессируют флуоресцентные репортеры, антигены МусоЬас!егшт !иЬегси1ок1к и антигены ЬСМУ.

Целью данного исследования является разработка рекомбинантных сегментов, которые могут быть введены в прототип гбкКН полученного на основе генома бкРНК РЫ-8 (Мтбкй е! а1., 1. Вас!епо1, 181: 4505; 1999); (Мшбкй, М1сгоЫо1. Мо1. Вю1. Кеу, 63: 149; 1999); (Ноодк!га!еп е! а1., УиЫоду, 272: 218; 2000); (8ип е! а1., УиЫоду, 308: 354; 2003). Как обсуждалось выше, геном РЫ-8 состоит из трех сегментов: 8, М и Ь. Был сконструирован прототип тбкКЫ, в котором РНК-зависимая РНК-полимераза, кодируемая сегментом-Ь дикого типа (обозначаемым здесь νΐΕ), экспрессировала гены-пассажиры, клонированные в рекомбинантные сегменты-М и -8 (обозначаемые здесь гМ и г8, соответственно). Оба гМ и г8 содержат ген (полуальдегид аспарагиновой кислоты)-дегидрогеназы дикого типа (обозначаемый здесь ''акб,'' СепВапк # У00262), связанный с бактериальным сайтом связывания с рибосомой гена 10 и гена 8, соответственно (см. фиг. 4), и представляющий интерес ген (т.е. кодирующий флуоресцентный белок НсКеб и микобактериальный антиген ТВ8), функционально связанный с 1КЕ8 вируса гепатита С. Примечательно, что структурные гены фага на сегментах-М и -8 не были первоначально введены в гМ или г8, несмотря на то, что аллель акб г8 был заменен геном 8 сегмента-8 дикого типа в более позднем варианте осуществления настоящего изобретения для стабилизации тбкКЫ. Аллель акб и 1КЕ8::НсКеб и М!Ь-антиген-кодирующие последовательности были фланкированы 5'- и 3'-нетранслируемыми последовательностями, кодирующими рас, и последовательностями инициации синтеза минус-цепи РНК, соответственно. Другими словами, репортерные гены на гМ фланкированы 5'-последовательностью рас сегмента-М и 3'-концевой последовательностью сегмента-М. Аналогичным образом, г8 состоит из репортерных генов, фланкированных 5'-последовательностью рас сегмента-8 и 3'-концевой последовательностью генов сегмента-8 (фиг. 5). Следует отметить, что такая конфигурация позволяет продуцировать лишь гбкКН но не фаговые и не гбкКР-частицы.

Конструирование рекомбинантных сегментов осуществляли методами с использованием синтетической ДНК и стандартными методами рекомбинантных ДНК, такими как ПЦР, ОТ-ПЦР, сайтнаправленный мутагенез, гидролиз рестриктирующими ферментами, гель-электрофорез, лигирование, дидезокси-секвенирование и бактериальная трансформация, описанные в примере 1.

Рекомбинантный сегмент-8 (г8) был синтезирован фирмой М1б1апб Сетййеб Кеадеп! Со., (М1б1апб, ТХ). 5'- и 3'-последовательности были получены из копии кДНК сегмента-8 РЫ-8 (любезно предоставленной Ότ. Ьеопатб Мтбкй, номер доступа в СепЬапк АР226853) и имели модификации, описанные ниже. Сегмент г8 (8ЕО ΙΌ NО: 1) в 5№3'-ориентации состоит из указанных ниже гибридных компонентов (фиг. 4), таких как:

(ί) Последовательность рас сегмента 8 и сайт связывания с рибосомой (обозначаемый далее КВ8) гена 8, представляющие собой первые 187 нуклеотидов сегмента-8 (номер доступа в СепЬапк АР226853), необходимые для поглощения прокапсидом (Нсодк!га!еп е! а1., см. выше; 2000). КВ8 необходим для инициации трансляции в прокариотических клетках.

(ίί) Ген акб, функционально присоединенный к вышеуказанному КВ 8 для позитивного отбора в Дакб-штамме Х6212 Е.со11. Последовательность акб была получена из нуклеотидов 240-1343, номер доступа в СепЬапк У00262.

(ΐϊϊ) Внутренний сайт связывания с рибосомой вируса гепатита С для инициации трансляции в эукариотических клетках. Указанная последовательность охватывает нуклеотид 36-341, номер доступа в СепЬапк А242651.

(ίν) Сайт множественного клонирования (МС8) для инсерции гена-пассажира.

(ν) 3'-нетранслируемая область полиаденилирования мРНК г8 вируса лесов Семлики; нуклеотиды 1-261, номер доступа в СепЬапк У01398.

(νί) 3'-концевая последовательность сегмента-8 РЫ-8, т.е. нуклеотиды 3081-3192 сегмента-8 (номер

- 25 011282 доступа в СепЬапк ΑΓ226853), необходимые для обеспечения стабильности РНК и для связывания с полимеразой РЫ-8 перед инициацией синтеза минус-цепи РНК.

Синтетический ДНК-фрагмент, состоящий из вышеуказанных компонентов (8ЕО ΙΌ ХО: 1), присоединяли к Ркб-гидролизованной ДНК рТ7/Т3-18 (Са!. Хо. 7201, ΑтЬ^оη, Αикбп, ТХ) с использованием ДНК-лигазы Т4, как описано в примере 1. После лигирования, ДНК встраивали в штамм ЭН5а-Е Е.соб (1пубгодеп, Саг1кЬаб, СΑ, Са!. Хо. 11319-019) путем электропорации (пример 1) и трансформанты выделяли путем культивирования на среде Τ8Α с добавлением ампициллина (100 мкг/мл) при 37°С в течение 1б-24 ч. Продукты, полученные в результате успешного лигирования, идентифицировали путем выделения суперспирализованной ДНК из 2 мл культур, которые инокулировали уколочным введением полученных одиночных колоний с помощью стерильной зубочистки и помещения этой зубочистки в стерильную среду Т8В с добавлением ампициллина (100 мкг/мл); а затем эти культуры инкубировали при перемешивании (200 об/мин) при 37°С в течение 16-24 ч. После центрифугирования жидкий супернатант отбрасывали, и бактериальный осадок ресуспендировали в 100 мкл раствора Р1, поставляемого в наборе для очистки плазмидной ДНК М1шргер® (Р1адеп, Уа1епс1а, СΑ, Са!. Хо. 27106). Затем плазмидную ДНК экстрагировали и очищали в соответствии с инструкциями производителя (см. руководство Р1адеп, Уа1епс1а, СΑ, Са!. по. 27106). Очищенную плазмидную ДНК расщепляли рестриктирующей эндонуклеазой РкП (Хете Епд1апб В1с1аЬк, Веуег1у, МΑ, Са! по. К01408) в соответствии с инструкциями производителя и с использованием буферов, поставляемых производителем, а затем инкубировали при 37°С в течение 1 ч. Полученные ДНК-фрагменты фракционировали с помощью электрофореза в агарозном геле, как описано выше (см. пример 1), и плазмиды, обнаруживающие соответствующую картину, дополнительно охарактеризовывали путем секвенирования дидезокси-методом (пример 1). Эта процедура позволяла идентифицировать четыре независимых изолята, которые содержали плазмиду рТ7/Т3-18, несущую ДНК, кодирующую г8. Плазмиды в этих изолятах были обозначены ΑΓ1 и четыре изолята, содержащих эту плазмиду, высевали штрихом на среду ΠΑ с добавлением ампициллина (100 мкг/мл) и инкубировали при 37°С в течение 16-24 ч. Затем бактерии собирали с помощью стерильного ватного тампона (Рипит СибГогб, МЕ, Са!. Хо. 25-8061ШС) и суспендировали в среде Т8В, содержащей 30% (об./об.) глицерина (81дта, 8!. Ьошк, МО, Са!. Хо. С5516) при плотности примерно 10⁹ к.о.е./мл, а затем хранили в 1 мл-аликвотах при 80°С.

Второй г8 (г82) конструировали путем ПЦР-амплификации 1-1294 п.н. последовательности сегмента-8 РЫ-8 дикого типа (номер доступа в СепЬапк ΑΓ226853), связанной посредством Вд111-сайта с последовательностью 1КЕ8 вируса гепатита С и к расположенной ниже последовательности г8 (1301-2020 п.н.), как описано выше (г82, 8ЕО ΙΌ ХО: 3). Эту конструкцию лигировали в Ркб-сайт рТ7Т3-18 и трансформировали в Тор10 Е.соб. Трансформанты анализировали, как описано выше, и шесть подходящих изолятов обозначали ρΑΡ182.

Рекомбинантный сегмент-М (гМ, 8ЕО ΙΌ ХО: 2) был аналогичен г8, за исключением того, что 5'-рас и 3'-концевые последовательности были получены из сегмента-М дикого типа, из нуклеотидов 1-2б2 и 4677-4741, соответственно, номер доступа в СепЬапк ΑΕ226852. Таким образом, подобно г8, гМ состоит из экзогенных последовательностей, фланкированных 5'-рас и 3'-концевой последовательностью РЫ-8 (см. фиг. 4). 2060 п.н. сегмента гМ (8ЕО ΙΌ ХО: 2) клонировали в Крп1- и Рк!1-сайты (Хете Епд1апб Вю1аЬк, Веуег1у, МΑ, Са!. Хок. К01428 и К01408, соответственно) плазмиды рс^ΧΑ3.1_ζео(+) (1пубгодеп, Са!. Хо. У860-20, Саг1кЬаб, СΑ). Рекомбинантные плазмиды, содержащие соответствующие вставки, идентифицировали в соответствии с процедурой, применяемой для получения г8, и новую плазмиду обозначали ρΑΡ19.

Для конструирования эукариотического экспрессионного кластера, ρΑΡ1 расщепляли ферментами Нра1 и Хо!1 (Хете Епд1апб Вю1аЬк, Веуег1у, МΑ, Са!. Хо. К01058). Это КЕ-расщепление приводило к введению сайта направленного клонирования в МС8, в результате чего, после лигирования, ген Нс-Кеб и упаковка микобактериального антигена были локализованы непосредственно ниже 1КЕ8 НСУ и были функционально связаны с этой 1КЕ8. После расщепления концы линеаризованной плазмиды дефосфорилировали кишечной щелочной фосфатазой теленка (Хете Епд1апб Вю1аЬк, Веуег1у, МΑ, Са!. Хо. М02908) для предотвращения рециркуляризации. Затем дефосфорилированную плазмиму очищали с помощью электрофореза в 0,8% агарозном геле с последующей гель-экстракцией.

