KR20220092529A - Nk 세포 수용체 결합을 위한 다중 리간드와 접합된 나노입자를 사용하는 암 치료 방법 및 조성물 - Google Patents

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KR20220092529A
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앤드류 왕
킨 만 아유
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더 유니버시티 오브 노쓰 캐롤라이나 엣 채플 힐
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Abstract

본 발명은 NK 세포 표면 상의 제1 표적에 결합하는 적어도 하나의 제1 표적화제, 및 암 세포 표면 상의 제2 표적에 결합하는 적어도 하나의 제2 표적화제를 포함하는 입자를 포함하는 방법 및 조성물을 제공하며, 상기 제2 표적화제는 제1 표적화제와 상이하다.

Description

NK 세포 수용체 결합을 위한 다중 리간드와 접합된 나노입자를 사용하는 암 치료 방법 및 조성물
우선권 진술
본 출원은 미국 특허법 35 U.S.C. § 119(e) 하에 2019년 10월 18일자로 출원된 미국 임시 출원 제 62/923,060 호의 이익을 주장하며, 이의 전체 내용은 본원에 인용되어 포함된다.
정부 후원 진술
본 발명은 국립 보건원(National Institutes of Health)에서 수여한 승인 번호 제 CA198999 호에 따라 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 가지고 있다.
기술 분야
본 발명은 면역 조절 및 암 면역요법에 관한 것이다.
암을 치료하기 위해 환자 자신의 면역계를 활용하는 암 면역요법은 암 치료의 강력한 새로운 전략으로 부상하였다. 암 면역요법의 발전은 대부분 암을 근절하기 위해 적응 면역계를 활용하는데 중점을 두고 있지만, 항-종양 면역을 형성하기 위해 선천 면역 반응의 힘을 이용하는 것에 대한 관심이 증가하고 잇다. 초기 상관 연구는 적응 면역계에 대한 저항 기작 중에서, 종양 세포가 적응 면역계를 무효화하는 돌연변이를 통해 적응 면역계를 회피할 수 있음을 입증하였다. 선천성 면역계의 주요 작용자(key actor)는 자연 살해(NK: Natural Killer) 세포로서, 이는 1차 방어 역할을 한다. 적응 면역 세포(예컨대, T- 및 B-세포)와는 달리, NK 세포는 신생항원 없이도 암 세포에 대한 자발적인 세포용해 활성을 나타낸다.
NK 세포 활성화는 종종 하나 초과의 공동-자극 분자(예컨대, CD16 및 4-1BB)의 활성화를 수반하며, NK 세포-매개 항암 면역은 종종 NK 세포-활성화 리간드의 불량한 발현과 MHC I 및 암 세포에 대한 다른 동시-억제 분자의 과발현에 의해 방해를 받는다. 최근 몇 년 동안, NK 세포와 종양 세포를 표적화하는 몇몇 이중특이성 항체가 참여(engagement) 및 세포독성을 촉진하기 위해 성공적으로 조작되어 왔지만, 이의 번역은 표적 내, 종양 외 부작용으로 인해 방해를 받는다. 보다 중요하게는, 이러한 이중특이성은 하나의 NK 활성화 리간드만 포함하므로, NK 활성화를 제한한다.
본 발명은 NK 세포 표면 상의 표적에 결합하는 적어도 하나의 제1 표적화제와 암 세포 표면 상의 표적에 결합하는 적어도 하나의 제2 표적화제를 포함하는 나노입자, 및 이의 사용 방법을 제공함으로써 당업계의 단점을 극복한다.
본 발명은 암을 치료하고, 암 세포에서 세포독성을 유도하고, NK 세포 면역 반응을 유도하고, NK 세포를 활성화하고/하거나, 암 세포에 치료제를 전달하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
따라서, 본 발명의 일 양태는 NK 세포 표면 상의 제1 표적에 결합하는 적어도 하나의 제1 표적화제; 및 암 세포 표면 상의 제2 표적에 결합하는 적어도 하나의 제2 표적화제를 포함하는 나노입자를 제공하며, 상기 제2 표적화제는 제1 표적화제와 상이하다.
본 발명의 나노입자를 포함하는 조성물(예컨대, 약학 조성물)이 본원에 또한 제공된다.
본 발명의 추가 양태는 제1 표적화제가 NK 표면 상의 제1 표적에 결합하는 조건 하에 본 발명의 나노입자 및/또는 조성물을 NK 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, NK 세포의 활성화 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 양태는 제1 표적화제가 NK 표면 상의 제1 표적에 결합하는 조건 하에 본 발명의 나노입자 및/또는 조성물을 NK 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, NK 세포 면역 반응의 유도 방법을 제공한다.
본 발명의 추가 양태는 제2 표적화제가 암 세포 표면 상의 제2 표적에 결합하는 조건 하에 본 발명의 나노입자 및/또는 조성물을 암 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 암 세포에서 세포독성을 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명의 추가 양태는 제2 표적화제가 암 세포 표면 상의 제2 표적에 결합하여 치료제를 암 세포에 전달하는 조건 하에 치료제를 포함하는 본 발명의 나노입자 및/또는 조성물을 암 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 치료제를 암 세포에 전달하는 방법을 제공한다.
본 발명의 추가 양태는 제1 표적화제가 NK 세포의 표면 상의 제1 표적에 결합하는 조건 하에 유효량의 본 발명의 나노입자 및/또는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 NK 세포 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명의 추가 양태는 제1 표적화제가 NK 세포의 표면 상의 제1 표적에 결합하는 조건 하에 유효량의 본 발명의 나노입자 및/또는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 NK 세포를 활성화 하는 방법을 제공한다.
본 발명의 추가 양태는 제2 표적화제가 암 세포의 표면 상의 제2 표적에 결합하는 조건 하에 유효량의 본 발명의 나노입자 및/또는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 추가 양태는 제1 표적화제가 NK 세포의 표면 상의 제1 표적에 결합하고 제2 제제가 암 세포의 표면 상의 제2 표적에 결합하는 조건 하에 유효량의 본 발명의 나노입자 및/또는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 추가 양태는 제2 표적화제가 암 세포의 표면 상의 제2 표적에 결합하여 대상체의 암 세포에 치료제를 전달하는 조건 하에, 유효량의 본 발명의 나노입자 및/또는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하고, 상기 나노입자 및/또는 조성물은 치료제를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 암 세포에 치료제를 전달하는 방법을 제공한다.
추가로 본 발명의 나노입자 및/또는 조성물을 포함하는 키트; NK 세포 활성화에서 본 발명의 나노입자 및/또는 조성물의 사용 방법, 암 세포에서 세포독성 유도 방법, 암 세포에 치료제를 전달하는 방법, 및/또는 암 치료 방법; 및 본 발명의 입자 및/또는 조성물을 포함하는 사용을 위한 약제 제조가 제공된다.
본 발명의 이들 및 다른 양태가 하기 본 발명의 상세한 설명에서 보다 상세하게 다루어진다.
도 1a 내지 도 1d는 EGFR-표적화된 3가 나노인게이저(nanoengager)의 작용 기작 및 특성분석을 도시한다. 도 1a는 전신 투여 후 EGFR-과발현된 암에 대한 EGFR-표적화된 3가 나노인게이저의 작용 기작의 만화 설명을 도시한다. 도 1b 내지 도 1c는 EGFR-표적화된 무약물(drug-free) 및 EPI-캡슐화된 나노인게이저(α-EGFRα-CD16/α-4-1BB NP)의 대표적인 투과 전자 현미경(TEM: transmission electron microscope) 영상(도 1b) 및 수-평균 입자(DN) 분포 곡선(도 1c)을 도시한다. 도 1d는 무항체(antibody-free) EPI NP 및 α-EGFR/α-CD 16/α-4-1BB EPI NP(n = 3)의 pH-의존적 시험관 내 약물 방출 동역학을 도시한다.
도 2는 상이한 무약물(drug-free) 및 EPI-캡슐화된 NP의 대표적인 TEM 영상을 도시한다.
도 3은 0.1 M 포스페이트 완충된 염수(PBS: phosphate buffered saline) 중의 나노입자 분산액에서 나노입자-추적 분석(NTA)에 의해 결정된 상이한 무약물 및 EPI-캡슐화된 NP의 수-평균 입자 직경(DN) 분포 곡선을 도시한다. 모든 측정은 5가지 개별적인 측정의 평균을 기초로 한다.
도 4a 내지 도 4b는 상이한 생리학적 조건 하에 비-표적화된 EPI NP, α-EGFR EPI NP, 및 α-EGFR/α-CD16/α-4-1BB EPI NP의 시험관 내 약물 방출 동역학을 도시한다. 도 4a는 pH 6.0 및 7.0(37℃에서)에서 과량의 0.1 M PBS 중에서 인큐베이션한 후 비-작용화되고 상이한 항체-작용화된 EPI-캡슐화된 NP에 대해 기록된 시간-의존적 UV-가시광선 스펙트럼을 도시한다. 나노입자 농도는 2 mg/mL였다. 모든 측정은 3가지 개별적인 측정의 평균을 기초로 한다. 도 4b는 비-표적화되고 상이한 EGFR-표적화된 EPI NP의 시험관 내 약물 방출 프로파일을 도시한다.
도 5a 내지 도 5f는 EGFR-표적화된 삼작용화된(trifunctionalized) 나노인게이저의 물리화학적 특성을 도시한다. 도 5a 내지 도 5b는 FITC-표지된 (i) α-CD16 NP, (ii) α-4-1BB NP, (iii) α-EGFR NP, (iv) α-CD16/α-4-1BB NP, 및 (v) α-EGFR/α-CD16/α-4-1BB NP와 함께 인큐베이션 한 후 CD3- CD49b+ 확장된 뮤린 NK 세포의 대표적인 CLSM 영상(도 5a) 및 FACS 히스토그램(도 5b)을 도시한다. 도 5c는 FITC-표지된 α-EGFR NP, α-CD16/α-4-1BB NP, 및 α-EGFR/α-CD16/α-4-1BB NP(n = 3)와 함께 인큐베이션한 후 EGFR-과발현된 HT29, MB468, 및 A431 세포의 대표적인 FACS 히스토그램을 도시한다. 도 5d는 FACS에 의해 정량화된, EGFR-음성 Raji 세포에 대한 상이한 항체-작용화된 FITC-표지된 NP의 결합 친화도를 도시한다. 도 5e는 초기 처리 후 3일에 MTS 분석에 의해 평가된, (i) HT29, (ii) MB468, 및 (iii) A431 세포에 대한 유리(free) EPI, 비-표적화된 EPI NP, 및 상이한 항체-작용화된 EPI NP의 직접적인 시험관 내 독성을 도시한다. 도 5f는 상이한 EPI 처리에 의해 유도된 DNA 손상을 도시한다. 500 nM의 상이한 EPI 제형으로 1시간 동안 처리한 후 α-γ-H2AX(PE-표지됨)-염색된 HT29, MB468, 및 A431 세포의 대표적인 FACS 히스토그램. 처리된 세포를 세척하고, 24시간 더 배양한 다음, FACS에 적용하였다. DNA 손상을 정량화하기 위해, 처리된 세포를 고정하고 PE-표지된 α-γ-H2AX로 염색하기 전에 투과시켰다.
도 6a 내지 도 6h는 나노인게이저가 NK 세포를 활성화시켜 시험관 내에서 암 세포를 공격한다는 것을 보여준다. 도 6a는 α-CD16, α-4-1BB, α-CD16 NP, α-4-1BB NPs, 및 이들의 1 : 1 조합, 및 α-CD16/α-4-1BB NP로 전처리한 NK 세포의 시험관 내 세포독성을 도시한다. 표적 세포에 대한 효과기(effector) 세포(E/T) 비율은 1 : 1이었다. 세포독성을 처리 후 24시간에 측정하였다. 데이터를 평균 ± SEM(n = 6)으로 표시한다. 통계학적 유의성을 2-원 ANOVA에 이어 Tukey's HSD 사후 검정으로 계산하였다. *p < 0.05. 도 6b는 항체-전처리된 NK 세포와 함께 24시간 동안 공동-배양한 후 (비-조사된) B16F10-Luc 세포의 생물형광의 정량화를 도시한다. NK 세포를 37℃에서 30분 동안 유리(free) 또는 NP-접합된 α-CD16 및/또는 α-4-1BB(1 × 106 NK 세포 당 각 항체 1 μg의 농도로)로 전처리하고 1회 세척한 다음 1 : 1 효과기/표적 비율로 씨딩된 B16F10-Luc 세포(웰 당 2 × 104 세포)와 함께 공동-배양하였다. Bright-GloTM 루시퍼라제 시약(n = 6)과 함께 인큐베이션한 후 살아있는 세포는 강력한 생물형광 신호를 나타낸다. 도 6c는 항체-전처리된 NK 세포와 함께 24시간 동안 공동-배양한 후 조사된 B16F10-Luc 세포의 생물형광 정량화를 도시한다. B16F10-Luc 세포를 5 Gy 세슘-137 조사에 3시간 동안 적용하고 항체 전처리된 NK 세포와 함께 공동-배양하였다. NK 세포를 37℃에서 30분 동안 1 × 106 NK 세포 당 1 μg의 각 항체 농도로 유리(free) 또는 NP-접합된 α-CD16 및/또는 α-4-1BB로 전처리하고, 1회 세척하고 1 : 1 효과기/표적 비율로 씨딩된 B16F10-Luc 세포(웰 당 2 × 104 세포)와 함께 공동-배양하였다. Bright-GloTM 루시퍼라제 시약(n = 6)과 함께 인큐베이션한 후 살아있는 세포는 강력한 생물형광 신호를 나타낸다. 도 6d는 α-CD16 및 α-4-1BB, α-CD16 NP, α-4-1BB NP, 및 α-CD16/α-4-1BB NP로 전처리된 NK 세포와 인큐베이션한 후 비-조사된 B16F10 세포 및 5 Gy 조사된 B16F10 세포의 대표적인 위상-민감성 광학 영상을 나타낸다. E/T 비율은 1 : 1이었다. 비결합된 NK 세포를 세척하여 제거하고 영상화하였다. 도 6e는 α-CD16, α-4-1BB, α-CD16/α-4-1BB NP(유리 α-EGFR 또는 α-EGFR NP가 있거나 없음), α-EGFR/α-CD16/α-4-1BB NP(유리 EPI 또는 EPI NP가 있거나 없음), 및 α-EGFR/α-CD16/α-4-1BB EPI NP로 전처리된 HT29-Luc2 세포에 대한 NK 세포의 시험관 내 세포독성을 도시한다. 처리 후 24시간에 세포독성을 정량화하였다. E/T 비율은 1 : 1이었다. 데이터를 평균 ± SEM(n = 6)으로 표시한다. 통계학적 유의성을 2-원 ANOVA에 이어 Tukey's HSD 사후 검정으로 계산하였다. *p < 0.05. 도 6f는 E/T = 1 : 1로 확장된 NK 세포와 함께 공동-배양하기 전에 상이한 면역요법제로 처리된 후 HT29-Luc2 세포의 생물형광의 정량화를 도시한다. 좌측 패널: 1시간 동안 상이한 면역요법제로 처리하고 세척한 후 완전 배지(NK 세포의 부재 하에)에서 3일 동안 추가 배양한 후 HT29-Luc2 세포의 생물형광. 면역요법제의 용량은 600 nM의 유리/캡슐화된 EPI와 함께 공동-처리하거나 공동-처리하지 않은 1 × 104 세포(각 웰에서) 당 10 ng의 각 항체였다. 세포 생존력을 Bright-GloTM 루시퍼라제 시약으로 정량화하였다. 루시퍼라제 분석(n = 6)으로 인큐베이션한 후 살아있는 세포는 강력한 생물형광 신호를 나타낸다. 우측 패널: 상이한 면역요법제로 1시간 동안 처리하고, 세척하고 E/T = 1 : 1로 NK 세포와 함께 3일 동안 공동-배양한 후 HT29-Luc2 세포의 생물형광 영상. 면역요법제의 용량은 600 nM의 유리/캡슐화된 EPI와 함께 공동-처리하거나 공동-처리하지 않은 1 × 104 세포(각 웰에서) 당 10 ng의 각 항체였다. 세포 생존력을 Bright-GloTM 루시퍼라제 시약으로 정량화하였다. 루시퍼라제 분석(n = 6)으로 인큐베이션한 후 살아있는 세포는 강력한 생물형광 신호를 나타낸다. 도 6g는 NK 세포(1 : 1 효과기/표적 비율로)의 존재 또는 부재 하에 무약물 또는 EPI 캡슐화된 α-EGFR/α-CD16/α-4-1BB NP(600 nM의 캡슐화된 EPI 또는 동량의 무약물 NP 함유)로 처리한 후 3일에 기록된 HT29, MB468, 및 A431 세포의 생존력을 도시한다. 데이터를 평균 ± SEM(n = 8)으로 표시한다. 통계학적 유의성을 2-원 ANOVA에 이어 Tukey's HSD 사후 검정으로 계산하였다. *p < 0.05. 도 6h는 준-치료 용량(sub-therapeutic doses)의 EPI-캡슐화된 삼작용화된 나노인게이저(α-EGFR/α-CD16/α-4-1BB NP)로 전처리하고 NK 세포와 공동 배양한 HT29, MB468, A431 세포의 생존력을 도시한다. 세포(MB468 및 HT29 세포의 경우 웰 당 1 × 104 세포, A431 세포의 경우 웰 당 5 × 103 세포)를 1.2 μg의 무약물 또는 EPI-캡슐화된 α-EGFR/α-CD16/α-4-1BB NP로 1시간 동안 처리하고, 세척한 다음 E/T = 1 : 1 비율로 NK 세포와 함께 공동-배양하였다. MTS 분석을 첨가한 후 HT29(패널 a), MB468(패널 b) 및 A431(패널 c) 세포의 흡광도(490 nm에서). NK 세포 단독은 세포가 사이토카인이 없는 배양 배지에서 생존력을 상실했기 때문에 490 nm에서 유의하지 않은 흡광도를 나타냈다. 따라서, NK 세포와 함께 공동-배양된 처리군의 흡광도(490 nm에서)는 NK 세포에 의해 영향을 받지 않아야 한다.
