KR101586200B1 - 면역자극 조성물, 이의 제조 방법, 및 이를 포함하는 면역요법 조성물 - Google Patents

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Abstract

다가 음이온성 고분자, 톨-유사 수용체 리간드(toll-like receptor lagand), 및 양이온성 고분자를 함유하는 나노복합체를 포함하는 면역자극 조성물, 이의 제조 방법, 및 이를 포함하는 면역요법 조성물에 관한 것이다.

Description

면역자극 조성물, 이의 제조 방법, 및 이를 포함하는 면역요법 조성물{IMMUNOSTIMULATORY COMPOSITION, PRODUCING METHOD OF THE SAME, AND IMMUNOTHERAPEUTIC COMPOSITION INCLUDING THE SAME}
본원은, 다가 음이온성 고분자, 톨-유사 수용체 리간드(toll-like receptor lagand), 및 양이온성 고분자를 함유하는 나노복합체를 포함하는 면역자극 조성물, 상기 면역자극 조성물의 제조 방법, 및 상기 면역자극 조성물을 포함하는 면역요법 조성물에 관한 것이다.
암 면역요법은 면역학적 방법에 의해 암을 치료하고자 하는 최근의 치료 방법으로서, 기존의 바이러스 등의 백신과 유사하게 특정 암 항원에 대한 면역 반응, 특히 킬러 T 세포를 유도하여 암세포를 제거한다.
암 면역요법은 크게 능동(active) 면역요법과 수동(passive) 면역요법으로 나눌 수 있다. 수동 면역요법은 이미 형성된 항체, 사이토카인, 또는 T 세포를 투여하여 직ㆍ간접적으로 암 세포를 제거하는 방법이다. 최근에는 생체외 생산된 항체 또는 TIL(tumor-infiltrating lymphocyte) 등을 환자에게 주입하는 방법이 시도되고 있으나, 신체 내에서 부작용을 일으키고, 종양의 항암 효과가 장기간 지속되지 못하는 문제가 있다. 능동 면역요법은 암 항원을 주입하여 신체 내에 암 항원 특이 면역 반응을 유도하거나, BCG 투여와 같은 비특이 면역 반응을 유도하는 것이다. 특이 면역 반응을 위해서는 효과적으로 면역 반응을 유도할 수 있는 종양 세포 관련 항원(tumor associated antigen)을 찾는 것이 중요하다.
또한, 면역 자극 및 약물의 서방성 방출 효과를 제공하는 아주번트를 사용함으로써, 암 면역요법의 치료 효과를 증대시키고자 하는 많은 시도가 이루어지고 있다(대한민국 특허 출원번호 제10-2009-0118629호).
톨 유사 수용체 9의 작용체인 씨피지 올리고뉴클레오타이드(CpG ODNs)는 면역 자극 물질로 널리 알려져 있는 물질이나, 세포막을 통과하기가 어렵고 세포질에서 뉴클레아제에 의해서 쉽게 분해되어 전달 효율이 낮은 단점을 가지고 있다.
본원은, 다가 음이온성 고분자, 톨-유사 수용체 리간드(toll-like receptor lagand), 및 양이온성 고분자를 함유하는 나노복합체를 포함하는 면역자극 조성물, 이의 제조 방법, 및 이를 포함하는 면역요법 조성물을 제공하고자 한다.
그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 기술한 과제로 제한되지 않으며, 기술되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본원의 제 1 측면은, 다가 음이온성 고분자, 톨-유사 수용체 리간드(toll-like receptor lagand), 및 양이온성 고분자를 함유하는 나노복합체를 포함하는 면역자극 조성물을 제공한다.
본원의 제 2 측면은, 상기 본원의 제 1 측면에 따른 면역자극 조성물 및 항원을 포함하는, 면역요법 조성물을 제공한다.
