KR20230107833A - 입자 지름이 제어된 베타글루칸과 핵산과의 복합체 - Google Patents

입자 지름이 제어된 베타글루칸과 핵산과의 복합체 Download PDF

Info

Publication number
KR20230107833A
KR20230107833A KR1020237019697A KR20237019697A KR20230107833A KR 20230107833 A KR20230107833 A KR 20230107833A KR 1020237019697 A KR1020237019697 A KR 1020237019697A KR 20237019697 A KR20237019697 A KR 20237019697A KR 20230107833 A KR20230107833 A KR 20230107833A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
complex
spg
cpg
particle diameter
cancer
Prior art date
Application number
KR1020237019697A
Other languages
English (en)
Inventor
켄 이시이
다카토 구사카베
유지 가스야
나오 죠나이
후미히코 다케시타
잇신 다나카
에미 구로사와
교스케 스즈키
데츠후미 고가
요시히로 미야지
Original Assignee
다이이찌 산쿄 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 filed Critical 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤
Publication of KR20230107833A publication Critical patent/KR20230107833A/ko

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A61K47/6931—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer
    • A61K47/6939—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer the polymer being a polysaccharide, e.g. starch, chitosan, chitin, cellulose or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0041—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being polymeric
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1629—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/1652—Polysaccharides, e.g. alginate, cellulose derivatives; Cyclodextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/17—Immunomodulatory nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은, 입자 지름이 제어된 β(1→3) 글루칸과 핵산과의 복합체를 제공한다. 또한 본 발명은, 입자 지름이 제어된 β(1→3) 글루칸과 핵산과의 복합체의 제조 방법 및 용도를 제공한다.

