TW201601748A

TW201601748A - 使用藥物裝載之雙特異性配位體標靶的微型細胞與干擾素－γ的組合式腫瘤治療

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Publication number: TW201601748A
Application number: TW103134613A
Authority: TW
Inventors: 希曼蘇布拉姆哈特; 珍妮佛麥狄亞米德
Original assignee: 安珍尼Ｉｃ分子輸送私人有限公司
Priority date: 2013-10-04
Filing date: 2014-10-03
Publication date: 2016-01-16
Also published as: EP3052122A1; US20150098897A1; SG11201602429QA; MX2016004285A; EP3052122A4; CN105658233A; IL244851A0; BR112016007100A2; JP6538031B2; TWI737576B; JP2016532639A; US20170326235A1; IL244851B; US9731011B2; WO2015049589A1; CN105658233B; CA2926161A1; HK1223281A1; US10500277B2; KR102433719B1

Abstract

組成物和方法被提供用於癌症治療。該方法學必需，例如，投藥給一癌症病患一包含有複數個細菌衍生的完整的微型細胞或完整的被殺死的細菌細胞(它們的各個包含一抗-腫瘤試劑並且攜帶一雙特異性配位體在表面上，該配位體具有對一哺乳動物細胞組分的特異性)的第一組成物，以及一包含有干擾素-γ(IFN-γ)或一增加在該個體中IFN-γ的表現的試劑的第二組成物。該等組成物包括如所描述的該第一組成物和該第二組成物，選擇性地與額外的抗-腫瘤試劑。

Description

使用藥物裝載之雙特異性配位體標靶的微型細胞與干擾素-γ的組合式腫瘤治療

本發明係有關於使用藥物裝載之雙特異性配位體標靶的微型細胞(drug-loaded,bispecific ligand-targeted minicells)與干擾素-γ(interferon-gamma)的組合式腫瘤治療。

發明背景

目前，被使用於治療癌症的大多數藥物是被全身地投藥。雖然細胞毒性的抗癌藥物的全身性遞送在癌症治療扮演一決定性的角色，它亦產生嚴重的問題。例如，全身性暴露正常組織/器官至被投藥的藥物可引起嚴重的毒性。這個藉由被全身地遞送的癌症化學治療藥物時常必須在非常高的劑量下被遞送以克服藥物貧乏的生物利用性以及在一病患內大體積的分佈的事實而被加劇。又，全身性藥物投藥可是侵入性的，因為它時常需要使用一安全導管在一主要血管。因為全身性藥物投藥時常需要靜脈(無論周圍的或中央的)的使用，它可引起局部併發症[諸如靜脈炎(phlebitis)]。一藥物的外滲亦可導致發泡性(vesicant)/組織損傷在投藥的局部位址，諸如在長春花生物鹼(vinca alkaloids)和蒽環(anthracyclines)的投藥上是常見的。

在癌症治療的另一個挑戰是藉由腫瘤細胞逃避免疫監視。在免疫系統與惡性細胞(malignant cells)之間的交互作用在腫瘤形成(tumorigenesis)中扮演一重要的角色。免疫系統對於偵測和排斥被轉形的細胞的失敗可導致癌症發展。腫瘤使用多種機制以從免疫-調節的排斥逃脫。許多的這些機制現在已在一細胞的和分子的位準上被知曉。儘管這個知識，癌症免疫治療在臨床上仍然不是一個被確立的治療。

發明概要

本發明人發現：當動物蒙受一伴隨的病毒感染時，一動物經歷使用抗-腫瘤藥物裝載之雙特異性抗體標靶的微型細胞(anti-neoplastic drug-loaded,bispecific antibody-targeted,minicells)的癌症治療展現出一對該藥物更大的抗-腫瘤反應。進一步的調查顯示：在一於這個上下文中的抗-癌藥物的治療效力的被觀察到的增強是從在該等被投藥的藥物裝載之雙特異性抗體標靶的微型細胞的腫瘤-殺死能力與一對抗腫瘤細胞的經活化的宿主-免疫反應[它自己起因於病毒感染觸發的干擾素-γ(IFN-γ或IFNγ)的增加表現]之間的協同作用(synergism)引起。

IFN-γ本身已被調查它的潛在抗-腫瘤用途[在單治療和組合以其他抗-腫瘤試劑(anti-neoplastic agents)這兩者]。然而，此等調查沒有已導致臨床成功。例如，IFN-α(IFN-alpha)和IFN-γ的組合治療沒有展現一超過單獨以IFN-α治療的改善。參見，例如，Kloke et al.,Eur.J. Haematol.48：93-8(1992)和Wandl et al.,Semin.Oncol.(19：88-94 1992)。由美國食品暨藥物管理局(Food and Drug Administration,FDA)所核准的僅IFN-γ指示是用於治療慢性肉芽腫疾病(chronic granulomatous disease,CGD)和嚴重惡性骨石化症(severe malignant osteopetrosis)[骨疾病(bone disease)]。

因此，在它的方面的一者，本揭示提供一種用於在一個體中治療一腫瘤的方法。該方法需要投藥給該個體(A)一包含有複數個細菌衍生的完整的微型細胞和/或被殺死的細菌細胞的第一組成物，該等微型細胞和被殺死的細胞的各個包含一抗-腫瘤試劑並且經由一被黏附至該微型細胞表面的配位體(ligand)而被標靶至一腫瘤細胞表面受體，以及(B)一包含有干擾素-γ或一增加在該個體中IFN-γ的表現或活性的試劑的第二組成物。

在一些方面，該第二組成物包含有IFN-γ蛋白質，特別地一藥學上適當地經純化的IFN-γ蛋白質。在一些方面，該第二組成物包含有一病毒疫苗(viral vaccine)。在一些方面，該第二組成物包含有一編碼IFN-γ的核酸。

在一些方面，該第一組成物包含有自約10⁹至約10¹⁰個微型細胞或被殺死的細菌細胞。

在一些方面，該抗-腫瘤試劑是一放射性核種 (radionuclide)。在一些方面，該抗-腫瘤試劑是一化學治療藥物(chemotherapy drug)。在一些方面，該抗-腫瘤試劑是一功能性核酸(functional nucleic acid)或一編碼一功能性核酸的聚核苷酸(polynucleotide)。在一些方面，該功能性核酸抑制一促進腫瘤細胞增生(tumor cell proliferation)、血管生成(angiogenesis)或對化學治療抗性和/或抑制細胞凋亡(apoptosis)或細胞週期停滯(cell cycle arrest)的基因。在一些方面，該功能性核酸是選自於siRNA、miRNA、shRNA、lincRNA、反義RNA(antisense RNA)或核糖核酸酵素(ribozyme)。

亦被提供的是包含有一含有複數個細菌衍生的完整的微型細胞或完整的被殺死的細菌細胞[它們的各個包含一抗-腫瘤試劑並且攜帶一配位體在表面上，其中該配位體具有對一非-吞噬細胞的哺乳動物細胞表面受體(non-phagocytic mammalian cell surface receptor)的特異性]的第一組成物，以及一含有干擾素-γ(IFN-γ)或一增加在該個體中IFN-γ的表現的試劑的第二組成物之包裝(packages)、產物(products)或套組(kits)。

在另一個具體例中，被提供的是一包含有(a)複數個細菌衍生的完整的微型細胞或完整的被殺死的細菌細胞(它們的各個包含一抗-腫瘤試劑並且攜帶一配位體在表面上，其中該配位體具有對一非-吞噬細胞的哺乳動物細胞表面受體的特異性，以及(b)IFN-γ或一增加在該個體中IFN-γ的表現的試劑的組成物。

其他標的、特徵和優點從下面的描述是顯而易見的。詳細說明和特定的實施例僅被提供用於例示說明，因為在特別具體例的精神和範疇內的各種不同的變化和修改從這個描述是顯而易見的。

圖1A-1C表示關於3隻狗A、B和C分別地在不同時間點(x軸，被顯示為劑量的數目)所測量的腫瘤體積(在左側的y軸)和血清IFN-γ濃度(在右側的y軸)的圖。這些圖顯示當IFN-γ的血清濃度被提高時，腫瘤對藥物的反應是更大的。

圖2例示說明具有一約285mm³的腫瘤尺寸的在6週大雌性無胸腺的裸鼠(6 week-old female athymic nude mice)所建立的人類肺泡腺癌腫瘤異體移植物(human alveolar adenocarcinoma tumor xenografts)的使用IFN-γ與雙特異性配位體-標靶的和多柔比星-包裝的完整的微型細胞(bispecific ligand-targeted and doxorubicin-packaged intact minicells)的組合治療的效用。組1小鼠接受鹽水，組2小鼠僅接受IFN-γ，組3小鼠接受^EGFR微型細胞_Dox，以及組4小鼠接受^EGFR微型細胞_Dox和IFN-γ。在這個實施例中以及跟隨的那些，在x軸下方的三角形指示給藥的時間。

圖3描畫具有一約145mm³的中等腫瘤尺寸的在6週大雌性無胸腺的裸鼠所建立的人類乳房腫瘤異體移植物的使用IFN-γ與雙特異性配位體-標靶的和多柔比星-包裝的完整的微型細胞的組合治療的效用。組1小鼠接受鹽水，組2小鼠僅接受IFN-γ，組3小鼠接受^EGFR微型細胞_Dox，以及組4 小鼠接受^EGFR微型細胞_Dox和IFN-γ。

圖4例示說明具有約250mm³的大腫瘤尺寸的在6週大雌性無胸腺的裸鼠所建立的人類乳房腫瘤異體移植物的使用IFN-γ與雙特異性配位體-標靶的和多柔比星-包裝的完整的微型細胞的組合治療的效用。組1小鼠接受鹽水，組2小鼠僅接受IFN-γ，組3小鼠接受^EGFR微型細胞_Dox，以及組4小鼠接受^EGFR微型細胞_Dox和IFN-γ。

圖5描畫具有一在約265和約600mm³之間非常大的腫瘤尺寸的在6週大雌性無胸腺的裸鼠所建立的人類乳房腫瘤異體移植物的使用IFN-γ與雙特異性配位體-標靶的和多柔比星-包裝的完整的微型細胞的組合治療的效用。所有4隻小鼠接受^EGFR微型細胞_Dox和IFN-γ。

圖6描寫具有一約100mm³的腫瘤尺寸的在6週大雌性無胸腺的裸鼠所建立的人類肺泡腺癌腫瘤異體移植物的使用IFN-γ(2個不同的劑量)與雙特異性配位體-標靶的和多柔比星-包裝的完整的微型細胞的組合治療的效用。組1小鼠接受鹽水，組2小鼠接受^EGFR微型細胞_Dox，組3小鼠接受^EGFR微型細胞_Dox和0.75 x 10⁴IU的IFN-γ(每週2次)，以及組4小鼠接受^EGFR微型細胞_Dox和0.5 x 10⁴IU的IFN-γ(每週3次)。

圖7例示說明人類受體酪胺酸激酶(human receptor tyrosine kinases)的20個亞家族和58個成員(摘錄自Lemmon and Schlessinger,Cell 141：1117-134(2010))。

較佳實施例之詳細說明

如上面所注意到的，發明人確定：投藥抗-腫瘤藥物裝載之雙特異性抗體標靶的微型細胞給一具有一腫瘤的病患，在該病患被暴露至一提高位準的INF-γ的一情況下，導致一相較於當IFN-γ未被活化(亦即，當它的位準低於偵測極限)時所觀察到的而被大大地改善的抗-腫瘤反應。這個在微型細胞-調節的抗-腫瘤活性與被提高的IFN-γ之間的協同作用(synergy)從被增加的腫瘤反應的量是顯而易見的。沒有作出任何特別的機制(們)，發明人預期這裡所描述的方法利用在宿主抗-腫瘤反應中重要的免疫刺激的關鍵途徑。該等細菌衍生的微型細胞和IFN-γ在免疫刺激中引起不同的途徑，其共同地是重要的在擴大經由依據本揭示的雙特異性抗體標靶的微型細胞細胞內遞送至腫瘤細胞後該抗-腫瘤藥物起始的抗-腫瘤反應。

發明人亦發現：在腫瘤細胞周圍的血管展示完整性的一喪失；那就是，血管具有大的窗孔(fenestrations)並且是“漏的(leaky)”，甚至在血腦障壁(blood brain barrier,BBB)環境。因此，違反慣常的瞭解，像微型細胞一樣大的顆粒(亦即，要比上面所討論的BBB的一致孔徑限制更大)，然而要比在漏的血管壁中的窗孔更小；因此，它們可經由這些窗孔被動地溢出並且至腫瘤微環境內。

在進入腫瘤微環境後，微型細胞能夠藉由宿主腫瘤細胞觸發受體-調節的內化並且藉由它們而被接受。因此，一與一抗-腫瘤試劑被包裝的微型細胞將釋放該試劑至該腫瘤細胞的細胞質內，殺死它。

雖然IFN-γ已被建議供使用於腫瘤治療，它的臨床應用已被限制至今，在不小的部分起因於它的高毒性。IFN-γ刺激對腫瘤細胞的免疫反應的能力亦沒有已看見大的成功。因此，在本發明的上下文中，由IFN-γ所扮演的角色不僅是有利的，而且確實地令人驚訝的。

因此，在它的方面的一者，本揭示提供一種用於一腫瘤的治療，其需要投藥給具有該腫瘤的病患一包含有複數個攜帶一抗-腫瘤試劑的完整的、細菌衍生的微型細胞的組成物，同時亦投藥給該病患一增加他或她的IFN-γ的位準的試劑。依據另一個方面，被殺死的細菌細胞可與或代替微型細胞而被使用，因為此等細胞同樣地可被裝載以抗-癌藥物用於在攝取至標靶腫瘤細胞內之後釋放。參見，例如，公開的國際申請案WO/2008/012695(它的內容在此被併入本案以作為參考資料)。

一含有藥物裝載的微型細胞和/或被殺死的細菌細胞的組成物的投藥較佳地是全身性的，例如，靜脈內的(intravenous)或動脈內的(intra-arterial)。進一步，IFN-γ或一誘發IFN-γ的表現的試劑可藉由一不同的途徑[亦即，皮下的(subcutaneous)或肌肉內的(intramuscular)]而被投藥，但不是必須的。該微型細胞和/或被殺死的細菌細胞治療可與IFN-γ相伴地或在不同的時間而被投藥。

(A)定義

除非另有定義，在這個說明中所使用的所有技術性和科學性術語具有如由那些熟習此相關技藝者所通常瞭解的相同意思。

為方便起見，在本說明書、實施例和隨文檢附的申請專利範圍所採用的某些術語和片語的意思被提供如下。其它術語和片語被定義遍及本說明書。

除非上下文另有清楚地指定，單數形式“一(a)”、“一(an)”和“該(the)”包括複數參考者。

在此可交換地被使用的“癌症(cancer)”、“瘤(neoplasm)”、“腫瘤(tumor)”、“惡性(malignancy)”和“癌(carcinoma)”意指展現出一特徵在於細胞增生的控制的一顯著喪失的異常生長表現型(phenotype)的細胞或組織。這個揭示的方法和組成物特別地適用於惡性、預-轉移性(pre-metastatic)、轉移性(metastatic)和非-轉移性細胞(non-metastatic cells)。

