JPH1198998A - 有用蛋白質の製造方法 - Google Patents
有用蛋白質の製造方法Info
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- JPH1198998A JPH1198998A JP10218355A JP21835598A JPH1198998A JP H1198998 A JPH1198998 A JP H1198998A JP 10218355 A JP10218355 A JP 10218355A JP 21835598 A JP21835598 A JP 21835598A JP H1198998 A JPH1198998 A JP H1198998A
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- JP
- Japan
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- silkworm
- producing
- ultrafiltration
- recombinant baculovirus
- recombinant
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 組換えバキュロウイルスによる有用蛋白質の
製造方法を提供する。 【解決手段】 ４級アンモニウム塩で処理によって限外
濾過を容易にし、組換えバキュロウイルスの除去と目的
蛋白質の精製を容易にする。
製造方法を提供する。 【解決手段】 ４級アンモニウム塩で処理によって限外
濾過を容易にし、組換えバキュロウイルスの除去と目的
蛋白質の精製を容易にする。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、組換えバキュロウ
イルスを用いた遺伝子操作技術によって有用蛋白質を生
産する手法において、組換えバキュロウイルスの不活性
化とその後行程にあたる目的有用蛋白質の精製を容易に
するために夾雑蛋白質を効率よく除去することによっ
て、有用蛋白質の量産化を可能とし、以って高純度かつ
安価な医薬品（抗腫瘍・抗ウイルス）を製造する事を目
的とする有用蛋白質の製造方法に関する。
イルスを用いた遺伝子操作技術によって有用蛋白質を生
産する手法において、組換えバキュロウイルスの不活性
化とその後行程にあたる目的有用蛋白質の精製を容易に
するために夾雑蛋白質を効率よく除去することによっ
て、有用蛋白質の量産化を可能とし、以って高純度かつ
安価な医薬品（抗腫瘍・抗ウイルス）を製造する事を目
的とする有用蛋白質の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子組換え技術を用いた有用蛋白質の
生産方法には多くの技術が報告されているが、近年、遺
伝子組換えしたカイコ核多角体病ウイルスを用いた有用
蛋白質の生産方法についても、ブタ成長ホルモン（特開
平3-224491）、成人Ｔ細胞白血病ウイルス外皮蛋白質
（特開平2-57191）、インフルエンザウイルスＨＡ蛋白
質（特開平3-108480）、ネコインターフェロン（特開平
3-139276）等が開示されている。しかし、カイコ核多角
体病ウイルスを用いた有用蛋白質の生産方法によって特
に医薬品などを製造する場合には、安全性の観点から使
用した組換えカイコ核多角体病ウイルスの不活性化が不
可欠であり、さらには、除去することが好ましい。
生産方法には多くの技術が報告されているが、近年、遺
伝子組換えしたカイコ核多角体病ウイルスを用いた有用
蛋白質の生産方法についても、ブタ成長ホルモン（特開
平3-224491）、成人Ｔ細胞白血病ウイルス外皮蛋白質
（特開平2-57191）、インフルエンザウイルスＨＡ蛋白
質（特開平3-108480）、ネコインターフェロン（特開平
3-139276）等が開示されている。しかし、カイコ核多角
体病ウイルスを用いた有用蛋白質の生産方法によって特
に医薬品などを製造する場合には、安全性の観点から使
用した組換えカイコ核多角体病ウイルスの不活性化が不
可欠であり、さらには、除去することが好ましい。
【０００３】カイコ核多角体病ウイルスの不活性化に関
しては、Watanabe らが詳細に報告している（文献
１）。しかし、開示されている加熱、紫外線、乾燥な
ど、物理的な不活性化条件、および、フェノール、ホル
マリンなどの殺菌剤、アルコールなどによる化学的な不
活性化条件では蛋白質の変性が生じることから、有用蛋
白の製造に利用することは困難である。また、この報告
は、野生型カイコ核多角体病ウイルスの不活性化に関す
るものであり、組換えカイコ核多角体病ウイルスの不活
性化については開示されていない。
しては、Watanabe らが詳細に報告している（文献
１）。しかし、開示されている加熱、紫外線、乾燥な
ど、物理的な不活性化条件、および、フェノール、ホル
マリンなどの殺菌剤、アルコールなどによる化学的な不
活性化条件では蛋白質の変性が生じることから、有用蛋
白の製造に利用することは困難である。また、この報告
は、野生型カイコ核多角体病ウイルスの不活性化に関す
るものであり、組換えカイコ核多角体病ウイルスの不活
性化については開示されていない。
【０００４】特開平４-２０７１９８には、カイコ体液
をｐＨ０.５〜ｐＨ３.０にすることを特徴とする組換え
カイコ核多角体病ウイルスの不活性化方法が開示されて
いるが、この方法では酸性に対して安定な有用蛋白質を
製造する場合に限られることから、さらに幅広い有用蛋
白質に対して適用可能な組換えバキュロウイルスの不活
性化方法が求められていた。また、特開昭６１-１５２
２７６には、塩化ベンザルコニウムを用いた組換え大腸
菌の不活性化に関する技術が開示されているが、組換え
バキュロウイルスの不活性化方法については開示されて
いない。一方、ウイルスに対する塩化ベンザルコニウム
の不活性化はウイルスによって異なり、Yamamoto らは
ＨＩＶウイルスが塩化ベンザルコニウムで不活性化され
ることを報告しているが（文献２）、一方、Watanabe
らはカイコのFlacherie virus は塩化ベンザルコニウム
によって不活性化されないと報告している（文献３）。
すなわち、これらの従来技術では組換えカイコ核多角体
病ウイルスを用いた有用蛋白質の生産において、幅広い
有用蛋白質の活性の維持と組換えカイコ核多角体病ウイ
ルスの不活性化を両立することは困難であった。また、
さらに、カイコ幼虫において有用蛋白質を生産させた場
合、カイコ体液中にはカイコ由来の大量の蛋白質が含ま
れていることから、この大量に存在する夾雑蛋白質を効
率的に取り除く必要があった。夾雑蛋白質の除去を大規
模に行う一つの手法として、蛋白質の分子量の差によっ
て蛋白質を分離する方法である限外濾過膜による夾雑蛋
白質の除去が挙げられる。例えば、特開昭５６-８１５
２１号には血清中のアルブミンとグロブリンの分離に関
した開示されており、また、特開平９-１２５９９には
γ-リベチンの分離精製方法が示されている。しかしな
がら、カイコ幼虫の体液中に生産された有用蛋白質を限
外濾過によって処理しようとした場合、カイコ体液が著
しく茶褐色に着色し、このため限外濾過における濾過性
が悪くなり、カイコ幼虫体液の限外濾過による大量処理
は困難であった。
をｐＨ０.５〜ｐＨ３.０にすることを特徴とする組換え
カイコ核多角体病ウイルスの不活性化方法が開示されて
いるが、この方法では酸性に対して安定な有用蛋白質を
製造する場合に限られることから、さらに幅広い有用蛋
白質に対して適用可能な組換えバキュロウイルスの不活
性化方法が求められていた。また、特開昭６１-１５２
２７６には、塩化ベンザルコニウムを用いた組換え大腸
菌の不活性化に関する技術が開示されているが、組換え
バキュロウイルスの不活性化方法については開示されて
いない。一方、ウイルスに対する塩化ベンザルコニウム
の不活性化はウイルスによって異なり、Yamamoto らは
ＨＩＶウイルスが塩化ベンザルコニウムで不活性化され
ることを報告しているが（文献２）、一方、Watanabe
らはカイコのFlacherie virus は塩化ベンザルコニウム
によって不活性化されないと報告している（文献３）。
すなわち、これらの従来技術では組換えカイコ核多角体
病ウイルスを用いた有用蛋白質の生産において、幅広い
有用蛋白質の活性の維持と組換えカイコ核多角体病ウイ
ルスの不活性化を両立することは困難であった。また、
さらに、カイコ幼虫において有用蛋白質を生産させた場
合、カイコ体液中にはカイコ由来の大量の蛋白質が含ま
れていることから、この大量に存在する夾雑蛋白質を効
率的に取り除く必要があった。夾雑蛋白質の除去を大規
模に行う一つの手法として、蛋白質の分子量の差によっ
て蛋白質を分離する方法である限外濾過膜による夾雑蛋
白質の除去が挙げられる。例えば、特開昭５６-８１５
２１号には血清中のアルブミンとグロブリンの分離に関
した開示されており、また、特開平９-１２５９９には
γ-リベチンの分離精製方法が示されている。しかしな
がら、カイコ幼虫の体液中に生産された有用蛋白質を限
外濾過によって処理しようとした場合、カイコ体液が著
しく茶褐色に着色し、このため限外濾過における濾過性
が悪くなり、カイコ幼虫体液の限外濾過による大量処理
は困難であった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】そこで、酸に安定な有
用蛋白質に限らず、すべての有用蛋白質の活性を低下さ
せることなく組換えカイコ核多角体病ウイルスの不活性
化を行った後に、カイコ幼虫体液中の夾雑蛋白質を効率
良く除去できれば、従来組換えカイコ核多角体病ウイル
スを用いて量産が困難であった有用蛋白質でも量産が容
易となると期待できる。すなわち、本発明は、組換えカ
イコ核多角体病ウイルスを用いた有用蛋白質の製造にお
いて、幅広い有用蛋白質に適用可能な組換えカイコ核多
角体病ウイルスの不活性化方法とその後行程にあたる目
的有用蛋白質以外の夾雑蛋白質の効率的な除去方法を提
供することによって、有用蛋白質の量産化を可能とし、
以って高純度かつ安価な医薬品（抗腫瘍・抗ウイルス）
の製造を可能とすることを目的とする。
用蛋白質に限らず、すべての有用蛋白質の活性を低下さ
せることなく組換えカイコ核多角体病ウイルスの不活性
化を行った後に、カイコ幼虫体液中の夾雑蛋白質を効率
良く除去できれば、従来組換えカイコ核多角体病ウイル
スを用いて量産が困難であった有用蛋白質でも量産が容
易となると期待できる。すなわち、本発明は、組換えカ
イコ核多角体病ウイルスを用いた有用蛋白質の製造にお
いて、幅広い有用蛋白質に適用可能な組換えカイコ核多
角体病ウイルスの不活性化方法とその後行程にあたる目
的有用蛋白質以外の夾雑蛋白質の効率的な除去方法を提
供することによって、有用蛋白質の量産化を可能とし、
以って高純度かつ安価な医薬品（抗腫瘍・抗ウイルス）
の製造を可能とすることを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者は、こうした状
況に鑑み、鋭意工夫を重ねた結果、組換えカイコ核多角
体病ウイルスが感染したカイコ幼虫の体液に４級アンモ
ニウム塩を添加することによって、組換えカイコ核多角
体病ウイルスが不活性化すること、また、４級アンモニ
ウム塩、または、金属キレート剤を添加することによっ
て組換えカイコ核多角体病ウイルスが感染したカイコ幼
虫の体液の限外濾過における濾過性が大幅に向上するこ
と、さらに、組換えカイコ核多角体病ウイルスによって
産生した有用蛋白質の比活性が向上するため、後工程で
ある精製が容易となることを見出し本発明を完成するに
至った。
況に鑑み、鋭意工夫を重ねた結果、組換えカイコ核多角
体病ウイルスが感染したカイコ幼虫の体液に４級アンモ
ニウム塩を添加することによって、組換えカイコ核多角
体病ウイルスが不活性化すること、また、４級アンモニ
ウム塩、または、金属キレート剤を添加することによっ
て組換えカイコ核多角体病ウイルスが感染したカイコ幼
虫の体液の限外濾過における濾過性が大幅に向上するこ
と、さらに、組換えカイコ核多角体病ウイルスによって
産生した有用蛋白質の比活性が向上するため、後工程で
ある精製が容易となることを見出し本発明を完成するに
至った。
【０００７】すなわち本発明は、有用蛋白質をコードす
る遺伝子により組み換えられた組換えカイコ核多角体病
ウイルスをカイコ幼虫に感染させて有用蛋白質を生産す
る際に、カイコ幼虫の体液に４級アンモニウム塩を添加
した後に、限外濾過することを特徴とする有用蛋白質の
製造方法、ならびに、組換えカイコ核多角体病ウイルス
の不活性化方法を提供するものである。
る遺伝子により組み換えられた組換えカイコ核多角体病
ウイルスをカイコ幼虫に感染させて有用蛋白質を生産す
る際に、カイコ幼虫の体液に４級アンモニウム塩を添加
した後に、限外濾過することを特徴とする有用蛋白質の
製造方法、ならびに、組換えカイコ核多角体病ウイルス
の不活性化方法を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】以下、本発明に関し詳細に説明す
る。
る。
【０００９】本発明の有用蛋白質としては特に限定はさ
れないが、４級アンモニウム塩に対して安定な蛋白質が
好ましい。４級アンモニウム塩に対して安定な蛋白質と
しては種々のものが報告され、今後も多くのものが見出
されるであろうが、それらへの応用が可能である。例え
ば、４級アンモニウム塩に対して安定な有用蛋白質とし
て、ヒトインターフェロン（α、β、γの各タイプ）、
ネコインターフェロン、イヌインターフェロン（α、
β、γの各タイプ）などのインターフェロン類などが挙
げられる。インターフェロンは、抗ウイルス作用を示す
ところの蛋白質を主成分とする生理活性物質でＩＦＮと
略記される。また、その他に、イヌインターロイキン−
１２などのほ乳動物由来のインターロイキンなどが挙げ
られる。本発明では、特にネコＩＦＮ-ω、または、イ
ヌＩＦＮ-γが好ましく用いられる。
れないが、４級アンモニウム塩に対して安定な蛋白質が
好ましい。４級アンモニウム塩に対して安定な蛋白質と
しては種々のものが報告され、今後も多くのものが見出
されるであろうが、それらへの応用が可能である。例え
ば、４級アンモニウム塩に対して安定な有用蛋白質とし
て、ヒトインターフェロン（α、β、γの各タイプ）、
ネコインターフェロン、イヌインターフェロン（α、
β、γの各タイプ）などのインターフェロン類などが挙
げられる。インターフェロンは、抗ウイルス作用を示す
ところの蛋白質を主成分とする生理活性物質でＩＦＮと
略記される。また、その他に、イヌインターロイキン−
１２などのほ乳動物由来のインターロイキンなどが挙げ
られる。本発明では、特にネコＩＦＮ-ω、または、イ
ヌＩＦＮ-γが好ましく用いられる。
【００１０】イヌインターフェロン-γは参考文献５に
示されているアミノ酸配列からなるポリペプチドである
が、そのアミノ酸配列の一部が置換されたもの、また、
その一部が欠如したもの、あるいは、いくつかのアミノ
酸残基が付加されたものでも、イヌ由来細胞、例えば、
イヌＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３４）に対し
て、文献１６に示されているようなインターフェロン−
γの本来の生理活性を有するポリペプチドであれば本発
明に含まれる。具体的には、例えば、配列番号５に示す
成熟蛋白質部分のアミノ酸配列からなるポリペプチドが
挙げられる。また、例えば、配列番号６に示す成熟蛋白
質部分のような糖鎖結合部位を欠如させたイヌインター
フェロン-γを挙げることができる。また、配列番号