Description

입자 지름이 제어된 베타글루칸과 핵산과의 복합체
본 발명은, 입자 지름이 제어된 베타글루칸과 핵산이 형성하는 복합체에 관한 것이다.
CpG 올리고뉴클레오티드(CpG ODN)는, 면역 부활성의 CpG 모티프를 함유하는, 약 20 염기의 단일가닥 사슬 합성 DNA이다. CpG ODN의 숙주 수용체로서 톨양 수용체(Toll-like receptor) 9(TLR9)가 동정(同定)되어 있으며, TLR9를 통해 자연면역을 활성화하고, Ⅰ형 인터페론(이하, Ⅰ형 IFNs라고 한다.) 및 염증성 사이토카인을 유도한다(비특허문헌 1, 2). TLR9는, 형질세포양 수상세포(plasmacytoid dendritic cells. 이하, pDCs라고 한다.) 및 B 세포의 엔도솜(endosome) 내에 발현하고 있고, pDCs나 B 세포가 도입한 CpG ODN은, 엔도솜 내에 존재하는 TLR9와 상호작용하여, 자연면역을 활성화한다(비특허문헌 2).
CpG ODN이 유도하는 Ⅰ형 IFNs나 염증성 사이토카인을 이용하여, 감염증, 암, 천식 및 꽃가루 알레르기 등의 질환의 예방 또는 치료를 위한 새로운 면역요법제의 개발이 요망되고 있다(비특허문헌 2, 3). 이미 실용화되어 있는 CpG ODN을 포함하는 의약품으로는, B형 간염 백신인 Heplisav-B(R)를 들 수 있다. Heplisav-B(R)는 B형 간염 바이러스(이하, HBV라고 한다) 감염의 예방 백신이며, CpG ODN은 백신 애쥬번트로서 첨가되어 있다. Heplisav-B(R)는, 기존의 알루미늄 애쥬번트 첨가 B형 간염 백신인 Engerix-B(R)에 비해, 높은 약효를 나타낼 가능성이 인정되고 있는 점에서, CpG ODN은, 백신에 가장 흔히 사용되고 있는 알루미늄 애쥬번트에 비해, 높은 백신 애쥬번트 활성을 가질 가능성이 시사되어 있다(비특허문헌 4). 또, CpG ODN의 항암 활성을 이용한 임상시험도 진행되고 있고, 전이성 흑색종(melanoma)에 대한 치료약으로서의 개발도 진행되고 있다(비특허문헌 5).
골격 배열 및 면역 부활 특성이 각각 다른, 적어도 4개의 형태의 CpG ODN이 있다(비특허문헌 6). A형 또는 D형으로 불리는 CpG ODN은, 전형적으로는, 포스포디에스테르(PO) 골격 및 포스포로티오에이트(PS) 폴리 G 꼬리(poly G tail)와 함께 1개의 회문(palindromic) 구조의 CpG 모티프를 포함하고, pDCs를 활성화하여 대량의 IFN-α를 산생(産生)시키지만, pDCs의 성숙화나 B 세포 활성화를 유도할 수 없다(비특허문헌 7, 8). B형 또는 K형으로 불리는 CpG ODN은, PS 골격으로 이루어지고, 그 다수는 비회문 구조의 복수의 CpG 모티프를 함유하며, B 세포를 활성화하여 IL-6 등의 염증성 사이토카인을 산생시키고, pDCs를 활성화하여 성숙화시키지만, IFN-α 산생은 유도하지 않는다(비특허문헌 8, 9). 특허문헌 1에, 다수의 K형 CpG ODN이 기재되어 있다. 그 외의 CpG ODN의 형태인 C형 및 P형은, 각각 1개 및 2개의 회문 구조 CpG 서열을 함유하고 있고, 양쪽 모두 K형과 같이 B 세포를 활성화시키는 것에 더하여, D형과 같이 pDCs를 활성화시킬 수 있지만, P형 CpG ODN과 비교하여, C형 CpG ODN은 IFN-α 산생을 보다 약하게 유도한다(비특허문헌 10-12).
D형 및 P형 CpG ODN은, G-tetrads로 불리는 평행 4가닥 사슬 구조를 형성하는 후그스틴 염기쌍, 및 시스 회문 구조 부위와 트랜스 회문 구조 부위 사이의 왓슨-크릭 염기쌍의 고차 구조를 형성하고, 이러한 구조는 pDCs에 의한 강력한 IFN-α 산생에 필요하다(비특허문헌 12-14). 이러한 고차 구조는, 초기 엔도솜에의 국재화(局在化)나 TLR9를 통한 정보 전달에 필요하다고 생각되고 있지만, 단점으로서 CpG ODN의 다형성 및 응집의 원인이 되는 것으로 생각되고 있으며, 그 결과, D형 및 P형 CpG ODN의 임상 응용을 방해하고 있다(비특허문헌 15). 한편, K형 및 C형 CpG ODN은, 응집 등의 제조에 있어서의 장애물은 인정되고 있지 않고, 인간용 면역요법제 및 백신 애쥬번트로서 이용 가능할 것으로 생각된다(비특허문헌 16 및 17). 또, K형 CpG ODN은, 인간 임상시험에 있어서 감염증 및 암을 표적으로 하는 백신의 면역 원성을 높이는 결과가 보고되어 있다(비특허문헌 6, 16).
치마버섯(Schizophyllum commune) 유래의 가용성 β(1→3) 글루칸인 시조필란(Schizophylan)(이하, SPG라고 칭한다)은, 자궁경부암 환자에 있어서의 방사선 요법의 부활약으로서, 일본에서 임상에서 사용된 실적이 있다(비특허문헌 18). 마찬가지로, 표고버섯 유래의 가용성 β(1→3) 글루칸인 렌티난(이하, LNT라고 한다.)은 1985년에 승인된 의약품이며, 수술 불능 및 재발 위암 환자에 대하여 플루오로피리미딘계 약제와의 병용으로 사용되었다(비특허문헌 19, 20). β(1→3) 글루칸은, 폴리데옥시아데노신(이하, 폴리(dA)라고 칭한다)과 삼중 나선 구조의 복합체를 형성하는 것이 나타나 있다(비특허문헌 21).
특허문헌 2∼4에는, SPG를 포함하는 β(1→3) 글루칸과 핵산(유전자)과의 수용성 복합체의 유전자 캐리어로서의 사용이 개시되어 있다. 이들 문헌에는, 해당 복합체를 형성함으로써, 유전자의 안티센스 작용 및 핵산 분해 효소(뉴클레아제)에 대한 내성 작용을 높일 수 있는 것이 기재되어 있다.
특허문헌 5에는, β(1→3) 결합을 갖는 다당류를 캐리어(트랜스펙션제(transfection agent))로서 이용함으로써, CpG 서열을 포함하고, 인산디에스테르 결합을 포스포로티오에이트 결합 또는 포스포로디티오에이트 결합으로 치환한 면역 자극성 올리고뉴클레오티드의 작용을 높일 수 있는 것이 개시되어 있다.
특허문헌 6에는, 면역 자극성 올리고뉴클레오티드와, 장쇄(長鎖)의 β(1→6) 글루코시드 결합 측쇄(側鎖)를 갖는 β(1→3) 글루칸으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 면역 자극성 복합체가 기재되어 있다.
SPG와 복합체화한 CpG ODN의 3'말단에 인산디에스테르 결합을 갖는 폴리(dA)를 연결시킨 마우스 및 인간화(humanized)한 CpG ODN이 사이토카인 산생을 증강하여, 인플루엔자 백신 애쥬번트나 helper T세포 2형(이하, Th2라고 한다.) 관련 질환의 예방 또는 치료제로서 작용하는 것을 나타냈다(비특허문헌 22, 23, 특허문헌 7). 또, CpG ODN의 3'말단에 포스포로티오에이트 결합을 갖는 폴리(dA)를 연결하면, 복합체 형성이 거의 100％로까지 상승하는 것으로 나타났다(비특허문헌 24).
K형 CpG ODN(K3)의 3'말단에 dA를 40 염기 연결한 CpG ODN(이하, K3-dA40이라고 한다.)과 SPG와의 복합체(이하, 해당 복합체를 K3-SPG라고 한다.)를 인간 말초혈 단핵구(human peripheral blood mononuclear cells. 이하, hPBMCs라고 칭한다)에 작용시키면, K3 단독으로는 인정받지 못하는 IFN-α 산생이 인정되어, 핵산 처리 농도가 낮은 조건에서는, D형, P형, C형의 CpG ODN에 비해 높은 IFN-α 산생 레벨이었다(비특허문헌 25). 또, 마우스 모델에 있어서, K3-SPG에 의한 IFN-α 산생 유도 및 K3-SPG를 백신 애쥬번트로서 이용했을 때의 세포 상해성 T세포(CTL)나 helper T세포 1형(이하, Th1이라고 한다.) 유도 증강 활성은, TLR9를 통한 Ⅰ형 IFNs에 의존적인 것이 분명해졌다(비특허문헌 25). 또한, 다양한 마우스 암 이식 모델을 이용하여, K3-SPG 단독의 항암 활성을 평가한 결과, 정맥 내 투여한 K3-SPG의 항암 활성은, K3에 비해 높은 것이 분명해졌다(비특허문헌 26). 마우스 암 이식 모델에서의 K3-SPG의 항암 활성도, Ⅰ형 IFNs에 의존적인 것이 시사되어 있고, 게다가 CTL 유도에 중요한 IL-12에도 의존적일 가능성이 시사되어 있다(비특허문헌 26).
특허문헌 8에는, 항원/CpG 올리고뉴클레오티드/β(1→3) 글루칸계의 3원 복합체의 제조 방법이 개시되어 있다.
β(1→3) 글루칸류(BG)와 CpG ODN 핵산이 형성하는 복합체(이하, BG-CpG로 표기한다.)는, 생체내에서 자연면역을 활성화하여, CpG ODN 단독에 비해 강한 염증 응답 유도 등의 생리활성을 갖는다(비특허문헌 25). 즉, BG-CpG는, CpG ODN 단독의 임상 응용이 기대되는 표적 질환인, 감염증, 암, 알레르기 질환인 천식 및 꽃가루 알레르기에 대하여 가능성이 있는 면역요법제로 생각된다(비특허문헌 2, 3, 25, 26).
최근, CpG ODN의 암 면역요법에의 응용이 주목받고 있다(비특허문헌 27). 임상 응용에 대한 보고예로서, 흑색종암 항원의 CTL 에피토프를 수식한 바이러스양 나노입자(virus-like nanoparticles. 이하, VLPs라고 한다.)에 CpG ODN을 봉입한 핵산 제제(製劑)는, 스테이지 Ⅱ에서 Ⅳ의 흑색종 환자 22명 중 14명에 있어서, 흑색종암 항원 특이적인 CTL을 유도했다(비특허문헌 27). 또, 비임상 모델에 있어서도, 나노입자화한 CpG ODN의 항암 활성은, T세포 림프종, 간암, 대장암, 신경교종(glioma)에 대해 보고되어 있다(비특허문헌 28-31). 이상의 보고로부터, CpG ODN 제제의 입자 사이즈와 항암 활성이 상관하고 있을 가능성이 시사되며, 나노입자 형태를 취하는 BG-CpG는, 암 면역요법에 유용할 것으로 생각된다.
BG-CpG의 중요한 생리활성의 지표로서, Ⅰ형 IFNs인 IFN-α 산생 유도를 들 수 있다(비특허문헌 25). 특히, 임상에서의 BG-CpG의 약효를 시사하는 hPBMCs를 이용한 IFN-α 산생 유도 레벨을 측정하는 시험관내(in vitro) 평가계는, 비임상 암 이식 모델의 생체를 이용한 약효 평가계에 비해, 정량성이나 데이터의 안정성이 뛰어나다(비특허문헌 25, 26). 또, 비임상 마우스 모델에서의 시험관내 약효 평가에 대해서도, 마우스 생체를 이용한 항암 활성에 상관하는 IFN-α 및 IFN-γ 산생을 측정함으로써, 마우스 생체를 이용한 암 이식 모델에서의 항암 활성을 예측하는 것이 가능할 것으로 생각된다(비특허문헌 25, 26). 한편, BG-CpG의 암 증식 억제 활성은, 마우스 이식 모델을 이용한 평가로 밝힐 필요가 있다고 생각된다(비특허문헌 26). 대표적인 마우스 암 이식 모델로서, 흑색종 모델인 B16 암 피하이식 모델, 췌장암의 복막 파종 모델인 Pan-02 암 복강이식 모델을 들 수 있다(비특허문헌 26).
이상과 같이, BG-CpG의 의약 분야, 특히 암 면역요법이나 백신 애쥬번트에 있어서의 유용성이 확인되고 있다. 실용화를 위해, BG-CpG의 활성의 향상에 따른 투여량 삭감에 의한 제조 코스트의 저감, 상세한 제법, 품질 평가법의 확립이 요망되고 있다. 본 발명자들은, BG-CpG의 유효성을 결정짓는 요인의 하나로서 입자 지름에 주목했다. 당업자에게 주지인 바와 같이, 본 용도에 제공되는 BG-CpG는, 수계 매체 중에서 수십 nm 내지 수백 nm의 평균 입자 지름을 갖는 것이 확인되고 있다(특허문헌 9-14). 이와 같은 사이즈를 갖는 의약품은 나노메디슨(nanomedicine)이라고 칭해지며, 화학 합성의 의약품 또는 세포 배양 등을 이용하여 제조되는 바이오 의약품과는 다른 특성이나 기능을 갖는 의약품 형태로서 주목받고, 근래, 개발에 관한 가이드라인 등이 잇따라 공표되고 있다(비특허문헌 32-34). 이들에서는, 나노메디슨의 유효성을 최대화하면서, 의약품이 구비해야 하는 품질을 얻기 위해, 여러 가지 특성을 최적화할 필요가 있는 것이 기술되어 있다. 그중에서도 입자 지름에 대해서는 나노메디슨의 특성을 결정짓는 특히 중요한 요인의 하나인 것으로 생각되고 있다.
BG-CpG의 입자 지름과 약리 작용과의 관련성에 대해서는, 이하와 같은 보고가 있다. 특허문헌 10에서는, 당해 용도에 있어서의 통상의 평균 입자 지름으로서 10nm 내지 100nm, 바람직한 평균 입자 지름으로서 20nm 내지 50nm라는 범위가 개시되어 있다. 또, 실제로 시험에 제공된 BG-CpG(K3-SPG)의 평균 입자 지름이 30nm였던 것이 개시되어 있다. 한편, 시험관내에 있어서의 세포자극성을 기초적인 지표로 하여 BG-CpG의 입자 지름과 약리 작용과의 관련성을 조사한 특허문헌 11에서는, BG-CpG(핵산이 D35-dA40이고, 베타글루칸이 SPG인 복합체)의 적합한 관성 반경 범위가 20nm 내지 200nm인 것이 개시되어 있다. 상세하게는, 관성 반경으로서 5nm에서 200nm의 사이즈를 갖는 해당 복합체의 약리 작용을 비교한 결과로서, 관성 반경 20nm 내지 150nm가 적합한 범위로서 나타나 있다. 더욱 상세하게는, 해당 복합체가 갖는 생리활성의 관성 반경 의존성으로서, 다음의 1)-3)의 사실이 개시되어 있다. 1) 관성 반경 5nm 내지 10nm의 해당 복합체는 생리활성이 현저하게 낮다, 2) 동 150nm 내지 200nm의 해당 복합체는 생리활성이 약간 낮다, 3) 동 20nm 내지 150nmm의 범위에서는 해당 복합체의 생리활성에 큰 차이가 없다.
여기에서, 관성 반경이 작은 복합체의 활성이 낮은 원인으로서, 작은 복합체에서는 실제로는 복합체 형성 효율이 충분하지 않은 것, 및, 작은 분자에는 세포에 도입되기 어려운 성질이 있는 것을 들 수 있다. 여기에서, 측정 원리에 차이가 있기는 하지만, 관성 반경을 2배한 것이 대체로 평균 입자 지름으로 환산된다고 하면, 해당 복합체의 평균 입자 지름은 40nm 내지 300nm의 범위가 적합하고, 이 범위에 있어서는 해당 복합체의 약리 작용은 현저하게는 다르지 않은 것이 개시되어 있다. 한편, BG-CpG의 구성 성분으로서의 베타글루칸의 분자량 및 BG-CpG의 입자 지름 제어법에 대해서는, 상기의 특허문헌 11에 있어서, 핵산을 D35-dA40으로 했을 때, 다양한 분자량의 SPG와 복합화함으로써, 관성 반경으로서 10nm 이하에서 200nm 정도까지의 범위에서 평균 입자 지름이 다른 일련의 BG-CpG가 얻어지는 것이 나타나 있다. 또, 특허문헌 12에 있어서는, 분자량이 45만(3량체로서)인 SPG의 제법이 개시되어 있지만, SPG의 분자량이 미치는 해당 복합체의 입자 지름에 대한 영향에 대해서는 논의되고 있지 않다. 특허문헌 13에는, 베타글루칸이 구비해야 하는 중량 평균 분자량으로서 2000 이상인 것, 분자량이 45만(3량체로서)인 SPG가 BG-CpG의 구성 성분으로서 사용된 것이 나타나 있기는 하지만, SPG의 분자량이 미치는 해당 복합체의 입자 지름에 대한 영향에 대해서는 논의되고 있지 않다.
이상으로부터, BG-CpG의 입자 지름과 약리 작용과의 관련성에 대해서는, 수 nm 내지 수백 nm의 평균 입자 지름 범위에 있어서 연구가 이루어지고 있으며, 1) 평균 입자 지름이 20nm 이하 또는 300nm 이상인 BG-CpG는, 평균 입자 지름이 20nm 내지 300nm인 BG-CpG와 비교하여 활성이 낮고, 2) 평균 입자 지름 20nm 내지 300nm의 범위에서의 BG-CpG의 생리활성의 입자 지름 의존성은 분명하지는 않지만, 통상 적용되는 범위는 10nm 내지 100nm이고, 바람직한 평균 입자 지름의 범위는 20nm 내지 50nm라고 개시되어 있다. 또, 평균 입자 지름이 30nm인 BG-CpG가 정력적으로 항암제 또는 백신 애쥬번트로서 사용되고 있는 것을 알 수 있다.
미국특허 US 8,030,285 B2 국제공개 WO 01/034207 A1 국제공개 WO 02/072152 A1 일본국 특개2004-107272호 공보 국제공개 WO 2004/100965 A1 일본국 특개2007-70307호 공보 일본국 특개2008-100919호 공보 일본국 특개2010-174107호 공보 국제공개 WO 2016/103531 A1 국제공개 WO 2015/041318 A1 국제공개 WO 2016/098832 A1 국제공개 WO 2004/100965 A1 국제공개 WO 2001/034207 A1 일본국 특허 제5605793호 공보
Hemmi, H., et al. A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA. Nature 408, 740-745 (2000). Krieg, A.M. Therapeutic potential of Toll-like receptor 9 activation. Nature reviews. Drug discovery 5, 471-484 (2006). Klinman, D.M. Immunotherapeutic uses of CpG oligodeoxynucleotides. Nature reviews. Immunology 4, 249-258 (2004). Schillie, S., et al. Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices for Use of a Hepatitis B Vaccine with a Novel Adjuvant. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 2018 Apr 20; 67(15): 455-458. Ribas, A., et al. SD-101 in Combination with Pembrolizumab in Advanced Melanoma: Results of a Phase Ib, Multicenter Study. Cancer Discov. 2018 Oct; 8(10):1250-1257. Vollmer, J. & Krieg, A.M. Immunotherapeutic applications of CpG oligodeoxynucleotide TLR9 agonists. Advanced drug delivery reviews 61, 195-204 (2009). Krug, A., et al. Identification of CpG oligonucleotide sequences with high induction of IFN-alpha/beta in plasmacytoid dendritic cells. European journal of immunology 31, 2154-2163 (2001). Verthelyi, D., Ishii, K.J., Gursel, M., Takeshita, F. & Klinman, D.M. Human peripheral blood cells differentially recognize and respond to two distinct CPG motifs. Journal of immunology 166, 2372-2377 (2001). Hartmann, G. & Krieg, A.M. Mechanism and function of a newly identified CpG DNA motif in human primary B cells. Journal of immunology 164, 944-953 (2000). Hartmann, G., et al. Rational design of new CpG oligonucleotides that combine B cell activation with high IFN-alpha induction in plasmacytoid dendritic cells. European journal of immunology 33, 1633-1641 (2003). Marshall, J.D., et al. Identification of a novel CpG DNA class and motif that optimally stimulate B cell and plasmacytoid dendritic cell functions. Journal of leukocyte biology 73, 781-792 (2003). Samulowitz, U., et al. A novel class of immune-stimulatoryCpG oligodeoxynucleotides unifies high potency in type I interferon induction with preferred structural properties. Oligonucleotides 20, 93-101 (2010). Kerkmann, M., et al. Spontaneous formation of nucleic acid-based nanoparticles is responsible for high interferon-alpha induction by CpG-A in plasmacytoid dendritic cells. The Journal of biological chemistry 280, 8086-8093 (2005). Klein, D.C., Latz, E., Espevik, T. & Stokke, B.T. Higher order structure of short immunostimulatory oligonucleotides studied by atomicforce microscopy. Ultramicroscopy 110, 689-693 (2010). Puig, M., et al. Use of thermolytic protective groups to prevent G-tetrad formation in CpG ODN type D: structural studies and immunomodulatory activity in primates. Nucleic acids research 34, 6488-6495 (2006). Bode, C., Zhao, G., Steinhagen, F., Kinjo, T. & Klinman, D.M. CpG DNA as a vaccine adjuvant. Expert review of vaccines 10, 499-511 (2011). McHutchison, J.G., et al. Phase 1B, randomized, double-blind, dose-escalation trial of CPG 10101 in patients with chronic hepatitis C virus. Hepatology 46, 1341-1349 (2007). Okamura, K., et al. Clinical evaluation of schizophyllan combined with irradiation in patients with cervical cancer. A randomized controlled study. Cancer 58, 865-872 (1986). Oba, K.; Kobayashi, M.; Matsui, T.; Kodera, Y.; Sakamoto, J.Individual patient based meta-analysis of lentinan for unresectable/recurrent gastric cancer. Anticancer Res., 2009, 29, 2739-2746. Nakano, H.; Namatame, K.; Nemoto, H.; Motohashi, H.; Nishiyama, K.; Kumada, K. A multi-institutional prospective study of lentinan in advanced gastric cancer patients with unresectable and recurrent diseases: Effect onprolongation of survival and improvement of quality of life. Hepato-Gastroenterol., 1999, 46, 2662-2668. Sakurai, K., Mizu, M. & Shinkai, S. Polysaccharide-polynucleotide complexes. 