Гибридную последовательность размером 2,0 т.п.н., содержащую микобактериальный антиген (ТВ8), подвергали ПЦР-амплификации из плазмиды ρΑбΑρ!35.Вки.ТВ. 8 (Сгисе11) с использованием ДНК-полимеразы Αссиρ^^те (1пуйгодеп, Саг1кЬаб, СΑ) и праймеров, включающих сайты рестриктирующих эндонуклеаз (КЕ) Нра1 и Хоб. Размер амплифицированной последовательности подтверждали путем электрофореза в агарозном геле и эту последовательность очищали с использованием набора для ПЦРочистки р^цшск в соответствии с инструкциями производителя (Р1адеп, Са!. Хо. 28106, Уа1епс1а, СΑ).

Фрагмент, кодирующий ТВ8, лигировали с дефосфорилированной ρΑΡ1 с использованием ДНКлигазы Т4 (Хете Епд1апб Вю1аЬк, Са!. Хо. М02028) и полученную плазмиду обозначали р8ТВ2.

Антигенсодержащую гибридную последовательность ТВ8 и НС-Кеб-кодирующую последовательность аналогичным образом встраивали в Нра1-сайт в гМ, присутствующем на ρΑΡ19 (фиг. 4) в соответ

- 26 011282 ствии с техникой рекомбинантных ДНК, как описано выше. Полученные плазмиды обозначали рМТВ7 и рМНс-Кеб.

Плазмиды р8ТВ2 и рЬМ2775 (кодирующие сегмент-8 дикого типа) линеаризовали рестриктирующими ферментами 8рЫ и Ркб и полученные линеаризованные фрагменты очищали путем электрофореза в агарозном геле и экстракции. Плазмиды рМТВ7 и рМНс-Кеб линеаризовали аналогичным образом путем расщепления ферментами 8рЫ и Ркб. Линеаризованные последовательности ДНК от каждого из четырех КЕ-расщеплений использовали в качестве матриц в реакциях транскрипции ПигакспЬе Т7 (Еркеи!ге, Маб1кои, XVI) 1и νίΐΓο в соответствии с инструкциями производителя и получали фторированные РНКтранскрипты сегмента ν!8, сегмента г8, кодирующего антигены ТВ8, сегмента гМ, кодирующего антигены ТВ8, и сегмента гМ, кодирующего Нс-Кеб.

Аналогичным образом конструировали третью серию сегментов гбкРНК для экспрессии антигенов гликопротеинов СР-1 и СР-2 вируса лимфоцитарного хориоменингита (обозначаемого здесь ЬСМУ). 1511 п.н.-фрагмент подвергали ПЦР-амплификации из плазмиды рСМУ-СР, кодирующей предшественник полипротеина СР, локализованный на большой хромосоме генома ЬСМУ. Эту последовательность амплифицировали с использованием ДНК-полимеразы Ассирпте (1№Йгодеи, Саг1кЬаб, СА) и праймеров, включающих рестрикционные Нра1- и νοΐΙ-сайты. Размер амплифицированной последовательности подтверждали путем электрофореза в агарозном геле, и эту последовательность очищали с использованием набора для ПЦР-очистки О1Ас.|икк в соответствии с инструкциями производителя (Р1адеи, Са!. Νο. 28106, Уа1еис1а, СА). Плазмиды рАР182 и рАР19 линеаризовали рестриктирующими эндонуклеазами Нра1 и Νο!ΐ (№\ν Еид1аиб Вю1аЬк, Веνе^1у, МА, Са!. Νο. К01058) и дефосфорилировали кишечной щелочной фосфатазой теленка (Νον Еид1аиб Вю1аЬк, Веνе^1у, МА, Са!. Νο. М02908). СР-кодирующую последовательность аналогичным образом расщепляли ферментами Нра1 и Νο!ΐ и лигировали в линеаризованные плазмиды рАР182 и АР19, в результате чего получали плазмиды р8СР1 и рМСР2. Таким образом, эти плазмиды кодировали ген-предшественник полипротеина СР, фунционально связанный с ΙΚΕ8 НСУ г82 и гМ, соответственно.

р8СР1 и рМСР2 расщепляли КЕ КрЫ и Рйк соответственно, и использовали в качестве матриц для транскрипции ш νί!ίο. Фторированные РНК-транскрипты генерировали из каждой плазмиды с использованием ПигакспЬе Т7 (Еркеи!ге, Мабкои, VI), поставляемого в наборе для ш νί!Γ0 транскрипции в соответствии с инструкциями производителя. Полученные таким образом транскрипты кодировали последовательности антигенов СР-1 и СР-2 в г82 и гМ.

Пример 3. Конструирование упаковывающего штамма-прототипа и штамма для доставки.

Целью настоящего исследования является создание бактериального упаковывающего штаммапрототипа. Штамм 15Ό 8Ыде11а Г1ехиеп имеет в своей хромосоме необратимую делеционную мутацию по встраиванию маркера акб, которая приводит к нарушению продуцирования (полуальдегид аспарагиновой кислоты)-дегидрогеназы дикого типа (обозначаемого далее 'Ά8Ό), а следовательно, и к неспособности этого штамма синтезировать диаминопимелиновую кислоту, являющуюся компонентом клеточной стенки (обозначаемую здесь ПАР) (Ыхетоге е! а1., Уассте. 1997 1ии; 15 (8):804-7). Для роста в отсутствии генетической комплементации требуется добавление культуральной среды, содержащей 50 мкг/мл ЭАР (81дта-А1бпсй, 8!. Ьошк, МО, Са!. Νο. Ό1377).

Хотя бактерия 8Ыде11а была выбрана лишь в целях иллюстрации, однако, ее инвазивные свойства и природный тропизм по отношению к иммунным клеткам слизистых делает ее идеальным вектором для доставки. Поскольку акб-мутация должна комплементироваться гбкКЫ-кодируемым аллелем акб, то необходимо также создать вторую хромосомную мутацию для аттенюирования этого штамма, так, чтобы она вызывала его лизис после ее внедрения в клетку млекопитающих и высвобождения γ6&ΚΝ. Области размером приблизительно 1 т.п.н., расположенные выше и ниже гена тиг1 (кодирующего глутаматрацемазу), амплифицировали с помощью ПЦР, а затем присоединяли путем лигирования Мйе1-сайтов, кодируемых ПЦР-праймером, и лигировали в рСУЭ442 (геГ X) в кодируемые праймером 8к!1- и ХЬа1сайты. Полученную плазмиду переносили путем конъюгирования в бактерию 15Ό 8. Г1ехиеп. Коинтегрированные последовательности идентифицировали путем анализа на устойчивость к антибиотикам и чувствительность к сахарозе, а также путем ПЦР-анализа, и разделяли хорошо известными методами для продуцирования акб-, тиг1-штамма МРС51. Мутация тиг1 сообщает клетке неспособность синтезировать пептидогликановый компонент Ό-глутамат и требует добавления 50 мкг/мл Ό-глутамата в минимальную культуральную среду М9 для осуществления нормального роста. Кроме того, анализ на инвазию клеток НеЬа выявил, что данный штамм является инвазивным, но имеет непродолжительное время жизни внутри клетки (фиг. 7).

Для того чтобы определить, могут ли такие требования ауксотрофии комплементироваться ш !гаик посредством экспрессии гена акб, присутствующего в гбкК№ штамм МРС51 8. Лехиен трансформировали плазмидой рЬМ2 653, которая экспрессирует мРНК \\!Ь под контролем промотора 8Р6 и продуцирует белки РЫ-8, необходимые и достаточные для сборки прокапсида (8ии е! а1., У1го1оду, 308: 354; 2003). Плазмиду рЬМ2653 вводили путем электропорации и отбирали путем добавления 100 мкг/мл ампициллина.

Сборку прокапсида в МРС51рЬМ2653 оценивали путем дифференциальной фильтрации нативных и

- 27 011282

ДСН-денатурированных клеточных лизатов, которые анализировали путем иммуноблоттинга с использованием антисыворотки, специфичной к прокапсидным белкам (фиг. 8). Вкратце, поскольку ожидаемая молекулярная масса (М№) каждого прокапсида составляла 15 МДа, то было показано, что прокапсидные белки (87 кДа и 34 Да) не проходили через мембрану с отсечкой молекулярной массы 100 кДа, если только этот лизат не был обработан 10% ДСН, что указывало на сборку белка (фиг. 8). Кроме того, на микрофотографиях тонких срезов МРС51рЬМ2653, сделанных на трансмиссионном электронном микроскопе, ясно наблюдалось большое число прокапсидных частиц в концентрации приблизительно 60 нМ (фиг. 9).

Пример 4. Введение ззРНК, кодирующей сегменты гбзРНК, в упаковывающий штамм-протитип и индуцирование функциональной саморепликации гбзКЫ в указанном штамме.

Целью исследований, описанных в этом примере, является разработка способа продуцирования и сохранения гбзКЫ в бактериальном упаковывающем штамме. Выбранная стратегия включает трансформацию упаковывающего штамма 8. йех^и МРС51рЬМ2653 (пример 3) ίη νίίτο синтезированной ззРНК(+), кодирующей конструкции гМ и г8, описанные в примере 2. После встраивания в МРС51рЬМ2653, ззРНК(+) упаковывалась в прокапсид и синтез минус-цепи завершался, в результате чего образовывались гбзКЫ (фиг. 6). Затем гбзКЫ синтезировал мРНК, включающую мРНК νίΣ, гМ и г8 (т.е. ззРНК(+), которая пассивно секретировалась из гбзКЫ в цитоплазму штамма-носителя (фиг. 6)). Эти транскрипты продуцировали большее количество прокапсидов посредством экспрессии сегментов МЬ, гМ и г8, которые несут функциональный ген азб, комплементирующий азб-мутацию в МРС51, что позволяет игнорировать требование присутствия ПАР, необходимого для роста. Сегменты МЬ, гМ и г8 мРНК также упаковывались в прокапсиды, что приводило к образованию дополнительных гбзКЫ

Электрокомпетентные клетки МРС51рЬМ2 653 получали стандартными методами (АизиЬе1 е! а1., см. выше). Вкратце, одиночные клоны культивировали при 37°С в среде М9, в которую были добавлены ампициллин (100 мкг/мл), канамицин (50 мкг/мл) и 50 мкг/мл ПАР (81дта-А1бпсй, 8ί. ^шз, МО, Са!. Νο. Ώ1377). Пятьдесят миллилитров культур культивировали при ОП₆₀₀<0,1 и клетки собирали во время экспоненциального роста при ОП₆₀₀ 0,3 и 0,6. Клетки один раз промывали охлажденным на льду 5 мМ ЕПТА, 10% глицерином (об./об.), а затем три раза промывали охлажденным на льду 10% (об./об.) глицерином, причем после каждой промывки проводили центрифугирование при 4000/д. После конечной промывки и центрифугирования, клетки ресуспендировали в 10% (об./об.) глицерине, распределяли на 200 мкл-аликвоты и хранили при -80°С.

