CN102089423A - 通过表达ⅰ型干扰素反应的抑制剂来增强来自基于病毒的疫苗载体的转基因表达 - Google Patents

Abstract

基于病毒的载体经基因工程化可以表达抗病毒免疫系统的抑制剂(例如I型干扰素反应的抑制剂)，以便增强转基因表达。该转基因可以编码抗原或其他的治疗剂。

Description

通过表达Ⅰ型干扰素反应的抑制剂来增强来自基于病毒的疫苗载体的转基因表达

技术领域

本发明一般涉及来自基于病毒的载体的转基因表达的增强。特别地，本发明提供了编码I型干扰素反应的基因工程抑制剂的基于病毒的载体，以及所研究的可提供寄主细胞活性反应(例如免疫刺激性的、治疗性的、或选择性凋亡的)基因，借此增强转基因表达。

背景技术

先天的免疫系统充当抵抗包括细菌或病毒在内的侵入性病原体的防御体系的第一线。真核细胞经由许多细胞表面和胞内生殖系编码的模式识别受体(PRRs)比如Toll样受体(TLRs)、Nod样(核苷酸结合寡聚化结构域)受体、以及RNA解旋酶RIG-I(视黄酸诱导的基因-I)和MDA5(黑素瘤分化相关基因5)而具有识别病毒和微生物的成分的固有能力。病毒或细菌成分与这些受体结合调节了抗细菌和抗病毒的效应因子的上调和产生。

有颌类脊椎动物进化了适应的免疫系统，还发展了干扰素细胞因子家族。所述家族专门用于出现感染的自分泌和旁分泌性信号，并且促进在那些可提供对抗包括病毒和胞内细菌在内的传染剂的保护的细胞当中的交流。类似地，这些脊椎动物可以在受感染细胞内部通过中断细胞代谢过程或降解外来物质来激活用于限制感染的机制。干扰素(IFN)-α和干扰素-β包含I型IFN家族，并且首先被鉴定为赋予细胞抗病毒状态的体液因子。在对I型IFN抗病毒作用所必需的自分泌IFN诱导的效应因子和调节剂蛋白质中，有RNA依赖性蛋白激酶(PKR)、2，5′-寡腺苷酸合成酶(OAS)、RNA酶L、以及Mx蛋白质GTP酶。双链或高级结构的RNA在调节分别被可停止RNA翻译的IFN诱导的PKR激酶所催化的蛋白质磷酸化、以及被可降解RNA的OAS依赖性RNA酶L所催化的RNA降解中起着重要作用，并且还在通过IFN诱导的RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR1)的RNA编辑中起着重要作用。IFN-α/β的表达被IFN调节因子(IRE)家族的转录因子有效地控制。例如，当分别被TLR3和TLR4识别时，双链RNA和脂多糖，导致IRE-3和IRE-7活化；TLR7和TLR9检测出单链RNA和CpG DNA并且经由还涉及IRAK1/4和TRAF6的MyD88依赖性路径来刺激IRE-5和IRE-7。

最成功的哺乳动物的病毒病原体已经进化了阻断这些自分泌和旁泌性反应的机制，使得它们能够形成感染的。另外，特定的病毒或双链RNA可激活非TLR依赖性的PRR反应，经由胞质RNA解旋酶RIG-I和/或MDA5的信号通过衔接分子IPS-1(干扰素启动子刺激物1)，借此刺激取决于IRE-3和IRE-7的特定反应基因的转录。病毒蛋白质进化得克服这些反应的例子包括，但不限于：轮状病毒的NSP1蛋白，其结合IRE-3并抑制核的转位；鼠痘病毒的C12R蛋白，其结合IFN-α/β；流感的NS1，其抑制IRE-3的核转位并且干涉RIG-1依赖性信号；以及丙型肝炎病毒的NS3/4A蛋白酶，其特异性地切割MAV和参与IFN-α/β转录信号传导的TRIF蛋白。

疫苗已经在消灭或降低许多疾病发生方面取得成功。然而，迄今仍有一些疾病经证明对于免疫法的努力是顽抗的。另一方面，目前使用的疫苗不是最有效的并且/或者具有不适当的副作用。因此，很需要新的方法进行疫苗设计。以那些天然地能够感染真核细胞的减毒病毒为基础的载体的使用特别有前景。这些载体能够容易地进行基因工程，以包含并表达编码所研究抗原的转基因。不幸的是，在许多情况中，这些载体的给药不会导致产生足够的抗原以便在受体中引起保护性的免疫反应。这往往是因为被疫苗载体感染的寄主细胞不能区分病毒传染剂与被减毒的病毒疫苗载体。当疫苗病毒载体将成为真正的传染剂时，寄主细胞会对其作出反应：细胞启动免疫反应、尤其是IFN I反应，其破坏或者衰减疫苗载体产生被编码抗原的能力，从而使疫苗给药的目的失败。

人们一直需要开发新的、并且改进现有的疫苗传递载体，并且尤其需要解决寄主通过基于病毒的疫苗载体干扰抗原产生的问题。

发明内容

本发明提供了病毒载体，其除了经基因工程化以包含编码寄主细胞活性氨基酸序列(在此有时是指“被编码因子”，并且其可能是一种以上所研究的蛋白质或多肽，包括酶、抗原、抗体、治疗剂、凋亡试剂(例如，TNF)、癌症或肿瘤杀死剂等)的核酸序列之外，它们还被基因工程化成包含编码可抑制哺乳动物抗病毒免疫反应的因子(在此有时是指“抑制剂因子”或“干扰因子”)的核酸序列。例如，在病毒载体中的被编码因子可以是一种以上对肺结核或其他疾病(疟疾、人类免疫缺陷、流感、登革热等)特异的抗原。该载体还将经基因工程化从而编码可抑制哺乳动物对病毒的IFN I反应的抑制因子。结果是，被载体编码的抗原在真核寄主细胞中被转录并翻译，而没有被寄主细胞的抗病毒免疫反应干扰或者仅有减弱的干扰。因而，提高了在人类或者其他哺乳动物体内产生免疫刺激反应的能力。本发明还期待当使用病毒载体时应用所研究蛋白质(例如，胰岛素、肿瘤坏死因子等)的增强的传递，因为将没有被寄主细胞的抗病毒免疫反应干扰或者有减弱的干扰。

本发明的一个目的在于提供一种重组病毒载体，其包含一个以上用于编码寄主细胞1型干扰素(IFN)反应抑制因子的基因工程化的核苷酸；以及一个以上用于编码一个以上寄主细胞活性氨基酸序列的基因工程化的核苷酸。该一个以上用于编码一个以上寄主细胞活性氨基酸序列的基因工程化的核苷酸在寄主细胞中过表达。在本发明的一个实施方式中，寄主细胞1型IFN反应干扰因子是轮状病毒NSP1或流感病毒NS1。在另一个实施方式中，寄主细胞1型IFN反应干扰因子是轮状病毒NSP1、流感病毒NS1、鼠痘病毒C12R蛋白、丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶、牛痘病毒vIFN-α/βRc蛋白、腺病毒E1A蛋白质、副粘病毒的C蛋白、或者人类乳头状瘤病毒(HPV)E6癌蛋白。在又一个实施方式中，重组病毒载体由下述衍生得到：腺病毒、杆状病毒、痘病毒、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、慢病毒、肝炎病毒、虫媒病毒、或者水泡性口膜炎病毒(或各种其他的病毒)。在一些实施方式中，被编码因子包括一个以上免疫刺激性的氨基酸序列，该因子来自于下组中的一个或多个：轮状病毒、流感病毒、鼠痘病毒、肝炎病毒(例如，C等)、牛痘病毒、腺病毒、副粘病毒、HPV、HIV、HTLV、肠道病毒、疱疹病毒、EEE、VEE、西尼罗河病毒、诺沃克病毒、细小病毒、登革热病毒、以及出血热病毒(或很宽范围种类的其他病毒)。在一些实施方式中，一个以上寄主细胞活性氨基酸序列是抗原，比如结核分枝杆菌抗原。被编码因子还可以是酶、治疗性的肽或蛋白、凋亡剂或抗癌剂等，其中被编码因子的本性将取决于应用。

