CN113304256B - 非洲猪瘟病毒d205r和d345l基因的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了非洲猪瘟病毒D205R和D345L基因的应用,具体为非洲猪瘟病毒D205R和D345L基因在制备非洲猪瘟病毒疫苗中的应用；非洲猪瘟病毒D205R和D345L基因能够显著抑制病毒感染诱导的干扰素表达，并抑制干扰素刺激基因ISGs的表达，通过双荧光素酶报告基因系统检测发现，经对比，表达D205R和D345L基因能够抑制仙台病毒诱导的干扰素启动子活性和干扰素刺激应答元件(ISRE)活性。通过荧光定量PCR试验，发现D205R和D345L基因的表达能够显著抑制仙台病毒感染诱导的Ⅰ型干扰素IFNβ的mRNA表达水平，以及抑制发挥抗病毒功能的干扰素刺激基因ISG15和OASL的表达水平。

Description

非洲猪瘟病毒D205R和D345L基因的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及两种病毒蛋白的功能鉴定及其在制备基因缺失疫苗中的应用，主要涉及非洲猪瘟病毒D205R和D345L蛋白的功能鉴定及其在制备非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗中的应用。

背景技术

非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)是一种DNA病毒，是非洲猪瘟病毒科，非洲猪瘟病毒属的唯一成员。非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由ASFV引起的猪烈性传染病，能造成感染家猪100％死亡。ASF最初于20世纪20年代在肯尼亚爆发，随后在南非和东非地区迅速蔓延，并在1998年被引入印度洋地区。1957年首次在非洲以外的地区(葡萄牙)爆发，随后在欧洲的一些国家都报道了ASF疫情。2007年，随着ASF传入高加索地区的格鲁吉亚，ASF进一步跨大陆传播，并逐渐演变为地方流行病。ASF在国与国之间广泛的传播，严重影响了流行地区的经济发展。2018年8月3日在中国沈阳发现首例ASF病例，并在接下来几个月内席卷了全国，在我国大部分地区蔓延开来。至今为止，我国的非洲猪瘟防控形势依然复杂严峻。大家都期待能研制出安全有效的非洲猪瘟疫苗。

ASFV是一种结构复杂的双股线状DNA病毒，病毒结构由外向内依次为外囊膜、衣壳、内囊膜、核衣壳以及拟核，病毒粒子呈二十面体对称[9]。ASFV的基因组长度在170-193kb之间，基因组呈线状，由中间的保守区、两侧终端的可变区组成，多基因家族位于两侧的可变区。基因组末端的重复序列以反向互补不完全碱基配对的发夹环共价闭合。病毒基因组编码151到167个开放性阅读框(Open reading frame，ORF)，基因组长度及编码蛋白数量取决于末端区编码的多基因家族的数量。目前ASFV能够编码的蛋白数量尚未解析完全，而已知ASFV编码蛋白的功能也尚未研究清楚。

