KR20220135177A

KR20220135177A - 침팬지 아데노바이러스 혈청형 6의 돌기 유전자로 치환된 재조합 키메릭 아데노바이러스 벡터 및 그 응용

Info

Publication number: KR20220135177A
Application number: KR1020220034885A
Authority: KR
Inventors: 김수옥; 홍선표; 김석준; 장선옥; 김현주; 이상현
Original assignee: (주)진매트릭스
Priority date: 2021-03-29
Filing date: 2022-03-21
Publication date: 2022-10-06

Abstract

본 발명은 인간 아데노바이러스 5형의 섬유 단백질 말단의 돌기 도메인을 침팬지 아데노바이러스 혈청형 6의 돌기 유전자로 치환한 키메릭 아데노바이러스 벡터 및/또는 추가로 인간 아데노바이러스 5형의 헥손 단백질을 인간 아데노바이러스 혈청형 28의 초가변영역 1-7로 치환된 키메릭 아데노바이러스 벡터에 관한 것으로, 본 발명은 다양한 질병에 대한 치료제 또는 백신 개발에 있어서 최적의 아데노바이러스 벡터를 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 본 발명에서 제작된 키메릭 아데노바이러스 벡터를 생산용 숙주세포에 감염시킬 경우, 재조합 HAdV-5벡터-기반 백신에 비해 보다 뛰어난 세포 감염능을 나타내어 생산성 향상에 기여할 수 있다.

Description

침팬지 아데노바이러스 혈청형 6의 돌기 유전자로 치환된 재조합 키메릭 아데노바이러스 벡터 및 그 응용{Recombinant chimeric adenovirus vector substituted with the knob gene of chimpanzee adenovirus serotype 6 and use of the same}

본 발명은 숙주에서 인간 아데노바이러스 혈청형 5(HAdV-5)에 대한 기존면역(Pre-existing immunity)을 회피할 수 있는 최적의 조건을 가지는 키메릭 아데노바이러스 벡터(vector)에 관한 것으로, 보다 상세하게는 HAdV-5 유전자 서열을 기반으로 혈청 유병률이 낮은 아데노바이러스 혈청형의 돌기(knob) 단백질 또는 헥손 단백질을 발현하는 키메릭 아데노바이러스 벡터, 및 그 키메릭 아데노바이러스 벡터 기반의 사스-코로나바이러스-2와 인간 파필로마바이러스에 대한 예방 및 치료 백신 응용에 관한 것이다.

아데노바이러스(adenovirus)는 뉴클레오캡시드(neucleocapsid) 내에 선형의 이중가닥 DNA (linear double stranded DNA)를 포함하는 지름이 약 90-100mm의 중형크기의 비외피바이러스(nonenveloped virus)이다. 다양한 척추 동물(양서류, 조류 및 포유류)에서 발견되며, 대부분은 호흡기 감염(respiratory infection), 결막염(conjunctivitis)및 위장관염(gastroenteritis) 등을 일으킨다. 레트로바이러스와는 대조적으로, 숙주 세포의 게놈(genome)으로 삽입되지 않기 때문에 아데노바이러스의 DNA에 의한 숙주 세포의 형질 전환 또는 종양발생이 일어나지 않고, 비분열 세포에도 형질 도입이 가능하며 바이러스 생산성이 높은 특징을 가지고 있어 아데노바이러스 벡터는 유전자 치료 및 백신 이용에 널리 연구되었다.

1세대 재조합 아데노바이러스 (recombinant adenovirus) 벡터는 바이러스 복제에 관여하는 초기전사유전자인 E1 및 E3 유전자를 결실(deletion)하여 임상적 측면에서 보았을 때, 숙주에서의 복제-무능(replication-incompetent)상태로 만듦으로써 부작용을 감소시켰고, 외부 유전자(약 8 Kb까지)를 삽입하는데 제한이 적어졌다. 이제까지는, 서브그룹(subgroup) C에 속하는 인간 아데노바이러스 혈청형 2 및 5 (AdH2 및 HAdV-5)가 벡터로 가장 많이 연구되었으며, 재조합 HAdV-5 벡터-기반 백신은 전임상(preclinical trial) 단계에서 다양한 동물 모델을 통해 고면역원성(highly immunogenic)결과를 나타냄으로써 우수한 백신 효능이 입증되었다.

그러나, 재조합 HAdV-5 벡터-기반으로 개발한 HIV 백신의 임상 시험(clinical trial)에선 비임상 결과와 다른 불충분한 효능을 보였다. HAdV-5는 가장 흔하게 감염되는 아데노바이러스 혈청형 중 하나로, 기존면역(pre-existing immunity)에 의해 약 80 % 이상의 인구가 항-HAdV-5 중화항체(neutralizing antibody)를 보유하고 있다는 보고가 있다. HIV 백신 임상시험 결과에서 알 수 있듯이, 기존면역에 의해 형성된 항-HAdV-5 중화항체는 외래 유전자를 적재한 재조합 HAdV-5 벡터-기반 백신에 결합하여, 백신 효능을 감소시킨다.

아데노바이러스의 20면체 외피 단백질은 주된 외피 단백질(capsid protein)로 헥손(hexon), 섬유(fiber) 그리고 펜톤(penton)단백질로 구성된다. 헥손은 아데노바이러스의 외피단백질 중 가장 많은 부분을 차지하는 단백질로서 아데노바이러스 혈청형 간의 유전적 상동성이 낮은 초가변영역(hypervariable region; HVR)을 포함하고 있다. 펜톤은 외피 단백질의 구조적 안정성과 유연성을 담당하는 단백질로, Arg-Gly-Asp (RGD) 모티프를 통해 세포이입(cell entry)에 관여한다. 그리고 섬유는 말단에 존재하는 돌기(knob) 도메인을 통해 숙주세포의 수용체인 CAR(Coxsackie and adenovirus receptor)과 결합하여 세포이입이 일어난다. 3가지 외피 단백질(헥손, 섬유 및 펜톤)은 공통적으로 항-Ad 중화항체의 주요 인식부위로 작용한다고 알려져 있다. 최근에는 HAdV-5에 대한 기존 면역을 회피하기 위하여, 섬유 단백질의 돌기 도메인을 혈청 유병률이 낮은 인간 아데노바이러스 혈청형으로 교체한 키메릭 아데노바이러스 벡터 연구가 보고되었다. 하지만, 인간 아데노바이러스 혈청형을 이용한 키메릭 아데노바이러스 벡터의 경우, HAdV-5에 대한 중화항체와의 교차반응 가능성이 존재하기 때문에 HAdV-5에 대한 기존면역 회피능이 저하될 수 있다.

HAdV-5에 대한 중화항체와 교차반응 면역을 피하기 위해서 유전적으로 거리가 먼, 사람 외의 동물로부터 분리된 아데노바이러스 혈청형이 바이러스 벡터로 개발되었다. 이러한 비인간 아데노바이러스 벡터 중 침팬지 아데노바이러스(ChAdV) 혈청형을 이용한 바이러스 벡터가 가장 널리 사용되고 있다. ChAdV 혈청형은 HAdV-5보다 혈청 유병률이 낮은 것으로 조사되었다. 예를 들어, ChAdV-6, ChAdV-68에 대한 중화항체의 혈청보유률은 미국, 태국인의 혈청 샘플들 중 1.5-4%만이 검출되었다. 뿐만 아니라, ChAdV-63을 기반으로 한 말라리아 백신의 1상 임상시험 결과에서 안전성과 함께 모든 임상시험 지원자들에서 항원-특이 T세포(antigen-specific T cell) 반응이 높게 나타났다. ChAdV-벡터-기반 백신의 낮은 혈청유병률에도 불구하고, 벡터 특이 세포면역 (vector-specific cellular immunity)은 혈청형 간의 높은 교차반응이 주된 관심사이다.

코로나바이러스는 직경 100-200 mm의 입자표면에 외피를 가지는 positive-sense single stranded RNA 바이러스로, 7종의 코로나바이러스가 사람의 호흡기와 소화기계 감염을 유발한다고 알려져 있고 7종 가운데 2종은 알파-코로나바이러스 속 그리고 나머지 5종은 베타-코로나바이러스 속으로 밝혀졌다. 신종 코로나바이러스 감염증(COVID-19, novel coronavirus, 2019-nCov)을 유발하는 사스-코로나바이러스-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, 이하, 'SARS-CoV-2'라 함)는 베타-코로나바이러스 속에 해당하며 2019년 12월 중국 우한시에서 최초로 보고된 후(Wuhan-Hu-1), 전세계적으로 확진자가 속출하고 있으며 발생 이래 다양한 변이(알파 변이주, 베타 변이주, 델타 변이주 등)를 통해 팬데믹(pandemic)이 심화되고 있다.

SARS-CoV-2의 바이러스 외피는 스파이크 당단백질(spike glycoprotein, S 단백질), 헤마글루티닌-에스테라아제 이량체(hemagglutinin esterase dimer, HE) 등으로 이루어져 있다. S 단백질의 S₁영역은 주로 RBD (Receptor binding domain)를 통한 수용체 (Angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)와의 결합을, S₂영역은 3차구조의 극적 변화를 동반한 직접적인 세포-바이러스 융합(감염개시)을 담당한다. 따라서, 주요 항원(antigen)으로서 S 단백질을 표적하는 백신후보물질들이 개발 중 및 상용화되었다(AZD-1222(AstraZeneca), Bnt162b2(Pfizer), mRNA-1273(Moderna) and etc.)

RNA 바이러스는 DNA 복제 과정에서 오류를 교정하는 DNA repair pathway(base excision repair, nucleotide excision repair, mismatch repair)가 일어나는 DNA 바이러스와 달리, RNA 중합효소를 이용하므로 게놈복제과정에서 발생한 오류를 교정할 RNA repair 관련 단백질이 없기 때문에 DNA 바이러스 대비 돌연변이 발생이 빈번한 특성이 있다. SARS-CoV-2 변이 바이러스의 경우, S 단백질의 N-말단 도메인(N-terminal domain, NTD)과 RBD 도메인에서 돌연변이가 빈번하게 발생하였고, 이로 인해 사스-코로나바이러스-2의 S단백질을 타겟으로 개발된 기허가 백신들이 구조적 변화가 발생한 변이 바이러스의 S 단백질에 대한 항체 결합능력이 감소되어 변이 바이러스에 대한 방어 효능이 저하되었다.

2020년 12월 남아프리카 공화국에서 사스-코로나바이러스-2의 치명적인 변이가 발생하였고 베타 변이로의 분류 및 우려변이(variant of concern, VOC)로 지정되었다. 해당 변이주는 NTD에서의 deletion 뿐만 아니라 RBD에서 VOC들의 핵심 변이 3종(E484K, K417N, N501Y)을 모두 가지는 최초의 변이로 판명되었으며, 아스트라제네카의 AZD-1222 백신의 경우 베타 변이주(B.1.351)군에서 백신 효력이 기존 사스-코로나바이러스-2 대비 10 %까지 저하되는 등 기허가 백신들에 대한 급격한 효력 저하가 확인되었다.

또한, 베타 변이에 감염되었던 회복기 환자의 혈청에서 사스-코로나바이러스-2 및 다른 변이 바이러스들에 대해 교차반응(cross-neutralization)이 확인됨에 따라 사스-코로나바이러스-2에 대한 S단백질이 아닌 변이 바이러스에 대한 S단백질을 표적으로 한 백신 개발로 방향이 바뀌는 추세이며, 지속적인 변이 바이러스 출현에 맞서 대항 가능한 범용 백신(universal vaccine)에 대한 필요성이 대두되고 있다.

HPV는 약 170가지의 HPV 유전자형이 있으며, 크게 고위험군(high risk, hr) 과 저위험군으로 두 가지로 분류된다. 생식기 사마귀를 유발하는 저위험군에는 HPV-6/11/40/42/43/44/54/61 및 72 유형이 있으며, 고위험군 유형에는 HPV-16/18/31/35/39/45/51/52/56/58/66 및 68을 포함하며, 고위험 유형은 자궁 경부암의 99.7% 정도의 원인이 된다.

특히 HPV-16과 18 유형은 전 세계 자궁 경부암과 관련된 가장 보편적인 유형으로, 발병의 70% 이상을 차지한다. HPV는 또한 많은 음경, 외음부 및 항문 관련 암종의 원인이 되며 구강인두암의 40% 이상을 차지하기도 한다.

이러한 고위험군 HPV에 의한 지속적인 감염은 편평 상피내 병변 (Squamous intraepithelial lesion, SIL)의 발생을 초래한다. 이는 자궁 경부에서는 자궁 경부 상피내 종양 (Cervical intraepithelial neoplasia, CIN), 외음부에서는 외음부 상피내 신 종양 (Vulva intraepithelial neoplasia, VIN)이라 하며, 이러한 SIL은 악성 암으로 진행될 수 있다.

HPV는 외피가 없으며 유전체 크기가 약 8kb인 이중 가닥 DNA로 이루어진 바이러스로, 유전체는 6개의 초기 조절 단백질 (E1, E2, E4, E5, E6 및 E7)과 2개의 후기 구조 단백질 (L1 및 L2)를 암호화한다. 초기 유전자는 바이러스 DNA 복제, 전사 및 발암성 형질 전환과 관련이 있는 단백질을 암호화하고, 후기 유전자는 바이러스 캡시드 단백질을 암호화한다. 일반적인 고위험군 HPV 암 형성 과정에서, 바이러스의 유전체가 숙주의 염색체 DNA에 통합(integration)되고 E2 유전서열은 유전자의 선형화(Linearization) 동안 파괴된다. E2 단백질은 E6 및 E7의 전사 억제 인자이기 때문에 E2가 파괴되면 E6 및 E7 단백질의 발현이 시작된다. E6 단백질은 숙주의 세포자연사를 조절하는 단백질 p53의 분해를 촉진하고, telomerase를 활성화시켜 세포의 수명을 연장시킨다. 또한 E7 단백질은 종양 억제 단백질인 망막아세포종 단백질(pRb)을 표적으로 하여 이 단백질을 분해시킨다. 이렇듯 E6 및 E7은 세포주기 조절을 방해하고 숙주세포의 수명을 연장시켜, 유전적 불안정성과 세포의 악성 형질 전환 및 암을 발병시킨다.

HPV 치료 백신에서는 체액성 면역 반응보다는 세포성 면역에서의 감염 제거가 중요하다. HPV E6, E7 종양 단백질은 악성 종양의 발병 및 유지에 필수적이며, 전 악성 및 침습성 병변에서 발현되지만 건강한 세포에는 존재하지 않는다.

따라서 이러한 종양 단백질 (E6, E7)은 돌연변이에 의한 면역 반응을 피할 수 없으며, HPV 감염 및 병변에 대한 치료 백신의 개발의 가장 이상적인 타겟이다.

이상적인 치료 백신은 E6, E7 단백질을 표적화하여 강한 종양 특이적 T세포 유형 1 및 세포 독성 림프구 (cytotoxic T lymphocyte, CTL) 반응을 유도하여 감염 및 악성 세포를 사멸시킬 수 있다.

[선행 특허 문헌]

대한민국 특허 공개번호 제1020040054796호

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 숙주에서 HAdV-5에 대한 기존면역을 극복하는 키메릭 아데노바이러스 벡터 제작과 관련하여 종래의 재조합 HAdV-5 벡터 보다 우수한 아데노바이러스 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 높은 효율로 외래 유전자를 전달할 수 있는 치료 또는 예방 백신용 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 사스-코로나바이러스-2의 감염을 예방하기 위해서 베타 변이주의 S 유전자 서열을 포함하는 키메릭 아데노바이러스 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 사스-코로나바이러스-2의 감염을 예방하기 위한 백신을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 사람 파필로마바이러스의 16형의 E6, E7과 18형의 E6, E7의 유전자 서열을 포함하는 키메릭 아데노바이러스 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 HPV 치료 및 예방하기 위한 백신을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인간 아데노바이러스 5형의 섬유 단백질 말단의 돌기 도메인을 침팬지 아데노바이러스 혈청형 6의 돌기 유전자로 치환하거나, 상기 치환된 아데노바이러스 5형에 인간 아데노바이러스 5형의 헥손 단백질을 인간 아데노바이러스 혈청형 28의 초가변영역 1-7로 치환한 기존면역 회피능이 우수한 인간 아데노바이러스 혈청형 5 형 기반 키메릭 아데노바이러스 벡터를 제공한다.

본 발명은 인간 아데노바이러스 5형에 대하여 사람에서의 기존 면역이 존재하기 때문에 외래 유전자 전달 시 효능이 저하되는 점을 극복하고자 인간 아데노바이러스 5형에 대한 기존 면역을 회피할 수 있는 벡터에 관한 것이다.

본 발명에서 HAdV-5 유전자의 교체 부위는 섬유 단백질의 돌기 도메인이다. 섬유 단백질은 세 가지 도메인(tail, shaft, knob)으로 구성되며, 그 중 돌기 도메인이 중화항체의 주요한 인식부위로 알려져 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 침팬지 아데노바이러스 혈청형 6의 돌기 유전자에 의하여 발현된 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 침팬지 아데노바이러스 혈청형 6의 돌기 유전자 서열은 서열번호 2의 핵산 서열을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 돌기 서열은 사람에서 낮은 혈청 보유율을 가지는 희귀 아데노바이러스 혈청형의 유전자 서열을 사용한다. 예컨대, ChAdV-1, ChAdV-2, ChAdV-3, ChAdV-5, ChAdV-7, ChAdV-68 등이 있으며, 침팬지 아데노바이러스 이외에도 소, 돼지, 조류 등에서 발견되는 아데노바이러스 혈청형을 사용할 수 있다.