본원의 제 3 측면은, 다가 음이온성 고분자 및 톨-유사 수용체 리간드(toll-like receptor ligand)를 혼합하여 복합체를 형성하고, 및 상기 복합체와 양이온성 고분자를 혼합하여 나노복합체를 형성하는 것을 포함하는, 면역자극 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본원의 일 구현예에 따른, 다가 음이온성 고분자, 톨-유사 수용체 리간드(toll-like receptor lagand), 및 양이온성 고분자를 함유하는 나노복합체를 포함하는 면역자극 조성물은, 나노 기술을 이용한 면역 자극 물질의 전달 매개체로서, 면역활성화 물질인 톨-유사 수용체 리간드를 다가 음이온성 고분자 측쇄에 부착하고, 양이온성 고분자와 나노복합체를 구성함으로써, 엔도좀 내에 존재하는 톨-유사 수용체를 효과적으로 자극함으로써, 면역활성화 특성을 극대화할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따른 면역자극 조성물은 다가 음이온성 고분자인 히알루론산을 이용하여 톨 유사 수용체 9의 작용체인 씨피지 올리고뉴클레오타이드를 다가 구조로 합성하여 지속적인 면역 자극을 유도할 수 있으며, 양이온성 고분자로서 폴리엘라이신(Poly-L-Lysine)을 사용하여 세포 내 유입 전달 효율을 높일 수 있어, 면역자극에서 시너지 효과를 낼 수 있다.
본원의 일 구현예에 따른 면역자극 조성물은 우수한 세포 내 유입 전달 효율 및 지속적인 면역 자극 효과를 나타냄으로써 면역 세포를 효과적으로 조절할 수 있어 암 면역요법의 효능을 증가시킬 수 있다.
도 1은, 본원의 일 실시예에 따른 나노복합체의 전자주사현미경의 이미지 및 상기 나노복합체의 합성을 나타내는 모식도이다.
도 2는, 본원의 일 구현예에 따른 나노복합체에 의해 유도되는 면역자극 활성에 대한 모식도이다.
도 3a 내지 3c는, 본원의 일 실시예에 따른 나노복합체의 HA-EMCH의 결합을 핵자기공명분광기로 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는, 본원의 일 실시예에 따른 나노복합체의 HA-EMCH의 결합을 적외선분광기로 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는, 본원의 일 실시예에 따른 나노복합체를 처리한 면역세포 (a) BMDCs 및 (b) RAW264.7 세포의 생존율을 나타내는 것이다.
도 6a 내지 도 6c는, 본원의 일 실시예에 따른 나노복합체의 면역 세포 내 유입 효과를 나타내는 것으로, 도 6a는 형광현미경 이미지 [위:수지상세포(BMDC), 아래:대식세포(RAW264.7)]이며, 도 6b 및 6c는 차례대로 각각 대식세포 및 수지상세포의 유세포분석기 분석 결과이다.
도 7은, 본원의 일 실시예에 따른 나노복합체에 의한 면역 세포 BMDCs의 (a) TNF-α 및 (c) IL-6의 사이토카인 분비량 및 RAW264.7 세포의 (b) TNF-α 및 (d) IL-6의 사이토카인 분비량을 나타내는 것이다.
도 8은, 본원의 일 실시예에 따른 나노복합체에 의한 면역 세포 BMDCs의 (a) CD40 및 (c) CD86의 세포 표면 발현 정도 및 RAW264.7 세포의 (b) CD40 및 (d) CD86의 세포 표면 발현 정도를 나타내는 그래프이다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 구현예 및 실시예를 상세히 설명한다.
그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 구현예 및 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 "상에" 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "~(하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~ 를 위한 단계"를 의미하지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B"의 기재는, "A 또는 B, 또는 A 및 B"를 의미한다.
