JP2003512817A - 免疫調節分子を発現する組み換え呼吸系発疹ウィルスの生成 - Google Patents
免疫調節分子を発現する組み換え呼吸系発疹ウィルスの生成Info
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Abstract
(57)【要約】
1つ以上の免疫調節分子を発現する組み換え呼吸系発疹ウィルス（RSV）を提供する。免疫調節分子（サイトカインが好ましい）をコードするポリヌクレオチド配列の付加または置換によって組み換えウィルスを修飾する。サイトカインの導入によってウィルスの生物学および／またはRSVに対する宿主の免疫応答の面を上昇、低下、または別な方法で向上し、ウィルスのワクチンへの使用を容易にする。本発明で使用するためのサイトカインには、限定される訳ではないがインターロイキン2（IL-2）、インターロイキン4（IL-4）、インターロイキン5（IL-5）、インターロイキン6（IL-6）、またはインターロイキン18（IL-18）、腫瘍壊死因子（TNF）アルファ、インターフェロン・ガンマ（IFN）、および顆粒球-マクロファージ・コロニー刺激因子（GM-CSF）がある。好ましくは、ポリヌクレオチドまたは免疫調節分子を組み換えウィルスゲノムまたはアンチゲノムへ、一般的には遺伝子間または他の非コード部位に、分離遺伝子として付加または置換するが、別な方法で、例えば融合タンパク質として発現してもよい。
Description
【０００１】
発明の背景
ヒト呼吸系発疹ウィルス（HRSV）は、世界的な重度の小児呼吸器疾患の原因と
なる主要なウィルスである（Collinsら, Fields Virology 2:1313-1352, 1996；
参照により本明細書に組み込まれる）。RSVは、1歳未満の乳児における肺炎およ
び細気管支炎の原因として、他の全ての微生物病原体より上位である。実質的に
、全ての小児が2歳までに感染し、より年齢の高い小児および青少年においてか
なりの頻度で再感染が起こる（Chanockら, ヒトのウィルス感染（Viral Infecti
ons of Humans）, 第3版, A.S. Evans編, Plenum Press, N.Y., 1989；参照によ
り本明細書に組み込まれる）。RSVは小児の呼吸器疾患による入院の5人に1人以
上の原因であり、米国内だけで、これによる入院患者数は年間100,000人近く、
また死亡者は4,500人である（Heilman, J. Infect. Dis. 161:402-6, 1990；参
照により本明細書に組み込まれる）。更に、生涯の早い時期の重度の呼吸器感染
は喘息を発症または悪化させうるという証拠がある（Sigursら, Pediatrics 95:
500-505, 1995；参照により本明細書に組み込まれる）。
なる主要なウィルスである（Collinsら, Fields Virology 2:1313-1352, 1996；
参照により本明細書に組み込まれる）。RSVは、1歳未満の乳児における肺炎およ
び細気管支炎の原因として、他の全ての微生物病原体より上位である。実質的に
、全ての小児が2歳までに感染し、より年齢の高い小児および青少年においてか
なりの頻度で再感染が起こる（Chanockら, ヒトのウィルス感染（Viral Infecti
ons of Humans）, 第3版, A.S. Evans編, Plenum Press, N.Y., 1989；参照によ
り本明細書に組み込まれる）。RSVは小児の呼吸器疾患による入院の5人に1人以
上の原因であり、米国内だけで、これによる入院患者数は年間100,000人近く、
また死亡者は4,500人である（Heilman, J. Infect. Dis. 161:402-6, 1990；参
照により本明細書に組み込まれる）。更に、生涯の早い時期の重度の呼吸器感染
は喘息を発症または悪化させうるという証拠がある（Sigursら, Pediatrics 95:
500-505, 1995；参照により本明細書に組み込まれる）。
【０００２】
RSVは通常、小児集団に関係して考えられるが、年配者における重度の疾患の
重要な作因としても認識される（Falseyら, J. Infect. Dis. 172:389-394, 199
5；参照により本明細書に組み込まれる）。またRSVは、一定の免疫無防備状態に
ある個体（例えば骨髄移植のレシピエント）において生命に関わる疾病を引き起
こす（Fouillardら, Bone Marrow Transplant 9:97-100, 1992；参照により本明
細書に組み込まれる）。
重要な作因としても認識される（Falseyら, J. Infect. Dis. 172:389-394, 199
5；参照により本明細書に組み込まれる）。またRSVは、一定の免疫無防備状態に
ある個体（例えば骨髄移植のレシピエント）において生命に関わる疾病を引き起
こす（Fouillardら, Bone Marrow Transplant 9:97-100, 1992；参照により本明
細書に組み込まれる）。
【０００３】
RSVの治療のために、化学療法薬、リバビリンが使用できる。しかしながら、
その有効性および使用は論議されている。またRSVに介入するための認可された
製品もあり、それらはプールしたドナーのIgG（Groothuisら, N. Engl. J. Med.
329:1524-1530, 1993；参照により本明細書に組み込まれる）、またはヒト化RS
V特異的モノクローナル抗体からなる。高リスクの個体に受動的免疫予防薬とし
て投与する。これらの製品は有用である一方、コストの高さおよび他の因子（例
えば長期的な有効性がないこと）から、広く使用するには不適当である。他の欠
点には血液系ウィルスの伝染の可能性、そして調製および保存の困難性および費
用がある。更に、感染性疾患、特にウィルスが原因の疾患の制御の歴史から、ワ
クチンが最も重要であることが示されている。
その有効性および使用は論議されている。またRSVに介入するための認可された
製品もあり、それらはプールしたドナーのIgG（Groothuisら, N. Engl. J. Med.
329:1524-1530, 1993；参照により本明細書に組み込まれる）、またはヒト化RS
V特異的モノクローナル抗体からなる。高リスクの個体に受動的免疫予防薬とし
て投与する。これらの製品は有用である一方、コストの高さおよび他の因子（例
えば長期的な有効性がないこと）から、広く使用するには不適当である。他の欠
点には血液系ウィルスの伝染の可能性、そして調製および保存の困難性および費
用がある。更に、感染性疾患、特にウィルスが原因の疾患の制御の歴史から、ワ
クチンが最も重要であることが示されている。
【０００４】
RSVに対する有効なワクチン剤を開発するための何十年間にもわたる調査にも
関わらず、RSV感染に関係する深刻な罹患率およびかなりの死亡率を防ぐための
安全かつ有効なワクチンは未だ認められていない。好適なワクチンの開発が不成
功に終わっているのは、一部には幼い乳児においてRSV抗原に対する血清および
分泌抗体応答が低下しているという事実に関係している。このように、より年齢
の高い小児および成人は累積免疫によってウィルスのより深刻な影響から保護さ
れていると考えられるのに対し、これらの個体はより重度のRSV感染を受ける。
関わらず、RSV感染に関係する深刻な罹患率およびかなりの死亡率を防ぐための
安全かつ有効なワクチンは未だ認められていない。好適なワクチンの開発が不成
功に終わっているのは、一部には幼い乳児においてRSV抗原に対する血清および
分泌抗体応答が低下しているという事実に関係している。このように、より年齢
の高い小児および成人は累積免疫によってウィルスのより深刻な影響から保護さ
れていると考えられるのに対し、これらの個体はより重度のRSV感染を受ける。
【０００５】
最近、RSV感染における免疫機構が注目されている。分泌抗体は上部気道の保
護において最も重要であると考えられるのに対し、高レベルの血清抗体は下部気
道におけるRSV感染への耐性において重要な役割を果たしていると考えられてい
る。また、RSV特異的細胞障害性T細胞は誘導免疫の別のエフェクター兵器（effe
ctor arm）であるが、これもRSV感染の解明に重要である。しかしながら、この
後者のエフェクターは初期の免疫化によって増加してウィルス攻撃への耐性を増
加させるが、効果は短期間である。FおよびG表面糖タンパク質はRSVの2つの主な
防御抗原であり、RSV中和抗体および攻撃に対する長期の耐性を誘導することが
明らかになっているのは2つのRSVタンパク質のみである（Collinsら, フィール
ズのウィルス学（Fields Virology）, Fieldsら編, 2:1313-1352, Lippincott-R
aven, Philadeiphia, 1996；Connorsら, J. Virol. 65(3):1634-1637, 1991；参
照により本明細書に組み込まれる）。第3のRSV表面タンパク質、SHはRSV中和抗
体またはRSV攻撃への有意な耐性を誘導しなかった。
護において最も重要であると考えられるのに対し、高レベルの血清抗体は下部気
道におけるRSV感染への耐性において重要な役割を果たしていると考えられてい
る。また、RSV特異的細胞障害性T細胞は誘導免疫の別のエフェクター兵器（effe
ctor arm）であるが、これもRSV感染の解明に重要である。しかしながら、この
後者のエフェクターは初期の免疫化によって増加してウィルス攻撃への耐性を増
加させるが、効果は短期間である。FおよびG表面糖タンパク質はRSVの2つの主な
防御抗原であり、RSV中和抗体および攻撃に対する長期の耐性を誘導することが
明らかになっているのは2つのRSVタンパク質のみである（Collinsら, フィール
ズのウィルス学（Fields Virology）, Fieldsら編, 2:1313-1352, Lippincott-R
aven, Philadeiphia, 1996；Connorsら, J. Virol. 65(3):1634-1637, 1991；参
照により本明細書に組み込まれる）。第3のRSV表面タンパク質、SHはRSV中和抗
体またはRSV攻撃への有意な耐性を誘導しなかった。
【０００６】
RSV生ワクチンの開発の障害となっているのは弱毒化と免疫原性の好適なバラ
ンスを得ることの困難性である。他の障害には弱毒化したウィルスの遺伝子的不
安定性、細胞培養物中でのRSVの増殖が相対的に不十分であること、そしてウィ
ルス粒子の不安定性がある。更に、自然の感染によって誘導された免疫では、そ
の後の感染に対して完全に防御されない。おそらく多くの因子がこれに関与して
おり、それらには以下がある：気道の管腔表面上でのウィルス感染の制限におい
て免疫系が相対的に無効であること、局所的粘膜性免疫の寿命が短いこと、迅速
かつ広範なウィルス複製、幼児における免疫学的未熟による低い免疫応答、経胎
盤で誘導された移行血清抗体による免疫抑制、およびGタンパク質の高度のグリ
コシル化のようなウィルスのある種の特徴。また、以下に記載するように、RSV
は2つの抗原性亜群AおよびBとして存在し、1つの亜群に対する免疫は他方に対し
ては有効性が低い。
ンスを得ることの困難性である。他の障害には弱毒化したウィルスの遺伝子的不
安定性、細胞培養物中でのRSVの増殖が相対的に不十分であること、そしてウィ
ルス粒子の不安定性がある。更に、自然の感染によって誘導された免疫では、そ
の後の感染に対して完全に防御されない。おそらく多くの因子がこれに関与して
おり、それらには以下がある：気道の管腔表面上でのウィルス感染の制限におい
て免疫系が相対的に無効であること、局所的粘膜性免疫の寿命が短いこと、迅速
かつ広範なウィルス複製、幼児における免疫学的未熟による低い免疫応答、経胎
盤で誘導された移行血清抗体による免疫抑制、およびGタンパク質の高度のグリ
コシル化のようなウィルスのある種の特徴。また、以下に記載するように、RSV
は2つの抗原性亜群AおよびBとして存在し、1つの亜群に対する免疫は他方に対し
ては有効性が低い。
【０００７】
RSVは生涯の間に複数回、再感染しうるが、通常、再感染は先の感染によって
誘導された免疫による防御のために重篤度が低く、従って免疫予防が可能である
。弱毒化したRSV生ワクチンを鼻腔内投与して軽度の免疫感染を引き起こす。こ
れには非経口経路に比較して簡易かつ安全であるという利点がある。また、RSV
に対する耐性において主要な役割を果たす局所的気道免疫も直接刺激される。ま
た、一般的に非常に年齢の低い小児に見られるRSV特異的移行血清抗体の免疫抑
制効果を除去する。また、RSV抗原の非経口投与は時として免疫病理学的合併症
を伴うが（Murphyら, Vaccine 8(5):497-502, 1990；参照により本明細書に組み
込まれる）、これは生きたウィルスでは全く観察されていない。
誘導された免疫による防御のために重篤度が低く、従って免疫予防が可能である
。弱毒化したRSV生ワクチンを鼻腔内投与して軽度の免疫感染を引き起こす。こ
れには非経口経路に比較して簡易かつ安全であるという利点がある。また、RSV
に対する耐性において主要な役割を果たす局所的気道免疫も直接刺激される。ま
た、一般的に非常に年齢の低い小児に見られるRSV特異的移行血清抗体の免疫抑
制効果を除去する。また、RSV抗原の非経口投与は時として免疫病理学的合併症
を伴うが（Murphyら, Vaccine 8(5):497-502, 1990；参照により本明細書に組み
込まれる）、これは生きたウィルスでは全く観察されていない。
【０００８】
1960年代半ばに、ホルマリンで不活性化したウィルスワクチンがRSVに対して
試験されたが、RSV感染または疾病からの防御には失敗しており、事実、その後
のウィルス感染の際、症状は悪化した（Kimら, Am. J. Epidemiol., 89:422-434
, 1969；Chinら, Am. J. Epidemiol., 89:449-463；Kapikianら, Am. J. Epidem
iol., 89:405-421, 1969；参照により本明細書に組み込まれる）。
試験されたが、RSV感染または疾病からの防御には失敗しており、事実、その後
のウィルス感染の際、症状は悪化した（Kimら, Am. J. Epidemiol., 89:422-434
, 1969；Chinら, Am. J. Epidemiol., 89:449-463；Kapikianら, Am. J. Epidem
iol., 89:405-421, 1969；参照により本明細書に組み込まれる）。
【０００９】
更に最近、RSVのワクチン開発においては弱毒化したRSV変異体が注目されてい
る。Friedewaldら（J. Amer. Med. Assoc. 204:690-694, 1968；参照により本明
細書に組み込まれる）の報告によれば、RSVの低温継代変異体（cpRSV）は十分弱
毒化されており、ワクチンの候補であると考えられる。この変異体は26℃におけ
る増殖効率がその野生型（wt）親ウィルスに比較してわずかに高いが、その複製
は温度感受的でなく、あるいは低温適応的でもなかった。しかしながら、低温継
代変異体は成人のために弱毒化されたものであった。cpRSV変異体は、以前にRSV
に感染した乳幼児（すなわち血清陽性の個体）には十分弱毒化されて免疫原性が
あるものの、血清陰性乳児の上部気道に対しては低レベルの菌力を保持したまま
であった。
る。Friedewaldら（J. Amer. Med. Assoc. 204:690-694, 1968；参照により本明
細書に組み込まれる）の報告によれば、RSVの低温継代変異体（cpRSV）は十分弱
毒化されており、ワクチンの候補であると考えられる。この変異体は26℃におけ
る増殖効率がその野生型（wt）親ウィルスに比較してわずかに高いが、その複製
は温度感受的でなく、あるいは低温適応的でもなかった。しかしながら、低温継
代変異体は成人のために弱毒化されたものであった。cpRSV変異体は、以前にRSV
に感染した乳幼児（すなわち血清陽性の個体）には十分弱毒化されて免疫原性が
あるものの、血清陰性乳児の上部気道に対しては低レベルの菌力を保持したまま
であった。
【００１０】
同様に、Gharpureら（J. Virol. 3:414-421, 1969；参照により本明細書に組
み込まれる）は温度感受性RSV（tsRSV）変異体の単離について報告しているが、
これも有望なワクチン候補であった。ある変異体、ts-1は実験室およびボランテ
ィアにおいて広く評価された。この変異体は成人ボランティアにおいて無症状感
染し、免疫化の45日後、野生型ウィルスでの攻撃感染に対する耐性を施与した。
ここでも、血清陽性の乳児および小児は無症状感染されたが、血清陰性の乳児は
鼻炎および他の軽度の症状の兆候を示した。更に、ts表現型の不安定性が検出さ
れた。温度感受性を部分的または完全に喪失したウィルスがワクチンから回収可
能なウィルスのうちのわずかの割合を示したが、これは軽度の鼻炎以外に疾病の
兆候を伴わなかった。
み込まれる）は温度感受性RSV（tsRSV）変異体の単離について報告しているが、
これも有望なワクチン候補であった。ある変異体、ts-1は実験室およびボランテ
ィアにおいて広く評価された。この変異体は成人ボランティアにおいて無症状感
染し、免疫化の45日後、野生型ウィルスでの攻撃感染に対する耐性を施与した。
ここでも、血清陽性の乳児および小児は無症状感染されたが、血清陰性の乳児は
鼻炎および他の軽度の症状の兆候を示した。更に、ts表現型の不安定性が検出さ
れた。温度感受性を部分的または完全に喪失したウィルスがワクチンから回収可
能なウィルスのうちのわずかの割合を示したが、これは軽度の鼻炎以外に疾病の
兆候を伴わなかった。
【００１１】
これら、および他の研究によって明らかになったところによれば、ある種の低
温継代および温度感受性RSV株は弱毒化が不十分で一部のワクチン受容者（特に
血清陰性乳児）では軽度の疾病症状が生じ、他方、他のものは過剰に弱毒化され
て防御免疫応答を誘引するのに十分な複製が起こらなかった（Wrightら, Infect
. Immun. 37:397-400, 1982；参照により本明細書に組み込まれる）。更に、候
補であるワクチン変異体の遺伝子的不安定性により、その温度感受性表現型が喪
失し、これによって有効なRSVワクチンの開発が更に妨げられている（Hodesら,
Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 145:1158-1164, 1974；McIntochら, Pediatr. Res
. 8:689-696, 1974；およびBelsheら, J. Med. Virol. 3:101-110, 1978；参照
により本明細書に組み込まれる）。
温継代および温度感受性RSV株は弱毒化が不十分で一部のワクチン受容者（特に
血清陰性乳児）では軽度の疾病症状が生じ、他方、他のものは過剰に弱毒化され
て防御免疫応答を誘引するのに十分な複製が起こらなかった（Wrightら, Infect
. Immun. 37:397-400, 1982；参照により本明細書に組み込まれる）。更に、候
補であるワクチン変異体の遺伝子的不安定性により、その温度感受性表現型が喪
失し、これによって有効なRSVワクチンの開発が更に妨げられている（Hodesら,
Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 145:1158-1164, 1974；McIntochら, Pediatr. Res
. 8:689-696, 1974；およびBelsheら, J. Med. Virol. 3:101-110, 1978；参照
により本明細書に組み込まれる）。
【００１２】
弱毒化RSV生ワクチンに代わるものとして、研究者達は精製したRSVエンベロー
プ糖タンパク質を使用してサブユニットワクチンの候補の試験も行ってきた。コ
トンラットの肺において、糖タンパク質によってRSウィルス感染に対する耐性が
誘導されたが（Walshら, J. Infect. Dis. 155:1198-1204, 1987；参照により本
明細書に組み込まれる）、抗体の中和活性は非常に弱く、精製したサブユニット
ワクチンによるげっ歯動物の免疫化によって疾病の増強が引き起こされた（Murp
hyら, Vaccine 8:497-502, 1990；参照により本明細書に組み込まれる）。
プ糖タンパク質を使用してサブユニットワクチンの候補の試験も行ってきた。コ
トンラットの肺において、糖タンパク質によってRSウィルス感染に対する耐性が
誘導されたが（Walshら, J. Infect. Dis. 155:1198-1204, 1987；参照により本
明細書に組み込まれる）、抗体の中和活性は非常に弱く、精製したサブユニット
ワクチンによるげっ歯動物の免疫化によって疾病の増強が引き起こされた（Murp
hyら, Vaccine 8:497-502, 1990；参照により本明細書に組み込まれる）。
【００１３】
FまたはGエンベロープ糖タンパク質を発現する組み換えワクシニアウィルスワ
クチンも研究されてきた。これらの組み換え体は本物のウィルス相対物と区別が
つかないRSV糖タンパク質を発現し、ワクシニアRSVのFおよびG組み換え体に皮内
感染させたげっ歯動物はウィルスの感染力を中和する高レベルの特異的抗体を産
生した。実際、コトンラットのワクシニアF組み換え体による感染によって、下
部気道においてはRSVの複製に対するほとんど完全な耐性が、そして上部気道に
おいては有意な耐性が刺激された（Olmstedら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83
:7462-7466, 1986；参照により本明細書に組み込まれる）。しかしながら、チン
パンジーのワクシニアFおよびG組み換え体による免疫化によっては、上部気道に
おけるRSV攻撃に対する防御がほとんど全く得られず（Collinら, Vaccine 8:164
-168, 1990；参照により本明細書に組み込まれる）、また下部気道では防御が一
定しなかった（Croweら, Vaccine 11:1395-1404, 1993；参照により本明細書に
組み込まれる）。
クチンも研究されてきた。これらの組み換え体は本物のウィルス相対物と区別が
つかないRSV糖タンパク質を発現し、ワクシニアRSVのFおよびG組み換え体に皮内
感染させたげっ歯動物はウィルスの感染力を中和する高レベルの特異的抗体を産
生した。実際、コトンラットのワクシニアF組み換え体による感染によって、下
部気道においてはRSVの複製に対するほとんど完全な耐性が、そして上部気道に
おいては有意な耐性が刺激された（Olmstedら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83
:7462-7466, 1986；参照により本明細書に組み込まれる）。しかしながら、チン
パンジーのワクシニアFおよびG組み換え体による免疫化によっては、上部気道に
おけるRSV攻撃に対する防御がほとんど全く得られず（Collinら, Vaccine 8:164
-168, 1990；参照により本明細書に組み込まれる）、また下部気道では防御が一
定しなかった（Croweら, Vaccine 11:1395-1404, 1993；参照により本明細書に
組み込まれる）。
【００１４】
有効なRSVワクチンを開発するためのこれらの種々の努力にも関わらず、RSVに
対するワクチンは未だ認可されていない。過去の方法では有望性が実現されてい
ないことから、RSVワクチンを開発するための新たな戦略、特に組換えRSVを操作
して遺伝子変化を導入し、生存可能な弱毒化RSV組み換え体において新たな表現
型特性を生じさせることの必要性が強調される。しかしながら、RSVのゲノムRNA
および他の非セグメント化ネガティブ・センス（non-segmented negative-sense
）RNAウィルスの操作は、これまでのところ困難であることが証明されている。
この点について主な妨げとなるものには、これらのウィルスの裸の（naked）ゲ
ノムRNAの非感染性、そしてRSVの場合には、組織培養液中でのウィルス増殖が不
十分なこと、複製サイクルが長いこと、ビリオンの不安定性、複雑なゲノム、お
よび遺伝子産物の構成が困難であること（refractory organization of gene pr
oducts）がある。
対するワクチンは未だ認可されていない。過去の方法では有望性が実現されてい
ないことから、RSVワクチンを開発するための新たな戦略、特に組換えRSVを操作
して遺伝子変化を導入し、生存可能な弱毒化RSV組み換え体において新たな表現
型特性を生じさせることの必要性が強調される。しかしながら、RSVのゲノムRNA
および他の非セグメント化ネガティブ・センス（non-segmented negative-sense
）RNAウィルスの操作は、これまでのところ困難であることが証明されている。
この点について主な妨げとなるものには、これらのウィルスの裸の（naked）ゲ
ノムRNAの非感染性、そしてRSVの場合には、組織培養液中でのウィルス増殖が不
十分なこと、複製サイクルが長いこと、ビリオンの不安定性、複雑なゲノム、お
よび遺伝子産物の構成が困難であること（refractory organization of gene pr
oducts）がある。
【００１５】
組み換えDNA技術により、cDNAからの感染性非セグメント化負鎖（-鎖）RNAウ
ィルスを回収し、ウィルスクローンを遺伝子的に操作して新規のワクチン候補を
構築し、そしてその弱毒化および表現型安定性のレベルを迅速に評価することが
可能となった（総説についてはConzelmann, J. Gen. Virol. 77:381-389, 1996
；Paleseら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:11354-11358, 1996（参照によ
り本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。この点では、必須のウィルスタ
ンパク質の存在下でcDNAにコードされるアンチゲノムRNAから得られる感染性呼
吸系発疹ウィルス（RSV）、パラインフルエンザウィルス（PIV）、狂犬病ウィル
ス（RaV）、水疱性口内炎ウィルス（VSV）、麻疹ウィルス（MeV）、牛疫ウィル
ス、および仙台ウィルス（SeV）に関する組み換えレスキュー（rescue）が報告
されている（例えばGarcinら, EMBO J. 14:6087-6094, 1995；Lawsonら, Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:4477-4481, 1995；Radeckeら, EMBO J. 14:5773-5
784, 1995；Schnellら, EMBO J. 13:4195-4203, 1994；Whelanら, Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 92:8388-8392, 1995；Hoffmanら, J. Virol. 71:4272-4277,
1997；Pectersら, J. Virol. 73:5001-5009, 1999；Katoら, Genes to Cells 1
:569-579, 1996；Robertsら, Virology 247(1), 1-6, 1998；Baronら, J. Virol
. 71:1265-1271, 1997；国際特許WO97/06270号；米国特許仮出願第60/007,083号
（1995年9月27日出願）；米国特許出願第08/720,132号（1996年9月27日出願）；
米国特許仮出願第60/021,773号（1996年7月15日出願）；米国特許仮出願第60/04
6,141号（1997年5月9日出願）；米国特許仮出願第60/047,634号（1997年5月23日
出願）；米国特許第5,993,824号（1999年11月30日発行）（国際特許WO98/02530
号に対応）；米国特許仮出願第60/129,006号（1999年4月13日出願）；Collinsら
, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 92:11563-11567, 1995；Bukreyevら, J. Virol.
70:6634-6641, 1996；Juhaszら, J. Virol. 71(8):5814-5819, 1997；Durbinら,
Virology, 235:323-332, 1997；Heら, Virology 237:249-260, 1997；Baronら,
J. Virol. 71:1265-1271, 1997；Whiteheadら, Virology 247(2):232-239, 199
8a；Whiteheadら, J. Virol. 72(5):4467-4471, 1998b；Jinら, Virology 251:2
06-214, 1998；Whitedeadら, J. Virol. 73(4）3438-3442, 1999；Bukreyevら,
Proc. Nat. Acad. Sci. USA 96:2367-2372, 1999；Bucholzら, J. Virol. 73:25
1-259, 1999；Collinsら, Virology 259:251-255, 1999を参照されたい（それぞ
れは参照によりその全体が全ての目的で本明細書に組み込まれる））。
ィルスを回収し、ウィルスクローンを遺伝子的に操作して新規のワクチン候補を
構築し、そしてその弱毒化および表現型安定性のレベルを迅速に評価することが
可能となった（総説についてはConzelmann, J. Gen. Virol. 77:381-389, 1996
；Paleseら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:11354-11358, 1996（参照によ
り本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。この点では、必須のウィルスタ
ンパク質の存在下でcDNAにコードされるアンチゲノムRNAから得られる感染性呼
吸系発疹ウィルス（RSV）、パラインフルエンザウィルス（PIV）、狂犬病ウィル
ス（RaV）、水疱性口内炎ウィルス（VSV）、麻疹ウィルス（MeV）、牛疫ウィル
ス、および仙台ウィルス（SeV）に関する組み換えレスキュー（rescue）が報告
されている（例えばGarcinら, EMBO J. 14:6087-6094, 1995；Lawsonら, Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:4477-4481, 1995；Radeckeら, EMBO J. 14:5773-5
784, 1995；Schnellら, EMBO J. 13:4195-4203, 1994；Whelanら, Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 92:8388-8392, 1995；Hoffmanら, J. Virol. 71:4272-4277,
1997；Pectersら, J. Virol. 73:5001-5009, 1999；Katoら, Genes to Cells 1
:569-579, 1996；Robertsら, Virology 247(1), 1-6, 1998；Baronら, J. Virol
. 71:1265-1271, 1997；国際特許WO97/06270号；米国特許仮出願第60/007,083号
（1995年9月27日出願）；米国特許出願第08/720,132号（1996年9月27日出願）；
米国特許仮出願第60/021,773号（1996年7月15日出願）；米国特許仮出願第60/04
6,141号（1997年5月9日出願）；米国特許仮出願第60/047,634号（1997年5月23日
出願）；米国特許第5,993,824号（1999年11月30日発行）（国際特許WO98/02530
号に対応）；米国特許仮出願第60/129,006号（1999年4月13日出願）；Collinsら
, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 92:11563-11567, 1995；Bukreyevら, J. Virol.
70:6634-6641, 1996；Juhaszら, J. Virol. 71(8):5814-5819, 1997；Durbinら,
Virology, 235:323-332, 1997；Heら, Virology 237:249-260, 1997；Baronら,
J. Virol. 71:1265-1271, 1997；Whiteheadら, Virology 247(2):232-239, 199
8a；Whiteheadら, J. Virol. 72(5):4467-4471, 1998b；Jinら, Virology 251:2
06-214, 1998；Whitedeadら, J. Virol. 73(4）3438-3442, 1999；Bukreyevら,
Proc. Nat. Acad. Sci. USA 96:2367-2372, 1999；Bucholzら, J. Virol. 73:25
1-259, 1999；Collinsら, Virology 259:251-255, 1999を参照されたい（それぞ
れは参照によりその全体が全ての目的で本明細書に組み込まれる））。
【００１６】
組み換えDNA技術におけるこれらの発展に基づいて、現在はcDNAから感染性RSV
を回収し、RSVクローンに対して種々の遺伝子操作を設計および実施して新規の
ワクチン候補を構築することが可能となった。それ以来、他の所望の表現型特性
の中でも、弱毒化および表現型安定性のレベルは評価することができる。
を回収し、RSVクローンに対して種々の遺伝子操作を設計および実施して新規の
ワクチン候補を構築することが可能となった。それ以来、他の所望の表現型特性
の中でも、弱毒化および表現型安定性のレベルは評価することができる。
【００１７】
組み換えワクチンの開発へ向けた研究のある方法は、ウィルスを操作して1つ
以上のサイトカインまたは他の可能性のある抗ウィルス分子を発現させることで
ある。大部分は、これらの研究は野生型ワクシニアウィルスを必要とし、宿主の
免疫およびウィルスの病原論の基礎的な理解を深めることを目標として行われた
（例えばRamshawら, Immunol. Rev. 127:157-182, 1992（参照により本明細書に
組み込まれる）を参照されたい）。ワクチン開発のための免疫応答を向上するた
めのサイトカインの共発現の、利用可能性が長い間考察されてきた（Ramshawら,
Trends Biotechol 10:424-426, 1992；参照により本明細書に組み込まれる）。
しかしながら、研究目的でのポックスウィルスの使用はこのコンセプトの実用的
な適用を低下させる。なぜなら天然痘はヒト集団において撲滅されており、ポッ
クスウィルスワクチンはもはや積極的に使用されてはいないためである。
以上のサイトカインまたは他の可能性のある抗ウィルス分子を発現させることで
ある。大部分は、これらの研究は野生型ワクシニアウィルスを必要とし、宿主の
免疫およびウィルスの病原論の基礎的な理解を深めることを目標として行われた
（例えばRamshawら, Immunol. Rev. 127:157-182, 1992（参照により本明細書に
組み込まれる）を参照されたい）。ワクチン開発のための免疫応答を向上するた
めのサイトカインの共発現の、利用可能性が長い間考察されてきた（Ramshawら,
Trends Biotechol 10:424-426, 1992；参照により本明細書に組み込まれる）。
しかしながら、研究目的でのポックスウィルスの使用はこのコンセプトの実用的
な適用を低下させる。なぜなら天然痘はヒト集団において撲滅されており、ポッ
クスウィルスワクチンはもはや積極的に使用されてはいないためである。
【００１８】
ワクチン開発のためのサイトカイン共発現の可能な効用を検討するこれらの初
期の研究は、サイトカイン、インターロイキン2（IL-2）を発現するように操作
したワクシニアウィルスを含む。この組み換えウィルスの免疫不全無胸腺ヌード
マウスにおける弱毒化が報告された（Flexnerら, Nature 330:259-262, 1987；R
amshawら, Nature 329:545-546, 1987；参照により本明細書に組み込まれる）。
また、クリアランスおよび回収における種々の免疫エフェクターの役割が調査さ
れてきた（Karupiahら, J. Ex. Med. 172:1495-1503, 1990；Karupiahら, J. Im
munol. 144:290-298, 1990；Karupiahら, J. Immunol. 147:4327-4332, 1991；
参照により本明細書に組み込まれる）。ワクシニアウィルス組み換え体によるIL
-2発現によって、霊長類においてワクシニアウィルスによって形成される皮膚病
変が大きく減少し、これは有意な弱毒化を示している。これらの予備的な知見に
も関わらず、抗体産生はIL-2の存在下または非存在下で同等であることが確認さ
れた（Flexnerら, Vaccine 8:17-21, 1990；参照により本明細書に組み込まれる
）。
期の研究は、サイトカイン、インターロイキン2（IL-2）を発現するように操作
したワクシニアウィルスを含む。この組み換えウィルスの免疫不全無胸腺ヌード
マウスにおける弱毒化が報告された（Flexnerら, Nature 330:259-262, 1987；R
amshawら, Nature 329:545-546, 1987；参照により本明細書に組み込まれる）。
また、クリアランスおよび回収における種々の免疫エフェクターの役割が調査さ
れてきた（Karupiahら, J. Ex. Med. 172:1495-1503, 1990；Karupiahら, J. Im
munol. 144:290-298, 1990；Karupiahら, J. Immunol. 147:4327-4332, 1991；
参照により本明細書に組み込まれる）。ワクシニアウィルス組み換え体によるIL
-2発現によって、霊長類においてワクシニアウィルスによって形成される皮膚病
変が大きく減少し、これは有意な弱毒化を示している。これらの予備的な知見に
も関わらず、抗体産生はIL-2の存在下または非存在下で同等であることが確認さ
れた（Flexnerら, Vaccine 8:17-21, 1990；参照により本明細書に組み込まれる
）。
【００１９】
組み換えワクシニアウィルスによるサイトカイン共発現の別の例はインターロ
イキン4（IL-4）を含むが、これは抗ウィルスサイトカイン発現および細胞障害
性T細胞反応を抑制的に調節し、ウィルス感染を悪化させることが報告されてい
る（Sharmaら, J. Virol. 70:7103-7107, 1996）；参照により本明細書に組み込
まれる）。更に別の研究では、組み換えワクシニアウィルスによる酸化窒素合成
酵素の発現が高度に弱毒化しており、ワクシニアウィルス感染の制御におけるこ
の宿主の防御機構の重要性を示している（Rolphら, J. Virol. 70:7678-7685, 1
996；参照により本明細書に組み込まれる）。組み換えワクシニアウィルスによ
るIL-5またはIL-6の共発現によって、局所的IgAレベルが4倍上昇した（Ramsayら
, Reprod. Fertil. Dev. 6:389-392, 1994；参照により本明細書に組み込まれる
）。組み換えワクシニアウィルスによる腫瘍壊死因子（TNF）アルファの共発現
により、マウスの感染を制御する能力が向上されたが、これはこの分子がウィル
スに対する宿主の防御に関与していることを示唆している（Sambhiら, Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 88:4025-4029, 1991；参照により本明細書に組み込まれる
）。組み換えワクシニアウィルスによるマウスIFNγの発現によって正常または
免疫易感染性マウスにおけるウィルスの複製が大いに低下した（Kohonen-Corish
, Eur. J. Immunol. 20:157-161, 1990；参照により本明細書に組み込まれる）
。
イキン4（IL-4）を含むが、これは抗ウィルスサイトカイン発現および細胞障害
性T細胞反応を抑制的に調節し、ウィルス感染を悪化させることが報告されてい
る（Sharmaら, J. Virol. 70:7103-7107, 1996）；参照により本明細書に組み込
まれる）。更に別の研究では、組み換えワクシニアウィルスによる酸化窒素合成
酵素の発現が高度に弱毒化しており、ワクシニアウィルス感染の制御におけるこ
の宿主の防御機構の重要性を示している（Rolphら, J. Virol. 70:7678-7685, 1
996；参照により本明細書に組み込まれる）。組み換えワクシニアウィルスによ
るIL-5またはIL-6の共発現によって、局所的IgAレベルが4倍上昇した（Ramsayら
, Reprod. Fertil. Dev. 6:389-392, 1994；参照により本明細書に組み込まれる
）。組み換えワクシニアウィルスによる腫瘍壊死因子（TNF）アルファの共発現
により、マウスの感染を制御する能力が向上されたが、これはこの分子がウィル
スに対する宿主の防御に関与していることを示唆している（Sambhiら, Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 88:4025-4029, 1991；参照により本明細書に組み込まれる
）。組み換えワクシニアウィルスによるマウスIFNγの発現によって正常または
免疫易感染性マウスにおけるウィルスの複製が大いに低下した（Kohonen-Corish
, Eur. J. Immunol. 20:157-161, 1990；参照により本明細書に組み込まれる）
。
【００２０】
これらの研究はレトロウィルスにも及んでいる。最近、IL-2を発現するシミア
ン免疫不全ウィルス（SIV）が構築された（Gundlachら, J. Virol. 71:2225-223
2, 1997；参照により本明細書に組み込まれる）。IL-2発現ウィルスに感染した
アカゲザルでは、SIV特異的T細胞増殖反応および抗体価はコントロールウィルス
のものと同様であった。SIV特異的CTLがIL-2発現ウィルスに感染したサル、およ
び4検体中2検体のコントロール動物で検出された。別な研究では、nef遺伝子が
欠損し、IFNλ遺伝子を含有するSIV組み換え体をin vivoで弱毒化したが、サイ
トカイン遺伝子はin vivoでの複製の数週間後には不安定であり、更に弱毒化は
免疫原性の低下を伴った（Giavedoniら, J. Virol. 71:866-872, 1997；参照に
より本明細書に組み込まれる）。
ン免疫不全ウィルス（SIV）が構築された（Gundlachら, J. Virol. 71:2225-223
2, 1997；参照により本明細書に組み込まれる）。IL-2発現ウィルスに感染した
アカゲザルでは、SIV特異的T細胞増殖反応および抗体価はコントロールウィルス
のものと同様であった。SIV特異的CTLがIL-2発現ウィルスに感染したサル、およ
び4検体中2検体のコントロール動物で検出された。別な研究では、nef遺伝子が
欠損し、IFNλ遺伝子を含有するSIV組み換え体をin vivoで弱毒化したが、サイ
トカイン遺伝子はin vivoでの複製の数週間後には不安定であり、更に弱毒化は
免疫原性の低下を伴った（Giavedoniら, J. Virol. 71:866-872, 1997；参照に
より本明細書に組み込まれる）。
【００２１】
約185のORFを有し、宿主防御に干渉する多くのタンパク質をコードする大型の
2本鎖ポックスウィルス、または宿主防御に干渉するヒト免疫不全ウィルスを用
いた研究は、非セグメント化負鎖（-鎖）RNAウィルスには不十分なモデルである
。外来遺伝子を組み換え呼吸系発疹ウィルス（RSV）のゲノムから発現させるこ
とができ、これが安定に保持されることが既に証明されている（Bukreyev J. Vi
rol. 70:6634-6641, 1996；参照により本明細書に組み込まれる）。これは、宿
主のRSVに対する反応を変更、増加、または別の方法で向上させうるサイトカイ
ン、ケモカイン、リガンド、および他の分子のようなタンパク質を共発現させる
ことが可能であることを示している。組換えRSVから1つ以上の免疫調節分子を発
現させるのが好ましく、これはRSVの抗原生成の局所部位における発現が行われ
るからである。更に、共発現によって免疫調節物質の単独での調製および投与の
必要性が除去される。しかしながら、非レトロウィルス、すなわちポジティブセ
ンス、2本鎖、またはネガティブセンスRNAウィルスのゲノムから免疫調節物質を
発現させる戦略はこれまでに研究されていない。
2本鎖ポックスウィルス、または宿主防御に干渉するヒト免疫不全ウィルスを用
いた研究は、非セグメント化負鎖（-鎖）RNAウィルスには不十分なモデルである
。外来遺伝子を組み換え呼吸系発疹ウィルス（RSV）のゲノムから発現させるこ
とができ、これが安定に保持されることが既に証明されている（Bukreyev J. Vi
rol. 70:6634-6641, 1996；参照により本明細書に組み込まれる）。これは、宿
主のRSVに対する反応を変更、増加、または別の方法で向上させうるサイトカイ
ン、ケモカイン、リガンド、および他の分子のようなタンパク質を共発現させる
ことが可能であることを示している。組換えRSVから1つ以上の免疫調節分子を発
現させるのが好ましく、これはRSVの抗原生成の局所部位における発現が行われ
るからである。更に、共発現によって免疫調節物質の単独での調製および投与の
必要性が除去される。しかしながら、非レトロウィルス、すなわちポジティブセ
ンス、2本鎖、またはネガティブセンスRNAウィルスのゲノムから免疫調節物質を
発現させる戦略はこれまでに研究されていない。
【００２２】
現在、RSVに対する宿主の免疫応答の増加および修飾が必要とされている。こ
れはRSVワクチンを生後間もない乳児、有効性が低くいくつかの点で成人のもの
と異なる免疫応答を有する（mount）ことが知られている年齢群に投与するため
である。例えば、RSVに対する中和抗体応答および細胞障害性T細胞応答は幼い乳
児では低下している（KovarikおよびSiegrist, Immunol. Today 19:150-152, 19
98；KovarikおよびSiegrist, Immunol. Cell. Biol. 76:222-236, 1998；Murphy
ら, J. Clin. Microbiol. 24:894-989, 1986；Risdonら, Cell. Immunol. 154:1
4, 1994；参照により本明細書に組み込まれる）。一般に認識されるように、新
生児の免疫系はTh-2型Tヘルパー細胞応答（すなわちIL-4分泌によって定義され
るTヘルパー細胞サブセット）に偏っている（EarlyおよびReen, Eur. J. Immuno
l. 26:2885-2889, 1996；参照により本明細書に組み込まれる）。新生児由来のT
細胞はB細胞に対するヘルパー細胞活性が低く、より少ない量のサイトカイン（I
L-2、インターフェロン・ガンマ（IFNγ）、およびIL-4を含む）を生成する（Sp
lawskiら, J. Clin. Invest. 87, 454, 1991；HassanおよびReen, Scand. J. Im
munol. 39:597, 1994；Wilson, Pediatr. 54:118, 1991；参照により本明細書に
組み込まれる）。また、生後間もない乳児は一般に経胎盤由来RSV特異的IgGを有
し、これは免疫応答に干渉するか、またはそれを変更する（Murphyら, J. Clin.
Microbiol. 24:894-989, 1986および23:1009-1014, 1986；Siegristら, Eur. J
. Immunol. 28:4138-4148, 1998；参照により本明細書に組み込まれる）。最終
的に、ある種のRSV免疫化は免疫病理学的合併症を伴いうる（Murphyら, Vaccine
8:497-502, 1990；Warisら, J. Virol. 71:6935-6939, 1997；参照により本明
細書に組み込まれる）。これは一般に生きた弱毒化ウィルスの感染では観察され
ないが、個々のRSV抗原、および最も明白にはGタンパク質が、生きたウィルスに
よって発現された場合にでも、免疫病理学的応答を誘導させる可能性があるとい
う証拠がある（Johnsonら, J. Virol. 72:2871-2880；参照により本明細書に組
み込まれる）。RSV免疫応答、免疫介在型防御、および免疫病理学的応答に関与
するこれらの多くの因子は、RSVワクチンに対する宿主応答を調節する方法の開
発の必要性を示している。
れはRSVワクチンを生後間もない乳児、有効性が低くいくつかの点で成人のもの
と異なる免疫応答を有する（mount）ことが知られている年齢群に投与するため
である。例えば、RSVに対する中和抗体応答および細胞障害性T細胞応答は幼い乳
児では低下している（KovarikおよびSiegrist, Immunol. Today 19:150-152, 19
98；KovarikおよびSiegrist, Immunol. Cell. Biol. 76:222-236, 1998；Murphy
ら, J. Clin. Microbiol. 24:894-989, 1986；Risdonら, Cell. Immunol. 154:1
4, 1994；参照により本明細書に組み込まれる）。一般に認識されるように、新
生児の免疫系はTh-2型Tヘルパー細胞応答（すなわちIL-4分泌によって定義され
るTヘルパー細胞サブセット）に偏っている（EarlyおよびReen, Eur. J. Immuno
l. 26:2885-2889, 1996；参照により本明細書に組み込まれる）。新生児由来のT
細胞はB細胞に対するヘルパー細胞活性が低く、より少ない量のサイトカイン（I
L-2、インターフェロン・ガンマ（IFNγ）、およびIL-4を含む）を生成する（Sp
lawskiら, J. Clin. Invest. 87, 454, 1991；HassanおよびReen, Scand. J. Im
munol. 39:597, 1994；Wilson, Pediatr. 54:118, 1991；参照により本明細書に
組み込まれる）。また、生後間もない乳児は一般に経胎盤由来RSV特異的IgGを有
し、これは免疫応答に干渉するか、またはそれを変更する（Murphyら, J. Clin.
Microbiol. 24:894-989, 1986および23:1009-1014, 1986；Siegristら, Eur. J
. Immunol. 28:4138-4148, 1998；参照により本明細書に組み込まれる）。最終
的に、ある種のRSV免疫化は免疫病理学的合併症を伴いうる（Murphyら, Vaccine
8:497-502, 1990；Warisら, J. Virol. 71:6935-6939, 1997；参照により本明
細書に組み込まれる）。これは一般に生きた弱毒化ウィルスの感染では観察され
ないが、個々のRSV抗原、および最も明白にはGタンパク質が、生きたウィルスに
よって発現された場合にでも、免疫病理学的応答を誘導させる可能性があるとい
う証拠がある（Johnsonら, J. Virol. 72:2871-2880；参照により本明細書に組
み込まれる）。RSV免疫応答、免疫介在型防御、および免疫病理学的応答に関与
するこれらの多くの因子は、RSVワクチンに対する宿主応答を調節する方法の開
発の必要性を示している。
【００２３】
概して、RSVによる深刻な健康問題を緩和する安全かつ有効なワクチンを操作
する更なる手段および方法を開発する差し迫った必要が当該分野に存在する。こ
の点では、広範なワクチンへの使用に有用な感染性弱毒化RSVワクチンの候補を
構築するために単独で、あるいは他の型の遺伝子操作と組み合わせて使用できる
広範で多様な遺伝子修飾のメニューの開発が必要とされている。弱毒化RSV生ワ
クチンウィルスへの有用な操作は、宿主の免疫応答および免疫介在型防御を調節
する1つ以上の因子の組換えRSVクローンによる共発現を含みうる。驚くべきこと
に、本発明は感染性弱毒化RSVワクチン候補の構築のための更なる手段を提供す
ることによってこの必要を満たす。
する更なる手段および方法を開発する差し迫った必要が当該分野に存在する。こ
の点では、広範なワクチンへの使用に有用な感染性弱毒化RSVワクチンの候補を
構築するために単独で、あるいは他の型の遺伝子操作と組み合わせて使用できる
広範で多様な遺伝子修飾のメニューの開発が必要とされている。弱毒化RSV生ワ
クチンウィルスへの有用な操作は、宿主の免疫応答および免疫介在型防御を調節
する1つ以上の因子の組換えRSVクローンによる共発現を含みうる。驚くべきこと
に、本発明は感染性弱毒化RSVワクチン候補の構築のための更なる手段を提供す
ることによってこの必要を満たす。
【００２４】
発明の概要
本発明は1つ以上の免疫調節分子を発現するように操作した組換えRSV（rRSV）
を提供する。組み換えウィルスは修飾されたゲノムまたはアンチゲノムを有し、
これは感染した細胞でウィルスによって発現される免疫調節分子をコードするポ
リヌクレオチド配列を取り込む。本発明で使用するための好ましい免疫調節分子
はサイトカインである。しかしながら、種々の他の免疫調節分子（ケモカイン、
ケモカインまたはサイトカイン・アンタゴニスト、表面または可溶性レセプター
、接着分子、リガンドなどを含む）も、ウィルスの生物学および／またはRSVに
対する宿主の免疫応答の面を変更するために有用である。更に詳細な態様では、
免疫調節物質はインターロイキン2（IL-2）、インターロイキン4（IL-4）、イン
ターフェロン・ガンマ（IFNγ）、または顆粒球-マクロファージ・コロニー刺激
因子（GM-CSF）分子から選択されるサイトカインである。
を提供する。組み換えウィルスは修飾されたゲノムまたはアンチゲノムを有し、
これは感染した細胞でウィルスによって発現される免疫調節分子をコードするポ
リヌクレオチド配列を取り込む。本発明で使用するための好ましい免疫調節分子
はサイトカインである。しかしながら、種々の他の免疫調節分子（ケモカイン、
ケモカインまたはサイトカイン・アンタゴニスト、表面または可溶性レセプター
、接着分子、リガンドなどを含む）も、ウィルスの生物学および／またはRSVに
対する宿主の免疫応答の面を変更するために有用である。更に詳細な態様では、
免疫調節物質はインターロイキン2（IL-2）、インターロイキン4（IL-4）、イン
ターフェロン・ガンマ（IFNγ）、または顆粒球-マクロファージ・コロニー刺激
因子（GM-CSF）分子から選択されるサイトカインである。
【００２５】
サイトカインおよび他の免疫調節分子を、それらが感染細胞においてウィルス
によって発現され、ウィルス生物学の1つ以上の面を修飾するような方法で、本
発明の組換えRSVに導入することができる。例えば、免疫調節物質の取り込みお
よび発現によってウィルスの感染性、複製、および／または病原性が変更され、
1つ以上の宿主の免疫応答、例えば抗RSV中和抗体応答、Tヘルパー細胞応答、細
胞障害性T細胞（CTL）応答、および／またはナチュラルキラー（NK）細胞応答が
誘引または変化されうる。
によって発現され、ウィルス生物学の1つ以上の面を修飾するような方法で、本
発明の組換えRSVに導入することができる。例えば、免疫調節物質の取り込みお
よび発現によってウィルスの感染性、複製、および／または病原性が変更され、
1つ以上の宿主の免疫応答、例えば抗RSV中和抗体応答、Tヘルパー細胞応答、細
胞障害性T細胞（CTL）応答、および／またはナチュラルキラー（NK）細胞応答が
誘引または変化されうる。
【００２６】
本発明は、天然に見られる、または組み換えDNA技術によって操作した多様な
タンパク質の組換えRSVからの細胞内共発現を提供する。これらのタンパク質は
一般に造血細胞に作用するか、または造血細胞の天然のシグナルおよび相互作用
を妨害できる。これらの組み換えウィルスを構築するために、ウィルスゲノムま
たはアンチゲノムを修飾して、サイトカインまたは他の免疫調節分子をコードす
るポリヌクレオチド配列を取り込ませる。ポリヌクレオチド配列をゲノムまたは
アンチゲノム内で、一般に分離遺伝子としてその独自の遺伝子開始（GS）および
停止（GE）シグナルと共に付加または置換する。一般に、免疫調節物質をコード
するポリヌクレオチド配列を、組換えRSVゲノムまたはアンチゲノムの遺伝子間
または他の非コード領域に、ゲノムまたはアンチゲノム内のオープン・リーディ
ング・フレームを分裂させないような好適な遺伝子座で、付加または置換する。
タンパク質の組換えRSVからの細胞内共発現を提供する。これらのタンパク質は
一般に造血細胞に作用するか、または造血細胞の天然のシグナルおよび相互作用
を妨害できる。これらの組み換えウィルスを構築するために、ウィルスゲノムま
たはアンチゲノムを修飾して、サイトカインまたは他の免疫調節分子をコードす
るポリヌクレオチド配列を取り込ませる。ポリヌクレオチド配列をゲノムまたは
アンチゲノム内で、一般に分離遺伝子としてその独自の遺伝子開始（GS）および
停止（GE）シグナルと共に付加または置換する。一般に、免疫調節物質をコード
するポリヌクレオチド配列を、組換えRSVゲノムまたはアンチゲノムの遺伝子間
または他の非コード領域に、ゲノムまたはアンチゲノム内のオープン・リーディ
ング・フレームを分裂させないような好適な遺伝子座で、付加または置換する。
【００２７】
サイトカインまたは他の免疫調節物質の発現レベルは組み換えゲノムまたはア
ンチゲノム内のサイトカインをコードするポリヌクレオチドの遺伝子順位を変更
することによって調整できる。例えば、サイトカインをコードするポリヌクレオ
チドを、いずれかのRSV遺伝子内のいずれかの遺伝子間の位置または非コード領
域に導入できる。導入位置が上流または“プロモーターに近接している”ほど、
調節物質の発現のレベルは高くなる。
ンチゲノム内のサイトカインをコードするポリヌクレオチドの遺伝子順位を変更
することによって調整できる。例えば、サイトカインをコードするポリヌクレオ
チドを、いずれかのRSV遺伝子内のいずれかの遺伝子間の位置または非コード領
域に導入できる。導入位置が上流または“プロモーターに近接している”ほど、
調節物質の発現のレベルは高くなる。
【００２８】
免疫調節因子をコードする遺伝子またはゲノムセグメントをRSVに挿入する別
の方法は、cDNAを挿入するのではなく、cDNAを上記のRSV遺伝子開始および遺伝
子停止シグナルの制御下に置くことであり、これによって遺伝子はゲノムからで
はなくアンチゲノムから発現する。理想的には、外来遺伝子をアンチゲノムの3
’末端のプロモーターのすぐ下流に配し、このプロモーターに近接した位置によ
って高レベルの発現を確実にする。
の方法は、cDNAを挿入するのではなく、cDNAを上記のRSV遺伝子開始および遺伝
子停止シグナルの制御下に置くことであり、これによって遺伝子はゲノムからで
はなくアンチゲノムから発現する。理想的には、外来遺伝子をアンチゲノムの3
’末端のプロモーターのすぐ下流に配し、このプロモーターに近接した位置によ
って高レベルの発現を確実にする。
【００２９】
RSVからサイトカインまたは他の免疫調節物質を発現させる更に別の方法は、
遺伝子のORFを哺乳動物の内部リボソーム侵入部位の制御下に置き、このORFをRS
V遺伝子のいずれか1つ以上の下流非コード領域に挿入することである。
遺伝子のORFを哺乳動物の内部リボソーム侵入部位の制御下に置き、このORFをRS
V遺伝子のいずれか1つ以上の下流非コード領域に挿入することである。
【００３０】
更に別の発現方法は、キメラまたは融合タンパク質の構築による。例えば、感
染した細胞およびビリオンの表面で発現させることが所望されるタンパク質のエ
クトドメインをSH ORFまたは他の非必須遺伝子の下流末端に結合させ、リーディ
ングフレームが妨害されないようにしてキメラタンパク質を得ることができる。
この形態では、SH部分はシグナルおよび膜アンカーを提供し、C-末端結合ドメイ
ンは細胞外に表示される。
染した細胞およびビリオンの表面で発現させることが所望されるタンパク質のエ
クトドメインをSH ORFまたは他の非必須遺伝子の下流末端に結合させ、リーディ
ングフレームが妨害されないようにしてキメラタンパク質を得ることができる。
この形態では、SH部分はシグナルおよび膜アンカーを提供し、C-末端結合ドメイ
ンは細胞外に表示される。
【００３１】
組換えRSVによる1つ以上の免疫調節分子の発現は、RSV抗原生成の局所部位に
おいて免疫調節分子を発現させるので好ましい。このように、本発明の技術に従
う免疫調節分子の共発現は免疫調節物質の単独での調製および投与の必要性を除
去する。更に、本発明の組換えRSVはワクチン開発に有用な他の好ましい特性を
有する。例えば、組み換えゲノムまたはアンチゲノムをサイトカインを発現する
ように変化させると、（i）細胞培養物中でのウィルス増殖の変化；（ii）感染
した宿主の上部気道および／または下部気道におけるウィルスの弱毒化の変化；
（iii）ウィルスのプラークサイズの変化；および／または（iv）免疫原性の変
化から選択される1つ以上の新規の特性、あるいは、それに代わって、またはそ
れに付随して、野生型もしくは親（すなわちサイトカインを発現しない）RSVに
よって誘引される宿主の応答に比較して変化した宿主の応答（例えば高い抗RSV
中和抗体応答、Tヘルパー細胞応答、細胞障害性T細胞（CTL）応答、および／ま
たはナチュラルキラー（NK）細胞応答）を誘引する能力を示すワクチン候補が得
られる。
おいて免疫調節分子を発現させるので好ましい。このように、本発明の技術に従
う免疫調節分子の共発現は免疫調節物質の単独での調製および投与の必要性を除
去する。更に、本発明の組換えRSVはワクチン開発に有用な他の好ましい特性を
有する。例えば、組み換えゲノムまたはアンチゲノムをサイトカインを発現する
ように変化させると、（i）細胞培養物中でのウィルス増殖の変化；（ii）感染
した宿主の上部気道および／または下部気道におけるウィルスの弱毒化の変化；
（iii）ウィルスのプラークサイズの変化；および／または（iv）免疫原性の変
化から選択される1つ以上の新規の特性、あるいは、それに代わって、またはそ
れに付随して、野生型もしくは親（すなわちサイトカインを発現しない）RSVに
よって誘引される宿主の応答に比較して変化した宿主の応答（例えば高い抗RSV
中和抗体応答、Tヘルパー細胞応答、細胞障害性T細胞（CTL）応答、および／ま
たはナチュラルキラー（NK）細胞応答）を誘引する能力を示すワクチン候補が得
られる。
【００３２】
本発明の好ましい観点では、組換えRSVは導入されたサイトカインまたは他の
免疫調節物質を高レベルで（例えば感染した組織培養細胞の培養液中で測定して
2.5マイクログラム／mlまでのレベルで）発現する。組み換えウィルスをin vitr
oおよびin vivoで弱毒化し、それでもなおワクチン接種した被験体において野生
型RSVに対する高レベルの防御効果を示し、弱毒化された表現型を示す一方、低
下していない、またはより一般的には上昇したレベルのウィルス抗原を発現する
ように操作する。このように、低下していない、または上昇したmRNA転写および
抗原発現によって免疫原性の可能性が保存されている一方、それに付随するRNA
複製およびウィルス増殖の低下によって弱毒化される。この新規の一連の表現型
特性はワクチン開発のために非常に望ましい。免疫調節物質を発現するように操
作した組換えRSVで観察される他の有用な表現型の変化には、相当する野生型ま
たは変異体の親RSV株と比較してのプラークサイズの変化および細胞変性性の変
化がある。
免疫調節物質を高レベルで（例えば感染した組織培養細胞の培養液中で測定して
2.5マイクログラム／mlまでのレベルで）発現する。組み換えウィルスをin vitr
oおよびin vivoで弱毒化し、それでもなおワクチン接種した被験体において野生
型RSVに対する高レベルの防御効果を示し、弱毒化された表現型を示す一方、低
下していない、またはより一般的には上昇したレベルのウィルス抗原を発現する
ように操作する。このように、低下していない、または上昇したmRNA転写および
抗原発現によって免疫原性の可能性が保存されている一方、それに付随するRNA
複製およびウィルス増殖の低下によって弱毒化される。この新規の一連の表現型
特性はワクチン開発のために非常に望ましい。免疫調節物質を発現するように操
作した組換えRSVで観察される他の有用な表現型の変化には、相当する野生型ま
たは変異体の親RSV株と比較してのプラークサイズの変化および細胞変性性の変
化がある。
【００３３】
サイトカインまたは他の免疫調節物質を発現するように修飾した組換えRSVに
おいて提供される表現型の影響と組み合わせて、多くの場合、組み換えウィルス
の弱毒化を増加または低下させる更なる変異を導入することによって弱毒化の表
現型を調整することが所望される。このように、少なくとも1つ、好ましくは2つ
以上の異なる弱毒化変異（例えば既知の生物学的に誘導した変異型RSV株の一群
から同定される変異）を導入することによって、候補となるワクチン株を更に弱
毒化することができる。好ましいヒト変異型RSV株は低温継代（cp）変異体およ
び／または温度感受性（ts）変異体であり、これは例えば以下に示す変異体であ
る：“cpts RSV 248（ATCC VR 2450）、cpts RSV 248／404（ATCC VR 2454）、c
pts RSV 248／955（ATCC VR 2453）、cpts RSV 530（ATCC VR 2452）、cpts RSV
530／1009（ATCC VR 2451）、cpts RSV 530／1030（ATCC VR 2455）、RSV B-1
cp52／2B5（ATCC VR 2542）、およびRSV B-1 cp-23（ATCC VR 2579）”（それぞ
れはAmerican Type Culture Collection（ATCC；10801 University Boulevard,
Manassas, Virginia 20110-2209, U.S.A.）とのブタペスト条約の条件下にあり
、上に示した承認番号が与えられている）。この生物学的に誘導した変異体の代
表的な一群から弱毒化変異の幅広い“メニュー”が提供され、そのそれぞれを群
内の他の変異と組み合わせてワクチンへの使用のための本発明の組換えRSVにお
ける弱毒化または他の好ましい表現型のレベルを測定することができる。このよ
うにサイトカインまたは免疫調節物質を発現するように修飾したRSVクローンに
受容（adopt）または移入できる更なる変異は、種々の温度感受性（ts）、低温
継代（cp）、小型プラーク（sp）、低温受容型（ca）、または宿主範囲限定型（
hr）変異型RSV株において同定されうる。更なる弱毒化変異を非RSV負鎖（-鎖）R
NAウィルスにおいて同定し、米国特許仮出願第60/129,006号（1999年4月13日出
願）に記載されるように、レシピエントのRSVゲノムまたはアンチゲノム中の相
当する相同な部位に変異をマッピングし、（同一の、または保存的な変異のいず
れかによって）レシピエント中に存在する配列を変異体遺伝子型に変異させるこ
とによって本発明のRSV変異に導入してもよい。更なる有用な変異は、ここに組
み込まれる文献に記載されるように、組み換えミニゲノム系および感染性ウィル
スを使用する変異分析によって経験的に確認することができる。
おいて提供される表現型の影響と組み合わせて、多くの場合、組み換えウィルス
の弱毒化を増加または低下させる更なる変異を導入することによって弱毒化の表
現型を調整することが所望される。このように、少なくとも1つ、好ましくは2つ
以上の異なる弱毒化変異（例えば既知の生物学的に誘導した変異型RSV株の一群
から同定される変異）を導入することによって、候補となるワクチン株を更に弱
毒化することができる。好ましいヒト変異型RSV株は低温継代（cp）変異体およ
び／または温度感受性（ts）変異体であり、これは例えば以下に示す変異体であ
る：“cpts RSV 248（ATCC VR 2450）、cpts RSV 248／404（ATCC VR 2454）、c
pts RSV 248／955（ATCC VR 2453）、cpts RSV 530（ATCC VR 2452）、cpts RSV
530／1009（ATCC VR 2451）、cpts RSV 530／1030（ATCC VR 2455）、RSV B-1
cp52／2B5（ATCC VR 2542）、およびRSV B-1 cp-23（ATCC VR 2579）”（それぞ
れはAmerican Type Culture Collection（ATCC；10801 University Boulevard,
Manassas, Virginia 20110-2209, U.S.A.）とのブタペスト条約の条件下にあり
、上に示した承認番号が与えられている）。この生物学的に誘導した変異体の代
表的な一群から弱毒化変異の幅広い“メニュー”が提供され、そのそれぞれを群
内の他の変異と組み合わせてワクチンへの使用のための本発明の組換えRSVにお
ける弱毒化または他の好ましい表現型のレベルを測定することができる。このよ
うにサイトカインまたは免疫調節物質を発現するように修飾したRSVクローンに
受容（adopt）または移入できる更なる変異は、種々の温度感受性（ts）、低温
継代（cp）、小型プラーク（sp）、低温受容型（ca）、または宿主範囲限定型（
hr）変異型RSV株において同定されうる。更なる弱毒化変異を非RSV負鎖（-鎖）R
NAウィルスにおいて同定し、米国特許仮出願第60/129,006号（1999年4月13日出
願）に記載されるように、レシピエントのRSVゲノムまたはアンチゲノム中の相
当する相同な部位に変異をマッピングし、（同一の、または保存的な変異のいず
れかによって）レシピエント中に存在する配列を変異体遺伝子型に変異させるこ
とによって本発明のRSV変異に導入してもよい。更なる有用な変異は、ここに組
み込まれる文献に記載されるように、組み換えミニゲノム系および感染性ウィル
スを使用する変異分析によって経験的に確認することができる。
【００３４】
ワクチンへの使用のために選択される本発明の組換えRSVは多くの場合、少な
くとも2つ、場合によっては3つ以上の弱毒化変異を含有し、広範な臨床における
使用のために満足のいくレベルの弱毒化が得られる。ある態様では、少なくとも
1つの弱毒化変異が（ドナーまたはレシピエント遺伝子のいずれかにおける）RSV
ポリメラーゼ遺伝子Lに存在し、温度感受性（ts）表現型を含みうる、または含
みえない弱毒化表現型を示すポリメラーゼタンパク質におけるアミノ酸変化を示
す1つ以上のヌクレオチド置換を含む。サイトカインまたは免疫調節物質を発現
するように修飾した組換えRSVはL以外の更なるRSV遺伝子、例えばM2遺伝子にts
変異を組み込んでもよい。しかしながら、この点で好ましいワクチン候補は1つ
以上のヌクレオチド置換を大型ポリメラーゼ遺伝子Lに取り込み、アミノ酸Asn43
、Cys319、Phe521、Gln831、Met1169、Tyr1321、および／またはhis1690におけ
るアミノ酸変化（例えばAsn43がIleに、Phe521がLeuに、Gln831がLeuに、Met116
9がValに、およびTyr1321がAsnに変化）を生じる。もちろん、これらの位置に他
の代わりとなるアミノ酸変化、特に同定された変異体の残基に関して保存的な変
化を施与し、同定された変異置換と同様の効果を得ることができる。本発明の組
換えRSVに取り込むための更なる好ましい変異には、RSVのN遺伝子中のVal267、R
SVのF遺伝子中のGlu218および／またはThr523におけるアミノ酸置換、および遺
伝子M2の遺伝子開始配列におけるヌクレオチド置換を示す弱毒化変異が含まれる
。ここに示す弱毒化変異の1つ以上（これらの変異の全てまで）を組み合わせて
免疫調節分子を発現するように修飾したRSVに取り込み、ワクチン・レシピエン
トの選択した集団または広範な集団において使用するための好適な弱毒化組み換
えウィルスを生成してもよい。
くとも2つ、場合によっては3つ以上の弱毒化変異を含有し、広範な臨床における
使用のために満足のいくレベルの弱毒化が得られる。ある態様では、少なくとも
1つの弱毒化変異が（ドナーまたはレシピエント遺伝子のいずれかにおける）RSV
ポリメラーゼ遺伝子Lに存在し、温度感受性（ts）表現型を含みうる、または含
みえない弱毒化表現型を示すポリメラーゼタンパク質におけるアミノ酸変化を示
す1つ以上のヌクレオチド置換を含む。サイトカインまたは免疫調節物質を発現
するように修飾した組換えRSVはL以外の更なるRSV遺伝子、例えばM2遺伝子にts
変異を組み込んでもよい。しかしながら、この点で好ましいワクチン候補は1つ
以上のヌクレオチド置換を大型ポリメラーゼ遺伝子Lに取り込み、アミノ酸Asn43
、Cys319、Phe521、Gln831、Met1169、Tyr1321、および／またはhis1690におけ
るアミノ酸変化（例えばAsn43がIleに、Phe521がLeuに、Gln831がLeuに、Met116
9がValに、およびTyr1321がAsnに変化）を生じる。もちろん、これらの位置に他
の代わりとなるアミノ酸変化、特に同定された変異体の残基に関して保存的な変
化を施与し、同定された変異置換と同様の効果を得ることができる。本発明の組
換えRSVに取り込むための更なる好ましい変異には、RSVのN遺伝子中のVal267、R
SVのF遺伝子中のGlu218および／またはThr523におけるアミノ酸置換、および遺
伝子M2の遺伝子開始配列におけるヌクレオチド置換を示す弱毒化変異が含まれる
。ここに示す弱毒化変異の1つ以上（これらの変異の全てまで）を組み合わせて
免疫調節分子を発現するように修飾したRSVに取り込み、ワクチン・レシピエン
トの選択した集団または広範な集団において使用するための好適な弱毒化組み換
えウィルスを生成してもよい。
【００３５】
弱毒化変異は組換えRSVゲノムもしくはアンチゲノムのコード部分、またはcis
-調節配列のような非コード領域において選択してもよい。代表的な非コード変
異には遺伝子開始配列における単一または複数の塩基変化（例えばヌクレオチド
7605（代表的な組み換え配列のヌクレオチド7606）におけるM2遺伝子開始配列に
おける単一または複数の塩基置換）が含まれる。
-調節配列のような非コード領域において選択してもよい。代表的な非コード変
異には遺伝子開始配列における単一または複数の塩基変化（例えばヌクレオチド
7605（代表的な組み換え配列のヌクレオチド7606）におけるM2遺伝子開始配列に
おける単一または複数の塩基置換）が含まれる。
【００３６】
上記の変異に加え、本発明に従って修飾した感染性RSVは、RSVもしくはRSV様
ウィルス（例えばヒト、ウシ、ヒツジ、マウス（マウスの肺炎ウィルス）、また
は鳥類の肺炎ウィルス）由来の、または別のエンベロープ・ウィルス（例えばパ
ラインフルエンザウィルス（PIV））由来のヘテロロガスのコードまたは非コー
ドヌクレオチド配列を取り込むことができる。代表的なヘテロロガス配列は、あ
るヒトRSV株由来のRSV配列を、異なるヒトRSV株由来の配列と組み合わせて、サ
イトカインまたは他の免疫調節物質を発現するように修飾したRSVに含有する。
例えば、本発明の組換えRSVは2つ以上の野生型または変異型RSV株（例えばcpts
RSV 248、cpts 248／404、cpts 248／955、cpts RSV 530、cpts 530／1009、ま
たはcpts 530／1030から選択される変異株）由来の配列を取り込んでもよい。あ
るいはまた、これらの新規の変異体は2つ以上の野生型または変異型ヒトRSV亜群
由来の配列（例えばヒトRSV亜群Aおよび亜群B配列の組み合わせ）を取り込んで
もよい（国際出願PCT/US/08802号および関連する米国特許出願60/021,773号、60
/046,141号、60/047,634号、08/892,403号、09/291,894号参照（参照により本明
細書に組み込まれる））。更に別の観点では、1つ以上のヒトRSVコードまたは非
コードポリヌクレオチドをヘテロロガスのRSVまたは非RSVウィルス由来の相対す
る配列で単独で、あるいは1つ以上の選択した弱毒化変異（例えばcpおよび／ま
たはts変異）と組み合わせて置換し、新規の弱毒化ワクチン株を生成する。
ウィルス（例えばヒト、ウシ、ヒツジ、マウス（マウスの肺炎ウィルス）、また
は鳥類の肺炎ウィルス）由来の、または別のエンベロープ・ウィルス（例えばパ
ラインフルエンザウィルス（PIV））由来のヘテロロガスのコードまたは非コー
ドヌクレオチド配列を取り込むことができる。代表的なヘテロロガス配列は、あ
るヒトRSV株由来のRSV配列を、異なるヒトRSV株由来の配列と組み合わせて、サ
イトカインまたは他の免疫調節物質を発現するように修飾したRSVに含有する。
例えば、本発明の組換えRSVは2つ以上の野生型または変異型RSV株（例えばcpts
RSV 248、cpts 248／404、cpts 248／955、cpts RSV 530、cpts 530／1009、ま
たはcpts 530／1030から選択される変異株）由来の配列を取り込んでもよい。あ
るいはまた、これらの新規の変異体は2つ以上の野生型または変異型ヒトRSV亜群
由来の配列（例えばヒトRSV亜群Aおよび亜群B配列の組み合わせ）を取り込んで
もよい（国際出願PCT/US/08802号および関連する米国特許出願60/021,773号、60
/046,141号、60/047,634号、08/892,403号、09/291,894号参照（参照により本明
細書に組み込まれる））。更に別の観点では、1つ以上のヒトRSVコードまたは非
コードポリヌクレオチドをヘテロロガスのRSVまたは非RSVウィルス由来の相対す
る配列で単独で、あるいは1つ以上の選択した弱毒化変異（例えばcpおよび／ま
たはts変異）と組み合わせて置換し、新規の弱毒化ワクチン株を生成する。
【００３７】
本発明の関連する観点では、開示したサイトカインをコードする配列の導入に
関連する修飾をキメラ・ヒト-ウシRSV内に取り込むが、それらはヒトおよびウシ
RSV株の両方由来のヌクレオチド配列を導入し、感染性キメラウィルスまたはサ
ブウィルス（subviral）粒子を生成するように組み換え操作したものである。本
発明の代表的なヒト-ウシ・キメラRSVはヒトおよびウシの両方のポリヌクレオチ
ド配列、並びに主要なヌクレオカプシド（N）タンパク質、ヌクレオカプシド・
リンタンパク質（P）、大型ポリメラーゼタンパク質（L）、およびRNAポリメラ
ーゼ伸長因子を含むキメラRSVゲノムまたはアンチゲノムを取り込む。更なるRSV
タンパク質を種々の組み合わせで含有させ、ある範囲の感染性サブウィルス粒子
（完全なウィルス粒子、または過剰なタンパク質、抗原決定基、または他の更な
る成分を含有するウィルス粒子まで）を提供してもよい。
関連する修飾をキメラ・ヒト-ウシRSV内に取り込むが、それらはヒトおよびウシ
RSV株の両方由来のヌクレオチド配列を導入し、感染性キメラウィルスまたはサ
ブウィルス（subviral）粒子を生成するように組み換え操作したものである。本
発明の代表的なヒト-ウシ・キメラRSVはヒトおよびウシの両方のポリヌクレオチ
ド配列、並びに主要なヌクレオカプシド（N）タンパク質、ヌクレオカプシド・
リンタンパク質（P）、大型ポリメラーゼタンパク質（L）、およびRNAポリメラ
ーゼ伸長因子を含むキメラRSVゲノムまたはアンチゲノムを取り込む。更なるRSV
タンパク質を種々の組み合わせで含有させ、ある範囲の感染性サブウィルス粒子
（完全なウィルス粒子、または過剰なタンパク質、抗原決定基、または他の更な
る成分を含有するウィルス粒子まで）を提供してもよい。
【００３８】
本発明に使用するためのキメラ・ヒト-ウシRSVは一般に米国特許出願（弱毒化
ヒト-ウシ・キメラ呼吸系発疹ウィルスワクチンの生成（Production of Attenua
ted, Human-Bovine chimeric Respiratory Syncytial Virus Vaccines）, Bucho
lzら, 2000年6月23日出願, Attorney Docket第015280-398100US号）、およびそ
の優先的（its priority）米国仮出願第60/143,132号に記載されている（それぞ
れは参照により本明細書に組み込まれる）。これらのキメラ組換えRSVは、ヒト
またはウシRSV株または亜群ウィルス由来の、またはそれを模範とした部分的ま
たは完全な“バックグラウンド”RSVゲノムまたはアンチゲノムを、異なるRSV株
または亜群ウィルスの1つ以上のヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメントと
組み合わせて含有し、ヒト-ウシ・キメラRSVゲノムまたはアンチゲノムを形成す
る。本発明のある観点では、キメラRSVは部分的または完全なウシRSVバックグラ
ウンドゲノムまたはアンチゲノムを、1つ以上のヒトRSV由来のヘテロロガス遺伝
子またはゲノムセグメントと組み合わせて取り込む。本発明の別の観点では、免
疫調節分子を発現するように修飾したRSVは部分的または完全なヒトRSVバックグ
ラウンドゲノムまたはアンチゲノムを、1つ以上のウシRSV由来のヘテロロガス遺
伝子またはゲノムセグメントと組み合わせて取り込む。
ヒト-ウシ・キメラ呼吸系発疹ウィルスワクチンの生成（Production of Attenua
ted, Human-Bovine chimeric Respiratory Syncytial Virus Vaccines）, Bucho
lzら, 2000年6月23日出願, Attorney Docket第015280-398100US号）、およびそ
の優先的（its priority）米国仮出願第60/143,132号に記載されている（それぞ
れは参照により本明細書に組み込まれる）。これらのキメラ組換えRSVは、ヒト
またはウシRSV株または亜群ウィルス由来の、またはそれを模範とした部分的ま
たは完全な“バックグラウンド”RSVゲノムまたはアンチゲノムを、異なるRSV株
または亜群ウィルスの1つ以上のヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメントと
組み合わせて含有し、ヒト-ウシ・キメラRSVゲノムまたはアンチゲノムを形成す
る。本発明のある観点では、キメラRSVは部分的または完全なウシRSVバックグラ
ウンドゲノムまたはアンチゲノムを、1つ以上のヒトRSV由来のヘテロロガス遺伝
子またはゲノムセグメントと組み合わせて取り込む。本発明の別の観点では、免
疫調節分子を発現するように修飾したRSVは部分的または完全なヒトRSVバックグ
ラウンドゲノムまたはアンチゲノムを、1つ以上のウシRSV由来のヘテロロガス遺
伝子またはゲノムセグメントと組み合わせて取り込む。
【００３９】
本発明の更なる観点は、遺伝子の位置の変化または遺伝子順位の変更によって
免疫調節分子を発現するように修飾したRSVを生成または修飾することを伴う。
この点で、多くの前述の組み込まれた文献は、RSVおよび他のウィルスにおける
天然に存在する順位の修飾に焦点を当てている。例えば、RSVにおいてNS1、NS2
、SH、およびG遺伝子を個別に削除し、NS1およびNS2遺伝子を共に削除すること
によってウィルスプロモーターに比較して下流にあるそれぞれの遺伝子の位置を
移動した。例えば、NS1およびNS2を共に削除するとNは3位から1位に移動し、Pは
4位から2位に移動する、などである。あるいはまた、遺伝子順位内の他のいずれ
かの遺伝子を削除すると、更に下流に位置する遺伝子の（プロモーターに対する
）位置のみが作用を受ける。例えば、SHが野生型ウィルスの6位を占め、その削
除によって5位のM（または他の上流の遺伝子のいずれか）は作用を受けないが、
Gはプロモーターに対して7位から6位に移動される。留意すべきことに、遺伝子
削除は生物学的に誘導した変異型ウィルスに（まれに）存在しうる。例えば、細
胞培養物中で広く継代した亜群B RSVはSHおよびG遺伝子を同時に欠失する（Karr
onら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:13961-13966, 1997；参照により本明細
書に組み込まれる）。“上流”および“下流”とはそれぞれプロモーターに近接
する方向、およびプロモーターから分離する方向をいうことに留意されたい（プ
ロモーターはネガティブ・センスゲノムRNAの3’先頭末端にある）。
免疫調節分子を発現するように修飾したRSVを生成または修飾することを伴う。
この点で、多くの前述の組み込まれた文献は、RSVおよび他のウィルスにおける
天然に存在する順位の修飾に焦点を当てている。例えば、RSVにおいてNS1、NS2
、SH、およびG遺伝子を個別に削除し、NS1およびNS2遺伝子を共に削除すること
によってウィルスプロモーターに比較して下流にあるそれぞれの遺伝子の位置を
移動した。例えば、NS1およびNS2を共に削除するとNは3位から1位に移動し、Pは
4位から2位に移動する、などである。あるいはまた、遺伝子順位内の他のいずれ
かの遺伝子を削除すると、更に下流に位置する遺伝子の（プロモーターに対する
）位置のみが作用を受ける。例えば、SHが野生型ウィルスの6位を占め、その削
除によって5位のM（または他の上流の遺伝子のいずれか）は作用を受けないが、
Gはプロモーターに対して7位から6位に移動される。留意すべきことに、遺伝子
削除は生物学的に誘導した変異型ウィルスに（まれに）存在しうる。例えば、細
胞培養物中で広く継代した亜群B RSVはSHおよびG遺伝子を同時に欠失する（Karr
onら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:13961-13966, 1997；参照により本明細
書に組み込まれる）。“上流”および“下流”とはそれぞれプロモーターに近接
する方向、およびプロモーターから分離する方向をいうことに留意されたい（プ
ロモーターはネガティブ・センスゲノムRNAの3’先頭末端にある）。
【００４０】
遺伝子順位を移動する修飾（すなわち、組み換えウィルスゲノムにおいて1つ
以上の遺伝子をよりプロモーターに近接する位置またはよりプロモーターから離
れた位置に移動させる位置的な修飾）をして本発明のサイトカイン発現RSVを生
成または修飾することによって、生物学的特性が変更されたウィルスが得られる
。例えば、NS1、NS2、SH、G、NS1およびNS2の両方、またはSHおよびGの両方が欠
失したRSVはin vitro、In vivo、またはその両方において弱毒化されることが明
らかとなっている。この表現型は主に特定のウィルスタンパク質の発現の喪失に
よるものと考えられる。しかしながら、変更された遺伝子マップも観察される表
現型に寄与していると考えられる。この作用はSHが欠失したウィルスでよく例証
されるが、このウィルスはいくつかの細胞型で野生型より効率よく増殖し、これ
はおそらく、遺伝子欠損によって転写、複製、またはその両方の効率が向上され
、遺伝子順位および（もしかすると）ゲノムサイズが変化するためである。他の
ウィルス（例えばNS1および／またはNS2が欠失したRSV）では、遺伝子順位に変
化によって生じたと考えられる増殖の変化は、RSVタンパク質の発現の喪失によ
る更に優性な表現型によって不明瞭であると考えられた。
以上の遺伝子をよりプロモーターに近接する位置またはよりプロモーターから離
れた位置に移動させる位置的な修飾）をして本発明のサイトカイン発現RSVを生
成または修飾することによって、生物学的特性が変更されたウィルスが得られる
。例えば、NS1、NS2、SH、G、NS1およびNS2の両方、またはSHおよびGの両方が欠
失したRSVはin vitro、In vivo、またはその両方において弱毒化されることが明
らかとなっている。この表現型は主に特定のウィルスタンパク質の発現の喪失に
よるものと考えられる。しかしながら、変更された遺伝子マップも観察される表
現型に寄与していると考えられる。この作用はSHが欠失したウィルスでよく例証
されるが、このウィルスはいくつかの細胞型で野生型より効率よく増殖し、これ
はおそらく、遺伝子欠損によって転写、複製、またはその両方の効率が向上され
、遺伝子順位および（もしかすると）ゲノムサイズが変化するためである。他の
ウィルス（例えばNS1および／またはNS2が欠失したRSV）では、遺伝子順位に変
化によって生じたと考えられる増殖の変化は、RSVタンパク質の発現の喪失によ
る更に優性な表現型によって不明瞭であると考えられた。
【００４１】
弱毒化生ワクチンとしての組み換えウィルスの特性を向上しようとする努力の
中で、更なる変化を導入してサイトカイン発現RSVの遺伝子順位を変化させる（
米国仮出願（プロモーターに近接する遺伝子から防御抗原を発現する呼吸系発疹
ウィルスワクチン（Respiratory Syncytial Virus Vaccines Expressing Protec
tive Antigens from Promotor-Proximal Genes）, Kremplら, 2000年6月23日出
願, Attorney Docket第015280-424000US号）（参照により本明細書に組み込まれ
る）参照）。特にGおよびF遺伝子は単独またはタンデムで、その野生型遺伝子順
位に比較してよりプロモーターに近接した位置に移動してもよい。これら2つの
タンパク質は、通常、RSV遺伝子順位（NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L）の7位（G）
および8位（F）を占有する。好結果の回収の可能性を高めるために、代表的な移
動操作を、SH遺伝子を欠失したRSVの型において実施した（Whiteheadら, J. Vir
ol. 73:3438-42(1999)；参照により本明細書に組み込まれる）。このウィルスは
in vitroにおいて大型のプラークを生成するので、これによって回収が容易にな
る（Bukreyevら, J. Virol. 71:8973-82(1997)；参照により本明細書に組み込ま
れる）。その後GおよびFを個々に1位に移動させるか、または共にそれぞれ1位お
よび2位に移動させた。驚くべきことに、GまたはFを1位に移動させた、またはG
およびFをそれぞれ1位および2位に移動させた組換えRSVは容易に回収された。
中で、更なる変化を導入してサイトカイン発現RSVの遺伝子順位を変化させる（
米国仮出願（プロモーターに近接する遺伝子から防御抗原を発現する呼吸系発疹
ウィルスワクチン（Respiratory Syncytial Virus Vaccines Expressing Protec
tive Antigens from Promotor-Proximal Genes）, Kremplら, 2000年6月23日出
願, Attorney Docket第015280-424000US号）（参照により本明細書に組み込まれ
る）参照）。特にGおよびF遺伝子は単独またはタンデムで、その野生型遺伝子順
位に比較してよりプロモーターに近接した位置に移動してもよい。これら2つの
タンパク質は、通常、RSV遺伝子順位（NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L）の7位（G）
および8位（F）を占有する。好結果の回収の可能性を高めるために、代表的な移
動操作を、SH遺伝子を欠失したRSVの型において実施した（Whiteheadら, J. Vir
ol. 73:3438-42(1999)；参照により本明細書に組み込まれる）。このウィルスは
in vitroにおいて大型のプラークを生成するので、これによって回収が容易にな
る（Bukreyevら, J. Virol. 71:8973-82(1997)；参照により本明細書に組み込ま
れる）。その後GおよびFを個々に1位に移動させるか、または共にそれぞれ1位お
よび2位に移動させた。驚くべきことに、GまたはFを1位に移動させた、またはG
およびFをそれぞれ1位および2位に移動させた組換えRSVは容易に回収された。
【００４２】
同様に、サイトカイン発現RSVへの取り込みのための遺伝子順位の広範な修飾
が、NS2遺伝子が単独で欠失している、またはNS1およびNS2遺伝子が共に欠失し
ている2つの高度に弱毒化されたワクチン候補を用いて行われてきた。これら2つ
のワクチン候補では、GおよびF糖タンパク質が共にそれぞれ1位および2位に移動
しており、また、G、F、およびSH糖タンパク質がその本来の下流の位置から欠失
している。このように、回収されたウィルスG1F2ΔNS2ΔSHおよびG1F2／ΔNS1Δ
NS2ΔSHはそれぞれ2および3個の遺伝子の欠失を、GおよびF遺伝子の移動に加え
て含有する。関係する変化の程度を例証するために、野生型RSV（NS1-NS2-N-P-M
-SH-G-F-M2-L）とG1F2／ΔNS2ΔSHウィルス（G-F-NS1-N-P-M-M2-L）またはΔNS1
ΔNS2ΔSH（G-F-N-P-M-M2-L）の遺伝子順位を比較できる。これはほとんど、ま
たは全ての遺伝子のプロモーターに対する位置が変化したことを示している。そ
れにも関わらず、これらの高度に弱毒化された誘導体は細胞培養物中で増殖する
能力を保持していた。
が、NS2遺伝子が単独で欠失している、またはNS1およびNS2遺伝子が共に欠失し
ている2つの高度に弱毒化されたワクチン候補を用いて行われてきた。これら2つ
のワクチン候補では、GおよびF糖タンパク質が共にそれぞれ1位および2位に移動
しており、また、G、F、およびSH糖タンパク質がその本来の下流の位置から欠失
している。このように、回収されたウィルスG1F2ΔNS2ΔSHおよびG1F2／ΔNS1Δ
NS2ΔSHはそれぞれ2および3個の遺伝子の欠失を、GおよびF遺伝子の移動に加え
て含有する。関係する変化の程度を例証するために、野生型RSV（NS1-NS2-N-P-M
-SH-G-F-M2-L）とG1F2／ΔNS2ΔSHウィルス（G-F-NS1-N-P-M-M2-L）またはΔNS1
ΔNS2ΔSH（G-F-N-P-M-M2-L）の遺伝子順位を比較できる。これはほとんど、ま
たは全ての遺伝子のプロモーターに対する位置が変化したことを示している。そ
れにも関わらず、これらの高度に弱毒化された誘導体は細胞培養物中で増殖する
能力を保持していた。
【００４３】
本発明の他の詳細な観点では、免疫調節分子を発現するように修飾した組換え
RSVを、他の病原体、特にパラインフルエンザウィルス（PIV）のような呼吸器系
の病原体の防御抗原のための“ベクター”として使用する。例えば、サイトカイ
ンを発現するように修飾した組換えRSVを操作して、PIV由来の防御抗原をコード
する配列を取り込んでもよい。PIVのcDNAのクローニングおよび本発明を補足す
る他の開示は以下に見られる：米国特許出願（クローン化したヌクレオチド配列
からのパラインフルエンザウィルスワクチンの生成（Protection of Parainflue
nza Virus Vaccines from Cloned Nucleotide Sequences）, 1998年5月22日出願
, 第09/083,793号（国際特許WO98/53078号に相当））およびその優先的仮出願（
1997年5月23日出願, 第60/047,575号）、米国仮出願（弱毒化ヒト-ウシ・キメラ
・パラインフルエンザウィルスワクチン（Attenuated Human-Bovine Chemeric P
arainfluenza Virus Vaccines）, Baillyら, 1999年7月9日出願, Attorney Dock
et第15280-399000US号）；および米国仮出願（非必須遺伝子の欠失または除去に
よって弱毒化した組み換えパラインフルエンザウィルスワクチン（Recombinant