ззРНК(+) сегментов г8 и гМ, используемых в электропорации МРС51р ЬМ2653, синтезировали ίη νίίτο с использованием линеаризованных р8ТВ2 и рМТВ7 в качестве ДНК-матриц, соответственно, как описано в примере 2. МРС51 рЬМ2653-клетки подвергали электропорации с использованием 2 мкг ззРНК(+) (1,0 мкг г8 + 1,0 мкг гМ). Электропорацию проводили с помощью импульсного устройства Се1те-Ри1зег при 200 Ом, 25 мкФ и 1,8 кВ (ВюКаб, Негси1ез, СА). Клетки восстанавливали в течение 2 ч при 28°С на среде 8ОС (са! #15544-034, Ιηνίίτο^η, Саг1зЬаб, СА), в которую было добавлено 50 мкг/мл ЦАР и в которой отсутствовали антибиотики. Затем клетки высевали на агар М9 с соответствующими антибиотиками, в который было добавлено 50 мкг/мл П-глутамата и 0,1 мкг/мл ПАР, концентрация которого была ниже минимальной концентрации ПАР, необходимой для поддержания роста МРС51 рЬМ2 653. Клетки оставляли для роста при 25-27°С, а затем их переносили в среду М9 с Ар/Κη/^-глатаматом и добавляли ПАР до 0,01 мкг/мл или удаляли. Клетки культивировали при 22°С-25°С, в результате чего образовывались колонии, которые были устойчивыми к ампициллину, что было обусловлено присутствием рЬМ2653, и были ПАР-независимыми, что было обусловлено экспрессией генов азб на г8 и гМ.

Для повышения способности к росту, МРС51рЬМ2653 подвергали электропорации с использованием ίη νίίτο транскрибированной ззРНК из рМТВ7 и плазмиды рЬМ2775, кодирующей сегмент-8 дикого типа, в качестве источника гена 8. Эту процедуру и последующие стадии культивирования проводили, как описано выше, в результате чего получали ПАР-независимый гбзКЫ-содержащий штамм МРС51, обозначенный Ь8М!Ь4 (фиг. 10).

Аналогичным образом, МРС51рЬМ2653 подвергали электропорации с использованием ίη νίίτο транскрибированной ззРНК из плазмиды рЬМ2775, кодирующей сегмент-8 дикого типа, в качестве источника гена 8 и из рМНс-Кеб, кодирующей белок Нс-Кеб, функционально связанный с 1КЕ8 сегмента гМ. Эту процедуру и последующие стадии культивирования проводили, как описано выше, в результате чего получали ПАР-независимый гбзКЫ-содержащий штамм МРС51, обозначенный Ь8МНс-Кеб.

В третьем примере, ззРНК, ίη νίίτο транскрибированную из конструкции г82 р8СР1 (включающей ген 8), кодирующей СР-антиген ЬСМУ, использовали для устранения необходимости присутствия последовательности гена-8 из \\18. Клетки МРС51рЬМ2653 8.Пехг1еп подвергали электропорации с использованием ίη νίίτο транскрибированной РНК из р8СР1 и рМСР2, как описано выше в примерах. Последующие стадии культивирования проводили, как описано выше, в результате чего получали ПАРнезависимый гбзКЫ-содержащий штамм МРС51, обозначенный Ь8дрМдр. Присутствие гбзКЫ подтверждали с помощью иммуноблоттинга лизатов целых клеток, проводимого с использованием нуклеокапсид-специфической антисыворотки, и с помощью ОТ-ПЦР, проводимой с использованием праймеров, специфичных к (+)- и (-)-цепям г82 и гМ.

- 28 011282

Интересно отметить. что электропорация МРС51. осуществляемая с использованием ш уйто транскрибированной ккРНК с любой комбинацией г8 и гМ. не приводила к образованию трансформантов. если только не присутствовал \\1Ь ккРНК или плазмида. кодирующая \\1Ь. либо если нужный штамм не был ранее трансформирован плазмидой. кодирующей \\1Ь. Кроме того. обработка ш уйго транскрибированной ккРНК РНКазой А до электропорации МРС51рЬМ2653 не приводила к получению трансформантов. В качестве дополнительного примера. демонстрирующего эффективность и продуктивность электропорации РНК как средства создания гбкКИ. проводили электропорацию ш уйто транскриптов всех трех сегментов дикого типа в Ркеиботопак куппдае (в природном хозяине РЫ-8) методами. аналогичными методам. описанным выше. Это приводило к восстановлению литического бактериофага РЫ-8 дикого типа. на что указывало образование бляшек на бактериальных газонах. полученных в результате электропорации и визуализации на трансмиссионном электронном микроскопе фаговых частиц дикого типа в клетках Р. куппдае. полученных в результате электропорации (фиг. 12).

Очевидно. что независимость от ЭАР является следствием амплификации генов акб⁺ на РНК г8 и/или гМ. кодируемых соответствующим гбкКИ. Действительно. ОТ-ПЦР-анализ полноразмерной РНК. происходящей от штаммов. несущих вышеописанные гбкКИ. который проводили с использованием праймеров. специфичных к амплификации минус- или плюс-цепи РНК. указывал на восстановление кДНК сегментов г8 и гМ. При этом следует напомнить. что синтез минус-цепи в данном фаге происходит только после поглощения всех трех геномных сегментов. Во время этой процедуры. МРС51 8. Пехпеп. несущий гбкКИ Ь8М!Ь4 и Ь8МНс-Кеб. сохранял ЭАР-независимость в течение 3 месяцев в непрерывной культуре. И наконец. указанные конструкции продолжали продуцировать капсидные белки. детектируемые с помощью иммуноблоттинга. и подвергались сборке нуклеокапсиды. наблюдаемые с помощью трансмиссионного электронного микроскопа (фиг. 11).

Следовательно. в целом. эти результаты продемонстрировали. что комплементация акб-делеции в МРС51рЬМ2653 является результатом поглощения РНК и упаковывающего и самореплицирующего действия гбкИС в упаковывающем штамме. Эти результаты также продемонстрировали. что с помощью описанных процедур могут быть получены гбкКИ. которые сохраняются в полученных штаммах.

Пример 5. Экспрессия гбкКИ-кодируемых последовательностей в клетках млекопитающих.

Объем настоящего изобретения не ограничивается доставкой гбкКИ в ткань или организм млекопитающего с использованием бактериального упаковывающего штамма. и в целях иллюстрации было принято решение использовать аттенюированную инвазивную бактерию МРС51 8Ыде11а Пехпеп (примеры 3 и 4). поскольку. в природе. она является инвазивной для многих клеточных линий тканевых культур и для животных-моделей. Этот штамм конструировали. как описано в примере 3. для индуцирования лизиса бактериальных клеток после их инвазии в эукариотические клетки и высвобождения гбкКИ из эндоцитарной везикулы и для высвобождения гбкКИ в цитоплазму эукариотической клетки.

В качестве первого свидетельства был выбран штамм МРС51. содержащий гбкКИ Ь8М!Ь4. Эта конструкция гбкКИ кодирует упаковку антигена М. !иЬегси1ок1к. обозначенного ТВ8. Точный состав этой упаковки не имеет существенного значения для осуществления настоящего изобретения. однако. в целях иллюстрации был выбран компонент антигенной упаковки. который представляет собой последовательность. кодирующую белковый антиген 85А. Как описано в примере 2. антигенную упаковку лигировали с последовательностью ГКБ8 НСУ и помещали под трансляционный контроль этой последовательности. Отсутствие экспрессии конструкции ТВ 8 в бактериальном штамме. несущем указанный гбкКИ (МРС51+Ь8М!Ь4). подтверждали с помощью иммуноблот-анализа лизатов целых клеток. зондированных на присутствие антигена 85А с использованием поликлональной антисыворотки (АЬсат. СатЬпбде. ик).

Клетки НеЬа Дпуйгодеп. Саг1кЬаб. СА) культивировали в среде ЭМБМ + 10% фетальной бычьей сыворотки (РВ8) Дпуйгодеп. Саг1кЬаб. СА) + 1% раствора антибиотика/противогрибкового средства (Ιπуйтодеп. Саг1кЬаб. СА) по меньшей мере до 60%-ной конфлюэнтности на покровных стеклах в 6луночных планшетах для культивирования тканей при 37°С. 5% СО₂. Одновременно с этим. МРС51+Ь8М!Ь4 8.Пехпеп культивировали при встряхивании в 50 мл среды М9 при 28°С до ОЭ₆₀₀. составляющей по меньшей мере 0.6. За 24 ч до проведения анализов на инзазию. среды удаляли из лунок с клетками НеЬа и заменяли средой ЭМБМ + 10% РВ8. За 2 ч до инвазии. среду клеток НеЬа заменяли средой ЭМБМ и бактериальные культуры разводили и оставляли для стационарного роста при 37°С. Затем концентрацию О2 в инкубаторе для культивирования тканей снижали до 1% добавлением И2 и РВ8промытую суспензию МРС51+Ь8М!Ь4 в ЭМБМ добавляли в культуры НеЬа при множественности заражения (МОЕ 100 и инкубировали в течение 1 ч. Одновременно с этим. бактериальные суспензии 8. Пехпеп 15Ό (акб) и МРС51рЬМ2653. полученные аналогичным образом. добавляли в лунки с клетками НеЬа. как описано выше.

После инвазивного инкубирования в течение 1 ч клетки НеЬа два раза промывали РВ8. культуральную среду (ПМБМ+РВ8) заменяли и в течение 1 ч добавляли 150 мкг/мл сульфата гентамицина (81дта. 8!. Ьошк. МО) для уничтожения всех остальных бактериальных клеток. которые не проникали в клетки НеЬа. а поэтому они не были защищены клетками НеЬа. Гентамицин представляет собой широко применяемый антибиотик. обычно используемый в указанной концентрации. но он не проходит через мембра

- 29 011282 ны эукариотических клеток. Через 1 ч культуральную среду заменяли свежей средой ЭМЕМ+ЕВ8 и клетки тканевой культуры инкубировали при 37°С, 5% СО₂, в течение 14 ч.