본원의 제 1 측면은, 다가 음이온성 고분자, 톨-유사 수용체 리간드(toll-like receptor lagand), 및 양이온성 고분자를 함유하는 나노복합체를 포함하는 면역자극 조성물을 제공한다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 다가 음이온성 고분자는 카르복실기 및/또는 히드록시기를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 히알루론산, 폴리감마글루탐산, 셀룰로오스, 폴리아크릴산, 폴리아미노산, 다당류, 이들의 유도체, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 다가 음이온성 고분자의 카르복실기 및/또는 히드록시기는 약물 또는 단백질과 그라프트 중합체 결합을 하여 복합체를 형성할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 히알루론산은 생체에 적합하고 생분해성이며 독성을 가지고 있지 않은 글루코론산과 아세틸 글루코사민으로 구성된 직선 모양의 다당류로서, 히알루론산의 카르복실기 및/또는 히드록시기가 약물 또는 단백질과 그라프트 중합체 결합을 하여 복합체를 형성할 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 톨-유사 수용체 리간드는 씨피지 올리고뉴클레오티드(CpG ODNs), MPLA(Monophosphoryl lipid A), 이미퀴모드, 레시퀴모드, 플라젤린(flagellin), 폴리아이시[poly(I:C)], 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 씨피지 올리고뉴클레오티드는 톨-유사 수용체 9의 작용체인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 양이온성 고분자는 폴리엘라이신(Poly-L-Lysine, PLL), 폴리에틸렌이민(Polyethyleneimine), 폴리아미도아민(polyamidoamine), 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 양이온성 고분자는 음이온성인 DNA와 정전기적 상호작용에 의해 쉽게 복합체를 형성할 수 있어, 세포 내로 유전자를 전달할 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 면역활성화 물질인 상기 톨-유사 수용체 리간드가 상기 다가 음이온성 고분자의 측쇄에 부착된 후, 양이온성 고분자와 나노복합체를 구성함으로써, 엔도좀 내에 존재하는 톨-유사 수용체를 효과적으로 자극함으로써, 면역활성화 특성을 극대화할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 톨-유사 수용체 리간드와 상기 다가 음이온성 고분자의 복합체는, 상기 양이온성 고분자와 정전기적 상호작용에 의해 나노복합체를 형성하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 톨-유사 수용체 리간드의 인산기와 상기 양이온성 고분자의 아민기가 약 0.1 : 10 내지 약 0.1 : 100의 비율, 예를 들어, 약 1 : 2의 비율로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 다가성 음이온성 고분자, 상기 톨-유사 수용체 리간드, 및 상기 양이온성 고분자는 약 1 내지 약 10 : 약 0.01 내지 약 1 : 약 1 내지 약 10의 중량비일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 본원의 제 2 측면은, 상기 본원의 제 1 측면에 따른 면역자극 조성물; 및 항원을 포함하는 면역요법 조성물을 제공한다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 항원은 암 항원, 암-관련 바이러스로부터 유래된 항원, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 암 항원 및 암-관련 바이러스로부터 유래된 항원은 단백질, 유전자, 펩타이드, 소분자(small molecule), 바이러스, 암세포, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 제 3 측면은, 다가 음이온성 고분자 및 톨-유사 수용체 리간드(toll-like receptor ligand)를 혼합하여 복합체를 형성하고, 및 상기 복합체와 양이온성 고분자를 혼합하여 나노복합체를 형성하는 것을 포함하는, 면역자극 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 다가 음이온성 고분자는 카르복실기 및/또는 히드록시기를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 히알루론산, 폴리감마글루탐산, 셀룰로오스, 폴리아크릴산, 폴리아미노산, 다당류, 이들의 유도체, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 다가 음이온성 고분자의 카르복실기 및/또는 히드록시기는 약물 또는 단백질과 그라프트 중합체 결합(conjugation)을 하여 복합체를 형성할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 히알루론산은 생체에 적합하고 생분해성이며 독성을 가지고 있지 않은 글루코론산과 아세틸 글루코사민으로 구성된 직선 모양의 다당류로서, 히알루론산의 카르복실기 및/또는 히드록시기가 약물 또는 단백질과 그라프트 중합체 결합을 하여 복합체를 형성할 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 톨-유사 수용체 리간드는 씨피지 올리고뉴클레오티드(CpG ODNs), MPLA(Monophosphoryl lipid A), 이미퀴모드, 레시퀴모드, 플라젤린(flagellin), 폴리아이시[poly(I:C)], 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 양이온성 고분자는 폴리엘라이신(Poly-L-Lysine, PLL), 폴리에틸렌이민(Polyethyleneimine), 폴리아미도아민(polyamidoamine), 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 양이온성 고분자는 음이온성인 DNA와 정전기적 상호작용에 의해 쉽게 복합체를 형성할 수 있어, 세포 내로 유전자를 전달할 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 면역활성화 물질인 상기 톨-유사 수용체 리간드가 상기 다가 음이온성 고분자의 측쇄에 부착된 후, 양이온성 고분자와 결합하여 나노복합체를 구성함으로써, 엔도좀 내에 존재하는 톨-유사 수용체를 효과적으로 자극함으로써, 면역활성화 특성을 극대화할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 톨-유사 수용체 리간드의 인산기와 상기 양이온성 고분자의 아민기가 약 0.1 : 10 내지 약 0.1 : 100의 비율, 예를 들어, 약 1 : 2의 비율로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 다가 음이온성 고분자, 상기 톨-유사 수용체 리간드, 및 상기 양이온성 고분자는 약 1 내지 약 10 : 약 0.01 내지 약 1: 약 1 내지 약 10의 중량비일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
도 1은, 본원의 일 실시예에 따른 면역자극 조성물의 나노복합체 전자주사현미경 이미지 및 상기 나노복합체 합성의 모식도를 나타내는 것이다. 구체적으로, 히알루론산의 카르복실기와 히드록실기가 씨피지 올리고누클레오티드와 결합한 후, 양이온성 고분자인 폴리엘라이신과 결합하여 나노복합체를 형성하는 것을 나타낸다.