2. Complementary polynucleotide mimic behavior of the naturalpolysaccharide schizophyllan in the macromolecular complex with single-stranded RNA and DNA. Biomacromolecules 2, 641-650 (2001). Shimada, N., et al. A polysaccharide carrier to effectively deliver native phosphodiester CpG DNA to antigen-presenting cells. Bioconjugate chemistry 18, 1280-1286 (2007). Koyama, S., et al. Plasmacytoid dendritic cells delineate immunogenicity of influenza vaccine subtypes. Science translational medicine 2, 25ra24 (2010). Minari, J., et al. Enhanced cytokine secretion from primary macrophages due to Dectin-1 mediated uptake of CpG DNA/beta-1,3-glucan complex. Bioconjugate chemistry 22, 9-15 (2011). Kobiyama, K., et al. Nonagonistic Dectin-1 ligand transforms CpG into a multitask nanoparticulate TLR9 agonist. PNAS 111, 3086-3091 (2014). Kitahata, Y., et al. Circulating nano-particulate TLR9 agonist scouts out tumor microenvironment to release immunogenic dead tumor cells. Oncotarget 7, 48860-48869 (2016). Speiser DE, Schwarz K, Baumgaertner P, et al. Memory and effector CD8 T-cell responses after nanoparticle vaccination of melanoma patients. J Immunother. 2010; 33(8):848-858. Nikitczuk KP, Schloss RS, Yarmush ML, Lattime EC. PLGA-polymer encapsulating tumor antigen and CpG DNA administered into the tumor microenvironment elicits a systemic antigen-specific IFN-γ response and enhances survival. J Caner Ther. 2013;4(1):280-290. Kwon S, Kim D, Park B, et al. Induction of immunological memory response by vaccination with TM4SF5 epitope-CpG-DNA-liposome complex in a mouse hepatocellular carcinoma model. Oncology Rep. 2013; 29(2):735-740. Kwon S, Kim Y-E, Park J-A, Kim D-S, Kwon H-J, Lee Y. Therapeutic effect of a TM4SF5-specific peptide vaccine against colon cancer in a mouse model. BMB Rep. 2014; 47(4):215-220. Zhao D, Alizadeh D, Zhang L, et al. Carbon nanotubes enhance CpG uptake and potentiate antiglioma immunity. Clin Cancer Res. 2011; 17(4):771-782. 후생노동성 「블록 공중합체 미셀 의약품의 개발에 관한 후생노동성/유럽의약품청의 공동 리플렉션 페이퍼의 공표 등에 대해서」, 약식심사발 0110 제1호, 2014년 1월 10일 후생노동성 의약·생활위생국 심사관리과, 「핵산(siRNA) 탑재 나노 제제에 관한 리플렉션 페이퍼」에 대해서, 2016년 3월 28일 후생노동성 의약·생활위생국 심사관리과, 「리포솜 제제의 개발에 관한 가이드라인」에 대해서, 2016년 3월 28일
BG-CpG는, 베타글루칸과 핵산이 비공유 결합에 의해 느슨하게 집합하고 있는 특징적인 구조를 갖지만, BG-CpG의 입자 지름과 약리 작용과의 관련성에 관한 지견은 아직 충분하지 않다. 따라서 BG-CpG 등의 베타글루칸과 핵산의 복합체로 이루어지는 의약품을 얻기 위해, 입자 지름이 약리 작용에 미치는 영향을 상세하게 조사할 필요가 있다. 베타글루칸과 핵산의 복합체에 대해서, 종래 알려져 있지 않았던 적합한 입자 지름의 범위를 찾아내는 것이 본 발명의 과제이다. 또한, 적합한 범위로 입자 지름이 제어된, BG-CpG 등의 베타글루칸과 핵산의 복합체를 제조하기 위한, 견뢰성이 높은 제법 및 분석 방법을 확립하는 것도 본 발명의 과제이다.
본 발명자들은 예의 검토를 행하여, 평균 입자 지름이 단계적으로 다른 일련의 BG-CpG를 제조했다. 그 결과 본 발명자들은, 약 20nm 내지 180nm, 바람직하게는 약 20nm 내지 130nm, 또는 약 40nm 내지 180nm, 보다 바람직하게는 약 80nm 내지 130nm, 또는 약 130nm 내지 180nm의 범위로 평균 입자 지름이 엄밀하게 제어된 BG-CpG를 제조할 수 있는 것을 찾아냈다. 그리고 평균 입자 지름이 20nm 내지 130nm, 또는 40nm 내지 180nm의 범위에 있는 BG-CpG의 항암 작용을 검토하여, 평균 입자 지름이 커질수록 그 작용도 커지는 것을 찾아냈다.
따라서 본 발명은, 이하를 포함한다.
[1] 입자 지름이 제어된, β(1→3) 글루칸과 핵산과의 복합체.
[2] 평균 입자 지름이 80nm 내지 130nm인 것을 특징으로 하는, [1]에 기재한 복합체.
[3] 평균 입자 지름이 130nm 내지 180nm인 것을 특징으로 하는, [1]에 기재한 복합체.
[4] 상기 β(1→3) 글루칸이, 시조필란인 것을 특징으로 하는, [1] 또는 [2]에 기재한 복합체.
[5] 상기 β(1→3) 글루칸이, 렌티난인 것을 특징으로 하는, [1] 또는 [3]에 기재한 복합체.
[6] 상기 핵산이, K형의 CpG 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는, [1]∼[5] 중 어느 한 항에 기재한 복합체.
[7] 상기 핵산이, K형 CpG 올리고뉴클레오티드의 3'말단에 폴리데옥시아데노신이 연결된 핵산인 것을 특징으로 하는, [1]∼[6] 중 어느 한 항에 기재한 복합체.
[8] 상기 핵산이, 서열 번호 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 인간화 K형 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 및 폴리데옥시아데닐산을 포함하는 올리고데옥시뉴클레오티드로서, 폴리데옥시아데노신이, 인간화 K형 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드의 3'말단에 연결되고, 올리고데옥시뉴클레오티드의 인산디에스테르 결합의 일부 또는 전부가 포스포로티오에이트 결합에 의해 치환되어 있는, [1]∼[7] 중 어느 한 항에 기재한 복합체.
[9] [1]∼[8] 중 어느 한 항에 기재한 복합체를 포함하는 의약 조성물.
[10] 바이러스 감염증, 암, 알레르기 질환, 세포내 기생성 원충 또는 세균 감염증의 예방 또는 치료를 위한, [9]에 기재한 의약 조성물.
[11] 바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한, [10]에 기재한 의약 조성물.
[12] 바이러스 감염증이 RS 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스 감염증인, [11]에 기재한 의약 조성물.
[13] [1]∼[8] 중 어느 한 항에 기재한 복합체를 포함하는 면역 부활제.
[14] 백신 애쥬번트인, [13]의 면역 부활제.
[15] (a) [1]∼[8] 중 어느 한 항에 기재한 복합체, 또는, [13] 또는 [14]에 기재한 면역 부활제, 및
(b) 항원
을 포함하는, 의약 조성물.
[16] 해당 항원에 대한 면역 반응을 유도하기 위한, [15]에 기재한 조성물.
[17] 항원이 병원체 유래의 항원인, [16]에 기재한 조성물.
[18] 병원체의 감염증의 예방 또는 치료용인, [17]에 기재한 조성물.
[19] 병원체가 바이러스인, [18]에 기재한 조성물.
[20] 바이러스가 RS 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스인, [19]에 기재한 조성물.
[21] 항원이 암 유래의 항원인, [16]에 기재한 조성물.
[22] 암의 예방 또는 치료용인, [21]에 기재한 조성물.
[23] (a) [1]∼[8] 중 어느 한 항에 기재한 복합체, 또는, [9], [10], [15], [16], [21], [22] 중 어느 한 항에 기재한 의약 조성물, 및
(b) 항암제
를 포함하는, 의약 조성물.
[24] 항암제가 면역 체크포인트 저해제인, [23]에 기재한 조성물.
[25] 면역 체크포인트 저해제가, PD1 저해약, PD-L1 저해약 및 CTLA-4 저해약 중 어느 것인, [24]에 기재한 조성물.
[26] β(1→3) 글루칸의 분자량 특성을 이용한 [1]∼[8] 중 어느 한 항에 기재한 복합체의 제조 방법.
[27] [9]에 기재한 의약 조성물을 포함하는, 의약 조성물의 유효량을 피검자에게 투여하는 것을 포함하는, 바이러스 감염증, 암, 알레르기 질환, 세포내 기생성 원충 또는 세균 감염증의 치료 또는 예방 방법.
[28] 바이러스 감염증이 RS 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스 감염증인, [27]에 기재한 치료 또는 예방 방법.
[29] [15]에 기재한 의약 조성물을 포함하는, 의약 조성물의 유효량을 피검자에게 투여하는 것을 포함하는, 바이러스 감염증, 암, 알레르기 질환, 세포내 기생성 원충 또는 세균 감염증의 치료 또는 예방 방법.
[30] 바이러스 감염증이 RS 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스 감염증인, [29]에 기재한 치료 또는 예방 방법.
[31] 다른 항암제와 병용하는 것을 특징으로 하는, [27] 또는 [29]에 기재한 암의 치료 또는 예방 방법.
[32] 항암제가 면역 체크포인트 저해제인, [31]에 기재한 치료 또는 예방 방법.
[33] 면역 체크포인트 저해제가, PD1 저해약, PD-L1 저해약 및 CTLA-4 저해약 중 어느 것인, [32]에 기재한 치료 또는 예방 방법.
본 발명에 의하면, 실용성이 높은 제법·제조 조건으로, 베타글루칸의 분자량 특성을 선택 또는 제어함으로써, 20nm 내지 180nm, 바람직하게는 20nm 내지 130nm, 또는 40nm 내지 180nm, 보다 바람직하게는 80nm 내지 130nm, 또는 130nm 내지 180nm의 범위에서 평균 입자 지름이 엄밀하게 제어된 BG-CpG가 제공된다. 따라서 암 면역요법 등의 치료약 또는 예방약 또는 이들 구성 성분의 하나로서, 최적의 입자 지름을 선정할 수 있다. 본 발명의 BG-CpG는 종래의 BG-CpG에 비해, 적은 투여량으로 현저한 유효성이 얻어지는 점에서, 종래의 BG-CpG로는 치료나 예방이 곤란했던 질환에 대하여 적용할 수 있을 가능성이 있다.
도 1은, 제조한 mSPG 및 SPG 표준 시료의 1H-NMR 스펙트럼 차트이다.
도 2는, 제조한 mSPG 및 SPG 표준 시료의 13C-NMR 스펙트럼 차트이다.
도 3은, 풀루란의 분자량 교정 곡선이다.
도 4A는, K3-SPG에 의한 인간 PBMC로부터의 IFN-α 산생 유도능의 평가 결과를 나타내는 그래프이다. 도 4A는, 0, 0.75, 2, 6, 20㎍/mL의 농도의 K3-SPG로 hPBMCs를 자극했을 때의 IFN-α 산생 레벨의 AUC 값을 나타낸다. 도 4B는, 마우스 비장 세포로부터의 IFN-γ 산생 유도능의 평가 결과를 나타내는 그래프이다. 도 4B는 0, 0.75, 2, 6, 20㎍/mL의 농도의 K3-SPG로 마우스 비장 세포를 자극했을 때의 IFN-γ 유도 레벨의 AUC 값을 나타낸다. 도 4에서 사용한 피험 물질의 로트 번호는 다음과 같다: ·KAInv3701:20170613-01 ·KAmSP001a:20170613-02 ·KAmSP002a:20170613-03 ·KASPG0070:20170613-04 ·KASPG0071:20170613-05 ·KASPG0095:20170926-07. 도 4A의 그래프의 오른쪽에, 각 로트 번호의 샘플의 DLS(nm) 평가 결과를 나타낸다.
도 5는, hPBMCs를 CpG ODN 농도 0, 0.75, 2, 6, 20의 BG-CpG로 자극했을 때의, IFN-α 산생 레벨의 AUC 값과 DLS를 이용한 평균 입자 지름의 상관을, 스피어만(Spearman) 검정에 의해 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은, K3-SPG의 약리 작용의 생체내(in vivo) 평가를 나타낸다. 도 6의 상단에, 이 생체내 평가 실험의 프로토콜을 나타낸다. 그 프로토콜에 따라, K3-SPG, K3 및 PBS(컨트롤)의 종양 사이즈를 경시적(經時的)으로 측정한 결과를 나타내는 그래프를 도 6의 하단에 나타낸다. 도 6의 하단의 그래프에 있어서, 가로축은 B16의 피하이식을 행한 다음의 일수를 나타내고, 세로축은 K3-SPG, K3 및 PBS 투여군의 종양 사이즈를 나타낸다.
도 7은, 렌티난을 소정 조건으로 알칼리 처리했을 때의 알칼리 처리 시간과 해당 렌티난을 구성 성분으로 하는 BG-CpG의 평균 입자 지름과의 관계를 나타낸다.
도 8은, 다양한 평균 입자 지름을 갖는 K3-LNT에 의한 마우스 비장 세포로부터의 IFN-γ 산생 유도능의 평가 결과를 나타내는 그래프이다. 2 및 10㎍/mL 농도의 K3-LNT로 마우스 비장 세포를 자극했을 때의 IFN-γ 유도 레벨의 합계를 나타낸다.
도 9는, K3-LNT의 약리 작용의 생체내 평가를 나타낸다. C57BL/6 마우스의 피하에 2.5×105개의 B16 종양 세포를 이식하고(이식일을 제0일라고 한다.), 7, 9 및 11일 후에 합계로 3회 K3-LNT를 종양 내 투여했다. 비교로서, 생리식염액(saline)을 투여했다. 가로축은 B16의 피하이식을 행한 다음의 일수를 나타내고, 세로축은 K3-LNT 및 생리식염액 투여군의 종양 사이즈를 나타낸다. 도 9에서 사용한 피험 물질의 로트 번호는 다음과 같다: ·KALNT0706:20201106-07 ·KALNT0710:20201106-04 ·KALNT0709:20201106-03 ·KALNT0712:20201106-06.
도 10은, 도 9와 마찬가지로 K3-LNT의 약리 작용의 생체내 평가를 나타낸다. 단, 이식한 종양 세포의 수는 5×105개로 했다. 또 비교로서, 생리식염액(saline) 및 K3를 투여했다. 도 10에서 사용한 피험 물질의 로트 번호는 다음과 같다: ·KALNT0710:20201106-04 ·KALNT0709:20201106-03.
1. 입자 지름이 제어된 β(1→3) 글루칸과 핵산과의 복합체
본 발명은, 입자 지름이 제어된 β(1→3) 글루칸과 핵산과의 복합체를 제공한다. 본 발명자들은 예의 검토를 통해, β(1→3) 글루칸과 핵산의 복합체의 평균 입자 지름이 20nm 내지 180nm의 범위 내, 바람직하게는 20nm 내지 130nm, 또는 40nm 내지 180nm, 보다 바람직하게는 80nm 내지 130nm, 또는 약 130nm 내지 180nm의 범위 내인 경우에, 해당 복합체의 항암 활성이 현저하게 높은 것을 찾아내어, 본 발명을 완성시켰다. 따라서 평균 입자 지름이 그와 같은 범위로 제어된 BG-CpG를, 암 면역요법 등의 치료약 또는 예방약으로서 이용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 β(1→3) 글루칸은, 핵산과 복합체를 형성하는 성질을 갖는 한 특별히 한정되는 것은 아니지만, 시조필란(SPG), 렌티난(LNT), 커들란, 스클레로글루칸, 파키만(pachyman), 그리포란(grifolan), 라미나란 등의 β(1→3) 글루칸류를 들 수 있다. 그들이 핵산과 복합체를 형성하는 성질을 갖는 것은 이미 보고되어 있다(국제공개 WO2004/100965 및 일본국 특허 제4850512호, 면역 자극제). 본 발명에서 사용할 수 있는 특히 적합한 β(1→3) 글루칸으로서, SPG와 LNT를 들 수 있다.
본 발명에서의 β(1→3) 글루칸과 핵산과의 복합체는, 그것으로 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 β(1→3) 글루칸(BG)과, CpG ODN을 포함하는 핵산이 형성하는 복합체(BG-CpG)이다. 더욱 바람직하게는 본 발명에서의 복합체는, SPG와, K형 CpG ODN(K3)의 3'말단에 dA를 40 염기 연결한 CpG ODN(K3-dA40)과의 복합체(K3-SPG), 또는 LNT와, K형 CpG ODN(K3)의 3'말단에 dA를 40 염기 연결한 CpG ODN(K3-dA40)과의 복합체(K3-LNT)이다.
하기 4.에서 상세하게 기술하지만, SPG 산생능이 높은 치마버섯 균주를 선발해 적절한 배양 조건하에서 배양하여, 효율 좋게 배지(培地) 중에 SPG를 분비시키고, 그 배지를 정제함으로써 SPG를 얻을 수 있다. SPG를 그대로 사용할 수도 있지만, 필요에 따라 적절한 분자량으로 제어를 행한 다음 사용한다. 베타글루칸의 분자량 제어를 행하는 방법에 대해서도 하기 2.에서 상세하게 기술한다.
본 발명에 있어서는, 「입자 지름이 제어된 복합체」란, 베타글루칸과 핵산과의 복합체의 평균 입자 지름을 목적으로 하는 범위로 하기 위해, 적절한 분자량의 베타글루칸을 구성 성분으로서 사용하여, 제조된 복합체를 의미한다. 여기에서, 베타글루칸의 분자량은 특정되어 있지 않아도 된다. 또한, 본 발명에서 「엄밀한 제어」란, 대체로 10nm 내지 50nm 또는 그것보다 좁은 간격으로 해당 복합체의 평균 입자 지름을 제어하는 것을 의미한다. 이와 같은 엄밀한 제어에 의해, 다양한 의약 용도의 베타글루칸과 핵산과의 복합체의 최적의 평균 입자 지름 범위를 분명히 할 수 있다. 또한, 이와 같은 엄밀한 제어에 의해, 최대의 약리 효과를 발휘하는 평균 입자 지름을 갖는 베타글루칸과 핵산과의 복합체를 제조할 수 있다.
국제공개 WO2016/098832에서는, 대체로 1만∼540만의 범위에서 분자량이 다른 일련의 SPG를 사용하여, d(A)40-D35로 불리는 핵산과의 복합체가 제조되고, 그 관성 반경과 생리활성과의 관련이 개시되어 있다. 그것에 의하면, 관성 반경의 제어 범위는, 5nm 내지 8nm, 8nm 내지 10nm, 20nm 내지 70nm, 60nm 내지 100nm, 100nm 내지 150nm, 150 내지 200nm이며, 관성 반경 20nm 이상에서의 제어 폭은 50nm 이상으로 되어 있다. 이것은, 입자 지름으로 변환하면, 그 제어 폭은 대체로 100nm 이상인 것을 의미하고, 엄밀한 제어가 이루어지고 있다고는 할 수 없다. 또, 이들 복합체의 약리 효과의 강도는 3단계의 반정성적인 평가에 그치고 있는 동시에, 관성 반경 8nm 내지 150nm의 범위에서 약리 효과의 차이가 인정되고 있지 않다.
