CN1426462A

CN1426462A - 抗干扰素(ifn)反应的肺炎病毒非结构蛋白

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Publication number: CN1426462A
Application number: CN01808776A
Authority: CN
Inventors: K·K·孔泽尔曼
Original assignee: Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 2000-04-26
Filing date: 2001-04-26
Publication date: 2003-06-25
Anticipated expiration: 2021-04-26
Also published as: PT1276853E; US7700092B2; US20080160039A1; JP2004504274A; CN100473721C; EP1276853B1; DE50110752D1; BR0110384A; DE10020505A1; ES2271005T3; KR20020097232A; AU2001256327B2; ATE336570T1; CA2407053A1; KR100584831B1; EP1276853A1; IL152326A0; WO2001081554A1; DK1276853T3; CY1105704T1

Abstract

本发明涉及肺炎病毒NS1蛋白和/或NS2蛋白或编码肺炎病毒NS1蛋白和/或NS2蛋白的核酸在制造用来减弱干扰素(IFN)介导的免疫反应的药物制剂中的应用。本发明还涉及重组肺炎病毒，特别是对干扰素(IFN)介导的免疫反应有增强的、减弱的抗性或缺乏抗性的呼吸道合胞病毒(RSV)。本发明进一步涉及对干扰素(IFN)介导的免疫反应的抗性增加的重组病毒，以及在药物制剂(如，疫苗)中使用所述病毒。

Description

抗干扰素(IFN)反应的肺炎病毒非结构蛋白

发明背景

本发明的技术领域

本发明涉及采用肺炎病毒NS1蛋白和/或NS2蛋白或编码肺炎病毒NS1蛋白和/或NS2蛋白的核酸，来制造减弱干扰素(IFN)介导的免疫反应的药物制剂。本发明进一步涉及重组肺炎病毒，特别是对宿主干扰素(IFN)介导的免疫反应的抗性增强、减弱或缺乏的呼吸道合胞病毒(RSV)，对干扰素(IFN)介导的免疫反应的抗性增加的重组病毒，以及在药物制剂(如，疫苗)中使用这些病毒。

已有技术的描述

牛呼吸道合胞病毒(BRSV)是牛犊呼吸道疾病最重要的病原体，会造成重大的经济损失(40；45)。的牛犊中发生的免疫反应和病理类似于人呼吸道合胞病毒(HRSV)造成症状，而HRSV仍是造成全世界婴幼儿严重毛细支气管炎与肺炎的主要原因(9)。HRSV和BRSV以及相关病毒(小鼠肺炎病毒(PVM))的分子克隆，不仅确定了BRSV与HRSV之间的紧密关系，同时揭示出，由于它们与副粘病毒科其它成员有着本质性的不同，导致了在副粘病毒科内建立了肺炎病毒亚科(36；37)。在这一亚科中，RSV病毒和PVM构成了肺炎病毒属，而鸟肺炎病毒(APV)至今仍是变肺炎病毒属的唯一成员。

对于Mononegavirales目所有的成员，约15kb的RSV和PVM的基因组RNA存在于核糖核蛋白(RNP)复合体中，作为基因顺序转录的模板(25；49)。10个转录单位所表达的11种蛋白质以3’-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-5’的顺序排列(5；9；30；31)。编码的蛋白质包括五个RNP相关蛋白质：核蛋白(N)、磷蛋白(P)、RNA聚合酶的大催化亚基(L)以及由M2基因两个重叠开放阅读框中的第一个编码的转录延伸因子(M2-1)(8；17；27；38)。M2转录单位的第二个开放阅读框(M2-2)编码了一种如(1)所描述的非必需蛋白质，它可能参与调控RNA的合成(4；28)。三种病毒蛋白质与病毒包膜相关：融合蛋白F、假定的吸附蛋白G以及小型疏水性蛋白SH。

基因组3’末端位置上存在的两个非结构蛋白的基因，将肺炎病毒属的成员与Mononegavirales目的其它成员区别开了。由于它们的位置接近于3’末端，各NS基因被过度转录。编码的蛋白质可在被感染的细胞中被检知(10；16)。BRSV的NS基因分别编码了具有136个和124个氨基酸的多肽。将来自A、B亚型HBSV的NS蛋白进行比较可知，NS1蛋白氨基酸的同源性分别为69％和68％，NS2蛋白氨基酸的同源性分别为84％和83％(5；34)。PVM的NS1和NS2蛋白与RSV的NS基因之间没有明显的同源性(大约20％相同)，但却有类似的功能。然而，没有明显的迹象表明所产生的序列在病毒的生命周期中具有NS蛋白的功能。有报道说，HRSV的NS1蛋白与M蛋白相关，而NS2蛋白与RSV的结构蛋白没有可检测的相关性，这说明NS1与NS2有不同的功能(16；47)。最近，有试验提出，NS1对病毒RNA的转录有抑制作用，试验中让人造的HRSV的小基因组分别在NS1存在与不存在的情况下生长。此外，在同一研究中还发现了NS2的抑制作用，但NS2的这种作用是很不显著的(3)。

最近建立的从cDNA中制造(“回收”)感染性的负链RNA病毒的方法(11)，使得重组人(8；29)和牛(5)RSV的生产以及在上述病毒中研究单个蛋白的功能成为可能。可存活的NS2基因缺失突变体的成功制备证实，在细胞培养中NS2对病毒的复制不是必需的(5；43)。mRNA的模式和相对数量以及在感染细胞中制得的全长的RNA没有显著的改变。然而，缺失突变体是减毒的，与原来的病毒相比，其生长速率较慢且感染性病毒效价较低。因此，尽管NS2是非必需的，它却是一种能以目前还未知的机制实质性地支持病毒生长的辅助因子。然而，至今为止，NS蛋白的功能仍是未知的。

发明概述

本发明的依据是，RSV和RSV相关病毒，尤其是肺炎病毒属(RSV和PVM)的病毒(所有这些下文中将称其为“RSV”)的NS1和/或NS2蛋白对IFN介导的免疫反应有拮抗作用。

本发明涉及使用RSV的NS1和/或NS2蛋白或编码RSV NS1蛋白的核酸序列或编码RSVNS2的核酸序列，以制造用于减弱IFN(尤其是IFN-α和/或IFN-β)介导的免疫反应的药物制剂。

本发明的另一方面涉及在动物中减弱IFN介导的免疫反应的方法，包括施用RSV NS1和/或NS2蛋白或编码RSV NS1蛋白的核酸或编码RSV NS2蛋白的核酸。特别地，本发明涉及使用RSV的NS1和/或NS2蛋白或编码这些蛋白质的核酸，通过抑制IFN介导的抗病毒反应以改变IFN介导的免疫反应。

在本发明优选的实施方案中，将RSV NS1蛋白与NS2蛋白联合使用以制造药物制剂，或将编码RSV NS1蛋白的核酸序列与编码RSV NS2蛋白的核酸序列联合使用以制造药物制剂，用以减弱IFN介导的免疫反应。本发明所用的“联合”是指同时施用或相继施用。

本发明的另一个方面，RSV NS1和/或NS2蛋白被用来在IFN介导的免疫反应中保护不相关的病毒。较好的是，RSV NS1和/或NS2蛋白是BRSV NS蛋白。NS1和NS2蛋白以协同的方式保护不相关的病毒。本发明使用的“不相关的病毒”是指不表达RSV NS1和/或NS2蛋白的病毒。在一个优选的实施方案中，这种病毒是狂犬病病毒。较好的是，RSVNS1和/或NS2蛋白由病毒核酸表达。

另一方面，本发明的药物制剂含有RSV NS1和/或NS2蛋白或编码RSV NS1蛋白的核酸序列和/或编码RSV NS2的核酸序列，它可减弱IFN介导的免疫反应，并且进一步包括疫苗。较好的是，与药物制剂一起施用这种疫苗可以降低疫苗被用药个体排斥。

本发明还涉及使用改变的RSV NS1和/或NS2蛋白，来制造可调节IFN介导的免疫反应的药物制剂。在一个优选的实施方案中，这种改变提高了NS1和/或NS2蛋白对IFN的调节活性。

本发明涉及使用带有编码NS1和/或NS2的修饰核酸序列的重组RSV来制造疫苗，其中，修饰减弱或消除了病毒逃避IFN介导的免疫反应的能力。在优选的实施方案中，编码NS1和/或NS2的修饰核酸序列与所述的重组RSV是同源或异源的。更好的是，其中使用的重组RSV来自人、牛RSV或来自PVM。

此外，本发明包括有可改变宿主范围的RSV类，其中编码RSV NS1和/或NS2的核酸序列被编码能感染所需宿主的不同RSV的NS1和/或NS2的核酸序列所替代，还包括产生这些有着可改变宿主细胞取向的RSV类的方法。

