ES2828092T3 - Minicélulas inmunomoduladoras y métodos de uso - Google Patents

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Abstract

Una minicelula bacteriana, que comprende una proteina citolisina dependiente de colesterol, en donde dicha minicelula no presenta un anticuerpo u otra molecula que comprenda una region Fc de un anticuerpo, que cumple al menos uno de los siguiente: i) la proteina citolisina dependiente de colesterol se selecciona de listeriolisina O, listeriolisina O L461T, listeriolisina O E247M, listeriolisina O D320K, listeriolisina O E247M, listeriolisina O D320K, listeriolisina O L461T, estreptolisina O, estreptolisina O c, estreptolisina O e, esfaericolisina, antrolisina O, cereolisina, turingiensilisina O, weihenstefanensilisina, alveolisina, brevilisina, butiriculisina, tetanolisina O, noviilisina, lectinolisina, pneumolisina, mitilisina, pseudoneumolisina, suilisina, intermedilisina, ivanolisina, seeligeriolisina O, vaginolisina y piolisina, ii) la proteina citolisina dependiente de colesterol es perfringolisina O, iii) la proteina citolisina dependiente de colesterol comprende la secuencia de aminoacidos del SEQ ID NO: 1 en donde dicha minicelula no comprende invasina.

Description

DESCRIPCIÓN
Minicélulas inmunomoduladoras y métodos de uso
La presente invención se refiere a una minicélula bacteriana, que comprende una proteína citolisina dependiente de colesterol, en la que dicha minicélula no presenta un anticuerpo u otra molécula que comprende una región Fc de un anticuerpo, que cumple al menos uno de los siguiente:
i) la proteína citolisina dependiente de colesterol se selecciona de listeriolisina O, listeriolisina O L461T, listeriolisina O e247M, listeriolisina O D320K, listeriolisina O E247M, listeriolisina O D320K, listeriolisina O L461T, estreptolisina O, estreptolisina O c, estreptolisina O e, esfaericolisina, antrolisina O, cereolisina, turingiensilisina O, weihenstefanensilisina, alveolisina, brevilisina, butiriculisina, tetanolisina O, noviilisina, lectinolisina, pneumolisina, mitilisina, pseudoneumolisina, suilisina, intermedilisina, ivanolisina, seeligeriolisina O, vaginolisina, y piolisina, ii) la proteína citolisina dependiente de colesterol es perfringolisina O,
iii) la proteína citolisina dependiente de colesterol comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 1
en donde dicha minicélula no comprende invasina.
La presente invención además se refiere a dicha minicélula para su uso en el tratamiento de cáncer
La presente solicitud además divulga composiciones y métodos para la producción, purificación, formulación, y para el uso de minicélulas eubacterianas inmunomoduladoras para su uso en el tratamiento de enfermedades, tales como cáncer de vejiga y otras malignidades. El alcance de la invención, sin embargo, se define por las reivindicaciones.
Descripción de la técnica relacionada
La siguiente descripción de los antecedentes de la invención se proporciona para ayudar en el entendimiento de la invención, pero no se admite para describir o constituir la técnica anterior a la invención.
Es bien conocido que el sistema inmunitario juega un papel importante en la prevención del cáncer. Llega a estar cada vez más claro que la inmunomodulación puede ser una estrategia terapéutica atractiva en el tratamiento del cáncer. La terapia inmunomoduladora anticancerosa comercializada más antigua es una cepa atenuada viva de Mycobacterium bovis, Bacilo de Calmette-Guerin (BCG), la cual se usa como terapia adyuvante posoperatoria para el tratamiento de cáncer de vejiga invasivo no muscular. Otras estrategias inmunomoduladoras anticancerosas experimentales no comercializadas incluyen el uso de otras especies atenuadas vivas de bacterias tales como Salmonella typhimurium, Bifidobacterias, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyrogenes, Serratia marcescens, Clostridium novyi, Salmonella choleraesius, y Vibrio cholera. Aunque es algo eficaz, cada cepa usada está limitada por el riesgo de infección, el temor de la reversión genética de las cepas atenuadas vivas a patogenicidad, y sepsis. Todas estas estrategias se han encontrado con toxicidad extrema reminiscente de la infección bacteriana viva con toxicidad que se da en o cerca de la dosis más eficaz. Esto da como resultado índices terapéuticos limitados para cada tipo de cepa.
Para abordar los asuntos de toxicidad con bacterias vivas como terapia inmunomoduladora, otros han intentado usar diferentes componentes bacterianos (en lugar del organismo vivo completo) para generar el mismo efecto inmunitario. Sustancias terapéuticas experimentales de este tipo incluyen toxinas bacterianas purificadas, lipopolisacáridos proinflamatorios purificados (LPS), ácido teicoico (TCA) purificado, y otras preparaciones de pared celular bacteriana y otras fracciones subcelulares bacterianas. Estas estrategias han mejorado los perfiles de toxicidad pero son con una pérdida concomitante de eficacia en algunos casos. Además, muchas solamente estimulan una respuesta inmunitaria polarizada (o bien Th1 o Th2) estimulando la mayoría respuestas Th2 (generadoras de anticuerpo). Está razonablemente bien documentado que una respuesta Th1 (respuesta inmunitaria celular) parece ser preferencial con respecto a tener un efecto inmunomodulador antitumoral. Por último, estas preparaciones pueden ser difíciles de fabricar a una escala y calidad para soportar la demanda del mercado y pueden solamente generar por último un subconjunto de respuestas inmunitarias incapaces de generar efectos antitumorales. En el caso de toxinas proteicas usadas en el tratamiento de la mayoría de los cánceres, la eficacia de la toxina proteica está significativamente limitada por la toxicidad a tejidos normales. Además, los parámetros farmacocinéticos (PK) del fármaco que contribuyen a los niveles de exposición sistémicos frecuentemente no están y no pueden estar completamente optimizados para simultáneamente maximizar la actividad antitumoral y minimizar los efectos secundarios, particularmente cuando las mismas dianas celulares o mecanismos son responsables de la actividad antitumoral y la toxicidad de tejido normal. De nuevo, esto da como resultado un índice terapéutico muy limitado, habitual para la mayoría de las toxinas proteicas.
Además de vectores bacterianos y componentes bacterianos vivos como "generalistas" inmunomoduladores, otros investigadores han intentado desarrollar diferentes citocinas y quimiocinas inmunomoduladoras de Th1 específicas como sustancias terapéuticas anticancerosas. Ejemplos incluyen, pero sin limitación, interferón gamma (IFN-y), interferón alfa (IFN-a), factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos (GMCSF), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), interleuquina-2 (IL-2), interleuquina-12 (IL-12), e interleuquina-18 (IL-18). Cada una de estas estrategias han estado limitadas por la toxicidad inesperada e intensa con poco o ningún beneficio terapéutico inmunológico cuando se administraban solas. Llega a estar algo más claro que los agentes de citocina o quimiocina solos no invocan el espectro completo de la respuesta inmunitaria Th1 necesaria para tener un efecto anticanceroso y que estos factores probablemente estén trabajando en sintonía a variados niveles que son dinámicos con el tiempo. Esto es una cascada casi imposible de sucesos de señalización inmunológica para recapitular y orquestar con una formulación de producto múltiple. La mayoría de las citocinas agente solas han fallado clínicamente, siendo la excepción el interferón pegilado para el tratamiento de infecciones víricas de la hepatitis C crónica.
Basándose en las limitaciones observadas de estas estrategias para el desarrollo de terapias anticancerosas inmunomoduladoras, hay una necesidad de una terapia inmunomoduladora que podría imitar una infección bacteriana sin introducir el riesgo de infección y toxicidad asociada a infección mientras que aún invoca una respuesta inmunitaria potente y suficientemente diversa para impartir actividad anticancerosa.
Sumario
La presente invención se define en las reivindicaciones. La siguiente divulgación está describiendo la invención con mayor detalle. En la medida en que la descripción comprende las realizaciones no contenidas en el alcance de las reivindicaciones, estas realizaciones deberían considerarse como ilustrativas para posibles alternativas, sin embargo, no como parte de la invención. Algunas realizaciones divulgan una minicélula bacteriana, que comprende una proteína citolisina dependiente de colesterol, en la que dicha minicélula no presenta un anticuerpo u otra molécula que comprende una región Fc de un anticuerpo.
En algunas realizaciones, la proteína citolisina dependiente de colesterol se selecciona de listeriolisina O, listeriolisina O L461T, listeriolisina O E247M, listeriolisina O D320K, listeriolisina O E247M, listeriolisina O D320K, listeriolisina O L461T, estreptolisina O, estreptolisina O c, estreptolisina O e, esfaericolisina, antrolisina O, cereolisina, turingiensilisina O, weihenstefanensilisina, alveolisina, brevilisina, butiriculisina, tetanolisina O, noviilisina, lectinolisina, pneumolisina, mitilisina, pseudoneumolisina, suilisina, intermedilisina, ivanolisina, seeligeriolisina O, vaginolisina, y piolisina. En algunas realizaciones, la proteína citolisina dependiente de colesterol es perfringolisina O. En algunas realizaciones, la proteína citolisina dependiente de colesterol comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 1.
De acuerdo con la invención, la minicélula no comprende invasina.
En algunas realizaciones, la minicélula además comprende una citocina Th1. En algunas realizaciones, la citocina Th1 se selecciona de IL-2, GMCSF, IL-12p40, IL-12p70, IL-18, TNF-a e IFN-y.
En algunas realizaciones, la minicélula además comprende una citocina Th2. En algunas realizaciones, la citocina Th2 se selecciona de IL-1 a, IL-1p, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13.
En algunas realizaciones, la minicélula además comprende una fosfolipasa. En algunas realizaciones, la fosfolipasa es PC-PLC o PI-PLC.
En algunas realizaciones, la minicélula comprende una toxina proteica seleccionada de los fragmentos A/B de la toxina diftérica, el fragmento A de la toxina diftérica, toxinas LF y EF del ántrax, toxina adenilato ciclasa, gelonina, botulinolisina B, botulinolisina E3, botulinolisina C, toxina botulínica, toxina colérica, toxinas A, B y alfa de Clostndium, ricina, toxina shiga A, toxina tipo shiga, toxina A del cólera, toxina pertussis S1, exotoxina A de Pseudomonas, toxina lábil por calor de E. coli (LTB), melitina, caspasas activadas, pro-caspasas, citocinas, quimiocinas, péptidos penetrantes de células, y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, la minicélula no comprende ningún otra parte terapéuticamente activa. En algunas realizaciones, la minicélula no comprende una molécula pequeña terapéutica, ninguna otra proteína terapéutica, o un ácido nucleico terapéutico. En algunas realizaciones, la minicélula no presenta la porción de unión Fc de la Proteína G o la Proteína A. En algunas realizaciones, la minicélula no comprende ningún ácido nucleico terapéutico, por ejemplo un ARNip.
Algunas realizaciones divulgadas en el presente documento proporcionan una bacteria productora de minicélula, que comprende: un gen expresable que codifica un producto génico productor de minicélula que modula uno o más de la formación de septo, la fisión binaria, y la segregación cromosómica; y un casete de expresión recombinante capaz de la expresión funcional de una proteína citolisina dependiente de colesterol, en la que la bacteria no presenta un anticuerpo u otra molécula que comprende una región Fc de un anticuerpo y no presenta la porción de unión Fc de la Proteína G o la Proteína A.
En algunas realizaciones, la bacteria productora de minicélula además comprende: un gen "de suicidio genético" expresable que codifica una endonucleasa heteróloga, en la que el cromosoma de la bacteria productora de minicélula comprende uno o más sitios de reconocimiento de la endonucleasa; una auxotrofia definida; y una deleción o mutación en el gen IpxM/msbB.
En algunas realizaciones, la endonucleasa se selecciona de I-CeuI, PI-SceI, I-ChuI, I-CpaI, I-SceIII, I-CreI, I-MsoI, IScelI, I-ScelV, I-Csml, I-Dmol, I-PorI, PI-Tlil, PI-TlilI, y PI-ScpI. En algunas realizaciones, la auxotrofia es debida a una deleción o mutación inactivadora en un gen metabólico esencial. En algunas realizaciones, el gen expresable que codifica el producto génico productor de minicélula se selecciona de ftsZ, sulA, ccdB, y sfiC.
En algunas realizaciones, la proteína citolisina dependiente de colesterol se selecciona de listeriolisina O, listeriolisina O L461T, listeriolisina O E247M, listeriolisina O D320K, listeriolisina O E247M, listeriolisina O D320K, listeriolisina O L461T, estreptolisina O, estreptolisina O c, estreptolisina O e, esfaericolisina, antrolisina O, cereolisina, turingiensilisina O, weihenstefanensilisina, alveolisina, brevilisina, butiriculisina, tetanolisina O, noviilisina, lectinolisina, pneumolisina, mitilisina, pseudoneumolisina, suilisina, intermedilisina, ivanolisina, seeligeriolisina O, vaginolisina, y piolisina. En algunas realizaciones, la proteína citolisina dependiente de colesterol es perfringolisina O. En algunas realizaciones, la proteína citolisina dependiente de colesterol comprendel SEQ ID NO: 1.
Las minicélulas se pueden usar para el tratamiento de cáncer.
Algunas realizaciones proporcionan las minicélulas para su uso en el tratamiento de cáncer, que comprende administrar a un paciente en necesidad del mismo una minicélula bacteriana que comprende una proteína citolisina dependiente de colesterol, en el que dicha administración induce un efecto inmunomodulador antitumoral no inmunógeno.
De acuerdo con la invención, la minicélula no presenta un anticuerpo u otra molécula que comprende una región Fc de un anticuerpo.
En algunas realizaciones, la proteína citolisina dependiente de colesterol se selecciona de listeriolisina O, listeriolisina O L461T, listeriolisina O E247M, listeriolisina O D320K, listeriolisina O E247M, listeriolisina O D320K, listeriolisina O L461T, estreptolisina O, estreptolisina O c, estreptolisina O e, esfaericolisina, antrolisina O, cereolisina, turingiensilisina O, weihenstefanensilisina, alveolisina, brevilisina, butiriculisina, tetanolisina O, noviilisina, lectinolisina, pneumolisina, mitilisina, pseudoneumolisina, suilisina, intermedilisina, ivanolisina, seeligeriolisina O, vaginolisina, y piolisina. En algunas realizaciones, la proteína citolisina dependiente de colesterol es perfringolisina O. En algunas realizaciones, la proteína citolisina dependiente de colesterol comprendel SEQ ID NO: 1.
De acuerdo con la invención, la minicélula no comprende invasina.
En algunas realizaciones, la minicélula además comprende una citocina Th1. En algunas realizaciones, la citocina Th1 se selecciona de IL-2, GMCSF, IL-12p40, IL-12p70, IL-18, TNF-a e IFN-y.
En algunas realizaciones, la minicélula además comprende una citocina Th2. En algunas realizaciones, la citocina Th2 se selecciona de IL-1a, IL-1p, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13.
En algunas realizaciones, la minicélula además comprende una fosfolipasa. En algunas realizaciones, la fosfolipasa es PC-PLC o PI-PLC.
En algunas realizaciones, el método además comprende una toxina proteica seleccionada de los fragmentos A/B de la toxina diftérica, el fragmento A de la toxina diftérica, toxinas LF y Ef del ántrax, toxina adenilato ciclasa, gelonina, botulinolisina B, botulinolisina E3, botulinolisina C, toxina botulínica, toxina colérica, toxinas A, B y alfa de Clostridium, ricina, toxina shiga A, toxina tipo shiga, toxina A del cólera, toxina pertussis S1, exotoxina A de Pseudomonas, toxina lábil por calor de E. coli (LTB), melitina, caspasas activadas, pro-caspasas, citocinas, quimiocinas, péptidos penetrantes de células, y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, la minicélula no comprende ningún otra parte terapéuticamente activa. En algunas realizaciones, la minicélula no comprende una molécula pequeña terapéutica, ninguna otra proteína terapéutica, o un ácido nucleico terapéutico. En algunas realizaciones, la minicélula no presenta la porción de unión Fc de la Proteína G o la Proteína A.
En algunas realizaciones, el cáncer comprende un tumor sólido, un tumor metastásico, o un tumor líquido. En algunas realizaciones, el cáncer es de origen epitelial, fibroblástico, muscular u óseo. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona de cánceres de mama, pulmón, pancreáticos, prostáticos, testiculares, ováricos, gástricos, intestinales, de boca, lengua, faringe, hepáticos, anales, rectales, de colon, esofágicos, de vesícula biliar, piel, útero, vaginales, de pene y renales. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de vejiga urinaria. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona de adenocarcinomas, sarcomas, fibrosarcomas, y cánceres de ojo, cerebro y huesos. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona de linfoma no Hodgkin, mieloma, linfoma de Hodgkin, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide aguda y leucemia mieloide crónica.
En algunas realizaciones, la administración genera una respuesta inmunitaria dominada por Th1. En algunas realizaciones, la administración genera una respuesta inmunitaria dominada por Th2.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es un histograma que muestra que los resultados de un ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) indica permeabilización de membrana celular de mamífero mediada por PFO.
La Figura 2 es una gráfica que muestra citoxicidad in vitro de perfringolisina O recombinante purificada (BTX-100) frente a cantidades equivalentes de perfringolisina O (PFO) administrada por minicélulas.
La Figura 3 es una gráfica que muestra que la eliminación de la parte de direccionamiento ("targeting moiety") invasina no tenía efecto sobre la actividad antitumoral de minicélulas que contenía PFO.
La Figura 4 representa fotografías y una gráfica que muestra efectos antitumorales similares de las minicélulas VAX-IPD en metástasis de pulmón y ovario.
La Figura 5 es un histograma que muestra que las minicélulas VAX-IPD son detectables en los pulmones pero no en los ovarios de ratones tras la administración intravenosa.
La Figura 6 es un histograma que muestra que las minicélulas VAX-IPD tienen poco efecto antitumoral en ratones NIH-III fuertemente inmunodeprimidos.
La Figura 7 es una gráfica que muestra que las minicélulas VAX-IP son altamente eficaces en el modelo murino MB49 de cáncer de vejiga invasivo no muscular establecido.
La Figure 8 es una ilustración esquemática para un esquema general de la construcción de cepas productoras de minicélula VAX-IP y minicélulas VAX-IP a partir de las mismas.
La Figura 9 es un mapa plasmídico de pVX-336.
La Figura 10 es un mapa plasmídico de pVX-128.
La Figura 11 muestra las micrografías electrónicas de barrido de la formación de minicélula inducible.
La Figura 12 representa fotografías y una gráfica que demuestra la expresión de invasina y perfringolisina O en minicélulas VAX-IP.
Descripción detallada
Definiciones
Como se usa en el presente documento, el término "minicélulas inmunomoduladoras de Th1" se refiere a minicélulas que son capaces de estimular una respuesta inmunitaria Th1.
Como se usa en el presente documento, el término "minicélulas inmunomoduladoras de Th2" se refiere a minicélulas que son capaces de estimular una respuesta inmunitaria Th2.
Como se usa en el presente documento, el término "minicélulas inmunomoduladoras de Th1/Th2" se refiere a minicélulas que son capaces de estimular tanto una respuesta inmunitaria Th1 como Th2.
Como se usa en el presente documento, el término "minicélula inmunomoduladora invasiva recombinante" se refiere a una minicélula que se ha producido por ingeniería genética para expresar y presentar proteínas de superficie de minicélula heterólogas capaces de estimular la internalización dentro de células eucariotas.
Como se usa en el presente documento, el término "minicélula inmunomoduladora invasiva natural" se refiere a una minicélula producida a partir de una bacteria normalmente invasiva de modo que dichas minicélulas expresan y presentan proteínas de superficie de minicélula de origen natural capaces de estimular la internalización dentro de células eucariotas.
Como se usa en el presente documento, el término "inmunógena" se refiere a una respuesta inmunitaria humoral o celular específica a antígeno, mediada por mecanismos inmunitarios adaptativos. Una minicélula inmunógena dirige la respuesta inmunitaria para responder a un antígeno particular y específico y es útil en el contexto del uso de minicélulas inmunógenas como vacuna específica para un patógeno, por ejemplo.
Como se usa en el presente documento, el término "inmunomoduladora" se refiere a la modulación genérica (es decir, no inmunógena per se) de la respuesta inmunitaria de una manera deseada que incluye, pero sin limitación, la producción de las respuestas inmunitarias Th1 y Th2. Como se usa en el presente documento, el término "inmunoterapia" se refiere al uso de un compuesto inmunomodulador, por ejemplo, una minicélula inmunomoduladora, para generar una respuesta inmunitaria genérica (es decir no inmunógena per se) que tenga efecto beneficioso con respecto a la eliminación o frenado de la progresión de la enfermedad, especialmente cáncer.
Como se usa en el presente documento, el término "minicélula adherente" se refiere a una minicélula que es capaz de unirse y adherirse a la superficie de una célula eucariota no constitutivamente fagocítica sin estimular apreciable endocitosis de dichas minicélulas.
Como se usa en el presente documento, el término "minicélula mucoadherente" se refiere a una minicélula que es capaz de unirse y adherirse a una superficie mucosa.
Como se usa en el presente documento, el término "minicélulas VAX-P" se refiere a minicélulas que expresan y comprenden perfringolisina O (PFO). Como se usa en el presente documento, el término "minicélulas VAX-IP" se refiere a minicélulas que expresan y presentan la molécula de superficie celular dirigida a pan-integrina Beta Invasina de Yersinia pseudotuberculosis y algún equivalente funcional de la misma, en el que las minicélulas además comprenden perfringolisina O (PFO).
