KR102424707B1 - 표적단백질발현을 증가시킨 진핵세포질 내 다중항원발현용 재조합벡터 및 진핵세포 내 벡터전달시스템용 살모넬라 티피뮤리움의 조합 조성물 - Google Patents
표적단백질발현을 증가시킨 진핵세포질 내 다중항원발현용 재조합벡터 및 진핵세포 내 벡터전달시스템용 살모넬라 티피뮤리움의 조합 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 생체 치료 및 감염병 예방을 하기 위하여 셈리키 삼림열 바이러스(Semliki Forest Virus) RdRp, CMVp, SV40p, P2A를 이용하여 표지 단백질이 혁신적으로 증폭이 개선된 진핵 세포질 내 다중 항원을 발현하는 벡터 및 약독화된 능동적 살모넬라를 운반하기 위한 벡터 시스템을 확립하였으며, 본 발명의 다중 항원 발현용 재조합 벡터 및 이에 의해 형질전환된 살모넬라 티피뮤리움을 이용하면 생체 내 플라스미드 전달 및 표적 항원 발현이 효과적으로 이루어 질 수 있으므로 차세대 DNA 백신 기술로 유용하게 이용할 수 있다.
Description
본 발명은 생체 치료 및 감염병 예방을 하기 위하여 셈리키 삼림열 바이러스(Semliki Forest Virus) RdRp, CMVp, SV40p, P2A를 이용하여 표지 단백질이 혁신적으로 증폭이 개선된 진핵 세포질 내 다중 항원을 발현하는 벡터 및 약독화된 능동적 살모넬라를 운반하기 위한 벡터 시스템을 확립하였다.
현대 의학에서는 분자 생물학적으로 다양한 수단을 통해 숙주 세포로의 표적물질 전달과 유전자 치료가 이루어진다. 핵산과 분자아날로그는 만성질환과 암차료 그리고 백신 요법증강제등의 수단으로 이용된다.
또한, 유전자 돌연변이를 개선하기 위해 플라즈미드 DNA 형태의 핵산, RNA 간섭(RNAi), 또는 유전자가위, pre-mRNA 스플라이싱 기술의 응용이 사용된다. 질병이 발병하기 전에인체 무해한 대립 유전자를 대체함으로써 질병 예방을 위한유전자 치료법으로 이용 되고 있다.
그러나 인비트로(In-vitro) 및 인비보(in-vivo) 실험에서 살아있는 세포 내로 유전자 분자의 전달은 낮은 형질감염 효율 및 숙주 환경으로부터의 빠른 제거와 같은 근본적인 이유로 효과가 떨어진다. 혈청에 존재하는 핵산 분해 효소는 5분에서 60분의 반감기를 갖는 변형되지 않은 siRNA와 DNA를 약 10분 이내에 제거하는 것으로 보고되었다.
성공적인 치료 및 예방 효과를 위해서는 DNA를 표적 조직/세포로 효율적으로 전달하고, 높은 효능으로 발현하며 필요한 기간 동안 지속되도록 전략을 수립해야 한다. 이러한 측면에서, 일반적으로 사용되는 바이러스성 벡터 및 양이온성 리포좀은 생체 내에서 다양한 장벽에 도달한다. 임상 시험에도 불구하고, 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 폭스 바이러스, 파르보 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 리포좀과 같은 바이러스 벡터는 면역 인식, 돌연변이 유발에 의한 삽입 및 염증에 의한 독성으로 인해 DNA의 전달을 방해하는 근본적인 한계를 가진다.
따라서, DNA를 치료하는 동안 면역 억제 치료를 위한 동시 투여가 필수적이며, 그렇지 않으면 전달 수단에 의해 운반된 항체는 후속 치료의 효능을 현저히 감소시킬 수 있다.
또한, 바이러스 벡터는 제한된 용량을 가지므로 지속적인 발현을 유지하기가 어려울 수 있으며 바이러스를 사용한 전처리 과정은 높은 역가를 획득하기 위해 고도한 기술이 요구된다. 무엇보다도 급작스런 바이러스 감염으로 심각한 생명을 위협하는 상황에서 항생제 치료 만으로는 통제하는데 한계가 있다. 이러한 한계로 인해 바이러스 벡터를 매개로 하는 DNA의 전달은 생명을 위협하는 질병 제한된다. 박테리아를 이용한 DNA의 전달은 기존의 바이러스 또는 리포좀을 이용한 전달시스템 대비유리한 장점을 가진다. 박테리아 유전자 조작 및 배양은 기존의 벡터시스템과 비교했을 때 다루기 쉽고 경제적이다. 세포 내 각기 다른 부위에 특정 종류의 박테리아가 존재하며 예를들어 리스테리아 및 시겔라는 세포질에서 살모넬라 및 예르시니아는 액포 내부에 위치하도록 진화되었고, 아그로박테리움종은 세포 밖의 공간에위치한다.
따라서, 박테리아의 경우, 세포 내 각기 다른 부분을 표적할 수 있으며 바이러스 벡터와는 달리, 박테리아 벡터는 숙주의 면역 감시를 피해 향상된 플라스미드 DNA 전달을 할 수 있기에 병원체에 유리하도록 숙주 면역 시스템을 조작 할 수 있다.
박테리아에 의한 전신 면역 반응의 유도는 전달된 항원의 기능을 더욱 향상시킬 수 있다. 다양한 박테리아 중에서, 특히 살모넬라는 숙주 면역계를 표적으로하는 능력을 가지기에 생체 내 조건에서 효율적이며 안전한 플라스미드 DNA를 전달하는 시스템으로 이용할 수 있다.
이에 본 발명자는 효율적인 항원 전달 시스템을 확보하기 위하여, 플라스미드 벡터와 운반 가능한 살모넬라 균주를 제작했으며, 두 가지 전략이 공존하는 호스트-벡터 시스템을 구축하였다.
기존의 바이러스 및 리포좀기반 기술의 대안으로 생체 내 플라스미드 전달 및 표적 항원 발현이 효과적으로 이루어질 수 있는 벡터 및 형질전환 균주를 확보하기 위하여 셈리키 삼림열 바이러스(Semliki Forest Virus) RdRp, CMVp, SV40p, P2A를 이용하여 표지 단백질이 혁신적으로 증폭이 개선된 진핵 세포질 내 다중 항원을 발현하는 벡터 및 약독화된 살모넬라를 제공하고자 하였다.
상기 문제를 해결하기 위하여, 본 발명은 제 1 프로모터; 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 RdRp(RNA dependent RNA polymerase) 유전자 카세트; 제 2 프로모터 및 asd(aspartate-semialdehyde dehydrogenase) 유전자를 포함하는 다중 항원 발현용 재조합 벡터를 제공한다.
상기 다중 항원은 P2A 절단 서열에 의해 연결되는 것이며, 상기 P2A 절단 서열은 서열번호 1의 핵산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 제 1 프로모터는 CMV(cytomegalovirus) 프로모터인 것일 수 있다.
상기 제 2 프로모터는 SV40(simian virus 40) 프로모터인 것일 수 있다.
또한, 제 1 프로모터; 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 RdRp(RNA dependent RNA polymerase) 유전자 카세트; 제 2 프로모터 및 asd(aspartate-semialdehyde dehydrogenase) 유전자를 포함하는 제조합 벡터에 의해 형질전환된 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella Typhimurium) 균주를 제공한다.
상기 살모넬라 티피뮤리움 변이 균주는 살모넬라 티피뮤리움의 염색체 DNA에서 l on 유전자 및 cpxR 유전자를 결실시키는 것일 수 있다.
상기 살모넬라 티피뮤리움 균주는 살모넬라 티피뮤리움의 염색체 DNA에서 sifA(Salmonella-Induced Filament A) 유전자를 결실시키는 것일 수 있다.
아울러, 본 발명은 살모넬라 티피뮤리움 균주를 포함하는 약독화된 살모넬라 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 다중 항원 발현용 재조합 벡터 및 이에 의해 형질전환된 살모넬라 티피뮤리움을 이용하면 생체 내 플라스미드 전달 및 표적 항원 발현이 효과적으로 이루어 질 수 있으므로 차세대 DNA 백신 기술로 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 PCR 및 제한효소를 이용한 제작된 플라스미드 및 살모넬라 균주의 형질전환 여부를 확인한 사진이다:
(A) BamHI각 플라스미드를 절단하여 아가로스젤에 전기영동 후 GFP;1195bp, mCherry;1180bp, GFP-P2A-mCherry;1972bp 위치의 산물을 확인,
(B) PCR을 통한살모넬라 균주에 포함된 플라스미드의 코딩 유전자를 증폭하여 GFP;1195bp, mCherry;1180bp, GFP-P2A-mCherry 1972bp 위치에서 산물을 확인.
도 2는 다중 항원 전달을 위한 pJHL204 플라스미드의 구성 및 이중항원의 전달 및 발현을 확인하기 위한 모식도 및 사진이다:
(A) 다중 항원 전달을 위한 pJHL204 플라스미드의 모식도: CMV 프로모터, Semiliki Forest Virus의 RNA 의존성 RNA 중합 효소, SV40 프로모터, AmpR 또는 asd 마커 및 pBR,
(B) 이중 항원 전달을 입증하기 위해 생성된 플라스미드를 나타낸 모식도: 두 항원은 P2A 절단 서열에 의해 연결됨,
(C) RAW 세포를 사용한 이중 항원 전달 및 발현의 확인 결과.