发明详述

为更详细地研究RSV蛋白质的功能，产生了缺少NS1基因或NS1和NS2基因都缺少的BRSV的缺失突变体，并在不同的细胞系中研究了它们的表现。

在MDBK细胞(对wt BRSV感染非常敏感，且wt BRSV的效价高于所有其它的被测细胞系)被感染后观察到了第一种现象，即NS缺失突变体对宿主细胞因子的敏感性有所提高。然而，缺少一种或两种NS基因的病毒在MDBK细胞中生长得很差，而在其它细胞系(如Vero或BSR)中，NS基因的缺乏却仅仅使感染效价降低了10倍。共培养试验证实，作为决定性宿主细胞因子的I型干扰素是由BRSV感染的MDBK细胞产生的。显然，在被感染的MDBK培养物中，通过自分泌和旁分泌细胞的刺激可诱导抗病毒状态。尽管wt BRSV能够抵消这种反应，但NS缺失突变体都没有这种功能。另一方面，Vero细胞缺少I型干扰素基因(15；46)，这样病毒感染就不会诱导抗病毒状态且使NS缺失突变体能够生长。尽管Vero细胞不能产生干扰素，但它们可以通过IFN-α受体(IRNAR)复合体以JAK/STAT介导信号的方式对外源干扰素的刺激产生反应。感染的MDBK分泌的牛干扰素在Vero“反应者”细胞中诱导抗病毒反应，使NS缺失突变体的生长受到抑制，而对wt BRSV却不然。将Vero细胞和与IFNAR结合可封闭IFN的抗体一起温育可以防止MDBK上清液引起的抗病毒反应。因此，在抗病毒反应的诱导过程中MDBK细胞上清液中唯一的活性组分是IFN-α和/或IFN-β。

在用MDBK细胞上清液处理的Vero细胞中，对NS缺失突变体的抑制效果很弱(使双缺失突变体最多减少7倍)，这与MDBK细胞中对NS缺失突变体的严格抑制是没有可比性的。这可能由许多因素造成。大概用牛源的异源IFN刺激来自灵长类动物的Vero细胞不及用MDBK刺激有效。与人类中的情况类似，不同类型的牛IFN-α(2-8型)和IFN-β(1-3型)已经被确定，它们有不同的生物学活性(7)。另外，Vero细胞的抗病毒机制也不及MDBK有效。活化的且被感染的巨噬细胞(已知较其它细胞能够分泌较大量的I型干扰素)的上清液使Vero“接受者”细胞中NS缺失突变体的减少提高至50倍。用重组人IFN-αA/D或IFN-β刺激Vero细胞，NS缺失突变体的复制可以剂量依赖的方式被抑制，其中，500单位几乎可以完全抑制复制活性。

因此，通过本发明，可以证明RSV蛋白是IFN介导的宿主细胞反应的拮抗剂。

另外，采用其它的负链RNA病毒(狂犬病病毒)作为表达RBSV产生的NS基因的载体，两种NS蛋白NS1和NS2的活性显示出可以提高IFN对不相关病毒的抗性。另一个发现是，NS1和NS2蛋白可以来自不同的RSV。

总之，RSV NS蛋白一个重要的生物学功能是，它们参与保护病毒抵抗细胞的干扰素介导的抗病毒机制(IFN拮抗效应)。另外，出人意料的发现是，将两种NS蛋白联合使用，所述IFN拮抗效应会成倍增加。这是在抵抗干扰素方面两种病毒蛋白协同作用的第一个例子。

病毒蛋白质在其天然宿主细胞中克服固有免疫反应的适应过程被认为是确定病毒宿主范围的一个很重要的因素，且可以防止病毒通过物种屏障(13；23；26)。例如，猿病毒5的V蛋白(SV5)在灵长类细胞中能够抑制干扰素效应基因的活性，但在鼠类细胞中却没有此功能(14)。这可能是防止小鼠甚至SCID小鼠产生SV5感染的相关机制(13)。最近，HRSV(BRSV的人的等价者)被报道可在人类细胞中抵抗IFN诱导的抗病毒活性(2)，并且，根据我们的结果，我们认为HRSV NS蛋白在人类细胞中是拮抗IFN反应最理想的蛋白质，且优于在不同来源细胞中所得到的结果。

实际上，NS蛋白使宿主对RSV感染的易感性所起的作用可以解释为什么这些紧密相关的病毒对宿主范围有严格的限制。BRSV和HRSV可以进入人、牛以及鼠细胞；NS蛋白抵抗宿主特异性防御机制能力的不同确定了病毒是否会被排斥。这也被早期的发现所支持。尽管HRSV在初生小鼠胚胎(ME)细胞中的生长明显受到限制，在向培养基中添加抗鼠IFN血清后产生的病毒会增加，且感染可扩展到整个单细胞层(26)。另外，与BRSV相比，重组BRSV(其表面蛋白G和F被HRSV的表面蛋白替代，以使它们容易进入灵长类细胞)在黑猩猩中的复制只有些许提高。然而，感染仍然十分有限，且不足以产生保护作用以抵抗同源HRSV的试验感染(6)。从我们的观察中，我们认为，BRSV NS蛋白在抵抗灵长类防御机制方面的低有效性是决定宿主范围的主要因素。

因此，我们的结论对于有关有效减毒的RSV活疫苗的设计有重要意义。缺少NS1或NS2基因或两种基因同时缺少，将使过度减毒的病毒无法逃避任何干扰素反应。另外，可以设计含有能够逃避牛和人固有防御机制的中间体的疫苗(这是由于就在不同的RSV(例如，BRSV和HRSV)之间相互交换NS蛋白)，特别是产生BRSV和HRSV疫苗。此外，可以在仅能部分消除IFN抑制活性的NS蛋白中引入突变体。

另外，依照本发明，RSV NS1和/或NS2蛋白或编码NS1和/或NS2蛋白的核酸序列也可用来制造药物制剂，以减弱IFN介导的免疫反应。在一个优选的实施方案中，RSV NS1与NS2蛋白联合使用以制造药物制剂。药物制剂包括可在动物或人体中改变IFN介导的免疫反应的有效量的NS1和/或NS2，以及药学上可接受的载体或稀释剂。可以用常规的技术制造药物制剂。例如，本发明的药物制剂可以通过将所需量的RSV NS1和/或NS2蛋白或编码RSV NS1蛋白的核酸序列或编码RSV NS2的核酸序列与灭菌的等渗溶液(用合适的缓冲液将其pH值调至6.0左右)相混合而制造。

本发明的药物制剂可以包括常规的组分，比如药学上可接受的载体或稀释剂(例如，盐水、pH调节剂、缓冲液、防腐剂等)。这些组分可由精通本技术的技术人员来选择。

本发明的“IFN”这一术语优先是指I型干扰素，即IFN-α和IFN-β。

这里，“IFN介导的免疫反应”这一术语是指由干扰素(尤其是IFN-α和IFN-β)的活性诱导的免疫作用和/或抗病毒作用，这种作用是作为(例如)对病毒感染的反应(如增加MHC糖蛋白的表达)、抗病毒机制激活的反应(如破坏被病毒感染的细胞)、或是病毒的复制被抑制的反应。

“IFN介导的免疫反应的减弱”意味着免疫作用和/或抗病毒作用被减弱，这种作用是由干扰素(尤其是IFN-α和IFN-β)的活性诱导的，例如作为对病毒感染的反应(如增加MHC糖蛋白的表达)、抗病毒机制激活的反应(如破坏被病毒感染的细胞)、或是病毒的复制被抑制的反应。

本发明的“IFN拮抗活性”意味着免疫作用和/或抗病毒作用被减弱或消除，这种作用是由干扰素(尤其是IFN-α和IFN-β)的活性诱导的，例如，作为对病毒感染的反应(如增加MHC糖蛋白的表达)、抗病毒机制激活的反应(如破坏被病毒感染的细胞)、或是病毒的复制被抑制的反应。

本发明的“修饰的”或“改变的”术语涉及用作参照的野生型。

这里使用的“核酸序列”是指核苷酸碱基的各种连续序列，并且可以包括核糖核酸或脱氧核糖核酸。较好的是，核酸序列是cDNA。

“与RSV同源或异源的编码NS1和/或NS2的核酸序列”是指编码NS1和/或NS2的核酸序列来自于相同或不同种类的RSV，或来自于肺炎病毒属的其它病毒，例如PVM。

对RSV NS1和/或NS2蛋白顺序的修饰包括一个或多个氨基酸的取代、缺失和插入。较好的是，修饰对蛋白质在减弱IFN介导的免疫反应或拮抗IFN方面的生物学活性没有影响。本发明的各种氨基酸插入变体包括，氨基和/或羧基末端融合以及内部序列有一个或多个氨基酸插入。氨基酸插入变体是那些在蛋白质内的特殊位点引入一个或多个氨基酸的变体；然而结合对所得产物进行的合适的筛选也可能随机插入。缺失变体是以序列中有一个或多个氨基酸的缺失为特征的。取代的氨基酸变体是那些从序列中至少移去一个残基，并在原来的位置上用另一残基替代的蛋白质。较好的是，未修饰的NS1或NS2蛋白的序列与野生型至少有40％的同源性，更好是至少50％，再好是至少80％或至少90％，最好是95％。

优选的修饰发生在物种间非保守的位置上。较好的，这种类型的修饰包括用另一种有类似尺寸和极性的氨基酸取代一种氨基酸。可能发生的取代类型可以首先被用来分析不同生物的同源蛋白质之间氨基酸取代的频率。基于这些分析，保守性取代被定义为在下列基团中发生的取代：

1.小型脂肪族的非极性或弱极性氨基酸：Ala，Ser，Thr(Pro，Gly)

2.带有负电荷的氨基酸及其酰胺类：Asn，Asp，Glu，Gln

3.带有正电荷的氨基酸：His，Arg，Lys

4.大型脂肪族的极性氨基酸：Met，Leu，Ile，Val(Cys)

