ES2271005T3 - Proteinas ns neumovirus que antagonizan la respuesta a interferon (ifn). - Google Patents
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Abstract
El uso de una proteína NS2 o de una secuencia de ácido nucleico que codifica NS2 para la preparación de una formulación farmacéutica para reducir la respuesta inmune mediada por IFN.
Description
Proteínas NS de neumovirus que antagonizan la
respuesta a interferón (IFN).
La presente invención se refiere al uso de una
proteína NS2 de neumovirus o de una secuencia de ácido nucleico que
codifica NS2 para la preparación de una formulación farmacéutica
para reducir la respuesta inmune mediada por interferón (IFN). La
presente invención se refiere además al uso de una proteína NS1 y
una proteína NS2 de neumovirus o de un ácido nucleico que codifica
la proteína NS1 y la proteína NS2 de neumovirus para la preparación
de una formulación farmacéutica para reducir la respuesta inmune
mediada por interferón (IFN). La invención trata asimismo de
neumovirus recombinantes, en especial de virus respiratorios
sincitiales (RSV) con una resistencia incrementada, reducida o nula
frente a la respuesta inmune del huésped mediada por interferón
(IFN), de virus recombinantes con una resistencia incrementada
frente a la respuesta inmune mediada por interferón (IFN) y del uso
de estos virus en formulaciones farmacéuticas, por ejemplo como
vacunas.
El virus respiratorio sincitial bovino (BRSV) es
el agente etiológico más importante de enfermedades del tracto
respiratorio en terneros y la causa de considerables pérdidas
económicas (40;45). La respuesta inmune y la patología en terneros
es similar a los síntomas provocados por el virus respiratorio
sincitial humano (HRSV), que sigue siendo la causa principal de
graves bronquiolitis y neumonías en lactantes y niños pequeños en
todo el mundo (9). La clonación molecular de HRSV y BRSV, así como
de un virus relacionado, el neumovirus de ratón (Pneumonia Virus of
Mice; PVM), no sólo ha confirmado el muy estrecho parentesco entre
BRSV y HRSV sino que también ha puesto de manifiesto importantes
diferencias comunes respecto a otros miembros de la familia
Paramyxoviridae, lo que ha dado lugar al establecimiento de
la subfamilia Pneumovirinae dentro de la familia
Paramyxoviridae (26;37). Los virus RSV y el PVM forman el
género Neumovirus dentro de la subfamilia, y el neumovirus aviar
(APV), como único representante hasta la fecha, el género
Metaneumovirus.
Como en todos los miembros del orden
Mononegavirales, el ARN genómico, de aproximadamente 15 kb, de RSV y
PVM está contenido en un complejo ribonucleoproteico (RNP) que sirve
de molde para la transcripción secuencial de genes (25;49). Se
expresan once proteínas, dispuestas en el orden
3'-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-5',
mediante 10 unidades de transcripción (5;9;30;31). Las proteínas
codificadas comprenden cinco proteínas asociadas a RNP: la
nucleoproteína (N), la fosfoproteína (P), la subunidad catalítica
grande de la ARN-polimerasa (L) y un factor de
elongación de la transcripción (M2-1), que es
codificado por el primero de dos marcos de lectura abiertos
solapantes del gen M2 (8;17;27;38). El segundo marco de lectura
abierto de la unidad de transcripción de M2 (M2-2)
codifica, como se describió, una proteína no esencial (1) que,
presumiblemente, participa en la regulación de la síntesis de ARN
(4;28). Tres proteínas víricas están asociadas con la envuelta del
virus: la proteína de fusión F, la proteína G asociada putativa y
una pequeña proteína hidrófoba SH.
La presencia de dos genes de proteínas no
estructurales en la posición 3'-terminal del genoma
distingue los miembros del género Neumovirus de todos los demás
representantes del orden Mononegavirales. Los genes NS se
transcriben excesivamente debido a su posición cercana al extremo
3'. Las proteínas codificadas se detectaron en células infectadas
(10;16). Los genes NS de BRSV codifican polipéptidos de 136 y 124
aminoácidos. La comparación con las proteínas NS de HRSV de los
subgrupos A y B mostró unas homologías de aminoácidos del 69% y 68%
para las proteínas NS1 y del 84% y 83% para las proteínas NS2
(5;34). Las proteínas NS1 y NS2 del PVM no muestran una homología
significativa con los genes NS de RSV (aproximadamente 20% de
identidad), pero poseen funciones análogas. Las secuencias
deducidas, sin embargo, no proporcionaron ningún indicio obvio
acerca de la función de las proteínas NS en el ciclo vital del
virus. Según se informó, la proteína NS1 de HRSV está asociada con
la proteína M, mientras que la proteína NS2 no muestra ninguna
asociación detectable con las proteínas estructurales de RSV, lo que
apunta a que NS1 y NS2 desempeñan funciones diferentes (16;47).
Recientemente se sugirió una función inhibidora de NS1 en la
transcripción del ARN del virus en experimentos en los que se
cultivaron minigenomas artificiales de HRSV en presencia o ausencia
de NS1. En el mismo estudio también se observó un efecto inhibidor,
aunque mucho menos pronunciado, para NS2 (3).
Los procedimientos recientemente establecidos
para la producción ("recovery", recuperación) de virus
infecciosos de ARN de hebra negativa a partir de ADNc (11)
permitieron generar RSV recombinantes humanos (8;29) y bovinos (5) y
estudiar las funciones de las proteínas individuales en el contexto
vírico. La producción con éxito de mutantes de deleción del gen de
NS2 viables confirmó que NS2 no es esencial para la replicación del
virus en cultivos celulares (5;43). El patrón y las cantidades
relativas de ARNm y de ARN de longitud completa que se generaron en
las células infectadas no estaban significativamente alterados. No
obstante, los mutantes de deleción estaban atenuados en comparación
con el virus inicial, mostraban unas tasas de crecimiento más bajas
y presentaban menores títulos de virus infecciosos. Aunque NS2 no es
esencial, constituye así un factor accesorio que es capaz de
fomentar considerablemente el crecimiento del virus mediante un
mecanismo hasta ahora desconocido. Sin embargo, la función de las
proteínas NS sigue siendo desconocida.
El documento WO 99/64068 se refiere a virus de
ARN de hebra negativa atenuados con una actividad antagonista de
interferón alterada para su uso como vacunas y formulaciones
farmacéuticas. El documento WO 98/02530 se refiere a la producción
de vacunas de RSV atenuados que se obtienen a partir de secuencias
nucleotídicas clonadas. Buchholz y col. (Buchholz y col., Journal of
Virology, enero 1999, páginas 251-259) se refieren a
la producción de BRSV a partir de ADNc.
Esta invención se basa en el descubrimiento de
que las proteínas NS1 y/o NS2 de RSV y de virus similares a RSV,
especialmente del género Neumovirus (RSV y PVM), que en lo sucesivo
se denominan todos "RSV", poseen un efecto antagonista sobre la
respuesta inmune mediada por IFN.
La presente invención se refiere al uso de una
proteína NS2 de neumovirus o de una secuencia de ácido nucleico que
codifica NS2 para la preparación de una formulación farmacéutica
para reducir la respuesta inmune mediada por interferón (IFN).
La presente invención se refiere además al uso
de una proteína NS1 y NS2 de RSV o de una secuencia de ácido
nucleico que codifica NS1 de RSV y una secuencia de ácido nucleico
que codifica NS2 de RSV para la preparación de una formulación
farmacéutica para reducir la respuesta inmune mediada por IFN,
preferentemente por IFN alfa y/o beta.
En una forma de realización preferida de la
presente invención, la proteína NS1 de RSV se usa en combinación con
la proteína NS2 para la preparación de una formulación farmacéutica,
o una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína NS1 de
RSV se usa en combinación con una secuencia de ácido nucleico que
codifica la proteína NS2 de RSV para la preparación de una
formulación farmacéutica para reducir la respuesta inmune mediada
por IFN. Según la presente invención, "en combinación" se
refiere a una administración que se efectúa simultánea o
sucesivamente.
En otro aspecto de la presente invención, la
proteína NS2 de RSV o las proteínas NS1 y NS2 de RSV se usan para
proteger un virus no relacionado contra la respuesta inmune mediada
por IFN. En el caso de las proteínas NS1 y/o NS2 de RSV se trata
preferentemente de las proteínas NS de BRSV. Las proteínas NS1 y
NS2 protegen de forma cooperativa un virus no relacionado. Según la
presente invención, "virus no relacionado" se refiere a virus
que no expresan la proteína NS1 y/o NS2 de RSV. En una forma de
realización preferida, el virus es el virus de la rabia. Las
proteínas NS1 y/o NS2 de RSV se expresan preferentemente a partir
del ácido nucleico vírico.
En otro aspecto más, las formulaciones
farmacéuticas de la invención antes mencionadas comprenden asimismo
una vacuna. Preferentemente, la administración de la vacuna junto
con las formulaciones farmacéuticas da como resultado una
eliminación más lenta de la vacuna del cuerpo al que se
administra.
La invención también trata del uso de proteínas
NS2 de RSV modificadas para la preparación de una formulación
farmacéutica para modular la respuesta inmune mediada por IFN. En
una forma de realización preferida, la modificación da como
resultado una intensificación de la actividad moduladora de la
proteína NS2 sobre IFN.
La presente invención también se refiere al uso
de un RSV recombinante que lleva una secuencia de ácido nucleico
modificada que codifica NS2 para la preparación de una vacuna, en la
que la modificación reduce o destruye la capacidad del virus para
eludir la respuesta inmune mediada por IFN. En una forma de
realización preferida, la secuencia de ácido nucleico modificada que
codifica NS2 es homóloga o heteróloga respecto a dicho RSV
recombinante. Se prefieren especialmente los usos en los que el RSV
recombinante deriva de RSV humano o bovino, o de PVM.
Para estudiar con más detalle la función de las
proteínas de RSV, se generaron mutantes de deleción de BRSV en los
que faltaban el gen NS1 o los genes NS1 y NS2 y se estudió su
comportamiento en diferentes líneas celulares.
El primer indicio de una mayor sensibilidad de
los mutantes de deleción de NS frente a factores de la célula
huésped se observó tras la infección de células MDBK, que son
totalmente competentes para una infección por BRSV natural y
presentan un título de BRSV natural mayor que cualquiera de las
otras líneas celulares ensayadas. Por el contrario, los virus que
carecían de uno o ambos genes NS crecían peor en las células MDBK,
mientras que en otras líneas celulares, tales como Vero o BSR, la
ausencia de los genes NS únicamente redujo 10 veces los títulos
infecciosos. Mediante experimentos de cocultivo se identificaron
interferones de tipo I como los factores decisivos de las células
huésped producidos por las células MDBK infectadas por BRSV.
Obviamente se induce en los cultivos de MDBK infectados un estado
antiviral por estimulación autocrina y paracrina de las células.
Mientras que el BRSV natural es capaz de contrarrestar esta
respuesta, ninguno de los mutantes de deleción de NS es capaz de
ello. Por el contrario, las células Vero carecen de los genes de
interferón de tipo I (15;46), de manera que la infección vírica no
da como resultado la inducción de un estado antiviral y permite el
crecimiento de los mutantes de deleción de NS. Aunque las células
Vero no son capaces de producir interferón, pueden reaccionar a la
estimulación por interferón exógeno mediante una transmisión de
señales mediada por JAK/STAT a través del complejo receptor de
interferón alfa (IFNAR). Los interferones bovinos secretados por
las células MDBK infectadas indujeron en las células Vero
"respondedoras" una respuesta antiviral que inhibía el
crecimiento de los mutantes de deleción de NS pero no el del BRSV
natural. El efecto antiviral causado por los sobrenadantes de MDBK
se suprimió mediante la incubación de las células Vero con un
anticuerpo que bloquea la unión de IFN al IFNAR. Por lo tanto, los
únicos componentes activos de los sobrenadantes de las células MDBK
en la inducción de la respuesta antiviral en las células Vero eran
el IFN alfa y/o el IFN beta.