本发明的另一个目在于提供一种应用重组病毒载体的方法，该载体包含：一个以上用于编码寄主细胞1型IFN反应抑制因子的基因工程化的核苷酸；以及一个以上用于编码一个以上寄主细胞活性氨基酸序列的基因工程化的核苷酸，从而在体外或体内(例如，在哺乳动物比如人类体内)提供给细胞一个以上寄主细胞活性的氨基酸序列。当用重组病毒载体感染细胞时，将得到更大的氨基酸产生量，因为细胞将没有能力或者具有减弱的能力来启动有效的哺乳动物对于重组病毒的IFN I反应。该一个以上用于编码一个以上寄主细胞活性氨基酸序列的基因工程化的核苷酸在寄主细胞中过表达。在本发明的一个实施方式中，寄主细胞1型IFN反应干扰因子是轮状病毒NSP1或流感病毒NS1。在另一个实施方式中，寄主细胞1型IFN反应干扰因子是轮状病毒NSP1、流感病毒NS1、鼠痘病毒C12R蛋白、丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶、牛痘病毒vIFN-α/βRc蛋白、腺病毒E1A蛋白、副粘病毒的C蛋白、或者人类乳头状瘤病毒(HPV)E6癌蛋白。在又一个实施方式中，重组病毒载体由下述衍生得到：腺病毒、杆状病毒、痘病毒、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、慢病毒、肝炎病毒、虫媒病毒、或者水泡性口膜炎病毒(或很宽范围种类的其他病毒)。在又一个实施方式中，被编码因子包括一个以上免疫刺激性的氨基酸序列，该因子来自于下组中的一个或多个：轮状病毒、流感病毒、鼠痘病毒、肝炎病毒(例如，C等)、牛痘病毒、腺病毒、副粘病毒、HPV、HIV、HTLV、肠道病毒、疱疹病毒、EEE、VEE、西尼罗河病毒、诺沃克病毒、细小病毒、登革热病毒、以及出血热病毒(或很宽范围种类的其他病毒)。在一些实施方式中，一个以上寄主细胞活性氨基酸序列是抗原，比如结核分枝杆菌抗原。被编码因子还可以是酶、治疗性的肽或蛋白、凋亡剂或抗癌剂等，其中被编码因子的本性将取决于应用。

本发明的又一个目的在于提供用于一种在体外或体内调整寄主细胞中反应的机制，以便选择性地提供更大或更小量的1型IFN反应。通过在不同1型IFN抑制因子中间进行选择，能够提供重组病毒载体，其具有：抑制因子；以及一个以上用于编码一个以上寄主细胞活性氨基酸序列的基因工程化的核苷酸。取决于经基因工程化进入病毒载体的干扰因子，被改装的重组病毒载体能够以更大或更小的量在体外或体内(例如、在哺乳动物比如人类体内)为细胞提供一个以上寄主细胞活性氨基酸序列。还可以通过下述方式实现调整：在不同的启动子当中进行选择、提供附加拷贝的用于编码所研究蛋白质的核苷酸、以及其它方式。当用重组病毒载体感染细胞时，将得到更大的氨基酸产生量，因为细胞将没有能力或者具有减弱的能力来启动有效的哺乳动物对于重组病毒的IFN I反应。增加的产生量能够通过用于制备重组病毒载体的改装而被调节，使得在一些应用中能够取得明显更高的产生量，而在其他的应用中则仅取得略微较高的产生量。提供的调整在此期待在寄主细胞中提供出从低产生量到高产生量的全谱被编码因子。该一个以上用于编码一个以上寄主细胞活性氨基酸序列的基因工程化的核苷酸在寄主细胞中被过表达至受采用的改装所控制的程度。在本发明的一个实施方式中，寄主细胞1型IFN反应干扰因子是轮状病毒NSP1或流感病毒NS1。在另一个实施方式中，寄主细胞1型IFN反应干扰因子是轮状病毒NSP1、流感病毒NS1、鼠痘病毒C12R蛋白、丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶、牛痘病毒vIFN-α/βRc蛋白、腺病毒E1A蛋白、副粘病毒的C蛋白、或人类乳头状瘤病毒(HPV)E6癌蛋白。在又一个实施方式中，重组病毒载体由下述衍生得到：腺病毒、杆状病毒、痘病毒、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、慢病毒、肝炎病毒、虫媒病毒、或者水泡性口膜炎病毒(或很宽范围种类的其他病毒)。在又一个实施方式中，被编码因子包括一个以上免疫刺激性的氨基酸序列，该因子来自于下组中的一个或多个：轮状病毒、流感病毒、鼠痘病毒、肝炎病毒(例如，C等)、牛痘病毒、腺病毒、副粘病毒、HPV、HIV、HTLV、肠道病毒、疱疹病毒、EEE、VEE、西尼罗河病毒、诺沃克病毒、细小病毒、登革热病毒、以及出血热病毒(或很宽范围种类的其他病毒)。在一些实施方式中，一个以上寄主细胞活性氨基酸序列是抗原，比如结核分枝杆菌抗原。被编码因子还可以是酶、治疗性的肽或蛋白、凋亡剂或抗癌剂等，其中被编码因子的本性将取决于应用。

附图说明

图1A-C为抗病毒免疫反应抑制剂的序列。A，来自于流感病毒的NS1的DNA序列(SEQ ID NO：1)；B，来自于轮状病毒的NSP1的DNA序列(SEQ ID NO：2)；C，来自于腺病毒的VAI的RNA基因序列(SEQ ID NO：3)。

图2.IFN拮抗剂基因VAI提高了TB.S抗原的表达。免疫印迹描绘了与未转染的Hela细胞(泳道1和3)相比，来自于被VAI基因转染的Hela细胞的腺病毒表达的TB.S抗原的增强的产生(泳道2和4)。在50和100MOI处都可看到TB.S抗原的更高表达。在被VAI转染(泳道6)和未被VAI转染的(泳道5)用空载体Ad35感染的Hela细胞中没有观察到TB.S抗原的表达。泳道7和8分别显示了未用VAI基因转染、和用VAI基因转染的未被感染的对照Hela细胞。

具体实施方式

本发明是以病毒载体的开发为基础的，该病毒载体除经基因工程化而包含编码一个以上所研究的在寄主细胞内部具有活性的氨基酸序列(例如，蛋白质、肽、酶、或者其他被编码因子或试剂)的核酸序列之外，还被基因工程化成包含编码一个以上可抑制寄主细胞抗病毒的免疫反应的因子(在此称作“抑制剂因子”或“干扰因子”)的核酸序列。因此，用病毒疫苗载体感染的哺乳动物寄主细胞可产生所研究的蛋白质，而没有被寄主细胞的抗病毒免疫反应妨害或抑制。这些氨基酸被基因工程化的核酸所表达并且具有寄主细胞活性，即，它们具备有益于寄主细胞的活性(特性、特征等)。在一些实施方式中，这些氨基酸是抗原，并且这些抗原在其中免疫反应抑制剂也由载体表达的细胞中的提高的表达导致了改进的对于抗原的细胞的和体液的免疫反应。另外，转基因表达的改进还可以能够减小取得足够免疫反应所要求的载体剂量。在其他实施方式中，另外被编码因子本质上可以是治疗性的。在此，术语“治疗性的”被用于表示这样的因子：其不是抗原，但其在寄主细胞内部具有一些其它的有利作用(例如，胰岛素、凝血因子VIII及其他肽是“治疗性的”)。被编码因子还可以是选择性凋亡因子(例如，肿瘤坏死因子TNF)，并且可用作抗癌剂。

