PT1276853E - Próteinas ns de pneumovírus que antagonizam a resposta de interferão (ifn) - Google Patents

Description

ΡΕ1276853 1 DESCRIÇÃO "PROTEÍNAS NS DE PNEUMOVÍRUS QUE ANTAGONIZAM A RESPOSTA DE INTERFERÃO (IFN)"

ANTECEDENTES DO INVENTO

Campo Técnico do invento 0 presente invento refere-se à utilização de uma proteína NS2 de pneumovírus ou de um ácido nucleico codificando a proteína NS2 de pneumovírus para a preparação de uma formulação farmacêutica para reduzir a resposta imunitária mediada por interferão (IFN). Adicionalmente, o presente invento refere-se à utilização de uma proteína NS1 e de uma proteína NS2 de pneumovírus ou de um ácido nucleico codificando a proteína NS1 e a proteína NS2 de pneumovírus para a preparação de uma formulação farmacêutica para reduzir a resposta imunitária mediada por interferão (IFN). 0 invento refere-se também a pneumovírus recombinantes, em particular vírus sinciciais respiratórios (RSV), possuindo uma maior, menor ou nenhuma resistência à resposta imunitária mediada por interferão (IFN) do hospedeiro, vírus recombinantes possuindo uma maior resistência à resposta imunitária mediada por interferão (IFN) e à utilização destes vírus em formulações farmacêuticas, p. ex., como vacinas. 2 ΡΕ1276853

Descrição da Técnica Anterior 0 vírus sincicial respiratório bovino (BRSV) é o agente etiológico mais importante de doenças no tracto respiratório em vitelos e causa importantes perdas económicas (40; 45). A resposta imunitária e a patologia em vitelos imita os sintomas causados pelo vírus sincicial respiratório humano (HRSV) que é ainda a causa predominante de bronquiolite grave e pneumonia em bebés e crianças em todo o mundo (9) . A clonagem molecular de HRSV e BRSV bem como de um vírus aparentado, o vírus da pneumonia de ratinhos (PVM) não só confirmou uma íntima relação entre BRSV e HRSV como revelou também que estes partilham diferenças essenciais em relação a outros membros da família Paramyxoviridae conduzindo ao estabelecimento da subfamília Pneumovirinae dentro da família Paramyxoviridae (36; 37). Dentro desta subfamília, os vírus RSV e PVM formam o género Pneumovirus enquanto que o pneumovírus aviário (APV) é até agora o único membro do género Metapneumovirus.

Tal como com todos os membros da ordem Monone-gavirales o ARN genómico de cerca de 15 kb de RSV e PVM está contido num complexo ribonucleoproteico (RNP) actuando como molde para a transcrição sequencial dos genes (25; 49) . Onze proteínas são expressas pelas 10 unidades de transcrição dispostas na ordem 3'-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-5' (5; 9; 30; 31). As proteínas codificadas compreendem cinco proteínas associadas a RNP: a nucleoproteína (N) , a 3 ΡΕ1276853 fosfoproteína (P) , a grande subunidade catalítica da ARN-polimerase (L) ; e um factor de elongação da transcrição (M2-1) codificado pelo primeiro dos dois enquadramentos de leitura abertos sobreponíveis do gene de M2 (8; 17; 27; 38) . 0 segundo enquadramento de leitura aberto da unidade de transcrição M2 (M2-2) codifica uma proteína não essencial tal como descrito (1) presumivelmente envolvida na regulação da síntese de ARN (4; 28). Três proteínas virais estão associadas ao envelope do vírus: a proteína de fusão F, a suposta proteína de ligação G, e uma pequena proteína hidrófoba SH. A presença de dois genes de proteínas não estruturais numa posição 3'-terminal do genoma distingue os membros do género Pneumovirus de todos os outros membros da ordem Mononegavirales. Devido à sua posição próxima do terminal 3' os genes de NS são transcritos em excesso. As proteínas codificadas foram detectadas em células infectadas (10; 16) . Os genes de NS de BRSV codificam polipé-ptidos com 136 e 124 aminoácidos. Uma comparação com as proteínas NS de HRSV dos subgrupos A e B mostrou homologias de aminoácidos de 69% e 68% para as proteínas NS1 e de 84% e 83% para as proteínas NS2 (5; 34). As proteínas NS1 e NS2 de PVM não mostram homologia significativa com os genes de NS de RSV (cerca de 20% de identidade) mas têm contudo uma função análoga. No entanto, as sequências derivadas não revelaram uma indicação óbvia quanto à função das proteínas NS no ciclo de vida do vírus. Foi relatado que a proteína NS1 de HRSV está associada à proteína M enquanto que a 4 ΡΕ1276853 proteína NS2 não mostrou uma associação detectável com proteínas estruturais de RSV indicando diferentes funções para NS1 e NS2 (16; 47). Recentemente, uma função inibidora de NS1 na transcrição do ARN virai foi sugerida por experiências nas quais foram criados minigenomas de HRSV artificiais na ausência e na presença de NS1. Adicionalmente, no mesmo estudo foi também observado um efeito inibidor para NS2 mas este efeito para NS2 era muito menos pronunciado (3). Métodos recentemente estabelecidos para a preparação ("recuperação") de vírus de ARN infecciosos de cadeia negativa a partir de ADNc (11) permitiram a criação de RSV humano (8; 29) e bovino (5) recombinantes e a examinação das funções individuais das proteínas no contexto virai. A preparação com sucesso de mutantes de deleção viáveis do gene de NS2 confirmou que NS2 não é essencial para a replicação do vírus em cultura celular (5; 43). 0 padrão e as quantidades relativas dos ARNms e do ARN inteiro produzidos em células infectadas não foram visivelmente alterados. No entanto, os mutantes de deleção eram atenuados, apresentavam taxas de crescimento mais lentas e proporcionavam menores títulos de vírus infeccioso em comparação com o vírus de partida. Assim, embora NS2 não seja essencial representa um factor acessório que é capaz de suportar substancialmente o crescimento do vírus através de um mecanismo até agora desconhecido. No entanto, até agora a função da proteína NS2 permanece desconhecida. WO 99/64068 refere-se a vírus de ARN de cadeia negativa 5 ΡΕ1276853 atenuados com uma actividade antagonista de interferão alterada para a utilização como vacinas e produtos farmacêuticos. WO 98/02530 refere-se à produção de vacinas de RSV atenuadas obtidas a partir de sequências nucleotidicas clonadas. Bucholz et al. (Bucholz et al., Journal of Virology, Jan. de 1999, páginas 251-259) refere-se à criação de BRSV a partir de ADNc.

SUMÁRIO DO INVENTO

Este invento baseia-se na descoberta de que as proteínas NS1 e/ou NS2 de RSV e de vírus aparentados com RSV, particularmente os do género Pneumovirus (RSV e PVM) os quais serão todos referidos a seguir como "RSV", têm um efeito antagonístico sobre a resposta imunitária mediada por IFN. O presente invento refere-se à utilização de uma proteína NS2 de pneumovirus ou de um ácido nucleico codificando a proteína NS de pneumovirus para a preparação de uma formulação terapêutica para reduzir a resposta imunitária mediada por interferão (IFN). Adicionalmente, o presente invento refere-se à utilização de uma proteína NS1 e NS2 de RSV ou de uma sequência de ácido nucleico codificando NS1 de RSV e uma sequência de ácido nucleico codificando NS2 de RSV para a preparação de uma formulação terapêutica para a redução de uma resposta imunitária mediada por IFN, de preferência através de IFN alfa e/ou beta. 6 ΡΕ1276853

Numa concretização preferida do presente invento a proteina NS1 de RSV é utilizada em combinação com a proteína NS2 para a preparação de uma formulação terapêutica, ou uma sequência de ácido nucleico codificando a proteina NS1 de RSV é utilizada em combinação com uma sequência de ácido nucleico codificando a proteína NS2 de RSV para a preparação de uma formulação terapêutica para reduzir a resposta imunitária mediada por IFN. "Em combinação" de acordo com o presente invento refere-se a uma administração simultânea ou sucessiva.

Noutro aspecto do presente invento a proteína NS2 de RSV ou as proteínas NS1 e NS2 de RSV são utilizadas para proteger um vírus não aparentado da resposta imunitária mediada por IFN. De preferência, as proteínas NS1 e/ou NS2 de RSV são as proteínas NS de BRSV. As proteínas NS1 e NS2 protegem um vírus não aparentado de um modo cooperativo. "Vírus não aparentados" de acordo com o presente invento refere-se a vírus que não expressam a proteína NS1 e/ou NS2 de RSV. Numa concretização preferida o vírus é o vírus da raiva. De preferência, as proteínas NS1 e/ou NS2 de RSV são expressas a partir do ácido nucleico virai.

Noutro aspecto as formulações farmacêuticas acima mencionadas do invento compreendem ainda uma vacina. De preferência, uma administração da vacina juntamente com as formulações farmacêuticas resulta numa eliminação reduzida da vacina do corpo no qual é administrada. 7 ΡΕ1276853 0 invento refere-se também à aplicação de proteínas NS2 de RSV alteradas para a preparação de uma formulação farmacêutica para modulação da resposta imunitária mediada por IFN. Numa concretização preferida a alteração resulta numa maior actividade moduladora de IFN da proteina NS2. 0 presente invento refere-se à utilização de um RSV recombinante possuindo uma sequência de ácido nucleico modificada codificando NS2 para a preparação de uma vacina em que a modificação diminui ou elimina a capacidade do virus para escapar a uma resposta imunitária mediada por IFN. Numa concretização preferida a sequência de ácido nucleico modificada codificando NS2 é homóloga ou heteróloga ao referido RSV recombinante. Particularmente preferidas são as aplicações em que o RSV recombinante é derivado de RSV humano, bovino ou de PVM.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO

Para estudar a função das proteínas de RSV em mais pormenor foram criados mutantes de deleção de BRSV sem o gene de NS1 ou os genes de NS1 e NS2 e estudaram-se quanto ao seu comportamento em diferentes linhas celulares.

Uma primeira indicação quanto à maior sensibilidade dos mutantes de deleção de NS em relação a factores da célula hospedeira foi observada após infecção 8 ΡΕ1276853 de células MDBK que são completamente sensíveis a uma infecção de BRSV wt e proporcionam maiores títulos de BRSV wt que todas as outras linhas celulares testadas. No entanto, os vírus sem um ou ambos os genes de NS cresceram pior em células MDBK enquanto que noutras linhas celulares tais como Vero ou BSR a ausência dos genes de NS resultou apenas numa redução de 10 vezes nos títulos infecciosos. Experiências de co-cultura identificaram interferões de tipo I como os factores das células hospedeiras cruciais produzidos por células MDBK infectadas com BRSV. Obviamente, um estado antiviral é induzido em culturas de MDBK infectadas através de estimulação celular autócrina e parácrina. Embora BRSV wt seja capaz de contrariar esta resposta nenhum dos mutantes de deleção de NS partilha esta capacidade. As células Vero por outro lado não têm os genes de interferão de tipo I (15; 46) logo a infecção do vírus não resulta em indução de um estado antiviral e permite o crescimento dos mutantes de deleção de NS. Embora as células Vero não sejam capazes de produção de interferão elas podem reagir à estimulação através de interferão exógeno por meio de sinalização mediada por JAK/STAT através do complexo receptor alfa de IFN (IFNAR). Interferões bovinos secretados pelas células MDBK infectadas induziram uma resposta antiviral em células Vero "respondedoras" suprimindo o crescimento dos mutantes de deleção de NS mas não de BRSV wt. O efeito antiviral causado pelos sobrenadantes de MDBK foi prevenido através de incubação das células Vero com um anticorpo que bloqueia a ligação de IFN a IFNAR. Assim, os únicos componentes 9 ΡΕ1276853 activos dos sobrenadantes das células MDBK na indução da resposta antiviral eram IFN alfa e/ou IFN beta.