Como se usa en el presente documento, el término "minicélulas VAX-IPT" se refiere a minicélulas que expresan y presentan la molécula de superficie celular dirigida a pan-integrina Beta Invasina de Yersinia pseudotuberculosis y algún equivalente funcional de la misma, en el que las minicélulas además comprenden perfringolisina O (PFO) y una toxina proteica.
Como se usa en el presente documento, el término "minicélulas VAX-IPP" se refiere a minicélulas que expresan y presentan la molécula de superficie celular dirigida a pan-integrina Beta Invasina de Yersinia pseudotuberculosis y algún equivalente funcional de la misma, en el que las minicélulas comprenden perfringolisina O (PFO) y un polipéptido exógeno distinto de una toxina proteica. Como se usa en el presente documento, el término "minicélulas VAX-IPD" se refiere a minicélulas que expresan y presentan la molécula de superficie celular dirigida a panintegrina Beta Invasina de Yersinia pseudotuberculosis y algún equivalente funcional de la misma, en el que las minicélulas comprenden perfringolisina O (PFO) y el fragmento catalítico de la toxina diftérica.
Como se usa en el presente documento, el término "minicélulas VAX-IPG" se refiere a minicélulas que expresan y presentan la molécula de superficie celular dirigida a pan-integrina Beta Invasina de Yersinia pseudotuberculosis y algún equivalente funcional de la misma, en el que las minicélulas comprenden perfringolisina O (PFO) y gelonina. Como se usa en el presente documento, el término "minicélulas VAX-IPPA" se refiere a minicélulas que expresan y presentan la molécula de superficie celular dirigida a pan-integrina Beta Invasina de Yersinia pseudotuberculosis y algún equivalente funcional de la misma, en el que las minicélulas comprenden perfringolisina O (PFO) y exotoxina A de Pseudomonas.
Como se usa en el presente documento, el término "minicélulas VAX-IPR" se refiere a minicélulas que expresan y presentan la molécula de superficie celular dirigida a pan-integrina Beta Invasina de Yersinia pseudotuberculosis y algún equivalente funcional de la misma, en el que las minicélulas comprenden perfringolisina O (PFO) y ricina A.
Como se usa en el presente documento, el término "proteína citolisina formadora de poro" y el término "proteína citolisina dependiente de colesterol" se usan indistintamente y se refieren a una proteína que puede atacar las membranas celulares que comprenden colesterol para formar poro(s) sobre la membrana celular. Para algunas proteínas citolisina dependientes de colesterol, no se requiere la presencia de colesterol en la membrana celular para que proteína citolisina dependiente de colesterol se una a la membrana celular. Por ejemplo, la proteína citolisina dependiente de colesterol puede ser un miembro de la familia de las exotoxinas formadoras de poro pbarril secretadas por bacterias Gram-positivas. Ejemplos no limitantes de proteínas citolisina dependientes de colesterol incluyen listeriolisina O, listeriolisina O L461T, listeriolisina O E247M, listeriolisina O D320K, listeriolisina O E247M, listeriolisina O D320K, listeriolisina O L461T, estreptolisina O, estreptolisina O c, estreptolisina O e, esfaericolisina, antrolisina O, cereolisina, turingiensilisina O, weihenstefanensilisina, alveolisina, brevilisina, butiriculisina, tetanolisina O, noviilisina, lectinolisina, pneumolisina, mitilisina, pseudoneumolisina, suilisina, intermedilisina, ivanolisina, seeligeriolisina O, vaginolisina, piolisina, y perfringolisina O. En algunas realizaciones, la proteína citolisina dependiente de colesterol comprende una secuencia de aminoácidos de ECTGLAWEWWR (SEq ID NO: 1). En algunas realizaciones, la proteína citolisina dependiente de colesterol comprende una secuencia de aminoácidos de WEWWRT (SEQ ID NO: 2).
Como se usa en el presente documento, el término "ácido nucleico terapéutico" se refiere a una molécula de ácido nucleico que tiene un efecto terapéutico cuando se introduce en un organismo eucariota (por ejemplo, un mamífero tal como el ser humano). Un ácido nucleico terapéutico puede ser, por ejemplo, un ADNmc, un ADNbc, un ARNmc (incluido un ARNhc), un ARNbc (incluido un ARNip), un ARNt (incluido un ARNt de uso codónico raro), un ARNm, un micro ARN (miARN), ARN ribosómico (ARNr), un ácido peptidonucleico (ANP), un híbrido de ADN:ARN, un oligonucleótido antisentido, una ribozima, un aptámero, o cualquier combinación de los mismos.
Como se usa en el presente documento, el término "proteína terapéutica" se refiere a una proteína que tiene un efecto terapéutico cuando se introduce en un organismo eucariota (por ejemplo, un mamífero tal como el ser humano). Un polipéptido terapéutico puede ser, por ejemplo, una toxina proteica, una citolisina dependiente de colesterol, un enzima funcional, una caspasa activada, una pro-caspasa, una citocina, una quimiocina, un péptido penetrante de células, o cualquier combinación y/o pluralidad de lo anterior.
Como se usa en el presente documento, el término "terapéutico" significa que tiene un efecto biológico o combinación de efectos biológicos que previene, inhibe, elimina, o previene la progresión de una enfermedad u otros procesos biológicos aberrantes en un animal. Una parte terapéuticamente activa puede incluir, por ejemplo, una molécula pequeña terapéuticamente activa, una proteína terapéuticamente activa, y/o un ácido nucleico terapéuticamente activo,
Como se usa en el presente documento, el término "molécula pequeña" se refiere a una molécula que tiene un efecto biológico y que tiene un peso molecular de menos de 5.000 Daltons. En algunas realizaciones, las moléculas pequeñas tienen un peso molecular de menos de 2.500 Daltons. En algunas realizaciones, las moléculas pequeñas tienen un peso molecular de menos de 1.000 Daltons. En algunas realizaciones, las moléculas pequeñas tienen un peso molecular de menos de 800 Daltons. En algunas realizaciones, las moléculas pequeñas tienen un peso molecular de menos de 500 Daltons.
Como se usa en el presente documento, el término "fármaco de molécula pequeña terapéutico" o "fármaco de molécula pequeña" se refiere a una molécula pequeña que tiene un efecto terapéutico cuando se introduce en un organismo eucariota (por ejemplo, un mamífero tal como el ser humano).
Como se usa en el presente documento, el término "diana de invasina integrina Beta " se refiere a un heterodímero de integrina Beta capaz de ser unido por invasina.
Como se usa en el presente documento, el término "gen de división celular procariota" se refiere a un gen que codifica un producto génico que participa en el proceso de división celular procariota. Se han descubierto y caracterizado en la técnica muchos genes de división celular. Ejemplos de genes de división celular incluyen, pero sin limitación, zipA, sulA, secA, dicA, dicB, dicC, dicF, ftsA, ftsl, ftsN, ftsK, ftsL, ftsQ, ftsW, ftsZ, minC, minD, minE, seqA, ccdB, sfiC, y ddlB.
Como se usa en el presente documento, el término "transgén" se refiere a un gen o material genético que se ha trasferido de manera natural o por alguna de un número de técnicas de ingeniería genética de un organismo a otro.
En algunas realizaciones, el transgén es un segmento de ADN que contiene una secuencia génica que se ha aislado de un organismo y se introduce en un organismo diferente. Este segmento no nativo de a Dn puede conservar la capacidad de producir ARN o proteína en el organismo transgénico, o puede alterar la función normal del código genético del organismo transgénico. En algunas realizaciones, el transgén es una secuencia de ADN construida de manera artificial, independientemente de si contiene o no una secuencia codificante del gen, que se introduce en un organismo en el que el transgén no se encontraba previamente.
Como se usa en el presente documento, se dice que un agente se ha "purificado" si se incrementa su concentración, y/o se disminuye la concentración de uno o más contaminantes indeseados, en una composición relativa a la composición de la que se ha purificado el agente. En algunas realizaciones, la purificación incluye enriquecimiento de un agente en una composición y/o aislamiento de un agente de la misma.
El término "suficientemente desprovisto de células parentales", sinónimo de "suficientemente desprovisto", como se usa en el presente documento se refiere a una composición de minicélulas purificadas que tienen un nivel de contaminación de célula parental que tiene poco o ningún efecto sobre el perfil de toxicidad y/o efecto terapéutico de minicélulas terapéuticas dirigidas.
El término "dominio" o "domino proteico" usado en el presente documento se refiere a una región de una molécula o estructura que comparte características físicas y/o químicas comunes. Ejemplos no limitativo de dominios proteicos incluyen regiones de unión de transmembrana hidrófoba o membrana periférica, regiones enzimáticas o receptoras globulares, dominios de interacción proteína-proteína, y/o dominios de unión de ácido nucleico.
Los términos "Eubacteria" y "procariota" se usa en el presente documento tal como estos términos son usados por los expertos en la materia. Los términos "eubacteriano" y "procariota" usado en el presente documento abarcan Eubacterias, incluidas tanto bacterias Gram-negativas y Gram-positivas, virus procariotas (por ejemplo, bacteriófago), y parásitos intracelulares obligados (por ejemplo, Richettsia, Chlamydia, etc.).
El término "polipéptido inmunopotenciador" es sinónimo de "polipéptido inmunoestimulador" y "polipéptido inmunomodulador" y los términos se usan indistintamente en el presente documento para referirse a cualquier colección de diversos tipos de molécula proteica que tienen un efecto inmunomodulador cuando se introduce en un organismo o célula eucariota (por ejemplo, un mamífero tal como el ser humano). Un polipéptido inmunomodulador puede ser una citocina, una quimiocina, una citolisina dependiente de colesterol, un enzima funcional, un anticuerpo o mimético de anticuerpo, una caspasa activada, una pro-caspasa, una citocina, una quimiocina, un péptido penetrante de células, o cualquier combinación y/o pluralidad de lo anterior.
Los términos "inmunógeno" y "antígeno" son intercambiables y se usan en el presente documento para referirse a polipéptidos, carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos, y otras moléculas frente a las que se puede preparar una respuesta de anticuerpo específico a antígeno, celular y/o alergénica. En el contexto de la presente invención, "inmunogenicidad", sinónimo de "antigenicidad" de la minicélula no es responsable del efecto inmunoterapéutico. Las respuestas inmunitarias específicas a antígeno dependen de la presencia del antígeno/inmunógeno, y no están incluidas en la definición de las respuestas inmunomoduladoras Th1 o Th2 como se usa en el presente documento. El término "sobreexpresión" usado en el presente documento se refiere a la expresión de un ácido nucleico funcional, polipéptido o proteína codificada por ADN en una célula hospedadora, en el que el ácido nucleico, polipéptido o proteína normalmente ninguno no está presente en la célula hospedadora, o en el que el ácido nucleico, polipéptido o proteína está presente en la célula hospedadora a un nivel superior que el normalmente expresado a partir del gen endógeno que codifica el ácido nucleico, polipéptido o proteína.
El término "modular" como se usa en el presente documento significa interactuar con una diana directa o indirectamente para alterar la actividad de la diana para regular un proceso biológico. El modo de "modular" incluye, pero sin limitación, aumentar la actividad de la diana, inhibir la actividad de la diana, limitar la actividad de la diana, y extender la actividad de la diana.
El término "heterólogo" como se usa en el presente documento se refiere a una proteína, gen, ácido nucleico, agente de formación de imagen, componente tampón, o cualquier otro material biológicamente activo o inactivo que no se encuentra de manera natural en una minicélula o cepa bacteriana productora de minicélula que se expresa, transcribe, traduce, amplifica o de otra manera se genera por cepas bacterianas productoras de minicélula que albergan material genético recombinante que codifica dicho material heterólogo o que codifica genes que son capaces de producir dicho material heterólogo (por ejemplo, un metabolito bioactivo no nativo a la célula parental). El término "exógeno" como se usa en el presente documento se refiere a una proteína (incluidos los anticuerpos), gen, ácido nucleico, fármaco de molécula pequeña, agente de formación de imagen, tampón, radionucleido, o cualquier otro material biológicamente activo o inactivo que no es nativo a una célula, o en el caso de una minicélula, no nativo a la célula parental de la minicélula. El material exógeno difiere del material heterólogo en virtud del hecho de que se genera, purifica, y añade por separado.
El término "terapéutico" como se usa en el presente documento significa que tiene un efecto biológico o combinación de efectos biológicos que previene, inhibe, elimina, o previene la progresión de una enfermedad u otros procesos biológicos aberrantes en un animal. El término "diagnóstico" como se usa en el presente documento significa que tiene la capacidad de detectar, controlar, seguir, y/o identificar una enfermedad o afección en un animal (incluidos los seres humanos) o de una muestra biológica incluyendo, pero sin limitación, sangre, orina, saliva, sudor y heces.
El término "teranóstico" como se usa en el presente documento significa que tiene los efectos combinados de una composición terapéutica y una diagnóstica.
El término "recombinantemente expresado" como se usa en el presente documento significa la expresión de uno o más ácido(s) nucleico(s) y/o proteína(s) a partir de una molécula de ácido nucleico que se construye usando técnicas de ingeniería genética modernas en las que la molécula de ácido nucleico construida no se da de manera natural en minicélulas y/o cepas bacterianas productoras de minicélula en las que la molécula de ácido nucleico está presente como una molécula de ácido nucleico episómico o como parte del cromosoma bacteriano productor de minicélula.
El término "episómico" como se usa en el presente documento significa una molécula de ácido nucleico que es independiente del(de los) cromosoma(s) de un organismo o célula dada.
El término "destoxificado" como se usa en el presente documento se refiere a una modificación realizada a una composición o componente de la misma que da como resultado una reducción significativa en toxicidad aguda de la composición modificada o componente de la misma, independientemente de cuál sea la base biológica causante de la toxicidad de la composición o el componente de la misma.
Como se usa en el presente documento, el término "molécula bioactiva" se refiere a una molécula que tiene un efecto biológico sobre un organismo o célula eucariota (por ejemplo, un mamífero tal como el ser humano) cuando se introduce en el organismo o la célula humana. Moléculas bioactivas incluyen, pero sin limitación, ácidos nucleicos terapéuticos, polipéptidos terapéuticos (incluidas las toxinas proteicas) y fármacos de molécula pequeña terapéuticos.
Descripción
El alcance de la presente invención se define por las reivindicaciones adjuntas. Si en la siguiente descripción las realizaciones están divulgadas sin caer bajo el alcance de las reivindicaciones, se deberían considerar como ilustrativas, sin embargo, no como parte de la invención. La presente solicitud se refiere al uso de minicélulas bacterianas in vitro e in vivo para estimular el sistema inmunitario de manera que tenga un efecto anticanceroso indirecto mediado por dicha respuesta inmunitaria. Las minicélulas eubacterianas tienen distintas ventajas como inmunomoduladores, ya que imitan la bacteria viva pero no están vivas y no son infecciosas y, por lo tanto, tienen toxicidad reducida cuando se comparan con las terapias inmunomoduladoras con bacterias vivas. Además, las minicélulas bacterianas se pueden producir por ingeniería genética de manera que contengan diferentes componentes moleculares, cada uno de los cuales puede preferentemente aumentar, invocar, o de otra manera incitar un cierto tipo de respuesta inmunitaria (es decir, Th1 frente a Th2). Las minicélulas bacterianas divulgadas en el presente documento se diseñan para generar respuestas inmunitarias que tienen indirecta actividad anticancerosa además de alguna actividad antitumoral directa. Las minicélulas también pueden estar dirigidas específicamente a tipos celulares o tejidos que se sabe que están implicados en la iniciación, promoción, soporte, y mantenimiento de una respuesta inmunitaria en una animal. La presente solicitud proporciona el uso de minicélulas bacterianas como terapias inmunomoduladoras no vivas para cáncer y otras enfermedades.
Las minicélulas bacterianas son nanopartículas biológicas encapsuladas por membrana acromosómicas (aproximadamente 250 - 500 nm de diámetro) que se forman por bacterias tras una alteración en el aparato de división normal de las células bacterianas. Esencialmente, las minicélulas son pequeñas réplicas metabólicamente activas de células bacterianas normales con la excepción de que no contienen ADN cromosómico y como tal, son no divisoras, no viables, y no infecciosas. Aunque las minicélulas no contienen cromosomas bacterianos, las moléculas de ADN plasmídico (más pequeñas que los cromosomas), moléculas de ARN (de todos los subtipos y estructuras), proteínas nativas y/o recombinantemente expresadas, y otros metabolitos se ha demostrado que todos se segregan dentro de las minicélulas. Las minicélulas son únicamente adecuadas como inmunomoduladores in vivo debido a que se pueden producir por ingeniería genética para combinar uno o más diferentes componentes moleculares inmunomoduladores de origen natural, heterólogos o exógenos en una partícula única en la que cada componente está presente en cantidades discretas. Esto contrasta brutalmente con las inmunoterapias basadas en bacterias en las que las bacterias vivas son capaces de continuar dividiéndose, son persistentes, y generan cantidades desconocidas de los componentes inmunomoduladores de novo después de la administración in vivo. La persistencia y la propagación de las inmunoterapias con bacterias vivas pueden conducir a muchas complicaciones diferentes incluyendo infección, insuficiencia orgánica, sepsis, y muerte. En resumen, las minicélulas se pueden "producir por ingeniería genética" para preferentemente encapsular, acoplarse a, o absorber moléculas biológicamente activas, incluidos diversos ácidos nucleicos, proteínas, fármacos de molécula pequeña, y cualquier combinación de los mismos para posterior generación de respuestas inmunomoduladoras en aplicaciones medicinales tanto profilácticas como terapéuticas en las que la prevención, el mantenimiento, y/o la inhibición de la enfermedad por medio de dicha respuesta inmunomoduladora es deseable.
Las minicélulas bacterianas producidas por ingeniería genética se han usado directamente como agentes anticancerosos como se describe en el documento de Patente de EE.UU. N.° 7.183.105. Por ejemplo, se ha enseñado dentro del documento de Patente de EE.UU. N.° 7.183.105 que las minicélulas se pueden producir por ingeniería genética para usar los anticuerpos localizados en la superficie de la minicélula para dirigir y administrar fármacos de molécula pequeña, péptidos, proteínas, y diversos ácidos nucleicos, junto o en sintonía directamente con células cancerosas para ejercer un efecto anticanceroso dirigido directo. Otros investigadores también han publicado los mismos descubrimientos que los enseñados en el documento de Patente de EE.UU. N.° 7.183.105, con respecto al uso de minicélulas como vehículos de suministro dirigidos, como se ilustra en las Publicaciones de Patente de EE.UU. N.° 20070298056, 20080051469 y 20070237744, cada una de las cuales se incorpora en el presente documento por referencia. Ninguna de estas referencias enseñan que las minicélulas se puedan producir por ingeniería genética y utilizar como inmunoterapias anticancerosas, capaces de ejercer efectos antitumorales indirectos. Más bien, cada referencia enseña la misma estrategia de uso de minicélulas para dirigir específicamente y administrar agentes anticancerosos solamente directamanente a células tumorales in vivo. Las referencias anteriormente incluidas enseñan colectivamente a no usar minicélulas bacterianas para causar efectos inmunomoduladores no inmunógenos cuando se usan como terapias de cáncer in vivo. Por ejemplo, el documento de patente de EE.UU. N.° 7.183.105 describe varias estrategias que se pueden tomar para disminuir o evadir respuestas inmunitarias que incluyen el uso de minicélulas de bacterias en forma de L (que no contienen membrana exterior) así como generar protoplastos (no contienen membrana exterior ni pared celular). Ejemplos proporcionados en las Publicaciones de Patente de EE.UU. N.° 20070298056, 20080051469 y 20070237744 indican que se requiere dirigir, usando un anticuerpo selectivo para un receptor de superficie celular selectivo a tumor conocido acoplado a la superficie del vehículo minicélula para la actividad antitumoral. Además, estas referencias también indican que cuando se usan minicélulas no dirigidas, no se observa esa respuesta antitumoral significativa. En otro trabajo relacionado, MacDiarmid y colaboradores demuestran que tanto minicélulas no dirigidas como minicélulas dirigidas a tumor que no contienen carga de fármaco citotóxica, son igualmente incapaces de generar una respuesta antitumoral y que se requieren tanto un anticuerpo dirigido al tumor como la carga citotóxica (MacDiarmid, et al. Cáncer Cell, 2007, Volumen 11, págs. 431-445). Además, MacDiarmid et al. discuten los beneficios de evadir el sistema inmunitario, describen tal evasión como parte de su razón para diseñar, y por lo tanto enseñar explícitamente a no usar minicélulas como terapéuticas inmunomoduladoras. Por el contrario, la presente divulgación proporciona, por ejemplo, el uso de minicélulas bacterianas como sustancias terapéuticas inmunomoduladoras capaces de provocar actividad antitumoral potente, indirecta. Por ejemplo, las minicélulas divulgadas en el presente documento se pueden usar para inducir un efecto inmunomodulador antitumoral no inmunógeno en un sujeto.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona el uso de minicélulas bacterianas como sustancias terapéuticas inmunomoduladoras capaces de provocar efectos antitumorales potentes por mecanismos directos e indirectos simultáneos mediados por efectos inmunomoduladores antitumorales directos dirigidos a tumor y concomitantes, respectivamente. Por ejemplo, las minicélulas se pueden diseñar para estimular, no específicamente, una respuesta inmunitaria anticancerosa mientras que también funciona específicamente, y en sintonía con dicha respuesta inmunitaria, administrando también una carga tóxica directamente a las células cancerosas. Por tanto, algunas realizaciones de la presente divulgación se refieren a destrucción directa de células tumorales y/o células endoteliales tumorales por suministro dirigido de fármaco usando minicélulas y por el efecto adyuvante no específico indirecto que implica la activación de NK y otras actividades de las células inmunitarias que incluye, pero sin limitación, la liberación de citocinas típicas de una respuesta Th1.