干扰素是机体天然免疫的重要组成部分，尤其是在病毒感染过程中，干扰素在机体抗病毒过程中起着关键性的作用。宿主能够通过不同的模式识别受体识别病原微生物的不同组分，当这些组分被识别时，机体立即启动一系列的信号级联反应，以促进干扰素的合成与分泌，进而诱导相关抗病毒基因ISGs的表达。相关研究表明，在非洲猪瘟病毒感染的初期能够抑制宿主分泌干扰素的能力，从而成功感染宿主细胞。目前许多研究都专注于ASFV多基因家族蛋白在病毒感染中的作用。MGF360和MGF505家族位于ASFV基因组两端的高度可变区，不同多基因家族的基因在结构和功能上呈现多样性。同一家族的基因序列高度相似，其在基因组中的的定位和及其编码蛋白结构功能通常具有相似性，ASFV在进化过程中这些基因存在丢失的倾向。多基因家族通常与ASFV的毒力有关，研究表明MGF360和MGF505家族的某些成员缺失后能够使ASFV的毒力下降，并且与同种基因型的强毒株相比，感染缺失多基因家族的弱毒株能够显著促进干扰素及下游ISGs的表达。这提示了多基因家族MGF360与MGF505能够间接或直接抑制干扰素的产生。强毒株Benin 97/1在敲除MGF36011L、MGF36012L、MGF36013L、MGF36014L和MGF5051R、MGF5052R、MGF5053R后能使巨噬细胞IFN-β分泌水平得到明显回升，并且感染家猪后能够对家猪起到一定的保护作用。虽然多基因家族蛋白抑制干扰素表达的功能已经得到大部分学者的认可，但在体内实验中多基因家族这种特性并不是依靠单个多基因家族成员实现的，而是需要多个多基因家族蛋白成员协同作用。多基因家族的这种特性使得目前大部分的研究都集中在缺失多个多基因家族成员对病毒毒力的影响以及疫苗的研制。然而，目前只有几个多基因家族蛋白功能得到了确定，如MGF505家族的A528R、MGF-505-7R和MGF360家族的A276R、MGF360-12L。虽然这些蛋白都能够抑制干扰素的产生，但是作用机制并不相同。此外，学者还发现ASFV编码的DP96R、I329L和A238L蛋白也发挥着免疫逃逸的作用。DP96R通过抑制TBK1的磷酸化阻断cGAS-STING-TBK1信号通路抑制干扰素启动子的激活。I329L与TLR3信号通路中的关键接头蛋白TRIF相互作用，使TRL3信号通路不能被激活，从而抑制下游干扰素的合成。A238L是一种典型的多功能蛋白，它能通过多种途径调控核转录因子的活性。探究非洲猪瘟病毒抑制天然免疫的机制有助于了解非洲猪瘟病毒的致病机制和疫苗的研发。

我们成功筛选到了两个可以显著抑制干扰素表达的非洲猪瘟病毒蛋白，即D205R和D345L基因。D205R和D345L蛋白具有抑制宿主细胞抗病毒天然免疫应答的功能，能显著抑制干扰素刺激基因ISG15和OASL的表达水平，可作为构建非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗的候选缺失基因，具有重要的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供两种病毒蛋白的功能鉴定及其在制备基因缺失疫苗中的应用。

非洲猪瘟病毒D205R和D345L基因在制备非洲猪瘟病毒疫苗中的应用，非洲猪瘟病毒D205R和D345L基因核酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。

非洲猪瘟病毒D205R和D345L基因在抑制宿主细胞抗病毒天然免疫应答中的应用。

用非洲猪瘟病毒D205R和D345L基因翻译成的蛋白质在制备非洲猪瘟病毒疫苗中的应用，其中非洲猪瘟病毒D205R基因翻译成蛋白质的氨基酸序列为：

非洲猪瘟病毒D345L基因翻译成蛋白质的氨基酸序列为：

试验证明，非洲猪瘟病毒D205R和D345L基因能够显著抑制病毒感染诱导的干扰素表达，并抑制干扰素刺激基因ISGs的表达。通过双荧光素酶报告基因系统检测发现，与对照组相比，表达D205R和D345L基因能够抑制仙台病毒诱导的干扰素启动子活性和干扰素刺激应答元件(ISRE)活性。通过荧光定量PCR试验，发现D205R和D345L基因的表达能够显著抑制仙台病毒感染诱导的Ⅰ型干扰素IFNβ的mRNA表达水平，以及抑制发挥抗病毒功能的干扰素刺激基因ISG15和OASL的表达水平。综上，本发现鉴定了两种具有抑制宿主细胞抗病毒天然免疫应答功能的非洲猪瘟病毒蛋白，为制备非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗提供了新的选择。

