KR100584831B1 - 인터페론 (아이에프엔) 반응을 길항시키는 뉴모바이러스엔에스 단백질 - Google Patents
인터페론 (아이에프엔) 반응을 길항시키는 뉴모바이러스엔에스 단백질 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 인터페론(IFN)에 의해 매개되는 면역반응을 약화시키기 위한 약학 제형물의 제조를 위한 뉴모바이러스 NS1 단백질 및/또는 NS2 단백질 혹은 뉴모바이러스 NS1 단백질 및/또는 NS2 단백질을 암호화하는 핵산의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 인터페론(IFN) 매개되는 면역반응에 대한 증가된 내성, 감소된 내성 또는 결여된 내성을 가지는 재조합 뉴모바이러스, 특히 호흡기 합포체 바이러스(RSV), 인터페론(IFN) 매개되는 면역반응에 대한 증가된 내성을 가지는 재조합 바이러스 및 약학 적용, 예를 들면 백신으로서의 바이러스 용도에 관한 것이다.
인터페론, RSV, 면역반응, 내성
Description
본 발명은 인터페론(IFN)에 의해 매개되는 면역반응을 약화시키기 위한 약학 제형물의 제조를 위한 뉴모바이러스 NS1 단백질 및/또는 NS2 단백질 혹은 뉴모바이러스 NS1 단백질 및/또는 NS2 단백질을 암호화하는 핵산의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 재조합 뉴모바이러스, 구체적으로 말하면 숙주의 인터페론(IFN) 매개되는 면역반응에 대해 증가된 내성, 감소된 내성 또는 결여된 내성을 가지는 호흡기 합포체 바이러스(RSV), 인터페론(IFN) 매개되는 면역반응에 대해 증가된 내성을 가지는 재조합 바이러스 및 약학 제형물에서 이러한 바이러스의 예를 들면, 백신으로서의 용도에 관한 것이다.
소 호흡기 합포체 바이러스(BRSV)는 송아지의 호흡기도 질환의 가장 중요한 병인이고 중요한 경제적 손실을 입힌다(40; 45). 송아지에서의 면역반응 및 병리는 여전히 전세계의 유아와 아동에서 심각한 세기관지염 및 폐렴의 주요 원인인 인간 호흡기 합포체 바이러스(HRSV)에 의해 발생되는 증상과 유사하다(9). HRSV 및 BRSV와 관련 바이러스, 즉 마우스의 폐렴 바이러스(PVM)의 분자적 클로닝이 BRSV와 HRSV 사이의 밀접한 관계를 확인하였고 이들이 파라믹소비리대(Paramyxoviridae) 과내에서 뉴모비리내(Pneumovirinae) 아과의 정립을 이끌어내는 파라믹소비리대 과의 다른 멤버와의 본질적인 차이점을 공유한다는 것을 보여주었다(36; 37). 이 아과 내에서, RSV 바이러스 및 PVM이 뉴모바이러스 속을 구성하고 반면 조류 뉴모바이러스(APV)가 지금까지 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus) 속의 유일한 멤버였다.
모노네가비랄레스(Mononegavirales) 목의 모든 멤버에 있어서 RSV 및 PVM의 약 15 kb 게노믹 RNA가 유전자의 연속 전사를 위한 주형으로 작용하는 리보뉴클레오프로틴(RNP) 복합체에 함유되어 있다(25; 49). 11 단백질이 3'-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-5' 순서로 배열된 10 전사 유닛에 의해 발현된다(5; 9; 30; 31). 암호화된 단백질은 5 RNP 수반 단백질: 핵단백질(N), 인단백질(P), RNA 폴리머라제의 큰 촉매 서브유닛(L) 및 M2 유전자의 2 오버랩핑 개방 판독 프레임 중 첫번째에 의해 암호화된 전사 신장 인자(M2-1)를 포함한다(8; 17; 27; 38). M2 전사 유닛(M2-2)의 두번째 개방 판독 프레임은 아마도 RNA 합성의 조절(4; 28)에 관여하는 것 같은 기술되어 있는 비-필수 단백질(1)을 암호화한다. 3 바이러스 단백질은 바이러스 외피와 회합된다; 융합 단백질 F, 가정의 접합 단백질 G 및 작은 소수성 단백질 SH.
게놈의 3'-말단 위치에 2 비-구조 단백질 유전자의 존재가 모노네가비랄레스 목의 모든 다른 멤버로부터 뉴모바이러스 속의 멤버를 구분한다. 3'-말단에 인접한 그들의 위치 때문에 NS 유전자는 지나치게 전사된다. 암호화된 단백질이 감염된 세포에서 검출되었다(10; 16). BRSV NS 유전자는 136 및 124 아미노산을 가지는 폴리 펩타이드를 암호화한다. 서브그룹 A 및 B로부터의 HRSV의 NS 단백질과의 비교가 NS1 단백질의 경우에는 69% 및 68% 및 NS2 단백질의 경우에는 84% 및 83%의 아미노산 상동성을 보여주었다(5; 34). PVM NS1 및 NS2 단백질은 RSV NS 유전자와 상당한 상동성을 보이지는 않지만(약 20% 동일) 그럼에도 불구하고 유사한 기능을 갖는다. 그러나, 유래된 서열은 바이러스의 생활환에서 NS 단백질의 기능에 대한 명백한 암시를 나타내지 않았다. HRSV NS1 단백질은 M 단백질과 회합하고 반면 NS2 단백질은 RSV 구조 단백질과의 검출 가능한 회합을 보이지 않는다는 것이 보고되어 있고(16; 47), 이는 NS1과 NS2의 상이한 기능을 의미한다. 최근에, NS1의 바이러스 RNA 전사 억제 기능이 인공 HRSV 미니게놈을 NS1의 유무하에 성장시키는 실험에 의해 설명되었다. 또한, 같은 연구에서 억제 효과가 또한 NS2의 경우에도 관찰되었지만 NS2의 이 효과는 훨씬 덜 두드러졌다(3).
최근에 cDNA로부터 감염성 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스의 확립된 제조("회수")방법(11)이 재조합 인간(8; 29) 및 소(5) RSV의 생산 및 바이러스 상황에서 각 단백질 기능의 시험을 가능하게 하였다. 생존 가능한 NS2 유전자 결실 돌연변이체의 성공적인 제조는 NS2가 세포 배양균에서 바이러스 복제에 필수적이지는 않다는 것을 보여주었다(5; 43). 감염된 세포에서 생산된 mRNA와 전체 길이 RNA의 패턴 및 상대량은 가시적으로는 변화하지 않았다. 그러나, 결실 돌연변이체는 출발 바이러스와 비교하여 약독화되었고, 느린 성장 속도를 보이며 더 낮은 감염 바이러스 역가를 제공하였다. 따라서, NS2는 비-필수적이긴 하지만 그것은 지금까지 알려지지 않은 기작에 의해 바이러스 성장을 실질적으로 지속시킬 수 있는 보조 인자를 나타낸다. 그러나, 지금까지 NS 단백질의 기능은 알려지지 않았다.
발명의 요약
본 발명은 RSV 및 RSV-관련 바이러스의 NS1 및/또는 NS2 단백질, 구체적으로 말하면 이하에서 "RSV"로 언급될 모든 뉴모바이러스 속(RSV 및 PVM)의 단백질이 IFN 매개되는 면역반응에 길항 효과를 미친다는 발견을 기초로 한다.
본 발명은 IFN, 바람직하게는 IFN 알파 및/또는 베타에 의해 매개되는 면역반응을 약화시키기 위한 약학 제형물의 제조를 위한 RSV NS1 및/또는 NS2 단백질 혹은 RSV NS1을 암호화하는 핵산 서열 또는 RSV NS2를 암호화하는 핵산 서열의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 일면은 RSV NS1 및/또는 NS2 단백질 혹은 RSV NS1 단백질을 암호화하는 핵산 또는 NS2 단백질을 암호화하는 핵산을 투여하는 단계를 포함하는, 동물에서 IFN 매개되는 면역반응의 약화방법에 관한 것이다. 구체적으로 말하면, 본 발명은 IFN 매개되는 항바이러스성 반응을 억제시킴으로써 IFN 매개되는 면역반응을 변화시키기 위한 RSV NS1 및/또는 NS2 단백질 혹은 이들 단백질을 암호화하는 핵산의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 양태에서는 IFN 매개되는 면역반응을 약화시키기 위한 약학 제형물의 제조를 위해 RSV NS1 단백질이 NS2 단백질과 함께 사용되거나, IFN 매개되는 면역반응을 약화시키기 위한 약학 제형물의 제조를 위해 RSV NS1 단백질을 암호화하는 핵산 서열이 RSV NS2 단백질을 암호화하는 핵산 서열과 함께 사용된다. 본 발명에 따른 "함께"는 동시 또는 연속 투여를 의미한다.
본 발명의 또다른 일면에서 RSV NS1 및/또는 NS2 단백질은 IFN 매개되는 면역반응으로부터 무관한 바이러스를 보호하는 데 사용된다. 바람직하게는, RSV NS1 및/또는 NS2 단백질은 BRSV NS 단백질이다. NS1 및 NS2 단백질은 협조적인 방식으로 무관한 바이러스를 보호한다. 본 발명에 따른 "무관한 바이러스"는 RSV NS1 및/또는 NS2 단백질을 발현하지 않는 바이러스를 언급한다. 바람직한 양태에서 바이러스는 광견병 바이러스이다. 바람직하게는, RSV NS1 및/또는 NS2 단백질이 바이러스 핵산으로부터 발현된다.
또다른 일면에서 RSV NS1 및/또는 NS2 단백질 혹은 RSV NS1을 암호화하는 핵산 서열 및/또는 NS2를 암호화하는 핵산 서열을 함유하고 IFN 매개되는 면역반응을 약화시키는 본 발명의 약학 제형물은 백신을 추가로 포함한다. 바람직하게는, 약학 제형물과 함께 백신의 투여는 그것이 투여된 체내로부터 백신의 감소된 배출을 초래한다.
본 발명은 또한 IFN 매개되는 면역반응을 조절하기 위한 약학 제형물의 제조를 위한 변질된 RSV NS1 및/또는 NS2 단백질의 적용에 관한 것이다. 바람직한 양태에서 변질은 NS1 및/또는 NS2 단백질의 증대된 IFN 조절 활성을 초래한다.
본 발명은 백신의 제조를 위한 NS1 및/또는 NS2를 암호화하는 변형된 핵산 서열을 지니고 있는 재조합 RSV의 용도에 관한 것이고, 여기에서 변형은 IFN 매개되는 면역반응을 회피하는 바이러스의 능력을 감소시키거나 제거한다. 바람직한 양태에서 NS1 및/또는 NS2를 암호화하는 변형된 핵산 서열은 상기 재조합 RSV에 대해 동종성이거나 이종성이다. 재조합 RSV가 인간, 소 RSV 또는 PVM으로부터 유래되는 적용이 특히 바람직하다.
또한, 본 발명은 RSV의 NS1 및/또는 NS2를 암호화하는 핵산 서열이 목적하는 숙주를 감염시킬 수 있는 상이한 RSV로부터의 NS1 및/또는 NS2를 암호화하는 핵산 서열에 의해 교체되는 변질된 숙주 범위를 가지는 RSV 및 변질된 숙주 세포 향성을 가지는 그러한 RSV의 생산방법을 포함한다.
RSV 단백질의 기능을 더욱 상세히 연구하기 위해 NS1 유전자나 NS1 및 NS2 유전자가 결여된 BRSV 결실 돌연변이체를 생산하여 상이한 세포주에서의 이들의 행동을 연구하였다.
