ES2317673T3 - Sistema de expresion y vacunas de los virus sincitiales respiratorias recombinantes. - Google Patents

Abstract

Una partícula vírica sincitial respiratoria (RSV) atenuada, infecciosa aislada, que comprende un antigenoma o genoma de RSV que contiene al menos una supresión funcional en M2-ORF3 del genoma de RSV, para uso como medicamento.

Description

Sistemas de expresión y vacunas de los virus sincitiales respiratorios recombinantes.

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1. Introducción

La presente invención se refiere a plantillas de ARN de virus de cadena negativa recombinantes que pueden usarse para expresar productos génicos heterólogos en sistemas de células hospedantes apropiados y/o para construir virus recombinantes que expresan, empaquetan y/o presentan el producto génico heterólogo para uso como medicamento. En particular, la presente invención se refiere a métodos para generar virus sincitiales respiratorios recombinantes y al uso de estos virus recombinantes como vectores de expresión y vacunas. La invención se describe mediante ejemplos en los que se usan genomas víricos sincitiales respiratorios recombinantes para generar partículas víricas infecciosas.

2. Fundamento de la invención

Se ha diseñado genéticamente un cierto número de virus de ADN para dirigir la expresión de proteínas heterólogas en sistemas de células hospedantes (por ejemplo, virus vaccinia, baculovirus, etc.). Recientemente, se han hecho avances similares con virus de ARN de cadena positiva (por ejemplo, poliovirus). Se cree que los productos de expresión de estas construcciones, es decir, el producto génico heterólogo del virus quimérico que expresa el producto génico heterólogo, son potencialmente útiles en formulaciones de vacunas (vacunas de virus subunitario o completo). Un inconveniente del uso de virus tales como vaccinia para construir virus recombinantes o quiméricos de uso en vacunas es la falta de variación en sus epítopes principales. Esta falta de variabilidad en las cepas víricas plantea limitaciones estrictas en el uso repetido de vaccinia quimérico, porque vacunaciones múltiples generarán resistencia del hospedante a la cepa, de manera que el virus inoculado no puede infectar al hospedante. La inoculación de un individuo resistente con vaccinia quimérico no inducirá, por tanto, estimulación inmune.

Como contraste, virus de ARN de cadena negativa tales como el virus de la gripe y el virus sincitial respiratorio, demuestran una amplia variabilidad de sus epítopes principales. Realmente, se han identificado miles de variantes de la gripe; evolucionando cada cepa por impulso antígeno. Los virus de cadena negativa tales como el virus de la gripe y el sincitial respiratorio serían candidatos atractivos para construir virus quiméricos de uso en vacunas, porque su variabilidad genética permite la construcción de un vasto repertorio de formulaciones de vacunas que estimularán inmunidad sin riesgo de desarrollar una tolerancia.

2.1 Virus sincitial respiratorio

Las familias de virus que contienen ARN de cadena sencilla envuelto del genoma de sentido negativo se clasifican en grupos que tienen genomas no segmentados (Paramyxoviridae, Rhabdoviridae) o los que tienen genomas segmentados (Orthomyxoviridae, Bunyaviridae y Arenaviridae). Los paramyxoviridae se han clasificado en tres géneros: paramyxovirus (virus sendai, virus paragripales tipos 1-4, paperas, virus de la enfermedad de newcastle); morbillivirus (virus del sarampión, virus del moquillo canino y virus de la peste bovina): y pneumovirus (virus sincitial respiratorio y virus sincitial respiratorio bovino).

El virus sincitial respiratorio humano (RSV) es la causa principal de enfermedad grave del tracto respiratorio inferior en niños pequeños y niños jóvenes y es responsable de morbidez y mortalidad considerables. Dos subgrupos de RSV diversos antígenamente A y B están presentes en poblaciones humanas. El RSV también se reconoce como un agente de enfermedad importante en adultos inmunocomprometidos y en los mayores. Debido a la resistencia incompleta a infección con RSV inducida por infección natural, el RSV puede infectar múltiples veces durante la infancia y la vida. El objetivo de la inmunoprofilaxis de RSV es inducir suficiente resistencia para prevenir la enfermedad grave que puede estar asociada con la infección con RSV. Las estrategias actuales para desarrollar vacunas de RSV giran principalmente alrededor de la administración de antígeno vírico purificado o el desarrollo de RSV atenuado vivo para administración intranasal. Sin embargo, no ha habido hasta la fecha vacunas aprobadas o terapia antivírica altamente eficaz para RSV.

La infección con RSV puede variar desde una infección desapercibida hasta neumonía grave y muerte. El RSV posee un genoma de ARN de sentido negativo no segmentado de cadena sencilla de 15.221 nucleótidos (Collins, 1991, en The paramyxoviruses, págs. 103-162, D.W. Kingsbury (red.) Plenum Press, Nueva York). El genoma de RSV codifica 10 mARNs (Collins et al., 1984, J. Virol. 49: 572-578). El genoma contiene una secuencia líder de 44 nucleótidos en los términos 3' seguida por el NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L y una secuencia de remolque de 155 nucleótidos en los términos 5' (Collins, 1991, supra). Cada unidad de transcripción de gen contiene una extensión corta de secuencia de inicio de genes (GS) conservada y secuencias de terminación de genes (GE).

El ARN genómico vírico es no infeccioso como ARN desprovisto. El genoma de ARN de RSV está encapsidado estrechamente con la principal proteína de la nucleocápsida (N) y está asociado con la fosfoproteína (P) y la subunidad de polimerasa grande (L). Estas proteínas forman el núcleo de la nucleoproteína, que se reconoce como la unidad mínima de infectividad (Brown et al., 1997), J. Virol. 1:368-373). Las proteínas N, P y L de RSV forman la transcriptasa de ARN dependiente de ARN vírico para transcripción y replicación del genoma de RSV (Yu et al., 1995, J. Virol. 69:2412-2419; Grosfeld et al., 1995, J. Virol. 69:5677-86). Estudios recientes indican que los productos del gen M2 (M2-1 y M2-2) están implicados y se requieren para transcripción (Collins et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. 93:81-5).

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La proteína M se expresa como una proteína de membrana periférica, mientras que las proteínas F y G se expresan como proteínas de membrana integrales y están implicadas en fijación del virus y entrada vírica a células. Las proteínas G y F son los antígenos principales que obtienen anticuerpos neutralizantes in vivo (como se ha reexaminado en McIntosh y Chanock, 1990 "Respiratory Syncytial Virus" 2ª ed. Virology (D.M. Knipe et al., Red.) Raven Press, Ltd., N.Y.). El dimorfismo antígeno entre los subgrupos de RSV A y B está enlazado principalmente con la glicoproteína G, mientras que la glicoproteína F está relacionada más estrechamente entre los subgrupos.

A pesar de décadas de investigación, no se ha desarrollado una vacuna sde RSV segura y eficaz para la prevención de la morbidez y la mortalidad graves asociadas con la infección con RSV. Una vacuna de virus inactivado con formalina no ha proporcionado protección contra infección con RSV y sus síntomas exacerbados durante la infección subsiguiente por el virus de tipo natural en niños pequeños (Kapikian et al., 1969, Am. J. Epidemiol. 89:405-21; Chin et al., 1969, Am. J. Epidemiol. 89:449-63). Los esfuerzos desde entonces se han enfocado en desarrollar mutantes sensibles a la temperatura atenuados vivos por mutagénesis química o paso en frío del RSV de tipo natural (Gharpure et al., 1969, J. Virol. 3:414-21; Crowe et al., 1994, Vaccine 12:691-9). Sin embargo, pruebas anteriores produjeron resultados desalentadores con estos mutantes sensibles a la temperatura atenuados vivos. Los virus candidatos estaban infraatenuados o sobreatenuados (Kim et al., 1973, Pediatrics 52:56-63; Wright et al., 1976, J. Pediatrics 88:931-6) y algunas de las vacunas candidatas eran inestables genéticamente, lo que producía la pérdida del fenotipo atenuado (Hodes et al., 1974, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 145:1158-64).

Se han hecho también intentos para diseñar vectores de vaccinia recombinantes que expresen glicoproteínas de envoltura F o G de RSV. Sin embargo, el uso de estos vectores como vacunas para proteger frente a infección con RSV en estudios de animales ha mostrado resultados inconsecuentes (Olmsted et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. 83:7462-7466; Collins et al., 1990, Vaccine 8:164-168).

Así, los esfuerzos han vuelto a diseñar RSV recombinante para generar vacunas. Durante largo tiempo, los virus de ARN de sentido negativo eran refractarios al estudio. Sólo recientemente ha sido posible recuperar virus de ARN de cadena negativa usando un método de genética inversa recombinante (Patente de los EE.UU. Nº 5.166.057 de Palese et al.). Aunque este método se aplicó originalmente a diseñar genomas víricos de gripe (Luytjes et al. 1989, Cell 59:1107-1113; Enami et al. 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11563-11567), se ha aplicado con éxito a una amplia variedad de virus de ARN de cadena negativa segmentados y no segmentados, incluyendo rabia (Schnell et al. 1994, EMBO J. 13:4195-4203); VSV (Lawson et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:4477-81); el virus del sarampión (Radecke et al., 1995, EMBO J. 14:5773-84); el virus de la peste bovina (Baron & Barrett, 1997, J. Virol. 71:1265-1271); el virus paragripal humano (Hoffman & Banerjee, 1997, J. Virol. 71:3272-7; Dubin et al., 1997, Virology 235:323-32); SV5 (He et al., 1997, Virology 237:249-60); el virus sincitial respiratorio (Collins et al. 1991; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9663-9667) y el virus sendai (Park et al. 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5537-5541; Kato et al. 1996, Genes to Cells 1:569-579). Aunque se ha usado este método para rescatar con éxito RSV, un cierto número de grupos ha informado de que RSV es aún refractario a estudio, dadas varias propiedades de RSV que lo distinguen de los paramyxovirus mejor caracterizados de los géneros Paramyxovirus, Rubulavirus y Morbillivirus. Estas diferencias incluyen un mayor número de ARNs, un orden génico inusual en el extremo 3' del genoma, una diversidad de secuencias de cepa a cepa extensiva, varias proteínas no encontradas en otros virus de ARN de cadena negativa no segmentados y un requisito para que la proteína de M2 (ORF1) proceda con tratamiento total de transcriptos de longitud completa y rescate de un genoma de longitud completa (Collins et al. PCT WO97/12032; Collins P.L. et al. págs. 1313-1357 del volumen 1, Fields Virology, et al., reds. (3ª ed., Raven Press, 1996).

3. Compendio de la invención

La presente invención se refiere a virus RS recombinantes atenuados infecciosos diseñados genéticamente y a vectores víricos que contienen al menos una supresión funcional en el M2-ORF2 del genoma de RSV, para uso como vacunas. Según la presente invención, estos vectores vírucos y virus RS combinantes pueden diseñarse para contener genes heterólogos, incluyendo genes de otros virus, organismos patógenos, genes celulares, antígenos de tumores, o para codificar combinaciones de genes de diferentes cepas de RSV.

Se describen plantillas de ARN vírico de cadena negativa recombinante que pueden usarse para transfectar células transformadas que expresan la polimerasa de ARN dependiente de ARN y permiten complementación. Alternativamente, pueden usarse un plásmido que expresa los componentes de la polimerasa de ARN de un promotor apropiado para transfectar células para permitir la complementación de as plantillas de ARN vírico de cadena negativa. La complementación puede conseguirse también con el uso de un virus auxiliar o virus de tipo natural para proporcionar la polimerasa de ARN dependiente de ARN. Las plantillas de ARN se preparan por transcripción de secuencias de ADN apropiadas con una polimerasa de ARN dirigida a ADN. Las plantillas de ARN resultantes son de polaridad negativa o positiva y contienen secuencias terminales apropiadas que permiten al aparato de sintetización de ARN reconocer la plantilla. Pueden construirse mARNs bicistrónicos para permitir inicio interno de la traducción de secuencias víricas y posibilitar la expresión de secuencias de codificación de proteínas extrañas del lugar de inicio terminal regular, o viceversa.

Como se demuestra por los ejemplos descritos aquí, genoma de RSV recombinante en la orientación de sentido positivo o sentido negativo se co-transfecta con vectores de expresión que codifican la proteína de nucleocápsida (N) vírica, la fosfoproteína (P) de nucleocápsida asociada, la proteína subunidad de polimerasa grande (L), con o sin la proteína de M2/ORF1 de RSV para generar partículas víricas infecciosas. Se usan plásmidos que codifican polipéptidos de virus RS como fuente de proteínas que eran capaces de replicarse y transcribir RNPs derivadas sintéticamente. Se encontró que el subconjunto mínimo de proteínas de RSV necesarias para replicación y expresión específicas de la RNP vírica eran las tres proteínas del complejo de polimerasa (N, P y L). Esto sugiere que puede no requerirse absolutamente la función del gen M2 completo para la replicación, expresión y rescate de RSV infeccioso.

Se conocen vacunas de RSV que comprenden el virus atenuado vivo de, por ejemplo, Firestone et al. (1996, Virology, 225:419-22) y Juhasz et al. (1997, J. Virol., 71:5814-19).

Pueden utilizarse ventajosamente los productos de expresión y/o viriones quiméricos obtenidos en formulaciones de vacunas. Puede utilizarse RSV recombinante diseñado genéticamente para demostrar un fenotipo atenuado como una vacuna de RSV vivo. Puede diseñarse RSV recombinante para expresar los polipéptidos antígenos de otra cepa de RSV (por ejemplo, proteínas G y F de RSV) u otro virus (por ejemplo, un péptido inmunógeno de gp120 o HIV) para generar un RSV quimérico que sirva como vacuna, que sea capaz de obtener respuestas inmunes humorales y mediadas por células de vertebrados. El uso de gripe recombinante o RSV recombinante para este fin es especialmente atractivo porque estos virus demuestran una variabilidad de cepas tremenda, permitiendo la construcción de un vasto repertorio de formulaciones de vacunas. La capacidad para seleccionar entre miles de variantes del virus para construir virus quiméricos elimina el problema de resistencia del hospedante con que se tropieza usando otros virus tales como vaccinia.

3.1 Definiciones

Según se usan aquí, las siguientes expresiones tendrán los significados indicados:

cARN =

ARN anti-genómico

HA =

hemaglutinina (glicoproteína de envoltura)

HIV =

virus de la inmunodeficiencia humana

L =

subunidad de polimerasa grande

M =

proteína de matriz (linajes dentro de la envoltura)

MDCK =

células de riñón canino Madin Darby

MDBK =

células de riñón de bovino Madin Darby

moi =

multiplicidad de infección

N =

proteína de nucleocápsida

NA =

neuramidasa (glicoproteína de envoltura)

NP =

nucleoproteína (asociada con ARN y requerida para actividad de polimerasa)

NS =

proteína no estructural (función desconocida)

nt =

nucleótido

P =

fosfoproteína de nucleocápsida

PA, PB1, PB2 =

componentes de polimerasa de ARN dirigida por ARN

RNP =

ribonucleoproteína (ARN, PB2, PB1, PA y NP)

rRNP =

RNP recombinante

RSV =

virus sincitial respiratorio

vARN =

ARN de virus genómico

complejo de polimerasa vírico =

PA, PB1, PB2 y NP

WSN =

virus A/WSN/33 de la gripe

virus WSN-HK =

virus de reordenación que contiene siete genes de virus WSN y el gen de NA del virus A/HK/8/68 de la gripe

4. Descripción de las figuras

Fig. 1. Representación esquemática de la construcción RSV/CAT (pRSVA2CAT) usada en experimentos de rescate. Las regiones líder de aproximadamente 100 nt de longitud y de remolque de 200 nt de longitud de RSC se construyeron por reasociación controlada de oligonucleótidos sintéticos que contienen complementariedad solapante parcial. Los oligonucleótidos líderes solapantes están indicados por los 1L - 5L mostrados en la construcción. Los nucleótidos de remolque solapantes están indicados por los 1T - 9T mostrados en la construcción. Las secuencias de nucleótidos de los ADNs líder y de remolque se ligaron a ADN de gen de CAT purificado en los lugares de XbaI y PstI indicados, respectivamente. Esta construcción completa se ligó después a pUC19 digerido con KpnI/HindIII. La inclusión de una secuencia de promotor de T7 y un lugar de HgaI flanqueando las secuencias de remolque y líder, respectivamente, permitió la síntesis in vitro de transcriptos de ARN de RSV/CAT que contenían los extremos 3' y 5' de la secuencia genómica precisa.