“藥物”意指在動物(特別地哺乳動物和人類)中產生一局部的或全身的效用的任何生理地或藥理學地活性物質。

在這個說明中可交換地被使用的“個別(individual)”、“個體(subject)”、“宿主”和“病患”術語意指診斷(diagnosis)、治療(treatment)或療法(therapy)是所欲的任何哺乳動物個體。該個別、個體、宿主或病患可以是一人類或一非-人類動物。因此，適合的個體可包括但不限於非-人類的靈長類(non-human primates)、牛、馬、狗、貓、天竺鼠(guinea pigs)、兔、大鼠(rats)以及小鼠(mice)。

術語“治療(treatment)”、“治療(treating)”、“治療 (treat)”以及類似之語意指在一腫瘤病患中獲得一所欲的藥理學的和/或生理的效用。該效用可以是預防性的(prophylactic)就完全地或部分地預防腫瘤或它的症狀而言和/或可以是治療性的(therapeutic)就對於腫瘤和/或歸因於該腫瘤的副作用(adverse effect)的一部分或完全的安定或治癒而言。治療涵蓋在一哺乳動物(特別地一人類)的一腫瘤的任何治療。一所欲的效用，特別地，是可被測量如腫瘤質量的降低或腫瘤質量增加的抑制腫瘤反應。除了腫瘤反應以外，整體存活(overall survival)、無進展存活(progress-free survival)的一增加，或者腫瘤復發的時間或副作用的一降低亦可被臨床地使用作為一所欲的治療效用。

(B)治療

本揭示藉由符合發明人的發現的實驗證據而被反映和證實：細菌衍生的和完整的微型細胞或者完整的被殺死的細菌細胞，當連同一增加IFN-γ的位準的試劑而被投藥給一腫瘤病患時，可達到一要比當該等微型細胞或被殺死的細菌細胞被單獨投藥時令人驚訝地更大的治療效力。

(C)抗-腫瘤試劑

片語“抗-腫瘤試劑”代表一預防或抑制腫瘤細胞的生長、發育、成熟或擴散的藥物(無論是化學的或生物的)。

在這個揭示的上下文中，篩選一抗-腫瘤試劑用於治療一特定的腫瘤病患視數種因素而定，符合慣常的醫學實施。這些因素包括但不限於病患的年齡、腫瘤的期別 (stage)以及病患可能已接受的任何先前的治療。

依據本揭示，一藥物可被選自於下面所詳述的種類的一者，用於包裝至接著被投藥以治療一腫瘤的完整的、細菌衍生的微型細胞內。這些藥物亦可以是從藥物設計和發現成果而被設計的合成類似物。

．多功能烷化劑(polyfunctional alkylating agents)，由環磷醯胺(cyclophosphamide)[癌得星(cytoxan)]、甲基二(氯乙基)胺(mechlorethamine)、黴法蘭(melphalan)[威克瘤(alkeran)]、氯芥苯丁酸(chlorambucil)[瘤克寧(leukeran)]、塞替派(thiopeta)[塞歐普斯(thioplex)]、白消安(busulfan)[馬利蘭(myleran)]所例示。

．烷化藥物(alkylating drugs)，由甲基苄肼(procarbazine)[甲苯肼(matulane)]、達卡巴仁(dacarbazine)(DTIC)、六甲蜜胺(altretamine)[克瘤靈(hexalen)]、苯丁酸氮芥(clorambucil)、順鉑(cisplatin)[普雷蒂諾(platinol)]、卡鉑(carboplatin)、好克癌(ifosafamide)、奧沙利鉑(oxaliplatin)所例示。

．抗代謝物(antimetabolites)，由胺甲喋呤(methotrexate)(MTX)、6-硫代嘌呤(6-thiopurines){美克多能(mercaptopurine)[6-MP]、硫鳥嘌呤(thioguanine)[6-TG]}、巰基嘌呤(mercaptopurine)[補利血素(purinethol)]、硫鳥嘌呤(thioguanine)、磷酸氟達拉濱(fludarabine phosphate)、克拉曲濱(cladribine)：[祿斯得停(leustatin)]、噴司他丁(pentostatin)、氟脲嘧啶 (flurouracil)(5-FU)、阿糖胞苷(cytarabine)(ara-C)、阿扎胞苷(azacitidine)所例示。

．植物生物鹼(plant alkaloids)、萜類(terpenoids)和拓樸異構酶抑制劑(topoisomerase inhibitors)，由長春鹼(vinblastine)[長春花鹼(velban)]、長春新鹼(vincristine)[安可平(oncovin)]、長春地辛(vindesine)、長春瑞濱(vinorelbine)、鬼臼毒素(podophyllotoxins)[依托泊苷(etoposide){VP-16}和替尼泊苷(teniposide){VM-26}]、喜樹鹼(camptothecins)[拓撲替康(topotecan)和伊立替康(irinotecan)]、紫杉烷(taxanes){諸如紫杉醇(paclitaxel)[汰癌勝(taxol)]和多西他賽(docetaxel)[剋癌易(taxotere)]}所例示。

．抗生素(antibiotics)，由多柔比星(doxorubicin)[阿德力黴素(adriamycin)、羅拜克斯(rubex)、都可喜(doxil)]、柔紅黴素(daunorubicin)、多卡黴素(duocarmycin)、伊達比星(idarubicin)、放線菌素(dactinomycin)[可美淨(cosmegen)]、普卡黴素(plicamycin)[光輝黴素(mithramycin)]、絲裂黴素(Mitomycin)：突變黴素(mutamycin)、博來黴素(bleomycin)[博萊黴素(blenoxane)]所例示。

．激素試劑(hormonal agents)，由雌激素和雄激素抑制劑(estrogen and androgen inhibitors)[他莫昔芬(tamoxifen)和氟他胺(flutamide)]、促性腺激素-釋放激素促效劑(gonadotropin-releasing hormone agonists){亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)[諾雷德(zoladex)]}、芳香酶抑制劑(aromatase inhibitors){氨魯米特(aminoglutethimide)和阿那曲唑(anastrozole)[瑞寧得(arimidex)]}所例示。

．雜項抗癌藥物(miscellaneous anticancer drugs)，由安吖啶(amsacrine)、天冬醯胺酸酶(asparaginase)(El-spar)、羥基脲(hydroxyurea)、米托蒽醌(mitoxantrone)[諾肖林(novantrone)]、米托坦(mitotane)[密妥坦(lysodren)]、美登醇(maytansinoid)、視黃酸衍生物(retinoic acid derivatives)、骨髓生長因子(bone marrow growth factors)[沙格司亭(sargramostim)和非格司亭(filgrastim)]、氨磷汀(amifostine)所例示。

．破壞葉酸代謝(folate metabolism)的試劑，例如，培美曲塞(pemetrexed)。

．DNA低甲基試劑(DNA hypomethylating agents)，例如，阿扎胞苷(azacitidine)，地西他濱(decitabine)。

．聚(腺苷二磷酸[ADP]-核糖)聚合酶(PARP)途徑抑制劑{poly(adenosine diphosphate[ADP]-ribose)polymerase(PARP)pathway inhibitors}，諸如依尼帕尼(iniparib)、奧拉帕尼(olaparib)、維利帕尼(veliparib)。

．PI3K/Akt/mTOR途徑抑制劑，例如，依維莫司(everolimus)。

．組蛋白去乙醯酶(HDAC)抑制劑[histone deacetylase(HDAC)inhibitors]，例如，伏利諾他(vorinostat)、恩替司他(entinostat)(SNDX-275)、莫替司他(mocetinostat) (MGCD0103)、帕比司他(panobinostat)(LBH589)、羅米地辛(romidepsin)、丙戊酸(valproic acid)。

．周期蛋白-依賴型激酶(CDK)抑制劑[cyclin-dependent kinase(CDK)inhibitors]，例如，黃酮吡醇(flavopiridol)、奧羅莫星(olomoucine)、羅可嘌呤(roscovitine)、肯泡隆(kenpaullone)、AG-024322(Pfizer)、fascaplysin、ryuvidine、purvalanol A、NU2058、BML-259、SU 9516、PD-0332991、P276-00。

．熱休克蛋白(HSP90)抑制劑[heat shock protein(HSP90)inhibitors]，例如，格爾德黴素(geldanamycin)、坦螺旋黴素(tanespimycin)、阿螺旋黴素(alvespimycin)、根赤殼菌素(radicicol)、魚藤素(deguelin)、BIIB021。

．鼠雙微粒體2(MDM2)抑制劑[murine double minute 2(MDM2)inhibitors]，例如，順-咪唑啉(cis-imidazoline)、苯并二氮呯二酮(benzodiazepinedione)、螺-吲哚酮(spiro-oxindoles)、異喹啉酮(isoquinolinone)、噻吩(thiophene)、5-脫氮黄素(5-deazaflavin)、色胺(tryptamine)。

．間變性淋巴瘤激酶(ALK)抑制劑[anaplastic lymphoma kinase(ALK)inhibitors]，例如，胺吡啶(aminopyridine)、二胺基嘧啶(diaminopyrimidine)、吡啶并異喹啉(pyridoisoquinoline)、吡咯并吡唑(pyrrolopyrazole)、吲哚并咔唑(indolocarbazole)、吡咯并嘧啶(pyrrolopyrimidine)、二苯胺基嘧啶(dianilinopyrimidine)。

．聚[ADP核糖]聚合酶(PARP)抑制劑{poly [ADPribose]polymerase(PARP)inhibitors}，由苯甲醯胺(benzamide)、二氮雜萘酮(phthalazinone)、三環吲哚(tricyclic indole)、苯并咪唑(benzimidazole)、吲唑(indazole)、吡咯并咔唑(pyrrolocarbazole)、二氮雜萘酮(phthalazinone)、異吲哚啉酮(isoindolinone)所例示。

可使用在本揭示的活性試劑不限於上面所列舉的那些藥物種類或特別的試劑。不同的發現平台繼續產生針對癌細胞的獨特分子特徵的新試劑；確實，數千種此等化學的和生物的藥物已被發現，僅其中的一些在此被列出。又，按照在本揭示的發現，完整的、細菌衍生的微型細胞和被殺死的細菌細胞容納包裝各種不同的試劑(親水性或疏水性)的令人驚訝的能力，意指實質上任何此藥物(當被包裝在微型細胞)具有治療一癌症的潛力。

抗-腫瘤試劑的種類的同樣地例示說明是放射性核種、化學治療藥物以及功能性核酸[包括但不限於調節RNA(regulatory RNA)]。

1.放射性核種

一“放射性核種”是一種具有一不安定的原子核[亦即，特徵在於可被給予至一在該原子核內新產生的輻射粒子(radiation particle)或至一原子的電子的過多能量的一者]的原子。因此，一放射性核種經歷放射性衰變(radioactive decay)，並且放射出γ射線(gamma ray)(們)和/或次原子粒子(subatomic particles)。許多放射性核種在本技藝被知曉，並且它們的一些被知曉適合於醫療用途，諸如釔-90(yttrium-90)、鎝-99m(technetium-99m)、碘-123(iodine-123)、碘-124、碘-125、碘-131、銣-82(rubidium-82)、鉈-201(thallium-201)、鎵-67(gallium-67)、氟-18(fluorine-18)、氙-133(xenon-133)以及銦-111(indium-111)。

放射性核種已發現廣泛使用在核醫學中，特別地作為β-射線發射體(beta-ray emitters)用於傷害腫瘤細胞。因此，放射性核種在本揭示中適合被採用作為抗-腫瘤試劑。

放射性核種可藉由任何已知的技術與完整的、細菌衍生的微型細胞結合。因此，一蛋白質或其他微型細胞-表面部分(surface moiety)(參見下面)可使用商業上可獲得的標記方法[諸如使用Pierce碘化試劑，Pierce Biotechnology Inc.(Rockford,IL)的一產品，在Rice et al.,Semin.Nucl.Med.41,265-282(2011)被詳說]而被標記以一放射性核種。另擇地，放射性核種可被併入至在微型細胞中的蛋白質內。

在後者的情況下，一微型細胞-生產細菌菌株被轉形以編碼外來蛋白質的質體DNA(plasmid DNA)。當微型細胞在不對稱性細胞分裂(asymmetric cell division)的期間被形成，數個複本(copies)的質體DNA分離至該微型細胞細胞質內。所形成的重組微型細胞在放射性標記的胺基酸的存在下被培育，在此等情況之下藉此來自該質體DNA、在該微型細胞內被表現的外來蛋白質併入該等放射性核種-攜帶的胺基酸。按照Clark-Curtiss and Curtiss,Methods Enzymol.101：347-362(1983)的規範，例如，重組的微型細胞被培育在含有³⁵S-甲硫胺酸(³⁵S-methionine)的最小生長培養基(minimal growth medium)中，由此新表現的、質體-編碼的蛋白質併入³⁵S-甲硫胺酸。如所欲的，一類似的方法可被使用為了重組的微型細胞變成與其他放射性標記而被包裝。

在微型細胞表面上的寡醣亦可使用，例如，由Fukuda,Curr.Protocols Molec.Biol.(Suppl.26),17.5.1-17.5.8(1994)所描述的建立好的規範而被放射性標記。此等對微型細胞特有的寡醣的例示說明是在衍生自革蘭氏陰性菌(Gram-negative bacteria)(參見下面)的微型細胞的表面上所發現的脂多醣(lipopolysaccharide,LPS)的O-多醣組分(O-polysaccharide component)。

在這個方面的一較佳方法學是放射性標記一被使用以標靶微型細胞至特定腫瘤的雙特異性抗體。參見在下面的G部分和專利公開案US2007/0237744(其內容在此被併入本案以作為參考資料)。那是，該“被塗布(coated)”在一微型細胞上的雙特異性抗體暴露一顯著數量的額外表面蛋白質用於放射性標記。因此，達到一較高的比活性(specific activity)的與該抗體-塗布的微型細胞締合的放射標記是可能的。相反的，無-塗布的微型細胞的放射性標記[亦即，當該等放射性核種標記僅地方性部分(endemic moieties)]可導致較弱的標記(較低的比活性)。在一個具體例中，這個較弱的標記被認為發生，因為衍生自革蘭氏陰性菌的微型細胞的外膜-相關的蛋白質藉由LPS(如下面進一步所討論的，包含有O-多醣的長鏈覆蓋該微型細胞表面)而被遮蔽。

關於治療一腫瘤，若不完全消除該腫瘤，本揭示的一組成物將呈完全地提供一足夠至少降低腫瘤質量的在-腫瘤照射的位準的一劑量或複數個劑量而被遞送。治療的進展可在一逐件的基礎上沿著這個方式而被監測。然而，一般而言，被包裝在該組成物的放射性(radioactivity)的數量典型地將是在約30至50Gy的等級，雖然本發明亦預期一更高數量的放射性，比如說，約50至200Gy，這提供一在約30Gy與約200Gy之間的總範圍。

在一些例子中被包裝在該組成物的放射性的數量可甚至要比上面所提到的更低，提供高度有效的和專一性的遞送微型細胞-目標放射性核種至一腫瘤。因此，在一個方面該組成物含有自約20至40Gy，或約10至30Gy，或約1至約20Gy，或者小於10Gy。

2.化學治療藥物(chemotherapeutic drug)

