KR20100085905A - 타입 ｉ 인터페론 반응 억제제의 발현에 의한 바이러스-계 백신 벡터로부터 형질전이 유전자 발현의 증강 - Google Patents

Abstract

바이러스-계 벡터는 형질전이 유전자 발현을 증강시키기 위해 항-바이러스 면역체계의 억제제(예컨대, 타입 I 인터페론 반응의 억제제)를 발현시키도록 유전적으로 조작된다. 형질전이 유전자는 항원 또는 기타 치료제를 암호화할 수 있다.

Description

타입 Ｉ 인터페론 반응 억제제의 발현에 의한 바이러스-계 백신 벡터로부터 형질전이 유전자 발현의 증강{Enhancement of transgene exression from viral based vaccine vecors by expression of suppressors of thetype I interferon response}

본 발명은 일반적으로 바이러스-계 벡터로부터 형질전이 유전자 발현의 증강에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 숙주세포 활성 반응(예컨대, 면역자극, 치료, 또는 선택적 세포자멸)을 제공하여 형질전이 유전자 발현을 증강시키는 관심 유전자와 함께, 타입 I 인터페론 반응의 유전적으로 조작된 억제제를 암호화하는 바이러스-계 벡터를 제공한다.

선천성 면역체계는 세균 또는 바이러스를 비롯한 침투하는 병원체에 대한 제일선의 방어 체계로 작용한다. 진핵세포는 톨-유사 수용체(TLRs), 노드-유사(뉴클레오티드-결합 올리고머화 도메인) 수용체, 및 RNA 헬리케이즈 RIG-I(레티노산-유도성 유전자-I) 및 MDA5(흑색종 분화 관련 유전자 5)와 같은 수많은 세포 표면 및 세포 내 배자계열(germline)-암호화된 양상-인식 수용체(PRRs)를 통해 바이러스 및 미생물의 성분을 인식하는 고유의 능력을 갖는다. 이러한 수용체에 의한 바이러스성 또는 세균성 성분의 결합은 항세균성 및 항바이러스성 효과기의 상향-조절 및 생산을 매개한다. 적응성 면역체계를 진화시킨 턱이 있는 척추동물은 또한 감염 존재의 자가분비 및 주변분비 신호전달에 기여하고 바이러스 및 세포 내 세균을 비롯한 감염원에 대한 보호를 제공하는 세포들 사이의 의사소통을 용이하게 하는 인터페론 사이토카인 패밀리를 발달시켰다. 유사하게, 이들은 세포 과정의 중단 또는 외래 성분의 분해에 의해 감염을 제한하도록 의도된 감염된 세포 내 기작을 활성화시킬 수 있다. 인터페론(IFN)-α 및 -β는 처음에 타입 I IFN 패밀리를 포함하고 세포에 항바이러스 상태를 부여하는 체액 인자로서 확인되었다. 이들 중에서 타입 1 IFNs의 항바이러스 작용에 필수적인 자가분비 IFN-유도된 효과기 및 조정자 단백질은 RNA-의존성 단백질 키나아제(PKR), 2,5'-올리고아데닐레이트 합성효소(OAS), RNase L, 및 Mx 단백질 GTPase이다. 이중-가닥 또는 고도로 구조화된 RNA는 각각 RNA를 분해하는 RNA 번역 및 OAS-의존성 RNase L을 정지시키는 IFN-유도된 PKR 키나아제에 의한 단백질 인산화 및 RNA 분해를 조절하는데, 또한 IFN-유도된 RNA-특이적 아데노신 디아미나제(ADAR1)에 의한 RNA 교정에 중심적인 역할을 한다. IFN-α/β의 발현은 IFN 조절 인자(IRF) 패밀리의 전사 인자에 의해 효과적으로 제어된다. 예를 들어, 각각 TLR3 및 TLR4에 의해 인식될 때, 이중-가닥 RNA 및 지질다당질은 IRF-3 및 IRF-7 활성화를 초래하고; TLR7 및 TLR9는 단일-가닥 RNA 및 CpG DNA를 검출하고 또한 IRAK 1/4 및 TRAF6을 포함하는 MyD88-의존성 경로를 통해 IRF-5 및 IRF-7을 자극한다.

포유동물의 대부분의 성공적인 바이러스 병원체는 이러한 자가분비 및 주변분비 반응을 차단하고, 이들이 감염을 확립하는 것을 가능케 하는 기작을 발전시켜왔다. 더욱이, 특정 바이러스 또는 이중-가닥 RNA는 어댑터 분자 IPS-1(인터페론-프로모터 자극기 1)을 통해 세포질 RNA 헬리케이즈 RIG-I 및/또는 MDA5를 통해 신호를 전달하고, 그로 인해 특정 반응 유전자의 IRF-3 및 IRF-7 의존성 전사를 자극하는, TLR-비의존성 PRR 반응을 활성화시킨다. 이러한 반응을 극복하도록 진화된 바이러스성 단백질의 예시에는 IRF-3에 결합하고 핵 전위를 방지하는 로타바이러스의 NSP1 단백질, IFN-α/β에 결합하는 엑트로멜리아 바이러스의 C12R 단백질, IRF-3의 핵 전위를 방지하고 RIG-I 의존성 신호전달을 방해하는 인플루엔자의 NS1, 및 IFN-α/β 전사의 신호전달에 관여하는 MAV 및 TRIF 단백질을 특이적으로 절단하는 C형 간염 바이러스의 NS3/4A 프로테아제가 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.

백신은 많은 질병의 발생을 근절하거나 감소시키는데 성공적이었다. 그러나, 일부 질병은 지금까지 면역화 노력에 내성을 나타내는 것으로 입증되었다. 다른 질병에 대해, 현재 사용되고 있는 백신은 최적으로 효과적이지 않고/않거나 원치 않는 부작용을 나타낸다. 따라서, 백신 고안에 대한 새로운 접근법이 계속 요구되고 있다. 자연적으로 진핵세포를 감염시킬 수 있는 약독화된 백신을 기반으로 하는 벡터의 사용이 특히 유망하다. 이러한 벡터는 관심 항원을 암호화하는 형질전이 유전자를 포함하고 발현하도록 용이하게 유전적으로 조작될 수 있다. 불행히도, 많은 사례에서 이러한 벡터의 투여는 수용자에서 보호적 면역반응을 촉발하기에 충분한 항원의 생산을 유발하지 않는다. 이는 주로 백신 벡터로 감염된 숙주세포가 바이러스성 감염체와 약독화된 바이러스성 백신 벡터를 구별하지 못하기 때문이다. 숙주세포는 진정한 감염체인 것처럼 백신 바이러스 벡터와 반응하고: 세포는 암호화된 항원을 생산하는 백신 벡터의 능력을 파괴하거나 약화시켜, 백신 투여의 목적을 무력화시키는, 면역반응, 특히 EFN I 반응을 작동한다. 현존하는 백신 전달 담체를 새롭게 개발하고 향상시키고, 특히 바이러스-계 백신 벡터에 의한 항원의 생산을 방해하는 숙주의 문제점을 해결하고자 하는 요구가 계속되고 있다.

본 발명은 숙주세포 활성 아미노산 서열(때로는 본 명세서에서 "암호화된 인자"로 언급되고, 효소, 항원, 항체, 치료제, 세포자멸 제제(예컨대, TNF), 암 또는 종양 사멸 제제 등을 포함하는 하나 이상의 관심 단백질 또는 펩티드일 수 있음)을 암호화하는 핵산 서열을 포함하도록 유전적으로 조작되는 것에 더하여, 이들은 또한 포유동물 항-바이러스 면역반응(때로는 본 명세서에서 "억제 인자" 또는 "간섭 입자"로 언급됨)을 억제하는 인자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하도록 유전적으로 조작된 바이러스 벡터를 제공한다. 예를 들어, 바이러스 벡터 내 암호화된 인자들은 결핵 또는 기타 질환(말라리아, 인간 면역결핍, 인플루엔자, 뎅기 등)에 특이적인 하나 이상의 항원일 수 있다. 벡터는 또한 바이러스에 대한 포유동물 IFN I 반응을 억제하는 억제 인자를 암호화하도록 유전적으로 조작될 것이다. 그 결과, 벡터에 의해 암호화되는 항원은 간섭 없이 또는 숙주세포의 항-바이러스 면역반응에 의한 감소된 간섭으로 진핵 숙주세포 내에서 전사되고 번역된다. 따라서, 인간 또는 기타 포유동물에서 면역자극 반응을 유발하는 능력이 증가한다. 본 발명은 또한 숙주세포의 항-바이러스 면역반응에 의한 간섭이 없거나 간섭이 감소될 것이기 때문에 바이러스 벡터를 사용하여 관심 단백질(예컨대, 인슐린, 종양 괴사 인자 등)의 증대된 전달을 위한 적용을 고려한다.

본 발명의 목적은 숙주세포 타입 1 인터페론(DFN) 반응 억제 인자를 암호화하는 하나 이상의 유전적으로 조작된 핵산; 및 하나 이상의 숙주세포 활성 아미노산 서열을 암호화하는 하나 이상의 유전적으로 조작된 핵산을 포함하는, 재조합 바이러스 벡터를 제공하는 것이다. 하나 이상의 숙주세포 활성 아미노산 서열을 암호화하는 하나 이상의 유전적으로 조작된 핵산은 숙주세포 내에서 과 발현된다. 본 발명의 일 실시형태에서, 숙주세포 타입 1 IFN 반응 간섭 인자는 로타바이러스 NSP1 또는 인플루엔자 바이러스 NS1이다. 다른 실시형태에서, 숙주세포 타입 IFN 반응 간섭 인자는 로타바이러스 NSP1, 인플루엔자 바이러스 NS1, 엑트로멜리아 바이러스 C12R 단백질, C형 간염 바이러스 NS3/4A 프로테아제, 우두 바이러스 vIFN-α/β Rc 단백질, 아데노바이러스 E1A 단백질, 파라믹소바이러스의 C 단백질, 또는 인간 파필로마바이러스(HPV) E6 종양단백질이다. 또 다른 실시형태에서, 재조합 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 베큘로바이러스, 폭스 바이러스, 홍역 바이러스, 폴리오바이러스, 렌티바이러스, 간염 바이러스, 아르보바이러스 또는 수포성 구내염 바이러스(또는 매우 다양한 기타 바이러스)로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 암호화된 인자들은 로타바이러스, 인플루엔자 바이러스, 엑트로멜리아 바이러스, 간염 바이러스(예컨대, C 등), 우두 바이러스, 아데노바이러스, 파라믹소바이러스, HPV, HIV, HTLV, 엔테로바이러스, 헤르페스바이러스, EEE, VEE, 서부 나일강 바이러스, 노르워크 바이러스, 파르보바이러스, 뎅기 바이러스, 및 출혈열 바이러스(또는 매우 다양한 기타 바이러스)의 하나 이상으로부터 유래되는 하나 이상의 면역자극성 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 숙주세포 활성 아미노산 서열은 항원, 예컨대 결핵균 항원이다. 암호화된 인자들은 또한 효소, 치료적 펩티드 또는 단백질, 세포자멸 제제 또는 항암제 등일 수 있고, 이 경우 암호화된 인자들의 특성은 적용에 좌우될 것이다.