Fig. 2. Cromatograma de capa fina (TLC) que muestra la actividad de CAT presente en extractos de células 293 tras la infección y transfección con ARN transcrito de la construcción RSV/CAT mostrada en la Figura 11. Se infectaron monocapas confluentes de células 293 en placas de seis pocillos (\sim106 células) con RSV A2 o B9320 con una m.o.i. de 0,1-1,0 ufp de células. En 1 hora post-infección se transfectaron células con 5-10 \mug de CAT/RSV usando el método Transfect-Act^{TM} de Life Technologies. A las 24 horas post-infección, se cosecharon las monocapas infectadas/transfectadas y se trataron para ensayo de la subsecuencia CAT según Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, Capítulo 9.6.2; Gorman et al., (1982) Mol. Cell Biol. 2:1044-1051. Las pistas 1, 2, 3 y 4 muestran la actividad de CAT presente en (1) células 293 no infectadas, células 293 infectadas transfectadas con CAT/RSV-A2, co-infectadas con sobrenadante de (2) anterior. La actividad de CAT observada en cada pista se produjo de 1/5 del extracto celular total de 106 células.

Fig. 3. Representación esquemática del genoma de la cepa A2 de RSV mostrando las posiciones relativas de los pares de cebadores usados para la síntesis de cADNs que comprenden el genoma completo. Se indican los lugares de endonucleasas usadas para empalmar estos clones entre sí; estos lugares estaban presentes en la secuencia de RSV nativo y estaban incluidos en los cebadores usados para síntesis de cADN. Se usaron aproximadamente 100 ng de ARN genómico vírico en reacciones de RT/PCR para la síntesis separada de cada uno de los siete cADNs. Se muestran también los cebadores para la síntesis de la primera y segunda cadena de cADN de la plantilla de ARN genómico. Para cada cADN, los cebadores para la síntesis de la primera cadena son los nº 1-7 y los cebadores para la síntesis de la segunda cadena son los nº 1'-7'.

Fig. 4. Representación esquemática de la cepa B9320 del subgrupo B de RSV. Se crearon lugares de BamHI en los cebadores de oligonucleótidos usados para RT/PCR con el fin de clonar los genes G y F de la cepa B9320 en el cADN antigenómico del subgrupo A2 de RSV (FIG. 4A). Un fragmento de cADN que contenía genes G y F de 4326 nucleótidos a 9387 nucleótidos de la cepa A2 se subclonó primero en pUC19 (pUCRVH). Se crearon lugares de Bgl II en las posiciones de 4630 (unión intergénica SH/G) (FIG. 4B) y 7554 (unión intergénica F/M2) (FIG. 4C). Se insertó cADN de B93260 A-G y F en pUCR/H, del que se suprimieron los genes A-G y F. El clon de cADN antigenómico resultante se denominó pRSVB-GF y se usó para transfectar células Hep-2 para generar virus RSVB-GF infeccioso.

Fig. 5. El virus RSVB-GF recombinante se caracterizó por RT/PCR usando cebadores específicos del subgrupo B de RSV. Los cebadores específicos del subgrupo B de RSV en la región de G se incubaron con partes alícuotas de los genomas víricos de RSV recombinantes y se sometieron a PCR. Los productos de PCR se analizaron por electroforesis en un gel de agarosa del 1% y se visualizaron coloreando con bromuro de etidio. Como se muestra, no se produjo producto de PCR en la reacción de RT/PCR usando como plantilla A2 de RSV. Sin embargo, se vio un producto predicho de 254 pares de bases en RT/PCR de ARN de RSVB-GF y testigo de PCR de ADN de plásmido pRSV-GF como plantilla, indicando que el virus rescatado contenía genes G y F derivados de virus B9320.

Fig. 6. Identificación de (rRSVA2(B-G) quimérico por RT/PCR y análisis de manchas de Northern de expresión de ARN. FIG. 6A. Análisis de RT/PCR de rRSV A2(B-G) quimérico, A2(B-G), en comparación con A2(A2) de tipo natural. ARN viriónico extraído de rRSVA2(B-G) (pistas 1, 2) y rRSVA2 (pistas 3,4) se sometió a transcripción inversa usando un cebador reasociado a vARN de sentido (-) en el gen de RSV F en presencia (+) o ausencia (-) de transcriptasa inversa (RT), seguido por PCR con un cebador flanqueando exactamente el lugar de inserción de B-G. No se detectó ADN en RT/PCR cuando estuvo ausente transcriptasa inversa (RT) (pistas 2, 4). Se produjo de rRSVA(B-G) un fragmento de cADN, que es aproximadamente 1 kb mayor que el cADN derivado de A2. Este producto de ADN de PCR más largo se digirió mediante la enzima de restricción StuI única para el gen B-G insertado (pista 5). Se indica un marcador de tamaño de ADN de 100 pb (M). FIG. 6B. Análisis de manchas de Northern de la expresión de mARN de G. Se infectaron células Hep-2 con RSV B3920, rRSV y rRSV A2 quimérico (B-G). A las 48 h post-infección, se extrajo el ARN celular total y se sometió a electroforesis en gel de agarosa del 1,2% que contenía formaldehído. Se transfirió ARN a membrana de nylon Hybond y se hibridó el filtro con una sonda de oligonucleótidos marcada con 32P específica para mARN de A2-G o específica para mARN de B9320-G. Ambos transcriptos específico para A2 G y específico para B9320 G se detectaron en las células infectadas con RSV-A2 (B-G). Se indica también el transcripto de ARN de salida (G-M2) de células infectadas con RSV A2 (B-G).

Fig. 7. Análisis de la expresión de proteínas por rRSV A2 (B-G). Se infectaron simuladamente células Hep-2 (pistas 1-5), se infectaron con RSV B9320 (pistas 2, 6), rRSV (pistas 3, 7) y rRSV A2 (B-G) (pistas 4, 8). A las 14-18 h post-infección, se marcaron células infectadas con 35S-promix y se inmunoprecipitaron polipéptidos mediante antisuero policlonal de cabra contra cepa A2 de RSV (pistas 1-5) o mediante antisuero policlonal de ratón contra cepa B9320 de RSV (pistas 5-8). Los polipéptidos inmunoprecipitados se separaron en un gel de poliacrilamida del 10%. Se produjeron proteína G específica de RSV A2 y proteína G específica de RSV B9320 en células infectadas con rRSV A2 (B-G). La migración de proteína G se indica por *. Se indica la movilidad de la glicoproteína F1, y N, P y M. Los tamaños moleculares se muestran a la izquierda en kilodaltons.

Fig. 8. Morfología de placas de rRSV, rRSVC3G, rRSV A2 (B-G) y virus A2 de tipo natural (wt A2). Se infectaron células Hep-2 con cada virus y se incubaron a 35ºC durante seis días. Las monocapas de células se fijaron, se visualizaron por inmunocoloración y se fotografiaron.

Fig. 9. Curva de crecimiento de rRSV, rRSVC4G, RSV A2 de tipo natural (wt A2) y A2 de rRSV (B-G) quimérico. Se infectaron células Hep-2 con cualquier virus en una moi de 0,5 y se cosechó el medio a intervalos de 24 h. El título de cada virus se determinó por duplicado mediante ensayo de placas en células Hep-2 y se visualizó por inmunocoloración.

Fig. 10. Agrupaciones de residuos cargados de proteína L de RSV fijadas como objetivo para mutagénesis dirigida al lugar. Se convirtieron en alaninas residuos de aminoácidos cargados contiguos en agrupaciones por mutagénesis dirigida al lugar del gen de L de RSV usando el juego de mutagénesis dirigida al lugar QuikChange (Stratagene).

Fig. 11. Residuos de cisteína de proteína L de RSV fijados como objetivo para mutagénesis dirigida al lugar. Los residuos de cisteína se convirtieron en residuos de alanina por mutagénesis dirigida al lugar del gen de L de RSV usando el juego de mutagénesis dirigida al lugar QuikChange (Stratagene).

Fig. 12. Identificación de mutantes de supresión de M2-2 y SH de RSV. Las supresiones en M2-2 se generaron por digestión con Hind III de pET(S/B) seguida por reclonación de un fragmento de Sac I a BamHI restante en un clon de longitud completa. La supresiones en SH se generaron por digestión con Sac I de pET(A/S) seguida por reclonación de un fragmento de Avr II Sac I restante en un clon de longitud completa. FIG. 12A. La identificación del rRSVsSH y RSV M2-2 recuperados se realizó por RT/PCR usando pares de cebadores específicos para el gen de SH o M2-2, respectivamente. FIG. 12B. Se detectó también rRSV SH M2-2 por RT/PCR usando pares de cebadores específicos para los genes de M2-2 y SH. Los productos de RT/PCR se hicieron pasar sobre un gel de agarosa con bromuro de etidio y se visualizaron bandas por luz ultravioleta (UV).

5. Descripción de la invención

La presente invención se refiere a virus RS recombinantes diseñados genéticamente y a vectores víricos que contienen al menos una supresión funcional en el M2-ORF2 del genoma de RSV, para su uso como medicamento. Opcionalmente, estos virus y vectores pueden comprender genes heterólogos, por ejemplo genes derivados de diferentes cepas de virus RS. La invención se refiere a la construcción y uso de dichas plantillas de ARN víricas RS de cadena negativa, recombinantes, que pueden usarse con polimerasa de ARN dirigida a ARN vírico para expresar productos génicos heterólogos en células hospedantes apropiadas y/o para rescatar el gen heterólogo en partículas de virus. Las platillas de ARN de la presente invención pueden prepararse por transcripción de secuencias de ADN apropiadas usando una polimerasa de ARN dirigida a ADN tal como polimerasa de bacteriófago T7, T3 o Sp6. Las plantillas de ARN recombinantes pueden usarse para transfectar linajes celulares continuos/transfectados que expresan las proteínas de polimerasa de ARN dirigida a ARN, permitiendo complementación.

Los ejemplos ilustrativos muestran que se rescata RSV infeccioso de cADN que contiene el genoma de RSV en el sentido genómico o antigenómico introducido en células que expresan las proteínas N, P y L del complejo de polimerasa de RSV. Los ejemplos de trabajo demuestran que no se requiere la expresión de M2-2 para recuperación de RSV infeccioso de cADN, lo que es contrario a lo que se ha indicado anteriormente (Collins et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11563-7). Además, la supresión del cADN de RSV de M2-ORF2 menos produce el rescate de partículas de RSV atenuado. El RSV suprimido de M2 es un vehículo excelente para generar RSV quimérico que codifica los productos génicos heterólogos en lugar de los genes de M2, teniendo utilidad estos vectores víricos quiméricos y partículas de virus rescatadas como vectores de expresión para la expresión de productos génicos heterólogos y como vacunas de RSV atenuadas vivas que expresan polipéptidos antígenos de RSV o polipéptidos antígenos de otros virus.

La revelación se demuestra adicionalmente mediante ejemplos ilustrativos en los que un clon de cADN que contenía el genoma completo de RSV, además de un promotor de T7, una ribozima de virus de la hepatitis delta y un terminador de T7, se usa para generar una partícula vírica infecciosa cuando se co-transfecta con vectores de expresión que codifican las proteínas N, P, L y/o M2-ORF1 de RSV. Además, los ejemplos de trabajo describen transcriptos de ARN de ADN clonado que contienen la región de codificación, en orientación de sentido negativo, del gen de cloranfenicol-acetil-transferasa (CAT) o el gen de proteína fluorescente verde (GFP) flanqueados por los nucleótidos 5' terminal y 3' terminal del genoma de RSV. Los ejemplos de trabajo demuestran además que un promotor de RSV mutado para tener actividad aumentada produjo rescate de partículas de RSV infecciosas de un cADN de RSV de longitud completa con alta eficacia. Estos resultados demuestran el uso con éxito de plantillas de cadena negativa víricas recombinantes y polimerasa de RSV con actividad aumentada para rescatar RSV. Este sistema es una herramienta excelente para diseñar virus de RSV con propiedades biológicas definidas, por ejemplo, vacunas atenuadas vivas contra RSV, y para usar RSV recombinante como vector de expresión para la expresión de productos génicos heterólogos.

Esta invención se refiere a la construcción y uso de plantillas de ARN vírico de cadena negativa recombinantes como se define en las reivindicaciones, que pueden usarse con polimerasa de ARN dirigida a ARN vírico para expresar productos génicos heterólogos en células hospedantes apropiadas, para rescatar el gen heterólogo en partículas de virus y/o expresar plantillas de ARN vírico de cadena negativa recombinantes mutadas o quiméricas (véase Patente de los EE.UU. Nº 5.166.057 de Palese et al., incorporada aquí como referencia en su integridad). En una realización específica de la invención, el producto génico heterólogo es un péptido o proteína derivados de otra cepa del virus u otro virus. Las plantillas de ARN pueden estar en orientación de sentido positivo o negativo y se preparan por transcripción de secuencias de ADN apropiadas usando una polimerasa de ARN dirigida a ADN tal como polimerasa de bacteriófago T7, T3 o Sp6.

La capacidad para reconstituir RNPs in vitro permite el diseño de nuevos virus de la gripe y RSV quiméricos que expresan genes extraños. Una forma de conseguir este objetivo implica modificar genes víricos existentes. Por ejemplo, el gen G o F puede modificarse para contener secuencias extrañas, tales como el gen HA de la gripe en sus dominios externos. Cuando la secuencia heteróloga son epítopes o antígenos de organismos patógenos, estos virus quiméricos pueden usarse para inducir una respuesta inmune protectora contra el agente de la enfermedad del que se derivan estos determinantes. Por ejemplo, puede construirse un ARN quimérico en el que una secuencia de codificación derivada de la región de codificación gp120 del virus de la inmunodeficiencia humana se insertó en la secuencia de codificación de RSV, y virus quiméricos producidos de la transfección de este segmento de ARN quimérico en una célula hospedante infectada con RSV de tipo natural.

Además de modificar genes que codifican proteínas superficiales, pueden alterarse genes que codifican proteínas no superficiales. Se ha mostrado que estos últimos genes están asociados con muchas de las respuestas inmunes celulares importantes en el sistema de virus RS. Así, la inclusión de un determinante extraño en el gen G o F de RSV puede inducir, tras la infección, una respuesta inmune celular eficaz contra este determinante. Tal método puede ser particularmente provechoso en situaciones en las que la inmunidad protectora depende fuertemente de la inducción de respuestas inmunes celulares (por ejemplo, malaria, etc.).

5.1 Construcción de las plantillas de ARN recombinantes

Pueden construirse secuencias de codificación de genes heterólogas flanqueadas por el complemento del lugar de unión de polimerasa vírica/promotor, por ejemplo, el complemento de los términos 3'-RSV o los términos 3'- y 5'-RSV usando procedimientos conocidos en la técnica. Pueden flanquearse también secuencias de codificación de genes heterólogas por el complemento del lugar de unión de polimerasa de RSV/promotor, por ejemplo, las secuencias líder y de remolque de RSV usando procedimientos conocidos en la técnica. Las moléculas de ADN recombinante que contienen estas secuencias híbridas pueden clonarse y transcribirse por una polimerasa de ARN dirigida a ADN, tal como polimerasa de bacteriófago T7, T3 o Sp6 y similares, para producir las plantillas de ARN recombinantes que poseen las secuencias víricas apropiadas que permiten el reconocimiento y actividad de polimerasa vírica.

En una realización preferida de la presente invención, las secuencias heterólogas se derivan del genoma de otra cepa de RSV, por ejemplo, se diseña el genoma de la cepa A de RSV para incluir las secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos antígenos G y F de cepa B de RSV, o fragmentos de ellos. En tal realización de la invención, pueden usarse secuencias de codificación heterólogas de otra cepa de RSV para sustituir secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos antígenos de la cepa de partida, o expresarse además de los polipéptidos antígenos de la cepa progenitora, de modo que se diseñe un genoma de RSV recombinante para expresar los polipéptidos antígenos de una, dos o más cepas de RSV.

En otra realización todavía de la invención, las secuencias heterólogas se derivan del genoma de cualquier cepa del virus de la gripe. Según la presente invención, las secuencias de codificación heterólogas de la gripe pueden insertarse dentro de una secuencia de codificación de RSV de tal modo que se exprese un producto génico quimérico que contenga la secuencia de péptido heterólogo dentro de la proteína vírica de RSV. En cualquier realización, las secuencias heterólogas derivadas del genoma de la gripe pueden incluir, aunque sin limitarse a ellas, HA, NA, PB1, PB2, PA, NS1 o NS2.

Las secuencias de codificación heterólogas pueden insertarse dentro de una secuencia de codificación de gen de RSV de tal modo que se exprese un producto génico quimérico que contenga la secuencia de péptido heterólogo dentro de la proteína vírica de la gripe.

