JP2002034577A

JP2002034577A - 有用タンパク質の製造方法、イヌ疾病の治療剤およびイヌ疾病の治療方法

Info

Publication number: JP2002034577A
Application number: JP2000229148A
Authority: JP
Inventors: Hisayo Okamoto; 尚代岡本; Masanari Yamada; 勝成山田
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 2000-07-28
Filing date: 2000-07-28
Publication date: 2002-02-05

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】有用タンパク質の特定成分を増加させる製造
法の提供。【解決手段】例えばイヌインターフェロン−γのよう
な有用タンパク質の遺伝子をコードした組換えバキュロ
ウイルスを例えばカイコ幼虫のような昆虫に感染させる
ことによって当該有用タンパク質を得る方法において、
当該昆虫から体液を採取した後、ｐＨ４から１０で２日
以上維持することを特徴とする有用タンパク質の製造方
法。上記の方法により得られる有用タンパク質を含んで
なるイヌ疾病の治療剤。上記のイヌ疾病の治療剤をイヌ
に注射投与することを特徴とするイヌ疾病の治療方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、組換えバキュロウ
イルスを用いた遺伝子組換え操作技術によって有用タン
パク質を生産する手法において、昆虫体液を採取した
後、ｐＨ４から１０で２日以上維持することで、目的と
するタンパク質の特定成分を増加させる手法に関するも
のであり、これによって、高純度有用タンパク質の量産
化を可能とし、安価な医薬品（抗腫瘍・抗ウイルス・皮
膚病等）を製造する有用タンパク質の製造方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子組換え技術を用いた有用タンパク
質の生産方法には多くの技術が報告されているが、近
年、遺伝子組換えしたカイコ核多角体病ウイルスを用い
た有用タンパク質の生産方法についても、ブタ成長ホル
モン（特開平3-224491）、成人Ｔ細胞白血病ウイルス外
皮タンパク質（特開平2-57191）、インフルエンザウイ
ルスＨＡタンパク質（特開平3-108480）、ネコインター
フェロン（特開平3-139276）等が開示されている。

【０００３】しかし、その宿主としてカイコ生体を用い
て有用タンパク質を生産させた場合、カイコ生体中には
さまざまなプロテアーゼが存在し、それらがカイコ体内
で生産された有用タンパク質の一部を分解するために、
そのポリペプチド鎖が様々な長さに切断された変異体が
生成してしまう。そのため、得られたカイコ体液または
その抽出液は目的とする有用タンパク質および変異体か
らなる多成分混合物となる。このような多成分からなる
有用タンパク質を医薬品とした場合、各成分をそれぞれ
単独に精製分離し、各成分ごとに毒性試験、薬効試験等
詳細な解析を行うことが必要であり、また製剤化の際、
それぞれの成分を常に一定量に管理することが必要とな
る。従って、有用タンパク質を遺伝子組換え医薬品とす
る場合、目的の成分を高純度で精製分画する必要があ
る。しかし、これらの多成分混合物から目的とする有用
タンパク質成分を分離精製することは非常な困難を伴
い、大量生産が困難であった。

【０００４】このようなカイコ生体内におけるプロテア
ーゼによる有用タンパク質の分解を抑制する方法として
は、例えば蛹の状態のカイコに遺伝子組み換えウイルス
を接種する方法（特開平９−２１５４９９）などが知ら
れている。これは、蛹化したカイコへのウイルスの接種
では、体内のプロテアーゼの活性や代謝そのものが低下
しているためにタンパク質の分解や不純物の生成が起こ
りにくく、目的タンパク質の回収率が高くなると述べら
れているが、目的とするタンパク質およびその分解物に
ついては区別されておらず、目的タンパク質成分のみを
選択的に増加させることができるかどうかについては言
及されていない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】そこで、カイコ体液ま
たはその抽出液中に含まれる様々な大きさの有用タンパ
ク質変異体混合物から目的とする成分を選択的に増加さ
せることができれば、従来組換えカイコ核多角体病ウイ
ルスを用いて高純度での量産が困難であった有用タンパ
ク質でも量産が容易となると期待できる。すなわち、本
発明は、組換えバキュウロウイルスを用いた有用タンパ
ク質の製造において、有用タンパク質変異体混合物のう
ち、目的とする成分を選択的に増加させる方法を提供す
ることによって、高純度有用タンパク質の量産化を可能
とし、以って安価な医薬品（抗腫瘍・抗ウイルス・皮膚
病等）の製造を可能とすることを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者は、こうした状
況に鑑み、鋭意工夫を重ねた結果、組換えバキュウロウ
イルスが感染した昆虫の体液を採取した後、ｐＨ４から
１０で２日以上維持することによって、当該体液に含ま
れるプロテアーゼの活性がコントロールされて目的とす
る有用タンパク質が選択的に増加すること、それにより
後工程である精製が容易となることを見出し本発明を完
成するに至った。

【０００７】すなわち本発明は、有用タンパク質をコー
ドする遺伝子により組み換えられた組換えバキュウロウ
イルスを昆虫に感染させて有用タンパク質を生産する際
に、当該昆虫の体液を採取した後、ｐＨ４から１０で２
日以上維持することで、目的の有用タンパク質を選択的
に増加させることを特徴とする有用タンパク質の製造方
法を提供するものである。

【０００８】すなわち本発明は、「有用タンパク質の遺
伝子をコードした組換えバキュロウイルスを昆虫に感染
させることによって当該有用タンパク質を得る方法にお
いて、当該昆虫から体液を採取した後、ｐＨ４から１０
で２日以上維持することを特徴とする有用タンパク質の
製造方法。」「上記の方法により得られる有用タンパク
質を含んでなるイヌ疾病の治療剤。」および、「上記の
イヌ疾病の治療剤をイヌに注射投与することを特徴とす
るイヌ疾病の治療方法。」である。

【０００９】

【発明の実施の形態】以下、本発明に関し詳細に説明す
る。

【００１０】本発明の有用タンパク質としては特に限定
はされないが、例えば、ヒトインターフェロン（α、
β、γの各タイプ）、ネコインターフェロン、イヌイン
ターフェロン（α、β、γの各タイプ）などのインター
フェロン類などが挙げられる。インターフェロンは、抗
ウイルス作用を示すところのタンパク質を主成分とする
生理活性物質でＩＦＮと略記される。また、その他に、
イヌインターロイキン−１２などのほ乳動物由来のイン
ターロイキンなどが挙げられる。本発明では、特にイヌ
ＩＦＮ-γが好ましく用いられる。

【００１１】イヌインターフェロン-γは参考文献２に
示されているアミノ酸配列からなるポリペプチドである
が、その他にイヌＩＦＮ-γの活性を有するものであれ
ば良く、糖鎖、酸化、アミノ酸配列などの構造に限定さ
れない。つまり、そのアミノ酸配列の一部が置換された
もの、また、その一部が欠如したもの、あるいは、いく
つかのアミノ酸残基が付加されたものでも、イヌ由来細
胞、例えば、イヌＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ−３
４）に対して、文献１１に示されているようなインター
フェロン−γの本来の生理活性を有するポリペプチドで
あれば本発明に含まれる。具体的には、例えば、配列番
号１に示す成熟タンパク質部分のような糖鎖結合部位を
欠如させたイヌインターフェロン-γを挙げることがで
きる。また、配列番号２から９に示す成熟タンパク質部
分のようなＣ末端が欠如したイヌインターフェロン-γ
を挙げることができる。

【００１２】遺伝子組換えバキュロウイルスのうち、例
えばカイコ核多角体病ウイルスは次のようにして作製す
ることができる。すなわち、有用タンパク質をコードす
るＤＮＡの上流に核多角体病ウイルス由来のプロモータ
ー領域を含むＤＮＡ断片、下流に終止シグナル以下のＤ
ＮＡ断片を有する組換えプラスミドと、核多角体病ウイ
ルスのＤＮＡを、例えばＢＭ−Ｎ細胞のようなカイコ培
養細胞に同時に感染させることによって、細胞内で外来
の有用タンパク質をコードするＤＮＡとウイルスＤＮＡ
の組換えが起こり、遺伝子組換えウイルスが作製され
る。このようにして作製された組換えウイルスは、核多
角体病ウイルスの多角体タンパク質の遺伝子領域に外来
のＤＮＡが置換または挿入されており多角体を形成する
ことができないため、非組換えウイルスと容易に区別す
ることが可能である。

【００１３】このような遺伝子組換え核多角体病ウイル
スとして、例えば、イヌＩＦＮ-γのタンパク質をコー
ドするＤＮＡが組換えられたrＢＮＶγを挙げることが
できる。

【００１４】イヌＩＦＮ-γのタンパク質をコードする
ＤＮＡが組換えられたrＢＮＶγは、例えば次のように
作製することができる。まず、イヌＩＦＮ-γの蛋白を
コードするＤＮＡ（文献２）を、例えば次のようにして
製造する。すなわち、イヌの細胞からポリ（Ａ）ＲＮＡ
を抽出した後、ｃＤＮＡに転換し、イヌＩＦＮ-γをコ
−ドする遺伝子配列を元にしたプライマ−を用いてポリ
メラーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと略す）を行うことによ
ってイヌＩＦＮ-γをコ−ドする遺伝子を得ることがで
きる。

