JPH1198996A - 有用蛋白質の製造法 - Google Patents
有用蛋白質の製造法Info
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- JPH1198996A JPH1198996A JP10216309A JP21630998A JPH1198996A JP H1198996 A JPH1198996 A JP H1198996A JP 10216309 A JP10216309 A JP 10216309A JP 21630998 A JP21630998 A JP 21630998A JP H1198996 A JPH1198996 A JP H1198996A
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- Japan
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- silkworm
- recombinant
- interferon
- producing
- recombinant baculovirus
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 組換えバキュロウイルスによる有用蛋白質の
製造方法を提供する。 【解決手段】 ４級アンモニウム塩で処理することによ
り、組換えバキュロウイルスの比活性化と目的蛋白質の
精製を容易にする。
製造方法を提供する。 【解決手段】 ４級アンモニウム塩で処理することによ
り、組換えバキュロウイルスの比活性化と目的蛋白質の
精製を容易にする。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、組換えバキュロウ
イルスを用いた遺伝子操作技術によって有用蛋白質を生
産する手法において、組換えバキュロウイルスの不活性
化とその後行程にあたる目的有用蛋白質の精製を容易に
することによって、有用蛋白質の量産化を可能とし、以
って高純度かつ安価な医薬品（抗腫瘍・抗ウイルス剤
等）を製造する事を目的とする有用蛋白質の製造方法に
関する。
イルスを用いた遺伝子操作技術によって有用蛋白質を生
産する手法において、組換えバキュロウイルスの不活性
化とその後行程にあたる目的有用蛋白質の精製を容易に
することによって、有用蛋白質の量産化を可能とし、以
って高純度かつ安価な医薬品（抗腫瘍・抗ウイルス剤
等）を製造する事を目的とする有用蛋白質の製造方法に
関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子組換え技術を用いた有用蛋白質の
生産方法には多くの技術が報告されているが、近年、遺
伝子組換えしたバキュロウイルスを用いた有用蛋白質の
生産方法についても、ブタ成長ホルモン（特開平3-2244
91）、成人Ｔ細胞白血病ウイルス外皮蛋白質（特開平2-
57191）、インフルエンザウイルスＨＡ蛋白質（特開平3
-108480）、ネコインターフェロン（特開平3-139276）
等が開示されている。しかし、バキュロウイルスを用い
た有用蛋白質の生産方法によって特に医薬品などを製造
する場合には、安全性の観点から使用した組換えバキュ
ロウイルスの不活性化が不可欠である。また、有用蛋白
質の生産を目的とした組換えカイコ核多角体病ウイルス
の不活性化においては、組換えバキュロウイルスの感染
力を失わせると同時に、目的とする有用蛋白質の活性を
維持することが必要である。
生産方法には多くの技術が報告されているが、近年、遺
伝子組換えしたバキュロウイルスを用いた有用蛋白質の
生産方法についても、ブタ成長ホルモン（特開平3-2244
91）、成人Ｔ細胞白血病ウイルス外皮蛋白質（特開平2-
57191）、インフルエンザウイルスＨＡ蛋白質（特開平3
-108480）、ネコインターフェロン（特開平3-139276）
等が開示されている。しかし、バキュロウイルスを用い
た有用蛋白質の生産方法によって特に医薬品などを製造
する場合には、安全性の観点から使用した組換えバキュ
ロウイルスの不活性化が不可欠である。また、有用蛋白
質の生産を目的とした組換えカイコ核多角体病ウイルス
の不活性化においては、組換えバキュロウイルスの感染
力を失わせると同時に、目的とする有用蛋白質の活性を
維持することが必要である。
【０００３】バキュロウイルスの一つであるカイコ核多
角体病ウイルスの不活性化に関しては、Watanabe らが
詳細に報告している（文献１）。しかし、開示されてい
る加熱、紫外線、乾燥など、物理的な不活性化条件、お
よび、フェノール、ホルマリンなどの殺菌剤、アルコー
ルなどによる化学的な不活性化条件では蛋白質の変性が
生じることから、有用蛋白の製造に利用することは困難
である。また、この報告は、野生型カイコ核多角体病ウ
イルスの不活性化に関するものであり、組換えカイコ核
多角体病ウイルスの不活性化については開示されていな
い。
角体病ウイルスの不活性化に関しては、Watanabe らが
詳細に報告している（文献１）。しかし、開示されてい
る加熱、紫外線、乾燥など、物理的な不活性化条件、お
よび、フェノール、ホルマリンなどの殺菌剤、アルコー
ルなどによる化学的な不活性化条件では蛋白質の変性が
生じることから、有用蛋白の製造に利用することは困難
である。また、この報告は、野生型カイコ核多角体病ウ
イルスの不活性化に関するものであり、組換えカイコ核
多角体病ウイルスの不活性化については開示されていな
い。
【０００４】特開平４-２０７１９８には、カイコ体液
をｐＨ０.５〜ｐＨ３.０にすることを特徴とする組換え
カイコ核多角体病ウイルスの不活性化方法が開示されて
いるが、この方法では酸性に対して安定な有用蛋白質を
製造する場合に限られることから、さらに幅広い有用蛋
白質に対して適用可能な組換えバキュロウイルスの不活
性化方法が求められていた。また、特開昭６１-１５２
２７６には、塩化ベンザルコニウムを用いた組換え大腸
菌の不活性化に関する技術が開示されているが、組換え
バキュロウイルスの不活性化方法については開示されて
いない。一方、ウイルスに対する塩化ベンザルコニウム
の不活性化作用はウイルスによって異なり、Yamamoto
らはＨＩＶウイルスが塩化ベンザルコニウムで不活性化
されることを報告しているが（文献２）、一方、Watana
be らはカイコのFlacherie virusは塩化ベンザルコニウ
ムによって不活性化されないと報告している（文献
３）。
をｐＨ０.５〜ｐＨ３.０にすることを特徴とする組換え
カイコ核多角体病ウイルスの不活性化方法が開示されて
いるが、この方法では酸性に対して安定な有用蛋白質を
製造する場合に限られることから、さらに幅広い有用蛋
白質に対して適用可能な組換えバキュロウイルスの不活
性化方法が求められていた。また、特開昭６１-１５２
２７６には、塩化ベンザルコニウムを用いた組換え大腸
菌の不活性化に関する技術が開示されているが、組換え
バキュロウイルスの不活性化方法については開示されて
いない。一方、ウイルスに対する塩化ベンザルコニウム
の不活性化作用はウイルスによって異なり、Yamamoto
らはＨＩＶウイルスが塩化ベンザルコニウムで不活性化
されることを報告しているが（文献２）、一方、Watana
be らはカイコのFlacherie virusは塩化ベンザルコニウ
ムによって不活性化されないと報告している（文献
３）。
【０００５】すなわち、これらの従来技術では組換えバ
キュロウイルスを用いた有用蛋白質の生産において、幅
広い有用蛋白質の活性の維持と組換えバキュロウイルス
の不活性化を両立することは困難であった。
キュロウイルスを用いた有用蛋白質の生産において、幅
広い有用蛋白質の活性の維持と組換えバキュロウイルス
の不活性化を両立することは困難であった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】そこで、酸に安定な有
用蛋白質に限らず、すべての有用蛋白質の活性を低下さ
せることなく組換えバキュロウイルスの不活性化が可能
となれば、従来組換えバキュロウイルスを用いて量産が
困難であった有用蛋白質でも量産が容易となると期待で
きる。すなわち、本発明は、組換えバキュロウイルスを
用いた有用蛋白質の製造において、幅広い有用蛋白質に
適用可能な組換えバキュロウイルスの不活性化方法とそ
の後行程にあたる目的有用蛋白質の精製を容易にする方
法を提供することによって、有用蛋白質の量産化を可能
とし、以って高純度かつ安価な医薬品（抗腫瘍・抗ウイ
ルス剤等）の製造を可能とすることを目的とする。
用蛋白質に限らず、すべての有用蛋白質の活性を低下さ
せることなく組換えバキュロウイルスの不活性化が可能
となれば、従来組換えバキュロウイルスを用いて量産が
困難であった有用蛋白質でも量産が容易となると期待で
きる。すなわち、本発明は、組換えバキュロウイルスを
用いた有用蛋白質の製造において、幅広い有用蛋白質に
適用可能な組換えバキュロウイルスの不活性化方法とそ
の後行程にあたる目的有用蛋白質の精製を容易にする方
法を提供することによって、有用蛋白質の量産化を可能
とし、以って高純度かつ安価な医薬品（抗腫瘍・抗ウイ
ルス剤等）の製造を可能とすることを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者は、こうした状
況に鑑み、鋭意工夫を重ねた結果、組換えバキュロウイ
ルスが感染した昆虫細胞の培養上清、または、組換えバ
キュロウイルスが感染した昆虫幼虫の体液に４級アンモ
ニウム塩を添加することによって、組換えバキュロウイ
ルスが不活性化すること、さらに、組換えバキュロウイ
ルスによって産生した有用蛋白質の比活性が向上するた
め、後工程である精製が容易となることを見出し本発明
を完成するに至った。
況に鑑み、鋭意工夫を重ねた結果、組換えバキュロウイ
ルスが感染した昆虫細胞の培養上清、または、組換えバ
キュロウイルスが感染した昆虫幼虫の体液に４級アンモ
ニウム塩を添加することによって、組換えバキュロウイ
ルスが不活性化すること、さらに、組換えバキュロウイ
ルスによって産生した有用蛋白質の比活性が向上するた
め、後工程である精製が容易となることを見出し本発明
を完成するに至った。
【０００８】すなわち本発明は、有用蛋白質をコードす
る遺伝子により組み換えられた組換えバキュロウイルス
を昆虫培養細胞、または、昆虫幼虫に感染させて有用蛋
白質を生産する際に、昆虫細胞培養上清または昆虫幼虫
の体液に４級アンモニウム塩を添加することを特徴とす
る有用蛋白質の製造方法、ならびに、組換えバキュロウ
イルスの不活性化方法を提供するものである。
る遺伝子により組み換えられた組換えバキュロウイルス
を昆虫培養細胞、または、昆虫幼虫に感染させて有用蛋
白質を生産する際に、昆虫細胞培養上清または昆虫幼虫
の体液に４級アンモニウム塩を添加することを特徴とす
る有用蛋白質の製造方法、ならびに、組換えバキュロウ
イルスの不活性化方法を提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】以下、本発明に関し詳細に説明す
る。
る。
【００１０】本発明の有用蛋白質としては特に限定はさ
れないが、４級アンモニウム塩に対して安定な蛋白質が
好ましい。４級アンモニウム塩に対して安定な蛋白質と
しては種々のものが報告され、今後も多くのものが見出
されるであろうが、それらへの応用が可能である。例え
ば、４級アンモニウム塩に対して安定な有用蛋白質とし
て、ヒトインターフェロン（α、β、γの各タイプ）、
ネコインターフェロン、イヌインターフェロン（α、
β、γの各タイプ）などのインターフェロン類などが挙
げられる。インターフェロンは、抗ウイルス作用を示す
ところの蛋白質を主成分とする生理活性物質でＩＦＮと
略記される。また、その他に各種ほ乳動物由来のインタ
ーロイキンなどが挙げられる。本発明では、特にネコＩ
ＦＮ-ω、または、イヌＩＦＮ-γが好ましく用いられ
る。
れないが、４級アンモニウム塩に対して安定な蛋白質が
好ましい。４級アンモニウム塩に対して安定な蛋白質と