７、８に示す成熟蛋白質部分のようなＣ末端が欠如した
イヌインターフェロン-γを挙げることができる。
示されているアミノ酸配列からなるポリペプチドである
が、そのアミノ酸配列の一部が置換されたもの、また、
その一部が欠如したもの、あるいは、いくつかのアミノ
酸残基が付加されたものでも、イヌ由来細胞、例えば、
イヌＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３４）に対し
て、文献１６に示されているようなインターフェロン−
γの本来の生理活性を有するポリペプチドであれば本発
明に含まれる。具体的には、例えば、配列番号５に示す
成熟蛋白質部分のアミノ酸配列からなるポリペプチドが
挙げられる。また、例えば、配列番号６に示す成熟蛋白
質部分のような糖鎖結合部位を欠如させたイヌインター
フェロン-γを挙げることができる。また、配列番号
７、８に示す成熟蛋白質部分のようなＣ末端が欠如した
イヌインターフェロン-γを挙げることができる。
【００１１】遺伝子組換えバキュロウイルスは、例えば
次のようにして作製することができる。すなわち、有用
蛋白質をコードするＤＮＡの上流に核多角体病ウイルス
由来のプロモーター領域を含むＤＮＡ断片、下流に終止
シグナル以下のＤＮＡ断片を有する組換えプラスミド
と、核多角体病ウイルスのＤＮＡを、例えばＢＭ−Ｎ細
胞のようなカイコ培養細胞に同時に感染させることによ
って、細胞内で外来の有用蛋白質をコードするＤＮＡと
ウイルスＤＮＡの組換えが起こり、遺伝子組換えウイル
スが作製される。このようにして作製された組換えウイ
ルスは、核多角体病ウイルスの多角体蛋白質の遺伝子領
域に外来のＤＮＡが置換または挿入されており多角体を
形成することができないため、非組換えウイルスと容易
に区別することが可能である。
次のようにして作製することができる。すなわち、有用
蛋白質をコードするＤＮＡの上流に核多角体病ウイルス
由来のプロモーター領域を含むＤＮＡ断片、下流に終止
シグナル以下のＤＮＡ断片を有する組換えプラスミド
と、核多角体病ウイルスのＤＮＡを、例えばＢＭ−Ｎ細
胞のようなカイコ培養細胞に同時に感染させることによ
って、細胞内で外来の有用蛋白質をコードするＤＮＡと
ウイルスＤＮＡの組換えが起こり、遺伝子組換えウイル
スが作製される。このようにして作製された組換えウイ
ルスは、核多角体病ウイルスの多角体蛋白質の遺伝子領
域に外来のＤＮＡが置換または挿入されており多角体を
形成することができないため、非組換えウイルスと容易
に区別することが可能である。
【００１２】このような遺伝子組換え核多角体病ウイル
スとして、例えば、ネコＩＦＮの蛋白質をコードするＤ
ＮＡが組換えられたｒＢＮＶ１００や 、イヌＩＦＮ-γ
の蛋白質をコードするＤＮＡが組換えられたrＢＮＶγ
を挙げることができる。
スとして、例えば、ネコＩＦＮの蛋白質をコードするＤ
ＮＡが組換えられたｒＢＮＶ１００や 、イヌＩＦＮ-γ
の蛋白質をコードするＤＮＡが組換えられたrＢＮＶγ
を挙げることができる。
【００１３】ｒＢＮＶ１００は、特開平４−２０７１９
８に開示された方法によって作製することができる。す
なわち、生命科学研究所にFERM Ｐ-１６３３号として
寄託されている大腸菌の形質転換体から一般的な手法に
より抽出したプラスミドからネコＩＦＮの蛋白質をコー
ドするＤＮＡ部分を、例えばｐＢＭ０３０（文献４）な
どのカイコのクローニングベクターの発現調節部分の下
流に連結するという一般的な遺伝子操作技術によって組
換えプラスミドを作製することができる。この組換えプ
ラスミドとカイコ核多角体病ウイルスＤＮＡ（文献４）
とを、文献４に示されている方法で、カイコ樹立細胞、
例えば、ＢＭ−Ｎ細胞（文献４）にコ・トランスフェク
ションした後、培養を続ける。培養液中には、非組換え
ウイルス（野生型）と組換えウイルスの両方が出現する
ため、限界希釈法およびプラーク法などの一般的な方法
によって、組換えウイルスをクローニングする。組換え
ウイルスは核多核体の形成能がないことから、野生型ウ
イルスと容易に区別することが可能である。
８に開示された方法によって作製することができる。す
なわち、生命科学研究所にFERM Ｐ-１６３３号として
寄託されている大腸菌の形質転換体から一般的な手法に
より抽出したプラスミドからネコＩＦＮの蛋白質をコー
ドするＤＮＡ部分を、例えばｐＢＭ０３０（文献４）な
どのカイコのクローニングベクターの発現調節部分の下
流に連結するという一般的な遺伝子操作技術によって組
換えプラスミドを作製することができる。この組換えプ
ラスミドとカイコ核多角体病ウイルスＤＮＡ（文献４）
とを、文献４に示されている方法で、カイコ樹立細胞、
例えば、ＢＭ−Ｎ細胞（文献４）にコ・トランスフェク
ションした後、培養を続ける。培養液中には、非組換え
ウイルス（野生型）と組換えウイルスの両方が出現する
ため、限界希釈法およびプラーク法などの一般的な方法
によって、組換えウイルスをクローニングする。組換え
ウイルスは核多核体の形成能がないことから、野生型ウ
イルスと容易に区別することが可能である。
【００１４】イヌＩＦＮ-γの蛋白質をコードするＤＮ
Ａが組換えられたrＢＮＶγは、例えば次のように作製
することができる。まず、イヌＩＦＮ-γの蛋白をコー
ドするＤＮＡ（文献５）を、例えば次のようにして製造
する。すなわち、イヌの細胞からポリ（Ａ）ＲＮＡを抽
出した後、ｃＤＮＡに転換し、イヌＩＦＮ-γをコ−ド
する遺伝子配列を元にしたプライマ−を用いてポリメラ
ーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと略す）を行うことによって
イヌＩＦＮ-γをコ−ドする遺伝子を得ることができ
る。
Ａが組換えられたrＢＮＶγは、例えば次のように作製
することができる。まず、イヌＩＦＮ-γの蛋白をコー
ドするＤＮＡ（文献５）を、例えば次のようにして製造
する。すなわち、イヌの細胞からポリ（Ａ）ＲＮＡを抽
出した後、ｃＤＮＡに転換し、イヌＩＦＮ-γをコ−ド
する遺伝子配列を元にしたプライマ−を用いてポリメラ
ーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと略す）を行うことによって
イヌＩＦＮ-γをコ−ドする遺伝子を得ることができ
る。
【００１５】イヌの細胞、例えばマイト−ジェンなどで
刺激されたイヌリンパ球などよりＲＮＡを得る方法とし
ては、通常の方法、例えば、ポリソ−ムの分離、ショ糖
密度勾配遠心や電気泳動を利用した方法などがあげられ
る。上記イヌ細胞よりＲＮＡを抽出する方法としては、
グアニジン・チオシアネ−ト処理後ＣｓＣｌ密度勾配遠
心を行うグアニジン・チオシアネ−ト−塩化セシウム法
（文献６）バナジウム複合体を用いてリボヌクレア−ゼ
インヒビタ−存在下に界面活性剤で処理したのちフェノ
−ル抽出を行う方法（文献７），グアニジン・チオシア
ネ−ト−ホット・フェノ−ル法、グアニジン・チオシア
ネ−ト−グアニジン塩酸法、グアニジン・チオシアネ−
ト−フェノ−ル・クロロホルム法、グアニジン・チオシ
アネ−トで処理したのち塩化リチウムで処理してＲＮＡ
を沈殿させる方法などの中から適当な方法を選んで行う
ことができる。
刺激されたイヌリンパ球などよりＲＮＡを得る方法とし
ては、通常の方法、例えば、ポリソ−ムの分離、ショ糖
密度勾配遠心や電気泳動を利用した方法などがあげられ
る。上記イヌ細胞よりＲＮＡを抽出する方法としては、
グアニジン・チオシアネ−ト処理後ＣｓＣｌ密度勾配遠
心を行うグアニジン・チオシアネ−ト−塩化セシウム法
（文献６）バナジウム複合体を用いてリボヌクレア−ゼ
インヒビタ−存在下に界面活性剤で処理したのちフェノ
−ル抽出を行う方法（文献７），グアニジン・チオシア
ネ−ト−ホット・フェノ−ル法、グアニジン・チオシア
ネ−ト−グアニジン塩酸法、グアニジン・チオシアネ−
ト−フェノ−ル・クロロホルム法、グアニジン・チオシ
アネ−トで処理したのち塩化リチウムで処理してＲＮＡ
を沈殿させる方法などの中から適当な方法を選んで行う
ことができる。
【００１６】イヌリンパ球などより通常の方法、例え
ば、塩化リチウム／尿素法、グアニジン・イソチオシア
ネ−ト法、オリゴｄＴセルロ−スカラム法等によりｍＲ
ＮＡを単離し、得られたｍＲＮＡから通常の方法、例え
ば、Ｇｕｂｌｅｒらの方法（文献８），Ｈ.Ｏｋａｙａ
ｍａらの方法（文献９）等によりｃＤＮＡを合成する。
得られたｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するには、基本的
にはトリ骨芽球ウイルス（ＡＭＶ）などの逆転写酵素な
どを用いるほか１部プライマ−を用いてＤＮＡポリメラ
−ゼなどを用いる方法を組み合わせてよいが、市販の合
成あるいはクロ−ニング用キットを用いるのが便利であ
る。このｃＤＮＡを鋳型としてイヌＩＦＮ-γの塩基配
列を基にしたプライマ−を用いてＰＣＲを行うことによ
ってイヌＩＦＮ-γの蛋白質をコ−ドするＤＮＡを得る
ことができる。
ば、塩化リチウム／尿素法、グアニジン・イソチオシア
ネ−ト法、オリゴｄＴセルロ−スカラム法等によりｍＲ
ＮＡを単離し、得られたｍＲＮＡから通常の方法、例え
ば、Ｇｕｂｌｅｒらの方法（文献８），Ｈ.Ｏｋａｙａ
ｍａらの方法（文献９）等によりｃＤＮＡを合成する。
得られたｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するには、基本的
にはトリ骨芽球ウイルス（ＡＭＶ）などの逆転写酵素な
どを用いるほか１部プライマ−を用いてＤＮＡポリメラ
−ゼなどを用いる方法を組み合わせてよいが、市販の合
成あるいはクロ−ニング用キットを用いるのが便利であ
る。このｃＤＮＡを鋳型としてイヌＩＦＮ-γの塩基配
列を基にしたプライマ−を用いてＰＣＲを行うことによ
ってイヌＩＦＮ-γの蛋白質をコ−ドするＤＮＡを得る
ことができる。
【００１７】このイヌＩＦＮ-γの蛋白質をコ−ドする
ＤＮＡをカイコのクローニングベクター（文献４）に連
結して作製した組み換え体プラスミドとカイコ核多角体
病ウイルスＤＮＡとを、カイコ樹立細胞にコトランスフ
ェクションして作製することができる。従って、組み換
え体ウイルスは、ｉｎ ｖｉｖｏ的な方法で作製するこ
とができる。
ＤＮＡをカイコのクローニングベクター（文献４）に連
結して作製した組み換え体プラスミドとカイコ核多角体
病ウイルスＤＮＡとを、カイコ樹立細胞にコトランスフ
ェクションして作製することができる。従って、組み換
え体ウイルスは、ｉｎ ｖｉｖｏ的な方法で作製するこ
とができる。
【００１８】すなわち、イヌＩＦＮ-γの蛋白質をコー
ドするＤＮＡ部分を、例えばｐＢＭ０３０（文献４）な
どのカイコのクローニングベクターの発現調節部分の下
流に連結するという一般的な遺伝子操作に従って組換え
体プラスミドを作製することができる。この組換え体プ
ラスミドとカイコ核多角体病ウイルスＤＮＡ（文献４）
とを、文献のような方法でカイコ樹立細胞、例えばＢＭ
−Ｎ株（文献４）にコトランスフェクションした後、培
養を続け、培養液中に出現した非組換え体（野性型）と
組換え体のウイルスの中から限界希釈法、もしくはプラ
ーク法などの一般的な方法によって組換え体ウイルスを
クローニングすることができる。組換え体ウイルスは多
角体の形成能がないことから、野性型ウイルスと容易に
区別できる。有用蛋白質の生産は、前記の組換えカイコ
核多角体ウイルスを、カイコ生体中で増殖させることに
より行なう。すなわち、前記の組換え体ウイルスを含む
培養液をカイコ幼虫に注射して、クワの葉または合成飼
料を与えて飼育する。飼育後、カイコを切開し得られた
体液から有用蛋白質を回収することができる。
ドするＤＮＡ部分を、例えばｐＢＭ０３０（文献４）な
どのカイコのクローニングベクターの発現調節部分の下
流に連結するという一般的な遺伝子操作に従って組換え
体プラスミドを作製することができる。この組換え体プ
ラスミドとカイコ核多角体病ウイルスＤＮＡ（文献４）
とを、文献のような方法でカイコ樹立細胞、例えばＢＭ
−Ｎ株（文献４）にコトランスフェクションした後、培
養を続け、培養液中に出現した非組換え体（野性型）と
組換え体のウイルスの中から限界希釈法、もしくはプラ
ーク法などの一般的な方法によって組換え体ウイルスを
クローニングすることができる。組換え体ウイルスは多
角体の形成能がないことから、野性型ウイルスと容易に
区別できる。有用蛋白質の生産は、前記の組換えカイコ
核多角体ウイルスを、カイコ生体中で増殖させることに
より行なう。すなわち、前記の組換え体ウイルスを含む
培養液をカイコ幼虫に注射して、クワの葉または合成飼
料を与えて飼育する。飼育後、カイコを切開し得られた
体液から有用蛋白質を回収することができる。
【００１９】このようにして得られた、組換えバキュロ
ウイルスを感染させたカイコ細胞培養上清、または、カ
イコ幼虫の体液から、限外濾過膜を用いて組換えバキュ
ロウイルスを除去することができる。限外濾過膜として
は、分子量分画サイズが１００，０００以下のものを用
いるのが好ましい。
ウイルスを感染させたカイコ細胞培養上清、または、カ
イコ幼虫の体液から、限外濾過膜を用いて組換えバキュ
ロウイルスを除去することができる。限外濾過膜として
は、分子量分画サイズが１００，０００以下のものを用
いるのが好ましい。
【００２０】組換えバキュロウイルスの不活性化に使用
する４級アンモニウム塩としては、アルキルトリメチル
アンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、
アルキルジメチルベンジルアンモニウム塩、アルキルピ
リジニウム塩、アシルアミノプロピルジメチルベンジル
アンモニウム塩などを用いることができるが、具体的に
は、経済性または安全性の観点から、例えば塩化ベンザ
ルコニウム、塩化ベンゼトニウムが好適に使用される。
する４級アンモニウム塩としては、アルキルトリメチル
アンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、
アルキルジメチルベンジルアンモニウム塩、アルキルピ
リジニウム塩、アシルアミノプロピルジメチルベンジル
アンモニウム塩などを用いることができるが、具体的に
は、経済性または安全性の観点から、例えば塩化ベンザ
ルコニウム、塩化ベンゼトニウムが好適に使用される。
【００２１】使用される４級アンモニウム塩の濃度は、
組換えバキュロウイルスの不活性化に十分で、かつ、目
的とする有用蛋白質の活性を低下させない濃度であれば
よく、例えば、終濃度で０.０１％以上が好適に用いら
れる。しかし、過度に高濃度の４級アンモニウム塩を使
用することは、経済的に不利であるばかりでなく、目的
とする有用蛋白質の精製を困難とする場合がある。通
常、０.５％以下の濃度の４級アンモニウム塩による処
理が、有用蛋白質の生産において良い結果をもたらす。
組換えバキュロウイルスの不活性化に十分で、かつ、目
的とする有用蛋白質の活性を低下させない濃度であれば
よく、例えば、終濃度で０.０１％以上が好適に用いら
れる。しかし、過度に高濃度の４級アンモニウム塩を使
用することは、経済的に不利であるばかりでなく、目的
とする有用蛋白質の精製を困難とする場合がある。通
常、０.５％以下の濃度の４級アンモニウム塩による処
理が、有用蛋白質の生産において良い結果をもたらす。
【００２２】カイコ幼虫体液を４級アンモニウム塩で処
理する方法としては、カイコ幼虫体液抽出液に４級アン
モニウム塩を添加する方法、もしくは、４級アンモニウ
ム塩水溶液にカイコ細胞の培養上清またはカイコ体液を
添加する方法、もしくは、切開したカイコを直接４級ア
ンモニウム塩水溶液に浸漬する方法が可能であるが、い