Com uma redução de 7 vezes no máximo dos mutantes de dupla deleção o efeito inibidor nos mutantes de deleção de NS em células Vero tratadas com sobrenadantes de células MDBK foi fraco e por isso não comparável com a severa inibição dos mutantes de deleção de NS em células MDBK. Isto pode ser atribuído a vários factores. Presumivelmente, a estimulação das células Vero derivadas de primata com IFN heterólogo de origem bovina é menos eficiente em comparação com a estimulação de MDBK. Semelhante à situação no homem, foram identificados diferentes tipos de IFN alfa (tipos 2 a 8) e de IFN beta (tipos 1 e 3) bovinos que apresentam diferentes actividades biológicas (7). Para além disso, os mecanismos antivirais das células Vero parecem ser menos eficientes que os de MDBK. Os sobrenadantes de macrófagos activados e infectados que se sabe secretarem quantidades mais elevadas de interferão de tipo I que outras células causaram um aumento de até 50 vezes na redução dos mutantes de deleção de NS em células Vero "respondedoras". Através da estimulação de células Vero com IFN alfa A/D ou IFN beta humano, a replicação dos mutantes de deleção de NS pôde ser inibida de um modo dependente da dose em que 500 unidades inibiram quase completamente a actividade replicativa.

Por isso, através do presente invento foram identificadas proteínas de RSV como antagonistas da resposta de células hospedeiras mediada por IFN. 10 ΡΕ1276853

Para além disso, utilizando outro virus de ARN de cadeia negativa, o virus da raiva, como vector para a expressão do gene de NS derivado de BRSV mostrou-se que a actividade das duas proteínas NS, NS1 e NS2, era capaz de aumentar a resistência a IFN de um virus não aparentado. Outra descoberta foi que as proteinas NS1 e NS2 podem ser derivadas de diferentes RSVs.

Em resumo, pode ser atribuída uma importante função biológica às proteinas NS de RSV por mediarem uma protecção do virus contra mecanismos celulares antivirais mediados por interferão (efeito antagonizador de IFN). Para além disso, foi inesperadamente verificado que através da utilização de ambas as proteinas NS em combinação o referido efeito antagonizador de IFN é multiplicado. Este é o primeiro exemplo de uma cooperação de duas proteínas virais no antagonismo a interferão.

Supõe-se que a adaptação de proteínas virais para contrariar respostas imunitárias inatas dentro das células do seu hospedeiro natural é um factor importante para a determinação do espectro de hospedeiros virais e pode prevenir que os vírus atravessem a barreira das espécies (13; 23; 26) . A proteína V do vírus símio 5 (SV5) é por exemplo capaz de bloquear a activação de genes que respondem a interferão em células de primata mas não em células de murídeo (14) . Isto pode ser o mecanismo relevante que previne uma infecção produtiva de ratinhos 11 ΡΕ1276853 por SV5 e até de ratinhos SCID (13) . Recentemente, foi relatado que HRSV, o equivalente humano de BRSV, era resistente à actividade antiviral induzida por IFN em células humanas (2), e dos nossos resultados concluímos que as proteínas NS de HRSV estão optimizadas para antagonizar a resposta de IFN em células humanas e melhor que em células de origem diferente.

De facto, a contribuição das proteínas NS para a sensibilidade do hospedeiro a uma infecção por RSV pode explicar o porquê destes vírus intimamente aparentados terem um espectro de hospedeiros fortemente limitado. BRSV e HRSV são capazes de entrar em células humanas, bovinas e de murídeo; a diferente capacidade das proteínas NS para antagonizar os mecanismos de defesa específicos do hospedeiro pode determinar se o vírus é ou não eliminado. Isto é também apoiado por descobertas anteriores. Embora o crescimento de HRSV em células embrionárias de ratinho primárias (ME) fosse claramente limitado, a produção de vírus foi aumentada após a adição ao meio de soro anti-IFN de murídeo e a infecção disseminou-se por toda a monocamada (26). Para além disso, BRSV recombinantes possuindo as suas proteínas de superfície G e F substituídas pelas de HRSV para facilitar a sua penetração em células de primata foram apenas ligeiramente mais competentes para replicação em chimpanzé que BRSV. No entanto, a infecção permaneceu muito limitada e não foi suficiente para induzir uma protecção contra uma infecção experimental com HRSV homólogo (6) . A partir das nossas observações concluímos que a baixa 12 ΡΕ1276853 eficácia das proteínas NS de BRSV a antagonizar os mecanismos de defesa dos primatas é o determinante primário do espectro de hospedeiros.

Por isso, os nossos resultados têm importantes implicações para o desenho de vacinas vivas de RSV atenuado eficazes. A deleção de NS1 ou NS2 ou de ambos os genes resulta em vírus sobre-atenuados incapazes de escapar a qualquer resposta de interferão. Para além disso, podem ser desenhadas vacinas que tenham a capacidade intermédia de escapar aos mecanismos de defesa inatos dos bovinos e humanos devido a uma troca mútua das proteínas NS entre os diferentes RSVs, por exemplo, BRSV e HRSV, e particularmente para criar vacinas de BRSV e HRSV. Adicionalmente, podem ser introduzidas mutações nas proteínas NS que eliminem apenas parcialmente a actividade antagonizadora de IFN. A proteína NS2 ou uma sequência de ácido nucleico codificando NS2 do invento é adequada para a produção de uma formulação farmacêutica para a redução da resposta imunitária mediada por IFN. Para além disso, as proteínas NS1 e NS2 de RSV ou as sequências de ácido nucleico codificando NS1 e codificando NS2 de acordo com este invento são também úteis para a preparação de formulações farmacêuticas para a redução da resposta imunitária mediada por IFN. Numa concretização preferida, NSl de RSV é utilizada em combinação com a proteína NS2 para a preparação de uma formulação farmacêutica. A formulação 13 ΡΕ1276853 farmacêutica compreende uma quantidade eficaz de NS1 e NS2 para alterar a resposta imunitária mediada por IFN num animal ou num humano, e um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável. A formulação farmacêutica pode ser preparada utilizando técnicas convencionais. Assim, a formulação farmacêutica de acordo com o presente invento pode ser preparada através da mistura de uma quantidade desejada de uma proteína NS1 e/ou NS2 de RSV ou de uma sequência de ácido nucleico codificando NS1 e/ou uma sequência de ácido nucleico codificando NS2 com uma solução isotónica estéril cujo valor de pH é ajustado a um pH de cerca de 6,0 utilizando um tampão apropriado. A formulação farmacêutica de acordo com o presente invento pode incluir componentes convencionais, p. ex., um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável tal como solução salina, regulador do pH, tampão, conservante e semelhantes. Tais componentes são conhecidos dos peritos na técnica que os podem seleccionar. O termo "IFN" de acordo com o presente invento refere-se de preferência ao interferão de tipo I, nomeadamente o interferão α e β. O termo "resposta imunitária mediada por IFN" refere-se aqui aos efeitos de imunização e/ou antivirais induzidos pela actividade do interferão, particularmente do interferão α e β, em resposta, p. ex., uma infecção virai tal como uma maior expressão de glicoproteínas de MHC, 14 ΡΕ1276853 activação de mecanismos antivirais tais como a destruição das células infectadas pelo virus ou a inibição da replicação virai. "Redução da resposta imunitária mediada por IFN" significa que os efeitos de imunização e/ou antivirais são reduzidos o que é induzido pela actividade do interferão, particularmente do interferão α e β, por exemplo como uma resposta à infecção pelo virus tal como maior expressão de glicoproteinas de MHC, activação de mecanismos antivirais tais como a destruição das células infectadas pelo virus ou a inibição da replicação virai. "Actividade antagonizadora de IFN" de acordo com o presente invento significa que os efeitos de imunização e/ou antivirais são reduzidos ou abolidos o que é induzido pela actividade do interferão, particularmente do interferão α e β, por exemplo como uma resposta à infecção do virus tal como maior expressão de glicoproteinas de MHC, activação de mecanismos antivirais tais como a destruição das células infectadas pelo virus ou a inibição da replicação virai.

Os termos "modificado" ou "alterado" de acordo com o presente invento referem-se ao tipo selvagem que é utilizado como referência. "Sequência de ácido nucleico" tal como aqui se utiliza significa qualquer sequência continua de bases 15 ΡΕ1276853 nucleotídicas e pode consistir em ácido ribonucleico ou ácido desoxirribonucleico. De preferência, a sequência de ácido nucleico é ADNc.

Uma "sequência de ácido nucleico codificando NS1 e/ou NS2 homólogas ou heterólogas a um RSV" significa que a sequência de ácido nucleico codificando NS1 e/ou NS2 é derivada da mesma espécie de RSV ou de outra diferente ou de outro virus do género Pneumovirus, p. ex., PVM.

As modificações dentro de uma sequência proteica de NS1 de RSV ou NS2 de RSV incluem substituições, deleções e inserções de aminoácidos únicas ou múltiplas. De preferência, as modificações não têm efeito na actividade biológica das proteínas na redução da resposta imunitária mediada por IFN ou a antagonizar IFN. As variantes de inserção de aminoácidos de acordo com o presente invento incluem fusões amino e/ou carboxilo-terminais e inserções de sequência internas de um ou múltiplos aminoácidos. As variantes de inserção de aminoácidos são aquelas em que um ou mais aminoácidos são introduzidos num local específico dentro da proteína; no entanto, é também possível inserção aleatória em combinação com a pesquisa apropriada do produto resultante. As variantes de deleção são caracterizadas pela deleção de um ou mais aminoácidos da sequência. As variantes de substituição de aminoácidos são aquelas em que pelo menos um resíduo é removido da sequência e substituído por outro resíduo no mesmo local. De preferência, a sequência da proteína NS1 ou NS2 não modificada tem uma 16 ΡΕ1276853 homologia com o tipo selvagem de pelo menos 40%, de preferência pelo menos 50%, sendo preferível pelo menos 80% ou pelo menos 90%, particularmente 95%.

As modificações preferidas estão presentes em posições que não são conservadas entre as espécies. De preferência, uma modificação deste tipo compreende a substituição de um aminoácido por outro possuindo um tamanho e uma polaridade semelhantes. Em relação ao tipo de possíveis substituições feitas podem primeiro ser utilizadas análises da frequência das substituições de aminoácidos entre proteínas homólogas em diferentes organismos. Com base nestas análises substituições conservativas são definidas como substituições dentro dos grupos listados abaixo: 1. pequenos: Ala, 2. alifáticos, apoiares ou fracamente polares Ser, Thr (Pro, Gly) carregados negativamente e suas amidas: Asn,

Asp, Glu, Gin 3. carregados positivamente: His, Arg, Lys 4. alifáticos, apoiares grandes: Met, Leu, Ile,

Vai (Cys) 5. aromáticos grandes: Phe, Tyr, Trp.

Três aminoácidos estão escritos entre parêntesis devido ao seu papel específico na arquitectura das proteínas. Gly é o único aminoácido sem cadeia lateral e confere portanto flexibilidade à cadeia peptídica. Pro possui uma geometria invulgar limitando fortemente a 17 ΡΕ1276853 flexibilidade da cadeia. Cys pode estar envolvido em ligações dissulfureto.