본 발명에서는 인간 아데노바이러스 5형의 tail 및 shaft 도메인과 침팬지 아데노바이러스 혈청형 6의 knob 조합된 섬유단백질을 포함하는 키메릭 아데노바이러스 벡터를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 인간 아데노바이러스 5형의 헥손 단백질을 인간 아데노바이러스 혈청형 28의 초가변영역 1-7로 치환된 키메릭 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 인간 아데노바이러스 혈청형 28의 헥손 단백질 내 초가변영역 유전자 서열은 서열번호 4의 핵산 서열을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 헥손 초가변영역 서열은 인간에서 낮은 혈청 보유율을 가지는 희귀 아데노바이러스 혈청형의 유전자 서열을 사용한다. 예컨대, HAdV-14, HAdV-19, HAdV-32, HAdV-34, HAdV-36, HAdV-43 등이 있으며, 인간 이외에도 소, 돼지, 조류 등에서 발견되는 아데노바이러스 혈청형을 사용할 수 있다.

본 발명에서는 침팬지 아데노바이러스 혈청형6의 knob 유전자로 조합된 섬유단백질을 포함한 아데노바이러스 벡터에 인간 아데노바이러스 5형의 헥손 단백질에서 초가변영역을 인간 아데노바이러스 28형의 유전자로 치환한 헥손 단백질을 포함하는 키메릭 아데노바이러스 벡터를 제공한다.

본 발명의 상기 벡터의 벡터 조절 인자로 ITR 서열(inverted terminal repeat), BR322 복제개시점, 카나마이신 저항성 유전자, ITR 서열, 막화 서열(encapsidation signal), CMV 인핸서, CMV 프로모터, 및 SV40 ploy(A) 신호서열 순서로 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 벡터는 BR322 복제개시점, 항생제 저항성 유전자를 포함하는 것이 바람직하고, 카나마이신(kanamycin)에 대한 저항성 유전자(Kan)를 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 선별을 위해 사용되는 항생제로는 앰피실리(ampicilin), 클로람피니콜(chloroamphenicol), 테트라사이클린(tetracycline) 또는 네오마이신(neomycin)에 대한 항생제 저항성 유전자를 사용할 수 있다.

상기 벡터는 아데노바이러스의 ITR 서열(inverted terminal repeat)과 막화 서열(encapsidation signal)을 포함하는 것이 바람직하다. ITR 서열 및 막화 서열은 각각 아데노바이러스 DNA 복제 및 패키징에 필수적인 요소이다.

상기 벡터는 인핸서로 사이토메갈로바이러스 즉시 초기 인핸서(cytomegalovirus immediate early enhancer; CMV enhancer)를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 예컨대, 인핸서는 시미안 바이러스(Simian virus 40; SV40)의 인핸서를 사용할 수 있다.

상기 프로모터는 바이러스 유래 또는 포유류 유래 프로모터인 것이 바람직하고, 구체적으로 사이토메갈로 바이러스 (Cytomegalovirus; CMV) 프로모터를 말한다. CMV 프로모터는 모든 포유 동물 세포와 곤충세포에서 외래 유전자 발현을 효율적으로 유도하는 강력한 프로모터로 인정받고 있다.

상기 벡터의 SV40 poly(A) 신호 서열은 시미안 바이러스 (Simian virus 40; SV40)의 폴리 아데닐 신호를 말하며, 이를 벡터에 포함하는 것이 바람직하다. SV40 poly(A) 신호서열의 사용은 전령RNA(mRNA)의 안정성을 높여주어, 단백질 발현을 보다 용이하게 할 수 있다.

본 발명의 상기 벡터는 도 5 또는 도 6에 개시된 키메릭 아데노바이러스 벡터인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 벡터는 삽입체로 a) 코로나 바이러스의 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자, 또는 b) 인간 인유두종 바이러스 타입 16 또는 18의 E6 및 E7 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 벡터는 포유동물 세포를 감염시킬 수 있는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 키메릭 아데노바이러스 벡터로 형질전환 된 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 침팬지 아데노바이러스 돌기 유전자로 치환된 키메릭 아데노바이러스 벡터와 상기 벡터에 추가로 희귀 인간 아데노바이러스의 헥손 초가변영역으로 치환된 키메릭 아데노바이러스 벡터의 형질전환 된 세포는 HEK293, PERC6 또는 911 세포를 포함하는 포유 동물 세포인 것이 바람직하고, HEK293 세포가 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

예컨대, 본 발명을 위해 적합한 아데노바이러스 생산 세포는 복제불능 아데노바이러스(replication defective adenovirus)의 E1 및 E3 유전자 결손 부위를 상보성 전환(trans-complementation)하여 바이러스 생산이 가능한 세포여야 하며, 상기 바이러스 초기전사유전자들로 형질 전환시킨 세포들이 많이 개발되고 있다. E1 및 E3 유전자가 도입되기 바람직한 세포에는 A549 (carcinomic human alveolar basal epithelial cell), HeLa(Human Cervical cancer cell), CHO(Chinese hamster ovary cell), MRC5 (human lung fibroblast), 그리고 PC12(rat pheochromocytoma cell)등이나, 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 키메릭 아데노바이러스 벡터에 의해 암호화된 분리된 폴리펩타이드를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 키메릭 아데노바이러스 벡터 또는 그 벡터에 의하여 코딩된 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 상기 요소들은 인위적으로 합성 및 Gibson assembly 방법을 통하여 벡터를 제공한다.

또한 본 발명의 구현예에 있어서, 상기 키메릭아데노바이러스 벡터 기반의 백신으로 베타 변이주 S 또는 사람 파필로마바이러스 16형, 18형의 E6E7 단백질이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 상기 키메릭 아데노바이러스벡터 기반의 베타 변이주 S를 사용하여 마우스 면역 및 바이러스 중화효능을 제공한다.

또 본 발명은 상기 키메릭 아데노바이러스벡터 기반의 베타 변이주 S에 따른 특이적 T 세포의 면역반응에 대한 효능을 제공한다.

본 발명은 키메릭 아데노바이러스벡터 기반의 베타 변이주 S 바이러스 면역 후 사스-코로나바이러스-2와 델타변이 바이러스에 대한 방어 효능을 제공한다.

본 발명은 상기 키메릭 아데노바이러스벡터 기반의 HPV16형, 18형 E6E7 바이러스를 사용하여 마우스 종양세포 치료의 효능을 제공한다.

본 발명은 키메릭 아데노바이러스벡터 기반의 HPV16형, 18형 E6E7 바이러스에 따른 특이적 T 세포의 면역반응에 대한 효능을 제공한다.

본 발명은 키메릭 아데노바이러스벡터 기반의 HPV16형, 18형 E6E7 바이러스를 사용하여 마우스 종양세포 예방의 효능을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 키메릭 아데노바이러스 벡터 또는 그 벡터에 의하여 코딩된 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)의 감염증 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 키메릭 아데노바이러스 벡터 또는 그 벡터에 의하여 코딩된 사람 파필로마바이러스 질병의 자궁경부암 질환에 의한 치료용 백신인 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명자들은 혈청 보유률이 낮은 아데노바이러스 혈청형의 캡시드 단백질 유전자 서열을 조합함으로써 HAdV-5에 대한 기존면역 문제점을 개선하는 키메릭 아데노바이러스 벡터를 개발하고자 예의 노력한 결과, 재조합 HAdV-5 벡터를 기반으로 돌기 유전자 서열을 ChAdV-6의 해당 유전자로 교체한 ChimAd벡터 또는 ChimAd-H28벡터에 HAdV-5의 헥손 단백질 내 초가변영역을 혈청형 28의 해당 유전자로 교체한 ChimAd-H28 벡터가 최적의 아데노바이러스 벡터로서 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

인구 약 80% 이상이 자연적으로 아데노바이러스에 대한 중화 항체를 보유하고 있기 때문에 외래 유전자를 적재한 아데노바이러스 벡터 기반의 백신은 HAdV-5에 대한 기존면역으로 면역효능이 저하되는 문제점이 있다. 개발된 키메릭 아데노바이러스 벡터는 세포병변효과(Cytopathic effect, CPE)와 시험관 내(in vitro) 중화항체 시험을 통하여 종래의 재조합 HAdV-5 벡터의 이러한 문제점을 개선한 우수한 아데노바이러스 벡터로서 가능성을 제시한다.

구체적으로 본 발명은 BR322 복제 개시점, 카나마이신 저항성 유전자, ITR (inverted terminal repeat) 서열, 막화 서열(encapsidation signal), CMV 인핸서, CMV 프로모터, 및 SV40 poly(A) 신호 서열로 구성된 재조합 HAdV-5 벡터를 기반으로 HAdV-5의 돌기(knob) 도메인 유전자 서열을 희귀 혈청형인 침팬지 아데노바이러스 혈청형 6의 해당 유전자로 교체한 AdKnob 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 ChimAd 벡터를 기반으로 HAdV-5의 헥손 단백질 내 영역을 인간 혈청 유병률이 낮은 아데노바이러스 혈청형인 HAdV-28의 해당 유전자로 교체한 ChimAd-H28벡터를 제공한다.

본 발명으로 상기 ChimAd, ChimAd-H28 벡터에 대한 세포 감염능 및 중화항체 시험으로 기존 면역 회피효과를 제공한다.

본 발명에서 제공되는 키메릭 아데노바이러스의 세포 감염능을 분석하기 위해서 기존 HAdV-5와 비교하여 동일 MOI 바이러스 도스(multiplicity of infection, 감염 중복도) 및 시간 조건에서 바이러스 titer를 측정하였다. 그 결과, HAdV-5 바이러스 보다 키메릭 아데노바이러스 의해 감염된 세포수 및 바이러스 titer가 증가하는 것을 확인하였다. ChAdV-6의 돌기 유전자 및 HAdV-28의 HVR 유전자로 인해 HAdV-5에 비해 숙주세포로의 감염능이 증가하였으며, 바이러스 생산성이 증가한 것으로 사료된다.

또한, 본 발명에서 시험관 내 중화항체 시험을 통하여 ChimAd 벡터의 HAdV-5에 대한 중화항체 면역 회피능을 평가하였다. 시험관 내 중화항체 시험은 항-HAdV-5항체와 바이러스를 반응한 뒤, HEK293 세포에 감염시켜 최종적으로 HAdV-5, ChimAd 및 ChimAd-H28 바이러스에 의해 감염된 세포를 확인하였다. 그 결과, HAdV-5 바이러스와 비교하였을 때, ChimAd 바이러스에 의해 10¹- 10²에서 약 4배 이상의 아데노바이러스 감염세포가 확인됨에 따라 종래 HAdV-5 보다 높은 기존면역 회피능을 나타냈다. 또한, ChimAd-H28 바이러스에 의해 약 2.8배 더 감염된 세포를 확인하였다.

본 발명은 면역학적 보조제와 상기 키메릭 벡터 또는 그 벡터에 의하여 코딩되는 폴리펩타이드 및, 임의로 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물이 제공된다.

보조제를 포함하는 본 발명에 따른 조성물은 예를 들면, 사람 대상체용 백신으로서 사용될 수 있다. 면역학적 보조제는 또한 본원에서 짧게는 "보조제"로 언급되며, 항원 단독 투여와 비교하여, 항원/면역원성에 대한 면역 반응의 질 및/또는 강도를 가속화시키고/시키거나, 연장시키고/시키거나 향상시킴으로써 어떠한 제공된 백신에 요구되는 항원/면역원의 양 및/또는 목적한 항원/면역원에 대한 적절한 면역 반응을 생성하기 위하여 요구되는 주사 빈도를 감소시킨다.

본 발명에 따른 조성물과 관련하여 사용될 수 있는 보조제의 예는 수산화알루미늄(백반)의 겔-유사 침전물;AlPO4; 알하이드로겔; 그람-음성 세균의 외부 막으로부터의 세균 생성물, 특히 모노포스포릴 지질 A(MPLA), 리포폴리사카라이드(LPS), 무라밀디펩타이드 및 이의 유도체; 프루언드 불완전 보조제(Freund's incomplete adjuvant); 리포소옴, 특히 중성 리포소옴, 조성물 및 임의로 사이토킨을 함유하는 리포소옴; 비-이온성블록공중합체; ISCOMATRIX 보조제(참조: Drane et al, 2007); CpG 디뉴크렐오타이드(CpG 모티프)를 포함하는 메틸화되지 않은 DNA, 특히, 포스포로티오에이트(PTO) 골격을 갖는 CpG ODN(CpG PTO ODN) 또는 포스포디에스테르(PO) 골격(CpG PO ODN); 합성 리포펩타이드 유도체, 특히 Pam3Cys; 리포아라비노만난; 펩티도글리칸; 자이모산;열 쇼크 단백질(HSP), 특히 HSP 70; dsRNA 및 이의 합성 유도체, 특히 Poly I:poly C; 다가양이온성(polycationic) 펩타이드, 특히 폴리-L-아르기닌; 탁솔; 피브로넥틴; 플라겔린; 이미다조퀴놀린; 보조제 활성을 가진 사이토킨, 특히 GM-CSF, 인터루킨-(IL-)2, IL-6, IL-7, IL-18, 제I 형 및 제II 형 인터페론, 특히 인터페론-감마, TNF-알파; 25-디하이드로피타민 D3(칼시트리올); 및 합성 올리고펩타이드, 특히 MHCII-제공된 펩타이드이다. 폴리옥시에틸렌(POE) 및 폴리옥시프로필렌(POP), 예를 들면, POE-POP-POE 블록 공중합체를 함유하는 비-이온성 블록 중합체를 보조제로서 사용할 수 있다(참조: Newman et al, 1998) 이러한 유형의 보조제가 활성 성분으로서 핵산을 포함하는 조성물에 특히 유용하다.

경우에 따라, 각종의 약제학적으로 허용되는 부형제를 사용할 수 있다. 바람직한 약제학적으로 허용되는 부형제는 본 발명에 따른 용도를 논의하는 경우 하기 언급되어 있다.

특이적인 수용체의 활성화는 면역 반응을 자극할 수 있다. 이러한 수용체는 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며, 예를 들면, 사이토킨 수용체, 특히 제I형 사이토킨 수용체, 제II 형 사이토킨 수용체, TNF 수용체; 및 전사 인자로서 작용하는 비타민 D 수용체; 및 톨-유사 수용체 1(TLR1), TLR-2, TLR 3, TLR4, TLR5, TLR-6, TLR7, 및 TLR9를 포함한다. 이러한 수용체에 대한 작용제는 보조제 활성을 가지는데, 즉, 면역자극성이다.

본 발명의 구현예에 따라 ChimAd 벡터 기반의 베타 변이주의 S 서열과 사스-코로나바이러스-2의 N 일부 서열을 포함하는 ChimAd-CV와 ChimAd-CVN을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 사스-코로나바이러스-2의 베타변이주의 변형된 스파이크 단백질은 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 사스-코로나바이러스-2의 베타변이주의 변형된 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 8에 기재된 염기서열로 이루어진 것이 바람직하나, 해당 서열에 하나 이상의 치환, 결손, 역위 등의 돌연변이를 통하여 본 발명의 목적을 달성하는 모든 돌연변이 서열도 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명의 일 구현예에서 상기 사스-코로나바이러스-2의 뉴클레오캡시드 단백질의 44번부터 180번까지의 아미노산 잔기는 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 사스-코로나바이러스-2의 뉴클레오캡시드 단백질의 247번부터 364번의 아미노산 잔기는 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 것이 바람직하나, 해당 서열에 하나 이상의 치환, 결손, 역위 등의 돌연변이를 통하여 본 발명의 목적을 달성하는 모든 돌연변이 서열도 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명에서 생산된 ChimAd-CV 및 ChimAd-CVN 백신 조성물은 사스-코로나바이러스-2와 베타변이주, 델타변이주에 대한 우수한 중화항체 역가를 제공한다.

본 발명의 구현예에 따라 생산된 ChimAd-CV 및 ChimAd-CVN 백신 조성물은 베타 변이주 기반 슈도바이러스에 대한 우수한 중화항체 역가를 제공한다.

본 발명은 생산된 ChimAd-CV 및 ChimAd-CVN 백신 조성물은 특이적 T 세포의 면역반응에 대한 효능을 제공한다.

본 발명은 상기 방법으로 생산된 ChimAd-CV 및 ChimAd-CVN 백신 조성물은 사스-코로나바이러스-2와 델타변이주에 대한 방어 효능을 제공한다.

본 발명의 구현예에 따라 생산된 ChimAd-CV 와 ChimAd-CVN로 면역 및 바이러스 감염 후 몸무게 변화와 생존율을 확인하였다. 사스-코로나바이러스-2 감염에 대해 ChimAd-CV 와 ChimAd-CVN 접종한 실험군 모두 100% 생존율을 보이는 것으로 보아 우수한 방어능을 확인하였다. 또한, 델타변이주 감염에 대해 ChimAd-CV는 감염 7일 후 생존율 100%, 평균 체중 100% 유지하였으나, ChimAd-CVN에서는 감염 7일 후 생존율 40%, 평균 체중이 약 20% 내의 평균 몸무게가 감소를 보이는 것을 확인하였다.

본 발명의 구현예에 따라 ChimAd 벡터 기반의 사람 파필로마바이러스 유형16형의 E6E7과 유형18형E6E7서열을 포함하는 ChimAd-HPV를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 사람 파필로마바이러스 유형16형의 E6E7과 유형18형의 E6E7단백질은 서열번호 13에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 사람 파필로마바이러스의 유형 16형과 18형의 변형된 E6, E7을 코딩하는 유전자는 서열번호 14에 기재된 염기서열로 이루어진 것이 바람직하나, 해당 서열에 하나 이상의 치환, 결손, 역위 등의 돌연변이를 통하여 본 발명의 목적을 달성하는 모든 돌연변이 서열도 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명에서 사람 파필로마바이러스에 의한 자궁경부암 치료 효과의 효능을 확인하기 위하여, TC-1 종양세포와 생산된 바이러스를 주입하였다. 본 발명의 구현예에 따르면 재조합 항원 주입 후 종양부피를 측정함으로써 치료효능을 확인하였다. 그 결과, ChimAd-HPV 바이러스에서 대조군(ChimAd)대비 종양부피에 대한 치료 효능을 확인하였다.

또한 본 발명은 구현예에 따라 생산된 ChimAd-HPV 백신 조성물은 특이적 T 세포의 면역반응에 대한 효능을 제공한다.

