JP2008100919A - Ｔｈ２細胞関連疾患の予防等に用いられる核酸／多糖複合体 - Google Patents

Abstract

【課題】 天然型のリン酸バックボーンを有するCpG DNAを使い、アレルギー性疾患等のTh2細胞関連疾患に対する予防もしくは治療に有効な手段を提供する。
【解決手段】 ポリ（dＡ）テールが付加され、天然型のバックボーンを有するCpG DNA、特にK−タイプまたはD−タイプの配列を持つCpG DNAを、平均分子量25000以上のβ−1,3−グルカンと複合体化して投与する。CpG DNAを単独投与する場合に比べて、IFN−γの産生促進と長時間持続効果等に示されるようにTh2よりもTh1細胞への分化が増大する。【選択図】 図８

Description

医薬組成物の技術分野に属し、特に、特定のオリゴヌクレオチドと多糖とから成り、免疫系におけるTh1細胞とTh2細胞のバランスを調節してTh2細胞関連疾患の予防や治療に用いられ得る核酸／多糖複合体に関する。

非メチル化CpG配列を含むオリゴヌクレオチド（CpG DNAまたはCpG ODNと略記）は脊椎動物の免疫システムを活性化することが知られており（非特許文献１−３）、その活性化の初期段階は、抗原提示細胞、特に樹状細胞、マクロファージ、およびB-細胞によるCpG DNAの細胞認識である。認識されたCpG DNAはエンドサイトーシス経路を通って輸送されるが、その間にファゴソーム様小胞体でトール様受容体9（TLR9）と呼ばれるパターン認識受容体によって認識される（非特許文献４）。このTLR9による認識は、IL-6、TNF−α、IL-12等のサイトカイン産生を誘導するための引き金となり、Th1細胞への分化を促進させる。これらのサイトカインはナチュラルキラー（NK）細胞、樹状細胞等を活性化し（非特許文献５−８）、最終的にIFN−γを産出する。したがって、事実上、CpG DNAとTLR9との相互作用は先天的および適応型の免疫システムに橋架けしていることになる。最近、CpG DNAが感染病原体、癌の抗原、アレルゲンに対するワクチンのアジュバントなどに有用であることが臨床試験で示されている（非特許文献９−１５）。
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しかしながら、CpG DNA療法には重大な欠点がある。一般に、核酸が単独で生体液の中に露出すると、ヌクレアーゼによる代謝および血しょう蛋白質との非特異的結合が起こって、直ちに排除される。CpG DNAを実用的な療法に転換するためには、タンパク質とのこれらの好ましくない相互作用を避けることによってCpG DNAを標的細胞に到達させることが本質的に重要である。

そこで、天然型のリン酸バックボーンであるホスホジエステル（phosphodiester：PO）を、S−アナログのホスホロチオエート（Phosphorothioate：PS）に変えることで比較的強いヌクレアーゼ耐性能を付与したものが臨床実験で比較的よく検討されている。しかしながら、補体系で非特異的反応を含む予期されなかった生体反応の細胞障害を引き起こすことが幾つかの最近の研究で指摘された（非特許文献１６−１７）。これらの副作用は、血清タンパク質との非特異的結合およびPSの抗原性により説明されている。そこで、そのようなアナログ型核酸を使用せずに、天然型のリン酸バックボーンを有するCpG DNAでヌクレアーゼ媒介代謝から保護することが望まれている。
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最近の研究では、CpG DNAを構造的ならびに機能的に異なる幾つかのタイプへ分類している（非特許文献１８−２１）。その中の1つがK-タイプと記述されるもので、TCGT（またはA）モチーフを含んでいて、リンパ系樹状細胞を活性化し、主にIL-6とIL-12を産生し、最終的にIFN−γが産出される。代表的なもう1つの分類にD−タイプと呼ばれるものがある。D−タイプの構造的な区別は相補的な配列と3’−末端にGカルテットとをもち、細胞認識力が増大した非メチル化CpGジヌクレオチドである（非特許文献２２）。そのD−タイプは形質細胞様細胞を活性化し、IFN−αを大量に産生し、それによりNK細胞を刺激するために多量のIFN−γも産生する（非特許文献１９）。K−タイプのPSアナログは天然型ホスホジエステルと同様の活性を示すが、D−タイプに不可欠の配列をPSに取り替えることはできないと言われている。
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β−（1→3）−D−グルカンの主鎖と、各3個のグルコース当りに１個のβ−（1→3）−D−グルコシル側鎖から成るシゾフィラン（SPG）と呼ばれる天然多糖類がある（非特許文献２３）。SPGを含むβ−1,3−グルカンに免疫刺激活性があることは従来から知られており、アジュバントとしてワクチンまたは免疫刺激性核酸に添加される例が報告されている（特許文献１および２）。SPGは婦人科癌に対する免疫増強法の筋肉内注射製剤臨床薬として20年以上の使用実績があり（非特許文献２４および２５）、生体内での安全性が確認されている（非特許文献２６）。
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本発明者らは、上記SPGが１本鎖のホモポリヌクレオチドと新規な複合体を形成することを見出した。そして、この複合体の基本的性質が研究され（非特許文献２７−３０）、その複合体をDNAの輸送に適用した。この複合体がタンパク質との好ましくない相互作用に対してDNAを保護し、その結果、サイトカイン産生を増加させることができることを示して、CpG DNAのキャリヤーとしても適用できる可能性を示している（非特許文献３１−３２、特許文献３および４）。それらの報告では、古典的なCpG配列のオリゴヌクレオチドのPSアナログの DNAを使用し、それをマクロファージ様細胞のような細胞にin vitroで輸送した。
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しかしながら、最近見出されたＫ−タイプやＤ−タイプのCpG DNAのような有用配列のオリゴヌクレオチドの本来的な機能を効率的に発揮させて医薬の開発に資することができるような具体的な手段は確立されていない。