Para além disso, podem ser introduzidas modificações tais como as detalhadas acima na sequência proteica de NS1 de RSV ou NS2 de RSV resultando num aumento ou numa redução da actividade biológica das proteínas para reduzir a resposta imunitária mediada por IFN ou para antagonizar IFN.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Fig. 1. (A) Representação esquemática dos geno-mas de BRSVs recombinantes. A posição dos transcritos (barras cinzentas) e das regiões de codificação da proteína (barras brancas) são mostradas em relação ao genoma virai (ARNv) (barras negras). O alargamento compara a organização dos vírus inteiros com os mutantes de deleção de NS. O ARN líder está indicado por linhas horizontais; as posições relativas dos respectivos nucleótidos e locais de restrição utilizados para clonagem estão indicadas. (B) Organização dos vírus da raiva (RV) recombinantes possuindo ORFs geneticamente marcados de NS1 de BRSV ou NS2 de BRSV entre os genes de G e L de RV.

Fig. 2. Ausência de transcritos de NS1 e NS2 em BRSV recombinante. 0 ARN inteiro de células BSR infectadas pelos vírus indicados foi isolado 2 a 4 dias após a infecção e analisado através de hibridação "Northern" 18 ΡΕ1276853 utilizando sondas compreendendo os genes de NS1, NS2, NS1 a NS2 e N. Os ARNms de NS1, NS2 e N estão indicados.

Fig. 3. Os mutantes de deleção de NS são mais atenuados em células MDBK que em células BSR. Monocamadas quase confluentes de BSR T7-5 (A) e MDBK (B) foram infectadas a uma MOI de 0,01 com BRSV (circulos negros), BRSV ANSl (quadrados brancos), BRSV ANS2 (triângulos negros) ou BRSV ANS1/2 (circulos brancos). Os titulos de virus infecciosos foram determinados de dois em dois dias tal como descrito na secção Exemplo. A começar no sexto dia, a replicação de todos os mutantes em células BSR e a replicação de BRSV wt em células MDBK resultou em destruição celular massiva. Os valores foram obtidos a partir de duas experiências independentes cada uma das quais efectuada em triplicado. As barras indicam o desvio padrão.

Fig. 4. Os sobrenadantes das células MDBK infectadas com virus ou de macrófagos infectados inibem o crescimento dos mutantes de deleção de NS de BRSV em células Vero co-cultivadas. A fundamentação lógica das experiências de co-cultura é mostrada esquematicamente em (A). Células MDBK ou macrófagos bovinos estimulados com LPS foram infectados com BRSV a uma MOI de 1, semeados em inserções de cultura celular "Anopore Membrane" de Nunc e cultivados com células Vero "respondedoras" infectadas por BRSV wt, BRSV ANSl, BRSV ANS2 ou BRSV ANS1/2. Após três dias, as inserções foram removidas e foram determinados os 19 ΡΕ1276853 títulos de vírus infecciosos das células Vero. Os resultados em (B) são mostrados como % de inibição incluindo o desvio padrão e como vezes de redução (dos valores médios) em comparação com controlos obtidos com MDBKs não infectadas ou macrófagos não infectados e não estimulados. Os valores são obtidos a partir de 6 (MDBKs) e 4 (macrófagos) experiências de co-cultura.

Fig. 5. Um anticorpo monoclonal do receptor de interferão alfa (IFNA-R2) (#2) neutraliza o efeito do factor inibidor produzido pelas MDBKs ou pelos macrófagos. Células Vero "respondedoras" infectadas com rBRSV ANS1, rBRSV ANS2, rBRSV ANS1/2 ou rBRSV wt a uma MOI de 0,1 foram cada uma incubada com 5 μρ/πιΐ de um anticorpo monoclonal contra IFNAR2 (#2), MHC I (#3), TNF-R1 (#4) ou na ausência de anticorpo (#1) durante três horas. A co-cultura com células MDBK infectadas (ver fundamentação lógica da experiência na Fig. 4) foi efectuada na presença de 1 μρ/ιηΐ do respectivo anticorpo. O título foi determinado em seis (#1 e #2) ou duas experiências (#3 e #4). As barras indicam o desvio padrão.

Fig. 6. Todos os mutantes de deleção de NS de BRSV são sensíveis a IFN de tipo I. As células Vero infectadas com BRSV (círculos negros), BRSV ANS1 (quadrados brancos), BRSV ANS2 (triângulos) ou BRSV ANS1/2 (círculos brancos) a uma MOI de 0,1 foram incubadas com IFN alfa A/D (A) ou IFN beta (B) recombinantes nas quantidades indicadas. Os títulos de vírus infecciosos foram determinados 4 dias após a infecção. 20 ΡΕ1276853

Fig. 7. A resistência a IFN de BRSV é mais pronunciada em células bovinas que em células de primata. Células MDBK (colunas a cheio) ou Vero (colunas vazias) foram infectadas com rBRSV a uma MOI de 1 e tratadas com IFN alfa A/D recombinante nas quantidades indicadas. Os titulos de virus infecciosos foram determinados 3 dias após a infecção.

Fig. 8. Maior resistência a IFN dos virus da raiva (RV) em células infectadas com RVs expressando NS1 e NS2. Células Vero (A) ou MDBK (B) foram infectadas com RV SAD VB, SAD VB-NS1 ou SAD VB-NS2 ou co-infectadas com SAD VB-NS1 e SAD VB-NS2. Imediatamente após a infecção as culturas foram tratadas com IFN alfa A/D nas quantidades indicadas. Os titulos de virus infecciosos foram determinados 2 dias após a infecção. Os resultados representam os valores médios de pelo menos quatro experiências independentes e as barras de erro indicam os desvios padrão.

Fig. 9. Amostras duplicadas de lxlO5 células Hep2 foram infectadas, cada uma, com os diferentes isolados de HRSV durante 1 hora (MOI = 0,1) em 0,5 ml de DMEM sem FCS após o que cada amostra recebeu 0,5 ml + FCS a 5%. Depois as células infectadas foram semeadas em placas de cultura de tecidos de 4 cm2. Após 1, 2, 3 e 4 dias foi removido um valor corrente para cada isolado do virus, o virus foi libertado através de congelação/descongelação e 21 ΡΕ1276853 os títulos dos diferentes isolados clínicos dependendo do período de infecção foram determinados através de titulação. Foi determinada a pfu/ml através de contagem após coloração das células infectadas com um anticorpo contra RSV-F.

Fig. 10. Amostras duplicadas de lxlO5 células Hep2 foram infectadas, cada uma, com os diferentes isolados de HRSV durante 1 hora (MOI = 0,1) em 0,5 ml de DMEM sem FCS e foram depois semeadas em placas de cultura de tecidos de 4 cm2. 0, 150, 500, 10000 U/ml de IFN de tipo I A/D recombinante foram ressuspensas noutros 0,5 ml de DMEM + FCS a 5% e adicionadas após 30 minutos. Após um período de incubação de 72 horas, o vírus foi libertado através de congelação/descongelação e os títulos dos diferentes isolados clínicos dependendo da quantidade de IFN adicionada foram determinados através de titulação. Foi determinada a pfu/ml através de contagem após coloração das células infectadas com um anticorpo contra RSV-F.

Fig. 11. Organização de vírus da raiva (RV) recombinantes ancorando NS1 de HRSV ou NS2 de HRSV ou ORFs geneticamente marcados de NS1 de BRSV, NS2 de BRSV, NS1 de PVM ou NS2 de PVM entre os genes de G e L de RV.

Fig. 12. Maior resistência a IFN dos vírus da raiva (RV) em células infectadas com RVs expressando NS1 e NS2. Células MDBK foram infectadas com RV SAD VB, SAD VB-hNS1 ou SAD VB-hNS2 ou co-infectadas com SAD VB-hNSl e SAD 22 ΡΕ1276853 VB-hNS2 ou com SAD VB-bNSl e SAD VB-bNS2. Imediatamente após a infecção as culturas foram tratadas com IFN alfa A/D nas quantidades indicadas. Os títulos dos vírus foram determinados 2 dias após a infecção. Os resultados representam os valores médios de pelo menos quatro experiências independentes e as barras de erro indicam os desvios padrão.

Fiq. 13. Maior resistência a IFN dos vírus da raiva (RV) em células infectadas com RVs expressando NS1 e NS2. Células MDBK foram infectadas com RV SAD VB, SAD VB-mNSl ou SAD VB-mNS2 ou co-infectadas com SAD VB-mNSl e SAD VB-mNS2 ou com SAD VB-bNSl e SAD VB-bNS2. Imediatamente após a infecção as culturas foram tratadas com IFN alfa A/D nas quantidades indicadas. Os títulos dos vírus foram determinados 2 dias após a infecção. Os resultados representam os valores médios de pelo menos quatro experiências independentes e as barras de erro indicam os desvios padrão.

Fig. 14. Organização dos BRSVs quiméricos ancorando genes de NS heterólogos.

Fig. 15. As quimeras PVM/BRSV são ligeiramente atenuadas em células Vero. Células Vero foram infectadas com BRSV wt (círculos negros), BRSV hNSlbNS2 (quadrados cinzento escuro), BRSV hNSlhNS2 (quadrados cinzento claro), BRSV mNSlbNS2 (triângulos cinzento escuro) e BRSV mNSlmNS2 (triângulos cinzento claro) a uma MOI de 0,1. Os títulos de 23 ΡΕ1276853 vírus infecciosos foram determinados em quatro dias sucessivos. Os valores foram obtidos a partir de pelo menos duas experiências independentes.

Fig. 16. 0 crescimento de BRSV hNSlhNS2 é atenuado em células MDBK. Células MDBK foram infectadas com BRSV wt (círculos negros) e BRSV hNSlhNS2 (quadrados cinzento claro) a uma MOI de 0,1. Os títulos de vírus infecciosos foram determinados em quatro dias consecutivos. Os valores são valores médios obtidos em pelo menos duas experiências independentes.

Fig. 17. BRSV hNSlhNS2 é sensível a IFN de tipo I em células MDBK. Células Vero (A) e MDBK (B) foram infectadas com BRSV wt (círculos negros) e BRSV hNSlhNS2 (quadrados cinzento claro) a uma MOI de 0,1 e depois incubadas com IFN alfa A/D nas quantidades indicadas. Os títulos de vírus infecciosos foram determinados 3 dias após a infecção. Os valores foram obtidos em pelo menos duas experiências independentes.

Fig. 18. Comparação das sequências de aminoáci-dos das proteínas NS1 (Fig. 18A) e NS2 (Fig. 18B) de HRSV (hNSl, hNS2), BRSV (bNSl, bNS2) e PVM (mNSl, mNS2); número de acesso GenBank U35030 (estirpe de HRSV Long), AF092942 (estirpe de BRSV ATue 51908) e D10331 (PVM).

Os seguintes Exemplos são apresentados com o fim ilustrar diferentes concretizações do invento e não se pretende que limitem o presente invento de nenhum modo. ΡΕ1276853 24

EXEMPLOS

Exemplo 1: Construção e recuperação de mutantes de deleção de BRSV sem genes de NS 0 BRSV recombinante (rBRSV) é derivado da estirpe de BRSV A51908 (American Type Culture Collection (ATCC) (33), variante Atue51908 (N° de acesso GenBank AF092942)), e foi cultivado em células MDBK tal como já descrito (5). A clonagem do ADNc inteiro da estirpe de BRSV Atue51908 (N° de acesso GenBank AF092942) e a construção de plasmideos que permitem a transcrição mediada pela ARN-polimerase T7 do ARN anti-genómico inteiro de BRSV ou do ARN anti-genómico sem o gene de NS2 (pBRSV ANS2) foi descrita noutro sítio (5).