Como se desvela en el presente documento, se han empleado otras terapias con bacterias vivas como agentes anticancerosos en el pasado pero se han limitado por la toxicidad debido a su naturaleza viable. Los proveedores de estas tecnologías reclaman que las terapias con bacterias vivas funcionan preferentemente colonizando las regiones hipóxicas de los tumores, invadiendo las células tumorales en el proceso, y causando necrosis adicional. Notablemente, cada una de estas tecnologías subraya la importancia de tener una formulación de bacterias vivas para conseguir la eficacia y algunas van tan lejos como para demostrar la inactividad de las terapias con bacterias muertas. Estos ejemplos no conducirían a un experto en la técnica a utilizar minicélulas, sin embargo, mejor a evitar hacerlo enseñando así que la viabilidad bacteriana, la colonización de, y la persistencia dentro del tejido tumoral es primordial para la eficacia. Las minicélulas no son viables, no persisten y, por lo tanto, no se esperaría que tuvieran un efecto, dadas los descubrimientos de aquellos que utilizan las terapias con bacterias vivas. A diferencia de estos resultados, la presente divulgación hace uso de minicélulas no vivas, autolimitantes, incapaces de persistir in vivo, como inmunoterapia frente a cáncer.
La terapia inmunomoduladora divulgada en el presente documento se puede usar con cualquier tipo de tumor. Un experto en la materia apreciará que ciertos tipos de tumor pueden ser más susceptibles y, por lo tanto, potencialmente más dispuestos a esta estrategia de terapia. Por ejemplo, la terapia inmunomoduladora y las minicélulas divulgadas en el presente documento se pueden usar para tratar cáncer de vejiga invasivo. Más de 300.000 nuevos casos de cáncer de vejiga son informados mundialmente cada año, 70 % de los cuales se detectan tempranamente en la fase invasiva no muscular. Esta población normalmente se clasifica dentro de tres fases de enfermedad calificadas Ta, T1 y Tis por lo cual el tumor es papilar (anteriormente referido como superficial), ha invadido la lámina propia pero no todavía el músculo, y el carcinoma in situ (tumor no invasivo liso), respectivamente. A continuación, cada tipo de tumor además se clasifica por grado (grados 1-3) basándose en diferentes factores entre otros el índice proliferativo y similares. El patrón de cuidado para enfermedad de bajo riesgo, basándose en la fase y el grado, es resección transureteral del tumor de vejiga (TURBT) seguido de administración posoperativa inmediata de un agente quimioterapéutico. El patrón de cuidado recomendado para los pacientes de riesgo intermedio es TURBT, seguido de instalación posoperatoria inmediata de quimioterapia, seguido de un tratamiento de inducción de 6 semanas con quimioterapia. En el caso de pacientes en los que falla la quimioterapia, se realiza una segunda resección cistoscópica y al paciente se le administra una cepa atenuada viva de Mycobactenum bovis, Bacilo de Calmette-Guerin (BCG), 14 días después. La sustancia quimioterapéutica de elección para la instalación posoperatoria inmediata es mitomicina C, aunque doxorubicina, epirubicina, valrubicina, paclitaxel y gemcitabina todas se han utilizado con efecto similar. En enfermedad de alto riesgo, incluidos aquellos pacientes que presentan carcinoma in situ, BCG es el único agente eficaz. El tratamiento inmunomodulador con BCG es mucho muy superior al de cualquiera de las sustancias quimioterapéuticas empleadas hasta la fecha en la población de riesgo intermedio y alto pero es limitado ya que no se puede administrar inmediatamente después de la operación. El riesgo asociado con la absorción sistémica de BCG vivo de que la vejiga se perforare durante el procedimiento de TURBT es demasiado grande para justificar su uso en el ajuste posoperatorio inmediato, aunque la inmunomodulación mediada por BCG es una estrategia muy superior a la quimioterapia con respecto a las tasas de recurrencia observadas. Por lo tanto, la mayoría de los urólogos tienden a esperar los 14 días para administrar BCG, mientras que se renuncia a la instalación posoperatoria inmediata recomendada. Por otro lado, los resultados, también en términos de recurrencia, son mucho mejores si el tratamiento se inicia usando las directrices del tratamiento clínico posoperatorio inmediato. Tomado en conjunto, hay una necesidad clara de un terapia inmunomoduladora no viva que se pueda administrar inmediatamente después de la operación, a diferencia de BCG, a pacientes que han recibido TURBT para cáncer de vejiga invasivo no muscular. Por otra parte, un estimado 30 % de pacientes que reciben BCG voluntariamente paran la terapia debido a los efectos secundarios tóxicos. Se ha demostrado que la toxicidad está en función de la viabilidad de BCG. Por lo tanto, existe una gran necesidad de un agente terapéutico que pueda impartir el mismo beneficio inmunomodulador de BCG, pero sin el riesgo de infección o las toxicidades asociadas a viabilidad.
En algunas realizaciones, las minicélulas inmunomoduladoras se pueden utilizar como una inmunoterapia administrada intravesicalmente en (i) el ajuste posoperatorio inmediato en cáncer de vejiga invasivo no muscular, (ii) en lugar de la terapia con BCG para la inducción y terapias de mantenimiento de la misma y (iii) como terapia de último recurso para los pacientes intolerantes a BCG y refractarios a BCG. La presente divulgación se proporciona como ejemplo de la necesidad de inmunoterapias eficaces, no vivas, para su uso en cáncer. Además, el uso de minicélulas inmunomoduladoras multieficaces, las cuales contienen una o más combinaciones de polipéptidos citotóxicos encapsulados, polipéptidos de alteración endosómica, fármacos de molécula pequeña, o ácidos nucleicos como se definen en las reivindicaciones, son de beneficio en el cáncer de vejiga debido a que son capaces de causar efectos citolíticos de célula tumoral y efectos citolíticos de célula endotelial tumoral por medio de suministro, mientras que aún ejerce efectos inmunomoduladores antitumorales indirectos adicionales encargados por el sistema inmunitario. Una aplicación no limitativa de minicélulas inmunomoduladoras citotóxicas en cáncer de vejiga, es el uso de perfringolisina O. Otra aplicación no limitativa de minicélulas inmunomoduladoras citotóxicas en cáncer de vejiga, es el uso del fragmento catalítico de la toxina diftérica, y perfringolisina O.
En algunas realizaciones, las minicélulas se producen por ingeniería genética y se utilizan para generar respuestas inmunitarias dominadas por Th1. Las minicélulas inmunomoduladoras de Th1 son capaces de generar la producción de citocinas y quimiocinas Th1 que incluyen, pero sin limitación, IFN-y, IFN-a, IL-12, IL-2, GMCSF, IL-18, TGF-p, y TNF-a.
La minicélula desvelada en el presente documento, comprende una proteína citolisina dependiente de colesterol. De acuerdo con la invención, la minicélula no presenta una molécula que comprende una región Fc de un anticuerpo. La molécula que comprende una región Fc de una anticuerpo puede, por ejemplo, ser un anticuerpo o un derivado de anticuerpo. De acuerdo con la invención, la minicélula no comprende invasina. En algunas realizaciones, la minicélula no comprende una molécula pequeña terapéutica y/o un ácido nucleico terapéutico. En algunas realizaciones, la minicélula tampoco comprende ninguna proteína terapéutica distinta de una toxina proteica, una citocina Th1, una citocina Th2, una fosfolipasa, y/o una proteína citolisina dependiente de colesterol. En algunas realizaciones, la minicélula no comprende ninguna parte terapéuticamente activa distinta de una toxina proteica, una citocina Th1, una citocina Th2, una fosfolipasa, y/o una proteína citolisina dependiente de colesterol. En algunas realizaciones, la cantidad de proteína citolisina dependiente de colesterol sobre la minicélula está a un nivel tóxico para una célula de mamífero cuando la minicélula se pone en contacto con dicha célula de mamífero.
En algunas realizaciones, minicélulas inmunomoduladoras de Th1 incluyen, pero sin limitación, aquellas producidas a partir de las cepas invasivas naturales de bacterias, incluidas, pero sin limitación, cepas invasivas de Salmonella spp., Listeria spp., Mycobacterium spp., Shigella spp., Yersinia spp., y Escherichia coli. Estas minicélulas inmunomoduladoras de Th1 invasivas naturales presentarán ligandos localizados en la superficie de la minicélula de origen natural que son capaces de estimular la internalización de minicélulas dentro de células eucariotas, para ayudar en la generación de respuestas inmunoterapéuticas dominantes Th1. Un experto en la materia apreciará que las minicélulas invasivas naturales no existen en la naturaleza per se sino que son producidas por ingeniería genética a partir de cepas de bacterias invasivas no productoras de minicélula usando una o más de las estrategias genéticas para generar minicélulas como se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, las minicélulas inmunomoduladoras de Th1 invasivas naturales además comprenden una o más proteínas recombinantemente expresadas y ácidos nucleicos diseñados para además aumentar, modular, o estabilizar las respuestas inmunitarias dominantes Th1. Las proteínas recombinantemente expresadas incluyen, pero sin limitación, citocinas Th1 tales como IL-2, GMCSF, IL-12p40, IL-12p70, IL-18, TNF-a e IFN-y. Además, las minicélulas inmunomoduladoras de Th1 invasivas naturales pueden expresar una o más proteínas citolisina formadoras de poro, tales como listeriolisina O (LLO) y alguna variante o equivalente funcional de la misma para facilitar la fuga endosómica de componentes minicelulares dentro del citosol de las células que han internalizado dichas minicélulas para aumentar, modular, o estabilizar las respuestas inmunitarias dominantes Th1 mediadas por dichas minicélulas. También se pueden usar fosfolipasas, tales como PC-PLC o PI-PLC, como agentes de alteración endosómicos utilizados para aumentar, modular, o estabilizar las respuestas inmunitarias dominantes Th1 aumentando la liberación de componente minicelular desde el endosoma dentro del citosol de células eucariotas que han internalizado dichas minicélulas. Las minicélulas inmunomoduladoras de Th1 invasivas naturales pueden expresar una combinación de una o más de una citocina Th1 y una o más citolisinas de alteración endosómicas. Las minicélulas inmunomoduladoras de Th1 invasivas naturales también pueden contener toxinas proteicas recombinantemente expresadas para fomentar la necrosis y/o la apoptosis que a su vez también además puede aumentar, modular, y/o estabilizar las respuestas inmunitarias Th1. La toxina proteica recombinantemente expresada/producida preferida es perfringolisina O. Otras toxinas proteicas recombinantemente expresadas/producidas a utilizar usando minicélulas inmunomoduladoras de Th1 invasivas naturales incluyen, pero sin limitación, los fragmentos A/B de la toxina diftérica, el fragmento A de la toxina diftérica, toxinas LF y e F del ántrax, toxina adenilato ciclasa, gelonina, botulinolisina B, botulinolisina E3, botulinolisina C, toxina botulínica, toxina colérica, toxinas A, B y alfa de Clostridium, ricina, toxina shiga A, toxina tipo shiga, toxina A del cólera, toxina pertussis S1, exotoxina A de Pseudomonas, toxina lábil por calor de E. coli (LTB), melitina, variantes pH estables de listeriolisina O (independientes del pH; sustitución de aminoácido L461T), variantes termoestables de listeriolisina O (sustituciones de aminoácido E247M, D320K), y variantes pH y termoestables de listeriolisina O (sustituciones de aminoácido E247M, D320K, y L461T), estreptolisina O, estreptolisina O c, estreptolisina O e, esfaericolisina, antrolisina O, cereolisina, turingiensilisina O, weihenstefanensilisina, alveolisina, brevilisina, butiriculisina, tetanolisina O, noviilisina, lectinolisina, pneumolisina, mitilisina, pseudoneumolisina, suilisina, intermedilisina, ivanolisina, seeligeriolisina O, vaginolisina, y piolisina, caspasas activadas, pro-caspasas, citocinas, quimiocinas, péptidos penetrantes de células, y cualquier combinación de los ejemplos anteriores. La expresión recombinante de polipéptido(s) puede ser el resultado de la expresión a partir de cualquiera de los diversos vectores de expresión procariotas recombinantes episómicos conocidos en la técnica que incluyen, pero sin limitación, plásmidos, cósmidos, fagémidos, y cromosomas artificiales bacterianos (BAC), y cualquier combinación de los ejemplos anteriores. De forma similar, la expresión recombinante se puede conseguir por un casete de expresión procariota cromosómicamente localizado presente en una o más copias del cromosoma de célula parental productora de minicélula. Las minicélulas inmunomoduladoras de Th1 invasivas naturales también se pueden producir por ingeniería genética para expresar o contener uno o más ácidos nucleicos inmunomoduladores que se sabe que estimulan los receptores tipo Toll 3, 7, 8, y/o 9 localizados en el endosoma para aumentar los efectos inmunomoduladores de Th1. Tales ácidos nucleicos incluyen, pero sin limitación, ADN monocatenario, ARN monocatenario, ADN bicatenario, ARN bicatenario, horquillas de ADN y horquillas de ARN, cada uno de los cuales se puede expresar recombinantemente como reconocerán fácilmente los expertos en la materia. En algunas realizaciones, las minicélulas inmunomoduladoras de Th1 invasivas naturales se derivan de una cepa productora de minicélula que alberga el sistema de suicidio genético de endonucleasa de asentamiento ("homing") de la Publicación de Patente de EE.UU. N.° 2010011 2670. La endonucleasa de asentamiento I-ceul descrita en esa patente digiere selectivamente los cromosomas de la mayoría de las especies bacterianas en sitios conservados discretos, que sirve por un lado para destruir selectivamente las células parentales y por otro lado para generar fragmentos de ADN bicatenario en el proceso.
Algunas realizaciones proporcionan una bacteria productora de minicélula inmunomoduladora de Th1 invasiva natural que comprende: (i) un gen expresable que codifica un producto génico productor de minicélula que modula uno o más de la formación de septo, la fisión binaria, y la segregación cromosómica; y (ii) una toxina proteica capaz de estimular un efecto inmunoterapéutico, incluida, pero sin limitación, perfringolisina O. En algunas realizaciones, la bacteria no presenta un anticuerpo u otra molécula que comprende una región Fc de un anticuerpo y no presenta la porción de unión Fc de la Proteína G o la Proteína A. En algunas realizaciones, la bacteria productora de minicélula inmunomoduladora de Th1 invasiva natural además comprende uno o más de (iii) un gen "de suicidio genético" expresable que codifica una endonucleasa heteróloga, en la que el cromosoma de la bacteria productora de minicélula inmunomoduladora de Th1 invasiva natural comprende uno o más sitios de reconocimiento de la endonucleasa; (iv) una auxotrofia definida; y (v) una deleción o mutación en el gen IpxM/msbB (u otro equivalente funcional). En algunas realizaciones, el gen productor de minicélula es un gen de división celular. Ejemplos del gen de división celular incluyen, pero sin limitación, ftsZ, sulA, ccdB, y sfiC. En algunas realizaciones, el gen productor de minicélula se expresa bajo el control de un promotor inducible. En algunas realizaciones, el gen suicida de endonucleasa está localizado en el cromosoma de la bacteria productora de minicélula. En algunas realizaciones, la endonucleasa es una endonucleasa de asentamiento. La endonucleasa de asentamiento incluye, pero sin limitación, I-Ceul, Pl-Scel, I-Chul, I-Cpal, I-Scelll, I-Crel, I-Msol, I-Scell, I-ScelV, I-Csml, I-Dmol, I-Porl, Pl-Tlil, Pl-Tlill, y Pl-Scpl. En algunas realizaciones, la endonucleasa se expresa bajo el control de un promotor inducible. En algunas realizaciones, la auxotrofia es debida a una deleción o mutación inactivadora en un gen metabólico esencial. En algunas realizaciones, la deleción o mutación inactivadora está en el gen dapA o su homólogo funcional. En algunas realizaciones, la bacteria productora de minicélula además comprende una deleción o mutación inactivadora en un gen que codifica un producto génico que está implicado en la síntesis de lipopolisacárido, en la que el gen está genéticamente modificado en comparación con el correspondiente gen tipo silvestre. En algunas realizaciones, el gen inactivado es IpxM/msbB el cual codifica un producto génico que causa que la bacteria produzca una molécula de lípido A alterada en comparación con las moléculas de lípido A en una correspondiente bacteria tipo silvestre. En algunas realizaciones, la molécula de lípido A alterada es deficiente con respecto a la adición de ácido miristólico a la porción de lípido A de la molécula de lipopolisacárido en comparación con las moléculas de lípido A en una correspondiente bacteria tipo silvestre. En algunas realizaciones, la bacteria productora de minicélula además comprende una deleción o mutación inactivadora en un gen que está implicado en la recombinación homóloga, en la que el gen está genéticamente modificado en comparación con un correspondiente gen tipo silvestre, en la que las bacterias productoras de minicélula son deficientes en reparación de daño de ADN, reduciendo el riesgo de recuperación del mecanismo de suicidio genético. En algunas realizaciones la bacteria productora de minicélula inmunomoduladora de Th1 invasiva natural es una bacteria Gram negativa que incluye, pero sin limitación, cepas invasivas de Yersinia spp., Campylobacter spp., Pseudomonas spp., Salmonella spp., Shigella spp., Rickettsia spp., y Escherichia coli. En algunas realizaciones, la bacteria productora de minicélula inmunomoduladora de Th1 invasiva natural es una bacteria Gram positiva que incluye, pero sin limitación, Mycobacterium spp., Streptococcus spp., Listeria monocytogenes, Chlamydia spp., y Brucella spp.
Las minicélulas inmunomoduladoras de Th1 incluyen, pero sin limitación, aquellas producidas a partir de cepas no invasivas de bacterias que se han modificado por ingeniería genética para llegar a ser invasivas. Muchas de las cepas no invasivas de bacterias son conocidas por los expertos en la materia e incluyen, pero sin limitación, cepas no invasivas de Escherichia coli, Salmonella spp., Shigella spp., Lactobacillus spp., Pseudomonas spp., y similares. Estas cepas normalmente no invasivas están modificadas genéticamente para presentar ligandos localizados en la superficie de la minicélula heterólogos capaces de estimular la internalización de minicélulas dentro de células eucariotas. Las minicélulas inmunomoduladoras de Th1 invasivas recombinantes resultantes pueden ser internalizadas por células inmunitarias y otras eucariotas para generar respuestas inmunoterapéuticas dominantes Th1. En algunas realizaciones, las minicélulas inmunomoduladoras de Th1 invasivas recombinantes además comprenden una o más proteínas inmunomoduladoras recombinantemente expresadas y ácidos nucleicos diseñados para además aumentar, modular, o estabilizar las respuestas inmunitarias dominantes Th1. Ejemplos de la proteína inmunomoduladora incluyen, pero sin limitación, citocinas Th1 tales como IL-2, GMCSF, IL-12p40, IL-12p70, IL-18, TNF -a, e IFN-y. Las minicélulas inmunomoduladoras de Th1 invasivas recombinantes pueden expresar una o más proteínas citolisina formadoras de poro, tales como listeriolisina O (LLO) y alguna variante o equivalente funcional de la misma para facilitar la fuga endosómica de los componentes minicelulares en el citosol de las células que han internalizado las minicélulas para aumentar, modular, o estabilizar las respuestas inmunitarias dominantes Th1 mediante las minicélulas. También se pueden usar fosfolipasas, tales como PC-PLC o PI-PLC, como agentes de alteración endosómicos utilizados para aumentar, modular, o estabilizar las respuestas inmunitarias dominantes Th1 aumentando la liberación de componente minicelular dese el endosoma dentro del citosol de células eucariotas que han internalizado las minicélulas. Las minicélulas inmunomoduladoras de Th1 invasivas recombinantes pueden expresar una combinación de una o más de una citocina Th1 y una o más citolisinas de alteración endosómicas. Las minicélulas inmunomoduladoras de Th1 invasivas naturales también pueden contener toxinas proteicas recombinantemente expresadas para fomentar la necrosis y/o la apoptosis que después a su vez además puede aumentar, modular, y/o estabilizar las respuestas inmunitarias Th1. La toxina proteica recombinantemente expresada/producida preferida es perfringolisina O. Otros ejemplos de toxinas proteicas recombinantemente expresadas/producidas que se pueden utilizar usando minicélulas inmunomoduladoras de Th1 invasivas recombinantes incluyen, pero sin limitación, los fragmentos A/B de la toxina diftérica, el fragmento A de la toxina diftérica, toxinas LF y EF del ántrax, toxina adenilato ciclasa, gelonina, botulinolisina B, botulinolisina E3, botulinolisina C, toxina botulínica, toxina colérica, toxinas A, B y alfa de Clostridium , ricina, toxina shiga A, toxina tipo shiga, toxina A del cólera, toxina pertussis S1, exotoxina A de Pseudomonas, toxina lábil por calor de E. coli (LTB), melitina, variantes pH estables de listeriolisina O (independientes del pH; sustitución de aminoácido L46lT), variantes termoestables de listeriolisina O (sustituciones de aminoácido E247M, D320K), y variantes pH y termoestables de listeriolisina O (sustituciones de aminoácido E247M, D320K, y L461T), estreptolisina O, estreptolisina O c, estreptolisina O e, esfaericolisina, antrolisina O, cereolisina, turingiensilisina O, weihenstefanensilisina, alveolisina, brevilisina, butiriculisina, tetanolisina O, noviilisina, lectinolisina, pneumolisina, mitilisina, pseudoneumolisina, suilisina, intermedilisina, ivanolisina, seeligeriolisina O, vaginolisina, y piolisina, caspasas activadas, pro-caspasas, citocinas, quimiocinas, péptidos penetrantes de células, y cualquier combinación de los ejemplos anteriores. La expresión recombinante de polipéptido(s) puede ser el resultado de la expresión a partir de cualquiera de los diversos vectores de expresión procariotas recombinantes episómicos conocidos en la técnica que incluyen, pero sin limitación, plásmidos, cósmidos, fagémidos, y cromosomas artificiales bacterianos (BAC), y cualquier combinación de los ejemplos anteriores. De forma similar, la expresión recombinante se puede conseguir por un casete de expresión procariota cromosómicamente localizado presente en una o más copias del cromosoma de célula parental productora de minicélula. Las minicélulas inmunomoduladoras de Th1 invasivas recombinantes también se pueden producir por ingeniería genética para expresar o contener uno o más ácidos nucleicos inmunomoduladores que se sabe que estimulan los receptores tipo Toll 3, 7, 8, y/o 9 localizados en el endosoma para aumentar los efectos inmunomoduladores de Th1. Tales ácidos nucleicos incluyen, pero sin limitación, ADN monocatenario, ARN monocatenario, ADN bicatenario, ADN bicatenario lineal, ARN bicatenario, horquillas de ADN y horquillas de ARN, cada uno de los cuales se puede expresar recombinantemente como reconocerán fácilmente los expertos en la materia. En algunas realizaciones, las minicélulas inmunomoduladoras de Th1 invasivas recombinantes se derivan de una cepa productora de minicélula que alberga el sistema de suicidio genético de endonucleasa de asentamiento de la Publicación de Patente de EE.UU. N.° 2010-0112670. La endonucleasa de asentamiento I-Ceul descrita en el presente documento digiere selectivamente los cromosomas de la mayoría de las especies bacterianas en sitios discretos, conservados, que sirve por un lado para destruir selectivamente las células parentales, y por otro lado, para generar fragmentos de ADN lineales bicatenarios en el proceso.