한편, 상기의 선행기술(Miyamoto N., et al., Bioconjugate Chemistry 2017, 28, 565-573)에서는, SPG와 CpG-dA40을 구성 성분으로 하는 베타글루칸과 핵산과의 복합체(CpG-SPG라고 한다.)에 있어서, 그 입자 지름을 증대시키는 시도가 이루어지고 있다. 여기에서는, CpG와 상보적인 서열을 갖는 핵산(cCpG-dA40)을 준비하고, 그 SPG와의 복합체(cCpG-SPG)가 제조되었다. 다음으로 CpG-SPG와 cCpG-SPG를 혼합함으로써, 양복합체의 CpG와 cCpG가 비공유 결합으로 결합함으로써 각각의 복합체끼리가 가교되어, 입자 지름이 큰 구조체(CL-CpG 나노겔이라고 한다.)가 생성되었다. CpG-SPG와 cCpG-SPG의 관성 반경이 대체로 10nm인 것에 대해, CL-CpG 나노겔의 관성 반경은 대체로 150nm였다. CL-CpG 나노겔의 관성 반경은, 평균 입자 지름으로는 대체로 300nm에 대응하고, CpG-SPG와 비교하여 강력한 애쥬번트 효과를 갖고 있는 것이 확인되었다.
이상과 같이, 본 선행기술의 CL-CpG 나노겔에서는, CpG-SPG와의 비교로서 입자 지름을 증대시키는 것에 성공하고는 있지만, 입자 지름을 엄밀하게 제어할 수 있었다고는 할 수 없다. 즉, 300nm 전후의 평균 입자 지름 제어가 엄밀하게는 되고 있지 않아, 베타글루칸과 핵산과의 복합체의 평균 입자 지름을 최적화하고 있다고는 할 수 없다.
이상과 같이, 선행기술에서는, 평균 입자 지름이 대체로 300nm까지 증대시키는 것에 성공하고 있는 예가 있기는 하지만, 엄밀한 제어, 즉 대체로 10nm 내지 50nm 또는 그것보다 작은 간격으로 해당 복합체의 평균 입자 지름을 제어하지 못하고 있다. 발명자들은, 이와 같은 엄밀성이 부족한 입자 지름 제어 때문에, 베타글루칸과 핵산과의 복합체가 본래 갖는 현저한 약리 효과를 발휘하고 있지 못하고 있을 가능성이 있다고 생각했다. 즉, 입자 지름의 엄밀한 제어에 의해, 최대의 약리 효과를 발휘하는 평균 입자 지름을 특정하는 동시에, 해당 평균 입자 지름을 갖는 베타글루칸과 핵산과의 복합체의 제조를 가능하게 하는 기술의 개발이 중요하다고 생각했다.
균주나 품종에 따라, 산생·함유되는 베타글루칸의 분자량은 다를 수 있다. 따라서, 최적의 균주의 종류나 배양·생육 조건에 의해 큰 분자량의 베타글루칸을 제조하는 것이 가능하다. 또, 천연 다당류인 베타글루칸은 분자량 분포 폭이 넓기 때문에, 가령 평균 분자량이 작은 경우라도, 큰 분자량 성분이 포함되어 있다. 이것을 분획·정제함으로써, 분자량이 큰 베타글루칸을 얻는 것이 가능하다. 더 나아가서는, 소정의 분자량을 갖는 다당류를 화학적 또는 물리적으로 가교함으로써, 분자량을 증대시킬 수 있는 것도 알려져 있다(Basu A., et al., Bioconjugate Chemistry 2015, 26, 1396-1412; Pawar H. A., et al., Biology and Medicine(Aligarh) 2015, 6, 224).
이러한 수법에 의해, 다당류의 분자량은 무한대, 즉 겔로서 불용화될 때까지 크게 하는 것이 가능하다. 즉, 이러한 수법을 적절히 적용함으로써, 베타글루칸의 분자량을 무한대까지 크게 할 수 있다. 또한, 본 발명에서 개시하고 있는 분자량 제어 조건 등에 의해, 일단 고분자량의 베타글루칸을 취득·제조한 후에, 저분자량화하는 것도 가능하다. 이미 기술한 바와 같이, 선행기술(국제공개 WO2016/098832 및 Miyamoto N., et al., Bioconjugate Chemistry 2017, 28, 565-573)에서는, 관성 반경이 150nm인 베타글루칸과 핵산과의 복합체의 유용성이 나타나 있다. 상기 중 어느 방법으로 고분자량의 베타글루칸을 준비함으로써, 평균 입자 지름으로서 300nm 정도의 베타글루칸과 핵산과의 복합체가 의약상 유용한 것이 나타나 있다. 단, 본 선행기술에 있어서는 입자 지름이 엄밀하게는 제어되고 있지 않아, 즉 대체로 10nm 내지 50nm 또는 그것보다 좁은 간격으로 평균 입자 지름을 제어하지 못하고 있기 때문에, 300nm라는 평균 입자 지름이 최적이라고는 할 수 없다.
이와 같이 하여 얻은 SPG와 핵산(바람직하게는 암 면역요법제로서의 유용성이 확인되어 있는 K3-dA40)으로 구성되고, 또한 입자 지름이 엄밀하게 제어된 BG-CpG를 제조할 수 있다. 놀랍게도, 암 면역요법을 상정한 약리 평가계에 있어서, 평균 입자 지름이 80nm 내지 130nm, 또는 130nm 내지 180nm의 범위에 있는 BG-CpG의 약리 효과가 현저하게 높은 것을 본 발명자들은 찾아냈다. 이미 기술한 바와 같이, 종래의 연구에 있어서 실적이 풍부한 BG-CpG의 평균 입자 지름은 30nm 부근, 또는 20nm 내지 50nm이며, 본 발명자들이 찾아낸 평균 입자 지름은 그 범위 외이다.
본 명세서의 실시예에 있어서, 상기의 입자 지름이 엄밀하게 제어된 BG-CpG에 대해, 임상에서의 사용의 적부를 충분히 고려한 최신의 시험관내 및 생체내의 약리 평가계를 이용하여, 암 면역요법제로서의 효과를 평가했다. 그 결과 본 발명자들은, BG-CpG의 입자 지름과 약리 활성은 강한 관련성이 있고, 평균 입자 지름이 80nm 내지 130nm, 또는 130nm 내지 180nm의 범위에 있는 BG-CpG가 현저하게 높은 약리 작용을 갖는 것을 찾아냈다.
하기에 나타내는 실시예에서 나타내는 바와 같이, hPBMCs를 이용하여 BG-CpG의 IFN-α 유도능을 평가하는 시험관내 평가계와, 마우스 비장 세포를 이용해 BG-CpG의 IFN-γ 유도능을 평가하는 시험관내 평가계를 이용하여, 약리 활성(항암 활성)에 가장 적합한 BG-CpG의 입자 지름을 결정했다. 이러한 시험관내 평가계는, 실험 간의 편차가 많은 마우스 암 이식 모델에 비해, 데이터의 안정성이나 정량성이 높은 것으로 생각된다. 또, BG-CpG의 IFN-α 유도 레벨은 중용량으로 최대 효과(Emax)(소위 벨 쉐이프(bell shape))를 나타냈다. 정량성을 높이기 위해, 하기의 실시예에 있어서 BG-CpG의 IFN-α 유도능을, 곡선 아래 면적(area under curve. 이하, AUC라고 칭한다.)에 의해 산출했다. 마찬가지로 IFN-γ에 있어서도, BG-CpG의 첨가량을 2㎍/mL 및 10㎍/mL의 2 수준으로 하고, 각각 24시간 배양 후의 IFN-γ 산생량을 측정하여, 이들을 합계한 값을 약리 작용의 강도의 지표로 했다. 그 결과, 20nm 내지 130nm, 또는 40nm 내지 180nm의 범위에서, 평균 입자 지름이 커질수록 BG-CpG는 강한 약리 작용을 나타냈다. 최대의 약리 작용을 갖는 BG-CpG의 평균 입자 지름은, 본 발명의 입자 지름의 엄밀한 제어에 의해 비로소 찾아내기에 이르렀다.
또한 하기의 실시예에 있어서, 시험관내 평가에 의해 좁혀진 BG-CpG의 항암 활성을, 마우스에 B16 흑색종암을 이식한 모델(Kitahata, Y., et al. Circulating nano-particulate TLR9 agonist scouts out tumor microenvironment to release immunogenic dead tumor cells. Oncotarget 7, 48860-48869(2016))을 이용하여 평가했다. 그 결과, 생체내에서 BG-CpG의 항암 활성이 인정되었다. 이상에서 기술한 바와 같이, 입자 지름이 엄밀하게 제어된 본 발명의 BG-CpG는, 높은 항암 활성을 나타내는 것이 발견되었다.
2. 입자 지름이 제어된 β(1→3) 글루칸과 핵산과의 복합체를 포함하는 의약 조성물
본 발명의 BG-CpG를 그 작용기전에 의거하여, 각종 질환의 치료약 또는 예방 약·백신으로서 이용할 수 있다. 본 발명은, 상기 본 발명의 복합체를 포함하는 의약 조성물을 제공하는 것이다. 특정의 질환에 대한 예방적 또는 치료적인 적응을 정하고, 그 유효성 및 안전성을 탐색 연구, 비임상시험, 임상시험에 의해 예측 또는 검증한 다음, 실용화된다. 이 의약품 개발 프로세스 중 어느 단계에서, 본 발명의 BG-CpG의 입자 지름은 최적화되거나, 또는 허용 범위가 정해진다. 일반적으로는 탐색 연구 단계에 있어서, 그 시험관내 또는 생체내에서의 활성을 지표로 하여 입자 지름은 최적화되거나, 또는 허용 범위가 정해진다. 또, 비임상시험에서의 안전성 시험에 있어서, 최적화된 입자 지름 또는 허용 범위로서 설정된 입자 지름 범위의 타당성이 안전성면에서 검증된다.
본 발명의 의약 조성물은, 상기 본 발명의 복합체를 상투(常套) 수단에 따라 제제화함으로써 얻을 수 있다. 본 발명의 의약 조성물은, 본 발명의 복합체와 약리학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함한다. 또, 본 의약 조성물은 항원을 추가로 포함하고 있어도 된다. 이와 같은 의약 조성물은, 경구 또는 비경구 투여에 적합한 제형으로서 제공된다.
비경구 투여를 위한 조성물로는, 예를 들면, 주사제, 좌약제(坐劑) 등이 이용되며, 주사제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등의 제형을 포함해도 된다. 이와 같은 주사제는, 공지의 방법에 따라 조제할 수 있다. 주사제의 조제 방법으로는, 예를 들면, 상기 본 발명의 복합체를 통상 주사제에 이용되는 무균의 수성 용매에 용해 또는 현탁함으로써 조제할 수 있다. 주사용 수성 용매로는, 예를 들면, 증류수; 생리적 식염수; 인산 완충액, 탄산 완충액, 트리스 완충액, 초산(酢酸) 완충액 등의 완충액 등을 사용할 수 있다. 이와 같은 수성 용매의 pH는 5∼10을 들 수 있고, 바람직하게는 6∼8이다. 조제된 주사액은, 적당한 앰플에 충전되는 것이 바람직하다.
또, 본 발명의 복합체의 현탁액을, 진공 건조, 동결 건조 등의 처리를 가함으로써, 본 발명의 복합체의 분말 제제를 조제할 수도 있다. 본 발명의 복합체를 분말 상태로 보존하고, 사용 시에 해당 분말을 주사용 수성 용매로 분산함으로써, 사용에 제공할 수 있다.
의약 조성물 중의 본 발명의 복합체의 함유량은, 통상, 의약 조성물 전체의 약 0.1∼100 중량％, 바람직하게는 약 1∼99 중량％, 더욱 바람직게는 약 10∼90 중량％ 정도이다.
본 발명의 의약 조성물은, 유효 성분으로서, 본 발명의 복합체를 단독으로 함유하고 있어도 되고, 본 발명의 복합체를 다른 유효 성분과 조합하여 함유하고 있어도 된다.
３. 의약 용도
본 발명의 복합체는 뛰어난 면역 부활 활성을 가지므로, 본 발명의 복합체 및 의약 조성물은, 면역 부활제로서 이용할 수 있다. 본 발명의 복합체 또는 의약 조성물을 포유동물(인간 등의 영장류, 마우스 등 설치류 등)에게 투여함으로써, 해당 포유동물에 있어서의 면역 반응을 야기할 수 있다. 특히, 본 발명의 복합체는, D형 CpG ODN의 활성 특성을 갖고, 말초혈 단핵구를 자극하여, Ⅰ형 인터페론(Pan-IFN-α, IFN-α2 등) 및 Ⅱ형 인터페론(IFN-γ)의 양쪽을 대량으로 산생시키므로, Ⅰ형 인터페론 산생 유도제, Ⅱ형 인터페론 산생 유도제, Ⅰ형 및 Ⅱ형 인터페론 산생 유도제로서 유용하다. Ⅰ형 및 Ⅱ형 인터페론의 양쪽의 산생을 유도하는 점에서, 본 발명의 복합체 및 이것을 함유하는 의약 조성물은, Ⅰ형 및 Ⅱ형 인터페론 중 어느 한쪽 또는 양쪽이 유효한 질환의 예방 또는 치료에 유용하다. Ⅰ형 인터페론이 유효한 질환으로는, 바이러스 감염증(예를 들면, C형 간염 바이러스(HCV), 헤르페스 바이러스, 파필로마(papilloma) 바이러스, RS 바이러스, 인플루엔자 바이러스 등), 암 등을 들 수 있다. Ⅱ형 인터페론이 유효한 질환으로는, 알레르기 질환, 세포내 기생성 원충(리슈마니아(Leishmania) 등)이나 세균(리스테리아(Listeria), 결핵균 등) 등의 감염증 등을 들 수 있다. RS 바이러스나 인플루엔자 바이러스를 포함하는 급성 바이러스 감염증에 대해서는, Ⅰ형 인터페론 및 Ⅱ형 인터페론 모두, 바이러스 배제에 관한 면역 응답을 높이므로, 본 발명의 복합체 및 이것을 함유하는 의약 조성물은 급성 바이러스 감염증에 대한 유효성을 기대할 수 있다.
본 발명의 복합체 및 이것을 함유하는 의약 조성물에 의해 치료될 수 있는 종양은 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는, 췌장암, 간암, 위암, 대장암, 신장암, 유방암, 자궁암(예를 들면, 자궁경부암), 난소암, 폐암, 갑상선암, 피부암(예를 들면, 흑육종), 두경부암, 육종, 전립선암, 방광암, 뇌종양, 소화관 간질종양(GIST), 백혈병(예를 들면, 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML) 또는 만성 림프성 백혈병(CLL) 또는 급성 림프성 백혈병(ALL)), 림프종 또는 악성 림프종(예를 들면, T 림프종(성인 T세포 백혈병을 포함한다.), B세포 림프종, 비호지킨 림프종 또는 미만성 대세포형 B세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)), 보다 바람직하게는, 본 발명의 복합체 및 이것을 함유하는 의약 조성물에 의해 강력하게 유도되는 사이토카인인 IFN-α 및 IFN-γ에 감수성이 높은 암(비특허문헌 26 및 Martin-Hijaro, L. and Sainz Jr., B. 2020: The interactions between cancer stem cells and the innate interferon signaling pathway. Frontiers in immunology 11, Article 526.)인 것으로 여겨지는, 흑색종, T 림프종, 대장암, 췌장암, 만성 골수성 백혈병, 간암, 자궁경부암, 난소암, 방광암, 성인 T세포 백혈병, 더욱 바람직하게는, 흑색종, T 림프종(성인 T세포 백혈병 포함), 대장암, 췌장암을 들 수 있다.
또, 본 발명의 복합체는, 강력한 백신 애쥬번트 활성을 갖고, 본 발명의 복합체를 항원과 함께 포유동물에게 투여하면, 해당 항원에 대한 면역 반응을 강력하게 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명은, (a) 본 발명의 복합체 및 (b) 항원을 포함하는, 당해 항원에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물도 제공하는 것이다. 본 발명의 복합체는, 항원에 대한 액성 면역 반응(항원 특이적 항체 산생)과 세포성 면역 반응(항원 특이적 CTL 유도)의 양쪽을 강력하게 유도한다. 따라서, 본 발명의 복합체 및 이것을 함유하는 의약 조성물은, 백신 애쥬번트로서 유용하다.
본 명세서에 있어서, 애쥬번트란 면역 응답을 촉진하는 보조제를 말하며, 항원과 함께 생체에 투여되었을 때, 그 항원에 대한 면역 응답을 비특이적으로 증강시키는 물질을 의미한다.
항원으로는, 투여 대상인 포유동물(사람 등의 영장류, 마우스 등의 설치류 등)에게 있어서 항원성을 갖고 있고, 항체 또는 세포 상해성 T 림프구(CTL, CD8＋ T세포)를 항원으로서 인식할 수 있는 한, 특별히 한정되는 것은 아니며, 항원이 되는 모든 물질(단백질, 펩티드, 핵산, 지질, 당질, 그리고 상기 물질의 수식체(예를 들면, 1개 또는 복수의 아미노산의 결실(缺失), 치환 및/또는 부가 등(이하, 변이 등)을 도입한 수식체 등)을 이용할 수 있다. 항원으로는, 원충, 진균, 세균, 바이러스 등의 병원체 유래의 항원, 암, 또는 특정의 질환에 관계된 항원도 이용될 수 있다.
본 명세서에 있어서, 「항원 A가, 병원체 X에서 유래한다」란, 항원 A가, 당해 병원체 X에 구성 인자로서 포함되는 것을 의미한다. 예를 들면, 항원 A가 폴리펩티드인 경우, 그 폴리펩티드의 아미노산 서열이, 병원체 X의 게놈으로 코드된 단백질의 아미노산 서열 중에 존재하는 것을 의미한다.
병원체 유래의 항원으로는, 병원체 그 자체 또는 그 일부, 불활화(不活化) 또는 약독화(弱毒化)한 병원체 그 자체 또는 그 일부, 또는 그들의 변이 등을 도입한 수식체 등을 들 수 있다.
항원으로서 병원체 유래의 항원을 이용하면, 당해 항원에 대한 면역 반응이 야기되어, 해당 항원을 포함하는 병원체를 면역학적으로 생체외로 배제하는 구조가 구축된다. 따라서, (a) 본 발명의 복합체, 및 (b) 병원체 유래의 항원을 포함하는, 당해 항원에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물은, 당해 병원체의 예방 또는 치료를 위해서 유용하다.
본 발명의 복합체는, 항원에 대한 액성 면역 반응(항원 특이적 항체 산생)과 함께, 세포성 면역 반응(항원 특이적 CTL 유도)의 양쪽을 강력하게 유도한다. 따라서, 세포 상해성 T 림프구에 의해 인식되는 것이 알려져 있는 세포내 감염성의 병원체(바이러스, 원충, 진균, 세균 등) 유래의 항원이나, 암화된 세포에 관련된 항원(예를 들면, 종양 항원) 등이 항원으로서 적합하게 이용된다.
세포내 감염성 바이러스로는, 특별히 한정되지 않지만, RS 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, C형 간염 바이러스(HCV), A형 간염 바이러스(HAV), B형 간염 바이러스(HBV), 에볼라 바이러스, 사이토메갈로 바이러스(cytomegalovirus), 아데노 바이러스, 폴리오 바이러스, 일본뇌염 바이러스, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스(mumpsvirus), 풍진 바이러스, 광견병 바이러스, 황열 바이러스, 수두 대상포진 바이러스, 한타 바이러스, 뎅기열 바이러스, 노로 바이러스, 로타 바이러스, 파르보 바이러스, 코로나 바이러스, 디스템퍼 바이러스, 성인 T세포 백혈병 바이러스(HTLV-1), 인간 면역부전 바이러스(HIV), 헤르페스 바이러스, 파필로마 바이러스 등을 들 수 있다. 세포내 감염성 박테리아로는, 마이코플라스마 등을 들 수 있다. 세포내 감염성 원충으로는, 말라리아 원충, 주혈 흡충 등을 들 수 있다. 세포내 감염성 병원체는, 바람직하게는 바이러스(구체적으로는, RS 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스 등)이다.
암화된 세포에 관련된 항원으로는, 암화된 세포에 있어서 특이적으로 발현하는 단백질, 당쇄, 펩티드, 그리고 상기 물질의 변이체(결실, 치환 및/또는 부가) 또는 그 수식체 등을 들 수 있다.
본 발명의 복합체는, Ⅰ형 및 Ⅱ형 인터페론의 양쪽을 강력하게 유도하므로, 일양태에 있어서, 바이러스로서, Ⅰ형 인터페론 및 Ⅱ형 인터페론의 양쪽이 유효한 급성 바이러스 감염증을 일으키는 바이러스(예, RS 바이러스, 인플루엔자 바이러스)가 선택된다.
예를 들면, (a) 본 발명의 복합체 및 (b) 병원체나 암 유래의 항원을 포함하는, 당해 항원에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물을, 당해 병원체 감염증이나 암 환자, 당해 병원체 감염증이나 암으로 이환할 가능성이 있는 사람에게 투여함으로써, 해당 투여를 받은 대상 중의 세포 상해성 T 림프구(CTL)를 항원 특이적으로 활성화시켜, 해당 항원 특이적인 항체 산생을 유도하고, 즉, 온혈동물(바람직하게는, 사람)의 방어 면역 반응을 유도함으로써, 해당 감염증이나 암을 예방·치료할 수 있다. 즉, 해당 조성물은, 상기 감염증, 암 등의 질환의 예방 또는 치료를 위한 백신으로서 유용하다.
또, 본 발명의 복합체는, 항원에 대한 액성 면역 반응(항원 특이적 항체 산생)과 세포성 면역 반응(항원 특이적 CTL 유도)의 양쪽을 강력하게 유도할 수 있으므로, 항원으로서, 병원체나 암 세포의 표면 항원과 내부 항원 중 어느 것을 이용하는 것도 가능하고, 표면 항원과 내부 항원을 혼합하여 이용하는 것도, 또한 바람직하다.
(a) 본 발명의 복합체 및 (b) 항원을 포함하는, 당해 항원에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물은, 상기 본 발명의 의약 조성물에 준하여 조제할 수 있다.
본 발명의 복합체 또는 본 발명의 의약 조성물은, 다른 의약과 동시에 또는 개별적으로 투여할 수 있다. 예를 들면, 다른 의약을 투여한 후에 본 발명의 복합체 또는 본 발명의 의약 조성물을 투여하거나, 이러한 복합체 또는 의약 조성물을 투여한 후에 다른 의약을 투여하거나, 또는 당해 복합체 또는 의약 조성물과 다른 의약을 동시에 투여해도 된다. 다른 의약으로는, 화학 요법제, 방사선 요법 등 각종 항암제 등을 들 수 있고, 본 발명의 복합체 또는 의약 조성물에 더하여 추가적인 약제를 포함하는 의약 조성물도 본 발명에 포함된다.
TLR-9 작동약은 면역 체크포인트 저해제와의 병용에 의한 현저한 항종양 효과를 발휘한다(Adamus, T. and Kortylewski, M., The revival of CpG pligonucleotide-based cancer immunotherapies, Contenp. Oncol.(Pozn.) 21(1A), 56-60(2017).). 면역 체크포인트 저해제로는, PD1 저해약, PD-L1 저해약 및 CTLA-4 저해약이 있고, 각각, 예를 들면, 항PD-1 항체, 항PD-L1 항체 및 항CTLA-4 항체가 알려져 있다(Bagchi, S., Yuan, R., and Engleman, E.G., Immune checkpoint inhibitors for the treatment of cancer: clinical impact and mechanism of response and resistance, Ann. Rev. Pathol. 16, 223-249(2021).). IMO-2125로 불리는 TLR-9 작동약과 항PD-1 항체와의 병용 효과는, 췌장암의 동물 모델에 의해 검증되고 있다(Carbone C., et al., Intratumoral injection of TLR-9 agonist promotes an immunopermissive microenvironment transition and causes cooperative antitumor activity in combination with anti-PD1 in pancreatic cancer, J. Immunother. Cancer 9 2021). 따라서, TLR-9 작동약인 본 발명의 복합체 또는 본 발명의 의약 조성물과 면역 체크포인트 저해제와의 병용은 유용한 치료법이 될 수 있다.