숙주 세포 인자에 대한 NS 결실 돌연변이체의 증가된 감수성에 관한 첫번째 표지가 wt BRSV 감염에 대해 완전히 감수성이 된 MDBK 세포 감염 후에 관찰되었고 다른 모든 시험 세포주보다 높은 wt BRSV 역가를 제공하였다. 그러나, NS 유전자 하나 또는 둘 모두가 결여된 바이러스는 MDBK 세포에서 점점 나빠지고 반면 Vero 또는 BSR과 같은 다른 세포주에서는 NS 유전자의 부재가 감염 역가의 10배 감소만을 초래한다. 동시-배양 실험이 BRSV 감염된 MDBK 세포에 의해 생산된 중요한 숙주 세포 인자로서 I형 인터페론을 동정하였다. 명백하게, 항바이러스성 상태가 자가분비(autocrine) 및 측분비(paracrine) 세포 자극에 의해 감염된 MDBK 배양균에서 유도된다. wt BRSV는 이 반응과 상호작용할 수 있지만 NS 결실 돌연변이체는 이 능력을 공유하지 않았다. 한편 Vero 세포는 I형 인터페론 유전자가 결여되어(15; 46) 바이러스 감염이 항바이러스성 상태의 유도를 초래하지 않고 NS 결실 돌연변이 체의 성장을 가능하게 한다. Vero 세포가 인터페론을 생산할 수는 없지만 이들은 IFN 알파 수용체(IFNAR) 복합체를 통한 JAK/STAT 매개되는 시그널링에 의해 외생성 인터페론에 의한 자극과 반응할 수 있다. 감염된 MDBK 세포에 의해 분비된 소 인터페론은 NS 결실 돌연변이체의 성장을 억제시키는 Vero "리스판더(responder)" 세포에서 항바이러스성 반응을 유도하였지만 wt BRSV는 그렇지 않았다. MDBK 상등액에 의해 야기된 항바이러스성 효과는 Vero 세포를 IFNAR과 결합하는 항체 블로킹 IFN과 배양시킴으로써 저지되었다. 이에 따라, 항바이러스성 반응의 유도에서 MDBK 세포 상등액의 유일한 활성 성분은 IFN 알파 및/또는 IFN 베타였다.
최고 7배의 이중 결실 돌연변이체의 감소로 MDBK 세포 상등액으로 처리된 Vero 세포에서 NS 결실 돌연변이체에 미치는 억제 효과는 약해지고 이에 따라 MDBK 세포에서 NS 결실 돌연변이체의 엄격한 억제에 필적하지 않는다. 이는 여러가지 요인에 기인할 수 있다. 아마도, 영장류 유래된 Vero 세포의 소 기원의 이종성 IFN으로의 자극은 MDBK의 자극과 비교하여 덜 효율적일 것이다. 사람에서의 상황과 마찬가지로 상이한 유형의 소 IFN 알파(유형 2 내지 8)와 IFN 베타(유형 1 및 3)가 상이한 생물학적 활성을 보이는 것으로 동정되었다(7). 추가로, Vero 세포의 항바이러스성 기작은 MDBK의 항바이러스성 기작보다 덜 효율적인 것 같다. 다른 세포보다 다량의 I형 인터페론을 분비하는 것으로 알려져 있는 활성화되고 감염된 대식구의 상등액이 Vero "리스판더" 세포에서 NS 결실 돌연변이체의 50배까지의 증대된 감소를 초래하였다. Vero 세포를 재조합 인간 IFN 알파 A/D 또는 IFN 베타로 자극함으로써, NS 결실 돌연변이체의 복제는 투여량-의존성 방식으로 억제될 수 있고, 여기 에서 500 유닛이 복제 활성을 거의 완전히 억제한다.
따라서, 본 발명에 의해 RSV 단백질이 IFN 매개되는 숙주 세포 반응의 길항제로서 동정되었다.
게다가, BRSV 유래된 NS 유전자의 발현을 위한 벡터로서 또다른 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스인 광견병 바이러스를 사용하면 두 NS 단백질 NS1 및 NS2의 활성이 무관한 바이러스의 IFN 내성을 증가시킬 수 있는 것으로 보여진다. 또다른 발견은 NS1 및 NS2 단백질이 상이한 RSV로부터 유래될 수 있다는 것이다.
요약하여 말하면, 이들이 세포성 인터페론 매개되는 항바이러스성 기작에 대한 바이러스의 보호를 매개한다는 점에서(IFN 길항 효과) 중요한 생물학적 기능이 RSV NS 단백질에 기인할 수 있다. 게다가, 두 NS 단백질을 함께 사용함으로써 상기 IFN 길항 효과가 증배된다는 것이 예상외로 밝혀졌다. 이것이 인터페론과의 대항에서 두 바이러스성 단백질의 협조의 첫번째 예이다.
이들의 천연 숙주 세포 내에서 타고난 면역반응을 방해하기 위한 바이러스 단백질의 변화가 바이러스 숙주 범위를 결정하기 위한 중요한 인자인 것으로 추측되고 바이러스가 종 장벽을 횐단하는 것을 막을 수 있다(13, 23; 26). 예를 들면, 원숭이 바이러스 5(SV5)의 V 단백질은 영장류 세포에서는 인터페론 반응성 유전자의 활성화를 차단할 수 있지만 쥐 세포에서는 그렇지 않다(14). 이것이 마우스 및 심지어는 SCID 마우스의 생산성 SV5 감염을 방지하는 적절한 기작일 수 있다(13). 최근에, BRSV의 인간 등가물인 HRSV가 인간 세포에서 IFN 유도되는 항바이러스성 활성에 대해 내성인 것으로 보고되어 있고(2), 본 발명의 결과로부터 HRSV NS 단백 질이 상이한 기원의 세포에서보다는 인간 세포에서 IFN 반응을 길항시키도록 최적화된다고 결론내렸다.
실제로, NS 단백질의 RSV 감염에 대한 숙주 감수성에의 기여가 왜 이렇게 밀접하게 관련있는 바이러스들이 엄격하게 제한된 숙주 범위를 가지는 지를 설명해줄 수 있다. BRSV 및 HRSV는 인간, 소 및 쥐 세포에 진입할 수 있고; 숙주-특이적 방어 기작을 길항시키는 NS 단백질의 상이한 능력이 바이러스가 제거되었는지 또는 그렇지 않은 지를 결정할 수 있다. 이것은 또한 선행 발견에 의해 지지된다. 1차 마우스 배(ME) 세포에서 HRSV의 성장은 분명히 제한되지만, 바이러스 수율은 항-쥐 IFN 혈청을 배지에 첨가한 다음 완전한 단층으로 감염 스프레딩(spread)시킨 후에 증가한다(26). 추가로, 영장류 세포에의 침투를 촉진하기 위해 HRSV의 G 및 F에 의해 교체된 G 및 F 표면 단백질을 가지는 재조합 BRSV는 복제에 있어서 BRSV보다 침팬지에서 약간만 더 경쟁적이다. 그러나, 감염은 매우 제한되고 동종성 HRSV로의 실험 감염에 대한 보호를 유도하기에 충분하지 않다(6). 이 관찰로부터 영장류의 방어 기작을 길항시키는 데 있어서 BRSV NS 단백질의 저효율이 숙주 범위의 주요 결정인자인 것으로 결론내려진다.
따라서, 본 발명의 결과는 효과적인 약독화 RSV 생(live) 백신의 디자인을 위한 중요한 의미를 내포하고 있다. NS1이나 NS2 또는 두 유전자 모두의 결실이 인터페론 반응을 회피할 수 없는 과-약독화된 바이러스를 초래한다. 추가로, 상이한 RSV, 예를 들면 BRSV와 HRSV 사이의 NS 단백질의 상호 교환으로 인한 소 및 인간의 타고난 방어 기작을 회피하는 중재능을 가지는 백신이 디자인될 수 있고, 구체적으 로 말하면 BRSV 및 HRSV 백신이 생산될 수 있다. 또한, IFN 길항 활성을 부분적으로만 제거하는 돌연변이가 NS 단백질에서 일어날 수 있다.
게다가, 본 발명에 따른 RSV NS1 및/또는 NS2 단백질 혹은 NS1 및/또는 NS2를 암호화하는 핵산 서열은 또한 IFN 매개되는 면역반응을 약화시키기 위한 약학 제형물의 제조에도 유용하다. 바람직한 양태에서, RSV NS1은 약학 제형물의 제조를 위해 NS2 단백질과 함께 사용된다. 약학 제형물은 동물 또는 인간에서 IFN 매개되는 면역반응을 변질시키는 유효량의 NS1 및/또는 NS2와, 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함한다. 약학 제형물은 통상의 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 약학 제형물은 목적하는 양의 RSV NS1 및/또는 NS2 단백질 혹은 NS1을 암호화하는 핵산 서열 및/또는 NS2를 암호화하는 핵산 서열을 적당한 완충제를 사용하여 약 6.0의 pH로 조절된 pH 값을 가지는 멸균 등장액에 혼합함으로써 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 제형물은 통상의 성분, 예를 들면 생리 식염수, pH 조절제, 완충제, 방부제 등과 같은 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 이러한 성분은 당업자에게 알려져 있고 그들에 의해 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 용어 "IFN"은 바람직하게는 I형 인터페론, 즉 인터페론 α및 β를 언급한다.
본원에서 용어 "IFN 매개되는 면역반응"은 예를 들면, MHC 당단백질의 증가된 발현과 같은 바이러스 감염, 바이러스-감염된 세포의 파괴와 같은 항바이러스성 기작의 활성화 또는 바이러스 복제의 억제에 대한 반응으로서 인터페론, 특히 인터 페론 α및 β의 활성에 의해 유도되는 면역화 및/또는 항바이러스성 효과를 언급한다.
"IFN 매개되는 면역반응의 약화"는 예를 들면, MHC 당단백질의 증가된 발현과 같은 바이러스 감염, 바이러스-감염된 세포의 파괴와 같은 항바이러스성 기작의 활성화 또는 바이러스 복제의 억제에 대한 반응으로서 인터페론, 특히 인터페론 α및 β에 의해 유도되는 면역화 및/또는 항바이러스성 효과가 약화되었다는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 "IFN 길항 활성"은 예를 들면, MHC 당단백질의 증가된 발현과 같은 바이러스 감염, 바이러스-감염된 세포의 파괴와 같은 항바이러스성 기작의 활성화 또는 바이러스 복제의 억제에 대한 반응으로서 인터페론, 특히 인터페론 α및 β의 활성에 의해 유도되는 면역화 및/또는 항바이러스성 효과가 약화되었거나 제거되었다는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 용어 "변형된" 또는 "변질된"은 참조로 사용되는 야생형과 관계가 있다.
본원에서 사용되는 "핵산 서열"은 뉴클레오티드 염기의 연속 서열을 의미하고 리보핵산 또는 데옥시리보핵산으로 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 핵산 서열은 cDNA이다.
"RSV에 대해 동종성이거나 이종성인 NS1 및/또는 NS2를 암호화하는 핵산 서열"은 NS1 및/또는 NS2를 암호화하는 핵산 서열이 동일하거나 상이한 RSV 종 또는 뉴모바이러스 속의 또다른 바이러스, 예를 들면 PVM으로부터 유래된다는 것을 의미 한다.
RSV NS1 또는 RSV NS2의 단백질 서열 내에서의 변형은 단일 또는 복수 아미노산 치환, 결실 및 삽입을 포함한다. 바람직하게는, 변형은 IFN 매개되는 면역반응을 약화시키거나 IFN을 길항시키는 데 있어서 단백질의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는다. 본 발명에 따른 아미노산 삽입 변이체는 아미노 및/또는 카복시 말단 융합 및 단일 또는 복수 아미노산의 서열 내부 삽입을 포함한다. 아미노산 삽입 변이체는 하나 이상의 아미노산이 단백질내 특정 부위에 도입되는 것이지만; 랜덤 삽입 또한 생성 산물의 적당한 스크리닝과 함께 가능하다. 결실 변이체는 서열로부터 하나 이상의 아미노산의 결실로 특징지워진다. 치환 아미노산 변이체는 적어도 하나의 잔기가 서열로부터 제거되고 동일한 부위에 또다른 잔기에 의해 대체되는 것이다. 바람직하게는, 비변형 NS1 또는 NS2 단백질의 서열은 야생형과 적어도 40%, 바람직하게는 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 특히 95%의 상동성을 가진다.