Algunas realizaciones proporcionan una bacteria productora de minicélula inmunomoduladora de Th1 invasiva recombinante que comprende: (i) un gen expresable que codifica un producto génico productor de minicélula que modula uno o más de la formación de septo, la fisión binaria, y la segregación cromosómica; (ii) un casete de expresión recombinante capaz de la expresión funcional y la presentación en superficie de una o más partes de direccionamiento localizadas en la superficie de la minicélula heterólogas capaces de estimular la internalización dentro de las células eucariotas, y (iii) una toxina proteica capaz de estimular un efecto inmunoterapéutico, incluida, pero sin limitación, perfringolisina O. La bacteria productora de minicélula inmunomoduladora de Th1 invasiva recombinante también puede incluir, en algunas realizaciones, uno o más de (iv) un gen "de suicidio genético" expresable que codifica una endonucleasa heteróloga, en la que el cromosoma de la bacteria productora de minicélula comprende uno o más sitios de reconocimiento de la endonucleasa; (v) una auxotrofía definida; y (vi) una deleción o mutación en el gen IpxM/msbB (u otro equivalente funcional). En algunas realizaciones, el gen productor de minicélula es un gen de división celular. El gen de división celular incluye, pero sin limitación, ftsZ, sulA, ccdB, y sfiC. En algunas realizaciones, el gen productor de minicélula se expresa bajo el control de un promotor inducible. En algunas realizaciones, el gen suicida de endonucleasa está localizado en el cromosoma de la bacteria productora de minicélula. En algunas realizaciones, la endonucleasa es una endonucleasa de asentamiento. La endonucleasa de asentamiento incluye, pero sin limitación, I-CeuI, PI-Scel, I-ChuI, I-CpaI, I-SceIII, I-CreI, I-MsoI, I-SceII, I-SceIV, I-CsmI, I-DmoI, I-PorI, PI-TliI, PI-TliII, y PI-ScpI. En algunas realizaciones, la endonucleasa se expresa bajo el control de un promotor inducible. En algunas realizaciones, la auxotrofia es debida a una deleción o mutación inactivadora en un gen metabólico esencial. En algunas realizaciones, la deleción o mutación inactivadora está en el gen dapA o su homólogo funcional. En algunas realizaciones, la bacteria productora de minicélula además comprende una deleción o mutación inactivadora en un gen que codifica un producto génico que está implicado en la síntesis de lipopolisacárido, en la que el gen está genéticamente modificado en comparación con el correspondiente gen tipo silvestre. En algunas realizaciones, el gen inactivado es IpxM/msbB el cual codifica un producto génico que causa que la bacteria produzca una molécula de lípido A alterada en comparación con las moléculas de lípido A en una correspondiente bacteria tipo silvestre. En algunas realizaciones, la molécula de lípido A alterada es deficiente con respecto a la adición de ácido miristólico a la porción de lípido A de la molécula de lipopolisacárido en comparación con las moléculas de lípido A en una correspondiente bacteria tipo silvestre. En algunas realizaciones, la bacteria productora de minicélula además comprende una deleción o mutación inactivadora en un gen que está implicado en la recombinación homóloga, en la que el gen está genéticamente modificado en comparación con un correspondiente gen tipo silvestre, en la que las bacterias productoras de minicélula son deficientes en reparación de daño de ADN. En algunas realizaciones, la bacteria productora de minicélula inmunomoduladora de Th1 invasiva recombinante es una bacteria Gram negativa que incluye, pero sin limitación, Campylobacter jejuni, Haemophilus influenzae, BordeteIIa pertussis, Brucella spp., Franciscella tularemia, Legionella pneumophilia, Neisseria meningitidis, Kliebsella, Yersinia spp., Helicobacter pylori, Neisseria gonorrhoeae, Legionella pneumophila, Salmonella spp., Shigella spp., Pseudomonas spp., y Escherichia coli. En algunas realizaciones, la bacteria productora de minicélula inmunomoduladora de Th1 invasiva recombinante es una bacteria Gram positiva que incluye, pero sin limitación, Staphylococcus spp., Lactobacillus spp., Streptococcus spp., Bacillus subtilis, Clostridium difficile, y Bacillus cereus.
En algunas realizaciones, se producen minicélulas inmunomoduladoras de Th1 a partir de cepas no invasivas de bacterias. Muchas de las cepas no invasivas de bacterias son conocidas por los expertos en la materia e incluyen, pero sin limitación, cepas no invasivas de Escherichia coli, Salmonella spp., Shigella spp., Lactobacillus spp., Pseudomonas spp., y similares. Estas minicélulas inmunomoduladoras de Th1 no invasivas pueden ser internalizadas por células inmunitarias y otras eucariotas para generar respuestas inmunoterapéuticas dominantes Th1. En algunas realizaciones, las minicélulas inmunomoduladoras de Th1 no invasivas recombinantes además comprenden una o más proteínas inmunomoduladoras recombinantemente expresadas y ácidos nucleicos diseñados para además aumentar, modular, o estabilizar las respuestas inmunitarias dominantes Th1. Ejemplos de la proteína inmunomoduladora incluyen, pero sin limitación, citocinas Th1 tales como IL-2, GMCSF, IL-12p40, IL-12p70, IL-18, TNF-a e IFN-y. Las minicélulas inmunomoduladoras de Th1 no invasivas recombinantes pueden expresar una o más proteínas citolisina formadoras de poro, tales como listeriolisina O (LLO) y alguna variante o equivalente funcional de la misma para facilitar la fuga endosómica de componentes minicelulares dentro del citosol de las células que han internalizado dichas minicélulas para aumentar, modular, o estabilizar las respuestas inmunitarias dominantes Th1 mediadas por dichas minicélulas. También se pueden usar fosfolipasas, tales como PC-PLC o PI-PLC, como agentes de alteración endosómicos utilizados para aumentar, modular, o estabilizar las respuestas inmunitarias dominantes Th1 aumentando la liberación de componente minicelular desde el endosoma dentro del citosol de células eucariotas que han internalizado dichas minicélulas. Las minicélulas inmunomoduladoras de Th1 no invasivas recombinantes pueden expresar una combinación de una o más de una citocina Th1 y una o más citolisinas de alteración endosómicas. Las minicélulas inmunomoduladoras de Th1 no invasivas recombinantes también pueden contener toxinas proteicas recombinantemente expresadas para fomentar la necrosis y/o la apoptosis que a su vez también además puede aumentar, modular, y/o estabilizar las respuestas inmunitarias Th1. La toxina proteica recombinantemente expresada/producida preferida es perfringolisina O. Otras toxinas proteicas recombinantemente expresadas/producidas a utilizar usando minicélulas inmunomoduladoras de Th1 no invasivas recombinantes incluyen, pero sin limitación, los fragmentos A/B de la toxina diftérica, el fragmento A de la toxina diftérica, toxinas LF y EF del ántrax, toxina adenilato ciclasa, gelonina, botulinolisina B, botulinolisina E3, botulinolisina C, toxina botulínica, toxina colérica, toxinas A, B y alfa de Clostridium, ricina, toxina shiga A, toxina tipo shiga, toxina A del cólera, toxina pertussis S1, exotoxina A de Pseudomonas, toxina lábil por calor de E. coli (LTB), melitina, variantes pH estables de listeriolisina O (independientes del pH; sustitución de aminoácido L461T), variantes termoestables de listeriolisina O (sustituciones de aminoácido E247M, D320K), y variantes pH y termoestables de listeriolisina O (sustituciones de aminoácido E247M, D320K, y L461T), estreptolisina O, estreptolisina O c, estreptolisina O e, esfaericolisina, antrolisina O, cereolisina, turingiensilisina O, weihenstefanensilisina, alveolisina, brevilisina, butiriculisina, tetanolisina O, noviilisina, lectinolisina, pneumolisina, mitilisina, pseudoneumolisina, suilisina, intermedilisina, ivanolisina, seeligeriolisina O, vaginolisina, y piolisina, caspasas activadas, pro-caspasas, citocinas, quimiocinas, péptidos penetrantes de células, y cualquier combinación de los ejemplos anteriores. La expresión recombinante de polipéptido(s) puede ser el resultado de la expresión a partir de cualquiera de los diversos vectores de expresión procariotas recombinantes episómicos conocidos en la técnica que incluyen, pero sin limitación, plásmidos, cósmidos, fagémidos, y cromosomas artificiales bacterianos (BAC), y cualquier combinación de los ejemplos anteriores. De forma similar, la expresión recombinante se puede conseguir por un casete de expresión procariota cromosómicamente localizado presente en una o más copias del cromosoma de célula parental productora de minicélula. Las minicélulas inmunomoduladoras de Th1 no invasivas recombinantes también se pueden producir por ingeniería genética para expresar o contener uno o más ácidos nucleicos inmunomoduladores que se sabe que estimulan los receptores 3, 7, 8, y/o 9 tipo Toll localizados en el endosoma para aumentar los efectos inmunomoduladores de Th1. Tales ácidos nucleicos incluyen, pero sin limitación, ADN monocatenario, ARN monocatenario, ADN bicatenario, ADN bicatenario lineal, ARN bicatenario, horquillas de ADN y horquillas de ARN, cada uno de los cuales se puede expresar recombinantemente como reconocerán fácilmente los expertos en la materia. En algunas realizaciones, las minicélulas inmunomoduladoras de Th1 no invasivas recombinantes se derivan de una cepa productora de minicélula que alberga el sistema de suicidio genético de endonucleasa de asentamiento de la Publicación de Patente de EE.UU. N.° 2010-0112670, incorporada en el presente documento a modo de referencia. La endonucleasa de asentamiento I-Ceul descrita en el presente documento digiere selectivamente los cromosomas de la mayoría de las especies bacterianas en sitios discretos, conservados, que sirve por un lado para destruir selectivamente las células parentales, y por otro lado, para generar fragmentos de ADN lineales bicatenarios en el proceso.
Algunas realizaciones proporcionan una bacteria productora de minicélula inmunomoduladora de Th1 no invasiva recombinante que comprende: (i) un gen expresable que codifica un producto génico productor de minicélula que modula uno o más de la formación de septo, la fisión binaria, y la segregación cromosómica; y (ii) una toxina proteica capaz de estimular un efecto inmunoterapéutico, incluida, pero sin limitación, perfringolisina O. En algunas realizaciones, la bacteria productora de minicélula inmunomoduladora de Th1 no invasiva recombinante además comprende uno o más de (iii) un gen "de suicidio genético" expresable que codifica una endonucleasa heteróloga, en la que el cromosoma de la bacteria productora de minicélula inmunomoduladora de Th1 no invasiva recombinante comprende uno o más sitios de reconocimiento de la endonucleasa; (iv) una auxotrofia definida; y (v) una detección o mutación en el gen IpxM/msbB (u otro equivalente funcional). En algunas realizaciones, el gen productor de minicélula es un gen de división celular. El gen de división celular incluye, pero sin limitación, ftsZ, sulA, ccdB, y sfiC. En algunas realizaciones, el gen productor de minicélula se expresa bajo el control de un promotor inducible. En algunas realizaciones, el gen suicida de endonucleasa está localizado en el cromosoma de la bacteria productora de minicélula. En algunas realizaciones, la endonucleasa es una endonucleasa de asentamiento. Ejemplos de endonucleasa de asentamiento incluyen, pero sin limitación, I-Ceul, Pl-Scel, I-Chul, I-Cpal, I-Scelll, I-Crel, I-Msol, I-Scell, I-ScelV, I-Csml, I-Dmol, I-Porl, Pl-Tlil, Pl-Tlill, y Pl-Scpl. En algunas realizaciones, la endonucleasa se expresa bajo el control de un promotor inducible. En algunas realizaciones, la auxotrofia es debida a una deleción o mutación inactivadora en un gen metabólico esencial. En algunas realizaciones la deleción o mutación inactivadora está en el gen dapA o su homólogo funcional. En algunas realizaciones, la bacteria productora de minicélula además comprende una deleción o mutación inactivadora en un gen que codifica un producto génico que está implicado en la síntesis de lipopolisacárido, en la que el gen está genéticamente modificado en comparación con el correspondiente gen tipo silvestre. En algunas realizaciones, el gen inactivado es IpxM/msbB el cual codifica un producto génico que causa que la bacteria produzca una molécula de lípido A alterada en comparación con las moléculas de lípido A en una correspondiente bacteria tipo silvestre. En algunas realizaciones, la molécula de lípido A alterada es deficiente con respecto a la adición de ácido miristólico a la porción de lípido A de la molécula de lipopolisacárido en comparación con las moléculas de lípido A en una correspondiente bacteria tipo silvestre. En algunas realizaciones, la bacteria productora de minicélula además comprende una deleción o mutación inactivadora en un gen que está implicado en la recombinación homóloga, en la que el gen está genéticamente modificado en comparación con un correspondiente gen tipo silvestre, en la que las bacterias productoras de minicélula son deficientes en reparación de daño de ADN, reduciendo el riesgo de recuperación del mecanismo de suicidio genético. En algunas realizaciones, la minicélula inmunomoduladora de Th1 no invasiva recombinante es una bacteria Gram negativa que incluye, pero sin limitación, cepas invasivas de Yersinia spp., Campylobacter spp., Pseudomonas spp., Salmonella spp., Shigella spp., Rickettsia spp., y Escherichia coli. En algunas realizaciones la bacteria productora de minicélula inmunomoduladora de Th1 no invasiva recombinante es una bacteria Gram positiva que incluye, pero sin limitación, Mycobacterium spp., Streptococcus spp., Listeria monocytogenes, Chlamydia spp., y Brucella spp.
En algunas realizaciones, las minicélulas se producen por ingeniería genética y se utilizan para generar respuestas inmunitarias dominadas por Th2. Ejemplos de la minicélula inmunomoduladora de Th2 capaz de generar la producción de citocinas y quimiocinas Th2 incluyen, pero sin limitación, IL-1 a, IL-1p, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13.
En algunas realizaciones, las minicélulas inmunomoduladoras de Th2 incluyen, pero sin limitación, aquellas producidas a partir de cepas de bacterias no invasivas de origen natural, adherentes, o mucoadhesivas que incluyen, pero sin limitación, cepas no invasivas, adherentes y mucoadhesivas de Streptococcus spp.,, Staphylococcus spp., Salmonella spp., Shigella spp., Lactobacillus spp., Pseudomonas spp., Klebsiella spp., y Escherichia coli. Estas minicélulas inmunomoduladoras de Th2 no invasivas naturales no presentan los ligandos localizados en la superficie de la minicélula de origen natural que son capaces de estimular la internalización de las minicélulas dentro de células eucariotas, aunque pueden ser tragadas por células inmunitarias constitutivamente fagocíticas tales como macrófagos, células dendríticas, y neutrófilos. Las minicélulas inmunomoduladoras de Th2 adherentes y mucoadherentes expresan proteínas localizadas en la superficie de la minicélula que pueden estimular la adherencia a las superficies de células eucariotas y superficies mucosas, respectivamente, sin embargo no causan internalización apreciable, siendo la excepción para normalmente células constitutivamente fagocíticas tales como macrófagos, neutrófilos y células dendríticas. Un experto en la materia apreciará que las minicélulas inmunomoduladoras de Th2 no invasivas naturales, las minicélulas inmunomoduladoras de Th2 adherentes, y las minicélulas inmunomoduladoras de Th2 mucoadherentes no existen en la naturaleza per se sino son producidas por ingeniería genética a partir de las especies de bacterias no invasivas, adherentes, y mucoadherentes no productoras de minicélula usando una o más de las estrategias genéticas para generar minicélulas como se describe en el presente documento. Las cepas no adherentes de Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Salmonella spp., Shigella spp., Lactobacillus spp., Pseudomonas spp., Klebsiella spp., y Escherichia coli son fácilmente modificadas por ingeniería genética por los expertos en la materia de biología molecular y/o genéticas microbianas para llegar a ser adherentes por clonación y expresión recombinante de factores adherentes a superficie celular bacteriana de modo que la expresión de dichos factores adherentes heterólogos da como resultado minicélulas inmunomoduladoras de Th2 adherentes recombinantes.
Algunas realizaciones proporcionan una bacteria productora de minicélula inmunomoduladora de Th2 no invasiva natural, adherente, o mucoadherente que comprende: (i) un gen expresable que codifica un producto génico productor de minicélula que modula uno o más de la formación de septo, la fisión binaria, y la segregación cromosómica. En algunas realizaciones, la bacteria productora de minicélula inmunomoduladora de Th2 no invasiva natural, adherente, o mucoadherente además comprende uno o más de (ii) un gen "de suicidio genético" expresable que codifica una endonucleasa heteróloga, en la que el cromosoma de la bacteria productora de minicélula inmunomoduladora de Th2 no invasiva natural, adherente y/o mucoadherente comprende uno o más sitios de reconocimiento de la endonucleasa; (iii) una auxotrofía definida; y (iv) una deleción o mutación en el gen lpxM/msbB (u otro equivalente funcional). En algunas realizaciones, el gen productor de minicélula es un gen de división celular. El gen de división celular incluye, pero sin limitación, ftsZ, sulA, ccdB, y sfiC. En algunas realizaciones, el gen productor de minicélula se expresa bajo el control de un promotor inducible. En algunas realizaciones, el gen suicida de endonucleasa está localizado en el cromosoma de la bacteria productora de minicélula. En algunas realizaciones, la endonucleasa es una endonucleasa de asentamiento. Ejemplos de endonucleasa de asentamiento incluyen, pero sin limitación, I-CeuI, PI-SceI, I-ChuI, I-CpaI, I-SceIII, I-CreI, I-MsoI, I-SceII, I-SceIV, I-CsmI, I-DmoI, I-PorI, PI-TliI, PI-TliII, y PI-ScpI. En algunas realizaciones, la endonucleasa se expresa bajo el control de un promotor inducible. En algunas realizaciones, la auxotrofia es debida a una deleción o mutación inactivadora en un gen metabólico esencial. En algunas realizaciones, la deleción o mutación inactivadora está en el gen dapA o su homólogo funcional. En algunas realizaciones, la bacteria productora de minicélula además comprende una deleción o mutación inactivadora en un gen que codifica un producto génico que está implicado en la síntesis de lipopolisacárido, en la que el gen está genéticamente modificado en comparación con el correspondiente gen tipo silvestre. En algunas realizaciones, el gen inactivado es lpxM/msbB el cual codifica un producto génico que causa que la bacteria produzca una molécula de lípido A alterada en comparación con las moléculas de lípido A en una correspondiente bacteria tipo silvestre. En algunas realizaciones, la molécula de lípido A alterada es deficiente con respecto a la adición de ácido miristólico a la porción de lípido A de la molécula de lipopolisacárido en comparación con las moléculas de lípido A en una correspondiente bacteria tipo silvestre. En algunas realizaciones, la bacteria productora de minicélula además comprende una deleción o mutación inactivadora en un gen que está implicado en la recombinación homóloga, en la que el gen está genéticamente modificado en comparación con un correspondiente gen tipo silvestre, en la que las bacterias productoras de minicélula son deficientes en reparación de daño de ADN, reduciendo el riesgo de recuperación del mecanismo de suicidio genético. En algunas realizaciones la bacteria productora de la minicélula inmunomoduladora de Th2 no invasiva natural, adherente, y/o mucoadherente es una bacteria Gram negativa que incluye, pero sin limitación, cepas invasivas de Yersinia spp., Campylobacter spp., Pseudomonas spp., Salmonella spp., Shigella spp., Rickettsia spp., y Escherichia coli. En algunas realizaciones, la bacteria productora de minicélula inmunomoduladora de Th2 no invasiva natural, adherente, o mucoadherente es una bacteria Gram positiva que incluye, pero sin limitación, Mycobactenum spp., Streptococcus spp., Listeria monocytogenes, Chlamydia spp., y Brucella spp.