被採用在本揭示的一抗-腫瘤試劑亦可是一化學治療藥物。在這個描述中，“化學治療藥物”、“化學治療試劑(chemotherapeutic agent)”和“化學治療(chemotherapy)”可交換地被採用以意味一種具有殺死或破壞一腫瘤細胞的能力的藥物。一化學治療試劑可以是如下面進一步詳細說明的一小分子藥物或一生物藥物。

“小分子藥物”子類別包含特徵在於具有(i)一在一生物過程(biological process)上的效用和(ii)一如相較於一蛋白質或聚合物巨分子(polymeric macromolecule)低分子量的化合物。小分子藥物典型地是約800道耳頓(Daltons)或更小，具有一約150道耳頓的下限，如由被使用以治療多形性神經膠質母細胞瘤(gliaoblastoma multiforme)和其他類型的腦癌的Temodar®[替莫唑胺(temozolomide)](在約194道耳頓)所例示說明的。在這個上下文中，“約”指示合格的分子量數值在測量精確度受到變化並且在數個道耳頓或數十個道耳頓的等級上受到實驗誤差。因此，一小分子藥物可具有約900道耳頓或更小、約800或更小、約700或更小、約600或更小、約500或更小，或者約400道耳頓或更小(例如，在約150至約400道耳頓的範圍)的分子量。更特別地，一小分子藥物可具有一約400道耳頓或更多、約450道耳頓或更多、約500道耳頓或更多、約550道耳頓或更多、約600道耳頓或更多、約650道耳頓或更多、約700道耳頓或更多，或者約750道耳頓或更多的分子量。在另一個具體例中，該被包裝至該等微型細胞內的小分子藥物具有一在約400與約900道耳頓之間、在約450與約900道耳頓之間、在約450與約850道耳頓之間、在約450與約800道耳頓之間、在約500與約800道耳頓之間，或者在約550與約750道耳頓之間的分子量。

特別地，合適的小分子藥物尤其是包括但不限於：氮芥子氣(nitrogen mustards)、亞硝脲(nitrosorueas)、次乙亞胺(ethyleneimine)、烷基磺酸鹽(alkane sulfonates)、四嗪(tetrazine)、鉑化合物(platinum compounds)、嘧啶類似物(pyrimidine analogs)、嘌呤類似物(purine analogs)、抗-代謝物(anti-metabolites)、葉酸類似物(folate analogs)、蒽環(anthracyclines)、紫杉烷、長春花生物鹼以及拓樸異構酶抑制劑(topoisomerase inhibitors)。因此，一供使用在本發明的小分子藥物尤其可選自於在下列的任一者中：烯二炔(enediynes)，諸如地而沐星A(dynemicin A)、unicalamycin、卡奇黴素γ1(calicheamicin γ1)和加利車黴素θ1(calicheamicin θ1)；meayamicin，FR901464的一合成類似物；如例如由Tanpure et al.,Bioorg.Med.Chem.21：8019-32(2013)所描述的苯并環庚烯衍生物(benzosuberene derivatives)；阿里他汀(auristatins)，諸如阿里他汀E(auristatin E)、單-甲基阿里他汀E(mono-methyl auristatin E,MMAE)和阿里他汀F，它們是阿里他汀的合成類似物；倍癌黴素(duocarmysins)，諸如多卡黴素SA(duocarmycin SA)和CC-1065；美登素(maytansine)和它的衍生物[美登醇(maytansinoids)]，諸如DM1和DM4；伊立替康(irinotecan)(Camptosar®)和其他拓撲異構酶抑制劑[諸如拓撲替康(topotecan)、依托泊苷、米托蒽醌(mitoxantrone)和替尼泊苷(teniposide)]；以及谷田黴素(yatakemycin)，它的合成是由Okano et al.,J.Am.Chem.Soc.128：7136-37(2006)所詳述的。

更特別地，該等在這個段落所詳述的特別的小分子藥物的任何一個或多個或全部是例示說明適合供使用在這個發明的那些：放線菌素D(actinomycin-D)、威克瘤、ara-C、阿那曲唑、BiCNU、比卡魯胺(bicalutamide)、比生群(bisantrene)、博來黴素、白消安、卡培他濱(capecitabine)(Xeloda®)、卡鉑、卡鉬(carboplatinum)、卡莫司汀(carmustine)、CCNU、氯芥苯丁酸(chlorambucil)、順鉑、克拉曲濱、CPT-11、環磷醯胺、阿糖胞苷、胞嘧啶阿糖胞苷(cytosine arabinoside)、癌得星、達卡巴仁、放線菌素、柔紅黴素、右雷佐生(dexrazoxane)、多西他賽、多柔比星、DTIC、表柔比星(epirubicin)、次乙亞胺、依托泊苷、氟尿苷(floxuridine)、氟達拉濱(fludarabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、氟他胺、福莫司汀(fotemustine)、吉西他濱(gemcitabine)、六甲銨(hexamethylamine)、羥基脲、伊達比星(idarubicin)、愛斯達(ifosfamide)、伊立替康、洛莫司汀(lomustine)、甲基二(氯乙基)胺、黴法蘭、美克多能、胺甲喋呤、絲裂黴素、米托坦、米托蒽醌、奧沙利鉑、紫杉醇、帕米膦酸(pamidronate)、噴司他丁、普卡黴素、甲基苄肼、鏈氮黴素(streptozocin)、STI-571、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷、四嗪、硫鳥嘌呤、塞替派(thiotepa)、拓優得(tomudex)、拓撲替康、曲奧舒凡(treosulphan)、三甲曲沙(trimetrexate)、長春鹼、長春新鹼、長春地辛、長春瑞濱以及VP-16。

相反的，為了這個描述的目的，一“生物藥物(biologic drug)”被定義以表示可藉由一生物過程而被創造的任何生物活性巨分子，排除下面所討論的“功能性核酸”和藉由如上面所定義的小分子藥物的尺寸定性的多肽。“生物藥物”子類別因此排除並且不與該等小分子藥物和功能性核酸子類別重疊。生物藥物的例示說明是治療性蛋白質和抗體，無論天然的或重組的或合成地製造的(例如，使用藥物化學和藥物設計的工具)。

某些被設計用於化學治療目的的分子在臨床前或臨床試驗的期間仍然失敗，起因於不能接受的毒性或其他安全考量。發明人已顯示：包裝一化學治療藥物在一微型細胞，繼而全身性遞送至一腫瘤病患，導致遞送該藥物至腫瘤細胞。進一步，甚至在腫瘤細胞被破碎之後以及含有藥物的細胞質被釋放至附近的正常組織，結果對正常組織是沒有毒性的。這是因為該藥物已被結合至腫瘤細胞的結構(諸如DNA)，並且不可再攻擊正常細胞。因此，本發明是特別有用的對於遞送高度毒性的化學治療藥物至一腫瘤病患。

在這個描述中的片語“高度毒性化學治療藥物”和“超級毒性化學治療藥物”意指如相較於它們對於癌細胞的有效劑量具有一對正常細胞相對低的致死劑量(lethal dose)的化學治療藥物。因此，在一個方面一高度毒性化學治療藥物對於一被標靶的癌症[諸如(1)該藥物被設計的一癌症類型，(2)一臨床前或臨床試驗被運行針對那個藥物的第一癌症類型，或者(3)該藥物在所有被測試的癌症中顯示最高效力的癌症類型]具有一要比它的中位有效劑量(median effective dose,ED₅₀)更低的中位致死劑量(median lethal dose,LD₅₀)。例如，一高度毒性化學治療藥物可具有一要比約500%、400%、300%、250%、200%、150%、120%或100%的該藥物對於一標靶癌症的ED₅₀更低的LD₅₀。在另一方面，一高度毒性化學治療藥物具有一要比它對於一被標靶的癌症的最小有效劑量(例如，約500%、400%、300%、250%、200%、150%、120%、100%、90%、80%、70%、60%或50%的最小有效劑量)更低的最大亞-致死劑量(sub-lethal dose)(亦即，不引起嚴重的或不可逆的毒性的最高劑量)。

因此，依據本描述的一具體例，在一個體的一腫瘤藉由一包含有全身性地投藥一治療有效數量的一含有複數個完整的、細菌衍生的微型細胞(它們的各個包含一高度毒性化學治療藥物)的組成物之方法而被治療。下面所討論的美登醇和多卡黴素是代表性的因此所採用的超級毒性化學治療藥物的種類。

在上下文中適合的癌症化學治療藥物尤其包括氮芥子氣、亞硝脲、次乙亞胺、烷基磺酸鹽、四嗪、鉑化合物、嘧啶類似物、嘌呤類似物、抗代謝物、葉酸類似物、蒽環、紫杉烷、長春花生物鹼、拓樸異構酶抑制劑以及激素試劑。

例示說明該小分子藥物子類別的化學治療藥物是放線菌素D、威克瘤、ara-C、阿那曲唑、BiCNU、比卡魯胺、比生群、博來黴素、白消安、卡培他濱(Xeloda®)、卡鉑、卡鉬、卡莫司汀、CCNU、氯芥苯丁酸、順鉑、克拉曲濱、CPT-11、環磷醯胺、阿糖胞苷、胞嘧啶阿糖胞苷、癌得星、達卡巴仁、放線菌素、柔紅黴素、右雷佐生、多西他賽、多柔比星、DTIC、表柔比星、次乙亞胺、依托泊苷、氟尿苷、氟達拉濱、氟尿嘧啶、氟他胺、福莫司汀、吉西他濱、六甲銨、羥基脲、伊達比星、愛斯達、伊立替康、洛莫司汀、甲基二(氯乙基)胺、黴法蘭、美克多能、胺甲喋呤、絲裂黴素、米托坦、米托蒽醌、奧沙利鉑、紫杉醇、帕米膦酸、噴司他丁、普卡黴素、甲基苄肼、鏈氮黴素、STI-571、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷、四嗪、硫鳥嘌呤、塞替派、拓優得、拓撲替康、曲奥舒凡、三甲曲沙、長春鹼、長春新鹼、長春地辛、長春瑞濱以及VP-16。

美登醇(分子量：~738道耳頓)是美登素(maytansine)的化學衍生物的一族群，具有有效力的細胞毒性。按照本發明，雖然由於毒性考量被認為對於人類病患使用不安全，美登醇是適合於經由微型細胞遞送至腫瘤病患。

多卡黴素(分子量：~588道耳頓)是一系列的相關天然產物，首先被分離自鏈黴菌屬(Streptomyces)細菌。它們亦具有有效力的細胞毒性但是被認為對於人類使用不安全的。像美登醇、多卡黴素是適合的化學治療藥物供使用在本發明。

同樣地例示說明是在國際專利申請案WO1998/002446中所描述的嗎福啉基蒽環衍生物(morpholinyl anthracycline derivatives)的種類的化合物。在此等衍生物中的是奈莫柔比星(nemorubicin){3’-去胺基-3’-[2(S)-甲氧基-4-嗎福啉基]多柔比星(3’-deamino-3’-[2(S)-methoxy-4-morpholinyl]doxorubicin)}、a/k/a MMDX和它的主要代謝物PNU-159682{3’-去胺基-3”-4’-脫水-[2”(S)-甲氧基-3”(R)-羥基-4”-嗎福啉基]多柔比星(3’-deamino-3”-4’-anhydro-[2”(S)-methoxy-3”(R)-hydroxy-4”-morpholinyl]doxorubicin)}[它的結構化學式被顯示在下面]，以及被描述在美國專利第8,470,984號(它的內容在此被併入本案以作為參考資料)的這些4個其他此等衍生物：3'-去胺基-3"-4'-脫水-[2"(S)-甲氧基-3"(R)-羥基-4"-嗎福啉基]伊達比星{3'-deamino-3"-4'-anhydro-[2"(S)-methoxy-3"(R)-hydroxy-4"-morpholinyl] idarubicin}；3'-去胺基-3"-4'-脫水-[2"(S)-甲氧基-3"(R)-羥基-4"-嗎福啉基]柔紅黴素{3'-deamino-3"-4'-anhydro-[2"(S)-methoxy-3"(R)-hydroxy-4''-morpholinyl]daunorubicin}；3'-去胺基-3"-4'-脫水-[2"(S)-甲氧基-3"(R)-羥基-4"-嗎福啉基]-洋红黴素{3'-deamino-3"-4'-anhydro-[2"(S)-methoxy-3"(R)-hydroxy-4''-morpholinyl]-caminomycin}；以及3'-去胺基-3"-4'-脫水-[2"(S)-乙氧基-3"(R)-羥基-4"-嗎福啉基]多柔比星{3'-deamino-3"-4'-anhydro-[2"(S)-ethoxy-3"(R)-hydroxy-4"-morpholinyl]d-oxorubicin}]。

按照本發明，任何前述的衍生物的一藥學上可接受的酸加成鹽(pharmaceutically acceptable acid addition salt)亦是自體螢光嗎福啉基蒽環衍生物的這個族群的一員。

生物的化學治療藥物的子類別包括，但不限於：天冬醯胺酸酶(asparaginase)、AIN-457、巴匹珠單抗(bapineuzumab)、貝利單抗(belimumab)、貝倫妥單抗(brentuximab)、布雷奴單抗(briakinumab)、卡那奴單抗(canakinumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、達洛珠單抗(dalotuzumab)、狄諾塞麥(denosumab)、依帕珠單抗(epratuzumab)、estafenatox、法利珠單抗(farletuzumab)、芬妥木單抗(figitumumab)、加利昔單抗(galiximab)、吉妥珠單抗(gemtuzumab)、吉瑞昔單抗(girentuximab)(WX-G250)、替伊莫單抗(ibritumomab)、伊珠單抗(inotuzumab)、伊匹單抗(ipilimumab)、美泊利單抗(mepolizumab)、莫羅莫那-CD3(muromonab-CD3)、他那莫單抗(naptumomab)、奈昔木單抗(necitumumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、奥瑞珠單抗(ocrelizumab)、奥法木單抗(ofatumumab)、奥昔珠單抗(otelixizumab)、奥唑米星(ozogamicin)、帕昔單抗(pagibaximab)、帕木單抗(panitumumab)、培妥珠單抗(pertuzumab)、雷莫蘆單抗(ramucirumab)、瑞利珠單抗(reslizumab)、利妥昔單抗(rituximab)、REGN88、蘇蘭珠單抗(solanezumab)、他尼珠單抗(tanezumab)、替利珠單抗(teplizumab)、tiuxetan、托西莫單抗(tositumomab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)(Herceptin®)、曲美木(tremelimumab)、維多珠單抗(vedolizumab)、扎魯木單抗(zalutumumab)以及扎木單抗(zanolimumab)。

該組成物可含有最多約1mg的該化學治療藥物。另擇地，該化學治療藥物的數量可以是至多約750μg、500μg、250μg、100μg、50μg、10μg、5μg、1μg、0.5μg或0.1μg。在另一個方面，當被使用而沒有被包裝至微型細胞內時，該組成物含有一具有一小於約1/1,000，或另擇地小於約1/2,000、1/5,000、1/10,000、1/20,000、1/50,000、1/100,000、1/200,000或1/500,000的該藥物的治療有效數量的數量之化學治療藥物。按照本揭示的又另一個方面，該組成物可含有至少約1nmol的該化學治療藥物。因此，本揭示亦包含該化學治療藥物的數量是分別至少約2nmol、約3nmol、約4nmol、約5nmol、約10nmol、約20nmol、約50nmol、約100nmol，以及約800nmol的具體例。