도 2는, 본원의 일 실시예에 따른 면역자극 조성물에 의해 유도되는 면역 자극 활성을 나타낸 모식도이다. 구체적으로, 히알루론산과 씨피지 올리고누클레오티드의 복합체와 폴리엘라이신(PLL)이 정전기적 상호작용에 의해 결합하여 나노복합체를 형성함으로써, 세포 내 유입 전달 효율이 증가되고, 톨-유사 수용체 9를 다가(multivalent) 작용으로 자극시켜 면역 자극에 시너지 효과를 나타낼 수 있음을 나타낸다.
이하, 본원의 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명하며, 본 실시예에 의하여 본원의 범위가 제한되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1: PLL/HA-CpG 나노복합체의 제조
히알루론산 고분자의 카르복실기와 씨피지 올리고뉴클레오타이드의 싸이올을 EMCH[3,3'-N-(1-말레이미도카프로산) 히드라지드] 연결기를 사용하여 결합(conjugation)시켰다. 히알루론산(HA, 3 mg/mL)을 2-(N-모폴리노) 에탄술폰산(MES) 완충용액에 용해시킨 후, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 히드로클로라이드(EDC, 10 mg/mL), N-히드록시풀포숙신이미드(sulfo-NHS, 2.8 mg/mL), 3,3'-N-(1-말레이미도카프로산) 히드라지드(EMCH, Pierce, 1.2 mg/mL)를 상기 히알루론산 수용액에 첨가하였다. 5 시간 동안 4℃에서 교반하면서 반응시켰다. 그런 다음, 반응하지 않은 물질들을 제거하기 위해서 2 일 동안 투석하였다. CpG의 인산기와 폴리엘라이신(PLL)의 아민기의 비율을 1:2가 되도록 혼합하고 안전한 형태를 형성할 수 있도록 40 분 동안 실온에 유지하였다.
실시예 2: PLL / HA - CpG 나노복합체의 특성 분석
적외선 분광기와 핵 자기 공명 분광기를 통해 분석하여 히알루론산과 EMCH 연결기의 결합을 확인하였다. 핵 자기공명 분광기에서는 6.852 ppm에서의 말레이미드기와 9.512 ppm에서의 아마이드기의 새로운 피크가 생성되는 것을 확인하였다(도 3a 내지 도 3c). 적외선 분광기에서는 아미드의 C=O 스트레치(stretch)를 통해 1,565 cm-1에서 새로운 결합이 생성되는 것을 확인하였다(도 4).
다가 나노복합체의 크기는 Electrophoretic Light Scattering-ELSZ와 SEM(주사전자현미경)을 통해 분석하였다. SEM 분석을 위해 실시예 1에서와 같이 제조한 다가 나노복합체를 실리콘 웨이퍼에 보관하였고, 진공을 통해 수분을 제거하였다. 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, PLL/HA-GpG 나노복합체의 주사전자현미경 이미지는 구형의 이미지를 나타내며, 균일한 크기를 갖는 것으로 확인되었으며, 크기는 대략 500 nm 정도로 측정되었다.