바람직한 변형은 종 사이에 보존되지 않는 위치에서 일어난다. 바람직하게는, 이 유형의 변형은 일 아미노산의 유사한 크기 및 극성을 가지는 또다른 아미노산으로의 치환을 포함한다. 일어날 수 있는 치환의 유형 측면에서, 상이한 유기체에서 동종성 단백질 간의 아미노산 치환 빈도의 분석이 1차로 사용될 수 있다. 이러한 분석을 기초로 보존성 치환이 하기에 일람된 그룹 내에서의 치환으로 한정된다:
1. 작은 지방족, 비극성 또는 약한 극성: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly)
2. 음으로 하전 또는 이의 아마이드: Asn, Asp, Glu, Gln
3. 양으로 하전: His, Arg, Lys
4. 큰 지방족 비극성: Met, Leu, Ile, Val (Cys)
5. 큰 방향족: Phe, Tyr, Trp
3 아미노산은 단백질 구성에서의 특이한 역할 때문에 괄호 안에 쓰여 있다. Gly는 측쇄가 없는 유일한 아미노산이고 따라서 펩타이드 체인에 유연성을 부여한다. Pro는 체인 유연성을 강하게 제한하는 특이한 형태를 가진다. Cys는 디설파이드 결합에 관여할 수 있다.
추가로, 전술한 변형이 RSV NS1 또는 RSV NS2의 단백질 서열에 도입되어 IFN 매개되는 면역반응을 약화시키거나 IFN을 길항시키기 위한 단백질의 생물학적 활성의 증대 또는 약화를 초래할 수 있다.
도 1. (A) 재조합 BRSV 게놈의 개략도. 바이러스 게놈(vRNA)(흑색 바)에 대한 전사체(회색 바) 및 단백질 암호화 영역(백색 바)의 위치가 도시되어 있다. 확대도가 전체 길이의 바이러스 및 NS 결실 돌연변이체의 구성을 비교한다. 리더 RNA는 수평선에 의해 표시되고; 각 뉴클레오티드의 상대적 위치 및 클로닝을 위해 사용되는 제한 부위가 표시되어 있다. (B) RV G 및 L 유전자 사이에 유전자 표지된 BRSV NS1 또는 BRSV NS2 ORF를 지니고 있는 재조합 광견병 바이러스(RV)의 구성.
도 2. 재조합 BRSV에서 NS1 및 NS2 전사체의 부재. 표시된 바이러스에 의해 감염된 BSR 세포로부터 전체 길이의 RNA를 감염 2 내지 4일 후에 분리하여 NS1, NS2, NS1 내지 NS2 및 N 유전자를 포함하는 탐침을 사용하는 노던 하이브리드화에 의해 분석하였다. NS1, NS2 및 N mRNA가 나타나 있다.
도 3. NS 결실 돌연변이체는 BSR 세포에서보다 MDBK 세포에서 더욱 약독화된다. 거의 융합된 BSR T7-5 (A) 및 MDBK (B) 단층을 BRSV(흑색 원), BRSV △NS1(백색 정사각형), BRSV △NS2(흑색 삼각형) 또는 BRSV △NS1/2(백색 원)에 의해 0.01의 MOI로 감염시켰다. 감염 바이러스 역가를 실시예 단락에 기술되어 있는 것처럼 이틀마다 측정하였다. 6째날부터 출발하여, BSR 세포에서 모든 돌연변이체의 복제 및 MDBK 세포에서 wt BRSV의 복제가 대량의 세포 파괴를 초래하였다. 값이 각각 3회 시행되는 2 독립 실험으로부터 얻어진다. 바는 표준 편차를 나타낸다.
도 4. 바이러스-감염된 MDBK 세포 또는 감염된 대식구의 상등액이 동시-배양된 Vero 세포에서 BRSV NS 결실 돌연변이체의 성장을 억제한다. 동시-배양 실험의 이론이 (A)에 개략적으로 도시되어 있다. MDBK 세포 또는 LPS-자극된 소 대식구를 BRSV에 의해 1의 MOI로 감염시키고, Nunc "Anopore Membrane" 세포 배양 삽입물에 시딩한 다음, wt BRSV, BRSV △NS1, BRSV △NS2 또는 BRSV △NS1/2에 의해 감염된 Vero "리스판더" 세포와 배양시켰다. 3일 후에, 삽입물을 제거하고 Vero 세포의 감염 바이러스 역가를 측정하였다. 결과가 (B)에서 표준 편차를 포함하는 억제율%과 비감염된 MDBK 또는 비감염되었고 비자극된 대식구로 얻어지는 대조와 비교한 (평균값의) 시간 단축으로서 나타나 있다. 값은 6(MDBK) 및 4(대식구) 동시배양 실험으로부터 얻어진다.
도 5. 인터페론 알파 수용체(IFNA-R2) 단일클론 항체(#2)가 MDBK 또는 대식 구에 의해 생산되는 억제 인자의 효과를 중화시킨다. 0.1의 MOI로 rBRSV △NS1, rBRSV △NS2, rBRSV △NS1/2 또는 wt rBRSV에 의해 감염된 Vero "리스판더" 세포를 각각 IFNAR2(#2), MHC I(#3), TNF-R1 (#4)에 대한 단일클론 항체 5 ㎍/㎖와 또는 항체의 부재하에(#1) 3시간 동안 배양시켰다. 감염된 MDBK 세포와의 동시-배양(도 4의 실험 이론 참조)이 각 항체 1 ㎍/㎖의 존재하에 실행되었다. 이 역가는 6(#1 및 #2) 또는 2 실험(#3 및 #4)에서 측정되었다. 바는 표준 편차를 나타낸다.
도 6. 모든 BRSV NS 결실 돌연변이체는 I형 IFN에 대해 민감하다. 0.1의 MOI로 BRSV(흑색 원), BRSV △NS1(백색 정사각형), BRSV △NS2(삼각형) 또는 BRSV △NS1/2(백색 원)에 의해 감염된 Vero 세포를 표시된 양으로 재조합 IFN 알파 A/D (A) 또는 IFN 베타 (B)와 배양시켰다. 감염 바이러스 역가를 감염 4일 후에 측정하였다.
도 7. BRSV의 IFN 내성은 영장류 세포에서보다 소 세포에서 더욱 두드러진다. MDBK(흑색 컬럼) 또는 Vero 세포(백색 컬럼)를 1의 MOI로 rBRSV에 의해 감염시키고 표시된 양의 재조합 IFN 알파 A/D로 처리하였다. 감염 바이러스 역가를 감염 3일 후에 측정하였다.
도 8. RV를 발현하는 NS1 및 NS2로 감염된 세포에서 광견병 바이러스(RV)의 증가된 IFN 내성. Vero (A) 또는 MDBK 세포 (B)를 RV SAD VB, SAD VB-NS1 또는 SAD VB-NS2로 감염시키거나 SAD VB-NS1과 SAD VB-NS2로 동시-감염시켰다. 감염 직후에 배양균을 표시된 양의 IFN 알파 A/D로 처리하였다. 감염 바이러스 역가를 감염 2일 후에 측정하였다. 결과는 적어도 4 독립 실험으로부터의 평균 값을 나타내고 에러 바는 표준 편차를 나타낸다.
도 9. 1 ×105 Hep2 세포의 2 샘플을 각각 FCS 없는 DMEM 0.5 ㎖에서 1시간 동안(MOI=0.1) 상이한 HRSV 분리물로 감염시키고 이후 각 샘플에 0.5 ㎖ DMEM + 5% FCS를 주입하였다. 이후 감염된 세포를 4 ㎠ 조직 배양판에 시딩하였다. 1, 2, 3 및 4일 후에 각 바이러스 분리물에 대한 현재의 값을 제거하고, 바이러스를 냉동/해동에 의해 방출시킨 다음 감염 기간에 따라 상이한 임상적 분리물의 역가를 적정에 의해 측정하였다. pfu/㎖는 감염된 세포를 RSV-F에 대한 항체로 염색시킨 후에 계수함으로써 측정되었다.
도 10. 1×105 Hep2 세포의 2 샘플을 각각 FCS 없는 DMEM 0.5 ㎖에서 1시간 동안(MOI=0.1) 상이한 HRSV 분리물로 감염시키고 이후 4 ㎠ 조직 배양판에 시딩하였다. 재조합 I형 IFN A/D 0, 150, 500, 10,000 U/㎖를 또다른 DMEM 0.5 ㎖ + 5% FCS에 현탁시켜 30분 후에 첨가하였다. 72시간 배양시킨 후에, 바이러스를 냉동/해동에 의해 방출시켜 첨가된 IFN의 양에 따른 상이한 임상적 분리물의 역가를 적정에 의해 측정하였다. pfu/㎖는 감염된 세포를 RSV-F에 대한 항체로 염색시킨 후에 계수함으로써 측정되었다.
도 11. RV G 유전자와 L 유전자 사이에 HRSV NS1이나 HRSV NS2 또는 유전자 표지된 BRSV NS1, BRSV NS2, PVM NS1이나 PVM NS2 ORF를 지니고 있는 재조합 광견병 바이러스(RV)의 구성.
도 12. NS1 및 NS2를 발현하는 RV로 감염된 광견병 바이러스(RV)의 증가된 IFN 내성. MDBK 세포를 RV SAD VB, SAD VB-hNS1 또는 SAD VB-hNS2로 감염시키거나 SAD VB-hNS1과 SAD VB-hNS2 또는 SAD VB-bNS1과 SAD VB-bNS2로 동시-감염시켰다. 감염 직후에 배양균을 표시된 양의 IFN 알파 A/D로 처리하였다. 바이러스 역가를 감염 2일 후에 측정하였다. 결과는 적어도 4 독립 실험으로부터의 평균 값을 나타내고 에러 바는 표준 편차를 나타낸다.
도 13. NS1 및 NS2를 발현하는 RV로 감염된 광견병 바이러스(RV)의 증가된 IFN 내성. MDBK 세포를 RV SAD VB, SAD VB-mNS1, 또는 SAD VB-mNS2로 감염시키거나 SAD VB-mNS1과 SAD VB-mNS2 또는 SAD VB-bNS1과 SAD VB-bNS2로 동시-감염시켰다. 감염 직후에 배양균을 표시된 양의 IFN 알파 A/D로 처리하였다. 바이러스 역가를 감염 2일 후에 측정하였다. 결과는 적어도 4 독립 실험으로부터의 평균 값을 나타내고 에러 바는 표준 편차를 나타낸다.
도 14. 이종성 NS 유전자를 지니고 있는 키메릭 BRSV의 구성.
도 15. PVM/BRSV 키메라는 Vero 세포에서 약간 약독화된다. Vero 세포를 BRSV wt(흑색 원), BRSV hNS1bNS2(진한 회색 정사각형), BRSV hNS1hNS2(엷은 회색 정사각형), BRSV mNS1bNS2(진한 회색 삼각형) 및 BRSV mNS1mNS2(엷은 회색 삼각형)에 의해 0.1의 MOI로 감염시켰다. 감염 바이러스 역가를 연속 4일 측정하였다. 값은 적어도 2 독립 실험으로부터 얻어진다.
도 16. BRSV hNS1hNS2의 성장이 MDBK 세포에서 약독화된다. MDBK 세포를 0.1의 MOI로 BRSV wt(흑색 원) 및 BRSV hNS1hNS2(엷은 회색 정사각형)에 의해 감염시켰다. 감염 바이러스 역가를 연속 4일 측정하였다. 값은 적어도 2 독립 실험으로부 터 얻어지는 평균 값이다.
도 17. BRSV hNS1hNS2는 MDBK 세포에서 IFN I형에 대해 민감하다. Vero (A) 및 MDBK (B) 세포를 BRSV wt(흑색 원) 및 BRSV hNS1hNS2(엷은 회색 정사각형)에 의해 0.1의 MOI로 감염시키고 이후 표시된 양의 재조합 IFN 알파 A/D와 배양시켰다. 감염 바이러스 역가를 감염 3일 후에 측정하였다. 값은 적어도 2 독립 실험으로부터 얻어진다.
도 18. HRSV(hNS1; hNS2), BRSV(bNS1, bNS2) 및 PVM(mNS1, mNS2)의 NS1(도 18A) 및 NS2(도 18B) 단백질; GenBank 기탁번호 U35030(HRSV long 계통), AF092942(BRSV 계통 ATue 51908) 및 D10331(PVM)의 아미노산 서열의 비교.
하기 실시예는 본 발명의 다양한 양태를 설명하기 위해 제시되었고 어떤 식으로든 본 발명을 제한하지 않는다.