본 발명의 다른 목적은 세포에게 생체 내 또는 시험관 내(예컨대, 인간과 같은 포유동물 내) 하나 이상의 숙주세포 활성 아미노산 서열을 제공하기 위해, 숙주세포 타입 1 IFN 반응 억제 인자를 암호화하는 하나 이상의 유전적으로 조작된 핵산; 및 하나 이상의 숙주세포 활성 아미노산 서열을 암호화하는 하나 이상의 유전적으로 조작된 핵산을 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 제공하는 것이다. 세포가 재조합 바이러스 벡터로 감염되면, 세포가 재조합 바이러스에 효과적인 포유동물 IFN I 반응을 작동하는 능력이 사라지거나 능력이 감소될 것이기 때문에 아미노산의 더 많은 생산이 유발될 것이다. 하나 이상의 숙주세포 활성 아미노산 서열을 암호화하는 하나 이상의 유전적으로 조작된 핵산은 숙주세포에서 과 발현된다. 본 발명의 일 실시형태에서, 숙주세포 타입 1 IFN 반응 간섭 인자는 로타바이러스 NSP1 또는 인플루엔자 바이러스 NS1이다. 다른 실시형태에서, 숙주세포 타입 IFN 반응 간섭 인자는 로타바이러스 NSP1, 인플루엔자 바이러스 NS1, 엑트로멜리아 바이러스 C12R 단백질, C형 간염 바이러스 NS3/4A 프로테아제, 우두 바이러스 vIFN-α/β Rc 단백질, 아데노바이러스 E1A 단백질, 파라믹소바이러스의 C 단백질, 또는 인간 파필로마바이러스(HPV) E6 종양단백질이다. 또 다른 실시형태에서, 재조합 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 베큘로바이러스, 폭스 바이러스, 홍역 바이러스, 폴리오바이러스, 렌티바이러스, 간염 바이러스, 아르보바이러스 또는 수포성 구내염 바이러스(또는 매우 다양한 기타 바이러스)로부터 유래된다. 또 다른 실시형태에서, 암호화된 인자들은 로타바이러스, 인플루엔자 바이러스, 엑트로멜리아 바이러스, 간염 바이러스(예컨대, C 등), 우두 바이러스, 아데노바이러스, 파라믹소바이러스, HPV, HIV, HTLV, 엔테로바이러스, 헤르페스바이러스, EEE, VEE, 서부 나일강 바이러스, 노르워크 바이러스, 파르보바이러스, 뎅기 바이러스, 및 출혈열 바이러스(또는 매우 다양한 기타 바이러스)의 하나 이상으로부터 유래되는 하나 이상의 면역자극성 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 숙주세포 활성 아미노산 서열은 항원, 예컨대 결핵균 항원이다. 암호화된 인자들은 또한 효소, 치료적 펩티드 또는 단백질, 세포자멸 제제 또는 항암제 등일 수 있고, 이 경우 암호화된 인자들의 특성은 적용에 좌우될 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 더 많거나 더 적은 양의 타입 1 IFN 반응을 선택적으로 제공하기 위해, 숙주세포, 생체 내에서 또는 시험관 내에서, 숙주세포 내에서 반응을 맞춤하는 기작을 제공하는 것이다. 서로 다른 타입 1 IFN 억제 인자들 사이로부터의 선택에 의해, 억제 인자; 및 하나 이상의 숙주세포 활성 아미노산 서열을 암호화하는 하나 이상의 유전적으로 조작된 핵산을 갖는 재조합 바이러스 벡터가 제공될 수 있다. 맞춤형 재조합 바이러스 벡터가 바이러스 벡터 내로 유전적으로 조작된 간섭 인자에 따라서 더 많거나 더 적은 양으로 생체 내 또는 시험관 내에서(예컨대, 인간과 같은 포유동물에서) 세포에 하나 이상의 숙주세포 활성 아미노산 서열을 제공할 수 있다. 맞춤은 또한 서로 다른 프로모터들로부터 선택하고, 관심 단백질을 암호화하는 핵산의 부가적인 복제를 제공함에 의해, 그리고 기타 수단에 의해 달성될 수 있다. 세포가 재조합 바이러스 벡터로 감염되면, 세포는 재조합 바이러스에 효과적인 포유동물 IFN I 반응을 작동하는 능력이 사라지거나 능력이 감소될 것이기 때문에 아미노산의 더 많은 생산이 야기될 것이다. 증가된 생산량은 일부 적용에서는 현저히 더 높은 생산이 달성될 수 있는 반면, 다른 적용에서는 단지 약간 더 높은 생산이 달성될 수 있도록, 재조합 바이러스 벡터를 제조하는데 사용되는 맞춤에 의해 조절될 수 있다. 본 명세서에서 고려되는 맞춤은 숙주세포 내에서 암호화된 인자들의 낮은 생산부터 높은 생산까지의 완전한 스펙트럼을 고려한다. 하나 이상의 숙주세포 활성 아미노산 서열을 암호화하는 하나 이상의 유전적으로 조작된 핵산은 사용된 맞춤에 의해 조절되는 수준으로 숙주세포 내에서 과 발현된다. 본 발명의 일 실시형태에서, 숙주세포 타입 1 IFN 반응 간섭 인자는 로타바이러스 NSP1 또는 인플루엔자 바이러스 NS1이다. 다른 실시형태에서, 숙주세포 타입 EFN 반응 간섭 인자는 로타바이러스 NSP1, 인플루엔자 바이러스 NS1, 엑트로멜리아 바이러스 C12R 단백질, C형 간염 바이러스 NS3/4A 프로테아제, 우두 바이러스 vIFN-α/β Rc 단백질, 아데노바이러스 E1A 단백질, 파라믹소바이러스의 C 단백질, 또는 인간 파필로마바이러스(HPV) E6 종양단백질이다. 또 다른 실시형태에서, 재조합 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 베큘로바이러스, 폭스 바이러스, 홍역 바이러스, 폴리오바이러스, 렌티바이러스, 간염 바이러스, 아르보바이러스 또는 수포성 구내염 바이러스 또는 매우 다양한 기타 바이러스로부터 유래된다. 또 다른 실시형태에서, 암호화된 인자들은 로타바이러스, 인플루엔자 바이러스, 엑트로멜리아 바이러스, 간염 바이러스(예컨대, C 등), 우두 바이러스, 아데노바이러스, 파라믹소바이러스, HPV, HIV, HTLV, 엔테로바이러스, 헤르페스바이러스, EEE, VEE, 서부 나일강 바이러스, 노르워크 바이러스, 파르보바이러스, 뎅기 바이러스, 및 출혈열 바이러스(또는 매우 다양한 기타 바이러스)의 하나 이상으로부터 유래되는 하나 이상의 면역자극성 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 숙주세포 활성 아미노산 서열은 항원, 예컨대 결핵균 항원이다. 암호화된 인자들은 또한 효소, 치료적 펩티드 또는 단백질, 세포자멸 제제 또는 항암제 등일 수 있고, 이 경우 암호화된 인자들의 특성은 적용에 좌우될 것이다.

본 발명은 숙주세포 내에서 활성인 하나 이상의 관심 아미노산 서열(예컨대, 단백질, 펩티드, 효소, 또는 기타 암호화된 인자 또는 제제)을 암호화하는 핵산 서열을 포함하도록 유전적으로 조작되는 것에 더하여, 또한 바이러스에 대한 숙주세포 면역반응을 억제하는 하나 이상의 인자들(본 명세서에서 "억제 인자" 또는 "간섭 입자"로 언급됨)을 암호화하는 핵산 서열을 포함하도록 유전적으로 조작된, 바이러스 벡터의 개발을 근거로 한다. 따라서, 바이러스성 백신 벡터로 감염된 포유동물 숙주세포는 숙주세포의 항-바이러스 면역반응에 의해 방해되거나 억제되지 않고 관심 단백질(들)을 생산한다. 아미노산은 유전적으로 조작된 핵산으로부터 발현되고 숙주세포 활성으로, 즉 이들은 숙주세포에 유익한 활성(특성, 특징 등)을 보유한다. 일부 실시형태에서, 아미노산은 항원이고, 면역반응 억제제가 또한 벡터로부터 발현되는 세포 내에서 이들 항원의 증가된 발현은 항원에 대한 개선된 세포성 및 체액성 면역반응을 유발한다. 또한, 형질전이 유전자 발현에 있어서의 개선은 또한 적당한 면역반응을 달성하는데 요구되는 벡터 투여량의 감소를 허용할 수 있다. 다른 실시형태에서, 암호화된 인자들은 사실상 다른 방법으로 치료적일 수 있다. 본 명세서에서, 용어 "치료적"은 항원은 아니지만, 숙주세포 내에서 일부 다른 유익한 효과를 갖는 인자들을 지칭하는데 사용된다(예를 들어, 인자, 인자 VIII 및 기타 펩티드는 "치료적"임). 암호화된 인자들은 또한 선택적으로 세포자멸성일 수 있고(예컨대, TNF) 항암제로 작용할 수 있다.

만약 숙주세포의 면역반응을 억제하는 간섭 입자(보통 단백질)가 바이러스 기원이라면, 이들은 이종 유래(즉, 바이러스 백신 벡터와 다른 바이러스 타입으로부터 유래하거나 기원함) 또는 동종 유래(즉, 동일한 타입의 바이러스로부터 유래하거나 기원함)일 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스 벡터는 예를 들어, 이종 유래 바이러스, 예컨대 인플루엔자 바이러스 유래의 면역체계 억제제를 포함하고 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 대안적으로, 아데노바이러스 벡터는 바이러스 벡터가 이미 본래 이 억제제를 암호화한다고 하더라도, 동종 유래 아데노바이러스 면역체계 억제제를 포함하고 과발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 후자의 경우에, 동종 유래 면역체계 억제제는 기원의 바이러스 내 또는 본 발명에 따라 유전적으로 조작되기 전의 바이러스 벡터 내 발현의 정상적 또는 특징적 수준보다 높은 수준으로 유전적으로 조작된 벡터 내에서 과발현된다. 이는, 예를 들어, 억제제를 암호화하는 유전자의 다중 복제를 포함하도록 바이러스 벡터를 유전적으로 조작함으로써, 또는 억제제의 전사가 더욱 효과적인 프로모터(예컨대, 수퍼 프로모터)에 의해 유도되도록 바이러스 벡터를 유전적으로 조작함으로써, 또는 이들 전략의 조합에 의해 달성된다.