しては種々のものが報告され、今後も多くのものが見出
されるであろうが、それらへの応用が可能である。例え
ば、４級アンモニウム塩に対して安定な有用蛋白質とし
て、ヒトインターフェロン（α、β、γの各タイプ）、
ネコインターフェロン、イヌインターフェロン（α、
β、γの各タイプ）などのインターフェロン類などが挙
げられる。インターフェロンは、抗ウイルス作用を示す
ところの蛋白質を主成分とする生理活性物質でＩＦＮと
略記される。また、その他に各種ほ乳動物由来のインタ
ーロイキンなどが挙げられる。本発明では、特にネコＩ
ＦＮ-ω、または、イヌＩＦＮ-γが好ましく用いられ
る。
【００１１】イヌインターフェロン-γは参考文献５に
示されているアミノ酸配列からなるポリペプチドである
が、そのアミノ酸配列の一部が置換されたもの、また、
その一部が欠如したもの、あるいは、いくつかのアミノ
酸残基が付加されたものでも、イヌ由来細胞、例えば、
イヌＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３４）に対し
て、文献１６に示されているようなインターフェロン−
γの本来の生理活性を有するポリペプチドであれば本発
明に含まれる。具体的には、例えば、配列番号５に示す
成熟蛋白質部分のアミノ酸配列からなるポリペプチドが
挙げられる。また、例えば、配列番号６に示す成熟蛋白
質部分のような糖鎖結合部位を欠如させたイヌインター
フェロン-γを挙げることができる。また、配列番号
７、８に示す成熟蛋白質部分のようなＣ末端が欠如した
イヌインターフェロン-γを挙げることができる。
示されているアミノ酸配列からなるポリペプチドである
が、そのアミノ酸配列の一部が置換されたもの、また、
その一部が欠如したもの、あるいは、いくつかのアミノ
酸残基が付加されたものでも、イヌ由来細胞、例えば、
イヌＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３４）に対し
て、文献１６に示されているようなインターフェロン−
γの本来の生理活性を有するポリペプチドであれば本発
明に含まれる。具体的には、例えば、配列番号５に示す
成熟蛋白質部分のアミノ酸配列からなるポリペプチドが
挙げられる。また、例えば、配列番号６に示す成熟蛋白
質部分のような糖鎖結合部位を欠如させたイヌインター
フェロン-γを挙げることができる。また、配列番号
７、８に示す成熟蛋白質部分のようなＣ末端が欠如した
イヌインターフェロン-γを挙げることができる。
【００１２】遺伝子組換えバキュロウイルスは、例えば
次のようにして作製することができる。すなわち、有用
蛋白質をコードするＤＮＡの上流に核多角体病ウイルス
由来のプロモーター領域を含むＤＮＡ断片、下流に終止
シグナル以下のＤＮＡ断片を有する組換えプラスミド
と、核多角体病ウイルスのＤＮＡを、例えばＢＭ−Ｎ細
胞のようなカイコ培養細胞に同時に感染させることによ
って、細胞内で外来の有用蛋白質をコードするＤＮＡと
ウイルスＤＮＡの組換えが起こり、遺伝子組換えウイル
スが作製される。このようにして作製された組換えウイ
ルスは、核多角体病ウイルスの多角体蛋白質の遺伝子領
域に外来のＤＮＡが置換または挿入されており多角体を
形成することができないため、非組換えウイルスと容易
に区別することが可能である。
次のようにして作製することができる。すなわち、有用
蛋白質をコードするＤＮＡの上流に核多角体病ウイルス
由来のプロモーター領域を含むＤＮＡ断片、下流に終止
シグナル以下のＤＮＡ断片を有する組換えプラスミド
と、核多角体病ウイルスのＤＮＡを、例えばＢＭ−Ｎ細
胞のようなカイコ培養細胞に同時に感染させることによ
って、細胞内で外来の有用蛋白質をコードするＤＮＡと
ウイルスＤＮＡの組換えが起こり、遺伝子組換えウイル
スが作製される。このようにして作製された組換えウイ
ルスは、核多角体病ウイルスの多角体蛋白質の遺伝子領
域に外来のＤＮＡが置換または挿入されており多角体を
形成することができないため、非組換えウイルスと容易
に区別することが可能である。
【００１３】このような遺伝子組換え核多角体病ウイル
スとして、例えば、ネコＩＦＮの蛋白質をコードするＤ
ＮＡが組換えられたｒＢＮＶ１００や 、イヌＩＦＮ-γ
の蛋白質をコードするＤＮＡが組換えられたrＢＮＶγ
を挙げることができる。
スとして、例えば、ネコＩＦＮの蛋白質をコードするＤ
ＮＡが組換えられたｒＢＮＶ１００や 、イヌＩＦＮ-γ
の蛋白質をコードするＤＮＡが組換えられたrＢＮＶγ
を挙げることができる。
【００１４】ｒＢＮＶ１００は、特開平４−２０７１９
８に開示された方法によって作製することができる。す
なわち、生命科学研究所にFERM Ｐ-１６３３号として
寄託されている大腸菌の形質転換体から一般的な手法に
より抽出したプラスミドからネコＩＦＮの蛋白質をコー
ドするＤＮＡ部分を、例えばｐＢＭ０３０（文献４）な
どのカイコのクローニングベクターの発現調節部分の下
流に連結するという一般的な遺伝子操作技術によって組
換えプラスミドを作製することができる。この組換えプ
ラスミドとカイコ核多角体病ウイルスＤＮＡ（文献４）
とを、文献４に示されている方法で、カイコ樹立細胞、
例えば、ＢＭ−Ｎ細胞（文献４）にコ・トランスフェク
ションした後、培養を続ける。培養液中には、非組換え
ウイルス（野生型）と組換えウイルスの両方が出現する
ため、限界希釈法およびプラーク法などの一般的な方法
によって、組換えウイルスをクローニングする。組換え
ウイルスは核多核体の形成能がないことから、野生型ウ
イルスと容易に区別することが可能である。
８に開示された方法によって作製することができる。す
なわち、生命科学研究所にFERM Ｐ-１６３３号として
寄託されている大腸菌の形質転換体から一般的な手法に
より抽出したプラスミドからネコＩＦＮの蛋白質をコー
ドするＤＮＡ部分を、例えばｐＢＭ０３０（文献４）な
どのカイコのクローニングベクターの発現調節部分の下
流に連結するという一般的な遺伝子操作技術によって組
換えプラスミドを作製することができる。この組換えプ
ラスミドとカイコ核多角体病ウイルスＤＮＡ（文献４）
とを、文献４に示されている方法で、カイコ樹立細胞、
例えば、ＢＭ−Ｎ細胞（文献４）にコ・トランスフェク
ションした後、培養を続ける。培養液中には、非組換え
ウイルス（野生型）と組換えウイルスの両方が出現する
ため、限界希釈法およびプラーク法などの一般的な方法
によって、組換えウイルスをクローニングする。組換え
ウイルスは核多核体の形成能がないことから、野生型ウ
イルスと容易に区別することが可能である。
【００１５】イヌＩＦＮ-γの蛋白質をコードするＤＮ
Ａが組換えられたrＢＮＶγは、例えば次のように作製
することができる。まず、イヌＩＦＮ-γの蛋白をコー
ドするＤＮＡ（文献５）を、例えば次のようにして製造
する。すなわち、イヌの細胞からポリ（Ａ）ＲＮＡを抽
出した後、ｃＤＮＡに転換し、イヌＩＦＮ-γをコ−ド
する遺伝子配列を元にしたプライマ−を用いてポリメラ
ーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと略す）を行うことによって
イヌＩＦＮ-γをコ−ドする遺伝子を得ることができ
る。
Ａが組換えられたrＢＮＶγは、例えば次のように作製
することができる。まず、イヌＩＦＮ-γの蛋白をコー
ドするＤＮＡ（文献５）を、例えば次のようにして製造
する。すなわち、イヌの細胞からポリ（Ａ）ＲＮＡを抽
出した後、ｃＤＮＡに転換し、イヌＩＦＮ-γをコ−ド
する遺伝子配列を元にしたプライマ−を用いてポリメラ
ーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと略す）を行うことによって
イヌＩＦＮ-γをコ−ドする遺伝子を得ることができ
る。
【００１６】イヌの細胞、例えばマイト−ジェンなどで
刺激されたイヌリンパ球などよりＲＮＡを得る方法とし
ては、通常の方法、例えば、ポリソ−ムの分離、ショ糖
密度勾配遠心や電気泳動を利用した方法などがあげられ
る。上記イヌ細胞よりＲＮＡを抽出する方法としては、
グアニジン・チオシアネ−ト処理後ＣｓＣｌ密度勾配遠
心を行うグアニジン・チオシアネ−ト−塩化セシウム法
（文献６）バナジウム複合体を用いてリボヌクレア−ゼ
インヒビタ−存在下に界面活性剤で処理したのちフェノ
−ル抽出を行う方法（文献７），グアニジン・チオシア
ネ−ト−ホット・フェノ−ル法、グアニジン・チオシア
ネ−ト−グアニジン塩酸法、グアニジン・チオシアネ−
ト−フェノ−ル・クロロホルム法、グアニジン・チオシ
アネ−トで処理したのち塩化リチウムで処理してＲＮＡ
を沈殿させる方法などの中から適当な方法を選んで行う
ことができる。
刺激されたイヌリンパ球などよりＲＮＡを得る方法とし
ては、通常の方法、例えば、ポリソ−ムの分離、ショ糖
密度勾配遠心や電気泳動を利用した方法などがあげられ
る。上記イヌ細胞よりＲＮＡを抽出する方法としては、
グアニジン・チオシアネ−ト処理後ＣｓＣｌ密度勾配遠
心を行うグアニジン・チオシアネ−ト−塩化セシウム法
（文献６）バナジウム複合体を用いてリボヌクレア−ゼ
インヒビタ−存在下に界面活性剤で処理したのちフェノ
−ル抽出を行う方法（文献７），グアニジン・チオシア
ネ−ト−ホット・フェノ−ル法、グアニジン・チオシア
ネ−ト−グアニジン塩酸法、グアニジン・チオシアネ−
ト−フェノ−ル・クロロホルム法、グアニジン・チオシ
アネ−トで処理したのち塩化リチウムで処理してＲＮＡ
を沈殿させる方法などの中から適当な方法を選んで行う
ことができる。
【００１７】イヌリンパ球などより通常の方法、例え
ば、塩化リチウム／尿素法、グアニジン・イソチオシア
ネ−ト法、オリゴｄＴセルロ−スカラム法等によりｍＲ
ＮＡを単離し、得られたｍＲＮＡから通常の方法、例え
ば、Ｇｕｂｌｅｒらの方法（文献８），Ｈ．Ｏｋａｙａ
ｍａらの方法（文献９）等によりｃＤＮＡを合成する。
得られたｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するには、基本的
にはトリ骨芽球ウイルス（ＡＭＶ）などの逆転写酵素な
どを用いるほか１部プライマ−を用いてＤＮＡポリメラ
−ゼなどを用いる方法を組み合わせてよいが、市販の合
成あるいはクロ−ニング用キットを用いるのが便利であ
る。このｃＤＮＡを鋳型としてイヌＩＦＮ-γの塩基配
列を基にしたプライマ−を用いてＰＣＲを行うことによ
ってイヌＩＦＮ-γの蛋白質をコ−ドするＤＮＡを得る
ことができる。
ば、塩化リチウム／尿素法、グアニジン・イソチオシア
ネ−ト法、オリゴｄＴセルロ−スカラム法等によりｍＲ
ＮＡを単離し、得られたｍＲＮＡから通常の方法、例え
ば、Ｇｕｂｌｅｒらの方法（文献８），Ｈ．Ｏｋａｙａ
ｍａらの方法（文献９）等によりｃＤＮＡを合成する。
得られたｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するには、基本的
にはトリ骨芽球ウイルス（ＡＭＶ）などの逆転写酵素な
どを用いるほか１部プライマ−を用いてＤＮＡポリメラ
−ゼなどを用いる方法を組み合わせてよいが、市販の合
成あるいはクロ−ニング用キットを用いるのが便利であ
る。このｃＤＮＡを鋳型としてイヌＩＦＮ-γの塩基配
列を基にしたプライマ−を用いてＰＣＲを行うことによ
ってイヌＩＦＮ-γの蛋白質をコ−ドするＤＮＡを得る
ことができる。
【００１８】このイヌＩＦＮ-γの蛋白質をコ−ドする
ＤＮＡをカイコのクローニングベクター（文献４）に連
結して作製した組み換え体プラスミドとカイコ核多角体
病ウイルスＤＮＡとを、カイコ樹立細胞にコトランスフ
ェクションして作製することができる。従って、組み換
え体ウイルスは、ｉｎ ｖｉｖｏ的な方法で作製するこ
とができる。
ＤＮＡをカイコのクローニングベクター（文献４）に連
結して作製した組み換え体プラスミドとカイコ核多角体
病ウイルスＤＮＡとを、カイコ樹立細胞にコトランスフ
ェクションして作製することができる。従って、組み換
え体ウイルスは、ｉｎ ｖｉｖｏ的な方法で作製するこ
とができる。
【００１９】すなわち、イヌＩＦＮ-γの蛋白質をコー