3.功能性核酸

“功能性核酸”意指一在導入至一宿主細胞內之後特別地干擾一蛋白質的表現的核酸分子。關於治療一腫瘤，依據本揭示，較佳的是一經由完整的、細菌衍生的微型細胞而被遞送至腫瘤細胞的功能性核酸負載(functional nucleic acid payload)抑制一促進腫瘤細胞增生、血管生成或對化學治療抗性和/或抑制細胞凋亡或細胞週期停滯的基因(亦即，一“腫瘤-促進基因”)。

一般而言是被使用在這個揭示的功能性核酸分子具有藉由與一用於一蛋白質的轉錄本(transcript)交互作用以減少一蛋白質的表現的能力的例子。這個類別的用於本揭示的微型細胞負載尤其包括調節RNA(regulatory RNA)[諸如siRNA、shRNA、短的RNA(典型地在長度上小於400個鹼基)、微-RNA(micro-RNA)(miRNA)、核糖核酸酵素和誘騙RNA(decoy RNA)]、反義核酸以及LincRNA。在這個方面，“核糖核酸酵素”意指一種具有一可以一核苷酸鹼基序列-專一性的方式重複地切割其它RNA分子的酵素活性之RNA分子。“反義寡核苷酸”表示一互補於一部分的一特定基因轉錄本的核酸分子，藉此該分子可雜合至該轉錄本並且阻斷它的轉譯。一反義寡核苷酸可包含有RNA或DNA。“LincRNA”或“長的基因間無-編碼RNA(non-coding RNA)”標題包含要比200個核苷酸更長的非-蛋白質編碼轉錄本。如由例如Khalil et al.,Proc Nat’l Acad.USA 106：11667-72(2009)所討論的，LincRNA可調節基因的轉錄、剪接(splicing)和/或轉譯。

調節RNA的各個類型可以是抑制一如上所描述的腫瘤-促進基因的功能性核酸分子的來源並且，因此，根據本揭示那是適合用於使用。因此，在本揭示的一較佳具體例中，該等完整的微型細胞攜帶siRNA分子調節一可被利用以標靶腫瘤-促進基因的轉錄後、基因-默化的RNA干擾(RNAi)機制。例如，參見MacDiarmid et al.,Nature Biotech.27：645-51(2009)(抗體-表現的微型細胞遞送，連同化學治療藥物、抗衡發展對藥物的抗性的siRNA)，以及Park,Advanced Drug Delivery Rev.61：850-62(2009)(分別遞送治療性siRNA至乳房、卵巢、子宮頸、肝、肺和前列腺癌)。

如被注意到的，“siRNA”一般而言意指因為它們特別地干擾蛋白質表現的能力而被命名的自約10至約30個核苷酸長的雙-股RNA分子。較佳地，siRNA分子是12-28個核苷酸長，更佳地15-25個核苷酸長，又更佳地19-23個核苷酸長以及最佳地21-23個核苷酸長。因此，siRNA分子在長度上可以是12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29個核苷酸。

一股的長度表示一siRNA分子的長度。例如，一被描述為21個核糖核苷酸(ribonucleotides)長[一為21-單體單元(21-mer)]的siRNA可包含有黏合19個相鄰的鹼基配對的兩個相對股的RNA。在各個股上的2個剩餘的核糖核苷酸將形成一“突出(overhang)”。當一siRNA含有不同長度的2股時，該等股的較長者表示siRNA的長度。例如，一含有一為21個核苷酸長的股以及一為20個核苷酸長的第二股的dsRNA，構成一個21-單體單元。

協助siRNA和調節RNA的特別地設計的工具一般而言是容易獲得的。例如，一電腦-為基礎的siRNA設計工具在網路上在www.dharmacon.com是可獲得的。

在另一個較佳具體例中，本揭示的完整的微型細胞攜帶像siRNA能夠調節一轉錄後的、基因默化的RNA干擾(RNAi)機制的miRNA。亦像siRNA，由miRNA所調節的基因-默化效用可被利用以標靶腫瘤-促進基因。例如，參見Kota et al.,Cell 137：1005-17(2009)(在鼠類肝癌模型中經由轉染遞送一miRNA導致抑制癌細胞增生、腫瘤-專一性細胞凋亡和戲劇性保護免於疾病進展而沒有毒性)，以及Takeshita,et al.,Molec.Ther.18：181-87(2010)(經由瞬間轉染遞送合成的miRNA抑制在骨組織上的轉移性前列腺腫瘤細胞的生長)。

雖然這兩者調節RNA干擾，miRNA和siRNA已注意到差異。在這個方面，“miRNA”一般而言意指一種類的17-至27-個核苷酸單-股RNA分子(如就siRNA而言代替雙股的)。因此，miRNA分子在長度上可以是17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27個核苷酸。較佳地，miRNA分子是21-25個核苷酸長。

在miRNA與siRNA之間的另一個差異是：前者一般而言不完全互補mRNA標靶。另一方面，siRNA必須是完全地互補於mRNA標靶。因此，siRNA一般而言導致默化一單一、特定的標靶，而miRNA是雜亂的。

此外，雖然這兩者被組合至RISC(RNA-誘導的默化複合物)內，siRNA和miRNA在RISC組合前它們個別的初始處理不同。這些差異被詳細描述在Chu et al.,PLoS Biology 4：1122-36(2006)以及Gregory et al.,Methods in Molecular Biology 342：33-47(2006)。

許多資料庫作為miRNA儲藏所。例如，參見miRBase(www.mirbase.org)和tarbase(http：//diana.cslab.ece.ntua.gr/DianaToolsNew/index.php？r=tarbase/index)。在慣常的使用，miRNA典型地被命名以字首“-mir”，組合以一順序號碼。例如，一在小鼠mir-352之後所發現的新miRNA將被命名為小鼠“mir-353”。

再次，協助調節RNA(包括miRNA)的設計的工具是容易獲得的。在這個方面，一電腦-為基礎的miRNA設計工具在網路上在wmd2.weigelworld.org/cgi-bin/mirnatools.pl是可獲得的。

如上面所注意到的，一在本揭示所採用的功能性核酸可抑制一促進腫瘤細胞增生、血管生成或對化學治療抗性的基因。該被抑制的基因本身亦可抑制細胞凋亡或細胞週期停滯。可藉由一功能性核酸而被標靶的基因的實例被提供在下面。

本揭示的功能性核酸較佳地標靶一促進藥物抗性、抑制細胞凋亡或促進一腫瘤表現型的蛋白質的基因或轉錄本。在這些上下文中功能性核酸策略的成功應用已在本技藝被達到，但是沒有微型細胞載體的益處。參見，例如，Sioud,Trends Pharmacol.Sci.25：22-8(2004)、Caplen,Expert Opin.Biol.Ther.3：575-86(2003)、Nieth et al.,FEBS Lett.545：144-50(2003)、Caplen and Mousses,Ann.NY Acad.Sci.1002：56-62(2003)、Duxbury et al.,Ann.Surg.240：667-74(2004)、Yague et al.,Gene Ther.11：1170-74(2004)，以及Duan et al.,Mol.Cancer Ther.3：833-8(2004)。

促成藥物抗性的蛋白質構成功能性核酸的較佳標靶。該等蛋白質可促成後天的藥物抗性或內在的藥物抗性。當患病的細胞(諸如腫瘤細胞)最初對藥物反應，但是在後續治療週期上變成不反應(refractory)時，抗性表現型被獲得。涉及後天的藥物抗性的有用標靶包括ATP結合匣轉運子(ATP binding cassette transporters)，諸如P-醣蛋白(P-glycoprotein)[P-gp、P-170、PGY1、MDR1、ABCB1、MDR-相關的蛋白質(MDR-associated protein)、多藥物抗性蛋白質1(multidrug resistance protein 1)]、MDR-2和MDR-3。MRP2(多-藥物抗性相關的蛋白質)、BCR-ABL[斷裂點叢集區-阿貝爾森原致癌基因(breakpoint cluster region-Abelson protooncogene)]、一個STI-571抗性-相關的蛋白質、肺抗性-相關的蛋白質、環氧合酶-2(cyclooxygenase-2)、核因子κ(nuclear factor kappa)、XRCC1[X射線交叉-互補組1(X-ray cross-complementing group 1)]、ERCC1[切除交叉-互補基因(excision cross-complementing gene)]、GSTP1[麩胱甘肽S-轉移酶(glutathione S-transferase)]、突變的β-微管蛋白(mutant β-tubulin)以及生長因子(growth factors)(諸如IL-6)是涉及後天藥物抗性的額外標靶。

促成藥物抗性的特別地有用的標靶包括ATP結合匣轉運子，諸如P-醣蛋白、MDR-2、MDR-3、BCRP、APT11a以及LRP。

有用的標靶亦包括促進細胞凋亡抗性的蛋白質。這些包括Bcl-2[B細胞白血病(B cell leukemia)/淋巴瘤(lymphoma)]、Bcl-X_L、A1/Bfl 1、局部黏著激酶(focal adhesion kinase)、二氫二醇去氫酶(dihydrodiol dehydrogenase)，以及p53突變蛋白質。

有用的標靶進一步包括致癌的(oncogenic)和突變的腫瘤抑制蛋白質。這些的例示說明是β-連環蛋白(β-Catenin)、PKC-α[蛋白質激酶C(protein kinase C)]、C-RAF、K-Ras(V12)、DP97死盒RNA解旋酶(DP97 Dead box RNA helicase)、DNMT1[DNA甲基轉移酶1(DNA methyltransferase 1)]、FLIP[似Flice抑制蛋白質(Flice-like inhibitory protein)、C-SFC、53BPI、聚梳族群蛋白質EZH2(polycomb group protein EZH2)[zeste同源物的增強子(enhancer)]、ERBB1、HPV-16 E5和E7[人類乳突病毒早期5和早期7(human papillomavirus early 5 and early 7)]、Fortilin & MCI1P[骨髓細胞白血病1蛋白質(myeloid cell leukemia 1 protein)]、DIP13α[DDC交互作用蛋白質13a(DDC interacting protein 13a)]、MBD2[甲基CpG結合域(methyl CpG binding domain)]、P21、KLF4[似Kruppel因子4(Kruppel-like factor 4)]、tpt/TCTP[轉譯控制的腫瘤蛋白質(translational controlled tumor protein)]、SPK1和SPK2[神經鞘胺醇激酶(sphingosine kinase)]、P300、PLK1[似Polo激酶(Polo-like kinase-1)]、Trp53、Ras、ErbB1、VEGF[血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor)]、BAG-1[BCL2-相關的抗凋亡基因1(BCL2-associated athanogene 1)]、MRP2、BCR-ABL、STI-571抗性-相關的蛋白質(STI-571 resistance-associated protein)、肺抗性-相關的蛋白質(lung resistance-related protein)、環氧化酶-2(cyclooxygenase-2)、核因子κ(nuclear factor kappa)、XRCC1、ERCC1、GSTP1、突變的β微管蛋白(mutant β-tubulin)，以及生長因子。

亦如標靶有用的是由細胞質的聚腺苷酸化要素結合蛋白質(cytoplasmic polyadenylation element binding proteins,CEPB)所例示的整體的調節要素(regulatory element)。例如，CEPB4被過度表現在該蛋白質活化數百種與腫瘤生長相關的基因的神經膠質母細胞瘤(glioblastoma)和胰腺癌(pancreatic cancers)中，並且它沒有在健康細胞中被偵測到[Oritz-Zapater et al.,Nature Medicine,doi：10.1038/nm.2540(西元2011年12月4日被線上公開)]。因此，依據本描述，一神經膠質母細胞瘤的治療可經由投藥一含有完整的、細菌衍生的微型細胞[包含一抵銷CEPB4的過度表現的試劑(諸如一藉由該等腫瘤細胞破壞CEPB4表現的siRNA或其他功能性核酸分子)]的組成物而被實現。

進一步有用的功能性核酸是涉及DNA複製和修復的那些。實例包括核糖核苷酸還原酶(ribonucleotide reductase,RR)，它是一用於癌症的可能治療標靶，因為它催化核糖核苷5’-二磷酸(ribonucleoside 5’-diphosphates)成為對於DNA複製和修復必需的它們對應的2’-去氧核糖核苷5’-三磷酸(2’-deoxyribonucleoside 5’-triphosphates)。參見D'Angiolella et al.,Cell：149：1023-34(2012)。人類RR包含有2個次單元(subunits)RRM1和RRM2，並且標靶這兩個次單元的功能性核酸在本發明是有用的。有用的功能性核酸的一進一步實例包括複製蛋白質A(replication protein A,RPA)、一對於在所有生物的DNA複製是必需的由70-kDa (RPA1)、32-kDa(RPA2)和14-kDa(RPA3)次單元所組成的三聚體複合物(trimeric complex)。參見Iftode et al.,Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.34：141-80(1999)。

(D)腫瘤

本揭示的組成物和方法在治療各種不同的腫瘤類型是有用的，不限於一特定的種類。這是因為該等微型細胞或被殺死的細菌細胞可包裝不同的抗-腫瘤試劑並且，特別地當被附加以一對不同的腫瘤細胞特異性的雙特異性配位體，可標靶不同腫瘤類型的細胞。此外，微型細胞或被殺死的細菌細胞組合以IFN-γ的能力被預期能夠刺激任何腫瘤細胞的免疫反應。

依據本揭示的一具體例，本組成物和方法被使用在治療一或多種選自於腎上腺癌(adrenal cancer)、肛門癌(anal cancer)、再生不良性貧血(aplastic anemia)、膽管癌(bile duct cancer)、膀胱癌(bladder cancer)、骨癌(bone cancer)、在成人的腦/CNS腫瘤、在兒童的腦/CNS腫瘤、乳癌、在男性的乳癌、在兒童的癌、未知原發性的癌(cancer of unknown primary)、卡索曼氏病(Castleman disease)、子宮頸癌(cervical cancer)、結腸/直腸癌(colon/rectum cancer)、子宮內膜癌(endometrial cancer)、食道癌(esophagus cancer)、尤文家族腫瘤(Ewing family of tumors)、眼癌(eye cancer)、膽囊癌(gallbladder cancer)、胃腸類癌腫瘤(gastrointestinal carcinoid tumors)、胃腸基質腫瘤(gastrointestinal stromal tumor)(gist)、妊娠性滋養層疾病(gestational trophoblastic disease)、霍奇金氏病(Hodgkin disease)、卡波西氏肉瘤(Kaposi sarcoma)、腎癌(kidney cancer)、喉和下咽癌(laryngeal and hypopharyngeal cancer)、白血病(leukemia)、在成人的白血病-急性淋巴球性(leukemia-acute lymphocytic,ALL)、白血病-急性骨髓性(leukemia-acute myeloid,AML)、白血病-慢性淋巴球性(leukemia-chronic lymphocytic,CLL)、白血病-慢性骨髓性(leukemia-chronic myeloid,cml)、白血病-慢性骨髓單核球性(leukemia-chronic myelomonocytic,CMML)、在兒童的白血病、肝癌(liver cancer)、肺癌(lung cancer)、肺癌-非-小細胞(lung cancer-non-small cell)、肺癌-小細胞(lung cancer-small cell)、肺類癌腫瘤(lung carcinoid tumor)、淋巴瘤(lymphoma)、皮膚的淋巴瘤(lymphoma of the skin)、惡性間皮瘤(malignant mesothelioma)、多發性骨髓瘤(multiple myeloma)、骨髓化生不良症候群(myelodysplastic syndrome)、鼻腔和鼻竇癌(nasal cavity and paranasal sinus cancer)、鼻咽癌(nasopharyngeal cancer)、神經母細胞瘤(neuroblastoma)、非-何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)、在兒童的非-何杰金氏淋巴瘤、口腔和口咽癌(oral cavity and oropharyngeal cancer)、骨肉瘤(osteosarcoma)、卵巢癌(ovarian cancer)、胰腺癌(pancreatic cancer)、陰莖癌(penile cancer)、垂體腫瘤(pituitary tumors)、前列腺癌(prostate cancer)、視網膜母細胞瘤(retinoblastoma)、橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)、唾液腺癌(salivary gland cancer)、肉瘤-成人軟組織癌 (sarcoma-adult soft tissue cancer)、皮膚癌(skin cancer)、皮膚癌-基底和鱗狀細胞(basal and squamous cell)、皮膚癌-黑色素瘤(skin cancer-melanoma)、小腸癌(small intestine cancer)、胃癌(stomach cancer)、睾丸癌(testicular cancer)、胸腺癌(thymus cancer)、甲狀腺癌(thyroid cancer)、子宮肉瘤(uterine sarcoma)、陰道癌(vaginal cancer)、陰門癌(vulvar cancer)、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia)以及威爾姆斯瘤(Wilms tumor)的癌症。