本発明者は、β−1,3−グルカンを用いることによりＫ−タイプおよびＤ−タイプに代表されるCpG DNAが天然型ホスホジエステルをリン酸バックボーンとして該多糖と複合体化され、この複合体により、Th2細胞に対してTh1細胞の活性を優位に導くCpG DNAの機能が増幅されることを見出し本発明を導き出した。
すなわち、本発明は天然型のホスホジエステルバックボーンおよびポリ(dA)テールを有するCpGオリゴヌクレオチドと、分子量25000以上のβ−1,3−グルカンとから成り、Th2細胞関連疾患の予防または治療に用いられ得る核酸／多糖複合体を提供するものである。

本発明の複合体は、細胞毒性のない天然型Cp
DNAと生体内での安全性が確認されているβ−1,3−グルカンとから構成されている。
本発明の核酸／多糖複合体は、Th1細胞活性を優位にするサイトカインや抗体の産生を促進し、Th2細胞活性を優位にするサイトカインや抗体の産生を抑制することができるので、アレルギー疾患に代表されるTh2細胞に関連した疾患の予防または治療のための医薬組成物に用いられることができるものと期待される。

本発明の複合体を形成する主剤としてのCpG DNAには、TCGT（or TCGA）モチーフを含むK−タイプもしくは3’−末端にGカルテットを有するD−タイプを選ぶ（非特許文献１８−２１）。そして、β−1,3−グルカンと安定な複合体を形成させるために、末端にポリ（dＡ）を付加しておく必要がある。このポリ（dＡ）テールはどちらの末端でもかまわないが、5’−末端に付ける方がより好適である。また、dA（デオキシアデノシン）の数は特に限定されるものではないが、一般に30〜50個とするのが好ましく、例えば、40個である。各タイプのモチーフは一つの核酸分子中に複数個存在してもよく、その複数個のタイプが異なるものでもかまわない。本発明の複合体において用いられるのに特に好適な配列の例を記すと、Ｋタイプとしては、5’末端に40個のdAが結合され、複数個のCpG をもつK3｛5'−(dA)₄₀−ATCGACTCTCGAGCGTTCTC−3'（配列番号１）：以下、d(A)₄₀−K3と記すことがある｝が挙げられ、D−タイプとしてはD35｛5'−(dA)₄₀−GGTGCATCGATGCAGGGGGG−3'（配列番号２：以下、d(A)₄₀−D35と記すことがある）が挙げられる（非特許文献１８）。