ドするＤＮＡ部分を、例えばｐＢＭ０３０（文献４）な
どのカイコのクローニングベクターの発現調節部分の下
流に連結するという一般的な遺伝子操作に従って組換え
体プラスミドを作製することができる。この組換え体プ
ラスミドとカイコ核多角体病ウイルスＤＮＡ（文献４）
とを、文献のような方法でカイコ樹立細胞、例えばＢＭ
−Ｎ株（文献４）にコトランスフェクションした後、培
養を続け、培養液中に出現した非組換え体（野性型）と
組換え体のウイルスの中から限界希釈法、もしくはプラ
ーク法などの一般的な方法によって組換え体ウイルスを
クローニングすることができる。組換え体ウイルスは多
角体の形成能がないことから、野性型ウイルスと容易に
区別できる。
ドするＤＮＡ部分を、例えばｐＢＭ０３０（文献４）な
どのカイコのクローニングベクターの発現調節部分の下
流に連結するという一般的な遺伝子操作に従って組換え
体プラスミドを作製することができる。この組換え体プ
ラスミドとカイコ核多角体病ウイルスＤＮＡ（文献４）
とを、文献のような方法でカイコ樹立細胞、例えばＢＭ
−Ｎ株（文献４）にコトランスフェクションした後、培
養を続け、培養液中に出現した非組換え体（野性型）と
組換え体のウイルスの中から限界希釈法、もしくはプラ
ーク法などの一般的な方法によって組換え体ウイルスを
クローニングすることができる。組換え体ウイルスは多
角体の形成能がないことから、野性型ウイルスと容易に
区別できる。
【００２０】有用蛋白質の生産は、前記の組換えカイコ
核多角体ウイルスをカイコ樹立細胞中、またはカイコ生
体中で増殖させることにより行なう。
核多角体ウイルスをカイコ樹立細胞中、またはカイコ生
体中で増殖させることにより行なう。
【００２１】カイコ樹立細胞を用いる場合は、前記組換
え体ウイルスを含む培養液により、ＢＭ−Ｎ細胞を感染
させ、平面培養または浮遊培養により培養する。ＢＭ−
Ｎ細胞を培養する培地としては、例えば牛血清を添加し
たＴＣ−１０培地（文献１２）を使用することができ
る。培養温度は２５〜２８℃が適当である。培養後、培
溶液を遠心分離しその上清から有用蛋白質を回収する。
え体ウイルスを含む培養液により、ＢＭ−Ｎ細胞を感染
させ、平面培養または浮遊培養により培養する。ＢＭ−
Ｎ細胞を培養する培地としては、例えば牛血清を添加し
たＴＣ−１０培地（文献１２）を使用することができ
る。培養温度は２５〜２８℃が適当である。培養後、培
溶液を遠心分離しその上清から有用蛋白質を回収する。
【００２２】カイコ生体を用いる場合は、前記の組換え
体ウイルスを含む培養液をカイコ幼虫に注射して、クワ
の葉または合成飼料を与えて飼育する。飼育後、カイコ
を切開し得られた体液から有用蛋白質を回収する。
体ウイルスを含む培養液をカイコ幼虫に注射して、クワ
の葉または合成飼料を与えて飼育する。飼育後、カイコ
を切開し得られた体液から有用蛋白質を回収する。
【００２３】組換えバキュロウイルスの不活性化に使用
する４級アンモニウム塩としては、アルキルトリメチル
アンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、
アルキルジメチルベンジルアンモニウム塩、アルキルピ
リジニウム塩、アシルアミノプロピルジメチルベンジル
アンモニウム塩などを用いることができるが、具体的に
は、経済性または安全性の観点から、例えば塩化ベンザ
ルコニウム、塩化ベンゼトニウムが好適に使用される。
する４級アンモニウム塩としては、アルキルトリメチル
アンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、
アルキルジメチルベンジルアンモニウム塩、アルキルピ
リジニウム塩、アシルアミノプロピルジメチルベンジル
アンモニウム塩などを用いることができるが、具体的に
は、経済性または安全性の観点から、例えば塩化ベンザ
ルコニウム、塩化ベンゼトニウムが好適に使用される。
【００２４】使用される４級アンモニウム塩の濃度は、
組換えバキュロウイルスの不活性化に十分で、かつ、目
的とする有用蛋白質の活性を低下させない濃度であれば
よく、例えば、終濃度で組換えバキュロウイルスを感染
させた昆虫培養細胞の培養上清、または、組換えバキュ
ロウイルスを感染させたカイコ幼虫の体液に対して０.
０１重量％以上が好適に用いられる。しかし、過度に高
濃度の４級アンモニウム塩を使用することは、経済的に
不利であるばかりでなく、目的とする有用蛋白質の精製
を困難とする場合がある。通常、０.５重量％以下の濃
度の４級アンモニウム塩による処理が、有用蛋白質の生
産において良い結果をもたらす。
組換えバキュロウイルスの不活性化に十分で、かつ、目
的とする有用蛋白質の活性を低下させない濃度であれば
よく、例えば、終濃度で組換えバキュロウイルスを感染
させた昆虫培養細胞の培養上清、または、組換えバキュ
ロウイルスを感染させたカイコ幼虫の体液に対して０.
０１重量％以上が好適に用いられる。しかし、過度に高
濃度の４級アンモニウム塩を使用することは、経済的に
不利であるばかりでなく、目的とする有用蛋白質の精製
を困難とする場合がある。通常、０.５重量％以下の濃
度の４級アンモニウム塩による処理が、有用蛋白質の生
産において良い結果をもたらす。
【００２５】カイコ細胞の培養上清、および、カイコ体
液を４級アンモニウム塩で処理する方法としては、カイ
コ細胞の培養上清またはカイコ体液に４級アンモニウム
塩を添加する方法、もしくは、４級アンモニウム塩水溶
液にカイコ細胞の培養上清またはカイコ体液を添加する
方法、もしくは、切開したカイコを直接４級アンモニウ
ム塩水溶液に浸漬する方法などが可能であるが、いずれ
の方法によっても同様な効果が得られる。また、４級ア
ンモニウム塩による処理温度、処理時間は、組換えバキ
ュロウイルスが十分に不活性化される条件であればよ
く、特に制限はないが、例えば０℃から２５℃におい
て、１時間から２４時間処理することによって良好な結
果が得られる。
液を４級アンモニウム塩で処理する方法としては、カイ
コ細胞の培養上清またはカイコ体液に４級アンモニウム
塩を添加する方法、もしくは、４級アンモニウム塩水溶
液にカイコ細胞の培養上清またはカイコ体液を添加する
方法、もしくは、切開したカイコを直接４級アンモニウ
ム塩水溶液に浸漬する方法などが可能であるが、いずれ
の方法によっても同様な効果が得られる。また、４級ア
ンモニウム塩による処理温度、処理時間は、組換えバキ
ュロウイルスが十分に不活性化される条件であればよ
く、特に制限はないが、例えば０℃から２５℃におい
て、１時間から２４時間処理することによって良好な結
果が得られる。
【００２６】こうして遺伝子組み換え技術によって製造
された有用蛋白質を単離・精製するための方法に特に限
定はなく、通常の蛋白質の精製方法を用いることができ
る。例えば、目的とする有用蛋白質が本来有する活性を
指標としながら、シリカゲル担体、イオン交換性担体、
ゲル濾過担体、キレート性担体、色素担持担体等を用い
たクロマトグラフィーや、限外濾過、ゲル濾過、透析、
塩析等による脱塩、濃縮を組み合わせることによって精
製し単離することができる。
された有用蛋白質を単離・精製するための方法に特に限
定はなく、通常の蛋白質の精製方法を用いることができ
る。例えば、目的とする有用蛋白質が本来有する活性を
指標としながら、シリカゲル担体、イオン交換性担体、
ゲル濾過担体、キレート性担体、色素担持担体等を用い
たクロマトグラフィーや、限外濾過、ゲル濾過、透析、
塩析等による脱塩、濃縮を組み合わせることによって精
製し単離することができる。
【００２７】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明の範囲がこれに限定されるもので
はない。
に説明するが、本発明の範囲がこれに限定されるもので
はない。
【００２８】参考例１ ＜イヌＩＦＮ-γをコードするＤＮＡを導入した組換え
カイコ核多核体病ウイルスの作成＞ （１）イヌｃＤＮＡの調製 イヌ末梢血よりリンパ球を分離し、フィトヘムアグルチ
ニン（ＰＨＡ）を５０μｇ／ｍｌの終濃度で４８時間刺
激した。刺激後、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジ−ン社）を
用いて総ＲＮＡを調製した。得られたＲＮＡを１ｍＭ
ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）（以下ＴＥと略する。）に溶解し、７０℃で５分間
処理した後、１Ｍ ＬｉＣｌを含むＴＥを同量加えた。
０．５ＭＬｉＣｌを含むＴＥで平衡化したオリゴｄＴセ
ルロ−スカラムにＲＮＡ溶液をアプライし、同緩衝液に
て洗浄した。さらに０．３Ｍ ＬｉＣｌを含むＴＥにて
洗浄後、０．０１％ ＳＤＳを含む２ｍＭ ＥＤＴＡ
（ｐＨ７．０）で吸着したポリ（Ａ）ＲＮＡを溶出し
た。こうして得られたポリ（Ａ）ＲＮＡを用いて一本鎖
ｃＤＮＡを合成した。すなわち、滅菌した０．５ｍｌの
ミクロ遠心チュ−ブに５μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡと０．
５μｇのオリゴｄＴプライマ−（１２−１８ｍｅｒ）を
入れ、ジエチルピロカルボネ−ト処理滅菌水を加えて１
２μｌにし、７０℃で１０分間インキュベ−トしたのち
氷中に１分間つけた。これに２００ｍＭトリス塩酸（ｐ
Ｈ８．４），５００ｍＭ ＫＣｌ溶液を２μｌ，２５ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2 を２μｌ，１０ｍＭ ｄＮＴＰを１μｌ
および０．１Ｍ ＤＴＴを２μｌそれぞれ加え、４２℃
で５分間インキュベ−トしたのち、２００ユニットのＧ
ｉｂｃｏＢＲＬ社製ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒ
Ｔを１μｌ加え、４２℃でさらに５０分間インキュベ−
トしてｃＤＮＡ合成反応を行った。さらに７０℃で１５
分間インキュベ−トして反応を停止し、氷上に５分間置
いた。この反応液に１μｌのＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅ
Ｈ（２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を加え、３７℃で２０分間イ
ンキュベ−トした。
カイコ核多核体病ウイルスの作成＞ （１）イヌｃＤＮＡの調製 イヌ末梢血よりリンパ球を分離し、フィトヘムアグルチ
ニン（ＰＨＡ）を５０μｇ／ｍｌの終濃度で４８時間刺
激した。刺激後、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジ−ン社）を
用いて総ＲＮＡを調製した。得られたＲＮＡを１ｍＭ
ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）（以下ＴＥと略する。）に溶解し、７０℃で５分間
処理した後、１Ｍ ＬｉＣｌを含むＴＥを同量加えた。
０．５ＭＬｉＣｌを含むＴＥで平衡化したオリゴｄＴセ
ルロ−スカラムにＲＮＡ溶液をアプライし、同緩衝液に
て洗浄した。さらに０．３Ｍ ＬｉＣｌを含むＴＥにて
洗浄後、０．０１％ ＳＤＳを含む２ｍＭ ＥＤＴＡ
（ｐＨ７．０）で吸着したポリ（Ａ）ＲＮＡを溶出し
た。こうして得られたポリ（Ａ）ＲＮＡを用いて一本鎖
ｃＤＮＡを合成した。すなわち、滅菌した０．５ｍｌの
ミクロ遠心チュ−ブに５μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡと０．
５μｇのオリゴｄＴプライマ−（１２−１８ｍｅｒ）を
入れ、ジエチルピロカルボネ−ト処理滅菌水を加えて１
２μｌにし、７０℃で１０分間インキュベ−トしたのち
氷中に１分間つけた。これに２００ｍＭトリス塩酸（ｐ
Ｈ８．４），５００ｍＭ ＫＣｌ溶液を２μｌ，２５ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2 を２μｌ，１０ｍＭ ｄＮＴＰを１μｌ
および０．１Ｍ ＤＴＴを２μｌそれぞれ加え、４２℃
で５分間インキュベ−トしたのち、２００ユニットのＧ
