KR20160055863A - 면역 부활 활성을 갖는 올리고뉴클레오티드 함유 복합체 및 그 용도 - Google Patents

면역 부활 활성을 갖는 올리고뉴클레오티드 함유 복합체 및 그 용도 Download PDF

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다이키 아오시
후미히코 다케시타
유지 가스야
다카코 니와
마코토 고이즈미
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Abstract

본 발명은 인간화 K형 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 및 폴리데옥시아데닐산을 포함하는 올리고데옥시뉴클레오티드로서, 폴리데옥시아데닐산이, 그 인간화 K형 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드의 3'측에 배치되어 있는 올리고데옥시뉴클레오티드를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 올리고데옥시뉴클레오티드 및 β-1,3-글루칸을 함유하는 복합체를 제공한다.

Description

면역 부활 활성을 갖는 올리고뉴클레오티드 함유 복합체 및 그 용도{COMPLEX CONTAINING OLIGONUCLEOTIDE HAVING IMMUNOPOTENTIATING ACTIVITY AND USE THEREOF}
본 발명은 면역 부활(賦活) 활성을 갖는 올리고뉴클레오티드 함유 복합체 및 그 용도에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 면역 부활 활성을 갖는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN) 및 β-글루칸을 함유하는 복합체 및 그 의약 용도에 관한 것이다.
CpG 올리고뉴클레오티드(CpG ODN)는 면역 부활성의 CpG 모티프를 함유하는, 짧은(약 20염기쌍) 단일가닥 사슬의 합성 DNA 단편(斷片)으로서, 톨양 수용체(toll-like receptor)(9)(TLR9)의 강력한 아고니스트(Agonist)이며, 수상(樹狀) 세포(DCs) 및 B 세포를 활성화하여, I형 인터페론(IFNs) 및 염증성 사이토카인을 산생시키고(비특허문헌 1, 2), 세포 상해성 T 임파구(CTL) 반응을 포함하는, Th1형의 액성 및 세포성 면역 반응의 애주번트(Adjuvant)로서 작용한다(비특허문헌 3, 4). 그래서 CpG ODN은 감염증, 암, 천식 및 꽃가루 알레르기에 대하여 가능성이 있는 면역 요법제로 여겨져 왔다(비특허문헌 2, 5).
골격 배열 및 면역 부활 특성이 각각 다른, 적어도 4개의 형의 CpG ODN이 있다(비특허문헌 6). D형(A형이라고도 불린다) CpG ODN은 전형적으로는, 포스포디에스테르(PO) 골격 및 포스포로티오에이트(PS) 폴리 G 꼬리(poly G tail)와 함께 1개의 회문(Palindromic) 구조의 CpG 모티프를 포함하고, 형질 세포양 DCs(pDCs)를 활성화하여 대량의 IFN-α를 산생시키지만, pDC 성숙화나 B 세포 활성화를 유도할 수 없다(비특허문헌 7, 8). 다른 3개의 형의 ODN은 PS 골격으로 이루어진다. K형(B형이라고도 불린다) CpG ODN은, 전형적으로는 비회문 구조의, 복수의 CpG 모티프를 함유하고, B 세포를 강력하게 활성화하여 IL-6을 산생시키며, pDCs를 활성화하여 성숙화시키지만, 거의 IFN-α를 산생하지 않는다(비특허문헌 8, 9). 최근, 개발된 C형 및 P형의 CpG ODN은 각각 1개 및 2개의 회문 구조 CpG 서열을 함유하고 있고, 양쪽 모두 K형과 같이 B 세포를 활성화시키며, D형과 같이 pDCs를 활성화시킬 수 있지만, P형 CpG ODN과 비교하여, C형 CpG ODN은 IFN-α 산생을 보다 약하게 유도한다(비특허문헌 10-12). 특허문헌 1에 다수의 뛰어난 K형 CpG ODN이 기재되어 있다.
D형 및 P형 CpG ODN은 G-tetrads로 불리는 평행 4가닥 사슬 구조를 형성하는 후그스틴 염기쌍, 및 시스 회문 구조 부위와 트랜스 회문 구조 부위 사이의 왓슨-크릭 염기쌍이라는 고차(高次) 구조를 각각 형성하는 것이 나타내어져 있고, 이들은 pDCs에 의한 강력한 IFN-α 산생에 필요하다(비특허문헌 12-14). 이와 같은 고차 구조는 초기 엔도솜(Endosome)에의 국재화(局在化)나 TLR9를 통한 정보 전달에 필요한것 같지만, 이들은 산물의 다형성(多型性) 및 침전의 영향을 받아, 그 결과 그 임상 응용을 방해하고 있다(비특허문헌 15). 따라서, K형 및 C형 CpG ODN만이, 인간용 면역 요법제 및 백신 애주번트로서 일반적으로 이용 가능하다(비특허문헌 16 및 17). K형 CpG ODN은 인간 임상 시험에 있어서, 감염증 및 암을 표적으로 하는 백신의 면역원성을 높이지만(비특허문헌 6, 16), 최적의 애주번트 효과를 위해서는 항원과 K형 CpG ODN의 사이의 화학적 및 물리적 연결이 필요하다. 이와 같은 결과는 4개의 형(K, D, P, 및 C)의 CpG ODN에는 장점 및 단점이 있는 것을 나타내고 있어, 응집(Aggregation)하는 일 없이, B 세포 및 pDCs의 양쪽을 활성화하는 「올·인·원(all in one)」 CpG ODN의 개발이 기대되고 있다.
치마버섯(Schizophyllum commune) 유래의 가용성 β-1,3-글루칸인 시조필란(SPG)은 자궁경부암 환자에 있어서의 방사선 요법의 부활약으로서 일본에서 최근 30년에 걸쳐 인가되어 있는 의약이다(비특허문헌 18). 마찬가지로, 표고버섯 유래의 가용성 β-1,3-글루칸인 렌티난(LNT)은 1985년에 승인된 의약이며, 수술 불능 및 재발 위암 환자에 대하여 플루오로피리미딘계 약제와의 병용으로 사용되고 있다(비특허문헌 19, 20). β-1,3-글루칸은 폴리데옥시아데닐산(dA)과 삼중 나선 구조의 복합체를 형성하는 것이 나타내어져 있다(비특허문헌 21).
특허문헌 2∼4에는, 시조필란을 포함하는 β-1,3-글루칸과 핵산(유전자)의 수용성 복합체의 유전자 캐리어로서의 사용이 개시되어 있다. 이들 문헌에는, 해당 복합체를 형성함으로써, 유전자의 안티센스(Antisense) 작용 및 핵산 분해 효소(뉴클레아제)에의 내성 작용을 높일 수 있는 것이 기재되어 있다.
특허문헌 5에는 β-1,3-결합을 갖는 다당류를 캐리어(트랜스펙션제(transfection agent))로서 이용함으로써, CpG 서열을 포함하고, 인산디에스테르 결합을 포스포로티오에이트 결합 또는 포스포로디티오에이트 결합으로 치환한 면역 자극성 올리고뉴클레오티드의 작용을 높일 수 있는 것이 개시되어 있다.
특허문헌 6에는 면역 자극성 올리고뉴클레오티드와, 장쇄(長鎖)의 β-1,6-글루코시드 결합 측쇄(側鎖)를 갖는 β-1,3-글루칸으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 면역 자극성 복합체가 기재되어 있다.
본 발명자들은, 이전, SPG와 복합체화한, 5'말단에 인산디에스테르 결합을 갖는 폴리(dA)를 연결시킨 마우스 및 인간화(humanized)한 CpG ODN이 사이토카인 산생을 증강하여 인플루엔자 백신 애주번트나 Th2 세포 관련 질환의 예방 또는 치료제로서 작용하는 것을 나타냈다(비특허문헌 22, 23, 특허문헌 7). K형 및 D형의 각각의 CpG의 5'말단에 폴리(dA)를 부가하여, SPG와 복합체를 형성하면, 각각 K형 및 D형의 특성을 유지하면서, 그 활성이 증강되었다. 그러나, 보다 효과적으로, 비용 효율이 높은, 전(前) 임상 및 임상 개발을 하는데 있어, CpG-SPG 복합체의 고수율을 달성하는 것이 곤란했다. 최근, CpG ODN에 포스포로티오에이트 결합을 갖는 폴리(dA)를 연결하면, 복합체 형성이 거의 100％로까지 상승하는 것이 나타났다(비특허문헌 24). 그러나, 최적의 인간화 CpG 서열을 동정(同定)하여, 4개의 형의 CpG ODN의 「올·인·원」활성을 얻기 위한 인자를 최적화하기 위한 면밀한 시험은 이루어지지 않고 있다.
특허문헌 8에는, 항원/CpG 올리고뉴클레오티드/β-1,3-글루칸계의 3원 복합체의 제조 방법이 개시되어 있다.
미국특허 US 8,030,285 B2 국제공개 WO 01/034207 A1 국제공개 WO 02/072152 A1 일본국 특개 2004-107272호 공보 국제공개 WO 2004/100965 A1 일본국 특개 2007-70307호 공보 일본국 특개 2008-100919호 공보 일본국 특개 2010-174107호 공보
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본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 종전의 CpG-SPG 복합체보다 강력한 활성을 갖는 면역 부활제를 제공하는 것이다.
본 발명자들은 예의 검토를 실시한 바, 3'말단에 폴리(dA) 꼬리를 갖는 K형 CpG ODN인 K3(서열번호 2) 및 SPG를 포함하는 신규 복합체, 즉 K3-SPG를 동정했다. 이것은 완전하게 가용화할 수 있는, 고차 나노 입자를 형성했다. 마찬가지로, 본 발명자들은 상기 K형 CpG ODN 및 렌티난(LNT)을 포함하는 신규 복합체 K3-LNT의 제작에도 성공했다. K3-SPG, K3-LNT는 D형 CpG ODN 서열을 갖고 있지 않음에도 불구하고, K형 CpG ODN에 특유의 면역 부활 활성(예를 들면, B 세포(바람직하게는, 인간 B 세포)를 활성화하여 IL-6을 산생시키는 활성)과, D형 CpG ODN에 특유의 면역 부활 활성(예를 들면, 형질 세포양 수상 세포를 활성화하여 IFN-α를 산생시키는 활성)을 함께 가지고 있었다. 또한, K3-LNT, 및 K3-SPG는 강력한 백신 애주번트 활성을 가지고 있어, 항원과 함께 면역 접종하면, 해당 항원 특이적인 액성 면역 및 세포성 면역의 양쪽을 유도하여, 실제, RSV 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스에 대하여 매우 강한 감염 방어 효과를 나타냈다. 이들 지견에 의거해 더욱 검토를 진행하여, 본 발명을 완성했다.
즉, 본 발명은 이하에 나타내는 바와 같다.
[1] 인간화 K형 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 및 폴리데옥시아데닐산을 포함하는 올리고데옥시뉴클레오티드로서, 폴리데옥시아데닐산이, 인간화 K형 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드의 3'측에 배치되어 있는 올리고데옥시뉴클레오티드.
[2] 인간화 K형 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드가, 10 뉴클레오티드 이상의 길이이고, 또한 하기 식으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 [1]에 기재된 올리고데옥시뉴클레오티드:
[화학식 1]
Figure pct00001
(식 중, 중앙의 CpG 모티프는 메틸화되어 있지 않고, W는 A 또는 T이며, N1, N2, N3, N4, N5 및 N6은 어떠한 뉴클레오티드여도 됨).
[3] 인간화 K형 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드가, 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 [1] 또는 [2]에 기재된 올리고데옥시뉴클레오티드.
[4] 올리고데옥시뉴클레오티드의 인산디에스테르 결합의 일부 또는 전체가 포스포로티오에이트 결합으로 치환되어 있는 [1]∼[3] 중 어느 하나에 기재된 올리고데옥시뉴클레오티드.
[5] 올리고데옥시뉴클레오티드의 인산디에스테르 결합의 전체가 포스포로티오에이트 결합에 의해 치환되어 있는 [4]에 기재된 올리고데옥시뉴클레오티드.
[6] 폴리데옥시아데닐산의 길이가, 20∼60 뉴클레오티드 길이인 [1]∼[5] 중 어느 하나에 기재된 올리고데옥시뉴클레오티드.
[7] [1]∼[6] 중 어느 하나에 기재된 올리고데옥시뉴클레오티드 및 β-1,3-글루칸을 함유하는 복합체.
[8] β-1,3-글루칸이 렌티난, 시조필란, 스클레로글루칸, 커드란, 파키만(pachyman), 그리포란(grifolan), 또는 라미나란인 [7]에 기재된 복합체.
[9] β-1,3-글루칸이 렌티난, 시조필란 또는 스클레로글루칸인 [8]에 기재된 복합체.
[10] 하기 (i)에 기재된 올리고데옥시뉴클레오티드 및 (ii)에 기재된 β-1,3-글루칸으로 이루어지는 복합체.
(i) 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 올리고데옥시뉴클레오티드의 3'측에 20∼60 뉴클레오티드 길이의 폴리데옥시아데닐산이 결합하고, 또한 인산디에스테르 결합의 전체가 포스포로티오에이트 결합에 의해 치환되어 있는 올리고데옥시뉴클레오티드
(ii) 렌티난 또는 시조필란
[11] 삼중 나선 구조상의 것인, [7]∼[10] 중 어느 하나에 기재된 복합체.
[12] B 세포를 활성화하여 IL-6을 산생시키는 활성 및 수상 세포를 활성화하여 IFN-α를 산생시키는 활성을 갖는 [7]∼[11] 중 어느 하나에 기재된 복합체.
[13] [1]∼[6] 중 어느 하나에 기재된 올리고데옥시뉴클레오티드 또는 [7]∼[12] 중 어느 하나에 기재된 복합체를 포함하는 의약 조성물.
[14] 바이러스 감염증, 암, 알레르기 질환, 세포 내 기생성 원충 또는 세균 감염증의 예방 또는 치료를 위한 [13]에 기재된 의약 조성물.
[15] 바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 [14]에 기재된 의약 조성물.
[16] 바이러스 감염증이 RS 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스 감염증인 [15]에 기재된 의약 조성물.
[17] [7]∼[12] 중 어느 하나에 기재된 복합체를 포함하는 I형 및/또는 II형 인터페론 산생 유도제.
[18] [1]∼[6] 중 어느 하나에 기재된 올리고데옥시뉴클레오티드 또는 [7]∼[12] 중 어느 하나에 기재된 복합체를 포함하는 면역 부활제.
[19] 백신 애주번트인 [18]에 기재된 면역 부활제.
[20] [1]∼[6] 중 어느 하나에 기재된 올리고데옥시뉴클레오티드 또는 [7]∼[12] 중 어느 하나에 기재된 복합체를 포함하는 바이러스 감염증, 암, 알레르기 질환, 세포 내 기생성 원충 또는 세균 감염증의 예방 또는 치료제.
[21] 바이러스 감염증이 RS 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스 감염증인 [20]에 기재된 예방 또는 치료제.
[22] 의약 조성물의 제조를 위한 [1]∼[6] 중 어느 하나에 기재된 올리고데옥시뉴클레오티드 또는 [7]∼[12] 중 어느 하나에 기재된 복합체의 사용.
[23] 의약 조성물이, 바이러스 감염증, 암, 알레르기 질환, 세포 내 기생성 원충 또는 세균 감염증의 예방 또는 치료를 위한 의약 조성물인 [22]에 기재된 사용.
[24] 바이러스 감염증이 RS 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스 감염증인 [23]에 기재된 사용.
[25] [1]∼[6] 중 어느 하나에 기재된 올리고데옥시뉴클레오티드 또는 [7]∼[12] 중 어느 하나에 기재된 복합체의 약리적 유효량을 온혈 동물에 투여하는 것을 포함하는, 당해 온혈 동물에 있어서의 질환의 치료 또는 예방을 위한 방법.