도 3은 네이키드 DNA 및 살모넬라 전달을 통한 플라스미드의 활성을 비교한 사진이다:
(A) 정제된 pJHL206, pJHL206-GFP, pJHL206-mCherry 또는 pJHL206-GFP-P2A-mCherry 을 리포펙타민 3000을 사용하여 진핵 세포로 형질 감염시킴,
(B) RAW 세포 또는 Hek293T 세포는 JOL2420, JOL2421, JOL2422 또는 JOL2423 균주에 감염되었고, 세포는 형광 발현에 대해 관찰됨, 녹색과 적색 형광 모두에서 상대적인 발현을 확인함.
도 4는 플라스미드의 RdRp 활성 및 SV40 활성을 분석한 결과를 나타낸 그래프와 사진이다:
(A) BALB/c 마우스에 정맥 내 또는 근육 내 경로를 통해 pJHL204, pJHL204-GFP, pJHL204-GFPΔnsP4 및 pJHL204-GFPΔSV40 플라스미드들을 각각 주입하였고, 접종 12 시간 후, 복막 대 식세포를 수확하고 유세포 분석기에서 GFP의 발현을 정량화하였음,
(B) Hek293T 세포의 녹색 형광 세포의 수 및 형광 강도를 비교함,
(C) mRNA 수준에서 GFP 발현의 qRT-PCR 평가함, ***는 pJHL204 플라스미드 단독 대조군에 대한 유의한 차이를 나타내고, P <0.05 수준은 상당히 다른 것으로 간주됨.
도 5는 sifA 결실 약독화 살모넬라 균주의 특성을 확인한 사진과 그래프이다:
(A) sifA 돌연변이 전달 균주 JOL2394 및 야생형 균주 JOL401의 세포 내 모습, 액막의 유무는 노란색 화살표로 표시됨,
(B) sifA 돌연변이 전달 균주 JOL2394 및 야생형 균주 JOL401의 액틴 응축의 차이 확인함, 황색 화살표는 살모넬라 전달 균주 JOL2394의 동일한 효과가 유의미하게 낮은 반면, 야생형 균주 401에 의한 중증 감염 후 액틴 축합함,
(C) 및 (D) 비-포식 세포, Caco-2 및 식세포 RAW 세포에서 살모넬라 JOL401 및 JOL2394의 세포 독성을 조사하여 세포 사멸 수준을 정량화 하였음.
도 6은 H&E 염색을 통한 약독화 균주의 안전성을 확인한 사진이다:
JOL2394 균주의 약독화 수준을 조직 섹션을 사용하여 JOL401 Wt 균주와 비교하여 염증 징후를 확인하였고, 화살표는 대식세포의 축적으로 표시된 염증의 징후를 나타냄.
도 7은 접착, 침습, 생존 및 사이토 카인 유도의 in-vitro 평가를 확인한 그래프이다:
(A) JOL2394의 접착력 및 침입 가능성을 포식 작용(RAW 세포) 및 비-포식 세포성 HeLa 세포를 사용하여 JOL401 Wt 균주와 비교하였으며, *은 야생형 균주에 대한 JOL2394 균주 사이에 유의한 차이를 나타내고, 유의 수준은 P <0.05에서 측정됨,
(B) JOL2394 및 JOL401의 세포 내 생존 가능성을 RAW 세포 및 HeLa 세포를 사용하여 세포 내 생존 분석하였고, ***는 Wt 변형과 비교하여 유의한 차이를 나타내고, 유의 수준은 P <0.05에서 측정됨.
(C) JOL2394 백신 균주 및 JOL401 Wt 균주에 의한 사이토카인 유도(N-g, TNF-α, IL-12, IL-18 및 IL-4)를 비교하였으며, *은 야생형 변형과 비교하여 유의 한 차이를 나타내며, 유의 수준은 P <0.05에서 측정됨.
도 8은 선택된 유전자의 발현 프로파일 및 살모넬라 전달 균주의 스트레스에 따른 생존 반응을 확인한 그래프이다:
(A) 살모넬라 야생형 JOL401 및 전달 균주 JOL2394를 산화 스트레스(5 μM H2O2 )에 노출시켜 숙주 세포-유도 스트레스를 qRT-PCR 분석을 사용하여 정량화하였고, 발현 데이터는 유클리드 거리를 나타내는 클러스터 덴드로그램으로서 제시함,
(B) 살모넬라 야생형 균주 JOL401, JOL911(Δlon ΔcpxR) 및 JOL2394(Δlon ΔcpxR ΔsifA)를 산 및 산화성 H2O2 스트레스에 노출하여 감수성을 비교함, ***는 각 응력 조건에서 JOL401 변형에 대한 유의 한 차이를 나타내고, 유의 수준은 P <0.05에서 측정됨.
도 9는 살모넬라 전달 균주의 생체 내 분포 및 안전성을 평가한 결과를 나타낸 사진과 그래프이다:
(A) 살모넬라 JOL2394는 pMMP-65::GFPuv 플라스미드로 형질전환 된 다음 6시간, 24시간, 5일 후 간, 지라, 콩팥, 심장, 폐에서 발현량을 촬여하였고, 상대 확산은 각 장기에 대한 강도 플롯으로 확인함,
(B) 장기에 분포된 절대 세포 수 및 장기로부터 얼마나 빨리 멸종되는지를 야생형 JOL401 및 전달 JOL2394 균주를 사용하여 접종후 24 시간 및 5 일 후에 간, 지라, 콩팥, 심장, 폐, 뇌에서 박테리아 수를 확인하였음,
(C) 야생형 JOL401 및 전달 JOL2394 균주를 사용하여 접종한 마우스에 대하여 기간에 따라 잠재적인 사망률을 매일 모니터링 하였으며, 사망자 수는 생존 그래프로 제시함.
도 10은 마우스 장기에서 살모넬라 JOL2394의 분포 및 플라스미드의 전달을 확인한 그래프와 사진이다:
(A) 마우스 기관으로 전달되는 실제 플라스미드 수를 pJHL204-GFP 플라스미드를 호스팅하는 살모넬라 균주로 실험 감염시킨 후 비장 및 간 조직에서 Ct 수와 플라스미드 복사수를 확인함,
(B) pJHL201::lacZ 및 pJHL201lacZ에서 마우스의 간, 폐, 지라에서 살모넬라 JOL2394에 의한 플라스미드의 전달 정도를 확인함.
도 11은 네이키드 플라스미드 전달 및 살모넬라 매개 플라스미드 전달을 비교한 그래프이다;
(A) pJHL204-GFP 플라스미드를 네이키드 플라스미드 DNA 형태 또는 살모넬라 전달 시스템으로 제조하여 마우스에 접종한 다음 비장 세포, 간 세포 및 복막 대 식세포에서 플라스미드 전달 및 발현을 확이함,
***는 각 경로에 대해 플라스미드 DNA 전달 마우스와 비교하여 유의한 차이를 나타내고, 유의 수준은 P <0.05, ns:큰 차이가 없음,
(B) 살모넬라 벡터 균주는 GFP 또는 mCherry를 발현하는 각 플라스미드 작 제물로 형질전환된 것을 마우스에 투여하여 비장 및 간 세포에서 유세포를 분석함(* p <0.05. ** p <0.01.).
도 12는 생체 내 조건에서 살모넬라 매개 플라스미드 전달의 수명에 대하여 나타낸 그래프이다.
(A) BamHI각 플라스미드를 절단하여 아가로스젤에 전기영동 후 GFP;1195bp, mCherry;1180bp, GFP-P2A-mCherry;1972bp 위치의 산물을 확인,
(B) PCR을 통한살모넬라 균주에 포함된 플라스미드의 코딩 유전자를 증폭하여 GFP;1195bp, mCherry;1180bp, GFP-P2A-mCherry 1972bp 위치에서 산물을 확인.
도 2는 다중 항원 전달을 위한 pJHL204 플라스미드의 구성 및 이중항원의 전달 및 발현을 확인하기 위한 모식도 및 사진이다:
(A) 다중 항원 전달을 위한 pJHL204 플라스미드의 모식도: CMV 프로모터, Semiliki Forest Virus의 RNA 의존성 RNA 중합 효소, SV40 프로모터, AmpR 또는 asd 마커 및 pBR,
(B) 이중 항원 전달을 입증하기 위해 생성된 플라스미드를 나타낸 모식도: 두 항원은 P2A 절단 서열에 의해 연결됨,
(C) RAW 세포를 사용한 이중 항원 전달 및 발현의 확인 결과.
도 3은 네이키드 DNA 및 살모넬라 전달을 통한 플라스미드의 활성을 비교한 사진이다:
(A) 정제된 pJHL206, pJHL206-GFP, pJHL206-mCherry 또는 pJHL206-GFP-P2A-mCherry 을 리포펙타민 3000을 사용하여 진핵 세포로 형질 감염시킴,
(B) RAW 세포 또는 Hek293T 세포는 JOL2420, JOL2421, JOL2422 또는 JOL2423 균주에 감염되었고, 세포는 형광 발현에 대해 관찰됨, 녹색과 적색 형광 모두에서 상대적인 발현을 확인함.
도 4는 플라스미드의 RdRp 활성 및 SV40 활성을 분석한 결과를 나타낸 그래프와 사진이다:
(A) BALB/c 마우스에 정맥 내 또는 근육 내 경로를 통해 pJHL204, pJHL204-GFP, pJHL204-GFPΔnsP4 및 pJHL204-GFPΔSV40 플라스미드들을 각각 주입하였고, 접종 12 시간 후, 복막 대 식세포를 수확하고 유세포 분석기에서 GFP의 발현을 정량화하였음,
(B) Hek293T 세포의 녹색 형광 세포의 수 및 형광 강도를 비교함,
(C) mRNA 수준에서 GFP 발현의 qRT-PCR 평가함, ***는 pJHL204 플라스미드 단독 대조군에 대한 유의한 차이를 나타내고, P <0.05 수준은 상당히 다른 것으로 간주됨.