본 발명의 추가적인 태양은 수용체 숙주세포 내에서 면역체계 억제 인자의 양 또는 활성을 요구되는 수준으로 맞춘 "조정된(tuned)" 또는 "조정가능한(tunable)" 바이러스 벡터의 제공이다. 이러한 조정은, 예를 들어, 면역반응을 억제하는 하나 이상의 인자들의 동질성 및/또는 발현 양상을 조작하거나 변경함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 인자 또는 관심 단백질의 전사를 유도하는 프로모터는, 만약 높은 수준의 전사가 바람직하다면, 매우 활성인 프로모터를 사용하고, 만약 낮은 수준의 전사가 바람직하다면, 약한 프로모터를 사용하여, 전사의 요구되는 수준이 달성되도록 선택될 수 있다. 또한, 면역반응의 특정 경로는 선택된 경로를 편협하게 또는 특이적으로 억제하는 인자들의 감별 발현에 의해 특이적으로 표적될 수 있다. 예를 들어, 인플루엔자 A의 NS1 단백질은 IRF-3의 핵 전위를 방해하고 감염 시 초기에 RIG-I 의존성 신호전달을 방해하는 반면, C형 간염 바이러스의 NS3/4A 프로테아제는 비연관 기작에 의해 반응 시 후기에 IFN-α/β의 전위에 직접적으로 관여하는 인자를 절단하고 엑트로멜리아 바이러스의 C12R 단백질은 또 다른 기작에 의해 감염에 대한 반응 시 후기에 생산된 IFN-α/β에 결합하여 불활성화시킨다. 구조물 내에 사용된 특정 프로모터를 선택적으로 선택함으로써, 그리고 구조물에 의해 암호화되는 특정 인자들 또는 인자들의 조합을 선택적으로 선택함으로써, 맞춤형 숙주세포 반응이 촉발될 수 있다. 인자들의 발현을 변경하는 기타 방법예는: 유도성 프로모터의 사용; 세포- 또는 조직-특이적 프로모터의 사용; 전사를 증가시키거나 감소시키는 다양한 유전적 요소의 포함(예컨대, 인핸서 서열 등); 선호 또는 비-선호 코돈 서열의 사용; 등이 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 또한, 인자 또는 숙주세포 활성 관심 단백질은 벡터 투여 목적에 따라서 증가되거나 감소된 활성을 갖도록 변경되거나 선택될 수 있다. 면역반응을 "억제하는"에 의해 본 발명자들은 진핵세포 내 바이러스의 존재에 의해 촉발되는 전형적인 또는 정상적인 면역반응이 완전히 또는 부분적으로 억제되고, 줄어들고, 감소되고, 방해되는 것 등을 의미한다. 이러한 억제는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 항-바이러스 면역반응(예컨대, IFNα, EFNβ 등)의 각인(hallmark)이고, 특징이고, 또는 그와 관련된 성분의 양, 활성 또는 특성에 있어서의 감소를 검출하는 것을 포함하는, 당해 분야의 숙련자에게 자명할 임의의 몇몇 방식으로 검출되고 측정될 수 있다. 억제 수준은 일반적으로 약 25% 이상, 바람직하게는 약 50% 및 더욱 바람직하게는 약 60, 70, 80, 90 또는 100%이다. 억제 수준은 전형적으로, 대조군 세포(하나 이상의 형질전이 유전자를 암호화하지만 면역체계 억제제를 암호화하지 않는 바이러스 벡터로 형질감염된 세포)에서 생산된 동일한 성분의 양과 비교하여, 본 발명의 바이러스 벡터(하나 이상의 형질전이 유전자와 하나 이상의 면역체계 억제제를 암호화하는 벡터)로 형질감염된 숙주세포 내 생산된 하나 이상의 성분들의 양 사이의 차이를 검출함으로써 측정된다.

유사하게, 형질전이 유전자의 "증강하는(enhancing)" 발현은 일반적으로, 대조군 세포와 비교하여, 본 발명의 벡터로 형질감염된 숙주세포 내에서 발현된(즉, 전사되고 번역된) 형질전이 유전자의 양에 있어서의 증가, 증대 등을 일컫는다. 이러한 증강은 당해 분야의 숙련자에게 자명할 임의의 몇몇 방법들에 의해, 예컨대, 벡터로부터 생산된 형질전이 유전자 생성물의 양, 활성 또는 특성에 있어서의 증가를 검출함으로써; 생산된 형질전이 유전자 생성물과 관련된 성분(예컨대, mRNA, 형질전이 유전자 생성물에 의해 생산된 성분 또는 효과, 형질전이 유전자 생성물에 대한 항체 등)의 양, 활성 또는 특성에 있어서의 증가를 검출함으로써 측정될 수 있다. 증강 수준은 일반적으로 약 25% 이상, 바람직하게는 약 50% 및 더욱 바람직하게는 약 60, 70, 80, 90 또는 100%, 또는 심지어 그 이상이다.

바이러스 감염에 대한 숙주 방어로서 IFN 체계의 기본적인 중요성은 수많은 바이러스가 IFN-유도된 항바이러스 반응을 인식하는 유전자 생성물을 암호화한다는 발견에 의해 더욱 설명된다. 바이러스는 IFN-유도된 단백질의 유도 및 작용을 차단하기 위해 수개의 상이한 전략을 사용한다. DNA 및 RNA 바이러스 모두 DFN 신호전달 경로의 활성을 손상시키는 단백질을 암호화한다. 다중 기작이 관여하는 것으로 보인다. 이들 중에는 모방(mimicry)이 있다. 바이러스가 IFN 신호전달 경로의 세포성 성분을 모방하는 생성물을 암호화하는 몇몇 예시가 존재한다. 이러한 분자적 모방은 IFN 신호전달 과정의 길항작용(antagonism)을 야기할 수 있다. 예를 들어, 폭스바이러스는 가용성 DFN 수용체 동종체(vIFN-Rc)를 암호화한다. 이들 vIFN-Rc 동종체는 폭스바이러스-감염된 세포로부터 분비되고 IFNs에 결합하며, 그로 인해 이들이 자신의 선천적 수용체를 통해 항바이러스 반응을 촉발하도록 작용하는 것을 방지한다. vIFN-α/β Rc 단백질은 우두 바이러스 및 몇몇 부가적인 오르토폭스바이러스로부터 분비된다. vDFN-α/β 수용체 동종체인, 웨스턴 리저브(Western Reserve) 균주 내 B18R 유전자 생성물 및 코펜하겐(Copenhagen) 균주 내 B19R 생성물은 FFN-β뿐만 아니라 몇몇 상이한 IFN-α 아종(subspecies)에 결합하고 IFN-α/β 신호전달 활성을 차단한다. IFN 신호전달에 영향을 미치는 3개의 추가적인 DNA 바이러스는 아데노바이러스, 파필로마바이러스, 및 인간 헤르페스바이러스 8(HHV-8)이다. 아데노바이러스 E1A 단백질은 ISGF-3 활성화의 상류 지점에서 IFN-매개된 신호전달을 차단한다. ISGF-3의 DNA 결합 활성은 E1A에 의해 억제된다. SeV(SeV)의 C 단백질, 숙주의 세포질 내에서 복제하는 파라믹소바이러스는 IFN-유도된 세포성 유전자의 전사 활성을 방해함으로써 IFN-유도된 항바이러스 반응의 활성화를 회피한다. 센다이 바이러스의 경우에, C 단백질은 2 이상의 방식으로 IFN 작용을 방해한다. C 단백질은 STAT-1의 합성을 방해하고 이들은 또한 STAT-1의 증가된 턴오버(turnover)를 유발한다. 인간 파필로마바이러스(HPV) E6 종양단백질은 선택적으로 IRF-3에는 선택적으로 결합하지만 IRF-2 및 IRF-9를 유도하는 기타 세포성 IRFs에 대해서는 단지 매우 빈약하게 결합한다. IRF-3과 E6의 연합은 전이활성(transactivation)을 억제하고, 그로 인해 IFN 반응을 회피하는 기작으로 HPV에 제공한다. 아데노바이러스 E1A 단백질은 또한 p300에 결합하는 E1A의 능력에 좌우되는 기작에 의해 IRF-3-매개된 전사 활성화를 억제한다. HHV-8, 카포시 육종과 관련된 감마 헤르페스 바이러스는 IFN-α/β에 의해 유도되는 전사 활성화의 억제제(repressor)로서 기능하는 IRF 동종체(vIRF)를 합성한다. HHV-8-암호화된 vIRF 단백질은 또한 IRF-1-매개된 전사 활성화를 억제한다. 다른 2개의 헤르페스바이러스인, 베리셀라-조스터 바이러스(VZV) 및 사이토메갈로바이러스(CMV)는 또한 EFN 신호전달 경로의 기능을 파괴한다. VZV는 STAT-1 및 JAK-2 단백질의 발현을 억제하지만 JAK-1에는 별다른 영향을 미치지 않는다. 상이한 전략의 길항작용이 MHC 클래스 II 발현이 또한 억제된, CMV-감염된 세포에서 야기된다. CMV-감염된 섬유모세포에서 증강된 단백질 분해로 인해 JAK-1의 수준에서 특이적인 감소가 일어난다. 몇몇 비분절된 음성-가닥 RNA 바이러스는 타입 I IFN 수용체로부터 EFN 수용체-매개된 신호전달을 중화하는 유전자 생성물을 암호화한다. 예를 들어, 시미안 바이러스 5 또는 멈프스 바이러스로의 감염은 STAT-1의 증가된 프로테오솜-매개된 분해를 야기하는 반면, 파라인플루엔자 바이러스 타입 2로 감염된 세포에서는 STAT-2의 분해가 일어난다. 에볼라 바이러스의 VP35 단백질, 음성-가닥 RNA 바이러스는 길항작용의 정확한 생화학적 기작이 아직 정의되지 않았다고 하더라도 타입 I EFN 길항제로 작용한다. VP35는 EFN-β 프로모터의 바이러스 유도 및 ISRE-유도된 유전자 발현의 dsRNA- 및 바이러스-매개된 활성화를 억제한다. 3개의 예시적인 억제제(인플루엔자 바이러스 유래 NS1, 로타바이러스 유래 NSP1, 및 아데노바이러스 유래 VAI)를 암호화하는 핵산 서열을 도 1A-C에 나타내었다.