【００１５】イヌの細胞、例えばマイト−ジェンなどで
刺激されたイヌリンパ球などよりＲＮＡを得る方法とし
ては、通常の方法、例えば、ポリソ−ムの分離、ショ糖
密度勾配遠心や電気泳動を利用した方法などがあげられ
る。上記イヌ細胞よりＲＮＡを抽出する方法としては、
グアニジン・チオシアネ−ト処理後ＣｓＣｌ密度勾配遠
心を行うグアニジン・チオシアネ−ト−塩化セシウム法
（文献３）バナジウム複合体を用いてリボヌクレア−ゼ
インヒビタ−存在下に界面活性剤で処理したのちフェノ
−ル抽出を行う方法（文献４），グアニジン・チオシア
ネ−ト−ホット・フェノ−ル法、グアニジン・チオシア
ネ−ト−グアニジン塩酸法、グアニジン・チオシアネ−
ト−フェノ−ル・クロロホルム法、グアニジン・チオシ
アネ−トで処理したのち塩化リチウムで処理してＲＮＡ
を沈殿させる方法などの中から適当な方法を選んで行う
ことができる。

【００１６】イヌリンパ球などより通常の方法、例え
ば、塩化リチウム／尿素法、グアニジン・イソチオシア
ネ−ト法、オリゴｄＴセルロ−スカラム法等によりｍＲ
ＮＡを単離し、得られたｍＲＮＡから通常の方法、例え
ば、Ｇｕｂｌｅｒらの方法（文献５）、Ｈ.Ｏｋａｙａ
ｍａらの方法（文献６）等によりｃＤＮＡを合成する。
得られたｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するには、基本的
にはトリ骨芽球ウイルス（ＡＭＶ）などの逆転写酵素な
どを用いるほか１部プライマ−を用いてＤＮＡポリメラ
−ゼなどを用いる方法を組み合わせてよいが、市販の合
成あるいはクロ−ニング用キットを用いるのが便利であ
る。このｃＤＮＡを鋳型としてイヌＩＦＮ-γの塩基配
列を基にしたプライマ−を用いてＰＣＲを行うことによ
ってイヌＩＦＮ-γのタンパク質をコ−ドするＤＮＡを
得ることができる。

【００１７】このイヌＩＦＮ-γのタンパク質をコ−ド
するＤＮＡをカイコのクローニングベクター（文献１）
に連結して作製した組み換え体プラスミドとカイコ核多
角体病ウイルスＤＮＡとを、カイコ樹立細胞にコトラン
スフェクションして作製することができる。従って、組
み換え体ウイルスは、ｉｎｖｉｖｏ的な方法で作製す
ることができる。

【００１８】すなわち、イヌＩＦＮ-γのタンパク質を
コードするＤＮＡ部分を、例えばｐＢＭ０３０（文献
１）などのカイコのクローニングベクターの発現調節部
分の下流に連結するという一般的な遺伝子操作に従って
組換え体プラスミドを作製することができる。この組換
え体プラスミドとカイコ核多角体病ウイルスＤＮＡ（文
献１）とを、文献のような方法でカイコ樹立細胞、例え
ばＢＭ−Ｎ株（文献１）にコトランスフェクションした
後、培養を続け、培養液中に出現した非組換え体（野性
型）と組換え体のウイルスの中から限界希釈法、もしく
はプラーク法などの一般的な方法によって組換え体ウイ
ルスをクローニングすることができる。組換え体ウイル
スは多角体の形成能がないことから、野性型ウイルスと
容易に区別できる。有用タンパク質の生産は、前記の組
換えカイコ核多角体ウイルスを昆虫細胞中、または昆虫
生体中で増殖させることにより行なう。

【００１９】昆虫細胞としてカイコ樹立細胞を用いる場
合は、前記組換えウイルスを含む培養液により、ＢＭ−
Ｎ細胞を感染させ、平面培養または浮遊培養により培養
する。ＢＭ−Ｎ細胞を培養する培地としては、例えば牛
血清を添加したＴＣ−１０培地（文献９）やＴＣ−１０
０培地（日本農産工業（株）製）を使用することができ
る。培養温度は２５〜２８℃が適当である。培養後、培
養液を遠心分離しその上清から有用タンパク質を回収す
る。

【００２０】昆虫生体を用いる場合は、前記の組換え体
ウイルスを含む培養液を昆虫に注射して、人工飼料を与
えて飼育する。飼育後、体液を採取しその上清から有用
タンパク質を回収する。

【００２１】昆虫細胞や昆虫生体を用いて有用タンパク
質を生産する場合、有用タンパク質が生産された溶液に
塩化ベンザルコニウム、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四
酢酸）あるいは界面活性剤などを添加して、組換えウイ
ルスを不活化することができる。この目的で塩化ベンザ
ルコニウム、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）ある
いは界面活性剤などを添加する場合は、ウイルスを不活
化するのに十分な量のこれら添加剤を添加することによ
り２〜２４時間でウイルスが不活化される。その後、限
外濾過などにより不活化されたウイルスを取り除く。

【００２２】本発明では、上記のような方法で得られる
有用タンパク質を含有する昆虫の体液をｐＨ４から１０
で２日以上維持することが必要である。この処理を行う
ことで、目的とする有用タンパク質成分を増加させるこ
とができる。これは、この範囲のｐＨにおいて、有用タ
ンパク質の特定の部位が切断されやすくなるためと考え
られる。また、この操作は、ｐＨ７から９の範囲で行う
ことがより好ましい。

【００２３】ｐＨをこれらの範囲に維持する方法として
は、昆虫体液を目的とするｐＨに調整したバッファーに
浸績する方法などがある。

【００２４】この方法では有用タンパク質成分としては
アミノ酸配列のＣ末端が疎水性アミノ酸である有用タン
パク質の製造に適しており、さらに好ましくは、有用タ
ンパク質が配列番号６記載のイヌインターフェロン−γ
の製造に適している。

【００２５】本発明では、ｐＨ４から１０で２日以上維
持する際に、金属キレート剤を含有させる方法が好まし
く採用される。

【００２６】昆虫体液またはその抽出液を金属キレート
剤で処理する方法としては、昆虫体液またはその抽出液
に金属キレート剤を添加する方法、もしくは、金属キレ
ート剤を含む水溶液に昆虫体液を添加する方法、もしく
は、切開した昆虫を直接金属キレート剤を含む水溶液に
浸漬する方法が可能であるが、いずれの方法によっても
同様な効果が得られる。

【００２７】組換えバキュウロウイルスが感染した昆虫
体液またはその抽出液に添加される金属キレート剤とし
ては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレン
ジアミン三酢酸、エチレンジアミン二酢酸、トランス
１，２−シクロヘキサンジアミン四酢酸、ジエチレント
リアミン五酢酸、トリエチレンテトラミン六酢酸または
それらの塩、０−フェナントロリン、ジピリジン等のジ
アミン類が挙げられるが、医薬品等の製造においては安
全性の観点からＥＤＴＡが好適に用いられる。使用され
る金属キレート剤の濃度は、昆虫生体中のメタルプロテ
アーゼの活性を阻害できる濃度であればよく、好ましく
は１ｍＭから３０ｍＭであり、さらに好ましくは２．５
ｍＭから２５ｍＭである。

【００２８】昆虫生体内においては、様々なプロテアー
ゼの作用によって有用タンパク質が分解されるため、得
られた体液または抽出液には、バキュロウイルスに組み
込んだ遺伝子から得られる完全長のアミノ酸配列を持つ
有用タンパク質よりも短い配列を持つ複数の変異体が得
られると考えられる。このような有用タンパク質を分解
するプロテアーゼとしては、種々のものが考えられる
が、その中には代表的な消化酵素であるトリプシン様の
活性を持つものもあると考えられる。トリプシンはタン
パク質のアルギニン及びリシンなどの塩基性アミノ酸残
基のカルボキシル基側を切断する酵素である。これらの
プロテアーゼの活性はｐＨによってコントロールするこ
とができるため、例えば、トリプシンの酵素活性を高め
るようなｐＨに維持することによって有用タンパク質の
Ｃ末端がアルギニンまたはリシン残基になるようなアミ
ノ酸配列の変異体を特異的に増加させることができる。

【００２９】このため、筆者らがさまざまなｐＨにおけ
る有用タンパク質の特定のアミノ酸配列の含有量につい
て検討した結果、組換えバキュウロウイルスが感染した
昆虫体液またはその抽出液をｐＨ４から１０で維持する
ことが好ましく、さらには金属キレート剤存在下ではｐ
Ｈ５から７で維持することが好ましく、金属キレート剤
非存在下ではｐＨ７から９で維持することが好ましいこ
とを見いだした。

【００３０】この方法により製造される有用タンパク質
としては、金属キレート剤存在下ではｐＨ５から７で維
持する場合はアミノ酸配列のＣ末端が塩基性アミノ酸で
あることが好ましく、より好ましくは配列番号５のタン
パク質の製造である。金属キレート剤非存在下ではｐＨ
７から９で維持する場合は疎水性アミノ酸であることが
好ましく、より好ましくは配列番号６のタンパク質の製
造である。

【００３１】また、昆虫体液またはその抽出液の維持
は、昆虫体液中に含まれる酵素の活性が保持される温度
が好適である。好ましい温度としては０℃から４０℃で
あり、さらには１５℃から３０℃において維持すること
が望ましい。

【００３２】こうして処理された有用タンパク質を含む
昆虫の体液を採取した後、さらに単離・精製するための
方法に特に限定はなく、通常のタンパク質の精製方法を
用いることができる。例えば、目的とする有用タンパク
質が本来有する活性を指標としながら、シリカゲル担
体、イオン交換性担体、ゲル濾過担体、キレート性担
体、色素担持担体等を用いたクロマトグラフィーや、限
外濾過、ゲル濾過、透析、塩析等による脱塩、濃縮を組
み合わせることによって精製し単離することができる。