도 5는 sifA 결실 약독화 살모넬라 균주의 특성을 확인한 사진과 그래프이다:
(A) sifA 돌연변이 전달 균주 JOL2394 및 야생형 균주 JOL401의 세포 내 모습, 액막의 유무는 노란색 화살표로 표시됨,
(B) sifA 돌연변이 전달 균주 JOL2394 및 야생형 균주 JOL401의 액틴 응축의 차이 확인함, 황색 화살표는 살모넬라 전달 균주 JOL2394의 동일한 효과가 유의미하게 낮은 반면, 야생형 균주 401에 의한 중증 감염 후 액틴 축합함,
(C) 및 (D) 비-포식 세포, Caco-2 및 식세포 RAW 세포에서 살모넬라 JOL401 및 JOL2394의 세포 독성을 조사하여 세포 사멸 수준을 정량화 하였음.
도 6은 H&E 염색을 통한 약독화 균주의 안전성을 확인한 사진이다:
JOL2394 균주의 약독화 수준을 조직 섹션을 사용하여 JOL401 Wt 균주와 비교하여 염증 징후를 확인하였고, 화살표는 대식세포의 축적으로 표시된 염증의 징후를 나타냄.
도 7은 접착, 침습, 생존 및 사이토 카인 유도의 in-vitro 평가를 확인한 그래프이다:
(A) JOL2394의 접착력 및 침입 가능성을 포식 작용(RAW 세포) 및 비-포식 세포성 HeLa 세포를 사용하여 JOL401 Wt 균주와 비교하였으며, *은 야생형 균주에 대한 JOL2394 균주 사이에 유의한 차이를 나타내고, 유의 수준은 P <0.05에서 측정됨,
(B) JOL2394 및 JOL401의 세포 내 생존 가능성을 RAW 세포 및 HeLa 세포를 사용하여 세포 내 생존 분석하였고, ***는 Wt 변형과 비교하여 유의한 차이를 나타내고, 유의 수준은 P <0.05에서 측정됨.
(C) JOL2394 백신 균주 및 JOL401 Wt 균주에 의한 사이토카인 유도(N-g, TNF-α, IL-12, IL-18 및 IL-4)를 비교하였으며, *은 야생형 변형과 비교하여 유의 한 차이를 나타내며, 유의 수준은 P <0.05에서 측정됨.
도 8은 선택된 유전자의 발현 프로파일 및 살모넬라 전달 균주의 스트레스에 따른 생존 반응을 확인한 그래프이다:
(A) 살모넬라 야생형 JOL401 및 전달 균주 JOL2394를 산화 스트레스(5 μM H2O2 )에 노출시켜 숙주 세포-유도 스트레스를 qRT-PCR 분석을 사용하여 정량화하였고, 발현 데이터는 유클리드 거리를 나타내는 클러스터 덴드로그램으로서 제시함,
(B) 살모넬라 야생형 균주 JOL401, JOL911(Δlon ΔcpxR) 및 JOL2394(Δlon ΔcpxR ΔsifA)를 산 및 산화성 H2O2 스트레스에 노출하여 감수성을 비교함, ***는 각 응력 조건에서 JOL401 변형에 대한 유의 한 차이를 나타내고, 유의 수준은 P <0.05에서 측정됨.
도 9는 살모넬라 전달 균주의 생체 내 분포 및 안전성을 평가한 결과를 나타낸 사진과 그래프이다:
(A) 살모넬라 JOL2394는 pMMP-65::GFPuv 플라스미드로 형질전환 된 다음 6시간, 24시간, 5일 후 간, 지라, 콩팥, 심장, 폐에서 발현량을 촬여하였고, 상대 확산은 각 장기에 대한 강도 플롯으로 확인함,
(B) 장기에 분포된 절대 세포 수 및 장기로부터 얼마나 빨리 멸종되는지를 야생형 JOL401 및 전달 JOL2394 균주를 사용하여 접종후 24 시간 및 5 일 후에 간, 지라, 콩팥, 심장, 폐, 뇌에서 박테리아 수를 확인하였음,
(C) 야생형 JOL401 및 전달 JOL2394 균주를 사용하여 접종한 마우스에 대하여 기간에 따라 잠재적인 사망률을 매일 모니터링 하였으며, 사망자 수는 생존 그래프로 제시함.
도 10은 마우스 장기에서 살모넬라 JOL2394의 분포 및 플라스미드의 전달을 확인한 그래프와 사진이다:
(A) 마우스 기관으로 전달되는 실제 플라스미드 수를 pJHL204-GFP 플라스미드를 호스팅하는 살모넬라 균주로 실험 감염시킨 후 비장 및 간 조직에서 Ct 수와 플라스미드 복사수를 확인함,
(B) pJHL201::lacZ 및 pJHL201lacZ에서 마우스의 간, 폐, 지라에서 살모넬라 JOL2394에 의한 플라스미드의 전달 정도를 확인함.
도 11은 네이키드 플라스미드 전달 및 살모넬라 매개 플라스미드 전달을 비교한 그래프이다;
(A) pJHL204-GFP 플라스미드를 네이키드 플라스미드 DNA 형태 또는 살모넬라 전달 시스템으로 제조하여 마우스에 접종한 다음 비장 세포, 간 세포 및 복막 대 식세포에서 플라스미드 전달 및 발현을 확이함,
***는 각 경로에 대해 플라스미드 DNA 전달 마우스와 비교하여 유의한 차이를 나타내고, 유의 수준은 P <0.05, ns:큰 차이가 없음,
(B) 살모넬라 벡터 균주는 GFP 또는 mCherry를 발현하는 각 플라스미드 작 제물로 형질전환된 것을 마우스에 투여하여 비장 및 간 세포에서 유세포를 분석함(* p <0.05. ** p <0.01.).
도 12는 생체 내 조건에서 살모넬라 매개 플라스미드 전달의 수명에 대하여 나타낸 그래프이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 감염병에 대한 성공적인 치료 및 예방을 하기 위해 DNA를 표적 조직 및 세포로 효율적으로 전달해야하며 높은 효율로 발현하기 위하여 벡터 시스템 제작 및 개선된 약독화 살모넬라 전달시스템을 구축하였다.
구체적으로, 1) 항원 발현 강도 향상을 위해 세포질 RNA 증폭 시스템으로 구현된 pJHL204 플라스미드 시스템의 구축, 2) 개선된 항원성, 자체 억제 능력 그리고 향상된 플라스미드 전달 능력 및 안전성을 위해 설계된 플라스미드 시스템과 고효율 살모넬라 전달 시스템의 조합 등의 두 가지 측면을 결합하여 안전하고 효율적인 생체 내 사용을위한 효율적인 플라스미드 DNA 전달 및 발현을 위한 시스템을 확립하였다.
본 발명은 제 1 프로모터; 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 RdRp(RNA dependent RNA polymerase) 유전자 카세트; 제 2 프로모터 및 asd(aspartate-semialdehyde dehydrogenase) 유전자를 포함하는 다중 항원 발현용 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에서 용어 "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 생성물을 의미한다. 상기 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 것이 바람직할 수 있으며, 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점(복제 원점, replication origin), (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 선별 표지 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 포함할 수 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.
상기 다중 항원은 P2A 절단 서열에 의해 연결되는 것이며, 상기 P2A 절단 서열은 서열번호 1의 핵산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 P2A 절단 서열은 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 서열번호 1로 이루어진 핵산 서열일 수 있다.
본 발명에서 제작된 플라스미드 시스템은 P2A 절단 신호를 삽입하여 단일 벡터에서 다수의 유전자를 전달하도록 고안되었고, 셈리키 삼림열 바이러스(Semliki Forest Virus)로부터 유래된 RdRp의 활성으로 인해 RNA의 세포질 증폭이 대조군 대비 150배 증가하였으며 RdRp 결실 벡터 대비 20배 증가하는 것을 확인하였다.
상기 제 1 프로모터는 CMV(cytomegalo virus) 프로모터인 것일 수 있다.
상기 제 2 프로모터는 SV40(simian virus 40) 프로모터인 것일 수 있다.
본 발명의 다중 항원 발현용 재조합 벡터에 삽입된 초기 CMV 프로모터와 핵 내 존재하는 신호와 반응하며 RdRp 하류에 삽입된 SV40 프로모터의 폴리아데닐화 신호와 결합하여 숙주의 핵산 분해효소에 대해 견딜 수 있도록 하여 세포핵으로 이동이 용이하도록 설계하였고 이를 세포 형질감염 및 동물 감염을 통해 타겟 형광 단백질의 mRNA 정도가 5배 증가하였으며 형광 발현도 마찬가지로 확연히 증가한 것을 확인하였다.
또한, 본 발명은 제 1 프로모터; 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 RdRp(RNA dependent RNA polymerase) 유전자 카세트; 제 2 프로모터 및 asd(aspartate-semialdehyde dehydrogenase) 유전자를 포함하는 제조합 벡터에 의해 형질전환된 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella Typhimurium) 균주를 제공한다.