실시예 1: NS 유전자가 결여된 BRSV 결실 돌연변이체의 작제 및 구제
재조합 BRSV(rBRSV)가 BRSV 계통 A51908(American Type Culture Collection(ATCC) (33), 변이체 Atue51908(GenBank 기탁번호 AF092942))로부터 유래되고, 이를 전술한 바와 같이 MDBK 세포에서 배양시켰다(5). BRSV 계통 Atue51908(GenBank 기탁번호 AF092942)의 전체 길이 cDNA의 클로닝 및 BRSV 전체 길이의 안티게놈 RNA 또는 NS 유전자가 없는 안티게놈 RNA(pBRSV △NS2)의 T7 RNA 폴리머라제 매개되는 전사를 가능하게 하는 플라스미드의 작제는 다른 곳에 기술되어 있다(5).
NS1 유전자(pBRSV △NS1) 또는 유전자 NS1과 NS2 모두(pBRSV △NS1/2)가 결여된 작제물 또한 pBRSV를 기초로 생산하였다. NS1 유전자를 NotI 및 AseI으로 절단함으로써 pBRSV로부터 제거하고, Klenow 폴리머라제로 채운 다음 리게이팅한다. 이 방식으로 pBRSV △NS1이 수득되었다. 이중 결실 돌연변이체 pBRSV △NS1/2를 생산하기 위해 N 유전자의 일부를 포함하는 0.6 kb PCR 단편을 증폭시켰다. 이 목적을 위해, N 개시 코돈의 상류에 NotI 제한 부위(밑줄)를 함유하는 프라이머 NNot(+) (5'-TAGGCGGCCGCAAAAATGGCTCTTAGCAAGGTG-3')와 특이한 StuI 제한 부위(rBRSV 위치 1671)의 rBRSV 하류의 nt 1735-1715에 상응하는 역 프라이머 Nstu(-) (5'-TCCTTTGTATCGTTTCATTTC-3')를 사용하였다. NotI(rBRSV 위치 72) 및 StuI(rBRSV 위치 1671)로 분해시킴으로써 pBRSV로부터 NS1 및 NS2 유전자와 N 유전자의 일부를 결실시킨 후에, StuI 제한된 PCR 단편을 사용하여 결실된 서열을 교체하였다(도 1).
재조합 wt 바이러스 rBRSV의 서열을 비교하면 NS1, NS2 및 NS1/NS2 결실 돌연변이체는 각각 496, 509 및 1060 뉴클레오티드가 결여되었다. 모든 작제물에서 3'-말단 유전자의 전사는 원래의 리더/NS1 전사 개시 시그널에 의해 유도된다(도 1).
생존 가능한 재조합 바이러스 rBRSV, rBRSV △NS1, rBRSV △NS2 및 rBRSV △NS1/2가 T7 프로모터-조절되는 플라스미드의 각 바이러스 cDNA(10 ㎍)로의 형질감염(CaPO4 프로토콜; 포유류 형질감염 키트, Stratagene) 후에 T7 RNA 폴리머라제 를 발현하는 BSR T7/5 세포(5)에서 각 cDNA 작제물로부터 수득될 수 있다. BRSV 단백질 N 및 P(pTITB-N 및 pTITB-P, 플라스미드당 4 ㎍)와, L 및 M2(pTITB-L 및 pTITB-M2, 플라스미드당 2 ㎍)를 암호화하는 플라스미드를 T7 RNA 폴리머라제를 안정하게 발현하는 약 106 BSR T7/5 세포(5)에 각 바이러스 cDNA로 동시-형질감염시켰다. 4시간 후에, 형질감염 배지를 제거하고 5% FCS를 함유하는 BHK-21 배지(Gibco)를 첨가하였다. BRSV cDNA로 형질감염된 세포를 5일마다 세포병원성 효과가 관찰될 수 있을 때까지 1:3의 비로 희석시켰다.
NS1/2 이중 돌연변이체를 포함하는 모든 경우에 BRSV N, P, L 및 M2 단백질을 암호화하는 지지체 플라스미드의 동시-형질감염이 합포체의 형성을 초래하였다. 형질감염된 세포를 1:3의 비로 희석시키고 명확한 세포병원성 효과가 발견된 후에 바이러스를 수확하였다.
바이러스 원액의 제조를 위해 80% 융합된 MDBK와 Vero 세포를 혈청 없는 Dulbecco's 최소 필수 배지(DMEM)에서 0.1의 감염 중복도(MOI)로 감염시켰다. 1시간 동안 흡착시킨 후에 접종물을 제거하고 세포를 37℃의 5%의 CO2 대기중 2.5% FCS가 보충된 DMEM에서 명확한 세포병원성 효과(CPE)가 관찰될 때까지 배양시켰다. 바이러스를 냉동 및 후속 해동에 의해 방출시켰다. Vero 세포에서 바이러스 역가는 마이크로타이터 플레이트에서 연속 희석시킨 다음 감염된 병소를 계수함으로써 측정된다. 이 목적을 위해 병소를 F 융합 단백질(스페인 마드리드, J.A. Melero의 허가 하에 입수)에 대한 항체를 사용하는 간접 염색에 의해 염색시켰다. NS 결실 돌 연변이체의 바이러스 원액의 제조가 0.1의 MOI로 감염된 Vero 세포에서 수행되었다. 0.1의 MOI로 Vero 세포의 감염 후에 명확한 CPE가 관찰될 때까지 rBRSV의 경우에는 3일 및 NS 결실 돌연변이체의 경우에는 5일이 걸렸다.
실시예 2: NS 결실 돌연변이체의 성장
바이러스의 성장 특징이 바이러스를 구제하는 데 사용된 BHK 세포로부터 유래된 세포주 BSR T7/5에서 1차 분석되었다. 전체 길이의 모 바이러스와 달리 모든 3 돌연변이체는 약독화되었고 이는 두 NS 단백질의 바이러스 복제에의 기여를 나타낸다. 흥미롭게도, 단독 결실 돌연변이체와 이중 결실 돌연변이체 간의 감염된 세포에서의 바이러스의 분포 및 최종 역가의 분명한 차이점은 관찰될 수 없었다. 모든 돌연변이체는 0.1의 MOI로 BSR T7/5 세포의 감염 및 6일간의 후속 배양 후에 2 ×105 pfu의 감염 역가를 달성하였다. 그러나, 모 바이러스는 1 ×106 pfu까지 도달한다(도 3A). 약간 증가한 역가를 갖는 유사한 결과가 Hep2 또는 Vero 세포의 감염에 의해 달성되었고 후자가 HRSV의 배양을 위한 바람직한 세포주이다.
그 결과, wt BRSV(5)의 성장을 최적으로 지속하는 소 기원의 세포주인 MDBK가 사용되었다. 실제로, 2 ×106 pfu의 약간 증가한 BRSV 역가가 감염 6일 후에 달성될 수 있다(도 3B). 그러나, 놀랍게도, 이 세포주에서 결실 돌연변이체의 성장이 크게 영향을 받았다. 단독 결실 돌연변이체 △NS1 및 △NS2는 6일 후에 BSR 세포에서보다 100배 낮은 단지 3 ×103 pfu의 역가를 달성하였다. 이중 결실 돌연변이체 △NS1/2는 감염 후 최초 6일 내에는 검출할 정도로 증식할 수 없었다. 세포를 희석 시켜 또다시 8일간 배양시킨 후에 2 ×102의 바이러스 역가가 달성될 수 있었다. MDBK 세포가 wt BRSV를 위한 최적의 숙주 세포를 나타내지만, 이들은 분명히 모든 NS 결실 돌연변이체를 허용하지 않고 반면 wt BRSV를 위한 최적 이하의 숙주 세포인 BSR 및 Vero 세포는 NS 결실 돌연변이체 성장의 비교적 양호한 지속을 보인다.
실시예 3: NS 유전자가 결여된 BRSV 결실 돌연변이체의 RNA와의 노던 하이브리드화
노던 하이브리드화를 위해 RNA를 rBRSV 또는 NS 결실 돌연변이체로 감염된 세포로부터 분리하였다.
Vero 세포를 재조합 바이러스 rBRSV, rBRSV △NS1, rBRSV △NS2 및 rBRSV △NS1/2에 의해 0.1의 MOI로 감염시키고 명확한 CPE가 관찰된 후에(rBRSV의 경우에는 3일 후, NS 결실 돌연변이체의 경우에는 5일 후) 전체 RNA를 분리하였다. RNA를 변성 겔 전기영동으로 분리하여, 나일론 막(Duralon-UV, Stratagene)에 옮긴 다음, UV 조사에 의해 막에 결합시켰다. 길이가 약 500 nt인 NS1, NS2 및 N 유전자 특이적 DNA 탐침을 닉 해독(닉 해독 키트, Amersham)에 의해 (α-32P)dCTP(3,000 Ci/mmol, Amersham)로 표지하였다. 하이브리드화된 필터를 증강 스크린을 사용하여 Kodak Biomax MS 필름에 노출시키거나 인 영상(Storm, Molecular Dynamics)에 의해 평가하였다.
바이러스가 NS1 및 NS2에 대해 특이적인 RNA의 존재 또는 부재만 상이한 모든 바이러스에 대해 유사한 전사체 패턴을 관찰하였다(도 2). BRSV 및 HRSV NS2 결 실 돌연변이체로 이미 관찰된 것처럼(5; 43), 유사한 양의 N mRNA 및 게노믹 RNA가 사용되는 재조합체에 상관없이 모든 감염된 세포에 존재하였다. 따라서, NS 단백질은 일반적으로 RNA 복제 또는 전사에서 별도의 단계에 영향을 미치는 대신 오히려 RNA 합성에 영향을 미친다.
실시예 4: MDBK 세포 및 소 대식구에 의해 생산된 가용성 인자는 NS 결실 돌연변이체의 성장에 영향을 미친다
MDBK 세포에서 NS 결실 돌연변이체 성장의 분명한 선택적 억제의 원인인 세포성 인자를 동정하기 위해 MDBK 세포에 의해 생산된 가용성 분자가 NS 결실 돌연변이체의 성장을 제한할 수 있는 지를 1차 시험하였다. 이 목적을 위해, MDBK 세포 및 Vero 세포를 바이러스 불침투성이지만 가용성 인자에 대해서는 침투성인 막에 의한 두 세포 배양균의 분리를 가능하게 하는 장치에서 동시-배양시켰다(도 4A). 상단 디쉬에서는 MDBK 세포가 이펙터 세포로 사용되었고 반면 하단 디쉬에서는 Vero 세포가 리스판더 세포로 사용되었다.
현탁액중 Vero 리스판더 세포를 1시간 동안 FCS 없는 DMEM에서 0.1의 MOI로 rBRSV △NS1, rBRSV △NS2, 또는 rBRSV △NS1/2에 의해 모의 감염 또는 감염시켰다. 세척한 후에 2.5% FCS를 함유하는 DMEM에서 5 ×105 세포를 각각 6 웰 디쉬에 시딩한다. 밤새 LPS(Sigma) 10 ㎍/㎖로 자극된 MDBK 이펙터 세포 또는 소 대식구를 현탁액에서 1시간 동안 1의 MOI로 rBRSV에 의해 감염시켰다. 세척한 후에 1 ×106 세포를 200 nm Anopore 막(Nunc)이 장착된 25 mm 세포 배양균 삽입물에 시딩하고 감염된 Vero "리스판더" 세포를 함유하는 디쉬에 둔다. 3일간 동시 배양한 후에 막 삽입물을 제거하고 Vero 세포의 바이러스 역가를 실시예 1에 기술되어 있는 것처럼 측정하였다.
적어도 5 독립 동시-배양 실험을 수행하였다. 음성 대조로서 사용되는 비감염 MDBK 이펙터 세포 또는 BSR 세포는 Vero 리스판더 세포에서 wt BRSV 또는 NS 결실 돌연변이체의 성장에 억제 효과를 미치지 않았다. BRSV-감염된 MDBK 세포(MOI 약 1)와의 동시-배양은 약하지만 재현 가능한 NS 결실 돌연변이체의 억제를 초래하였고 반면 wt BRSV의 성장은 영향을 받지 않았다(도 4B). 가장 두드러지는 효과는 NS1/2 이중 결실 돌연변이체로 관찰되었다. 이 경우에 역가는 비감염 MDBK 세포와 비교하면 감염된 MDBK 세포의 존재하에 약 7배 감소하였다. 이 경우에 단독 결실 돌연변이체 rBRSV △NS1 및 rBRSV △NS2의 역가는 각각 2배 및 4배 감소하였다.
