KR20230016247A - 면역 조절성 미니세포 및 사용 방법 - Google Patents

면역 조절성 미니세포 및 사용 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 면역 조절성 박테리아 미니세포 및 상기 미니세포의 이용 방법에 관한 것이다.

Description

면역 조절성 미니세포 및 사용 방법{IMMUNOMODULATORY MINICELLS AND METHODS OF USE}
본 발명은 방광암 및 기타 악성 종양과 같은 질병의 치료에 사용하기 위한 면역 조절성 진정 박테리아 미니세포(immunomodulatory eubacterial minicell)의 생산, 정제, 제형화 및 사용을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
관련 출원서
본 발명은 35 U.S.C. § 119(e)의 규정에 의해 2012년 10월 02일자로 출원된 미국 가출원 제 61/709102 호에 대한 우선권을 주장하며, 이는 명백히 본원에서 그 전체가 참고로 인용된다.
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본 발명은 서열목록과 함께 전자 양식으로 출원되어 있다. 상기 서열목록은 2013년 10월 02일자로 생성된 SEQLISTING.TXT란 표제의 파일로서 제공되며, 그 크기는 20Kb이다. 상기 서열목록의 전자 양식 내의 정보는 본원에서 그 전체가 참고로 인용된다.
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면역 시스템은 암의 예방에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 널리 공지되어 있다. 면역 조정은 암 치료에서의 매력적인 치료학적 접근법일 수 있다는 것이 점점 더 명확해지고 있다. 가장 오래된 공개된 항암 면역 조절 요법은 마이코박테리아 보비스(Mycobacterium bovis)의 생약독화 균주(live attenuated strain)인 바실리 칼메트 구에린(Bacille Calmette-Guerin, BCG)으로, 이는 비근육 침습성 방광암의 치료를 위한 수술 후 보조 요법으로서 사용된다. 기타 공지되지 않은 실험적인 항암 면역 조절 접근법들은 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 비피도박테리아(Bifidobacteria), 리스테리아 모노사이토제네스( Listeria monocytogenes), 스트렙토코쿠스 파이로제네스(Streptococcus pyrogenes), 세라티아 마르체센스(Serratia marcescens), 클로스트리듐 노비(Clostridium novyi), 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella choleraesuis) 및 비브리오 콜레라(Vibrio cholera)와 같은 기타 생약독화 종들(live attenuated species)의 사용을 포함한다. 다소 효과적일지라도, 사용된 균주 각각은 감염 위험성, 생약독화 균주들의 병원성으로의 유전적 복귀에 대한 두려움, 및 패혈증에 의해 제한된다. 이들 접근법 모두는 가장 효과적인 투여량에서 또는 그 근사치에서 나타나는 독성을 갖는 생(生)-박테리아 감염을 연상케 하는 극도의 독성에 직면해 왔다. 이는 균주 유형 각각에 대해 협소한 치료 지수를 야기한다.
면역 조절 요법으로서 살아있는 박테리아가 갖는 독성 문제를 제시하기 위해, 다른 연구자들은 동일한 면역학적 효과를 발휘하기 위해 상이한 박테리아 성분들(온전하게 살아있는 유기체와는 대조적임)을 이용하려고 노력하였다. 이러한 유형의 실험 치료제들로는 정제된 박테리아 독소, 정제된 전염증성 지질 다당류(LPS), 정제된 테이코산(TCA) 및 기타 박테리아 세포벽 제제, 및 기타 박테리아성 세포하 분획(bacterial sub-cellular fraction)을 들 수 있다. 이들 접근법은 개선된 독성 프로파일을 갖지만, 몇몇의 경우에는 부수적인 효능 손실이 나타난다. 부가적으로, 많은 접근법이 단지 분극화 면역 반응(Th1 또는 Th2)을 자극하며, 여기서 대부분의 접근법이 Th2(항체 생성) 반응을 자극한다. Th1 반응(세포성 면역 반응)은 항종양 면역 조절 효과를 갖는다는 측면에서 우선적인 것으로 보인다는 문헌이 매우 많다. 마지막으로, 이들 제제는 시장 수요를 지지하기 위한 규모 및 양으로 제조하기 어려울 수 있으며, 궁극적으로는 항종양 효과를 나타낼 수 없는 하위 부류의 면역 반응들을 야기할 수만 있을 수 있다. 대부분의 암의 치료에 사용되는 단백질 독소들의 경우에, 단백질 독소의 효능은 정상 조직에 대한 독성에 의해 유의하게 제한된다. 게다가, 종종 전신 노출 수준에 기여하는 약물 동력학적(PK) 매개변수들은, 특히 세포 표적 또는 기작들이 항종양 활성 및 정상 조직 독성에 책임이 있는 경우 항종양 활성을 최대화하는 동시에 부작용을 최소화하기 위해 최적화되지 않거나 전적으로 최적화되지 않을 수 있다. 또한, 이는 매우 협소한 치료 지수를 초래하며, 이는 대부분의 단백질 독소에 있어서 일반적이다.
면역 조절성 "일반종(generalist)"으로서 살아있는 박테리아 벡터 및 박테리아 성분들 이외에, 기타 연구가들은 항암 치료제들로서 상이하고 특이적인 Th1 면역 조절성 사이토카인 및 케모카인을 개발하려고 노력해 왔다. 그 예로는 인터페론 감마(IFN-γ), 인터페론 알파(IFN-α), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GMCSF), 종양 괴사 인자 알파(TNF-α), 인터류킨-2(IL-2), 인터류킨-12(IL-12) 및 인터류킨-18(IL-18)을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 이들 접근법 각각은 단독으로 투여되는 경우에 면역학적 치료 이점은 거의 없지만 예상치 못한 심각한 독성에 의해 제한되었다. 단일의 사이토카인 또는 케모카인 약제들은 항암 효과를 가질 필요성이 있는 전체 영역의 Th1 면역 반응을 유발하지 않으며, 이들 인자들은 시간이 지남에 따라 역학적이 되는 다양한 수준에서 협주적으로 작용할 가능성이 있다는 것이 다소 자명하게 되고 있다. 이는, 다중 생성물 제형을 개괄하고 조직하기 위한 거의 불가능한 면역학적 신호 전달 사건의 캐스케이드이다. 대부분의 단일 약제인 사이토카인은 임상적으로 성공하지 못했으며, 예외로는 만성 간염 C의 바이러스 감염의 치료를 위한 페길화(pegylation)된 인터페론이 있다.
면역 조절성 항암 치료제의 개발에 대한 이들 접근법의 관측된 제약에 기초하여, 항암 활성을 부여하기에 충분한 강력하고 다양한 면역 반응을 여전히 야기하면서도 감염 및 감염 연관 독성의 위험성의 도입 없이 생박테리아 감염을 모방할 수 있는 면역 조절 요법에 대한 필요성이 존재한다.
본 발명은 방광암 기타 악성 종양과 같은 질병의 치료용 면역 조절성 박테리아 미니세포, 상기 미니세포 생산 박테리아, 상기 미니세포를 이용한 암의 치료 방법 등을 제공하는 것을 목적으로 한다.
몇몇 실시예에는 콜레스테롤 의존성 세포 용해소 단백질(cholesterol-dependent cytolysin protein)을 포함하는 박테리아 미니세포(bacterial minicell)가 개시되어 있으며, 여기서 상기 미니세포는 항체, 또는 항체의 Fc 영역을 포함하는 기타 분자를 표시하지 않는다.
몇몇 실시예에서, 상기 콜레스테롤 의존성 세포 용해소 단백질은 리스테리올리신 O(listeriolysin O), 리스테리올리신 O L461T, 리스테리올리신 O E247M, 리스테리올리신 O D320K, 리스테리올리신 O E247M, 리스테리올리신 O D320K, 리스테리올리신 O L461T, 스트렙토리신 O(streptolysin O), 스트렙토리신 O c, 스트렙토리신 O e, 스파에리코리신(sphaericolysin), 안트로리신 O(anthrolysin O), 세레올리신(cereolysin), 튜린지엔시리신 O(thuringiensilysin O), 바이헨스테파넨실리신(weihenstephanensilysin), 알베올리신(alveolysin), 브레빌리신(brevilysin), 부티리쿨리신(butyriculysin), 테타놀리신 O(tetanolysin O), 노비일리신(novyilysin), 렉티놀리신(lectinolysin), 뉴몰리신(pneumolysin), 미틸리신(mitilysin), 슈도뉴몰리신(pseudopneumolysin), 수일리신(suilysin), 인터메딜리신(intermedilysin), 이바놀리신(ivanolysin), 세엘리제리올리신 O(seeligeriolysin O), 바기놀리신(vaginolysin) 및 피올리신(pyolysin)으로부터 선택된다. 몇몇 실시예에서, 상기 콜레스테롤 의존성 세포 용해소 단백질은 퍼프린골리신 O이다. 몇몇 실시예에서, 상기 콜레스테롤 의존성 세포 용해소 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 실시예에서, 상기 미니세포는 인바신(invasin)을 더 포함한다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포는 인바신을 포함하지 않는다.
몇몇 실시예에서, 상기 미니세포는 Th1 사이토카인을 더 포함한다. 몇몇 실시예에서, 상기 Th1 사이토카인은 IL-2, GMCSF, IL-12p40, IL-12p70, IL-18, TNF-α 및 IFN-γ로부터 선택된다.
몇몇 실시예에서, 상기 미니세포는 Th2 사이토카인을 더 포함한다. 몇몇 실시예에서, 상기 Th2 사이토카인은 IL-1α, IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 및 IL-13으로부터 선택된다.
몇몇 실시예에서, 상기 미니세포는 포스포리파아제를 더 포함한다. 몇몇 실시예에서, 상기 포스포리파아제는 PC-PLC 또는 PI-PLC이다.
몇몇 실시예에서, 상기 미니세포는 디프테리아 독소의 단편 A/B, 디프테리아 독소의 단편 A, 탄저병 독소 LF 및 EF, 아데닐레이트 시클라아제 독소, 겔로닌(gelonin), 보툴리노리신 B(botulinolysin B), 보툴리노리신 E3, 보툴리노리신 C, 보툴리눔 독소(botulinum toxin), 콜레라 독소, 클로스트리듐(Clostridium) 독소 A, B 및 알파, 리신(ricin), 시가 A(Shiga A) 독소, 시가 유사 A 독소, 콜레라 A 독소, 백일해 S1 독소, 슈도모나스(Pseudomonas) 외독소 A, 대장균(E. coli) 이열성 독소(LTB), 멜리틴(melittin), 활성화된 카스파아제(activated caspase), 프로-카스파아제(pro-caspase), 사이토카인, 케모카인, 세포 투과성 펩티드 및 이들의 조합으로부터 선택된 단백질 독소를 더 포함한다.
몇몇 실시예에서, 상기 미니세포는 임의의 기타 치료학적 활성 모이어티(moiety)를 포함하지 않는다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포는 치료용 소분자, 임의의 기타 치료용 단백질 또는 치료용 핵산을 포함하지 않는다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포는 단백질 G 또는 단백질 A의 Fc 결합 부분을 표시하지 않는다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포는 임의의 치료용 핵산, 예를 들어 siRNA를 포함하지 않는다.
본원에 개시된 몇몇 실시예는 미니세포 생산 박테리아를 제공하며, 여기서 상기 미니세포 생산 박테리아는 격막 형성, 이분열(binary fission) 및 염색체 분리 중 하나 이상을 조정하는 미니세포 생산 유전자 산물을 암호화하는 발현 가능한 유전자; 및 콜레스테롤 의존성 세포 용해소 단백질의 기능적 발현을 가능케 하는 재조합 발현 카세트를 포함하며, 여기서 상기 박테리아는 항체, 또는 항체의 Fc 영역을 포함하는 기타 분자를 표시하지 않으며, 단백질 G 또는 단백질 A의 Fc 결합 부분을 표시하지 않는다.
몇몇 실시예에서, 상기 미니세포 생산 박테리아는 이종성 엔도뉴클레아제를 암호화하되, 상기 미니세포 생산 박테리아의 염색체는 상기 엔도뉴클레아제의 하나 이상의 인식 부위를 포함하는 발현 가능한 "유전적 자살" 유전자; 한정된 영양 요구성; 및 lpxM/msbB 유전자에서의 결실 또는 돌연변이를 더 포함한다.
몇몇 실시예에서, 상기 엔도뉴클레아제는 I-CeuI, PI-SceI, I-ChuI, I-CpaI, I-SceIII, I-CreI, I-MsoI, I-SceII, I-SceIV, I-CsmI, I-DmoI, I-PorI, PI-TliI, PI-TliII 및 PI-ScpI로부터 선택된다. 몇몇 실시예에서, 상기 영양 요구성은 필수 대사 유전자에서의 결실 또는 불활성화 돌연변이에 의한 것이다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포 생산 유전자 산물을 암호화하는 발현 가능한 유전자는 ftsZ, sulA, ccdB 및 sfiC로부터 선택된다.
몇몇 실시예에서, 상기 콜레스테롤 의존성 세포 용해소 단백질은 리스테리올리신 O, 리스테리올리신 O L461T, 리스테리올리신 O E247M, 리스테리올리신 O D320K, 리스테리올리신 O E247M, 리스테리올리신 O D320K, 리스테리올리신 O L461T, 스트렙토리신 O, 스트렙토리신 O c, 스트렙토리신 O e, 스파에리코리신, 안트로리신 O, 세레올리신, 튜린지엔시리신 O, 바이헨스테파넨실리신, 알베올리신, 브레빌리신, 부티리쿨리신, 테타놀리신 O, 노비일리신, 렉티놀리신, 뉴몰리신, 미틸리신, 슈도뉴몰리신, 수일리신, 인터메딜리신, 이바놀리신, 세엘리제리올리신 O, 바기놀리신 및 피올리신으로부터 선택된다. 몇몇 실시예에서, 상기 콜레스테롤 의존성 세포 용해소 단백질은 퍼프린골리신 O이다. 몇몇 실시예에서, 상기 콜레스테롤 의존성 세포 용해소 단백질은 서열번호 1을 포함한다.
몇몇 실시예에서, 상기 미니세포는 인바신의 기능적 발현을 가능케 하는 재조합 발현 카세트를 더 포함한다.
몇몇 실시예는 암을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 암 치료 방법은 콜레스테롤 의존성 세포 용해소 단백질을 포함하는 박테리아 미니세포를 이를 필요로 하는 환자에 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 투여는 비면역원성 항종양 면역 조절 효과를 유도한다.
몇몇 실시예에서, 상기 미니세포는 항체, 또는 항체의 Fc 영역을 포함하는 기타 분자를 표시하지 않는다.
몇몇 실시예에서, 상기 콜레스테롤 의존성 세포 용해소 단백질은 리스테리올리신 O, 리스테리올리신 O L461T, 리스테리올리신 O E247M, 리스테리올리신 O D320K, 리스테리올리신 O E247M, 리스테리올리신 O D320K, 리스테리올리신 O L461T, 스트렙토리신 O, 스트렙토리신 O c, 스트렙토리신 O e, 스파에리코리신, 안트로리신 O, 세레올리신, 튜린지엔시리신 O, 바이헨스테파넨실리신, 알베올리신, 브레빌리신, 부티리쿨리신, 테타놀리신 O, 노비일리신, 렉티놀리신, 뉴몰리신, 미틸리신, 슈도뉴몰리신, 수일리신, 인터메딜리신, 이바놀리신, 세엘리제리올리신 O, 바기놀리신 및 피올리신으로부터 선택된다. 몇몇 실시예에서, 상기 콜레스테롤 의존성 세포 용해소 단백질은 퍼프린골리신 O이다. 몇몇 실시예에서, 상기 콜레스테롤 의존성 세포 용해소 단백질은 서열번호 1을 포함한다.
몇몇 실시예에서, 상기 미니세포는 인바신을 더 포함한다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포는 인바신을 포함하지 않는다.
몇몇 실시예에서, 상기 미니세포는 Th1 사이토카인을 더 포함한다. 몇몇 실시예에서, 상기 Th1 사이토카인은 IL-2, GMCSF, IL-12p40, IL-12p70, IL-18, TNF-α 및 IFN-γ로부터 선택된다.
몇몇 실시예에서, 상기 미니세포는 Th2 사이토카인을 더 포함한다. 몇몇 실시예에서, 상기 Th2 사이토카인은 IL-1α, IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 및 IL-13으로부터 선택된다.
몇몇 실시예에서, 상기 미니세포는 포스포리파아제를 더 포함한다. 몇몇 실시예에서, 상기 포스포리파아제는 PC-PLC 또는 PI-PLC이다.
몇몇 실시예에서, 상기 방법은 디프테리아 독소의 단편 A/B, 디프테리아 독소의 단편 A, 탄저병 독소 LF 및 EF, 아데닐레이트 시클라아제 독소, 겔로닌, 보툴리노리신 B, 보툴리노리신 E3, 보툴리노리신 C, 보툴리눔 독소, 콜레라 독소, 클로스트리듐 독소 A, B 및 알파, 리신, 시가 A 독소, 시가 유사 A 독소, 콜레라 A 독소, 백일해 S1 독소, 슈도모나스 외독소 A, 대장균 이열성 독소(LTB), 멜리틴, 활성화된 카스파아제, 프로-카스파아제, 사이토카인, 케모카인, 세포 투과성 펩티드 및 이들의 조합으로부터 선택된 단백질 독소를 더 포함한다.
몇몇 실시예에서, 상기 미니세포는 임의의 기타 치료학적 활성 모이어티를 포함하지 않는다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포는 치료용 소분자, 임의의 기타 치료용 단백질 또는 치료용 핵산을 포함하지 않는다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포는 단백질 G 또는 단백질 A의 Fc 결합 부분을 표시하지 않는다.
몇몇 실시예에서, 상기 암은 고형 종양, 전이성 종양 또는 액형 종양을 포함한다. 몇몇 실시예에서, 상기 암은 상피조직, 섬유아세포, 근육 또는 뼈에서 기원한다. 몇몇 실시예에서, 상기 암은 유방암, 폐암, 췌장암, 전립선암, 고환암, 난소암, 위암, 장암, 구강암, 설암, 인두암, 간암, 항문암, 직장암, 결장암, 식도암, 담낭암, 피부암, 자궁암, 질암, 음경암 및 신장암으로부터 선택된다. 몇몇 실시예에서, 상기 암은 비뇨기 방광암이다. 몇몇 실시예에서, 상기 암은 선암, 육종, 섬유 육종, 안암, 뇌암 및 골암으로부터 선택된다. 몇몇 실시예에서, 상기 암은 비호지킨 림프종, 골수종, 호지킨 림프종, 급성 림프구성 림프종, 만성 림프구성 림프종, 급성 골수성 림프종 및 만성 골수성 림프종으로부터 선택된다.
몇몇 실시예에서, 상기 투여는 Th1 우세 면역 반응을 야기한다. 몇몇 실시예에서, 상기 투여는 Th2 우세 면역 반응을 야기한다.
본 발명에 따른 콜레스테롤 의존성 세포 용해소 단백질을 포함하는 면역 조절성 박테리아 미니세포는 방광암 및 기타 악성 종양과 같은 질병의 치료에 매우 우수한 효과를 나타낸다.
도 1은 락트산 탈수소효소(LDH) 방출 분석 결과가 PFO 매개 포유류 세포막의 투과화(permeabilization)를 나타낸다는 것을 보여주는 막대그래프이다.
도 2는 미니세포에 의해 전달된 등가량의 퍼프린골리신 O(PFO)에 대한 정제된 재조합 퍼프린골리신 O(BTX-100)의 시험관 내(in vitro) 세포독성을 보여주는 도면이다.
도 3은 표적화 모이어티인 인바신의 제거가 PFO를 함유한 미니세포의 항종양 활성에 대해 어떠한 효과도 나타내지 않는다는 것을 보여주는 도면이다.
도 4는 폐 및 난소 전이에서 VAX-IPD 미니세포의 유사한 항종양 효과를 보여주는 사진 및 도표를 도시하고 있다.
도 5는 VAX-IPD 미니세포의 정맥 내 투여 이후에는, 상기 미니세포가 마우스의 폐에서 검출 가능하지만 난소에서는 검출할 수 없다는 것을 보여주는 막대그래프이다.
도 6은 VAX-IPD 미니세포가 심각하게 면역 약화된 NIH-III 마우스에서 항종양 효과를 거의 나타내지 않는다는 것을 보여주는 막대그래프이다.
도 7은 VAX-IP 미니세포가 확립된 비근육 침습성 방광암의 MB49 쥐 모델에서 매우 효과적이라는 것을 보여주는 도면이다.
도 8은 VAX-IP 미니세포 생산 균주 및 이로부터의 VAX-IP 미니세포의 구축을 위한 일반적인 반응식에 대한 개략도이다.
도 9는 pVX-336의 플라스미드 지도이다.
도 10은 pVX-128의 플라스미드 지도이다.
도 11은 유도성 미니세포 형성의 주사 전자 현미경(SEM) 사진들을 보여준다.
도 12는 VAX-IP 미니세포에서 인바신 및 퍼프린골리신 O의 발현을 증명한 사진 및 도표를 도시하고 있다.
정의
본원에서 사용된 바와 같이, "Th1 면역 조절성 미니세포"란 용어는 Th1 면역 반응을 자극할 수 있는 미니세포를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "Th2 면역 조절성 미니세포"란 용어는 Th2 면역 반응을 자극할 수 있는 미니세포를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "Th1/Th2 면역 조절성 미니세포"란 용어는 Th1 및 Th2 면역 반응을 자극할 수 있는 미니세포를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "재조합 침습성 면역 조절성 미니세포"란 용어는 진핵 세포 내로의 내부화를 자극할 수 있는 이종성 미니세포의 표면 단백질들을 발현하고 표시하기 위해 유전적으로 조작되어 있는 미니세포를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "자연적으로 침습성인 면역 조절성 미니세포"란 용어는 진핵 세포 내로의 내부화를 자극할 수 있는 자연적으로 발생하는 미니세포의 표면 단백질들을 발현하고 표시하도록 정상적으로 침습성인 박테리아로부터 생산된 미니세포를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "면역원성"이란 용어는 적응성 면역 기작들에 의해 매개된 항원 특이적 체액성 또는 세포성 면역 반응을 지칭한다. 면역원성 미니세포는 특정의 특이적 항원에 대해 반응하도록 면역 반응을 지시하고, 예를 들어 병원체에 특이적인 백신으로서 면역원성 미니세포를 이용한다는 맥락에서 유용하다.