도 7a 내지 도 7c는 NK 세포에 대한 CD16 및 4-1BB 공동-자극 분자의 시공간적 동시-활성화가 생체 내에서 뮤린 종양 성장을 지연시킴을 도시한다. 면역 세포-고갈된 C57BL/6 마우스 모델에서, B 세포, NK 세포, CD4+ T 세포, 및 CD8+ T 세포는 접종 후 5, 8, 10, 12, 15, 및 18일에 α-CD20, α-NK1.1, α-CD4, 및 α-CD8(300 μg/주입)의 복강내(i.p) 주입에 의해 고갈되었다. 마우스 IgG 2a(300 μg/주입)를 이소형 대조군으로서 투여하였다. 접종 후 6, 7, 및 8일에 α-CD16/α-4-1BB NP(100 μg의 각 항체 함유)를 정맥내로(i.v.) 투여하였다. 접종 후 6, 7, 및 8일에 100 μg의 α-CD16 및/또는 100 μg의 α-4-1BB(유리 또는 NP-접합됨)를 함유하는 면역치료제를 i.v.로 미정맥에 투여하였다. 면역자극 군에 있는 마우스의 이종이식(xenograft) 종양에 4시간 동안 단일 5 Gy 조사에 적용하고 암 세포에서 NK 세포 활성화 리간드를 상향조절하기 위해 면역치료제를 투여하였다. 도 7a 내지 도 7b는 상이한 면역치료제로 처리한 후 B16F10 종양-보유 마우스의 평균 종양 성장 곡선 (i), (ii), 및 생존 곡선 (iii), (iv)을 도시한다(n = 6마리 마우스/군). 도 7c는 α-CD16/α-4-1BB NP로 처리한 후 B16F10 종양-보유 면역 세포-고갈된 마우스의 평균 종양 성장 곡선 (i), 및 생존 곡선 (ii)을 도시한다(n = 7마리 마우스/군). 데이터를 평균 ± SEM으로 표시한다. *p < 0.05. 종양 성장 곡선의 통계학적 유의성을 Tukey 사후 검정과 함께 1-원 ANOVA를 통해 계산하였다. * p < 0.05. 생존 곡선의 통계학적 유의성을 로그-순위(Mantel-Cox) 검정을 통해 계산하였다. * p < 0.05.
도 8a는 CD16 및 4-1BB 수용체의 시공간적 동시-활성화가 생체 내에서 비-조사된 B16F10 이종이식 종양 성장을 지연시킴을 도시한다. 선은 조사 없이 상이한 면역치료제를 투여받은 후 B16F10 종양-보유 마우스의 개별적인 종양 성장 곡선을 나타낸다(n = 6마리 마우스/군).
도 8b는 5 Gy의 세슘-137 조사가 C57BL/6 마우스에서 B16F10 종양 모델에서 α-CD16/α-4-1BB의 항암 활성을 상승적으로(synergistically) 개선함을 도시한다. 도 8b 상부 패널: α-CD16/α-4-1BB NP로 상이한 처리 후 비-조사된 및 조사된 B16F10 종양-보유 마우스의 평균 종양 곡선. 접종 후 19일에, α-CD16/α-4-1BB NP로 첫 번째 처리 전 5 Gy IR은 5 Gy IR을 받은 것과 비교하여 평균 종양 부피를 약 60%까지 감소시켰다. 대조적으로, α-CD16/α-4-1BB NP(IR 없이)로의 처리는 비-처리 군에 비해 평균 종양 부피를 단지 약 40%까지만 감소시켰다. 이는 5 Gy IR이 α-CD16/α-4-1BB NP의 항암 활성을 상승적으로(그러나 부가적으로는 아님) 개선하였음을 나타낸다. 도 8b 하부 패널: α-CD16/α-4-1BB NP로 상이한 처리 후 비-조사된 및 조사된 B16F10 종양-보유 마우스의 생존 곡선. 비처리군에 대한 평균 생존 시간은 19 ± 1일이었다. α-CD16/α-4-1BB NP(면역자극 없음)로의 처리는 생존을 평균 3일 증가시켰다(즉, 평균 생존 시간 = 22 ± 2 일). 추가 처리 없이 5 Gy 조사는 생존을 평균 3일 증가시켰다(즉, 평균 생존 시간 = 22 ± 1 일). 5 Gy IR에 이은 α-CD16/α-4-1BB NP 처리는 생존 시간을 14일 증가시켰다(즉, 평균 생존 시간 = 32 ± 1 일). 이는 조사가 α-CD16/α-4-1BB NP의 항암 활성을 상승적으로 증가시켰음을 나타낸다.
도 8c는 CD16 및 4-1BB 수용체의 시공간적 동시-활성화가 생체 내에서 조사된 B16F10 이종이식 종양 성장을 지연시킴을 도시한다. 선은 첫 번째 처리 전 5 Gy 조사와 함께 상이한 면역치료제로 처리받은 후 B16F10 종양-보유 마우스의 개별적인 종양 성장 곡선을 나타낸다(n = 6마리 마우스/군). 도 8d는 α-CD16/α-4-1BB NP가 NK 세포를 효과적으로 동시-활성화하고 생체 내에서 암 면역요법을 개선함을 도시한다. 선은 α-CD16/α-4-1BB NP로 처리받은 후 또는 단지 5 Gy IR만 받은 후 면역 세포-고갈된 B16F10 종양-보유 마우스의 개별적인 종양 성장을 나타낸다(n = 7마리 마우스/군).
도 8e는 T 세포-결핍 Nu 마우스에서 B16F10 종양에 대한 유리 α-CD16 플러스 유리 α-4-1BB 및 α-CD16/α-4-1BB NP의 항암 활성을 도시한다. 도 8e 패널 A는 T 세포-결핍 Nu 마우스에서 B16F10 종양 모델에 대한 실험 계획을 도시한다. 접종 후 6, 7, 및 8일에 미정맥 주입을 통해 100 μg의 각 항체를 포함하는 3회 용량의 면역치료제를 투여하였다. 면역자극군의 마우스는 첫 번째 면역치료제 투여 3시간 전에 단일 5 Gy 세슘-137 조사(IR)를 하였다. 생체 내 효능 연구를 접종 후 21일에 종료하였다. 상이한 면역치료제로 처리 후 B16F10 종양-보유 마우스의 개별적인 종양 성장 곡선(도 8e 패널 B) 및 평균 종양 성장 곡선(도 8e 패널 c)을 기록하였다. 종양 성장 억제(TGI: tumor growth inhibition)를 처리군의 평균 종양 부피에 기초하여 계산하였고, 비처리 대조군을 접종 후 19일에 기록하였다. 면역자극(5 Gy IR) 없이, α-CD16 플러스 α-4-1BB 또는 α-CD16/α-4-1BB NP는 종양 성장을 억제하지 않았다(p = 0.6423 대 비처리군). 5 Gy IR은 36%의 TGI로 종양 성장을 지연시켰다. 5 Gy IR에 이은 α-CD16 플러스 α-4-1BB로의 처리는 61%의 TGI로 종양 성장을 효과적으로 지연시켰다. 5 Gy IR에 이은 α-CD16/α-4-1BB NP로의 처리는 78%의 TGI로 종양 성장을 추가로 지연시켰다(p = 0.0181 대 5 Gy IR에 이어 α-CD16 플러스 α-4-1BB로의 처리). n = 모든 군에 대해 6마리 마우스. 통계학적 유의성을 Tukey 사후 검정과 함께 1-원 ANOVA를 통해 계산하였다.
도 9a 내지 도 9d는 EGFR-표적화된 나노인게이저가 생체 내에서 EGFR-과발현된 종양 성장을 효과적으로 억제함을 도시한다. 도 9a는 T-세포 결핍 Nu 마우스에서 A431 및 MB468 종양 모델에 대한 실험 계획을 도시한다. 접종 후 6, 8, 및 10일에 100 μg의 α-EGFR, 100 μg의 α-CD16 및 100 μg의 α-4-1BB(160 μg의 유리/캡슐화된 EPI 포함/미포함)를 함유하는 3개 용량의 면역치료제/화학-면역치료제를 미정맥에 i.v.로 투여하였다. 도 9b는 상이한 처리를 받은 후 A431 보유 Nu 마우스에 대해 기록된 평균 종양 성장 곡선(i), 생존 곡선, 및 중앙 생존(MS)(ii)을 도시한다(n = 6마리 마우스/군). 도 9c는 상이한 처리를 받은 후 MB468 이종이식 종양-보유 Nu 마우스에 대해 기록된 평균 종양 성장 곡선 및 종양 성장 억제(TGI)를 도시한다(n = 6마리 마우스/군). TGI를 연구 종점(접종 후 125일)에서 비처리군과 관련된 처리군의 평균 종양 부피 변화를 비교하여 계산하였다. 도 9d는 T 세포-결핍 Nu 마우스에서 EGFR+ HT29 및 EGFR Raji 이중-이종이식 종양 모델에 대한 실험 계획을 도시한다. 접종 후 6, 8, 및 10일에 3개 용량의 면역치료제/화학-면역치료제를 미정맥에 i.v.로 투여하였다. 생체 내 효능 연구는 Raji 종양의 큰 직경이 10 mm에 도달했을 때 접종 후 20일에 종료하였다. 상이한 처리를 받은 후 HT29(i), 및 Raji(ii) 이종이식 종양의 평균 종양 성장 곡선(비처리 대조군의 경우 n = 5, 다른 모든 처리군의 경우 n = 7). TGI를 연구 종점(접종 후 20일)에서 비처리군과 관련된 처리군의 평균 종양 부피 변화를 비교하여 계산하였다. 데이터를 평균 ± SEM으로 표시한다. 평균 종양 성장 곡선의 통계학적 유의성을 Tukey 사후 검정과 함께 1-원 ANOVA를 통해 계산하였다. * p < 0.05. 생존 곡선의 통계학적 유의성을 로그-순위(Mantel-Cox) 검정을 통해 계산하였다. * p < 0.05.
도 10a는 EGFR-표적화된 나노인게이저(α-EGFR/α-CD16/α-4-1BB NP)가 생체 내에서 EGFR-과발현된 A431 종양의 성장을 효과적으로 억제함을 도시한다. 선은 상이한 처리를 받은 후 A431 보유 Nu 마우스에 대해 기록된 개별적인 종양 성장 곡선을 나타낸다(n = 6마리 마우스/군).
도 10b는 α-EGFR/α-CD16/α-4-1BB EPI NP가 T 세포-결핍 Nu 마우스에서 A431 이종이식 종양의 성장을 효과적으로 억제함을 도시한다. 도 10b 좌측 패널: 무약물 α-EGFR/α-CD16/α-4-1BB NP, α-EGFR/α-CD16/α-4-1BB EPI NP, 및 α-EGFR/α-CD16/α-4-1BB NP 플러스 유리 EPI로 처리한 후 A431 종양-보유 마우스의 평균 종양 곡선. 통계학적 유의성을 Tukey 사후 검정과 함께 1-원 ANOVA를 통해 계산하였다. * p < 0.05. 도 10b 우측 패널: 무약물 α-EGFR/α-CD16/α-4-1BB NP, α-EGFR/α-CD16/α-4-1BB EPI NP, 및 α-EGFR/α-CD16/α-4-1BB NP 플러스 유리 EPI로 처리한 후 A431 종양-보유 마우스의 생존 곡선. n = 군 당 6마리. 통계학적 유의성을 로그-순위(Mantel-Cox) 검정을 통해 계산하였다. * p < 0.05.
도 10c는 EGFR-표적화된 나노인게이저(α-EGFR/α-CD16/α-4-1BB NP)가 생체 내에서 EGFR-과발현 MB468 종양의 성장을 효과적으로 억제함을 도시한다. 선은 상이한 처리를 한 후 MB468 보유 Nu 마우스에 대해 기록된 개별적인 종양 성장 곡선을 도시한다(n = 6마리 마우스/군).
도 10d는 α-EGFR/α-CD16/α-4-1BB EPI NP가 T 세포-결핍 Nu 마우스에서 MB468 이종이식 종양의 성장을 효과적으로 억제함을 도시한다. 무약물 α-EGFR/α-CD16/α-4-1BB NP, α-EGFR/α-CD16/α-4-1BB EPI NP, 및 α-EGFR/α-CD16/α-4-1BB NP 플러스 유리 EPI로 처리한 후 MB468 종양-보유 마우스의 평균 종양 곡선을 도시한다. 통계학적 유의성을 Tukey 사후 검정과 함께 1-원 ANOVA를 통해 계산하였다. * p < 0.05.
도 10e는 EGFR-표적화된 나노인게이저가 생체 내에서 EGFR-과발현된 종양을 공격하도록 NK 세포를 안내함으로써 화학면역요법을 개선함을 도시한다. 선은 상이한 처리를 받은 후 T-세포 결핍 Nu 마우스에서 이중-이종이식 종양 모델의 HT29 및 Raji의 개별적인 종양 성장 곡선을 도시한다(비처리 대조군의 경우 n = 5, 다른 모든 처리군의 경우 n = 7).
도 10f는 A431 종양-보유 Nu 마우스에서 상이한 항체-작용화된 Cy5-표지된 NP의 생체분포를 도시한다. 도 10f 패널 A는 주입된 Cy5-표지된 NP의 상이한 농도의 생체 외 NIR 형광 영상과 상이한 Cy5-표지된 NP의 농도-의존적 광자 효율의 플롯을 도시한다. 광자 효율은 주입된 Cy5-표지된 Np의 농도에 따라 선형으로 증가한다. 도 10f 패널 B는 A431 이종이식 종양 및 비처리된 마우스 및 α-EGFR(마우스 당 100 μg) 플러스 Cy5-표지된 α-CD16/α-4-1BB NP(마우스 당 100 μg의 각 항체가 함유된 6 mg NP), Cy5-표지된 α-EGFR NP(마우스 당 100 μg 접합된 α-EGFR이 함유된 2 mg NP) 플러스 Cy5-표지된 α-CD16/α-4-1BB NP(마우스 당 100 μg의 각 항체가 함유된 4 mg), 및 Cy5-표지된 α-EGFR/α-CD16/α-4-1BB NP(마우스 당 100 μg의 각 항체가 함유된 6 mg NP)가 투여된 마우스로부터 보존된 주요 장기의 생체 외 형광 영상을 도시한다. 좌측에서 우측으로 보존된 조직: A431 이종이식 종양, 간, 비장, 신장, 폐, 및 심장. 영상은 605 ± 20 nm에서 여기된 광원을 사용하여 기록하였다. 형광 방출은 690 ± 20 nm에서 기록하였다.