EFN 억제 인자는 또한 다른 비-바이러스 근원으로부터, 예를 들어 숙주세포(예컨대, 사이토카인 신호전달의 억제제(SOCS), PKR의 우성 음성 및 RNase L의 우성 음성)으로부터 입수될 수 있고, 본 발명의 실행 내에 사용될 수 있다. IFN 반응(예컨대, 인터페론 자극된 유전자에 대한 siRNAs)을 억제하거나 약하게 하고 바이러스 발현 벡터 내로 유전적으로 조작되고 그로부터 성공적으로 발현될 수 있는 핵산 서열에 의해 암호화되는 임의의 인자가 본 발명의 실행 내에 사용될 수 있다. 예시에는 타입 I IFNs의 항바이러스 작용에 필수적인 다양한 자가분비 IFN-유도된 효과기 및 조정자 단백질, 예컨대 RNA-의존성 단백질 키나아제(PKR); 2,5'-올리고아데닐레이트 합성효소(OAS); RNase L; Mx 단백질 GTPases; IFN-유도된 RNA-특이적 아데노신 디아미나제(ADAR1); IRF-5 및 IRF-7와 같은 IFN 조절 인자; TLR3, TLR4, TLR7 및 TLR9와 같은 (IRF) 패밀리의 전사 인자; IRAKI/4 및 TRAF6과 같은 인자; RLR, MyD88, TAKl, TOLLIP, TlFA 등 뿐만 아니라, 상기에 기술된 것들을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.

이러한 인자의 하나 이상의 기능성 형태는 본 발명의 바이러스 벡터에 의해 작동적으로 암호화된다. "기능적 형태"에 의해 본 발명자들은 적합한 숙주세포, 예컨대, 포유동물 숙주세포 내에서 본 발명의 바이러스 벡터로부터 전사될 때, 암호화되는 인자가 약 25% 이상, 바람직하게는 약 50%, 및 더욱 바람직하게는 약 100% 또는 그 이상의 그의 통상의 활성을 갖는 것을 의미한다. "작동적으로 암호화되는"에 의해 본 발명자들은 인자를 암호화하는 핵산 서열이 적합한 숙주세포, 예컨대 포유동물 세포 내에서의 성공적인 전사 및 번역을 수행할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명의 벡터는 바이러스-계 벡터이다. "바이러스-계"에 의해 본 발명자들은 자연 발생적인 바이러스로부터 또는 그를 근거로 하는 벡터 또는 담체를 의미한다. 이러한 벡터는 일반적으로 임의의 수개의 가능한 유익한 방식으로 유전적 조작을 통해 이들의 선천적 형태로부터 변경되었을 것이다. 예를 들어, 바이러스 벡터는 일반적으로: 이들이 질환 증상을 야기하지 않거나 단지 경미한 질환 증상을 야기하고; 이들이 숙주세포 내에서 복제가 될 수 없도록 변경될 수 있고; 이들은 다른 유기체로부터의 이종 유래 유전자(예컨대, 일과성(passenger) 유전자 또는 형질전이 유전자), 또는 유사한 유기체로부터의 유전자의 다중 복제의 도입을 용이하게 하는 핵산 서열을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있고; 이들은 보체, 바이러스 유래 IRES, 선도 펩티드 서열, rnRNA 안정성을 증가시키도록 고안된 서열 등을 활성화하는 유전자 내 결실을 암호화할 수 있도록 약화된다. 구체적으로 본 발명의 목적을 위해, 바이러스 벡터는 1) 하나 이상의 관심 단백질 또는 폴리펩티드 및 2) 바이러스에 의한 침투에 대해 포유동물 세포의 면역반응을 억제하는 하나 이상의 인자들을 포함하고 발현하도록 유전적으로 조작된다. 또한, 면역반응을 억제하는 하나 이상의 폴리펩티드 및 하나 이상의 인자들의 동질성 및 발현 양상은 숙주세포 내에서 맞춤형 또는 조정된 반응을 야기하도록 고안될 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 실행에 있어서, 바이러스-유래 벡터는 비-복제성이고, 표적 세포/조직 내에서 제한된 복제를 갖고/갖거나 숙주세포의 항-바이러스 반응을 억제하는 인자들은 세포- 또는 조직-특이적 방식으로 발현된다. 이는 바이러스 감염을 피하는 숙주세포 능력의 억제가 단지 일시적이거나 숙주 내 특이적 위치로 국한되어야 하고, 또는 숙주를 바이러스에 의한 감염에 일반적으로 민감하게 하는 것을 방지하기 위해, 단지 특정 촉발된 기작을 선택적으로 하향-조절해야만 하기 때문이다. 예를 들어, 아데노바이러스-유래 벡터는 전형적으로 E1-E3 결실된 것이고 CMV 또는 기타 바이러스/포유동물 프로모터의 전사 조절 하에서 형질전이 유전자를 운반한다. E1-E3 유전자 생성물은 통상 바이러스 DNA의 전사, 표적 세포 세포골격의 재배열, MHC의 하향 조절 및 새로운 비리온의 조립에 포함된다. 타입 I IFN 반응 억제제의 포함이 번역, 및 일부 경우에는 아마도 벡터 및 일과성 유전자 서열 모두의 전사를 증강시킬 수 있는 반면, 이는 결실된 유전자 또는 유전자 기능의 대체를 위한 기작을 제공하지는 않는다. 또한, 세포 표면에 의해 선천성 면역반응을 활성화시키는 수많은 기작이 존재하므로, 특히 백신 벡터의 경우에, 타입 I IFN 반응을 완벽하게 방지하는 것은 어려울 뿐만 아니라 바람직하지 못하다. 또한, IFN α/β 반응이 약간의 국소 주변분비 기능을 갖는 반면, 본 발명의 주된 목적은 자가분비 반응을 하향 조절하는 억제제의 도입이다. 마지막으로, 세포 내 병원체에 대한 숙주 면역반응은 타입 I IFNs로 한정되지 않으며 동족 면역(cognate immunity)에 요구되는 타입 I IFNs도 아니다.

적합한 바이러스-유래 벡터의 예시에는 폭스 바이러스, 홍역 바이러스, 폴리오바이러스, 인플루엔자 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스 등으로부터 유래된 벡터뿐만 아니라, 아데노바이러스(복제성 및 비-복제성 모두), 베큘로바이러스 벡터로부터 유래된 것들이 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 또한, 다양한 비조작된 성분들(예컨대, 오모실(Ormosil))이 사용될 수 있다.

벡터에 의해 암호화되는 형질전이 유전자와 관련하여, 본 발명의 일 실시형태에서는, 형질전이 유전자가 세포 또는 체액성 면역반응을 촉발하도록 고안된 항원을 암호화한다. 일반적으로, 이러한 항원은 바이러스, 세균, 또는 진핵 기생체와 같은 유기체 또는 제제를 야기하는 질환으로부터의, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드, 또는 이들의 항원성 절편이다. 항원은 전체 단백질, 또는 단백질의 일부분(예컨대, 그의 하나 이상의 항원성 영역), 또는 단백질 유래 하나 이상의 항원성 에피토프일 수 있다. 일반적으로, 이러한 에피토프는, 예를 들어, 적어도 약 8개 아미노산 길이이다. 이러한 바이러스 벡터는 임의의 혈청형일 수 있고, 인플루엔자 바이러스; RSV, HTLV-I, 및 HTLV-II와 같은 레트로바이러스, HPV와 같은 파필로마비리데, EBV, CMV 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스와 같은 헤르페스바이러스; HIV-I 및 HIV-2와 같은 렌티바이러스; 광견병과 같은 라브도바이러스; 폴리오바이러스와 같은 피코르노바이러스; 우두와 같은 폭스바이러스; 로타바이러스; 및 아데노-관련 바이러스 1과 같은 파르보바이러스, 미코박테륨 spp., 헬리코박터 파일로리, 살모넬라 spp., 쉬겔라 spp., 대장균, 리케차 spp., 리스테리아 spp., 레지오넬라 뉴모니아, 슈도모나스 spp., 비브리오 spp., 바실러스 안트라시스, 보렐리아 부르크도르페리, 플라스모디움 팔시파룸과 같은 플라스모디움 spp.; 트리파노솜 크로지와 같은 트리파노솜 spp.; 지아르디아 인테스티날리스와 같은 지아르디아 spp.; 부필러스 spp., 바베시아 미크로티와 같은 바베시아 spp.; 엔타모에바 히스토리카와 같은 엔타모에바 spp.; 에이메리아 맥시마와 같은 에이메리아 spp.; 레이시마니아 spp.; 스키스토솜 spp., 부르지아 spp., 파스시다 spp., 디로필라리아 spp., 우체레리아 spp., 온코세르카 spp. 등과 같은 질환 또는 병인체와 관련된 항원을 포함할 수 있다. 특히, Rv1733, Rv313Oc, Rv2627c, Rv2628, Rv3641c, Rv3135, Rv3136, Rv0383c, RvO394c, Rv3514, Rv3532, Rv1997, RvO159c, Rv1039c, Rv1197, Rv3620c, Rv2347c, 및 Rv1792와 같은 결핵균 항원; 및/또는 포자소체(circumsporozoite) 단백질(CSP) 또는 이의 펩티드 절편과 같은 말라리아 항원이 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 암 항원에 대한 면역반응을 야기하는데 사용될 수 있는데, 그의 예시에는 mucl, 서비빈(survivin), 섬모 향신경 인자(ciliary neurotrophic factor), 사이클로옥시게나제 1 , 섬유모세포 성장인자, 내피 분화 인자, MAGE-I, 티로시나제 등이 포함되지만, 이들로 한정되지는 않는다.

또한, 하나 이상의 항원은 바이러스 벡터 내에서 개별적으로 또는 키메릭 항원, 즉, 2개 이상의 상이한 항원을 포함하는 단일 번역가능 유전자 생성물로서 암호화될 수 있다. 항원은 동일한 질환과 관련될 수 있거나(예컨대, 몇몇 결핵 항원은 단일의 인접한 전사물 내에서 암호화될 수 있음) 상이한 질환과 관련될 수 있다(예컨대, 디프테리아, 백일해 및 파상풍 항원이 단일 전사물 내에 포함될 수 있다). 대안적으로, 다중 항원은 예를 들어, 내부 리보솜 결합부위(IRES), 다중 개별적 프로모터 및 정지 신호를 이용하는 바이시스트로닉(bicistronic) 발현, 또는 다중 암호화된 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 전사를 위한 기타 유사한 장치를 이용하여 개별적으로 암호화될 수 있다. 또한, 항원 및 항-바이러스 면역반응을 억제하는 인자의 배열은 또한 개별적으로, 또는 키메라로서, 또는 다중 전사 등을 위한 장치를 이용하여 암호화될 수 있다.