ｉｂｃｏＢＲＬ社製ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒ
Ｔを１μｌ加え、４２℃でさらに５０分間インキュベ−
トしてｃＤＮＡ合成反応を行った。さらに７０℃で１５
分間インキュベ−トして反応を停止し、氷上に５分間置
いた。この反応液に１μｌのＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅ
Ｈ（２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を加え、３７℃で２０分間イ
ンキュベ−トした。
【００２９】（２）イヌＩＦＮ-γ遺伝子の調製 イヌＩＦＮ-γのＮ末端およびＣ末端の塩基配列（文献
５）をもとに、５´ＧＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＴＴＡ
ＴＡＣＡＧＣＴＡＴＡＴＣＴＴＡＧＣＴ３´ （配列番
号１）と５´ＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＴＣＧＡＴＧ
ＣＴＣＴＧＣＧＧＣＣＴＣＧＡＡＡ３´（配列番号２）
の２種類の末端にＥｃｏＲＩ切断部位を付加したプライ
マ−をＤＮＡシンセサイザ−にて合成した。上記（１）
で得られたｃＤＮＡを０．５ｍｌのミクロ遠心チュ−ブ
に２μｌづつ取り、各プライマ−を２０ｐｍｏｌ，２０
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）、１．５ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2 、２５ｍＭ ＫＣｌ，１００μｇ／ｍｌ ゼラ
チン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、４単位 Ｔａｑ ＤＮＡポ
リメラ−ゼとなるように各試薬を加え、全量１００μｌ
とする。ＤＮＡの変性条件を９４℃，１分、プライマ−
のアニ−リング条件を５５℃、２分、プライマ−の伸長
条件を７２℃、３分の各条件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅ
ｒ Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡサ−マルサイクラ−を用い、
３０サイクル反応させた。これを１％アガロ−スゲルに
て電気泳動し、約５６０ｂｐのＤＮＡ断片を常法（文献
１０）に従って調製した。このＤＮＡ断片をＩｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ社のＴ−ＶｅｃｔｏｒにＴＡＫＡＲＡ社のＤ
ＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１を用いて
１６℃、２時間反応を行い、連結した。これを用いて常
法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体より
プラスミドＤＮＡを常法に従い調製した。次にこのプラ
スミドにＰＣＲ断片が挿入されていることを前述と同じ
条件のＰＣＲによって確認し、Ｇｅｎｅｓｉｓ ２００
０ ＤＮＡ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ（デュポ
ン社）を用いて、ダイデオキシ法（文献１１）でイヌＩ
ＦＮ-γＤＮＡの塩基配列を確認した。
５）をもとに、５´ＧＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＴＴＡ
ＴＡＣＡＧＣＴＡＴＡＴＣＴＴＡＧＣＴ３´ （配列番
号１）と５´ＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＴＣＧＡＴＧ
ＣＴＣＴＧＣＧＧＣＣＴＣＧＡＡＡ３´（配列番号２）
の２種類の末端にＥｃｏＲＩ切断部位を付加したプライ
マ−をＤＮＡシンセサイザ−にて合成した。上記（１）
で得られたｃＤＮＡを０．５ｍｌのミクロ遠心チュ−ブ
に２μｌづつ取り、各プライマ−を２０ｐｍｏｌ，２０
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）、１．５ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2 、２５ｍＭ ＫＣｌ，１００μｇ／ｍｌ ゼラ
チン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、４単位 Ｔａｑ ＤＮＡポ
リメラ−ゼとなるように各試薬を加え、全量１００μｌ
とする。ＤＮＡの変性条件を９４℃，１分、プライマ−
のアニ−リング条件を５５℃、２分、プライマ−の伸長
条件を７２℃、３分の各条件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅ
ｒ Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡサ−マルサイクラ−を用い、
３０サイクル反応させた。これを１％アガロ−スゲルに
て電気泳動し、約５６０ｂｐのＤＮＡ断片を常法（文献
１０）に従って調製した。このＤＮＡ断片をＩｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ社のＴ−ＶｅｃｔｏｒにＴＡＫＡＲＡ社のＤ
ＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１を用いて
１６℃、２時間反応を行い、連結した。これを用いて常
法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体より
プラスミドＤＮＡを常法に従い調製した。次にこのプラ
スミドにＰＣＲ断片が挿入されていることを前述と同じ
条件のＰＣＲによって確認し、Ｇｅｎｅｓｉｓ ２００
０ ＤＮＡ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ（デュポ
ン社）を用いて、ダイデオキシ法（文献１１）でイヌＩ
ＦＮ-γＤＮＡの塩基配列を確認した。
【００３０】（３）カイコ発現用プラスミドの作製 ベクターｐＢＭ０３０（文献４）１μｇを３０ユニット
の制限酵素ＥｃｏＲＩで３７℃、１６時間消化した後、
１ユニットのバクテリア由来アルカリホスファターゼで
末端を脱リン酸化した。これを１％アガロ−スゲルにて
電気泳動し、約１１．３ＫｂのＤＮＡ断片を常法に従い
調製した。
の制限酵素ＥｃｏＲＩで３７℃、１６時間消化した後、
１ユニットのバクテリア由来アルカリホスファターゼで
末端を脱リン酸化した。これを１％アガロ−スゲルにて
電気泳動し、約１１．３ＫｂのＤＮＡ断片を常法に従い
調製した。
【００３１】ＴＡＫＡＲＡ社のＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏ
ｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１を用いて、１６℃、１６時間ラ
イゲ−ション反応を行い、上記のように調製した、ｐＢ
Ｍ０３０と、実施例２で調製したイヌＩＦＮ-γのＤＮ
Ａ断片を連結した。これを用いて常法に従い大腸菌ＨＢ
１０１を形質転換した。１００μｇ／ｍｌのアンピシリ
ンを含むＬＢプレート上に生育するコロニーの中から、
イヌＩＦＮ-γをコードするＤＮＡの開始コドンから２
７ｂｐまでを含むプライマー、すなわち、５’ＡＴＧＡ
ＡＴＴＡＴＡイヌＡＧＣＴＡＴＡＴＣＴＴＡＧＣＴ３’
（配列番号３）とｐＢＭ０３０のクローニングサイトＥ
ｃｏＲＩから下流の２６ｂｐのプライマー、すなわち、
５’ＡＴＣＡＡＣＡＡＣＧＣＡＣＡＧＡＡＴＣＴＡＡＣ
ＧＣＴ３’（配列番号４）の２種類のプライマーを用い
て、ＤＮＡの変性条件を９４℃，１分、プライマ−のア
ニ−リング条件を５５℃、２分、プライマ−の伸長条件
を７２℃、３分の各条件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ
Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡサ−マルサイクラ−を用い、３０
サイクルでＰＣＲを行い、約６５０ｂｐのＤＮＡ断片が
得られた、イヌＩＦＮ-γをコードするＤＮＡがｐＢＭ
０３０に正方向に組み込まれているプラスミドを得た。
この組換え体プラスミドをｐＢＭγとした。このプラス
ミドを含有する大腸菌をＥ．ｃｏｌｉ（ｐＢＭγ）と名
付けた。
ｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１を用いて、１６℃、１６時間ラ
イゲ−ション反応を行い、上記のように調製した、ｐＢ
Ｍ０３０と、実施例２で調製したイヌＩＦＮ-γのＤＮ
Ａ断片を連結した。これを用いて常法に従い大腸菌ＨＢ
１０１を形質転換した。１００μｇ／ｍｌのアンピシリ
ンを含むＬＢプレート上に生育するコロニーの中から、
イヌＩＦＮ-γをコードするＤＮＡの開始コドンから２
７ｂｐまでを含むプライマー、すなわち、５’ＡＴＧＡ
ＡＴＴＡＴＡイヌＡＧＣＴＡＴＡＴＣＴＴＡＧＣＴ３’
（配列番号３）とｐＢＭ０３０のクローニングサイトＥ
ｃｏＲＩから下流の２６ｂｐのプライマー、すなわち、
５’ＡＴＣＡＡＣＡＡＣＧＣＡＣＡＧＡＡＴＣＴＡＡＣ
ＧＣＴ３’（配列番号４）の２種類のプライマーを用い
て、ＤＮＡの変性条件を９４℃，１分、プライマ−のア
ニ−リング条件を５５℃、２分、プライマ−の伸長条件
を７２℃、３分の各条件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ
Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡサ−マルサイクラ−を用い、３０
サイクルでＰＣＲを行い、約６５０ｂｐのＤＮＡ断片が
得られた、イヌＩＦＮ-γをコードするＤＮＡがｐＢＭ
０３０に正方向に組み込まれているプラスミドを得た。
この組換え体プラスミドをｐＢＭγとした。このプラス
ミドを含有する大腸菌をＥ．ｃｏｌｉ（ｐＢＭγ）と名
付けた。
【００３２】（４）イヌＩＦＮ-γをコードするＤＮＡ
で組換えられた組換えカイコ核多角体病ウイルスの作製 参考文献４の方法で組換えウイルスを作製した。すなわ
ち、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．１）、
０.２８Ｍ ＮａＣｌ、０.７ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、０.
７ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4からなる２.５ｍｌの溶液に、２.
５ｍｌのＤＮＡ混合液（０.２５Ｍ ＣａＣｌ2、カイコ
核多角体病ウイルスＢｍＮＰＶ Ｔ３株（文献４）のＤ
ＮＡ１０μｇ、組換え体プラスミドｐＢＭγのＤＮＡ６
５μｇを含む）を滴下し、生じた懸濁液０．５ｍｌを５
ｍｌの１０％ＦＢＳを添加したＴＣ−１０培地（文献１
３）中、２５ｃｍ2のフラスコで平面培養した約３×１
０5個のＢｍＮ細胞の培養基に加え、カイコ細胞にＤＮ
Ａを導入した。２０時間後、新鮮な培地と交換し、さら
に７日間培養後、培養液を回収した。その培養液を遠心
して清澄化した上清を希釈して平面に培養したＢＭ−Ｎ
細胞の培養基に添加して８日間培養後、顕微鏡観察によ
りウイルス感染が見られ、かつ多角体が形成していない
培養基を選択した（限界希釈法）。
で組換えられた組換えカイコ核多角体病ウイルスの作製 参考文献４の方法で組換えウイルスを作製した。すなわ
ち、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．１）、
０.２８Ｍ ＮａＣｌ、０.７ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、０.
７ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4からなる２.５ｍｌの溶液に、２.