As construções sem o gene de NSl (pBRSV ANSl) ou ambos os genes de NSl e NS2 (pBRSV ANSl/2) foram geradas com base em pBRSV. O gene de NSl foi removido de pBRSV cortando com NotI e Asei, preenchendo com polimerase Klenow e subsequente re-ligação. Deste modo obteve-se pBRSV ANSl. Para gerar o mutante de dupla deleção pBRSV ANSl/2 foi amplificado um fragmento de PCR de 0,6 kb que compreende ptécnica do gene de N. Para este fim, foi utilizado o iniciador NNot(+) (5'-TAGGCGGCCGCAAAAATGGCTCTTAGC-AAGGTG- 3') contendo um local de restrição Not I (sublinhado) a montante do codão de início de N bem como o iniciador inverso Nstu(-) (5'-TCCTTTGTATCGTTTCATTTC-3') correspon- 25 ΡΕ1276853

dendo aos nt 1735-1715 de rBRSV a jusante do local de restrição único StuI (posição 1671 de rBRSV). Após a deleção dos genes de NS1 e NS2 e de uma porção do gene de N de pBRSV através de digestão com NotI (posição 72 de rBRSV) e StuI (posição 1671 de rBRSV), o fragmento de PCR restringido com StuI foi utilizado para substituir as sequências suprimidas (Fig. 1).

Em comparação com a sequência do virus wt recombinante rBRSV, os mutantes de deleção de NSl, NS2 e NS1/NS2 não têm 496, 509 e 1060 nucleótidos, respec- tivamente. Em todas as construções a transcrição do gene 3'-terminal é induzida pelo sinal de inicio da transcrição lider original/NSl (Fig. 1) .

Os virus recombinantes viáveis rBRSV, rBRSV ANSl, rBRSV ANS2 e rBRSV ANS1/2 puderam ser obtidos a partir das respectivas construções de ADNc em células BSR T7/5 (5) expressando a ARN-polimerase T7 após transfecção (protocolo de CaP04; Estojo de Transfecção de Mamifero, Stratagene) de plasmideos controlados pelo promotor T7 com o respectivo ADNc de virus (10 μρ). Os plasmideos codificando as proteínas N e P (pTITB-N e pTITB-P, 4 μρ por plasmideo) , e L e M2 (pTITB-L e pTITB-M2, 2 μρ por plasmideo) de BRSV foram co-transfectados com cada ADNc de virus para cerca de 106 células BSR T7/5 que expressam estavelmente a ARN-polimerase do fago T7 (5). Após 4 horas, o meio de transfecção foi removido e foi adicionado meio BHK-21 (Gibco) contendo FCS a 5%. As células transfectadas com 26 ΡΕ1276853 ADNc de BRSV foram diluídas de 5 em 5 dias a uma razão de 1:3 até se poder observar um efeito citopatogénico.

Todos os casos incluindo a co-transfecção de duplos mutantes NS1/2 dos plasmídeos de suporte codificando as proteínas N, P, L e M2 de BRSV resultaram na formação de sincícios. Após diluição das células transfectadas a uma razão de 1:3 e a ocorrência de um claro efeito citopatogénico os vírus foram colhidos.

Para a preparação de soluções de reserva de vírus, células MDBK e Vero confluentes a 80% foram infectadas a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,1 em meio essencial mínimo de Dulbecco (DMEM) sem soro. Após adsorção durante uma hora o inoculo foi removido e as células foram incubadas a 37°C em DMEM suplementado com FCS a 2,5% numa atmosfera de CO2 a 5% até ser observado um claro efeito citopático (CPE). Os vírus foram libertados através de congelação e subsequente descongelação. Os títulos dos vírus em células Vero foram determinados através de séries de diluição em placas de microtítulo seguidas de contagem dos focos infectados. Para este fim os focos foram corados através de coloração indirecta utilizando um anticorpo contra a proteína de fusão F (obtida por cortesia de J.A. Melero, Madrid). A preparação de soluções de reserva de vírus dos mutantes de deleção de NS foi realizada em células Vero infectadas a uma MOI de 0,1. Levou 3 dias no caso de rBRSV e 5 dias no caso dos mutantes de deleção de NS até ser observado um claro CPE após infecção das células Vero a uma MOI de 0,1. 27 ΡΕ1276853

Exemplo 2: Crescimento dos mutantes de deleção de NS

As características de crescimento dos vírus foram primeiro analisadas na linha celular BSR T7/5 derivada de células BHK que foi utilizada para recuperar os vírus. Em contraste com o vírus inteiro original todos os três mutantes eram atenuados indicando uma contribuição de ambas as proteínas NS para a replicação do vírus. Interessan-temente, não se conseguiram observar diferenças óbvias em relação à distribuição dos vírus em células infectadas e aos títulos finais entre o mutante de deleção única e o de dupla. Todos os mutantes alcançaram títulos de infecção de 2xl05 pfu após infecção de células BSR T7/5 a uma MOI de 0,1 e um período de incubação subsequente de 6 dias. No entanto, o vírus original alcançou até ΙχΙΟ6 pfu (Fig. 3A). Resultados semelhantes com títulos ligeiramente maiores foram alcançados através da infecção de células Hep2 ou Vero sendo as últimas a linha celular preferida para a cultura de HRSV.

Subsequentemente, foi utilizada uma linha celular de origem bovina, MDBK, que suporta de forma óptima o crescimento de BRSV wt (5) . De facto, pôde-se alcançar títulos ligeiramente maiores de BRSV de 2*106 pfu após 6 dias de infecção (Fig. 3B). No entanto, surpreendentemente, o crescimento dos mutantes de deleção nesta linha celular foi fortemente afectado. Os mutantes de deleção única ANSl e ANS2 alcançaram títulos de apenas 3*103 pfu após 6 dias o 28 ΡΕ1276853 que é 100 vezes menor que em células BSR. O mutante de dupla deleção ANS1/2 foi incapaz de se multiplicar de forma detectável nos primeiros 6 dias de infecção. Apenas se pôde obter um titulo de virus de 2><102 quando as células foram diluidas e incubadas durante mais 8 dias. Embora as células MDBK representem a célula hospedeira óptima para BRSV wt, elas não são obviamente permissivas para todos os mutantes de deleção de NS enquanto que as células BSR e Vero sendo células hospedeiras subóptimas para BRSV wt exibem um suporte relativamente bom para o crescimento dos mutantes de deleção de NS.

Exemplo 3: Hibridação "Northern" com ARN de mutantes de deleção de BRSV sem genes de NS

Para as hibridações "Northern" o ARN foi isolado de células infectadas com rBRSV ou com os mutantes de deleção de NS. Células Vero foram infectadas com os virus recombinantes rBRSV, rBRSV ANS1, rBRSV ANS2 e rBRSV ANSl/2 a uma MOI de 0,1 e o ARN total foi isolado após ser observado um forte CPE (para rBRSV após 3 dias, para os mutantes de deleção de NS após 5 dias) . O ARN foi separado através de electroforese em gel desnaturante, transferido para membrana de nylon (Duralon-UV, Stratagene) e ligado à membrana por meio de irradiação UV. Sondas de ADN especificas dos genes de NS1, NS2 e N de cerca de 500 nt de comprimento foram marcadas com (a-32P)dCTP (3000 Ci/mmol, 29 ΡΕ1276853

Amersham) através de "nick translation" (Nick-translation kit, Amersham). Os filtros hibridados foram expostos a películas Kodak BioMax MS utilizando ecrãs intensificadores ou foram avaliados por meio de imagiologia de fósforo (Storm, Molecular Dynamics).

Foram observados padrões de transcritos semelhantes para todos os vírus em que os vírus diferiam apenas na presença ou ausência de ARNs específicos para NS1 e NS2 (Fig. 2). Tal como já observado para os mutantes de deleção de NS2 de BRSV e HRSV (5/ 43) estavam presentes quantidades semelhantes de ARNm e de ARN genómico de N em todas as células infectadas independentemente do recombinante utilizado. Portanto, as proteínas NS têm um efeito na síntese de ARN em geral em vez de afectarem passos distintos da replicação ou da transcrição do ARN.

Exemplo 4: Factores solúveis produzidos por células MDBK e macrófagos bovinos afectam o crescimento de mutantes de deleção de NS

Para identificar factores celulares responsáveis pela óbvia inibição selectiva do crescimento dos mutantes de deleção de NS em células MDBK foi primeiro examinado se as moléculas solúveis produzidas pelas células MDBK são capazes de limitar o crescimento dos mutantes de deleção de NS. Para este fim, células MDBK e células Vero foram co-cultivadas em dispositivos que permitem a separação das duas culturas celulares através de uma membrana que é 30 ΡΕ1276853 impermeável ao vírus mas permeável a factores solúveis (Fig. 4A) . As células MDBK na caixa de cima foram utilizadas como células efectoras enquanto que as células Vero na caixa inferior serviram como células respondedoras.

As células Vero respondedoras em suspensão foram falsamente infectadas ou infectadas com rBRSV ANS1, rBRSV ANS2 ou rBRSV ANS1/2 a uma MOI de 0,1 em DMEM sem FCS durante uma hora. Após lavagem, foram semeadas em placas de 6 poços 5χ105 células em cada em DMEM contendo FCS a 2,5%. As células efectoras MDBK ou macrófagos bovinos estimulados com 10 μρ/ιηΐ de LPS (Sigma) de um dia para o outro foram infectadas em suspensão com rBRSV a uma MOI de 1 durante 1 h. Após lavagem, ΙχΙΟ6 células foram semeadas em inserções de cultura celular de 25 mm equipadas com uma membrana Anopore de 200 nm (Nunc) e colocadas em placas contendo as células Vero "respondedoras" infectadas. Após co-cultura durante três dias as inserções de membrana foram removidas e o título de vírus das células Vero foi determinado tal como descrito no Exemplo 1.

Foram efectuadas pelo menos cinco experiências de co-cultura independentes. As células efectoras MDBK não infectadas ou as células BSR utilizadas como controlo negativo não mostraram qualquer efeito inibidor no crescimento de BRSV wt ou dos mutantes de deleção de NS em células respondedoras Vero. A co-cultura com células MDBK infectadas com BRSV (MOI = 1) resultou numa inibição fraca mas reprodutível dos mutantes de deleção de NS enquanto que 31 ΡΕ1276853 o crescimento de BRSV wt não foi afectado (Fig. 4B) . O efeito mais pronunciado foi observado com o mutante de dupla deleção NS1/NS2. Neste caso os titulos foram reduzidos cerca de 7 vezes na presença de células MDBK infectadas em comparação com células MDBK não infectadas. Os titulos dos mutantes de deleção única rBRSV ANS1 e rBRSV ANS2 foram neste caso reduzidos 2 e 4 vezes, respec-tivamente.

Uma vez que os sobrenadantes de células MDBK não infectadas foram incapazes de afectar o crescimento dos mutantes de deleção em células respondedoras Vero assumiu-se que os factores de MDBK eficazes eram induzidos pela infecção virai. Não só infecções com BRSV wt como também com uma pluralidade de mutantes de deleção de BRSV incluindo rBRSV ANS1/2 e um mutante com os genes de SH e G suprimidos (rBRSV ASH/G; não publicado) resultaram na secreção de factores eficazes. Adicionalmente, pôde demonstrar-se que a infecção com um virus de ARN diferente, virus da raiva, resultou também numa indução de factores eficazes em células MDBK. Estes resultados sugeriram fortemente uma indução do estado antiviral em células respondedoras Vero mediado por citocinas, particularmente por interferão.