El efecto inhibidor sobre los mutantes de
deleción de NS en las células Vero tratadas con sobrenadantes de
células MDBK era débil, con una reducción máxima de 7 veces en el
caso del doble mutante de deleción, y, por lo tanto, no era
comparable a la fuerte inhibición de los mutantes de deleción de NS
en las células MDBK. Esto se puede deber a diferentes factores. La
estimulación de las células Vero, procedentes de primates, con el
IFN heterólogo de origen bovino es, presumiblemente, menos eficaz
que la estimulación de MDBK. Al igual que para el ser humano, se
identificaron diferentes IFN alfa (tipos 2 a 8) e IFN beta (tipos 1
y 3) bovinos que muestran diferentes actividades biológicas (7).
Además, los mecanismos antivirales de las células Vero parecen ser
menos eficaces que los de MDBK. Los sobrenadantes de macrófagos
activados e infectados, conocidos por secretar mayores cantidades de
interferón de tipo I que otras células, provocaron una mayor
reducción, de hasta 50 veces, de los mutantes de deleción de NS en
las células Vero "respondedoras". Mediante la estimulación de
las células Vero con IFN alfa A/D o IFN beta humano recombinante se
pudo inhibir la replicación de los mutantes de deleción de NS de
forma dependiente de la dosis, inhibiendo 500 unidades casi por
completo la actividad de replicación.
Por lo tanto, mediante la presente invención se
identifican las proteínas de RSV como antagonistas de la respuesta
de la célula huésped mediada por IFN.
Mediante el uso de otro virus de ARN de hebra
negativa, el virus de la rabia, como vector para la expresión de los
genes NS derivados de BRSV se pudo demostrar asimismo que la
actividad de las dos proteínas NS NS1 y NS2 puede aumentar la
resistencia a IFN de un virus no relacionado. Se descubrió además
que las proteínas NS1 y NS2 pueden proceder de diferentes RSV.
En conjunto, se pudo asignar a las proteínas NS
de RSV una importante función biológica: proporcionan al virus
protección contra los mecanismos antivirales celulares mediados por
interferón (efecto antagonista de IFN). Inesperadamente se descubrió
asimismo que el uso conjunto de ambas proteínas NS potencia el
correspondiente efecto antagonista de IFN. Este es el primer ejemplo
de una cooperación de dos proteínas víricas para la antagonización
del interferón.
La adaptación de las proteínas víricas a
contrarrestar las respuestas innatas de las células de su huésped
natural es seguramente un factor importante en la determinación del
espectro de huéspedes del virus y puede impedir que los virus
superen las barreras entre especies (13;23;26). La proteína V del
virus 5 de simios (SV5) es capaz, por ejemplo, de bloquear la
activación de los genes que responden a interferón en células de
primate pero no en células de ratón (14). Éste podría ser el
mecanismo determinante que evita que se produzca una infección
productiva por SV5 en ratones, incluso en ratones SCID (13).
Recientemente se describió que el HRSV, el homólogo humano del BRSV,
es resistente a la actividad antiviral inducida por IFN en células
humanas (2), y los autores deducen de sus resultados que las
proteínas NS de HRSV están optimizadas para antagonizar la respuesta
a IFN en células humanas más que en células de otro origen.
De hecho, la contribución de las proteínas NS al
estado competente de los huéspedes para una infección por RSV puede
explicar por qué los virus estrechamente relacionados poseen un
espectro de huéspedes muy limitado. BRSV y HRSV son capaces de
penetrar en células humanas, bovinas y murinas; la diferente
capacidad de las proteínas NS para antagonizar los mecanismos de
defensa específicos del huésped podría decidir entonces si el virus
se elimina o no. Resultados anteriores también lo corroboran. El
crecimiento de HRSV en células embrionarias primarias de ratón (ME)
estaba notablemente limitado; sin embargo, tras añadir al medio
suero anti-IFN de ratón, la producción de virus
aumentó y la infección se extendió por toda la capa de células (26).
Además, los BRSV recombinantes en los que, para facilitar la entrada
en células de primate, se sustituyeron las proteínas superficiales G
y F por las del HRSV eran un poco más competentes en cuanto a la
replicación en chimpancés que los BRSV. La infección, sin embargo,
permaneció muy limitada y no fue suficiente para inducir una
protección contra una infección adicional por HRSV homólogo (6). Los
autores deducen de sus observaciones que la reducida eficacia de las
proteínas NS de BRSV en la antagonización de los mecanismos de
defensa de primates constituye el factor determinante principal del
espectro de huéspedes.
Por esta razón, los descubrimientos de los
autores tienen importantes implicaciones para el diseño de vacunas
vivas atenuadas eficaces de RSV. La deleción de NS1 o NS2, o de
ambos genes, da como resultado virus hiperatenuados que no son
capaces de escapar a ninguna respuesta a interferón. Además,
mediante la sustitución recíproca de las proteínas NS entre
diferentes RSV, por ejemplo BRSV y HRSV para, en particular,
producir vacunas de BRSV y HRSV, se pueden concebir vacunas que
poseen una capacidad intermedia para eludir los mecanismos de
defensa bovinos y humanos innatos. Adicionalmente se pueden efectuar
mutaciones en las proteínas NS que sólo destruyen parcialmente la
actividad antagonista de IFN.
La proteína NS2 o una secuencia de ácido
nucleico que codifica NS2 según esta invención es adecuada para
preparar una formulación farmacéutica para atenuar la respuesta
inmune mediada por interferón.
Además, las proteínas NS1 y NS2 de RSV o las
secuencias de ácido nucleico que codifican NS1 y NS2 según la
invención también son adecuadas para preparar formulaciones
farmacéuticas para atenuar la respuesta inmune mediada por IFN. En
una forma de realización preferida se usa NS1 de RSV en combinación
con la proteína NS2 para preparar una formulación farmacéutica. La
formulación farmacéutica contiene una cantidad eficaz de NS1 y NS2
para modificar la respuesta inmune mediada por IFN en un animal o
ser humano y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. La
formulación farmacéutica se puede preparar con técnicas
convencionales. Así, por ejemplo, la formulación farmacéutica de la
presente invención se puede preparar mezclando la cantidad deseada
de una proteína NS1 y/o NS2 de RSV o de una secuencia de ácido
nucleico que codifica NS1 y/o de una secuencia de ácido nucleico que
codifica NS2 con una solución isotónica estéril que, mediante un
tampón que actúa en el intervalo de pH apropiado, está adaptada a un
pH de aproximadamente 6,0.
La formulación farmacéutica según la presente
invención puede contener componentes convencionales, por ejemplo un
vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, tal como
soluciones salinas, reguladores de pH, tampones, conservantes y
similares. Este tipo de componentes son conocidos para el experto y
pueden ser seleccionados por él.
La expresión "IFN" según la presente
invención se refiere preferentemente al interferón de tipo I,
concretamente al interferón \alpha y \beta.
La expresión "respuesta inmune mediada por
IFN" se refiere en la presente memoria a los efectos inmunizantes
y/o antivirales inducidos por la acción del interferón, en
particular del interferón \alpha y \beta, como respuesta a, por
ejemplo, una infección vírica, como, por ejemplo, una mayor
expresión de las glicoproteínas del MHC, la activación de mecanismos
antivirales tales como la destrucción de las células infectadas por
virus, o la inhibición de la replicación del virus.
"Reducción de la respuesta inmune mediada por
IFN" significa que se atenúan los efectos inmunizantes y/o
antivirales inducidos por la acción del interferón, en particular
del interferón \alpha y \beta, como respuesta a, por ejemplo,
una infección vírica, como, por ejemplo, una mayor expresión de las
glicoproteínas del MHC, la activación de mecanismos antivirales
tales como la destrucción de las células infectadas por virus, o la
inhibición de la replicación del virus.
"Actividad antagonista de IFN" según la
presente invención significa que se atenúan o anulan los efectos
inmunizantes y/o antivirales inducidos por la acción del interferón,
en particular del interferón \alpha y \beta, como respuesta a,
por ejemplo, una infección vírica, como, por ejemplo, una mayor
expresión de las glicoproteínas del MHC, la activación de mecanismos
antivirales tales como la destrucción de las células infectadas por
virus, o la inhibición de la replicación del virus.
Las expresiones "modificado" o
"alterado" según la presente invención se refieren al tipo
natural, que sirve de patrón de referencia.
"Secuencia de ácido nucleico" tal y como se
usa en la presente memoria significa cualquier secuencia continua de
bases nucleotídicas y puede componerse de ácido ribonucleico y ácido
desoxirribonucleico. La secuencia de ácido nucleico es
preferentemente ADNc.
"Secuencia de ácido nucleico que codifica NS1
y/o NS2 homóloga o heteróloga respecto a un RSV" significa que la
secuencia de ácido nucleico que codifica NS1 y/o NS2 deriva de una
especie de RSV igual o diferente o de un virus diferente del género
Neumovirus, por ejemplo PVM.
Las alteraciones en una secuencia proteica de
NS1 de RSV o de NS2 de RSV incluyen sustituciones, deleciones e
inserciones de aminoácidos aisladas o múltiples. Preferentemente,
las modificaciones no influyen en la actividad biológica de las
proteínas en cuanto a la reducción de la respuesta inmune mediada
por IFN o a la antagonización de IFN. Las variantes de inserción de
aminoácidos según la presente invención incluyen fusiones amino- y/o
carboxiterminales e inserciones intrasecuenciales de aminoácidos
aislados o múltiples. Las variantes de inserción de aminoácidos son
aquellas en las que se introducen uno o varios aminoácidos en un
punto determinado de la proteína; asimismo es posible efectuar una
inserción aleatoria en combinación con un cribado adecuado del
producto resultante. Las variantes de deleción se caracterizan por
la eliminación de uno o varios aminoácidos de la secuencia. Las
variantes de sustitución de aminoácidos son aquellas en las que se
ha eliminado al menos un resto de la secuencia y se ha sustituido en
su lugar por otro resto. Preferentemente, la secuencia de la
proteína NS1 o NS2 alterada presenta una homología con el tipo
natural de al menos 40%, preferentemente de al menos 50%, más
preferentemente de al menos 80% o al menos 90%, en especial del
95%.
Las modificaciones preferidas se encuentran en
las posiciones que no están conservadas entre las especies. En una
modificación de este tipo se sustituye preferentemente un aminoácido
por otro de tamaño y polaridad similares. Respecto al tipo de
sustituciones realizables, se pueden efectuar en primer lugar
análisis de la frecuencia con la que se dan sustituciones de
aminoácidos entre proteínas homólogas de diferentes organismos.
Basándose en estos análisis, las sustituciones conservadoras se
definen como sustituciones dentro de los grupos expuestos a
continuación:
- 1.
- pequeños alifáticos apolares o débilmente polares: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly)
- 2.
- de carga negativa y sus amidas: Asn, Asp, Glu, Gln
- 3.
- de carga positiva: His, Arg, Lys
- 4.
- grandes alifáticos apolares: Met, Leu, Ile, Val (Cys)
- 5.
- grandes aromáticos: Phe, Tyr, Trp.