在一具體例中，該等組成物和方法適合用於治療腦腫瘤。有超過120個類型的腦腫瘤。大多數醫療機構使用世界衛生組織(World Health Organization,WHO)的分類系統以鑑定腦腫瘤。WHO藉由細胞來源和細胞如何表現來分類腦腫瘤，從最小侵襲性(aggressive)(良性)至最大侵襲性(惡性)。一些腫瘤類型被分配一等級，在自第I級(最小惡性)至第IV級(最大惡性)的範圍，這表示生長的速率。在分級系統中有變化，視腫瘤類型而定。一個別腫瘤的分類和分級幫助預測它可能的行為。最頻繁地被診斷的類型包括聽神經瘤(acoustic neuroma)、星形細胞瘤(astrocytoma)[包括第I級-毛細胞性星形細胞瘤(pilocytic astrocytoma)、第II級-低-級別星形細胞瘤(low-grade astrocytoma)、第III級-間變性星形細胞瘤(anaplastic astrocytoma)和第IV級-神經膠質母細胞瘤(GBM)]、脊索瘤(chordoma)、CNS淋巴瘤(CNSlymphoma)、顱咽管瘤(craniopharyngioma)、其他神經膠瘤(gliomas)[腦幹神經膠瘤(brain stem glioma)、室管膜瘤 (ependymoma)、混合性神經膠瘤(mixed glioma)、視神經神經膠瘤(optic nerve glioma)和亞室管膜瘤(subependymoma)]、神經管胚細胞瘤(medulloblastoma)、腦脊髓膜瘤(meningioma)、轉移性腦腫瘤(metastatic brain tumors)、寡樹突神經膠細胞瘤(oligodendroglioma)，垂體腫瘤(pituitary tumors)、原始神經外胚層(primitive neuroectodermal,PNET)、其它腦-相關的病況(brain-related conditions)，以及神經鞘瘤(schwannoma)。

在兒童中，這些腦腫瘤類型更常見：腦幹神經膠瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、青少年毛細胞性星形細胞瘤(juvenile pilocytic astrocytoma,JPA)、神經管胚細胞瘤、視神經神經膠瘤、松果體腫瘤(pineal tumor)、原始神經外胚層腫瘤(primitive neuroectodermal tumors,PNET)，以及橫紋樣腫瘤(rhabdoid tumor)。

(E)微型細胞和被殺死的細菌細胞

“微型細胞”意指一缺乏染色體(“無染色體”)的細菌細胞的一衍生物，並且藉由在細胞分裂(cell division)與DNA分離(DNA segregation)的二分裂(binary fission)的期間一在配位(coordination)的擾亂而被產生。微型細胞不同於其它小囊泡(small vesicles)，諸如所謂的“膜泡(membrane blebs)”(在尺寸上~0.2μm或更小)]，其在某些情況下被自動地產生和釋放但不是起因於特定的基因重排(genetic rearrangements)或游離基因體的基因表現(episomal gene expression)。基於同樣的理由，完整的微型細胞是不同於不是起因於特定的基因重排或游離基因體的基因表現而被產生的細菌空殼(bacterial ghosts)。在這個揭示中所採用的細菌衍生的微型細胞是完全地完整的，並且因此與特徵在一被破壞或降解、甚至移除的外或限定膜(defining membrane)的其它無染色體形式的細菌細胞的衍生物是可區別的。參見美國專利第7,183,105號在第111段、第54行以及其下面等等。特徵化本揭示的微型細胞的完整的膜容許保持該治療負載在該微型細胞中，直到該負載在一腫瘤細胞中被釋放、攝取後。

在這個揭示所採用的微型細胞可從細菌細胞[諸如大腸桿菌(E.coli)和鼠傷寒沙門氏菌(S.typhymurium)]而被製備。原核染色體的複製(prokaryotic chromosomal replication)被連接至涉及中期-細胞隔板形成(mid-cell septum formation)的正常二分裂。在大腸桿菌中，例如，min基因(諸如minCD)的突變可移除在細胞分裂的期間在細胞極(cell poles)的隔板形成的抑制，導致產生一正常的子細胞(daughter cell)和一染色體-較少的微型細胞。參見de Boer et al.,J.Bacteriol.174(1)：63-70(1992)；Raskin & de Boer,J.Bacteriol.181：6419-6424(1999)；Hu & Lutkenhaus,Mol.Microbio.34(1)：82-90(1999)；Harry,Mol.Microbiol.40(4)：795-803(2001)。

除了min操縱子(min operon)突變以外，染色體-較少的微型細胞亦在一範圍的影響隔板形成的其它基因重排或突變[例如，在枯草芽孢桿菌(B.subtilis)的divIVB1]之後被產生。參見Reeve and Cornett,J.Virol.15：1308-16(1975)。微型細胞亦可在一在涉及細胞分裂/染色體分離(chromosome segregation)的蛋白質的基因表現的位準的擾動之後被形成。例如，minE的過度表現導致極分裂(polar division)和產生微型細胞。類似地，染色體-較少的微型細胞可導致在染色體分離的缺陷，例如，在枯草芽孢桿菌的smc突變(Britton et al.,Genes Dev.12：1254-9(1998))、在枯草芽孢桿菌的spoOJ刪除(deletion)(Ireton et al.,J.Bacteriol.176：5320-29(1994))、在大腸桿菌的mukB突變(Hiraga et al.,J.Bacteriol.171：1496-1505(1989))，以及在大腸桿菌的parC突變(Stewart and D’Ari,J. Bacteriol.174：4513-6(1992))。進一步，CafA可增強細胞分裂的速率和/或抑制在複製後的染色體分配(chromosome partitioning)(Okada et al.,J.Bacteriol.176：917-22(1994))，導致形成鏈狀細胞(chained cells)和染色體-較少的微型細胞。

因此，由於在這些細菌中細菌細胞分裂的守恆性質，微型細胞可從任何細菌細胞(不論是革蘭氏陽性或革蘭氏陰性來源)而被製備用於本發明。再者，如上面所注意到的，被使用在本揭示的微型細胞應該具有完整的細胞壁(亦即，是“完整的微型細胞”)，並且應該與其它小囊泡(諸如不歸因於特定的基因重排或游離基因體的基因表現的膜泡)區別和分離。

如所提到的，在一特定具體例中，用於微型細胞的親代(來源)細菌可以是革蘭氏陽性，或它們可以是革蘭氏陰性。因此，在一方面，該等親代細菌是選自於Terra-/Glidobacteria(BV1)、變形菌門(Proteobacteria)(BV2)、包括螺旋體門(Spirochaetes)、鞘脂桿菌綱(Sphingobacteria)和浮黴狀細菌(Planctobacteria)的BV4的一或多個。按照另一個方面，該等細菌是選自於厚壁菌門(Firmicutes)(BV3)[諸如桿菌綱(Bacilli)、梭菌綱(Clostridia)或柔膜菌門(Tenericutes)/柔膜菌綱(Mollicutes)]或者放線菌綱(Actinobacteria)(BV5)[諸如放線菌目(Actinomycetales)或雙歧桿菌目(Bifidobacteriales)]的一或多個。

按照本發明，被殺死的細菌細胞是如在BERGEY'S MANUAL OF SYSTEMATIC BIOLOGY的第2版所定義的細菌、藍綠細菌(cyanobateria)、真細菌(eubacteria)和古細菌(archaebacteria)的非-活的原核細胞(non-living prokaryotic cell)。此等細胞被認為是“完整的”，若它們擁有一完整的細胞壁和/或細胞膜並且含有對細菌物種是內源性的遺傳物質(genetic material)(核酸)。製備被殺死的細菌細胞的方法被描述，例如，在美國專利申請公開案第2008/0038296號(它的內容在此被併入本案以作為參考資料)。

在又一進一步方面，該細菌是選自於初細菌(Eobacteria)[綠彎菌門(Chloroflexi)、異常球菌-棲熱菌門(Deinococcus-Thermus)]、藍綠細菌(Cyanobacteria)、熱脫硫桿菌門(Thermodesulfobacteria)、嗜熱菌(thermophiles)[產水菌門(Aquificae)、熱袍菌門(Thermotogae)]、A、β、γ[腸桿菌科(Enterobacteriaceae)]、δ或ε變形菌門(delta or Epsilon Proteobacteria)、螺旋體門(Spirochaetes)、纖維桿菌門(Fibrobacteres)、綠菌門(Chlorobi)/擬桿菌門(Bacteroidetes)、衣原體門(Chlamydiae)/疣微菌門(Verrucomicrobia)、浮黴菌門(Planctomycetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、產金菌門(Chrysiogenetes)、脫鐵桿菌門(Deferribacteres)、梭桿菌門(Fusobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、互養菌門(Synergistetes)、網團菌門(Dictyoglomi)、互養菌門(Synergistetes)、網團菌門(Dictyoglomi)、黏膠球形菌門(Lentisphaerae)、芽孢桿菌目(Bacillales)、芽孢桿菌科(Bacillaceae)、李斯特氏菌科(Listeriaceae)、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、乳桿菌目(Lactobacillales)、腸球菌科(Enterococcaceae)、乳桿菌科(Lactobacillaceae)、明串珠菌科(Leuconostocaceae)、鏈球菌科(Streptococcaceae)、梭菌目(Clostridiales)、鹽厭氧菌目(Halanaerobiales)、嗜熱厭氧菌目(Thermoanaerobacterales)、支原體目(Mycoplasmatales)、蟲原體目(Entomoplasmatales)、厭氧原體目(Anaeroplasmatales)、無膽甾原體目(Acholeplasmatales)、Haloplasmatales、放射菌亞目(Actinomycineae)、放線菌科(Actinomycetaceae)、棒桿菌亞目(Corynebacterineae)、諾卡氏菌科(Nocardiaceae)、棒桿菌科(Corynebacteriaceae)、弗蘭克氏菌亞目(Frankineae)、弗蘭克氏菌科(Frankiaceae)、微球菌亞目(Micrococcineae)、短桿菌科(Brevibacteriaceae)以及雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae)的一或多個。

關於藥學使用，本揭示的一組成物應該包含有儘可能完全地從免疫原性組分(immunogenic components)和其它毒性污染物而被分離的微型細胞或被殺死的細菌細胞。用於純化細菌衍生的微型細胞以移除游離內毒素(free endotoxin)和親代細菌細胞的方法學被描述在WO 2004/113507(在此以它的整體被併入本案以做為參考資料)。簡言之，純化方法達到移除(a)小囊泡(諸如，一般而言在尺寸上要比0.2μm更小的膜泡)、(b)從細胞膜所釋放的游離外毒素，以及(c)親代細菌(不論活的或死的)和它們的碎片(亦是游離內毒素的來源)。此等移除尤其可在誘導該等親本細胞以形成絲狀結構(filaments)、抗生素(antibiotics)殺死活的細菌細胞以及抗體對抗游離內毒素之後使用一為0.2μm濾膜以移除較小的囊泡和細胞碎片，一為0.45μm濾膜以移除親代細胞而被實施。

在下面的純化操作程序是一藉由發明人的發現，儘管它們的細菌來源的不同，所有完整的微型細胞在尺寸上是大概400nm，亦即，要比膜泡和其它更小的囊泡更大並且還要比親代細菌更小。關於微型細胞的尺寸測定可藉由使用固態(諸如電子顯微鏡)或藉由液體-為基礎的技術[例如，動態光散射(dynamic light scattering)]而被完成。由各個此技術所產生的尺寸數值可具有一誤差範圍，並且該等數值可在技術之間有些微不同。因此，呈一乾燥狀態的微型細胞的尺寸可經由電子顯微鏡而被測量為大概400nm±50nm。另一方面，動態光散射可測量相同的微型細胞在尺寸上大概500nm±50nm。又，藥物-包裝之配位體標靶的微型細胞可再次使用動態光散射而被測量為大概400nm至600nm±50nm。

尺寸數值的這個散射在實施上容易被提供，例如，為了如上所述的從免疫原性組分和其它有毒污染物分離微型細胞的目的。那是，一完整的、細菌衍生的微型細胞的特徵在於由一提供該微型細胞一剛性、球形結構的剛性膜(rigid membrane)所圍繞的細胞質。這個結構在穿透式電子顯微照片(transmission-electron micrographs)是明顯的，其中微型細胞直徑橫越該微型細胞在剛性膜的外界限之間被測量。這種測量提供了400nm±50nm的上面所提到的尺寸數值。

一被殺死的細菌細胞或一衍生自革蘭氏陰性菌的微型細胞的另一個結構要素是經由脂質A錨(lipid A anchor)而被嵌入在外膜的脂多醣(LPS)的O-多醣組分。該組分是一具有重複的碳水化合物-殘基單元(carbohydrate-residue units)的鏈，每個鏈具有多達70至100個重複單元的4至5個糖。因為這些鏈在一液體環境(如在活體內)不是剛性的，它們可採取一提供海藻在一珊瑚礁海環境的一般外觀的波動、撓性結構；亦即，鏈隨著液體移動，同時維持錨定至該微型細胞膜。

如上面所注意到的，由O-多醣組分所影響，動態光散射可提供一約500nm至約600nm的微型細胞尺寸的數值。然而，來自革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌的微型細胞一樣地容易穿過一為0.45μm濾膜，其證實一為400nm±50nm的有效微型細胞尺寸。上面所提到的散射在尺寸上是由本發明所涵蓋並且，特別地，藉由修飾語“大概”在片語“在尺寸上大概400nm”和類似之語中而被表示。

關於毒性污染物，本揭示的一組成物可含有小於約350EU游離內毒素。在這個方面的例示說明是分別約250EU、約200EU、約150EU、約100EU、約90EU、約80EU、約70EU、約60EU、約50EU、約40EU、約30EU、約20EU、約15EU、約10EU、約9EU、約8EU、約7EU、約6EU、約5EU、約4EU、約3EU、約2EU、約1EU、約0.9EU、約0.8EU、約0.7EU、約0.6EU、約0.5EU、約0.4EU、約0.3EU、約0.2EU、約0.1EU、約0.05EU以及約0.01EU的游離內毒素的位準。