複合体のもう一方の原料であるβ−1,3−グルカンには、側鎖を持たないカードランや側鎖にグルコース残基をもつシゾフィラン（SPG）、グリフォラン、レンチナンなどが天然の素材から得られており、それらを使用することができる。本発明の複合体に用いられるのに好ましいβ−1,3−グルカンは、側鎖にグルコース残基をもつものであり、特にシゾフィランが好ましい。また、側鎖のグルコース残基を化学変換することにより、細胞のレセプターに親和性を有する官能基（アミノ基、アミノ酸基、ペプチド基、コレステロール基など）を導入することも可能である。そして、CpG DNAと安定な複合体を形成し後述するようにTh1細胞を優位にする効果を発揮するためには分子量の制御が重要であり、約25000以上の平均分子量にする必要がある。

CpG DNAとβ−1,3−グルカンとの複合体の調製方法に関しては、本発明者らの先行出願特許（特許文献３および４）に記載された条件と同様に行うことが出来る。すなわち、本来は、天然または水中で三重螺旋として存在するβ−1,3−グルカンを非プロトン性有機極性溶媒またはアルカリ水溶液に溶解して一本鎖に解く。このうち溶媒として特に好ましいのは、非プロトン性有機極性溶媒であるジメチルスルホキシド（DMSO）である。このようにして得られた一本鎖のβ−1,3−グルカンの溶液とCpGオリゴヌクレオチドの溶液（中性付近のpHの緩衝水溶液）とを混合し、適当時間保持する、例えば、5℃で一夜保持することにより複合体が形成される。

このようにして得られる本発明の複合体は、アレルギー疾患に代表されるTh2細胞関連の予防や治療に用いられ得るものと期待される。以下この点に関して説明する。図１０は、よく知られた免疫系におけるTh1細胞とTh2細胞の働きを模式的に示すものである。Th0細胞（ナイーブTh細胞）は、抗原提示細胞が産生するサイトカインにより、Th1細胞またはTh2細胞へと分化する。すなわち、IL（インターロイキン）−12やIFN（インターフェロン）−αなどのサイトカインはTh0細胞をTh1細胞に分化させる。Th1細胞は、IFN−γなどのサイトカインを産生し、細胞性免疫に関与し感染防御や炎症性反応などに参加する。Th1の活性が高くなるとIgG2a抗体などの抗体が多くなる。他方、IL-4やIL-13などのサイトカインがあるとTh0細胞からTh1細胞への分化が優位になる。Th2細胞は液性免疫に関与し、その活性が高くなるとIgE抗体やIgG1抗体などの抗体が多くなる。Th1細胞の産生するIFN−γは、Th2の働きを抑えIgE抗体の産生を抑制する。

Th1／Th2バランスが崩れ、Th2細胞優位の病態であるTh2細胞関連疾患の典型例がアレルギー疾患（草熱、鼻結膜炎、鼻炎、喘息など）であり、その他に各種の癌（腫瘍）もこの疾患に属すると言われている。他方、Th1細胞優位による疾患は、肝障害や動脈硬化などと考えられている。

本発明に従い特定配列の天然型CpG DNAをβ−1,3−グルカンと複合体化して投与すると、当該CpG DNAを単独投与する場合に比べてTh2細胞への分化に対するTh1細胞への分化の比率が格段に増大することが確認されている。したがって、Th2細胞優位の状態を改善して、Th2細胞関連疾患の治療に役立つものと考えられる。

後述する実施例は、以上のような本発明の複合体の効果を評価するために、本発明の複合体を抗原提示細胞に投与して、図１０に示す(1)〜(4)のサイトカインまたは抗体量を測定したインビトロとインビボの実験結果を示すものである。具体的には実施例5と6で(1)（図４、５参照）を、実施例8で(2)（図６参照）を、実施例9で(3)（図７、８参照）と(4)（図９参照）を測定した。このうち、実施例９は抗原のモデルとして用いた卵白アルブミン（OVA）に対するアレルギー反応を抑制するのに当該複合体が優れていることを示すものである。なお、本実施例ではOVAを抗原のモデルとして使用したが、予めCpG DNA／β−1,3−グルカン複合体に抗原物質を適当量混合して、生体に投与することにより、ワクチン的な効果も期待できる。また、その場合に抗原物質は単にCpG DNA／β−1,3−グルカン複合体に混合されるのみならず、該複合体の一部とコンジュゲートさせて投与させることも可能である。