도 11a 내지 도 11d는 EGFR-표적화된 나노인게이저가 NK 세포를 종양으로 모집하고 dsDNA 파손을 증가시킴으로써 화학면역요법을 개선함을 도시한다. 도 11a는 상이한 면역치료제/화학-면역치료제의 미정맥 i.v. 투여 후 40시간에 기록된 Nu 마우스의 A431 종양 모델에서 Cy5-표지된 및 EPI-캡슐화된 나노인게이저의 생체분포를 도시한다(Cy5-표지된 α-EGFR/α-CD16/α-4-1BB NP, α-EGFR/α-CD16/α-4-1BB EPI NP, 및 α-EGFR/α-CD16/α-4-1BB NP 플러스 유리 EPI로 투여된 군의 경우 n = 6을 제외한 모든 대조군 및 실험군의 경우 n = 5, 및 α-EGFR EPI NP로 투여된 군의 경우 n = 4). 데이터를 평균 ± SEM으로 표시한다. 통계학적 유의성을 Tukey 사후 검정과 함께 2-원 ANOVA를 통해 계산하였다. * p < 0.05. 도 11b 내지 도 11c는 α-NK1.1- 및 α-EGFR-공동-염색된 A431 종양 섹션(도 11b) 및 α-γ-H2AX-염색되고(도 11d) 처리 40시간 후에 보존된 면역형광 영상의 정량화를 도시한다. 도 11d는 상이한 면역치료제/화학면역치료제의 i.v. 투여 40시간 후 A431 종양-보유 Nu 마우스에 대해 기록된 혈청 TNF-α 및 INF-γ 수준을 도시한다.
도 11e는 A431 종양-보유 Nu 마우스에서 상이한 항체-작용화된 EPI-캡슐화된 NP의 생체분포를 도시한다. 도 11e 패널 A는 주입된 EPI의 상이한 농도의 생체 외 NIR 형광 영상과 유리 EPI의 농도-의존적 광자 효율의 플롯을 도시한다. 광자 효율은 주입된 EPI의 농도에 따라 선형으로 증가한다. 도 11E 패널 B는 A431 이종이식 종양 및 비처리된 마우스 및 유리 EPI(마우스 당 160 μg의 EPI), α-EGFR/α-CD16/α-4-1BB EPI NP(마우스 당 100 μg의 각 항체가 함유된 총 6 mg NP 당 160 μg의 캡슐화된 EPI), α-EGFR/α-CD16/α-4-1BB NP(마우스 당 100 μg의 각 항체가 함유된 6 mg NP) 플러스 유리 EPI(마우스 당 160 μg의 EPI), α-EGFR EPI NP(마우스 당 100 μg의 접합된 α-EGFR이 함유된 6 mg NP 당 160 μg의 EPI), 및 α-EGFR EPI NP(마우스 당 100 μg 의 접합된 α-EGFR이 함유된 6 mg NP 당 160 μg 의 EPI) 플러스 α-CD16/α-4-1BB NP(마우스 당 100 μg의 각 항체가 함유된 4 mg NP)가 투여된 마우스로부터 보존된 주요 장기의 생체 외 형광 영상을 도시한다. 좌측에서 우측으로 보존된 조직: A431 이종이식 종양, 간, 비장, 신장, 폐, 및 심장. 영상은 465 ± 20 nm에서 여기된 광원을 사용하여 기록하였다. 형광 방출은 590 ± 20 nm에서 기록하였다.
본 주제는 이제 현재 개시된 주제의 대표적인 실시형태가 나타나 있는 첨부된 실시예를 참조하여 이하에서 보다 완전하게 설명될 것이다. 그러나, 현재 개시된 주제는 다른 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시형태에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 오히려, 이러한 실시형태는 본 개시내용이 철저하고 완전할 수 있고, 현재 개시된 주제의 범위를 당업자에게 충분히 전달하도록 제공된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 본 발명을 설명할 때 사용된 용어는 단지 특정한 실시형태를 설명하기 위해 사용된 것이며 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다.
문맥이 달리 나타내지 않는 한, 본원에 기술된 본 발명의 다양한 특징이 임의의 조합으로 사용될 수 있다는 것이 구체적으로 의도된다. 더욱이, 본 발명은 또한 본 발명의 일부 실시형태에서, 본원에 설명된 임의의 특징 또는 특징들의 조합이 배제되거나 생략될 수 있음을 고려한다. 설명을 위해, 명세서에 복합체가 성분 A, B 및 C를 포함한다고 명시되어 있는 경우, A, B 또는 C, 또는 이들의 조합 중 어느 하나가 생략될 수 있고 단독으로 또는 임의의 조합으로 부인될 수 있다는 것이 구체적으로 의도된다.
뉴클레오티드 서열은 달리 구체적으로 나타내지 않는 한 왼쪽에서 오른쪽으로 5'에서 3' 방향으로 단일 가닥으로만 제시된다. 뉴클레오티드 및 아미노산은 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회에서 권장하는 방식으로, 또는 (아미노산의 경우) 37 C.F.R. §1.822 및 확립된 사용법 둘 모두에 따라 한 글자 코드, 또는 세 글자 코드로 표시된다.
달리 지시되지 않는 한, 당업자에게 공지된 표준 방법은 유전자 클로닝, 핵산 분자 증폭 및 검출 등에 사용될 수 있다. 이러한 기술은 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어 문헌[Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed. (Cold Spring Harbor, NY, 1989)]; 문헌[Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New York)]을 참조한다.
본원에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 수탁 번호 및 기타 참고 문헌은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
정의
하기 용어가 당업자에 의해 잘 이해되는 것으로 여겨지지만, 하기 정의는 현재 개시된 주제의 설명을 용이하게 하기 위해 제시된다.
오랜 특허법 협약에 따라, 용어 "하나(a 및 an)" 및 "그(the)"는 청구범위를 포함하여 본 출원서에서 사용될 때 하나 이상을 의미할 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, 명세서 및 청구범위에 사용된 크기, 바이오마커 농도, 확률, 백분율 등의 양을 표현하는 모든 숫자는 모든 경우에 "약"이라는 용어에 의해 수정되는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 양은 약 10%, 5%, 1%, 또는 0.5%만큼 변할 수 있다. 따라서, 달리 표시되지 않는 한, 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 기재된 수치 매개변수는 현재 개시된 주제에 의해 얻고자 하는 원하는 특성에 따라 변할 수 있는 근사치이다.
2개 이상의 항목 또는 조건의 설명에서 사용될 때 용어 "및/또는"은 명명된 모든 항목 또는 조건이 존재하거나 적용 가능한 상황, 또는 항목 또는 조건 중 하나만(또는 전체 미만) 존재하거나 적용 가능한 상황을 지칭한다. 또한 본원에서 사용된 바와 같이, "및/또는"은 대안("또는")으로 해석될 때 조합의 결여뿐만 아니라 연관된 나열된 항목 중 하나 이상의 임의의 모든 가능한 조합을 지칭하고 포함한다.
또한, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 길이, 용량, 시간, 온도 등과 같은 측정 가능한 값을 언급할 때 본원에서 사용되는 용어 "약"은 명시된 양의 ± 20%, ± 10%, ± 5%, ± 1%, ± 0.5%, 또는 심지어는 ± 0.1%의 변동을 포함하는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "포함하는(including)", "함유하는(containing)" 및 "~을 특징으로 하는(characterized by)"과 동의어인 "포함하는(comprising)"이라는 용어는 포괄적이거나 개방형이며 추가의 인용되지 않은 요소 및/또는 방법 단계를 배제하지 않는다. "포함하는(comprising)"은 명명된 요소 및/또는 단계가 존재하지만, 다른 요소 및/또는 단계가 추가될 수 있고 여전히 관련 주제의 범위 내에 있음을 의미하는 기술 용어이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "~로 이루어진(consisting of)"이라는 문구는 청구범위에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. "~로 이루어진(consisting of)" 또는 "~로 이루어지는(consists of)"이라는 문구가 청구범위 서문 바로 다음에 나오는 것이 아니라, 청구의 본문의 절에 나타날 때, 이는 해당 조항에 명시된 요소만 제한한다; 다른 요소는 전체로서 청구범위에서 제외되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "~로 본질적으로 이루어진(consisting essentially of)"이라는 문구는 청구범위를 명시된 재료 또는 단계와, 청구된 주제의 기본적이고 신규한 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 명시된 재료 또는 단계로 제한한다.
"포함하는(comprising)", "~로 본질적으로 이루어진(consisting essentially of)" 및 "~로 이루어진(consisting of)"이라는 용어와 관련하여, 이들 세 가지 용어 중 하나가 본원에서 사용되는 경우, 현재 개시된 주제는 다른 용어의 사용을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상체" 및 "환자"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며 인간 및 비인간 동물 둘 모두를 지칭한다. 본 발명의 대상체는 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 혜택을 받을 수 있고/있거나 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 장애에 대해 치료될 수 있는 장애에 민감한 임의의 대상체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 임의의 방법의 대상체는 포유동물이다. 본원에 사용된 용어 "포유동물"은 비제한적으로 인간, 영장류, 비인간 영장류(예컨대, 원숭이 및 개코원숭이), 소, 양, 염소, 돼지, 말, 고양이, 개, 토끼, 설치류(예컨대, 랫트, 마우스, 햄스터 등) 등을 포함한다. 인간 대상체는 신생아, 유아, 청소년 및 성인을 포함한다. 추가 선택사항으로서, 대상체는 실험 동물 및/또는 질병의 동물 모델일 수 있다. 바람직하게는, 대상체는 인간이다. 대상체는 임의의 성별, 임의의 민족 및 임의의 연령일 수 있다.
"이를 필요로 하는 대상체" 또는 "~을 필요로 하는 대상체"는 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 치료될 수 있는 장애가 있는 것으로 알려졌거나, 장애를 갖거나 발병할 것으로 의심되거나 장애를 갖거나 발병할 위험이 있는 대상체이거나, 본원에 기술된 것들을 포함하는 입자 및/또는 조성물의 전달로부터 이익을 얻는 대상체이다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "투여하는(administering)" 또는 "투여된(administered)"은 국소, 비경구 및/또는 경구 투여를 포함하는 것을 의미하며, 이들 모두는 본원에 기술되어 있다. 비경구 투여는 비제한적으로 정맥내, 피하 및/또는 근육내 투여(예를 들어, 골격근 또는 심장근 투여)를 포함한다. 실제 투여 방법 및 순서는 특히 이용되는 화합물의 특정 제제, 및 이용되는 하나 이상의 다른 화합물의 특정 제형에 따라 달라질 것이라는 것이 이해될 것이다. 주어진 조건 세트에 대한 본 발명의 조성물의 최적의 투여 방법 및 투여 순서는 본 명세서에 기재된 정보를 고려하여 통상적인 기술을 사용하여 당업자에 의해 확인될 수 있다.
용어 "투여하는(administering)" 또는 "투여된(administered)"은 또한 비제한적으로 경구, 설하, 협측, 비강, 경피, 직장, 근육내, 정맥내, 동맥내(관상동맥내), 뇌실내, 척추강내, 및 피하 경로를 지칭한다. 우수한 임상 관행에 따라, 본 화합물은 과도한 유해하거나 불리한 부작용 없이, 즉, 투여와 관련된 이점이 해로운 영향을 능가하지 않고 효과적인 유익한 효과를 생성할 용량으로 투여될 수 있다.
또한 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료하다(treat)", "치료하는(treating)" 또는 "치료(treatment)"는 예를 들어, 이로운 및/또는 치료 효과가 될 수 있는 조절 효과를, 예를 들어, 당업계에 잘 알려져 있는 바와 같이 대상체의 상태(예컨대, 하나 이상의 증상) 개선, 장애, 질병 또는 질환의 진행 지연, 및/또는 상태, 장애, 질환 또는 질병의 임상적인 매개변수의 변화 등을 포함하여 상태, 장애, 질환 또는 질병에 걸린 대상체에 부여하는 임의의 유형의 작용을 지칭한다.
추가로 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "예방적(proactive)", "예방하다(prevent)", "예방하는(preventing)" 또는 "예방(prevention)"은 대상체에서 질병, 장애 및/또는 임상적 증상의 발병 및/또는 진행의 부재, 회피 및/또는 지연 및/또는 본 발명의 방법의 부재 시에 발생하는 것과 비교하여 질병, 장애 및/또는 임상적 증상의 발병의 중증도 감소를 초래하는 임의의 유형의 작용을 지칭한다. 예방은 질병, 장애 및/또는 임상적 증상의 완전한, 예컨대 총체적인 부재일 수 있다. 예방은 또한 부분적일 수 있으므로, 대상체에서 질병, 장애 및/또는 임상적 증상의 발생 및/또는 발병의 중증도가 본 발명의 부재시 발생하는 것보다 더 적을 수 있다.
"유효량" 또는 "치료 유효량"은 치료 및/또는 유익한 효과일 수 있는, 원하는 효과를 생성하기에 충분한 본 발명의 화합물 또는 조성물의 양을 지칭한다. 일반적으로, "치료 유효량(therapeutically effective amount)" 또는 "치료 유효량(treatment effective amount)"은 원하는 효과를 달성하기에 충분하지만 비독성인, 활성 성분(즉, 본 발명의 입자)의 양, 예컨대 증상의 중증도 및/또는 빈도의 감소 또는 제거 및/또는 손상의 개선 또는 치료(remediation), 또는 달리 질병 또는 임의의 다른 바람직하지 않은 증상의 진행을 예방, 방해, 지연 또는 역전시킬 수 있는 양을 지칭한다. 유효량은 당업자의 지식과 전문성 내에서 연령, 대상체의 일반적인 상태, 치료되는 상태의 중증도, 투여되는 특정 제제, 치료 지속기간, 임의의 동시 치료의 특성, 사용되는 약학적으로 허용되는 담체, 및 유사 인자에 따라 달라질 것이다. 적절한 경우, 임의의 개별적인 경우의 유효량 또는 치료 유효량은 관련 문서 및 문헌을 참조하고/하거나 일상적인 실험을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다. (예컨대, 문헌[Remington, The Science and Practice of Pharmacy (최신판)] 참조). 본원에서 사용된 용어 "생물학적으로 활성"은 자연 발생 분자의 구조적, 조절적, 또는 생화학적 기능을 갖는 효소 또는 단백질을 의미한다.
본원에 기술된 모든 방법은 본원에 달리 표시되지 않거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 임의의 적절한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 모든 예 또는 예시적인 언어(예컨대 "~와 같은")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 설명하기 위한 것이며 달리 청구되지 않는 한 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
"아미노산 서열" 및 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"과 같은 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 아미노산 서열을 인용된 단백질 분자와 관련된 완전한 천연 아미노산 서열(즉, 자연에서 발생하는 것과 같이 단백질에서 발견되는 아미노산만을 함유하는 서열)로 제한하려는 것은 아니다. 현재 개시된 주제의 단백질 및 단백질 단편은 재조합 접근법에 의해 생성될 수 있거나 자연 발생 공급원으로부터 단리될 수 있다. 단백질 단편은 임의의 크기일 수 있으며, 예를 들어 4개의 아미노산 잔기에서 1개의 아미노산을 뺀 전체 아미노산 서열까지의 크기 범위일 수 있다.
용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 임의의 이소형의 항체 또는 면역글로불린, 비제한적으로 Fab, Fv, 단일 사슬 Fv(scFv), Fc, 및 Fd 단편, 키메라 항체, 인간화된 항체, 단일-사슬 항체, 및 항체 및 비-항체 단백질의 항원 결합 부위를 포함하는 융합 단백질을 비롯하여, 항원에 대한 특이적 결합을 유지하는 항체의 단편을 포함한다. 항체는 일부 실시형태에서, 예를 들어 방사성 동위원소, 검출 가능한 생성물을 생성하는 효소, 형광 단백질 등으로 검출 가능하게 표지될 수 있다. 일부 실시형태에서 항체는 특이적 결합 쌍의 구성원, 예를 들어 비오틴(비오틴-아비딘 특이적 결합 쌍의 구성원) 등과 같은 다른 모이어티에 추가로 접합될 수 있다. 또한 Fab', Fv, F(ab')2, 및 항원에 대한 특이적 결합을 유지하는 다른 항체 단편(예를 들어, 적어도 하나의 파라토프를 포함하는 임의의 항체 단편)이 본 용어에 포함된다.