Algunas realizaciones proporcionan minicélulas inmunomoduladoras citotóxicas dirigidas multiefecto. Las minicélulas inmunomoduladoras citotóxicas dirigidas multiefecto contienen una parte de direccionamiento localizada en la superficie de la minicélula, una carga citotóxica, y/o proteína de fuga endosómica. Las minicélulas inmunomoduladoras citotóxicas dirigidas multiefecto son capaces de provocar efectos antitumorales directos por medio de dirigir y administrar una carga citotóxica directamente a las células tumorales además de ser capaces de provocar un efecto inmunomodulador de Th1 que da como resultado actividad antitumoral adicional.
Como se describe en el presente documento, pero sin ser parte de la invención, las minicélulas VAX-IP abarcan todas las minicélulas inmunomoduladoras citotóxicas multiefecto que expresan y presentan invasina y perfringolisina O en sintonía. Es preferido que la preparación final de las minicélulas esté comprendida de LPS destoxificado y esté suficientemente desprovista de cualquier célula parental contaminante viable in vivo en virtud del novedoso mecanismo de suicidio genético inducible y la auxotrofía de DAP.
Como se describe en el presente documento, pero sin ser parte de la invención, las minicélulas VAX-IPT abarcan todas las minicélulas inmunomoduladoras citotóxicas multiefecto que expresan y presentan invasina, perfringolisina O, y una toxina proteica en sintonía. Es posible que la preparación final de las minicélulas esté comprendida de LPS destoxificado y esté suficientemente desprovista de cualquier célula parental contaminante viable in vivo en virtud del novedoso mecanismo de suicidio genético inducible y la auxotrofía de DAP.
Como se describe en el presente documento, pero sin ser parte de la invención, una subclase de minicélula VAX-IPT es minicélula VAX-IPD, la cual es una minicélula inmunomoduladora citotóxica multiefecto que expresa y presenta invasina, perfringolisina O, y el fragmento catalítico (fragmento A) de la toxina diftérica en sintonía. Es posible que la preparación final de las minicélulas esté comprendida de LPS destoxificado y esté suficientemente desprovista de cualquier célula parental contaminante viable in vivo en virtud de un novedoso mecanismo de suicidio genético inducible y la auxotrofía de DAP. En algunas realizaciones, sin ser parte de la invención, las minicélulas bacterianas VAX-IPD se usan para dirigir y más eficazmente administrar el fragmento catalítico de la toxina diftérica in vitro e in vivo. Por ejemplo, se observa la actividad citolítica óptima en presencia de los tres de invasina, PFO, y el fragmento catalítico (fragmento A) de la toxina diftérica. Y, VAX-IPD tiene requerimientos similares para los tres componentes para ejercer potencia de amplio espectro a través de un panel de tipos de células endoteliales y tumorales murinas y humanas que se sabe que expresan integrinas beta activadas. Sorprendentemente, las células HL60 que se sabe que expresan integrinas beta, no están afectadas por VAX-IPD. Este resultado es inesperado y tras la revisión adicional de la bibliografía, se descubrió que las células HL60 expresan integrinas beta pero en una forma desactivada. Sin embargo, la actividad de la invasina, la cual se ha caracterizado a fondo, se ha informado que es dependiente del estado de activación beta per se. Este resultado inesperado está probablemente contribuyendo también a la falta de toxicidad esperada demostrada in vivo ya que las integrinas beta se expresan en muchos tipos de tejidos, aunque en la mayoría de los ejemplos a muy bajos niveles, y también se encuentra en forma unida a ligando o desactivada. Notablemente, se observa que las minicélulas VAX-IPD son capaces de prevenir o eliminar la metástasis así como ejercer efectos antitumorales primordiales in vivo. También se observaron resultados similares, con respecto a la actividad y la toxicidad, aunque en un modelo diferente.
La Proteína G es una proteína de superficie celular expresada por la bacteria Gram positiva Streptococcus del Grupo G. Su función biológica natural es prevenir la opsonización de Streptococcus del Grupo G durante el proceso de infección mediante la unión de la región Fc de los anticuerpos de modo que las región Fc se enmascare del sistema inmunitario. La Proteína G contiene dos dominios de unión Fc. En algunas realizaciones, las minicélulas no tienen la porción de unión Fc de la proteína G. En algunas realizaciones, las minicélulas no presentan la porción de unión Fc de la proteína G.
La Proteína A es una proteína de superficie celular expresada por la bacteria Gram positiva Staphylococcus aureus. Como la Proteína G, su función biológica natural es también prevenir la opsonización de Staphylococcus aureus durante el proceso de infección. Staphylococcus aureus usa la proteína A para unirse a la región Fc de los anticuerpos. La proteína A contiene cuatro dominios de unión Fc discretos. En algunas realizaciones, las minicélulas no tienen la porción de unión Fc de la proteína A. En algunas realizaciones, las minicélulas no presentan la porción de unión Fc de la proteína A.
Las minicélulas de acuerdo con la invención no comprenden un anticuerpo u otra molécula que comprende una región Fc de un anticuerpo. Las minicélulas de acuerdo con la invención no presentan un anticuerpo u otra molécula que comprende una región Fc de un anticuerpo.
Algunas realizaciones de la invención proporcionan una bacteria productora de minicélula VAX-P que comprende: (i) un gen expresable que codifica un producto génico productor de minicélula que modula uno o más de la formación de septo, la fisión binaria, y la segregación cromosómica; y (ii) un casete de expresión recombinante capaz de la expresión funcional de perfringolisina O. De acuerdo con la invención, la bacteria no presenta un anticuerpo u otra molécula que comprende una región Fc de un anticuerpo y preferentemente no presenta la porción de unión Fc de la Proteína G o la Proteína A. En algunas realizaciones, la bacteria productora de minicélula VAX-P además comprende uno o más de (iii) un gen "de suicidio genético" expresable que codifica una endonucleasa heteróloga, en la que el cromosoma de la bacteria productora de minicélula comprende uno o más sitios de reconocimiento de la endonucleasa; (iv) una auxotrofia definida; y (v) una deleción o mutación en el gen IpxM/msbB (u otro equivalente funcional). En algunas realizaciones, el gen productor de minicélula es un gen de división celular. Ejemplos del gen de división celular incluyen, pero sin limitación, ftsZ, sulA, ccdB, y sfiC. En algunas realizaciones, el gen productor de minicélula se expresa bajo el control de un promotor inducible. En algunas realizaciones, el gen suicida de endonucleasa está localizado en el cromosoma de la bacteria productora de minicélula. En algunas realizaciones, la endonucleasa es una endonucleasa de asentamiento. Ejemplos de endonucleasa de asentamiento incluyen, pero sin limitación, I-CeuI, Pl-Scel, I-ChuI, I-CpaI, I-SceIII, I-CreI, I-MsoI, I-SceII, I-SceIV, I-CsmI, I-DmoI, I-PorI, PI-TliI, Pl-TliII, y PI-ScpI. En algunas realizaciones, la endonucleasa se expresa bajo el control de un promotor inducible. En algunas realizaciones, la auxotrofia es debida a una deleción o mutación inactivadora en un gen metabólico esencial. En algunas realizaciones, la deleción o mutación inactivadora está en el gen dapA o su homólogo funcional. En algunas realizaciones, la bacteria productora de minicélula además comprende una deleción o mutación inactivadora en un gen que codifica un producto génico que está implicado en la síntesis de lipopolisacárido, en la que el gen está genéticamente modificado en comparación con el correspondiente gen tipo silvestre. En algunas realizaciones, el gen inactivado es lpxM/msbB el cual codifica un producto génico que causa que la bacteria produzca una molécula de lípido A alterada en comparación con las moléculas de lípido A en una correspondiente bacteria tipo silvestre. En algunas realizaciones, la molécula de lípido A alterada es deficiente con respecto a la adición de ácido miristólico a la porción de lípido A de la molécula de lipopolisacárido en comparación con las moléculas de lípido A en una correspondiente bacteria tipo silvestre. En algunas realizaciones, la bacteria productora de minicélula además comprende una deleción o mutación inactivadora en un gen que está implicado en la recombinación homóloga, en la que el gen está genéticamente modificado en comparación con un correspondiente gen tipo silvestre, en la que las bacterias productoras de minicélula son deficientes en reparación de daño de ADN. En algunas realizaciones la bacteria productora de minicélula VAX-P es una bacteria Gram negativa que incluye, pero sin limitación, Campylobacter jejuni, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Brucella spp., Franciscella tularemia, Legionella pneumophilia, Neisseria meningitidis, Kliebsella, Yersinia spp., Helicobacter pylori, Neisseria gonorrhoeae, Legionella pneumophila, Salmonella spp., Shigella spp., Pseudomonas aeruginosa, y Escherichia coli. En algunas realizaciones, la bacteria productora de minicélula VAX-P es una bacteria Gram positiva que incluye, pero sin limitación, Staphylococcus spp., Lactobacillus spp., Streptococcus spp., Bacillus subtilis, Clostridium difficile, y Bacillus cereus.
Algunas realizaciones sin ser parte de la invención pueden proporcionar una bacteria productora de minicélula VAX-IP que comprende: (i) un gen expresable que codifica un producto génico productor de minicélula que modula uno o más de la formación de septo, la fisión binaria, y la segregación cromosómica; y (ii) un casete de expresión recombinante capaz de la expresión funcional y la presentación superficial de invasina además de la expresión de perfringolisina O. En algunas realizaciones, la bacteria no presenta un anticuerpo u otra molécula que comprende una región Fc de un anticuerpo y no presenta la porción de unión Fc de la Proteína G o la Proteína A. En algunas realizaciones, la bacteria productora de minicélula VAX-IP además comprende uno o más de (iii) un gen "de suicidio genético" expresable que codifica una endonucleasa heteróloga, en la que el cromosoma de la bacteria productora de minicélula comprende uno o más sitios de reconocimiento de la endonucleasa; (iv) una auxotrofia definida; y (v) una deleción o mutación en el gen lpxM/msbB (u otro equivalente funcional). En algunas realizaciones, el gen productor de minicélula es un gen de división celular. Ejemplos del gen de división celular incluyen, pero sin limitación, ftsZ, sulA, ccdB, y sfiC. En algunas realizaciones, el gen productor de minicélula se expresa bajo el control de un promotor inducible. En algunas realizaciones, el gen suicida de endonucleasa está localizado en el cromosoma de la bacteria productora de minicélula. En algunas realizaciones, la endonucleasa es una endonucleasa de asentamiento. Ejemplos de endonucleasa de asentamiento incluyen, pero sin limitación, I-CeuI, Pl-SceI, I-ChuIl, I-CpaI, I-SceIII, I-CreI, I-MsoI, I-SceII, I-SceIV, I-CsmI, I-DmoI, I-PorI, PI-TliI, Pl-TliII, y PI-ScpI. En algunas realizaciones, la endonucleasa se expresa bajo el control de un promotor inducible. En algunas realizaciones, la auxotrofia es debida a una deleción o mutación inactivadora en un gen metabólico esencial. En algunas realizaciones, la deleción o mutación inactivadora está en el gen dapA o su homólogo funcional. En algunas realizaciones, la bacteria productora de minicélula además comprende una deleción o mutación inactivadora en un gen que codifica un producto génico que está implicado en la síntesis de lipopolisacárido, en la que el gen está genéticamente modificado en comparación con el correspondiente gen tipo silvestre. En algunas realizaciones, el gen inactivado es lpxM/msbB el cual codifica un producto génico que causa que la bacteria produzca una molécula de lípido A alterada en comparación con las moléculas de lípido A en una correspondiente bacteria tipo silvestre. En algunas realizaciones, la molécula de lípido A alterada es deficiente con respecto a la adición de ácido miristólico a la porción de lípido A de la molécula de lipopolisacárido en comparación con las moléculas de lípido A en una correspondiente bacteria tipo silvestre. En algunas realizaciones, la bacteria productora de minicélula además comprende una deleción o mutación inactivadora en un gen que está implicado en la recombinación homóloga, en la que el gen está genéticamente modificado en comparación con un correspondiente gen tipo silvestre, en la que las bacterias productoras de minicélula son deficientes en reparación de daño de ADN. En algunas realizaciones la bacteria productora de minicélula VAX-IP es una bacteria Gram negativa que incluye, pero sin limitación, Campylobacter jejuni, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Brucella spp., Franciscella tularemia, Legionella pneumophilia, Neisseria meningitidis, Kliebsella, Yersinia spp., Helicobacter pylori, Neisseria gonorrhoeae, Legionella pneumophila, Salmonella spp., Shigella spp., Pseudomonas aeruginosa, y Escherichia coli. En algunas realizaciones, la bacteria productora de minicélula VAX-IP es una bacteria Gram positiva que incluye, pero sin limitación, Staphylococcus spp., Lactobacillus spp., Streptococcus spp., Bacillus subtilis, Clostridium difficile, y Bacillus cereus.
Algunas realizaciones sin ser parte de la invención pueden proporcionar una bacteria productora de minicélula VAX-IPD que comprende: (i) un gen expresable que codifica un producto génico productor de minicélula que modula uno o más de la formación de septo, la fisión binaria, y la segregación cromosómica; y (ii) un casete de expresión recombinante capaz de la expresión funcional y la presentación superficial de invasina además de la expresión de perfringolisina O y el fragmento catalítico (fragmento A) de la toxina diftérica. En algunas realizaciones, la bacteria no presenta un anticuerpo u otra molécula que comprende una región Fc de un anticuerpo y no presenta la porción de unión Fc de la Proteína G o la Proteína A. En algunas realizaciones, la bacteria productora de minicélula VAX-IPD además comprende uno o más de (iii) un gen "de suicidio genético" expresable que codifica una endonucleasa heteróloga, en la que el cromosoma de la bacteria productora de minicélula comprende uno o más sitios de reconocimiento de la endonucleasa; (iv) una auxotrofia definida; y (v) una deleción o mutación en el gen lpxM/msbB (u otro equivalente funcional). En algunas realizaciones, el gen productor de minicélula es un gen de división celular. Ejemplos del gen de división celular incluyen, pero sin limitación, ftsZ, sulA, ccdB, y sfiC. En algunas realizaciones, el gen productor de minicélula se expresa bajo el control de un promotor inducible. En algunas realizaciones, el gen suicida de endonucleasa está localizado en el cromosoma de la bacteria productora de minicélula. En algunas realizaciones, la endonucleasa es una endonucleasa de asentamiento. Ejemplos de endonucleasa de asentamiento incluyen, pero sin limitación, I-CeuI, PI-SceI, I-ChuI, I-CpaI, I-SceIII, I-CreI, I-MsoI, I-SceII, I-SceIV, I-CsmI, I-DmoI, I-PorI, PI-TliI, PI-TliII, y PI-ScpI. En algunas realizaciones, la endonucleasa se expresa bajo el control de un promotor inducible. En algunas realizaciones, la auxotrofia es debida a una deleción o mutación inactivadora en un gen metabólico esencial. En algunas realizaciones, la deleción o mutación inactivadora está en el gen dapA o su homólogo funcional. En algunas realizaciones, la bacteria productora de minicélula además comprende una deleción o mutación inactivadora en un gen que codifica un producto génico que está implicado en la síntesis de lipopolisacárido, en la que el gen está genéticamente modificado en comparación con el correspondiente gen tipo silvestre. En algunas realizaciones, el gen inactivado es IpxM/msbB el cual codifica un producto génico que causa que la bacteria produzca una molécula de lípido A alterada en comparación con las moléculas de lípido A en una correspondiente bacteria tipo silvestre. En algunas realizaciones, la molécula de lípido A alterada es deficiente con respecto a la adición de ácido miristólico a la porción de lípido A de la molécula de lipopolisacárido en comparación con las moléculas de lípido A en una correspondiente bacteria tipo silvestre. En algunas realizaciones, la bacteria productora de minicélula además comprende una deleción o mutación inactivadora en un gen que está implicado en la recombinación homóloga, en la que el gen está genéticamente modificado en comparación con un correspondiente gen tipo silvestre, en la que las bacterias productoras de minicélula son deficientes en reparación de daño de ADN. En algunas realizaciones la bacteria productora de minicélula VAX-IPD es una bacteria Gram negativa que incluye, pero sin limitación, Campylobacter jejuni, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Brucella spp., Franciscella tularemia, Legionella pneumophilia, Neisseria meningitidis, Kliebsella, Yersinia spp., Helicobacter pylori, Neisseria gonorrhoeae, Legionella pneumophila, Salmonella spp., Shigella spp., Pseudomonas aeruginosa, y Escherichia coli. En algunas realizaciones, la bacteria productora de minicélula VAX-IPD es una bacteria Gram positiva que incluye, pero sin limitación, Staphylococcus spp., Lactobacillus spp., Streptococcus spp., Bacillus subtilis, Clostridium difficile, y Bacillus cereus.
Las minicélulas tienen distintos mecanismos y ventajas con respecto a la carga de polipéptidos inmunomoduladores (por ejemplo, citocinas, toxinas proteicas, y citolisinas) y ácidos nucleicos (por ejemplo, ARN bicatenario, ARN de horquilla, ADN lineal bicatenario). Por ejemplo, se pueden usar células bacterianas parentales productoras de minicélula inmunomoduladora para expresar/producir recombinantemente una o más citocinas, toxinas proteicas, y citolisinas antes o en el mismo momento en el que se producen las minicélulas. Los polipéptidos recombinantes se expresan, segregan dentro, y encapsulan por minicélulas y, a continuación, se utilizan para aumentar, modular y/o estabilizar las respuestas inmunitarias Th1 o Th2 provocadas por las minicélulas inmunomoduladoras in vivo. La producción recombinante de diversos componentes proteicos de minicélula inmunomoduladora, puede incluir, pero sin limitación, perfringolisina O e invasina, puede ser facilitada por cualquier combinación de métodos de expresión recombinantes conocidos por los expertos en la materia. A modo de ejemplo no limitativo, se puede facilitar la expresión recombinante de una pauta de lectura abierta ligada de manera operativa localizada en el cromosoma que codifica un componente proteico particular, tal como invasina. La expresión recombinante de los componentes proteicos de minicélulas inmunomoduladoras se puede facilitar mediante el uso de una o más construcciones de expresión procariotas episómicas tales como plásmidos, cósmidos, fagémidos, y cromosomas artificiales bacterianos (BAC). Las pautas de lectura abiertas procariotas ligadas de manera operativa que codifican los componentes proteicos deseados individuales del producto de minicélula inmunomoduladora final pueden estar presentes en la misma construcción de expresión episómica o en construcciones de expresión episómicas separadas y distintas. La producción de los componentes proteicos deseados se puede situar bajo el control de promotor procariota inducible o alternativamente se puede situar bajo el control de un sistema promotor procariota constitutivamente activo. Un experto en la materia fácilmente reconocerá los sistemas promotores procariotas disponibles para su uso con la presente invención. Ejemplos de sistema promotor incluyen, pero sin limitación, sistema Lac inducible por IPTG y su miríada de derivados, el sistema pRHA inducible por L-ramnosa, el sistema pBAD inducible por L-arabinosa, el sistema polimerasa T7, el sistema CI857ts, y similares. Una realización de generación de cepas que no son parte de la presente invención, es decir, cepas productoras de minicélula VAX-IP y minicélulas VAX-IP a partir de las mismas, se ilustra en el Ejemplo 6 y la Figura 8.
En los casos en los que el(los) polipéptido(s) se preforma(n) por la célula parental por el modo de la expresión recombinante de un casete de expresión procariota (localización cromosómica o episómica) y, a continuación, se empaquetan dentro de las minicélulas como un inmunopotenciador, la semivida del(de los) polipéptido(s) dentro de la minicélula se puede incrementar mediante el uso de cepas bacterianas productoras de minicélula inmunomoduladora que albergan una o más deleciones u otras mutaciones no funcionales en los genes de proteasa (por ejemplo, el Ion proteasa de E. coli) responsables de la proteolisis. En ausencia de la(s) proteasa(s), las moléculas de toxina proteica se acumulan hasta un nivel mayor, incrementando la potencia de las minicélulas dirigidas que administran las moléculas polipeptídicas terapéuticas. En el caso de cepas productoras de minicélula de Escherichia coli, se pueden introducir mutación o deleciones dentro de uno o más de los genes lon, tonB, abgA, ampA, ampM, pepP, clpP, dcp, ddpX/vanX, elaD, frvX, gcp/b3064, hslV, hchA/b1967, hyaD, hybD, hycH, hycl, iadA, ldcA, ycbZ, pepD, pepE, pepQ, pepT, pmbA, pqqL, prlC, ptrB, sgcX, sprT, tldD, ycaL, yeaZ, yegQ, ygeY, yggG, yhbO, yibG, ydpF, degS, ftsH/hflB, glpG, hofD/hopD, lepB, lspA, pppA, sohB, spa, yaeL, yfbL, dacA, dacB, dacC, degP/htrA, degQ, iap, mepA, nlpC,pbpG, tsp, ptrA, teas, umuD, ydcP, ydgD, ydhO, yebA, yhbU, yhjJ, y nlpD.