본 발명의 다른 실시형태에서, 항원을 제외한 모이어티는 바이러스 벡터에 의해 암호화된다. 예를 들어, 유리한 작용을 갖는 다양한 단백질/폴리펩티드/펩티드가 암호화될 수 있는데, 그의 예시에는 결손되거나 개체 내에서 부적절하게 작용하는 단백질(예컨대, 인슐린, CFTR 등)이 포함되지만 이들로 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 방법은 예를 들어, 유전성 장애의 교정을 위한 단백질의 전달을 위해 사용될 수 있다. 이러한 유전자는 예를 들어, 낭성섬유증을 위한 낭성섬유증 막투과 전도성 조절인자(CFTR) 유전자와 같은 결손 유전자의 대체; 또는 HIV의 치료를 위한 인테그레이즈(integrase) 안티센스 유전자와 같은새로운 유전자의 도입; 또는 인터루킨-27(IL-27)와 같은 타입 I T 세포 반응을 증강시키는 유전자; 또는 콜레스테롤 및 콜레스테롤 수용체 또는 인슐린 및 인슐린 수용체와 같은 특정 수용체, 대사물 또는 호르몬의 발현을 조절하는 유전자; 또는 종양 괴사 인자(TNF)-관련 세포자멸-유도성 리간드(TRAIL)와 같은 암세포를 사멸시킬 수 있는 생성물을 암호화하는 유전자; 또는 골 흡수를 억제하는 자연 발생적인 단백질 오스테오프로테그린(OPG); 또는 완전-길이 인간화 항체, 예를 들어 암세포에 대한 HER2/neu(erbB2) 수용체에 작용하는 인간화 단일클론 항체를 효과적으로 발현하는 것을 포함할 것이다.

본 발명의 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 백신 제제 및/또는 면역반응을 촉발하기 위한 제제, 또는 포유동물의 일부 다른 유형의 치료를 위한 제제에 포함된다. 본 발명의 조성물은 본 명세서에 기술된 바와 같이 실질적으로 정제된 바이러스 벡터, 및 약학적으로 적합한 담체를 포함한다. 이러한 조성물의 제제는 당해 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 전형적으로, 이러한 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로 제조되지만, 정제, 알약, 분말 등과 같은 고체가 또한 고려된다. 투여 전에, 용액 또는 현탁액인, 액체와 혼합하기 위해 고체 형태 또는 농축된 형태가 또한 제조될 수 있다. 제제는 또한 유화될 수 있다. 활성 성분은 약학적으로 허용가능하고 활성 제제와 양립할 수 있는 부형제와 혼합될 수 있다. 적합한 부형제는, 예를 들어, 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등, 또는 이의 조합이다. 또한, 조성물은 습윤제 또는 유화제, pH 완충제 등과 같은 소량의 보조 성분을 포함할 수 있다. 만약 조성물의 경구 형태를 투여하는 것이 바람직하다면, 다양한 증점제, 향미제, 희석제, 유화제, 분산 보조제 또는 결합제 등이 첨가될 수 있다. 본 발명의 조성물은 투여에 적합한 형태로 조성물을 제공하기 위해 임의의 이러한 부가적인 성분들을 포함할 수 있다. 제형 내 바이러스 벡터의 최종 양은 달라질 수 있지만, 일반적으로 약 1-99%일 것이다. 조성물은 추가로 부가적인 항원보강제를 포함할 수 있는데, 그의 적합한 예시에는 셉픽(Seppic), 퀼(Quil) A, 알하이드로겔(Alhydrogel)과 같은 알루미늄 계 항원보강제가 포함되지만 이들로 한정되는 것은 아니다. 조성물은 단일 유형의 바이러스 벡터를 포함할 수 있거나, 하나 이상의 유형의 바이러스 벡터가 제제 내에 사용될 수 있는데, 즉 제제는 이러한 벡터의 "칵테일"을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법은 약학적으로 허용가능한 담체 내에 본 명세서에 기술된 바와 같은 하나 이상의 바이러스-계 벡터를 포함하는 조성물을 포유동물에게 투여하는 것을 포함한다. 포유동물은 일반적으로 인간일 것이지만, 이것이 항상 그러할 필요는 없다. 본 발명의 수의적 적용이 또한 고려된다. 제제는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 주사에 의해, 경구로, 비강 내로, 경피로, 정맥 내로, 복막 내로, 피하로, 근육 내로, 흡입에 의해 등을 포함하는, 당해 분야의 숙련자에게 잘 알려진 임의의 많은 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 또한, 조성물은 단독으로 또는 다른 약품 또는 면역원성 조성물과 조합하여, 예컨대, 다중-성분 백신의 일부분으로서 투여될 수 있다. 또한, 투여는 단일 사례일 수 있거나, 다중 추가 접종량이 예컨대, 백신의 경우에는, 면역반응을 증가시키기 위해; 또는 암과 같은 기타 질환을 치료하는 경우에는, 1회의 치료를 모면한 암세포를 제거하기 위해; 또는 임의의 다른 이유로, 다양한 시간의 간격으로 투여될 수 있다. 투여는 바람직하게는 예방적인데, 즉 질환-유발 요인에의 노출이 야기되거나 야기되었다고 의심되기 전에 이루어진다. 그러나, 투여는 또한 사실 후, 즉 질환 야기 유기체에의 공지된 또는 의심되는 노출 후, 또는 치료적으로, 질환 증상의 발현 후일 수 있다.

투여되는 바이러스 벡터의 양은 치료되는 질환 또는 상태뿐만 아니라, 투여되는 대상의 특성(예를 들어, 종, 성별, 연령, 유전적 조립(makeup), 일반 건강 등)에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 사용되는 투여량은 문헌[Shata 등, Vaccine 20: 623-629 (2001); Shata 및 Hone, J. Virol. 75: 9665-9670 (2001)]에 기술된 바와 같이, 약 10³ 내지 10¹¹ 생육가능 유기체, 바람직하게는 약 10³ 내지 10⁹ 생육가능 바이러스 입자(또는 pfu)일 수 있다.

본 발명은 또한 이를 필요로 하는 개체 내에서 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 생산을 증가시키는 방법을 제공한다. 당해 방법은 바이러스 벡터로부터, 단백질/폴리펩티드/펩티드와 개체의 세포 내에서 항-바이러스 면역반응을 억제하는 인자를 동시-발현하는 것을 포함한다. 만약 단백질/폴리펩티드/펩티드가 질환 유발 요인과 관련된 항원이라면, 그렇다면 당해 방법은 개체 내에서 면역반응을 유발하는 방법일 수 있다. 만약 촉발되는 면역반응이 보호적이라면(즉, 만약 면역반응이 질환-유발 요인에 의해 야기되는 질환 증상의 발생을 예방하거나 감소시킨다면), 그렇다면 당해 방법은 또한 개체를 예방접종하는 방법으로 언급될 수 있다. 대안적으로, 본 발명은 또한 개체에 본 발명의 바이러스 벡터를 투여함으로써 질환을 치료하거나 질환의 증상을 감소시키는 방법을 제공한다. 이 경우, 바이러스 벡터 형질전이 유전자는 바이러스 벡터가 투여되는 개체에서 질환의 증상을 예방하거나 감소시키는데 필요하거나 도움이 되는 단백질/폴리펩티드/펩티드를 암호화한다.

도 1A-C. 항-바이러스 면역반응 억제제의 서열. A, 인플루엔자 바이러스 유래 NS1의 DNA 서열(서열번호: 1); B, 로타바이러스 유래 NSP1의 DNA 서열(서열번호: 2); C, 아데노바이러스 유래 VAI의 RNA 유전자 서열(서열번호: 3)
도 2. IFN 길항제 유전자 VAI는 TB.S 항원의 발현을 증가시킨다. 면역블롯은 비형질감염된 헬라 세포(레인 1 및 3)와 비교하여 VAI 유전자 형질감염된 헬라 세포(레인 2 및 4)로부터 아데노바이러스 발현된 TB.S 항원의 증가된 생산을 나타내었다. TB.S 항원의 더 높은 발현이 50 및 100 MOI에서 모두 확인되었다. VAI 형질감염된(레인 6) 헬라 세포 및 빈(empty) 벡터 Ad35로 감염된 비형질감염된(레인 5) 헬라 세포에서는 TB.S 항원의 발현이 관찰되지 않았다. 레인 7 및 8은 각각 VAI 유전자로 비형질감염되고 형질감염된 비감염 대조군 헬라 세포를 나타낸다.

실시예

실시예 1. TB.S 항원의 발현을 증가시키는 IFN 길항제 유전자 VAI

이 실험은 아데노바이러스 벡터 내에 클로닝된 결핵 항원의 발현에 대한 IFNs의 부정적인 효과를 감소시키기 위해 인터페론 길항제 유전자의 사용을 기술한다. 실험은 하기와 같이 고안되고 수행되었다. Ad35-TB.S는 결핵균 유래의 항원 85A, 85B 및 TB 10.4의 융합 단백질을 암호화하는 아데노바이러스 35의 복제 결손, E1 결실된 유도체이다. 다른 그룹 B 아데노바이러스와 같이, 아데노바이러스 35는 표면 마커 CD46을 발현하는 포유동물 세포를 감염시키고 그로 인해 모든 유핵 인간 세포의 광대한 대부분을 감염시킬 수 있다. 이 실험에 사용된 인터페론 길항제 유전자는 바이러스-관련 I(VAI) RNA 유전자였다. VAI RNA 유전자 생성물은 인터페론-유도된, 이중-가닥 RNA-활성화 단백질 키나아제 PKR의 활성화를 차단함으로써 세포성 항바이러스 반응에 대해 방어한다(Galabru J, Katze MG, Robert N, Hovanessian AG. Eur J Biochem. 1989 Jan 2;178(3):581-9). 1,724 bp 삽입체로 PCR 증폭된 VAI RNA 유전자를 제로블런트 토포(ZeroBlunt® TOPO®) PCR 클로닝 키트(인비트로젠)를 사용하여 pCR-블런트 II-TOPO 벡터 내로 클로닝하였다. 일단 VAI RNA 유전자가 포유동물 세포 내로 도입되면, 이는 RNA 중합효소 III에 의해 대량으로 전사된다.