【００３３】特に、イヌＩＦＮ−γの生産においては、
キレート担体および陰イオン交換担体および色素担持担
体を用いてカラム精製することがイヌＩＦＮ−γの純度
を向上させるために有効である。また、カラム担体を用
いた精製を行う際に、ＩＦＮ-γの活性を有するタンパ
ク質を含む溶液中に界面活性剤を０．００１〜１重量％
添加する方法が好ましく採用でき、これにより精製挙動
に変化なく高純度に製造することができる。界面活性剤
を添加することにより、カラム担体やカラム容器への目
的タンパク質の吸着によるロスを防止でき、高い収率で
の製造が可能になる。

【００３４】本発明の製造法により得られるイヌＩＦＮ
−γはイヌ疾病の治療剤として有効である。

【００３５】本発明に係るイヌ疾病の治療剤は、皮膚病
をはじめ腫瘍、アレルギー疾患、感染症、自己免疫疾
患、関節炎など免疫能が低下した疾病などさまざまなイ
ヌの疾病に対して、従来のこれらイヌの疾病に対する治
療薬や治療方法に比べ、驚くべき顕著な治療効果および
予防効果を示す。

【００３６】本発明における、イヌの皮膚病としては、
アレルギー性皮膚炎、免疫介在性皮膚炎、腫瘍性皮膚
炎、寄生虫性皮膚炎、細菌性皮膚炎、真菌性皮膚炎、内
分泌疾患、角化異常などが挙げられる。アレルギー性皮
膚炎としては、例えばアトピー性皮膚炎、接触性皮膚
炎、ノミによる皮膚炎、ダニによる皮膚炎などが挙げら
れ、免疫介在性皮膚炎としては、例えば狼瘡、天疱瘡、
アカントーシス、表皮壊死、皮膚血管炎、ブドウ膜炎、
悪性脱毛、強皮症、好酸球性皮膚炎などが挙げられ、寄
生虫性皮膚炎としては、ノミによる皮膚炎、ダニによる
皮膚炎、ウジによる皮膚炎、フィラリアによる皮膚炎な
どが挙げられ、細菌性皮膚炎としては、例えば膿皮症な
どが挙げられ、真菌性皮膚炎としては、例えば表皮性皮
膚炎、全身性皮膚炎などが挙げられ、内分泌疾患として
は、例えば甲状腺皮膚炎、成長ホルモン反応性皮膚炎、
エストロゲン性皮膚炎などが挙げられ、角化異常として
は、例えば本態性脂漏性皮膚炎、脂肪酸欠乏性皮膚炎、
亜鉛欠乏性皮膚炎、ビタミンＡ欠乏性皮膚炎などが挙げ
られる。イヌの腫瘍としては、乳腺腫瘍、好酸球性肉芽
腫、類表皮腫、皮膚腫瘍、脂肪腫、耳血腫、肺水腫、皮
膚有茎軟腫または肛門腫瘍などが挙げられ、イヌの感染
症としては、イヌパルボウイルス感染症、ジステンバー
感染症などが挙げられ、そしてアレルギー性疾病として
は、イヌの花粉症などが挙げられる。

【００３７】また、本発明において用いられるイヌ疾病
の治療剤は、イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質
に加えて任意に他の成分を含むことができる。本剤に添
加される成分は、主として、本剤が投与される方式に依
存して決定される。本剤が固体として用いられる場合
は、例えばラクトース等の充填剤、カルボキシメチルセ
ルロース、ゼラチン等の結合剤、着色剤、コーティング
剤等を用いることができ、このような固体の剤は経口投
与に好適であろう。また、担体または賦形剤として例え
ば、白色ワセリン、セルロース誘導体、界面活性剤、ポ
リエチレングリコール、シリコーン、オリーブ油等を加
えてクリーム、乳液、ローション等の形態として外用剤
として患部に塗布して用いることもできる。また、本剤
が液体として投与される場合は、通常行われている生理
学的に許容される溶媒、および、乳化剤、安定剤を含む
ことができる。溶媒としては、水、ＰＢＳ、等張性生理
食塩水等があげられ、乳化剤としては、ポリオキシエチ
レン系界面活性剤、脂肪酸系界面活性剤、シリコーン等
が例示でき、安定剤としては、イヌ血清アルブミン、ゼ
ラチン等のタンパク質、または、ポリエチレングリコー
ル、エチレングリコール等のポリオール、または、ソル
ビトール、トレハロースなどの糖類等があげられる。

【００３８】本発明の治療剤の投与方法に特に限定はな
いが、注射投与することによってより治療効果が期待で
きる。注射投与方法としては、静脈内投与、筋肉内投
与、皮下投与、腹腔内投与、胸腔内投与いずれの方法で
もよいが、皮下投与が簡便で患犬の負担も軽く好適であ
る。

【００３９】また、投与量は、個体の大きさ、投与方
法、症状などに依存して決定されるであろうが、一般に
は、イヌ疾病の症状を改善させるに十分な量を投与すれ
ば良い。例えば、１用量、１日当たり０.００２から１.
０MU／kgのイヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質の
投与で十分な効果が得られるが、好ましくは０.００５
から０.５MU／kg の用量が効果および経済的な面から好
ましい。ここにおいて、kg は患畜犬の体重の単位であ
り、Uは、上記イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質
の抗ウイルス活性から決定されるユニット数を表し、ウ
イルスとしてvesicular stomatitis virus （ＶＳ
Ｖ）、感受性細胞としてイヌＭＤＣＫ（ＡＴＣＣＣＣ
Ｌ−３４）細胞を用いて文献９のＣＰＥ法に従って測定
した時、ＶＳＶによるイヌＭＤＣＫ細胞の細胞変性率を
５０％防ぐことができるイヌＩＦＮ-γの量が１ユニッ
トである。

【００４０】また、本発明の治療剤の投与頻度もまた、
個体の大きさ、投与方法、症状などに依存して決定され
るであろうが、通常、週当たり１から２回の投与で、治
療開始から２週目には顕著な症状の改善が認められるで
あろう。また、治療経過を観察しながら投与頻度を増減
することも、投与回数を増減することも可能であるが、
飼い主の負担と治療効果の観点から、１日から７日の間
隔で２から１０回投与することが好ましい。

【００４１】また、本治療方法においては、イヌ疾病を
治療するための従来技術による治療剤を組み合わせて補
助的に用いることができる。この場合は、本発明の治療
剤は、抗ヒスタミン剤（ジフェンヒドラミン類）、消炎
剤（塩酸ジブカイン等）、殺虫・殺菌剤（マラチオン、
塩化ベンザルコニウム等）、ステロイド剤（デキサメタ
ゾン等）などから選ばれる他の薬剤と共に投与される。