５ｍｌのＤＮＡ混合液（０.２５Ｍ ＣａＣｌ2、カイコ
核多角体病ウイルスＢｍＮＰＶ Ｔ３株（文献４）のＤ
ＮＡ１０μｇ、組換え体プラスミドｐＢＭγのＤＮＡ６
５μｇを含む）を滴下し、生じた懸濁液０．５ｍｌを５
ｍｌの１０％ＦＢＳを添加したＴＣ−１０培地（文献１
３）中、２５ｃｍ2のフラスコで平面培養した約３×１
０5個のＢｍＮ細胞の培養基に加え、カイコ細胞にＤＮ
Ａを導入した。２０時間後、新鮮な培地と交換し、さら
に７日間培養後、培養液を回収した。その培養液を遠心
して清澄化した上清を希釈して平面に培養したＢＭ−Ｎ
細胞の培養基に添加して８日間培養後、顕微鏡観察によ
りウイルス感染が見られ、かつ多角体が形成していない
培養基を選択した（限界希釈法）。
【００３３】限界希釈法を７回繰り返し、組換え体ウイ
ルスをクローニングした。ここで作製したイヌＩＦＮγ
をコードするＤＮＡを含む組換えウイルスをｒＢＮＶγ
とした。
ルスをクローニングした。ここで作製したイヌＩＦＮγ
をコードするＤＮＡを含む組換えウイルスをｒＢＮＶγ
とした。
【００３４】（５）ｒＢＮＶγウイルス液の調製 ７５ｃｍ２のフラスコ底面で、１５ｍｌの１０％ＦＢＳ
を含むＴＣ−１０培地中で平面培養した約３×１０6個
のＢｍＮ細胞に、前記（４）でクローニングした組換え
体ウイルスを含むＢＭ−Ｎ細胞の培養液５０μｌをＢＭ
−Ｎ細胞に添加して、２７℃で５日間培養後、培養液を
３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、遠心上清を組
換え体ウイルス液として得た。ウイルス液を１０〜７倍
希釈し、その１ｍｌをＢＭ−Ｎ細胞の培養基に添加して
２７℃で７日間培養を続けると、顕微鏡観察によって培
養基のＢＭ−Ｎ細胞にウイルス感染が認められた。
を含むＴＣ−１０培地中で平面培養した約３×１０6個
のＢｍＮ細胞に、前記（４）でクローニングした組換え
体ウイルスを含むＢＭ−Ｎ細胞の培養液５０μｌをＢＭ
−Ｎ細胞に添加して、２７℃で５日間培養後、培養液を
３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、遠心上清を組
換え体ウイルス液として得た。ウイルス液を１０〜７倍
希釈し、その１ｍｌをＢＭ−Ｎ細胞の培養基に添加して
２７℃で７日間培養を続けると、顕微鏡観察によって培
養基のＢＭ−Ｎ細胞にウイルス感染が認められた。
【００３５】参考例２ ＜ネコＩＦＮをコードするDNAを含む組換えカイコ核多
核体病ウイルスの作成＞ （１）ネコＩＦＮをコードする遺伝子断片の調製 プラスミドpFeIFN１（特開平２−１９５８８４）から、
特開平４−２０７１９８に示された方法にしたがって、
ネコＩＦＮをコードするDNAを含む組換えカイコ核多核
体病ウイルスを作成した。すなわち、pFeIFN１から得ら
れるネコＩＦＮ遺伝子を含むSfaN1-Hinc II 断片を pUC
１８に導入した後、BamHI - HincII 断片として再度切
り出しネコＩＦＮ遺伝子とした。
核体病ウイルスの作成＞ （１）ネコＩＦＮをコードする遺伝子断片の調製 プラスミドpFeIFN１（特開平２−１９５８８４）から、
特開平４−２０７１９８に示された方法にしたがって、
ネコＩＦＮをコードするDNAを含む組換えカイコ核多核
体病ウイルスを作成した。すなわち、pFeIFN１から得ら
れるネコＩＦＮ遺伝子を含むSfaN1-Hinc II 断片を pUC
１８に導入した後、BamHI - HincII 断片として再度切
り出しネコＩＦＮ遺伝子とした。
【００３６】（２）カイコ発現用プラスミドの作製 カイコクローニングベクターｐＢＭ０３０（文献４）の
Bgl II - Hinc IIサイトに上記（ａ）のBam HI - Hinc
II 断片を挿入してプラスミドｐＹＵ８７１を得た。
Bgl II - Hinc IIサイトに上記（ａ）のBam HI - Hinc
II 断片を挿入してプラスミドｐＹＵ８７１を得た。
【００３７】（３）ネコＩＦＮをコードするＤＮＡで組
換えられた組換えカイコ核多角体病ウイルスの作製 文献４の方法で組換えウイルスを作製した。すなわち、
５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．１）、０.
２８Ｍ ＮａＣｌ、０.７ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、０.７ｍ
Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4からなる２.５ｍｌの溶液に、２.５ｍ
ｌのＤＮＡ混合液（０.２５Ｍ ＣａＣｌ２、カイコ核
多角体病ウイルスＢｍＮＰＶ Ｔ３株（文献４）のＤＮ
Ａ１０μｇ、組換え体プラスミドｐＹＵ８７１のＤＮＡ
６５μｇを含む）を滴下し、生じた懸濁液０．５ｍｌを
５ｍｌの１０％ＦＢＳを添加したＴＣ−１０培地（文献
１３）中、２５ｃｍ2のフラスコで平面培養した約３×
１０5個のＢｍＮ細胞の培養基に加え、カイコ細胞にＤ
ＮＡを導入した。２０時間後、新鮮な培地と交換し、さ
らに７日間培養後、培養液を回収した。その培養液を遠
心して清澄化した上清を希釈して平面に培養したＢＭ−
Ｎ細胞の培養基に添加して８日間培養後、顕微鏡観察に
よりウイルス感染が見られ、かつ多角体が形成していな
い培養基を選択した（限界希釈法）。
換えられた組換えカイコ核多角体病ウイルスの作製 文献４の方法で組換えウイルスを作製した。すなわち、
５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．１）、０.
２８Ｍ ＮａＣｌ、０.７ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、０.７ｍ
Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4からなる２.５ｍｌの溶液に、２.５ｍ
ｌのＤＮＡ混合液（０.２５Ｍ ＣａＣｌ２、カイコ核
多角体病ウイルスＢｍＮＰＶ Ｔ３株（文献４）のＤＮ
Ａ１０μｇ、組換え体プラスミドｐＹＵ８７１のＤＮＡ
６５μｇを含む）を滴下し、生じた懸濁液０．５ｍｌを
５ｍｌの１０％ＦＢＳを添加したＴＣ−１０培地（文献
１３）中、２５ｃｍ2のフラスコで平面培養した約３×
１０5個のＢｍＮ細胞の培養基に加え、カイコ細胞にＤ
ＮＡを導入した。２０時間後、新鮮な培地と交換し、さ
らに７日間培養後、培養液を回収した。その培養液を遠
心して清澄化した上清を希釈して平面に培養したＢＭ−
Ｎ細胞の培養基に添加して８日間培養後、顕微鏡観察に
よりウイルス感染が見られ、かつ多角体が形成していな
い培養基を選択した（限界希釈法）。
【００３８】限界希釈法を７回繰り返し、組換え体ウイ
ルスをクローニングした。ここで作製したネコＩＦＮを
コードするＤＮＡを含む組換えウイルスをｒＢＮＶ１０
０とした。
ルスをクローニングした。ここで作製したネコＩＦＮを
コードするＤＮＡを含む組換えウイルスをｒＢＮＶ１０
０とした。
【００３９】（４）ｒＢＮＶ１００ウイルス液の調製 ７５ｃｍ2のフラスコ底面で、１５ｍｌの１０％ＦＢＳ
を含むＴＣ−１０培地中で平面培養した約３×１０6個
のＢｍＮ細胞に、前記（３）でクローニングした組換え
体ウイルスｒＢＮＶ１００を含むＢＭ−Ｎ細胞の培養液
５０μｌをＢＭ−Ｎ細胞に添加して、２７℃で５日間培
養後、培養液を３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し
て、遠心上清を組換え体ウイルス液として得た。ウイル
ス液を１０〜７倍希釈し、その１ｍｌをＢＭ−Ｎ細胞の
培養基に添加して２７℃で７日間培養を続けると、顕微
鏡観察によって培養基のＢＭ−Ｎ細胞にウイルス感染が
認められた。
を含むＴＣ−１０培地中で平面培養した約３×１０6個
のＢｍＮ細胞に、前記（３）でクローニングした組換え
体ウイルスｒＢＮＶ１００を含むＢＭ−Ｎ細胞の培養液
５０μｌをＢＭ−Ｎ細胞に添加して、２７℃で５日間培
養後、培養液を３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し
て、遠心上清を組換え体ウイルス液として得た。ウイル
ス液を１０〜７倍希釈し、その１ｍｌをＢＭ−Ｎ細胞の
培養基に添加して２７℃で７日間培養を続けると、顕微
鏡観察によって培養基のＢＭ−Ｎ細胞にウイルス感染が
認められた。
【００４０】参考例３ ＜抗ウイルス活性測定法＞抗ウイルス活性は、文献１１
に従ってＣＰＥ法により測定した。測定用ウイルスとし
てＶｅｓｉｃｕｌａｒ Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒ
ｕｓを用い、感受性細胞としては、イヌＩＦＮ-γの抗
ウイルス活性を測定する場合にはイヌＭＤＣＫ（ＡＴＣ
Ｃ ＣＣＬ−３４）細胞を、また、ネコＩＦＮの抗ウイ
ルス活性を測定する場合にはネコＦＣ９（文献１４）を
用いた。すなわち、９６穴マイクロプレート上にコンフ
ルーエントとなるまで３７℃で培養されたイヌＭＤＣＫ
（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３４）細胞にイヌＩＦＮ-γを含
むサンプルの希釈液を、または、同様に３７℃でコンフ
ルーエントとなるまで培養されたネコＦＣ９細胞にネコ
ＩＦＮを含むサンプルの希釈液を加え、さらに、３７℃
で２０時間から２４時間培養し抗ウイルス活性を誘導さ
せた。ＶＳＶを加え３７℃で２４時間培養した後、生存
してマイクロプレート上に付着しているイヌＭＤＣＫ細
胞、または、ネコＦＣ９細胞を２０％ホルマリンを含む
クリスタルバイオレット染色液で染色した。マイクロプ
レート上のクリスタルバイオレットの量を５７０nm に
おける吸光度を測定することによって、細胞を５０％生
存させる時のイヌＩＦＮ-γ、または、ネコＩＦＮの量
を求め、この時のイヌＩＦＮ-γ、または、ネコＩＦＮ
の量を、抗ウイルス活性１ユニット（１Ｕ）と定義し
た。
に従ってＣＰＥ法により測定した。測定用ウイルスとし
てＶｅｓｉｃｕｌａｒ Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒ
ｕｓを用い、感受性細胞としては、イヌＩＦＮ-γの抗
ウイルス活性を測定する場合にはイヌＭＤＣＫ（ＡＴＣ
Ｃ ＣＣＬ−３４）細胞を、また、ネコＩＦＮの抗ウイ
ルス活性を測定する場合にはネコＦＣ９（文献１４）を
用いた。すなわち、９６穴マイクロプレート上にコンフ
ルーエントとなるまで３７℃で培養されたイヌＭＤＣＫ
（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３４）細胞にイヌＩＦＮ-γを含
むサンプルの希釈液を、または、同様に３７℃でコンフ
ルーエントとなるまで培養されたネコＦＣ９細胞にネコ
ＩＦＮを含むサンプルの希釈液を加え、さらに、３７℃
で２０時間から２４時間培養し抗ウイルス活性を誘導さ
せた。ＶＳＶを加え３７℃で２４時間培養した後、生存
してマイクロプレート上に付着しているイヌＭＤＣＫ細
胞、または、ネコＦＣ９細胞を２０％ホルマリンを含む
クリスタルバイオレット染色液で染色した。マイクロプ
レート上のクリスタルバイオレットの量を５７０nm に
おける吸光度を測定することによって、細胞を５０％生
存させる時のイヌＩＦＮ-γ、または、ネコＩＦＮの量
を求め、この時のイヌＩＦＮ-γ、または、ネコＩＦＮ
の量を、抗ウイルス活性１ユニット（１Ｕ）と定義し
た。
【００４１】参考例４ ＜細胞変性効果によるウイルス濃度の定量＞文献１４の
方法に従って、組換えウイルス濃度を定量した。すなわ
ち、組換えカイコ核多角体病ウイルスを感染させたカイ
コ培養細胞培養上清、または、カイコ幼虫体液を希釈
し、５×１０5個／ｍｌのＢＭ−Ｎ細胞培養液に添加し
た。２７℃で１０日間培養した後に、顕微鏡観察によっ
てＢＭ−Ｎ細胞に対する細胞変性効果を確認し、感染性
ウイルス量を算定した。感染性ウイルス量は、文献１５
に従ってＴＣＩＤ50（５０％ tissue culture infectio
us dose）を求めることによって決定した。
方法に従って、組換えウイルス濃度を定量した。すなわ
ち、組換えカイコ核多角体病ウイルスを感染させたカイ
コ培養細胞培養上清、または、カイコ幼虫体液を希釈
し、５×１０5個／ｍｌのＢＭ−Ｎ細胞培養液に添加し
た。２７℃で１０日間培養した後に、顕微鏡観察によっ
てＢＭ−Ｎ細胞に対する細胞変性効果を確認し、感染性
ウイルス量を算定した。感染性ウイルス量は、文献１５
に従ってＴＣＩＤ50（５０％ tissue culture infectio
us dose）を求めることによって決定した。
【００４２】実施例１ ＜カイコ樹立細胞でのイヌＩＦＮ-γの生産と塩化ベン
ザルコニウムによる組換えカイコ核多角体病ウイルスの
不活性化＞前記参考例１で得た組換え体ｒＢＮＶγウイ