항체는 예를 들어 Fv, Fab 및 (Fab')2뿐만 아니라 이중-기능성(즉, 이중-특이적) 하이브리드 항체(예컨대, 문헌[Lanzavecchia et al, 1987] 참조) 및 단일 사슬(예컨대, 문헌[Huston et al, 1988] 및 문헌[Bird et al, 1988] 참조, 이들 각각은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함됨)를 비롯하여 다양한 다른 형태로 존재할 수 있다. 일반적으로, 문헌[Hood et al, 1984], 및 문헌[Hunkapiller & Hood, 1986]을 참조한다. "검출 분자"라는 어구는 본원에서 특정 바이오마커의 검출을 가능하게 하기 위해 바이오마커에 충분한 특이성으로 결합할 수 있는 임의의 분자를 포함하는 가장 넓은 의미로 사용된다. 검출을 허용한다는 것은 특정 바이오마커 구성원의 존재 또는 부재를 결정하는 것을 의미할 수 있고, 일부 실시형태에서, 특정 바이오마커의 양을 결정하는 것을 의미할 수 있다. 검출 분자는 항체, 항체 단편 및 핵산 서열을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "표적"은 내인성 또는 외인성 관심 분자, 예를 들어 "마커"를 포함한다. 표적은 배타적으로 또는 주로 하나 또는 몇 개의 조직 유형, 하나 또는 몇 개의 세포 유형, 하나 또는 몇 개의 질병, 및/또는 하나 또는 몇 개의 발달 단계와 관련된 마커일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적은 단백질(예컨대, 세포 표면 수용체, 막횡단 단백질, 당단백질, 등), 탄수화물(예컨대, 글리칸 모이어티, 글리코칼릭스, 등), 지질(예컨대, 스테로이드, 인지질, 등), 및/또는 핵산(예컨대 DNA, RNA, 등)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적은 NK 세포 표적(예컨대, "제1 표적")일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적(즉, 마커)은 악성 세포, 예컨대 종양 항원(예컨대, "제2 표적") 상에 독점적으로 또는 더 많은 양으로 존재하는 분자일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적은 전립선암 마커일 수 있다. 특정 실시형태에서, 전립선암 마커는 대부분의 전립선 조직에서 발현되지만, 정상 조직에서보다 전립선암 조직에서 훨씬 더 많이 발현되는 100 kDa 막횡단 당단백질인, 전립선 특이적 막 항원(PSMA: prostate specific membrane antigen)이다. 일부 실시형태에서, 표적은 유방암 마커일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적은 결장암 마커일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적은 직장암 마커일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적은 폐암 마커일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적은 췌장암 마커일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적은 난소암 마커일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적은 골암 마커일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적은 신장암 마커일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적은 간암 마커일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적은 신경계암 마커일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적은 위암 마커일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적은 고환암 마커일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적은 두경부암 마커일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적은 식도암 마커일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적은 자궁경부암 마커일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "나노입자" 및/또는 "나노구체"는 나노미터 크기 범위인 중합체성 입자 또는 구체를 기술한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "마이크로입자" 또는 "마이크로구체"는 마이크로미터 크기 범위의 입자 또는 구체를 기술한다. 두 가지 유형의 입자 또는 구체 모두는 약물, 영상화제 및/또는 항원이 고체 용액 또는 고체 분산액의 형태로 통합되거나 이러한 물질이 흡수, 캡슐화, 및/또는 화학적으로 결합될 수 있는 약물 담체로서 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "표적화제"는 특정 마커(즉, 표적)에 결합하는 제제를 포함한다. 본 발명의 표적화제(예컨대, 표적화 모이어티)는 핵산(예컨대, 압타머), 폴리펩티드(예컨대, 항체), 당단백질, 소분자, 탄수화물, 지질, 등일 수 있다. 예를 들어, 표적화제는 압타머일 수 있으며, 이는 일반적으로 폴리펩티드와 같은 특정 표적에 결합하는 올리고뉴클레오티드(예컨대, DNA, RNA, 또는 이의 유사체 또는 유도체)이다. 일부 실시형태에서, 표적화제는 펩티드 또는 폴리펩티드(예컨대, 항체 또는 종양 마커(예컨대, 암 세포 표면 상의 표적)를 특이적으로 인식하는 항체의 일부)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적화제는 항체 또는 이의 단편일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적화제는 항체의 Fc 단편일 수 있다.
입자 및 조성물
본 개시내용은 단일 입자에 NK 세포-결합 표적 및 암 세포-결합 표적을 포함하는 나노입자의 이용을 설명하고, 선택적으로 치료제와 함께, NK 세포 면역 반응 활성화 및 암 세포의 직접적인 치료를 조합하는 접근법에 관한 것이다.
따라서, 일 실시형태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 입자(예컨대, 나노입자)를 제공한다: NK 세포 표면 상의 제1 표적에 결합하는 적어도 하나의 제1 표적화제(예컨대, 여기서 상기 제1 표적화제는 이의 각각의 제1 표적에 결합함); 및 암 세포 표면 상의 제2 표적에 결합하는 적어도 하나의 제2 표적화제(예컨대, 여기서 상기 제2 표적화제는 이의 각각의 제2 표적에 결합함), 여기서 상기 제2 표적화제는 제1 표적화제와 상이하다(예컨대, 여기서 각각의 제1 표적과 각각의 제2 표적은 상이한 표적이다). 일부 실시형태에서, 본 발명의 입자는 1개 초과의 제1 표적 제제, 예컨대 적어도 2개의 제1 표적화제(2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 등 포함)를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 적어도 2개의 제1 표적화제는 NK 세포 표면 상의 상이한 제1 표적에 결합한다, 예컨대, 여기서 상기 적어도 2개의 제1 표적화제는 2개의 상이한 제1 표적화제이다. 일부 실시형태에서, 제1 표적 제제는 다수의 동일한 제1 결합 제제, 예컨대, 약 5개, 10개, 50개, 100개, 500개, 1000개, 2000개, 5000개, 10,000개, 또는 그 이상의 동일한 제1 결합 제제 또는 그 안의 임의의 값 또는 범위를 포함할 수 있다.
본 발명의 입자 유형은 비제한적으로 중합체 나노입자 예컨대 PLGA-기반, PLA-기반, 폴리사카라이드-기반(덱스트란, 사이클로덱스트린, 키토산, 헤파린), 덴드리머, 히드로겔; 지질-기반 나노입자 예컨대 지질 나노입자, 지질 하이브리드 나노입자, 리포좀, 미셀; 무기물-기반 나노입자 예컨대 초상자성 산화철 나노입자, 금속 나노입자, 백금 나노입자, 칼슘 포스페이트 나노입자, 양자점; 탄소-기반 나노입자 예컨대 풀러렌, 탄소 나노튜브; 및 나노규모의 단백질-기반 복합체를 포함한다. 본 발명의 마이크로입자 유형은 비제한적으로 PLGA-기반, PLA-기반, 폴리사카라이드-기반(덱스트란, 사이클로덱스트린, 키토산, 헤파린), 덴드리머, 히드로겔; 지질-기반 마이크로입자 예컨대 지질 마이크로입자, 미셀; 무기물-기반 마이크로입자 예컨대 초상자성 산화철 마이크로입자, 백금 마이크로입자 및 당업계에 공지된 것과 같은 것들을 포함하는 중합체 마이크로입자인 마이크로미터 규모의 크기를 갖는 입자를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이러한 입자는 생성될 수 있고/있거나 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된 문헌[Au et al. 2019 ACS Cent. Sci. 5(1): 122-144] 및 문헌[Au et al. 2018 ACS Nano 12(2): 1544-1563]에 기술된 것과 같이, 당업계에 공지된 기작을 통해 흡수될, 캡슐화될, 또는 화학적으로 결합될 물질을 가질 수 있다.
본 발명의 입자는 NK 세포 표면 상의 제1 표적에 결합하는 적어도 하나의 제1 표적화제; 및 암 세포 표면 상의 제2 표적에 결합하는 적어도 하나의 제2 표적화제, 예컨대, 마이크로입자, 예컨대, 나노입자를 포함하는 임의의 크기의 입자일 수 있다. 일부 실시형태에서, 입자는 나노입자일 수 있으며, 예컨대 여기서 상기 입자(예컨대, 나노입자) 직경은 1 μm 이하이며, 예컨대, 여기서 상기 나노입자의 직경은 1 nm, 5 nm, 10 nm, 20 nm, 30 nm, 40 nm, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 125 nm, 150 nm, 175 nm, 200 nm, 225 nm, 250 nm, 275 nm, 300 nm, 325 nm, 350 nm, 375 nm, 400 nm, 425 nm, 450 nm, 475 nm, 500 nm, 525 nm, 550 nm, 575 nm, 600 nm, 625 nm, 650 nm, 675 nm, 700 nm, 725 nm, 725 nm, 750 nm, 775 nm, 800 nm, 825 nm, 850 nm, 875 nm, 900 nm, 925 nm, 950 nm, 960 nm, 970 nm, 980 nm, 990 nm, 995 nm, 996 nm, 997 nm, 998 nm, 또는 999 nm, 또는 그 안의 임의의 값 또는 범위이다. 일부 실시형태에서, 나노입자의 직경은 약 5 nm 내지 약 750 nm, 약 10 nm 내지 약 500 nm, 약 5 nm 내지 약 999 nm, 또는 약 50 nm 내지 약 900 nm일 수 있다. 일부 실시형태에서, 입자의 직경은 입자 집단의 평균 직경일 수 있으며, 예컨대, 여기서 상기 나노입자의 평균 직경은 예컨대, 약 5 nm 내지 약 750 nm, 약 10 nm 내지 약 500 nm, 약 5 nm 내지 약 999 nm, 또는 약 50 nm 내지 약 900 nm, 또는 그 안의 임의의 값 또는 범위일 수 있다. 본 발명의 나노입자 또는 나노구체는 100 nm 이하(예컨대, 약 1 nm 내지 약 100 nm의 범위)의 직경을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 100 nm 초과의 치수를 갖는 입자는 여전히 나노입자로 지칭될 수 있다. 따라서, 나노입자에 대한 상한 범위는 약 1 μm일 수 있으며, 일부 실시형태에서, 500 nm일 수 있다. 본 발명의 마이크로입자 또는 마이크로구체는 약 0.5 마이크로미터 내지 약 100 마이크로미터의 직경을 가질 수 있다.
본 발명의 제1 표적화제는 NK 세포 표면 상의 표적에 결합하는 임의의 표적화제일 수 있다. NK 세포 표면 상의 표적은 본원에서 "제1 표적"으로 지칭될 수 있으며, 여기서 각각의 제1 표적화제는 각각의 제1 표적(예컨대, 제1 표적화제의 결합 파트너)에 결합한다. 일부 실시형태에서, NK 세포 표면 상의 제1 표적은 CD16, 4-1BB, NKG2D, TRAIL, NKG2C, CD137, 0X40, CD27, KIRs, NKG2a, dnam-1, 2b4, NKp30a, NKp30b, NKp30c, 항체 Fc 구성성분, 또는 이들의 임의의 조합, 및 현재 알려져 있거나 후에 식별된 NK 세포 표면 상의 임의의 다른 마커일 수 있다. 일부 실시형태에서, NK 세포 표면 상의 표적은 CD16 및/또는 4-1BB일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 발명의 입자는 CD16(예컨대, 제1 표적화제의 각각의 제1 표적)에 결합하는 제1 표적화제를 포함할 수 있으며 4-1BB(예컨대, 상이한 제1 표적화제의 각각의 제1 표적)에 결합하는 다른 상이한 제1 표적화제를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 나노입자는 서로 상이한 다수의 제1 표적화제(예컨대, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 등)를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "각각의 제1 표적"은 특정한 제1 표적화제에 의해 인식될 특이적인 제1 표적이다. 예를 들어 제1 표적 X에 대해 특이성을 갖는 제1 표적화제는 제1 표적 X를 인식하고 결합할 것이므로, 제1 표적 X는 제1 표적화제의 각각의 제1 표적이다.
본 발명의 제2 표적화제는 암 세포 표면 상의 표적에 결합하는 임의의 표적화제일 수 있다. 암 세포 표면 상의 표적은 본원에서 "제2 표적"으로 지칭될 수 있으며, 여기서 각각의 제2 표적화제는 각각의 제2 표적(예컨대, 제2 표적화제의 결합 파트너)에 결합한다. 비제한적인 예시적인 암 및 종양 세포 항원이 문헌[S.A. Rosenberg (Immunity 10:281 (1991))]에 기술되어 있다. 다른 예시적인 암 및 종양 항원은 비제한적으로 다음을 포함한다: BRCA1 유전자 산물, BRCA2 유전자 산물, gplOO, 티로시나제, GAGE-1/2, BAGE, RAGE, LAGE, NY-ESO-1, CDK-4, β-카테닌, MUM-1, 카스파제-8, KIAA0205, HPVE, SART-1, PRAME, p15, 흑색종 종양 항원(문헌[Kawakami et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3515]; 문헌[Kawakami et al., (1994) J. Exp. Med., 180:347]; 문헌[Kawakami et al., (1994) Cancer Res. 54:3124]), MART-1, gplOO MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, CEA, TRP-1, TRP-2, P-15, 티로시나제(문헌[Brichard et al., (1993) J. Exp. Med. 178:489]); HER-2/neu 유전자 산물(미국특허 제 4,968,603 호), CA 125, LK26, FB5(엔도시알린), TAG 72, AFP, CA19-9, NSE, DU-PAN-2, CA50, SPan-1, CA72-4, HCG, STN(시알릴 Tn 항원), c-erbB-2 단백질, PSA, L-CanAg, 에스트로겐 수용체, 우유 지방 글로불린, p53 종양 억제제 단백질(문헌[Levine, (1993) Ann. Rev. Biochem. 62:623]); 뮤신 항원(국제공개 WO 90/05142 호); 텔로머라제; 핵 매트릭스 단백질; 전립선 산 포스파타제; 유두종 바이러스 항원; 및/또는 현재 알려진 항원 또는 비제한적으로 다음의 암을 바롯하여 암으로 관련되어 있는 것으로 후에 알려진 항원: 선암종, 흉선종, 육종, 뇌암(예컨대, 교모세포종), 두경부암, 식도암, 위암, 폐암(예컨대, 소세포 폐암, 비 소세포 폐암), 방광암, 신장암(예컨대, 신세포 암종), 간암(예컨대, 간세포 암종), 췌장암, 자궁암, 난소암, 자궁경부암, 항문암, 흑색종, 전립선암, 유방암, 혈액 세포 암(예컨대, 백혈병, 림프종(예컨대, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종), 다발성 골수종), 직장결장암, 및 임의의 다른 암 또는 현재 알려져 있거나 후에 식별되는 악성 상태(예컨대, 문헌[Rosenberg, (1996) Ann. Rev. Med. 47:481-91] 참조). 일부 실시형태에서, 암 세포 표면 상의 표적은 비제한적으로 EGFR, PSMA, 넥틴-4, 뮤신, HER-2, CD30, CD22, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 따라서, 본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 나노입자는 서로 상이한 다수의 제2 표적화제(예컨대, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 등)를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "각각의 제2 표적"은 특정한 제2 표적화제에 의해 인식될 특이적인 제2 표적이다. 예를 들어 제2 표적 X에 대해 특이성을 갖는 제2 표적화제는 제2 표적 X를 인식하고 결합할 것이므로, 제2 표적 X는 제2 표적화제의 각각의 제2 표적이다.