5.大型芳香族氨基酸：Phe，Tyr，Trp。

有三种氨基酸被写在括号中，这是因为它们在蛋白质结构中有特殊的作用。Gly是唯一没有侧链的氨基酸，因此可赋予肽链柔性。Pro有特殊的几何形状，可强烈限制链的柔性。Cys可以参与二硫键。

另外，以上详述的修饰可以被引入RSV NS1或RSV NS2的蛋白质序列中，这将使蛋白质减弱IFN介导的免疫反应或拮抗IFN的生物学活性增强或降低。

附图简述

图1.(A)重组BRSV基因组的示意图。显示了与病毒基因组(vRNA)(黑色带)相关的转录物(灰色带)和蛋白质编码区域(白色带)的位置。放大的部分比较了全长病毒和NS缺失突变体的结构。前导RNA以水平线标出；还指出了各个核苷酸的相对位置以及用于克隆的限制位点。(B)重组狂犬病病毒(RV)的结构，带有遗传标记的位于RV G和L基因之间的BRSV NS1或BRSV NS2 ORF(开放性阅读框)。

图2.重组BRSV中NS1和NS2转录物的缺失。被所述病毒感染的BSR细胞的全长RNA在感染后2-4天被分离，并用Northern杂交法进行分析(使用的探针包括NS1、NS2、NS1对NS2以及N基因)。标出了NS1、NS2以及N mRNA的位置。

图3.与在BSR细胞中相比，MDBK细胞中NS缺失突变体的毒性更弱。融合的BSRT7-5(A)和MDBK(B)单细胞层以0.01的MOI(感染复数)被BRSV(黑色圆圈)、BRSVΔNS1(白色方块)、BRSVΔNS2(黑色三角)或BRSVΔNS1/2(白色圆圈)感染。如实施例部分所描述的那样，每两天测定一次感染性病毒效价。从第六天开始，BSR细胞中所有突变体的复制以及MDBK细胞中wt BRSV的复制导致大量的细胞死亡。这些数值是从两组独立的实验中获得的，每组实验进行三次。竖线显示了标准差。

图4.被病毒感染的VDBK细胞或感染的巨噬细胞的上清液抑制BRSV NS缺失突变体在共培养的Vero细胞中生长。(A)是共培养实验基本原理的示意图。MDBK细胞或被LPS刺激的牛巨噬细胞被BRSV感染，接种在Nunc″Anopore Membrane″细胞培养插入物中，并和被wt BRSV、BRSVΔNS1、BRSVΔNS2、BRSVΔNS1/2感染的Vero“反应者”细胞一起培养。三天后，取出插入物并测定Vero细胞的感染性病毒效价。(B)中的结果显示了包括标准差的抑制百分比，以及与对照(用未感染的MDBK或未感染、未被刺激的巨噬细胞获得)相比的减少倍数(平均值)。数值取自6次(MDBK)和4次(巨噬细胞)共培养实验。

图5.干扰素α受体(IFNA-R2)的单克隆抗体(#2)中和了MDBK或巨噬细胞产生的抑制因子的作用。以0.1的MOI被rBRSVΔNS1、rBRSVΔNS2、rBRSVΔNS1/2或wt rBRSV感染的Vero“反应者”细胞，分别和5μg/ml抗IFNAR2(#2)、MHC I(#3)、TNF-R1(#4)的单克隆抗体或在无抗体(#1)的情况下一起培养三小时。在存在1μg/ml各自抗体的情况下再与被感染的MDBK细胞共培养(实验原理参见图4)。在六次(#1和#2)或两次实验(#3和#4)中测定效价。竖线显示了标准差。

图6.所有的BRSV NS缺失突变体都是I型IFN敏感的。将以0.1的MOI被BRSV(黑色圆圈)、BRSVΔNS1(白色方块)、BRSVΔNS2(三角)或BRSVΔNS1/2(白色圆圈)感染的Vero细胞与所需量的重组IFN-αA/D(A)或IFN-β(B)一起培养。感染4天后测定感染性病毒效价。

图7.牛细胞中BRSV的IFN抗性比在灵长类动物细胞中更加显著。使MDBK(实心柱)或Vero细胞(空心柱)以1的MOI被rBRSV感染，并用所需量的重组IFN-αA/D处理。感染3天后测定感染性病毒效价。

图8.被表达RV类的NS1和NS2感染的细胞中狂犬病病毒(RV)增强的IFN抗性。Vero(A)或MDBK细胞(B)被RV SAD VB、SAD VB-NS1或SAD VB-NS2感染，或被SAD VB-NS1和SAD VB-NS2共感染。感染后立即用所需量的IFN-αA/D处理培养物。感染2天后测定感染性病毒效价。结果是至少四次独立实验的平均值和误差，竖线显示了标准差。

图9.1×10⁵Hep2细胞的副份样品，每一个样品都在0.5ml DMEM w/o FCS中用不同的HRBS分离物感染1小时(MOI＝0.1)，随后每个样品都接受了0.5ml+5％FCS。然后将感染的细胞接种到4cm²的组织培养平板上。1、2、3和4天后从每个病毒分离物中除去当前值，通过冷冻/解冻病毒被释放，并可以通过滴定来测定取决于感染阶段的不同临床分离物的效价。用抗RSV-F的抗体将感染的细胞染色后，通过计数可以确定pfu/ml。

图10.1×10⁵Hep2细胞的副份样品，每一个样品都在0.5ml DMEM w/o FCS中用不同的HRBS分离物感染1小时(MOI＝0.1)，然后将感染的细胞接种到4cm²的组织培养平板上。将0、150、500、10,000U/ml的重组I型IFN A/D悬浮在另一0.5ml DMEM+5％FCS中，并在30分钟后加入。温育72小时后，通过冷冻/解冻处理释放病毒，并根据感染阶段通过滴定来测定不同临床分离物的效价。用抗RSV-F的抗体将感染的细胞染色后，通过计数确定pfu/ml。

图11.重组狂犬病病毒(RV)在RV G和L基因之间的结构，带有HRSV NS1或HRSV NS2或遗传标记的BRSV NS1、BRSV NS2、PVM NS1或PVM NS2的各种ORF。

图12.被表达NS1和NS2的RV类感染的狂犬病病毒(RV)的增强的IFN抗性。MDBK细胞被RV SAD VB、SAD VB-hNS1或SAD VB-hNS2感染，或与SAD VB-hNS1和SAD VB-hNS2共培养，或与SAD VB-bNS1和SAD VB-bNS2共培养。感染后立即用所需量的IFN-αA/D处理培养物。感染2天后测定感染性病毒效价。结果表示至少四次独立实验的平均值和误差，竖线显示了标准差。

图13.被表达NS1和NS2的RV类感染的狂犬病病毒(RV)的增强的IFN抗性。MDBK细胞被RV SAD VB、SAD VB-mNS1或SAD VB-mNS2感染，或与SAD VB-mNS1和SAD VB-mNS2共培养，或与SAD VB-bNS1和SAD VB-bNS2共培养。感染后立即用所需量的IFN-αA/D处理培养物。感染2天后测定感染性病毒效价。结果表示至少四次独立实验的平均值和误差，竖线显示了标准差。

图14.含有异源NS基因的嵌合BRSV的结构。

图15.PVM/BRSV嵌合体在Vero细胞中是轻微减毒的。Vero细胞以0.1的MOI被BRSV(黑色圆圈)、BRSV hNS1bNS2(深灰色方块)、BRSV hNS1hNS2(浅灰色方块)、BRSVmNS1bNS2(深灰色三角)和BRSV mNS1mNS2(浅灰色三角)感染。连续四天测量感染性病毒效价。数值取自至少两次独立的实验。

图16.BRSV hNS1hNS2在MDBK细胞上的生长减弱。MDBK细胞以0.1的MOI被BRSV wt(黑色圆圈)和BRSV hNS1hNS2(浅灰色方块)感染。连续四天测量感染性病毒效价。数值取自至少两次独立的实验的平均值。

图17.MDBK细胞中BRSV hNS1hNS2对I型IFN敏感。Vero(A)和MDBK(B)细胞以0.1的MOI被BRSV wt(黑色圆圈)和BRSV hNS1hNS2(浅灰色方块)感染，随后与所需量的重组IFN-αA/D温育。感染3天后测定感染性病毒效价。数值取自至少两次独立的实验。

图18.HRSV(hNS1；hNS2)、BRSV(bNS1；bNS2)和PVM(mNS1；mNS2)的NS1(图18A)和NS2蛋白(图18B)氨基酸序列的比较；GenBank编号为U35030(HRSV，Long品系)、AF092942(BRSV，ATue 51908品系)和D10331(PVM)。

以下的实施例是为了阐明本发明不同的实施方案，无论如何不能理解为是对本发明的限制。

实施例

实施例1：缺少NS基因的BRSV缺失突变体的构建与补救

重组BRSV(rBRSV)来自于BRSV A51908品系(美国模式培养物保藏所(ATCC)(33)，ATue51908变体(GenBank序列号为AF092942))，并按前述方法在MDBK细胞中培养(5)。克隆全长的A51908品系BRSV(GenBank序列号为AF092942)的cDNA并构建质粒(使T7 RNA聚合酶能够参与BRSV全长反基因组RNA或没有NS2基因的反基因组RNA(pBRSVΔNS2)的转录)，这在别处已经描述过了(5)。