Tres aminoácidos se han puesto entre paréntesis
debido a su papel especial que desempeñan en la arquitectura de las
proteínas. La Gly es el único aminoácido sin cadena lateral y, por
lo tanto, confiere flexibilidad a la cadena peptídica. La Pro posee
una geometría inusual, lo que limita considerablemente la
flexibilidad de la cadena. La Cys puede participar en puentes
disulfuro.
Asimismo se pueden introducir en la secuencia
proteica de NS1 de RSV o de NS2 de RSV modificaciones, como las
expuestas anteriormente, que tienen como resultado una
intensificación o atenuación de la actividad biológica de las
proteínas para atenuar la respuesta inmune mediada por IFN o
antagonizar el IFN.
Fig. 1. (A) Diagrama de los genomas de BRSV
recombinante. Se muestra la posición de los transcritos (barras
grises) y del marco que codifica la proteína (barras blancas) en
relación con el genoma vírico (ARNv) (barras negras). En la
ampliación se compara la organización del virus de longitud total
con los mutantes de deleción de NS. El ARN líder está marcado con
rayas horizontales; se indican las posiciones relativas de los
nucleótidos correspondientes y de los sitios de restricción usados
para la clonación. (B) Organización de los virus de la rabia (RV)
recombinantes que poseen marcos de lectura abiertos para NS1 de BRSV
o NS2 de BRSV marcados genéticamente entre los genes G y L de
RV.
Fig. 2. Ausencia de transcritos de NS1 y NS2 en
BRSV recombinantes. El ARN total de células BSR infectadas con los
virus indicados se aisló entre 2 y 4 días después de la infección y
se analizó por hibridación Northern con sondas que comprendían los
genes NS1, NS2, NS1 a NS2 y N. Los ARNm de NS1, NS2 y N están
marcados.
Fig. 3. Los mutantes de deleción de NS están más
atenuados en las células MDBK que en las células BSR. Se infectaron
capas casi confluentes de células BSR T7-5 (A) y
MDBK (B) con BRSV (círculos negros), BRSV \DeltaNS1 (cuadrados
blancos), BRSV \DeltaNS2 (triángulos negros) o BRSV \DeltaNS1/2
(círculos blancos) a una MOI de 0,01. Los títulos de virus
infecciosos se determinaron cada dos días como se describe en la
sección de ejemplos. A partir del sexto día, la replicación de todos
los mutantes en las células BSR y la replicación del BRSV natural en
las células MDBK produjo una destrucción celular masiva. Los valores
provienen de dos experimentos independientes que en cada caso se
realizaron por triplicado. Las barras indican la desviación
típica.
Fig. 4. Los sobrenadantes de células MDBK
infectadas por virus o de macrófagos infectados inhiben el
crecimiento de los mutantes de deleción de NS de BRSV en células
Vero cocultivadas. El diseño de los experimentos de cocultivo se
muestra esquemáticamente en (A). Las células MDBK o los macrófagos
bovinos estimulados con LPS se infectaron con BRSV a una MOI de 1,
se sembraron en insertos para el cultivo celular "Anopore
Membrane" de Nunc y se cultivaron con células Vero
"respondedoras" infectadas con BRSV natural, BRSV \DeltaNS1,
BRSV \DeltaNS2 o BRSV \DeltaNS1/2. Al cabo de tres días se
retiraron los insertos y se determinaron los títulos de virus
infecciosos de las células Vero. Los resultados en (B) se indican en
% de inhibición, incluida la desviación típica, y como reducción de
x veces (partiendo de la media) respecto a los controles, en los que
se usaron células MDBK no infectadas o macrófagos no infectados ni
estimulados. Los valores provienen de 6 (MDBK) y 4 (macrófagos)
experimentos de
cocultivo.
cocultivo.
Fig. 5. Un anticuerpo monoclonal (nº 2) contra
el receptor de interferón alfa (IFNA-R2) neutraliza
el efecto del factor inhibidor producido por MDBK o macrófagos. Las
células Vero "respondedoras" infectadas con BRSVr \DeltaNS1,
BRSVr \DeltaNS2, BRSVr \DeltaNS1/2 o BRSVr natural a una MOI de
0,1 se incubaron durante 3 horas con 5 \mug/ml de un anticuerpo
monoclonal contra IFNAR2 (nº 2), MHC I (nº 3),
TNF-R1 (nº 4) o en ausencia de anticuerpos (nº 1).
El cocultivo con células MDBK infectadas (véase el diseño del
experimento en la Fig. 4) se realizó en presencia de 1 \mug/ml
del anticuerpo correspondiente. Los títulos se determinaron en seis
(nº 1 y nº 2) o dos (nº 3 y nº 4) experimentos. Las barras indican
la desviación típica.
Fig. 6. Todos los mutantes de deleción de NS de
BRSV son sensibles al IFN de tipo I. Las células Vero infectadas
con BRSV (círculos negros), BRSV \DeltaNS1 (cuadrados blancos),
BRSV \DeltaNS2 (triángulos) o BRSV \DeltaNS1/2 (círculos
blancos) a una MOI de 0,1 se incubaron con las cantidades indicadas
de IFN alfa A/D (A) o IFN beta (B) recombinante. Los títulos de
virus infecciosos se determinaron 4 días después de la
infección.
Fig. 7. La resistencia de BRSV a IFN es más
pronunciada en células bovinas que en células de primate. Se
infectaron células MDBK (columnas negras) o Vero (columnas blancas)
con BRSVr a una MOI de 1 y se trataron con las cantidades indicadas
de IFN alfa A/D recombinante. Los títulos de virus infecciosos se
determinaron 3 días después de la infección.
Fig. 8. Mayor resistencia de los virus de la
rabia (rabies virus; RV) a IFN en células infectadas con RV que
expresan NS1 y NS2. Se infectaron células Vero (A) o MDBK (B) con RV
SAD VB, SAD VB-NS1 o SAD VB-NS2 o se
coinfectaron con SAD VB-NS1 y SAD
VB-NS2. Inmediatamente después de la infección, los
cultivos se trataron con las cantidades indicadas de IFN alfa A/D.
Los títulos de virus infecciosos se determinaron 2 días después de
la infección. Los resultados representan los valores medios de al
menos cuatro experimentos independientes y las barras de error
indican la desviación típica.
Fig. 9. Se infectaron por duplicado 1 x 10^{5}
células Hep2 con los diferentes aislados de HRSV durante 1 hora
(MOI = 0,1) en 0,5 ml de DMEM sin SFB, después de lo cual se
añadieron en cada caso 0,5 ml + 5% de SFB. A continuación se
sembraron las células infectadas en placas de cultivo de tejido de 4
cm^{2}. Al cabo de 1, 2, 3 y 4 días se tomó un valor actual para
cada aislado de virus, se liberó el virus por
congelación/descongelación y se determinó por titulación el título
de los diferentes aislados clínicos en función de la duración de la
infección. Las ufp/ml se determinaron por recuento tras teñir las
células infectadas con un anticuerpo contra
RSV-F.
Fig. 10. Se infectaron por duplicado 1 x
10^{5} células Hep2 con los diferentes aislados de HRSV durante 1
hora (MOI = 0,1) en 0,5 ml de DMEM sin SFB y a continuación se
sembraron en placas de cultivo de tejido de 4 cm^{2}. Se
suspendieron 0, 150, 500, 10.000 U/ml de IFN A/D de tipo I
recombinante en otros 0,5 ml de DMEM + 5% de SFB y se añadieron al
cabo de 30 min. Después de un tiempo de incubación de 72 horas se
liberó el virus por congelación/descongelación y se determinó por
titulación el título de los diferentes aislados clínicos en función
de la cantidad de IFN aplicada. Las ufp/ml se determinaron por
recuento tras teñir las células infectadas con un anticuerpo contra
RSV-F.
Fig. 11. Organización de los virus de la rabia
(RV) recombinantes que poseen NS1 de HRSV o NS2 de HRSV o marcos de
lectura abiertos de NS1 de BRSV, NS2 de BRSV, NS1 de PVM o NS2 de
PVM marcados genéticamente entre los genes G y L de RV.
Fig. 12. Mayor resistencia de los virus de la
rabia (rabies virus; RV) a IFN en células infectadas con RV que
expresan NS1 y NS2. Se infectaron células MDBK con RV SAD VB, SAD
VB-hNS1 o SAD VB-hNS2 o se
coinfectaron con SAD VB-hNS1 y SAD
VB-hNS2 o SAD VB-bNS1 y SAD
VB-bNS2. Inmediatamente después de la infección, los
cultivos se trataron con las cantidades indicadas de IFN alfa A/D.
Los títulos de virus infecciosos se determinaron 2 días después de
la infección. Los resultados representan los valores medios de
cuatro experimentos independientes y las barras de error indican la
desviación típica.
Fig. 13. Mayor resistencia de los virus de la
rabia (rabies virus; RV) a IFN en células infectadas con RV que
expresan NS1 y NS2. Se infectaron células MDBK con RV SAD VB, SAD
VB-mNS1 o SAD VB-mNS2 o se
coinfectaron con SAD VB-mNS1 y SAD
VB-mNS2 o SAD VB-bNS1 y SAD
VB-bNS2. Inmediatamente después de la infección, los
cultivos se trataron con las cantidades indicadas de IFN alfa A/D.
Los títulos de virus infecciosos se determinaron 2 días después de
la infección. Los resultados representan los valores medios de
cuatro experimentos independientes y las barras de error indican la
desviación típica.
Fig. 14. Organización de los BRSV quiméricos con
genes NS heterólogos.
Fig. 15. Las quimeras PVM/BRSV están ligeramente
atenuadas en células Vero. Se infectaron células Vero con BRSV
natural (círculos negros), BRSV hNS1bNS2 (cuadrados de color gris
oscuro), BRSV hNS1hNS2 (cuadrados de color gris claro), BRSV
mNS1bNS2 (triángulos de color gris oscuro) y BRSV mNS1mNS2
(triángulos de color gris claro) a una MOI de 0,1. Los títulos de
virus infecciosos se determinaron en cuatro días consecutivos. Los
valores provienen de al menos dos experimentos independientes.
Fig. 16. El crecimiento de BRSV hNS1hNS2 está
atenuado en células MDBK. Se infectaron células MDBK con BRSV
natural (círculos negros) y BRSV hNS1hNS2 (cuadrados de color gris
claro) a una MOI de 0,1. Los títulos de virus infecciosos se
determinaron en cuatro días consecutivos. Los valores son valores
medios de al menos dos experimentos independientes.
Fig. 17. BRSV hNS1hNS2 es sensible a IFN de tipo
I en células MDBK. Se infectaron células Vero (A) y MDBK (B) con
BRSV natural (círculos negros) y BRSV hNS1hNS2 (cuadrados de color
gris claro) a una MOI de 0,1 y a continuación se incubaron con las
cantidades indicadas de IFN alfa A/D recombinante. Los títulos de
virus infecciosos se determinaron 3 días después de la infección.
Los valores provienen de al menos dos experimentos
indepen-
dientes.
dientes.
Fig. 18. Comparación de las secuencias de
aminoácidos de las proteínas NS1 (Fig. 18A) y NS2 (Fig. 18B) de
HRSV (hNS1; hNS2), BRSV (bNS1, bNS2) y PVM (mNS1, mNS2); nº de
acceso GenBank: U35030 (cepa Long de HRSV), AF092942 (cepa ATue
51908 de BRSV) y D10331 (PVM).
Los siguientes ejemplos se exponen con el fin de
ilustrar diferentes formas de realización de la invención y no
pretenden limitar de manera alguna la presente invención.