本揭示的一組成物亦可含有至少約10⁹個微型細胞或被殺死的細菌細胞，例如，至少約1x10⁹個、至少約2x10⁹個或至少約5x10⁹個。在一些具體例中，該組成物含有不超過約10¹¹個微型細胞或被殺死的細菌細胞，例如，不超過約1x10¹¹個或不超過約9x10¹⁰個，或者不超過約8x10¹⁰個。

(F)包裝一抗-腫瘤試劑至微型細胞或被殺死的細菌細胞內

可藉由一核酸所編碼的抗-腫瘤試劑(諸如蛋白質和功能性核酸)可藉由轉形一編碼該抗-腫瘤試劑的載體(諸如一質體)至親代細菌細胞而被導入至微型細胞內。當一微型細胞從該親代細菌細胞被形成時，該微型細胞保留質體和/或表現產物(抗-腫瘤試劑)的某些複本。包裝一表現產物至一微型細胞內的更多細節被提供在WO03/033519(它的內容以它的整體被併入本揭示以作為參考資料)。

在WO03/033519中存在的數據證實，例如，攜帶哺乳動物基因表現質體的重組微型細胞可被遞送至吞噬細胞和非-吞噬細胞。該申請案亦描述以在游離基因體地複製的質體DNA(episomally-replicating plasmid DNA)上所攜帶的異源核酸基因轉形微型細胞-生產的親代細菌菌株。在分離親代細菌和微型細胞之後，一些游離基因體的DNA分離至該等微型細胞內。所形成的重組微型細胞容易由哺乳動物吞噬細胞所吞噬並且在細胞內的吞噬溶酶體(phagolysosomes)中變成被降解。再者，一些重組DNA逃脫吞噬溶酶體的膜並且被運送至重組基因被表現的哺乳動物細胞細胞核。

核酸亦可直接地被包裝至微型細胞內。因此，一核酸可藉由在一緩衝液中共培育複數個完整的微型細胞與該核酸而被直接地包裝至完整的微型細胞內。為了最佳化該核酸在該等完整的微型細胞中的裝載，該緩衝液組成物可被變化隨著一在這個領域所熟知的條件的函數。該緩衝液亦可被變化視要被裝載在該等微型細胞的該核酸的核苷酸序列和長度而定。適合用於裝載的示範性緩衝液包括，但不限於，磷酸鹽緩衝液(phosphate buffered saline,PBS)。一旦被包裝，該核酸仍然在該微型細胞內，並且被保護免於降解。以被培育在無菌鹽水的siRNA-包裝的微型細胞的延長培育研究已顯示，例如，沒有siRNA的漏出。

在其他具體例中，針對不同的mRNA標靶的複數種核酸可被包裝在相同的微型細胞。此一方法可被使用以對抗藥物抗性和細胞凋亡抗性。例如，癌症病患慣常地展現出對化學治療藥物的抗性。此抗性可藉由過度-表現基因{諸如多-藥物抗性(MDR)泵[multi-drug resistance(MDR)pumps]和抗-細胞凋亡基因等等}而被調節。為了對抗這個抗性，微型細胞可被包裝以對MDR-相關的基因治療顯著濃度的功能性核酸並且在化學治療前被投藥給一病患。再者，針對不同的mRNA標靶的複數種功能性核酸包裝至相同的微型細胞內可增強治療成功，因為大多數的分子標靶受到突變並且具有複數個對偶基因(alleles)。直接地包裝一核酸至一微型細胞內的更多細節被提供在WO2009/027830(它的內容以它的整體被併入本案以做為參考資料)。

小分子藥物(無論親水性或疏水性)可藉由產生一在一含有微型細胞的細胞外介質(extracellular medium)與該微型細胞細胞質之間的藥物的濃度梯度而被包裝在微型細胞。當該細胞外介質含有一要比微型細胞細胞質更高的藥物濃度時，該藥物自然地向下移動這個濃度梯度，至該微型細胞細胞質內。然而，當濃度梯度被逆轉時，該藥物沒有移出該微型細胞。藥物裝載方法和它令人驚訝的本質的更多細節被發現，例如，在美國專利申請公開案第2008/0051469號。

為了裝載微型細胞和正常地不是水溶性的藥物，該等藥物最初可被溶解在一適當的溶劑中。例如，紫杉醇可被溶解在一為1：1摻合的乙醇和聚氧乙烯蓖麻油EL(cremophore EL)[聚乙氧基化蓖麻油(polyethoxylated castor oil)]，繼而一配於PBS的稀釋以達到一被部分地稀釋在水性介質並且攜帶最小數量的有機溶劑以確保藥物維持在溶液的紫杉醇的溶液。微型細胞可被培育在這個最終介質用於藥物裝載。因此，發明人發現：甚至疏水性藥物可擴散至微型細胞的細胞質或膜內以達到一高的和治療顯著的細胞質的藥物裝載。這是未被預期的，因為該微型細胞膜是由一被預期預防疏水性分子擴散至細胞質內的疏水性磷脂雙層(hydrophobic phospholipid bilayer)所組成。

它被證明各種不同的例示說明不同尺寸和化學特性的代表性小分子藥物裝載至微型細胞內：多柔比星、紫杉醇、氟-紫杉醇(fluoro-paclitaxel)、順鉑、長春鹼、monsatrol、胸腺嘧啶核苷酸合成酶(TS)抑制劑OSI-7904[thymidylate synthase(TS)inhibitor OSI-7904]、伊立替康、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、吉西他濱和卡鉑。再者，全面的，所形成的小分子藥物-包裝的微型細胞顯示顯著的抗-腫瘤效力(在活體外和在活體內)。在此所呈現的這些數據因此證明微型細胞裝載方法的有效性和變通性。

(G)指引微型細胞或被殺死的細菌細胞至特定的哺乳動物細胞

按照這個揭示的一進一步方面，如上面所描述的一組成物的微型細胞或被殺死的細菌細胞經由一配位體而被指引至一標靶哺乳動物腫瘤細胞。在一些具體例中該配位體是“雙特異性(bispecific)”。那是，該配位體顯示一對於微型細胞和哺乳動物(腫瘤)細胞組分這兩者的特異性，藉此它引起一特定的囊泡結合至該標靶細胞，因此後者吞噬前者。使用雙特異性配位體以標靶一微型細胞至一腫瘤細胞進一步被描述在WO 05/056749和WO 05/079854，並且使用雙特異性配位體以標靶一被殺死的細菌細胞至一腫瘤細胞進一步被描述在美國專利第8,591,862號，它們的個別內容在此以它的整體被併入本案以作參考資料。一旦此一配位體被附著至一囊泡，該配位體的未佔用的特異性[“單特異性(monospecificity)”]附屬直到它與該標靶(腫瘤)哺乳動物細胞交互作用。

該配位體可憑藉在該配位體與一在細胞膜上的組分[諸如一多醣、一醣蛋白(glycoprotein)或一多肽(polypeptide)]之間的交互作用而被附著至該等囊泡的細胞膜。該被表現的配位體被錨定在一囊泡的表面上，藉此該配位體的表面組分-結合部分被暴露，使得當該囊泡和該哺乳動物細胞達成接觸時，該部分可結合該標靶哺乳動物細胞表面組分。

另擇地，該配位體可藉由一細菌衍生的囊泡的一活的對應體(counterpart)而被表現和展示，例如，藉由一微型細胞的親代細胞或藉由一在它變成一被殺死的細胞之前的細菌細胞。在這個實例中，該配位體不需要一對該囊泡的特異性並且僅展示一對於一為哺乳動物細胞的特徵的組分的特異性。那是，此組分不需要對腫瘤細胞本身或甚至對在治療下的特定種類的腫瘤細胞是獨特的，只要該等腫瘤細胞呈現該組分在它們的表面上。

在靜脈內投藥後，囊泡快速地累積在腫瘤微環境。這個累積[發生有如上面-所描述的漏的腫瘤血管分布(leaky tumor vasculature)的一作用]造成遞送囊泡-包裝的治療負載至接著內化被包裝的囊泡的腫瘤的細胞。

發明人已發現：這個遞送方法適用於一範圍的哺乳動物腫瘤細胞，包括正常地對微型細胞的特異性黏附和胞吞作用(endocytosis)有抵抗力的細胞。例如，包含有一針對一抗-HER2受體或抗-EGF受體的抗體的配位體可結合微型細胞至在一範圍的被標靶的非-吞噬細胞(諸如肺、卵巢、腦、乳房、前列腺和皮膚癌細胞)上的個別受體。

因此所達到的結合在藉由各個類型的非-吞噬細胞攝取該等囊泡之前。那是，在本發明的上下文中，一適合的標靶細胞呈現一細胞表面組分(藉由一在一囊泡上的配位體結合它引發那個囊泡的胞吞作用)。

更特別地，發明人發現：在(a)一微型細胞或一被殺死的細菌細胞上的配位體與(b)一哺乳動物細胞表面受體之間的交互作用可活化一攝取途徑[在此被稱為一“受體-調節的胞吞作用(receptor-mediated endocytosis)”(rME)途徑]至標靶宿主細胞(諸如一腫瘤細胞)的晚期胞內體的/溶酶體的隔室(late endosomal/lysosomal compartment)內。藉由這個rME途徑，發明人發現：細菌衍生的囊泡經由早期胞內體(early endosome)、晚期胞內體((late endosome)和溶酶體(lysosome)而被處理，導致釋放它們的負載至哺乳動物宿主細胞的細胞質內。再者，一核酸的一負載不僅在晚期胞內體的/溶酶體的隔室中逃脫完全的降解，而且藉由宿主細胞而被表現。

如上面所描述的，一用於這個遞送方法的配位體可以是“雙特異性”，因為它分別地結合至在一負載-攜帶的囊泡上和在一標靶細胞上的表面組分，並且它與後者組分的交互作用導致攝取該囊泡至rME途徑內。在任何情況下，一特定的標靶細胞-表面組分可以是一用於藉由該配位體結合的候選物，按照本發明，若與該組分交互作用實際上接近一需要一來自該標靶細胞表面的細胞溶質內化作用(cytosolic internalization)的胞吞途徑。此等候選物經由一分析{其中一表現一候選組分在它的表面上的細胞類型與攜帶一結合該候選物並且亦被連接至一螢光染料或其它經得起偵測[例如，經由共聚焦顯微鏡(confocal microscopy)看得見地]的標記的配位體之微型細胞被活體外共-培育}而被容易地評估在本發明的合適性。(這個種類的一活體外分析藉由MacDiarmid等人(2007)在第436頁的第3圖的說明而被描述)。因此，該標記的一被觀察的內化作用藉由該被測試的標靶細胞-表面組分適合於本發明的此一分析而構成一正指示。

候選標靶細胞-表面組分的例示說明是(A)受體酪胺酸激酶(receptor tyrosine kinases)或“RTK”、在一相似於其他膜主體蛋白(integral membrane proteins)所具者的速率下經歷構成內化(constitutive internalization)(胞吞作用)的跨膜蛋白(transmembrane proteins)的一家族之成員。參見 Goh and Sorkin,Cold Spring Harb.Perspect.Biol.5：a017459(2013)。RTK的家族是由Lemmon and Schlessinger,Cell 141(7)：1117-134(2010)所描述。如上面所描述的(亦參見圖7)，下表列出在20個亞家族中，在人類蛋白質體的所有58個RTK，其中的任何一或多個可在本發明被測試適合性。

同樣地例示說明的是下列成員：(B)結合葉酸和減少葉酸衍生物並且調節四氫葉酸(tetrahydrofolate)至細胞的內部的遞送之膜-相關的、高親和力的葉酸結合蛋白質(folate binding proteins)(葉酸受體)的種類；(C)在一同源的細胞介素(cytokine)的內化扮演一角色的膜-結合的細胞介素受體(membrane-bound cytokine receptors)的次群組，諸如IL13；(D)被表現在某些癌細胞並且調節同源的單克隆抗體(cognate monoclonal antibodies)[例如，利妥苷單抗(rituximab)在CD20的例子中]的內化的表面抗原[諸如CD20、CD33、間皮素(mesothelin)和HM1.24]；以及(E)黏著受體(adhesion receptors)[整合素(integrins)]、經由胞內體的途徑被交易並且是癌細胞黏著至細胞外基質的主要調節者的跨膜醣蛋白(transmembrane glyproteins)的家族。

依據本發明，該配位體可以是展現所欲的特異性(specificity)或特異性們(specificities)的任何多肽或多醣，視情況而定。較佳的配位體是抗體。在它的現今使用中，術語“抗體”包含一種藉由活體外或活體內產生一免疫反應所獲得的免疫球蛋白分子。因此，“抗體”種類包括單克隆抗體(monoclonal antibodies)和人類化的抗體(humanized antibodies)，諸如單-鏈抗體片段(single-chain antibody fragments,scFv)、雙特異性抗體等等。如由Caravella and Lugovskoy,Curr.Opin.Chem.Biol.14：520-28(2010)(在此以它的整體被併入本案以做為參考資料)的評論性文章所證明的，許多不同的雙特異性蛋白質和抗體-為基礎的配位體被知曉。依據本揭示有用的抗體亦可藉由已知的重組DNA技術而被獲得。

因此，按照本發明，藉由非-限制性實例的方式，一攜帶對一表面組分(諸如一腫瘤抗原)特異性的抗體可被使用以標靶微型細胞至在一要被治療的腫瘤的細胞。在這個方面例示說明的細胞表面受體包括RTK的任一者表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、血管內皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)、血小板-衍生生長因子受體(platelet-derived growth factor receptor,PDGFR)和似胰島素生長因子受體(insulin-like growth factor receptor,IGFR)[它們各個被高度地表現在數種固態腫瘤(solid tumors)(包括腦腫瘤)]，以及在一些垂體腺瘤(pituitary adenomas)中被過度表現的葉酸受體(folate receptor)。此一雙特異性配位體亦可被標靶至突變的或各種不同的受體，例如，IL-13Rα2受體，其被表現在50%至80%的人類多形性神經膠質母細胞瘤腫瘤(human glioblastoma multiforme tumor)[參見Wykosky et al.,Clin Cancer Res.14：199-208(2008)、Jarboe et al.,Cancer Res.67：7983-86(2007)、Debinski et al.,J.Neurooncol.48：103-11(2000)和Okada et al.,J. Bacteriol.176：917-22(1994)]，但是其不同於被表現在正常組織的它的生理對應體(physiological counterpart)IL4R/IL13R。參見Hershey,J.Allergy Clin.Immunol.111：677-90(2003)。因此，IL13Rα2事實上從正常的腦細胞缺乏的。參見Debinski and Gibo,Mol.Med.6：440-49(2000)。此外，轉移至腦的腫瘤可過度表現某些受體(其亦可為合適的標靶)。例如，Da Silva et al.,Breast Cancer Res.12：R46(1-13)(2010)顯示：乳癌的腦轉移表現RTK的HER家族的所有成員。HER2被擴增和過度表現在20%的腦轉移，EGFR被過度表現在21%的腦轉移，HER3被過度表現在60%的腦轉移以及HER4被過度表現在22%的腦轉移。有趣地，HER3表現在存在於腦中的乳癌細胞被增加。