４. 특정 범위의 평균 입자 지름을 갖는, β(1→3) 글루칸과 핵산과의 복합체의 제조 방법
본 발명은, 특정 범위의 평균 입자 지름을 갖는, β(1→3) 글루칸과 핵산과의 복합체의 제조 방법도 제공한다. 본 발명에서는, 공급원이 분명한 원재료를 사용하고, 실현 가능한 제법에 의해 입자 지름이 엄밀하게 제어된 BG-CpG를 제조하는 것에 성공했다.
이미 기술한 바와 같이, SPG는, 치마버섯(Schizophyllum commune)의 균주가 산생하는 β(1→3) 글루칸이며, 그 균주는 복수 알려져 있다. 본 발명자들은, 상이한 치마버섯 균주의 SPG의 생산량을 예의 검토한 결과, 특정의 균주에 있어서 특히 생산성이 높은 것을 찾아냈다. 따라서 SPG의 생산성이 높은 치마버섯 균주를 이용하여 SPG를 얻는 것은, 본 발명의 적합한 양태이다. 마찬가지로, 렌티난(LNT)은, 표고버섯 자실체(字實體)에 포함되는 β(1→3) 글루칸이며, 표고버섯 자실체로부터 LNT를 추출하는 것은, 본 발명의 적합한 양태이다.
(1) 치마버섯 균주를 이용한 베타글루칸의 제조 방법
치마버섯 균주 등을 이용하여 베타글루칸을 제조하려면, 당업자에게 주지인 방법(기쿠모토 쇼이치 등. 치마버섯이 생산하는 다당에 관한 연구. 농화(濃化) 44, 337-342(1970); 미즈노 다카시·가와이 마사미츠 편(編). 버섯의 화학·생화학. 학회출판센터(1992))에 따라, 치마버섯 균주를 해당 균주가 생육 가능한 배지 중에서 배양하고, 균체 밖의 배지 중에서 SPG를 생산시키면 된다. 그 배지로는, 치마버섯에 속하는 균주를 통상 이용할 수 있는 영양원(榮養源)(탄소원, 질소원, 무기 염류)을 함유하고, 추가로 필요에 따라 유기 영양원을 포함하는 통상의 배지를 이용할 수 있지만, 탄소원으로서 당류를 함유하는 배양액이 바람직하다. 이러한 배지로는, 각종의 합성 배지, 반합성 배지, 천연 배지 등 모두 이용 가능하다.
상기 탄소원으로는, 당류가 바람직하고, 해당 당류로는, 글루코오스, 프룩토오스, 만노오스, 갈락토오스, 자일로오스, 아라비노오스 등의 단당류, 수크로오스, 말토오스, 락토오스, 트레할로오스 등의 이당류, 프락토올리고당, 자일로올리고당 등의 올리고당류, 덱스트린이나 전분 등의 다당류를 들 수 있고, 이들을 단독 또는 조합하여 이용할 수 있다. 이들 중에서도, 주탄소원으로서, 글루코오스, 프룩토오스 등의 6탄당, 수크로오스, 락토오스 등의 이당류, 전분이나 덱스트린, 또는 이들 탄수화물의 가수분해물 등의 다당류를 이용하는 것이 바람직하다. 또, 비트 착즙, 사탕수수 착즙, 감귤류를 비롯한 과실 착즙, 또는 이들 착즙에 당을 첨가한 것 등을 이용할 수도 있다. 이 밖에, 글리세롤, 에틸렌 글리콜 등의 알코올류, 만니톨, 소르비톨, 에리스리톨 등의 당 알코올류, 유기산 등의 그 외의 탄소원을 적절히 사용할 수 있다. 이들 탄소원은, 배양 도중에 수시로 첨가해도 되고, 예를 들면, 글루코오스 등의 당류를 배지 중으로 적절히 피드하면, 베타글루칸의 생산 속도·생성량을 상대적으로 증대시킬 수 있다.
상기 질소원으로는, 펩톤, 고기 엑기스, 대두분(soy flour), 카제인, 아미노산, 맥아 엑기스, 옥수수 침지액(corn steep liquor), 카제인 분해물, 효모 엑기스, 요소 등의 유기 질소원, 질산(硝酸)나트륨, 황산암모늄, 암모니아 가스, 암모니아수 등의 무기 질소원을 단독 또는 조합하여 이용할 수 있다.
상기 무기 염류로는, 예를 들면, 염화나트륨, 염화칼륨, 탄산칼슘, 황산마그네슘, 인산나트륨, 인산칼륨, 염화코발트 등의 염류, 중금속류염 등을 사용할 수 있고, 필요에 따라 비타민류도 첨가 사용할 수 있다. 또한, 배양 중에 발포가 생기는 경우에는, 공지의 각종 소포제(消泡劑)를 적절히 배지 중에 첨가할 수도 있다.
본 발명의 균주의 배양 조건에는, 특별한 제한은 없고, 해당 균주가 양호하게 생육할 수 있는 범위 내에서 적절히 선택할 수 있다. 통상, pH 5.0 내지 pH 8.5, 20℃ 내지 35℃에서 5일간 내지 14일간 정도 배양하면 되지만, 이러한 배양 조건은, 사용하는 균주의 종류나 특성, 외부 조건 등에 따라 적절히 변경할 수 있고, 최적 조건을 선택할 수 있다. 또, 배지에의 균주의 접종량은, 플라스크 배양의 경우는 1％, 백금이(白金耳, platinum loop), 스케일 업의 경우는 종배양액을 본배양액의 1％(v/v) 내지 10％(v/v) 첨가하는 것이 바람직하지만, 실질적으로 배양 가능하면 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 균주의 배양은, 통기(通氣) 교반, 진탕 등에 의한 호기적 조건하에서 행한다. 배양 시간은, 목적으로 하는 베타글루칸의 생성 농도에 도달할 때까지 행하여지는 것이 바람직하고, 통상 5일간 내지 14일간 행하여진다. 또, 연속적으로 베타글루칸의 기질인 당류나 배지 성분을 연속 첨가하여, 베타글루칸을 연속적으로 생산해도 된다.
상기와 같이 배양한 후, 균체 밖으로 분비 생산된 베타글루칸을 상법(常法)에 따라 배양액으로부터 분리, 채취한다. 구체적으로는, 배양액으로부터 원심분리, 여과 등에 의해 균체 등의 고형물을 분리 제거하거나, 활성탄, 이온교환 수지 등에 의해 불순물이나 염류를 제거하는 등, 여러 가지 알려진 정제 수단을 선택, 조합하여 행할 수 있다. 또한, 예를 들면, 소수성 수지에의 흡착·용출, 에탄올, 메탄올, 초산에틸, n-부탄올 등을 이용한 용매 침강, 실리카 겔 등에 의한 컬럼법 또는 박층 크로마토그래피, 역상 컬럼을 이용한 분취용 고속 액체 크로마토그래피 등을, 단독으로 또는 적절히 조합하여, 경우에 따라 반복 사용함으로써, 분리 정제할 수 있다.
또, 균체 밖으로 분비 생산된 베타글루칸을 상기의 방법으로 분리하기 전후에 있어서, 균체의 살균을 실시해도 된다. 살균 온도는, 균체가 사멸하는 온도이면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 90℃ 이상, 또는 가압하 121℃에서 실시할 수 있다. 살균 시간은, 임의의 시간을 설정할 수 있지만, 바람직하게는 15분 내지 60분이 적합하다.
(2) 표고버섯 자실체를 이용한 베타글루칸의 제조 방법
렌티난은, 표고버섯 자실체에 포함되는 베타글루칸이다. 따라서 표고버섯 자실체로부터 추출, 정제함으로써 렌티난을 얻을 수 있다. 본 발명의 렌티난의 제조에 있어서는, 당업자 주지의 방법(오모리 기요토시·고이데 히로시. 버섯재배전과. 농산어촌문화협회(2001); 최신 바이오테크놀로지 전서 편집위원회 편. 버섯의 증식과 육종. 농업도서(1992)) 또는 신규한 방법에 따라, 원목 재배 또는 균상(菌床) 재배 등의 방법에 의해 표고버섯 자실체를 재배하고, 해당 자실체로부터 렌티난을 추출할 수 있다.
원목 재배는, 주로 상수리나무, 졸참나무(Quercus serrata), 물참나무(Quercus crispula)를 이용해 목재부후균(wood-rotting fungi)의 버섯을 재배하는 방법으로, 벌채해 건조시킨 통나무에 균을 이식하는 방법이다. 식균 작업을 하고 발생 관리를 행하여, 발생한 표고버섯을 수확한다.
균상 재배는, 광엽수 톱밥(sawdust), 칩더스트(chip dust) 또는 칩 등의 목재 분쇄 물질 1종 이상에, 겨, 쌀겨 등의 곡류, 콩류의 분쇄 물질 1종 이상을 혼합하고, 물을 첨가해 함수율을 조정한 배지를 상법에 따라 가압정형 자루 포장, 살균, 냉각하여 균상을 제작하는 것을 들 수 있다. 이것에 표고버섯종균을 접종하고, 일정 기간 배양 관리한 균상을 통상 재배(자루에서 균상을 꺼내어 배지 전체에서 버섯을 발생시키는 재배 방법) 또는 상면 재배(균상의 상부만 노출시켜 배지 상부에서만 버섯을 발생시키는 재배)에 있어서 발생 관리를 행하여, 발생한 표고버섯을 수확한다.
렌티난의 추출·정제를, 당업자에게 주지인 방법(Chihara et al. Fractionation and purification of the polysaccharides with marked antitumor activity, especially lentinan, from Lentinus edodes(Berk.) Sing. Cancer Research 30, 2776-2781(1970); 지하라 고로. 암과 면역 증강. 고단샤(1980))에 의해 행할 수 있다. 또는, 렌티난의 추출·정제를 공지가 아닌 신규한 방법에 의해 행할 수도 있다.
표고버섯 자실체에 함유되는 베타글루칸은, 상법에 따라, 자실체로부터 제조된다. 구체적으로는, 재단한 자실체를 열수 추출하고, 활성탄, 이온교환 수지 등에 의해 불순물이나 염류를 제거하는 등, 여러 가지 알려진 정제 수단을 선택하고, 조합하여 행할 수 있다. 또한, 예를 들면, 에탄올, 메탄올, 초산에틸, n-부탄올 등을 이용한 용매 침강 소수성 수지에의 흡착·용출, 실리카 겔 등에 의한 컬럼법 또는 박층 크로마토그래피, 역상 컬럼을 이용한 분취용 고속 액체 크로마토그래피 등을, 단독으로 또는 적절히 조합하여, 경우에 따라 반복해서 사용함으로써, 분리 정제할 수 있다.
이와 같은 제조 공정의 도중, 또는 최종 공정에 있어서, 필요에 따라 유기 용매, 수계 매체에 의한 세정을 행하고, 당업자 주지의 방법으로, 동결 건조, 감압 건조 등을 행하여 목적물을 얻는다.
(3) 베타글루칸의 분자량 제어 방법
베타글루칸의 분자량 제어를 행하는 방법으로서, 효소 분해, 알칼리 가수분해, 산 가수분해, 고압 호모지나이저에 의한 전단력, 초음파 에너지에 의한 분해를 들 수 있지만, 그것으로 한정되는 것은 아니다. 이들 중에서 적절한 방법을 선택하여 적절히 이용할 수 있다(미야자키 도시오 편. 다당류의 구조와 생리활성. 아사쿠라 서점(1990)).
(4) 베타글루칸의 구조 결정의 방법
얻어진 베타글루칸의 구조에 대해서는, 통상의 유기 화합물과 마찬가지로, 1H-NMR, 13C-NMR, 적외 흡수 스펙트럼, 원소 분석 등의 수법에서 선택 또는 조합함으로써 결정할 수 있다.
베타글루칸의 핵자기 공명 스펙트럼(이하, NMR이라고 칭한다)의 측정에 범용되는 측정 용매인 디메틸술폭시드-d6(DMSO-d6)를 이용한 경우, 1H-NMR에 있어서는, 수산기의 시그널도 관측되어, 매우 브로드한 스펙트럼을 부여한다. 한편, 0.25M 중수소화 수산화나트륨/중수(重水)는, DMSO-d6보다도, 베타글루칸이 비교적 용이하게 용해된다. 또, 1H NMR에 있어서는, 수산기의 시그널은 관측되지 않으므로, 글루칸 구성 유닛의 특징을 명확히 알 수 있다. 측정 용매에 0.25M 중수소화 수산화나트륨/중수를 이용한 경우, 베타글루칸은 실온에서 분해되어 가는 경향이 있는 점에서, NMR 스펙트럼 측정 온도 조건, 필요 샘플량을 최적화함으로써, 분석에 적합한 스펙트럼을 얻을 수 있다.
분자량 및 분자 사이즈에 대해서는, 다각도 광산란법, 사이즈 배제 크로마토그래피(SEC), 동적 광산란법 등 당업자 주지의 방법에 의해, 절대적인 수치로서, 분자량 기지(旣知)의 표준 물질에 상당하는 상대적인 수치로서, 또는 일정한 상관성을 갖는 척도로서 특정할 수 있다. β(1→3) 글루칸(BG)은 쇄상(鎖狀)의 분자이며, 중성 수용액 중에서 3가닥의 사슬이 얽힌 상태로 존재하지만, 알칼리 용액 중에서는 단일가닥 사슬로 해리된 상태로 존재한다(국제공개 WO2015/041318, 면역 부활 활성을 갖는 올리고뉴클레오티드 함유 복합체 및 그 용도; 일본국 특허 제5605793호, β-1,3-글루칸/핵산 복합체의 조제 방법(특원2010-043592); 다노하타 다이지로, 사나다 유스케, 모치즈키 신이치, 미야모토 노리코, 사쿠라이 가즈오. 핵산/β-1,3-글루칸 집합체의 용액 물성. 고분자 논문집 72:37-47(2015)). BG와 마찬가지로 쇄상의 구조를 갖는 풀루란을 분자량 표품(標品)으로서 이용하고, 알칼리 조건하에서의 사이즈 배제 크로마토그래피법(SEC법)에 의해, 상대적인 분자량의 추정이 가능하다. 또한, 크로마토그래피 검출기로서 다각도 광산란 검출기(MALLS)를 병용함으로써, 정적(靜的) 광산란법에 의한 절대 분자량 및 분자 사이즈를 추정하는 것이 가능하다(Wyatt, P. J. Anal Chim Acta 1993, 272, 1; Podzimek, S. J Appl Polym Sci 1994, 54, 91).
(5) 핵산의 제조 방법
핵산에 대해서는, 당업자 주지의 합성 기술 및 핵산 화학에 의거하여 K3-dA40 등을 제조할 수 있다. 그와 같은 제조 방법은 예를 들면, (1) Gait, M.J.(1985). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, (2) Gait, M.J.(1990). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, (3) Eckstein, F.(1991). Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press, (4) Adams, R.L. et al.(1992). The Biochemistry of the Nucleic Acids, Chapman&Hall, (5) Shabarova, Z. et al.(1994). Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids, Weinheim; Blackburn, G.M. et al.(1996). Nucleic Acids in Chemistry and Biology, Oxford University Press, (6) Hermanson, G.T.(I996). Bioconjugate Techniques, Academic Press에 기재되어 있고, 이들 문헌의 본 명세서와의 관련 부분은 참고로서 원용된다. 또한 Stein et al. 1988, Nucl. Acids Res. 16:3209에 기재된 방법에 의해 포스포로티오에이트·올리고뉴클레오티드를 합성하는 것도 가능하다. 그리고 또한, Sarin et al. 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7448-7451에 기재된 방법에 의해, 조절 구멍 유리 폴리머 지지체 등을 사용하여, 메틸포스포네이트·올리고뉴클레오티드를 조제하는 것도 가능하다.
(6) BG-CpG의 제조 방법
상기에서 기술한 바와 같이 하여 얻은 베타글루칸 및 핵산을 원료로 하여, 당업자에게 주지인 방법에 따라 BG-CpG를 제조할 수 있다((1) 국제공개 WO2016/103531 및 PCT/JP2014/084772, 면역 부활 활성을 갖는 핵산 다당 복합체의 항종양약으로서의 응용, (2) 국제공개 WO2015/041318, 면역 부활 활성을 갖는 올리고뉴클레오티드 함유 복합체 및 그 용도, (3) 일본국 특허 제5605793호, β-1,3-글루칸/핵산 복합체의 조제 방법(특원2010-043592)).
즉, 베타글루칸의 주쇄를 구성하는 당 단위수(이하, mG라고 한다.)와 핵산의 염기수(베타글루칸과 상호작용하는 핵산으로서 데옥시아데노신을 사용할 때, 이하, dA라고 한다.)와의 화학양론비가 2:1, 즉 mG/dA 비가 2인 것을 고려하여, 적절히, 목적에 따라 한쪽의 구성 성분의 혼합 비율을 증감한다. 통상 베타글루칸은 나선 구조나 응집체를 형성하고 있으므로, 복합화 전에 알칼리 처리 또는 N,N-디메틸술폭시드를 포함하는 수계 매체에 용해하여 단량체로 한 다음에 복합체 형성에 제공한다. 또는 이들 매체 중에 양 구성 성분을 공존시킨 다음, 계(系)를 중화 또는 유기 용매를 희석 또는 제거함으로써 복합체를 형성한다. BG-CpG의 특성 해석은, 그 구조적 특징 및 의약품이 구비해야 하는 일반적인 품질 특성을 확인 또는 보증하기 위해 실시한다.
BG와 CpG 올리고뉴클레오티드 복합체(BG-CpG)는, 중성 수용액 중에서 안정하게 존재하고, 용해성도 양호한 점에서, 동적 광산란법(DLS법)에 의한 입자 지름 측정이 가능하다. 용액이나 현탁액 중에서 브라운 운동을 하고 있는 입자에 레이저광을 조사하면, 입자로부터의 산란광에는 확산 계수에 따른 요동이 발생한다. 큰 입자는 움직임이 느리므로 산란광 강도의 요동은 완만하고, 한편, 작은 입자는 움직임이 빠르므로 산란광의 요동은 급격하게 변화한다. DLS법에서는 이 확산 계수를 반영한 산란광의 요동을 검출하고, 스톡스-아인슈타인식을 이용하여 입자 지름을 측정한다. 본 법으로 구해지는 평균 입자 지름 및 입자 지름 분포는 콜로이드 분산계의 제제를 중심으로 그 특성을 나타내는 중요한 인자 중 하나이다(제17개정 일본약국방 참고정보 「동적 광산란법에 의한 액체 중의 입자 지름 측정법」 P2346-2348). DLS법에는, 검출한 신호의 해석 방법의 차이에 따라, 광자 상관법과 주파수 해석법이 있고, 입자 지름이 수 nm에서 약 1㎛까지, 또는 침강의 영향이 인정되기까지의 입자에 적용된다. 본 명세서의 실시예에서는, 광자 상관법을 이용해, 산란광 강도의 자기 상관 함수로부터 큠란트(Cumulant) 해석에 의해, 산란광 강도 기준에 의한 평균 입자 지름을 구했다(제17개정 일본약국방 참고정보 「동적 광산란법에 의한 액체 중의 입자 지름 측정법」 P2346-2348; ISO 22412: 2008 Particle size analysis - Dynamic light scattering(DLS)). 여기에서, 피험 물질의 입자 지름 분포가 단봉성(unimodal)인 경우에는, 그 피크 톱의 입자 지름이 평균 입자 지름이며, 본 발명에서는 해당 평균 입자 지름과 BG-CpG의 약리 작용과의 상관성을 조사했다. 한편, 양봉성(bimodal) 또는 다봉성의(multimodal) 입자 지름 분포를 갖는 경우에는, 최대의 광산란 강도를 나타내는 피크를 선택하고, 그 피크 톱의 입자 지름, 즉 당해 피크의 평균 입자 지름과 BG-CpG의 약리 작용과의 상관성을 조사했다.
다음으로, 실시예, 시험예 및 의약 조성물로 하는 예를 들어, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들로 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1 균체 배양에 의한 SPG의 제조
본 발명자들이 수집해 보유하고 있는 일본 국내에서 채취한 시료로부터 분리한 치마버섯 균주 33주로부터, SPG 고생산능을 갖는 치마버섯 균주의 선발을 행하였다. 치마버섯 균주를 감자 덱스트로오스 한천배지(Potato Dextrose Agar)(PDA) 슬랜트에 충분히 생육시키고, 그 PDA 슬랜트로부터 표면에 생육한 균체의 1/4을 멸균수 5mL로 호모지나이즈(homogenize)하고, 미리 멸균한 SPG 배지(글루코오스 3.0％, 효모추출물 0.3％, 인산이수소암모늄 0.15％, 인산이수소칼륨 0.1％, 황산마그네슘 칠수화물 0.05％, (멸균 전 pH 4.8)) 80mL를 포함하는 500mL 용적 삼각 플라스크 1개에 접종했다. 균체를 접종한 500mL 용적 삼각 플라스크를, 회전 진탕기를 이용해, 210rpm, 28℃에서 7일간(168시간) 진탕하여 배양을 행하였다.
배양 종료 후, 얻어진 배양액 45mL 또는 15mL를 원심분리(10000rpm, 10분)하여, 배양액을 배양 상청 및 균체로 분별했다. 얻어진 배양 상청의 30mL 또는 10mL에 메탄올을 첨가하여, 35％ 메탄올 용액이 되도록 조제했다. 메탄올 첨가에 의해 석출된 침전물을 원심분리(10000rpm, 10분)하여, 그 침전물을 회수했다. 회수한 침전물에 무수 메탄올을 10mL 또는 5mL를 첨가해 세정한 다음, 재차 원심분리를 행하였다. 침전물에 멸균수 1mL 내지 3mL를 첨가해 약 1시간 정도 정치한 후, 동결 건조를 행하여, SPG 추출물을 얻었다.
시험예 1 치마버섯의 각 균주의 SPG 생산성의 평가
실시예 1에서 얻어진 SPG 추출물의 양을 칭량했다. 각 균주의 SPG 추출물의 생산성은, 해당 SPG 추출물량과 배양 상청액량으로부터 산출한 배양 상청 중의 SPG 추출물 농도를 지표로 하여 평가했다.
표 1에 나타내는 바와 같이, F-19065, F-30213, F-82046, F-33504, F-15977, F-15537의 균주가, 높은 SPG 생산성을 갖는 것이 확인되었다. 또, F-19065, F-30213, F-82046, F-33504의 균주에 대해서는 매우 높은 SPG 생산성을 갖는 것이 확인되었다.
실시예 2 SPG 고생산주의 균체 배양에 의한 SPG의 제조
SPG의 생산성이 높았던 치마버섯 균주 F-82046 및 F-30213의 2주를 선발하여, SPG의 제조에 이용하는 것으로 했다.
실시예 1과 마찬가지로 하여, PDA 슬랜트의 표면에 생육한 균체의 1/4을, 멸균수 3mL로 호모지나이즈하여, 미리 멸균한 SPG 배지 80mL를 포함하는 500mL 용적 삼각 플라스크 1개에 접종했다. 균체를 접종한 500mL 용적 삼각 플라스크는, 회전 진탕기를 이용해, 210rpm, 28℃에서 4일간 진탕하여, 전배양(前培養)을 행하였다. 전배양액 5mL를 호모지나이즈하여 SPG 배지 80mL를 포함하는 500mL 용적 삼각 플라스크에 접종했다. 전배양액을 접종한 500mL 용적 삼각 플라스크를, 회전 진탕기를 이용해, 210rpm, 28℃에서 10일간 진탕하여, 본배양을 행하였다.
배양 종료 후, 배양액 전량을 원심관에 분주(分注)하고, 원심분리(10,000rpm, 10분)를 행하였다. 얻어진 상청은 점도가 높기 때문에 멸균수를 1.5∼1 배량 첨가한 후, 부유 균체를 제거하기 위해 흡인 여과했다. 여과액(濾液)에 35％가 되도록 메탄올을 첨가하고, 교반 후 하룻밤 정치했다. 석출된 침전물을 원심분리(10,000rpm, 10분)하고, 그 침전물을 메탄올로 세정했다. 다음으로, 침전물에 멸균수를 첨가하여 침윤시킨 후, 동결 건조를 행하였다. 이 동결 건조물을 SPG 추출물로 했다.