ずれの方法によっても同様な効果が得られる。また、４
級アンモニウム塩による処理温度、処理時間は、組換え
バキュロウイルスが十分に不活性化される条件であれば
よく、特に制限はないが、例えば０℃から２５℃におい
て、１時間から２４時間処理することによって良好な結
果が得られる。
理する方法としては、カイコ幼虫体液抽出液に４級アン
モニウム塩を添加する方法、もしくは、４級アンモニウ
ム塩水溶液にカイコ細胞の培養上清またはカイコ体液を
添加する方法、もしくは、切開したカイコを直接４級ア
ンモニウム塩水溶液に浸漬する方法が可能であるが、い
ずれの方法によっても同様な効果が得られる。また、４
級アンモニウム塩による処理温度、処理時間は、組換え
バキュロウイルスが十分に不活性化される条件であれば
よく、特に制限はないが、例えば０℃から２５℃におい
て、１時間から２４時間処理することによって良好な結
果が得られる。
【００２３】組換えカイコ核多角体ウイルスが感染した
カイコ幼虫体液に添加される金属キレート剤としては、
エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンジアミ
ン３酢酸、エチレンジアミン２酢酸、トランス１，２−
シクロヘキサンジアミン４酢酸、ジエチレントリアミン
５酢酸、トリエチレンテトラミン６酢酸またはそれらの
塩、０−フェナントロリン、ジピリジン等のジアミン類
が挙げられるが、医薬品等の製造においては安全性の観
点からＥＤＴＡが好適に用いられる。使用される金属キ
レート剤の濃度は、カイコ幼虫体液の着色が抑制される
濃度であれば良く特に制限はないが、通常２ｍＭ以上添
加することでカイコ幼虫体液の着色が効果的に抑制され
る。また、金属キレート剤による処理温度については特
に制限はなく、目的とする蛋白質の活性が安定に保持さ
れる温度であればよく、通常は、０℃から３０℃が好適
である。
カイコ幼虫体液に添加される金属キレート剤としては、
エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンジアミ
ン３酢酸、エチレンジアミン２酢酸、トランス１，２−
シクロヘキサンジアミン４酢酸、ジエチレントリアミン
５酢酸、トリエチレンテトラミン６酢酸またはそれらの
塩、０−フェナントロリン、ジピリジン等のジアミン類
が挙げられるが、医薬品等の製造においては安全性の観
点からＥＤＴＡが好適に用いられる。使用される金属キ
レート剤の濃度は、カイコ幼虫体液の着色が抑制される
濃度であれば良く特に制限はないが、通常２ｍＭ以上添
加することでカイコ幼虫体液の着色が効果的に抑制され
る。また、金属キレート剤による処理温度については特
に制限はなく、目的とする蛋白質の活性が安定に保持さ
れる温度であればよく、通常は、０℃から３０℃が好適
である。
【００２４】また、組換えバキュロウイルスが感染した
カイコ培養細胞またはカイコ幼虫体液に高濃度の塩を添
加したのちに限外濾過することで目的とする有用蛋白質
は良好に透過される。添加する塩の濃度としては目的と
する有用蛋白質が変性しない濃度であればよいが、１Ｍ
以上の塩を添加したときに良好な濾過性が得られる。
カイコ培養細胞またはカイコ幼虫体液に高濃度の塩を添
加したのちに限外濾過することで目的とする有用蛋白質
は良好に透過される。添加する塩の濃度としては目的と
する有用蛋白質が変性しない濃度であればよいが、１Ｍ
以上の塩を添加したときに良好な濾過性が得られる。
【００２５】また、用いる塩は塩析効果の少ない塩が好
適に用いられ、具体的にはＮａＣｌ、ＫＣｌなどが挙げ
られる。
適に用いられ、具体的にはＮａＣｌ、ＫＣｌなどが挙げ
られる。
【００２６】組換えカイコ核多角体ウイルスが感染した
カイコ幼虫体液の限外濾過における限外濾過膜の素材に
は特に制限はないが、セルロース誘導体、ポリフェニル
スルホン誘導体など、工業的に入手可能な限外濾過膜が
好適に利用できる。また、限外濾過膜の形状にも特に限
定はなく、平膜状の限外濾過膜、ホローファイバー状の
限外濾過膜など一般に市販されている限外濾過膜が利用
できる。また、用いる限外濾過膜に依存していろいろな
タイプの限外濾過装置が利用可能であるが、いずれのタ
イプの限外濾過装置を用いても同様な効果が得られる。
カイコ幼虫体液の限外濾過における限外濾過膜の素材に
は特に制限はないが、セルロース誘導体、ポリフェニル
スルホン誘導体など、工業的に入手可能な限外濾過膜が
好適に利用できる。また、限外濾過膜の形状にも特に限
定はなく、平膜状の限外濾過膜、ホローファイバー状の
限外濾過膜など一般に市販されている限外濾過膜が利用
できる。また、用いる限外濾過膜に依存していろいろな
タイプの限外濾過装置が利用可能であるが、いずれのタ
イプの限外濾過装置を用いても同様な効果が得られる。
【００２７】限外濾過膜の性能としては、カイコ幼虫体
液中に存在する蛋白質のうち、SDS-PAGE上で分子量が約
３０,０００と７０,０００であり、かつ、両者合わせて
カイコ幼虫体液中の全蛋白量の８０％から９０％を占め
る蛋白質を透過させない分子量分画能を有しておればよ
く、通常、限外濾過膜の性能として表示されている分子
量分画サイズとして、５０,０００以上３００,０００未
満の限外濾過膜が好適に利用できる。さらに、意外なこ
とに、カイコ幼虫体液中に存在する上記SDS-PAGE上で分
子量が約３０,０００と７０,０００の蛋白質は、分子量
分画サイズ１００,０００の限外濾過膜をほとんど透過
しないことが本発明で見出された。したがって、分子量
分画サイズ１００,０００の限外濾過膜を目的蛋白質が
透過する場合は、分子量分画サイズ１００,０００の限
外濾過膜を用いた限外濾過において、カイコ体液中の主
な夾雑蛋白質と目的蛋白質の分離は透過液側で良好に達
成されることになる。
液中に存在する蛋白質のうち、SDS-PAGE上で分子量が約
３０,０００と７０,０００であり、かつ、両者合わせて
カイコ幼虫体液中の全蛋白量の８０％から９０％を占め
る蛋白質を透過させない分子量分画能を有しておればよ
く、通常、限外濾過膜の性能として表示されている分子
量分画サイズとして、５０,０００以上３００,０００未
満の限外濾過膜が好適に利用できる。さらに、意外なこ
とに、カイコ幼虫体液中に存在する上記SDS-PAGE上で分
子量が約３０,０００と７０,０００の蛋白質は、分子量
分画サイズ１００,０００の限外濾過膜をほとんど透過
しないことが本発明で見出された。したがって、分子量
分画サイズ１００,０００の限外濾過膜を目的蛋白質が
透過する場合は、分子量分画サイズ１００,０００の限
外濾過膜を用いた限外濾過において、カイコ体液中の主
な夾雑蛋白質と目的蛋白質の分離は透過液側で良好に達
成されることになる。
【００２８】カイコ幼虫体液を限外濾過する場合、カイ
コ体液が時間とともに茶褐色に着色し、この着色によっ
て限外濾過の濾過性が低下する現象が認められる。目的
とする有用蛋白質は多くの場合安定性が良好ではないた
め、限外濾過処理はできるだけ短時間とすることが望ま
しい。カイコ幼虫体液はｐＨを６以下に保持することに
よって有効にその着色が抑制されることが本発明で見出
された。したがって、ｐＨ６以下の条件下で限外濾過す
ることで良好な濾過性が得られ、より短時間で限外濾過
処理を終了することが可能となる。しかし、一度ｐＨを
６以下とした場合でも、そのｐＨを７以上とするとカイ
コ幼虫体液の着色が始まり、このため限外濾過における
濾過性が悪くなる。
コ体液が時間とともに茶褐色に着色し、この着色によっ
て限外濾過の濾過性が低下する現象が認められる。目的
とする有用蛋白質は多くの場合安定性が良好ではないた
め、限外濾過処理はできるだけ短時間とすることが望ま
しい。カイコ幼虫体液はｐＨを６以下に保持することに
よって有効にその着色が抑制されることが本発明で見出
された。したがって、ｐＨ６以下の条件下で限外濾過す
ることで良好な濾過性が得られ、より短時間で限外濾過
処理を終了することが可能となる。しかし、一度ｐＨを
６以下とした場合でも、そのｐＨを７以上とするとカイ
コ幼虫体液の着色が始まり、このため限外濾過における
濾過性が悪くなる。
【００２９】目的蛋白質の単離、精製プロセスの必要
上、または、目的蛋白質の安定性の理由などから、組換
えカイコ核多角体ウイルスが感染したカイコ幼虫体液を
ｐＨ７以上にする必要がある場合には、金属キレート剤
の添加が有効である。すなわち、金属キレート剤を添加
した場合は、ｐＨが７以上の場合でもカイコ幼虫体液が
着色することがないため、限外濾過における濾過性を良
好に維持することが可能となる。
上、または、目的蛋白質の安定性の理由などから、組換
えカイコ核多角体ウイルスが感染したカイコ幼虫体液を
ｐＨ７以上にする必要がある場合には、金属キレート剤
の添加が有効である。すなわち、金属キレート剤を添加
した場合は、ｐＨが７以上の場合でもカイコ幼虫体液が
着色することがないため、限外濾過における濾過性を良
好に維持することが可能となる。
【００３０】こうして限外濾過処理された有用蛋白質を
さらに単離・精製するための方法に特に限定はなく、通
常の蛋白質の精製方法を用いることができる。例えば、
目的とする有用蛋白質が本来有する活性を指標としなが
ら、シリカゲル担体、イオン交換性担体、ゲル濾過担
体、キレート性担体、色素担持担体等を用いたクロマト
グラフィーや、限外濾過、ゲル濾過、透析、塩析等によ
る脱塩、濃縮を組み合わせることによって精製し単離す
ることができる。
さらに単離・精製するための方法に特に限定はなく、通
常の蛋白質の精製方法を用いることができる。例えば、
目的とする有用蛋白質が本来有する活性を指標としなが
ら、シリカゲル担体、イオン交換性担体、ゲル濾過担
体、キレート性担体、色素担持担体等を用いたクロマト
グラフィーや、限外濾過、ゲル濾過、透析、塩析等によ
る脱塩、濃縮を組み合わせることによって精製し単離す
ることができる。
【００３１】特に、イヌＩＦＮ−γの生産においては、
限外濾過処理した後に、カチオン交換担体を用いてカラ
ム精製することがイヌＩＦＮ−γの純度を向上させるた
めに有効である。また、ネコＩＦＮは、限外濾過処理し
た後にアフィニティー担体を用いてカラム精製すること
で大幅に純度が向上する。
限外濾過処理した後に、カチオン交換担体を用いてカラ
ム精製することがイヌＩＦＮ−γの純度を向上させるた
めに有効である。また、ネコＩＦＮは、限外濾過処理し
た後にアフィニティー担体を用いてカラム精製すること
で大幅に純度が向上する。
【００３２】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明の範囲がこれに限定されるもので
はない。
に説明するが、本発明の範囲がこれに限定されるもので
はない。
【００３３】参考例１ ＜イヌＩＦＮ-γをコードするＤＮＡを導入した組換え
カイコ核多核体病ウイルスの作成＞ （１）イヌｃＤＮＡの調製 イヌ末梢血よりリンパ球を分離し、フィトヘムアグルチ
ニン（ＰＨＡ）を５０μｇ／ｍｌの終濃度で４８時間刺
激した。刺激後、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジ−ン社）を
用いて総ＲＮＡを調製した。得られたＲＮＡを１ｍＭ
ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）（以下ＴＥと略する。）に溶解し、７０℃で５分間
処理した後、１Ｍ ＬｉＣｌを含むＴＥを同量加えた。
０．５ＭＬｉＣｌを含むＴＥで平衡化したオリゴｄＴセ
ルロ−スカラムにＲＮＡ溶液をアプライし、同緩衝液に
て洗浄した。さらに０．３Ｍ ＬｉＣｌを含むＴＥにて
洗浄後、０．０１％ ＳＤＳを含む２ｍＭ ＥＤＴＡ
（ｐＨ７．０）で吸着したポリ（Ａ）ＲＮＡを溶出し
た。こうして得られたポリ（Ａ）ＲＮＡを用いて一本鎖
ｃＤＮＡを合成した。すなわち、滅菌した０．５ｍｌの
ミクロ遠心チュ−ブに５μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡと０．
５μｇのオリゴｄＴプライマ−（１２−１８ｍｅｒ）を
入れ、ジエチルピロカルボネ−ト処理滅菌水を加えて１
２μｌにし、７０℃で１０分間インキュベ−トしたのち
氷中に１分間つけた。これに２００ｍＭトリス塩酸（ｐ
Ｈ８．４），５００ｍＭ ＫＣｌ溶液を２μｌ，２５ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2 を２μｌ，１０ｍＭ ｄＮＴＰを１μｌ
および０．１Ｍ ＤＴＴを２μｌそれぞれ加え、４２℃
で５分間インキュベ−トしたのち、２００ユニットのＧ
ｉｂｃｏＢＲＬ社製ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒ
Ｔを１μｌ加え、４２℃でさらに５０分間インキュベ−
トしてｃＤＮＡ合成反応を行った。さらに７０℃で１５
分間インキュベ−トして反応を停止し、氷上に５分間置
いた。この反応液に１μｌのＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅ
Ｈ（２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を加え、３７℃で２０分間イ
ンキュベ−トした。
カイコ核多核体病ウイルスの作成＞ （１）イヌｃＤＮＡの調製 イヌ末梢血よりリンパ球を分離し、フィトヘムアグルチ
ニン（ＰＨＡ）を５０μｇ／ｍｌの終濃度で４８時間刺
激した。刺激後、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジ−ン社）を
用いて総ＲＮＡを調製した。得られたＲＮＡを１ｍＭ
ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）（以下ＴＥと略する。）に溶解し、７０℃で５分間
処理した後、１Ｍ ＬｉＣｌを含むＴＥを同量加えた。
０．５ＭＬｉＣｌを含むＴＥで平衡化したオリゴｄＴセ
ルロ−スカラムにＲＮＡ溶液をアプライし、同緩衝液に
て洗浄した。さらに０．３Ｍ ＬｉＣｌを含むＴＥにて
洗浄後、０．０１％ ＳＤＳを含む２ｍＭ ＥＤＴＡ
（ｐＨ７．０）で吸着したポリ（Ａ）ＲＮＡを溶出し
た。こうして得られたポリ（Ａ）ＲＮＡを用いて一本鎖
ｃＤＮＡを合成した。すなわち、滅菌した０．５ｍｌの
ミクロ遠心チュ−ブに５μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡと０．
５μｇのオリゴｄＴプライマ−（１２−１８ｍｅｒ）を
入れ、ジエチルピロカルボネ−ト処理滅菌水を加えて１
２μｌにし、７０℃で１０分間インキュベ−トしたのち
氷中に１分間つけた。これに２００ｍＭトリス塩酸（ｐ
Ｈ８．４），５００ｍＭ ＫＣｌ溶液を２μｌ，２５ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2 を２μｌ，１０ｍＭ ｄＮＴＰを１μｌ
および０．１Ｍ ＤＴＴを２μｌそれぞれ加え、４２℃
で５分間インキュベ−トしたのち、２００ユニットのＧ
ｉｂｃｏＢＲＬ社製ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒ
Ｔを１μｌ加え、４２℃でさらに５０分間インキュベ−
トしてｃＤＮＡ合成反応を行った。さらに７０℃で１５
分間インキュベ−トして反応を停止し、氷上に５分間置
いた。この反応液に１μｌのＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅ
Ｈ（２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を加え、３７℃で２０分間イ
ンキュベ−トした。