[26] 질환이, 바이러스 감염증, 암, 알레르기 질환, 세포 내 기생성 원충 또는 세균 감염증인 [25]에 기재된 방법.
[27] 바이러스 감염증이 RS 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스 감염증인 [26]에 기재된 방법.
[28] 온혈 동물이 사람인 [25]∼[27] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[29] [1]∼[6] 중 어느 하나에 기재된 올리고데옥시뉴클레오티드 또는 [7]∼[12] 중 어느 하나에 기재된 복합체의 약리적 유효량을 온혈 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 당해 온혈 동물에 있어서의 방어 면역 반응을 유도하는 방법.
[30] 바이러스 감염증, 암, 알레르기 질환, 세포 내 기생성 원충 또는 세균 감염증의 치료 또는 예방에 있어서 사용하기 위한 [1]∼[6] 중 어느 하나에 기재된 올리고데옥시뉴클레오티드, 또는 [7]∼[12] 중 어느 하나에 기재된 복합체.
[31] 바이러스 감염증이 RS 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스 감염증인 [30] 에 기재된 올리고데옥시뉴클레오티드 또는 복합체.
[32] (a) [1]∼[6] 중 어느 하나에 기재된 올리고데옥시뉴클레오티드 또는 [7]∼[12] 중 어느 하나에 기재된 복합체 및 (b) 항원을 포함하는 의약 조성물.
[33] 해당 항원에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 [32]에 기재된 조성물.
[34] 항원이 병원체 유래의 항원인 [33]에 기재된 조성물.
[35] 병원체 감염증의 예방 또는 치료용인 [34]에 기재된 조성물.
[36] 병원체가 바이러스인 [35]에 기재된 조성물.
[37] 바이러스가 RS 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스인 [36]에 기재된 조성물.
본 발명에 의해, 뛰어난 면역 부활 활성을 갖는 올리고데옥시뉴클레오티드나 이를 포함하는 복합체가 제공된다. 특히, 본 발명의 복합체는 K형 CpG ODN에 특유의 면역 부활 활성과, D형 CpG ODN에 특유의 면역 부활 활성을 함께 갖는다. 또한, 본 발명의 복합체는 강력한 백신 애주번트 활성을 갖고 있어, 본 발명의 복합체를 항원과 함께 면역 접종하면, 해당 항원 특이적인 액성 면역 및 세포성 면역의 양쪽을 자극하여, 매우 강한 감염 방어 효과를 나타낸다. 따라서, 본 발명의 복합체는 면역 부활제나 백신 애주번트로서 유용하다.
도 1은 CpG ODN과 LNT 또는 SPG의 복합체화의 방법을 나타낸다.
도 2는 PBMCs의 pan-IFN-α 산생을 나타낸다.
도 3은 K3, K3-dA40 또는 K3-SPG로 자극했을 때에 인간 PBMCs로부터 산생되는 사이토카인 프로파일을 나타낸다.
도 4는 K3-SPG의 주사 전자 현미경상을 나타낸다.
도 5는 동적 광 산란에 의해 해석한, K3-SPG, SPG 및 D35의 입자 사이즈를 나타낸다.
도 6은 K3, K3-SPG 또는 D35 자극에 의해 유도된, PBMCs의 pan-IFN-α, IFN-α2, 및 IFN-γ 산생을 나타낸다.
도 7은 K3, K3-dA40, K3-SPG, CpG21798(P형 CpG ODN), CpG21889(P), CpG2395(C) 또는 M362(C) 자극(0.74, 2.2, 6.6 또는 20㎍/ml)에 의해 유도된, 인간 PBMCs의 pan-IFN-α 및 IL-6 산생을 나타낸다.
도 8은 K3-SPG의 K형 CpG ODN 함유 엔도솜에의 공국재(共局在)를 나타낸다. 스케일 바(scale bar)는 10㎛를 나타낸다. 이 결과는, 적어도 2회의 독립된 시험에 있어서의 대표적인 것이다.
도 9는 K3-SPG의 D형 CpG ODN 함유 엔도솜에의 공국재를 나타낸다. 스케일 바는 10㎛를 나타낸다.
도 10은 OVA 단독, OVA+K3, 또는 OVA+K3-SPG에 의해 면역된 마우스의 항원 특이적 혈청 항체가를 나타낸다. *p＜0.05(Mann-Whitney U test).
도 11은 OVA 단독, OVA+K3, 또는 OVA+K3-SPG에 의해 면역된 마우스의 비장 세포의, 항원에서의 재자극에 의해 유도된 IFNγ 산생을 나타낸다.
도 12는 OVA 단독, OVA+K3, 또는 OVA+K3-SPG에서의 면역에 의해 유도된 OVA 특이적 CD8T 세포의 비율을 나타낸다. *p＜0.05(Mann-Whitney U test).
도 13은 OVA 단독, OVA+K3, OVA+K3-dA40 또는 OVA+K3-SPG에서의 면역에 의해 유도된, 생체 내(in vivo) OVA 특이적 CTL 활성을 나타낸다. *p＜0.05(Mann-Whitney U test).
도 14는 K3-SPG의 펩티드 백신 애주번트 효과를 나타낸다.
도 15는 K3-SPG의 용량 의존적 애주번트 효과를 나타낸다.
도 16은 OVA 단독, OVA+K3, 또는 OVA+K3-SPG에 의해 면역된 마우스의 항원 특이적 혈청 항체가를 나타낸다. 면역 접종시의 OVA 용량을 각 그래프 상에 나타낸다. *p＜0.05(Mann-Whitney U test).
도 17은 OVA 단독, OVA+K3, 또는 OVA+K3-SPG에 의해 면역된 마우스의 비장 세포의, 항원에서의 재자극에 의해 유도된 IFNγ 산생을 나타낸다. 면역 접종시의 OVA 용량을 각 그래프 상에 나타낸다.
도 18은 공(空)(vector), 덱틴-1(Dectin-1), 또는 덱틴-2 트랜스펙턴트(transfectant)에의 SPG의 결합을 나타낸다.
도 19는 공(vector), 덱틴-1, 또는 덱틴-2 트랜스펙턴트에의 K3 또는 K3-SPG의 결합을 나타낸다.
도 20은 C57BL/6J 마우스 또는 덱틴-1 결손 마우스 비장 세포의, 고갈 처리 자이모산(Zymosan Depleted) 자극 유도 TNF-α 산생을 나타낸다.
도 21은 C57BL/6J 마우스 또는 덱틴-1 결손 마우스 비장 세포의, SPG 자극 유도 TNF-α 산생을 나타낸다.
도 22는 C57BL/6J 마우스 또는 덱틴-1 결손 마우스 비장 세포의, CpG ODN 자극 유도 IFN-α 산생에 대한 고갈 처리 자이모산의 효과를 나타낸다. *p＜0.05(t-test).
도 23은 C57BL/6J 마우스 비장 세포의, CpG ODN 자극 유도 IFN-α 산생에 대한 SPG의 효과를 나타낸다.
도 24는 K3-SPG에 의해 유도되는 사이토카인 산생이 TLR9에 의존하는 것을 나타낸다. a) FL-DCs의 IFN-α 산생, b) 비장 세포의 IL-6 및 IL-12 p40 산생, c) FL-DCs의 IFN-α 산생, d) 비장 세포의 IL-6 및 IL-12 p40 산생.
도 25는 OVA+K3-SPG로 면역된 Tlr9+/+ 또는 Tlr9-/- 마우스의 항원 특이적 혈청 항체가를 나타낸다. *p＜0.05(Mann-Whitney U test).
도 26은 OVA+K3-SPG로 면역된 Tlr9+/+ 또는 Tlr9-/- 마우스의 비장 세포의, 항원에서의 재자극에 의해 유도된 IFN-γ 산생을 나타낸다. *p＜0.05(Mann-Whitney U test).
도 27은 Tlr9+/+ 또는 Tlr9-/- 마우스를 OVA+K3-SPG로 면역함으로써 유도된 OVA 특이적 CD8T 세포의 비율을 나타낸다. *p＜0.05(Mann-Whitney U test).
도 28은 K3-SPG의 애주번트 효과가 덱틴-1에 의존하지 않는 것을 나타낸다. a) 혈청 중의 항원 특이적 항체 역가. b) 항원 재자극에 의한 비장 세포의 IFN-γ 산생. c) 생체 내에서 유도되는 항원 특이적 CD8T 세포의 비율.
도 29는 OVA+K3-SPG로 면역된 덱틴-1+/- 또는 덱틴-1-/- 마우스의 항원 특이적 혈청 항체가를 나타낸다.
도 30은 OVA+K3-SPG로 면역된 덱틴-1+/- 또는 덱틴-1-/- 마우스의 비장 세포의, 항원에서의 재자극에 의해 유도된 IFN-γ 산생을 나타낸다.
도 31은 덱틴-1+/- 또는 덱틴-1-/- 마우스를 OVA+K3-SPG로 면역함으로써 유도된 OVA 특이적 CD8T 세포의 비율을 나타낸다. *p＜0.05(Mann-Whitney U test).
도 32는 Alexa 488-K3-SPG 투여 1시간 후의, iLNs 표면 상에의 K3-SPG의 국재(局在)를 나타낸다.
도 33은 DQ-OVA 투여 1시간 후의, iLNs 중의, OVA, MARCO＋ 세포, 및 Siglec-1+ 세포의 국재를 나타낸다.
도 34는 도 33에 있어서의 OVA의 MARCO＋ 세포 또는 Siglec-1＋ 세포와의 공국재를 Volocity로 해석한 결과를 나타낸다. *p＜0.05(t-test).
도 35는 Alexa 488-K3 또는 Alexa 488-K3-SPG 투여 1시간 후의 iLNs 중의, K3, K3-SPG, 및 MARCO＋ 세포의 국재를 나타낸다.
도 36은 도 35에 있어서의 K3 또는 K3-SPG의 MARCO＋ 세포와의 공국재를 Volocity로 해석한 결과를 나타낸다. *p＜0.05(t-test).
도 37은 클로드로네이트 리포솜에 의한 고갈화 시험의 프로토콜(상측 패널), 혈청중 항원 특이적 항체 역가(좌측 하부) 및 항원 자극 사이토카인 산생을 나타낸다. *p＜0.05(t-test).
도 38은 K3 또는 K3-SPG를 투여한 C57BL/6J 또는 Tlr9-/- 마우스의 각종 DCs에 있어서의 CD40 발현을 나타낸다.
도 39는 SV, WIV 또는 SV+K3-SPG로 면역한 마우스에 있어서의 혈청 중 항원 특이적 항체 역가를 나타낸다.
도 40은 SV, WIV 또는 SV+K3-SPG로 면역 감작(感作; sensitization) 후에, 인플루엔자 바이러스 A/P/R8(H1N1)로 부하했을 때의, 체중의 경시 변화(좌측) 및 생존률 커브(우측)를 나타낸다.
도 41은 SV+K3 또는 SV+K3-SPG로 면역 감작한 사이노몰구스 원숭이(cynomolgus monkey) 혈청 중의 항원 특이적 혈청 항체 역가의 경시 변화를 나타낸다. *p＜0.05(t-test).
도 42는 SV+K3 또는 SV+K3-SPG로 면역 감작한 사이노몰구스 원숭이 혈청 중의 항원 특이적 혈청 항체 역가를 나타낸다(110주째).
도 43은 K3과 K3-SPG 사이의 백신 애주번트 효과의 비교.
도 44는 K3, K3-LNT 또는 K3-SPG에 의한 pan-IFN-a 산생과 IL-6 산생을 나타낸다.
도 45는 K3, K3-LNT 또는 K3-SPG 첨가 RSV F 서브유닛 백신을 접종한 마우스에 있어서의, 혈청 중 RSV F 항원 특이적 IgG 항체가를 나타낸다.
도 46은 K3 또는 K3-LNT 또는 K3-SPG 첨가 RSV F 서브유닛 백신을 접종한 마우스에 있어서의, RSV F 항원 자극에 의해 특이적으로 유도되는 사이토카인 산생을 나타낸다.
도 47은 K3 또는 K3-LNT 또는 K3-SPG 첨가 RSV F 서브유닛 백신을 접종한 코튼 래트(cotton rat)에 있어서의, RSV 감염 방어 효과를 나타낸다.
１．올리고데옥시뉴클레오티드
본 발명은 K형 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 및 폴리데옥시아데닐산(dA)을 포함하는, 올리고데옥시뉴클레오티드(이하, 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드라고 칭한다)를 제공하는 것이다.
본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드에는 인산디에스테르 결합이 수식(修飾)(예를 들면, 일부 또는 모든 인산디에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합에 의해 치환)되어 있는 것을 포함한다.
본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드는 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다.
또한, 본 명세서에 있어서 올리고데옥시뉴클레오티드와 ODN은 같은 의미이다. 또한, 「인간화 K형 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(CpG ODN)」와, 「인간화 K형 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(CpG ODN) 잔기」는 말미의 용어 「잔기」의 유무에 상관없이 같은 의미이며, 교환 가능하게 이용된다. 또한, 폴리데옥시아데닐산과 폴리데옥시아데노신산(잔기)은 같은 의미이다. 용어 「잔기」는, 보다 큰 분자량의 화합물의 부분 구조를 의미하지만, 본 명세서 중, 「인간화 K형 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(CpG ODN)」가 독립한 분자를 의미하는지, 보다 큰 분자량의 화합물의 부분 구조를 의미하는지는, 당업자라면 문맥으로부터 용이하게 이해 가능하다. 「폴리데옥시아데닐산」 등, 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드에 포함되는 다른 부분 구조에 관한 용어에 대해서도 동일하다.
CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(CpG ODN)는 면역 부활성의 비메틸화 CpG 모티프를 함유하는 단일가닥 사슬 DNA이며, TLR9의 아고니스트이다. CpG ODN에는, 골격 배열 및 면역 부활 특성이 각각 다른, K형(B형이라고도 불린다), D형(A형이라고도 불린다), C형 및 P형의 4개의 형이 있다(Advanced drug delivery reviews 61, 195-204 (2009)). 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드는 이들 중 K형 CpG ODN을 포함한다.
K형 CpG ODN은 전형적으로는 비회문 구조의, 복수의 비메틸화 CpG 모티프를 함유하고, B 세포를 활성화하여 IL-6을 산생시키지만, 형질 세포양 수상 세포(pDCs)의 IFN-α 산생을 거의 유도하지 않는다는 구조적 및 기능적 특성을 갖는 CpG ODN이다. 비메틸화 CpG 모티프란 적어도 1개의 사이토신(C)-구아닌(G) 서열을 포함하는 짧은 뉴클레오티드 서열로서, 해당 사이토신-구아닌 서열에 있어서의 사이토신의 5위가 메틸화되어 있지 않은 것을 가리킨다. 또한, 이하의 설명에서, CpG란, 특별히 양해가 없는 한 비메틸화 CpG를 의미한다. 따라서, 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드는 K형 CpG ODN을 포함함으로써, K형 CpG ODN에 특유의 면역 부활 활성(예를 들면, B 세포(바람직하게는, 인간 B 세포)를 활성화하여 IL-6을 산생시키는 활성)을 갖는다. 당해 기술 분야에 있어서 다수의 인간화 K형 CpG ODN가 알려져 있다(Journal of immunology 166, 2372-2377 (2001)；Journal of immunology 164, 944-953 (2000)；US 8,030,285 B2).
본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드에 포함되는 K형 CpG ODN은 바람직하게는 인간화되어 있다. 「인간화」란, 인간 TLR9에 대한 아고니스트 활성을 갖는 것을 의미한다. 따라서, 인간화 K형 CpG ODN을 포함하는 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드는, 인간에 대하여 K형 CpG ODN에 특유의 면역 부활 활성(예를 들면, 인간 B 세포를 활성화하여 IL-6을 산생시키는 활성)을 갖는다.