본 발명의 암세포는 임의의 암 유래의 세포일 수 있다. 일부 실시형태에서, 암세포는 선암종, 흉선종, 육종, 뇌암(예컨대, 교모세포종), 두경부암, 갑상선암, 육종, 편평 세포 암종, 피부암, 침샘암, 식도암, 위암, 폐암(예컨대, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암), 방광암, 신장암(예컨대, 신세포 암종), 간암(예컨대, 간세포 암종), 췌장암, 자궁암, 난소암, 자궁경부암, 항문암, 흑색종, 전립선암, 고환암, 유방암, 혈액 세포 암(예컨대, 백혈병, 림프종(예컨대, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종), 다발성 골수종), 직장결장암, 임의의 다른 암 또는 현재 알려져 있거나 후에 식별될 악성 상태 유래의 세포일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 입자는 추가의 표적화제, 예컨대 제3 표적화제, 제4 표적화제, 제5 표적화제 등을 포함할 수 있으며, 이는 NK 세포 표면 및/또는 암 세포 표면 상에서 발현되지 않는 추가 표적(예컨대, 각각의 제3 표적, 각각의 제4 표적, 각각의 제5 표적 등)에 결합한다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 표적화제는 항체 또는 이의 활성 단편일 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 표적화제 및/또는 제2 표적화제는 항체 또는 이의 활성 단편일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적화제 각각은 항체 또는 이의 활성 단편이다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 이의 활성 단편은 모노클로날 항체, Fab 단편, Fab'-SH 단편, FV 단편, scFV 단편, (Fab')2 단편, Fc-융합 단백질, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 입자(예컨대, 나노입자)는 CD16에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 활성 단편, 4-1BB에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 활성 단편, 및/또는 EGFR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 활성 단편을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 입자(예컨대, 나노입자)는 치료제를 추가로 포함할 수 있다. 비-제한적인 예시적인 치료제는 소분자(예컨대, 세포독성제), 핵산(예컨대, RNAi 제제), 단백질(예컨대, 항체), 펩티드, 지질, 탄수화물, 호르몬, 금속, 방사성 원소 및 화합물, 약물, 백신, 면역학적 제제, 등, 및/또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료제는 암 치료에 유용한 제제, 예컨대, 화학요법제일 수 있다. 화학요법제의 비제한적인 예는 다우노마이신, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 카보플라틴, 베라파밀, 시토신 아라비노시드, 아미노프테린, 데모콜신, 타목시펜, 악티노마이신 D, 알킬화제(제한 없이, 질소 머스타드, 에틸렌이민 유도체, 알킬 설포네이트, 니트로소우레아 및 트리아젠 포함): 우라실 머스타드, 클로르메틴, 사이클로포스파미드(시톡산®), 이포스파미드, 멜팔란, 클로람부실, 피포브로만, 트리에틸렌-멜라민, 트리에틸렌티오포스포라민, 부설판, 카머스틴, 로무스틴, 스트렙토조신, 다카바진, 및 테모졸로미드; 항대사물질(제한 없이, 엽산 길항제, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체 및 아데노신 디아미나제 억제제 포함): 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실(5-FU), 플록스우리딘, 시타라빈, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 플루다라빈 포스페이트, 펜토스타틴, 및 젬시타빈, 천연물 및 이의 유도체(예를 들어, 빈카 알칼로이드, 항종양 항생제, 효소, 림포카인 및 에피포도필로톡신): 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 블레오마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, Ara-C, 파클리탁셀(파클리탁셀은 Taxol®로서 상업적으로 이용 가능함), 도세탁셀, 미트라마이신, 데옥시코-포마이신, 미토마이신-C, L-아스파라기나제, 인터페론(특히 IFN-a), 에토포사이드, 및 테니포사이드를 포함하며; 다른 항-증식성 세포독성제는 나벨벤, CPT-11, 아나스트라졸, 레트라졸, 카페시타빈, 레록사핀, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 및 드롤록사핀이다. 추가의 항-증식성 세포독성제는 비제한적으로 멜팔란, 헥사메틸 멜라민, 티오테파, 시타라빈, 이다트렉세이트, 트리메트렉세이트, 다카바진, L-아스파라기나제, 캄프토테신, 토포테칸, 비칼루타미드, 플루타미드, 류프롤리드, 피리도벤조인돌 유도체, 인터페론, 인터류킨, 항증식성 세포독성제(비제한적으로, EGFR 억제제, Her-2 억제제, CDK 억제제, 및 트라스트주맙 포함)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료제는 에피루비신(EPI), 독소루비신, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 카보플라틴, 다우노루비신, 탁솔, 도세탁셀, 젬시타빈, 5-플루오로우라실, 미토마이신, 시타라빈, 시톡산, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학요법제이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 입자(예컨대, 나노입자) 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용되는"은 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않은 물질이 아닌 물질을 의미하며, 즉, 상기 물질은 실질적으로 유해한 생물학적 효과를 야기하거나 그것이 함유된 조성물의 임의의 다른 성분과 유해한 방식으로 상호작용하지 않으면서, 본 발명의 조성물과 함께 대상체에 투여될 수 있다. 당업자에게 잘 알려진 바와 같이(예컨대, 문헌[Remington's Pharmaceutical Science]; 최신판 참조), 물질은 활성 성분의 임의의 분해를 최소화하고 대상체에서 임의의 불리한 부작용을 최소화하도록 자연적으로 선택될 것이다. 본 발명의 조성물에 대한 예시적인 약학적으로 허용되는 담체는 비제한적으로 무균 발열원 무함유 물 및 무균 발열원 무함유 생리 식염수뿐만 아니라, 당업계에 잘 알려진 바와 같은, 본 발명의 대상체, 특히 인간 대상체로의 주사 및/또는 전달에 적합한 다른 담체를 포함한다.
본 발명은 또한 시험관 내, 생체 외, 및/또는 생체 내 치료 또는 연구 목적을 위해 본 발명의 입자(예컨대, 나노입자)를 세포 또는 대상체에 전달하는 방법을 제공한다.
따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명은 제1 표적화제가 NK 세포 표면 상의 제1 표적(예컨대, 제1 표적화제의 각각의 표적)에 결합하는 조건 하에 NK 세포를 본 발명의 입자(예컨대, 나노입자) 또는 조성물과 접촉하는 단계를 포함하는, NK 세포를 활성화하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 제1 표적화제가 NK 세포 표면 상의 제1 표적(예컨대, 제1 표적화제의 각각의 표적)에 결합하는 조건 하에 NK 세포를 본 발명의 입자(예컨대, 나노입자) 또는 조성물과 접촉하는 단계를 포함하는, NK 세포 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 제2 표적화제가 암세포 표면 상의 제2 표적(예컨대, 제2 표적화제의 각각의 표적)에 결합하는 조건 하에 암세포를 본 발명의 입자(예컨대, 나노입자) 또는 조성물과 접촉하는 단계를 포함하는, 암세포에서 세포독성을 유도하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 나노입자 또는 조성물은 치료제를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 암세포는 입자 및/또는 조성물과 접촉하여 치료제를 암세포에 전달한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 제2 표적화제가 암세포 표면 상의 제2 표적(예컨대, 제2 표적화제의 각각의 표적)에 결합하는 조건 하에 치료제를 포함하는 암세포를 본 발명의 입자(예컨대, 나노입자) 또는 조성물과 접촉하여, 치료제를 암세포에 전달하는 단계를 포함하는, 치료제를 암세포에 전달하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 제1 표적화제가 NK 세포의 표면 상의 제1 표적(예컨대, 제1 표적화제의 각각의 표적)에 결합하는 조건 하에 본 발명의 유효량의 입자(예컨대, 나노입자) 또는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 NK 세포 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 입자 및/또는 조성물은 적어도 2개의 제1 표적화제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 2개의 제1 표적화제가 결합하는 NK 세포는 동일한 NK 세포이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 제1 표적화제가 NK 세포의 표면 상의 제1 표적(예컨대, 제1 표적화제의 각각의 표적)에 결합하는 조건 하에 본 발명의 유효량의 입자(예컨대, 나노입자) 또는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 NK 세포를 활성화하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 입자 및/또는 조성물은 적어도 2개의 제1 표적화제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 2개의 제1 표적화제가 결합하는 NK 세포는 동일한 NK 세포이다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 본 발명의 임의의 방법의 대상체는 암으로 진단되었다. 일부 실시형태에서, 암은 선암종, 흉선종, 육종, 뇌암(예컨대, 교모세포종), 두경부암, 식도암, 위암, 폐암(예컨대, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암), 방광암, 신장암(예컨대, 신세포 암종), 간암(예컨대, 간세포 암종), 췌장암, 자궁암, 난소암, 자궁경부암, 항문암, 흑색종, 전립선암, 유방암, 혈액 세포 암 (예컨대, 백혈병, 림프종(예컨대, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종), 다발성 골수종), 직장결장암, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 제2 표적화제가 암세포 표면 상의 제2 표적(예컨대, 제2 표적화제의 각각의 표적)에 결합하는 조건 하에 본 발명의 유효량의 입자(예컨대, 나노입자) 또는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체(예컨대, 이를 필요로 하는 대상체)에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 제1 표적화제가 NK 세포 표면 상의 제1 표적(예컨대, 제1 표적화제의 각각의 표적)에 결합하고 제2 제제가 암세포 표면 상의 제2 표적(예컨대, 제2 표적화제의 각각의 표적)에 결합하는 조건 하에 본 발명의 유효량의 입자(예컨대, 나노입자) 또는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 제2 표적화제가 암세포 표면 상의 제2 표적(예컨대, 제2 표적화제의 각각의 표적)에 결합하여, 치료제를 대상체의 암세포에 전달하는 조건 하에 치료제를 포함하는 본 발명의 유효량의 입자(예컨대, 나노입자) 또는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 암의 암세포에 치료제를 전달하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 본 발명의 입자(예컨대, 나노입자) 또는 조성물은 정맥내, 근육내, 피하, 국소, 경구, 경피, 복강내, 척수강내, 뇌실내, 안구내, 유리체내, 안와내, 비강내, 이식에 의해, 흡입에 의해, 종양내, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 경로를 통해 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 유효량의 치료제(예컨대, 화학요법제) 및/또는 방사선 요법을 대상체에 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 입자 및/또는 조성물의 투여와 함께 투여될 수 있는 비제한적인 예시적인 치료제는 소분자(예컨대 세포독성제), 핵산(예컨대 RNAi 제제), 단백질/펩티드(예컨대 항체), 지질, 탄수화물, 호르몬, 금속, 방사성 원소 및 화합물, 약물, 백신, 면역학적 제제 등, 및/또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료제는 암 치료에 유용한 제제, 예컨대, 화학요법제일 수 있다. 화학요법제의 비제한적인 예는 다우노마이신, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 카보플라틴, 베라파밀, 시토신 아라비노시드, 아미노프테린, 데모콜신, 타목시펜, 악티노마이신 D, 알킬화제(제한 없이, 질소 머스타드, 에틸렌이민 유도체, 알킬 설포네이트, 니트로소우레아 및 트리아젠 포함): 우라실 머스타드, 클로르메틴, 사이클로포스파미드(시톡산®), 이포스파미드, 멜팔란, 클로람부실, 피포브로만, 트리에틸렌-멜라민, 트리에틸렌티오포스포라민, 부설판, 카머스틴, 로무스틴, 스트렙토조신, 다카바진, 및 테모졸로미드; 항대사물질(제한 없이, 엽산 길항제, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체 및 아데노신 디아미나제 억제제 포함): 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실(5-FU), 플록스우리딘, 시타라빈, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 플루다라빈 포스페이트, 펜토스타틴, 및 젬시타빈, 천연물 및 이의 유도체(예를 들어, 빈카 알칼로이드, 항종양 항생제, 효소, 림포카인 및 에피포도필로톡신): 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 블레오마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, Ara-C, 파클리탁셀(파클리탁셀은 Taxol®로 상업적으로 이용 가능함), 도세탁셀, 미트라마이신, 데옥시코-포마이신, 미토마이신-C, L-아스파라기나제, 인터페론(특히 IFN-a), 에토포사이드, 및 테니포사이드를 포함하며; 다른 항증식성 세포독성제는 나벨벤, CPT-11, 아나스트라졸, 레트라졸, 카페시타빈, 레록사핀, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 및 드롤록사핀이다. 추가의 항증식성 세포독성제는 비제한적으로 멜팔란, 헥사메틸 멜라민, 티오테파, 시타라빈, 이다트렉세이트, 트리메트렉세이트, 다카바진, L-아스파라기나제, 캄프토테신, 토포테칸, 비칼루타미드, 플루타미드, 류프롤리드, 피리도벤조인돌 유도체, 인터페론, 인터류킨, 항증식성 세포독성제(제한 없이, EGFR 억제제, Her-2 억제제, CDK 억제제, 및 트라스트주맙 포함)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 입자 및/또는 조성물의 투여와 함께 투여될 수 있는 치료제는 에피루비신(EPI), 독소루비신, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 카보플라틴, 다우노루비신, 탁솔, 도세탁셀, 젬시타빈, 5-플루오로우라실, 미토마이신, 시타라빈, 시톡산, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학요법제이다.
본 발명의 추가 양태는 NK 세포 활성화, 암세포에서 세포독성 유도, 암세포에 치료제 전달, 및/또는 암 치료에서 본 발명의 입자(예컨대, 나노입자) 및/또는 조성물의 사용을 포함한다. 본 발명의 입자(예컨대, 나노입자) 및/또는 조성물을 포함하는 사용을 위한 약제 제조가 또한 본원에서 제공된다.
일부 실시형태에서, 사용을 위한 본 발명의 입자(예컨대, 나노입자) 및/또는 조성물 및 지침을 포함하는 키트가 또한 본원에서 제공된다.
약학 조성물 및 사용 방법
일부 실시형태에서, 본 발명은 또한 다음 중 하나 이상과 함께 본 발명의 입자를 포함하는 조성물을 제공한다: 약학적으로 허용되는 희석제; 담체; 가용화제; 유화제; 보존제; 및/또는 보조제. 이러한 조성물은 유효량의 입자를 함유할 수 있다. 따라서, 약학 조성물 또는 약제의 제조에서 본원에서 제공되는 바와 같은 입자의 사용이 또한 포함된다. 이러한 조성물은 본원에 기술된 바와 같은 다양한 질병 및 장애의 치료에서 사용될 수 있다.
약학 제제에 대해 허용되는 제형 성분은 사용되는 용량 및 농도에서 수용자에게 무독성이다. 본원에 제공된 입자 외에, 본 발명에 따른 조성물은 예를 들어, pH, 삼투압 농도, 점도, 투명도, 색상, 등장성, 냄새, 무균성, 안정성, 용해 또는 방출 속도, 조성물의 흡수 또는 침투를 변경, 유지 또는 보존하기 위한 성분을 함유할 수 있다. 약학 조성물의 제형화에 적합한 물질은 비제한적으로 아미노산(예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라진, 아르기닌 또는 리신); 항균제; 항산화제(예컨대 아스코르브산, 소듐 설파이트 또는 소듐 히드로겐-설파이트); 완충제(예컨대 아세테이트, 보레이트, 바이카보네이트, Tris-HCl, 시트레이트, 포스페이트 또는 다른 유기산); 벌크제(예컨대 만니톨 또는 글리신); 킬레이트제(예컨대 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)); 착화제(예컨대 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-사이클로덱스트린 또는 히드록시프로필-베타-사이클로덱스트린); 충전제; 모노사카라이드; 다이사카라이드; 및 기타 탄수화물(예컨대 글루코스, 만노스 또는 덱스트린); 단백질(예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린); 착색제, 향미제 및 희석제; 유화제; 친수성 중합체(예컨대 폴리비닐피롤리돈); 저분자량 폴리펩티드; 염-형성 반대이온(예컨대 소듐); 보존제(예컨대 벤잘코늄 클로라이드, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 펜에틸 알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산 또는 과산화수소); 용매(예컨대 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜); 당 알코올(예컨대 만니톨 또는 솔비톨); 현탁제; 계면활성제 또는 습윤제(예컨대 플루로닉, PEG, 솔비탄 에스터, 폴리솔베이트 예컨대 폴리솔베이트 20, 폴리솔베이트 80, 트리톤, 트로메타민, 레시틴, 콜레스테롤, 틸록사팔); 안정성 향상제(예컨대 수크로스 또는 솔비톨); 긴장성 향상제(예컨대 알칼리 금속 할라이드, 바람직하게는 소듐 또는 포타슘 클로라이드, 만니톨 솔비톨); 전달 비히클; 희석제; 부형제 및/또는 약학적 보조제를 포함한다.
약학 조성물 중의 1차 비히클 또는 담체는 사실상 수성 또는 비수성일 수 있다. 이러한 조성물에 적합한 비히클 또는 담체는 주사용수(예컨대, 멸균수), 생리 식염수 또는 인공 뇌척수액을 포함하며, 가능하게는 비경구 투여용 조성물에서 일반적인 다른 물질로 보충된다. 중성 완충된 염수 또는 혈청 알부민과 혼합된 염수가 추가의 예시적인 비히클이다.
본 발명의 입자를 포함하는 조성물은 원하는 순도를 갖는 선택된 조성물을 동결건조된 케이크 또는 수용액 형태의 선택적인 제형화제와 함께 혼합함으로써 저장을 위해 제조될 수 있다. 또한, 입자는 수크로스와 같은 적절한 부형제를 사용하여 동결건조물로서 제형화될 수 있다.
제형 성분은 투여 부위에 허용되는 농도로 존재한다. 완충제는 생리학적 pH 또는 약간 더 낮은 pH, 전형적으로 약 4.0 내지 약 8.5의 pH 범위 이내, 또는 대안적으로는, 약 5.0 내지 8.0 범위 내에서 조성물을 유지하는데 유리하게 사용된다. 약학 조성물은 약 pH 6.5 내지 8.5의 TRIS 완충액, 또는 약 pH 4.0 내지 5.5의 아세테이트 완충액을 포함할 수 있으며, 추가로 솔비톨 또는 이에 대한 적합한 대체물을 추가로 포함할 수 있다.