En aquellos casos en los que las secuencias heterólogas se derivan de HIV, tales secuencias pueden incluir, aunque sin limitarse a ellas, secuencias derivadas del gen env (es decir, secuencias que codifican la totalidad o parte de gp160, gp120 y/o gyp41), del gen pol (es decir, secuencias que codifican la totalidad o parte de transcriptasa inversa, endonucleasa, proteasa y/o integrasa), el gen gag (es decir, secuencias que codifican la totalidad o parte de p7, p6, p55, p17/18, p24/25) tat, rev, nef, vif, vpu, vpr y/o vpx.

Un método para construir estas moléculas híbridas es insertar la secuencia de codificación heteróloga en un ADN complemento de un ARN genómico de RSV, de manera que la secuencia heteróloga esté flanqueada por las secuencias víricas requeridas para actividad de polimerasa vírica; es decir, el lugar de unión de polimerasa vírica/promotor, al que se hace referencia como el lugar de unión de polimerasa vírica. En un método alternativo, pueden ligarse oligonucleótidos que codifican el lugar de unión de polimerasa vírica, por ejemplo, el complemento del término 3' o ambos términos de los segmentos genómicos del virus, a la secuencia de codificación heteróloga para construir la molécula híbrida. La colocación de un gen extraño o segmento de un gen extraño dentro de una secuencia objetivo estaba dictada antes por la presencia de lugares de enzimas de restricción apropiados dentro de la secuencia objetivo. Sin embargo, los avances recientes en biología molecular han disminuido este problema en gran medida. Los lugares de enzimas de restricción pueden situarse fácilmente en cualquier lugar dentro de una secuencia objetivo mediante el uso de mutagénesis dirigida al lugar (por ejemplo, véanse las técnicas descritas por Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:488). Variaciones en la tecnología de reacción en cadena de polimerasa (PCR), descritas después, permiten también la inserción específica de secuencias (es decir, lugares de enzimas de restricción) y permiten la construcción fácil de moléculas híbridas. Alternativamente, podrían usarse reacciones PCR para preparar plantillas recombinantes sin necesidad de clonar. Por ejemplo, podrían usarse reacciones de PCR para preparar moléculas de ADN de doble cadena que contengan un promotor de polimerasa de ARN dirigida a ADN (por ejemplo, bacteriófago T3, T7 o Sp6) y la secuencia híbrida que contenga el gen heterólogo y el lugar de unión de polimerasa vírica de la gripe. Podrían transcribirse después plantillas de ARN directamente desde este ADN recombinante. En otra realización aún, las plantillas de ARN recombinantes pueden prepararse ligando ARNs que especifican la polaridad negativa del gen heterólogo y el lugar de unión de polimerasa vírica usando una ligasa de ARN. Se describen en las siguientes subsecciones requisitos de secuencias para actividad de polimerasa vírica y construcciones que pueden usarse según la invención.

5.1.1. Inserción de los genes heterólogos

El gen que codifica la proteína L contiene un marco de lectura abierto simple. Los genes que codifican NS o M2 contienen dos marcos de lectura abiertos para NS1 y NS2 y ORF1 y 2, respectivamente. Las proteínas G y F, codificadas por genes separados, son las principales glicoproteínas superficiales del virus. En consecuencia, estas proteínas son los objetivos principales para la respuesta inmune humoral después de la infección. La inserción de una secuencia de gen extraño en cualquiera de estas regiones de codificación podría conseguirse por una adición de las secuencias extrañas a expresar o por una sustitución completa de la región de codificación vírica con el gen extraño o mediante una sustitución parcial. Las secuencias heterólogas insertadas en el genoma de RSV pueden ser de cualquier longitud hasta aproximadamente 5 kilobases. Se conseguiría mejor probablemente una sustitución completa mediante el uso de mutagénesis dirigida por PCR.

Alternativamente, podría construirse un mARN bicistrónico para permitir el inicio interno de la traducción de secuencias víricas y hacer posible la expresión de secuencias de codificación de proteínas extrañas desde el lugar de inicio terminal regular. Alternativamente, puede construirse una secuencia de mARN bicistrónico en el que la secuencia vírica se traduzca desde el marco de lectura abierto terminal regular, mientras que se inicie la secuencia extraña desde un lugar interno. Pueden utilizarse ciertas secuencias de lugar de entrada de ribosoma interno (IRES). Las secuencias IRES que se escojan deben ser lo suficientemente cortas para no interferir con limitaciones de empaquetado de virus RS. Así, es preferible que las IRES escogidas para tal método bicistrónicono no tengan más de 500 nucleótidos de longitud, prefiriéndose menos de 250 nucleótidos. Además, es preferible que las IRES utilizadas no compartan homología de secuencias o estructural con elementos picornavíricos. Los elementos de IRES preferidos incluyen aunque sin limitarse a ellos, las IRES de BIP de mamífero y las IRES de virus de la hepatitis C.

5.2 Expresión de productos génicos heterólogos usando plantilla de ARN recombinante

Las plantillas recombinantes preparadas como se ha descrito antes pueden usarse de una variedad de formas para expresar los productos génicos heterólogos en células hospedantes apropiadas o para crear virus quiméricos que expresen los productos génicos heterólogos. En una realización, la plantilla recombinante puede combinarse con complejo de polimerasa vírica purificado más abajo, para producir rRNPs que sean infecciosas. Con este fin, la plantilla recombinante puede transcribirse en presencia del complejo de polimerasa vírica. Alternativamente, la plantilla recombinante puede mezclarse con, o transcribirse en presencia del complejo de polimerasa vírica, preparado usando métodos de ADN recombinante (por ejemplo, véase Kingsbury et al., 1987, Virology 156:396-403). En otra realización todavía, la plantilla recombinante puede usarse para transfectar células hospedantes apropiadas para dirigir la expresión del producto génico heterólogo en altos niveles. Los sistemas de células hospedantes que proporcionan altos niveles de expresión incluyen linajes celulares continuos que suministran funciones víricas tales como linajes celulares superinfectados con RSV, linajes celulares diseñados para complementar funciones víricas de RSV, etc.

5.3 Preparación de virus de ARN de cadena negativa quimérico

Con el fin de preparar virus quimérico, pueden usarse RNPs reconstituidas que contienen ARNs de RSV modificados o ARN que codifica proteínas extrañas para transfectar células que también están infectadas con un virus RSV "progenitor". Alternativamente, las preparaciones de RNP reconstituida pueden mezclarse con las RNPs de virus progenitor de tipo natural y usarse para transfección directamente. Tras la reordenación, los nuevos virus pueden aislarse e identificarse sus genomas mediante análisis de hibridación. En métodos adicionales descritos aquí para la producción de virus quimérico infeccioso, pueden replicarse rRNPs en sistemas de células hospedantes que expresan las proteínas de RSV o de polimerasa vírica de la gripe (por ejemplo, en sistemas de expresión de virus/células hospedantes; linajes celulares transformados diseñados para expresar las proteínas de polimerasa, etc.), de manera que se rescate virus quimérico infeccioso; en este caso, no se necesita utilizar virus auxiliar porque esta función es proporcionada por las proteínas de polimera vírica expresadas. En un método particularmente deseable, células infectadas con rRNPs diseñadas para los ocho segmentos del virus de la gripe pueden dar como resultado la producción de virus quimérico infeccioso que contiene el genotipo deseado, eliminando así la necesidad de un sistema de selección.

Teóricamente, se puede sustituir uno cualquiera de los genes de RSV, o parte de uno cualquiera de los genes de RSV, con la secuencia extraña. Sin embargo, una parte necesaria de esta ecuación es la capacidad para propagar el virus defectuoso (defectuoso porque falta o se ha alterado un producto génico vírico normal). Existe un cierto número de métodos posibles para salvar este problema.

Un tercer método para propagar el virus recombinante puede implicar co-cultivo con virus de tipo natural. Esto podría hacerse tomando simplemente virus recombinante y co-infectando células con éste y otro virus de tipo natural (preferiblemente una cepa de vacuna). El virus de tipo natural debe complementar al producto génico de virus defectuoso y permitir el crecimiento de ambos virus, el virus de tipo natural y el recombinante. Ésta sería una situación análoga a la propagación de partículas que interfieren con defectuoso del virus de la gripe (Nayak et al., 1983, en: Genetics of Influenza Viruses, P. Palese y D.W. Kingsbury, reds., Springer-Verlag, Viena, págs. 255-279). En el caso de virus que interfieren con defectuoso, pueden modificarse condiciones tales como que la mayoría del virus propagado es la partícula defectuosa en lugar del virus de tipo natural. Por tanto, este método puede ser útil para generar cepas de alto título de virus recombinante. No obstante, estas cepas deben contener necesariamente algún virus de tipo natural.

Alternativamente, pueden replicarse RNPs sintéticas en células co-infectadas con virus recombinantes que expresan las proteínas de polimerasa de virus RS. De hecho, este método puede usarse para rescatar virus infeccioso recombinante según la invención. Con este fin, las proteínas de polimerasa de virus RSV pueden expresarse en cualquier sistema de vector de expresión/célula hospedante, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, vectores de expresión víricos (por ejemplo, virus vaccinia, adenovirus, baculovirus, etc.) o linajes celulares que expresen las proteínas de polimerasa (por ejemplo, véase Krystal et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2709-2713).

5.4 Generación de virus quiméricos con un fenotipo atenuado

Los métodos descritos pueden usarse para introducir mutaciones o secuencias heterólogas para generar virus atenuados quiméricos que tienen muchas aplicaciones, incluyendo análisis de la biología molecular de RSV, patogénesis y propiedades de crecimiento e infección. Pueden introducirse mutaciones o secuencias heterólogas por ejemplo en las secuencias de codificación de proteína F o G, secuencias de codificación de NS1, NS2, M1ORF1, N, P o L. Puede eliminarse un gen vírico particular, o su expresión, para generar un fenotipo atenuado adicionalmente, por ejemplo, puede suprimirse el M ORF del genoma de RSV. Los genes internos individuales de RSV humano pueden sustituirse por equivalente de otras cepas, o su equivalente bovino o de ratón. Esto puede incluir parte o la totalidad de uno o más de los NS1, NS2, N, P, M, SH, M2 (ORF1), y genes de L o los genes de G y F. El genoma de RSV contiene diez mARNs que codifican tres proteínas transmembrana, proteína G, proteína F de fusión requerida para penetración y la pequeña proteína SH; las proteínas de nucleocápsida N, P y L; el factor M2 ORF 1 de alargamiento de la transcripción, la proteína M de matriz y dos proteínas no estructurales, NS1 y NS2. Puede fijarse como objetivo una cualquiera de las proteínas para generar un fenotipo atenuado adicionalmente. Otras mutaciones que pueden utilizarse para producir un fenotipo atenuado adicionalmente son mutaciones de inserción, supresión y dirigida al lugar de las secuencias líder y de remolque.

Según la presente invención, un RSV atenuado presenta un grado de virulencia sustancialmente más bajo en comparación con un virus de tipo natural, incluyendo una velocidad de crecimiento más lenta, de tal modo que no tienen lugar los síntomas de infección vírica en un individuo inmunizado.

El RSV recombinante atenuado adicionalmente puede generarse incorporando un amplio intervalo de mutaciones, incluyendo cambios de nucleótidos simples, mutaciones específicas del lugar, inserciones, sustituciones, supresiones o reordenaciones. Estas mutaciones pueden afectar a un pequeño segmento del genoma de RSV, por ejemplo, de 15 a 30 nucleótidos, o a segmentos grandes del genoma de RSV, por ejemplo, de 50 a 100 nucleótidos, dependiendo de la naturaleza de la mutación. Alternativamente, se introducen mutaciones aguas arriba o aguas abajo de un elemento regulador que actúa cis existente con el fin de cortar su actividad, produciendo así un fenotipo atenuado.

Además, puede alterarse una región reguladora no codificante de un virus para regular hacia abajo cualquier gen vírico, por ejemplo, reducir la transcripción de su mARN y/o reducir la replicación de vARN (ARN vírico), de modo que se produzca un virus atenuado.

Las alteraciones de regiones reguladoras no codificantes del genoma vírico que produzcan regulación hacia abajo de la replicación de un gen vírico y/o regulación hacia abajo de la transcripción de un gen vírico darán como resultado la producción de partículas defectuosas en cada ronda de replicación, es decir, partículas que empaquetan menos que el complemento total de segmentos víricos requeridos para un virus patógeno totalmente infeccioso. Por tanto, el virus alterado demostrará características atenuadas porque el virus se desprenderá de más partículas defectuosas que partículas de tipo natural en cada ronda de replicación. Sin embargo, puesto que la cantidad de proteína sintetizada en cada ronda es similar para ambos virus de tipo natural y las partículas defectuosas, tales virus atenuados son capaces de inducir una buena respuesta inmune.

El método anterior es aplicable igualmente a virus segmentados y no segmentados, en los que la regulación hacia abajo de la transcripción de un gen vírico reducirá la producción de su mARN y el producto génico codificado. Cuando el gen vírico codifica una proteína estructural, por ejemplo, una cápsida, matriz, proteína superficial o de envoltura, se reducirá el número de partículas producidas durante la replicación de manera que el virus alterado demuestre características atenuadas, por ejemplo, un título que produzca niveles de infección subclínicos. Por ejemplo, una disminución de la expresión de cápsidas víricas reducirá el número de neurocápsidas empaquetadas durante la replicación, mientras que una disminución de expresión de la proteína de envoltura puede reducir el número y/o infectividad de los viriones de progenie. Alternativamente, una disminución de la expresión de las enzimas víricas requeridas para replicación, por ejemplo, las polimerasa, replicasa, helicasa y similares, debería disminuir el número de genomas de progenie generados durante la replicación. Puesto que se reduce el número de partículas infecciosas producidas durante la replicación, los virus alterados demostraban características atenuadas. Sin embargo, el número de partículas de virus antígenas producidas será suficiente para inducir una respuesta inmune vigorosa.

Una forma alternativa de diseñar virus atenuados implica la introducción de una alteración, incluyendo, aunque sin limitarse a ellas, una inserción, supresión o sustitución de uno o más residuos de aminoácidos y/o epítopes en una o más de las proteínas víricas. Esto puede conseguirse fácilmente diseñando la alteración apropiada en la secuencia de genes vírica correspondiente. Cualquier cambio que altere la actividad de la proteína vírica de manera que se modifique o reduzca la replicación vírica puede conseguirse según la invención.

Por ejemplo, pueden diseñarse alteraciones que interfieren con, pero no anulan completamente, la unión vírica a receptores de células hospedantes y la subsiguiente infección, en antígenos superficiales víricos o proteasas víricas implicados en la elaboración para producir una cepa atenuada. Pueden modificarse antígenos superficiales víricos para contener inserciones, sustituciones o supresiones de uno o más aminoácidos o epítopes que interfieren con, o reducen, la afinidad de unión del antígeno vírico con los receptores de la célula hospedante. Este método ofrece una ventaja añadida porque puede producirse un virus quimérico que expresa un epítope extraño que demuestra también características atenuadas. Tales virus son candidatos ideales para uso como vacunas recombinantes vivas.

A este respecto, RSV es un sistema ideal en el que diseñar epítopes extraños, porque la capacidad para seleccionar entre miles de variantes del virus para construir virus quiméricos evita el problema de resistencia del hospedante o tolerancia inmune con las que se tropieza cuando se usan otros vectores de virus tales como vaccinia.

Pueden diseñarse alteraciones de proteasas víricas requeridas para elaborar proteínas víricas para producir atenuación. Las alteraciones que afectan a la actividad de enzimas y hacen a la enzima menos eficaz en elaboración deberían afectar a la infectividad vírica, el empaquetado y/o la liberación para producir un virus atenuado.

Pueden alterarse enzimas víricas implicadas en replicación vírica y transcripción de genes víricos, por ejemplo, polimerasas, replicasas, helicasas, etc. víricas de manera que la enzima sea menos eficaz o activa. La reducción de la actividad de tales enzimas puede dar como resultado la producción de menos genomas de progenie y/o transcriptos víricos, de manera que se produzcan menos partículas infecciosas durante la replicación.

Las alteraciones diseñadas en cualquiera de las enzimas víricas incluyen, aunque sin limitarse a ellas, inserciones, supresiones y sustituciones en la secuencia de aminoácidos del lugar activo de la molécula. Por ejemplo, podría alterarse el lugar de unión de la enzima de manera que se reduzca su afinidad de unión al sustrato y, como resultado, la enzima sea menos específica y/o eficaz. Por ejemplo, un objetivo de elección es el complejo de polimerasa vírica, porque existen mutaciones sensibles a la temperatura en todas las proteínas de polimerasa. Así, pueden diseñarse cambios en el gen de polimerasa vírica introducidos en las posiciones de aminoácidos asociadas con tal sensibilidad a la temperatura de manera que se produzca una cepa atenuada.

