JP2019107004A - 免疫調節ミニ細胞および使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、米国特許法第119条(e)の下で、その全内容が明確に本明細書に援用される2012年10月2日出願の米国特許仮出願第61/709102号に基づく優先権を主張するものである。
本出願は、電子フォーマットでの配列リストと共に出願されている。配列表は、2013年10月2日に作成され、20Kbのファイルサイズであり、ファイル名がSEQLISTING.TXTであるファイルとして提供される。配列表の電子フォーマット中の情報は、その全内容が参照により本明細書に援用される。
浸潤性膀胱癌の治療のための術後アジュバント療法として用いられる。他の市販されていない実験的抗癌免疫調節手法としては、サルモネラ・チフィリウム(Salmonella typhimurium)、ビフィズス属細菌(Bifidobacteria)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyrogenes)、
セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、クロストリジウム・ノビイ(Clostridium novyi)、サルモネラ・コレレスイス(Salmonella choleraesius)、およびビブリ
オ・コレラ(Vibrio cholera)などの細菌のその他の弱毒生菌種の使用が挙げられる。ある程度効果的ではあるが、用いられる各菌株は、感染リスク、弱毒生菌株の病原性への遺伝的復帰の恐れ、および敗血症によって制限される。これらの手法はすべて、最も有効な用量で、またはその近辺で発生する毒性での生菌感染を思わせる極度の毒性に直面してきた。この結果、各菌株型に対する治療指数は狭い。
に有効性が失われる場合もある。加えて、多くは、極性化免疫応答(polarizing immune response)(Th1またはTh2のいずれか)のみを刺激し、大部分は、Th2(抗体産生)応答を刺激する。Th1応答(細胞性免疫応答)が、抗腫瘍免疫調節効果を有するという意味で、優先的であると思われることは、比較的充分に報告されている。最後に、これらの製剤は、市場での需要を支援するスケールおよび品質で製造することが困難であり得、ならびに最終的には、抗腫瘍効果を発生させることができない免疫応答の一部を発生させるだけであり得る。ほとんどの癌の治療に用いられるタンパク質毒素の場合、タンパク質毒素の有効性は、正常組織に対する毒性によって大きく制限される。加えて、全身暴露レベルに寄与する薬物の薬物動態(PK)パラメーターは、多くの場合、特に、同じ細胞標的または機構が抗腫瘍活性および正常組織毒性を担う場合に、同時に抗腫瘍活性を最大化し、副作用を最小化するように充分に最適化されず、および最適化することができない。ここでもはやり、この結果として、治療指数が非常に狭くなり、これはほとんどのタンパク質毒素に共通である。
て、他の研究者らは、抗癌治療剤として、異なる特異的Th1免疫調節性サイトカインおよびケモカインの開発を試みてきた。例としては、これらに限定されないが、インターフェロンガンマ(IFN‐γ)、インターフェロンアルファ(IFN‐α)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GMCSF)、腫瘍壊死因子アルファ(TNF‐α)、インターロイキン‐2(IL‐2)、インターロイキン‐12(IL‐12)、およびインターロイキン‐18(IL‐18)が挙げられる。これらの手法の各々は、単独で投与された場合に、免疫学的治療の有益性がほとんどまたはまったくなく、予測されない重篤な毒性によって制限されてきた。単一のサイトカインまたはケモカイン剤では、抗癌効果を有するために必要とされる完全な範囲のTh1免疫応答が引き起こされないこと、およびこれらの因子が、経時で動的である様々なレベルにて一緒に作用している可能性が高いことがある程度明らかにありつつある。このことは、複合的な製品製剤化によって再現し、組織化することがほぼ不可能である免疫学的シグナル伝達イベントのカスケードである。慢性C型肝炎ウィルス感染の治療のためのペグ化インターフェロン以外、ほとんどの単一剤サイトカインは、臨床的に成功していない。
)、テタノリジンO(tetanolysin O)、ノビイリジン(novyilysin)、レクチノリジン
(lectinolysin)、ニューモリジン(pneumolysin)、ミチリジン(mitilysin)、シュードニューモリジン(pseudopneumolysin)、スイリジン(suilysin)、インテルメジリジ
ン(intermedilysin)、イバノリジン(ivanolysin)、セエリゲリオリジンO(seeligeriolysin O)、バギノリジン(vaginolysin)、およびピオリジン(pyolysin)から選択される。ある実施形態では、コレステロール依存性細胞溶解素タンパク質は、パーフリンゴリジンO(perfringolysin O)である。ある実施形態では、コレステロール依存性細胞溶解素タンパク質は、配列番号1のアミノ酸配列を含む。
よびlpxM/msbB遺伝子における欠失または変異を含む。
‐TliII、およびPI‐ScpIから選択される。ある実施形態では、栄養素要求性は、必須代謝遺伝子における欠失または不活性化変異によるものである。ある実施形態では、ミニ細胞産生遺伝子産物をコードする発現可能遺伝子は、ftsZ、sulA、ccdB、およびsfiCから選択される。
L‐10、およびIL‐13から選択される。
る。ある実施形態では、癌は、腺癌、肉腫、線維肉腫、ならびに眼、脳、および骨の癌から選択される。ある実施形態では、癌は、非ホジキンリンパ腫、骨髄腫、ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、および慢性骨髄性白血病から選択される。
本明細書で用いられる場合、「Th1免疫調節ミニ細胞」の用語は、Th1免疫応答を刺激することができるミニ細胞を意味する。
的細胞表面分子(pan-Beta1-integrin-targeting cell surface molecule)インベイシンおよびそのいずれかの機能等価物を発現し、提示するミニ細胞を意味し、ミニ細胞は、さらに、パーフリンゴリジンO(PFO)を含む。
E247M、リステリオリジンO D320K、リステリオリジンO E247M、リステリオリジンO D320K、リステリオリジンO L461T、ストレプトリジンO、ストレプトリジンO c、ストレプトリジンO e、スファエリコリジン、アントロリジンO、セレオリジン、チューリンゲンシリジンO、ウエイヘンステファネンシリジン、アルベオリジン、ブレビリジン、ブチリクリジン、テタノリジンO、ノビイリジン、レクチノリジン、ニューモリジン、ミチリジン、シュードニューモリジン、スイリジン、インテルメジリジン、イバノリジン、セエリゲリオリジンO、バギノリジン、ピオリジン、お
よびパーフリンゴリジンOが挙げられる。ある実施形態では、コレステロール依存性細胞溶解素タンパク質は、ECTGLAWEWWR(配列番号1)のアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、コレステロール依存性細胞溶解素タンパク質は、WEWWRT(配列番号2)のアミノ酸配列を含む。
、マイクロRNA(miRNA)、リボソームRNA(rRNA)、ペプチド核酸(PNA)、DNA:RNAハイブリッド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、またはこれらのいずれかの組み合わせであってよい。
グメントは、トランスジェニック生物中においてRNAまたはタンパク質を産生する能力を保持していてよく、またはそれは、トランスジェニック生物の遺伝子コードの正常機能を改変してもよい。ある実施形態では、導入遺伝子は、それが遺伝子コード配列を含有するかどうかに関わらず、人工構築DNA配列であり、それは、導入遺伝子がこれまでに見出されていなかった生物中に導入される。
。
本出願は、免疫系を、前記免疫応答によって媒介される間接的抗癌効果を有するように刺激するための、生体外および生体内での細菌ミニ細胞の使用に関する。真正細菌ミニ細胞は、生細菌を模倣するが、生きてはおらず、感染性は持たず、従って、生細菌免疫調節療法と比較した場合に毒性が抑制されているという点で、免疫調節剤として明確な利点を有している。加えて、細菌ミニ細胞は、異なる分子成分を含有し、その各々が、選択的に特定の種類の免疫応答(すなわち、Th1対Th2)を高めるか、引き起こすか、またはそれ以外では刺激し得るように、遺伝子操作されてよい。本明細書で開示される細菌ミニ細胞は、いずれかの直接の抗腫瘍活性に加えて、間接的な抗癌活性を有する免疫応答を発生させるように設計される。ミニ細胞はまた、動物における免疫学的応答の開始、促進、支援、および維持に関与していることが知られている細胞型または組織を特異的に標的とすることもできる。本出願は、癌およびその他の疾患のための非生存免疫調節療法(non-living immunomodulatory therapies)としての細菌ミニ細胞の使用を提供する。
在する状態で組み合わせて単一の粒子とするように操作可能であることから、独特の形で生体内免疫調節剤として適する。このことは、生体内への投与後に、生細菌が分裂、存続、および未知量の免疫調節成分の新たな産生を継続することができる生細菌に基づく免疫療法とは、明らかに対照的である。生細菌免疫療法の存続および増殖は、感染、臓器不全、敗血症および死亡を含む多くの様々な合併症に繋がり得る。まとめると、ミニ細胞は、予防的および治療的医薬品用途の両方において免疫調節応答をその後に発生させるための種々の核酸、タンパク質、小分子薬物、およびこれらのいずれかの組み合わせを含む生物活性分子を、選択的に封入、結合、または吸収するように「操作」することができるものであり、前記免疫調節応答によって、疾患が予防、維持、および/または阻害されることが望ましい。