본원에서 사용된 바와 같이, "면역 조절성"이란 용어는 Th1 및 Th2 면역 반응의 생성을 포함하지만 이에 제한되지 않는 목적하는 방식으로 상기 면역 반응의 포괄적인 조정(즉, 그 자체는 면역원성이 아님)을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "면역 요법"이란 용어는 질병, 특히 암의 제거 또는 이의 진행의 지연에 대해 유리한 이점을 갖는 포괄적 면역 반응(즉, 그 자체는 면역원성이 아님)을 생성하기 위한 면역 조절성 화합물, 예를 들어 면역 조절성 미니세포의 용도를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "부착성 미니세포"란 용어는 미니세포의 인지 가능한 내포작용(endocytosis)을 자극하지 않으면서 비구성적 식균성 진핵 세포의 표면에 결합하고 부착할 수 있는 미니세포를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "점막 부착성 미니세포"란 용어는 점막 표면에 결합하고 부착할 수 있는 미니세포를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "VAX-P 미니세포"란 용어는 퍼프린골리신 O(PFO)를 발현하고 포함하는 미니세포를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "VAX-IP 미니세포"란 용어는 여시니아 슈도튜베르쿨로시스(Yersinia pseudotuberculosis)로부터의 pan-β1-인테그린 표적화 세포의 표면 분자인 인바신, 및 이의 임의의 기능적 등가물을 발현하고 표시하는 미니세포를 지칭하며, 여기서 상기 미니세포는 퍼프린골리신 O(PFO)를 더 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "VAX-IPT 미니세포"란 용어는 여시니아 슈도튜베르쿨로시스로부터의 pan-β1-인테그린 표적화 세포의 표면 분자인 인바신, 및 이의 임의의 기능적 등가물을 발현하고 표시하는 미니세포를 지칭하되, 상기 미니세포는 퍼프린골리신 O(PFO) 및 단백질 독소를 더 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "VAX-IPP 미니세포"란 용어는 여시니아 슈도튜베르쿨로시스로부터의 pan-β1-인테그린 표적화 세포의 표면 분자인 인바신, 및 이의 임의의 기능적 등가물을 발현하고 표시하는 미니세포를 지칭하되, 상기 미니세포는 퍼프린골리신 O(PFO), 및 단백질 독소가 아닌 외생성 폴리펩티드를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "VAX-IPD 미니세포"란 용어는 여시니아 슈도튜베르쿨로시스로부터의 pan-β1-인테그린 표적화 세포의 표면 분자인 인바신, 및 이의 임의의 기능적 등가물을 발현하고 표시하는 미니세포를 지칭하되, 상기 미니세포는 퍼프린골리신 O(PFO), 및 디프테리아 독소의 촉매 단편을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "VAX-IPG 미니세포"란 용어는 여시니아 슈도튜베르쿨로시스로부터의 pan-β1-인테그린 표적화 세포의 표면 분자인 인바신, 및 임의의 기능적 등가물을 발현하고 표시하는 미니세포를 지칭하되, 상기 미니세포는 퍼프린골리신 O(PFO) 및 겔로닌을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "VAX-IPPA 미니세포"란 용어는 여시니아 슈도튜베르쿨로시스로부터의 pan-β1-인테그린 표적화 세포의 표면 분자인 인바신, 및 이의 임의의 기능적 등가물을 발현하고 표시하는 미니세포를 지칭하되, 상기 미니세포는 퍼프린골리신 O(PFO) 및 슈도모나스 외독소 A를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "VAX-IPR 미니세포"란 용어는 여시니아 슈도튜베르쿨로시스로부터의 pan-β1-인테그린 표적화 세포의 표면 분자인 인바신, 및 이의 임의의 기능적 등가물을 발현하고 표시하는 미니세포를 지칭하되, 상기 미니세포는 퍼프린골리신 O(PFO) 및 리신 A를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "기공 형성 세포 용해소 단백질"이란 용어 및 "콜레스테롤 의존성 세포 용해소 단백질"이란 용어는 상호 교차로 사용할 수 있으며, 세포막 상에 기공(들)을 형성하기 위해 콜레스테롤을 포함하는 세포막을 공격할 수 있는 단백질을 지칭한다. 몇몇 콜레스테롤 의존성 세포 용해소 단백에 있어서, 세포막에서의 콜레스테롤의 존재는 상기 콜레스테롤 의존성 세포 용해소 단백질이 세포막에 결합하는데 필요하지 않다. 예를 들어, 상기 콜레스테롤 의존성 세포 용해소 단백질은 그램 양성 박테리아에 의해 분비된 β-베럴(β-barrel)형 기공 형성 외독소 패밀리의 멤버일 수 있다. 콜레스테롤 의존성 세포 용해소 단백질의 비제한적인 예로는 리스테리올리신 O, 리스테리올리신 O L461T, 리스테리올리신 O E247M, 리스테리올리신 O D320K, 리스테리올리신 O E247M, 리스테리올리신 O D320K, 리스테리올리신 O L461T, 스트렙토리신 O, 스트렙토리신 O c, 스트렙토리신 O e, 스파에리코리신, 안트로리신 O, 세레올리신, 튜린지엔시리신 O, 바이헨스테파넨실리신, 알베올리신, 브레빌리신, 부티리쿨리신, 테타놀리신 O, 노비일리신, 렉티놀리신, 뉴몰리신, 미틸리신, 슈도뉴몰리신, 수일리신, 인터메딜리신, 이바놀리신, 세엘리제리올리신 O, 바기놀리신, 피올리신 및 퍼프린골리신 O를 들 수 있다. 몇몇 실시예에서, 상기 콜레스테롤 의존성 세포 용해소 단백질은 ECTGLAWEWWR(서열번호 1)의 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 실시예에서, 상기 콜레스테롤 의존성 세포 용해소 단백질은 WEWWRT(서열번호 2)의 아미노산 서열을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료용 핵산"이란 용어는 진핵생물(예를 들어, 인간과 같은 포유동물) 내로 도입되는 경우에 치료 효과를 갖는 핵산 분자를 지칭한다. 치료용 핵산은, 예를 들어 ssDNA, dsDNA, ssRNA(shRNA를 포함함), dsRNA(siRNA를 포함함), tRNA(희귀 코돈 사용빈도 tRNA를 포함함), mRNA, 마이크로-RNA(miRNA), 리보솜 RNA(rRNA), 펩티드 핵산(PNA), DNA:RNA 혼성체, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 앱타머(aptamer), 또는 이의 임의의 조합일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료용 단백질"이란 용어는 진핵생물(예를 들어, 인간과 같은 포유동물) 내로 도입되는 경우에 치료 효과를 갖는 단백질을 지칭한다. 치료용 폴리펩티드는, 예를 들어 단백질 독소, 콜레스테롤 의존성 세포 용해소, 기능성 효소, 활성화된 카스파아제, 프로-카스파아제, 사이토카인, 케모카인, 세포 투과성 펩티드, 또는 상기 성분들의 임의의 조합 및/또는 이들 복수의 성분들일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료용"이란 용어는 동물에서 질병의 진행, 또는 기타 비정상적인 생물학적 과정들을 예방, 억제, 제거 및 방지하는 생물학적 효과, 또는 생물학적 효과들의 조합을 갖는다는 것을 의미한다. 치료학적 활성 모이어티로는, 예를 들어 치료학적 활성 소분자, 치료학적 활성 단백질 및/또는 치료학적 활성 핵산을 들 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "소분자"란 용어는 생물학적 효과를 가지며, 5,000달톤 미만의 분자량을 갖는 분자를 지칭한다. 몇몇 실시예에서, 소분자는 2,500달톤 미만의 분자량을 갖는다. 몇몇 실시예에서, 소분자는 1,000달톤 미만의 분자량을 갖는다. 몇몇 실시예에서, 소분자는 800달톤 미만의 분자량을 갖는다. 몇몇 실시예에서, 소분자는 500달톤 미만의 분자량을 갖는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료용 소분자 약물" 또는 "소분자 약물"이란 용어는 진핵생물(예를 들어, 인간과 같은 포유동물) 내로 도입되는 경우에 치료 효과를 갖는 소분자를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "β1 인테그린 인바신 표적"이란 용어는 인바신에 의해 결합될 수 있는 포유류의 β1 인테그린 헤테로다이머(heterodimer)를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "원핵성 세포 분열 유전자"란 용어는 원핵성 세포 분열 과정에 참여하는 유전자 산물을 암호화하는 유전자를 지칭한다. 많은 세포 분열 유전자들은 당해 기술분야에서 발견되어 특성 분석되어 있다. 세포 분열 유전자의 예로는 zipA, sulA, secA, dicA, dicB, dicC, dicF, ftsA, ftsI, ftsN, ftsK, ftsL, ftsQ, ftsW, ftsZ, minC, minD, minE, seqA, ccdB, sfiC 및 ddlB를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "이식 유전자"란 용어는 하나의 유기체에서 다른 유기체로 자연적으로 전달되었거나, 임의의 다수의 유전 공학 기법에 의해 전달되었던 유전자 또는 유전 물질을 지칭한다. 몇몇 실시예에서, 상기 이식 유전자는 하나의 유기체로부터 단리되었으며, 상이한 유기체 내로 도입되는 유전자 서열을 함유하는 DNA 절편이다. 이러한 비고유의 DNA 절편은 유전자 변환 유기체 내에서 RNA 또는 단백질을 생성하는 능력을 보유할 수 있거나, 이는 유전자 변환 유기체의 유전 암호의 정상적인 기능을 변경시킬 수 있다. 몇몇 실시예에서, 상기 이식 유전자는, 상기 이식 유전자가 이전에는 발견되지 않았던 유기체에 도입되는 유전자 코딩 서열을 함유하는지의 여부와는 무관하게 인공적으로 구축된 DNA 서열이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 약제는, 상기 약제가 정제의 대상이 되었던 조성물에 대비하여 조성물 중에서 이의 농도가 증가하고, 및/또는 하나 이상의 원하지 않는 오염 물질의 농도가 증가하는 경우에 "정제"된 것으로 본다. 몇몇 실시예에서, 정제는 조성물 중 약제의 농축, 및/또는 이로부터의 약제의 단리를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "충분히 결여됨"이란 용어와 유사한 "모세포가 충분히 결여됨"이란 용어는 독성 프로파일에 대한 효과가 거의 없고, 및/또는 표적화된 치료용 미니세포의 치료 효과를 갖는 모세포 오염 수준을 갖는 정제된 미니세포의 조성물을 지칭한다.
본원에서 사용된 "도메인" 또는 "단백질 도메인"이란 용어는 공통의 물리적 및/또는 화학적인 특성을 공유하는 분자 또는 구조체의 영역을 지칭한다. 단백질 도메인의 비제한적인 예로는 소수성 횡단막 또는 말초 세포막 결합 영역, 구형의 효소 또는 수용체 영역, 단백질-단백질 상호작용 도메인 및/또는 핵산 결합 도메인을 들 수 있다.
"진정세균(eubacteria)" 및 "원핵생물(prokaryote)"이란 용어는, 이들 용어가 당해 기술분야의 기술자들에 의해 사용됨에 따라 본원에서 사용된다. 본원에서 사용된 "진정세균성" 및 "원핵성"이란 용어는 그램 음성 및 그램 양성 박테리아 둘 모두를 포함하는 진정세균, 원핵성 바이러스(예를 들어, 박테리오파지), 및 세포 내 절대 기생균(예를 들어, 리케챠(Rickettsia), 클라미디아(Chlamydia) 등)을 포함한다.
"면역 강화용 폴리펩티드"란 용어는 "면역 자극성 폴리펩티드" 및 "면역 조절성 폴리펩티드"와 동의어이며, 상기 용어는 진핵생물 또는 세포(예를 들어, 인간과 같은 포유동물) 내로 도입되는 경우에 면역 조절 효과를 갖는 다양한 유형의 단백질 분자들의 임의의 집합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호 교차 가능하게 사용된다. 면역 조절성 폴리펩티드는 사이토카인, 케모카인, 콜레스테롤 의존성 세포 용해소, 기능성 효소, 항체 또는 항체 모방체, 활성화된 카스파아제, 프로-카스파아제, 사이토카인, 케모카인, 세포 투과성 펩티드, 또는 상기 성분들의 임의의 조합 및/또는 이들 복수의 성분들일 수 있다.
"면역원" 및 "항원"이란 용어는 상호 교차 가능하며, 폴리펩티드, 탄수화물, 지질, 핵산, 및 항원 특이적 항체 반응, 세포 반응 및/또는 알레르기 반응이 개시될 수 있는 기타 분자들을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 본 발명의 문맥에서, 상기 미니세포의 "항원성"과 동의어인 "면역원성"은 면역 치료 효과에 대해 책임이 없다. 항원 특이적 면역 반응은 항원/면역원의 존재에 의존하며, 본원에서 사용된 바와 같은 Th1 또는 Th2 면역 조절성 반응의 정의에 포함되지 않는다.
본원에서 사용된 "과발현"이란 용어는 숙주 세포에서 DNA에 의해 암호화된 기능성 핵산, 폴리펩티드 또는 단백질의 발현을 지칭하되, 상기 핵산, 폴리펩티드 또는 단백질은 정상적으로는 숙주 세포에 존재하지 않거나, 상기 핵산, 폴리펩티드 또는 단백질은 상기 핵산, 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화하는 내생성 유전자로부터 정상적으로 발현된 수준보다 높은 수준으로 숙주 세포 내에 존재한다.
본원에서 사용된 같은 "조정하기(modulate)"란 용어는 표적의 활성을 변경하여 생물학적 과정을 조절하기 위해 표적과 직접 또는 간접적으로 상호작용을 한다는 것을 의미한다. "조정" 모드로는 표적 활성의 증강, 표적 활성의 억제, 표적 활성의 제한, 및 표적 활성의 확대를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이 "이종성(heterologous)"이란 용어는 미니세포 또는 미니세포 생산 박테리아 균주에서 자연적으로는 발견되지 않는 단백질, 유전자, 핵산, 영상 작용제(imaging agent), 완충제 성분, 또는 임의의 기타 생물학적 활성 또는 불활성 물질을 지칭하는 것으로, 이들 물질은 상기 이종성 물질을 암호화하거나 상기 이종성 물질(예를 들어, 모세포에 대해 고유한 것이 아닌 생물활성 대사산물)을 생산할 수 있는 유전자들을 암호화하는 재조합 유전 물질을 함유하고 있는 미니세포 생산 박테리아 균주에 의해 발현, 전사, 번역 또는 증폭되거나, 다르게 생성된다.
본원에서 사용된 바와 같이 "외생성"이란 용어는 세포에 대해 고유한 것이 아니거나, 미니세포의 경우에 상기 미니세포의 모세포의 태생에 대해 고유한 것이 아닌 단백질(항체를 포함함), 유전자, 핵산, 소분자 약물, 영상 작용제, 완충제, 방사성 핵종(radionuclide), 또는 임의의 기타 생물학적 활성 또는 불활성 물질을 지칭한다. 외생성 물질은 별도로 생성, 정제 및 부가된다는 측면에서 이종성 물질과는 다르다.
본원에서 사용된 바와 같이 "치료용"이란 용어는 동물에서 질병의 진행, 또는 기타 비정상적인 생물학적 과정들을 예방, 억제, 제거 및 방지하는 생물학적 효과, 또는 생물학적 효과들의 조합을 갖는다는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "진단용"이란 용어는 동물(인간을 포함함)에서 또는 생물학적 시료로부터 질병 또는 상태를 검출, 모니터링, 추적 및/또는 확인하기 위한 능력을 갖는다는 것을 의미하며, 상기 생물학적 시료로는 혈액, 소변, 타액, 땀 및 대변을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이 "치료 진단용(theranostic)"이란 용어는 치료용 및 진단용 조성물의 조합된 효과를 갖는다는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "재조합적 발현"이란 용어는 첨단 유전 공학 기법들을 이용하여 구축된 핵산 분자로부터 하나 이상의 핵산(들) 및/또는 단백질(들)의 발현을 의미하되, 상기 구축된 핵산 분자는 인공적인 핵산 분자가 에피솜(episome)성 핵산 분자, 또는 미니세포 생산 박테리아 염색체의 일부로서 존재하는 미니세포 및/또는 미니세포 생산 박테리아 균주에서 자연적으로 존재하지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이 "에피솜성(episomal)"이란 용어는 주어진 유기체 또는 세포의 염색체(들)와는 독립적인 핵산 분자를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "해독(detoxified)"이란 용어는 조성물 또는 이의 성분에 대해 이루어진 변형을 지칭하며, 이때 상기 변형은 조성물 또는 이의 성분에 대한 독성의 원인이 되는 생물학적 기반이 되는 것이 무엇인지와는 무관하게 변형된 조성물 또는 이의 성분에 대한 급성 독성의 유의한 감소를 초래한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "생물활성 분자(bioactive molecule)"란 용어는 인간 유기체 또는 세포에 도입되는 경우에 진핵생물 또는 세포(예를 들어, 인간과 같은 포유동물)에 대해 생물학적 효과를 갖는 분자를 지칭한다. 생물활성 분자로는 치료용 핵산, 치료용 폴리펩티드(단백질 독소를 포함함) 및 치료용 소분자 약물을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
설명
본 발명은 상기 면역 반응에 의해 매개되는 간접적인 항암 효과를 갖는 것과 같은 방식으로 면역 시스템을 자극하기 위한 시험관 내 및 생체 내(in vivo)에서의 박테리아 미니세포의 사용에 관한 것이다. 진정세균 세포는 이들이 생박테리아를 모방하지만, 살아있지 않고 감염성도 아니며, 따라서 생박테리아성 면역 조절 요법들과 비교하여 감소된 독성을 갖는다는 점에서 면역 조절제로서 명확한 이점을 갖는다. 게다가, 박테리아 미니세포는 상이한 분자 성분들을 함유하도록 유전적으로 조작될 수 있으며, 이때 상기 분자 성분들 각각은 특정 유형의 면역 반응(즉 Th1 대 Th2)을 우선적으로 증강 또는 야기하거나, 다르게 조장할 수 있다. 본원에 개시된 박테리아 미니세포들은 임의의 직접적인 항종양 활성 이외에도 간접적인 항암 활성을 갖는 면역 반응을 야기하도록 설계된다. 상기 미니세포들은 또한 동물에서의 면역 반응의 억제, 조장, 지지 및 유지와 연관이 있는 것으로 공지된 세포 유형 또는 조직을 특이적으로 표적화할 수 있다. 본 발명은 암 및 기타 질병들에 대한 살아있지 않는 면역 조절 요법들로서 박테리아 미니세포의 용도를 제공한다.
박테리아 미니세포는 박테리아 세포의 정상적인 분열 장치에서의 붕괴 이후에 박테리아에 의해 형성되는 비염색체성의 피막된 생물학적 나노입자(직경이 약 250 내지 500㎚임)이다. 본질적으로, 미니세포는 정상적인 박테리아 세포의 대사적으로 활성인 소형 복제품이며, 예외적으로 이들은 염색체 DNA를 함유하지 않으며, 그로 인해 비분열성이고, 생존 불가능하며, 비감염성이다. 미니세포가 박테리아 염색체를 함유하지 않을지라도, 플라스미드 DNA 분자(염색체보다 작음), RNA 분자(아형 및 구조 모두를 가짐), 고유의 단백질 및/또는 재조합적으로 발현된 단백질 및 기타 대사 산물들 모두는 미니세포 내로 분리되는 것으로 나타났다. 미니세포는 상이한 자연 발생적, 이종성 또는 외생성의 면역 조절성 분자 성분들 중 하나 이상이 단일 입자 내로 조합하기 위해 조작될 수 있기 때문에 생체 내 면역 조절제로서 유일하게 적합하며, 상기 면역 조절성 분자 성분들 각각은 개별적인 양으로 존재한다. 이는 생박테리아가 생체 내 투여 이후에 처음부터 공지되지 않은 양의 면역 조절성 성분들을 계속해서 분열, 지속 및 생성할 수 있는 생박테리아 기반 면역 요법들과는 첨예하게 대조적이다. 살아있는 박테리아 면역 요법들의 지속 및 보급은 감염, 장기 부전, 패혈증 및 사망을 비롯한 많은 합병증을 초래할 수 있다. 요약하면, 미니세포는 상기 면역 조절성 반응을 통한 질병의 예방, 유지 및/또는 억제가 바람직한 예방 및 치료용 약물 적용 둘 모두에서 면역 조절성 반응의 후속적인 생성을 위해 다양한 핵산, 단백질, 소분자 약물 및 이들의 임의의 조합을 포함하는 생물학적 활성 분자를 우선적으로 캡슐화하거나, 이에 결합되거나 이를 흡수하기 위해 "조작"될 수 있다.
유전적으로 조작된 박테리아 미니세포는 본원에서 전체가 참고로 인용된 미국 특허 제7,183,105호에 개시된 바와 같은 항암제로서 직접 사용되었다. 예를 들어, 미니세포가 미니세포 표면-국소화된 항체를 이용하여 암세포에 소분자 약물, 펩티드, 단백질 및 다양한 핵산을 함께 또는 협주적으로 직접 표적화하고 전달하여 직접적인 표적화 항암 효과를 발휘하도록 조작될 수 있다는 것이 미국 특허 제7,183,105호에 교시되어 있다. 기타 연구가들은 또한 각각이 본원에서 참고로 인용된 미국 특허 공개공보 제2007/0298056호, 제2008/0051469호 및 제2007/0237744호에 예시된 바와 같은 표적화된 전달 비히클로서의 미니세포의 용도에 대해 미국 특허 제7,183,105호에 교시된 바와 같은 동일한 발견을 보고하였다. 이들 인용문헌 중 어떠한 문헌에도 미니세포가 조작되어 간접적인 항종양 효과를 발휘할 수 있는 항암 면역 요법으로서 이용될 수 있다는 것이 교시되어 있지 않다. 오히려, 각각의 인용문헌에는 생체 내에서 항암제를 특이적으로 표적화하여 이를 직접적으로만 종양 세포에 전달하기 위해 미니세포를 이용하는 동일한 접근법이 교시되어 있다. 상기에 포함된 인용문헌에는 전체적으로 생체 내에서 암 치료제로서 사용되는 경우에 비면역원성 면역 조절 효과를 야기하기 위한 박테리아 미니세포의 용도와는 무관한 것이 교시되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제7,183,105호에는 원형질체(외막 및 세포벽 둘 모두를 함유하지 않음)를 생성할 뿐만 아니라 L형 박테리아(외막을 함유하지 않음)로부터의 미니세포의 용도를 포함한 면역 반응을 완화하거나 회피하기 위해 적용될 수 있는 몇몇 접근법이 개시되어 있다. 미국 특허 공개공보 제2007/0298056호, 제2008/0051469호 및 제2007/0237744호에 제공된 예에는 상기 미니세포 비히클의 표면에 결합된 공지된 종양 선택적 세포 표면 수용체에 대해 선택적인 항체를 이용한 표적화가 항종양 활성을 위해 요구된다는 것이 나타나 있다. 추가로, 이들 인용문헌에는 또한 표적화되지 않은 미니세포가 사용되는 경우에 어떠한 유의한 항종양 반응도 관측되지 않는다는 것이 나타나 있다. 기타 관련된 작업에서, 맥더미드(MacDiarmid)와 동료들은 표적화되지 않은 미니세포, 및 세포독성 약물 적재물을 함유하지 않는 종양 표적화 미니세포 둘 모두가 동일하게 항종양 반응을 초래할 수 있고, 표적화용 항체 및 세포독성 적재물 둘 모두가 요구된다는 것을 증명하였다(MacDiarmid 등, Cancer Cell, 2007, Volume 11, p. 431-445). 부가적으로, 맥더미드 등은 면역 시스템을 회피하는 이점을 토의하고, 이들 설계에 대한 근거의 일부로서 이 같은 회피를 개시하며, 따라서 면역 조절 치료제로서의 미니세포의 이용과는 무관한 것이 교시되어 있다. 대조적으로, 본 발명은, 예를 들어 강력하고 간접적인 항종양 활성을 유도할 수 있는 면역 조절 치료제로서의 박테리아 미니세포의 용도를 제공한다. 예를 들어, 본원에 개시된 미니세포는 개체에서 비면역원성 항종양 면역 조절 효과를 이끌어 내기 위해 사용될 수 있다.
몇몇 실시예에서, 본 발명은 직접적인 종양 표적화 및 부수적인 항종양 면역 조절 효과에 의해 각각 매개되는 직접 및 간접적인 동시 기작에 의해 강력한 항종양 효과를 이끌어 낼 수 있는 면역 조절 치료제로서의 박테리아 미니세포의 용도를 제공한다. 예를 들어, 상기 미니세포는 또한 독성 적재물(toxic payload)을 암세포에 직접 전달함으로써 또한 상기 면역 반응과 특이적이고 협주적으로 작용하면서 비특이적으로 항암 면역 반응을 자극하도록 설계될 수 있다. 따라서 본 발명의 몇몇 실시예는 미니세포를 이용한 표적화된 약물 전달에 의한 종양 세포 및/또는 종양 내피세포의 직접적인 살해, 및 Th1 반응을 대표하는 사이토카인의 방출을 포함하지만 이에 제한되지 않는 NK 및 기타 면역세포 활성의 활성화를 포함한 간접적인 비특이적 보조 효과에 의한 종양 세포 및/또는 종양 내피세포의 직접적인 살해에 관한 것이다.
본원에 개시된 바와 같이, 기타 생박테리아 요법들은 과거에 항암제로서 사용되었지만, 이들의 생존 가능한 특성으로 인해 독성에 의해 제한되었다. 이들 기술의 조달업자들은 살아있는 박테리아 요법들이 우선적으로 종양의 저산소 영역을 콜로니화하고, 그 과정에서 종양 세포를 침입하고, 추가적인 괴사를 야기함으로써 작용한다고 주장하고 있다. 중요하게도, 이들 기술 각각은 효능을 달성하기 위해 생박테리아성 제형을 갖는 것의 중요성을 강조하며, 일부는 살해된 박테리아 요법들의 불활성을 증명하기 위해 현재까지 이르렀다. 이들 예는 기술자들이 여전히 미니세포를 이용하도록 할 수 없으며, 오히려 종양 조직의 박테리아성 생존성 및 콜로니화 및 종양 조직 내의 지속성이 효능보다 중요하다는 것을 교시함으로써 그렇게 하는 것을 회피하도록 할 수 있다. 미니세포는 생존 불가능하고 지속할 수 없으며, 따라서 생박테리아 요법을 이용하는 이들의 교시를 고려할 때 효과를 갖는 것으로 기대되지 않을 수 있다. 이들 교시와는 대조적으로, 본 발명은 생체 내에서 지속할 수 없는 자기 제한적이고 살아있지 않는 미니세포를 암에 대한 면역 요법으로서 이용한다.