본 발명에서 생산된 바이러스의 특이적 T 세포의 면역반응 효능을 확인하고자 ELISPOT (Enzyme-Linked ImmunoSpot, ELISPOT) 실험 기법을 사용하였다. 본 발명에서 종양세포와 항원이 주입된 마우스 비장세포를 분리하여 각 항원에 대한 면역반응을 확인하였다. 그 결과, ChimAd-HPV 바이러스는 HPV E7 단백질 항원에 대한 특이적 면역반응이 유도되는 것으로 사료된다.

본 발명은 상기 방법으로 생산된 ChimAd-HPV 백신 조성물에 대한 마우스 종양세포 예방 효능을 제공한다. 본 발명에서 사람 파필로마바이러스에 의한 자궁경부암 예방 효과를 확인하기 위하여, 바이러스와 TC-1 종양세포를 주입하였다. 본 발명에서 재조합 항원을 주입한 뒤 종양세포를 주입하여 암 발생에 대한 예방 효과를 확인하였다. 그 결과, ChimAd-HPV 바이러스는 대조군에 비하여 종양세포가 발생하지 않은 것을 확인하였다.

본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명은 다양한 질병에 대한 치료제 또는 백신 개발에 있어서 최적의 아데노바이러스 벡터를 제공할 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명에서 제작된 키메릭 아데노바이러스 벡터를 생산용 숙주세포에 감염시킬 경우, 재조합 HAdV-5벡터-기반 백신에 비해 보다 뛰어난 세포 감염능을 나타내어 생산성 향상에 기여할 수 있다. 또한 본 발명의 키메릭 아데노바이러스는 인간에게 접종 시 HAdV-5에 대한 기존면역을 극복할 수 있다. 또한, 사스-코로나바이러스-2, 사람 파필로마바이러스의 예방 또는 치료제 백신 개발 시 보다 효과적으로 외래 유전자를 전달할 수 있는 면역 유효성을 확인함에 따라 우수한 키메릭 아데노바이러스 벡터가 될 것으로 사료된다.

도 1은 본 발명에서 HAdV-5와 ChAdV-6의 섬유 단백질에 대한 아미노산 서열을 Clustal Omega 및 ESPript 프로그램을 통해 서열 분석한 결과(A)와 키메릭 아데노바이러스 벡터의 섬유 단백질을 모식도로 나타낸 것(B)이다.
도 2은 본 발명에서 HAdV-5와 HAdV-28의 헥손 단백질에 대한 아미노산 서열을 Clustal Omega 및 ESPript 프로그램을 통해 서열 분석한 결과(A)와 키메릭 아데노바이러스 벡터의 헥손 단백질을 모식도로 나타낸 것(B)이다.
도 3는 본 발명에서 제작한 벡터 조절 인자 합성 유전자의 배열을 모식화하여 나타낸 것이다.
도 4은 본 발명에서의 HAdV-5 벡터 제작 과정을 모식도로 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에서 제작한 ChimAd 벡터 제작과정을 모식도로 나타낸 결과(A)와 최종 ChimAd 벡터 구조를 나타낸 것(B)이다.
도 6는 본 발명에서 제작한 ChimAd-H28 벡터 제작과정을 모식도로 나타낸 결과(A)와 최종 ChimAd-H28 벡터 구조를 나타낸 것(B)이다.
도 7은 본 발명에서 제작한 2종의 키메릭 아데노바이러스 벡터(ChimAd, ChimAd-H28) 내 키메릭 캡시드 유전자를 PCR 방법으로 ChAdV-6의 돌기 유전자(0.5 Kb)와 HAdV-28의 헥손 HVR 유전자(1 Kb)를 증폭하여 0.8 % agarose gel에 분리하여 자외선을 투과하여 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명에서 제작한 HAdV-5 벡터 및 2종의 키메릭 아데노바이러스 벡터로 HEK293 세포에 형질전환 유도한 뒤, 세포병변효과 (CPE)가 형성된 것을 광학현미경을 이용하여 200배 배율에서 촬영하여 나타낸 것이다.
도 9은 HEK293 세포에서 HAdV-5 및 2종의 키메릭 아데노바이러스를 생산한 뒤 웨스턴 블롯을 통하여 헥손(약 108 kDa), 섬유(약 61 kDa) 그리고 펜톤(약 68 kDa) 단백질 발현을 나타낸 것이다.
도 10는 본 발명에서 제작한 HAdV-5 및 키메릭 아데노바이러스들을 HEK293 세포에 0, 5, 10, 25, 50 MOI 바이러스 도스로 감염하고 48시간 뒤, 항-헥손다클론 항체를 이용한 면역세포화학염색법을 통해 아데노바이러스에 감염된 양성 세포 수를 광학현미경 200배 배율에서 촬영하여 카운팅하여 바이러스 titer로 환산하여 나타낸 그래프이다. X축은 세포에 감염시킨 바이러스 도스를, Y축은 각 바이러스 도스에 따른 HAdV-5, ChimAd 및 ChimAd-H28 바이러스 titer를 나타낸다. * 표시는 paired t-test를 이용하여 검증한 HAdV-5 바이러스와 키메릭 아데노바이러스 간의 유의 수준을 나타낸 것이다(* p<0.05, ** p<0.01).
도 11은 본 발명에서 제작한 HAdV-5 및 키메릭 아데노바이러스들을 항-HAdV-5 다클론 항체와 반응하여, HEK293 세포에서 시험관 내 (in vitro) 중화항체 시험을 수행한 뒤 아데노바이러스에 감염된 세포수를 측정한 값을 그래프로 도식화한 것이다. X축은 10¹부터 10⁴까지 연속 희석한 항-HAdV-5 다클론 항체 희석 배수를, Y축은 HAdV-5, ChimAd 및 ChimAd-H28 바이러스에 의해 감염된 세포의 수를 나타낸다. * 표시는 paired t-test를 이용하여 검증한 HAdV-5 바이러스와 키메릭 아데노바이러스 간의 유의 수준을 나타낸 것이다(* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.005, **** p<0.0005).
도 12은 본 발명에서 제작한 HAdV-5 및 키메릭 아데노바이러스들을 건강한 사람 혈청(n=7)과 반응하여, HEK293 세포에서 시험관 내 중화항체 시험을 수행한 결과를 아데노바이러스에 감염된 세포수를 측정하여 역수로 나타낸 값을 점 도표로 나타낸 것이다. X축은 혈청과 반응한 아데노바이러스를, Y축은 7개 사람 혈청 샘플에 대한 아데노바이러스 중화항체(Ad Nab) titer를 나타낸다. Paired t-test를 이용하여 검증한 HAdV-5 바이러스와 ChimAd 바이러스 그리고 ChimAd-H28 바이러스 간의 유의 수준을 P값으로 나타낸 것이다.
도 13은 유전자 합성을 통해 확보한 코로나바이러스 유전자를 ChimAd 벡터에 Gibson assembly 유전자 합성 방법을 이용하여 ChimAd-CV, ChimAd-CVN을 클로닝하는 모식도이다.
도 14은 BALB/c female 마우스를 이용하여 ChimAd-CV, ChimAd-CVN에 의해 유도된 바이러스 결합 항체 역가를 사스-코로나바이러스-2 S단백질에 대한 결과는 A로, 베타변이주 S단백질 결과는 B로 나타낸다.
도 15는 BALB/c female 마우스를 이용하여 ChimAd-CV, ChimAd-CVN의에 의해 유도된 바이러스 중화항체 역가를 베타 변이주(B.1.351 variant type)의 슈도바이러스을 이용한 중화항체 측정 결과(A, B) 로 나타낸다.
도 16는 BALB/c female 마우스를 이용하여 ChimAd-CV, ChimAd-CVN의 S 펩타이드를 자극항원으로 사용한 세포성 면역결과(A, B)와 NP 펩타이드를 자극항원으로 사용한 세포성 면역결과(C, D)를 나타낸다.
도 17는 hACE2 transgenic female 마우스를 이용하여 ChimAd-CV, ChimAd-CVN애 의해 유도된 바이러스 결합 항체 역가를 사스-코로나바이러스-2의 S단백질에 대한 결과는 A로, 델타변이주 S단백질 결과는 B로 나타낸다.
도 18은 hACE2 transgenic female 마우스를 이용하여 ChimAd-CV, ChimAd-CVN에 의해 유도된 바이러스 중화항체 역가를 확인한 결과로 사스-코로나바이러스-2의 FRNT를 이용한 중화항체 측정 결과(A, B) 로 나타낸다. 또한, 델타 변이주의 FRNT를 이용한 중화항체 측정 결과(C, D) 로 나타낸다.
도 19은 hACE2 transgenic female 마우스를 이용하여 ChimAd-CV, ChimAd-CVN에 의해 면역된 마우스 동물모델에서 A-B. 사스-코로나바이러스-2 (Wuhan-Hu-1), 델타변이주 (B.1.617.2) 공격시험 후 생존률, C-D. 사스-코로나바이러스-2 (Wuhan-Hu-1), 델타변이주 (B.1.617.2) 공격시험 후 평균 체중을 나타낸다.
도 20은 공격시험 후 폐에서 검출된 코로나바이러스 역가를 나타낸다.
도 21는 유전자 합성을 통해 확보한 사람 파필로마바이러스 유전자를 ChimAd벡터에 Gibson assembly 유전자 합성 방법을 이용하여 ChimAd-HPV를 클로닝하는 모식도이다.
도 22는 ELISPOT 결과로, ChimAd-HPV 백신후보물질에 대한 특이적 T 세포 면역반응을 나타낸 결과로, HPV16형 E7 펩타이드를 자극항원으로 사용한 세포성 면역결과 (A, B)를 나타낸다.
도 23는 종양의 크기를 측정한 결과로, C57BL/6 쥐에 종양세포주인 TC-1 세포를 피하 주입한 후, 대조군을 비롯한 백신후보물질을 종양세포 주입 전과 후에 주입하여 시간에 따른 암의 크기를 측정한 결과이며, ChimAd-HPV군에서 종양부피가 가장 낮게 나타나는 결과 (A, B) 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 다음 실시예에 의해 국한되지, 않는다는 것은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 키메릭 아데노바이러스 벡터 제작을 위한 유전자 합성

1-1) ChAdV-6의 돌기(knob) 유전자 합성

HAdV-5의 섬유 단백질 말단의 돌기 도메인을 비인간 아데노바이러스인 ChAdV-6의 해당 유전자로 교체한 키메릭 아데노바이러스 벡터를 제작하기 위하여, HAdV-5(Genebank: AY339865.1)와 ChAdV-6(Genebank: AY530877)의 섬유 단백질에 대한 아미노산 서열의 유전적 상동성을 Clustal Omega 프로그램을 이용하여 분석하였다. 최종적으로, Clustal Omega 결과는 ESPript figure를 통해 상동성 부위를 시각화하였고 (도 1A), ChAdV-6의 돌기 도메인(SEQ ID NO: 1) 중 HAdV-5의 유전자서열과 상동성이 낮은 부위인 405 아미노산부터 574 아미노산(SEQ ID NO: 1)에 해당하는 염기서열을 유전자 합성하여 확보하였다(도 1B, SEQ ID NO: 2).

1-2) HAdV-28의 초가변영역(HVR) 유전자 합성

HAdV-5의 헥손 단백질 내 초가변영역을 인간에서 혈청 유병률이 낮은 아데노바이러스 혈청형인 HAdV-28의 해당 유전자로 교체한 키메릭 아데노바이러스 벡터를 제작하기 위하여, HAdV-5(Genebank: AY339865.1)와 HAdV-28(Genebank: DQ149626.1)의 헥손 단발질에 대한 아미노산 서열의 유전적 상동성을 Clustal Omega 프로그램을 이용하여 분석하였다. 최종적으로, Clustal Omega 결과는 ESPript figure를 통해 상동성 부위를 시각화하여 HAdV-5와 HAdV-28 간의 아미노산 서열의 유전적 상동성이 낮은 HVR1영역부터 HVR7영역까지 설정하였다(표 1, 도 2A). 이후 HAdV-5의 헥손 단백질 내 HVR 영역을 HAdV-28의 해당 유전자로 교체하기 위해, HAdV-28의 HVR1영역의 시작부터(132 아미노산) HVR7영역 말단(449 아미노산)에 이르는 염기서열을 유전자 합성하여 확보하였다(도 2B, SEQ ID NO: 4).

Target	HVR region	Position	Sequence
HAdV-5	HVR1	132-168	PCEWDEAATALEINLEEEDDDNEDEVDEQAEQQKTHV(서열번호 15)
	HVR2	188-195	VEGQTPKY(서열번호 16)
	HVR3	209-220	SQWYETEINHAA(서열번호 17)
	HVR4	248-265	GILVKQQNGKLESQVEMQ(서열번호 18)
	HVR5	268-284	STTEATAGNGDNLTPKV(서열번호 19)
	HVR6	305-316	TIKEGNSRELMG(서열번호 20)
	HVR7	418-458	GGVINTETLTKVKPKTGQENGWEKDATEFSDKNEIRVGNNF(서열번호 21)
HAdV-28	HVR1	132-153	SSQWDAQEKSGQGSDMVTKTHT(서열번호 22)
	HVR2	173-185	TEITADNQKKEIF(서열번호 23)
	HVR3	199-209	ENWQENEVFYG(서열번호 24)
	HVR4	237-256	AKFKTPAEGQEPKELDIDLA(서열번호 25)
	HVR5	259-273	DTDGGTADTEYKADI(서열번호 26)
	HVR6	294-305	GKEDDSSEINLV(서열번호 27)
	HVR7	407-449	DGLGTNATYQGVKVSTGDGATQSGWAKDDTMARQNQICRGNIY(서열번호 28)

표 1은 HAdV-5와 HAdV-28 간의 염기서열 분석을 통해 선정한 HVR 영역

1-3) 벡터 조절 인자 합성

현재까지 알려진 벡터 조절 인자(예: 프로모터, 복제 개시점 등)들을 조합하여, 키메릭 아데노바이러스 벡터 내 삽입할 벡터 조절인자를 합성하였다. 더 자세하게는 해당 벡터 조절 인자들은 ITR (inverted terminal repeat, Genebank: AY339865.1), BR322 복제 개시점(Genebank: MT612434.1), 카나마이신 저항성 유전자(Genebank: MT084773.1), ITR 서열, 막화 서열(encapsidation signal, Genebank: AY339865.1), CMV 인핸서(Genebank: MT267310.1), CMV 프로모터(Genebank: MT267310.1), 및 SV40 poly(A)(Genebank: MT612432.1) 순으로 조합하여 유전자 합성하여 확보하였다(도 3).

실시예 2: 키메릭 아데노바이러스 벡터의 제조

2-1) HAdV-5 벡터의 제조

HAdV-5 (ATCC, VR-1516)의 DNA를 주형으로 하여 PCR 방법으로 프라이머를 이용하여 E1과 E3 유전자 일부를 제외하고 PCR 증폭하여 그 증폭된 산물(fragment A-G)을 얻었다(표 2). 7개의 벡터 PCR 증폭산물과 상기 합성한 CMV 프로모터 서열을 포함하는 합성 유전자 (4.1 Kb)는 각 말단에 동일한 서열(약 20 bp)을 두어, gibson assembly(NEB, E2611S) 반응을 통해 결합시킴으로써 HAdV-5 벡터를 제작하였다(도 4). 이를 기본 벡터로 하여 ChimAd 벡터를 제작하였다.

Primer name	Sequence (5' to 3' direction)	PCR product
Fragment A	F: TAAGGGTGGGAAAGAATATATAAGGTGGGGGTC(서열번호 29)	4 Kb
	R: GCC TTC CAT CAA GGG CAT CCC G(서열번호 30)
Fragment B	F: GTAAAGTTCCAAGAAGCGCGGGATGC(서열번호 31)	4 Kb
	R: AGTTAATCTCCTGGTTCACCGTCTG(서열번호 32)
Fragment C	F: GTAACCGCATACGAGCAGACGGTG(서열번호 33)	4 Kb
	R: CGTGGAGCGGAAGGTCACG(서열번호 34)
Fragment D	F: GCCAGACATGATGCAAGACCCCGTG(서열번호 35)	4 Kb
	R: CGTACCACTGAGATTCTCCTATTTGAGGTTC(서열번호 36)
Fragment E	F: CAACCTGAACCTCAAATAGGAGAATCTCAG(서열번호 37)	4 Kb
	R: GGATAACGATCTAAAGGCGAACTTCAAAC(서열번호 38)
Fragment F	F: GTCAGGCAGTAGTTTGAAGTTCGC(서열번호 39)	4.7 Kb
	R: CTCTAGTTATAACTAGAGGATCTTGATGTAATCCAGGGTTAG(서열번호 40)
Fragment G	F: CCTCTAGTTATAACTAGAGTACCCGGGATCTTATTCCCTTTAAC(서열번호 41)	5 Kb
	R: CGGAGTAACTTGTATGTGTTGGGAATTG(서열번호 42)
Gene synthesis (promoter, etc.)	F: CAATTCCCAACACATACAAGTTACTCCG(서열번호 43)	5 Kb
	R: TATATTCTTTCCCACCCTTACGCGTTAAGATACATTGATG(서열번호 44)

표 2은 HAdV-5 벡터 제작에 사용한 PCR 프라이머

2-2) ChimAd 벡터의 제조

상기 제작한 HAdV-5 벡터를 주형으로 표 3의 프라이머를 이용하여 돌기 유전자 서열을 제외하고 PCR 증폭하여 벡터 PCR 증폭산물을 얻었다. 합성한 ChAdV-6 돌기 유전자는 3', 5' 말단에 벡터 PCR 증폭산물과 동일한 서열(약 20 bp)을 갖도록 PCR 증폭하여 삽입유전자를 얻어 벡터 PCR 증폭산물과 gibson assembly 반응을 통해 결합하여 ChimAd 벡터를 제작하였다(도 5).