例えば、米国特許第7,183,105号には、L型細菌(外膜を持たない)からのミニ細胞の使用、ならびにプロトプラスト(外膜および細胞壁を持たない)の作製を含む、免疫応答を低減または回避するために用いられ得るいくつかの手法について記載されている。米国特許出願公開第20070298056号、同第20080051469号、および同第20070237744号に提供される例から、ミニ細胞媒体の表面に結合された既知の腫瘍選択的細胞表面受容体に対して選択的である抗体を用いた標的化が、抗腫瘍活性のために必要であることが示されている。さらに、これらの参考文献にも、非標的化ミニ細胞が用いられる場合、有意な抗腫瘍応答が観察されないことが示唆されている。その他の関連する研究において、MacDiarmidおよびその共同研究者らは、細胞傷害性薬物ペイロードを持たない非標的化ミニ細胞および腫瘍標的化ミニ細胞がいずれも、同様に抗腫瘍応答を発生させることができないこと、そして標的化抗体および細胞傷害性ペイロードの両方が必要であることを実証している(MacDiarmid, et al. Cancer Cell, 2007, Volume
11, p. 431-445)。加えて、MacDiarmid, et al.は、免疫系を回避することの有益性を
考察し、そのような回避を、設計に対する自身の理論的根拠の一部として記述し、従って、免疫調節治療剤としてのミニ細胞の使用を明確に阻害(teach away)している。対照的に、本開示は、例えば、強力で間接的な抗腫瘍活性を引き起こすことができる免疫調節治療剤としての細菌ミニ細胞の使用を提供している。例えば、本明細書で開示されるミニ細胞を用いて、被験者中に非免疫原性抗腫瘍免疫調節効果を誘導することができる。
)、粘膜固有層へ浸潤しているが筋肉はまだである、および上皮内癌である(扁平非浸潤性腫瘍)。各腫瘍型は、次に、増殖指標などを含む様々な因子に基づいて段階分けすることにより(グレード1〜3)さらに分類される。ステージおよびグレードに基づく低リスク疾患の標準治療は、経尿道的膀胱腫瘍切除術(TURBT)、およびこれに続く即時の化学療法剤の術後投与である。中リスク患者に推奨される標準治療は、TURBT、およびこれに続く即時の化学療法の術後実施(postoperative installation)、およびこれに続く化学療法による6週間の導入治療である。患者に化学療法が成功しない場合、2回目の膀胱鏡下切除術が実施され、患者には、マイコバクテリウム・ボビス、カルメット・ゲラン桿菌(BCG)の弱毒生菌株が、14日後に与えられる。即時術後実施のための化学療法剤の選択肢は、マイトマイシンCであるが、類似の効果を有する、ドキソルビシン、エピルビシン、バルルビシン、パクリタキセル、およびゲムシタビンはすべて用いられる。上皮内癌を示す患者を含む高リスク疾患の場合は、BCGが唯一の有効な薬剤である。BCG免疫調節治療は、中および高リスク集団において現在までに用いられてきた化学療法剤のいずれよりも遥かに優れているが、術後即時に投与することができないという点で制限される。TURBT手順の過程で膀胱に穿孔処理する場合、生BCGの全身吸収に伴うリスクが大き過ぎるため、BCG媒介による免疫調節は、観察される再発率という点で化学療法よりも遥かに優れた手法ではあるが、術後即時の状況でそれを用いる価値はない。従って、ほとんどの泌尿器科医は、BCGを投与するまで14日間待つ傾向にあり、その間に、推奨される即時術後実施が先に行われる。他方、予後は、やはり再発という点で、即時術後臨床治療のガイドラインを用いて治療を開始する場合、非常に良好である。合わせて考えると、BCGとは異なり、筋層非浸潤膀胱癌に対してTURBTを受けた患者に、術後直ちに投与することができる非生存免疫調節療法が明らかに求められている。さらに、BCGを受けた患者のおよそ30%が、毒性の副作用のために、自発的に治療法を中止している。毒性は、BCG生存率の関数であることが実証されている。従って、BCGと同じ免疫調節の有益性を付与することができるが、感染のリスクまたは生存率に関連する毒性は持たない治療剤が強く求められている。
ンテグリン標的化部分インベイシンを含有する多効果インテグリン標的化免疫調節ミニ細胞(multi-effect integrin-targeted immunomodulatory minicells)の使用は、それが
、インテグリンの標的化および送達による直接の腫瘍細胞殺傷効果、ならびに腫瘍内皮細胞殺傷効果の両方を引き起こすことができ、同時になお、免疫系によって機能される追加の間接的な抗腫瘍免疫調節効果も作用させることから、膀胱癌に有益である。膀胱癌における多効果インテグリン標的化細胞傷害性免疫調節ミニ細胞の限定されない1つの適用は、VAX‐IPの使用であり、これは、表面局在化インテグリン標的化部分インベイシンおよびパーフリンゴリジンOを含むミニ細胞である。VAX‐IPは、免疫調節療法および/または直接抗腫瘍/腫瘍内皮細胞療法として用いることができる。膀胱癌における多効果インテグリン標的化細胞傷害性免疫調節ミニ細胞の別の限定されない適用は、VAX‐IPDの使用であり、これは、表面局在化インテグリン標的化部分インベイシン、ジフテリア毒素の触媒断片、およびパーフリンゴリジンOを含むミニ細胞である。VAX‐IPDは、免疫調節療法および/または直接抗腫瘍/腫瘍内皮細胞療法として用いることができる。
spp.)、エルシニア属菌種、および大腸菌の浸潤菌株が挙げられるがこれらに限定され
ない天然浸潤菌株から産生されたものが挙げられる。これらの天然浸潤Th1免疫調節ミニ細胞は、真核細胞中へのミニ細胞の内部移行を刺激することができる天然ミニ細胞表面局在化リガンドを提示して、Th1優位の免疫治療応答の発生を補助する。当業者であれば、天然浸潤ミニ細胞が、それ自体は自然に存在するのではなく、本明細書で述べるミニ細胞作製のための遺伝子的手法の1つ以上を用いて細菌の非ミニ細胞産生浸潤菌株から操作されるものであることは理解される。
トリジウム毒素A、B、およびアルファ、リシン、志賀A毒素、志賀様A毒素、コレラA毒素、百日咳S1毒素、シュードモナス外毒素A、大腸菌熱不安定性毒素(LTB)、メリチン、リステリオリジンOのpH安定変異体(pH‐非依存性;アミノ酸置換 L461T)、リステリオリジンOの熱安定変異体(アミノ酸置換 E247M、D320K)、リステリオリジンOのpHおよび熱安定変異体(アミノ酸置換 E247M、D320K、およびL461T)、ストレプトリジンO、ストレプトリジンO c、ストレプトリジンO e、スファエリコリジン、アントロリジンO、セレオリジン、チューリンゲンシリジンO、ウエイヘンステファネンシリジン、アルベオリジン、ブレビリジン、ブチリクリジン、テタノリジンO、ノビイリジン、レクチノリジン、ニューモリジン、ミチリジン、シュードニューモリジン、スイリジン、インテルメジリジン、イバノリジン、セエリゲリオリジンO、バギノリジン、およびピオリジン、活性化カスパーゼ、プロカスパーゼ、サイトカイン、ケモカイン、細胞透過性ペプチド、ならびに前述の例のいずれかの組み合わせが挙げられる。(1もしくは複数の)ポリペプチドの組換え発現は、これらに限定されないが、プラスミド、コスミド、ファージミド、および細菌人工染色体(BAC)、ならびに前述の例のいずれかの組み合わせを含む本技術分野にて公知の種々のエピソーム組換え原核生物発現ベクターのいずれからの発現の結果であってもよい。同様に、組換え発現は、ミニ細胞産生親細胞染色体の1つ以上のコピーに存在する染色体に位置する原核生物発現カセットによって達成されてよい。天然浸潤Th1免疫調節ミニ細胞はまた、エンドソーム局在化トール様受容体3、7、8、および/または9を刺激してTh1免疫調節効果を向上させることが知られている1つ以上の免疫調節核酸を発現または含有するように操作されてもよい。そのような核酸としては、これらに限定されないが、一本鎖DNA、一本鎖RNA、二本鎖DNA、二本鎖RNA、DNAヘアピン、およびRNAへアピンが挙げられ、これらの各々は、当業者であれば容易に認識されるように、組換え発現することができる。ある実施形態では、天然浸潤Th1免疫調節ミニ細胞は、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第20100112670号のホーミングエンドヌクレアーゼ遺伝子自殺系を持つミニ細胞産生菌株から誘導される。そこに記載されているI‐ceuIホーミングエンドヌクレアーゼは、別々の保存部位におけるほとんどの細菌種の染色体を選択的に消化し、一方では、選択的に親細胞を殺傷するように働き、他方では、そのプロセスにおいて二本鎖DNA断片を作り出すように作用する。
、誘導性プロモーターの制御下で発現される。ある実施形態では、栄養素要求性は、必須代謝遺伝子の欠失または不活性化変異によるものである。ある実施形態では、欠失または不活性化変異は、dapA遺伝子またはその機能相同体に存在する。ある実施形態では、ミニ細胞産生細菌はさらに、リポポリサッカリド合成に関与する遺伝子産物をコードする遺伝子に、欠失または不活性化変異を含み、この遺伝子は、対応する野生型遺伝子と比較して遺伝子改変されている。ある実施形態では、不活性化された遺伝子は、対応する野生型細菌中のリピドA分子と比較して変更されたリピドA分子を細菌に産生させる遺伝子産物をコードするlpxM/msbBである。ある実施形態では、変更されたリピドA分子は、対応する野生型細菌中のリピドA分子と比較して、リポポリサッカリド分子のリピドA部分へのミリストレイン酸(myristolic acid)の付加という点が欠けている。ある実
施形態では、ミニ細胞産生細菌は、さらに、相同組換えに関与する遺伝子中に欠失または不活性化変異を含み、この遺伝子は、対応する野生型遺伝子と比較して遺伝子改変されており、ミニ細胞産生細菌は、DNA損傷修復を欠いており、遺伝子自殺機構からの回復のリスクが低減される。ある実施形態では、天然浸潤Th1免疫調節ミニ細胞産生細菌は、エルシニア属菌種、カンピロバクター属菌種(Campylobacter spp.)、シュードモナス属菌種(Pseudomonas spp.)、サルモネラ属菌種、シゲラ属菌種、リケッチア属菌種、および大腸菌の浸潤菌株が挙げられるがこれらに限定されないグラム陰性細菌である。ある実施形態では、天然浸潤Th1免疫調節ミニ細胞産生細菌は、マイコバクテリウム属菌種、ストレプトコッカス属菌種、リステリア・モノサイトゲネス、クラミジア属菌種、およびブルセラ属菌種(Brucella spp.)が挙げられるがこれらに限定されないグラム陽性細菌
である。