나노복합체의 물리적 변수와 CpG의 봉입양은 하기 표 1에 나타냈다. 나노복합체의 크기와 다분산지수를 나노입자분석기를 통해서 측정하였고, 그 결과 일정한 크기와 평균입경은 536 nm 정도이며 표면전하는 -37 mV임을 확인하였다.
Figure 112014128514381-pat00001
실시예 3: 세포 생존률 평가
두 면역 세포 BMDCs 골수유래수지상세포 및 RAW264.7 대식세포(BMDCs: 실험실에서 마우스로부터 직접 분리함, RAW264.7: 한국세포주은행으로부터 입수함)에 HA, HA-CpG(CpG-5 ㎍/mL) 및 PLL+HA-CpG(CpG-5 ㎍/mL) 나노복합체를 24 시간 동안 처리한 후, 생존율을 평가하였다. 생존율 평가에는 세포증식 및 생존능력을 측정하기 MTS 분석이 사용되었다. MTS 분석법은 세포내의 미토콘드라이의 전자 전달계에 존재하는 탈수소 효소를 이용하여 발색물질을 생성하는 원리를 이용하는 것으로, 살아있는 세포 내에서 발생 강도가 증가한다. 이 발생강도를 흡광도 490 nm에서 마이크로플레이트리더기기를 이용하여서 측정하였다. 도 5에서 볼 수 있는 바와 같이, BMDCs 및 RAW264.7 면역 세포에서 각각의 시료들은 독성을 나타나지 않았다. 따라서, 이러한 효과는 시료들이 독성이 없으며 생체친화적인 것을 알 수 있다.
실시예 4: BMDCs 및 RAW264.7 세포의 세포 내 유입 효과 평가
두 종류의 면역 세포에 24 시간 동안 CpG(CpG-5 ㎍/mL), HA-CpG(CpG-5 ㎍/mL) 및 PLL+HA-CpG(CpG-5 ㎍/mL) 나노복합체를 처리한 후 형광현미경과 유세포분석기를 이용하여 평가하였다. 도 6a의 형광이미지에서 보이듯이 CpG와 HA-CpG보다 PLL/HA-CpG 나노복합체의 경우에 강한 형광세기가 관찰되었다. 유세포분석기를 통해 분석하였을 때도 PLL/HA-CpG 나노복합체를 처리한 경우 단독으로 CpG를 처리하였을 때보다 BMDCs에서는 1.84 배, RAW264.7 세포에서는 1.82 배 높은 것을 확인하였다(도 6b 및 도 6c). 하지만 CpG 단독과 HA-CpG는 차이가 나지 않는 것으로 보아, PLL이 세포 내 유입 전달 효율을 증대시키는 것을 알 수 있다.
실시예 5: BMDCs 및 RAW264.7 세포의 활성 증가
BMDCs 및 RAW264.7 세포의 활성은 전구염증 싸이토카인(TNF-α, IL-6)의 분비량을 이엘아이에스에이(ELISA,enzyme linked immunoassay)분석법을 이용하여 분석되었다. 이엘아이에스에이 분석법은 in vitro(생체외)의 항원-항체반응을 이용한 미량 분석 기술로 항체에 효소를 결합시킨 후 그 반응을 흡광도 450 nm에서 마이크로플레이트리더기기를 이용하여서 정량하였다. 도 7에서 볼 수 있는 바와 같이, 면역자극물질인 CpG가 포함된 HA-CpG를 처리하였을 경우 Th1 반응을 유도하는 IL-6의 분비가 농도에 따라 증가되는 것으로 확인되었다[도 7의 (c) 및 (d)]. 또한, 세포사멸과 종양생성억제를 유도하는 TNF-α의 분비량은 PLL/HA-CpG의 처리 후에 큰 폭으로 증가되었다[도 7의 (a) 및 (b)]. 도 8에서 볼 수 있는 바와 같이, 시료를 BMDCs 및 RAW264.7 세포에 처리하여 성숙됨에 따라 발현되는 CD40 및 CD86를 표지한 결과, 대조(CpG,HA-CpG)와 비교하여 모두 발현량이 증가되었음이 확인되었다. 특히, PLL+HA-CpG의 처리 후 상당하게 증가되었다.