본 발명에 있어서 적합하게 이용되는 K형 CpG ODN은 10 뉴클레오티드 이상의 길이이고, 또한 하기 식으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다;
[화학식 2]
Figure pct00002
(식 중, 중앙의 CpG 모티프는 메틸화되어 있지 않고, W는 A 또는 T이며, N1, N2, N3, N4, N5 및 N6는 어떠한 뉴클레오티드여도 됨).
일양태에 있어서, 본 발명의 K형 CpG ODN은 10 뉴클레오티드 이상의 길이이며, 상기 식의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단, 상기 식 중, 중앙의 4 염기의 CpG 모티프(TCpGW)는 10 뉴클레오티드 중에 포함되어 있으면 되고, 반드시 상기 식 중, N3 및 N4의 사이에 위치할 필요는 없다. 또한, 상기 식 중, N1, N2, N3, N4, N5 및 N6는 어떠한 뉴클레오티드여도 되고, N1 및 N2, N2 및 N3, N3 및 N4, N4 및 N5, 그리고 N5 및 N6 중 적어도 어느 1개(바람직하게는 1개)의 조합은 2 염기의 CpG 모티프여도 된다. 상기 4 염기의 CpG 모티프가 N3 및 N4의 사이에 위치하지 않는 경우, 상기 식 중, 중앙의 4 염기(4∼7번째의 염기) 중의 연속하는 어떠한 2 염기가 CpG 모티프이며, 다른 2개의 염기는 어떠한 뉴클레오티드여도 된다.
본 발명에 있어서 보다 적합하게 이용되는 K형 CpG ODN은 1개 또는 복수의 CpG 모티프를 포함하는 비회문 구조를 함유한다. 보다 적합하게 이용되는 K형 CpG ODN은 1개 또는 복수의 CpG 모티프를 포함하는 비회문 구조로 이루어진다.
인간화 K형 CpG ODN은 일반적으로 TCGA 또는 TCGT로 이루어지는 4 염기의 CpG 모티프를 특징으로 한다. 또한, 대부분의 케이스에 있어서, 1개의 인간화 K형 CpG ODN 중에 이 4 염기의 CpG 모티프가 2 또는 3개 포함된다. 따라서, 바람직한 양태에 있어서, 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드에 포함되는 K형 CpG ODN은 적어도 1개, 보다 바람직하게는 2 이상, 더욱 바람직하게는 2 또는 3개, TCGA 또는 TCGT로 이루어지는 4 염기의 CpG 모티프를 포함한다. 해당 K형 CpG ODN이 2 또는 3개의 4 염기의 CpG 모티프를 갖는 경우, 이들 4 염기의 CpG 모티프는 동일하거나 달라도 된다. 다만, 인간 TLR9에 대한 아고니스트 활성을 갖는 한, 특별히 한정되지 않는다.
본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드에 포함되는 K형 CpG ODN은, 보다 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
K형 CpG ODN의 길이는 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드가 면역 부활 활성(예를 들면, B 세포(바람직하게는 인간 B 세포)를 활성화하여 IL-6을 산생시키는 활성)을 갖는 한, 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 100 뉴클레오티드 길이 이하(예를 들면, 10-75 뉴클레오티드 길이)이다. K형 CpG ODN의 길이는 보다 바람직하게는 50 뉴클레오티드 길이 이하(예를 들면, 10-40 뉴클레오티드 길이)이다. K형 CpG ODN의 길이는 더욱 바람직하게는 30 뉴클레오티드 길이 이하(예를 들면, 10-25 뉴클레오티드 길이)이다. K형 CpG ODN의 길이는 가장 바람직하게는 12-25 뉴클레오티드 길이이다.
폴리데옥시아데닐산(dA)의 길이는 β-1,3-글루칸(바람직하게는 렌티난, 또는 시조필란) 사슬과 함께 삼중 나선 구조를 형성하는데 충분한 길이이면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 안정된 삼중 나선 구조를 형성하는 관점에서는, 통상 20 뉴클레오티드 길이 이상, 바람직하게는 40 뉴클레오티드 길이 이상, 보다 바람직하게는 60 뉴클레오티드 길이 이상이다. 폴리 dA는, 길면 길수록 β-1,3-글루칸과 안정된 삼중 나선 구조를 형성하므로, 이론적으로는 상한이 없지만, 너무 길면 올리고데옥시뉴클레오티드의 합성 시의 길이에 불균일이 생기는 원인이 되므로, 통상, 100 뉴클레오티드 길이 이하, 바람직하게는 80 이하이다. 한편, 상기 안정된 삼중 나선 구조의 형성에 더하여, 단위량의 β-1,3-글루칸 주변에 결합하는 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드량을 증대시키고, 또한 올리고데옥시뉴클레오티드의 합성 시의 길이의 불균일의 회피, 복합화 효율의 관점에서는, 폴리 dA의 길이는, 바람직하게는 20∼60 뉴클레오티드 길이(구체적으로는, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 또는 60 뉴클레오티드 길이), 보다 바람직하게는 30∼50 뉴클레오티드 길이(30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 뉴클레오티드 길이), 가장 바람직하게는 30∼45 뉴클레오티드 길이(30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 뉴클레오티드 길이)이다. 특히, 30 뉴클레오티드 길이 이상인 경우, 양호한 복합화 효율을 나타낸다. 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드는 폴리 dA를 포함함으로써, 2개의 시조필란 사슬과 함께 삼중 나선 구조를 형성하는 활성을 갖는다. 또한, 폴리데옥시아데닐산을 「폴리(dA)」또는 「poly(dA)」로 표기하기도 한다.
1분자의 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드에는, 복수개의 K형 CpG ODN 및/또는 폴리 dA가 포함되어 있어도 되지만, 바람직하게는 K형 CpG ODN 및 폴리 dA가 1개씩 포함되고, 가장 바람직하게는 K형 CpG ODN 및 폴리 dA가 1개씩으로 이루어진다.
본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드는 폴리 dA가 K형 CpG ODN의 3'측에 배치되어 있는 것을 특징으로 한다. 이 배치에 의해, 본 발명의 복합체(상세는 아래에 서술한다)가, K형 CpG ODN에 특유의 면역 부활 활성에 더하여, D형 CpG ODN에 특유의 면역 부활 활성을 갖게 된다.
K형 CpG ODN과 폴리 dA는, 직접 공유 결합에 의해 연결되어 있어도 되고, 스페이서 서열을 통하여 연결되어 있어도 된다. 스페이서 서열이란, 2개의 근접한 구성 요소의 사이에 삽입되는 1 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 스페이서 서열의 길이는, 본 발명의 복합체가, 면역 부활 활성(바람직하게는 B 세포를 활성화하여 IL-6을 산생시키는 활성, 및 수상 세포를 활성화하여 IFN-α를 산생시키는 활성)을 갖는 한, 특별히 한정되지 않지만, 통상 1∼10 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 1∼5 뉴클레오티드 길이, 보다 바람직하게는 1∼3 뉴클레오티드 길이이다. 가장 바람직하게는 K형 CpG ODN과 폴리 dA가 직접 공유 결합에 의해 연결된다.
본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드는, K형 CpG ODN, 폴리 dA 및 임의적인 스페이서 서열에 더하여, 그 5'말단 및/또는 3'말단에 부가적인 뉴클레오티드 서열을 갖고 있어도 된다. 해당 부가적인 뉴클레오티드 서열의 길이는, 본 발명의 복합체가 면역 부활 활성(바람직하게는 B 세포를 활성화하여 IL-6을 산생시키는 활성, 및 수상 세포를 활성화하여 IFN-α를 산생시키는 활성)을 갖는 한, 특별히 한정되지 않지만, 통상 1∼10 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 1∼5 뉴클레오티드 길이, 보다 바람직하게는 1∼3 뉴클레오티드 길이이다.
바람직한 양태에 있어서, 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드는 이와 같은 5'말단 및/또는 3'말단의 부가적인 뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는다. 즉, 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드는 바람직하게는 K형 CpG ODN, 폴리 dA 및 임의적인 스페이서 서열로 이루어지고, 보다 바람직하게는 K형 CpG ODN 및 폴리 dA로 이루어진다.
가장 바람직한 양태에 있어서, 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드는 K형 CpG ODN(구체적으로는, 예를 들면, 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 올리고데옥시뉴클레오티드) 및 폴리 dA로 이루어지고, K형 CpG ODN이 해당 올리고데옥시뉴클레오티드의 5'말단에, 폴리 dA가 3'말단에, 각각 위치한다. 구체적으로는, 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 올리고데옥시뉴클레오티드의 3'말단에 20∼60 뉴클레오티드 길이(보다 바람직하게는 30∼50 뉴클레오티드 길이(30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 뉴클레오티드 길이), 가장 바람직하게는 30∼45 뉴클레오티드 길이(30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 뉴클레오티드 길이))의 폴리 dA가 결합된 올리고데옥시뉴클레오티드이며, 예를 들면, 서열번호 2, 또는 9∼12로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 올리고데옥시뉴클레오티드이다.
본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드의 전체 길이는 통상 30∼200 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 35∼100 뉴클레오티드 길이, 보다 바람직하게는 40∼80 뉴클레오티드 길이(구체적으로는, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80 뉴클레오티드 길이), 보다 바람직하게는 50∼70 뉴클레오티드 길이(구체적으로는, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 뉴클레오티드 길이), 가장 바람직하게는 50∼65 뉴클레오티드 길이(구체적으로는, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65 뉴클레오티드 길이)이다.
본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드는, 생체 내에서의 분해(예를 들면, 엑소 또는 엔도뉴클레아제에 의한 분해)에 대하여 저항성이 되도록 적절히 수식되어 있어도 된다. 바람직하게는, 해당 개변(改變)은 포스포로티오에이트 수식 또는 포스포로디티오에이트 수식을 포함한다. 즉, 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드 중의 인산디에스테르 결합의 일부 또는 전체가, 포스포로티오에이트 결합 또는 포스포로디티오에이트 결합에 의해 치환되어 있다.
바람직하게는 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드는 인산디에스테르 결합의 수식을 포함하고, 보다 바람직하게는 인산디에스테르 결합의 수식은 포스포로티오에이트 결합(즉, 국제공개 WO 95/26204에 기재되어 있는 바와 같이, 비가교 산소 원자 중의 1개가, 유황 원자로 치환된다)이다. 즉, 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드 중의 인산디에스테르 결합의 일부 또는 전체가, 포스포로티오에이트 결합에 의해 치환되어 있다.
본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드는 바람직하게는 K형 CpG ODN에 있어서, 포스포로티오에이트 결합, 또는, 포스포로디티오에이트 결합에 의한 수식을 포함하고, 보다 바람직하게는 해당 K형 CpG ODN의 인산디에스테르 결합의 전체가, 포스포로티오에이트 결합으로 치환된다. 또한, 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드는 바람직하게는 폴리 dA에 있어서, 포스포로티오에이트 결합, 또는, 포스포로디티오에이트 결합을 포함하고, 보다 바람직하게는 해당 폴리 dA의 인산디에스테르 결합의 전체가, 포스포로티오에이트 결합으로 치환된다. 보다 바람직하게는 본 발명의 인간화 K형 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 및 폴리데옥시아데닐산을 포함하는 올리고데옥시뉴클레오티드의 인산디에스테르 결합의 전체가, 포스포로티오에이트 결합으로 치환된다. 가장 바람직하게는 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드는 인간화 K형 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(예를 들면, 서열번호 1)의 3'말단에 20∼60 뉴클레오티드 길이(보다 바람직하게는 30∼50 뉴클레오티드 길이(30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 뉴클레오티드 길이), 가장 바람직하게는 30∼45 뉴클레오티드 길이(30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 뉴클레오티드 길이))의 폴리 dA가 결합된 올리고데옥시뉴클레오티드로서, 당해 올리고데옥시뉴클레오티드에 포함되는 전체의 인산디에스테르 결합이, 포스포로티오에이트 결합으로 치환되어 있다. 포스포로티오에이트 결합에 의해, 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드에 있어서, 분해에 대한 저항성뿐만 아니라, 면역 부활 활성(예를 들면, B 세포를 활성화시켜 IL-6을 산생시키는 활성)의 증강, 및 CpG-β-1,3-글루칸 복합체의 고수율이 기대되기 때문이다. 또한, 본 명세서에 있어서의 포스포로티오에이트 결합은 포스포로티오에이트 골격과, 인산디에스테르 결합은 인산 골격과 같은 의미이다.
본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드에는, 상기 올리고데옥시뉴클레오티드의 모든 약학적으로 허용 가능한 염류, 에스테르, 또는 그러한 에스테르의 염류를 포함한다.
본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드의 약학적으로 허용 가능한 염류로는, 적합하게는 나트륨염, 칼륨염, 리튬염과 같은 알칼리 금속염, 칼슘염, 마그네슘염과 같은 알칼리 토류 금속염, 알루미늄염, 철염, 아연염, 구리염, 니켈염, 코발트염 등의 금속염；암모늄염과 같은 무기염, t-옥틸아민염, 디벤질아민염, 모르폴린염, 글루코사민염, 페닐글리신알킬에스테르염, 에틸렌디아민염, N-메틸글루카민염, 구아니딘염, 디에틸아민염, 트리에틸아민염, 디시클로헥실아민염, N,N'-디벤질에틸렌디아민염, 클로로프로카인염, 프로카인염, 디에탄올아민염, N-벤질-페네틸아민염, 피페라진염, 테트라메틸암모늄염, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄염과 같은 유기염 등의 아민염；불화수소산염, 염산염, 브롬화수소산염, 요오드화수소산염과 같은 할로겐 원자화 수소산염, 질산염, 과염소산염, 황산염, 인산염 등의 무기산염；메탄술폰산염, 트리플루오로메탄술폰산염, 에탄술폰산염과 같은 저급 알칸술폰산염, 벤젠술폰산염, p-톨루엔술폰산염과 같은 아릴술폰산염, 아세트산염, 사과산염, 푸마르산염, 호박산염, 구연산염, 주석산염, 옥살산염, 말레인산염 등의 유기산염；및, 글리신염, 리신염, 아르기닌염, 오르니틴염, 글루타민산염, 아스파라긴산염과 같은 아미노산염을 들 수 있다.
본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드는 단일가닥 사슬, 2가닥 사슬, 3가닥 사슬 중 어느 하나의 형태여도 되지만, 바람직하게는 단일가닥 사슬이다.
본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드는 바람직하게는 단리(單離)되어 있다. 「단리」란, 목적으로 하는 성분 이외의 인자를 제거하는 조작이 이루어져서, 천연에 존재하는 상태를 벗어나 있는 것을 의미한다. 「단리된 올리고데옥시뉴클레오티드」의 순도(평가 대상물의 총 중량에 차지하는 목적으로 하는 올리고데옥시뉴클레오티드 중량의 백분율)는 통상 70％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 99％ 이상이다.
본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드는 뛰어난 면역 부활 활성(예를 들면, B 세포(바람직하게는 인간 B 세포)를 활성화하여 IL-6을 산생시키는 활성)을 가지므로, 면역 부활제 등으로서 유용하다. 또한, 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드는 2가닥의 β-1,3-글루칸(바람직하게는 렌티난, 시조필란, 또는 스클레로글루칸)과 함께 삼중 나선 구조를 형성하는 성질을 가지므로, 하기의 본 발명의 복합체의 조제에 유용하다.
2．복합체
본 발명은, 상기 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드 및 β-1,3-글루칸을 함유하는 복합체(이하, 본 발명의 복합체라고 칭한다)를 제공하는 것이다.