サンプル材料 シゾフィラン（SPG）は三井製糖（株）より入手したサンプルである。その重量平均分子量と繰り返しユニット数はそれぞれ1.5×10⁵および231である。異なる分子量のSPGの調製は既知の方法で行った（非特許文献３３）。
Kimura, T.; Koumoto, K.; Sakurai, K.; Shinkai,S., Chem. Lett., 2000, 1242-1243 CpG DNAは、K−タイプのCpG DNAとして5'−末端にポリdAテール：(dA)40を付加した5'−(dA)40−ATCGACTCTCGAGCGTTCTC−3'（配列番号１；d(A)40-K3と略記）を、およびD−タイプのCpG DNAとして5'−(dA)40−GGTGCATCGATGCAGGGGGG（配列番号１；d(A)40-D35と略記）を使用した。DNAのリン酸バックボーンはいずれも天然型のホスホジエステルで、ホスホロチオエート型ではない。両サンプルともHokkaido System Science社の合成品で、高圧液体クロマトグラフィーで精製されている。 その他、牛胎児血清（FBS）およびペニシリン/ストレプトマイシンはGibco/BRLから、購入した。DMEM（登録商標）培地とRPM11640は日水製薬（株）より入手した。

複合体の調製 DNA 2mgを10mM Tris緩衝液（pH7.8）1mlに溶解した。混合後の水の容量比が0.9になるように、適当な濃度のSPG/DMSO溶液をDNA溶液に加えた。一本鎖のSPG（ｓ-SPG）とDNAのモル比がl.5になるように制御した混合物を5℃で一夜保つことにより複合体を形成させ、DMSOを限外濾過で除いた。濾過後、DNAの最終濃度を、紫外線吸収測定により決定した。

複合体の性状 d(A)₄₀-K3およびd(A)₄₀-D3がSPGと複合体を形成していることを確かめるため、円偏光２色性スペクトル（CD）を測定した。調製した溶液の組成を表１に示す。

図１および図２に、35℃におけるd(A)₄₀-K3およびd(A)₄₀-D35のCDスペクトルの測定結果を示した。SPGが付加された場合と、DNA単独の場合でスペクトルが異なることにより、この温度で複合体を形成しているものと考えられる。
さらに、これらのサンプルについてゲル電気泳動を行った結果、図３に示したように、単独のCpG DNAサンプルに比べ、SPGが付加されたCpG DNAのサンプルは、移動が認められず、分子サイズが増大し、複合体を形成しているものと考えられる。

マウスと細胞の準備 生後7〜8週の雌のC57/B6またはBALB/cのマウスから、脾臓及び、大腿骨を摘出した。RMPI1640媒体/10%FBS、2mM L−グルタミン、10mM HEPES、0.11mg/mlのSodium pyruvateに単一の脾臓細胞の懸濁物を調製した。骨髄の樹状細胞を10%のFCSを含むDMEM媒体中に、8−9日間、骨髄細胞をFlt3−リガンド(100ng/ml; PeproTech)と共に培養することによって、Flt3リガンド誘導BMDC（105の細胞/穴）を発生させた（非特許文献３４）。10%のFBSと1wt%のペニシリン/ストレプトマイシン混合物を含むDMEM中で、マウスのマクロファージ様細胞（J774.Al）を培養した（非特許文献３１）。その細胞に対する免疫性応答は、免疫刺激剤投与後の上清を集めて、産生したサイトカインをELISAアッセイで評価した。
Coban, C.; Ishii, K. J.; Kawai, T., Hemmi, H.; Sato, S.; Uematsu, S.,Yamamoto, M.; Takeuchi, O.; Itagami, S.; Kumar, N.;Horii, T.; Akira, S., J. Exp Med., 2005, 201, (1), 19-25.

ELISAアッセイ 脾臓細胞は10%FBSで補われたRPMI1640中に保持された。媒体はペニシリン/ストレプトマイシン混合物を1wt%含んでいる。その細胞は5%CO₂インキュベータ中37℃で培養した。48穴のプレートにこの細胞（5×10⁶細胞/ml(1穴/1ml)）を播種し、37℃、2hインキュベートした。単独のCpG DNAまたはSPG/CpG DNA複合体を細胞に加えた。その細胞を37℃で24時間、インキュベートし、浮遊物を集めてELISAアッセイにかけた。トータルIL-12の産生量は、市販のELISAキットを使用し、メーカー（Endogen）のプロトコルに従って決定した。BMDCを使用する実験に関しては、IL-12p40、IFN−γ（R＆D systems）、およびIFNα（PBL Biomedical Laboratories）を、メーカーの指示に従い、ELISAによって測定した。J774.Al細胞を（1×10⁶細胞/ml（1穴/200μl））48穴プレートに播種し、37℃で5hインキュベートした後、サンプルを細胞に加えた。細胞は37℃で24 hインキュベートし、上清ELISAアッセイにかけた。