ルス液 ０.５ｍｌを、１０％ＦＢＳを含むＴＣ−１００
培地（フナコシ製）中で平面培養した約３×１０6個の
ＢＭ−Ｎ細胞に加えた。３０分後、新鮮な５ｍｌの１０
％ＦＢＳを含むＴＣ−１０培地と交換し、２７℃でさら
に３日間培養した。得られた培養液の遠心上清に、終濃
度でそれぞれ０％、０.０１％、０.０２％の塩化ベンザ
ルコニウムを添加し、４℃で２０時間静置した後、５０
００rpmで遠心分離を行い上清を得た。得られた上清の
抗ウイルス活性、蛋白濃度、感染性の組換えカイコ核多
角体病ウイルス量を調べた結果を表１に示した。
ザルコニウムによる組換えカイコ核多角体病ウイルスの
不活性化＞前記参考例１で得た組換え体ｒＢＮＶγウイ
ルス液 ０.５ｍｌを、１０％ＦＢＳを含むＴＣ−１００
培地（フナコシ製）中で平面培養した約３×１０6個の
ＢＭ−Ｎ細胞に加えた。３０分後、新鮮な５ｍｌの１０
％ＦＢＳを含むＴＣ−１０培地と交換し、２７℃でさら
に３日間培養した。得られた培養液の遠心上清に、終濃
度でそれぞれ０％、０.０１％、０.０２％の塩化ベンザ
ルコニウムを添加し、４℃で２０時間静置した後、５０
００rpmで遠心分離を行い上清を得た。得られた上清の
抗ウイルス活性、蛋白濃度、感染性の組換えカイコ核多
角体病ウイルス量を調べた結果を表１に示した。
【００４３】
【表１】
【００４４】この結果から、０.０１％以上の塩化ベン
ザルコニウム処理によって、組換えカイコ核多角体病ウ
イルスが不活性化されたことがわかる。また、塩化ベン
ザルコニウム処理した後も、抗ウイルス活性は十分に保
持されており、検討した濃度では、塩化ベンザルコニウ
ムによってイヌＩＦＮ-γは変性しないことがわかる。
さらに、塩化ベンザルコニウム処理によって、抗ウイル
ス活性の比活性が向上した。すなわち塩化ベンザルコニ
ウム処理によって夾雑蛋白質が除去されることから、イ
ヌＩＦＮ-γの精製が容易になる。
ザルコニウム処理によって、組換えカイコ核多角体病ウ
イルスが不活性化されたことがわかる。また、塩化ベン
ザルコニウム処理した後も、抗ウイルス活性は十分に保
持されており、検討した濃度では、塩化ベンザルコニウ
ムによってイヌＩＦＮ-γは変性しないことがわかる。
さらに、塩化ベンザルコニウム処理によって、抗ウイル
ス活性の比活性が向上した。すなわち塩化ベンザルコニ
ウム処理によって夾雑蛋白質が除去されることから、イ
ヌＩＦＮ-γの精製が容易になる。
【００４５】実施例２ ＜カイコ生体中でのイヌＩＦＮ-γの生産と塩化ベンザ
ルコニウムによる組換えカイコ核多角体病ウイルスの不
活性化＞５令２日目のカイコ幼虫に、参考例１の（５）
で得た組換え体ウイルスのウイルス液を２μｌ／頭注射
し、２５℃で４日間、市販の人工飼料（カネボウシルク
エレガンス社製）を与えて飼育した。１０頭のカイコの
腹部を切り、０％、０.０１％、または、０.０２％の塩
化ベンザルコニウムを含む１００ｍｌの５０ｍＭ酢酸バ
ッファー（ｐＨ３. ５）に浸漬し、４℃で２０時間保持
した。得られたカイコ体液抽出液を５,０００ｒｐｍ、
１５分間遠心分離し上清を回収した。得られた上清の抗
ウイルス活性、蛋白濃度、感染性の組換えカイコ核多角
体病ウイルス量を調べた結果を表２に示した。
ルコニウムによる組換えカイコ核多角体病ウイルスの不
活性化＞５令２日目のカイコ幼虫に、参考例１の（５）
で得た組換え体ウイルスのウイルス液を２μｌ／頭注射
し、２５℃で４日間、市販の人工飼料（カネボウシルク
エレガンス社製）を与えて飼育した。１０頭のカイコの
腹部を切り、０％、０.０１％、または、０.０２％の塩
化ベンザルコニウムを含む１００ｍｌの５０ｍＭ酢酸バ
ッファー（ｐＨ３. ５）に浸漬し、４℃で２０時間保持
した。得られたカイコ体液抽出液を５,０００ｒｐｍ、
１５分間遠心分離し上清を回収した。得られた上清の抗
ウイルス活性、蛋白濃度、感染性の組換えカイコ核多角
体病ウイルス量を調べた結果を表２に示した。
【００４６】
【表２】
【００４７】この結果から、０.０１％以上の塩化ベン
ザルコニウム処理によって、組換えカイコ核多角体病ウ
イルスが不活性化されたことがわかる。また、塩化ベン
ザルコニウム処理した後も、抗ウイルス活性は十分に保
持されており、検討した濃度では、塩化ベンザルコニウ
ムによってイヌＩＦＮ-γは変性しないことがわかる。
さらに、塩化ベンザルコニウム処理によって、抗ウイル
ス活性の比活性が向上した。すなわち塩化ベンザルコニ
ウム処理によって夾雑蛋白質が除去されることから、イ
ヌＩＦＮ-γの精製が容易になる。
ザルコニウム処理によって、組換えカイコ核多角体病ウ
イルスが不活性化されたことがわかる。また、塩化ベン
ザルコニウム処理した後も、抗ウイルス活性は十分に保
持されており、検討した濃度では、塩化ベンザルコニウ
ムによってイヌＩＦＮ-γは変性しないことがわかる。
さらに、塩化ベンザルコニウム処理によって、抗ウイル
ス活性の比活性が向上した。すなわち塩化ベンザルコニ
ウム処理によって夾雑蛋白質が除去されることから、イ
ヌＩＦＮ-γの精製が容易になる。
【００４８】実施例３ ＜塩化ベンゼントニウムによる組換えカイコ核多角体病
ウイルスの不活性化＞５令２日目のカイコ幼虫に、参考
例１の（５）で得た組換え体ウイルスのウイルス液を２
μｌ／頭注射し、２５℃で４日間、市販の人工飼料（カ
ネボウシルクエレガンス社製）を与えて飼育した。１０
頭のカイコの腹部を切り、０％、０.０１％、または、
０.０２％の塩化ベンゼトニウムを含む１００ｍｌの５
０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ３. ５）に浸漬し、４℃で
２０時間保持した。得られたカイコ体液抽出液を５,０
００ｒｐｍ、１５分間遠心分離し上清を回収した。得ら
れた上清の感染性の組換えカイコ核多角体病ウイルス量
を調べた結果を表３に示した。
ウイルスの不活性化＞５令２日目のカイコ幼虫に、参考
例１の（５）で得た組換え体ウイルスのウイルス液を２
μｌ／頭注射し、２５℃で４日間、市販の人工飼料（カ
ネボウシルクエレガンス社製）を与えて飼育した。１０
頭のカイコの腹部を切り、０％、０.０１％、または、
０.０２％の塩化ベンゼトニウムを含む１００ｍｌの５
０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ３. ５）に浸漬し、４℃で
２０時間保持した。得られたカイコ体液抽出液を５,０
００ｒｐｍ、１５分間遠心分離し上清を回収した。得ら
れた上清の感染性の組換えカイコ核多角体病ウイルス量
を調べた結果を表３に示した。
【００４９】
【表３】
【００５０】表３から明らかなように、０.０１％以上
の塩化ベンゼトニウム処理によって、組換えカイコ核多
角体病ウイルスが不活性化されたことが分かる。
の塩化ベンゼトニウム処理によって、組換えカイコ核多
角体病ウイルスが不活性化されたことが分かる。
【００５１】実施例４ ＜カイコ樹立細胞でのネコＩＦＮの生産と塩化ベンザル
コニウムによる組換えカイコ核多角体病ウイルスの不活
性化＞前記参考例２で得た組換え体ｒＢＮＶ１００ウイ
ルス液 ０.５ｍｌを、１０％ＦＢＳを含むＴＣ−１００
培地（フナコシ製）中で平面培養した約３×１０6個の
ＢＭ−Ｎ細胞に加えた。３０分後、新鮮な５ｍｌの１０
％ＦＢＳを含むＴＣ−１０培地と交換し、２７℃でさら
に３日間培養した。得られた培養液の遠心上清に、終濃
度でそれぞれ０％、０.０１％、０.０２％の塩化ベンザ
ルコニウムを添加し、４℃で２０時間静置した後、５０
００rpmで遠心分離を行い上清を得た。得られた上清の
抗ウイルス活性、蛋白濃度、感染性の組換えカイコ核多
角体病ウイルス量を調べた結果を表４に示した。
コニウムによる組換えカイコ核多角体病ウイルスの不活
性化＞前記参考例２で得た組換え体ｒＢＮＶ１００ウイ
ルス液 ０.５ｍｌを、１０％ＦＢＳを含むＴＣ−１００
培地（フナコシ製）中で平面培養した約３×１０6個の
ＢＭ−Ｎ細胞に加えた。３０分後、新鮮な５ｍｌの１０
％ＦＢＳを含むＴＣ−１０培地と交換し、２７℃でさら
に３日間培養した。得られた培養液の遠心上清に、終濃
度でそれぞれ０％、０.０１％、０.０２％の塩化ベンザ
ルコニウムを添加し、４℃で２０時間静置した後、５０
００rpmで遠心分離を行い上清を得た。得られた上清の
抗ウイルス活性、蛋白濃度、感染性の組換えカイコ核多
角体病ウイルス量を調べた結果を表４に示した。
【００５２】
【表４】
【００５３】この結果から、０.０１％以上の塩化ベン
ザルコニウム処理によって、組換えカイコ核多角体病ウ
イルスが不活性化されたことがわかる。また、塩化ベン
ザルコニウム処理した後も、抗ウイルス活性は十分に保
持されており、検討した濃度では、塩化ベンザルコニウ
ムによってネコＩＦＮは変性しないことがわかる。さら
に、塩化ベンザルコニウム処理によって、抗ウイルス活
性の比活性が向上した。すなわち塩化ベンザルコニウム
処理によって夾雑蛋白質が除去されることから、ネコＩ
ＦＮの精製が容易になる。
ザルコニウム処理によって、組換えカイコ核多角体病ウ
イルスが不活性化されたことがわかる。また、塩化ベン
ザルコニウム処理した後も、抗ウイルス活性は十分に保
持されており、検討した濃度では、塩化ベンザルコニウ
ムによってネコＩＦＮは変性しないことがわかる。さら
に、塩化ベンザルコニウム処理によって、抗ウイルス活
性の比活性が向上した。すなわち塩化ベンザルコニウム
処理によって夾雑蛋白質が除去されることから、ネコＩ
ＦＮの精製が容易になる。
【００５４】実施例５ ＜カイコ生体中でのネコＩＦＮの生産と塩化ベンザルコ
ニウムによる組換えカイコ核多角体病ウイルスの不活性
化＞５令２日目のカイコ幼虫に、参考例２の（４）で得
た組換え体ウイルスのウイルス液を２μｌ／頭注射し、
２５℃で４日間、市販の人工飼料（カネボウシルクエレ
ガンス社製）を与えて飼育した。１０頭のカイコの腹部
を切り、０％、０.０１％、または、０.０２％の塩化ベ
ンザルコニウムを含む１００ｍｌの５０ｍＭ酢酸バッフ
ァー（ｐＨ３. ５）に浸漬し、４℃で２０時間保持し
た。得られたカイコ体液抽出液を５,０００ｒｐｍ、１
５分間遠心分離し上清を回収した。得られた上清の抗ウ
イルス活性、蛋白濃度、感染性の組換えカイコ核多角体
病ウイルス量を調べた結果を表５に示した。
ニウムによる組換えカイコ核多角体病ウイルスの不活性
化＞５令２日目のカイコ幼虫に、参考例２の（４）で得
た組換え体ウイルスのウイルス液を２μｌ／頭注射し、
２５℃で４日間、市販の人工飼料（カネボウシルクエレ
ガンス社製）を与えて飼育した。１０頭のカイコの腹部
を切り、０％、０.０１％、または、０.０２％の塩化ベ
ンザルコニウムを含む１００ｍｌの５０ｍＭ酢酸バッフ
ァー（ｐＨ３. ５）に浸漬し、４℃で２０時間保持し
た。得られたカイコ体液抽出液を５,０００ｒｐｍ、１
５分間遠心分離し上清を回収した。得られた上清の抗ウ
イルス活性、蛋白濃度、感染性の組換えカイコ核多角体
病ウイルス量を調べた結果を表５に示した。
【００５５】
【表５】
【００５６】この結果から、０.０１％以上の塩化ベン
ザルコニウム処理によって、組換えカイコ核多角体病ウ
イルスが不活性化されたことがわかる。また、塩化ベン
ザルコニウム処理した後も、抗ウイルス活性は十分に保
持されており、検討した濃度では、塩化ベンザルコニウ
ムによってネコＩＦＮは変性しないことがわかる。さら
に、塩化ベンザルコニウム処理によって、抗ウイルス活
性の比活性が向上した。すなわち塩化ベンザルコニウム
処理によって夾雑蛋白質が除去されることから、ネコＩ
ＦＮの精製が容易になる。
ザルコニウム処理によって、組換えカイコ核多角体病ウ
イルスが不活性化されたことがわかる。また、塩化ベン
ザルコニウム処理した後も、抗ウイルス活性は十分に保
持されており、検討した濃度では、塩化ベンザルコニウ
ムによってネコＩＦＮは変性しないことがわかる。さら
に、塩化ベンザルコニウム処理によって、抗ウイルス活
性の比活性が向上した。すなわち塩化ベンザルコニウム
処理によって夾雑蛋白質が除去されることから、ネコＩ
ＦＮの精製が容易になる。
【００５７】実施例６ ＜カイコ生体中で生産したイヌＩＦＮ-γの精製＞実施
例２により得られた塩化ベンザルコニウム処理したカイ
コ体液抽出物（イヌＩＦＮ-γ活性：４.０×１０６U／
ｍｌ、比活性５.６×１０５U／ｍｇ蛋白質）を材料とし
て精製を行った。このカイコ抽出液２５０ｍｌを、担体
量２０ｍｌの"スルホプロピルセファロース（ハイパフ
ォーマンスタイプ）"にかけ、２０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７.０）２００ｍｌで洗浄後、塩化ナトリウムの
直線的な濃度勾配により吸着物を溶出し、抗ウイルス活
性画分を集めて、イヌＩＦＮ-γを回収した。この画分
は４.９×１０6U／ｍｌのイヌＩＦＮ-γ活性を含み、比