【００３４】（２）イヌＩＦＮ-γ遺伝子の調製 イヌＩＦＮ-γのＮ末端およびＣ末端の塩基配列（文献
５）をもとに、５´ＧＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＴＴＡ
ＴＡＣＡＧＣＴＡＴＡＴＣＴＴＡＧＣＴ３´ （配列番
号１）と５´ＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＴＣＧＡＴＧ
ＣＴＣＴＧＣＧＧＣＣＴＣＧＡＡＡ３´（配列番号２）
の２種類の末端にＥｃｏＲＩ切断部位を付加したプライ
マ−をＤＮＡシンセサイザ−にて合成した。上記（１）
で得られたｃＤＮＡを０．５ｍｌのミクロ遠心チュ−ブ
に２μｌづつ取り、各プライマ−を２０ｐｍｏｌ，２０
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）、１．５ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2 、２５ｍＭ ＫＣｌ，１００μｇ／ｍｌ ゼラ
チン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、４単位 Ｔａｑ ＤＮＡポ
リメラ−ゼとなるように各試薬を加え、全量１００μｌ
とする。ＤＮＡの変性条件を９４℃，１分、プライマ−
のアニ−リング条件を５５℃、２分、プライマ−の伸長
条件を７２℃、３分の各条件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅ
ｒ Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡサ−マルサイクラ−を用い、
３０サイクル反応させた。これを１％アガロ−スゲルに
て電気泳動し、約５６０ｂｐのＤＮＡ断片を常法（文献
１０）に従って調製した。このＤＮＡ断片をＩｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ社のＴ−ＶｅｃｔｏｒにＴＡＫＡＲＡ社のＤ
ＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１を用いて
１６℃、２時間反応を行い、連結した。これを用いて常
法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体より
プラスミドＤＮＡを常法に従い調製した。次にこのプラ
スミドにＰＣＲ断片が挿入されていることを前述と同じ
条件のＰＣＲによって確認し、Ｇｅｎｅｓｉｓ ２００
０ ＤＮＡ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ（デュポ
ン社）を用いて、ダイデオキシ法（文献１１）でイヌＩ
ＦＮ-γＤＮＡの塩基配列を確認した。
５）をもとに、５´ＧＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＴＴＡ
ＴＡＣＡＧＣＴＡＴＡＴＣＴＴＡＧＣＴ３´ （配列番
号１）と５´ＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＴＣＧＡＴＧ
ＣＴＣＴＧＣＧＧＣＣＴＣＧＡＡＡ３´（配列番号２）
の２種類の末端にＥｃｏＲＩ切断部位を付加したプライ
マ−をＤＮＡシンセサイザ−にて合成した。上記（１）
で得られたｃＤＮＡを０．５ｍｌのミクロ遠心チュ−ブ
に２μｌづつ取り、各プライマ−を２０ｐｍｏｌ，２０
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）、１．５ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2 、２５ｍＭ ＫＣｌ，１００μｇ／ｍｌ ゼラ
チン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、４単位 Ｔａｑ ＤＮＡポ
リメラ−ゼとなるように各試薬を加え、全量１００μｌ
とする。ＤＮＡの変性条件を９４℃，１分、プライマ−
のアニ−リング条件を５５℃、２分、プライマ−の伸長
条件を７２℃、３分の各条件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅ
ｒ Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡサ−マルサイクラ−を用い、
３０サイクル反応させた。これを１％アガロ−スゲルに
て電気泳動し、約５６０ｂｐのＤＮＡ断片を常法（文献
１０）に従って調製した。このＤＮＡ断片をＩｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ社のＴ−ＶｅｃｔｏｒにＴＡＫＡＲＡ社のＤ
ＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１を用いて
１６℃、２時間反応を行い、連結した。これを用いて常
法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体より
プラスミドＤＮＡを常法に従い調製した。次にこのプラ
スミドにＰＣＲ断片が挿入されていることを前述と同じ
条件のＰＣＲによって確認し、Ｇｅｎｅｓｉｓ ２００
０ ＤＮＡ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ（デュポ
ン社）を用いて、ダイデオキシ法（文献１１）でイヌＩ
ＦＮ-γＤＮＡの塩基配列を確認した。
【００３５】（３）カイコ発現用プラスミドの作製 ベクターｐＢＭ０３０（文献４）１μｇを３０ユニット
の制限酵素ＥｃｏＲＩで３７℃、１６時間消化した後、
１ユニットのバクテリア由来アルカリホスファターゼで
末端を脱リン酸化した。これを１％アガロ−スゲルにて
電気泳動し、約１１．３ＫｂのＤＮＡ断片を常法に従い
調製した。
の制限酵素ＥｃｏＲＩで３７℃、１６時間消化した後、
１ユニットのバクテリア由来アルカリホスファターゼで
末端を脱リン酸化した。これを１％アガロ−スゲルにて
電気泳動し、約１１．３ＫｂのＤＮＡ断片を常法に従い
調製した。
【００３６】ＴＡＫＡＲＡ社のＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏ
ｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１を用いて、１６℃、１６時間ラ
イゲ−ション反応を行い、上記のように調製した、ｐＢ
Ｍ０３０と、実施例２で調製したイヌＩＦＮ-γのＤＮ
Ａ断片を連結した。これを用いて常法に従い大腸菌ＨＢ
１０１を形質転換した。１００μｇ／ｍｌのアンピシリ
ンを含むＬＢプレート上に生育するコロニーの中から、
イヌＩＦＮ-γをコードするＤＮＡの開始コドンから２
７ｂｐまでを含むプライマー、すなわち、５’ＡＴＧＡ
ＡＴＴＡＴＡイヌＡＧＣＴＡＴＡＴＣＴＴＡＧＣＴ３’
（配列番号３）とｐＢＭ０３０のクローニングサイトＥ
ｃｏＲＩから下流の２６ｂｐのプライマー、すなわち、
５’ＡＴＣＡＡＣＡＡＣＧＣＡＣＡＧＡＡＴＣＴＡＡＣ
ＧＣＴ３’（配列番号４）の２種類のプライマーを用い
て、ＤＮＡの変性条件を９４℃，１分、プライマ−のア
ニ−リング条件を５５℃、２分、プライマ−の伸長条件
を７２℃、３分の各条件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ
Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡサ−マルサイクラ−を用い、３０
サイクルでＰＣＲを行い、約６５０ｂｐのＤＮＡ断片が
得られた、イヌＩＦＮ-γをコードするＤＮＡがｐＢＭ
０３０に正方向に組み込まれているプラスミドを得た。
この組換え体プラスミドをｐＢＭγとした。このプラス
ミドを含有する大腸菌をＥ．ｃｏｌｉ（ｐＢＭγ）と名
付けた。
ｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１を用いて、１６℃、１６時間ラ
イゲ−ション反応を行い、上記のように調製した、ｐＢ
Ｍ０３０と、実施例２で調製したイヌＩＦＮ-γのＤＮ
Ａ断片を連結した。これを用いて常法に従い大腸菌ＨＢ
１０１を形質転換した。１００μｇ／ｍｌのアンピシリ
ンを含むＬＢプレート上に生育するコロニーの中から、
イヌＩＦＮ-γをコードするＤＮＡの開始コドンから２
７ｂｐまでを含むプライマー、すなわち、５’ＡＴＧＡ
ＡＴＴＡＴＡイヌＡＧＣＴＡＴＡＴＣＴＴＡＧＣＴ３’
（配列番号３）とｐＢＭ０３０のクローニングサイトＥ
ｃｏＲＩから下流の２６ｂｐのプライマー、すなわち、
５’ＡＴＣＡＡＣＡＡＣＧＣＡＣＡＧＡＡＴＣＴＡＡＣ
ＧＣＴ３’（配列番号４）の２種類のプライマーを用い
て、ＤＮＡの変性条件を９４℃，１分、プライマ−のア
ニ−リング条件を５５℃、２分、プライマ−の伸長条件
を７２℃、３分の各条件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ
Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡサ−マルサイクラ−を用い、３０
サイクルでＰＣＲを行い、約６５０ｂｐのＤＮＡ断片が
得られた、イヌＩＦＮ-γをコードするＤＮＡがｐＢＭ
０３０に正方向に組み込まれているプラスミドを得た。
この組換え体プラスミドをｐＢＭγとした。このプラス
ミドを含有する大腸菌をＥ．ｃｏｌｉ（ｐＢＭγ）と名
付けた。
【００３７】（４）イヌＩＦＮ-γをコードするＤＮＡ
で組換えられた組換えカイコ核多角体病ウイルスの作製 参考文献４の方法で組換えウイルスを作製した。すなわ
ち、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．１）、
０.２８Ｍ ＮａＣｌ、０.７ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、０.
７ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4からなる２.５ｍｌの溶液に、２.
５ｍｌのＤＮＡ混合液（０.２５Ｍ ＣａＣｌ2、カイコ
核多角体病ウイルスＢｍＮＰＶ Ｔ３株（文献４）のＤ
ＮＡ１０μｇ、組換え体プラスミドｐＢＭγのＤＮＡ６
５μｇを含む）を滴下し、生じた懸濁液０．５ｍｌを５
ｍｌの１０％ＦＢＳを添加したＴＣ−１０培地（文献１
３）中、２５ｃｍ2のフラスコで平面培養した約３×１
０5個のＢＭ−Ｎ細胞の培養基に加え、カイコ細胞にＤ
ＮＡを導入した。２０時間後、新鮮な培地と交換し、さ
らに７日間培養後、培養液を回収した。その培養液を遠
心して清澄化した上清を希釈して平面に培養したＢＭ−
Ｎ細胞の培養基に添加して８日間培養後、顕微鏡観察に
よりウイルス感染が見られ、かつ多角体が形成していな
い培養基を選択した（限界希釈法）。
で組換えられた組換えカイコ核多角体病ウイルスの作製 参考文献４の方法で組換えウイルスを作製した。すなわ
ち、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．１）、
０.２８Ｍ ＮａＣｌ、０.７ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、０.
７ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4からなる２.５ｍｌの溶液に、２.
５ｍｌのＤＮＡ混合液（０.２５Ｍ ＣａＣｌ2、カイコ
核多角体病ウイルスＢｍＮＰＶ Ｔ３株（文献４）のＤ
ＮＡ１０μｇ、組換え体プラスミドｐＢＭγのＤＮＡ６
５μｇを含む）を滴下し、生じた懸濁液０．５ｍｌを５
ｍｌの１０％ＦＢＳを添加したＴＣ−１０培地（文献１
３）中、２５ｃｍ2のフラスコで平面培養した約３×１
０5個のＢＭ−Ｎ細胞の培養基に加え、カイコ細胞にＤ
ＮＡを導入した。２０時間後、新鮮な培地と交換し、さ
らに７日間培養後、培養液を回収した。その培養液を遠
心して清澄化した上清を希釈して平面に培養したＢＭ−
Ｎ細胞の培養基に添加して８日間培養後、顕微鏡観察に
よりウイルス感染が見られ、かつ多角体が形成していな
い培養基を選択した（限界希釈法）。
【００３８】限界希釈法を７回繰り返し、組換え体ウイ
ルスをクローニングした。ここで作製したイヌＩＦＮγ
をコードするＤＮＡを含む組換えウイルスをｒＢＮＶγ
とした。
ルスをクローニングした。ここで作製したイヌＩＦＮγ
をコードするＤＮＡを含む組換えウイルスをｒＢＮＶγ
とした。
【００３９】（５）ｒＢＮＶγウイルス液の調製 ７５ｃｍ２のフラスコ底面で、１５ｍｌの１０％ＦＢＳ
を含むＴＣ−１０培地中で平面培養した約３×１０6個
のＢＭ−Ｎ細胞に、前記（４）でクローニングした組換
え体ウイルスを含むＢＭ−Ｎ細胞の培養液５０μｌをＢ
Ｍ−Ｎ細胞に添加して、２７℃で５日間培養後、培養液
を３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、遠心上清を
組換え体ウイルス液として得た。ウイルス液を１０〜７
倍希釈し、その１ｍｌをＢＭ−Ｎ細胞の培養基に添加し
て２７℃で７日間培養を続けると、顕微鏡観察によって
培養基のＢＭ−Ｎ細胞にウイルス感染が認められた。
を含むＴＣ−１０培地中で平面培養した約３×１０6個
のＢＭ−Ｎ細胞に、前記（４）でクローニングした組換
え体ウイルスを含むＢＭ−Ｎ細胞の培養液５０μｌをＢ
Ｍ−Ｎ細胞に添加して、２７℃で５日間培養後、培養液
を３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、遠心上清を
組換え体ウイルス液として得た。ウイルス液を１０〜７
倍希釈し、その１ｍｌをＢＭ−Ｎ細胞の培養基に添加し
て２７℃で７日間培養を続けると、顕微鏡観察によって
培養基のＢＭ−Ｎ細胞にウイルス感染が認められた。
【００４０】参考例２ ＜ネコＩＦＮをコードするDNAを含む組換えカイコ核多
核体病ウイルスの作成＞ （１）ネコＩＦＮをコードする遺伝子断片の調製 プラスミドpFeIFN１（特開平２−１９５８８４）から、
特開平４−２０７１９８に示された方法にしたがって、
ネコＩＦＮをコードするDNAを含む組換えカイコ核多核
体病ウイルスを作成した。すなわち、pFeIFN１から得ら
れるネコＩＦＮ遺伝子を含むSfaN1-Hinc II 断片を pUC
１８に導入した後、BamHI - HincII 断片として再度切
り出しネコＩＦＮ遺伝子とした。
核体病ウイルスの作成＞ （１）ネコＩＦＮをコードする遺伝子断片の調製 プラスミドpFeIFN１（特開平２−１９５８８４）から、
特開平４−２０７１９８に示された方法にしたがって、
ネコＩＦＮをコードするDNAを含む組換えカイコ核多核
体病ウイルスを作成した。すなわち、pFeIFN１から得ら
れるネコＩＦＮ遺伝子を含むSfaN1-Hinc II 断片を pUC
１８に導入した後、BamHI - HincII 断片として再度切
り出しネコＩＦＮ遺伝子とした。
【００４１】（２）カイコ発現用プラスミドの作製 カイコクローニングベクターｐＢＭ０３０（文献４）の
Bgl II - Hinc IIサイトに上記（ａ）のBam HI - Hinc
II 断片を挿入してプラスミドｐＹＵ８７１を得た。
Bgl II - Hinc IIサイトに上記（ａ）のBam HI - Hinc
II 断片を挿入してプラスミドｐＹＵ８７１を得た。
【００４２】（３）ネコＩＦＮをコードするＤＮＡで組
換えられた組換えカイコ核多角体病ウイルスの作製 文献４の方法で組換えウイルスを作製した。すなわち、
５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．１）、０.