본원에 개시된 면역 조절 요법은 임의의 종양 유형과 함께 사용될 수 있다. 당해 기술분야에서 통상의 지식을 갖는 자는 특정한 종양 유형이 이러한 요법에 대한 접근법에 더욱 민감하며, 따라서 잠재적으로는 더욱 이러한 요법에 우호적일 수 있다는 것을 인지한다. 예를 들어, 본원에 개시된 면역 조절 요법 및 미니세포는 침습성 방광암을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 300,000개 이상의 새로운 방광암의 사례가 매년 전 세계적으로 보고되고 있으며, 이들 중 70%는 비근육 침습성 단계에서 초기에 검출된다. 이러한 개체군은 전형적으로 Ta, Tl 및 Tis로 지칭되는 3개의 질병 단계로 분류되며, 이로 인해 상기 종양은 유두종(이전에는 표피성 종양으로 지칭됨)이며, 근육이 아닌 라미나 프로프리아(lamnia propria), 및 원 위치에서 암종(편평한 비침습성 종양)을 각각 침입하였다. 이어, 각각의 종양 유형은 증식 지수 등을 포함한 상이한 인자에 기초하여 등급화(1 내지 3 등급)함으로써 추가로 분류된다. 단계 및 등급에 기초한 저위험군 질병에 대한 치료 기준은 화학 치료제의 수술 직후 투여 이후의 방광 종양의 요도 경유 절제(TURBT)이다. 중간 위험군 환자에 대해 추천된 치료 기준은 화학 요법의 수술 직후의 설치, 및 화학 요법의 6주간 유도 치료 이후의 TURBT이다. 화자가 화학 요법에 실패한 사건에서, 제2 방광경 절제술이 수행되며, 14일 후에는 환자에게 마이코박테리아 보비스의 약독화 생균주인 바실리 칼메트 구에린(BCG)이 투여된다. 독소루비신, 에피루비신, 발루비신, 파클리탁셀 및 겜시타빈 모두가 유사한 효과로 인해 사용되었을 지라도 수술 직후 설치를 위한 선택된 화학 치료제는 미토마이신 C이다. 원 위치에서 암종이 제시된 이들 환자를 포함한 고위험군 질병에서, BCG는 유일한 효과적인 약제이다. BCG 면역 조절성 치료는 중간 위험군 및 고위험군 개체군에서 현재까지 이용되는 임의의 화학 치료제에 의한 치료보다 훨씬 우수하지만, 이는 수술 직후에 투여될 수 없다는 점에서 제한되고 있다. 방광이 TURBT 과정 도중에 천공되는 경우에 생BCG의 전신 흡수와 연관된 위험성은 너무 커서, BCG 매개 면역 조절이 관측된 재발율에 대비하여 훨씬 우수한 화학 요법에 대한 접근법일지라도, 수술 직후 세팅(setting)에서의 이의 사용을 정당화할 수 없다. 따라서 대부분의 비뇨기과 전문의들은 추천된 수술 직후 설치를 선행하면서 BCG를 투여하기 위해 14일 동안 기다리는 경향이 있다. 반면, 또한 재발 측면에서의 결과는 치료가 수술 직후 임상 치료 지침을 이용하여 개시되는 경우에 훨씬 양호하다. 종합하면, 비근육 침습성 방광암에 대해 TURBT를 받았던 환자에게 BCG와는 달리 수술 직후에 투여될 수 있는 살아있지 않는 면역 조절 요법에 대한 명백한 필요성이 존재한다. 더욱이, BCG를 투여 받았던 환자의 30%의 추정치가 독성 부작용 때문에 요법을 자발적으로 중단하였다. 독성은 BCG 생존성의 함수인 것으로 증명되었다. 따라서 동일한 BCG의 면역 조절 이점을 제공할 수 있지만 감염의 위험성 및 생존성 연관 독성이 없는 치료제에 대해 큰 필요성이 존재한다.
몇몇 실시예에서, 면역 조절성 미니세포는 (i) 비근육 침습성 방광암에서 수술 직후 세팅에서의 방광 내 투여된 면역 요법으로서 이용될 수 있고, (ii) 동일한 유도 및 유지 요법들을 위한 BCG 요법을 대신하여 이용될 수 있으며,(iii) BCG 과민성 및 BCG 저항성 환자를 위한 구제 요법으로서 이용될 수 있다. 결코 이러한 이용 방법은 본 발명을 제한하려는 의도가 아니라, 오히려 암에 사용하기 위한 효과적이고 비생환적 면역 요법들에 대한 필요성을 예시하기 위함이다. 부가적으로, 캡슐화된 세포독성 폴리펩티드, 엔도좀 붕괴용 폴리펩티드, 소분자 약물 또는 핵산의 하나 이상의 조합과 함께 미니세포의 표면 상의 인테그린 표적화 모이어티인 인바신을 함유하는 다중 효용의 인테그린 표적화 면역 조절성 미니세포의 사용은 면역 시스템에 의해 나타난 부가적이고 간접적인 항종양 면역 조절 효과를 여전히 발휘하면서 인테그린의 표적화 및 전달을 통해 직접적인 종양 세포 살해 효과 및 종양 내피세포 살해 효과 둘 모두를 야기할 수 있기 때문에 방광암에 도움이 된다. 방광암에서 다중 효용의 인테그린 표적화 세포독성의 면역 조절성 미니세포의 하나의 비제한적인 적용은 표면-국소화된 인테그린 표적화 모이어티인 인바신 및 퍼프린골리신 O를 포함하는 미니세포인 VAX-IP의 사용이다. VAX-IP는 면역 조절 요법 및/또는 직접적인 항종양/종양 내피세포 요법으로서 사용될 수 있다. 방광암에서 다중 효용의 인테그린 표적화 세포독성의 면역 조절성 미니세포의 다른 비제한적인 적용은 표면-국소화된 인테그린 표적화 모이어티인 인바신, 디프테리아 독소의 촉매 단편 및 퍼프린골리신 O를 포함하는 미니세포인 VAX-IPD의 사용이다. VAX-IPD는 면역 조절 요법 및/또는 직접적인 항종양/종양 내피세포 요법으로서 사용될 수 있다.
몇몇 실시예에서, 미니세포는 조작되어, Th1 우세 면역 반응을 야기하기 위해 사용될 수 있다. Th1 면역 조절성 미니세포는 IFN-γ, IFN-α, IL-12, IL-2, GMCSF, IL-18, TGF-β 및 TNF-α를 포함하지만 이에 제한되지 않는 Th1 사이토카인 및 케모카인의 생산을 야기할 수 있다.
몇몇 실시예에서, 본원에 개시된 미니세포는 콜레스테롤 의존성 세포 용해소 단백질을 포함한다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포는 항체의 Fc 영역을 포함하는 분자를 표시하지 않는다. 항체의 Fc 영역을 포함하는 분자는, 예를 들어 항체 또는 항체 유도체일 수 있다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포는 인바신을 포함하지 않는다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포는 치료용 소분자 및/또는 치료용 핵산을 포함하지 않는다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포는 또한 단백질 독소, Th1 사이토카인, Th2 사이토카인, 포스포리파아제 및/또는 콜레스테롤 의존성 세포 용해소 단백질을 제외한 임의의 치료용 단백질을 포함하지 않는다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포는 단백질 독소, Th1 사이토카인, Th2 사이토카인, 포스포리파아제 및/또는 콜레스테롤 의존성 세포 용해소 단백질을 제외한 임의의 치료학적 활성 모이어티를 포함하지 않는다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포 상의 콜레스테롤 의존성 세포 용해소 단백질의 양은 상기 미니세포가 포유류 세포와 접촉하고 있는 경우에 상기 포유류 세포에 대해 독성을 나타내는 수준이다.
몇몇 실시예에서, Th1 면역 조절성 미니세포는 살모넬라 종, 리스테리아 종, 마이코박테리아 종, 시겔라 종, 여시니아 종 및 대장균(Escherichia coli)의 침습성 균주를 포함하지만 이에 제한되지 않는 자연적으로 침습성인 박테리아 균주로부터 생산된 미니세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들 자연적으로 침습성인 Th1 면역 조절성 미니세포는 진핵 세포 내로의 미니세포의 내부화를 자극할 수 있는 자연적으로 발생하는 미니세포 표면-국소화된 리간드를 표시하여 Th1 우성 면역 치료 반응을 야기하는데 도움을 줄 것이다. 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 자연적으로 침습성인 미니세포가 그 자체로 자연계에 존하지 않지만, 본원에서 개시된 바와 같이 미니세포를 생성하기 위한 하나 이상의 유전적 접근법을 이용하여 미니세포를 생산하지 못하는 침습성 박테리아 균주로부터 조작된다는 것을 인지할 것이다.
몇몇 실시예에서, 자연적으로 침습성인 Th1 면역 조절성 미니세포는 Th1 우성 면역 반응을 추가로 증강, 조절 또는 안정화시키기 위해 설계된 재조합에 의해 발현되는 하나 이상의 단백질 및 핵산을 더 포함한다. 상기 재조합에 의해 발현된 단백질로는 IL-2, GMCSF, IL-12p40, IL-12p70, IL-18, TNF-α 및 IFN-γ와 같은 Th1 사이토카인을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 부가적으로, 자연적으로 침습성인 Th1 면역 조절성 미니세포는, 상기 미니세포에 의해 매개된 Th1 우성 면역 반응을 증강, 조절 또는 안정화시키기 위해 상기 미니세포를 내포화시켰던 세포의 사이토졸 내로의 미니세포 구성성분의 에피솜성 탈출(endosomal escape)을 조장하기 위해 리스테리올리신 O(LLO)와 같은 하나 이상의 기공 형성 세포 용해소 단백질, 및 이의 임의의 기능적 변이체 또는 등가물을 발현할 수 있다. PC-PLC 또는 PI-PLC와 같은 포스포리파아제는 또한 엔도솜으로부터 상기 미니세포를 내포화했던 진핵 세포의 사이토졸 내로의 미니세포 구성성분의 방출을 증강시킴으로써 Th1 우성 면역 반응을 증강, 조절 또는 안정화시키기 위해 사용된 엔도좀 분열제로서 사용될 수 있다. 자연적으로 침습성인 Th1 면역 조절성 미니세포는 Th1 사이토카인 및 하나 이상의 엔도좀 붕괴용 세포 용해소의 하나 이상의 조합을 발현할 수 있다. 자연적으로 침습성인 Th1 면역 조절성 미니세포는 또한 결과적으로 Th1 면역 반응을 추가로 증강, 조절 및/또는 안정화시킬 수 있는 괴사 및/또는 세포사멸(apoptosis)을 조장하기 위해 재조합에 의해 발현된 단백질 독소를 함유할 수도 있다. 재조합에 의해 발현된 바람직한 단백질 독소는 퍼프린골리신 O이다. 자연적으로 침습성인 Th1 면역 조절성 미니세포를 이용하여 활용될 재조합에 의해 발현/생산된 기타 단백질 독소로는 디프테리아 독소의 단편 A/B, 디프테리아 독소의 단편 A, 탄저병 독소 LF 및 EF, 아데닐레이트 시클라아제 독소, 겔로닌(gelonin), 보툴리노리신 B(botulinolysin B), 보툴리노리신 E3, 보툴리노리신 C, 보툴리눔 독소(botulinum toxin), 콜레라 독소, 클로스트리듐(Clostridium) 독소 A, B 및 알파, 리신(ricin), 시가 A(Shiga A) 독소, 시가 유사 A 독소, 콜레라 A 독소, 백일해 S1 독소, 슈도모나스(Pseudomonas) 외독소 A, 대장균 이열성 독소(LTB), 멜리틴(melittin), 리스테리올리신 O의 pH 안정성 변이체(pH 독립성; L461T 아미노산 치환), 리스테리올리신 O의 열 안정성 변이체(E247M 및 D320K 아미노산 치환), 리스테리올리신 O의 pH 및 열 안정성 변이체(E247M, D320K 및 L461T 아미노산 치환), 스트렙토리신 O, 스트렙토리신 O c, 스트렙토리신 O e, 스파에리코리신, 안트로리신 O, 세레올리신, 튜린지엔시리신 O, 바이헨스테파넨실리신, 알베올리신, 브레빌리신, 부티리쿨리신, 테타놀리신 O, 노비일리신, 렉티놀리신, 뉴몰리신, 미틸리신, 슈도뉴몰리신, 수일리신, 인터메딜리신, 이바놀리신, 세엘리제리올리신 O, 바기놀리신, 피올리신, 활성화된 카스파아제, 프로-카스파아제, 사이토카인, 케모카인, 세포 침투성 펩티드, 및 상기 예들의 임의의 조합을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 폴리펩티드(들)의 재조합 발현은 플라스미드, 코스미드, 파지미드 및 박테리아성 인공 염색체(BACs), 및 상기 예들의 임의의 조합을 들 수 있지만 이에 제한되지 않는, 당해 기술분야에 공지된 임의의 다양한 에피솜성 재조합 원핵 발현 벡터로부터의 발현 결과일 수 있다. 유사한 방식에서, 재조합 발현은 염색체 상에 위치한 원핵성 발현 카세트에 의해 달성될 수 있으며, 이때 상기 원핵성 발현 카세트는 미니세포 생산 모세포 염색체의 하나 이상의 복제품 내에 존재한다. 자연적으로 침습성인 Th1 면역 조절성 미니세포는 또한 Th1 면역 조절 효과를 증강시키기 위해 에피솜-국소화된 Toll 유사 수용체 3, 7, 8 및/또는 9를 자극하도록 공지된 하나 이상의 면역 조절성 핵산을 발현하거나 포함하도록 조작될 수 있다. 이 같은 핵산으로는 각각이 당해 기술분야의 기술자들에 의해 용이하게 인식되는 바와 같이 재조합에 의해 발현될 수 있는 단일 가닥 DNA, 단일 가닥 RNA, 이중 가닥 DNA, 이중 가닥 RNA, DNA 헤어핀(hairpin) 및 RNA 헤어핀을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 몇몇 실시예에서, 자연적으로 침습성인 Th1 면역 조절성 미니세포는 본원에서 참고로 인용된 미국 특허 공개공보 제2010/0112670호의 귀소성(homing) 엔도뉴클레아제 유전적 자살 시스템을 함유하고 있는 미니세포 생산 균주로부터 유래한다. 본원에 개시된 I-ceuI 귀소성 엔도뉴클레아제는 별개의 보존된 부위에서 대부분의 박테리아종의 염색체를 선택적으로 절단하여, 한편으로는 모세포를 선택적으로 살해하고 다른 한편으로는 상기 과정에서 이중 가닥 DNA 단편을 생성하도록 작용한다.
몇몇 실시예는 자연적으로 침습성인 Th1 면역 조절성 미니세포 생산 박테리아를 제공하며, 여기서 상기 박테리아는 (i) 격막 형성, 이분열 및 염색체 분리 중 하나 이상을 조절하는 미니세포 생산 유전자 산물을 암호화하는 발현 가능한 유전자; 및 (ii) 퍼프린골리신 O를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 면역 치료 효과를 자극할 수 있는 단백질 독소를 포함한다. 몇몇 실시예에서, 상기 박테리아는 항체, 또는 항체의 Fc 영역을 포함하는 기타 분자를 표시하지 않으며, 단백질 G 또는 단백질 A의 Fc 결합 부분을 표시하지 않는다. 몇몇 실시예에서, 상기 자연적으로 침습성인 Th1 면역 조절성 미니세포 생산 박테리아는 (iii) 이종성 엔도뉴클레아제를 암호화하되, 상기 자연적으로 침습성인 Th1 면역 조절성 미니세포 생산 박테리아의 염색체가 상기 엔도뉴클레아제의 하나 이상의 인식 부위를 포함하는 발현 가능한 "유전적 자살" 유전자; (iv) 한정된 영양 요구성; 및 (v) lpxM / msbB 유전자(또는 기타 기능적 등가물)에서의 결실 또는 돌연변이 중 하나 이상을 더 포함한다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포 생산 유전자는 세포 분열 유전자이다. 상기 세포 분열 유전자의 예로는 ftsZ, sulA, ccdB 및 sfiC를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포 생산 유전자는 유도성 프로모터의 제어 하에 발현된다. 몇몇 실시예에서, 상기 엔도뉴클레아제 자살 유전자는 상기 미니세포 생산 박테리아의 염색체 상에 위치한다. 몇몇 실시예에서, 상기 엔도뉴클레아제는 귀소성 엔도뉴클레아제이다. 상기 귀소성 엔도뉴클레아제로는 I-CeuI, PI-SceI, I-ChuI, I-CpaI, I-SceIII, I-CreI, I-MsoI, I-SceII, I-SceIV, I-CsmI, I-DmoI, I-PorI, PI-TliI, PI-TliII 및 PI-ScpI를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 몇몇 실시예에서, 상기 엔도뉴클레아제는 유도성 프로모터의 제어 하에 발현된다. 몇몇 실시예에서, 상기 영양 요구성은 필수 대사 유전자에서의 결실 또는 불활성화 돌연변이로부터 기인한다. 몇몇 실시예에서, 상기 결실 또는 불활성화 돌연변이는 dapA 유전자 또는 이의 기능적 유사체 내에 존재한다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포 생산 박테리아는 지질 다당류의 합성과 연관이 있는 유전자 산물을 암호화하는 유전자에서의 결실 또는 불활성화 돌연변이를 더 포함하되, 상기 유전자는 상응하는 야생형 유전자와 비교하여 유전적으로 변형되어 있다. 몇몇 실시예에서, 상기 불활성화된 유전자는 lpxM / msbB로서, 상기 박테리아가 상응하는 야생형 박테리아 내의 지질 A 분자와 비교하여 변경된 지질 A 분자를 생산하도록 하는 유전자 산물을 암호화한다. 몇몇 실시예에서, 상기 변경된 지질 A 분자는 상응하는 야생형 박테리아 내의 지질 A 분자와 비교하여 지질 다당류 분자의 지질 A 부분에 대한 미리스트올레산의 부가에 대하여 결함이 있다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포 생산 박테리아는 상동성 재조합과 연관이 있는 유전자에서의 결실 또는 불활성화 돌연변이를 더 포함하되, 상기 유전자는 상응하는 야생형 유전자와 비교하여 유전적으로 변형되어 있으며, 여기서 상기 미니세포 생산 박테리아는 DNA 손상 복구에 결함이 있어, 유전적 자살 기작으로부터 회복 위험성을 감소시킨다. 몇몇 실시예에서, 상기 자연적으로 침습성인 Th1 면역 조절성 미니세포 생산 박테리아는 여시니아 종, 캄필로박터 종(Campylobacter spp .), 슈도모나스 종, 살모넬라 종, 시겔라 종, 리케챠 종 및 대장균의 침습성 균주를 포함하지만 이에 제한되지 않는 그램 음성 박테리아이다. 몇몇 실시예에서, 상기 자연적으로 침습성인 Th1 면역 조절성 미니세포 생산 박테리아로는 마이코박테리아 종, 스트렙토코쿠스 종, 리스테리아 모노사이토제네스, 클라미디아 종 및 브루셀라 종(Brucella spp .)을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
Th1 면역 조절성 미니세포로는 침습성이 되도록 유전적으로 조작되었던 비침습성 박테리아 균주로부터 생산된 미니세포를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 많은 비침습성 박테리아 균주는 통상의 기술자들에게 공지되어 있으며, 대장균, 살모넬라 종, 시겔라 종, 락토바실러스 종(Lactobacillus spp .), 슈도모나스 종 등의 비침습성 균주를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이들 정상적으로 비침습성인 균주는 진핵 세포 내로의 미니세포의 내부화를 자극할 수 있는 이종성 미니세포 표면-국소화된 리간드를 표시하기 위해 유전적으로 변형되어 있다. 상기 얻어진 재조합 침습성 Th1 면역 조절성 미니세포는 Th1 우성 면역 치료 반응을 야기하기 위해 면역 세포 및 기타 진핵 세포에 의해 내부화될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 재조합 침습성 Th1 면역 조절성 미니세포는 Th1 우성 면역 반응을 추가로 증강, 조절 또는 안정화시키도록 설계된 재조합에 의해 발현되는 하나 이상의 면역 조절성 단백질을 더 포함한다. 상기 면역 조절성 단백질의 예로는 IL-2, GMCSF, IL-12p40, IL-12p70, IL-18, TNF-α 및 IFN-γ와 같은 Th1 사이토카인을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 재조합 침습성 Th1 면역 조절성 미니세포는 미니세포에 의해 매개된 Th1 우성 면역 반응을 증강, 조절 또는 안정화시키기 위해 상기 미니세포를 내부화시켰던 세포의 사이토졸 내로의 미니세포 구성성분의 엔도솜성 탈출을 조장하기 위해 리스테리올리신 O(LLO)와 같은 하나 이상의 기공 형성 세포 용해소 단백질 및 이의 임의의 기능적 변이체 또는 등가물을 발현할 수 있다. PC-PLC 또는 PI-PLC와 같은 포스포리파아제는 또한 에피솜으로부터 상기 미니세포를 내부화시켰던 진핵 세포의 사이토졸 내로의 미니세포 구성성분의 방출을 증강시킴으로써 Th1 우성 면역 반응을 증강, 조절 또는 안정화시키기 위해 이용된 엔도좀 분열제(endosomal disrupting agent)로서 사용될 수 있다. 재조합 침습성 Th1 면역 조절성 미니세포는 Th1 사이토카인 및 하나 이상의 엔도좀 붕괴용 세포 용해소의 하나 이상의 조합을 발현할 수 있다. 자연적으로 침습성인 Th1 면역 조절성 미니세포는 또한 결과적으로 Th1 면역 반응을 추가로 증강, 조절 및/또는 안정화시킬 수 있는 괴사 및/또는 세포사멸을 조장하기 위해 재조합에 의해 발현된 단백질 독소를 함유할 수도 있다. 상기 재조합에 의해 발현/생산된 바람직한 단백질 독소는 퍼프린골리신 O이다. 재조합 침습성 Th1 면역 조절성 미니세포를 이용하여 활용될 수 있는 재조합에 의해 발현/생산된 단백질 독소의 기타 예로는 디프테리아 독소의 단편 A/B, 디프테리아 독소의 단편 A, 탄저병 독소 LF 및 EF, 아데닐레이트 시클라아제 독소, 겔로닌, 보툴리노리신 B, 보툴리노리신 E3, 보툴리노리신 C, 보툴리눔 독소, 콜레라 독소, 클로스트리듐 독소 A, B 및 알파, 리신, 시가 A 독소, 시가 유사 A 독소, 콜레라 A 독소, 백일해 S1 독소, 슈도모나스 외독소 A, 대장균 이열성 독소(LTB), 멜리틴, 리스테리올리신 O의 pH 안정성 변이체(pH 독립성; L461T 아미노산 치환), 리스테리올리신 O의 열 안정성 변이체(E247M 및 D320K 아미노산 치환), 리스테리올리신 O의 pH 및 열 안정성 변이체(E247M, D320K 및 L461T 아미노산 치환), 스트렙토리신 O, 스트렙토리신 O c, 스트렙토리신 O e, 스파에리코리신, 안트로리신 O, 세레올리신, 튜린지엔시리신 O, 바이헨스테파넨실리신, 알베올리신, 브레빌리신, 부티리쿨리신, 테타놀리신 O, 노비일리신, 렉티놀리신, 뉴몰리신, 미틸리신, 슈도뉴몰리신, 수일리신, 인터메딜리신, 이바놀리신, 세엘리제리올리신 O, 바기놀리신, 피올리신, 활성화된 카스파아제, 프로-카스파아제, 사이토카인, 케모카인, 세포 침투성 펩티드, 및 상기 예들의 임의의 조합을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 폴리펩티드(들)의 재조합 발현은 플라스미드, 코스미드, 파지미드 및 박테리아성 인공 염색체(BAC), 및 상기 예들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 당해 기술분야에 공지된 임의의 다양한 에피솜성 재조합 원핵 발현 벡터로부터의 발현 결과일 수 있다. 유사한 방식에서, 재조합 발현은 염색체 상에 위치한 원핵성 발현 카세트에 의해 달성될 수 있으며, 이때 상기 원핵성 발현 카세트는 미니세포 생산 모세포 염색체의 하나 이상의 복제품 내에 존재한다. 재조합 침습성 Th1 면역 조절성 미니세포는 또한 Th1 면역 조절 효과를 증강시키기 위해 에피솜-국소화된 Toll 유사 수용체 3, 7, 8 및/또는 9를 자극하도록 공지된 하나 이상의 면역 조절성 핵산을 발현하거나 포함하도록 조작될 수 있다. 이 같은 핵산으로는 각각이 당해 기술분야의 기술자들에 의해 용이하게 인식되는 바와 같이 재조합에 의해 발현될 수 있는 단일 가닥 DNA, 단일 가닥 RNA, 이중 가닥 DNA, 선형 이중 가닥 DNA, 이중 가닥 RNA, DNA 헤어핀 및 RNA 헤어핀을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 몇몇 실시예에서, 재조합 침습성 Th1 면역 조절성 미니세포는 본원에서 참고로 인용된 미국 특허 공개공보 제2010/0112670호의 귀소성 엔도뉴클레아제 유전적 자살 시스템을 함유하고 있는 미니세포 생산 균주로부터 유래한다. 본원에 개시된 I-ceuI 귀소성 엔도뉴클레아제는 별개의 보존된 부위에서 대부분의 박테리아종의 염색체를 선택적으로 절단하여, 한편으로는 모세포를 선택적으로 살해하고 다른 한편으로는 상기 과정에서 이중 가닥 선형 DNA 단편을 생성하도록 작용한다.