본 발명의 플라스미드 시스템은 임의의 선택적 항생제 마커를 포함하지 않고, 숙주-벡터 상호의존성을 asd 영양요구변이(auxotrophy)를 이용하여 구축하였기에 asd가 결실된 살모넬라는 asd 유전자를 가지는 플라스미드를 운반하므로 숙주-벡터 시스템이 살모넬라 내에서 플라스미드를 안정적으로 유지할 수 있도록 하였으며 항생제가 숙주세포에 미칠 수 있는 영향을 최소화하였다.
상기 살모넬라 티피뮤리움 변이 균주는 살모넬라 티피뮤리움의 염색체 DNA에서 lon 유전자 및 cpxR 유전자를 결실시키는 것일 수 있다.
상기 살모넬라 티피뮤리움 균주는 살모넬라 티피뮤리움의 염색체 DNA에서 sifA(Salmonella-Induced Filament A) 유전자를 결실시키는 것일 수 있다.
살모넬라의 주요 유전자인 lon 및 cpxR을 삭제함으로써 균주의 스트레스 감수성을 향상시키고 sifA 유전자를 결실하여 침습성 및 자가 억제 능력을 개선하기 위한 능동적 약독화 살모넬라 균주를 제작하여 플라스미드가 DNA 세포질 내로 효율적으로 방출되도록 하였다. 본 발명의 균주는 네이키드 DNA 백신 플라스미드에 비해 약 10배~15배 가량 전달 능력이 높게 나타났으며 안전성 평가를 통해 현저히 약독화 되었으며 마우스 감염을 통해 1주일 이내 소멸되는 것을 확인하였다.
면역학적 평가를 통해 살모넬라에 의한 전신 면역 반응의 유도를 확인함으로써 벡터만이 아닌 숙주 면역계를 표적으로 하는 박테리아를 통한 면역 활성으로 전달된 항원의 기능을 더욱 향상시킬 수 있다.
아울러, 본 발명은 살모넬라 티피뮤리움 균주를 포함하는 약독화된 살모넬라 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 백신 조성물에 있어서, 상기 약독화된 살모넬라 변이주 혼합물은 변이주 생균 또는 사균의 형태로 준비될 수 있고, 바람직하게는 변이주 생균의 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "백신"은 생체에 면역을 주는 항원을 함유한 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원 또는 항원성 물질을 말한다. 생체 내 면역은 병원균의 감염 후에 생체 내 면역력이 자동으로 얻어지는 자동 면역과 외부에서 주입한 백신에 의하여 얻어지는 수동 면역으로 크게 나누어진다. 자동 면역은 면역에 관계하는 항체의 생성기간이 길고 지속적인 면역력의 특징이 있는 반면, 백신에 의한 수동 면역은 감염증 치료에 즉시 작용하나 지속력이 떨어지는 단점이 있다.
상기 백신 조성물은 안정제, 유화제, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, pH 조정제, 계면활성제, 리포솜, 이스콤(iscom) 보조제, 합성 글리코펩티드, 증량제, 카복시폴리메틸렌, 서브바이랄(subviral) 입자 보조제, 콜레라독소, N,N-디옥타데실-N',N'-비스(2-하이드록시에틸)-프로판디아민, 모노포스포릴 지질 A, 디메틸디옥타데실-암모늄 브로마이드 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 제 2 보조제를 추가로 함유할 수 있다.
또한, 상기 백신 조성물은 수의학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어 "수의학적으로 허용 가능한 담체"란 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원 보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 작용제, 흡착 지연제 등을 포함한다. 백신용 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제로는 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다.
또한, 상기 백신용 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 드립(drip) 또는 스프레이 등의 비강용 제형 그리고 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리 에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 비강내 투여를 위한 제제에 적합한 침투제는 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 그러한 적합한 제형물은 안정성과 순응도를 위해 바람직하게 무균, 등장 및 완충되도록 제형화된다. 비강내 투여를 위한 제제는 또한 정상적인 섬모 작용을 유지시키기위해 점액 분비를 여러 측면에서 자극하도록 제조되며, 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 18th Ed.,Mack Publishing Co., Easton, PA(1990))에 기술된 바와 같이, 적합한 제형이 바람직하게 등장성의, pH 5.5 내지 6.5를 유지하는 약간 완충된 제형이며, 가장 바람직하게 항미생물 방부제 및 적합한 약물 안정화제를 포함한다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
<실시예 1>
실험 재료 및 방법
<1-1> 박테리아 균주, 플라스미드 및 프라이머 정보
본 발명에서 이용된 박테리아 균주, 플리스미드 및 프라이머는 하기 표 1 및 표 2에 기재하였다. 모든 박테리아 균주는 Lauria Bertani(LB: BD, Sparks, USA) 배양액 및 Brilliant Green Agar(BGA; BD, Sparks, USA)를 이용하여 37℃에서 배양하였다. 플라스미드 운반을 위한 Salmonella Typhimurium은 염색체의 lon과 cpxR 유전자를 결실하여 약독화하였다. 약독화 균주인 JOL911은 최소한의 변형을 이용하여 Datsanko 및 Wanner에 의해 개발된 Lambda Red 재조합 기법을 이용하여 sifA 유전자의 in-frame 결실에 사용되었다.
구체적으로, FRT-flanked chloramphenicol(Cat) 유전자는 살모넬라의 sifA 유전자 상위와 하위 시퀀스를 이용한 프라이머로 증폭하였다. 선형의 FRT-CatR-FRT는 pKD3 플라스미드로부터 증폭하고 PCR 생성물을 DpnI로 처리하여 잔여 플라스미드를 제거하였다.
정제된 선형의 PCR 생성물을 1-mm-gap BTX cuvette(Harvard Apparatus, MA, USA)를 이용하여 전기천공법으로(5 pg-0.5 μg of DNA, 2500 v, 200 Ω-600 Ω, 25 μf) pKD46가 코딩된 재조합효소 양성 균주로 형질전환하여 Cat내성 LB 배지에서 형질전환된 세포를 선별하고 sifA 유전자의 내부프라이머를 사용하여 유전자의 결실을 확인하였다. 37℃에서 배양함으로써 pKD46 플라스미드를 완전히 제거 후, 생성된 콜로니를 pCP20 플라스미드로 형질전환하여 숙주로부터 CatR 유전자를 완전히 제거하였다. sifA 유전자 내부 프라이머에 의해 완전한 결실을 확인하였으며 최종적으로 생성된 균주를 JOL2500이라 명명하였다.
| 계통/플라스미드 | 설명 | 참조 |
| 플라스미드 | ||
| pSFV3-LacZ | ampR ,SP6 promoter, pBR322 ori | 추가 유전자 |
| pcDNA 3.1 | ampR , neor , CMV promoter, SV40 promoter, f1 ori | 실험실 보유 |
| pCold-mCherry | ampR, cspA promoter, ColE1 ori | 실험실 보유 |
| pAc-EGFPc1 | kanR , CMV promoter, SV40 promoter, f1 ori | 실험실 보유 |
| pJHL201 | ampR, CMV promoter, pBR322 ori, LacZ promoter | 본 발명 |
| pJHL202 | asd+, CMV promoter, pBR322 ori | 본 발명 |
| pJHL203 | asd+, CMV promoter, MCS, pBR322 ori | 본 발명 |
| pJHL204 | asd+, CMV promoter, SV40 promoter, pBR322 ori | 본 발명 |
| pJHL204-GFP | asd+, CMV promoter, SV40 promoter, GFP, pBR322 ori | 본 발명 |
| pJHL204-mCherry | asd+, CMV promoter, SV40 promoter, mCherry, pBR322 ori | 본 발명 |
| pJHL204-GFP-P2A-mCherry | asd+, CMV promoter, SV40 promoter, GFP-P2A-mCherry, pBR322 ori | 본 발명 |
| pJHL205 | ampR, CMV promoter, MCS, pBR322 ori | 본 발명 |
| pJHL206 | ampR, CMV promoter, SV40 promoter, pBR322 ori | 본 발명 |
| pJHL206-GFP | ampR, CMV promoter, SV40 promoter, GFP, pBR322 ori | 본 발명 |
| pJHL206-mCherry | ampR, CCMV promoter, SV40 promoter, mCherry, pBR322 ori | 본 발명 |
| pJHL206-GFP-P2A-mCherry | ampR, CMV promoter, SV40, GFP-P2A-mCherry, pBR322 ori | 본 발명 |
| pJHL-204-GFPΔSV40 | asd+, CMV promoter, MCS, GFP, pBR322 ori | 본 발명 |
| JHL204-GFP△nsP4 | asd+, CMV promoter, SV40 promoter, deleted nsP4, GFP, pBR322 ori | 본 발명 |
| pJHL201△LacZ | ampR, CMV promoter, pBR322 ori, deleted LacZ promoter | 본 발명 |
| S.Typhimurium | ||
| JOL401 | Wild type of S.Typhimurium | 실험실 보유 |
| JOL2394 | ΔlonΔcpxRΔsifA mutant of S.Typhimurium | 본 발명 |
| JOL911 | ΔlonΔcpxR mutant of S.Typhimurium | 실험실 보유 |
| JOL2420 | JOL2500 containing pJHL204 | 본 발명 |
| JOL2421 | JOL2500 containing pJHL204-GFP | 본 발명 |