Primer name	Sequence (5' to 3' direction)	PCR product
6Knob vector	F: CCTTTGCTACCAACTCATTCTCTTTTTCATACATTGCCC(서열번호 45)	33.4 Kb
	R: ACAATTAGGGCTTGGGTCAGGTGTGGTCCACAAAGTTAGC(서열번호 46)
6Knob insert	F: GCTAACTTTGTGGACCACACCTGACCCAAGCCCTAATTGT(서열번호 47)	0.5 Kb
	R: GGGCAATGTATGAAAAAGAGAATGAGTTGGTAGCAAAGG(서열번호 48)

표 3는 ChimAd 벡터 제작을 위해 벡터 및 돌기(knob) 유전자 증폭에 사용한 PCR 프라이머

2-3) ChimAd-H28 벡터의 제조

ChimAd 벡터를 주형으로 하여 PCR 방법으로 표 4의 프라이머를 이용하여 HAdV-5의 HVR 영역(19,879-20,858 bp)을 제외한 벡터 서열을 PCR 증폭하여 그 증폭된 산물 (32.9 Kb)과 상기 합성한 HAdV-28의 HVR 서열 (1 Kb)의 PCR 증폭산물을 Gibson assembly 반응을 통해 결합하여 ChimAd-H28 벡터를 제작하였다(도 6).

Primer name	Sequence (5' to 3' direction)	PCR product
28HVR vector	F: TGCAGGGGTAACATCTACGCCATGGAAATCAATCTAAATG(서열번호 49)	32.9 Kb
	R: TGCGCATCCCACTGACTGGAATTTGGGGCACCCTTGGGAG(서열번호 50)
28HVR insert	F: CTCCCAAGGGTGCCCCAAATTCCAGTCAGTGGGATGCGCA(서열번호 51)	1 Kb
	R: CATTTAGATTGATTTCCATGGCGTAGATGTTACCCCTGCA(서열번호 52)

표 4는 ChimAd-H28 벡터 제작을 위해 벡터 및 28형 헥손 HVR 유전자 증폭에 사용한 PCR 프라이머.

도 7에서 보듯이, PCR 방법으로 ChimAd 벡터에선 0.5 Kb의 삽입된 ChAdV-6 돌기 유전자만 증폭이 되며, 이를 주형으로 하는 ChimAd-H28 벡터에서는 ChAdV-6 돌기 유전자와 1 Kb의 HAdV-28 헥손 HVR 유전자의 증폭이 동시에 확인되었다. 이를 통해 HAdV-5 벡터 내 키메릭 캡시드 유전자 유무를 확인함으로써 최종 키메릭 아데노바이러스 벡터 2종(ChimAd, ChimAd-H28)을 확보하였다.

실시예 3 :아데노바이러스의 생산

본 발명에서 설계하고 제작한 HAdV-5 및 2종의 키메릭 아데노바이러스에 대한 바이러스 형성을 평가하기 위하여, 각 벡터를 PacⅠ제한효소를 이용하여 아데노바이러스 형성에 불필요한 pBR322 복제 개시점 및 카나마이신 저항성 유전자 서열을 절단하여 제거하고, 전날 100 mm cell culture dish에 1.6 x 10⁶ 개 세포 수로 계대 배양한 E1 및 E3 유전자를 발현하는 HEK293 세포(human embryonic kidney; ATCC, CRL-1573)에 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, #11668027)을 사용하여 형질 전환하였다.

형질 전환을 유도한 세포는 온도 37℃, CO₂ 분압 5.0 %가 유지되는 배양기에서 10-20일간 배양하며, 아데노바이러스 감염에 의한 세포병변효과 형성을 모니터링 하였다(도 8). 전체 CPE에서 HAdV-5 및 2종의 키메릭 아데노바이러스를 수확하기 위하여, 플라스크 바닥에 부착된 세포를 스크래퍼(scraper)를 이용하여 떼어낸 뒤 배양액과 함께 4 ℃, 500 x g 조건에서 원심 분리하여 상층액은 제거하였고 1X PBS로 세척한 뒤 얻은 펠렛(pellet)에 냉동-해동 과정을 3회 반복하여 아데노바이러스를 방출시켰다. 세포 파편(cell debris)은 상온 14,000 x g 조건에서 원심 분리하여 아데노바이러스가 포함된 상층액을 1.5 mL 마이크로 튜브(microcentrifuge tube)에 분주하여 -80℃에서 보관하였다.

도 8에서 보이는 바와 같이, 본 발명에서 제작한 HAdV-5, ChimAd 및 ChimAd-H28 벡터를 이용한 HEK293 세포에서의 형질전환에 의해 CPE가 형성된 것을 광학현미경을 통해 200배 배율에서 확인하였다. 이러한 결과를 통해, 상기 제작된 3개 벡터에 의해 숙주세포에서 아데노바이러스 복제가 이루어졌고, 바이러스 증식 또는 발현된 아데노바이러스의 단백질에 의하여 세포독성이 유발되었을 것으로 사료된다.

실시예 4: 아데노바이러스 외피 단백질 확인을 위한 웨스턴 블롯 분석

HEK293 세포주에서 생산한 HAdV-5 및 키메릭 아데노바이러스들에 대한 아데노바이러스 구조 단백질 발현을 확인하기 위하여 웨스턴 블롯 분석을 하기와 같은 방법으로 수행하였다. HAdV-5, ChimAd 및 ChimAd-H28 바이러스는 SDS-PAGE loading dye를 첨가하여 100℃에서 15분간 중탕한 뒤 10 % SDS-PAGE에 100V로 전기영동으로 단백질을 분리하고, PVDF 맴프레인으로 이동시켰다. PVDF 맴브레인은 5% 스킴밀크 용액으로 활성을 제거한 뒤 1차 항체인 항-HAdV-5 다클론 항체(Abcam, #ab6982)를 TBS용액으로 1:1000 희석하여 상온에서 1시간 반응시켰다. 이후 TBS-T 완충용액으로 3회 세척한 뒤, 2차 항체인 HRP가 부착된 염소 유래 항-마우스 면역글로불린G를 TBS 용액으로 1:5000 희석하여 상온에서 1시간 반응하고 TBS-T 완충용액으로 반복하여 세척하였다. 웨스턴 결과 확인은 디아미노벤지딘(Sigma, #34002)를 이용하여 발색한 뒤 확인하였다(도 9).

도 9에서 보듯이, HAdV-5, ChimAd 및 ChimAd-H28 바이러스에서 항-HAdV-5 다클론 항체에 모두 특이적으로 반응하여 헥손(약 108 kDa), 섬유(약 61 kDa) 그리고 펜톤(약 68 kDa) 단백질이 검출되었다. 검출된 HAdV-5 바이러스의 섬유 단백질과 ChimAd 바이러스의 섬유 단백질을 비교하였을 때, ChimAd 바이러스에서 동일한 사이즈의 섬유 단백질이 확인되었으므로 ChAdV-6의 돌기 유전자로 교체된 ChimAd 바이러스의 돌기 단백질이 정상적으로 발현되었음을 알 수 있다. 또한 HAdV-5와 ChimAd-H28에서 동일한 사이즈의 헥손 단백질이 확인되어 HAdV-28의 HVR유전자로 교체된 ChimAd-H28 바이러스의 헥손 단백질이 정상적으로 발현되었음을 알 수 있다. 뿐만 아니라, 키메릭 아데노바이러스 두 벡터에 의해 아데노바이러스의 주요 외피 단백질(헥손, 섬유 및 펜톤)들이 안정적으로 발현되고 있음을 확인할 수 있다.

실시예 5: HEK293세포에서의 아데노바이러스감염능(infectivity) 분석

숙주 세포의 CAR 수용체와 결합하여 세포이입에 작용하는 돌기 단백질이 ChAdV-6의 유전자 서열로 교체된 2종의 키메릭 아데노바이러스의 세포 감염능을 분석하기 위하여, 동일한 MOI 바이러스 도스 조건에서 HAdV-5, ChimAd 및 ChimAd-H28 바이러스에 의한 감염된 세포를 관찰하였다.

아데노바이러스 감염 역가 측정은 아데노바이러스 헥손 단백질에 결합하는 항-헥손 다클론 항체를 이용한 면역세포화학염색법(immunocytochemistry)의 QuickTiter™titer immunoassay kit (Cell biolabs, #VPK-109)를 사용하였다. 역가 측정에 사용할 아데노바이러스는 1X PBS를 이용하여 10배 연속희석(serial dilution)방법을 통해 10¹부터 10⁶까지 희석한 뒤, 1시간 전 계대 배양하여 2.5 X 10⁵ 세포수로 준비한 24 well plate(SPL, #30024)의 HEK293 세포에 아데노바이러스 희석액을 100 ㎕씩 분주하여 감염을 유도하였다. 온도 37℃ CO₂분압 5.0 %가 유지되는 배양기에서 감염 48시간 뒤, 아데노바이러스 검출을 위한 면역염색을 실시하였다. 48시간 감염시킨 세포는 상층액을 제거하고 cold methanol을 분주하여 -20℃온도에서 20분 방치함으로써 세포를 고정시켰다. 고정된 세포는 1X PBS 용액으로 methanol을 충분히 제거한 후 1% 스킴밀크(Difco, #232100) 용액으로 활성을 억제한 뒤 1차 항체인 항-헥손 항체를 1XPBS로 희석하여 1시간 상온에서 반응시켰다. 1X PBS로 3회 세척한 뒤, HRP가 결합된 2차 항체를 1X로 희석하여 반응시켰다. 그 다음 3.3'-diaminobenzidine stain kit (DAB)(Thermo Fisher, #34002)를 이용하여 10분간 발색한 뒤 광학현미경을 이용하여 아데노바이러스가 감염된 양성 세포인 갈색 스팟이 50-100개 사이로 관찰되는 바이러스 희석배수 구간을 선정하여, Cell biolabs사에서 제공하는 아데노바이러스 titer 환산 공식을 적용함으로써, HAdV-5 과 ChimAd 및 ChimAd-H28 바이러스의 감염 역가(pfu/mL) 값을 측정하였다.

감염능 분석은 24 well plate에 2.5X10⁵ 개 세포수로 계대 배양한 HEK293 세포를 온도 37℃, CO₂분압 5.0 %가 유지되는 배양기에서 1시간 배양한 뒤, 상기 바이러스 titer 측정을 통해 얻은 pfu/mL 값을 토대로 HAdV-5 및 키메릭 아데노바이러스들을 각각 0, 5, 10, 25, 50 MOI 바이러스 도스로 1X PBS를 이용하여 희석하여 세포에 감염을 유도하였다. 감염 48 시간 뒤, 항-헥손다클론 항체를 이용한 면역세포화학염색법을 통해 각 MOI 바이러스 도스에서의 아데노바이러스 감염 세포수를 광학현미경 200X 배율에서 최소 4개 field를 카운팅하였으며(표 5), 양성 세포수(갈색 스팟)는 pfu/mL 값으로 환산하여 각 MOI 바이러스 도스 별 HAdV-5 및 키메릭 아데노바이러스들의 감염능을 비교하였다(도 10).

Ad infected cell spots	Virus dose (MOI)
Ad infected cell spots	5	10	25	50
HAdV-5	4.0	8.1	16.6	22.2
ChimAd	10.1	17.9	21.6	34.6
ChimAd-H28	9.5	17.7	19.8	32.3

표 5는 동일 MOI 조건에서의 HAdV-5 및 키메릭 아데노바이러스에 의해 감염된 세포수.

표 5에서 보는 바와 같이, 동일한 시간 및 MOI 바이러스 도스로 HEK293세포에 감염시켰을 때 HAdV-5 바이러스 보다 ChimAd와 ChimAd-H28 바이러스에 의해 감염된 세포수가 높게 나타났다.

또한, 도 10에서 각 MOI 바이러스 도스 별 생성된 바이러스 titer를 비교하였을 때 HAdV-5 바이러스 보다 ChimAd 바이러스와 ChimAd-H28 바이러스에서 각각 1.3-3 배, 1-2배 많은 바이러스 titer를 확인되었고, 이는 통계학적으로 유의한 차이를 나타냈다. 이러한 상기 결과를 통해, ChAdV-6 돌기 유전자 및 HAdV-28 헥손 HVR 유전자 교체로 인해 세포 감염능 뿐만 아니라 바이러스 생산성도 증가됨을 확인하였다.

실시예 6: 항-HAdV-5 다클론 항체를 이용한 시험관 내 (in vitro) 중화항체 시험

제작된 2종의 키메릭 아데노바이러스들에서 주요 중화항체 인식 부위인 헥손의 HVR영역 및 돌기 유전자 교체로 인한 HAdV-5 벡터 기존면역 회피능을 평가하기 위하여, HAdV-5에 대한 중화항체로 항-HAdV-5 다클론 항체(Abcam, #ab6982)를 사용하여 시험관 내 중화항체 시험을 수행하였다.

시험관 내 중화항체 시험은 항-HAdV-5항체를 연속희석(serial dilution)방법을 통해 10^-4 희석배수까지 1X PBS 용액을 이용하여 희석하였고, 50 MOI 바이러스 도스에 해당하는 1.25 X 10⁷ VP의 HAdV-5, ChimAd 및 ChimAd-H28 바이러스와 상온에서 1시간 중화 반응한 후 2.5 X 10⁵ 개 세포수로 준비한 24 well cell culture plate 내 HEK293 세포에 각각 분주하여 온도 37℃, CO₂분압 5.0 %가 유지되는 배양기에서 배양하며 48시간 동안 바이러스 감염을 유도하였다. 감염 48시간 뒤, 항-헥손 다클론 항체를 이용한 면역세포화학염색법을 실시하였고, 각 항-HAdV-5 다클론 항체 희석 배수 구간(10¹-10⁴)을 광학현미경을 이용하여 200배 배율에서 최소 4개의 field 내 HAdV-5, ChimAd 및 ChimAd-H28 바이러스가 감염된 양성 세포수를 카운팅함으로써 항 HAdV-5 항체에 대한 중화반응 회피능을 분석하였다(표 6).

Ad infected cell spots	Dilution of anti-HAdV-5 antibody
Ad infected cell spots	10¹	10²	10³	10⁴
HAdV-5	1.0	12.5	44.1	57.8
ChimAd	4.4	40.1	97.0	100.8
ChimAd-H28	2.6	13.5	69.5	100.1

표 6은 항-HAdV-5 다클론 항체와 반응 뒤, HAdV-5 및 키메릭 아데노바이러스에 의해 감염된 세포수.

도 11에서 보이는 바와 같이, HAdV-5 바이러스와 비교하여 ChimAd 바이러스에 의해 낮은 항체 희석 배수(10¹ - 10²)에서는 약 3.1배에서 약 4.5배, 높은 항체 희석 배수 (10³ - 10⁴)에서는 약 1.8배에서 약 2.2배 많은 아데노바이러스 감염 세포를 확인하였고, ChimAd-H28 바이러스도 HAdV-5 바이러스 대비 낮은 항체 희석 배수에서는 약 2.8배, 높은 항체 희석 배수에서는 약 1.5배에서 약 1.7배 많은 아데노바이러스 감염 세포를 확인하였고, 이는 통계적으로 유의한 차이를 나타냈다. 이를 통해, 아데노바이러스 캡시드 단백질 중 돌기 유전자 치환만으로 중화항체 반응을 최대 4.5배까지 회피할 수 있다는 결과를 얻었다. 또한, 상기 결과는 최근 개발된 HAdV-5 구조에 HAdV-3의 돌기 유전자로 교체한 키메릭 아데노바이러스 벡터(HAdV-5 벡터 대비 2배 회피능)의 시험관 내 중화항체 시험 결과 보다 2배 높은 회피능을 나타냈다.

결과적으로, 본 발명에서 제작한 ChimAd 벡터는 종래의 키메릭 아데노바이러스 벡터 보다 HAdV-5에 대한 기존 면역 회피능이 우수한 아데노바이러스 벡터로 사료된다.

실시예 7: 인간 혈청을 이용한 시험관 내 (in vitro) 중화항체 시험

본 발명에서 제작된 키메릭 아데노바이러스 벡터인, ChimAd 및 ChimAd-H28 바이러스를 인식 가능한 사람 혈청 내 중화항체 titer를 평가하기 위하여, 7명의 건강한 성인의 혈청을 이용하여 시험관 내 중화항체 시험을 실시하였다. 사람 혈청은 56 ℃에서 30분간 열-불활성화(heat-inactivation)을 통해 보체계(complement cascade)를 불활성화 시킨 뒤, 1X PBS로 2 배수 연속 희석하였다. 이 후 불활성화된 혈청들은 동일한 50 MOI 바이러스 도스 조건의 아데노바이러스와 상온 1시간 중화 반응한 뒤, 상기 실시예 6에서 기술한 시험관 내 중화항체 시험 방법을 통해, 감염 2일 차의 HEK293 세포에서의 HAdV-5 및 키메릭 아데노바이러스들의 감염 여부를 양성 세포수(갈색 스팟)를 광학현미경을 사용하여 200배 배율에서 최소 4개 field를 측정하여 평균으로 나타내었다(표 7). 염색된 세포 수는 역수로 환산한 뒤, 100을 곱하여 사람 혈청 내 HAdV-5, ChimAd 및 ChimAd-H28 바이러스에 대한 중화항체 titer를 도출하여 점 도표로 나타내었다(도 12).

Ad infected cell spots	Human serum (N=7)
Ad infected cell spots	#1	#2	#3	#4	#5	#6	#7
HAdV-5	18.5	14.4	1.4	8.6	19.25	11.4	8.6
ChimAd	45.2	50.8	23.2	22	39	31.2	22
ChimAd-H28	44	44	6	27.2	43.6	27.6	23.8

표 7은 사람 혈청과의 반응 뒤, HAdV-5 및 키메릭 아데노바이러스에 의해 감염된 세포수.

표 7에서 볼 수 있듯이, 7개의 사람 혈청군에서 HAdV-5 바이러스 보다 ChimAd 바이러스에 의해 평균적으로 4.6 배 더 감염된 세포를 확인하였고, ChimAd-H28 바이러스에 의해 평균적으로 2.9배 더 감염된 세포를 확인하였으며 이는 통계학적으로 유의한 차이를 나타냈다. 또한, 염색된 세포수를 역수로 나타낸 도 11에서 볼 수 있듯이, HAdV-5 바이러스 보다 ChimAd 바이러스에서 평균 2.6-2.7배 낮은 Ad 중화항체(NAb) titer를 확인할 수 있다. 이러한 결과는 HAdV-5 벡터-기반 백신 보다 ChimAd 벡터-기반 또는 ChimAd-H28 벡터-기반 백신을 사람에게 투여 시 벡터 면역이 낮으므로, 더 효율적으로 외래 유전자를 전달할 수 있는 최적의 아데노바이러스 벡터가 될 것으로 사료된다.