Затем покровные стекла с клетками НеЬа вынимали, фиксировали 2% параформальдегидом в РВ8 (рН 7,4) после чего клетки делали проницаемыми с использованием 0,1% тритона Х-100 в РВ8 (рН 7,4), блокировали в течение 2 ч 3% В8А, 5% нормальной козьей сывороткой, 0,05% азидом натрия в РВ8 (рН 7,4), и зондировали антисывороткой, специфичной к антигену 85А (Ι§Υ) (АЬеат, СатЬпбде, МА) при разведении 1:100 в 1% В8А, 3% NС8, 0,05% азида натрия в РВ8 (рН 7,4). Затем клетки подвергали контрзондированию с использованием ФИТЦ-конъюгированных кроличьих антител против Ι§Υ (АЬеат, СатЬпбде, МА) при разведении 1:100 в 1% В8А, 3% NС8, 0,05% азиде натрия в РВ8 (рН 7,4) и анализировали под флуоресцентным микроскопом. Контрольная группа клеток НеЬа, которая не была обработана бактериями, 15Ό 8. Пехпеп. или МРС51рЬМ2653, не обнаруживала флуоресценции, указывающей на экспрессию антигена 85 А. Клетки НеЬа, обработанные инвазивным МРС51+Ь8М!Ь4, обнаруживали интенсивную флуоресценцию, что указывало на экспрессию в клетках антигена 85А, являющегося частью гибридного белка, содержащего антиген ТВ8 (фиг. 13). И снова, важно отметить, что экспрессия антигена 85А не детектировалась в упаковывающем штамме/штамме-носителе 8Ыде11а, и после 14-часового инкубирования не было выделено живых бактерий 8Ыде11а. Это ясно свидетельствует о трансляции гб§В№продуцируемого рекомбинантного сегмента мРНК у млекопитающих.

Способом, аналогичным описанному выше, инвазию клеток НеЬа проводили с использованием МРС51+Ь8МНс-Веб, который имеет последовательность непосредственно флуоресцирующего гена НсВеб, присутствующего на сегментах гМ. Через 12 ч после инвазии покровные стекла с клетками НеЬа фиксировали и наблюдали под флуоресцентным микроскопом. Контрольные группы, обработанные 8. Пехпеп 15Ό и МРС51рЬМ2653, не обнаруживали Нс-Веб-флуоресценции, тогда как МРС51+Ь8МНсВеб-обработанные клетки НеЬа обнаруживали прямую флуоресценцию (фиг. 14). Для дополнительного подтверждения того, что эта флуоресценция не обусловлена экспрессией Нс-Веб, клетки НеЬа фиксировали и зондировали Нс-Веб-специфическим антителом и контрзондировали конъюгированным вторым антителом. И в этом случае, флуоресценцию обнаруживали только клетки, обработанные МРС51+Ь8МНс-Веб (фиг. 15). Кроме того, экспрессия Не-Веб не могла быть детектирована с помощью иммуноблот-анализа или микроскопического анализа на прямую флуоресценцию одного МРС51+Ь8МНс-Веб. Эти комбинированные результаты, полученные путем непосредственного наблюдения флуоресценции и иммунодетекции белков, свидетельствуют о том, что гб&В№кодируемая РНК была транслирована с образованием белка в клетках млекопитающих. И наконец, поскольку за этот период времени, живой штамм 8Ыде11а либо вообще не был выделен, либо было выделено лишь небольшое его количество, и поскольку оголенная РНК имела ограниченное время полужизни, а в кодируемые белки могли транслироваться только (+)-цепь или мРНК, то очевидно, что источником транслируемой информационной РНК является мРНК, продуцируемая нуклеокапсидом γ65ΡΝ после лизиса упаковывающего штамма/штамма для доставки, присутствующего в клетках НеЬа.

Пример 6. Иллюстративные последовательности рекомбинантного сегмента-8 и рекомбинантного сегмента-82.

Как показано на фиг. 4, ниже представлены иллюстративные последовательности, которые были использованы в настоящем изобретении для конструирования рекомбинантного сегмента-8 (г8).

РШ1:

сгдсад рас сегмента-8 бактериофага Р1п-8 и сайт связывания с рибосомой гена-8, 187 (основание 1-187 сегмента-8, номер доступа в СепЬапк АР226853):

даааййса аа!сПЙда с1а!йсдс1 ддса!адс!с йсддад1да адссПсси даааддсдсд ааддюссса ссадс1сддд д1дайсд!д аса1йсс!д §да!с1сдда дВадсМд !с!с!аддад ас!дацсдК сдд1с!садд ШаааШда дайдадда! ааадаса (8Е<2 П) ΝΟ: 1) ·> присоединены к гену ах/ акб Е.со11 (основание 240-1343, номер доступа в СепЬапк У00262):

- 30 011282 <П£аааааХ£1 Х§§ййагс ££С1£2С£С£ ^йХ^ё^ёб С1сс£йсй а^саас^са |££йеаа§а §с§с§асйс §ас£ссайс §сссХ^сй сЙЙсйсХ Хска^сй^ §сса££<й§с £СС£кйй ^с^^аасса сХ^сасасХХса^аХ^сс 1й£а1с12Е а@£с@с1ааа ££ССС1С£а1 с£§сёаШй аес§§а1§8с саа!са§§ас

1сй1ссааа ассаас^ааа а§а1§ас£сс «еесд^аа £сйс£1§аа й£асссс£1 а§сс(^аХ®Х1§а^1с£й §2§1^1йа йс^ссаа!® аХсй^й^а й££$®йс ^й^саасс! асса^сс^с йсс^с^ §£1.£С£с§ас аШ^с^а цйайаасс са^аХ^^сс а1с1&1а1ц£ сса1§12§са ^аХ^аасХс^ с§асссс§1с сХс!§сйй сХс^айХсе аас§сааа§Х сасаассХй асссяй^св (^а^сс^сс £е1££айас 0£с1££С£2£ й£ссХ§ай οο§ΐβ£^β асаааса§сХ с^аХаас^ са£а§сс§сё аа^а^е^аа а££§са§£С£ §ааассааса ацаХссХсаа сасаХсйсс £йайсс§£ йцаХее® βΧ^Χ^Ιβο^ί ^с^цсаХ са§ссац2са ЙсасйХй аай^ааааа а^а^^ХсХ айссцасс^ (§£аа(>аас1 βοΧββοί^Οβ §££с§ааа£Х с£йсс§аас ^аХс^^ааа ХсасХа1§с§ [да^йаасс сса@(й£сс£ Йасс§£сас сс]’§йё§сс £ос1£С£1аа ^с^аайХ^ ^асса^а^Х ХссХ^са^с сййсс£1е £ёс£асса£с §§сс§с£да§ сс£с1£с§1с §§аХёсйс§ 1саасЦвс£ йа (8Εζ> ГО N0: 2) —> присоединены к /НЕЗ

1ВЕ8 вируса гепатита С (основание 36-341, номер доступа в СепЬапк А1242651):

аХсасйссс аа§£йас1£ е*сайассе §ай§ас§са £са1с$1с1с ас^айааа йа^сай ^с^са^аа аееасййв айакайс с1£йсс£й ^с^с^сса сасаайс^Х §с1§ассас§ ΐβοί^Βδ а§^асссссс

1дХ£ад£аас йс(#1сйс асдса^ааад с^ссй^сса 1§£с§йа£й1§а§1ё(св сйссдддаз а£ссай£(£ §1с1§с££аасс@£1@а£й сасс§§аай §сса§Еас§а ассс£с1саа1£сс1££а§а ссссс^ссац асХ§сй£сс

1£са§сс1сс сенсей §а§1а$1ёй

Хсй^^ака е§Ж№йаааййссйЩ ^йсХ^сс^ ай^Е^Ы г^ср^сс сс§е§а§§Хс ХсЕйцасср§сассаГ£ (8Е<)

ГО N0: 3) ·> присоединены к сайту множественного клонирования

Сайт множественного клонирования и кодоны терминации:

аХ£ ей аас §Сё ёсс &Я Хаа йа аХа ааХ ааа йа (8ЕЦ ГО N0:4) —> присоединены к 3 '-нетранслирумой последовательности вируса 8РУ

3'-нетранслирумая область вируса лесов Семлики (основание 1-262, номер доступа в СепЬапк У01398):

£йа£8§Ха в^сааХ^са й^аййдс аа§аааай§ ааааса§ааа аа§Хй®£°Х аа^саа^с аййассаХ аас;§й1аа сй§йасаа а^с^саасаа £ассХ£С£са ай£@сссс£ Х£§Хсс£ссХ сас£§ааасХ с^^саасФ са1ай&аса сайаай£§ саайайЕЕ аа§сйаса1 аа£сХйай с§ас§аа!аа й^аХЙй аййайй £саай££й

ХйаайХй сс (8ЕЦ ГО N0: 5) -^присоединена к сайту связывания ро13’ РНК сегмента-8ф8

3'-сайт связывания с полимеразой сегмента-8 РЫ-83 (основание 3081-3192, номер доступа в СепЬапк АР226853):

{гсйа§с§ёс ааХс^аассс йс£ хсайа§§ а&§йй£са аа(сс£с§£с кйа!@а@с Х£йс§ааа§ ^асаассс^а аа£££££а§с §а£§асйс£ ^ХссХсс^сХ сс (8ЕЦ ГО N0:6)

Рз£1:

01§са§

Как показано на фиг. 4, ниже представлены иллюстративные последовательности, которые были использованы в настоящем изобретении для конструирования гена 8 фага РЫ-8 дикого типа рекомбинантного сегмента-82 (г82).