基于pBRSV还可以产生缺少NS1基因(pBRSVΔNS1)或是缺少NS1和NS2两种基因(pBRSVΔNS1/2)的结构。通过用NotI和AseI酶切、用Klenow聚合酶补平随后再重新连接可以从pBRSV中除去NS1基因。用这种方法可以获得pBRSVΔNS1。为产生双缺失突变体pBRSVΔNS1/2，将含有部分N基因的0.6kb的PCR片段进行扩增。为达到这个目的，使用引物NNot(+)(5’-TAG GCGGCCGCAAAAATGGCTCTTAGCAAGGTG-3’)(在N起始密码子上游含有一个NotI限制性酶切位点(划线部分))以及反向引物Nstu(-)(5’-TCCTTTGTATCGTTTCATTTC-3’)(与唯一的StuI限制性酶切位点(rBRSV第1671位)下游的rBRSV上第1735-1715个核苷酸相对应)。通过用NotI(rBRSV第72位)和StuI(rBRSV第1671位)消化，从pBRSV中除去NS1和NS2基因以及部分N基因后，用StuI限制性的PCR片段替代缺失的序列(图1)。

与重组wt病毒rBRSV的序列相比，NS1、NS2和NS1/NS2缺失突变体分别缺少496、509和1060个核苷酸。在所有结构中，3’末端基因的转录是由最初的前导序列/NS1转录起始信号诱导的(图1)。

各种重组病毒：rBRSV、rBRSVΔNS1、rBRSVΔNS2和rBRSVΔNS1/2可以在BSR T7/5细胞中(5)从各自的cDNA中获得，用各个病毒的cDNA(10μg)转染(CaPO₄方案；哺乳动物转染试剂盒，Stratagene)T7启动子控制的质粒后，这种细胞可以表达T7 RNA聚合酶。编码BRSV的N和P蛋白(pTITB-N和pTITB-P，每个质粒4μg)、以及L和M2蛋白(pTITB-L和pTITB-M2，每个质粒2μg)的质粒与各个病毒的cDNA一起被共转染进约10⁶个稳定表达T7 RNA聚合酶噬菌体的BSR T7/5细胞(5)。4小时后，除去转染介质并加入含有5％FCS的BHK-21介质(Gibco)。每5天以1∶3的比例稀释被BRSV cDNA转染的细胞，直至可以观察到细胞病变效应。

在所有情况中(包括NS1/2双缺失突变体)，编码BRSV N、P、L和M2蛋白的载体质粒的共转染将导致合胞体的形成。以1∶3的比例稀释转染的细胞且有明显的细胞病变效应出现后，就可以收获病毒。

为制造病毒母液，在无血清的Dulbecco极限必需培养基(DMEM)中有80％的融合的MDBK和Vero细胞以0.1的感染复数(MOI)被感染。吸附一小时后除去接种物，并在含有5％CO₂的空气中将细胞置于添加有2.5％FCS的DMEM中以37℃温育，直至可以观察到明显的细胞病变效应(CPE)。通过冷冻随后再解冻使病毒释放。通过在微量滴定板上连续稀释再计算转染灶的数量可以确定在Vero细胞上的病毒效价。为了这个目的，可以用抗F融合蛋白的抗体(来自于J.A.Melero，马德里)间接染色的方法将转染灶染色。NS缺失突变体病毒母液的制造是在以0.1的MOI被感染的Vero细胞上进行的。以0.1的MOI感染Vero细胞后，若是rBRSV需要3天，若是NS缺失突变体则需要5天，才可以观察到明显的CPE。

实施例2：NS缺失突变体的生长

先在来自BHK细胞的BSR T7/5细胞系(用来补救病毒)中分析病毒的生长特性。与亲本的全长病毒相比，所有三种突变体都是减毒的，这证明为病毒复制贡献了两种NS蛋白。有趣的是，至于病毒在被感染细胞中的分配以及单缺失与双缺失突变体最终的效价，却没有观察到明显的不同。以0.1的MOI感染BSR T7/5细胞并温育6天之后，获得的所有突变体的感染效价为2×10⁵pfu。而亲本病毒可达1×10⁶pfu(图3A)。通过感染Hep2或Vero细胞(后者是培养HRSV优选的细胞系)也可以获得类似的效价略有提高的结果。

随后采用牛源的细胞系MDBK，这种细胞系能优先支持wt BRSV的生长(5)。实际上，感染6天后就可以使BRSV的效价略有提高(2×10⁶pfu)(图3B)。然而奇怪的是，缺失突变体在这种细胞系中的生长受到了强烈的影响。6天后，所得单缺失突变体ΔNS1和ΔNS2的效价仅为3×10³pfu，这比BSR细胞中低了100倍。在感染最初6天内，无法检测双缺失突变体ΔNS1/2的增殖。在细胞未被稀释之前再温育8天才可获得2×10²的病毒效价。尽管MDBK细胞是wt BRSV最为理想的宿主，它们显然不能容许所有NS缺失突变体的生长，而作为wt BRSV第二理想宿主的BSR和Vero细胞对NS缺失突变体的生长却有相对较好的支持。

实施例3：缺少NS基因的BRSV缺失突变体RNA的Northern杂交

为进行Northern杂交，从被rBRSV或NS缺失突变体感染的细胞中分离RNA。

Vero细胞以0.1的MOI被重组病毒rBRSV、rBRSVΔNS1、rBRSVΔNS2和rBRSVΔNS1/2感染，在观察到明显的CPE后(rBRSV需要3天，NS缺失突变体需要5天)分离全部的RNA。通过变性凝胶电泳将RNA分离，转移至尼龙膜(Duralon-UV，Stratagene)，并用紫外照射的方法使RNA结合在膜上。通过缺口平移(缺口平移试剂盒，Amersham)用(α-³²P)dCTP(3，000Ci/mmol，Amersham)标记约有500个核苷酸长度的NS1、NS2和N基因特异性的DNA探针。将杂交滤膜暴露于使用加强屏的Kodak Biomax MS胶片，或用磷成像的方法检测(Storm，Molecular Dynamics)。

对于所有的病毒都观察到了类似的转录物模式，其中，病毒仅在是否存在对NS1和NS2特异的RNA方面有所不同(图2)。由于在BRSV和HRSV NS2缺失突变体中已经观察到这种现象(5；43)，不论使用何种重组体，在所有被感染的细胞中都出现了类似量的N mRNA和基因组RNA。因此，NS蛋白通常主要是影响RNA的合成，而不是影响RNA复制或转录中的各个步骤。

实施例4：MDBK细胞和牛巨噬细胞产生的可溶性因子对NS缺失突变体生长的影响

为鉴别对NS缺失突变体在MDBK细胞中的生长有明显的选择性抑制作用的细胞因子，首先检测了MDBK细胞产生的可溶性分子是否能够限制NS缺失突变体的生长。为了这个目的，将MDBK细胞与Vero细胞在一种装置中共培养，这种装置可通过一种不容许病毒透过但可以让可溶性因子透过的膜将两种细胞培养物分离开(图4A)。上层平皿中的MDBK细胞是作为效应细胞，而下层平皿中的Vero细胞是作为反应者细胞。

悬浮液中的Vero反应者细胞在没有FCS的DMEM中被rBRSVΔNS1、rBRSVΔNS2或rBRSVΔNS1/2以0.1的MOI模拟感染或感染，时间是一小时。洗涤后，将5×10⁵个细胞(每份都在含有2.5％FCS的DMEM中)接种到6孔平皿中。被10μg/ml LPS(Sigma)刺激过夜的MDBK效应细胞或牛巨噬细胞在悬浮液中被rBRSV以1的MOI感染1小时。洗涤后，1×10⁶个细胞被接种在装有200nm Anopore膜(Nunc)的25mm的细胞培养插入物中，并将其放在含有被感染的Vero“反应者”细胞的平皿中。共培养三天后，除去膜插入物，并用实施例1中所描述的方法测定Vero细胞的病毒效价。

至少进行5次独立的共培养实验。用未被感染的MDBK效应细胞或BSR细胞作为阴性对照，实验表明wt BRSV或NS缺失突变体在Vero反应者细胞中的生长没有受到抑制。与BRSV感染的MDBK细胞(MOI＝1)共培养会对NS缺失突变体产生弱的但可再现的抑制，但对wt BRSV细胞的生长却没有影响(图4B)。用NS1/2双缺失突变体观察到了最显著的影响。在这种情况下，与未被感染的MDBK细胞相比，使用被感染的MDBK细胞可使效价降低约7倍。这种情况下，单缺失突变体rBRSVΔNS1和rBRSVΔNS2的效价分别降低了2倍和4倍。

由于未被感染的MDBK细胞的上清液无法影响缺失突变体在Vero反应者细胞中的生长，这说明有效的MDBK因子是由病毒感染诱导的。不仅是用wt BRSV感染，而且用包括rBRSVΔNS1/2在内的各种BRSV缺失突变体以及缺失SH基因和G基因(rBRSVΔSH/G；未公布)的突变体感染都可以诱导有效因子的分泌。此外，可以证明，用不同的RNA病毒(即狂犬病病毒)感染同样会导致MDBK细胞中各种有效因子的诱导。这些结果都有力地说明，Vero反应者细胞中抗病毒状态的诱导是由细胞因子(尤其是干扰素)介导的。