\newpage
El BRSV recombinante (BRSVr) procede de la cepa
A51908 de BRSV (American Type Culture Collection, Colección
Americana de Cultivos Tipo (ATCC)) (33), variante Atue51908 (nº de
acceso GenBank AF092942), y se cultivó en células MDBK como se
describió previamente (5). La clonación del ADNc de longitud
completa de la cepa Atue51908 de BRSV (nº de acceso GenBank
AF092942) y la construcción de los plásmidos que permiten la
transcripción mediada por la ARN-polimerasa de T7
del ARN antigenómico de longitud completa de BRSV o del ARN
antigenómico sin el gen de NS2 (pBRSV \DeltaNS2) se han descrito
previamente (5).
Los constructos que carecen del gen NS1 (pBRSV
\DeltaNS1) o de ambos genes NS1 y NS2 (pBRSV \DeltaNS1/2) se
generaron igualmente a partir de pBRSV. El gen NS1 se eliminó de
pBRSV cortando con NotI y AseI, rellenando con la
polimerasa Klenow y religándolo seguidamente. De este modo se obtuvo
pBRSV \DeltaNS1. Para la producción del doble mutante de deleción
pBRSV \DeltaNS1/2 se amplificó un fragmento de PCR de 0,6 kb que
comprendía parte del gen N. Para ello se usó el cebador NNot(+)
(5'-TAGGCGGCCGCAAAAATGGCTCTTAGCAAGGTG-3')
que contenía un sitio de corte para NotI (subrayado) situado
en dirección 5' del codón de iniciación de N, así como el cebador
inverso Nstu(-)
(5'-TCCTTTGTATCGTTTCATTTC-3') que
correspondía a los nt 1735-1715 de BRSVr situados en
dirección 3' del único sitio de corte para StuI (posición
1671 en BRSVr). Tras la deleción de los genes NS1 y NS2 y de una
parte del gen N de pBRSV por digestión con NotI (posición 72
en BRSVr) y StuI (posición 1671 en BRSVr) se usó el fragmento
de PCR digerido con StuI para sustituir las secuencias
delecionadas (Fig. 1).
En comparación con la secuencia del virus
natural recombinante BRSVr, los mutantes de deleción de NS1, NS2 y
NS1/2 carecen de 496, 509 y 1060 nucleótidos, respectivamente. En
todos los constructos se inicia la transcripción del gen
3'-terminal mediante la señal de iniciación de la
transcripción original líder/NS1 (Fig. 1).
Los virus recombinantes BRSVr, BRSVr
\DeltaNS1, BRSVr \DeltaNS2 y BRSVr \DeltaNS1/2 viables se
pudieron obtener a partir de los constructos de ADNc
correspondientes en células BSR T7/5 que expresan la
ARN-polimerasa de T7 (5) tras la transfección
(protocolo de CaPO_{4}; Mammalian Transfection Kit, Stratagene) de
plásmidos controlados por el promotor de T7 con el ADNc vírico
correspondiente (10 \mug). Los plásmidos que codificaban las
proteínas de BRSV N y P (pTITB-N y
pTITB-P, 4 \mug por plásmido) y L y M2
(pTITB-L y pTITB-M2, 2 \mug por
plásmido) se cotransfectaron junto con el ADNc vírico
correspondiente en aproximadamente 10^{6} células BSR T7/5 que
expresaban de forma estable la ARN-polimerasa del
fago T7 (5). Al cabo de 4 horas se retiró el medio de transfección y
se añadió medio BHK-21 (Gibco) con 5% de SFB. Las
células transfectadas con el ADNc de BRSV se pasaron cada 5 días en
una relación 1:3 hasta observarse un efecto citopatógeno.
En todos los casos, incluido el doble mutante de
deleción de NS1/2, la cotransfección de los plásmidos soporte que
codificaban las proteínas N, P, L y M2 de BRSV dio lugar a la
formación de sincitios. Los virus se recogieron tras pasar las
células transfectadas en una relación 1:3 y aparecer un claro efecto
citopatógeno.
Para la preparación de soluciones madre de virus
se infectaron células MDBK y Vero a una confluencia de 80% con una
multiplicidad de la infección (MOI) de 0,1 en medio mínimo esencial
de Dulbecco (DMEM) sin suero. Después de una adsorción de una hora
de duración, se retiró el inóculo y las células se incubaron a 37ºC
y bajo una atmósfera de CO_{2} al 5% en DMEM suplementado con 2,5%
de SFB hasta que se observó un claro efecto citopatógeno (CPE). Los
virus se liberaron por congelación y descongelación siguiente. Los
títulos de virus se determinaron en células Vero mediante diluciones
seriadas en placas de microvaloración y recuento siguiente de los
focos infectados. Para ello, los focos se tiñeron por tinción
indirecta con un anticuerpo contra la proteína de fusión F (cedido
amablemente por J.A. Melero, Madrid). La preparación de las
soluciones madre de virus de los mutantes de deleción de NS se llevó
a cabo con células Vero que se infectaron con una MOI de 0,01. Una
vez infectadas las células Vero con una MOI de 0,1, transcurrieron 3
días en el caso del BRSVr y 5 días en el caso de los mutantes de
deleción de NS hasta que se observó un claro CPE.
Las características de crecimiento de los virus
se analizaron primero en la línea celular BSR T7/5 derivada de las
células BHK, que se usó para la selección de los virus. Los tres
mutantes estaban atenuados en comparación con el virus parental de
longitud completa, lo que indica que ambas proteínas NS contribuyen
a la replicación del virus. Lo interesante es que no se pudieron
detectar diferencias obvias en la extensión de los virus en las
células infectadas ni en los títulos finales entre los dos mutantes
de deleción simples y el doble mutante de deleción. Todos los
mutantes alcanzaron unos títulos infecciosos de 2 x 10^{5} ufp
tras la infección de células BSR T7/5 con una MOI de 0,1 y un
tiempo de incubación posterior de 6 días. Por el contrario, el virus
parental produjo hasta 1 x 10^{6} ufp (Fig. 3A). Se obtuvieron
resultados similares, con unos títulos ligeramente mayores, en la
infección de células Hep2 o Vero, constituyendo estas últimas la
línea celular preferida para el cultivo de HRSV.
A continuación se usó una línea celular de
origen bovino, MDBK, que fomenta de forma óptima el crecimiento de
BRSV natural (5). De hecho, en MDBK se pudieron alcanzar títulos de
BRSV natural ligeramente mayores, de 2 x 10^{6} ufp, 6 días
después de la infección (Fig. 3B). Sorprendentemente, sin embargo,
el crecimiento de los mutantes de deleción en esta línea celular
estaba fuertemente reducido. Los mutantes de deleción simples
\DeltaNS1 y \DeltaNS2 alcanzaron unos títulos de tan sólo 3 x
10^{3} ufp después de 6 días, es decir, 100 veces menores que en
las células BSR. El doble mutante de deleción \DeltaNS1/2 no fue
capaz de reproducirse de una forma notable en los primeros 6 días de
la infección. Sólo después de pasar las células y de incubarlas de
nuevo durante 8 días se pudieron obtener unos títulos de virus de 2
x 10^{2}. Aunque las células MDBK constituyen la célula huésped
óptima para el BRSV natural, obviamente son poco permisivas para
todos los mutantes de deleción de NS, mientras que, por el
contrario, las células BSR y Vero, que constituyen células huésped
subóptimas para el BRSV natural, fomentan relativamente el
crecimiento de los mutantes de deleción de NS.
Para la hibridación Northern se aisló el ARN de
células infectadas con BRSVr o con los mutantes de deleción de
NS.
Se infectaron células Vero con los virus
recombinantes BRSVr, BRSVr \DeltaNS1, BRSVr \DeltaNS2 y BRSVr
\DeltaBS1/2 a una MOI de 0,1 y se aisló el ARN total tras observar
un fuerte CPE (para BRSVr, después de 3 días, para los mutantes de
deleción de NS, después de 5 días). El ARN se separó por
electroforesis en gel desnaturalizante, se transfirió a una membrana
de nilón (Duralon-UV, Stratagene) y se fijó en la
membrana por radiación UV. Mediante traslado de la mella se
marcaron muestras de ADN específicas de los genes NS1, NS2 y N, de
una longitud aproximada de 500 nt, con
(a-^{32}P)dCTP (3,000 Ci/mmol, Amersham)
(Nick-translation kit, Amersham). Los filtros
hibridados se expusieron usando películas intensificadoras Screens
Kodak BioMax MS o se valoraron mediante la generación de imágenes
con placa de fósforo (Storm, Molecular Dynamics).
Se detectaron patrones de transcripción
similares para todos los virus, difiriendo los virus únicamente en
la presencia o ausencia de los ARN específicos de NS1 y NS2 (Fig.
2). Como ya se observó para los mutantes de deleción de NS2 de BRSV
y HRSV (5;43), todas las células infectadas presentaban cantidades
similares de ARNm de N y ARN genómico, independientemente del
recombinante usado. Por lo tanto, las proteínas NS actúan más bien
sobre la síntesis de ARN en general en lugar de influir sobre
determinados pasos de la replicación o transcripción de ARN.
Para identificar los factores celulares
responsables de la inhibición, obviamente selectiva, del crecimiento
de los mutantes de deleción de NS en las células MDBK, se comprobó
en primer lugar si las moléculas solubles producidas por las células
MDBK son capaces de limitar el crecimiento de los mutantes de
deleción de NS. Para ello se cocultivaron células MDBK y Vero en
dispositivos que permiten separar los dos cultivos celulares
mediante una membrana impermeable a virus pero permeable a factores
solubles (Fig. 4A). En la placa superior se usaron las células MDBK
como células efectoras, mientras que las células Vero sirvieron de
células respondedoras en la placa inferior.
Las células Vero respondedoras se infectaron en
suspensión con mock o con BRSVr \DeltaNS1, BRSVr \DeltaNS2 o
BRSVr \DeltaNS1/2 a una MOI de 0,1 durante una hora en DMEM sin
SFB. Después del lavado se sembraron 5 x 10^{5} células en DMEM
con 2,5% de SFB en placas de 6 pocillos. Las células MDBK efectoras
o los macrófagos bovinos estimulados durante la noche con 10
\mug/ml de LPS (Sigma) se infectaron en suspensión durante 1 h con
BRSVr a una MOI de 1. Después del lavado se sembraron 1 x 10^{6}
células en insertos de 25 mm para el cultivo celular dotados de una
membrana Anopore (Nunc) de 200 nm y se colocaron sobre las placas
con las células Vero "respondedoras". Tras cocultivarlas
durante tres días, se retiraron los insertos de membrana y se
determinaron los títulos de virus de las células Vero como se
describió en el ejemplo 1.
Se realizaron al menos cinco ensayos de
cocultivo independientes. Las células MDBK efectoras no infectadas o
las células BSR usadas como control negativo no mostraron ningún
efecto inhibidor sobre el crecimiento del BRSV natural o de los
mutantes de deleción de NS en las células Vero "respondedoras".
El cocultivo con células MDBK infectadas con BRSV (MOI = 1) dio como
resultado una inhibición débil, pero reproducible, de los mutantes
de deleción de NS, mientras que, por el contrario, el crecimiento de
BRSV natural no se vio afectado (Fig. 4B). El efecto más claro se
pudo observar con el doble mutante de deleción NS1/2. En este caso,
los títulos eran aproximadamente 7 veces menores en presencia de
células MDBK infectadas que con células MDBK no infectadas. Los
títulos de los mutantes de deleción simples BRSVr \DeltaNS1 y
BRSVr \DeltaNS2 disminuyeron en este caso 2 y 4 veces,
respectivamente.