간략히, 헬라 세포를 완전 이글스 최소 필수 배지(EMEM) 내 6-웰 배양 플레이트 내로 접종하고 >80% 융합성까지 배양하였다. 다음날, 각 그룹으로부터 검사 웰 내 세포의 개수를 세었고, 1 ml의 희석된 Ad35-TB.S 바이러스 또는 빈 바이러스(TB.S를 암호화하지 않는 바이러스)를 50 및 100의 감염다중도(MOI)로 각 웰에 첨가하였다. 감염은 CO₂ 인큐베이터에서 4시간 동안 수행하였다. 4시간 후, 1 ml의 완전 배지를 각 웰 내 감염 혼합물에 첨가하고 이어서 VAI 유전자 함유 pCR-블런트 II-TOPO 플라스미드를 일시적으로 Ad35-TB.S 바이러스 및 빈 바이러스 감염된 세포 모두에게 형질감염시켰다. 비감염된 세포를 포함하는 대조군 세포를 동일한 방식으로 처리하였다. 48시간 후, 각 웰로부터 세포를 용해시키고 Ag-85 특이적 항혈청을 이용한 면역블롯팅으로 분석하였다. 도 2는 VAI로 형질감염되지 않은 헬라 세포(레인 1 및 3)와 비교하여 VAI 유전자로 형질감염된 헬라 세포(레인 2 및 4) 유래 아데노바이러스-발현된 TB.S 항원의 생산을 비교하는 면역블롯을 나타낸다. 보는 바와 같이, TB 항원 TB.S의 발현은 VAI 형질감염된 세포에서 현저히 증가하였다. TB.S 항원의 더 높은 발현이 VAI 감염된 세포에서 50 및 100 MOI 모두에서 확인되었다. 이 실시예는 VAI 단백질이 또한 숙주세포 내에서 발현된다면 숙주세포 내 항원의 발현이 증가함을 보여준다.

실시예 2. 헤마글루틴(HA) 단백질의 발현을 증가시키는 IFN 길항제 유전자 NS1

바이시스트로닉 발현 카세트 내 인플루엔자 바이러스 유래 IFN I 억제성 단백질 NS1 및 조류 인플루엔자 H5N1의 헤마글루틴(HA) 단백질을 암호화하는 아데노바이러스 벡터 백신 구조물을 제조한다. 이 아데노바이러스 벡신 구조물로 감염된 세포 내 HA 형질전이 유전자의 발현을 동일한 HA 형질전이 유전자를 발현하지만 NS1 단백질은 발현하지 않는 동족 아데노바이러스 벡신 구조물로 감염된 A549 및 헬라 세포에서의 발현과 비교한다. 더 높은 수준의 HA가 NS1이 또한 발현되는 세포 내에서 발현된다. 이 연구는 관심 형질전이 유전자를 암호화하고 발현하는 것에 더하여, 타입 I 인터페론의 억제제를 암호화하고 억제하는 아데노바이러스 벡터를 사용하는 접근법을 입증한다.

실시예 3. 타입 I IFN 반응 억제제의 포함에 의한 백신 면역원성의 증강

바이러스 벡터 촉발된 면역반응에 대한 타입 I IFN 반응의 억제 효과를 입증하기 위해, 3 그룹의 10 BALB/c 마우스를 하기와 같이 면역접종한다. 제1 그룹은 100 μl의 식염수만을 근육 내로 투여받고, 제2 그룹은 결핵균 항원 85A, 85B 및 RV3407의 융합을 암호화하는 아데노 혈청형 35 벡터를 1Oe10 pfu로 근육 내로 투여받고, 제3 그룹은 결핵균 항원 85A, 85B 및 RV3407과 VAI 유전자의 융합을 암호화하는 아데노 혈청형 35 벡터를 1Oe1O pfu로 근육 내로 투여받는다. 모든 동물은 초회감작-후(post-priming) 2주 후 동일한 백신으로 추가 접종된다. 추가접종 2주 후 모든 동물을 안락사시키고 혈액을 채취한다.

동물 모델 내 암호화된 생성물에 대한 면역 및 기타 생물학적 반응의 측정 방법은 당해 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 암호화된 Mtb 항원에 대한 혈청 IgG 및 IgA 반응을 측정하기 위해, 400-500 μl의 혈액을 개별적인 튜브 내로 채취하고 얼음에서 4시간 동안 인큐베이션하여 응고되게 한다. 5분간 미세원심분리기 내에서 원심분리한 후, 혈청을 새 튜브로 옮기고 -80℃에서 보관한다.

관심 유전자에 의해 발현된 항원에 대한 점막 IgG 및 IgA 반응은 면역접종 전 및 그 후에 일정한 간격으로 회수될 대변 침전물 및 질 세척액을 이용하여 결정된다(Srinivasan 등, Biol. Reprod. 53: 462; 1995; Staats 등, J. Immunol. 157: 462; 1996). 표준 ELISA가 혈청 및 점막 시료 내 관심 항원에 대한 IgG 및 IgA 반응을 정량하는데 사용된다(Abacioglu 등, AIDS Res. Hum. Retrovir. 10: 371; 1994; Pincus 등, AIDS Res. Hum. Retrovir. 12: 1041; 1996). 난 알부민은 음성 대조군 항원으로서 각 ELISA에 포함될 수 있다. 또한, 각 ELISA는 양성 대조군 혈청, 대변 침전물 또는 질 세척액 시료를 적절히 포함할 수 있다. 양성 대조군 시료는 기술된 바와 같이, 10 μg 콜레라 독소와 혼합된 관심 유전자에 의해 발현된 10 μg의 항원이 비강 내로 면역접종된 동물로부터 회수된다(Yamamoto 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 5267; 1997). 종말점 역가는 음성 대조군 열의 평균과 3개의 표준 오차 값의 합보다 큰 490 nm에서의 흡광도에 있어서의 증가를 야기하는 최후 혈청 희석의 역수를 취함으로써 계산된다. 세포성 면역은 세포 내 사이토카인 염색(세포 내 사이토카인 세포계산으로도 언급됨)에 의해 또는 ELISPOT(Letsch A. 등, Methods 31: 143-49; 2003)에 의해 측정될 수 있다. ICS가 또한 항원-특이적 CD4+ 및 CD8+ T-세포를 표현형적으로 특정하기 위해 동시 능력을 부가한다고 하더라도, 두 방법 모두 항원-특이적 면역반응의 정량을 가능케 한다. 이러한 분석은 IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-IO 및 IFN-을 분비하는 항원-특이적 T 세포의 개수를 평가할 수 있다(WU 등, AIDS Res. Hum. Retrovir. 13: 1187; 1997). ELISPOT 분석은 기술되고(Wu 등, Infect. Immun. 63: 4933; 1995) 이전에 사용된(Xu-Amano 등, J. Exp. Med. 178: 1309; 1993; Okahashi 등, Infect. Immun. 64: 1516; 1996) 바와 같이, 상업적으로 이용가능한 포획 및 검출 mAbs(R&D Systems and Pharmingen)를 사용하여 수행된다. 각 분석은 미토겐(Con A) 및 난 알부민 대조군을 포함한다. 본 명세서에 기술된 항-IFN 암호화 벡터 시스템은 IFN 내성 유전자를 포함하지 않는 전달 시스템에 비해 몇몇 장점을 갖는다. 항원 유전자가 더 높은 수준으로 더 오랜 기간 동안 발현되고, 따라서 더 강력한 면역반응을 유도한다.

이 실시예는 타입 I 인터페론 반응의 억제제 및 관심 면역원 모두를 발현하는 아데노바이러스 벡터 백신에 의해 촉발된 면역반응이 면역원만을 암호화하는 아데노바이러스 벡터에 비해 증가함을 나타낸다.

실시예 4. 타입 1 인터페론 반응 억제제의 발현에 의한 베큘로바이러스-계 백신 벡터 유래 형질전이 유전자 발현의 증강

수많은 바이러스 계 벡터가 포유동물 세포를 성공적으로 형질감염시키는데 사용되었다. 이들 중에는 아데노바이러스, 아데노바이러스-관련 바이러스(AAV), 파포바바이러스, 및 우두바이러스가 있다. 최근의 음성 임상 시험 결과가 미국에서의 그들의 사용을 제한할 수 있다고 하더라도(Gene Therapy, 7: 110, 2000, Nature Biotechnology 26, 3-4, 2008); 아데노바이러스 벡터는 잘 연구되어있고 백신 임상 시험뿐만 아니다 수많은 유전자 치료 시험에 사용되고 있다. 아데노-관련 바이러스(AAV)를 사용하는 임상 시험이 또한 있었다. 포유동물 세포를 감염시키는데 사용될 수 있는 대안적인 벡터는 곤충-감염 베큘로바이러스(Trends Biotechnol., 20, 173-180, 2002)이다. 베큘로바이러스는 간균 바이러스이고, 따라서, 캡시드 계 바이러스 시스템과는 달리, 재조합 베큘로바이러스 내로 삽입될 수 있는 유전적 물질의 양을 제한하지 않는다. 포유동물 바이러스 유래 바이러스 벡터와는 달리, 베큘로바이러스 유전자 발현은 곤충 특이적 프로모터에 의해 유도된다. 따라서, 베큘로바이러스 유전자는 인간 세포 내에서 발현되지 않고(Virology 125: 107-117, 1983), 따라서 면역반응을 야기할 수 없다. 또한, 포유동물 세포는 베큘로바이러스 유전자 생성물에 대해 선재(pre-existing) 면역성을 갖지 않는다. 또한, 포유동물 바이러스를 근거로 하는 바이러스 벡터와는 달리, 포유동물 세포 내에 선재하는 베큘로바이러스는 없다. 따라서, 베큘로바이러스 벡터의 재조합은 일어날 수 없고, 베큘로바이러스로의 감염은 내인성 인간 바이러스를 생산하지 않는다. 베큘로바이러스 시스템의 다른 장점은 베큘로바이러스는 무혈청 배양 배지 내에서 대량으로 생육될 수 있고, 이는 치료제의 바이러스 및 프리온 감염원으로의 혈청 오염의 가능한 위험성을 제거한다.