En los casos en los que el(los) ácido(s) nucleico(s) inmunomodulador(es) se preforma(n) por la célula parental por medio de la expresión recombinante de un casete de expresión procariota (localización cromosómica o episómica) y, a continuación, se empaquetan dentro de las minicélulas como un inmunopotenciador, la semivida del(de los) ácido(s) nucleico(s) dentro de la minicélula se incrementa mediante el uso de cepas bacterianas productoras de minicélula inmunomoduladora que albergan una o más deleciones u otras mutaciones no funcionales en los genes de nucleasa (por ejemplo, el rnc nucleasa de E. coli) responsables de la degradación de ARN bicatenario. En ausencia de la(s) nucleasa(s), las moléculas de ácido nucleico inmunomoduladoras se acumulan hasta un nivel mayor, incrementando la potencia de las minicélulas inmunomoduladoras que albergan dichas moléculas de ácido nucleico inmunomoduladoras.
Para que las minicélulas inmunomoduladoras se usen como agentes inmunoterapéuticos en seres humanos, dichas células deberían contener pocos o ningún contaminante, tales como células bacterianas parentales. Los niveles de células contaminantes viables y otros contaminantes deberían ser bastantes bajos para no causar efectos secundarios adversos en los pacientes o para interferir con la actividad de la minicélula. La expresión inducible de un gen de endonucleasa de asentamiento, referida como mecanismo de suicidio genético, es un mecanismo preferido por el cual se eliminan las células parentales contaminantes vivas, especialmente cuando se usa en combinación con métodos de filtración convencionales. Debido a que las minicélulas se derivan de algunas bacterias que son patógenas u oportunistas patógenas, es deseable que las células parentales contaminantes se eliminen de manera funcional de una población dada antes de la administración sistémica, y particularmente intravenosa. Lo mismo es cierto para la administración intravesical a pacientes de cáncer de vejiga invasivo no muscular que han recibido cirugía TURBT, especialmente cuando ha ocurrido una perforación en la vejiga o se sospecha. Por consiguiente, La formulación de minicélula deseada sería una en la que el recuento de célula parental viva residual sería tan bajo como fuera posible para no causar efectos secundarios adversos o interferir con la actividad de minicélula deseada. Para maximizar la seguridad y limitar la toxicidad debida a la viabilidad de alguna célula parental contaminante, las minicélulas divulgadas en el presente documento se derivan de cepas productoras de minicélula que comprenden características de seguridad, por ejemplo, una o más de las tres características de seguridad divulgadas a continuación. En algunas realizaciones, las cepas productoras de minicélula comprenden al menos estas tres características de seguridad sinérgicas. La primera es un mecanismo de suicidio genético que destruye las células parentales vivas sin someterlas a lisis (y expulsar lipopolisacárido libre) después de que la etapa de formación de minicélulas se haya completado. La presente solicitud incorpora el uso de un mecanismo de suicidio genético regulado que tras la exposición al inductor apropiado, introduce daño irreparable a los cromosomas de las células parentales productoras de minicélula como se describe en la Publicación de Patente de EE.UU. N.° 20100112670. El mecanismo de suicidio funciona para introducir roturas irreparables de la doble cadena al cromosoma de las células parentales y se puede usar como un accesorio a las técnicas de separación convencionales para mejorar la purificación de la minicélula. La segunda característica de seguridad es una auxotrofia definida, preferentemente, pero no necesariamente, en la ruta de biosíntesis del ácido diaminopimélico (DAP), y lo más preferentemente en el gen dapA de una cepa productora de minicélula de E. coli. Las cepas productoras de minicélula de E. coli que presentan auxotrofía de dA p (dapA-) no pueden sobrevivir fuera del laboratorio sin el suplemento de DAP. Además, DAP no se encuentra en mamíferos, seres humanos incluidos, y como tal ninguna célula parental productora de minicélula que está presente en el producto de minicélula será capaz de sobrevivir en el entorno o in vivo. Existen muchas variaciones sobre este tema para diferentes bacterias Gram negativas y Gram positivas. Por ejemplo, en Salmonella, spp., las auxotrofías en las rutas de biosíntesis de aminoácido aromático (los genes aro) producen en efecto, el mismo resultado. En el caso de Shigella spp. las auxotrofía en la ruta de biosíntesis de guanina producirán, en efecto, el mismo resultado. La tercera característica de seguridad es opcional e implica una deleción del gen lpxM en cepas productoras de minicélula de E. coli. La deleción del gen lpxM puede dar como resultado la producción de moléculas de lipopolisacárido (LPS) destoxificadas. El gen lpxM (también referido como el gen msbB) funciona para añadir un grupo de ácido miristólico terminal a la porción de lípido A de la molécula de LPS y la eliminación de este grupo (por medio de la eliminación del gen lpxM) da como resultado la destoxificación marcada de LPS. Específicamente, la destoxificación se caracteriza por un descenso en la producción de citocinas proinflamatorias en respuesta a la exposición a LPS. Un experto en la materia apreciará que las citocinas aún se producen usando la forma destoxificada de LPS. La destoxificación controla solamente los niveles de citocinas producidas, haciendo posible disminuir la respuesta proinflamatoria tipo sepsis aguda mientras que se permite que se consigan respuestas inmunitarias Th1 y/o Th2 más fuertes, sin toxicidad patente. Esta deleción se puede introducir en cualquier gen funcionalmente equivalente de cualquier cepa productora de minicélula Gram negativa o Gram positiva para conseguir el mismo efecto. El perfil de seguridad aumentado puede reducir el riesgo de infección y el potencial para desarrollar sepsis, disminuir la posibilidad de la reversión genética a través de los sucesos de recombinación con otra bacteria, y minimizar el riesgo de sucesos de inserción en el hospedador. Desde una perspectiva reguladora y de producción, también se prefiere que los marcadores de resistencia a antibióticos se eliminen del cromosoma bacteriano de la cepa de célula parental productora de minicélula. El uso de la mayoría de los marcadores de gen de resistencia a antibiótico en las cepas de bacterias productoras de minicélula es indeseable para cumplir con los requerimientos reguladores impuestos por la "U.S. Food and Drug Administration" (FDA) para su uso en seres humanos. La FDA solamente tolerará el uso del marcador del gen de resistencia a kanamicina con fines de selección para bacterias o cepas de producción bacterianas en las que el producto final está destinado para su uso en seres humanos.
Algunas realizaciones proporcionan un método de producción de minicélulas inmunomoduladoras, que comprende cultivar las bacterias productoras de minicélula inmunomoduladora apropiadas divulgadas en el presente documento y separar sustancialmente las minicélulas inmunomoduladoras de las células parentales productoras de minicélula, de ese modo generando una composición que comprende minicélulas inmunoterapéuticas. En algunas realizaciones, el método además comprende inducir la formación de minicélula inmunomoduladora a partir de un cultivo de células parentales productoras de minicélula. En algunas realizaciones, el método además comprende inducir la expresión del gen que codifica la endonucleasa de suicidio genético. En algunas realizaciones, la formación de minicélula se induce por la presencia de uno o más compuestos químicos seleccionados de isopropil p-D-1-tiogalactopiranosida (IPTG), ramnosa, arabinosa, xilosa, fructosa, melibiosa y tetraciclina. En algunas realizaciones, la expresión del gen que codifica la endonucleasa de suicidio genético se induce por un cambio en la temperatura. En algunas realizaciones, el método además comprende purificar las minicélulas inmunomoduladoras de la composición. En algunas realizaciones, las minicélulas inmunomoduladoras se separan sustancialmente de las células parentales por un proceso seleccionado del grupo que incluye, pero sin limitación, centrifugación, filtración, ultrafiltración, ultracentrifugación, gradación por densidad, inmunoafinidad, inmunoprecipitación, y cualquier combinación de los anteriores métodos de purificación.
Algunas realizaciones proporcionan una minicélula eubacteriana que comprende una membrana externa, en la que los componentes de lipopolisacárido de la membrana externa comprende moléculas de Lípido A que no tienen resto de ácido miristólico ("lipopolisacárido destoxificado" o "LPS destoxificado"). El LPS destoxificado da como resultado la reducción de las respuestas inmunitarias proinflamatorias en un hospedador mamífero en comparación con la respuesta inflamatoria inducida por la membrana externa de minicélulas eubacterianas que se derivan de una correspondiente bacteria tipo silvestre.
La presente divulgación describe el novedoso uso de minicélulas eubacterianas inmunomoduladoras con el fin de estimular el sistema inmunitario de tal manera que tenga efectos antitumorales indirectos potentes mediados, por completo o en parte, por la respuesta inmunitaria además de algún efecto antitumoral directo. Por ejemplo, las minicélulas inmunomoduladoras divulgadas en el presente documento se pueden usar como una terapia intravesical para cáncer de vejiga invasivo no muscular.
1. Producción de minicélula
Las minicélulas son nanopartículas biológicas encapsuladas por membrana, acromosómicas (aproximadamente 250­ 500 nm de diámetro dependiendo del tipo de cepa y las condiciones de crecimiento usadas) que se forman por bacterias tras una alteración en el aparato de la división celular normal. Esencialmente, las minicélulas son pequeñas réplicas metabólicamente activas de células bacterianas normales con la excepción de que no contienen ADN cromosómico y como tal, son de no división y no viables. Aunque las minicélulas no contienen ADN cromosómico, ADN plasmídico, ARN, proteínas nativas y/o recombinantemente expresadas, y otros metabolitos se ha demostrado que todos se segregan dentro de las minicélulas.
Las alteraciones en la coordinación entre la replicación cromosómica y la división celular conduce a la formación de minicélula a partir de la región polar de la mayoría de los procariotas en forma baciliforme. La alteración de la coordinación entre la replicación cromosómica y la división celular se puede facilitar por la sobreexpresión de algunos de los genes implicados en la formación de septo y la fisión binaria. Como alternativa, las minicélulas se pueden producir en cepas que albergan mutaciones en genes implicados en la formación de septo y la fisión binaria. Los mecanismos de segregación de cromosoma dañados también pueden conducir a la formación de minicélula como se ha mostrado en muchos procariotas diferentes.
De manera similar, la producción de minicélula se puede conseguir mediante la sobreexpresión o mutación de los genes implicados en la segregación de cromosomas emergentes dentro de las células hijas. Por ejemplo, se ha demostrado que las mutaciones en los locis de parC o mukB de E. coli producen minicélulas. Ambos afectan a las etapas requeridas separadas en el proceso de segregación de cromosoma en Enterobacteriacea. Se puede asumir que como los genes de división celular anteriormente descritos, la manipulación de los niveles de tipo silvestre de cualquier gen dado implicado en el proceso de segregación de cromosoma que da como resultado la producción de minicélula tendrá efectos similares en otros miembros de la familia.
Debido a que los procesos de división celular y replicación cromosómica son críticos para la supervivencia, existe un alto nivel de conservación genética y funcional entre los miembros de la familia procariota con respecto a los genes responsables de estos procesos. Como resultado, la sobreexpresión o la mutación de un gen de división celular capaz de conducir la producción de minicélula en un miembro de la familia se puede usar para producir minicélulas en otro. Por ejemplo, se ha mostrado que la sobreexpresión del gen ftsZ de E. coli en otros miembros de la familia Enterobacteriacea tales como Salmonella spp. y Shigella spp así como otros miembros de la clase tales como Pseudomonas spp. darán como resultado niveles similares de producción de minicélula.
Lo mismo se puede demostrar en las cepas productoras de minicélula basadas en mutación de la familia Enterobacteriacea. Por ejemplo, la deleción del locus min en alguno de los miembros de la familia Enterobacteriacea da como resultado la producción de minicélula. Los genes de división celular de las Enterobacteriacea en los que la mutación puede conducir a la formación de minicélula incluyen, pero sin limitación, los genes min (MinCDE). Aunque es posible la producción de minicélula a partir de las cepas min mutantes, estas cepas tienen valor comercial limitado en términos de ser cepas de producción. La razón de esto es que las cepas con deleciones o mutaciones dentro de los genes min producen minicélulas a niveles constitutivamente bajos. Esto presenta dos problemas en términos de comercialización y economías de escala. El primero es que las producciones de minicélula a partir de estas cepas son bajas, lo cual incrementa el coste de producción. El segundo es que las producciones de minicélula son altamente variables con las cepas mutantes y la variabilidad entre lotes tiene un impacto enorme sobre el coste de producción, el control de la calidad de producción y el cumplimiento regulador. El uso de las cepas mutantes de división celular para producir minicélulas que encapsulan moléculas biológicamente activas tales como proteínas, ARN, ADN y otros catabolitos para el suministro diagnóstico o terapéutico es problemático. El inicio de la producción de minicélula en las cepas mutantes no se puede controlar y se da a un nivel bajo de manera que el resultado final es que algunas minicélulas no contendrán moléculas biológicamente activas mientras que otras contendrán cantidades ampliamente variables de moléculas biológicamente activas. Estos defectos cuando se toman juntos o por separado restringen mucho la utilidad de estas cepas mutantes con fin comercial.
Las cepas productoras de minicélula que sobreexpresan los genes de división celular ("sobreexpresores") se prefieren por encima de las cepas basadas en mutación debido a que el fenotipo de producción de minicélula es controlable siempre que los genes de división celular a sobreexpresar estén situados bajo el control de un sistema promotor eubacteriano inducibles u otro condicionalmente activo. La producción de minicélula a partir de cepas que sobreexpresan el gen de división celular ftsZ se descubrieron por los investigadores que estaban identificando los genes esenciales de la división celular en E. coli usando estudios de suplemento basado en plásmido. En estos estudios, el gen ftsZ estaba presente en más de 10 copias por célula. Se demostró que la presencia de las copias de gen múltiple de ftsZ producen minicélulas y células filamentosas extremadamente largas. Finalmente, esta transición en el fenotipo filamentoso irreversible impacta negativamente en las producciones de minicélula a partir de cepas que sobreexpresan ftsZ a partir de plásmidos multicopia, aunque el número de minicélulas producidas es aún mayor que el de cualquier cepa mutante. Desde entonces se ha demostrado que al reducir el número de copias del gen ftsZ a una única, duplicación cromosómica, el número de minicélulas producidas incrementa por encima de aquellas cepas en las que ftsZ se localiza en plásmidos multicopia y que el fenotipo filamentoso es menos profundo. Por tanto, la(s) composición(es) preferida(s) son cepas productoras de minicélula que induciblemente sobreexpresan el gen ftsZ a partir de un duplicado, copia cromosómicamente integrada de ftsZ. El gen ftsZ duplicado usado se puede derivar directamente de las especies de bacterias en las que el fenotipo de producción de minicélula está siendo modificado por ingeniería genética y también se puede derivar de la secuencia del gen ftsZ de otras especies de bacterias. A modo de ejemplo no limitativo, la sobreexpresión del gen ftsZ de Escherichia coli se puede usar para generar minicélulas de Escherichia coli y Salmonella typhimurium. Las cepas resultantes están comprendidas del gen ftsZ y una copia separada, duplicativa, e inducible del gen ftsZ en el cromosoma y el(los) mecanismo(s) de suicidio genético descrito(s) en la Publicación de Patente de EE. UU. N.° 2010/0112670, que se incorpora en el presente documento en su totalidad. A modo de ejemplo no limitativo, los genes de división que se pueden sobreexpresar para producir minicélulas en la familia Enterobacteriaceae incluyen, pero sin limitación, ftsZ, minE, sulA, ccdB, y sfiC. La composición preferida es para tener una copia(s) duplicada(s) de un gen(es) de división celular bajo el control de un promotor inducible que está establemente integrado en el cromosoma de una cepa eubacteriana dada. Un experto en la materia fácilmente reconoce que esta misma estrategia se podría impartir si el casete del gen de división celular inducible estuviera presente en un plásmido, cósmido, cromosoma artificial bacteriano (BAC), bacteriófago recombinante u otra molécula de ADN episómica presente en la célula.
Esta estrategia de fenotipo inducible para la producción de minicélula tiene varias ventajas distintas sobre los sistemas mutantes. La primera es que debido a que no hay mutaciones genéticas constitutivas en estas cepas, no existe presión selectiva durante el crecimiento normal y las células del cultivo mantienen una fisiología muy estable y normal hasta que se induce el fenotipo de minicélula. El resultado final es que las cepas productoras de minicélula inducibles son más sanas y más estables, lo cual da como resultado finalmente producciones mayores de minicélulas. Otra ventaja distinta de uso de la estrategia de fenotipo inducible para la producción de minicélula es en los casos en los que las minicélulas son para usarse para administrar moléculas biológicamente activas tales como proteínas, ARN terapéuticos, ADN plásmidos, y otros catabolitos bioactivos que pueden ser producidos por las células parentales productoras de minicélula de modo que las minicélulas que se producen encapsulan aquellas moléculas biológicamente activas. En estos casos, el método preferido es inducir la formación de la(s) molécula(s) biológicamente activa(s) con las células parentales antes de inducir el fenotipo de minicélula, de manera que todas la minicélulas producidas contendrán la cantidad deseada de la(s) molécula(s) biológicamente activa(s). Como alternativa, las propias minicélulas son capaces de producir la molécula bioactiva después de ser separadas de las células parentales. Esto incluye, pero sin limitación, formar la molécula bioactiva a partir de un ácido nucleico episómico o ARN que codifica la molécula bioactiva localizada dentro de la minicélula o expresando previamente los componentes proteicos de minicélulas después de ser separadas de las células parentales. Cualquiera de estas estrategias de expresión se pueden emplear para expresar y presentar partes de unión sobre las superficies de las minicélulas. Estas ventajas, cuando se usan en combinación, dan como resultado una mayor calidad y cantidad de minicélulas. Además, estas minicélulas además pueden comprender fármacos de molécula pequeña que se pueden cargar en las minicélulas como se describe con mayor detalle a continuación.
2. Purificación de minicélula
Debido a que las minicélulas se derivan de algunas bacterias que son patógenas u oportunistas patógenas, Es de suma importancia que cualquier célula parental contaminante se elimine de manera funcional de una población dada antes de la administración. Convencionalmente, las células parentales vivas se han eliminado por medios físicos o medios biológicos o ambos.
Los medios físicos incluyen el uso de procedimientos de separación basados en centrifugación, metodologías de filtración, metodologías de cromatografía, o cualquier combinación de los mismos.
La eliminación biológica se consigue mediante, pero sin limitación, lisis preferencial de células parentales, el uso de cepas parentales auxotróficas, tratamiento con antibióticos, tratamiento con radiación UV, privación de ácido diaminopimélico (DAP), adsorción selectiva de células parentales, tratamiento con otros agentes que dañan el ADN, e inducción de un gen suicida.
La lisis preferencial de las células parentales normalmente se media induciendo el ciclo lítico de un profago lisógeno. En el caso de cepas productoras de minicélula, lo más útil es usar un profago que es lisis competente pero defectuoso en la reinfección, de manera que las minicélulas posteriormente no se infectan y se someten a lisis durante la activación del fenotipo lítico. Como alternativa y a modo de ejemplo no limitativo, los genes individuales tales como aquellos clasificados como miembros de la familia del gen de holina, se pueden expresar para conseguir niveles similares de lisis sin las preocupaciones sobre la reinfección inherente al uso de los profagos lisógenos. Ambas estrategias están limitadas por el hecho de que el suceso de lisis, independientemente del método usado para conseguirlo, expulsa cantidades inaceptables de endotoxina libre en los medios. La eliminación de tales grandes cantidades de endotoxina libre requiere mucho tiempo, sufre de variabilidad entre lotes, y finalmente es prohibitivo en cuanto costes.
El uso de cepas auxotróficas aumenta las preocupaciones sobre la reversión y como tal solamente se pueden usar en casos en los que las minicélulas sean para ser producidas a partir de las cepas comensales o no patógenas de las bacterias. Por tanto, su aplicación está limitada con respecto a ser usadas como un método para la eliminación de células parentales no patógenas vivas usadas en la producción de minicélula.
El tratamiento con irradiación UV puede ser útil en la eliminación de células parentales vivas en una ejecución de la producción de minicélula con la excepción del hecho de que la irradiación UV es aleatoria con respecto a sus efectos sobre los ácidos nucleicos y los resultados son altamente variables de lote a lote. Además, no se prefiere este método cuando se usa minicélulas para administrar ácidos nucleicos terapéuticos o profilácticos ya que la irradiación UV daña aleatoriamente todos los ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN plasmídico también sería altamente susceptible al daño del ADN por irradiación UV y se puede volver infeccioso aunque aún se administre eficazmente por minicélulas.
La privación de ácido diaminopimélico (DAP) puede ser útil en la eliminación de células parentales vivas con la excepción de que esta estrategia está limitada por el número de especies para las que se puede usar. En otras palabras, no todas las especies celulares parentales capaces de producir minicélulas requieren de DAP para la supervivencia. Los mutantes de DAP en cepas productoras de minicélula de E. coli son de gran ventaja y en algunos casos preferidos sobre el tipo silvestre. La ventaja de usar DAP es que este compuesto (ácido diaminopimélico, un componente de la pared celular de E. coli) es crítico para el crecimiento de E. coli y no está presente en o producido por animales. Por tanto, se debería administrar una célula parental productora de minicélula de E. coli "viable" junto con las minicélulas dirigidas, la célula parental sería incapaz de crecer y de ese modo sería inerte al animal y con respecto a la actividad de la minicélula. Se puede usar una estrategia similar con cepas parentales productoras de minicélula basadas en Salmonella spp. excepto en el caso de que se eliminen los genes aro, preferentemente aroB.