실시예 8: ChimAd 벡터 기반 코로나 백신 적용

8-1) SARS-CoV-2 S 단백질, N 단백질을 암호화하는 유전자 변형

코로나바이러스 구조단백질을 이용하여 백신을 개발하기 위하여, 아미노산 치환 등의 변형을 포함한 Spike 단백질 및 N단백질의 NTD 및 CTD를 포함하는 S 폴리펩타이드 합성 유전자를 2종을 확보하였다.

구체적으로, CV유전자의 경우, 베타변이 S단백질의 사스-코로나바이러스-2 기준 614번의 글라이신, 682~685번 잔기의 산성 아미노산으로의 치환 및 986, 987번의 연속된 프롤린 치환 돌연변이가 도입되었다. [Pallesen, Jesper, et al. Proceedings of the National Academy of Sciences　114.35 (2017): E7348-E7357. Bangaru, Sandhya, et al. Science　370.6520 (2020): 1089-1094. Plante, Jessica A., et al. Nature　592.7852 (2021): 116-121.].

CVN유전자의 경우 N단백질의 44번부터 180번, 247번부터 364번이 각각 Spike 단백질의 N말단 및 C말단에 (GGGGS)₃ linker를 통해 연결되었으며, 이 때 trRosetta, Alphafold 와 같은 prediction tool을 통해 추가적인 구조 예측을 진행하였다. [Du, Zongyang, et al. Nature Protocols　(2021): 1-18. Jumper, John, et al. Nature　596.7873 (2021): 583-589.]

8-2) SARS-CoV-2 백신물질로 사용될 유전자 합성

코로나바이러스 구조단백질을 이용하여 백신을 개발하기 위하여, 구조 단백질 중 Spike 단백질과 Nucleocapsid 단백질을 암호화하는 합성 유전자를 확보하였다. 각각의 백신후보는 표 8과 같이 코로나바이러스의 B.1.351 유래 S 단백질, Wuhan-Hu-1 유래 N 단백질을 선정하여 아데노바이러스에서 발현이 용이하도록 codon 최적화를 하였다. S 단백질을 포함하는 region을 CV, N 단백질 일부와 S 단백질을 융합하는 키메라 형태를 CVN으로 명명하였다.

	Region	Accession no.
CV	Spike surface glycoprotein	QUT64557(B.1.351)
CVN	NP(NTD)-Spike-NP(CTD)	QUT64557(B.1.351), MN908947(Wuhan-Hu-1)

8-3) SARS-CoV-2 유전자를 포함한 키메릭 아데노바이러스 클로닝

키메릭 아데노바이러스 벡터인 ChimAd벡터에 상기 합성한 SARS-CoV-2 백신 항원 2종을 클로닝하기 위하여, ChimAd 벡터의 plasmid DNA를 주형으로 하여 GOI binding region의 유전자 일부를 제외하고 PCR 증폭하여 그 증폭된 산물(약 33.4 Kb)을 gel extraction 과정을 거쳐 정제하였다. 클로닝을 위한 삽입 유전자는 ChimAd 벡터에서 GOI binding region 5' 및 3' 말단과 동일한 서열(homologous region, 약 20bp)을 포함하도록 PCR 증폭하기 위해 하기 표 9의 프라이머를 이용하여 얻은 증폭산물 CV (약 3.8 Kb)와 CVN (약 4.7 Kb)를 확보한 후 앞서 DNA 정제한 벡터 PCR 증폭산물과 각각 gibson assembly 반응을 통해 결합하여 최종적으로 ChimAd-CV, ChimAd-CVN plasmid 2종을 확보하였다(도 13).

Primer name	Sequence (5' to 3' direction)	PCR product
ChimAd vector	F: CTAAGCTTCTAGATAAGATATCCGATCCAC(서열번호 53)	33.4 Kb
	R: CGCGTCGACGGTACCAGATCTCTAGCGGATC(서열번호 54)
CV region	F: GATCTGGTACCGTCGACGCGATGTTTGTGTTTCTGGTGCTG (서열번호 55)	3.8 Kb
	R: TATCTTATCTAGAAGCTTAGTCAGGTATAGTGCAGTTTCAC (서열번호 56)
CVN region	F: GATCTGGTACCGTCGACGCGATGGGCCTGCCCAACAACAC (서열번호 57)	4.7 Kb
	R: TATCTTATCTAGAAGCTTAGTCAGGGGAAGGTCTTGTAGGC (서열번호 58)

8-4) 키메릭아데노바이러스 기반 코로나 백신후보물질의 생산 및 정제

본 발명에서 제작한 ChimAd-CV, ChimAd-CVN plasmid를 이용하여 키메릭아데노바이러스 기반 코로나 백신후보물질을 생산하기 위하여, 각 plasmid를 PacⅠ제한효소(NEB사, R0547L)를 처리해 아데노바이러스 형성에 불필요한 pBR322 복제 개시점 및 카나마이신 저항성 유전자 서열 등을 절단하여 제거하고, HEK293 세포에 Lipofectamine 2000 (Invitrogen사, 11668027)을 사용하여 형질 전환하여 온도 37℃CO₂ 분압 5.0 %가 유지되는 배양기에서 10-20일간 배양한 후 primary virus stock을 확보하였다.

ChimAd-CV 및 ChimAd-CVN 바이러스 생산은 상기 확보한 primary virus stock을 이용하여 약 1x 10⁶ cells/ml cell density의 HEK293 세포에 2 MOI의 역가로 감염시켜 48시간 후 0.45 ㎛ CFF microfiltration filter(Cytiva, CFP-4-E-6A)를 이용하여 세포를 농축하였다. 회수한 세포에 0.5 % Tween20(sigma-aldrich, P2287-500ML)과 20 U/ml benzonase(Milipore, E1014-25KU)를 4시간 처리하여 cell lysis와 host cell DNA degradation을 유도하였다. 이후 2 ㎛ 및 0.6 ㎛ ULTA GF filter (Cytiva, KGF-A-0210TT, KGF-A-9606TT)를 이용해 cell debris를 제거하고, tangential flow filtration (TFF)을 통해 바이러스 농축과 buffer exchange를 진행하였다. PBS 완충액 상태의 바이러스 시료는 HiTrap Capto Q ImpRes 컬럼(Cytiva, 17547051)을 이용한 anion exchange chromatography와 Capto core 700 컬럼(Cytiva, 17548115)을 이용한 fast protein liquid chromatography(FPLC)를 통해 ChimAd-CV, ChimAd-CVN 바이러스를 분리하여 최종적으로 백신 완충액으로 제형화 단계를 거쳐 0.2 ㎛ ULTA GF filter (Cytiva, KGF-A-9610TT)로 최종 여과하여 2개의 백신후보물질을 확보하였다.

8-5) 결합항체가/ 중화항체가/ 세포성면역 분석을 통한 면역원성 실험 결과

(1) BALB/c female을 이용한 면역 유도

상기 제조방법으로 확보한 ChimAd-CV 및 ChimAd-CVN 백신후보물질을 이용하여 마우스 면역을 실시하였다. 시험 그룹에는 완충제, Mock-up으로 사용된 ChimAd, 그리고 ChimAd-CV, ChimAd-CVN으로 총 4그룹을 포함한다. 면역 유도 시험에는 5주령 BALB/c 암컷 마우스를 사용하였으며, 각 아데노바이러스 시험군은 2.5*10^9 ifu/dose의 농도로 주사하였다. 4주 간격으로 접종은 1차접종 과 2차접종으로 총 2회 (0일차, 28일차) 근육주사 하였으며, 최초 접종 이후 4주, 6주 후에 (27일차, 42일차) 혈액을 채취하여 혈청을 분리하고 비장을 적출하였다.

(2) ELISA; ChimAd-CV, ChimAd-CVN에 의한 마우스 항-혈청의 결합항체가

마우스 면역 유도 시험을 통한 혈청 내의 항체여부를 확인하기 위하여 결합항체가 테스트를 수행하였다. 테스트를 수행하기 위해, Microplate에 코로나바이러스 사스-코로나바이러스-2와 베타변이주 S 단백질을 1ug/ml의 농도로 100ng/well씩 분주하고 4℃에서 16시간 이상 코팅하였다. 반응 후 plate는 0.05% Tween20이 포함된 1XPBS로 (PBS-T) 4번 이상 세척하였으며, 0.5% casein을 100ul 분주하여 37℃에서 1시간 반응시켜주었다. PBS-T로 세척을 진행하고 각각의 혈청을 1:100으로 희석한 후 3배씩 연속적으로 희석하여 약 1x10⁶까지 희석하였다. 분주 후 37℃에서 1시간 반응시킨 뒤, PBS-T로 세척 후 HRP가 결합된 Goat anti-mouse IgG HRP (Thermo)를 1:5000으로 희석하여 1시간 반응하였다. 반응이 끝나고 발색을 진행하기 위하여 TMB 용액 (Thermo)을 50ul 분주하여 15-20분간 발색 반응을 진행하였으며, 이후 Stop 용액 (Thermo)을 동량 첨가하여 반응을 정지시켜준 뒤, 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

결합 항체 역가 결과, ChimAd-CV, ChimAd-CVN 접종한 실험 군 대조군 대비하여 모두 사스-코로나바이러스-2와 베타변이주에 10⁴이상의 높은 결합 항체 역가를 나타내는 것을 확인하였다. 대조군을 접종한 실험군에서는 사스-코로나바이러스-2와 베타변이주에 대한 결합 항체 역가가 모두 측정되었으나, 유효하지 않은 값으로 확인되었다(도 14).

(3) pVNT (pseudovirus neutralization test)

; ChimAd-CV, ChimAd-CVN에 의한 마우스 항-혈청의 슈도바이러스에 대한 중화항체가 측정

마우스 면역 유도 시험을 통한 혈청 내의 항체의 중화항체가 테스트를 수행하였다. 슈도바이러스 시스템은 Lentivirus의 back bone을 사용하여 발광유전자와 사스-코로나바이러스-2 또는 베타변이주의 Spike 단백질을 발현하고 있는 바이러스이다. 본 실험은 Takara사의 Lenti-X™Packaging Mix 제품을 사용하여 사스-코로나바이러스-2와 베타변이주의 Spike 단백질을 포함한 슈도바이러스를 생산하였다. 생산된 슈도바이러스는 ACE2 단백질이 과 발현된 293T 세포에 형질전환 시켜 luciferase 발현을 정량화 하여 측정한 뒤 일정 RLU (Relative Light Units) 값을 사용하여 중화항체 시험을 수행하였다. 중화항체 시험은 먼저 각각의 마우스 혈청을 56℃에서 30분간 불활화 하였고, 10% FBS가 포함된 DMEM 배지를 사용하였다. 혈청은 1/8로 희석한 뒤 2-fold로 연속적으로 희석하여 약 10³까지 수행하였으며, 각각의 일정한 RLU값을 가진 슈도바이러스를 희석된 혈청과 동일한 양으로 혼합하여 37℃5% CO₂배양기에서 1시간 중화반응을 시켜주었다. 하루 전에 배양한 hACE2-293T 세포에 바이러스와 혈청 혼합물을 100ul 처리하여 약 72시간 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배양 종료 후 약 100ul 배양액을 제거하고, One-Glo luciferase reagent (Promega)를 30ul 추가하여 3-5분 반응시켜준 뒤, 60ul의 혼합물을 white plate로 옮겨주어 luminometer를 이용하여 발광 값을 측정하였다. 측정된 RLU 값을 통계 프로그램을 사용하여 혈청의 희석 배율에 따른 IC50 값을 계산하였다.

베타변이 바이러스에 대한 중화항체 결과, 표 10과 같이 ChimAd-CV 접종군은 IC₅₀=1253, ChimAd-CVN 접종 그룹은 IC₅₀=1131으로 모두 10³이상으로 음성대조군 대비 높은 중화항체가를 확인하였다(도 15).

No	Group	pVNT(IC50)
No	Group	4wk	6wk
1	PBS	7	42
2	ChimAd	9	0
3	ChimAd-CV	244	1253
4	ChimAd-CVN	409	1131

(4)ELISpot; ChimAd-CV, ChimAd-CVN 아데노바이러스에 의한 특이적 T 세포 면역반응

마우스 면역 유도 시험에서 1차접종 4주후, 2차접종 2주후 (1차접종 6주후)에 각각의 그룹에서 비장을 적출하였다. 비장은 Cell strainer (Falcon) 제품을 사용하여 비장세포를 회수하였고, PBS 완충용액으로 세척하였다. 세척 후 적혈구 용해 버퍼 (Sigma)를 이용하여 적혈구를 제거하였고, 비장 세포의 수를 세어 시험에 사용되는 세포의 농도로 희석하였다. 본 실험은 R&D system의 mouse IFN-gamma ELISpot kit를 사용하였으며, 제조사의 사용법에 따라 시험을 수행하였다. 각 시험에는 1X10⁵ cells, 2X10⁴ cells의 비장세포와 Genscript사의 사스-코로나바이러스-2의 Spike 단백질의 펩타이드 풀 또는 Nucleprotein 펩타이드 풀을 자극 항원으로 사용하여 함께 37℃, 5% CO2 배양기에서 16시간 배양하였다. 배양 후에 세척 용액으로 세척을 하였으며, 비오틴이 결합되어 있는 IFN-gamma 검출 항체를 100ul씩 넣어주고 상온에서 2시간 교반 하여 반응하였다. 반응 후에도 세척용액을 이용하여 4번의 세척하였고, streptavidin-AKP(alkaline phosphate)을 100ul씩 넣어주고 상온에서 2시간 배양하였다. 마지막 세척을 한 뒤, 100ul의 BCIP/NBT 기질을 첨가하여 상온에서 약 45분 동안 반응시켜주었으며, 반응에 의한 발색이 나타나게 되면 멸균된 물로 세척한 후 발색 된 spot의 개수를 세어 준 뒤, Spot Forming Unit (SFU)의 세포 수를 환산하였다.

S 단백질, N 단백질 각각의 자극 항원에 대한 특이적 T-세포 면역 유도를 ELISpot 시험을 통해 측정한 결과, 1차접종 후 (4주차) 보다 2차접종 후 (6주차)에 T-세포 면역이 증가하였으며, 특히, Spike 단백질의 펩타이드에 대하여 ChimAd-CV보다 ChimAd-CVN에서 약 2배 높은 특이적 면역반응을 유도하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, ChimAd-CVN은 Nucleocapsid peptide에 대하여 특이적 면역반응이 유도됨을 확인하였다(도 16).

No	Group	SPF/10^6 splenocytes (Spike peptide pool)
No	Group	4wk	6wk
1	PBS	34	17
2	ChimAd	61	42
3	ChimAd-CV	2367	3824
4	ChimAd-CVN	3020	6949

8-6) ChimAd-CV, ChimAd-CVN 동물면역 후 항체역가, 중화항체가 및 공격시험

A. hACE2 transgenic female mouse를 이용한 면역 유도 및 공격시험

IVI에서 실시한 면역 유도 시험 및 공격 시험은 Jackson Laboratory (ME, USA)에서 구입한 6주령의 암컷 human ACE2 transgenic mice (Tg(K18-ACE2)2Prlmn)을 사용하였다. 위 시험은 모두 국제백신연구소 내 BSL-3등급 시설에서 실시되었다. 면역 유도 시험 그룹에는 완충제, Mock-up으로 사용된 ChimAd, 그리고 ChimAd-CV, ChimAd-CVN으로 총 4그룹을 포함한다. 마우스는 4주간격으로 2회 근육내 접종하였으며, 1차 프라이밍 접종 4주, 6주 후에 혈액을 채취하였다.

B. ELISA ; ChimAd-CV, ChimAd-CVN에 의한 마우스 항-혈청의 항체 역가 측정

마우스 면역 유도 시험 후 혈청 내의 항체 역가를 측정하기 위하여 수행되었다. 96-well plate에 사스-코로나바이러스-2 S 단백질과 델타변이주 S 단백질을 2ug/ml의 농도로 100ng/well씩 분주하고 4℃에서 16시간 이상 코팅하였다. 반응 후 1% BSA가 포함된 PBS를 100ul 분주하여 반응시켜 주었다. 각각의 혈청을 1:100으로 희석한 뒤, 5-fold로 연속적으로 희석하여 4도에서 16시간 이상 반응시켜 주었다. HRP가 결합된 Goat anti-mouse IgG HRP (Southern Biotech)를 1:3000으로 희석하여 37℃에서 1시간 반응하였다. 반응이 끝나고 발색을 진행하기 위하여 TMB 용액 (Millipore)을 분주하여 발색 반응을 진행하였으며, 이후 0.5 N HCl 용액(Merck)을 동량 첨가하여 반응을 정지시켜준 뒤, 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

대조군에 비교하여 ChimAd-CV을 접종한 실험군과 ChimAd-CVN를 접종한 실험군 모두 사스-코로나바이러스-2와 델타 변이주에 대하여 10⁵이상의 높은 결합 항체 역가를 나타내는 것을 확인하였다(도 17).