如果抑制寄主细胞免疫反应的干扰因子(通常为蛋白质)的起源是病毒性的，则它们可以是异源的(即来源于或者起源于不同于病毒疫苗载体的病毒类型)或者是同源的(即来源于或者起源于相同类型的病毒)。例如，腺病毒载体可以经基因工程化而包含并表达例如来自于异源病毒比如流感病毒的免疫系统抑制剂。作为另一种选择，腺病毒载体可以经基因工程化而包含并过表达同源腺病毒的免疫系统抑制剂，即使病毒载体可能已经天然地编码抑制剂。在后一情形中，同源的免疫系统抑制剂被在基因工程化载体中以一定水平过表达，所述水平高于正常的水平或者相当于在起源病毒中、或者在根据本发明进行基因工程化以前的病毒载体中特有的表达水平。这可以通过如下方案完成：例如，经基因工程化使病毒载体包含多拷贝的编码抑制剂的基因；或者使病毒载体基因工程化以使得抑制剂的转录被更有效的启动子(例如超级启动子)驱动；或者组合这些策略等。

本发明的进一步方面在于提供“调整的”或“可调整的”病毒载体，其中在受体寄主细胞内部免疫系统抑制因子的含量或活性被调整成期望水平。例如通过操控或改变一个以上抑制免疫反应的因子的一致性和/或表达模型，可以进行这样的调整。例如，能够选择驱动所研究的因子或蛋白质转录的启动子，以便获得期望的转录水平，同时如果期望高水平的转录则使用具有非常有活性的启动子，并且如果期望低水平的转录则使用很弱的启动子。另外，通过受限地或特异性地抑制被选择路径的因子的差异表达，特定的免疫反应路径可以被特异性地靶向。例如，甲型流感的NS1蛋白可抑制IRE-3的核转位并且抑制在感染早期RIG-1依赖性信号传导，而丙型肝炎病毒的NS3/4A蛋白酶可通过无关的机制在后来的反应中切割与IFN-α/β的翻译直接有关的因子，并且鼠痘病病毒的C12R蛋白可通过另一机制在后来对于感染的反应中结合并钝化产生的IFN-α/β。通过选择性地选择在构建体内部使用的特定的启动子，并且通过选择性地选择被构建体编码的特定的因子或者因子的组合，能够引起被调整的寄主细胞反应。其他改变因子表达的方式包括，但不限于：使用诱导性启动子；使用细胞或组织特异性的启动子；包含不同的可增强或减弱转录的遗传成分(例如，增强子序列等)；使用优选的或非优选的密码子序列；等等。另外，取决于载体给药的目标，所研究的因子或寄主细胞活性蛋白可以被改变或选择，以便具有增强或减弱的活性。

对于“抑制”免疫反应，我们指的是完全地或局部地抑制、减轻、降低、阻碍等由真核细胞内部存在病毒所引起的典型的或正常的免疫反应。这样的抑制可以以本领域的技术人员想到的数种方式中的任一方式被检测和测量，包括，但不限于：检测物质的含量、活性或特征的减少，所述物质是抗病毒免疫反应的标志、是抗病毒免疫反应的特征、或者与抗病毒免疫反应有关(例如IFN α、IFN β等)。抑制水平一般至少是约25％，优选约50％，更优选约60％、70％、80％、90％或100％。抑制水平典型地通过如下方法进行测量：检测与在对照细胞(用编码一个以上转基因、但不编码免疫系统抑制剂的病毒载体转染的细胞)中产生的相同物质的含量相比较、在已经用本发明的病毒载体(编码一个以上转基因加上一种以上免疫系统抑制剂的载体)转染的寄主细胞中产生的一种以上物质的含量之间的差异。

类似地，对于“增强”转基因表达，一般指的是与对照细胞相比，在用本发明载体转染的寄主细胞内部提高、增加被表达(即，转录并翻译)的转基因的含量。这样的增强可以通过本领域的技术人员想到的数种方法中的任何一种来进行测量，例如：检测由载体产生的转基因产品的含量、活性或特征的提高；检测与被产生的转基因产品有关的物质(例如mRNA、物质或者转基因产品所产生的作用、对于转基因产品的抗体等)的含量、活性或特征的提高。增强水平一般至少是约25％，优选约50％，更优选约60％、70％、80％、90％或100％，或者更高。

通过发现许多病毒可编码对抗IFN诱导的抗病毒反应的基因产物，IFN系统作为寄主抗病毒感染的防御的基本重要性被进一步显示。病毒利用数种不同的策略来阻断IFN诱导的蛋白质的诱导和作用。DNA和RNA病毒都编码削弱IFN信号路径的活性的蛋白质。显然将会涉及多个机制。其中之一是模仿。存在其中病毒编码可模仿在IFN信号转导路径中细胞组分的产物的数个实施例。这种分子模仿能够导致IFN信号处理的拮抗作用。痘病毒，例如，编码可溶性的IFN受体同系物(vIFN-Rc)。这些vIFN-Rc同系物被从受痘病毒感染的细胞中分泌出来并且结合IFNs，从而防止它们通过它们的天然受体起作用以引起抗病毒反应。vIFN-α/βRc蛋白被牛痘病毒和数种额外的正痘病毒分泌。vIFN-α/β受体同系物，即在西方储备菌株(Western Reserve strain)中的B18R基因产物和在哥本哈根菌株(Copenhagen strain)中的B19R产物，结合数种不同的IFN-α亚种和IFN-β，并且阻断IFN-α/β信号活动。三种额外的影响IFN信号传导的DNA病毒是腺病毒、乳头状瘤病毒、以及人类疱疹病毒8(HHV-8)。腺病毒E1A蛋白可阻断在ISGF-3活化的上游点处IFN调节的信号传导。ISGF-3的DNA结合活性被E1A抑制。SeV的C蛋白(SeV)，即在寄主细胞质中复制的副粘病毒，通过干涉IFN诱导的细胞基因的转录活化而阻遏了IFN诱导的抗病毒反应。就仙台病毒而言，C蛋白以至少两种方式干涉IFN作用。C蛋白抑制了STAT-1的合成，并且它们还诱导STAT-1提高的转换(turnover)。人类乳头状瘤病毒(HPV)E6癌蛋白选择性地结合于IRF-3，但是仅非常弱地结合于其他包括IRF-2和IRF-9在内的细胞IRFs。E6与IRF-3的联系抑制反式激活(transactivation)，从而为HPV提供机制以阻遏IFN反应。腺病毒E1A蛋白还通过取决于E1A结合p300的能力的机制来抑制IRF-3调节的转录活化。HHV-8，一种与卡波西肉瘤有关的γ疱疹病毒，合成具有阻遏被IFN-α/β诱导的转录活化的功能的IRF同系物(vIRF)。被HHV-8编码的vIRF蛋白质还抑制IRF-1调节的转录活化。两种其他的疱疹病毒，即水痘-带状疱疹病毒(VZV)和巨细胞病毒(CMV)，还破坏了IFN信号转导路径的功能。VZV抑制STAT-1和JAK-2蛋白的表达，但是对JAK-1几乎没有影响。拮抗作用的不同策略发生在受CMV感染的细胞中，其中MHC II类表达也被抑制。由于在受CMV感染的成纤维细胞中蛋白质降解增强，所以在JAK-1水平上有特定的降低。数种非节段(nonsegmented)负链RNA病毒编码可拮抗IFN受体调节的来自于I型IFN受体的信号传导的基因产物。例如，感染猿猴病毒5或腮腺炎病毒会导致受蛋白体调节的STAT-1降解的提高，反之，在用副流感病毒类型2感染的细胞中则存在STAT-2的降解。埃博拉病毒的VP35蛋白，一种负链RNA病毒，具有I型IFN拮抗剂的功能，虽然还没有定义精确的拮抗作用的生物化学机制。VP35抑制了IFN-β启动子的病毒诱导、和dsRNA调节的及病毒调节的ISRE驱动的基因表达的活化。编码三个示例性抑制剂(来自流感病毒的NS1、来自轮状病毒的NSP1、以及来自腺病毒的VAI)的核酸序列显示在图1A-C中。