活性は３.０×１０7U／ｍｇであった。この時のイヌＩ
ＦＮ-γ活性の回収率は８８％であり、比活性は５４倍
に向上した。
例２により得られた塩化ベンザルコニウム処理したカイ
コ体液抽出物（イヌＩＦＮ-γ活性：４.０×１０６U／
ｍｌ、比活性５.６×１０５U／ｍｇ蛋白質）を材料とし
て精製を行った。このカイコ抽出液２５０ｍｌを、担体
量２０ｍｌの"スルホプロピルセファロース（ハイパフ
ォーマンスタイプ）"にかけ、２０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７.０）２００ｍｌで洗浄後、塩化ナトリウムの
直線的な濃度勾配により吸着物を溶出し、抗ウイルス活
性画分を集めて、イヌＩＦＮ-γを回収した。この画分
は４.９×１０6U／ｍｌのイヌＩＦＮ-γ活性を含み、比
活性は３.０×１０7U／ｍｇであった。この時のイヌＩ
ＦＮ-γ活性の回収率は８８％であり、比活性は５４倍
に向上した。
【００５８】実施例７ ＜カイコ生体中で生産したネコＩＦＮの精製＞実施例５
により得られた塩化ベンザルコニウム処理したカイコ体
液抽出物（ネコＩＦＮ活性：２.０×１０6U／ｍｌ、比
活性：５.６×１０5U／ｍｇ蛋白質）を材料として精製
を行った。このカイコ抽出液５００ｍｌを、担体量３０
ｍｌの"ブルーセファロース（ファストフロータイプ）"
にかけ、続いてこのカラムを０.５Ｍ塩化ナトリウムを
含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８.０）５００ｍｌで
溶出した。溶出液は、１.９×１０6U／ｍｌのネコＩＦ
Ｎ活性を含み、比活性は４.４×１０7U／ｍｇ蛋白質で
あった。この時のネコＩＦＮ活性の回収率は９３％であ
り、比活性は８０倍に向上した。
により得られた塩化ベンザルコニウム処理したカイコ体
液抽出物（ネコＩＦＮ活性：２.０×１０6U／ｍｌ、比
活性：５.６×１０5U／ｍｇ蛋白質）を材料として精製
を行った。このカイコ抽出液５００ｍｌを、担体量３０
ｍｌの"ブルーセファロース（ファストフロータイプ）"
にかけ、続いてこのカラムを０.５Ｍ塩化ナトリウムを
含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８.０）５００ｍｌで
溶出した。溶出液は、１.９×１０6U／ｍｌのネコＩＦ
Ｎ活性を含み、比活性は４.４×１０7U／ｍｇ蛋白質で
あった。この時のネコＩＦＮ活性の回収率は９３％であ
り、比活性は８０倍に向上した。
【００５９】
【発明の効果】組換えバキュロウイルスを用いた有用蛋
白質の製造において、組換えバキュロウイルスの不活性
化が幅広い有用蛋白質の製造において可能となり、か
つ、目的とする有用蛋白質の精製が容易になる。以って
有用蛋白質の量産化を可能とし、高純度かつ安価な医薬
品（抗腫瘍・抗ウイルス剤等）の製造が可能となる。
白質の製造において、組換えバキュロウイルスの不活性
化が幅広い有用蛋白質の製造において可能となり、か
つ、目的とする有用蛋白質の精製が容易になる。以って
有用蛋白質の量産化を可能とし、高純度かつ安価な医薬
品（抗腫瘍・抗ウイルス剤等）の製造が可能となる。
【００６０】参考文献 １．Ｓ．Ｗａｔａｎａｂｅら：Ｊａｐａｎ Ｊ．Ｅｘ
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ｏｇｙ，１７９，４５６−４７３（１９８９）
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ｉ，１６，５０５−５０８（１９８８） ３．Ｍ．Ｗａｔａｎａｂｅら：日本蚕糸学雑誌，３７，
２１３−２１８（１９６８） ４．Ｔ．Ｈｏｒｉｕｃｈｉら：Ａｇｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．，５１，１５７３−１５８０，（１９８７）． ５．Ｄｅｖｏｓら：Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ
ｅｒｃｈ，１２，９５−１０２（１９９２）． ６．Ｃｈｉｒｇｗｉｎら：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、
１８、５２９４（１９７９）． ７．Ｂｅｒｇｅｒら：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１
８，５１４３（１９７９）． ８．Ｇｕｂｌｅｒら：Ｇｅｅｎ．２５，２３６−２６９
（１９８３）． ９．Ｏｋａｙａｍａら：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，２，１６１，（１９８２）＆ ３，２８０，（１
９８３）． １０．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒ
ｙ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．１９８２． １１．Ｐｒｏｂｅｒら：Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８，３
３６−３４１（１９８７）． １２．日本生化学会編：続生化学実験講座第５巻、（１
９８６）．Ｐ２５０−２５６、東京化学同人． １３．G. R. Ｇａｒｄｉｎｅｒら：Ｊ．Ｉｎｖｅｒｔｅ
ｂｒａｔｅ Ｐｈａｔｈｏｌ．２５，３６３−３７０
（１９７５） １４．Ｊ．Ｋ．Ｙａｍａｍｏｔｏら：Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏ ｐａｔｈｏｌ．，１
１，１−１９（１９８６） １５．モダンバイオロジーシリーズ２３、動物組織培養
法（１９７６）Ｐ２９６−３００、共立出版 １６．Ｉｊｚｅｒｍａｎｎｓら：Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ，１７９，４５６−４７３（１９８９）
【００６１】
配列番号：１ 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GAATTCATGAATTATACAAGCTATATCTTAGC
【００６２】配列番号：２ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GCGAATTCTTATTTCGATGCTCTGCGGCCTCGAAA
【００６３】配列番号：３ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ATGAATTATACAAGCTATATCTTAGCT
【００６４】配列番号：４ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ATCAACAACGCACAGAATCTAACGCT
【００６５】配列番号：5 配列の長さ：501 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：イヌ 配列の特徴 特徴を表わす記号：sig peptide 存在位置：1..72 特徴を決定した方法：S 特徴を表わす記号：mat peptide 存在位置：73..498 特徴を決定した方法：S 配列 ATG AAT TAT ACA AGC TAT ATC TTA GCT TTT CAG CTT TGC GTG ATT TTG 48 Met Asn Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Val Ile Leu TGT TCT TCT GGC TGT AAC TGT CAG GCC ATG TTT TTT AAA GAA ATA GAA 96 Cys Ser Ser Gly Cys Asn Cys Gln Ala Met Phe Phe Lys Glu Ile Glu AAC CTA AAG GAA TAT TTT AAT GCA AGT AAT CCA GAT GTA TCG GAC GGT 144 Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Asn Ala Ser Asn Pro Asp Val Ser Asp Gly GGG TCT CTT TTC GTA GAT ATT TTG AAG AAA TGG AGA GAG GAG AGT GAC 192 Gly Ser Leu Phe Val Asp Ile Leu Lys Lys Trp Arg Glu Glu Ser Asp AAA ACA ATC ATT CAG AGC CAA ATT GTC TCT TTC TAC TTG AAA CTG TTT 240 Lys Thr Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Leu Lys Leu Phe GAC AAC TTT AAA GAT AAC CAG ATC ATT CAA AGG AGC ATG GAT ACC ATC 288 Asp Asn Phe Lys Asp Asn Gln Ile Ile Gln Arg Ser Met Asp Thr Ile AAG GAA GAC ATG CTT GGC AAG TTC TTA AAT TCA TCC ACC AGT AAG AGG 336 Lys Glu Asp Met Leu Gly Lys Phe Leu Asn Ser Ser Thr Ser Lys Arg GAG GAC TTC CTT AAG CTG ATT CAA ATT CCT GTG AAC GAT CTG CAG GTC 384 Glu Asp Phe Leu Lys Leu Ile Gln Ile Pro Val Asn Asp Leu Gln Val CAG CGC AAG GCG ATA AAT GAA CTC ATC AAA GTG ATG AAT GAT CTC TCA 432 Gln Arg Lys Ala Ile Asn Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser CCA AGA TCC AAC CTA AGG AAG CGG AAA AGG AGT CAG AAT CTG TTT CGA 480 Pro Arg Ser Asn Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser Gln Asn Leu Phe Arg GGC CGC AGA GCA TCG AAA TAA 501 Gly Arg Arg Ala Ser Lys ***
【００６６】配列番号：6 配列の長さ：501 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：イヌ 配列の特徴 特徴を表わす記号：sig peptide 存在位置：1..72 特徴を決定した方法：S 特徴を表わす記号：mat peptide 存在位置：73..498 特徴を決定した方法：S 配列 ATG AAT TAT ACA AGC TAT ATC TTA GCT TTT CAG CTT TGC GTG ATT TTG 48 Met Asn Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Val Ile Leu TGT TCT TCT GGC TGT AAC TGT CAG GCC ATG TTT TTT AAA GAA ATA GAA 96 Cys Ser Ser Gly Cys Asn Cys Gln Ala Met Phe Phe Lys Glu Ile Glu AAC CTA AAG GAA TAT TTT CAG GCA AGT AAT CCA GAT GTA TCG GAC GGT 144 Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Gln Ala Ser Asn Pro Asp Val Ser Asp Gly GGG TCT CTT TTC GTA GAT ATT TTG AAG AAA TGG AGA GAG GAG AGT GAC 192 Gly Ser Leu Phe Val Asp Ile Leu Lys Lys Trp Arg Glu Glu Ser Asp AAA ACA ATC ATT CAG AGC CAA ATT GTC TCT TTC TAC TTG AAA CTG TTT 240 Lys Thr Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Leu Lys Leu Phe GAC AAC TTT AAA GAT AAC CAG ATC ATT CAA AGG AGC ATG GAT ACC ATC 288 Asp Asn Phe Lys Asp Asn Gln Ile Ile Gln Arg Ser Met Asp Thr Ile AAG GAA GAC ATG CTT GGC AAG TTC TTA CAG TCA TCC ACC AGT AAG AGG 336 Lys Glu Asp Met Leu Gly Lys Phe Leu Gln Ser Ser Thr Ser Lys Arg GAG GAC TTC CTT AAG CTG ATT CAA ATT CCT GTG AAC GAT CTG CAG GTC 384 Glu Asp Phe Leu Lys Leu Ile Gln Ile Pro Val Asn Asp Leu Gln Val CAG CGC AAG GCG ATA AAT GAA CTC ATC AAA GTG ATG AAT GAT CTC TCA 432 Gln Arg Lys Ala Ile Asn Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser CCA AGA TCC AAC CTA AGG AAG CGG AAA AGG AGT CAG AAT CTG TTT CGA 480 Pro Arg Ser Asn Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser Gln Asn Leu Phe Arg GGC CGC AGA GCA TCG AAA TAA 501 Gly Arg Arg Ala Ser Lys ***