C. FRNT (Focus Reduction Neutralization Test); ChimAd-CV, ChimAd-CVN 마우스 항-혈청의 코로나바이러스에 대한 중화항체가 측정

마우스 면역 유도 시험 후 혈청 내의 중화항체를 측정하기 위하여 시험을 수행하였다. 중화항체 시험을 위해 먼저 각각의 마우스 혈청을 56℃에서 30분간 불활화 반응을 하였고, 2% FBS가 포함된 DMEM 배지를 사용하여 2-fold로 연속적으로 희석하였다. 희석된 혈청과 4.5x10²PFU/25ul의 사스-코로나바이러스-2 코로나바이러스 (NCCP #43326 (BetaCoV/Korea/KCDC03/2020)와 4.0x10²PFU/25ul의 델타변이주 코로나바이러스 (NCCP #43390 (hCoV-19/Korea119861/KDCA/2021)와 혼합하여 37℃에서 30분간 반응시켜주었다. 반응 후, 하루 전에 배양한 Vero cells (1.5x10⁴cells/well)에 바이러스와 혈청 혼합물을 50ul 처리하여 37℃, CO₂ 배양기에서 4시간 배양하였다. 4시간 반응 후에 상층액을 제거하고 PBS 완충 용액을 이용하여 세척하였으며, 4% formaldehyde 용액 (Sigma)를 300ul 처리하여 빛이 없는 곳에서 16시간 이상 고정시켜주었다. 반응 후 PBS를 이용하여 세척을 진행한 뒤, 100% cold methanol을 추가하여 10분간 반응시켜준 뒤, Blocking 용액을 이용하여 상온에서 1시간 반응시켜주었다. 이후, 1:3000으로 희석된 anti-SARS-CoV-2 NP rabbit monoclonal antibody (Sino Biological)를 처리하여 37도에서 1시간 배양하였고, 배양 후 0.1% Tween20이 포함된 PBS 용액 (PBS-T)으로 세척한 뒤, 1:2000로 희석한 HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG (Bio-Rad)를 처리하여 37℃에서 1시간 배양하였다. PBS-T로 세척 진행 후, TMB 용액을 빛이 없는 조건에서 상온에서 30분간 반응시켜주었고, 물로 반응을 정지시킨 후 건조시켰다. FRNT50 분석을 위해 Spot reader (Cytation 7 Cell Imaging Multi-Mode Reader)를 사용하였으며, 혈청의 희석 배율에 따라 값을 계산하였다. FRNT법은 바이러스에 감염된 세포에 바이러스 유래 단클론 항체를 부착시킨 후 HRP(horedish peroxidase)로 표지된 2차항체를 붙여 기질로 발색시켜 바이러스에 감염된 세포를 확인하여 중화항체를 측정하는 방법이다.

사스-코로나바이러스-2 바이러스에 대한 중화항체 결과, 표 5와 같이 중화항체가를 확인할 수 있으며, 이는 ChimAd-CV와 ChimAd-CVN 그룹 모두 음성 대조군에 비해 1차 접종 이후 100배 이상 높은 중화항체 역가를 나타낸 것을 확인하였다. 2차 접종 이후에는 ChimAd-CV 접종군은 30배 이상, ChimAd-CVN 접종군은 50배 이상 높은 중화 항체 역가를 나타내는 것을 확인하였다.

또한, 델타변이주 바이러스에 대한 중화항체 결과, 2차 접종 이후 ChimAd-CV 접종군과 ChimAd-CVN 접종군 모두 음성 대조군에 비해 40배 이상 높은 중화 항체 역가를 나타내는 것을 확인하였다(도 18).

No	Group	사스-코로나바이러스-2(FRNT50)		델타변이주(FRNT50)
No	Group	4wk	6wk	4wk	6wk
1	PBS	10	10	10	10
2	ChimAd	10	50	10	26
3	ChimAd-CV	1288	1660	646	1202
4	ChimAd-CVN	1096	3020	513	1096

D. ChimAd-CV, ChimAd-CVN 면역 후 바이러스 공격 시험

공격 시험은 부스팅 접종 4주 후에 5x10⁵ PFU SARS-CoV-2 바이러스 (사스-코로나바이러스-2, 델타변이주)를 비강 내로 감염시켰다. 접종 후에는 매일 생존과 체중을 모니터링 하였으며, 감염 후 2일, 4일 7일차에는 혈액, 폐, 간, 신장, 비장을 채취하여 장기 무게를 측정하고 폐에서의 바이러스 역가를 측정하였다.

사스-코로나바이러스-2(Wuhan-Hu-1) 공격에 대해 ChimAd-CV와 ChimAd-CVN의 백신 방어능을 확인 결과, 모두생존율 100%로 나타났으며, ChimAd-CVN 접종군은 몸무게가 감소하지 않고 유지되는 것을 확인하였으며, ChimAd-CV 접종군은 한 마리를 제외하고 모두 몸무게가 감소하지 않고 유지되었으며, 몸무게가 10% 이상 감소했다가 회복한 개체가 있는 것을 확인하였다.

또한, 델타변이주 (Delta variant) 공격에 대해 ChimAd-CV와 ChimAd-CVN의 백신 방어능을 확인 결과, ChimAd-CVN에서는 감염 7일 후 생존율 40%, 평균 체중이 약 20% 내의 평균 몸무게가 감소를 보이는 것을 확인하였다. ChimAd-CV 결과에서는 감염 7일 후 생존율 100%, 평균 체중 100% 유지하는 결과를 확인할 수 있었다(도 19).

E. ChimAd-CV, ChimAd-CVN 면역 유도와 공격 시험에 대한 폐 바이러스 역가 (Plaque assay)

마우스 면역유도 및 공격시험 진행 후 폐에서의 잔존 바이러스 역가 측정을 위하여 Plague assay 테스트를 진행하였다. 역가 측정을 위해서 Vero cells (ATCC, Cat#CCL-81)을 사용하였으며, 37℃5% CO₂배양기에서 16시간 이상 배양하였다. 모든 그룹에서 채취한 폐에서 분리한 바이러스는 4-fold로 단계적으로 10⁶까지 희석하여, 배양한 Vero cell에 희석한 바이러스를 200ul씩 추가하여 상온에서 30분 반응시켜주었다. 반응 후 바이러스 혼합물을 제거해주고 0.8% Agarose와 2% FBS가 포함된 DMEM (Overlay media)을 덮어주고 15분간 상온에서 반응시킨 후, 37℃5% CO₂ 배양기에서 72시간 배양하였다. 10% 포르말린 용액으로 1시간 동안 고정한 뒤, Overlay media를 제거하고, crystal violet (Sigma)을 사용하여 plaque를 5분 동안 염색하였다. 바이러스 역가를 확인하기 위하여, plaque의 개수를 세어 준 뒤, 각각의 희석배수와 총 양(ml)을 계산하여 최종적인 역가를 계산하였다.

공격시험 이후 폐에서의 잔존 바이러스 역가 측정 결과, 사스-코로나바이러스-2 및 델타변이주 공격에 대해 ChimAd-CV 접종군에서는 바이러스 공격 후 대조군에 비해 공격 2일 후에 lung virus titer가 20,000배 이상 감소하는 것을 확인하였으며, 공격 4일 후와 7일 후에는 virus clearance되어 측정되지 않는 것을 확인하였다. ChimAd-CVN 접종군은 virus clearance되어 2일 후, 4일 후, 7일 후까지 모두 lung virus titer가 측정되지 않는 것을 확인하였다(도 20).

실시예 9: 키메릭 아데노바이러스 기반 HPV 치료 및 예방 백신 적용

9-1) HPV16형 E6, E7과 HPV 18형의 E6, E7의 단백질을 암호화하는 유전자 변형

HPV 유형 16의 항암 유발 단백질의 유전자 변형을 위해서, E6 단백질의 경우 항암단백질 p53의 binding domain으로 인한 발암 유도성 단백질과의 상호작용을 억제하기 위해 113번부터 122번 잔기의 결실 돌연변이를 유도하였다. E7 단백질의 경우 주된 표적인 pRb와의 상호작용을 강하게 저해하며 E7 자체의 변형활성능력을 억제하기 위해 21번부터 26번 잔기의 결실 돌연변이를 유도하였다. 또한, HPV 유형 18의 항암 유발 단백질의 유전자 변형을 위해서, E6 단백질의 경우 항암단백질 p53의 binding domain으로 인한 발암 유도성 단백질과의 상호작용을 억제하기 위해 113번부터 122번 잔기의 결실 돌연변이를 유도하였다. E7 단백질의 경우 주된 표적인 pRb와의 상호작용을 강하게 저해하며 E7 자체의 변형활성능력을 억제하기 위해 24번부터 29번 잔기의 결실 돌연변이를 유도하였다.

사람 파필로마바이러스 유형 16 유래의 종양 단백질인 E6, E7의 아미노산이 결실된 선형(Linear; E6E7) 형태의 폴리펩타이드와 사람 파필로마바이러스 유형 18 유래의 종양 단백질인 E6, E7의 아미노산이 결실된 선형(Linear; E6E7) 폴리펩타이드는 Linker로 결합하였다.

9-2) 키메릭 아데노바이러스 기반 HPV16, 18형 E6, E7 유전자 합성 및 키메릭 아데노바이러스 클로닝

사람 파필로마바이러스 유형 16형과 18형의 항암 유발 단백질인 E6와 E7 유전자를 변형시키고, 이 단백질을 암호화하는 합성 유전자를 확보하였음. 각각의 단백질은 표 13과 같이 strain을 선정하여 HEK Cell에서 발현이 용이하도록 codon을 최적화하였다.

	Accession no.
HPV 16E6E7	E6; AAV91660.1, E7; BAO18680.1
HPV 18 E6E7	E6; 1ADC35716.1, E7; 1ADC35717.1

키메릭 아데노바이러스 벡터에 클로닝한 HPV 백신항원 클로닝은 상기 사스-코로나 바이러스 백신 제작과 동일한 방법(실시예 8-3)으로 진행하여 최종적으로 ChimAd-HPV plasmid 확보하였다(도 21).

Primer name	Sequence (5' to 3' direction)	PCR product
ChimAd vector	F: CTAAGCTTCTAGATAAGATATCCGATCCAC (서열번호 59)	33.4 Kb
	R: CGCGTCGACGGTACCAGATCTCTAGCGGATC (서열번호 60)
HPV16/18 E6E7	F: GATCTGGTACCGTCGACGCGATGCACCAGAAGAGAACA (서열번호 61)	1.4Kb
	R: TATCTTATCTAGAAGCTTAGTTATTGTTGACTAGCGCACCATGG (서열번호 62)

9-3) C57BL/6 female을 이용한 면역 유도

상기 제조방법으로 확보한 ChimAd-HPV 백신후보물질을 이용하여 마우스 면역을 실시하였다. 시험 그룹에는 완충제, Mock-up으로 사용된 ChimAd, 그리고 ChimAd-HPV 총 3그룹을 포함한다. 면역 유도 시험에는 5주령 C57BL/6 암컷 마우스를 사용하였으며, 각 아데노바이러스 시험군은 2*10^7 PFU/ml의 농도로 주사하였다. 4주 간격으로 접종은 1차접종 과 2차접종으로 총 2회 (0일차, 14일차) 근육주사 하였으며, 최초 접종 이후 2주, 4주 후에 (14일차, 28일차) 혈액을 채취하여 혈청을 분리하고 비장을 적출하였다.

또한, 자궁경부암 치료 효과를 확인하기 위하여, 1차접종 7일 전 6주령의 C57BL/6 암컷 쥐에 TC-1 종양세포를 1X10⁵ 세포를 옆구리 피하주사를 하였으며, 그룹마다 6마리의 쥐를 사용하였다. 또한, 자궁경부암 예방 효과를 확인하기 위하여, 2차접종 7일 후 6주령의 C57BL/6 암컷 쥐에 TC-1 종양세포를 1X10⁵ 세포를 옆구리 피하주사를 하였으며 각 그룹별 6마리씩 사용하였다.

9-4) ELISPOT; ChimAd-HPV 아데노바이러스에 의한 특이적 T 세포 면역반응

2차 접종을 주사한 날로부터 35일째 되는 날, 각각의 그룹에서 비장을 적출하였다. Cell strainer (Falcon) 제품을 이용하여 비장을 잘게 부순 뒤 비장세포를 회수하고, PBS 완충용액으로 워싱하였다. 이 후, 적혈구 용해 버퍼 (Sigma)를 이용하여 적혈구를 제거해주었으며, 비장 세포 수를 카운팅하여 시험에 사용할 세포의 수로 희석하였다. 본 실험은 R&D system의 mouse IFN-gamma ELISpot kit를 사용하였으며, 제조사의 사용법에 따라 시험을 수행하였다.

그리고 mouse IFN-gamma 단일클론 항체가 코팅된 플레이트에 각각의 마우스에서 회수한 비장세포 2X10⁵ cells, 4X10⁴ cells와 Genscript사의 HPV E7 단백질의 49-57 아미노산 펩타이드를 자극 항원으로 사용하여 함께 넣고 37℃5% CO₂ 배양기에서 16시간 배양하였다. 배양 후 1X Wash버퍼를 이용하여 4번의 세척을 하고, 비오틴이 결합되어있는 IFN-gamma 검출 항체를 100ul씩 넣어주고 상온에서 2시간 교반하여 배양하였다. 1X Wash버퍼를 이용하여 4번의 세척하였고, streptavidin-AKP(alkaline phosphate)을 100ul씩 넣어주고 상온에서 2시간 배양하였다. 마지막 세척 후, 100ul의 BCIP/NBT 기질을 첨가하여 상온에서 45분 동안 배양하였고, 반응에 의한 발색이 나타나게 되면 멸균된 물로 세척한 후 발색 된 점의 개수를 카운팅 하였다.

HPV E7 단백질 항원에 대한 특이적 T 세포 면역반응을 ELISPOT으로 측정한 결과, ChimAd-HPV 그룹에서 대조군에 비해 높은 결과를 나타내어, 항원에 대한 특이적 면역반응을 유도하는 것을 확인할 수 있었다. (도 22)

9-5) Tumor inhibition assay; ChimAd-HPV 아데노바이러스에 의한 종양 치료 및 예방 효과 확인

ChimAd-HPV 아데노바이러스에 대한 자궁경부암 치료 효과를 확인하기 위하여, 6주령의 C57BL/6 암컷 쥐에 TC-1 종양세포를 1X10⁵ 세포를 옆구리 피하주사를 하였으며, 그룹마다 6마리의 쥐를 사용하였다. 치료 효능을 확인하기 위하여, TC-1세포 주입 7일 후, 대조군과 ChimAd-HPV 아데노바이러스를 근육주사를 진행하였으며, 종양세포 주입 21일째 되는 날 2차 주입을 하였다. 또, 예방 효능을 확인하기 위하여, 2주간격으로 대조군과 ChimAd-HPV 아데노바이러스를 근육주사를 2회 주입 수행하고, 2차 주입 14일 이후 TC-1 종양세포를 1X10⁵ 세포를 옆구리 피하주사 실시 하였다. 종양세포는 4-5 일마다 디지털 캘리퍼를 사용하여 가장 긴 (길이) 및 가장 짧은 치수 (너비)를 측정하여 마우스의 종양 크기를 추정하였다. 종양 부피는 다음과 같은 식에 의해 계산되었다: 종양부피=(길이X너비²)/2.

도 22와 같이 ChimAd-HPV 아데노바이러스를 통한 종양부피를 측정한 결과, 치료 및 예방 효능 모두에서 음성대조군 및 양성대조군에 비교하여 ChimAd-HPV 아데노바이러스 그룹에서 종양부피가 낮게 나타났으며, 예방 효능에서는 ChimAd-HPV 아데노바이러스 그룹에서 종양세포가 발생하지 않는 것을 확인할 수 있었다. (도 23)

[서열 목록]

SEQ ID NO: 1- Chimpanzee adenovirus serotype 6 Fiber knob domain a.a sequence(synthesized ChAdV-6 knob a.a sequences are underlined)

SEQ ID NO: 2- Chimpanzee adenovirus serotype 6/Pan6/Sad23 Fiber knob domain nucleotide sequence

SEQ ID NO: 3- Chimeric hexon HVR 1 to 7 region a.a sequence (HAdV-5 hexon + HAdV-28 HVR 1-7 region)

SEQ ID NO: 4- Chimeric hexon HVR 1 to 7 region nucleotide sequence (HAdV-5 hexon + HAdV-28 HVR 1-7 region)

SEQ ID NO: 5- Chimeric fiber gene sequence (HAdV-5 tail, shift domain + ChAdV-6 knob domain)

SEQ ID NO: 6- Chimeric hexon gene sequence (HAdV-5 hexon + HAdV-28 HVR 1-7region)

[ChimAd 기반 코로나백신 서열]

SEQ ID NO: 7 - SARS-CoV-2_B.1.351(beta) spike modified amino acid sequence

SEQ ID NO: 8 - SARS-CoV-2_B.1.351(beta) spike modified nucleic acid sequence

하기는 본 발명의 융합 CVN 폴리펩타이드 삽입체의 서열을 기재한다.

상기 서열에서 서열번호 9은 SARS-CoV-2-B.1.1.351 Spike 단백질의 N말단에 결합한 서열이고, 서열번호 10은 C말단에 결합한 서열이며, 밑줄은 링커를 의미하고, 화살표는 SARS-CoV-2-B.1.1.351 Spike 단백질이 삽입되는 위치를 나타낸다.

상기 서열에서 서열번호 11는 SARS-CoV-2-B.1.1.351 Spike 단백질의 N말단에 결합한 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자 서열이고, 서열12는 C말단에 결합한 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자 서열이고, 밑줄은 링커를 코딩하는 유전자 서열을 의미하고, 화살표는 SARS-CoV-2-B.1.1.351 Spike 단백질이 삽입되는 위치를 나타낸다.