IFN抑制因子还可以由其他的非病毒来源得到，例如，从寄主细胞(例如细胞因子信号传导抑制剂(SOCS)、显性负性的PKR和显性负性的RNA酶L)得到，并且可以在本发明的实施方式中使用。任何可抑制或衰减IFN反应、并且被能够经基因工程化进入病毒表达载体并成功地由该病毒表达载体表达的核酸序列所编码的的因子(例如抗受干扰素刺激基因的siRNA)可以在本发明的实施方式中使用。其例子包括，但不限于，如上所述的那些因子、以及各种自分泌IFN诱导的效应因子和对I型IFNs的抗病毒作用所必需的调节剂蛋白质，比如：RNA依赖性蛋白激酶(PKR)；2，5′-寡腺苷酸合成酶(OAS)；RNA酶L；Mx蛋白GTP酶；IFN诱导的RNA特异性的腺苷脱氨酶(ADAR1)；IFN调节因子比如IRF-5和IRF-7；(IRF)家族的转录因子比如TLR3、TLR4、TLR7和TLR9；因子比如IRAK1/4和TRAF6；RLR、MyD88、TAK1、TOLLIP、TIFA等。

这些因子的一种以上功能型被本发明的病毒载体可操作地编码。对于“功能型”，我们是指，当在合适的寄主细胞例如哺乳动物寄主细胞中由本发明的病毒载体转录时，被编码的因子具有其平常活性的至少约25％、优选约50％、并且更优选约100％或以上。对于“可操作地编码”，我们是指，编码因子的核酸序列易于在合适的寄主细胞、比如哺乳动物细胞内部成功地转录并翻译。

本发明的载体是基于病毒的载体。对于“基于病毒的(或病毒基的、以病毒为基础的)”，我们指的是，载体或媒介物是由天然产生的病毒衍生的、或者以天然产生的病毒为基础。这样的载体一般地已经从它们的天然形式以数种可能有利的方式中的任何一种经过基因工程而发生变化。例如，病毒载体一般要进行衰减，以使得它们不会引起病征或者仅引起温和的病征；它们可以被改变，使得不能在寄主细胞内部复制；它们可以经基因工程化而包含核酸序列，该核酸序列可促进来自其他生物体的异源基因(例如客基因或者转基因)的导入、或者导入多拷贝的来自类似生物体的基因；它们可以编码可激活补体的基因缺失、来自病毒的IRES、前导肽序列、设计成提高mRNA稳定性等的序列。

尤其是，为本发明的目的，病毒载体经基因工程化而包含并表达1)一种以上所研究的蛋白质或多肽和2)一种以上抑制哺乳动物细胞对于病毒侵入的免疫反应的因子。另外，一种以上多肽和一种以上抑制免疫反应的因子的特征性和表达模式能够被设计得引起在寄主细胞内部的调整或可调的反应。

一般地，在本发明实践中，基于病毒的载体在靶细胞/组织中是非复制型的、具有有限的复制，并且/或者可抑制寄主细胞抗病毒反应的因子以细胞或组织特异性的手段被表达。这是因为，抑制寄主细胞抵御病毒感染的能力应该仅是临时的，或者被限制在寄主中特定的位置；或者应该仅选择性地下调特定的触发机制以避免造成寄主对病毒感染的一般敏感性。例如，基于腺病毒的载体被典型地进行E1-E3删除，并且携带在CMV或其他病毒/哺乳动物启动子的转录控制下的转基因。该E1-E3基因产物通常与病毒DNA的转录、靶细胞细胞骨架的重排、MHC的下调和新病毒子的组装有关。而I型IFN反应抑制剂的包含可以增强翻译、以及有时或许载体和过客基因序列两者的转录，其不会提供用于被删除基因的置换或者基因功能的机制。另外，因为有许多通过细胞表面和胞内模式识别激活先天免疫反应的机制，既难以又不期望完全消除I型IFN反应，特别是就疫苗载体而言。而且，虽然IFNα/β反应具有一些局部旁泌性功能，本发明的主要目的是并入可下调自分泌反应的抑制剂。最后，宿主对胞内病原体的免疫应答既不局限于I型IFNs，I型IFNs也不是同源免疫性所要求的。

合适的病毒衍生的载体的例子包括，但不限于，那些由腺病毒(复制型和非复制型)衍生的载体、杆状病毒载体、以及由痘病毒、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、流感病毒、水泡性口膜炎病毒、反向病毒、慢病毒等衍生的载体。另外，可以使用各种纳米工程化(nanoengineered)物质(例如Ormosil)。

就被载体编码的转基因而言，在本发明的一个具体实施方式中，转基因编码被期望引起细胞或体液免疫反应的抗原。一般来讲，这样的抗原是来自引起疾病的生物体或试剂比如病毒、细菌、或真核寄生虫的蛋白质、多肽或肽、或者其抗原片段。该抗原可以是完整的蛋白质、或者蛋白质一部分(例如其一个以上抗原性区域)、或者一种以上来自蛋白质的抗原表位。一般来讲，这样的表位例如长度是至少约8个氨基酸。这样的病毒载体可以是任何血清型，并且可以包括与疾病或下述病原有关的抗原：比如流感病毒；反向病毒，比如RSV、HTLV-1、以及HTLV-II；乳头瘤病毒，比如HPV；疱疹病毒，比如EBV、CMV或单纯疱疹病毒；慢病毒，比如HIV-1和HIV-2；棒状病毒，比如狂犬病；小RNA病毒，比如脊髓灰质炎病毒；痘病毒，比如牛痘；轮状病毒；以及细小病毒，比如腺病毒相关病毒1；分枝杆菌；幽门螺旋杆菌；沙门氏菌；志贺氏菌；大肠杆菌；立克次氏体；李司忒氏菌；军团菌肺炎；假单胞菌；弧菌；炭疽杆菌；伯疏氏螺旋体；疟原虫，比如恶性疟原虫；锥体虫，比如克氏锥虫；贾第鞭毛虫，比如肠贾第虫；方头蜱；巴贝虫，比如微小巴贝虫；内变形虫，比如痢疾内变形虫；艾美虫，比如巨型艾美耳球虫；利什曼虫；血吸虫；布鲁格丝虫；吸虫；恶丝虫；吴策线虫；盘尾丝虫等。特别地，结核分枝杆菌抗原比如Rv1733、Rv3130c、Rv2627c、Rv2628、Rv3641c、Rv3135、Rv3136、Rv0383c、Rv0394c、Rv3514、Rv3532、Rv1997、Rv0159c、Rv1039c、Rv1197、Rv3620c、Rv2347c、以及Rv1792；以及/或者疟疾抗原比如环子孢子蛋白质(CSP)或其肽片段可以被使用。