【００４２】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明の範囲がこれに限定されるもので
はない。

【００４３】参考例１＜イヌＩＦＮ-γをコードするＤＮＡを導入した組換え
カイコ核多核体病ウイルスの作成＞（１）イヌｃＤＮＡの調製イヌ末梢血よりリンパ球を分離し、フィトヘムアグルチ
ニン（ＰＨＡ）を５０μｇ／ｍｌの終濃度で４８時間刺
激した。刺激後、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジ−ン社）を
用いて総ＲＮＡを調製した。得られたＲＮＡを１ｍＭ
ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）（以下ＴＥと略する。）に溶解し、７０℃で５分間
処理した後、１ＭＬｉＣｌを含むＴＥを同量加えた。
０．５ＭＬｉＣｌを含むＴＥで平衡化したオリゴｄＴセ
ルロ−スカラムにＲＮＡ溶液をアプライし、同緩衝液に
て洗浄した。さらに０．３ＭＬｉＣｌを含むＴＥにて
洗浄後、０．０１％ＳＤＳを含む２ｍＭＥＤＴＡ
（ｐＨ７．０）で吸着したポリ（Ａ）ＲＮＡを溶出し
た。こうして得られたポリ（Ａ）ＲＮＡを用いて一本鎖
ｃＤＮＡを合成した。すなわち、滅菌した０．５ｍｌの
ミクロ遠心チュ−ブに５μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡと０．
５μｇのオリゴｄＴプライマ−（１２−１８ｍｅｒ）を
入れ、ジエチルピロカルボネ−ト処理滅菌水を加えて１
２μｌにし、７０℃で１０分間インキュベ−トしたのち
氷中に１分間つけた。これに２００ｍＭトリス塩酸（ｐ
Ｈ８．４），５００ｍＭＫＣｌ溶液を２μｌ，２５ｍ
ＭＭｇＣｌ2 を２μｌ，１０ｍＭｄＮＴＰを１μｌ
および０．１ＭＤＴＴを２μｌそれぞれ加え、４２℃
で５分間インキュベ−トしたのち、２００ユニットのＧ
ｉｂｃｏＢＲＬ社製ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＲ
Ｔを１μｌ加え、４２℃でさらに５０分間インキュベ−
トしてｃＤＮＡ合成反応を行った。さらに７０℃で１５
分間インキュベ−トして反応を停止し、氷上に５分間置
いた。この反応液に１μｌのＥ．ｃｏｌｉＲＮａｓｅ
Ｈ（２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を加え、３７℃で２０分間イ
ンキュベ−トした。（２）イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質をコー
ドする遺伝子の調製イヌＩＦＮ-γの塩基配列（文献２）をもとに、５´ＧＣＡＧＡＴＣＴＡＴＧＡＡＴＴＡＴＡＣＡＡＧＣ
ＴＡＴＡＴＣＴＴＡＧＣＴ３´（配列番号：１０）と５´ＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＴＣＧＡＴＧＣＴＣＴ
ＧＣＧＧＣＣＴＣＧＡＡＡ３´（配列番号：１１）の２種類のプライマ−を日本バイオサービス（株）に依
頼し合成した。前項で得られたｃＤＮＡを０．５ｍｌの
ミクロ遠心チュ−ブに２μｌづつ取り、各プライマ−を
２０ｐｍｏｌ，２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）、１．５ｍＭＭｇＣｌ２、２５ｍＭＫＣｌ，１
００μｇ／ｍｌゼラチン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、４単
位ＥｘＴａｑＤＮＡポリメラ−ゼ（宝酒造（株）製）
となるように各試薬を加え、全量１００μｌとする。Ｄ
ＮＡの変性条件を９４℃，１分、プライマ−のアニ−リ
ング条件を５５℃、２分、プライマ−の伸長条件を７２
℃、３分の各条件でＰｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｅｔ
ｕｓ社のＤＮＡサ−マルサイクラ−を用い、３０サイク
ル反応させた。これを１％アガロ−スゲルにて電気泳動
し、５１７ｂｐのＤＮＡ断片（配列番号：１２）を常法
（文献７）に従って調製した。このＤＮＡ断片をＩｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ社のＴ−Ｖｅｃｔｏｒに宝酒造（株）に
常法に従い連結した。これを用いて常法に従い大腸菌を
形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡ
を常法に従い調製した。次に蛍光ＤＮＡシーケンサー
（パーキンエルマー社製ＤＮＡシーケンサー３７３Ｓ）
を用い、その添付プロトコールに従って、パーキンエル
マー社のダイターミネーターサイクルシーケンシングキ
ットを用いて、得られたＤＮＡ断片がイヌＩＦＮ-γを
コードするＤＮＡの塩基配列であることを確認した。（３）カイコ発現用プラスミドの作製次にこのＤＮＡ断片を鋳型として３種類のプライマーの
組合せ（配列番号：１３〜１８）で上記と同様の条件で
ＰＣＲを行い、３種類のＰＣＲ増幅断片（配列番号：１
９〜２１）を得た。これらを常法に従い回収し、配列番
号：１９に示す断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏ
ＲＶで、配列番号：２０に示す断片を制限酵素Ｈｉｎ
ｃＩＩおよびＳｎａｂＩで、配列番号：２２に示す断
片を制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＥｃｏＲＩで、それぞれ
切断後、制限酵素処理した配列番号：１９に示す断片と
制限酵素処理した配列番号：２１に示す断片を混和して
ｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ部位へ常法に従い
挿入し、組換えベクターを得た。さらにこのベクターを
制限酵素ＥｃｏＲＶで切断後、配列番号：２０に示す
断片を常法に従い挿入し組換えベクターを得、挿入され
たＤＮＡの塩基配列（配列番号：２２）を上記と同様に
して確認した。その後、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃ
ｏＲＩで挿入されたＤＮＡを回収し、これを制限酵素
ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩで切断したｐＢＭ０３０
（文献１）に常法に従い挿入して、カイコ発現用組換え
ベクターｐＢＭγＳ２(-)を作製した。（４）イヌＩＦＮ-γをコードするＤＮＡで組換えられ
た組換えカイコ核多角体病ウイルスの作製参考文献１の方法で組換えウイルスを作製した。すなわ
ち、５０ｍＭＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．１）、
０.２８ＭＮａＣｌ、０.７ｍＭＮａ2ＨＰＯ4、０.
７ｍＭＮａＨ2ＰＯ4からなる２.５ｍｌの溶液に、２.
５ｍｌのＤＮＡ混合液（０.２５ＭＣａＣｌ2、カイコ
核多角体病ウイルスＢｍＮＰＶＴ３株（文献１）のＤ
ＮＡ１０μｇ、組換え体プラスミドｐＢＭγのＤＮＡ６
５μｇを含む）を滴下し、生じた懸濁液０．５ｍｌを５
ｍｌの１０％ＦＢＳを添加したＴＣ−１０培地（文献１
０）中、２５ｃｍ2のフラスコで平面培養した約３×１
０5個のＢＭ−Ｎ細胞の培養基に加え、カイコ細胞にＤ
ＮＡを導入した。２０時間後、新鮮な培地と交換し、さ
らに７日間培養後、培養液を回収した。その培養液を遠
心して清澄化した上清を希釈して平面に培養したＢＭ−
Ｎ細胞の培養基に添加して８日間培養後、顕微鏡観察に
よりウイルス感染が見られ、かつ多角体が形成していな
い培養基を選択した（限界希釈法）。

【００４４】限界希釈法を７回繰り返し、組換え体ウイ
ルスをクローニングした。ここで作製したイヌＩＦＮγ
をコードするＤＮＡを含む組換えウイルスをｒＢＮＶγ
とした。（５）ｒＢＮＶγウイルス液の調製７５ｃｍ２のフラスコ底面で、１５ｍｌの１０％ＦＢＳ
を含むＴＣ−１０培地中で平面培養した約３×１０6個
のＢＭ−Ｎ細胞に、前記（４）でクローニングした組換
え体ウイルスを含むＢＭ−Ｎ細胞の培養液５０μｌをＢ
Ｍ−Ｎ細胞に添加して、２７℃で５日間培養後、培養液
を３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、遠心上清を
組換え体ウイルス液として得た。ウイルス液を１０〜７
倍希釈し、その１ｍｌをＢＭ−Ｎ細胞の培養基に添加し
て２７℃で７日間培養を続けると、顕微鏡観察によって
培養基のＢＭ−Ｎ細胞にウイルス感染が認められた。参考例２＜ＨＰＬＣによる成分分析＞ＨＰＬＣ装置システムはＬ
Ｃ−１０ＡＤシリーズ（島津製作所製）を用い、カラム
はコスモシール５Ｃ１８−ＡＲ−３００（ナカライテス
イク社製）を用いた。また、溶離液はA液として0.05%ト
リフルオロ酢酸水溶液、B液として0.05%トリフルオロ酢
酸を含むアセトニトリルを用いた。流速は1ml/minと
し、ピーク検出波長は２１０ｎｍで行った。溶出はリニ
アグラジェント（B液濃度０分：40%、３０分：46%）に
より分析を行った。

【００４５】試料のカイコ抽出液上清１ｍｌは、前処理
としてウルトラフリーＣＬ（ミリポア社製）を用いて限
外濾過を行い、５０μｌを分析に用いた。

【００４６】その結果、ウェスタンブロッティングによ
りウサギ抗イヌIFN-γポリクローナル抗体に反応性を示
すことが確認されたピークは５本であり、これらは２７
分から３０分に溶出された。それぞれの成分を分取して
構造解析を行った。分子量はＴＯＦ−ＭＡＳによって測
定し、Ｃ末端アミノ酸配列は臭化シアン分解後、ペプチ
ドマッピングを行い、得られたＣ末端ペプチドをエドマ
ン分解法によって決定した。その結果、これらのピーク
を示すイヌＩＦＮ−γの配列は、それぞれ溶出順に配列
番号５のメチオニンが酸化されたもの、配列番号４、配
列番号６のメチオニンが酸化されたもの、配列番号５、
配列番号６であった。

【００４７】実施例１及び比較例１・ｐＨ６に維持する温度と目的とする有用タンパク質の
増加の関係５令２日目のカイコ幼虫に、参考例１の（５）で得た組
換え体ウイルスのウイルス液を２μｌ／頭注射し、２５
℃で４日間、市販の人工飼料（カネボウシルクエレガン
ス社製）を与えて飼育した。１００頭のカイコ幼虫の腹
部を切り、ＥＤＴＡ2.5mMを含む１０００ｍｌの２０ｍ
Ｍ酢酸バッファー(pH6.0)に浸漬し、４℃で２０時間保
持した。

【００４８】得られたカイコ体液抽出液を８０００ｒｐ
ｍで１０分間遠心分離し、上清を回収した。得られた上
清を３等分し、各々５℃、１５℃、２５℃のインキュベ
ーター中で５日間熟成した。その後、参考例２に示した
方法に従ってＨＰＬＣにて各成分の比率を分析した。

【００４９】その結果、イヌIFN-γの活性を示す５つの
成分の総ピーク面積に対する配列番号５のピークの面積
比は、各々０．４６，０．５２，０．７１であった。な
お、熟成前のピーク面積比は０．１８であった。目的と
する有用タンパク質がｐＨ６に維持することで増加した
ことがわかる。

【００５０】実施例２及び比較例２・熟成前後での有用タンパク質の含有量の比較５令２日目のカイコ幼虫に、参考例１の（５）で得た組
換え体ウイルスのウイルス液を２μｌ／頭注射し、２５
℃で４日間、市販の人工飼料（カネボウシルクエレガン
ス社製）を与えて飼育した。１００頭のカイコ幼虫の腹
部を切り、２０頭ずつをpHを変化させたＥＤＴＡ2.5mM
を含む２００ｍｌの２０ｍＭ酢酸バッファーに浸漬し、
４℃で２０時間保持した。このときのバッファーのpH
は、各々pH5.5、6.0、7.0、8.0、9.0であった。

【００５１】得られたカイコ体液抽出液を８０００ｒｐ
ｍで１０分間遠心分離し、上清を回収した。得られた上
清を５℃のインキュベーター中で５日間熟成した。その
後、参考例２に示した方法に従ってＨＰＬＣにて各成分
の比率を分析した。

【００５２】その結果、イヌIFN-γの活性を示す５つの
成分の総ピーク面積に対する配列番号５のピークの面積
比は、各々０．４６，０．４４，０．４２，０．４１，
０．４１であった。なお、熟成前のピーク面積比はそれ
ぞれすべて０．１８から０．２２の間であった。