상술한 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드는 K형 CpG ODN을 포함하므로, 그 단독으로는, K형 CpG ODN에 특유의 면역 부활 활성(예를 들면, B 세포(바람직하게는 인간 B 세포)를 활성화하여 IL-6을 산생시키는 활성)을 발휘하고, D형 CpG ODN에 특유의 면역 부활 활성(예를 들면, 형질 세포양 수상 세포를 활성화하여 IFN-α를 산생시키는 활성)이 부족하다. 그러나, 놀랄만한 것은, β-1,3-글루칸(바람직하게는 렌티난, 또는 시조필란)과 복합체를 형성함으로써, D형 CpG ODN의 서열을 필요로 하지 않고, D형 CpG ODN에 특유의 면역 부활 활성(예를 들면, 형질 세포양 수상 세포를 활성화하여 IFN-α를 산생시키는 활성)을 획득한다. 즉, 본 발명의 복합체는 K형 CpG ODN에 특유의 면역 부활 활성(예를 들면, B 세포(바람직하게는 인간 B 세포)를 활성화하여 IL-6을 산생시키는 활성)과, D형 CpG ODN에 특유의 면역 부활 활성(예를 들면, 형질 세포양 수상 세포(바람직하게는 인간 형질 세포양 수상 세포)를 활성화하여 IFN-α를 산생시키는 활성)의 양쪽을 갖는다.
본 발명에서 이용되는 β-1,3-글루칸으로는, 렌티난, 시조필란, 스클레로글루칸, 커드란, 파키만, 그리포란, 또는 라미나란 등을 들 수 있다. β-1,3-글루칸은 바람직하게는 렌티난, 시조필란 또는 스클레로글루칸과 같이, 1,6-글루코피라노시드 분기를 많이 함유하는 (측쇄율 33∼40％) β-1,3-글루칸이며, 보다 바람직하게는 렌티난, 또는 시조필란이며, 가장 바람직하게는 렌티난이다.
렌티난(LNT)은 표고버섯 유래의 공지의 β-1,3-1,6-글루칸이며, 분자식은 (C6H10O5)n, 분자량은 약 30∼70만이다. 물, 메탄올, 에탄올(95), 또는 아세톤에는 거의 녹지 않지만, 극성 유기 용매인 DMSO나 수산화나트륨 수용액에 용해된다.
렌티난은 활성화 마크로파지(macrophage), 킬러 T 세포, 내추럴 킬러 세포 및 항체 의존성 마크로파지 중개성 세포 장해 작용(ADMC) 활성의 증강 작용을 갖는다(Hamuro, J., et al.：Immunology, 39, 551-559, 1980, Hamuro, J., et al.：Int. J. Immunopharmacol., 2, 171, 1980, Herlyn, D., et al.：Gann, 76, 37-42, 1985). 동물 실험에 있어서는 동계(同系) 종양 그리고 자가 종양에 대하여 화학 요법제와의 병용 투여에 의해 종양 증식 억제 작용 및 연명 효과가 인정되고 있다. 또한, 렌티난의 단독 투여에 의해서도 종양 증식 억제 작용 그리고 연명 효과가 인정되고 있다. 임상 시험에 있어서는 수술 불능 또는 재발 위암 환자에 대하여, 테가푸르(tegafur) 경구 투여와의 병용에 의해 생존 기간의 연장이 인정되어(의약품 인터뷰 폼 「렌티난 정맥주사용 1mg 「아지노모토」」), 일본에서 승인되어 있다. 렌티난의 단독 투여에 의한 효과는 현재로서는 확인되어 있지 않다.
시조필란(SPG)은 치마버섯 유래의 공지의 가용성 β-글루칸이다. SPG는 β-(1→3)-D-글루칸의 주쇄와, 각 3개의 글루코오스당 1개의 β-(1→6)-D-글리코실 측쇄로 이루어진다(Tabata, K., Ito, W., Kojima, T., Kawabata, S. and Misaki A., 「Carbohydr. Res.」, 1981, 89, 1, p.121-135). SPG는 부인과암에 대한 면역 증강법의 근육 내 주사제제 임상약으로서 20년 이상의 사용 실적이 있고(시미즈, 히네, 하미, 마스부치, 「Biotherapy」, 1990, 4, p. 1390 하세가와, 「Oncology and Chemotherapy」, 1992, 8, p. 225), 생체 내에서의 안전성이 확인되어 있다(Theresa, M. McIntire and David, A. Brant, 「J. Am. Chem. Soc.」, 1998, 120, p.6909).
본 명세서에 있어서 「복합체」란, 복수의 분자가, 정전(靜電) 결합, 반데르발스(Van der waals) 결합, 수소 결합, 소수(疎水)성 상호 작용 등의 비공유 결합 또는 공유 결합을 통하여 회합함으로써 얻어지는 산물을 의미한다.
본 발명의 복합체는 바람직하게는 삼중 나선 구조상이다. 바람직한 양태에 있어서, 당해 삼중 나선 구조를 형성하는 3가닥의 사슬 중, 2가닥은 β-1,3-글루칸 사슬이며, 1가닥은 상기 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드 중의 폴리데옥시아데닐산의 사슬이다. 또한, 당해 복합체는 일부에, 삼중 나선 구조를 형성하고 있지 않은 부분을 포함하고 있어도 된다.
본 발명의 복합체에 있어서의 올리고데옥시뉴클레오티드와 β-1,3-글루칸의 조성비는, 올리고데옥시뉴클레오티드 중의 폴리데옥시아데닐산의 사슬 길이, 및 β-1,3-글루칸의 길이 등에 따라 변화할 수 있다. 예를 들면, β-1,3-글루칸 사슬과 폴리데옥시아데닐산의 사슬의 길이가 동등한 경우에는, 2가닥의 β-1,3-글루칸 사슬과, 1가닥의 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드가 회합하여 삼중 나선 구조를 형성할 수 있다. 일반적으로는, β-1,3-글루칸 사슬에 비해 폴리데옥시아데닐산의 사슬 길이는 짧기 때문에, 2가닥의 β-1,3-글루칸 사슬에 대하여, 복수의 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드가 폴리데옥시아데닐산을 통해 회합하여 삼중 나선 구조를 형성할 수 있다(도 1 참조).
본 발명의 복합체는 인간화 K형 CpG ODN 및 β-1,3-글루칸(예를 들면, 렌티난, 시조필란, 스클레로글루칸, 커드란, 파키만, 그리포란, 또는 라미나란)을 함유하는 복합체이며, 바람직하게는 인간화 K형 CpG ODN 및 β-1,3-글루칸(예를 들면, 렌티난, 시조필란, 스클레로글루칸)으로 이루어지는 복합체이다. 보다 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 올리고데옥시뉴클레오티드의 3'측에 20∼60 뉴클레오티드 길이(구체적으로는, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 또는 60 뉴클레오티드 길이)의 폴리데옥시아데닐산이 결합하고, 또한 인산디에스테르 결합의 전체가 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 올리고데옥시뉴클레오티드, 및 β-1,3-글루칸(예를 들면, 렌티난, 시조필란)으로 이루어지는 복합체(예를 들면, K3-dA20∼60-LNT, K3-dA20∼60-SPG)이며, 보다 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 올리고데옥시뉴클레오티드의 3'측에 30∼50 뉴클레오티드 길이(구체적으로는, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 뉴클레오티드 길이)의 폴리데옥시아데닐산이 결합하고, 또한 인산디에스테르 결합의 전체가 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 올리고데옥시뉴클레오티드 및 β-1,3-글루칸(예를 들면, 렌티난, 시조필란)으로 이루어지는 복합체(예를 들면, K3-dA30∼50-LNT, K3-dA30∼50-SPG)이며, 가장 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 올리고데옥시뉴클레오티드의 3'측에 30∼45 뉴클레오티드 길이(구체적으로는, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 뉴클레오티드 길이)의 폴리데옥시아데닐산이 결합하고, 또한 인산디에스테르 결합의 전체가 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 올리고데옥시뉴클레오티드, 및 β-1,3-글루칸(예를 들면, 렌티난, 시조필란)으로 이루어지는 복합체(K3-dA30∼45-LNT, K3-dA30∼45-SPG)이다.
본 발명의 복합체의 조제 방법에 관해서는 비특허문헌 21∼24나, 일본국 특개 2008-100919호 공보에 기재된 조건과 동일하게 실시할 수 있다. 즉, 본래는 천연에서 삼중 나선 구조로서 존재하는 β-1,3-글루칸을 비(非)프로톤성 유기 극성 용매(디메틸술폭시드(DMSO), 아세토니트릴, 아세톤 등) 또는 알칼리 수용액(수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아, 수산화칼슘 등)에 용해하여 단일가닥 사슬로 푼다. 이와 같이 하여 얻어진 단일가닥 사슬의 β-1,3-글루칸의 용액과 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드의 용액(수용액, 중성 부근의 pH의 완충 수용액, 또는 산성의 완충 수용액, 바람직하게는 수용액 또는 중성 부근의 pH의 완충 수용액)을 혼합하고, 필요에 따라서 다시 pH를 중성 부근으로 조정 후, 적당 시간 유지하는, 예를 들면, 5℃에서 하룻밤 유지한다. 그 결과, 2가닥의 β-1,3-글루칸 사슬과 해당 올리고데옥시뉴클레오티드 중의 폴리 dA 사슬이 삼중 나선 구조를 형성함으로써, 본 발명의 복합체가 형성된다. 생성된 복합체에 대하여, 사이즈 배제 크로마토그래피에 의한 정제, 한외 여과(限外濾過; ultrafiltration), 투석 등을 실시함으로써, 복합체 미(未)형성의 올리고데옥시뉴클레오티드를 제거할 수 있다. 또한, 생성된 복합체에 대하여, 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 정제를 실시함으로써, 복합체 미형성의 β-1,3-글루칸을 제거할 수 있다. 상기의 방법에 의해 복합체를 적절히 정제할 수 있다.
본 발명의 복합체의 형성은, 예를 들면 CD(원편광 2색성) 스펙트럼에 의한 컨포메이션(Conformation) 변화, 사이즈 배제 크로마토그래피에 의한 UV 흡수 시프트, 겔 전기 영동, 마이크로칩 전기 영동, 캐필러리(Capillary) 전기 영동을 측정함으로써 확인할 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다.
본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드와 β-1,3-글루칸의 혼합비는, 폴리 dA 사슬의 길이 등을 고려하여 적절히 설정할 수 있지만, 통상 몰비(SPG/ODN)가 0.02∼2.0, 바람직하게는 0.1∼0.5이다. 또 다른 양태에 있어서, 몰비(β-1,3-글루칸(LNT 등)/ODN)가 예를 들면 0.005∼1.0, 바람직하게는 0.020∼0.25이다.
본 발명의 복합체의 조제 방법에 대하여 CpG-ODN과 LNT 복합체를 예로 설명한다. LNT를 0.05∼2N, 바람직하게는 0.1∼1.5N의 알칼리 수용액(예를 들면, 0.25N 수산화나트륨 수용액)에 용해시키고, 1℃∼40℃에서 10시간∼4일간 방치하여(예를 들면, 실온에서 하룻밤 방치한다), 단일가닥 사슬의 LNT 수용액(예를 들면, 50mg/ml의 LNT 수용액)을 조제한다. 상기 LNT 수용액과 별도 조제한 CpG 수용액(예를 들면, 100μM의 CpG 수용액)을 몰비(LNT/ODN) 0.005∼1.0로 혼합하고, 계속해서 상기 LNT 수용액에 산성의 완충 수용액(예를 들면, NaH2PO4)을 첨가하여 중화하고, 1∼40℃에서 6시간∼4일간(예를 들면, 4℃에서 하룻밤) 유지함으로써 복합화를 완료시킨다. 또한, 상기 복합화를 위해 LNT 수용액을 마지막에 첨가하여 혼합해도 된다. 복합체의 형성은 예를 들면 사이즈 배제 크로마토그래피를 이용하여, CpG ODN의 고분자량측에의 시프트를 240∼280㎚(예를 들면, 260㎚)에 있어서의 흡수를 모니터링함으로써 확인할 수 있다.
일양태에 있어서, 본 발명의 복합체는 막대상 입자의 형태를 나타낸다. 입자 직경은, 재료로서 이용하는 β-1,3-글루칸(예를 들면, 시조필란)이 천연에서 삼중 나선 구조를 나타냄으로써 형성하는 입자의 직경과 동등하고, 통상 평균 입자 직경이 10-100㎚, 바람직하게는 20-50㎚이다. 해당 입자 직경은 복합체를 물에 용해하고, Malvern Instruments Zeta Sizer를 이용하여 80℃의 조건에서 동적 광 산란법에 의해 계측할 수 있다.
본 발명의 복합체는 바람직하게는 단리되어 있다. 「단리된 복합체」의 순도(평가 대상물의 총 중량에서 차지하는 목적으로 하는 복합체 중량의 백분율)는 통상 70％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상, 더욱 바람직하게는 99％ 이상이다.
본 발명의 복합체는 뛰어난 면역 부활 활성을 갖고, 특히, K형 CpG ODN에 특유의 면역 부활 활성(예를 들면, B 세포(바람직하게는 인간 B 세포)를 활성화하여 IL-6을 산생시키는 활성)과, D형 CpG ODN에 특유의 면역 부활 활성(예를 들면, 형질 세포양 수상 세포(바람직하게는 인간 형질 세포양 수상 세포)를 활성화하여 IFN-α를 산생시키는 활성)의 양쪽을 가지므로, 면역 부활제 등으로서 유용하다. 예를 들면, K형 CpG ODN(예를 들면, 서열번호 2, 11, 12)과 LNT를 포함하는 복합체(K3-LNT) 및 K형 CpG ODN(예를 들면, 서열번호 2)과 SPG를 포함하는 복합체(K3-SPG)는 염증 응답 유도능(pan-IFN-a, IL-6 등), 바이러스 접종 개체에 있어서의 혈청 중 항원 특이적 IgG 항체가(Total IgG, IgG2c 등)의 증강 작용, 바이러스 접종 개체에 있어서의 항원 특이적 사이토카인 산생능(IFN-γ, IL2 등), 바이러스에 대한 감염 방어 효과를 갖는다. K3-LNT에 대해서는 바이러스 접종 개체에 있어서 Th2형 사이토카인(IL-13 등)의 산생 증강능도 갖는다. 따라서, 신규 백신 애주번트 후보로서 유용하다.
３．의약 조성물
본 발명은 상기 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드 또는 상기 본 발명의 복합체를 포함하는, 의약 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 의약 조성물은 상기 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드 또는 상기 본 발명의 복합체를 상투 수단에 따라서 제제(製劑)화함으로써 얻을 수 있다. 본 발명의 의약 조성물은 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드 또는 복합체와 약리학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함한다. 또한, 본 의약 조성물은 항원을 더 포함하고 있어도 된다. 이와 같은 의약 조성물은 경구 또는 비경구 투여에 적합한 제형(劑形)으로서 제공된다.
비경구 투여를 위한 조성물로는 예를 들면 주사제, 좌약제 등이 이용되며, 주사제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등의 제형을 포함해도 된다. 이와 같은 주사제는 공지의 방법에 따라서 조제할 수 있다. 주사제의 조제 방법으로는 예를 들면 상기 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드 또는 복합체를 통상 주사제에 이용되는 무균의 수성 용매에 용해 또는 현탁함으로써 조제할 수 있다. 주사용 수성 용매로는 예를 들면 증류수；생리적 식염수；인산 완충액, 탄산 완충액, 트리스 완충액, 아세트산 완충액 등의 완충액 등을 사용할 수 있다. 이와 같은 수성 용매의 pH는 5∼10을 들 수 있고, 바람직하게는 6∼8이다. 조제된 주사액은 적당한 앰플에 충전되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드 또는 복합체의 현탁액을 진공 건조, 동결 건조 등의 처리를 가함으로써, 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드 또는 복합체의 분말 제제를 조제할 수도 있다. 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드 또는 복합체를 분말 상태로 보존하고, 사용 시에 해당 분말을 주사용 수성 용매로 분산함으로써, 사용에 제공할 수 있다.