5.4.1 El gen de L de RSV como objetivo para atenuación

Se describe que el gen de L de RSV es un objetivo importante para generar RSV recombinante con un fenotipo atenuado. El gen de L representa el 48% del genoma de RSV completo. La presente revelación abarca mutantes que generan gen de L con mutaciones definidas o mutaciones aleatorias en el gen de L de RSV. Puede usarse cualquier número de procedimientos conocidos por los expertos en la técnica para generar mutaciones definidas o aleatorias en el gen de L de RSV. Una vez introducidas las mutaciones, se examina in vitro la funcionalidad de los mutantes de cADN de gen de L usando un sistema de replicación de minigenoma y los mutantes de gen de L recuperados se analizan después adicionalmente in vitro e in vivo.

Las siguientes estrategias son ejemplos de los métodos que pueden usarse para generar mutantes con un fenotipo atenuado. Además, las siguientes estrategias como se describen después se han aplicado al gen de L sólo a modo de ejemplo, y pueden aplicarse también a cualquiera de los otros genes de RSV.

Un método para generar mutantes con un fenotipo atenuado utiliza un método de mutagénesis de escaneo para mutar agrupaciones de aminoácidos cargados a alaninas. Este método es particularmente eficaz para fijar como objetivo dominios funcionales, puesto que las agrupaciones de aminoácidos cargados no se encuentran generalmente enterradas dentro de la estructura de la proteína. La sustitución de los aminoácidos cargados con sustituciones conservadoras, tales como aminoácidos neutros, por ejemplo, alanina, no debería alterar groseramente la estructura de la proteína sino que en cambio debería alterar la actividad del dominio funcional de la proteína. Así, la rotura de agrupaciones cargadas debería interferir con la capacidad de esa proteína para interactuar con otras proteínas, haciendo así termosensible la actividad de la proteína mutada, lo que puede producir mutantes sensibles a la temperatura.

Una agrupación de aminoácidos cargados puede definirse arbitrariamente como una extensión de cinco aminoácidos en la que al menos dos o más residuos son residuos cargados. Según el método de mutagénesis de escaneo, todos los residuos cargados de la agrupación se mutan a alaninas usando mutagénesis dirigida al lugar. Debido al lugar grande del gen de L de RSV, hay muchos residuos cargados agrupados. Dentro del gen de L, hay al menos dos agrupaciones de cuatro residuos cargados contiguos y al menos diecisiete agrupaciones de tres residuos cargados contiguos. Pueden sustituirse al menos dos a cuatro de los residuos cargados de cada agrupación con un aminoácido neutro, por ejemplo, alanina.

En otro método todavía para generar mutantes con un fenotipo atenuado, se utiliza un método de mutagénesis de escaneo para mutar cisteínas a aminoácidos tales como glicinas o alaninas. Tal método obtiene ventaja del papel frecuente de cisteínas en formaciones de enlaces intramoleculares e intermoleculares, pudiendo alterarse así la estabilidad y función de una proteína mutando cisteínas a otro residuo, tal como una sustitución conservadora, por ejemplo, valina o alanina, o una sustitución drástica, por ejemplo, ácido aspártico, debido a la rotura de la estructura terciaria de la proteína. Hay aproximadamente treinta y nueve residuos de cisteína presentes en el gen de L de RSV.

En otro método aún, la mutagénesis aleatoria del gen de L de RSV cubrirá residuos distintos de cargados o cisteínas. Puesto que el gen de L de RSV es muy grande, tal método puede conseguirse mutagenizando fragmentos de cADN grandes del gen de L por mutagénesis de PCR. La funcionalidad de tales mutantes puede examinarse por un sistema de replicación de minigenoma y los mutantes recuperados se analizan después adicionalmente in vitro e in vivo.

5.5 Formulaciones de vacunas usando los virus quiméricos

Virtualmente cualquier secuencia de gen heteróloga puede construirse en los virus quiméricos de la invención para uso en vacunas. La presente revelación se refiere a vacunas de RSV bivalentes que confieren protección contra RSV-A y RSV-B. Para formular tal vacuna, se usa un virus RS quimérico que expresa los polipéptidos antígenos de ambos subtipos RSV-A y RSV-B. La presente revelación se refiere también a una vacuna bivalente que puede conferir protección contra RSV y gripe. Para formular tal vacuna, se usa un virus RS quimérico que expresa los polipéptidos antígenos de RSV y gripe.

Pueden expresarse por o como parte de los virus quiméricos epítopes que inducen una respuesta inmune protectora a cualquiera de una variedad de organismos patógenos, o antígenos que se unen a anticuerpos neutralizantes. Por ejemplo, las secuencias de genes heterólogas que pueden construirse en los virus quiméricos de la invención para uso en vacunas incluyen, aunque sin limitarse a ellas, secuencias derivadas de un virus de inmunodeficiencia humana (HIV), preferiblemente de tipo 1 o tipo 2.

Tales péptidos derivados de HIV pueden incluir, aunque sin limitarse a ellas, secuencias derivadas del gen env (es decir, secuencias que codifican todo o parte de gp160, gp120 y/o gp41), el gen pol (es decir, secuencias que codifican la totalidad o parte de transcriptasa inversa, endonucleasa, proteasa y/o integrasa), el gen gag (es decir, secuencias que codifican todo o parte de p7, p6, p55, p17/18, p24/25), tat, rev, nef, vif, vpu, vpr y/o vpx.

Otras secuencias heterólogas pueden derivarse de antígeno superficial de virus de la hepatitis B (HBsAg); las glicoproteínas de virus del herpes (por ejemplo, gD, gE); VP1 de poliovirus; determinantes antígenos de organismos patógenos no víricos tales como bacterias y parásitos, por nombrar sólo unos pocos. Puede expresarse la totalidad o porciones de genes de inmunoglobulina. Por ejemplo, pueden construirse en los virus quiméricos de la invención regiones variables de inmunoglobulinas anti-idiotípicas que imitan a tales epítopes.

Puede formularse una vacuna vírica recombinante viva o una vacuna vírica recombinante inactivada. Puede preferirse una vacuna viva porque la multiplicación en el hospedante conduce a un estímulo prolongado de clase y magnitud similares a las que tienen lugar en infecciones naturales y, por tanto, pueden conferir inmunidad sustancial de larga duración. La producción de tales formulaciones de vacunas de virus recombinante vivas puede conseguirse usando métodos convencionales que implican propagación del virus en cultivo de células o en el alantoides del embrión de pollo seguida por purificación.

A este respecto, el uso de RSV diseñado genéticamente (vectores) con fines de vacuna puede requerir la presencia de características de atenuación en estas cepas. Las vacunas candidatas de virus vivo actuales para uso en seres humanos se adaptan al frío, son sensibles a la temperatura o se hacen pasar de manera que obtengan varios (seis) genes de virus de aves, lo que produce atenuación. La introducción de mutaciones apropiadas (por ejemplo, supresiones) en las plantillas usadas para transfección puede proporcionar los nuevos virus con características de atenuación. Por ejemplo, pueden hacerse en mutaciones de supresión mutaciones de sentido equivocado que están asociadas con sensibilidad a la temperatura o adaptación al frío. Estas mutaciones deben ser más estables que las mutaciones puntuales asociadas con mutantes sensibles al frío o la temperatura, y las frecuencias de reversión deben ser extremadamente
bajas.

Alternativamente, pueden construirse virus quiméricos con características "suicidas". Tales virus pasarían a través de sólo una o unas pocas rondas de replicación en el hospedante. Cuando se usa como vacuna, el virus recombinante pasaría a través de un ciclo de replicación simple e induciría un nivel suficiente de respuesta inmune, pero no pasaría adicionalmente en el hospedante humano y causaría enfermedad. Los virus recombinantes que carecen de uno o más de los genes de virus RS esenciales no serían capaces de experimentar rondas sucesivas de replicación. Tales virus defectuosos pueden producirse co-transfectando RNPs reconstituidas que carecen de un(unos) gen(es) específico(s)
en linajes celulares que expresan permanentemente este(estos) gen(es). Los virus que carecen de un(unos) gen(es) esencial(es) se replicarán en estos linajes celulares, pero cuando se administren al hospedante humano no serán capaces de completar una ronda de replicación. Tales preparaciones pueden transcribir y traducir, en su ciclo abortivo, un número suficiente de genes para inducir una respuesta inmune. Alternativamente, podrían administrarse mayores cantidades de las cepas, de manera que estas preparaciones sirvan como vacunas de virus inactivados (matados). Para vacunas inactivadas, se prefiere que el producto génico heterólogo se exprese como un componente vírico, de modo que el producto génico esté asociado con el virión. La ventaja de tales preparaciones es que contienen proteínas nativas y no experimentan inactivación por tratamiento con formalina u otros agentes usados en la fabricación de vacunas de virus matados.

Pueden prepararse formulaciones de vacunas inactivadas usando técnicas convencionales para "matar" los virus quiméricos. Las vacunas inactivadas están "muertas" en el sentido de que se ha destruido su infectividad. Idealmente, se destruye la infectividad del virus sin afectar a su inmunogenicidad. Con el fin de preparar vacunas inactivadas, el virus quimérico puede desarrollarse en cultivo de células o en el alantoides del embrión de pollo, purificarse por ultracentrifugación zonal, inactivarse por formaldehído o \beta-propiolactona y agruparse. La vacuna resultante se inocula usualmente intramuscularmente.

Pueden formularse virus inactivados con un coadyuvante adecuado con el fin de aumentar la respuesta inmunológica. Tales coadyuvantes pueden incluir, aunque sin limitarse a ellos, geles minerales, por ejemplo, hidróxido de aluminio; sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones; péptidos; emulsiones en aceite; y coadyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG y Corynebacterium parvum.

Pueden usarse muchos métodos para introducir las formulaciones de vacunas descritas antes; éstos incluyen, aunque sin limitarse a ellos, vías oral, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea e intranasal. Puede ser preferible introducir la formulación de vacuna de virus quimérico por la vía natural de infección del organismo patógeno para el que se diseña la vacuna. Cuando se usa una preparación de vacuna de virus quimérico vivo, puede ser preferible introducir la formulación por la vía natural de infección para el virus de la gripe. Puede usarse ventajosamente la capacidad de RSV y el virus de la gripe para inducir una respuesta inmune secretora y celular vigorosa. Por ejemplo, la infección del tracto respiratorio por virus RSV o de la gripe quiméricos puede inducir una respuesta inmune secretora fuerte, por ejemplo en el sistema urogenital, con protección concomitante contra un agente causante de enfermedad particular.

Las siguientes secciones describen a modo de ejemplo, y no como limitación, la manipulación de los genomas víricos de ARN de cadena negativa usando RSV como ejemplo, para demostrar la aplicabilidad de los métodos de la presente invención para generar virus quiméricos con los fines de expresión de gen heterólogo, generación de partículas víricas infecciosas y partículas víricas atenuadas con propósitos de vacunación.

6. Rescate de virus sincitiales respiratorios (RSV) infecciosos usando ARN derivado de adns recombinantes específicos (sólo para ilustración)

Este ejemplo describe un procedimiento para el rescate de virus sincitial respiratorio (RSV) infeccioso, derivado de cADNs recombinantes que codifican el genoma de ARN de RSV completoena RSVs estables e infecciosos, como se indica en la Sección 5 anterior. El método descrito puede aplicarse a virus de ARN segmentados y no segmentados, incluyendo ortomyxovirus, paramyxovirus, por ejemplo, virus Sendai, virus paragripales tipos 1-4, paperas, virus de la enfermedad de newcastle; morbillivirus, por ejemplo, sarampión, virus del moquillo canino, virus de la peste bovina; pneumovirus, por ejemplo, virus sincitial respiratorio; rhabdovirus, por ejemplo, rabia, vesiculovirus, virus de la estomatitis vesicular; pero se describe a modo de ejemplo en términos de RSV. Este procedimiento puede usarse en la producción de virus RSV quiméricos que pueden expresar genes extraños, es decir, genes no nativos de RSV, incluyendo otras proteínas víricas tales como la proteína env de HIV. Otra manera de ejemplo para conseguir la producción de RSV quimérico implica modificar genes de RSV nativos existentes, como se describe adicionalmente. Por consiguiente, este ejemplo describe también la utilidad de este procedimiento en la atenuación dirigida de la patogenicidad de RSV, dando como resultado la producción de una vacuna con propiedades biológicas diseñadas definidas para uso en seres humanos.

La primera etapa del procedimiento de rescate que implica al genoma de ARN de RSV completo requiere la síntesis de una copia de longitud completa del genoma de 15 kilobases (kb) de la cepa A2 de RSV. Esto se consigue empalmando entre sí cADNs de doble cadena subgenómicos (usando procedimientos estándares para manipulación genética) de tamaño variable de 1 kb a 3,5 kb, para formar el cADN genómico completo. La determinación de la secuencia de nucleótidos del cADN genómico permite la identificación de errores introducidos durante el procedimiento de montaje; los errores pueden corregirse por mutagénesis dirigida al lugar o por sustitución de la región de error con un fragmento de ADN de doble cadena sintetizado químicamente. Después del montaje, el cADN genómico se sitúa adyacente a un extremo átono de un promotor de transcripción (por ejemplo, el promotor de T7) y la secuencia de ADN que sigue a la terminación de la transcripción en el otro extremo, por ejemplo, una endonucleasa específica o una ribozima, para permitir la síntesis de una copia de ARN de sentido más o menos del genoma del virus completo in vitro o en células cultivadas. Las secuencias líder o de remolque pueden contener secuencias adicionales según se desee, tales como terminadores de transcripción de ribozima flanqueante y T7 en tándem. La ribozima puede ser una ribozima de virus de hepatitis delta o una ribozima cabeza de martillo y funciona para producir un extremo 3' exacto libre de nucleótidos no víricos.

Según este aspecto de la invención, pueden hacerse mutaciones, sustituciones o supresiones de la secuencia genómica del RSV nativo que produzcan un aumento de la actividad de promotor de RSV. Los solicitantes han demostrado que incluso un aumento de la actividad de promotor de RSV aumenta en gran medida la eficacia de rescate de RSV, permitiendo el rescate de partículas de RSV infeccioso de un cADN de RSV de longitud completa que lleven la mutación. En particular, una mutuación puntual en posición 4 del genoma (C a G) produce un aumento de varias veces de la actividad del promotor y el rescate de partículas de virus infeccioso de un clon de cADN de RSV de longitud completa que lleve la mutación.

El procedimiento de rescate utiliza la interacción de ARN del genoma de la cepa A2 de RSV de longitud completa, que se transcribe desde el cADN construido, con proteínas de virus del subgrupo B de RSV auxiliares dentro de células cultivadas. Esto puede conseguirse de un cierto número de formas. Por ejemplo, el ARN genómico del virus de longitud completa de la cepa A2 de RSV puede transcribirse in vitro y transfectarse en células infectadas con la cepa B9320 de RSV, tales como células 293, usando métodos de transfección estándares. Además, el ARN genómico de cepa A2 de RSV transcrito in vitro puede transfectarse en un linaje celular que expresa las proteínas de la cepa A2 de RSV esenciales (en ausencia de virus auxiliar) desde genes del virus integrados establemente.

Alternativamente, ARN del genoma del virus transcrito in vitro (cepa A2 de RSV) puede transfectarse también en células infectadas con un virus heterólogo (por ejemplo, en particular virus vaccinia) que expresen las proteínas de la cepa A2 de RSV auxiliares esenciales, específicamente las proteínas N, P, L y/o M2-ORF1. Además, el ARN genómico transcrito in vitro puede transfectarse en células infectadas con un virus heterólogo, por ejemplo, virus vaccinia, que expresen polimerasa de T7, lo que permite la expresión de proteínas auxiliares de ADNs plásmidos transfectados que contengan los genes de N, P, L y M2/ORF1 auxiliares.

Como alternativa a la transfección de ARN genómico transcrito in vitro, puede transfectarse ADN plásmido que contiene la construcción de cADN de RSV en células infectadas con un virus heterólogo, por ejemplo virus vaccinia, que exprese las proteínas de la cepa A2 de RSV auxiliares esenciales y polimerasa de T7, permitiendo por ello la transcripción del ARN genómico de RSV completo desde el ADN plásmido que contiene la construcción de cADN de RSV. El virus vaccinia no necesita sin embargo suministrar las propias proteínas auxiliares, sino sólo la polimerasa de T7; pueden expresarse después proteínas auxiliares desde plásmidos transfectados que contengan los genes de N, P, L y M2/ORF1 de RSV, situados apropiadamente adyacentes a sus propios promotores de T7.