포유동물 프로모터(예컨대, CAG) 또는 바이러스 내부 리보솜 결합부위(IRES), 예를 들어 뇌심근염(encephalomyocarditis) 바이러스(EMCV) IRES가 베큘로바이러스 내 형질전이 유전자의 상류에 삽입되면, 형질전이 유전자의 성공적인 발현이 포유동물 세포 내에서 달성될 수 있다. 베큘로바이러스 벡터는 백신 개발의 우수한 후보자인 듯하고, 베큘로바이러스 시스템을 사용하는 백신 후보자는 대부분의 다른 바이러스 백신 시스템에 비해 명백한 장점을 갖는 듯하다. 불행히도, 포유동물 세포 내 외래 단백질의 베큘로바이러스 발현은 타입 I 인터페론(IFN) 반응을 유발한다(J. Immunol., 178, 2361-2369, 2007). 이 IFN 반응은 단백질 키나아제 R(PKR) 및 2'-5' 올리고아데닐레이트-합성효소(2'-5T OAS)를 이용하여 외래 단백질의 발현을 제한한다. 활성화 PKR은 진핵 개시 인자 eIF2의 아단위를 인산화시킴으로써 번역을 차단한다. 한편, 2-5A 합성효소는 mRNA 및 리보좀 RNA를 분해하는 단일-가닥 특이적 엔도리보뉴클리아제인, RNase L을 활성화시키는 짧은, 2'-5' OAS 관련 올리고아데닐레이트를 생산한다. 이들 기작은 베큘로바이러스 시스템에 의해 암호화되는 일과성 핵산의 전사 및 번역을 파괴하거나 억제하는 것 같다. 성공적인 바이러스 병원체는 이들이 IFNs의 자가분비 및 주변분비 반응을 차단함으로서 감염을 확립하게 하는 기작을 진화시켜 왔다. 따라서, 숙주세포 타입 I 인터페론(IFN) 반응을 방해하는 하나 이상의 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 베큘로바이러스를 형성함으로써, 현저한 형질전이 유전자 발현이 재조합 베큘로바이러스로 형질감염된 포유동물 세포 내에서 관찰된다. 타입 I 인터페론(EFN) 경로를 조절할 수 있는 단백질의 예시에는 로타바이러스의 NSP1 단백질, 엑트로멜리아 바이러스의 C12R 단백질, 및 인플루엔자의 NS1이 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. C12R 단백질은 INF-α/β에 결합하여 면역반응을 조절한다. 최근의 연구는 로타바이러스 비구조 단백질 NSP1이 ERF3과 상호작용을 하고 이 상호작용이 IRF3의 프로테오솜-매개 분해를 유발하고, 이어서 INF-β를 억제한다는 것을 나타내었다. 인플루엔자의 NS1 단백질은 타입 I EFN 경로에 대해 몇몇 효과를 나타내는 것으로 확인되었다. NS1 단백질의 카르복시-말단 도메인의 활성은 숙주 mRNA 가공(processing) 기작을 억제한다. 이 도메인은 또한 세포성 번역 개시 인자 eIF4GI와의 직접적인 상호작용에 의해 바이러스 mRNA의 선호 번역을 용이하게 한다. 또한, dsRNA에 결합하고 잠정적 세포성 키나아제(들)과의 상호작용에 의해, NS1 단백질은 IFN-유도된 dsRNA 활성화 키나아제(PKR), 2',5'-올리고아데닐레이트 합성효소 시스템, 및 NF-KB 또는 ERF 3 및 c-Jun/ATF2와 같은 사이토카인 전사 인자의 활성화를 차단한다. 그 결과, NS1 단백질은 INF-α 및 INF-β 유전자의 유발을 억제하고, 그로 인해 감염된 세포 내 세포자멸의 발생을 방지하거나 지연시키고, 인접한 세포 내 항바이러스 상태의 형성을 방지하거나 지연시킨다. 따라서, 항원 및 면역반응 조정자 모두를 암호화하는 핵산을 갖는 베큘로바이러스 시스템을 제작함으로써, 우수한 백신 후보자가 생성된다.

재조합 베큘로바이러스의 제작은 전이 벡터를 사용하여 수행된다. 외래 유전자 또는 관심 유전자(들)을 포함하는 재조합 베큘로바이러스는 베큘로바이러스 감염에 민감한 곤충 세포를 야생형 베큘로바이러스 및 관심 유전자(들)을 포함하는 전이 벡터로 동시-형질감염시킴으로써 제조된다. 예를 들어, 그의 전체 내용이 참고로서 본 명세서에 포함되는, Pellett 등에 허여되는 미국특허 제6,126,944호는 개시 부위에 추가의 뉴클레오티드의 부가 없이, 번역 개시 부위에 베큘로바이러스 폴리헤드린 유전자와 병렬되는 외래 유전자의 효과적인 발현을 위한 베큘로바이러스 전이 벡터의 제작을 기술한다.

제작의 용이성, 및 큰 외래 DNA-절편(>20 kbp)을 수용하는 능력은 형질전이 유전자 발현의 더 안정한, 일시적 및 세포 타입-특이적 대조군과 함께 확대되거나 표적된 세포 친화성을 갖는 베큘로바이러스의 개발을 허용한다. 결핵균 항원 Ag85A, Ag85B, 및 Rv3407의 융합 단백질을 암호화하는 재조합 베큘로바이러스가 제작된다. 베큘로바이러스는 포유동물 세포를 감염시키는 것으로 나타났고; 따라서 CHO, 헬라, 및 BHK 세포는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터의 조절 하에서, 인플루엔자-A의 NS1 또는 로타바이러스의 NSP1를 암호화하는 전이 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 조직 배양 플라스크 내에서 성장한다. 대조군 세포는 pcDNA3.1 벡터 단독으로 감염된다. 제오마이신 내성인 안정한 형질전환체는 증식하고 DMEM 함유 6-웰 조직 배양 플라스크 내에 접종하고 >60% 융합성까지 배양한다. 각 그룹으로부터 검사 웰을 세고 신선한, 무혈청 배지 내 세포를 1-2시간의 기간 동안에 10, 100, 1000, 및 5000의 다중감염도(MOI)로 재조합 베큘로바이러스로 감염시킨다. 선택적으로, 배양 배지는 형질전이 유전자 발현을 최대화하기 위해 10 mM 소듐 부티레이트가 보충될 수 있다. 바이러스의 제거 후, 신선한 배지를 첨가하고 배양액을 37℃에서 48시간 동안 배양한다. 배양액을 면역블롯팅에 의해 항원에 대해 검사한다. 웨스턴 블롯 분석을 위해, 세포 추출물을 변성 폴리아크릴아마이드 겔에 용해시키고, 단백질을 니트로셀룰로스 막으로 옮기고 표준 방법 및 Ag85-특이적 항혈청을 이용하여 면역블롯팅한다. NS1- 및 NSP1-발현 세포는 NS1 또는 NSP1을 발현하지 않는 대조군 세포에서 관찰되는 것을 초과하여 형질전이 유전자 융합 단백질(들)을 생산한다.

바이시스트로닉 발현 카세트 내에서 NS1 및 조류 인플루엔자 H5N1의 헤마글루틴(HA)을 암호화하는 형질전이 유전자 모두를 암호화하는 재조합 베큘로바이러스를 제작한다.

이 재조합 베큘로바이러스로 감염된 세포 내 형질전이 유전자의 발현을 HA 형질전이 유전자를 발현하지만 NS1 단백질은 발현하지 않는 대조군 재조합 베큘로바이러스 내 발현과 비교한다. 비교는 현저하게 더 많은 HA 단백질이 NS1-HA 재조합으로 감염된 세포 내에서 생산되는 것을 나타내고, 이는 타입 I 인터페론의 억제제를 암호화하는 재조합 베큘로바이러스를 사용하는 접근법을 입증한다. 마우스에서 면역원성 연구는 HA 면역원만을 발현하는 재조합 베큘로바이러스로 감염된 대조군 세포와 비교하여, NS1 및 HA 면역원 모두를 발현하는 재조합 베큘로바이러스로 감염된 세포 내에서 촉발된 HA에 대한 면역반응의 크기에 있어서의 증가를 입증한다. 이러한 발견은 재조합 베큘로바이러스 백신의 개발 및 사용을 위한 명백하고 중요한 의미를 갖는다. 증가된 형질전이 유전자 발현은 암호화된 항원에 대해 개선된 세포성 및 체액성 면역반응을 초래한다. 따라서 본 발명은 매우 다양한 질환의 예방 및 치료를 위한 EFN 반응을 억제하는 인자를 암호화하는 재조합 베큘로바이러스 백신을 위한 광범위한 범위의 적용을 갖는다.

실시예 5. 백신으로서 타입 I IFN 반응 및 하나 이상의 관심 항원을 억제하는 인자를 발현하는 재조합 바이러스 벡터의 사용

Mtb 항원 85A, 85B 및 Rv3407과 인플루엔자 A 유래 NS1 단백질을 암호화하는 재조합 베큘로바이러스를 제작하고, NS1 단백질이 결실된 유사한 백신을 또한 제작한다. 비-인간 영장류 내에서 이 백신의 보호적 효능을 평가하기 위해, 3 그룹의 6마리 체중 및 성별-짝지은 붉은 털 원숭이를 1) 식염수, 2) 재조합 베큘로바이러스 AB 3407 또는 3) 재조합 베큘로바이러스 AB3407NS1로 면역접종한다. 그룹 2 및 3 내 각 동물은 근육 내 주사에 의해 개별적인 재조합 베큘로바이러스의 1×10⁷ vp를 투여받는다. 면역접종 15주 후, 모든 동물은 대략 300 cfu의 결핵균 에르드만(Erdman)의 기관지 장치에 의해 시험감염된다. 모든 동물은 흉부 X-선, 체중, 급식, 기침, 졸음증, 및 TB 특이적 단백질에 대한 면역반응을 이용해 결핵의 임상적 증상을 6개월 동안 매달 평가하였다. 6개월 관찰 기간 동안 사망한 모든 동물을 부검하고 조직 병리 및 기관에 의한 Mtb 부하를 측정한다. 빈사 상태의 모든 동물을 인도적으로 안락사시키고 유사하게 검사한다. 시험감염 6개월 후 생존하는 모든 동물을 안락사시키고 조직 병리 및 폐, 간 및 비장 내 Mtb 부하를 위해 부검한다. 재조합 베큘로바이러스 백신 내 NS1의 포함은 감소된 사망률, 감소된 조직 손상 및 실험적으로 감염된 동물의 폐 내에서 더 낮은 개수의 생육가능 Mtb 유기체를 유발한다.

본 발명이 그의 바람직한 실시형태에 관하여 기술되었다고 하더라도, 당해 분야의 숙련자는 본 발명이 첨부된 청구범위의 요지 및 범주 내에서 변경과 함께 실행될 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 본 발명은 상기에 기술된 바와 같은 실시형태로 한정되지 않아야 하고, 본 명세서에 제공된 상세한 설명의 요지 및 범주 내에서 모든 변경 및 그의 등가물을 추가로 포함해야만 한다.