SPG 추출물을 1M 수산화나트륨 수용액에 1mg/mL의 농도로 용해하고, 5℃에서 24시간, 천천히 진탕했다. 그 후, 구멍 지름 5㎛, 계속해서 동 1㎛의 옴니포아 멤브레인 필터(머크 밀리포아 제조)로 여과하고, 얻어진 여과액에 2 배량의 메탄올을 첨가해 SPG를 석출시켰다. 석출한 SPG를, 메탄올:물＝3:1의 혼액을 사용하여 수회 세정했다. 이 세정은 용액이 중성이 될 때까지 반복하고, 추가로, 메탄올 및 아세톤으로 1회씩 세정했다. 마지막으로, 40℃에서 건조하고, 정제된 분자량 제어 전의 SPG(massive SPG. 이하, mSPG라고 한다.)를 얻었다.
치마버섯 균주 F-82046을 이용하여 제조한 mSPG를 mSPG-1a, 동 F-30213에서 유래하는 SPG를 mSPG-2a로 했다. 또, 시약으로서 구입한 2 로트의 SPG(제조업자의 로트 번호 SCZ-37-01A는, 본 발명에서는 iSPG-1, 동 SCZ-36-1은, 본 발명에서는 iSPG-2라고 한다.)를 표준 시료로서 이용하고, 이들 mSPG의 1H-NMR 및 13C-NMR 스펙트럼을 취득하여, 비교를 행하였다. 여기에서, 용매는, 0.25M 중수소화 수산화나트륨/중수로 하고, 높은 S/N 비와 화합물의 안정성을 양립하는 최적의 측정 온도가 15℃인 것을 찾아내어, 해당 온도에서 측정을 행하였다. 도 1 및 도 2에 나타내는 바와 같이, mSPG-1a 및 mSPG-2a의 1H-NMR 스펙트럼 및 13C-NMR 스펙트럼은, 어느 쪽도 SPG 표준 시료의 스펙트럼과 일치하는 동시에, 불순물 유래의 현저한 시그널은 관측되지 않았다. 이상으로부터, 본 실시예에서 제조한 2 로트의 mSPG가 높은 순도를 갖고 있는 것이 확인되었다.
실시예 3 대형 플라스크를 이용한 균체 배양에 의한 SPG의 제조
대량의 SPG를 제조하기 위해, Ultra Yield Flask 2.5L(Thomson Instrument Company 제조)를 사용한 배양을 행하였다. 치마버섯 균주로는 F-82046주를 이용했다. 배양은, 전전배양, 전배양, 본배양의 3단계로 했다. 균의 접종에서는, 치마버섯 균주 F-82046의 동결 시드를 1개 사용했다.
치마버섯 균주 F-82046의 동결 시드 제작을 위해, PDA 슬랜트의 표면에 생육한 치마버섯 균체의 1/4을, 멸균수 3mL로 호모지나이즈하여, 미리 멸균한 SPG 배지 80mL를 포함하는 500mL 용적 삼각 플라스크 1개에 접종했다. 균체를 접종한 500mL 용적 삼각 플라스크를, 회전 진탕기를 이용해, 210rpm, 28℃에서 3일간 진탕하여 배양을 행하였다. 배양액 63mL에 7mL의 미리 멸균한 글리세롤을 첨가해 혼합한 후, Cryotube(Thermo Fisher Scientific 제조)에 1.8mL씩 분주하고, -80℃의 프리저로 동결하여 보존했다.
전전배양에서는, 1개의 동결 시드를 실온에서 융해하여, 미리 멸균한 SPG 배지 80mL를 포함하는 500mL 용적 삼각 플라스크 1개에 전량을 접종했다. 균체를 접종한 500mL 용적 삼각 플라스크는, 회전 진탕기를 이용해, 210rpm, 28℃에서 3일간 진탕하여 전전배양을 행하였다. 전배양에서는, 전전배양액 20mL를 호모지나이즈하여, 미리 멸균한 SPG 배지 1000mL를 포함하는 Ultra Yield Flask 2.5L에 전량을 접종했다. 2.5L 플라스크를, 회전 진탕기를 이용해, 130rpm, 28℃에서 3일간 진탕하여 전배양을 행하였다. 본배양에서는, 전배양액 10mL를, 미리 멸균한 SPG 배지 1000mL를 포함하는 Ultra Yield Flask 2.5L에 접종했다. 이 2.5L 플라스크를, 회전 진탕기를 이용해, 130rpm, 28℃에서 11일간 진탕하여 본배양을 행하였다. 복수의 플라스크 간에서 안정한 SPG 생산량이 얻어지고, 배지 중의 SPG 농도는 평균으로 약 2,000㎍/mL가 되었다. 배양 종료 후, 각각의 플라스크의 액량이 1.5L가 되도록 증류수를 첨가하여 오토클레이브 멸균(121℃, 20분)을 행하였다. 멸균 후의 배양액을, 추가로 등량의 증류수로 희석하고, 나일론 자루(구멍 지름 150㎛)로 균체를 제거한 다음, 여과지(No. 2. Advantec사 제조)를 이용하여 흡인 여과했다. 스무스플로우 펌프(Q 시리즈, 가부시키가이샤 다쿠미나)를 이용해, 얻어진 처리 여과액과 메탄올을 혼합하고, 메탄올 농도를 30％ 내지 35％로 한 다음 하룻밤 정치하여 석출물을 얻었다. 이 석출물로 이루어지는 부유 획분(劃分)과 액 중에서 겔 상태인 부유물을 핀셋과 국자, 나일론 자루를 이용하여 회수했다. 회수한 석출물을 원심분리(8,000rpm, 30분)하고, 그 침전물을 메탄올로 세정했다. 다음으로, 침전물에 멸균수를 첨가하여 침윤시킨 후, 동결 건조를 행하여, SPG 추출물을 동결 건조체로서 얻었다(SPG-247: 수량(收量) 10.4g).
이 SPG 추출물(SPG-247)의 일부인 151mg을, 1M 수산화나트륨 수용액에 1mg/mL의 농도로 용해하고, 5℃에서 24시간, 천천히 진탕했다. 그 후, 구멍 지름 5㎛, 계속해서 동 1㎛의 옴니포아 멤브레인 필터로 여과하고, 얻어진 여과액에 2 배량의 메탄올을 첨가해 SPG를 석출시켰다. 석출한 SPG에 메탄올:물＝3:1의 혼액을 사용하여 수회 세정했다. 이 세정을 용액이 중성이 될 때까지 반복하고, 추가로, 메탄올 및 아세톤으로 1회씩 세정했다. 마지막으로 40℃에서 건조하여, mSPG(mSPG-19a: 수량 125mg)를 얻었다.
실시예 4 알칼리 처리에 의한 SPG의 분자량 제어
실시예 2에 기재한 치마버섯 균주 F-82046을 이용해 제조된 SPG 추출물을 원료로 하여, mSPG-1a와 마찬가지로 해서 mSPG-1b를 제조했다. 여기에서 얻어진 mSPG-1b 또는 mSPG-1a를 원료로 하여, 이하와 같이, 분자량이 제어된 SPG를 제조했다. mSPG를 5M 수산화나트륨 수용액에, 1mg/mL의 농도로 용해했다. 해당 용액을 온도 28℃ 내지 50℃로 하여, 8시간∼72시간 천천히 진탕했다. 진탕한 용액의 2 배량의 메탄올을 첨가해 SPG를 석출시켰다. 석출한 SPG에 메탄올:물＝3:1의 혼액을 사용하여 수회 세정했다. 이 세정을 용액이 중성이 될 때까지 반복하고, 추가로, 메탄올 및 아세톤으로 1회씩 세정했다. 마지막으로 40℃에서 건조하여, 정제되고, 분자량이 제어된 SPG를 얻었다. 이들 범위에서 온도 및 시간을 변화시킴으로써, 다양한 분자 사이즈를 갖는 SPG를 제조했다.
제조한 SPG를 표 2에 나타낸다.
그 밖에, 농도 1M 내지 5M의 수산화나트륨 수용액을 이용하고, 온도 17℃ 내지 55℃, 48시간∼96시간의 범위의 여러 가지 조건에서 진탕 처리함으로써, 분자량이 제어된 SPG를 제조할 수 있는 것을 확인했다.
실시예 5 고압 호모지나이저에 의한 SPG의 분자량 제어
고압 호모지나이저로서, 압력식 호모지나이저(Avestin사 제조 Emulsiflex C-5형 또는 파우렉사 제조 마이크로플루다이저(Microfluidizer) M-110EH형)를 사용했다. 치마버섯 균주 F-82046의 배양에 의해 얻어진 SPG 추출물을, 1mg/mL 내지 3mg/mL의 농도가 되도록 증류수 30mL에 용해하고, 침윤시켰다. 해당 SPG 용액을 압력식 호모지나이저의 유로에 투입하고, 최대 유화 압력 15,000psi 내지 25,000psi가 될 때까지, 서서히 유화 압력을 올리면서, 반복해서 SPG 용액을 호모지나이즈했다. 처리된 SPG 용액에 등량의 메탄올을 첨가해 수 시간 정치하고, 석출한 침전물을 원심분리하여 회수했다. 메탄올로 세정 후, 침전물에 소량의 물을 첨가하여 침윤시킨 후, 동결 건조했다. 이와 같이 하여 알칼리 처리에 의하지 않는 방법으로 분자량이 제어된 SPG(SPG-85: 수량 44mg, SPG-86: 수량 49mg, SPG-87: 수량 38mg)를 제조할 수 있었다.
시험예 2 분자량의 측정
SPG의 분자량은, 이하의 순서에 따라, 표품으로서 사용한 풀루란 환산값으로 하여 측정했다. 피험 물질로서의 SPG에 0.25M 수산화나트륨 수용액을 첨가하고, 5℃에서 1시간 교반하여, 측정 시료로 했다. 분자량 표품인 풀루란 스탠다드(Shodex사. 분자량은 각각, 2350kD, 1220kD, 642kD, 337kD, 194kD 및 107kD.)를 정제수에 용해하여, 측정 시료로 했다. 사이즈 배제 크로마토그래피 장치(SEC)에 시차 굴절 검출기(RI)를 접속해, 이들 측정 시료를 분석했다(SEC-RI법이라고 한다.). 풀루란 스탠다드의 머무름 시간으로부터 분자량 교정 곡선을 작성하고, 시료의 분자량을 추정했다. 이하에 SEC-RI법의 분석 조건을 기재한다.
고속 액체 크로마토그래프 시스템(인젝터, 펌프, 컬럼 히터, RI 검출기): A1200(Agilent사), 이동상: 약 10mM 수산화나트륨 수용액(pH 12), 유속: 0.4mL/min, 컬럼: Asahipak GS-2G 7B(Shodex), Asahipak GS-620HQ(Shodex), Asahipak GS-320HQ(Shodex)를 이 순서로 직렬 접속, 컬럼 온도: 40℃, 시료 농도: 약 2mg/mL, 시료 주입량: 100μL, 분석 시간: 75분.
분자량 교정 곡선을 도 3에 나타낸다. 풀루란 환산의 분자량 107kD 내지 2350kD의 범위(「Log(분자량)」로서 5.03 내지 6.37의 범위)에서, 분자량의 측정이 가능한 것이 확인되었다.
다음으로, 상기의 분자량 교정 곡선 및 분자량 측정 시료의 머무름 시간으로부터 산출한 SPG의 분자량을 표 3 및 표 4에 나타낸다. 알칼리 처리 조건에 의해, SPG의 분자량을 50kD 정도에서부터 1000kD 이상의 광범위로 제어 할 수 있는 것이 판명되었다. 또, 분자량 제어 전의 SPG(mSPG)에 대해서는 피크의 일부가 분자량 교정 곡선의 분자량 상한을 초과하고 있었기 때문에, 중량 평균 분자량을 산출할 수 없었다. 그러나, 본 측정에 의해, 이들 mSPG가 분자량이 제어된 SPG보다 큰 분자량, 즉 대체로 1000kD보다 큰 거대한 분자량을 갖고 있는 것이 확인되었다. 한편, 일부의 분자량 제어 SPG 및 구입한 SPG(SPG-95, SPG-72, SPG-76 및 iSPG-1)에서는, 피크의 일부가 분자량 교정 곡선의 분자량 하한에 미치지는 못했지만 분포가 보였기 때문에, 참고로서 피크 톱 분자량 및 중량 평균 분자량을 산출했다. 이들 SPG는, 다른 SPG보다 작은 분자량, 즉 대체로 100kD보다 작은 분자량을 갖고 있는 것이 확인되었다.
실시예 6 β(1→3) 글루칸과 핵산과의 복합체의 제조
β(1→3) 글루칸으로서 SPG(mSPG, iSPG 또는 분자량이 제어된 SPG), 핵산으로서 K3-dA40을 선택하고, β(1→3) 글루칸과 핵산과의 복합체를 다음과 같이 하여 제조했다. 수 mg의 SPG를 칭량하여, 10mg/mL가 되도록 0.25M 수산화나트륨 수용액에 용해하고, 4℃에서 24시간, 때때로 교반하면서 정치했다. K3-dA40(59 나트륨염)에 증류수를 첨가하여, 100μM의 수용액을 조제했다. 다음으로, 주로 mG/dA 비가 2.5가 되도록 소정의 비율로, 해당 K3-dA40 수용액에 상기의 SPG 알칼리 용액을 첨가하고, 교반함으로써, SPG와 K3-dA40을 복합화했다. 그 후, SPG 알칼리 용액과 동량의 330mM 인산이수소나트륨 수용액을 첨가하여 중화하고, 4℃에서 하룻밤 정치함으로써 K3-SPG를 얻었다.
또한, SPG로는, 실시예 2 또는 표 2에 기재한 것에 더하여, 표 5에 나타내는 것을 사용했다.
제조한 K3-SPG를 표 6에 나타낸다.
시험예 3 β(1→3) 글루칸과 핵산과의 복합체 형성 효율의 평가
실시예 6에서 제조한 β(1→3) 글루칸과 핵산과의 복합체 형성 효율을, SEC에 의해 평가했다. 측정 시료로서, 실시예 6에서 제조, 용액으로서 얻어진 K3-SPG를 이용했다. 또, 대조로서 분석한 K3-dA40 단독의 수용액은, 복합체 시료 중의 총 K3-dA40의 이론 농도와 동일해지도록, SPG를 용해하지 않는 0.25M 수산화나트륨 수용액을 이용하여, 실시예 6에 나타내는 공정으로 제조했다. SEC의 조건을 다음에 나타낸다.
고속 액체 크로마토그래프 시스템(인젝터, 펌프, 컬럼 히터, UV 검출기): A1100(Agilent), 이동상: 100mM 인산 완충액(pH 7.4, nacalai tesuque, 카탈로그 번호: 37244-35), 유속: 0.5mL/min, 컬럼: Asahipak GF-1G 7B(Shodex), Asahipak GF-7M HQ(Shodex), Asahipak GF-1G 7M HQ(Shodex)를 이 순서로 직렬 접속, 컬럼 온도: 40℃, 검출 파장: 260nm, 시료 주입량: 10μL.
복합화 전의 K3-dA40량에 대한 복합화 후의 K3-dA40의 잔량으로부터, 복합화 효율을 계산했다. K3-dA40이 모두 복합화되어 잔량이 0인 경우, 복합체 형성 효율은 100％가 된다.
실시예 6에서 제조한 K3-SPG의 복합체 형성 효율의 측정 결과를 표 7에 나타낸다. 어느 것도 형성 효율은 96％ 이상이며, 모든 정제 SPG(분자량 제어 전), 분자량이 제어된 SPG 및 구입한 SPG가, 본 발명의 K3-SPG의 제조 방법에 의해, 매우 높은 효율로 핵산과의 사이에서 복합체를 형성하는 것이 확인되었다.
시험예 4 DLS에 의한 복합체 입자 지름의 평가
실시예 6에서 제조한 복합체(K3-SPG)의 입자 지름을, DLS법에 있어서, 광자 상관법에 의해, 산란광 강도 기준에 의한 평균 입자 지름으로서 측정했다. 이때, 검출 가능한 산란광 강도가 얻어지는 최저한의 K3-SPG 농도가 되도록, 적절히, 인산 완충액(8g/L NaCl, 200mg/L 인산이수소칼륨, 1150mg/L 무수 인산수소이나트륨.)으로 희석했다.
실시예 6에서 제조한 K3-SPG의 평균 입자 지름의 측정 결과를 표 8에 나타낸다. 평균 입자 지름이 21.9nm 내지 122.2nm인 범위에서 엄밀하게 제어되고 있는 것이 확인되었다.
시험예 5 K3-SPG의 약리 작용의 시험관내 평가
인간 PBMCs(Lonza사. 카탈로그 번호: Cat#CC-2702 Lot#31468) 및 C57BL/6 마우스로부터 조제한 비장 세포를 이용하여, 각각의 IFN-α 산생 유도능 및 IFN-γ 산생 유도능을 평가했다. 인간 PBMCs 및 마우스 비장 세포를 96 구멍의 플레이트에, 1 구멍당 1×106개의 세포수로 파종했다. K3-dA40(59 나트륨염) 환산 농도로서, 0, 0.75, 2, 6, 20㎍/mL가 되도록 K3-SPG를 세포에 첨가하고, 24시간 후의 배양 상청 중의 hIFN-α를, 사이토카인 ELISA 키트(PBL사)에 의해 측정했다. K3-SPG에 의한 hIFN-α 유도능은, 전체 K3-SPG 농도의 hIFN-α 유도 레벨의 곡선 아래 면적(이하, AUC라고 칭한다)의 값을 산출하여 평가했다. 마찬가지로, K3-SPG에 의한 IFN-γ 유도능을 평가했다. 그 결과를 도 4에 나타낸다. 도 4 우측 표에 나타나는 바와 같이, KAmSP001a(평균 입자 지름: 121.1nm) 및 KAmSP002a(평균 입자 지름: 122.2nm)는 입자 지름이 크고, KAInv3701(평균 입자 지름: 31.3nm) 및 KASPG0095(평균 입자 지름: 21.9nm)는 입자 지름이 작다. 도 4에 나타나 있는 바와 같이, 인간 동결 PBMC에 있어서도, 마우스 비장 세포에 있어서도, 입자 지름이 큰 K3-SPG는, 입자 지름이 작은 K3-SPG와 비교하여, IFN-α와 IFN-γ의 산생 유도능이 높았다.
시험예 6 복합체의 약리 작용의 시험관내 평가
K3-SPG 복합체로 처리한 인간 PBMCs(Lonza사, Cat#CC-2702 Lot#31468)로부터의 IFN-α(hIFN-α) 산생 레벨과, K3-SPG의 평균 입자 지름과의 상관관계를 평가했다. 인간 PBMCs를, 96 구멍 플레이트의 1 구멍당 1×106개의 세포수로 파종하고, 각각의 BG-CpG에 대해서, CpG ODN 농도 0, 0.75, 2, 6, 20㎍/ml가 되도록 세포에 첨가하고, 24시간 후의 배양 상청 중의 hIFN-α 산생 레벨을, 사이토카인 ELISA 키트(PBL사)에 의해 측정했다. BG-CpG에 의한 hIFN-α 유도능을, 전체 CpG 농도의 hIFN-α 유도 레벨의 AUC 값을 산출하여 평가했다. hIFN-α 산생 레벨과 평균 입자 지름의 상관관계를, 스피어만 검정을 이용하여 검토했다. 그 결과, 상관계수는 0.7789로, 정(正)의 상관을 나타냈다(도 5). 즉, 평균 입자 지름 20nm 내지 130nm의 범위에서, 입자 지름이 커질수록 강한 약리 작용을 갖는 것이 확인되었다.
시험예 7 K3-SPG의 약리 작용의 생체내 평가
C57BL/6 마우스에 C57BL/6 마우스 유래의 흑색종 세포주인 B16 암 세포를 2×105개 피하 접종하고(0일째), 9일째에 K3(진디자인사), 또는 실시예 3에서 제조한 K3-SPG(복합체 명칭: KAmSP001a)를, 30㎍/head 및 100㎍/head의 양으로 정맥 내 투여했다. K3 또는 K3-SPG의 투여를, 하루 걸러 합계 3회 실시하고, 경시적으로 종양 사이즈를 측정했다. 그 결과, 도 6에 나타내는 바와 같이, K3-SPG를 투여한 군(삼각)에서, K3 투여군(사각)과 비교하여 현저한 항종양 효과가 관측되었다. 즉, 투여량을 몰수로 환산하면, K3에 비해 약 3배의 중량차가 있는 K3-SPG의 약효는, K3와 비교하여 우위성이 인정되는 결과였다.
실시예 7 베타글루칸이 렌티난인 BG-CpG의 제조
상기의 발명을 실시하기 위한 형태의 항에서 기술한 바와 같이, 상법에 따라 렌티난을 제조했다. 여기에서, 표고버섯 자실체의 재배법으로는 균상 재배를 적용하고, 기존의 정제 수단을 선택, 조합함으로써 정제를 행하였다. 또한, 실시예 4에 나타낸 방법으로, 그 분자량을 제어하고, 정제를 행하였다. 이와 같이 하여 얻어진 렌티난을 이용해, 실시예 6에 나타낸 방법에 의해 BG-CpG를 제조했다. 이하, 렌티난을 구성 성분으로 하는 BG-CpG를 K3-LNT로 표기한다. 표 9에는, 제조한 K3-LNT의 평균 입자 지름을 나타낸다. 여기에서 표 9에는, 각 K3-LNT의 제조를 위해 사용한 렌티난의 분자량 제어 조건도 병기하고 있다. 렌티난에 대한 소정 조건의 알칼리 처리의 적용 시간을 변화시킴으로써, K3-LNT로 했을 때의 입자 지름을 제어 할 수 있는 것이 확인되었다. 렌티난의 알칼리 처리 시간과 K3-LNT의 평균 입자 지름과의 관계를 나타낸 도 7로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 의해, 40nm 내지 180nm의 범위에서 평균 입자 지름이 엄밀하게 제어된 K3-LNT를 제조할 수 있는 것을 알 수 있었다.
시험예 8 K3-LNT의 약리 작용의 시험관내 평가
상기의 시험예 5와 마찬가지로 하여 K3-LNT의 IFN-γ 산생 유도능을 평가했다. 단, 세포종으로는 마우스 비장 세포를 선택하고, 96 구멍 플레이트의 1 구멍당 파종한 세포수는 1×107개로 했다. 또, K3-LNT의 첨가량은 2㎍/mL 및 10㎍/mL의 2 수준으로 하여, 각각 24시간 배양 후의 IFN-γ 산생량을 측정하고, 이들을 합계한 값을 K3-LNT의 약리 작용의 강도의 지표로 했다. 그 결과, 도 8에 나타내는 바와 같이, 평균 입자 지름 약 40nm 내지 180nm의 범위에서 상관계수가 0.9081로, K3-LNT의 입자 지름이 커질수록 강한 약리 작용을 갖는 것이 확인되었다.
시험예 9 K3-LNT의 약리 작용의 생체내 평가
상기의 시험예 7과 마찬가지로 하여, K3-LNT의 항종양 효과를 평가했다. 단, 평가 0일째의 C57BL/6 마우스에의 B16 암 세포의 피하이식은 2.5×105개 또는 5.0×105개로 하고, 7일째부터 하루 걸러 합계 3회의 K3-LNT를 투여했다. 여기에서, K3-LNT의 투여 경로는 종양 내로하고, 그 투여량은 50㎍/head로 했다. 비교용 핵산인 K3의 투여량은 16.7㎍/head로 했다. 도 9에 나타내는 바와 같이, 평균 입자 지름 70nm 내지 175nm의 K3-LNT가 강력한 항종양 효과를 갖는 것이 확인되었다. 또, 일부의 검체에 대해서 시험예 7과 마찬가지로 K3와의 비교를 행한바, 도 10에 나타내는 바와 같이, 평균 입자 지름 149nm 및 175nm의 K3-LNT가 K3와 비교하여 우위성이 인정되는 결과를 얻었다.
암 면역요법의 치료약 또는 예방약의 성분으로서, BG-CpG의 최적의 입자 지름을 선정했다. 본 발명의 BG-CpG는 평균 입자 지름이, 20nm 내지 180nm, 바람직해 20nm 내지 130nm, 또는 40nm 내지 180nm, 보다 바람직하게는 80nm 내지 130nm, 또는 130nm 내지 180nm의 범위로 엄밀하게 제어되어 있다. 또한 본 발명의 BG-CpG는 종래의 BG-CpG에 비해, 적은 투여량으로 현저한 효과를 얻을 수 있는 점에서, 종래의 BG-CpG로는 치료나 예방이 곤란했던 질환에 대하여 적용함으로써, 더 나아가서는 종래의 BG-CpG보다 염가로 제조할 수 있음으로써, 산업상의 이익에 공헌할 수 있다.
본 출원은, 2020년 11월 12일자로 일본국에 출원된 특원2020-189032를 기초로 하고 있고, 여기에서 언급함으로써, 그 내용은 모두 본 명세서에 포함되는 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED <120> Beta-glucan-nucleic acid complexes with controlled particle size <130> 093203 <150> JP 2020-189032 <151> 2020-11-12 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 1 atcgactctc gagcgttctc 20