Para estudar as citocinas envolvidas em mais pormenor foram utilizados macrófagos bovinos como células efectoras. Macrófagos bovinos foram isolados do sangue de uma vaca e de um vitelo utilizando centrifugação com 32 ΡΕ1276853 gradiente de Ficoll (Lymphoflot, Biotest, Dreieich) a 1500 rpm e adsorção da fracção de células mononucleares ao fundo do balão de cultura de células. Após incubação de um dia para o outro as células não aderentes foram removidas lavando três vezes com RPMI (Gibco) sem FCS. As restantes células aderentes (90-95% positivas para CD14) foram incubadas em RPMI contendo FCS a 10% a 37°C e CO2 a 5%. Os macrófagos bovinos isolados foram estimulados com LPS de um dia para o outro e co-cultivados com células Vero tal como descrito acima.

Após incubação com macrófagos estimulados, infectados com virus ou não estimulados as quantidades obtidas de rBRSV inteiro permaneceram inalteradas. Em contraste com o controlo de macrófagos não estimulados e não infectados, foi no entanto observada uma redução de 30 a 50 vezes para os mutantes de deleção de NS (Fig. 4B) . Também a estimulação dos macrófagos apenas com LPS sem subsequente infecçao com virus foi suficiente para causar uma redução de cerca de 10 vezes em rBRSV ANS1/2. Uma vez que se sabe que os macrófagos estimulados são produtores de interferão de tipo I estas experiências indicam um envolvimento de IFN alfa e/ou beta na inibição do crescimento dos mutantes de deleção de NS de BRSV.

Exemplo 5: A deleção dos genes de NS torna BRSV sensível a interferão de tipo I Pôde ser demonstrado por meio de análise de FACS que as células Vero utilizadas como células respondedoras 33 ΡΕ1276853 nas experiências de co-cultura (ver Exemplo 4) expressam a subunidade alfa do receptor de interferão de tipo I (IFNAR2) (44) . Para estudar se o IFN alfa e/ou beta produzido por células MDBK ou macrófagos infectados medeia o efeito inibidor nos mutantes de deleção de NS, células Vero respondedoras foram infectadas com rBRSV ANSl/2, rBRSV ANS2 ou rBRSV ANSl e depois tratadas com um anticorpo monoclonal que bloqueia IFNAR2 (PBL Laboratories). 0 tratamento das células respondedoras foi efectuado imediatamente após a infecção através de incubação das células durante 1 h com 5 μρ/ιηΐ de um anticorpo neutralizante de ratinho anti-cadeia 2 do receptor do interferão alfa/beta humano (CD118) (PBL Biomedical Laboratories) ou com 5 μρ/ιηΐ de um anticorpo de controlo que reconheça moléculas de TNFRI ou MHC de classe I. Após diluição das células em placas de seis poços, as células foram mantidas em 1 μg/ml dos respectivos anticorpos e incubadas na presença de células efectoras MDBK infectadas durante três dias.

Embora tenha sido observada uma inibição dos mutantes de deleção de NS nas culturas celulares contendo anticorpos de controlo ou sem anticorpo, o efeito inibidor foi quase completamente abolido nas células tratadas com anticorpo de IFNAR2 (Fig. 5). Devido a este resultado a indução de um estado antiviral em células Vero respondedoras pode ser atribuído exclusivamente aos interferões de tipo I produzidos pelas células MDBK ou pelos macrófagos. 34 ΡΕ1276853

Interferões de tipo I humanos recombinantes foram então utilizados para analisar directamente o comportamento de BRSV wt e dos mutantes de BRSV em células estimuladas por IFN. Para estudar o efeito do interferão de tipo I na replicação de BRSV e dos mutantes de deleção de NS, células Vero ou MDBK foram infectadas com os diferentes virus a uma MOI de 0,1 tal como descrito acima e semeadas em placas de seis poços em DMEM contendo FCS a 2,5%. O interferão de tipo I universal recombinante (interferão alfa A/D humano) ou o interferão beta humano (PBL Biomedical Laboratories) foi adicionado directamente após semear até uma concentração de 15000 U/ml. Os títulos dos vírus foram determinados após um período de incubação de três dias por meio de uma série de diluições e coloração indirecta das células infectadas com um anticorpo contra a proteína de fusão F.

Todos os três mutantes de deleção de NS mostraram uma susceptibilidade muito semelhante e dependente da dose à resposta celular induzida por IFN em que 1500 U resultaram numa redução de cerca de 10000 vezes nos títulos infecciosos (Fig. 6). Por outro lado o BRSV wt foi relativamente resistente ao tratamento de IFN. A protecção não foi, no entanto, completa e 1500 U de IFN alfa ou IFN beta causaram uma redução de cerca de 13 vezes.

Para avaliar a possibilidade da produção de BRSV wt em células bovinas ser mais pronunciada que na linha celular de primata Vero, infectámos células MDBK e Vero a uma MOI de 1 em experiências paralelas e adicionámos as 35 ΡΕ1276853 mesmas quantidades de IFN. Em células MDBK e Vero não tratadas, BRSV cresceu até aos mesmos títulos de 1,7><107 e 4*106 pfu/ml, respectivamente (Fig. 7). Com o tratamento de IFN os títulos em células Vero diminuíram mais depressa que em células MDBK. Após a adição de 10000 U de IFN os títulos infecciosos em células Vero eram 555 vezes menores que em células MDBK embora as últimas apresentassem já danos celulares consideráveis. A forte inibição dos mutantes de deleção de NS demonstrou que a resposta antiviral das células MDBK tem pelo menos a mesma força que a das células Vero. Portanto a maior protecção de BRSV wt em células MDBK sugere que BRSV lida mais eficientemente com a resposta antiviral celular bovina que com a das células de primata.

Exemplo 6: NS1 e NS2 de BRSV juntos aumentam a resistência do virus da raiva à resposta antiviral mediada por IFN A deleção de cada gene de NS de BRSV resultou no mesmo grau de sensibilidade às respostas celulares mediadas por IFN. Isto sugere que ambas as proteínas NS são necessárias para contrariar os mecanismos antivirais. Para confirmar a função cooperativa obrigatória de NS1 e NS2 e para descobrir se as duas proteínas NS podem ser utilizadas para protecção de um vírus não relacionado, desenvolvemos vírus da raiva recombinantes que expressam NS1 (SAD VB-NS1) ou NS2 (SAD VB-NS2). Foram construídos RVs recombinantes contendo um gene de NS1 ou NS2 adicional (Fig. 1) com base no ADNc de RV inteiro (SAD L16) que compreende mais uma sequência stop e de reinicio da transcrição dentro da 36 ΡΕ1276853 sequência não codificante 3' do gene de G (SAD VB) (32) . 0 gene adicional foi introduzido entre os genes de G e L do vírus da raiva atenuado SAD L16 (Fig. 1B), um método que já tinha tido sucesso para outros genes (12; 39). Primeiro foram construídos ADNcs incluindo versões das proteínas NSl e NS2 de BRSV com uma etiqueta proteica C-terminal. Foram introduzidos 27 nucleótidos adicionais correspondendo a uma região interna da proteína hemaglutinina (HA) de influenza imediatamente antes do codão stop de NSl por meio de PCR utilizando o iniciador inverso NSlHAr-EcoRI (5'— GCAATAGAATTCCTAAGCGTAATCTGGTACATCATAAGGATAATTCAGACCAAGAAGAG T-3') (contendo um local de restrição EcoRI; sublinhado). No caso de NS2, foram introduzidos 24 nucleótidos correspondendo ao péptido sintético FLAG utilizando o iniciador inverso NS2FLr-EcoRI (5'-GCAATAGAATTCCTATTTATCG-TCATCATCTTTATAATCTGGATTTAAATCATACTTATA-3') (EcoRI sublinhado) . Estes fragmentos de PCR foram utilizados para substituir as sequências correspondentes de um plasmídeo (pBSBRSVNSlNS2) , contendo o nt 1 ao nt 957 do ADNc de BRSV inteiro (5) . O gene NS1-HA foi excisado com NotI e EcoRI. Após uma reacção de preenchimento com polimerase Klenow o fragmento de 475 nt foi introduzido no local único SmaI de pSAD VB imediatamente a jusante do sinal de início da transcrição adicional. Isto deu pSAD VB-NS1HA. Um fragmento NS2-FL de 47 0 nt foi clonado de um modo semelhante após excisão com Asei e EcoRI e preenchimento com polimerase Klenow resultando em pSAD VB-NS2FL.

Foi obtido RV recombinante com o gene de NSl ou NS2 tal como descrito anteriormente (19) após transfecção 37 ΡΕ1276853 (protocolo de CaPCU; Estojo de Transfecção de Mamífero, Stratagene) de plasmídeos controlados pelo promotor T7 com o respectivo ADNc do vírus (10 μρ) . Os plasmídeos codificando a proteínas N (pTITB-N, 5 μ9) , P e L (pTITB-P e pTITB-L, 2,5 μρ por plasmídeo) de RV foram co-transfectados com os respectivos ADNcs virais para cerca de 106 células BSR T7/5 que expressam estavelmente a ARN-polimerase do fago T7 (5) . Após 4 horas, o meio de transfecção foi removido e foi substituído por meio BHK-21 (Gibco) contendo FCS a 10%. Os sobrenadantes das culturas celulares foram colhidos 6 dias após a transfecção e adicionados a novas células BSR. A detecção de RVs infecciosos foi efectuada através de coloração imunitária utilizando um conjugado de FITC (Centocor) que reconhece a nucleoproteína N de RV. Pôde-se obter recombinantes a partir do ADNc em células BSR T7/5 que expressam as proteínas de RV N, P e L a partir de plasmídeos transfectados. A expressão das proteínas NS não teve obviamente nenhum efeito adverso na replicação, nas características de crescimento nem nos títulos infecciosos dos recombinantes em células BSR (não mostrado).

Para examinar a actividade das proteínas de BRSV expressas foram infectadas células Vero com RV original (SAD VB) ou individualmente com cada um dos recombinantes ou co-infectadas com os dois recombinantes SAD VB-NS1 e SAD VB-NS2. A infecção com os RV recombinantes SAD VB, SAD VB-NS1 e SAD VB-NS2, respectivamente, foi efectuada tal como 38 ΡΕ1276853 descrito anteriormente (18) em suspensão utilizando uma MOI de 5. Para a co-infecção com SAD VB-NS1 e SAD VB-NS2 foi utilizada uma MOI de 2,5 para cada recombinante. Foi adicionado interferão de tipo I A/D universal recombinante até concentrações de 500 U/ml directamente após diluição das células. Os titulos dos virus foram determinados dois dias após a infecção através de séries de diluições e coloração imunitária com um conjugado de FITC dirigido contra a proteina N de RV (Centocor). Adicionalmente a expressão das proteínas de RV foi examinada dois dias após a infecção em pelo menos 4 experiências independentes. O crescimento de RV SAD VB original e dos virus que expressam a proteina NS1 ou NS2 das infecções simples foi afectado na mesma extensão (Fig. 8A). Após adição de 50 UI de IFN alfa os titulos cairam cerca de 1 log e depois ainda diminuíram muito lentamente com quantidades crescentes de IFN. Isto indica uma fraca resposta a IFN das células VERO ou uma elevada resistência intrínseca de RV à resposta mediada por IFN em células Vero. No entanto, em células co-transfectadas com vírus que expressam NS1 e NS2, pôde ser demonstrada uma protecção da replicação do vírus. Os títulos dos vírus permaneceram significativamente mais elevados que nas infecções simples e diminuíram apenas ligeiramente de um modo dependente da dose.