２８Ｍ ＮａＣｌ、０.７ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、０.７ｍ
Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4からなる２.５ｍｌの溶液に、２.５ｍ
ｌのＤＮＡ混合液（０.２５Ｍ ＣａＣｌ２、カイコ核
多角体病ウイルスＢｍＮＰＶ Ｔ３株（文献４）のＤＮ
Ａ１０μｇ、組換え体プラスミドｐＹＵ８７１のＤＮＡ
６５μｇを含む）を滴下し、生じた懸濁液０．５ｍｌを
５ｍｌの１０％ＦＢＳを添加したＴＣ−１０培地（文献
１３）中、２５ｃｍ2のフラスコで平面培養した約３×
１０5個のＢＭ−Ｎ細胞の培養基に加え、カイコ細胞に
ＤＮＡを導入した。２０時間後、新鮮な培地と交換し、
さらに７日間培養後、培養液を回収した。その培養液を
遠心して清澄化した上清を希釈して平面に培養したＢＭ
−Ｎ細胞の培養基に添加して８日間培養後、顕微鏡観察
によりウイルス感染が見られ、かつ多角体が形成してい
ない培養基を選択した（限界希釈法）。
換えられた組換えカイコ核多角体病ウイルスの作製 文献４の方法で組換えウイルスを作製した。すなわち、
５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．１）、０.
２８Ｍ ＮａＣｌ、０.７ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、０.７ｍ
Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4からなる２.５ｍｌの溶液に、２.５ｍ
ｌのＤＮＡ混合液（０.２５Ｍ ＣａＣｌ２、カイコ核
多角体病ウイルスＢｍＮＰＶ Ｔ３株（文献４）のＤＮ
Ａ１０μｇ、組換え体プラスミドｐＹＵ８７１のＤＮＡ
６５μｇを含む）を滴下し、生じた懸濁液０．５ｍｌを
５ｍｌの１０％ＦＢＳを添加したＴＣ−１０培地（文献
１３）中、２５ｃｍ2のフラスコで平面培養した約３×
１０5個のＢＭ−Ｎ細胞の培養基に加え、カイコ細胞に
ＤＮＡを導入した。２０時間後、新鮮な培地と交換し、
さらに７日間培養後、培養液を回収した。その培養液を
遠心して清澄化した上清を希釈して平面に培養したＢＭ
−Ｎ細胞の培養基に添加して８日間培養後、顕微鏡観察
によりウイルス感染が見られ、かつ多角体が形成してい
ない培養基を選択した（限界希釈法）。
【００４３】限界希釈法を７回繰り返し、組換え体ウイ
ルスをクローニングした。ここで作製したネコＩＦＮを
コードするＤＮＡを含む組換えウイルスをｒＢＮＶ１０
０とした。
ルスをクローニングした。ここで作製したネコＩＦＮを
コードするＤＮＡを含む組換えウイルスをｒＢＮＶ１０
０とした。
【００４４】（４）ｒＢＮＶ１００ウイルス液の調製 ７５ｃｍ2のフラスコ底面で、１５ｍｌの１０％ＦＢＳ
を含むＴＣ−１０培地中で平面培養した約３×１０6個
のＢＭ−Ｎ細胞に、前記（３）でクローニングした組換
え体ウイルスｒＢＮＶ１００を含むＢＭ−Ｎ細胞の培養
液５０μｌをＢＭ−Ｎ細胞に添加して、２７℃で５日間
培養後、培養液を３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し
て、遠心上清を組換え体ウイルス液として得た。ウイル
ス液を１０〜７倍希釈し、その１ｍｌをＢＭ−Ｎ細胞の
培養基に添加して２７℃で７日間培養を続けると、顕微
鏡観察によって培養基のＢＭ−Ｎ細胞にウイルス感染が
認められた。
を含むＴＣ−１０培地中で平面培養した約３×１０6個
のＢＭ−Ｎ細胞に、前記（３）でクローニングした組換
え体ウイルスｒＢＮＶ１００を含むＢＭ−Ｎ細胞の培養
液５０μｌをＢＭ−Ｎ細胞に添加して、２７℃で５日間
培養後、培養液を３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し
て、遠心上清を組換え体ウイルス液として得た。ウイル
ス液を１０〜７倍希釈し、その１ｍｌをＢＭ−Ｎ細胞の
培養基に添加して２７℃で７日間培養を続けると、顕微
鏡観察によって培養基のＢＭ−Ｎ細胞にウイルス感染が
認められた。
【００４５】参考例３ ＜抗ウイルス活性測定法＞抗ウイルス活性は、文献１１
に従ってＣＰＥ法により測定した。測定用ウイルスとし
てＶｅｓｉｃｕｌａｒ Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒ
ｕｓを用い、感受性細胞としては、イヌＩＦＮ-γの抗
ウイルス活性を測定する場合にはイヌＭＤＣＫ（ＡＴＣ
Ｃ ＣＣＬ−３４）細胞を、また、ネコＩＦＮの抗ウイ
ルス活性を測定する場合にはネコＦＣ９（文献１４）を
用いた。すなわち、９６穴マイクロプレート上にコンフ
ルーエントとなるまで３７℃で培養されたイヌＭＤＣＫ
（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３４）細胞にイヌＩＦＮ-γを含
むサンプルの希釈液を、または、同様に３７℃でコンフ
ルーエントとなるまで培養されたネコＦＣ９細胞にネコ
ＩＦＮを含むサンプルの希釈液を加え、さらに、３７℃
で２０時間から２４時間培養し抗ウイルス活性を誘導さ
せた。ＶＳＶを加え３７℃で２４時間培養した後、生存
してマイクロプレート上に付着しているイヌＭＤＣＫ細
胞、または、ネコＦＣ９細胞を２０％ホルマリンを含む
クリスタルバイオレット染色液で染色した。マイクロプ
レート上のクリスタルバイオレットの量を５７０nm に
おける吸光度を測定することによって、細胞を５０％生
存させる時のイヌＩＦＮ-γ、または、ネコＩＦＮの量
を求め、この時のイヌＩＦＮ-γ、または、ネコＩＦＮ
の量を、抗ウイルス活性１ユニット（１Ｕ）と定義し
た。
に従ってＣＰＥ法により測定した。測定用ウイルスとし
てＶｅｓｉｃｕｌａｒ Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒ
ｕｓを用い、感受性細胞としては、イヌＩＦＮ-γの抗
ウイルス活性を測定する場合にはイヌＭＤＣＫ（ＡＴＣ
Ｃ ＣＣＬ−３４）細胞を、また、ネコＩＦＮの抗ウイ
ルス活性を測定する場合にはネコＦＣ９（文献１４）を
用いた。すなわち、９６穴マイクロプレート上にコンフ
ルーエントとなるまで３７℃で培養されたイヌＭＤＣＫ
（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３４）細胞にイヌＩＦＮ-γを含
むサンプルの希釈液を、または、同様に３７℃でコンフ
ルーエントとなるまで培養されたネコＦＣ９細胞にネコ
ＩＦＮを含むサンプルの希釈液を加え、さらに、３７℃
で２０時間から２４時間培養し抗ウイルス活性を誘導さ
せた。ＶＳＶを加え３７℃で２４時間培養した後、生存
してマイクロプレート上に付着しているイヌＭＤＣＫ細
胞、または、ネコＦＣ９細胞を２０％ホルマリンを含む
クリスタルバイオレット染色液で染色した。マイクロプ
レート上のクリスタルバイオレットの量を５７０nm に
おける吸光度を測定することによって、細胞を５０％生
存させる時のイヌＩＦＮ-γ、または、ネコＩＦＮの量
を求め、この時のイヌＩＦＮ-γ、または、ネコＩＦＮ
の量を、抗ウイルス活性１ユニット（１Ｕ）と定義し
た。
【００４６】参考例４ ＜細胞変性効果によるウイルス濃度の定量＞文献１４の
方法に従って、組換えウイルス濃度を定量した。すなわ
ち、組換えカイコ核多角体病ウイルスを感染させたカイ
コ培養細胞培養上清、または、カイコ幼虫体液抽出液を
希釈し、５×１０5個／ｍｌのＢＭ−Ｎ細胞培養液に添
加した。２７℃で１０日間培養した後に、顕微鏡観察に
よってＢＭ−Ｎ細胞に対する細胞変性効果を確認し、感
染性ウイルス量を算定した。感染性ウイルス量は、文献
１５に従ってＴＣＩＤ５０（５０％ tissue culture in
fectious dose）を求めることによって決定した。
方法に従って、組換えウイルス濃度を定量した。すなわ
ち、組換えカイコ核多角体病ウイルスを感染させたカイ
コ培養細胞培養上清、または、カイコ幼虫体液抽出液を
希釈し、５×１０5個／ｍｌのＢＭ−Ｎ細胞培養液に添
加した。２７℃で１０日間培養した後に、顕微鏡観察に
よってＢＭ−Ｎ細胞に対する細胞変性効果を確認し、感
染性ウイルス量を算定した。感染性ウイルス量は、文献
１５に従ってＴＣＩＤ５０（５０％ tissue culture in
fectious dose）を求めることによって決定した。
【００４７】実施例１ ＜カイコ生体中でのイヌＩＦＮ-γの生産と限外濾過に
よる夾雑蛋白質の除去＞５令２日目のカイコ幼虫に、参
考例１の（５）で得た組換え体ウイルスのウイルス液を
２μｌ／頭注射し、２５℃で４日間、市販の人工飼料
（カネボウシルクエレガンス社製）を与えて飼育した。
１０頭のカイコの腹部を切り、０％、０.０１％、また
は、０.０２％の塩化ベンザルコニウムを含む１００ｍ
ｌの５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ３. ５）に浸漬し、
４℃で２０時間保持した。得られたカイコ体液抽出液を
２Ｎ ＮａＯＨで中和した後に、５,０００ｒｐｍで１５
分間遠心分離し上清を回収した。得られた上清２ｍｌを
分子量分画１００,０００の限外濾過膜を用いて、３,０
００ｒｐｍで４５分間遠心することで限外濾過処理を行
い、透過液と未透過液の液量、蛋白濃度、抗ウイルス活
性を測定した結果を表１に示す。
よる夾雑蛋白質の除去＞５令２日目のカイコ幼虫に、参
考例１の（５）で得た組換え体ウイルスのウイルス液を
２μｌ／頭注射し、２５℃で４日間、市販の人工飼料
（カネボウシルクエレガンス社製）を与えて飼育した。
１０頭のカイコの腹部を切り、０％、０.０１％、また
は、０.０２％の塩化ベンザルコニウムを含む１００ｍ
ｌの５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ３. ５）に浸漬し、
４℃で２０時間保持した。得られたカイコ体液抽出液を
２Ｎ ＮａＯＨで中和した後に、５,０００ｒｐｍで１５
分間遠心分離し上清を回収した。得られた上清２ｍｌを
分子量分画１００,０００の限外濾過膜を用いて、３,０
００ｒｐｍで４５分間遠心することで限外濾過処理を行
い、透過液と未透過液の液量、蛋白濃度、抗ウイルス活
性を測定した結果を表１に示す。
【００４８】
【表１】
【００４９】表１から、０.０１％以上の塩化ベンザル
コニウム処理によって限外濾過処理における透過液量が
無添加の場合に比較して増加し、その結果、回収蛋白量
も大幅に増大したことがわかる。つまり、塩化ベンザル
コニウムは限外濾過における濾過性を大幅に改善する効
果を有することがわかる。また、この時の透過液側のイ
ヌＩＦＮ−γの比活性が処理前の比活性と比較して向上
していることから、限外濾過処理がイヌＩＦＮ−γの精
製においても有効なことがわかる。
コニウム処理によって限外濾過処理における透過液量が
無添加の場合に比較して増加し、その結果、回収蛋白量
も大幅に増大したことがわかる。つまり、塩化ベンザル
コニウムは限外濾過における濾過性を大幅に改善する効
果を有することがわかる。また、この時の透過液側のイ
ヌＩＦＮ−γの比活性が処理前の比活性と比較して向上
していることから、限外濾過処理がイヌＩＦＮ−γの精
製においても有効なことがわかる。
【００５０】実施例２ ＜限外濾過によるカイコ幼虫体液由来蛋白質の除去＞５
令２日目のカイコ幼虫に、参考例１の（５）で得た組換
え体ウイルスのウイルス液を２μｌ／頭注射し、２５℃
で４日間、市販の人工飼料（カネボウシルクエレガンス
社製）を与えて飼育した。１０頭のカイコの腹部を切
り、０.０１％の塩化ベンザルコニウムを含む１００ｍ
ｌの５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ３.５）に浸漬し、
４℃で２０時間保持した。得られたカイコ体液抽出液を
２Ｎ ＮａＯＨで中和した後に、５,０００ｒｐｍで１５
分間遠心分離し上清を回収した。得られた上清２ｍｌを
分子量分画５０,０００、１００,０００、そして、３０
０,０００の限外濾過膜を用いて、３,０００ｒｐｍで４
５分間遠心することで限外濾過処理を行い、その透過液
と未透過液を回収した。この透過液と未透過液の蛋白量
の測定結果を表２に示した。また、分子量分画１００,
０００と３００,０００の限外濾過膜を用いた時の透過
液と未透過液のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるクマシーブリ
リアントブルーによる染色結果を図１に示した。
令２日目のカイコ幼虫に、参考例１の（５）で得た組換
え体ウイルスのウイルス液を２μｌ／頭注射し、２５℃
で４日間、市販の人工飼料（カネボウシルクエレガンス
社製）を与えて飼育した。１０頭のカイコの腹部を切
り、０.０１％の塩化ベンザルコニウムを含む１００ｍ
ｌの５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ３.５）に浸漬し、
４℃で２０時間保持した。得られたカイコ体液抽出液を
２Ｎ ＮａＯＨで中和した後に、５,０００ｒｐｍで１５
分間遠心分離し上清を回収した。得られた上清２ｍｌを
分子量分画５０,０００、１００,０００、そして、３０
０,０００の限外濾過膜を用いて、３,０００ｒｐｍで４
５分間遠心することで限外濾過処理を行い、その透過液
と未透過液を回収した。この透過液と未透過液の蛋白量
の測定結果を表２に示した。また、分子量分画１００,
０００と３００,０００の限外濾過膜を用いた時の透過
液と未透過液のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるクマシーブリ
リアントブルーによる染色結果を図１に示した。
【００５１】
【表２】
【００５２】表２から、分子量分画サイズ３００,００
０の限外濾過膜を用いた限外濾過では、処理前のカイコ
体液抽出液の蛋白濃度と透過液の蛋白濃度がほとんど同
じことから、カイコ幼虫体液のほぼ全ての蛋白質が、分
子量分画サイズ３００,０００の限外濾過膜を透過する
ことがわかる。このことは、図１のＳＤＳ−ＰＡＧＥの
結果からも明らかである。したがって、分子量分画サイ
ズ３００,０００の限外濾過膜ではカイコ幼虫体液中の
夾雑蛋白質を有効に除去することは困難である。一方、
図１から、分子量分画１００,０００の限外濾過処理に
おける透過液には、カイコ幼虫体液中の主な蛋白である
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分子量３０,０００と７０,０００
の蛋白がほとんどないことがわかる。したがって、目的
とする蛋白質が、分子量分画サイズ１００,０００の限
外濾過膜を透過する場合には、用いた限外濾過膜の透過
液中では夾雑蛋白質の大半が除去されているため、目的
とする有用蛋白質を透過液から効率的に回収できること
がわかる。
０の限外濾過膜を用いた限外濾過では、処理前のカイコ
体液抽出液の蛋白濃度と透過液の蛋白濃度がほとんど同
じことから、カイコ幼虫体液のほぼ全ての蛋白質が、分
子量分画サイズ３００,０００の限外濾過膜を透過する
ことがわかる。このことは、図１のＳＤＳ−ＰＡＧＥの
結果からも明らかである。したがって、分子量分画サイ
ズ３００,０００の限外濾過膜ではカイコ幼虫体液中の
夾雑蛋白質を有効に除去することは困難である。一方、
図１から、分子量分画１００,０００の限外濾過処理に
おける透過液には、カイコ幼虫体液中の主な蛋白である
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分子量３０,０００と７０,０００
の蛋白がほとんどないことがわかる。したがって、目的