in vitroでのサイトカイン産生へのSPG分子量の依存性 分子量の異なる数種のSPGとCpG DNAとの複合体25μg/mlを、マウスのマクロファージ様細胞J774.Al（1×10⁶cells/ml）200μlに投与した場合の、IL-12の産生量に対するSPGの分子量依存性を示したのが図4である。K−タイプおよびD−タイプのいずれのCpG DNAに対しても複合体を形成する相手のSPGの分子量の増加に伴ってIL-12の産生量は増加しており、その効果は約25000以上（重量平均分子量）で顕著に認められた。

in vitroでのCpG DNAのタイプ別産生サイトカインの差異 Flt3リガンド誘導BMDCに対する免疫応答におけるK-タイプとD-タイプのCpG DNAの差異はIFN-αの産生量によると考えられる。Flt3L誘導BMDCはCD11c+/B220+とCD11c+/B220という2つのサブセットを含んでいる。K−タイプは両サブセットをIL-12産生へ導き、D−タイプはCD11c+/B220+からはIFN−α産生を、CD11c+/B220-からはIL-12産生を導く。図5の上段にIL-12の、下段にIFN−αの産生量を示した。IL-12の産生は、d(A)₄₀-K3を複合体化したとき劇的に増加している。この複合体化による増加はd(A)₄₀-D35の場合にも観測されているが、その産生量はd(A)₄₀-K3の場合に比べると小さい。IFN−αの産生は、K-タイプからは認められず、D−タイプからの産生が複合体化により大きく増加することが示された。このタイプによる産生サイトカインの相違は実際の免疫治療に適用する場合に微妙な影響を及ぼすことも考えられる。
なお、この実施例7で用いたSPGの重量平均分子量は1.5×10⁵であり、以下の実施例8および9においても同様である。

in vivoでのIFN-γ分泌の誘導 CpG DNAで誘発された自然免疫の活性化はNK細胞を間接的に活性化し、IFN−γを産生すると考えられている。そのIFN−γ産生を含むNK細胞の活性化は、さらにIL-12またはIFN−αの産生を促進し、それらの全てがTh1を誘導して適応的免疫反応を引き起こすことが知られている（非特許文献３５）。図6は、CpG DNA単独のまたはSPGと複合体化した場合のd(A)₄₀-K3およびd(A)₄₀-D35のCpG DNAを注入したマウスの血液中に産生したIFN−γの濃度の経時変化を示したものである。CpG DNA単独注入の場合、1時間後に最大に達した後、急激に減少している。他方、SPGと複合体化したものは、4〜6時間後にIFN−γの濃度が最大となり、以後あまり減少せず持続していろ。その最大値は単独投与時の最大値の約2倍で、持続時間は1〜2日間程度確認している。なお、CpG DNAのタイプ間の比較では、Kタイプの方がDタイプの場合より最大値および持続効果が大きいが、このサンプル間の差異はそれほど大きなものではない。
Gerosa, F.; Gobbi,A.; Zorzi, P.; Burg, S.; Briere,F.; Carra, G.; Trinchieri, G., J. of Immunol.,2005, 174, (20), 727-34.