Para avaliar novamente a observação de cima de que as proteínas NS de BRSV podem bloquear a resposta antiviral das células bovinas mais eficazmente que a das 39 ΡΕ1276853 células Vero, foram conduzidas experiências em paralelo em células MDBK (Fig. 8B) . 0 RV SAD VB padrão e os recombi- nantes que expressam NS replicaram-se em células MDBK até titulos ligeiramente menores que em células Vero. Em contraste com as células Vero um tratamento de IFN reduziu até uma extensão significativa os titulos infecciosos das infecções simples de RV wt e dos virus que expressam NS. Uma diminuição imediata dos titulos infecciosos num grau de 3 log indicou uma resposta celular mediada por IFN altamente eficiente. No entanto, apesar desta resposta, em células co-infectadas com SAD VB-NS1 e SAD VB-NS2 a replicação do virus foi completamente protegida até quantidades de IFN adicionado de 150 UI. Estes resultados puderam ser confirmados através de uma análise da síntese proteica de RV. Em células não tratadas todos os recombinantes produziram quantidades semelhantes de proteínas de RV enquanto que em células tratadas com IFN apenas as co-infecções foram capazes de efectuar síntese proteica significativa até à adição de mais de 150-200 UI (não mostrado).

Os resultados mencionados acima mostram que ambas as proteínas NS de BRSV são não só capazes de conferir resistência à resposta antiviral mediada por IFN a BRSV como também a outro vírus não aparentado. Adicionalmente, os resultados confirmam que ambas as proteínas NS são necessárias e suficientes para exercer o efeito antago-nizador de IFN. 40 ΡΕ1276853

Exemplo 7: Resistência a interferão de isolados clínicos de RSV humano (HRSV)

Para mostrar que também o HRSV tem mecanismos de defesa contra o interferão, foram realizadas experiências com isolados clínicos de pacientes hospitalizados. Os isolados foram obtidos a partir de um estudo multicentro coordenado pelo Prof. Werchau de Ruhr University em Bochum. Obtiveram-se quatro isolados de pacientes tratados em hospitais alemães devido a "bronquiolite" diagnosticada (#61; #86; #109 e #110; grupo 1) e foram obtidos três isolados a partir de pacientes com "bronquite obstrutiva" diagnosticada (#104; #112 e #162; grupo 2).

Para impedir uma adaptação destes isolados clínicos a linhas celulares, estes foram propagados em células Hep2 durante duas passagens e empregues nas experiências subsequentes. As curvas de crescimento destes isolados foram determinadas com células Hep2. Enquanto que os isolados #61, #86 e #109 do grupo 1 para além do isolado #112 do grupo 2 cresceram rapidamente em células Hep2 e alcançaram títulos infecciosos semelhantemente elevados entre 3><106 e 4><107 pfu/ml após 3 dias, os isolados #110 do grupo 1 bem como #104 e #162 do grupo 2 eram claramente atenuados no crescimento e alcançaram apenas títulos de apenas 3xl04 pfu/ml após 3 dias (Fig. 9). Estas diferenças no crescimento foram também observadas em células de epitélio respiratório primário: enquanto que #61, #86, #109 e #112 induziram claramente a formação de sincícios, apenas 41 ΡΕ1276853 se pôde detectar infecções de células individuais para os isolados #110, #104 e #162 após o mesmo período de infecção (não mostrado).

Para determinação da resistência ao interferão dos isolados individuais, células Hep2 foram infectadas com os diferentes isolados (MOI = 0,1) durante 1 hora e foi depois aplicado interferão de tipo I A/D recombinante em concentrações de 150 a 5000 U/ml. Após um período de incubação de 72 horas, os títulos dos vírus de cada isolado clínico foram determinados por meio de titulação final. A este respeito observou-se que todos os isolados clínicos de HRSV independentemente da sua taxa de crescimento estavam protegidos do efeito antiviral do IFN de tipo I recombinante. Apenas com concentrações muito elevadas de IFN de 5000 U/ml a competência de replicação dos diferentes isolados clínicos de HRSV foi reduzida em apenas 10 vezes (Fig. 10). Estes dados mostram que todos os isolados clínicos de HRSV são capazes de contrariar o efeito antiviral de concentrações elevadas de IFN de tipo I recombinante e isto até pelo menos à mesma extensão que a estirpe laboratorial Long de HRSV (ver Fig. 7).

Os genes NS1 e NS2 dos isolados foram amplificados através de RT-PCR e as suas sequências determinadas. Foi estabelecido que ambos os genes são altamente conservados confirmando os resultados do ensaio de IFN. Tanto para a proteína NS1 como NS2 ocorreram apenas diferenças muito ligeiras na sequência de aminoácidos em comparação 42 ΡΕ1276853 com a estirpe Long de HRSV e entre os isolados. A proteína NS2 de HRSV Long e as proteínas NS1 dos isolados clínicos #104, 112, 61 e 110 são idênticas. Cada um dos isolados #162, 86 e 109 continha uma substituição de aminoácidos em relação à sequência de HRSV Long (#86/ N(76)S, #162, V(82)M, #109 E(91)G). As proteínas NS2 de todos os isolados clínicos são idênticas nas suas sequências de aminoácidos e diferem de HRSV Long em 2 substituições DN(7,8)GT e T(21)I. Portanto as proteínas NS e genes de NS, respectivamente, de HRSV Long foram utilizadas para mais experiências.

Exemplo 8: As proteínas NS1 e NS2 de RSV humano (HRSV) juntas aumentam a resistência do vírus da raiva à resposta antiviral mediada por IFN

Para demonstrar que ambas as proteínas NS de HRSV têm um efeito antagonizador de IFN de tipo I e que esta função pode ser transferida para outros vírus não aparentados, foram desenvolvidos vírus da raiva recombinantes que expressavam NS1 (SAD VB-hNSl) ou NS2 (SAD VB-hNS2) de HRSV (estirpe Long) . Os RVs recombinantes com o gene de NS1 ou NS2 adicional (Fig. 11) foram construídos com base no ADNc de RV inteiro (SAD L16) contendo uma sequência stop e de reinicio da transcrição adicional na sequência não codificante 3' do gene de G (SAD VB) (32). O gene adicional foi introduzido entre os genes de G e L de vírus da raiva atenuados SAD L16 (Fig. 1B) tal como já descrito para os genes de NS de BRSV. Os ADNcs dos dois genes de HRSV foram obtidos por meio de RT-PCR. Para este fim foi isolado ARN 43 ΡΕ1276853 total a partir de células Vero infectadas com HRSV (Long). Para o gene NS1 foram utilizados os seguintes iniciadores: hNSl-Ncol5' (5'-ATT GAC CAT GGG CAG CAA TTC ATT-3'; síntese

da primeira cadeia e PCR) e hNSl-EcoRI5' (5'-ATT GAG AAT

TCT TAT GGA TTA AGA TCA AA-3'), para o gene de NS2 os iniciadores: hNS2-NcoI5' (5'-ATT GAC CAT GGA CAC AAC CCA CA-3 ' ) e hNS2 -EcoRI 3 ' (5'-ATT GAG AAT TCT TAT GGA TTG AGA

TCA TA-3'). Após restrição com as enzimas de restrição NotI e EcoRI estes fragmentos de PCR foram clonados no plasmídeo TIT cortado do mesmo modo (pTIT-hNSl, pTIT-hNS2). Depois, o gene de NS1 foi amplificado a partir de pTIT-hNSl utilizando PCR com os iniciadores hNSl-Not5' (5'-TAT GAA

GCG GCC GCC CCC TCT CTT CTT TCT ACA GAA AAT GGG CAG CAA TTC

ATT GAG-3') e hNSl-EcoRI3' e digerido com as enzimas de restrição NotI e EcoRI. Após uma reacção de preenchimento com a polimerase Klenow, o fragmento foi introduzido no local único Sma I de pSAD VB imediatamente a jusante do sinal de início da transcrição adicional. Isto produziu pSAD VB-hNSl. O gene NS2 foi amplificado a partir de pTIT-hNS2 utilizando o iniciador hNS2-AseI5' (5'-ATA CTT ATT AAT

TGG GGC AAA TAA ATC AGT TCC CCA ACC AGC CAT GGA CAC AAC CCA

CAA TG-3') e hNS2-Acc6513' (5'-ATA AAT GGT ACC AAA AGA TAA

CAC TGT GTG AAT TAA ATT TTG AAA AGT GCT TAT GGA TTG AGA TCA TAC TTG-3'), cortado com Asei e EcoRI e após preenchimento com polimerase Klenow foi clonado de um modo semelhante ao do gene hNSl. Isto resultou em pSAD VB-hNS2 (Fig. 11). O RV recombinante contendo o gene de NS1 ou NS2 de HRSV foi obtido tal como descrito anteriormente (19) 44 ΡΕ1276853 após transfecção (protocolo de CaP04; Estojo de Transfecção de Mamífero, Stratagene) de plasmídeos controlados pelo promotor T7 utilizando o respectivo ADNc do vírus (10 yg) . Os plasmídeos codificando as proteínas N (pTITB-N, 5 yg), P e L (pTITB-P e pTITB-L, 2,5 yg por cada plasmídeo) de RV foram co-transfectados com os respectivos ADNcs virais em cerca de 106 células BSR T7/5 que expressam estavelmente a ARN-polimerase do fago T7 (5) . Após 4 horas, o meio de transfecção foi removido e substituído por meio BHK-21 (Gibco) com FCS a 10%. Os sobrenadantes das culturas celulares foram colhidos 6 dias após a transfecção e adicionados a novas células BSR. A detecção de RVs infecciosos foi efectuada através de coloração imunitária utilizando um conjugado de FITC (Centocor) que reconhece a nucleoproteína N de RV. A expressão das proteínas NS de HRSV não teve obviamente nenhum efeito adverso na replicação, nas características de crescimento nem nos títulos infecciosos dos RVs recombinantes em células BSR (não mostrado).

Para examinar a actividade das proteínas de HRSV expressas foram infectadas células MDBK com RV original (SAD VB) ou individualmente com cada um dos recombinantes ou co-infectadas com os dois recombinantes SAD VB-hNSl e SAD VB-hNS2. A infecção com os recombinantes SAD VB, SAD VB-hNSl e SAD VB-hNS2 de RV, respectivamente, foi efectuada tal como já descrito (18) em suspensão utilizando uma MOI de 5. Para co-infecção com SAD VB-hNSl e SAD VB-hNS2 foi utilizada uma MOI de 2,5 para cada recombinante. Foi 45 ΡΕ1276853 adicionado directamente após diluição das células interferão de tipo I A/D universal recombinante em concentrações de 50-500 U/ml. Os titulos dos virus foram determinados dois dias após a infecção através de séries de diluições e coloração imunitária com um conjugado de FITC dirigido contra a proteína N de RV (Centocor). O tratamento de IFN reduziu claramente os títulos infecciosos das infecções simples de RV wt e dos vírus que expressam hNS. Uma adição de apenas 50 UI de IFN alfa resultou numa queda nos títulos infecciosos de 3 ordens de grandeza. Em células co-infectadas com SAD VB-hNSl e SAD VB-hNS2, no entanto, a replicação do vírus foi claramente protegida até quantidades de 150 UI de IFN adicionado (Fig. 11).

Estes resultados demonstram que também as duas proteínas NS de HRSV são capazes de antagonizar a resposta celular a IFN e de tornar um vírus não aparentado resistente à resposta antiviral mediada por IFN. Adicionalmente, os resultados confirmam que ambas as proteínas NS são necessárias e suficientes para exercer o efeito antago-nizador de IFN.