Claims (33)

  1. 입자 지름이 제어된, β(1→3) 글루칸과 핵산과의 복합체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    평균 입자 지름이 80nm 내지 130nm인 것을 특징으로 하는 복합체.
  3. 제 1 항에 있어서,
    평균 입자 지름이 130nm 내지 180nm인 것을 특징으로 하는 복합체.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 β(1→3) 글루칸이, 시조필란인 것을 특징으로 하는 복합체.
  5. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
    상기 β(1→3) 글루칸이, 렌티난인 것을 특징으로 하는 복합체.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산이, K형의 CpG 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 복합체.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산이, K형 CpG 올리고뉴클레오티드의 3'말단에 폴리데옥시아데노신이 연결된 핵산인 것을 특징으로 하는 복합체.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산이, 서열 번호 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 인간화 K형 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 및 폴리데옥시아데닐산을 포함하는, 올리고데옥시뉴클레오티드로서, 폴리데옥시아데노신이, 인간화 K형 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드의 3'말단에 연결되고, 올리고데옥시뉴클레오티드의 인산디에스테르 결합의 일부 또는 전부가 포스포로티오에이트 결합에 의해 치환되어 있는, 복합체.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 기재한 복합체를 포함하는, 의약 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서,
    바이러스 감염증, 암, 알레르기 질환, 세포내 기생성 원충 또는 세균 감염증의 예방 또는 치료를 위한, 의약 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서,
    바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한, 의약 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서,
    바이러스 감염증이 RS 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스 감염증인, 의약 조성물.
  13. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 기재한 복합체를 포함하는, 면역 부활제.
  14. 제 13 항에 있어서,
    백신 애쥬번트인, 면역 부활제.
  15. (a) 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 기재한 복합체, 또는, 제 13 항 또는 제 14 항에 기재한 면역 부활제, 및
    (b) 항원
    을 포함하는, 의약 조성물.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 항원에 대한 면역 반응을 유도하기 위한, 조성물.
  17. 제 16 항에 있어서,
    항원이 병원체 유래의 항원인, 조성물.
  18. 제 17 항에 있어서,
    병원체의 감염증의 예방 또는 치료용인, 조성물.
  19. 제 18 항에 있어서,
    병원체가 바이러스인, 조성물.
  20. 제 19 항에 있어서,
    바이러스가 RS 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스인, 조성물.
  21. 제 16 항에 있어서,
    항원이 암 유래의 항원인, 조성물.
  22. 제 21 항에 있어서,
    암의 예방 또는 치료용인, 조성물.
  23. (a) 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 기재한 복합체, 또는, 제 9 항, 제 10 항, 제 15 항, 제 16 항, 제 21 항, 제 22 항 중 어느 한 항에 기재한 의약 조성물, 및
    (b) 항암제
    를 포함하는, 의약 조성물.
  24. 제 23 항에 있어서,
    항암제가 면역 체크포인트 저해제인, 조성물.
  25. 제 24 항에 있어서,
    면역 체크포인트 저해제가, PD1 저해약, PD-L1 저해약 및 CTLA-4 저해약 중 어느 것인, 조성물.
  26. β(1→3) 글루칸의 분자량 특성을 이용한, 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 기재한 복합체의 제조 방법.
  27. 제 9 항에 기재한 의약 조성물을 포함하는, 의약 조성물의 유효량을 피검자에게 투여하는 것을 포함하는, 바이러스 감염증, 암, 알레르기 질환, 세포내 기생성 원충 또는 세균 감염증의 치료 또는 예방 방법.
  28. 제 27 항에 있어서,
    바이러스 감염증이 RS 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스 감염증인, 치료 또는 예방 방법.
  29. 제 15 항에 기재한 의약 조성물을 포함하는, 의약 조성물의 유효량을 피검자에게 투여하는 것을 포함하는, 바이러스 감염증, 암, 알레르기 질환, 세포내 기생성 원충 또는 세균 감염증의 치료 또는 예방 방법.
  30. 제 29 항에 있어서,
    바이러스 감염증이 RS 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스 감염증인, 치료 또는 예방 방법.
  31. 제 27 항 또는 제 29 항에 있어서,
    다른 항암제와 병용하는 것을 특징으로 하는 암의 치료 또는 예방 방법.
  32. 제 31 항에 있어서,
    항암제가 면역 체크포인트 저해제인, 치료 또는 예방 방법.
  33. 제 32 항에 있어서,
    면역 체크포인트 저해제가, PD1 저해약, PD-L1 저해약 및 CTLA-4 저해약 중 어느 것인, 치료 또는 예방 방법.
KR1020237019697A 2020-11-12 2021-11-11 입자 지름이 제어된 베타글루칸과 핵산과의 복합체 KR20230107833A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020189032 2020-11-12
JPJP-P-2020-189032 2020-11-12
PCT/JP2021/041490 WO2022102694A1 (ja) 2020-11-12 2021-11-11 粒子径が制御された、ベータグルカンと核酸との複合体