另外、本发明的载体可以被用于引起对癌症抗原的免疫反应，所述癌症抗原的例子包括，但不限于：MUC1、存活蛋白、纤毛神经营养性因子、环加氧酶1、成纤维细胞生长因子、内皮分化因子、MAGE-1、酪氨酸酶等。

此外，一种以上抗原可以被编码在病毒载体中，或者分别编码，或者作为嵌合抗原(即，单一的包含两种以上不同抗原的可翻译的基因产物)。该抗原可能涉及到相同的疾病(例如数种结核抗原可以被编码在单一的、邻接的转录产物中)，或者可以涉及到不同的疾病(例如白喉、百日咳和破伤风抗原可以被包含于单一转录产物中)。作为另一种选择，例如，通过采用双顺反子表达，多个抗原可以被单独编码。该双顺反子表达使用内部核糖体进入位点(IRES)、多个单个的启动子和停止信号、或其他用于转录多个被编码蛋白质、多肽或肽的类似装置。另外，抗原和抑制抗病毒免疫反应的因子的排列还可以被单独地编码，或者作为嵌合体、或者使用用于多个转录的装置等。

在本发明的其他实施方式中，除抗原之外的部分被病毒载体编码。例如、具有有利作用的不同的蛋白质/多肽/肽可以被编码，其例子包括，但不限于，遗漏的或者其功能不适合个体形式的蛋白质(例如，胰岛素、CFTR等)。例如，本发明的方法能够被用于蛋白质的传递以便用于改正遗传性紊乱。例如，这样的基因将包括：缺损基因比如用于囊性纤维化的囊性纤维化横跨膜传导调控子(CFTR)基因的替代者；或者新基因比如用于治疗HIV的整合酶反义基因的导入物；或者用于增强I型T细胞反应的基因比如白介素-27(IL-27)；或者用于调节特定受体、代谢产物或激素比如胆固醇和胆固醇受体以及胰岛素和胰岛素受体的表达的基因；或者用于编码能够杀死癌细胞的产物比如与肿瘤坏死因子(TNF)相关的程序性细胞死亡诱导配体(TRAIL)的基因；或者天然产生的抑制骨吸收的蛋白质护骨蛋白(OPG)；或者用于有效地表达全长的人源化抗体例如作用于癌细胞上HER2/neu(erbB2)受体的人源化单克隆抗体。

在本发明的一些实施方式中，病毒载体被包含于疫苗制品和/或用于引起免疫反应的制品、或者用于其它类型哺乳动物治疗的制品中。本发明的组合物基本上包括在此描述的被纯化的病毒载体、以及药理学上合适的载体。这样的组合物的制备是本领域的技术人员所熟知的。典型地，这样的组合物或者作为液体溶液制备或者作为悬浮液制备，然而，也期待固体形式比如药片、丸剂、粉末等。还可以制备在给药之前形式适合于与溶液或悬浮液混合在液体中的固体形式或者浓缩物。该制品还可以被乳化。可以将活性成分与药学可接受的、并且与活性成分兼容的赋形剂混合。合适的赋形剂例如是水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等、或其组合。另外，组合物可以含有较小含量的辅助物质比如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂等。如果希望口服形式给药该组合物，则可以加入不同的增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或者粘合剂等。本发明的组合物可以含有任何这些附加的成分，以便以适合给药的形式提供该组合物。在配方中病毒载体的最终含量可以变化，但是一般是约1-99％。该组合物还可以包含附加的辅助剂，其合适的例子包括，但不限于：Seppic、Quil A、铝基辅助剂比如Alhydrogel等。该组合物可以含有单一类型的病毒载体，或者在制品中可以使用一种以上类型的病毒载体，即，制品可以包含这些载体的“鸡尾酒”。

本发明的方法涉及将在药理学可接受的载体中包含在此描述的一种以上基于病毒的载体的组合物给药于哺乳动物。而哺乳动物一般是人类，也不限于此情形。本发明的兽医应用也是可期待的。该制品可以通过本领域技术人员所熟知的许多合适方法中的任何一种来给药，该方法包括，但不限于：注射、口服、鼻饲、经皮、静脉内、腹膜内、皮下地、肌内注射、吸入等。另外，组合物可以单独给药或者与其他药物或免疫原性组合物结合使用，例如作为多组分疫苗的一部分来给药。另外，给药可以单一地发生。或者多个增效剂剂量可以在不同的时间间隔被给药，例如就疫苗而言，用于加强免疫反应；或者就治疗其他疾病比如癌症而言，用于除去逃过第一轮治疗的癌细胞；或者出于任何其他的原因。给药优选是预防性的，即，在暴露于引起疾病的试剂已经出现、或者疑似已经出现以前。然而，给药还可以事后进行，即，在已知暴露于或者疑似暴露于引起疾病的生物体之后，或者治疗性给药，例如在病征出现之后。

待被给药的病毒载体的含量可以依据对其给药的个体的特征(例如，种类、性别、年龄、遗传组成、一般健康等)、以及正在治疗的疾病或状况而改变。一般来讲，使用的剂量可以是约10³至10¹¹个存活的生物体、优选约10³至10⁹个存活的病毒颗粒(或pfu)，如文献(Shata et al.，Vaccine 20：623-629(2001)；Shata and Hone，J.Virol.75：9665-9670(2001))所述。

本发明还提供在需要其的个体中提高蛋白质生产、多肽或肽的方法。该方法包括来自病毒载体的蛋白质/多肽/肽与在个体细胞中抑制抗病毒免疫反应的因子共表达。如果蛋白质/多肽/肽是与疾病引起试剂有关的抗原，则方法可以是在个体中诱导免疫反应的方法。如果引起的免疫反应是保护性的(即，如果免疫反应抑制或者减轻由疾病引起试剂所引起的发病症状)，那么该方法还可以称为个体接种疫苗的方法。作为另一种选择，本发明还提供了通过将本发明的病毒载体给药于个体来治疗疾病或者减轻症状疾病的方法。该情况下，病毒载体转基因编码那些为抑制或减轻待将病毒载体给药于其的个体中病症所必需的或有帮助的蛋白质/多肽/肽。

实施例

实施例1.IFN拮抗剂基因VAI提高TB.S抗原的表达

该实验描述了干扰素拮抗剂基因的用途，其用于降低IFNs对于在腺病毒载体中表达克隆的结核抗原的消极效果。按如下所述设计并进行实验。

Ad35-TB.S是编码抗原85A、85B和来自结核分枝杆菌的TB10.4的融合蛋白的腺病毒35的复制缺陷型的、删除E1的衍生物。如同其他B组腺病毒那样，腺病毒35可感染表达表面标志CD46的哺乳动物细胞，并且因此能够感染绝大多数所有具核人类细胞。在该实验中使用的干扰素拮抗剂基因是与病毒有关的I(VAI)RNA基因。该VAI RNA基因产物通过阻断干扰素诱导的双链RNA激活的蛋白激酶PKR的活化而抵御细胞的抗病毒反应(Galabru J，Katze MG，Robert N，Hovanessian AG.Eur J Biochem.1989Jan 2；178(3)：581-9)。通过使用

PCR克隆试剂盒(Invitrogen)，在1,724bp插入物上经PCR扩增的VAI RNA基因被克隆入pCR-Blunt II-TOPO载体。一旦VAI RNA基因被导入哺乳动物细胞，其会被RNA聚合酶III大量地转录。