약학 조성물은 정제의 제조에 적합한 비-독성 부형제와의 혼합물에 유효량의 본 발명의 입자를 포함할 수 있다. 정제를 멸균수, 또는 다른 적절한 비히클에 용해시킴으로써, 용액은 단위-투여 형태로 제조될 수 있다. 적합한 부형제는 비제한적으로 불활성 물질, 예컨대 칼슘 카보네이트, 소듐 카보네이트 또는 바이카보네이트, 락토스, 또는 칼슘 포스페이트; 또는 결합제, 예컨대 전분, 젤라틴, 또는 아카시아; 또는 윤활제 예컨대 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 또는 활석을 포함한다.
추가의 약학 조성물은 지속(sustained-) 또는 제어(controlled-) 전달 제형 형태이다. 다양한 다른 지속- 또는 제어-전달 수단, 예컨대 리포좀 담체, 생체-부식성 마이크로입자 또는 다공성 비드 및 데포 주사를 제형화하는 기술이 될 수 있다. 지속-방출 제형은 성형품 형태의 반투과성 중합체 매트릭스, 예컨대, 필름, 또는 마이크로캡슐, 폴리에스터, 히드로겔. 폴리락타이드, L-글루탐산과 감마 에틸-L-글루타민의 공중합체, 폴리 (2-히드록시 에틸-메타크릴레이트), 에틸렌 비닐 아세테이트, 또는 폴리-D(-)-3-히드록시부티르산을 포함할 수 있다. 지속 방출 조성물은 또한 당업계에 공지된 임의의 몇몇 방법에 의해 제조될 수 있는 리포좀을 포함할 수 있다.
생체 내 투여에 사용될 약학 조성물은 전형적으로 멸균 상태이다. 멸균은 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 달성될 수 있다. 조성물이 동결되었을 경우, 멸균은 동결 및 재구성 전 또는 후에 수행될 수 있다. 비경구 투여용 조성물은 동결 건조된 형태로 또는 용액 중에서 저장될 수 있다. 특정 실시형태에서, 비경구 조성물은 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어, 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개가 있는 정맥내 용액 백 또는 바이알, 또는 주사에 사용될 준비가 된 멸균 사전 충전된 주사기에 배치된다.
조성물은 공지된 기술에 따라, 선택적으로 미세바늘, 미세발사체(microprojectile), 패치, 전극, 접착제, 지지체, 및/또는 패키징, 또는 제트 전달용 제형을 포함하는, 경피 전달용으로 제형화될 수 있다. 예컨대, 미국 특허 제 8,043,250 호; 제 8,041,421 호; 제 8,036,738 호; 제 8,025,898 호; 제 8,017,146 호를 참조한다.
본 발명의 약학 조성물이 일단 제형화되면, 용액, 현탁액, 겔, 에멀젼, 고체로서, 또는 탈수 또는 동결건조 분말로서 멸균 바이알에 저장될 수 있다. 이러한 제형은 바로 사용할 수 있는 형태(ready-to-use form) 또는 투여 전에 재구성되는 형태(예컨대, 동결건조)로 저장될 수 있다.
약학 조성물을 제형화하기 위해 사용되는 성분은 바람직하게는 고순도이고 잠재적으로 유해한 오염물이 실질적으로 없다(예를 들어, 적어도 식품(NF: National Food) 등급, 일반적으로 적어도 분석 등급, 보다 전형적으로 적어도 약학 등급). 더욱이, 생체 내 사용을 위한 조성물은 일반적으로 무균 상태이다. 주어진 화합물이 사용 전에 합성되어야 하는 정도까지, 생성된 생성물은 전형적으로 합성 또는 정제 과정 동안 존재할 수 있는 임의의 잠재적인 독성 물질, 특히 임의의 내독소가 실질적으로 없다. 비경구 투여용 조성물은 또한 멸균되고, 실질적으로 등장성이고 GMP 조건하에 제조된다.
본 발명은 다중-용량 또는 단일-용량 투여 단위를 생산하기 위한 키트를 제공한다. 예를 들어, 본 발명에 따른 키트는 단일 및 다중-챔버의 사전 충전된 주사기(예를 들어, 액체 주사기, 동결 주사기 또는 바늘이 없는 주사기)를 비롯하여 각각 건조된 조성물을 갖는 제1 용기 및 수성 희석제를 갖는 제2 용기를 모두 함유할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 비경구적으로, 전형적으로 주사에 의해 전달될 수 있다. 주사는 안구내, 복강내, 문맥내, 근육내, 정맥내, 척추강내, 뇌내(실질내), 뇌실내, 유리체내, 동맥내, 병변내, 병변주위 또는 피하일 수 있다. 점안액은 안구내 투여에 사용될 수 있다. 일부 경우에, 주사는 치료가 목표로 하는 특정 뼈 또는 뼈들 부근에 국한될 수 있다. 비경구 투여의 경우, 키메라 단백질은 약학적으로 허용되는 비히클에 키메라 단백질을 포함하는 발열원 없는 비경구적으로 허용되는 수용액으로 투여될 수 있다. 비경구 주사에 특히 적합한 비히클은 키메라 단백질이 적절하게 보존된 멸균 등장 용액으로서 제형화된 멸균 증류수이다.
본 발명의 입자를 포함하는 약학 조성물은 볼루스 주사에 의해 및/또는 주입에 의해, 이식 장치에 의해, 지속 방출 시스템 또는 장기간 방출을 달성하기 위한 다른 수단에 의해 연속적으로 투여될 수 있다. 약학 조성물은 또한 원하는 분자가 흡수되거나 캡슐화된 막, 스펀지 또는 다른 적절한 물질의 이식을 통해 국소적으로 투여될 수 있다. 이식 장치가 사용되는 경우, 장치는 임의의 적절한 조직 또는 기관에 이식될 수 있으며, 원하는 분자의 전달은 확산, 시간-방출 볼루스 또는, 연속 방출을 통해 이루어질 수 있다. 제제는 이어서 데포 주입을 통해 전달될 수 있는 제품의 제어 또는 지속 방출을 제공할 수 있는, 주사 가능한 마이크로구체, 생체-분해성 입자, 중합체 화합물(예컨대 폴리락트산; 폴리글리콜산; 또는 코폴리(락트산/글리콜)산(PLGA), 비드 또는 리포솜과 같은 제제로 제형화될 수 있다. 히알루론산을 함유한 제형은 순환에서 지속 기간을 촉진하는 효과가 있다.
본 발명의 입자를 포함하는 본 조성물은 흡입용으로 제형화될 수 있다. 이러한 실시형태에서, 입자는 흡입용 건조 분말로서 제형화될 수 있거나, 입자 흡입 용액은 또한 분무에 의한 것과 같은 에어로졸 전달을 위한 추진제와 함께 제형화될 수 있다.
본 발명의 특정 약학 조성물은 경구와 같은 소화관을 통해 전달될 수 있다. 이러한 방식으로 투여되는 본 발명의 입자는 정제 및 캡슐과 같은 고체 투여 형태의 배합에 통상적으로 사용되는 담체와 함께 또는 담체 없이 제형화될 수 있다. 캡슐은 생체이용률이 최대화되고 사전-전신 분해가 최소화될 때 위장관의 지점에서 제형의 활성 부분을 방출하도록 설계될 수 있다. 입자의 흡수를 촉진하기 위해 추가 제제가 포함될 수 있다. 경구 투여의 경우, 변형된 아미노산을 사용하여 소화 효소에 대한 내성을 부여할 수 있다. 희석제, 향미제, 저융점 왁스, 식물성 기름, 윤활제, 현탁제, 정제 붕해제, 및 결합제가 또한 사용될 수 있다.
입자를 포함하는 본 조성물은 또한 생체 외에서 사용될 수 있다. 그러한 경우에, 대상체로부터 제거된 세포, 조직 또는 기관은 입자에 노출되거나 입자와 함께 배양된다. 그런 다음 배양된 세포는 대상체 또는 다른 대상체에 다시 이식되거나 다른 목적으로 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 면역학적 반응의 기회를 감소시키기 위해, 본 발명의 입자는 주변 조직의 침윤을 피하기 위해 캡슐화될 수 있다. 캡슐화 재료는 전형적으로 입자의 방출을 허용하지만 환자의 면역계 또는 주변 조직의 기타 유해한 요인에 의한 세포 파괴를 방지하는 생체적합성, 반투과성 중합체 인클로저 또는 멤브레인이다.
제공되는 약학 조성물은 예방적 및/또는 치료적 치료를 위해 투여될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 입자의 독성 및 치료 효능은 예를 들어 LD5O(집단의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량) 결정을 포함하여, 세포 배양 및/또는 실험 동물에서 표준 약학 절차에 따라 결정될 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 용량 비율은 치료 지수이며 LD50/ED50 비율로 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 조성물이 바람직하다.
세포 배양 및/또는 동물 연구에서 얻은 데이터는 치료 대상체에 대한 투여량 범위를 공식화하는 데 사용할 수 있다. 활성 성분의 투여량은 전형적으로 독성이 거의 또는 전혀 없는 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내에 속한다. 투여량은 사용된 투여 형태 및 사용된 투여 경로에 따라 이러한 범위 내에서 변할 수 있다.
치료적으로 또는 예방적으로 사용되는 본 발명의 입자를 포함하는 약학 조성물의 유효량은 예를 들어 치료 맥락 및 목적에 따라 달라질 것이다. 당업자는 특정 실시형태에 따른 치료를 위한 적절한 투여량 수준이 따라서 부분적으로 전달될 조성물, 입자가 사용될 적응증, 투여 경로, 및 대상체의 크기(체중, 체표면 또는 장기 크기) 및/또는 상태(나이 및 일반적인 건강)에 따라 달라질 것임을 알 것이다. 임상의는 최적의 치료 효과를 얻기 위해 투여량을 조절하고 투여 경로를 수정할 수 있다. 본 발명의 입자 투여를 위한 전형적인 투여량은 약 0.001 mg/kg 내지 2000 mg/kg 범위이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 입자는 1주 내지 3주 마다 정맥내로 투여될 수 있다.
투여 빈도는 제형 내 입자의 약동학적 매개변수에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 임상의는 원하는 효과를 달성하는 용량에 도달할 때까지 조성물을 투여할 것입니다. 따라서, 조성물은 시간 경과에 따라 단일 용량 또는 2회 이상의 용량(이는 동일한 양의 원하는 분자를 함유하거나 함유하지 않을 수 있음)으로서, 또는 이식 장치 또는 카테터를 통한 연속 주입으로서 투여될 수 있다. 치료는 시간이 지남에 따라 계속되거나 간헐적일 수 있다. 적절한 투여량의 추가 개선은 당업자에 의해 일상적으로 이루어지며 그들이 일상적으로 수행하는 작업의 범위 내에 있다. 적절한 용량-반응 데이터를 사용하여 적절한 용량을 확인할 수 있다.
일부 실시형태에서, 입자는 하나 이상의 다른 치료제 및/또는 상이한 요법과 병용하여 투여될 수 있다. 치료제의 예는 비제한적으로 항감염제(예컨대 방부제, 항생제 및/또는 항진균제), 항염제 및/또는 면역조절제를 포함한다. 치료제는 입자와 동시에 투여될 수 있고/있거나 상이한 시점에 투여될 수 있다. 치료제의 투여 경로는 입자의 투여 경로와 동일하거나 상이할 수 있다.
본 발명의 장애를 치료하기 위해, 본 발명의 입자를 포함하는 조성물은 장애의 중증도를 반영하는 적어도 하나의 지표에서 지속적인 개선을 유도하기에 충분한 양 및 시간 동안 이를 필요로 하는 대상체에 투여될 수 있다. 예를 들어, 입자는 약 매 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일 또는 그 이상의 일 및/또는 주 마다 투여될 수 있다. 다른 실시형태에서, 입자는 1주 및/또는 1개월 및/또는 1년에 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10회 또는 그 이상일 수 있다. 일부 실시형태에서, 개선은 대상체가 적어도 1 내지 7일, 또는 일부 경우에는 1 내지 6주 간격으로 적어도 2번의 경우에 개선을 나타내는 경우 개선은 "지속된" 것으로 간주된다. 적절한 간격은 치료 중인 질병 상태에 따라 어느 정도 달라질 것이다. 개선이 지속되는지 여부를 결정하기 위한 적절한 간격을 결정하는 것은 당업자의 범위 내에 있다.
본 발명의 입자 및/또는 본원에 기술된 바와 같은 약학 조성물을 포함하는 키트가 또한 본원에 제공된다. 일부 키트는 용기(예컨대, 바이알 또는 앰플)에 입자 및/또는 조성물을 포함하고, 또한 위에 개시된 다양한 방법에서 입자 및/또는 조성물을 사용하기 위한 지침을 포함할 수 있다. 입자 및/또는 조성물은 예를 들어 용액의 일부로서 또는 고체(예를 들어, 동결건조된 분말)로서를 비롯한 다양한 형태일 수 있다. 지침은 적절한 유체에서 입자를 제조(예를 들어, 용해 또는 재현탁)하는 방법 및/또는 본원에 기술된 질병 및 장애의 치료를 위해 입자를 투여하는 방법에 대한 설명을 포함할 수 있다.
키트는 또한 완충제, 염, 착화 금속 이온 및 약학 조성물에 대한 섹션에서 상기 기재된 기타 제제와 같은 다양한 기타 성분을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 키메라 단백질과 함께 포함되거나 별도의 용기에 포함될 수 있다. 키트는 또한 키메라 단백질과 함께 투여하기 위한 다른 치료제를 포함할 수 있다. 이러한 제제의 예는 상기 기재된 장애 또는 상태를 치료하기 위한 제제를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
하기 실시예는 단지 본원에 제공된 입자 및 조성물의 특정 양태를 예시하기 위해 제공되며 따라서 청구된 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예
다음의 실시예는 예시적인 실시형태를 제공한다. 하기 실시예의 특정 양태는 실시형태의 실시에서 잘 작동하도록 본 발명자들에 의해 발견되거나 고려된 기술 및 절차의 관점에서 개시된다. 본 개시내용 및 당해 기술 분야의 일반적인 수준에 비추어, 당업자는 하기 실시예가 단지 예시적인 것으로 의도되고 현재 청구된 주제의 범위를 벗어나지 않으면서 수많은 변화, 수정 및 변경이 이용될 수 있음을 이해할 것이다.
실시예 1: NK 세포-매개된 면역요법을 위한 삼작용화된 나노인게이저.
본 연구는 표피 성장 인자 수용체(EGFR)-발현 종양을 표적으로 하고 NK 세포-매개 면역요법을 가능하게 할 수 있는 나노인게이저 플랫폼을 개발하였다. 나노인게이저는 종양에 화학요법을 제공하고 치료 효과를 더욱 향상시킬 수 있다. 나노인게이저 플랫폼은 생체적합성 폴리(에틸렌 글리콜)-블록-폴리(락타이드-코-글리콜라이드) PEG-PLGA 나노입자(NP)를 기반으로 한다. NP는 세툭시맙(항-인간 EGFR 항체, α-EGFR), 및 2개의 NK 활성화제: 항-CD16(α-CD16) 및 항-4-1BB(α-4-1BB) 항체로 작용화된다. 화학요법 에피루비신(EPI)도 또한 NP 내에 캡슐화될 수 있다. 이러한 3가 나노인게이저는 EGFR-과발현된 종양에서 제어-방출 EPI에 맞게 조정되었을 뿐만 아니라 전신 투여 후 순환하는 NK 세포를 모집하고 활성화하도록 설계되었다(도 1a).