| JOL2422 | JOL2500 containing pJHL204-mCherry | 본 발명 |
| JOL2423 | JOL2500 containing pJHL204-GFP-P2A-Cherry | 본 발명 |
| JOL2537 | JOL2394 containing pJHL201 | 본 발명 |
| JOL2545 | JOL2394 containing pJHL201△LacZ | 본 발명 |
| JOL2546 | JOL911 containing pJHL201 | 본 발명 |
| JOL2547 | JOL911 containing pJHL201△LacZ | 본 발명 |
| Escherichia coli | ||
| DH5α | F -endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG ΦΔΔhsdR17(rK- mK+), λ- | |
| E.coli232 | F λ φ80 Δ(lacZYA-argF) endA1 recA1 hadR17 deoR thi-1 glnV44 gyrA96 relA1 ΔasdA4 |
| 계통/플라스미드 | 서열번호 | 서열(5' - 3') |
| CMV-F1 | 3 | ACATGCATGCATAGTAATCAATTACGGGGTC |
| CMV-R1 | 4 | GTATGTCACACATCCGCCAGATCTGACGGTTCACTAAACCAGC |
| CMV-F2 | 5 | TGGCGGATGTGTGACATACACGACGCCAAAAGATTTTGTTCC |
| CMV-R2 | 6 | CTCCGCCGGCGCGATGGGGACGAGGGG |
| asd-F | 7 | GGCAACGTTGGTTAGGCTTAATACCCGTG |
| asd-R | 8 | ACATGCATGCCTGATGGCTTCGCTATCATTG |
| MCS-F | 9 | CCCGGATCCGTTTAAACGGGCCC |
| MCS-R | 10 | GGGGGATCCCCCCTGCCCGGTTATTA |
| SV40-F | 11 | AGCTTTGTTTAAACGTGTGTCAGTT |
| SV40-R | 12 | GGGGGCCCGCGAAACGATCC |
| SV40-GFP-F2 | 13 | CAGGATGAGGATCGTTTCGCGCCACCATGGTGAGCAAGGG |
| SV40-GFP-R1 | 14 | CCCTTGCTCACCATGGTGGCGCGAAACGATCCTCATCCTG |
| mCherry_F | 15 | TTGGCGCGCCATGGTGAGCAAGGGC |
| mCherry-R | 16 | CCTTAATTAACTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGCCGG |
| p2A-mCherry-F1 | 17 | CCCTGATCATTGGCGCGCCGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAG |
| p2A-mCherry-R1 | 18 | CCCTTGATCATTGGCGCGCCGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAG |
| p2A-mCherry-F2 | 19 | TGGAGGAGAACCCTGGACCTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA |
| p2A-mCherry-R2 | 20 | CCTTAATTAACTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGCCGG |
| GFP-F | 21 | TTGGCGCGCCGCCACCATGGTGAGC |
| GFP-R | 22 | GGTTAATTAATTACTTGTACAGCTC |
<1-2> 동물모델과 윤리규정
모든 동물실험은 한국 동물 보호 학회 및 동물 보호법, 2007:제13조(동물 실험) 지침에 따라 전북대학교로부터 허가 받아 수행하였다(CBNU-2018-00264). 6주령의 특정 병원체가 함유되지 않은(SPF) 암컷 BALB/c 마우스(Samtako, Korea)를 플라스미드 운반 실험에 사용하였다. 모든 동물에게 항생제가 없는 음식과 물을 이용하여 사육하였다.
<1-3> RdRp를 이용하여 이중 항원의 발현 가능한 플라스미드 제작
RdRp(RNA dependent RNA polymerase)를 이용하여 여러 개의 항원 발현이 가능한 재조합 플라스미드는 pSFV3-LacZ를 통해 제작하였다.
구체적으로, CMV 프로모터와 RdRp 유전자 카세트를 overlap PCR(Bioneer, Korea)을 이용하여 제작 하여 벡터 내부의 SP6 프로모터를 CMV 프로모터로 대체함으로써 효과적인 진핵세포 시스템에서의 전사가 이루어지도록 하였다(pJHL201). 생성된 플라스미드는 진핵생물에서 이용가능 하도록 제한효소인 ASCII 및 SphI(Takara, Tokyo, Japan)를 이용하여 위해 AmpR 유전자를 asd 유전자로 대체하였고 최종산물을 pJHL202라 하였다. 벡터 내 LacZ 부분을 제거 후 다양한 유전자의 삽입을 위한 MCS 카세트(BamHI-PmeI-ApaI-BclI-PacI-SgfI-PsiI-AscI-BamHI)를 재조합하였다. P2A 절단 유전자를 이용함으로써 다양한 항원의 발현이 가능하도록 하여 삽입한 플라스미드를 pJHL203이라 한다.
또한, 효율적인 항원 발현을 위하여 RdRp가 인지하는 본래의 프로모터가 손상되지 않도록 MCS 상류에 SV40 프로모터를 추가하였다. SV40 프로모터와 RdRp 사이 이렇게 제작된 플라스미드를 pJHL204라 하였다. 항원 발현에 있어서 RdRp의 역할을 확인하기 위하여 온전한 RdRp 제작물의 nsP4 부분을 제거함으로써 RdRp 돌연변이를 제작하였다. 또한, 플라스미드 P2A 절단 펩타이드의 효과를 관찰하기 위해 각각의 GFP와 mCherry 및 GFP-P2A-mCherry 퓨전 단백질이 발현되도록 유전자를 MCS에 재조합하였다. 각 산물은 PCR 및 효소절단을 통해 확인하였다(도 1A).
<1-4>
RdRp 진핵 생물 발현 시스템에서 이중 항원의 발현 분석
제작된 pJHL204-GFP-P2A-mCherry 플라스미드의 형질주입 및 발현 효과를 네이키드 플라스미드 DNA를 이용하여 살모넬라 전달 시스템에서 평가하였다.
구체적으로, RAW 세포 및 HEK293T 세포를 10% FBS가 함유된 RPMI-1640 배지와 10% FBS가 함유된 DMEM를 각각 사용하여 96웰 플레이트에서 세포가 웰의 40% 정도 되도록 배양하였다. 세포는 웰당 1x104 세포수가 되도록 분주하였고 5% CO2 배양기에서 배양하였으며 각 플라스미드는 lipofectamine 3000(Invitrogen, CA, USA)을 이용하여 HEK293T 세포로 형질주입하였다.
또한, 전기충격법을 이용하여 동일한 플라스미드를 약독화 살모넬라 균주인 JOL2500으로 형질전환 후 JOL2423을 제작하여 대식세포인 Raw와 비대식세포인HEK293T 세포에서 이중항원의 발현을 관찰하였다. 형질전환 여부는 PCR을 이용하여 확인하였다(도 1B). 40%정도 배양된 Raw 세포에 JOL2423을 MOI40으로 하여 2시간 30분 배양하고 세포를 1xPBS로 3회 세척 후, 겐타마이신 100μg/ml을 2시간 동안농도에서 처리하여 세포 밖의잔여 박테리아를 제거하였다. 세포를 다시 1xPBS로 2회 세척하고 항생제가 함유된 배지에서 3일 동안 배양하였다. 녹색 및 적색 형광필터를 이용하여 형광 현미경(Leica, Germany) 하에서 GFP 및 mCherry의 발현을 조사 하였다.
<1-5> 시험관 내에서 RdRp의 활성 분석
표적항원 발현에 대한 RdRp 활성의 효과를 Hek293T 세포에서 조사하였다. 10%FBS가 함유된 DMEM을 이용하여 HEK293T 세포를 배양한 후 12웰 플레이트에 각 2x104 세포수가 되도록 분주하였다. 웰면적의 40%정도 배양된 세포에 pJHL204 벡터 대조군, pJHL204-GFP, pJHL204-GFP ΔRdRp(RdRp돌여변이체) 및 pJHL204-GFP Δ(SV40 돌연변이체)등의 각 플라스미드를 lipofectamine 3000으로 형질주입하였다. 세포를 3일 동안 배양하고 형광 현미경(Leica, Germany)으로 관찰하였으며 GFP mRNA 발현 수준은 qRT-PCR(Applied biosystems, ThermoFissher, Waltham, USA, USA)을 사용하여 관찰하였다. 3일 배양 후 형질 감염된 HEK293T 세포로부터 총 RNA를 분리하였다. cDNA합성 키트(Toyobo, Tokyo, Japan)를 사용하여 전체 RNA를 cDNA로 변환하고, 실시간 PCR은 기존에 이용한 프로토콜에 따라 SYBR green을 사용하여 수행하였다. GFP 발현의 상대적인 배수 변화를 계산하고 세번의 독립적 시험의 평균을 ± SD로 표현하였다.
<1-6>
sifA 결실 살모넬라의 세포 내 역할 분석
세포 내 위치한 살모넬라 JOL2394의 운명을 조사하기 위해 투과 전자 현미경 (TEM)을 수행하였다.
구체적으로, 살모넬라 JOL2394 및 야생형 균주 JOL401을 600nm 파장에서 0.6 OD로 배양 후 원심 분리를 하여 수득하였다. HeLa 세포의 단층에 40MOI의 살모넬라를 감염시키고 2시간 30분 동안 공동 배양 후, 1xPBS로 3회 세척하고 마지막으로 겐타마이신(Gentamycine)을 첨가하여 세포 외 살모넬라를 제거하였다. 감염된 세포를 수득하고 0.05M 카코딜산 나트륨(sodium cacodylate)(7.2 pH)와 2% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde), 2% 글루타르알데하이드(Glutaraldehyde) 제조한 고정 완충액으로 고정하고 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 다음날, 고정된 세포를 0.05M 카코딜산 나트륨(7.2 pH)로 3회 세척하고, 4℃에서 1시간 30분 동안 0.05M 1% osmium tetraoxide이 포함된 0.05M 카코딜산 나트륨(7.2 pH)로 고정하였다. 증류수로 세척 한 후, 4℃에서 30분 동안 0.5% 아세트산 우라닐(uranyl acetate)로 En 블록 염색을 수행하였다. 이어서, 에탄올을 이용하여 30%, 40%, 50%, 70%, 80%, 90% 및100%(3회)에서 순차적 탈수를 수행하였다. 100% Hitachi, Japan 셀로 전이 후, 펠렛을 수지 혼합물로 침윤시킨 후 60℃에서 48 시간 동안 중합시켰다. 마지막으로, 초미세박절기를 사용하여 절편을 만들고 30000 배율에서 100 kV의 가속 전압을 사용하여 투과 전자 현미경(Hitachi, Japan) 하에서 관찰하였다.