[ChimAd 벡터 기반 HPV 백신 서열]

SEQ ID NO: 13 - Human papillomavirus type 16, E6, E7 & Human papillomavirus type 18, E6, E7 modified amino acid sequence (linker underlined)

SEQ ID NO: 14 - Human papillomavirus type 16, E6, E7 & Human papillomavirus type 18, E6, E7 modified nucleic acid sequence (linker underlined)

<110> GENEMATRIX INC. <120> Recombinant chimeric adenovirus vector substituted with the knob gene of chimpanzee adenovirus serotype 6 and use of the same <130> P21-0020HSP <150> KR 10-2021-0040269 <151> 2021-03-29 <160> 62 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 173 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimpanzee adenovirus serotype 6 Fiber knob domain a.a sequence(synthesized ChAdV-6 knob a.a sequences are underlined) <400> 1 Pro Asp Pro Ser Pro Asn Cys Gln Leu Leu Ser Asp Arg Asp Ala Lys 1 5 10 15 Phe Thr Leu Cys Leu Thr Lys Cys Gly Ser Gln Ile Leu Gly Thr Val 20 25 30 Ala Val Ala Ala Val Thr Val Gly Ser Ala Leu Asn Pro Ile Asn Asp 35 40 45 Thr Val Lys Ser Ala Ile Val Phe Leu Arg Phe Asp Ser Asp Gly Val 50 55 60 Leu Met Ser Asn Ser Ser Met Val Gly Asp Tyr Trp Asn Phe Arg Glu 65 70 75 80 Gly Gln Thr Thr Gln Ser Val Ala Tyr Thr Asn Ala Val Gly Phe Met 85 90 95 Pro Asn Ile Gly Ala Tyr Pro Lys Thr Gln Ser Lys Thr Pro Lys Asn 100 105 110 Ser Ile Val Ser Gln Val Tyr Leu Thr Gly Glu Thr Thr Met Pro Met 115 120 125 Thr Leu Thr Ile Thr Phe Asn Gly Thr Asp Glu Lys Asp Thr Thr Pro 130 135 140 Val Ser Thr Tyr Ser Met Thr Phe Thr Trp Gln Trp Thr Gly Asp Tyr 145 150 155 160 Lys Asp Lys Asn Ile Thr Phe Ala Thr Asn Ser Phe Ser 165 170 <210> 2 <211> 519 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimpanzee adenovirus serotype 6/Pan6/Sad23 Fiber knob domain nucleotide sequence <400> 2 cctgacccaa gccctaattg tcaattactt tcagacagag atgccaaatt tactctctgt 60 cttacaaaat gcggtagtca aatactaggc actgtggcag tggcggctgt tactgtagga 120 tcagcactaa atccaattaa tgacacagtc aaaagcgcca tagttttcct tagatttgat 180 tccgatggtg tactcatgtc aaactcatca atggtaggtg attactggaa ctttagggag 240 ggacagacca ctcaaagtgt agcctataca aatgctgtgg gattcatgcc aaatataggt 300 gcatatccaa aaacccaaag taaaacacct aaaaatagca tagtcagtca ggtatattta 360 actggagaaa ctactatgcc aatgacacta accataactt tcaatggcac tgatgaaaaa 420 gacacaaccc cagttagcac ctactctatg acttttacat ggcagtggac tggagactat 480 aaggacaaaa atattacctt tgctaccaac tcattctct 519 <210> 3 <211> 318 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric hexon HVR 1 to 7 region a.a sequence (HAdV-5 hexon + HAdV-28 HVR 1-7 region) <400> 3 Ser Ser Gln Trp Asp Ala Gln Glu Lys Ser Gly Gln Gly Ser Asp Met 1 5 10 15 Val Thr Lys Thr His Thr Phe Gly Gln Ala Pro Tyr Ser Gly Ile Asn 20 25 30 Ile Thr Lys Glu Gly Ile Gln Ile Gly Thr Glu Ile Thr Ala Asp Asn 35 40 45 Gln Lys Lys Glu Ile Phe Ala Asp Lys Thr Phe Gln Pro Glu Pro Gln 50 55 60 Ile Gly Glu Glu Asn Trp Gln Glu Asn Glu Val Phe Tyr Gly Gly Arg 65 70 75 80 Val Leu Lys Lys Thr Thr Pro Met Lys Pro Cys Tyr Gly Ser Tyr Ala 85 90 95 Lys Pro Thr Asn Glu Asn Gly Gly Gln Ala Lys Phe Lys Thr Pro Ala 100 105 110 Glu Gly Gln Glu Pro Lys Glu Leu Asp Ile Asp Leu Ala Phe Phe Asp 115 120 125 Thr Asp Gly Gly Thr Ala Asp Thr Glu Tyr Lys Ala Asp Ile Val Leu 130 135 140 Tyr Ser Glu Asp Val Asp Ile Glu Thr Pro Asp Thr His Ile Ser Tyr 145 150 155 160 Met Pro Gly Lys Glu Asp Asp Ser Ser Glu Ile Asn Leu Val Gln Gln 165 170 175 Ser Met Pro Asn Arg Pro Asn Tyr Ile Ala Phe Arg Asp Asn Phe Ile 180 185 190 Gly Leu Met Tyr Tyr Asn Ser Thr Gly Asn Met Gly Val Leu Ala Gly 195 200 205 Gln Ala Ser Gln Leu Asn Ala Val Val Asp Leu Gln Asp Arg Asn Thr 210 215 220 Glu Leu Ser Tyr Gln Leu Leu Leu Asp Ser Ile Gly Asp Arg Thr Arg 225 230 235 240 Tyr Phe Ser Met Trp Asn Gln Ala Val Asp Ser Tyr Asp Pro Asp Val 245 250 255 Arg Ile Ile Glu Asn His Gly Thr Glu Asp Glu Leu Pro Asn Tyr Cys 260 265 270 Phe Pro Leu Asp Gly Leu Gly Thr Asn Ala Thr Tyr Gln Gly Val Lys 275 280 285 Val Ser Thr Gly Asp Gly Ala Thr Gln Ser Gly Trp Ala Lys Asp Asp 290 295 300 Thr Met Ala Arg Gln Asn Gln Ile Cys Arg Gly Asn Ile Tyr 305 310 315 <210> 4 <211> 954 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric hexon HVR 1 to 7 region nucleotide sequence (HAdV-5 hexon + HAdV-28 HVR 1-7 region) <400> 4 tccagtcagt gggatgcgca agaaaaaagt ggacaaggaa gtgacatggt tactaaaact 60 cacacatttg ggcaggcgcc ttattctggt ataaatatta caaaggaggg tattcaaata 120 ggtactgaaa ttaccgccga caatcaaaag aaagaaattt ttgccgataa aacatttcaa 180 cctgaacctc aaataggaga agagaactgg caagaaaatg aagtcttcta tggcgggaga 240 gtcctaaaaa agactacccc aatgaaacca tgttacggtt catatgcaaa acccacaaat 300 gaaaatggag ggcaagcaaa attcaaaaca cctgctgaag gacaggaacc taaagaactt 360 gacattgacc ttgctttttt cgacactgac ggcggaacag ctgacactga atataaagca 420 gatattgtat tgtacagtga agatgtagat atagaaaccc cagacactca tatttcttac 480 atgcccggca aggaagatga cagttcagaa atcaatctag ttcaacaatc tatgcccaac 540 aggcctaatt acattgcttt tagggacaat tttattggtc taatgtatta caacagcacg 600 ggtaatatgg gtgttctggc gggccaagca tcgcagttga atgctgttgt agatttgcaa 660 gacagaaaca cagagctttc ataccagctt ttgcttgatt ccattggtga tagaaccagg 720 tacttttcta tgtggaatca ggctgttgac agctatgatc cagatgttag aattattgaa 780 aatcatggaa ctgaagatga acttccaaat tactgctttc cactggacgg attgggaact 840 aatgctacct atcaaggtgt aaaagtatca actggagatg gtgctacgca aagcggatgg 900 gcaaaagacg acacaatggc caggcaaaac caaatatgca ggggtaacat ctac 954 <210> 5 <211> 1731 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric fiber gene sequence (HAdV-5 tail, shift domain + ChAdV-6 knob domain) <400> 5 atgaagcgcg caagaccgtc tgaagatacc ttcaaccccg tgtatccata tgacacggaa 60 accggtcctc caactgtgcc ttttcttact cctccctttg tatcccccaa tgggtttcaa 120 gagagtcccc ctggggtact ctctttgcgc ctatccgaac ctctagttac ctccaatggc 180 atgcttgcgc tcaaaatggg caacggcctc tctctggacg aggccggcaa ccttacctcc 240 caaaatgtaa ccactgtgag cccacctctc aaaaaaacca agtcaaacat aaacctggaa 300 atatctgcac ccctcacagt tacctcagaa gccctaactg tggctgccgc cgcacctcta 360 atggtcgcgg gcaacacact caccatgcaa tcacaggccc cgctaaccgt gcacgactcc 420 aaacttagca ttgccaccca aggacccctc acagtgtcag aaggaaagct agccctgcaa 480 acatcaggcc ccctcaccac caccgatagc agtaccctta ctatcactgc ctcaccccct 540 ctaactactg ccactggtag cttgggcatt gacttgaaag agcccattta tacacaaaat 600 ggaaaactag gactaaagta cggggctcct ttgcatgtaa cagacgacct aaacactttg 660 accgtagcaa ctggtccagg tgtgactatt aataatactt ccttgcaaac taaagttact 720 ggagccttgg gttttgattc acaaggcaat atgcaactta atgtagcagg aggactaagg 780 attgattctc aaaacagacg ccttatactt gatgttagtt atccgtttga tgctcaaaac 840 caactaaatc taagactagg acagggccct ctttttataa actcagccca caacttggat 900 attaactaca acaaaggcct ttacttgttt acagcttcaa acaattccaa aaagcttgag 960 gttaacctaa gcactgccaa ggggttgatg tttgacgcta cagccatagc cattaatgca 1020 ggagatgggc ttgaatttgg ttcacctaat gcaccaaaca caaatcccct caaaacaaaa 1080 attggccatg gcctagaatt tgattcaaac aaggctatgg ttcctaaact aggaactggc 1140 cttagttttg acagcacagg tgccattaca gtaggaaaca aaaataatga taagctaact 1200 ttgtggacca cacctgaccc aagccctaat tgtcaattac tttcagacag agatgccaaa 1260 tttactctct gtcttacaaa atgcggtagt caaatactag gcactgtggc agtggcggct 1320 gttactgtag gatcagcact aaatccaatt aatgacacag tcaaaagcgc catagttttc 1380 cttagatttg attccgatgg tgtactcatg tcaaactcat caatggtagg tgattactgg 1440 aactttaggg agggacagac cactcaaagt gtagcctata caaatgctgt gggattcatg 1500 ccaaatatag gtgcatatcc aaaaacccaa agtaaaacac ctaaaaatag catagtcagt 1560 caggtatatt taactggaga aactactatg ccaatgacac taaccataac tttcaatggc 1620 actgatgaaa aagacacaac cccagttagc acctactcta tgacttttac atggcagtgg 1680 actggagact ataaggacaa aaatattacc tttgctacca actcattctc t 1731 <210> 6 <211> 2832 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric hexon gene sequence (HAdV-5 hexon + HAdV-28 HVR 1-7region) <400> 6 atggctaccc cttcgatgat gccgcagtgg tcttacatgc acatctcggg ccaggacgcc 60 tcggagtacc tgagccccgg gctggtgcag tttgcccgcg ccaccgagac gtacttcagc 120 ctgaataaca agtttagaaa ccccacggtg gcgcctacgc acgacgtgac cacagaccgg 180 tcccagcgtt tgacgctgcg gttcatccct gtggaccgtg aggatactgc gtactcgtac 240 aaggcgcggt tcaccctagc tgtgggtgat aaccgtgtgc tggacatggc ttccacgtac 300 tttgacatcc gcggcgtgct ggacaggggc cctactttta agccctactc tggcactgcc 360 tacaacgccc tggctcccaa gggtgcccca aattccagtc agtgggatgc gcaagaaaaa 420 agtggacaag gaagtgacat ggttactaaa actcacacat ttgggcaggc gccttattct 480 ggtataaata ttacaaagga gggtattcaa ataggtactg aaattaccgc cgacaatcaa 540 aagaaagaaa tttttgccga taaaacattt caacctgaac ctcaaatagg agaagagaac 600 tggcaagaaa atgaagtctt ctatggcggg agagtcctaa aaaagactac cccaatgaaa 660 ccatgttacg gttcatatgc aaaacccaca aatgaaaatg gagggcaagc aaaattcaaa 720 acacctgctg aaggacagga acctaaagaa cttgacattg accttgcttt tttcgacact 780 gacggcggaa cagctgacac tgaatataaa gcagatattg tattgtacag tgaagatgta 840 gatatagaaa ccccagacac tcatatttct tacatgcccg gcaaggaaga tgacagttca 900 gaaatcaatc tagttcaaca atctatgccc aacaggccta attacattgc ttttagggac 960 aattttattg gtctaatgta ttacaacagc acgggtaata tgggtgttct ggcgggccaa 1020 gcatcgcagt tgaatgctgt tgtagatttg caagacagaa acacagagct ttcataccag 1080 cttttgcttg attccattgg tgatagaacc aggtactttt ctatgtggaa tcaggctgtt 1140 gacagctatg atccagatgt tagaattatt gaaaatcatg gaactgaaga tgaacttcca 1200 aattactgct ttccactgga cggattggga actaatgcta cctatcaagg tgtaaaagta 1260 tcaactggag atggtgctac gcaaagcgga tgggcaaaag acgacacaat ggccaggcaa 1320 aaccaaatat gcaggggtaa catctacgcc atggaaatca atctaaatgc caacctgtgg 1380 agaaatttcc tgtactccaa catagcgctg tatttgcccg acaagctaaa gtacagtcct 1440 tccaacgtaa aaatttctga taacccaaac acctacgact acatgaacaa gcgagtggtg 1500 gctcccgggc tagtggactg ctacattaac cttggagcac gctggtccct tgactatatg 1560 gacaacgtca acccatttaa ccaccaccgc aatgctggcc tgcgctaccg ctcaatgttg 1620 ctgggcaatg gtcgctatgt gcccttccac atccaggtgc ctcagaagtt ctttgccatt 1680 aaaaacctcc ttctcctgcc gggctcatac acctacgagt ggaacttcag gaaggatgtt 1740 aacatggttc tgcagagctc cctaggaaat gacctaaggg ttgacggagc cagcattaag 1800 tttgatagca tttgccttta cgccaccttc ttccccatgg cccacaacac cgcctccacg 1860 cttgaggcca tgcttagaaa cgacaccaac gaccagtcct ttaacgacta tctctccgcc 1920 gccaacatgc tctaccctat acccgccaac gctaccaacg tgcccatatc catcccctcc 1980 cgcaactggg cggctttccg cggctgggcc ttcacgcgcc ttaagactaa ggaaacccca 2040 tcactgggct cgggctacga cccttattac acctactctg gctctatacc ctacctagat 2100 ggaacctttt acctcaacca cacctttaag aaggtggcca ttacctttga ctcttctgtc 2160 agctggcctg gcaatgaccg cctgcttacc cccaacgagt ttgaaattaa gcgctcagtt 2220 gacggggagg gttacaacgt tgcccagtgt aacatgacca aagactggtt cctggtacaa 2280 atgctagcta actataacat tggctaccag ggcttctata tcccagagag ctacaaggac 2340 cgcatgtact ccttctttag aaacttccag cccatgagcc gtcaggtggt ggatgatact 2400 aaatacaagg actaccaaca ggtgggcatc ctacaccaac acaacaactc tggatttgtt 2460 ggctaccttg cccccaccat gcgcgaagga caggcctacc ctgctaactt cccctatccg 2520 cttataggca agaccgcagt tgacagcatt acccagaaaa agtttctttg cgatcgcacc 2580 ctttggcgca tcccattctc cagtaacttt atgtccatgg gcgcactcac agacctgggc 2640 caaaaccttc tctacgccaa ctccgcccac gcgctagaca tgacttttga ggtggatccc 2700 atggacgagc ccacccttct ttatgttttg tttgaagtct ttgacgtggt ccgtgtgcac 2760 cagccgcacc gcggcgtcat cgaaaccgtg tacctgcgca cgcccttctc ggccggcaac 2820 gccacaacat aa 2832 <210> 7 <211> 1270 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2_B.1.351(beta) spike modified amino acid sequence <400> 7 Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val 1 5 10 15 Asn Phe Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe 20 25 30 Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu 35 40 45 His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp 50 55 60 Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Ala 65 70 75 80 Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu 85 90 95 Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser 100 105 110 Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile 115 120 125 Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr 130 135 140 Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr 145 150 155 160 Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu 165 170 175 Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe 180 185 190 Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr 195 200 205 Pro Ile Asn Leu Val Arg Gly Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu 210 215 220 Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr 225 230 235 240 Leu His Ile Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr 245 250 255 Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe 260 265 270 Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys 275 280 285 Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr 290 295 300 Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr 305 310 315 320 Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly 325 330 335 Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg 340 345 350 Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser 355 360 365 Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu 370 375 380 Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg 385 390 395 400 Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Asn Ile Ala 405 410 415 Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala 420 425 430 Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr 435 440 445 Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp 450 455 460 Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val 465 470 475 480 Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro 485 490 495 Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe 500 505 510 Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr 515 520 525 Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr 530 535 540 Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln 545 550 555 560 Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro 565 570 575 Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val 580 585 590 Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val Ala Val Leu 595 600 605 Tyr Gln Gly Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile His Ala Asp 610 615 620 Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe 625 630 635 640 Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val Asn Asn Ser 645 650 655 Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln 660 665 670 Thr Gln Thr Asn Ser Pro Gln Gln Ala Gln Ser Val Ala Ser Gln Ser 675 680 685 Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Val Glu Asn Ser Val Ala Tyr 690 695 700 Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile Ser Val Thr 705 710 715 720 Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val Asp Cys Thr 725 730 735 Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu Leu Leu Gln 740 745 750 Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr Gly Ile Ala 755 760 765 Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln Val Lys Gln 770 775 780 Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe Asn Phe Ser 785 790 795 800 Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu 805 810 815 Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Ile Lys 820 825 830 Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp Leu Ile Cys 835 840 845 Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp 850 855 860 Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly Thr Ile Thr 865 870 875 880 Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala 885 890 895 Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val 900 905 910 Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile 915 920 925 Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys 930 935 940 Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val 945 950 955 960 Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp 965 970 975 Ile Leu Ser Arg Leu Asp Pro Pro Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg 980 985 990 Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln 995 1000 1005 Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr 1010 1015 1020 Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe Cys 1025 1030 1035 1040 Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala Pro His Gly 1045 1050 1055 Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe 1060 1065 1070 Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg 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SARS-CoV-2_B.1.351(beta) spike modified nucleic acid sequence <400> 8 atgtttgtgt ttctggtgct gctgcctctg gtgagcagcc agtgcgtgaa cttcaccacc 60 agaacccagc tgcctcctgc ctacaccaac agctttacca gaggcgtgta ttaccccgac 120 aaagtgttta gatcctccgt gctgcacagc acccaggacc tgtttctgcc ctttttcagc 180 aacgtgacct ggttccatgc catccacgtg agcggcacca acggcaccaa gagattcgcc 240 aatcccgtgc tgccttttaa tgacggcgtg tactttgcca gcaccgagaa gagcaatatc 300 atcagaggct ggatcttcgg caccaccctg gatagcaaga cccagagcct gctgatcgtg 360 aataatgcca ccaatgtggt gatcaaagtg tgcgagttcc agttttgtaa cgaccccttt 420 ctgggcgtgt attaccacaa gaacaacaaa agctggatgg agagcgaatt cagagtgtac 480 agcagcgcca ataactgcac ctttgagtac gtgagccagc cctttctgat ggacctggag 540 ggcaagcagg gcaacttcaa gaacctgaga gagttcgtgt ttaaaaatat cgacggctac 600 ttcaagatct acagcaagca tacacccatc aacctggtga gaggcctgcc ccagggcttc 660 agcgccctgg agcccctggt ggacctgccc atcggcatca acattacccg gtttcagacc 720 ctgcacagaa gctatctgac ccccggcgac agcagcagcg gctggaccgc cggagccgcc 780 gcctattatg tgggctacct gcagcccaga accttcctgc tgaaatacaa cgagaacggc 840 accatcaccg acgccgtgga ctgcgccctg gaccccctga gcgagaccaa gtgtaccctg 900 aagagcttta ccgtggagaa gggcatctac cagaccagca actttagagt gcagcccacc 960 gagagcatcg tgagatttcc caacatcacc aacctgtgcc ccttcgggga ggtgtttaat 1020 gccaccagat tcgccagcgt gtacgcctgg aatagaaaaa gaatcagcaa ctgcgtggcc 1080 gactacagcg tgctgtacaa ctctgccagc ttttccacct ttaagtgcta cggcgtgagc 1140 ccaaccaaac tgaacgacct gtgcttcacc aacgtgtacg ccgacagctt cgtgatcaga 1200 ggcgacgagg tgagacagat cgcccccggc cagaccggca atatcgccga ttacaactac 1260 aagctgcccg acgactttac cggctgcgtg atcgcctgga acagcaacaa cctggacagc 1320 aaggtgggcg gcaactacaa ctacctgtac agactgttta gaaagagcaa cctgaagccc 1380 tttgagagag acatcagcac cgagatctac caggccggca gcaccccctg caacggcgtg 1440 aaaggcttta attgttactt cccactgcag tcctacggct tccagcctac ctacggcgtg 1500 ggatatcagc cctatagagt ggtggtgctg tccttcgagc tgctgcacgc ccccgccacc 1560 gtgtgcggcc caaagaagag caccaacctg gtgaagaaca agtgcgtgaa cttcaacttc 1620 aacggcctga ccggcaccgg cgtgctgacc gagtccaaca agaaatttct gcccttccag 1680 cagttcggaa gagacattgc cgataccacc gacgccgtga gagaccccca gaccctggag 1740 atcctggaca tcaccccctg tagcttcggc ggcgtgtccg tgatcacccc aggcaccaac 1800 acctccaacc aggtggccgt gctgtaccag ggcgtgaact gtaccgaggt gcctgtggcc 1860 atccacgccg atcagctgac cccaacctgg agagtgtact ccaccggctc caacgtgttc 1920 cagaccagag ccggctgtct gatcggcgcc gagcacgtga acaactccta cgagtgcgac 1980 atccctatcg gcgccggcat ctgcgccagc taccagaccc agaccaatag cccccagcag 2040 gcccagtccg tggccagcca gtccatcatt gcctacacca tgtccctggg cgtggagaac 2100 agcgtggcct actccaacaa cagcatcgcc atccccacca atttcaccat cagcgtgacc 2160 accgaaatcc tgccagtgag catgaccaaa acctccgtgg attgcaccat gtacatctgc 2220 ggagactcca ccgagtgctc caacctgctg ctgcagtacg gctccttttg cacccagctg 2280 aacagagccc tgaccggaat cgccgtggag caggataaaa acacccagga agtgttcgcc 2340 caggtgaaac agatctacaa gacccccccc atcaaagatt ttggaggctt taattttagc 2400 cagatcctgc ctgatccctc caaacccagc aagagatcct ttatcgagga tctgctgttc 2460 aacaaagtga cactggccga tgccggattt atcaaacagt acggagactg cctgggcgac 2520 atcgccgcca gagacctgat ctgcgcccag aagtttaacg gcctgaccgt gctgccaccc 2580 ctgctgaccg acgagatgat cgcccagtat acctccgccc tgctggccgg caccatcacc 2640 tccggctgga cctttggcgc cggagccgcc ctgcagatcc catttgccat gcagatggcc 2700 tacagattta atggaatcgg agtgacccag aacgtgctgt atgagaacca gaaactgatc 2760 gccaatcagt tcaacagcgc catcggcaag atccaggatt ctctgagctc caccgcctct 2820 gccctgggca agctgcagga cgtggtgaat cagaacgccc aggccctgaa caccctggtg 2880 aaacagctga gcagcaactt tggcgccatc agcagcgtgc tgaatgatat cctgagcaga 2940 ctggatcctc cagaggccga ggtgcagatc gacagactga tcacagggag actgcagagc 3000 ctgcagacct atgtgacaca gcagctgatc agagccgccg aaattagagc cagcgccaac 3060 ctggccgcca ccaaaatgag cgagtgtgtg ctgggacaga gcaaaagagt ggacttctgc 3120 ggcaaaggct accatctgat gagcttcccc cagagcgccc cccacggcgt ggtgttcctg 3180 catgtgacct acgtgcccgc ccaggaaaaa aattttacca ccgcccctgc catctgtcac 3240 gacggcaaag cccattttcc cagagagggc gtgtttgtga gcaacggcac ccactggttt 3300 gtgacccaga gaaactttta cgaaccccag atcatcacca cagataatac ctttgtgagc 3360 ggaaattgtg atgtggtgat cggcatcgtg aataataccg tgtatgatcc tctgcagcca 3420 gagctggaca gctttaagga ggagctggac aagtatttta aaaatcatac cagccccgac 3480 gtggatctgg gagatatcag cggaatcaac gcctccgtgg tgaatatcca gaaggagatc 3540 gacagactga acgaggtggc caaaaatctg aatgagtccc tgatcgacct gcaggagctg 3600 ggcaaatatg aacagtacat caagtggcca tggtacatct ggctggggtt tatcgccgga 3660 ctgatcgcca tcgtgatggt gaccatcatg ctgtgttgca tgaccagctg ttgtagctgt 3720 ctgaaaggct gttgtagctg cggcagctgc tgcaaatttg acgaggatga ttccgagcca 3780 gtgctgaagg gagtgaaact gcactatacc tga 3813 <210> 9 <211> 138 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence bound to the N-terminus of SARS-CoV-2-B.1.1.351 Spike protein <400> 9 Met Gly Leu Pro Asn Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln 1 5 10 15 His Gly Lys Glu Asp Leu Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile 20 25 30 Asn Thr Asn Ser Ser Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala 35 40 45 Thr Arg Arg Ile Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys 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gggcaatttt 120 ggcgaccagg agctgatcag acagggcacc gactacaaac actggcccca gatcgcccag 180 ttcgccccca gcgccagcgc cttcttcggc atgagcagaa tcggcatgga ggtgaccccc 240 agcggcacct ggctgaccta caccggcgcc atcaagctgg acgacaagga ccccaacttc 300 aaggaccagg tgatcctgct gaacaagcac atcgacgcct acaagacctt cccctga 357 <210> 13 <211> 494 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human papillomavirus type 16, E6, E7 & Human papillomavirus type 18, E6, E7 modified amino acid sequence <400> 13 Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro 1 5 10 15 Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp 20 25 30 Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu 35 40 45 Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly 50 55 60 Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile 65 70 75 80 Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu 85 90 95 Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Lys 100 105 110 Gln Arg 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<400> 14 atgcaccaga agagaacagc catgttccag gaccctcagg aacggccacg gaagctccca 60 caactttgta cagagctgca aacaaccatt catgacatca tccttgaatg cgtttactgc 120 aagcagcaac ttctgcgccg ggaagtctac gatttcgctt tcagagatct gtgcatcgtg 180 tatagagacg ggaaccccta cgccgtgtgt gacaaatgcc ttaaattcta cagtaagatt 240 tcagagtacc ggcattattg ctacagcctt tatggaacta cattggagca gcagtacaac 300 aaacctttgt gcgatcttct tatccggtgc attaagcaac ggcacttgga caaaaaacaa 360 cggttccata acatcagggg caggtggact ggacgctgca tgagttgctg tcgctcaagc 420 cgcactcgga gagagactca actgatgcat ggtgatactc caactttgca cgaatatatg 480 ttggacctcc aacccgaaac tacccaactg aatgacagct ctgaggaaga ggacgaaatc 540 gacggccctg cagggcaagc cgaacctgac agggcccatt ataacattgt gacattttgc 600 tgcaaatgcg atagtacttt gagactctgt gtgcagtcaa ctcatgttga cattagaaca 660 cttgaagacc tcctcatggg gacactgggg attgtttgcc caatctgttc acagaaaccc 720 agaggccgca aaaggcggtc tatggctcgc tttgaggacc ctacaaggag gccctacaag 780 ctccccgatt tgtgtacaga actgaatacc agtcttcagg atattgaaat cacttgcgtc 840 tactgcaaaa ctgtgctcga acttaccgaa gtctttgaat ttgccttcaa ggaccttttt 900 gttgtgtatc gcgattcaat cccacacgca gcctgtcaca aatgtattga cttctactct 960 aggatcagag aattgaggca ctattcagac tctgtgtatg gcgacacctt ggaaaaattg 1020 accaacactg gattgtataa tctgcttatt cggtgtctta agctccggca cttgaacgaa 1080 aaacgcagat tccacaacat tgccgggcat tatcgcgggc aatgccattc ttgttgcaat 1140 cgcgcccgcc aggagcggct gcaaaggcgc agagagactc aggtgatgca tggacccaag 1200 gccactctcc aggacatcgt ccttcatctt gaaccccaga acgaaattcc cgttcaactt 1260 agcgactcag aagaagaaaa tgatgaaatc gacggagtga accatcagca tctcccagca 1320 agaagagccg agccacaaag acacacaatg ctctgtatgt gctgcaagtg tgaagcacgg 1380 atcgaactcg tcgtcgaatc tagtgcagat gatctcagag cctttcaaca gctcttcttg 1440 aatacactga gctttgtctg tccatggtgc gctagtcaac aa 1482 <210> 15 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR1 <400> 15 Pro Cys Glu Trp Asp Glu Ala Ala Thr Ala Leu Glu Ile Asn Leu Glu 1 5 10 15 Glu Glu Asp Asp Asp Asn Glu Asp Glu Val Asp Glu Gln Ala Glu Gln 20 25 30 Gln Lys Thr His Val 35 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PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR1 <400> 22 Ser Ser Gln Trp Asp Ala Gln Glu Lys Ser Gly Gln Gly Ser Asp Met 1 5 10 15 Val Thr Lys Thr His Thr 20 <210> 23 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR2 <400> 23 Thr Glu Ile Thr Ala Asp Asn Gln Lys Lys Glu Ile Phe 1 5 10 <210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR3 <400> 24 Glu Asn Trp Gln Glu Asn Glu Val Phe Tyr Gly 1 5 10 <210> 25 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 25 Gly Thr Ala Ala Cys Cys Gly Cys Ala Thr Ala Cys Gly Ala Gly Cys 1 5 10 15 Ala Gly Ala Cys Gly Gly Thr Gly 20 <210> 26 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR5 <400> 26 Asp Thr Asp Gly Gly Thr Ala Asp Thr Glu Tyr Lys Ala Asp Ile 1 5 10 15 <210> 27 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR6 <400> 27 Gly Lys Glu Asp Asp Ser Ser Glu Ile Asn Leu Val 1 5 10 <210> 28 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR7 <400> 28 Asp Gly Leu Gly Thr Asn Ala Thr Tyr Gln Gly Val Lys Val Ser Thr 1 5 10 15 Gly Asp Gly Ala Thr Gln Ser Gly Trp Ala Lys Asp Asp Thr Met Ala 20 25 30 Arg Gln Asn Gln Ile Cys Arg Gly Asn Ile Tyr 35 40 <210> 29 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 29 taagggtggg aaagaatata taaggtgggg gtc 33 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 30 gccttccatc aagggcatcc cg 22 <210> 31 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 31 gtaaagttcc aagaagcgcg ggatgc 26 <210> 32 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 32 agttaatctc ctggttcacc gtctg 25 <210> 33 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 33 gtaaccgcat acgagcagac ggtg 24 <210> 34 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 34 cgtggagcgg aaggtcacg 19 <210> 35 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 35 gccagacatg atgcaagacc ccgtg 25 <210> 36 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 36 cgtaccactg agattctcct atttgaggtt c 31 <210> 37 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 37 caacctgaac ctcaaatagg agaatctcag 30 <210> 38 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 38 ggataacgat ctaaaggcga acttcaaac 29 <210> 39 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 39 gtcaggcagt agtttgaagt tcgc 24 <210> 40 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 40 ctctagttat aactagagga tcttgatgta atccagggtt ag 42 <210> 41 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 41 cctctagtta taactagagt acccgggatc ttattccctt taac 44 <210> 42 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 42 cggagtaact tgtatgtgtt gggaattg 28 <210> 43 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 43 caattcccaa cacatacaag ttactccg 28 <210> 44 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 44 tatattcttt cccaccctta cgcgttaaga tacattgatg 40 <210> 45 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 45 cctttgctac caactcattc tctttttcat acattgccc 39 <210> 46 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 46 acaattaggg cttgggtcag gtgtggtcca caaagttagc 40 <210> 47 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 47 gctaactttg tggaccacac ctgacccaag ccctaattgt 40 <210> 48 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 48 gggcaatgta tgaaaaagag aatgagttgg tagcaaagg 39 <210> 49 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 49 tgcaggggta acatctacgc catggaaatc aatctaaatg 40 <210> 50 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 50 tgcgcatccc actgactgga atttggggca cccttgggag 40 <210> 51 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 51 ctcccaaggg tgccccaaat tccagtcagt gggatgcgca 40 <210> 52 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 52 catttagatt gatttccatg gcgtagatgt tacccctgca 40 <210> 53 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 53 ctaagcttct agataagata tccgatccac 30 <210> 54 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 54 cgcgtcgacg gtaccagatc tctagcggat c 31 <210> 55 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 55 gatctggtac cgtcgacgcg atgtttgtgt ttctggtgct g 41 <210> 56 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 56 tatcttatct agaagcttag tcaggtatag tgcagtttca c 41 <210> 57 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 57 gatctggtac cgtcgacgcg atgggcctgc ccaacaacac 40 <210> 58 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 58 tatcttatct agaagcttag tcaggggaag gtcttgtagg c 41 <210> 59 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 59 ctaagcttct agataagata tccgatccac 30 <210> 60 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 60 cgcgtcgacg gtaccagatc tctagcggat c 31 <210> 61 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 61 gatctggtac cgtcgacgcg atgcaccaga agagaaca 38 <210> 62 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 62 tatcttatct agaagcttag ttattgttga ctagcgcacc atgg 44