NK 세포-매개 화학면역요법을 위한 다가 EGFR-표적화된 나노인게이저의 설계: 다가 비-표적화 및 EGFR-표적화된 α-CD16 및 α-4-1BB-작용화된 무약 및 EPI-캡슐화된 PEG-PLGA NP(EPI NP)를 2단계 제조 방법을 통해 조작하였다(도 1b, 도 1c, 도 2 및 도 3; 표 1). 코어 아지드-작용화된 무약물 및 EPI-캡슐화된 NP를 나노침전 방법을 통해 먼저 제조하였다(문헌[Au et al. 2019 ACS Cent. Sci. 5(1): 122-144]). 이어서 디벤조시클로옥틴(DBCO)-작용화된 α-CD16, α-4-1BB, 및 α-EGFR은 구리가 없는 아지드-사이클로옥틴 고리화 첨가를 통해 아지드-작용화된 NP에 정량적으로 접합시켰다(문헌[Au et al. 2018 ACS Nano 12(2) : 1544-1563]). 1 : 1 α-CD16 대 α-4-1BB 몰 비율 및 1 : 1 : 1 α-CD16 대 α-4-1BB 대 α-EGFR 몰 비율을 2가 및 3가 NP의 제조에 사용하였다. EPI NP는 대략 2.7 중량/중량%의 EPI로 캡슐화하였다(도 1d). 캡슐화된 EPI는 생리학적 조건에서 pH 의존적 제어 방출을 겪었고, 캡슐화된 EPI의 약 절반은 처음 24시간 내에 약산성(pH 6.0) 세포외 종양 미세환경 및 초기 엔도솜 조건에서 방출되었다(도 1d 및 도 4a 내지 도 4b). 형광-활성화 세포 분류(FACS: fluorescence-activated cell sorting) 결합 분석을 통해 α-CD16- 및 α-4-1BB-작용화된 NP가 각각 A488-표지된 뮤린 CD16 및 텍사스 레드-표지된 뮤린 4-1BB에 선택적으로 결합함을 확인하였다. 추가 시험관 내 결합 분석 및 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM: confocal laser scanning microscopy) 연구를 통해 4개의 상이한 FITC-표지된 다가 α-CD16 및/또는 α-4-1BB NP 모두가 NK 세포에 선택적으로 결합함을 확인하였다(도 5a 내지 도 5b). EGFR-과발현된 HT29(대장직장 선암종), MB468(삼중-음성 유방암) 및 A431(표피양 암종) 세포에 대한 상이한 α-EGFR-작능화된 NP의 결합 친화도를 시험관 내 결합 분석(도 5c) 및 CLSM에 의해 확인하였다. 대조군 EGFR 비발현 Raji 세포에서는 비특이적 결합이 관찰되지 않았다(도 5d). 시험관 내 CLSM 연구를 통해 3개의 EGFR-과발현된 암세포 모두 EGFR-표적화된 NP와 함께 짧은 인큐베이션 후 캡슐화된 EPI를 차지함을 확인하였다. 표적화된 EPI-캡슐화된 NP는 4 내지 6 μM 사이의 반-최대 억제 농도(IC50)로 HT29, MB468 및 A431 세포에 대해 직접적인 항암 활성을 나타내는 반면(도 5e), 동일한 농도의 비-표적화된 EPI NP 또는 NP-고정 항체는 미미한 독성을 나타냈다. γ-H2AX 분석(도 5f)을 통해 EPI가 세포 DNA에 삽입된 결과로서 암세포에서 DNA 이중-가닥 파손의 형성을 확인하였다.
α-CD16 및 α-4-1BB-작용화된 나노입자는 시험관 내 에서 NK 세포를 효과적으로 활성화할 수 있다: 본 연구의 한 가지 목표는 α-CD16 및 α-4-1BB의 NP 제형이 유리 α-CD16 및 α-4-1BB 항체보다 NK 활성화에 보다 효과적임을 보여주는 것이었다. NK 세포에 대한 CD16 및 4-1BB 자극 분자의 효과적인 시공간적 활성화가 NK 세포-매개 특이적 용균을 증가시킬 수 있음을 입증하기 위해, 루시페라제-표지된 B16F10(B16F10-Luc) 표적화된 세포의 존재 하에 NK 세포 세포독성 분석을 수행하였다. NK 세포 단독은 NK 세포가 암세포를 인식/결합하지 않고 활성화되지 않기 때문에 1 : 1 효과기/표적(E/T) 비율(도 6a 내지 도 6b)에서 B16F10-Luc 세포에 대해 제한된 직접적인 세포독성(약 10%)을 나타냈다. 암세포 인식 또는 결합을 가능하게 하기 위해, B16F10-Luc 세포 표면 상의 NK 세포-활성화 리간드(예컨대, CD112, ULBP-1)를 상향 조절하기 위해 종양 세포에 5Gy 조사(IR)를 제공하였다. 이러한 면역 자극 시에, NK 세포는 B16F10-Luc 세포에 대해 중간 정도의 세포독성을 나타냈다(도 6a). 유리 α-CD16 또는 α-4-1BB로 NK 세포를 전처리하면 세포독성이 각각 44.4 ± 2.6% 및 38.0 ± 3.7%로 유의하게 증가하였다(도 6a 및 도 6c). α-CD16 NP- 및 α-4-1BB NP-전처리된 NK 세포는 유리 항체-전처리된 NK 세포보다 유의하게 더 높은 독성(각각 52.7 ± 1.9% 및 57.9 ± 3.5%)을 나타냈다. 이러한 증가된 세포독성은 NP에 의한 CD16 및 4-1BB 공동 자극 분자의 증가된 협력 결합 및 보다 효과적인 결찰("클러스터링")에 의해 설명될 수 있다. 가장 중요하게는, 두 NK 활성화제(α-CD16/a-4-1BB NP)를 모두 함유하는 NP 전처리는 NK 세포 세포독성을 77.1 ± 2.1%로 추가로 증가시켰으며, 이는 유리 α-CD16 플러스 유리 α-4-1BB를 사용한 전처리(p = 0.0019 대 치료) 및 α-CD16 NP + α-4-1BB NP(p = 0.0207)보다 훨씬 더 높다. 증가된 세포독성은 두 유리 작용성 항체를 결합하여 달성될 수 없는 이중-항체-작용화된 NP에서 두 자극 분자의 동시 활성화와 클러스터링 효과에 의해 설명될 수 있다. 면역자극된 B16F10 세포와 α-CD16/α-4-1BB NP-전처리된 NK 세포의 결합을 위상-민감성 광학 현미경에 의해 직접 확인하였다(도 6d).
다음으로, EGFR-표적화된 삼작용화된 나노인게이저가 반딧불이 루시퍼라제-발현 HT29 세포(HT29-Luc2)에 대한 NK 세포 세포독성을 개선하는 방법을 조사하였다. B16F10-Luc 세포와 유사하게, NK 세포 단독은 HT29-Luc2 세포에 대해 매우 낮은 세포독성을 나타내었다(도 6f, 상부 패널). 유사하게, 유리 α-EGFR 또는 α-EGFR NP의 존재 하에 유리 α-CD16 및 α-4-IBB 또는 α-CD16 NP 및 α-4-1BB NP로 전처리된 HT29-Luc2 세포는 NK 세포 세포독성에 유의한 영향을 미치지 않았으며 이는 표적 리간드가 NK 활성화제와 연관되지 않았기 때문이다. 한편, 무약물 및 EPI-캡슐화된 삼작용성 나노인게이저(α-EGFR/α-CD16/α-4-1BB NP)는 모두 NK 세포 세포독성을 유의하게 증가시켰다(도 6e 및 도 6f, 하단 패널). 치료 효능의 이러한 증가는 α-EGFR의 표적화 효과 및 NK 활성화제에 대한 이의 연결에 기인한다. 본 연구에서, EPI는 NK 세포 세포독성에 유의한 영향을 미치지 않았다(도 6e). 추가 시험관 내 독성 연구를 통해 무약물 또는 EPI-캡슐화된 3가 나노인게이저의 준-치료용량이 HT29, MB469 및 A431 세포에 대한 NK 세포의 세포독성을 효과적으로 향상시킬 수 있음을 확인하였다(도 6g 및 도 6h). NK 세포 세포독성의 향상은 유리 α-EGFR, α-CD16 및 α-4-1BB 항체의 조합에 의해 달성될 수 없었다. 위상-감응 광학 현미경 연구를 통해 α-EGFR/α-CD16/α-4-1BB NP-전처리된 암세포에 대한 NK 세포의 결합을 확인하였지만, α-CD16/α-4-1BB 및 α-EGFR NP-전처리된 암세포에서는 유의미한 NK 세포 결합이 관찰되지 않았다. 따라서, 접합된 α-EGFR은 3가 NP가 NK 세포를 모집하고 활성화하는데 필수적이다.
CD16 및 4-1BB 자극 분자의 시공간적 공동-활성화는 NK 세포를 효과적으로 활성화하여 생체 내 에서 암을 근절할 수 있지만 생물학적 표적화를 필요로 한다: 시험관 내 관찰을 4가지 암 마우스 모델을 사용하여 검증하였다. α-CD16/a-4-1BB NP의 생체 내 효능을 조사하기 위해, B16F10 동계 마우스 흑색종 모델을 이용하였으며, 여기서 면역만능(immunocompetent) C57BL/6 마우스는 접종 후 5, 8, 10, 12, 15, 및 18일에 α-CD20, α-NK1.1, α-CD4, 및 α-CD8(300 μg/주사)의 i.p. 주사에 의한 면역 세포-고갈된 B 세포, NK 세포, CD4+ T 세포, 및 CD8+ T 세포이다. 마우스 IgG 2a(300 μg/주사)를 이소형 대조군으로서 투여하였다. α-CD16/α-4-1BB NP(100 μg의 각 항체 함유)를 접종 후 6, 7, 및 8일에 i.v.로 투여하였다. 100 μg의 α-CD16 및/또는 100 μg의 α-4-1BB(유리 또는 NP-접합됨)가 함유된 면역치료제를 접종 후 6, 7, 및 8일에 미정맥에 i.v.로 투여하였다. 면역자극군에 있는 마우스의 이종이식 종양에 면역치료제를 투여하기 4시간 전에 단일 5 Gy 조사를 적용하여 암세포에서 NK 세포 활성화 리간드를 상향조절하였다. α-CD16/α-4-BB NP는 중간 정도의 항암 활성(평균 종양 부피 - 접종 후 19일에 비처리군보다 약 40% 더 작음; p = 0.0479 대 비처리군) 및 약간 연장된 생존(절대 성장 지연(AGD: absolute growth delay) = +3일; p = 0.0156 대 비처리군; 도 7a, 도 8a 및 도 8b)을 나타태는 것으로 확인되었다. 더욱이, 유리 항체, 항체-작용화된 NP, 또는 이들의 1 : 1 조합을 사용한 치료는 유의한 항암 활성을 나타내지 않았다(도 7b 및 도 8b). 이러한 효능의 부족은 NK 세포의 종양 세포에 대한 인식/결합의 부족과 일치한다. α-CD16/α-4-BB NP의 효과는 동물 시스템 전반에 걸쳐 NK 세포의 비특이적 활성화에 의해 촉진될 가능성이 있다. 그러나, 이러한 시스템 활성화는 독성 관점에서 바람직하지 않다.
종양 세포/표적화의 NK 인식을 가능하게 하기 위해, 종양에 5 Gy를 조사하였다. 방사선 조사 후, 마우스를 α-CD16/α-4-BB NP로 처리하였거나 α-CD16, α-4-BB, α-CD16 NP, α-4-BB NP 또는 이들의 1 : 1 조합으로 대조군 처리하였다. α-CD16/α-4-BB NP에 의한 강력한 치료 반응은 방사선 요법만을 받은 마우스와 비교했을 때 약 60%의 종양 성장 감소로 관찰되었다(접종 후 19일에)(도 7b 및 도 8b 내지 도 8c). α-CD16 NP와 α-4-1BB NP의 조합도 또한 종양 성장을 억제하였지만 억제는 α-CD16/α-4-1BB NP보다 덜 유의하였다. 다른 처리는 대조군과 비교할 때 종양 성장을 유의하게 지연시키지 않았다. 이러한 발견은 효과적인 NK 활성화와 종양 표적화/결합이 모두 NK 세포-매개 암 치료에서 필수적인 기작임을 시사한다.
CD16 및 4-1BB는 또한 동계 모델에서 적응 면역계를 활성화할 수 있기 때문에, B16F10 종양 모델에서 면역 세포 고갈 연구를 수행하여 치료 효과가 NK 세포 활성으로 인한 것임을 검증하였다. CD20+ B 세포, CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 고갈은 α-CD16/α-4-1BB NP의 항암 효능에 유의한 영향을 미치지 않았다(각각 p = 0.4448, 0.5590 및 0.4859 대 이소형 대조군; 도 7c 및 도 8d). 한편, α-NK1.1에 의한 NK 세포의 고갈은 α-CD16/α-4-1BB NP의 항암 효능을 유의하게 감소시켰다(p < 0.0001 대 이소형 대조군). 이러한 치료제를 또한 T 세포-결핍 흉선 누드(Nu) 마우스의 B16F10 이종이식 종양 모델에서 조사하였다. 이들 마우스는 적응 면역계가 결여되어 있고, α-CD16/α-4-1BB NP(방사선 요법에 의해 표적화됨)는 효과적인 치료였으며(도 8e), 추가로 이러한 NP의 작용 기작이 선천 면역계를 통한 것임을 확인시켜준다.
EGFR-표적화된 삼작용화된 나노인게이저는 생체 내 에서 EGFR-과발현된 암 성장을 효과적으로 억제한다: 방사선 요법이 전신 질환을 표적으로 하는데 활용될 수 없다는 점을 감안할 때, 본 연구는 표적화 리간드를 통해 종양 세포를 표적으로 할 수 있는 나노인게이저를 조작하는 것을 목표로 하고 있다. EGFR 표적화를 원리 증명을 입증하기 위해 선택하였다. EGFR-표적화된 3가 나노인게이저가 추가적인 외부 면역자극 없이 효과적인 NK-세포 매개 면역요법 및 화학면역요법을 허용한다는 것을 입증하기 위해, EGFR-과발현된 A431 종양 모델에서 포괄적인 생체 내 항암 효능 연구를 수행하였다(도 9a). 본 연구는 EGFR 표적화 단독으로는 효과적인 치료를 제공하지 않으며, α-EGFR 치료는 대조군과 비교할 때 최소 효과를 나타냄을 보여주었다(p = 0.6127 대 비처리군; 도 9b 및 도 10a). 유리 α-EGFR 및 α-CD16/α-4-1BB NP 또는 α-EGFR NP 및 α-CD16/a-4-1BB NP를 사용한 처리는 종양 성장의 중간 정도의 지연을 야기하였다(각각 p = 0.0046 및 0.0061 대 비처리군). α-EGFR/α-CD16/α-4-1BB NP를 사용한 처리는 비처리군과 비교하여 초기 치료 후 평균 24일의 종양 성장 지연 및 평균 18일의 연장된 생존으로 가장 강력한 처리 반응을 가졌다(p = 0.0018). 이러한 데이터를 통해 EGFR-표적화된 나노인게이저가 외부 자극 없이도 NK 세포가 EGFR-과발현된 종양 세포를 공격하도록 효과적으로 안내할 수 있음을 확인하였다.
NP는 또한 화학요법을 전달하고 화학면역요법을 가능하게 하기 때문에, 화학요법 페이로드와 함께 EGFR-표적화된 나노인게이저의 사용을 조사하였다. EPI를 모델 약물로서 사용하였다. 유리 EPI, α-EGFR EPI NP, α-EGFR/α-CD16/α-4-1BB EPI NP, α-EGFR/α-CD16/α-4-1BB NP 및 유리 EPI, 및 α-CD16/α-4-1BB NP와 α-EGFR EPI NP의 항암 활성을 비교하였다. 유리 EPI 및 α-EGFR EPI NP를 사용한 처리는 종양 성장 속도를 약간 감소시켰다(각각 p = 0.0017 및 p = 0.0061 대 비처리군; 도 9b 및 도 10a). 별도로 투여된 α-EGFR/α-CD16/α-4-1BB NP 및 유리 EPI를 사용한 화학면역요법은 α-CD16/α-4-1BB/α-EGFR NP 단독과 비교하여 효능을 유의하게 개선하지 않았다(p = 0.8531; 도 9b 및 도 10b). 그러나, α-EGFR/α-CD16/α-4-1BB EPI NP를 사용한 EGFR-표적화된 화학면역요법은 약 40일 동안 종양 성장을 효과적으로 억제하고 생존을 유의하게 연장시켰다(각각 p = 0.0017 및 0.0362 대 비처리군 및 α-EGFR/α-CD16/α-4-lBB NP 및 유리 EPI를 사용한 치료. 연구 종점(접종 후 75일)에서, α-EGFR/α-CD16/α-4-1BB EPI NP로 처리한 마우스의 절반이 생존한 반면, 다른 처리군의 마우스는 장기 생존을 달성하지 못하였다. 이러한 결과는 효과적인 표적화된 화학면역요법이 화학요법과 작용 항체가 동시에 암에 도달할 때만 달성될 수 있다는 것을 강조한다.