とする蛋白質が、分子量分画サイズ１００,０００の限
外濾過膜を透過する場合には、用いた限外濾過膜の透過
液中では夾雑蛋白質の大半が除去されているため、目的
とする有用蛋白質を透過液から効率的に回収できること
がわかる。
【００５３】実施例３ ＜カイコ生体中でのネコＩＦＮの生産と限外濾過による
夾雑蛋白の除去＞５令２日目のカイコ幼虫に、参考例２
の（４）で得た組換え体ウイルスのウイルス液を２μｌ
／頭注射し、２５℃で４日間、市販の人工飼料（カネボ
ウシルクエレガンス社製）を与えて飼育した。１０頭の
カイコの腹部を切り、０％、０.０１％塩化ベンザルコ
ニウムを含む１００ｍｌの５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐ
Ｈ３. ５）に浸漬し、４℃で２０時間保持した。得られ
たカイコ体液抽出液を２ＮＮaＯＨで中和した後、５,０
００ｒｐｍで１５分間遠心分離し上清を回収した。得ら
れた上清２ｍｌを分子量分画１００,０００の限外濾過
膜を用いて、３,０００ｒｐｍで３０分間遠心すること
で限外濾過処理を行い、透過液と未透過液の液量、抗ウ
イルス活性、蛋白濃度を測定した結果を表３に示す。
夾雑蛋白の除去＞５令２日目のカイコ幼虫に、参考例２
の（４）で得た組換え体ウイルスのウイルス液を２μｌ
／頭注射し、２５℃で４日間、市販の人工飼料（カネボ
ウシルクエレガンス社製）を与えて飼育した。１０頭の
カイコの腹部を切り、０％、０.０１％塩化ベンザルコ
ニウムを含む１００ｍｌの５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐ
Ｈ３. ５）に浸漬し、４℃で２０時間保持した。得られ
たカイコ体液抽出液を２ＮＮaＯＨで中和した後、５,０
００ｒｐｍで１５分間遠心分離し上清を回収した。得ら
れた上清２ｍｌを分子量分画１００,０００の限外濾過
膜を用いて、３,０００ｒｐｍで３０分間遠心すること
で限外濾過処理を行い、透過液と未透過液の液量、抗ウ
イルス活性、蛋白濃度を測定した結果を表３に示す。
【００５４】
【表３】
【００５５】表３から、０.０１％の塩化ベンザルコニ
ウム処理によって限外濾過処理における透過液量が無添
加の場合に比較して大きく増加し、その結果、回収蛋白
量も大幅に増大したことがわかる。つまり、塩化ベンザ
ルコニウムは限外濾過における濾過性を大幅に改善する
効果を有することがわかる。また、この時の透過液側の
ネコＩＦＮの比活性が処理前の比活性と比較して向上し
ていることから、限外濾過処理がネコＩＦＮの精製にお
いても有効なことがわかる。
ウム処理によって限外濾過処理における透過液量が無添
加の場合に比較して大きく増加し、その結果、回収蛋白
量も大幅に増大したことがわかる。つまり、塩化ベンザ
ルコニウムは限外濾過における濾過性を大幅に改善する
効果を有することがわかる。また、この時の透過液側の
ネコＩＦＮの比活性が処理前の比活性と比較して向上し
ていることから、限外濾過処理がネコＩＦＮの精製にお
いても有効なことがわかる。
【００５６】実施例４ ＜金属キレート剤添加による限外濾過＞５令２日目のカ
イコ幼虫に、参考例１の（５）で得た組換え体ウイルス
のウイルス液を２μｌ／頭注射し、２５℃で４日間、市
販の人工飼料（カネボウシルクエレガンス社製）を与え
て飼育した。１０頭のカイコの腹部を切り、ＥＤＴＡを
終濃度で０ｍＭ、１.２５ｍＭ、２.５ｍＭ、５ｍＭを添
加した０.０１％の塩化ベンザルコニウムを含む１００
ｍｌの５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ３. ５）に浸漬
し、４℃で２０時間保持した。得られたカイコ体液抽出
液を２Ｎ ＮａＯＨで中和した後に、５,０００ｒｐｍで
１５分間遠心分離し上清を回収した。この上清を４℃で
７日間保存した時の着色度を５００ｎｍにおける吸光度
を測定することで求めた。さらに、その２ｍｌを分子量
分画サイズ１００,０００の限外濾過膜を用いて、３,０
００ｒｐｍで３０分間遠心することで限外濾過処理を行
い、透過液の液量、蛋白濃度を測定した結果を表４に示
す。
イコ幼虫に、参考例１の（５）で得た組換え体ウイルス
のウイルス液を２μｌ／頭注射し、２５℃で４日間、市
販の人工飼料（カネボウシルクエレガンス社製）を与え
て飼育した。１０頭のカイコの腹部を切り、ＥＤＴＡを
終濃度で０ｍＭ、１.２５ｍＭ、２.５ｍＭ、５ｍＭを添
加した０.０１％の塩化ベンザルコニウムを含む１００
ｍｌの５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ３. ５）に浸漬
し、４℃で２０時間保持した。得られたカイコ体液抽出
液を２Ｎ ＮａＯＨで中和した後に、５,０００ｒｐｍで
１５分間遠心分離し上清を回収した。この上清を４℃で
７日間保存した時の着色度を５００ｎｍにおける吸光度
を測定することで求めた。さらに、その２ｍｌを分子量
分画サイズ１００,０００の限外濾過膜を用いて、３,０
００ｒｐｍで３０分間遠心することで限外濾過処理を行
い、透過液の液量、蛋白濃度を測定した結果を表４に示
す。
【００５７】
【表４】
【００５８】表４から、２.５ｍＭ以上のＥＤＴＡを添
加した場合には、カイコ幼虫体液抽出液の着色は明らか
に抑制されており、また、着色の程度が低いほど限外濾
過における濾過性が良好なことがわかる。
加した場合には、カイコ幼虫体液抽出液の着色は明らか
に抑制されており、また、着色の程度が低いほど限外濾
過における濾過性が良好なことがわかる。
【００５９】実施例５ ＜酸性条件下での限外濾過＞５令２日目のカイコ幼虫
に、参考例１の（５）で得た組換え体ウイルスのウイル
ス液を２μｌ／頭注射し、２５℃で４日間、市販の人工
飼料（カネボウシルクエレガンス社製）を与えて飼育し
た。１０頭のカイコの腹部を切り、０.０１％の塩化ベ
ンザルコニウムを含む１００ｍｌの５０ｍＭ酢酸バッフ
ァー（ｐＨ３.５）に浸漬し４℃で２０時間保持した。
この抽出液を２分割し、２Ｎ ＮａＯＨを用いて一方を
ｐＨ５に、他方をｐＨ７に調整した。これらｐＨ調整し
た抽出液を遠心分離（５,０００ｒｐｍで１５分間）し
上清を回収し、得られた上清を４℃で保存した。７日
後、この上清の５００ｎｍにおける吸光度を測定した。
さらに、その２ｍｌを分子量分画サイズ１００,０００
の限外濾過膜を用いて、３,０００ｒｐｍで３０分間遠
心することで限外濾過処理を行い、透過液の液量、蛋白
濃度を測定した結果を表５に示す。
に、参考例１の（５）で得た組換え体ウイルスのウイル
ス液を２μｌ／頭注射し、２５℃で４日間、市販の人工
飼料（カネボウシルクエレガンス社製）を与えて飼育し
た。１０頭のカイコの腹部を切り、０.０１％の塩化ベ
ンザルコニウムを含む１００ｍｌの５０ｍＭ酢酸バッフ
ァー（ｐＨ３.５）に浸漬し４℃で２０時間保持した。
この抽出液を２分割し、２Ｎ ＮａＯＨを用いて一方を
ｐＨ５に、他方をｐＨ７に調整した。これらｐＨ調整し
た抽出液を遠心分離（５,０００ｒｐｍで１５分間）し
上清を回収し、得られた上清を４℃で保存した。７日
後、この上清の５００ｎｍにおける吸光度を測定した。
さらに、その２ｍｌを分子量分画サイズ１００,０００
の限外濾過膜を用いて、３,０００ｒｐｍで３０分間遠
心することで限外濾過処理を行い、透過液の液量、蛋白
濃度を測定した結果を表５に示す。
【００６０】
【表５】
【００６１】表５から明らかな様に、ｐＨ５に調整した
カイコ幼虫体液抽出液の着色は明らかに抑制されてお
り、また、着色の程度が低いｐＨ５の方が、ｐＨ７より
限外濾過における濾過性が良好なことがわかる。
カイコ幼虫体液抽出液の着色は明らかに抑制されてお
り、また、着色の程度が低いｐＨ５の方が、ｐＨ７より
限外濾過における濾過性が良好なことがわかる。
【００６２】実施例６ ＜塩存在下での限外濾過＞５令２日目のカイコ幼虫に、
参考例１の（５）で得た組換え体ウイルスのウイルス液
を２μｌ／頭注射し、２５℃で４日間、市販の人工飼料
（カネボウシルクエレガンス社製）を与えて飼育した。
１００頭のカイコの腹部を切り、１０００ｍｌの２０ｍ
Ｍリン酸バッファー（ｐＨ４.０）に浸漬し４℃で２０
時間保持した。
参考例１の（５）で得た組換え体ウイルスのウイルス液
を２μｌ／頭注射し、２５℃で４日間、市販の人工飼料
（カネボウシルクエレガンス社製）を与えて飼育した。
１００頭のカイコの腹部を切り、１０００ｍｌの２０ｍ
Ｍリン酸バッファー（ｐＨ４.０）に浸漬し４℃で２０
時間保持した。
【００６３】得られたカイコ体液抽出液を２Ｎ ＮａＯ
Ｈで中和したのち、８,０００ｒｐｍで１０分間遠心分
離し上清を回収した。得られた上清液約１ｌを２等分
し、一つは、分子量分画５０,０００の限外濾過膜（親
水性ポリエーテルスルホン製）を用いて、そのまま限外
濾過した。もう一方は、終濃度２ＭとなるようにＮａＣ
ｌを加え、よく溶解したのちに限外濾過した。得られた
それぞれの透過液中のイヌＩＦＮ-γ活性と蛋白濃度を
測定した結果を表６に示した。
Ｈで中和したのち、８,０００ｒｐｍで１０分間遠心分
離し上清を回収した。得られた上清液約１ｌを２等分
し、一つは、分子量分画５０,０００の限外濾過膜（親
水性ポリエーテルスルホン製）を用いて、そのまま限外
濾過した。もう一方は、終濃度２ＭとなるようにＮａＣ
ｌを加え、よく溶解したのちに限外濾過した。得られた
それぞれの透過液中のイヌＩＦＮ-γ活性と蛋白濃度を
測定した結果を表６に示した。
【００６４】
【表６】
【００６５】表６から明らかなようにＮａＣｌ存在下で
限外濾過することで、透過液中のイヌＩＦＮ-γの比活
性が大幅に改善されおり、高塩濃度で限外濾過すること
でさらに精製効率が向上することが分かる。
限外濾過することで、透過液中のイヌＩＦＮ-γの比活
性が大幅に改善されおり、高塩濃度で限外濾過すること
でさらに精製効率が向上することが分かる。
【００６６】実施例７ ＜限外濾過による組換えカイコ核多核体病ウイルスの除
去＞５令２日目のカイコ幼虫に、参考例１の（５）で得
た組換え体ウイルスのウイルス液を２μｌ／頭注射し、
２５℃で４日間、市販の人工飼料（カネボウシルクエレ
ガンス社製）を与えて飼育した。１０頭のカイコの腹部
を切り、１００ｍｌの蒸留水に浸漬し４℃で２０時間保
持した。得られたカイコ体液抽出液を５,０００ｒｐｍ
で１５分間遠心分離し上清を回収した。得られた上清２
ｍｌを分子量分画サイズ５０,０００、１００,０００、
そして、３００,０００の限外濾過膜を用いて、３,００
０ｒｐｍで３０分間遠心することで限外濾過処理を行
い、その透過液中の組換えカイコ核多核体病ウイルスの
量を測定した。なお、対照として限外濾過を行わないと
きのカイコ幼虫体液抽出液中の組換えカイコ核多核体病
ウイルスの量も測定した。
去＞５令２日目のカイコ幼虫に、参考例１の（５）で得
た組換え体ウイルスのウイルス液を２μｌ／頭注射し、
２５℃で４日間、市販の人工飼料（カネボウシルクエレ
ガンス社製）を与えて飼育した。１０頭のカイコの腹部
を切り、１００ｍｌの蒸留水に浸漬し４℃で２０時間保
持した。得られたカイコ体液抽出液を５,０００ｒｐｍ
で１５分間遠心分離し上清を回収した。得られた上清２
ｍｌを分子量分画サイズ５０,０００、１００,０００、
そして、３００,０００の限外濾過膜を用いて、３,００
０ｒｐｍで３０分間遠心することで限外濾過処理を行
い、その透過液中の組換えカイコ核多核体病ウイルスの
量を測定した。なお、対照として限外濾過を行わないと
きのカイコ幼虫体液抽出液中の組換えカイコ核多核体病
ウイルスの量も測定した。
【００６７】
【表７】
【００６８】表７に示した結果から、限外濾過により、
ウイルス量の減少が認められ、分子量分画サイズ１０
０,０００以下の限外濾過膜の透過液中には、組換えカ
イコ核多核体病ウイルスが検出されないことから、分子
量分画サイズ１００,０００以下の限外濾過膜を用いた
限外濾過処理によって、組換えカイコ核多核体病ウイル
スが完全に除去されることがわかる。
ウイルス量の減少が認められ、分子量分画サイズ１０
０,０００以下の限外濾過膜の透過液中には、組換えカ
イコ核多核体病ウイルスが検出されないことから、分子
量分画サイズ１００,０００以下の限外濾過膜を用いた
限外濾過処理によって、組換えカイコ核多核体病ウイル
スが完全に除去されることがわかる。
【００６９】実施例７ ＜カイコ生体中で生産したイヌＩＦＮ-γの精製＞５令
２日目のカイコ幼虫に、参考例１の（５）で得た組換え
体ウイルスのウイルス液を２μｌ／頭注射し、市販の人
工飼料（カネボウシルクエレガンス社製）を与えて、２
５℃で４日間飼育した。２５頭のカイコの腹部を切り、
ＥＤＴＡを終濃度で２.５ｍＭ添加した０.０１％の塩化
ベンザルコニウムを含む２５０ｍｌの５０ｍＭ酢酸バッ
ファー（ｐＨ３.５）に浸漬し、４℃で２０時間保持し
た。２Ｎ ＮａＯＨで中和した後、遠心分離（５,０００
ｒｐｍ、１５分間）によって上清を得た。このカイコ体
液抽出物（イヌＩＦＮ-γ活性：４.０×１０6U／ｍｌ、
比活性５.６×１０5U／ｍｇ蛋白質）を材料として精製
を行った。このカイコ抽出液２５０ｍｌを、ホローファ
イバー型の限外濾過装置（Amicon社製、分子量分画サイ
ズ１００,０００、Ｈ１Ｐ４０−１００）を用いて限外
濾過を行い透過液２３０ｍｌを得た。この透過液２００
ｍｌを担体量５ｍｌの"スルホプロピルセファロース
（ハイパフォーマンスタイプ）"にかけ、２０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７.０）５０ｍｌで洗浄後、塩化ナトリ
ウムの直線的な濃度勾配により吸着物を溶出し、抗ウイ
ルス活性画分を集めて、イヌＩＦＮ-γを回収した。こ
の画分は６.０×１０6U／ｍｌのイヌＩＦＮ-γ活性を含
み、比活性は７.１×１０7U／ｍｇであった。この時の
イヌＩＦＮ-γ活性の回収率は８９％であり、比活性は
１２７倍に向上した。なお、対照実験として、限外濾過
処理だけを省略した同様のイヌＩＦＮ−γの精製を行っ
たが、イヌＩＦＮ−γの回収率は３５％と低く、比活性
の向上度も４６倍と低い値であった。なお、この対照実
験では、大半のイヌＩＦＮ−γ活性がカラムの通過画分
に回収された。
２日目のカイコ幼虫に、参考例１の（５）で得た組換え
体ウイルスのウイルス液を２μｌ／頭注射し、市販の人
工飼料（カネボウシルクエレガンス社製）を与えて、２
５℃で４日間飼育した。２５頭のカイコの腹部を切り、
ＥＤＴＡを終濃度で２.５ｍＭ添加した０.０１％の塩化
ベンザルコニウムを含む２５０ｍｌの５０ｍＭ酢酸バッ
ファー（ｐＨ３.５）に浸漬し、４℃で２０時間保持し
た。２Ｎ ＮａＯＨで中和した後、遠心分離（５,０００
ｒｐｍ、１５分間）によって上清を得た。このカイコ体
液抽出物（イヌＩＦＮ-γ活性：４.０×１０6U／ｍｌ、
比活性５.６×１０5U／ｍｇ蛋白質）を材料として精製
を行った。このカイコ抽出液２５０ｍｌを、ホローファ
イバー型の限外濾過装置（Amicon社製、分子量分画サイ
ズ１００,０００、Ｈ１Ｐ４０−１００）を用いて限外
濾過を行い透過液２３０ｍｌを得た。この透過液２００
ｍｌを担体量５ｍｌの"スルホプロピルセファロース
（ハイパフォーマンスタイプ）"にかけ、２０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７.０）５０ｍｌで洗浄後、塩化ナトリ
ウムの直線的な濃度勾配により吸着物を溶出し、抗ウイ
ルス活性画分を集めて、イヌＩＦＮ-γを回収した。こ
の画分は６.０×１０6U／ｍｌのイヌＩＦＮ-γ活性を含
み、比活性は７.１×１０7U／ｍｇであった。この時の
イヌＩＦＮ-γ活性の回収率は８９％であり、比活性は
１２７倍に向上した。なお、対照実験として、限外濾過
処理だけを省略した同様のイヌＩＦＮ−γの精製を行っ