Claims

인간 아데노바이러스 5형의 섬유 단백질 말단의 돌기 도메인을 침팬지 아데노바이러스 혈청형 6의 돌기 유전자로 치환한 키메릭 아데노바이러스 벡터.
제1항에 있어서, 상기 벡터는 추가로 인간 아데노바이러스 5형의 헥손 단백질을 인간 아데노바이러스 혈청형 28의 초가변영역 1-7로 치환된 것을 특징으로 하는 키메릭 아데노바이러스 벡터.
제 1항에 있어서, 상기 침팬지 아데노바이러스 혈청형 6의 돌기 유전자에 의하여 발현된 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 키메릭 아데노바이러스 벡터.
제 1항에 있어서, 상기 침팬지 아데노바이러스 혈청형 6의 돌기 유전자 서열은 서열번호 2의 핵산 서열을 포함하는 키메릭 아데노바이러스 벡터.
제 1항에 있어서, 상기 벡터는 인간 아데노바이러스 5형의 테일(Tail) 및 사프트(Shaft) 도메인과 침팬지 아데노바이러스 혈청형 6의 돌기 도메인으로 조합된 섬유단백질을 더욱 포함하는 키메릭 아데노바이러스 벡터.
제 2항에 있어서, 상기 인간 아데노바이러스 5형의 헥손 단백질을 인간 아데노바이러스 혈청형 28의 초가변영역 1-7로 치환된 키메릭 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 키메릭 아데노바이러스 벡터.
제 2항에 있어서, 상기 인간 아데노바이러스 5형의 헥손 단백질을 인간 아데노바이러스 혈청형 28의 초가변영역 1-7로 치환된 키메릭 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 4의 핵산 서열을 포함하는 키메릭 아데노바이러스 벡터.
제 1항에 있어서, 상기 벡터는 도 5 또는 6에 개시된 키메릭 아데노바이러스 벡터.
제1항에 있어서, 상기 벡터는 삽입체로
a) 코로나 바이러스의 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자, 또는
b) 인간 인유두종 바이러스 타입 16 또는 18의 E6 및 E7 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 키메릭 아데노바이러스 벡터.
제 1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 키메릭 아데노바이러스 벡터로 형질전환된 숙주세포.
제10항에 있어서, 상기 세포는 HEK293, PERC6 또는 911 세포인 숙주세포.
제 1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 키메릭 아데노바이러스 벡터에 의해 암호화된 분리된 폴리펩타이드.
제 1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 키메릭 아데노바이러스 벡터 또는 그 벡터에 의하여 코딩된 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물.
제 1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 키메릭 아데노바이러스 벡터 또는 그 벡터에 의하여 코딩된 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)의 감염증 예방 또는 치료용 백신 조성물
제 1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 키메릭 아데노바이러스 벡터 또는 그 벡터에 의하여 코딩된 사람 파필로마바이러스 질병의 자궁경부암 질환에 의한 치료용 백신인 것을 특징으로 하는 조성물.