简言之，将Hela细胞接种入六孔组织培养平板上的完全Eagle最低必需培养基(EMEM)中，孵育至＞80％融合。第二天，来自每个组的试孔中细胞的数量被计数，并且以50和100的感染复数(MOI)将1mL稀释的Ad35-TB.S病毒或空病毒(不编码TB.S的病毒)加至每个孔。感染在CO₂培养箱中进行4小时。在4小时后，将1mL的完全培养基加至每个孔中的感染混合物，然后含有VAI基因的pCR-Blunt II-TOPO质粒被瞬时转染进入Ad35-TB.S病毒和空病毒感染细胞。以同样方式进行处理含有未感染细胞的对照细胞。在48小时后，来自每个孔的细胞被裂解并通过免疫印迹法用Ag-85特异性抗血清进行分析。

图2显示了与未转染VAI的Hela细胞(泳道1和3)相比，来自于被VAI基因转染的Hela细胞(泳道2和4)的腺病毒表达的TB.S抗原产生的免疫印迹对比。能够看出，在VAI转染的细胞中TB抗原TB.S的表达被明显地提高。在感染了VAI的细胞中，在50和100MOI处都可看到TB.S抗原的更高表达。

该实施例显示，如果VAI蛋白质也在寄主细胞中表达，在寄主细胞中抗原的表达得到提高。

实施例2.IFN拮抗剂基因NS1提高血凝素(HA)蛋白的表达

制备编码在双顺反子表达盒中来自流感病毒的IFN I抑制蛋白NS1和禽流感H5N1的血凝素(HA)蛋白的腺病毒载体疫苗构建体。将在用该腺病毒疫苗构建体感染的细胞中HA转基因的表达与在用表达相同的HA转基因但是不表达NS1蛋白质类似的腺病毒疫苗构建体感染的A549和Hela细胞中的表达相比较。在也表达NS1的细胞中表达了更高水平的HA。该研究验证了除编码并表达所研究的转基因之外、还使用编码并表达I型干扰素的抑制剂的腺病毒载体的方法。

实施例3.通过包含I型IFN反应抑制剂的疫苗免疫原性的增强

为了表明I型IFN反应抑制对病毒载体引起的免疫反应的影响，按如下所述对3组的10BALB/c小鼠接种疫苗。第一组只接收盐水，100μL肌内注射；第二组接受编码结核分枝杆菌抗原85A、85B和RV3407的融合蛋白的腺病毒血清型35载体，10¹⁰pfu肌内注射；第三组接受编码结核分枝杆菌抗原85A、85B和RV3407的融合蛋白的腺病毒血清型35载体和VAI基因，10¹⁰pfu肌内注射。对所有动物用相同的疫苗进行接触抗原后(post-priming)促进2周。对进行两周后促进的所有动物实施安乐死，并且收集脾和血液。

免疫及其他在动物模型中对编码产物的生物学反应的测量方法是本领域技术人员所熟知的。为了测量血清IgG和IgA对被编码Mtb的抗原的反应，收集400-500μL的血液置于单个的试管，并且允许通过在冰上孵育4hr而凝结。在微型离心机中离心五分钟后，将血清将转移至新鲜的试管中并且在-80℃下储存。通过使用将在疫苗接种之前、以及在疫苗接种之后每隔一定间隔收获的粪粒和阴道洗涤物，来确定粘膜IgG和IgA对被所研究基因表达的抗原的反应(Srinivasan et al.，Biol.Reprod.53：462；1995)；(Staats et al.，J.Immunol.157：462；1996)。标准的ELISA被用于定量IgG和IgA在血清和粘膜的样本中对所研究抗原的反应(Abacioglu et al.，AIDS Res.Hum.Retrovir.10：371；1994)；(Pincus et al.，AIDS Res.Hum.Retrovir.12：1041；1996)。卵清蛋白能够被包含于每个ELISA中作为阴性对照抗原。另外，视情况而定，每个ELISA能够包括阳性对照血清、粪粒或者阴道洗涤样本。阳性对照样本从动物身上收集，该动物通过鼻饲10μg被所研究基因表达的抗原与10μg霍乱毒素混合而接种疫苗，如同文献(Yamamoto et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.94：5267；1997)描述的那样。当血清稀释度产生在490nm处吸光度上升、大于阴性对照序列的平均值加三个标准误差值时，取最后的血清稀释度的倒数，计算出终点滴度。

可以通过胞内细胞因子染色(也称作胞内细胞因子细胞计数)或者通过ELISPOT(Letsch A.et al.，Methods 31：143-49；2003)来测量细胞免疫性。两个方法都允许定量抗原特异性的免疫反应，虽然ICS也增加了可同时通过表型表征抗原特异性的CD4+和CD8+T细胞的能力。这样的测定能够评估分泌IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IFN的抗原特异性T细胞的数量(Wu et al.，AIDS Res.Hum.Retrovir.13：1187；1997)。按文献(Wu et al，InfectImmun 63：4933；1995)所述方法和先前使用的方法(Xu-Amano et al.，J.Exp.Med.178：1309；1993)；(Okahashi et al.，Infect.Immun.64：1516；1996)，通过使用可商业购买的捕获物并检测mAbs(R & D Systems and Pharmingen)，进行ELISPOT测定。每个测定都包括有丝分裂原(Con A)和卵清蛋白对照。编码在此描述的载体系统的抗IFN与没有IFN抗性基因的传递系统相比具有数个优点。这些抗原基因以较高水平、并且以比较长的时间周期被表达，因此诱导更剧烈的免疫反应。

该实施例显示，被既表达I型干扰素反应抑制剂、又表达所研究免疫原的腺病毒载体疫苗所引起的免疫反应与仅编码免疫原的腺病毒载体相比得到提高。

实施例4.通过表达1型干扰素反应的抑制剂来增强来自基于杆状病毒的疫苗载体的转基因表达

许多基于病毒的载体已被成功地用于转染哺乳动物细胞。它们当中有腺病毒、腺病毒相关病毒(AAV)、乳多泡病毒、以及牛痘病毒。腺病毒载体已经被详细地研究，并且已经在许多基因治疗试验中和疫苗临床试验中使用；虽然最近的负面临床试验结果可以限制它们在美国的使用(Gene Therapy，7：110，2000；Nature Biotechnology.26，3-4，2008)。仍然有通过使用腺病毒相关病毒(AAV)进行的临床试验。

能够被用于感染哺乳动物细胞的可选载体是昆虫感染性杆状病毒(Trends Biotechnol.，20，173-180，2002)。杆状病毒是棒状的病毒，并且因此与基于病毒壳体的病毒系统相反，对能够被插入重组体杆状病毒中的遗传物质的含量没有限制。不同于由哺乳动物病毒衍生的病毒载体，杆状病毒基因表达被昆虫特异性启动子驱动。因此，杆状病毒基因在人类细胞中不表达(Virology.25：107-117，1983)，并且因此不能引起免疫反应。另外，哺乳动物细胞对杆状病毒基因产物没有预先存在的免疫性。另外，不同于基于哺乳动物病毒的病毒载体，在哺乳动物细胞内部没有先前存在的杆状病毒。因此，杆状病毒载体的重组不能发生，并且用杆状病毒感染不能产生内源的人类病毒。杆状病毒系统的另一个优点是，杆状病毒能够在无血清的培养基中大量地培养，该培养基中除去了病毒试剂和感染性蛋白质试剂对治疗剂造成血清污染的潜在危害。