의약 조성물 중의 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드 또는 복합체의 함유량은 통상 의약 조성물 전체의 약 0.1∼100중량％, 바람직하게는 약 1∼99중량％, 더욱 바람직하게는 약 10∼90중량％ 정도이다.
본 발명의 의약 조성물은 유효 성분으로서, 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드 또는 복합체를 단독으로 함유하고 있어도 되고, 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드 또는 복합체를 다른 유효 성분과 조합하여 함유하고 있어도 된다.
４．의약 용도
본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드 및 복합체는 뛰어난 면역 부활 활성을 가지므로, 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드, 복합체 및 의약 조성물은 면역 부활제로서 이용할 수 있다. 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드, 복합체 또는 의약 조성물을 포유 동물(사람 등의 영장류, 마우스 등의 설치류 등)에게 투여함으로써, 해당 포유 동물에 있어서의 면역 반응을 야기할 수 있다. 특히, 본 발명의 복합체는 D형 CpG ODN의 활성 특성을 갖고, 말초혈 단핵구를 자극하여, I형 인터페론(Pan-IFN-α, IFN-α2 등) 및 II형 인터페론(IFN-γ)의 양쪽을 대량으로 산생시키므로, I형 인터페론 산생 유도제, II형 인터페론 산생 유도제, I형 및 II형 인터페론 산생 유도제로서 유용하다. I형 및 II형 인터페론의 양쪽의 산생을 유도하므로, 본 발명의 복합체 및 이것을 함유하는 의약 조성물은 I형 및 II형 인터페론 중 어느 한쪽 또는 양쪽이 유효한 질환의 예방 또는 치료에 유용하다. I형 인터페론이 유효한 질환으로는, 바이러스 감염증(예를 들면, C형 간염 바이러스(HCV), 헤르페스 바이러스, 파필로마(papilloma) 바이러스, RS 바이러스, 인플루엔자 바이러스 등), 암 등을 들 수 있다. II형 인터페론이 유효한 질환으로는, 알레르기 질환, 세포 내 기생성 원충(리슈마니아(leishmania) 등)이나 세균(리스테리아(listeria), 결핵균 등) 등의 감염증 등을 들 수 있다. RS 바이러스나 인플루엔자 바이러스를 포함하는 급성 바이러스 감염증에 대해서는, I형 인터페론 및 II형 인터페론 모두, 바이러스 배제에 관한 면역 응답을 높이므로, 본 발명의 복합체 및 이를 함유하는 의약 조성물은 급성 바이러스 감염증에 대한 유효성을 기대할 수 있다.
또한, 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드 및 복합체, 특히, 본 발명의 복합체는 강력한 백신 애주번트 활성을 갖고, 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드 및 복합체를, 항원과 함께, 포유 동물에게 투여하면, 해당 항원에 대한 면역 반응을 강력하게 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명은 (a) 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드, 또는 본 발명의 복합체, 및 (b) 항원을 포함하는, 당해 항원에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물도 제공하는 것이다. 특히, 본 발명의 복합체는 항원에 대한 액성 면역 반응(항원 특이적 항체 산생)과 세포성 면역 반응(항원 특이적 CTL 유도)의 양쪽을 강력하게 유도한다. 따라서, 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드, 복합체, 및 의약 조성물, 특히 본 발명의 복합체 및 이것을 함유하는 의약 조성물은 백신 애주번트로서 유용하다.
본 명세서에 있어서, 애주번트란 면역 응답을 촉진하는 보조제를 말하며, 항원과 함께 생체에 투여되었을 때, 그 항원에 대한 면역 응답을 비특이적으로 증강시키는 물질을 의미한다.
항원으로는, 투여 대상인 포유 동물(사람 등의 영장류, 마우스 등의 설치류 등)에 있어서 항원성을 갖고 있고, 항체 또는 세포 상해성 T 임파구(CTL, CD8＋T세포)를 항원으로서 인식할 수 있는 한, 특별히 한정되지 않고, 항원이 되는 모든 물질(단백질, 펩티드, 핵산, 지질, 당질, 그리고 상기 물질의 수식체(예를 들면, 1개 또는 복수의 아미노산의 결실(缺失), 치환, 및/또는 부가 등(이하, 변이 등)을 도입한 수식체 등)을 이용할 수 있다. 항원으로는, 원충, 진균, 세균, 바이러스 등의 병원체 유래의 항원, 암, 또는 특정 질환에 관계된 항원도 이용될 수 있다.
본 명세서에 있어서, 「항원 A가, 병원체 X에서 유래한다」란, 항원 A가, 당해 병원체 X에 구성 인자로서 포함되는 것을 의미한다. 예를 들면, 항원 A가 폴리펩티드인 경우, 그 폴리펩티드의 아미노산 서열이, 병원체 X의 게놈으로 코드된 단백질의 아미노산 서열 중에 존재하는 것을 의미한다.
병원체 유래의 항원으로는 병원체 그 자체 또는 그 일부, 불활화(不活化) 또는 약독화(弱毒化)한 병원체 그 자체 또는 그 일부, 또는 이들의 변이 등을 도입한 수식체 등을 들 수 있다.
항원으로서 병원체 유래의 항원을 이용하면, 당해 항원에 대한 면역 반응이 야기되어, 해당 항원을 포함하는 병원체를 면역학적으로 생체 외로 배제하는 구조가 구축된다. 따라서, (a) 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드, 또는 본 발명의 복합체, 및 (b) 병원체 유래의 항원을 포함하는, 당해 항원에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물은, 당해 병원체의 예방 또는 치료를 위해서 유용하다.
본 발명의 복합체는 항원에 대한 액성 면역 반응(항원 특이적 항체 산생)과 함께, 세포성 면역 반응(항원 특이적 CTL 유도)의 양쪽을 강력하게 유도한다. 따라서, 세포 상해성 T 임파구에 의해 인식되는 것이 알려져 있는 세포 내 감염성의 병원체(바이러스, 원충, 진균, 세균 등) 유래의 항원이나, 암화된 세포에 관련된 항원(예를 들면, 종양 항원) 등이 항원으로서 적합하게 이용된다.
세포 내 감염성 바이러스로는, 특별히 한정되지 않지만, RS 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, C형 간염 바이러스(HCV), A형 간염 바이러스(HAV), B형 간염 바이러스(HBV), 에볼라 바이러스, 사이토메갈로 바이러스(cytomegalo virus), 아데노 바이러스, 폴리오 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 풍진 바이러스, 광견병 바이러스, 황열 바이러스, 수두 대상 포진 바이러스, 한타 바이러스, 뎅기열 바이러스, 노로 바이러스, 로타 바이러스, 파르보 바이러스, 코로나 바이러스, 디스템퍼 바이러스, 성인 T 세포 백혈병 바이러스(HTLV-1), 인간 면역 부전 바이러스(HIV), 헤르페스 바이러스, 파필로마 바이러스 등을 들 수 있다. 세포 내 감염성 박테리아로는, 마이코플라스마 등을 들 수 있다. 세포 내 감염성 원충으로는, 말라리아 원충, 주혈 흡충 등을 들 수 있다. 세포 내 감염성 병원체는 바람직하게는 바이러스(구체적으로는, RS 바이러스, 또는 인플루엔자 바이러스 등)이다.
암화된 세포에 관련된 항원으로는, 암화된 세포에 있어서 특이적으로 발현하는 단백질, 당쇄, 펩티드, 그리고 상기 물질의 변이체(결실, 치환, 및/또는 부가) 또는 그 수식체 등을 들 수 있다.
본 발명의 복합체는 I형 및 II형 인터페론의 양쪽을 강력하게 유도하므로, 일양태에 있어서, 바이러스로서, I형 인터페론 및 II형 인터페론의 양쪽이 유효한 급성 바이러스 감염증을 일으키는 바이러스(예를 들면, RS 바이러스, 인플루엔자 바이러스)가 선택된다.
예를 들면, (a) 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드, 또는 본 발명의 복합체, 및 (b) 병원체나 암 유래의 항원을 포함하는, 당해 항원에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물을, 당해 병원체 감염증이나 암 환자, 당해 병원체 감염증이나 암으로 이환할 가능성이 있는 사람에게 투여함으로써, 해당 투여를 받은 대상 중의 세포 상해성 T 임파구(CTL)를 항원 특이적으로 활성화시켜, 해당 항원 특이적인 항체 산생을 유도하고, 즉, 온혈 동물(바람직하게는 사람)의 방어 면역 반응을 유도함으로써, 해당 감염증이나 암을 예방 치료할 수 있다. 즉, 해당 조성물은 상기 감염증, 암 등의 질환의 예방 또는 치료를 위한 백신으로서 유용하다.
또한, 본 발명의 복합체는 항원에 대한 액성 면역 반응(항원 특이적 항체 산생)과 세포성 면역 반응(항원 특이적 CTL 유도)의 양쪽을 강력하게 유도할 수 있으므로, 항원으로서, 병원체나 암 세포의 표면 항원과 내부 항원의 어느 것을 이용하는 것도 가능하고, 표면 항원과 내부 항원을 혼합하여 이용하는 것도, 또한 바람직하다.
(a) 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드, 또는 본 발명의 복합체, 및 (b) 항원을 포함하는, 당해 항원에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물은 상기 본 발명의 의약 조성물에 준하여 조제할 수 있다.
본 명세서 중에서 들어진 특허 및 특허 출원 명세서를 포함하는 모든 간행물에 기재된 내용은 본 명세서에서의 인용에 의해, 그 전체가 명시된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 포함되는 것이다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들의 실시예에 의해 전혀 한정되는 것은 아니다.
[방법]
동물 및 시약
Tlr9 결손 마우스 및 덱틴-1 결손 마우스의 작성에 대해서는 이전에 기재했다(Koyama, S., et al., Science translational medicine 2, 25ra24 (2010); Saijo, S., et al., Nature immunology 8, 39-46 (2007)). C57BL/6J 마우스는 니혼 크레아로부터 구입했다.
모든 동물 실험은 의약 기반 연구소 및 오사카 대학 동물 시설의 기관 가이드 라인에 따라서 실시했다. 이하의 CpG ODNs는 (주)진디자인에서 합성되었다(밑줄은 포스포로티오에이트 결합을 나타낸다).
[표 1]
Figure pct00003
특히, 상기 K3-dA40(서열번호 2)에 추가하여, K3-dA35(서열번호 12), K3-dA30(서열번호 11), K3-dA25(서열번호 10) 및 K3-dA20(서열번호 9)의 합성(표 2)에 대하여 기재한다.
[표 2]
Figure pct00004
(상기 서열 중의 s는 뉴클레오티드간의 인산디에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 치환되어 있는 것을 나타냄).
본 올리고데옥시뉴클레오티드는 상법(常法)인 고상 포스포라미디트(Phosphoramidite)법(Nucleic Acids in Chemistry and Biology, 3. Chemical synthesis (1990)ed. G. Michael Blackburn and Michael J. Gait. Oxford University Press)을 이용하여 합성했다.
표 3에, 표 2에 기재된 CpG ODN의 분자량, 및, 이하의 조건으로 역상(逆相) HPLC로 분석한 경우의 유지 시간을 나타낸다(칼럼: Waters, X-Bridge C18 2.5㎛, 4.6×75㎜, A 용액: 100mM 헥사플루오로이소프로판올, 8mM 트리에틸아민, B 용액：메탄올, B％: 5％→30％(20min, linear gradient); 60℃; 1ml/min; 260㎚).
[표 3]
Figure pct00005
오브알부민(OVA)은 생화학 공업(주)로부터 구입했다. DQ-OVA, Alexa488-OVA, CFSE, 및 리포펙타민(Lipofectamine) 2000은 Invitrogen으로부터 구입했다. Hoechst33258, 자이모산 및 커드란은 SIGMA로부터 구입했다. 고갈 처리 자이모산은 Invivogen로부터 구입했다. 클로드로네이트 리포솜은 FormuMax로부터 구입했다. 인플루엔자 스플릿 프로덕트(split product) 백신, 포르말린 불활화 전(全) 바이러스(WIV), 및 정제 인플루엔자 바이러스(H1N1)는 이전에 기재한 바와 같이 조제했다(Koyama, S., et al., Science translational medicine 2, 25ra24 (2010)).
CpG ODN과 SPG의 복합체화(도 1)
7.22mg의 K3-dA40을 물(3.7mL)에 용해했다. SPG(미츠이세이토우) 15mg를 0.25N NaOH(1mL)에 용해했다. 1mL의 330mM NaH2PO4를 DNA 용액에 첨가하고, 다음으로 SPG 용액을 DNA/NaH2PO4 용액에 첨가하여, 4℃에서 하룻밤 유지함으로써 복합체화를 완료했다. 몰비(MSPG/MDNA)는 0.27로 고정했다. 복합체의 형성은 마이크로칩 전기 영동 장치(SHIMADZU：MultiNA)에 의해 확인했다.
CpG ODN과 LNT의 복합체화(도 1)
렌티난(LNT：아지노모토 가부시키가이샤, 로트 번호: 2D8X1)을 50mg/ml가 되도록, 0.25N NaOH에 용해하여, 실온에서 하룻밤 방치했다. 각종 CpG ODN(표 2, 3)은 100mM가 되도록 주사용수에 용해했다. LNT 수용액과 각종 CpG 수용액(K3-dA20(서열번호 9), K3-dA25(서열번호 10), K3-dA30(서열번호 11), K3-dA35(서열번호 12), K3-dA40(서열번호 2))을 표 4에 나타내는 비율로 혼합하고, 계속해서, 첨가한 LNT와 동(同)체적의 330mM NaH2PO4를 첨가하여, 4℃에서 하룻밤 유지함으로써 복합체화를 완료했다. 복합체의 형성은 사이즈 배제 크로마토그래피를 이용하여, CpG ODN의 고분자량측에의 시프트를, 260㎚에 있어서의 흡수를 모니터링함으로써 확인했다(System: Agilent 1100series, Column: Asahipak GF7M-HQ(Shodex) 2가닥 연결, Flow rate: 0.8mL/min, Buffer: 10mM EDTA PBS, pH7.4, Temperature: 40℃).
[표 4]
Figure pct00006
인간 PBMCs의 조제 및 자극(도 2, 3, 6, 7)
PBMCs는 3명의 건강한 성인 남성 자원봉사자(30∼40세)로부터 얻었다. 인간 PBMCs를 이용하는 모든 시험은 의약 기반 연구소의 시설 내 임상시험 심사 위원회에 의해 인가되었다. 피콜(ficoll)을 이용하여 PBMCs를 조제 후, 1×107개/ml의 농도로 뿌렸다. PBMCs를, 컴플리트 RPMI(10％ FCS, 페니실린, 및 스트렙토마이신이 첨가된 RPMI 1640) 중에서 유지했다. PBMCs를, K3(0.24, 0.74, 2.2, 6.6, 20㎍/mL), K3-dA40, K3-SPG(K3-dA40의 복합체), dA40-K3, SPG-K3(dA40-K3의 복합체), D35, CpG21798, CpG21889, CpG2395, 또는 M362로 24시간 자극했다. 상청을 pan-IFN-α(Mabtech), IL-6(R&D), 및 Milliplex(Millipore)용의 ELISA로 처리했다.
전자 현미경 해석(도 4)
염색하기 전에, 시료를 포름바 카본 코트 그립(Formvar carbon coat grip) 상에 적하했다. 음성 염색을 위해, 2％ 아세트산우라늄(pH 4.0)의 액적을 그립 상에 올려 풍건(air dry)시켰다. 그립을 전자 현미경(Hitachi H-7650) 상에서 40,000배의 확대율로 관찰했다.
동적 광 산란(도 5)
수용액 중의 평균 나노 입자 사이즈를, 80℃에서, Malvern Instruments Zeta Sizer 상에서 동적 광 산란법을 이용해 측정했다.