<1-7>
sifA 결실에 의한 액틴의 응축 효과 분석
HeLa 세포를 커버슬립에 배양 후 40 MOI의 JOL2394 및 JOL401 야생형 살모넬라 균주로 감염하였다. 세포를 2시간 30분 동안 배양하고 1xPBS로 3회 세척하였다. 세포를 겐타마이신으로 처리하고 8시간 이상 추가로 배양하였다. 감염된 세포가 배양된 슬라이드를 실온에서 30분 동안 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정시키고 1XPBS로 3회 세척하였다. 세포를 실온에서 10분 동안 0.01% 트리톤 X-100가 포함된 PBS으로 투과화하였다. 세척 후, 세포를 5% 소혈청 알부민(bovine serum albumin)으로 블락킹(blocking)하였다. 액틴 필라멘트를 염색하기 위해, 100μL의 1X phalloidin(Abnova, Taiwan)을 1% BSA에서 제조하고 어둠 속에서 1시간 동안 세포와 함께 배양 하였다. 핵 염색은 DAPI(Sigma, CA, USA)를 사용하여 수행하였다. 야생형 JOL401과 JOL2394는에 의한 액틴 축합 수준 및 전달 은 감염 후 0, 2, 5, 8시간이 경과함에 따라 형광 현미경(Leica, Germany)에서 관찰되었다.
<1-8> 살모넬라 벡터의 체외 안전성 분석
약독화 살모넬라 균주의 안전성은 대식세포(RAW 세포) 또는 비대식세포인 Caco2 세포에서 수행 된 세포 독성 분석에서 확인하였다.
구체적으로, 각 세포를 웰당 1 x 104 세포수로 분주하고 웰의 60-70%가 되었을 때, JOL2394 및 야생형인 JOL401 균주를 40 MOI로 접종하였다. 2시간 30분 감염 후, PBS로 3회 세척하고 겐타마이신 처리하여 세포 외 박테리아를 제거하였다. 세포 배지에 1 nM/ml Cytotox green(Essenbioscience, MI, USA) 을 첨가한 후 3일 동안 IncuCyte 라이브 영상 시스템을 이용하여 세포를 모니터링하였다. GFP의 상대적 발현은 Caco2 세포에서 측정되었다. 대식세포의 세포 독성을 프로피디움 요오드화물(propidium iodide) 염색을 이용하여 정량화하고 유세포 분석에서 정량화하였다. RAW 세포와 HeLa 세포를 사용하여 추가 접착, 침입 및 생존 분석을 수행하였다. 각 세포를 12웰 플레이트에 분주 후 배양하고 40 MOI에서 각각의 균주로 접종 하였다. 접착을 위한 배양 시간은 30분 동안 유지하고, 침습 및 생존 분석은 2시간 30분 동안 수행하였다. 각 배양 기간 후 세포를 PBS로 3회 세척하고 겐타마이신으로 처리하여 세포 외 박테리아를 제거하였다. 접착 및 침습 분석을 위한 배양 직후, 0.05% Tx 100-PBS를 첨가하여 세포를 용해시키고 5분 동안 배양하였다. 총 용해된 세포, 1ml를 수집하고 박테리아 수 계산을 위해 10배로 희석하여 배지에 도금하였다. 생존 분석을 위해, 24시간 동안 배양을 계속하고 박테리아의 수를 접착 및 침습 분석과 유사하게 계산하였다. 데이터는 각각 초기 접종원으로부터 LogCFU/ml 및 %생존율로 제시되었다. 각 실험을 두 번 반복하고 두 실험의 평균에 표준 편차를 제시하였다.
<1-9> 살모넬라 벡터의 면역학적 분석
야생형 살모넬라 JOL401 및 Vs JOL2394의 감염시 면역 조절 사이토카인의 유도는 RAW 세포에서 관찰하였다.
구체적으로, RAW 세포에 40 MOI에서 각각의 균주를 접종하고, 앞에서 설명한 한 바와 같이 2시간 30분 동안 감염을 수행하였다. 세척 및 겐타마이신 처리를 수행하고 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 37℃에서 배양하였다. 12시간 및 24시간 시점에 세포를 수확하고 cDNA 합성을 위해 총 RNA를 분리하였다. IFN-γTNF-α, IL-12, IL-18 및 IL-4의 발현 수준은 qRT-PCR(Applied biosystems)을 사용하여 수행 하였다. 하우스키핑 유전자인 GAPDH에 대해 발현 수준을 정규화하고 상대적인 배수 변화를 계산하였다.
<1-10> 살모넬라 벡터의 생체 내 안전성 분석
살모넬라 JOL2394의 생체 내 분포를 BALB/c 마우스에서 관찰하였다(n=12). 살모넬라의 생체 내 분포를 확인하기 위해, 균주를 GFPuv 플라스미드로 형질 전환시키고 꼬리 정맥을 통해 접종하였다. 마우스의 절반을 사용하여 감염된 마우스로부터 얻은장기에서 24시간 후 야생형 균주와 분포를 비교하였다. 남은 생쥐를 7일에 희생시키고 LB배지에 도말 하여 각 기관의 박테리아 집단을 측정하였다. 또한, 마우스 기관은 FOBI 생체 내 이미징 시스템 하에서 관찰하였고, 감염 후 6시간 및 24시간에 각 기관의 형광 강도를 측정하였다.
<1-11> 플리스미드 복제 수 계산
살모넬라에 의해 전달된 플라스미드의 카피 수는 접종 후 24시간 후에 마우스로부터 채취 된 비장, 간 및 복막 대식세포에서 얻은 107 세포를 사용하여 확인하였다. 세포를 수확하고, RPMI-1640 배지로 2회 세척하고, 겐타마이신을 처리하였다. 이어서 세포를 용해시키고 플라스미드 DNA를 분리하였다. 살모넬라 전달 플라스미드의 카피수는 플라스미드의 알려진 카피수에 대한 CT 값에 대해 측정된 표준 곡선으로부터 계산되었다. pJHL204-GPF 플라스미드를 10배씩 희석하여 101,102, 103, 104 및 105 플라스미드 카피수로 제조하였다. 각 카피수에 대한 각각의 CT 값은 qRT-PCR(Applied Biosystems)에 의해 결정되었다. 플라스미드 카피수와 CT 값 사이에 그래프를 작성하였다.
<1-12> 살모넬라 균의 장기 분포 및 플라스미드 전달 분석
살모넬라 돌연변이체 분포 및 각기 다른 기관으로의 플라스미드 전달 능력은 BALB/c 마우스에서 관찰하였다. pJHL204-GFP 벡터를 운반하는 야생형(Wt) 또는 ST Vs JOL2394를 마우스(n = 4)의 꼬리 정맥 또는 근육 내 경로를 통해 100㎕의 PBS에 1 x 105 CFU가 되도록 접종하였다. 접종 24시간, 48시간 감염 후생장 기관, 비장, 간, 신장, 심장, 뇌, 폐 및 내장에서의 살모넬라 분포를 CFU 수치의 10배 희석으로 열거하여 정량화하였다. 각 기관을 3 ml의 PBS에서 수확하고 균질화하였다. 균질물을 10배 희석으로 제조하고 CFU 계산을 위해 한천에 도말하고 각 기관의 박테리아 집단을 결정하였다. 살모넬라에 의한 장기-특이적 플라스미드 전달을 확인하기 위해, LacZ X-gal 염색에 의해 장기 조직에 대한 면역 조직 화학 평가가 수행되었다.
<1-13> 생체 내에서의 네이키드 플라스미드와 살모넬라 매개 전달 효율 분석
마우스 기관 및 대식세포에서의 플라스미드 전달 효능 및 분포를 비교하기 위해, 마우스 접종 연을 통해 pJHL204-GFP 플라스미드를 사용하여 네이키드 플라스미드와 살모넬라 매개 전달을 비교하였다.
구체적으로, 마우스당 1㎍의 플라스미드와 1x105 CFUST Vs를 BALB/c 마우스(n=5) 정맥 내 경로, 근육 내 경로 및 복강 내 경로에 대해 꼬리 정맥을 통해 접종하였다. 마우스를 3일 동안 면밀히 모니터링하고 관찰 기간이 끝날 때, 모든 마우스를 희생시켜 복막 대식세포, 비장 세포 및 간 세포를 수확하였다. 수확된 세포는 앞서 기술한 절차에 따라 적혈구(RBC) 용해 완충액으로 처리되었다. 세포를 PBS로 1회 및 FACS 완충액(Macsquant, Miltenyi, Germany)으로 2회 세척하였다. 200㎕에 포함된 1x105 세포를 FACS 완충액으로 재현탁하고 GFP 발현 세포 집단을 유세포 분석법(Macsquant, Miltenyi, Germany)으로 정량화하였다. 결과는 2번의 독립적인 시험의 평균 ±SD로 표현 하였다.