当哺乳动物启动子(例如CAG)或病毒性内部核糖体进入位点(IRES)例如脑心肌炎病毒(EMCV)IRES被插入杆状病毒中转基因的上游时，能够在哺乳动物细胞中成功实现转基因的表达。杆状病毒载体似乎是出色的用于疫苗开发的候选对象，并且使用杆状病毒系统的疫苗候选物显示出与大多数其他病毒疫苗系统相比具有明确的优点。不幸的是，在哺乳动物细胞中异种蛋白的杆状病毒表达导致I型干扰素(IFN)反应(J.Immunol.，178，2361-2369，2007)。这种IFN反应利用蛋白激酶R(PKR)和2′-5′腺苷酸合成酶(2′-5′OAS)限制了异种蛋白表达。激活的PKR通过真核生物的起始因子eIF2的亚基的磷酸化阻断翻译。另一方面，2-5A合成酶产生较短的、可激活RNA酶L的2′-5′OAS相关的寡腺苷酸，RNA酶L是单链特异性的可消化mRNA和核蛋白体RNA的核糖核酸内切酶。这些机制可能会破坏或抑制被杆状病毒系统编码的过客核酸的转录和翻译。

成功的病毒的病原体具有进化的机制，使它们能够通过阻断IFNs的自分泌和旁泌性反应而形成感染。因此，通过产生含有编码一种以上可干涉寄主细胞I型干扰素(IFN)反应的蛋白质的核酸序列的重组体杆状病毒，在用重组体杆状病毒转染的哺乳动物细胞中观察到显著的转基因表达。能够调节I型干扰素(IFN)路径的蛋白质的例子包括，但不限于，轮状病毒的NSP1蛋白、鼠痘病毒的C12R蛋白、以及流感的NS1。C12R蛋白结合于INF-α/β，从而调节免疫反应。最近的研究已经表明，轮状病毒非结构性蛋白质NSP1与IRF3互相作用，并且该相互作用导致受蛋白酶体调节的IRF3降解，其依次抑制INF-β。流感的NS1蛋白已经显示出对I型IFN路径具有数种影响。NS1蛋白的羧基端结构域的活性质将抑制寄主mRNA加工机制。该结构域还可通过与细胞的翻译起始因子eIF4GI的直接相互作用促进病毒mRNA的优先翻译。另外，通过结合于dsRNA并与假定的细胞激酶互相作用，NS1蛋白可抑制IFN诱导的被dsRNA激活的激酶(PKR)、2′，5′-寡腺苷酸合成酶系统、以及细胞因子转录因子比如NF-KB或IRE 3及c-/ATF2的活化。其结果是，NS1蛋白质抑制INF-α和INF-β基因的表达，从而抑制或者延迟在受感染细胞中程序性细胞死亡的发展，并且抑制或者延迟在邻近细胞中抗病毒状态的形成。因此，通过构建携带了同时编码抗原和免疫反应调节剂的核酸的杆状病毒系统，可产生优良的疫苗候选对象。

使用转移载体进行重组体杆状病毒的构建。合并了外源基因或所研究基因的重组体杆状病毒是通过下述方法产生的：用野生型杆状病毒和包含所研究基因的转移载体共转染对杆状病毒感染敏感的昆虫细胞。例如，其全部内容并入本文作为参考的Pellett等的美国专利6,126,944，描述了用于有效表达外源基因的杆状病毒转移载体的构建，无需在起始位点加入别的核苷酸，所述外源基因在翻译起始位点处与杆状病毒多角体蛋白基因并列。

构建的容易、以及可以接受较大外来物DNA片段(＞20kbp)的能力允许开发具有扩大的或靶向的细胞趋性的杆状病毒，而且该杆状病毒同时还具有更加稳定的、时序的和细胞类型特异性的转基因表达控制。构建出编码结核分枝杆菌抗原Ag85A、Ag85B和Rv3407的融合蛋白的重组杆状病毒。杆状病毒已经显示出可感染哺乳动物细胞；因此，CHO、HeLa、以及BHK细胞在组织培养烧瓶中被培养，并用编码受控于巨细胞病毒(CMV)启动子的流感NS1或者轮状病毒NSP1的转移载体pcDNA3.1转染。对照细胞单独用pcDNA3.1载体感染。Zeomycin抗性的稳定的转化体被扩展，并且接种入6孔组织培养烧瓶的DMEM中并孵育至＞60％融合。来自每组的测试孔被计数，并且在新鲜的无血清培养基中的细胞被用重组杆状病毒以10、100、1000、以及5000的感染复数(MOI)感染1-2小时的周期。任选地，培养基能够补充10mM丁酸钠以便使转基因表达最大化。在除去病毒后，加入新鲜的培养基，并且培养物在37℃下孵育48小时。通过免疫印迹法检查培养物的抗原表达情况。为进行Western blot分析，将细胞抽提物溶解在变性聚丙烯酰胺凝胶中，并且将蛋白质转印至硝酸纤维素膜，并且使用标准方法和Ag85特异性抗血清进行免疫印迹分析。表达NS1和NSP1的细胞产生转基因融合蛋白，其产量过量于在不表达NS1或NSP1的对照细胞中观察到的情况。

构建在双顺反子表达盒中既编码NS1又编码转基因的重组杆状病毒，所述转基因编码禽流感H5N1的血凝素(HA)。将在用该重组杆状病毒感染的细胞中转基因的表达与在表达HA转基因但是不表达NS1蛋白质的对照重组杆状病毒构建体中的表达进行比较。该对比显示，在用NS1-HA重组体感染的细胞中产生了明显更多的HA蛋白质，验证了使用编码I型干扰素抑制剂的重组杆状病毒的方法。在小鼠体内的免疫原性研究表明，与用仅表达HA免疫原的重组杆状病毒感染的对照细胞相比，在用同时表达NS1和HA免疫原的重组杆状病毒感染的细胞中引起的对HA的免疫反应的等级有了提高。

这些研究结果为开发和使用重组杆状病毒疫苗提供了清楚和显著的暗示。提高的转基因表达导致了对被编码抗原的改进的细胞和体液免疫反应。本发明因此对于编码可抑制IFN反应的因子的重组杆状病毒疫苗而言具有广阔的应用范围，用于预防并治疗多种疾病。

实施例5.表达抑制I型IFN反应的因子和一种以上所研究抗原的重组病毒载体作为疫苗的应用。

构建编码Mtb抗原85A、85B和Rv3407以及来自甲型流感NS1蛋白的重组杆状病毒，还构建了缺乏NS1蛋白的类似疫苗。为了评价该疫苗在非人类灵长类动物中的保护性效果，每组有6个体重和性别相匹配的恒河猴的三个组被接种1)盐水、2)重组杆状病毒AB3407、或者3)重组杆状病毒AB3407NS1。在第2组和第3组中的每个动物通过肌肉注射接受1×10⁷vp的各个重组杆状病毒。在接种15周后，所有的动物接受支气管加载大约300cfu结核分枝杆菌M.tuberculosis Erdman的挑战实验。每月都评价所有的动物，通过胸X射线、体重、喂食、咳嗽、昏睡、以及对TB特异性蛋白的免疫反应，评价肺结核临床症状共六个月。对所有在六个月观察期间死亡的动物进行尸检，并且测量组织病理学和器官的Mtb负荷。所有垂死的动物被人道地实施安乐死，并且进行类似的检验。挑战实验后6个月，对所有存活下来的动物实施安乐死并尸检，检测组织病理学和在肺、肝脏和脾中的Mtb负荷。在重组杆状病毒疫苗中包含NS1导致死亡率降低、组织损伤降低和在实验性感染的动物的肺中存活的Mtb生物体的计数较低。