비감염 MDBK 세포의 상등액이 Vero 리스판더 세포에서 결실 돌연변이체의 성장에 영향을 미칠 수 없기 때문에 효과적인 MDBK 인자가 바이러스 감염에 의해 유도된다고 가정하였다. wt BRSV에 의한 감염과 rBRSV △NS1/2 및 SH와 G 유전자가 결실된 돌연변이체(rBRSV △SH/G, 비공개)를 포함하는 복수 개의 BRSV 결실 돌연변이체로의 감염이 효과적인 인자의 분비를 초래하였다. 또한 상이한 RNA 바이러스, 즉 광견병 바이러스로의 감염 또한 MDBK 세포에서 효과적인 인자의 유도를 초래하는 것으로 확인될 수 있었다. 이러한 결과는 Vero 리스판더 세포에서 항바이러스성 상태의 유도가 시토킨, 특히 인터페론에 의해 매개된다는 것을 강력하게 주장한다.
더욱 상세히 관련 시토킨을 연구하기 위해 소 대식구를 이펙터 세포로 사용 하였다. 소 대식구를 1,500 rpm의 Ficoll 구배 원심분리(Lymphoflot, Biotest, Dreieich) 및 단핵 세포 분획의 세포 배양 플라스크 바닥에의 흡착을 이용하여 소와 송아지의 혈액으로부터 분리하였다. 밤새 배양한 후에 비-부착 세포를 FCS 없는 RPMI(Gibco)로 3회 세척함으로써 제거하였다. 나머지 부착 세포(90-95% CD14 양성)를 37℃의 5% CO2중 10% FCS를 함유하는 RPMI에서 배양하였다. 분리된 소 대식구를 전술한 바와 같이 LPS로 밤새 자극하고 Vero 세포와 동시-배양하였다.
자극되었거나, 바이러스-감염되었거나 자극되지 않은 대식구와 배양시킨 후에 전체 길이 rBRSV의 수득량은 변화가 없었다. 그러나, 자극되지 않았고 감염되지 않은 대식구 대조와 달리, 30배 내지 50배 감소가 NS 결실 돌연변이체로 관찰되었다(도 4B). 또한 후속 바이러스 감염 없이 LPS만으로의 대식구 자극이 rBRSV △NS1/2에서 약 10배 감소를 일으키기에 충분하다. 자극된 대식구가 I형 인터페론의 생산자인 것으로 알려져 있기 때문에 이러한 실험은 BRSV NS 결실 돌연변이체의 성장 억제에서 IFN 알파 및/또는 베타의 관여를 보여준다.
실시예 5: NS 유전자의 결실은 BRSV를 I형 인터페론 감수성으로 만든다
동시-배양 실험(실시예 4 참조)에서 리스판더 세포로 사용되는 Vero 세포가 인터페론 I형 수용체 알파 서브유닛(IFNAR2)을 발현한다는 것이(44) FACS 분석에 의해 확인될 수 있다. 감염된 MDBK 세포 또는 대식구에 의해 생산된 IFN 알파 및/또는 베타가 NS 결실 돌연변이체에의 억제 효과를 매개하는 지를 연구하기 위해 Vero 리스판더 세포를 rBRSV △NS1/2, rBRSV △NS2, 또는 rBRSV △NS1/2로 감염시 키고 이후에 단일클론 항체 블로킹 IFNAR2(PBL Laboratories)로 처리하였다. 리스판더 세포의 처리는 감염 직후에 세포를 1시간 동안 중화 마우스 항-인간 인터페론 알파/베타 수용체 체인 2(CD118) 항체(PBL Biomedical Laboratories) 5 ㎍/㎖ 또는 TNFRI 또는 MHC I 부류 분자를 인식하는 항체 5 ㎍/㎖와 배양시킴으로써 수행된다. 세포를 6 웰 디쉬에서 희석시킨 후에 세포를 각 항체 1 ㎍/㎖에서 유지하고 감염된 MDBK 이펙터 세포의 존재하에 3일간 배양하였다.
NS 결실 돌연변이체의 억제가 대조 항체를 함유하는 세포 배양균에서 또는 항체가 없는 세포 배양균에서 관찰되어도 억제 효과는 IFNAR2 항체로 처리된 세포에서 거의 완전히 제거되었다(도 5). 이 결과로 인해 Vero 리스판더 세포에서 항바이러스성 상태의 유도는 MDBK 세포 또는 대식구에 의해 생산된 I형 인터페론에 독점적으로 기인할 수 있다.
이어서 재조합 인간 I형 인터페론이 IFN 자극된 세포에서 wt BRSV 및 BRSV 돌연변이체의 행동을 직접 분석하는 데 사용되었다. I형 인터페론이 BRSV 및 NS 결실 돌연변이체의 복제에 미치는 영향을 연구하기 위해 Vero 또는 MDBK 세포를 전술한 바와 같이 0.1의 MOI로 상이한 바이러스에 의해 감염시키고 6 웰 디쉬에서 2.5% FCS를 함유하는 DMEM 중에 시딩하였다. 보편적인 재조합 I형 인터페론(인간 인터페론 알파 A/D) 또는 인간 인터페론 베타(PBL Biomedical Laboratories)를 15,000 U/㎖의 농도까지 시딩한 후에 직접 첨가하였다. 바이러스 역가를 3일간 배양한 후에 연속 희석 및 감염된 세포의 F 융합 단백질에 대한 항체로의 간접 염색에 의해 측정하였다.
모든 3 NS 결실 돌연변이체가 IFN 유도된 세포 반응에 대해 매우 유사하고 투여량-의존성인 감수성을 보이는데 여기에서 1,500 U가 감염 역가의 약 10,000배 감소를 초래하였다(도 6). 한편 wt BRSV는 IFN 처리에 대해 비교적 내성이다. 그러나, 방어는 완벽하지 않았고 1,500 U IFN 알파 또는 IFN 베타가 약 13배 감소를 일으켰다.
소 세포에서의 wt BRSV의 보호가 Vero 영장류 세포주에서보다 더욱 두드러질 가능성을 평가하기 위해 대응 실험에서 1의 MOI로 MDBK 및 Vero 세포를 감염시키고 동량의 IFN을 첨가하였다. 비처리 MDBK 및 Vero 세포에서는 BRSV가 각각 1.7 ×107 및 4 ×106 pfu/㎖의 동일한 역가까지 성장하였다(도 7). IFN 처리로 Vero 세포에서의 역가는 MDBK 세포에서보다 더 신속하게 감소하였다. 10,000 U IFN의 첨가 후에 Vero 세포에서의 감염 역가는 MDBK 세포에서보다 555배 낮았지만 후자는 이미 상당한 세포 손상을 보였다. NS 결실 돌연변이체의 강력한 억제가 MDBK 세포의 항바이러스성 반응이 Vero 세포의 항바이러스성 반응과 적어도 동일한 강도를 가진다는 것을 확인하였다. 따라서 MDBK 세포에서 wt BRSV의 증대된 보호가 BRSV가 영장류 세포보다 더 효율적으로 소 세포 항바이러스성 반응을 다룬다는 것을 설명한다.
실시예 6: BRSV NS1 및 NS2가 함께 IFN 매개되는 항바이러스성 반응에 대한 광견병 바이러스의 내성을 증대시킨다
BRSV의 각 NS 유전자의 결실은 IFN 매개되는 세포 반응에 대해 대략 동일한 감수성을 초래하였다. 이는 두 NS 단백질이 모두 항바이러스성 기작을 저지하는 데 필요하다는 것을 설명한다. NS1과 NS2의 의무적이고 협조적인 기능을 확인하고 두 NS 단백질이 무관한 바이러스의 보호를 위해서도 사용될 수 있는 지를 확인하기 위해, NS1(SAD VB-NS1) 또는 NS2(SAD VB-NS2)를 발현하는 재조합 광견병 바이러스를 생산하였다. 추가의 NS1 또는 NS2 유전자를 함유하는 재조합 RV(도 1)를 G 유전자의 3' 비-암호화 서열(SAD VB) 내에 추가의 전사 정지 및 재개 서열을 포함하는 전체 길이의 RV cDNA(SAD L16)를 기초로 작제하였다(32). 추가의 유전자를 약독화된 광견병 바이러스 SAD L16(도 1B)의 G 유전자와 L 유전자 사이에 도입하였고, 이 방법은 다른 유전자 경우에 이미 성공적이었다(12; 39). C-말단 단백질 tag를 가지는 BRSV NS1 또는 NS2 단백질의 버전을 포함하는 첫번째 cDNA가 작제되었다. 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 단백질의 내부 영역에 상응하는 추가의 27 뉴클레오티드를 역 프라이머 NS1HAr-EcoRI(5'-GCAATAGAATTCCTAAGCGTAATCTGGTACATCATAAGGATAATTCAGACCAAGAAGAGT-3')(EcoRI 제한 부위 함유; 밑줄)를 사용하는 PCR에 의해 NS1 정지 코돈 바로 앞에 도입하였다. NS2의 경우에는, 합성 FLAG 펩타이드에 상응하는 24 뉴클레오티드를 역 프라이머 NS2FLr-EcoRI(5'-GCAATAGAATTCCTATTTATCGTCATCATCTTTATAATCTGGATTTAAATCATACTTATA-3')(EcoRI 밑줄)을 사용하여 도입하였다. 이러한 PCR 단편은 전체 길이 BRSV cDNA의 nt 1 내지 nt 957을 함유하는 플라스미드(pBSBRSVNS1NS2)의 상응하는 서열을 교체하는 데 사용되었다(5). NS1-HA 유전자를 NotI 및 EcoRI로 절단한다. Klenow 폴리머라제로의 채움 반응 후에 475 nt 단편을 부가의 전사 개시 시그널의 하류에 pSAD VB의 특이한 SmaI 부위에 도입하였다. 이것이 pSAD VB-NS1HA를 제공하였다. 470 nt NS2-FL 단편을 AseI 및 EcoRI로 절단한 다음 Klenow 폴리머라제로 채운 후에 유사한 방식으로 클로닝하면 pSAD VB-NS2FL이 제공된다.
NS1 또는 NS2 유전자를 가지는 재조합 RV가 T7 프로모터-조절되는 플라스미드의 각 바이러스 cDNA(10 ㎍)로의 형질감염(CaPO4 프로토콜; 포유류 형질감염 키트, Stratagene) 후에 전술한 바와 같이(19) 수득된다. RV 단백질 N(pTITB-N, 5 ㎍), P 및 L(pTITB-P 및 pTITB-L, 플라스미드당 2.5 ㎍)을 암호화하는 플라스미드를 각 바이러스 cDNA로 파지 T7 RNA 폴리머라제를 안정하게 발현하는 약 106 BSR T7/5 세포로 동시-형질감염시켰다(5). 4시간 후에, 형질감염 배지를 제거하고 10% FCS를 함유하는 BHK-21 배지(Gibco)로 교체하였다. 세포 배양균 상등액을 형질감염 6일 후에 수확하여 새로운 BSR 세포에 첨가하였다. 감염성 RV의 검출은 RV 핵단백질 N을 인식하는 FITC 컨쥬케이트(Centocor)를 사용하는 면역 염색에 의해 수행된다.
재조합체는 형질감염된 플라스미드로부터 N, P, 및 L RV 단백질을 발현하는 BSR T7/5 세포에서 cDNA로부터 수득될 수 있다. NS 단백질의 발현은 복제, 성장 특징 및 BSR 세포에서의 재조합체의 감염 역가에 역효과를 미치지 않았다(비도시).