Puesto que los sobrenadantes de las células MDBK
no infectadas no eran capaces de alterar el crecimiento de los
mutantes de deleción en las células Vero respondedoras, se supuso
que los factores eficaces de MDBK eran inducidos por la infección
vírica. No sólo las infecciones con BRSV natural, sino también las
infecciones con una serie de mutantes de deleción de BRSV, entre
otros BRSVr \DeltaNS1/2 y un mutante con una deleción de los genes
SH y G (BRSVr \DeltaSH/G; no publicado), provocaron la secreción
de los factores eficaces. Adicionalmente se pudo demostrar que la
infección con otro virus de ARN, el virus de la rabia (Rabies
Virus), también conducía a la inducción de los factores que
influyen en las células MDBK. Estos resultados apuntan claramente a
una inducción del estado antiviral en las células Vero
"respondedoras" mediada por citocinas, en particular por
interferón.
Para estudiar con más detalle las citocinas
implicadas se usaron macrófagos bovinos como células efectoras. Los
macrófagos bovinos se aislaron de la sangre de una vaca y de un
ternero por centrifugación en gradiente de Ficoll (Lymphoflot,
Biotest, Dreieich) a 1.500 rpm y adsorción de la fracción de células
mononucleares al fondo del frasco de cultivo celular. Tras
incubarlas durante la noche, las células no adherentes se eliminaron
lavando tres veces con RPMI (Gibco) sin SFB. Las células adherentes
(90-95% positivas para CD14) se incubaron a 37ºC y
5% de CO_{2} en RPMI con 10% de SFB. Los macrófagos bovinos
aislados se estimularon durante la noche con LPS, se infectaron con
BRSVr y se cocultivaron con células Vero como se describió
anteriormente.
Las cantidades obtenidas de BRSVr de longitud
completa permanecieron inalteradas después de la incubación con
macrófagos estimulados, infectados con virus o no estimulados. Sin
embargo, para los mutantes de deleción de NS se pudo observar una
reducción de 30 a 50 veces en comparación con el control de
macrófagos no estimulados y no infectados (Fig. 4B). La sola
estimulación de los macrófagos con LPS sin infección siguiente con
virus también era suficiente para provocar una reducción de BRSVr
\DeltaNS1/2 de aproximadamente 10 veces. Puesto que los macrófagos
estimulados son conocidos por producir interferón de tipo I, estos
experimentos apuntaban a una implicación de IFN alfa y/o beta en la
inhibición del crecimiento de los mutantes de deleción de NS de
BRSV.
Mediante el análisis FACS se pudo demostrar que
las células Vero usadas como células "respondedoras" en los
ensayos de cocultivo (véase el ejemplo 4) expresan la subunidad alfa
del receptor de interferón de tipo I (IFNAR2) (44). Para averiguar
si el IFN alfa y/o beta producido por las células MDBK o los
macrófagos media el efecto inhibidor sobre los mutantes de deleción
de NS, se infectaron células Vero respondedoras con BRSVr
\DeltaNS1/2, BRSVr \DeltaNS2 o BRSVr \DeltaNS1/2 y a
continuación se trataron con un anticuerpo monoclonal que bloquea el
IFNAR2 (PBL-Laboratories). El tratamiento de las
células respondedoras se realizó inmediatamente después de la
infección incubando las células durante 1 h con 5 \mug/ml de un
anticuerpo neutralizador de ratón contra la cadena 2 del receptor de
interferón alfa/beta humano (CD118) (PBL Biomedical Laboratories) o
con 5 \mug/ml de un anticuerpo control que reconocía el TNFRI o
las moléculas del MHC de clase I. Tras pasar las células a placas de
seis pocillos, las células se mantuvieron en 1 \mug/ml del
anticuerpo correspondiente y se incubaron durante tres días en
presencia de células MDBK efectoras.
Mientras que en los cultivos celulares con los
anticuerpos control o sin anticuerpo se observó una inhibición de
los mutantes de deleción de NS, el efecto inhibidor estaba anulado
casi por completo en las células tratadas con el anticuerpo INFAR2
(Fig. 5). De este modo, la inducción de un estado antiviral en las
células Vero respondedoras sólo se pudo atribuir a los interferones
de tipo I producidos por las células MDBK o los macrófagos.
Después se usaron interferones de tipo I humanos
recombinantes para analizar directamente el comportamiento del BRSV
natural y de sus mutantes en células estimuladas por IFN. Con el fin
de estudiar el efecto que ejerce el interferón de tipo I sobre la
replicación de BRSV y de los mutantes de deleción de NS, se
infectaron células Vero o MDBK con los diferentes virus a una MOI de
0,1, como se describió anteriormente, y se sembraron en DMEM con
2,5% de SFB en placas de seis pocillos. Inmediatamente después del
sembrado se añadió interferón de tipo I universal (interferón alfa
A/D humano) o interferón beta humano
(PBL-Biomedical-Laboratories) hasta
una concentración de 15.000 U/ml. Los títulos de virus se
determinaron tras un periodo de incubación de tres días mediante
diluciones seriadas y tinción indirecta de los focos celulares
infectados con un anticuerpo contra la proteína de fusión F.
Los tres mutantes de deleción de NS mostraron
una sensibilidad fuerte y muy similar dependiente de la dosis frente
a la respuesta celular inducida por IFN, produciendo 1.500 U una
reducción de más de 10.000 veces de los títulos infecciosos (Fig.
6). Por el contrario, el BRSV natural se mostró relativamente
resistente frente al tratamiento con IFN. La protección, sin
embargo, no fue completa, y 1.500 U de IFN alfa o de IFN beta
provocaron una reducción de aproximadamente 13 veces.
Para estudiar la posibilidad de que la
protección del BRSV natural pueda ser más pronunciada en células
bovinas que en la línea celular Vero de primates, los autores
infectaron, en experimentos paralelos, células MDBK y Vero con una
MOI de 1 y añadieron cantidades iguales de IFN. En las células MDBK
y Vero no tratadas, el BRSV creció hasta producir unos títulos de
1,7 x 10^{7} y 4 x 10^{6} ufp/ml, respectivamente (Fig. 7). Con
el tratamiento con IFN, los títulos disminuyeron más rápidamente en
células Vero que en células MDBK. Tras añadir 10.000 U de IFN, los
títulos infecciosos eran 555 veces menores en las células Vero que
en las células MDBK, aunque estas últimas ya presentaban
considerables daños celulares. Como se demostró con la fuerte
inhibición de los mutantes de deleción de NS, la respuesta
antiviral de la células MDBK es por lo menos tan fuerte como la de
las células Vero. Por lo tanto, la mayor protección del BRSV natural
en las células MDBK indica que el BRSV vence la respuesta antiviral
celular bovina más eficazmente que la de células de primates.
La deleción de cada uno de los genes NS de BRSV
dio lugar a aproximadamente el mismo grado de sensibilidad frente a
las respuestas celulares mediadas por IFN. Esto sugiere que son
necesarias ambas proteínas NS para contrarrestar los mecanismos
antivirales. Para confirmar la función forzosamente cooperativa de
NS1 y NS2 y para averiguar si ambas proteínas NS se pueden usar para
proteger un virus no relacionado, los autores desarrollaron virus de
la rabia recombinantes que expresan NS1 (SAD VB-NS1)
o NS2 (SAD VB-NS2). Los RV recombinantes con el gen
NS1 o NS2 añadido (Fig. 1) se construyeron a partir del ADNc de
longitud completa de RV (SAD L16) que contenía una secuencia
adicional de terminación de la transcripción y de reiniciación en la
secuencia 3' no codificante del gen G (SAD VB) (32). El gen
adicional se insertó entre los genes G y L del virus de la rabia
atenuado SAD L16 (Fig. 1B), un procedimiento que ya se ha realizado
con éxito para otros genes (12;39). Primero se construyeron ADNc que
en el extremo C terminal contenían versiones de las proteínas NS1 o
NS2 de BRSV provistas de una proteína tag. Justo antes del
codón de terminación de NS1 se introdujeron por PCR y usando el
cebador inverso NS1HAr-EcoRI
(5'-GCAATAGAATTCCTAAGCGTAATCTGGTACATCATAAGGATAATTCAGACCAAGAAGAGT-3')
(contiene un
sitio de corte para EcoRI; subrayado) 27 nucleótidos adicionales correspondientes a una región interna de la proteína hemaglutinina (HA) de influenza. En el caso de NS2 se introdujeron 24 nucleótidos con el cebador inverso NS2FLr-EcoRI (5'-GCAATAGAATTCCTATTTATCGTCATCATCTTTATAATCTGGATTTAAATCATACTTATA-3') (EcoRI subrayado) correspondientes al péptido sintético FLAG. Estos fragmentos de PCR se usaron para sustituir las secuencias correspondientes de un plásmido (pBSBRSVNS1NS2) que contenía los nt 1 a nt 957 del ADNc de longitud completa de BRSV (5). El gen NS1-HA se cortó con NotI y EcoRI. Tras una reacción de relleno con la polimerasa Klenow se introdujo el fragmento de 475 nt de longitud en el único sitio SmaI del pSAD VB situado directamente en dirección 3' de la señal adicional de iniciación de la transcripción. De ello resultó pSAD VB-NS1HA. De forma correspondiente se clonó un fragmento NS2-FL de 470 nt de longitud tras cortar con AseI y EcoRI y rellenar con la polimerasa Klenow, lo que dio lugar a pSAD VB-NS2FL.
sitio de corte para EcoRI; subrayado) 27 nucleótidos adicionales correspondientes a una región interna de la proteína hemaglutinina (HA) de influenza. En el caso de NS2 se introdujeron 24 nucleótidos con el cebador inverso NS2FLr-EcoRI (5'-GCAATAGAATTCCTATTTATCGTCATCATCTTTATAATCTGGATTTAAATCATACTTATA-3') (EcoRI subrayado) correspondientes al péptido sintético FLAG. Estos fragmentos de PCR se usaron para sustituir las secuencias correspondientes de un plásmido (pBSBRSVNS1NS2) que contenía los nt 1 a nt 957 del ADNc de longitud completa de BRSV (5). El gen NS1-HA se cortó con NotI y EcoRI. Tras una reacción de relleno con la polimerasa Klenow se introdujo el fragmento de 475 nt de longitud en el único sitio SmaI del pSAD VB situado directamente en dirección 3' de la señal adicional de iniciación de la transcripción. De ello resultó pSAD VB-NS1HA. De forma correspondiente se clonó un fragmento NS2-FL de 470 nt de longitud tras cortar con AseI y EcoRI y rellenar con la polimerasa Klenow, lo que dio lugar a pSAD VB-NS2FL.
El RV recombinante con el gen NS1 o NS2 se pudo
obtener como se describió previamente (19) después de la
transfección (protocolo CaPO_{4}; Mammalian Transfection Kit,
Stratagene) de plásmidos controlados por el promotor de T7 con el
ADNc vírico correspondiente (10 \mug). Los plásmidos que
codificaban las proteínas N (pTIT-N, 5 \mug), P y
L (pTIT-P y pTIT-L, 2,5 \mug por
plásmido) de RV se cotransfectaron con el ADNc vírico
correspondiente en aproximadamente 10^{6} células BSR T7/5 que
expresan de forma estable la ARN-polimerasa del fago
T7 (5). Al cabo de 4 horas se retiró el medio de transfección y se
sustituyó por medio BHK-21 (Gibco) con 10% de SF.
Seis días después de la transfección se recogieron los sobrenadantes
del cultivo celular y se depositaron sobre células BSR nuevas. La
detección de RV infecciosos se llevó a cabo por inmunotinción con un
conjugado con FITC (Centocor) que reconoce la nucleoproteína N de
RV.