虽然本发明已经描述了其优选的实施方式，但本领域的技术人员应理解，在不违背本发明精神和附后的权利要求的范围的情况下，本发明能够具有各种变型。因此，本发明将不会限于如上所述实施方式，而是应该不违背在此提供的精神和描述的范围的情况下进一步包括所有的变型和其等效形式。

序列表

<110>AERAS全球TB疫苗基金会

<120>通过表达I型干扰素反应的抑制剂来增强来自基于病毒的疫苗载体的转基因表达

<130>PUSWC1000346S

<150>US 60/969,283

<151>2007-08-31

<160>3

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>693

<212>DNA

<213>流感病毒

<400>1

atggatccaa acactgtgtc aagctttcag gtagattgct ttctttggca tgtccgcaaa  60

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gaaatggcgg gaacaattag gtcagaagtt tga                               693

<210>2

<211>1479

<212>DNA

<213>轮状病毒属

<400>2

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ttactgagaa ttggagcaaa ctcagtatgg actccagttt cttcaaataa aattagagga  120

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catgatctaa tcaataacaa agataaaata cttgcagcat tatcaacatc atcgttaaaa  840

caattcgaaa cacatgattt aaatttagga agagtaaaag ctgacatttt tgaacttgga  900

catcattgca aaccaaatta tatttcatca aatcattggc aaccggcatc aaaaattttc  960

cagtgtaagt ggtgcaatgt aaagtatgca tttagagata tggattggaa gatggaatca  1020

atgtataatg aactcttaag ttttctacag tcctgttaca aaagtaatgt taatgtaggg  1080

cattgtagtt caattgaaag tgtttatcca ctagtcaaag atatgctttg gcattcaatt  1140

acaaaatata ttgatcaaac tattgagaaa ttatttgatg caatgaatcc ggtgcaagtg  1200

aatgagcaac ttgtaattaa cttctattgg caaatagata tcgctctgta cactcacatc  1260

aaaatgatac taaaaactga agctcttccg tttactttca cacttaacca gttcaattct  1320

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tatgagctcc taatctcgga ttccgaagac gacgactga                         1479

<210>3

<211>158

<212>DNA

<213>腺病毒

<400>3

ggctcgactc cgtggcctgg aggctaagcg aacgggttgg gctgcgcgtg taccccggtt  60

cgaatctcga atcaggctgg agccgcagct aacgtggtac tggcactccc gtctcgaccc  120

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Claims (14)

1.一种重组病毒载体，其包含：

一个以上用于编码寄主细胞1型干扰素(IFN)反应抑制因子的基因工程化的核苷酸；以及

一个以上用于编码一种以上寄主细胞活性氨基酸序列的基因工程化的核苷酸；

其中，所述一个以上用于编码所述一个以上寄主细胞活性氨基酸序列的基因工程化的核苷酸在所述寄主细胞中过表达。

2.如权利要求1所述的重组病毒载体，其特征在于，所述寄主细胞1型IFN反应抑制因子是轮状病毒NSP1或流感病毒NS1。

3.如权利要求1所述的重组病毒载体，其特征在于，所述寄主细胞1型IFN反应抑制因子选自下组：轮状病毒NSP1、流感病毒NS1、鼠痘病毒C12R蛋白、丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶、牛痘病毒vIFN-α/βRc蛋白、腺病毒E1A蛋白、副粘病毒的C蛋白、以及人类乳头状瘤病毒(HPV)E6癌蛋白。

4.如权利要求1所述的重组病毒载体，其特征在于，所述重组病毒载体由选自下组的病毒衍生得到：腺病毒、杆状病毒、痘病毒、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、慢病毒、肝炎病毒、虫媒病毒和水泡性口膜炎病毒。

5.如权利要求1所述的重组病毒载体，其特征在于，所述一种以上免疫刺激性氨基酸序列由下述一个以上病毒衍生得到：轮状病毒、流感病毒、鼠痘病毒、肝炎病毒、牛痘病毒、腺病毒、副粘病毒、HPV、HIV、HTLV、肠道病毒、疱疹病毒、EEE、VEE、西尼罗河病毒、诺沃克病毒、细小病毒、登革热病毒、以及出血热病毒。

6.如权利要求1所述的重组病毒载体，其特征在于，所述一种以上寄主细胞活性氨基酸序列是抗原。

7.如权利要求6所述的重组病毒载体，其特征在于，所述抗原是结核分枝杆菌抗原。

8.一种在个体的寄主细胞中引起可调整的反应的方法，其包括下述步骤：

将重组病毒载体给药于所述个体的所述寄主细胞，该重组病毒载体包含：

一个以上用于编码寄主细胞1型干扰素(IFN)反应抑制因子的基因工程化的核苷酸；以及

一个以上用于编码一种以上寄主细胞活性氨基酸序列的基因工程化的核苷酸；

其中所述一个以上用于编码所述一种以上寄主细胞活性氨基酸序列的基因工程化的核苷酸在所述寄主细胞中以调整的含量被过表达，所述一种以上寄主细胞活性氨基酸序列在所述寄主细胞中的过表达可在所述寄主细胞中引起所述可调整的反应，并且

其中所述调整的含量(a)与所述一个以上用于编码所述寄主细胞1型IFN反应抑制因子的基因工程化的核苷酸有关；(b)与用于所述一个以上用于编码所述寄主细胞1型IFN反应抑制因子的基因工程化的核苷酸、或者所述一个以上用于编码所述一种以上寄主细胞活性氨基酸的基因工程化的核苷酸的启动子有关；或者(c)与所述一个以上用于编码所述寄主细胞1型IFN反应抑制因子的基因工程化的核苷酸、或者所述一个以上用于编码所述一种以上寄主细胞活性氨基酸序列的基因工程化的核苷酸的拷贝数有关。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述一种以上寄主细胞活性氨基酸序列是免疫刺激性的，并且所述可调整的反应是所述个体的免疫反应。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述一种以上寄主细胞活性氨基酸序列对于所述寄主细胞是治疗性的，并且所述可调整的反应对于所述个体是治疗性的。

11.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述寄主细胞是癌细胞，所述一种以上寄主细胞活性氨基酸序列是促进程序性细胞死亡或另外杀死癌细胞的序列，所述可调整的反应是程序性细胞死亡或所述癌细胞的死亡。

12.一种在个体中引起对一种以上免疫原性氨基酸序列的免疫反应的方法，包括下述步骤：

将重组病毒载体给药于所述个体，该重组病毒载体包含：

一个以上用于编码寄主细胞1型干扰素(IFN)反应抑制因子的基因工程化的核苷酸；以及

一个以上编码所述一种以上免疫原性氨基酸序列的基因工程化的核苷酸；

其中，来自所述重组病毒载体的所述一种以上免疫原性氨基酸序列的表达在所述个体中引起对所述一种以上免疫原性氨基酸序列的免疫反应。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述一种以上免疫原性氨基酸序列是用于肺结核或疟疾的抗原。

14.一种在个体中治疗癌症的方法，包括下述步骤：

将重组病毒载体给药于所述个体，该重组病毒载体包含：

一个以上用于编码寄主细胞1型干扰素(IFN)反应抑制因子的基因工程化的核苷酸；以及

一个以上编码一种以上诱导程序性细胞死亡的氨基酸序列的基因工程化的核苷酸；

其中，来自所述重组病毒载体的所述一种以上程序性细胞死亡诱导性的氨基酸序列的表达导致所述个体中癌细胞的程序性细胞死亡。

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