LFおよびEF、アデニル酸シクラーゼ毒素、ゲロニン、ボツリノリジンB、ボツリノリジンE3、ボツリノリジンC、ボツリヌス毒素、コレラ毒素、クロストリジウム毒素A、B、およびアルファ、リシン、志賀A毒素、志賀様A毒素、コレラA毒素、百日咳S1毒素、シュードモナス外毒素A、大腸菌熱不安定性毒素(LTB)、メリチン、リステリオリジンOのpH安定変異体(pH‐非依存性;アミノ酸置換 L461T)、リステリオリジンOの熱安定変異体(アミノ酸置換 E247M、D320K)、リステリオリジンOのpHおよび熱安定変異体(アミノ酸置換 E247M、D320K、およびL461T)、ストレプトリジンO、ストレプトリジンO c、ストレプトリジンO e、スファエリコリジン、アントロリジンO、セレオリジン、チューリンゲンシリジンO、ウエイヘンステファネンシリジン、アルベオリジン、ブレビリジン、ブチリクリジン、テタノリジンO、ノビイリジン、レクチノリジン、ニューモリジン、ミチリジン、シュードニューモリジン、スイリジン、インテルメジリジン、イバノリジン、セエリゲリオリジンO、バギノリジン、およびピオリジン、活性化カスパーゼ、プロカスパーゼ、サイトカイン、ケモカイン、細胞透過性ペプチド、ならびに前述の例のいずれかの組み合わせが挙げられる。(1もしくは複数の)ポリペプチドの組換え発現は、これらに限定されないが、プラスミド、コスミド、ファージミド、および細菌人工染色体(BAC)、ならびに前述の例のいずれかの組み合わせを含む本技術分野にて公知の種々のエピソーム組換え原核生物発現ベクターのいずれからの発現の結果であってもよい。同様に、組換え発現は、ミニ細胞産生親細胞染色体の1つ以上のコピーに存在する染色体に位置する原核生物発現カセットによって達成されてよい。組換え浸潤Th1免疫調節ミニ細胞はまた、エンドソーム局在化トール様受容体3、7、8、および/または9を刺激してTh1免疫調節効果を向上させることが知られている1つ以上の免疫調節核酸を発現または含有するように操作されてもよい。そのような核酸としては、これらに限定されないが、一本鎖DNA、一本鎖RNA、二本鎖DNA、直鎖状二本鎖DNA、二本鎖RNA、DNAヘアピン、およびRNAへアピンが挙げられ、これらの各々は、当業者であれば容易に認識されるように、組換え発現することができる。ある実施形態では、組換え浸潤Th1免疫調節ミニ細胞は、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第2010‐0112670号のホーミングエンドヌクレアーゼ遺伝子自殺系を持つミニ細胞産生菌株から誘導される。そこに記載されているI‐CeuIホーミングエンドヌクレアーゼは、別々の保存部位におけるほとんどの細菌種の染色体を選択的に消化し、一方では、選択的に親細胞を殺傷するように働き、他方では、そのプロセスにおいて二本鎖直鎖状DNA断片を作り出すように作用する。
V、I‐CsmI、I‐DmoI、I‐PorI、PI‐TliI、PI‐TliII、およびPI‐ScpIが挙げられる。ある実施形態では、エンドヌクレアーゼは、誘導性プロモーターの制御下で発現される。ある実施形態では、栄養素要求性は、必須代謝遺伝子における欠失または不活性化変異によるものである。ある実施形態では、欠失または不活性化変異は、dapA遺伝子またはその機能相同体に存在する。ある実施形態では、ミニ細胞産生細菌はさらに、リポポリサッカリド合成に関与する遺伝子産物をコードする遺伝子に、欠失または不活性化変異を含み、この遺伝子は、対応する野生型遺伝子と比較して遺伝子改変されている。ある実施形態では、不活性化された遺伝子は、対応する野生型細菌中のリピドA分子と比較して変更されたリピドA分子を細菌に産生させる遺伝子産物をコードするlpxM/msbBである。ある実施形態では、変更されたリピドA分子は、対応する野生型細菌中のリピドA分子と比較して、リポポリサッカリド分子のリピドA部分へのミリストレイン酸の付加という点が欠けている。ある実施形態では、ミニ細胞産生細菌は、さらに、相同組換えに関与する遺伝子中に欠失または不活性化変異を含み、この遺伝子は、対応する野生型遺伝子と比較して遺伝子改変されており、ミニ細胞産生細菌は、DNA損傷修復を欠いている。ある実施形態では、組換え浸潤Th1免疫調節ミニ細胞産生細菌は、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、ボルデテラ・パータシス(Bordetella
pertussis)、ブルセラ属菌種、フランシセラ・ツラレミア(Franciscella tularemia)、レジオネラ・ニューモフィリア(Legionella pneumophilia)、ナイセリア・メニンギ
ティディス(Neisseria meningitidis)、クリエブセラ(Kliebsella)、エルシニア属菌種、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、サルモネラ属菌種、シゲラ属菌種、シュードモナス属菌種、および大腸菌が挙げられるがこれらに限定されないグラム陰性細菌である。ある実施形態では、組換え浸潤Th1免疫調節ミニ細胞産生細菌は、スタフィロコッカス属菌種(Staphylococcus spp.)、ラクトバチルス
属菌種、ストレプトコッカス属菌種、バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)、ク
ロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)、およびバチルス・セレウス
(Bacillus cereus)が挙げられるがこれらに限定されないグラム陽性細菌である。
または安定化させることもできる組換え発現タンパク質毒素も含有してよい。好ましい組換え発現/産生タンパク質毒素は、パーフリンゴリジンOである。組換え非浸潤Th1免疫調節ミニ細胞を用いて利用されるその他の組換え発現/産生タンパク質毒素としては、これらに限定されないが、ジフテリア毒素の断片A/B、ジフテリア毒素の断片A、炭疽毒素LFおよびEF、アデニル酸シクラーゼ毒素、ゲロニン、ボツリノリジンB、ボツリノリジンE3、ボツリノリジンC、ボツリヌス毒素、コレラ毒素、クロストリジウム毒素A、B、およびアルファ、リシン、志賀A毒素、志賀様A毒素、コレラA毒素、百日咳S1毒素、シュードモナス外毒素A、大腸菌熱不安定性毒素(LTB)、メリチン、リステリオリジンOのpH安定変異体(pH‐非依存性;アミノ酸置換 L461T)、リステリオリジンOの熱安定変異体(アミノ酸置換 E247M、D320K)、リステリオリジンOのpHおよび熱安定変異体(アミノ酸置換 E247M、D320K、およびL461T)、ストレプトリジンO、ストレプトリジンO c、ストレプトリジンO e、スファエリコリジン、アントロリジンO、セレオリジン、チューリンゲンシリジンO、ウエイヘンステファネンシリジン、アルベオリジン、ブレビリジン、ブチリクリジン、テタノリジンO、ノビイリジン、レクチノリジン、ニューモリジン、ミチリジン、シュードニューモリジン、スイリジン、インテルメジリジン、イバノリジン、セエリゲリオリジンO、バギノリジン、およびピオリジン、活性化カスパーゼ、プロカスパーゼ、サイトカイン、ケモカイン、細胞透過性ペプチド、ならびに前述の例のいずれかの組み合わせが挙げられる。(1もしくは複数の)ポリペプチドの組換え発現は、これらに限定されないが、プラスミド、コスミド、ファージミド、および細菌人工染色体(BAC)、ならびに前述の例のいずれかの組み合わせを含む本技術分野にて公知の種々のエピソーム組換え原核生物発現ベクターのいずれからの発現の結果であってもよい。同様に、組換え発現は、ミニ細胞産生親細胞染色体の1つ以上のコピーに存在する染色体に位置する原核生物発現カセットによって達成されてよい。組換え非浸潤Th1免疫調節ミニ細胞はまた、エンドソーム局在化トール様受容体3、7、8、および/または9を刺激してTh1免疫調節効果を向上させることが知られている1つ以上の免疫調節核酸を発現または含有するように操作されてもよい。そのような核酸としては、これらに限定されないが、一本鎖DNA、一本鎖RNA、二本鎖DNA、直鎖状二本鎖DNA、二本鎖RNA、DNAヘアピン、およびRNAへアピンが挙げられ、これらの各々は、当業者であれば容易に認識されるように、組換え発現することができる。ある実施形態では、組換え非浸潤Th1免疫調節ミニ細胞は、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第2010‐0112670号に記載のホーミングエンドヌクレアーゼ遺伝子自殺系を持つミニ細胞産生菌株から誘導される。そこに記載されているI‐CeuIホーミングエンドヌクレアーゼは、別々の保存部位におけるほとんどの細菌種の染色体を選択的に消化し、一方では、選択的に親細胞を殺傷するように働き、他方では、そのプロセスにおいて二本鎖直鎖状DNA断片を作り出すように作用する。
ある実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ホーミングエンドヌクレアーゼである。ホーミングエンドヌクレアーゼの例としては、これらに限定されないが、I‐CeuI、PI‐SceI、I‐ChuI、I‐CpaI、I‐SceIII、I‐CreI、I‐MsoI、I‐SceII、I‐SceIV、I‐CsmI、I‐DmoI、I‐PorI、PI‐TliI、PI‐TliII、およびPI‐ScpIが挙げられる。ある実施形態では、エンドヌクレアーゼは、誘導性プロモーターの制御下で発現される。ある実施形態では、栄養素要求性は、必須代謝遺伝子における欠失または不活性化変異によるものである。ある実施形態では、欠失または不活性化変異は、dapA遺伝子またはその機能相同体に存在する。ある実施形態では、ミニ細胞産生細菌はさらに、リポポリサッカリド合成に関与する遺伝子産物をコードする遺伝子に、欠失または不活性化変異を含み、この遺伝子は、対応する野生型遺伝子と比較して遺伝子改変されている。ある実施形態では、不活性化された遺伝子は、対応する野生型細菌中のリピドA分子と比較して変更されたリピドA分子を細菌に産生させる遺伝子産物をコードするlpxM/msbBである。ある実施形態では、変更されたリピドA分子は、対応する野生型細菌中のリピドA分子と比較して、リポポリサッカリド分子のリピドA部分へのミリストレイン酸の付加という点が欠けている。ある実施形態では、ミニ細胞産生細菌は、さらに、相同組換えに関与する遺伝子中に欠失または不活性化変異を含み、この遺伝子は、対応する野生型遺伝子と比較して遺伝子改変されており、ミニ細胞産生細菌は、DNA損傷修復を欠いており、遺伝子自殺機構からの回復のリスクが低減される。ある実施形態では、組換え非浸潤Th1免疫調節ミニ細胞産生細菌は、エルシニア属菌種、カンピロバクター属菌種、シュードモナス属菌種、サルモネラ属菌種、シゲラ属菌種、リケッチア属菌種、および大腸菌の浸潤菌株が挙げられるがこれらに限定されないグラム陰性細菌である。ある実施形態では、組換え非浸潤Th1免疫調節ミニ細胞産生細菌は、マイコバクテリウム属菌種、ストレプトコッカス属菌種、リステリア・モノサイトゲネス、クラミジア属菌種、およびブルセラ属菌種が挙げられるがこれらに限定されないグラム陽性細菌である。