Las metodologías de adsorción selectivas todavía se tienen que explorar con respecto a la purificación de minicélulas a partir de células parentales viables. La adsorción selectiva se define como cualquier proceso por el que las células parentales o minicélulas se adsorben preferentemente a un sustrato en virtud de su afinidad para el sustrato. A modo de ejemplo no limitativo, las interacciones proteína-proteína de alta afinidad se podrían explotar para este uso. A modo de ejemplo no limitativo, la proteína de membrana externa de minicélula novedosa Lpp-OmpA::Proteína A tiene una alta afinidad para la región Fc de la mayoría de los anticuerpos. El gen que codifica Lpp-OmpA::Proteína A está bajo el control de un promotor inducible que se podría introducir fácilmente en el cromosoma de una cepa productora de minicélula inmunomoduladora. Las minicélulas inmunomoduladoras se podrían producir a partir de esta cepa antes de la activación de la expresión del gen de invasina de modo que las minicélulas producidas no expresan o presentan Lpp-Om-pA::Proteína A sobre su superficie celular. Una vez que se produce la cantidad deseada de las minicélulas inmunomoduladoras a partir de la cepa, a las células viables dentro del cultivo se les podría dar la señal para producir la proteína Lpp-OmpA::Proteína A de modo que Lpp-OmpA::Proteína A se expresa y se presenta solamente sobre las células viables. Una vez que Lpp-OmpA::Proteína A se expresa preferentemente sobre la superficie de las células parentales viables, se pueden adsorber fácilmente a un sustrato recubierto con anticuerpos u otras proteínas que contienen la región Fc. Una vez absorbida, las minicélulas se pueden purificar selectivamente de las células parentales viables por un número de medios diferentes dependientes del tipo de sustrato usado. Los sustratos incluyen, pero sin limitación, columnas cromatográficas de fase sólida usadas en aplicaciones de filtración por gravedad, perlas magnéticas, columnas de intercambio iónico, o columnas de HPLC.
En algunas realizaciones, las minicélulas se separan sustancialmente de las células parentales productoras de minicélula en una composición que comprende minicélulas. Por ejemplo, tras la separación, la composición que comprende las minicélulas es más de aproximadamente 99,9 %, 99,5 %, 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 94 %, 93 %, 92 %, 91 %, 90 %, 89 %, 88 %, 87 %, 86 %, 85 %, 84 %, 83 %, 82 %, 81 %, 80 %, 79 %, 78 %, 77 %, 76 %, 75 %, 74 %, 73 %, 72 %, 71 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 % o 30 % libre de células parentales productoras de minicélula. En algunas realizaciones, la composición contiene menos de aproximadamente 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 % o 30 % de células parentales productoras de minicélula.
Preferentemente, la composición final contiene bastantes pocas células parentales contaminantes, viables o de otra manera, así no son demasiado tóxicas o interfieren con la actividad de las minicélulas dirigidas cuando se administran in vivo con fines terapéuticos.
Un método preferido de eliminación suficiente de células bacterianas parentales viables contaminantes o prevención de la supervivencia in vivo es a través de la incorporación de un mecanismo de suicidio genético inducible, que incluye, pero sin limitación, la activación y la expresión de una endonucleasa de asentamiento o equivalente funcional del mismo como se describe en la Publicación de Patente de EE.UU. N.° 20100112670.
3. Producción genética de m inicélulas dirigidas a células, tejidos, y órganos específicos
Tras la producción y posterior purificación, se pueden usar minicélulas VAX-IP, VAX-IPT, VAX-IPP, VAX-IPD, VAX-IPG, VAX-IPPA, y VAX-IPR (todas las cuales no son parte de la invención, puesto que las minicélulas de acuerdo con la invención no comprenden invasina) como vehículos de suministro dirigido a tipos celulares específicos diana que tienen expresión y/o actividad elevadas de integrinas beta y están implicadas en la enfermedad in vivo para administrar preferentemente y más eficazmente sus cargas de toxina proteica al tejido dirigido, órgano, y tipo celular. Las minicélulas dirigidas VAX-IP, VAX-IPT, VAX-IPP, VAX-IPD, VAX-IPG, VAX-IPPA, y VAX-IPR divulgadas en el presente documento se pueden dirigir a antígenos de superficie específicos a célula cancerosa eucariota que incluyen, pero sin limitación, integrina a3p1, integrina a4p1, integrina a5p1, integrina a6p1, integrina avpl, e integrina p1. Como se describe con mayor detalle a continuación, los niveles de expresión y/o actividad de los miembros de la familia de integrina beta se encuentran en muchos tipos de tumor sólido así como en la vasculatura tumoral en comparación con las integrinas beta de bajo nivel, inactivadas y/o ocupadas por ligando en tejidos y vasculatura normales.
4. Adición de cargas en las m inicélulas
Las minicélulas eubacterianas son capaces de encapsular y administrar varias clases de compuestos biológicamente activos que tienen beneficio terapéutico, profiláctico, o diagnóstico a un animal. Los tipos de los compuestos biológicamente activos (cargas) que se pueden administrar por minicélulas incluyen, pero sin limitación, moléculas pequeñas (incluidos fármacos de molécula pequeña), ácidos nucleicos, polipéptidos, radioisótopo, lípidos, lipopolisacáridos y cualquier combinación de los mismos.
Las proteínas están comprendidas de polipéptidos y están codificadas por ADN. Las proteínas pueden ser biológicamente funcionales, tales como enzimas, toxinas, o proteínas de señalización. Las proteínas pueden ser estructurales, tal como es el caso para actina y similares. Las proteínas pueden unirse firmemente a otras proteínas, tal como con anticuerpos y miméticos de anticuerpo, y se usan para alterar las funciones que requieren interacciones proteína/proteína. Las proteínas pueden proporcionar señales de localización siendo fluorescentes o bioluminiscentes. Las proteínas pueden servir como inmunógenos o servir a otros fines terapéuticos (tales como suministrar o restablecer enzima en una célula diana, tejido, órgano, o animal). Las proteínas pueden ayudar en la transferencia intracelular después de la endocitosis de otros tipos de carga. Por ejemplo, se pueden emplear proteínas tales como listeriolisina O de Listeria monocytogenes para facilitar la transferencia de la(s) carga(s) de minicélula del(de los) compartimento(s) endocitótico(s) de una célula diana al citosol de una célula diana. Las proteínas también pueden ser enzimas convertidoras de profármaco. Una toxina proteica recombinantemente expresada/producida preferida no limitativa es perfringolisina O. Otros polipéptidos terapéuticos recombinantemente expresados/producidos a administrar por minicélulas dirigidas incluyen, pero sin limitación, toxinas proteicas, citolisinas dependientes de colesterol, enzimas funcionales, miméticos de anticuerpo, alteradores de la interacción proteína/proteína, caspasas activadas, procaspasas, citocinas, quimiocinas, péptidos penetrantes de células, y cualquier combinación de lo anterior. La expresión recombinante de un polipéptido(s) terapéutico(s) puede ser el resultado de la expresión de cualquiera de los diversos vectores de expresión procariotas recombinantes episómicos conocidos en la técnica que incluyen, pero sin limitación, plásmidos, cósmidos, fagémidos, y cromosomas artificiales bacterianos (BAC), y cualquier combinación de lo anterior. De forma similar, la expresión recombinante se puede conseguir por un casete de expresión procariota cromosómicamente localizado presente en una o más copias del cromosoma de célula parental productora de minicélula. La producción recombinante de diversos componentes proteicos de minicélula inmunomoduladora (incluidas, pero sin limitación, perfringolisina O e invasina) se pueden facilitar por cualquier combinación de métodos de expresión recombinantes conocidos por los expertos en la materia. A modo de ejemplo no limitativo, se puede facilitar la expresión recombinante de una pauta de lectura abierta ligada de manera operativa localizada en el cromosoma que codifica un componente proteico particular, tal como invasina. La expresión recombinante de los componentes proteicos de minicélulas inmunomoduladoras se puede facilitar mediante el uso de una o más construcciones de expresión procariotas episómicas tales como plásmidos, cósmidos, fagémidos, y cromosomas artificiales bacterianos (BAC). Las pautas de lectura abiertas procariotas ligadas de manera operativa que codifican los componentes proteicos deseados individuales del producto de minicélula inmunomoduladora final pueden estar presentes en la misma construcción de expresión episómica o en construcciones de expresión episómicas separadas y distintas. La producción de los componentes proteicos deseados se pueden situar bajo el control promotor procariota inducible o alternativamente se puede situar bajo el control de un sistema promotor procariota constitutivamente activo. Un experto en la materia fácilmente reconocerá los sistemas promotores procariotas disponibles para su uso. Ejemplos de sistemas promotores incluyen, pero sin limitación, sistema Lac inducible por IPTG y su miríada de derivados, el sistema pRHA inducible por L-ramnosa, el sistema pBAD inducible por L-arabinosa, el sistema polimerasa T7, el sistema CI857ts, y similares. A modo de ejemplo no limitativo, los métodos específicos de generación de cepas productoras de minicélula VAX-IP y minicélulas VAX-IP a partir las mismas, se incluyen como el Ejemplo 6 y la Figura 8.
Ejemplos de toxinas proteicas incluyen, pero sin limitación, perfringolisina O, gelonina, fragmento A de la toxina diftérica, fragmento A/B de la toxina diftérica, toxina del tétano, toxina lábil por calor de E. coli (LTI y/o LTII), toxina colérica, toxina iota de C. perfringes, exotoxina A de Pseudomonas, toxina shiga, toxina de ántrax, MTX (toxina mosquicidal de B. sphaericus), estreptolisina, toxina de cebada, melitina, toxinas LF y EF del ántrax, toxina adenilato ciclasa, botulinolisina B, botulinolisina E3, botulinolisina C, toxina botulínica A, toxina colérica, toxinas A, B y alfa de Clostridium, ricina, toxina shiga A, toxina tipo shiga, toxina A del cólera, toxina pertussis S1, toxina lábil por calor de E. coli (LTB), variantes pH estables de listeriolisina O (independientes del pH; sustitución de aminoácido L461T), variantes termoestables de listeriolisina O (sustituciones de aminoácido E247M, D320K), y variantes pH y termoestables de listeriolisina O (sustituciones de aminoácido E247M, D320K, y L461T), estreptolisina O, estreptolisina O c, estreptolisina O e, esfaericolisina, antrolisina O, cereolisina, turingiensilisina O, weihenstefanensilisina, alveolisina, brevilisina, butiriculisina, tetanolisina O, noviilisina, lectinolisina, pneumolisina, mitilisina, pseudoneumolisina, suilisina, intermedilisina, ivanolisina, seeligeriolisina O, vaginolisina, y piolisina. Las toxinas proteicas pueden estar localizadas en diferentes compartimentos subcelulares de la minicélula al criterio del técnico. Cuando las minicélulas dirigidas divulgadas en el presente documento se derivan de una cepa productora de minicélula parental Gram-negativa, los polipéptidos terapéuticos recombinantemente expresados producidos a partir de las mismas pueden estar localizados en el citosol, la valva interna de la membrana interna, la valva externa de la membrana interna, el periplasma, la valva interna de la membrana externa, la membrana externa de las minicélulas, y cualquier combinación de lo anterior. Cuando las minicélulas dirigidas divulgadas en el presente documento se derivan de una cepa productora de minicélula parenteral Gram-positiva, los polipéptidos terapéuticos recombinantemente expresados producidos a partir de las mismas pueden estar localizados en el citosol, la pared celular, la valva interna de la membrana, la membrana de las minicélulas, y cualquier combinación de lo anterior.
5. Composiciones farmacéuticas
La presente solicitud también se refiere a composiciones, incluidas, pero sin limitación, composiciones farmacéuticas. El término "composición" usado en el presente documentos se refiere a una mezcla que comprende al menos un vehículo, preferentemente un vehículo fisiológicamente aceptable, y una o más composiciones de minicélula. El término "vehículo" usado en el presente documento se refiere a un compuesto químico que no inhibe o previene la incorporación del(de los) péptido(s) biológicamente activo(s) en células o tejidos. Un vehículo normalmente es una sustancia inerte que permite que un principio activo se formule o esté compuesto dentro de una forma farmacéutica adecuada (por ejemplo, una píldora, una cápsula, un gel, una película, un comprimido, una micropartícula (por ejemplo, una microesfera), una solución; una pomada; una pasta, un aerosol, unas gotículas, un coloide o una emulsión, etc.). Un "vehículo fisiológicamente aceptable" es un vehículo adecuado para su uso bajo condiciones fisiológicas que no abroga (reduce, inhibe o previene) la actividad biológica y las propiedades del compuesto. Por ejemplo, sulfóxido de dimetilo (DMSO) es un vehículo que facilita la absorción de muchos compuestos orgánicos dentro de las células o tejidos de un organismo. Preferentemente, el vehículo es un vehículo fisiológicamente aceptable, preferentemente un vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable, en el que se dispone la composición de minicélula.
Una "composición farmacéutica" se refiere a una composición en la que el vehículo es un vehículo farmacéuticamente aceptable, mientras que "una composición veterinaria" es una en la que el vehículo es un vehículo veterinariamente aceptable. El término "vehículo farmacéuticamente aceptable" o "vehículo veterinariamente aceptable" usado en el presente documento incluye cualquier medio o material que no es biológicamente o de otro mono indeseado, es decir, el vehículo se puede administrar a un organismo junto con una composición de minicélula sin causar ningún efecto biológico indeseable o interactuar de una manera perjudicial con el complejo o cualquiera de sus componentes o el organismo. Ejemplos de reactivos farmacéuticamente aceptables se proporcionan en la Farmacopea de Estados Unidos, "The National Formulary, United States Pharmacopeial Convention", Inc., Rockville, Md. 1990. Los términos "cantidad terapéuticamente eficaz" y "cantidad farmacéuticamente eficaz" se refieren a una cantidad suficiente para inducir o efectuar una respuesta medible en la célula diana, tejido, o cuerpo de un organismo. Qué constituye una cantidad terapéuticamente eficaz dependerá de diversos factores, los cuales el médico tendrá en cuenta para llegar a la pauta posológica deseada.
Las composiciones también pueden comprender otros componentes químicos, tales como diluyentes y excipientes. Un "diluyente" es un compuesto químico diluido en un disolvente, preferentemente un disolvente acuoso, que facilita la disolución de la composición en el disolvente, y también puede servir para estabilizar la forma biológicamente activa de la composición o uno o más de sus componentes. Se utilizan sales disueltas en soluciones tamponadas como diluyentes en la técnica. Por ejemplo, diluyentes preferidos son soluciones tamponadas que contienen una o más sales diferentes. Un ejemplo no limitativo de solución tamponada preferida es solución salina tamponada con fosfato (particularmente junto con composiciones destinadas a la administración farmacéutica), ya que imita las condiciones salinas de la sangre humana. Puesto que las sales tampón pueden controlar el pH de una solución a bajas concentraciones, un diluyente tamponado rara vez modifica la actividad biológica de un compuesto o composición farmacéutica dada.
Un "excipiente" es cualquier sustancia más o menos inerte que se puede añadir a una composición para conferir una propiedad adecuada, por ejemplo, una consistencia adecuada o para producir una formulación de fármaco. Excipientes y vehículos adecuados incluyen, en particular, rellenos tales como azúcares, incluidos lactosa, sacarosa, manitol, o preparaciones de sorbitol celulosa tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, agar, pectina, goma xantana, goma guar, goma garrofín, ácido hialurónico, almidón de patata caseína, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, poliacrilato, carboximetilcelulosa sódica y/o polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, también se pueden incluir agentes desintegrantes, tales como polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o una sal de los mismos tales como alginato sódico. Otros excipientes y vehículos adecuados incluyen hidrogeles, hidrocoloides gelificables, y quitosano. Las microesferas de quitosano y las microcápsulas se pueden usar como vehículos. Véase, por ejemplo, el documento WO 98/52547 (el cual describe formulaciones de microesfera para dirigir compuestos al estómago, comprendiendo las formulaciones un núcleo interno (que incluye opcionalmente un hidrocoloide gelificado) que contiene uno o más principios activos, una membrana comprendida de un polímero insoluble en agua (por ejemplo, etilcelulosa) para controlar la tasa de liberación del(de los) principio(s) activo(s), y una capa externa comprendida de un polímero catiónico bioadhesivo, por ejemplo, un polisacárido catiónico, una proteína catiónica, y/o un polímero catiónico sintético; el documento de Patente de EE. UU. N.° 4.895.724. Normalmente, el quitosano se reticula usando un agente adecuado, por ejemplo, glutaraldehído, glioxal, epiclorhidrina, y succinaldehído. Las composiciones que emplean quitosano como vehículo se pueden formular en diversas formas farmacéuticas, incluidos píldoras, comprimidos, micropartículas y microesferas, entre otras aquellas que proporcionan liberación controlada del(de los) principio(s) activo(s). Otros polímeros catiónicos bioadhesivos adecuados incluyen gelatina ácida, poligalactosamina, poliaminoácidos tales como polilisina, polihistidina, poliornitina, compuestos policuaternarios, prolamina, poliimina, detilaminoetildextrano (DEAE), DEAE-imina, DEAE-metacrilato, DEAE-acrilamida, DEAE-dextrano, DEAE-celulosa, poli-p-aminoestireno, polioxetano, copolimetacrilatos, poliamidoaminas, almidones catiónicos, polivinilpiridina, y politiodietilaminometiletileno.
Las composiciones se pueden formular de cualquier manera adecuada. Las composiciones de minicélula se pueden dispersar uniformemente (homogéneamente) o no uniformemente (heterogéneamente) en el vehículo. Formulaciones adecuadas incluyen formulaciones secas y líquidas. Formulaciones secas incluyen polvos secados por congelación o liofilizados, los cuales son particularmente bien adecuados para el suministro de aerosol a los senos o al pulmón o para almacenamiento a largo plazo seguido de la reconstitución en un diluyente adecuado antes de la administración. Otras formulaciones secas preferidas incluyen aquellas en las que una composición desvelada en el presente documento está comprendida dentro de la forma de comprimido o píldora adecuada para la administración oral o compuesta en una formulación de liberación sostenida. Cuando la composición está destinada a administración oral para que se administre al epitelio en los intestinos, es preferido que la formulación esté encapsulada con un recubrimiento entérico para proteger la formulación y prevenir la liberación prematura de las composiciones de minicélula incluidas en la misma. Como los expertos en la materia apreciarán, las composiciones divulgadas en el presente documento se pueden colocar dentro de cualquier forma farmacéutica adecuada. Las píldoras y los comprimidos representan algunas de las formas farmacéuticas. Las composiciones también se pueden encapsular en cualquier cápsula adecuada u otro material de recubrimiento, por ejemplo, por compresión, inmersión, recubrimiento de bombo, secado por pulverización, etc. Cápsulas adecuadas incluyen aquellas hechas de gelatina y almidón. A su vez, tales cápsulas pueden estar recubiertas con uno o más materiales adicionales, por ejemplo, y recubrimiento entérico, si se desea. Las formulaciones líquidas incluyen formulaciones acuosas, geles, y emulsiones.
Algunas realizaciones proporcionan composiciones que comprenden un recubrimiento bioadhesivo, preferentemente mucoadhesivo. Un "recubrimiento bioadhesivo" es un recubrimiento que permite que una sustancia (por ejemplo, una composición de minicélula) se adhiera a una superficie o sustancia biológica mejor de lo que ocurre sin el recubrimiento. Un "recubrimiento mucoadhesivo" es un recubrimiento bioadhesivo preferido que permite que una sustancia, por ejemplo, una composición se adhiera mejor a la mucosa de lo que ocurre sin el recubrimiento. Por ejemplo, las minicélulas se recubren con un mucoadhesivo. A continuación, las partículas recubiertas se pueden ensamblar dentro de una forma farmacéutica adecuada para suministro a un organismo. Preferentemente, y dependiendo de la localización en la que se expresa la parte de transporte de superficie celular a la que se dirige, a continuación, la forma farmacéutica se recubre con otro recubrimiento para proteger la formulación hasta que alcance la localización deseada, en la que el mucoadhesivo es capaz de retener la formulación mientras que la composición interactúa con la parte de transporte de superficie de la célula diana.
Las composiciones divulgadas en el presente documento se pueden administrar a cualquier organismo, por ejemplo, un animal, preferentemente un mamífero, pájaro, pez, insecto, o arácnido. Mamíferos preferidos incluyen animales bovinos, caninos, equinos, felinos, ovinos, y porcinos, y primates no humanos. Los humanos son particularmente preferidos. Existen múltiples técnicas de administración o suministro de un compuesto en la técnica que incluyen, pero sin limitación, administración oral, rectal (por ejemplo, un enema o supositorio) aerosol (por ejemplo, para suministro nasal o pulmonar), parenteral, y tópica. Preferentemente, se administran cantidades suficientes del polipéptido biológicamente activo para conseguir el efecto deseado. La cantidad particular de composición a administrar dependerá de muchos factores, incluido el efecto a conseguir, el tipo de organismo al cual se administra la composición, la ruta de suministro, la pauta posológica, y la edad, salud, y sexo del organismo. Como tal, la dosis particular de una composición incorporada en una formulación dada se deja al criterio del experto en la materia.
Los expertos en la materia apreciarán que cuando las composiciones divulgadas en el presente documento se administran como agentes para conseguir un resultado biológico deseado particular, el cual puede incluir un efecto(s) terapéutico(s), diagnóstico(s) o protector(es) (incluida la vacunación), puede ser posible combinar la composición de minicélula con un vehículo farmacéutico adecuado. La elección de vehículo farmacéutico y la preparación de las minicélulas como agente terapéutico o protector dependerá del uso y el modo de administración deseados. Las formulaciones y los métodos adecuados de administración de agentes terapéuticos incluyen aquellos para suministro oral, pulmonar, nasal, bucal, ocular, dérmico, rectal, intravenoso o vaginal.