<1-14> RdRp 활성의 생체 내 평가
재조합 플라스미드 벡터의 RdRp 활성을 BALB/c 마우스에서 확인하였다(n=5). 각각의 플라스미드제작물인 pJHL-204, pJHL-204 GFP, pJHL-204 GFPΔnsp4 및 pJHL-204-GFPΔSV40을 JOL2500 살모넬라티피무리움(ST Vs) 균주로 형질전환시켰다. 정맥 내 또는 근육 내 경로를 위해 꼬리 정맥을 통해 100μl의 PBS에 포함된 1x105 CFU의 STVs를 사용하여 각각의 마우스에 접종하였다. 12시간의 감염 후, 복막 대식세포를 감염된 마우스로부터 수확하고, 유세포 분석에서 GFP의 발현을 정량화하였다. GFP의 상대적 발현을 STVs에 의해 전달된 각각의 플라스미드 제작물과 비교하였다.
<1-15> 생체 내에서의 살모넬라 매개 이중 항원 발현 분석
P2A 절단 서열에 의해 연결된 이중 항원의 발현 효능은 BALB/c마우스를 사용하여 평가되었다. 유전자 GFP, mCherry 및 GFP-P2A-mCherry를 함유하는 플라스미드 제작물을 마우스당 1x105 CFU의 박테리아가 포함된 100㎕ PBS를 마우스의 꼬리를 통해 정맥 내 접종하였다. 감염 24시간 후, 비장 및 간 세포를 추출하고 적색, 녹색 및 이중 형광의 발현 정도를 유세포 분석을 이용하여 정량화하였다. 실험은 두번의 독립적인 시험으로 수행되었으며 결과는 평균± SD로 표시하였다.
<1-16> 생체 내의 살모넬라 벡터 안전성 분석
살모넬라 벡터의 생체 내 안전성 평가는 JOL401(Wt) 및 JOL2394(Vs) 균주를 사용하여 마우스 접종을 통해 확인되었다.
구체적으로, 마우스당(n = 5) 박테리아 균주 1x105 CFU로 꼬리 정맥을 통해 접종하였다. 접종 후, 마우스를 5일 동안 관찰하고 체중을 측정하였으며 5일 후, 모든 마우스를 희생하여 염증 평가를 위해 간, 비장, 뇌, 심장 및 신장으로부터 조직을 채취하였다. Hematoxylin and eosin(H & E) 염색을 위해 조직 섹션을 3일 동안 10% formaldehyde-PBS 용액에 고정시켰다. 대식세포, 호중구와 같은 면역 세포의 침윤으로 표시된 염증의 수를 상대 수준으로 비교하였다.
<1-17> 통계 분석
모든 데이터는 GraphPad Prism 6.00 소프트웨어(San Diego, CA, USA)를 사용하여 분석하였다. Tukey의 다중 비교 테스트를 통한 일원 분산 분석(ANOVA)을 수행하여 유요한 값을 P값 <0.05 로하여 테스트 그룹 간의 통계적 차이를 평가하였다.
<실시예 2> 실험 결과
<2-1> RNA의존 RNA 중합 효소 활성에 기반하여 개선된 DNA 백신 벡터의 구축 및 특성 확인
플라스미드 DNA의 시험 관내(in-vitro) 및 생체 내(in-vivo) 전달은 플라스미드 벡터 및 전달 시스템의 특성에 의존한다. 또한, 전사 및 번역 효능은 플라스미드 자체의 특정한 특징에 의해 결정된다. 다수의 항원이 단일 플라스미드를 통해 전달 될 수 있다면, 시간, 자원을 절약할뿐만 아니라 항원 전달의 효능을 증가시킬수 있고 다수의 항원을 단일 표적 세포로 전달할 수 있는 특별한 기능을 가질 수 있다.
이에 항원 발현 효능을 증가시키기 위해 포함 된 몇몇 중요한 특징과 함께 다수의 항원을 전달할 수 있는 진핵 생물 DNA 플라스미드 벡터 pJHL204를 구축하였다(도 2A).
플라스미드의 기본 바탕은 pSFV3-LacZ로부터 이루어져 있으며, 효율적인 진핵 생물 내 발현을 위해 CMV 프로모터를 RdRp 서열의 상류에 두었다(pJHL201). 숙주 핵으로의 DNA의 도입 메카니즘은 효율적인 발현을 위한 비바이러스성 DNA 벡터에 있어서 필수적이며, 이는 초기 유전자 인핸서와 프로모터에 의해 제공된다.
또한, 숙주로의 전달 및 이동하는 동안 발생할 수 있는 핵산 분해효소에 의한 DNA 분해는 이에 대해 내성을 가지는 SV40 late poly(A) 신호 서열을 이용함으로써 최소화된다. 항생제 마커는 생체 내 DNA 백신 시스템에는 적합하지 않다. 따라서, 엠피실린 저항성 선택적 마커는 asd 선택적 마커(pJHL202)로 대체되었다. 다중 클로닝 부위(MCS)를 삽입하기 위해, 6개의 제한 효소 삽입 서열카세트를 RdRp서열의 하류에 위치시키고 RdRp가 인식 가능한 서열의 아래에 놓았다. 진핵 생물에서 전사의 효율을 증가시키기 위해, MCS를 Kozak서열과 프레임으로 융합시켰다. mRNA 번역을 촉진하기 위해, 효율적인 SV40 프로모터를기존의 RdRp 프로모터와 Kozak서열(pJHL204) 사이에 두었다. 단일 플라스미드 시스템에서 2개의 항원을 전달하기 위해, GFP 및 mCherry 단백질을 P2A 전사 절단 서열에 연결하고 MCS에 넣었다. 플라스미드 벡터는 RdRp의 기능적 역량을 이용하여 다중클로닝 부위(MCS)에 클로닝 된 표적 항원 mRNA의 세포질에서 효과적인증폭이 가능하도록 한다. CMV 프로모터로 인해 진핵세포 내에서 RdRp 및 유전자의 초기 전사가 효율적으로 일어났다. 전사시, mRNA는 RdRp에 의한 복제 및 번역이 이루어질 수 있는 세포질로 다시 이동한다. RdRp는 MCS와 연결된 SV40 프로모터 바로 위에 위치한 본래의 프로모터를 인식 할 수 있으며, 이는 RNA 생성물, 양성 및 음성 mRNA 가닥 모두를 증폭시켜 세포질 내에서 더 많은 양의 전사물을 생성하여 번역을 증가시킬 수 있다. pJHL204 플라스미드 내의 다수의 항원의 절단 및 발현 효능을 조사하기 위해, 2개의 마커 항원인 GFP 및 mCherry를 단일 항원 형태 및 P2A 연결된 형태로 사용하였다(도 2B).
발현 효과를 시험 관내 세포 배양을 통해 두 항원 모두 동일한 비율인 1:1로 발현하여 두 항원이 동일한 표적 세포 내에서 발현된다는 사실을 입증하였다. 또한, 이중 항원의 발현 효능을 증가시키는 데있어서 RdRp 시스템의 효능을높은 신호강도로 확인하였다(도 2C).
<2-2> 네이키드 DNA와 살모넬라 매개 플라스미드 전달 확인
플라스미드 전달의 효능은 표적 세포의 유형 및 전달 전략에 따라 달라질 수있다. 플라스미드 전달 연구에서 대식세포 및 비 대식세포를 모두 조사하는 것이 중요한다. 또한, 이들 세포주는 면역 자극의 주요 경로를 구분할 수 있는 특징을 지닌다. 비대식세포에서의 플라스미드 전달 효능은 교정의학용 DNA 전달 시스템의 사용과 유사하지만, 대식세포에서의 DNA 전달은 백신에 관한 면역 자극 효능에 중요한다. RAW 및 HEK293T 세포의 네이키드 및 살모넬라 매개 플라스미드 DNA 전달 평가의 비교는 이중 항원의 효율적인 발현을 보이지만, 살모넬라 전달 시스템은 특히 대식세포를 표적으로하고, 세포 수 및 발현 강도와 관련하여 매우 높은 수준의 항원이 발현되었다(도 3).
<2-3> 항원 발현에 있어서 RdRp 및 SV40 프로모터의 역할 확인
RdRp 및 SV40 프로모터가 포함된 플라스미드인 pJHL204의 주요 요소의 기능적 역할을 조사하는 것은 중요하며, 항원 발현 효능은 주로 이 두 요소에 의존한다. pJHL204-GFP로 수행된 시험 관내 및 생체 내 실험은 HEK293T 세포 및 마우스의 근육 내 및 정맥 내 접종 된 GFP 발현에 대하여 RdRp 및 SV40 프로모터의 역할을 확인하였다.
그 결과, 생쥐 복막 대식세포에서 GFP의 발현은 RdRp 및 SV40 프로모터의 기능을 가진 pJHL204-GFP에서 총 세포의 45%이상을 차지하는 가장 높게 발현되었다(도 4A).
SV40 프로모터의 기능이 있는 RdRp 억제 돌연변이 균주는 훨씬 더 적은 수의 GFP 발현 세포를 보인다. SV40 프로모터 결실 돌연변이 플라스미드를 접종한 마우스 그룹은 복막 대식세포에서 일반적인 정도의 GFP 발현을 보인다. 동일한 현상을 HEK293T 세포를 사용하여 RdRp 및 SV40 프로모터가 작용하는 pJHL204-GFP 플라스미드로 형질감염하고 효능을 확인함으로써 시험관내 세포 배양 모델에서 추가로 조사하였다. 돌연변이체에 의해 전달된 세포의 수는 상당히 낮았으며, SV40 프로모터 돌연변이체는 적당한 수의 발현을 보였다. 생체 내 및 시험 관내 형질 감염에서 관찰한 결과는 더 높은 수준의 항원 발현 및전달에 있어서 RdRp 및 SV40 프로모터 모두 상호적으로 관여하였다(도 4B).