in vivoでのアレルギー反応抑制効果の増強 CpG DNAで誘発された自然免疫の活性化は樹状細胞から産生されるIL-12などを介しTh1を誘導して適応的免疫反応を引き起こすことが知られている。同様に抗体価の増強も見られるがアレルギー反応に関わるとされるIgEの産生を抑制することも知られている（非特許文献３６）。図７は、CpG DNA単独のまたはSPGと複合体化した場合のd(A)₄₀-K3およびd(A)₄₀-D35のCpG DNAをアレルギーも出るタンパクとして使用したＯＶＡタンパクと同時投与しアレルギー反応抑制効果を確認したものである。CpG DNA単独投与の場合に比べTotal IgGの抗体価は変化しないもののIgE, IgG1の強い抑制、IgG2aの顕著な上昇がみられた。また、図8で示すように時間を追ってこれらの抗体価を解析したところd(A)₄₀-K3およびd(A)₄₀-D35のCpG DNA-SPG複合体両方において有意にIgEの抗体価の抑制がみられた。それと逆にIgG2aは有意に抗体価の上昇が見られた。さらにこれらの効果をTh2細胞の抗原特異的サイトカイン産生にて解析したところ、図9に示すようにアレルギー反応の際に検出されるTh2細胞のIL-4、IL-13の産生がd(A)₄₀-K3およびd(A)₄₀-D35のCpG DNA-SPG複合体両方において有意に抑制されていた。
Ishii KJ, Gursel I, Gursel M, Klinman DM. Curr Opin Mol Ther. 2004Apr;6(2):166-74.

Th2細胞関連疾患、特に、アレルギー反応（例えば、花粉症 喘息）を抑制できる薬剤、抗腫瘍（例えば、ガン）効果を期待できる薬剤。

d(A)₄₀-K3+SPGおよびd(A)₄₀-K3のCDスペクトル図（実施例３）。 d(A)₄₀-D35+SPGおよびd(A)₄₀-D35のCDスペクトル図（実施例３）。 ゲル電気泳動図（実施例３）。 SPG／CpG DNA複合体中のSPGの分子量とIL-12産生量との関係（実施例６）。 Flt3リガンド誘導BMDCで24時間後に産生したサイトカインに及ぼす、SPGと複合体を形成しているCpG DNAのK−タイプとD−タイプの比較（実施例７）。 SPG／CpG DNA複合体によるIFN−γの産生促進および持続効果のin vivoにおける確認（実施例８）。 SPG／CpG DNA複合体によるアレルギーモデルタンパク抗原に対するアジュバント効果のin vivoにおける抗体価とくにIgE産生抑制の確認（実施例９）。 SPG／CpG DNA複合体によるアレルギーモデルタンパク抗原に対するアジュバント効果のin vivoにおける抗体価とくにIgE産生抑制の確認−（時間軸）（実施例９）。 SPG／CpG DNA複合体によるアレルギーモデルタンパク抗原に対するアジュバント効果のin vivoにおけるTh2サイトカインの抑制の確認（実施例９）。 免疫系におけるTh1／Th2細胞の働きを模式的に示す図。

Claims (11)

1. 天然型のホスホジエステルバックボーンおよびポリ（dＡ）テールを有するCpGオリゴヌクレオチドと、分子量25000以上のβ−1,3−グルカンとから成ることを特徴とする、Th2細胞関連疾患の予防または治療に用いられる核酸／多糖複合体。
2. Th2細胞関連疾患がアレルギー疾患であることを特徴とする請求項１の核酸／多糖複合体。
3. CpGオリゴヌクレオチドが、Ｋ−タイプのものであることを特徴とする請求項１または２の核酸／多糖複合体。
4. CpGオリゴヌクレオチドが、Ｄ−タイプのものであることを特徴とする請求項１または２の核酸／多糖複合体。
5. CpGオリゴヌクレオチドが、5’−ATCGACTCTCGAGCGTTCTC−3’の塩基配列を有することを特徴とする請求項３の核酸／多糖複合体。
6. CpGオリゴヌクレオチドが、5’−GGTGCATCGATGCAGGGGGG−3’の塩基配列を有することを特徴とする請求項４の核酸／多糖複合体。
7. CpGオリゴヌクレオチドが5’−末端にポリ（dＡ）テールを有することを特徴とする請求項１〜６のいずれかの核酸／多糖複合体。
8. β−1,3−グルカンがシゾフィランであることを特徴とする請求項１〜７のいずれかの核酸／多糖複合体。
9. 一本鎖のβ−1,3−グルカンの溶液とCpGオリゴヌクレオチドの溶液とを、中性の水媒体中で混合することにより生成させることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかの核酸／多糖複合体調製法。
10. β−1,3−グルカン溶液の溶媒が非プロトン性有機極性溶媒またはアルカリ水溶液であることを特徴とする、請求項９の複合体調製法。
11. 非プロトン性極性溶媒としてジメチルスルホキシドを用いることを特徴とする請求項１０の複合体調製法。