)、および大腸菌の非浸潤、接着性ならびに粘膜付着性(muco-adhesive)菌株が挙げら
れるがこれらに限定されない細菌の天然非浸潤、接着性または粘膜付着性菌株から産生されたものが挙げられる。これらの天然非浸潤Th2免疫調節ミニ細胞は、真核細胞中へのミニ細胞の内部移行を刺激することができる天然ミニ細胞表面局在化リガンドを提示しないが、それらは、マクロファージ、樹状細胞、および好中球などの構成的食作用免疫細胞によって貪食され得る。接着性および粘膜接着性Th2免疫調節ミニ細胞は、それぞれ、真核細胞の表面および粘膜表面への接着を刺激することができるミニ細胞表面局在化タンパク質を発現するが、マクロファージ、好中球、および樹状細胞などの通常は構成的に食作用性である細胞を除いて、認識可能な内部移行を引き起こさない。当業者であれば、天然非浸潤Th2免疫調節ミニ細胞、接着性Th2免疫調節ミニ細胞、および粘膜接着性Th2免疫調節ミニ細胞が、それ自体は自然に存在するのではなく、本明細書で述べるミニ細胞作製のための遺伝子的手法の1つ以上を用いて細菌の非ミニ細胞産生非浸潤、接着性、および粘膜接着性種から操作されるものであることは理解される。ストレプトコッカス属菌種、スタフィロコッカス属菌種、サルモネラ属菌種、シゲラ属菌種、ラクトバチルス属菌種、シュードモナス属菌種、クレブシエラ属菌種、および大腸菌の非接着性菌株は、細菌細胞表面接着因子のクローン化および組換え発現を、前記異種接着因子の発現の結果
として組換え接着性Th2免疫調節ミニ細胞が得られるようにして行うことにより、分子生物学および/または微生物遺伝学の当業者によって容易に操作されて、接着性とされる。
細胞は、プロテインAのFc結合部分を提示しない。
ゴリジンOの発現に加えて、インベイシンの機能発現および表面提示を行うことができる組換え発現カセットを含むVAX‐IPミニ細胞産生細菌を提供する。ある実施形態では、この細菌は、抗体または抗体のFc領域を含むその他の分子を提示せず、プロテインGまたはプロテインAのFc結合部分も提示しない。ある実施形態では、VAX‐IPミニ細胞産生細菌はさらに、(iii)異種エンドヌクレアーゼをコードし、このミニ細胞産生細菌の染色体が、そのエンドヌクレアーゼの1つ以上の認識部位を含んでいる発現可能「遺伝子自殺」遺伝子;(iv)定められた栄養素要求性;および(v)lpxM/msbB遺伝子(またはその他の機能等価物)における欠失または変異のうちの1つ以上を含む。ある実施形態では、ミニ細胞産生遺伝子は、細胞分裂遺伝子である。細胞分裂遺伝子の例としては、これらに限定されないが、ftsZ、sulA、ccdB、およびsfiCが挙げられる。ある実施形態では、ミニ細胞産生遺伝子は、誘導性プロモーターの制御下で発現される。ある実施形態では、エンドヌクレアーゼ自殺遺伝子は、ミニ細胞産生細菌の染色体上に位置する。ある実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ホーミングエンドヌクレアーゼである。ホーミングエンドヌクレアーゼの例としては、これらに限定されないが、I‐CeuI、PI‐SceI、I‐ChuI、I‐CpaI、I‐SceIII、I‐CreI、I‐MsoI、I‐SceII、I‐SceIV、I‐CsmI、I‐DmoI、I‐PorI、PI‐TliI、PI‐TliII、およびPI‐ScpIが挙げられる。ある実施形態では、エンドヌクレアーゼは、誘導性プロモーターの制御下で発現される。ある実施形態では、栄養素要求性は、必須代謝遺伝子における欠失または不活性化変異によるものである。ある実施形態では、欠失または不活性化変異は、dapA遺伝子またはその機能相同体に存在する。ある実施形態では、ミニ細胞産生細菌はさらに、リポポリサッカリド合成に関与する遺伝子産物をコードする遺伝子に、欠失または不活性化変異を含み、この遺伝子は、対応する野生型遺伝子と比較して遺伝子改変されている。ある実施形態では、不活性化された遺伝子は、対応する野生型細菌中のリピドA分子と比較して変更されたリピドA分子を細菌に産生させる遺伝子産物をコードするlpxM/msbBである。ある実施形態では、変更されたリピドA分子は、対応する野生型細菌中のリピドA分子と比較して、リポポリサッカリド分子のリピドA部分へのミリストレイン酸の付加という点が欠けている。ある実施形態では、ミニ細胞産生細菌は、さらに、相同組換えに関与する遺伝子中に欠失または不活性化変異を含み、この遺伝子は、対応する野生型遺伝子と比較して遺伝子改変されており、ミニ細胞産生細菌は、DNA損傷修復を欠いている。ある実施形態では、VAX‐IPミニ細胞産生細菌は、カンピロバクター・ジェジュニ、ヘモフィルス・インフルエンザエ、ボルデテラ・パータシス、ブルセラ属菌種、フランシセラ・ツラレミア、レジオネラ・ニューモフィリア、ナイセリア・メニンギティディス、クリエブセラ、エルシニア属菌種、ヘリコバクター・ピロリ、ナイセリア・ゴノレア、レジオネラ・ニューモフィラ、サルモネラ属菌種、シゲラ属菌種、シュードモナス・エルジノーサ、および大腸菌が挙げられるがこれらに限定されないグラム陰性細菌である。ある実施形態では、VAX‐IPミニ細胞産生細菌は、スタフィロコッカス属菌種、ラクトバチルス属菌種、ストレプトコッカス属菌種、バチルス・スブチリス、クロストリジウム・ディフィシル、およびバチルス・セレウスが挙げられるがこれらに限定されないグラム陽性細菌である。
れた栄養素要求性;および(v)lpxM/msbB遺伝子(またはその他の機能等価物)における欠失または変異のうちの1つ以上を含む。ある実施形態では、ミニ細胞産生遺伝子は、細胞分裂遺伝子である。細胞分裂遺伝子の例としては、これらに限定されないが、ftsZ、sulA、ccdB、およびsfiCが挙げられる。ある実施形態では、ミニ細胞産生遺伝子は、誘導性プロモーターの制御下で発現される。ある実施形態では、エンドヌクレアーゼ自殺遺伝子は、ミニ細胞産生細菌の染色体上に位置する。ある実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ホーミングエンドヌクレアーゼである。ホーミングエンドヌクレアーゼの例としては、これらに限定されないが、I‐CeuI、PI‐SceI、I‐ChuI、I‐CpaI、I‐SceIII、I‐CreI、I‐MsoI、I‐SceII、I‐SceIV、I‐CsmI、I‐DmoI、I‐PorI、PI‐TliI、PI‐TliII、およびPI‐ScpIが挙げられる。ある実施形態では、エンドヌクレアーゼは、誘導性プロモーターの制御下で発現される。ある実施形態では、栄養素要求性は、必須代謝遺伝子における欠失または不活性化変異によるものである。ある実施形態では、欠失または不活性化変異は、dapA遺伝子またはその機能相同体に存在する。ある実施形態では、ミニ細胞産生細菌はさらに、リポポリサッカリド合成に関与する遺伝子産物をコードする遺伝子に、欠失または不活性化変異を含み、この遺伝子は、対応する野生型遺伝子と比較して遺伝子改変されている。ある実施形態では、不活性化された遺伝子は、対応する野生型細菌中のリピドA分子と比較して変更されたリピドA分子を細菌に産生させる遺伝子産物をコードするlpxM/msbBである。ある実施形態では、変更されたリピドA分子は、対応する野生型細菌中のリピドA分子と比較して、リポポリサッカリド分子のリピドA部分へのミリストレイン酸の付加という点が欠けている。ある実施形態では、ミニ細胞産生細菌は、さらに、相同組換えに関与する遺伝子中に欠失または不活性化変異を含み、この遺伝子は、対応する野生型遺伝子と比較して遺伝子改変されており、ミニ細胞産生細菌は、DNA損傷修復を欠いている。ある実施形態では、VAX‐IPDミニ細胞産生細菌は、カンピロバクター・ジェジュニ、ヘモフィルス・インフルエンザエ、ボルデテラ・パータシス、ブルセラ属菌種、フランシセラ・ツラレミア、レジオネラ・ニューモフィリア、ナイセリア・メニンギティディス、クリエブセラ、エルシニア属菌種、ヘリコバクター・ピロリ、ナイセリア・ゴノレア、レジオネラ・ニューモフィラ、サルモネラ属菌種、シゲラ属菌種、シュードモナス・エルジノーサ、および大腸菌が挙げられるがこれらに限定されないグラム陰性細菌である。ある実施形態では、VAX‐IPDミニ細胞産生細菌は、スタフィロコッカス属菌種、ラクトバチルス属菌種、ストレプトコッカス属菌種、バチルス・スブチリス、クロストリジウム・ディフィシル、およびバチルス・セレウスが挙げられるがこれらに限定されないグラム陽性細菌である。
グフレームは、同じエピソーム発現コンストラクト上に存在しても、または別々の異なるエピソーム発現コンストラクト上に存在してもよい。所望されるタンパク質成分の産生は、誘導性原核生物プロモーターの制御下に置かれてよく、または別の選択肢として、構成的に活性である原核生物プロモーター系の制御下に置かれてもよい。当業者であれば、本発明での使用に利用可能である原核生物プロモーター系を容易に認識するであろう。プロモーター系の例としては、これらに限定されないが、IPTG誘導性Lac系およびその数々の誘導体、L‐ラムノース誘導性pRHA系、L‐アラビノース誘導性pBAD系、T7ポリメラーゼ系、CI857ts系などが挙げられる。VAX‐IPミニ細胞産生菌株およびそこからVAX‐IPミニ細胞を作製することの1つの限定されない実施形態は、実施例6および図8に示される。