몇몇 실시예는 재조합 침습성 Th1 면역 조절성 미니세포 생산 박테리아를 제공하며, 여기서 상기 박테리아는 (i) 격막 형성, 이분열 및 염색체 분리 중 하나 이상을 조절하는 미니세포 생산 유전자 산물을 암호화하는 발현 가능한 유전자; (ii) 진핵 세포 내로의 내부화를 자극할 수 있는 하나 이상의 이종성 미니세포 표면-국소화된 표적화 모이어티의 기능적 발현 및 표면 표시를 가능케 하는 재조합 발현 카세트; 및 (iii) 퍼프린골리신 O를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 면역 치료 효과를 자극할 수 있는 단백질 독소를 포함한다. 몇몇 실시예에서, 상기 재조합 침습성 Th1 면역 조절성 미니세포 생산 박테리아는 또한 (iv) 이종성 엔도뉴클레아제를 암호화하되, 상기 미니세포 생산 박테리아의 염색체가 상기 엔도뉴클레아제의 하나 이상의 인식 부위를 포함하는 발현 가능한 "유전적 자살" 유전자; (v) 한정된 영양 요구성; 및 (vi) lpxM / msbB 유전자(또는 기타 기능적 등가물)에서의 결실 또는 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포 생산 유전자는 세포 분열 유전자이다. 상기 세포 분열 유전자로는 ftsZ, sulA, ccdB 및 sfiC를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포 생산 유전자는 유도성 프로모터의 제어 하에 발현된다. 몇몇 실시예에서, 상기 엔도뉴클레아제 자살 유전자는 미니세포 생산 박테리아의 염색체 상에 위치한다. 몇몇 실시예에서, 상기 엔도뉴클레아제는 귀소성 엔도뉴클레아제이다. 상기 귀소성 엔도뉴클레아제로는 I-CeuI, PI-SceI, I-ChuI, I-CpaI, I-SceIII, I-CreI, I-MsoI, I-SceII, I-SceIV, I-CsmI, I-DmoI, I-PorI, PI-TliI, PI-TliII 및 PI-ScpI를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 몇몇 실시예에서, 상기 엔도뉴클레아제는 유도성 프로모터의 제어 하에 발현된다. 몇몇 실시예에서, 상기 영양 요구성은 필수 대사 유전자 내에서의 결실 또는 불활성화 돌연변이에 기인한다. 몇몇 실시예에서, 상기 결실 또는 불활성화 돌연변이는 dapA 유전자 또는 이의 기능적 유사체 내에 존재한다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포 생산 박테리아는 지질 다당류의 합성과 연관이 있는 유전자 산물을 암호화하는 유전자에서의 결실 또는 불활성화 돌연변이를 더 포함하되, 상기 유전자는 상응하는 야생형 유전자와 비교하여 유전적으로 변형되어 있다. 몇몇 실시예에서, 상기 불활성화된 유전자는 lpxM / msbB로서, 상기 박테리아가 상응하는 야생형 박테리아 내의 지질 A 분자와 비교하여 변경된 지질 A 분자를 생산하도록 하는 유전자 산물을 암호화한다. 몇몇 실시예에서, 상기 변경된 지질 A 분자는 상응하는 야생형 박테리아 내의 지질 A 분자와 비교하여 지질 다당류 분자의 지질 A 부분에 대한 미리스트올레산의 부가에 대하여 결함이 있다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포 생산 박테리아는 상동성 재조합과 연관이 있는 유전자에서 결실 또는 불활성화 돌연변이를 더 포함하되, 상기 유전자는 상응하는 야생형 유전자와 비교하여 유전적으로 변형되어 있으며, 여기서 상기 미니세포 생산 박테리아는 DNA 손상 복구에 결함이 있다. 몇몇 실시예에서, 상기 재조합 침습성 Th1 면역 조절성 미니세포 생산 박테리아는 캄필로박터 제주니(C. jejuni), 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 브루셀라 종, 프란시셀라 툴라레미아(Franciscella tularemia), 레지오넬라 뉴모필리아(Legionella pneumophilia), 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis), 클리엡셀라(Kliebsella), 여시니아 종, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori), 네이세리아 고노르호애(Neisseria gonorrhoeae), 레지오넬라 뉴모필라(L. pneumophila), 살모넬라 종, 시겔라 종, 슈도모나스 종 및 대장균을 포함하지만 이에 제한되지 않는 그램 음성 박테리아이다. 몇몇 실시예에서, 상기 재조합 침습성 Th1 면역 조절성 미니세포 생산 박테리아는 스태필로코쿠스 종(Staphylococcus spp .), 락토바실러스 종, 스트렙토코쿠스 종, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 클로스트리듐 디피실레(Clostridium difficile) 및 바실러스 세리우스(B. cereus)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 그램 양성 박테리아이다.
몇몇 실시예에서, Th1 면역 조절성 미니세포는 비침습성 박테리아 균주로부터 생산된다. 많은 비침습성 박테리아 균주는 통상의 기술을 가진 자에게 공지되어 있으며, 대장균, 살모넬라 종, 시겔라 종, 락토바실러스 종, 슈도모나스 종 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이들 비침습성 Th1 면역 조절성 미니세포는 Th1 우성 면역 치료 반응을 야기하기 위해 면역 세포 및 기타 진핵 세포에 의해 내부화될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 재조합 비침습성 Th1 면역 조절성 미니세포는 Th1 우성 면역 반응을 추가로 증강, 조절 또는 안정화시키기 위해 설계된 재조합에 의해 발현되는 하나 이상의 면역 조절성 단백질을 더 포함한다. 상기 면역 조절성 단백질의 예로는 IL-2, GMCSF, IL-12p40, IL-12p70, IL-18, TNF-α 및 IFN-γ와 같은 Th1 사이토카인을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 재조합 비침습성 Th1 면역 조절성 미니세포는, 상기 미니세포에 의해 매개되는 Th1 우성 면역 반응을 증강, 조절 또는 안정화시키기 위해 상기 미니세포를 내포화시켰던 세포의 사이토졸 내로의 미니세포 구성성분의 에피솜성 탈출을 조장하기 위해 리스테리올리신 O(LLO)와 같은 하나 이상의 기공 형성 세포 용해소 단백질 및 이의 임의의 기능적 변이체 또는 등가물을 포함할 수 있다. PC-PLC 또는 PI-PLC와 같은 포스포리파아제는 또한 에피솜으로부터 상기 미니세포를 내포화시켰던 진핵 세포의 사이토졸 내로의 미니세포 구성성분의 방출을 증강시킴으로써 Th1 우성 면역 반을 증강, 조절 또는 안정화시키기 위해 이용되는 엔도좀 분열제로서 사용될 수 있다. 재조합 비침습성 Th1 면역 조절성 미니세포는 Th1 사이토카인 및 하나 이상의 엔도좀 붕괴용 세포 용해소 중 하나 이상의 조합을 발현할 수 있다. 재조합 비침습성 Th1 면역 조절성 미니세포는 또한 결과적으로 Th1 면역 반응을 추가로 증강, 조절 및/또는 안정화시킬 수 있는 괴사 및/또는 세포사멸을 조장하기 위해 재조합에 의해 발현된 단백질 독소를 함유할 수도 있다. 재조합에 의해 발현/생산된 바람직한 단백질 독소는 퍼프린골리신 O이다. 재조합 침습성 Th1 면역 조절성 미니세포를 이용하여 활용될 수 있는 기타 재조합에 의해 발현/생산된 단백질 독소로는 디프테리아 독소의 단편 A/B, 디프테리아 독소의 단편 A, 탄저병 독소 LF 및 EF, 아데닐레이트 시클라아제 독소, 겔로닌, 보툴리노리신 B, 보툴리노리신 E3, 보툴리노리신 C, 보툴리눔 독소, 콜레라 독소, 클로스트리듐 독소 A, B 및 알파, 리신, 시가 A 독소, 시가 유사 A 독소, 콜레라 A 독소, 백일해 S1 독소, 슈도모나스 외독소 A, 대장균 이열성 독소(LTB), 멜리틴, 리스테리올리신 O의 pH 안정성 변이체(pH 독립성; L461T 아미노산 치환), 리스테리올리신 O의 열 안정성 변이체(E247M 및 D320K 아미노산 치환), 리스테리올리신 O의 pH 및 열 안정성 변이체(E247M, D320K 및 L461T 아미노산 치환), 스트렙토리신 O, 스트렙토리신 O c, 스트렙토리신 O e, 스파에리코리신, 안트로리신 O, 세레올리신, 튜린지엔시리신 O, 바이헨스테파넨실리신, 알베올리신, 브레빌리신, 부티리쿨리신, 테타놀리신 O, 노비일리신, 렉티놀리신, 뉴몰리신, 미틸리신, 슈도뉴몰리신, 수일리신, 인터메딜리신, 이바놀리신, 세엘리제리올리신 O, 바기놀리신, 피올리신, 활성화된 카스파아제, 프로-카스파아제, 사이토카인, 케모카인, 세포 침투성 펩티드, 및 상기 예들의 임의의 조합을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 폴리펩티드(들)의 재조합 발현은 플라스미드, 코스미드, 파지미드 및 박테리아성 인공 염색체(BAC), 및 상기 예들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 당해 기술분야에 공지된 임의의 다양한 에피솜성 재조합 원핵 발현 벡터로부터의 발현 결과일 수 있다. 유사한 방식에서, 재조합 발현은 염색체 상에 위치한 원핵성 발현 카세트에 의해 달성될 수 있으며, 이때 상기 원핵성 발현 카세트는 미니세포 생산 모세포 염색체의 하나 이상의 복제품 내에 존재한다. 재조합 침습성 Th1 면역 조절성 미니세포는 또한 Th1 면역 조절 효과를 증강시키기 위해 에피솜-국소화된 Toll 유사 수용체 3, 7, 8 및/또는 9를 자극하도록 공지된 하나 이상의 면역 조절성 핵산을 발현하거나 포함하도록 조작될 수 있다. 이 같은 핵산으로는 각각이 당해 기술분야의 기술자들에 의해 용이하게 인식되는 바와 같이 재조합에 의해 발현될 수 있는 단일 가닥 DNA, 단일 가닥 RNA, 이중 가닥 DNA, 선형 이중 가닥 DNA, 이중 가닥 RNA, DNA 헤어핀 및 RNA 헤어핀을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 몇몇 실시예에서, 재조합 침습성 Th1 면역 조절성 미니세포는 본원에서 참고로 인용된 미국 특허 공개공보 제2010/0112670호의 귀소성 엔도뉴클레아제 유전적 자살 시스템을 함유하고 있는 미니세포 생산 균주로부터 유래한다. 본원에 개시된 I-ceuI 귀소성 엔도뉴클레아제는 별개의 보존된 부위에서 대부분의 박테리아종의 염색체를 선택적으로 절단하여, 한편으로는 모세포를 선택적으로 살해하고 다른 한편으로는 상기 과정에서 이중 가닥 선형 DNA 단편을 생성하도록 작용한다.
몇몇 실시예는 재조합 비침습성 Th1 면역 조절성 미니세포 생산 박테리아를 제공하며, 여기서 박테리아는 (i) 격막 형성, 이분열 및 염색체 분리 중 하나 이상을 조절하는 미니세포 생산 유전자 산물을 암호화하는 발현 가능한 유전자; 및 (ii) 퍼프린골리신 O를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 면역 치료 효과를 자극할 수 있는 단백질 독소를 포함한다. 몇몇 실시예에서, 상기 재조합 비침습성 Th1 면역 조절성 미니세포 생산 박테리아는 (iii) 이종성 엔도뉴클레아제를 암호화하되, 상기 재조합 비침습성 Th1 면역 조절성 미니세포 생산 박테리아의 염색체가 상기 엔도뉴클레아제의 하나 이상의 인식 부위를 포함하는 발현 가능한 "유전적 자살" 유전자; (iv) 한정된 영양 요구성; 및 (v) lpxM / msbB 유전자(또는 기타 기능적 등가물)에서의 결실 또는 돌연변이 중 하나 이상을 더 포함한다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포 생산 유전자는 세포 분열 유전자이다. 상기 세포 분열 유전자로는 ftsZ, sulA, ccdB 및 sfiC를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포 생산 유전자는 유도성 프로모터의 제어 하에 발현된다. 몇몇 실시예에서, 상기 엔도뉴클레아제 자살 유전자는 미니세포 생산 박테리아의 염색체 상에 위치한다. 몇몇 실시예에서, 상기 엔도뉴클레아제는 귀소성 엔도뉴클레아제이다. 상기 귀소성 엔도뉴클레아제의 예로는 I-CeuI, PI-SceI, I-ChuI, I-CpaI, I-SceIII, I-CreI, I-MsoI, I-SceII, I-SceIV, I-CsmI, I-DmoI, I-PorI, PI-TliI, PI-TliII 및 PI-ScpI를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 몇몇 실시예에서, 상기 엔도뉴클레아제는 유도성 프로모터의 제어 하에 발현된다. 몇몇 실시예에서, 상기 영양 요구성은 필수 대사 유전자에서의 결실 또는 불활성화 돌연변이에 기인한다. 몇몇 실시예에서, 상기 결실 또는 불활성화 돌연변이는 dapA 유전자 또는 이의 기능적 유사체 내에 존재한다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포 생산 박테리아는 지질 다당류의 합성과 연관이 있는 유전자 산물을 암호화하는 유전자에서의 결실 또는 불활성화 돌연변이를 더 포함하되, 상기 유전자는 상응하는 야생형 유전자와 비교하여 유전적으로 변형되어 있다. 몇몇 실시예에서, 상기 불활성화된 유전자는 lpxM/msbB로서, 상기 박테리아가 상응하는 야생형 박테리아 내의 지질 A 분자와 비교하여 변경된 지질 A 분자를 생산하도록 하는 유전자 산물을 암호화한다. 몇몇 실시예에서, 상기 변경된 지질 A 분자는 상응하는 야생형 박테리아 내의 지질 A 분자와 비교하여 지질 다당류 분자의 지질 A 부분에 대한 미리스트올레산의 부가에 대하여 결함이 있다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포 생산 박테리아는 상동성 재조합과 연관이 있는 유전자에서의 결실 또는 불활성화 돌연변이를 더 포함하되, 상기 유전자는 상응하는 야생형 유전자와 비교하여 유전적으로 변형되어 있으며, 여기서 상기 미니세포 생산 박테리아는 DNA 손상 복구에 결함이 있어, 유전적 자살 기작으로부터 회복 위험성을 감소시킨다. 몇몇 실시예에서, 상기 재조합 비침습성 Th1 면역 조절성 미니세포 생산 박테리아는 여시니아 종, 캄필로박터 종, 슈도모나스 종, 살모넬라 종, 시겔라 종, 리케챠 종 및 대장균을 포함하지만 이에 제한되지 않는 그램 음성 박테리아이다. 몇몇 실시예에서, 상기 재조합 비침습성 Th1 면역 조절성 미니세포 생산 박테리아는 마이코박테리아 종, 스트렙토코쿠스 종, 리스테리아 모노사이토제네스, 클라미디아 종 및 브루셀라 종을 포함하지만 이에 제한되지 않는 그램 양성 박테리아이다.
몇몇 실시예에서, 미니세포는 조작되어, Th2 우세 면역 반응을 야기하기 위해 이용된다. Th2 사이토카인 및 케모카인 생산을 야기할 수 있는 Th2 면역 조절성 미니세포의 예로는 IL-1α, IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 및 IL-13을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
몇몇 실시예에서, Th2 면역 조절성 미니세포로는 스트렙토코쿠스 종, 스태필로코쿠스 종, 살모넬라 종, 시겔라 종, 락토바실러스 종, 슈도모나스 종, 클렙시엘라 종(Klebsiella spp .) 및 대장균의 비침습성, 부착성 및 점막 부착성 균주를 포함하지만 이에 제한되지 않는 자연적으로 발생하는 비침습조절 활성착성 또는 점막 부착성 박테리아 균주를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 이들 자연적으로 비침습성인 Th2 면역 조절성 미니세포는 대식세포, 수지상 세포 및 호중성 백혈구와 같은 구성적 식균성 면역세포에 의해 내포화될 수 있을지라도 진핵 세포 내로의 미니세포의 내부화를 자극할 수 있는 자연적으로 발생하는 미니세포 표면-국소화된 리간드를 표시하지 않는다. 부착성 및 점막 부착성 Th2 면역 조절성 미니세포는 진핵 세포의 표면 및 점막 표면 각각에 대한 부착을 자극할 수 있는 미니세포 표면-국소화된 단백질을 발현하지만, 여전히 인지 가능한 내부화를 야기하지 않으며, 이때 대식세포, 호중성 백혈구 및 수지상 세포와 같은 정상적으로 구성적인 식균성 세포에 대해서는 예외로 한다. 당해 기술분야의 통상을 지식을 가진 자는 자연적으로 비침습성인 Th2 면역 조절성 미니세포, 부착성 Th2 면역 조절성 미니세포 및 점막 부착성 Th2 면역 조절성 미니세포가 그 자체로는 자연계에 존재하지 않지만, 오히려 본원에 개시된 바와 같이 미니세포를 생성하기 위한 하나 이상의 유전적 접근법을 이용하여 미니세포를 생산하지 못하는 비침습성, 부착성 및 점막 부착성 박테리아 종으로부터 조작된다는 것을 인지할 것이다. 스트렙토코쿠스 종, 스태필로코쿠스 종, 살모넬라 종, 시겔라 종, 락토바실러스 종, 슈도모나스 종, 클렙시엘라 종 및 대장균의 비부착성 균주는 박테리아 세포 표면 부착 인자의 발현이 재조합 부착성 Th2 면역 조절성 미니세포를 초래하도록 상기 이종조절 활성착 인자의 클로닝 및 재조합 발현에 의해 부착성이 되도록 분자 생물학 및/또는 미생물 유전학 분야에서의 기술자들에 의해 용이하게 조작된다.
몇몇 실시예는 자연적으로 비침습성, 부착성 또는 점막 부착성인 Th2 면역 조절성 미니세포 생산 박테리아를 제공하며, 여기서 상기 박테리아는 (i) 격막 형성, 이분열 및 염색체 분리 중 하나 이상을 조절하는 미니세포 생산 유전자 산물을 암호화하는 발현 가능한 유전자를 포함한다. 몇몇 실시예에서, 상기 자연적으로 비침습성, 부착성 또는 점막 부착성인 Th2 면역 조절성 미니세포 생산 박테리아는 (ii) 이종성 엔도뉴클레아제를 암호화하되, 상기 자연적으로 비침습성, 부착성 및/또는 점막 부착성인 Th2 면역 조절성 미니세포 생산 박테리아의 염색체가 상기 엔도뉴클레아제의 하나 이상의 인식 부위를 포함하는 발현 가능한 "유전적 자살" 유전자; (iii) 한정된 영양 요구성; 및 (iv) lpxM / msbB 유전자(또는 기타 기능적 등가물)에서의 결실 또는 돌연변이 중 하나 이상을 더 포함한다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포 생산 유전자는 세포 분열 유전자이다. 상기 세포 분열 유전자로는 ftsZ, sulA, ccdB 및 sfiC를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포 생산 유전자는 유도성 프로모터의 제어 하에 발현된다. 몇몇 실시예에서, 상기 엔도뉴클레아제 자살 유전자는 상기 미니세포 생산 박테리아의 염색체 상에 위치한다. 몇몇 실시예에서, 상기 엔도뉴클레아제는 귀소성 엔도뉴클레아제이다. 상기 귀소성 엔도뉴클레아제의 예로는 I-CeuI, PI-SceI, I-ChuI, I-CpaI, I-SceIII, I-CreI, I-MsoI, I-SceII, I-SceIV, I-CsmI, I-DmoI, I-PorI, PI-TliI, PI-TliII 및 PI-ScpI를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 몇몇 실시예에서, 상기 엔도뉴클레아제는 유도성 프로모터의 제어 하에 발현된다. 몇몇 실시예에서, 상기 영양 요구성은 필수 대사 유전자에서의 결실 또는 불활성화 돌연변이에 기인한다. 몇몇 실시예에서, 상기 결실 또는 불활성화 돌연변이는 dapA 유전자 또는 이의 기능적 유사체 내에 존재한다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포 생산 박테리아는 지질 다당류의 합성과 연관이 있는 유전자 산물을 암호화하는 유전자에서의 결실 또는 불활성화 돌연변이를 더 포함하되, 상기 유전자는 상응하는 야생형 유전자와 비교하여 유전적으로 변형되어 있다. 몇몇 실시예에서, 상기 불활성화된 유전자는 lpxM / msbB로서, 상기 박테리아가 상응하는 야생형 박테리아 내의 지질 A 분자와 비교하여 변경된 지질 A 분자를 생산하도록 하는 유전자 산물을 암호화한다. 몇몇 실시예에서, 상기 변경된 지질 A 분자는 상응하는 야생형 박테리아 내의 지질 A 분자와 비교하여 지질 다당류 분자의 지질 A 부분에 대한 미리스트올레산의 부가에 대하여 결함이 있다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포 생산 박테리아는 상동성 재조합과 연관이 있는 유전자에서의 결실 또는 불활성화 돌연변이를 더 포함하되, 상기 유전자는 상응하는 야생형 유전자와 비교하여 유전적으로 변형되어 있으며, 여기서 상기 미니세포 생산 박테리아는 DNA 손상 복구에 결함이 있어, 유전적 자살 기작으로부터 회복 위험성을 감소시킨다. 몇몇 실시예에서, 상기 자연적으로 비침습성, 부착성 및/또는 점막 부착성인 Th2 면역 조절성 미니세포 생산 박테리아는 여시니아 종, 캄필로박터 종, 슈도모나스 종, 살모넬라 종, 시겔라 종, 리케챠 종 및 대장균의 침습성 균주를 포함하지만 이에 제한되지 않는 그램 음성 박테리아이다. 몇몇 실시예에서, 상기 자연적으로 비침습성, 부착성 또는 점막 부착성인 Th2 면역 조절성 미니세포 생산 박테리아는 마이코박테리아 종, 스트렙토코쿠스 종, 리스테리아 모노사이토제네스, 클라미디아 종 및 브루셀라 종을 포함하지만 이에 제한되지 않는 그램 양성 박테리아이다.