(H) 增加IFN-γ的位準的試劑

本組成物和方法可進一步包括一增加在一病患的IFN-γ的位準(例如，活性或表現位準)的試劑。

在一具體例中，該試劑包括一IFN-γ蛋白質或類似物。IFN-γ的商業產品(諸如Actimmune®)是或將是可獲得的。Actimmune®是一干擾素γ的生物工程形式，一作為一經由刺激人類免疫系統的生物反應修飾劑的蛋白質。如上面所注意到的，FDA已核准Actimmune®供使用在具有慢性肉芽腫疾病(chronic granulomatous disease)和嚴重、惡性骨石化症(malignant osteopetrosis)的兒童和成人。

IFN-γ產生是藉由由APC所分泌的細胞介素(cytokines)[最特別地介白素(interleukin,IL)-12和IL-18]而被控制。這些細胞介素作為一橋樑以在先天性免疫反應中連接感染與IFN-γ產生。許多病原體(pathogens)的巨噬細胞辨識(macrophage recognition)誘導IL-12和趨化介素(chemokines)的分泌。這些趨化介素吸引NK細胞至發炎的位址，並且IL-12促進IFN-γ合成在這些細胞中。在巨噬細胞、NK和T細胞中，IL-12和IL-18刺激的組合進一步增加IFN-γ 產生。因此，為了這個揭示的目的任何這些蛋白質或它們的組合是適合的試劑。

IFN-γ產生的負調節劑包括IL-4、IL-10、轉化生長因子-β(transforming growth factor-β)以及糖皮質素(glucocorticoids)。抑制這些因子的蛋白質或核酸將能夠刺激IFN-γ的產生。

亦適合供使用在這個上下文的是編碼IFN-γ的聚核苷酸或活化IFN-γ的產生和/或分泌的基因。

增加IFN-γ的位準的試劑亦可是一病毒疫苗。許多可誘發IFN-γ產生而沒有引起感染或其他類型的不良效用的病毒疫苗是可獲得的。這個種類的病毒-疫苗試劑的例示說明是一flu[流行性感冒(influenza)]疫苗。

數據顯示：需要用於有效地活化宿主對腫瘤細胞的免疫反應的IFN-γ的血清濃度是低的，當該病患亦接受藥物裝載之雙特異性抗體標靶的微型細胞或被殺死的細菌細胞的投藥。因此，在一方面發明的方法學導致不高於約30,000pg/mL的血清IFN-γ濃度的增加。在另一個方面，該血清IFN-γ濃度被增加至不高於約5000pg/mL、1000pg/mL、900pg/mL、800pg/mL、700pg/mL、600pg/mL、500pg/mL、400pg/mL、300pg/mL、200pg/mL或100pg/mL。在一進一步方面，所形成的血清IFN-γ濃度是至少約10pg/mL，或者至少約20pg/mL、30pg/mL、40pg/mL、50pg/mL、60pg/mL、70pg/mL、80pg/mL、90pg/mL、100pg/mL、150pg/mL、200pg/mL、300pg/mL、400pg/mL或500pg/mL。

按照一些方面，該試劑是一IFN-γ蛋白質、工程化的蛋白質或類似物。在一些方面，投藥達到每ml的宿主血液自約0.02ng至1微克的IFN-γ。在一個方面，在宿主血液中被達到的IFN-γ濃度是每ml自約0.1ng至約500ng，或每ml自約0.2ng至約200ng，或每ml自約0.5ng至約100ng，或每ml自約1ng至約50ng，或每ml自約2ng至約20ng。因此在本揭示的組成物中IFN-γ的治療劑量可被決定。

(I)配方(formulations)和投藥途徑和排程

本揭示的一組成物的配方可呈單位劑量形式存在，例如，在安瓶(ampules)或小瓶(vials)或者在多-劑量容器中，有或沒有一添加的防腐劑(preservative)。該配方可以是一溶液、一懸浮液(suspension)，或一配於油性或水性載劑(oily or aqueous vehicles)的乳劑(emulsion)，並且可含有配方試劑(formulatory agents)(諸如懸浮、安定和/或分散試劑)。一合適的溶液是與接受者的血液等張的(isotonic)並且藉由鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)和右旋糖溶液(dextrose solution)而被例示說明。另擇地，配方可以是呈凍乾粉末形式，用於與一合適的載劑[例如，無菌(sterile)、無熱原(pyrogen-free)的水或生理鹽水(physiological saline)]重構。該等配方亦可以是呈一儲庫型製劑(depot preparation)的形式。此等長-效配方可藉由植入(implantation)[例如，皮下地(subcutaneously)或肌肉內地(intramuscularly)]或藉由肌肉內注射(intramuscular injection)而被投藥。

在一些方面，一包括一治療有效數量的一抗-腫瘤試劑的微型細胞-或被殺死的細菌細胞-含有的組成物被提供。依據本揭示，一“治療有效”數量的一抗-腫瘤試劑是一劑量的該討論到的試劑，例如，當被投藥給一個體時引起一藥學反應的一siRNA或一化學治療藥物。

在一些方面，一包括一治療有效數量的一增加IFN-γ的位準的試劑的組成物被提供。在一些方面，一包括一如所描述的微型細胞或被殺死的細菌細胞和一增加IFN-γ的位準的試劑這兩者的組成物、套組(kit)、包裝(package)或產品(product)被提供。

因此，在本揭示的上下文中，如下面被進一步描述的，當攜帶一治療負載的微型細胞或被殺死的細菌細胞被投藥時，一治療有效數量可藉由參考不論在一動物模型或在一人類個體中的腫瘤或一腫瘤的症狀的預防或改善而被估計。一在一特定的例子中對於一特別的個體證明“治療有效數量”的數量可能不是對於100%的被相似地治療該腫瘤的個體有效的，儘管此劑量藉由熟練的開業醫師被認為是一“治療有效數量”。在這個方面的適當劑量亦將變化按照例如腫瘤的類型、階段和嚴重性的一作用。同樣地，當“治療有效的”被使用以意指微型細胞在一藥學組成物中的數量時，該數量可根據什麼抗-腫瘤試劑被包裝至該等微型細胞內以及那個試劑在治療一腫瘤的效力而被確定。在這個方面，治療效用可以一臨床的或病理的參數(諸如腫瘤質量)而被測量。因此，腫瘤質量的一減少或被減少的增加可被使用以測量治療效用。

關於增加IFN-γ的位準的試劑，一“治療有效數量”可意指在投藥後該試劑的數量達到如在上面所提供的所欲的宿主血液濃度。

在本揭示內的配方可經由各種不同的途徑而被投藥並且至在一哺乳動物身體的各種不同的位址，以達到所欲的治療效用(們)(無論是局部地或全身地)。在一特別的方面，投藥的途徑是靜脈內的注射。

一般而言，本揭示的配方可在由常規試驗所定義的適當劑量下被使用，以獲得最佳的生理效用，同時最小化任何可能的毒性。劑量攝生法(dosage regimen)可依據各種不同的因素(包括病患的年齡、體重、性別、醫療條件；腫瘤的嚴重性或階段、投藥的途徑以及病患的腎和肝功能)而被篩選。

在達到產生最大效力與最小的副作用的範圍內的微型細胞、被殺死的細菌細胞和治療試劑的濃度的最佳精確性可以和典型地將需要一根據對標靶位址和標靶細胞可用性的試劑的動力學的攝生法。當決定用於一治療攝生法的最佳濃度時，微型細胞或試劑的分佈、平衡和消除可被考慮。微型細胞和治療試劑的劑量可分別地被調節以達到所欲的效用。

再者，該等配方的劑量投藥可使用一藥物動力學的/藥效學的模型化系統(pharmacokinetic/pharmacodynamic modeling system)而被最佳化。因此，一或多個劑量攝生法可被選擇以及一藥物動力學的/藥效學的模型可被使用以決定一或多個劑量攝生法的藥物動力學/藥效學的圖譜(profile)。根據一特別的此圖譜，用於投藥的劑量攝生法的一者接著可被選擇達到所欲的藥物動力學的/藥效學的反應。例如，參見WO 00/67776。

被包裝以一抗-腫瘤試劑和該增加IFN-γ的位準的試劑的該等微型細胞或被殺死的細菌細胞可呈一組合配方或有如個別的組成物而被同時地投藥，或者相繼地一個在另一個之後。當被相繼地投藥時，該等微型細胞或被殺死的細菌細胞可在該增加IFN-γ的位準的試劑之前或之後被投藥。在一個方面，當該等微型細胞或被殺死的細菌細胞在投藥後達到最大血漿位準或有效的血漿位準時，宿主已達到或保持一最小位準的IFN-γ。此一最小位準是需要在該等組成物之間產生協同作用的一者。這個可藉由在投藥該等微型細胞或被殺死的細菌細胞之前投藥該增加IFN-γ位準的試劑，或者藉由在該等微型細胞或被殺死的細菌細胞被投藥(特別地在一相對高的劑量)之後不久投藥該試劑而被達到。被注意的是：這兩種組成物的投藥可連續地發生。在那個方面，接著，該等投藥導致持續曝露該宿主至該等微型細胞或被殺死的細菌細胞和該增加IFN-γ的試劑這兩者。

本揭示的一配方或配方的組合可被投藥一週至少一次給一腫瘤病患在數週的過程。因此，該配方可被投藥一週至少一次在一數週至數月的期間。

更特別地，發明的配方可被投藥一天至少一次歷時約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天。另擇地，該等配方可被投藥每天約一次或者每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天或更多天約一次。

在本揭示的另一個具體例中，配方可被投藥每週約一次或者每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20週或更多週約一次。另擇地，該等配方可被投藥一週至少一次歷時約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20週或更多週。

另擇地，該等配方可被投藥每月約一次或者每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月或更多月約一次。

該等配方可呈一單一每日劑量而被投藥。另擇地，總每日劑量可呈每天2、3或4次的分次劑量(divided doses)而被投藥。

下列實施例僅為例示說明而不是限制，並且提供本揭示的一更完整的瞭解。

實施例1.腫瘤尺寸減少與干擾素-γ位準有關

這個實施例證明：在接受以藥物裝載的微型細胞治療的狗中腦腫瘤體積的減少與干擾素-γ(IFNγ)的表現位準有關。因此，這個實施例建議：IFN-γ增加藥物裝載的微型細胞的效力。提供低數量的所需的IFN-γ，這個實施例進一步建議在IFN-γ和藥物裝載之雙特異性抗體標靶的微型細胞之間的協同作用。

材料和方法 多柔比星-包裝的犬EGFR-標靶的微型細胞的製備和給藥

微型細胞被衍生自傷寒桿菌(Salmonella enterica serovar Typhimurium)、鼠傷寒沙氏桿菌(S.typhimurium)的一minCDE-染色體刪除突變體、被純化、被包裝以多柔比星(dox)並且經由黏附一包含有抗-微型細胞表面O-多醣和抗-犬EGFR特異性的雙特異性單克隆抗體(MAb)而被標靶(被命名^EGFR微型細胞_Dox)。

在這個研究中的狗是贈送給在澳大利亞悉尼的獸醫專科中心(Veterinary Specialist Centre,VSC)或小動物專科醫院(Small Animal Specialist Hospital,SASH)做為病患的寵物狗。研究參與被提供給標準治療已由狗的主人所謝絕，就重病而言，沒有有意義的標準治療存在的病患。狗被治療符合由國家健康和醫學研究理事會(National Health and Medical Research Council)(澳大利亞)對於實驗動物的照顧和使用所公布的規範，並且具有EnGeneIC動物倫理委員會(EnGeneIC Animal Ethics Committee)的核准。簽署知情同意被獲得自全部的所有人。

所有腦腫瘤藉由可行的組織學(histology)或細胞學(cytology)而被診斷。死前診斷(antemortem diagnoses)是根據在磁振造影(magnetic resonance imaging,MRI)和臨床症狀(clinical signs)上的特徵外觀的一組合。組織學的診斷被認為太侵入的在這些腦腫瘤案例中並且診斷藉由驗屍(necropsy)而被確認。

以每劑量1x10¹⁰個^EGFR微型細胞_Dox的治療被執行在一每週的基礎上。治療是經由一被無菌地放置的周圍靜脈導管(peripheral vein catheter)(左頭部的)而被投藥在2ml在一為2分鐘注入(infusion)。

MRI腫瘤成像

腫瘤影像使用一飛利浦1.5T Achieva掃描器(scanner)在Specialist磁振造影被執行。規範(protocol)使用一個8-通道頭部線圈(8-channel head coil)或8-通道膝蓋線圈(8-channel knee coil)視狗的尺寸而定(小狗使用膝蓋線圈)。

序列被獲得自在三平面所獲得的矢狀T1(sagittal T1)、軸向T2(axial T2)、冠狀梯度迴訊(Coronal Gradient Echo)、顯影前的軸向擴散加權影像(axial diffusion weighted images,DWI)、冠狀體積流體-衰減反轉恢復(coronal volumetric fluid-attenuated inversion recovery,FLAIR)以及釓後T1加權影像(post gadolinium T1 weighted images)。

IFN-γ酵素-結合免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)

血液在微型細胞給藥前被取得以及血清直接地從獸醫診所得到。IFN-γ測量使用來自Development System的犬IFN-γ DuoSet ELISA套組(#DY781B)按照製造商的說明書呈二重複執行。

結果

就在接受微型細胞治療的三隻狗中的腫瘤體積變化而言的結果被表示在圖1A-1C。線圖代表腫瘤測量[左y軸=體積呈(mm³)或最長的直徑(mm)]有如微型細胞劑量的數目(x軸)的一函數。十字(crosses)代表該等腫瘤藉由磁振造影(MRI)被觀察和測量的劑量。

在治療的期間，兩個狗顯示在某些治療時期在腫瘤體積的急劇減少(在圖1A和1B中的狗A和B)。意外地發現：狗在那些時期蒙受病毒感染。在許多可能與病毒感染有關的被檢查的參數中，被發現的是：IFN-γ的血清濃度高度地與腫瘤體積減少率相關。

在圖1A-1C的各個中，三角標記代表在所指示的劑量藉由ELISA所測量的血清干擾素γ(IFNγ)位準。右側y軸指示IFN-γ位準(呈pg/mL)。在分析被執行但IFN-γ低於該分析的偵測極限(<56pg/mL)下，數據點藉由三角標記在0pg/mL所代表。當腫瘤長度(l)、寬度(w)和高度(h)測量被做出時，腫瘤體積(V)使用橢球公式(V=(π/6)*l*w*h)而被計算出。

這些圖因此證明一在血清IFN-γ位準與腦腫瘤體積減少率之間的強相關性。什麼亦是令人驚訝的是：任何可偵測的IFN-γ位準導致增加的抗-腫瘤反應。在狗B中在劑量41(圖1B)，所指向的最低的IFN-γ位準是約500pg/mL。IFN-γ在藥物-裝載的微型細胞的腫瘤治療上的此一激烈效用是在它們之間的協同作用的一強指示。

實施例2.在以 ^EGFR 微型細胞 _Dox 和IFN-γ治療之後在小鼠異體移植物(mouse xenografts)[人類肺泡腺癌(human alveolar adenocarcinoma)]的顯著腫瘤退化(tumor regression)