Parainfluenza Virus Vaccines Attenuated by Deletion or Abliation of a No
n-Essential Gene）, Durbinら, 1999年7月9日出願, Attorney Docket第15280-3
94000US号）；それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。この開示は、感染
性PIVウィルスクローンの生成、または本発明で使用するためのPIV遺伝子または
ゲノムセグメントの供給源の提供のために使用してもよい以下のプラスミドの説
明を含む：p3／7（131）（ATCC97990）；p3／7（131）2G（ATCC97989）；および
p218（131）（ATCC97991）；それぞれはAmerican Type Culture Collection（AT
CC；10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, U.S.A.）
とのブタペスト条約の条件下にあり、上に示した承認番号が与えられている。
RSVを、他の病原体、特にパラインフルエンザウィルス（PIV）のような呼吸器系
の病原体の防御抗原のための“ベクター”として使用する。例えば、サイトカイ
ンを発現するように修飾した組換えRSVを操作して、PIV由来の防御抗原をコード
する配列を取り込んでもよい。PIVのcDNAのクローニングおよび本発明を補足す
る他の開示は以下に見られる：米国特許出願（クローン化したヌクレオチド配列
からのパラインフルエンザウィルスワクチンの生成（Protection of Parainflue
nza Virus Vaccines from Cloned Nucleotide Sequences）, 1998年5月22日出願
, 第09/083,793号（国際特許WO98/53078号に相当））およびその優先的仮出願（
1997年5月23日出願, 第60/047,575号）、米国仮出願（弱毒化ヒト-ウシ・キメラ
・パラインフルエンザウィルスワクチン（Attenuated Human-Bovine Chemeric P
arainfluenza Virus Vaccines）, Baillyら, 1999年7月9日出願, Attorney Dock
et第15280-399000US号）；および米国仮出願（非必須遺伝子の欠失または除去に
よって弱毒化した組み換えパラインフルエンザウィルスワクチン（Recombinant
Parainfluenza Virus Vaccines Attenuated by Deletion or Abliation of a No
n-Essential Gene）, Durbinら, 1999年7月9日出願, Attorney Docket第15280-3
94000US号）；それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。この開示は、感染
性PIVウィルスクローンの生成、または本発明で使用するためのPIV遺伝子または
ゲノムセグメントの供給源の提供のために使用してもよい以下のプラスミドの説
明を含む：p3／7（131）（ATCC97990）；p3／7（131）2G（ATCC97989）；および
p218（131）（ATCC97991）；それぞれはAmerican Type Culture Collection（AT
CC；10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, U.S.A.）
とのブタペスト条約の条件下にあり、上に示した承認番号が与えられている。
【００４４】
本発明のこの観点によれば、免疫調節分子を発現するように修飾した組換えRS
Vを提供するが、これは少なくとも1つのPIV配列（例えばPIV1およびPIV2またはP
IV1およびPIV3のいずれか、または両方に由来する配列を含有するポリヌクレオ
チド）を取り込む。RSVの個々の遺伝子をヒトPIV由来の相対する遺伝子（例えば
PIV1、PIV2、またはPIV3のF糖タンパク質遺伝子）で置換してもよい。あるいは
また、選択したヘテロロガスゲノムセグメント（例えば免疫原性タンパク質の細
胞質尾部、膜貫通ドメイン、またはエクトドメインをコードするもの）を相対す
るゲノムセグメントの代わりに、例えばRSV中の同じ遺伝子において、RSV中の異
なる遺伝子内で、またはRSVゲノムまたはアンチゲノムの非コード配列で置換し
てもよい。ある態様では、HPIV3のF遺伝子由来のゲノムセグメントを相対するヒ
トRSVゲノムセグメントの代わりに置換してキメラタンパク質、例えばPIVのエク
トドメインに融合するRSVの細胞質尾部および／または膜貫通ドメインを有する
融合タンパク質をコードするコンストラクトを生成し、新規の弱毒化ウィルス、
および／またはPIVおよびRSVの両方に対して免疫原性を有する多価ワクチンを得
る。あるいはまた、1つ以上のPIV3遺伝子またはゲノムセグメントを部分的また
は完全なキメラまたは非キメラRSVゲノムまたはアンチゲノムに付加することが
できる。
Vを提供するが、これは少なくとも1つのPIV配列（例えばPIV1およびPIV2またはP
IV1およびPIV3のいずれか、または両方に由来する配列を含有するポリヌクレオ
チド）を取り込む。RSVの個々の遺伝子をヒトPIV由来の相対する遺伝子（例えば
PIV1、PIV2、またはPIV3のF糖タンパク質遺伝子）で置換してもよい。あるいは
また、選択したヘテロロガスゲノムセグメント（例えば免疫原性タンパク質の細
胞質尾部、膜貫通ドメイン、またはエクトドメインをコードするもの）を相対す
るゲノムセグメントの代わりに、例えばRSV中の同じ遺伝子において、RSV中の異
なる遺伝子内で、またはRSVゲノムまたはアンチゲノムの非コード配列で置換し
てもよい。ある態様では、HPIV3のF遺伝子由来のゲノムセグメントを相対するヒ
トRSVゲノムセグメントの代わりに置換してキメラタンパク質、例えばPIVのエク
トドメインに融合するRSVの細胞質尾部および／または膜貫通ドメインを有する
融合タンパク質をコードするコンストラクトを生成し、新規の弱毒化ウィルス、
および／またはPIVおよびRSVの両方に対して免疫原性を有する多価ワクチンを得
る。あるいはまた、1つ以上のPIV3遺伝子またはゲノムセグメントを部分的また
は完全なキメラまたは非キメラRSVゲノムまたはアンチゲノムに付加することが
できる。
【００４５】
本発明に使用するためのキメラRSVを構築するために、ヘテロロガス遺伝子を
全体または部分的にバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノムに付加または置
換してもよい。置換によって生成されるキメラの場合、ヒトまたはウシRSV由来
のタンパク質またはタンパク質領域（例えば細胞質尾部、膜貫通ドメインまたは
エクトドメイン、エピトープ部位または領域、結合部位または領域、活性部位ま
たは活性部位を含有する領域など）をコードする選択した遺伝子またはゲノムセ
グメントをバックグラウンドRSVゲノムまたはアンチゲノム中の相対する遺伝子
またはゲノムの代わりに置換し、それぞれの野生型（または変異体の親）RSV株
の一方または両方に比較して所望の表現型変化を有する新規の組み換え体を得る
。ここで使用する“相対する”遺伝子またはゲノムセグメントとは、異なるRSV
源に由来する相対するポリヌクレオチドで、相同もしくは同等のタンパク質もし
くはタンパク質ドメイン、エピトープ、もしくはアミノ酸残基をコードする、ま
たは相同もしくは同等のcis作用性シグナルを示すものをいい、これには、限定
される訳ではないが異なるRSV亜群または株中の種および対立遺伝子変異体があ
る。
全体または部分的にバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノムに付加または置
換してもよい。置換によって生成されるキメラの場合、ヒトまたはウシRSV由来
のタンパク質またはタンパク質領域（例えば細胞質尾部、膜貫通ドメインまたは
エクトドメイン、エピトープ部位または領域、結合部位または領域、活性部位ま
たは活性部位を含有する領域など）をコードする選択した遺伝子またはゲノムセ
グメントをバックグラウンドRSVゲノムまたはアンチゲノム中の相対する遺伝子
またはゲノムの代わりに置換し、それぞれの野生型（または変異体の親）RSV株
の一方または両方に比較して所望の表現型変化を有する新規の組み換え体を得る
。ここで使用する“相対する”遺伝子またはゲノムセグメントとは、異なるRSV
源に由来する相対するポリヌクレオチドで、相同もしくは同等のタンパク質もし
くはタンパク質ドメイン、エピトープ、もしくはアミノ酸残基をコードする、ま
たは相同もしくは同等のcis作用性シグナルを示すものをいい、これには、限定
される訳ではないが異なるRSV亜群または株中の種および対立遺伝子変異体があ
る。
【００４６】
これに代わる他の態様では、ヘテロロガス抗原決定基を保有するためのベクタ
ーが非RSV病原体（例えばヒト・パラインフルエンザウィルス（HPIV））の抗原
決定基を1つ以上取り込むように、サイトカイン発現RSVを設計する。ある代表的
な態様では、1つ以上のHNおよび／またはF糖タンパク質またはその抗原性ドメイ
ン、フラグメント、またはエピトープをコードする1つ以上のHPIV1、HPIV2、ま
たはHPIV3遺伝子またはゲノムセグメントを、部分的または完全なHRSVベクター
ゲノムまたはアンチゲノム内に付加する、または取り込む。更に詳細な態様では
、HPIV1、HPIV2、またはHPIV3のHNまたはF遺伝子のオープン・リーディング・フ
レーム（ORF）を含有する転写単位を、キメラHRSVベクターゲノムまたはアンチ
ゲノム内に付加する、または取り込む。
ーが非RSV病原体（例えばヒト・パラインフルエンザウィルス（HPIV））の抗原
決定基を1つ以上取り込むように、サイトカイン発現RSVを設計する。ある代表的
な態様では、1つ以上のHNおよび／またはF糖タンパク質またはその抗原性ドメイ
ン、フラグメント、またはエピトープをコードする1つ以上のHPIV1、HPIV2、ま
たはHPIV3遺伝子またはゲノムセグメントを、部分的または完全なHRSVベクター
ゲノムまたはアンチゲノム内に付加する、または取り込む。更に詳細な態様では
、HPIV1、HPIV2、またはHPIV3のHNまたはF遺伝子のオープン・リーディング・フ
レーム（ORF）を含有する転写単位を、キメラHRSVベクターゲノムまたはアンチ
ゲノム内に付加する、または取り込む。
【００４７】
本発明のcDNA、ベクター、およびウィルス粒子内に取り込んだ変異を個別に、
または組み合わせて、サイトカインまたは他の免疫調節物質を発現するように修
飾したRSVに導入することができ、また導入された変異を含む救助されたウィル
スの表現型を容易に決定できる。代表的な態様では、弱毒化された生物学的に誘
導されたウィルスが示す野生型RSVに対するアミノ酸変化、例えばcpRSVまたはts
RSVによって表される変化を組み合わせてサイトカインを発現する組換えRSV内に
取り込み、ワクチンに使用するために所望のレベルで弱毒化させる。
または組み合わせて、サイトカインまたは他の免疫調節物質を発現するように修
飾したRSVに導入することができ、また導入された変異を含む救助されたウィル
スの表現型を容易に決定できる。代表的な態様では、弱毒化された生物学的に誘
導されたウィルスが示す野生型RSVに対するアミノ酸変化、例えばcpRSVまたはts
RSVによって表される変化を組み合わせてサイトカインを発現する組換えRSV内に
取り込み、ワクチンに使用するために所望のレベルで弱毒化させる。
【００４８】
このように、本発明はサイトカインまたは他の免疫調節物質を発現するように
修飾した組換えRSV、並びに新規のベクターおよびウィルス粒子を提供し、これ
は、選択した組み合わせで組み換えゲノムまたはアンチゲノムに導入した複数の
表現型特異的変異を取り込んで好適な弱毒化感染性ウィルスまたはサブウィルス
粒子を生成しうる。この過程は、慣例的な表現型評価と組み合わせて、弱毒化、
温度感受性、変更された免疫原性、低温適応性、小型プラークサイズ、宿主範囲
の制限などのような所望の特徴を有する組換えRSVを提供する。このように同定
された変異を“メニュー”に編集し、種々の組み合わせで導入し、選択したレベ
ルの弱毒化、免疫原性、および安定性に対してワクチンウィルスを測定する。
修飾した組換えRSV、並びに新規のベクターおよびウィルス粒子を提供し、これ
は、選択した組み合わせで組み換えゲノムまたはアンチゲノムに導入した複数の
表現型特異的変異を取り込んで好適な弱毒化感染性ウィルスまたはサブウィルス
粒子を生成しうる。この過程は、慣例的な表現型評価と組み合わせて、弱毒化、
温度感受性、変更された免疫原性、低温適応性、小型プラークサイズ、宿主範囲
の制限などのような所望の特徴を有する組換えRSVを提供する。このように同定
された変異を“メニュー”に編集し、種々の組み合わせで導入し、選択したレベ
ルの弱毒化、免疫原性、および安定性に対してワクチンウィルスを測定する。
【００４９】
本発明の更に別の観点では、サイトカインまたは他の免疫調節物質を発現する
ように修飾したRSVで、弱毒化変異を有する、または有さないものを、更なるヌ
クレオチド修飾を有するように構築し、所望の表現型、構造、または機能の変化
を生じさせる。一般に、選択したヌクレオチド修飾は表現型の変化、例えば増殖
特性、弱毒化、温度感受性、低温適応性、プラークサイズ、宿主範囲の制限、ま
たは免疫原性の変化を示す。この点において構造の変化には、操作および同定を
容易にするためのcDNAをコードするRSVへの制限部位の導入または除去が含まれ
る。
ように修飾したRSVで、弱毒化変異を有する、または有さないものを、更なるヌ
クレオチド修飾を有するように構築し、所望の表現型、構造、または機能の変化
を生じさせる。一般に、選択したヌクレオチド修飾は表現型の変化、例えば増殖
特性、弱毒化、温度感受性、低温適応性、プラークサイズ、宿主範囲の制限、ま
たは免疫原性の変化を示す。この点において構造の変化には、操作および同定を
容易にするためのcDNAをコードするRSVへの制限部位の導入または除去が含まれ
る。
【００５０】
好ましい態様では、サイトカインまたは他の免疫調節物質を発現するRSV組み
換え体のゲノムまたはアンチゲノム内のヌクレオチド変化は、遺伝子の部分的も
しくは完全な欠失によるウィルス遺伝子の修飾、またはその発現の低下もしくは
除去（ノックアウト）を含む。この点での変異の標的遺伝子には付着（G）タン
パク質、融合（F）タンパク質、小型疎水性（SH）タンパク質、RNA結合タンパク
質（N）、リンタンパク質（P）、大型ポリメラーゼタンパク質（L）、転写伸長
因子（M2 ORF1産物）、転写／翻訳調節タンパク質（M2 ORF2）産物、マトリック
ス（M）タンパク質、および2つの非構造タンパク質、NS1およびNS2がある。これ
らのタンパク質のそれぞれを全体または部分的に、単独で、または他の所望の修
飾と組み合わせて、選択的に削除、置換、または再配置して新規のRSV組み換え
体を得る。
換え体のゲノムまたはアンチゲノム内のヌクレオチド変化は、遺伝子の部分的も
しくは完全な欠失によるウィルス遺伝子の修飾、またはその発現の低下もしくは
除去（ノックアウト）を含む。この点での変異の標的遺伝子には付着（G）タン
パク質、融合（F）タンパク質、小型疎水性（SH）タンパク質、RNA結合タンパク
質（N）、リンタンパク質（P）、大型ポリメラーゼタンパク質（L）、転写伸長
因子（M2 ORF1産物）、転写／翻訳調節タンパク質（M2 ORF2）産物、マトリック
ス（M）タンパク質、および2つの非構造タンパク質、NS1およびNS2がある。これ
らのタンパク質のそれぞれを全体または部分的に、単独で、または他の所望の修
飾と組み合わせて、選択的に削除、置換、または再配置して新規のRSV組み換え
体を得る。
【００５１】
本発明のある観点では、SH、NS1、NS2、もしくはG遺伝子、またはM2 ORF2を、
サイトカインまたは他の免疫調節物質を発現する組み換えウィルスにおいて修飾
する。例えば、これらの遺伝子のそれぞれを全体もしくは部分的に削除するか、
またはその発現を低下もしくは除去して（例えば停止コドンもしくはフレームシ
フト変異の導入、または転写もしくは翻訳開始部位の変更によって）、得られる
組み換え体クローンの表現型を変更し、増殖、弱毒化、免疫原性、または他の所
望の表現型特性を向上させてもよい。例えば、組み換えゲノムまたはアンチゲノ
ム中のSH遺伝子の削除によって、in vitroにおける向上された増殖および／また
はin vivoにおける弱毒化のような新規の表現型特性を有するワクチン候補が得
られる。関連する観点では、SH遺伝子の削除、または別の選択した非必須遺伝子
もしくはゲノムセグメント（例えばNS1またはNS2遺伝子）の削除は、免疫調節物
質を発現するように修飾したウィルスにおいて、単独で、または弱毒化された表
現型を示す1つ以上の異なる変異、例えば直接（または、例えば変異を示すコド
ンに複数のヌクレオチド変化を導入することによって、修飾した型で）受容した
（adopted）点変異と組み合わせて、生物学的に誘導した弱毒化RSV変異体から構
築する。例えば、SH、NS1、NS2、またはM2-2遺伝子を、cpts248／404、cpts530
／1009、cpts530／1030、または別の選択した変異RSV株から受容した（adopted
）1つ以上のcpおよび／またはts変異と組み合わせて削除し、異なる変異の共同
作用による高いウィルス生成、向上された弱毒化、改善された免疫原性、および
弱毒化された表現型からの逆戻りに対する遺伝子耐性を示す組換えRSVを生成し
てもよい。
サイトカインまたは他の免疫調節物質を発現する組み換えウィルスにおいて修飾
する。例えば、これらの遺伝子のそれぞれを全体もしくは部分的に削除するか、
またはその発現を低下もしくは除去して（例えば停止コドンもしくはフレームシ
フト変異の導入、または転写もしくは翻訳開始部位の変更によって）、得られる
組み換え体クローンの表現型を変更し、増殖、弱毒化、免疫原性、または他の所
望の表現型特性を向上させてもよい。例えば、組み換えゲノムまたはアンチゲノ
ム中のSH遺伝子の削除によって、in vitroにおける向上された増殖および／また
はin vivoにおける弱毒化のような新規の表現型特性を有するワクチン候補が得
られる。関連する観点では、SH遺伝子の削除、または別の選択した非必須遺伝子
もしくはゲノムセグメント（例えばNS1またはNS2遺伝子）の削除は、免疫調節物
質を発現するように修飾したウィルスにおいて、単独で、または弱毒化された表
現型を示す1つ以上の異なる変異、例えば直接（または、例えば変異を示すコド
ンに複数のヌクレオチド変化を導入することによって、修飾した型で）受容した
（adopted）点変異と組み合わせて、生物学的に誘導した弱毒化RSV変異体から構
築する。例えば、SH、NS1、NS2、またはM2-2遺伝子を、cpts248／404、cpts530
／1009、cpts530／1030、または別の選択した変異RSV株から受容した（adopted
）1つ以上のcpおよび／またはts変異と組み合わせて削除し、異なる変異の共同
作用による高いウィルス生成、向上された弱毒化、改善された免疫原性、および
弱毒化された表現型からの逆戻りに対する遺伝子耐性を示す組換えRSVを生成し
てもよい。
【００５２】
本発明の組換えRSVにおける別のヌクレオチド修飾は、組み換えゲノムまたは
アンチゲノムにおける選択した遺伝子に関するcis作用性調節配列の削除、挿入
、付加、または再配列を含むことができる。ある態様では、RSV遺伝子のcis作用
性調節配列をヘテロロガス調節配列に一致するように変化させるが、これは異な
るRSV内の同じ遺伝子の相対するcis作用性調節配列、または異なるRSV遺伝子のc
is作用性調節配列であってもよい。例えば、同じRSV株における異なる遺伝子の
遺伝子末端シグナルへの変換または置換によって遺伝子末端シグナルを修飾して
もよい。他の態様では、ヌクレオチド修飾は組み換えゲノムまたはアンチゲノム
内の翻訳開始部位の挿入、削除、置換、または再配列を含み、例えば選択した型
のタンパク質のために別の翻訳開始部位を除去してもよい。ある態様では、分泌
型RSV Gタンパク質の翻訳開始部位を除去してこの型のGタンパク質の発現を修飾
し、それによって所望のin vivo効果を生じさせる。他の態様では、ミニレプリ
コンまたは感染性ウィルスの経験的な分析によって同定した変異を導入すること
ができる（例えばKuoら, J. Virol. 71:4944-4953, 1997；Whiteheadら, J. Vir
ol. 73:3438-3442, 1999（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい
）。
アンチゲノムにおける選択した遺伝子に関するcis作用性調節配列の削除、挿入
、付加、または再配列を含むことができる。ある態様では、RSV遺伝子のcis作用
性調節配列をヘテロロガス調節配列に一致するように変化させるが、これは異な
るRSV内の同じ遺伝子の相対するcis作用性調節配列、または異なるRSV遺伝子のc
is作用性調節配列であってもよい。例えば、同じRSV株における異なる遺伝子の
遺伝子末端シグナルへの変換または置換によって遺伝子末端シグナルを修飾して
もよい。他の態様では、ヌクレオチド修飾は組み換えゲノムまたはアンチゲノム
内の翻訳開始部位の挿入、削除、置換、または再配列を含み、例えば選択した型
のタンパク質のために別の翻訳開始部位を除去してもよい。ある態様では、分泌
型RSV Gタンパク質の翻訳開始部位を除去してこの型のGタンパク質の発現を修飾
し、それによって所望のin vivo効果を生じさせる。他の態様では、ミニレプリ
コンまたは感染性ウィルスの経験的な分析によって同定した変異を導入すること
ができる（例えばKuoら, J. Virol. 71:4944-4953, 1997；Whiteheadら, J. Vir
ol. 73:3438-3442, 1999（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい
）。
【００５３】
本発明の関連する観点では、サイトカインまたは他の免疫調節物質を発現する
単離された感染性組換えRSVを生成するための組成物（例えばRSVをコードするcD
NAを取り込む単離されたポリヌクレオチドおよびベクター）および方法を提供す
る。免疫調節物質をコードするように修飾したRSVゲノムまたはアンチゲノムを
含む分子を取り込む新規の単離されたポリヌクレオチド分子およびベクターは本
発明のこれらの観点に含まれる。また、N、P、L、およびRNAポリメラーゼ伸長因
子タンパク質をコードする1つ以上の単離されたポリヌクレオチド分子を含む同
一の、または異なる発現ベクターも提供する。これらのタンパク質をゲノムまた
はアンチゲノムのcDNAから直接発現させることもできる。好ましくは細胞または
細胞未含有の細胞抽出液中でベクターを発現または共発現させ、それによって感
染性RSV粒子またはサブウィルス粒子を生成させる。
単離された感染性組換えRSVを生成するための組成物（例えばRSVをコードするcD
NAを取り込む単離されたポリヌクレオチドおよびベクター）および方法を提供す
る。免疫調節物質をコードするように修飾したRSVゲノムまたはアンチゲノムを
含む分子を取り込む新規の単離されたポリヌクレオチド分子およびベクターは本
発明のこれらの観点に含まれる。また、N、P、L、およびRNAポリメラーゼ伸長因
子タンパク質をコードする1つ以上の単離されたポリヌクレオチド分子を含む同
一の、または異なる発現ベクターも提供する。これらのタンパク質をゲノムまた
はアンチゲノムのcDNAから直接発現させることもできる。好ましくは細胞または
細胞未含有の細胞抽出液中でベクターを発現または共発現させ、それによって感
染性RSV粒子またはサブウィルス粒子を生成させる。
【００５４】
サイトカインまたは他の免疫調節物質を発現するように修飾したRSVを生成す
るための上記の方法および組成物は感染性ウィルスもしくはサブウィルス粒子、
またはその誘導体を生成する。感染性ウィルスは本物のRSVウィルス粒子と同等
のもので、同様の感染性を有する。これはフレッシュの細胞を直接感染できる。
感染性サブウィルス粒子は一般にウィルス粒子の準成分（subcomponent）であり
、好適な条件下で感染を開始できる。例えば、ゲノムまたはアンチゲノムのRNA
、およびN、P、L、およびM2（ORF1）タンパク質を含有するヌクレオカプシドは
、細胞質内に導入されると感染を開始できるサブウィルス粒子の一例である。本
発明で提供するサブウィルス粒子は1つ以上のタンパク質、タンパク質セグメン
ト、または他のウィルス成分を欠如し、一般には感染性を有するウィルス粒子を
含む。
るための上記の方法および組成物は感染性ウィルスもしくはサブウィルス粒子、
またはその誘導体を生成する。感染性ウィルスは本物のRSVウィルス粒子と同等
のもので、同様の感染性を有する。これはフレッシュの細胞を直接感染できる。
感染性サブウィルス粒子は一般にウィルス粒子の準成分（subcomponent）であり
、好適な条件下で感染を開始できる。例えば、ゲノムまたはアンチゲノムのRNA
、およびN、P、L、およびM2（ORF1）タンパク質を含有するヌクレオカプシドは
、細胞質内に導入されると感染を開始できるサブウィルス粒子の一例である。本
発明で提供するサブウィルス粒子は1つ以上のタンパク質、タンパク質セグメン
ト、または他のウィルス成分を欠如し、一般には感染性を有するウィルス粒子を
含む。
【００５５】
他の態様では、本発明は上記のような免疫調節物質をコードするように修飾し
たRSVゲノムまたはアンチゲノムをコードする単離されたポリヌクレオチド分子
を含有する発現ベクター、およびRSVのN、P、L、およびRNAポリメラーゼ伸長因
子タンパク質をコードする1つ以上の単離されたポリヌクレオチド分子を含有す
る発現ベクター（同一の、または異なるベクター）を含有する細胞または細胞未
含有の細胞抽出液を提供する。これらのタンパク質の1つ以上をゲノムまたはア
ンチゲノムのcDNAから発現させることもできる。発現の際、ゲノムまたはアンチ
ゲノム、およびN、P、L、およびRNAポリメラーゼ伸長因子タンパク質を合一して
感染性RSVウィルスまたはサブウィルス粒子を生成する。
たRSVゲノムまたはアンチゲノムをコードする単離されたポリヌクレオチド分子
を含有する発現ベクター、およびRSVのN、P、L、およびRNAポリメラーゼ伸長因
子タンパク質をコードする1つ以上の単離されたポリヌクレオチド分子を含有す
る発現ベクター（同一の、または異なるベクター）を含有する細胞または細胞未
含有の細胞抽出液を提供する。これらのタンパク質の1つ以上をゲノムまたはア
ンチゲノムのcDNAから発現させることもできる。発現の際、ゲノムまたはアンチ
ゲノム、およびN、P、L、およびRNAポリメラーゼ伸長因子タンパク質を合一して
感染性RSVウィルスまたはサブウィルス粒子を生成する。
【００５６】
本発明の組換えRSVは、RSV感染に感受性を有する宿主においてRSVに対する所
望の免疫応答を生成するための種々の組成物に有用である。本発明の弱毒化した
RSVは感染したヒト・宿主において防御免疫応答を誘引する能力があり、しかも
十分弱毒化されていて接種された宿主において重篤な呼吸器疾患の許容できない
症状を引き起こさない。弱毒化されたウィルスまたはサブウィルス粒子は細胞培
養物上清中に存在するか、培養液から単離するか、または部分的もしくは完全に
精製してもよい。またウィルスを透析してもよく、必要により保存または宿主へ
の運搬のために種々の他の成分と合一することができる。
望の免疫応答を生成するための種々の組成物に有用である。本発明の弱毒化した
RSVは感染したヒト・宿主において防御免疫応答を誘引する能力があり、しかも
十分弱毒化されていて接種された宿主において重篤な呼吸器疾患の許容できない
症状を引き起こさない。弱毒化されたウィルスまたはサブウィルス粒子は細胞培
養物上清中に存在するか、培養液から単離するか、または部分的もしくは完全に
精製してもよい。またウィルスを透析してもよく、必要により保存または宿主へ
の運搬のために種々の他の成分と合一することができる。
【００５７】
本発明は生理学的に許容しうるキャリアーおよび／またはアジュバント、およ
びサイトカインを発現するように修飾した単離されたRSV粒子またはサブウィル
ス粒子を含有する新規のワクチンを提供する。好ましい態様では、ワクチンは変
異体の親RSVを含有するが、これはサイトカインをコードするように修飾したゲ
ノムまたはアンチゲノムを有し、また、少なくとも1つ、好ましくは2つ以上の弱
毒化変異または上記のような他のヌクレオチド修飾を有して、弱毒化および免疫
原性が好適なバランスとなっている。ワクチンを103から106PFU、またはそれ以
上の弱毒化ウィルス用量で調製できる。ワクチンウィルスは、単一のRSV株もし
くは抗原性亜群（例えばAまたはB）に対する、または複数のRSV株もしくは亜群
に対する免疫応答を誘引してもよい。この点では、本発明の組換えRSVを、1つま
たは複数のRSV株または亜群に対するより効果的な防御のために、異なる免疫原
性を有する他のRSVワクチン株または亜群と共にワクチン製剤中に合一すること
ができる。
びサイトカインを発現するように修飾した単離されたRSV粒子またはサブウィル
ス粒子を含有する新規のワクチンを提供する。好ましい態様では、ワクチンは変
異体の親RSVを含有するが、これはサイトカインをコードするように修飾したゲ
ノムまたはアンチゲノムを有し、また、少なくとも1つ、好ましくは2つ以上の弱
毒化変異または上記のような他のヌクレオチド修飾を有して、弱毒化および免疫
原性が好適なバランスとなっている。ワクチンを103から106PFU、またはそれ以
上の弱毒化ウィルス用量で調製できる。ワクチンウィルスは、単一のRSV株もし
くは抗原性亜群（例えばAまたはB）に対する、または複数のRSV株もしくは亜群
に対する免疫応答を誘引してもよい。この点では、本発明の組換えRSVを、1つま
たは複数のRSV株または亜群に対するより効果的な防御のために、異なる免疫原
性を有する他のRSVワクチン株または亜群と共にワクチン製剤中に合一すること
ができる。
【００５８】
関連する観点では、本発明は哺乳動物被験体において個体の免疫系を刺激して
RSVに対する免疫応答を誘引する方法を提供する。方法は、免疫学的十分量のサ
イトカインまたは他の免疫調節物質を発現するように修飾した弱毒化RSVを生理
学的に許容しうるキャリアーおよび／またはアジュバントに混合したものを投与
することを含む。ある態様では、免疫原性組成物はサイトカインを発現するよう
に修飾した単離されたRSV粒子またはサブウィルス粒子を含有するワクチンであ
り、少なくとも1つ、好ましくは2つ以上の弱毒化された変異または上記のような
所望の表現型を示す他の修飾を有する。ワクチンを103から106PFU、またはそれ
以上の弱毒化ウィルス用量で調製できる。ワクチンは単一のRSV株もしくは抗原
性亜群（例えばAまたはB）に対する、または複数のRSV株もしくは亜群に対する
免疫応答を誘引してもよい。本発明のRSV組み換え体を異なる免疫原性を有するR
SVと共にワクチン混合物に合一するか、または調整した治療プロトコールにおい
て別々に投与して、1つのRSV株に対する、または複数のRSV株もしくは亜群に対
するより有効な防御を誘引することができる。好ましくは免疫原性組成物を、例
えばスプレー、液滴、またはエアロゾールによって、上部気道に投与する。多く
の場合、組成物を、RSVに対する抗体に関して血清陰性であるか、または経胎盤
で獲得したRSVに対する抗体を有する個体に投与する。
RSVに対する免疫応答を誘引する方法を提供する。方法は、免疫学的十分量のサ
イトカインまたは他の免疫調節物質を発現するように修飾した弱毒化RSVを生理
学的に許容しうるキャリアーおよび／またはアジュバントに混合したものを投与
することを含む。ある態様では、免疫原性組成物はサイトカインを発現するよう
に修飾した単離されたRSV粒子またはサブウィルス粒子を含有するワクチンであ
り、少なくとも1つ、好ましくは2つ以上の弱毒化された変異または上記のような
所望の表現型を示す他の修飾を有する。ワクチンを103から106PFU、またはそれ
以上の弱毒化ウィルス用量で調製できる。ワクチンは単一のRSV株もしくは抗原
性亜群（例えばAまたはB）に対する、または複数のRSV株もしくは亜群に対する
免疫応答を誘引してもよい。本発明のRSV組み換え体を異なる免疫原性を有するR
SVと共にワクチン混合物に合一するか、または調整した治療プロトコールにおい
て別々に投与して、1つのRSV株に対する、または複数のRSV株もしくは亜群に対
するより有効な防御を誘引することができる。好ましくは免疫原性組成物を、例
えばスプレー、液滴、またはエアロゾールによって、上部気道に投与する。多く
の場合、組成物を、RSVに対する抗体に関して血清陰性であるか、または経胎盤
で獲得したRSVに対する抗体を有する個体に投与する。
【００５９】
具体的な態様の説明
本発明は、RSV感染の治療または予防のための組換えRSVワクチン候補の有用性
改善のための一またはそれ以上の免疫活性調節因子分子を発現するように設計さ
れた単離した感染性組換えRSV（rRSV）を提供する。組換えウイルスは、一また
はそれ以上の免疫活性調節因子分子をコードするポリヌクレオチドの配列を組み
込む修飾型ゲノムまたはアンチゲノムを有する。
改善のための一またはそれ以上の免疫活性調節因子分子を発現するように設計さ
れた単離した感染性組換えRSV（rRSV）を提供する。組換えウイルスは、一また
はそれ以上の免疫活性調節因子分子をコードするポリヌクレオチドの配列を組み
込む修飾型ゲノムまたはアンチゲノムを有する。
【００６０】
様々なサイトカインおよび他の免疫活性調節因子分子は、感染細胞内でウイル
スによって発現するという方法で本発明の組換えRSVに取り込まれられ、ウイル
ス生物学の一またはそれ以上の側面、例えば感染性、複製、病原性などを修飾し
、および/または一またはそれ以上の宿主免疫反応、例えば抗-RSV中和抗体反応
、t-ヘルパー細胞反応、細胞障害性T細胞（CTL）細胞反応、および/またはナチ
ュラルキラー（NK）細胞反応などを変化させることができる。免疫活性調節因子
分子はサイトカイン、またはケモカイン、ケモカインもしくはサイトカインアン
タゴニスト、酵素（例えば、一酸化窒素）、表面もしくは可溶性の受容体、接着
分子およびリガンドなどの他の免疫活性調節因子でもよい。本発明の組換えウイ
ルスによって組み込まれおよび発現される際には、サイトカインまたはそのコー
ドするポリヌクレオチドはウイルス生物学の側面および/またはRSVに対する宿主
免疫反応を変化、言い換えれば、増加、減少またはさもなければ増強するように
働く。
スによって発現するという方法で本発明の組換えRSVに取り込まれられ、ウイル
ス生物学の一またはそれ以上の側面、例えば感染性、複製、病原性などを修飾し
、および/または一またはそれ以上の宿主免疫反応、例えば抗-RSV中和抗体反応
、t-ヘルパー細胞反応、細胞障害性T細胞（CTL）細胞反応、および/またはナチ
ュラルキラー（NK）細胞反応などを変化させることができる。免疫活性調節因子
分子はサイトカイン、またはケモカイン、ケモカインもしくはサイトカインアン
タゴニスト、酵素（例えば、一酸化窒素）、表面もしくは可溶性の受容体、接着
分子およびリガンドなどの他の免疫活性調節因子でもよい。本発明の組換えウイ
ルスによって組み込まれおよび発現される際には、サイトカインまたはそのコー
ドするポリヌクレオチドはウイルス生物学の側面および/またはRSVに対する宿主
免疫反応を変化、言い換えれば、増加、減少またはさもなければ増強するように
働く。
【００６１】
本発明の基本的な側面において、本明細書での開示により、天然に発見された
または組換えDNA技術によって設計された広範囲な免疫活性調節因子タンパク質
のいずれかの組換えRSVからの細胞内共同発現が提供される。このような活性調
節因子は典型的に造血細胞に作用し、または造血細胞およびウイルス感染を含む
それらの環境間のシグナルおよび相互作用をブロックし得る。驚くほど広範囲の
分子配列がこの方法での発現に従う。多くの例の中には、可溶性のメッセンジャ
ーとして作用するまたは可溶性のメッセンジャーと拮抗もしくは分離する、また
は免疫システムの細胞と相互作用するタンパク質がある。代表的な分子には、イ
ンターロイキン、インターフェロン、ケモカインの様々なサブファミリー、様々
なコロニー刺激因子（CSFs）、Flt3リガンドなどのある分子、および造血細胞を
調節する他の因子を含む様々なメンバーのサイトカイン/ケモカイングループが
含まれる。本発明内で有用な代表的なサイトカインおよびケモカインの詳細なリ
ストは、次のレビューに見出され得る：サイトカインハンドブック、A. Thomson
(ed.). Academic Press, San Diego, 1998; およびサイトカイン、A. Mire-Sl
uisおよび R. Thorpe (eds.) Academic Press, San Diego, 1998（これらは本明
細書にて参照として援用する）。
または組換えDNA技術によって設計された広範囲な免疫活性調節因子タンパク質
のいずれかの組換えRSVからの細胞内共同発現が提供される。このような活性調
節因子は典型的に造血細胞に作用し、または造血細胞およびウイルス感染を含む
それらの環境間のシグナルおよび相互作用をブロックし得る。驚くほど広範囲の
分子配列がこの方法での発現に従う。多くの例の中には、可溶性のメッセンジャ
ーとして作用するまたは可溶性のメッセンジャーと拮抗もしくは分離する、また
は免疫システムの細胞と相互作用するタンパク質がある。代表的な分子には、イ
ンターロイキン、インターフェロン、ケモカインの様々なサブファミリー、様々
なコロニー刺激因子（CSFs）、Flt3リガンドなどのある分子、および造血細胞を
調節する他の因子を含む様々なメンバーのサイトカイン/ケモカイングループが
含まれる。本発明内で有用な代表的なサイトカインおよびケモカインの詳細なリ
ストは、次のレビューに見出され得る：サイトカインハンドブック、A. Thomson
(ed.). Academic Press, San Diego, 1998; およびサイトカイン、A. Mire-Sl
uisおよび R. Thorpe (eds.) Academic Press, San Diego, 1998（これらは本明
細書にて参照として援用する）。
【００６２】
本発明での使用に適切なサイトカインおよびケモカインには、IL-1アルファお
よびベータならびにIL-2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16
、17および18を含むインターロイキンも含まれるが、これらに限定されない。ま
た、インターフェロンガンマ（INFγ）ならびにインターフェロンアルファ、ベ
ータおよびオメガを含む他のインターフェロンも含まれる。本発明の組換えウイ
ルス内で使用する他の分子には、腫瘍壊死因子（TNF）ならびにFasリガンド（CD
95）、CD40リガンドおよび最近報告されたB-細胞-刺激BlySタンパク質を含むそ
の関連するリガンドおよび受容体がある（Mooreら, Science 285: 260-263, 199
9）。他の分子にはFlt3リガンドが含まれる。Flt3またはCD40リガンドなどのリ
ガンドは、感染細胞の表面上で発現し、および感染細胞の免疫認識を変化または
増強させることができるということを本明細書において特に言及しておく。Flt3
などのリガンドは、組換えRSV粒子のエンヴェロープに組み込まれるように設計
され、該リガンドは、この場合樹状突起細胞へウイルスを標的送達させるように
ウイルスの向性を変化することができる。
よびベータならびにIL-2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16
、17および18を含むインターロイキンも含まれるが、これらに限定されない。ま
た、インターフェロンガンマ（INFγ）ならびにインターフェロンアルファ、ベ
ータおよびオメガを含む他のインターフェロンも含まれる。本発明の組換えウイ
ルス内で使用する他の分子には、腫瘍壊死因子（TNF）ならびにFasリガンド（CD
95）、CD40リガンドおよび最近報告されたB-細胞-刺激BlySタンパク質を含むそ
の関連するリガンドおよび受容体がある（Mooreら, Science 285: 260-263, 199
9）。他の分子にはFlt3リガンドが含まれる。Flt3またはCD40リガンドなどのリ
ガンドは、感染細胞の表面上で発現し、および感染細胞の免疫認識を変化または
増強させることができるということを本明細書において特に言及しておく。Flt3
などのリガンドは、組換えRSV粒子のエンヴェロープに組み込まれるように設計
され、該リガンドは、この場合樹状突起細胞へウイルスを標的送達させるように
ウイルスの向性を変化することができる。
【００６３】
しかし、本発明の組換えRSVへ導入される追加の免疫活性調節因子分子には、
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）および幹細胞因子などのコロ
ニー刺激因子（CSFs）が含まれる。代表的なケモカインには、IL-8、INF-ガンマ
（Mig）誘導型モノカイン、サイトカイン応答性遺伝子2（Crg-2）（Mahalingam
ら, J. Virol. 73: 1479-1491, 1999）、血小板因子-4（PF-4）、好中球活性タ
ンパク質-2（NAP-2）、メラノーマ増殖-刺激活性（GRO）アルファ、ベータおよ
びガンマ、上皮細胞-由来好中球誘引物質-78（ENA-78）、顆粒球走化性タンパク
質-2（GCP-2）、IFN-ガンマ-誘発性タンパク質-10（IP-10）、間質細胞-由来因
子1（SDF-1）アルファおよびベータを含むCXCグループが含まれる。第三の現在-
認識されているグループであるCCケモカインには、エオタキシン（eotaxin）、
単球走化性タンパク質（MCP）1、2、3、4および5、RANTES（活性制御、正常T-細
胞表現および分泌型）、マクロファージ炎症性タンパク質（MIP）1アルファおよ
びベータならびに胸腺および活性-制御型ケモカイン（TARC）が含まれる。
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）および幹細胞因子などのコロ
ニー刺激因子（CSFs）が含まれる。代表的なケモカインには、IL-8、INF-ガンマ
（Mig）誘導型モノカイン、サイトカイン応答性遺伝子2（Crg-2）（Mahalingam
ら, J. Virol. 73: 1479-1491, 1999）、血小板因子-4（PF-4）、好中球活性タ
ンパク質-2（NAP-2）、メラノーマ増殖-刺激活性（GRO）アルファ、ベータおよ
びガンマ、上皮細胞-由来好中球誘引物質-78（ENA-78）、顆粒球走化性タンパク
質-2（GCP-2）、IFN-ガンマ-誘発性タンパク質-10（IP-10）、間質細胞-由来因
子1（SDF-1）アルファおよびベータを含むCXCグループが含まれる。第三の現在-
認識されているグループであるCCケモカインには、エオタキシン（eotaxin）、
単球走化性タンパク質（MCP）1、2、3、4および5、RANTES（活性制御、正常T-細
胞表現および分泌型）、マクロファージ炎症性タンパク質（MIP）1アルファおよ
びベータならびに胸腺および活性-制御型ケモカイン（TARC）が含まれる。
【００６４】
他の有用な免疫活性調節因子分子には、受容体に結合しその結果活性化させず
にブロックする自然-発現分泌型IL-1受容体アンタゴニスト（Arend, Ad. Immuno
l. 54: 167-227, 1993, 本明細書にて参照として援用する）などのサイトカイン
アンタゴニストが含まれる。他の例は、可溶性TNFに結合し分離できる腫瘍壊死
因子（TNF）の受容体の細胞外領域およびIgGの定常領域間で作られる遺伝子-設
計型融合タンパク質である（Fisherら, N. Eng. J. Med. 334: 1697-1702, 1996
）。第三の例は、IL-1を分離する組換えIL-1受容体である（Takebeら, J. Inter
feron Cytokine Res. 18 : 321-326, 1998, 本明細書にて参照として援用する）
。rRSVでの発現に従う他のサイトカイン/ケモカインアンタゴニストには、例え
ばIL-1などの完全な分子に由来するタンパク質（Palaszynski, Biochem. Biophy
s. Res. Commun. 147: 24-209, 1987, 本明細書にて参照として援用する）、ま
たは例えばTNFなどの機能に重要な残基の部位特異的突然変異誘発によって生じ
る不活性型（von Feldtら, Immunol. Res. 13: 96-109, 1994, 本明細書におい
て参照として援用する）が含まれる。他の分子には様々なウイルス-由来の同族
体および活性調節因子が含まれる。発現のために本発明によって組換えRSVに容
易に挿入され、そして免疫原性、有効性ならびにげっ歯類または霊長類の動物モ
デルおよび臨床における疾患に対する効果が直接評価され得るポリペプチド免疫
活性調節因子の大きな配列が存在する。
にブロックする自然-発現分泌型IL-1受容体アンタゴニスト（Arend, Ad. Immuno
l. 54: 167-227, 1993, 本明細書にて参照として援用する）などのサイトカイン
アンタゴニストが含まれる。他の例は、可溶性TNFに結合し分離できる腫瘍壊死
因子（TNF）の受容体の細胞外領域およびIgGの定常領域間で作られる遺伝子-設
計型融合タンパク質である（Fisherら, N. Eng. J. Med. 334: 1697-1702, 1996
）。第三の例は、IL-1を分離する組換えIL-1受容体である（Takebeら, J. Inter
feron Cytokine Res. 18 : 321-326, 1998, 本明細書にて参照として援用する）
。rRSVでの発現に従う他のサイトカイン/ケモカインアンタゴニストには、例え
ばIL-1などの完全な分子に由来するタンパク質（Palaszynski, Biochem. Biophy
s. Res. Commun. 147: 24-209, 1987, 本明細書にて参照として援用する）、ま
たは例えばTNFなどの機能に重要な残基の部位特異的突然変異誘発によって生じ
る不活性型（von Feldtら, Immunol. Res. 13: 96-109, 1994, 本明細書におい
て参照として援用する）が含まれる。他の分子には様々なウイルス-由来の同族
体および活性調節因子が含まれる。発現のために本発明によって組換えRSVに容
易に挿入され、そして免疫原性、有効性ならびにげっ歯類または霊長類の動物モ
デルおよび臨床における疾患に対する効果が直接評価され得るポリペプチド免疫
活性調節因子の大きな配列が存在する。
【００６５】
免疫活性調節因子を発現するように設計された組換えRSVを生成するために、
サイトカインまたは他の免疫活性調節因子分子をコードするポリヌクレオチド配
列を組み込むように、ウイルスのゲノムまたはアンチゲノムが修飾され、すなわ
ち、典型的にそれ自身の遺伝子開始（GS）および遺伝子終結（GE）シグナルを有
する別個の遺伝子として付加される。一般的に、免疫活性調節因子をコードする
ポリヌクレオチド配列は、ゲノムまたはアンチゲノム内の読み取り枠を破壊しな
いようにいずれかの適切な座にて、組換えRSVゲノムまたはアンチゲノムの遺伝
子間または他の非コード領域に付加または置換される。ゲノムまたはアンチゲノ
ム内の非コード構成部分は除去され、そしてサイトカインをコードするポリヌク
レオチドは欠失部位にて置換され得るが、典型的に、活性調節因子をコードする
ポリヌクレオチド配列は、組換えゲノムまたはアンチゲノム内に過剰な配列とし
て導入される。
サイトカインまたは他の免疫活性調節因子分子をコードするポリヌクレオチド配
列を組み込むように、ウイルスのゲノムまたはアンチゲノムが修飾され、すなわ
ち、典型的にそれ自身の遺伝子開始（GS）および遺伝子終結（GE）シグナルを有
する別個の遺伝子として付加される。一般的に、免疫活性調節因子をコードする
ポリヌクレオチド配列は、ゲノムまたはアンチゲノム内の読み取り枠を破壊しな
いようにいずれかの適切な座にて、組換えRSVゲノムまたはアンチゲノムの遺伝
子間または他の非コード領域に付加または置換される。ゲノムまたはアンチゲノ
ム内の非コード構成部分は除去され、そしてサイトカインをコードするポリヌク
レオチドは欠失部位にて置換され得るが、典型的に、活性調節因子をコードする
ポリヌクレオチド配列は、組換えゲノムまたはアンチゲノム内に過剰な配列とし
て導入される。
【００６６】
サイトカインまたは他の免疫活性調節因子を発現するように修飾された本発明
の組換えRSVの設計は、典型的に、ゲノムまたはアンチゲノム内の選択された位
置にサイトカインをコードするポリヌクレオチドを付加または置換することを含
む。サイトカインまたは他の免疫活性調節因子の発現レベルは、組換えゲノムま
たはアンチゲノム内のサイトカインをコードするポリヌクレオチドの遺伝子配列
位置を変化することで調節できる。例えば、サイトカインをコードするポリヌク
レオチドはRSV遺伝子のいずれかの遺伝子間の位置または非コード領域に導入す
ることができる。サイトカインをコードするポリヌクレオチドの導入は、サイト
カインまたは他の免疫活性調節因子の発現をそれぞれ増強したまは減少させるた
めにこれらの遺伝子またはORFsのいずれかに関してよりプロモーター近位または
よりプロモーター遠位である位置で選択され得る。
の組換えRSVの設計は、典型的に、ゲノムまたはアンチゲノム内の選択された位
置にサイトカインをコードするポリヌクレオチドを付加または置換することを含
む。サイトカインまたは他の免疫活性調節因子の発現レベルは、組換えゲノムま
たはアンチゲノム内のサイトカインをコードするポリヌクレオチドの遺伝子配列
位置を変化することで調節できる。例えば、サイトカインをコードするポリヌク
レオチドはRSV遺伝子のいずれかの遺伝子間の位置または非コード領域に導入す
ることができる。サイトカインをコードするポリヌクレオチドの導入は、サイト
カインまたは他の免疫活性調節因子の発現をそれぞれ増強したまは減少させるた
めにこれらの遺伝子またはORFsのいずれかに関してよりプロモーター近位または
よりプロモーター遠位である位置で選択され得る。
【００６７】
本明細書での使用に際しては、"RSV遺伝子"は一般的にmRNAをコードするRSVゲ
ノムの部分を意味し、そして典型的に、10-ヌクレオチド遺伝子-開始（GS）シグ
ナルとともに上流末端で開始し、12から13-ヌクレオチド遺伝子-終結（GE）シグ
ナルとともに下流末端で終了する。本発明に使用される10のそのような遺伝子は
、RSVに対して知られ、すなわちNS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2およびLであ
る。"遺伝子"という用語は、また本明細書において"翻訳の読み取り枠"（ORF）
を意味するように使用される。ORFは、さらに明確には重要なRSVタンパク質をコ
ードする翻訳の読み取り枠として定義され、そのうちの11が現在認識されている
：NS１、NS２、N、P、M、SH、G、F、M2-1（あるいはM2（ORF1））、M2-2（ある
いはM2（ORF2））およびLである。したがって"遺伝子"という用語は、サブゲノ
ムのRNAをコードするゲノムのRNA配列およびORFを交互に意味する（後者の用語
は、RSVのM2遺伝子の場合において、一つのｍRNAが別個のタンパク質をコードす
る二つの重なるORFを有するという状況において特に用いられる）。Collinsら,
J. Gen. Virol. 71: 3015-3020, 1990; Bermingham および Collins, Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 96: 11259-11264, 1999; Ahmadianら, EMBO J. 19: 2681-26
89, 2000; Jinら, J. Virol. 74: 74-82, 2000（それぞれを本明細書において参
照として援用する）。"遺伝子"という用語が、プロモーターの位置に関する遺伝
子の位置を決定するという意味で使用される場合は、その用語は通常厳密には遺
伝子-開始および遺伝子-終結シグナルのモチーフの転写によって境されるｍRNA
をコードする配列を意味する。（Collinsら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:
4594-4598, 1986; Kuoら, J. Virol. 70: 6892-6901, 1996; それぞれを本明細
書において参照として援用する）。
ノムの部分を意味し、そして典型的に、10-ヌクレオチド遺伝子-開始（GS）シグ
ナルとともに上流末端で開始し、12から13-ヌクレオチド遺伝子-終結（GE）シグ
ナルとともに下流末端で終了する。本発明に使用される10のそのような遺伝子は
、RSVに対して知られ、すなわちNS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2およびLであ
る。"遺伝子"という用語は、また本明細書において"翻訳の読み取り枠"（ORF）
を意味するように使用される。ORFは、さらに明確には重要なRSVタンパク質をコ
ードする翻訳の読み取り枠として定義され、そのうちの11が現在認識されている
：NS１、NS２、N、P、M、SH、G、F、M2-1（あるいはM2（ORF1））、M2-2（ある
いはM2（ORF2））およびLである。したがって"遺伝子"という用語は、サブゲノ
ムのRNAをコードするゲノムのRNA配列およびORFを交互に意味する（後者の用語
は、RSVのM2遺伝子の場合において、一つのｍRNAが別個のタンパク質をコードす
る二つの重なるORFを有するという状況において特に用いられる）。Collinsら,
J. Gen. Virol. 71: 3015-3020, 1990; Bermingham および Collins, Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 96: 11259-11264, 1999; Ahmadianら, EMBO J. 19: 2681-26
89, 2000; Jinら, J. Virol. 74: 74-82, 2000（それぞれを本明細書において参
照として援用する）。"遺伝子"という用語が、プロモーターの位置に関する遺伝
子の位置を決定するという意味で使用される場合は、その用語は通常厳密には遺
伝子-開始および遺伝子-終結シグナルのモチーフの転写によって境されるｍRNA
をコードする配列を意味する。（Collinsら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:
4594-4598, 1986; Kuoら, J. Virol. 70: 6892-6901, 1996; それぞれを本明細
書において参照として援用する）。
【００６８】
"ゲノムセグメント"は、ORF、遺伝子、もしくは遺伝子外の領域の部分または
その組み合わせであり得るRSVゲノムからの連続するヌクレオチドのいずれかの
長さを意味する。
その組み合わせであり得るRSVゲノムからの連続するヌクレオチドのいずれかの
長さを意味する。
【００６９】
サイトカインをコードする遺伝子を含む非自己の遺伝子のRSVへの挿入の一つ
の代替方法は、上記RSVの遺伝子-開始および遺伝子-終結シグナルのコントロー
ル下、ｃDNAを置くことであるが、遺伝子はゲノムからよりもむしろアンチゲノ
ムから発現されるようにｃDNAを挿入することである。好ましくは非自己の遺伝
子は、アンチゲノムの3'末端のプロモーターからすぐ下流に置かれ、このような
プロモーター近位の配置により高レベルの発現が確保される。この方法について
は、非自己のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子をアンチ
ゲノム鎖に置き、そしてさらにアンチゲノムプロモーターをゲノムのプロモータ
ーによって置換するという狂犬病ウイルスに関する記載があった（Flinke およ
び Conzelmann, J. Virol. 71: 7281-7288, 1997, 本明細書において参照として
援用する）。しかし、RSVに関しては、アンチゲノムプロモーターは効率的な転
写をつかさどることができ、それゆえ一般的にはアンチゲノムプロモーターを置
換する必要はない。実際、我々は、非自己の遺伝子がアンチゲノムから発現する
ミニレプリコンを設計した。
の代替方法は、上記RSVの遺伝子-開始および遺伝子-終結シグナルのコントロー
ル下、ｃDNAを置くことであるが、遺伝子はゲノムからよりもむしろアンチゲノ
ムから発現されるようにｃDNAを挿入することである。好ましくは非自己の遺伝
子は、アンチゲノムの3'末端のプロモーターからすぐ下流に置かれ、このような
プロモーター近位の配置により高レベルの発現が確保される。この方法について
は、非自己のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子をアンチ
ゲノム鎖に置き、そしてさらにアンチゲノムプロモーターをゲノムのプロモータ
ーによって置換するという狂犬病ウイルスに関する記載があった（Flinke およ
び Conzelmann, J. Virol. 71: 7281-7288, 1997, 本明細書において参照として
援用する）。しかし、RSVに関しては、アンチゲノムプロモーターは効率的な転
写をつかさどることができ、それゆえ一般的にはアンチゲノムプロモーターを置
換する必要はない。実際、我々は、非自己の遺伝子がアンチゲノムから発現する
ミニレプリコンを設計した。
【００７０】
しかし、非自己遺伝子発現のための他の方法は、哺乳類の内在リボソームエン
トリー部位のコントロール下、ORFを置き、そしていずれかの一またはそれ以上
のRSV遺伝子の下流非コード領域へこのORFを挿入することである。この方法はイ
ンフルエンザウイルスに関して以前記載されていた（Gracia-Sastreら, J. Viro
l. 68: 6254-6261,1994, 本明細書において参照として援用する）。この結果、
真正ウイルスのORFはｍRNAの5'末端で妨げられないが、下流非コード領域が内在
するリボソームエントリーによって発現する非自己のORFを有するというｍRNAの
発現が起こる。あるいは、リボソームの終結-再開（stop-restart）によってア
クセスできるように下流域のORFを配置することもできる（Horvathら, EMBO J.
9: 2639-2647, 1990, 本明細書において参照として援用する）。
トリー部位のコントロール下、ORFを置き、そしていずれかの一またはそれ以上
のRSV遺伝子の下流非コード領域へこのORFを挿入することである。この方法はイ
ンフルエンザウイルスに関して以前記載されていた（Gracia-Sastreら, J. Viro
l. 68: 6254-6261,1994, 本明細書において参照として援用する）。この結果、
真正ウイルスのORFはｍRNAの5'末端で妨げられないが、下流非コード領域が内在
するリボソームエントリーによって発現する非自己のORFを有するというｍRNAの
発現が起こる。あるいは、リボソームの終結-再開（stop-restart）によってア
クセスできるように下流域のORFを配置することもできる（Horvathら, EMBO J.
9: 2639-2647, 1990, 本明細書において参照として援用する）。
【００７１】
しかし、発現のための他の方法は、キメラまたは融合タンパク質の設計による
。例えば、感染細胞の表面およびビリオンで発現するように期待されるタンパク
質の外領域が、読み取り枠が妨げられずにキメラタンパク質を生じるようにSHOR
Fの下流末端に付加される。このような配置では、SH部分はシグナルおよび膜の
アンカーを提供し、C-末端の付加した領域は細胞外に置かれる。この方法は、SH
タンパク質は免疫予防において重要な抗原ではなくインビトロまたはインビボで
の効率的な複製に必要とされないという発見を利用している。この方法は、Flt3
を発現する細胞すなわち樹状突起細胞へウイルスを標的送達させる目的で、Flt3
リガンドなどのリガンドがビリオンの表面で発現されるような場合に特に好まれ
る。しかし、他のウイルスの遺伝子はキメラタンパク質を設計するのに用いられ
得る。例えば、Gタンパク質は容易にC-末端での欠失および挿入を受容すること
が示されており、そしてこの結果、Gタンパク質は非自己のポリペプチド部分を
受け入れ得る。さらに、RSV遺伝子のいずれも、第二のコピーとして挿入される
ことができ、それによってキメラタンパク質を生成する際のタンパク質機能の不
活性化が耐えられる。
。例えば、感染細胞の表面およびビリオンで発現するように期待されるタンパク
質の外領域が、読み取り枠が妨げられずにキメラタンパク質を生じるようにSHOR
Fの下流末端に付加される。このような配置では、SH部分はシグナルおよび膜の
アンカーを提供し、C-末端の付加した領域は細胞外に置かれる。この方法は、SH
タンパク質は免疫予防において重要な抗原ではなくインビトロまたはインビボで
の効率的な複製に必要とされないという発見を利用している。この方法は、Flt3
を発現する細胞すなわち樹状突起細胞へウイルスを標的送達させる目的で、Flt3
リガンドなどのリガンドがビリオンの表面で発現されるような場合に特に好まれ
る。しかし、他のウイルスの遺伝子はキメラタンパク質を設計するのに用いられ
得る。例えば、Gタンパク質は容易にC-末端での欠失および挿入を受容すること
が示されており、そしてこの結果、Gタンパク質は非自己のポリペプチド部分を
受け入れ得る。さらに、RSV遺伝子のいずれも、第二のコピーとして挿入される
ことができ、それによってキメラタンパク質を生成する際のタンパク質機能の不
活性化が耐えられる。
【００７２】
本発明の代替する態様において、より望ましい表現型特徴を提供するために、
組換えウイルスは一以上の免疫活性調節因子、例えば複数のサイトカインまたは
サイトカインおよびケモカインをコードするように修飾される。しかし付加的な
側面において、一以上のRSVは、異なるサイトカイン、例えば宿主でのCTL反応を
増強するサイトカインおよびNK細胞反応を増強する他のサイトカインなどをそれ
ぞれ発現するように設計されており、そしてこれらの異なるウイルスはワクチン
の有効性を高めるために、同時にまたは調製された治療プロトコールにしたがっ
て投与され得る。
組換えウイルスは一以上の免疫活性調節因子、例えば複数のサイトカインまたは
サイトカインおよびケモカインをコードするように修飾される。しかし付加的な
側面において、一以上のRSVは、異なるサイトカイン、例えば宿主でのCTL反応を
増強するサイトカインおよびNK細胞反応を増強する他のサイトカインなどをそれ
ぞれ発現するように設計されており、そしてこれらの異なるウイルスはワクチン
の有効性を高めるために、同時にまたは調製された治療プロトコールにしたがっ
て投与され得る。
【００７３】
RSVは一般的には、外皮によって覆われた区分けされていないパラミクソウイ
ルスファミリーの負（negative）のRNAウイルス鎖として特徴付けられる（Colli
nsら, Fields Virology 2: 1313-1352, 1996, 本明細書において参照として援用
する）。そのゲノムは、既知のA2株では15,222ヌクレオチド（nt）の長さであり
、10のタンパク質をコードすることをが以前示された10のメッセンジャーRNAに
転写される（Collinsら, Fields Virology 2: 1313-1352, 1996; Atriaら, J. V
irol. 72: 1452-1461, 1988; Bukreyevら, J. Virol. 71: 8973-8982, 1997; Co
llinsら, Porch. Natl. Acad. SCI. USA 93: 81-85, 1996; TenおよびCollins,
J. Virol. 72: 5707-5716, 1998; TenおよびCollins, J. Virol. 73: 466-473,
1999: Whiteheadら, J. Virol. 73: 3438-3442, 1999, それぞれ本明細書におい
て参照として援用する）。
ルスファミリーの負（negative）のRNAウイルス鎖として特徴付けられる（Colli
nsら, Fields Virology 2: 1313-1352, 1996, 本明細書において参照として援用
する）。そのゲノムは、既知のA2株では15,222ヌクレオチド（nt）の長さであり
、10のタンパク質をコードすることをが以前示された10のメッセンジャーRNAに
転写される（Collinsら, Fields Virology 2: 1313-1352, 1996; Atriaら, J. V
irol. 72: 1452-1461, 1988; Bukreyevら, J. Virol. 71: 8973-8982, 1997; Co
llinsら, Porch. Natl. Acad. SCI. USA 93: 81-85, 1996; TenおよびCollins,
J. Virol. 72: 5707-5716, 1998; TenおよびCollins, J. Virol. 73: 466-473,
1999: Whiteheadら, J. Virol. 73: 3438-3442, 1999, それぞれ本明細書におい
て参照として援用する）。
【００７４】
現在確認されているRSVタンパク質の四つは、ヌクレオキャプシド/ポリメラー
ゼタンパク質、すなわち主要なヌクレオキャプシドNタンパク質、ホスホプロテ
インP、およびポリメラーゼタンパク質LならびにM2遺伝子内の最初の読み取り枠
（ORF）によってコードされている抗転写終結タンパク質のM2-1である。これら
のうち三つは、表面糖タンパク質、すなわち付加Gタンパク質、浸透および融合
細胞形成を担う融合F糖タンパク質ならびに機能の知られていない小さい疎水性S
Hタンパク質である。マトリックスMタンパク質は、ビリオン形成に関与する内在
ビリオンタンパク質である。二つの機能の知られていない非構造タンパク質NS1
およびNS２がある。GおよびFタンパク質は主要な中和および防御抗原である（Co
llinsら, Fields Virology 2: 1313-1352, 1996; Connorsら,J.Virol. 66: 1277
-1281, 1992）。RSVによる再感染に対する抵抗性は、これらのタンパク質に対し
て特異的な血清および粘膜の抗体によって大きく仲介される。RSV-特異的細胞障
害性T細胞は、またRSV感染によって誘導され、そして多くの異なるタンパク質に
対して示され得るが、このエフェクターが再感染に対する長期の抵抗性に重要な
貢献をすることはまだ示されていない。しかし、CD8+およびCD4+細胞のいずれも
免疫反応を調製するのに重要であり、そしていずれもウイルスの病原論に関与し
得る（Johnson,ら, J.Virol. 72: 2871-2880, 1998; SrikiatkhachornおよびBra
ciale, J. Exp. Med. 186: 421-432, 1997）。したがって、FおよびGは最も重要
な抗原性決定基であるが、他のタンパク質もまた免疫反応において重要な役割を
果たすことができる。
ゼタンパク質、すなわち主要なヌクレオキャプシドNタンパク質、ホスホプロテ
インP、およびポリメラーゼタンパク質LならびにM2遺伝子内の最初の読み取り枠
（ORF）によってコードされている抗転写終結タンパク質のM2-1である。これら
のうち三つは、表面糖タンパク質、すなわち付加Gタンパク質、浸透および融合
細胞形成を担う融合F糖タンパク質ならびに機能の知られていない小さい疎水性S
Hタンパク質である。マトリックスMタンパク質は、ビリオン形成に関与する内在
ビリオンタンパク質である。二つの機能の知られていない非構造タンパク質NS1
およびNS２がある。GおよびFタンパク質は主要な中和および防御抗原である（Co
llinsら, Fields Virology 2: 1313-1352, 1996; Connorsら,J.Virol. 66: 1277
-1281, 1992）。RSVによる再感染に対する抵抗性は、これらのタンパク質に対し
て特異的な血清および粘膜の抗体によって大きく仲介される。RSV-特異的細胞障
害性T細胞は、またRSV感染によって誘導され、そして多くの異なるタンパク質に
対して示され得るが、このエフェクターが再感染に対する長期の抵抗性に重要な
貢献をすることはまだ示されていない。しかし、CD8+およびCD4+細胞のいずれも
免疫反応を調製するのに重要であり、そしていずれもウイルスの病原論に関与し
得る（Johnson,ら, J.Virol. 72: 2871-2880, 1998; SrikiatkhachornおよびBra
ciale, J. Exp. Med. 186: 421-432, 1997）。したがって、FおよびGは最も重要
な抗原性決定基であるが、他のタンパク質もまた免疫反応において重要な役割を
果たすことができる。
【００７５】
最後に、RNA調節因子M2-2をコードするM2 ｍRNA内の第二のORFがある。M2-2
ｍRNAは他のパラミクソウイルスまたはラブドウイルスには見出されていないが
、それぞれタンパク質を発現する二つの重なりあう翻訳の読み取り枠（ORFs）を
含む（図1A）（Collinsら, J. Gen. Virol. 71: 3015-20, 1990, 本明細書にお
いて参照として援用する）。上流のORF1は、194のアミノ酸からなるM2-1タンパ
ク質をコードし、該M2-1タンパク質は、ビリオンの構造上の構成成分であり（Pe
eplesら, Virology 95: 137-45, 1979, 本明細書において参照として援用する）
、ならびに転写鎖延長を促進しおよび遺伝子接合点（junction）での読み通し頻
度を増加する抗転写終結因子である（Collinsら, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 9
3: 81-5, 1996; FearnsおよびCollins, J. Virol. 73: 5852-5864, 1999; Colli
nsら, Virology 259: 251-255, 1999: Hardyら, J. Virol. 72: 520-6, 1998,
それぞれ本明細書において参照として援用する）。A2株のORF2は、コドン1、3お
よび7に三つの可能な開始部位を有し、これらは全てORF1と重なり合う（図１A）
。これらのうちの最初のものから開始すると、90のアミノ酸から成るM2-2タンパ
ク質を与える。M2 ORF2は現在までに確認された全ての肺炎ウイルスに存在して
いる（Collinsら, J. Gen. Virol. 71: 3015-20, 1990; Lingら, J. Gen. Virol
. 73: 1709-15, 1992; Zamoraら, J. Gen.Virol. 73: 737-41, 1992, それぞれ
本明細書において参照として援用する）。無細胞系でのM2 ｍRNAの翻訳によりM2
-1タンパク質およびM2-2タンパク質となるのに適切な大きさの第二の11kDaのタ
ンパク質を生じた（Collinsら, J. Gen. Virol. 71: 3015-20, 1990）。モデル
のミニレプリコンシステムでのM2-2の共同発現は、RNA合成に対し非常に有効な
ダウンレギュレーション効果を有することが発見された（Collinsら, Proc. Nat
. Acad. Sci. USA 93: 81-5, 1996 : Hardyら, J. Virol. 72: 520-6, 1998）。
さらに最近になって、RSV M2-2タンパク質はRSV-感染細胞内のマイナーな種とし
て検出された。したがって、いくつかの証拠により、M2-2ORFは11番目のRSV遺伝
子であることが示される。しかし、ORFが重要なウイルスタンパク質をコードす
るという決定的な証拠は、感染ウイルス内のORFの発現によって仲介される生物
学的効果の確認を含む。これは、本発明の方法にしたがい、M2-2 ORFの全てまた
は部分を切除または欠失させ、そしてその結果RNAの転写および複製のバランス
内シフトを含む表現型の変化を認識することにより、M2-2に対し示される。従来
の研究により、M2-2タンパク質は一般に転写およびRNA複製をダウンレギュレー
トするということが示唆されていたが、現在では、M2-2は意外にも転写から複製
へのRNA合成のバランスをシフトさせるということが知られている（2000年7月9
日にCollinsらによって提出され、ならびに米国代理明細書（Attorney Docket）
No.015280-403100および優先権を伴う米国仮出願No.60/143,097によって確認さ
れる米国特許出願「M2 ORF2の修飾を含む弱毒化呼吸性シンシチウムウイルスワ
クチンの生成」; Berminghamら, Proc Natl, Acad. Sci. USA 96: 11259-11264,
1999; およびJinら, J. Virol. 74: 74-82, 2000（それぞれ本明細書にて参照
として援用する）を参照されたい）。
ｍRNAは他のパラミクソウイルスまたはラブドウイルスには見出されていないが
、それぞれタンパク質を発現する二つの重なりあう翻訳の読み取り枠（ORFs）を
含む（図1A）（Collinsら, J. Gen. Virol. 71: 3015-20, 1990, 本明細書にお
いて参照として援用する）。上流のORF1は、194のアミノ酸からなるM2-1タンパ
ク質をコードし、該M2-1タンパク質は、ビリオンの構造上の構成成分であり（Pe
eplesら, Virology 95: 137-45, 1979, 本明細書において参照として援用する）
、ならびに転写鎖延長を促進しおよび遺伝子接合点（junction）での読み通し頻
度を増加する抗転写終結因子である（Collinsら, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 9
3: 81-5, 1996; FearnsおよびCollins, J. Virol. 73: 5852-5864, 1999; Colli
nsら, Virology 259: 251-255, 1999: Hardyら, J. Virol. 72: 520-6, 1998,
それぞれ本明細書において参照として援用する）。A2株のORF2は、コドン1、3お
よび7に三つの可能な開始部位を有し、これらは全てORF1と重なり合う（図１A）
。これらのうちの最初のものから開始すると、90のアミノ酸から成るM2-2タンパ
ク質を与える。M2 ORF2は現在までに確認された全ての肺炎ウイルスに存在して
いる（Collinsら, J. Gen. Virol. 71: 3015-20, 1990; Lingら, J. Gen. Virol
. 73: 1709-15, 1992; Zamoraら, J. Gen.Virol. 73: 737-41, 1992, それぞれ
本明細書において参照として援用する）。無細胞系でのM2 ｍRNAの翻訳によりM2
-1タンパク質およびM2-2タンパク質となるのに適切な大きさの第二の11kDaのタ
ンパク質を生じた（Collinsら, J. Gen. Virol. 71: 3015-20, 1990）。モデル
のミニレプリコンシステムでのM2-2の共同発現は、RNA合成に対し非常に有効な
ダウンレギュレーション効果を有することが発見された（Collinsら, Proc. Nat
. Acad. Sci. USA 93: 81-5, 1996 : Hardyら, J. Virol. 72: 520-6, 1998）。
さらに最近になって、RSV M2-2タンパク質はRSV-感染細胞内のマイナーな種とし
て検出された。したがって、いくつかの証拠により、M2-2ORFは11番目のRSV遺伝
子であることが示される。しかし、ORFが重要なウイルスタンパク質をコードす
るという決定的な証拠は、感染ウイルス内のORFの発現によって仲介される生物
学的効果の確認を含む。これは、本発明の方法にしたがい、M2-2 ORFの全てまた
は部分を切除または欠失させ、そしてその結果RNAの転写および複製のバランス
内シフトを含む表現型の変化を認識することにより、M2-2に対し示される。従来
の研究により、M2-2タンパク質は一般に転写およびRNA複製をダウンレギュレー
トするということが示唆されていたが、現在では、M2-2は意外にも転写から複製
へのRNA合成のバランスをシフトさせるということが知られている（2000年7月9
日にCollinsらによって提出され、ならびに米国代理明細書（Attorney Docket）
No.015280-403100および優先権を伴う米国仮出願No.60/143,097によって確認さ
れる米国特許出願「M2 ORF2の修飾を含む弱毒化呼吸性シンシチウムウイルスワ
クチンの生成」; Berminghamら, Proc Natl, Acad. Sci. USA 96: 11259-11264,
1999; およびJinら, J. Virol. 74: 74-82, 2000（それぞれ本明細書にて参照
として援用する）を参照されたい）。
【００７６】
したがって、本発明の別の側面において、M2 ORF2の発現は、免疫活性調節因
子分子を発現するように修飾された組換えRSV内で減少または切除される。M2 OR
Fの全体または一部を欠失させまたはM2 ORF2の発現を減少もしくは切除させると
いう修飾は、結果として得られるウイルスまたはサブウイルス粒子内での望まし
い表現型変化の範囲を明らかにする。好ましい態様において、M2 ORF2欠失およ
びノックアウト突然変異体は、対応する野生-型または突然変異型親RSV株の成長
と比較して、弱毒化されたウイルスの成長を表す。例えば細胞培養での成長は、
対応する野生-型または突然変異型親RSV株の成長と比較して、約2倍、しばしば
約5倍、および好ましくは約10倍、またはそれ以上（例えば、培養内で7-8日間後
に計測すると）減少し得る。さらに詳細には、本発明の組換えRSVは、遅いウイ
ルス成長速度を表し、最初の2-5日間での成長は、対応する野生-型または突然変
異型親RSV株の成長速度と比較して約100倍および1000倍までまたはそれ以上減少
する。これらの望ましい効果はM2-2 ORF2発現の減少または欠失によって明らか
にされる。中間の効果はM2-2タンパク質合成の減少によって得られる。さらにM2
-2は調節タンパク質であるので、ウイルス成長および遺伝子発現パターンの変更
は、またM2-ORF2発現を減少させるよりむしろ増加させることにより得ることが
できる。上述のように、これは、M2-ORF2を別個の遺伝子として発現させること
によって、必要ならば遺伝子をよりプロモーター近位またはプロモーター遠位の
位置へ移動させることによって容易に達成することができる。
子分子を発現するように修飾された組換えRSV内で減少または切除される。M2 OR
Fの全体または一部を欠失させまたはM2 ORF2の発現を減少もしくは切除させると
いう修飾は、結果として得られるウイルスまたはサブウイルス粒子内での望まし
い表現型変化の範囲を明らかにする。好ましい態様において、M2 ORF2欠失およ
びノックアウト突然変異体は、対応する野生-型または突然変異型親RSV株の成長
と比較して、弱毒化されたウイルスの成長を表す。例えば細胞培養での成長は、
対応する野生-型または突然変異型親RSV株の成長と比較して、約2倍、しばしば
約5倍、および好ましくは約10倍、またはそれ以上（例えば、培養内で7-8日間後
に計測すると）減少し得る。さらに詳細には、本発明の組換えRSVは、遅いウイ
ルス成長速度を表し、最初の2-5日間での成長は、対応する野生-型または突然変
異型親RSV株の成長速度と比較して約100倍および1000倍までまたはそれ以上減少
する。これらの望ましい効果はM2-2 ORF2発現の減少または欠失によって明らか
にされる。中間の効果はM2-2タンパク質合成の減少によって得られる。さらにM2
-2は調節タンパク質であるので、ウイルス成長および遺伝子発現パターンの変更
は、またM2-ORF2発現を減少させるよりむしろ増加させることにより得ることが
できる。上述のように、これは、M2-ORF2を別個の遺伝子として発現させること
によって、必要ならば遺伝子をよりプロモーター近位またはプロモーター遠位の
位置へ移動させることによって容易に達成することができる。
【００７７】
M2 ORF2の発現は、好ましくは、M2 ORF2内にフレームシフト変異または一また
はそれ以上の終止コドンを組み込むという組換えRSVゲノムまたはアンチゲノム
の修飾よって減少または切除される。さらに本発明の詳細な側面において、M2 O
RF2は、特定のフレームシフト変異を引き起こす突然変異誘発に支配されており
、これはNdeI突然変異として上記で援用した開示において言及されている。NdeI
突然変異に対するORF2内の制限酵素部位は、ゲノム位置8299で確認され、そして
フレームシフト変異（2ヌクレオチド付加）は予想される90のアミノ酸からなる
タンパク質のコドン47にて確認された。したがって、NdeI突然変異体（組換えrA
2-NdeI株によって例示される）は、フレームシフトによってコードされる18のヘ
テロアミノ酸に融合されたM2-2のN-末端46アミノ酸をコードする。M2 ORF2ノッ
クアウト突然変異体を生じる任意のフレームシフト変異が容易に確認される。
はそれ以上の終止コドンを組み込むという組換えRSVゲノムまたはアンチゲノム
の修飾よって減少または切除される。さらに本発明の詳細な側面において、M2 O
RF2は、特定のフレームシフト変異を引き起こす突然変異誘発に支配されており
、これはNdeI突然変異として上記で援用した開示において言及されている。NdeI
突然変異に対するORF2内の制限酵素部位は、ゲノム位置8299で確認され、そして
フレームシフト変異（2ヌクレオチド付加）は予想される90のアミノ酸からなる
タンパク質のコドン47にて確認された。したがって、NdeI突然変異体（組換えrA
2-NdeI株によって例示される）は、フレームシフトによってコードされる18のヘ
テロアミノ酸に融合されたM2-2のN-末端46アミノ酸をコードする。M2 ORF2ノッ
クアウト突然変異体を生じる任意のフレームシフト変異が容易に確認される。
【００７８】
他のさらに本発明の詳細な側面において、第二の代表的なM2-2ノックアウト突
然変異であるK5突然変異がサイトカイン-表現型RSVに組み込まれ、該K5突然変異
はM2 ORF2内において三つの可能性のある開始コドンをACG終止コドンへ変化させ
ることによりM2 ORF2の発現を切除する。終止コドンはまた、復帰または非-AUG
開始（non-AUG initiation）の可能性を最小限にするために、コドン13でM2 ORF
2を終了させるORF1の終止コドンに続いて、各レジスターで付加され得る。本明
細書における代表的なM2 ORF2ノックアウト突然変異体は、上記に援用した開示
においてさらに詳述された組換えrA2-K5株である（rA2ΔM2-2としても言及され
る）。M2 ORF2発現または弱毒化したRSVワクチン候補を生じるM2-2タンパク質発
現または機能の中断を得るための他の変更は、M2-2タンパク質を部分的もしくは
完全に機能しないようにするかまたはその発現を終了させるために全体または一
部においてM2 ORF2コード配列を部分的にまたは完全に欠失させることを含む。
しかし、他のM2-ORF2発現レベルを変更する方法は、上流域のORF1と関連したそ
の翻訳開始部位またはスペーシングを変更することである。例えば、M2-ORF2は
、M2-ORF2をその遺伝子開始および遺伝子終結シグナルとともにゲノムまたはア
ンチゲノムの遺伝子間もしくは他の非コード領域へ挿入することなどにより、ゲ
ノムまたはアンチゲノム内のいずれかの座において別個の遺伝子として表現され
得る。M2-ORF2を含むこれらの代表的な操作は、本発明の組換えワクチン候補内
での他のRSV遺伝子の発現を変更または切除するために実施され得る。
然変異であるK5突然変異がサイトカイン-表現型RSVに組み込まれ、該K5突然変異
はM2 ORF2内において三つの可能性のある開始コドンをACG終止コドンへ変化させ
ることによりM2 ORF2の発現を切除する。終止コドンはまた、復帰または非-AUG
開始（non-AUG initiation）の可能性を最小限にするために、コドン13でM2 ORF
2を終了させるORF1の終止コドンに続いて、各レジスターで付加され得る。本明
細書における代表的なM2 ORF2ノックアウト突然変異体は、上記に援用した開示
においてさらに詳述された組換えrA2-K5株である（rA2ΔM2-2としても言及され
る）。M2 ORF2発現または弱毒化したRSVワクチン候補を生じるM2-2タンパク質発
現または機能の中断を得るための他の変更は、M2-2タンパク質を部分的もしくは
完全に機能しないようにするかまたはその発現を終了させるために全体または一
部においてM2 ORF2コード配列を部分的にまたは完全に欠失させることを含む。
しかし、他のM2-ORF2発現レベルを変更する方法は、上流域のORF1と関連したそ
の翻訳開始部位またはスペーシングを変更することである。例えば、M2-ORF2は
、M2-ORF2をその遺伝子開始および遺伝子終結シグナルとともにゲノムまたはア
ンチゲノムの遺伝子間もしくは他の非コード領域へ挿入することなどにより、ゲ
ノムまたはアンチゲノム内のいずれかの座において別個の遺伝子として表現され
得る。M2-ORF2を含むこれらの代表的な操作は、本発明の組換えワクチン候補内
での他のRSV遺伝子の発現を変更または切除するために実施され得る。
【００７９】
上述のように、免疫活性調節因子を発現するように設計された本発明の組換え
RSVの組換えRSVは、ワクチン開発に対し非常に望ましい表現型の特徴を有する。
代表的な態様としては、サイトカインを発現する組換えゲノムまたはアンチゲノ
ムの変更は、例えばi）細胞培養内でのウイルス成長の変化; ii）感染宿主の上
位および/または下位の呼吸器系内でのウイルスの転写減衰（attenuation）の変
化; iii）ウイルスプラークサイズの変化; および/またはvi）免疫原性の変化か
ら選択される一またはそれ以上の新規な特徴を表し、または択一的もしくは同時
に、変化した宿主反応、例えば野生-型または突然変異型親RSVと比較して増加し
た抗-RSV中和抗体反応、T-ヘルパー細胞反応、細胞障害性T細胞（CTL）反応およ
び/またはナチュラルキラー（NK）細胞反応を引き出すワクチン候補も生じる。
RSVの組換えRSVは、ワクチン開発に対し非常に望ましい表現型の特徴を有する。
代表的な態様としては、サイトカインを発現する組換えゲノムまたはアンチゲノ
ムの変更は、例えばi）細胞培養内でのウイルス成長の変化; ii）感染宿主の上
位および/または下位の呼吸器系内でのウイルスの転写減衰（attenuation）の変
化; iii）ウイルスプラークサイズの変化; および/またはvi）免疫原性の変化か
ら選択される一またはそれ以上の新規な特徴を表し、または択一的もしくは同時
に、変化した宿主反応、例えば野生-型または突然変異型親RSVと比較して増加し
た抗-RSV中和抗体反応、T-ヘルパー細胞反応、細胞障害性T細胞（CTL）反応およ
び/またはナチュラルキラー（NK）細胞反応を引き出すワクチン候補も生じる。
【００８０】
本発明の好ましい側面において、組換えRSVは高レベルの誘導されたサイトカ
インまたは他の免疫活性調節因子を発現し、例えば2.5マイクログラム/mlまで感
染組織培養細胞培地内で計測される。組換えウイルスは、インビトロおよびイン
ビボで弱毒化され（それらはワクチン摂取された被験者において野生-型RSVに対
し高レベルの防御有効性を示すが）、減少しないまたはより典型的には増加した
ウイルス抗原レベルを発現し、一方でまた弱毒化した表現型を表すように設計さ
れている。したがって免疫原性ポテンシャルは、減少しないまたは増加したmRNA
転写および抗原発現のために維持され、一方で弱毒化はRNA複製およびウイルス
成長の同時減少によって達成される。この新規な揃いの表現型の特徴は、ワクチ
ン開発に非常に望ましい。免疫活性調節因子を発現するように設計された組換え
RSVで観察される他の有用な表現型変化は、プラークサイズの変化および対応す
る野生-型または突然変異型親RSV株と比較して変化した細胞病原性を含む。
インまたは他の免疫活性調節因子を発現し、例えば2.5マイクログラム/mlまで感
染組織培養細胞培地内で計測される。組換えウイルスは、インビトロおよびイン
ビボで弱毒化され（それらはワクチン摂取された被験者において野生-型RSVに対
し高レベルの防御有効性を示すが）、減少しないまたはより典型的には増加した
ウイルス抗原レベルを発現し、一方でまた弱毒化した表現型を表すように設計さ
れている。したがって免疫原性ポテンシャルは、減少しないまたは増加したmRNA
転写および抗原発現のために維持され、一方で弱毒化はRNA複製およびウイルス
成長の同時減少によって達成される。この新規な揃いの表現型の特徴は、ワクチ
ン開発に非常に望ましい。免疫活性調節因子を発現するように設計された組換え
RSVで観察される他の有用な表現型変化は、プラークサイズの変化および対応す
る野生-型または突然変異型親RSV株と比較して変化した細胞病原性を含む。
【００８１】
追加の好ましい態様においては、免疫活性調節因子を発現するように設計され
た組換えRSVは、対応する野生-型または突然変異型親RSV株の成長および弱毒化
と比較して、培養内での弱毒化されたウイルス成長およびインビボでの弱毒化を
表す。例えば細胞培養内での成長は、約2倍、しばしば約5倍、および好ましくは
約10倍から20倍、またはそれ以上（例えば、培養内で7-8日間後に計測すると）
減少し、およびインビボでの複製は、対応する野生-型または突然変異型親RSV株
の成長および複製と比較して、比較できるほどに減少する（attenuated）。さら
に詳細な側面において、本発明の組換えRSVは、遅いウイルス成長速度を表し、
最初の2-5日間での成長は対応する野生-型または突然変異型親RSV株の成長速度
と比較して、約100倍および1000倍までまたはそれ以上減少する。他の側面にお
いて、組換えウイルスは増加した抗原発現を表す。最も好ましい本発明の側面に
おいて、免疫活性調節因子を発現するように設計された組換えRSVは著しく弱毒
化されるが、高い免疫原性を示し、およびワクチン摂取された宿主内のRSVに対
し強い防御免疫反応を発揮する。
た組換えRSVは、対応する野生-型または突然変異型親RSV株の成長および弱毒化
と比較して、培養内での弱毒化されたウイルス成長およびインビボでの弱毒化を
表す。例えば細胞培養内での成長は、約2倍、しばしば約5倍、および好ましくは
約10倍から20倍、またはそれ以上（例えば、培養内で7-8日間後に計測すると）
減少し、およびインビボでの複製は、対応する野生-型または突然変異型親RSV株
の成長および複製と比較して、比較できるほどに減少する（attenuated）。さら
に詳細な側面において、本発明の組換えRSVは、遅いウイルス成長速度を表し、
最初の2-5日間での成長は対応する野生-型または突然変異型親RSV株の成長速度
と比較して、約100倍および1000倍までまたはそれ以上減少する。他の側面にお
いて、組換えウイルスは増加した抗原発現を表す。最も好ましい本発明の側面に
おいて、免疫活性調節因子を発現するように設計された組換えRSVは著しく弱毒
化されるが、高い免疫原性を示し、およびワクチン摂取された宿主内のRSVに対
し強い防御免疫反応を発揮する。
【００８２】
本発明は、一またはそれ以上の免疫活性調節因子分子を発現する弱毒化した生
RSVワクチン候補の開発を提供する。これらの組換えウイルスは、cDNA中間体お
よびcDNA-ベースの回復システムを介して設計される。cDNAから調製される組換
えウイルスは独立して複製し、あたかも生物由来かのように同様な方法で繁殖す
る。望ましい構造上のまたは表現型の影響を生じるための様々な他の突然変異お
よびヌクレオチド修飾と同様、追加の転写減衰（attenuating）突然変異を組み
込むように、本発明の組換えRSVはさらに修飾され得る。
RSVワクチン候補の開発を提供する。これらの組換えウイルスは、cDNA中間体お
よびcDNA-ベースの回復システムを介して設計される。cDNAから調製される組換
えウイルスは独立して複製し、あたかも生物由来かのように同様な方法で繁殖す
る。望ましい構造上のまたは表現型の影響を生じるための様々な他の突然変異お
よびヌクレオチド修飾と同様、追加の転写減衰（attenuating）突然変異を組み
込むように、本発明の組換えRSVはさらに修飾され得る。
【００８３】
本発明の追加の側面として、本明細書において開示されたcDNAから組換えRSV
を生成するための物質および方法、ならびに全範囲の突然変異およびヌクレオチ
ドの修飾の作成およびテストについての詳細は、以下に述べられている。例えば
、1995年9月27日に提出された米国特許仮出願No.60/007,083; 1996年9月27日に
提出された米国特許出願No.08/720,132; 1996年7月15日に提出された米国特許仮
出願No.60/021,773; 1997年5月9日に提出された米国特許仮出願No.60/046,141;
1997年5月23日に提出された米国特許仮出願No.60/047,634; 1999年11月30日に発
行された米国特許No.5,993,824（国際公開公報、国際公開番号98/02530に対応す
る）; 1999年4月13日にCollinsらによって提出された米国特許出願No.09/291,89
4; 1999年4月13日にMurphyらによって提出された米国特許仮出願No.60/129,006;
Croweら, Vaccine 12: 691-699, 1994; およびCroweら, Vaccine 12: 783-790,
1994; Collinsら, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 92: 11563-11567,1995; Bukrey
evら, J. Virol. 70: 6634-41, 1996, Juhasz ら, J. Virol. 71(8): 5814-5819
, 1997; Dubrinら, Virology 235: 323-332, 1997; Karron ら, J. Infect. Dis
. 176: 1428-1436, 1997; Heら, Virology 237: 249-260, 1997; Baronら J.Vir
ol. 71: 1265-1271, 1997; Whiteheadら, Virology 247(2): 232-9, 1998a; Whi
teheadら, J. Virol. 72(5): 4467-4471 1998b ; Jinら, Virology 251: 206-21
4, 1998; Bukreyevら, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 96: 2367-2372, 1999; Berm
inghamおよびCollins, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 11259-11264, 1999; J
uhaszら, Vaccine 17: 1416-1424, 1999; Juhaszら, J. Virol. 73: 5176-5180,
1999; Teng およびCollins, J. Virol. 73: 466-473, 1999; Whiteheadら, J.