【００５３】実施例３・有用タンパク質生産におけるEDTA添加量依存性５令２日目のカイコ幼虫に、参考例１の（５）で得た組
換え体ウイルスのウイルス液を２μｌ／頭注射し、２５
℃で４日間、市販の人工飼料（カネボウシルクエレガン
ス社製）を与えて飼育した。２００頭のカイコ幼虫の腹
部を切り、ＥＤＴＡを2.5mM、5mM、25mM含む、またはＥ
ＤＴＡを含まない５００ｍｌの２０ｍＭ酢酸バッファー
(pH6.0)に５０頭ずつ浸漬し、４℃で２０時間保持し
た。

【００５４】得られたカイコ体液抽出液を８０００ｒｐ
ｍで１０分間遠心分離し、上清を回収した。得られた上
清を５℃のインキュベーター中で５日間熟成した。その
後、参考例２に示した方法に従ってＨＰＬＣにて各成分
の比率を分析した。

【００５５】その結果、イヌIFN-γの活性を示す５つの
成分の総ピーク面積に対する配列番号５のピークの面積
比は、ＥＤＴＡ添加量が２．５ｍＭ，５ｍＭ，２５ｍＭ
であるものは各々０．４１，０．４１，０．４０であっ
た。

【００５６】実施例４及び比較例３・ＥＤＴＡ無添加５令２日目のカイコ幼虫に、参考例１の（５）で得た組
換え体ウイルスのウイルス液を２μｌ／頭注射し、２５
℃で４日間、市販の人工飼料（カネボウシルクエレガン
ス社製）を与えて飼育した。５０頭のカイコ幼虫の腹部
を切り、ＥＤＴＡを含まない５００ｍｌの２０ｍＭリン
酸バッファー(pH8.0)に浸漬し、４℃で２０時間保持し
た。

【００５７】得られたカイコ体液抽出液を８０００ｒｐ
ｍで１０分間遠心分離し、上清を回収した。得られた上
清を２等分し、５℃および１５℃のインキュベーター中
で５日間熟成した。その後、参考例２に示した方法に従
ってＨＰＬＣにて各成分の比率を分析した。

【００５８】その結果、イヌIFN-γの活性を示す５つの
成分の総ピーク面積に対する配列番号６のピークの面積
比は、各々０．５３，０．６８であった。なお、熟成前
の配列番号６のピーク面積比は０．２から０．３であっ
た。

【００５９】実施例５及び比較例４・日数５令２日目のカイコ幼虫に、参考例１の（５）で得た組
換え体ウイルスのウイルス液を２μｌ／頭注射し、２５
℃で４日間、市販の人工飼料（カネボウシルクエレガン
ス社製）を与えて飼育した。５０頭のカイコ幼虫の腹部
を切り、ＥＤＴＡ2.5mMを含む５００ｍｌの２０ｍＭ酢
酸バッファー(pH3.0)に浸漬し、４℃で２０時間保持し
た。

【００６０】得られたカイコ体液抽出液を８０００ｒｐ
ｍで１０分間遠心分離し、上清を回収した。得られた上
清を４等分し、それぞれ２５℃のインキュベーター中で
１、２、３、５日間熟成した。その後、参考例２に示し
た方法に従ってＨＰＬＣにて各成分の比率を分析した。

【００６１】その結果、イヌIFN-γの活性を示す５つの
成分の総ピーク面積に対する配列番号５のピークのの面
積比は各々０．２４，０．４８，０．６２，０．７１で
あった。

【００６２】実施例６カイコ生体中で生産したイヌＩＦＮ-γの活性を有する
タンパク質の精製（１）初段にＣｕキレート担体を用いたイヌＩＦＮ-γ
の活性を有するタンパク質の精製実施例１の２５℃５日維持で得られたカイコ体液抽出液
（(1)とする）および実施例４の１５℃５日維持で得ら
れたカイコ体液抽出液（(2)とする）を用いて、Ｃｕキ
レート担体による精製を行った。担体は、Chelating Se
pharose Fast Flow（Amersham-Pharmacia社製）に１％
硫酸銅水溶液を用いて銅イオンを結合させ、調製した。
精製はまず、カイコ体液抽出液(2)を用いて検討を行っ
た。抽出液はｐＨ値を５．５に調製し、Ｃｕキレート担
体にアプライした。担体の容量は抽出液と等量とし、ア
プライ後の洗浄は２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ：５．５）
にてＵＶ吸収がなくなるまで十分に行った。カラムに吸
着したタンパク質の溶出は塩化アンモニウムの塩濃度を
１Ｍまで段階的に上げて行い、またそれでも溶出されな
いタンパク質は０．１ＭのＥＤＴＡおよび０．１ＮのＮ
ａＯＨを用いて溶出した。各フラクションのイヌＩＦＮ
-γの活性を有するタンパク質および夾雑タンパクの検
出はウエスタンブロッティング、銀染色およびＨＰＬＣ
にて行った。その結果、低分子のイヌＩＦＮ-γの活性
を有するタンパク質は非吸着画分に銀染色にてイヌＩＦ
Ｎ-γのバンドがクリアに検出でき、夾雑タンパク質は
ほとんど除去されていた。なお、その他の画分には低分
子のイヌＩＦＮ-γは全く検出されなかった。また、高
分子のイヌＩＦＮ-γは非吸着画分には検出されず、
０．１〜０．６Ｍ塩化アンモニウム溶出画分において検
出された。なお、この画分にも夾雑タンパク質はほとん
ど検出されなかった。さらに０．１ＭのＥＤＴＡおよび
０．１ＮのＮａＯＨを用いて溶出した画分に夾雑タンパ
ク質が検出され、ここにはイヌＩＦＮ-γの活性を有す
るタンパク質は全く検出されなかった。

【００６３】次にカイコ体液抽出液(1)を用いて検討を
行った。本体液抽出液中にはＥＤＴＡが含有しており、
そのままＣｕキレート担体にアプライするとＣｕイオン
が破荷してしまい精製不能となるため、まず限外ろ過に
より、ＥＤＴＡを除いた。限外ろ過はＡｍｉｃｏｎ社の
ＨＯＬＬＯＷＦＩＢＥＲＣＡＲＴＲＩＤＧＥ（TYPE:
HOP10-20）を用い、２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ：５．５）に置換した。以降はカイコ体液抽出液
(1)と同様の操作を行って、同様の結果が得られた。
このように、初段にＣｕキレート担体を用いた精製法に
よって、カイコ由来夾雑タンパクの大部分を除去し、低
分子のイヌＩＦＮ-γと高分子のイヌＩＦＮ-γも分画で
きた。（２）Ｑセファロース担体を用いたイヌＩＦＮ-γの活
性を有するタンパク質の精製上記（１）の２種類の初段Ｃｕキレート精製液を用いて
２段目Ｑセファロース担体による低分子イヌＩＦＮ-γ
の分画を検討した。精製はｐＨ：９で行った。初段Ｃｕ
キレート精製液をそれぞれ限外ろ過にて２０ｍＭのグリ
シンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ：９）に置換し、担体にアプ
ライした。限外ろ過はＡＤＶＡＮＴＥＣ社のＦＩＬＴＥ
ＲＨＯＬＤＥＲ（MODEL: UHP-43KおよびUHP-76K）（装
置）およびＡｍｉｃｏｎ社のＹＭ１０（膜）をそれぞれ
用いた。窒素ボンベの圧力は1.2〜1.5kg/cm2で行った。
なお、各操作は装置を氷冷しながら行った。溶出はＮａ
Ｃｌの濃度を１Ｍまで５ｍＭ刻みで行った。その結果、
カイコ体液抽出液(1)由来の初段Ｃｕキレート精製液お
よびカイコ体液抽出液(2)由来の初段Ｃｕキレート精製
液どちらの精製液を用いた場合も、２０〜２５ｍＭ（画
分(1)），３０〜３５ｍＭ（画分(2)）および４０〜５０
ｍＭ（画分(3)）の各ＮａＣｌ濃度の溶出画分でイヌＩ
ＦＮ-γが溶出された（ウエスタンブロッティング）。
なおその他の溶出画分およびアルカリ洗浄画分ではイヌ
ＩＦＮγは検出されなかった。（３）ブルー担体を用いたイヌＩＦＮ-γの活性を有す
るタンパク質の精製さらに、（２）で得られた各溶出画分（カイコ体液抽出
液(1)由来のＱセファロース担体による溶出画分(1)およ
びカイコ体液抽出液(2)由来のＱセファロース担体によ
る溶出画分(3)）をそれぞれ別々にブルー担体に供し、
イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質の単一化を検
討した。担体へのアプライはｐＨ：５．５で行った。各
溶出画分をそれぞれ限外ろ過にて２０ｍＭの酢酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ：５．５）に置換し、担体にアプライ
した。限外ろ過はＡＤＶＡＮＴＥＣ社のＦＩＬＴＥＲ
ＨＯＬＤＥＲ（MODEL: UHP-43KおよびUHP-76K）（装
置）およびＡｍｉｃｏｎ社のＹＭ１０（膜）をそれぞれ
用いた。窒素ボンベの圧力は1.2〜1.5kg/cm2で行った。
なお、各操作は装置を氷冷しながら行った。溶出は２０
ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ：７．１）中での
ＮａＣｌの濃度を０〜１Ｍまで段階的に上げて行った。
その結果、カイコ体液抽出液(2)由来のＱセファロース
担体による溶出画分(3)では、ＮａＣｌの濃度が０Ｍ
で、カイコ体液抽出液(1)由来のＱセファロース担体に
よる溶出画分(1)では、ＮａＣｌの濃度が５０ｍＭ〜１
５０ｍＭでそれぞれ配列番号６のイヌＩＦＮ-γホモ２
量体、配列番号５のイヌＩＦＮ-γのホモ２量体がＨＰ
ＬＣ解析でそれぞれ９６％の純度で精製できた。