비장 세포 및 수상 세포 배양(도 8, 9)
6주령 C57BL/6J 마우스, Tlr9 결손 마우스, 및 덱틴-1 결손 마우스로부터 마우스 비장을 채취했다. 비장 세포를 현탁 후, ACK 용해 완충액에서 적혈구(RBCs)를 용해하여, 세포를 컴플리트 RPMI 중에서 유지했다. 세포를 1×107 cells/mL의 농도로 뿌렸다. 마우스 골수 유래 세포를, 인간 Flt3L(Peprotech)(100ng/mL)와 함께 7일간 배양함으로써, 골수 유래 DCs를 작성했다. 세포를 1×107cells/mL의 농도로 뿌렸다. 마우스 M-CSF(Peprotech)(20ng/mL)와 함께 7일간 배양함으로써 BMDMs를 작성했다. 이들 세포는 컴플리트 RPMI 중에서 유지했다.
세포 내 분포(도 8, 9)
BMDMs를 5×107cells/mL로 뿌리고, Alexa 488-K3(1μM) 및 Alexa 647-K3-SPG(1μM), 또는 Alexa 488-D35(1μM) 및 Alexa 647-K3-SPG(1μM)에 의해 3시간 자극했다. 세포를 Hoechst33258로 30분 염색함으로써 핵을 가시화하고, 다음으로 세포를 고정하고, 형광 현미경을 이용하여 해석했다.
면역 접종
6주령의 C57BL/6J 마우스, Tlr9 결손 마우스, 및 덱틴-1 결손 마우스의 꼬리가 붙어 있는 부분에,
OVA(0.1, 1, 10, 또는 100㎍)；
OVA(0.37, 1.1, 3.3, 또는 10㎍) 및 K3(538pmol)；
OVA(0.37, 1.1, 3.3, 또는 10㎍) 및 K3-dA40(538pmol)；또는
OVA(0.37, 1.1, 3.3, 또는 10㎍) 및 K3-SPG(538pmol)
을 0일째 및 10일째에 투여했다. 다른 시험에 있어서는, 6주령의 C57BL/6J 마우스의 꼬리가 붙어 있는 부분에,
분할 백신(Split vaccine)(0.1㎍) 단독;
분할 백신 및 K3(538pmol); 또는
분할 백신 및 K3-SPG(538pmol)
를 0일째 및 10일째에 투여했다. 17일째에 채혈하여, 항원 특이적 혈청 항체 역가를 ELISA에 의해 측정했다(도 10, 15a, 16, 25, 28a, 29, 43a). 17일째에 마우스 비장을 채취하여, 비장 세포를 상술의 방법으로 조제했다. 세포를
OVA257-264(OVA257): SIINFEKL(10㎍/mL);
OVA323-339(OVA323): ISQAVHAAHAEINEAGR(10㎍/mL);
전체 OVA 단백질(OVA)(10㎍/mL);
NP260-283(NP260): ARSALILRGSVAHKSCLPACVYGP(10㎍/mL); 또는
분할 백신(10㎍/mL)에 의해 24 또는 48시간 재자극했다. 상청을, 마우스 IFN-γ를 위한 ELISA로 처리했다(도 11, 15b, 17, 26, 28b, 30, 43b). 테트라머 어세이(tetramer assay)를 위해, 비장 세포를 H-2Kb OVA 테트라머(MBL), 항 CD8α(KT15), 항 TCRβ(H57-597), 항 CD62L(MEL-14), 및 항 CD44(IM7) 항체, 및 7-AAD로 염색했다. OVA 테트라머＋CD44＋CD8α＋TCRβ＋ 세포수를 FACS에 의해 측정했다(도 12, 15c, 27, 28c, 31).
시험관 내(in vitro) CTL 어세이(도 13)
6주령의 C57BL/6J 마우스의 꼬리가 붙어 있는 부분에,
OVA(100㎍);
OVA 및 K3(3.3㎍);
OVA 및 K3-dA40(3.3㎍); 또는
OVA 및 K3-SPG(3.3㎍)
를 0일째에 투여했다. 면역 접종 후 7일째에, 나이브(naive) C57BL/6J 비장 세포를, 다른 농도의 CFSE(5 또는 0.5μM)에 의해, 10분간, 37℃에서 표지했다. 염색한 고농도의 세포를 OVA257(10㎍/mL)로 90분간, 37℃에서 펄스했다. 배지에서 2회 세정 후, 표지한 세포를 혼합하여, 정맥 내 투여에 의해 면역된 마우스에 이입했다. 이입으로부터 24시간 후, 비장 세포를 채취하여, CFSE로 표지한 세포의 비율을 FACS로 측정했다.
펩티드 면역 접종
C57BL/6J 마우스를,
OVA257(10㎍);
OVA257 및 K3(10㎍);
OVA257 및 K3-dA40(10㎍); 또는
OVA257 및 K3-SPG(10㎍)
로 면역했다. 면역으로부터 7일 후에, 비장 세포를 조제하여, H-2Kb OVA 테트라머, 항 CD8α, 항 TCRβ, 항 CD62L, 및 항 CD44 항체로 염색했다. OVA 테트라머＋ CD44＋ CD8α＋ TCRβ＋ 세포수를 FACS에 의해 해석했다(도 14의 좌측). 조제한 비장 세포를 시험관 내에서 OVA257(10㎍/mL) 및 Golgi Plug에 의해 4시간, 재자극했다. 세포를 항 IFN-γ, 항 CD8α, 및 항 CD3e 항체로 염색하여, IFN-γ＋ CD8α＋ CD3e＋ 세포수를 FACS로 측정했다(도 14의 우측).
트랜스펙션(transfection) 및 덱틴-1 결합 어세이(도 18, 19)
HEK293을 리포펙타민 2000을 이용하여 공(空), 덱틴-1, 또는 덱틴-2 발현 플라스미드(plasmid)로 트랜스펙션했다. 트랜스펙션 후 48시간에, 세포를, FITC-SPG(0.5μM), Alexa 488-labeled K3-dA40(0.5μM), 또는 Alexa 488-labeled K3-SPG(0.5μM)로, 37℃에서 60분간 처리했다. 처리 후, 세포를 모아, SPG 또는 CpG ODN 양성 세포를 FACS에 의해 해석했다.
면역 세포의 자극(도 20, 21, 22, 23, 24)
C57BL/6J 마우스, Tlr9 결손 마우스, 또는 덱틴-1 결손 마우스로부터의 비장 세포 및 FL-DCs를 K3-SPG(0.014, 0.03, 0.04, 0.08, 0.12, 0.25, 0.37, 0.74, 1.1, 2.2, 3.3, 6.7, 10, 또는 20㎍/mL), 자이모산(3.7, 11.1, 33.3, 또는 100㎍/mL), 커드란, 고갈 처리 자이모산, 또는 SPG로 24시간 자극했다. 다른 시험에 있어서는, C57BL/6J 마우스 또는 덱틴-1 결손 마우스로부터의 비장 세포를, D35(1μM)의 존재 하 또는 비존재 하에서, 고갈 처리 자이모산(100, 33.3, 또는 11.1㎍/mL) 또는 SPG(100, 33.3, 또는 11.1㎍/mL)로, 24시간 자극했다. 상청을 IFN-α(PBL), IL-6(R&D), IL-12 p40(R&D), IL-12 p70(R&D), 및 Bioplex(BIO-RAD)를 위한 ELISA로 처리했다.
면역 조직 화학(도 32)
C57BL/6J 마우스의 꼬리가 붙어 있는 부분에,
DQ-OVA(10㎍)；
Alexa 488-K3-SPG(10㎍)；
Alexa 647-K3-SPG(10㎍)；또는
DQ-OVA 및 Alexa647-K3-SPG(10㎍)
를 투여했다. iLNs를 채취 후, 크라이오스탯(Cryostat)을 이용해 동결 절편(切片)을 조제했다. 동결 절편을 4％ 파라포름알데히드로 10분간 고정하여, 항 Siglec-1(MOMA-1), 항 MARCO(ED31), 항 CD3e(145-2C11), 또는 항 CD11c(N418) 항체와 인큐베이트(incubate)했다. 화상화의 결과를 ImageJ에 의해 해석했다.
2광자 현미경(도 33, 35)
C57BL/6J 마우스, Tlr9 결손 마우스, 또는 덱틴-1 결손 마우스의 꼬리가 붙어 있는 부분에, DQ-OVA(10㎍), Alexa 488-K3(10㎍), 또는 Alexa 488-K3-SPG(10㎍)를 투여했다. iLN 채취의 30분 전에, 마우스의 꼬리가 붙어 있는 부분에 PE-항 MARCO 항체, 또는 PE-항 Siglec-1 항체를 투여했다. 항원 및 애주번트의 투여 후 1시간에, iLNs를 채취하여, 2광자 현미경(Olympus)에 의한 화상 해석으로 처리했다. 피어슨 상관을, Volocity 공국재 해석을 이용해 계산했다.
항원 및 애주번트 투여 후의 생체 내 분포(도 34, 36)
C57BL/6J 마우스의 꼬리가 붙어 있는 부분에,
Alexa 647-K3(538pmol),
Alexa 647-K3-SPG(538pmol),
Alexa 488-OVA(10㎍),
Alexa 488-OVA 및 K3(10㎍),
Alexa 488-OVA 및 K3-SPG(10㎍),
DQ-OVA(10㎍),
DQ-OVA 및 Alexa 647-K3(538pmol), 또는
DQ-OVA 및 Alexa 647-K3-SPG(538pmol)
을 투여했다. 투여 24시간 후에 iLNs를 채취했다. 단일 세포 현탁액을 조제하기 위해, iLNs를 콜라게나아제 D(1mg/mL) 및 DNase I(0.1mg/mL)와 37℃에서 30분간 인큐베이트했다. 조제한 세포를 항 B220(RA3-6B2), 항 CD8α(56-6.7), 및 항 CD11c 항체와 인큐베이트하여, 다른 DC 집단을 분리했다. OVA 및 CpG ODNs의 세포 내 흡수를 FACS에 의해 해석했다.
클로드로네이트 리포솜 주입(도 37)
면역 접종의 5일 또는 2일 전 중 어느 한쪽에, 6주령의 C57BL/6J 마우스의 꼬리가 붙어 있는 부분에, 클로드로네이트 리포솜을 투여했다. 0일째에, OVA 및 K3-SPG에 의해, 마우스를 꼬리가 붙어 있는 부분에서 면역했다. 8일째에 혈액 및 비장을 채취하여, 혈청 항체 역가 및 T 세포 반응을 ELISA에 의해 측정했다.
생체 내에 있어서의 DC 활성화의 검토(도 38)
C57BL/6J 마우스 또는 Tlr9 결손 마우스의 꼬리가 붙어 있는 부분에, K3(10㎍) 또는 K3-SPG(10㎍)를 투여했다. 투여로부터 24시간 후에, iLNs를 상술의 방법으로 조제했다. 세포를 항 CD11c, 항 mPDCA-1(JF05-1C2.4.1), 항 CD8α, 및 항 CD40(3/23) 항체와 인큐베이트하여 FACS로 해석했다.
인플루엔자 바이러스에 대한 감염 방어 응답의 검토
6주령의 C57BL/6J 마우스에,
분할 백신(0.1㎍);
분할 백신 및 K3-SPG(10㎍); 또는
WIV(0.2㎍)
를 0일째 및 14일째에 투여했다. 면역 접종으로부터 2주일 후에, 혈청 항체 역가를 ELISA에 의해 측정하고(도 39), 마우스에 2.3×103pfu(10LD50)의 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34를 비강 내에 접종했다. 접종 후 20일간에 걸쳐 마우스의 체중 및 사망률을 모니터했다(도 40).
사이노몰구스 원숭이의 백신 모델(도 41, 42)
사이노몰구스 원숭이의 피하에, 인플루엔자 분할 백신(5㎍) 및 K3(5nmol); 또는
분할 백신 및 K3-SPG(5nmol)를 0일째 및 14일째에 투여했다. 혈액 시료를, -2, 2, 4, 6, 8 및 110주째에 채취하여, 혈청 항체 역가를 ELISA에 의해 측정했다.
통계학적 해석
무리간의 통계학적 유의성(P＜0.05)은 스튜던트 T검정(student's t-test) 또는 만-휘트니 U검정(Mann-Whitney U test)를 이용하여 결정했다.
[결과]
1) K3-SPG의 막대상 나노 사이즈 입자는, K형 및 D형 CpG ODN의 2개의 특성을 획득한다.
도 1에 도시하는 바와 같이, CpG ODN과 SPG 사이의 보다 좋은 복합체화 효율에는 변성-복원 순서를 통하여, 5'말단 또는 3'말단에 있어서 폴리 dA40의 PS 골격의 추가적 배열을 필요로 한다(Shimada, N., et al., Bioconjugate chemistry 18, 1280-1286 (2007); Minari, J., et al., Bioconjugate chemistry 22, 9-15 (2011)). 인간화 CpG ODN에 의한 복합체 형성의 최적화의 과정에서, 본 발명자들은 CpG ODN의 5'말단 및 3'말단의 면역 부활성에의 영향을 조사했다. 복합체화 효율은 동등함에도 불구하고, SPG와 복합체화한 5'-K3-dA40-3'는 인간 말초혈액 단핵구(PBMCs)를 활성화하여, 다량의 IFN-α를 산생시켰지만, 5'-dA40-K3-3'에서는 그렇지 않았다(도 2, 도 3). K3, K3-dA40 및 dA40-K3는 인간 PBMCs를 활성화하여 IL-6과 같은 다른 사이토카인을 산생시킬 수 있지만, IFN-α는 산생시킬 수 없었다(도 2, 도 3). 이들 결과는 신규 TLR9 아고니스트로는 3'-CpG보다도 5'-CpG의 쪽이 보다 바람직한 것을 나타낸다.
K3-SPG의 정성(定性) 및 정량(定量)을, 주사형 전자 현미경(SEM) 및 동적 광 산란(DLS)에 의해 실시했다. K3-SPG는 막대상 구조를 가지며, 이전의 보고(Bae, A.H., et al., Carbohydrate research 339, 251-258 (2004))에서 보여진 것과 일치했다(도 4). 이것은 30nm의 평균 직경을 갖는 가용성의 단량체 나노 입자와 같이 인지되고, SPG 자체와 동등하며, D형 CpG ODN(D35)보다도 작았다(도 5)(Klein, D.C. et al., Ultramicroscopy 110, 689-693 (2010); Costa, L.T., et al., Biochemical and biophysical research communications 313, 1065-1072 (2004)).
K3-SPG가 나노 입자를 형성하는 것을 고려하여, K3-SPG의 면역 부활 활성을 C, D 및 P형 CpG ODN과 비교했다. K3-SPG로 자극된 PBMCs는 대량의 IFN-α 및 IFN-γ를 산생했지만, D35(도 6), P형 및 C형 CpG ODN(도 7)에 의해 유도되는 그것보다도, 매우 낮은 농도에서의 자극에서 IFN-α를 산생했다. 이들 IFNs는 D형 특이적인 사이토카인인 것이 알려져 있으므로(Krug, A., et al., European journal of immunology 31, 2154-2163 (2001); Verthelyi, D. et al., Journal of immunology 166, 2372-2377 (2001); Gursel, M. et al., Journal of leukocyte biology 71, 813-820 (2002)), 이들 결과는, K3-SPG가, K형의 특성을 해치는 일 없이, D형 CpG ODN의 특성을 획득한 것을 시사한다. K형 및 D형 CpG ODN의 이중 기능을 이해하기 위해, 본 발명자들은 골수 유래 마크로파지에 있어서의 K3-SPG의 세포 내 국재(局在)를 해석했다. K3-SPG는 C형 CpG ODN과 같이(Guiducci, C., et al., The Journal of experimental medicine 203, 1999-2008 (2006)), K형 CpG ODN을 함유하는 엔도솜뿐만 아니라, D형 CpG ODN을 함유하는 엔도솜과도 공국재하였으므로(도 8, 도 9), K3-SPG가, K형 및 D형 CpG ODN에 의해, 엔도솜 매개 자연 면역 시그널계를 전달했을 가능성이 시사되었다. 이들 결과는, K3-SPG가, 나노 사이즈화된, 고차이고, 또한 완전하게 가용화된 입자를 형성하고, 이 「올·인·원」K3-SPG가, 다른 형의 CpG ODN 및 종래 알려져 있는 CpG-SPG 복합체보다도 강력한 활성을 나타내며, 이들과는 다른 특성을 나타내는 것이 강하게 시사되었다.