몇몇 실시예는 다중 효용의 표적화된 세포독성/면역 조절성 미니세포를 제공한다. 다중 효용의 표적화된 세포독성/면역 조절성 미니세포는 미니세포 표면-국소화된 표적화 모이어티, 세포독성 적재물 및/또는 에피솜성 탈출 단백질을 함유한다. 다중 효용의 표적화된 세포독성/면역 조절성 미니세포는 추가적인 항종양 활성을 초래하는 Th1 면역 조절 효과를 야기할 수 있다는 것 이외에도 세포독성 적재물을 종양 세포에 직접적으로 표적화하고 전달함으로써 직접적인 항종양 효과를 유도할 수 있다.
본원에 개시된 바와 같이, VAX-IP 미니세포는 인바신 및 퍼프린골리신 O를 협주적으로 발현하고 표시하는 다중 효용의 세포독성/면역 조절성 미니세포 모두를 포함한다. 미니세포의 최종 제제는 해독된 LPS로 구성되며, 신규한 유도성 유전적 자살 기작 및 DAP 영양 요구성으로 인해 임의의 생체 내 생존 가능한 오염 모세포가 충분히 결여되어 있는 것이 바람직하다.
본원에 개시된 바와 같이, VAX-IPT 미니세포는 인바신, 퍼프린골리신 O 및 단백질 독소를 협주적으로 발현하고 표시하는 다중 효용의 세포독성/면역 조절성 미니세포 모두를 포함한다. 미니세포의 최종 제제는 해독된 LPS로 구성되며, 신규한 유도성 유전적 자살 기작 및 DAP 영양 요구성으로 인해 임의의 생체 내 생존 가능한 오염 모세포가 충분히 결여되어 있는 것이 바람직하다.
본원에 개시된 바와 같이, VAX-IPT 미니세포의 하나의 비제한적인 바람직한 하위 부류는 VAX-IPD 미니세포로서, 인바신, 퍼프린골리신 O 및 디프테리아 독소의 촉매 단편(단편 A)을 발현하고 표시하는 다중 효용의 세포독성/면역 조절성 미니세포이다. 미니세포의 최종 제제는 해독된 LPS로 구성되며, 신규한 유도성 유전적 자살 기작 및 DAP 영양 요구성으로 인해 임의의 생체 내 생존 가능한 오염 모세포가 충분히 결여되어 있는 것이 바람직하다. 몇몇 실시예에서, VAX-IPD 박테리아 미니세포는 시험관 내 및 생체 내에서 디프테리아 독소의 촉매 단편을 표적화하고 더욱 효율적으로 전달하기 위해 사용된다. 예를 들어, 최적의 살해 활성은 인바신, PFO 및 디프테리아 독소의 촉매 단편(단편 A) 3가지 모두의 존재 하에 관측된다. 그리고 VAX-IPD는 활성화된 β1 인테그린을 발현하기 위해 공지된 쥐 및 인간 내피세포 및 종양 세포 유형의 집단에 걸쳐 광범위한 스펙트럼 효능을 발휘하기 위해 3가지 성분 모두에 대해 유사한 요건을 갖는다. 놀랍게도, β1 인테그린을 발현하는 것으로 또한 공지된 HL60 세포는 VAX-IPD에 의해 영향을 받지 않는다. 이는 예상 밖의 결과이며, 문헌의 추가적인 검토 시에 HL60 세포는 β1 인테그린을 발현하지만, 불활성화 형태로 발현한다는 것을 발견하였다. 그러나 완전히 특성 분석되어 있는 인바신 활성은 그 자체로서 β1 활성화 상태에 의존하는 것으로는 보고되어 있지 않았다. 이러한 예상 밖의 결과는, β1 인테그린이 비록 대부분의 경우에 매우 낮은 수준으로 존재할지라도 많은 조직 유형에서 발현되고 리간드 결합된 형태 또는 불활성화 형태로 발견됨에 따라 생체 내에서 증명된 예상된 독성의 결핍에 또한 기여할 가능성이 있다. 중요하게도, VAX-IPD 미니세포가 생체 내에서 주요 항종양 효과를 발휘할 뿐만 아니라 전이를 예방하거나 제거할 수 있는 것으로 관측된다. 비록 상이한 모델일지라도 활성 및 독성에 대한 유사한 결과가 또한 관측된다.
단백질 G는 그램 양성 박테리아 그룹 G의 스트렙토코쿠스에 의해 발현되는 세포 표면 단백질이다. 이의 천연의 생물학적 기능은 항체의 Fc 영역이 면역 시스템으로부터 마스킹(masking)되도록 Fc 영역에 결합함으로써 감염 과정 도중에 그룹 G의 스트렙토코쿠스의 옵소닌화(opsonization)를 방지하는 것이다. 단백질 G는 2개의 Fc 결합 도메인을 함유하고 있다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포는 단백질 G의 Fc 결합 부분을 갖고 있지 않다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포는 단백질 G의 Fc 결합 부분을 표시하지 않는다.
단백질 A는 그램 양성 박테리아인 스태필로코쿠스 아우레우스(S. aureus)에 의해 발현되는 세포 표면 단백질이다. 단백질 G와 같이, 이의 천연의 생물학적 기능은 또한 감염 과정 도중에 스태필로코쿠스 아우레우스의 옵소닌화를 방지하는 것이다. 스태필로코쿠스 아우레우스는 항체의 Fc 영역에 결합하기 위해 단백질 A를 이용한다. 단백질 A는 4개의 별개의 Fc 결합 도메인을 함유하고 있다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포는 단백질 A의 Fc 결합 부분을 갖고 있지 않다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포는 단백질 A의 Fc 결합 부분을 표시하지 않는다.
몇몇 실시예에서, 본원에 개시된 미니세포는 항체, 또는 항체의 Fc 영역을 포함하는 기타 분자를 포함하지 않는다. 몇몇 실시예에서, 본원에 개시된 미니세포는 항체, 또는 항체의 Fc 영역을 포함하는 기타 분자를 표시하지 않는다.
몇몇 실시예는 VAX-P 미니세포 생산 박테리아를 포함하며, 여기서 상기 박테리아는 (i) 격막 형성, 이분열 및 염색체 분리 중 하나 이상을 조절하는 미니세포 생산 유전자 산물을 암호화하는 발현 가능한 유전자; 및 (ii) 퍼프린골리신 O의 기능적 발현을 가능케 하는 재조합 발현 카세트를 포함한다. 몇몇 실시예에서, 상기 박테리아는 항체, 또는 항체의 Fc 영역을 포함하는 기타 분자를 표시하지 않으며, 단백질 G 또는 단백질 A의 Fc 결합 부분을 표시하지 않는다. 몇몇 실시예에서, 상기 VAX-P 미니세포 생산 박테리아는 (iii) 이종성 엔도뉴클레아제를 암호화하되, 상기 미니세포 생산 박테리아의 염색체는 상기 엔도뉴클레아제의 하나 이상의 인식 부위를 포함하는 발현 가능한 "유전적 자살" 유전자; (iv) 한정된 영양 요구성; 및 (v) pxM / msbB 유전자(또는 기타 기능적 등가물)에서의 결실 또는 돌연변이 중 하나 이상을 더 포함한다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포 생산 유전자는 세포 분열 유전자이다. 상기 세포 분열 유전자의 예로는 ftsZ, sulA, ccdB 및 sfiC를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포 생산 유전자는 유도성 프로모터의 제어 하에 발현된다. 몇몇 실시예에서, 상기 엔도뉴클레아제 자살 유전자는 상기 미니세포 생산 박테리아의 염색체 상에 위치한다. 몇몇 실시예에서, 상기 엔도뉴클레아제는 귀소성 엔도뉴클레아제이다. 상기 귀소성 엔도뉴클레아제의 예로는 I-CeuI, PI-SceI, I-ChuI, I-CpaI, I-SceIII, I-CreI, I-MsoI, I-SceII, I-SceIV, I-CsmI, I-DmoI, I-PorI, PI-TliI, PI-TliII 및 PI-ScpI를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 몇몇 실시예에서, 상기 엔도뉴클레아제는 유도성 프로모터의 제어 하에 발현된다. 몇몇 실시예에서, 상기 영양 요구성은 필수 대사 유전자에서의 결실 또는 불활성화 돌연변이에 기인한다. 몇몇 실시예에서, 상기 결실 또는 불활성화 돌연변이는 dapA 유전자 또는 이의 기능적 유사체 내에 존재한다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포 생산 박테리아는 지질 다당류의 합성과 연관이 있는 유전자 산물을 암호화하는 유전자에서의 결실 또는 불활성화 돌연변이를 더 포함하되, 상기 유전자는 상응하는 야생형 유전자와 비교하여 유전적으로 변형되어 있다. 몇몇 실시예에서, 상기 불활성화된 유전자는 lpxM / msbB로서, 상기 박테리아가 상응하는 야생형 박테리아 내의 지질 A 분자와 비교하여 변경된 지질 A 분자를 생산하도록 하는 유전자 산물을 암호화한다. 몇몇 실시예에서, 상기 변경된 지질 A 분자는 상응하는 야생형 박테리아 내의 지질 A 분자와 비교하여 질 다당류 분자의 지질 A 부분에 대한 미리스트올레산의 부가에 대하여 결함이 있다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포 생산 박테리아는 상동성 재조합과 연관이 있는 유전자에서의 결실 또는 불활성화 돌연변이를 더 포함하되, 상기 유전자는 상응하는 야생형 유전자와 비교하여 유전적으로 변형되어 있으며, 여기서 상기 미니세포 생산 박테리아는 DNA 손상 복구에 결함이 있다. 몇몇 실시예에서, 상기 VAX-P 미니세포 생산 박테리아는 캄필로박터 제주니, 헤모필루스 인플루엔자에, 보르데텔라 페르투시스, 브루셀라 종, 프란시셀라 툴라레미아, 레지오넬라 뉴모필리아, 네이세리아 메닌기티디스, 클리엡셀라, 여시니아 종, 헬리코박터 파일로리, 네이세리아 고노르호애, 레지오넬라 뉴모필라, 살모넬라 종, 시겔라 종, 슈도모나스 에루지노사(P. aeruginosa) 및 대장균을 포함하지만 이에 제한되지 않는 그램 음성 박테리아이다. 몇몇 실시예에서, 상기 VAX-P 미니세포 생산 박테리아는 스태필로코쿠스 종, 락토바실러스 종, 스트렙토코쿠스 종, 바실러스 서브틸리스, 클로스트리듐 디피실레 및 바실러스 세리우스를 포함하지만 이에 제한되지 않는 그램 양성 박테리아이다.
몇몇 실시예는 VAX-IP 미니세포 생산 박테리아를 포함하며, 여기서 상기 박테리아는 (i) 격막 형성, 이분열 및 염색체 분리 중 하나 이상을 조절하는 미니세포 생산 유전자 산물을 암호화하는 발현 가능한 유전자; 및 (ii) 퍼프린골리신 O의 발현 이외에도 인바신의 기능적 발현 및 표면 표시를 가능케 하는 재조합 발현 카세트를 포함한다. 몇몇 실시예에서, 상기 박테리아는 항체, 또는 항체의 Fc 영역을 포함하는 기타 분자를 표시하지 않으며, 단백질 G 또는 단백질 A의 Fc 결합 부분을 표시하지 않는다. 몇몇 실시예에서, 상기 VAX-IP 미니세포 생산 박테리아는 (iii) 이종성 엔도뉴클레아제를 암호화하되, 상기 미니세포 생산 박테리아의 염색체는 엔도뉴클레아제의 하나 이상의 인식 부위를 포함하는 발현 가능한 "유전적 자살" 유전자; (iv) 한정된 영양 요구성; 및 (v) lpxM / msbB 유전자(또는 기타 기능적 등가물)에서의 결실 또는 돌연변이 중 하나 이상을 더 포함한다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포 생산 유전자는 세포 분열 유전자이다. 상기 세포 분열 유전자의 예로는 ftsZ, sulA, ccdB 및 sfiC를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포 생산 유전자는 유도성 프로모터의 제어 하에 발현된다. 몇몇 실시예에서, 상기 엔도뉴클레아제 자살 유전자는 미니세포 생산 박테리아의 염색체 상에 위치한다. 몇몇 실시예에서, 상기 엔도뉴클레아제는 귀소성 엔도뉴클레아제이다. 상기 귀소성 엔도뉴클레아제의 예로는 I-CeuI, PI-SceI, I-ChuI, I-CpaI, I-SceIII, I-CreI, I-MsoI, I-SceII, I-SceIV, I-CsmI, I-DmoI, I-PorI, PI-TliI, PI-TliII 및 PI-ScpI를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 몇몇 실시예에서, 상기 엔도뉴클레아제는 유도성 프로모터의 제어 하에 발현된다. 몇몇 실시예에서, 상기 영양 요구성은 필수 대사 유전자에서의 결실 또는 불활성화 돌연변이에 기인한다. 몇몇 실시예에서, 상기 결실 또는 불활성화 돌연변이는 dapA 유전자 또는 이의 기능적 유사체 내에 존재한다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포 생산 박테리아는 지질 다당류의 합성과 연관이 있는 유전자 산물을 암호화하는 유전자에서의 결실 또는 불활성화 돌연변이를 더 포함하되, 상기 유전자는 상응하는 야생형 유전자와 비교하여 유전적으로 변형되어 있다. 몇몇 실시예에서, 상기 불활성화된 유전자는 lpxM/msbB로서, 상기 박테리아가 상응하는 야생형 박테리아 내의 지질 A 분자와 비교하여 변경된 지질 A 분자를 생산하도록 하는 유전자 산물을 암호화한다. 몇몇 실시예에서, 상기 변경된 지질 A 분자는 상응하는 야생형 박테리아 내의 지질 A 분자와 비교하여 지질 다당류 분자의 지질 A 부분에 대한 미리스트올레산의 부가에 대하여 결함이 있다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포 생산 박테리아는 상동성 재조합과 연관이 있는 유전자에서의 결실 또는 불활성화 돌연변이를 더 포함하되, 상기 유전자는 상응하는 야생형 유전자와 비교하여 유전적으로 변형되어 있으며, 여기서 상기 미니세포 생산 박테리아는 DNA 손상 복구에 결함이 있다. 몇몇 실시예에서, 상기 VAX-IP 미니세포 생산 박테리아는 캄필로박터 제주니, 헤모필루스 인플루엔자에, 보르데텔라 페르투시스, 브루셀라 종, 프란시셀라 툴라레미아, 레지오넬라 뉴모필리아, 네이세리아 메닌기티디스, 클리엡셀라, 여시니아 종, 헬리코박터 파일로리, 네이세리아 고노르호애, 레지오넬라 뉴모필라, 살모넬라 종, 시겔라 종, 슈도모나스 에루지노사 및 대장균를 포함하지만 이에 제한되지 않는 그램 음성 박테리아이다. 몇몇 실시예에서, 상기 VAX-IP 미니세포 생산 박테리아는 스태필로코쿠스 종, 락토바실러스 종, 스트렙토코쿠스 종, 바실러스 서브틸리스, 클로스트리듐 디피실레 및 바실러스 세리우스를 포함하지만 이에 제한되지 않는 그램 양성 박테리아이다.
몇몇 실시예는 VAX-IPD 미니세포 생산 박테리아를 포함하며, 여기서 상기 박테리아는 (i) 격막 형성, 이분열 및 염색체 분리 중 하나 이상을 조절하는 미니세포 생산 유전자 산물을 암호화하는 발현 가능한 유전자; 및 (ii) 퍼프린골리신 O 및 디프테리아 독소의 촉매 단편(단편 A)의 발현 이외에도 인바신의 기능적 발현 및 표면 표시를 가능케 하는 재조합 발현 카세트를 포함한다. 몇몇 실시예에서, 상기 박테리아는 항체, 또는 항체의 Fc 영역을 포함하는 기타 분자를 표시하지 않으며, 단백질 G 또는 단백질 A의 Fc 결합 부분을 표시하지 않는다. 몇몇 실시예에서, 상기 VAX-IPD 미니세포 생산 박테리아는 (iii) 이종성 엔도뉴클레아제를 암호화하되, 상기 미니세포 생산 박테리아의 염색체는 엔도뉴클레아제의 하나 이상의 인식 부위를 포함하는 발현 가능한 "유전적 자살" 유전자; (iv) 한정된 영양 요구성; 및 (v) lpxM / msbB 유전자(또는 기타 기능적 등가물)에서의 결실 또는 돌연변이 중 하나 이상을 더 포함한다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포 생산 유전자는 세포 분열 유전자이다. 상기 세포 분열 유전자의 예로는 ftsZ, sulA, ccdB 및 sfiC를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포 생산 유전자는 유도성 프로모터의 제어 하에 발현된다. 몇몇 실시예에서, 상기 엔도뉴클레아제 자살 유전자는 상기 미니세포 생산 박테리아의 염색체 상에 위치한다. 몇몇 실시예에서, 상기 엔도뉴클레아제는 귀소성 엔도뉴클레아제이다. 상기 귀소성 엔도뉴클레아제의 예로는 I-CeuI, PI-SceI, I-ChuI, I-CpaI, I-SceIII, I-CreI, I-MsoI, I-SceII, I-SceIV, I-CsmI, I-DmoI, I-PorI, PI-TliI, PI-TliII 및 PI-ScpI를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 몇몇 실시예에서, 상기 엔도뉴클레아제는 유도성 프로모터의 제어 하에 발현된다. 몇몇 실시예에서, 상기 영양 요구성은 필수 대사 유전자에서의 결실 또는 불활성화 돌연변이에 기인한다. 몇몇 실시예에서, 상기 결실 또는 불활성화 돌연변이는 dapA 유전자 또는 이의 기능적 유사체 내에 존재한다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포 생산 박테리아는 지질 다당류의 합성과 연관이 있는 유전자 산물을 암호화하는 유전자에서의 결실 또는 불활성화 돌연변이를 더 포함하되, 상기 유전자는 상응하는 야생형 유전자와 비교하여 유전적으로 변형되어 있다. 몇몇 실시예에서, 상기 불활성화된 유전자는 lpxM / msbB로서, 상기 박테리아가 상응하는 야생형 박테리아 내의 지질 A 분자와 비교하여 변경된 지질 A 분자를 생산하도록 하는 유전자 산물을 암호화한다. 몇몇 실시예에서, 상기 변경된 지질 A 분자는 상응하는 야생형 박테리아 내의 지질 A 분자와 비교하여 지질 다당류 분자의 지질 A 부분에 대한 미리스트올레산의 부가에 대하여 결함이 있다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포 생산 박테리아는 상동성 재조합과 연관이 있는 유전자에서의 결실 또는 불활성화 돌연변이를 더 포함하되, 상기 유전자는 상응하는 야생형 유전자와 비교하여 유전적으로 변형되어 있으며, 여기서 상기 미니세포 생산 박테리아는 DNA 손상 복구에 결함이 있다. 몇몇 실시예에서, 상기 VAX-IPD 미니세포 생산 박테리아는 캄필로박터 제주니, 헤모필루스 인플루엔자에, 보르데텔라 페르투시스, 브루셀라 종, 프란시셀라 툴라레미아, 레지오넬라 뉴모필리아, 네이세리아 메닌기티디스, 클리엡셀라, 여시니아 종, 헬리코박터 파일로리, 네이세리아 고노르호애, 레지오넬라 뉴모필라, 살모넬라 종, 시겔라 종, 슈도모나스 에루지노사 및 대장균을 포함하지만 이에 제한되지 않는 그램 음성 박테리아이다. 몇몇 실시예에서, 상기 VAX-IPD 미니세포 생산 박테리아는 스태필로코쿠스 종, 락토바실러스 종, 스트렙토코쿠스 종, 바실러스 서브틸리스, 클로스트리듐 디피실레 및 바실러스 세리우스를 포함하지만 이에 제한되지 않는 그램 양성 박테리아이다.
미니세포는 면역 조절성 폴리펩티드(예를 들어, 사이토카인, 단백질 독소 및 세포 용해소) 및 핵산(예를 들어, 이중 가닥 RNA, 헤어핀 RNA, 및 이중 가닥 선형 DNA)의 적재(loading)에 대하여 명확한 기작 및 이점을 갖는다. 예를 들어, 면역 조절성 미니세포 생산 박테리아 모세포는 미니세포가 생산되기 전 또는 이들의 생산과 동시에 하나 이상의 사이토카인, 단백질 독소 및 세포 용해소를 재조합에 의해 발현/생산하기 위해 사용될 수 있다. 재조합 폴리펩티드는 미니세포에 의해 발현되고, 미니세포 내로 분리되며, 미니세포에 의해 캡슐화된 후, 생체 내에서 면역 조절성 미니세포에 의해 유도된 h1 또는 Th2 면역 반응을 증강, 조절 및/또는 안정화시키기 위해 이용된다. 퍼프린골리신 O 및 인바신을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는 다양한 면역 조절성 미니세포 단백질 성분들의 재조합 생산은 당업자에게 공지된 재조합 발현 방법들의 임의의 조합에 의해 조장될 수 있다. 비제한적인 예로서, 재조합 발현은 인바신과 같은 특정한 단백질 성분을 코딩하는, 염색체 상에 위치하고 작동 가능하게 연결된 개방 판독 프레임으로부터 조장될 수 있다. 면역 조절성 미니세포의 단백질 성분들의 재조합 발현은 플라스미드, 코스미드, 파지미드 및 박테리아성 인공 염색체(BAC)와 같은 하나 이상의 에피솜성 원핵성 발현 구조체의 사용에 의해 조장될 수 있다. 최종 면역 조절성 미니세포 생성물의 개개의 목적하는 단백질 성분들을 코딩하는 작동 가능하게 연결된 원핵성 개방 판독 프레임은 동일한 에피솜성 발현 구조체 상에 존재할 수 있거나, 독립된 별개의 에피솜성 발현 구조체 상에 존재할 수 있다. 상기 목적하는 단백질 성분들의 생산은 유도성 원핵성 프로모터의 제어를 받을 수 있거나, 대안적으로는 구성적으로 활성인 원핵성 프로모터 시스템의 제어를 받을 수 있다. 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 상기 원핵성 프로모터 시스템이 본 발명에서 사용이 가능함을 용이하게 인지할 것이다. 프로모터 시스템의 예로는 IPTG 유도성 Lac 시스템 및 이의 다수의 유도체, L-람노오스 유도성 pRHA 시스템, L-아라비노오스 유도성 pBAD 시스템, T7 폴리메라아제 시스템, CI857ts 시스템 등을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. VAX-IP 미니세포 생산 균주, 및 이로부터의 VAX-IP 미니세포를 생산하는 하나의 비제한적인 실시예는 실시예 6 및 도 8에 예시되어 있다.
폴리펩티드(들)가 원핵성 발현 카세트(염색체 또는 에피솜 상의 위치)로부터의 재조합 발현을 통해 모세포에 의해 미리 형성된 후, 면역 강화제로서 미니세포의 내부에 패키징(packaging)되는 경우, 상기 미니세포 내의 폴리펩티드(들)의 반감기는 단백질 분해에 책임이 있는 프로테아제 유전자(예를 들어, 대장균의 lon 프로테아제)에서의 하나 이상의 결실 또는 기타 비기능적 돌연변이를 함유하고 있는 면역 조절성 미니세포 생산 박테리아 균주의 사용에 의해 증가될 수 있다. 상기 프로테아제(들)의 부재 시, 상기 단백질 독소 분자는 보다 높은 수준까지 축적되어, 치료용 폴리펩티드 분자를 전달하는 표적화된 미니세포의 효능을 증가시킨다. 대장균 미니세포 생산 균주의 경우, 돌연변이 또는 결실은 lon, tonB, abgA, ampA, ampM, pepP, clpP, dcp, ddpX/vanX, elaD, frvX, gcp /b3064, hslV, hchA/b1967, hyaD, hybD, hycH, hycI, iadA, ldcA, ycbZ, pepD, pepE, pepQ, pepT, pmbA, pqqL, prlC, ptrB, sgcX, sprT, tldD, ycaL, yeaZ, yegQ, ygeY, yggG, yhbO, yibG, ydpF, degS, ftsH/hflB, glpG, hofD / hopD, lepB, lspA, pppA, sohB, spa, yaeL, yfbL, dacA, dacB, dacC, degP/htrA, degQ, iap, mepA, nlpC, pbpG, tsp, ptrA, teas, umuD, ydcP, ydgD, ydhO, yebA, yhbU, yhjJ 및 nlpD 유전자들 중 하나 이상의 유전자 내로 도입될 수 있다.