【００６４】実施例７・イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質製剤の調製実施例６で得られた配列番号６のイヌＩＦＮ-γのホモ
２量体および配列番号５のイヌＩＦＮ-γのホモ２量体
それぞれの精製溶液に、注射用生理食塩水、アラビアゴ
ム（三栄薬品貿易（株））、ポリエチレングリコール、
グリシンを加えて、アラビアゴム終濃度１％、ポリエチ
レングリコール終濃度０．５％、グリシン１０ｍＭに調
製した。さらに、ポジダイン（ポール（株））で処理し
てパイロジェンを除去した後、２５０℃で２時間乾熱滅
菌したガラスバイアルに１ｍｌずつ分注した。その後、
無菌的に凍結乾燥することによって、１バイアル中に
０.１ＭＵから２.５ＭＵのイヌＩＦＮ-γを含むイヌＩ
ＦＮ-γ製剤を得た。このイヌＩＦＮ-γ製剤は、室温暗
条件下で安定であり、また、蒸留水または生理的食塩水
によって良好に溶解した。

【００６５】実施例８・イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質によるイヌ
皮膚病の治療実施例７で得られたイヌＩＦＮ-γの活性を有するタン
パク質の製剤を用いて、イヌ皮膚病に対する治療効果を
試験した。イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質の
製剤を１ｍｌの注射用生理的食塩水で溶解後、皮下注射
により投与し、皮膚疾患および副作用について臨床症状
を観察することによって治療効果を判定した。その結
果、脂漏性皮膚炎、膿皮症、アカントーシス、真菌性皮
膚炎、アトピー性皮膚炎、天疱瘡、ウジ寄生性皮膚炎、
エストロゲン反応性皮膚炎に対して驚くべき治療効果が
認められた。なお、すべての症例において臨床上問題と
なる副作用は認められなかった。

【００６６】

【表１】

【００６７】

【表２】

【００６８】

【発明の効果】組換えバキュロウイルスを用いた有用タ
ンパク質の製造において、当該ウイルスを感染させた昆
虫の体液を採取した後、ｐＨ４から１０で２日以上維持
することで、目的の有用タンパク質の特定成分を増加さ
せることができ、その後の精製が容易になる。これによ
って高純度有用タンパク質の量産化を可能とし、安価な
医薬品（抗腫瘍・抗ウイルス・皮膚病等）の製造が可能
となる。

【００６９】参考文献１．Ｔ．Ｈｏｒｉｕｃｈｉら：Ａｇｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．，５１，１５７３−１５８０，（１９８７）．２．Ｄｅｖｏｓら：Ｊ．ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＲｅｓ
ｅｒｃｈ，１２，９５−１０２（１９９２）．３．Ｃｈｉｒｇｗｉｎら：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、
１８、５２９４（１９７９）．４．Ｂｅｒｇｅｒら：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１
８，５１４３（１９７９）．５．Ｇｕｂｌｅｒら：Ｇｅｅｎ．２５，２３６−２６９
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（１９７５）１１．Ｉｊｚｅｒｍａｎｓら：Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ，１７９，４５６−４７３（１９８９）