씨피지 올리고뉴클레오타이드는 톨 유사 수용체 9의 자극과 Myd88 신호 경로를 통해 수지상 세포와 대식세포의 성숙을 유도하는 것으로 알려져 있다. 전체적으로 종합해보면, 이러한 결과는 수지상 세포의 활성과 성숙 정도는 CpG가 단독으로 처리되었을 때보다 PLL/HA-CpG로 처리되었을 경우 더 높아지는 것으로 확인되었다. 이는, 세포 내 전달 효율과 톨 유사 수용체 9의 다가 자극의 두 가지의 시너지로 유도되는 면역활성이 증대하기 때문이다.
전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (15)

  1. 다가 음이온성 고분자, 톨-유사 수용체 리간드(toll-like receptor lagand), 및 양이온성 고분자를 함유하는 나노복합체를 포함하는, 면역자극 조성물로서,
    상기 다가 음이온성 고분자는 히알루론산을 포함하는 것이며,
    상기 톨-유사 수용체 리간드는 씨피지 올리고뉴클레오티드, 폴리아이시[poly(I:C)], 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것이고,
    상기 양이온성 고분자는 폴리엘라이신을 포함하는 것이며,
    상기 톨-유사 수용체 리간드와 상기 다가 음이온성 고분자는, 상기 양이온성 고분자와 정전기적 상호작용에 의해 나노복합체를 형성하고,
    상기 양이온성 고분자는 상기 나노복합체의 세포 내 유입 전달 효율을 향상시키는 역할을 수행하는 것인,
    면역자극 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 톨-유사 수용체 리간드의 인산기와 상기 양이온성 고분자의 아민기가 0.1 : 10 내지 0.1 : 100의 비율로 포함되는 것인, 면역자극 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 다가 음이온성 고분자, 상기 톨-유사 수용체 리간드, 및 상기 양이온성 고분자는 1 내지 10 : 0.01 내지 1 : 1 내지 10의 중량비인 것인, 면역자극 조성물.
  8. 제 1 항, 제 6 항, 및 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 면역자극 조성물; 및 항원을 포함하는, 면역요법 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 항원은 암항원, 암-관련 바이러스로부터 유래된 항원, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것인, 면역요법 조성물.
  10. 다가 음이온성 고분자 및 톨-유사 수용체 리간드(toll-like receptor ligand)를 혼합하여 복합체를 형성하고, 및
    상기 복합체와 양이온성 고분자를 혼합하여 나노복합체를 형성하는 것
    을 포함하는, 면역자극 조성물의 제조 방법으로서,
    상기 다가 음이온성 고분자는 히알루론산을 포함하는 것이며,
    상기 톨-유사 수용체 리간드는 씨피지 올리고뉴클레오티드, 폴리아이시[poly(I:C)], 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것이고,
    상기 양이온성 고분자는 폴리엘라이신을 포함하는 것이며,
    상기 톨-유사 수용체 리간드와 상기 다가 음이온성 고분자는, 상기 양이온성 고분자와 정전기적 상호작용에 의해 나노복합체를 형성하고,
    상기 양이온성 고분자는 상기 나노복합체의 세포 내 유입 전달 효율을 향상시키는 역할을 수행하는 것인,
    면역자극 조성물의 제조 방법.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 제 10 항에 있어서,
    상기 톨-유사 수용체 리간드의 인산기와 상기 양이온성 고분자의 아민기가 0.1 : 10 내지 0.1 : 100의 비율로 포함되는 것인, 면역자극 조성물의 제조 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002053184A2 (en) * 2001-01-05 2002-07-11 Intercell Ag Uses for polycationic compounds as vaccine adjuvants

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
한국고분자학회, 2014년 가을 학술대회(10/06~10/08, 제주 ICC), 39권 2호, 의료용 고분자 부문위원회, 917번,‘Enhanced immunostimulatory Activity by multivalent CpG oligonucleotide Nanoconjugates’* *

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