ミニ細胞製剤は、有害な副作用を引き起こさないように、または意図するミニ細胞活性に干渉しないように、残留生存親細胞数が可能な限り低い製剤ということになる。安全性を最大化し、いずれの混入親細胞の生存性による毒性をも制限するために、本明細書で開示されるミニ細胞は、以下で開示される3つの安全機能のうちの1つ以上を例とする安全機能を含むミニ細胞産生菌株から誘導される。ある実施形態では、ミニ細胞産生菌株は、これら3つの相乗効果的安全機能を少なくとも含む。第一は、ミニ細胞形成工程の完了後、残留生存親細胞を、溶解することなく(および遊離リポサッカリドを排出することなく)殺傷する遺伝子自殺機構である。本出願は、米国特許出願公開第20100112670号に記載のように、適切な誘導因子に暴露されると修復不能な損傷をミニ細胞産生親細胞の染色体に導入する制御された遺伝子自殺機構の使用を取り入れる。自殺機構は、親細胞の染色体に修復不能な二本鎖の破壊を導入するように働き、ミニ細胞精製を改善するための従来の分離技術への補助として用いることができる。第二の安全機能は、必須ではないが好ましくはジアミノピメリン酸(DAP)生合成経路における、最も好ましくは大腸菌ミニ細胞産生菌株のdapA遺伝子における、定められた栄養素要求性である。DAP栄養素要求性(dapA‐)を示す大腸菌のミニ細胞産生菌株は、DAPの補充なしでは実験室外で生存することができない。さらに、DAPは、ヒトを含む哺乳類には見られず、そのため、ミニ細胞製品中に存在するいかなるミニ細胞産生親細胞も、環境中または生体内で生存することができない。この主題に関して、異なるグラム陰性およびグラム陽性細菌に対して多くの変更が存在する。例えば、サルモネラ属菌種では、芳香族アミノ酸生合成経路の栄養素要求性(aro遺伝子)が、実質的に同じ結果をもたらす。シゲラ属菌種の場合は、グアニン生合成経路の栄養素要求性が、実質的に同じ結果をもたらす。第三の安全機能は、所望に応じて存在してよいものであり、大腸菌ミニ細胞産生菌株におけるlpxM遺伝子の欠失を伴う。lpxM遺伝子の欠失の結果、解毒リポポリサッカリド(LPS)分子の産生を得ることができる。lpxM遺伝子(msbB遺伝子とも称される)は、LPS分子のリピドA部分に末端ミリストレイン酸基を付加するように機能するものであり、この基の除去の結果(lpxM遺伝子の消失による)、LPSの顕著な解毒が得られる。具体的には、解毒は、LPSへの暴露に応答する炎症性サイトカインの産生の減少として特徴付けられる。当業者であれば、LPSの解毒形態を用いてもサイトカインが作り出されることは理解される。解毒は、産生されるサイトカインのレベルを制御するだけであり、それによって、急性敗血症様炎症応答を抑制することが可能となり、同時により強力なTh1および/またはTh2免疫応答を、明らかな毒性なしに達成することができる。この欠失は、いかなるグラム陰性またはグラム陽性ミニ細胞産生菌株のいかなる機能的に等価である遺伝子へも導入して、同じ効果を達成することができる。向上された安全プロファイルにより、感染のリスクおよび敗血症を発症する可能性を低減すること、他の細菌との組換えイベントを通しての遺伝子復帰の可能性を低下させること、およびホストでの挿入イベントのリスクを最小限に抑えることができる。法規制および製造の観点から、抗生物質抵抗性マーカーがミニ細胞産生親細胞株の細菌染色体から排除されることも好ましい。ヒトにおける使用に関する米国食品医薬品局(FDA)によって課される規制要件に従うには、ほとんどの抗生物質抵抗性遺伝子マーカーは、細菌のミニ細胞産生菌株での使用が望ましくない。最終品がヒトでの使用を意図している場合にFDAによって認められているのは、細菌または細菌の生産株を選別する目的でのカナマイシン抵抗性遺伝子マーカーの使用だけである。
ラノシド(IPTG)、ラムノース、アラビノース、キシロース、フルクトース、メリビオース、およびテトラサイクリンから選択される1つ以上の化学化合物の存在によって誘導される。ある実施形態では、遺伝子自殺エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子の発現は、温度の変化によって誘導される。ある実施形態では、この方法は、さらに、組成物から免疫調節ミニ細胞を精製することを含む。ある実施形態では、免疫調節ミニ細胞は、これらに限定されないが、遠心分離、ろ過、限外ろ過、超遠心分離、密度勾配、免疫親和性、免疫沈降、および前述の精製方法のいずれかの組み合わせを含む群から選択されるプロセスによって親細胞から実質的に分離される。
ミニ細胞は、正常細胞分裂装置の破壊後に細菌によって形成される非染色体性の膜封入生物学的ナノ粒子である(菌株型および用いられる増殖条件に応じて、直径およそ250〜500nm)。本質的には、ミニ細胞は、染色体DNAを含有しないこと以外は正常細菌細胞の小代謝活性レプリカであり、このため、非分裂性および非生存性である。ミニ細胞は、染色体DNAを含有しないが、プラスミドDNA、RNA、天然および/または組換え発現タンパク質、ならびにその他の代謝物はすべて、ミニ細胞中に隔離されることが示されている。
ミニ細胞産生に用いることができる。例えば、サルモネラ属菌種およびシゲラ属菌種などのその他の腸内細菌科ファミリーメンバー、ならびにシュードモナス属菌種などのその他のクラスメンバーでの大腸菌ftsZ遺伝子の過剰発現が、類似レベルのミニ細胞産生をもたらすことが示されている。
Zがマルチコピープラスミド上に位置する菌株の場合よりも産生されるミニ細胞の数が増加すること、およびフィラメント状フェノタイプが広範囲ではなくなることが示されてきた。従って、(1もしくは複数の)好ましい組成物は、染色体上に組み込まれたftsZの重複コピー(duplicate, chromosomally integrated copy of ftsZ)からftsZ遺伝子を誘導的に過剰発現するミニ細胞産生菌株である。用いられる重複ftsZ遺伝子は、ミニ細胞産生フェノタイプが操作されている細菌種から直接誘導することができ、また、他の細菌種からのftsZ遺伝子配列から誘導することもできる。限定されない例として、大腸菌のftsZ遺伝子の過剰発現を用いて、大腸菌およびサルモネラ・チフィリウム(Salmonella typhimurium)からミニ細胞を作製することができる。得られた菌株は、染色体上の野生型ftsZ遺伝子、およびftsZ遺伝子の別個の重複性および誘導性コピー、ならびにその全内容が本明細書に援用される米国特許出願公開第2010/0112670号に記載の(1もしくは複数の)誘導性遺伝子自殺機構を含む。限定されない例として、腸内細菌科においてミニ細胞を産生させるために過剰発現させることができる分裂
遺伝子としては、これらに限定されないが、ftsZ、minE、sulA、ccdB、およびsfiCが挙げられる。好ましい組成物は、誘導性プロモーターの制御下にあり、所定の真正細菌株の染色体へ安定的に組み込まれた(1もしくは複数の)細胞分裂遺伝子の(1もしくは複数の)重複コピーを有するべきである。当業者であれば、誘導性細胞分裂遺伝子カセットが、プラスミド、コスミド、細菌人工染色体(BAC)、組換えバクテリオファージ、または細胞中に存在するその他のエピソームDNA分子上に存在する場合、同じ戦略が与えられ得ることは容易に理解される。
ミニ細胞は、病原性または日和見病原性である一部の細菌から誘導されるため、いかなる混入親細胞も、投与の前に、所定の集団から機能的に排除されることが最大限に重要である。従来から、生存親細胞は、物理的手段または生物学的手段またはその両方によって排除されてきた。
ルの溶解を達成することもできる。いずれの手法も、それを達成するために用いられる方法に関わらず、溶解イベントが許容されない量の遊離内毒素を媒体中へ排出するという事実によって制限される。そのような大量の遊離内毒素を除去することは、時間が掛かり、ロット間の変動の影響を受け、最終的にはコストが非常に高くなってしまう。
産生およびそれに続く精製の後、VAX‐IP、VAX‐IPT、VAX‐IPP、VAX‐IPD、VAX‐IPG、VAX‐IPPA、およびVAX‐IPRミニ細胞を、ベータ1‐インテグリンの高められた発現および/または活性を有し、生体内で疾患に関与する特定の細胞型を標的とし、そのタンパク質毒素ペイロードを、標的とされた組織、器官、および細胞型へ選択的に、およびより効率的に送達するための標的化送達媒体として用いることができる。本明細書で開示される標的化VAX‐IP、VAX‐IPT、VAX‐IPP、VAX‐IPD、VAX‐IPG、VAX‐IPPA、およびVAX‐IPRミニ細胞は、インテグリンα3β1、インテグリンα4β1、インテグリンα5β1、インテグリンα6β1、インテグリンαvβ1、およびインテグリンβ1が挙げられるがこれらに限定されない真核生物癌細胞特異的表面抗原へ標的化することができる。以下でより詳細に述べるように、これらのベータ1インテグリンファミリーメンバーの発現および/または活性レベルは、正常組織および脈管構造における低レベル、非活性化、および/またはリガンド占有ベータ1インテグリンと比較して、多くの固形腫瘍型、ならびに腫瘍脈管構造で見出される。
真正細菌ミニ細胞は、動物にとっての治療、予防、または診断上の有益性を持ついくつかのクラスの生物活性化合物を封入し、送達することができる。ミニ細胞による送達が可能である生物活性化合物(ペイロード)の種類としては、これらに限定されないが、小分子(小分子薬物を含む)、核酸、ポリペプチド、放射性同位元素、脂質、リポポリサッカリド、およびこれらのいずれかの組み合わせが挙げられる。