【００７０】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 東レ株式会社 <120> 有用タンパク質の製造方法 <130> 51E15310 <160> 22 <210> 1 <211> 501 <212> DNA PRT <213> dog <220> <221> CDS <222> (1)...(498) <220> <221> mat#peptide <222> (73)...(498) <400> 1 atg aat tat aca agc tat atc tta gct ttt cag ctt tgc gtg att ttg 48 Met Asn Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Val Ile Leu tgt tct tct ggc tgt aac tgt cag gcc atg ttt ttt aaa gaa ata gaa 96 Cys Ser Ser Gly Cys Asn Cys Gln Ala Met Phe Phe Lys Glu Ile Glu aac cta aag gaa tat ttt cag gca agt aat cca gat gta tcg gac ggt 144 Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Gln Ala Ser Asn Pro Asp Val Ser Asp Gly ggg tct ctt ttc gta gat att ttg aag aaa tgg aga gag gag agt gac 192 Gly Ser Leu Phe Val Asp Ile Leu Lys Lys trp Arg Glu Glu Ser Asp aaa aca atc att cag agc caa att gtc tct ttc tac ttg aaa ctg ttt 240 Lys Thr Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Leu Lys Leu Phe gac aac ttt aaa gat aac cag atc att caa agg agc atg gat acc atc 288 Asp Asn Phe Lys Asp Asn Gln Ile Ile Gln Arg Ser Met Asp Thr Ile aag gaa gac atg ctt ggc aag ttc tta cag tca tcc acc agt aag agg 336 Lys Glu Asp Met Leu Gly Lys Phe Leu Gln Ser Ser Thr Ser Lys Arg gag gac ttc ctt aag ctg att caa att cct gtg aac gat ctg cag gtc 384 Glu Asp Phe Leu Lys Leu Ile Gln Ile Pro Val Asn Asp Leu Gln Val cag cgc aag gcg ata aat gaa ctc atc aaa gtg atg aat gat ctc tca 432 Gln Arg Lys Ala Ile Asn Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser cca aga tcc aac cta agg aag cgg aaa agg agt cag aat ctg ttt cga 480 Pro Arg Ser Asn Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser Gln Asn Leu Phe Arg ggc cgc aga gca tcg aaa taa 501 Gly Arg Arg Ala Ser Lys *** <210> 2 <211> 462 <212> DNA PRT <213> dog <220> <221> CDS <222> (1)...(459) <220> <221> mat#peptide <222> (73)...(459) <400> 2 atg aat tat aca agc tat atc tta gct ttt cag ctt tgc gtg att ttg 48 Met Asn Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Val Ile Leu tgt tct tct ggc tgt aac tgt cag gcc atg ttt ttt aaa gaa ata gaa 96 Cys Ser Ser Gly Cys Asn Cys Gln Ala Met Phe Phe Lys Glu Ile Glu aac cta aag gaa tat ttt cag gca agt aat cca gat gta tcg gac ggt 144 Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Gln Ala Ser Asn Pro Asp Val Ser Asp Gly ggg Tct ctt ttc gta gat att ttg aag aaa tgg aga gag gag agt gac 192 Gly Ser Leu Phe Val Asp Ile Leu Lys Lys Trp Arg Glu Glu Ser Asp aaa aca atc att cag agc caa att gtc tct ttc tac ttg aaa ctg ttt 240 Lys Thr Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Leu Lys Leu Phe gac aac ttt aaa gat aac cag atc att caa agg agc atg gat acc atc 288 Asp Asn Phe Lys Asp Asn Gln Ile Ile Gln Arg Ser Met Asp Thr Ile aag gaa gac atg ctt ggc aag ttc tta cag tca tcc acc agt aag agg 336 Lys Glu Asp Met Leu Gly Lys Phe Leu Gln Ser Ser Thr Ser Lys Arg gag gac ttc ctt aag ctg att caa att cct gtg aac gat ctg cag gtc 384 Glu Asp Phe Leu Lys Leu Ile Gln Ile Pro Val Asn Asp Leu Gln Val cag cgc aag gcg ata aat gaa ctc atc aaa gtg atg aat gat ctc tca 432 Gln Arg Lys Ala Ile Asn Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser cca aga tcc aac cta agg aag cgg aaa taa 462 Pro Arg Ser Asn Leu Arg Lys Arg Lys *** <210> 3 <211> 459 <212> DNA PRT <213> dog <220> <221> CDS <222> (1)...(456) <220> <221> mat#peptide <222> (73)...(456) <400> 3 atg aat tat aca agc tat atc tta gct ttt cag ctt tgc gtg att ttg 48 Met Asn Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Val Ile Leu tgt tct tct ggc tgt aac tgt cag gcc atg ttt ttt aaa gaa ata gaa 96 Cys Ser Ser Gly Cys Asn Cys Gln Ala Met Phe Phe Lys Glu Ile Glu aac cta aag gaa tat ttt cag gca agt aat cca gat gta tcg gac ggt 144 Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Gln Ala Ser Asn Pro Asp Val Ser Asp Gly ggg Tct ctt ttc gta gat att ttg aag aaa tgg aga gag gag agt gac 192 Gly Ser Leu Phe Val Asp Ile Leu Lys Lys Trp Arg Glu Glu Ser Asp aaa aca atc att cag agc caa att gtc tct ttc tac ttg aaa ctg ttt 240 Lys Thr Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Leu Lys Leu Phe gac aac ttt aaa gat aac cag atc att caa agg agc atg gat acc atc 288 Asp Asn Phe Lys Asp Asn Gln Ile Ile Gln Arg Ser Met Asp Thr Ile aag gaa gac atg ctt ggc aag ttc tta cag tca tcc acc agt aag agg 336 Lys Glu Asp Met Leu Gly Lys Phe Leu Gln Ser Ser Thr Ser Lys Arg gag gac ttc ctt aag ctg att caa att cct gtg aac gat ctg cag gtc 384 Glu Asp Phe Leu Lys Leu Ile Gln Ile Pro Val Asn Asp Leu Gln Val cag cgc aag gcg ata aat gaa ctc atc aaa gtg atg aat gat ctc tca 432 Gln Arg Lys Ala Ile Asn Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser cca aga tcc aac cta agg aag cgg taa 459 Pro Arg Ser Asn Leu Arg Lys Arg *** <210> 4 <211> 456 <212> DNA PRT <213> dog <220> <221> CDS <222> (1)...(453) <220> <221> mat#peptide <222> (73)...(453) <400> 4 atg aat tat aca agc tat atc tta gct ttt cag ctt tgc gtg att ttg 48 Met Asn Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Val Ile Leu tgt tct tct ggc tgt aac tgt cag gcc atg ttt ttt aaa gaa ata gaa 96 Cys Ser Ser Gly Cys Asn Cys Gln Ala Met Phe Phe Lys Glu Ile Glu aac cta aag gaa tat ttt cag gca agt aat cca gat gta tcg gac ggt 144 Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Gln Ala Ser Asn Pro Asp Val Ser Asp Gly ggg Tct ctt ttc gta gat att ttg aag aaa tgg aga gag gag agt gac 192 Gly Ser Leu Phe Val Asp Ile Leu Lys Lys Trp Arg Glu Glu Ser Asp aaa aca atc att cag agc caa att gtc tct ttc tac ttg aaa ctg ttt 240 Lys Thr Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Leu Lys Leu Phe gac aac ttt aaa gat aac cag atc att caa agg agc atg gat acc atc 288 Asp Asn Phe Lys Asp Asn Gln Ile Ile Gln Arg Ser Met Asp Thr Ile aag gaa gac atg ctt ggc aag ttc tta cag tca tcc acc agt aag agg 336 Lys Glu Asp Met Leu Gly Lys Phe Leu Gln Ser Ser Thr Ser Lys Arg gag gac ttc ctt aag ctg att caa att cct gtg aac gat ctg cag gtc 384 Glu Asp Phe Leu Lys Leu Ile Gln Ile Pro Val Asn Asp Leu Gln Val cag cgc aag gcg ata aat gaa ctc atc aaa gtg atg aat gat ctc tca 432 Gln Arg Lys Ala Ile Asn Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser cca aga tcc aac cta agg aag taa 456 Pro Arg Ser Asn Leu Arg Lys *** <210> 5 <211> 453 <212> DNA PRT <213> dog <220> <221> CDS <222> (1)...(450) <220> <221> mat#peptide <222> (73)...(450) <400> 5 atg aat tat aca agc tat atc tta gct ttt cag ctt tgc gtg att ttg 48 Met Asn Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Val Ile Leu tgt tct tct ggc tgt aac tgt cag gcc atg ttt ttt aaa gaa ata gaa 96 Cys Ser Ser Gly Cys Asn Cys Gln Ala Met Phe Phe Lys Glu Ile Glu aac cta aag gaa tat ttt cag gca agt aat cca gat gta tcg gac ggt 144 Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Gln Ala Ser Asn Pro Asp Val Ser Asp Gly ggg tct ctt ttc gta gat att ttg aag aaa tgg aga gag gag agt gac 192 Gly Ser Leu Phe Val Asp Ile Leu Lys Lys Trp Arg Glu Glu Ser Asp aaa aca atc att cag agc caa att gtc tct ttc tac ttg aaa ctg ttt 240 Lys Thr Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Leu Lys Leu Phe gac aac ttt aaa gat aac cag atc att caa agg agc atg gat acc atc 288 Asp Asn Phe Lys Asp Asn Gln Ile Ile Gln Arg Ser Met Asp Thr Ile aag gaa gac atg ctt ggc aag ttc tta cag tca tcc acc agt aag agg 336 Lys Glu Asp Met Leu Gly Lys Phe Leu Gln Ser Ser Thr Ser Lys Arg gag gac ttc ctt aag ctg att caa att cct gtg aac gat ctg cag gtc 384 Glu Asp Phe Leu Lys Leu Ile Gln Ile Pro Val Asn Asp Leu Gln Val cag cgc aag gcg ata aat gaa ctc atc aaa gtg atg aat gat ctc tca 432 Gln Arg Lys Ala Ile Asn Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser cca aga tcc aac cta agg aag cgg taa 453 Pro Arg Ser Asn Leu Arg Lys Arg *** <210> 6 <211> 450 <212> DNA PRT <213> dog <220> <221> CDS <222> (1)...(447) <220> <221> mat#peptide <222> (73)...(447) <400> 6 atg aat tat aca agc tat atc tta gct ttt cag ctt tgc gtg att ttg 48 Met Asn Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Val Ile Leu tgt tct tct ggc tgt aac tgt cag gcc atg ttt ttt aaa gaa ata gaa 96 Cys Ser Ser Gly Cys Asn Cys Gln Ala Met Phe Phe Lys Glu Ile Glu aac cta aag gaa tat ttt cag gca agt aat cca gat gta tcg gac ggt 144 Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Gln Ala Ser Asn Pro Asp Val Ser Asp Gly ggg tct ctt ttc gta gat att ttg aag aaa tgg aga gag gag agt gac 192 Gly Ser Leu Phe Val Asp Ile Leu Lys Lys Trp Arg Glu Glu Ser Asp aaa aca atc att caG agc caa att gtc tct ttc tac ttg aaa ctg ttt 240 Lys Thr Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Leu Lys Leu Phe gAc aac ttt aaa gat aac cag atc att caa agg agc atg gat acc atc 288 Asp Asn Phe Lys Asp Asn Gln Ile Ile Gln Arg Ser Met Asp Thr Ile aag gaa gac atg ctt ggc aag ttc tta cag tca tcc acc agt aag agg 336 Lys Glu Asp Met Leu Gly Lys Phe Leu Gln Ser Ser Thr Ser Lys Arg gag gac ttc ctt aag ctg att caa att cct gtg aac gat ctg cag gtc 384 Glu Asp Phe Leu Lys Leu Ile Gln Ile Pro Val Asn Asp Leu Gln Val cag cgc aag gcg ata aat gaa ctc atc aaa gtg atg aat gat ctc tca 432 Gln Arg Lys Ala Ile Asn Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser cca aga tcc aac cta taa 450 Pro Arg Ser Asn Leu *** <210> 7 <211> 447 <212> DNA PRT <213> dog <220> <221> CDS <222> (1)...(444) <220> <221> mat#peptide <222> (73)...(444) <400> 7 atg aat tat aca agc tat atc tta gct ttt cag ctt tgc gtg att ttg 48 Met Asn Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Val Ile Leu tgt tct tct ggc tgt aac tgt cag gcc atg ttt ttt aaa gaa ata gaa 96 Cys Ser Ser Gly Cys Asn Cys Gln Ala Met Phe Phe Lys Glu Ile Glu aac cta aag gaa tat ttt cag gca agt aat cca gat gta tcg gac ggt 144 Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Gln Ala Ser Asn Pro Asp Val Ser Asp Gly ggg tct ctt ttc gta gat att ttg aag aaa tgg aga gag gag agt gac 192 Gly Ser Leu Phe Val Asp Ile Leu Lys Lys Trp Arg Glu Glu Ser Asp aaa aca atc att cag agc caa att gtc tct ttc tac ttg aaa ctg ttt 240 Lys Thr Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Leu Lys Leu Phe gac aac ttt aaa gat aac cag atc att caa agg agc atg gat acc atc 288 Asp Asn Phe Lys Asp Asn Gln Ile Ile Gln Arg Ser Met Asp Thr Ile aag gaa gac atg ctt ggc aag ttc tta cag tca tcc acc agt aag agg 336 Lys Glu Asp Met Leu Gly Lys Phe Leu Gln Ser Ser Thr Ser Lys Arg gag gac ttc ctt aag ctg att caa att cct gtg aac gat ctg cag gtc 384 Glu Asp Phe Leu Lys Leu Ile Gln Ile Pro Val Asn Asp Leu Gln Val cag cgc aag gcg ata aat gaa ctc atc aaa gtg atg aat gat ctc tca 432 Gln Arg Lys Ala Ile Asn Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser cca aga tcc aac taa 447 Pro Arg Ser Asn *** <210> 8 <211> 444 <212> DNA PRT <213> dog <220> <221> CDS <222> (1)...(441) <220> <221> mat#peptide <222> (73)...(441) <400> 8 atg aat tat aca agc tat atc tta gct ttt cag ctt tgc gtg att ttg 48 Met Asn Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Val Ile Leu tgt tct tct ggc tgt aac tgt cag gcc atg ttt ttt aaa gaa ata gaa 96 Cys Ser Ser Gly Cys Asn Cys Gln Ala Met Phe Phe Lys Glu Ile Glu aac cta aag gaa tat ttt cag gca agt aat cca gat gta tcg gac ggt 144 Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Gln Ala Ser Asn Pro Asp Val Ser Asp Gly ggg tct ctt ttc gta gat att ttg aag aaa tgg aga gag gag agt gac 192 Gly Ser Leu Phe Val Asp Ile Leu Lys Lys Trp Arg Glu Glu Ser Asp aaa aca atc att cag agc caa att gtc tct ttc tac ttg aaa ctg ttt 240 Lys Thr Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Leu Lys Leu Phe gac aac ttt aaa gat aac cag atc att caa agg agc atg gat acc atc 288 Asp Asn Phe Lys Asp Asn Gln Ile Ile Gln Arg Ser Met Asp Thr Ile aag gaa gac atg ctt ggc aag ttc tta cag tca tcc acc agt aag agg 336 Lys glu Asp Met Leu Gly Lys Phe Leu Gln Ser Ser Thr Ser Lys Arg gag gac ttc ctt aag ctg att caa att cct gtg aac gat ctg cag gtc 384 Glu Asp Phe Leu Lys Leu Ile Gln Ile Pro Val Asn Asp Leu Gln Val cag cgc aag gcg aTa aat gaa ctc atc aaa gtg atg aat gat ctc tca 432 Gln Arg Lys Ala Ile Asn Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser cca aga tcc taa 444 Pro Arg Ser *** <210> 9 <211> 441 <212> DNA PRT <213> dog <220> <221> CDS <222> (1)...(438) <220> <221> mat#peptide <222> (73)...(438) <400> 9 atg aat tat aca agc tat atc tta gct ttt cag ctt tgc gtg att ttg 48 Met Asn Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Val Ile Leu tgt tct tct ggc tgt aac tgt cag gcc atg ttt ttt aaa gaa ata gaa 96 Cys Ser Ser Gly Cys Asn Cys Gln Ala Met Phe Phe Lys Glu Ile Glu aac cta aag gaa tat ttt cag gca agt aat cca gat gta tcg gac ggt 144 Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Gln Ala Ser Asn Pro Asp Val Ser Asp Gly ggg tct ctt ttc gta gat att ttg aag aaa tgg aga gag gag agt gac 192 Gly Ser Leu Phe Val Asp Ile Leu Lys Lys Trp Arg Glu Glu Ser Asp aaa aca atc att cag agc caa att gtc tct ttc tac ttg aaa ctg ttt 240 Lys Thr Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Leu Lys Leu Phe gac aac ttt aaa gat aac cag atc att caa agg agc atg gat acc atc 288 Asp Asn Phe Lys Asp Asn Gln Ile Ile Gln Arg Ser Met Asp Thr Ile aag gaa gac atg ctt ggc aag ttc tta cag tca tcc acc agt aag agg 336 Lys Glu Asp Met Leu Gly Lys Phe Leu Gln Ser Ser Thr Ser Lys Arg gag gac ttc ctt aag ctg att caa att cct gtg aac gat ctg cag gtc 384 Glu Asp Phe Leu Lys Leu Ile Gln Ile Pro Val Asn Asp Leu Gln Val cag cgc aag gcg ata aat gaa ctc atc aaa gtg atg aat gat ctc tca 432 Gln Arg Lys Ala Ile Asn Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser cca aga taa 441 Pro Arg *** <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 gcagatctat gaattataca agctatatct tagct 35 <210> 11 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 11 gcgaattctt atttcgatgc tctgcggcct cgaaa 35 <210> 12 <211> 517 <212> DNA <213> dog <400> 12 gcagatctat gaattataca agctatatct tagcttttca gctttgcgtg attttgtgtt 60 cttctggctg taactgtcag gccatgtttt ttaaagaaat agaaaaccta aaggaatatt 120 ttcaggcaag taatccagat gtatcggacg gtgggtctct tttcgtagat attttgaaga 180 aatggagaga ggagagtgac aaaacaatca ttcagagcca aattgtctct ttctacttga 240 aactgtttga caactttaaa gataaccaga tcattcaaag gagcatggat accatcaagg 300 aagacatgct tggcaagttc ttacagtcat ccaccagtaa gagggaggac ttccttaagc 360 tgattcaaat tcctgtgaac gatctgcagg tccagcgcaa ggcgataaat gaactcatca 420 aagtgatgaa tgatctctca ccaagatcca acctaaggaa gcggaaaagg agtcagaatc 480 tgtttcgagg ccgcagagca tcgaaataag aattcgc 517 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 13 ataggatcca tgaattatac aagctatatc 30 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 14 ctggatatct ggattacttg cctgaaaata ttc 33 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 15 ccatacgtat cggacggtgg gtctctt 27 <210> 16 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 16 ggtggtcgac tgtaagaact tgccaagcat gtcttc 36 <210> 17 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 17 ccgatatcca ccagtaagag ggaggacttc cttaag 36 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 18 ctcgaattct tatttcgatg ctctgcggcc tcg 33 <210> 19 <211> 147 <212> DNA <213> dog <400> 19 ataggatcca tgaattatac aagctatatc ttagcttttc agctttgcgt gattttgtgt 60 tcttctggct gtaactgtca ggccatgttt tttaaagaaa tagaaaacct aaaggaatat 120 tttcaggcaa gtaatccaga tatccag 147 <210> 20 <211> 201 <212> DNA <213> dog <400> 20 ccatacgtat cggacggtgg gtctcttttc gtagatattt tgaagaaatg gagagaggag 60 agtgacaaaa caatcattca gagccaaatt gtctctttct acttgaaact gtttgacaac 120 tttaaagata accagatcat tcaaaggagc atggatacca tcaaggaaga catgcttggc 180 aagttcttac agtcgaccac c 201 <210> 21 <211> 195 <212> DNA <213> dog <400> 21 ccgatatcca ccagtaagag ggaggacttc cttaagctga ttcaaattcc tgtgaacgat 60 ctgcaggtcc agcgcaaggc gataaatgaa ctcatcaaag tgatgaatga tctctcacca 120 agatccaacc taaggaagcg gaaaaggagt cagaatctgt ttcgaggccg cagagcatcg 180 aaataagaat tcgag 195 <210> 22 <211> 517 <212> DNA <213> dog <400> 22 gcagatctat gaattataca agctatatct tagcttttca gctttgcgtg attttgtgtt 60 cttctggctg taactgtcag gccatgtttt ttaaagaaat agaaaaccta aaggaatatt 120 ttaatgcaag taatccagat gtatcggacg gtgggtctct tttcgtagat attttgaaga 180 aatggagaga ggagagtgac aaaacaatca ttcagagcca aattgtctct ttctacttga 240 aactgtttga caactttaaa gataaccaga tcattcaaag gagcatggat accatcaagg 300 aagacatgct tggcaagttc ttaaatagca gcaccagtaa gagggaggac ttccttaagc 360 tgattcaaat tcctgtgaac gatctgcagg tccagcgcaa ggcgataaat gaactcatca 420 aagtgatgaa tgatctctca ccaagatcca acctaaggaa gcggaaaagg agtcagaatc 480 tgtttcgagg ccgcagagca tcgaaataag aattcgc 517