Los recombinantes se pudieron obtener a partir
del ADNc en células BSR T7/5 que expresaban las proteínas N, P y L
de RV de los plásmidos transfectados. La expresión de las proteínas
NS no ejercía ningún efecto negativo obvio sobre la replicación, las
características de crecimiento y los títulos infecciosos de los
recombinantes en células BSR (no mostrado).
Para estudiar la actividad de las proteínas de
BRSV expresadas se infectaron células Vero con el RV parental (SAD
VB) o con cada uno de los recombinantes, o se cotransfectaron con
ambos recombinantes SAD VB-NS1 y SAD
VB-NS2. Las infecciones con los recombinantes SAD
VB, SAD VB-NS1 o SAD VB-NS2 de RV se
realizó según se describió previamente (18) en suspensión, usando
una MOI de 5. Para la coinfección con SAD VB-NS1 y
SAD VB-NS2 se usó una MOI de 2,5 por recombinante.
Inmediatamente después de pasar las células se añadió interferón A/D
de tipo I universal recombinante hasta una concentración de 500
U/ml. Los títulos de virus se determinaron dos días después de la
infección mediante diluciones seriadas e inmunotinción con un
conjugado con FITC (Centocor) dirigido contra la proteína N de RV.
Adicionalmente se comprobó la expresión de las proteínas de RV dos
días después de la infección en al menos 4 experimentos
independientes.
El crecimiento del RV SAD VB parental y de los
virus que expresan las proteínas NS1 o NS2 de las infecciones
individuales estaba igual de alterado (Fig. 8A). Al añadir 50 UI de
IFN alfa, los títulos disminuyeron en aproximadamente 1 log y
después siguieron bajando muy lentamente a medida que aumentaban las
cantidades de IFN. Esto indica una débil respuesta de las células
Vero a IFN o una elevada resistencia intrínseca del RV frente a la
respuesta mediada por IFN en las células Vero. En las células
coinfectadas con virus que expresaban NS1 y NS2, sin embargo, se
pudo demostrar una protección de la replicación del virus. Los
títulos de virus permanecieron significativamente más elevados que
en las infecciones individuales y sólo disminuyeron lentamente de
forma dependiente de la dosis.
Para comprobar de nuevo la observación anterior
de que las proteínas NS de BRSV pueden contrarrestar la respuesta
antiviral de células bovinas más eficazmente que la de las células
Vero, se realizaron en paralelo ensayos en células MDBK (Fig. 8B).
El RV SAD VB normal y los recombinantes que expresaban NS se
replicaron en células MDBK no tratadas con títulos ligeramente
menores que en las células Vero. Al contrario que en las células
Vero, el tratamiento con IFN redujo considerablemente los títulos
infecciosos de las infecciones individuales con RV natural y con los
virus que expresaban NS. La disminución inmediata de los títulos
infecciosos en 3 puntos log indicaba una respuesta celular mediada
por IFN altamente eficaz. Sin embargo, a pesar de esta respuesta, la
replicación del virus en las células coinfectadas con SAD
VB-NS1 y SAD VB-NS2 estaba
completamente protegida hasta las cantidades de IFN usadas, de 150
UI. Estos resultados se pudieron confirmar mediante el análisis de
la síntesis de proteínas de RV. En las células no tratadas, todos
los recombinantes produjeron cantidades comparables de proteínas de
RV, mientras que, por el contrario, en las células tratadas con IFN
sólo las coinfecciones eran capaces de producir una síntesis de
proteínas significativa hasta que se añadieron más de
150-200 UI (no mostrado).
Los resultados anteriores demuestran que las dos
proteínas NS de BRSV no sólo son capaces de conferir al BRSV
resistencia frente a la respuesta antiviral mediada por IFN sino
también a otro virus no relacionado. Además, los resultados
confirman que son necesarias y suficientes ambas proteínas para
ejercer la actividad antagonista de IFN.
Para demostrar que también el HRSV posee
mecanismos de defensa frente a interferón, se realizaron
experimentos con aislados clínicos de pacientes hospitalizados. Los
aislados provienen de un estudio multicéntrico coordinado por el
profesor Werchau en la Ruhr-Universität Bochum.
Cuatro aislados provienen de pacientes tratados en hospitales
alemanes con el diagnóstico "bronquiolitis" (nº 61; nº 86; nº
109 y nº 110; grupo 1) y tres aislados de pacientes tratados con el
diagnóstico "bronquitis obstructiva" (nº 104; nº 112 y nº 162;
grupo 2).
Para evitar la adaptación de estos aislados
clínicos a líneas celulares se multiplicaron en células Hep2 en tan
solo dos pasos y se usaron en los experimentos siguientes. Las
curvas de crecimiento de estos aislados se determinaron en células
Hep2. Mientras que los aislados nº 61; nº 86 y nº 109 del grupo 1,
así como el aislado nº 112 del grupo 2 crecieron rápidamente en
células Hep2 y produjeron, al cabo de 3 días, títulos infecciosos
aproximadamente igual de altos, entre 3 x 10^{6} y 4 x 10^{7}
ufp/ml, los aislados nº 110 del grupo 1, así como nº 104 y nº 162
del grupo 2 presentaban un crecimiento claramente atenuado y sólo
lograron unos títulos de 3 x 10^{4} ufp/ml al cabo de 3 días (Fig.
9). Estas diferencias en el crecimiento también se pudieron
observar en células epiteliales respiratorias primarias: Mientras
que nº 61, nº 86, nº 109 y nº 112 indujeron una notable formación de
sincitios, en el caso de los aislados nº 110, nº 104 y nº 162 sólo
se pudieron detectar infecciones aisladas después del mismo tiempo
de infección (no mostrado).
Para determinar la resistencia de cada uno de
los aislados a interferón se infectaron células Hep2 durante 1 hora
con los diferentes aislados (MOI = 0,1) y después se aplicó
interferón A/D de tipo I recombinante a concentraciones de 150 a
5.000 U/ml. Después de un periodo de incubación de 72 horas se
determinaron por titulación hasta el punto final los títulos de
virus de cada uno de los aislados clínicos. Se observó que todos los
aislados clínicos de HRSV estaban protegidos contra el efecto
antiviral del IFN de tipo I recombinante, independientemente de su
tasa de crecimiento. Sólo a concentraciones muy elevadas de IFN, de
5.000 U/ml, se redujo la capacidad de replicación de los diferentes
aislados clínicos de HRSV en tan sólo 10 veces (Fig. 10). Estos
datos demuestran que todos los aislados clínicos de HRSV son capaces
de contrarrestar el efecto antiviral que producen altas
concentraciones de IFN de tipo I recombinante, y lo hacen, además,
en al menos la misma medida que la cepa de laboratorio HRSV Long
(véase la Fig. 7).
Se amplificaron por RT-PCR los
genes NS1 y NS2 de los aislados y se determinó su secuencia. Se
observó que ambos genes están altamente conservados, lo que confirma
los resultados de los ensayos con IFN. Tanto en la proteína NS1 como
en la NS2 sólo existen diferencias muy pequeñas en la secuencia de
aminoácidos respecto a la cepa HRSV Long y entre los aislados. La
proteína NS1 de HRSV Long y las proteínas NS1 de los aislados nº
104, 112, 61 y 110 son idénticas. Los aislados nº 162, 86 y 109
presentan una sustitución de aminoácido respecto a la secuencia de
HRSV Long (nº 86: N(76)S, nº 162:
V(82)M, nº 109 E(91)G). Las proteínas
NS2 de todos los aislados clínicos presentan una secuencia de
aminoácidos idéntica y difieren de HRSV Long en 2 sustituciones,
DN(7,8)GT y T(21)I. Por este motivo se
usaron las proteínas o genes NS de HRSV Long para los ensayos
posteriores.
Para demostrar que las dos proteínas NS de HRSV
poseen un efecto antagonista de IFN de tipo I y que esta función se
puede aplicar a otro virus no relacionado, se desarrollaron virus de
la rabia recombinantes que expresaban NS1 (SAD
VB-hNS1) o NS2 (SAD VB-hNS2) de HRSV
(cepa Long). Los RV recombinantes con el gen NS1 o NS2 añadido (Fig.
11) se construyeron a partir del ADNc de longitud completa de RV
(SAD L16) que contenía una secuencia adicional de terminación de la
transcripción y de reiniciación en la secuencia 3' no codificante
del gen G (SAD VB) (32). El gen adicional se insertó entre los genes
G y L del virus de la rabia atenuado SAD L16, como se describió para
los genes NS de BRSV (Fig. 1B). Los ADNc de los dos genes de HRSV se
obtuvieron por RT-PCR. Para ello se aisló el ARN
total de células Vero infectadas con HRSV (Long). Para el gen NS1 se
usaron los siguientes cebadores: hNS1-NcoI5'
(5'-ATT GAC CAT GGG CAG CAA TTC
ATT-3'; síntesis de la primera hebra y PCR) y
hNS1-EcoRI5' (5'-ATT GAG AAT TCT TAT
GGA TTA AGA TCA AA-3'), para el gen NS2 los
cebadores hNS2-NcoI5' (5'-ATT GAC
CAT GGA CAC AAC CCA CA-3') y
hNS2-EcoRI3' (5'-ATT GAG AAT TCT TAT
GGA TTG AGA TCA TA-3'). Tras la digestión con las
enzimas de restricción NotI y EcoRI, estos fragmentos de PCR se
clonaron en un plásmido TIT cortado del mismo modo
(pTIT-hNS1, pTIT-hNS2). El gen NS1
se amplificó después por PCR a partir de pTIT-hNS1
con los cebadores hNS1-Not5' (TAT GAA GCG GCC GCC
CCC TCT CTT CTT TCT ACA GAA AAT GGG CAG CAA TTC ATT
GAG-3') y hNS1-EcoRI3' y se digirió
con las enzimas de restricción NotI y EcoRI. Tras una reacción de
relleno con la polimerasa Klenow, el fragmento se insertó en el
único sitio SmaI del pSAD VB situado directamente en dirección 3' de
la señal adicional de iniciación de la transcripción. De ello
resultó pSAD VB-hNS1. El gen NS2 se amplificó a
partir del pTIT-hNS2 con los cebadores
hNS2-AseI5' (5'-ATA CTT ATT AAT TGG
GGC AAA TAA ATC AGT TCC CCA ACC AGC CAT GGA CAC AAC CCA CAA
TG-3') y hNS2-Acc65I3'
(5'-ATA AAT GGT ACC AAA AGA TAA CAC TGT GTG AAT TAA
ATT TTG AAA AGT GCT TAT GGA TTG AGA TCA TAC TTG-3'),
se cortó con AseI y Acc65I y, tras el relleno con la polimerasa
Klenow, se clonó de forma correspondiente al gen hNS1. De ello
resultó pSAD VB-hNS2 (Fig. 11).
El RV recombinante con el gen NS1 o NS2 de HRSV
se pudo obtener como se describió previamente (19) después de la
transfección (protocolo CaPO_{4}; Mammalian Transfection Kit,
Stratagene) de plásmidos controlados por el promotor de T7 con el
ADNc vírico correspondiente (10 \mug). Los plásmidos que
codificaban las proteínas N (pTIT-N, 5 \mug), P y
L (pTIT-P y pTIT-L, 2,5 \mug por
plásmido) de RV se cotransfectaron con el ADNc vírico
correspondiente en aproximadamente 10^{6} células BSR T7/5 que
expresan de forma estable la ARN-polimerasa del fago
T7 (5). Al cabo de 4 horas se retiró el medio de transfección y se
sustituyó por medio BHK-21 (Gibco) con 10% de SF.