【００６７】配列番号：7 配列の長さ：441 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：イヌ 配列の特徴 特徴を表わす記号：sig peptide 存在位置：1..72 特徴を決定した方法：S 特徴を表わす記号：mat peptide 存在位置：73..438 特徴を決定した方法：S 配列 ATG AAT TAT ACA AGC TAT ATC TTA GCT TTT CAG CTT TGC GTG ATT TTG 48 Met Asn Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Val Ile Leu TGT TCT TCT GGC TGT AAC TGT CAG GCC ATG TTT TTT AAA GAA ATA GAA 96 Cys Ser Ser Gly Cys Asn Cys Gln Ala Met Phe Phe Lys Glu Ile Glu AAC CTA AAG GAA TAT TTT CAG GCA AGT AAT CCA GAT GTA TCG GAC GGT 144 Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Gln Ala Ser Asn Pro Asp Val Ser Asp Gly GGG TCT CTT TTC GTA GAT ATT TTG AAG AAA TGG AGA GAG GAG AGT GAC 192 Gly Ser Leu Phe Val Asp Ile Leu Lys Lys Trp Arg Glu Glu Ser Asp AAA ACA ATC ATT CAG AGC CAA ATT GTC TCT TTC TAC TTG AAA CTG TTT 240 Lys Thr Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Leu Lys Leu Phe GAC AAC TTT AAA GAT AAC CAG ATC ATT CAA AGG AGC ATG GAT ACC ATC 288 Asp Asn Phe Lys Asp Asn Gln Ile Ile Gln Arg Ser Met Asp Thr Ile AAG GAA GAC ATG CTT GGC AAG TTC TTA CAG TCA TCC ACC AGT AAG AGG 336 Lys Glu Asp Met Leu Gly Lys Phe Leu Gln Ser Ser Thr Ser Lys Arg GAG GAC TTC CTT AAG CTG ATT CAA ATT CCT GTG AAC GAT CTG CAG GTC 384 Glu Asp Phe Leu Lys Leu Ile Gln Ile Pro Val Asn Asp Leu Gln Val CAG CGC AAG GCG ATA AAT GAA CTC ATC AAA GTG ATG AAT GAT CTC TCA 432 Gln Arg Lys Ala Ile Asn Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser CCA AGA TAA 441 Pro Arg ***
【００６８】配列番号：8 配列の長さ：453 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：イヌ 配列の特徴 特徴を表わす記号：sig peptide 存在位置：1..72 特徴を決定した方法：S 特徴を表わす記号：mat peptide 存在位置：73..450 特徴を決定した方法：S 配列 ATG AAT TAT ACA AGC TAT ATC TTA GCT TTT CAG CTT TGC GTG ATT TTG 48 Met Asn Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Val Ile Leu TGT TCT TCT GGC TGT AAC TGT CAG GCC ATG TTT TTT AAA GAA ATA GAA 96 Cys Ser Ser Gly Cys Asn Cys Gln Ala Met Phe Phe Lys Glu Ile Glu AAC CTA AAG GAA TAT TTT CAG GCA AGT AAT CCA GAT GTA TCG GAC GGT 144 Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Gln Ala Ser Asn Pro Asp Val Ser Asp Gly GGG TCT CTT TTC GTA GAT ATT TTG AAG AAA TGG AGA GAG GAG AGT GAC 192 Gly Ser Leu Phe Val Asp Ile Leu Lys Lys Trp Arg Glu Glu Ser Asp AAA ACA ATC ATT CAG AGC CAA ATT GTC TCT TTC TAC TTG AAA CTG TTT 240 Lys Thr Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Leu Lys Leu Phe GAC AAC TTT AAA GAT AAC CAG ATC ATT CAA AGG AGC ATG GAT ACC ATC 288 Asp Asn Phe Lys Asp Asn Gln Ile Ile Gln Arg Ser Met Asp Thr Ile AAG GAA GAC ATG CTT GGC AAG TTC TTA CAG TCA TCC ACC AGT AAG AGG 336 Lys Glu Asp Met Leu Gly Lys Phe Leu Gln Ser Ser Thr Ser Lys Arg GAG GAC TTC CTT AAG CTG ATT CAA ATT CCT GTG AAC GAT CTG CAG GTC 384 Glu Asp Phe Leu Lys Leu Ile Gln Ile Pro Val Asn Asp Leu Gln Val CAG CGC AAG GCG ATA AAT GAA CTC ATC AAA GTG ATG AAT GAT CTC TCA 432 Gln Arg Lys Ala Ile Asn Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser CCA AGA TCC AAC CTA AGG TAA 453 Pro Arg Ser Asn Leu Arg ***
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (11)
- 【請求項１】 組換えバキュロウイルスを感染させたカ
イコ細胞培養上清、または、組換えバキュロウイルスを
感染させたカイコ幼虫の体液を４級アンモニウム塩で処
理することを特徴とする有用蛋白質の製造方法。 - 【請求項２】 有用蛋白質がイヌインターフェロン-
γ、ネコインターフェロン-ω、イヌインターロイキン-
１２またはヒトインターフェロンであることを特徴とす
る請求項１に記載の有用蛋白質の製造方法。 - 【請求項３】イヌインターフェロン-γが、配列番号５
から８のいずれかに示すアミノ酸配列からなるポリペプ
チドであることを特徴とする請求項２記載の有用蛋白質
の製造方法。 - 【請求項４】 組換えバキュロウイルスを感染させた培
養細胞が、カイコ由来樹立株ＢＭ-Ｎ細胞であることを
特徴とする請求項１に記載の有用蛋白質の製造方法。 - 【請求項５】 ４級アンモニウム塩が塩化ベンザルコニ
ウムまたは塩化ベンゼトニウムであることを特徴とする
請求項１から４のいずれか１項に記載の有用蛋白質の製
造方法。 - 【請求項６】 ４級アンモニウム塩を、組換えバキュウ
ロウイルスを感染させたカイコ培養細胞または組換えバ
キュウロウイルスを感染させたカイコ幼虫の体液に対し
て、０.０１重量％以上の濃度で処理することを特徴と
する請求項１から５のいずれか１項記載の有用蛋白質の
製造方法。 - 【請求項７】 組換えバキュロウイルスが、イヌインタ
ーフェロン-γ、ネコインターフェロン-ω、イヌインタ
ーロイキン-１２またはヒトインターフェロンの蛋白質
をコードするＤＮＡにより、遺伝子組換えされた組換え
カイコ核多角体病ウイルスであることを特徴とする請求
項１から６のいずれか１項記載の有用蛋白質の製造方
法。 - 【請求項８】 イヌインターフェロン−γの蛋白質をコ
ードするＤＮＡにより、遺伝子組換えされた組換えカイ
コ核多角体病ウイルスを用いてイヌインターフェロン−
γを製造する際に、４級アンモニウム塩で処理した後に
カチオン交換担体を用いて精製することを特徴とする請
求項７に記載の有用蛋白質の製造方法。 - 【請求項９】 カチオン交換体が、スルフォプロピルセ
ファロースであることを特徴とする請求項８に記載の有
用蛋白質の製造法。 - 【請求項１０】 ネコインターフェロン−ωの蛋白質を
コードするＤＮＡにより、遺伝子組換えされた組換えカ
イコ核多角体病ウイルスを用いてネコインターフェロン
−ωを製造する際に、４級アンモニウム塩で処理した後
にアフィニティー担体を用いて精製することを特徴とす
る請求項７に記載の有用蛋白質の製造方法。 - 【請求項１１】アフィニティー担体がブルーセファロー
スであることを特徴とする請求項１０に記載の有用蛋白
質の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10216309A JPH1198996A (ja) | 1997-08-01 | 1998-07-30 | 有用蛋白質の製造法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20808597 | 1997-08-01 | ||
| JP9-208085 | 1997-08-01 | ||
| JP10216309A JPH1198996A (ja) | 1997-08-01 | 1998-07-30 | 有用蛋白質の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1198996A true JPH1198996A (ja) | 1999-04-13 |
Family
ID=26516629
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10216309A Pending JPH1198996A (ja) | 1997-08-01 | 1998-07-30 | 有用蛋白質の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1198996A (ja) |
-
1998
- 1998-07-30 JP JP10216309A patent/JPH1198996A/ja active Pending
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060411 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20060822 |