为更详细的研究有关的细胞因子，采用牛巨噬细胞作为效应细胞。牛巨噬细胞是从母牛和小牛的血液中分离的，方法是用Ficoll梯度离心法(Lymphoflot，Biotest，Dreieich)以1,500rpm离心，使单核细胞组分吸附在细胞培养烧瓶的底部。温育过夜后，用不含FCS的RPMI(Gibco)冲洗三次以除去未吸附的细胞。将保留的吸附细胞(90-95％CD14阳性)在含有10％FCS的RPMI中于37℃及5％CO₂下温育。分离的牛巨噬细胞被LPS刺激过夜，并与上述Vero细胞共培养。

在与被刺激的、病毒感染的巨噬细胞或未被刺激的巨噬细胞共培养后，所得全长rBRSV的量仍未改变。然而，与未被被刺激且未被病毒感染的巨噬细胞对照不同的是，可观察到NS缺失突变体减少了30-50倍(图4B)。仅仅用LPS刺激巨噬细胞而不用病毒感染也足以使rBRSVΔNS1/2减少约10倍。由于已知被刺激的巨噬细胞可以产生I型干扰素，这些实验证实IFN-α和/或IFN-β可抑制BRSV NS缺失突变体的生长。

实施例5：NS基因的缺失使BRSV对I型干扰素敏感

以FACS分析的方法可以证明，共培养实验(参见实施例4)中，作为反应者细胞的Vero细胞可表达I型干扰素受体的α亚基(IFNAR2)(44)。为研究由被感染的MDBK细胞或巨噬细胞产生的IFN-α和/或IFN-β是否会介导NS缺失突变体的抑制作用，用rBRSVΔNS1/2、rBRSVΔNS2或rBRSVΔNS1/2感染Vero反应者细胞，随后再用可封闭IFNAR2(PBL实验室)的单克隆抗体处理。感染后立即处理反应者细胞，方法是将细胞与5μg/ml可中和小鼠抗人IFN-α/β受体链2(CD118)的抗体(PBL生物医学实验室)，或和5μg/ml可识别TNFRI或MHC-I类分子的对照抗体一起温育。将细胞稀释到六孔平皿后，细胞以1μg/ml含有各自的抗体，并与被感染的MDBK效应细胞温育三天。

当在含有对照抗体或没有抗体的细胞培养物中观察到NS缺失突变体的抑制作用时，在经IFNAR2抗体处理的细胞中抑制作用就几乎完全停止了(图5)。由于这个结果，Vero反应者细胞的抗病毒状态的诱导可专一地归因于MDBK细胞或巨噬细胞产生的各种I型干扰素。

然后用重组人I型干扰素直接分析wt BRSV和BRSV突变体在IFN刺激的细胞中的作用。为研究I型干扰素对BRSV和NS缺失突变体复制的影响，如上所述，Vero细胞或MDBK细胞被不同的病毒以0.1的MOI被感染并接种在含有2.5％FCS的DMEM的六孔平皿中。接种后，直接加入重组的通用I型干扰素(人干扰素-αA/D)或人干扰素-β(PBL生物医学实验室)直至浓度达到15,000U/ml。温育三天后，用连续稀释和将被感染的细胞间接染色(用抗F融合蛋白的抗体)的方法测定病毒效价。

所有的三种NS缺失突变体对IFN诱导的细胞反应都有非常类似的以及剂量依赖的易感性，其中，1,500U可导致感染效价降低约10,000倍(图6)。另一方面，wt BRSV对IFN处理有相对的抗性。然而，保护作用是不完全的，1,500U的IFN-α或IFN-β造成了约13倍的降低。

为确定wt BRSV在牛细胞中的保护作用较在灵长类Vero细胞系中要显著得多的可能性，我们在平行实验中以1的MOI感染MDBK细胞和Vero细胞，并加入同样量的IFN。在未处理的MDBK细胞和Vero细胞中，BRSV可生长至同样的效价(分别为1.7×10⁷pfu/ml和4×10⁶pfu/ml)(图7)。用IFN处理后，Vero细胞中的效价比MDBK细胞降低得快。加入10,000U IFN后，Vero细胞中的感染效价比MDBK细胞低了555倍，尽管后者已出现相当多的细胞损伤。NS缺失突变体强烈的抑制作用证明，MDBK细胞的抗病毒反应与Vero细胞的反应至少有同等强度。因此，MDBK细胞中wt BRSV保护作用的提高说明，BRSV赋予牛细胞的抗病毒反应要比赋予灵长类细胞的更加有效。

实施例6：BRSV NS1和NS2一起提高了狂犬病病毒对IFN介导的抗病毒反应的抗性

BRSV各个NS基因的缺失可导致对IFN介导的细胞反应有大约相同程度的敏感性。这说明这两种NS蛋白对于抵抗抗病毒机制都是需要的。为确定NS1和NS2的强制性的协作功能，以及查明为这两种NS蛋白是否都可用来保护不相关的病毒，我们建立了可表达NS1(SAD VB-NS1)或NS2(SAD VB-NS2)的重组狂犬病病毒。含有NS1或NS2基因(图1)的重组RV是基于全长的RV cDNA(SAD L16)构建的，它在G基因(SAD VB)的3’非编码序列中含有额外的转录终止和再启动序列(32)。额外的基因在减毒的狂犬病病毒SAD L16的G基因和L基因之间被引入(图1B)，这一方法对其它的基因已经成功(12；39)。首先构建包括带有C末端蛋白质标记的BRSV NS1或NS2蛋白版本在内的cDNA。然后通过PCR，使用反向引物NS1HAr-EcoRI(5’-GCAATA GAATTCCTAAGCGTAATCTGGTACATCATAAGGATAATTCAGACCAAGAAGAGT-3’)(划线部分是EcoRI限制酶切位点)，在NS1终止密码子之前直接引入与流感血凝素(HA)蛋白质内部区域相对应的额外的27个核苷酸。若为NS2，使用反向引物NS2FLr-EcoRI(5’-GCAATA GAATTCCTATTTATCGTCATCATCTTTATAATCTGGATTTAAATCATACT TATA-3’)(划线部分是EcoRI限制酶切位点)引入与合成FLAG肽相对应的24个核苷酸。这些PCR片段被用来替代含有全长BRSV cDNA第1-957个核苷酸的质粒(pBSBRSVNS1NS2)相应的序列(5)。NS1-HA基因被NotI和EcoRI切除。用Klenow聚合酶进行补平反应后，475个核苷酸的片段被引入pSAD VB中紧靠额外的转录起始信号下游的唯一的SmaI位点。这样就得到了pSADVB-NS1HA。用类似的方法克隆有470个核苷酸的NS2-FL片段，用AseI和EcoRI切除并用Klenow聚合酶补平后可以获得pSAD VB-NS2FL。

用各自的病毒cDNA(10μg)转染(CaPO₄方案；哺乳动物转染试剂盒，Stratagene)T7启动子控制的质粒后，用前面所描述的方法(19)获得带有NS1或NS2基因的重组RV。编码RV N蛋白(pTITB-N，5μg)、P蛋白和L蛋白(pTITB-P和pTITB-L，每种质粒2.5μg)的质粒与各种病毒的cDNA一起被共转染进约10⁶个稳定表达T7 RNA聚合酶噬菌体的BSRT7/5细胞(5)。4小时后，除去转染培养基并用含有10％FCS的BHK-21培养基(Gibco)代替。转染6天后收集细胞培养物的上清液并将其加到新的BSR细胞中。用免疫染色(使用识别RV核蛋白N的FITC共轭物(Centocor))的方法检测各种传染性RV。

从来自于各转染质粒的表达RV蛋白质N、P和L的BSR T7/5细胞中可以获得各重组体。NS蛋白的表达对BSR细胞中各重组体的复制、生长特性以及感染效价显然都没有不良作用(未显示)。

为检测所表达的BRSV各蛋白质的活性，用亲本RV(SAD VB)感染Vero细胞，或用各个重组体分别感染Vero细胞，或与SAD VB-NS1和SAD VB-NS2这两种重组体共转染Vero细胞。用以前所描述的方法(18)，在悬浮液中以5的MOI分别用重组RV SAD VB、SAD VB-NS1和SAD VB-NS2进行感染。为和SAD VB-NS1和SAD VB-NS2进行共转染，对每种重组体所采用的MOI为2.5。将细胞稀释后直接加入重组的通用I型干扰素A/D，直至浓度达到500U/ml。感染两天后，通过连续稀释和免疫染色(使用直接抗RV蛋白质N(Centocor)的FITC共轭物)的方法测定病毒效价。此外在至少4次独立实验中，在感染两天后还检测了各种RV蛋白质的表达。

亲本RV SAD VB的生长以及一次感染中表达NS1或NS2蛋白的病毒以相同的程度被影响(图8A)。添加50IU IFN-α后效价降低了约1个对数，且随着IFN量的增加其效价降低得更慢。这说明Vero细胞有弱的IFN反应，或者说Vero细胞中RV对IFN介导的反应有很高的固有抗性。然而，在与表达NS1和NS2的病毒共转染的细胞中，可以证明对病毒的复制有保护作用。病毒效价仍然明显高于单感染，且仅以剂量依赖的方式缓慢降低。

为再次确认上面的发现，即与Vero细胞相比，BRSV的NS蛋白可以更有效地阻断牛细胞的抗病毒反应，在MDBK细胞中进行了平行实验(图8B)。与Vero细胞相比，标准的RV SAD VB以及表达NS的重组体在未处理的MDBK细胞中以较低的效价复制。与Vero细胞相反，IFN的处理明显降低了wt RV一次感染的感染效价以及表达NS的病毒。感染效价立即以3个对数下降的情况说明存在着高度有效的IFN介导的细胞反应。然而，除了这种反应，在用SAD VB-NS1和SAD VB-NS2共感染的细胞中，病毒的复制被完全保护直至加入150IU的IFN。通过分析RV蛋白质的合成可以确定这些结果。在未处理的细胞中，所有的重组体产生了类似量的RV蛋白，而在用IFN处理的细胞中，只有共感染才能进行显著的蛋白质合成，直至加入多于150-200IU的IFN(未显示)。