Seis días después de la transfección se recogieron los sobrenadantes
del cultivo celular y se depositaron sobre células BSR nuevas. La
detección de RV infecciosos se llevó a cabo por inmunotinción con un
conjugado con FITC (Centocor) que reconoce la nucleoproteína N de
RV. La expresión de las proteínas NS de HRSV no ejercía ningún
efecto negativo obvio sobre la replicación, las características de
crecimiento y los títulos infecciosos de los RV recombinantes en
células BSR (no mostrado).
Para estudiar la actividad de las proteínas de
HRSV expresadas, se infectaron células MDBK con el RV parental (SAD
VB) o con cada uno de los recombinantes, o se cotransfectaron con
ambos recombinantes SAD VB-hNS1 y SAD
VB-hNS2. Las infecciones con los recombinantes SAD
VB, SAD VB-hNS1 o SAD VB-hNS2 de RV
se realizó según se describió previamente (18) en suspensión, usando
una MOI de 5. Para la coinfección con SAD VB-hNS1 y
SAD VB-hNS2 se usó una MOI de 2,5 por recombinante.
Inmediatamente después de pasar las células se añadió interferón A/D
de tipo universal recombinante a una concentración de 50 a 500 U/ml.
Los títulos de virus se determinaron dos días después de la
infección mediante diluciones seriadas e inmunotinción con un
conjugado con FITC (Centocor) dirigido contra la proteína N de RV.
El tratamiento con IFN redujo claramente los títulos infecciosos de
las infecciones individuales de RV natural y de los virus que
expresan hNS. La adición de tan sólo 50 UI de IFN alfa provocó una
disminución de 3 puntos log_{10} en el título infeccioso. En las
células coinfectadas con SAD VB-hNS1 y SAD
VB-hNS2, sin embargo, la replicación del virus
estaba claramente protegida hasta unas cantidades de IFN usadas de
150 UI (Fig. 11).
Estos resultados demuestran que también las dos
proteínas NS de HRSV son capaces de antagonizar la respuesta celular
a IFN y de conferir a un virus no relacionado resistencia frente a
la respuesta antiviral mediada por IFN. Los resultados confirman
además que son necesarias y suficientes ambas proteínas NS para
ejercer la actividad antagonista de IFN.
Para demostrar que también las dos proteínas NS
del PVM confieren resistencia al IFN de tipo I y que esta función se
puede aplicar al virus de la rabia, se desarrollaron virus de la
rabia recombinantes que expresaban NS1 (SAD VB-mNS1)
o NS2 (SAD VB-mNS2) de PVM. Los ADNc de los dos
genes de PVM fueron facilitados por Andrew Easton; University of
Warwick, R.U. (nº de acceso GenBank D10331; Fig. 18). Los RV
recombinantes con el gen NS1 o NS2 añadido (Fig. 11) se construyeron
igualmente a partir de SAD VB (32; véanse los ejemplos 6 y 8). El
gen adicional se insertó entre los genes G y L del virus del RV SAD
L16, como se describió anteriormente para los genes NS de BRSV o
HRSV (Fig. 1B). Los genes para ambas proteínas NS se amplificaron
por PCR, insertando en el gen NS1, directamente delante del codón de
terminación de la traducción, 27 nucleótidos adicionales que
codifican una región interna de la proteína hemaglutinina (HA) de
influenza (HA-tag). En el gen NS2 se insertaron, directamente
delante del codón de terminación, 24 nucleótidos que codifican un
péptido sintético FLAG (FLAG-tag). Para el gen NS1 de PVM se
usaron los siguientes cebadores: mNS1-NotIEcoRV5'
(5'-AAT GAT ATC GCG GCC GCC CCC TCT CTT CTT TCT ACA
GAA ATG GGC TGT AAT GTG ATG ATG-3') y
mNS1ha-EcoRI/V3' (5'-AAT GAT ATC
GAA TTC TTA AGC GTA ATC GG TAC ATC ATA AGG ATA ACC ACT GAT CAG CTC
TAC-3'), para el gen NS2 de PVM los cebadores
mNS2-AseIEcoRV5' (5'-AAT GAT ATC ATT
AAT TGG GGC AAA TAA ATC AGT TCC CCA ACC AGC CAT GTC CAC AGC TAT GAA
CAA G-3') y mNS2fl-EcoRI/V3'
(5'-AAT GAT ATC GAA TTC TCA TTT ATC GTC ATC ATC TTT
ATA GTC ATC ATC ATC CTC ATC-3'). Tras la digestión
con las enzimas de restricción EcoRV, estos fragmentos de PCR se
insertaron en el único sitio SmaI del pSAD VB situado directamente
en dirección 3' de la señal adicional de iniciación de la
transcripción. De ello resultaron pSAD VB-mNS1 y
pSAD VB-mNS2 (Fig. 11).
El RV recombinante con el gen NS1 o NS2 de PVM
se pudo obtener en células BSR T7/5 que expresaban las proteínas N,
P y L de RV a partir de plásmidos transfectados, como se describió
en los ejemplos 6 y 8.
La expresión de las proteínas NS no presentaba
ningún efecto negativo obvio sobre la replicación, las
características de crecimiento y los títulos infecciosos de los
recombinantes en las células MSR (no mostrado).
Para estudiar la actividad de las proteínas de
PVM expresadas, se infectaron células MDBK con el RV parental (SAD
VB) o con cada uno de los recombinantes, o se cotransfectaron con
ambos recombinantes SAD VB-mNS1 y SAD
VB-mNS2. Las infecciones con los recombinantes SAD
VB, SAD VB-mNS1 o SAD VB-mNS2 de RV
se realizó según se describió previamente (18) en suspensión, usando
una MOI de 5. Para la coinfección con SAD VB-mNS1 y
SAD VB-mNS2 se usó una MOI de 2,5 por recombinante.
Inmediatamente después de pasar las células se añadió interferón A/D
de tipo I universal recombinante a concentraciones de 50 a 500 U/ml.
Los títulos de virus se determinaron dos días después de la
infección mediante diluciones seriadas e inmunotinción con un
conjugado con FITC (Centocor) dirigido contra la proteína N de RV.
El tratamiento con IFN redujo claramente los títulos infecciosos de
las infecciones individuales de RV natural y de los virus que
expresaban mNS. La adición de tan sólo 50 UI de IFN alfa provocó una
disminución de 3 puntos log en los títulos infecciosos. En las
células coinfectadas con SAD VB-mNS1 y SAD
VB-mNS2, sin embargo, la replicación del virus
estaba notablemente protegida hasta unas cantidades de IFN usadas de
100 UI (Fig. 13).
Estos resultados demuestran que también las dos
proteínas NS de PVM son capaces de antagonizar la respuesta celular
a IFN y de conferir a un virus no relacionado resistencia frente a
la respuesta antiviral mediada por IFN. Puesto que la homología
entre las proteínas NS de PVM y las de HRSV asciende a tan sólo 17%
(para NS1) y 20% (para NS2), no se pudo predecir la función
antagonista de IFN. Al igual que se observó para las proteínas NS de
BRSV y HRSV, también en el caso del PVM son necesarias y suficientes
ambas proteínas NS para ejercer la actividad antagonista de IFN.
Los autores construyeron asimismo BRSV
quiméricos recombinantes en los que los genes NS propios se
sustituyeron por los genes NS de otros neumovirus.
Para la producción de BRSV recombinantes que
contenían el gen NS1 de HRSV o PVM en lugar del gen NS1 de BRSV, se
usó un plásmido que contenía los nt 1 a 957 del ADNc de longitud
completa de BRSV (5) y presentaba adicionalmente un sitio de corte
para EcoRI en el nt 311 del gen NS1 (pbNS1EcoRIbNS2). De este modo
se puede eliminar la región codificante completa del gen NS1por
digestión con las enzimas de restricción NotI y EcoRI. Los genes NS1
de HRSV y de PVM se amplificaron por PCR usando los cebadores
hNS1-NotI5' y hNS1-EcoRI3' para NS1
de HRSV y mNS1-NotIEcoRV5' y
mNS1ha-EcoRI3' para NS1 de PVM y, tras la digestión
con las enzimas de restricción NotI y EcoRI, se insertaron en el
plásmido, generándose phNS1bNS2 y pmNS1bNS2, respectivamente. Ambos
plásmidos se digirieron a continuación con NotI y Acc65I y los
fragmentos generados, con una longitud de 1094 nt para hNS1bNS2 y de
1043 nt para mNS1bNS2, se introdujeron en el ADNc de longitud
completa de BRSV. De ello resultaron BRSVr hNS1bNS2 y BRSVr mNS1bNS2
(Fig. 14).
Para la producción de BRSV con genes NS2
heterólogos (BRSVr bNS1hNS2 o BRSVr bNS1mNS2), el pNS1NS2 (5) se
digirió primero con la enzima de restricción Acc65I y a continuación
parcialmente con la enzima de restricción AseI, de modo que se corta
un fragmento con un tamaño de 446 nt que contiene el gen bNS2. En
este punto se introdujo un fragmento que contenía el gen hNS2 o
mNS2. Estos fragmentos se generaron por PCR usando los cebadores
hNS2-AseI5' y hNS2-Acc65I3' para el
gen NS2 de HRSV o mNS2-AseIEcoRV5' y
mNS2-Acc65I3' (5'-ATA AAT GGT ACC
AAA AGA TAA CAC TGT GTG AAT TAA ATT TTG AAA AGT GCT CAT TTA TCG TCA
TCT TTA TAG-3') para el gen NS2 de PVM. A
continuación, los fragmentos se digirieron con las enzimas de
restricción AseI y Acc6I y se introdujeron en pNS1NS2, de manera que
se generó pbNS1hNS2 o pbNS1mNS2. Estos plásmidos se digirieron
después con las enzimas de restricción NotI y Acc65I, y el fragmento
correspondiente (949 nt para bNS1hNS2 y 1069 nt para bNS1mNS2) se
introdujo en el ADNc de longitud completa de BRSV, de manera que se
generaron BRSVr bNS1hNS2 y BRSVr bNS1mNS2 (Fig. 14).
Para la producción de BRSV recombinantes que
contenían ambos genes NS de HRSV o PVM, los plásmidos phNS1bNS2 o
pmNS1bNS2 se digirieron primero con la enzima de restricción Acc65I
y a continuación parcialmente con la enzima de restricción AseI. A
continuación, los fragmentos antes descritos para el gen NS2 de HRSV
y el gen NS2 de PVM se introdujeron en el plásmido correspondiente,
de manera que se generó phNS1hNS2 o pmNS1mNS2. Estos plásmidos
también se digirieron con las enzimas de restricción NotI y Acc65I,
y los fragmentos generados, con una longitud de 1094 nt para
hNS1hNS2 y 1163 nt para mNS1mNS2, se introdujeron en el ADNc de
longitud completa de BRSV. De ello resultaron BRSVr hNS1hNS2 y
BRSVr mNS1mNS2 (Fig. 14).