附图说明

图1为D205R和D345L基因对仙台病毒诱导的干扰素启动子活性的影响。**表示差异极显著(P<0.01)，***表示差异极极显著(P<0.001)。

图2为D205R和D345L基因对仙台病毒诱导的IFNβ的mRNA表达量的影响。**表示差异极显著(P<0.01)，***表示差异极极显著(P<0.001)。

图3为D205R和D345L基因对干扰素刺激基因ISGs表达的影响。**表示差异极显著(P<0.01)，***表示差异极极显著(P<0.001)。

具体实施方法

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法及装置，如无特殊说明，均为常规方法及装置。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购得。为使本发明专利的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明专利的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在具体实施例中进行了例示。

在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明专利的技术方案，在实施例中仅仅示出了与根据本发明专利的方案密切相关的技术方案和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。

293T细胞(人胚肾细胞系)：美国标准生物品收藏中心(American Type CultureCollection，ATCC)，编号为CRL-3216。

实施例一、非洲猪瘟病毒D205R和D345L基因可显著抑制病毒感染诱导的干扰素启动子活性和干扰素刺激应答元件活性

本发明以非洲猪瘟病毒China/2018/AnhuiXCGQ(GenBank登录号：MK128995.1)D205R和D345L基因的核苷酸序列为模板，由苏州金唯智生物科技有限公司合成，并成功构建到pCAGGS载体上，分别命名为pCAGGS-D205R和pCAGGS-D345L，质粒构建后，送北京擎科生物技术有限公司进行测序，测序无误后，进行后续的细胞试验。

复苏293T细胞，并培养于含有双抗(100units/mL青霉素和100units/mL链霉素)和10％的胎牛血清(Gibco)的DMEM(Gibco)培养基中。先将293T细胞均匀铺到24孔板中，置于37℃，5％CO2浓度的细胞培养箱中培养。待细胞长到汇和度为80-90％时，将500ng pCAGGS-D205R或pCAGGS-D345L或pCAGGS-NS1(H7N9)(为用流感病毒H7N9毒株的NS1核苷酸序列构建的质粒，作为阳性对照)，分别与500ng的IFN-β-Luc或ISRE-Luc、50ng的内参pRL-TK质粒，依照VigoFect(威格拉斯生物技术有限公司)的说明书，共转染至293T细胞，转染4-6h后换成完全培养基继续培养，每组实验设置三个重复。转染24h后，将完全培养基换成病毒维持液(无血清DMEM中含2μg/ml的胰酶)，用仙台病毒(100HAU/ml)感染细胞，病毒吸附1h，期间每15min倾斜摇晃细胞板一次。吸附1h后，吸去上清，用PBS清洗细胞3次，加入2ml病毒维持液。病毒感染16h后，按照双荧光素酶报告系统检测试剂盒(Promega Dual-

Report)的推荐方法收取蛋白样，离心后取上清到96孔板中，用GloMax进行荧光测定。用GraphPadPrism8对实验结果进行分析。结果发现，如图1所示，ASFV的D205R和D345L两个基因具有较为明显的抑制干扰素启动子活性和干扰素刺激应答元件活性的作用。

实施例二、非洲猪瘟病毒D205R和D345L基因能抑制IFN-β的转录

先将293T细胞铺到12孔板中，待细胞长到汇和度为80-90％时，按照VigoFect说明书将4μg的pCAGGS-D205R和pCAGGS-D345L分别瞬时转染293T细胞，4-6h后换成完全培养基。转染24h后用SeV(100HAU/ml)刺激细胞12h，然后用TRIzol(品牌：MNG，货号：740404.200)裂解细胞，并按照说明书提取RNA，反转录后用做荧光定量PCR(qPCR)的模板。按照qPCR(北京全式金生物技术有限公司，

Green qPCRSuperMix)说明书的推荐体系进行荧光定量PCR实验。实验结果用GraphPad Prism8进行分析。结果表明，如图2所示，D205R和D345L蛋白都可抑制由SeV诱导的IFN-β的转录。