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230107833A true KR20230107833A (ko) 2023-07-18

Family

ID=81601257

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237019697A KR20230107833A (ko) 2020-11-12 2021-11-11 입자 지름이 제어된 베타글루칸과 핵산과의 복합체

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20240000954A1 (ko)
EP (1) EP4252757A1 (ko)
JP (1) JPWO2022102694A1 (ko)
KR (1) KR20230107833A (ko)
CN (1) CN116615206A (ko)
CA (1) CA3201815A1 (ko)
TW (1) TW202233245A (ko)
WO (1) WO2022102694A1 (ko)

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS565793U (ko) 1979-06-25 1981-01-19
WO2001034207A1 (fr) 1999-11-10 2001-05-17 Japan Science And Technology Corporation Supports de genes
WO2002072152A1 (fr) 2001-03-13 2002-09-19 Japan Science And Technology Corporation Supports de gene mettant en oeuvre un polysaccharide et leur procede de production
JP2004107272A (ja) 2002-09-19 2004-04-08 Japan Science & Technology Corp 遺伝子治療剤
WO2004100965A1 (ja) 2003-05-15 2004-11-25 Japan Science And Technology Agency 免疫刺激剤
JP2007070307A (ja) 2005-09-09 2007-03-22 Japan Science & Technology Agency 免疫刺激性複合体
JP2008100919A (ja) 2006-10-17 2008-05-01 Japan Science & Technology Agency Ｔｈ２細胞関連疾患の予防等に用いられる核酸／多糖複合体
JP2010174107A (ja) 2009-01-28 2010-08-12 Kitakyushu Foundation For The Advancement Of Industry Science & Technology 三元複合体の製造方法及び抗原タンパク質／ＣｐＧオリゴヌクレオチド／β−１，３−グルカン系三元複合体
US8030285B2 (en) 1999-04-12 2011-10-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
WO2015041318A1 (ja) 2013-09-20 2015-03-26 独立行政法人医薬基盤研究所 免疫賦活活性を有するオリゴヌクレオチド含有複合体及びその用途
WO2016098832A1 (ja) 2014-12-16 2016-06-23 公立大学法人北九州市立大学 ポリヌクレオチド／シゾフィラン複合体及びそれを含む医薬組成物
WO2016103531A1 (ja) 2014-12-26 2016-06-30 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所 免疫賦活活性を有する核酸多糖複合体の抗腫瘍薬としての応用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010043592A (ja) 2008-08-12 2010-02-25 Nachi Fujikoshi Corp 可変容量型ピストンポンプ
JP5605793B2 (ja) 2010-02-27 2014-10-15 独立行政法人科学技術振興機構 β−１，３−グルカン／核酸複合体の調製方法

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS565793U (ko) 1979-06-25 1981-01-19
US8030285B2 (en) 1999-04-12 2011-10-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
WO2001034207A1 (fr) 1999-11-10 2001-05-17 Japan Science And Technology Corporation Supports de genes
WO2002072152A1 (fr) 2001-03-13 2002-09-19 Japan Science And Technology Corporation Supports de gene mettant en oeuvre un polysaccharide et leur procede de production
JP2004107272A (ja) 2002-09-19 2004-04-08 Japan Science & Technology Corp 遺伝子治療剤
WO2004100965A1 (ja) 2003-05-15 2004-11-25 Japan Science And Technology Agency 免疫刺激剤
JP2007070307A (ja) 2005-09-09 2007-03-22 Japan Science & Technology Agency 免疫刺激性複合体
JP2008100919A (ja) 2006-10-17 2008-05-01 Japan Science & Technology Agency Ｔｈ２細胞関連疾患の予防等に用いられる核酸／多糖複合体
JP2010174107A (ja) 2009-01-28 2010-08-12 Kitakyushu Foundation For The Advancement Of Industry Science & Technology 三元複合体の製造方法及び抗原タンパク質／ＣｐＧオリゴヌクレオチド／β−１，３−グルカン系三元複合体
WO2015041318A1 (ja) 2013-09-20 2015-03-26 独立行政法人医薬基盤研究所 免疫賦活活性を有するオリゴヌクレオチド含有複合体及びその用途
WO2016098832A1 (ja) 2014-12-16 2016-06-23 公立大学法人北九州市立大学 ポリヌクレオチド／シゾフィラン複合体及びそれを含む医薬組成物
WO2016103531A1 (ja) 2014-12-26 2016-06-30 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所 免疫賦活活性を有する核酸多糖複合体の抗腫瘍薬としての応用

Non-Patent Citations (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Bode, C., Zhao, G., Steinhagen, F., Kinjo, T. & Klinman, D.M. CpG DNA as a vaccine adjuvant. Expert review of vaccines 10, 499-511 (2011).
Hartmann, G. & Krieg, A.M. Mechanism and function of a newly identified CpG DNA motif in human primary B cells. Journal of immunology 164, 944-953 (2000).
Hartmann, G., et al. Rational design of new CpG oligonucleotides that combine B cell activation with high IFN-alpha induction in plasmacytoid dendritic cells. European journal of immunology 33, 1633-1641 (2003).
Hemmi, H., et al. A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA. Nature 408, 740-745 (2000).
Kerkmann, M., et al. Spontaneous formation of nucleic acid-based nanoparticles is responsible for high interferon-alpha induction by CpG-A in plasmacytoid dendritic cells. The Journal of biological chemistry 280, 8086-8093 (2005).
Kitahata, Y., et al. Circulating nano-particulate TLR9 agonist scouts out tumor microenvironment to release immunogenic dead tumor cells. Oncotarget 7, 48860-48869 (2016).
Klein, D.C., Latz, E., Espevik, T. & Stokke, B.T. Higher order structure of short immunostimulatory oligonucleotides studied by atomicforce microscopy. Ultramicroscopy 110, 689-693 (2010).
Klinman, D.M. Immunotherapeutic uses of CpG oligodeoxynucleotides. Nature reviews. Immunology 4, 249-258 (2004).
Kobiyama, K., et al. Nonagonistic Dectin-1 ligand transforms CpG into a multitask nanoparticulate TLR9 agonist. PNAS 111, 3086-3091 (2014).
Koyama, S., et al. Plasmacytoid dendritic cells delineate immunogenicity of influenza vaccine subtypes. Science translational medicine 2, 25ra24 (2010).
Krieg, A.M. Therapeutic potential of Toll-like receptor 9 activation. Nature reviews. Drug discovery 5, 471-484 (2006).
Krug, A., et al. Identification of CpG oligonucleotide sequences with high induction of IFN-alpha/beta in plasmacytoid dendritic cells. European journal of immunology 31, 2154-2163 (2001).
Kwon S, Kim D, Park B, et al. Induction of immunological memory response by vaccination with TM4SF5 epitope-CpG-DNA-liposome complex in a mouse hepatocellular carcinoma model. Oncology Rep. 2013; 29(2):735-740.
Kwon S, Kim Y-E, Park J-A, Kim D-S, Kwon H-J, Lee Y. Therapeutic effect of a TM4SF5-specific peptide vaccine against colon cancer in a mouse model. BMB Rep. 2014; 47(4):215-220.
Marshall, J.D., et al. Identification of a novel CpG DNA class and motif that optimally stimulate B cell and plasmacytoid dendritic cell functions. Journal of leukocyte biology 73, 781-792 (2003).
McHutchison, J.G., et al. Phase 1B, randomized, double-blind, dose-escalation trial of CPG 10101 in patients with chronic hepatitis C virus. Hepatology 46, 1341-1349 (2007).
Minari, J., et al. Enhanced cytokine secretion from primary macrophages due to Dectin-1 mediated uptake of CpG DNA/beta-1,3-glucan complex. Bioconjugate chemistry 22, 9-15 (2011).
Nakano, H.; Namatame, K.; Nemoto, H.; Motohashi, H.; Nishiyama, K.; Kumada, K. A multi-institutional prospective study of lentinan in advanced gastric cancer patients with unresectable and recurrent diseases: Effect onprolongation of survival and improvement of quality of life. Hepato-Gastroenterol., 1999, 46, 2662-2668.
Nikitczuk KP, Schloss RS, Yarmush ML, Lattime EC. PLGA-polymer encapsulating tumor antigen and CpG DNA administered into the tumor microenvironment elicits a systemic antigen-specific IFN-γ response and enhances survival. J Caner Ther. 2013;4(1):280-290.
Oba, K.; Kobayashi, M.; Matsui, T.; Kodera, Y.; Sakamoto, J.Individual patient based meta-analysis of lentinan for unresectable/recurrent gastric cancer. Anticancer Res., 2009, 29, 2739-2746.
Okamura, K., et al. Clinical evaluation of schizophyllan combined with irradiation in patients with cervical cancer. A randomized controlled study. Cancer 58, 865-872 (1986).
Puig, M., et al. Use of thermolytic protective groups to prevent G-tetrad formation in CpG ODN type D: structural studies and immunomodulatory activity in primates. Nucleic acids research 34, 6488-6495 (2006).
Ribas, A., et al. SD-101 in Combination with Pembrolizumab in Advanced Melanoma: Results of a Phase Ib, Multicenter Study. Cancer Discov. 2018 Oct; 8(10):1250-1257.
Sakurai, K., Mizu, M. & Shinkai, S. Polysaccharide-polynucleotide complexes. 2. Complementary polynucleotide mimic behavior of the naturalpolysaccharide schizophyllan in the macromolecular complex with single-stranded RNA and DNA. Biomacromolecules 2, 641-650 (2001).
Samulowitz, U., et al. A novel class of immune-stimulatoryCpG oligodeoxynucleotides unifies high potency in type I interferon induction with preferred structural properties. Oligonucleotides 20, 93-101 (2010).
Schillie, S., et al. Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices for Use of a Hepatitis B Vaccine with a Novel Adjuvant. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 2018 Apr 20; 67(15): 455-458.
Shimada, N., et al. A polysaccharide carrier to effectively deliver native phosphodiester CpG DNA to antigen-presenting cells. Bioconjugate chemistry 18, 1280-1286 (2007).
Speiser DE, Schwarz K, Baumgaertner P, et al. Memory and effector CD8 T-cell responses after nanoparticle vaccination of melanoma patients. J Immunother. 2010; 33(8):848-858.
Verthelyi, D., Ishii, K.J., Gursel, M., Takeshita, F. & Klinman, D.M. Human peripheral blood cells differentially recognize and respond to two distinct CPG motifs. Journal of immunology 166, 2372-2377 (2001).
Vollmer, J. & Krieg, A.M. Immunotherapeutic applications of CpG oligodeoxynucleotide TLR9 agonists. Advanced drug delivery reviews 61, 195-204 (2009).
Zhao D, Alizadeh D, Zhang L, et al. Carbon nanotubes enhance CpG uptake and potentiate antiglioma immunity. Clin Cancer Res. 2011; 17(4):771-782.
후생노동성 「블록 공중합체 미셀 의약품의 개발에 관한 후생노동성/유럽의약품청의 공동 리플렉션 페이퍼의 공표 등에 대해서」, 약식심사발 0110 제1호, 2014년 1월 10일
후생노동성 의약·생활위생국 심사관리과, 「리포솜 제제의 개발에 관한 가이드라인」에 대해서, 2016년 3월 28일
후생노동성 의약·생활위생국 심사관리과, 「핵산(siRNA) 탑재 나노 제제에 관한 리플렉션 페이퍼」에 대해서, 2016년 3월 28일

Also Published As

Publication number Publication date
US20240000954A1 (en) 2024-01-04
TW202233245A (zh) 2022-09-01
EP4252757A1 (en) 2023-10-04
CA3201815A1 (en) 2022-05-19
WO2022102694A1 (ja) 2022-05-19
JPWO2022102694A1 (ko) 2022-05-19
CN116615206A (zh) 2023-08-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7278551B2 (ja) 免疫賦活活性を有するオリゴヌクレオチド含有複合体及びその用途
US8017154B2 (en) Polyamino acid for use as adjuvant
US9572894B2 (en) Biodegradable particulate formulations
US20230381306A1 (en) Structure-Function Relationships in the Development of Immunotherapeutic Agents
JP2019515900A (ja) がんを処置するためのＴｏｌｌ様レセプター９アゴニストおよび腫瘍抗原を含む粒子の腫瘍内送達
Ebrahimian et al. Induction of a balanced Th1/Th2 immune responses by co-delivery of PLGA/ovalbumin nanospheres and CpG ODNs/PEI-SWCNT nanoparticles as TLR9 agonist in BALB/c mice
JP6698069B2 (ja) 免疫賦活活性を有するＣｐＧスペーサーオリゴヌクレオチド含有複合体及びその用途
JP6536964B2 (ja) 免疫賦活活性を有する核酸多糖複合体の抗腫瘍薬としての応用
Dong et al. Antigen-conjugated silica solid sphere as nanovaccine for cancer immunotherapy
KR20160060072A (ko) 면역 부활화제
KR20230107833A (ko) 입자 지름이 제어된 베타글루칸과 핵산과의 복합체
EP4085974A1 (en) Short-chain cpg-containing oligodeoxynucleotide with linked polydeoxyadenylic acid, complex containing said oligodeoxynucleotide, and use thereof
Zhang et al. Lentinan-functionalized PBAE-G-nanodiamonds as an adjuvant to induce cGAS-STING pathway-mediated macrophage activation and immune enhancement
JP7048102B2 (ja) 免疫賦活活性を有する核酸多糖複合体の抗腫瘍薬としての応用
KR101586200B1 (ko) 면역자극 조성물, 이의 제조 방법, 및 이를 포함하는 면역요법 조성물
TWI725494B (zh) 具有免疫賦活活性之核酸多醣複合體作為抗腫瘤藥之應用
TWI701047B (zh) 具有免疫賦活活性之核酸多醣複合體作為抗腫瘤藥之應用
CN115887640A (zh) 香菇多糖在制备pH响应型纳米药物载体上的应用
Flannigan Characterization of adjuvant properties of microparticulate beta-glucan