ΡείΙ:

с1§сае рас сегмента-8 бактериофага РЫ-8 (1-187 п.н., номер доступа в СепЬапк АР226853):

&аааййсааа1сйЙ£асй1йс£с1£@;сай£сСсйс£2а£1£аа£ссйссс15ааа£<’с§с§аа§£к:сссасса£сй:§££§££ айс|^асаШсс1£§£а1сЮё£а^са£сШ^скйё2а5ас15а8С^с§£кйса££Шааасд»а£ай5а§£>айаа£аса (8Ε<}ΙΟΝΟ:1)

Ген 8 бактериофага РЫ-8 в сегменте-8 (п.н. 188-1291, номер доступа в СепЬапк АР226853):

- 31 011282 а1£§^§аМсШсаас1{^а1§свсси§₈с)ййаасаё£ё1Есадсаа£1{Л12£иаа£сс|’2(’а1с£а1Ёс1дд1а£_Саа£С£ айёсТсса£са£а1са1д1ссааа£ас2£12Сййса₈с1£&т5дсасЁС££Ш:сасс£сщ1£2а2сада1д1С2а£1£аа£12сЁ с§аа2с£1а1с1сис£а§а1с^§а£са1сйс1§с1с^§ас8а§£ссас£й££сс£а1£с£сйа1££с£1£шсасс§а1:§сац £1£аи1сдссайдадс£Ёс1£сйссйсс§1а£а££аГ£К:£агаааё£С£а££С£с«£сс£ссас§с^с1£Ю£ЁеЙ££ск:1с1 1с1сда{£аасааа£аасаа£с1£аа£а£сйааас£йс8а1££са1с£ааа££са£а2Ёсс£еасс£££йассс1с££а££аса£а сссйОДасс;рсаа21ссас1££ЦсЁ££сс(£аса£а£1а18ас£с)саа££саа§аа1§2С£1ссс{с£с₈£да^с{£с{аасаа 2с₈1ас1§сайдйсйсд12сЁд1асасад12а1сад1асйсс1дд1ссд{а1ас2а1сас1аС2д1даёЯкааа2с12§1:с1сдсас2а2 дсда^сЁассЁсссадЁдс^аЁс^Ейдаайдсевдсссссддйсс^сдиа^сда^сдадсд^адасасаасдсдсас^с аадаадаасадссдс^дсайёссЩсдддсадссдсассдсддаасдддйдЩдддссдасдса^д^аЦйсссс^дсКас ассКсдссаддЁсдайсассЙсассддЁдадддсзасса&дКссдаШсосасаасЁсдск^сса^аасдасасЁдаЁодсдй £1£с§£аесай£аас1££а1сдсаШхаёа(£саа££аааа1айа£1с£а1§£1дасса1дас1асй£с1(’£ас£сс§с1сааса£сд с£к£с1£ссеа1э1секе:е1а1сЕсссйай1саеи£й1с£айсЕс1ес1с1йк1аЕсса£и1са1саас£С£аайЕаеааесайс£ ^аЦс (8ЕЦ Ш N0:7)

ВдШ:

ада1с1 —> присоединен к ΙΆΕ8

ШЕ8 вируса гепатита С (основание 36-341, номер доступа в СепЬапк А1242651):

а1сас1сссс ^даддаас 1асЁд1сйс ас§садааад сдссйдсса 1д£сдйа§1а1:£а£1§1:с£ 1дса₈ссХсс аддасссссс сГсссдддад адссаЁад^ ^с^сддаассд^дади сассддаай дссаддасда сс22£1ссй (сйдаАа ассс₈с1саа1₈ссЁ22а₈а Ш₈82сд1₈ сссссдссад ас1ес1а₈сс еадй^дй ^сдсдаааддссйдЁе ай^ес! 1₈с§ад1дсс ссддда^с (сдйщасс^дсасса# (5Εζ)

Ш N0: 3) присоединена к сайту множественного клонирования

аЬд §й аас дед §сс дс11аа йа а1а аа1 ааа гаа (8ЕЦ ГО N0: 4) —> присоединен к 3 '-нетранслирумой последовательности вируса 8ΡΥ

3'-нетранслирумая область вируса лесов Семлики (основание 1-262, номер доступа в СепЬапк ν01398):

§йа£££(а ££саа1££са йдаЁа{а§с аадаааайд аааасадааа аадйаддд! аа₈сааГддс а{а(аасса1 аас1£1а1аа сй§1аасаа адсдсаасаа дасс^сеса айддссссд ^^ссдсс! сас₈дааас1 с§§§£саас1 саййдаса сайаай§§ саа1аайдд аадсйаса! аадейаай сдасдааЁаа йддайШ аййайй §саай£§й йтаий) сс (8Εζ) ПЭ N0: 5) -^присоединена к сайту связывания ро13' РНК сегмента-8ф8

3'-сайт связывания с полимеразой сегмента-5 РЫ-8 (основание 3081-3192, номер доступа в СепЬапк АЕ226853):

дейадецде аа1с§аассс 1ссд хсаЁаадд адеДсадса ааЮсдсддс 1сйа^а§с ^ссдааад дасаасссда аа§₈££§а§с даддаейед £1сс1ссдс1 сс (8Εζ) ГО ΝΟ: 6)

Рзс1:

с1§са§

Пример 7. Иллюстративные последовательности для рекомбинантного сегмента-М.

Как показано на фиг. 4, ниже представлены иллюстративные последовательности, которые были использованы в настоящем изобретении для конструирования рекомбинантного сегмента-М.

ΚρηΙ:

дд(асс —э присоединена к рас сегмента-М

Последовательность рас сегмента-М и сайт связывания с рибосомой гена 10 (основание 1-262 номер доступа в СепЬапк АЕ226852)

- 32 011282 даааййсааа^сШсддсаайадд^ддаааШсааададд^сдадссдасдаассЮдйдаассдддаадгдсс^сШа сКксйайаесааЦйаас1а№Ксайс ассддддд^сдакадсдсадаадгдаддсдсдддеаПдаадсааакассйадсдйаасдасддассйеадддСддсддад! сйсай§да1:ссссйдсйсйдасадааас сайссйасааддада^сас (8Е() ΙΌ N0: 8) -Э присоединена к Β$1 II

ВдШ:

а°а1с1 —> присоединен к гену а$<1 акб Ε^ο1ί (основание 240-1343, номер доступа в СеηЬаηк У00262):

аГ£аааааГ§1 1д§1Пй1с ддйддсдсд с1ссдйс1с аТдсаасдса 1ддПдаада дсдсдасйс дасдссайс дссс!§1сй сййсйс!ййадсйд дссаддс1дс дссдййй ддсддаасса с1ддсасас1:йаддакдсс 1йда1с1дд аддсдсйаа ддссскда! а1сай£1да сс1д1сад§§ сддсдайа! ассаасдааа йййсааа дсйсд1даа адсдда(д§с аадцйас!д дайдасдса дса!сд!с1с 1§сдса1§аа а§а1дасдсс айакайс йдассссд! саайаддас дйайассд асддайааа 1аа1££сай аддасййд йддсддйа сйдйссдй адсс1да1д1 (§а1дйдй дддбдрйй йсдссаа^ аййдйда йдд(йдйс дйдсаасс! ассаддссдс Йссддсдд1 дд!додсдас ай1дсд1да дйайаасс садайаЕсс ай{дй<§д сса1дгддса да!даасйд сдассседй сййдсйй сйдаййд аасдсааад! сасаассйа асссдйдсд £4§а£сС§сс дд1ддайас Й1д§сд1дс сдсСддсцдд 1адсс1цай сс^ддайд асзаасадс! сдайасдд! сададссдсд аада§1ддаа ацддсаддсд дааассааса адайсйаа сасаййсс дйайссдд 1ада1ддй1 а!§1§1§с§1 дй£££дса1 1дсдс1дсса садссаддса йсасййа аайдааааа а§а1д)д1с1 айссдассд Хддаадаас! дс1д§с1дс§ сасаайсд!

дддсдааадГ сдйссдаас даТсдддааа йасйХдсд {дадсйасс ссадс1дссд йассддсас дс1дассас§ ссддйддсс §сс1§сдйа дсЛдааНйд ддассарад! йсхдйадс сй1ассд1д ддсдассадс (есВДдяед дрссдсцдад ссдс1дсд1с дда1§сПс§ йзасЦ^сд ίαα (8ЕС> ГО N0: 9) —> присоединены к Азе!

Азе!:

§§с§с§сс -> присоединен к 1ИЕ8 ИСУ

IΡΕ8 вируса гепатита С (основание 36-341, номер доступа в СеηЬаηк А1242651):

айасйссс 1д1§ад§аас ййдййс асдсадааад сдссйдсса 1§дсдйад1 (ПдадГдТсд {дсадссйс а§®асссссс сйссгейад адссайд1§ дййдсддаа ссдд1дадй сассддаай дссаддасда ссдддйсй ййддайа асссдсйаа (ссГддада ЙдддсдХд сссссдссад асйдсйдсс дад1ад{дй дддйдсдаа адцссОДд (йас1дсс1° айедгДО ^еа^ос ссвддаддк йдйдассд

1дсасс (8Εζ) ГО N0:10) присоединены к сайту множественного клонирования

Сайт множественного клонирования:

а(§ дй аас дед дсс дс! йа йа ай аа( ааа йа (8Εζ) ГО N0: 11)·^ присоединен к З'-нетранслируемой последовательности 8РУ

3'-нетранслирумая область вируса лесов Семлики (основание 1-262, номер доступа в СеηЬаηк У01398):

дйадддй ддсаа!ддса йдаййдс аадаааайд аааасадааа аадйаддд! аадсаа(ддс аййасса! аас!дййа сйдйасаа адсдсаасаа дасс!дсдса айддссссд 1ддйсдсс1 сас§дааас1 сддддсаас! саййдаса сайаайдд саайайдд аадсйаса! аадейаай сдасдаайа ЙддаШй аййайй дсаайддй ЙйаШКсс (8Е0 ГО N0: 12) —> присоединена к 3 '-сайту связывания с полимеразой РЫ-8

- 33 011282

3'-сайт связывания с полимеразой сегмента-М РР1-8 (основание 4677-4741. номер доступа в СепЬапк ас!дй§а!ааасаддасссддаадддхаасссдададд8ддад1даддсЙсддсс!ссасис(8Ер ГО N0: 13) присоединен к Ρ.κίΙ

Ρ5ΐΙ:

с!ёсад

Пример 8. Экстракция и очистка гйкВИ

Для подтверждения того. что штамм МРС51 Ь8М!Ь4 продуцировал нуклеокапсиды. одиночные клоны культивировали при 28°С в среде М9. в которую были добавлены ампициллин (100 мкг/мл). канамицин (50 мкг/мл) и Ό-глутамат (50 мкг/мл). Культуры выращивали при ОЭ₆₀₀ <0.1 и клетки собирали во время экспоненциального роста при ОЭ₆₀₀ 0.6 и 0.8. Эти клетки собирали центрифугированием при 8000 об/мин в течение 5 мин. Для лизиса клеток. бактерии ресуспендировали в 5 мл РВ8 и подвергали лизису при 20000 фунт/кв.дюйм в прессе Френча (ТРегто Е1ес!гоп). Лизаты подвергали центрифугированию при 8000хд в течение 5 мин. и супернатант очищали в градиенте 10-30% (масс/об) сахарозы. содержащем 10 мМ фосфата калия (рН 7.3; 81дта. 8!. Ьошк. МО. Са!. №. Р5379) и 1 мМ хлорида магния (81дта. 8!. Ьошк. МО. Са!. №. М1028). Затем эти градиенты помещали в ротор 1824.15 центрифуги АуапР 1-301 (Весктап СоиРег. Ри11ег1оп. СА. Са!. №.363118). После центрифугирования при 23000 об/мин и при 23°С в течение 90 мин. нуклеокапсиды образовывали четкую полосу. которую собирали и отдельно хранили при -80°С. Остальное содержимое пробирок разделяли на 1 мл-аликвоты и хранили -80°С. Присутствие гйкВЫ в этих аликвотах подтверждали путем иммуноблотинга с использованием капсид-специфической антисыворотки и посредством ОТ-ПЦР. проводимой с использованием праймеров. сконструированных для амплификации (+) и (-)-цепи РНК Ь8М!Ь4.