Exemplo 9: As proteínas NS1 e NS2 de pneumovírus de murideo (vírus da pneumonia dos ratinhos; PVM) juntas aumentam a resistência do vírus da raiva à resposta antiviral mediada por IFN

Para demonstrar que também as duas proteínas NS de PVM medeiam resistência a IFN de tipo I e que esta 46 ΡΕ1276853 função pode ser transferida para o vírus da raiva, foram desenvolvidos vírus da raiva recombinantes que expressavam NS1 (SAD VB-mNSl) ou NS2 (SAD VB-mNS2) de PVM. Os ADNcs dos dois genes de PVM foram gentilmente proporcionados por Andrew Easton; University of Warwick, U.K. (N° de acesso GenBank D10331; Fig. 18). Os RVs recombinantes com um gene de NS1 ou NS2 adicional (Fig. 11) foram também construídos com base em SAD VB (32; ver Exemplos 6 e 8) . 0 gene adicional foi introduzido entre os genes de G e L de RV SAD L16 (Fig. 1B) tal como já descrito acima para os genes de NS de BRSV. Os genes das duas proteínas NS foram amplificados por meio de PCR introduzindo no gene de NS1 27 nucleótidos adicionais codificando uma região interna da proteína hemaglutinina de influenza (HA) (etiqueta HA) imediatamente antes do codão stop da tradução. Imediatamente a montante do codão stop do gene de NS2 foram introduzidos 24 nucleótidos codificando um péptido FLAG sintético (etiqueta FLAG) . Para o gene de NS1 de PVM foram utilizados os seguintes iniciadores: mNSl-NotIEcoRV5' (5' —

AAT GAT ATC GCG GCC GCC CCC TCT CTT CTT TCT ACA GAA ATG GGC

TGT AAT GTG ATG ATG-3') e mNSlha-EcoRI/V3' (5'-AAT GAT ATC

GAA TTC TTA AGC GTA ATC GG TAC ATC ATA AGG ATA ACC ACT GAT CAG CTC TAC-3' ) , para o gene de NS2 de PVM os iniciadores

mNS2-AseIEcoRV5 ' (5'-AAT GAT ATC ATT AAT TGG GGC AAA TAA

ATC AGT TCC CCA ACC AGC CAT GTC CAC AGC TAT GAA CAA G-3') e mNS2f l-EcoRI/V3 ' (5'-AAT GAT ATC GAA TTC TCA TTT ATC GTC

ATC ATC TTT ATA GTC ATC ATC ATC CTC ATC-3'). Após digestão com a enzima de restrição FcoRV estes fragmentos de PCR foram então introduzidos no local único Sma I de pSAD VB 47 ΡΕ1276853 imediatamente a jusante do sinal de inicio da transcrição adicional. Isto produziu pSAD VB-mNSl e pSAD VB-mNS2 (Fig. 11) . O RV recombinante contendo o gene de NS1 ou NS2 de PVM foi obtido em células BSR T7/5 que expressam as proteínas N, P e L de RV a partir de plasmídeos transfe-tados tal como já descrito nos Exemplos 6 e 8. A expressão das proteínas NS não teve obviamente nenhum efeito adverso na replicação, nas características de crescimento nem nos títulos infecciosos dos recombinantes em células BSR (não mostrado).

Para avaliar a actividade das proteínas de PVM expressas foram infectadas células MDBK com RV original (SAD VB) ou individualmente com cada um dos recombinantes ou co-infectadas com os dois recombinantes SAD VB-mNSl e SAD VB-mNS2. A infecção com os recombinantes SAD VB, SAD VB-mNSl e SAD VB-mNS2 de RV, respectivamente, foi efectuada tal como já descrito (18) em suspensão utilizando uma MOI de 5. Para a co-infecção com SAD VB-mNSl e SAD VB-mNS2 foi utilizada uma MOI de 2,5 para cada recombinante. Foi adicionado directamente após diluição das células inter-ferão de tipo I A/D universal recombinante em concentrações de 50-500 U/ml. Os títulos dos vírus foram determinados dois dias após a infecção através de séries de diluições e coloração imunitária com um conjugado de FITC dirigido contra a proteína N de RV (Centocor) . O tratamento de IFN reduziu claramente os títulos infecciosos das infecções 48 ΡΕ1276853 simples de RV wt e dos vírus que expressam hNS. Uma adição de apenas 50 UI de IFN alfa resultou numa queda nos títulos infecciosos de 3 ordens de grandeza. Em células co-infectadas com SAD VB-mNSl e SAD VB-mNS2, no entanto, a replicação do vírus foi claramente protegida até quantidades de 100 UI de IFN adicionado (Fig. 13).

Estes resultados demonstram que também as duas proteínas NS de PVM são capazes de antagonizar a resposta celular a IFN e de tornar um vírus não aparentado resistente à resposta antiviral mediada por IFN. Uma vez que a homologia das proteínas NS de PVM com as de HRSV é de apenas 17% (para NS1) e de 20% (para NS2) a função antago-nizadora de IFN era imprevista. Tal como já observado para as proteínas NS de BRSV e HRSV também no caso de PVM ambas as proteínas NS são necessárias e suficientes para exercer a actividade antagonizadora de IFN.

Exemplo 10: Preparação de BRSV recombinante ancorando genes de NS heterólogos

Construímos ainda BRSVs quiméricos recombinantes através da substituição dos próprios genes de BRSV por genes de NS de outros pneumovírus.

Para a preparação de BRSVs recombinantes contendo o gene de NS1 de HRSV ou PVM em vez do gene de NS1 de BRSV foi utilizado um plasmídeo contendo os nucleótidos 1 a 957 do ADNc inteiro de BRSV (5) e que possui adicionalmente um 49 ΡΕ1276853 local de restrição EcoRI no gene NS1 no nt 311 (pbNSlEcoRIbNS2). Deste modo a região de codificação completa do gene de NS2 pode ser removida através de digestão com as enzimas de restrição NotI e EcoRI. 0 gene de NS1 de HRSV e PVM foi amplificado por meio de PCR utilizando os iniciadores hNSl-NotI5' e hNSl-EcoRI3' para NS1 de HRSV e mNSl-NotIEcoRV5' e mNSlha-EcoRI3' para NS1 de PVM e após digestão com as enzimas de restrição Not I e EcoRI foi introduzido num plasmideo dando phNSlbNS2 e pmNSlbNS2. Depois, ambos os plasmideos foram digeridos com Not I e Accl e os fragmentos resultantes de 1094 nt de comprimento para hNSlbNS2 e de 1043 nt para mNSlbNS2, respectivamente, foram inseridos no ADNc de BRSV inteiro. Isto produziu rBRSV hNSlbNS2 e rBRSV mNSlbNS2 (Fig. 14).

Para a preparação de BRSVs possuindo genes de NS2 heterólogos (rBRSV bNSlhNS2 e rBRSV bNSlmNS2), pNSlNS2 (5) foi cortado primeiro com a enzima de restrição Acc65I e depois parcialmente com a enzima de restrição Asei excisando um fragmento de 44 6 nt compreendendo o gene de bNS2. Neste local foi então introduzido um fragmento contendo o gene de hNS2 ou mNS2, respectivamente. Estes fragmentos foram gerados por PCR utilizando os iniciadores hNS2-AseI5' e hNS2-Acc65I3' para o gene de NS2 de HRSV ou mNS2-AseIEcoRV5' e mNS2-Acc65I3' (5'-ATA AAT GGT ACC AAA AGA TAA CAC TGT GTG AAT TAA ATT TTG AAA AGT GCT CAT TTA TCG TCA TCA TCT TTA TAG-3') para o gene de NS2 de PVM. Os fragmentos foram subsequentemente digeridos com as enzimas de restrição Asei e Acc65I e introduzidos em pNSlNS2 dando 50 ΡΕ1276853 pbNSlhNS2 e pbNSlmNS2. Estes plasmídeos foram então digeridos com as enzimas de restrição NotI e Acc651 e os fragmentos resultantes (949 nt para bNSlhNS2 e 1069 nt para bNSlmNS2) foram inseridos no ADNc de BRSV inteiro produzindo rBRSV bNSlhNS2 e rBRSV bNSlmNS2 (Fig. 14).

Para a preparação de BRSVs recombinantes contendo ambos os genes de NS de HRSV e PVM, respectivamente, os plasmídeos phNSlbNS2 e pmNSlbNS2 foram primeiro cortados com a enzima de restrição Acc65I e depois parcialmente com a enzima de restrição Asei. Depois, os fragmentos descritos acima do gene de NS2 de HRSV e do gene de NS2 de PVM foram introduzidos nos respectivos plasmídeos dando phNSlhNS2 e pmNSlmNS2. Estes plasmídeos foram também digeridos com as enzimas de restrição A7dtl e Acc65I e os fragmentos resultantes de 1094 nt para hNSlhNS2 e 1163 nt para mNSlmNS2 foram inseridos no ADNc inteiro de BRSV. Isto deu rBRSV hNSlhNS2 e rBRSV mNSlmNS2 (Fig. 14) .

Os vírus recombinantes viáveis rBRSV hNSlbNS2, rBRSV bNSlhNS2 e rBRSV hNSlhNS2 bem como rBRSV mNSlbNS2, rBRSV bNSlmNS2 e rBRSV mNSlmNS2 puderam ser obtidos a partir das respectivas construções de ADNc em células BSR T7/5 (5) após transfecção (protocolo de CaPO^/ Estojo de

Transfecção de Mamífero, Stratagene) de plasmídeos controlados pelo promotor T7 utilizando os respectivos ADNcs dos vírus (10 μρ) . Os plasmídeos codificando as proteínas N e P (pTITB-N e pTITB-P, 4 μρ por cada plasmídeo) e L e M2 (pTITB-L e pTITB-M2, 2 μρ por cada 51 ΡΕ1276853 plasmídeo) de BRSV foram co-transfectados com cada ADNc do vírus para cerca de 106 células BSR T7/5 que expressam estavelmente a ARN-polimerase do fago T7 (5). Após 4 horas, o meio de transfecção foi removido e foi adicionado meio BHK-21 (Gibco) contendo FCS a 5%. As células transfectadas com ADNc de BRSV foram diluídas de 5 em 5 dias a uma razão de 1:3 até se poder observar um efeito citopatogénico.

Em todos os casos a co-transfecção dos plasmídeos de suporte codificando as proteínas N, P, L e M2 de BRSV resultaram na formação de sincícios. Após diluição das células transfectadas a uma razão de 1:3 e a ocorrência de um claro efeito citopatogénico os vírus foram colhidos.

Para a preparação de soluções de reserva de vírus, células Vero confluentes a 80% foram infectadas a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,1 em meio essencial mínimo de Dulbecco (DMEM) sem soro. Após adsorção durante uma hora o inoculo foi removido e as células foram incubadas a 37°C em DMEM suplementado com FCS a 2,5% numa atmosfera de CO2 a 5% até ser observado um claro efeito citopático (CPE) após aprox. 4 dias. Os vírus foram libertados através de congelação e subsequente descongelação. Os títulos dos vírus em células Vero foram determinados através de séries de diluição em placas de micro-título seguido de contagem dos focos infectados. Para este fim os focos foram corados através de coloração indirecta utilizando um anticorpo contra a proteína de fusão F (SEROTEK, U.K.). 52 ΡΕ1276853

Exemplo 11: Crescimento das quimeras de BRSV: a resistência a IFN é dependente do tipo celular

As características de crescimento dos vírus foram primeiro analisadas em células Vero. Embora BRSV hNSlhNS2 e BRSV hNSlbNS2 se tenham comportado de forma semelhante a BRSV wt, BRSV mNSlmNS2 e BRSV mNSlbNS2 eram ligeiramente atenuados em comparação com o vírus original inteiro. Isto indica que a função ou funções das proteínas NS de BRSV na replicação do vírus são efectuadas pela proteína NS de HRSV em toda a sua extensão. Tanto o BRSV wt original como as duas quimeras HRSV/BRSV alcançaram títulos de infecção de cerca de 5*105 pfu após infecção das células Vero com uma MOI de 0,1 e um período de incubação subsequente de 3 dias (Fig. 15) . Por outro lado, as quimeras PVM/BRSV alcançaram apenas cerca de 4><105 pfu após 3 dias, indicando que os genes de NS de PVM não são óptimos para efectuar a função dos genes de BRSV (e de HRSV) na replicação do vírus.