면역 조절성 핵산(들)이 원핵성 발현 카세트(염색체 또는 에피솜 상의 위치)로부터의 재조합 발현을 통해 모세포에 의해 미리 형성된 후, 면역 강화제로서 미니세포의 내부에 패키징되는 경우, 상기 미니세포 내의 핵산(들)의 반감기는 이중 가닥 RNA의 분해에 책임이 있는 뉴클레아제 유전자(예를 들어, 대장균의 rnc 뉴클레아제)에서의 하나 이상의 결실 또는 기타 비기능적 돌연변이를 함유하고 있는 면역 조절성 미니세포 생산 박테리아 균주의 사용에 의해 증가된다. 상기 뉴클레아제(들)의 부재 시, 면역 조절성 핵산 분자는 보다 높은 수준까지 축적되어, 상기 면역 조절성 핵산 분자를 함유하고 있는 면역 조절성 미니세포의 효능을 증가시킨다.
면역 조절성 미니세포가 인간에서 면역 치료제로서 사용되기 위해서는, 상기 미니세포는 생존 가능한 박테리아 모세포와 같은 어떠한 오염 물질도 함유해서는 안 된다. 생존 가능한 오염 세포 및 기타 오염 물질의 수준은 환자에서 유해한 부작용을 야기하지 않거나 미니세포 활성을 간섭하지 않도록 충분히 낮아야 한다. 유전적 자살 기작으로서 지칭되는 귀소성 엔도뉴클레아제 유전자의 유도성 발현은, 특히 통상적인 여과 방법과 함께 사용되는 경우에 살아있는 오염 모세포를 제거하기 위한 바람직한 기작이다. 미니세포가 병원성이거나 기회주의적으로 병원성인 몇몇 박테리아로부터 유래하기 때문에 오염 모세포는 전신적 투여, 및 특히 정맥 내 투여 이전에 소정의 개체군으로부터 기능적으로 제거되는 것이 바람직하다. TURBT 수술을 받았던 비근육 침습성 방광암 환자, 특히 방광에 천공이 발생했거나 의심되는 비근육 침습성 방광암 환자에 대한 방광 내 투여에 대해서도 또한 사실이다. 그 결과, 상기 목적하는 미니세포 제형은 살아있는 잔류 모세포수가 유해한 부작용을 야기하지 않거나 의도된 미니세포 활성을 간섭하지 않기 위해 가능한 한 낮아야 하는 제형일 수 있다. 임의의 오염 모세포의 생존성으로 인해 안정성을 최대화하고 독성을 제한하기 위해, 본원에 개시된 미니세포는 안전성 특성, 예를 들어 하기에 개시된 3개의 안전성 특성 중 하나를 포함하는 미니세포 생산 균주로부터 유래한다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포 생산 균주는 적어도 이들 3개의 상승적 안전성 특성을 포함한다. 제1 안전 특성은 미니세포 형성 단계가 완료된 이후에 이들을 용해시키지 않으면서 살아있는 잔류 모세포를 살해하는 유전적 자살 기작이다. 본 발명에는 미국 특허 공개공보 제2010/0112670호에 개시된 바와 같이 적절한 유도제에 대한 노출 시에 미니세포 생산 모세포의 염색체에 대해 심각한 손상을 도입하는 제어된 유전적 자살 기작의 사용이 혼입된다. 상기 자살 기작은 모세포의 염색체에 심각한 이중 가단 절단을 도입하도록 작동하며, 미니세포의 정제를 개선하기 위한 통상적인 분리 기법에 대한 부가물로서 사용될 수 있다. 제2 안전성 특성은 한정된 영양 요구성으로, 디아미노피멜산(DAP) 생합성 경로에서 바람직하지만 필수적인지는 않으며, 대장균 미니세포 생산균주의 dapA 유전자에서 가장 바람직하다. DAP 영양 요구성(dapA-)을 나타내는 대장균의 미니세포 생산 균주는 DAP의 보충 없이는 실험실 밖에서는 생존할 수 없다. 추가로, DAP는 인간을 포함한 포유동물에서는 발견되지 않으며, 그로 인해 상기 미니세포 생성물에 존재하는 임의의 미니세포 생산 모세포는 상기 환경 또는 생체 내에서 생존할 수 없을 것이다. 이러한 주제에 대한 많은 변화는 상이한 그램 음성 및 그램 양성 박테리아에 대해 존재한다. 예를 들어, 살모넬라 종에서 방향족 아미노산 생합성 경로(aro 유전자)에서의 영양 요구성은 사실상 동일한 결과를 산출한다. 시겔라 종의 경우, 구아닌 생합성 경로에서의 영양 요구성은 사실상 동일한 결과를 산출할 것이다. 제3 안전성 특성은 선택적이며, 대장균 미니세포 생산 균주에서의 lpxM 유전자의 결실을 수반한다. 상기 lpxM 유전자의 결실은 해독된 지질 다당류(LPS) 분자의 생산을 초래할 수 있다. 상기 lpxM 유전자(msbB 유전자로도 지칭됨)는 LPS 분자의 지질 A 부분에 미리스트올레산 말단기를 부가하도록 작용하며, 이러한 기의 제거(pxM 유전자의 제거를 통한 제거)는 뚜렷한 LPS의 해독을 초래한다. 구체적으로, 해독은 LPS에 대한 노출에 반응하여 전염증성 사이토카인 생산의 감소로 특징지어 진다. 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 사이토카인이 여전히 LPS의 해독된 형태를 이용하고 있다는 것을 인지할 것이다. 상기 해독은 생성된 사이토카인의 수준만을 제어하여, 더욱 강력한 Th1 및/또는 Th2 면역 반응이 명시적인 독성 없이 달성되도록 하면서 상기 급성 패혈증 유사 전염증성 반응을 약화시키는 것을 가능하게 한다. 이러한 결실은 동일한 효과를 달성하기 위해 임의의 그램 음성 또는 그램 양성 미니세포 생산 균주의 임의의 기능적 등가 유전자 내로 도입될 수 있다. 상기 증강된 안전성 프로파일은 감염 위험성, 및 패혈증을 일으키는 잠재성을 감소시킬 수 있고, 기타 박테리아에 의한 재조합 사건을 통한 유전적 복귀의 가능성을 줄일 수 있으며, 숙주에서의 삽입 사건의 위험성을 최소화할 수 있다. 조절 및 제조의 견지에서, 상기 미니세포 생산 모세포 균주의 박테리아 염색체로부터 항생제 내성 마커를 제거하는 것이 또한 바람직하다. 인간에 사용하기 위해 미국 식품 의약국(FDA)에 의해 도입된 규제 요건을 준수하기 위해서는 박테리아의 미니세포 생산 균주 내의 대부분의 항생제 내성 유전자 마커의 사용이 바람직하지 않다. FDA는 박테리아 또는 박테리아성 생산 균주에 대한 선택 목적을 위해 카나마이신 내성 유전자 마커의 사용만을 용인할 것이며, 여기서 최종 산물은 인간에 사용하도록 의도된다.
몇몇 실시예는 면역 조절성 미니세포를 제조하는 방법을 제공하되, 상기 방법은 본원에 개시된 적절한 면역 조절성 미니세포 생산 박테리아를 배양하는 단계, 및 미니세포 생산 모세포로부터 면역 조절성 미니세포를 실질적으로 분리하고, 그 결과 면역 치료용 미니세포를 포함하는 조성물을 생성하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시예에서, 상기 방법은 미니세포 생산 모세포의 배양균으로부터 면역 조절성 미니세포의 형성을 감소시키는 단계를 더 포함한다. 몇몇 실시예에서, 상기 방법은 유전적 자살 엔도뉴클레아제를 암호화하는 유전자의 발현을 유도하는 단계를 더 포함한다. 몇몇 실시예에서, 미니세포의 형성은 이소프로필 β-D-l- 티오갈락토피라노사이드(IPTG), 람노오스, 아라비노오스, 자일로오스, 프룩토오스, 멜리비오스 및 테트라사이클린으로부터 선택된 하나 이상의 화학적인 화합물의 존재에 의해 유도된다. 몇몇 실시예에서, 상기 유전적 자살 엔도뉴클레아제를 암호화하는 유전자의 발현은 온도의 변화에 의해 유도된다. 몇몇 실시예에서, 상기 방법은 상기 조성물로부터 면역 조절성 미니세포를 정제하는 단계를 더 포함한다. 몇몇 실시예에서, 상기 면역 조절성 미니세포는 원심분리, 여과, 한외여과, 초원심분리, 밀도 구배, 면역 친화도, 면역 침전, 및 상기 정제 방법들의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택되지만 이에 제한되지 않는 과정에 의해 모세포로부터 실질적으로 분리된다.
몇몇 실시예는 외막을 포함하는 진정세균 미니세포를 제공하며, 이때 상기 외막의 지질 다당류 구성성분은 어떠한 미리스트올레산 모이어티("해독된 지질 다당류" 또는 "해독된 LPS")도 갖지 않는 지질 A 분자를 포함한다. 해독된 LPS는 상응하는 야생형 박테리아로부터 유래한 진정세균 미니세포의 외막에 의해 유도된 염증 반응과 비교하여 포유류 숙주에서의 전염증성 면역 반응의 감소를 초래한다.
본 발명에는 임의의 직접적인 항종양 효과 이외에도 상기 면역 반응에 의해 전적으로 또는 부분적으로 매개되는 강력하고 간접적인 항종양 효과를 갖는 방식으로 면역 시스템을 자극할 목적으로 면역 조절성 진정세균 미니세포의 신규한 용도가 개시되어 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 면역 조절성 미니세포는 비근육 침습성 방광암을 위한 방광 내 요법으로서 사용될 수 있다.
1. 미니세포 생산
미니세포는 정상적인 세포 분열 장치에서의 붕괴 이후에 박테리아에 의해 형성되는 비염색체성의 피막된 생물학적 나노입자(사용된 균주 유형 및 성장 조선에 따라 직경이 약 250 내지 500㎚임)이다. 본질적으로, 미니세포는 정상적인 박테리아 세포의 소형의 대사적으로 활성인 복제품이며, 예외적으로 이들은 염색체 DNA를 함유하지 않으며, 그로 인해 비분열성이며, 생존 불가능하다. 비록 미니세포가 염색체 DNA를 함유하지 않을지라도, 플라스미드 DNA, RNA, 천연 단백질 및/또는 재조합에 의해 발현된 단백질 및 기타 대사산물들 모두는 미니세포 내로 분리되는 것으로 나타났다.
염색체 복제와 세포 분열 사이의 협동에서의 붕괴는 대부분의 막대 형상 원핵생물의 극성 영역으로부터 미니세포의 형성을 초래한다. 염색체 복제와 세포 분열 사이의 협도에서의 붕괴는 격막 형성 및 이분열과 연관이 있는 유전자들 중 일부의 과발현을 통해 조장될 수 있다. 대안적으로는, 미니세포는 격막 형성 및 이분열과 연관이 있는 유전자에서의 돌연변이를 함유하고 있는 균주에서 생산될 수 있다. 염색체 분리 기작의 불능은 또한 많은 상이한 원핵생물에서 나타낸 바와 같이 미니세포의 형성을 초래할 수 있다.
유사하게도, 미니세포의 생산은 딸세포 내로의 발생 초기 염색체의 분리와 관련이 있는 유전자들의 과발현 또는 돌연변이에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 대장균의 parC 또는 mukB 유전자위에서의 돌연변이는 미니세포를 생산하는 것으로 증명되었다. 둘 모두는 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae)에서 염색체 분리 과정의 별개의 필수 단계에 영향을 미친다. 상술한 세포 분열 유전자와 같이, 미니세포의 생산을 초래하는 염색체 분리 과정과 연관이 있는 임의의 소정의 유전자의 야생형 수준의 조작은 기타 패밀리 멤버에서 유사한 효과를 가질 것으로 추정될 수 있다.
상기 세포 분열 및 염색체 복제 과정이 생존에 매우 결정적이기 때문에, 이들 과정에 책임이 있는 유전자에 대하여 원핵생물 패밀리 멤버들 중에 유전적 및 기능적 보존 수준이 높게 존재하다. 그 결과 하나의 패밀리 멤버에서 미니세포의 생산을 추진할 수 있는 세포 분열 유전자의 과발현 또는 돌연변이는 다른 패밀리 멤버에서 미니세포를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 슈도모나스 종과 같은 기타 클래스 멤버뿐만 아니라 살모넬라 종 및 시겔라 종과 같은 기타 엔테로박테리아세아에 패밀리 멤버에서 장균 ftsZ 유전자의 과발현은 유사한 수준의 미니세포의 생산을 초래할 것으로 나타나 있다.
상기 엔테로박테리아세아에 패밀리의 돌연변이 기반 미니세포 생산 균주에서 동일한 것이 증명될 수 있다. 예를 들어, 임의의 엔테로박테리아세아에 패밀리 멤버에서의 min 유전자위의 결실은 미니세포의 생산을 초래한다. 돌연변이가 미니세포의 형성을 초래하는 엔테로박테리아세아에로부터의 세포 분열 유전자로는 min 유전자(MinCDE)를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 상기 min 돌연변이 균주로부터의 미니세포의 생산이 가능할지라도, 이들 균주는 생산 균주라는 측면에서는 제한된 상업적 가치를 갖는다. 이에 대한 이유는, 상기 min 유전자 내에서 결실 또는 돌연변이를 갖는 균주가 구성적으로 낮은 수준으로 미니세포를 만든다는 것이다. 이는 상용화 및 규모의 경제(economy of scale)의 측면에서 2가지의 문제점을 제시한다. 첫 번째 문제점은, 이들 균주로부터의 미니세포의 수율이 낮으며, 이는 생산 비용을 증가시킨다는 것이다. 두 번째 문제점은, 미니세포의 수율이 돌연변이 균주에 따라 매우 가변적이고, 로트간 변이성(lot-to-lot variability)이 생산 비용, 제조 품질 관리 및 규제 순응(regulatory compliance)에 엄청나게 영향을 미친다는 것이다.
단백질과 같은 생물학적 활성 분자를 캡슐화하는 미니세포를 생산하는 세포 분열 돌연변이 균주를 이용함으로써 RNA, DNA, 및 진단 또는 치료용 전단을 위한 기타 이화산물(catabolite)들은 문제가 있다. 돌연변이 균주에서의 미니세포 생산의 개시는 제어될 수 없으며, 최종 결과가 몇몇 미니세포가 생물학적 활성 분자를 함유함지 않는 반면, 다른 미니세포가 매우 광범위하게 변경 가능한 양의 생물학적 활성 분자를 함유할 것이라는 것이 되도록 낮은 수준으로 이루어진다. 함께 종합하거나 별개로 다루는 경우에 이들 단점은 상업적 목적을 위해 이들 돌연변이 균주의 유용성을 매우 제한한다.
세포 분열 유전자를 과발현하는 미니세포 생산 균주("과발현 균주")는, 과발현될 세포 분열 유전자가 유도성이거나 기타 구성적으로 활성인 진정세균성 프로모터 시스템의 제어를 받는 한 미니세포 생산 표현형이 제어 가능하기 때문에 돌연변이 기반 균주에 대해 선호된다. 세포 분열 유전자 ftsZ를 과발현하는 균주로부터의 미니세포의 생산은 플라스미드 기반 상보성 연구를 이용하여 대장균에서 필수 세포 분열 유전자를 확인하던 연구자들에 의해 발견되었다. 이들 연구에서, 상기 ftsZ 유전자는 세포 당 10개 이상의 복제수로 존재하였다. ftsZ의 다중 유전자 복제수의 존재는 미니세포 및 매우 긴 필라멘트형 세포를 생산하기 위해 증명되었다. 궁극적으로, 비가역적인 섬유상 표현형으로의 이러한 전이는 비록 생산된 미니세포의 개수가 임의의 돌연변이 균주보다 여전히 높을지라도 다중 복사 플라스미드로부터 ftsZ를 과발현하는 균주로부터의 미니세포의 수율에 악영향을 미친다. 그 이후로, ftsZ 유전자의 복제수를 단일의 염색체 중복으로 감소시킴으로써 상기 생산된 미니세포의 개수는 ftsZ가 다중 복사 플라스미드 상에 위치하는 이들 균주보다 증가하였으며, 섬유상 표현형이 덜 극심한 것으로 증명되었다. 따라서 바람직한 조성물(들)은 ftsZ의 염색체 상에 통합된 복사본으로부터 ftsZ 유전자를 유도성으로 과발현하는 미니세포 생산 균주이다. 상기 사용된 복사본의 ftsZ 유전자는 상기 미니세포 생산 표현형이 조작되어 있는 박테리아의 종으로부터 직접 유래할 수 있으며, 또한 기타 박테리아 종으로부터의 ftsZ 유전자 서열로부터 유래할 수 있다. 비제한적인 예로서, 대장균의 ftsZ 유전자의 과발현은 대장균 및 살모넬라 티피뮤리움으로부터 미니세포를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 얻어진 균주는 야생형 ftsZ 유전자 및 염색체 상의 ftsZ 유전자의 별개의 중복 및 유도성 복제수, 및 본원에서 그 전체가 참고로 인용된 미국 특허 공개공보 제2010/0112670호에 개시된 유도성 유전적 자살 기작(들)으로 구성되어 있다. 비제한적인 예로서, 엔테로박테리아세아에 패밀리에서 미니세포를 생상하기 위해 과발현될 수 있는 세포 분열 유전자로는 ftsZ, minE, sulA, ccdB 및 sfiC를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 상기 바람직한 조성물은 소정의 진정세균성 균주의 염색체 내로 안정하게 통합되어 있는 유도성 프로모터의 제어 하에 있는 세포 분열 유전자(들) 복사본(들)을 갖는 것이다. 유도성 세포 분열 유전자 카세트가 세포 내에 존재하는 플라스미드, 코스미드, 박테리아성 인공 염색체(BAC), 재조합 박테리오파지 또는 기타 에피솜성 DNA 분자 상에 존재하는 경우에 이러한 동일한 전략을 제공할 수 있다는 것이 당해 기술분야의 기술자에 의해 용이하게 인지된다.
미니세포의 생산에 대한 이러한 유도성 표현형 접근법은 돌연변이 시스템에 대한 몇몇 명백한 이점을 갖는다. 첫 번째 이점은 이들 균주 내에는 구성적이고 유전적인 돌연변이가 존재하지 않기 때문에 정상적인 성장 도중에는 어떠한 선택적 압력도 존재하지 않으며, 상기 미니세포 표현형이 유도될 때까지 배양 세포는 매우 안정하고 정상적인 생리현상을 유지한다는 것이다. 최종 결과는 유도성 미니세포 생산 균주가 더욱 건강하고, 더욱 안정하다는 것이며, 이는 궁극적으로 더욱 높은 수율의 미니세포를 초래한다. 상기 미니세포의 생산에 대한 유도성 표현형 접근법을 이용하는 다른 명백한 이점은 미니세포가 단백질, 치료용 RNA, 플라스미드 DNA, 및 생산되는 미니세포가 이들 생물학적 활성 분자를 캡슐화하도록 미니세포 생산 모세포에 의해 생성될 수 있는 기타 생물활성 이화산물과 같은 생물학적 활성 분자를 전달하기 위해 사용되어야하는 경우이다. 이들 경우, 상기 바람직한 방법은 상기 생산된 미니세포 모두가 목적하는 양의 생물학적 활성 분자(들)를 함유할 수 있도록 상기 미니세포 표현형을 유도하기 이전에 모세포 내에서의 생물학적 활성 분자(들)의 형성을 유도하는 것이다. 대안적으로는, 상기 미니세포 자체는 상기 모세포로부터 분리된 이후에 생물활성 분자를 생산할 수 있다. 이는 상기 미니세포 내에 위치하는 생물활성 분자를 암호화하는 에피솜성 핵산 또는 RNA로부터 생물활성 분자를 형성하는 단계, 또는 상기 모세포로부터 분리된 이후에 미니세포의 기존의 단백질 구성성분에 의해 생물활성 분자를 형성하는 단계를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 임의의 이들 발현 전략은 미니세포의 표면 상에 결합 모이어티를 발현하고 표시하기 위해 이용될 수 있다. 이들 전략은 함께 사용되는 경우에 보다 높은 품질 및 양의 미니세포를 초래한다. 부가적으로, 이들 미니세포는 하기에 상세하게 개시된 바와 같이 미니세포 내로 적재될 수 있는 소분자 약물을 더 포함할 수 있다.
2. 미니세포의 정제
미니세포가 병원성이거나 기회주의적으로 병원성인 몇몇 박테리아로부터 유래하기 때문에, 임의의 오염 모세포가 투여 이후에 조성의 개체군으로부터 기능적으로 제거되는 것이 매우 중요하다. 통상적으로, 살아있는 모세포는 물리적 수단 또는 생물학적 수단, 또는 둘 모두를 통해 제거되었다.
물리적인 수단은 원심분리 기반 분리 과정, 여과 방법론, 크로마토그래피 방법론 또는 이들 임의의 조합의 이용을 포함한다.
생물학적 제거는 모세포의 우선적인 용해, 영양 요구성 모균주의 사용, 항생제 처리, 자외선 처리, 디아미노피멜산(DAP) 박탈, 모세포의 선택적 흡수, 기타 DNA 손상제의 처리, 및 자살 유전자의 유도에 의해 달성되지만, 이에 제한되지 않는다.
모세포의 우선적인 용해는 전형적으로 용원성 프로파지(prophage)의 용해 주기를 유도함으로써 매개된다. 미니세포 생산 균주의 경우, 미니세포가 용해성 표현형의 활성화 도중에 후속적으로 감염되어 용해되지 않도록 용해능을 갖지만 재감염에 결함이 있는 프로파지를 사용하는 것이 가장 유용하다. 대안적이고 비제한적인 예로서, 홀인(holin) 유전자 패밀리의 멤버로서 분류된 유전자와 같은 개개의 유전자는 용원성 프로파지의 사용에 고유한 재감염에 대한 우려 없이 유사한 수준의 용해를 달성하기 위해 발현될 수 있다. 상기 접근법 둘 모두는 이를 달성하기 위해 사용된 방법과는 무관하게 용해 사건이 예상치 못한 양이 유리 내독소를 매질로 방출한다는 사실에 의해 제한된다. 이 같이 많은 양의 유리 내독소의 제거는 시간 소모적이며, 로트간 변이성으로 어려움에 처하게 되며, 궁극적으로 막대한 비용이 든다.
영양 요구성 균주의 사용은 복귀에 대한 관심을 불러일으키며, 그로 인해 미니세포가 공생 또는 비병원성 박테리아 균주로부터 생산되어야 하는 경우에만 사용될 수 있다. 따라서 이들 적용은 미니세포의 생산에 사용되는 살아있는 비병원성 모세포의 제거 방법으로서 사용된다는 측면에서 제한된다.
자외선 처리는 자외선 조사가 핵산에 대한 이의 효과에 대해 무작위적이며, 결과가 로트 간 매우 변이성이라는 사실을 제외한 상태에서 이루어진 미니세포의 생산 시에 살아있는 모세포의 제거에 유용할 수 있다. 부가적으로, 이러한 방법은 자외선 조사가 모든 핵산을 무작위로 손상시킴에 따라 치료 또는 예방용 핵산을 전달하기 위해 미니세포를 사용하는 경우에는 바람직하지 않다. 예를 들어, 플라스미드 DNA는 또한 자외선 조사에 의한 DNA 손상에 매우 민감할 수 있으며, 미니세포에 의해 여전히 효과적으로 전달될지라도 비효율적으로 될 수 있다.
디아미노피멜산(DAP) 박탈은 이러한 접근법이 이를 위해 사용될 수 있는 종의 개수에 의해 제한된다는 것을 제외하고는 살아있는 모세포의 제거에 유용할 수 있다. 반면, 미니세포를 생산할 수 있는 모든 모세포 종이 생존을 위해 DAP를 필요로 하는 것은 아니다. 대장균 미니세포 생산 균주 중 DAP 돌연변이체는 커다란 이점이 있으며, 몇몇의 경우에 야생형보다 선호된다. DAP를 이용하는 이점은 이러한 화합물(대장균 세포벽 구성성분인 디아미노피멜산)이 대장균의 성장에 중요하며, 동물에 존재하지 않으며, 이에 의해 생산되지 않는다. 따라서 "생존 가능한" 대장균 미니세포 생산 모세포가 표적화된 미니세포와 함께 투여되어야 하는 경우, 상기 모세포는 성장할 수 없을 것이고, 따라서 동물에 있어서 불활성이고, 또한 미니세포 활성에 대해 불활성일 것이다. 유사한 접근법은, 이 같은 경우에 aro 유전자, 바람직하게는 aroB가 제거된다는 것 이외에, 살모넬라 종 기반미니세포 생산 모균주와 함께 사용될 수 있다.