上面提到的结果显示，两种BRS VNS蛋白不仅可以使BRSV对IFN介导的抗病毒反应有抗性，而且使另一种不相关的病毒也有这种功能。此外，结果证实这两种NS蛋白对于产生IFN拮抗作用而言是必需的且是足够的。

实施例7：人RSV(HRSV)临床分离物的干扰素抗性

为显示HRSV也有抗干扰素的防御机制，用就诊病人的临床分离物进行了实验。分离物是从与鲁尔大学(波鸿)的Werchau教授合作进行的多中心研究(multicenter study)中获得的。四种分离物来自于在德国的各医院中被诊断患有“毛细支气管炎”的病人(#61；#86；#109和#110，第一组)，三种分离物来自于被诊断患有“障碍性支气管炎”的病人(#104；#112和#162，第二组)。

为防止这些临床分离物对各细胞系产生适应性，将它们在Hep2细胞上传代培养了两次，然后再用在以后的实验中。用Hep2细胞确定了这些分离物的生长曲线。第一组中的#61；#86和#109分离物以及第二组中的#104分离物在Hep2细胞中生长得很快且在3天后获得了类似的高感染效价(在3×10⁶和4×10⁷pfu/ml之间)，第一组中的#110分离物以及第二组中的#104和#162分离物的生长明显减慢，3天后所得效价仅为3×10⁴pfu/ml(图9)。在初生呼吸道上皮细胞中也观察到了这些生长上的不同：#61、#86、#109和#112显然导致了合胞体的形成，对于分离物#110、#104以及#162，经过同样的感染阶段后只有单细胞感染可以被检测出(未显示)。

为确定各个分离物对干扰素的抗性，用不同的分离物感染(MOI＝0.1)Hep2细胞，时间是一小时，然后以150-5,000U/ml的浓度使用重组的I型干扰素A/D。温育72小时后，用终点滴定的方法测定各个临床分离物的病毒效价。这样可以观察到，所有的临床HRSV分离物不论其生长速率如何，都受到了保护从而免于重组的I型IFN的抗病毒作用。只有当IFN浓度非常高时(5,000U/ml)，不同的临床HRSV分离物的复制能力仅仅降低了10倍(图10)。这些数据显示，所有的临床HRSV分离物都能够抵抗高浓度重组I型IFN的抗病毒作用，且这与Long实验室品系的HRSV至少能达到同样的程度(参见图7)。

用RT-PCR扩增分离物的NS1和NS2基因，从而可以确定它们的序列。两个基因都被确定是高度保守的，这证实了IFN分析的结果。与Long品系HRSV和各分离物相比，NS1和NS2蛋白两者在氨基酸序列上只发生了轻微的不同。HRSV(Long)的NS2蛋白和临床分离物#104、112、61和110的NS1蛋白是完全一样的。与HRSV(Long)的序列相比，分离物#162、86和109中的每一个都有一个氨基酸被取代(#86：N(76)S，#162：V(82)M，#109E(91)G)。所有临床分离物的NS2蛋白在氨基酸序列上都是一样的，有别于HRSV(Long)有两个取代物：DN(7，8)GT和T(21)I。因此，HRSV(Long)的NS蛋白和基因分别被用于进一步的实验。

实施例8：人RSV(HRSV)的NS1和NS2蛋白一起提高了狂犬病病毒对IFN介导可抗病毒反应的抗性

为证实HRSV的两种NS蛋白都对I型IFN有拮抗作用，且这种功能可转移到另一种不相关病毒，我们建立了表达HRSV(Long品系)的NS1(SAD VB-hNS1)或NS2(SAD VB-hNS2)重组狂犬病病毒。带有额外的NS1或NS2基因的重组RV(图11)是基于全长的RV cDNA(SADL16)构建的，它在G基因(SAD VB)的3’非编码序列中含有额外的转录终止和再启动序列(32)。额外的基因在减毒的狂犬病病毒SAD L16的G基因和L基因之间被引入(图1B)，这在BRSV的NS基因中已经描述过。通过RT-PCR可以获得这两种HRSV基因的cDNA。为了这个目的，从被HRSV(Long)感染的Vero细胞中分离出全部RNA。对于NS1基因使用下面的引物：hNS1-NcoI5’(5’-ATT GAC CAT GGG CAG CAA TTC ATT-3’；第一链合成并PCR)以及hNS1-EcoR15’(5’-ATT GAG AAT TCT TAT GGA TTA AGA TCA AA-3’)，对于NS2基因引物是hNS2-NcoI5’(5’-ATT GAC CAT GGA CAC AAC CCA CA-3’)以及hNS2-EccRI3’(5’-ATT GAGAAT TCT TAT GGA TTG AGA TCA TA-3’)。用限制性内切酶NotI和EcoRI限制性切割之后，这些PCR片段被克隆进以同样方式酶切的TIT质粒(pTIT-hNS1，pTIT-hNS2)。然后，以hNS1-Not5’(5’-TAT GAA GCG GCC GCC CCC TCT CTT CTT TCT ACA GAA AAT GGG CAG CAA TTCATT GAG-3’)和hNS1-EcoRI3’作为引物以PCR的方法使NS1基因从pTIT-hNS1中扩增，然后用限制性内切酶NotI和EcoRI消化。用Klenow聚合酶进行补平反应后，片段被引入pSAD VB中紧靠额外的转录起始信号下游唯一的SmaI位点。这样就得到了pSAD VB-hNS1。用引物hNS2-AseI5’(5’-ATA CTT ATT AAT TGG GGC AAA TAA ATC AGT TCC CCA ACC AGC CATGGA CAC AAC CCA CAA TG-3’)以及hNS2-Acc65I3’(5’-ATA AAT GGT ACC AAA AGA TAA CACTGT GTG AAT TAA ATT TTG AAA AGT GCT TAT GGA TTG AGA TCA TAC TTG-3’)从pTIT-hNS2中扩增NS2基因，用AseI和EcoRI酶切并用Klenow聚合酶补平之后就可以用与hNS1基因类似的方法克隆NS2基因。这样就得到了pSAD VB-hNS2(图11)。

在用各自的病毒cDNA(10μg)转染(CaPO₄方案；哺乳动物转染试剂盒，Stratagene)T7启动子控制的质粒后，用以前所描述的方法(19)可以获得含有HRSV NS1或NS2基因的重组RV。编码RV N蛋白(pTITB-N，5μg)、P蛋白和L蛋白(pTITB-P和pTITB-L，每种质粒2.5μg)的质粒与各种病毒的cDNA一起被共转染进约10⁶个稳定表达T7 RNA聚合酶噬菌体的BSR T7/5细胞(5)。4小时后，除去转染培养基，并用含有10％FCS的BHK-21培养基(Gibco)代替。转染6天后收集细胞培养物的上清液并将其加到新的BSR细胞中。用免疫染色(使用识别RV核蛋白N的FITC共轭物(Centocor))的方法检测传染性RV。HRSV NS蛋白的表达对BSR细胞中各重组RV的复制、生长特性以及感染效价显然没有不良作用(未显示)。

为检测所表达的HRSV各蛋白质的活性，用亲本RV(SAD VB)感染MDBK细胞，或用各个重组体分别感染MDBK细胞，或与SAD VB-hNS1和SAD VB-hNS2这两种重组体共转染MDBK细胞。用以前所描述的方法(18)，在悬浮液中以5的MOI分别用重组RV SAD VB、SAD VB-hNS1和SAD VB-hNS2进行感染。为和SAD VB-hNS1和SAD VB-hNS2进行共转染，对每个重组体所采用的MOI为2.5。将细胞稀释后以50-500U/ml的浓度直接加入重组的通用I型干扰素A/D。感染两天后通过连续稀释和免疫染色(使用直接抗NRV蛋白质(Centocor)的FITC共轭物)的方法测定感染效价。IFN的处理明显降低了wt RV和表达hNS的各种病毒一次感染的感染效价。仅仅加入50U IU的IFN-α导致感染效价降低了3个数量级。然而，在用SAD VB-hNS1和SAD VB-hNS2共感染的细胞中，病毒的复制明显受到了保护直至加入150IU的IFN(图11)。

这些结果证明，两种HRSV NS蛋白不仅可以拮抗IFN的细胞反应，而且使另一种不相关的病毒对IFN介导的抗病毒反应也有抗性。此外，结果进一步证实这两种NS蛋白对于产生IFN拮抗效应而言是必需的且是足够的。