또한, pJHL204-GFP의 경우 GFP mRNA 복제수에서 150배 이상 증가한 반면, RdRp 돌연변이체 및 SV40 프로모터 돌연변이체는 각각 약 10% 및 15% 증가하였다(도 4C).
<2-4> 살모넬라 전달 균주의 특성 확인
lon, cpxR 및 sifA 결실 살모넬라 돌연변이 균주는 살모넬라의 액포로부터 자기 억제 능력 및 효율적인 탈출을 통합함으로써보다 높은 수준의 항원을 전달하도록 조작되었다. 감염된 세포의 살모넬라균은 sifA 돌연변이체에서 액막의 부족으로 세포질에 균주가 존재하였다(도 5A).
또한, 돌연변이 균주는 살모넬라 균의 액포 내 생존에 유리한 액틴 재배열을 수행 할 수 없다. 야생형 JOL401 균주와 전달 균주 JOL2394를 비교하여 수행된 액틴 응축 실험 결과 JOL2394에 의한 액틴 조작이 감소하였다(도 5B).
또한, 살모넬라 감염 초기단계에서는 야생형과 sifA가 결실된 살모넬라 사이의 액틴 응축 정도가 유사하게 보이지만 후기 단계에서 sifA 돌연변이체는 SCV 및 플라스미드 전달 효능으로부터 살모넬라 탈출과 유의한 관련성을 갖는 액틴 조절에 미치는 영향이 감소한 것을 알 수 있다.
또한, 돌연변이 살모넬라 균주는 야생형에 의해 유발되는 세포 독성에 영향을 주지 않았으며 대식세포 세포에 의한 사멸로 성공적인 생체 내 플라스미드 벡터 전달에 필수적인 약독화 수준임을 확인하였다(도 5C).
아울러, 야생형 JOL401 균주보다 JOL2394 균주에서 염증의 추가 징후가 낮게 관찰됨에 따라 약독화 균주의 안전성을 확인하였다(도 6).
<2-5> 살모넬라에 의한 접착, 침입, 세포 내 생존 및 사이토카인 유도 확인
항원 전달 가능한 살모넬라 균주의 접착력 및 침습 능력 증가는 플라스미드의 성공적인 전달에 필수적이다. RAW 세포와 HeLa 세포를 통해 수행한 접착 및 침습 결과에 따르면, JOL2394 균주는 야생형 균주보다 접착 및 침습할 수 있는 잠재력이 상당히 높았다(도 7A).
그러나, 세포 내 생존은 야생형 균주보다 현저히 낮았다. lon, cpxR 및 sifA의 결실에 의해 유도된 특정 표현형은 벡터의 안전성을 도모하기 위하여 빨리 소멸해야하기 때문에 플라스미드 전달 균주로서 특히 중요한다.(도 7B).
접착, 침윤 및 생존 그리고 사이토 카인 반응의 능력에 대한 매우 높은 수준의 전염증성 반응은 플라스미드 전달에 적합하지 않기 때문에 플라스미드 전달 벡터로서 안전성 측면 및 유용성을 결정하는 요소이다. IFN-g, TNF-α, IL-12, IL-18 및 IL-4 사이토카인을 조사하기 위해 수행 된 qRT-PCR 분석은 돌연변이 균주가 IFN-g, TNF-α 및 IL-18 둘 다에 면역 유도에 유리한 수준으로 유의하게 유도됨을 밝혀냈으나, IL-12 및 IL-4는 야생형 JOL401 균주와 비교하여 유의미하게 변화되지 않았다(도 7C).
<2-6> 살모넬라 전달 균주의 독성 유전자 유도 및 스트레스에 대한 취약성 확인
lon, cpxR, sifA 유전자의 결실은 살모넬라 Salmonella Pathogenicity Island I(SPI-1)에 위치한 여러가지 독성 유전자의 발현을 유의하게 증가시켰다(도 8A).
SPI-1 유전자의 증가는 JOL2394 균주의 접착력 및 침습 능력에 의해 증가 된 독성과 연관이 있다. 또한 살모넬라의 두 가지 유전자로 구성된 cpxR 스트레스 반응 시스템의 제거로 인한 산화 및 H2O2 스트레스 조건에 대한 민감성이 증가함에 따른 빠른 세포 내 사멸을 확인하였다(도 8B).
<2-7> 생쥐의 장기에서 살모넬라 균주 생체 내 전달 및 생존 확인
살모넬라 돌연변이 균주의 생체 내 분포 동역학을 조사하기 위해, 마우스를 이용하여전신 감염이 가능하도록 꼬리 정맥을 통해 균주를 접종 하였다. 접종 후 6시간 및 24시간에 형광 발현 정도를 관찰한 결과 특히 간에서 높은 수치가 관찰되었다. 짧은 기간 생체 내 접종 하는 동안, 야생형 균주 JOL401 및 전달 균주 JOL2394는 마우스의 다양한 중요장기에 분포함을 알 수 있었다. 그러나, 7일째에 수행 된 장기 회복 연구에서는 약화된 JOL2394 균주에 대해 모든 기관에서2 LogCFU/ml이하의 상당히 낮은 수를 나타내었고, 야생형 균주는 7 LogCFU/ml를 초과하여 생쥐에서 발병 및 죽음까지 이르게 하였다(도 9A 및 9B).
또한, 접종 후 10일이 되기 전에 모든 JOL401 감염 마우스가 죽는 것을 관찰하였다(도 9C).
<2-8> 살모넬라 전달 균주의 생체 내 플라스미드 전달 능력 확인
살모넬라 JOL2394 균주에 의해 주요 기관, 비장 및 간으로 전달되는 플라스미드의 수를 확인하기 위해, pJHL201-lacZ로 형질전환된 JOL2394 균주를 사용하였다. 플라스미드 복제수를 Ct수와 복제수 사이의 보정 곡선으로 만든 다음, 이를 기반으로 한 수식을 사용하여 생체 내 플라스미드 전달 능력을 비장 및 간 조직을 사용하여 측정하였다(도 10A).
또한, X gal 염색을 통해 면역 조직 화학적 염색으로 각 비장, 간, 폐 및 장 조직의 조직 절편에서 lacZ가 포함된 플라스미드의 전달 및 발현을 확인하였다(도 10B).
또한, 마우스 모델에서네이키드 DNA 전달 및 살모넬라 매개 DNA 전달을 비교 한 결과, 살모넬라균은 특히 림프계의 장기 및 세포를 표적화할 수 있으며, pJHL204-GFP 플라스미드의 전달은 살모넬라에 의해 높은 수준의 발현을 보였다. (도 11A 및 11B). 접종된 마우스로부터 획득한 복막 대식세포에서 더 높은 형광의 발현이 관찰되는데, 이는 항원 제시 세포의 일종으로 살모넬라의 표적 대식세포임을 알 수 있다.
또한, 살모넬라 전달 시스템이비장 및 간에서 이중 항원을 전달하며 효과적으로 발현하고 절단이 이루어짐을 확인함에 따라 생체 내 시스템에서 마찬가지로 효과적으로 작용함을 입증하였다(도 11B).
<2-9> 살모넬라 매개 플라스미드 전달의 수명
생체 내 조건에서 플라스미드 전달의 수명은 플라스미드 전달의 중요한 특징 및 그 치료 효과를 설명한다. 바이러스 및 리포좀 기반 전달 시스템의 주요 약점 중 하나는 동물 숙주 내에 짧은 기간 존재할 수 있다는 것이다. 살모넬라 전달 시스템의 플라스미드 발현 효능을 조사하고, 동물 모델 내에서 완전한 제거가 이루어지기까지 살모넬라 균주의 총 지속 시간 동안 플라스미드의 지속적인 존재 및 전달을 관찰하였다. 접종 후 7일 및 14일에, 26~32%의 복막 대식세포에서 GFP의 발현이 유지됨에 따라 살모넬라 균주가 존재함으로써 플라스미드 또한 발현이 지속됨을 알 수 있었으며 이는 치료 수단에 있어서 이용 가능한 기간이 증가함이 확인되었다(도 12).
<110> Jeonbuk National University Industry-Academic Collaboration Foundation
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cytosol and an attenuated Salmonella Typhimurium as the vector
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<213> Artificial Sequence
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<223> P2A amino acid
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1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
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ggttaattaa ttacttgtac agctc 25
Claims (8)
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- 삭제
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- CMV(cytomegalo virus) 프로모터; 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 RdRp(RNA dependent RNA polymerase) 유전자 카세트; V40(simian virus 40) 프로모터 및 asd(aspartate semialdehyde dehydrogenase) 유전자를 포함하는 다중 항원 발현용 제조합 벡터에 의해 형질전환된 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella Typhimurium) 균주로서,
다중 항원은 서열번호 1의 핵산 서열로 이루어진 P2A 절단 서열에 의해 연결되는 것이고,
살모넬라 티피뮤리움 변이 균주는 살모넬라 티피뮤리움의 염색체 DNA에서 lon, cpxR 및 sifA(Salmonella-Induced Filament A) 유전자를 결실시킨 것인 형질전환된 살모넬라 티피뮤리움 균주. - 삭제
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