Virol. 73: 9773-9780, 1999; Whiteheadら, J. Virol. 73: 871-877, 1999; お
よびWhiteheadら, J. Virol. 73: 3438-3442, 1999; したがって前記参考文献の
それぞれは、本明細書全体において全目的に対し参照として援用される。
を生成するための物質および方法、ならびに全範囲の突然変異およびヌクレオチ
ドの修飾の作成およびテストについての詳細は、以下に述べられている。例えば
、1995年9月27日に提出された米国特許仮出願No.60/007,083; 1996年9月27日に
提出された米国特許出願No.08/720,132; 1996年7月15日に提出された米国特許仮
出願No.60/021,773; 1997年5月9日に提出された米国特許仮出願No.60/046,141;
1997年5月23日に提出された米国特許仮出願No.60/047,634; 1999年11月30日に発
行された米国特許No.5,993,824（国際公開公報、国際公開番号98/02530に対応す
る）; 1999年4月13日にCollinsらによって提出された米国特許出願No.09/291,89
4; 1999年4月13日にMurphyらによって提出された米国特許仮出願No.60/129,006;
Croweら, Vaccine 12: 691-699, 1994; およびCroweら, Vaccine 12: 783-790,
1994; Collinsら, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 92: 11563-11567,1995; Bukrey
evら, J. Virol. 70: 6634-41, 1996, Juhasz ら, J. Virol. 71(8): 5814-5819
, 1997; Dubrinら, Virology 235: 323-332, 1997; Karron ら, J. Infect. Dis
. 176: 1428-1436, 1997; Heら, Virology 237: 249-260, 1997; Baronら J.Vir
ol. 71: 1265-1271, 1997; Whiteheadら, Virology 247(2): 232-9, 1998a; Whi
teheadら, J. Virol. 72(5): 4467-4471 1998b ; Jinら, Virology 251: 206-21
4, 1998; Bukreyevら, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 96: 2367-2372, 1999; Berm
inghamおよびCollins, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 11259-11264, 1999; J
uhaszら, Vaccine 17: 1416-1424, 1999; Juhaszら, J. Virol. 73: 5176-5180,
1999; Teng およびCollins, J. Virol. 73: 466-473, 1999; Whiteheadら, J.
Virol. 73: 9773-9780, 1999; Whiteheadら, J. Virol. 73: 871-877, 1999; お
よびWhiteheadら, J. Virol. 73: 3438-3442, 1999; したがって前記参考文献の
それぞれは、本明細書全体において全目的に対し参照として援用される。
【００８４】
cDNAから組換えRSVを生成するための代表的な方法は、典型的に組織培養細胞
へ同時移入されたプラスミドからの、RSVアンチゲノムRNAならびにRSV N、P、M2
-1およびLタンパク質の細胞間の同時発現を含む。これにより、組換えウイルス
と名づけられる感染性cDNA由来ウイルスの生成を生じる生産的な感染が起こる。
一度生成されると、組換えRSVは容易に生物由来ウイルスと同様の方法で繁殖し
、そしてもし前者がマーカーとして一またはそれ以上の導入された変化を含むよ
うに修飾されていなかったならば、組換えウイルスと対照となる生物由来ウイル
スとは判別できない。
へ同時移入されたプラスミドからの、RSVアンチゲノムRNAならびにRSV N、P、M2
-1およびLタンパク質の細胞間の同時発現を含む。これにより、組換えウイルス
と名づけられる感染性cDNA由来ウイルスの生成を生じる生産的な感染が起こる。
一度生成されると、組換えRSVは容易に生物由来ウイルスと同様の方法で繁殖し
、そしてもし前者がマーカーとして一またはそれ以上の導入された変化を含むよ
うに修飾されていなかったならば、組換えウイルスと対照となる生物由来ウイル
スとは判別できない。
【００８５】
cDNAから感染性RSVを生成するための能力は、cDNA中間体を介して感染性ウイ
ルスへ前もって決められた変化を導入するための方法を提供する。この方法によ
り広範囲の感染性弱毒化RSV誘導体、例えば、ウイルスタンパク質内に一または
それ以上のアミノ酸置換、一もしくはそれ以上の遺伝子欠失または遺伝子発現の
切除および/またはウイルス表現型に望ましい効果をもたらすシス-アクティング
（cis-acting）RNAシグナルでの一またはそれ以上のヌクレオチドの置換を有す
る組換えワクチン候補の生成が示された（例えばBukreyevら,J. Virol. 71: 897
3-8982, 1997; Whiteheadら, J. Virol. 72: 4467-4471,1998; Whiteheadら, Vi
rology 247: 232-239, 1998; BerminghamおよびCollins, Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 96: 11259-11264, 1999; Juhaszら, Vaccine 17: 1416-1424,1999; Juha
sz ら, J. Virol. 73: 5176-5180, 1999; Teng およびCollins, J. Virol. 73:
466-473, 1999; Whiteheadら, J. Virol. 73: 871-877, 1999; Whiteheadら, J.
Virol. 73: 3438-3442, 1999; およびCollinsら, Adv. Virus Res. 54: 423-45
1, 1999（それぞれは本明細書において参照として援用される）を参照されたい
）。
ルスへ前もって決められた変化を導入するための方法を提供する。この方法によ
り広範囲の感染性弱毒化RSV誘導体、例えば、ウイルスタンパク質内に一または
それ以上のアミノ酸置換、一もしくはそれ以上の遺伝子欠失または遺伝子発現の
切除および/またはウイルス表現型に望ましい効果をもたらすシス-アクティング
（cis-acting）RNAシグナルでの一またはそれ以上のヌクレオチドの置換を有す
る組換えワクチン候補の生成が示された（例えばBukreyevら,J. Virol. 71: 897
3-8982, 1997; Whiteheadら, J. Virol. 72: 4467-4471,1998; Whiteheadら, Vi
rology 247: 232-239, 1998; BerminghamおよびCollins, Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 96: 11259-11264, 1999; Juhaszら, Vaccine 17: 1416-1424,1999; Juha
sz ら, J. Virol. 73: 5176-5180, 1999; Teng およびCollins, J. Virol. 73:
466-473, 1999; Whiteheadら, J. Virol. 73: 871-877, 1999; Whiteheadら, J.
Virol. 73: 3438-3442, 1999; およびCollinsら, Adv. Virus Res. 54: 423-45
1, 1999（それぞれは本明細書において参照として援用される）を参照されたい
）。
【００８６】
前記は、弱毒化した突然変異体株（例えば、温度感受性（ts）、低温通過（co
ld passaged）（cp）低温受容（ca）、小プラーク（sp）および宿主域制限（hr
）突然変異体株）を得るために、本発明の範囲内においてRSVの突然変異誘発、
単離および特徴づけのための、ならびに弱毒化した表現型を明らかにする遺伝子
変化を確認するための有用な方法および手順の代表例である。これらの方法とと
もに、前記文献は複製、免疫原性、遺伝子安定性ならびに生物由来および組換え
技術によって生成した弱毒化ヒトRSV（マウスおよび非-ヒト霊長類モデルシステ
ムを含む受容されたモデルシステムでのヒトRSV AおよびBのサブグループを含む
）の防御有効性を決定するための手順について詳述する。さらにこれらの文献は
、RSV感染の予防および治療のための、一価および二価のワクチンを含む免疫原
組成の開発ならびに試験の一般的な方法について記載する。
ld passaged）（cp）低温受容（ca）、小プラーク（sp）および宿主域制限（hr
）突然変異体株）を得るために、本発明の範囲内においてRSVの突然変異誘発、
単離および特徴づけのための、ならびに弱毒化した表現型を明らかにする遺伝子
変化を確認するための有用な方法および手順の代表例である。これらの方法とと
もに、前記文献は複製、免疫原性、遺伝子安定性ならびに生物由来および組換え
技術によって生成した弱毒化ヒトRSV（マウスおよび非-ヒト霊長類モデルシステ
ムを含む受容されたモデルシステムでのヒトRSV AおよびBのサブグループを含む
）の防御有効性を決定するための手順について詳述する。さらにこれらの文献は
、RSV感染の予防および治療のための、一価および二価のワクチンを含む免疫原
組成の開発ならびに試験の一般的な方法について記載する。
【００８７】
不可欠のRSVタンパク質と同時に発現するRSVゲノムまたはアンチゲノムをコー
ドするcDNAの設計および発現によって感染性組換えRSVを生成する方法は、上記
に援用した文献にもまた記載されている（例えば1995年9月27日に提出された米
国特許仮出願No.60/007,083; 1996年9月27日に提出された米国特許出願No.08/72
0,132; 1996年7月15日に提出された米国特許仮出願No.60/021,773; 1997年5月9
日に提出された米国特許仮出願No.60/046,141; 1997年5月23日に提出された米国
特許仮出願No.60/047,634: 1997年7月15日に提出された米国特許出願No.08/892,
403（国際公開公報、国際公開番号98/02530に対応する）; （それぞれ本明細書
において参照として援用される）を参照されたい）。
ドするcDNAの設計および発現によって感染性組換えRSVを生成する方法は、上記
に援用した文献にもまた記載されている（例えば1995年9月27日に提出された米
国特許仮出願No.60/007,083; 1996年9月27日に提出された米国特許出願No.08/72
0,132; 1996年7月15日に提出された米国特許仮出願No.60/021,773; 1997年5月9
日に提出された米国特許仮出願No.60/046,141; 1997年5月23日に提出された米国
特許仮出願No.60/047,634: 1997年7月15日に提出された米国特許出願No.08/892,
403（国際公開公報、国際公開番号98/02530に対応する）; （それぞれ本明細書
において参照として援用される）を参照されたい）。
【００８８】
また、生物-由来RSV突然変異体、例えばcpts RSV 248（ATCC VR 2450）、cpts
RSV 248/404（ATCC VR 2454）、cpts RSV 248/955（ATCC VR 2453）、cpts RSV
530（ATCC VR 2452）、cpts RSV 530/1009（ATCC VR 2451）、cpts RSV 530/10
30（ATCC VR 2455）、RSV B-1 cp52/2B5（ATCC VR 2542） およびRSV B-1 cp-23
（ATCC VR 2579）を示す生物由来RSV突然変異体から組換えRSVで採用されるcpお
よびts突然変異で確認される表現型-特異的突然変異を組み込むように修飾され
る感染性組換えRSVの設計および評価方法も開示される。したがって、提供され
る組換えRSVは、同じまたは異なる生物由来RSV突然変異体、例えば一またはそれ
以上の248/404、530/1009または530/1030生物突然変異体からの一、ニまたはそ
れ以上のts突然変異を組み込み得る。後者においては、多数の弱毒化した組換え
体は、ニ、三またはそれ以上の生物突然変異体からの転写減衰（attenuating）
突然変異の組み合わせ、例えばRSV突然変異体である530/1009/404、248/404/100
9、248/404/1030または248/404/1009/1030突然変異体からの転写減衰（attenuat
ing）突然変異の組み合わせを有し得る。代表的な態様において、一またはそれ
以上の転写減衰（attenuating）突然変異は、RSVポリメラーゼ遺伝子内のアミノ
酸Phe521、Gln831、Met1169またはTyr1321での温度-感受性置換または遺伝子M2
の遺伝子-開始配列内の温度-感受性ヌクレオチド置換を明らかにする。代表的な
態様において、これらの突然変異は、一またはそれ以上の、生物由来突然変異体
RSVのL遺伝子で確認される次にあげる変化とともに、同一のまたは従来の変化を
含む; Asn43に対しIle、Phe521に対しLeu、Gln831に対しLeu、Met1169に対しVal
およびTyr1321に対しAsn。
RSV 248/404（ATCC VR 2454）、cpts RSV 248/955（ATCC VR 2453）、cpts RSV
530（ATCC VR 2452）、cpts RSV 530/1009（ATCC VR 2451）、cpts RSV 530/10
30（ATCC VR 2455）、RSV B-1 cp52/2B5（ATCC VR 2542） およびRSV B-1 cp-23
（ATCC VR 2579）を示す生物由来RSV突然変異体から組換えRSVで採用されるcpお
よびts突然変異で確認される表現型-特異的突然変異を組み込むように修飾され
る感染性組換えRSVの設計および評価方法も開示される。したがって、提供され
る組換えRSVは、同じまたは異なる生物由来RSV突然変異体、例えば一またはそれ
以上の248/404、530/1009または530/1030生物突然変異体からの一、ニまたはそ
れ以上のts突然変異を組み込み得る。後者においては、多数の弱毒化した組換え
体は、ニ、三またはそれ以上の生物突然変異体からの転写減衰（attenuating）
突然変異の組み合わせ、例えばRSV突然変異体である530/1009/404、248/404/100
9、248/404/1030または248/404/1009/1030突然変異体からの転写減衰（attenuat
ing）突然変異の組み合わせを有し得る。代表的な態様において、一またはそれ
以上の転写減衰（attenuating）突然変異は、RSVポリメラーゼ遺伝子内のアミノ
酸Phe521、Gln831、Met1169またはTyr1321での温度-感受性置換または遺伝子M2
の遺伝子-開始配列内の温度-感受性ヌクレオチド置換を明らかにする。代表的な
態様において、これらの突然変異は、一またはそれ以上の、生物由来突然変異体
RSVのL遺伝子で確認される次にあげる変化とともに、同一のまたは従来の変化を
含む; Asn43に対しIle、Phe521に対しLeu、Gln831に対しLeu、Met1169に対しVal
およびTyr1321に対しAsn。
【００８９】
最近開発された本発明の態様の一つにおいて、RSV突然変異体 cpts248/955の
配列が、最初の29ヌクレオチド（ゲノムの3'-末端）および最後の33ヌクレオチ
ド（ゲノムの5'-末端）を除いて決定された。その後、該配列と親ウイルスのcpt
s248の配列とが比較された。突然変異体ウイルス cpts248/955は、次にあげる突
然変異ばかりでなくcpts248内で従来より確認されている全ての突然変異を含ん
だ: 1. ヌクレオチド3236のP遺伝子-末端シグナルでのA残基の挿入。これにより
、7A'から8A'までのポリ-Aトラクトが増加する。これは、組換えRSV rA2ウイル
スの調製において以前観察された挿入と同じであり、該挿入によりマウスの複製
レベルは変化しなかった。2. cpRSVヌクレオチド（nt）8626でのAからUへの突然
変異によるLポリメラーゼの43アミノ酸のAsnからIleへの突然変異。それゆえcpt
s248/955表現型はヌクレオチド8626でのミスセンス変異によると考えられている
。これは、RSV530、1030、1009および248突然変異体に対する従来の所見と整合
的である。
配列が、最初の29ヌクレオチド（ゲノムの3'-末端）および最後の33ヌクレオチ
ド（ゲノムの5'-末端）を除いて決定された。その後、該配列と親ウイルスのcpt
s248の配列とが比較された。突然変異体ウイルス cpts248/955は、次にあげる突
然変異ばかりでなくcpts248内で従来より確認されている全ての突然変異を含ん
だ: 1. ヌクレオチド3236のP遺伝子-末端シグナルでのA残基の挿入。これにより
、7A'から8A'までのポリ-Aトラクトが増加する。これは、組換えRSV rA2ウイル
スの調製において以前観察された挿入と同じであり、該挿入によりマウスの複製
レベルは変化しなかった。2. cpRSVヌクレオチド（nt）8626でのAからUへの突然
変異によるLポリメラーゼの43アミノ酸のAsnからIleへの突然変異。それゆえcpt
s248/955表現型はヌクレオチド8626でのミスセンス変異によると考えられている
。これは、RSV530、1030、1009および248突然変異体に対する従来の所見と整合
的である。
【００９０】
しかし免疫活性調節因子を発現するように設計された組換えRSVに組み込まれ
られ得る追加の突然変異は、例えばヘテロRSVまたはより遠位に関連する負のRNA
鎖（distantly related negative stranded RNA）ウイルスで確認される転写減
衰（attenuating）突然変異である。特に、一つの負のRNA鎖（negative strande
d RNA）ウイルスで確認される転写減衰（attenuating）および他の望ましい突然
変異は、M2 ORF2の欠失およびノックアウト突然変異体のゲノムまたはアンチゲ
ノム内の対応する位置へ"転移"、例えば複写され得る。簡単に言うと、一つのヘ
テロな負のRNA鎖（negative stranded RNA）ウイルスでの望ましい突然変異は、
RSV宿主（例えば、それぞれウシまたはヒトRSVである）へ転移される。これは、
ヘテロウイルス内の突然変異の位置を決め、その結果、配列によって宿主RSV内
の対応する位置を認識すること、およびRSV宿主の生来の配列を突然変異体遺伝
子型へ変異させること（同一または従来の突然変異のいずれかによる）を含む。
これについては2000年4月12日に提出された国際出願No.PCT/US00/09695および対
応する優先権を伴う米国特許仮出願通しNo.60/129,006（それぞれ本明細書にお
いて参照として援用される）に記載されている。これらの開示が教えるところに
よると、ヘテロ突然変異体ウイルスで確認される変化に従来より対応する突然変
異の対象となる位置での変化をコードするように、宿主ゲノムまたはアンチゲノ
ムを修飾するのが好ましい。例えば、もしアミノ酸置換が、対応する野生-型の
配列に比較して突然変異体ウイルスでの突然変異の位置を示すならば、同様の置
換が組換えウイルス内の対応する残基で起こるであろう。好ましくは、置換は突
然変異体ウイルスタンパク質に存在する置換残基に対する同一または従来のアミ
ノ酸を含む。しかし、突然変異体タンパク質内の置換残基に関して、従来とは異
なり（non-conservatively）突然変異の位置で生来のアミノ酸残基を変更するこ
ともまた可能である（例えば野生-型残基の機能を破壊または損なうために他の
アミノ酸を使用することなどによる）。負のRNA鎖（Negative Stranded）ウイル
スであって、該負のRNA鎖（Negative Stranded）ウイルスから代表的な突然変異
が確認され、本発明の組換えRSVに転移される上記負のRNA鎖（Negative Strande
d）ウイルスは、他のRSVs（例えばマウス）、PIV、センダイウイルス（SeV）、
ニューカッスル病ウイルス（NDV）、シミアンウイルス5（SV5）、麻疹ウイルス
（MeV）、牛疫ウイルス、イヌのジステンパーウイルス（CDV）、狂犬病ウイルス
（RaV）および小胞性口内炎ウイルス（VSV）を含む。様々な代表的な突然変異が
開示され、該突然変異にはRSV Lタンパク質の521の位置でのフェニルアラニンの
アミノ酸置換（HPIV3 Lタンパク質の456の位置でのフェニルアラニンの置換に対
応する）が含まれるが、これに限定されない。欠失または挿入によって示される
突然変異の場合は、組換えウイルスへの対応する欠失または挿入として導入され
るが、欠失されまたは挿入されるタンパク質フラグメントの特定の大きさおよび
アミノ酸配列は変化し得る。
られ得る追加の突然変異は、例えばヘテロRSVまたはより遠位に関連する負のRNA
鎖（distantly related negative stranded RNA）ウイルスで確認される転写減
衰（attenuating）突然変異である。特に、一つの負のRNA鎖（negative strande
d RNA）ウイルスで確認される転写減衰（attenuating）および他の望ましい突然
変異は、M2 ORF2の欠失およびノックアウト突然変異体のゲノムまたはアンチゲ
ノム内の対応する位置へ"転移"、例えば複写され得る。簡単に言うと、一つのヘ
テロな負のRNA鎖（negative stranded RNA）ウイルスでの望ましい突然変異は、
RSV宿主（例えば、それぞれウシまたはヒトRSVである）へ転移される。これは、
ヘテロウイルス内の突然変異の位置を決め、その結果、配列によって宿主RSV内
の対応する位置を認識すること、およびRSV宿主の生来の配列を突然変異体遺伝
子型へ変異させること（同一または従来の突然変異のいずれかによる）を含む。
これについては2000年4月12日に提出された国際出願No.PCT/US00/09695および対
応する優先権を伴う米国特許仮出願通しNo.60/129,006（それぞれ本明細書にお
いて参照として援用される）に記載されている。これらの開示が教えるところに
よると、ヘテロ突然変異体ウイルスで確認される変化に従来より対応する突然変
異の対象となる位置での変化をコードするように、宿主ゲノムまたはアンチゲノ
ムを修飾するのが好ましい。例えば、もしアミノ酸置換が、対応する野生-型の
配列に比較して突然変異体ウイルスでの突然変異の位置を示すならば、同様の置
換が組換えウイルス内の対応する残基で起こるであろう。好ましくは、置換は突
然変異体ウイルスタンパク質に存在する置換残基に対する同一または従来のアミ
ノ酸を含む。しかし、突然変異体タンパク質内の置換残基に関して、従来とは異
なり（non-conservatively）突然変異の位置で生来のアミノ酸残基を変更するこ
ともまた可能である（例えば野生-型残基の機能を破壊または損なうために他の
アミノ酸を使用することなどによる）。負のRNA鎖（Negative Stranded）ウイル
スであって、該負のRNA鎖（Negative Stranded）ウイルスから代表的な突然変異
が確認され、本発明の組換えRSVに転移される上記負のRNA鎖（Negative Strande
d）ウイルスは、他のRSVs（例えばマウス）、PIV、センダイウイルス（SeV）、
ニューカッスル病ウイルス（NDV）、シミアンウイルス5（SV5）、麻疹ウイルス
（MeV）、牛疫ウイルス、イヌのジステンパーウイルス（CDV）、狂犬病ウイルス
（RaV）および小胞性口内炎ウイルス（VSV）を含む。様々な代表的な突然変異が
開示され、該突然変異にはRSV Lタンパク質の521の位置でのフェニルアラニンの
アミノ酸置換（HPIV3 Lタンパク質の456の位置でのフェニルアラニンの置換に対
応する）が含まれるが、これに限定されない。欠失または挿入によって示される
突然変異の場合は、組換えウイルスへの対応する欠失または挿入として導入され
るが、欠失されまたは挿入されるタンパク質フラグメントの特定の大きさおよび
アミノ酸配列は変化し得る。
【００９１】
様々な追加のタイプの突然変異もまた前記援用した参考文献で開示され、該突
然変異は、弱毒化、免疫原性および/または他の有利な構造上および/または表現
型の効果を調節すべく、本発明の組換えRSVへ容易に設計され得る。例えば、制
限部位マーカーは、cDNAの設計および操作を容易にすべく組換えアンチゲノムま
たはゲノム内に型通りに導入される。本発明のおいて有用な点または部位-特異
的な突然変異以外の広範囲なヌクレオチドの修飾についても、援用した参考文献
中に記載されている。例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ（CAT）またはルシフェラーゼ遺伝子などの追加の非自己遺伝子を発現する組
換えRSVの生成方法および組成が開示される。このような組換え体は、一般に挿
入された遺伝子と関連した減少した成長を表す。この弱毒化は挿入された遺伝子
の長さの増加とともに増加するように思われる。組換えRSVへの非自己遺伝子の
挿入は複製レベルを減少させ、およびインビトロでの継代中安定であるという発
見により、ワクチン使用のためのRSV弱毒化の別な効果的な方法が提供される。
然変異は、弱毒化、免疫原性および/または他の有利な構造上および/または表現
型の効果を調節すべく、本発明の組換えRSVへ容易に設計され得る。例えば、制
限部位マーカーは、cDNAの設計および操作を容易にすべく組換えアンチゲノムま
たはゲノム内に型通りに導入される。本発明のおいて有用な点または部位-特異
的な突然変異以外の広範囲なヌクレオチドの修飾についても、援用した参考文献
中に記載されている。例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ（CAT）またはルシフェラーゼ遺伝子などの追加の非自己遺伝子を発現する組
換えRSVの生成方法および組成が開示される。このような組換え体は、一般に挿
入された遺伝子と関連した減少した成長を表す。この弱毒化は挿入された遺伝子
の長さの増加とともに増加するように思われる。組換えRSVへの非自己遺伝子の
挿入は複製レベルを減少させ、およびインビトロでの継代中安定であるという発
見により、ワクチン使用のためのRSV弱毒化の別な効果的な方法が提供される。
【００９２】
本発明の組換え体RSV中への包含のための前述の参考文献に開示された更に別
のヌクレオチド修飾には、一つまたはそれ以上の非必須（例えば、複製および／
または感染力のための）RSV遺伝子またはゲノムセグメントの部分的または完全
な欠失または削除が含まれる。RSV遺伝子またはゲノムセグメントは、欠失して
いてよく、RSV NS1、NS2、N、P、M、G、F、SH、M2 ORF1、M2 ORF2および／また
はL遺伝子の読み取り枠および／またはシス作用性調節配列の部分的なまたは完
全な欠失が含まれる。本発明のこの側面の範囲内で、ヌクレオチド修飾は、ある
選択された遺伝子を欠失または沈黙させて、in vitro では充分に複製するが、i
n vivoでの複製については弱毒化される組換え体ワクチン候補を得るように遺伝
子操作することができる（Bukreyev et al., J.Virol. 71:8973-8982,1997; 23]
Teng et al., J.Virol. 73:466-473,1999; それぞれ、本明細書中に援用される
）。例えば、SH遺伝子の欠失は、rA2ΔSHによって示されるウイルスを生じるが
、これは、in vitro において野生型rRSV（rA2）の場合に等しいまたはそれより
僅かに大きい効率で複製し、マウスおよびチンパンジーにおいて中程度に弱毒化
される（Bukreyev et al., J.Virol. 71:8973-8982,1997; Whitehead et al., J
.Virol. 73:3438-3442,1999; それぞれ、本明細書中に援用される）。NS2遺伝子
が欠失している、rA2ΔNS2と称される組換え体RSVは、in vitro において感染性
ウイルスの減少した成長速度および減少した収量を示し、マウスおよびチンパン
ジーにおいて著しく弱毒化される（Teng et al., J.Virol. 73:466-473,1999; W
hitehead et al., J.Virol. 73:3438-3442,1999; それぞれ、本明細書中に援用
される）。同様の in vitro 性状は、NS2遺伝子が欠失している組換え体ウシRSV
について開示されている（Buchholz et al., J.Virol. 73:251-259,1999; 本明
細書中に援用される）。
のヌクレオチド修飾には、一つまたはそれ以上の非必須（例えば、複製および／
または感染力のための）RSV遺伝子またはゲノムセグメントの部分的または完全
な欠失または削除が含まれる。RSV遺伝子またはゲノムセグメントは、欠失して
いてよく、RSV NS1、NS2、N、P、M、G、F、SH、M2 ORF1、M2 ORF2および／また
はL遺伝子の読み取り枠および／またはシス作用性調節配列の部分的なまたは完
全な欠失が含まれる。本発明のこの側面の範囲内で、ヌクレオチド修飾は、ある
選択された遺伝子を欠失または沈黙させて、in vitro では充分に複製するが、i
n vivoでの複製については弱毒化される組換え体ワクチン候補を得るように遺伝
子操作することができる（Bukreyev et al., J.Virol. 71:8973-8982,1997; 23]
Teng et al., J.Virol. 73:466-473,1999; それぞれ、本明細書中に援用される
）。例えば、SH遺伝子の欠失は、rA2ΔSHによって示されるウイルスを生じるが
、これは、in vitro において野生型rRSV（rA2）の場合に等しいまたはそれより
僅かに大きい効率で複製し、マウスおよびチンパンジーにおいて中程度に弱毒化
される（Bukreyev et al., J.Virol. 71:8973-8982,1997; Whitehead et al., J
.Virol. 73:3438-3442,1999; それぞれ、本明細書中に援用される）。NS2遺伝子
が欠失している、rA2ΔNS2と称される組換え体RSVは、in vitro において感染性
ウイルスの減少した成長速度および減少した収量を示し、マウスおよびチンパン
ジーにおいて著しく弱毒化される（Teng et al., J.Virol. 73:466-473,1999; W
hitehead et al., J.Virol. 73:3438-3442,1999; それぞれ、本明細書中に援用
される）。同様の in vitro 性状は、NS2遺伝子が欠失している組換え体ウシRSV
について開示されている（Buchholz et al., J.Virol. 73:251-259,1999; 本明
細書中に援用される）。
【００９３】
一つの実施例において、SH遺伝子の発現が、SH mRNAおよびタンパク質をコー
ドしているポリヌクレオチド配列の除去によって削除された組換え体RSVを生じ
た。SH遺伝子の欠失は、回収可能な感染性RSVのみならず、感染性ウイルスの収
量およびプラークサイズの両方に基づく、組織培養中での実質的に改善された成
長を示すものも生じた。SH欠失によって規定される組織培養中のこの改善された
成長は、例えば、培養物中の不充分なRSV収量の問題を克服することによって、
免疫モジュレーターを発現するように遺伝子操作されたRSVワクチンウイルスを
開発するのに有用な手段を提供する。更に、これら欠失は、遺伝子復帰に対して
極めて安定であり、それに由来するRSVクローンをワクチン薬として特に有用に
させる。
ドしているポリヌクレオチド配列の除去によって削除された組換え体RSVを生じ
た。SH遺伝子の欠失は、回収可能な感染性RSVのみならず、感染性ウイルスの収
量およびプラークサイズの両方に基づく、組織培養中での実質的に改善された成
長を示すものも生じた。SH欠失によって規定される組織培養中のこの改善された
成長は、例えば、培養物中の不充分なRSV収量の問題を克服することによって、
免疫モジュレーターを発現するように遺伝子操作されたRSVワクチンウイルスを
開発するのに有用な手段を提供する。更に、これら欠失は、遺伝子復帰に対して
極めて安定であり、それに由来するRSVクローンをワクチン薬として特に有用に
させる。
【００９４】
SHマイナスRSV組換え体も、マウスの上気道において部位特異的弱毒化を示し
、これは、ワクチン開発に新規な利点を与える。肝ウイルスワクチンとして評価
中の最新のRSV株のいくつか、例えば、cp突然変異体は、組織培養において変化
した成長をほとんど示さない。これらは宿主域突然変異であり、それらは、チン
パンジーおよびヒトの気道における複製を下気道で約100倍制限する。もう一つ
の典型的な種類の突然変異であるts突然変異は、上気道から下気道への上昇する
体温勾配により、下気道におけるウイルス複製を優先的に制限する性質がある。
これらcpおよびts突然変異体とは対照的に、SHマイナスRSV突然変異体は、上気
道においてより大きい制限の異なった表現型を有する。これは、極めて幼い幼児
で使用するためのワクチンウイルスに特に望ましいが、それは、そのメンバーが
主として鼻で呼吸しているこの攻撃を受けやすい年齢集団において、安全なワク
チン投与を確実にするには、上気道における複製の制限が必要とされるからであ
る。更に、どの年齢集団においても、上気道における減少した複製は、中耳炎に
よる罹病率を減少させるであろう。これら利点に加えて、例えば、約400ntを含
むSH欠失突然変異およびmRNA全体の削除の性質は、極めて復帰しにくい種類の突
然変異を示す。
、これは、ワクチン開発に新規な利点を与える。肝ウイルスワクチンとして評価
中の最新のRSV株のいくつか、例えば、cp突然変異体は、組織培養において変化
した成長をほとんど示さない。これらは宿主域突然変異であり、それらは、チン
パンジーおよびヒトの気道における複製を下気道で約100倍制限する。もう一つ
の典型的な種類の突然変異であるts突然変異は、上気道から下気道への上昇する
体温勾配により、下気道におけるウイルス複製を優先的に制限する性質がある。
これらcpおよびts突然変異体とは対照的に、SHマイナスRSV突然変異体は、上気
道においてより大きい制限の異なった表現型を有する。これは、極めて幼い幼児
で使用するためのワクチンウイルスに特に望ましいが、それは、そのメンバーが
主として鼻で呼吸しているこの攻撃を受けやすい年齢集団において、安全なワク
チン投与を確実にするには、上気道における複製の制限が必要とされるからであ
る。更に、どの年齢集団においても、上気道における減少した複製は、中耳炎に
よる罹病率を減少させるであろう。これら利点に加えて、例えば、約400ntを含
むSH欠失突然変異およびmRNA全体の削除の性質は、極めて復帰しにくい種類の突
然変異を示す。
【００９５】
SH遺伝子修飾の場合に更に考察されるのは、ヒトおよびウシのRSVを含めたい
ろいろなRSV、および有用なRSV組換え体ワクチンを生じるための追加の手段およ
び方法を提供する他の肺炎ウイルスの中でのSH遺伝子の比較である。例えば、二
つのRSV抗原性サブグループAおよびBは、若干のSHドメインにおいて比較的高度
の保存を示す。二つのこのようなドメインにおいて、RSV AおよびBのN末端領域
および推定の膜貫通ドメインは、アミノ酸レベルで84％同一性を示すが、C末端
推定エクトドメインは更に異なる（約50％同一性）。二つのヒトRSVサブグルー
プB株8／60および18537のSH遺伝子の比較は、一つのアミノ酸相違だけを示した
（Anderson et al., 上記）。ヒト対ウシのRSVのSHタンパク質は、約40％同一で
あり、（i）保存残基の非対称分布；（ii）極めて類似の疎水性プロフィール；
（iii）一方の部位が疎水性残基の両側にある二つのN結合グリコシル化部位の存
在；および（iv）各SHタンパク質の中心の疎水性領域のカルボキシ末端側の単一
システイン残基を含めた主な構造的特徴を有する（Anderson et al., 上記）。
これらおよび他の配列類似性および相違を評価することにより、感染性M2 ORF2
欠失クローンおよびノックアウト突然変異RSVクローン中に置換または挿入され
て、例えば、多特異的免疫原性作用または、代わりにまたは更に、弱毒化のよう
な望ましい作用を有するワクチンを生じることができる一つまたは複数の異種配
列の選択を行うことができる。
ろいろなRSV、および有用なRSV組換え体ワクチンを生じるための追加の手段およ
び方法を提供する他の肺炎ウイルスの中でのSH遺伝子の比較である。例えば、二
つのRSV抗原性サブグループAおよびBは、若干のSHドメインにおいて比較的高度
の保存を示す。二つのこのようなドメインにおいて、RSV AおよびBのN末端領域
および推定の膜貫通ドメインは、アミノ酸レベルで84％同一性を示すが、C末端
推定エクトドメインは更に異なる（約50％同一性）。二つのヒトRSVサブグルー
プB株8／60および18537のSH遺伝子の比較は、一つのアミノ酸相違だけを示した
（Anderson et al., 上記）。ヒト対ウシのRSVのSHタンパク質は、約40％同一で
あり、（i）保存残基の非対称分布；（ii）極めて類似の疎水性プロフィール；
（iii）一方の部位が疎水性残基の両側にある二つのN結合グリコシル化部位の存
在；および（iv）各SHタンパク質の中心の疎水性領域のカルボキシ末端側の単一
システイン残基を含めた主な構造的特徴を有する（Anderson et al., 上記）。
これらおよび他の配列類似性および相違を評価することにより、感染性M2 ORF2
欠失クローンおよびノックアウト突然変異RSVクローン中に置換または挿入され
て、例えば、多特異的免疫原性作用または、代わりにまたは更に、弱毒化のよう
な望ましい作用を有するワクチンを生じることができる一つまたは複数の異種配
列の選択を行うことができる。
【００９６】
遺伝子欠失の場合に更に考察されるのは、変化する遺伝子位置の作用である。
例えば、SH遺伝子の欠失は、下流の遺伝子位置のよりプロモーターに近位の位置
への有効な変化を生じる。これは、組換え体ウイルスにおける下流遺伝子の転写
の増加に関連することがありうる。或いは、任意の遺伝子の位置を、例えば、上
流または下流の遺伝子間領域または他の非コーディング領域への遺伝子の挿入ま
たは転位によって発現を変更するように変化させることができる。したがって、
ゲノムまたはアンチゲノム中の遺伝子の順序または位置を変化させることによっ
てRSV遺伝子発現のレベルを変更する方法を提供する。下流遺伝子の低下した発
現レベルは、弱毒化表現型を規定すると予想されるが、増加した発現は、許容宿
主、例えば、チンパンジーおよびヒトにおける組換え体RSV中の反対の作用を得
ることができる。
例えば、SH遺伝子の欠失は、下流の遺伝子位置のよりプロモーターに近位の位置
への有効な変化を生じる。これは、組換え体ウイルスにおける下流遺伝子の転写
の増加に関連することがありうる。或いは、任意の遺伝子の位置を、例えば、上
流または下流の遺伝子間領域または他の非コーディング領域への遺伝子の挿入ま
たは転位によって発現を変更するように変化させることができる。したがって、
ゲノムまたはアンチゲノム中の遺伝子の順序または位置を変化させることによっ
てRSV遺伝子発現のレベルを変更する方法を提供する。下流遺伝子の低下した発
現レベルは、弱毒化表現型を規定すると予想されるが、増加した発現は、許容宿
主、例えば、チンパンジーおよびヒトにおける組換え体RSV中の反対の作用を得
ることができる。
【００９７】
上に引用された参考文献に記載されたもう一つの実施例において、NS2の発現
は、翻訳読み取り枠（ORF）中への停止コドンの導入によって削除される。感染
性ウイルスの放出速度は、野生型と比較されるこのNS2ノックアウトウイルスに
ついて減少した。更に、突然変異ウイルスおよび野生型ウイルスのプラークの比
較は、NS2ノックアウトのそれらの寸法が大きく減少したことを示した。この種
類の突然変異は、したがって、サイトカインまたは他の免疫モジュレーターを発
現するように遺伝子操作された生存しうる組換え体RSV中に包含されて、変更さ
れた表現型、この場合、減少したウイルス成長速度および減少した in vitro プ
ラーク寸法を生じることができる。これらおよび他のノックアウト方法および突
然変異体は、したがって、減少した in vitro プラーク寸法と in vivo 弱毒化
との間の相関に基づいて、また更に別の組換え体RSVワクチン薬を提供するであ
ろう。NS2遺伝子の発現も、NS2遺伝子の完全な除去によって削除されて、同様の
表現型を有するウイルスを生じた。
は、翻訳読み取り枠（ORF）中への停止コドンの導入によって削除される。感染
性ウイルスの放出速度は、野生型と比較されるこのNS2ノックアウトウイルスに
ついて減少した。更に、突然変異ウイルスおよび野生型ウイルスのプラークの比
較は、NS2ノックアウトのそれらの寸法が大きく減少したことを示した。この種
類の突然変異は、したがって、サイトカインまたは他の免疫モジュレーターを発
現するように遺伝子操作された生存しうる組換え体RSV中に包含されて、変更さ
れた表現型、この場合、減少したウイルス成長速度および減少した in vitro プ
ラーク寸法を生じることができる。これらおよび他のノックアウト方法および突
然変異体は、したがって、減少した in vitro プラーク寸法と in vivo 弱毒化
との間の相関に基づいて、また更に別の組換え体RSVワクチン薬を提供するであ
ろう。NS2遺伝子の発現も、NS2遺伝子の完全な除去によって削除されて、同様の
表現型を有するウイルスを生じた。
【００９８】
首尾よく欠失された他のRSV遺伝子には、NS1およびG遺伝子が含まれる。前者
は、それぞれのタンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列の除去によっ
て欠失したが、後者は、フレームシフトを導入することまたは翻訳出発部位を変
更し、停止コドンを導入することによって欠失した。具体的には、NS1遺伝子は
、アンチゲノムcDNA中のヌクレオチド122〜630の除去し、それによってNS1の上
流の非翻訳領域をNS2の翻訳開始コドンへ結合することにより欠失した。rA2ΔNS
1と称されるこのウイルスは、減少したRNA複製、プラークサイズ、成長速度、お
よび in vitro の感染性ウイルスのほぼ10倍低い収量を示した。興味深いことに
、回収されたNS1マイナスウイルスは、組織培養中において、NS2欠失ウイルスの
場合ほど小さくはないとしても、小さいプラークを生じる。NS1マイナスウイル
スが成長しうるということは、効率が低下しているとしても、NS1タンパク質を
、ウイルス成長に重要でないものである補助タンパク質として確認する。NS1マ
イナスウイルスのプラークサイズは、NS2タンパク質の発現が、翻訳停止コドン
のそのコーディング配列中への導入によって削除されたNS2ノックアウトウイル
スの場合と同様であった。小プラーク表現型は、一般的には、弱毒化突然変異と
関連している。したがって、この種類の突然変異は、生存しうる組換え体RSV中
に包含されて、変更された表現型を生じることができる。これらおよび他のノッ
クアウト方法および突然変異体は、したがって、in vitro のプラークサイズと
in vivo の弱毒化との間の既知の相関に基づいて、本発明の範囲内のまた更に別
の組換え体RSVワクチン薬を提供するであろう。NS2ノックアウト突然変異体は、
上気道における中程度に弱毒化された表現型およびナイーブチンパンジーの下気
道における極めて弱毒化された表現型を示した。この突然変異体はまた、チンパ
ンジーにおいて大きく減少した疾患症状をもたらすと同時に、野生型ウイルスに
よるチャレンジへの有意の抵抗を刺激した（Whitehead et al., J.Virol. 73:34
38-3442,1999; 本明細書中に援用される）。
は、それぞれのタンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列の除去によっ
て欠失したが、後者は、フレームシフトを導入することまたは翻訳出発部位を変
更し、停止コドンを導入することによって欠失した。具体的には、NS1遺伝子は
、アンチゲノムcDNA中のヌクレオチド122〜630の除去し、それによってNS1の上
流の非翻訳領域をNS2の翻訳開始コドンへ結合することにより欠失した。rA2ΔNS
1と称されるこのウイルスは、減少したRNA複製、プラークサイズ、成長速度、お
よび in vitro の感染性ウイルスのほぼ10倍低い収量を示した。興味深いことに
、回収されたNS1マイナスウイルスは、組織培養中において、NS2欠失ウイルスの
場合ほど小さくはないとしても、小さいプラークを生じる。NS1マイナスウイル
スが成長しうるということは、効率が低下しているとしても、NS1タンパク質を
、ウイルス成長に重要でないものである補助タンパク質として確認する。NS1マ
イナスウイルスのプラークサイズは、NS2タンパク質の発現が、翻訳停止コドン
のそのコーディング配列中への導入によって削除されたNS2ノックアウトウイル
スの場合と同様であった。小プラーク表現型は、一般的には、弱毒化突然変異と
関連している。したがって、この種類の突然変異は、生存しうる組換え体RSV中
に包含されて、変更された表現型を生じることができる。これらおよび他のノッ
クアウト方法および突然変異体は、したがって、in vitro のプラークサイズと
in vivo の弱毒化との間の既知の相関に基づいて、本発明の範囲内のまた更に別
の組換え体RSVワクチン薬を提供するであろう。NS2ノックアウト突然変異体は、
上気道における中程度に弱毒化された表現型およびナイーブチンパンジーの下気
道における極めて弱毒化された表現型を示した。この突然変異体はまた、チンパ
ンジーにおいて大きく減少した疾患症状をもたらすと同時に、野生型ウイルスに
よるチャレンジへの有意の抵抗を刺激した（Whitehead et al., J.Virol. 73:34
38-3442,1999; 本明細書中に援用される）。
【００９９】
上記のように、免疫モジュレーターを発現する本発明の組換え体RSV中への包
含に有用なもう一つのノックアウト突然変異は、転写／複製調節因子M2-2をコー
ドすることが本明細書中において新たに特性決定されたM2 ORF2の欠失または削
除を伴う（本明細書中においてそれぞれ援用される、Collins et al., によって
2000年7月9日に出願され且つ代理人事件整理番号015280-403100USおよび優先権
米国予備特許出願60／143,097号によって確認される PRODUCTION OF ATTENUATED
RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS VACCINES INVOLVING MODIFICATION OF M2 ORF2
と称する米国特許出願；Bermingham et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:11259
-11264,1999；および Jin et al., J.Virol. 74:74-82,2000 を参照されたい）
。本発明のこの側面において、M2 ORF2の発現は、好ましくは、組換え体RSVゲノ
ムまたはアンチゲノムを修飾して、フレームシフト突然変異、M2 ORF2中の一つ
またはそれ以上の停止コドンを包含させることによって、または開始コドンの変
更によって減少するまたは削除される。M2 ORF2発現またはM2-2タンパク質の発
現または機能を破壊して弱毒RSVワクチン候補を生じる他の変更には、M2-2タン
パク質を部分的にまたは完全に非機能性にするまたはその発現を終わらせるM2 O
RF2コーディング配列の全部または一部分の部分的または完全な欠失が含まれる
。或いは、M2-2遺伝子の発現は、組換え体RSVにおいて、例えば、組換え体ゲノ
ムまたはアンチゲノム中のよりプロモーターに近位のまたはプロモーターに遠位
の位置にM2-2 ORFを置くことにより、それぞれアップレギュレーションまたはダ
ウンレギュレーションすることができる。M2-2のアップレギュレーションは、M2
-2 ORFを、それ自体の遺伝子出発および遺伝子末端シグナルを含む別々の遺伝子
として含むようにゲノムまたはアンチゲノムを構築することによって行うことも
できる。好ましい態様において、M2 ORF2欠失およびノックアウト突然変異体は
、該当する野生型または突然変異親RSV株の成長と比較して弱毒化されたウイル
ス成長を示す。更に、これら組換え体は、遅延したウイルス成長速度を示す。更
に、M2-2は調節タンパク質であるので、ウイルス成長および遺伝子発現パターン
の変更は、M2-ORF2発現を減少させるよりもむしろ増加させることによって行う
こともできる。上記のように、これは、M2-ORF2を別々の遺伝子として発現させ
、そして必要ならば、その遺伝子をよりプロモーターに近位のまたはプロモータ
ーに遠位の場所に移動することによって容易に行うことができる。M2 ORF2欠失
およびノックアウト突然変異を有する組換え体ワクチンウイルスは、好ましくは
、mRNA転写の変化も示す。この変化の一つの側面は、該当する野生型または突然
変異親RSV株のmRNA合成速度と比較して遅延したウイルスmRNA合成速度である。
しかしながら、一定時間後（例えば、感染後24時間に）、M2 ORF2欠失およびノ
ックアウト突然変異体は、累積的mRNA合成の増加を示す。この累積的mRNA合成の
増加は、該当する野生型または突然変異親RSV株のmRNA蓄積と比較して約50〜100
％、100〜200％、200〜300％またはそれ以上のレベルに達することがありうる。
含に有用なもう一つのノックアウト突然変異は、転写／複製調節因子M2-2をコー
ドすることが本明細書中において新たに特性決定されたM2 ORF2の欠失または削
除を伴う（本明細書中においてそれぞれ援用される、Collins et al., によって
2000年7月9日に出願され且つ代理人事件整理番号015280-403100USおよび優先権
米国予備特許出願60／143,097号によって確認される PRODUCTION OF ATTENUATED
RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS VACCINES INVOLVING MODIFICATION OF M2 ORF2
と称する米国特許出願；Bermingham et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:11259
-11264,1999；および Jin et al., J.Virol. 74:74-82,2000 を参照されたい）
。本発明のこの側面において、M2 ORF2の発現は、好ましくは、組換え体RSVゲノ
ムまたはアンチゲノムを修飾して、フレームシフト突然変異、M2 ORF2中の一つ
またはそれ以上の停止コドンを包含させることによって、または開始コドンの変
更によって減少するまたは削除される。M2 ORF2発現またはM2-2タンパク質の発
現または機能を破壊して弱毒RSVワクチン候補を生じる他の変更には、M2-2タン
パク質を部分的にまたは完全に非機能性にするまたはその発現を終わらせるM2 O
RF2コーディング配列の全部または一部分の部分的または完全な欠失が含まれる
。或いは、M2-2遺伝子の発現は、組換え体RSVにおいて、例えば、組換え体ゲノ
ムまたはアンチゲノム中のよりプロモーターに近位のまたはプロモーターに遠位
の位置にM2-2 ORFを置くことにより、それぞれアップレギュレーションまたはダ
ウンレギュレーションすることができる。M2-2のアップレギュレーションは、M2
-2 ORFを、それ自体の遺伝子出発および遺伝子末端シグナルを含む別々の遺伝子
として含むようにゲノムまたはアンチゲノムを構築することによって行うことも
できる。好ましい態様において、M2 ORF2欠失およびノックアウト突然変異体は
、該当する野生型または突然変異親RSV株の成長と比較して弱毒化されたウイル
ス成長を示す。更に、これら組換え体は、遅延したウイルス成長速度を示す。更
に、M2-2は調節タンパク質であるので、ウイルス成長および遺伝子発現パターン
の変更は、M2-ORF2発現を減少させるよりもむしろ増加させることによって行う
こともできる。上記のように、これは、M2-ORF2を別々の遺伝子として発現させ
、そして必要ならば、その遺伝子をよりプロモーターに近位のまたはプロモータ
ーに遠位の場所に移動することによって容易に行うことができる。M2 ORF2欠失
およびノックアウト突然変異を有する組換え体ワクチンウイルスは、好ましくは
、mRNA転写の変化も示す。この変化の一つの側面は、該当する野生型または突然
変異親RSV株のmRNA合成速度と比較して遅延したウイルスmRNA合成速度である。
しかしながら、一定時間後（例えば、感染後24時間に）、M2 ORF2欠失およびノ
ックアウト突然変異体は、累積的mRNA合成の増加を示す。この累積的mRNA合成の
増加は、該当する野生型または突然変異親RSV株のmRNA蓄積と比較して約50〜100
％、100〜200％、200〜300％またはそれ以上のレベルに達することがありうる。
【０１００】
本発明の範囲内で更に提供されるのは、該当する野生型または突然変異親RSV
株のウイルスRNA複製（ゲノム／アンチゲノムの合成）と比較されるウイルスRNA
複製の減少を示す、M2 ORF2欠失およびノックアウト突然変異を包含する免疫モ
ジュレーター発現性RSVである。したがって、ゲノムRNAの蓄積（例えば、24時間
の感染後時間後の）は、該当する野生型または突然変異親RSV株におけるゲノムm
RNA蓄積と比較して約25〜30％、15〜25％、10〜15％であるかまたはそれより低
い。好ましい側面において、mRNA対ゲノムRNAの累積モル比は、該当する野生型
または突然変異親RSV株について認められるmRNA対ゲノムRNAの累積モル比と比較
して2〜5倍、5〜10倍、10〜20倍またはそれ以上に増加する。
株のウイルスRNA複製（ゲノム／アンチゲノムの合成）と比較されるウイルスRNA
複製の減少を示す、M2 ORF2欠失およびノックアウト突然変異を包含する免疫モ
ジュレーター発現性RSVである。したがって、ゲノムRNAの蓄積（例えば、24時間
の感染後時間後の）は、該当する野生型または突然変異親RSV株におけるゲノムm
RNA蓄積と比較して約25〜30％、15〜25％、10〜15％であるかまたはそれより低
い。好ましい側面において、mRNA対ゲノムRNAの累積モル比は、該当する野生型
または突然変異親RSV株について認められるmRNA対ゲノムRNAの累積モル比と比較
して2〜5倍、5〜10倍、10〜20倍またはそれ以上に増加する。
【０１０１】
これら有益な表現型変化に加えて、本発明の組換え体RSV中のM2 ORF2欠失また
はノックアウト突然変異の包含は、該当する野生型または突然変異親RSV株に感
染した細胞中のウイルスタンパク質蓄積と比較して、感染した細胞中のウイルス
タンパク質蓄積を増加させる。増加したウイルスタンパク質レベル（例えば、感
染後36時間における）は、50〜100％、100〜200％、200〜300％またはそれ以上
でありうる。これは、該当する野生型または突然変異親RSV株における1種類また
は複数の抗原の発現と比較して増加したウイルス抗原の発現が、増加した免疫原
性をもたらし、それによって、組換え体ウイルス中の望まれる弱毒化突然変異に
より生じる低下した抗原発現および免疫原性を相殺するので、特に望ましい。表
現型的形質のこの驚くべき集合は、それらワクチン候補が、免疫原性の可能性を
犠牲にすることなく適当に弱毒化されうるし、実際に、増加した免疫原性活性を
示すことがありうるので、ワクチン開発に極めて望ましい。
はノックアウト突然変異の包含は、該当する野生型または突然変異親RSV株に感
染した細胞中のウイルスタンパク質蓄積と比較して、感染した細胞中のウイルス
タンパク質蓄積を増加させる。増加したウイルスタンパク質レベル（例えば、感
染後36時間における）は、50〜100％、100〜200％、200〜300％またはそれ以上
でありうる。これは、該当する野生型または突然変異親RSV株における1種類また
は複数の抗原の発現と比較して増加したウイルス抗原の発現が、増加した免疫原
性をもたらし、それによって、組換え体ウイルス中の望まれる弱毒化突然変異に
より生じる低下した抗原発現および免疫原性を相殺するので、特に望ましい。表
現型的形質のこの驚くべき集合は、それらワクチン候補が、免疫原性の可能性を
犠牲にすることなく適当に弱毒化されうるし、実際に、増加した免疫原性活性を
示すことがありうるので、ワクチン開発に極めて望ましい。
【０１０２】
引用された参考文献中に与えられ且つ本発明中で有用なまた更に別の方法およ
び組成物は、組換え体ゲノムまたはアンチゲノム中の異なったシス作用性調節配
列を変更する免疫モジュレーターを発現するように修飾されたRSV組換え体中に
異なったヌクレオチド修飾を含む。例えば、RSV G糖タンパク質のある選択され
た形の翻訳出発部位は、G糖タンパク質のこの形の発現を破壊するように欠失さ
れうる。RSV Gタンパク質は、二つの形で、すなわち、アンカーII型内在性膜タ
ンパク質としておよび膜アンカーのほとんど全部を欠き且つ分泌されるN末端切
除型として合成される（Hendricks et al., J.Virol. 62:2228-2233,1988）。そ
れら二つの形は、二つの異なった出発部位での翻訳開始によって誘導されること
が示されており、長い方の形は、G ORFの第一AUGで開始し、もう一方は、コドン
48のORFの第二AUGで開始し、そして更に、タンパク質分解によってプロセシング
される（Roberts et al., J.Virol. 68:4538-4546 1994）。この第二出発部位の
存在は、高度に保存され、これまでに配列決定されたヒト、ウシおよびヒツジRS
Vの全ての株に存在している。Gタンパク質の可溶性型は、中和抗体を捕捉するお
とりとして作用することによって宿主免疫を軽減させるかもしれないということ
が示唆されている。更に、可溶性Gは、Th2に偏った応答の選択的刺激に関与して
いるが、これは、順次、RSVへの引き続きの暴露で増加した免疫病理学に関連し
ていると考えられる。RSVウイルスワクチンに関して、抗体捕捉または免疫系の
不均衡刺激を最小限にすることは極めて望ましいので、Gタンパク質の分泌型の
発現を削除することは望ましいと考えられる。これは、組換え体ウイルスにおい
て達成されている。したがって、この突然変異は、ウイルスを直接的に弱毒化す
るよりもむしろ、組換え体ウイルスによってもたらされる宿主免疫応答を定性的
におよび／または定量的に変更するのに特に有用である。更に、Gタンパク質遺
伝子を全て欠失することができる。得られたウイルスは、宿主域作用を示し、HE
p-2細胞上で非能率的に成長するが、ベロ細胞上では野生型ウイルスと同程度に
効率よく成長する。おそらくは、結合機能は、別のタンパク質によって与えられ
ることもありうるし、または全体で与えられることがありうる。したがって、本
発明は、Gタンパク質を欠くが、免疫原性を増加させる免疫モジュレーターを発
現する生弱毒RSVワクチンも提供する。
び組成物は、組換え体ゲノムまたはアンチゲノム中の異なったシス作用性調節配
列を変更する免疫モジュレーターを発現するように修飾されたRSV組換え体中に
異なったヌクレオチド修飾を含む。例えば、RSV G糖タンパク質のある選択され
た形の翻訳出発部位は、G糖タンパク質のこの形の発現を破壊するように欠失さ
れうる。RSV Gタンパク質は、二つの形で、すなわち、アンカーII型内在性膜タ
ンパク質としておよび膜アンカーのほとんど全部を欠き且つ分泌されるN末端切
除型として合成される（Hendricks et al., J.Virol. 62:2228-2233,1988）。そ
れら二つの形は、二つの異なった出発部位での翻訳開始によって誘導されること
が示されており、長い方の形は、G ORFの第一AUGで開始し、もう一方は、コドン
48のORFの第二AUGで開始し、そして更に、タンパク質分解によってプロセシング
される（Roberts et al., J.Virol. 68:4538-4546 1994）。この第二出発部位の
存在は、高度に保存され、これまでに配列決定されたヒト、ウシおよびヒツジRS
Vの全ての株に存在している。Gタンパク質の可溶性型は、中和抗体を捕捉するお
とりとして作用することによって宿主免疫を軽減させるかもしれないということ
が示唆されている。更に、可溶性Gは、Th2に偏った応答の選択的刺激に関与して
いるが、これは、順次、RSVへの引き続きの暴露で増加した免疫病理学に関連し
ていると考えられる。RSVウイルスワクチンに関して、抗体捕捉または免疫系の
不均衡刺激を最小限にすることは極めて望ましいので、Gタンパク質の分泌型の
発現を削除することは望ましいと考えられる。これは、組換え体ウイルスにおい
て達成されている。したがって、この突然変異は、ウイルスを直接的に弱毒化す
るよりもむしろ、組換え体ウイルスによってもたらされる宿主免疫応答を定性的
におよび／または定量的に変更するのに特に有用である。更に、Gタンパク質遺
伝子を全て欠失することができる。得られたウイルスは、宿主域作用を示し、HE
p-2細胞上で非能率的に成長するが、ベロ細胞上では野生型ウイルスと同程度に
効率よく成長する。おそらくは、結合機能は、別のタンパク質によって与えられ
ることもありうるし、または全体で与えられることがありうる。したがって、本
発明は、Gタンパク質を欠くが、免疫原性を増加させる免疫モジュレーターを発
現する生弱毒RSVワクチンも提供する。
【０１０３】
引用された参考文献には、他の典型的な遺伝子、例えば、NS1およびNS2のシス
作用性転写シグナルを変更することによる組換え体RSVの表現型のモジュレーシ
ョンも記載されている。これらヌクレオチド修飾の結果は、例えば、リードスル
ーmRNAのレベルを減少させ且つ下流遺伝子からのタンパク質の発現を増加させる
ようにシス調節要素を変更することによる遺伝子発現の修飾と一致する。得られ
た組換え体ウイルスは、好ましくは、増加した成長速度および増加したプラーク
サイズを示すであろう。シス作用性調節配列への典型的な修飾には、RSV遺伝子
に関連した遺伝子末端（GE）および遺伝子出発（GS）シグナルへの修飾が含まれ
る。この場合、典型的な変化には、これらシグナルを天然に存在するRSV N遺伝
子のGEシグナルと一致させるNS1およびNS2遺伝子のGEシグナルの変更が含まれる
。得られた組換え体ウイルスは、増加した成長速度およびプラークサイズを示し
、したがって、免疫調節分子を発現するRSVワクチン候補の表現型を有益に修飾
するためのまた更に別の手段を提供する。
作用性転写シグナルを変更することによる組換え体RSVの表現型のモジュレーシ
ョンも記載されている。これらヌクレオチド修飾の結果は、例えば、リードスル
ーmRNAのレベルを減少させ且つ下流遺伝子からのタンパク質の発現を増加させる
ようにシス調節要素を変更することによる遺伝子発現の修飾と一致する。得られ
た組換え体ウイルスは、好ましくは、増加した成長速度および増加したプラーク
サイズを示すであろう。シス作用性調節配列への典型的な修飾には、RSV遺伝子
に関連した遺伝子末端（GE）および遺伝子出発（GS）シグナルへの修飾が含まれ
る。この場合、典型的な変化には、これらシグナルを天然に存在するRSV N遺伝
子のGEシグナルと一致させるNS1およびNS2遺伝子のGEシグナルの変更が含まれる
。得られた組換え体ウイルスは、増加した成長速度およびプラークサイズを示し
、したがって、免疫調節分子を発現するRSVワクチン候補の表現型を有益に修飾
するためのまた更に別の手段を提供する。
【０１０４】
本発明の範囲内で更に有用なのは、RSVサブグループAおよびB双方からの配列
を含む免疫モジュレーターを発現する弱毒RSVを生産させて、例えば、RSV A若し
くはBワクチンまたは二価のRSV A／Bワクチンを生じる、上に引用された参考文
献に与えられた方法および組成物である。例えば、1種類または複数のサイトカ
インを発現し且つRSVサブグループAおよびB双方からの配列を含む弱毒RSVワクチ
ンウイルスを生産させて、例えば、RSV A若しくはBワクチンまたは二価のRSV A
／Bワクチンを生じる、上に引用された参考文献に与えられた方法および組成物
（例えば、本明細書中に援用される、Collins et al. によって1999年4月13日出
願の米国特許第99／291,894号を参照されたい）。一つの実施例において、弱毒
サブグループAウイルスを用いてサブグループB RSVのFおよび／またはG糖タンパ
ク質を発現させるRSVサブグループB特異的ワクチンウイルスを提供する。Fおよ
びGタンパク質は、主要防御抗原であり且つRSVサブグループ特異性の大部分を与
えるので、このキメラのウイルスは、サブグループBに対する強い免疫応答を刺
激するであろう。この戦略は、二者択一のアプローチを用いて行うことができる
。一つは、サブグループBウイルスのG糖タンパク質遺伝子をサブグループAバッ
クグラウンド中に（または逆に）追加の遺伝子として挿入することである。しか
しながら、Fタンパク質も有意のサブグループ特異性を示すので、サブグループB
特異的ワクチン中の両方のサブグループB糖タンパク質を発現させることが好ま
しいであろう。更に、本明細書中の内容にしたがってサブグループBウイルスを
更に修飾して、適当な弱毒化および免疫原性を得ることが望まれる。したがって
、RSVサブグループBワクチンを得るための第二のより望ましい戦略は、サブグル
ープA組換え体cDNAバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノムからGおよびF遺
伝子を除去し、それらの代わりにサブグループB RSVのGおよびF遺伝子を置くこ
とである。得られたA／BキメラRSVは、サブグループAの内部タンパク質およびサ
ブグループBの外部防御抗原を含有する。次に、このウイルスを、上記のような
弱毒化突然変異の体系的包含によって望ましいレベルまで弱毒化することができ
る。例えば、キメラRSV A／Bウイルス中に包含された特異的弱毒化突然変異には
、（i）5個のcp突然変異の内の3個、すなわち、N（V267I）における突然変異お
よびL（C319YおよびH1690Y）における二つであって、Fにおける二つはB1 F遺伝
子との置換によって除去されるのでこれらを除く；（ii）弱毒株A2ウイルス中で
識別された248（Q831L）、1030（Y1321N）および、場合により404-L（D1183E）
突然変異；（iii）M2遺伝子の遺伝子出発シグナル中の9位の単一ヌクレオチド置
換；および（iv）SH遺伝子の欠失が含まれる。キメラRSV A／B中の他の直ちに利
用可能な突然変異には、単独または組合せでのNS1、NS2、SHまたはG遺伝子の欠
失、および530および1009突然変異が含まれるが、これらに制限されるわけでは
ない。
を含む免疫モジュレーターを発現する弱毒RSVを生産させて、例えば、RSV A若し
くはBワクチンまたは二価のRSV A／Bワクチンを生じる、上に引用された参考文
献に与えられた方法および組成物である。例えば、1種類または複数のサイトカ
インを発現し且つRSVサブグループAおよびB双方からの配列を含む弱毒RSVワクチ
ンウイルスを生産させて、例えば、RSV A若しくはBワクチンまたは二価のRSV A
／Bワクチンを生じる、上に引用された参考文献に与えられた方法および組成物
（例えば、本明細書中に援用される、Collins et al. によって1999年4月13日出
願の米国特許第99／291,894号を参照されたい）。一つの実施例において、弱毒
サブグループAウイルスを用いてサブグループB RSVのFおよび／またはG糖タンパ
ク質を発現させるRSVサブグループB特異的ワクチンウイルスを提供する。Fおよ
びGタンパク質は、主要防御抗原であり且つRSVサブグループ特異性の大部分を与
えるので、このキメラのウイルスは、サブグループBに対する強い免疫応答を刺
激するであろう。この戦略は、二者択一のアプローチを用いて行うことができる
。一つは、サブグループBウイルスのG糖タンパク質遺伝子をサブグループAバッ
クグラウンド中に（または逆に）追加の遺伝子として挿入することである。しか
しながら、Fタンパク質も有意のサブグループ特異性を示すので、サブグループB
特異的ワクチン中の両方のサブグループB糖タンパク質を発現させることが好ま
しいであろう。更に、本明細書中の内容にしたがってサブグループBウイルスを
更に修飾して、適当な弱毒化および免疫原性を得ることが望まれる。したがって
、RSVサブグループBワクチンを得るための第二のより望ましい戦略は、サブグル
ープA組換え体cDNAバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノムからGおよびF遺
伝子を除去し、それらの代わりにサブグループB RSVのGおよびF遺伝子を置くこ
とである。得られたA／BキメラRSVは、サブグループAの内部タンパク質およびサ
ブグループBの外部防御抗原を含有する。次に、このウイルスを、上記のような
弱毒化突然変異の体系的包含によって望ましいレベルまで弱毒化することができ
る。例えば、キメラRSV A／Bウイルス中に包含された特異的弱毒化突然変異には
、（i）5個のcp突然変異の内の3個、すなわち、N（V267I）における突然変異お
よびL（C319YおよびH1690Y）における二つであって、Fにおける二つはB1 F遺伝
子との置換によって除去されるのでこれらを除く；（ii）弱毒株A2ウイルス中で
識別された248（Q831L）、1030（Y1321N）および、場合により404-L（D1183E）
突然変異；（iii）M2遺伝子の遺伝子出発シグナル中の9位の単一ヌクレオチド置
換；および（iv）SH遺伝子の欠失が含まれる。キメラRSV A／B中の他の直ちに利
用可能な突然変異には、単独または組合せでのNS1、NS2、SHまたはG遺伝子の欠
失、および530および1009突然変異が含まれるが、これらに制限されるわけでは
ない。
【０１０５】
上記のように、本発明は、キメラヒト-ウシ組換え体ウイルス中の免疫調節分
子を発現する組換え体RSVの構築および使用も包含する。本発明のこの側面にお
いて用いるためのキメラヒト-ウシRSVは、概して、Bucholz et al. によって200
0年6月23日に出願され且つ代理人事件整理番号015280-398100USよっておよびそ
の優先権米国予備特許出願60／143,132号において確認される PRODUCTION OF AT
TENUATED, HUMAN-BOVINE CHIMERIC RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS VACCINES と
称する米国特許出願（本明細書中においてそれぞれ援用される）に記載されてい
る。これらキメラ組換え体RSVには、ヒト-ウシキメラRSVゲノムまたはアンチゲ
ノムを形成するように異なったRSV株またはサブグループウイルスの一つまたは
それ以上の異種遺伝子またはゲノムセグメントと組み合わされたヒトまたはウシ
RSV株またはサブグループウイルスに由来するまたはそれを模倣した部分的また
は完全な“バックグラウンド”RSVゲノムまたはアンチゲノムが含まれる。本発
明の若干の側面において、キメラRSVは、ヒトRSVからの一つまたはそれ以上の異
種遺伝子またはゲノムセグメントと組み合わされた部分的または完全なウシRSV
バックグラウンドゲノムまたはアンチゲノムを包含する。本発明の別の側面にお
いて、キメラRSVは、ウシRSVからの一つまたはそれ以上の異種遺伝子またはゲノ
ムセグメントと組み合わされた部分的または完全なヒトRSVバックグラウンドゲ
ノムまたはアンチゲノムを包含する。
子を発現する組換え体RSVの構築および使用も包含する。本発明のこの側面にお
いて用いるためのキメラヒト-ウシRSVは、概して、Bucholz et al. によって200
0年6月23日に出願され且つ代理人事件整理番号015280-398100USよっておよびそ
の優先権米国予備特許出願60／143,132号において確認される PRODUCTION OF AT