발현된 BRSV 단백질의 활성을 시험하기 위해 Vero 세포를 모 RV(SAD VB)로 감염시키거나 각 재조합체로 개별적으로 또는 두 재조합 SAD VB-NS1과 SAD VB-NS2로 동시-감염시켰다. 재조합 RV SAD VB, SAD VB-NS1 및 SAD VB-NS2로의 감염을 각각 5의 MOI를 사용하여 현탁액에서 전술한 바와 같이(18) 수행하였다. SAD VB-NS1 및 SAD VB-NS2로의 동시-감염을 위해서는 2.5의 MOI가 각 재조합체에 대해 사용되었다. 보편적인 재조합 I형 인터페론 A/D를 세포의 희석 직후에 500 U/㎖의 농도까지 첨가하였다. 바이러스 역가를 감염 2일 후에 연속 희석 및 RV 단백질 N(Centocor)에 대한 FITC 컨쥬케이트로의 면역 염색에 의해 측정하였다. 또한 RV 단백질의 발현을 감염 2일 후에 적어도 4 독립 실험에 의해 시험하였다.
모 RV SAD VB 및 단독 감염체의 NS1 또는 NS2 단백질을 발현하는 바이러스의 성장은 동일한 정도로 영향을 받는다(도 8A). 50 IU IFN 알파의 첨가시 역가가 약 1 로그 감소하였고 이어서 IFN의 양이 증가함에 따라 매우 서서히 추가로 감소한다. 이는 Vero 세포의 약한 IFN 반응 또는 Vero 세포에서 IFN 매개되는 반응에 대한 RV의 높은 고유 내성을 의미한다. 그러나, NS1 및 NS2를 발현하는 바이러스로 동시-형질감염된 세포에서, 바이러스 복제의 보호가 확인될 수 있다. 바이러스 역가는 단독 감염체에서보다 상당히 높게 유지되고 투여량-의존성 방식으로 단지 서서히 감소한다.
다시 BRSV의 NS 단백질이 Vero 세포보다 소 세포의 항바이러스성 반응을 더욱 효율적으로 블로킹할 수 있다는 상기 관찰을 평가하기 위해 MDBK 세포로 대응 실험을 수행하였다(도 8B). 표준 RV SAD VB 및 NS를 발현하는 재조합체는 Vero 세포에서보다 약간 낮은 역가까지 비처리 MDBK 세포에서 복제되었다. Vero 세포와 달리 IFN 처리는 wt RV 및 NS를 상당한 정도까지 발현하는 바이러스의 단독 감염체의 감염 역가를 감소시켰다. 감염 역가의 3 로그 등급까지의 즉각적인 감소는 매우 효율적인 IFN 매개되는 세포 반응을 의미한다. 그러나, SAD VB-NS1 및 SAD VB-NS2로 동시감염된 세포에서의 이 반응에도 불구하고 바이러스 복제는 150 IU IFN의 양이 첨가될 때까지 완벽하게 보호되었다. 이러한 결과는 RV 단백질 합성의 분석에 의해 확인될 수 있다. 비처리된 세포에서 모든 재조합체는 유사량의 RV 단백질을 생산하고 반면 IFN 처리된 세포에서는 동시-감염만이 150-200 IU 이상의 첨가까지 상당한 단백질 합성을 수행할 수 있다(비도시).
전술한 결과는 두 BRSV NS 단백질이 IFN 매개되는 항바이러스 반응에 대한 내성을 부여할 수 있고 또다른 무관한 바이러스에 대한 내성도 부여할 수 있다는 것을 보여준다. 또한, 이 결과는 두 NS 단백질이 모두 필요하고 IFN 길항 효과를 발휘시키기에 충분하다는 것을 확인한다.
실시예 7: 인간 RSV(HRSV)의 임상적 분리물의 인터페론 내성
또한 HRSV가 인터페론에 대한 방어 기작을 가진다는 것을 보이기 위해 입원 환자의 임상적 분리물로 실험을 수행하였다. 분리물은 보쿰에 소재하는 루르 대학의 Werchau 교수와의 멀티센터 공동 연구로부터 입수하였다. 4 분리물을 "세기관지염"으로 진단받아 German 병원에서 치료받는 환자로부터 입수하였고(#61; #86; #109; 및 #110; 그룹 1) 3 분리물을 "폐쇄성 기관지염"으로 진단받은 환자로부터 입수하였다(#104; #112, 및 #162; 그룹 2).
이러한 임상적 분리물의 세포주에의 적응을 방지하기 위해 이들을 2 계대 동안 Hep2 세포에서 번식시켜 후속 실험에 이용하였다. 이들 분리물의 성장 곡선이 Hep2 세포로 결정되었다. 그룹 2의 분리물 #112와 함께 그룹 1의 분리물 #61; #86; 및 #109가 Hep2 세포에서 신속하게 성장하여 3일 후에 3 ×106 내지 4 ×107 pfu/㎖의 유사하게 높은 감염 역가를 달성하지만, 그룹 1의 분리물 #110 및 그룹 2의 #104와 #162는 성장에서 분명히 약독화되었고 3일 후에 단지 3 ×104 pfu/㎖의 역가만을 달성하였다(도 9). 성장에 있어서 이러한 차이는 또한 1차 호흡기 상피세포에서도 관찰되고; 반면 #61; #86; #109 및 #112는 분명히 합포체의 형성을 유도하였으며, 단독 세포 감염체만이 동일한 감염 기간 후에 분리물 #110, #104 및 #162에서 검출될 수 있었다(비도시).
각 분리물의 인터페론 내성을 측정하기 위해 Hep2 세포를 상이한 분리물(MOI=0.1)로 1시간 동안 감염시킨 다음 재조합 I형 인터페론 A/D를 150 내지 5,000 U/㎖의 농도로 적용하였다. 72시간 동안 배양한 후에, 각 임상적 분리물의 바이러스 역가를 종점 적정에 의해 측정하였다. 이러한 측면에서 모든 임상적 HRSV 분리물은 이들의 성장 속도와 상관없이 재조합 I형 IFN의 항바이러스성 효과로부터 보호된다는 것이 관찰되었다. 5,000 U/㎖의 매우 높은 IFN 농도만으로는 상이한 임상적 HRSV 분리물의 복제 능력이 10배만 감소하였다(도 10). 이러한 데이타는 모든 임상적 HRSV 분리물이 고농도의 재조합 I형 IFN의 항바이러스성 효과를 저지할 수 있다는 것과 HRSV 실험실 계통 Long(도 7 참조)과 적어도 동일한 정도라는 것을 보여준다.
분리물의 NS1 및 NS2 유전자를 RT-PCR에 의해 증폭시키고 이들의 서열을 결정하였다. 두 유전자가 모두 고도로 보존되는 것으로 확정되었는데 이는 IFN 분석 의 결과를 확인해준다. 분리물 중에서 NS1 및 NS2 단백질 모두의 경우에 HRSV Long 계통과 비교하여 아미노산 서열의 매우 약간의 차이만이 관찰되었다. HRSV Long의 NS2 단백질 및 임상적 분리물 #104, 112, 61 및 110의 NS1 단백질은 동일하다. 각 분리물 #162, 86 및 109는 HRSV Long 서열과 비교하여 1 아미노산 치환을 포함하였다(#86; N(76)S, #162; V(82)M, #109E(91)G). 모든 임상적 분리물의 NS2 단백질은 그들의 아미노산 서열에 있어서 동일하고 2 치환 DN(7.8)GT 및 T(21)I에 의해서 HRSV Long와 상이하다. 따라서 HRSV Long의 NS 단백질 및 유전자가 각각 추가의 실험을 위해 사용되었다.
실시예 8: 인간 RSV(HRSV)의 NS1 및 NS2 단백질은 함께 IFN 매개되는 항바이러스성 반응에 대한 광견병 바이러스의 내성을 증대시킨다
HRSV의 두 NS 단백질이 IFN I형 길항 효과를 가진다는 것과 이 기능이 또다른 무관한 바이러스에 전달될 수 있다는 것을 확인하기 위해 HRSV(Long 계통)의 NS1(SAD VB-hNS1) 또는 NS2(SAD VB-hNS2)를 발현하는 재조합 광견병 바이러스를 생산하였다. 추가의 NS1 또는 NS2 유전자를 가지는 재조합 RV(도 11)를 G 유전자의 3' 비-암호화 서열(SAD VB)에 추가의 전사 중지 및 재개 서열을 함유하는 전체 길이의 RV cDNA(SAD L16)를 기초로 작제하였다(32). 추가의 유전자를 BRSV의 NS 유전자에 대해 이미 기술한 것처럼 약독화된 광견병 바이러스 SAD L16(도 1B)의 G 유전자와 L 유전자 사이에 도입하였다. 두 HRSV 유전자의 cDNA를 RT-PCR에 의해 수득하였다. 이 목적을 위해 전체 RNA를 HRSV(Long) 감염된 Vero 세포로부터 분리하였다. NS1 유전자의 경우에는 다음 프라이머가 사용되고: hNS1-NcoI5'(5'-ATT GAC CAT GGG CAG CAA TTC ATT-3'; 첫번째 스트랜드 합성 및 PCR) 및 hNS1-EcoRI5'(5'-ATT GAG AAT TCT TAT GGA TTA AGA TCA AA-3', NS2 유전자의 경우에는 프라이머 hNS2-NcoI5'(5'-ATT GAC CAT GGA CAC AAC CCA CA-3') 및 hNS2-EcoRI3'(5'-ATT GAG AAT TCT TAT GGA TTG AGA TCA TA-3')가 사용되었다. NotI 및 EcoRI 제한 효소로의 제한 후에 이들 PCR 단편을 동일한 방식으로 절단된 TIT 플라스미드(pTIT-hNS1, pTIT-hNS2)로 클로닝하였다. 이어서, NS1 유전자를 프라이머 hNS1-Not5'(5'-TAT GAA GCG GCC GCC CCC TCT CTT CTT TCT ACA GAA AAT GGG CAG CAA TTC ATT GAG-3') 및 hNS1-EcoRI3'로의 PCR을 사용하여 pTIT-hNS1으로부터 증폭시켜 NotI 및 EcoRI 제한 효소로 분해시킨다. Klenow 폴리머라제로의 채움 반응 후에 단편을 추가의 전사 개시 시그널의 하류에 pSAD VB의 특이한 SmaI 부위에 도입하였다. 이것이 pSAD VB-hNS1을 제공하였다. NS2 유전자를 프라이머 hNS2-AseI5'(5'-ATA CTT ATT AAT TGG GGC AAA TAA ATC AGT TCC CCA ACC AGC CAT GGA CAC AAC CCA CAA TG-3') 및 hNS2-Acc6513'(5'-ATA AAT GGT ACC AAA AGA TAA CAC TGT GTG AAT TAA ATT TTG AAA AGT GCT TAT GGA TTG AGA TCA TAC TTG-3')를 사용하여 pTIT-hNS2로부터 증폭시켜, AseI 및 EcoRI로 절단한 다음, Klenow 폴리머라제로 채운 후에 hNS1 유전자와 유사한 방식으로 클로닝하였다. 이것이 pSAD VB-hNS2를 생산하였다(도 11).
HRSV의 NS1 또는 NS2 유전자를 함유하는 재조합 RV를 각 바이러스 cDNA(10 ㎍)를 사용하는 T7 프로모터-조절 플라스미드의 형질감염(CaPO4 프로토콜; 포유류 형질감염 키트, Stratagene) 후에 전술한 바와 같이(19) 수득하였다. RV 단백질 N(pTITB-N, 5 ㎍), P 및 L(pTITB-P 및 pTITB-L, 각 플라스미드당 2.5 ㎍)을 암호화하는 플라스미드를 각 바이러스 cDNA를 사용하여 파지 T7 RNA 폴리머라제를 안정하게 발현하는 약 106 BSR T7/5 세포(5)로 동시-형질감염시켰다. 4시간 후에, 형질감염 배지를 제거하고 10% FCS를 함유하는 BHK-21 배지(Gibco)로 교체하였다. 세포 배양균 상등액을 형질감염 6일 후에 수확하여 새로운 BSR 세포에 첨가하였다. 감염성 RV의 검출은 RV 핵단백질 N을 인식하는 FITC 컨쥬게이트(Centocor)를 사용하는 면역 염색에 의해 수행된다. HRSV NS 단백질의 발현은 분명히 복제, 성장 특징 및 BSR 세포에서의 재조합 RV의 감염 역가에 역효과를 미치지 않았다(비도시).