实施例9：鼠肺炎病毒(小鼠的肺炎病毒；PVM)的NS1和NS2蛋白一起提高了狂犬病病毒对IFN介导的抗病毒反应的抗性

为证实PVM的两种NS蛋白也可介导I型IFN抗性，且这种功能可转移到狂犬病病毒，我们建立了表达PVM的NS1(SAD VB-mNS1)或NS2(SAD VB-mNS2)重组狂犬病病毒。两种PVM基因的cDNA是由Warwick大学(英国)的Andrew Easton惠予提供的(GenBank编号为D10331；图18)。还根据SAD VB构建了带有额外的NS1或NS2基因的重组RV(图11)(32；参见实施例6和8)。额外的基因在RV SAD L16的G基因和L基因之间被引入(图1B)，这在BRSV的NS基因中已经描述过。通过PCR，在NS1基因紧靠转录终止密码子之前的位置上引入编码流感血凝素(HA)蛋白(HA tag)内部区域的额外的27个核苷酸，就可以扩增两种NS蛋白的基因。在紧靠NS2基因终止密码子上游的地方引入编码合成FLAG肽(FLAG tag)的24个核苷酸。对于NS1基因使用下面的引物：mNS1-NotIEcoRV5’(5’-AAT GAT ATC GCGGCC GCC CCC TCT CTT CTT TCT ACA GAA ATG GGC TGT AAT GTG ATG ATG-3’)以及mNS1ha-EcoRI/V3’(5’-AAT GAT ATC GAA TTC TTA AGC GTA ATC GG TAC ATC ATA AGG ATA ACCACT GAT CAG CTC TAC-3’)，对于PVM的NS2基因引物是mNS2-AseIEcoRV5’(5’-AAT GAT ATCATT AAT TGG GGC AAA TAA ATC AGT TCC CCA ACC AGC CAT GTC CAC AGC TAT GAA CAA G-3’)以及mNS2fl-EcoRI/V3’(5’-AAT GAT ATC GAA TTC TCA TTT ATC GTC ATC ATC TTT ATAGTC ATC ATC ATC CTC ATC-3’)。用限制性内切酶EcoRV消化后，然后将这些PCR片段引入pSAD VB中紧靠额外的转录起始信号下游的唯一的SmaI位点。这样就获得了pSADVB-mNS1和pSAD VB-mNS2(图11)。

从来自于转染质粒的表达RV蛋白质N、P和L的BSR T7/5细胞中可以获得含有PVM NS1或NS2基因的重组RV，这在实施例6和8中已经描述过了。NS蛋白的表达对BSR细胞中重组体的复制、生长特性以及感染效价显然没有不良作用(未显示)。

为评定所表达的PVM蛋白质的活性，用亲本RV(SAD VB)感染MDBK细胞，或用各个重组体分别感染MDBK细胞，或与SAD VB-mNS1和SAD VB-mNS2这两种重组体共感染MDBK细胞。用以前所描述的方法(18)，在悬浮液中以5的MOI分别用重组RV SAD VB、SAD VBmNS1和SAD VB-mNS2进行感染。为与SAD VB-mNS1和SAD VB-mNS2进行共感染，对每个重组体所采用的MOI为2.5。将细胞稀释后以50-500U/ml的浓度直接加入重组的通用I型干扰素A/D。感染两天后，通过连续稀释和免疫染色(使用直接抗N RV蛋白质(Centocor)的FITC共轭物)的方法测定病毒效价。IFN的处理明显降低了wt RV和表达hNS的各病毒一次感染的感染效价。然而，在用SAD VB-mNS1和SAD VB-mNS2共感染的细胞中，病毒的复制明显受到了保护直至加入100IU的IFN(图13)。

这些结果证明，两种PVM NS蛋白能够拮抗IFN的细胞反应，并且使不相关的病毒对IFN介导的抗病毒反应也有抗性。由于PVM NS蛋白与HRSV的那些蛋白质的同源性只有17％(对NS1)和20％(对NS2)，IFN拮抗功能是无法预见的。就像BRSV和HRSV的NS蛋白一样，对于PVM而言，这两种NS蛋白对于产生IFN拮抗作用同样是必需的且是足够的。

实施例10：制造含有异源NS基因的重组BRSV

通过用其它肺炎病毒的NS基因替换已有的BRSV基因，我们进一步构建了重组的嵌合BRSV。

为制造用HRSV或PVM的NS1基因替代BRSV NS1基因的重组BRSV，我们使用了含有全长BRSV cDNA第1-957个核苷酸的质粒(5)，此外在它NS1基因中第311个核苷酸上还有一个EcoRI限制性位点(pbNS1EcoRIbNS2)。这样，用NotI和EcoRI限制性内切酶消化可以除去NS2基因完整的编码区域。对HRSV NS1使用hNS1-NotI5’和hNS1-EcoRI3’引物，对PVM NS1使用mNS1-NotIEcoRV5’和mNS1ha-EcoRI3’引物，通过PCR可以扩增HRSV和PVM的NS1基因，用NotI和EcoRI限制性酶消化后将基因引入质粒中，这样就可以获得phNS1bNS2和pmNS1bNS2。随后，用NotI和AccI消化这两个质粒，所得片段分别有1094个核苷酸(hNS1bNS2)和1043个核苷酸(mNS1bNS2)，将得到的片段分别插入BRSV的全长cDNA中。这样就获得了rBRSV hNS1bNS2和rBRSV mNS1bNS2(图14)。

为制造带有异源NS2基因(rBRSV bNS1hNS2和rBRSV bNS1mNS2)的BRSV，先用限制性酶Acc65I切割pNS1NS2(5)，然后用限制性酶AseI除去部分含有bNS2基因由446个核苷酸组成的片段。然后在片段的这样位点分别引入hNS2或mNS2基因。通过PCR产生这些片段，对HRSV NS2基因用hNS2-AseI5’和hNS2-Acc65I3’作为引物，或者是对PVM NS2基因用mNS2-AseIEcoRV5’和mNS2-Acc65I3’(5’-ATA AAT GGT ACC AAA AGA TAA CAC TGT GTG AATTAA ATT TTG AAA AGT GCT CAT TTA TCG TCA TCA TCT TTA TAG-3’)作为引物。随后用限制性酶AseI和Acc65I消化这些片段并将它们引入pNS1NS2以获得pbNS1hNS2和pbNS1mNS2，然后用限制性酶NotI和Acc65I消化这些质粒，并将所得片段(bNS1hNS2有949个核苷酸，bNS1mNS2有1069个核苷酸)插入全长的BRSV cDNA中，这样就可以获得rBRSV bNS1hNS2和rBRSV bNS1mNS2(图14)。

为分别制造含有HRSV和PVM两种NS基因的重组BRSV，先用限制性酶Acc65I切割质粒phNS1bNS2和pmNS1bNS2，然后部分用限制性酶AseI切割。随后将HRSV NS2基因和PVMNS2基因的上述片段引入各自的质粒中，这样就得到了phNS1hNS2和pmNS1mNS2。同样，用限制性酶NotI和Acc65I消化这些质粒，并将所得片段(hNS1hNS2有1094个核苷酸，mNS1mNS2有1163个核苷酸)插入全长的BRSV cDNA中。这样就可以获得rBRSV hNS1hNS2和rBRSV mNS1mNS2(图14)。

各种活体重组病毒：rBRSV hNS1bNS2、rBRSV bNS1hNS2和rBRSV hNS1hNS2以及rBRSVmNS1bNS2、rBRSV bNS1mNS2和rBRSV mNS1mNS2可以在BSR T7/5细胞中(5)由各自的cDNA获得，这需要先用各个病毒的cDNA(10μg)转染(CaPO₄方案；哺乳动物转染试剂盒，Stratagene)T7启动子控制的质粒。编码BRSV的N和P蛋白(pTITB-N和pTITB-P，每种质粒4μg)、以及L和M2蛋白(pTITB-L和pTITB-M2，每种质粒2μg)的质粒与各个病毒的cDNA一起被共转染进约10⁶个稳定表达T7噬菌体RNA聚合酶的BSR T7/5细胞(5)。4小时后，除去转染介质并加入含有5％FCS的BHK-21培养基(Gibco)。每5天以1∶3的比例稀释被BRSV cDNA转染的细胞，直至可以观察到细胞病变效应。

在所有情况中，编码BRSV N、P、L和M2蛋白质的载体质粒的共转染作用可导致合胞体的形成。以1∶3的比例稀释转染细胞且有清楚的细胞病变效应出现后，就可以收获病毒。

为制造病毒母液，在无血清的Dulbecco极限必需培养基(DMEM)中有80％的融合Vero细胞以0.1的感染复数(MOI)被感染。吸附一小时后除去接种物，并将细胞在含有5％CO₂的空气中于添加有2.5％FCS的DMEM中以37℃温育，大约4天后可以观察到明显的细胞病变效应(CPE)。通过冷冻随后再解冻处理释放病毒。通过在微量滴定板上连续稀释再计算转染灶的数量可以确定在Vero细胞上的病毒效价。为了这个目的，可以用抗F融合蛋白的抗体(SEROTEK，英国)间接染色的方法将转染灶染色。

实施例11：BRSV嵌合体的生长：IFN抗性具有细胞类型依赖性

首先在Vero细胞中分析病毒的生长特性。由于BRSV hNS1hNS2和BRSV hNS1bNS2的行为与BRSV wt类似，与亲本的全长病毒相比，BRSV mNS1mNS2和BRSV mNS1bNS2是轻微减毒的。这说明BRSV NS蛋白在病毒复制中的功能全部是由HRSV NS蛋白完成的。用Vero细胞以0.1的MOI感染随后再温育3天之后，两种亲本wt BRSV和两种HRSV/BRSV嵌合体都获得了约5×10⁵pfu的感染效价(图15)。另一方面，3天之后PVM/BRSV嵌合体的效价只有约4×10⁵pfu，这说明PVM NS基因不能理想地完成病毒复制中BRSV(和HRSV)基因的功能。