Subsequentemente, foi utilizada uma linha celular de origem bovina, MDBK, que é óptima no suporte do crescimento de BRSV wt e em contraste com células Vero possui um sistema de IFN de tipo I funcional (5) . Neste caso o crescimento de BRSV hNSlhNS2 foi reduzido em comparação com BRSV wt. Após 3 dias foi alcançado um título de 4χ104 pfu em contraste com BRSV que cresce até 1*106 pfu (Fig. 16) . Na célula hospedeira óptima para BRSV wt, as células bovinas MDBK, o crescimento de BRSV hNSlhNS2 é 53 ΡΕ1276853 obviamente atenuado enquanto que nas células Vero negativas para IFN não se pode observar atenuação.

Foram então utilizados interferões de tipo I humanos recombinantes para analisar o comportamento de BRSV wt e BRSV hNSlhNS2 em células estimuladas com IFN. Para estudar o efeito de interferão de tipo I na replicação de células Vero e MDBK recombinantes estas foram infectadas com os diferentes virus a uma MOI de 0,1 tal como descrito acima e semeadas em placas de seis poços em DMEM contendo FCS a 2,5%. Interferão de tipo I universal recombinante (interferão alfa A/D humano, PBL Biomedical Laboratories) foi adicionado directamente após semear em concentrações de 500-10000 U/ml. Os titulos dos virus foram determinados após um período de incubação de três dias através de uma série de diluições e coloração indirecta das células infectadas com um anticorpo contra a proteína de fusão F. Não se conseguiu observar qualquer diferença em células Vero entre BRSV wt e BRSV hNSlhNS2 em relação à sua resistência a IFN. Para ambos os vírus pôde ser observada uma ligeira redução nos títulos infecciosos apenas após a adição de 5000 U e mais (Fig. 17A). Em contraste em células MDBK, BRSV hNSlhNS2 mostrou uma forte sensibilidade dependente da dose à resposta celular induzida por IFN em que apenas 1500 U resultaram numa redução de 3 vezes e 10000 U numa redução de 30 vezes nos títulos infecciosos. Por outro lado, BRSV wt exibiu uma elevada resistência ao tratamento de IFN. Mesmo 10000 U de IFN alfa não afectaram 54 ΡΕ1276853 a replicação de BRSV wt (Fig. 17B). Embora o BRSV hNSlhNS2 quimérico apresente uma resistência a IFN semelhante à de BRSV wt em células Vero, é incapaz de prevenir completamente a resposta antiviral induzida por IFN em células de origem bovina. Isto demonstra que as proteínas NS de BRSV têm mais sucesso na gestão da resposta celular antiviral bovina que as proteínas NS de HRSV. Obviamente, o efeito antagonizador de IFN das proteínas NS é sub-óptimo em células hospedeiras heterólogas. Os vírus RS quiméricos possuindo proteínas NS heterólogas são atenuados in vivo e podem ser utilizados como vacinas vivas.

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LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS

<110> WYETH <120> PROTEÍNAS NS DE PNEUMOVÍRUS QUE ANTAGONIZAM A RESPOSTA DE INTERFERÃO (IFN)

<130> 128-001 PEP <140> 01 929 607.8 <141> 2001-04-26 <150> DE 100 20 505.4 <151> 2000-04-26 <160> 16 <170> Patentln Ver. 2.1

<210> 1 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Iniciador NNot (+) <400> 1 taggcggccg caaaaatggc tcttaggaag gtg 33

<210> 2 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Iniciador Nstu (-) <400> 2 tcctttgtat cgtttcattt c 21

<210> 3 <211> 60 <212> ADN 64 ΡΕ1276853 Λ 00 \—I Osl V Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: Iniciador NSlHAr-EcoRI <400> 3 gcaatagaat tcctaagcgt aatctggtac atcataagga taattcagac caagaagagt 60 <210> 4 <211> 60 Λ Osl \—I Osl V ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Iniciador NS2FLr-EcoRI <400> 4 gcaatagaat tcctatttat cgtcatcatc tttataatct ggatttaaat catacttata 60 <210> 5 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Iniciador hNSl-NcoI5 <400> 5 attgaccatg ggcagcaatt catt 24 <210> 6 <211> 29 Λ Osl \—1 Osl V ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: Iniciador hNSl-EcoRI5 <400> 6 attgagaatt cttatggatt aagatcaaa 29

<210> 7 <211> 23 A Osl \—1 Osl V ADN 65 ΡΕ1276853 <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: Iniciador hNS2-NcoI5 <400> 7 attgaccatg gacacaaccc aca 23

<210> 8 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: Iniciador hNS2-EcoRI3 <400> 8 attgagaatt cttatggatt gagatcata 29

<210> 9 <211> 57 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Iniciador hNSl-NotI5 <400> 9 tatgaagcgg ccgccccctc tcttctttct acagaaaatg ggcagcaatt cattgag 57

<210> 10 <211> 62 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Iniciador hNS2-AseI5 <400> 10 atacttatta attggggcaa ataaatcagt tccccaacca gccatggaca caacccacaa 60 tg 62 <210> 11 <211> 71 66 ΡΕ1276853

<212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Iniciador hNS2-Acc65I3 <400> 11 ataaatggta ccaaaagata acactgtgtg aattaaattt gaaaagtgct tatggattga 60 gatcatactt g 71

<210> 12 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Iniciador mNSl-NotIEcoRV5 <400> 12 aatgatatcg cggccgcccc ctctcttctt tctacagaaa tgggctgtaa tgtgatgatg 60

<210> 13 <211> 62 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: Iniciador mNSlha-EcoRI/V3 <400> 13 aatgatatcg aattcttaag cgtaatcggt acatcataag gataaccact gatcagctct 60 ac 62

<210> 14 <211> 67 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Iniciador mNS2-AselEcoRV5 <400> 14 60 67 aatgatatca ttaattgggg caaataaatc agttccccaa ccagccatgt ccacagctat gaacaag 67 ΡΕ1276853

<210> 15 <211> 57 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: Iniciador mNS2fl-EcoRI/V3 <400> 15 aatgatatcg aattctcatt tatcgtcatc atctttatag tcatcatcat cctcatc 57

<210> 16 <211> 75 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: Iniciador mNS2-Acc65I3 <400> 16 ataaatggta ccaaaagata acactgtgtg aattaaattt tgaaaagtgc tcatttatcg 60 tcatcatctt tatag 75

Lisboa, 3 de Outubro de 2006

Claims (25)

1. ΡΕ1276853 1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de uma proteina NS2 de RSV ou de uma sequência de ácido nucleico codificando NS2 para a preparação de uma formulação farmacêutica para redução da resposta imunitária mediada por IFN.
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que é utilizada a NS2 de RSV e adicionalmente uma proteina NS1 ou a sequência de ácido nucleico codificando NS2 e adicionalmente um ácido nucleico codificando NS1.
3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a resposta imunitária é uma resposta anti-viral.
4. 4. Utilização de acordo com as reivindicações 1-3, em que a resposta imunitária mediada por IFN é inibida .
5. 5. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, em que a sequência de ácido nucleico é ADN ou ARN.
6. 6. Utilização de acordo com as reivindicações 2-5, em que as proteínas NS1 e NS2 de RSV são utilizadas juntas ou em que a sequência de ácido nucleico codificando 2 ΡΕ1276853 NS1 é utilizada juntamente com a sequência de ácido nuclei-co codificando NS2.
7. 7. Utilização de acordo com a reivindicação 6, em que a proteína NS1 e a proteína NS2 de RSV são derivadas de diferentes vírus RSV ou em que a sequência de ácido nucleico codificando NS1 de RSV e a sequência de ácido nucleico codificando NS2 de RSV são derivadas de diferentes virus RSV.
8. 8. Utilização de acordo com a reivindicação 5, em que a sequência de ácido nucleico está contida num plasmideo ou num vector ou num vector derivado de virus ou num ADN recombinante ou virus de ARN.
9. 9. Utilização de acordo com a reivindicação 8, em que o referido vector é um vector de expressão de um gene virai utilizado para fins de imunização em terapia génica ou em terapia cito-redutora (destruição de células; anticancro).
10. 10. Utilização de acordo com a reivindicação 8, em que o virus ou o vector derivado de virus é derivado de um virus de ADN tal como adenovirus (AdV), virus adeno-associado (AAV), herpesvirus ou virus da varíola.
11. 11. Utilização de acordo com a reivindicação 8, em que o vírus ou o vector derivado de vírus é derivado de 3 ΡΕ1276853 um vírus de cadeia positiva, de preferência de vírus das famílias Alfaviridae, Flaviviridae e Picornaviridae.
12. 12. Utilização de acordo com a reivindicação 8, em que o vírus ou vector derivado de vírus é derivado de um vírus de ARN de cadeia negativa segmentado ou não segmentado.
13. 13. Utilização de acordo com a reivindicação 8, em que o vírus de ARN é derivado das famílias Paramyxo-viridae, Filoviridae, Bornaviridae ou Rhabdoviridae, particularmente para vírus da raiva.
14. 14. Utilização de acordo com a reivindicação 13, em que o vírus de ARN é derivado de RSV humano ou animal.
15. 15. Utilização de acordo com a reivindicação 14, em que a sequência de ácido nucleico codificando NS2 é heteróloga ao referido RSV humano ou animal.
16. 16. Utilização de acordo com as reivindicações 1 a 15, em que a formulação farmacêutica contém ainda uma vacina.
17. 17. Utilização de acordo com as reivindicações 1 a 16, em que a proteína NS2 é modificada.
18. 18. Utilização de acordo com a reivindicação 17, em que a modificação é seleccionada de entre o grupo de 4 ΡΕ1276853 substituições, deleções ou inserções de aminoácidos.
19. 19. Utilização de acordo com as reivindicações 17 ou 18, em que a modificação resulta num aumento da actividade antagonizadora de IFN da proteína NS2.
20. 20. Utilização de acordo com a reivindicação 17 ou 18, em que a modificação resulta numa redução da actividade antagonizadora de IFN da proteína NS2.
21. 21. Utilização de acordo com as reivindicações 1 a 20, em que IFN é interferão de tipo I (IFN alfa ou IFN beta).
22. 22. Utilização de acordo com a reivindicação 1, sendo a proteína NS2 ou a sequência de ácido nucleico codificando NS2 derivada de BRSV, HRSV ou PVM.
23. 23. Utilização de acordo com a reivindicação 2, sendo a proteína NS1 e/ou NS2 de RSV ou a sequência de ácido nucleico codificando NS1 e/ou a sequência de ácido nucleico codificando NS2 derivadas de BRSV, HRSV ou PVM.
24. 24. Utilização de acordo com a reivindicação 22, possuindo a proteína NS2 de BRSV, HRSV ou PVM a sequência de acordo com a Fig. 18 ou a sequência de ácido nucleico codificando NS2 de BRSV, HRSV ou PVM codificando a sequência de acordo com a Fig. 18. 5 ΡΕ1276853
25. 25. Utilização de acordo com a reivindicação 23, possuindo a proteina NS1 e/ou NS2 de RSV de BRSV, HRSV ou PVM a sequência de acordo com a Fig. 18 ou a sequência de ácido nucleico codificando NS1 e/ou a sequência de ácido nucleico codificando NS2 de BRSV, HRSV ou PVM codificando a sequência de acordo com a Fig. 18. Lisboa, 3 de Outubro de 2006