たが、イヌＩＦＮ−γの回収率は３５％と低く、比活性
の向上度も４６倍と低い値であった。なお、この対照実
験では、大半のイヌＩＦＮ−γ活性がカラムの通過画分
に回収された。
【００７０】実施例８ ＜カイコ生体中で生産したネコＩＦＮの精製＞５令２日
目のカイコ幼虫に、実施例２の（４）で得た組換え体ウ
イルスのウイルス液を２μｌ／頭注射し、市販の人工飼
料（カネボウシルクエレガンス社製）を与えて、２５℃
で４日間飼育した。２５頭のカイコの腹部を切り、ＥＤ
ＴＡを終濃度で２.５ｍＭ添加した０.０１％の塩化ベン
ザルコニウムを含む２５０ｍｌの５０ｍＭ酢酸バッファ
ー（ｐＨ３. ５）に浸漬し、４℃で２０時間保持した。
２Ｎ ＮａＯＨで中和した後、遠心分離（５,０００ｒｐ
ｍ、１５分間）によって上清を得た。このカイコ体液抽
出物（ネコＩＦＮ活性：３.０×１０6U／ｍｌ、比活
性：６.１×１０5U／ｍｇ蛋白質）を材料として精製を
行った。このカイコ抽出液２５０ｍｌを、ホローファイ
バー型の限外濾過装置（Amicon社製、分子量分画サイズ
１００,０００、Ｈ１Ｐ４０−１００）を用いて限外濾
過を行い透過液２２０ｍｌを得た。このカイコ抽出液２
００ｍｌを、担体量５ｍｌの"ブルーセファロース（ハ
イパフォーマンスタイプ）"にかけ、続いてこのカラム
を０.５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ８.０）２００ｍｌで溶出した。溶出液は、２.９
×１０6U／ｍｌのネコＩＦＮ活性を含み、比活性は４.
８×１０7U／ｍｇ蛋白質であった。この時のネコＩＦＮ
活性の回収率は９２％であり、比活性は７９倍に向上し
た。なお、対照実験として、限外濾過処理だけを省略し
た同様のネコＩＦＮの精製を行ったが、ネコＩＦＮの回
収率は４７％と低く、比活性の向上度も３８倍と低い値
であった。なお、この対照実験では、大半のネコＩＦＮ
活性がカラムの通過画分に回収された。
目のカイコ幼虫に、実施例２の（４）で得た組換え体ウ
イルスのウイルス液を２μｌ／頭注射し、市販の人工飼
料（カネボウシルクエレガンス社製）を与えて、２５℃
で４日間飼育した。２５頭のカイコの腹部を切り、ＥＤ
ＴＡを終濃度で２.５ｍＭ添加した０.０１％の塩化ベン
ザルコニウムを含む２５０ｍｌの５０ｍＭ酢酸バッファ
ー（ｐＨ３. ５）に浸漬し、４℃で２０時間保持した。
２Ｎ ＮａＯＨで中和した後、遠心分離（５,０００ｒｐ
ｍ、１５分間）によって上清を得た。このカイコ体液抽
出物（ネコＩＦＮ活性：３.０×１０6U／ｍｌ、比活
性：６.１×１０5U／ｍｇ蛋白質）を材料として精製を
行った。このカイコ抽出液２５０ｍｌを、ホローファイ
バー型の限外濾過装置（Amicon社製、分子量分画サイズ
１００,０００、Ｈ１Ｐ４０−１００）を用いて限外濾
過を行い透過液２２０ｍｌを得た。このカイコ抽出液２
００ｍｌを、担体量５ｍｌの"ブルーセファロース（ハ
イパフォーマンスタイプ）"にかけ、続いてこのカラム
を０.５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ８.０）２００ｍｌで溶出した。溶出液は、２.９
×１０6U／ｍｌのネコＩＦＮ活性を含み、比活性は４.
８×１０7U／ｍｇ蛋白質であった。この時のネコＩＦＮ
活性の回収率は９２％であり、比活性は７９倍に向上し
た。なお、対照実験として、限外濾過処理だけを省略し
た同様のネコＩＦＮの精製を行ったが、ネコＩＦＮの回
収率は４７％と低く、比活性の向上度も３８倍と低い値
であった。なお、この対照実験では、大半のネコＩＦＮ
活性がカラムの通過画分に回収された。
【００７１】
【発明の効果】組換えバキュロウイルスを用いた有用蛋
白質の製造において、限外濾過処理を行うことで、組換
えバキュロウイルスの除去と有用蛋白質の精製が同時に
可能となり、かつ、目的とする有用蛋白質の精製が容易
になる。以って有用蛋白質の量産化を可能とし、高純度
かつ安価な医薬品（抗腫瘍・抗ウイルス剤等）の製造が
可能となる。
白質の製造において、限外濾過処理を行うことで、組換
えバキュロウイルスの除去と有用蛋白質の精製が同時に
可能となり、かつ、目的とする有用蛋白質の精製が容易
になる。以って有用蛋白質の量産化を可能とし、高純度
かつ安価な医薬品（抗腫瘍・抗ウイルス剤等）の製造が
可能となる。
【００７２】参考文献 １．Ｓ．Ｗａｔａｎａｂｅら：Ｊａｐａｎ Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．，２１，２９９−３１３（１９５１） ２．Ｎ．Ｙａｍａｍｏｔｏrら：Ｂｏｋｉｎ Ｂｏｂａ
ｉ，１６，５０５−５０８（１９８８） ３．Ｍ．Ｗａｔａｎａｂｅら：日本蚕糸学雑誌，３７，
２１３−２１８（１９６８） ４．Ｔ．Ｈｏｒｉｕｃｈｉら：Ａｇｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．，５１，１５７３−１５８０，（１９８７）． ５．Ｄｅｖｏｓら：Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ
ｅｒｃｈ，１２，９５−１０２（１９９２）． ６．Ｃｈｉｒｇｗｉｎら：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、
１８、５２９４（１９７９）． ７．Ｂｅｒｇｅｒら：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１
８，５１４３（１９７９）． ８．Ｇｕｂｌｅｒら：Ｇｅｅｎ．２５，２３６−２６９
（１９８３）． ９．Ｏｋａｙａｍａら：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，２，１６１，（１９８２）＆ ３，２８０，（１
９８３）． １０．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒ
ｙ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．１９８２． １１．Ｐｒｏｂｅｒら：Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８，３
３６−３４１（１９８７）． １２．日本生化学会編：続生化学実験講座第５巻、（１
９８６）．Ｐ２５０−２５６、東京化学同人． １３．G. R. Ｇａｒｄｉｎｅｒら：Ｊ．Ｉｎｖｅｒｔｅ
ｂｒａｔｅ Ｐｈａｔｈｏｌ．２５，３６３−３７０
（１９７５） １４．Ｊ．Ｋ．Ｙａｍａｍｏｔｏら：Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏ ｐａｔｈｏｌ．，１
１，１−１９（１９８６） １５．モダンバイオロジーシリーズ２３、動物組織培養
法（１９７６）Ｐ２９６−３００、共立出版 １６．Ｉｊｚｅｒｍａｎｓら：Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ，１７９，４５６−４７３（１９８９）
ｐ．Ｍｅｄ．，２１，２９９−３１３（１９５１） ２．Ｎ．Ｙａｍａｍｏｔｏrら：Ｂｏｋｉｎ Ｂｏｂａ
ｉ，１６，５０５−５０８（１９８８） ３．Ｍ．Ｗａｔａｎａｂｅら：日本蚕糸学雑誌，３７，
２１３−２１８（１９６８） ４．Ｔ．Ｈｏｒｉｕｃｈｉら：Ａｇｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．，５１，１５７３−１５８０，（１９８７）． ５．Ｄｅｖｏｓら：Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ
ｅｒｃｈ，１２，９５−１０２（１９９２）． ６．Ｃｈｉｒｇｗｉｎら：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、
１８、５２９４（１９７９）． ７．Ｂｅｒｇｅｒら：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１
８，５１４３（１９７９）． ８．Ｇｕｂｌｅｒら：Ｇｅｅｎ．２５，２３６−２６９
（１９８３）． ９．Ｏｋａｙａｍａら：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，２，１６１，（１９８２）＆ ３，２８０，（１
９８３）． １０．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒ
ｙ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．１９８２． １１．Ｐｒｏｂｅｒら：Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８，３
３６−３４１（１９８７）． １２．日本生化学会編：続生化学実験講座第５巻、（１
９８６）．Ｐ２５０−２５６、東京化学同人． １３．G. R. Ｇａｒｄｉｎｅｒら：Ｊ．Ｉｎｖｅｒｔｅ
ｂｒａｔｅ Ｐｈａｔｈｏｌ．２５，３６３−３７０
（１９７５） １４．Ｊ．Ｋ．Ｙａｍａｍｏｔｏら：Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏ ｐａｔｈｏｌ．，１
１，１−１９（１９８６） １５．モダンバイオロジーシリーズ２３、動物組織培養
法（１９７６）Ｐ２９６−３００、共立出版 １６．Ｉｊｚｅｒｍａｎｓら：Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ，１７９，４５６−４７３（１９８９）
【００７３】
配列番号：１ 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GAATTCATGAATTATACAAGCTATATCTTAGC
【００７４】配列番号：２ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GCGAATTCTTATTTCGATGCTCTGCGGCCTCGAAA
【００７５】配列番号：３ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ATGAATTATACAAGCTATATCTTAGCT
【００７６】配列番号：４ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ATCAACAACGCACAGAATCTAACGCT
【００７７】配列番号：5 配列の長さ：501 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：イヌ 配列の特徴 特徴を表わす記号：sig peptide 存在位置：1..72 特徴を決定した方法：S 特徴を表わす記号：mat peptide 存在位置：73..498 特徴を決定した方法：S 配列 ATG AAT TAT ACA AGC TAT ATC TTA GCT TTT CAG CTT TGC GTG ATT TTG 48 Met Asn Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Val Ile Leu TGT TCT TCT GGC TGT AAC TGT CAG GCC ATG TTT TTT AAA GAA ATA GAA 96 Cys Ser Ser Gly Cys Asn Cys Gln Ala Met Phe Phe Lys Glu Ile Glu AAC CTA AAG GAA TAT TTT AAT GCA AGT AAT CCA GAT GTA TCG GAC GGT 144 Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Asn Ala Ser Asn Pro Asp Val Ser Asp Gly GGG TCT CTT TTC GTA GAT ATT TTG AAG AAA TGG AGA GAG GAG AGT GAC 192 Gly Ser Leu Phe Val Asp Ile Leu Lys Lys Trp Arg Glu Glu Ser Asp AAA ACA ATC ATT CAG AGC CAA ATT GTC TCT TTC TAC TTG AAA CTG TTT 240 Lys Thr Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Leu Lys Leu Phe GAC AAC TTT AAA GAT AAC CAG ATC ATT CAA AGG AGC ATG GAT ACC ATC 288 Asp Asn Phe Lys Asp Asn Gln Ile Ile Gln Arg Ser Met Asp Thr Ile AAG GAA GAC ATG CTT GGC AAG TTC TTA AAT TCA TCC ACC AGT AAG AGG 336 Lys Glu Asp Met Leu Gly Lys Phe Leu Asn Ser Ser Thr Ser Lys Arg GAG GAC TTC CTT AAG CTG ATT CAA ATT CCT GTG AAC GAT CTG CAG GTC 384 Glu Asp Phe Leu Lys Leu Ile Gln Ile Pro Val Asn Asp Leu Gln Val CAG CGC AAG GCG ATA AAT GAA CTC ATC AAA GTG ATG AAT GAT CTC TCA 432 Gln Arg Lys Ala Ile Asn Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser CCA AGA TCC AAC CTA AGG AAG CGG AAA AGG AGT CAG AAT CTG TTT CGA 480 Pro Arg Ser Asn Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser Gln Asn Leu Phe Arg GGC CGC AGA GCA TCG AAA TAA 501 Gly Arg Arg Ala Ser Lys ***