선택적 흡수 방법론은 생존 가능한 모세포로부터 미니세포를 정제한다는 측면에서 여전히 탐구되어야 한다. 선택적 흡수는 모세포 또는 미니세포가 기질에 대한 이들의 친화도로 인해 우선적으로 기질에 흡수되는 임의의 과정으로서 한정된다. 비제한적인 예로, 높은 친화도의 단백질-단백질 상호작용은 이러한 사용을 위해 활용될 수 있다. 비제한적인 예로, 신규한 미니세포 외막 단백질 Lpp-OmpA::단백질 A는 대부분의 항체의 Fc 영역에 대해 높은 친화도를 갖는다. Lpp-OmpA::단백질 A를 암호화하는 유전자는 유도성 프로모터의 제어 하에 있으며, 면역 조절성 미니세포 생산 균주의 염색체 상에 용이하게 도입될 수 있다. 면역 조절성 미니세포는 상기 생산된 미니세포가 이들의 세포 표면 상에 Lpp-OmpA::단백질 A를 발현하거나 표시하지 못하도록 인바신 유전자의 발현의 활성화 이전에 이러한 균주로부터 생산될 수 있다. 일단 목적하는 양의 면역 조절성 미니세포가 상기 균주로부터 생산되며, Lpp-OmpA::단백질 A만이 발현되어 생존 가능한 세포 상에 표시되도록 Lpp-OmpA::단백질 A 단백질을 생산하는 위해 배양액 내의 생존 가능한 세포에는 신호가 제공될 수 있다. 일단 Lpp-OmpA::단백질 A가 우선적으로 생존 가능한 모세포의 표면 상에 발현되면, 이들은 항체 또는 기타 Fc-영역 함유 단백질로 코팅된 기질에 용이하게 흡수될 수 있다. 일단 흡수되면, 미니세포는 사용된 기질 유형에 의존하는 다수의 상이한 수단에 의해 생존 가능한 모세포로부터 선택적으로 정제될 수 있다. 기질로는 중력식 여과 용도로 사용된 고상 크로마토그래피 칼럼, 자성 비드, 이온 교환 칼럼 또는 HPLC 칼럼을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
몇몇 실시예에서, 미니세포는 미니세포를 포함하는 조성물 중의 미니세포 생산 모세포로부터 실질적으로 분리된다. 예를 들어, 분리 이후에 상기 미니세포를 포함하는 조성물에는 약 99.9%, 99.5%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35% 또는 30% 이상 미니세포 생산 모세포가 존재하지 않는다. 몇몇 실시예에서, 상기 조성물은 약 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29% 또는 30% 미만의 미니세포 생산 모세포를 함유한다.
바람직하게는, 상기 최종 조성물은 치료 목적으로 생체 내에 투여되는 경우에 지나치게 독성을 나타내지 않거나 표적화된 미니세포의 활성을 간섭하지 않도록 생존 가능하거나 또는 그렇지 않을지라도 충분한 오염 모세포를 함유하지 않는다.
생존 가능한 오염 박테리아 모세포를 충분히 제거하거나 생체 내에서 이들의 생존을 방지하는 바람직한 방법은, 미국 특허 공개공보 제2010/0112670호에 개시된 바와 같은 귀소성 엔도뉴클레아제 또는 이의 기능적 등가물의 활성화 및 발현을 포함하지만 이에 제한되지 않는 유도성 유전적 자살 기작의 혼입을 통해 수행된다.
3. 특정 세포, 조직 및 기관에 대한 미니세포의 표적화
생산 및 후속적인 정제 이후, VAX-IP, VAX-IPT, VAX-IPP, VAX-IPD, VAX-IPG, VAX-IPPA 및 VAX-IPR 미니세포는 표적화된 조직, 조직 및 세포 유형으로 이들의 단백질 독소 적재물을 우선적이고 더욱 효율적으로 전달하기 위해 표적화 특정 세포 유형에 대한 표적화된 전달 비히클로서 사용될 수 있으며, 여기서 상기 표적화된 전달 비히클은 β1-인테그린의 발현 및/또는 활성이 증가되어 있으며, 생체 내에서 질병과 연관이 있다. 본원에 개시된 표적화된 VAX-IP, VAX-IPT, VAX-IPP, VAX-IPD, VAX-IPG, VAX-IPPA 및 VAX-IPR 미니세포는 인테그린 α3β1, 인테그린 α4β1, 인테그린 α5β1, 인테그린 α6β1, 인테그린 αvβ1, 및 인테그린 β1을 포함하지만 이에 제한되지 않는 진핵 세포성 암세포 특이적 표면 항원에 표적화될 수 있다. 하기에서 더욱 상세하게 개시된 바와 같이, 이들 β1 인테그린 패밀리 멤버의 발현 및/또는 활성 수준은 정상 조직 및 맥관 구조 내의 낮은 수준의 불활성화 및/또는 리간드-점유된 β1 인테그린과 비교하여 종양 맥관 구조에서뿐만 아니라 많은 고형 종양 유형에서도 발견되고 있다.
4. 미니세포 내로의 적재물의 적재
진정세균 미니세포는 동물에 대해 치료, 예방 또는 진단 이점을 갖는 생물학적 활성 화합물의 몇몇 부류를 캡슐화하고 전달할 수 있다. 미니세포에 의해 전달될 수 있는 생물학적 활성 화합물(적재물)의 유형으로는 소분자(소분자 약물을 포함함), 핵산, 폴리펩티드, 방사성 동위원소, 지질, 지질 다당류 및 이들의 임의의 조합을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
단백질은 폴리펩티드로 구성되어 있으며, DNA에 의해 암호화되어 있다. 단백질은 효소, 독소 또는 신호 전달 단백질과 같이 생물학적으로 기능성일 수 있다. 단백질은 구조상일 수 있으며, 그로 인해 그 사례가 액틴 등이다. 단백질은 항체 및 항체 모방체와 같이 기타 단백질에 견고하게 결합할 수 있으며, 단백질/단백질 상호작용을 필요로 하는 기능을 방해하기 위해 사용될 수 있다. 단백질은 형광성 또는 생물 발광성이 됨으로써 국소화 신호를 제공할 수 있다. 단백질은 면역원으로서 작용할 수 있거나, 기타 치료 목적(예를 들어, 표적 세포, 조직, 조직 또는 동물에서 효소를 제공하거나 복원함)으로 작용한다. 단백질은 기타 적재물 유형의 내포작용 후 세포 내 전달에 도움이 될 수 있다. 예를 들어, 리스테리아 모노사이토제네스로부터의 리스테리올리신 O와 같은 단백질은 내포작용성 구획(들)로부터 표적 세포의 사이토졸로의 상기 미니세포 적재물(들)의 전달을 조장하기 위해 이용될 수 있다. 단백질은 또한 프로드러그 전환 효소(pro-drug converting enzyme)일 수 있다. 재조합에 의해 발현/생산된 하나의 비제한적인 바람직한 단백질 독소는 퍼프린골리신 O이다. 표적화된 미니세포에 의해 전달될 기타 재조합에 의해 발현/생산된 치료용 폴리펩티드로는 단백질 독소, 콜레스테롤 의존성 세포 용해소, 기능성 효소, 항체 모방체, 단백질/단백질 상호작용 교란 물질(disrupter), 활성화된 카스파아제, 프로-카스파아제, 사이토카인, 케모카인, 세포 투과성 펩티드 및 상기 성분들의 임의의 조합을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 치료용 폴리펩티드(들)의 재조합 발현은 플라스미드, 코스미드, 파지미드 및 박테리아성 인공 염색체(BAC), 및 상기 예들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 당해 기술분야에 공지된 임의의 다양한 에피솜성 재조합 원핵성 발현 벡터로부터의 발현 결과일 수 있다. 유사한 방식에서, 재조합 발현은 염색체 상에 위치한 원핵성 발현 카세트에 의해 달성될 수 있으며, 이때 상기 원핵성 발현 카세트는 미니세포 생산 모세포 염색체의 하나 이상의 복제품 내에 존재한다. 다양한 면역 조절성 미니세포 단백질 성분들(퍼프린골리신 O 및 인바신을 포함하지만 이에 제한되지 않음)의 재조합 생산은 당해 기술분야의 기술자에게 공지된 재조합 발현 방법들의 임의의 조합에 의해 조장될 수 있다. 비제한적인 예로서, 재조합 발현은 인바신과 같은 특정한 단백질 성분을 코딩하는, 염색체 상에 위치하고 작동 가능하게 연결된 개방 판독 프레임으로부터 조장될 수 있다. 면역 조절성 미니세포의 단백질 성분들의 재조합 발현은 플라스미드, 코스미드, 파지미드 및 박테리아성 인공 염색체(BAC)와 같은 하나 이상의 에피솜성 원핵성 발현 구조체의 사용에 의해 조장될 수 있다. 최종 면역 조절성 미니세포 생성물의 개개의 목적하는 단백질 성분들을 코딩하는 작동 가능하게 연결된 원핵성 개방 판독 프레임은 동일한 에피솜성 발현 구조체 상에 존재할 수 있거나, 독립된 별개의 에피솜성 발현 구조체 상에 존재할 수 있다. 상기 목적하는 단백질 성분들의 생산은 유도성 원핵성 프로모터의 제어를 받을 수 있거나, 대안적으로는 구성적으로 활성인 원핵성 프로모터 시스템의 제어를 받을 수 있다. 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 상기 원핵성 프로모터 시스템이 사용 가능함을 용이하게 인지할 것이다. 프로모터 시스템의 예로는 IPTG 유도성 Lac 시스템 및 이의 다수의 유도체, L-람노오스 유도성 pRHA 시스템, L-아라비노오스 유도성 pBAD 시스템, T7 폴리메라아제 시스템, CI857ts 시스템 등을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 비제한적인 예로서, VAX-IP 미니세포 생산 균주, 및 이로부터의 VAX-IP 미니세포를 생산하는 특정 방법이 실시예 6 및 도 8로서 포함된다.
단백질 독소의 예로는 퍼프린골리신 O, 겔로닌, 디프테리아 독소 단편 A, 디프테리아 독소 단편 A/B, 파상풍 독소, 대장균 이열성 독소(LTI 및/또는 LTII), 콜레라 독소, 클로스트리디움 퍼프린젠스(C. perfringens) 아이오타 독소(iota toxin), 슈도모나스 외독소 A, 시가 독소, 탄저병 독소, MTX(바실루스 스파에리쿠스(B. sphaericus) 모기 살충 독소(mosquilicidal toxin), 스트렙토리신, 보리 독소, 멜리틴, 탄저병 독소 LF 및 EF, 아데닐레이트 시클라아제 독소, 보툴리노리신 B, 보툴리노리신 E3, 보툴리노리신 C, 보툴리눔 독소 A, 콜레라 독소, 클로스트리듐 독소 A, B 및 알파, 리신, 시가 A 독소, 시가 유사 A 독소, 콜레라 A 독소, 백일해 S1 독소, 대장균 이열성 독소(LTB), 리스테리올리신 O의 pH 안정성 변이체(pH 독립성; L461T 아미노산 치환), 리스테리올리신 O의 열 안정성 변이체(E247M 및 D320K 아미노산 치환), 리스테리올리신 O의 pH 및 열 안정성 변이체(E247M, D320K 및 L461T 아미노산 치환), 스트렙토리신 O, 스트렙토리신 O c, 스트렙토리신 O e, 스파에리코리신, 안트로리신 O, 세레올리신, 튜린지엔시리신 O, 바이헨스테파넨실리신, 알베올리신, 브레빌리신, 부티리쿨리신, 테타놀리신 O, 노비일리신, 렉티놀리신, 뉴몰리신, 미틸리신, 슈도뉴몰리신, 수일리신, 인터메딜리신, 이바놀리신, 세엘리제리올리신 O, 바기놀리신 및 피올리신을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 단백질 독소는 당업계의 기술자의 판단에 따라 상기 미니세포의 상이한 세포하 구획에 국소화될 수 있다. 본원에 개시된 표적화된 미니세포가 그램 음성 미니세포 생산 모균주로부터 유래하는 경우, 이로부터 생산되는 재조합에 의해 발현된 치료용 폴리펩티드는 사이토졸, 내막의 내부 첨판(inner leaflet), 내막의 외부 첨판, 주변 세포질, 외막의 내부 첨판, 미니세포의 외막, 및 상기 예들의 임의의 조합으로 국소화될 수 있다. 본원에 개시된 표적화된 미니세포가 그램 양성 미니세포 생산 모균주로부터 유래하는 경우, 이로부터 생산되는 재조합에 의해 발현된 치료용 폴리펩티드는 사이토졸, 세포벽, 멤브레인의 내부 첨판, 미니세포의 멤브레인, 및 상기 예들의 임의의 조합으로 국소화될 수 있다.
5. 약학 조성물
본 발명은 또한 약학 조성물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 조성물에 관한 것이다. 본원에서 사용된 "조성물"이란 용어는 적어도 하나의 담체, 바람직하게는 생리학적으로 허용 가능한 담체, 및 하나 이상의 미니세포 조성물을 포함하는 혼합물을 지칭한다. 본원에서 사용된 "담체"란 용어는 세포 또는 조직 내로의 생물학적 활성 펩티드(들)의 혼입을 억제하지 않거나 막지 않는 화학적인 화합물을 지칭한다. 담체는 전형적으로 활성 성분이 적절한 투여 형태(예를 들어, 환제, 캡슐, 겔, 필름, 정제, 미세입자(예를 들어, 미소 구체), 용액; 연고; 페이스트, 에어로졸, 소적(droplet), 콜로이드 또는 유제 등)로 제형화되거나 혼합되도록 하는 불활성 물질이다. "생리학적으로 허용 가능한 담체"는 상기 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 제거(감소, 억제 또는 방지)하지 않는 생리학적 조건 하에서 사용하기에 적절한 담체이다. 예를 들어, 디메틸 설폭사이드(DMSO)는 유기체의 세포 또는 조직 내로의 많은 유기 화합물의 흡수를 조장하기 때문에 이는 담체이다. 바람직하게는, 상기 담체는 생리학적으로 허용 가능한 담체, 바람직하게는 약학적 또는 수의학적으로 허용 가능한 담체로, 그 내부에는 상기 미니세포 조성물이 배치된다.
"약학 조성물"은 상기 담체가 약학적으로 허용 가능한 담체인 조성물을 지칭하는 반면, "수의학적 조성물"은 상기 담체가 수의학적으로 허용 가능한 담체인 조성물이다. 본원에서 사용된 "약학적으로 허용 가능한 담체" 또는 "수의학적으로 허용 가능한 담체"란 용어는 생물학적이지 않거나, 그렇지 않는 경우에 바람직하지 않은 임의의 매질 또는 물질을 포함한다. 즉, 상기 담체는 임의의 원하지 않는 생물학적 효과를 야기하지 않거나 복합체 또는 이의 임의의 성분들, 또는 유기체와 유해한 방식으로는 상호작용하지 않으면서 미니세포 조성물과 함께 상기 유기체에 투여될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 시약의 예는 본원에서 그 전체가 본 발명에 인용된 문헌[The United States Pharmacopeia, The National Formulary, United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Md. 1990]에 제공되어 있다. "치료학적 유효량" 및 "약학적 유효량"이란 용어는 유기체의 표적 세포, 조직 또는 몸체에서 측정 가능한 반응을 유도가거나 유발하기에 충분한 양을 지칭한다. 치료학적 유효량을 구성하는 것은 식견을 갖춘 전문의가 목적하는 투여 방법에 도달할 때 설명하려고 하는 다양한 인자에 의존할 것이다.
상기 조성물은 또한 희석제 및 부형제와 같은 기타 화학적인 성분들을 포함할 수 있다. "희석제"는 용매 중에서 상기 조성물의 용해를 조장하는 용매, 바람직하게는 수성 용매에 희석된 화학적인 화합물이며, 이는 또한 상기 조성물 또는 하나 이상의 이의 성분들의 생물학적 활성 형태를 안정화시키도록 작용할 수 있다. 완충 용액에 용해된 염은 당해 기술분야에서 희석제로서 이용될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 희석제는 하나 이상의 상이한 염을 함유하는 완충 용액이다. 상기 완충 용액이 인간 혈액의 염 조건을 모방하기 때문에 바람직한 완충 용액의 비제한적인 예는 인산 완충 식염수(특히 약학적 투여를 위해 의도된 조성물과 함께)이다. 완충염이 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어할 수 있기 때문에, 완충 희석제는 소정의 화합물 또는 약학 조성물의 생물학적 활성을 거의 변화시키지 않는다.
"부형제"는 적절한 특성, 예를 들어 적절한 밀도를 부여하거나 약물 제형을 생산하기 위해 조성물에 첨가될 수 있는 다소 불활성인 임의의 물질이다. 적절한 부형제 및 담체로는 특히 락토오스, 수크로오스 및 만니톨을 포함한 당과 같은 충전제, 또는 예를 들어 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 한천, 펙틴, 크산탄 검, 구아 검, 메뚜기콩 검, 히알루론산, 카제인, 감자 전분, 젤라틴, 트라가칸트 검, 메틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸-셀룰로오스, 폴리아크릴레이트, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스 및/또는 폴리비닐 피롤리돈(PVP)과 같은 소르비톨 셀룰로오스 제제를 들 수 있다. 필요한 경우, 가교된 폴리비닐 피롤리돈, 한천, 또는 알긴산 또는 이의 염(예를 들어 알긴산나트륨)과 같은 붕해제가 또한 포함될 수 있다. 기타 적절한 부형제 및 담체로는 하이드로겔, 겔화성 하이드로콜로이드 및 키토산을 들 수 있다. 키토산 미소 구체 및 마이크로캡슐은 담체로서 사용될 수 있다.예를 들어, 국제공개공보 제WO 98/52547호(화합물을 복부로 표적화하기 위한 미소 구체 제형을 개시하고 있으며, 여기서 상기 제형은 하나 이상의 활성 성분을 함유하는 내핵(겔화된 하이드로콜로이드를 선택적으로 포함함), 상기 활성 성분(들)의 방출 속도를 제어하기 위해 불수용성 중합체(예를 들어, 에틸셀룰로오스)로 구성된 멤브레인, 및 생체 접착성 양이온 중합체, 예를 들어, 양이온성 다당류, 양이온성 단백질 및/또는 합성 양이온성 중합체로 구성된 외층을 포함함); 및 미국 특허 제4,895,724호를 참고한다. 전형적으로, 키토산은 적절한 약제, 예를 들어, 글루타르알데하이드, 글리옥살, 에피클로로히드린 및 숙신알데하이드를 이용하여 가교된다. 담체로서 키토산을 이용하는 조성물은 환제, 정제, 미세입자 및 미소 구체(상기 활성 성분(들)의 제어된 방출을 제공하는 미소 구체를 포함함)를 비롯한 다양한 투여 형태로 제형화될 수 있다. 기타 적절한 생체 접착성 양이온 중합체로는 산성 젤라틴, 폴리갈락토사민, 폴리아미노산(예를 들어, 폴리리신, 폴리히스티딘 및 폴리오르니틴), 다중 사차 화합물(polyquaternary compound), 폴리아민, 폴리이민, 디에틸아미노에틸덱스트란(DEAE), DEAE-이민, DEAE-메타크릴레이트, DEAE-아크릴아마이드, DEAE-덱스트란, DEAE-셀룰로오스, 폴리-p-아미노스티렌, 폴리옥세탄, 코폴리메타크릴레이트류, 폴리아미도아민류, 양이온성 전분, 폴리비닐피리딘 및 폴리티오디에틸아미노메틸에틸렌을 들 수 있다.
상기 조성물은 임의의 적절한 방식으로 제형화될 수 있다. 미니세포 조성물은 상기 담체 내에서 균일하게(동질성으로) 또는 불균일하게(이질성으로) 분산되어 있을 수 있다. 적절한 제형으로는 건조 및 액체 제형을 들 수 있다. 건조 제형으로는 냉동 건조되고 동결 건조된 분말을 들 수 있으며, 이때 상기 분말은 특히 부비강 또는 폐로의 에어로졸 전달에 매우 적합하거나, 장기간 저장한 후 투여 이후에 적절한 희석제 내에서의 복원에 매우 적합하다. 기타 바람직한 건조 제형으로는 본원에 개시된 조성물이 경구 투여용으로 적합한 정제 또는 환제 형태로 압축되거나 서방형 제형으로 혼합되는 제형을 들 수 있다. 상기 조성물이 장 내의 상피조직으로 전달되도록 경구 투여용으로 의도되는 경우, 상기 제형을 보호하고 본원에 개시된 미니세포 조성물의 조기 방출을 방지하기 위해 상기 제형을 장용성 코팅물(enteric coating)로 캡슐화되는 것이 바람직하다. 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 본원에 개시된 조성물은 임의의 적절한 투여 형태 내에 넣을 수 있다. 환제 및 정제는 이 같은 투여 형태의 일부를 나타낸다. 또한 상기 조성물은, 예를 들어 압축, 침지, 팬 코팅, 분무 건조 등에 의해 임의의 적절한 캡슐 또는 기타 코팅 물질 내로 캡슐화될 수 있다. 적절한 캡슐로는 젤라틴 및 전분으로부터 제조된 캡슐을 들 수 있다. 다음으로, 이 같은 캡슐은, 예를 들어 하나 이상의 부가적인 물질로 코팅될 수 있으며, 필요한 경우에 장용성 코팅물로 코팅될 수 있다. 액체 제형으로는 수성 제형, 겔 및 유제를 들 수 있다.
몇몇 실시예는 생체 접착성 코팅물, 바람직하게는 점막 접착성 코팅물을 포함하는 조성물을 제공한다. "생체 접착성 코팅물"은 물질(예를 들어, 미니세포 조성물)이 상기 코팅물의 부재 시에 나타나는 것보다 양호하게 생물학적 표면 또는 물질에 접착하도록 하는 코팅물이다. "점막 접착성 코팅물"은 물질, 예를 들어 조성물이 상기 코팅물의 부재 시에 나타나는 것보다 양호하게 점막에 접착하도록 하는 바람직한 생체 접착성 코팅물이다. 예를 들어, 미니세포는 점막 접착제로 코팅될 수 있다. 이어 코팅된 입자는 유기체에 전달하기에 적절한 투여 형태로 조립될 수 있다. 바람직하게, 그리고 표적화 될 세포 표면 수송 모이어티가 발현되는 위치에 따라, 상기 투여 형태는 이어서 제형이 목적하는 위치에 도달할 때까지 제형을 보호하기 위해 다른 코팅물로 코팅되며, 여기서 상기 점막 접착제는 상기 조성물이 표적 세포 표면 수송 모이어티와 상호작용을 하는 동안에 상기 제형이 유지되도록 할 수 있다.
본원에 개시된 조성물은 임의의 유기체, 예를 들어 동물, 바람직하게는 포유동물, 조류, 어류, 곤충 또는 거미류에 투여될 수 있다. 바람직한 포유동물로는 소, 개, 말, 고양이, 양 및 돼지와 같은 동물, 및 비인간 영장류를 들 수 있다. 인간은 특히 바람직하다. 당해 기술분야에는 화합물을 투여하거나 전달하는 다중 기법이 존재하며, 상기 기법으로는 경구 투여, 직장 투여(예를 들어, 관장 또는 좌제), 에어로졸 투여(예를 들어, 비강 또는 폐 전달용), 비경구 투여 및 국부 투여를 들 수 있다. 바람직하게는, 충분한 양의 생물학적 활성 펩티드가 의도된 효과를 달성하기 위해 전달된다. 전달될 조성물의 특정 양은 달성될 효과를 포함한 다양한 인자, 상기 조성물이 전달되는 유기체의 유형, 전달 경로, 투여 방법, 및 상기 유기체의 나이, 건강 및 성에 의존할 것이다. 상기와 같이, 소정의 제형에 혼입된 조성물의 특정 투여량은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자의 판단에 따른다.