Усовершенствованную процедуру очистки гйкВЫ проводили следующим образом. 500 мл культуры

8.Г1ехпеп МРС51. несущей гйкВН Ь8М!Ь4. культивировали при 28°С до ОЭ₆₀₀=0.8 и клетки осаждали. гйкВЫ очищали путем многостадийной фильтрации и центрифугирования. Клеточный осадок сначала лизировали на микрофлюидизаторе 1пуепкук АРУ (Ьаке νί11κ. VI) и осветляли путем центрифугирования. Затем осветленный супернатант обрабатывали путем фильтрации в тангенциальном потоке (ТРР) с использованием системы РеШсоп (МРРроге 1пс.. ВШепса. МА). снабженной фильтром с размером пор 0.45 мкм (М1Шроге #Р2НУ МРС 05. или эквивалентом). После этого. свободные нуклеиновые кислоты гидролизовали бензоназой (в течение 30 мин при 25°С).

Затем проводили вторую стадию фильтрации для концентрирования гй&ВЫ и отмывки от компонентов среды. от гидролизованных нуклеиновых кислот и от нуклеаз. Затем для концентрирования продукта и замены буфера на забуференный фосфатом физиологический раствор или другой выбранный и специально изготовленный буфер осуществляли фильтрацию в тангенциальном потоке (ТРР) с использованием спирального 100-кДа-модуля для ультрафильтрации (М1Шроге #СЭЬР 006 ЬН. или эквивалента). После фильтрации в тангенциальном потоке. одну половину частично очищенного гй&ВЫ осаждали путем добавления №С1 и ПЭГ. а затем ресуспендировали в небольшом объеме фосфатного буфера (Ноодк!га!еп е! а1.. У1го1оду. 272:218-224. 2000). Затем проводили очистку двумя градиентами в аналитическом объеме с использованием части (10-25%) ПЭГ-осажденного и ресуспендированного материала.

Ресуспендированый гйкВН наслаивали на предварительно полученные градиенты сахарозы и препарата ОрР-ргер и центрифугировали в течение ночи. Полосу гйкВН (идентифицированную путем иммуноблоттинга и с помощью ОТ-ПЦР-анализа) собирали и градиентный материал удаляли путем диализа против буфера. специально изготовленного в лаборатории. Затем очищенный материал (пре- и постградиент) обрабатывали для удаления остаточного эндотоксина (если это необходимо) с помощью рионоомбенной хроматографии и/или Ас!1с1еап Е!ох™ (8!егодепе. СагкЬай. СА). И наконец. очищенные гйкВН распределяли на аликвоты и хранили при 4°С.

Аликвоты использовали в каждой стадии очистки и анализировали посредством иммуноблоттинга и ОТ-ПЦР.

Пример 9. Иммуногенность гй&ВЫ у мышей.

Поскольку настоящее изобретение основано на использовании РНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага. то необходимо определить. является ли полимераза фага РР1-8 активной в эукариотах. Способность очищенных нуклеокапсидов вырабатывать гуморальный ответ против упаковки микобактериального антигена ТВ8. кодируемой на г8 и гМ. тестировали путем вакцинации 6-8-недельных мышей ВАЬВ/с (ТРе 1асккоп ЬаЬога!огу. Ваг НагЬог. МЕ. Са!. №. 000651) очищенными нуклеокапсидами. Пять групп. каждая из которых содержала по пять мышей. вакцинировали: 10 мкг пустого прокапсида. 10 нг нуклеокапсида. 100 нг нуклеокапсида. 1 мкг нуклеокапсида и 10 мкг нуклеокапсида. Мышей подвергали первичной вакцинации на день 0. а затем их вакцинировали двумя бустер-дозами на 14-й и 42-й дни. Все вакцинации проводили путем внутримышечной инъекции нуклеокапсидов в задние конечности каждой мыши.

Для оценки гуморальных ответов на антигены ТВ8. до вакцинации и через 10 дней после каждой

- 34 011282 вакцинации брали пробы сыворотки. Из хвостовой вены каждой мыши брали примерно 100 мкл крови на мышь и собирали в отдельные пробирки, а затем кровь оставляли для свертывания путем инкубирования в течение 4 ч на льду. После центрифугирования в микроцентрифуге в течение 5 мин, сыворотку переносили в свежие пробирки и хранили при -20°С.

Для количественной оценки 1дО-ответов на антигены ТВ8 проводили твердофазный ЕЫ8А. Очищенные растворимые микобактериальные антигены суспендировали в РВ8 при концентрация 2 мкг/мл и использовали для покрытия 96-луночных микротитрационных ЕЬ18А-планшетов. Эти планшеты инкубировали в течение ночи при 4°С, а затем четыре раза промывали 0,05% раствором (об./об.) ТВ8-твина. После этого, планшеты блокировали при комнатной температуре в течение 1 ч с использованием блотто (5% (мас./об.) обезжиренного сухого молока в ТВ 8-растворе). Затем планшеты промывали раствором ТВ8-твина, как описано выше. Сыворотку разводили в блотто, и в планшеты добавляли трехкратные серийные разведения, начиная с разведения 1:30, в дубликатах, так, чтобы объем составлял 100 мкл на лунку. В каждый ЕЬ18А включали неиммунную сыворотку в качестве негативного контроля. Планшеты инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем четыре раза промывали раствором ТВ8твина. Для детекции использовали второе антитело, которое представляло собой меченное щелочной фосфатазой аффинноочищенное козье антитело против мышиных 1дО (специфичное к тяжелой цепи) (Ассига!е Сбет1са1 апб 8аепЦПс Согрогайоп, №ез!Ьигу, ΝΥ, Са!. №. 8ВА103004). Указанное второе антитело разводили 1:2000 ш ТВ8, а затем в каждую лунку добавляли 2% (мас./об.) обезжиренного сухого молока и 5% (об./об.) сыворотку ягненка, по 100 мкл каждого, и смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Окраску проявляли путем проведения последовательного 15-минутного инкубирования в 100 мкл субстрата, а затем в 100 мкл индикаторного фермента проявляющей ЕЫ8А-системы 1пуйтодеп (Са! №. 19589-019). Поглощение определяли при 490 нм на спектрофотометре для микропланшетов 8рес!гаМах (Мо1еси1аг Иеуюез, 8иппууа1е, СА). Титры в конечной точке вычисляли как обратную величину последнего серийного разведения, которое продуцировало увеличение оптической плотности при 490 нм до значения, превышающего среднее значение, полученное для ряда лунок негативного контроля, плюс три величины стандартной ошибки.

Клеточный иммунитет может быть измерен путем окрашивания внутриклеточных цитокинов (также называемого цитометрией внутриклеточных цитокинов) или с помощью ЕЫ8РОТ (Ье1зсб А. е! а1., Ме!1юбз 31:143-49; 2003). Оба эти метода позволяют количественно оценивать антигенспецифические иммунные ответы, хотя для фенотипической характеризации антигенспецифических СЭ4'- и СЬ8'-Тклеток может быть также одновременно использована имульсная система 1С8. С помощью таких анализов можно определять число антигенспецифических Т-клеток, секретируюющих 1Ь-2, 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-6, 1Ь10 и ΙΡΝ-γ (№и е! а1., АЮ8 Кез. Нит. Ке!гоу1г. 13:1187; 1997). Анализы ЕЫ8РОТ проводили с использованием коммерчески доступных тАЬ для захвата и детекции (К&И 8уз!етз апб Рбагттдеп), способом, описанным в литературе (№и е! а1., 1пГес!. 1ттип. 63:4933; 1995) и применяемым ранее (Хи-Атапо е! а1.,

I. Ехр. Меб. 178:1309; 1993); (Окабазб е! а1., 1пГес!. 1ттип. 64: 1516; 1996). В каждом анализе, в качестве контроля использовали митоген (Соп А) и овальбумин.

Пример 10. Экспрессия сегмента-Ь.

Как описано выше в примерах 3 и 4, сегмент \\1Ь вводили в бактериальный упаковывающий штамм в виде внехромосомно реплицирующейся плазмиды. Очевидно, что более стабильным методом экспрессии \\1Ь является интеграция в бактериальную хромосому. Усеченная копия тебЬ, не содержащая последовательности рас, может быть интегрирована в хромосому с получением прокапсид-продуцирующего штамма, и в этом случае, полноразмерная РНК сегмента-Ь дикого типа или рекомбинантного сегмента-Ь должна быть затем введена путем электропорации в интегрированные последовательности, содержащие РНК гМ и г8, для завершения упаковки всех трех сегментов. Альтернативно, полноразмерный \\1Ь может быть интегрирован в хромосому, чтобы исключить необходимость введения РНК \\1Ь путем электропорации.

Хромосомная интеграция может быть достигнута путем гомологичной рекомбинации с использованием термочувствительной плазмиды (обозначаемой далее Т8), т.е. плазмиды, которая может реплицироваться только при допустимой температуре (30°С), но не при недопустимых температурах (42°С и выше) (Кге!зсбтег е! а1., I. Вас!егю1. 124:225; 1975); (НазЫто!о апб 8ек1дисЫ, I. Вас!егю1. 127:1561; 1976). Примерами плазмид Т8 являются рМАК705, рТ8А29, рТ8С29, рТ8К29, каждая из которых представляет собой производное р8С1О1 (НатШоп е! а1., I. Вас1еио1. 171:4617; 1989); (РЫШрз, Р1азт1б 41:78; 1999).