【００７８】配列番号：6 配列の長さ：501 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：イヌ 配列の特徴 特徴を表わす記号：sig peptide 存在位置：1..72 特徴を決定した方法：S 特徴を表わす記号：mat peptide 存在位置：73..498 特徴を決定した方法：S 配列 ATG AAT TAT ACA AGC TAT ATC TTA GCT TTT CAG CTT TGC GTG ATT TTG 48 Met Asn Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Val Ile Leu TGT TCT TCT GGC TGT AAC TGT CAG GCC ATG TTT TTT AAA GAA ATA GAA 96 Cys Ser Ser Gly Cys Asn Cys Gln Ala Met Phe Phe Lys Glu Ile Glu AAC CTA AAG GAA TAT TTT CAG GCA AGT AAT CCA GAT GTA TCG GAC GGT 144 Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Gln Ala Ser Asn Pro Asp Val Ser Asp Gly GGG TCT CTT TTC GTA GAT ATT TTG AAG AAA TGG AGA GAG GAG AGT GAC 192 Gly Ser Leu Phe Val Asp Ile Leu Lys Lys Trp Arg Glu Glu Ser Asp AAA ACA ATC ATT CAG AGC CAA ATT GTC TCT TTC TAC TTG AAA CTG TTT 240 Lys Thr Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Leu Lys Leu Phe GAC AAC TTT AAA GAT AAC CAG ATC ATT CAA AGG AGC ATG GAT ACC ATC 288 Asp Asn Phe Lys Asp Asn Gln Ile Ile Gln Arg Ser Met Asp Thr Ile AAG GAA GAC ATG CTT GGC AAG TTC TTA CAG TCA TCC ACC AGT AAG AGG 336 Lys Glu Asp Met Leu Gly Lys Phe Leu Gln Ser Ser Thr Ser Lys Arg GAG GAC TTC CTT AAG CTG ATT CAA ATT CCT GTG AAC GAT CTG CAG GTC 384 Glu Asp Phe Leu Lys Leu Ile Gln Ile Pro Val Asn Asp Leu Gln Val CAG CGC AAG GCG ATA AAT GAA CTC ATC AAA GTG ATG AAT GAT CTC TCA 432 Gln Arg Lys Ala Ile Asn Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser CCA AGA TCC AAC CTA AGG AAG CGG AAA AGG AGT CAG AAT CTG TTT CGA 480 Pro Arg Ser Asn Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser Gln Asn Leu Phe Arg GGC CGC AGA GCA TCG AAA TAA 501 Gly Arg Arg Ala Ser Lys ***
【００７９】配列番号：7 配列の長さ：441 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：イヌ 配列の特徴 特徴を表わす記号：sig peptide 存在位置：1..72 特徴を決定した方法：S 特徴を表わす記号：mat peptide 存在位置：73..438 特徴を決定した方法：S 配列 ATG AAT TAT ACA AGC TAT ATC TTA GCT TTT CAG CTT TGC GTG ATT TTG 48 Met Asn Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Val Ile Leu TGT TCT TCT GGC TGT AAC TGT CAG GCC ATG TTT TTT AAA GAA ATA GAA 96 Cys Ser Ser Gly Cys Asn Cys Gln Ala Met Phe Phe Lys Glu Ile Glu AAC CTA AAG GAA TAT TTT CAG GCA AGT AAT CCA GAT GTA TCG GAC GGT 144 Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Gln Ala Ser Asn Pro Asp Val Ser Asp Gly GGG TCT CTT TTC GTA GAT ATT TTG AAG AAA TGG AGA GAG GAG AGT GAC 192 Gly Ser Leu Phe Val Asp Ile Leu Lys Lys Trp Arg Glu Glu Ser Asp AAA ACA ATC ATT CAG AGC CAA ATT GTC TCT TTC TAC TTG AAA CTG TTT 240 Lys Thr Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Leu Lys Leu Phe GAC AAC TTT AAA GAT AAC CAG ATC ATT CAA AGG AGC ATG GAT ACC ATC 288 Asp Asn Phe Lys Asp Asn Gln Ile Ile Gln Arg Ser Met Asp Thr Ile AAG GAA GAC ATG CTT GGC AAG TTC TTA CAG TCA TCC ACC AGT AAG AGG 336 Lys Glu Asp Met Leu Gly Lys Phe Leu Gln Ser Ser Thr Ser Lys Arg GAG GAC TTC CTT AAG CTG ATT CAA ATT CCT GTG AAC GAT CTG CAG GTC 384 Glu Asp Phe Leu Lys Leu Ile Gln Ile Pro Val Asn Asp Leu Gln Val CAG CGC AAG GCG ATA AAT GAA CTC ATC AAA GTG ATG AAT GAT CTC TCA 432 Gln Arg Lys Ala Ile Asn Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser CCA AGA TAA 441 Pro Arg ***
【００８０】配列番号：8 配列の長さ：453 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：イヌ 配列の特徴 特徴を表わす記号：sig peptide 存在位置：1..72 特徴を決定した方法：S 特徴を表わす記号：mat peptide 存在位置：73..450 特徴を決定した方法：S 配列 ATG AAT TAT ACA AGC TAT ATC TTA GCT TTT CAG CTT TGC GTG ATT TTG 48 Met Asn Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Val Ile Leu TGT TCT TCT GGC TGT AAC TGT CAG GCC ATG TTT TTT AAA GAA ATA GAA 96 Cys Ser Ser Gly Cys Asn Cys Gln Ala Met Phe Phe Lys Glu Ile Glu AAC CTA AAG GAA TAT TTT CAG GCA AGT AAT CCA GAT GTA TCG GAC GGT 144 Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Gln Ala Ser Asn Pro Asp Val Ser Asp Gly GGG TCT CTT TTC GTA GAT ATT TTG AAG AAA TGG AGA GAG GAG AGT GAC 192 Gly Ser Leu Phe Val Asp Ile Leu Lys Lys Trp Arg Glu Glu Ser Asp AAA ACA ATC ATT CAG AGC CAA ATT GTC TCT TTC TAC TTG AAA CTG TTT 240 Lys Thr Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Leu Lys Leu Phe GAC AAC TTT AAA GAT AAC CAG ATC ATT CAA AGG AGC ATG GAT ACC ATC 288 Asp Asn Phe Lys Asp Asn Gln Ile Ile Gln Arg Ser Met Asp Thr Ile AAG GAA GAC ATG CTT GGC AAG TTC TTA CAG TCA TCC ACC AGT AAG AGG 336 Lys Glu Asp Met Leu Gly Lys Phe Leu Gln Ser Ser Thr Ser Lys Arg GAG GAC TTC CTT AAG CTG ATT CAA ATT CCT GTG AAC GAT CTG CAG GTC 384 Glu Asp Phe Leu Lys Leu Ile Gln Ile Pro Val Asn Asp Leu Gln Val CAG CGC AAG GCG ATA AAT GAA CTC ATC AAA GTG ATG AAT GAT CTC TCA 432 Gln Arg Lys Ala Ile Asn Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser CCA AGA TCC AAC CTA AGG TAA 453 Pro Arg Ser Asn Leu Arg ***
【図１】実施例２における、分子量分画１００,０００
と３００,０００の限外濾過膜を用いた時の透過液と未
透過液のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるクマシーブリリアン
トブルーによる染色結果を示す図である。
と３００,０００の限外濾過膜を用いた時の透過液と未
透過液のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるクマシーブリリアン
トブルーによる染色結果を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ // Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 7/00 7/00 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 岡田 勇雄 愛知県名古屋市港区大江町９番地の１ 東 レ株式会社名古屋事業場内
Claims (17)
- 【請求項１】 組換えバキュロウイルスを感染させたカ
イコ細胞培養上清、または、組換えバキュロウイルスを
感染させたカイコ幼虫の体液から、限外濾過膜を用いて
組換えバキュロウイルスを除去することを特徴とする有
用蛋白質の製造方法。 - 【請求項２】 限外濾過膜の、分子量分画サイズが１０
０,０００以下であることを特徴とする請求項１記載の
有用蛋白質の製造方法。 - 【請求項３】 組換えバキュロウイルスを感染させたカ
イコ細胞培養上清、または、組換えバキュロウイルスを
感染させたカイコ幼虫の体液に１Ｍ以上の塩を添加した
後に限外濾過することを特徴とする有用蛋白質の製造方
法。 - 【請求項４】 組換えバキュロウイルスを感染させたカ
イコ細胞培養上清、または、組換えバキュロウイルスを
感染させたカイコ幼虫の体液を４級アンモニウム塩で処
理した後に限外濾過することを特徴とする有用蛋白質の
製造方法。 - 【請求項５】 組換えバキュロウイルスを感染させたカ
イコ細胞培養上清、または、組換えバキュロウイルスを
感染させたカイコ幼虫の体液を、４級アンモニウム塩お
よび金属キレート剤で処理した後に限外濾過することを
特徴とする有用蛋白質の製造方法。 - 【請求項６】 限外濾過をｐＨ６以下の条件で行うこと
を特徴とする請求項２から４記載の有用蛋白質の製造方
法。 - 【請求項７】 分子量分画サイズが５０,０００以上３
００,０００未満の限外濾過膜で限外濾過することを特
徴とする請求項３から６のいずれか１項記載の有用蛋白
質の製造方法。 - 【請求項８】 ４級アンモニウム塩が塩化ベンザルコニ
ウムまたは塩化ベンゼトニウムであることを特徴とする
請求項４から７のいずれか１項記載の有用蛋白質の製造
方法。 - 【請求項９】 ４級アンモニウム塩を、組換えバキュロ
ウイルスを感染させたカイコ細胞培養上清、または、カ
イコ幼虫の体液に対して０.０１重量％以上の濃度で処
理することを特徴とする請求項４から８のいずれか１項
記載の有用蛋白質の製造方法。 - 【請求項１０】 金属キレート剤がテトラエチレンジア
ミン４酢酸であることを特徴とする請求項５から９のい
ずれか１項記載の有用蛋白質の製造方法。 - 【請求項１１】 有用蛋白質がイヌインターフェロン-
γ、ネコインターフェロン-ω、イヌインターロイキン
１２またはヒトインターフェロンであることを特徴とす
る請求項１から１０のいずれか１項記載の有用蛋白質の
製造方法。 - 【請求項１２】イヌインターフェロン-γが配列番号５
から８のいずれか記載のアミノ酸配列であることを特徴
とする請求項１１記載の有用蛋白質の製造方法。 - 【請求項１３】 組換えバキュロウイルスが、イヌイン
ターフェロン-γ、ネコインターフェロン-ω、イヌイン
ターロイキン１２またはヒトインターフェロンの蛋白質
をコードするＤＮＡにより、遺伝子組換えされた組換え
カイコ核多角体病ウイルスであることを特徴とする請求
項１から１２のいずれか１項記載の有用蛋白質の製造方
法。 - 【請求項１４】 イヌインターフェロン−γの蛋白質を
コードするＤＮＡにより、遺伝子組換えされた組換えカ
イコ核多角体病ウイルスを用いてイヌインターフェロン
−γを製造する際に、４級アンモニウム塩で処理した後
にカチオン交換担体を用いて精製することを特徴とする
請求項１３に記載の有用蛋白質の製造方法。 - 【請求項１５】 カチオン交換体が、スルフォプロピル
セファロースであることを特徴とする請求項１４に記載
の有用蛋白質の製造法。 - 【請求項１６】 ネコインターフェロン−ωの蛋白質を
コードするＤＮＡにより、遺伝子組換えされた組換えカ
イコ核多角体病ウイルスを用いてネコインターフェロン
−ωを製造する際に、４級アンモニウム塩で処理した後
にアフィニティー担体を用いて精製することを特徴とす
る請求項１３に記載の有用蛋白質の製造方法。 - 【請求項１７】 アフィニティー担体がブルーセファロ
ースであることを特徴とする請求項１６に記載の有用蛋
白質の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10218355A JPH1198998A (ja) | 1997-08-01 | 1998-07-31 | 有用蛋白質の製造方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9-208086 | 1997-08-01 | ||
| JP20808697 | 1997-08-01 | ||
| JP10218355A JPH1198998A (ja) | 1997-08-01 | 1998-07-31 | 有用蛋白質の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1198998A true JPH1198998A (ja) | 1999-04-13 |
Family
ID=26516630
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10218355A Pending JPH1198998A (ja) | 1997-08-01 | 1998-07-31 | 有用蛋白質の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1198998A (ja) |
-
1998
- 1998-07-31 JP JP10218355A patent/JPH1198998A/ja active Pending
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060418 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20060822 |