Cuando virus de replicación proporciona la función auxiliar durante experimentos de rescate, se usa la cepa B9320 de RSV, permitiendo la diferenciación de rescate de progenie dirigida contra RSV B9320. La cepa A2 de RSV rescatada se identifica positivamente por la presencia de secuencias "marcadoras" de nucleótidos específicas insertadas en la copia de cADN del genoma de RSV antes del rescate.

El establecimiento de un sistema de rescate para cepa A2 de RSV nativa, es decir, "de tipo natural", permite introducir modificaciones en la copia de de cADN del genoma de RSV para construir RSV quimérico que contenga secuencias heterólogas de alguna manera con las de RSV nativo, de tal modo que pueda atenuarse en patogenicidad el virus rescatado resultante para proporcionar una vacuna humana segura y eficaz como se discute en la Sección 5.4 anterior. Las alteraciones genéticas requeridas para causar atenuación del virus pueden ser gruesas (por ejemplo, traslocación de genes completos y/o secuencias reguladoras dentro del genoma del virus) o pequeñas (por ejemplo, sustitución(es), adición(es) y/o supresión(es) simple(s) o múltiple(s) en dominios reguladores o funcionales clave dentro del genoma del virus), como se describe adicionalmente con detalle.

Además de la(s) alteración(es) (incluyendo alteración resultante de traslocación) del material genético de RSV para proporcionar secuencia heteróloga, este procedimiento permite la inserción de genes "extraños" (es decir, genes no nativos en RSV) o componentes genéticos de los mismos que presentan función biológica o antigenicidad de tal forma que den expresión de estos materiales genéticos; de esta manera, el RSV quimérico modificado puede actuar como un sistema de expresión para otras proteínas heterólogas o elementos genéticos, tales como ribozimas, ARN anti-sentido, oligorribonucleótidos específicos, con potencial profiláctico o terapéutico, u otras proteínas víricas con fines de vacuna.

6.1 Rescate de las secuencias líder y de remolque de la cepa A2 de RSV usando como virus auxiliar cepa B9320 de RSV 6.1.1 Virus y células

Aunque se usaron en este Ejemplo cepa A2 de RSV y cepa B9320 de RSV, eran sólo como ejemplos. Está dentro de la experiencia de la técnica usar otras cepas de virus RSV subgrupo A y RSV subgrupo B según las enseñanzas de este Ejemplo. Se abarcan por la invención métodos que emplean tales otras cepas.

La cepa A2 de RSV y la cepa B9320 de RSV se desarrollaron en células Hep-2 y células Vero respectivamente, y se usaron células 293 como hospedante durante los experimentos de transfección/rescate. Los tres linajes celulares se obtuvieron de ATCC (Rockville, Maryland).

6.1.2 Construcción & análisis funcional de plásmidos informadores

El plásmido pRSVA2CAT (Fig. 1) se construyó como se describe seguidamente.

Los cADNs de los componentes líder de 44 nucleótidos y de remolque de 155 nucleótidos de la cepa A2 de RSV (véase Mink et al., Virology 185:615-624 (1991); Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88:9663-9667 (1991)), incluyendo también el componente de remolque la secuencia de consenso de promotor de polimerasa de bacteriófago T7, se montaron separadamente por reasociación controlada de oligonucleótidos y complementariedad de superposición parcial (véase Fig. 1). Los oligonucleótidos usados en la reasociación se sintetizaron en un sintetizador de ADN de Applied Bosystems (Foster City, CA). Los oligonucleótidos separados y sus posiciones relativas en las secuencias líder y de remolque se indican en la Fig. 1. Los oligonucleótidos usados para construir la líder fueron:

1

Los oligonucleótidos usados para construir la remolque fueron:

2

Los cADNs líder y de remolque completos se ligaron después respectivamente a los lugares de XbaI y PstI del gen informador de cloranfenicol-acetil-transferasa (CAT) para formar una construcción de cADN de RSV/CAT de 1 kb lineal. Esta construcción de cADN se ligó después a los lugares de kpn I y Hind II de pUC19. La integridad de la construcción pRSVA2CAT final se comprobó por análisis en gel del tamaño de los productos de digestión de Xba I/Pst I y kpn I/Hind II. Los cADNs líder y de remolque completos se ligaron también al gen de proteína fluorescente verde (GFP) usando lugares de enzimas de restricción apropiados para formar una construcción de cADN lineal. La RSV-GFP-CAT resultante es una construcción informadora bicistrónica que expresa CAT y GFP.

La transcripción in vitro de pRSVA2CAT linealizada con Hga I con polimerasa de bacteriófago T7 se realizó según el método del suministrador de T7 (Promega Corporation, Madison, Wisconsin). Se infectaron células 293 confluentes en placas de seis pocillos (\sim1 x 106 células por pocillo) con cepa B9320 de RSV con 1 unidad de formación de placas (u.f.p.) por célula y se transfectaron 1 hora más tarde con 5-10 \mug del ARN transcrito in vitro de la construcción pRSVA2CAT. El procedimiento de transfección siguió el procedimiento de transfección de Collins et al., Virology 195:252-256 (1993) y empleó reactivos Transect/ACT^{TM} y Opti-MEM según las especificaciones del fabricante (Gibco-BRL, Bethesda, Maryland). A las 24 horas post-infección, se ensayó la actividad de CAT en las células 293 usando un método estándar (Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, Capítulo 9.6.2; Gorman et al., (1982) Mol. Cell Biol. 2: 1044-1051). La detección de altos niveles de actividad de CAT indicaban que el ARN de sentido negativo transcrito in vitro que contiene las regiones "líder" y de "remolque" del genoma de la cepa A2 de RSV y el gen de CAT pueden ser encapsidados, replicados y expresados usando proteínas suministradas por la cepa B9320 de RSV (véase Fig. 2). El nivel de actividad de CAT observado en estos experimentos fue al menos tal alto como el observado en experimentos de rescate similares en los que se usó como virus auxiliar cepa A2 de RSV homóloga. La capacidad de una cepa B9320 de RSV subgrupo B distinta antígenamente para soportar la emcapsidación, replicación y transcripción de un ARN de cepa A2 de RSV subgrupo A no se ha relatado formalmente hasta ahora a conocimiento de los inventores.

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6.2 Construcción de un cADN que representa el genoma completo de RSV

Para obtener una plantilla para síntesis de cADN, se purificó ARN genómico de RSV, que comprendía 15.222 nucleótidos, de células Hep-2 infectadas según el método descrito por Ward et al., J. Gen. Virol. 64:167-1876 (1983). En base a la secuencia de nucleótidos publicada de RSV, se sintetizaron oligonucleótidos usando un sintetizador de ADN de Applied Biosystems (Applied Biosystems, Foster City, CA) para actuar como cebadores para síntesis de la primera y segunda cadena de cADN de la plantilla de ARN genómico. Las secuencias de nucleótidos y las posiciones relativas de los cebadores de cADN y lugares de endonucleasas claves dentro del genoma de RSV se indican en la Fig. 3. La producción de cADNs de ARN genómico del virus se realizó según el método de transcripción inversa/reacción en cadena de polimerasa (RT/PCR) de Perkin Elmer Corporation, Norwalk, Connecticut (véase también Wang et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86:9717-9721); los cADNs multiplicados se purificaron por electroelución de la banda de ADN apropiada de geles de agarosa. Se ligó directamente ADN purificado al vector plásmido pCRII (Invitrogen Coro. San Diego) y se transformó en células de E. coli "One Shot" (Invitrogen) o células de E. coli "SURE" (Stratagene, San Diego). Los cADNs específicos del virus, clonados, resultantes, se montaron por técnicas de clonación estándares (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY, 1989) para producir un cADN que se extendía sobre el genoma de RSV completo. Se determinó la secuencia del genoma de cADN completo, y se sustituyeron las secuencias incorrectas por mutagénesis dirigida al lugar o ADN sintetizado químicamente. Se introdujeron sustituciones de nucleótidos en las bases 7291 y 7294 (estando el número de base 1 al comienzo del extremo 3' del ARN genómico) en el gen "F", para producir un nuevo lugar de endonucleasa Stu I, y en las posiciones 7423, 7424 y 7425 (también en el gen F) para producir un nuevo lugar de Pme I. Estos cambios se diseñaron para actuar como marcadores definitivos para sucesos de rescate. La polimerasa de bacteriófago T7 y el lugar de endonucleasa Hga I se pusieron en extremos opuestos del cADN del genoma del virus de tal modo que pueda sintetizarse in vitro ARN del genoma del virus de sentido negativo o positivo. Los cADNs que representan la secuencia de promotor de polimerasa de T7 y la secuencia de reconocimiento para Hga I se sintetizaron en un sintetizador de ADN de Applied Biosystems y se ligaron separadamente a los extremos del cADN del genoma del virus, o se añadieron como parte integral de cebadores de PCR durante la multiplicación de la porción terminal del cADN del genoma, cuando fue apropiado; se usó este último procedimiento cuando estaban ausentes lugares de endonucleasas apropiados cerca de los términos del cADN del genoma, impidiendo una ligación directa del cADN de promotor de T7/lugar de Hga I sintetizado químicamente al cADN del genoma. Esta construcción completa (cADN del genoma y secuencia de reconocimiento de promotor de T7/Hga I flanqueante) se clonó después en los lugares de Kpn I/Not I del fagémido Bluescript II SK (Stratagene, San Diego) del que se había separado el promotor de T7 endógeno por mutagénesis dirigida al lugar. Puede rescatarse ARN transcrito de esta construcción de genoma completo usando virus auxiliar del subgrupo B de RSV para dar RSV infeccioso según el Ejemplo 6.1. Puede emplearse este sistema de rescate básico para el ARN genómico de cepa A2 de RSV nativo, es decir, de "tipo natural" para introducir una variedad de modificaciones en la copia de cADN del genoma, produciendo la introducción en el genoma de secuencias heterólogas. Tales cambios pueden diseñarse para reducir patogenicidad vírica sin restringir la replicación del virus hasta un punto en el que se haga imposible el rescate o en el que la expresión de genes del virus sea insuficiente para estimular una inmunidad adecuada.

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Se usaron los siguientes oligonucleótidos para construir la secuencia de ribozima/terminador de T7:

3

Se generó un clon de cADN que contenía el genoma completo de RSV, un promotor de T7, una ribozima de virus de hepatitis delta y un terminador de T7. Esta construcción puede usarse para generar ARN antigenómico o RSV in vivo en presencia de polimerasa de T7. El análisis de secuencias indicó que el plásmido contenía pocas mutaciones en el genoma de RSV.

6.2.1 Modificaciones del genoma de RSV

Las modificaciones del genoma de ARN de RSV pueden comprender alteraciones gruesas de la estructura genética de RSV, tales como redistribución de genes. Por ejemplo, el gen M1 de RSV puede traslocarse a una posición más próxima al extremo 5' del genoma, con el fin de obtener ventaja del gradiente de 3' a 5' conocido en la expresión del gen del virus, produciendo niveles reducidos de expresión de proteína de M1 en células infectadas y reduciendo por ello la proporción de montaje y maduración del virus. Pueden traslocarse también apropiadamente otros genes y/o regiones reguladoras, en algunos casos desde otras cepas de RSV de origen humano o animal. Por ejemplo, el gen F (y posiblemente el gen "G") del subgrupo B de RSV humano podría insertarse en, de otra forma, un genoma de cepa A de RSV (en lugar de, o además, de los genes F y G de cepa A de RSV).

En otro método, puede traslocarse la secuencia de ARN de la proteína N de los virus RSV desde su lugar próximo a 3' a una posición más próxima al extremo 5' del genoma, tomando ventaja nuevamente del gradiente de 3' a 5' de la transcripción del gen para reducir el nivel de proteína N producida. Reduciendo el nivel de proteína N producida, resultaría un aumento concomitante de las proporciones relativas de transcripción de genes implicados en la estimulación de la inmunidad del hospedante a RSV y una reducción concomitante de la proporción relativa de replicación del genoma. Así, traslocando la secuencia de ARN de RSV que codifica proteína N de RSV, se producirá un virus RS quimérico que tenga patogenicidad atenuada con relación a RSV nativo.

Otro ejemplo de modificación de traslocación que da como resultado la producción de RSV quimérico atenuado comprende la traslocación de la secuencia de ARN de RSV que codifica la proteína L de RSV. Se cree que esta secuencia del virus RS es responsable de la producción de proteína de polimerasa vírica. Traslocando la secuencia de RSV que codifica proteína L de su posición 5' terminal nativa del genoma de RSV nativo a una posición en o cerca del término 3' del genoma, se producirá un virus RSV quimérico que presentará patogenicidad atenuada. Otro ejemplo de traslocación todavía comprende cambiar las posiciones de las secuencias de ARN de RSV que codifican las proteínas G y F de RSV (es decir, su relación entre sí en el genoma) para conseguir un RSV quimérico que tenga patogenicidad atenuada resultante de la ligera modificación en la cantidad de las proteínas G y F producidas. Se cree que tales modificaciones de redistribución de genes como se ejemplifican y discuten antes producen un RSV modificado quimérico que tiene patogenicidad atenuada en comparación con el material de partida RSV nativo. Las secuencias de nucleótidos para las proteínas codificadas anteriores son conocidas, como lo es la secuencia de nucleótidos para el genoma de RSV completo. Véase McIntosh, Respiratory Syncytial Virus in Virology, 2ª Ed. redactado por B.N. Fields, D.M. Knipe et al., Raven Press, Ltd. Nueva York, 1990 Capítulo 38, págs. 1045-1073, y las referencias citadas ahí.

Estas modificaciones pueden comprender adicional o alternativamente sustituciones, supresiones o adiciones de nucleótidos, simples o múltiples, específicas para el lugar, localizadas dentro de genes y/o dominios reguladores del genoma de RSV. Tales sustituciones, supresiones o adiciones simples o múltiples, específicas para el lugar pueden reducir la patogenicidad del virus sin atenuarlo excesivamente, por ejemplo, reduciendo el número de residuos de lisina o arginina en el lugar de división en la proteína F para reducir la eficacia de su división por proteasa de la célula hospedante (cuya división se cree una etapa esencial en activación funcional de la proteína F), y reducir por ello posiblemente virulencia. Pueden usarse también modificaciones específicas para el lugar en las regiones reguladoras 3' o 5' del genoma de RSV para aumentar la transcripción a expensas de la replicación del genoma. Además, puede hacerse manipulación localizada de los dominios dentro de la proteína N, que se cree que controla el cambio entre trascripción y replicación, para reducir la replicación del genoma pero permitiendo aún altos niveles de transcripción. Además, pueden alterarse el(los) dominio(s) citoplásmico(s) de las glicoproteínas G y F con el fin de reducir su proporción de migración a través del retículo endoplásmico y el aparato de Golgi de células infectadas, disminuyendo por ello la maduración del virus. En tales casos, puede ser suficiente modificar la migración de la proteína G sólo, que permitiría después sobre-regulación adicional de la producción de "F", el principal antígeno implicado en la estimulación de la producción de anticuerpos neutralizantes durante infecciones con RSV. Tales sustituciones, supresiones o adiciones localizadas dentro de genes y/o elementos reguladores del genoma de RSV se cree que producen RSV modificado quimérico que tiene también patogenicidad reducida con relación al genoma de RSV nativo.

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6.3 Rescate de un cADN que representa el genoma completo de RSV 6.3.1 La construcción y análisis funcional de plásmidos de expresión

Los genes de N, P y L de RSV codifican la polimerasa vírica de RSV. La función de los genes de M de RSV es desconocida. La capacidad de plásmidos de expresión de N, P, M y L de RSV para servir a la función de proteínas de cepa A2 de RSV auxiliares se valoró como se describe después. Los genes de N, P, L y M2-1 de RSV se clonaron en el vector PCITE 2a(+) modificado (Novagen, Madison, WI) bajo el control del promotor de T7 y se flanquearon por un terminador de T7 en su extremo 3'. PCITE-2a(+) se modificó por inserción de una secuencia de terminador de T7 de PCITE-3a(+) en los lugares de Alwn I y Bgl II de PCITE-2a(+). La funcionalidad de los plásmidos de expresión de N, P y L se determinó por su capacidad para replicar el pRSVA2CAT transfectado. Con aproximadamente 80% de confluencia, se infectaron células Hep-2 en placas de seis pocillos con MVA con una moi de 5. Después de 1 hora, las células infectadas se transfectaron con pRSVA2CAT (0,5 mg) y plásmidos que codifican los genes de N (0,4 mg), P (0,4 mg) y L (0,2 mg) usando lipofec TACE (Life Technologies, Galthersburg, M.D.). La transfección transcurrió durante 5 horas o durante la noche y se sustituyó después el medio de transfección con MEM reciente que contenía 2% de FBS (suero de bovino fetal). Dos días después de la infección, se lisaron las células y se analizó en los lisados la actividad de CAT usando el juego CAT ELISA de Boehringer Mannheim. Se detectó actividad de CAT en células que se habían transfectado con plásmidos de N, P y L junto con pRSVA2CAT. Sin embargo, no se detectó actividad de CAT cuando se omitió uno cualquiera de los plásmidos de expresión. Además, la co-transfección de RSV-GFP-CAT con los plásmidos de expresión de N, P y L produjo expresión de proteínas de GFP y CAT. Las relaciones de diferentes plásmidos de expresión y moi del virus vaccinia recombinante se optimizaron en el sistema de expresión del gen informador.