이러한 발견을 확인하기 위해, MB468 종양 모델에서 생체 내 효능 연구를 수행하여 무약물 및 EPI-캡슐화된 나노인게이저 모두의 항암 효과를 검증하였다(도 9a). A431 종양 모델에서 관찰된 항암 활성과 유사하게, 무약물 α-EGFR/α-CD16/α-4-1BB NP를 사용한 처리는 종양 성장이 유의하게 늦추었고(p = 0.0002 대 비처리군) 60%의 종양 성장 억제(TGI)를 야기하였다(도 9c 및 도 10c). α-EGFR/α-CD16/α-4-1BB EPI NP를 사용한 화학면역요법은 MB468 종양에 대해 강력한 항암 활성을 나타냈으며, 연구 종점에서 처리된 마우스의 83%가 안정한 질환(즉, 종양 부피의 25% 미만 증가)을 나타냈다(TGI = 84%). 반면에, α-EGFR/α-CD16/α-4-1BB NP와 유리 EPI 또는 α-EGFR EPI NP와 α-CD16/α-4-1BB NP를 사용한 처리는 단지 종양 성장 속도만을 늦추었고 각각 64% 및 49%의 TGI를 야기하였다(p < 0.0001 대 α-EGFR/α-CD16/α-4-1BB EPI NP를 사용한 처리; 도 9c 및 도 10d). 이는 화학요법제를 EGFR-표적화된 나노인게이저에 캡슐화하면 표적화된 동시 화학면역요법의 효과가 향상된다는 것을 나타낸다.
NK 세포-기반 치료에서 종양 표적화의 중요성을 추가로 검증하기 위해, EGFR을 발현하는 HT29 종양 및 EGFR 음성 Raji 종양을 갖는 이중-이종이식 종양 모델을 사용하여 나노인게이저를 조사하였다(도 9d). EGFR-음성 Raji 종양 모델은 다제 내성 단백질 1 수용체의 과발현을 감안할 때, NK 세포-매개 용균에 민감하고 소분자 안트라사이클린 치료에 둔감하기 때문에 음성 대조군으로 선택하였다. A431 및 MB468 종양 모델과 유사하게, 유리 α-CD16 및 α-4-IBB, α-CD16/α-4-1BB NP, 및 α-CD16/α-4-1BB NP와 유리 α-EGFR을 사용한 처리는 NK 세포가 종양을 인식하지 못하기 때문에 HT29 종양(p = 0.1171 대 비처리군) 및 Raji 종양(p = 0.1171 대 비처리군; 도 9d 및 도 10e)의 성장을 억제하지 않았다. 다른 한편으로, α-EGFR/α-CD16/α-4-1BB NP를 사용한 EGFR-표적화된 면역요법은 HT29 종양 성장을 유의하게 지연시켰고 연구 종점에서 66% TGI를 초래하였다(p = 0.0081 대 비처리군; 도 9d 및 도 10f). 그러나, 이러한 처리는 Raji 종양 성장에 유의한 영향을 미치지 않았다(p = 0.2805 대 비처리군; 도 9d 및 도 10e). 이러한 연구의 데이터는 생물학적 표적화가 NK-매개된 면역요법에 중요하고, EGFR-표적화된 나노인게이저가 EGFR-발현 종양에 매우 효과적이고 특이적이라는 것을 확고하게 확립하였다. A431 및 MB468 종양 모델에서 관찰된 항암 활성과 유사하게, 유리 EPI와 α-EGFR/α-CD16/α-4-1BB NP의 동시-처리는 HT29 종양의 처리 효과를 추가로 개선하지 않았다(p = 0.2014 대 α-EGFR/α-CD16/α-4-1BB NP를 사용한 처리; 도 9d 및 도 10e). 반대로, α-EGFR/α-CD16/α-4-1BB EPI NP를 사용한 처리는 HT29 종양 성장을 완전히 억제하고 84%의 평균 TGI를 야기하였다(p = 0.0113 대 비처리군, p = 0.0276 대 α-CD16/α-4-1BB/α-EGFR NP 플러스 유리 EPI를 사용한 처리). HT29 종양에 대한 개선된 항암 활성은 EPI가 EGFR-과발현된 종양에 표적화된 전달에 의해 설명될 수 있다. Raji 종양 성장은 이러한 표적화된 처리에 의해 영향을 받지 않았다(p = 0.0503 대 비처리군). HT29는 A431 및 MB468보다 EGFR 항원 발현이 낮지만, 모든 처리군에서 EGFR-음성 Raji 종양에서 관찰된 효능의 결여는 관찰된 항종양 활성이 선천성 면역계의 전신성 활성화보다는 표적화된 암세포와 NK 세포 사이의 특이적 결합을 수반함을 확인시켜주었다.
NK 세포-매개 화학면역요법을 위한 EGFR-표적화된 삼작용화된 나노인게이저에 대한 기계론적 통찰력: 삼작용화된 나노인게이저의 기능 기작에 대한 통찰력을 얻기 위해, A431 종양 모델을 사용하여 상관 연구를 수행하였다. 생체 외 근적외선 형광 영상화 방법을 통한 생체분포 연구는 종양이 α-EGFR과 동시-투여될 때 미미한 양(< 0.2 %ID/g)의 Cy5-표지된 α-CD16/α-4-1BB NP를 차지하는 것으로 나타났다(도 10f 및 도 11a). 한편, 투여된 Cy5-표지된 α-EGFR/α-CD16/α-4-1BB NP의 약 5.7 ± 1.3 %ID/g은 종양에 축적되어, Cy5-표지된 α-EGFR NP 플러스 Cy5-표지된 α-CD16/α-4-1BB NP보다 약 3배 더 높았다(p = 0.0251). EGFR-표적화된 3가 NP의 증가된 종양 흡수는 순환하는 NK 세포와 종양 세포의 결합을 촉진하고 종양-침윤성 NK1.1+ NK 세포의 수를 약 17배 증가시켰지만(도 11b), 조직병리학적 연구에서 나타나는 바와 같이, 유의한 DNA 손상은 관찰되지 않았다(도 11c). NP-공동-고정된 α-CD16 및 α-4-1BB도 또한 NK 세포를 효과적으로 활성화시켰기 때문에, 3가 나노인게이저로 처리한 후 혈청 사이토카인 수준(예컨대 TNF-α, INF-γ)이 유의하게 증가하였다(도 11d). 특히, 이러한 향상은 EGFR-표적화된 나노인게이저로 처리된 마우스에서만 관찰될 수 있지만 α-EGFR NP와 α-CD16/α-4-1BB NP의 조합에서는 관찰되지 않는다(도 11a). 이는 α-CD16/α-4-1BB NP에 의한 NK 세포 활성화가 NK 세포에 의한 종양 세포 인식을 촉진하지 않아 면역 활성화가 효과적이지 않기 때문이다. 화학면역요법군에서 유사한 생체분포 경향이 관찰되었다(도 11a 및 도 11e). α-EGFR로 작용화된 모든 EPI-캡슐화된 NP는 유리 EPI(약 3 %ID/g)에 비해 유의하게 더 높은 EPI 흡수(8.5 %ID/g 내지 10 %ID/g)를 갖는다. 증가된 EPI 흡수는 조직병리학적 연구에서 관찰된 바와 같이 (DNA 손상을 유발하는) 더 높은 γ-H2AX 발현과 일치한다(도 11c). α-EGFR/α-CD16/α-4-1BB EPI NP 또는 α-EGFR/α-CD16/α-4-1BB NP 플러스 유리 EPI의 투여는 혈청 사이토카인 수준에 영향을 미치지 않았으며, 이는 동시 EPI 처리가 NK 세포 항종양 활성에 영향을 미치지 않음을 시사한다(도 11d). 이러한 포괄적인 기계론적 연구를 통해 맞춤형 EPI-캡슐화된 나노인게이저가 세포독성 화학요법제를 암세포에 효과적으로 전달할 수 있고 NK 세포가 종양 세포를 공격하도록 촉진할 수 있음을 확인하였다.
이러한 연구는 화학요법의 동시 표적화된 전달과 암을 근절하기 위해 숙주의 선천성 면역계를 활성화하기 위한 새로운 번역 가능한 다중 모드 암 치료 플랫폼을 제시한다. 본 발명의 EGFR-표적화된 3가 나노인게이저는 순환하는 NK 세포를 동원하고 활성화하여 종양 세포를 공격하는 동시에 치료 용량의 세포독성 화학요법제를 종양 세포에 동시에 전달할 수 있음을 입증하였다. 종합적인 시험관 내 및 생체 내 연구는 이러한 합성 치사율은 기존의 화학면역요법 전략으로는 달성될 수 없음을 보여주었다. 데이터는 강력한 NK 활성화와 생물학적 표적화 모두가 NK 세포-매개 암 치료에서 중요하며, NP-기반 치료가 이러한 응용분야에 고유하게 적합하다는 것을 입증하였다. 생물학적 표적화의 필요성은 또한 이러한 접근법으로 전신/비특이적 독성이 낮다는 것을 시사한다. 나노인게이저의 간단한 모듈식 설계는 화학요법의 쉬운 교환을 가능케하고, 상이한 유형의 암 치료를 위한 모이어티를 표적으로 하고 다양한 유형의 면역 세포와 결합한다. 나노인게이저 플랫폼의 개발은 현재 이용 가능한 조합 면역요법 전략을 향상시킬 수 있다.
전술한 내용은 본 발명을 예시하는 것으로서, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명은 그 안에 포함되는 청구범위의 등가물과 함께, 다음의 청구범위에 의해 정의된다.
표
Figure pct00001

Claims (40)

  1. 나노입자로서,
    자연 살해(NK) 세포 표면 상의 제1 표적에 결합하는 적어도 하나의 제1 표적화제; 및
    암 세포 표면 상의 제2 표적에 결합하는 적어도 하나의 제2 표적화제를 포함하며, 상기 제2 표적화제는 상기 제1 표적화제와 상이한, 나노입자.
  2. 제1항에 있어서,
    적어도 2개의 제1 표적화제를 포함하는, 나노입자.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 적어도 2개의 제1 표적화제는 상기 NK 세포 표면 상의 상이한 표적에 결합하는, 나노입자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 NK 세포 표면 상의 상기 제1 표적은 CD16, 4-1BB, NKG2D, TRAIL, NKG2C, CD137, 0X40, CD27, KIR, NKG2a, dnam-1, 2b4, NKp30a, NKp30b, NKp30c, 항체 Fc 성분, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 나노입자.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 NK 세포 표면 상의 상기 제1 표적은 CD16 및/또는 4-1BB인, 나노입자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암세포는 선암종, 흉선종, 육종, 뇌암, 두경부암, 식도암, 위암, 폐암, 방광암, 신장암, 간암, 췌장암, 자궁암, 난소암, 자궁경부암, 항문암, 흑색종, 전립선암, 유방암, 혈액 세포 암, 직장결장암, 또는 이들의 임의의 조합 유래의 세포인, 나노입자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암 세포 표면 상의 상기 제2 표적은 EGFR, PSMA, 넥틴-4, 뮤신, HER-2, CD30, CD22, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 나노입자.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 암 세포 표면 상의 상기 제2 표적은 EGFR인, 나노입자.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 표적화제 및/또는 상기 제2 표적화제는 항체 또는 이의 활성 단편인, 나노입자.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 활성 단편은 모노클로날 항체, Fab 단편, Fab'-SH 단편, FV 단편, scFV 단편, (Fab')2 단편, Fc-융합 단백질, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 나노입자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    치료제를 추가로 포함하는, 나노입자.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 치료제는 에피루비신(EPI), 독소루비신, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 카보플라틴, 다우노루비신, 탁솔, 도세탁셀, 젬시타빈, 5-플루오로우라실, 미토마이신, 시타라빈, 시톡산, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학요법제인, 나노입자.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 화학요법제는 에피루비신(EPI)인, 나노입자.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 나노입자 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 조성물.
  15. NK 세포를 활성화하는 방법으로서,
    제1 표적화제가 NK 세포 표면 상의 제1 표적에 결합하는 조건 하에 NK 세포를 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 나노입자 및/또는 제14항의 조성물과 접촉하는 단계를 포함하는, 방법.
  16. NK 세포 면역 반응을 유도하는 방법으로서,
    제1 표적화제가 NK 세포 표면 상의 제1 표적에 결합하는 조건 하에 NK 세포를 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 나노입자 및/또는 제14항의 조성물과 접촉하는 단계를 포함하는, 방법.
  17. 암세포에서 세포독성을 유도하는 방법으로서,
    제2 표적화제가 암세포 표면 상의 제2 표적에 결합하는 조건 하에 암세포를 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 나노입자 및/또는 제14항의 조성물과 접촉하는 단계를 포함하는, 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 나노입자 또는 조성물은 치료제를 추가로 포함하는, 방법.
  19. 암세포에 치료제를 전달하는 방법으로서,
    제2 표적화제가 암세포 표면 상의 제2 표적에 결합하여, 치료제를 암세포에 전달하는 조건 하에, 치료제를 포함하는 암세포를 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 나노입자 및/또는 제14항의 조성물과 접촉하는 단계를 포함하는, 방법.
  20. 이를 필요로 하는 대상체에서 NK 세포 면역 반응을 유도하는 방법으로서,
    제1 표적화제가 NK 세포 표면 상의 제1 표적에 결합하는 조건 하에 대상체에 유효량의 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 나노입자 및/또는 제14항의 조성물 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 나노입자 및/또는 조성물은 적어도 2개의 제1 표적화제를 포함하고 상기 적어도 2개의 제1 표적화제에 결합하는 상기 NK 세포가 동일한 NK 세포인, 방법.
  22. 이를 필요로 하는 대상체에서 NK 세포를 활성화하는 방법으로서,
    제1 표적화제가 NK 세포 표면 상의 제1 표적에 결합하는 조건 하에 대상체에 유효량의 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 나노입자 및/또는 제14항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 나노입자 및/또는 조성물은 적어도 2개의 제1 표적화제를 포함하고 상기 적어도 2개의 제1 표적화제에 결합하는 상기 NK 세포가 동일한 NK 세포인, 방법.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체는 암으로 진단되는, 방법.
  25. 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서,
    제2 표적화제가 암세포 표면 상의 제2 표적에 결합하는 조건 하에 유효량의 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 나노입자 및/또는 제14항의 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  26. 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서,
    제1 표적화제가 NK 세포 표면 상의 제1 표적에 결합하고 제2 제제가 암세포 표면 상의 제2 표적에 결합하는 조건 하에 유효량의 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 나노입자 및/또는 제14항의 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  27. 이를 필요로 하는 대상체에서 암의 암세포에 치료제를 전달하는 방법으로서,
    제2 표적화제가 암세포 표면 상의 제2 표적에 결합하여 대상체에서 암세포에 치료제를 전달하는 조건 하에, 치료제를 포함하는 유효량의 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 나노입자 또는 제14항의 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  28. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암은 교모세포종, 두경부암, 식도암, 위암, 폐암, 방광암, 신세포 암종, 간세포 암종, 췌장암, 자궁경부암, 항문암, 흑색종, 전립선암, 유방암, 비-호지킨 림프종 또는 직장결장암 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  29. 제20항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 나노입자 또는 조성물은 정맥내, 근육내, 피하, 국소, 경구, 경피, 복강내, 척수강내, 뇌실내, 유리체내, 안구내, 안와내, 비강내, 이식에 의해, 흡입에 의해, 종양내, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 경로를 통해 투여되는, 방법.
  30. 제20항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    유효량의 치료제 및/또는 방사선 요법을 상기 대상체에 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 치료제는 에피루비신(EPI), 독소루비신, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 카보플라틴, 다우노루비신, 탁솔, 도세탁셀, 젬시타빈, 5-플루오로우라실, 미토마이신, 시타라빈, 시톡산, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  32. 제31항에 있어서,
    상기 화학요법제는 에피루비신(EPI)인, 방법.
  33. 제20항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체는 포유동물인, 방법.
  34. 제33항에 있어서,
    상기 포유동물은 인간인, 방법.
  35. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 나노입자 및/또는 제14항의 조성물 및 사용 지침을 포함하는 키트.
  36. NK 세포 활성화에서 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 나노입자 및/또는 제14항의 조성물의 용도.
  37. 암세포에서 세포독성 유도에서 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 나노입자 및/또는 제14항의 조성물의 용도.
  38. 암세포에 치료제 전달에서 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 나노입자 및/또는 제14항의 조성물의 용도.
  39. 암 치료에서 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 나노입자 및/또는 제14항의 조성물의 용도.
  40. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 나노입자 및/또는 제14항의 조성물을 포함하는 사용을 위한 약제의 제조.
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