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/57 37/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＦＣ０７Ｋ 14/57 Ｃ１２Ｒ 1:91）Ｃ１２Ｎ 5/10 ）Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｆ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91）Ｃ１２Ｒ 1:91）Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/66 ＢＣ１２Ｒ 1:91）Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）Ｃ１２Ｒ 1:91）Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA25 CA04 DA02 EA02 4B064 AG12 CA10 CA19 CC15 CC24 CD30 CE20 DA04 4B065 AA90X AA90Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA43 4C084 AA02 AA06 BA01 BA22 CA17 CA53 DA24 MA66 NA14 ZA891 ZB071 ZB261 ZB331 ZB351 ZC611 4H045 AA10 AA20 BA10 CA40 DA18 EA20 FA72 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】有用タンパク質の遺伝子をコードした組換
えバキュロウイルスを昆虫に感染させることによって当
該有用タンパク質を得る方法において、当該昆虫から体
液を採取した後、ｐＨ４から１０で２日以上維持するこ
とを特徴とする有用タンパク質の製造方法。
【請求項２】昆虫がカイコであることを特徴とする請求
項１記載の有用タンパク質の製造方法。
【請求項３】カイコの形態が幼虫であることを特徴とす
る請求項２記載の有用タンパク質の製造方法。
【請求項４】有用タンパク質がインターフェロンである
ことを特徴とする請求項１から３のいずれか１項記載の
有用タンパク質の製造方法。
【請求項５】インターフェロンがイヌインターフェロン
-γであることを特徴とする請求項４記載の有用タンパ
ク質の製造方法。
【請求項６】ｐＨがｐＨ７から９の範囲であることを特
徴とする請求項１から５のいずれか１項記載の有用タン
パク質の製造方法。
【請求項７】有用タンパク質のアミノ酸配列のＣ末端が
疎水性アミノ酸であることを特徴とする請求項１から６
のいずれか１項記載の有用タンパク質の製造方法。
【請求項８】有用タンパク質が配列番号６記載のアミノ
酸配列であることを特徴とする請求項５記載の有用タン
パク質の製造方法。
【請求項９】金属キレート剤を含有することを特徴とす
る請求項１から５のいずれか１項記載の有用タンパク質
の製造方法。
【請求項１０】金属キレート剤がエチレンジアミン四酢
酸であることを特徴とする請求項９記載の有用タンパク
質の製造方法。
【請求項１１】金属キレート剤が、組換えバキュロウイ
ルスを感染させた昆虫の体液またはその抽出液に対して
１から３０ｍＭの濃度であることを特徴とする請求項９
または１０記載の有用タンパク質の製造方法。
【請求項１２】ｐＨがｐＨ５から７の範囲であることを
特徴とする請求項１，２，３，４，５，９，１０，１１
のいずれか１項記載の有用タンパク質の製造方法。
【請求項１３】有用タンパク質のアミノ酸配列のＣ末端
が塩基性アミノ酸であることを特徴とする請求項１，
２，３，４，５，９，１０，１１，１２のいずれか１項
記載の有用タンパク質の製造方法。
【請求項１４】有用タンパク質が配列番号５記載のアミ
ノ酸配列であることを特徴とする請求項５記載の有用タ
ンパク質の製造方法。
【請求項１５】組換えバキュロウイルスが、当該有用タ
ンパク質をコードするＤＮＡにより、遺伝子組換えされ
た組換えカイコ核多角体病ウイルスであることを特徴と
する請求項１から１４のいずれか１項記載の有用タンパ
ク質の製造方法。
【請求項１６】請求項１から１５のいずれか１項記載の
方法により得られる有用タンパク質を含んでなるイヌ疾
病の治療剤。
【請求項１７】イヌ疾病の治療剤が抗ウイルス治療剤、
腫瘍治療剤、感染症治療剤、自己免疫疾患または皮膚病
治療剤から選ばれる少なくとも１つの治療剤であること
を特徴とする請求項１６に記載のイヌ疾病の治療剤。
【請求項１８】請求項１６または１７に記載のイヌ疾病
の治療剤をイヌに注射投与することを特徴とするイヌ疾
病の治療方法。