TENUATED, HUMAN-BOVINE CHIMERIC RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS VACCINES と
称する米国特許出願（本明細書中においてそれぞれ援用される）に記載されてい
る。これらキメラ組換え体RSVには、ヒト-ウシキメラRSVゲノムまたはアンチゲ
ノムを形成するように異なったRSV株またはサブグループウイルスの一つまたは
それ以上の異種遺伝子またはゲノムセグメントと組み合わされたヒトまたはウシ
RSV株またはサブグループウイルスに由来するまたはそれを模倣した部分的また
は完全な“バックグラウンド”RSVゲノムまたはアンチゲノムが含まれる。本発
明の若干の側面において、キメラRSVは、ヒトRSVからの一つまたはそれ以上の異
種遺伝子またはゲノムセグメントと組み合わされた部分的または完全なウシRSV
バックグラウンドゲノムまたはアンチゲノムを包含する。本発明の別の側面にお
いて、キメラRSVは、ウシRSVからの一つまたはそれ以上の異種遺伝子またはゲノ
ムセグメントと組み合わされた部分的または完全なヒトRSVバックグラウンドゲ
ノムまたはアンチゲノムを包含する。
【０１０６】
典型的な態様において、本発明は、主要ヌクレオキャプシド（N）タンパク質
、ヌクレオキャプシドリンタンパク質（P）、ラージポリメラーゼタンパク質（L
）、RNAポリメラーゼ延長因子、およびヒト-ウシキメラRSVゲノムまたはアンチ
ゲノムを形成するように異なったRSVの一つまたはそれ以上の異種遺伝子および
／またはゲノムセグメントと組み合わされたヒトまたはウシRSVの部分的または
完全なRSVバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノムを含む感染性サイトカイ
ン発現性RSVに関する。本発明中で有用である一つまたは複数の異種遺伝子およ
び／またはゲノムセグメントには、一つまたはそれ以上のRSV NS1、NS2、N、P、
M、SH、M2（ORF1）、M2（ORF2）、L、FまたはG遺伝子またはゲノムセグメントが
含まれる。或いは、ヒト-ウシキメラRSV中への包含のための異種遺伝子およびゲ
ノムセグメントには、RSVゲノムのリーダー、トレーラーまたは遺伝子間領域、
またはそれらのセグメントが含まれうる。1種類またはそれ以上のサイトカイン
をコードしている種々のポリヌクレオチドは、キメラのゲノムまたはアンチゲノ
ム中に包含されうる。
、ヌクレオキャプシドリンタンパク質（P）、ラージポリメラーゼタンパク質（L
）、RNAポリメラーゼ延長因子、およびヒト-ウシキメラRSVゲノムまたはアンチ
ゲノムを形成するように異なったRSVの一つまたはそれ以上の異種遺伝子および
／またはゲノムセグメントと組み合わされたヒトまたはウシRSVの部分的または
完全なRSVバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノムを含む感染性サイトカイ
ン発現性RSVに関する。本発明中で有用である一つまたは複数の異種遺伝子およ
び／またはゲノムセグメントには、一つまたはそれ以上のRSV NS1、NS2、N、P、
M、SH、M2（ORF1）、M2（ORF2）、L、FまたはG遺伝子またはゲノムセグメントが
含まれる。或いは、ヒト-ウシキメラRSV中への包含のための異種遺伝子およびゲ
ノムセグメントには、RSVゲノムのリーダー、トレーラーまたは遺伝子間領域、
またはそれらのセグメントが含まれうる。1種類またはそれ以上のサイトカイン
をコードしている種々のポリヌクレオチドは、キメラのゲノムまたはアンチゲノ
ム中に包含されうる。
【０１０７】
より詳細な態様の範囲内で、本発明の組換え体RSVは、RSV F、Gおよび／また
はSH糖タンパク質またはそれらの免疫原性ドメインまたはエピトープをコードす
る一つまたはそれ以上の異種遺伝子および／またはゲノムセグメントを包含する
。或いは、組換え体RSVは、ヒトおよびウシ両方の糖タンパク質ドメインまたは
免疫原性エピトープを有するキメラ糖タンパク質を包含してよい。例えば、後者
の種類のキメラは、ウシゲノムまたはアンチゲノム中の該当する糖タンパク質の
機能性残留部分をコードしているゲノムセグメントと一緒に、適当な読み枠中の
糖タンパク質エクトドメインをコードしている異種ゲノムセグメントをウシバッ
クグラウンドゲノムまたはアンチゲノム中に包含することによって構築すること
ができ、それによって得られたキメラウイルスは、機能性キメラ糖タンパク質を
発現する。
はSH糖タンパク質またはそれらの免疫原性ドメインまたはエピトープをコードす
る一つまたはそれ以上の異種遺伝子および／またはゲノムセグメントを包含する
。或いは、組換え体RSVは、ヒトおよびウシ両方の糖タンパク質ドメインまたは
免疫原性エピトープを有するキメラ糖タンパク質を包含してよい。例えば、後者
の種類のキメラは、ウシゲノムまたはアンチゲノム中の該当する糖タンパク質の
機能性残留部分をコードしているゲノムセグメントと一緒に、適当な読み枠中の
糖タンパク質エクトドメインをコードしている異種ゲノムセグメントをウシバッ
クグラウンドゲノムまたはアンチゲノム中に包含することによって構築すること
ができ、それによって得られたキメラウイルスは、機能性キメラ糖タンパク質を
発現する。
【０１０８】
本発明の他の代わりの態様において、免疫調節分子を発現するように修飾され
たヒト-ウシキメラRSVを提供するが、ここにおいて、ヒトRSV“バックグラウン
ド”は、ある選択されたウシ遺伝子、ゲノムセグメント、または複数の遺伝子ま
たはゲノムセグメントの包含によって弱毒化される。若干の態様において、BRSV
から選択された異種遺伝子セットは、HRSVバックグラウンドゲノムまたはアンチ
ゲノム中に協調的に転移する。個々のまたは協調的に転移される群の遺伝子が選
択されうる典型的なウシRSV遺伝子には、RSV N、P、NS1、NS2、M2-1およびM遺伝
子が含まれ、これらは、ウシRSVからの一つまたはそれ以上の異種遺伝子によっ
てヒトRSVバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノム中に単独でまたは任意の
組合せで置き換えられて、弱毒キメラ誘導体を生じることができる。より詳細な
側面において、ヒトRSVのNおよびP遺伝子は両方とも、ウシRSVからのNおよびP相
対遺伝子によって協調的に置換される。この協調遺伝子置換は、RSVゲノム中の
若干の遺伝子間の機能的協調性によって促進され、それは、しばしば、ゲノム中
で隣接した遺伝子対の場合に起こる。したがって、他の代わりの態様において、
ヒトRSVのNS1およびNS2遺伝子は両方とも、ウシRSVからのNS1およびNS2相対遺伝
子によって置換される。また更に別の態様において、HRSVのM2-1、M2-2およびL
遺伝子の内の二つまたはそれ以上は、ウシRSVからの相対遺伝子によって置換さ
れる。高レベルの宿主域制限が望まれる本発明中の若干のワクチン候補に関して
、ヒトRSVのN、P、NS1、NS2、M2-1およびM遺伝子はそれぞれ、ウシRSVからのN、
P、NS1、NS2、M2-1およびM相対遺伝子によって置換される。これら種々の構築物
中において、本明細書中に開示されたサイトカイン発現に関する任意の選択され
た修飾は、キメラのゲノムまたはアンチゲノム中に包含されうる。
たヒト-ウシキメラRSVを提供するが、ここにおいて、ヒトRSV“バックグラウン
ド”は、ある選択されたウシ遺伝子、ゲノムセグメント、または複数の遺伝子ま
たはゲノムセグメントの包含によって弱毒化される。若干の態様において、BRSV
から選択された異種遺伝子セットは、HRSVバックグラウンドゲノムまたはアンチ
ゲノム中に協調的に転移する。個々のまたは協調的に転移される群の遺伝子が選
択されうる典型的なウシRSV遺伝子には、RSV N、P、NS1、NS2、M2-1およびM遺伝
子が含まれ、これらは、ウシRSVからの一つまたはそれ以上の異種遺伝子によっ
てヒトRSVバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノム中に単独でまたは任意の
組合せで置き換えられて、弱毒キメラ誘導体を生じることができる。より詳細な
側面において、ヒトRSVのNおよびP遺伝子は両方とも、ウシRSVからのNおよびP相
対遺伝子によって協調的に置換される。この協調遺伝子置換は、RSVゲノム中の
若干の遺伝子間の機能的協調性によって促進され、それは、しばしば、ゲノム中
で隣接した遺伝子対の場合に起こる。したがって、他の代わりの態様において、
ヒトRSVのNS1およびNS2遺伝子は両方とも、ウシRSVからのNS1およびNS2相対遺伝
子によって置換される。また更に別の態様において、HRSVのM2-1、M2-2およびL
遺伝子の内の二つまたはそれ以上は、ウシRSVからの相対遺伝子によって置換さ
れる。高レベルの宿主域制限が望まれる本発明中の若干のワクチン候補に関して
、ヒトRSVのN、P、NS1、NS2、M2-1およびM遺伝子はそれぞれ、ウシRSVからのN、
P、NS1、NS2、M2-1およびM相対遺伝子によって置換される。これら種々の構築物
中において、本明細書中に開示されたサイトカイン発現に関する任意の選択され
た修飾は、キメラのゲノムまたはアンチゲノム中に包含されうる。
【０１０９】
本発明のいろいろな側面の範囲内で、本明細書中に開示のサイトカインを発現
するように修飾されたヒト-ウシキメラRSVを構築するが、ここにおいて、キメラ
のゲノムまたはアンチゲノムは、ヒトRSVからの一つまたはそれ以上の異種遺伝
子および／またはゲノムセグメントと組み合わされた部分的または完全なウシRS
Vバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノムを含む。若干の態様において、F、
GおよびSHより選択される一つまたはそれ以上のヒトRSV糖タンパク質遺伝子、ま
たはF、Gおよび／またはSHの一つまたは複数の細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン
、エクトドメインまたは免疫原性エピトープ部分をコードしている一つまたはそ
れ以上のゲノムセグメントを、部分的または完全なウシRSVバックグラウンドゲ
ノムまたはアンチゲノム中に加えるまたは置換する。例えば、ヒトRSV糖タンパ
ク質遺伝子FおよびGの一方または両方を、部分的ウシRSVバックグラウンドゲノ
ムまたはアンチゲノム中のFおよびG糖タンパク質相対遺伝子の一方または両方に
置き換えるように置換することができる。これらおよび関連の態様の範囲内で、
ヒト-ウシキメラゲノムまたはアンチゲノムは、サブグループAおよびサブグルー
プBヒトRSVの一方または両方からの抗原決定基を包含することができる。より詳
細な側面において、ヒトRSV糖タンパク質遺伝子FおよびGは両方とも、ウシRSVバ
ックグラウンドゲノムまたはアンチゲノム中のFおよびG糖タンパク質相対遺伝子
に置き換えるように置換される。引用された参考文献に記載されたこれら特徴を
有する典型的なヒト-ウシキメラRSVは、rBRSV／A2である。このキメラウイルス
中で与えられる修飾の一つまたはそれ以上の組合せにおいて、ワクチン候補ウイ
ルスは、本明細書中に開示のサイトカイン発現を支配する修飾を包含するであろ
う。
するように修飾されたヒト-ウシキメラRSVを構築するが、ここにおいて、キメラ
のゲノムまたはアンチゲノムは、ヒトRSVからの一つまたはそれ以上の異種遺伝
子および／またはゲノムセグメントと組み合わされた部分的または完全なウシRS
Vバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノムを含む。若干の態様において、F、
GおよびSHより選択される一つまたはそれ以上のヒトRSV糖タンパク質遺伝子、ま
たはF、Gおよび／またはSHの一つまたは複数の細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン
、エクトドメインまたは免疫原性エピトープ部分をコードしている一つまたはそ
れ以上のゲノムセグメントを、部分的または完全なウシRSVバックグラウンドゲ
ノムまたはアンチゲノム中に加えるまたは置換する。例えば、ヒトRSV糖タンパ
ク質遺伝子FおよびGの一方または両方を、部分的ウシRSVバックグラウンドゲノ
ムまたはアンチゲノム中のFおよびG糖タンパク質相対遺伝子の一方または両方に
置き換えるように置換することができる。これらおよび関連の態様の範囲内で、
ヒト-ウシキメラゲノムまたはアンチゲノムは、サブグループAおよびサブグルー
プBヒトRSVの一方または両方からの抗原決定基を包含することができる。より詳
細な側面において、ヒトRSV糖タンパク質遺伝子FおよびGは両方とも、ウシRSVバ
ックグラウンドゲノムまたはアンチゲノム中のFおよびG糖タンパク質相対遺伝子
に置き換えるように置換される。引用された参考文献に記載されたこれら特徴を
有する典型的なヒト-ウシキメラRSVは、rBRSV／A2である。このキメラウイルス
中で与えられる修飾の一つまたはそれ以上の組合せにおいて、ワクチン候補ウイ
ルスは、本明細書中に開示のサイトカイン発現を支配する修飾を包含するであろ
う。
【０１１０】
免疫調節分子の発現を支配する修飾を有する本発明のまた更に別のヒト-ウシ
キメラRSVは、部分的または完全なウシRSVバックグラウンドゲノムまたはアンチ
ゲノム中の相対遺伝子またはゲノムセグメントの野生型遺伝子順序位置と比較し
てよりプロモーターに近位である位置で加えられるまたは置換される、F、Gおよ
びSHより選択される一つまたはそれ以上のヒトRSV糖タンパク質遺伝子を包含す
る。一つのこのような態様において、ヒトRSV糖タンパク質遺伝子GおよびFは両
方とも、遺伝子順序1位および2位でそれぞれ置換されて、それぞれ、部分的ウシ
RSVバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノム中の野生型7位および8位で欠失
したGおよびF糖タンパク質相対遺伝子に置き換えられる。上に引用された開示に
記載されたこれら特徴を有する典型的なヒト-ウシキメラRSVは、rBRSV／A2-G1F2
である。
キメラRSVは、部分的または完全なウシRSVバックグラウンドゲノムまたはアンチ
ゲノム中の相対遺伝子またはゲノムセグメントの野生型遺伝子順序位置と比較し
てよりプロモーターに近位である位置で加えられるまたは置換される、F、Gおよ
びSHより選択される一つまたはそれ以上のヒトRSV糖タンパク質遺伝子を包含す
る。一つのこのような態様において、ヒトRSV糖タンパク質遺伝子GおよびFは両
方とも、遺伝子順序1位および2位でそれぞれ置換されて、それぞれ、部分的ウシ
RSVバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノム中の野生型7位および8位で欠失
したGおよびF糖タンパク質相対遺伝子に置き換えられる。上に引用された開示に
記載されたこれら特徴を有する典型的なヒト-ウシキメラRSVは、rBRSV／A2-G1F2
である。
【０１１１】
ヒト-ウシキメラRSV中の協調遺伝子転移は、ウシバックグラウンドゲノムまた
はアンチゲノム中のヒト抗原遺伝子の導入にも向けられる。若干の態様において
、F、G、SHおよびMより選択される一つまたはそれ以上のヒトRSVエンベロープ関
連遺伝子を、部分的または完全なウシRSVバックグラウンドゲノムまたはアンチ
ゲノム中で加えるまたは置換する。例えば、F、G、SHおよびMより選択される一
つまたはそれ以上のヒトRSVエンベロープ関連遺伝子は、F、G、SHおよびMより選
択される一つまたはそれ以上のエンベロープ関連遺伝子が欠失している部分的ウ
シRSVバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノム中で加えられてよいしまたは
置換されてよい。より詳細な側面において、ヒトRSVエンベロープ関連遺伝子F、
GおよびMとして定義される遺伝子セットからの一つまたはそれ以上の遺伝子は、
エンベロープ関連遺伝子F、G、SHおよびMが欠失している部分的ウシRSVバックグ
ラウンドゲノムまたはアンチゲノム中で加えられる。引用された参考文献に記載
されたこれら特徴を有する典型的なヒト-ウシキメラRSVは、rBRSV／A2-MGFであ
る。このキメラウイルス中で与えられる修飾の一つまたはそれ以上との組合せに
おいて、本発明は、組換え体ウイルスによるサイトカイン発現を支配するある選
択された修飾を包含するであろう。
はアンチゲノム中のヒト抗原遺伝子の導入にも向けられる。若干の態様において
、F、G、SHおよびMより選択される一つまたはそれ以上のヒトRSVエンベロープ関
連遺伝子を、部分的または完全なウシRSVバックグラウンドゲノムまたはアンチ
ゲノム中で加えるまたは置換する。例えば、F、G、SHおよびMより選択される一
つまたはそれ以上のヒトRSVエンベロープ関連遺伝子は、F、G、SHおよびMより選
択される一つまたはそれ以上のエンベロープ関連遺伝子が欠失している部分的ウ
シRSVバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノム中で加えられてよいしまたは
置換されてよい。より詳細な側面において、ヒトRSVエンベロープ関連遺伝子F、
GおよびMとして定義される遺伝子セットからの一つまたはそれ以上の遺伝子は、
エンベロープ関連遺伝子F、G、SHおよびMが欠失している部分的ウシRSVバックグ
ラウンドゲノムまたはアンチゲノム中で加えられる。引用された参考文献に記載
されたこれら特徴を有する典型的なヒト-ウシキメラRSVは、rBRSV／A2-MGFであ
る。このキメラウイルス中で与えられる修飾の一つまたはそれ以上との組合せに
おいて、本発明は、組換え体ウイルスによるサイトカイン発現を支配するある選
択された修飾を包含するであろう。
【０１１２】
免疫調節分子をも発現するキメラRSVを生じるための異種免疫原性タンパク質
、ドメインおよびエピトープの導入は、免疫感作された宿主中で新規な免疫応答
を生じるのに特に有用である。異なったRSVサブグループまたは株の受容体ゲノ
ムまたはアンチゲノム中のドナーRSVサブグループまたは株であるものからの免
疫原性遺伝子またはゲノムセグメントの付加または置換は、ドナーサブグループ
または株、受容サブグループまたは株、またはドナーおよび受容体両方のサブグ
ループまたは株に対して向けられる免疫応答を生じることができる。この目的を
達成するために、免疫モジュレーターを発現する組換え体RSVを構築することも
でき、これは、キメラタンパク質、例えば、異なったRSVのエクトドメインに融
合した一つのRSVに特異的な細胞質テイルおよび／または膜貫通ドメインを有す
る免疫原性糖タンパク質を発現して、例えば、ヒト-ウシ融合タンパク質、また
は二つの異なったヒトRSVサブグループまたは株からのドメインを包含する融合
タンパク質を提供する。好ましい態様において、免疫調節分子を発現するRSVは
、ヒトおよびウシ両方の糖タンパク質ドメインまたは免疫原性エピトープを有す
る組換え体ウイルスまたはウイルス下粒子中のキメラ糖タンパク質をコードする
ように更に修飾されたそのゲノムまたはアンチゲノムを有する。例えば、ヒトRS
V F、SHまたはG糖タンパク質からの糖タンパク質エクトドメインをコードしてい
る異種ゲノムセグメントは、該当するウシF、SHまたはG糖タンパク質細胞質ドメ
インおよびエンドドメインをコードしているポリヌクレオチド配列（すなわち、
ゲノムセグメント）と結合して、ヒト-ウシキメラRSVゲノムまたはアンチゲノム
を形成することができる。
、ドメインおよびエピトープの導入は、免疫感作された宿主中で新規な免疫応答
を生じるのに特に有用である。異なったRSVサブグループまたは株の受容体ゲノ
ムまたはアンチゲノム中のドナーRSVサブグループまたは株であるものからの免
疫原性遺伝子またはゲノムセグメントの付加または置換は、ドナーサブグループ
または株、受容サブグループまたは株、またはドナーおよび受容体両方のサブグ
ループまたは株に対して向けられる免疫応答を生じることができる。この目的を
達成するために、免疫モジュレーターを発現する組換え体RSVを構築することも
でき、これは、キメラタンパク質、例えば、異なったRSVのエクトドメインに融
合した一つのRSVに特異的な細胞質テイルおよび／または膜貫通ドメインを有す
る免疫原性糖タンパク質を発現して、例えば、ヒト-ウシ融合タンパク質、また
は二つの異なったヒトRSVサブグループまたは株からのドメインを包含する融合
タンパク質を提供する。好ましい態様において、免疫調節分子を発現するRSVは
、ヒトおよびウシ両方の糖タンパク質ドメインまたは免疫原性エピトープを有す
る組換え体ウイルスまたはウイルス下粒子中のキメラ糖タンパク質をコードする
ように更に修飾されたそのゲノムまたはアンチゲノムを有する。例えば、ヒトRS
V F、SHまたはG糖タンパク質からの糖タンパク質エクトドメインをコードしてい
る異種ゲノムセグメントは、該当するウシF、SHまたはG糖タンパク質細胞質ドメ
インおよびエンドドメインをコードしているポリヌクレオチド配列（すなわち、
ゲノムセグメント）と結合して、ヒト-ウシキメラRSVゲノムまたはアンチゲノム
を形成することができる。
【０１１３】
他の態様において、ワクチン製剤に有用な組換え体RSVは、循環性ウイルス中
の抗原ドリフトを調整するように好都合に修飾することができる。典型的には、
その修飾は、Gおよび／またはFタンパク質においてであろう。一つのRSV株から
のGまたはF遺伝子全体、またはその特定の免疫原性領域をコードしているゲノム
セグメントを、異なったRSV株またはサブグループの受容体クローン中の該当す
る領域の置換によって、またはいくつかの抗原形態が示されるように遺伝子の一
つまたはそれ以上のコピーを加えることによって、キメラRSVゲノムまたはアン
チゲノムcDNA中に包含させる。次に、修飾されたRSVクローンから生じる子孫ウ
イルスを、出現するRSV株に対するワクチン接種プロトコールにおいて用いるこ
とができる。
の抗原ドリフトを調整するように好都合に修飾することができる。典型的には、
その修飾は、Gおよび／またはFタンパク質においてであろう。一つのRSV株から
のGまたはF遺伝子全体、またはその特定の免疫原性領域をコードしているゲノム
セグメントを、異なったRSV株またはサブグループの受容体クローン中の該当す
る領域の置換によって、またはいくつかの抗原形態が示されるように遺伝子の一
つまたはそれ以上のコピーを加えることによって、キメラRSVゲノムまたはアン
チゲノムcDNA中に包含させる。次に、修飾されたRSVクローンから生じる子孫ウ
イルスを、出現するRSV株に対するワクチン接種プロトコールにおいて用いるこ
とができる。
【０１１４】
本発明のまた更に別の側面において、免疫調節分子を発現するように修飾され
た組換え体RSVは、2種類以上のRSV株または群（例えば、ヒトRSV AおよびRSV B
両方のサブグループ）、HPIV3、HPIV2およびHPIV1を含めたヒトパラインフルエ
ンザウイルス（HPIV）、麻疹ウイルスおよび他の病原体を含めたいろいろな病原
体からの抗原決定基を包含する“ベクター”として容易に設計することができる
（例えば、本明細書中にそれぞれ援用される、米国予備特許出願第60／170,195
号；米国特許出願第09／458,813号；および米国特許出願第09／459,062号を参照
されたい）。種々の態様の範囲内において、組換え体ゲノムまたはアンチゲノム
は、一つまたはそれ以上の異種病原体の一つまたはそれ以上の抗原決定基をコー
ドしている一つまたはそれ以上の異種遺伝子またはゲノムセグメントと組み合わ
された部分的または完全なRSV“ベクターゲノムまたはアンチゲノム”を含む。
異種病原体は、異種RSV（すなわち、異なった株またはサブグループのRSV）であ
ってよいし、異種遺伝子またはゲノムセグメントは、RSV NS1、NS2、N、P、M、S
H、M2（ORF1）、M2（ORF2）、L、FまたはGタンパク質またはそのフラグメント（
例えば、免疫原性ドメインまたはエピトープ）をコードしていてよい。例えば、
ベクターゲノムまたはアンチゲノムは、部分的または完全なRSV Aゲノムまたは
アンチゲノムであってよいし、そして一つまたは複数の異種遺伝子またはゲノム
セグメントは、RSV Bサブグループウイルスの一つまたは複数の抗原決定基をコ
ードしていてよい。
た組換え体RSVは、2種類以上のRSV株または群（例えば、ヒトRSV AおよびRSV B
両方のサブグループ）、HPIV3、HPIV2およびHPIV1を含めたヒトパラインフルエ
ンザウイルス（HPIV）、麻疹ウイルスおよび他の病原体を含めたいろいろな病原
体からの抗原決定基を包含する“ベクター”として容易に設計することができる
（例えば、本明細書中にそれぞれ援用される、米国予備特許出願第60／170,195
号；米国特許出願第09／458,813号；および米国特許出願第09／459,062号を参照
されたい）。種々の態様の範囲内において、組換え体ゲノムまたはアンチゲノム
は、一つまたはそれ以上の異種病原体の一つまたはそれ以上の抗原決定基をコー
ドしている一つまたはそれ以上の異種遺伝子またはゲノムセグメントと組み合わ
された部分的または完全なRSV“ベクターゲノムまたはアンチゲノム”を含む。
異種病原体は、異種RSV（すなわち、異なった株またはサブグループのRSV）であ
ってよいし、異種遺伝子またはゲノムセグメントは、RSV NS1、NS2、N、P、M、S
H、M2（ORF1）、M2（ORF2）、L、FまたはGタンパク質またはそのフラグメント（
例えば、免疫原性ドメインまたはエピトープ）をコードしていてよい。例えば、
ベクターゲノムまたはアンチゲノムは、部分的または完全なRSV Aゲノムまたは
アンチゲノムであってよいし、そして一つまたは複数の異種遺伝子またはゲノム
セグメントは、RSV Bサブグループウイルスの一つまたは複数の抗原決定基をコ
ードしていてよい。
【０１１５】
別の態様において、RSVベクターゲノムまたはアンチゲノムは、部分的または
完全なウシRSV（BRSV）ゲノムまたはアンチゲノムであり、そして一つまたは複
数の抗原決定基をコードしている一つまたは複数の異種遺伝子またはゲノムセグ
メントは、一つまたはそれ以上のヒトRSV（HRSV）に由来する。例えば、部分的
または完全なBRSVゲノムまたはアンチゲノムは、F、GおよびSHより選択される一
つまたはそれ以上のHRSV糖タンパク質遺伝子をコードしている一つまたはそれ以
上の遺伝子またはゲノムセグメント、またはHRSVのF、Gおよび／またはSHの細胞
質ドメイン、膜貫通ドメイン、エクトドメインまたは免疫原性エピトープ部分を
コードしている一つまたはそれ以上のゲノムセグメントを包含してよい。
完全なウシRSV（BRSV）ゲノムまたはアンチゲノムであり、そして一つまたは複
数の抗原決定基をコードしている一つまたは複数の異種遺伝子またはゲノムセグ
メントは、一つまたはそれ以上のヒトRSV（HRSV）に由来する。例えば、部分的
または完全なBRSVゲノムまたはアンチゲノムは、F、GおよびSHより選択される一
つまたはそれ以上のHRSV糖タンパク質遺伝子をコードしている一つまたはそれ以
上の遺伝子またはゲノムセグメント、またはHRSVのF、Gおよび／またはSHの細胞
質ドメイン、膜貫通ドメイン、エクトドメインまたは免疫原性エピトープ部分を
コードしている一つまたはそれ以上のゲノムセグメントを包含してよい。
【０１１６】
他の代わりの態様において、異種抗原決定基を有するために“ベクター”とし
て設計される、免疫調節分子を発現するように修飾されたRSVは、ヒトパライン
フルエンザウイルス（HPIV）のような非RSV病原体の一つまたはそれ以上の抗原
決定基を包含する。一つの典型的な態様において、一つまたはそれ以上のHNおよ
び／またはF糖タンパク質またはその抗原ドメイン、フラグメントまたはエピト
ープをコードしている一つまたはそれ以上のHPIV1、HPIV2またはHPIV3遺伝子ま
たはゲノムセグメントを、部分的または完全なHRSVベクターゲノムまたはアンチ
ゲノムに加えるまたは中に包含させる。より詳細な態様では、HPIV1、HPIV2また
はHPIV3 HNまたはF遺伝子の読み取り枠（ORF）を含む転写単位を、キメラHRSVベ
クターゲノムまたはアンチゲノムに加えるまたは中に包含させる。
て設計される、免疫調節分子を発現するように修飾されたRSVは、ヒトパライン
フルエンザウイルス（HPIV）のような非RSV病原体の一つまたはそれ以上の抗原
決定基を包含する。一つの典型的な態様において、一つまたはそれ以上のHNおよ
び／またはF糖タンパク質またはその抗原ドメイン、フラグメントまたはエピト
ープをコードしている一つまたはそれ以上のHPIV1、HPIV2またはHPIV3遺伝子ま
たはゲノムセグメントを、部分的または完全なHRSVベクターゲノムまたはアンチ
ゲノムに加えるまたは中に包含させる。より詳細な態様では、HPIV1、HPIV2また
はHPIV3 HNまたはF遺伝子の読み取り枠（ORF）を含む転写単位を、キメラHRSVベ
クターゲノムまたはアンチゲノムに加えるまたは中に包含させる。
【０１１７】
また更に別の代わりの態様において、免疫調節分子を発現するように修飾され
たRSVの組換え体ゲノムまたはアンチゲノムは、部分的または完全なHRSVまたはB
RSVゲノムまたはアンチゲノムを含み、異種病原体は、麻疹ウイルス、サブグル
ープAおよびサブグループBの呼吸器性シンチアルウイルス、流行性耳下腺炎ウイ
ルス、ヒト乳頭腫ウイルス、1型および2型のヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペ
スウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、エプスタイン・バールウ
イルス、フィロウイルス、ブンヤウイルス、フラビウイルス、アルファウイルス
およびインフルエンザウイルスより選択される。この代表的な候補病原体リスト
に基づいて、一つまたは複数の選択される異種抗原決定基は、麻疹ウイルスHAお
よびFタンパク質；サブグループAおよびサブグループBの呼吸器性シンチアルウ
イルスF、G、SHおよびM2タンパク質；流行性耳下腺炎ウイルスHNおよびFタンパ
ク質；ヒト乳頭腫ウイルスL1タンパク質；1型または2型のヒト免疫不全ウイルス
gp160タンパク質；単純ヘルペスウイルスおよびサイトメガロウイルスのgB、gC
、gD、gE、gG、gH、gI、gJ、gK、gLおよびgMタンパク質；狂犬病ウイルスGタン
パク質；エプスタイン・バールウイルスgp350タンパク質；フィロウイルスGタン
パク質；ブンヤウイルスGタンパク質；フラビウイルスEおよびNS1タンパク質；
およびアルファウイルスEタンパク質；およびそれらの抗原ドメイン、フラグメ
ントおよびエピトープより選択されてよい。一つの態様において、異種病原体は
麻疹ウイルスであり、一つまたは複数の異種抗原決定基は、麻疹ウイルスHAおよ
びFタンパク質およびそれらの抗原ドメイン、フラグメントおよびエピトープよ
り選択される。このようなキメラ構築物を得るために、麻疹ウイルスHA遺伝子の
読み取り枠（ORF）を含む転写単位を、HRSVベクターゲノムまたはアンチゲノム
に加えてよいしまたは中に包含させてよい。
たRSVの組換え体ゲノムまたはアンチゲノムは、部分的または完全なHRSVまたはB
RSVゲノムまたはアンチゲノムを含み、異種病原体は、麻疹ウイルス、サブグル
ープAおよびサブグループBの呼吸器性シンチアルウイルス、流行性耳下腺炎ウイ
ルス、ヒト乳頭腫ウイルス、1型および2型のヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペ
スウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、エプスタイン・バールウ
イルス、フィロウイルス、ブンヤウイルス、フラビウイルス、アルファウイルス
およびインフルエンザウイルスより選択される。この代表的な候補病原体リスト
に基づいて、一つまたは複数の選択される異種抗原決定基は、麻疹ウイルスHAお
よびFタンパク質；サブグループAおよびサブグループBの呼吸器性シンチアルウ
イルスF、G、SHおよびM2タンパク質；流行性耳下腺炎ウイルスHNおよびFタンパ
ク質；ヒト乳頭腫ウイルスL1タンパク質；1型または2型のヒト免疫不全ウイルス
gp160タンパク質；単純ヘルペスウイルスおよびサイトメガロウイルスのgB、gC
、gD、gE、gG、gH、gI、gJ、gK、gLおよびgMタンパク質；狂犬病ウイルスGタン
パク質；エプスタイン・バールウイルスgp350タンパク質；フィロウイルスGタン
パク質；ブンヤウイルスGタンパク質；フラビウイルスEおよびNS1タンパク質；
およびアルファウイルスEタンパク質；およびそれらの抗原ドメイン、フラグメ
ントおよびエピトープより選択されてよい。一つの態様において、異種病原体は
麻疹ウイルスであり、一つまたは複数の異種抗原決定基は、麻疹ウイルスHAおよ
びFタンパク質およびそれらの抗原ドメイン、フラグメントおよびエピトープよ
り選択される。このようなキメラ構築物を得るために、麻疹ウイルスHA遺伝子の
読み取り枠（ORF）を含む転写単位を、HRSVベクターゲノムまたはアンチゲノム
に加えてよいしまたは中に包含させてよい。
【０１１８】
キメラRSVの構築を行う本発明の全ての態様において、異種または“ドナー”
のポリヌクレオチドの、受容体または“バックグラウンド”のゲノムまたはアン
チゲノムへの付加または置換は、目的のドナー遺伝子の一部分だけを含むことが
できる。一般的には、シス作用性調節要素および遺伝子間配列のような非コーデ
ィングヌクレオチドは、ドナー遺伝子コーディング領域と一緒に転移する必要は
ない。したがって、特定の遺伝子のコーディング配列（例えば、部分的または完
全な読み取り枠（ORF））を、相対遺伝子またはドナー配列と比較して異なった
遺伝子の異種プロモーター（例えば、バックグラウンドゲノムまたはアンチゲノ
ム中に存在するプロモーター）の制御下において、部分的または完全なバックグ
ラウンドゲノムまたはアンチゲノムに加えてよいしまたは置換してよい。種々の
追加のゲノムセグメントは、新規な且つ有用な性状を有するキメラRSVを発現す
るようにキメラゲノムまたはアンチゲノム中に包含させるのに有用なドナーポリ
ヌクレオチドを提供する。例えば、異種ゲノムセグメントは、ヒトまたはウシRS
Vからのある選択されたタンパク質の糖タンパク質細胞質テイル領域、膜貫通ド
メインまたはエクトドメイン、エピトープ部位または領域、結合部位または結合
部位含有領域、活性部位または活性部位含有領域等の一部分または全部をコード
することができる。これらおよび他のゲノムセグメントを、完全なバックグラウ
ンドゲノムまたはアンチゲノムに加え、または相対ゲノムセグメントの代わりに
そこに置換して、新規なRSV組換え体を生じることができる。若干の組換え体は
、キメラタンパク質、例えば、別のRSVのエクトドメインに融合した一つのRSVの
細胞質テイルおよび／または膜貫通ドメインを有するタンパク質を発現するであ
ろう。
のポリヌクレオチドの、受容体または“バックグラウンド”のゲノムまたはアン
チゲノムへの付加または置換は、目的のドナー遺伝子の一部分だけを含むことが
できる。一般的には、シス作用性調節要素および遺伝子間配列のような非コーデ
ィングヌクレオチドは、ドナー遺伝子コーディング領域と一緒に転移する必要は
ない。したがって、特定の遺伝子のコーディング配列（例えば、部分的または完
全な読み取り枠（ORF））を、相対遺伝子またはドナー配列と比較して異なった
遺伝子の異種プロモーター（例えば、バックグラウンドゲノムまたはアンチゲノ
ム中に存在するプロモーター）の制御下において、部分的または完全なバックグ
ラウンドゲノムまたはアンチゲノムに加えてよいしまたは置換してよい。種々の
追加のゲノムセグメントは、新規な且つ有用な性状を有するキメラRSVを発現す
るようにキメラゲノムまたはアンチゲノム中に包含させるのに有用なドナーポリ
ヌクレオチドを提供する。例えば、異種ゲノムセグメントは、ヒトまたはウシRS
Vからのある選択されたタンパク質の糖タンパク質細胞質テイル領域、膜貫通ド
メインまたはエクトドメイン、エピトープ部位または領域、結合部位または結合
部位含有領域、活性部位または活性部位含有領域等の一部分または全部をコード
することができる。これらおよび他のゲノムセグメントを、完全なバックグラウ
ンドゲノムまたはアンチゲノムに加え、または相対ゲノムセグメントの代わりに
そこに置換して、新規なRSV組換え体を生じることができる。若干の組換え体は
、キメラタンパク質、例えば、別のRSVのエクトドメインに融合した一つのRSVの
細胞質テイルおよび／または膜貫通ドメインを有するタンパク質を発現するであ
ろう。
【０１１９】
本発明の他の詳細な側面において、免疫調節分子を発現するように修飾された
RSVを、組換え体RSVゲノムまたはアンチゲノム中の一つまたはそれ以上の遺伝子
またはゲノムセグメントの相対的な遺伝子順序または空間的位置を移動すること
によって生じまたは修飾して、ヒトおよび他の哺乳動物において感染性であり、
弱毒化されていて、そして免疫原性である組換え体ワクチンウイルスを生じる（
本明細書中において援用される、Krempl et al. によって2000年6月23日に出願
され且つ代理人事件整理番号015280-424000USよって確認される RESPIRATORY SY
NCYTIAL VIRUS VACCINES EXPRESSING PROTECTIVE ANTIGENS FROM PROMOTER-PROX
IMAL GENES と称する米国予備特許出願を参照されたい）。本発明のこれら組換
え体RSVは、典型的には、主要ヌクレオキャプシド（N）タンパク質、ヌクレオキ
ャプシドリンタンパク質（P）、ラージポリメラーゼタンパク質（L）、RNAポリ
メラーゼ延長因子、および組換え体ゲノムまたはアンチゲノム中の一つまたはそ
れ以上の位置移動したRSV遺伝子またはゲノムセグメントを有する部分的または
完全な組換え体RSVゲノムまたはアンチゲノムを含む。本発明の若干の側面にお
いて、組換え体RSVは、部分的または完全な組換え体RSVゲノムまたはアンチゲノ
ム中の一つまたはそれ以上の置換ポリヌクレオチドの挿入、欠失または転位によ
ってよりプロモーターに近位のまたはプロモーターに遠位の位置に移動すること
ができる一つまたはそれ以上の位置移動した遺伝子またはゲノムセグメントを特
徴とする。置換ポリヌクレオチドは、組換え体ゲノムまたはアンチゲノムの非コ
ーディング領域（NCR）中に挿入するまたは転位させることができるし、または
組換え体RSVゲノムまたはアンチゲノム中に別個の遺伝子単位（GU）として包含
させることができる。
RSVを、組換え体RSVゲノムまたはアンチゲノム中の一つまたはそれ以上の遺伝子
またはゲノムセグメントの相対的な遺伝子順序または空間的位置を移動すること
によって生じまたは修飾して、ヒトおよび他の哺乳動物において感染性であり、
弱毒化されていて、そして免疫原性である組換え体ワクチンウイルスを生じる（
本明細書中において援用される、Krempl et al. によって2000年6月23日に出願
され且つ代理人事件整理番号015280-424000USよって確認される RESPIRATORY SY
NCYTIAL VIRUS VACCINES EXPRESSING PROTECTIVE ANTIGENS FROM PROMOTER-PROX
IMAL GENES と称する米国予備特許出願を参照されたい）。本発明のこれら組換
え体RSVは、典型的には、主要ヌクレオキャプシド（N）タンパク質、ヌクレオキ
ャプシドリンタンパク質（P）、ラージポリメラーゼタンパク質（L）、RNAポリ
メラーゼ延長因子、および組換え体ゲノムまたはアンチゲノム中の一つまたはそ
れ以上の位置移動したRSV遺伝子またはゲノムセグメントを有する部分的または
完全な組換え体RSVゲノムまたはアンチゲノムを含む。本発明の若干の側面にお
いて、組換え体RSVは、部分的または完全な組換え体RSVゲノムまたはアンチゲノ
ム中の一つまたはそれ以上の置換ポリヌクレオチドの挿入、欠失または転位によ
ってよりプロモーターに近位のまたはプロモーターに遠位の位置に移動すること
ができる一つまたはそれ以上の位置移動した遺伝子またはゲノムセグメントを特
徴とする。置換ポリヌクレオチドは、組換え体ゲノムまたはアンチゲノムの非コ
ーディング領域（NCR）中に挿入するまたは転位させることができるし、または
組換え体RSVゲノムまたはアンチゲノム中に別個の遺伝子単位（GU）として包含
させることができる。
【０１２０】
本発明の典型的な態様において、単離された感染性組換え体RSVを、RSVゲノム
およびそのセグメントのRSV NS1、NS2、N、P、M、SH、M2（ORF1）、M2（ORF2）
、L、FおよびG遺伝子およびゲノムセグメントおよびリーダー、トレーラーおよ
び遺伝子間領域より選択される一つまたはそれ以上のRSV遺伝子またはゲノムセ
グメントより選択されうる一つまたはそれ以上の置換ポリヌクレオチドの付加、
欠失または転位によって構築する。より詳細な態様において、組換え体RSVゲノ
ムまたはアンチゲノム中のポリヌクレオチドインサートおよび欠失または転位要
素は、RSVゲノムまたはそのセグメントの一つまたは複数のRSV NS1、NS2、N、P
、M、SH、M2（ORF1）、M2（ORF2）、L、FおよびG遺伝子またはゲノムセグメント
およびリーダー、トレーラーおよび遺伝子間領域より選択される一つまたはそれ
以上のウシRSV（BRSV）またはヒトRSV（HRSV）遺伝子またはゲノムセグメントよ
り選択される。
およびそのセグメントのRSV NS1、NS2、N、P、M、SH、M2（ORF1）、M2（ORF2）
、L、FおよびG遺伝子およびゲノムセグメントおよびリーダー、トレーラーおよ
び遺伝子間領域より選択される一つまたはそれ以上のRSV遺伝子またはゲノムセ
グメントより選択されうる一つまたはそれ以上の置換ポリヌクレオチドの付加、
欠失または転位によって構築する。より詳細な態様において、組換え体RSVゲノ
ムまたはアンチゲノム中のポリヌクレオチドインサートおよび欠失または転位要
素は、RSVゲノムまたはそのセグメントの一つまたは複数のRSV NS1、NS2、N、P
、M、SH、M2（ORF1）、M2（ORF2）、L、FおよびG遺伝子またはゲノムセグメント
およびリーダー、トレーラーおよび遺伝子間領域より選択される一つまたはそれ
以上のウシRSV（BRSV）またはヒトRSV（HRSV）遺伝子またはゲノムセグメントよ
り選択される。
【０１２１】
本発明の若干の側面において、置換ポリヌクレオチドを、組換え体RSVゲノム
またはアンチゲノムを形成するように挿入して、サイトカインをコードするポリ
ヌクレオチドを導入する突然変異を生じるまたは補足する。この方法での置換ポ
リヌクレオチドの挿入は、組換え体ゲノムまたはアンチゲノム中の一つまたはそ
れ以上の“移動した”RSV遺伝子またはゲノムセグメントを、野生型RSV（例えば
、HRSV A2またはBRSVカンサス株）ゲノムまたはアンチゲノム中の一つまたは複
数の該当する遺伝子またはゲノムセグメントの位置に相対してよりプロモーター
に遠位の位置に位置移動させる。
またはアンチゲノムを形成するように挿入して、サイトカインをコードするポリ
ヌクレオチドを導入する突然変異を生じるまたは補足する。この方法での置換ポ
リヌクレオチドの挿入は、組換え体ゲノムまたはアンチゲノム中の一つまたはそ
れ以上の“移動した”RSV遺伝子またはゲノムセグメントを、野生型RSV（例えば
、HRSV A2またはBRSVカンサス株）ゲノムまたはアンチゲノム中の一つまたは複
数の該当する遺伝子またはゲノムセグメントの位置に相対してよりプロモーター
に遠位の位置に位置移動させる。
【０１２２】
或いは、置換ポリヌクレオチドを、本発明の組換え体RSV中においてこの方法
で欠失して組換え体RSVゲノムまたはアンチゲノムを形成して、サイトカインを
コードしている遺伝子の導入を調整するまたは補足することができる。この場合
の置換ポリヌクレオチドの欠失は、組換え体ゲノムまたはアンチゲノム中の一つ
またはそれ以上の“移動した”RSV遺伝子またはゲノムセグメントを、野生型RSV
中の一つまたは複数の該当する遺伝子またはゲノムセグメントの位置に相対して
よりプロモーターに近位の位置に位置移動させる。サイトカインをコードする組
換え体RSVからの欠失のための置換ポリヌクレオチドは、一つまたはそれ以上のR
SV NS1、NS2、SH、M2（ORF1）またはG遺伝子またはそのゲノムセグメントより選
択することができる。
で欠失して組換え体RSVゲノムまたはアンチゲノムを形成して、サイトカインを
コードしている遺伝子の導入を調整するまたは補足することができる。この場合
の置換ポリヌクレオチドの欠失は、組換え体ゲノムまたはアンチゲノム中の一つ
またはそれ以上の“移動した”RSV遺伝子またはゲノムセグメントを、野生型RSV
中の一つまたは複数の該当する遺伝子またはゲノムセグメントの位置に相対して
よりプロモーターに近位の位置に位置移動させる。サイトカインをコードする組
換え体RSVからの欠失のための置換ポリヌクレオチドは、一つまたはそれ以上のR
SV NS1、NS2、SH、M2（ORF1）またはG遺伝子またはそのゲノムセグメントより選
択することができる。
【０１２３】
本発明のより詳細な態様において、RSV NS1遺伝子を含む置換ポリヌクレオチ
ドを欠失して、組換え体RSVゲノムまたはアンチゲノムを形成する。或いは、RSV
NS2遺伝子を含む置換ポリヌクレオチドを欠失して、組換え体RSVゲノムまたは
アンチゲノムを形成してよい。或いは、RSV SH遺伝子を含む置換ポリヌクレオチ
ドを欠失して、組換え体RSVゲノムまたはアンチゲノムを形成してよい。或いは
、RSV M2（ORF2）遺伝子を含む置換ポリヌクレオチドを欠失して、組換え体RSV
ゲノムまたはアンチゲノムを形成することができる。或いは、RSV G遺伝子を含
む置換ポリヌクレオチドを欠失して、組換え体RSVゲノムまたはアンチゲノムを
形成することができる。
ドを欠失して、組換え体RSVゲノムまたはアンチゲノムを形成する。或いは、RSV
NS2遺伝子を含む置換ポリヌクレオチドを欠失して、組換え体RSVゲノムまたは
アンチゲノムを形成してよい。或いは、RSV SH遺伝子を含む置換ポリヌクレオチ
ドを欠失して、組換え体RSVゲノムまたはアンチゲノムを形成してよい。或いは
、RSV M2（ORF2）遺伝子を含む置換ポリヌクレオチドを欠失して、組換え体RSV
ゲノムまたはアンチゲノムを形成することができる。或いは、RSV G遺伝子を含
む置換ポリヌクレオチドを欠失して、組換え体RSVゲノムまたはアンチゲノムを
形成することができる。
【０１２４】
また更に別の態様において、RSV遺伝子またはゲノムセグメントを含む多重置
換ポリヌクレオチドは、サイトカインをコードする突然変異RSV中で欠失するこ
とができる。例えば、RSV FおよびG遺伝子を両方とも欠失して、免疫調節分子を
コードしている遺伝子インサートを有する組換え体RSVゲノムまたはアンチゲノ
ムを更に修飾することができる。或いは、RSV NS1およびNS2遺伝子は両方とも、
組換え体RSVゲノムまたはアンチゲノム中で欠失することができる。或いは、RSV
SHおよびNS2遺伝子は両方とも、組換え体RSVゲノムまたはアンチゲノム中で欠
失することができる。或いは、RSV SH、NS1およびNS2遺伝子は全て、組換え体RS
Vゲノムまたはアンチゲノム中で欠失することができる。
換ポリヌクレオチドは、サイトカインをコードする突然変異RSV中で欠失するこ
とができる。例えば、RSV FおよびG遺伝子を両方とも欠失して、免疫調節分子を
コードしている遺伝子インサートを有する組換え体RSVゲノムまたはアンチゲノ
ムを更に修飾することができる。或いは、RSV NS1およびNS2遺伝子は両方とも、
組換え体RSVゲノムまたはアンチゲノム中で欠失することができる。或いは、RSV
SHおよびNS2遺伝子は両方とも、組換え体RSVゲノムまたはアンチゲノム中で欠
失することができる。或いは、RSV SH、NS1およびNS2遺伝子は全て、組換え体RS
Vゲノムまたはアンチゲノム中で欠失することができる。
【０１２５】
本発明のいろいろな態様において、サイトカインまたは他の免疫調節分子をコ
ードしている単離された感染性組換え体RSVを提供するが、ここにおいて、一つ
またはそれ以上の置換ポリヌクレオチドを、組換え体RSVゲノムまたはアンチゲ
ノム中で加え、置換し、または転位させて、一つまたはそれ以上の移動したRSV
遺伝子またはゲノムセグメントを位置移動させる。これら修飾の内、遺伝子およ
びゲノムセグメントの挿入および転位は、対象の遺伝子またはゲノムセグメント
を、該当する（例えば、ウシまたはヒト）野生型RSVゲノムまたはアンチゲノム
中の各対象（挿入されるまたは転位する）遺伝子またはゲノムセグメントのそれ
ぞれの位置に相対してよりプロモーターに近位のまたはプロモーターに遠位の位
置に導入するまたは転位させることができる。組換え体RSVゲノムまたはアンチ
ゲノム中で加えられる、置換する、または転位することができる置換ポリヌクレ
オチドは、RSV NS1、NS2、SH、M2（ORF2）、Fおよび／またはG遺伝子またはその
ゲノムセグメントの一つまたはそれ以上より選択することができる。
ードしている単離された感染性組換え体RSVを提供するが、ここにおいて、一つ
またはそれ以上の置換ポリヌクレオチドを、組換え体RSVゲノムまたはアンチゲ
ノム中で加え、置換し、または転位させて、一つまたはそれ以上の移動したRSV
遺伝子またはゲノムセグメントを位置移動させる。これら修飾の内、遺伝子およ
びゲノムセグメントの挿入および転位は、対象の遺伝子またはゲノムセグメント
を、該当する（例えば、ウシまたはヒト）野生型RSVゲノムまたはアンチゲノム
中の各対象（挿入されるまたは転位する）遺伝子またはゲノムセグメントのそれ
ぞれの位置に相対してよりプロモーターに近位のまたはプロモーターに遠位の位
置に導入するまたは転位させることができる。組換え体RSVゲノムまたはアンチ
ゲノム中で加えられる、置換する、または転位することができる置換ポリヌクレ
オチドは、RSV NS1、NS2、SH、M2（ORF2）、Fおよび／またはG遺伝子またはその
ゲノムセグメントの一つまたはそれ以上より選択することができる。
【０１２６】
より詳細な態様において、置換ポリヌクレオチドは、一つまたはそれ以上のRS
V糖タンパク質、またはRSV糖タンパク質の免疫原性ドメインまたはエピトープを
コードする一つまたはそれ以上のRSV遺伝子またはゲノムセグメントを含む組換
え体ゲノムまたはアンチゲノム中での挿入または転位のために選択される。典型
的な態様において、これら置換ポリヌクレオチドは、RSV F、Gおよび／またはSH
糖タンパク質またはその免疫原性ドメインまたはエピトープをコードしている遺
伝子またはゲノムセグメントより選択される。例えば、F、GおよびSHより選択さ
れる一つまたはそれ以上のRSV糖タンパク質遺伝子は、組換え体RSVゲノムまたは
アンチゲノム中で、一つまたは複数の遺伝子の野生型遺伝子順序位置と比較して
よりプロモーターに近位またはプロモーターに遠位である位置に加える、置換す
るまたは転位させることができる。
V糖タンパク質、またはRSV糖タンパク質の免疫原性ドメインまたはエピトープを
コードする一つまたはそれ以上のRSV遺伝子またはゲノムセグメントを含む組換
え体ゲノムまたはアンチゲノム中での挿入または転位のために選択される。典型
的な態様において、これら置換ポリヌクレオチドは、RSV F、Gおよび／またはSH
糖タンパク質またはその免疫原性ドメインまたはエピトープをコードしている遺
伝子またはゲノムセグメントより選択される。例えば、F、GおよびSHより選択さ
れる一つまたはそれ以上のRSV糖タンパク質遺伝子は、組換え体RSVゲノムまたは
アンチゲノム中で、一つまたは複数の遺伝子の野生型遺伝子順序位置と比較して
よりプロモーターに近位またはプロモーターに遠位である位置に加える、置換す
るまたは転位させることができる。
【０１２７】
典型的な態様において、RSV糖タンパク質遺伝子Gは、組換え体RSVゲノムまた
はアンチゲノム中で、Gの野生型遺伝子順序位置と比較してよりプロモーターに
近位である遺伝子順序位置に転位する。より詳細な側面において、RSV糖タンパ
ク質遺伝子Gは、その組換え体RSVゲノムまたはアンチゲノム中で遺伝子順序1位
に移動する。他の典型的な態様において、RSV糖タンパク質遺伝子Fは、例えば、
組換え体ゲノムまたはアンチゲノム中の遺伝子順序1位までF遺伝子を移動するこ
とによって、組換え体RSVゲノムまたはアンチゲノム中でよりプロモーターに近
位の位置に転位する。また更に別の典型的な態様において、RSV糖タンパク質遺
伝子GおよびFは両方とも、組換え体RSVゲノムまたはアンチゲノム中で、それら
のそれぞれの野生型遺伝子順序位置と比較してより近位である遺伝子順序位置に
転位する。より詳細な側面において、RSV糖タンパク質遺伝子Gは、遺伝子順序1
位まで移動し、RSV糖タンパク質遺伝子Fは、遺伝子順序2位まで移動する。
はアンチゲノム中で、Gの野生型遺伝子順序位置と比較してよりプロモーターに
近位である遺伝子順序位置に転位する。より詳細な側面において、RSV糖タンパ
ク質遺伝子Gは、その組換え体RSVゲノムまたはアンチゲノム中で遺伝子順序1位
に移動する。他の典型的な態様において、RSV糖タンパク質遺伝子Fは、例えば、
組換え体ゲノムまたはアンチゲノム中の遺伝子順序1位までF遺伝子を移動するこ
とによって、組換え体RSVゲノムまたはアンチゲノム中でよりプロモーターに近
位の位置に転位する。また更に別の典型的な態様において、RSV糖タンパク質遺
伝子GおよびFは両方とも、組換え体RSVゲノムまたはアンチゲノム中で、それら
のそれぞれの野生型遺伝子順序位置と比較してより近位である遺伝子順序位置に
転位する。より詳細な側面において、RSV糖タンパク質遺伝子Gは、遺伝子順序1
位まで移動し、RSV糖タンパク質遺伝子Fは、遺伝子順序2位まで移動する。
【０１２８】
糖タンパク質遺伝子シフトを特徴とするまた更に別の構築物において、組換え
体RSVゲノムまたはアンチゲノム中で加えられ、置換され、または転位した、F、
GおよびSHより選択される一つまたはそれ以上のRSV糖タンパク質遺伝子またはそ
のゲノムセグメントを有する組換え体M2 ORF2欠失およびノックアウトRSVを製造
するが、ここにおいて、一つまたはそれ以上のRSV NS1、NS2、SH、M2（ORF2）ま
たはG遺伝子またはそのゲノムセグメントは欠失している。したがって、RSV F、
GまたはSHの遺伝子またはゲノムセグメントは、RSV NS1遺伝子を含む置換ポリヌ
クレオチドを欠失して組換え体RSVゲノムまたはアンチゲノムを形成しているバ
ックグラウンド中で加えられてよいし、置換されてよいしまたは転位してよい。
或いは、RSV F、GまたはSHの遺伝子またはゲノムセグメントは、RSV NS2遺伝子
を含む置換ポリヌクレオチドを欠失して組換え体RSVゲノムまたはアンチゲノム
を形成しているバックグラウンド中で加えられてよいし、置換されてよいしまた
は転位してよい。或いは、RSV F、GまたはSHの遺伝子またはゲノムセグメントは
、RSV SH遺伝子を含む置換ポリヌクレオチドを欠失して組換え体RSVゲノムまた
はアンチゲノムを形成しているバックグラウンド中で加えられてよいし、置換さ
れてよいしまたは転位してよい。
体RSVゲノムまたはアンチゲノム中で加えられ、置換され、または転位した、F、
GおよびSHより選択される一つまたはそれ以上のRSV糖タンパク質遺伝子またはそ
のゲノムセグメントを有する組換え体M2 ORF2欠失およびノックアウトRSVを製造
するが、ここにおいて、一つまたはそれ以上のRSV NS1、NS2、SH、M2（ORF2）ま
たはG遺伝子またはそのゲノムセグメントは欠失している。したがって、RSV F、
GまたはSHの遺伝子またはゲノムセグメントは、RSV NS1遺伝子を含む置換ポリヌ
クレオチドを欠失して組換え体RSVゲノムまたはアンチゲノムを形成しているバ
ックグラウンド中で加えられてよいし、置換されてよいしまたは転位してよい。
或いは、RSV F、GまたはSHの遺伝子またはゲノムセグメントは、RSV NS2遺伝子
を含む置換ポリヌクレオチドを欠失して組換え体RSVゲノムまたはアンチゲノム
を形成しているバックグラウンド中で加えられてよいし、置換されてよいしまた
は転位してよい。或いは、RSV F、GまたはSHの遺伝子またはゲノムセグメントは
、RSV SH遺伝子を含む置換ポリヌクレオチドを欠失して組換え体RSVゲノムまた
はアンチゲノムを形成しているバックグラウンド中で加えられてよいし、置換さ
れてよいしまたは転位してよい。
【０１２９】
一つの態様において、RSV糖タンパク質遺伝子Gは、SH遺伝子欠失を有する組換
え体RSVゲノムまたはアンチゲノム中で、Gの野生型遺伝子順序位置と比較してよ
りプロモーターに近位である遺伝子順序位置に転位する。より詳細な側面におい
て、RSV糖タンパク質遺伝子Gは、上に引用された参考文献に記載された組換え体
ワクチン候補G1／ΔSHによって例示されるように、組換え体RSVゲノムまたはア
ンチゲノム中で遺伝子順序1位に移動する。もう一つの態様において、RSV糖タン
パク質遺伝子Fは、SH遺伝子欠失を有する組換え体RSVゲノムまたはアンチゲノム
中で、よりプロモーターに近位の位置に転位する。より詳細な側面において、F
遺伝子は、組換え体F1ΔSHによって例示されるように、遺伝子順序1位に移動す
る。更にもう一つの態様において、RSV糖タンパク質遺伝子GおよびFは両方とも
、ΔSH組換え体RSVゲノムまたはアンチゲノム中で、GおよびFの野生型遺伝子順
序位置と比較してよりプロモーターに近位である遺伝子順序位置に転位する。よ
り詳細な側面において、RSV糖タンパク質遺伝子Gは、遺伝子順序1位に移動し、R
SV糖タンパク質遺伝子Fは、組換え体G1F1／ΔSHによって例示されるように、組
換え体RSVゲノムまたはアンチゲノム中で遺伝子順序1位に移動する。
え体RSVゲノムまたはアンチゲノム中で、Gの野生型遺伝子順序位置と比較してよ
りプロモーターに近位である遺伝子順序位置に転位する。より詳細な側面におい
て、RSV糖タンパク質遺伝子Gは、上に引用された参考文献に記載された組換え体
ワクチン候補G1／ΔSHによって例示されるように、組換え体RSVゲノムまたはア
ンチゲノム中で遺伝子順序1位に移動する。もう一つの態様において、RSV糖タン
パク質遺伝子Fは、SH遺伝子欠失を有する組換え体RSVゲノムまたはアンチゲノム
中で、よりプロモーターに近位の位置に転位する。より詳細な側面において、F
遺伝子は、組換え体F1ΔSHによって例示されるように、遺伝子順序1位に移動す
る。更にもう一つの態様において、RSV糖タンパク質遺伝子GおよびFは両方とも
、ΔSH組換え体RSVゲノムまたはアンチゲノム中で、GおよびFの野生型遺伝子順
序位置と比較してよりプロモーターに近位である遺伝子順序位置に転位する。よ
り詳細な側面において、RSV糖タンパク質遺伝子Gは、遺伝子順序1位に移動し、R
SV糖タンパク質遺伝子Fは、組換え体G1F1／ΔSHによって例示されるように、組
換え体RSVゲノムまたはアンチゲノム中で遺伝子順序1位に移動する。
【０１３０】
遺伝子位置移動したRSVのまた更に別の実施例を、F、GおよびSHより選択され
る一つまたは複数の糖タンパク質遺伝子のシフトを特徴とする本発明の範囲内で
用いるのに提供するが、これらは、一つまたは複数のRSV NS1、NS2、SH、M2（OR
F2）およびG遺伝子またはゲノムセグメントより選択される多重遺伝子またはゲ
ノムセグメントを欠失している組換え体RSVゲノムまたはアンチゲノム中で生じ
る（本明細書中において援用される、Krempl et al. によって2000年6月23日に
出願され且つ代理人事件整理番号015280-424000USよって確認される RESPIRATOR
Y SYNCYTIAL VIRUS VACCINES EXPRESSING PROTECTIVE ANTIGENS FROM PROMOTER-
PROXIMAL GENES と称する米国特許出願を参照されたい）。一つの実施例におい
て、RSV SHおよびNS2遺伝子を両方とも欠失して、組換え体RSVゲノムまたはアン
チゲノムを形成し、RSV糖タンパク質遺伝子GおよびFの一方または両方は、組換
え体RSVゲノム中で、よりプロモーターに近位の遺伝子順序位置に転位する。よ
り詳細な側面において、組換え体G1F1／ΔNS2ΔSHによって例示されるように、G
は遺伝子順序1位に移動し、Fは遺伝子順序2位に移動する。もう一つの実施例に
おいて、RSV SH、NS1およびNS2遺伝子を全て欠失して、組換え体RSVゲノムまた
はアンチゲノムを形成し、RSV糖タンパク質遺伝子GおよびFの一方または両方は
、組換え体ワクチン候補G1F1／ΔNS2ΔNS2ΔSHによって例示されるように、組換
え体RSVゲノムまたはアンチゲノム中で、よりプロモーターに近位の位置に転位
する。
る一つまたは複数の糖タンパク質遺伝子のシフトを特徴とする本発明の範囲内で
用いるのに提供するが、これらは、一つまたは複数のRSV NS1、NS2、SH、M2（OR
F2）およびG遺伝子またはゲノムセグメントより選択される多重遺伝子またはゲ
ノムセグメントを欠失している組換え体RSVゲノムまたはアンチゲノム中で生じ
る（本明細書中において援用される、Krempl et al. によって2000年6月23日に
出願され且つ代理人事件整理番号015280-424000USよって確認される RESPIRATOR
Y SYNCYTIAL VIRUS VACCINES EXPRESSING PROTECTIVE ANTIGENS FROM PROMOTER-
PROXIMAL GENES と称する米国特許出願を参照されたい）。一つの実施例におい
て、RSV SHおよびNS2遺伝子を両方とも欠失して、組換え体RSVゲノムまたはアン
チゲノムを形成し、RSV糖タンパク質遺伝子GおよびFの一方または両方は、組換
え体RSVゲノム中で、よりプロモーターに近位の遺伝子順序位置に転位する。よ
り詳細な側面において、組換え体G1F1／ΔNS2ΔSHによって例示されるように、G
は遺伝子順序1位に移動し、Fは遺伝子順序2位に移動する。もう一つの実施例に
おいて、RSV SH、NS1およびNS2遺伝子を全て欠失して、組換え体RSVゲノムまた
はアンチゲノムを形成し、RSV糖タンパク質遺伝子GおよびFの一方または両方は
、組換え体ワクチン候補G1F1／ΔNS2ΔNS2ΔSHによって例示されるように、組換
え体RSVゲノムまたはアンチゲノム中で、よりプロモーターに近位の位置に転位
する。
【０１３１】
本発明のまた更に別の側面において、サイトカインまたは他の免疫調節分子を
発現するように修飾された遺伝子位置移動したRSVを、ヒト-ウシキメラRSVと組
み合わせるまたは中に包含させる（Bucholz et al. によって2000年6月23日に出
願され且つ代理人事件整理番号015280-398100USよっておよびその優先権米国予
備特許出願60／143,132号において確認される PRODUCTION OF ATTENUATED, HUMA
N-BOVINE CHIMERIC RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS VACCINES と称する米国特許
出願（本明細書中においてそれぞれ援用される）を参照されたい）。これらの側
面の範囲内で、組換え体ゲノムまたはアンチゲノムは、ヒト-ウシキメラRSVゲノ
ムまたはアンチゲノムについて異なったRSVからの一つまたはそれ以上の異種遺
伝子またはゲノムセグメントと組み合わされた部分的または完全なヒトRSV（HRS
V）またはウシRSV（BRSV）バックグラウンドゲノムまたはアンチゲノムを含む。
異なったHRSVまたはBRSVの異種遺伝子またはゲノムセグメントは、部分的または
完全なHRSVまたはBRSVバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノム中の相対遺伝
子またはゲノムセグメントの野生型遺伝子順序位置と比較してよりプロモーター
に近位またはプロモーターに遠位である位置で加えてよいしまたは置換してよい
。一つのこのような実施例において、ヒトRSV糖タンパク質遺伝子GおよびFは両
方とも、組換え体ウイルスrBRSV／A2-G1F2によって例示されるように、遺伝子順
序1位および2位でそれぞれ置換されて、部分的ウシRSVバックグラウンドゲノム
またはアンチゲノム中の野生型7位および8位でそれぞれ欠失したGおよびF糖タン
パク質相対遺伝子に置き換えられる。他の態様において、F、G、SHおよびMより
選択される一つまたはそれ以上のヒトRSVエンベロープ関連遺伝子を、部分的ま
たは完全なウシRSVバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノム中で加えるまた
は置換する。より詳細な側面において、F、G、SHおよびMより選択される一つま
たはそれ以上のヒトRSVエンベロープ関連遺伝子を、F、G、SHおよびMより選択さ
れる一つまたはそれ以上のエンベロープ関連遺伝子が欠失している部分的ウシRS
Vバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノム中で加えるまたは置換する。一つ
の態様において、ヒトRSVエンベロープ関連遺伝子F、GおよびMは、組換え体ウイ
ルスrBRSV／A2-MGFによって例示されるように、エンベロープ関連遺伝子F、G、S
HおよびMを全て欠失している部分的ウシRSVバックグラウンドゲノムまたはアン
チゲノム中で加えられる。
発現するように修飾された遺伝子位置移動したRSVを、ヒト-ウシキメラRSVと組
み合わせるまたは中に包含させる（Bucholz et al. によって2000年6月23日に出
願され且つ代理人事件整理番号015280-398100USよっておよびその優先権米国予
備特許出願60／143,132号において確認される PRODUCTION OF ATTENUATED, HUMA
N-BOVINE CHIMERIC RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS VACCINES と称する米国特許
出願（本明細書中においてそれぞれ援用される）を参照されたい）。これらの側
面の範囲内で、組換え体ゲノムまたはアンチゲノムは、ヒト-ウシキメラRSVゲノ
ムまたはアンチゲノムについて異なったRSVからの一つまたはそれ以上の異種遺
伝子またはゲノムセグメントと組み合わされた部分的または完全なヒトRSV（HRS
V）またはウシRSV（BRSV）バックグラウンドゲノムまたはアンチゲノムを含む。
異なったHRSVまたはBRSVの異種遺伝子またはゲノムセグメントは、部分的または
完全なHRSVまたはBRSVバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノム中の相対遺伝
子またはゲノムセグメントの野生型遺伝子順序位置と比較してよりプロモーター
に近位またはプロモーターに遠位である位置で加えてよいしまたは置換してよい
。一つのこのような実施例において、ヒトRSV糖タンパク質遺伝子GおよびFは両
方とも、組換え体ウイルスrBRSV／A2-G1F2によって例示されるように、遺伝子順
序1位および2位でそれぞれ置換されて、部分的ウシRSVバックグラウンドゲノム
またはアンチゲノム中の野生型7位および8位でそれぞれ欠失したGおよびF糖タン
パク質相対遺伝子に置き換えられる。他の態様において、F、G、SHおよびMより
選択される一つまたはそれ以上のヒトRSVエンベロープ関連遺伝子を、部分的ま
たは完全なウシRSVバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノム中で加えるまた
は置換する。より詳細な側面において、F、G、SHおよびMより選択される一つま
たはそれ以上のヒトRSVエンベロープ関連遺伝子を、F、G、SHおよびMより選択さ
れる一つまたはそれ以上のエンベロープ関連遺伝子が欠失している部分的ウシRS
Vバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノム中で加えるまたは置換する。一つ
の態様において、ヒトRSVエンベロープ関連遺伝子F、GおよびMは、組換え体ウイ
ルスrBRSV／A2-MGFによって例示されるように、エンベロープ関連遺伝子F、G、S
HおよびMを全て欠失している部分的ウシRSVバックグラウンドゲノムまたはアン
チゲノム中で加えられる。
【０１３２】
本発明の組換え体RSV中に遺伝子操作される望ましい表現型変化には、細胞培
養物またはある選択された宿主環境における弱毒化、弱毒表現型からの復帰への
耐性、増加した免疫原性（例えば、引き出された免疫応答の増大または減少によ
って決定される）、選択されたウイルス産物の転写および／または翻訳のアップ
レギュレーションまたはダウンレギュレーション等が含まれるが、これらに制限
されるわけではない。本発明の好ましい側面において、免疫モジュレーターを発
現するように遺伝子操作されたRSVであって、組換え体ゲノムまたはアンチゲノ
ムが、弱毒化または追加の弱毒化表現型を規定する一つまたはそれ以上の弱毒化
突然変異を導入することによって更に修飾されているRSVを提供する。これら突
然変異は、上に引用された参考文献に記載の合理的設計突然変異誘発計画にした
がって、de novo で生じ、弱毒化作用について調べることができる。或いは、弱
毒化突然変異は、生物学的に誘導される突然変異体RSV中で確認された後、本発
明の組換え体RSV中に包含させることができる。
養物またはある選択された宿主環境における弱毒化、弱毒表現型からの復帰への
耐性、増加した免疫原性（例えば、引き出された免疫応答の増大または減少によ
って決定される）、選択されたウイルス産物の転写および／または翻訳のアップ
レギュレーションまたはダウンレギュレーション等が含まれるが、これらに制限
されるわけではない。本発明の好ましい側面において、免疫モジュレーターを発
現するように遺伝子操作されたRSVであって、組換え体ゲノムまたはアンチゲノ
ムが、弱毒化または追加の弱毒化表現型を規定する一つまたはそれ以上の弱毒化
突然変異を導入することによって更に修飾されているRSVを提供する。これら突
然変異は、上に引用された参考文献に記載の合理的設計突然変異誘発計画にした
がって、de novo で生じ、弱毒化作用について調べることができる。或いは、弱
毒化突然変異は、生物学的に誘導される突然変異体RSV中で確認された後、本発
明の組換え体RSV中に包含させることができる。
【０１３３】
一つまたはそれ以上の免疫調節分子を発現するRSVワクチン株中に包含するた
めの生物学的に誘導されるRSV中の弱毒化突然変異は、天然に存在しうるし、ま
たは周知の突然変異誘発法によって野生型RSV株中に導入することができる。例
えば、弱毒RSV株は、化学的突然変異原が加えられている細胞培養物中でのウイ
ルス成長中の化学的突然変異誘発によって、成長制限突然変異を導入するために
最適以下の温度で継代されているウイルスの選択によって、または概して、本明
細書中および本明細書中に援用されるUSSN08／327,263号に記載のように、細胞
培養物中で小プラーク（sp）を生じるまたは温度感受性（ts）表現型を示す突然
変異誘発ウイルスの選択によって生じることができる。
めの生物学的に誘導されるRSV中の弱毒化突然変異は、天然に存在しうるし、ま
たは周知の突然変異誘発法によって野生型RSV株中に導入することができる。例
えば、弱毒RSV株は、化学的突然変異原が加えられている細胞培養物中でのウイ
ルス成長中の化学的突然変異誘発によって、成長制限突然変異を導入するために
最適以下の温度で継代されているウイルスの選択によって、または概して、本明
細書中および本明細書中に援用されるUSSN08／327,263号に記載のように、細胞
培養物中で小プラーク（sp）を生じるまたは温度感受性（ts）表現型を示す突然
変異誘発ウイルスの選択によって生じることができる。
【０１３４】
“生物学的に誘導されるRSV”とは、組換え手段によって生じていない任意のR
SVを意味する。したがって、生物学的に誘導されるRSVには、例えば、野生型ゲ
ノム配列を有する天然に存在するRSVおよび標準野生型RSV配列からのゲノム変異
を有するRSV、例えば、弱毒表現型を規定する突然変異を有するRSVを含めた全て
のサブグループおよび株の天然に存在するRSVが含まれる。同様に、生物学的に
誘導されるRSVには、特に、非組換え突然変異誘発および選択法によって親RSV株
から誘導されるRSV突然変異体が含まれる（例えば、本明細書中に援用される国
際公開WO93／21310号を参照されたい）。
SVを意味する。したがって、生物学的に誘導されるRSVには、例えば、野生型ゲ
ノム配列を有する天然に存在するRSVおよび標準野生型RSV配列からのゲノム変異
を有するRSV、例えば、弱毒表現型を規定する突然変異を有するRSVを含めた全て
のサブグループおよび株の天然に存在するRSVが含まれる。同様に、生物学的に