6.3.2. Recuperación de RSV infeccioso del cADN de RSV completo

Se infectaron células Hep-2 con MVA (virus vaccinia recombinante que expresa polimerasa de T7) con una moi de uno. Cincuenta minutos después, se añadió a las células mezcla de transfección. La mezcla de transfección consistía en 2 \mug de vector de expresión de N, 2 \mug de vector de expresión de P, 1 \mug de vector de expresión de L, 1,25 \mug de vector de expresión de M2/ORF1, 2 \mug de clon de genoma de RSV con promotor aumentado, 50 \mul de LipofecTACE (Life Technologies, Galthersburg, M.D.) y 1 ml de OPTI-MEM. Un día después, la mezcla de transfección se sustituyó por MEM que contenía 2% de FCS. Se incubaron las células a 37ºC durante 2 días. El sobrenadante de transfección se cosechó y usó para infectar células Hep-2 nuevas en presencia de 40 \mug/ml de arac (fármaco contra virus vaccinia). Las células Hep-2 infectadas se incubaron durante 7 días. Después de cosechar el sobrenadante P1, se usaron células para inmunocolorear usando anticuerpos dirigidos contra proteína F de cepa A2 de RSV. Se identificaron seis lugares coloreados establemente con fusión célula-célula visible (típica para infección con RSV). El ARN se extrajo de sobrenadante P1 y se usó como plantilla para análisis de RT-PCR. Se generaron productos de PCR correspondientes a regiones de F y M2, y ambos productos contenían los marcadores introducidos. En el testigo, los productos de PCR derivados de virus RSV natural carecían de los marcadores.

Se creó una mutación puntual en posición 4 de la secuencia líder del clon del genoma de RSV (residuo C a G) y este clon del genoma se designó pRSVC4GLwt. Este clon se ha mostrado en un contexto de gen informador para aumentar la actividad del promotor en varias veces comparado con el tipo natural. Después de introducir esta mutación en el genoma de longitud completa, se rescató virus infeccioso del clon de cADN. El virus RSV recombinante rescatado formaba placas más pequeñas que el virus RSV de tipo natural (Figura 8).

Este sistema permite el rescate de RSV mutado. Por tanto, puede ser una herramienta excelente para diseñar vacunas atenuadas vivas contra RSV y usar vector de RSV y virus para conseguir expresión de gen heterólogo. Puede ser posible expresar proteína G de RSV tipo B en el fondo de tipo A, de modo que la vacuna sea capaz de proteger la infección con RSV de tipo A y tipo B. También puede ser posible conseguir atenuación y mutaciones sensibles a la temperatura en el genoma de RSV, cambiando el orden de genes o por mutagénesis dirigida al lugar de la proteína L.

6.4 Uso de anticuerpos monoclonales para diferenciar virus rescatado de virus auxiliar

Con el fin de neutralizar el virus auxiliar de la cepa B9320 de RSV y facilitar la identificación de cepa A2 de RSV rescatada, se fabricaron anticuerpos monoclonales contra cepa B9320 de RSV.

Se infectaron intranasalmente (i.n.) seis ratones hembras BALB/c con 105 unidades de formación de placas (u.f.p.) de RSV B9320, seguido 5 semanas después por inoculación intraperitoneal (i.p.) con 106-107 ufp de RSV B9320 en una mezcla que contenía 50% de coadyuvante de Feund completo. Dos semanas después de la inoculación i.p., se ensayó en una muestra de sangre de cada ratón la presencia de anticuerpo específico para RSV usando un ensayo de neutralización estándar (Beeler y Coelingh, J. Virol. 63:2941-2950 (1988)). Se reforzaron después adicionalmente ratones que producían el nivel más alto de anticuerpo neutralizante con 106 u.f.p. de la cepa B9320 de RSV en solución salina tamponada con fosfato (PBS), inyectadas intravenosamente en la base de la cola. Tres días después, se sacrificaron los ratones y se recogieron sus bazos como fuente de células B productoras de anticuerpo monoclonal. Se desgarraron esplenocitos (incluyendo células B) del bazo de los ratones a través de incisiones hechas en la cápsula del bazo en 5 ml de Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DME). Se dejaron sedimentar agregados de células, y las células suspendidas restantes se recogieron separadamente por centrifugación a 2.000 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Estos glóbulos de células se resuspendieron en 15 ml de NH4Cl del 0,83 (p/v) y se dejaron reposar durante 5 minutos para lisar glóbulos rojos. Se recogieron después esplenocitos por centrifugación como antes a través de una almohadilla de 10 ml de suero de becerro fetal. Se enjuagaron después los esplenocitos en DME, se reglobulizaron y se resuspendieron finalmente en 20 ml de DME reciente. Se mezclaron después estos esplencitos con células Sp2/0 (un linaje celular de mieloma de ratón usado como compañeros de fusión para la inmortalización de esplenocitos) en una relación de 10:1, células de bazo:células Sp2/0. Las células Sp2/0 se obtuvieron de la ATCC y se mantuvieron en DME suplementado con 10% de suero de bovino fetal. Se centrifugó después la mezcla de células durante 8 minutos a 2.000 x g a temperatura ambiente. El glóbulo de células se resuspendió en 1 ml de polietilenglicol peso molecular 1.000 (PEG 1000) al 50%, seguido por adición de volúmenes iguales de DME a intervalos de 1 minuto hasta alcanzar un volumen final de 25 ml. Las células fusionadas se globulizaron después como antes y se resuspendieron en 3,5 x 106 células de bazo por ml en medio de crecimiento (medio acondicionado al 50% de células Sp2/0, medio HA al 50% que contenía 100 ml de RPMI, 25 ml de FCS, 100 \mug/ml de gentamicina, 4 ml de medio 50 X de hipoxantina, timidina, aminopterina (HAT) suministrado como una mezcla preparada de Sigma Chem. Co., St. Louis, MO). La suspensión de células se distribuyó sobre placas de pocillos (200 \mul/pocillo) y se incubó a 37ºC, humedad del 95% y 5% de CO2. Se subcultivaron después colonias de células de hibridomas (esplenocitos fusionados y células Sp2/0) en placas de 24 pocillos y se desarrollaron hasta casi confluentes; se tomaron después muestras del medio de crecimiento sobrenadante para detectar la presencia de anticuerpo monoclonal neutralizante de cepa B9320 de RSV, usando un ensayo de neutralización estándar (Beeler y Coelingh, J. Virol. 63:2941-50 (1988)). Se resuspendieron células de hibridomas de pocillos con actividad neutralizante en medio de crecimiento y se diluyeron para dar una densidad de células de 0,5 células por 100 \mul y se pusieron en placas de 96 pocillos, 200 \mul por pocillo. Este procedimiento aseguró la producción de monoclones (es decir, linajes celulares de hibridomas derivados de una célula simple) en los que se volvió a ensayar la producción de anticuerpo monoclonal neutralizante. Los linajes celulares de hibridomas que producían anticuerpo monoclonal capaz de neutralizar cepa B9329 de RSV pero no cepa A2 de RSV se infectaron seguidamente en ratones, i.p. (106 células por ratón). Dos semanas después de la inyección i.p., se sacó fluido ascítico de los ratones que contenía anticuerpo monoclonal neutralizante para cepa B9320 de RSV con una aguja de calibre 19 y se guardó a -20ºC.

Este anticuerpo monoclonal se usó para neutralizar al virus auxiliar de la cepa B9329 de RSV tras el rescate de la cepa A2 de RSV como se describe en la Sección 9.1. Esto se realizó diluyendo anticuerpo monoclonal neutralizante 1 en 50 con agar del 0,4% (p/v) fundido en Medio Esencial Mínimo de Eagle (EMEM) que contenía 1% de FCS. Esta mezcla se añadió después a monocapas de células Hep-2, que se habían infectado con la progenie de experimentos de rescate con una moi de 0,1-0,01 u.f.p. por célula. El anticuerpo monoclonal en el agar inhibió superpuesto el crecimiento de la cepa B9320 de RSV, pero permitió el crecimiento de la cepa A2 de RSV, produciendo formación de placas por la cepa A2. Estas placas se cogieron usando una pipeta pasteur para separar un tapón de agar sobre la placa y las células infectadas dentro de la placa; las células y el tapón de agar se resuspendieron en 2 ml de EMEM, 1% de FCS, y se puso en placa e nuevo el virus liberado en presencia de anticuerpo monoclonal en una monocapa de células Hep-2 nuevas para purificar adicionalmente del virus auxiliar. El virus puesto en placa dos veces se usó después para infectar células Hep-2 en placas de 24 pocillos, y se usó la progenie de eso para infectar placas de seis pocillos con una moi de 0,1 u.f.p. por célula. Finalmente, se usó ARN de células infectadas total de un pocillo de una placa de seis pocillos en una reacción de RT/PCR usando cebadores de primera y segunda cadenas a cada lado de las "secuencias marcadoras" (introducidas en el genoma de la cepa A2 de RSV para actuar como medio de reconocimiento de sucesos de rescate) como se describe en la Sección 6.2 anterior. El ADN producido de la reacción de RT/PCR se digirió a continuación con Stu I y Pme I para identificar positivamente las "secuencias marcadoras" introducidas en el cADN de la cepa A2 de RSV, y establecer por ello la validez del procedimiento de rescate.

7. Rescate de partículas de RSV infecciosas en ausencia de expresión de M2 (sólo para ilustración)

Los siguientes experimentos se realizaron para comparar las eficacias de rescate de viriones de RS en presencia y ausencia del gen M2/ORF1. Si no se requiere la función del gen M2/ORF1 para conseguir rescate de partículas de RSV infecciosas de RSV, debe ser posible rescatar viriones de RS en ausencia de la expresión de la función del gen M2/ORF1. En los presentes análisis, células Hep-2 que son susceptibles a replicación de RSV se co-transfectaron con plásmidos que codifican los genes de "N", "P" y "L" de la polimerasa vírica de RSV y el cADN correspondiente al antigenoma de longitud completa de RSV, en presencia o ausencia de ADN plásmido que codifica el gen M2/ORF1, y se midió el número de unidades infecciosa de RSV con el fin de determinar si se requería o no el producto del gen M2/ORF1 para rescatar partículas de RSV infecciosas.

Se usaron los siguientes plásmidos en los experimentos descritos después: un clon de cADN que codifica el antigenoma de longitud completa de la cepa A2 de RSV, denominado pRSVC4GLwt; y plásmidos que codifican las proteínas de polimerasa N, P y L, y un plásmido que codifica el factor de alargamiento de M2/ORF1, cada uno aguas abajo de un promotor de ARN de T7, designado por el nombre de la proteína vírica codificada.

Se transfectó pRSVC4GLwt, junto con plásmidos que codifican proteínas N, P y L, en células Hep-2 que se habían preinfectado con un virus vaccinia recombinante que expresa la polimerasa de ARN de T7 (denominado MVA). En otro grupo de células Hep-2, se co-transfectó pRSVC4GLwt con plásmidos que codifican las proteínas de polimerasa N, P y L, y además un plásmido que codifica la función de M2. La transfección y recuperación de RSV recombinante se realizaron como sigue: se dividieron células Hep-2 en placas de seis pocillos (35 mm por pocillo) 5 horas o 24 horas antes de la transfección. Cada pocillo contenía aproximadamente 1 x 106 células que se desarrollaron en MEM (medio esencial mínimo) que contenía 10% de FBS (suero de bovino fetal). Se infectaron monocapas de células Hep-2 del 70-80% de confluencia con MVA con una multiplicidad de infección (moi) de 5 y se incubaron a 35ºC durante 60 minutos. Se lavaron después las células una vez con OPTI-MEM (Life Technologies) y se sustituyó el medio de cada placa con 1 ml de OPTI-MEM y 0,2 ml de la mezcla de transfección. La mezcla de transfección se preparó mezclando los cuatro plásmidos, pRSVC4GLwt, plásmidos de N, P y L, en un volumen final de 0,1 ml de OPT-MEM en cantidades de 0,5-0,6 \mug de pRSVC4GLwt, 0,4 \mug de plásmido de N, 0,4 \mug de plásmido de P y 0,2 \mug de plásmido de L. Se preparó una segunda mezcla que incluía adicionalmente 0,4 \mug de plásmido de M2/ORF1. Las mezclas de plásmidos de 0,1 ml se combinaron con 0,1 ml de OPTI-MEM que contenía 10 \mul de lipofecTACE (Life Technologies, Gaithersburg, M.D.) para constituir la mezcla de transfección completa. Después de una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente, la mezcla de transfección se añadió a las células, y un día después se sustituyó ésta por MEM que contenía 2% de FBS. Se incubaron cultivos a 35ºC durante 3 días, en cuyo momento se cosecharon los sobrenadantes. Las células se incubaron a 35ºC porque el virus MVA es ligeramente sensible a la temperatura y es mucho más eficaz a 35ºC.

Tres días después de la transfección se ensayó en los sobrenadantes de células transfectadas la presencia de unidades infecciosas de RSV mediante un inmunoensayo que indicaría la presencia de partículas empaquetadas de RSV (véase Tabla I). En este ensayo, se hicieron pasar 0,3-0,4 ml de los sobrenadantes de cultivo sobre células Hep-2 nuevas (no infectadas) y se recubrieron con metilcelulosa del 1% y 1 x medio L15 que contenía 2% de FBS. Después de incubación durante 6 días, se cosechó el sobrenadante y las células se fijaron y colorearon por un método de peroxidasa de rábano picante indirecto, usando un anticuerpo anti-RSV de cabra que reconoce a la partícula vírica de RSV (Biogenesis, Sandown, NH) seguido por un anticuerpo anti-cabra de conejo conjugado a peroxidasa de rábano picante. Los complejos de anticuerpo que se unieron a células infectadas con RSV se detectaron por adición de sustrato cromógeno de AEC-(3-amino-9-etilcarbazol) (DAKO) según las instrucciones del fabricante. Las placas de RSV se indicaron por una coloración negra-marrón resultante de la reacción entre el sustrato cromógeno y los complejos RSV-anticuerpo unidos a las placas. El número de placas de RSV se expresa como el número de unidades de formación de placas (u.f.p.) por 0,5 ml de sobrenadante de transfección (véase Tabla I).

Las comparaciones de la cantidad de viriones de RS recuperados de los sobrenadantes de placas de transfección en presencia o ausencia de M2/OFR1 se muestran en la Tabla I. Los resultados de cuatro experimentos separados demostraron que la ausencia de M2/ORF1 del ensayo de transfección no disminuyó el número de unidades infecciosas de RSV observadas. Así, los resultados de estos experimentos indican claramente que puede rescatarse RSV en ausencia del M2/ORF1 de células transfectadas sólo con plásmidos que codifican las tres proteínas de polimerasa, N, P y L, y el cADN que codifica el antigenoma de RSV de longitud completa. El rescate de viriones de RSV verdadero en ausencia de M2/ORF1 se indicó adicionalmente por la capacidad para pasar el RSV recombinante rescatado durante hasta seis pasadas. Por tanto, la producción de viriones de RSV no depende de la expresión del gen M2/ORF1, ni la inclusión del gen M2/ORF1 en el ensayo de transfección aumenta la eficacia de rescate de RSV verdadero.

TABLA I La producción de RSV infeccioso mediante transfección de plásmido no depende de la expresión de M2/ORF1

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8. Ejemplo: expresión de proteínas de subgrupo de RSV B-G y -F por cepa A2 de RSV (sólo para ilustración)

Los siguientes experimentos se realizaron para generar un RSV quimérico que expresa los polipéptidos antígenos de más de una cepa de RSV. Dos subgrupos antígenos principales (A y B) del virus sincitial respiratorio (RSV) causan enfermedades humanas. Las glicoproteínas F y G son los dos principales determinantes antígenos de RSV. Las glicoproteínas F de virus de los subgrupos A y B se estima que están relacionadas al 50%, mientras que la relación de las glicoproteínas G es considerablemente menor, aproximadamente 1-5%. La infección de subgrupo A de RSV induce resistencia parcial o nula a la replicación de una cepa de subgrupo B y viceversa. Se necesitan ambas vacunas de virus RSV subgrupo A y subgrupo B para proteger de la infección con RSV.