발현된 HRSV 단백질의 활성을 검사하기 위해 MDBK 세포를 모 RV(SAD VB) 또는 각 개별 재조합체로 감염시키거나 두 재조합 SAD VB-hNS1과 SAD VB-hNS2로 동시-감염시켰다. 재조합 RV SAD VB, SAD VB-hNS1 및 SAD VB-hNS2로의 감염은 각각 5의 MOI를 사용하여 현탁액에서 전술한 바와 같이(18) 수행되었다. SAD VB-hNS1 및 SAD VB-hNS2로의 동시-감염을 위해서 2.5의 MOI가 각 재조합에 대해 사용되었다. 보편적인 재조합 I형 인터페론 A/D를 세포의 희석 직후에 50-500 U/㎖의 농도로 첨가하였다. 바이러스 역가를 감염 2일 후에 연속 희석 및 N RV 단백질에 대한 FITC 컨쥬케이트(Centocor)로의 면역 염색에 의해 측정하였다. IFN 처리가 분명히 wt RV의 단독 감염체 및 hNS를 발현하는 바이러스의 감염 역가를 감소시켰다. 단지 50 U IU IFN 알파의 첨가가 감염 역가를 3 정도 감소시켰다. 그러나, SAD VB-hNS1 및 SAD VB-hNS2로 동시-감염된 세포에서, 바이러스 복제는 분명히 150 IU IFN의 양이 첨가될 때까지 보호된다(도 11).
이러한 결과는 두 HRSV NS 단백질이 IFN에 대한 세포 반응을 길항시킬 수 있고 무관한 바이러스를 IFN 매개되는 항바이러스성 반응에 대해 내성이도록 할 수 있다는 것을 설명한다. 또한, 이 결과는 두 NS 단백질이 모두 필요하고 IFN 길항 활성을 발휘하게 하기에 충분하다는 것을 확인한다.
실시예 9: 쥐 뉴모바이러스(마우스의 폐렴 바이러스; PVM)의 NS1 및 NS2 단백질은 함께 IFN 매개되는 항바이러스성 반응에 대한 광견병 바이러스의 내성을 증대시킨다
PVM의 두 NS 단백질이 또한 IFN I형 내성을 매개한다는 것과 이 기능이 광견병 바이러스에 전달될 수 있다는 것을 확인하기 위해, PVM의 NS1(SAD VB-mNS1) 또는 NS2(SAD VB-mNS2)를 발현하는 재조합 광견병 바이러스를 생산하였다. 두 PVM 유전자의 cDNA는 영국 워릭 대학의 Andrew Easton에 의해 기꺼이 제공되었다(GenBank 기탁번호 D10331; 도 18). 추가의 NS1 또는 NS2 유전자를 가지는 재조합 RV(도 11) 또한 SAD VB(32; 실시예 6 및 8 참조)를 기초로 작제하였다. 추가의 유전자를 BRSV의 NS 유전자에 대해 이미 전술한 것처럼 RV SAD L16(도 1B)의 G 유전자와 L 유전자 사이에 도입하였다. 두 NS 단백질의 유전자를 전사 정지 코돈 바로 앞의 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 단백질(HA tag)의 내부 영역을 암호화하는 NS1 유전자 27 추가의 뉴클레오티드로 도입하는 PCR에 의해 증폭시켰다. NS2 유전자의 정지 코돈 상류에 합성 FLAG 펩타이드(FLAG tag)를 암호화하는 24 뉴클레오티드를 도입하였다. PVM의 NS1 유전자 경우에는 다음 프라이머가 사용되고: mNS1-NcoIEcoRV5'(5'- AAT GAT ATC GCG GCC GCC CCC TCT CTT CTT TCT ACA GAA ATG GGC TGT AAT GTG ATG ATG-3') 및 mNS1ha-EcoRI/V3'(5'-AAT GAT ATC GAA TTC TTA AGC GTA ATC GG TAC ATC ATA AGG ATA ACC ACT GAT CAG CTC TAC-3'), PVM의 NS2 유전자 경우에는 프라이머 mNS2-AseIEcoRV5'(5'-AAT GAT ATC ATT AAT TGG GGC AAA TAA ATC AGT TCC CCA ACC AGC CAT GTC CAC AGC TAT GAA CAA G-3') 및 mNS2fl-EcoRI/V3'(5'-AAT GAT ATC GAA TTC TCA TTT ATC GTC ATC ATC TTT ATA GTC ATC ATC ATC CTC ATC-3')가 사용되었다. 제한 효소 EcoRV로의 분해 후에 이들 PCR 단편을 이어서 추가의 전사 개시 시그널의 하류에 pSAD VB의 특이한 SmaI 부위에 도입하였다. 이것이 pSAD VB-mNS1 및 pSAD VB-mNS2(도 11)를 제공하였다.
PVM의 NS1 또는 NS2 유전자를 함유하는 재조합 RV가 실시예 6 및 8에서 이미 기술된 것처럼 형질감염된 플라스미드로부터 RV 단백질 N, P 및 L을 발현하는 BSR T7/5 세포에서 수득되었다. NS 단백질의 발현은 분명히 복제, 성장 특징 및 BSR 세포에서의 재조합체의 감염 역가에 역효과를 미치지 않았다(비도시).
발현된 PVM 단백질의 활성을 평가하기 위해 MDBK 세포를 모 RV(SAD VB)로 또는 각 개별 재조합체로 감염시키거나 두 재조합체 SAD VB-mNS1과 SAD VB-mNS2로 동시-감염시켰다. 재조합 RV SAD VB, SAD VB-mNS1 및 SAD VB-mNS2로의 감염은 각각 5의 MOI를 사용하여 현탁액에서 이미 기술한 것처럼(18) 수행되었다. SAD VB-mNS1 및 SAD VB-mNS2로의 동시-감염을 위해서는 2.5의 MOI가 각 재조합체에 대해 사용되었다. 보편적인 재조합 I형 인터페론 A/D를 세포의 희석 직후에 50-500 U/㎖의 농도로 첨가하였다. 바이러스 역가를 감염 2일 후에 연속 희석 및 N RV 단백질에 대 한 FITC 컨쥬게이트(Centocor)로의 면역 염색에 의해 측정하였다. IFN 처리가 분명하게 wt RV의 단독 감염체 및 hNS를 발현하는 바이러스의 감염 역가를 감소시켰다. 그러나, SAD VB-mNS1 및 SAD VB-mNS2로 동시-감염된 세포에서, 바이러스 복제는 분명히 100 IU IFN의 양이 첨가될 때까지 보호되었다(도 13).
이러한 결과는 또한 두 PVM NS 단백질이 IFN에 대한 세포 반응을 길항시킬 수 있고 무관한 바이러스를 IFN 매개되는 항바이러스성 반응에 대해 내성이도록 할 수 있다는 것을 확인한다. PVM NS 단백질의 HRSV의 NS 단백질과의 상동성이 단지 17%(NS1) 및 20%(NS2)이기 때문에, IFN 길항 기능은 예측할 수 없었다. BRSV 및 HRSV의 NS 단백질로 이미 관찰된 것처럼, PVM의 경우에도 두 NS 단백질이 모두 필요하고 IFN 길항 활성을 발휘하게 하기에 충분하다.
실시예 10: 이종성 NS 유전자를 지니고 있는 재조합 BRSV의 제조
자기 BRSV 유전자를 다른 뉴모바이러스로부터의 NS 유전자로 교체함으로써 재조합 키메릭 BRSV를 추가로 작제하였다.
BRSV NS1 유전자 대신 HRSV 또는 PVM의 NS1 유전자를 함유하는 재조합 BRSV의 제조를 위해 전체 길이 BRSV cDNA(5)의 nt 1 내지 957을 함유하고 또한 nt 311의 NS1 유전자에 EcoRI 제한 부위를 가지는(pbNS1EcoRIbNS2) 플라스미드가 사용되었다. 이 방식으로 NS2 유전자의 완전한 암호화 영역이 NotI 및 EcoRI 제한 효소로의 분해에 의해 제거될 수 있다. HRSV 및 PVM NS1 유전자를 HRSV NS1의 경우에는 프라이머 hNS1-NotI5' 및 hNS1-EcoRI3' 및 PVM NS1의 경우에는 mNS1-NotIEcoRV5' 및 mNS1ha-EcoRI3'를 사용하여 PCR에 의해 증폭시킨 다음, NotI 및 EcoRI 제한 효 소로의 분해 후에 플라스미드에 도입하여 phNS1bNS2 및 pmNS1bNS2를 생산하였다. 이후, 두 플라스미드를 모두 NotI 및 AccI로 분해시켜 각각 hNS1bNS2의 경우에는 1094 nt 길이 및 mNS1bNS2의 경우에는 1043 nt 길이의 생성 단편을 전체 길이 BRSV cDNA에 삽입하였다. 이것이 rBRSV hNS1bNS2 및 rBRSV mNS1bNS2를 생산하였다(도 14).
이종성 NS2 유전자를 지니고 있는 BRSV의 제조를 위해(rBRSV bNS1hNS2 및 rBRSV bNS1mNS2), pNS1NS2(5)를 제한 효소 Acc65I로 1차 절단한 다음 bNS2 유전자를 포함하는 446 nt 단편을 절단하는 제한 효소 AseI로 부분 절단하였다. 이어서 이 부위에 각각 hNS2 또는 mNS2 유전자를 함유하는 단편을 도입하였다. 이들 단편은 HRSV NS2 유전자의 경우에는 프라이머 hNS2-AseI5' 및 hNS2-Acc65I3' 또는 PVM NS2 유전자의 경우에는 mNS2-AseIEcoRV5' 및 mNS2-Acc65I3'(5'-ATA AAT GGT ACC AAA AGA TAA CAC TGT GTG AAT TAA ATT TTG AAA AGT GCT CAT TTA TCG TCA TCA TCT TTA TAG-3')을 사용하는 PCR에 의해 생성되었다. 이어서 단편을 제한 효소 AseI 및 Acc65I로 분해시키고 pNS1NS2에 도입하여 pbNS1hNS2 및 pbNS1mNS2를 생산하였다. 이어서 이들 플라스미드를 제한 효소 NotI 및 Acc655I로 분해시켜 생성 단편(bNS1hNS2의 경우에는 949 nt 및 bNS1mNS2의 경우에는 1069 nt)을 전체 길이 BRSV cDNA에 삽입하여 rBRSV bNS1hNS2 및 rBRSV bNS1mNS2를 생산하였다(도 14).
각각 HRSV 및 PVM의 두 NS 유전자를 함유하는 재조합 BRSV의 제조를 위해, 플라스미드 phNS1bNS2 및 pmNS1bNS2를 제한 효소 Acc65I로 1차 절단한 다음 제한 효소 AseI로 부분 절단한다. 이후, HRSV NS2 유전자 및 PVM NS2 유전자의 전술한 단편을 각 플라스미드에 도입하여 phNS1hNS2 및 pmNS1mNS2를 생산하였다. 또한 이들 플라스미드를 제한 효소 NotI 및 Acc65I로 분해시켜 hNS1hNS2의 경우에는 1094 nt 및 mNS1mNS2의 경우에는 1163 nt의 생성 단편을 BRSV의 전체 길이 cDNA에 삽입하였다. 이것이 rBRSV hNS1hNS2 및 rBRSV mNS1mNS2를 생산하였다(도 14).
생존 가능한 재조합 바이러스 rBRSV hNS1bNS2, rBRSV bNS1hNS2 및 rBRSV hNS1hNS2와 rBRSV mNS1bNS2, rBRSV bNS1mNS2 및 rBRSV mNS1mNS2가 각 바이러스 cDNA(10 ㎍)를 사용하는 T7 프로모터-조절 플라스미드의 형질감염(CaPO4 프로토콜; 포유류 형질감염 키트, Stratagene) 후에 BSR T7/5 세포(5)에서 각 cDNA 작제물로부터 수득될 수 있다. BRSV 단백질 N 및 P(pTITB-N 및 pTITB-P, 각 플라스미드당 4 ㎍)와 L 및 M2(pTITB-L 및 pTITB-M2, 각 플라스미드당 2 ㎍)을 암호화하는 플라스미드를 각 바이러스 cDNA를 사용하여 파지 T7의 RNA 폴리머라제를 안정하게 발현하는 약 106 BSR T7/5 세포(5)로 동시-형질감염시켰다. 4시간 후에, 형질감염 배지를 제거하고 5% FCS를 함유하는 BHK-21 배지(Gibco)를 첨가하였다. BRSV cDNA로 형질감염된 세포를 5일마다 세포병원성 효과가 관찰될 수 있을 때까지 1:3의 비로 희석시켰다. 모든 경우에 BRSV의 N, P, L 및 M2 단백질을 암호화하는 지지 플라스미드의 동시-형질감염이 합포체의 형성을 초래하였다. 1:3의 비로 세포를 희석시키고 분명한 세포병원성 효과가 관찰된 후에 바이러스를 수확하였다.