誘導されるRSVには、特に、非組換え突然変異誘発および選択法によって親RSV株
から誘導されるRSV突然変異体が含まれる（例えば、本明細書中に援用される国
際公開WO93／21310号を参照されたい）。
【０１３５】
本発明の範囲内で用いるための典型的な弱毒RSVにおける複製の温度感受性レ
ベルは、許容温度でのその複製と、いくつかの制限温度での複製とを比較するこ
とによって決定される。ウイルスの複製が、許容温度での複製と比較して100倍
またはそれ以上減少する最低温度を停止温度（shutoff temperature）と称する
。実験動物およびヒトの場合、RSVの複製および毒力は両方とも、突然変異体の
停止温度と相関する。39℃の停止温度を有する突然変異体の複製は、適度に制限
されるが、38℃の停止温度を有する突然変異体は、あまり充分に複製しないし、
しかも疾患症状は、主に上気道に限定される。35℃〜37℃の停止温度を有するウ
イルスは、典型的には、チンパンジーで完全に弱毒化され、ヒトにおいては実質
的に弱毒化されるであろう。したがって、tsである本発明の弱毒RSVは、約35℃
〜39℃、好ましくは、35℃〜38℃の範囲内の停止温度を有するであろう。部分弱
毒株中へのts突然変異の付加は、本発明のワクチン組成物中で有用な多重弱毒ウ
イルスを生じる。
ベルは、許容温度でのその複製と、いくつかの制限温度での複製とを比較するこ
とによって決定される。ウイルスの複製が、許容温度での複製と比較して100倍
またはそれ以上減少する最低温度を停止温度（shutoff temperature）と称する
。実験動物およびヒトの場合、RSVの複製および毒力は両方とも、突然変異体の
停止温度と相関する。39℃の停止温度を有する突然変異体の複製は、適度に制限
されるが、38℃の停止温度を有する突然変異体は、あまり充分に複製しないし、
しかも疾患症状は、主に上気道に限定される。35℃〜37℃の停止温度を有するウ
イルスは、典型的には、チンパンジーで完全に弱毒化され、ヒトにおいては実質
的に弱毒化されるであろう。したがって、tsである本発明の弱毒RSVは、約35℃
〜39℃、好ましくは、35℃〜38℃の範囲内の停止温度を有するであろう。部分弱
毒株中へのts突然変異の付加は、本発明のワクチン組成物中で有用な多重弱毒ウ
イルスを生じる。
【０１３６】
鼻腔内投与用候補ワクチンとしての多数の弱毒RSV株は、多数回の化学的突然
変異誘発を用いて、低温継代中に既に弱毒化されたウイルス中に多重突然変異を
導入して開発されてきている（例えば、本明細書中に援用される、Connors et a
l., Virology 208:478-484,1995; Crowe et al., Vaccine 12:691-699,1994; お
よび Crowe et al., Vaccine 12:783-790,1994）。齧歯類動物、チンパンジー、
成人および幼児での評価は、これら候補ワクチン株のいくつかが、遺伝的に比較
的安定であり、極めて免疫原性であり、そして充分に弱毒化されうるということ
を示す。これら弱毒ウイルスのいくつかのヌクレオチド配列分析は、それぞれの
増加した弱毒化レベルが、特定のヌクレオチドおよびアミノ酸置換と関連がある
ということを示す。上に引用された参考文献は、突然変異を感染性RSVクローン
のゲノムまたはアンチゲノム中に別々におよびいろいろな組合せで導入すること
により、付随的サイレント突然変異と表現型差の原因となるものとを常套手段に
よって区別する方法も開示している。親および誘導体ウイルスの表現型特性の評
価と連結されたこの方法は、弱毒化、温度感受性、低温適応、小プラークサイズ
、宿主域制限等のような望まれる特性の原因となる突然変異を確認する。
変異誘発を用いて、低温継代中に既に弱毒化されたウイルス中に多重突然変異を
導入して開発されてきている（例えば、本明細書中に援用される、Connors et a
l., Virology 208:478-484,1995; Crowe et al., Vaccine 12:691-699,1994; お
よび Crowe et al., Vaccine 12:783-790,1994）。齧歯類動物、チンパンジー、
成人および幼児での評価は、これら候補ワクチン株のいくつかが、遺伝的に比較
的安定であり、極めて免疫原性であり、そして充分に弱毒化されうるということ
を示す。これら弱毒ウイルスのいくつかのヌクレオチド配列分析は、それぞれの
増加した弱毒化レベルが、特定のヌクレオチドおよびアミノ酸置換と関連がある
ということを示す。上に引用された参考文献は、突然変異を感染性RSVクローン
のゲノムまたはアンチゲノム中に別々におよびいろいろな組合せで導入すること
により、付随的サイレント突然変異と表現型差の原因となるものとを常套手段に
よって区別する方法も開示している。親および誘導体ウイルスの表現型特性の評
価と連結されたこの方法は、弱毒化、温度感受性、低温適応、小プラークサイズ
、宿主域制限等のような望まれる特性の原因となる突然変異を確認する。
【０１３７】
このようにして確認される突然変異を、“メニュー”に集めた後、所望のよう
に、単独でまたは組合せで導入して、サイトカインを、所望のように適当なレベ
ルの弱毒化、免疫原性、弱毒表現型からの復帰への遺伝的耐性等に発現もする組
換え体RSVワクチンを調整する。好ましくは、本発明の組換え体RSVは、このよう
なメニューから確認される少なくとも一つ、より好ましくは、二つまたはそれ以
上の弱毒化突然変異の包含によって弱毒化されるが、これは、生物学的に誘導さ
れる突然変異体RSV株パネル中の一群の既知の突然変異として定義されうる。本
明細書中に記載の好ましい突然変異体RSV株パネルは、低温継代（cp）および／
または温度感受性（ts）突然変異体、例えば、cptsRSV248（ATCC VR2450）、cpt
sRSV248／404（ATCC VR2454）、cptsRSV248／955（ATCC VR2453）、cptsRSV530
（ATCC VR2452）、cptsRSV530／1009（ATCC VR2451）、cptsRSV530／1030（ATCC
VR2455）、RSV B-1cp52／2B5（ATCC VR2542）およびRSV B-1cp-23（ATCC VR257
9）と称されるRSV突然変異体から成るパネルである（それぞれ、ブダペスト条約
の条件に基づき、10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-220
9, U.S.A. の American Type Culture Collection（ATCC）に寄託され、上記の
受託番号を付与された）。
に、単独でまたは組合せで導入して、サイトカインを、所望のように適当なレベ
ルの弱毒化、免疫原性、弱毒表現型からの復帰への遺伝的耐性等に発現もする組
換え体RSVワクチンを調整する。好ましくは、本発明の組換え体RSVは、このよう
なメニューから確認される少なくとも一つ、より好ましくは、二つまたはそれ以
上の弱毒化突然変異の包含によって弱毒化されるが、これは、生物学的に誘導さ
れる突然変異体RSV株パネル中の一群の既知の突然変異として定義されうる。本
明細書中に記載の好ましい突然変異体RSV株パネルは、低温継代（cp）および／
または温度感受性（ts）突然変異体、例えば、cptsRSV248（ATCC VR2450）、cpt
sRSV248／404（ATCC VR2454）、cptsRSV248／955（ATCC VR2453）、cptsRSV530
（ATCC VR2452）、cptsRSV530／1009（ATCC VR2451）、cptsRSV530／1030（ATCC
VR2455）、RSV B-1cp52／2B5（ATCC VR2542）およびRSV B-1cp-23（ATCC VR257
9）と称されるRSV突然変異体から成るパネルである（それぞれ、ブダペスト条約
の条件に基づき、10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-220
9, U.S.A. の American Type Culture Collection（ATCC）に寄託され、上記の
受託番号を付与された）。
【０１３８】
生物学的に誘導される突然変異体のこの典型的なパネルから、ワクチン使用に
関して、免疫モジュレーターを発現する組換え体RSVにおける弱毒化レベルを検
定するためにパネル中の一つまたは複数の任意の他の突然変異とそれぞれ組み合
わせることができる弱毒化突然変異の広範囲のメニューを提供する。追加の突然
変異は、例えば、小プラーク（sp）、低温適応（ca）または宿主域制限（hr）突
然変異株中で確認されるような非tsおよび非cp弱毒化突然変異を有するRSVから
誘導することができる。弱毒化突然変異は、ドナーまたは受容体のRSV遺伝子の
コーディング部分、またはシス調節配列のような非コーディング領域中で選択す
ることができる。例えば、弱毒化突然変異には、M2遺伝子出発配列のヌクレオチ
ド7605における単一または多重塩基置換によって例示されるように、遺伝子出発
配列中の単一または多重塩基変化が含まれうる。
関して、免疫モジュレーターを発現する組換え体RSVにおける弱毒化レベルを検
定するためにパネル中の一つまたは複数の任意の他の突然変異とそれぞれ組み合
わせることができる弱毒化突然変異の広範囲のメニューを提供する。追加の突然
変異は、例えば、小プラーク（sp）、低温適応（ca）または宿主域制限（hr）突
然変異株中で確認されるような非tsおよび非cp弱毒化突然変異を有するRSVから
誘導することができる。弱毒化突然変異は、ドナーまたは受容体のRSV遺伝子の
コーディング部分、またはシス調節配列のような非コーディング領域中で選択す
ることができる。例えば、弱毒化突然変異には、M2遺伝子出発配列のヌクレオチ
ド7605における単一または多重塩基置換によって例示されるように、遺伝子出発
配列中の単一または多重塩基変化が含まれうる。
【０１３９】
本発明の範囲内のワクチン使用のために設計され且つ選択される、免疫モジュ
レーターを発現するRSVは、しばしば、広範囲の臨床使用に納得のいくレベルの
弱毒化を達成するように、少なくとも二つ、時々は三つまたはそれ以上の弱毒化
突然変異を有する。一つの態様において、少なくとも一つの弱毒化突然変異は、
RSVポリメラーゼ遺伝子中で起こり、温度感受性（ts）表現型を規定するポリメ
ラーゼタンパク質中のアミノ酸変化を規定するヌクレオチド置換を含む。この場
合の典型的な組換え体は、ラージポリメラーゼ遺伝子L中に一つまたはそれ以上
のヌクレオチド置換を包含して、アミノ酸Asn43、Phe521、Gln831、Met1169また
はTyr1321において、Asn43の代わりにIle、Phe521の代わりにLeu、Gln831の代わ
りにLeu、Met1169の代わりにValおよびTyr1321の代わりにAsnの変化によって例
示されるようなアミノ酸変化を引き起こす。或いは、または更に、本発明の組換
え体RSVは、いろいろなRSV遺伝子、例えば、M2遺伝子中にts突然変異を包含する
ことができる。好ましくは、二つまたはそれ以上のヌクレオチド変化を、弱毒化
突然変異を規定するコドン、例えば、ts突然変異を規定するコドン中に包含させ
、それによって、弱毒表現型からの復帰の可能性を減少させる。
レーターを発現するRSVは、しばしば、広範囲の臨床使用に納得のいくレベルの
弱毒化を達成するように、少なくとも二つ、時々は三つまたはそれ以上の弱毒化
突然変異を有する。一つの態様において、少なくとも一つの弱毒化突然変異は、
RSVポリメラーゼ遺伝子中で起こり、温度感受性（ts）表現型を規定するポリメ
ラーゼタンパク質中のアミノ酸変化を規定するヌクレオチド置換を含む。この場
合の典型的な組換え体は、ラージポリメラーゼ遺伝子L中に一つまたはそれ以上
のヌクレオチド置換を包含して、アミノ酸Asn43、Phe521、Gln831、Met1169また
はTyr1321において、Asn43の代わりにIle、Phe521の代わりにLeu、Gln831の代わ
りにLeu、Met1169の代わりにValおよびTyr1321の代わりにAsnの変化によって例
示されるようなアミノ酸変化を引き起こす。或いは、または更に、本発明の組換
え体RSVは、いろいろなRSV遺伝子、例えば、M2遺伝子中にts突然変異を包含する
ことができる。好ましくは、二つまたはそれ以上のヌクレオチド変化を、弱毒化
突然変異を規定するコドン、例えば、ts突然変異を規定するコドン中に包含させ
、それによって、弱毒表現型からの復帰の可能性を減少させる。
【０１４０】
本発明の方法によれば、一つまたは複数の免疫モジュレーターを発現する組換
え体RSVを容易に構築することができるし、生物学的に誘導される突然変異体RSV
株パネル中に存在する少なくとも一つおよび充分な数までの弱毒化突然変異を包
含すると特性決定することができる。したがって、突然変異は、ある選択され突
然変異体パネル、例えば、cptsRSV248（ATCC VR2450）、cptsRSV248／404（ATCC
VR2454）、cptsRSV248／955（ATCC VR2453）、cptsRSV530（ATCC VR2452）、cp
tsRSV530／1009（ATCC VR2451）、cptsRSV530／1030（ATCC VR2455）、RSV B-1c
p52／2B5（ATCC VR2542）およびRSV B-1cp-23（ATCC VR2579）からの任意の組合
せで組み立てることができる。この方法において、ワクチン候補の弱毒化は、血
清陰性幼児を含めた一つまたはより少ないクラスの患者において用いるために微
細に調整されうる。
え体RSVを容易に構築することができるし、生物学的に誘導される突然変異体RSV
株パネル中に存在する少なくとも一つおよび充分な数までの弱毒化突然変異を包
含すると特性決定することができる。したがって、突然変異は、ある選択され突
然変異体パネル、例えば、cptsRSV248（ATCC VR2450）、cptsRSV248／404（ATCC
VR2454）、cptsRSV248／955（ATCC VR2453）、cptsRSV530（ATCC VR2452）、cp
tsRSV530／1009（ATCC VR2451）、cptsRSV530／1030（ATCC VR2455）、RSV B-1c
p52／2B5（ATCC VR2542）およびRSV B-1cp-23（ATCC VR2579）からの任意の組合
せで組み立てることができる。この方法において、ワクチン候補の弱毒化は、血
清陰性幼児を含めた一つまたはより少ないクラスの患者において用いるために微
細に調整されうる。
【０１４１】
より具体的な態様において、ワクチン使用に選択される本発明の組換え体RSV
は、RSVポリメラーゼ遺伝子L中のAsn43、Phe521、Gln831、Met1169またはTyr132
1での温度感受性または他の弱毒化アミノ酸置換、または遺伝子M2の遺伝子出発
配列中の温度感受性ヌクレオチド置換を規定する少なくとも一つおよび充分な数
までの弱毒化突然変異を包含する。或いは、または更に、本発明の組換え体RSV
は、低温継代された弱毒RSVからの少なくとも一つおよび充分な数までの突然変
異、例えば、RSV N遺伝子中のVal267、RSV F遺伝子中のGlu218またはThr523、RS
Vポリメラーゼ遺伝子L中のCys319またはHis1690でのアミノ酸置換を規定する一
つまたはそれ以上の突然変異を包含することができる。
は、RSVポリメラーゼ遺伝子L中のAsn43、Phe521、Gln831、Met1169またはTyr132
1での温度感受性または他の弱毒化アミノ酸置換、または遺伝子M2の遺伝子出発
配列中の温度感受性ヌクレオチド置換を規定する少なくとも一つおよび充分な数
までの弱毒化突然変異を包含する。或いは、または更に、本発明の組換え体RSV
は、低温継代された弱毒RSVからの少なくとも一つおよび充分な数までの突然変
異、例えば、RSV N遺伝子中のVal267、RSV F遺伝子中のGlu218またはThr523、RS
Vポリメラーゼ遺伝子L中のCys319またはHis1690でのアミノ酸置換を規定する一
つまたはそれ以上の突然変異を包含することができる。
【０１４２】
他の詳細な態様において、本発明の組換え体RSVを更に修飾して、（i）RSVポ
リメラーゼ遺伝子L中のGln831をLeuへおよびTyr1321をAsnへの温度感受性アミノ
酸置換を規定する突然変異パネル；（ii）遺伝子M2の遺伝子出発配列中の温度感
受性ヌクレオチド置換；（iii）RSV N遺伝子中のVal267をIleへ、およびRSVポリ
メラーゼ遺伝子L中のCys319をTyrへおよびHis1690をTyrへのアミノ酸置換を規定
する低温継代RSVから採用される突然変異の弱毒化パネル；または（iv）RSV SH
、NS1、NS2、GおよびM2-2遺伝子の一つまたはそれ以上の発現の欠失または削除
より選択される弱毒化突然変異を包含させる。好ましくは、免疫モジュレーター
を発現するRSVのこれらおよび他の例は、生物学的に誘導される突然変異体RSVか
ら採用される少なくとも二つの弱毒化突然変異を包含し、これは、同じまたは異
なった生物学的に誘導される突然変異体RSV株から誘導することができる。更に
好ましくは、これら典型的な突然変異体は、突然変異を規定するコドンの多重ヌ
クレオチド変化によって安定化されるそれらの弱毒化突然変異の一つまたはそれ
以上を有する。
リメラーゼ遺伝子L中のGln831をLeuへおよびTyr1321をAsnへの温度感受性アミノ
酸置換を規定する突然変異パネル；（ii）遺伝子M2の遺伝子出発配列中の温度感
受性ヌクレオチド置換；（iii）RSV N遺伝子中のVal267をIleへ、およびRSVポリ
メラーゼ遺伝子L中のCys319をTyrへおよびHis1690をTyrへのアミノ酸置換を規定
する低温継代RSVから採用される突然変異の弱毒化パネル；または（iv）RSV SH
、NS1、NS2、GおよびM2-2遺伝子の一つまたはそれ以上の発現の欠失または削除
より選択される弱毒化突然変異を包含させる。好ましくは、免疫モジュレーター
を発現するRSVのこれらおよび他の例は、生物学的に誘導される突然変異体RSVか
ら採用される少なくとも二つの弱毒化突然変異を包含し、これは、同じまたは異
なった生物学的に誘導される突然変異体RSV株から誘導することができる。更に
好ましくは、これら典型的な突然変異体は、突然変異を規定するコドンの多重ヌ
クレオチド変化によって安定化されるそれらの弱毒化突然変異の一つまたはそれ
以上を有する。
【０１４３】
前述の説明により、cDNAから感染性RSVを生じる能力は、サイトカインまたは
他の免疫モジュレーターを発現するRSV組換え体中への特定の遺伝子操作された
変化の導入を可能にする。特に、感染性の組換え体RSVは、生物学的に誘導され
る弱毒RSV株中の一つまたは複数の特定の突然変異、例えば、ts、ca、attおよび
他の表現型を規定する突然変異の確認に用いられる。望まれる突然変異は、この
ようにして確認され、組換え体RSVワクチン株中に導入される。cDNAからウイル
スを生じる能力は、完全長さcDNAクローン中へのこれら突然変異の個々のまたは
いろいろな選択される組合せでの常套的包含を考慮し、その後、導入された突然
変異を含有する救出された組換え体ウイルスの表現型は、容易に決定することが
できる。
他の免疫モジュレーターを発現するRSV組換え体中への特定の遺伝子操作された
変化の導入を可能にする。特に、感染性の組換え体RSVは、生物学的に誘導され
る弱毒RSV株中の一つまたは複数の特定の突然変異、例えば、ts、ca、attおよび
他の表現型を規定する突然変異の確認に用いられる。望まれる突然変異は、この
ようにして確認され、組換え体RSVワクチン株中に導入される。cDNAからウイル
スを生じる能力は、完全長さcDNAクローン中へのこれら突然変異の個々のまたは
いろいろな選択される組合せでの常套的包含を考慮し、その後、導入された突然
変異を含有する救出された組換え体ウイルスの表現型は、容易に決定することが
できる。
【０１４４】
望まれる表現型、例えば、cpまたはts表現型と関連がある具体的な生物学的に
誘導される突然変異を確認し且つ感染性RSVクローン中に包含させることにより
、本発明は、確認される突然変異のところでのまたはそれにごく接近した他の部
位特異的修飾のために与えられる。生物学的に誘導されるRSV中で生じる大部分
の弱毒化殺全変異は、単一ヌクレオチド変化であるが、他の“部位特異的”突然
変異は、組換え技術によって、生物学的に誘導されるまたは組換え体のRSV中に
包含させることもできる。本明細書中で用いられる部位特異的突然変異には、1
〜3個、約5〜15個までまたはそれ以上の変更されたヌクレオチド（例えば、野生
型RSV配列から、ある選択された突然変異体RSV株の配列から、または突然変異誘
発を施された親組換え体RSVクローンから変更される）の挿入、置換、欠失また
は転位が含まれる。このような部位特異的突然変異は、ある選択された生物学的
に誘導される突然変異のところに、またはその領域の範囲内に包含されうる。或
いは、それら突然変異は、他のいろいろな場合、RSVクローン中で、例えば、タ
ンパク質活性部位、結合部位、免疫原性エピトープ等をコードしているシス作用
性調節配列またはヌクレオチド配列でまたはその付近で導入することができる。
有用な突然変異の確認は、ミニレプリコンシステムの使用によって容易にされる
。
誘導される突然変異を確認し且つ感染性RSVクローン中に包含させることにより
、本発明は、確認される突然変異のところでのまたはそれにごく接近した他の部
位特異的修飾のために与えられる。生物学的に誘導されるRSV中で生じる大部分
の弱毒化殺全変異は、単一ヌクレオチド変化であるが、他の“部位特異的”突然
変異は、組換え技術によって、生物学的に誘導されるまたは組換え体のRSV中に
包含させることもできる。本明細書中で用いられる部位特異的突然変異には、1
〜3個、約5〜15個までまたはそれ以上の変更されたヌクレオチド（例えば、野生
型RSV配列から、ある選択された突然変異体RSV株の配列から、または突然変異誘
発を施された親組換え体RSVクローンから変更される）の挿入、置換、欠失また
は転位が含まれる。このような部位特異的突然変異は、ある選択された生物学的
に誘導される突然変異のところに、またはその領域の範囲内に包含されうる。或
いは、それら突然変異は、他のいろいろな場合、RSVクローン中で、例えば、タ
ンパク質活性部位、結合部位、免疫原性エピトープ等をコードしているシス作用
性調節配列またはヌクレオチド配列でまたはその付近で導入することができる。
有用な突然変異の確認は、ミニレプリコンシステムの使用によって容易にされる
。
【０１４５】
部位特異的RSV突然変異体は、典型的に、所望の弱毒化表現型を保持するが、
弱毒化と無関係の変更された表現型特性、例えば、増加したまたは広がった免疫
原性および／または改善された成長を更に示すことがありうる。所望の部位特異
的突然変異体の更に別の例には、弱毒化突然変異を規定するコドンにおける追加
の安定化ヌクレオチド突然変異を包含するように設計された組換え体RSVが含ま
れる。可能な場合、二つまたはそれ以上のヌクレオチド置換を、親突然変異体ま
たは組換え体RSVクローンにおける弱毒化アミノ酸変化を規定するコドンのとこ
ろで導入して、弱毒表現型からの復帰への遺伝的耐性を有する生物学的に誘導さ
れたまたは組換え体のRSVを生じる。他の態様において、部位特異的ヌクレオチ
ド置換、付加、欠失または転位を、標的とされるヌクレオチド位置に相対して上
流（N末端方向）または下流（C末端方向）に、例えば、1〜3ヌクレオチド、5〜1
0ヌクレオチドおよび15ヌクレオチドまたはそれ以上まで5’または3’に導入し
て、例えば、既存のシス作用性調節要素を構築するまたは削除する。
弱毒化と無関係の変更された表現型特性、例えば、増加したまたは広がった免疫
原性および／または改善された成長を更に示すことがありうる。所望の部位特異
的突然変異体の更に別の例には、弱毒化突然変異を規定するコドンにおける追加
の安定化ヌクレオチド突然変異を包含するように設計された組換え体RSVが含ま
れる。可能な場合、二つまたはそれ以上のヌクレオチド置換を、親突然変異体ま
たは組換え体RSVクローンにおける弱毒化アミノ酸変化を規定するコドンのとこ
ろで導入して、弱毒表現型からの復帰への遺伝的耐性を有する生物学的に誘導さ
れたまたは組換え体のRSVを生じる。他の態様において、部位特異的ヌクレオチ
ド置換、付加、欠失または転位を、標的とされるヌクレオチド位置に相対して上
流（N末端方向）または下流（C末端方向）に、例えば、1〜3ヌクレオチド、5〜1
0ヌクレオチドおよび15ヌクレオチドまたはそれ以上まで5’または3’に導入し
て、例えば、既存のシス作用性調節要素を構築するまたは削除する。
【０１４６】
単一および多重点突然変異および部位特異的突然変異に加えて、免疫モジュレ
ーターを発現する組換え体RSVへの変化には、全部の遺伝子またはゲノムセグメ
ントの欠失、挿入、置換または転位が含まれうる。これら突然変異は、その変化
の性質に依って、ドナーまたは受容体のゲノムまたはアンチゲノム中において少
数の塩基（例えば、15〜30塩基、35〜50塩基またはそれ以上まで）、ヌクレオチ
ドのラージブロック（例えば、50〜100塩基、100〜300塩基、300〜500塩基、500
〜1,000塩基）またはほぼ完全なまたは完全な遺伝子（例えば、1,000〜1,500ヌ
クレオチド、1,500〜2,500ヌクレオチド、2,500〜5,000ヌクレオチド、5,00〜6,
5000ヌクレオチドまたはそれ以上）を変更することができる（すなわち、少数の
塩基は、免疫原性エピトープを挿入するまたは削除するようにまたは小ゲノムセ
グメントを変化させるように変更されうるが、塩基の一つまたは複数のラージブ
ロックは、遺伝子またはラージゲノムセグメントが加えられ、置換され、欠失し
または転位している場合に含まれる）。
ーターを発現する組換え体RSVへの変化には、全部の遺伝子またはゲノムセグメ
ントの欠失、挿入、置換または転位が含まれうる。これら突然変異は、その変化
の性質に依って、ドナーまたは受容体のゲノムまたはアンチゲノム中において少
数の塩基（例えば、15〜30塩基、35〜50塩基またはそれ以上まで）、ヌクレオチ
ドのラージブロック（例えば、50〜100塩基、100〜300塩基、300〜500塩基、500
〜1,000塩基）またはほぼ完全なまたは完全な遺伝子（例えば、1,000〜1,500ヌ
クレオチド、1,500〜2,500ヌクレオチド、2,500〜5,000ヌクレオチド、5,00〜6,
5000ヌクレオチドまたはそれ以上）を変更することができる（すなわち、少数の
塩基は、免疫原性エピトープを挿入するまたは削除するようにまたは小ゲノムセ
グメントを変化させるように変更されうるが、塩基の一つまたは複数のラージブ
ロックは、遺伝子またはラージゲノムセグメントが加えられ、置換され、欠失し
または転位している場合に含まれる）。
【０１４７】
本発明の更にもう一つの側面において、免疫モジュレーターを発現する組換え
体RSVは、気道の一時的遺伝子治療のためのベクターとして用いられる。この態
様により、組換え体RSVゲノムまたはアンチゲノムを更に修飾して、目的の遺伝
子産物をコードしているポリヌクレオチド配列を包含させる。目的に遺伝子産物
は、RSV発現を制御するものと同じまたは異なったプロモーターの制御下にある
。組換え体RSVゲノムまたはアンチゲノムを、N、P、LおよびM2（ORF1）タンパク
質と同時発現し且つ目的の遺伝子産物をコードしている配列を含有することによ
って生じる感染性RSVを、患者に投与する。これは、充分に感染性（すなわち、
培養された細胞に感染し、感染性子孫を生じるのに適格）である組換え体RSVを
含むことができるし、または例えば、G、FおよびSH表面糖タンパク質遺伝子の一
つまたはそれ以上を欠いているが、これらタンパク質の一つまたはそれ以上を安
定なまたは一時的発現によってトランスで与える細胞中で増殖する組換え体RSV
でありうる。このような場合、生じる組換え体ウイルスは、有効な感染に適格で
あろうが、感染性粒子を生じる場合には極めて効率が悪いと考えられる。発現さ
れる細胞表面糖タンパク質の不足は、感染した細胞を排除する場合の宿主免疫系
の効率を低下させるとも考えられる。これら特徴は、異種遺伝子の発現の永続性
および安全性を増加させるであろう。
体RSVは、気道の一時的遺伝子治療のためのベクターとして用いられる。この態
様により、組換え体RSVゲノムまたはアンチゲノムを更に修飾して、目的の遺伝
子産物をコードしているポリヌクレオチド配列を包含させる。目的に遺伝子産物
は、RSV発現を制御するものと同じまたは異なったプロモーターの制御下にある
。組換え体RSVゲノムまたはアンチゲノムを、N、P、LおよびM2（ORF1）タンパク
質と同時発現し且つ目的の遺伝子産物をコードしている配列を含有することによ
って生じる感染性RSVを、患者に投与する。これは、充分に感染性（すなわち、
培養された細胞に感染し、感染性子孫を生じるのに適格）である組換え体RSVを
含むことができるし、または例えば、G、FおよびSH表面糖タンパク質遺伝子の一
つまたはそれ以上を欠いているが、これらタンパク質の一つまたはそれ以上を安
定なまたは一時的発現によってトランスで与える細胞中で増殖する組換え体RSV
でありうる。このような場合、生じる組換え体ウイルスは、有効な感染に適格で
あろうが、感染性粒子を生じる場合には極めて効率が悪いと考えられる。発現さ
れる細胞表面糖タンパク質の不足は、感染した細胞を排除する場合の宿主免疫系
の効率を低下させるとも考えられる。これら特徴は、異種遺伝子の発現の永続性
および安全性を増加させるであろう。
【０１４８】
更に別の側面において、本発明は、生物学的に誘導されるRSVからの組換え体R
SVクローン中への採用される突然変異、例えば、cpおよびts突然変異の補足のた
めに与えられ、追加の種類の突然変異には、更に修飾されるRSV中の同じまたは
異なった遺伝子が含まれる。RSVは、10種類のmRNAおよび11種類のタンパク質を
コードする。これらの内の3種類は、膜貫通表面タンパク質、すなわち、結合Gタ
ンパク質、浸透に関与する融合Fタンパク質、および低分子疎水性SHタンパク質
である。GおよびFは、主要なウイルス中和抗原および防御抗原である。4種類の
更に別のタンパク質は、ウイルスヌクレオキャプシドと関連がある、すなわち、
RNA結合タンパク質N、リンタンパク質P、ラージポリメラーゼタンパク質Lおよび
転写延長因子M2 ORF1である。このM2 ORF2はまた、転写／翻訳調節因子であるタ
ンパク質M2-2をコードしている。マトリックスMタンパク質は、内部ビリオンの
一部分であり、おそらくは、ヌクレオキャプシドとエンベロープとの間の結合を
媒介する。最後に、機能がまだ知られていない二つの非構造タンパク質NS1およ
びNS2が存在する。これらタンパク質はそれぞれ、発現レベルに関して選択的に
変更することができるし、または免疫モジュレーターを発現する組換え体RSV中
において単独でまたは他の望まれる修飾と組み合わせて、全面的にまたは部分的
に加え、欠失し、置換しまたは転位して、新規なワクチン候補を生じることがで
きる。
SVクローン中への採用される突然変異、例えば、cpおよびts突然変異の補足のた
めに与えられ、追加の種類の突然変異には、更に修飾されるRSV中の同じまたは
異なった遺伝子が含まれる。RSVは、10種類のmRNAおよび11種類のタンパク質を
コードする。これらの内の3種類は、膜貫通表面タンパク質、すなわち、結合Gタ
ンパク質、浸透に関与する融合Fタンパク質、および低分子疎水性SHタンパク質
である。GおよびFは、主要なウイルス中和抗原および防御抗原である。4種類の
更に別のタンパク質は、ウイルスヌクレオキャプシドと関連がある、すなわち、
RNA結合タンパク質N、リンタンパク質P、ラージポリメラーゼタンパク質Lおよび
転写延長因子M2 ORF1である。このM2 ORF2はまた、転写／翻訳調節因子であるタ
ンパク質M2-2をコードしている。マトリックスMタンパク質は、内部ビリオンの
一部分であり、おそらくは、ヌクレオキャプシドとエンベロープとの間の結合を
媒介する。最後に、機能がまだ知られていない二つの非構造タンパク質NS1およ
びNS2が存在する。これらタンパク質はそれぞれ、発現レベルに関して選択的に
変更することができるし、または免疫モジュレーターを発現する組換え体RSV中
において単独でまたは他の望まれる修飾と組み合わせて、全面的にまたは部分的
に加え、欠失し、置換しまたは転位して、新規なワクチン候補を生じることがで
きる。
【０１４９】
したがって、生物学的に誘導されるRSV突然変異体から採用される弱毒化突然
変異に加えてまたはと組合せて、本発明は、更に、感染性RSVクローンの組換え
体遺伝子操作に基づいて、一つまたは複数の免疫モジュレーターを発現するよう
に遺伝子操作された組換え体RSVの表現型を弱毒化するまたはそれ以外の場合は
修飾するための一定範囲の追加の方法を提供する。種々の変更は、感染性クロー
ン中への包含のためのドナー遺伝子若しくはゲノムセグメントまたはバックグラ
ウンドゲノム若しくはアンチゲノムをコードしている単離されたポリヌクレオチ
ド配列中で生じることができる。より詳しくは、組換え体RSVにおいて所望の構
造および表現型の変化を得るために、本発明は、親ゲノムまたはアンチゲノムか
ら選択される一つまたは複数のヌクレオチドを欠失する、置換する、導入するま
たは転位する修飾、更には、一つまたは複数の免疫モジュレーターを発現するよ
うに遺伝子操作された組換え体RSV中で一つまたは複数の遺伝子またはゲノムセ
グメント全体を欠失する、置換する、導入するまたは転位する突然変異の導入を
考慮する。
変異に加えてまたはと組合せて、本発明は、更に、感染性RSVクローンの組換え
体遺伝子操作に基づいて、一つまたは複数の免疫モジュレーターを発現するよう
に遺伝子操作された組換え体RSVの表現型を弱毒化するまたはそれ以外の場合は
修飾するための一定範囲の追加の方法を提供する。種々の変更は、感染性クロー
ン中への包含のためのドナー遺伝子若しくはゲノムセグメントまたはバックグラ
ウンドゲノム若しくはアンチゲノムをコードしている単離されたポリヌクレオチ
ド配列中で生じることができる。より詳しくは、組換え体RSVにおいて所望の構
造および表現型の変化を得るために、本発明は、親ゲノムまたはアンチゲノムか
ら選択される一つまたは複数のヌクレオチドを欠失する、置換する、導入するま
たは転位する修飾、更には、一つまたは複数の免疫モジュレーターを発現するよ
うに遺伝子操作された組換え体RSV中で一つまたは複数の遺伝子またはゲノムセ
グメント全体を欠失する、置換する、導入するまたは転位する突然変異の導入を
考慮する。
【０１５０】
本発明による感染性RSVの望まれる修飾は、典型的には、所望の表現型変化、
例えば、ウイルス成長、温度感受性、宿主免疫応答を引き出す能力、弱毒化等の
変化を規定するように選択される。これら変化は、ドナーかまたは受容体のゲノ
ムまたはアンチゲノムにおいて、例えば、一つまたは複数の特定の遺伝子または
ゲノム領域（例えば、細胞質、膜貫通または細胞外ドメインのようなタンパク質
構造ドメイン、免疫原性エピトープ、結合領域、活性部位等をコードするゲノム
セグメント、またはシス作用性シグナル）を削除する、導入するまたは転位させ
る親RSVクローンの突然変異誘発によってもたらされうる。これに関する目的の
遺伝子には、RSVゲノムの遺伝子の全て、すなわち、3’-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-
M21／M2-2-L-5’、更には、他のRSV、他のウイルスおよび本明細書中に示される
種々の他の非RSV源からの異種遺伝子が含まれる。
例えば、ウイルス成長、温度感受性、宿主免疫応答を引き出す能力、弱毒化等の
変化を規定するように選択される。これら変化は、ドナーかまたは受容体のゲノ
ムまたはアンチゲノムにおいて、例えば、一つまたは複数の特定の遺伝子または
ゲノム領域（例えば、細胞質、膜貫通または細胞外ドメインのようなタンパク質
構造ドメイン、免疫原性エピトープ、結合領域、活性部位等をコードするゲノム
セグメント、またはシス作用性シグナル）を削除する、導入するまたは転位させ
る親RSVクローンの突然変異誘発によってもたらされうる。これに関する目的の
遺伝子には、RSVゲノムの遺伝子の全て、すなわち、3’-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-
M21／M2-2-L-5’、更には、他のRSV、他のウイルスおよび本明細書中に示される
種々の他の非RSV源からの異種遺伝子が含まれる。
【０１５１】
更に提供されるのは、免疫モジュレーターを発現するように遺伝子操作された
組換え体RSVにおける、ある選択された遺伝子の発現を、例えば、ある選択され
たRSVコーディング配列中の終止コドンを導入すること、機能的に結合したプロ
モーターに相対するRSV遺伝子位置を変化させること、上流の出発コドンを導入
してまたは除去して発現速度を変更すること、翻訳出発部位を修飾すること、GS
および／またはGE転写シグナルを修飾して（例えば、位置を変化させる、既存の
配列を変更する、または既存の配列を異種配列に置換することによって）表現型
（例えば、成長、転写への温度制限等）を変更すること、および例えば、ウイル
ス複製、一つまたは複数の選択された遺伝子の転写、または一つまたは複数の選
択されたタンパク質の翻訳における定量的または定性的変化を規定する種々の他
の欠失、置換、付加および転位によって修飾する修飾である。
組換え体RSVにおける、ある選択された遺伝子の発現を、例えば、ある選択され
たRSVコーディング配列中の終止コドンを導入すること、機能的に結合したプロ
モーターに相対するRSV遺伝子位置を変化させること、上流の出発コドンを導入
してまたは除去して発現速度を変更すること、翻訳出発部位を修飾すること、GS
および／またはGE転写シグナルを修飾して（例えば、位置を変化させる、既存の
配列を変更する、または既存の配列を異種配列に置換することによって）表現型
（例えば、成長、転写への温度制限等）を変更すること、および例えば、ウイル
ス複製、一つまたは複数の選択された遺伝子の転写、または一つまたは複数の選
択されたタンパク質の翻訳における定量的または定性的変化を規定する種々の他
の欠失、置換、付加および転位によって修飾する修飾である。
【０１５２】
他の種類の弱毒化突然変異を分析し、一つまたは複数の免疫モジュレーターを
発現するように遺伝子操作された組換え体RSV中に包含させる能力により、ワク
チン開発は、標的とされるRSVクローンの変化の広範囲の集合に拡大している。
例えば、SH遺伝子の欠失は、増加した成長を含めた新規な表現型特性を有する組
換え体RSVを生じる。本発明において、SH、NS1、NS2またはG遺伝子（または任意
の他の選択される非必須遺伝子またはゲノムセグメント）を組換え体RSV中で欠
失するが、これらは、弱毒表現型を規定する一つまたはそれ以上の追加の突然変
異、例えば、生物学的に誘導される弱毒RSV突然変異体から採用される一つまた
はそれ以上の突然変異を有していてもよい。典型的な態様において、SH、NS1、N
S2またはG遺伝子は、cpts248／404、cpts530／1009、cpts530／1030または別の
選択される突然変異体RSV株から採用される一つまたはそれ以上のcpおよび／ま
たはts突然変異との、または経験的に決定される他の変化との組合せで欠失して
、異なった突然変異の組合せの作用のために、増加したウイルス収量、増加した
弱毒化、および表現型復帰への耐性を有する組換え体RSVを生じる。
発現するように遺伝子操作された組換え体RSV中に包含させる能力により、ワク
チン開発は、標的とされるRSVクローンの変化の広範囲の集合に拡大している。
例えば、SH遺伝子の欠失は、増加した成長を含めた新規な表現型特性を有する組
換え体RSVを生じる。本発明において、SH、NS1、NS2またはG遺伝子（または任意
の他の選択される非必須遺伝子またはゲノムセグメント）を組換え体RSV中で欠
失するが、これらは、弱毒表現型を規定する一つまたはそれ以上の追加の突然変
異、例えば、生物学的に誘導される弱毒RSV突然変異体から採用される一つまた
はそれ以上の突然変異を有していてもよい。典型的な態様において、SH、NS1、N
S2またはG遺伝子は、cpts248／404、cpts530／1009、cpts530／1030または別の
選択される突然変異体RSV株から採用される一つまたはそれ以上のcpおよび／ま
たはts突然変異との、または経験的に決定される他の変化との組合せで欠失して
、異なった突然変異の組合せの作用のために、増加したウイルス収量、増加した
弱毒化、および表現型復帰への耐性を有する組換え体RSVを生じる。
【０１５３】
成長に必須でないRSV遺伝子、例えば、SH、NS1、NS2またはG遺伝子はいずれも
、組換え体RSV中で削除されるかまたはそれ以外の場合は修飾されて、毒力、病
原性、免疫原性および他の表現型特性への望まれる作用を生じることができる。
例えば、SHのような非必須遺伝子の欠失による削除は、培養中の増加したウイル
ス成長を引き起こす。理論によって拘束されたくはないが、この作用は、一部分
は、ウイルスゲノムの減少したヌクレオチド長さによると考えられる。一つの典
型的なSHマイナスクローンの場合、修飾されたウイルスゲノムは、野生型より39
8ヌクレオチド短い14,825nt長さである。P、M、FおよびM2遺伝子の場合のように
、例えば、RSVゲノム中のどこか他のコーディング領域または非コーディング領
域においてゲノムサイズを減少させる同様の突然変異を遺伝子操作することによ
り、本発明は、RSV成長を改善するためのいくつかの容易に入手可能な方法およ
び材料を提供する。
、組換え体RSV中で削除されるかまたはそれ以外の場合は修飾されて、毒力、病
原性、免疫原性および他の表現型特性への望まれる作用を生じることができる。
例えば、SHのような非必須遺伝子の欠失による削除は、培養中の増加したウイル
ス成長を引き起こす。理論によって拘束されたくはないが、この作用は、一部分
は、ウイルスゲノムの減少したヌクレオチド長さによると考えられる。一つの典
型的なSHマイナスクローンの場合、修飾されたウイルスゲノムは、野生型より39
8ヌクレオチド短い14,825nt長さである。P、M、FおよびM2遺伝子の場合のように
、例えば、RSVゲノム中のどこか他のコーディング領域または非コーディング領
域においてゲノムサイズを減少させる同様の突然変異を遺伝子操作することによ
り、本発明は、RSV成長を改善するためのいくつかの容易に入手可能な方法およ
び材料を提供する。
【０１５４】
更に、種々の他の遺伝子変更は、RSVゲノムまたはアンチゲノム中において、
一つまたは複数の免疫モジュレーターを発現するように遺伝子操作される感染性
組換え体RSV中に包含するために、単独でまたは生物学的に誘導される突然変異
体RSVから採用される一つまたはそれ以上の弱毒化突然変異と一緒に生じること
ができる。追加の異種遺伝子およびゲノムセグメント（例えば、異なったRSV遺
伝子、異なったRSV株または型、または非RSV源からの）は、全面的にまたは部分
的に挿入することができるし、遺伝子の順序を変更し、遺伝子オーバーラップを
除去し、RSVゲノムプロモーターをそのアンチゲノム相対物に置き換え、遺伝子
の一部分を除去しまたは置換し、そして遺伝子全体を欠失することさえもできる
。その配列中の異なったまたは追加の修飾は、種々の遺伝子間領域またはどこか
他のところでの独特の制限部位の挿入のような操作を容易にするように行うこと
ができる。非翻訳遺伝子配列は、異種配列を挿入するための能力を増加するよう
に除去することができる。
一つまたは複数の免疫モジュレーターを発現するように遺伝子操作される感染性
組換え体RSV中に包含するために、単独でまたは生物学的に誘導される突然変異
体RSVから採用される一つまたはそれ以上の弱毒化突然変異と一緒に生じること
ができる。追加の異種遺伝子およびゲノムセグメント（例えば、異なったRSV遺
伝子、異なったRSV株または型、または非RSV源からの）は、全面的にまたは部分
的に挿入することができるし、遺伝子の順序を変更し、遺伝子オーバーラップを
除去し、RSVゲノムプロモーターをそのアンチゲノム相対物に置き換え、遺伝子
の一部分を除去しまたは置換し、そして遺伝子全体を欠失することさえもできる
。その配列中の異なったまたは追加の修飾は、種々の遺伝子間領域またはどこか
他のところでの独特の制限部位の挿入のような操作を容易にするように行うこと
ができる。非翻訳遺伝子配列は、異種配列を挿入するための能力を増加するよう
に除去することができる。
【０１５５】
本発明の範囲内で更に提供されるのは、一つまたは複数の免疫モジュレーター
を発現するように遺伝子操作された組換え体RSVにおける、RSVクローンからの遺
伝子またはゲノムセグメントを除去することなく、ある選択された遺伝子または
ゲノムセグメントの発現を変更するまたは削除する遺伝子修飾である。例えば、
これは、フレームシフト突然変異またはある選択されたコーディング配列中の終
止コドンを導入すること、遺伝子の位置を変更するまたは上流の出発コドンを導
入してその発現速度を変更すること、またはGSおよび／またはGE転写シグナルを
変化させて表現型（例えば、成長、転写への温度制限等）を変更することによっ
て行うことができる。本発明のより詳細な側面において、一つまたは複数の免疫
モジュレーターを発現するように遺伝子操作された組換え体RSVを提供するが、
ここにおいて、NS2遺伝子の発現は、遺伝子またはそのセグメントの欠失を伴う
ことなく翻訳レベルで、例えば、二つのタンデム翻訳終止コドンを翻訳読み取り
枠（ORF）中に導入することによって削除される。これは、ある選択された遺伝
子が、その遺伝子の欠失することなく翻訳レベルで沈黙している生存しうるウイ
ルスを生じる。ノックアウトウイルスのこれら形態は、しばしば、組織培養にお
いて低下した成長速度および小プラークサイズを示すであろう。したがって、こ
れら方法は、主要ウイルス防御抗原の内の一つではないウイルス遺伝子の発現を
削除する弱毒化突然変異のまた更に別の新規な種類を提供する。この場合、遺伝
子またはゲノムセグメントの欠失を伴うことなく生じるノックアウトウイルス表
現型は、他には、標的タンパク質の合成を回復することができる補正突然変異を
有効に妨げるように、本明細書中に記載の欠失突然変異誘発によって生じること
ができる。一つまたは複数の免疫モジュレーターを発現するように遺伝子操作さ
れた組換え体RSV中への包含のためのいくつかの他の遺伝子ノックアウトは、当
該技術分野において周知である代わりの計画および方法を用いて行うことができ
る（例えば、本明細書中にそれぞれ援用される、Kretschmer et al., Virology
216:309-316,1996; Radicle et al., Virology 217:418-412,1996; および Kato
et al., EMBOSS J. 16:178-587,1987; および Schneider et al., Virology 27
7:314-322,1996 に記載のように）。
を発現するように遺伝子操作された組換え体RSVにおける、RSVクローンからの遺
伝子またはゲノムセグメントを除去することなく、ある選択された遺伝子または
ゲノムセグメントの発現を変更するまたは削除する遺伝子修飾である。例えば、
これは、フレームシフト突然変異またはある選択されたコーディング配列中の終
止コドンを導入すること、遺伝子の位置を変更するまたは上流の出発コドンを導
入してその発現速度を変更すること、またはGSおよび／またはGE転写シグナルを
変化させて表現型（例えば、成長、転写への温度制限等）を変更することによっ
て行うことができる。本発明のより詳細な側面において、一つまたは複数の免疫
モジュレーターを発現するように遺伝子操作された組換え体RSVを提供するが、
ここにおいて、NS2遺伝子の発現は、遺伝子またはそのセグメントの欠失を伴う
ことなく翻訳レベルで、例えば、二つのタンデム翻訳終止コドンを翻訳読み取り
枠（ORF）中に導入することによって削除される。これは、ある選択された遺伝
子が、その遺伝子の欠失することなく翻訳レベルで沈黙している生存しうるウイ
ルスを生じる。ノックアウトウイルスのこれら形態は、しばしば、組織培養にお
いて低下した成長速度および小プラークサイズを示すであろう。したがって、こ
れら方法は、主要ウイルス防御抗原の内の一つではないウイルス遺伝子の発現を
削除する弱毒化突然変異のまた更に別の新規な種類を提供する。この場合、遺伝
子またはゲノムセグメントの欠失を伴うことなく生じるノックアウトウイルス表
現型は、他には、標的タンパク質の合成を回復することができる補正突然変異を
有効に妨げるように、本明細書中に記載の欠失突然変異誘発によって生じること
ができる。一つまたは複数の免疫モジュレーターを発現するように遺伝子操作さ
れた組換え体RSV中への包含のためのいくつかの他の遺伝子ノックアウトは、当
該技術分野において周知である代わりの計画および方法を用いて行うことができ
る（例えば、本明細書中にそれぞれ援用される、Kretschmer et al., Virology
216:309-316,1996; Radicle et al., Virology 217:418-412,1996; および Kato
et al., EMBOSS J. 16:178-587,1987; および Schneider et al., Virology 27
7:314-322,1996 に記載のように）。
【０１５６】
本発明の組換え体RSVにおいて有用である他の突然変異には、シス作用性シグ
ナルに対して向けられる突然変異が含まれ、これは、例えば、RSVミニゲノムの
突然変異分析によって確認することができる。例えば、リーダーおよびトレーラ
ーおよびフランキング配列についての挿入および欠失の分析は、ウイルスプロモ
ーターおよび転写シグナルを確認し、RNA複製または転写のいろいろな減少度に
関連した一連の突然変異を提供する。これらシス作用性シグナルの飽和突然変異
誘発（それによって、それぞれの位置は、順次、ヌクレオチド代替物にそれぞれ
変更される）は、RNA複製または転写を減少させた（または一つの場合には増加
させた）多数の突然変異を確認もしている。これら突然変異のいずれかを、本明
細書中に記載のようにアンチゲノムまたはゲノム中に導入して、一つまたは複数
の免疫モジュレーターを発現するように遺伝子操作された組換え体RSVを更に修
飾することができる。完全なアンチゲノムcDNAを用いたトランス作用性タンパク
質およびシス作用性RNA配列の評価および操作は、RSVミニゲノムの使用によって
助けられるが（例えば、本明細書中に援用される、Grosfeld et al., J.Viol. 6
9:5677-5686,1995 を参照されたい）、そのヘルパー依存性状態は、複製に依存
しない感染性ウイルス中で回収されるにはあまりに阻害性である突然変異体の特
性決定において有用である。
ナルに対して向けられる突然変異が含まれ、これは、例えば、RSVミニゲノムの
突然変異分析によって確認することができる。例えば、リーダーおよびトレーラ
ーおよびフランキング配列についての挿入および欠失の分析は、ウイルスプロモ
ーターおよび転写シグナルを確認し、RNA複製または転写のいろいろな減少度に
関連した一連の突然変異を提供する。これらシス作用性シグナルの飽和突然変異
誘発（それによって、それぞれの位置は、順次、ヌクレオチド代替物にそれぞれ
変更される）は、RNA複製または転写を減少させた（または一つの場合には増加
させた）多数の突然変異を確認もしている。これら突然変異のいずれかを、本明
細書中に記載のようにアンチゲノムまたはゲノム中に導入して、一つまたは複数
の免疫モジュレーターを発現するように遺伝子操作された組換え体RSVを更に修
飾することができる。完全なアンチゲノムcDNAを用いたトランス作用性タンパク
質およびシス作用性RNA配列の評価および操作は、RSVミニゲノムの使用によって
助けられるが（例えば、本明細書中に援用される、Grosfeld et al., J.Viol. 6
9:5677-5686,1995 を参照されたい）、そのヘルパー依存性状態は、複製に依存
しない感染性ウイルス中で回収されるにはあまりに阻害性である突然変異体の特
性決定において有用である。
【０１５７】
一つまたは複数の免疫モジュレーターを発現するように遺伝子操作された組換
え体RSV中に包含されうる更に別の突然変異には、ゲノムの3’末端のそのアンチ
ゲノムからの相対物との置換が含まれるが、これは、RNA複製および転写の変化
と関連がある。更に、遺伝子間領域（本明細書中に援用される、Collins et al.
, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:4594-4598,1986）は、次々と含有量を短縮するま
たは延長するまたは変化させることができ、天然に存在する遺伝子オーバーラッ
プ（本明細書中に援用される、Collins et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:51
34-5138,1987）は、本明細書中に記載の方法によって、除去することができるし
または異なった遺伝子間領域に変化させることができる。一つの典型的な態様に
おいて、防御FおよびG抗原のような特定のRSVタンパク質の発現レベルは、天然
の配列を、合成によって製造され且つ有効な翻訳と一致するように設計された配
列に置換することによって増加させることができる。この場合、コドン使用は、
哺乳動物ウイルスタンパク質の翻訳レベルにおける主要因子でありうるというこ
とが分かっている（本明細書中に援用される、Haas et al., Current Biol. 6:3
15-324,1996）。主要防御抗原であるRSVのFおよびGタンパク質をコードしている
mRNAのコドン使用は、その使用が不充分な発現と一致するということを示してい
る。したがって、コドン使用は、本発明の組換え法によって改善されて、選択さ
れた遺伝子について改善された発現を達成することができる。もう一つの典型的
な態様において、ある選択されたRSV遺伝子の翻訳開始部位の周囲の配列（好ま
しくは、3位のヌクレオチドを含めた）を、単独でまたは上流の出発コドンの導
入と組み合わせて修飾して、翻訳のアップレギュレーションまたはダウンレギュ
レーションを規定することによってRSV遺伝子発現を調節する。
え体RSV中に包含されうる更に別の突然変異には、ゲノムの3’末端のそのアンチ
ゲノムからの相対物との置換が含まれるが、これは、RNA複製および転写の変化
と関連がある。更に、遺伝子間領域（本明細書中に援用される、Collins et al.
, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:4594-4598,1986）は、次々と含有量を短縮するま
たは延長するまたは変化させることができ、天然に存在する遺伝子オーバーラッ
プ（本明細書中に援用される、Collins et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:51
34-5138,1987）は、本明細書中に記載の方法によって、除去することができるし
または異なった遺伝子間領域に変化させることができる。一つの典型的な態様に
おいて、防御FおよびG抗原のような特定のRSVタンパク質の発現レベルは、天然
の配列を、合成によって製造され且つ有効な翻訳と一致するように設計された配
列に置換することによって増加させることができる。この場合、コドン使用は、
哺乳動物ウイルスタンパク質の翻訳レベルにおける主要因子でありうるというこ
とが分かっている（本明細書中に援用される、Haas et al., Current Biol. 6:3
15-324,1996）。主要防御抗原であるRSVのFおよびGタンパク質をコードしている
mRNAのコドン使用は、その使用が不充分な発現と一致するということを示してい
る。したがって、コドン使用は、本発明の組換え法によって改善されて、選択さ
れた遺伝子について改善された発現を達成することができる。もう一つの典型的
な態様において、ある選択されたRSV遺伝子の翻訳開始部位の周囲の配列（好ま
しくは、3位のヌクレオチドを含めた）を、単独でまたは上流の出発コドンの導
入と組み合わせて修飾して、翻訳のアップレギュレーションまたはダウンレギュ
レーションを規定することによってRSV遺伝子発現を調節する。
【０１５８】
或いは、または本明細書中に開示された他のRSV修飾と組み合わせて、一つま
たは複数の免疫モジュレーターを発現するように遺伝子操作された組換え体RSV
は、ウイルスの一つまたは複数の選択された遺伝子の転写GSシグナルを変更する
ことによって調節することができる。一つの典型的な態様において、NS2のGSシ
グナルは、ウイルス複製へのts制限を補足する一定の突然変異（例えば、本明細
書中に記載の404（M2）突然変異）を含むように修飾される。
たは複数の免疫モジュレーターを発現するように遺伝子操作された組換え体RSV
は、ウイルスの一つまたは複数の選択された遺伝子の転写GSシグナルを変更する
ことによって調節することができる。一つの典型的な態様において、NS2のGSシ
グナルは、ウイルス複製へのts制限を補足する一定の突然変異（例えば、本明細
書中に記載の404（M2）突然変異）を含むように修飾される。
【０１５９】
別の態様において、一つまたは複数の免疫モジュレーターを発現するように遺
伝子操作された組換え体RSVにおける遺伝子発現レベルを、転写レベルで修飾す
る。一つの側面において、RSV遺伝子地図中のある選択された遺伝子の位置は、
よりプロモーターに近位のまたはプロモーターに遠位の位置に変更することがで
き、それによって、その遺伝子はそれぞれ、一層効率よくまたはあまり効率よく
なく発現されるであろう。この側面により、特定の遺伝子の発現の調節を行って
、相互に位置置換された遺伝子の発現レベルの相応した減少をしばしば伴う野生
型レベルと比較して2倍、より典型的には4倍から10倍またはそれ以上までの遺伝
子発現の減少または増加をもたらすことができる。一つの例において、NS2遺伝
子（RSV遺伝子地図の順序で2番目）は、SH遺伝子（6番目）の位置で置換されて
、NS2の発現の予想される減少をもたらす。他の典型的な態様において、Fおよび
G遺伝子は、単独でまたは一緒に、RSV遺伝子地図中のよりプロモーターに近位の
またはプロモーターに遠位の部位に転位して、それぞれ、より高いまたはより低
い遺伝子発現レベルを達成する。これらおよび他の転位変化は、例えば、RNA複
製に関与する選択されたウイルスタンパク質の減少した発現による弱毒表現型を
有する、または増加した抗原発現のような他の望ましい性状を有するRSVの新規
な免疫モジュレーター発現性突然変異体を生じる。
伝子操作された組換え体RSVにおける遺伝子発現レベルを、転写レベルで修飾す
る。一つの側面において、RSV遺伝子地図中のある選択された遺伝子の位置は、
よりプロモーターに近位のまたはプロモーターに遠位の位置に変更することがで
き、それによって、その遺伝子はそれぞれ、一層効率よくまたはあまり効率よく
なく発現されるであろう。この側面により、特定の遺伝子の発現の調節を行って
、相互に位置置換された遺伝子の発現レベルの相応した減少をしばしば伴う野生
型レベルと比較して2倍、より典型的には4倍から10倍またはそれ以上までの遺伝
子発現の減少または増加をもたらすことができる。一つの例において、NS2遺伝
子（RSV遺伝子地図の順序で2番目）は、SH遺伝子（6番目）の位置で置換されて
、NS2の発現の予想される減少をもたらす。他の典型的な態様において、Fおよび
G遺伝子は、単独でまたは一緒に、RSV遺伝子地図中のよりプロモーターに近位の
またはプロモーターに遠位の部位に転位して、それぞれ、より高いまたはより低
い遺伝子発現レベルを達成する。これらおよび他の転位変化は、例えば、RNA複
製に関与する選択されたウイルスタンパク質の減少した発現による弱毒表現型を
有する、または増加した抗原発現のような他の望ましい性状を有するRSVの新規
な免疫モジュレーター発現性突然変異体を生じる。
【０１６０】
本発明の一つまたは複数の免疫モジュレーターを発現するように遺伝子操作さ
れた感染性組換え体RSVクローンは、本明細書中に開示された方法および組成物
によって遺伝子操作されて、免疫原性を増加させ且つ野生型RSVまたは親RSVの感
染によって与えられるよりも大きい防御レベルを生じることもできる。例えば、
異種RSV株または型からの、またはPIVのような非RSV源からの免疫原性エピトー
プは、ゲノムまたはアンチゲノムをコードしているポリヌクレオチド配列におけ
る適当なヌクレオチド変化によって組換え体クローンに加えることができる。或
いは、RSVは、免疫原性タンパク質、タンパク質ドメイン、または望ましいまた
は望ましくない免疫学的反応に関連した特定のタンパク質の形（Gの分泌型など
）を加えるまたは削除するように（例えば、アミノ酸の挿入、置換または欠失に
より）遺伝子操作することができる。
れた感染性組換え体RSVクローンは、本明細書中に開示された方法および組成物
によって遺伝子操作されて、免疫原性を増加させ且つ野生型RSVまたは親RSVの感
染によって与えられるよりも大きい防御レベルを生じることもできる。例えば、
異種RSV株または型からの、またはPIVのような非RSV源からの免疫原性エピトー
プは、ゲノムまたはアンチゲノムをコードしているポリヌクレオチド配列におけ
る適当なヌクレオチド変化によって組換え体クローンに加えることができる。或
いは、RSVは、免疫原性タンパク質、タンパク質ドメイン、または望ましいまた
は望ましくない免疫学的反応に関連した特定のタンパク質の形（Gの分泌型など
）を加えるまたは削除するように（例えば、アミノ酸の挿入、置換または欠失に
より）遺伝子操作することができる。
【０１６１】
本発明の方法の範囲内で、追加の遺伝子またはゲノムセグメントは、組換え体
RSVゲノムまたはアンチゲノム中にまたはそれに隣接して挿入することができる
。これら遺伝子は、受容体遺伝子との共通の制御下であってよいし、または独立
した転写シグナルセットの制御下であってよい。目的の遺伝子には、上に定義の
RSV遺伝子、更には、特に非RSV遺伝子が含まれる。これは、RSVに対する免疫応
答を定量的にも定性的にも変更し且つ改善する能力を提供する。本発明の典型的
な態様において、異種遺伝子またはゲノムセグメントの、および非コーディング
ヌクレオチド配列の場合、組換え体RSVゲノムまたはアンチゲノム中の挿入は、
また更に別の望ましい表現型的作用を引き起こすゲノム長さの望ましい増加をも
たらす。増加したゲノム長さは、インサートの長さに部分的に依存して、得られ
たRSVの弱毒化をもたらす。
RSVゲノムまたはアンチゲノム中にまたはそれに隣接して挿入することができる
。これら遺伝子は、受容体遺伝子との共通の制御下であってよいし、または独立
した転写シグナルセットの制御下であってよい。目的の遺伝子には、上に定義の
RSV遺伝子、更には、特に非RSV遺伝子が含まれる。これは、RSVに対する免疫応
答を定量的にも定性的にも変更し且つ改善する能力を提供する。本発明の典型的
な態様において、異種遺伝子またはゲノムセグメントの、および非コーディング
ヌクレオチド配列の場合、組換え体RSVゲノムまたはアンチゲノム中の挿入は、
また更に別の望ましい表現型的作用を引き起こすゲノム長さの望ましい増加をも
たらす。増加したゲノム長さは、インサートの長さに部分的に依存して、得られ
たRSVの弱毒化をもたらす。
【０１６２】
一つまたは複数の免疫モジュレーターを発現するように遺伝子操作された組換
え体RSV中のウイルス遺伝子またはゲノムセグメント全体の変化を伴う欠失、挿
入、置換および他の突然変異は、免疫抑制された個体の場合に特に重要である遺
伝的に安定なワクチン候補を生じる。これらの変化の多くは、得られたワクチン
株の弱毒化をもたらすであろうが、他は、別の種類の望ましい表現型変化を規定
するであろう。例えば、補助（すなわち、in vitro 成長に必須でない）遺伝子
は、宿主免疫を特異的に妨げるタンパク質をコードする優れた候補である（例え
ば、本明細書中に援用される、Kato et al., EMBO.J. 16:578-87,1997 を参照さ
れたい）。ワクチンウイルス中のこのような遺伝子の削除は、毒力および病原性
を低下させるおよび／または免疫原性を向上させると考えられる。
え体RSV中のウイルス遺伝子またはゲノムセグメント全体の変化を伴う欠失、挿
入、置換および他の突然変異は、免疫抑制された個体の場合に特に重要である遺
伝的に安定なワクチン候補を生じる。これらの変化の多くは、得られたワクチン
株の弱毒化をもたらすであろうが、他は、別の種類の望ましい表現型変化を規定
するであろう。例えば、補助（すなわち、in vitro 成長に必須でない）遺伝子
は、宿主免疫を特異的に妨げるタンパク質をコードする優れた候補である（例え
ば、本明細書中に援用される、Kato et al., EMBO.J. 16:578-87,1997 を参照さ
れたい）。ワクチンウイルス中のこのような遺伝子の削除は、毒力および病原性
を低下させるおよび／または免疫原性を向上させると考えられる。
【０１６３】
本発明の別の側面において、cDNAで発現されたゲノムまたはアンチゲノムから
生じる感染性免疫モジュレーター発現性RSVは、RSVまたはRSV様株、例えば、ヒ
ト、ウシ、ネズミ等の、または任意の肺炎ウイルス、例えば、マウス肺炎ウイル
ス、鳥類肺炎ウイルス（従来、シチメンチョウの鼻気管炎ウイルスと称される）
のいずれかでありうる。防御免疫応答を引き起こすためには、RSV株は、ヒトを
免疫感作するのに用いられるヒトRSVのような、免疫感作される対象に内因性で
あるものであってよい。内因性RSVのゲノムまたはアンチゲノムは、しかしなが
ら、異なった源の組合せからのRSV遺伝子またはゲノムセグメント、例えば、異
なったRSV種、サブグループまたは株からの、またはRSVおよびPIVのような別の
呼吸器病原体からの遺伝子またはゲノムセグメントの組合せを発現するように修
飾することができる。
生じる感染性免疫モジュレーター発現性RSVは、RSVまたはRSV様株、例えば、ヒ
ト、ウシ、ネズミ等の、または任意の肺炎ウイルス、例えば、マウス肺炎ウイル
ス、鳥類肺炎ウイルス（従来、シチメンチョウの鼻気管炎ウイルスと称される）
のいずれかでありうる。防御免疫応答を引き起こすためには、RSV株は、ヒトを
免疫感作するのに用いられるヒトRSVのような、免疫感作される対象に内因性で
あるものであってよい。内因性RSVのゲノムまたはアンチゲノムは、しかしなが
ら、異なった源の組合せからのRSV遺伝子またはゲノムセグメント、例えば、異
なったRSV種、サブグループまたは株からの、またはRSVおよびPIVのような別の
呼吸器病原体からの遺伝子またはゲノムセグメントの組合せを発現するように修
飾することができる。
【０１６４】
本発明の若干の態様において、一つまたは複数の免疫モジュレーターを発現す
るように遺伝子操作された組換え体RSVを提供するが、ここにおいて、ヒトまた
はウシRSV（例えば、ヒトRSVバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノム）中の
遺伝子またはゲノムセグメントは、非ヒト、非ウシRSV、例えば、ネズミRSVから
の相対異種遺伝子またはゲノムセグメントで置き換えられる。この場合のRSV遺
伝子またはゲノムセグメントの置換、欠失および付加には、RSV NS1、NS2、N、P
、M、SH、M2（ORF1）、M2（ORF2）およびL遺伝子の一つまたはそれ以上の一部分
または全部、または好ましくは、主要な中和および防御エピトープを含まないG
およびF遺伝子の一部分または全部が含まれうる。更に、プロモーターまたは転
写シグナルのようなヒトまたはウシRSVシス作用性配列は、非ヒト、非ウシ相対
配列で置き換えることができる。したがって、ヒトへの投与用に予定される感染
性組換え体RSVは、ウシRSVの他にネズミRSVからの遺伝子を含有するように修飾
されたヒトRSVでありうる。
るように遺伝子操作された組換え体RSVを提供するが、ここにおいて、ヒトまた
はウシRSV（例えば、ヒトRSVバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノム）中の
遺伝子またはゲノムセグメントは、非ヒト、非ウシRSV、例えば、ネズミRSVから
の相対異種遺伝子またはゲノムセグメントで置き換えられる。この場合のRSV遺
伝子またはゲノムセグメントの置換、欠失および付加には、RSV NS1、NS2、N、P
、M、SH、M2（ORF1）、M2（ORF2）およびL遺伝子の一つまたはそれ以上の一部分
または全部、または好ましくは、主要な中和および防御エピトープを含まないG
およびF遺伝子の一部分または全部が含まれうる。更に、プロモーターまたは転
写シグナルのようなヒトまたはウシRSVシス作用性配列は、非ヒト、非ウシ相対
配列で置き換えることができる。したがって、ヒトへの投与用に予定される感染
性組換え体RSVは、ウシRSVの他にネズミRSVからの遺伝子を含有するように修飾
されたヒトRSVでありうる。
【０１６５】
ヒトRSVコーディング配列（例えば、NS1、NS2、SHまたはGの）または非コーデ
ィング配列（例えば、プロモーター、遺伝子末端、遺伝子出発、遺伝子間または
他のシス作用性要素）の相対ウシRSV配列との置換は、種々の可能な弱毒化およ
び他の表現型作用を有するキメラRSVを生じる。特に、宿主域および他の所望の
作用は、ヒトRSVバックグラウンド中に移入されたウシRSV遺伝子を置換すること
に由来するが、ここにおいて、そのウシ遺伝子は、例えば、異種配列またはタン
パク質と、生物学的に相互作用するヒトRSV配列またはタンパク質（すなわち、
ウイルスの転写、翻訳、集合等のための置換された配列またはタンパク質と普通
に協同する配列またはタンパク質）との、またはより典型的には、宿主域制限に
おいて、許容宿主とあまり許容されない宿主との間で異なる細胞タンパク質また
は細胞環境の若干の他の側面との不一致から、ヒト細胞中で効率よく機能しない
。一つのこのような態様において、キメラウシ-ヒトRSVは、ヒトRSV NP遺伝子ま
たはゲノムセグメントの相対ウシNP遺伝子またはゲノムセグメントとの置換を包
含するが、このキメラは、場合により、追加の遺伝子変化、例えば、点突然変異
または遺伝子欠失を包含するように構築することができる。典型的な態様におい
て、ウシRSV配列は、例えば、本明細書中にそれぞれ援用される、Pastey et al.
, J.Gen.Viol. 76:193-197,1993; Pastey et al., Virus Res. 29:195-202,1993
; Zamora et al., J.Gen.Virol. 73:737-741,1992; Mallipeddi et al., J.Gen.
Virol. 74:2001-2004,1993; Mallipeddi et al., J.Gen.Virol. 73:2441-2444,1
992; および Zamora et al., Virus Res. 24:115-121,1992 に与えられるように
、および本明細書中に開示された内容にしたがって、ウシRSVの構造および機能
の既知の側面に基づいてヒトRSV中への導入について選択される。
ィング配列（例えば、プロモーター、遺伝子末端、遺伝子出発、遺伝子間または
他のシス作用性要素）の相対ウシRSV配列との置換は、種々の可能な弱毒化およ
び他の表現型作用を有するキメラRSVを生じる。特に、宿主域および他の所望の
作用は、ヒトRSVバックグラウンド中に移入されたウシRSV遺伝子を置換すること
に由来するが、ここにおいて、そのウシ遺伝子は、例えば、異種配列またはタン
パク質と、生物学的に相互作用するヒトRSV配列またはタンパク質（すなわち、
ウイルスの転写、翻訳、集合等のための置換された配列またはタンパク質と普通
に協同する配列またはタンパク質）との、またはより典型的には、宿主域制限に
おいて、許容宿主とあまり許容されない宿主との間で異なる細胞タンパク質また
は細胞環境の若干の他の側面との不一致から、ヒト細胞中で効率よく機能しない
。一つのこのような態様において、キメラウシ-ヒトRSVは、ヒトRSV NP遺伝子ま
たはゲノムセグメントの相対ウシNP遺伝子またはゲノムセグメントとの置換を包
含するが、このキメラは、場合により、追加の遺伝子変化、例えば、点突然変異
または遺伝子欠失を包含するように構築することができる。典型的な態様におい
て、ウシRSV配列は、例えば、本明細書中にそれぞれ援用される、Pastey et al.
, J.Gen.Viol. 76:193-197,1993; Pastey et al., Virus Res. 29:195-202,1993
; Zamora et al., J.Gen.Virol. 73:737-741,1992; Mallipeddi et al., J.Gen.