這個實施例證明：以雙特異性配位體-標靶的和多柔比星-包裝的完整的微型細胞與IFN-γ的組合治療可造成在6週大雌性無胸腺的裸鼠(athymic nude mice)所建立的人類肺泡腺癌腫瘤異體移植物的退化。

如上面所描述的，微型細胞被生產自一鼠傷寒沙氏桿菌minCDE-突變體菌株並且使用一先前被描述在MacDiarmid等人(2007)的梯度離心(gradient centrifugation)/成絲作用(filamentation)/過濾/內毒素移除操作程序而被純化。亦按照MacDiarmid等人(2007)，該等被純化的微型細胞被包裝以化學治療藥物多柔比星。

該雙特異性抗體(BsAb)是一含有分別地對在微型細胞上存在的鼠傷寒沙氏桿菌O-多醣和對在肺泡腺癌細胞上過度表現的人類EGFR結合特異性的單一多肽。O-多醣特異性被衍生自一小鼠單克隆抗體，其中變異區(variable regions)被分離自一融合瘤細胞株(hybridoma cell line)並且被表示為一單-鏈變異片段(single-chain variable fragment,scFv)。該融合瘤細胞株藉由以經純化的LPS免疫小鼠以及融合淋巴球與腫瘤細胞而被製備。隨後，克隆被篩選一能夠結合O-多醣的抗體。EGFR特異性(亦被表示為一scFv)被衍生自商業抗體Erbitux®(Bristol Myers Squibb,USA)。該等 2個scFv組分藉由一可撓性連接子(flexible linker)而被分離以及一個6xHis標籤(tag)被併入在N-端(N-terminus)，以促進藉由固定化的金屬親和層析法(immobilized metal affinity chromatography)的純化，以及一個c-myc標籤在C-端以幫助在額外的偵測。例如，如由Gall et al.,Protein Engineering,Design and Selection 17：357-66(2004)所證明的，連接子連結該等scFv組分是被熟知的。

編碼該BsAb的表現載體含有一hCMV啟動子用於高-位準表現以及一單一胜肽用於分泌該BsAb至細胞培養基內。該編碼該BsAb的表現載體在化學定義的蛋白質和無動物來源的介質中被安定地轉染至懸浮適應的中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)內，以及該蛋白質在培養中被表現超過10天。

2種層析管柱被使用以純化該抗體：一固定化的金屬離子親和層析管柱(immobilized metal ion affinity chromatography column)(IMAC-HisTrap Excel)和一羥磷灰石層析管柱(hydroxyapatite chromatography column)(BioRad CHT I)。這個方法達到一個>98%的抗體純度。關於產物的病毒安全性，該抗體使用TNBP/Tween完成一溶劑/清潔劑不活化，以及一病毒的過濾。來自1L的細胞培養上澄液(cell culture supernatant)的抗體的最終產量是10mg。

在這個實施例所使用的小鼠被購買自動物資源中心(Animal Resources Centre)(Perth,Australia)，並且所有的動物實驗被執行依照GUIDE OF CARE AND USE OF LABORATORY ANIMALS,8^th ed.(National Academies Press,2011)以及動物管理委員會(Animal Ethics Committee)核可。實驗在EnGeneIC Ltd.(Sydney,Australia)的NSW農業-認證的小動物場所(NSW Agriculture-accredited small animal facility)被執行。

在37℃、在一為95%空氣和5% CO₂的潮濕大氣(humidified atmosphere)下，人類肺泡腺癌細胞(A549，ATCC)在T-75燒瓶在被補充以5%小牛血清(bovine calf serum)和麩醯胺(glutamine)的GIBCO®-RPMI 1640培養基[Life Technologies(Carlsbad,CA,USA)的一產品]中被生長在組織培養至全匯聚(full confluency)。細胞(1x10⁶)配於具有50μL生長因子減少的Matrigel®[BD Biosciences(Franklin Lakes,NJ)的產品]的50μL無血清培養基(serum-free medium)中。該等細胞接著使用一個23-規格針頭而被皮下地注射在各個小鼠的肩胛骨之間。

所形成的腫瘤使用一電子數字卡尺(Mitutoyo，Japan，具有一為+/- 0.001英吋的測量準確度)而被測量一週2次，並且平均腫瘤體積使用下列公式而被計算長度(mm)x寬度(mm ² )x0.5=體積(mm ³ )。

當該等腫瘤達到一為~285mm³的平均值時治療開始，並且小鼠被隨機分配至每組7隻小鼠的4個不同的組別。所有治療呈一為100μl的總體積而被靜脈內地(i.v.)投藥。所有微型細胞劑量含有個別類型的1x10⁹個微型細胞。

就實驗設計而言，組1(對照)沒有接受無菌的生理鹽水。組2(對照)接受每劑量IFN-γ(0.5 x 10⁴IU)。組3(對照)接受^EGFR微型細胞_Dox。組4(實驗的)接受^EGFR微型細胞_Dox和每劑量IFN-γ(0.5 x 10⁴IU)。

結果(圖2)揭示：以^EGFR微型細胞_Dox所治療的小鼠(組3)達到腫瘤安定性。相反地，以^EGFR微型細胞_Dox和IFN-γ所治療的小鼠(組4)藉由第43天在一總計6劑量之後顯示高度顯著的腫瘤退化。單獨以IFN-γ治療的小鼠(組2)顯示無抗-腫瘤效力，並且腫瘤生長有如在鹽水治療的組(組1)。

實施例3.在以 ^EGFR 微型細胞 _Dox 和IFN-γ治療之後在小鼠異體移植物(人類乳癌-中度尺寸的腫瘤~145mm ³ )的顯著腫瘤退化

這個實施例證明：以雙特異性配位體-標靶的和多柔比星-包裝的完整的微型細胞與IFN-γ的組合治療可造成在6週大雌性無胸腺的裸鼠所建立的人類乳房腫瘤異體移植物的退化。

如上面所描述的，微型細胞被純化、被包裝以多柔比星，以及使用具有抗-O-多醣和抗-EGFR特異性的單鏈雙特異性抗體而被標靶。此外，亦如所描述的，人類乳癌細胞(MDA-MB-468；ATCC)在nu/nu小鼠中被建立有如異體移植物，並且腫瘤體積被測量。

當該等腫瘤達到一為~145mm³的平均值時治療開始，並且小鼠被隨機分配至每組7隻小鼠的4個不同的組別。所有治療呈一為100μl的總體積而被i.v.投藥。所有微型細胞劑量含有個別類型的1x10⁹個微型細胞。

實驗被設計如下：組1(對照)僅接受無菌的生理鹽水。組2(對照)接受每劑量IFN-γ(0.5 x 10⁴IU)。組3(對照)接受^EGFR微型細胞_Dox。組4(實驗的)接受^EGFR微型細胞_Dox和每劑量IFN-γ(0.5 x 10⁴IU)。

如在圖3所顯示的結果揭示：以^EGFR微型細胞_Dox所治療的小鼠(組3)達到腫瘤安定性，但是藉由約第25天該等腫瘤開始再次生長，可能起因於對多柔比星抗性的發展。相反地，以^EGFR微型細胞_Dox和IFN-γ所治療的小鼠(組4)小鼠顯示高度顯著的腫瘤退化，並且藉由第30天這些腫瘤在一總計6劑量之後更像癒傷組織(scar tissue)。單獨以IFN-γ治療的小鼠(組2)顯示無抗-腫瘤效力，並且腫瘤生長有如在鹽水治療的組(組1)。

實施例4.在以 ^EGFR 微型細胞 _Dox 和IFN-γ治療之後在小鼠異體移植物(人類乳癌-大腫瘤~250mm ³ )的顯著腫瘤退化

這個實施例證明：以雙特異性配位體-標靶的和多柔比星-包裝的完整的微型細胞與IFN-γ的組合治療可造成甚至在6週大雌性無胸腺的裸鼠所建立的人類乳房腫瘤異體移植物的大尺寸腫瘤(~250mm³)的退化。

如上面所描述的，微型細胞被純化、被包裝以多柔比星以及使用具有抗-O-多醣和抗-EGFR特異性的單鏈雙特異性抗體而被標靶。此外，亦如所描述的，人類乳癌細胞(MDA-MB-468)在nu/nu小鼠中被建立有如異體移植物，並且腫瘤體積被測量。

當該等腫瘤達到一為~250mm³的平均值時治療開始。如上面，小鼠被隨機分配至每組7隻小鼠的4個不同的組別。i.v.投藥和微型細胞劑量亦如上面。

如在圖4所顯示的結果揭示：以^EGFR微型細胞_Dox所治療的小鼠(組3)達到腫瘤退化，但是藉由~第23天該等腫瘤開始再次生長；如先前的，多柔比星抗性的發展是可能的原因。另一方面，以^EGFR微型細胞_Dox和IFN-γ所治療的小鼠(組4)小鼠顯示高度顯著的腫瘤退化，並且在一總計3劑量(亦即，藉由第28天)之後這些腫瘤更像癒傷組織。單獨以IFN-γ治療的小鼠(組2)顯示無抗-腫瘤效力，並且腫瘤生長有如在鹽水治療的組(組1)。

實施例5.在以 ^EGFR 微型細胞 _Dox 和IFN-γ治療之後在小鼠異體移植物(人類乳癌-非常大的腫瘤~250mm ³ 至600mm ³ )的腫瘤退化

這個實施例證明：以雙特異性配位體-標靶的和多柔比星-包裝的完整的微型細胞與IFN-γ的組合治療可造成甚至在6週大雌性無胸腺的裸鼠所建立的人類乳房腫瘤異體移植物的非常大尺寸的腫瘤(~250mm³至600mm³)的退化。

如上面所描述的，微型細胞被純化、被包裝以多柔比星以及使用具有抗-O-多醣和抗-EGFR特異性的單鏈雙特異性抗體而被標靶。亦如所描述的，人類乳癌細胞(MDA-MB-468)在nu/nu小鼠中被建立有如異體移植物，並且腫瘤體積被測量。

當該等腫瘤達到~250mm³至600mm³時治療開始。個別的小鼠以^EGFR微型細胞_Dox和每劑量IFN-γ(0.5 x 10⁴IU)而被治療。所有治療呈一為100μl的總體積而被i.v.投藥，並且所有微型細胞劑量含有個別類型的1x10⁹個微型細胞。

結果被描繪在圖5。儘管大尺寸的該等腫瘤，所有四隻小鼠達到腫瘤退化。這個顯示：小鼠將正常地被安樂死的甚至非常大的腫瘤(~600mm³)可以^EGFR微型細胞_Dox和IFN-γ(0.5 x 10⁴IU)的組合而被有效地治療。

實施例6.在以 ^EGFR 微型細胞 _Dox 和2劑量位準的IFN-γ治療之後在小鼠異體移植物(人類肺泡腺癌)的顯著腫瘤退化

這個實施例證明：以雙特異性配位體-標靶的和多柔比星-包裝的完整的微型細胞與在2個不同劑量位準的IFN-γ的組合治療可造成在6週大雌性無胸腺的裸鼠所建立的人類肺泡腺癌異體移植物的退化。

如上面所描述的，微型細胞被純化、被包裝以多柔比星以及使用具有抗-O-多醣和抗-EGFR特異性的單鏈雙特異性抗體而被標靶。亦如所描述的，人類肺泡腺癌(A549)細胞在nu/nu小鼠中被建立有如異體移植物，並且腫瘤體積被測量。

當該等腫瘤達到一為~100mm³的平均值時治療開始，並且小鼠被隨機分配至每組7隻小鼠的4個不同的組別。所有治療呈一為100μl的總體積而被i.v.投藥。所有微型細胞劑量含有個別類型的1x10⁹個微型細胞。

組1(對照)沒有接受無菌的生理鹽水。組2(對照)接受^EGFR微型細胞_Dox(每週2次)。組3(實驗的)接受^EGFR微型細胞_Dox和每劑量IFN-γ(0.75 x 10⁴IU)，每週2次。組4(實驗的)接受^EGFR微型細胞_Dox和每劑量IFN-γ(0.5 x 10⁴IU)，每週3次。

如圖6顯示：以^EGFR微型細胞_Dox和在兩個劑量(0.5 x 10⁴IU和0.75 x 10⁴IU；組3和4)的IFN-γ所治療的小鼠達到腫瘤安定性。相反地，以^EGFR微型細胞_Dox所治療的小鼠(組2)顯示無抗-腫瘤效力，並且腫瘤生長有如在鹽水治療的組(組1)。這些數據證明：組合IFN-γ與^EGFR微型細胞_Dox是必需的在這兩個IFN-γ劑量位準以達到腫瘤安定性在治療正常地對單獨的IFN-γ治療或單獨的^EGFR微型細胞_Dox治療抗性的腫瘤。

Claims

一種用於治療在一個體的一腫瘤的方法，其包含有投藥給該個體一第一組成物，以及一含有干擾素-γ(IFN-γ)或一增加在該個體中IFN-γ的表現的試劑的第二組成物；該第一組成物含有複數個細菌衍生的完整的微型細胞或完整的被殺死的細菌細胞，它們各自包含一抗-腫瘤試劑並且在表面上攜帶一配位體，其中該配位體對一非-吞噬細胞的哺乳動物細胞表面受體具有特異性。
如請求項1的方法，其中該第二組成物包含有經純化的IFN-γ蛋白質。
如請求項1的方法，其中該第二組成物包含有一病毒疫苗。
如請求項1的方法，其中該第二組成物包含有一編碼IFN-γ的核酸。
如請求項1-4的任一項的方法，其中該第一組成物包含有自約10⁹至約10¹⁰個微型細胞或被殺死的細菌細胞。
如請求項1-5的任一項的方法，其中該抗-腫瘤試劑是一放射性核種。
如請求項1-6的任一項的方法，其中該抗-腫瘤試劑是一化學治療藥物。
如請求項7的方法，其中該化學治療藥物是一具有一小於約900道耳頓的分子量的小分子藥物。
如請求項8的方法，其中該小分子藥物是細胞毒性。
如請求項9的方法，其中該小分子藥物是一嗎福啉基蒽環衍生物。
如請求項10的方法，其中該小分子藥物是PNU-159682。
如請求項1-7的任一項的方法，其中該抗-腫瘤試劑是一功能性核酸或一編碼一功能性核酸的聚核苷酸。
如請求項12的方法，其中該功能性核酸抑制一促進腫瘤細胞增生、血管生成或對化學治療抗性和/或抑制細胞凋亡或細胞週期停滯的基因。
如請求項12的方法，其中該功能性核酸是選自於siRNA、miRNA、shRNA、lincRNA、反義RNA或者核糖核酸酵素。
一種包裝、產品或套組，其包含有一第一組成物，以及一含有干擾素-γ(IFN-γ)或一增加在個體中IFN-γ的表現的試劑的第二組成物；第一組成物含有複數個細菌衍生的完整的微型細胞或完整的被殺死的細菌細胞，它們各自包含一抗-腫瘤試劑並且在表面上攜帶一配位體，其中該配位體對一非-吞噬細胞的哺乳動物細胞表面受體具有特異性。
一種組成物，其包含有(a)複數個細菌衍生的完整的微型細胞或完整的被殺死的細菌細胞，它們各自包含一抗-腫瘤試劑並且在表面上攜帶一配位體，其中該配位體對一非-吞噬細胞的哺乳動物細胞表面受體具有特異性；以及(b)干擾素-γ(IFN-γ)或一增加在個體中IFN-γ的表現的試劑。