るか、またはその他の治療目的で(標的細胞、組織、器官、もしくは動物における酵素の供給または回復など)作用することができる。タンパク質は、その他の種類のペイロードのエンドサイトーシス後における細胞内移行を補助することができる。例えば、リステリア・モノサイトゲネスからのリステリオリジンOなどのタンパク質を用いて、標的細胞の(1もしくは複数の)エンドサイトーシスコンパートメントから標的細胞のサイトゾルへの(1もしくは複数の)ミニ細胞ペイロードの移行を促進することができる。タンパク質はまた、プロドラッグ変換酵素であってもよい。1つの限定されない好ましい組換え発現/産生タンパク質毒素は、パーフリンゴリジンOである。標的化ミニ細胞によって送達されるその他の組換え発現/産生治療ポリペプチドとしては、これらに限定されないが、タンパク質毒素、コレステロール依存性細胞溶解素、機能性酵素、抗体模倣物、タンパク質/タンパク質相互作用破壊物質(protein/protein interaction disrupters)、活性化カスパーゼ、プロカスパーゼ、サイトカイン、ケモカイン、細胞透過性ペプチド、および前述のいずれかの組み合わせが挙げられる。(1もしくは複数の)治療ポリペプチドの組換え発現は、これらに限定されないが、プラスミド、コスミド、ファージミド、および細菌人工染色体(BAC)、ならびに前述のいずれかの組み合わせを含む本技術分野にて公知の種々のエピソーム組換え原核生物発現ベクターのいずれからの発現の結果であってもよい。同様に、組換え発現は、ミニ細胞産生親細胞染色体の1つ以上のコピーに存在する染色体に位置する原核生物発現カセットによって達成されてよい。種々の免疫調節ミニ細胞成分(これらに限定されないが、パーフリンゴリジンOおよびインベイシンが挙げられる)の組換え産生は、当業者に公知の組換え発現法のいずれの組み合わせによって促進されてもよい。限定されない例として、組換え発現は、染色体に位置し、インベイシンなどの特定のタンパク質成分をコードする操作可能に連結されたオープンリーディングフレームから促進することができる。免疫調節ミニ細胞のタンパク質成分の組換え発現は、プラスミド、コスミド、ファージミド、および細菌人工染色体(BAC)などの1つ以上のエピソーム原核生物発現コンストラクトの使用によって促進することができる。最終免疫調節ミニ細胞産物の個々の所望されるタンパク質成分をコードする操作可能に連結された原核生物オープンリーディングフレームは、同じエピソーム発現コンストラクト上に存在しても、または別々の異なるエピソーム発現コンストラクト上に存在してもよい。所望されるタンパク質成分の産生は、誘導性原核生物プロモーターの制御下に置かれてよく、または別の選択肢として、構成的に活性である原核生物プロモーター系の制御下に置かれてもよい。当業者であれば、使用することができる原核生物プロモーター系を容易に認識するであろう。プロモーター系の例としては、これらに限定されないが、IPTG誘導性Lac系およびその数々の誘導体、L‐ラムノース誘導性pRHA系、L‐アラビノース誘導性pBAD系、T7ポリメラーゼ系、CI857ts系などが挙げられる。限定されない例として、VAX‐IPミニ細胞産生菌株およびそこからVAX‐IPミニ細胞を作製する具体的な方法は、実施例6および図8として含まれる。
レプトリジン、オオムギ毒素(barley toxin)、メリチン、炭疽毒素LFおよびEF、アデニル酸シクラーゼ毒素、ボツリノリジンB、ボツリノリジンE3、ボツリノリジンC、ボツリヌス毒素A、コレラ毒素、クロストリジウム毒素A、B、およびアルファ、リシン、志賀A毒素、志賀様A毒素、コレラA毒素、百日咳S1毒素、大腸菌熱不安定性毒素(LTB)、リステリオリジンOのpH安定変異体(pH‐非依存性;アミノ酸置換 L461T)、リステリオリジンOの熱安定変異体(アミノ酸置換 E247M、D320K)、リステリオリジンOのpHおよび熱安定変異体(アミノ酸置換 E247M、D320K、およびL461T)、ストレプトリジンO、ストレプトリジンO c、ストレプト
リジンO e、スファエリコリジン、アントロリジンO、セレオリジン、チューリンゲンシリジンO、ウエイヘンステファネンシリジン、アルベオリジン、ブレビリジン、ブチリクリジン、テタノリジンO、ノビイリジン、レクチノリジン、ニューモリジン、ミチリジン、シュードニューモリジン、スイリジン、インテルメジリジン、イバノリジン、セエリゲリオリジンO、バギノリジン、ならびにピオリジンが挙げられる。タンパク質毒素は、当業者の判断により、ミニ細胞の異なる細胞内コンパートメントに局在化されてよい。本明細書で開示される標的化ミニ細胞が、グラム陰性親ミニ細胞産生菌株から誘導される場合、それから産生される組換え発現治療ポリペプチドは、サイトゾル、内膜の内層(inner leaflet)、内膜の外層、ペリプラズム、外膜の内層、ミニ細胞の外膜、および前述の
いずれかの組み合わせに局在化されてよい。本明細書で開示される標的化ミニ細胞が、グラム陽性親ミニ細胞産生菌株から誘導される場合、それから産生される組換え発現治療ポリペプチドは、サイトゾル、細胞壁、膜の内層、ミニ細胞の膜、および前述のいずれかの組み合わせに局在化されてよい。
本出願はまた、医薬組成物が挙げられるがこれに限定されない組成物にも関する。本明細書で用いられる「組成物」の用語は、少なくとも1つのキャリア、好ましくは生理学的に許容されるキャリア、および1つ以上のミニ細胞組成物を含む混合物を意味する。本明細書で用いられる「キャリア」の用語は、(1もしくは複数の)生物活性ペプチドの細胞または組織への取り込みを阻害または阻止しない化学化合物を意味する。キャリアは、通常、活性成分を適切な剤形(例:丸剤、カプセル、ゲル、フィルム、錠剤、マイクロ粒子(例:マイクロスフィア)、溶液;軟膏;ペースト、エアロゾル、液滴、コロイド、またはエマルジョンなど)へ製剤化または配合することを可能とする不活性物質である。「生理学的に許容されるキャリア」は、化合物の生物学的活性および特性を抑止(減少、阻害、または阻止)することのない、生理学的条件下での使用に適するキャリアである。例えば、ジメチルスルホキシド(DMSO)は、生物の細胞または組織中への多くの有機化合物の取り込みを促進することから、キャリアである。好ましくは、キャリアは、生理学的に許容されるキャリアであり、好ましくは、薬理学的に、または獣医学的に許容されるキャリアであり、ミニ細胞組成物がその中に配置される。
ましい緩衝溶液の限定されない例は、リン酸緩衝生理食塩水であり(特に、医薬投与を意図する組成物と組み合わされる)、それは、これがヒト血液の塩条件を模倣するものであるからである。緩衝塩は、低濃度にて溶液のpHを制御することができることから、緩衝希釈剤が所定の化合物または医薬組成物の生物活性を改変することはほとんどない。
される場合、そのようなカプセルは、腸溶コーティングを例とする1つ以上の追加の材料でコーティングされてもよい。液体製剤としては、水性製剤、ゲル、およびエマルジョンが挙げられる。
ば、状況に依存して異なる機能性要素は、固体、溶液、エマルジョン、分散体などの形態で、丸剤、カプセル、錠剤、坐薬、エアロゾル、液滴、またはスプレー中に組み込まれて送達されてよい。丸剤、錠剤、坐薬、エアロゾル、粉末、液滴、およびスプレーは、複雑な多層構造を有し、広い範囲のサイズを有し得る。エアロゾル、粉末、液滴、およびスプレーは、小サイズ(1ミクロン)から大サイズ(200ミクロン)の範囲であり得る。
マンノース、アラビアガム、ゼラチン、マンニトール、デンプンペースト、三ケイ酸マグネシウム、タルク、トウモロコシデンプン、ケラチン、コロイド状シリカ、ジャガイモデンプン、尿素、中鎖長トリグリセリド、デキストラン、および製剤の製造での使用に適するその他のキャリアが挙げられる。加えて、補助剤、安定化剤、増粘剤、および着色剤、ならびに香料も用いられてよい。安定化乾燥剤の例としては、トリウロースが挙げられ、好ましくは0.1%以上の濃度である(例えば、米国特許第5,314,695号を参照)。活性化合物は、疾患のプロセスまたは状態に対して所望される効果を発生させるのに充分な量で医薬組成物中に含まれる。
本開示は、固形腫瘍、転移性腫瘍、および液性腫瘍を含むがこれらに限定されない(1もしくは複数の)癌に対するミニ細胞媒介免疫療法に関する。固形および転移性腫瘍としては、上皮、線維芽細胞、筋肉、および骨に由来する腫瘍が挙げられ、これらに限定されないが、乳癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、精巣癌、卵巣癌、胃癌、腸癌、口腔癌、舌癌、咽頭癌、肝臓癌、肛門癌、直腸癌、結腸癌、食道癌、膀胱癌、胆嚢癌、皮膚癌、子宮癌、膣癌、陰茎癌、および腎臓癌が挙げられる。本明細書で開示される免疫調節ミニ細胞で治療され得るその他の固形癌型としては、これらに限定されないが、腺癌、肉腫、線維肉腫、ならびに眼、脳、および骨の癌が挙げられる。本明細書で開示される免疫調節ミニ細胞で治療され得る液性腫瘍としては、これらに限定されないが、非ホジキンリンパ腫、骨髄腫、ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、およびその他の白血病が挙げられる。
ある実施形態は、限定されないが、腸内細菌科細菌から、最適化された菌株を作り出すこと、および免疫調節ミニ細胞を作製することに関する。
パーフリンゴリジンOは、表1および図2に示されるように、VAX‐IPミニ細胞によって標的化され、送達される場合、生体外において細胞傷害性である。96ウェルプレートに、10% ウシ胎仔血清、ペニシリン、およびストレプトマイシンを含有するRPMI‐1640中の25000個のマウス移行細胞癌細胞株MB49を播種することによ
り、生体外実験を実施した。翌日、VAX‐IP、VAX‐I(パーフリンゴリジンO非含有)、または組換えパーフリンゴリジンO(BTX‐100、ATCCより購入)の細胞への添加を、播種された哺乳類細胞あたりの添加されたVAX‐IPおよびVAX‐Iミニ細胞の比(MOI) 1000:1で行った。添加されたBTX‐100の濃度は、VAX‐IPによって送達されるパーフリンゴリジンOの量と同等とした。最初に、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)活性アッセイを、細胞傷害性の代替読み取り(surrogate readout)として用いたが、それは、主として、LDH活性が、パーフリンゴリジンOの作
用機構であると報告されている哺乳類細胞膜漏出(mammalian cell membrane leakage)
の周知の指標であるからである。予想された通り、図1に示されるように、マウス乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)は、BTX‐100への暴露のほとんど直後に、MB49細胞から放出された。1000:1のMOIでのVAX‐IPで処理されたMB49細胞も、LDH活性を示したが、放出の開始はよりゆっくりであり、それは、VAX‐IPミニ細胞の内部移行、エンドソーム分解の開始、およびパーフリンゴリジンOによって媒介されるエンドソーム膜破壊による標的細胞中への最終的なパーフリンゴリジンOの放出が必要であることに起因する可能性が高い。コントロールとして用いたVAX‐Iミニ細胞は、LDHの有意な放出を示さなかった。驚くべきことに、BTX‐100で処理した細胞は、24時間の時点までに回復し、完全に生存および接着性であったことが続いて見出された。他方、VAX‐IPミニ細胞で処理したMB49細胞は、プレートから脱離し、死滅したように見えた。この結果を確認するために、様々なVAX‐IPミニ細胞を様々な濃度のBTX‐100と比較する同じ実験を再度行ったが、この場合は、標準的なMTT細胞生存性アッセイを、24時間の時間点で実施した。図2に示されるこれらの実験の結果は、通常は無毒性であるパーフリンゴリジンOの濃度の細胞内送達が、ミニ細胞によって送達された場合は、強い効力を持ち得ることを明らかに示している。