Virol. 74:2001-2004,1993; Mallipeddi et al., J.Gen.Virol. 73:2441-2444,1
992; および Zamora et al., Virus Res. 24:115-121,1992 に与えられるように
、および本明細書中に開示された内容にしたがって、ウシRSVの構造および機能
の既知の側面に基づいてヒトRSV中への導入について選択される。
【０１６６】
本発明の他の態様において、一つまたは複数の免疫モジュレーターを発現する
ように遺伝子操作された組換え体RSV中への導入の目的の突然変異は、Gタンパク
質の細胞質テイルを欠くマウス肺炎ウイルスの組織培養に適応した非病原性株（
ヒトRSVのネズミ相対物）を模範とする（Randhawa et al., Virology 207:240-2
45,1995）。したがって、本発明の一つの側面において、ヒトRSV糖タンパク質F
、GおよびSHの一つまたはそれ以上の細胞質および／または膜貫通ドメインを、
異種相対配列（例えば、ウシまたはネズミRSVのF、GまたはSHタンパク質の細胞
質または膜貫通ドメインからの配列）を用いてキメラRSV中で加え、欠失し、修
飾しまたは置換して、所望の弱毒化を達成する。もう一つの例として、Fタンパ
ク質の切断部位またはその付近のヌクレオチド配列、またはGタンパク質の推定
上の結合ドメインは、点突然変異、部位特異的変化によって、または遺伝子また
はゲノムセグメント全体を含む変更によって修飾されて、組織培養中のウイルス
成長への新規な作用および／または感染および病原性を達成することができる。
ように遺伝子操作された組換え体RSV中への導入の目的の突然変異は、Gタンパク
質の細胞質テイルを欠くマウス肺炎ウイルスの組織培養に適応した非病原性株（
ヒトRSVのネズミ相対物）を模範とする（Randhawa et al., Virology 207:240-2
45,1995）。したがって、本発明の一つの側面において、ヒトRSV糖タンパク質F
、GおよびSHの一つまたはそれ以上の細胞質および／または膜貫通ドメインを、
異種相対配列（例えば、ウシまたはネズミRSVのF、GまたはSHタンパク質の細胞
質または膜貫通ドメインからの配列）を用いてキメラRSV中で加え、欠失し、修
飾しまたは置換して、所望の弱毒化を達成する。もう一つの例として、Fタンパ
ク質の切断部位またはその付近のヌクレオチド配列、またはGタンパク質の推定
上の結合ドメインは、点突然変異、部位特異的変化によって、または遺伝子また
はゲノムセグメント全体を含む変更によって修飾されて、組織培養中のウイルス
成長への新規な作用および／または感染および病原性を達成することができる。
【０１６７】
本発明のより詳細な側面において、一つまたは複数の免疫モジュレーターを発
現するように遺伝子操作された組換え体RSVは、他の病原体の防御抗原、特に、
パラインフルエンザウイルス（PIV）のような気道病原体のベクターとして用い
られる。例えば、PIVからの防御抗原をコードする配列を包含する組換え体RSVを
遺伝子操作して、感染性弱毒ワクチンウイルスを生じることができる。PIVcDNA
のクローニングおよび本発明を補足する他の開示は、本明細書中においてそれぞ
れ援用される、1998年5月22日出願の PRODUCTION OF PARAINFLUENZA VIRUS VACC
INES FROM CLONED NUCLEOTIDE SEQUENCES と称する米国特許出願第09／083,793
号（国際公開第WO98／53078号に該当する）およびその優先権、1997年5月23日出
願の予備出願第60／047,575号、Bailly et al. によって1999年7月9日に出願さ
れ且つ代理人事件整理番号15280-399000よって確認される ATTENUATED HUMAN-BO
VINE CHIMERIC PARAINFLUENZA VIRUS VACCINES と称する米国予備特許出願；お
よび Durbin et al. によって1999年7月9日に出願され且つ代理人事件整理番号1
5280-394000よって確認される RECOMBINANT PARAINFLUENZA VIRUS VACCINES ATT
ENUATED BY DELETION OR ABLATION OF A NON-ESSENTIAL GENE と称する米国予備
特許出願において提供される。この開示には、感染性PIVウイルスクローンを生
じるまたは本発明の範囲内で用いるためのPIV遺伝子またはゲノムセグメントの
源を提供するのに用いることができる次のプラスミド、すなわち、それぞれ、ブ
ダペスト条約の条件に基づき、10801 University Boulevard, Manassas, Virgin
ia 20110-2209, U.S.A. の American Type Culture Collection（ATCC）に寄託
され、次の受託番号を付与されたp3／7（131）（ATCC97990）；p3／7（131）2G
（ATCC97989）；およびp218（131）（ATCC97991）の説明が含まれる。
現するように遺伝子操作された組換え体RSVは、他の病原体の防御抗原、特に、
パラインフルエンザウイルス（PIV）のような気道病原体のベクターとして用い
られる。例えば、PIVからの防御抗原をコードする配列を包含する組換え体RSVを
遺伝子操作して、感染性弱毒ワクチンウイルスを生じることができる。PIVcDNA
のクローニングおよび本発明を補足する他の開示は、本明細書中においてそれぞ
れ援用される、1998年5月22日出願の PRODUCTION OF PARAINFLUENZA VIRUS VACC
INES FROM CLONED NUCLEOTIDE SEQUENCES と称する米国特許出願第09／083,793
号（国際公開第WO98／53078号に該当する）およびその優先権、1997年5月23日出
願の予備出願第60／047,575号、Bailly et al. によって1999年7月9日に出願さ
れ且つ代理人事件整理番号15280-399000よって確認される ATTENUATED HUMAN-BO
VINE CHIMERIC PARAINFLUENZA VIRUS VACCINES と称する米国予備特許出願；お
よび Durbin et al. によって1999年7月9日に出願され且つ代理人事件整理番号1
5280-394000よって確認される RECOMBINANT PARAINFLUENZA VIRUS VACCINES ATT
ENUATED BY DELETION OR ABLATION OF A NON-ESSENTIAL GENE と称する米国予備
特許出願において提供される。この開示には、感染性PIVウイルスクローンを生
じるまたは本発明の範囲内で用いるためのPIV遺伝子またはゲノムセグメントの
源を提供するのに用いることができる次のプラスミド、すなわち、それぞれ、ブ
ダペスト条約の条件に基づき、10801 University Boulevard, Manassas, Virgin
ia 20110-2209, U.S.A. の American Type Culture Collection（ATCC）に寄託
され、次の受託番号を付与されたp3／7（131）（ATCC97990）；p3／7（131）2G
（ATCC97989）；およびp218（131）（ATCC97991）の説明が含まれる。
【０１６８】
本発明のこの態様により、一つまたは複数の免疫モジュレーターを発現するよ
うに遺伝子操作された組換え体RSVを提供するが、これは、少なくとも一つのPIV
配列、例えば、PIV1およびPIV2またはPIV1およびPIV3のどちらかまたは両方から
の配列を含有するポリヌクレオチドを包含する。RSVの個々の遺伝子は、PIV1、P
IV2またはPIV3のF糖タンパク質遺伝子のようなヒトPIVからの相対遺伝子と置き
換えることができる。或いは、細胞質テイル、膜貫通ドメインまたはエクトドメ
インのようなある選択された異種ゲノムセグメントは、例えば、RSV中の同じ遺
伝子において、RSV中の異なった遺伝子中で、またはRSVゲノムまたはアンチゲノ
ムの非コーディング配列中に、相対ゲノムセグメントの代わりに置換される。一
つの態様において、HPIV3のF遺伝子からのゲノムセグメントは、相対ヒトRSVゲ
ノムセグメントの代わりに置換されて、キメラタンパク質、例えば、新規な弱毒
ウイルスおよび／またはPIVおよびRSV両方に対して免疫原性の多価ワクチンを生
じるようにPIVのエクトドメインに融合したRSVの細胞質テイルおよび／または膜
貫通ドメインを有する融合タンパク質をコードする構築物を生じる。或いは、一
つまたはそれ以上のPIV3遺伝子またはゲノムセグメントは、部分的または完全な
キメラまたは非キメラのRSVゲノムまたはアンチゲノムに加えることができる。
うに遺伝子操作された組換え体RSVを提供するが、これは、少なくとも一つのPIV
配列、例えば、PIV1およびPIV2またはPIV1およびPIV3のどちらかまたは両方から
の配列を含有するポリヌクレオチドを包含する。RSVの個々の遺伝子は、PIV1、P
IV2またはPIV3のF糖タンパク質遺伝子のようなヒトPIVからの相対遺伝子と置き
換えることができる。或いは、細胞質テイル、膜貫通ドメインまたはエクトドメ
インのようなある選択された異種ゲノムセグメントは、例えば、RSV中の同じ遺
伝子において、RSV中の異なった遺伝子中で、またはRSVゲノムまたはアンチゲノ
ムの非コーディング配列中に、相対ゲノムセグメントの代わりに置換される。一
つの態様において、HPIV3のF遺伝子からのゲノムセグメントは、相対ヒトRSVゲ
ノムセグメントの代わりに置換されて、キメラタンパク質、例えば、新規な弱毒
ウイルスおよび／またはPIVおよびRSV両方に対して免疫原性の多価ワクチンを生
じるようにPIVのエクトドメインに融合したRSVの細胞質テイルおよび／または膜
貫通ドメインを有する融合タンパク質をコードする構築物を生じる。或いは、一
つまたはそれ以上のPIV3遺伝子またはゲノムセグメントは、部分的または完全な
キメラまたは非キメラのRSVゲノムまたはアンチゲノムに加えることができる。
【０１６９】
一つまたは複数の免疫モジュレーターを発現するように遺伝子操作された組換
え体RSVへの上記の修飾に加えて、RSVクローンにおける異なったまたは追加の修
飾は、種々の遺伝子間領域（例えば、GおよびF遺伝子間の独特のStuI部位）また
はどこか他のところでの独特の制限部位の挿入のような操作を容易にするように
行うことができる。非翻訳遺伝子配列は、異種配列を挿入するための能力を増加
するように除去することができる。
え体RSVへの上記の修飾に加えて、RSVクローンにおける異なったまたは追加の修
飾は、種々の遺伝子間領域（例えば、GおよびF遺伝子間の独特のStuI部位）また
はどこか他のところでの独特の制限部位の挿入のような操作を容易にするように
行うことができる。非翻訳遺伝子配列は、異種配列を挿入するための能力を増加
するように除去することができる。
【０１７０】
本発明のもう一つの側面において、一つまたは複数の免疫モジュレーターを発
現するように遺伝子操作された組換え体RSVをコードしている一つまたはそれ以
上のcDNAを包含する組成物（例えば、単離されたポリヌクレオチドおよびベクタ
ーを、単離された感染性ワクチンウイルスを製造するために提供する。これら組
成物および方法を用いて、感染性RSVを、RSVゲノムまたはアンチゲノム、ヌクレ
オキャプシド（N）タンパク質、ヌクレオキャプシドリンタンパク質（P）、ラー
ジ（L）ポリメラーゼタンパク質およびRNAポリメラーゼ延長因子から生じる。本
発明の関連の側面において、前述の構造的および表現型的変化を組換え体RSV中
に導入して感染性弱毒ワクチンウイルスを生じるための組成物および方法を提供
する。
現するように遺伝子操作された組換え体RSVをコードしている一つまたはそれ以
上のcDNAを包含する組成物（例えば、単離されたポリヌクレオチドおよびベクタ
ーを、単離された感染性ワクチンウイルスを製造するために提供する。これら組
成物および方法を用いて、感染性RSVを、RSVゲノムまたはアンチゲノム、ヌクレ
オキャプシド（N）タンパク質、ヌクレオキャプシドリンタンパク質（P）、ラー
ジ（L）ポリメラーゼタンパク質およびRNAポリメラーゼ延長因子から生じる。本
発明の関連の側面において、前述の構造的および表現型的変化を組換え体RSV中
に導入して感染性弱毒ワクチンウイルスを生じるための組成物および方法を提供
する。
【０１７１】
一つまたは複数の免疫モジュレーターを発現するように遺伝子操作された組換
え体RSVの感染性クローン中への前記に定義された突然変異の導入は、いろいろ
な周知の方法によって行うことができる。DNAに関する“感染性クローン”とは
、感染性ウイルスまたはウイルス下粒子を生じるのに鋳型として役立つことがで
きるゲノムまたはアンチゲノムRNA中に転写されうる合成のまたはそれ以外の場
合のcDNAまたはその産物を意味する。したがって、定義された突然変異は、慣用
的な技法（例えば、位置指定突然変異誘発）によってゲノムまたはアンチゲノム
のcDNAコピー中に導入することができる。本明細書中に記載のような完全なアン
チゲノムまたはゲノムcDNAを組み立てるためのアンチゲノムまたはゲノムcDNAサ
ブフラグメントの使用は、それぞれの領域を別々に操作（より小さいcDNAは、大
きいものより操作しやすい）後、完全cDNAを容易に組み立てることができるとい
う利点を有する。したがって、完全なアンチゲノムまたはゲノムcDNA、またはそ
の任意のサブフラグメントは、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発の鋳型とし
て用いることができる。これは、Bio-Rad Laboratories（Richmond, CA）の Mut
a-gene（登録商標）キットを用いるような一本鎖ファージミド型の中間体、また
は Stratagene（La Jolla, CA）のカメレオン突然変異誘発キットのように二本
鎖プラスミドを鋳型として直接的に用いる方法による、または目的の一つまたは
複数の突然変異を含有するオリゴヌクレオチドプライマーかまたは鋳型を用いる
ポリメラーゼ連鎖反応によることができる。次に、突然変異したサブフラグメン
トを組み立てて、完全なアンチゲノムまたはゲノムcDNAにすることができる。種
々の他の突然変異誘発技術が知られており、RSVアンチゲノムまたはゲノムcDNA
中において目的の突然変異を生じる場合に用いるのに利用可能である。突然変異
は、単一ヌクレオチド変化から一つまたはそれ以上の遺伝子またはゲノム領域を
含有するラージcDNA断片の置換までありうる。
え体RSVの感染性クローン中への前記に定義された突然変異の導入は、いろいろ
な周知の方法によって行うことができる。DNAに関する“感染性クローン”とは
、感染性ウイルスまたはウイルス下粒子を生じるのに鋳型として役立つことがで
きるゲノムまたはアンチゲノムRNA中に転写されうる合成のまたはそれ以外の場
合のcDNAまたはその産物を意味する。したがって、定義された突然変異は、慣用
的な技法（例えば、位置指定突然変異誘発）によってゲノムまたはアンチゲノム
のcDNAコピー中に導入することができる。本明細書中に記載のような完全なアン
チゲノムまたはゲノムcDNAを組み立てるためのアンチゲノムまたはゲノムcDNAサ
ブフラグメントの使用は、それぞれの領域を別々に操作（より小さいcDNAは、大
きいものより操作しやすい）後、完全cDNAを容易に組み立てることができるとい
う利点を有する。したがって、完全なアンチゲノムまたはゲノムcDNA、またはそ
の任意のサブフラグメントは、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発の鋳型とし
て用いることができる。これは、Bio-Rad Laboratories（Richmond, CA）の Mut
a-gene（登録商標）キットを用いるような一本鎖ファージミド型の中間体、また
は Stratagene（La Jolla, CA）のカメレオン突然変異誘発キットのように二本
鎖プラスミドを鋳型として直接的に用いる方法による、または目的の一つまたは
複数の突然変異を含有するオリゴヌクレオチドプライマーかまたは鋳型を用いる
ポリメラーゼ連鎖反応によることができる。次に、突然変異したサブフラグメン
トを組み立てて、完全なアンチゲノムまたはゲノムcDNAにすることができる。種
々の他の突然変異誘発技術が知られており、RSVアンチゲノムまたはゲノムcDNA
中において目的の突然変異を生じる場合に用いるのに利用可能である。突然変異
は、単一ヌクレオチド変化から一つまたはそれ以上の遺伝子またはゲノム領域を
含有するラージcDNA断片の置換までありうる。
【０１７２】
したがって、一つの代表的な態様において、突然変異は、Bio-Rad から入手可
能な Muta-gene ファージミド in vitro 突然変異誘発キットを用いることによ
って導入される。簡単にいうと、RSVゲノムまたはアンチゲノムの一部分をコー
ドしているcDNAを、プラスミドpTZ18U中にクローン化し、そしてCJ236細胞（Lif
e Technologies）を形質転換するのに用いる。ファージミド標品は、製造者によ
って推奨されるように製造される。オリゴヌクレオチドは、ゲノムまたはアンチ
ゲノムの所望の位置における変更されたヌクレオチドの導入による突然変異誘発
のために設計される。次に、遺伝子変更されたゲノムまたはアンチゲノムを含有
するプラミドを増幅させ、その配列を確認した後、その突然変異断片を完全長さ
ゲノムまたはアンチゲノムクローン中に再導入する。
能な Muta-gene ファージミド in vitro 突然変異誘発キットを用いることによ
って導入される。簡単にいうと、RSVゲノムまたはアンチゲノムの一部分をコー
ドしているcDNAを、プラスミドpTZ18U中にクローン化し、そしてCJ236細胞（Lif
e Technologies）を形質転換するのに用いる。ファージミド標品は、製造者によ
って推奨されるように製造される。オリゴヌクレオチドは、ゲノムまたはアンチ
ゲノムの所望の位置における変更されたヌクレオチドの導入による突然変異誘発
のために設計される。次に、遺伝子変更されたゲノムまたはアンチゲノムを含有
するプラミドを増幅させ、その配列を確認した後、その突然変異断片を完全長さ
ゲノムまたはアンチゲノムクローン中に再導入する。
【０１７３】
定義された突然変異を感染性RSV中に導入する能力は、RSV分子生物学および病
原学の分析を含めた多数の用途を有する。例えば、RSVタンパク質の機能は、そ
れらの発現レベルを削除するまたは低下させる、または突然変異タンパク質を生
じる突然変異を導入することによって研究し且つ操作することができる。下記の
一つの典型的な態様において、組換え体RSVを構築するが、ここにおいて、ウイ
ルス遺伝子、すなわち、SH遺伝子の発現は、mRNAコーディング配列およびフラン
キング転写シグナルの欠失によって削除される。驚くべきことに、このウイルス
は、回収されうるのみならず、組織培養中で効率よく成長した。実際に、その成
長は、感染性ウイルスの収量およびプラークサイズの双方に基づいて、野生型の
場合よりも実質的に増加した。SH欠失および本発明の他のRSV誘導体による組織
培養中での向上した成長は、RSVワクチンを開発するのに有用な手段を提供し、
これは、他のシステムにおいてワクチンウイルスの製造を複雑にしていた組織培
養中でのRSVの不充分な収量の問題を克服する。これら欠失は、遺伝子復帰に対
して極めて安定であり、そこから誘導されるRSVクローンをワクチン薬として特
に有用にする。
原学の分析を含めた多数の用途を有する。例えば、RSVタンパク質の機能は、そ
れらの発現レベルを削除するまたは低下させる、または突然変異タンパク質を生
じる突然変異を導入することによって研究し且つ操作することができる。下記の
一つの典型的な態様において、組換え体RSVを構築するが、ここにおいて、ウイ
ルス遺伝子、すなわち、SH遺伝子の発現は、mRNAコーディング配列およびフラン
キング転写シグナルの欠失によって削除される。驚くべきことに、このウイルス
は、回収されうるのみならず、組織培養中で効率よく成長した。実際に、その成
長は、感染性ウイルスの収量およびプラークサイズの双方に基づいて、野生型の
場合よりも実質的に増加した。SH欠失および本発明の他のRSV誘導体による組織
培養中での向上した成長は、RSVワクチンを開発するのに有用な手段を提供し、
これは、他のシステムにおいてワクチンウイルスの製造を複雑にしていた組織培
養中でのRSVの不充分な収量の問題を克服する。これら欠失は、遺伝子復帰に対
して極めて安定であり、そこから誘導されるRSVクローンをワクチン薬として特
に有用にする。
【０１７４】
本発明は、更に、一つまたはそれ以上の単離されたポリヌクレオチド、例えば
、一つまたはそれ以上のcDNAから、一つまたは複数の免疫モジュレーターを発現
するように遺伝子操作された組換え体RSVを製造する方法を提供する。本発明に
より、RSVゲノムまたはアンチゲノムをコードしているcDNAを、感染性RSVを形成
するのに必要なウイルスタンパク質との細胞内または in vitro 同時発現のため
に構築する。“RSVアンチゲノム”とは、子孫RSVゲノムの合成の鋳型として役立
つ単離されたポジティブセンスポリヌクレオチド分子を意味する。好ましくは、
転写性の複製性ヌクレオキャプシドを生じるのに必要なタンパク質をコードする
相補性配列、すなわち、N、P、LおよびM2（ORF1）タンパク質をコードする配列
のポジティブセンス転写物とハイブリッド形成する可能性を最小限にするように
、複製性中間体RNAに該当するポジティブセンス型のRSVゲノムまたはアンチゲノ
ムであるcDNAを構築する。RSVゲノムシステムにおいて、ゲノムおよびアンチゲ
ノムは、RSVによって相補されるにせよプラスミドによって相補されるにせよ、
救出において等しく活性であり、ゲノムかまたはアンチゲノムを用いることがで
きるので、方法論または他の根拠に基づいて選択を行うことができるということ
が示された。
、一つまたはそれ以上のcDNAから、一つまたは複数の免疫モジュレーターを発現
するように遺伝子操作された組換え体RSVを製造する方法を提供する。本発明に
より、RSVゲノムまたはアンチゲノムをコードしているcDNAを、感染性RSVを形成
するのに必要なウイルスタンパク質との細胞内または in vitro 同時発現のため
に構築する。“RSVアンチゲノム”とは、子孫RSVゲノムの合成の鋳型として役立
つ単離されたポジティブセンスポリヌクレオチド分子を意味する。好ましくは、
転写性の複製性ヌクレオキャプシドを生じるのに必要なタンパク質をコードする
相補性配列、すなわち、N、P、LおよびM2（ORF1）タンパク質をコードする配列
のポジティブセンス転写物とハイブリッド形成する可能性を最小限にするように
、複製性中間体RNAに該当するポジティブセンス型のRSVゲノムまたはアンチゲノ
ムであるcDNAを構築する。RSVゲノムシステムにおいて、ゲノムおよびアンチゲ
ノムは、RSVによって相補されるにせよプラスミドによって相補されるにせよ、
救出において等しく活性であり、ゲノムかまたはアンチゲノムを用いることがで
きるので、方法論または他の根拠に基づいて選択を行うことができるということ
が示された。
【０１７５】
天然のRSVゲノムは、典型的に、相補的ウイルスmRNAによって、11種類の既知
の種のウイルスタンパク質、すなわち、実質的には、本明細書中にそれぞれ援用
される（Mink et al., Virology 185:615-624,1991; Stec et al., Virology 18
3:273-287,1991; および Connors et al., Virol. 208:478-484,1995; Collins
et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:81-85,1996）に記載の非構造種NS1およびN
S2、N、P、マトリックス（M）、低分子疎水性（SH）、糖タンパク質（G）、融合
（F）、M2（ORF1）、M2（ORF2）およびLをコードするネガティブセンスポリヌク
レオチド分子を含む。これら11種類のタンパク質の一つまたはそれ以上は、機能
的に差があると考えられる構造的に異なった形で発現されることがありうるし、
しかも一つまたはそれ以上の異なったタンパク質種は、まだ確認されていないと
いうことが認められる。
の種のウイルスタンパク質、すなわち、実質的には、本明細書中にそれぞれ援用
される（Mink et al., Virology 185:615-624,1991; Stec et al., Virology 18
3:273-287,1991; および Connors et al., Virol. 208:478-484,1995; Collins
et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:81-85,1996）に記載の非構造種NS1およびN
S2、N、P、マトリックス（M）、低分子疎水性（SH）、糖タンパク質（G）、融合
（F）、M2（ORF1）、M2（ORF2）およびLをコードするネガティブセンスポリヌク
レオチド分子を含む。これら11種類のタンパク質の一つまたはそれ以上は、機能
的に差があると考えられる構造的に異なった形で発現されることがありうるし、
しかも一つまたはそれ以上の異なったタンパク質種は、まだ確認されていないと
いうことが認められる。
【０１７６】
本発明の目的に関して、本発明の組換え体RSVのゲノムまたはアンチゲノムは
、ウイルスまたはそれによってコードされるウイルス下粒子を感染性にするのに
必要な遺伝子またはそれらの一部分を含有しさえすればよい。更に、遺伝子また
はそれらの一部分は、2種類以上のポリヌクレオチド分子によって与えられてよ
い、すなわち、ある遺伝子は、別のヌクレオチド分子から相補性または同種のも
のによって与えられてよいし、またはゲノムまたはアンチゲノムcDNAから直接的
に発現されることができる。
、ウイルスまたはそれによってコードされるウイルス下粒子を感染性にするのに
必要な遺伝子またはそれらの一部分を含有しさえすればよい。更に、遺伝子また
はそれらの一部分は、2種類以上のポリヌクレオチド分子によって与えられてよ
い、すなわち、ある遺伝子は、別のヌクレオチド分子から相補性または同種のも
のによって与えられてよいし、またはゲノムまたはアンチゲノムcDNAから直接的
に発現されることができる。
【０１７７】
組換え体RSVとは、RSVまたはRSV様ウイルス、または組換え発現系に直接的に
または間接的に由来するまたはウイルスから増殖されるウイルス下粒子またはそ
こから生じるウイルス下粒子を意味する。組換え発現系は、RSV遺伝子発現にお
いて調節の役割を有する少なくとも一つまたは複数の遺伝要素、例えば、プロモ
ーター、RSV RNA中に転写される構造またはコーディング配列、および適当な転
写開始および終結配列の集合を含む機能的に結合した転写単位を含む組換え発現
ベクターを用いるであろう。
または間接的に由来するまたはウイルスから増殖されるウイルス下粒子またはそ
こから生じるウイルス下粒子を意味する。組換え発現系は、RSV遺伝子発現にお
いて調節の役割を有する少なくとも一つまたは複数の遺伝要素、例えば、プロモ
ーター、RSV RNA中に転写される構造またはコーディング配列、および適当な転
写開始および終結配列の集合を含む機能的に結合した転写単位を含む組換え発現
ベクターを用いるであろう。
【０１７８】
cDNAで発現されたゲノムまたはアンチゲノムから感染性RSVを生じるには、そ
のゲノムまたはアンチゲノムを、（i）RNA複製の可能なヌクレオキャプシドを生
じるのにおよび（ii）子孫ヌクレオキャプシドをRNAの複製および転写両方に適
格にするのに必要なRSVタンパク質と同時発現させる。ゲノムヌクレオキャプシ
ドによる転写は、他のRSVタンパク質を与え、生産的感染を開始する。或いは、
生産的感染に必要な更に別のRSVタンパク質は、同時発現によって供給されるこ
とがありうる。
のゲノムまたはアンチゲノムを、（i）RNA複製の可能なヌクレオキャプシドを生
じるのにおよび（ii）子孫ヌクレオキャプシドをRNAの複製および転写両方に適
格にするのに必要なRSVタンパク質と同時発現させる。ゲノムヌクレオキャプシ
ドによる転写は、他のRSVタンパク質を与え、生産的感染を開始する。或いは、
生産的感染に必要な更に別のRSVタンパク質は、同時発現によって供給されるこ
とがありうる。
【０１７９】
RSVアンチゲノムは、本発明において用いるために、RSVmRNAまたはゲノムRNA
の逆転写コピーのポリメラーゼ連鎖反応（PCR；例えば、本明細書中に援用され
る、米国特許第4,683,195号および同第4,683,202号、および PCR Protocols: A
Guide to Methods and Applications, Innis et al.,eds., Academic Press, Sa
n Diego, 1990 に記載される）により、クローン化cDNAセグメントを組み立てて
、完全なアンチゲノムを凝集体にすることによって構築することができる。例え
ば、そのアンチゲノムの左手末端を含有し、適当なプロモーター（例えば、T7 R
NAポリメラーゼプロモーター）から伸びているcDNA、およびSH遺伝子へのリーダ
ー領域補体を、プラスミド（例えば、pBR322）または種々の利用可能なコスミド
、ファージまたはDNAウイルスベクターのような適当な発現ベクター中で組み立
てる。そのベクターは、組立を容易にするように設計される独特の制限部位を含
有する合成ポリリンカーの突然変異誘発および／または挿入によって修飾するこ
とができる。例えば、本明細書中に記載のプラスミドベクターは、PstI-EcoRIフ
ラグメントを、好都合な制限酵素部位を含有する合成DNAに置換することによっ
てpBR322から誘導された。pBR322のベクターとしての使用は、RSV配列のヌクレ
オチド3716〜3732を安定化したが、それ以外の場合、ヌクレオチドの欠失または
挿入を維持し、そしてそのプラスミドの増殖は、細菌株DH10B中であり、他の場
合にはnt4499付近で起こる人工物の重複および挿入を免れた。製造の容易さのた
めに、G、FおよびM2遺伝子は、Lおよびトレーラー配列の場合と同様に、別のベ
クター中で組み立てることができる。アンチゲノムプラスミドの右手末端（例え
ば、Lおよびトレーラー配列）は、フランキングリボザイムおよびタンデムT7転
写ターミネーターのような所望の追加の配列を含有してよい。そのリボザイムは
、単一非ウイルスヌクレオチドを含有する3’末端を生じると考えられるハンマ
ーヘッド型（例えば、Grosfeld et al., J.Virol. 69:5677-5686,1995）であり
うるし、または3’末端フリーの非RSVヌクレオチドを生じると考えられるD型肝
炎ウイルス（Perrotta et al., Nature 350:434-436,1991）の場合のような他の
適当なリボザイムのいずれかでありうる。中央のセグメント（例えば、G-M2断片
）を、リーダー-SHプラスミドの適当な制限部位中に挿入するが、これは、順次
、L-トレーラー-リボザイム-ターミネーター断片の受容体であり、完全なアンチ
ゲノムを生じる。本明細書中に記載の代表的な実施例において、リーダー末端は
、最適活性のために3個の転写されたG残基を含むT7 RNAポリメラーゼのプロモー
ターに隣接するように構築されたが、転写は、これら3個の非ウイルスGをアンチ
ゲノムの5’末端に与える。これら3個の非ウイルスG残基は、5’末端フリーの非
ウイルスヌクレオチドを生じるように除去することができる。ほぼ正確な3’末
端を生じるために、トレーラー末端は、ハンマーヘッド型リボザイムに隣接する
ように構築されたが、これは、切断すると、コードされたRNAの3’末端に単一3
’-リン酸化U残基を与えると考えられる。
の逆転写コピーのポリメラーゼ連鎖反応（PCR；例えば、本明細書中に援用され
る、米国特許第4,683,195号および同第4,683,202号、および PCR Protocols: A
Guide to Methods and Applications, Innis et al.,eds., Academic Press, Sa
n Diego, 1990 に記載される）により、クローン化cDNAセグメントを組み立てて
、完全なアンチゲノムを凝集体にすることによって構築することができる。例え
ば、そのアンチゲノムの左手末端を含有し、適当なプロモーター（例えば、T7 R
NAポリメラーゼプロモーター）から伸びているcDNA、およびSH遺伝子へのリーダ
ー領域補体を、プラスミド（例えば、pBR322）または種々の利用可能なコスミド
、ファージまたはDNAウイルスベクターのような適当な発現ベクター中で組み立
てる。そのベクターは、組立を容易にするように設計される独特の制限部位を含
有する合成ポリリンカーの突然変異誘発および／または挿入によって修飾するこ
とができる。例えば、本明細書中に記載のプラスミドベクターは、PstI-EcoRIフ
ラグメントを、好都合な制限酵素部位を含有する合成DNAに置換することによっ
てpBR322から誘導された。pBR322のベクターとしての使用は、RSV配列のヌクレ
オチド3716〜3732を安定化したが、それ以外の場合、ヌクレオチドの欠失または
挿入を維持し、そしてそのプラスミドの増殖は、細菌株DH10B中であり、他の場
合にはnt4499付近で起こる人工物の重複および挿入を免れた。製造の容易さのた
めに、G、FおよびM2遺伝子は、Lおよびトレーラー配列の場合と同様に、別のベ
クター中で組み立てることができる。アンチゲノムプラスミドの右手末端（例え
ば、Lおよびトレーラー配列）は、フランキングリボザイムおよびタンデムT7転
写ターミネーターのような所望の追加の配列を含有してよい。そのリボザイムは
、単一非ウイルスヌクレオチドを含有する3’末端を生じると考えられるハンマ
ーヘッド型（例えば、Grosfeld et al., J.Virol. 69:5677-5686,1995）であり
うるし、または3’末端フリーの非RSVヌクレオチドを生じると考えられるD型肝
炎ウイルス（Perrotta et al., Nature 350:434-436,1991）の場合のような他の
適当なリボザイムのいずれかでありうる。中央のセグメント（例えば、G-M2断片
）を、リーダー-SHプラスミドの適当な制限部位中に挿入するが、これは、順次
、L-トレーラー-リボザイム-ターミネーター断片の受容体であり、完全なアンチ
ゲノムを生じる。本明細書中に記載の代表的な実施例において、リーダー末端は
、最適活性のために3個の転写されたG残基を含むT7 RNAポリメラーゼのプロモー
ターに隣接するように構築されたが、転写は、これら3個の非ウイルスGをアンチ
ゲノムの5’末端に与える。これら3個の非ウイルスG残基は、5’末端フリーの非
ウイルスヌクレオチドを生じるように除去することができる。ほぼ正確な3’末
端を生じるために、トレーラー末端は、ハンマーヘッド型リボザイムに隣接する
ように構築されたが、これは、切断すると、コードされたRNAの3’末端に単一3
’-リン酸化U残基を与えると考えられる。
【０１８０】
本発明のある態様において、転写し、複製するRSVヌクレオキャプシドを発生
させるために必要なタンパク質をコード化している相補的配列が一つまたはそれ
以上のヘルパーウイルスにより提供される。そのようなヘルパーウイルスは野生
型であっても変異体であってもよい。好適には、ヘルパーウイルスは、RSV cDNA
によりコード化されているウイルスと表現型的に区別できる。例えば、ヘルパー
ウイルスと免疫学的に反応するが、RSV cDNAによりコード化されているウイルス
とは反応しないモノクローナル抗体を提供するのが望まれる。そのような抗体は
中和抗体であろう。いくつかの態様において、組換え体の同定および回収を容易
にするためにヘルパーウイルスバックグラウンドを中和するため、または組換え
ウイルスからヘルパーウイルスを分離するためのアフィニティークロマトグラフ
ィーにおいて、抗体が使用できる。突然変異がRSV cDNA内へ導入でき、それは組
み換えRSVをそのような抗体による中和に対して非反応性または耐性にする。
させるために必要なタンパク質をコード化している相補的配列が一つまたはそれ
以上のヘルパーウイルスにより提供される。そのようなヘルパーウイルスは野生
型であっても変異体であってもよい。好適には、ヘルパーウイルスは、RSV cDNA
によりコード化されているウイルスと表現型的に区別できる。例えば、ヘルパー
ウイルスと免疫学的に反応するが、RSV cDNAによりコード化されているウイルス
とは反応しないモノクローナル抗体を提供するのが望まれる。そのような抗体は
中和抗体であろう。いくつかの態様において、組換え体の同定および回収を容易
にするためにヘルパーウイルスバックグラウンドを中和するため、または組換え
ウイルスからヘルパーウイルスを分離するためのアフィニティークロマトグラフ
ィーにおいて、抗体が使用できる。突然変異がRSV cDNA内へ導入でき、それは組
み換えRSVをそのような抗体による中和に対して非反応性または耐性にする。
【０１８１】
適切に弱毒化されたクローンを発生させるため、免疫モジュレーターを発現す
るように遺伝子操作された組換えRSVのゲノムまたはアンチゲノム内に種々のヌ
クレオチド挿入および欠失を作製することができる。野生型ヒトRSVゲノムのヌ
クレオチド長（15,222ヌクレオチド）は6の倍数であり、パラミクソウイルスお
よびモルビリウイルス属のメンバーは典型的には“6の法則”を守っている、即
ち、ゲノム（またはミニゲノム）はそのヌクレオチド長が6の倍数である場合に
のみ効率的に複製する（キャプシド被包化NPタンパク質に関するヌクレオチド残
基の正確な間隔が必要であると考えられている）。単一残基の増加によるRSVゲ
ノム長の変化は複製効率には影響を及ぼさず、継代後のいくつかの異なったミニ
ゲノム変異体の配列分析は、代償性変化なしに長さの相違が維持されていること
を示している。従って、RSVはゲノム長が6の倍数であることを厳密には必要とせ
ず、本発明の組換えRSVの複製を無効にすることなくRSVゲノムまたはミニゲノム
中のヌクレオチド挿入および欠失を作製できる。
るように遺伝子操作された組換えRSVのゲノムまたはアンチゲノム内に種々のヌ
クレオチド挿入および欠失を作製することができる。野生型ヒトRSVゲノムのヌ
クレオチド長（15,222ヌクレオチド）は6の倍数であり、パラミクソウイルスお
よびモルビリウイルス属のメンバーは典型的には“6の法則”を守っている、即
ち、ゲノム（またはミニゲノム）はそのヌクレオチド長が6の倍数である場合に
のみ効率的に複製する（キャプシド被包化NPタンパク質に関するヌクレオチド残
基の正確な間隔が必要であると考えられている）。単一残基の増加によるRSVゲ
ノム長の変化は複製効率には影響を及ぼさず、継代後のいくつかの異なったミニ
ゲノム変異体の配列分析は、代償性変化なしに長さの相違が維持されていること
を示している。従って、RSVはゲノム長が6の倍数であることを厳密には必要とせ
ず、本発明の組換えRSVの複製を無効にすることなくRSVゲノムまたはミニゲノム
中のヌクレオチド挿入および欠失を作製できる。
【０１８２】
免疫モジュレーターを発現するように遺伝子操作された組換えRSVのゲノムま
たはアンチゲノムをコード化しているcDNAを構築する別の手段には、サブユニッ
トcDNA成分の数を1または2ピースの少なさまで減少させる改良PCR条件を使用す
る逆転写−PCR（例えば、Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91：5695
−5699, 1994；Samal et al., J. Virol 70：5075−5082, l996、に記載されて
いる、各々が本明細書に参照文献として組み入れられる）が含まれる。別の態様
において、異なったプロモーター（例えば、T3、SP6）または異なったリボザイ
ム（例えば、肝炎デルタウイルスのもの）が使用できる。異なったDNAベクター
（例えば、コスミド）が大きなサイズのゲノムまたはアンチゲノムをより良好に
適応させるために増殖で使用できる。
たはアンチゲノムをコード化しているcDNAを構築する別の手段には、サブユニッ
トcDNA成分の数を1または2ピースの少なさまで減少させる改良PCR条件を使用す
る逆転写−PCR（例えば、Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91：5695
−5699, 1994；Samal et al., J. Virol 70：5075−5082, l996、に記載されて
いる、各々が本明細書に参照文献として組み入れられる）が含まれる。別の態様
において、異なったプロモーター（例えば、T3、SP6）または異なったリボザイ
ム（例えば、肝炎デルタウイルスのもの）が使用できる。異なったDNAベクター
（例えば、コスミド）が大きなサイズのゲノムまたはアンチゲノムをより良好に
適応させるために増殖で使用できる。
【０１８３】
RNA複製に必須なN、PおよびLタンパク質は、転写進行のためにM2（ORF1）タン
パク質のようなRNAポリメラーゼ伸張因子を必要とする。従って、M2（ORF1）ま
たは負鎖RNAウイルスのための実質的に等価な転写伸張因子が感染性RSVの製造に
必要とされ、増殖性感染間の機能性ヌクレオキャプシドの必須成分である。M2（
ORF1）タンパク質の必要性は、転写伸張因子としてのその役割と一致している。
負鎖RNAウイルスのためのRNAポリメラーゼ伸張因子タンパク質発現に対する要求
は本発明の特色である。M2（ORF1）は完全M2遺伝子の発現により、ゲノムかまた
はアンチゲノムによりまたはそれらの共発現により供給できる、しかしこの形式
では第二のORF2もまた発現され、それはウイルス回収に対して阻害効果を持つこ
とができる。従って、完全M2遺伝子を使用する感染性ウイルスの製造には、二つ
のORFの活性が、転写伸張活性を提供するためにM（ORF1）の十分な発現を可能に
し、M（ORF2）の発現をRNA複製が阻害されないように均衡がとれていなければな
らない。もしくは、ORF2を欠くように遺伝子操作された、または欠陥ORFをコー
ド化しているcDNAからORF1タンパク質が提供される。ウイルス産生の効率は、エ
ンベロープ成分（即ち、SH、M、G、Fタンパク質）をコード化している遺伝子の
ような、追加のウイルスタンパク質遺伝子の共発現によっても改良することがで
きる。
パク質のようなRNAポリメラーゼ伸張因子を必要とする。従って、M2（ORF1）ま
たは負鎖RNAウイルスのための実質的に等価な転写伸張因子が感染性RSVの製造に
必要とされ、増殖性感染間の機能性ヌクレオキャプシドの必須成分である。M2（
ORF1）タンパク質の必要性は、転写伸張因子としてのその役割と一致している。
負鎖RNAウイルスのためのRNAポリメラーゼ伸張因子タンパク質発現に対する要求
は本発明の特色である。M2（ORF1）は完全M2遺伝子の発現により、ゲノムかまた
はアンチゲノムによりまたはそれらの共発現により供給できる、しかしこの形式
では第二のORF2もまた発現され、それはウイルス回収に対して阻害効果を持つこ
とができる。従って、完全M2遺伝子を使用する感染性ウイルスの製造には、二つ
のORFの活性が、転写伸張活性を提供するためにM（ORF1）の十分な発現を可能に
し、M（ORF2）の発現をRNA複製が阻害されないように均衡がとれていなければな
らない。もしくは、ORF2を欠くように遺伝子操作された、または欠陥ORFをコー
ド化しているcDNAからORF1タンパク質が提供される。ウイルス産生の効率は、エ
ンベロープ成分（即ち、SH、M、G、Fタンパク質）をコード化している遺伝子の
ような、追加のウイルスタンパク質遺伝子の共発現によっても改良することがで
きる。
【０１８４】
免疫モジュレーターを発現するように遺伝子操作された感染性組換えRSVを発
生させるため、組換えM2 ORF2欠失およびノックアウト変異体RSVゲノムまたはア
ンチゲノムをコード化している単離されたポリヌクレオチド（例えば、DNA）がN
、P、LおよびM2（ORF1）タンパク質と別々に、またはシスで発現された（アンチ
ゲノムまたはゲノムcDNAからの発現を含んで）。これらのポリヌクレオチドはト
ランスフェクション、エレクトロポレーション、機械的挿入、形質導入などによ
り、増殖性RSV感染を支えることができる細胞、例えば、HEp−2、FRhL−DBS2、M
RCおよびベロ細胞、内へ挿入される。トランスフェクションのための単離された
ポリヌクレオチド配列は、例えば、リン酸カルシウム仲介トランスフェクション
（Wigler et al., Cell 14：725, 1978；Corsaro and Pearson, Somatic Cell G
enetics 7：603, 1981；Graham and Van der Eb, Virology 52：456, 1973）、
エレクトロポレーション（Neumann et al., EMBO J. 1：841−845, 1982）、DEA
E−デキストラン仲介トランスフェクション（Ausubel et al., （編）Current P
rotocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987）、陽
イオン性脂質仲介トランスフェクション（Hawley−Nelson et al., Focus 15：7
3−79, 1993）または市販品として入手可能なトランスフェクション試薬、例え
ば、LipofectACER（Life Technologies）により培養細胞内へ導入される（前記
の参照文献の各々は本明細書に参照文献として組み入れられる）。
生させるため、組換えM2 ORF2欠失およびノックアウト変異体RSVゲノムまたはア
ンチゲノムをコード化している単離されたポリヌクレオチド（例えば、DNA）がN
、P、LおよびM2（ORF1）タンパク質と別々に、またはシスで発現された（アンチ
ゲノムまたはゲノムcDNAからの発現を含んで）。これらのポリヌクレオチドはト
ランスフェクション、エレクトロポレーション、機械的挿入、形質導入などによ
り、増殖性RSV感染を支えることができる細胞、例えば、HEp−2、FRhL−DBS2、M
RCおよびベロ細胞、内へ挿入される。トランスフェクションのための単離された
ポリヌクレオチド配列は、例えば、リン酸カルシウム仲介トランスフェクション
（Wigler et al., Cell 14：725, 1978；Corsaro and Pearson, Somatic Cell G
enetics 7：603, 1981；Graham and Van der Eb, Virology 52：456, 1973）、
エレクトロポレーション（Neumann et al., EMBO J. 1：841−845, 1982）、DEA
E−デキストラン仲介トランスフェクション（Ausubel et al., （編）Current P
rotocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987）、陽
イオン性脂質仲介トランスフェクション（Hawley−Nelson et al., Focus 15：7
3−79, 1993）または市販品として入手可能なトランスフェクション試薬、例え
ば、LipofectACER（Life Technologies）により培養細胞内へ導入される（前記
の参照文献の各々は本明細書に参照文献として組み入れられる）。
【０１８５】
N、P、LおよびM2（ORF1）タンパク質は一つまたはそれ以上のcDNAおよび発現
ベクターによりコード化されており、それらはゲノムまたはアンチゲノムをコー
ド化しているものと同じでもまたは別々でも、およびそれらの組み合わせでもよ
い。さらに、一つまたはそれ以上のタンパク質、特にM2−1タンパク質はアンチ
ゲノムまたはゲノムから直接的に供給できる（Collins et al., Virology 259：
251−258 1999、本明細書に参照文献として組み入れられる）。望むなら、それ
自身のベクターにより、またはN、P、LまたはM2（ORF1）タンパク質および／ま
たは完全ゲノムまたはアンチゲノムをコード化しているベクターによりコード化
されている追加のタンパク質が含まれてもよい。トランスフェクトされたプラス
ミドからのゲノムまたはアンチゲノムおよびタンパク質の発現は、例えば、各々
のcDNAをT7RNAポリメラーゼのためのプロモーター調節下にあるようにすること
により達成され、それもまたT7RNAポリメラーゼのための発現系（例えば、T7RNA
ポリメラーゼを発現するワクシニアウイルスMVA株組換え体）の感染、トランス
フェクションまたは形質導入により供給される（Wyatt et al., Virology, 210
：202−205, 1995、本明細書に参照文献として組み入れられる）。ウイルスタン
パク質、および／またはT7RNAポリメラーゼはまた形質転換された哺乳類細胞か
ら、または前もって形成されたmRNAまたはタンパク質のトランスフェクションに
よっても提供できる。
ベクターによりコード化されており、それらはゲノムまたはアンチゲノムをコー
ド化しているものと同じでもまたは別々でも、およびそれらの組み合わせでもよ
い。さらに、一つまたはそれ以上のタンパク質、特にM2−1タンパク質はアンチ
ゲノムまたはゲノムから直接的に供給できる（Collins et al., Virology 259：
251−258 1999、本明細書に参照文献として組み入れられる）。望むなら、それ
自身のベクターにより、またはN、P、LまたはM2（ORF1）タンパク質および／ま
たは完全ゲノムまたはアンチゲノムをコード化しているベクターによりコード化
されている追加のタンパク質が含まれてもよい。トランスフェクトされたプラス
ミドからのゲノムまたはアンチゲノムおよびタンパク質の発現は、例えば、各々
のcDNAをT7RNAポリメラーゼのためのプロモーター調節下にあるようにすること
により達成され、それもまたT7RNAポリメラーゼのための発現系（例えば、T7RNA
ポリメラーゼを発現するワクシニアウイルスMVA株組換え体）の感染、トランス
フェクションまたは形質導入により供給される（Wyatt et al., Virology, 210
：202−205, 1995、本明細書に参照文献として組み入れられる）。ウイルスタン
パク質、および／またはT7RNAポリメラーゼはまた形質転換された哺乳類細胞か
ら、または前もって形成されたmRNAまたはタンパク質のトランスフェクションに
よっても提供できる。
【０１８６】
もしくは、アンチゲノムまたはゲノムの合成は組み合わせた転写−翻訳反応、
続いての細胞内へのトランスフェクションによりインビトロ（無細胞）で実施で
きる。または、アンチゲノムまたはゲノムRNAはインビトロで合成でき、RSVタン
パク質を発現している細胞内へトランスフェクトできる。
続いての細胞内へのトランスフェクションによりインビトロ（無細胞）で実施で
きる。または、アンチゲノムまたはゲノムRNAはインビトロで合成でき、RSVタン
パク質を発現している細胞内へトランスフェクトできる。
【０１８７】
本発明に従った候補ワクチンウイルスを選択するため、生存率、弱毒化および
免疫原性の基準がよく知られている方法に従って決定された。本発明のワクチン
として最も望ましいであろうウイルスは、生存率を維持し、安定な弱毒化表現型
を持ち、免疫した宿主での複製を示し（たとえより低いレベルであっても）、お
よび続いての野生型ウイルスの感染により起こされる重度な疾患に対する保護を
与えるのに十分な免疫応答の生成を、ワクチン接種を受けた人に有効に惹起しな
ければならない。他の既知の弱毒化RSVで報告されている結果に基づいた期待に
反して、本発明のウイルスは生存可能および以前の変異体よりもより適切に弱毒
化されているのみでなく、以前に研究された変異体よりもインビボで遺伝子的に
安定であり（保護的免疫応答を刺激する能力を保持している）、いくつかの例に
おいて、多修飾により与えられた保護が拡張されている、例えば、異なったウイ
ルス株またはサブグループに対する保護、または異なった免疫原理による保護（
例えば、分泌に対する血清イムノグロブリン、細胞性免疫性など）を誘導する。
本発明に先だっては、インビボ複製後のts表現型の遺伝子不安定性がtsウイルス
で普通であった（Murphy et al., Infect. Immun, 37：235−242, 1982）。
免疫原性の基準がよく知られている方法に従って決定された。本発明のワクチン
として最も望ましいであろうウイルスは、生存率を維持し、安定な弱毒化表現型
を持ち、免疫した宿主での複製を示し（たとえより低いレベルであっても）、お
よび続いての野生型ウイルスの感染により起こされる重度な疾患に対する保護を
与えるのに十分な免疫応答の生成を、ワクチン接種を受けた人に有効に惹起しな
ければならない。他の既知の弱毒化RSVで報告されている結果に基づいた期待に
反して、本発明のウイルスは生存可能および以前の変異体よりもより適切に弱毒
化されているのみでなく、以前に研究された変異体よりもインビボで遺伝子的に
安定であり（保護的免疫応答を刺激する能力を保持している）、いくつかの例に
おいて、多修飾により与えられた保護が拡張されている、例えば、異なったウイ
ルス株またはサブグループに対する保護、または異なった免疫原理による保護（
例えば、分泌に対する血清イムノグロブリン、細胞性免疫性など）を誘導する。
本発明に先だっては、インビボ複製後のts表現型の遺伝子不安定性がtsウイルス
で普通であった（Murphy et al., Infect. Immun, 37：235−242, 1982）。
【０１８８】
ワクチン使用およびその他の目的のための、免疫モジュレーターを発現するよ
うに遺伝子操作された組換えRSVを増殖させるため、RSV増殖を可能にする多くの
細胞株が使用できる。RSVは種々のヒトおよび動物細胞中で増殖する。ワクチン
使用のための弱毒化RSウイルスを増殖させるのに好適な細胞株には、DBS−FRhL
−2、MRC−5およびベロ細胞が含まれる。最も高いウイルス収量はベロ細胞のよ
うな上皮細胞株で通常達成される。細胞は典型的には約0.001から1.0またはそれ
以上の感染多重度でウイルスが接種され、ウイルスの複製を許す条件下、例えば
、約30−37℃で約3−5日、またはウイルスが適当な力価に到達するのに必要なだ
け長く培養される。ウイルスは細胞培養物から除かれ、細胞成分から分離され（
典型的にはよく知られている清澄化法、例えば、遠心分離により）、必要に応じ
当業者にはよく知られている方法によりさらに精製される。
うに遺伝子操作された組換えRSVを増殖させるため、RSV増殖を可能にする多くの
細胞株が使用できる。RSVは種々のヒトおよび動物細胞中で増殖する。ワクチン
使用のための弱毒化RSウイルスを増殖させるのに好適な細胞株には、DBS−FRhL
−2、MRC−5およびベロ細胞が含まれる。最も高いウイルス収量はベロ細胞のよ
うな上皮細胞株で通常達成される。細胞は典型的には約0.001から1.0またはそれ
以上の感染多重度でウイルスが接種され、ウイルスの複製を許す条件下、例えば
、約30−37℃で約3−5日、またはウイルスが適当な力価に到達するのに必要なだ
け長く培養される。ウイルスは細胞培養物から除かれ、細胞成分から分離され（
典型的にはよく知られている清澄化法、例えば、遠心分離により）、必要に応じ
当業者にはよく知られている方法によりさらに精製される。
【０１８９】
免疫モジュレーターを発現するように遺伝子操作され、十分に弱毒化されるか
または本明細書に記載したように修飾された組換えRSVは、ワクチン使用への適
切な弱毒化、表現型復帰変異への抵抗性および免疫原性を確認するために、種々
のよく知られているおよび一般的に受け入れられているインビトロおよびインビ
ボモデルで試験できる。インビトロアッセイにおいて、修飾されたウイルス（例
えば、多様に弱毒化され、生物学的に誘導されたまたは組換えRSV）はウイルス
複製の温度感受性、即ちts表現型、および小プラーク表現型が試験される。修飾
されたウイルスはさらにRSV感染の動物モデルで試験される。種々の動物モデル
が記載され要約されている（Meignier et al., 編, Animal Models of Respirat
ory Syncytial Virus Infection, Merieux Foundation Publication, 1991、本
明細書に参照文献として組み入れられる）。RSV感染のコトンラットモデルが記
載されており（U.S.4,800,078およびPrince et al., Virus Res. 3：193−206,
1985、本明細書に参照文献として組み入れられる）、ヒトおよび非ヒト霊長類に
おける弱毒化および効力を予測すると考えられている。加えて、チンパンジーを
使用するRSV感染の霊長類モデルは、Richardson et al., J. Med. Virol. 3：91
−100, 1978；Wright et al., Infect. Immun. 37：397−400, 1982；Crowe et
al., Vaccine 11：1395−1404, 1993, 各々は本明細書に参照文献として組み入
れられる、に詳細に記載されているように、ヒトにおける弱毒化および効力の予
測である。
または本明細書に記載したように修飾された組換えRSVは、ワクチン使用への適
切な弱毒化、表現型復帰変異への抵抗性および免疫原性を確認するために、種々
のよく知られているおよび一般的に受け入れられているインビトロおよびインビ
ボモデルで試験できる。インビトロアッセイにおいて、修飾されたウイルス（例
えば、多様に弱毒化され、生物学的に誘導されたまたは組換えRSV）はウイルス
複製の温度感受性、即ちts表現型、および小プラーク表現型が試験される。修飾
されたウイルスはさらにRSV感染の動物モデルで試験される。種々の動物モデル
が記載され要約されている（Meignier et al., 編, Animal Models of Respirat
ory Syncytial Virus Infection, Merieux Foundation Publication, 1991、本
明細書に参照文献として組み入れられる）。RSV感染のコトンラットモデルが記
載されており（U.S.4,800,078およびPrince et al., Virus Res. 3：193−206,
1985、本明細書に参照文献として組み入れられる）、ヒトおよび非ヒト霊長類に
おける弱毒化および効力を予測すると考えられている。加えて、チンパンジーを
使用するRSV感染の霊長類モデルは、Richardson et al., J. Med. Virol. 3：91
−100, 1978；Wright et al., Infect. Immun. 37：397−400, 1982；Crowe et
al., Vaccine 11：1395−1404, 1993, 各々は本明細書に参照文献として組み入
れられる、に詳細に記載されているように、ヒトにおける弱毒化および効力の予
測である。
【０１９０】
RSVワクチン候補の弱毒化および感染性を評価するための齧歯類およびチンパ
ンジーを含むRSVモデル系は本分野では広く受け入れられており、それらから得
られたデータはRSV感染および弱毒化とよく相関している。マウスおよびコトン
ラットモデルは、候補RSVウイルスがチンパンジーにおいて不適当な増殖を示す
ような例（例えば、RSVサブグループBウイルス）において特に有用である。
ンジーを含むRSVモデル系は本分野では広く受け入れられており、それらから得
られたデータはRSV感染および弱毒化とよく相関している。マウスおよびコトン
ラットモデルは、候補RSVウイルスがチンパンジーにおいて不適当な増殖を示す
ような例（例えば、RSVサブグループBウイルス）において特に有用である。
【０１９１】
これまでの記述に従うとおよび以下の実施例に基づくと、本発明はまた、免疫
モジュレーターを発現するように遺伝子操作され、単離された感染性組換えRSV
を含んでいる組成物をワクチン使用のために提供する。ワクチンの成分である弱
毒化ウイルスは単離され、および典型的には精製された形である。単離されたと
は、野生型ウイルスの天然環境以外に存在している（例えば、感染個体の鼻咽頭
のような）RSVを示している。より一般的には、単離されたとは細胞培養または
他の人工的培地の成分として弱毒化ウイルスを含むことを意味しており、ここで
それは制御された設定において増殖できおよび特徴付けられる。例えば、本発明
の弱毒化RSVは感染細胞培養物により産生され、細胞培養物から分離され、安定
化剤へ加えることができる。
モジュレーターを発現するように遺伝子操作され、単離された感染性組換えRSV
を含んでいる組成物をワクチン使用のために提供する。ワクチンの成分である弱
毒化ウイルスは単離され、および典型的には精製された形である。単離されたと
は、野生型ウイルスの天然環境以外に存在している（例えば、感染個体の鼻咽頭
のような）RSVを示している。より一般的には、単離されたとは細胞培養または
他の人工的培地の成分として弱毒化ウイルスを含むことを意味しており、ここで
それは制御された設定において増殖できおよび特徴付けられる。例えば、本発明
の弱毒化RSVは感染細胞培養物により産生され、細胞培養物から分離され、安定
化剤へ加えることができる。
【０１９２】
本発明のRSVワクチンは、活性成分として前記のように製造された、免疫学的
に有効量のRSVを含んでいる。生物学的に誘導されたまたは組換えRSVは直接ワク
チン処方に使用されるかまたは凍結乾燥される。凍結乾燥ウイルスは典型的には
約4℃で維持することができる。使用の準備ができた場合、凍結乾燥ウイルスは
さらに後で説明されるように安定化溶液（例えば、食塩水、SPG、Mg＋＋およびH
EPES）中、アジュバントとまたは無しで、再構成される。組換え的に修飾された
ウイルスは生理学的に受容可能な担体および／またはアジュバントとともに宿主
内へ導入することができる。有用な担体は本分野ではよく知られており、例えば
、水、緩衝化水溶液、0.4％食塩水、0.3％グリシン、ヒアルロン酸などが含まれ
る。得られた水性溶液は使用のためそのまま包装されるかまたは凍結乾燥され、
凍結乾燥した製剤は前に説明したように使用前に滅菌溶液と混合される。組成物
は、pH調節剤および緩衝剤、張度調節剤、湿潤剤などのような医薬として受容可
能な補助剤を含んでいてもよい、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩
化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタン モノラウレート、
トリエタノールアミン オレエートなど。受容可能なアジュバントには本分野で
はよく知られている物質である不完全フロイントアジュバント、リン酸アルミニ
ウム、水酸化アルミニウム、またはミョウバンが含まれる。好適なアジュバント
にはまたStimulonR QS−21（Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Farmingham, M
A）、MPLR（3−O−脱アセチル化モノホスホリル リピッドA；RIBI ImmunoChem R
esearch, Inc., Hamilton, MT）およびインターロイキン−12（Genetics Instit
ute, Cambridge, MA）が含まれる。
に有効量のRSVを含んでいる。生物学的に誘導されたまたは組換えRSVは直接ワク
チン処方に使用されるかまたは凍結乾燥される。凍結乾燥ウイルスは典型的には
約4℃で維持することができる。使用の準備ができた場合、凍結乾燥ウイルスは
さらに後で説明されるように安定化溶液（例えば、食塩水、SPG、Mg＋＋およびH
EPES）中、アジュバントとまたは無しで、再構成される。組換え的に修飾された
ウイルスは生理学的に受容可能な担体および／またはアジュバントとともに宿主
内へ導入することができる。有用な担体は本分野ではよく知られており、例えば
、水、緩衝化水溶液、0.4％食塩水、0.3％グリシン、ヒアルロン酸などが含まれ
る。得られた水性溶液は使用のためそのまま包装されるかまたは凍結乾燥され、
凍結乾燥した製剤は前に説明したように使用前に滅菌溶液と混合される。組成物
は、pH調節剤および緩衝剤、張度調節剤、湿潤剤などのような医薬として受容可
能な補助剤を含んでいてもよい、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩
化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタン モノラウレート、
トリエタノールアミン オレエートなど。受容可能なアジュバントには本分野で
はよく知られている物質である不完全フロイントアジュバント、リン酸アルミニ
ウム、水酸化アルミニウム、またはミョウバンが含まれる。好適なアジュバント
にはまたStimulonR QS−21（Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Farmingham, M
A）、MPLR（3−O−脱アセチル化モノホスホリル リピッドA；RIBI ImmunoChem R
esearch, Inc., Hamilton, MT）およびインターロイキン−12（Genetics Instit
ute, Cambridge, MA）が含まれる。
【０１９３】
エアロゾル、小滴、経口、局所または他の経路を経て本発明に記載したような
組換えRSVワクチン組成物で免疫すると、宿主の免疫系が、一つまたはそれ以上
のRSVウイルスタンパク質（例えば、Fおよび／またはG糖タンパク質）に特異的
な抗体を産生することによりワクチンに応答する。ワクチン接種の結果として、
宿主は少なくとも部分的にまたは完全にRSV感染に対して免疫されるか、または
特に下気道の中程度または重度のRSV疾患の発生に対して抵抗するようになる。
組換えRSVワクチン組成物で免疫すると、宿主の免疫系が、一つまたはそれ以上
のRSVウイルスタンパク質（例えば、Fおよび／またはG糖タンパク質）に特異的
な抗体を産生することによりワクチンに応答する。ワクチン接種の結果として、
宿主は少なくとも部分的にまたは完全にRSV感染に対して免疫されるか、または
特に下気道の中程度または重度のRSV疾患の発生に対して抵抗するようになる。
【０１９４】
本発明のRSVワクチンは、単一のRSV株または抗原性サブグループ（例えば、A
またはB）に対する、または多RSV株またはサブグループに対する免疫応答を惹起
する弱毒化ウイルスを含むことができる。これに関し、RSVは単一特異的免疫応
答または多RSV株またはサブグループに対する多特異的免疫応答を惹起できる。
もしくは、異なった免疫原性特性を持っているRSVがワクチン混合物中で混合で
き、または一つのRSV株に対するまたは多RSV株またはサブグループに対するより
効果的な保護を惹起するために協調性処置プロトコールで別々に投与される。
またはB）に対する、または多RSV株またはサブグループに対する免疫応答を惹起
する弱毒化ウイルスを含むことができる。これに関し、RSVは単一特異的免疫応
答または多RSV株またはサブグループに対する多特異的免疫応答を惹起できる。
もしくは、異なった免疫原性特性を持っているRSVがワクチン混合物中で混合で
き、または一つのRSV株に対するまたは多RSV株またはサブグループに対するより
効果的な保護を惹起するために協調性処置プロトコールで別々に投与される。
【０１９５】
ワクチンが投与される宿主は、RSVまたは密接に関連するウイルスによる感染
が疑われ、およびワクチン化されたウイルスの抗原に対して保護的免疫応答を発
生できる任意の哺乳類であろう。従って、適した宿主にはヒト、非ヒト霊長類、
ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、齧歯類などが含まれる。従って、本発明は
種々のヒトおよび獣医学使用のためのワクチンを作成する方法を提供する。
が疑われ、およびワクチン化されたウイルスの抗原に対して保護的免疫応答を発
生できる任意の哺乳類であろう。従って、適した宿主にはヒト、非ヒト霊長類、
ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、齧歯類などが含まれる。従って、本発明は
種々のヒトおよび獣医学使用のためのワクチンを作成する方法を提供する。
【０１９６】
免疫モジュレーターを発現するように遺伝子操作された弱毒化組換えRSVを含
んでいるワクチン組成物は、個体のRSVに対する免疫応答能を誘導または促進す
るのに十分である”免疫学的有効量”で、RSウイルス感染が疑われているまたは
危険性を持つ患者に投与される。ヒト患者の場合、本発明の弱毒化ウイルスは、
例えば、Wright et al., Infect Immun. 37：397−400, 1982；Kim et al., Ped
iatrics 52：56−63, 1973；およびWright et al., J. Pediatr. 88：931−936,
1976（これらは各々本明細書に参照文献として組み入れられる）に記載されて
いるような、よく確立されたヒトRSVワクチンプロトコールに従って投与される
。簡単には、成人または子供は小滴によって鼻孔内へ免疫学的に有効量で、典型
的には生理学的に受容可能な希釈剤または担体の0.5ml容量が接種される。この
ことは非複製ワクチンの非経口免疫化と比較すると単純で安全という利点を持っ
ている。また、RSVに対する抵抗に主たる役割を果たしている、局所気道免疫の
直接刺激を提供する。さらに、このワクチン接種様式は、典型的には非常に若い
子供に観察される、RSV特異的母体由来血清抗体の免疫抑制効果を効果的に避け
ている。また、RSV抗原の非経口投与は時には免疫病理学的合併症が付随するが
、生きているウイルスでは観察されていない。
んでいるワクチン組成物は、個体のRSVに対する免疫応答能を誘導または促進す
るのに十分である”免疫学的有効量”で、RSウイルス感染が疑われているまたは
危険性を持つ患者に投与される。ヒト患者の場合、本発明の弱毒化ウイルスは、
例えば、Wright et al., Infect Immun. 37：397−400, 1982；Kim et al., Ped
iatrics 52：56−63, 1973；およびWright et al., J. Pediatr. 88：931−936,
1976（これらは各々本明細書に参照文献として組み入れられる）に記載されて
いるような、よく確立されたヒトRSVワクチンプロトコールに従って投与される
。簡単には、成人または子供は小滴によって鼻孔内へ免疫学的に有効量で、典型
的には生理学的に受容可能な希釈剤または担体の0.5ml容量が接種される。この
ことは非複製ワクチンの非経口免疫化と比較すると単純で安全という利点を持っ
ている。また、RSVに対する抵抗に主たる役割を果たしている、局所気道免疫の
直接刺激を提供する。さらに、このワクチン接種様式は、典型的には非常に若い
子供に観察される、RSV特異的母体由来血清抗体の免疫抑制効果を効果的に避け
ている。また、RSV抗原の非経口投与は時には免疫病理学的合併症が付随するが
、生きているウイルスでは観察されていない。
【０１９７】
すべての患者において、投与されるRSVワクチンの正確な量および時期および
投与の反復は、患者の健康状態および体重、投与様式、処方の性質などに基づい
て決定されるであろう。一般的には投与量は患者当たり約103から約106プラーク
形成単位（PFU）またはそれ以上のウイルス、例えば、107から108PFUのウイルス
、より普通には患者当たり約104から約105PFUウイルスの範囲であろう。いつで
も、ワクチン処方は、例えば、特に補体固定、プラーク中和および／または酵素
結合免疫吸着アッセイ法により決定できるように、抗RSV免疫応答を効果的に刺
激または誘導するのに十分な本発明の弱毒化RSV量を提供しなければならない。
これに関連して、個体はまた上気道病気の徴候および症状がモニターされる。チ
ンパンジーへの投与については、ワクチンの弱毒化ウイルスはワクチン接種接種
動物の鼻咽喉内で野生型ウイルスよりも約10分の1またはそれ以下のレベルで、
または不完全に弱毒化されたRSVのレベルと比較した場合は約10分の1またはそれ
以下で増殖した。
投与の反復は、患者の健康状態および体重、投与様式、処方の性質などに基づい
て決定されるであろう。一般的には投与量は患者当たり約103から約106プラーク
形成単位（PFU）またはそれ以上のウイルス、例えば、107から108PFUのウイルス
、より普通には患者当たり約104から約105PFUウイルスの範囲であろう。いつで
も、ワクチン処方は、例えば、特に補体固定、プラーク中和および／または酵素
結合免疫吸着アッセイ法により決定できるように、抗RSV免疫応答を効果的に刺
激または誘導するのに十分な本発明の弱毒化RSV量を提供しなければならない。
これに関連して、個体はまた上気道病気の徴候および症状がモニターされる。チ
ンパンジーへの投与については、ワクチンの弱毒化ウイルスはワクチン接種接種
動物の鼻咽喉内で野生型ウイルスよりも約10分の1またはそれ以下のレベルで、
または不完全に弱毒化されたRSVのレベルと比較した場合は約10分の1またはそれ
以下で増殖した。
【０１９８】
新生児および乳児においては、十分なレベルの免疫性を惹起するには多数回投
与が必要とされる。投与は生まれて最初の月以内に開始されなければならず、天
然の（野生型）RSV感染に対する保護を十分なレベルに維持するのに必要なよう
に、小児期を通して、2ヶ月、6ヶ月、1年および2年のような間隔で投与される。
同様に、例えば、健康管理作業者、デイケア作業者、若い子供がいる家族、老人
、易感染性心肺機能を持つ個体のような反復または重度のRSV感染に感受性があ
る成人は、保護的免疫応答を確立および／または維持するために多数回の免疫化
を必要とすることができる。誘導された免疫性のレベルは中和分泌および血清抗
体の量を測定することによりモニターでき、保護の望ましいレベルを維持するの
に必要なように投与量を調節しまたはワクチン接種を繰り返す。さらに、異なっ
たワクチンウイルスが異なった受容体群への投与に指示されてもよい。例えば、
サイトカインまたは追加のT細胞エピトープに豊富なタンパク質を発現している
遺伝子操作されたRSV株は乳児よりもむしろ成人に対して特に都合がよい。もし
くは、より低いレベルの弱毒化をより年をとったワクチン接種者に選択すること
ができる。本発明に従って製造されたRSVワクチンは、多RSVサブグループまたは
株に対する保護を達成するため、TSVの別のサブグループまたは株の抗原を発現
しているウイルスと組み合わせることができる。もしくは、ワクチンウイルスは
前記のように一つのRSVクローン内へ多RSV株またはサブグループの保護的エピト
ープを取り込むように遺伝子操作されてもよい。
与が必要とされる。投与は生まれて最初の月以内に開始されなければならず、天
然の（野生型）RSV感染に対する保護を十分なレベルに維持するのに必要なよう
に、小児期を通して、2ヶ月、6ヶ月、1年および2年のような間隔で投与される。
同様に、例えば、健康管理作業者、デイケア作業者、若い子供がいる家族、老人
、易感染性心肺機能を持つ個体のような反復または重度のRSV感染に感受性があ
る成人は、保護的免疫応答を確立および／または維持するために多数回の免疫化
を必要とすることができる。誘導された免疫性のレベルは中和分泌および血清抗
体の量を測定することによりモニターでき、保護の望ましいレベルを維持するの
に必要なように投与量を調節しまたはワクチン接種を繰り返す。さらに、異なっ
たワクチンウイルスが異なった受容体群への投与に指示されてもよい。例えば、
サイトカインまたは追加のT細胞エピトープに豊富なタンパク質を発現している
遺伝子操作されたRSV株は乳児よりもむしろ成人に対して特に都合がよい。もし
くは、より低いレベルの弱毒化をより年をとったワクチン接種者に選択すること
ができる。本発明に従って製造されたRSVワクチンは、多RSVサブグループまたは
株に対する保護を達成するため、TSVの別のサブグループまたは株の抗原を発現
しているウイルスと組み合わせることができる。もしくは、ワクチンウイルスは
前記のように一つのRSVクローン内へ多RSV株またはサブグループの保護的エピト
ープを取り込むように遺伝子操作されてもよい。
【０１９９】
典型的には、異なったワクチンウイルスが使用される場合、それらは混合物と
して同時に投与されるであろうが、また別々に投与されてもよい。例えば、二つ
のRSVサブグループのF糖タンパク質は約10％のアミノ酸配列しか異なっていない
ので、この類似性が、動物をRSVまたはF抗原で免疫し異種株で攻撃すると観察さ
れるような交差保護的免疫反応の根拠である。従って、一つの株での免疫化で、
同一のまたは異なったサブグループの異なった株に対して保護することができる
。しかしながら、最適な保護は多分両方のサブグループに対する免疫化を必要と
するであろう。
して同時に投与されるであろうが、また別々に投与されてもよい。例えば、二つ
のRSVサブグループのF糖タンパク質は約10％のアミノ酸配列しか異なっていない
ので、この類似性が、動物をRSVまたはF抗原で免疫し異種株で攻撃すると観察さ
れるような交差保護的免疫反応の根拠である。従って、一つの株での免疫化で、
同一のまたは異なったサブグループの異なった株に対して保護することができる
。しかしながら、最適な保護は多分両方のサブグループに対する免疫化を必要と
するであろう。
【０２００】
免疫モジュレーターを発現するように遺伝子操作された組換えRSVは、個体が
続いて野生型RSVで感染された場合の肺炎および気管支炎のような重度の下気道
疾患に対して保護的である免疫応答の生成を惹起する。天然に循環しているウイ
ルスは未だ感染を起こすことができるので（特に上気道）、ワクチン接種の結果
として鼻炎の可能性が非常に減少し、続いての野生型のウイルスによる感染の抵
抗性が高められる。ワクチン接種後、インビトロおよびインビボで相同的野生型
ウイルス（同一のサブグループの）を中和できる血清および分泌抗体を検出可能
なレベルで宿主が発生していた。多くの例において、宿主抗体はまた異なった非
ワクチンサブグループの野生型ウイルスも中和するであろう。
続いて野生型RSVで感染された場合の肺炎および気管支炎のような重度の下気道
疾患に対して保護的である免疫応答の生成を惹起する。天然に循環しているウイ
ルスは未だ感染を起こすことができるので（特に上気道）、ワクチン接種の結果
として鼻炎の可能性が非常に減少し、続いての野生型のウイルスによる感染の抵
抗性が高められる。ワクチン接種後、インビトロおよびインビボで相同的野生型
ウイルス（同一のサブグループの）を中和できる血清および分泌抗体を検出可能
なレベルで宿主が発生していた。多くの例において、宿主抗体はまた異なった非
ワクチンサブグループの野生型ウイルスも中和するであろう。
【０２０１】
本発明の好適なRSV組換え体は、天然にヒトで循環している野生型ウイルスと
比較した場合、非常に減弱された毒性しか示さない。ウイルスはほとんどの免疫
された個体で感染の徴候が起こらないように十分に弱毒化されている。いくつか
の例において、弱毒化ウイルスはいまだにワクチン接種されていない個体に広ま
ることができる。しかしながら、重度の下気道感染はワクチン接種されたまたは
偶発的な宿主で発生しないようにその毒性は十分に除去されている。
比較した場合、非常に減弱された毒性しか示さない。ウイルスはほとんどの免疫
された個体で感染の徴候が起こらないように十分に弱毒化されている。いくつか
の例において、弱毒化ウイルスはいまだにワクチン接種されていない個体に広ま
ることができる。しかしながら、重度の下気道感染はワクチン接種されたまたは
偶発的な宿主で発生しないようにその毒性は十分に除去されている。
【０２０２】
免疫モジュレーターを発現するように遺伝子操作された弱毒化組換えRSVレベ
ルは、例えば、免疫化宿主の気道中に存在するウイルス量を定量し、野生型RSV
またはワクチン株候補として評価された他の弱毒化RSVによるウイルス量を比較
することにより決定される。例えば、本発明の弱毒化ウイルスは、野生型ウイル
スの複製レベルと比較すると、チンパンジーのような高度な感受性を持つ宿主の
上気道での複製を高い程度で制限するであろう、例えば、5から10分の1、20−50
分の1、100から1000分の1またはそれ未満。また、チンパンジーの上気道中での
弱毒化RSVワクチン株の複製レベルはRSV A2 ts−1（血清陰性乳児では不完全に
しか弱毒化されていないことが以前に示されている）のレベルよりも低くなけれ
ばならない。上気道でのウイルスの複製に関連している鼻汁の発生をさらに減少
させるためには、理想的ワクチン候補ウイルスは上および下気道の両方で制限さ
れたレベルの複製を示さなければならない。しかしながら、本発明の弱毒化ウイ
ルスはヒトにおいて十分に感染性および免疫原性であるに違いなく、ワクチン接
種した個体で保護を与える。感染個体の鼻咽頭中のRSウイルスレベルを決定する
方法は文献によく知られている。試料は鼻咽頭分泌液の吸引または洗浄により得
られ、ウイルスは組織培養または他の実験室法により定量される。例えば、Bels
he et al., J. Med. Virology 1：157−162, 1977；Friedewald et al., J. Ame
r. Med. Assoc. 204：690−694, 1968；Gharpure et al., J. Virol. 3：414−4
21, 1969；およびWright et al., Arch. Ges. Virusforsch. 41：238−247, 197
3（各々は本明細書において参照文献として組み入れられる）、を参照されたい
。
ルは、例えば、免疫化宿主の気道中に存在するウイルス量を定量し、野生型RSV
またはワクチン株候補として評価された他の弱毒化RSVによるウイルス量を比較
することにより決定される。例えば、本発明の弱毒化ウイルスは、野生型ウイル
スの複製レベルと比較すると、チンパンジーのような高度な感受性を持つ宿主の
上気道での複製を高い程度で制限するであろう、例えば、5から10分の1、20−50
分の1、100から1000分の1またはそれ未満。また、チンパンジーの上気道中での
弱毒化RSVワクチン株の複製レベルはRSV A2 ts−1（血清陰性乳児では不完全に
しか弱毒化されていないことが以前に示されている）のレベルよりも低くなけれ
ばならない。上気道でのウイルスの複製に関連している鼻汁の発生をさらに減少
させるためには、理想的ワクチン候補ウイルスは上および下気道の両方で制限さ
れたレベルの複製を示さなければならない。しかしながら、本発明の弱毒化ウイ
ルスはヒトにおいて十分に感染性および免疫原性であるに違いなく、ワクチン接
種した個体で保護を与える。感染個体の鼻咽頭中のRSウイルスレベルを決定する
方法は文献によく知られている。試料は鼻咽頭分泌液の吸引または洗浄により得
られ、ウイルスは組織培養または他の実験室法により定量される。例えば、Bels
he et al., J. Med. Virology 1：157−162, 1977；Friedewald et al., J. Ame
r. Med. Assoc. 204：690−694, 1968；Gharpure et al., J. Virol. 3：414−4
21, 1969；およびWright et al., Arch. Ges. Virusforsch. 41：238−247, 197
3（各々は本明細書において参照文献として組み入れられる）、を参照されたい
。
【０２０３】
いくつかに例において、免疫モジュレーターを発現するように遺伝子操作され
た組換えRSVを含んでいる本発明のRSVワクチンと他の因子（特に他の小児ウイル
ス）への保護的応答を誘導するワクチンを併用することが望まれる。例えば、本
発明の組換えRSVワクチンは、Clements et al., J. Clin. Microbiol. 29：1175
−1182, 1991（本明細書において参照文献として組み入れられる）に記載されて
いるようなPIVワクチンと同時に投与できる。本発明の別の態様において、前記
のように感染性RSVを製造するために使用されるRSVゲノムまたはアンチゲノム内
へそれらの保護的抗原をコード化している配列を取り込むことにより、本組換え
RSVはPIVのような他の気道病原体の保護的抗原のためのベクターとして用いるこ
とができる。
た組換えRSVを含んでいる本発明のRSVワクチンと他の因子（特に他の小児ウイル
ス）への保護的応答を誘導するワクチンを併用することが望まれる。例えば、本
発明の組換えRSVワクチンは、Clements et al., J. Clin. Microbiol. 29：1175
−1182, 1991（本明細書において参照文献として組み入れられる）に記載されて
いるようなPIVワクチンと同時に投与できる。本発明の別の態様において、前記
のように感染性RSVを製造するために使用されるRSVゲノムまたはアンチゲノム内
へそれらの保護的抗原をコード化している配列を取り込むことにより、本組換え
RSVはPIVのような他の気道病原体の保護的抗原のためのベクターとして用いるこ
とができる。
【０２０４】
以下の実施例は例示のために提供されており、本発明を制限するものではない
。簡潔には、これらの実施例は以下のことを記載している
。簡潔には、これらの実施例は以下のことを記載している
【０２０５】
実施例1
インターフェロンガンマを発現する組換えRSVの構築および性質決定
インターフェロンガンマ（IFNγ）、II型インターフェロンは、T細胞およびナ
チュラルキラー（NK）細胞により産生され、そして多様な生物学的影響を有する
（概説には、参考文献1および2を参照されたい）。IFNγは、固有の抗ウイルス
活性を有し、主要組織適合性クラスIおよびII分子の発現を上方制御し、マクロ
ファージおよびNK細胞を活性化し、そしてTヘルパー（Th）細胞増殖に重要な制
御上の役割を有する。サイトカイン分泌のパターンに基づき、ネズミTh細胞の2
つのサブセットが、区別されてきている：Th1サブセットのマーカーサイトカイ
ンには、IL-2およびIFNγが含まれ、そしてTh2サブセットのマーカーには、IL-4
、IL-5、IL-6およびIL-10が含まれる。IFNγは、Th2細胞の増殖を優先的に阻害
し、したがって、Th1反応に有利に働く。
チュラルキラー（NK）細胞により産生され、そして多様な生物学的影響を有する
（概説には、参考文献1および2を参照されたい）。IFNγは、固有の抗ウイルス
活性を有し、主要組織適合性クラスIおよびII分子の発現を上方制御し、マクロ
ファージおよびNK細胞を活性化し、そしてTヘルパー（Th）細胞増殖に重要な制
御上の役割を有する。サイトカイン分泌のパターンに基づき、ネズミTh細胞の2
つのサブセットが、区別されてきている：Th1サブセットのマーカーサイトカイ
ンには、IL-2およびIFNγが含まれ、そしてTh2サブセットのマーカーには、IL-4
、IL-5、IL-6およびIL-10が含まれる。IFNγは、Th2細胞の増殖を優先的に阻害
し、したがって、Th1反応に有利に働く。
【０２０６】
本実施例において、G-F遺伝子間領域に挿入された別個の遺伝子として、ネズ
ミ（m）IFNγをコードする感染性組換え（r）ヒトRSV（rRSV／mIFNγ）を構築し
た。rRSV／mIFNγに感染した培養細胞は、106細胞当たり22 mgのmIFNγを分泌し
た。rRSV／mIFNγの複製は、マウスの上部および下部気道において、それぞれ、
野生型（wt）RSVのものより63倍および20倍低かったが、さらなる遺伝子として
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）遺伝子を含む対照キ
メラrRSVの複製はそうではなかった。したがって、in vivoでのrRSV／mIFNγの
弱毒化は、mIFNγの活性に起因すると考えることが可能であり、そしてさらなる
遺伝子の存在それ自体に起因すると考えることは不可能であった。マウスは、wt
RSVでの続く攻撃（challenge）に完全に抵抗性であった。その増殖制限にもか
かわらず、rRSV／mIFNγでのマウスの感染は、ある程度のレベルのRSV特異的抗
体を誘導し、該レベルは、第56日に、wt RSVでの感染により、誘導されたものに
匹敵するかまたはそれより高かった。rRSV／mIFNγに感染したマウスは、肺にお
いて、高レベルのIFNγ mRNAおよび増加した量のIL-12 p40 mRNAを発展させたが
、一方、試験した他のサイトカインmRNAは、wt RSVにより誘導されたものに比較
し、変化しなかった。RSVの弱毒化は、典型的には、免疫原性の減少を伴うため
、rRSVによるIFNγの発現は、免疫原性が減少するのではなく維持される可能性
がある弱毒化の方法を代表する。
ミ（m）IFNγをコードする感染性組換え（r）ヒトRSV（rRSV／mIFNγ）を構築し
た。rRSV／mIFNγに感染した培養細胞は、106細胞当たり22 mgのmIFNγを分泌し
た。rRSV／mIFNγの複製は、マウスの上部および下部気道において、それぞれ、
野生型（wt）RSVのものより63倍および20倍低かったが、さらなる遺伝子として
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）遺伝子を含む対照キ
メラrRSVの複製はそうではなかった。したがって、in vivoでのrRSV／mIFNγの
弱毒化は、mIFNγの活性に起因すると考えることが可能であり、そしてさらなる
遺伝子の存在それ自体に起因すると考えることは不可能であった。マウスは、wt
RSVでの続く攻撃（challenge）に完全に抵抗性であった。その増殖制限にもか
かわらず、rRSV／mIFNγでのマウスの感染は、ある程度のレベルのRSV特異的抗
体を誘導し、該レベルは、第56日に、wt RSVでの感染により、誘導されたものに
匹敵するかまたはそれより高かった。rRSV／mIFNγに感染したマウスは、肺にお
いて、高レベルのIFNγ mRNAおよび増加した量のIL-12 p40 mRNAを発展させたが
、一方、試験した他のサイトカインmRNAは、wt RSVにより誘導されたものに比較
し、変化しなかった。RSVの弱毒化は、典型的には、免疫原性の減少を伴うため
、rRSVによるIFNγの発現は、免疫原性が減少するのではなく維持される可能性
がある弱毒化の方法を代表する。
【０２０７】
プラスミド構築
RSV遺伝子開始および遺伝子終止シグナルは、オリゴヌクレオチド
【０２０８】
【化１】
【０２０９】
（正のセンス、XmaI部位は太字、RSV遺伝子開始配列は下線、mIFNγ遺伝子の5
’末端部分に特異的な配列は斜字、そして開始コドンは太い斜字で示される）お
よび
’末端部分に特異的な配列は斜字、そして開始コドンは太い斜字で示される）お
よび
【０２１０】
【化２】
【０２１１】
（負のセンス、XmaI部位は太字、RSV遺伝子終止配列は下線、mIFNγ遺伝子の3
’末端部分に特異的な配列は斜字、そして終止コドン相補体は太い斜字で示され
る）を用いたPCRにより、mIFNγ cDNAに付着させた。PCR産物をプラスミドpUC19
にクローニングし、そしてその配列を確認し、そして該産物をその後、先に記載
されたアンチゲノム（antigenome）プラスミドD46／1024（13、図1）のXmaI部位
にクローニングした。
’末端部分に特異的な配列は斜字、そして終止コドン相補体は太い斜字で示され
る）を用いたPCRにより、mIFNγ cDNAに付着させた。PCR産物をプラスミドpUC19
にクローニングし、そしてその配列を確認し、そして該産物をその後、先に記載
されたアンチゲノム（antigenome）プラスミドD46／1024（13、図1）のXmaI部位
にクローニングした。
【０２１２】
RSV特異的およびIgアイソタイプ特異的酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）
精製RSV F糖タンパク質（4μg／ml）で被覆した96ウェルプレートを、4倍希釈
のマウス血清と、その後、以下のビオチン化アイソタイプ特異的ラット抗マウス
抗体：（i）IgG1重鎖に対するIgG1カッパ、（ii）IgG2a重鎖に対するIgG2aカッ
パ、アロタイプIgK-1A、および（iii）IgA重鎖に対するIgMモノクローナル抗体
クローンLO-MA-7（Accurate Chemical and Scientific Company、ニューヨーク
州）の1つとインキュベーションした。プレートをその後、アルカリホスファタ
ーゼと連結させたストレプトアビジン（Life Technologies、メリーランド州）
とインキュベーションし、そしてp-ニトロフェニルリン酸溶液（Sigma、ミズー
リ州）と反応させた。示されるアイソタイプに関する試薬の特異性は、以下の商
業的に得られる精製ネズミモノクローナル抗体：IgG1（MOPC 21）、IgG2a（RPC
5）、IgG3（FLOPC 21）（Cappel／Organon Teknika、ペンシルバニア州）、IgG2
b（MOPC 141）、IgA（TEPC 15）およびIgM（MOPC 104E）（Litton Bionetics、
サウスカロライナ州）に対するELISAにより確認した。総IgGは、F被覆プレート
を、試験血清の希釈とインキュベーションした後、マウスIgGに特異的であり、
そしてアルカリホスファターゼにコンジュゲート化したヤギIgG（Cappel）とイ
ンキュベーションし、これをその後、p-ニトロフェニルリン酸と反応させること
により、検出した。ELISA測定は、Vmax動力学マイクロタイター読取装置（Molec
ular Devices）を用いて行った。
のマウス血清と、その後、以下のビオチン化アイソタイプ特異的ラット抗マウス
抗体：（i）IgG1重鎖に対するIgG1カッパ、（ii）IgG2a重鎖に対するIgG2aカッ
パ、アロタイプIgK-1A、および（iii）IgA重鎖に対するIgMモノクローナル抗体
クローンLO-MA-7（Accurate Chemical and Scientific Company、ニューヨーク
州）の1つとインキュベーションした。プレートをその後、アルカリホスファタ
ーゼと連結させたストレプトアビジン（Life Technologies、メリーランド州）
とインキュベーションし、そしてp-ニトロフェニルリン酸溶液（Sigma、ミズー
リ州）と反応させた。示されるアイソタイプに関する試薬の特異性は、以下の商
業的に得られる精製ネズミモノクローナル抗体：IgG1（MOPC 21）、IgG2a（RPC
5）、IgG3（FLOPC 21）（Cappel／Organon Teknika、ペンシルバニア州）、IgG2
b（MOPC 141）、IgA（TEPC 15）およびIgM（MOPC 104E）（Litton Bionetics、
サウスカロライナ州）に対するELISAにより確認した。総IgGは、F被覆プレート
を、試験血清の希釈とインキュベーションした後、マウスIgGに特異的であり、
そしてアルカリホスファターゼにコンジュゲート化したヤギIgG（Cappel）とイ
ンキュベーションし、これをその後、p-ニトロフェニルリン酸と反応させること
により、検出した。ELISA測定は、Vmax動力学マイクロタイター読取装置（Molec
ular Devices）を用いて行った。
【０２１３】
mIFNγを発現するrRSVの構築および回収
mIFNγをコードするcDNAクローンを修飾し、RSV遺伝子開始および遺伝子終止
転写シグナルを隣接させた（図1）。このキメラ転写カセットを唯一のXmaI部位1
3を含むよう修飾されているアンチゲノムcDNA D46のG-F遺伝子間領域に挿入した
。Bukreyevら, J. Virol. 70, 6634-6641, 1996。mIFNγ挿入物を含むこのキメ
ラRSVアンチゲノムRNAは、長さ15,729ヌクレオチドであり、そして11のmRNAをコ
ードし、mIFNγ遺伝子は、3’から5’方向の8番目であるであろう。rRSV／mIFN
γは、Collinsら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 11563-11567, 1995に先に
記載されるように、トランスフェクションしたcDNAから回収した。
転写シグナルを隣接させた（図1）。このキメラ転写カセットを唯一のXmaI部位1
3を含むよう修飾されているアンチゲノムcDNA D46のG-F遺伝子間領域に挿入した
。Bukreyevら, J. Virol. 70, 6634-6641, 1996。mIFNγ挿入物を含むこのキメ
ラRSVアンチゲノムRNAは、長さ15,729ヌクレオチドであり、そして11のmRNAをコ
ードし、mIFNγ遺伝子は、3’から5’方向の8番目であるであろう。rRSV／mIFN
γは、Collinsら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 11563-11567, 1995に先に
記載されるように、トランスフェクションしたcDNAから回収した。
【０２１４】
rRSV／mIFNγは、異質の（foreign）遺伝子が、mIFNγでなく、クロラムフェ
ニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）をコードし、そして挿入物長がわ
ずかに長い（762対507ヌクレオチド）ことを除き、rRSV／mIFNγに同一である、
先に記載されたキメラウイルス、rRSV／CAT（以前D46／1024CATと称された）、B
ukreyevら, J. Virol. 70, 6634-6641, 1996、のものと匹敵する大きさのプラー
クを形成した。これらのキメラウイルス各々のプラークの大きさは、wt RSVのも
のよりわずかに小さかったが、そうでなければプラークの形態は区別不能であっ
た。
ニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）をコードし、そして挿入物長がわ
ずかに長い（762対507ヌクレオチド）ことを除き、rRSV／mIFNγに同一である、
先に記載されたキメラウイルス、rRSV／CAT（以前D46／1024CATと称された）、B
ukreyevら, J. Virol. 70, 6634-6641, 1996、のものと匹敵する大きさのプラー
クを形成した。これらのキメラウイルス各々のプラークの大きさは、wt RSVのも
のよりわずかに小さかったが、そうでなければプラークの形態は区別不能であっ
た。
【０２１５】
rRSV／mIFNγまたはwt RSVに感染した細胞から単離したポリ（A+）mRNAのノー
ザンブロット解析（未提示）は、前者が、期待される大きさのmIFNγ mRNAを発
現することを立証した。以前、非分節マイナス鎖RNAウイルス中に置かれた異質
の配列が、細胞培養中で、非常に安定であることが示されてきている。Bukreyev
ら, J. Virol. 70, 6634-6641, 1996； Schnellら, Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 93, 11359-11365, 1996。これと一致して、rRSV／mIFNγの8回の継代中、mIFN
γ遺伝子のノーザンブロットおよび逆転写PCR解析は、欠失のいかなる証拠も示
さなかった。
ザンブロット解析（未提示）は、前者が、期待される大きさのmIFNγ mRNAを発
現することを立証した。以前、非分節マイナス鎖RNAウイルス中に置かれた異質
の配列が、細胞培養中で、非常に安定であることが示されてきている。Bukreyev
ら, J. Virol. 70, 6634-6641, 1996； Schnellら, Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 93, 11359-11365, 1996。これと一致して、rRSV／mIFNγの8回の継代中、mIFN
γ遺伝子のノーザンブロットおよび逆転写PCR解析は、欠失のいかなる証拠も示
さなかった。
【０２１６】
rRSV／mIFNγの増殖およびin vitroでのmIFNγの産生
rRSV／mIFNγ、rRSV／CAT、およびwt RSVの増殖特性を、HEp-2細胞中で比較し
た（図2）。rRSV／CATは、同一のゲノム位置に同様の大きさの挿入物を含むため
、さらなる対照として選択した。2つのキメラウイルスは、wt RSVより増殖が遅
く、そして最終力価がより低かった。例えば、rRSV／mIFNγは、wt RSVの最大力
価107.6 PFU（プラーク形成単位）／ml（感染48時間後）に比較し、感染40時間
後、106.4 PFU／mlのピーク力価を達成し、16倍の減少を示した。
た（図2）。rRSV／CATは、同一のゲノム位置に同様の大きさの挿入物を含むため
、さらなる対照として選択した。2つのキメラウイルスは、wt RSVより増殖が遅
く、そして最終力価がより低かった。例えば、rRSV／mIFNγは、wt RSVの最大力
価107.6 PFU（プラーク形成単位）／ml（感染48時間後）に比較し、感染40時間
後、106.4 PFU／mlのピーク力価を達成し、16倍の減少を示した。
【０２１７】
rRSV／mIFNγまたはrRSV／CATに感染したHEp-2細胞を覆う培地を、感染後異な
る時点でmIFNγに関し解析した（図3）。mIFNγの濃度は、最初に試験した感染8
時間後、0.1 ng／ml、40時間後、1.8 mg／ml、そして120時間後に最大の4.4 mg
／mlに達し、これは106細胞当たり22 mgに相当した。
る時点でmIFNγに関し解析した（図3）。mIFNγの濃度は、最初に試験した感染8
時間後、0.1 ng／ml、40時間後、1.8 mg／ml、そして120時間後に最大の4.4 mg
／mlに達し、これは106細胞当たり22 mgに相当した。
【０２１８】
BALB／cマウスにおけるrRSV／mIFNγの複製、免疫原性、および防御効率
in vivoでrRSV／mIFNγの複製を評価するため、マウスを、106 PFUのrRSV／mI
FNγ、rRSV／CAT、またはwt RSVに鼻内感染させた。動物を感染第3日、第4日ま
たは第5日後に屠殺し、そして上部（鼻甲介）および下部（肺）気道におけるウ
イルス濃度をプラークアッセイにより測定した。rRSV／mIFNγの複製は、wt RSV
に比較し、上部および下部気道で、それぞれ、63および20倍まで減少した（図4
）。対照的に、rRSV／CATの複製は、wt RSVのものと有意に異ならず、匹敵する
大きさのさらなる異質の遺伝子の存在それ自体は、マウスにおいてRSV複製を減
弱しないことを示した。
FNγ、rRSV／CAT、またはwt RSVに鼻内感染させた。動物を感染第3日、第4日ま
たは第5日後に屠殺し、そして上部（鼻甲介）および下部（肺）気道におけるウ
イルス濃度をプラークアッセイにより測定した。rRSV／mIFNγの複製は、wt RSV
に比較し、上部および下部気道で、それぞれ、63および20倍まで減少した（図4
）。対照的に、rRSV／CATの複製は、wt RSVのものと有意に異ならず、匹敵する
大きさのさらなる異質の遺伝子の存在それ自体は、マウスにおいてRSV複製を減
弱しないことを示した。
【０２１９】
rRSV／mIFNγ、rRSV／CAT、またはwt RSVに感染したマウスから、血清試料を
第0日、第28日および第56日に回収し、そしてRSV特異的および抗体アイソタイプ
特異的ELISAにより、そしてRSV中和アッセイにより、解析した（表1）。ウイル
スにより誘導されるIgA抗体のレベルは、有意に異ならなかった。wt RSVまたはr
RSV／CATをワクチン接種した動物に比較し、rRSV／mIFNγをワクチン接種したマ
ウスにおいて、第56日には、RSV Fタンパク質に特異的な総IgGの有意な増加（4
倍）があったが、第28日にはなかった。IgG1抗体の力価は、第28日ではウイルス
間で有意に異ならなかったが、第56日には、rRSV／mIFNγで免疫感作したマウス
由来のIgG1の平均力価は、wt RSV（逆12.1 log2対9.3 log2；p＜0.05）またはrR
SV／CATで免疫感作したマウスのものより高かった。対照的に、第56日、IgG2aの
平均力価は、wt RSVに比較し、rRSV／mIFNγで免疫感作したマウスで減少した（
9.6 log2対11.6 log2；p＜0.001）。wt RSVまたはrRSV／CATに比較し、RSV／mIF
Nγに感染したマウスの中和抗体力価は、第28日にはかろうじてより低かったが
、第56日には、穏やかにより高かった（12.3 log2対11.2 log2；p＜0.2）。
第0日、第28日および第56日に回収し、そしてRSV特異的および抗体アイソタイプ
特異的ELISAにより、そしてRSV中和アッセイにより、解析した（表1）。ウイル
スにより誘導されるIgA抗体のレベルは、有意に異ならなかった。wt RSVまたはr
RSV／CATをワクチン接種した動物に比較し、rRSV／mIFNγをワクチン接種したマ
ウスにおいて、第56日には、RSV Fタンパク質に特異的な総IgGの有意な増加（4
倍）があったが、第28日にはなかった。IgG1抗体の力価は、第28日ではウイルス
間で有意に異ならなかったが、第56日には、rRSV／mIFNγで免疫感作したマウス
由来のIgG1の平均力価は、wt RSV（逆12.1 log2対9.3 log2；p＜0.05）またはrR
SV／CATで免疫感作したマウスのものより高かった。対照的に、第56日、IgG2aの
平均力価は、wt RSVに比較し、rRSV／mIFNγで免疫感作したマウスで減少した（
9.6 log2対11.6 log2；p＜0.001）。wt RSVまたはrRSV／CATに比較し、RSV／mIF
Nγに感染したマウスの中和抗体力価は、第28日にはかろうじてより低かったが
、第56日には、穏やかにより高かった（12.3 log2対11.2 log2；p＜0.2）。
【０２２０】
防御効率を評価するため、第56日、上述の群からの5匹のマウスを、動物当た
り106 PFUのwt RSVの鼻内点滴注入により攻撃した。4日後、マウスを屠殺し、そ
してウイルス定量化のため、鼻甲介および肺を採取した。攻撃ウイルスは、rRSV
／mIFNγにあらかじめ感染していた動物では検出不能であり、そしてwt RSVにあ
らかじめ感染していた動物の上部気道で、非常に低いレベルの複製が観察された
のみであった。
り106 PFUのwt RSVの鼻内点滴注入により攻撃した。4日後、マウスを屠殺し、そ
してウイルス定量化のため、鼻甲介および肺を採取した。攻撃ウイルスは、rRSV
／mIFNγにあらかじめ感染していた動物では検出不能であり、そしてwt RSVにあ
らかじめ感染していた動物の上部気道で、非常に低いレベルの複製が観察された
のみであった。
【０２２１】
表1：第0日（免疫感作前）、第28日および第56日のRSV血清抗体力価（逆平均l
og2±標準誤差）a
og2±標準誤差）a
【０２２２】
【表１】
【０２２３】
a群当たり8匹のマウスを用いた。第56日の抗体力価は、別個のアッセイで測定
した。 b個々の試料の高い可変性のため、wt RSV対照に比較した相違は、統計的に有
意でなかった（スチューデントt検定）。
した。 b個々の試料の高い可変性のため、wt RSV対照に比較した相違は、統計的に有
意でなかった（スチューデントt検定）。
【０２２４】
c、d、e、fwt RSV対照に比較し、スチューデントt検定により計算した、統計的有
意性。：cp＜0.05；dp＜0.001；ep＜0.02；fp＜0.2。 肺サイトカインmRNA 分泌されるサイトカインをコードするmRNAのレベルを、rRSV／mIFNγまたはwt
RSVに感染したマウスの肺で測定し、mIFNγ mRNA合成のレベルが増加している
かどうか、そしてその合成が、他のTh1またはTh2サイトカインmRNAレベルに影響
を与えるかどうか、決定した。rRSV／mIFNγ、wt RSVまたはプラセボに感染させ
た群からの各5匹のマウスを、感染1日後および4日後に、あるいは第28日のwt RS
Vでの攻撃の1日後および4日後（第29日および第32日）に屠殺した。総肺RNAを単
離し、そして商業的リボヌクレアーゼ保護アッセイにより、分泌サイトカインmR
NAに関し解析した（図5）。この直接アッセイは、既定の時間での関心の部位で
のmRNA濃度を反映し、そして採取した細胞のin vitro操作による、ありうる人為
現象を排除する。Th1マーカーサイトカインIL-2およびIFNγ、Th2マーカーサイ
トカインIL-4、IL-6およびIL-10、並びにIL-12ヘテロ二量体の誘導性構成要素で
あるIL-12 p40タンパク質に関し、mRNAレベルを測定した。
意性。：cp＜0.05；dp＜0.001；ep＜0.02；fp＜0.2。 肺サイトカインmRNA 分泌されるサイトカインをコードするmRNAのレベルを、rRSV／mIFNγまたはwt
RSVに感染したマウスの肺で測定し、mIFNγ mRNA合成のレベルが増加している
かどうか、そしてその合成が、他のTh1またはTh2サイトカインmRNAレベルに影響
を与えるかどうか、決定した。rRSV／mIFNγ、wt RSVまたはプラセボに感染させ
た群からの各5匹のマウスを、感染1日後および4日後に、あるいは第28日のwt RS
Vでの攻撃の1日後および4日後（第29日および第32日）に屠殺した。総肺RNAを単
離し、そして商業的リボヌクレアーゼ保護アッセイにより、分泌サイトカインmR
NAに関し解析した（図5）。この直接アッセイは、既定の時間での関心の部位で
のmRNA濃度を反映し、そして採取した細胞のin vitro操作による、ありうる人為
現象を排除する。Th1マーカーサイトカインIL-2およびIFNγ、Th2マーカーサイ
トカインIL-4、IL-6およびIL-10、並びにIL-12ヘテロ二量体の誘導性構成要素で
あるIL-12 p40タンパク質に関し、mRNAレベルを測定した。
【０２２５】
図5は、示されるウイルスでの免疫感作4日後、採取された5匹の個々の動物の
肺におけるIFNγおよびIL-12 p40 mRNAのアッセイのオートラジオグラフを示す
。mIFNγの増加した集積が、rRSV／mIFNγ感染動物で見られ、そしてwt RSVに感
染したものに比較し、rRSV／mIFNγ感染動物において、IL-12 p40 mRNAのわずか
だか統計的に有意な増加が見られた。このゲルそして他のゲルからの結果をホス
ホイメージャーで定量化し、そして各組の5匹のマウスの平均値を、同一のゲル
レーン中のマウスL-32ハウスキーピング遺伝子mRNAの割合として表した（図6）
。
肺におけるIFNγおよびIL-12 p40 mRNAのアッセイのオートラジオグラフを示す
。mIFNγの増加した集積が、rRSV／mIFNγ感染動物で見られ、そしてwt RSVに感
染したものに比較し、rRSV／mIFNγ感染動物において、IL-12 p40 mRNAのわずか
だか統計的に有意な増加が見られた。このゲルそして他のゲルからの結果をホス
ホイメージャーで定量化し、そして各組の5匹のマウスの平均値を、同一のゲル
レーン中のマウスL-32ハウスキーピング遺伝子mRNAの割合として表した（図6）
。
【０２２６】
wt RSVでの感染後第1日または第4日：（i）Th1サイトカインIFNγ mRNAの発現
、IL-2の発現はない；（ii）IL-12 p40 mRNAのレベルの増加；および（iii）Th2
サイトカインIL-6およびIL-10 mRNAの発現が観察された。rRSV／mIFNγでの感染
は、IFNγ mRNAのレベルが、第1日および第4日両方でより高いが、第4日に特に
そうであり、そしてIL-12 p40 mRNAのレベルもまた、第1日および第4日により高
いことを除き、wt RSVにより誘導されたものに類似のサイトカインプロフィール
を誘導した。したがって、IFNγおよびIL-12 p40における定量的な相違を別にす
れば、wt RSVおよびrRSV／mIFNγは、Th1およびTh2サイトカインの同様のプロフ
ィールを誘導した。ウイルス攻撃後（第29日および第32日）、IFNγ、IL-2、IL-
10、およびIL-12 p40のレベルもまた、ニセ免疫感作マウスに比較し、wt RSVま
たはrRSV／mIFNγで免疫感作したマウスで増加したが、IL-6レベルは増加しなか
った。
、IL-2の発現はない；（ii）IL-12 p40 mRNAのレベルの増加；および（iii）Th2
サイトカインIL-6およびIL-10 mRNAの発現が観察された。rRSV／mIFNγでの感染
は、IFNγ mRNAのレベルが、第1日および第4日両方でより高いが、第4日に特に
そうであり、そしてIL-12 p40 mRNAのレベルもまた、第1日および第4日により高
いことを除き、wt RSVにより誘導されたものに類似のサイトカインプロフィール
を誘導した。したがって、IFNγおよびIL-12 p40における定量的な相違を別にす
れば、wt RSVおよびrRSV／mIFNγは、Th1およびTh2サイトカインの同様のプロフ
ィールを誘導した。ウイルス攻撃後（第29日および第32日）、IFNγ、IL-2、IL-
10、およびIL-12 p40のレベルもまた、ニセ免疫感作マウスに比較し、wt RSVま
たはrRSV／mIFNγで免疫感作したマウスで増加したが、IL-6レベルは増加しなか
った。
【０２２７】
さらなる対照として、同一の実験において、別の群の動物を、ホルマリン不活
性化RSV（Connorsら, J. Virol. 66, 7444-7451, 1992）で非経口免疫感作し、
そして同一の採取および攻撃計画に供した。IL-4 mRNAは、最初の免疫感作また
は感染後、この群またはいかなる他の群でも検出されなかった。攻撃に際し、ホ
ルマリン処理ワクチンを投与された群で、IL-4 mRNAは非常に増加したが、他の
群では検出不能であった。
性化RSV（Connorsら, J. Virol. 66, 7444-7451, 1992）で非経口免疫感作し、
そして同一の採取および攻撃計画に供した。IL-4 mRNAは、最初の免疫感作また
は感染後、この群またはいかなる他の群でも検出されなかった。攻撃に際し、ホ
ルマリン処理ワクチンを投与された群で、IL-4 mRNAは非常に増加したが、他の
群では検出不能であった。
【０２２８】
前述の例は、GおよびF遺伝子間の、遺伝子の順序の8番目に置かれたさらなる
転写単位由来の別個のmRNAとしてmIFNγ遺伝子を発現するキメラウイルス、rRSV
／mIFNγの構築を詳述する。このウイルスは、細胞培養において、高レベルのmI
FNγの合成を指示した。細胞培養におけるrRSV／mIFNγの増殖は、wt RSVに比較
し、16倍減少した。しかし、この効果の度合いは、同一のゲノム位置にCAT遺伝
子を含む、rRSV／CATに関し観察されたものに匹敵した。したがって、in vitro
での該構築物に対する増殖制限は、コードされる産物の活性によるよりも、異質
の遺伝子の存在により特徴付けられる。mIFNγの発現が、ヒトHEp-2細胞におけ
るウイルス増殖を阻害しなかったことは、ヒトIFNγおよびmIFNγが、40％のア
ミノ酸配列同一性しか共有しないため、驚くべきことではない。
転写単位由来の別個のmRNAとしてmIFNγ遺伝子を発現するキメラウイルス、rRSV
／mIFNγの構築を詳述する。このウイルスは、細胞培養において、高レベルのmI
FNγの合成を指示した。細胞培養におけるrRSV／mIFNγの増殖は、wt RSVに比較
し、16倍減少した。しかし、この効果の度合いは、同一のゲノム位置にCAT遺伝
子を含む、rRSV／CATに関し観察されたものに匹敵した。したがって、in vitro
での該構築物に対する増殖制限は、コードされる産物の活性によるよりも、異質
の遺伝子の存在により特徴付けられる。mIFNγの発現が、ヒトHEp-2細胞におけ
るウイルス増殖を阻害しなかったことは、ヒトIFNγおよびmIFNγが、40％のア
ミノ酸配列同一性しか共有しないため、驚くべきことではない。
【０２２９】
BALB／cマウスにおけるrRSV／mIFNγの複製は、wt RSVに比較し、上部および
下部気道で、それぞれ、63および20倍減少した。対照的に、平行してアッセイさ
れたrRSV／CATは、wt RSVに比較し、制限されておらず、in vivoでのrRSV／mIFN
γの弱毒化は、さらなる遺伝子の存在それ自体によるのではなく、mIFNγの発現
の結果であることが示された。in vivoでの増殖制限は、感染初期に作用するた
め、これは、適応免疫に対する効果よりも、生来の免疫に対する、発現されたmI
FNγの影響、例えばオリゴアデニル酸シンテターゼの誘導およびその結果の抗ウ
イルスカスケード、またはおそらくNK細胞およびマクロファージの活性化による
ものである可能性があるようである。rRSV／mIFNγの増殖が63倍またはそれ未満
にしか制限されないことは、IFNγがRSVに対する抵抗性の主要なエフェクターで
ないことを示唆する。別の呼吸器ウイルス、インフルエンザAウイルスでは、効
率的な免疫反応に、宿主によるIFNγの発現は必要とされないが、その非存在は
、Th2に偏向した抗体およびサイトカイン反応を生じた（Grahamら, J. Exp. Med
. 178, 1725-1732, 1993）。
下部気道で、それぞれ、63および20倍減少した。対照的に、平行してアッセイさ
れたrRSV／CATは、wt RSVに比較し、制限されておらず、in vivoでのrRSV／mIFN
γの弱毒化は、さらなる遺伝子の存在それ自体によるのではなく、mIFNγの発現
の結果であることが示された。in vivoでの増殖制限は、感染初期に作用するた
め、これは、適応免疫に対する効果よりも、生来の免疫に対する、発現されたmI
FNγの影響、例えばオリゴアデニル酸シンテターゼの誘導およびその結果の抗ウ
イルスカスケード、またはおそらくNK細胞およびマクロファージの活性化による
ものである可能性があるようである。rRSV／mIFNγの増殖が63倍またはそれ未満
にしか制限されないことは、IFNγがRSVに対する抵抗性の主要なエフェクターで
ないことを示唆する。別の呼吸器ウイルス、インフルエンザAウイルスでは、効
率的な免疫反応に、宿主によるIFNγの発現は必要とされないが、その非存在は
、Th2に偏向した抗体およびサイトカイン反応を生じた（Grahamら, J. Exp. Med
. 178, 1725-1732, 1993）。
【０２３０】
RSV感染中のIFNγの同時発現が、T細胞増殖をTh1反応に有利にさらに偏向させ
る可能性があるかどうかの疑問は、サイトカインmRNAおよびRSV特異的抗体アイ
ソタイプのパターンを解析することにより、検討した。wt RSVでの感染は、Th1
マーカーIFNγのmRNAの増加と関連したが、IL-2、Th2マーカーIL-6およびIL-10
、並びに主に単球およびマクロファージにより産生されるIL-12 p40のmRNAの増
加とは関連しなかった。rRSV／mIFNγでの感染は、wt RSVで観察されたものより
、増加したレベルのIFNγ mRNAおよびわずかに増加したレベル（2倍未満）のIL-
12 p40 mRNAを生じた。mIFNγ mRNAの増加は、おそらく、少なくとも部分的に組
換えウイルスにより発現されたものによるものであった。IL-12 p40 mRNAの増加
はおそらく、その単球／マクロファージ供給源のIFNγ仲介活性化の結果であろ
うが、これは、以前、in vitroで観察されなかった（D’Andreaら, J. Exp. Med
. 176, 1387-1398, 1992）。
る可能性があるかどうかの疑問は、サイトカインmRNAおよびRSV特異的抗体アイ
ソタイプのパターンを解析することにより、検討した。wt RSVでの感染は、Th1
マーカーIFNγのmRNAの増加と関連したが、IL-2、Th2マーカーIL-6およびIL-10
、並びに主に単球およびマクロファージにより産生されるIL-12 p40のmRNAの増
加とは関連しなかった。rRSV／mIFNγでの感染は、wt RSVで観察されたものより
、増加したレベルのIFNγ mRNAおよびわずかに増加したレベル（2倍未満）のIL-
12 p40 mRNAを生じた。mIFNγ mRNAの増加は、おそらく、少なくとも部分的に組
換えウイルスにより発現されたものによるものであった。IL-12 p40 mRNAの増加
はおそらく、その単球／マクロファージ供給源のIFNγ仲介活性化の結果であろ
うが、これは、以前、in vitroで観察されなかった（D’Andreaら, J. Exp. Med
. 176, 1387-1398, 1992）。
【０２３１】
rRSV／mIFNγに感染した動物は、他のTh1マーカー、IL-2、あるいはTh2マーカ
ーIL-6またはIL-10のmRNAレベルにおいて、wt RSVとの相違を示さなかった。wt
RSVに比較し、rRSV／mIFNγで免疫感作したマウスでは、総IgGおよびIgG1 RSV特
異的抗体の穏やかな増加があった。後者の抗体は、Th2反応のマーカーである（S
napperら, Fundamental Immunology, Paul, W.E.監修（Raven Press, ニューヨ
ーク）, pp.837-863, 1993）。Th1反応のマーカーであるIgG2aの穏やかな減少も
あった（Snapperら, Fundamental Immunology, Paul, W.E.監修（Raven Press,
ニューヨーク）, pp.837-863, 1993）。したがって、サイトカインもまたは抗体
反応も、rRSV／mIFNγでの最初の感染に際しても、またはwt RSVでの続く攻撃に
際しても、Th1マーカーに対する増加した偏向と一致しなかった。
ーIL-6またはIL-10のmRNAレベルにおいて、wt RSVとの相違を示さなかった。wt
RSVに比較し、rRSV／mIFNγで免疫感作したマウスでは、総IgGおよびIgG1 RSV特
異的抗体の穏やかな増加があった。後者の抗体は、Th2反応のマーカーである（S
napperら, Fundamental Immunology, Paul, W.E.監修（Raven Press, ニューヨ
ーク）, pp.837-863, 1993）。Th1反応のマーカーであるIgG2aの穏やかな減少も
あった（Snapperら, Fundamental Immunology, Paul, W.E.監修（Raven Press,
ニューヨーク）, pp.837-863, 1993）。したがって、サイトカインもまたは抗体
反応も、rRSV／mIFNγでの最初の感染に際しても、またはwt RSVでの続く攻撃に
際しても、Th1マーカーに対する増加した偏向と一致しなかった。
【０２３２】
wt RSVまたはrRSV／mIFNγで免疫感作したマウスは、RSV攻撃に非常に抵抗性
であった。in vivoでの増殖制限にもかかわらず、rRSV／mIFNγは、wt RSVによ
り誘導されるものよりも高い、RSV Fタンパク質に対する総IgGおよびRSV中和血
清抗体の力価を誘導した。以前の研究（Croweら, Vaccine 12, 783-790, 1994）
は、生弱毒化ウイルスワクチン候補であるRSV cpts248／404をワクチン接種した
チンパンジーは、wt RSV免疫感作動物に比較し、より低い力価のRSV中和抗体を
発展させることを示し（7.9 log2対11.1 log2、9.2倍の相違）、RSV複製および
その免疫原性のレベル間の相関が示唆された。rRSV／IFNγに対する抗体反応が
、その減少したレベルのウイルス複製にもかかわらず、全体で中程度に増加した
ことは、生弱毒化RSVワクチンを開発するのに非常に望ましい表現型を示す。
であった。in vivoでの増殖制限にもかかわらず、rRSV／mIFNγは、wt RSVによ
り誘導されるものよりも高い、RSV Fタンパク質に対する総IgGおよびRSV中和血
清抗体の力価を誘導した。以前の研究（Croweら, Vaccine 12, 783-790, 1994）
は、生弱毒化ウイルスワクチン候補であるRSV cpts248／404をワクチン接種した
チンパンジーは、wt RSV免疫感作動物に比較し、より低い力価のRSV中和抗体を
発展させることを示し（7.9 log2対11.1 log2、9.2倍の相違）、RSV複製および
その免疫原性のレベル間の相関が示唆された。rRSV／IFNγに対する抗体反応が
、その減少したレベルのウイルス複製にもかかわらず、全体で中程度に増加した
ことは、生弱毒化RSVワクチンを開発するのに非常に望ましい表現型を示す。
【０２３３】
マウスまたはコットンラット（cotton rat）などのげっ歯類は、RSV抗原に対
する非常に効率的な免疫反応を発展させる（Collinsら, Vaccine 8, 164-168, 1
990）が、免疫原性は、通常、非ヒト霊長類またはヒトボランティアで評価され
る際、はるかに低い。これは、RSVに対する抗体反応が減少していることが示さ
れている幼児（Murphyら, J. Clin. Microbiol. 24, 894-898, 1986）で特に重
要である可能性がある。したがって、ヒトにおいて非常に有意である可能性があ
る免疫原性の相違が、しばしば、RSV抗原により強く免疫反応性であるために、
げっ歯類では検出されない。さらに、げっ歯類におけるRSVの複製は、非常に制
限されており、肺細胞の少ない割合しか感染せず、そして典型的には疾患が発生
しない程度である。弱毒化、免疫原性、または反応原性（reactogenisity）に対
するIFNγの影響は、完全に許容性である宿主で、より大きい可能性が非常に高
い。これを評価するため、本発明は、ネズミでなくヒトIFNγを発現する組換えR
SVの構築を提供する。RSV複製、疾患および免疫原性に関し、ヒトに最も似てい
る動物であるチンパンジーにおけるこのウイルスの評価は、候補ワクチンの弱毒
化および他の特徴の調整を可能にするであろう。1つの可能性がある問題、すな
わち感染した培養霊長類細胞におけるヒトサイトカインの発現がワクチンロット
の調製を妨げる可能性があることは、異なる種由来の細胞を使用することにより
、予防することが可能である。
する非常に効率的な免疫反応を発展させる（Collinsら, Vaccine 8, 164-168, 1
990）が、免疫原性は、通常、非ヒト霊長類またはヒトボランティアで評価され
る際、はるかに低い。これは、RSVに対する抗体反応が減少していることが示さ
れている幼児（Murphyら, J. Clin. Microbiol. 24, 894-898, 1986）で特に重
要である可能性がある。したがって、ヒトにおいて非常に有意である可能性があ
る免疫原性の相違が、しばしば、RSV抗原により強く免疫反応性であるために、
げっ歯類では検出されない。さらに、げっ歯類におけるRSVの複製は、非常に制
限されており、肺細胞の少ない割合しか感染せず、そして典型的には疾患が発生
しない程度である。弱毒化、免疫原性、または反応原性（reactogenisity）に対
するIFNγの影響は、完全に許容性である宿主で、より大きい可能性が非常に高
い。これを評価するため、本発明は、ネズミでなくヒトIFNγを発現する組換えR
SVの構築を提供する。RSV複製、疾患および免疫原性に関し、ヒトに最も似てい
る動物であるチンパンジーにおけるこのウイルスの評価は、候補ワクチンの弱毒
化および他の特徴の調整を可能にするであろう。1つの可能性がある問題、すな
わち感染した培養霊長類細胞におけるヒトサイトカインの発現がワクチンロット
の調製を妨げる可能性があることは、異なる種由来の細胞を使用することにより
、予防することが可能である。
【０２３４】
上述のように、いくつかのサイトカイン遺伝子が組換えDNAウイルス、大部分
はワクシニアウイルスに挿入されてきており、弱毒化、病原性、および免疫原性
に対する効果が明らかになってきている（Ramshawら, Nature 329, 545-546, 19
87； Flexnerら, Nature 330, 259-262, 1987； Rolfら, Curr. Opin. Immunol.