El primer método descrito aquí es para hacer un clon de cADN de RSV quimérico infeccioso que exprese antígenos de subgrupo B sustituyendo la región de G y F de clones de cADN de RSV A2 con genes de subgrupos B-G y -F. El RSV quimérico sería antígeno específico de subgrupo B. El segundo método descrito aquí es insertar gen de subgrupos B-G en el clon de cADN de A2 actual de manera que un virus expresaría antígenos específicos de subgrupos A y B.

8.1 Sustitución de genes de G y F de A2 por G y F de B9320

Los genes G y F de cepa B9320 de subgrupo B de RSV se multiplicaron a partir de vARN de B9320 por RT/PCR y se clonaron en vector pCRII para determinación de secuencia. El lugar de BamH I se creó en los cebadores de oligonucleótidos usados para RT/PCR con el fin de clonar los genes G y F de la cepa B9320 en cADN antigenómico de A2 (Fig. 4A). Un fragmento de cADN que contenía genes G y F de 4326 nt a 9387 nt de la cepa A2 se subclonó primero en pUC19 (pUCR/H). Se crearon lugares de Bgl II en las posiciones de 4630 (unión intergénica SH/G) y 7554 (unión intergénica F/M2) respectivamente, por un juego de mutagénesis dirigida al lugar Quickchange (Stratagene, La Jolla, CA). Se digirió cADN de G y F de B9320 insertado en vector pCR.II y se subclonó después en pUCR/H digerido con Bgl II del que se habían separado los genes G y F de A2. El clon de cADN con genes G y F de A2 sustituidos por G y F de B9320 se usó para sustituir la región de Xho I a Msc I del cADN antigenómico de A2 de longitud completa. El clon de cADN antigenómico resultante se denominó pRSVB-GF y se usó para transfectar células Hep-2 para generar virus RSVB-GF infeccioso.

La generación de virus RSVB-GF quimérico fue como sigue: se transfectó pRSVB-GF, junto con plásmidos que codifican proteínas N, P, L y M2/ORF1, en células Hep-2 que se habían infectado con MVA, un virus vaccinia recombinante que expresa la polimerasa de ARN de T7. Se dividieron células Hep-2 un día antes de la transfección en placas de seis pocillos. Se infectaron monocapas de células Hep-2 con 60%-70% de confluencia con MVA en una moi de 5 y se incubaron a 35ºC durante 60 min. Se lavaron después las células una vez con OPTI-MEM (Life Technologies, Gaithersburg, MD). Se sustituyó cada placa con 1 ml de OPTI-MEM y se añadió con 0,2 ml de medio de transfección. El medio de transfección se preparó mezclando cinco plásmidos en un volumen final de 0,1 ml de medio OPTI-MEM, a saber, 0,6 \mug de pRSVB-GF antigenoma de RSV, 0,4 \mug de plásmido de N, 0,4 \mug de plásmido de P, 0,2 \mug de plásmido de L y 0,4 \mug de plásmido de M2/ORF1. Esto se combinó con 0,1 ml de OPTI-MEM que contenía 10 \mul de lipofecTACE (Life Technologies, Gaithersburg, MD EE.UU.). Después de una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente, el ADN/LipofecTACE se añadió a las células y se sustituyó el medio un día después por MEM que contenía 2% de FBS. Se incubaron adicionalmente los cultivos a 35ºC durante 3 días y se cosecharon los sobrenadantes. Se usaron después partes alícuotas de los sobrenadantes de cultivo (PO) para infectar células Hep-2 nuevas. Después de incubación durante 6 días a 35ºC, se cosechó el sobrenadante y las células se fijaron y colorearon por un método de peroxidasa de rábano picante indirecto usando anticuerpo anti-RSV de cabra (Biogenesis, Sandown, NH) seguido por un anticuerpo anti-cabra de conejo enlazado a peroxidasa de rábano picante. Se detectaron después las células infectadas con virus por adición de sustrato cromógeno (DAKO, Carpintería, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Se detectaron placas de tipo RSV en las células que estaban infectadas con los sobrenadantes de células transfectadas con pRSVB-GF. El virus se purificó en placa adicionalmente dos veces y se multiplicó en células Hep-2.

Se caracterizó virus RSVB-GF recombinante por RT/PCR usando cebadores específicos de subgrupo B de RSV. Dos aislados de virus RSVB-GF recombinante purificados independientemente se extrajeron con un juego de extracción de ARN (Tel-Test, Friendswood, TX) y se precipitó ARN por isopropanol. Se reasociaron ARNs de viriones con un cebador que se extendía en la región de RSV desde los nt 4468 a 4482 y se incubaron durante 1 h en condiciones de RT estándares (reacciones de 10 \mul) usando transcriptasa inversa superscript (Life Technologies, Gaithersburg, MD). Se sometieron partes alícuotas de cada reacción a PCR (30 ciclos a 94ºC durante 30 s, 55ºC durante 30 s y 72ºC durante 2 min) usando cebadores específicos del subgrupo B en la región G (CACCACCTACCTTACTCAAGT y TTTGTTTGTGGGTTTGAGGTTGG). Los productos de PCR se analizaron por electroforesis en gel de agarosa de \sim1% y se visualizaron por coloración con bromuro de etidio. Como se muestra en la Fig. 5, no se produjo producto de ADN en reacciones de RT/PCR usando como plantilla cepa A2 de RSV. Sin embargo, se detectó un producto predicho de 254 pb en reacciones de RT/PCR utilizando ARN de RSVB-GF o el plásmido testigo de PCR, ADN d pRSVB-GF, como plantilla, indicando que el virus rescatado contenía genes G y F derivados de virus B9320.

8.2 Expresión de B9320G por virus RSV A2

Se multiplicó gen G de la cepa B9320 del subgrupo B de RSV a partir de vARN de B9320 por RT/PCR y se clonó en vector pCRII para determinación de secuencia. Se incorporaron dos lugares de Bgl II a los cebadores de PCR que contenían también señales de comienzo del gen y final del gen (GATATCAAGATCTACAATAACATTGGGGCAAATCG y GCTAAGAGATCTTTTTGAATAACTAAGCATG). Se digirió el inserto de cADN de B9303G con Bgl II y se clonó en la unión intergénica SH/G (4630 nt) o F/M2 (7552 nt) de un subclon de cADN de A2 (Fig. 4B y Fig. 4C). El fragmento de Xho I a Msc I que contenía la inserción de B9320G en la región intergénica SH/G o F/M2 se usó para sustituir a la región correspondiente de Xho I a Msc I del cADN antigenómico de A2. El clon de cADN antigenómico de RSV resultante se denominó pRSVB9320G-SH/G o pRSVB9320G-F/M2.

La generación de virus RSV A2 que tenía el gen B9320 G insertado en la región intergénica F/M2 se realizó de modo similar al que se ha descrito para generación de virus RSVB-GF. Brevemente, pRSVB9320G-F/M2 junto con plásmidos que codifican proteínas N, P y L se transfectaron en células Hep-2, infectadas con un recombinante de virus vaccinia MVA, que expresa la polimerasa de ARN de T7 (Life Technologies, Gaithersburg, M.D.). El medio de células transfectadas se sustituyó por MEM que contenía 2% de suero de bovino fetal (FBS) un día después de la transfección y se incubó adicionalmente durante 3 días a 35ºC. Se usaron después partes alícuotas de sobrenadantes de cultivo (PO) para infectar células Hep-2 nuevas. Después de incubación durante 6 días a 35ºC, se cosechó el sobrenadante y las células se fijaron y colorearon por un método de peroxidasa de rábano picante indirecto usando anticuerpo anti-RSV de cabra (Biogenesis) seguido por un anticuerpo anti-cabra de conejo enlazado a peroxidasa de rábano picante. Se detectaron después las células infectadas con virus por adición de sustrato cromógeno (Dako). Se detectaron placas tipo RSV en las células que se infectaron con los sobrenadantes de células transfectadas con pRSVB9320G/F/M2.

La caracterización del virus pRSVB9320G-F/M2 se realizó por RT/PCR usando cebadores específicos de B9320G. Se vio un producto de PCR predicho de 410 pb en una muestra de RT/PCR usando como plantilla ARN de
pRSVB9320G-F/M2, indicando que el virus rescatado contenía gen G derivado de B9320 (Figura 6).

La expresión del gen G de B9320 de RSV insertado se analizó por manchas de Northern usando oligonucleótido marcado con 32P específico para mARN de A2-G o B-G. Se extrajo el ARN celular total de células Hep-2 infectadas con RSVB 9320 de tipo natural, rRSVA2 o rRSVB9320G-F/M2 48 horas después de la infección usando un juego de extracción de ARN (RNA stat-60, Tel-Test). El ARN se sometió a electroforesis en un gel de agarosa del 1,2% que contenía formaldehído y se transfirió a una membrana de nylon (Amersham). Un oligonucleótido específico para el gen G de la cepa A2 (5'TCTTGACTGTTGTGGATTGCAGGGTTGACTTGACTCCGATCGATCC-3') y un oligonucleótido específico para el gen G de B9320 (5'CTTGTGTTGTTGTTGTATGGTGTGTTTCTGATTTTGTATTGATCGATCC-3') se marcaron con 32P-ATP mediante una reacción de quinasación conocida por los de experiencia ordinaria en la técnica. La hibridación de la membrana con uno de los oligonucleótidos específicos de gen G marcado con 32P se realizó a 65ºC y se lavó según el procedimiento estándar. Ambos ARN específicos de A2-G y B9320-G se detectaron en las células Hep-2 infectadas con rRSVB9320G-F/M2 (Figura 6B). Estos resultados demuestran la expresión de ARN específico del subtipo.

Se comparó la expresión de proteína del rRSVA2(B-G) quimérico con la de B9320 de RSV y rRSV por inmunoprecipitación de lisados de células Hep-2 infectadas marcadas con 35S. Brevemente, las células infectadas con virus se marcaron con 35S-promix (100 \muCi/ml de 35S-cys y 35S-met, Amersham, Arlington Heights, IL) a las 14 horas a 18 horas post-infección según un método conocido por los de experiencia ordinaria en la técnica. Las monocapas de células se lisaron mediante tampón RIPA y los polipéptidos se inmunoprecipitaron con antisuero policlonal producido en cabra contra virus RSV A2 roto con detergente (Fig. 7, pistas 1-4) o antisuero producido en ratones contra viriones de B9320 no rotos (Fig. 7, pistas 5-8). Los polipéptidos inmunoprecipitados radiomarcados se sometieron a electroforesis en geles de poliacrilamida del 10% que contenían 0,1% de SDS y se detectaron por autorradiografía. El suero anti-RSV A2 inmunoprecipitó los polipéptidos principales de la cepa A2 de RSV, mientras que el suero anti-B9320 reaccionó principalmente con proteína G de RSV B9320 y la proteína F conservada de ambos subgrupos A y B. Como se muestra en la Fig. 7, una proteína que es idéntica a la proteína A2-G (pista 3) se inmunoprecipitó de las células infectadas con rRSVA2(B-G) (pista 4) usando un antisuero contra RSV A2. La proteína G de la cepa B9320 de RSV no se reconoció por el antisuero anti-A2. Una especie de proteína, más pequeña que la proteína A2-G, se inmunoprecipitó de ambas células infectadas con B9320 (pista 6) y rRSVA2(B-G) (pista 9) usando el antisuero producido en ratones contra viriones de B9320. Este polipéptido no estaba presente en las células no infectadas e infectadas con RSV A2 y probablemente es para representar la proteína G específica para la cepa B9320 de RSV. Una comparación de secuencias de aminoácidos de ambas proteínas G de RSV A2 y B9320 indicaba que están presentes dos lugares de N-glicosilación potencial adicionales (N-X-S/t) en la proteína RSV A2G, que puede contribuir a una migración más lenta de la proteína G de A2 en las condiciones usadas. La proteína F de RSV B9320 migraba también ligeramente más rápido que la proteína F de RSV A2. Las proteínas P y M mostraban también diferencias de movilidad entre los dos subtipos de virus. No se conoce la identidad del polipéptido cerca de la parte superior del gel de proteína presente en células infectadas con RSV B9320 y rRSVA2(B-G). Los antisueros producidos en ratones contra los viriones de RSV B9320 reconocían pobremente las proteínas N, P y M en comparación con el antisuero de cabra producido contra la cepa A2 de RSV. Los datos descritos antes indican claramente que rRSV A2(B-G) quimérico expresa ambas proteínas G específicas de RSV A2 y B9320.

8.2.1 Replicación de RSV recombinante en cultivo de tejidos

Se purificaron en placa tres veces virus RS recombinantes y se multiplicaron en células Hep-2. Se realizaron ensayos en placa en células Hep-2 en placas de 12 pocillos usando un recubrimiento de 1% de metilcelulosa y 1 x medio L15 que contenía 2% de suero de bovino fetal (FBS). Después de incubación a 35ºC durante 6 días, las monocapas se fijaron con metanol y se identificaron placas por inmunocoloración. El tamaño y morfología de placas de rRSV fueron muy similares a los de A2 RSV de tipo natural (Fig. 8). Sin embargo, las placas formadas por rRSVC4G eran más pequeñas que las de rRSV y virus A2 de tipo natural. La única diferencia genética entre rRSV y rRSVC4 era una sustitución de nucleótidos simple en la región líder de RSV. Por tanto, el menor tamaño de placas de rRSV A2(B-G) no era distinguible del de rRSVC4G.

Se compararon las curvas de crecimiento de rRSV, rRSVC4G y rRSV A2 (B-G) con la del virus A2 de tipo natural derivado biológicamente. Se desarrollaron células Hep-2 en matraces de cultivo T25 y se infectaron con rRSV, rRSVC4G, rRSVA2(B-G) o cepa A2 de vRSV de tipo natural con una moi de 0,5. Después de 1 hora de adsorción a 37ºC, las células se lavaron tres veces con MEM que contenía 2% de FBS y se incubaron a 37ºC en 5% de CO2. A intervalos de 4 horas post-infección, se recogieron 250 \mul del sobrenadante de cultivo y se guardaron a -70ºC hasta titulación de virus. Cada parte alícuota tomada se sustituyó con una cantidad igual de medio nuevo. El título de cada virus se determinó por ensayo en placa sobre células Hep-2 y se visualizó por inmunocoloración (véase antes). Como se muestra en la Fig. 9, la cinética de crecimiento de rRSV es muy similar a la de virus A2 de tipo natural. El título de virus máximo para todos los virus se consiguió entre 48 h y 72 h. El título de virus de rRSVC4G fue aproximadamente 2,4 veces (a las 48 h) y 6,6 veces (a las 72 h) más bajo que rRSV y A2 RSV de tipo natural. El escaso crecimiento de rRSVC4G puede deberse también al cambio de nucleótidos simple en la región líder. El rRSV A2(B-G) quimérico mostraba una cinética más lenta y título de pico más bajo (Fig. 9).

9. Ejemplo: generación de mutantes de gen L de RSV (sólo para ilustración)

La estrategia para generar mutantes de gen L es introducir mutaciones definidas o mutaciones aleatorias en el gen L de RSV. La funcionalidad de los mutantes de cADN de gen L puede examinarse in vitro por un sistema de replicación de minigenoma. Los mutantes de gen L recuperados se analizan después adicionalmente in vitro e in vivo.

9.1 Estrategias de mutagénesis 9.1.1 Mutagénesis de escaneo para cambiar los aminoácidos cargados agrupados a alanina

Se ha mostrado que esta estrategia de mutagénesis es particularmente eficaz para fijar como objetivo sistemáticamente dominios funcionales expuestos en superficies de proteínas. La razón fundamental es que agrupaciones de residuos cargados no están enterrados generalmente en la estructura de la proteína. Hacer sustituciones conservadoras de estos residuos cargados con alaninas separará por tanto las cargas sin cambiar groseramente la estructura de la proteína. La rotura de agrupaciones cargadas puede interferir con la interacción de la proteína L de RSV con otras proteínas y hacer su actividad termosensible, produciendo por ello mutantes sensibles a la temperatura.

Una agrupación se definió originalmente de manera arbitraria como una extensión de 5 aminoácidos en la que dos o más residuos son residuos cargados. Para mutagénesis de escaneo, todos los residuos cargados de las agrupaciones pueden cambiarse a alaninas por mutagénesis dirigida al lugar. Debido al gran tamaño del gen de L de RSV, hay muchos residuos cargados agrupados en la proteína L. Por tanto, sólo se fijaron como objetivo residuos cargados contiguos de 3 a 5 aminoácidos por todo el gen de L completo (Fig. 10). La proteína L de RSV contiene 2 agrupaciones de cinco residuos cargados contiguos, 2 agrupaciones de cuatro residuos cargados contiguos y 17 agrupaciones de tres residuos cargados contiguos. Se sustituyeron con alaninas de dos a cuatro de los residuos cargados de cada agrupación.