2) K3-SPG는 포합(抱合)하는 일 없이 단백질 항원에 대한 강력한 CTL 반응을 유도하는 탁월한 백신 애주번트이다.
본 발명자들은 마우스 면역화 모델에 있어서의, K3, K3-dA40, 및 K3-SPG의 애주번트 효과를 비교했다. 야생형 마우스를, OVA 단독으로, 혹은 각 K3 유래 애주번트와 함께 OVA로 면역하면, K3-SPG가, K3에 의해 유도되는 것보다도 의미있게 높은 액성 면역 반응(도 10), 및 보다 강력한 T 세포 반응(도 11)을 유도했다. 주목해야할 것은, K3-SPG에 의해서, 보다 다수의 OVA 특이적 CD8T 세포가 유도되는 것이, 테트라머 어세이에 의해 명백해졌다(도 12). 공유 결합을 아무것도 하지 않고 공투여한 단백질 항원에 대한 매우 강력한 생체 내 CTL 활성도 인지되었다(도 13). 이 K3-SPG에 의한 강력한 CTL 유도는 펩티드 백신 접종에 의해서도 재현되어(도 14), 용량 의존적이었다(도 15). K3-SPG의 항원 절약 활성은 매우 강하여, 동등한 항체 및 CD4T 세포 반응은 100배량의 OVA 항원을 이용함으로써 달성되었다(도 16, 17). 이들의 결과는, K3-SPG가 K3 단독보다도 탁월한 애주번트인 것을 명확하게 나타낸다.
3) SPG는 가용성의 덱틴-1 리간드이지만, 덱틴-1 아고니스트는 아니다.
덱틴-1은 자이모산과 같은 β글루칸의 수용체인 것이 나타내어져 있으므로(Herre, J., et al., Blood 104, 4038-4045 (2004)), SPG 및 K3-SPG의 세포 흡수 및 그것에 연속하는 SPG 및 K3-SPG에 의한 활성화에 있어서의 덱틴-1의 역할에 대하여 조사했다. 유세포 분석법(flow cytometry)을 이용하여, 덱틴-1을 발현하는 HEK293 세포에 있어서, ODN의 존재와 상관없이 시험관 내에 있어서의 SPG 또는 K3-SPG의 흡수가 상승했지만, 덱틴-2나 컨트롤 벡터에서는 상승하지 않는 것을 찾아냈다(도 18, 19). 최근, 가용형의 β-글루칸은 덱틴-1 시그널링(Signaling)을 활성화하지 않는 것이 보고되었다(Goodridge, H.S., et al., Nature 472, 471-475 (2011)). 또한, 덱틴-1 시그널링은 사이토카인 시그널 억제 인자 1(SOCS1) 유도를 통하여, TLR9 매개 사이토카인 산생을 억제한다(Eberle, M.E. & Dalpke, A.H., Journal of immunology 188, 5644-5654 (2012)). 그래서, SPG의 아고니스트 활성을 조사했다. 비장 세포를 고갈 처리 자이모산으로 자극하면, 용량 의존적 및 덱틴-1 의존적인 TNF-α 및 다른 사이토카인의 산생이 인지되었지만(도 20), SPG 자극에서는 인지되지 않았다(도 21). 자이모산 및 커드란에 의한 사이토카인 산생은 덱틴-1 비의존적이었다. 고갈 처리 자이모산은 CpG ODN에 의해 유도된 IFN-α를 저해했지만, 이 저해는 덱틴-1 결손에 의해 경감되었다(도 22). 대조적으로, SPG는 CpG ODN에 의해 유도된 IFN-α를 저해하지 않았다(도 23). 이들 결과는, SPG는 덱틴-1의 리간드이지만 아고니스트가 아닌 것；따라서 SPG는 TLR9 매개 IFN-α 산생을 방해하지 않는 것을 나타낸다.
4) K3-SPG의 애주번트 효과는 TLR9에 의존하고, 덱틴-1에 부분적으로 의존한다.
K3-SPG는 CpG ODN과 β-글루칸의 복합체이므로, TLR9(Hemmi, H., et al., Nature 408, 740-745 (2000)) 및 덱틴-1(Saijo, S., et al., Nature immunology 8, 39-46 (2007))의 역할을 수용체 녹아웃 마우스를 이용해 조사했다. Tlr9 결손 마우스 및 덱틴-1 결손 마우스로부터의 비장 세포 및 Flt3 리간드 유도 골수 유래 DCs(FL-DCs)를 K3-SPG로 자극하면, 사이토카인 산생은 완전히 TLR9 의존적이었지만, 덱틴-1에 대해서는 그렇지 않았다(도 24). 시험관 내의 결과와 일치하여, K3-SPG 및 OVA에 의한 Tlr9 결손 마우스의 면역의 결과, 액성 반응 및 T 세포 반응이 감약(減弱)했다(도 25-27). OVA 및 10㎍의 K3-SPG로 마우스를 면역하면, 덱틴-1 결손 마우스는 야생형 마우스와 동등한 면역 반응을 나타냈다(도 28). 덱틴-1 결손 마우스를 OVA 및 1㎍의 K3-SPG로 면역하면, 항체 산생 및 T 세포로부터의 사이토카인 산생에 대해서는 의미있는 변화는 인지되지 않지만(도 29, 도 30), 테트라머 어세이에 있어서 감약한 CD8 T 세포 반응을 나타냈다(도 31). 이들 결과는, K3-SPG의 애주번트 효과는 TLR9 시그널링에 의존하는 것을 시사한다. SPG 및 K3-SPG는 덱틴-1 시그널링을 자극하지 않지만, K3-SPG의 효과는 생체 내에 있어서, 또한 부분적으로 덱틴-1에 의존한다.
5) 유입 영역 림프절에 있어서의 MARCO＋ 마크로파지는 항원과 함께 K3-SPG를 우선적으로 포착하지만, Siglec-1＋ 마크로파지는 포착하지 않는다.
K3-SPG는 단순한 항원 혼합물의 면역 접종을 통하여, 생체 내에 있어서 강력한 애주번트 효과를 가져오므로, 항원 및 K3-SPG의 양쪽을 포착하는 세포가, 애주번트 효과의 매개에 있어서 중요한 역할을 수행한다고 가정했다. 형광 표지 OVA 및 K3-SPG의 생체 내 분포를 조사하기 위해, 형광 현미경 및 2광자 현미경을 이용했다. 꼬리가 붙어 있는 부분에 주입후 1시간 이내에, 항원 및 애주번트는 유입 영역 림프절(iLNs)에 도달했다(도 32, 33, 35). 24시간 후, 몇 개의 K3-SPG가 CD3e＋ T 세포 영역으로 이동하여 DQ-OVA와 공국재했다. K3-SPG 및 DQ-OVA의 양쪽을 함유하는, iLN의 T 세포 영역에 있어서의 이들 세포는 CD11c＋DCs였다.
흥미로운 것은, 형광 시그널의 대부분은 iLN의 표면 상에 그대로 남아 있었다(도 32). 이로부터, LN 표면 상에 분포하는 것이 알려져 있는 2개의 형의 마크로파지인, Siglec-1(CD169 또는 MOMA-1이라고도 불린다)＋ 마크로파지(낭하동(囊下洞) 마크로파지로도 알려져 있다) 및 MARCO＋ 마크로파지(Martinez-Pomares, L. & Gordon, S., Trends in immunology 33, 66-70 (2012))에 초점을 맞추기로 했다. 통상의 형광 현미경을 이용한 조직학적 해석에서는 전체 iLN 표면을 적절히 볼 수 없었다；또한, 이들 마크로파지는 유세포 분석법 해석에 의해 단리하는 것이 곤란했다(Aoshi, T., et al., European journal of immunology 39, 417-425 (2009); Gray, E.E. & Cyster, J.G., Journal of innate immunity 4, 424-436 (2012)). 그래서, 2광자 현미경 이미징(imaging) 해석을 이용하여 항원 및 K3-SPG의 분포를 생체 외(Ex vivo) 방식으로 명확히 했다. 항 MARCO 항체 및 항 Siglec-1 항체의 투여 후, 특이적 마크로파지가 가시화되었다. 투여 후 1시간에 iLN 표면을 2광자 현미경으로 모니터하면, OVA 및 K3-SPG가 MARCO＋ 마크로파지와 공국재하고 있었지만, Siglec-1＋ 마크로파지와는 공국재하고 있지 않았다(도 33, 35). 이전의 보고에서, 면역 복합체 및 불활화 인플루엔자 바이러스가 Siglec-1＋ 마크로파지에 의해 포착되어, 액성 면역 반응을 유도하는 것이 시사되어 있다(Gonzalez, S.F., et al., Nature immunology 11, 427-434 (2010); Suzuki, K. et al., The Journal of experimental medicine 206, 1485-1493 (2009)). Volocity의 공국재 해석에 의한 확인의 결과, 분포 패턴은 MARCO＋ 마크로파지의 그것과 완전히 일치하고 있고, Siglec-1＋ 마크로파지와는 공국재하지 않았다(도 34, 36). 대조적으로, K3는 K3-SPG와 비교하면, MARCO＋ 영역과 Siglec-1＋ 영역의 사이에 확산적으로 분포하고 있었다(도 35, 36). 또한, Tlr9 결손 마우스 및 덱틴-1 결손 마우스의 양쪽 모두, K3-SPG와 동등한 국재를 나타냈다. K3-SPG의 애주번트 효과에 대한 이들 마크로파지의 공헌을 조사하기 위해, 꼬리가 붙어 있는 부분에 클로드로네이트 리포솜을 주입한 후의 마크로파지 및 DCs가 다른 회복 키네틱스(Kinetics)를 시험했다. 주입후, 2일째까지 마크로파지는 완전히 고갈되었다. 이들 세포는, 적어도 1주일에는 회복되지 않았지만, DCs는 이전 보고되어 있는 바와 같이(Aoshi, T., et al., Immunity 29, 476-486 (2008)), 5일째까지 거의 회복되었다. 마크로파지 및 DCs의 양쪽을 고갈시킨 바, 면역 반응은 의미 있게 억제되었다(도 37; Clo -d2). 마크로파지만을 고갈시키고, DCs를 고갈시키지 않은 경우, 면역 반응은 비처치(非處置) 마우스와 동등했다(도 37; Clo-d5). 이는 주입 후 LNs에 있어서, OVA 및 K3-SPG의 양쪽 모두 MARCO＋ 마크로파지에 의해 주로 포착되고, 그 마크로파지가 적응 면역 반응을 유도한 것을 시사한다. 바꾸어 말하면, K3-SPG의 애주번트 효과는 DC 집단에 크게 의존했다.
6) K3-SPG는 생체 내에 있어서, 항원을 갖는 DC 집단을 표적화하여, 강력하게 활성화한다.
본 발명자들의 지견은 나노 미립자 K3-SPG의 대부분은, 주입후에 iLNs에 있어서의 MARCO＋ 마크로파지에 의해 흡수되지만, 애주번트 효과는 DCs에 의해 컨트롤되는 것을 시사한다. 그래서, iLNs에 있어서의 DC 집단에 의한 항원 및 애주번트의 흡수에 초점을 맞추었다. 투여 후 24시간에 있어서, DC 집단에 의한 항원 및 애주번트의 흡수를 유세포 분석법에 의해 해석했다. 3개의 DC 서브세트(subset)(pDCs, CD8α＋ DCs, CD8α- DCs)에 있어서의 CpG 양성의 빈도는 K3-SPG 주입 후에, K3일 때보다 의미 있게 증가했다. 대조적으로, OVA 양성 DC의 빈도는 K3 주입후와 K3-SPG 주입후에 동등했다. 항원 및 애주번트의 양쪽 모두 양성의 DCs에 초점을 맞추면, K3-SPG에 있어서 K3보다 상당한 증가가 인지되었다. 주입후 24시간에 있어서, iLNs에 있어서의 pDCs 및 CD8α 양성 DCs의 양쪽 모두, K3-SPG에 의해 강력하게 활성화되었지만, K3에 의해서는 되지 않고, 이는 전체적으로 TLR9에 의존했다(도 38). 이들 결과로부터, pDCs 및 CD8α＋ DCs가, 성숙화를 위한 비미립자 K3가 아니라, 우선적으로 나노 미립자 K3-SPG를 포착하여, 애주번트 효과를 발휘하는 것이 나타났다.
7) K3-SPG는 마우스 및 비인간 영장류 모델에 있어서의 인플루엔자 백신의 강력한 애주번트이다.
K3-SPG의 애주번트 효과를, 마우스 및 비인간 영장류에 있어서, 보다 임상적으로 관련된 인플루엔자 백신 접종 모델을 이용해 조사했다. 마우스를 에테르 처리 헤마글루티닌(hemagglutinin) 항원 농축 비리온 불함유 분할 백신(SV) 및 표시한 애주번트로 면역 접종하고, 항체 반응 및 T 세포 반응을 비교하면, K3-SPG는 K3보다도 뛰어난 애주번트 효과를 나타냈다(도 43). 보다 중요한 것은, SV와 K3-SPG에 의한 면역 접종에 의해, 빌트인(Built-in) 애주번트로서 바이러스 RNA를 함유하는(Koyama, S., et al., Science translational medicine 2, 25ra24(2010)), 전체(비리온) 불활화 백신(WIV)(0.2㎍/마우스)을 이용한 백신 접종과 비교해도, 100배 큰 항체 반응이 생겼다(도39). SV(0.1㎍/마우스) 및 K3-SPG로 면역 접종한 마우스는 WIV로 면역화한 마우스보다도 체중의 감소가 적었다(도 40). 놀랄만한 것은, WIV 백신 접종 마우스에서는 불과 10％만 생존을 초래하는 용량에 있어서, K3-SPG는 치사적인 PR8 바이러스 부하에 대하여 100％ 방어를 초래했다(도 40). 이들 결과는, 마우스 모델에 있어서, K3-SPG가 단백질 또는 단백질 베이스 백신의 강력한 애주번트로서 기능한다는 생각을 강력하게 지지했다. 이 지견을, 사이노몰구스 원숭이를 이용한 비인간 영장류 모델로 확장하는 것으로 했다. 0일째 및 14일째에, 각 군 3마리의 사이노몰구스 원숭이를 K3 또는 K3-SPG와 함께 SV로 면역 접종했다. 혈청 항체 역가를 8주간에 걸쳐 모니터했다. SV 및 K3-SPG에 의해, 면역 접종의 2주일 후에 의미 있게 높은 항체 역가가 유도되고, 이 역가는 적어도 다시 6주간에 걸쳐 높은 상태대로였다(도 41). 면역 접종으로부터 2년(110주) 후에 있어서, K3-SPG군은 K3군보다도 높은 항체 역가를 나타냈다(도 42 및 43). 정리하면, 이들 결과로부터, K3-SPG가 비인간 영장류 모델에 있어서도 탁월한 백신 애주번트인 것이 시사되었다.
8) 인간 PBMCs를 이용한 K3-LNT 및 K3-SPG 복합체의 염증 응답 유도능의 검토
인간 PBMCs(Lonza사, Cat# CC-2702, Lot# 0000396517)를 이용하여, K3(K3-dA30, K3-dA35, K3-dA40) 단독, K3-LNT 복합체(K3-dA30-LNT, K3-dA35-LNT, K3-dA40-LNT) 및 K3-SPG 복합체(K3-dA40-LNT)의 pan-IFN-a(hIFNa)와 IL-6(hIL-6)의 산생 유도능을 평가했다.