9, 517-524, 1997、概説には、Rolfら, Curr. Opin. Immunol. 9, 517-524, 19
97を参照されたい）。ポックスウイルスでは、IFNγまたは1型IFNの発現は、宿
主に対し、該ウイルスを弱毒化したが、この弱毒化は、減少した体液性免疫反応
を伴った（Leongら, J. Virol. 68, 8125-8130, 1994； Bembridgeら, J. Virol
. 72, 4080-4087, 1998； Karacaら, Vaccine 16, 1496-1503, 1998）。nef遺伝
子を欠くサル免疫不全ウイルス（SIV）によるIFNγの発現は、サルに対する該SI
V突然変異体のさらなる弱毒化を生じたが、サイトカイン挿入物は、複製数週間
後に非常に不安定であり、そして弱毒化は、SIV糖タンパク質に対する体液性免
疫反応の減少を伴った（Giavedoniら, J. Virol. 71, 866-872, 1997）。本発明
は、この戦略を拡張し、マイナス鎖ウイルスに対するワクチンを提供する。本明
細書に提示される結果は、免疫原性を維持しながらであってもウイルスを弱毒化
することが可能であることを立証し、この結果は、以前には、ワクシニアウイル
スベクターによるIL-2発現のめったにない場合にのみ達成されたものである（Fl
exnerら, Vaccine 8, 17-21, 1990）。したがって、組換えRSVにおけるIFNγの
同時発現は、非分節マイナス鎖RNAウイルスの新規の種類の弱毒化を代表し、該
弱毒化は、免疫原性を損なうことなく、ウイルス増殖を減少させるものである。
はワクシニアウイルスに挿入されてきており、弱毒化、病原性、および免疫原性
に対する効果が明らかになってきている（Ramshawら, Nature 329, 545-546, 19
87； Flexnerら, Nature 330, 259-262, 1987； Rolfら, Curr. Opin. Immunol.
9, 517-524, 1997、概説には、Rolfら, Curr. Opin. Immunol. 9, 517-524, 19
97を参照されたい）。ポックスウイルスでは、IFNγまたは1型IFNの発現は、宿
主に対し、該ウイルスを弱毒化したが、この弱毒化は、減少した体液性免疫反応
を伴った（Leongら, J. Virol. 68, 8125-8130, 1994； Bembridgeら, J. Virol
. 72, 4080-4087, 1998； Karacaら, Vaccine 16, 1496-1503, 1998）。nef遺伝
子を欠くサル免疫不全ウイルス（SIV）によるIFNγの発現は、サルに対する該SI
V突然変異体のさらなる弱毒化を生じたが、サイトカイン挿入物は、複製数週間
後に非常に不安定であり、そして弱毒化は、SIV糖タンパク質に対する体液性免
疫反応の減少を伴った（Giavedoniら, J. Virol. 71, 866-872, 1997）。本発明
は、この戦略を拡張し、マイナス鎖ウイルスに対するワクチンを提供する。本明
細書に提示される結果は、免疫原性を維持しながらであってもウイルスを弱毒化
することが可能であることを立証し、この結果は、以前には、ワクシニアウイル
スベクターによるIL-2発現のめったにない場合にのみ達成されたものである（Fl
exnerら, Vaccine 8, 17-21, 1990）。したがって、組換えRSVにおけるIFNγの
同時発現は、非分節マイナス鎖RNAウイルスの新規の種類の弱毒化を代表し、該
弱毒化は、免疫原性を損なうことなく、ウイルス増殖を減少させるものである。
【０２３５】
実施例2
ネズミIL-2をコードする組換えRSVの構築および性質決定
本実施例では、G-F遺伝子間領域に挿入された転写カセットにおいて、ネズミ
インターロイキン-2（mIL-2）のコード配列を含む組換えRSVを構築した。回収さ
れたウイルス（rRSV／mIL-2）は、細胞培養において、高レベル（2.8μg／mlま
で）のmIL-2を発現した。in vitroでのrRSV／mIL-2の複製は、野生型（wt）組換
えRSV（rRSV）に比較し、13.6倍まで減少し、この効果は、異質の挿入物の存在
によるものであるが、mIL-2に特異的でなかった。BALB／cマウスの上部および下
部気道におけるrRSV／mIL-2ウイルスの複製は、6.3倍まで減少し、この効果は、
mIL-2に特異的であった。RSV特異的血清IgG1、IgG2a、IgA、および総IgGのレベ
ルを含む抗体反応、並びにwt RSV攻撃に対する防御効率のレベルは、wt rRSVの
ものと有意に異ならなかった。rRSV／mIL-2での感染1日後および4日後に単離し
た、総肺サイトカインmRNAの解析は、wt rRSVに比較し、上昇したレベルのIL-2
、IFNγ、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13およびIL-12 p40のmRNAを明らかにし
た。rRSV／mIL-2での感染10日後に単離した総肺単核細胞のフローサイトメトリ
ーは、wt rRSVに比較し、別個にIFNγまたはIL-4を発現するCD4＋ Tリンパ球の
増加したレベルを明らかにした。wt rRSV初回抗原刺激動物に比較した、サイト
カインmRNAまたはサイトカイン発現CD4＋細胞のこれらの上昇は、第28日のwt RS
V攻撃後、観察されなかった。したがって、組換えRSVによるmIL-2の発現は、in
vivoでのウイルスの穏やかな弱毒化、wt rRSVに匹敵するレベルでの血清抗体の
誘導、並びにwt rRSVに比較した、Th1およびTh2 CD4＋リンパ球およびサイトカ
インmRNA両方の一過性の増加と関連した。
インターロイキン-2（mIL-2）のコード配列を含む組換えRSVを構築した。回収さ
れたウイルス（rRSV／mIL-2）は、細胞培養において、高レベル（2.8μg／mlま
で）のmIL-2を発現した。in vitroでのrRSV／mIL-2の複製は、野生型（wt）組換
えRSV（rRSV）に比較し、13.6倍まで減少し、この効果は、異質の挿入物の存在
によるものであるが、mIL-2に特異的でなかった。BALB／cマウスの上部および下
部気道におけるrRSV／mIL-2ウイルスの複製は、6.3倍まで減少し、この効果は、
mIL-2に特異的であった。RSV特異的血清IgG1、IgG2a、IgA、および総IgGのレベ
ルを含む抗体反応、並びにwt RSV攻撃に対する防御効率のレベルは、wt rRSVの
ものと有意に異ならなかった。rRSV／mIL-2での感染1日後および4日後に単離し
た、総肺サイトカインmRNAの解析は、wt rRSVに比較し、上昇したレベルのIL-2
、IFNγ、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13およびIL-12 p40のmRNAを明らかにし
た。rRSV／mIL-2での感染10日後に単離した総肺単核細胞のフローサイトメトリ
ーは、wt rRSVに比較し、別個にIFNγまたはIL-4を発現するCD4＋ Tリンパ球の
増加したレベルを明らかにした。wt rRSV初回抗原刺激動物に比較した、サイト
カインmRNAまたはサイトカイン発現CD4＋細胞のこれらの上昇は、第28日のwt RS
V攻撃後、観察されなかった。したがって、組換えRSVによるmIL-2の発現は、in
vivoでのウイルスの穏やかな弱毒化、wt rRSVに匹敵するレベルでの血清抗体の
誘導、並びにwt rRSVに比較した、Th1およびTh2 CD4＋リンパ球およびサイトカ
インmRNA両方の一過性の増加と関連した。
【０２３６】
IL-2は、以前は「T細胞増殖因子」として知られていた、元祖サイトカインの1
つである。IL-2は、抗原またはマイトジェンでの刺激に際し、Th1およびTh2 CD4
＋細胞により産生され（Th1がより高いレベルを産生する）、それと共にCD8＋細
胞により産生される（Gaffenら, The Cytokine Handbook, A. W. Thomson（監修
）, p 73-103, Academic Press, 1998；およびThorpe, Cytokines, A. Mire-Slu
isおよびR. Thore（監修）, p 19-33, 1998）。ヒトIL-2タンパク質は、153アミ
ノ酸長の前駆体として合成され、そして20アミノ酸のシグナルペプチドの切断に
よりプロセシングされ、133アミノ酸の成熟タンパク質になる。そのネズミ類似
体（analog）は、同様の大きさを有し、そして63％アミノ酸類似性を共有する（
Kashimaら, Nature 313：402-4, 1985； Yokotaら, Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 82：68-72, 1985、各々本明細書に援用される）。未処理T細胞は、βおよびγ
鎖からなるIL-2の低親和性受容体を発現し；α鎖との会合は、該受容体を高親和
性受容体に修飾する。IL-2の結合に際し、該受容体は、該受容体と会合するJAK1
キナーゼによる多くの転写因子の活性化を誘発する。
つである。IL-2は、抗原またはマイトジェンでの刺激に際し、Th1およびTh2 CD4
＋細胞により産生され（Th1がより高いレベルを産生する）、それと共にCD8＋細
胞により産生される（Gaffenら, The Cytokine Handbook, A. W. Thomson（監修
）, p 73-103, Academic Press, 1998；およびThorpe, Cytokines, A. Mire-Slu
isおよびR. Thore（監修）, p 19-33, 1998）。ヒトIL-2タンパク質は、153アミ
ノ酸長の前駆体として合成され、そして20アミノ酸のシグナルペプチドの切断に
よりプロセシングされ、133アミノ酸の成熟タンパク質になる。そのネズミ類似
体（analog）は、同様の大きさを有し、そして63％アミノ酸類似性を共有する（
Kashimaら, Nature 313：402-4, 1985； Yokotaら, Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 82：68-72, 1985、各々本明細書に援用される）。未処理T細胞は、βおよびγ
鎖からなるIL-2の低親和性受容体を発現し；α鎖との会合は、該受容体を高親和
性受容体に修飾する。IL-2の結合に際し、該受容体は、該受容体と会合するJAK1
キナーゼによる多くの転写因子の活性化を誘発する。
【０２３７】
IL-2の制御ネットワークは非常に複雑である。IL-2は、多面的な生物学的影響
を有し、排他的ではないが、主に白血球に限定される。IL-2は、活性化T細胞の
劇的な成長および増殖を刺激し、そして高濃度では、休止T細胞の増殖を引き起
こすことが可能である。IL-2はT細胞細胞溶解活性を刺激する。IL-2はまた、活
性化B細胞の増殖も刺激し、そして免疫グロブリン分泌の誘導も促進する。IL-2
は、ナチュラルキラー（NK）細胞およびリンパ球活性化キラー（LAK）細胞の活
性を刺激する。IL-2はまた、単球の増殖および分化も促進する。ケモカイン受容
体CCR1、CCR2、およびCCR5はIL-2により誘導される。IL-2は、B型肝炎ウイルス
、ヒト免疫不全ウイルス、および単純疱疹ウイルスを含む、特定のウイルス感染
を治療するのに用いられてきている（Gaffenら, The Cytokine Handbook, A. W.
Thomson（監修）, p 73-103, Academic Press, 1998；およびThorpe, Cytokine
s, A. Mire-SluisおよびR. Thore（監修）, p 19-33, 1998）。AIDS患者に投与
されたIL-2は、CD4＋細胞の、実質的でそして維持された増加を誘導した（Kovac
sら, New Eng. J. Med. 335：1350-1356, 1996、本明細書に援用される）。
を有し、排他的ではないが、主に白血球に限定される。IL-2は、活性化T細胞の
劇的な成長および増殖を刺激し、そして高濃度では、休止T細胞の増殖を引き起
こすことが可能である。IL-2はT細胞細胞溶解活性を刺激する。IL-2はまた、活
性化B細胞の増殖も刺激し、そして免疫グロブリン分泌の誘導も促進する。IL-2
は、ナチュラルキラー（NK）細胞およびリンパ球活性化キラー（LAK）細胞の活
性を刺激する。IL-2はまた、単球の増殖および分化も促進する。ケモカイン受容
体CCR1、CCR2、およびCCR5はIL-2により誘導される。IL-2は、B型肝炎ウイルス
、ヒト免疫不全ウイルス、および単純疱疹ウイルスを含む、特定のウイルス感染
を治療するのに用いられてきている（Gaffenら, The Cytokine Handbook, A. W.
Thomson（監修）, p 73-103, Academic Press, 1998；およびThorpe, Cytokine
s, A. Mire-SluisおよびR. Thore（監修）, p 19-33, 1998）。AIDS患者に投与
されたIL-2は、CD4＋細胞の、実質的でそして維持された増加を誘導した（Kovac
sら, New Eng. J. Med. 335：1350-1356, 1996、本明細書に援用される）。
【０２３８】
本実施例は、RSV特異的遺伝子開始（GS）および遺伝子終止（GE）転写シグナ
ルに隣接するネズミインターロイキン-2（mIL-2）をコードする遺伝子を含むよ
う修飾された組換えRSVの構築および評価を立証する。図7は、rRSV／mIL-2のゲ
ノムのマップを例示する。ネズミIL-2遺伝子のcDNAコピーを含むプラスミドを直
線化し、そしてプライマー
ルに隣接するネズミインターロイキン-2（mIL-2）をコードする遺伝子を含むよ
う修飾された組換えRSVの構築および評価を立証する。図7は、rRSV／mIL-2のゲ
ノムのマップを例示する。ネズミIL-2遺伝子のcDNAコピーを含むプラスミドを直
線化し、そしてプライマー
【０２３９】
【化３】
【０２４０】
（XmaI制限エンドヌクレアーゼ部位を斜字で示し、RSV遺伝子開始配列を下線
で、IL-2翻訳開始コドンを太字で示す）および
で、IL-2翻訳開始コドンを太字で示す）および
【０２４１】
【化４】
【０２４２】
ンドヌクレアーゼ部位を斜字で示し、RSV遺伝子終止配列相補体を下線で、IL-
2翻訳終結コドン相補体を太字で示す）を用いたPCRにより増幅した。天然に存在
するIL-2 mRNAは、転写後レベルで制御を仲介する、mRNAの3’非翻訳領域内の「
不安定性配列」を含む。rRSVに挿入するためのIL-2 cDNAは、この配列を欠くよ
う、特別に設計した。増幅された断片をXmaI制限エンドヌクレアーゼで消化し、
アガロースゲル電気泳動により精製し、プラスミドpUC19のXmaI部位にクローニ
ングし、そして完全に配列決定し、正しい一次構造を確認した。該プラスミドを
XmaIで消化し、そして挿入物を精製し、そしてG-F遺伝子間領域に挿入されたXma
Iリンカーを含む15,231 nt長のRSVアンチゲノムをコードする、先に記載されたR
SVアンチゲノムプラスミドD46／1024（Bukreyevら, J. Virol. 70：6634-41, 19
96）の唯一のXmaI部位にクローニングした。該RSV／mIL-2アンチゲノムプラスミ
ドは、生物学的由来および組換えRSVの、それぞれ15,222および15,223ヌクレオ
チドのアンチゲノムより、549-550ヌクレオチド長い、15,772ヌクレオチドのア
ンチゲノムRNAをコードするであろう。
2翻訳終結コドン相補体を太字で示す）を用いたPCRにより増幅した。天然に存在
するIL-2 mRNAは、転写後レベルで制御を仲介する、mRNAの3’非翻訳領域内の「
不安定性配列」を含む。rRSVに挿入するためのIL-2 cDNAは、この配列を欠くよ
う、特別に設計した。増幅された断片をXmaI制限エンドヌクレアーゼで消化し、
アガロースゲル電気泳動により精製し、プラスミドpUC19のXmaI部位にクローニ
ングし、そして完全に配列決定し、正しい一次構造を確認した。該プラスミドを
XmaIで消化し、そして挿入物を精製し、そしてG-F遺伝子間領域に挿入されたXma
Iリンカーを含む15,231 nt長のRSVアンチゲノムをコードする、先に記載されたR
SVアンチゲノムプラスミドD46／1024（Bukreyevら, J. Virol. 70：6634-41, 19
96）の唯一のXmaI部位にクローニングした。該RSV／mIL-2アンチゲノムプラスミ
ドは、生物学的由来および組換えRSVの、それぞれ15,222および15,223ヌクレオ
チドのアンチゲノムより、549-550ヌクレオチド長い、15,772ヌクレオチドのア
ンチゲノムRNAをコードするであろう。
【０２４３】
該アンチゲノムプラスミドを用い、先に記載されるように、組換えウイルス回
収を指示した（Collinsら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92：11563-11567, 19
95、本明細書に援用される）。該ウイルスは、HEp-2細胞中で継代し、そして先
に記載されるようなプラークアッセイにより定量化した（Murphyら, Vaccine, 8
：497-502, 1990）。rRSV／mIL-2ウイルスは、野生型RSVのものよりわずかに小
さいプラークを形成したが、そうでなければ形態に関し、区別不能であった。rR
SV／mIL-2ウイルスプラークのわずかに減少した大きさは、先に記載されるrRSV
／CATおよびrRSV／mIFNγプラークのものに匹敵した（Bukreyevら, J. Virol. 7
0：6634-6641, 1996およびProc. Natl. Acad. Sci. USA 96：2367-2372, 1999、
各々本明細書に援用される）。
収を指示した（Collinsら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92：11563-11567, 19
95、本明細書に援用される）。該ウイルスは、HEp-2細胞中で継代し、そして先
に記載されるようなプラークアッセイにより定量化した（Murphyら, Vaccine, 8
：497-502, 1990）。rRSV／mIL-2ウイルスは、野生型RSVのものよりわずかに小
さいプラークを形成したが、そうでなければ形態に関し、区別不能であった。rR
SV／mIL-2ウイルスプラークのわずかに減少した大きさは、先に記載されるrRSV
／CATおよびrRSV／mIFNγプラークのものに匹敵した（Bukreyevら, J. Virol. 7
0：6634-6641, 1996およびProc. Natl. Acad. Sci. USA 96：2367-2372, 1999、
各々本明細書に援用される）。
【０２４４】
IL-2含有ウイルス（rRSV／mIL-2）は、感染した組織培養細胞の培地中で高レ
ベル（2.8マイクログラム／mlまで）のIL-2を発現することが見出された。これ
は106細胞当たり14マイクログラムのIL-2に相当し、これは、rRSV／mIFNγウイ
ルスで得られた、106細胞当たり22マイクログラムのIFNγの収量に匹敵するもの
である（Bukreyevら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96：2367-2372, 1999）。
ベル（2.8マイクログラム／mlまで）のIL-2を発現することが見出された。これ
は106細胞当たり14マイクログラムのIL-2に相当し、これは、rRSV／mIFNγウイ
ルスで得られた、106細胞当たり22マイクログラムのIFNγの収量に匹敵するもの
である（Bukreyevら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96：2367-2372, 1999）。
【０２４５】
rRSV／mIL-2ウイルスの増殖の動力学を調べるため、HEp-2細胞を、細胞当たり
2 pfuの感染効率で、この組換えまたは野生型RSVに感染させた。培地のアリコッ
トを8時間の時点で採取し、凍結し、そしてプラークアッセイにより、後に解析
した。rRSV／mIL-2ウイルスは、HEp-2細胞における増殖に関し、減弱しているこ
とが見出され、最大収量は、野生型のものより、およそ14から17倍低かった。こ
のレベルの弱毒化は、同一のアンチゲノム位置にCAT遺伝子またはmIFNγ遺伝子
いずれかを含むrRSVに関し、観察されるものと非常に類似である（Bukreyevら,
J. Virol. 70：6634-6641, 1996およびProc. Natl. Acad. Sci. USA 96：2367-2
372, 1999、各々本明細書に援用される）。したがって、細胞培養における弱毒
化のこの効果は、挿入物の存在のためであるようであるが、挿入物の性質と独立
であった。mIL-2およびmIFNγは、ネズミ起源のものであり、そして細胞がヒト
起源であるため、HEp-2細胞において、該サイトカインがin vitroで生物学的影
響を持たないのは驚くべきことではない。
2 pfuの感染効率で、この組換えまたは野生型RSVに感染させた。培地のアリコッ
トを8時間の時点で採取し、凍結し、そしてプラークアッセイにより、後に解析
した。rRSV／mIL-2ウイルスは、HEp-2細胞における増殖に関し、減弱しているこ
とが見出され、最大収量は、野生型のものより、およそ14から17倍低かった。こ
のレベルの弱毒化は、同一のアンチゲノム位置にCAT遺伝子またはmIFNγ遺伝子
いずれかを含むrRSVに関し、観察されるものと非常に類似である（Bukreyevら,
J. Virol. 70：6634-6641, 1996およびProc. Natl. Acad. Sci. USA 96：2367-2
372, 1999、各々本明細書に援用される）。したがって、細胞培養における弱毒
化のこの効果は、挿入物の存在のためであるようであるが、挿入物の性質と独立
であった。mIL-2およびmIFNγは、ネズミ起源のものであり、そして細胞がヒト
起源であるため、HEp-2細胞において、該サイトカインがin vitroで生物学的影
響を持たないのは驚くべきことではない。
【０２４６】
ノーザンブロットハイブリダイゼーションを用い、異質のmIL-2遺伝子と共に
、G、FおよびL遺伝子の転写を解析した。HEp-2細胞をrRSV／mIL-2またはwt RSV
に感染させ、そして5日後に細胞を採取し、総RNAを精製し、そしてポリ（A）+分
画を単離した。ノーザンブロット解析は、rRSV／IL-2ウイルスが、mIL-2 mRNAと
共に、隣接している遺伝子の転写リードスルーに由来するIL-2-GおよびF-IL-2二
シストロン性mRNAのおよその大きさである、重要でない種の発現を指示すること
を立証した。
、G、FおよびL遺伝子の転写を解析した。HEp-2細胞をrRSV／mIL-2またはwt RSV
に感染させ、そして5日後に細胞を採取し、総RNAを精製し、そしてポリ（A）+分
画を単離した。ノーザンブロット解析は、rRSV／IL-2ウイルスが、mIL-2 mRNAと
共に、隣接している遺伝子の転写リードスルーに由来するIL-2-GおよびF-IL-2二
シストロン性mRNAのおよその大きさである、重要でない種の発現を指示すること
を立証した。
【０２４７】
異質の遺伝子の安定性を解析した。rRSV／mIL-2ウイルスを、HEp-2細胞におけ
る8継代に供した。継代8由来の総細胞RNAを単離し、そしてそれぞれ、挿入部位
の上流および下流に位置するゲノム（GおよびF遺伝子）の断片に相当する、順方
向および逆方向プライマーを用い、RT-PCRを行った。これは、予測長867ヌクレ
オチドに対応する単一の検出可能PCR産物の産生を生じ、そして挿入物の部分的
または完全な欠失を反映する可能性がある、より短い長さの検出可能なPCR産物
はなかった。これは、8継代後に回収された各25のrRSV／CATプラーク単離体が、
酵素的に活性であるCATを発現することが可能な型でCAT遺伝子を保持したという
先の知見と一致する（Bukreyevら, J. Virol. 70：6640-6641, 1996、本明細書
に援用される）。
る8継代に供した。継代8由来の総細胞RNAを単離し、そしてそれぞれ、挿入部位
の上流および下流に位置するゲノム（GおよびF遺伝子）の断片に相当する、順方
向および逆方向プライマーを用い、RT-PCRを行った。これは、予測長867ヌクレ
オチドに対応する単一の検出可能PCR産物の産生を生じ、そして挿入物の部分的
または完全な欠失を反映する可能性がある、より短い長さの検出可能なPCR産物
はなかった。これは、8継代後に回収された各25のrRSV／CATプラーク単離体が、
酵素的に活性であるCATを発現することが可能な型でCAT遺伝子を保持したという
先の知見と一致する（Bukreyevら, J. Virol. 70：6640-6641, 1996、本明細書
に援用される）。
【０２４８】
mIL-2の発現を定量化するため、HEp-2細胞を細胞当たり2 PFUのMOIで、rRSV／
mIL-2（継代8）に感染させ、そして採取した培地のアリコットを、Quantikine M
マウスIL-2イムノアッセイ（R ＆ D Systems）を用いたELISAにより、アッセイ
した。分泌されたmIL-2の濃度は、感染8時間後、1.7 ng／mlであり、そして感染
120時間後、1000倍以上増加し、最大の2.8μg／mlとなった。
mIL-2（継代8）に感染させ、そして採取した培地のアリコットを、Quantikine M
マウスIL-2イムノアッセイ（R ＆ D Systems）を用いたELISAにより、アッセイ
した。分泌されたmIL-2の濃度は、感染8時間後、1.7 ng／mlであり、そして感染
120時間後、1000倍以上増加し、最大の2.8μg／mlとなった。
【０２４９】
rRSV／IL-2ウイルスの複製を、BALB-cマウスで評価した。マウスに、第0日、0
.1 ml接種物中の106 PFUのrRSV／mIL-2、rRSV／CAT、またはwt RSVを鼻内接種す
るか、あるいは0.1 mlのOpti-MEM培地にニセ感染させた。各群から5匹のマウス
を第3日、第4日および第5日に屠殺し、そして鼻甲介および肺組織を採取し、そ
して希釈組織抽出物のプラークアッセイにより、感染性RSVに関し、アッセイし
た（Murphyら, Vaccine 8：497-502, 1990、本明細書に援用される）。野生型RS
Vに比較し、rRSV／mIL-2ウイルスの複製は、第5日の鼻甲介の力価が野生型RSVの
ものと有意に異ならなかったことを唯一の例外とし、上部および下部気道両方で
、中程度であるが、統計的に有意な方式で弱毒化していることが見出された（図
8）。複製の最大相違は、第3日の上部気道および第5日の肺で、それぞれ5倍およ
び6.3倍であった。対照的に、rRSV／CATは、rRSV／mIL-2に匹敵する第3日の肺を
例外とし、野生型RSVと有意に異ならなかった。1つの例外は、第3日の肺におい
て、RSV／CATの力価が、wt rRSVに比較して、減少し、そしてrRSV／mIL-2のもの
と類似であったことであった。
.1 ml接種物中の106 PFUのrRSV／mIL-2、rRSV／CAT、またはwt RSVを鼻内接種す
るか、あるいは0.1 mlのOpti-MEM培地にニセ感染させた。各群から5匹のマウス
を第3日、第4日および第5日に屠殺し、そして鼻甲介および肺組織を採取し、そ
して希釈組織抽出物のプラークアッセイにより、感染性RSVに関し、アッセイし
た（Murphyら, Vaccine 8：497-502, 1990、本明細書に援用される）。野生型RS
Vに比較し、rRSV／mIL-2ウイルスの複製は、第5日の鼻甲介の力価が野生型RSVの
ものと有意に異ならなかったことを唯一の例外とし、上部および下部気道両方で
、中程度であるが、統計的に有意な方式で弱毒化していることが見出された（図
8）。複製の最大相違は、第3日の上部気道および第5日の肺で、それぞれ5倍およ
び6.3倍であった。対照的に、rRSV／CATは、rRSV／mIL-2に匹敵する第3日の肺を
例外とし、野生型RSVと有意に異ならなかった。1つの例外は、第3日の肺におい
て、RSV／CATの力価が、wt rRSVに比較して、減少し、そしてrRSV／mIL-2のもの
と類似であったことであった。
【０２５０】
rRSV／CATウイルスは、野生型RSVの15,222ヌクレオチドおよびrRSV／IL-2ウイ
ルスの15,772ヌクレオチドに比較し、15,984ヌクレオチドのゲノムを含む。した
がって、rRSV／CATおよび野生型RSVの力価の間の近い一致は、挿入物の存在自体
は、少なくともこの大きさの範囲の挿入物に関しては、マウスにおいて、RSVを
有意に弱毒化しないことを示す。同様の知見は、先の研究で報告された（Bukrey
evら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96：2367-2372, 1999、本明細書に援用され
る）。対照的に、rRSV／IL-2の力価は、in vivo試料の6つのうち5つで、有意に
減少した。したがって、同一のゲノム位に549ヌクレオチドの挿入されたmIL-2遺
伝子を持つrRSV／IL-2の弱毒化は、mIL-2に特異的であるようであった。
ルスの15,772ヌクレオチドに比較し、15,984ヌクレオチドのゲノムを含む。した
がって、rRSV／CATおよび野生型RSVの力価の間の近い一致は、挿入物の存在自体
は、少なくともこの大きさの範囲の挿入物に関しては、マウスにおいて、RSVを
有意に弱毒化しないことを示す。同様の知見は、先の研究で報告された（Bukrey
evら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96：2367-2372, 1999、本明細書に援用され
る）。対照的に、rRSV／IL-2の力価は、in vivo試料の6つのうち5つで、有意に
減少した。したがって、同一のゲノム位に549ヌクレオチドの挿入されたmIL-2遺
伝子を持つrRSV／IL-2の弱毒化は、mIL-2に特異的であるようであった。
【０２５１】
rRSV／mIL-2の免疫原性を評価するため、マウスを上述のように、rRSV／mIL-2
、rRSV／CATまたはwt rRSVに感染させ、そして血清試料を第0日（感染直前）、
第28日および第56日に採取した（表2）。各ウイルスは、高力価のRSV中和血清抗
体を誘導し、そして3つのウイルスは、これに基づいて区別不能であった。さら
に、抗原として精製RSV Fタンパク質を用いたELISAにより決定されるように、RS
V特異的血清IgA、IgG1、IgG2a、および総IgGの誘導に関し、3つのウイルス間に
、有意な相違はなかった（表2）。各群のマウスをその後、第56日に、動物当た
り106 PFUのwt RSVの鼻内接種により、攻撃した。4日後、第60日に、マウスを屠
殺し、そして上部および下部気道のウイルス力価を測定した。あらかじめ感染し
ている動物はすべて、攻撃ウイルス複製に対し、高レベルの抵抗性を示した。攻
撃ウイルスの複製は、rRSV／CATまたはrRSV／mIL-2にあらかじめ感染している動
物で検出不能であった（鼻甲介で＜2.0 log10 PFU／gおよび肺で＜1.7 log10 PF
U／gの平均力価）が、一方、wt rRSVで免疫感作されている動物では、低レベル
のRSVが検出された（鼻甲介で2.3 log10 PFU／gおよび肺で＜1.7 log10 PFU／g
の平均力価）。対照的に、あらかじめ感染していない動物は、鼻甲介および肺で
4.7 log10 PFU／gの平均力価を有した。したがって、3つのウイルスは、感染に
対する高レベルの抵抗性を誘導する能力に関し、区別不能であった。
、rRSV／CATまたはwt rRSVに感染させ、そして血清試料を第0日（感染直前）、
第28日および第56日に採取した（表2）。各ウイルスは、高力価のRSV中和血清抗
体を誘導し、そして3つのウイルスは、これに基づいて区別不能であった。さら
に、抗原として精製RSV Fタンパク質を用いたELISAにより決定されるように、RS
V特異的血清IgA、IgG1、IgG2a、および総IgGの誘導に関し、3つのウイルス間に
、有意な相違はなかった（表2）。各群のマウスをその後、第56日に、動物当た
り106 PFUのwt RSVの鼻内接種により、攻撃した。4日後、第60日に、マウスを屠
殺し、そして上部および下部気道のウイルス力価を測定した。あらかじめ感染し
ている動物はすべて、攻撃ウイルス複製に対し、高レベルの抵抗性を示した。攻
撃ウイルスの複製は、rRSV／CATまたはrRSV／mIL-2にあらかじめ感染している動
物で検出不能であった（鼻甲介で＜2.0 log10 PFU／gおよび肺で＜1.7 log10 PF
U／gの平均力価）が、一方、wt rRSVで免疫感作されている動物では、低レベル
のRSVが検出された（鼻甲介で2.3 log10 PFU／gおよび肺で＜1.7 log10 PFU／g
の平均力価）。対照的に、あらかじめ感染していない動物は、鼻甲介および肺で
4.7 log10 PFU／gの平均力価を有した。したがって、3つのウイルスは、感染に
対する高レベルの抵抗性を誘導する能力に関し、区別不能であった。
【０２５２】
マウスにおける選択されたサイトカインの肺mRNAのレベルを、106 PFUのrRSV
／mIL-2またはwt rRSVでの感染、あるいはニセ感染後、測定した。このアッセイ
は、細胞のin vitro刺激または操作を必要とせず、そしてすべての肺細胞の凝集
反応を測定するという利点を有する。感染後第1日および第4日、各群から4また
は5匹のマウスを屠殺し、そして肺を採取した。これらの日は、活性RSV複製の時
期と一致し、そしてこの期間に豊富なサイトカインmRNAの発現が立証されている
ことから選択した（Grahamら, J. Immunol. 151：2032-2040, 1993、本明細書に
援用される）。総肺RNAを単離し、そして先に記載される方法を用い、RNアーゼ
保護アッセイにより解析した（Bukreyevら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96：
2367-2372, 1999、本明細書に援用される）。個々の動物各々由来のRNAを別個に
アッセイした。配列決定ゲル上に示されるサイトカイン特異的ゲルバンドを、ホ
スホイメージャーにより定量化し、そして各マウスの各バンドの量を、同一マウ
スの同一ゲルレーン由来のL-32ハウスキーピング遺伝子mRNAの割合として表した
。その後、マウスの各群の平均値および標準偏差を決定した（図9）。
／mIL-2またはwt rRSVでの感染、あるいはニセ感染後、測定した。このアッセイ
は、細胞のin vitro刺激または操作を必要とせず、そしてすべての肺細胞の凝集
反応を測定するという利点を有する。感染後第1日および第4日、各群から4また
は5匹のマウスを屠殺し、そして肺を採取した。これらの日は、活性RSV複製の時
期と一致し、そしてこの期間に豊富なサイトカインmRNAの発現が立証されている
ことから選択した（Grahamら, J. Immunol. 151：2032-2040, 1993、本明細書に
援用される）。総肺RNAを単離し、そして先に記載される方法を用い、RNアーゼ
保護アッセイにより解析した（Bukreyevら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96：
2367-2372, 1999、本明細書に援用される）。個々の動物各々由来のRNAを別個に
アッセイした。配列決定ゲル上に示されるサイトカイン特異的ゲルバンドを、ホ
スホイメージャーにより定量化し、そして各マウスの各バンドの量を、同一マウ
スの同一ゲルレーン由来のL-32ハウスキーピング遺伝子mRNAの割合として表した
。その後、マウスの各群の平均値および標準偏差を決定した（図9）。
【０２５３】
表2：rRSV／mIL-2での感染に対するRSV血清抗体反応a
【０２５４】
【表２】
【０２５５】
a群当たり8匹のマウスを、第0日に、0.1 ml接種物中の動物当たり106 PFUの示
されるウイルスに感染させた。第56日に抗体力価を別個のアッセイで測定した。 bRSV Fタンパク質に特異的なアイソタイプ特異的血清ELISA抗体の力価を、記
載されるように測定した（Bukreyevら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96：2367
-2372, 1999）。
されるウイルスに感染させた。第56日に抗体力価を別個のアッセイで測定した。 bRSV Fタンパク質に特異的なアイソタイプ特異的血清ELISA抗体の力価を、記
載されるように測定した（Bukreyevら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96：2367
-2372, 1999）。
【０２５６】
cRSV中和血清抗体は、補体亢進60％プラーク減少アッセイにより測定した（Cr
oweら, Vaccine 11：1395-1404, 1993）。 本解析は、wt rRSVでの感染が、Th1サイトカインIFNγおよびTh2サイトカイン
IL-6のmRNAの豊富な集積を刺激し、そしてまた、IL-12ヘテロ二量体の誘導性サ
ブユニットである、IL-12 p40のmRNAの集積も刺激することを示した。IL-12は、
他の細胞の中でもとりわけ単球およびマクロファージにより産生されるが、Tリ
ンパ球に産生されず、そしてその産生は、IFNγにより亢進される。これらの3つ
の豊富なmRNAはまた、rRSV／IL-2感染マウスでも観察され、そしてwt rRSVを用
いたより、幾分高いレベルに集積した。rRSV／mIL-2での感染はまた、IL-2 mRNA
の集積も生じ、これはwt rRSV感染動物で観察されず、そしてウイルスに直接コ
ードされるものであるようだった。rRSV／mIL-2での感染はまた、いくつかのよ
り豊富でないTh2サイトカインmRNA、すなわちIL-4、IL-5、IL-10およびIL-13の
集積も刺激したが、wt rRSVはしなかった。したがって、組換えRSVからのIL-2の
同時発現は、Th1およびTh2マーカーサイトカイン両方のmRNAの集積の増加に関連
した。
oweら, Vaccine 11：1395-1404, 1993）。 本解析は、wt rRSVでの感染が、Th1サイトカインIFNγおよびTh2サイトカイン
IL-6のmRNAの豊富な集積を刺激し、そしてまた、IL-12ヘテロ二量体の誘導性サ
ブユニットである、IL-12 p40のmRNAの集積も刺激することを示した。IL-12は、
他の細胞の中でもとりわけ単球およびマクロファージにより産生されるが、Tリ
ンパ球に産生されず、そしてその産生は、IFNγにより亢進される。これらの3つ
の豊富なmRNAはまた、rRSV／IL-2感染マウスでも観察され、そしてwt rRSVを用
いたより、幾分高いレベルに集積した。rRSV／mIL-2での感染はまた、IL-2 mRNA
の集積も生じ、これはwt rRSV感染動物で観察されず、そしてウイルスに直接コ
ードされるものであるようだった。rRSV／mIL-2での感染はまた、いくつかのよ
り豊富でないTh2サイトカインmRNA、すなわちIL-4、IL-5、IL-10およびIL-13の
集積も刺激したが、wt rRSVはしなかった。したがって、組換えRSVからのIL-2の
同時発現は、Th1およびTh2マーカーサイトカイン両方のmRNAの集積の増加に関連
した。
【０２５７】
同一群各々からのマウスを、第28日に、wt RSVで攻撃し、そして第29日および
32日（攻撃1日後または4日後）に、解析のため肺を採取した。wt rRSVに感染さ
せ、そして28日後にwt RSVで攻撃したマウスは、IL-6、IFNγおよびIL-12 p40の
上昇したレベルのmRNAを示し、そしてIL-2およびIL-10のより低い度合いで上昇
したレベルのmRNAを示したが、IL-4、IL-5およびIL-13のmRNAは検出されなかっ
た。rRSV／mIL-2に感染させ、そしてwt RSVで攻撃したマウスは、1つの例外を除
き、同一のパターンを示した：IL-12 p40 mRNAに関しては、wt rRSV初回抗原刺
激群に比較し、第29日に有意な相違はなかったが、第32日にrRSV／mIL-2初回抗
原刺激群はわずかな減少（32％、P＜0.01）を有した。
32日（攻撃1日後または4日後）に、解析のため肺を採取した。wt rRSVに感染さ
せ、そして28日後にwt RSVで攻撃したマウスは、IL-6、IFNγおよびIL-12 p40の
上昇したレベルのmRNAを示し、そしてIL-2およびIL-10のより低い度合いで上昇
したレベルのmRNAを示したが、IL-4、IL-5およびIL-13のmRNAは検出されなかっ
た。rRSV／mIL-2に感染させ、そしてwt RSVで攻撃したマウスは、1つの例外を除
き、同一のパターンを示した：IL-12 p40 mRNAに関しては、wt rRSV初回抗原刺
激群に比較し、第29日に有意な相違はなかったが、第32日にrRSV／mIL-2初回抗
原刺激群はわずかな減少（32％、P＜0.01）を有した。
【０２５８】
やはり調べたのは、wt rRSVへの総肺CD4＋ Tリンパ球反応に対するrRSV／mIL-
2への反応であった。具体的には、細胞内サイトカイン免疫染色およびフローサ
イトメトリーを用い、Th1マーカーIFNγまたはTh2マーカーIL-4を発現する肺CD4
＋リンパ球を定量化した（Hussellら, J. Gen. Virol. 77：2447-2455, 1996；
Openshawら, J. Exp. Med. 182：1357-1367, 1995； Prussinら, J. Immunol. M
ethods 188：117-128, 1995；各々本明細書に援用される）。マウスを、106 PFU
のrRSV／mIL-2またはwt rRSVに感染させ、あるいはニセ感染させた。各群から4
匹の動物を、各々第4日および第10日に屠殺し、そして以下に記載されるように
、肺を採取し、そしてプロセシングした。各群の残ったマウスを、第28日に、10 6 PFUのwt RSVで鼻内攻撃し、そして各群から4匹のマウスを4日後および10日後
（第32日および第38日）に屠殺し、そしてその肺を採取し、そしてプロセシング
した。肺を細かく刻み、DNアーゼIおよびコラゲナーゼで消化し、そして総肺単
核細胞を遠心分離およびFicoll-Paque Plus培地（Amersham Pharmacia Biotech
）におけるバンド形成により、単離した。各動物由来の成分は、別個にプロセシ
ングした。エキソサイトーシスを遮断し、そしてサイトカインが細胞内集積する
ようにするモネンシンの存在下で、非特異的マイトジェン（2.5 ng／ml ホルボ
ール12-ミリステート13-アセテートおよび250 ng／ml イオノマイシン）と37℃
で4時間インキュベーションすることにより、細胞をin vitroで刺激した。Fc受
容体は、細胞を精製ラット抗マウスCD16／CD32（FcγIII／II受容体）と4℃で15
分間プレインキュベーションすることにより、遮断した。細胞を、パラホルムア
ルデヒド溶液（Cytofix緩衝液、PharMingen、4℃で20分間）で固定し、浸透化処
理し（PermWash、PharMingen、4℃で20分間）、そしてCD4＋（Tri-Colorコンジ
ュゲート化ラットIgG2aクローンCT-CD4、Caltag Laboratories）、IFNγ（FITC
コンジュゲート化ラットIgG1クローンXMG1.2、PharMingen）、およびIL-4（R-PE
コンジュゲート化ラットIgG2bクローンBVD4-1D11、PharMingen）分子に関し、染
色した。免疫染色は、あらかじめ最適化した量の各標識化抗体を用い、暗所で、
4℃で30分間であった。染色の特異性は、対照を用いて確認し、（i）反応性は、
同一抗体の非コンジュゲート化調製との4℃で30分間のプレインキュベーション
により遮断され、そして（ii）反応性は、一次抗体を、同一のアイソタイプであ
るが、異種特異性を有するものと置き換えると、失われた。公表された研究は、
in vitro刺激工程は、サイトカイン発現パターンを改変しないことを示した（Hu
ssellら, J. Gen. Virol. 77：2447-2455, 1996、本明細書に援用される）。リ
ンパ球分画は、記載されるように（Hussellら、1996、上記）ゲートで止め、そ
してFACSCaliburフローサイトメーター（Beckton Dickinson）を用いた3色フロ
ーサイトメトリーにより、解析した。試料当たりおよそ60,000のゲートで止めら
れたリンパ球を解析した。下位集団、例えば洗浄により単離されたものでなく、
総肺リンパ球を調べたことは注目に値する。
2への反応であった。具体的には、細胞内サイトカイン免疫染色およびフローサ
イトメトリーを用い、Th1マーカーIFNγまたはTh2マーカーIL-4を発現する肺CD4
＋リンパ球を定量化した（Hussellら, J. Gen. Virol. 77：2447-2455, 1996；
Openshawら, J. Exp. Med. 182：1357-1367, 1995； Prussinら, J. Immunol. M
ethods 188：117-128, 1995；各々本明細書に援用される）。マウスを、106 PFU
のrRSV／mIL-2またはwt rRSVに感染させ、あるいはニセ感染させた。各群から4
匹の動物を、各々第4日および第10日に屠殺し、そして以下に記載されるように
、肺を採取し、そしてプロセシングした。各群の残ったマウスを、第28日に、10 6 PFUのwt RSVで鼻内攻撃し、そして各群から4匹のマウスを4日後および10日後
（第32日および第38日）に屠殺し、そしてその肺を採取し、そしてプロセシング
した。肺を細かく刻み、DNアーゼIおよびコラゲナーゼで消化し、そして総肺単
核細胞を遠心分離およびFicoll-Paque Plus培地（Amersham Pharmacia Biotech
）におけるバンド形成により、単離した。各動物由来の成分は、別個にプロセシ
ングした。エキソサイトーシスを遮断し、そしてサイトカインが細胞内集積する
ようにするモネンシンの存在下で、非特異的マイトジェン（2.5 ng／ml ホルボ
ール12-ミリステート13-アセテートおよび250 ng／ml イオノマイシン）と37℃
で4時間インキュベーションすることにより、細胞をin vitroで刺激した。Fc受
容体は、細胞を精製ラット抗マウスCD16／CD32（FcγIII／II受容体）と4℃で15
分間プレインキュベーションすることにより、遮断した。細胞を、パラホルムア
ルデヒド溶液（Cytofix緩衝液、PharMingen、4℃で20分間）で固定し、浸透化処
理し（PermWash、PharMingen、4℃で20分間）、そしてCD4＋（Tri-Colorコンジ
ュゲート化ラットIgG2aクローンCT-CD4、Caltag Laboratories）、IFNγ（FITC
コンジュゲート化ラットIgG1クローンXMG1.2、PharMingen）、およびIL-4（R-PE
コンジュゲート化ラットIgG2bクローンBVD4-1D11、PharMingen）分子に関し、染
色した。免疫染色は、あらかじめ最適化した量の各標識化抗体を用い、暗所で、
4℃で30分間であった。染色の特異性は、対照を用いて確認し、（i）反応性は、
同一抗体の非コンジュゲート化調製との4℃で30分間のプレインキュベーション
により遮断され、そして（ii）反応性は、一次抗体を、同一のアイソタイプであ
るが、異種特異性を有するものと置き換えると、失われた。公表された研究は、
in vitro刺激工程は、サイトカイン発現パターンを改変しないことを示した（Hu
ssellら, J. Gen. Virol. 77：2447-2455, 1996、本明細書に援用される）。リ
ンパ球分画は、記載されるように（Hussellら、1996、上記）ゲートで止め、そ
してFACSCaliburフローサイトメーター（Beckton Dickinson）を用いた3色フロ
ーサイトメトリーにより、解析した。試料当たりおよそ60,000のゲートで止めら
れたリンパ球を解析した。下位集団、例えば洗浄により単離されたものでなく、
総肺リンパ球を調べたことは注目に値する。
【０２５９】
総肺単核細胞のおよそ半数がリンパ球としてゲートで止められ、そしてこの割
合は、非感染対照に比較し、rRSV／mIL-2またはwt rRSVでの最初の感染または攻
撃に反応し、有意に改変されなかった。CD4＋リンパ球と同定された単核細胞の
割合は、非感染対照（第4日および第10日に、それぞれ、9.0および7.2の平均パ
ーセンテージ）に比較し、どちらのウイルスでの最初の感染後も、本質的に変化
しなかった（wt rRSVでは、第4日および第10日に、それぞれ7.6および7.9の平均
パーセンテージ；rRSV／mIL-2では、第4日および第10日に、それぞれ7.5および1
0.7の平均パーセンテージ）。しかし、この割合は、非感染対照（上述のとおり
）に比較し、攻撃後、第32日および第38日で、ほぼ倍になった（wt rRSVでは、
第32日および第38日に、それぞれ18.2および15.4の平均パーセンテージ；rRSV／
mIL-2では、第32日および第38日に、それぞれ15.7および14の平均パーセンテー
ジ）。これは、攻撃ウイルスの非常に制限された複製にもかかわらず、強い二次
免疫反応があったことを示す。その後、IFNγの発現対IL-4の発現に関し、CD4＋
集団を調べた。図10は、rRSV／mIL-2、wt rRSVに感染したか、あるいはニセ処理
され、そして第10日に解析した、3匹の個々の動物に関するデータの例を示す。
完全な実験は、表3に要約される。
合は、非感染対照に比較し、rRSV／mIL-2またはwt rRSVでの最初の感染または攻
撃に反応し、有意に改変されなかった。CD4＋リンパ球と同定された単核細胞の
割合は、非感染対照（第4日および第10日に、それぞれ、9.0および7.2の平均パ
ーセンテージ）に比較し、どちらのウイルスでの最初の感染後も、本質的に変化
しなかった（wt rRSVでは、第4日および第10日に、それぞれ7.6および7.9の平均
パーセンテージ；rRSV／mIL-2では、第4日および第10日に、それぞれ7.5および1
0.7の平均パーセンテージ）。しかし、この割合は、非感染対照（上述のとおり
）に比較し、攻撃後、第32日および第38日で、ほぼ倍になった（wt rRSVでは、
第32日および第38日に、それぞれ18.2および15.4の平均パーセンテージ；rRSV／
mIL-2では、第32日および第38日に、それぞれ15.7および14の平均パーセンテー
ジ）。これは、攻撃ウイルスの非常に制限された複製にもかかわらず、強い二次
免疫反応があったことを示す。その後、IFNγの発現対IL-4の発現に関し、CD4＋
集団を調べた。図10は、rRSV／mIL-2、wt rRSVに感染したか、あるいはニセ処理
され、そして第10日に解析した、3匹の個々の動物に関するデータの例を示す。
完全な実験は、表3に要約される。
【０２６０】
表3：wt RSVまたはrRSV／mIL-2に感染したマウス由来の、IFNγ、IL-4、また
は両方を発現する肺CD4＋リンパ球のフローサイトメトリー解析a
は両方を発現する肺CD4＋リンパ球のフローサイトメトリー解析a
【０２６１】
【表３】
【０２６２】
aマウスを、第0日に、動物当たり106 PFUの示されるウイルスに鼻内感染させ
るか、またはニセ感染させた。示されるように、各群からの動物を第4日および
第10日に屠殺した。残った動物（ニセ感染群を含む）を、第28日に、動物当たり
106 PFUのwt RSVで攻撃し、そして示されるように、動物を第32日および第38日
（攻撃4日後および10日後）に屠殺した。総肺単核細胞を、CD4、IFNγおよびIL-
4に関する免疫染色を用いたフローサイトメトリーにより、解析した。値は、CD4
＋リンパ球の割合として示す。各群は、以下の例外を除き、1日当たり4匹のマウ
スを含んだ：第4日のwt RSV群は、3匹の動物を有し；第4日のニセ感染群は、2匹
の動物を有し、そして第10日および第38日のニセ感染群は、各3匹の動物を有し
た。各動物の細胞は、別個にプロセシングし、そして各群は、示されるSEと共に
、2-4匹のマウスの個々のデータの平均として表す。
るか、またはニセ感染させた。示されるように、各群からの動物を第4日および
第10日に屠殺した。残った動物（ニセ感染群を含む）を、第28日に、動物当たり
106 PFUのwt RSVで攻撃し、そして示されるように、動物を第32日および第38日
（攻撃4日後および10日後）に屠殺した。総肺単核細胞を、CD4、IFNγおよびIL-
4に関する免疫染色を用いたフローサイトメトリーにより、解析した。値は、CD4
＋リンパ球の割合として示す。各群は、以下の例外を除き、1日当たり4匹のマウ
スを含んだ：第4日のwt RSV群は、3匹の動物を有し；第4日のニセ感染群は、2匹
の動物を有し、そして第10日および第38日のニセ感染群は、各3匹の動物を有し
た。各動物の細胞は、別個にプロセシングし、そして各群は、示されるSEと共に
、2-4匹のマウスの個々のデータの平均として表す。
【０２６３】
b、cwt rRSV対照に比較し、スチューデントt検定により計算した、統計的有意
性：bp＜0.005；cp＜0.001。 dニセ群の動物は、第0日にニセ感染させたが、第28日にRSV攻撃を受けたこと
に注目されたい。したがって、第38日の時点は、wt RSV群の第10日の時点に相当
する。
性：bp＜0.005；cp＜0.001。 dニセ群の動物は、第0日にニセ感染させたが、第28日にRSV攻撃を受けたこと
に注目されたい。したがって、第38日の時点は、wt RSV群の第10日の時点に相当
する。
【０２６４】
最初の感染4日後、rRSV／mIL-2またはwt rRSVを投与された動物は、IFNγ陽性
、IL-4陽性、または二重陽性であるCD4＋リンパ球の増加したレベルを示したが
、反応の度合いは、2つのウイルスで非常に似ていた。第10日、IFNγ陽性、IL-4
陽性、または二重陽性である細胞の平均数は、wt rRSV感染マウスに比較し、rRS
V／mIL-2感染マウスで統計的に有意に増加した：それぞれ2.1倍（P＜0.05）、3.
6倍（P＜0.001）、および4.1倍（p＜0.001）。したがって、第4日の、上述のTh1
およびTh2サイトカインmRNAの増加（図9）は、第10日のCD4＋リンパ球によるサ
イトカイン合成により反映されたが、第4日のものにはされなかった。この遅延
は、後者のアッセイのより低い感受性、または発現の遅れ、またはIFNγの場合
、NK細胞などのCD4＋リンパ球以外の供給源による合成を反映する可能性がある
（Hussellら, J. Gen. Virol. 79：2593-2601, 1998、本明細書に援用される）
。
、IL-4陽性、または二重陽性であるCD4＋リンパ球の増加したレベルを示したが
、反応の度合いは、2つのウイルスで非常に似ていた。第10日、IFNγ陽性、IL-4
陽性、または二重陽性である細胞の平均数は、wt rRSV感染マウスに比較し、rRS
V／mIL-2感染マウスで統計的に有意に増加した：それぞれ2.1倍（P＜0.05）、3.