SEQUENCE LISTING <110> Aeras Global TB Vaccine Foundation <120> Enhancemenet of Transgene Expression from Viral-Based Vaccine Vectors by Expression of Suppressors of the Type I Interferon Response <130> 08560049ta <150> US 60/969,283 <151> 2007-08-31 <160> 3 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 693 <212> DNA <213> Influenza virus <400> 1 atggatccaa acactgtgtc aagctttcag gtagattgct ttctttggca tgtccgcaaa 60 cgagttgcag accaagaact aggtgatgcc ccattccttg atcggcttcg ccgagatcag 120 aaatccctaa gaggaagggg cagcactctc ggtctggaca tcgagacagc cacacgtgct 180 ggaaagcaga tagtggagcg gattctgaaa gaagaatccg atgaggcact taaaatgacc 240 atggcctctg tacctgcgtc gcgttaccta actgacatga ctcttgagga aatgtcaagg 300 gactggtcca tgctcatacc caagcagaaa gtggcaggcc ctctttgtat cagaatggac 360 caggcgatca tggataagaa catcatactg aaagcgaact tcagtgtgat ttttgaccgg 420 ctggagactc taatattgct aagggctttc accgaagagg gagcaattgt tggcgaaatt 480 tcaccattgc cttctcttcc aggacatact gctgaggatg tcaaaaatgc agttggagtc 540 ctcatcggag gacttgaatg gaatgataac acagttcgag tctctgaaac tctacagaga 600 ttcgcttgga gaagcagtaa tgagaatggg agacctccac tcactccaaa acagaaacga 660 gaaatggcgg gaacaattag gtcagaagtt tga 693 <210> 2 <211> 1479 <212> DNA <213> Rotavirus sp. <400> 2 atggcaacct ttaaggatgc ttgttttcat tatagaagga ttacaaaact aaacagggaa 60 ttactgagaa ttggagcaaa ctcagtatgg actccagttt cttcaaataa aattagagga 120 tggtgcattg agtgttgtca attgactgaa ttgacctttt gtcatggatg ctcattggct 180 cacgtttgtc aatggtgcat tcaaaacaaa cgttgcttct tagacaatga accacatctt 240 ttaaagttaa gaacctttga atctccaata acaaaggaaa aattgcagtg cattattgat 300 ttatataatc tactatttcc aatcagccct ggtatcataa atagatttaa aaaagcagtt 360 aaacaaagaa agtgtagaaa tgaaagtgat aaatcgtggt ataatcaatt actacttcca 420 attactctaa atgccgcagt ttttaaattt cattcgaggg aaatttacat ttttggattt 480 tatgaaggat catcagcatg catagattta ccatatagac ttgtaaattg cattgactta 540 tatgataaat tgctgttaga tcaaataaat tttgaaagaa tgagttgtct tccagataag 600 ttacaatcta tctatgcaaa taattatttt aaattgagca gacttccttc aatgaagttg 660 aaacaagttt attattcaga cttctccaaa caaaatttga ttaataagta taaaactaag 720 agtcgcatag tacttagaaa tctgactgaa ttcacttggg attctcaaat tgatttgcat 780 catgatctaa tcaataacaa agataaaata cttgcagcat tatcaacatc atcgttaaaa 840 caattcgaaa cacatgattt aaatttagga agagtaaaag ctgacatttt tgaacttgga 900 catcattgca aaccaaatta tatttcatca aatcattggc aaccggcatc aaaaattttc 960 cagtgtaagt ggtgcaatgt aaagtatgca tttagagata tggattggaa gatggaatca 1020 atgtataatg aactcttaag ttttctacag tcctgttaca aaagtaatgt taatgtaggg 1080 cattgtagtt caattgaaag tgtttatcca ctagtcaaag atatgctttg gcattcaatt 1140 acaaaatata ttgatcaaac tattgagaaa ttatttgatg caatgaatcc ggtgcaagtg 1200 aatgagcaac ttgtaattaa cttctattgg caaatagata tcgctctgta cactcacatc 1260 aaaatgatac taaaaactga agctcttccg tttactttca cacttaacca gttcaattct 1320 ataattaagg gaatcattaa ccaatggtgt gacgtcgctg aattggatct tttaccgtta 1380 tgcactgaac aaaccgacaa attggttaaa ctgaaagaag aagggaaact gtctgaagag 1440 tatgagctcc taatctcgga ttccgaagac gacgactga 1479 <210> 3 <211> 158 <212> DNA <213> Adenovirus <400> 3 ggctcgactc cgtggcctgg aggctaagcg aacgggttgg gctgcgcgtg taccccggtt 60 cgaatctcga atcaggctgg agccgcagct aacgtggtac tggcactccc gtctcgaccc 120 aggcctgcac aaaacctcca ggatacggag gcgggtcg 158

Claims (14)

1. 숙주세포 타입 1 인터페론(IFN) 반응 억제 인자를 암호화하는 하나 이상의 유전적으로 조작된 핵산; 및 하나 이상의 숙주세포 활성 아미노산 서열을 암호화하는 하나 이상의 유전적으로 조작된 핵산을 포함하고, 상기 하나 이상의 숙주세포 활성 아미노산 서열을 암호화하는 하나 이상의 유전적으로 조작된 핵산이 상기 숙주세포 내에서 과 발현되는 것인, 재조합 바이러스 벡터.
2. 제1항에 있어서, 상기 숙주세포 타입 1 IFN 반응 억제 인자가 로타바이러스 NSP1 또는 인플루엔자 바이러스 NS1인 것인 재조합 바이러스 벡터.
3. 제1항에 있어서, 상기 숙주세포 타입 1 IFN 반응 억제 인자가 로타바이러스 NSP1, 인플루엔자 바이러스 NS1, 엑트로멜리아 바이러스 C12R 단백질, C형 간염 바이러스 NS3/4A 프로테아제, 우두 바이러스 vIFN-α/β Rc 단백질, 아데노바이러스 E1A 단백질, 파라믹소바이러스의 C 단백질, 및 인간 파필로마바이러스(HPV) E6 종양단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 재조합 바이러스 벡터.
4. 제1항에 있어서, 상기 재조합 바이러스 벡터가 아데노바이러스, 베큘로바이러스, 폭스 바이러스, 홍역 바이러스, 폴리오바이러스, 렌티바이러스, 간염 바이러스, 아르보바이러스 및 수포성 구내염 바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 바이러스로부터 유래된 것인 재조합 바이러스 벡터.
5. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 면역자극 아미노산 서열이 로타바이러스, 인플루엔자 바이러스, 엑트로멜리아 바이러스, 간염 바이러스, 우두 바이러스, 아데노바이러스, 파라믹소바이러스, HPV, HIV, HTLV, 엔테로바이러스, 헤르페스바이러스, EEE, VEE, 서부 나일강 바이러스, 노르워크 바이러스, 파르보바이러스, 뎅기 바이러스, 및 출혈열 바이러스의 하나 이상으로부터 유래되는 것인 재조합 바이러스 벡터.
6. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 숙주세포 활성 아미노산 서열이 항원인 것인 재조합 바이러스 벡터.
7. 제6항에 있어서, 상기 항원이 결핵균 항원인 것인 재조합 바이러스 벡터.
8. 개체의 숙주세포 내에서 맞춤형 반응을 촉발하는 방법으로, 상기 개체의 상기 숙주세포에 숙주세포 타입 1 인터페론(IFN) 반응 억제 인자를 암호화하는 하나 이상의 유전적으로 조작된 핵산; 및 하나 이상의 숙주세포 활성 아미노산 서열을 암호화하는 하나 이상의 유전적으로 조작된 핵산을 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 투여하는 것을 포함하고, 상기 하나 이상의 숙주세포 활성 아미노산 서열을 암호화하는 하나 이상의 유전적으로 조작된 핵산이 상기 숙주세포 내에서 맞춤형 양으로 과 발현되고, 상기 숙주세포 내 상기 하나 이상의 숙주세포 활성 아미노산 서열의 과 발현이 상기 숙주세포 내에서 상기 맞춤형 반응을 촉발하고, 상기 맞춤형 양이 (a) 상기 숙주세포 타입 1 EFN 반응 억제 인자를 암호화하는 상기 하나 이상의 유전적으로 조작된 핵산과 관련되고, (b) 상기 숙주세포 타입 1 IFN 반응 억제 인자를 암호화하는 하나 이상의 유전적으로 조작된 핵산 또는 상기 하나 이상의 숙주세포 활성 아미노산을 암호화하는 상기 하나 이상의 유전적으로 조작된 핵산의 프로모터와 관련되고, 또는 (c) 상기 숙주세포 타입 1 IFN 반응 억제 인자를 암호화하는 상기 하나 이상의 유전적으로 조작된 핵산 또는 상기 하나 이상의 숙주세포 활성 아미노산 서열을 암호화하는 상기 하나 이상의 유전적으로 조작된 핵산의 복제 수에 관련되는 것인 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 하나 이상의 숙주세포 활성 아미노산 서열이 면역자극성이고 상기 맞춤형 반응이 상기 개체에 의한 면역반응인 것인 방법.
10. 제8항에 있어서, 상기 하나 이상의 숙주세포 활성 아미노산 서열이 상기 숙주세포에 치료적이고 상기 맞춤형 반응이 상기 개체에 치료적인 방법.
11. 제8항에 있어서, 상기 숙주세포가 암세포이고, 상기 하나 이상의 숙주세포 활성 아미노산 서열이 세포자멸을 촉진하거나 다르게는 암세포를 사멸하는 서열이고, 상기 맞춤형 반응이 상기 암세포의 세포자멸 또는 사멸인 것인 방법.
12. 개체 내에서 하나 이상의 면역원성 아미노산 서열에 대한 면역반응을 촉발하는 방법으로, 상기 개체에 숙주세포 타입 1 인터페론(IFN) 반응 억제 인자를 암호화하는 하나 이상의 유전적으로 조작된 핵산; 및 상기 하나 이상의 면역원성 아미노산 서열을 암호화하는 하나 이상의 유전적으로 조작된 핵산을 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 투여하는 단계를 포함하고; 상기 재조합 바이러스 벡터로부터 상기 하나 이상의 면역원성 아미노산 서열의 발현이 상기 개체 내에서 상기 하나 이상의 면역원성 아미노산 서열에 대한 면역반응을 촉발하는 것인 방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 하나 이상의 면역원성 아미노산 서열이 결핵 또는 말라리아에 대한 항원인 것인 방법.
14. 개체 내에서 암을 치료하는 방법으로, 상기 개체에 숙주세포 타입 1 인터페론(IFN) 반응 억제 인자를 암호화하는 하나 이상의 유전적으로 조작된 핵산; 및 하나 이상의 세포자멸-유도성 아미노산 서열을 암호화하는 하나 이상의 유전적으로 조작된 핵산을 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 투여하는 단계를 포함하고; 상기 재조합 바이러스 벡터로부터 상기 하나 이상의 세포자멸-유도성 아미노산 서열의 발현이 상기 개체 내에서 암세포의 세포자멸을 야기하는 것인 방법.

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