결과를 도 44에 나타낸다. 저용량의 자극에 있어서, pan-IFN-a와 IL-6 산생은 K3와 SPG의 복합체인 K3-SPG, 및 K3와 LNT의 복합체인 K3-LNT에 있어서, K3 단독에 비해 높은 것이 인지되었다. 또한, dA 꼬리(tail) 길이(dA30, dA35, dA40)가 다른 K3-LNT에 의해서 유도되는 염증성 사이토카인 산생능은, 거의 동등한 가능성이 시사되었다. 또한, K3-SPG와 K3-LNT의 염증성 사이토카인 산생능을 비교하면, K3-SPG에 비해, K3-LNT에 의한 pan-IFN-a 산생 유도능이 높을 가능성이 시사되었다. 한편, IL-6 산생량에 있어서는 K3-SPG와 K3-LNT는 동등한 것이 인지되었다.
9) K3-LNT 및 K3-SPG 복합체 첨가 RSV F 서브유닛 백신을 접종한 마우스에 있어서의, 혈청 중 RSV F 항원 특이적 IgG 항체가
7주령의 C57BL/6 마우스의 꼬리가 붙어 있는 부분에, 한마리당 RSV F 항원 0.5㎍과 각종 애주번트(K3 단독(K3-dA30, K3-dA35, K3-dA40), K3-LNT 복합체(K3-dA30-LNT, K3-dA35-LNT, K3-dA40-LNT) 및 K3-SPG 복합체(K3-dA40-SPG), 인산명반(alum phosphate)) 10㎍를 2주 간격으로 2회 면역했다. 최종 면역으로부터 1주 후에 말초혈의 회수와 혈청의 조제를 실시하여, 평가 시료로 했다. 혈청 중의 RSV F 백신 항원에 결합하는 항체가는 ELISA법을 이용해 측정했다. 도 45에 나타내는 바와 같이, RSV F 항원 특이적인 총 IgG(Total IgG) 유도는 RSV F 항원 단독 접종군(F)에 비해, 애주번트 첨가에 의해서 증강되어 있고, K3 단독(F+K3-dA30, F+K3-dA35, F+K3-dA40), K3-LNT(F+K3-dA30-LNT, F+K3-dA35-LNT, F+K3-dA40-LNT) 및 K3-SPG 복합체(F+K3-dA40-SPG)와 인산명반(F+Alum)의 애주번트 효과는 동등할 가능성이 시사되었다. Th2형 애주번트인 인산명반(F+Alum)을 접종한 마우스군에서는, IgG1 서브 클래스 유도능이 RSV F 항원 단독 접종군에 비해 높은 것이 인지되었다. 한편, IgG2c 서브 클래스 항체에 있어서, K3 단독(F+K3-dA30, F+K3-dA35, F+K3-dA40), K3-LNT(F+K3-dA30-LNT, F+K3-dA35-LNT, F+K3-dA40-LNT), K3-SPG(F+K3-dA40-SPG)를 접종한 면역군에서는 인산명반(F+Alum)에 비해 높은 결과가 나타나고 있고, K3-LNT 복합체는 K3-SPG와 동일한 Th1형 애주번트일 가능성이 시사되었다.
10) K3-LNT 및 K3-SPG 복합체 첨가 RSV F 서브유닛 백신을 접종한 마우스에 있어서의, RSV F 항원 특이적 사이토카인 산생능
7주령의 C57BL/6 마우스의 꼬리가 붙어 있는 부분에, 한마리당 RSV F 항원 0.5㎍과 각종 애주번트(K3 단독(K3-dA30, K3-dA35, K3-dA40), K3-LNT(K3-dA30-LNT, K3-dA35-LNT, K3-dA40-LNT) 및 K3-SPG 복합체(K3-dA40-SPG), 인산명반) 10㎍를 2주 간격으로 2회 면역했다. 최종 면역으로부터 1주 후에 비장을 회수하여, 비장 세포를 조제했다. 96well 배양 플레이트에 파종한 비장 세포를, RSV F 항원의 MHC class I 구속성 에피토프(Epitope) 펩티드, MHC class II 구속성 에피토프 펩티드, 백신 항원 단백질 각각으로 자극하여, 24시간 혹은 48시간 배양했다. RSV F 항원 특이적 사이토카인 산생능은 배양 상청을 시료로 하여, 사이토카인 ELISA법을 이용해 평가했다. 본 검토에서는, Th1형 사이토카인인 IFN-g, 활성화 T 세포로부터 산생되는 IL-2, Th2형 사이토카인인 IL-13의 3종의 사이토카인에 대하여 평가했다.
그 결과, 도 46에 나타내어지는 바와 같이, RSV F 항원 특이적인 IFN-g 산생 유도와 IL-2 산생 유도의 증강 효과는, K3-LNT(F+K3-dA30-LNT, F+K3-dA35-LNT, F+K3-dA40-LNT)와 K3-SPG(F+K3-dA40-SPG)에서 동등할 가능성이 시사되었다. Th2형 애주번트인 인산명반 애주번트 접종군(F+Alum)에서는, IFN-g 산생은 어떠한 자극에 있어서도 검출 한계 이하였다. 한편, IL-13 산생 증강 효과는, Th2형 애주번트인 인산명반 접종군에서 높게 인지되고, Th1형 애주번트인 K3-SPG 접종군에서는 낮은 결과가 되었다. 흥미로운 것은, K3-LNT 접종군(F+K3-dA30-LNT, F+K3-dA 35-LNT, F+K3-dA 40-LNT)에 있어서는, 동일한 Th1형 애주번트인 K3-SPG 접종군(F+K3-dA40-SPG)에 비해, 높은 IL-13 산생 증강 효과를 나타냈다. 이로부터, K3-LNT 복합체는, K3-SPG가 갖는 높은 Th1 응답 증강 효과에 더하여, Th2 응답 증강능도 갖는 것이 시사되었다.
11) K3-LNT 및 K3-SPG 첨가 RSV F 서브유닛 백신을 접종한 코튼 래트에 있어서의, RSV 감염 방어 효과
6∼7주령의 코튼 래트의 꼬리가 붙어 있는 부분에, 한마리당 RSV F 항원 1㎍과 각종 애주번트(K3-LNT(K3-dA35-LNT, K3-dA40-LNT) 및 K3-SPG 복합체(K3-dA40-SPG), 인산명반) 10㎍을 2주 간격으로 2회 면역했다. 최종 면역으로부터 2주 후에, RSV 혈청형 A(Long주)를 코튼 래트에 경비 접종을 이용하여 공격 감염시키고, 그 3일 후에 폐 내 바이러스량을 계측했다. Synagis(palivizumab) 투여군은, Synagis 2.5mg/kg을 공격 감염 하루 전에 근육 내 투여하여, 상기와 마찬가지로 감염 방어능의 평가를 실시했다. 중화 항체가는 공격 감염 직전에 마취 하에서 래트 경정맥으로부터 채혈하여, 얻어진 혈청을 이용하여 검토를 실시했다.
도 47의 좌측에 폐 내 바이러스량의 결과를, 우측에 중화 항체가의 결과를 나타낸다. 폐 내 바이러스량의 결과로부터, PBS-투여군에서는 약 105pfu/lung의 바이러스량이 인지되는데 비해, 인산명반 첨가 RSV F 백신을 투여한 군(F+Alum)에서는 평균값에서 약 100배나 낮은 바이러스량으로 억제되어 있었다. 한편, K3-SPG 첨가 백신 투여군(F+K3-dA40-SPG)에 있어서도, 감염 방어 유도능이 인지되었다. 가장 양호한 감염 방어 효과를 나타낸 것은 K3-LNT 첨가 백신군(F+K3-dA35-LNT, F+K3-dA40-LNT)이며, 인산명반이나 K3-SPG에 비해, 높은 감염 방어능에 기여하는 신규 백신 애주번트 후보일 가능성이 시사되었다.
중화 항체 유도능에 있어서는 인산명반 첨가 백신 투여군(F+Alum)에 있어서, 시나지스와 동등한 혈중 중화 활성이 인지되었다. 한편, K3-SPG 첨가 백신 투여군(F+K3-dA40-SPG)에 있어서는, 4마리 중 3마리에서 중화 항체가 거의 유도되어 있지 않으므로, K3-SPG가 기여하는 감염 방어 효과는 중화 항체 비의존적인 기작(機作)에 의하는 것으로 고찰되었다. 또한, K3-LNT 투여군(F+K3-dA35-LNT, F+K3-dA40-LNT)에 있어서는, K3-SPG에 비해, 높은 중화 항체가 인지되고 있으므로, K3-LNT 애주번트는 K3-SPG와 다른 특성, 예를 들면 Th2 응답 증강능을 가지고 있을 가능성이 시사되었다.
산업상의 이용 가능성
본 발명에 의해, 뛰어난 면역 부활 활성을 갖는 올리고데옥시뉴클레오티드나 이를 포함하는 복합체가 제공된다. 특히, 본 발명의 복합체는 K형 CpG ODN에 특유의 면역 부활 활성과, D형 CpG ODN에 특유의 면역 부활 활성을 함께 갖는다. 또한, K3-SPG 및 K3-LNT는 강력한 백신 애주번트 활성을 갖고 있고, K3-SPG 또는 K3-LNT를 항원과 함께 면역 접종하면, 해당 항원 특이적인 액성 면역 및 세포성 면역의 양쪽을 자극한다. 따라서, 본 발명의 복합체는 면역 활력제나 백신 애주번트로서 의약 분야에 있어서 유용하다.
본 출원은 일본에서 출원된 특원 2013-196206(출원일：2013년 9월 20일)을 기초로 하고 있고, 그 내용은 본 명세서에 모두 포함되는 것이다.
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Claims (37)

  1. 인간화 K형 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 및 폴리데옥시아데닐산을 포함하는 올리고데옥시뉴클레오티드로서, 폴리데옥시아데닐산이 인간화 K형 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드의 3'측에 배치되어 있는 올리고데옥시뉴클레오티드.
  2. 제 1 항에 있어서,
    인간화 K형 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드가, 10 뉴클레오티드 이상의 길이이고, 또한 하기 식으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고데옥시뉴클레오티드:
    [화학식 1]
    Figure pct00007

    (식 중, 중앙의 CpG 모티프는 메틸화되어 있지 않고, W는 A 또는 T이며, N1, N2, N3, N4, N5 및 N6는 어떠한 뉴클레오티드여도 됨).
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    인간화 K형 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드가 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 올리고데옥시뉴클레오티드.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    올리고데옥시뉴클레오티드의 인산디에스테르 결합의 일부 또는 전체가 포스포로티오에이트 결합에 의해 치환되어 있는 올리고데옥시뉴클레오티드.
  5. 제 4 항에 있어서,
    올리고데옥시뉴클레오티드의 인산디에스테르 결합의 전체가 포스포로티오에이트 결합에 의해 치환되어 있는 올리고데옥시뉴클레오티드.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    폴리데옥시아데닐산의 길이가 20∼60 뉴클레오티드 길이인 올리고데옥시뉴클레오티드.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 올리고데옥시뉴클레오티드 및 β-1,3-글루칸을 함유하는 복합체.
  8. 제 7 항에 있어서,
    β-1,3-글루칸이 렌티난, 시조필란, 스클레로글루칸, 커드란, 파키만, 그리포란, 또는 라미나란인 복합체.
  9. 제 8 항에 있어서,
    β-1,3-글루칸이 렌티난, 시조필란, 또는 스클레로글루칸인 복합체.
  10. 하기 (i)에 기재된 올리고데옥시뉴클레오티드, 및 (ii)에 기재된 β-1,3-글루칸으로 이루어지는 복합체:
    (i) 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 올리고데옥시뉴클레오티드의 3'측에 20∼60 뉴클레오티드 길이의 폴리데옥시아데닐산이 결합하고, 또한 인산디에스테르 결합의 전체가 포스포로티오에이트 결합으로 치환되어 있는 올리고데옥시뉴클레오티드
    (ii) 렌티난 또는 시조필란.
  11. 제 7 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    삼중 나선 구조상의 것인 복합체.
  12. 제 7 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    B 세포를 활성화하여 IL-6을 산생시키는 활성, 및 수상(樹狀) 세포를 활성화하여 IFN-α를 산생시키는 활성을 갖는 복합체.
  13. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 올리고데옥시뉴클레오티드, 또는 제 7 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 복합체를 포함하는 의약 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서,
    바이러스 감염증, 암, 알레르기 질환, 세포 내 기생성 원충 또는 세균 감염증의 예방 또는 치료를 위한 의약 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서,
    바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 의약 조성물.
  16. 제 15 항에 있어서,
    바이러스 감염증이 RS 바이러스, 또는 인플루엔자 바이러스 감염증인 의약 조성물.
  17. 제 7 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 복합체를 포함하는 I형 및/또는 II형 인터페론 산생 유도제.
  18. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 올리고데옥시뉴클레오티드, 또는 제 7 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 복합체를 포함하는 면역 부활제.
  19. 제 18 항에 있어서,
    백신 애주번트인 면역 부활제.
  20. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 올리고데옥시뉴클레오티드, 또는 제 7 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 복합체를 포함하는 바이러스 감염증, 암, 알레르기 질환, 세포 내 기생성 원충 또는 세균 감염증의 예방 또는 치료제.
  21. 제 20 항에 있어서,
    바이러스 감염증이 RS 바이러스, 또는 인플루엔자 바이러스 감염증인 예방 또는 치료제.
  22. 의약 조성물의 제조를 위한 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 올리고데옥시뉴클레오티드, 또는 제 7 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 복합체의 사용.
  23. 제 22 항에 있어서,
    의약 조성물이 바이러스 감염증, 암, 알레르기 질환, 세포 내 기생성 원충 또는 세균 감염증의 예방 또는 치료를 위한 의약 조성물인, 사용.
  24. 제 23 항에 있어서,
    바이러스 감염증이 RS 바이러스, 또는 인플루엔자 바이러스 감염증인, 사용.
  25. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 올리고데옥시뉴클레오티드, 또는 제 7 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 복합체의 약리적 유효량을 온혈 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 당해 온혈 동물에 있어서의 질환의 치료 또는 예방을 위한 방법.
  26. 제 25 항에 있어서,
    질환이 바이러스 감염증, 암, 알레르기 질환, 세포 내 기생성 원충 또는 세균 감염증인, 방법.
  27. 제 26 항에 있어서,
    바이러스 감염증이 RS 바이러스, 또는 인플루엔자 바이러스 감염증인, 방법.
  28. 제 25 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,
    온혈 동물이 사람인, 방법.
  29. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 올리고데옥시뉴클레오티드, 또는 제 7 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 복합체의 약리적 유효량을 온혈 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 당해 온혈 동물에 있어서의 방어 면역 반응을 유도하는 방법.
  30. 바이러스 감염증, 암, 알레르기 질환, 세포 내 기생성 원충 또는 세균 감염증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 올리고데옥시뉴클레오티드, 또는 제 7 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 복합체.
  31. 제 30 항에 있어서,
    바이러스 감염증이 RS 바이러스, 또는 인플루엔자 바이러스 감염증인 올리고데옥시뉴클레오티드 또는 복합체.
  32. (a) 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 올리고데옥시뉴클레오티드, 또는 제 7 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 복합체, 및
    (b) 항원을 포함하는 의약 조성물.
  33. 제 32 항에 있어서,
    상기 항원에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물.
  34. 제 33 항에 있어서,
    항원이 병원체 유래의 항원인 조성물.
  35. 제 34 항에 있어서,
    병원체의 감염증의 예방 또는 치료용인 조성물.
  36. 제 35 항에 있어서,
    병원체가 바이러스인 조성물.
  37. 제 36 항에 있어서,
    바이러스가 RS 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스인 조성물.
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