实施例三、非洲猪瘟病毒D205R和D345L基因能抑制干扰素刺激基因ISGs的表达

先将293T细胞铺到12孔板中，待细胞长到汇和度为80-90％时，按照VigoFect说明书将4μg的pCAGGS-D205R和pCAGGS-D345L分别瞬时转染293T细胞，4-6h后换成完全培养基。转染24h后用SeV(100HAU/ml)刺激细胞12h，然后用TRIzol裂解细胞，并按照说明书提取RNA，反转录后用做荧光定量PCR(qPCR)的模板。按照qPCR说明书的推荐体系进行荧光定量PCR实验。实验结果用GraphPad Prism8进行分析。结果表明，如图3所示，D205R和D345L蛋白都可抑制由SeV诱导的ISG15和OASL的转录。干扰素刺激基因ISGs作为由干扰素诱导表达的基因，能够靶向病毒复制的不同阶段进而抵抗病毒感染，在宿主抵抗病毒感染的过程中发挥着至关重要的作用。而D205R和D345L基因能够显著抑制ISG15和OASL的表达，进一步确定了D205R和D345L是与免疫抑制相关的基因，该发现为制备非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗提供了新的选择。

综合上述三个实施例的结果，可证明非洲猪瘟病毒D205R和D345L基因具有抑制宿主细胞抗病毒天然免疫应答的功能，而且可作为构建非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗的候选缺失基因。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

序列表

<110> 福建农林大学

<120> 非洲猪瘟病毒D205R和D345L基因的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 753

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggatactg ccatgcagct taaaacgtct attggtttaa ttacatgtcg tatgaacacc 60

caaaataacc aaatagaaac tattctggtt caaaaacgtt acagccttgc tttttcagaa 120

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catatttgga ttgaaactcc agtctacgaa ctataccaca aaaaatacca aaaatttagg 300

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cttacctgtg ccatacggga gtttgaagaa gaaaccggga ttacccgcga atattaccag 480

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cgttttatta gcaaacgcca gtcattaaac ctggagccta tcatcgggcc tgcatttaat 720

tttattaaaa actatttacg atacaagcac tag 753

<210> 2

<211> 1038

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggaaacct ttgtacgcct gtttaaagac tctcctcagc agcgctccga tgcctggcat 60

gctattcgtc gcactcaggt gggtggctct gaccttgcca gcgttttagg tttaaaccct 120

tacaaaagct attatataac cttggcggaa aaagcaaatc tttttaagaa gaatttgaac 180

cgcgctgctt gtagctgggg aacccttttt gagcgtgtta gtaaagatct gcttgagttg 240

ttctgccaaa ccaccgtcat aggtgacaat attcatattg atgggaccta tttgggatac 300

cccggacata gtaatagccc cgatgggttt tgtcacctaa cgctgggata cactcaacag 360

tcctgggaaa tcaaaacaat ttttaacaac gtacgctatg aggccacgaa acgcatcccc 420

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tatatgccgc aaatacaatc cggtcttgcc ctttcgccgc ctatctctat gggcatctac 540

gtcgaggcca tgtttcgcgt gtgcggcatt catcagctgg gatcgaataa tgagaccaat 600

acggatatcc accctccaga gtccatgctc ccgcttgcct ggggaatcat cacgatctgc 660

tctacacagg agcacaccga ggctcctcaa gattttggca cgctcgacgc ggaaacattt 720

cgccaactac ttgaaacgct gtatcaaaaa gatcagtaca ctattcacta ttctatgcct 780

tatgaaaccg cgtgtcccga aatgccaaat gtggttggct actttggatg gaaggtcttt 840

atctttcaaa taattccagt tatgaaacat ccccagtttt taaaagacaa atatcccatc 900

atacaacagt tcttacgtga cctacatact attaaagcct cgccatcccc catggagatg 960

tatgaaaaaa tttgctgctc agaggaaagc gctctatcca cagaggacat cgacaatttt 1020

acagatatgc ttacttag 1038

Claims (1)

1.非治疗目的的非洲猪瘟病毒D205R和D345L基因在抑制宿主细胞IFN-β、ISG15或OASL的转录中的应用。

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