6倍（P＜0.001）、および4.1倍（p＜0.001）。したがって、第4日の、上述のTh1
およびTh2サイトカインmRNAの増加（図9）は、第10日のCD4＋リンパ球によるサ
イトカイン合成により反映されたが、第4日のものにはされなかった。この遅延
は、後者のアッセイのより低い感受性、または発現の遅れ、またはIFNγの場合
、NK細胞などのCD4＋リンパ球以外の供給源による合成を反映する可能性がある
（Hussellら, J. Gen. Virol. 79：2593-2601, 1998、本明細書に援用される）
。
【０２６５】
動物を第28日に攻撃し、そして肺CD4＋細胞を第32日に調べた場合、rRSV／mIL
-2で初回抗原刺激されている動物におけるIFNγ陽性細胞の量は、wt rRSV免疫感
作マウスに比較し、3倍低かった（P＜0.001）。IL-4陽性および二重陽性細胞の
割合は、マウスの両群で同様であった。IFNγ発現CD4＋細胞において観察された
減少は、総肺IFNγ mRNAの量に反映されず、CD4＋リンパ球以外の細胞、例えばN
K細胞が、このmRNAの全体のレベルに貢献していることを示した。IFNγ陽性細胞
の減少は一過性であり、そして第38日、元来、rRSV／mIL-2またはwt rRSVで初回
抗原刺激されているマウス間で、IFNγまたはIL-4発現細胞の数に有意な相違は
なかった。この時点で、IFNγまたはIL-4を発現する総肺CD4＋細胞の割合は、そ
れぞれ〜19％および〜0.5％であった。
-2で初回抗原刺激されている動物におけるIFNγ陽性細胞の量は、wt rRSV免疫感
作マウスに比較し、3倍低かった（P＜0.001）。IL-4陽性および二重陽性細胞の
割合は、マウスの両群で同様であった。IFNγ発現CD4＋細胞において観察された
減少は、総肺IFNγ mRNAの量に反映されず、CD4＋リンパ球以外の細胞、例えばN
K細胞が、このmRNAの全体のレベルに貢献していることを示した。IFNγ陽性細胞
の減少は一過性であり、そして第38日、元来、rRSV／mIL-2またはwt rRSVで初回
抗原刺激されているマウス間で、IFNγまたはIL-4発現細胞の数に有意な相違は
なかった。この時点で、IFNγまたはIL-4を発現する総肺CD4＋細胞の割合は、そ
れぞれ〜19％および〜0.5％であった。
【０２６６】
要約すると、BALB／cマウスモデルにおける組換えRSVによるmIL-2の同時発現
は、（i）ウイルス増殖の穏やかな弱毒化を生じ、（ii）総肺mRNAの解析により
検出されるように、Th1およびTh2サイトカインの発現を増加させ、そして（iii
）IFNγまたはIL-4を発現する総肺CD4＋ Tリンパ球の反応を増加させた。rRSV／
mIL-2に対する上昇した免疫反応は、wt rRSVに比較した穏やかな弱毒化を説明す
る。ウイルス増殖の減弱は、CD4＋ Tリンパ球反応において観察された増加また
はIFNγ産生において観察された増加の結果である可能性があるか、あるいはこ
こではモニターされなかった他の要因、例えばCD8＋もしくはNK細胞の活性化お
よび増殖、または他の抗ウイルスサイトカイン、例えばI型IFN類もしくはTNFア
ルファの分泌の刺激を伴う可能性がある（Karupiahら, J. Exp. Med. 172：1495
-1503, 1990； Karupiahら, J. Immunol. 144：290-298, 1990； Karupiahら, J
. Immunol. 147：4327-4332, 1991、各々本明細書に援用される）。Th1およびTh
2サイトカインmRNAおよびCD4＋ Tリンパ球の集積の増大は、rRSV／mIL-2による
最初の感染中にのみ観察され、そしてwt RSVでの続く攻撃中には観察されなかっ
た。実際、攻撃4日後にIFNγ陽性CD4＋ Tリンパ球およびIL-12 p40 mRNAの穏や
かな減少があり、これは、関連する可能性がある影響である。しかし、IFNγ陽
性CD4＋ Tリンパ球の減少は一過性であり、そして攻撃後第10日には、観察され
なかった。
は、（i）ウイルス増殖の穏やかな弱毒化を生じ、（ii）総肺mRNAの解析により
検出されるように、Th1およびTh2サイトカインの発現を増加させ、そして（iii
）IFNγまたはIL-4を発現する総肺CD4＋ Tリンパ球の反応を増加させた。rRSV／
mIL-2に対する上昇した免疫反応は、wt rRSVに比較した穏やかな弱毒化を説明す
る。ウイルス増殖の減弱は、CD4＋ Tリンパ球反応において観察された増加また
はIFNγ産生において観察された増加の結果である可能性があるか、あるいはこ
こではモニターされなかった他の要因、例えばCD8＋もしくはNK細胞の活性化お
よび増殖、または他の抗ウイルスサイトカイン、例えばI型IFN類もしくはTNFア
ルファの分泌の刺激を伴う可能性がある（Karupiahら, J. Exp. Med. 172：1495
-1503, 1990； Karupiahら, J. Immunol. 144：290-298, 1990； Karupiahら, J
. Immunol. 147：4327-4332, 1991、各々本明細書に援用される）。Th1およびTh
2サイトカインmRNAおよびCD4＋ Tリンパ球の集積の増大は、rRSV／mIL-2による
最初の感染中にのみ観察され、そしてwt RSVでの続く攻撃中には観察されなかっ
た。実際、攻撃4日後にIFNγ陽性CD4＋ Tリンパ球およびIL-12 p40 mRNAの穏や
かな減少があり、これは、関連する可能性がある影響である。しかし、IFNγ陽
性CD4＋ Tリンパ球の減少は一過性であり、そして攻撃後第10日には、観察され
なかった。
【０２６７】
増加したサイトカインmRNAおよびCD4＋ Tリンパ球により立証される、rRSV／m
IL-2による最初の感染中の上昇した免疫反応は、増加したRSV特異的血清抗体ま
たは増加した防御有効性に反映されなかった。しかし、マウスにおいて、RSV感
染により誘導されるRSV特異的抗体の力価および防御免疫のレベルは非常に高い
ため、これらがさらなる刺激に感受性であるかどうかは明確でない。例えば、あ
らかじめRSVに感染していたマウスが攻撃された場合、ほとんどまたはまったく
攻撃ウイルス複製は観察されず、そしてそれゆえ防御免疫におけるさらなる増加
が観察されなかった可能性がある。この効果をさらに具体的に決定するため、rR
SV／mIL-2の複製および免疫原性は、RSVに対する免疫反応がより弱い非ヒト霊長
類でさらに評価されるであろう。ヒトおよびマウス間に、かなりの種間IL-2活性
があるようであるため、利用可能なrRSV／mIL-2ウイルスは、この目的に容易に
使用することが可能である（Flexnerら, Nature 330, 259-262, 1987； Huginら
, Cell Immunol. 152：499-509, 1993、各々本明細書に援用される）。あるいは
、本明細書の解説にしたがい、ヒトIL-2を発現する組換えRSVを、容易に構築す
ることが可能である。
IL-2による最初の感染中の上昇した免疫反応は、増加したRSV特異的血清抗体ま
たは増加した防御有効性に反映されなかった。しかし、マウスにおいて、RSV感
染により誘導されるRSV特異的抗体の力価および防御免疫のレベルは非常に高い
ため、これらがさらなる刺激に感受性であるかどうかは明確でない。例えば、あ
らかじめRSVに感染していたマウスが攻撃された場合、ほとんどまたはまったく
攻撃ウイルス複製は観察されず、そしてそれゆえ防御免疫におけるさらなる増加
が観察されなかった可能性がある。この効果をさらに具体的に決定するため、rR
SV／mIL-2の複製および免疫原性は、RSVに対する免疫反応がより弱い非ヒト霊長
類でさらに評価されるであろう。ヒトおよびマウス間に、かなりの種間IL-2活性
があるようであるため、利用可能なrRSV／mIL-2ウイルスは、この目的に容易に
使用することが可能である（Flexnerら, Nature 330, 259-262, 1987； Huginら
, Cell Immunol. 152：499-509, 1993、各々本明細書に援用される）。あるいは
、本明細書の解説にしたがい、ヒトIL-2を発現する組換えRSVを、容易に構築す
ることが可能である。
【０２６８】
実施例3
ネズミ顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（mGM-CSF）をコードする組換
えRSVの構築および性質決定 本実施例では、マウスにおけるRSVへの免疫反応に対する、RSVによるネズミGM
-CSF（mGM-CSF）の同時発現の影響を決定した。rRSV／mIFNγおよびrRSV／mIL-2
ウイルスに関し、上述される一般的な戦略にしたがい、G-F遺伝子間領域に挿入
されたRSV遺伝子開始および遺伝子終止シグナルの調節下に、mGM-CSF遺伝子を含
むアンチゲノムcDNAを構築した。このアンチゲノムcDNAを用い、rRSV／mGM-CSF
ウイルスを回収した。この組換えウイルスは、細胞培養における増殖に関し、中
程度に弱毒化され、そしてrRSV／CAT、rRSV／IL-2およびrRSV／mIFNγウイルス
のものと本質的に区別不能な効率で複製された。培養細胞を、rRSV／mGM-CSFウ
イルスに感染させると、高レベルのmGM-CSFが培地に分泌された。BALB／cマウス
に接種すると、rRSV／GM-CSFウイルスは、かろうじて弱毒化され、rRSV／IL-2ウ
イルス（上述のようにおよそ5倍弱毒化された）並びにin vivoで弱毒化されなか
ったrRSV／CATおよび野生型RSVウイルスの間の中間の増殖表現型を示した。rRSV
／GM-CSFウイルスで免疫感作されたマウスは、野生型RSVでの続く攻撃に非常に
抵抗性であった。興味深いことに、血清抗体反応を、上述のように、F特異的ELI
SAアッセイで解析すると、RSV／mGM-CSFウイルスは、野生型RSVに誘導されるも
のより、それぞれ10倍および6倍以上高い、血清IgG1および総血清IgGの力価を誘
導した。したがって、RSVによるmGM-CSFの同時発現は、亢進した免疫原性と関連
した。
えRSVの構築および性質決定 本実施例では、マウスにおけるRSVへの免疫反応に対する、RSVによるネズミGM
-CSF（mGM-CSF）の同時発現の影響を決定した。rRSV／mIFNγおよびrRSV／mIL-2
ウイルスに関し、上述される一般的な戦略にしたがい、G-F遺伝子間領域に挿入
されたRSV遺伝子開始および遺伝子終止シグナルの調節下に、mGM-CSF遺伝子を含
むアンチゲノムcDNAを構築した。このアンチゲノムcDNAを用い、rRSV／mGM-CSF
ウイルスを回収した。この組換えウイルスは、細胞培養における増殖に関し、中
程度に弱毒化され、そしてrRSV／CAT、rRSV／IL-2およびrRSV／mIFNγウイルス
のものと本質的に区別不能な効率で複製された。培養細胞を、rRSV／mGM-CSFウ
イルスに感染させると、高レベルのmGM-CSFが培地に分泌された。BALB／cマウス
に接種すると、rRSV／GM-CSFウイルスは、かろうじて弱毒化され、rRSV／IL-2ウ
イルス（上述のようにおよそ5倍弱毒化された）並びにin vivoで弱毒化されなか
ったrRSV／CATおよび野生型RSVウイルスの間の中間の増殖表現型を示した。rRSV
／GM-CSFウイルスで免疫感作されたマウスは、野生型RSVでの続く攻撃に非常に
抵抗性であった。興味深いことに、血清抗体反応を、上述のように、F特異的ELI
SAアッセイで解析すると、RSV／mGM-CSFウイルスは、野生型RSVに誘導されるも
のより、それぞれ10倍および6倍以上高い、血清IgG1および総血清IgGの力価を誘
導した。したがって、RSVによるmGM-CSFの同時発現は、亢進した免疫原性と関連
した。
【０２６９】
GM-CSFは、TおよびBリンパ球、マクロファージ、上皮および内皮細胞並びに線
維芽細胞を含む、非常に多様な細胞によって、しばしば、TおよびBリンパ球の場
合、抗原による刺激に反応し、またはマクロファージ、上皮細胞および線維芽細
胞の場合、炎症性病原体による刺激に反応し、産生される（QuesniauxおよびJon
es, pp. 35-670, The Cytokines中, A. W. Thomas（監修）, Academic Press, 1
998、本明細書に援用される）。GM-CSFは、造血細胞増殖および分化、宿主防御
、および免疫反応において、重要な役割を果たす。例えば、GM-CSFは、顆粒球-
マクロファージ前駆体の分化および増殖を刺激し、好中球移動および抗微生物活
性を誘導し、そして樹状細胞産生を誘導する。GM-CSFはまた、アジュバントとし
て用いた際、一次および二次免疫反応を両方とも増加させることも示されてきて
いるが、その適用は主に、抗腫瘍免疫の領域においてのみであった（Tarrら, pp
. 219-232, Manual of GM-CSF中, M. Marty（監修）, Blackwell Science, 1996
、本明細書に援用される）。しかし、これらの以前の例は、気道で複製するRSV
ワクチンウイルスによるGM-CSFの同時発現の宿主免疫反応に対する可能な影響に
対して、ほとんど情報を提供しない。
維芽細胞を含む、非常に多様な細胞によって、しばしば、TおよびBリンパ球の場
合、抗原による刺激に反応し、またはマクロファージ、上皮細胞および線維芽細
胞の場合、炎症性病原体による刺激に反応し、産生される（QuesniauxおよびJon
es, pp. 35-670, The Cytokines中, A. W. Thomas（監修）, Academic Press, 1
998、本明細書に援用される）。GM-CSFは、造血細胞増殖および分化、宿主防御
、および免疫反応において、重要な役割を果たす。例えば、GM-CSFは、顆粒球-
マクロファージ前駆体の分化および増殖を刺激し、好中球移動および抗微生物活
性を誘導し、そして樹状細胞産生を誘導する。GM-CSFはまた、アジュバントとし
て用いた際、一次および二次免疫反応を両方とも増加させることも示されてきて
いるが、その適用は主に、抗腫瘍免疫の領域においてのみであった（Tarrら, pp
. 219-232, Manual of GM-CSF中, M. Marty（監修）, Blackwell Science, 1996
、本明細書に援用される）。しかし、これらの以前の例は、気道で複製するRSV
ワクチンウイルスによるGM-CSFの同時発現の宿主免疫反応に対する可能な影響に
対して、ほとんど情報を提供しない。
【０２７０】
mGM-CSFの成熟型は、124アミノ酸の糖タンパク質である。該分子は、17アミノ
酸の切断N末端シグナル配列を含む前駆体として合成してもよい。GM-CSF ORFのc
DNAは、pUC18中にクローニングされて利用可能であり、そしてプラスミドおよび
挿入物中の唯一の制限部位を用い、両端で修飾し、合成オリゴヌクレオチドから
作成されるDNA二重鎖で、短い制限断片を置き換えた。該GM-CSFプラスミド中、O
RFにはHindIII部位が先行し、そしてORFはATG開始コドンのすぐ下流にMluI部位
を含む。このHindIII-MluI制限断片を切り出し、そしてGM-CSFコード配列を回復
する合成HindIII-MluI断片で置き換え、そして該配列を、RSV遺伝子開始シグナ
ルの調節下に置き、これにはXmaI部位が先行した。GM-CSF ORFの下流端では、Bs
rI部位が終止コドンに先行し、そしてこのコドンにBamHI部位が続いた。このBsr
I-BamHI断片を切り出し、コード配列を回復する合成BsrI-BamHI断片で置き換え
、そして下流RSV遺伝子終止シグナルおよびXmaI部位を付加した（図11）。この
転写カセットを、完全RSVアンチゲノムcDNAのG-F遺伝子間領域に挿入し、これを
XmaI部位の挿入により、修飾した。これは、組換えRSVゲノム長を、465ヌクレオ
チド増加させ、15,223から15,688にし、そしてコードされるmRNAの数は、10から
11に増加した。
酸の切断N末端シグナル配列を含む前駆体として合成してもよい。GM-CSF ORFのc
DNAは、pUC18中にクローニングされて利用可能であり、そしてプラスミドおよび
挿入物中の唯一の制限部位を用い、両端で修飾し、合成オリゴヌクレオチドから
作成されるDNA二重鎖で、短い制限断片を置き換えた。該GM-CSFプラスミド中、O
RFにはHindIII部位が先行し、そしてORFはATG開始コドンのすぐ下流にMluI部位
を含む。このHindIII-MluI制限断片を切り出し、そしてGM-CSFコード配列を回復
する合成HindIII-MluI断片で置き換え、そして該配列を、RSV遺伝子開始シグナ
ルの調節下に置き、これにはXmaI部位が先行した。GM-CSF ORFの下流端では、Bs
rI部位が終止コドンに先行し、そしてこのコドンにBamHI部位が続いた。このBsr
I-BamHI断片を切り出し、コード配列を回復する合成BsrI-BamHI断片で置き換え
、そして下流RSV遺伝子終止シグナルおよびXmaI部位を付加した（図11）。この
転写カセットを、完全RSVアンチゲノムcDNAのG-F遺伝子間領域に挿入し、これを
XmaI部位の挿入により、修飾した。これは、組換えRSVゲノム長を、465ヌクレオ
チド増加させ、15,223から15,688にし、そしてコードされるmRNAの数は、10から
11に増加した。
【０２７１】
rRSV／mIFNγおよびrRSV／mIL-2ウイルスに関し、上述される実験戦略および
方法を用い、mGMCSFを発現する組換えRSV（rRSV／mGMCSF）ウイルスを回収し、
増殖させ、そして解析した。回収されたrRSV／mGMCSFウイルスのゲノム中のGM-C
SF転写カセットの存在、およびin vitroでの連続継代中の挿入物の安定性は、感
染細胞由来の細胞内RNAのRT-PCR解析により、確認した。別個の豊富なmRNAとし
てのmGM-CSFの発現は、ノーザンブロット解析により確認した。さらに、rRSV／m
GMCSFに感染したHEp-2細胞は、培地上清1 ml当たり、1μgに近い量で、分泌され
るmGM-CSFを発現した。
方法を用い、mGMCSFを発現する組換えRSV（rRSV／mGMCSF）ウイルスを回収し、
増殖させ、そして解析した。回収されたrRSV／mGMCSFウイルスのゲノム中のGM-C
SF転写カセットの存在、およびin vitroでの連続継代中の挿入物の安定性は、感
染細胞由来の細胞内RNAのRT-PCR解析により、確認した。別個の豊富なmRNAとし
てのmGM-CSFの発現は、ノーザンブロット解析により確認した。さらに、rRSV／m
GMCSFに感染したHEp-2細胞は、培地上清1 ml当たり、1μgに近い量で、分泌され
るmGM-CSFを発現した。
【０２７２】
回収されたキメラrRSV／mGMCSFウイルスは、wt rRSVのものよりわずかに小さ
い（10％-15％の大きさの減少）プラークを形成した。rRSV／mGMCSF、rRSV／CAT
およびwt rRSVウイルスのin vitro増殖は、2 PFUのMOIでHEp-2細胞を感染させ、
そして感染性ウイルスの産生および放出の動力学を測定することにより調べた（
図12）。これは、rRSV／mGMCSFおよびrRSV／CATウイルスの増殖が、本質的に区
別不能であり、そしてwt組換えRSVに比較し、幾分遅れており、そして減少して
いることを示した（rRSV／CATおよびwt rRSV間で、感染40時間後に、52倍の最大
相違）。これらの結果は、RSVゲノムへのさらなる遺伝子の挿入が、先行する実
施例により詳細に記載されるように、in vitroでその増殖を減弱させるという一
般的な観察と一致する。この影響は、ゲノム長の増加、または増加した数の転写
カセット、または両方によるものである可能性があるが、GM-CSFタンパク質に特
異的であるようではない。さらに、ヒトおよびネズミGM-CSFは、生物学的活性ま
たは受容体結合において、交差反応性でなく（QuesniauxおよびJones, pp. 35-6
70, The Cytokines中, A. W. Thomas（監修）, Academic Press, 1998）、そし
てそれゆえ、このネズミサイトカインは、ヒト細胞株であるHEp-2細胞で活性で
あるはずがない。
い（10％-15％の大きさの減少）プラークを形成した。rRSV／mGMCSF、rRSV／CAT
およびwt rRSVウイルスのin vitro増殖は、2 PFUのMOIでHEp-2細胞を感染させ、
そして感染性ウイルスの産生および放出の動力学を測定することにより調べた（
図12）。これは、rRSV／mGMCSFおよびrRSV／CATウイルスの増殖が、本質的に区
別不能であり、そしてwt組換えRSVに比較し、幾分遅れており、そして減少して
いることを示した（rRSV／CATおよびwt rRSV間で、感染40時間後に、52倍の最大
相違）。これらの結果は、RSVゲノムへのさらなる遺伝子の挿入が、先行する実
施例により詳細に記載されるように、in vitroでその増殖を減弱させるという一
般的な観察と一致する。この影響は、ゲノム長の増加、または増加した数の転写
カセット、または両方によるものである可能性があるが、GM-CSFタンパク質に特
異的であるようではない。さらに、ヒトおよびネズミGM-CSFは、生物学的活性ま
たは受容体結合において、交差反応性でなく（QuesniauxおよびJones, pp. 35-6
70, The Cytokines中, A. W. Thomas（監修）, Academic Press, 1998）、そし
てそれゆえ、このネズミサイトカインは、ヒト細胞株であるHEp-2細胞で活性で
あるはずがない。
【０２７３】
in vivoでのrRSV／mGMCSFの複製を評価するため、BALB／cマウスを、動物当た
り106 PFUのrRSV／mGMCSF、rRSV／CATまたはwt rRSVに鼻内感染させた。rRSV／m
IFNγおよびrRSV／mIL-2ウイルスは、同一の実験で平行して解析し、そしてこれ
らのウイルスに関する結果は上述したことに注目されたい。各群からの動物を感
染後第3日、第4日および第5日に屠殺し、そして上部（鼻甲介）および下部（肺
）気道におけるウイルス濃度を、プラークアッセイにより測定した（表4）。上
述のように、rRSV／CATの複製は、肺の第3日に、0.4 log10低く、わずかである
が、統計的に有意な相違（p＜0.01）であったことを例外とし、すべての時点で
、どちらの部位でもwt rRSVのものと有意に異ならなかった。rRSV／mGMCSFの力
価は、すべての時点で、両部位で、他の2つのウイルスより一貫して低かったが
、肺の第5日のみで、wt rRSVおよびrRSV／CAT両方に比較し、相違が統計的に有
意であった（wt rRSVおよびrRSV／CATに比較し、およそ5倍の減少、それぞれp＜
0.01および0.001）。
り106 PFUのrRSV／mGMCSF、rRSV／CATまたはwt rRSVに鼻内感染させた。rRSV／m
IFNγおよびrRSV／mIL-2ウイルスは、同一の実験で平行して解析し、そしてこれ
らのウイルスに関する結果は上述したことに注目されたい。各群からの動物を感
染後第3日、第4日および第5日に屠殺し、そして上部（鼻甲介）および下部（肺
）気道におけるウイルス濃度を、プラークアッセイにより測定した（表4）。上
述のように、rRSV／CATの複製は、肺の第3日に、0.4 log10低く、わずかである
が、統計的に有意な相違（p＜0.01）であったことを例外とし、すべての時点で
、どちらの部位でもwt rRSVのものと有意に異ならなかった。rRSV／mGMCSFの力
価は、すべての時点で、両部位で、他の2つのウイルスより一貫して低かったが
、肺の第5日のみで、wt rRSVおよびrRSV／CAT両方に比較し、相違が統計的に有
意であった（wt rRSVおよびrRSV／CATに比較し、およそ5倍の減少、それぞれp＜
0.01および0.001）。
【０２７４】
表4：BALB／cマウスの上部（鼻甲介）および下部（肺）気道における野生型rR
SV、rRSV／CAT、およびrRSV／mGMCSFの複製a
SV、rRSV／CAT、およびrRSV／mGMCSFの複製a
【０２７５】
【表４】
【０２７６】
aマウスには、第0日に、軽い麻酔下で、動物当たり106 PFUの示されるウイル
スを鼻内投与し、そして第3日、第4日および第5日に屠殺した。 bウイルス力価は鼻甲介および肺組織で測定し、そして平均力価±標準誤差（l
og10 pfu／g組織）、n＝5で示す。
スを鼻内投与し、そして第3日、第4日および第5日に屠殺した。 bウイルス力価は鼻甲介および肺組織で測定し、そして平均力価±標準誤差（l
og10 pfu／g組織）、n＝5で示す。
【０２７７】
c-f同一行の値間のスチューデントt検定による統計的有意性：c、p＜0.05；d
、p＜0.01；e、p＜0.02；f、p＜0.001。他のp値は0.05を越えた。 rRSV／mGMCSFの免疫原性を評価するため、上述のようにマウスをrRSV／mGMCSF
、rRSV／CATまたはwt rRSVに感染させ、そして第0日（感染直前）、第28日およ
び第56日に血清試料を採取した（表5）。各ウイルスは、高力価のRSV中和血清抗
体を誘導した。rRSV／mGMCSFウイルスに関連する力価は、wt rRSVまたはrRSV／C
ATウイルスに関して観察されるものより1.5から2倍高かった。さらに、RSV特異
的血清IgA、IgG1、IgG2a、および総IgGの力価を、抗原として精製RSV Fタンパク
質を用いたELISAにより測定した（表5）。wt rRSVおよびrRSV／CATウイルス間で
抗体力価に有意な相違はなかった。対照的に、rRSV／mGMCSFウイルスは、wt rRS
Vに比較し、それぞれ、9.2倍および4.9倍高い力価のIgG1および総IgG抗体を誘導
した。比較のため、先の実施例では、rRSV／IFNγウイルスは、wt rRSVのものよ
り、それぞれ7倍および4倍高いIgG1および総IgG力価を誘導した。したがって、
マウスにおけるRSV免疫原性は、mIFNγまたはmGM-CSFの同時発現により、増加し
た。
、p＜0.01；e、p＜0.02；f、p＜0.001。他のp値は0.05を越えた。 rRSV／mGMCSFの免疫原性を評価するため、上述のようにマウスをrRSV／mGMCSF
、rRSV／CATまたはwt rRSVに感染させ、そして第0日（感染直前）、第28日およ
び第56日に血清試料を採取した（表5）。各ウイルスは、高力価のRSV中和血清抗
体を誘導した。rRSV／mGMCSFウイルスに関連する力価は、wt rRSVまたはrRSV／C
ATウイルスに関して観察されるものより1.5から2倍高かった。さらに、RSV特異
的血清IgA、IgG1、IgG2a、および総IgGの力価を、抗原として精製RSV Fタンパク
質を用いたELISAにより測定した（表5）。wt rRSVおよびrRSV／CATウイルス間で
抗体力価に有意な相違はなかった。対照的に、rRSV／mGMCSFウイルスは、wt rRS
Vに比較し、それぞれ、9.2倍および4.9倍高い力価のIgG1および総IgG抗体を誘導
した。比較のため、先の実施例では、rRSV／IFNγウイルスは、wt rRSVのものよ
り、それぞれ7倍および4倍高いIgG1および総IgG力価を誘導した。したがって、
マウスにおけるRSV免疫原性は、mIFNγまたはmGM-CSFの同時発現により、増加し
た。
【０２７８】
表5：第0日（免疫感作前）、第28日および第56日のRSV血清抗体力価（逆平均l
og2±標準誤差）a
og2±標準誤差）a
【０２７９】
【表５】
【０２８０】
a群当たり8匹のマウスを用いた。第56日の抗体力価を別個のアッセイで測定し
た。異なるELISA切り捨てを用いたため、IGサブクラスのELISAデータは、先の実
施例における、rRSV／IFNγまたはRSV／mIL-2ウイルスを投与された動物のもの
と、正確には比較することが不可能であることに注目されたい。しかし定性的な
比較は行うことが可能である。
た。異なるELISA切り捨てを用いたため、IGサブクラスのELISAデータは、先の実
施例における、rRSV／IFNγまたはRSV／mIL-2ウイルスを投与された動物のもの
と、正確には比較することが不可能であることに注目されたい。しかし定性的な
比較は行うことが可能である。
【０２８１】
各群のマウスをその後、第56日に、動物当たり106 PFUのwt RSVの鼻内接種に
より、攻撃した。4日後、第60日、マウスを屠殺し、そして上部および下部気道
のウイルス力価を測定した（未提示）。すべてのあらかじめ感染させた動物は、
攻撃ウイルス複製に対し、高レベルの抵抗性を示した。攻撃ウイルスの複製は、
rRSV／CATまたはrRSV／mGMCSFにあらかじめ感染させた動物で、検出不能であっ
た（鼻甲介で＜2.0 log10 PFU／gおよび肺で＜1.7 log10 PFU／gの平均力価）が
、一方、wt rRSVで免疫感作されている動物では、低レベルのRSVが検出された（
鼻甲介で2.3 log10 PFU／gおよび肺で＜1.7 log10 PFU／gの平均力価）。対照的
に、あらかじめ感染させていない動物は、鼻甲介および肺で4.7 log10 PFU／gの
平均力価を有した。したがって、3つのウイルスは、再感染に対する高レベルの
抵抗性を誘導する能力に関し、区別不能であった。
より、攻撃した。4日後、第60日、マウスを屠殺し、そして上部および下部気道
のウイルス力価を測定した（未提示）。すべてのあらかじめ感染させた動物は、
攻撃ウイルス複製に対し、高レベルの抵抗性を示した。攻撃ウイルスの複製は、
rRSV／CATまたはrRSV／mGMCSFにあらかじめ感染させた動物で、検出不能であっ
た（鼻甲介で＜2.0 log10 PFU／gおよび肺で＜1.7 log10 PFU／gの平均力価）が
、一方、wt rRSVで免疫感作されている動物では、低レベルのRSVが検出された（
鼻甲介で2.3 log10 PFU／gおよび肺で＜1.7 log10 PFU／gの平均力価）。対照的
に、あらかじめ感染させていない動物は、鼻甲介および肺で4.7 log10 PFU／gの
平均力価を有した。したがって、3つのウイルスは、再感染に対する高レベルの
抵抗性を誘導する能力に関し、区別不能であった。
【０２８２】
wt rRSVへの総肺CD4＋ Tリンパ球反応に対するrRSV／mGMCSFへの反応を測定し
た。マウスを106 PFUのrRSV／mGMCSFまたはwt rRSVに感染させ、あるいはニセ感
染させた。各群から4匹の動物を各々第4日および第10日に屠殺し、そして肺を採
取し、そしてプロセシングして総肺単核細胞を単離した。各群の残ったマウスを
、第28日に、106 PFUのwt RSVで鼻内攻撃し、そして各群から4匹のマウスを4日
後および10日後（第32日および第38日）に屠殺し、そしてその肺を採取し、そし
て単核細胞を単離した。rRSV／mIL-2ウイルスに関し、上述される方法を用い、C
D4＋マーカーに関する免疫染色、Th2マーカーサイトカインIL-4、またはTh1マー
カーサイトカインIFNγの細胞内発現に関する免疫染色を用いたフローサイトメ
トリーにより、総肺単核細胞を解析した。
た。マウスを106 PFUのrRSV／mGMCSFまたはwt rRSVに感染させ、あるいはニセ感
染させた。各群から4匹の動物を各々第4日および第10日に屠殺し、そして肺を採
取し、そしてプロセシングして総肺単核細胞を単離した。各群の残ったマウスを
、第28日に、106 PFUのwt RSVで鼻内攻撃し、そして各群から4匹のマウスを4日
後および10日後（第32日および第38日）に屠殺し、そしてその肺を採取し、そし
て単核細胞を単離した。rRSV／mIL-2ウイルスに関し、上述される方法を用い、C
D4＋マーカーに関する免疫染色、Th2マーカーサイトカインIL-4、またはTh1マー
カーサイトカインIFNγの細胞内発現に関する免疫染色を用いたフローサイトメ
トリーにより、総肺単核細胞を解析した。
【０２８３】
最初の感染後第4日に、rRSV／mGMCSFまたはwt rRSVを投与された動物は、IFN
γ陽性、IL-4陽性、または二重陽性であるCD4＋リンパ球の増加した割合を示し
た（表6）が、反応の度合いは、2つのウイルスで非常に類似であり、そして非常
に高くはなかった（非感染対照の1.04％に比較し、3.43-3.79％ IFNγ陽性）。
対照的に、第10日には、rRSV／mGMCSFを投与された動物は、IFNγ陽性であるCD4
＋リンパ球の非常に高いレベルを示した（wt rRSV感染動物の6.7％および非感染
対照の2.4％に比較し、21.4％）。IL-4陽性であるCD4＋細胞の割合は、はるかに
小さく、そしてどちらかの日に相対的に小さい増加を示した（第10日の値は：rR
SV／mGMCSFでは1.72％、RSV感染動物では1.08％、そして非感染対照では1.15％
）。マウスを攻撃した際、wt rRSVまたはrRSV／mGMCSFを投与された動物は、強
い二次反応を示し、第38日に、およそ20.5％の細胞がIFNγ陽性であった。対照
的に、IL-4を発現するCD4＋リンパ球の割合は、RSVに感染していない動物に関し
、ほぼ同一であった。したがって、感染中のRSVゲノムからのmGM-CSFの発現は、
Th1 CD4＋リンパ球の強い刺激を生じ、IFNγ陽性細胞の割合は、最初のRSV感染
中に達成されたものの3倍以上であり、そして二次RSV感染に関連する二次反応中
に達成されたものに匹敵した。
γ陽性、IL-4陽性、または二重陽性であるCD4＋リンパ球の増加した割合を示し
た（表6）が、反応の度合いは、2つのウイルスで非常に類似であり、そして非常
に高くはなかった（非感染対照の1.04％に比較し、3.43-3.79％ IFNγ陽性）。
対照的に、第10日には、rRSV／mGMCSFを投与された動物は、IFNγ陽性であるCD4
＋リンパ球の非常に高いレベルを示した（wt rRSV感染動物の6.7％および非感染
対照の2.4％に比較し、21.4％）。IL-4陽性であるCD4＋細胞の割合は、はるかに
小さく、そしてどちらかの日に相対的に小さい増加を示した（第10日の値は：rR
SV／mGMCSFでは1.72％、RSV感染動物では1.08％、そして非感染対照では1.15％
）。マウスを攻撃した際、wt rRSVまたはrRSV／mGMCSFを投与された動物は、強
い二次反応を示し、第38日に、およそ20.5％の細胞がIFNγ陽性であった。対照
的に、IL-4を発現するCD4＋リンパ球の割合は、RSVに感染していない動物に関し
、ほぼ同一であった。したがって、感染中のRSVゲノムからのmGM-CSFの発現は、
Th1 CD4＋リンパ球の強い刺激を生じ、IFNγ陽性細胞の割合は、最初のRSV感染
中に達成されたものの3倍以上であり、そして二次RSV感染に関連する二次反応中
に達成されたものに匹敵した。
【０２８４】
表6：野生型RSVまたはrRSV／GMCSFに感染したマウスから単離された総肺CD4＋
細胞のフローサイトメトリー解析a
細胞のフローサイトメトリー解析a
【０２８５】
【表６】
【０２８６】
aマウスは、第0日に、動物当たり106 PFUの示されるウイルスに鼻内感染させ
、またはニセ感染させた。各群からの動物を第4日および第10日に採取した（大
部分の場合、1日当たり群当たり4匹の動物を屠殺した）。残った動物は、第28日
に、動物当たり106 PFUのwt RSVで攻撃し、そして第32日および第38日に、群当
たり4匹の動物を屠殺した。CD4、IFNγおよびIL-4に関する免疫染色を用いたフ
ローサイトメトリーにより、総肺単核細胞を解析した。値は、示される標準誤差
を持つCD4＋リンパ球の割合として表した。Dbl＋は、IFNγおよびIL-4両方に関
する陽性を示す。
、またはニセ感染させた。各群からの動物を第4日および第10日に採取した（大
部分の場合、1日当たり群当たり4匹の動物を屠殺した）。残った動物は、第28日
に、動物当たり106 PFUのwt RSVで攻撃し、そして第32日および第38日に、群当
たり4匹の動物を屠殺した。CD4、IFNγおよびIL-4に関する免疫染色を用いたフ
ローサイトメトリーにより、総肺単核細胞を解析した。値は、示される標準誤差
を持つCD4＋リンパ球の割合として表した。Dbl＋は、IFNγおよびIL-4両方に関
する陽性を示す。
【０２８７】
Th1偏向Tリンパ球反応は、RSVへの防御免疫反応対免疫病原性反応のマーカー
であると広く考えられている（Connorsら, J. Virol. 68：5321-5325, 1994； W
arisら, J. Virol. 70：2852-2860, 1996； Hussellら, Eur. J. Immunol. 27：
3341-3349, 1997； Fischer, J. E, J. Virol. 71：8672-8677；本明細書に援用
される）。IFNを分泌するCD4＋リンパ球の増加したレベルは、rRSV／mGMCSFウイ
ルスが、Th1サブセットに強く偏向した免疫反応を刺激することを示した。実際
、RSV感染自体は、Th1偏向反応を刺激し、これは、おそらく、ナチュラルキラー
およびCD8＋ Tリンパ球により産生されるIFNによるものである（Hussellら, Eur
. J. Immunol. 27：3341-3349, 1997； Srikiatkhachornら, J. Exp. Med. 186
：421-432, 1997； Spenderら, J. Gen. Virol. 79：1751-1758, 1998；本明細
書に援用される）。したがって、rRSV／mGMCSFウイルスに対する免疫反応は、天
然感染のものに似ているが、非常に亢進されていた。RNアーゼ保護アッセイによ
る総肺mRNAの解析は、wt rRSVまたはrRSV／mGMCSFでの感染が、Th1偏向反応に一
致するIFNおよびIL-12のp40サブユニットのmRNAの増加を生じ、そして反応がrRS
V／mGMCSFウイルスに関し、より大きいことを示した。
であると広く考えられている（Connorsら, J. Virol. 68：5321-5325, 1994； W
arisら, J. Virol. 70：2852-2860, 1996； Hussellら, Eur. J. Immunol. 27：
3341-3349, 1997； Fischer, J. E, J. Virol. 71：8672-8677；本明細書に援用
される）。IFNを分泌するCD4＋リンパ球の増加したレベルは、rRSV／mGMCSFウイ
ルスが、Th1サブセットに強く偏向した免疫反応を刺激することを示した。実際
、RSV感染自体は、Th1偏向反応を刺激し、これは、おそらく、ナチュラルキラー
およびCD8＋ Tリンパ球により産生されるIFNによるものである（Hussellら, Eur
. J. Immunol. 27：3341-3349, 1997； Srikiatkhachornら, J. Exp. Med. 186
：421-432, 1997； Spenderら, J. Gen. Virol. 79：1751-1758, 1998；本明細
書に援用される）。したがって、rRSV／mGMCSFウイルスに対する免疫反応は、天
然感染のものに似ているが、非常に亢進されていた。RNアーゼ保護アッセイによ
る総肺mRNAの解析は、wt rRSVまたはrRSV／mGMCSFでの感染が、Th1偏向反応に一
致するIFNおよびIL-12のp40サブユニットのmRNAの増加を生じ、そして反応がrRS
V／mGMCSFウイルスに関し、より大きいことを示した。
【０２８８】
要約すると、BALB／cマウスモデルにおける組換えRSVによるmGM-CSFの同時発
現は、（i）ウイルス増殖の穏やかな弱毒化を生じ、（ii）RSV特異的血清IgG1お
よび総IgGの発現を増加させ、そして（iii）最初の感染中のIFNγを発現する総
肺CD4＋ Tリンパ球の反応を増加させた。この増加は、wt rRSVでの続く攻撃中、
反復されなかったため、mGM-CSFの継続している発現に応じるようであった。ウ
イルス増殖の減弱は、CD4＋ Tリンパ球反応の観察される増加、IFNγ産生の増加
、RSV特異的抗体の増加の結果である可能性があるか、あるいは、本明細書では
モニターされなかった他の要因、例えばCD8＋もしくはNK細胞の活性化および増
殖、または他の抗ウイルスサイトカイン、例えばI型IFN類もしくはTNFアルファ
の分泌の刺激を伴う可能性がある。したがって、RSV感染中のGM-CSFの同時発現
は、免疫反応の度合いを増加させ、そしてCD4＋リンパ球のTh1サブセットに向か
う強い偏向を維持した。これらは、RSVワクチンに非常に有利であり、そして予
測不可能であった特性である。
現は、（i）ウイルス増殖の穏やかな弱毒化を生じ、（ii）RSV特異的血清IgG1お
よび総IgGの発現を増加させ、そして（iii）最初の感染中のIFNγを発現する総
肺CD4＋ Tリンパ球の反応を増加させた。この増加は、wt rRSVでの続く攻撃中、
反復されなかったため、mGM-CSFの継続している発現に応じるようであった。ウ
イルス増殖の減弱は、CD4＋ Tリンパ球反応の観察される増加、IFNγ産生の増加
、RSV特異的抗体の増加の結果である可能性があるか、あるいは、本明細書では
モニターされなかった他の要因、例えばCD8＋もしくはNK細胞の活性化および増
殖、または他の抗ウイルスサイトカイン、例えばI型IFN類もしくはTNFアルファ
の分泌の刺激を伴う可能性がある。したがって、RSV感染中のGM-CSFの同時発現
は、免疫反応の度合いを増加させ、そしてCD4＋リンパ球のTh1サブセットに向か
う強い偏向を維持した。これらは、RSVワクチンに非常に有利であり、そして予
測不可能であった特性である。
【０２８９】
実施例4
ネズミIL-4をコードする組換えRSVの構築
ヒトIL-4は、長さ153アミノ酸であり、そして129アミノ酸分泌型にプロセシン
グされる。IL-4は活性化Tリンパ球、マスト細胞および好塩基球により産生され
、そして非常に多様な細胞に作用する（Chopartら, The Cytokine Handbook, A.
W. Thomson（監修）, p 133-174, Academic Press, 1998、本明細書に援用され
る）。IL-4の重要な効果は、Tヘルパー細胞前駆体のTh2サブクラスへの分化を誘
導することであり、一方、IFNγおよびIL-12は、Th1サブクラスへの分化を促進
する効果を有する。Th1およびTh2サブクラスは、マウスで、そしてより低い度合
いで、ヒトで、性質決定されてきており、そして一般的に、細胞仲介細胞傷害性
および炎症性反応（Th1）対抗体、特にIgE産生、および好酸球増殖および機能に
偏向する反応（Th2）に関連する（MosmannおよびSad, Immunol. Today 17：138-
146, 1996、本明細書に援用される）。
グされる。IL-4は活性化Tリンパ球、マスト細胞および好塩基球により産生され
、そして非常に多様な細胞に作用する（Chopartら, The Cytokine Handbook, A.
W. Thomson（監修）, p 133-174, Academic Press, 1998、本明細書に援用され
る）。IL-4の重要な効果は、Tヘルパー細胞前駆体のTh2サブクラスへの分化を誘
導することであり、一方、IFNγおよびIL-12は、Th1サブクラスへの分化を促進
する効果を有する。Th1およびTh2サブクラスは、マウスで、そしてより低い度合
いで、ヒトで、性質決定されてきており、そして一般的に、細胞仲介細胞傷害性
および炎症性反応（Th1）対抗体、特にIgE産生、および好酸球増殖および機能に
偏向する反応（Th2）に関連する（MosmannおよびSad, Immunol. Today 17：138-
146, 1996、本明細書に援用される）。
【０２９０】
rRSV／mIFNγ、rRSV／mIL-2、およびrRSV／mGM-CSFウイルスに関し上述される
一般的な戦略にしたがい、G-F遺伝子間領域に挿入されたRSV遺伝子開始および遺
伝子終止シグナルの調節下に、mIL-4遺伝子を含む、アンチゲノムcDNAを構築し
た。このアンチゲノムcDNAを用い、rRSV／mIL-4ウイルスを回収した。この組換
えウイルスは、細胞培養中の増殖に関し、中程度に減弱され、CAT、mIFNγ、mIL
-2、mGM-CSF挿入物を含む他のrRSVウイルスのものと本質的に区別不能な効率で
複製した。培養細胞をrRSV／mIL-4ウイルスに感染させると、高レベルのIL-4が
培地に分泌された。BALB／cマウスに接種すると、rRSV／mIL4ウイルスは、in vi
voで弱毒化されないrRSV／CATおよび野生型RSVウイルスのものと本質的に区別不
能な効率で複製した。したがって、mIL-4の同時発現は、RSVの複製を減弱しなか
った。rRSV／mIL-4ウイルスで免疫感作されたマウスは、野生型RSVでの続く攻撃
に非常に抵抗性であった。
一般的な戦略にしたがい、G-F遺伝子間領域に挿入されたRSV遺伝子開始および遺
伝子終止シグナルの調節下に、mIL-4遺伝子を含む、アンチゲノムcDNAを構築し
た。このアンチゲノムcDNAを用い、rRSV／mIL-4ウイルスを回収した。この組換
えウイルスは、細胞培養中の増殖に関し、中程度に減弱され、CAT、mIFNγ、mIL
-2、mGM-CSF挿入物を含む他のrRSVウイルスのものと本質的に区別不能な効率で
複製した。培養細胞をrRSV／mIL-4ウイルスに感染させると、高レベルのIL-4が
培地に分泌された。BALB／cマウスに接種すると、rRSV／mIL4ウイルスは、in vi
voで弱毒化されないrRSV／CATおよび野生型RSVウイルスのものと本質的に区別不
能な効率で複製した。したがって、mIL-4の同時発現は、RSVの複製を減弱しなか
った。rRSV／mIL-4ウイルスで免疫感作されたマウスは、野生型RSVでの続く攻撃
に非常に抵抗性であった。
【０２９１】
これらの前述の実施例は、BALB／cマウスにおける、rRSVによる個々のネズミ
サイトカインの発現、およびその評価を例示する。結果は、1つの典型的なサイ
トカイン、すなわちmIFNγの発現が、RSVを非常に弱毒化することを立証する。m
IL-2の発現は、中程度に弱毒化し、mGM-CSFはわずかに弱毒化し、そしてmIL-4は
弱毒化しなかった。rRSV／mIFNγウイルスの高レベルの弱毒化にもかかわらず、
免疫原性レベルは減少しなかった。これは、おそらく、発現されたサイトカイン
、mIFNγの生物学的活性を反映する。亢進された免疫原性の証拠はまた、rRSV／
mGM-CSFウイルスでも観察された。したがって、rRSVによる免疫調節因子の同時
発現には、2つの利点が観察された：すなわち、弱毒化および増加した免疫原性
である。これらはどちらも、RSVワクチンに非常に望ましい表現型的特性である
。
サイトカインの発現、およびその評価を例示する。結果は、1つの典型的なサイ
トカイン、すなわちmIFNγの発現が、RSVを非常に弱毒化することを立証する。m
IL-2の発現は、中程度に弱毒化し、mGM-CSFはわずかに弱毒化し、そしてmIL-4は
弱毒化しなかった。rRSV／mIFNγウイルスの高レベルの弱毒化にもかかわらず、
免疫原性レベルは減少しなかった。これは、おそらく、発現されたサイトカイン
、mIFNγの生物学的活性を反映する。亢進された免疫原性の証拠はまた、rRSV／
mGM-CSFウイルスでも観察された。したがって、rRSVによる免疫調節因子の同時
発現には、2つの利点が観察された：すなわち、弱毒化および増加した免疫原性
である。これらはどちらも、RSVワクチンに非常に望ましい表現型的特性である
。
【０２９２】
ネズミモデルにおいて立証されたこれらの効果に基づき、霊長類モデルにおけ
るワクチン使用のため、対応するヒトサイトカイン遺伝子を含むさらなる組換え
RSVを容易に提供し、そして評価することが可能である。マウスは、RSV感染に半
許容性であるのみであるため、マウスモデルで観察される効果は、実際には、よ
り高いレベルのRSV複製および遺伝子発現が、より高いレベルのRSV抗原およびサ
イトカインを生じるであろう霊長類で亢進するであろうと期待される。本発明の
これらの側面に加え、多様な他の免疫調節分子が、本明細書の解説にしたがい、
組換えRSVに導入されるであろう。多くの魅力的な候補の中にIL-18があり、該分
子は、IFNγ産生の刺激、並びにNK細胞および細胞傷害性T細胞の刺激に重要な役
割を果たすTh1型サイトカインである（Dinarello, J. Allergy Clin. Immunol.
103：11-24, 1999、本明細書に援用される）。
るワクチン使用のため、対応するヒトサイトカイン遺伝子を含むさらなる組換え
RSVを容易に提供し、そして評価することが可能である。マウスは、RSV感染に半
許容性であるのみであるため、マウスモデルで観察される効果は、実際には、よ
り高いレベルのRSV複製および遺伝子発現が、より高いレベルのRSV抗原およびサ
イトカインを生じるであろう霊長類で亢進するであろうと期待される。本発明の
これらの側面に加え、多様な他の免疫調節分子が、本明細書の解説にしたがい、
組換えRSVに導入されるであろう。多くの魅力的な候補の中にIL-18があり、該分
子は、IFNγ産生の刺激、並びにNK細胞および細胞傷害性T細胞の刺激に重要な役
割を果たすTh1型サイトカインである（Dinarello, J. Allergy Clin. Immunol.
103：11-24, 1999、本明細書に援用される）。
【０２９３】
微生物寄託情報
以下の材料が、ブダペスト条約の規約下で、アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション（American Type Culture Collection）, 10801 University Bou
levard, Manassas, Virginia 20110-2209に寄託されており、そして以下のよう
に称される：
・コレクション（American Type Culture Collection）, 10801 University Bou
levard, Manassas, Virginia 20110-2209に寄託されており、そして以下のよう
に称される：
【０２９４】
【表７】
【０２９５】
前述の発明は、理解を明確にする目的で、例として詳細に記載されてきている
が、当業者には、特定の変化および修飾は、付随する請求項の範囲内で行うこと
が可能であり、これは例示として提示され、限定としてではない。
が、当業者には、特定の変化および修飾は、付随する請求項の範囲内で行うこと
が可能であり、これは例示として提示され、限定としてではない。
【配列表】
【図１】 図1は、マウスIFNγを発現するように修飾した組換えRSVインタ
ーフェロンガンマ（rRSV／mIFNγ）キメラゲノムの構築を示す。mIFNγのcDNA（
陰をつけた長方形。両側に小文字で示す開始および停止コドンを含む）を修飾し
てRSV遺伝子の開始および停止シグナルとXmaIフラグメントを隣接させた。この
転写カセットを、あらかじめ8-ヌクレオチドXmaIリンカー（太字のイタリック）
をG-F遺伝子間領域に存在する独自のStuI部位（StuI部位を2分した断片、AGGお
よびCCTに下線を付した）に挿入して修飾したアンチゲノムcDNAに挿入した。 CCCGGGATGGGGAAATAATG（SEQ ID NO: 5）； TGAAGTTATTAAAAATTCCCGGG（SEQ ID NO: 6）； AGGCCCCGGGGCCT（SEQ ID NO: 7）
ーフェロンガンマ（rRSV／mIFNγ）キメラゲノムの構築を示す。mIFNγのcDNA（
陰をつけた長方形。両側に小文字で示す開始および停止コドンを含む）を修飾し
てRSV遺伝子の開始および停止シグナルとXmaIフラグメントを隣接させた。この
転写カセットを、あらかじめ8-ヌクレオチドXmaIリンカー（太字のイタリック）
をG-F遺伝子間領域に存在する独自のStuI部位（StuI部位を2分した断片、AGGお
よびCCTに下線を付した）に挿入して修飾したアンチゲノムcDNAに挿入した。 CCCGGGATGGGGAAATAATG（SEQ ID NO: 5）； TGAAGTTATTAAAAATTCCCGGG（SEQ ID NO: 6）； AGGCCCCGGGGCCT（SEQ ID NO: 7）
【図２】 図2は、HEp-2細胞におけるrRSV／mIFNγ、rRSV／CAT（クロラム
フェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を取り込む）、およびwtRSVの
増殖速度の詳細である。細胞単層を2PFU／細胞で感染させ（ウィルス毎に2ウェ
ルで重複測定）、上清の200μlアリコートを表示する時間に採取し、100mMの硫
酸マグネシウムおよび50mMのHEPESバッファー（pH7.5）を含有するように調整し
、瞬間凍結し、力価測定まで-70℃で保存した。採取した各アリコートを等量の
フレッシュな培地で置換した。それぞれの1段増殖曲線は2検体の感染細胞単層か
ら得たウィルス力価の平均を表す。wtRSVに感染させた細胞単層は感染後72時間
で90％以上破壊されたが（*）、これに対してrRSV／mIFNγまたはγRSV／CATに
感染させたものはほとんど無傷のままであり、これはin vitroにおけるキメラウ
ィルスの弱毒化を反映している。
フェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を取り込む）、およびwtRSVの
増殖速度の詳細である。細胞単層を2PFU／細胞で感染させ（ウィルス毎に2ウェ
ルで重複測定）、上清の200μlアリコートを表示する時間に採取し、100mMの硫
酸マグネシウムおよび50mMのHEPESバッファー（pH7.5）を含有するように調整し
、瞬間凍結し、力価測定まで-70℃で保存した。採取した各アリコートを等量の
フレッシュな培地で置換した。それぞれの1段増殖曲線は2検体の感染細胞単層か
ら得たウィルス力価の平均を表す。wtRSVに感染させた細胞単層は感染後72時間
で90％以上破壊されたが（*）、これに対してrRSV／mIFNγまたはγRSV／CATに
感染させたものはほとんど無傷のままであり、これはin vitroにおけるキメラウ
ィルスの弱毒化を反映している。
【図３】 図3は、rRSV／mIFNγまたはrRSV／CATに感染させたHEp-2細胞の
培養液中のmIFNγの蓄積速度を示す。細胞単層を2PFU／細胞で感染させ（ウィル
ス毎に2ウェルで重複測定）、サンプルを表示する時点で採取し、mIFNγ含有量
を各サンプルにおいてELISAにより、Quantikine MマウスIFNγイムノアッセイ（
R&D systems, MN）を使用して測定した。
培養液中のmIFNγの蓄積速度を示す。細胞単層を2PFU／細胞で感染させ（ウィル
ス毎に2ウェルで重複測定）、サンプルを表示する時点で採取し、mIFNγ含有量
を各サンプルにおいてELISAにより、Quantikine MマウスIFNγイムノアッセイ（
R&D systems, MN）を使用して測定した。
【図４】 図4は、106PFUのrRSV／mIFNγ、rRSV／CAT、またはwtRSVを鼻腔
内に接種したBALB／cマウスの上部気道および下部気道におけるウィルス複製速
度を示す。各群からの5検体のマウスを表示する日に殺害し、鼻甲介および肺組
織を除去し、ホモジナイズし、感染性ウィルスの濃度を個々の組織標本のプラー
クアッセイによって測定した。標準偏差を用いた組織1g当たりの平均log10価を
示す。上部気道および下部気道におけるウィルスの検出限界を示す。
内に接種したBALB／cマウスの上部気道および下部気道におけるウィルス複製速
度を示す。各群からの5検体のマウスを表示する日に殺害し、鼻甲介および肺組
織を除去し、ホモジナイズし、感染性ウィルスの濃度を個々の組織標本のプラー
クアッセイによって測定した。標準偏差を用いた組織1g当たりの平均log10価を
示す。上部気道および下部気道におけるウィルスの検出限界を示す。
【図５】 図5は、リボヌクレアーゼ保護アッセイによる肺のmIFNγ、IL-12
p40、およびL-32（ハウスキーピング遺伝子）のmRNAの検出を示す。マウス（1
群当たり5動物）に培養液のみ（模擬）または動物当たり106PFUのrRSV／mIFNγ
もしくはwtRSVを鼻腔内に接種し、接種後4日目に肺を回収し、総RNAを精製した
。RNAをmCK-2Bテンプレートセット（PharMingen RiboQuant マルチプローブRNア
ーゼ保護アッセイシステム）を使用して合成した放射活性RNAプローブとハイブ
リダイズさせ、リボヌクレアーゼAで処理し、精製し、5％変性アクリルアミドゲ
ルで電気泳動した。表示するmRNAに相当する保護された種を含有するゲルの領域
をオートラジオグラフで明らかにした。異なる暴露時間を3つのmRNAそれぞれに
使用した。正常なマウスRNAおよび酵母を更なる陰性対照として使用した。
p40、およびL-32（ハウスキーピング遺伝子）のmRNAの検出を示す。マウス（1
群当たり5動物）に培養液のみ（模擬）または動物当たり106PFUのrRSV／mIFNγ
もしくはwtRSVを鼻腔内に接種し、接種後4日目に肺を回収し、総RNAを精製した
。RNAをmCK-2Bテンプレートセット（PharMingen RiboQuant マルチプローブRNア
ーゼ保護アッセイシステム）を使用して合成した放射活性RNAプローブとハイブ
リダイズさせ、リボヌクレアーゼAで処理し、精製し、5％変性アクリルアミドゲ
ルで電気泳動した。表示するmRNAに相当する保護された種を含有するゲルの領域
をオートラジオグラフで明らかにした。異なる暴露時間を3つのmRNAそれぞれに
使用した。正常なマウスRNAおよび酵母を更なる陰性対照として使用した。
【図６】 図6は、rRSV／mIFNγまたはwtRSVで1次感染させた後、wtRSVで攻
撃感染させたマウスの肺におけるサイトカインmRNAのレベルを示す。マウスに、
動物当たり106PFUのrRSV／mIFNγ、wtRSV、または培養液のみを鼻腔内に接種し
た。接種後1日目または4日目に各群から5動物を殺害し、肺RNAを単離した。更な
る免疫化した動物は、28日目に106PFUのwtRSVで攻撃感染し、29または32日目に
各群からの5動物から総肺RNAを別々に単離した。選択したサイトカインについて
のmRNAの蓄積を図5の説明文に記載するリボヌクレアーゼ保護アッセイによって
測定した（PharMingen, CA, テンプレートセットmCK-1およびmCK-2B）。各mRNA
の放射活性をホスホルイメージャー分析によって定量し、バックグラウンドを控
除し、それぞれの値をL-32ハウスキーピング遺伝子のmRNAに対する放射活性の百
分率として算出し、標準偏差で5動物の平均値として表した。表示するサイトカ
インについて検出可能なmRNAを欠失したサンプルを星印でマークした。
撃感染させたマウスの肺におけるサイトカインmRNAのレベルを示す。マウスに、
動物当たり106PFUのrRSV／mIFNγ、wtRSV、または培養液のみを鼻腔内に接種し
た。接種後1日目または4日目に各群から5動物を殺害し、肺RNAを単離した。更な
る免疫化した動物は、28日目に106PFUのwtRSVで攻撃感染し、29または32日目に
各群からの5動物から総肺RNAを別々に単離した。選択したサイトカインについて
のmRNAの蓄積を図5の説明文に記載するリボヌクレアーゼ保護アッセイによって
測定した（PharMingen, CA, テンプレートセットmCK-1およびmCK-2B）。各mRNA
の放射活性をホスホルイメージャー分析によって定量し、バックグラウンドを控
除し、それぞれの値をL-32ハウスキーピング遺伝子のmRNAに対する放射活性の百
分率として算出し、標準偏差で5動物の平均値として表した。表示するサイトカ
インについて検出可能なmRNAを欠失したサンプルを星印でマークした。
【図７】 図7は、rRSV／mIL-2のゲノムマップを示す。mIL-2 ORFのcDNA（
この翻訳停止および開始コドンを太字で示した）をPCRで修飾し、RSV特異的遺伝
子開始および遺伝子停止転写シグナル（四角で囲んだ部分）およびXmaI部位（下
線部分）が隣接するようにした。得られたmIL-2転写カセットを、あらかじめ配
しておいたXmaI部位を使用してGおよびFの遺伝子間領域に挿入した（Bukreyevら
, J. Virol. 70:6634-6641, 1996；参照により本発明に組み込まれる）。 CCCGGGATGGGGCAAATATG（SEQ ID NO: 9）； TAAAGTTATTAAAAATTCCCGGG（SEQ ID NO: 10）。
この翻訳停止および開始コドンを太字で示した）をPCRで修飾し、RSV特異的遺伝
子開始および遺伝子停止転写シグナル（四角で囲んだ部分）およびXmaI部位（下
線部分）が隣接するようにした。得られたmIL-2転写カセットを、あらかじめ配
しておいたXmaI部位を使用してGおよびFの遺伝子間領域に挿入した（Bukreyevら
, J. Virol. 70:6634-6641, 1996；参照により本発明に組み込まれる）。 CCCGGGATGGGGCAAATATG（SEQ ID NO: 9）； TAAAGTTATTAAAAATTCCCGGG（SEQ ID NO: 10）。
【図８】 図8は、BALB／cマウスの上部気道（鼻甲介）および下部気道（肺
）におけるrRSV／mIL-2、rRSV／CAT、およびwt rRSVの複製の詳細を示す。動物
をそれぞれ106PFUの表示するウィルスに鼻腔内で感染させた。群当たり5動物を
表示する日に殺害し、鼻甲介および肺を回収し、ウィルス力価をプラークアッセ
イによって測定した。データはSDを用いたウィルスの平均濃度（log10PFU／g組
織）を表す。t試験でwt rRSVに比較してrRSV／mIL-2の力価は統計学的に優位に
低下した：鼻甲介、3日目、P＜0.01；4日目、P＜0.02；5日目、P＜0.1；肺、3日
目、P＜0.05；4日目、P＜0.05；5日目、P＜0.001。
）におけるrRSV／mIL-2、rRSV／CAT、およびwt rRSVの複製の詳細を示す。動物
をそれぞれ106PFUの表示するウィルスに鼻腔内で感染させた。群当たり5動物を
表示する日に殺害し、鼻甲介および肺を回収し、ウィルス力価をプラークアッセ
イによって測定した。データはSDを用いたウィルスの平均濃度（log10PFU／g組
織）を表す。t試験でwt rRSVに比較してrRSV／mIL-2の力価は統計学的に優位に
低下した：鼻甲介、3日目、P＜0.01；4日目、P＜0.02；5日目、P＜0.1；肺、3日
目、P＜0.05；4日目、P＜0.05；5日目、P＜0.001。
【図９】 図9は、動物当たり106PFUのrRSV／mIL-2またはwt rRSVに感染さ
せたマウス、または培養液のみを投与したマウス（模擬）におけるIL-2、IFNγ
、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、およびIL-12 p40の肺mRNAの蓄積を示す。
群当たり4または5検体のマウスを1日目および4日目に殺害し、総肺RNAを単離し
、既に報告されているRNアーゼ保護アッセイ（Bukreyevら, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 96:2367-2372, 1999）によって、RiboQuant マルチプローブRNアーゼ
保護アッセイシステム（PharMingen）および2つの異なるプローブテンプレート
セット（すなわちmCK-1およびmCK-2B）を使用して分析した。それぞれのマウス
を別々に分析し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で検出された保護された種を
それぞれホスホルイメージで定量し、同じサンプル中のL-32ハウスキーピング遺
伝子のmRNAの量の百分率として計算した。SDを用いた日にち毎の各群の平均値を
示す。それぞれのy軸は異なるスケールであることに留意されたい。
せたマウス、または培養液のみを投与したマウス（模擬）におけるIL-2、IFNγ
、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、およびIL-12 p40の肺mRNAの蓄積を示す。
群当たり4または5検体のマウスを1日目および4日目に殺害し、総肺RNAを単離し
、既に報告されているRNアーゼ保護アッセイ（Bukreyevら, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 96:2367-2372, 1999）によって、RiboQuant マルチプローブRNアーゼ
保護アッセイシステム（PharMingen）および2つの異なるプローブテンプレート
セット（すなわちmCK-1およびmCK-2B）を使用して分析した。それぞれのマウス
を別々に分析し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で検出された保護された種を
それぞれホスホルイメージで定量し、同じサンプル中のL-32ハウスキーピング遺
伝子のmRNAの量の百分率として計算した。SDを用いた日にち毎の各群の平均値を
示す。それぞれのy軸は異なるスケールであることに留意されたい。
【図１０】 図10は、IL-4（IL4 PE）またはIFNγ（IFNガンマFITC）を発現
するCD4＋リンパ球のフローサイトメトリー分析を示す点プロットである。マウ
スを106PFUのwtRSV（左のパネル）もしくはrRSV／mIL-2（中央のパネル）に感染
させるか、または模擬感染（右のパネル）させた。10日後に動物を殺害し、肺CD
4＋細胞を回収し、フローサイトメトリーで分析した。4分割の3つにCD4＋細胞の
百分率をそれぞれのプロットで示す。それぞれのプロットは別々のマウス由来の
細胞を表す。
するCD4＋リンパ球のフローサイトメトリー分析を示す点プロットである。マウ
スを106PFUのwtRSV（左のパネル）もしくはrRSV／mIL-2（中央のパネル）に感染
させるか、または模擬感染（右のパネル）させた。10日後に動物を殺害し、肺CD
4＋細胞を回収し、フローサイトメトリーで分析した。4分割の3つにCD4＋細胞の
百分率をそれぞれのプロットで示す。それぞれのプロットは別々のマウス由来の
細胞を表す。
【図１１】 図11にrRSV／mGMCSFのゲノムマップを示す。mGM-CSF ORFのcDN
A（この翻訳停止および開始コドンを太字で示す）を本文に記載するように制限
フラグメント置換によって修飾し、RSV特異的遺伝子開始および遺伝子停止転写
シグナル（四角で囲んだ部分）およびXmaI部位（下線部分）が隣接するようにし
た。得られたmIL-2転写カセットを、あらかじめ配しておいたXmaI部位を使用し
てGおよびFの遺伝子間領域に挿入した（Bukreyevら, J. Virol. 70:6634-6641,
1996；参照により本明細書に組み込まれる）。 AGTTACTTAAAAACATATTATCACAAAAGGCCCCGGGGCCTTGACCAAACTTAAACAGAATCAAAATAAA
CTCTGGGGCAAAT（SEQ ID NO: 8）； CCCGGGATGGGGCAAATATG（SEQ ID NO: 9）； TAAAGTTATTAAAAATTCCCGGG（SEQ ID NO: 10）
A（この翻訳停止および開始コドンを太字で示す）を本文に記載するように制限
フラグメント置換によって修飾し、RSV特異的遺伝子開始および遺伝子停止転写
シグナル（四角で囲んだ部分）およびXmaI部位（下線部分）が隣接するようにし
た。得られたmIL-2転写カセットを、あらかじめ配しておいたXmaI部位を使用し
てGおよびFの遺伝子間領域に挿入した（Bukreyevら, J. Virol. 70:6634-6641,
1996；参照により本明細書に組み込まれる）。 AGTTACTTAAAAACATATTATCACAAAAGGCCCCGGGGCCTTGACCAAACTTAAACAGAATCAAAATAAA
CTCTGGGGCAAAT（SEQ ID NO: 8）； CCCGGGATGGGGCAAATATG（SEQ ID NO: 9）； TAAAGTTATTAAAAATTCCCGGG（SEQ ID NO: 10）
【図１２】 図12は、HEp-2細胞におけるrRSV／mGMCSF、rRSV／CAT、および
wt rRSVの増殖速度を示す。細胞単層を細胞当たり2PFUで感染させ（ウィルス毎
に2ウェルで重複測定）、培養液の200μlアリコートを採取し、表示する時点で
置換した。これらのサンプルを瞬間凍結し、感染性ウィルスの力価を後にプラー
クアッセイで測定した。2つの単層の平均値をそれぞれの時点に示す。
wt rRSVの増殖速度を示す。細胞単層を細胞当たり2PFUで感染させ（ウィルス毎
に2ウェルで重複測定）、培養液の200μlアリコートを採取し、表示する時点で
置換した。これらのサンプルを瞬間凍結し、感染性ウィルスの力価を後にプラー
クアッセイで測定した。2つの単層の平均値をそれぞれの時点に示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 11/00 Ａ６１Ｐ 11/06 ４Ｃ０８７
11/06 31/14
31/14 37/04
37/04 Ｃ１２Ｎ 7/00
Ｃ１２Ｎ 7/00 7/04
7/04 15/00 ＺＮＡＡ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，
ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ
Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ
，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，
ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，
ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ
Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ
，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，
ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ
Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ
，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，
ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ
Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ
，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，
ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 マーフィー，ブライアン・アール
アメリカ合衆国メリーランド州20861，ベ
セスダ，テュスカワラス・ロード 5410
(72)発明者 ホワイトヘッド，スティーブン・エス
アメリカ合衆国メリーランド州20878，ゲ
イザーバーグ，プレイリー・ローズ・レイ
ン ７
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA25 BA26 BA27 BA30
CA04 CA06 CA20 DA02 DA20
EA02 EA04 GA11 GA25 HA17
4B065 AA90X AA95X AA95Y AB01
AC14 AC20 BA02 BA14 BA16
CA44 CA45
4C076 AA24 BB27 CC07 CC15 CC35
4C084 AA02 AA03 BA44 CA01 CA18
CA53 DA01 DA14 DA16 DA19
DA24 MA13 MA56 NA05 NA14
ZA59 ZB09 ZB33
4C085 AA03 BA57 CC08 DD62 EE03
GG10
4C087 AA01 AA02 AA03 BB65 BC83
CA12 CA16 MA13 NA05 NA14
ZA59 ZB09 ZB33
Claims (88)
- 【請求項１】 組換えRSVゲノムまたはアンチゲノム（antigenome）、主要
なヌクレオカプシド（nucleocapsid）（N）タンパク質、ヌクレオカプシドリン
タンパク質（P）、大型ポリメラーゼタンパク質（L）、およびRNAポリメラーゼ
伸長因子を含む単離した感染性組み換え呼吸系発疹ウィルス（RSV）であり、組
み換えゲノムまたはアンチゲノムが免疫調節分子をコードするヘテロロガスポリ
ヌクレオチドを取り込む、上記ウィルス。 - 【請求項２】 免疫調節分子がサイトカイン、ケモカイン（chemokine）、
酵素、サイトカイン・アンタゴニスト、ケモカイン・アンタゴニスト、表面レセ
プター、可溶性レセプター、接着分子、またはリガンドである、請求項1記載の
組換えRSV。 - 【請求項３】 免疫調節分子がインターロイキン2（IL-2）、インターロイ
キン4（IL-4）、インターフェロン・ガンマ（IFNγ）、または顆粒球マクロファ
ージコロニー刺激因子（GM-CSF）から選択される、請求項2記載の組換えRSV。 - 【請求項４】 サイトカインがインターフェロン・ガンマ（IFNγ）である
、請求項2記載の組換えRSV。 - 【請求項５】 サイトカインが顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM
-CSF）である、請求項2記載の組換えRSV。 - 【請求項６】 サイトカインがインターロイキン2（IL-2）である、請求項2
記載の組換えRSV。 - 【請求項７】 サイトカインがインターロイキン4（IL-4）である、請求項2
記載の組換えRSV。 - 【請求項８】 サイトカインの組み換えゲノムまたはアンチゲノムへの導入
によって、（i）細胞培養におけるウィルス増殖の変化；（ii）哺乳動物宿主の
下部気道および／または上部気道における弱毒化；（iii）プラークサイズの変
化；または（iv）細胞変性の変化を含む、野生型もしくは変異体の親ウィルスに
比較した組換えRSVにおける1つ以上の所望の表現型の変化が施与される、または
、野生型もしくは変異体の親ウィルスによって誘引される宿主の免疫応答に比較
して抗RSV中和抗体応答、Tヘルパー細胞応答、細胞障害性T細胞（CTL）応答、お
よび／またはナチュラルキラー（NK）細胞応答から選択される1つ以上の変更さ
れた宿主免疫応答が施与される、請求項1記載の組換えRSV。 - 【請求項９】 細胞培養物におけるウィルス増殖が相当する野生型または変
異体親RSV株の増殖に比較して約10-15倍以上弱毒化される、請求項1記載の組換
えRSV。 - 【請求項１０】 組み換えウィルスが細胞培養液中で免疫調節分子を約10-2
0マイクログラム／106細胞以上のレベルで発現する、請求項1記載の組換えRSV。 - 【請求項１１】 細胞培養物中で増殖させるため、そして哺乳動物宿主の上
部気道および下部気道の両方における複製のためにウィルスを弱毒化し、そして
ウィルスがワクチン接種された宿主においてRSVに対する防御免疫応答を誘引す
る、請求項1記載の組換えRSV。 - 【請求項１２】 感染した細胞において発現した免疫調節分子の活性によっ
てウィルスを弱毒化する、請求項1記載の組換えRSV。 - 【請求項１３】 ウィルスが野生型RSVによって誘導される血清IgGのレベル
より2-10倍以上高い血清IgGの力価を誘導する、請求項1記載の組換えRSV。 - 【請求項１４】 ゲノムまたはアンチゲノムが生物学的に誘導した変異型ヒ
トRSVにおいて同定される1つ以上の弱毒化変異の導入によって更に修飾される、
請求項1記載の組換えRSV。 - 【請求項１５】 ゲノムまたはアンチゲノムが生物学的に誘導された変異型
ヒトRSV株の一群に存在する弱毒化変異の少なくとも1つの相補体から全ての相補
体までを取り込み、該一群がcpts RSV 248（ATCC VR2450）、cpts RSV 248／404
（ATCC VR 2454）、cpts RSV 248／955（ATCC VR 2453）、cpts RSV 530（ATCC
VR 2452）、cpts RSV 530／1009（ATCC VR 2451）、cpts RSV 530／1030（ATCC
VR 2455）、RSV B-1 cp52／2B5（ATCC VR 2542）、およびRSV B-1 cp-23（ATCC
VR 2579）を含む、請求項14記載の組換えRSV。 - 【請求項１６】 組み換えゲノムまたはアンチゲノムが、RSV N遺伝子のVal
267、RSV F遺伝子のGlu218および／またはThr523、RSV ポリメラーゼ遺伝子LのA
sn43、Cys319、Phe521、Gln831、Met1169、Tyr1321および／またはHis1690のア
ミノ酸置換、そして遺伝子M2の遺伝子開始配列におけるヌクレオチド置換を示す
弱毒化変異の少なくとも1つの相補体から全ての相補体までを取り込む、請求項1
4記載の組換えRSV。 - 【請求項１７】 ゲノムまたはアンチゲノムが少なくとも2つの弱毒化変異
を取り込む、請求項14記載の組換えRSV。 - 【請求項１８】 ゲノムまたはアンチゲノムが変異を示すコドンにおける複
数のヌクレオチド変化によって安定化された弱毒化変異を少なくとも1つ含有す
る、請求項14記載の組換えRSV。 - 【請求項１９】 ゲノムまたはアンチゲノムが細胞培養物における増殖の変
化、弱毒化、温度感受性、低温適応性、プラークサイズ、宿主範囲の制限、抗原
発現、または免疫原性の変化から選択される表現型の変化を示す更なるヌクレオ
チド修飾を含む、請求項1記載の組換えRSV。 - 【請求項２０】 更なるヌクレオチド修飾によって組換えRSVのSH、NS1、NS
2、M2 ORF2、またはG遺伝子が変更される、請求項19記載の組換えRSV。 - 【請求項２１】 SH、NS1、NS2、M2 ORF2、またはG遺伝子の全体または一部
が削除されるか、あるいは遺伝子のオープン・リーディング・フレームにおける
フレーム・シフトもしくは1つ以上の停止コドンの導入、または翻訳開始部位の
修飾によって遺伝子の発現が低下または除去される、請求項20記載の組換えRSV
。 - 【請求項２２】 更なるヌクレオチド修飾が組換えRSVゲノムまたはアンチ
ゲノム内の選択した遺伝子のcis作用性調節配列のヌクレオチド削除、挿入、置
換、付加、または再配列を含む、請求項19記載の組換えRSV。 - 【請求項２３】 NS1およびNS2遺伝子の遺伝子末端（GE）シグナルが修飾さ
れる、請求項19記載の組換えRSV。 - 【請求項２４】 更なるヌクレオチド修飾が組換えRSVゲノムまたはアンチ
ゲノム内の翻訳開始部位の挿入、削除、置換、付加、または再配列を含む、請求
項19記載の組換えRSV。 - 【請求項２５】 分泌型RSV G糖タンパク質の翻訳開始部位が除去される、
請求項24記載の組換えRSV。 - 【請求項２６】 哺乳動物宿主において防御免疫応答を誘引する能力のある
微生物病原体のT-ヘルパーエピトープ、制限部位マーカー、またはタンパク質の
1つ以上から選択される非RSV分子をコードするようにゲノムまたはアンチゲノム
を修飾する、請求項19記載の組換えRSV。 - 【請求項２７】 ゲノムまたはアンチゲノムがパラインフルエンザウィルス
（PIV）由来の遺伝子またはゲノムセグメントを取り込む、請求項19記載の組換
えRSV。 - 【請求項２８】 遺伝子またはゲノムセグメントがPIVのHNもしくはF糖タン
パク質、またはその免疫原性ドメインもしくはエピトープをコードする、請求項
27記載の組換えRSV。 - 【請求項２９】 ゲノムセグメントがPIV1、PIV2、またはPIV3のHNまたはF
のエクトドメインまたは免疫原性エピトープをコードする、請求項27記載の組換
えRSV。 - 【請求項３０】 ゲノムまたはアンチゲノムがヒトまたはウシRSVの部分的
または完全なRSVバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノムを、異なるRSVのヘ
テロロガス遺伝子またはゲノムセグメントと組み合わせて含んでヒト-ウシ・キ
メラRSVゲノムまたはアンチゲノムを形成する、請求項1記載の組換えRSV。 - 【請求項３１】 ヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメントがRSVのF、G
、またはSH糖タンパク質またはその免疫原性ドメインもしくはエピトープをコー
ドする、請求項30記載の組換えRSV。 - 【請求項３２】 ヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメントが部分的RSV
バックグラウンドゲノムまたはアンチゲノムにおける相対する遺伝子またはゲノ
ムセグメントの代わりに置換される、請求項30記載の組換えRSV。 - 【請求項３３】 ヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメントが部分的また
は完全なRSVバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノムの非コード領域に隣接
して、または非コード領域内に付加される、請求項30記載の組換えRSV。 - 【請求項３４】 キメラゲノムまたはアンチゲノムが部分的または完全なヒ
トRSVバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノムを、ウシRSV由来のヘテロロガ
ス遺伝子またはゲノムセグメントと組み合わせて含有する、請求項30記載の組換
えRSV。 - 【請求項３５】 キメラゲノムまたはアンチゲノムが部分的または完全なウ
シRSVバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノムを、ヒトRSV由来のヘテロロガ
ス遺伝子またはゲノムセグメントと組み合わせて含有する、請求項30記載の組換
えRSV。 - 【請求項３６】 細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、エクトドメイン、また
はその免疫原性エピトープをコードする1つ以上のヒトRSV糖タンパク質遺伝子F
、G、およびSHまたはゲノムセグメントが、ウシRSVバックグラウンドゲノムまた
はアンチゲノムにおける相対する遺伝子またはゲノムセグメントの代わりに置換
される、請求項34記載の組換えRSV。 - 【請求項３７】 ヒトRSV糖タンパク質遺伝子FおよびGの一方または両方が
置換されてウシRSVバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノムにおける相対す
るFおよびGの一方または両方を置き換える、請求項36記載の組換えRSV。 - 【請求項３８】 ヒトRSV糖タンパク質遺伝子FおよびGの両方が置換されて
ウシRSVバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノムにおける相対するFおよびG
を置き換える、請求項37記載の組換えRSV。 - 【請求項３９】 ヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメントがヒトRSVの
亜群Aまたは亜群Bに由来する、請求項36記載の組換えRSV。 - 【請求項４０】 ヒト-ウシ・キメラゲノムまたはアンチゲノムがヒトRSVの
亜群Aおよび亜群Bの両方に由来する抗原決定基を取り込む、請求項36記載の組換
えRSV。 - 【請求項４１】 ウィルスである、請求項1記載の組換えRSV。
- 【請求項４２】 サブウィルス粒子である、請求項1記載の組換えRSV。
- 【請求項４３】 個体の免疫系を刺激してRSVに対する防御を誘導する方法
であり、免疫学的に十分な量の請求項1記載の組換えRSVを生理学的に許容しうる
キャリアーと組み合わせて個体に投与することを含む、上記方法。 - 【請求項４４】 組換えRSVを103から107PFUの用量で投与する、請求項43記
載の方法。 - 【請求項４５】 組換えRSVを上部気道に投与する、請求項43記載の方法。
- 【請求項４６】 組換えRSVをスプレー、液滴、またはエアロゾールで投与
する、請求項43記載の方法。 - 【請求項４７】 組換えRSVをRSVに対する抗体に関して血清陰性であるか、
またはRSVに対する経胎盤性獲得抗体を有する個体に投与する、請求項43記載の
方法。 - 【請求項４８】 組換えRSVが弱毒化され、相当する野生型または変異体の
親RSV株の増殖および抗原発現に比較して高い抗原発現を示す、請求項43記載の
方法。 - 【請求項４９】 組換えRSVがヒトRSV A、ヒトRSV B、または両方に対する
免疫応答を誘引する、請求項43記載の方法。 - 【請求項５０】 RSVに対する免疫応答を誘引する免疫原性組成物であり、
免疫学的に十分な量の請求項1記載の組換えRSVを、生理学的に許容しうるキャリ
アーに含む、上記組成物。 - 【請求項５１】 103から107PFUの用量で製剤化される、請求項50記載の免
疫原性組成物。 - 【請求項５２】 スプレー、液滴、またはエアロゾールによって上部気道に
投与するために製剤化される、請求項50記載の免疫原性組成物。 - 【請求項５３】 組換えRSVが相当する野生型または変異体の親RSV株の増殖
および抗原発現に比較して弱毒化された増殖および高い抗原発現を示す、請求項
50記載の免疫原性組成物。 - 【請求項５４】 ヒトRSV A、ヒトRSV B、または両方に対する免疫応答を誘
引する、請求項50記載の免疫原性組成物。 - 【請求項５５】 免疫調節分子をコードするポリヌクレオチド配列を取り込
むように修飾したRSVゲノムまたはアンチゲノムを含有する単離されたポリヌク
レオチド分子。 - 【請求項５６】 免疫調節分子がサイトカインである、請求項55記載の単離
されたポリヌクレオチド分子。 - 【請求項５７】 サイトカインがインターロイキン2（IL-2）、インターロ
イキン4（IL-4）、インターロイキン5（IL-5）、インターロイキン6（IL-6）、
インターロイキン18（IL-18）、腫瘍壊死因子（TNF）アルファ、インターフェロ
ン・ガンマ（IFN）、または顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）
から選択される、請求項56記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 - 【請求項５８】 ゲノムまたはアンチゲノムが生物学的に誘導された変異型
ヒトRSVにおいて同定される1つ以上の弱毒化変異の導入によって更に修飾され、
ヒトRSV糖タンパク質遺伝子FおよびGの両方が置換されてウシRSVゲノムまたはア
ンチゲノムにおける相対するFおよびG糖タンパク質遺伝子を置き換える、請求項
55記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 - 【請求項５９】 ゲノムまたはアンチゲノムが増殖特性の変化、弱毒化、温
度感受性、低温適応性、プラークサイズ、宿主範囲の制限、または免疫原性の変
化から選択される表現型変化で示される更なるヌクレオチド修飾を含有する、請
求項55記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 - 【請求項６０】 ゲノムまたはアンチゲノムがSH、NS1、NS2、G遺伝子、も
しくはM2-2 ORFの全体もしくは一部の削除によって、または遺伝子発現を低減も
しくは除去する遺伝子のオープン・リーディング・フレームにおけるフレームシ
フトもしくは停止コドンの導入によって修飾される、請求項59記載の単離された
ポリヌクレオチド分子。 - 【請求項６１】 SH、NS1、NS2、もしくはG遺伝子、またはM2-2 ORFの全体
または一部が削除される、請求項60記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 - 【請求項６２】 ヌクレオチド修飾がRSVゲノムまたはアンチゲノム内の選
択したRSV遺伝子のcis作用性調節配列の削除、挿入、付加、または再配列を含有
する、請求項59記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 - 【請求項６３】 感染性弱毒化RSV粒子を該RSVをコードする1つ以上の単離
されたポリヌクレオチド分子から生成する方法であり、以下： 細胞または細胞未含有の細胞抽出液において、免疫調節分子をコードするポリ
ヌクレオチド配列を取り込むように修飾した組換えRSVゲノムまたはアンチゲノ
ム、そしてRSV N、P、L、およびRNAポリメラーゼ伸長因子タンパク質を含有する
単離されたポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを発現させること； を含む、上記方法。 - 【請求項６４】 組換えRSVゲノムまたはアンチゲノム、そしてN、P、L、お
よびRNAポリメラーゼ伸長因子タンパク質が2つ以上の異なる発現ベクターから発
現される、請求項63記載の方法。 - 【請求項６５】 組み換えゲノムまたはアンチゲノムが部分的または完全な
RSVベクターゲノムまたはアンチゲノムを1つ以上のヘテロロガス病原体の1つ以
上の抗原決定基をコードする1つ以上のヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメ
ントと組み合わせて含有する、請求項1記載の単離された感染性組換えRSV。 - 【請求項６６】 該1つ以上のヘテロロガス病原体がヘテロロガスRSVであり
、該ヘテロロガス遺伝子またはゲノムセグメントが1つ以上のRSV NS1、NS2、N、
P、M、SH、M2（ORF1）、M2（ORF2）、L、F、もしくはGタンパク質またはそのフ
ラグメントをコードする、請求項65記載の単離された感染性組換えRSV。 - 【請求項６７】 ベクターゲノムまたはアンチゲノムが部分的または完全な
RSV Aゲノムまたはアンチゲノムであり、抗原決定基をコードするヘテロロガス
遺伝子またはゲノムセグメントがRSV B亜群ウィルスのものである、請求項65記
載の単離された感染性組換えRSV。 - 【請求項６８】 キメラゲノムまたはアンチゲノムが弱毒化を示すBRSVの1
つ以上の遺伝子またはゲノムセグメントを取り込む、請求項65記載の単離された
感染性組換えRSV。 - 【請求項６９】 1つ以上のHNおよび／またはF糖タンパク質をコードする1
つ以上のHPIV1、HPIV2、もしくはHPIV3遺伝子もしくはゲノムセグメント、また
はその抗原性ドメイン、フラグメント、もしくはエピトープが部分的または完全
なHRSVベクターゲノムまたはアンチゲノムに付加される、またはそれに取り込ま
れる、請求項65記載の単離された感染性組換えRSV。 - 【請求項７０】 ベクターゲノムまたはアンチゲノムが部分的または完全な
BRSVゲノムまたはアンチゲノムであり、抗原決定基をコードするヘテロロガス遺
伝子またはゲノムセグメントが1つ以上のHRSVのものである、請求項65記載の単
離された感染性組換えRSV。 - 【請求項７１】 部分的または完全なBRSVゲノムまたはアンチゲノムがF、G
、およびSHから選択される1つ以上のHRSV糖タンパク質遺伝子をコードする1つ以
上の遺伝子もしくはゲノムセグメント、またはHRSVのF、G、および／またはSHの
細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、エクトドメイン、もしくは免疫原性エピトー
プ部分をコードする1つ以上のゲノムセグメントを取り込む、請求項70記載の単
離された感染性組換えRSV。 - 【請求項７２】 ベクターゲノムまたはアンチゲノムが部分的または完全な
HRSVまたはBRSVのゲノムまたはアンチゲノムであり、ヘテロロガス病原体が麻疹
ウィルス、亜群Aおよび亜群B呼吸系発疹ウィルス、流行性耳下腺炎ウィルス、ヒ
ト乳頭腫ウィルス、1型および2型ヒト免疫不全ウィルス、単純疱疹ウィルス、サ
イトメガロウィルス、狂犬病ウィルス、エプスタイン・バーウィルス、フィロウ
ィルス（filovirus）、ブンヤウィルス、フラビウィルス（flaviviruses）、ア
ルファウィルス、およびインフルエンザウィルスから選択される、請求項65記載
の単離された感染性組換えRSV。 - 【請求項７３】 該1つ以上のヘテロロガス抗原決定基が麻疹ウィルスのHA
およびFタンパク質、亜群Aまたは亜群B呼吸系発疹ウィルスのF、G、SH、およびM
2タンパク質、流行性耳下腺炎ウィルスのHNおよびFタンパク質、ヒト乳頭腫ウィ
ルスのL1タンパク質、1型または2型ヒト免疫不全ウィルスのgp160タンパク質、
単純疱疹ウィルスおよびサイトメガロウィルスのgB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、
gJ、gK、gL、およびgMタンパク質、狂犬病ウィルスのGタンパク質、エプスタイ
ン・バーウィルスのgp350タンパク質、フィロウィルスのGタンパク質、ブンヤウ
ィルスのGタンパク質、フラビウィルスのEおよびNS1タンパク質、およびアルフ
ァウィルスのEタンパク質、そしてその抗原性ドメイン、フラグメント、および
エピトープから選択される、請求項72記載の単離された感染性組換えRSV。 - 【請求項７４】 ヘテロロガス病原体が麻疹ウィルスであり、ヘテロロガス
抗原決定基が麻疹ウィルスのHAおよびFタンパク質およびその抗原性ドメイン、
フラグメント、およびエピトープから選択される、請求項72記載の単離された感
染性組換えRSV。 - 【請求項７５】 麻疹ウィルスHA遺伝子のオープン・リーディング・フレー
ム（ORF）を含有する転写単位がHRSVベクターゲノムまたはアンチゲノムに付加
される、またはそれに取り込まれる、請求項74記載の単離された感染性組換えRS
V。 - 【請求項７６】 請求項1記載の単離された感染性組換えRSVであり、組み換
えゲノムまたはアンチゲノム内に1つ以上の移動されたRSV遺伝子またはゲノムセ
グメントを有し、これが野生型RSVゲノムまたはアンチゲノム内の該RSV遺伝子ま
たはゲノムセグメントの位置に比較してよりプロモーターに近接した、またはよ
りプロモーターから離れた位置に位置的に移動されている、上記の単離された感
染性組換えRSV。 - 【請求項７７】 該1つ以上の移動された遺伝子またはゲノムセグメントが
該部分的または完全な組換えRSVゲノムまたはアンチゲノム内の1つ以上の置換ポ
リヌクレオチドの削除、挿入、または再配列によってよりプロモーターに近接し
た、またはよりプロモーターから離れた位置へ移動される、請求項76記載の単離
された感染性組換えRSV。 - 【請求項７８】 該置換ポリヌクレオチドが150ヌクレオチド（nts）および
4,000ヌクレオチドの間の長さの1つ以上のポリヌクレオチド挿入部分を含み、こ
れがゲノムまたはアンチゲノムの非コード領域（NCR）に、または分離遺伝子単
位（GU）として挿入され、該組換えRSVにおいて該ポリヌクレオチド挿入部分が
完全なオープン・リーディング・フレーム（ORF）を欠失しており、弱毒化され
た表現型を示す、請求項77記載の単離された感染性組換えRSV。 - 【請求項７９】 該置換ポリヌクレオチドがRSVのNS1、NS2、N、P、M、SH、
M2（ORF1）、M2（ORF2）、L、F、およびG遺伝子およびゲノムセグメント、およ
びRSVゲノムのリーダー領域、トレーラー（trailer）領域、および遺伝子間領域
、およびそのセグメントから選択される1つ以上のRSV遺伝子またはゲノムセグメ
ントを含有する、請求項76記載の単離された感染性組換えRSV。 - 【請求項８０】 該置換ポリヌクレオチドがRSVのNS1、NS2、N、P、M、SH、
M2（ORF1）、M2（ORF2）、L、F、およびG遺伝子およびゲノムセグメント、およ
びRSVゲノムのリーダー領域、トレーラー領域、および遺伝子間領域から、およ
びそのセグメントから選択される1つ以上のウシRSV（BRSV）もしくはヒトRSV（H
RSV）遺伝子またはゲノムセグメントを含有する、請求項76記載の単離された感
染性組換えRSV。 - 【請求項８１】 該置換ポリヌクレオチドが削除されて組換えRSVゲノムま
たはアンチゲノムを形成し、これによって該組み換えゲノムまたはアンチゲノム
内の該1つ以上の移動されたRSV遺伝子またはゲノムセグメントが、野生型RSVゲ
ノムまたはアンチゲノム内の該RSV遺伝子またはゲノムセグメントの位置に比較
してよりプロモーターに近接した位置に移動される、請求項80記載の単離された
感染性組換えRSV。 - 【請求項８２】 削除されて組換えRSVゲノムまたはアンチゲノムを形成す
る該置換ポリヌクレオチドがRSVのNS1、NS2、SH、M2（ORF2）、もしくはG遺伝子
、またはそのゲノムセグメントを1つ以上含む、請求項81記載の単離された感染
性組換えRSV。 - 【請求項８３】 RSV糖タンパク質遺伝子Gが該組換えRSVゲノムまたはアン
チゲノム内で野生型のGの遺伝子順位（gene order position）に比較してよりプ
ロモーターに近接した遺伝子順位に再配置される、請求項76記載の単離された感
染性組換えRSV。 - 【請求項８４】 RSV糖タンパク質遺伝子Fが該組換えRSVゲノムまたはアン
チゲノム内で野生型のFの遺伝子順位に比較してよりプロモーターに近接した遺
伝子順位に再配置される、請求項76記載の単離された感染性組換えRSV。 - 【請求項８５】 RSV糖タンパク質遺伝子GおよびFの両方が該組換えRSVゲノ
ムまたはアンチゲノム内で野生型のGおよびFの遺伝子順位に比較してよりプロモ
ーターに近接した遺伝子順位に再配置される、請求項76記載の単離された感染性
組換えRSV。 - 【請求項８６】 RSV糖タンパク質遺伝子Gが該組換えRSVゲノムまたはアン
チゲノム内で1位の遺伝子順位に移動され、RSV糖タンパク質遺伝子Fが2位の遺伝
子順位に移動される、請求項85記載の単離された感染性組換えRSV。 - 【請求項８７】 RSVのSHおよびNS2遺伝子が共に削除されて組換えRSVゲノ
ムまたはアンチゲノムを形成する、請求項76記載の単離された感染性組換えRSV
。 - 【請求項８８】 RSVのSH、NS1、およびNS2遺伝子が全て削除されて組換えR
SVゲノムまたはアンチゲノムを形成する、請求項76記載の単離された感染性組換
えRSV。
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