La primera etapa de la invención fue introducir los cambios en pCITE-L que contiene el gen de L de RSV completo, usando un juego de mutagénesis dirigida al lugar QuikChange (Stratagene). Las mutaciones introducidas se confirmaron después por análisis de secuencia.

9.1.2. Mutagénesis de escaneo de cisteína

Las cisteínas son buenos objetivos para mutagénesis porque están implicadas frecuentemente en formaciones de enlaces intramoleculares e intermoleculares. Cambiando cisteínas a glicinas o alaninas, puede alterarse la estabilidad y función de una proteína por la rotura de su estructura terciaria. Están presentes treinta y nueve residuos de cisteína en la proteína L de RSV (Fig. 11). La comparación de la proteína L de RSV con otros miembros de los paramyxovirus indica que algunos de los residuos de cisteína están conservados.

Se cambiaron cinco residuos de cisteína conservados a valina (cambio conservador) o a ácidos aspárticos (cambio no conservador) usando un juego de mutagénesis dirigida al lugar QuikChange (Sratagene) que degeneran en oligonucleótidos múltiples. Será evidente para un experto en la técnica que la secuencia de los oligonucleótidos mutagénicos es determinada por la secuencia de proteína deseada. Las mutaciones introducidas se confirmaron por análisis de secuencia.

9.1.3. Mutagénesis aleatoria

La mutagénesis aleatoria puede cambiar cualquier residuo, no simplemente residuos cargados o cisteínas. Debido al tamaño del gen de L de RSV, se mutagenizaron varios fragmentos de cADN de gen de L por mutagénesis de PCR. Esto se consiguió por PCR usando una polimerasa exo Pfu obtenida de Stratagene. Se clonaron después fragmentos de PCR mutagenizados en un vector pCITE-L. El análisis de determinación de secuencia de 20 fragmentos de cADN mutagenizados indicó que se conseguían proporciones de mutación del 80%-90%. Se examinó después la funcionalidad de estos mutantes por un sistema de replicación de minigenoma. Cualquier mutante que mostraba función de polimerasa alterada se clonó después adicionalmente en el clon de cADN de RSV de longitud completa y se recuperó virus de células transfectadas.

9.2. Análisis funcional de mutantes de proteína L de RSV por sistema de replicación de minigenoma

Se ensayó la funcionalidad de los mutantes de genes de L por su capacidad para replicar un minigenoma de RSV que contenía un gen de CAT en su antisentido y flanqueado por secuencias líder y de remolque de RSV. Se infectaron células Hep-2 con recombinantes de vaccinia MVA que expresan polimerasa de ARN de T7. Después de una hora, se transfectaron las células con plásmidos que expresan proteína L mutada junto con plásmidos que expresan proteína N y proteína P, y plásmido pRSV/CAT que contiene el gen de CAT (minigenoma). La expresión del gen de CAT de las células transfectadas se determinó por un ensayo ELISA de CAT (BoehringerMannheim) según la instrucción del fabricante. La cantidad de actividad de CAT producida por el mutante de gen de L se comparó después con la de proteína L de tipo natural.

9.3 Recuperación de RSV recombinante mutante

Para recuperar o rescatar RSV recombinante mutante, se diseñaron mutaciones en el gen de L en plásmidos que codifican el genoma de RSV completo en sentido positivo (antigenoma). Los fragmentos de restricción de cADN del gen de L (BamH I y Not I) que contenían mutaciones en el gen de L se separaron del vector pCITE y se clonaron en el clon de cADN de RSV de longitud completa. Se determinó la secuencia de los clones de cADN para confirmar que cada uno contenía las mutaciones introducidas.

Cada virus mutante del gen de L de RSV se rescató por co-transfección de los siguientes plásmidos en células Hep-2 subconfluentes desarrolladas en placas de seis pocillos. Antes de la transfección, las células Hep-2 se infectaron con MVA, un virus vaccinia recombinante que expresa polimerasa de ARN de T7. Una hora más tarde, se transfectaron las células con los siguientes plásmidos:

\bullet

pCITE-N: que codifica gen de N de RSV de tipo natural, 0,4 \mug

\bullet

pCITE-P: que codifica gen de P de RSV de tipo natural, 0,4 \mug

\bullet

mutante de pCITE-L: que codifica gen de L de RSVmutante, 0,2 \mug

\bullet

mutante de pRSVL: RSV genómico de longitud completa de sentido positivo (antigenoma) que contiene las mismas mutaciones del gen de L que el mutante de pCITE-L, 0,6 \mug

Se introdujo ADN en células por lipofecTACE (Life Technologies) en OPTI-MEM. Después de transfección de cinco horas o durante la noche, se separó el medio de transfección y se sustituyó con MEM al 2%. Después de incubación a 35ºC durante tres días, se usaron los sobrenadantes de medios de las células transfectadas para infectar células Vero. Se recuperó el virus de las células Vero infectadas y se confirmaron las mutaciones introducidas en los virus recombinantes recuperados por determinación de secuencia del ADN de RT/PCR derivado de ARN vírico.

Los ejemplos de los mutantes de gen de L obtenidos por mutagénesis de escaneo de cargado a alanina se muestran en la Tabla II. Se ensayaron mutantes determinando la expresión de CAT por minigenoma de pRSV/CAT tras co-transfección de plásmidos que expresan N, P y L de tipo natural o mutante. Se cosecharon células y se lisaron 40 horas post-transfección después de incubar a 33ºC o 39ºC. La actividad de CAT se comprobó por ensayo ELISA de CAT (Boehringer Mannheim). Cada muestra representa la media de transfecciones duplicadas. La cantidad de CAT producida para cada muestra se determinó de una curva estándar lineal.

De los estudios preliminares anteriores, se han encontrado diferentes tipos de mutaciones.

9.3.1 Mutaciones perjudiciales

Siete mutantes de proteína L presentaban una reducción mayor del 99% de la cantidad de CAT producida en comparación con la de proteína L de tipo natural. Estas mutaciones redujeron drásticamente la actividad de la polimerasa de RSV y no se espera que sean viables.

9.3.2 Mutaciones intermedias

Varios mutantes de L mostraban un nivel intermedio de producción de CAT que variaba del 1% al 50% del de proteína L de tipo natural. Un subgrupo de estos mutantes se introdujo en virus y se encontró que era viable. Los datos preliminares indicaron que A2 mutante mostraba una reducción de 10 a 20 veces del título de virus cuando se desarrollaba a 40ºC en comparación con 33ºC. El A25 mutante presentaba un fenotipo de formación de placas más pequeñas cuando se desarrollaba a 33ºC y 39ºC. Este mutante tenía también una reducción de 10 veces en el título de virus a 40ºC en comparación con 33ºC.

9.3.3. Mutantes con función de proteína L similar o más alta que la proteína L de tipo natural

Algunos mutantes de gen de L produjeron niveles de expresión de gen de CAT similares a, o mayores, que la proteína L de tipo natural in vitro, y los mutantes del virus recuperados tienen fenotipos indistinguibles de los virus de tipo natural en cultivo de tejidos.

Una vez que se han identificado mutaciones en L que confieren sensibilidad a la temperatura y atenuación, se combinarán las mutaciones para descansar en el efecto acumulativo de marcadores sensibles a la temperatura múltiples. Se espera que los mutantes de L que llevan más de un marcador sensible a la temperatura tengan una temperatura opcional más baja y que sean genéticamente más estables que mutantes de marcador simple.

Los mutantes del gen de L generados pueden combinarse también con mutaciones presentes en otros genes de RSV y/o con mutantes de supresión de genes de RSV no esenciales (por ejemplo, supresión de SH y M2-2). Esto permitirá la selección de candidatos a vacunas de RSV atenuadas vivas seguras, estables y eficaces.

10. Generación de candidato a vacuna de virus sincitial respiratorio humano (RSV) suprimiendo los genes víricos SH y M2ORF2 10.1 Mutante de supresión de M2-2

Para suprimir genes M2-2, se introdujeron dos lugares de enzimas de restricción Hind III en los nucleótidos de RSV 8196 y 8430, respectivamente, en un subclon de cADN pET(S/B) que contenía un fragmento de restricción de RSV de 4478 a 8505. El fragmento de restricción de RSV se había preparado previamente por mutagénesis dirigida al lugar Quikchange (Stratagene, La Jolla, CA). La digestión de pET(S/B) con enzima de restricción Hind III separó una secuencia de 234 nucleótidos que contenía la mayoría del marco de lectura abierto de M2-2. Los nucleótidos que codifican los 13 primeros aminoácidos en el término N del producto de gen M2-2 no se separaron porque esta secuencia se superpone a M2-1. El fragmento de cADN que contenía la supresión del gen M2-2 se digirió con SacI y BamHI y se clonó de vuelta en un clon de cADN de RSV de longitud completa, denominado pRSVAM2-2.

Se generó RSV infeccioso con esta supresión de M2-2 transfectando plásmido pRSVAM2-2 en células Hep-2 infectadas con MVA que expresan genes de N, P y L. Brevemente, se transfectó pRSVAM2-2, junto con plásmidos que codifican proteínas N, P y L, en células Hep-2 que se habían infectado con un virus vaccinia recombinante (MVA) que expresa la polimerasa de ARN de T7. La transfección y recuperación de RSV recombinante se realizó como sigue. Se dividieron las células Hep-2 cinco horas o un día antes de la transfección en placas de seis pocillos. Se infectaron monocapas de células Hep-2 con 70%-80% de confluencia con MVA con una multiplicidad de infección (moi) de 5 y se incubaron a 35ºC durante 60 min. Se lavaron después las células una vez con OPTI-MEM (Life Technologies, Gaithersburg, M.D.). Se sustituyó cada placa con 1 ml de OPTI-MEM y se añadieron 0,2 ml de medio de transfección. El medio de transfección se preparó mezclando 0,5-0,6 \mug de antigenoma de RSV, 0,4 \mug de plásmido de N, 0,4 \mug de plásmido de P y 0,2 \mug de plásmido de L en un volumen final de 0,1 ml de medio OPTI-MEM. Éste se combinó con 0,1 ml de OPTI-MEM que contenía 10 \mul de lipofecTACE (Life Technologies). Después de una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente, se añadió a las células la mezcla de ADN/lipofecTACE. El medio se sustituyó un día más tarde con MEM que contenía 2% de FBS. Se incubaron adicionalmente cultivos a 35ºC durante 3 días y se cosecharon los sobrenadantes. Tres días después de la transfección, se hicieron pasar 0,3-0,4 ml de sobrenadantes de cultivo sobre células Hep-2 nuevas y se incubaron con MEM que contenía 2% de FBS. Después de incubación durante seis días, se cosechó el sobrenadante y las células se fijaron y colorearon mediante un método de peroxidasa de rábano picante indirecto usando anticuerpo anti-RSV de cabra (Biogenesis) seguido por un anticuerpo anti-cabra de conejo enlazado a peroxidasa de rábano picante. Las células infectadas con virus se detectaron después por adición de sustrato cromógeno (DAKO) según las instrucciones del fabricante. Se recuperó de las células transfectadas RSV recombinante que contenía supresión de gen M2-2. La identificación de rRSVAM2-2 se realizó por RT/PCR usando cebadores que flanqueaban la región suprimida. Como se muestra en la Fig. 12A, se detectó un fragmento de cADN que es 234 nucleótidos más corto que el RSV de tipo natural en células infectadas con rRSVAM2-2. No se detectó cADN en la reacción de RT/PCR que no contenía transcriptasa inversa en la reacción de RT. Esto indicó que el producto de ADN se derivaba de ARN vírico y no de contaminación. Las propiedades de RSV con supresión de M2-2 se están evaluando actualmente.

10.2 Mutante de supresión de SH (sólo para ilustración)

Para suprimir el gen SH de RSV, se introdujo un lugar de enzima de restricción Sac I en la señal de comienzo de gen del gen SH en la posición de nt 4220. Existe también un lugar de SacI único en el término C del gen SH. Se realizó mutagénesis dirigida al lugar en el subclon pET(A/S), que contiene un fragmento de restricción de AvrII (2129) SacI (4478). La digestión de mutante pET(A/S) con SacI separó un fragmento de 258 nucleótidos del gen SH. El subclon pET(A/S) que contiene la supresión de SH se digirió con Avr II y Sac I y el fragmento de restricción resultante se clonó después en un clon de cADN de RSV de longitud completa. El clon de cADN de longitud completa que contiene la supresión de SH se denominó pRSV\DeltaSH.

La generación del mutante pRSV\DeltaSH se realizó como se ha descrito antes (véase 10.1). Se recuperó RSV menos SH (rRSV\DeltaSH) de células infectadas con MVA que se habían co-transfectado con pRSV\DeltaSH junto con plásmidos de expresión de N, P y L. La identificación del rRSV\DeltaSH recuperado se realizó por RT/PCR usando un par de cebadores que flanqueaban el gen SH. Como se muestra en la Fig. 12A, se detectó una banda de cADN que es aproximadamente 258 nucleótidos más corta que el virus de tipo natural en las células infectadas con rRSV\DeltaSH. No se detectó ADN en la reacción de RT/PCR que no tenía transcriptasa inversa en la reacción de RT. Esto indicaba que el ADN de PCR se derivaba de ADN vírico y no era artefacto, y que el virus obtenido era verdaderamente RSV menos SH.

10.3 Generación de mutante de supresión de SH y M2-2

Se suprimieron ambos genes SH y M2-2 de la construcción de cADN de RSV de longitud completa por subclonación de cADN. Un fragmento de Sac I a Bam HI que contenía la supresión de M2-2 separado del subclon de cADN pET(S/B)\DeltaM2-2RSV se clonó en el clon de cADN pRSV\DeltaSH. El plásmido de supresión de genes doble pRSV\DeltaSHAM2-2 se confirmó por representación de enzimas de restricción. Como se muestra en la Fig. 12B, el mutante de supresión doble de SH/M2-2 es más corto que el cADN de pRSV de tipo natural.

La recuperación de RSV infeccioso que contiene ambas supresiones de SH y M2-2 se realizó como se ha descrito antes. Se obtuvo virus infeccioso con SH y M2-2 suprimidos de células Hep-2 tranfectadas.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA II Niveles de expresión de CAT de gen de L de RSV mutante

5

6

Claims (12)

1. Una partícula vírica sincitial respiratoria (RSV) atenuada, infecciosa aislada, que comprende un antigenoma o genoma de RSV que contiene al menos una supresión funcional en M2-ORF3 del genoma de RSV, para uso como medicamento.

2. La partícula de RSV infecciosa aislada de la reivindicación 1ª, que comprende además una secuencia heteróloga.

3. La partícula de RSV infecciosa aislada de la reivindicación 2ª, en la que la secuencia heteróloga se deriva del genoma de gripe.

4. Una molécula de ARN recombinante, en la que la molécula de ARN recombinante codifica una partícula de RSV infecciosa y comprende (i) al menos una supresión funcional en M2-ORF2 del genoma de RSV y (ii) una secuencia de ARN heteróloga que comprende el complemento inverso de una secuencia de codificación, para uso como medicamento.

5. La molécula de ARN recombinante de la reivindicación 4ª, en la que la secuencia heteróloga se deriva del genoma de un virus distinto de RSV.

6. La molécula de ARN recombinante de la reivindicación 4ª, en la que la secuencia heteróloga se deriva del genoma de otra cepa de RSV.

7. La molécula de ARN recombinante de la reivindicación 6ª, en la que la secuencia de codificación heteróloga codifica productos génicos de G o F.

8. La molécula de ARN recombinante de la reivindicación 4ª, que comprende además una mutación en el gen de L.

9. La molécula de ARN recombinante de la reivindicación 4ª, que comprende además una mutación en el gen SH.

10. Una composición que comprende un virus RSV quimérico producido por un método que comprende cultivar una célula hospedante que contiene secuencias de nucleótidos que contienen los productos génicos de N, P y L de RSV y un antigenoma o genoma de RSV, que contiene al menos una supresión funcional en M2-ORF2 del genoma de RSV y en la que el genoma de RSV codifica una partícula de RSV infecciosa, para uso como medicamento.

11. La partícula de RSV infecciosa aislada de la reivindicación 1ª, en la que la supresión funcional está entre los nucleótidos 8196 y 8430 del genoma de RSV.

12. La partícula de RSV infecciosa aislada de la reivindicación 11ª, que contiene al menos una mutación adicional, de manera que se producen al menos algunas partículas defectuosas durante cada ronda de replicación vírica en un hospedante.