パーフリンゴリジンOを含有するミニ細胞が生体内において抗腫瘍免疫調節活性を刺激することの第一の証拠は、胸腺欠損ヌードマウス(ヌードマウスは、部分的に免疫が破壊されており、T細胞活性を完全に欠いている)で実施されたヒト異種移植研究から得られた。ヒト膵癌細胞株BxPC3を用いた皮下異種移植研究において、q3dスケジュールで合計6回の静脈内投与を行った場合、VAX‐IPミニ細胞の抗腫瘍有効性が示された(図3参照)。このモデルでは、腫瘍細胞をヌードマウスに皮下移植し、100mm3の
サイズとし、その後、無作為に処理グループに分けた。腫瘍を持つマウスを、生理食塩水媒体、パクリタキセル、3.0×108 「裸(naked)」ミニ細胞(インベイシンまた
はパーフリンゴリジンOを含有しない大腸菌ミニ細胞)、3.0×108 VAX‐Pミニ細胞(ミニ細胞表面にインベイシンタンパク質を含有しない)、または3.0×108
VAX‐IPミニ細胞のいずれかにより、q3dスケジュールでの合計6回の静脈内投与で処理した。驚くべきことに、非標的化コントロールグループ、VAX‐Pミニ細胞(ミニ細胞表面にインベイシンタンパク質を含有しない)は、このモデルでの腫瘍成長の阻止において、VAX‐IPミニ細胞と同様に有効であり、一方「裸」ミニ細胞は有効ではなかった。ミニ細胞媒体の表面上に腫瘍標的化部分が存在しない場合での抗腫瘍活性は、まったく予想外であった。
パーフリンゴリジンOを含有するミニ細胞が生体内において抗腫瘍免疫調節活性を刺激することの第二の証拠は、B16F10マウスメラノーマ細胞株を用いた肺および卵巣転移の同系マウスモデルから得られた。このモデルでは、ホタルルシフェラーゼを構成的に発現するB16F10マウスメラノーマ細胞を、雌ヌードマウスに尾静脈注射した。マウスに、3日ごとにルシフェリンを注射し、マウスの肺における確立された転移の存在について、全身マウス画像化によって動物の画像分析を行った。腫瘍の確立が確認されると、マウスを無作為にコントロールグループへと分け、生理食塩水媒体または3.0×108
VAX‐IPDミニ細胞のいずれかを、qd3投与スケジュールで合計6回静脈内投与した。肺および卵巣転移に対する有意な抗腫瘍活性が、VAX‐IPDミニ細胞処理マウスで観察された(図4参照)。同じモデルおよび投与スケジュールを用いた第二の並行定量的VAX‐IPDプラスミド特異的PCRに基づく体内分布研究において、発明者らは、VAX‐IPDがマウスの肺および肺腫瘍に局在化していることを見出した。驚くべきことに、試験を行ったいずれの時間点においても、VAX‐IPDミニ細胞は、卵巣または卵巣腫瘍に局在化していなかった(図5参照)。これら2つの結果を合わせると、VAX‐IPDミニ細胞が、卵巣の組織または腫瘍に局在化していないのに、その器官部位において強い腫瘍抑制効果を有する場合、1つ以上の免疫因子である可能性が高い何らかの包括的因子が、抗腫瘍活性に寄与しているに違いないと結論付けられた。
上記実施例2および3で行われた生体内実験の観察結果に基づいて、同系B16F10マウスメラノーマモデルの確立された皮下腫瘍変動を用い、完全な免疫能を持つC57/BL6マウスにおけるVAX‐IPDミニ細胞の抗腫瘍有効性を、重度に免疫欠損したNIH‐IIIマウス(C57/BL6と同じ遺伝的背景であるが、T細胞およびナチュラルキラー細胞活性の両方を欠いている)における抗腫瘍活性と比較する第三の実験を行った。腫瘍が100mm3のサイズまで成長した後、マウスを無作為に処理グループに分け、生理食塩水または3.0×108 VAX‐IPDミニ細胞のいずれかにより、q3dスケジュールでの合計6回の静脈内投与で処理した。最終投与の後、マウスを安楽死させ、腫瘍を外科的に摘出し、秤量し、腫瘍負荷をスコア化した。図6に示す結果から、VAX‐IPDミニ細胞が、重度に免疫が破壊されたマウスでは有効ではないことが示される。
筋層非浸潤性膀胱癌のマウスモデルにおいてVAX‐IPミニ細胞が作用する能力を、図7に示す。この実験では、免疫能を持つ雌C57/BL6マウスに麻酔をかけ、膀胱へのカテーテル処置を施し、膀胱壁を、白金ガイドワイヤに取り付けられ、カテーテルを通して挿入された電気外科手術装置(Bovie 940、5Wに設定)を用いて2つの別々の部位において麻痺させた。焼灼後、膀胱を50uLのPBSでリンスし、次に100000のMB49マウス移行細胞癌腫瘍細胞を、カテーテルを通して注入した。カテーテ
ルを2時間その位置に固定して、膀胱壁への腫瘍接着を確保した。カテーテルを取り外し、動物を麻酔から回復させた。腫瘍を検出することができるまで、膀胱の触診によって動物を毎日モニタリングし、その時点で、動物を無作為に処理グループに分けた。次に、マウスに、生理食塩水、5×107 VAX‐IPミニ細胞、または1×108 VAX‐IPミニ細胞のいずれかを、尿路カテーテルを通して、q3dスケジュールで合計5回膀胱内投与した。次に、動物を安楽死させ、膀胱を切除し、秤量し、腫瘍負荷をスコア化した。この結果から、このモデルにおける確立されたMB49膀胱癌に対するVAX‐IPミニ細胞の用量依存的抗腫瘍効果が示される。
VAX‐IPミニ細胞の作製は、プラスミドpVX‐336(配列番号3)のクローン化から開始する。pVX‐336(プラスミドマップを図9に示す)を、L‐ラムノース誘導性プラスミドpVX‐128(配列番号4、プラスミドマップを図10に示す)のSalIおよびXbaI部位へインベイシンを方向性サブクローン化(directionally subcloning)することで構築した。陽性クローンの識別後、特有のXbaIおよびBamHI部位へのパーフリンゴリジンOの続いての方向性サブクローン化を行い、インベイシンとパーフリンゴリジンOとの間での転写融合物を作り出した(インベイシンおよびパーフリンゴリジンOの2つのタンパク質をコードする単一の原核生物メッセージRNA)。pVX‐336の陽性配列の識別後、このプラスミドを、大腸菌のIPTG誘導性ミニ細胞産生菌株に導入した(図8の概略図の工程1、および図11のIPTGによる誘導後にミニ細胞を産生する実際の菌株を参照)。この菌株は、熱誘導性I‐ceuI自殺遺伝子の染色体コピー、dapA遺伝子における欠失(実験室外または哺乳類中での親菌株の成長を不能とする)、およびlpxM遺伝子における欠失(リポポリサッカリドのリピドA成分を弱毒化する)も含有する。プラスミドの導入、ならびに10ug/mL ジアミノピメリン酸および50ug/mL カナマイシン含有LB寒天上での選別の後、単一コロニーを用いて、同じものを含有する液体LB培地中、30℃で成長させる一晩の培養を開始する。翌日、スターター培養物を、10ug/mL ジアミノピメリン酸および50ug/mL カナマイシン含有の新しいLB培地3L中に1/100で希釈し、振とうしながら30℃で成長させる。培養物の濁度を、光学密度600(OD600)によってモニタリングする。OD600が0.1の時点で、L‐ラムノースを最終濃度90uMまで添加することにより、培養物に、pVX‐336からのインベイシンおよびパーフリンゴリジンOの発現を誘導する。OD600が1.0の時点で、IPTGを最終濃度100uMまで添加することにより、培養物にVAX‐IPミニ細胞の形成を誘導する。培養物を、一晩定常期まで成長させ、翌日、本技術分野での標準であるように、分画遠心分離工程の組み合わせ、およびそれに続く密度勾配精製を用いて、VAX‐IPミニ細胞を精製する。精製後、赤血球溶血アッセイによってPFO含有量および活性についての試験を、ならびに一次検出抗体がインベイシンに特異的なマウスモノクローナル抗体IgG2b(mAb3A2)であるウェスタンブロットによってインベイシンの存在についての試験を、ミニ細胞に行う(溶血アッセイおよびウェスタンブロットについては図12を参照)。赤血球溶血アッセイは、VAX‐IPミニ細胞を、2mM EDTA、10ug/mL リゾチーム、5mM システインの組み合わせによって溶解し、続いて氷冷蒸留水による浸透圧ショックによって行う。溶解後、ライセートをタンパク質数について定量し、適切な量を、96ウェルプレート中の100000のヒツジ赤血球に添加する。プレートを、激しく振とうしながら、37℃にて1時間インキュベートする。1時間のインキュベーション時間の後、赤血球を、1000xGで5分間遠心分離し、溶血活性の尺度としての波長541nmでのヘモグロビン放出分析のために、上澄みを新しい96ウェルプレートに移す。
Claims (50)
- コレステロール依存性細胞溶解素タンパク質を含み、抗体、または抗体のFc領域を含むその他の分子を提示しない、細菌ミニ細胞。
- 前記コレステロール依存性細胞溶解素タンパク質が、リステリオリジンO、リステリオリジンO L461T、リステリオリジンO E247M、リステリオリジンO D320K、リステリオリジンO E247M、リステリオリジンO D320K、リステリオリジンO L461T、ストレプトリジンO、ストレプトリジンO c、ストレプトリジンO e、スファエリコリジン(sphaericolysin)、アントロリジンO(anthrolysin O
)、セレオリジン(cereolysin)、チューリンゲンシリジンO(thuringiensilysin O)
、ウエイヘンステファネンシリジン(weihenstephanensilysin)、アルベオリジン(alveolysin)、ブレビリジン(brevilysin)、ブチリクリジン(butyriculysin)、テタノリ
ジンO(tetanolysin O)、ノビイリジン(novyilysin)、レクチノリジン(lectinolysin)、ニューモリジン(pneumolysin)、ミチリジン(mitilysin)、シュードニューモリ
ジン(pseudopneumolysin)、スイリジン(suilysin)、インテルメジリジン(intermedilysin)、イバノリジン(ivanolysin)、セエリゲリオリジンO(seeligeriolysin O)、バギノリジン(vaginolysin)、およびピオリジン(pyolysin)から選択される、請求項
1に記載のミニ細胞。 - 前記コレステロール依存性細胞溶解素タンパク質が、パーフリンゴリジンOである、請求項1に記載のミニ細胞。
- 前記コレステロール依存性細胞溶解素タンパク質が、配列番号1のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のミニ細胞。