Использование плазмид Т8 для аллельного обмена подробно описано в литературе (НазЫто1о апб 8ек1дисЫ, I. Вас!епо1. 127:1561; 1976); (НатШоп е! а1., I. Вас!егю1. 171:4617; 1989); (РЫШрз, Р1азт1б 41:78; 1999). Вкратце, последовательность \\1Ь клонировали в плазмиду Т8, так, чтобы она была фланкирована последовательностями делетируемого гена. Затем плазмиду, несущую клонированный ген, вводили путем электропорации в нужную бактерию и клетки культивировали при 42°С для образования коинтегранта, т.е. для осуществления начальной рекомбинации между гомологичными последовательностями хромосомы и плазмиды. Коинтегранты отбирали путем культивирования клеток на среде, в которую был добавлен антибиотик, маркер устойчивости к которому присутствует на этой плазмиде. Если учесть, что плазмида не реплицируется при 42°С, то, очевидно, что коинтегранты будут устойчивыми к

- 35 011282 антибиотику. Коинтегранты содержат ориджин репликации плазмиды в хромосоме, но поскольку репликация из хромосомы негативно воздействует на клетки, то эти ко-интегранты затем культивируют при 30°С в присутствии антибиотика. Таким образом, второе событие рекомбинации при 30°С (разделение) приводит к регенерации плазмиды. Затем одиночные колонии тестировали на устойчивость к антибиотику при 42°С, и в итоге было обнаружено, что колонии, чувствительные к антибиотику, больше не содержали плазмиды, интегрированной в хромосому. Для сохранения клеток плазмиды, продуцированной в результате второй рекомбинации, эти клетки культивировали при 42°С в отсутствии антибиотиков.

В другом способе, плазмида Т8 может быть использована для экспрессии МЬ, в соответствии со способом, по существу, аналогичному способу, описанному в примере 3, но сначала, эти бактерии культивировали только при допустимой температуре. Сегмент клонировали под контролем бактериального промотора, такого как Т7, с которого он экспрессировался при 30°С. После введения РНК гМ и г8 путем электропорации, эти прокапсиды, кодированные МЬ, упаковывали и реплицировали обе РНК. Затем, плазмида может быть удалена из этих клеток путем культивирования при 42°С и в отсутствии антибиотиков. Полученные клетки, не содержащие плазмиду, продолжают реплицировать РНК и могут быть использованы в качестве бактериальных вакцинных векторов, не содержащих регуляторных элементов, ассоциированных с плазмидами, таких как элементы, ответственные за сообщение устойчивости к антибиотикам.

Хотя настоящее изобретение подробно описано со ссылками на конкретные варианты его осуществления, однако, для специалиста в данной области очевидно, что в настоящее изобретение могут быть внесены различные изменения и модификации, не выходящие за рамки существа и объема изобретения.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Бактериальный штамм для упаковки, продуцирования и/или доставки генов или РНК, включающий:

a) геномную ДНК, содержащую по меньшей мере одну селектируемую фенотипическую мутацию;

b) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гены, необходимые для продуцирования нуклеокапсида;

c) один или несколько нуклеокапсидов, содержащих белки, обладающие РНК-упаковывающей и РНК-полимеразной активностью; и

б) последовательности бзРНК, содержащиеся в указанном одном или нескольких нуклеокапсидах, где указанные последовательности бзРНК кодируют, по меньшей мере:

ί) генный продукт, который комплементирует указанную, по меньшей мере одну селектируемую фенотипическую мутацию, и ίί) представляющую интерес РНК, функционально связанную с последовательностью инициации трансляции в эукариотах.
2. Бактериальный штамм по п.1, где указанные последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гены, необходимые для продуцирования нуклеокапсида, присутствуют в указанном одном или нескольких нуклеокапсидах.
3. Бактериальная клетка по п.1, где указанные последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гены, необходимые для продуцирования нуклеокапсида, присутствуют в указанной геномной ДНК.
4. Бактериальная клетка по п.1, где указанная бактериальная клетка дополнительно содержит плазмиду и где указанные последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гены, необходимые для продуцирования нуклеокапсида, являются частью указанной плазмиды.
5. Штамм по п.1, где указанные последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гены, необходимые для продуцирования нуклеокапсида, включают сегмент-Ь РНК-фага или его функциональный мутант.
6. Бактериальный штамм по п.1, где указанные последовательности бзРНК, содержащиеся в указанном одном или нескольких нуклеокапсидах, включают по меньшей мере часть сегмента-8 РНК, или сегмента-М РНК-фага или вируса, или то и другое.
7. Бактериальный штамм по п.6, где указанной частью сегмента-8 является последовательность рас сегмента-8.
8. Бактериальный штамм по п.6, где указанной частью сегмента-8 является последовательность распознавания РНК-зависимой полимеразы для сегмента-8.
9. Бактериальный штамм по п.6, где указанной частью сегмента-М является последовательность рас сегмента-М.
10. Бактериальный штамм по п.6, где указанной частью сегмента-М является последовательность распознавания РНК-зависимой полимеразы для сегмента-М.
11. Бактериальный штамм по п.1, где указанной селектируемой фенотипической мутацией является ауксотрофная мутация.
12. Бактериальный штамм по п.11, где указанная ауксотрофная мутация выбрана из группы, со

- 36 011282 стоящей из агоА-, агаС-, 1еиЭ-, азб- и тиг1-мутаций.
13. Бактериальный штамм по п.1, где указанной селектируемой фенотипической мутацией является мутация синтеза клеточной стенки.
14. Бактериальный штамм по п.13, где указанная мутация синтеза клеточной стенки выбрана из группы, состоящей из азб- и тиг1-мутаций.
15. Бактериальный штамм по п.1, где указанной селектируемой фенотипической мутацией является мутация, предупреждающая рост при температуре выше 32°С.
16. Бактериальный штамм по п.15, где указанной селектируемой фенотипической мутацией, предупреждающей рост при температуре выше 32°С, является ЫгВ-мутация.
17. Бактериальный штамм по п.1, где указанные белки, обладающие РНК-упаковывающей и РНКполимеразной активностью, и указанные последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гены, необходимые для продуцирования нуклеокапсида фага или вируса, происходят из фага, выбранного из группы, состоящей из РЫ-6, РЫ-7, РЫ-8, РЫ-9, РЫ-10, РЫ-11, РЫ-12 и РЫ-13.
18. Бактериальный штамм по п.1, где указанный бактериальный штамм происходит из видов бактерий, выбранных из группы, состоящей из СатруЫЬаЫег, №1ззепа, НаетοрЫ1из, Аегои-юназ, Бгапс1зе11а, Υе^з^η^а. К1еЬз1е11а, Βο^бе!е11а, Ьедюпе11а, Сο^νηеЬас!е^^ит, СЫатуб1а, Вгисе11а, Ρзеибοтοηаз, ^1κοЬас!ег, СйгоЬас!ег, νίόΓίο, ЕзсНепсЫа, 8Ыде11а, 8а1тοηе11а, Ь1з!епа и ΜусοЬас!е^^ит.
19. Бактериальный штамм по п.1, где указанная представляющая интерес РНК кодирует белок, выбранный из группы, состоящей из вирусного антигена, бактериального антигена, паразитарного антигена, опухолевого антигена, антигена трансплантантов, аутоиммунного антигена, адъюванта и цитокина.
20. Рекомбинантный нуклеокапсид, содержащий двухцепочечную РНК (гбзВЫ) и включающий:

a) белки, обладающие РНК-упаковывающей и РНК-полимеразной активностью; и

b) последовательности бзРНК, кодирующие, по меньшей мере:

ί) генный продукт и ίί) представляющую интерес РНК, функционально связанную с последовательностью инициации трансляции в эукариотах.
21. гбзВЫ по п.20, дополнительно содержащий последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гены, необходимые для продуцирования нуклеокапсида.
22. гбзВЫ по п.21, где указанные последовательности нуклеиновой кислоты содержат сегмент-Ь РНК-фага или его функциональный мутант.
23. гбзВЫ по п.20, где указанные последовательности бзРНК содержат по меньшей мере часть сегмента-8 РНК-фага, или сегмента-М РНК-фага, или то и другое.
24. гбзВЫ по п.23, где указанной частью сегмента-8 является последовательность рас сегмента-8, ген 8 или сегмент-8 дикого типа.
25. гбзВЫ по п.23, где указанной частью сегмента-8 является последовательность распознавания РНК-зависимой полимеразы для сегмента-8.
26. гбзВЫ πο п.23, где указанной частью сегмента-М является последовательность рас сегмента-М.
27. гбзВЫ по п.23, где указанной частью сегмента-М является последовательность распознавания РНК-зависимой полимеразы для сегмента-М.
28. гбзЕЙ по п.20, где указанный генный продукт комплементирует селектируемую фенотипическую мутацию в клетке-хозяине.
29. гбзВЫ по п.28, где указанная фенотипическая мутация выбрана из группы, состоящей из агоА-, агоС- и 1еиЭ-мутаций.
30. гбзВЫ по п.20, где указанный представляющий интерес ген кодирует мутацию синтеза клеточной стенки.
31. гбзВЫ по п.30, где указанная мутация синтеза клеточной стенки выбрана из группы, состоящей из азб- и тиг1-мутаций.
32. гбзВЫ по п.20, где указанный представляющий интерес ген кодирует мутацию, предупреждающую рост при температуре выше 32°С.
33. гбзВЫ по п.32, где указанным представляющим интерес геном является ЫгВ.
34. гбзВЫ по п.20, где указанные белки, обладающие РНК-упаковывающей и РНК-полимеразной активностью, происходят из фага, выбранного из группы, состоящей из РЫ-6, РЫ-8 и РЫ-13.
35. гбзВЫ по п.20, где указанная представляющая интерес РНК кодирует белок, выбранный из группы, состоящей из вирусного антигена, бактериального антигена, паразитарного антигена, опухолевого антигена, антигена трансплантатов, аутоиммунного антигена, адъюванта и цитокина.
36. гбзВЫ по п.20, где одна или несколько указанных последовательностей бзРНК являются фторированными.
37. Вакцинный препарат, включающий бактериальные клетки, содержащие:

a) геномную ДНК, содержащую по меньшей мере одну селектируемую фенотипическую мутацию;

b) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гены, необходимые для продуцирования нуклеокапсида;

c) один или несколько нуклеокапсидов, содержащих белки, обладающие РНК-упаковывающей и

- 37 011282

РНК-полимеразной активностью; и

б) последовательности бкРНК. содержащиеся в указанном нуклеокапсиде. где указанные последовательности РНК кодируют. по меньшей мере:

ί) генный продукт и ίί) РНК. кодирующую иммуноген. функционально связанный с последовательностью инициации трансляции в эукариотах.
38. Вакцинный препарат по п.37. где одна или несколько указанных последовательностей бкРНК являются фторированными.
39. Вакцинный препарат. включающий рекомбинантные нуклеокапсиды. содержащие двухцепочечную РНК (гбкКИ) и включающие:

a) белки. обладающие РНК-упаковывающей и РНК-полимеразной активностью; и

b) последовательности бкРНК. кодирующие. по меньшей мере:

ί) генный продукт. который комплементирует по меньшей мере одну селектируемую фенотипическую мутацию;

ίί) РНК. кодирующую иммуноген. функционально связанный с последовательностью инициации трансляции в эукариотах; и (ίίί) последовательности нуклеиновой кислоты. кодирующие гены. необходимые для продуцирования нуклеокапсида фага или вируса.
40. Способ создания рекомбинантной бактерии для ее использования в качестве бактериального упаковывающего штамма. где указанный способ включает стадии введения по меньшей мере одной селектируемой фенотипической мутации в геномную ДНК бактерии;

генетического конструирования указанной бактерии так. чтобы она содержала ДНК. кодирующую функциональные нуклеокапсидные белки фага. содержащего двухцепочечную РНК; и встраивания в указанную бактерию мРНК-сегментов. кодирующих:

(ί) по меньшей мере один ген. кодирующий функциональный продукт. который комплементирует по меньшей мере одну указанную селектируемую фенотипическую мутацию; и (ίί) функциональные нуклеокапсидные белки фага. содержащего двухцепочечную РНК.
41. Способ по п.40. где указанные мРНК-сегменты дополнительно кодируют представляющий интерес ген.
42. Мутантная бактерия. содержащая одну или несколько последовательностей ДНК. экспрессирующих бкКР-прокапсиды. и мутацию. которая позволяет проводить отбор и сохранять гбкКИ. экспрессирующие функциональный ген. комплементирующий указанную мутацию.
43. Бактериальный штамм по п.14. где указанной мутацией синтеза клеточной стенки является акбмутация.
44. Бактериальный штамм по п.17. где указанные белки. обладающие РНК-упаковывающей и РНКполимеразной активностью. и указанные последовательности нуклеиновой кислоты. кодирующие гены. необходимые для продуцирования нуклеокапсида фага или вируса. происходят из фага РЫ-8 и включают ген 8 фага РЫ-8.
45. Бактериальный штамм по п.18. где указанный бактериальный штамм происходит из 8Ыде11а.
46. Бактериальный штамм по п.19. где указанным белком является бактериальный антиген.
47. Бактериальная клетка по п.46. где указанным бактериальным антигеном является туберкулезный антиген.
48. гбкКИ по п.31. где указанной мутацией синтеза клеточной стенки является акб-мутация.
49. гбкКИ по п.34. где указанные белки. обладающие РНК-упаковывающей и РНК-полимеразной активностью. происходят из фага РЫ-8 и включают ген 8 фага РЫ-8.
50. гбкКИ по п.35. где указанным белком является бактериальный антиген.
51. гбкКИ по п.50. где указанным бактериальным антигеном является туберкулезный антиген.
52. Бактериальный штамм по п.1. где указанная представляющая интерес РНК кодирует белок. усиливающий апоптоз.
53. Бактериальный штамм по п.52. где указанный белок. усиливающий апоптоз. выбран из группы. состоящей из каспазы-8. рецептора гибели-5. Рак и гибридного белка. включающего цитоплазматические домены Рак/эктодомен ί.Ό4.
54. Бактериальный штамм по п.1. где указанная представляющая интерес РНК кодирует белок. индуцирующий толерантность.
55. Бактериальный штамм по п.54. где указанным белком. индуцирующим толерантность. является каспаза 9.
56. Рекомбинантный нуклеокапсид. содержащий двухцепочечную РНК. по п.20. где указанная представляющая интерес РНК кодирует белок. усиливающий апоптоз.
57. Рекомбинантный нуклеокапсид. содержащий двухцепочечную РНК. по п.20. где указанная представляющая интерес РНК кодирует белок. индуцирующий толерантность.
58. Бактериальный штамм по п.1. где указанная бкРНК включает РНК. устойчивую к нуклеазе.

- 38 011282
59. Бактериальный штамм по п.58, где указанной РНК, устойчивой к нуклеазе, является фторированная РНК.
60. Рекомбинантный нуклеокапсид, содержащий двухцепочечную РНК, по п.20, где указанная бкРНК включает РНК, устойчивую к нуклеазе.
61. Рекомбинантный нуклеокапсид, содержащий двухцепочечную РНК, по п.б0, где указанной РНК, устойчивой к нуклеазе, является фторированная РНК.
62. Бактериальный штамм для упаковки, запуска синтеза и продуцирования гбкКХ, включающий:

a) геномную ДНК, содержащую по меньшей мере одну селектируемую фенотипическую мутацию;

b) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гены, необходимые для продуцирования прокапсида; и

c) один или несколько прокапсидов, содержащих белки, обладающие РНК-упаковывающей и РНКполимеразной активностью.
63. Фторированные последовательности РНК для запуска синтеза гбкКХ, кодирующие, по меньшей мере:

ί) генный продукт, который комплементирует по меньшей мере одну селектируемую фенотипическую мутацию, и ίί) представляющую интерес РНК, функционально связанную с последовательностью инициации трансляции в эукариотах.
64. Фторированные последовательности РНК, кодирующие, по меньшей мере:

ί) генный продукт, который комплементирует по меньшей мере одну селектируемую фенотипическую мутацию, ίί) ген-8 (8Е0 ΙΌ ХО: 7) для стабилизации продуцирования нуклеокапсида; и ϊϊΐ) представляющую интерес РНК, функционально связанную с последовательностью инициации трансляции в эукариотах.
65. Фторированные последовательности РНК, кодирующие, по меньшей мере:

ί) гены, необходимые для продуцирования нуклеокапсида;

ίί) генный продукт, который комплементирует по меньшей мере одну селектируемую фенотипическую мутацию, и ϊϊΐ) представляющую интерес РНК, функционально связанную с последовательностью инициации трансляции в эукариотах.
66. Фторированные последовательности РНК, кодирующие, по меньшей мере:

ί) гены, необходимые для продуцирования нуклеокапсида;

ίί) генный продукт, который комплементирует указанную, по меньшей мере одну селектируемую фенотипическую мутацию, ϊϊΐ) ген-8 (8Е0 ΙΌ ХО: 7) для стабилизации продуцирования нуклеокапсида; и ίν) представляющую интерес РНК, функционально связанную с последовательностью инициации трансляции в эукариотах.
67. Среда для электропорации, состоящая из:

(ί) бактериального штамма для упаковки, запуска синтеза и продуцирования гбкКХ, включающего:

a) геномную ДНК, содержащую по меньшей мере одну селектируемую фенотипическую мутацию;

b) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гены, необходимые для продуцирования прокапсида;

c) один или несколько прокапсидов, содержащих белки, обладающие РНК-упаковывающей и РНКполимеразной активностью; и (и) фторированных последовательностей РНК, кодирующих, по меньшей мере:

a) генный продукт, который комплементирует указанную, по меньшей мере одну селектируемую фенотипическую мутацию, и

b) представляющую интерес РНК, функционально связанную с последовательностью инициации трансляции в эукариотах.
68. Среда для электропорации, состоящая из:

(ί) бактериального штамма для упаковки, запуска синтеза и продуцирования гбкКХ, включающего:

a) геномную ДНК, содержащую по меньшей мере одну селектируемую фенотипическую мутацию;

b) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гены, необходимые для продуцирования прокапсида;

c) один или несколько прокапсидов, содержащих белки, обладающие РНК-упаковывающей и РНКполимеразной активностью; и (ίί) фторированных последовательностей РНК, кодирующих, по меньшей мере:

a) генный продукт, который комплементирует указанную, по меньшей мере одну селектируемую фенотипическую мутацию,

b) ген-8 (8Е0 ΙΌ ХО: 7) для стабилизации продуцирования нуклеокапсида; и

c) представляющую интерес РНК, функционально связанную с последовательностью инициации трансляции в эукариотах.

- 39 011282
69. Среда для электропорации, состоящая из:

(ΐ) бактериального штамма для упаковки, запуска синтеза и продуцирования гбкКЫ, включающего:

a) геномную ДНК, содержащую по меньшей мере одну селектируемую фенотипическую мутацию;

b) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гены, необходимые для продуцирования прокапсида;

c) один или несколько прокапсидов, содержащих белки, обладающие РНК-упаковывающей и РНКполимеразной активностью; и (ίί) фторированных последовательностей РНК, кодирующих, по меньшей мере:

a) гены, необходимые для продуцирования нуклеокапсида;

b) генный продукт, который комплементирует указанную по меньшей мере одну селектируемую фенотипическую мутацию,

c) ген-8 (8Е0 ΙΌ ΝΟ: 7) для стабилизации продуцирования нуклеокапсида; и

б) представляющую интерес РНК, функционально связанную с последовательностью инициации трансляции в эукариотах.
70. Бактериальный штамм по п.1, где указанной по меньшей мере одной селектируемой фенотипической мутацией является необратимая селектируемая фенотипическая мутация.
71. гбкКЫ по п.28, где указанной селектируемой фенотипической мутацией является необратимая селектируемая фенотипическая мутация.
72. Вакцинный препарат по п.37, где указанной по меньшей мере одной селектируемой фенотипической мутацией является необратимая селектируемая фенотипическая мутация.
73. Вакцинный препарат по п.39, где указанной по меньшей мере одной селектируемой фенотипической мутацией является необратимая селектируемая фенотипическая мутация.
74. Способ по п.40, где указанной по меньшей мере одной селектируемой фенотипической мутацией является необратимая селектируемая фенотипическая мутация.
75. Бактериальный штамм по п.62, где указанной по меньшей мере одной селектируемой фенотипической мутацией является необратимая селектируемая фенотипическая мутация.
76. Фторированные последовательности РНК по п.63, где указанной по меньшей мере одной селектируемой фенотипической мутацией является необратимая селектируемая фенотипическая мутация.
77. Фторированные последовательности РНК по п.64, где указанной по меньшей мере одной селектируемой фенотипической мутацией является необратимая селектируемая фенотипическая мутация.
78. Фторированные последовательности РНК по п.65, где указанной по меньшей мере одной селектируемой фенотипической мутацией является необратимая селектируемая фенотипическая мутация.
79. Фторированные последовательности РНК по п.66, где указанной по меньшей мере одной селектируемой фенотипической мутацией является необратимая селектируемая фенотипическая мутация.
80. Среда для электропорации по п.67, где указанной по меньшей мере одной селектируемой фенотипической мутацией является необратимая селектируемая фенотипическая мутация.
81. Среда для электропорации по п.68, где указанной по меньшей мере одной селектируемой фенотипической мутацией является необратимая селектируемая фенотипическая мутация.
82. Среда для электропорации по п.69, где указанной по меньшей мере одной селектируемой фенотипической мутацией является необратимая селектируемая фенотипическая мутация.