당해 기술분야의 기술자들은 본원에 개시된 조성물이 치료, 진단 또는 보호 효과(들)(백신 접종을 포함함)를 포함할 수 있는 특정의 목적하는 생물학적 결과를 달성하기 위해 약제로서 투여되는 경우에 상기 미니세포 조성물을 적절한 약학적 담체와 조합하는 것이 가능할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 약학적 담체의 선택, 및 치료제 또는 보호제로서 미니세포의 제조는 의도된 용도 및 투여 모드에 의존할 것이다. 적절한 제형, 및 치료제의 투여 방법으로는 경구, 폐, 비강, 구강, 안구, 피부, 직장, 정맥 내 또는 질 전달을 위한 제형 및 방법을 들 수 있다.
사용된 전달 모드에 따라, 문맥 의존성 기능 실체는 다양한 약학적으로 허용 가능한 형태로 전달될 수 있다. 예를 들어, 상기 문맥 의존성 기능 실체는 고체, 용액, 유제, 분산액 등의 형태로 전달될 수 있으며, 상기 형태는 환제, 캡슐, 정제, 좌제, 에어로졸, 소적 또는 분무액 내로 혼입된다. 환제, 정제, 좌제, 에어로졸, 분말, 소적 및 시럽은 복잡한 다층 구조를 가질 수 있으며, 넓은 범위의 크기를 가질 수 있다. 에어로졸, 분말, 소적 및 분무액은 작은 크기(1마이크론)에서 큰 크기(200마이크론)에 이를 수 있다.
본원에 개시된 약학 조성물은 고체, 동결 건조 분말, 용액, 유제, 분산액 등의 형태로 사용될 수 있으며, 여기서 얻어진 조성물은 장 또는 비경구 적용에 적절한 유기 또는 무기 담체 또는 부형제와 혼합에서 활성 성분으로서 본원에 개시된 화합물 중 하나 이상을 함유한다. 상기 활성 성분은, 예를 들어 정제, 펠릿, 캡슐, 좌제, 용액, 유제, 현탁액, 및 사용에 적합한 임의의 기타 형태를 위한 통상 비독성의 약학적으로 허용 가능한 담체와 혼합될 수 있다. 사용 가능한 담체로는 글루코오스, 락토오스, 만노오스, 아카시아 고무, 젤라틴, 만니톨, 전분 페이스트, 삼규산마그네슘, 활석, 옥수수 전분, 케라틴, 콜로이드성 실리카, 감자 전분, 요소, 중쇄 길이의 트리글리세라이드, 덱스트란, 및 제제를 고체, 반고체 또는 액체 형태로 제조할 때 사용하기에 적절한 기타 담체를 들 수 있다. 부가적으로, 보조제, 안정화제, 증점제, 착색제 및 향료가 사용될 수 있다. 건식 안정화제의 예로는 트리울로오스(triulose)를 들 수 있으며, 이는 바람직하게는 0.1% 초과의 농도로 존재한다(예를 들어, 미국 특허 제5,314,695호 참조). 상기 활성 화합물은 질병의 과정 또는 상태에 대해 목적하는 효과를 나타내기에 충분한 양으로 상기 약학 조성물에 포함된다.
6. 치료학적 징후
본 발명은 고형 종양, 전이성 종양 및 액형 종양을 포함하지만 이에 제한되지 않는 암(들)에 대한 미니세포 매개 면역 요법에 관한 것이다. 고형 및 전이성 종양으로는 상피조직, 섬유아세포, 근육 및 뼈 기원의 종양을 들 수 있으며, 유방암, 폐암, 췌장암, 전립선암, 고환암, 난소암, 위암, 장암, 구강암, 설암, 인두암, 간암, 항문암, 직장암, 결장암, 식도암, 비뇨기 방광암, 담낭암, 피부암, 자궁암, 질암, 음경암 및 신장암을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 본원에 개시된 면역 조절성 미니세포로 치료될 수 있는 기타 고형 암 유형으로는 선암, 육종, 섬유 육종, 안암, 뇌암 및 골암을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 본원에 개시된 면역 조절성 미니세포에 의해 치료될 수 있는 액형 종양으로는 비호지킨 림프종, 골수종, 호지킨 림프종, 급성 림프구성 림프종, 만성 림프구성 림프종, 급성 골수성 림프종, 만성 골수성 림프종 및 기타 림프종을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
VAX-P, VAX-IP 및 VAX-IPD 미니세포의 생체 내에서의 면역 조절 활성은 도 3 내지 도 6에 도시되어 있으며, 또한 실시예 2 내지 실시예 4에서 추가로 개시되어 있다. 면역 조절 효과가 VAX-P, VAX-IP 및 VAX- IPD 미니세포와 같은 퍼프린골리신 O 함유 미니세포 제형의 항종양 특성에 기여하고 있다는 첫 번째 생체 내 증거는 예상치 못한 것이었다. VAX-IP의 발생 및 특성 분석에서의 대조 실험을 수행하는 경우, 예상치 못하게도 표적화 모이어티 인바신의 제거가 생체 내 효능에 거의 영향을 미치지 않는 것으로 밝혀졌다(도 3 참조). 그러나 퍼프린골리신 O 성분의 제거는 종양의 성장을 막기 위한 미니세포의 능력에 대해 현저한 효과를 나타냈다. 예상치 못하게도, 미니세포가 난소에서는 검출되지 않았을지라도(국소화되지 않음), 상기 미니세포는 암컷 마우스의 난소를 콜로니화(colonization)하였던 종양에 대해 상당한 항종양 효과를 나타낼 수 있는 것으로 또한 밝혀졌다(도 4 및 도 5 참조). 이들 동일한 마우스에서, 폐를 콜로니화하였던 종양은 또한 성장이 유의하게 방지되었으며, 미니세포의 충분한 동시 국소화를 증명하였다. 종합해보면, 이들의 서로 다른 결과에 따르면, 종양 국소화가 항종양 효과에 중요하지 않을 수 있으며, 휴면 중인 면역 시스템의 일부 측면일 가능성도 있는 다른 포괄 인자(global factor)가 존재할 가능성 있는 것으로 나타나 있다. 부가적으로, 퍼프린골리신 O를 함유하는 미니세포는 심각하게 면역 약화된 NIH-III 마우스에서 성장하는 종양에 대해 어떠한 효과도 나타내지 않는 것(T 세포 기능 이외에도 NK 세포 기능이 결여됨)으로 증명되었다(도 6 참조).
본원에 개시된 바와 같이 제형화된 미니세포의 면역 조절 효과의 결과로서, 본 발명의 면역 조절성 미니세포의 하나의 비제한적이고 여전히 바람직한 치료 적용은 방광 내 투여, 및 비근육 침습성 방광암의 치료에 있다. 도 7에 도시되고 실시예 5에 개시된 바와 같이, 면역 조절성 미니세포는 비근육 침습성 방광암의 마우스 모델에서 그 효능이 이미 증명되었다.
7. 미니세포 제제
몇몇 실시예는 최적화된 균주의 생성, 및 이에 제한되지 않지만 엔테로박테리아세아에의 박테리아 패밀리로부터 면역 조절성 미니세포의 제조에 관한 것이다.
몇몇 실시예에서, 상기 미니세포를 생산하는 생존 가능한 모세포의 오염 수준은 105개의 미니세포 중 하나 미만이다. 몇몇 실시예에서, 상기 미니세포를 생산하는 생존 가능한 모세포의 오염 수준은 106개의 미니세포 중 하나 미만이다.
몇몇 실시예에서, 상기 미니세포를 생산하는 생존 가능한 모세포의 오염 수준은 107개의 미니세포 중 하나 미만이다.
몇몇 실시예에서, 상기 미니세포를 생산하는 생존 가능한 모세포의 오염 수준은 108개의 미니세포 중 하나 미만이다.
몇몇 실시예에서, 상기 미니세포를 생산하는 생존 가능한 모세포의 오염 수준은 109개의 미니세포 중 하나 미만이다.
몇몇 실시예에서, 상기 미니세포를 생산하는 생존 가능한 모세포의 오염 수준은 1010개의 미니세포 중 하나 미만이다.
몇몇 실시예에서, 상기 미니세포를 생산하는 생존 가능한 모세포의 오염 수준은 1011개의 미니세포 중 하나 미만이다.
몇몇 실시예에서, 상기 미니세포를 생산하는 생존 가능한 모세포의 오염 수준은 1012개의 미니세포 중 하나 미만이다.
몇몇 실시예에서, 상기 미니세포를 생산하는 생존 가능한 모세포의 오염 수준은 1013개의 미니세포 중 하나 미만이다.
몇몇 실시예에서, 상기 미니세포를 생산하는 생존 가능한 모세포의 오염 수준은 1014개의 미니세포 중 하나 미만이다.
몇몇 실시예에서, 상기 미니세포를 생산하는 생존 가능한 모세포의 오염 수준은 1015개의 미니세포 중 하나 미만이다.
몇몇 실시예에서, 상기 미니세포를 생산하는 생존 가능한 모세포의 오염 수준은 1016개의 미니세포 중 하나 미만이다.
달리 한정하지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 비록 본 발명이 실시예 및 실시예를 참고하여 개시되었을지라도, 본 발명의 진의에서 벗어나지 않는 한 다양하게 변경될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 인용된 모든 인용문헌은 본원에서 전체가 명백히 인용된다.
본 발명의 실시형태는 하기 실시예에서 더욱 상세하게 개시되어 있으며, 이는 임의의 방식으로 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1
퍼프린골리신 O는 표 1 및 도 2에서 증명된 바와 같이 VAX-IP 미니세포에 의해 표적화되어 전달되는 경우에 시험관 내에서 세포독성이 있다. 10% 소 태아 혈청, 페니실린 및 스트렙토마이신를 함유하는 RPMI-1640에서 25,000개의 쥐 이행 세포 암종 세포주 MB49(murine transitional cell carcinoma cell line MB49)로 96-웰 플레이트를 접종함으로써 시험관 내 실험을 수행하였다. 다음 날, VAX-IP, VAX-I(퍼프린골리신 O를 함유하지 않음) 또는 재조합 퍼프린골리신 O(BTX-100, ATCC로부터 구입함)를 1,000:1의 도말된 포유류 당 첨가된 VAX-IP 및 VAX-I 미니세포의 비율(MOI)로 세포에 첨가하였다. 첨가된 BTX-100의 농도는 VAX-IP에 의해 전달되는 퍼프린골리신 O의 양에 상응하였다. 초기에는 주로 락트산 탈수소효소(LDH) 활성이 퍼프린골리신 O가 작용하는 것으로 보고되었던 기작인 포유류 세포막 누출의 널리 공지된 지표이기 때문에 LDH 활성 분석은 세포독성의 대리 판독(surrogate readout)으로서 사용되었다. 예상된 바와 같이, 그리고 도 1에서 도시된 바와 같이, 쥐 락트산 탈수소효소(LDH)는 BTX-100에 대한 거의 노출 직후에 MB49 세포로부터 방출되었다. 1,000:1의 MOI로 VAX-IP에 의해 처리된 MB49 세포에서는 비록 방출 개시가 더욱 느렸지만 LDH 활성이 증명되었으며, 이는 VAX-IP 미니세포의 내부화, 엔도솜 분해의 개시, 및 퍼프린골리신 O에 의해 매개된 엠도솜 막 분해를 통한 표적 세포 내로의 퍼프린골리신 O의 궁극적인 방출에 대한 요건에 기인할 가능성이 있었다. 대조군으로서 사용된 VAX-I 미니세포에서는 LDH의 유의한 방출이 없는 것으로 증명되었다. 놀랍게도, BTX-100으로 처리된 세포가 24시간의 시점에 회복되었으며, 전적으로 생존 가능하여 부착성이 되는 것으로 추후에 밝혀졌다. 반면, VAX-IP 미니세포로 처리된 이들 MB49 세포는 플레이트로부터 떨어져 나왔으며, 외관상으로는 죽어 있었다. 이러한 결과를 확인하기 위해, BTX-100의 농도 범위에 대하여 다양한 VAX-IP 미니세포를 비교하는 동일한 실험을 반복하였지만, 이러한 경우에 표준 MTT 세포 생존성 분석은 24시간의 시점에 수행되었다. 도 2에 도시된 이들 실험의 결과에 따르면, 정상적으로는 독성이 없는 농도의 퍼프린골리신 O의 세포 내 전달은 미니세포에 의해 전달되는 경우에 매우 강력할 수 있는 것으로 명백히 증명되었다.
50% RBC 용해에서 1㎖ 당 미니세포 50% RBC 용해에서 PFO(g/㎖) 용혈 분석에 기초한 PFO(g/㎖) 미니세포 부가 2시간 후 MB49 세포로부터 방출된 LDH 활성(%) LDH 활성용 PFO(g/㎖) 50% MB49 생존 시 미니세포-대-MB49 MOI 50% MB49 생존 시 PFO(g/㎖)
BTX-100 NA 1.75×x10-9 NA 87.8 5×10-7 NA 1.07×10-6
VAX-I 용해 무 NA 0 1.8 0 독성 무 NA
VAX-IP 1.91×106 NA 9.16×10-16 94.0 2.29×10-7 307.2 1.41×10-8
실시예 2
퍼프린골리신 O를 함유하는 미니세포가 생체 내에서 항종양 면역 조절 활성을 자극한다는 증거의 제1 선은 흉선이 없는 누드 마우스(누드 마우스는 부분적으로 면역 약화되어 있으며, 전체 T 세포 활성이 결여됨)에서 수행된 인간 이종이식 연구로부터 유래하였다. 총 6회 분량의 투여량에 대해 q3d 스케줄에 따라 정맥 내에 제공되는 경우에 상기 VAX-IP 미니세포의 항종양 효능은 인간 췌장 암종 세포주 BxPC3을 이용한 피하 이종이식 연구에서 증명되었다(도 3 참조). 이러한 모델에서, 종양 세포는 누드 마우스에 피하 이식되었으며, 처리군으로 무작위로 분류하기 이전에 100㎣의 크기에 도달하도록 하였다. 종양 내포 마우스(tumor bearing mouse)는 염수 비히클, 파클리탁셀, 3.0×108개의 "네이키드(naked)" 미니세포(인바신 또는 퍼프린골리신 O를 함유하지 않은 대장균 미니세포), 3.0×108개의 VAX-P 미니세포(미니세포의 표면 상에 인바신 단백질을 함유하지 않음) 또는 3.0×108개의 VAX-IP 미니세포로 총 6회 분량의 투여량에 대해 q3d 스케줄에 따라 정맥 내 처리하였다. 놀랍게도, 상기 표적화되지 않은 대조군인 VAX-P 미니세포(미니세포의 표면 상에 인바신 단백질을 함유하지 않음)는 이러한 모델에서 종양 성장을 방지하는데 있어 VAX-IP 미니세포로서 동일하게 효과적이었으며, 반면에 "네이키드" 미니세포는 효과가 없었다. 상기 미니세포 비히클의 표면 상에 종양 표적화 모이어티의 부시 시의 항종양 활성은 전적으로 예상치 못한 결과였다.
실시예 3
퍼프린골리신 O를 함유하는 미니세포가 생체 내에서 항종양 면역 조절 활성을 자극한다는 증거의 제2 선은 B16F10 쥐 흑색종 세포주를 이용한 폐 및 난소 전이의 쥐 공통 유전자 모델(syngeneic murine model)로부터 유래하였다. 이러한 모델에서, 개똥벌레 루시퍼라아제를 구성적으로 발현하는 B16F10 쥐 흑색종 세포는 암컷 누드 마우스에 꼬리 정맥을 통해 정맥 내 주사하였다. 마우스에는 3일마다 1회씩 루시페린을 주사하였으며, 동물은 마우스의 폐에서의 확립된 전이의 존재를 위해 마우스 전시 이미징법(whole mouse imaging)으로 이미징하였다. 일단 종양 확립이 증명되면, 마우스는 대조군으로 무작위 분류하였으며, 총 6회 분량의 투여량에 대해 qd3 투여 스케줄에 따라 염수 비히클 또는 3.0×108개의 VAX-IPD 미니세포를 정맥 내 투여 받았다. 폐 및 난소 전이에 대한 유의한 항종양 활성은 VAX-IPD 미니세포 처리 마우스에서 관측되었다(도 4 참조). 동일한 모델 및 투여 스케줄을 이용한 제2의 병렬 정략적 VAX-IPD 플라스미드-특이적 PCR 기반 생물 분포 연구에서, 본 발명가들은 VAX-IPD가 마우스에서 폐 및 폐종양에 국소화된다는 것을 증명하였다. 놀랍게도, 시험한 어떠한 시점에서도 VAX-IPD 미니세포는 난소 또는 난소 종양에 국소화되지 않았다(도 5 참조). 이들 2개의 결과의 조합으로부터, 하나 이상의 면역 인자일 가능성이 있는 몇몇 포괄 인자는 VAX-IPD 미니세포가 난소 조직 또는 종양에 국소화되지 않지만 기관 부위에서 상당한 종양 억제 효과를 나타내고 있는 경우에 항종양 활성에 기여해야 한다는 것으로 결론이 내려졌다.
실시예 4
상기 실시예 2 및 실시예 3에서 수행된 생체 내 실험의 관측에 기초하여, 심각하게 면역 결핍된 NIH-III 마우스(C57/BL6로서 동일한 유전적 배경을 갖지만 T 세포 활성 및 자연 살해(NK) 세포 활성 둘 모두가 결여됨)에서의 항종양 활성과 완전 면역 적격(fully immune competent) C57/BL6 마우스에서의 VAX-IPD 미니세포의 항종양 효과를 비교하는 쥐 공통 유전자 B16F10 흑색종 모델의 확립된 피하 종양의 변화를 이용하여 세 번째 연구를 수행하였다. 종양이 100㎣의 크기까지 성장한 후, 마우스를 처리군으로 무작위 분류하고, 총 6회 분량의 투여량에 대해 q3d 스케줄에 따라 염수 또는 3.0×108개의 VAX-IPD 미니세포로 정맥 내 처리하였다. 최종 투여 후, 마우스를 안락사시켰고, 종양을 수술에 의해 추출하여 무게를 측정하였으며, 종양 부담(tumor burden)에 대해 점수를 매겼다. 도 6에 도시된 결과에 따르면, VAX-IPD 미니세포는 심각하게 면역 약화된 마우스에서는 효과가 없는 것으로 증명되었다.
실시예 5
비근육 침습성 방광암의 마우스 모델에서 작용하는 VAX-IP 미니세포의 능력은 도 7에 증명되어 있다. 이러한 실험에서, 암컷 면역 적격 C57/BL6 마우스를 마취시키고, 비뇨기 방광의 카테터 삽입(catheterization)에 적용하였고, 이들의 비뇨기 방광 벽은 백금 가이드 와이어에 부착되어 카테터를 통해 삽입된 전기 외과 장치(electrosurgical device; 보비 940(Bovie 940), 5W로 설정됨)를 이용하여 2개의 별개의 부위에 소작(cauterization)하였다. 소작 이후, 방광을 50㎕의 PBS로 세정한 후, 100,000개의 MB49 쥐 이행 세포 암종 종양 세포를 카테터를 통해 주입하였다. 상기 카테터는 방광 벽에 대한 종양 부착을 확인하기 위해 2시간 동안 적소에서 고정하였다. 카테터를 제거하고, 동물은 마취에서 회복하도록 하였다. 종양이 검출될 수 있을 때까지 방광 촉진법(bladder palpation)에 의해 동물을 매일 모니터링하였으며, 이 시점에 동물을 처리군으로 무작위 분류하였다. 이어 마우스는 총 5회 분량의 투여량에 대해 qd3 투여 스케줄에 따라 비뇨기 카테터를 통해 염수, 5×107개의 VAX-IP 미니세포 또는 1×108개의 VAX-IP 미니세포의 방광 내 투여를 받았다. 이어 동물을 안락사시켰으며, 방광을 적출하여 무게를 측정하였으며, 종양 부담에 대해 점수를 매겼다. 상기 결과에 따르면, VAX-IP 미니세포는 이러한 모델에서 확립된 MB49 비뇨기 방광 암종에 대해 강력하고 용량 의존적 항종양 효과를 갖는 것으로 증명되었다.
실시예 6
VAX-IP 미니세포의 생산은 플라스미드 pVX-336(서열번호 3)의 클로닝과 함께 시작된다. pVX-336(도 9에 도시된 플라스미드 지도)은 L-람노오스 유도성 플라스미드 pVX-128(서열번호 4; 도 10에 도시된 플라스미드 지도)의 SalI 및 XbaI 부위 내로 인바신을 방향성 있게 서브클로닝함으로써 구축되었다. 양성 클론의 동정 이후, 유일한 SalI 및 XbaI 부위 내로의 퍼프린골리신 O의 후속적인 방향성 서브클로닝을 수행하여 인바신과 퍼프린골리신 O 사이에 전사 융합체(2개의 단백질, 인바신 및 퍼프린골리신 O를 코딩하는 단일의 원핵성 메신저 RNA)를 생성하였다. pVX-336의 명확한 서열 확인 이후, 상기 플라스미드를 대장균의 IPTG-유도성 미니세포 생산 균주 내로 도입하였다(도 8 도해의 단계 1, 및 도 11에서의 IPTG에 의한 유도 시 미니세포를 생산하는 실제 균주 참조). 상기 균주는 또한 하나의 열적 유도성 I-ceuI 자살 유전자의 염색체 복사수, dapA 유전자에서의 결실(모균주가 실험실 밖 또는 포유동물에서 성장하지 못하도록 함), 및 lpxM 유전자에서의 결실(지질 다당류의 지질 A 성분을 약화시킴)을 함유한다. 플라스미드의 도입, 및 10㎍/㎖의 디아미노피멜산 및 50㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 LB 한천 상사에서의 선별 이후, 단일 콜로니를 이용하여 동일한 성분을 함유하는 액체 LB 배지에서 30℃에서 성장하도록 하룻밤 동안의 배양을 시작하였다. 다음 날, 종균 배양액(starter culture)을 10㎍/㎖의 디아미노피멜산 및 50㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 신선한 LB 배지에 1/100로 희석하고, 교반하면서 30℃에서 성장시켰다. 600㎚의 광학 밀도(OD600)에서 배양액 탁도(culture turbidity)를 모니터링하였다. 0.1의 OD600에서는 L-람노오스를 90μM의 최종 농도까지 첨가함으로써 pVX-336으로부터 인바신 및 퍼프린골리신 O를 발현하도록 배양액을 유도하였다. 1.0의 OD600에서는 IPTG를 100μM의 최종 농도까지 첨가함으로써 VAX-IP 미니세포의 형성을 위해 배양액을 유도하였다. 상기 배양액을 하룻밤 동안 정지기까지 성장하도록 하였으며, 다음 날에 당해 기술분야에서 일반적인 바와 같이 분별 원심분리 단계들의 조합을 이용하고 그 이후에 밀도 구배 정제법을 이용하여 VAX-IP 미니세포를 정제하였다. 일단 정제가 되면, 미니세포는 웨스턴 블랏(Western blot)에 의한 인바신의 존재뿐만 아니라 적혈구 용혈 분석을 통한 PFO 함량 및 활성에 대해 테스트하였으며(용혈 분석 및 웨스턴 블랏에 대해서는 도 12 참조), 이에 대한 1차 검출 항체는 인바신에 대해 특이적인 마우스 단클론성 IgG2b(mAb3A2)이다. 2mM EDTA, 10㎍/㎖의 라이소자임 및 5mM 시스테인의 조합을 이용하여 VAX-IP 미니세포를 용해한 후, 빙냉 증류수로 삼투암 충격을 가함으로써 적혈구 용혈 분석을 수행하였다. 일단 용해되면, 용해물은 단백질 함량에 대해 정량화하고, 적정량을 96-웰 플레이트에 있는 100,000개의 양 적혈구에 첨가하였다. 플레이트를 1시간 동안 격렬하게 교반하면서 37℃에서 배양하였다. 1시간의 배양 시간 이후, 적혈구를 5분 동안 1,000×G로 원심분리하고, 541㎚의 파장에서 용혈 활성의 척도로서 헤모글로빈 방출을 분석하기 위해 상층액을 새로운 96-웰 플레이트로 옮겼다.

Claims (1)

  1. 콜레스테롤 의존성 세포 용해소 단백질을 포함하는 박테리아 미니세포에 있어서,
    상기 미니세포는 항체, 또는 항체의 Fc 영역을 포함하는 기타 분자를 제시하지 않는 것을 특징으로 하는, 박테리아 미니세포.
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