- さらにインベイシンを含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のミニ細胞。
- 前記ミニ細胞がインベイシンを含まない、請求項1〜4のいずれか一項に記載のミニ細胞。
- さらにTh1サイトカインを含む、請求項1から6のいずれか一項に記載のミニ細胞。
- 前記Th1サイトカインが、IL‐2、GMCSF、IL‐12p40、IL‐12p70、IL‐18、TNF‐α、およびIFN‐γから選択される、請求項7に記載のミニ細胞。
- さらにTh2サイトカインを含む、請求項1から8のいずれか一項に記載のミニ細胞。
- 前記Th2サイトカインが、IL‐1α、IL‐1β、IL‐4、IL‐5、IL‐6、IL‐10、およびIL‐13から選択される、請求項9に記載のミニ細胞。
- さらにホスホリパーゼを含む、請求項1から10のいずれか一項に記載のミニ細胞。
- 前記ホスホリパーゼが、PC‐PLCおよびPI‐PLCから選択される、請求項11に記載のミニ細胞。
- さらに、ジフテリア毒素の断片A/B、ジフテリア毒素の断片A、炭疽毒素LFおよびEF、アデニル酸シクラーゼ毒素、ゲロニン、ボツリノリジンB、ボツリノリジンE3、ボツリノリジンC、ボツリヌス毒素、コレラ毒素、クロストリジウム毒素A、B、および
アルファ、リシン、志賀A毒素、志賀様A毒素、コレラA毒素、百日咳S1毒素、シュードモナス外毒素A、大腸菌熱不安定性毒素(LTB)、メリチン、活性化カスパーゼ、プロカスパーゼ、サイトカイン、ケモカイン、細胞透過性ペプチド、ならびにこれらの組み合わせから選択されるタンパク質毒素を含む、請求項1から12のいずれか一項に記載のミニ細胞。 - 前記ミニ細胞が、その他のいずれの治療活性部分も含まない、請求項1から13のいずれか一項に記載のミニ細胞。
- 前記ミニ細胞が、治療小分子、その他のいずれの治療タンパク質、または治療核酸も含まない、請求項14に記載のミニ細胞。
- 前記ミニ細胞が、プロテインGまたはプロテインAのFc結合部分を提示しない、請求項1から15のいずれか一項に記載のミニ細胞。
- 隔壁形成、二分裂、および染色体分離のうちの1つ以上を調節するミニ細胞産生遺伝子産物をコードする発現可能遺伝子;ならびに
コレステロール依存性細胞溶解素タンパク質の機能発現が可能である組換え発現カセットを含み、抗体、または抗体のFc領域を含むその他の分子を提示せず、かつ、プロテインGまたはプロテインAのFc結合部分も提示しない、ミニ細胞産生細菌。 - 異種エンドヌクレアーゼをコードし、前記ミニ細胞産生細菌の染色体が、前記エンドヌクレアーゼの1つ以上の認識部位を含んでいる発現可能「遺伝子自殺(genetic suicide
)」遺伝子;
定められた栄養素要求性;および
lpxM/msbB遺伝子における欠失または変異
をさらに含む、請求項17に記載のミニ細胞産生細菌。 - 前記エンドヌクレアーゼが、I‐CeuI、PI‐SceI、I‐ChuI、I‐CpaI、I‐SceIII、I‐CreI、I‐MsoI、I‐SceII、I‐SceIV、I‐CsmI、I‐DmoI、I‐PorI、PI‐TliI、PI‐TliII、およびPI‐ScpIから選択される、請求項18に記載のミニ細胞産生細菌。
- 前記栄養素要求性が、必須代謝遺伝子における欠失または不活性化変異によるものである、請求項18または19に記載のミニ細胞産生細菌。
- 前記ミニ細胞産生遺伝子産物をコードする前記発現可能遺伝子が、ftsZ、sulA、ccdB、およびsfiCから選択される、請求項17〜20のいずれか一項に記載のミニ細胞産生細菌。
- 前記コレステロール依存性細胞溶解素タンパク質が、リステリオリジンO、リステリオリジンO L461T、リステリオリジンO E247M、リステリオリジンO D320K、リステリオリジンO E247M、リステリオリジンO D320K、リステリオリジンO L461T、ストレプトリジンO、ストレプトリジンO c、ストレプトリジンO e、スファエリコリジン、アントロリジンO、セレオリジン、チューリンゲンシリジンO、ウエイヘンステファネンシリジン、アルベオリジン、ブレビリジン、ブチリクリジン、テタノリジンO、ノビイリジン、レクチノリジン、ニューモリジン、ミチリジン、シュードニューモリジン、スイリジン、インテルメジリジン、イバノリジン、セエリゲリオリジンO、バギノリジン、およびピオリジンから選択される、請求項1〜21のいずれか一項に記載のミニ細胞産生細菌。
- 前記コレステロール依存性細胞溶解素タンパク質が、パーフリンゴリジンOである、請求項17〜21のいずれか一項に記載のミニ細胞産生細菌。
- 前記コレステロール依存性細胞溶解素タンパク質が、配列番号1を含む、請求項17〜21のいずれか一項に記載のミニ細胞産生細菌。
- インベイシンの機能発現が可能である組換え発現カセットをさらに含む、請求項17〜24のいずれか一項に記載のミニ細胞。
- 必要とする患者に、コレステロール依存性細胞溶解素タンパク質を含む細菌ミニ細胞を投与することを含み、前記投与により、非免疫原性抗腫瘍免疫調節効果が誘導される、癌を治療する方法。
- 前記ミニ細胞が、抗体、または抗体のFc領域を含むその他の分子を提示しない、請求項26に記載の方法。
- 前記コレステロール依存性細胞溶解素タンパク質が、リステリオリジンO、リステリオリジンO L461T、リステリオリジンO E247M、リステリオリジンO D320K、リステリオリジンO E247M、リステリオリジンO D320K、リステリオリジンO L461T、ストレプトリジンO、ストレプトリジンO c、ストレプトリジンO e、スファエリコリジン、アントロリジンO、セレオリジン、チューリンゲンシリジンO、ウエイヘンステファネンシリジン、アルベオリジン、ブレビリジン、ブチリクリジン、テタノリジンO、ノビイリジン、レクチノリジン、ニューモリジン、ミチリジン、シュードニューモリジン、スイリジン、インテルメジリジン、イバノリジン、セエリゲリオリジンO、バギノリジン、およびピオリジンから選択される、請求項26または27に記載の方法。
- 前記コレステロール依存性細胞溶解素タンパク質が、パーフリンゴリジンOである、請求項26または27に記載の方法。
- 前記コレステロール依存性細胞溶解素タンパク質が、配列番号1を含む、請求項26または27に記載の方法。
- 前記ミニ細胞が、インベイシンをさらに含む、請求項26〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ミニ細胞が、インベイシンを含まない、請求項26〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ミニ細胞が、Th1サイトカインをさらに含む、請求項26〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Th1サイトカインが、IL‐2、GMCSF、IL‐12p40、IL‐12p70、IL‐18、TNF‐α、およびIFN‐γから選択される、請求項33に記載の方法。
- 前記ミニ細胞が、Th2サイトカインをさらに含む、請求項26〜34のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Th2サイトカインが、IL‐1α、IL‐1β、IL‐4、IL‐5、IL‐6、IL‐10、およびIL‐13から選択される、請求項35に記載の方法。
- 前記ミニ細胞が、ホスホリパーゼをさらに含む、請求項26〜36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ホスホリパーゼが、PC‐PLCおよびPI‐PLCから選択される、請求項37に記載の方法。
- 前記ミニ細胞が、さらに、ジフテリア毒素の断片A/B、ジフテリア毒素の断片A、炭疽毒素LFおよびEF、アデニル酸シクラーゼ毒素、ゲロニン、ボツリノリジンB、ボツリノリジンE3、ボツリノリジンC、ボツリヌス毒素、コレラ毒素、クロストリジウム毒素A、B、およびアルファ、リシン、志賀A毒素、志賀様A毒素、コレラA毒素、百日咳S1毒素、シュードモナス外毒素A、大腸菌熱不安定性毒素(LTB)、メリチン、活性化カスパーゼ、プロカスパーゼ、サイトカイン、ケモカイン、細胞透過性ペプチド、ならびにこれらの組み合わせから選択されるタンパク質毒素を含む、請求項26〜38のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ミニ細胞が、その他のいずれの治療活性部分も含まない、請求項26〜39のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ミニ細胞が、治療小分子、その他のいずれの治療タンパク質、または治療核酸も含まない、請求項40に記載の方法。
- 前記ミニ細胞が、プロテインGまたはプロテインAのFc結合部分を提示しない、請求項26〜41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記癌が、固形腫瘍、転移性腫瘍、または液性腫瘍を含む、請求項26〜42のいずれか一項に記載の方法。
- 前記癌が、上皮、線維芽細胞、筋肉、または骨に由来する癌である、請求項26〜42のいずれか一項に記載の方法。
- 前記癌が、乳癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、精巣癌、卵巣癌、胃癌、腸癌、口腔癌、舌癌、咽頭癌、肝臓癌、肛門癌、直腸癌、結腸癌、食道癌、胆嚢癌、皮膚癌、子宮癌、膣癌、陰茎癌(penal)、および腎臓癌から選択される、請求項26〜42のいずれか一項に
記載の方法。 - 前記癌が、膀胱癌である、請求項26〜42のいずれか一項に記載の方法。
- 前記癌が、腺癌、肉腫、線維肉腫、ならびに眼、脳、および骨の癌から選択される、請求項26〜42のいずれか一項に記載の方法。
- 前記癌が、非ホジキンリンパ腫、骨髄腫、ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、および慢性骨髄性白血病から選択される、請求項26〜42のいずれか一項に記載の方法。
- 前記投与により、Th1優位の免疫応答(Th1-dominated immune response)が発生す
る、請求項26〜48のいずれか一項に記載の方法。 - 前記投与により、Th2優位の免疫応答が発生する、請求項26〜48のいずれか一項に記載の方法。
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