Los virus recombinantes viables BRSVr hNS1bNS2,
BRSVr bNS1hNS2 y BRSVr hNS1hNS2 o BRSVr
mNS1bNS2, BRSVr bNS1mNS2 y BRSVr mNS1mNS2 se pudieron obtener a partir de los constructos de ADNc correspondientes en células MSR T7/5 (5) después de la transfección (protocolo CaPO_{4}; Mammalian Transfection Kit, Stratagene) de plásmidos controlados por el promotor de T7 con el ADNc vírico correspondiente (10 \mug). Los plásmidos que codificaban las proteínas N y P (pTIT-N y pTIT-P, 4 \mug por plásmido) y L y M2 (pTIT-L y pTITB-M2, 2 \mug por plásmido) de BRSV se cotransfectaron con el ADNc vírico correspondiente en aproximadamente 10^{6} células BSR T7/5 que expresan de forma estable la ARN-polimerasa del fago T7 (5). Al cabo de 4 horas se retiró el medio de transfección y se añadió medio BHK-21 (Gibco) con 5% de SFB. Las células transfectadas con ADNc de BRSV se pasaron cada 5 días en una relación 1:3 hasta observar un efecto citopatógeno.
mNS1bNS2, BRSVr bNS1mNS2 y BRSVr mNS1mNS2 se pudieron obtener a partir de los constructos de ADNc correspondientes en células MSR T7/5 (5) después de la transfección (protocolo CaPO_{4}; Mammalian Transfection Kit, Stratagene) de plásmidos controlados por el promotor de T7 con el ADNc vírico correspondiente (10 \mug). Los plásmidos que codificaban las proteínas N y P (pTIT-N y pTIT-P, 4 \mug por plásmido) y L y M2 (pTIT-L y pTITB-M2, 2 \mug por plásmido) de BRSV se cotransfectaron con el ADNc vírico correspondiente en aproximadamente 10^{6} células BSR T7/5 que expresan de forma estable la ARN-polimerasa del fago T7 (5). Al cabo de 4 horas se retiró el medio de transfección y se añadió medio BHK-21 (Gibco) con 5% de SFB. Las células transfectadas con ADNc de BRSV se pasaron cada 5 días en una relación 1:3 hasta observar un efecto citopatógeno.
En todos los casos, la cotransfección de los
plásmidos soporte que codificaban las proteínas N, P, L y M2 de BRSV
dio como resultado la formación de sincitios. Los virus se
recogieron tras pasar las células transfectadas en una relación 1:3
y aparecer un claro efecto citopatógeno.
Para la preparación de soluciones madre de virus
se infectaron células Vero a una confluencia de 80% con una
multiplicidad de la infección (MOI) de 0,1 en medio mínimo esencial
de Dulbecco (DMEM) sin suero. Después de una adsorción de una hora
de duración, se retiró el inóculo y las células se incubaron a 37ºC
y bajo una atmósfera de CO_{2} al 5% en DMEM suplementado con 2,5%
de SFB hasta que, después de aproximadamente 4 días, se observó un
claro efecto citopatógeno (CPE). Los virus se liberaron por
congelación y descongelación siguiente. Los títulos de virus se
determinaron en células Vero mediante diluciones seriadas en placas
de microvaloración y recuento siguiente de los focos infectados.
Para ello, los focos se tiñeron por tinción indirecta con un
anticuerpo contra la proteína de fusión F (SEROTEC U.K.).
Las características de crecimiento de los virus
se analizaron en primer lugar en células Vero. Mientras que BRSV
hNS1hNS2 y BRSV hNS1bNS2 se comportaron igual que el BRSV natural,
BRSV mNS1mNS2 y BRSV mNS1bNS2 estaban ligeramente atenuados en
comparación con el virus parental de longitud completa. Esto indica
que la(s) (función(es) de las proteínas NS de BRSV en
la replicación del virus pueden ser asumidas en su totalidad por las
proteínas NS de HRSV. Tanto el BRSV natural parental como las dos
quimeras HSRV/BRSV alcanzaron unos títulos infecciosos de
aproximadamente 5 x 10^{5} ufp después de la infección de células
Vero con una MOI de 0,1 y un periodo de incubación siguiente de 3
días (Fig. 15). Por el contrario, las quimeras PVM/BRSV alcanzaron
tan sólo aproximadamente 4 x 10^{5} ufp después de 3 días, lo que
indica que los genes NS de PVM no pueden desempeñar de forma óptima
la función de los genes de BRSV (y HRSV) en la replicación del
virus.
A continuación se usó una línea celular de
origen bovino, MDBK, que fomenta de forma óptima el crecimiento del
BRSV natural y que, al contrario que las células Vero, dispone de un
sistema de IFN de tipo I funcional (5). En este caso, el crecimiento
de BRSVhNS1hNS2 estaba limitado en comparación con el BRSV natural.
Al cabo de 3 días se alcanzaron tan sólo unos títulos de 4 x
10^{4} ufp, mientras que el BRSV natural, en cambio, crecía hasta
1 x 10^{6} ufp (Fig. 16). En la célula huésped óptima para BRSV,
las células MDBK bovinas, el crecimiento de BRSV hNS1hNS2 está
obviamente atenuado, mientras que, por el contrario, no se observa
ninguna atenuación en las células Vero
IFN-negativas.
Se usó interferón de tipo I humano recombinante
para analizar el comportamiento del BRSV natural y BRSV hNS1hNS2 en
células estimuladas con IFN. Para estudiar el efecto del interferón
de tipo I sobre la replicación de los BRSV recombinantes, se
infectaron células Vero o MDBK con los diferentes virus a una MOI de
0,1, como se describió anteriormente, y se sembraron en DMEM con
2,5% de SFB en placas de seis pocillos. Inmediatamente después del
sembrado se añadió interferón de tipo I universal recombinante
(interferón alfa A/D humano, PBL Biomedical Laboratories) a
concentraciones de 500 a 10.000 U/ml. Los títulos de virus se
determinaron después de un periodo de incubación de tres días
mediante diluciones seriadas y tinción indirecta de los focos
celulares infectados con un anticuerpo contra la proteína de fusión
F.
En las células Vero no se pudo detectar ninguna
diferencia entre BRSV natural y BRSV hNS1hNS2 en cuanto a su
resistencia a IFN. En ambos virus sólo se pudo detectar una ligera
reducción de los títulos infecciosos a partir de 5.000 U (Fig. 17A).
En las células MDBK, en cambio, el BRSV hNS1hNS2 mostró una fuerte
sensibilidad dependiente de la dosis frente a la respuesta celular
inducida por IFN, en el que ya 1.500 U produjeron una reducción de 3
veces en los títulos infecciosos y 10.000 U, una reducción de
aproximadamente 30 veces. Por el contrario, el BRSV natural se
mostró muy resistente al tratamiento con IFN. Ni siquiera 10.000 U
de IFN alfa pudieron influir en la replicación del BRSV natural
(Fig. 17B). Aunque el BRSV hNS1hNS2 quimérico presenta en células
Vero una resistencia a IFN similar a la del BRSV natural, no es
capaz de suprimir por completo la respuesta antiviral inducida por
IFN en células de origen bovino. Esto demuestra que las proteínas NS
del BRSV pueden contrarrestar la respuesta antiviral celular bovina
con más éxito que las proteínas NS del HRSV. Obviamente, el efecto
antagonista de IFN de las proteínas NS es subóptimo en células del
huésped heterólogo. Los virus RS quiméricos con proteínas NS
heterólogas están atenuados in vivo y se pueden usar como
vacunas vivas.
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replicatior of RS virus genomic RNA analogs and define. minimal,
trans-accting requirements for RNA replication. J
Virol 69:2412-2419.
Claims (25)
1. El uso de una proteína NS2 o de una secuencia
de ácido nucleico que codifica NS2 para la preparación de una
formulación farmacéutica para reducir la respuesta inmune mediada
por IFN.
2. El uso según la reivindicación 1, en el que
se usan la proteína NS2 de RSV y adicionalmente una proteína NS1 o
la secuencia de ácido nucleico que codifica NS2 y adicionalmente una
secuencia de ácido nucleico que codifica NS1.
3. El uso según la reivindicación 1 ó 2, en el
que la respuesta inmune es una respuesta antiviral.
4. El uso según las reivindicaciones 1 a 3, en
el que se inhibe la respuesta inmune mediada por IFN.
5. El uso según una de las reivindicaciones 1 a
4, en el que la secuencia de ácido nucleico es ADN o ARN.
6. El uso según las reivindicaciones 2 a 5, en
el que las proteínas NS1 y NS2 de RSV se usan conjuntamente o en el
que la secuencia de ácido nucleico que codifica NS1 se usa junto con
la secuencia de ácido nucleico que codifica NS2.
7. El uso según la reivindicación 6, en el que
la proteína NS1 y la proteína NS2 de RSV derivan de diferentes virus
RSV o en el que la secuencia de ácido nucleico que codifica NS1 de
RSV y la secuencia de ácido nucleico que codifica NS2 de RSV derivan
de diferentes virus RSV.
8. El uso según la reivindicación 5, en el que
la secuencia de ácido nucleico está contenida en un plásmido o en un
vector o en un vector derivado de un virus o en un virus de ADN o
ARN recombinante.
9. El uso según la reivindicación 8, en el que
el vector es un vector de expresión de genes vírico que se usa para
fines de inmunización, para la terapia génica o para la terapia
citorreductora (muerte celular; cáncer).
10. El uso según la reivindicación 8, en el que
el virus o el vector derivado de virus deriva de un virus de ADN,
como, por ejemplo, adenovirus (AdV), virus adenoasociado (AAV),
herpesvirus o poxvirus.
11. El uso según la reivindicación 8, en el que
el virus o el vector derivado de virus deriva de un virus de hebra
positiva, preferentemente de virus de las familias Alfa-, Flavi- y
Picornaviridae.
12. El uso según la reivindicación 8, en el que
el virus o el vector derivado de virus deriva de un virus de ARN de
hebra negativa segmentado o no segmentado.
13. El uso según la reivindicación 8, en el que
el virus de ARN deriva de las familias Paramyxoviridae,
Filoviridae, Bornaviridae o Rhabdoviridae, en
particular del virus de la rabia.
14. El uso según la reivindicación 13, en el que
el virus de ARN deriva del RSV humano o animal.
15. El uso según la reivindicación 14, en el que
la secuencia de ácido nucleico que codifica NS2 es heteróloga
respecto a dicho RSV humano o animal.
16. El uso según las reivindicaciones 1 a 15, en
el que la formulación farmacéutica comprende además una vacuna.
17. El uso según las reivindicaciones 1 a 16, en
el que la proteína NS2 está modificada.
18. El uso según la reivindicación 17, en el que
la modificación se selecciona del grupo de las sustituciones,
deleciones o inserciones de aminoácidos.
19. El uso según las reivindicaciones 17 ó 18,
en el que la modificación da como resultado un aumento de la
actividad antagonista de IFN de la proteína NS2.
20. El uso según las reivindicaciones 17 ó 18,
en el que la modificación da como resultado una reducción de la
actividad antagonista de IFN de la proteína NS2.
21. El uso según las reivindicaciones 1 a 20, en
el que el IFN es interferón de tipo I (IFN alfa o IFN beta).
22. El uso según la reivindicación 1, en el que
la proteína NS2 o la secuencia de ácido nucleico que codifica NS2
procede de BRSV, HRSV o PVM.
23. El uso según la reivindicación 2, en el que
la proteína NS1 y/o NS2 de RSV o la secuencia de ácido nucleico que
codifica NS1 y/o la secuencia de ácido nucleico que codifica NS2
procede de BRSV, HRSV o PVM.
\newpage
24. El uso según la reivindicación 23, en el que
la proteína NS2 de BRSV, HRSV o PVM posee la secuencia según la Fig.
18 o en el que el ácido nucleico que codifica NS2 de BRSV, HRSV o
PVM codifica una secuencia según la Fig. 18.
25. El uso según la reivindicación 27, en el que
la proteína NS1 de RSV y/o la proteína NS2 de BRSV, HRSV o PVM
posee la secuencia según la Fig. 18 o en el que el ácido nucleico
que codifica NS1 y/o el ácido nucleico que codifica NS2 de BRSV,
HRSV o PVM codifica una secuencia según la Fig. 18.
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