바이러스 원액의 제조를 위해 80% 융합된 Vero 세포를 혈청 없는 Dulbecco's 최소 필수 배지(DMEM)에서 0.1의 감염 중복도(MOI)로 감염시켰다. 1시간 동안 흡착 시킨 후에 접종물을 제거하고 세포를 37℃의 5% CO2 대기중 2.5% FCS가 보충된 DMEM에서 분명한 세포병원성 효과(CPE)가 대략 4일 후에 관찰될 때까지 배양시켰다. 바이러스를 냉동 및 후속 해동에 의해 방출시켰다. Vero 세포에서의 바이러스 역가를 마이크로타이터 플레이트에서 연속 희석시킨 다음 감염된 병소를 계수함으로써 측정하였다. 이 목적을 위해 병소를 F 융합 단백질에 대한 항체를 사용하는 간접 염색으로 염색시켰다(영국, SEROTEK).
실시예 11: BRSV 키메라의 성장: IFN 내성은 세포형 의존성이다
바이러스의 성장 특징을 Vero 세포에서 1차 분석하였다. BRSV hNS1hNS2 및 BRSV hNS1bNS2는 BRSV wt와 유사하게 행동하지만, BRSV mNS1mNS2 및 BRSV mNS1bNS2는 모 전체 길이 바이러스와 비교하여 약간 약독화되었다. 이는 바이러스 복제에 있어서 BRSV NS 단백질의 기능(들)이 HRSV NS 단백질에 의해 완벽하게 수행된다는 것을 의미한다. 모 wt BRSV와 2 HRSV/BRSV 키메라 모두 0.1의 MOI로 Vero 세포의 감염 및 3일간의 후속 배양 후에 약 5 ×105 pfu의 감염 역가를 달성하였다(도 15). 한편 PVM/BRSV 키메라는 3일 후에 단지 약 4 ×105 pfu를 달성하였는데 이는 PVM NS 유전자가 바이러스 복제에서 BRSV(및 HRSV) 유전자의 기능을 수행하기에 최적이 아님을 의미한다.
이어서, wt BRSV의 성장을 지속하기에 최적이고 Vero 세포와는 달리 기능성 IFN I형 시스템을 가지는 소 기원의 세포주, 즉 MDBK가 사용되었다(5). 이 경우에 BRSVhNS1hNS2의 성장은 wt BRSV와 비교하여 감소하였다. 1 ×106 pfu까지 성장하는 BRSV와 달리 단지 4 ×104 pfu의 역가가 3일 후에 달성되었다(도 16). wt BRSV를 위한 최적의 숙주 세포인 소 MDBK 세포에서, BRSV hNS1hNS2의 성장은 분명히 약화되고 반면 IFN-음성 Vero 세포에서는 약화가 관찰될 수 없었다.
이어서 재조합 인간 I형 인터페론이 IFN 자극된 세포에서 wt BRSV 및 BRSV hNS1hNS2의 행동을 분석하는 데 사용되었다. I형 인터페론이 재조합 Vero 또는 MDBK 세포의 복제에 미치는 영향을 연구하기 위해 전술한 바와 같이 0.1의 MOI로 상이한 바이러스를 사용하여 감염시키고 6 웰 디쉬에서 2.5% FCS를 함유하는 DMEM중에 시딩하였다. 보편적인 재조합 I형 인터페론(인간 인터페론 알파 A/D, PBL Biomedical Laboratories)을 시딩 직후에 500-10,000 U/㎖의 농도로 첨가하였다. 바이러스 역가를 3일간 배양한 후에 연속 희석 및 F 융합 단백질에 대한 항체로 감염된 세포의 간접 염색에 의해 측정하였다.
Vero 세포에서 wt BRSV와 BRSV hNS1hNS2 간의 이들의 IFN 내성의 차이는 관찰될 수 없었다. 두 바이러스 모두 감염 역가의 약간의 감소가 5000 U 이상의 첨가시에만 관찰될 수 있었다(도 17A). 이와 달리 MDBK 세포에서는 BRSV hNS1hNS2가 IFN 유도되는 세포 반응에 대해 강력한 투여량-의존성 감수성을 보였고 여기에서, 1500 U만큼 소량이 감염 역가의 3배 감소를 초래하였고 10,000 U가 약 30배 감소를 초래하였다. 한편 wt BRSV는 IFN 처리에 대해 높은 내성을 보였다. 심지어는 10,000 U IFN 알파도 wt BRSV의 복제에 영향을 미치지 않았다(도 17B). 키메릭 BRSV hNS1hNS2가 Vero 세포에서 wt BRSV의 내성과 유사한 IFN 내성을 보이지만 소 기원의 세포에서 IFN 유도되는 항바이러스성 반응을 완전히 저지할 수는 없다. 이는 BRSV NS 단백질이 HRSV NS 단백질보다 소 세포 항바이러스성 반응을 다루는 데 더욱 성공적임을 설명한다. 분명히, NS 단백질의 IFN 길항 효과는 이종성 숙주 세포에서 최적 이하이다. 이종성 NS 단백질을 지니고 있는 키메릭 RS 단백질이 생체내에서 약독화되고 생(live) 백신으로 사용될 수 있다.
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<223> Description of Artificial Sequence:Primer hNS1-NotI5
<400> 9
tatgaagcgg ccgccccctc tcttctttct acagaaaatg ggcagcaatt cattgag 57
<210> 10
<211> 62
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Primer hNS2-AseI5
<400> 10
atacttatta attggggcaa ataaatcagt tccccaacca gccatggaca caacccacaa 60
tg 62
<210> 11
<211> 71
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Primer hNS2-Acc65I3
<400> 11
ataaatggta ccaaaagata acactgtgtg aattaaattt gaaaagtgct tatggattga 60
gatcatactt g 71
<210> 12
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Primer mNS1-NotIEcoRV5
<400> 12
aatgatatcg cggccgcccc ctctcttctt tctacagaaa tgggctgtaa tgtgatgatg 60
60
<210> 13
<211> 62
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Primer mNS1ha-EcoRI/V3
<400> 13
aatgatatcg aattcttaag cgtaatcggt acatcataag gataaccact gatcagctct 60
ac 62
<210> 14
<211> 67
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Primer mNS2-Ase1EcoRV5
<400> 14
aatgatatca ttaattgggg caaataaatc agttccccaa ccagccatgt ccacagctat 60
gaacaag 67
<210> 15
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Primer mNS2f1-EcoRI/V3
<400> 15
aatgatatcg aattctcatt tatcgtcatc atctttatag tcatcatcat cctcatc 57
<210> 16
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Primer mNS2-Acc65I3
<400> 16
ataaatggta ccaaaagata acactgtgtg aattaaattt tgaaaagtgc tcatttatcg 60
tcatcatctt tatag 75
Claims (31)
- RSV NS2, 또는 RSV NS1 및 RSV NS2 단백질, 또는 RSV NS2를 암호화하는 핵산 서열, 또는 RSV NS1을 암호화하는 핵산 서열 및 RSV NS2를 암호화하는 핵산 서열을 함유하는, IFN에 의해 매개되는 면역반응에 의해 야기되는 질병의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 면역반응이 항바이러스성 반응인 약학 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 면역반응을 억제시키는 약학 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 핵산 서열이 DNA 또는 RNA인 약학 조성물.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, RSV NS1 및 RSV NS2 단백질이 함께 사용되거나 RSV NS1을 암호화하는 핵산 서열이 RSV NS2를 암호화하는 핵산 서열과 함께 사용되는 약학 조성물.
- 제 5 항에 있어서, RSV NS1 단백질 및 RSV NS2 단백질이 상이한 RSV 바이러스로부터 유래되고, RSV NS1을 암호화하는 핵산 서열 및 RSV NS2를 암호화하는 핵산 서열이 상이한 RSV 바이러스로부터 유래되는 약학 조성물.
- 제 4 항에 있어서, 핵산 서열이 플라스미드, 또는 벡터, 또는 바이러스 유래된 벡터, 또는 재조합 DNA 또는 RNA 바이러스에 함유되어 있는 약학 조성물.
- 제 7 항에 있어서, 벡터가 유전자 요법, 또는 세포 파괴 또는 항암 요법에서 면역화 목적을 위해 사용되는 바이러스 유전자 발현 벡터인 약학 조성물.
- 제 7 항에 있어서, 바이러스 또는 바이러스 유래된 벡터가 아데노바이러스(AdV), 아데노-수반 바이러스(AAV), 헤르페스 바이러스, 또는 폭스 바이러스로부터 유래되는 약학 조성물.
- 제 7 항에 있어서, 바이러스 또는 바이러스 유래된 벡터가 알파-(Alpha-), 플라비-(Flavi-) 또는 피코나비리대(Picornaviridae), 파라믹소비리대(Paramyxoviridae), 필로비리대(Filoviridae), 보르나비리대(Bornavidae), 또는 랍도비리대(Rhabdoviridae) 과의 바이러스로부터 유래되는 약학 조성물.
- 제 7 항에 있어서, 바이러스 또는 바이러스 유래된 벡터가 단편화 또는 비-단편화된 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스로부터 유래되는 약학 조성물.
- 제 10 항에 있어서, RNA 바이러스가 광견병 바이러스로부터 유래되는 약학 조성물.
- 제 10 항에 있어서, RNA 바이러스가 인간 또는 동물 RSV로부터 유래되는 약학 조성물.
- 제 13 항에 있어서, RSV NS2를 암호화하는 핵산 서열, 또는 RSV NS1을 암호화하는 핵산 서열 및 RSV NS2를 암호화하는 핵산 서열이 인간 또는 동물 RSV에 대해 이종성인 약학 조성물.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 약학 조성물이 백신을 추가로 함유하는 약학 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, RSV NS2, 또는 RSV NS1 및 RSV NS2 단백질의 IFN 길항 활성의 증가를 초래하는 변형된 RSV NS2, 또는 RSV NS1 및 RSV NS2 단백질을 함유하는 약학 조성물.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, RSV NS2, 또는 RSV NS1 및 RSV NS2 단백질의 IFN 길항 활성의 감소를 초래하는 변형된 RSV NS2, 또는 RSV NS1 및 RSV NS2 단백질을 함유하는 약학 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, IFN이 I형 인터페론(IFN 알파 또는 IFN 베타)인 약학 조성물.
- 삭제
- 삭제
- RSV NS2, 또는 RSV NS1 및 RSV NS2 단백질을 발현시키기 위해, RSV NS2, 또는 RSV NS1 및 RSV NS2를 암호화하는 핵산 서열을 함유하고, RSV NS2, 또는 RSV NS1 및 RSV NS2 단백질의 발현이 IFN에 의해 매개되는 면역반응을 회피하는 능력을 바이러스에 부여하거나 보강하는, 모노네가비랄레스(Mononegavirales) 목 바이러스 유래의 재조합 바이러스.
- 제 27 항에 있어서, 바이러스가 광견병 바이러스로부터 유래되는 재조합 바이러스.
- 삭제
- 제 1 항에 있어서, RSV NS2, 또는 RSV NS1 및 RSV NS2 단백질, 혹은 NS2를 암호화하는 핵산 서열, 또는 NS1을 암호화하는 핵산 서열 및 NS2를 암호화하는 핵산 서열이 BRSV, HRSV 또는 PVM으로부터 유래되는 약학 조성물.
- 제 30 항에 있어서, 도 18에 따른 서열을 가지는 BRSV, HRSV 또는 PVM의 RSV NS2, 또는 NS1 및 NS2 단백질, 또는 도 18에 따른 서열을 가지는 BRSV, HRSV 또는 PVM의 NS2를 암호화하는 핵산 서열, 또는 NS1을 암호화하는 핵산 서열 및 NS2를 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 약학 조성물.
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