随后采用牛源的细胞系MDBK，这种细胞系能较好地支持wt BRSV的生长，且与Vero细胞不同，它有功能性I型IFN系统(5)。这样，与wt BRSV相比，BRSVhNS1hNS2的生长就减缓了。3天后所得效价只有4×10⁴pfu，而BRSV却生长至1×10⁶pfu(图16)。在wt BRSV最为理想的宿主细胞牛MDBK细胞中，BRSV hNS1hNS2的生长显然减弱了，而在IFN阴性的Vero细胞中却没有观察到减弱作用。

然后用重组人I型干扰素来分析IFN刺激的细胞中wt BRSV和BRSV hNS1hNS2的行为。为研究I型干扰素对重组体复制的作用，如上所述，用不同的病毒以0.1的MOI感染Vero细胞或MDBK细胞，然后将它们接种在含有2.5％FCS DMEM的六孔平皿中。接种后，以500-10,000U/ml的浓度直接加入重组的通用I型干扰素(人干扰素-αA/D，PBL生物医学实验室)。温育三天后，用连续稀释和将被感染的细胞直接染色(用抗F融合蛋白的抗体)的方法测定病毒效价。

在Vero细胞上没有观察到有关wt BRSV和BRSV hNS1hNS2之间IFN抗性方面的任何不同。当添加5000U或更多IFN后可以看到，两种病毒的感染效价都有轻微的降低(图17A)。相反，在MDBK细胞上，BRSV hNS1hNS2对IFN诱导的细胞反应显示了强烈的剂量依赖敏感性，其中，低至1500U的IFN就可使感染效价降低3倍，而10,000U的IFN可使感染效价降低近30倍。另一方面，wt BRSV对IFN的处理显示了较高的抗性。甚至10,000U的IFN-α也不会影响wt BRSV的复制能力(图17B)。尽管Vero细胞中嵌合型BRSV hNS1hNS2对IFN的抗性与wt BRSV类似，但在牛源细胞中它不能完全防止IFN诱导的抗病毒反应。这种情况证明，与HRSV NS蛋白相比，BRSV NS蛋白能更成功地控制牛细胞的抗病毒反应。显然，在异源宿主细胞中NS蛋白的IFN拮抗效应不是最理想的。带有异源NS蛋白的嵌合RV病毒在活体内是减毒的，且可作为活疫苗使用。

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序列表<110>惠氏(WYETH)<120>抗干扰素(IFN)反应的肺炎病毒非结构蛋白<130>211-5PCT<140>PCT/EP01/04740<141>2001-04-26<150>DE100 20 505.4<151>2000-04-26<160>16<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物NNot(+)<400>1taggcggccg caaaaatggc tcttaggaag gtg 33<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物Nstu(-)<400>2tcctttgtat cgtttcattt c 21<210>3<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物NS1HAr-EcoRI<400>3gcaatagaat tcctaagcgt aatctggtac atcataagga taattcagac caagaagagt 60<210>4<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物NS2FLr-EcoRI<400>4gcaatagaat tcctatttat cgtcatcatc tttataatct ggatttaaat catacttata 60<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物hNS1-NcoI5<400>5attgaccatg ggcagcaatt catt 24<210>6<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物hNSL-EcoRI5<400>6attgagaatt cttatggatt aagatcaaa 29<210>7<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物hNS2-NcoI5<400>7attgaccatg gacacaaccc aca 23<210>8<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物hNS2-EcoRI3<400>8attgagaatt cttatggatt gagatcata 29<210>9<211>57<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物hNS1-NotI5<400>9tatgaagcgg ccgccccctc tcttctttct acagaaaatg ggcagcaatt cattgag 57<210>10<211>62<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物hNS2-AseI5<400>10atacttatta attggggcaa ataaatcagt tccccaacca gccatggaca caacccacaa 60tg 62<210>11<211>71<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物hNS2-Acc65I3<400>11ataaatggta ccaaaagata acactgtgtg aattaaattt gaaaagtgct tatggattga 60gatcatactt g 71<210>12<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物mNS1-NotIEcoRV5<400>12aatgatatcg cggccgcccc ctctcttctt tctacagaaa tgggctgtaa tgtgatgatg 60<210>13<211>62<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物mNS1ha-EcoRI/V3<400>13aatgatatcg aattcttaag cgtaatcggt acatcataag gataaccact gatcagctct 60ac 62<210>14<211>67<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物mNS2-Ase1EcoRV5<400>14aatgatatca ttaattgggg caaataaatc agttccccaa ccagccatgt ccacagctat 60gaacaag 67<210>15<211>57<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物mNS2f1-EcoRI/V3<400>15aatgatatcg aattctcatt tatcgtcatc atctttatag tcatcatcat cctcatc 57<210>16<211>75<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物mNS2-Acc65I3<400>16ataaatggta ccaaaagata acactgtgtg aattaaattt tgaaaagtgc tcatttatcg 60tcatcatctt tatag 75

Claims

1.RSV NS1和/或NS2蛋白或编码NS1的核酸序列和/或编码NS2的核酸序列在制造用来减弱干扰素(IFN)介导的免疫反应的药物制剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其中，免疫反应是抗病毒反应。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其中，免疫反应是抑制性的。

4.根据权利要求1-3中任何一项所述的应用，其中，核酸序列是DNA或RNA。

5.根据权利要求1-4所述的应用，其中，RSVNS1和NS2蛋白是一起使用的，或其中编码NS1的核酸序列与编码NS2的核酸序列是一起使用的。

6.根据权利要求5所述的应用，其中RSV NS1蛋白和NS2蛋白来自于不同的RSV病毒，或其中编码RSV NS1的核酸序列与编码RSV NS2的核酸序列来自于不同的RSV病毒。

7.根据权利要求4所述的应用，其中，核酸序列包含在质粒或载体或病毒衍生载体或重组DNA或RNA病毒中。

8.根据权利要求7所述的应用，其中所述载体是在基因治疗或细胞还原(细胞破坏、抗癌)治疗中为免疫目的而使用的病毒基因表达载体。

9.根据权利要求7所述的应用，其中，病毒或病毒衍生载体来自于腺病毒(AdV)、腺病毒相关病毒(AAV)、疱疹病毒或痘病毒之类的DNA病毒。

10.根据权利要求7所述的应用，其中，病毒或病毒衍生载体来自于正链病毒，优选来自于α病毒科、黄病毒科和小RNA病毒科的病毒。

11.根据权利要求7所述的应用，其中，病毒或病毒衍生载体来自于分节段或无节段的负链RNA病毒。

12.根据权利要求7所述的应用，其中，RNA病毒来自于副粘病毒科、黄病毒科、Bornaviridae或弹状病毒科，尤其是狂犬病病毒。

13.根据权利要求12所述的应用，其中，RNA病毒来自于人或动物的RSV。

14.根据权利要求13所述的应用，其中，编码NS1的核酸序列和/或编码NS2的核酸序列与所述人或动物的RSV是异源的。

15.根据权利要求1-14所述的应用，其中，药物制剂可进一步包括疫苗。

16.根据权利要求1-15所述的应用，其中，RSV NS1和/或NS2蛋白是修饰过的。

17.根据权利要求16所述的应用，其中，修饰选自氨基酸的取代、缺失或插入。

18.根据权利要求16或17所述的应用，其中，修饰导致NS1和/或NS2蛋白的IFN拮抗活性的增加。

19.根据权利要求16或17所述的应用，其中，修饰导致NS1和/或NS2蛋白IFN拮抗活性的降低。

20.带有经修饰的编码NS1和/或NS2蛋白的核酸序列的重组RSV在疫苗制造中的应用，其中所述的修饰降低或废除了病毒逃避宿主IFN介导的免疫反应的能力。

21.根据权利要求20所述的应用，其中经修饰的编码NS1和/或NS2的核酸序列与所述RSV是同源或异源的。

22.根据权利要求20或21所述的应用，其中重组RSV来自于人或牛的RSV。

23.根据权利要求20-22所述的应用，其中编码NS1和/或NS2的核酸序列来自于小鼠的肺炎病毒(PVM)。

24.根据权利要求1-23所述的应用，其中IFN是I型干扰素(IFN-α或IFN-β)。

25.一种改变RSV的宿主范围的方法，其中，编码NS1和/或NS2的核酸序列被编码来自能感染所需宿主的RSV的NS1和/或NS2的核酸序列替代。

26.一种改变了的宿主范围的重组RSV，其中，病毒的编码NS1和/或NS2的核酸序列被编码来自能感染所需宿主的RSV的NS1和/或NS2的核酸序列替代。

27.一种经遗传修饰以表达RSV NS1和/或NS2蛋白的重组病毒，其中，所述病毒可表达RSV的NS1和/或NS2蛋白，或增强了其逃避IFN介导的免疫反应的能力。

28.根据权利要求27所述的病毒，其中，所述病毒来自于狂犬病病毒。

29.根据权利要求26-28所述的病毒作为疫苗使用。

30.根据权利要求1所述的应用，RSV NS1和/或NS2蛋白或编码NS1的核酸序列和/或编码NS2的核酸序列来自于BRSV、HRSV或PVM。

31.根据权利要求1所述的应用，BRSV、HRSV或PVM的RSV NS1和/或NS2蛋白含有如图18的序列，或编码按图18的序列编码的BRSV、HRSV或PVM的NS1的核酸序列和/或NS2的核酸序列。