Dependiendo del modo de suministro empleado, la entidad funcional dependiente de contexto se puede administrar en diversas formas farmacéuticamente aceptables. Por ejemplo, la entidad funcional dependiente de contexto se puede administrar en forma de un sólido, solución, emulsión, dispersión y similares, incorporada en una píldora, cápsula, comprimido, supositorio, aerosol, gotículas o pulverizador. Las píldoras, los comprimidos, los supositorios, los aerosoles, los polvos, las gotículas y los pulverizadores pueden tener estructuras multicapa complejas y tener un gran rango de tamaños. Los aerosoles, los polvos, las gotículas y los pulverizadores pueden oscilar de pequeño (1 micra) a grande (200 micras) en tamaño.
Las composiciones farmacéuticas divulgadas en el presente documento se pueden usar en forma de un sólido, un polvo liofilizado, una solución, una emulsión, una dispersión y similares, en los que la composición resultante contiene uno o más de los documentos divulgados en el presente documento, como principio activo, en mezcla con un vehículo o excipiente orgánico o inorgánico adecuado para aplicaciones enterales o parenterales. El principio activo puede estar compuesto, por ejemplo, con los vehículos farmacéuticamente aceptables, no tóxicos para comprimidos, gránulos, cápsulas, supositorios, soluciones, emulsiones, suspensiones y cualquier otra forma adecuada para su uso. Los vehículos que se pueden usar incluyen glucosa, lactosa, manosa, goma de acacia, gelatina, manitol, pasta de almidón, trisilicato de magnesio, talco, almidón de maíz, queratina, sílice coloidal, almidón de patata, urea, triglicéridos de longitud de cadena media, dextranos y otros vehículos adecuados para su uso en las preparaciones de fabricación, en forma sólida, semisólida o líquida. Además se pueden usar agentes auxiliares, estabilizantes, espesantes y colorantes y perfumes. Ejemplos de un agente seco establizante incluyen triulosa, preferentemente a concentraciones de 0,1 % o más (Véase, por ejemplo, el documento de patente de EE.UU. N.° 5.314.695). El compuesto activo se incluye en la composición farmacéutica en una cantidad suficiente para producir el efecto deseado en el proceso o el estado de las enfermedades.
6. Indicaciones terapéuticas
La presente divulgación se refiere a inmunoterapia mediada por minicélula frente a cáncer(es) que incluyen, pero sin limitación, tumores sólidos, tumores metastásicos y tumores líquidos. Tumores sólidos y metastásicos incluyen aquellos de origen epitelial, fibroblástico, muscular y óseo e incluyen, pero sin limitación, cánceres de mama, pulmón, pancreáticos, prostáticos, testiculares, ováricos, gástricos, intestinales, de boca, lengua, faringe, hepáticos, anales, rectales, de colon, esofágicos, de vejiga urinaria, de vesícula biliar, piel, útero, vaginales, de pene y renales. Otros tipos de cáncer sólido que se pueden tratar con las minicélulas inmunomoduladoras divulgadas en el presente documento incluyen, pero sin limitación, adenocarcinomas, sarcomas, fibrosarcomas, y cánceres de ojo, cerebro y huesos. Tumores líquidos que se pueden tratar por las minicélulas inmunomoduladoras divulgadas en el presente documento incluyen, pero sin limitación, linfoma no Hodgkin, mieloma, linfoma de Hodgkin, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, y otras leucemias.
Las actividades inmunomoduladoras de minicélulas VAX-P (minicélula de acuerdo con la invención), VAX-IP (minicélula no de acuerdo con la invención), y VAX-IPD (minicélula no de acuerdo con la invención) in vivo se muestra en las Figuras 3-6 y como se describe además en los Ejemplos 2-4. La primera evidencia in vivo de que los efectos inmunomoduladores están contribuyendo a las propiedades antitumorales de perfringolisina O que contiene formulaciones de minicélula tales como minicélulas VAX-P, VAX-IP y VAX-IPD fue inesperada. En la realización de los experimentos de control en el desarrollo y caracterización in vivo de VAX-IP, se descubrió inesperadamente que la eliminación de la parte de direccionamiento invasina tenía poco o ningún efecto sobre la eficacia in vivo (véase la Figura 3). Sin embargo, la eliminación del componente de perfringolisina O tenía un efecto marcado sobre la capacidad de las minicélulas para prevenir el crecimiento tumoral. También se descubrió inesperadamente que las minicélulas podían tener profundos efectos antitumorales frente a tumores que habían colonizado los ovarios de ratones femeninos, aunque las minicélulas fueran indetectables (es decir, no se localizaron) en los ovarios (véase las Figuras 4 y 5). En esos mismos ratones, los ratones que habían colonizado el pulmón también previnieron significativamente el crecimiento y demostraron amplia colonización de minicélula. Tomado en conjunto, estos resultados discrepantes indican que la localización del tumor no puede ser crítica para un efecto antitumoral y hay probablemente otro factor global, probablemente sea algún aspecto del sistema inmunitario en juego. Además, se demostró que las minicélulas que contenían perfringolisina O no tenían efecto sobre los tumores crecidos en ratones NIH-III gravemente inmunodeprimidos (carecen de función de linfocito NK además de función de linfocito T) (véase la Figura 6).
Como resultado del efecto inmunomodulador de las minicélulas formuladas como se describe en el presente documento, una aplicación terapéutica no limitativa todavía preferida de las minicélulas inmunomoduladoras de la presente invención está en la administración intravesical y el tratamiento de cáncer de vejiga invasivo no muscular. Como se muestra en la Figura 7 y se describe en el Ejemplo 5, las minicélulas inmunomoduladoras ya han demostrado eficacia en un modelo de ratón de cáncer de vejiga invasivo no muscular.7
7. Preparaciones de minicélula
Algunas realizaciones se refieren a crear una cepa optimizada y preparar minicélulas inmunomoduladoras a partir de, pero sin limitación, la familia bacteriana Enterobacteriaceae.
En algunas realizaciones, el nivel de contaminación de célula parental viable productora de minicélula es menos de 1 en 105 minicélulas. En algunas realizaciones, el nivel de contaminación de célula parental viable productora de minicélula es menos de 1 en 106 minicélulas.
En algunas realizaciones, el nivel de contaminación de célula parental viable productora de minicélula es menos de 1 en 107 minicélulas.
En algunas realizaciones, el nivel de contaminación de célula parental viable productora de minicélula es menos de 1 en 108 minicélulas.
En algunas realizaciones, el nivel de contaminación de célula parental viable productora de minicélula es menos de 1 en 109 minicélulas.
En algunas realizaciones, el nivel de contaminación de célula parental viable productora de minicélula es menos de 1 en 1010 minicélulas.
En algunas realizaciones, el nivel de contaminación de célula parental viable productora de minicélula es menos de 1 en 1011 minicélulas.
En algunas realizaciones, el nivel de contaminación de célula parental viable productora de minicélula es menos de 1 en 1012 minicélulas.
En algunas realizaciones, el nivel de contaminación de célula parental viable productora de minicélula es menos de 1 en 1013 minicélulas.
En algunas realizaciones, el nivel de contaminación de célula parental viable productora de minicélula es menos de 1 en 1014 minicélulas.
En algunas realizaciones, el nivel de contaminación de célula parental viable productora de minicélula es menos de 1 en 1015 minicélulas.
En algunas realizaciones, el nivel de contaminación de célula parental viable productora de minicélula es menos de 1 en 1016 minicélulas.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos que se utilizan en el presente documento tienen el mismo significado que el normalmente entendido por un experto en la materia.
Ejemplos
Para la consideración de los siguientes ejemplos se debería indicar que las minicélulas que comprenden invasina no son parte de la invención.
Ejemplo 1
La perfringolisina O es citotóxica in vitro cuando se dirige y es administrada por minicélulas VAX-IP como se demuestra en la Tabla 1 y la Figura 2. Se realizaron experimentos in v/'trosembrando placas de 96 pocillos con 25.000 células transitorias murinas línea celular de carcinoma MB49 en RPMI-1640 que contenía suero fetal bovino al 10 %, penicilina y estreptomicina. Al día siguiente, se añadieron VAX-IP, VAX-I (que no contiene perfringolisina O), o perfringolisina O recombinante (BTX-100, adquirida de ATCC) a las células a una relación de minicélulas VAX-IP y VAX-I añadidas por mamífero en placa (la MOI) de 1.000:1. La concentración de BTX-100 añadida era equivalente a la cantidad de perfringolisina O que era administrada por VAX-IP. Inicialmente, se usaron ensayos de actividad de lactato deshidrogenasa (LDH) como una lectura subrogada de la citotoxicidad, principalmente debido a que la actividad de LDH es un indicador bien conocido de la fuga de la membrana celular mamífera, un mecanismo por el cual se ha informado que actúa la perfringolisina O. Como se espera y como es muestra en la Figura 1, la lactato deshidrogenasa murina (LDH), se liberó de las células MB49 casi inmediatamente después de la exposición a BTX-100. Las células MB49 tratadas con VAX-IP a una MOI de 1.000:1 también demostraron actividad LDH aunque el inicio de la liberación fue más lento, probablemente debido al requerimiento para la internalización de minicélula VAX-IP, la iniciación de la degradación endosómica, y la liberación final de perfringolisina O dentro de la célula diana por medio de rotura de la membrana endosómica, mediada por perfringolisina O. Las minicélulas VAX-I, usadas como control, no demostraron liberación significativa de LDH. Sorprendentemente, posteriormente se descubrió que las células tratadas con BTX-100 se habían recuperado en el punto de tiempo de 24 h y eran perfectamente viables y adherentes. Por otro lado, aquellas células m B49 tratadas con minicélulas VAX-IP se separaron de la placa y aparentemente murieron. Para confirmar este resultado, el mismo experimento se repitió comparando un rango de minicélulas de VAX-IP frente a un rango de concentraciones de BTX-100 pero en este caso se realizó un ensayo de viabilidad de célula MTT convencional en el punto de tiempo de 24 h. Los resultados de estos experimentos, mostrados en la Figura 2, demuestran claramente que el suministro intracelular de una concentración normalmente no tóxica de perfringolisina O puede ser bastante potente cuando es administrada por minicélulas.
Tabla 1
Figure imgf000028_0001
Ejemplo 2
La primera línea de evidencia de que las minicélulas que contienen perfringolisina O estimulan actividad inmunomoduladora antitumoral in vivo viene de estudios de xenoinjerto humano realizados en ratones Desnudos ("Nude") atímicos (los ratones Desnudos están parcialmente inmunodeprimidos y carecen de un complemento completo de la actividad de linfocito T). La eficacia antitumoral de las minicélulas VAX-IP cuando se administran intravenosamente en un calendario q3d para un total de 6 dosis se demostró en un estudio de xenoinjerto subcutáneo usando la línea celular de carcinoma pancreático humano BxPC3 (véase la Figura 3). En este modelo, la células tumorales se implantaron subcutáneamente en ratones Desnudos y se dejó que alcanzaran un tamaño de 100 mm3 antes de distribuirlos al azar en grupos de tratamiento. Los ratones portadores de tumor se trataron intravenosamente en un calendario q3d para 6 dosis totales con o bien vehículo salino, paclitaxel, 3,0x108 minicélulas "desnudas" (minicélulas de E. coli que no contenían invasina o perfringolisina O), 3,0x108 minicélulas VAX-P (que no contenían proteína invasina sobre la superficie de la minicélula), o 3,0x108 minicélulas de VAX-IP. Sorprendentemente, el grupo de control no dirigido, minicélulas VAX-P (que no contenían proteína invasina sobre la superficie de la minicélula), era igualmente eficaz que las minicélulas VAX-IP en la prevención del crecimiento tumoral en este modelo mientras que las minicélulas "desnudas" eran ineficaces. La actividad antitumoral en ausencia de una parte de direccionamiento de tumor sobre la superficie del vehículo de minicélula era completamente inesperado.
Ejemplo 3
La segunda línea de evidencia de que las minicélulas que contiene perfringolisina O estimulan la actividad inmunomoduladora antitumoral in vivo viene de un modelo murino sinérgico de metástasis pulmonar y ovárica usando la línea celular de melanoma murino B16F10. En este modelo, las células de melanoma murino B16F10 que expresan constitutivamente luciferasa de luciérnaga se inyectaron intravenosamente por la vena de la cola en ratones Desnudos hembras. Los ratones se inyectaron una vez cada 3 días con luciferina y se realizaron imágenes de los animales realizando imágenes del ratón completo para la presencia de metástasis establecida en los pulmones de los ratones. Una vez que se verificó el establecimiento del tumor, los ratones se distribuyeron al azar en grupos controles y recibieron o bien vehículo salino o 3,0x108 minicélulas de VAX-IPD intravenosamente en una pauta posológica qd3 para un total de 6 dosis. Se observó actividad antitumoral significativa frente a la metástasis de pulmón y ovario en ratones tratados con minicélulas VAX-IPD (véase la Figura 4). En un segundo y paralelo estudio de biodistribución basado en PCR específica a plásmido VAX-IPD cuantitativa usando el mismo modelo y la pauta posológica, los presentes inventores determinaron que VAX-IPD estaba localizado en los pulmones y los tumores pulmonares en los ratones. Sorprendentemente, en ningún punto de tiempo ensayado, las minicélulas VAX-IPD estaban localizadas en los ovarios o los tumores ováricos (véase la Figura 5). A partir de la combinación de estos dos resultados, se concluyó que algún factor global, probablemente sea uno o más factores inmunitarios, deba estar contribuyendo a la actividad antitumoral si las minicélulas VAX-IPD no se estaban localizando en el tejido o el tumor ovárico pero estaba teniendo un profundo efecto supresor de tumor en ese sitio orgánico.
Ejemplo4
Basándose en las observaciones de los experimentos in vivo realizados en los Ejemplos 2 y 3, anteriormente, se realizó un tercer estudio usando una variación de tumor subcutáneo establecido del modelo de melanoma murino B16F10 singénico que compara la eficacia antitumoral de las minicélulas VAX-IPD en ratones C57/BL6 completamente inmunocompetentes con la actividad antitumoral en ratones NIH-III gravemente inmunodeficientes (mismo contexto genético que C57/BL6 pero careciendo de actividad de tanto linfocito T como linfocito citolítico). Después de que los tumores hubieran crecido hasta un tamaño de 100 mm3, los ratones se distribuyeron al azar en los grupos de tratamiento y se trataron con o bien solución salina o 3,0x108 minicélulas de VAX-IPD intravenosamente en un calendario q3d para un total de 6 dosis. Tras la dosis final, los ratones se sacrificaron, se extirparon quirúrgicamente los tumores, se pesaron, y se clasificaron por carga tumoral. Los resultados, mostrados en la Figura 6, demuestran

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Una minicélula bacteriana, que comprende una proteína citolisina dependiente de colesterol, en donde dicha minicélula no presenta un anticuerpo u otra molécula que comprenda una región Fc de un anticuerpo, que cumple al menos uno de los siguiente:
i) la proteína citolisina dependiente de colesterol se selecciona de listeriolisina O, listeriolisina O L461T, listeriolisina O e247M, listeriolisina O D320K, listeriolisina O E247M, listeriolisina O D320K, listeriolisina O L461T, estreptolisina O, estreptolisina O c, estreptolisina O e, esfaericolisina, antrolisina O, cereolisina, turingiensilisina O, weihenstefanensilisina, alveolisina, brevilisina, butiriculisina, tetanolisina O, noviilisina, lectinolisina, pneumolisina, mitilisina, pseudoneumolisina, suilisina, intermedilisina, ivanolisina, seeligeriolisina O, vaginolisina y piolisina, ii) la proteína citolisina dependiente de colesterol es perfringolisina O,
iii) la proteína citolisina dependiente de colesterol comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 1
en donde dicha minicélula no comprende invasina.
2. Una minicélula bacteriana que comprende una proteína citolisina dependiente de colesterol para su uso en el tratamiento del cáncer, que induce un efecto inmunomodulador antitumoral no inmunógeno, en donde la minicélula no presenta un anticuerpo u otra molécula que comprenda una región Fc de un anticuerpo, dicha proteína citolisina dependiente de colesterol se selecciona de listeriolisina O, listeriolisina O L461T, listeriolisina O E247M, listeriolisina O D320K, listeriolisina O E247M, listeriolisina O D320K, listeriolisina O L461T, estreptolisina O, estreptolisina O c, estreptolisina O e, esfaericolisina, antrolisina O, cereolisina, turingiensilisina O, weihenstefanensilisina, alveolisina, brevilisina, butiriculisina, tetanolisina O, noviilisina, lectinolisina, pneumolisina, mitilisina, pseudoneumolisina, suilisina, intermedilisina, ivanolisina, seeligeriolisina O, vaginolisina, y piolisina, o
la proteína citolisina dependiente de colesterol es perfringolisina O, o
la proteína citolisina dependiente de colesterol comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 1 en donde dicha minicélula no comprende invasina.
3. La minicélula de la reivindicación 1, que además comprende al menos una de
(i) una citocina Th1,
(ii) una citocina Th2,
(iii) una fosfolipasa.
4. La minicélula de acuerdo con la reivindicación 3, en la que la citocina Th1 se selecciona de IL-2, GMCSF, IL-12p40, IL-12p70, IL-18, TNF-a e IFN-y, la citocina Th2 se selecciona de IL-1 a, IL-1p, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13, la fosfolipasa se selecciona de PC-PLC y PI-PLC.
5. La minicélula de cualquiera de las reivindicaciones 1,3 o 4, que además comprende al menos una de una toxina proteica seleccionada de los fragmentos A/B de la toxina diftérica, el fragmento A de la toxina diftérica, toxinas LF y EF del ántrax, toxina adenilato ciclasa, gelonina, botulinolisina B, botulinolisina E3, botulinolisina C, toxina botulínica, toxina colérica, toxinas A, B y alfa de Clostridium, ricina, toxina A shiga, toxina A tipo shiga, toxina A del cólera, toxina pertussis S1, exotoxina A de Pseudomonas, toxina lábil por calor de E. coli (LTB), melitina, caspasas activadas, procaspasas, citocinas, quimiocinas, péptidos penetrantes de células, y combinaciones de los mismos.
6. La minicélula de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en donde dicha minicélula no comprende ninguna otra parte terapéuticamente activa, en donde preferentemente dicha minicélula no comprende una molécula pequeña terapéutica, ninguna otra proteína terapéutica o un ácido nucleico terapéutico.
7. La minicélula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3 a 6, en donde dicha minicélula no presenta la porción de unión Fc de la Proteína G o la Proteína A.
8. La minicélula para su uso en el tratamiento de cáncer de acuerdo con la reivindicación 2, que además comprende al menos una de
(i) una citocina Th1,
(ii) una citocina Th2,
(iii) una fosfolipasa.
9. La minicélula para su uso en el tratamiento de cáncer de acuerdo con la reivindicación 8, en la que la citocina Th1 se selecciona de IL-2, GMCSF, IL-12p40, IL-12p70, IL-18, TNF-a e IFN-y, la citocina Th2 se selecciona de IL-1a, IL-1p, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13, la fosfolipasa se selecciona de PC-PLC y PI-PLC.
10. La minicélula para su uso en el tratamiento de cáncer de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2, 8 o 9, que además comprende al menos una de una toxina proteica seleccionada de los fragmentos A/B de la toxina diftérica, el fragmento A de la toxina diftérica, toxinas LF y EF del ántrax, toxina adenilato ciclasa, gelonina, botulinolisina B, botulinolisina E3, botulinolisina C, toxina botulínica, toxina colérica, toxinas A, B y alfa de Clostridium, ricina, toxina A shiga, toxina A tipo shiga, toxina A del cólera, toxina pertussis S1, exotoxina A de Pseudomonas, toxina lábil por calor de E. coli (LTB), melitina, caspasas activadas, pro-caspasas, citocinas, quimiocinas, péptidos penetrantes de células, y combinaciones de los mismos.
11. La minicélula para su uso en el tratamiento de cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en donde dicha minicélula no comprende ninguna otra parte terapéuticamente activa, en la que preferentemente dicha minicélula no comprende una molécula pequeña terapéutica, ninguna otra proteína terapéutica o un ácido nucleico terapéutico.
12. La minicélula para su uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 u 8 a 11, en donde dicha minicélula no presenta la porción de unión Fc de la Proteína G o la Proteína A.
13. La minicélula para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 u 8 a 12, en donde el cáncer comprende un tumor sólido, tumor metastásico, tumor líquido, o en donde el cáncer es de origen epitelial, fibroblástico, muscular u óseo, o en donde el cáncer se selecciona de cánceres de mama, pulmón, pancreáticos, prostáticos, testiculares, ováricos, gástricos, intestinales, de boca, lengua, faringe, hepáticos, anales, rectales, de colon, esofágicos, de vesícula biliar, piel, útero, vaginales, de pene y renales, o en donde el cáncer es cáncer de vejiga urinaria, o en donde el cáncer se selecciona de adenocarcinomas, sarcomas, fibrosarcomas, y cánceres de ojo, cerebro y hueso, o en donde el cáncer se selecciona de linfoma no Hodgkin, mieloma, linfoma de Hodgkin, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide aguda y leucemia mieloide crónica.
14. La minicélula bacteriana para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 u 8 a 13, en donde dicha administración genera una respuesta inmunitaria dominada por Th1, o una respuesta inmunitaria dominada por Th2.
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