JP2016113404A - ポリヌクレオチド/シゾフィラン複合体及びそれを含む医薬組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
前記シゾフィランと水素結合を介して結合し、CpG配列を有するポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体とを含み、
前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体の分子鎖1本と前記シゾフィランの分子鎖2本とからなる三重螺旋構造を有する複合体を形成していることを特徴とするポリヌクレオチド/シゾフィラン複合体を提供することにより上記課題を解決するものである。
(1)シゾフィラン及びCpG配列を有するポリヌクレオチドの種類、分子量、組み合わせ等に関わりなく、シゾフィランとポリヌクレオチドとの間の水素結合を介してポリヌクレオチド/シゾフィラン複合体を形成できるため、広範なシゾフィランとCpG配列を有するポリヌクレオチドの組み合わせについて、単一の操作によりポリヌクレオチド/シゾフィラン複合体を得ることができる。
本発明の第一の実施の形態に係るポリヌクレオチド/シゾフィラン複合体(以下、単に「ポリヌクレオチド/シゾフィラン複合体」と略称する場合がある。)は、シゾフィランと、シゾフィランと水素結合を介して結合し、CpG配列を有するポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体とを含んでいる。
accgatagcgctgccggtgacggcaccacg
accgatgacgtcgccggtgacggcaccacg
accgattcgcgagccggtgacggcaccacg
ggggggggggggcgatcggggggggggggg
gggggggggggacgatcgtcgggggggggg
ggggggggggggaacgttgggggggggggg
GAGAACGCTCGACCTTCGAT
TCCATGACGTTCCTGATGCT
TCTCCCAGCGTGCGCCAT
GGggtcaacgttgaGGGGGg
なお、シゾフィランの重量平均分子量は、光散乱法、沈降速度法(超遠心法)等の任意の公知の方法を用いて決定することができる。
シゾフィランは、通常、水中でシゾフィランの分子鎖3本からなる三重螺旋構造を呈している。したがって、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体と複合体を形成するためには、シゾフィランをDMSOのような溶媒に溶解して分子間水素結合及び疎水性相互作用による会合状態を解いて一本鎖にする。このようにして得られた一本鎖状のシゾフィランの溶液に、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体を含有する水溶液(又はアルコール等の極性溶媒の溶液)を添加していくと、水の添加による溶媒の極性の増大に伴い、疎水性相互作用によりポリヌクレオチドとシゾフィランとが会合し、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体の分子鎖を取り込みながら、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体とシゾフィランとの複合体が形成される。その結果、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体の分子鎖1本とシゾフィランの分子鎖2本とからなる三重螺旋構造を有する複合体が形成される。複合体の形成は、例えば、CD(円偏光二色性)スペクトルを測定することにより、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体のコンホメーション変化を調べることによって確認することができる。
本実施例において、Schizophyllum commune Friesを培養し、培養液中に産生されたシゾフィランを分離、精製することで高分子量シゾフィランを得た。その高分子シゾフィランを超音波処理することでシゾフィランを物理的に分解させた。また、超音波処理の時間を変えることで得られるシゾフィランの分子量を変化させるができた。
注2:光散乱の測定を精度よくするために、シゾフィランが中性の水中と同じコンホメーションを保っていることが分かっている0.01N NaOH水溶液中で測定した。
公知の核酸固相合成法にて、デオキシアデノシン1リン酸の重合体であるpoly(dA)Xを合成した。ここでXは重合度を示す。すなわち、(dA)Xは、デオキシアデノシンのX量体であることを示す。この類縁体として、ホスホジエステル結合のリン酸の酸素原子の一つがイオウに置換されているホスホロチオエート誘導体であるS−poly(dA)Xと、リン酸の酸素原子の2つがイオウに置換されているホスホロジチオエート誘導体であるD−poly(dA)Xも合成した。いずれもHPLCを用いて精製し、純度99%以上の精製物を得た。
CpG DNAは、K−タイプのCpG DNAとして5’−末端にポリdAテール:(dA)40を付加した5’−(dA)40−ATCGACTCTCGAGCGTTCTC−3’(配列番号1;(dA)40−K3と略記)を、及びD−タイプのCpG DNAとして5’−(dA)40−GGTGCATCGATGCAGGGGGG(配列番号1;(dA)40−D35と略記)を使用した。DNAのリン酸バックボーンはいずれもホスホロチオエート型で、両サンプルともHokkaido System Science社の合成品で、高速液体クロマトグラフィーで精製されている。また、3’−末端にポリdAテールを付加したK3−(dA)40とD35−(dA)40も同様にして合成した。これらの試料の複合化を実施例2と同様の方法で評価した。結果を表5に示す。
未反応のDNAは複合体に比べて分子量がはるかに小さいために、GPCで分離することができる。複合体のフラクションを確認しながら検出器から流出してくる溶液を分取した。また、未反応のシゾフィランは、特開2011−178707号公報に記載されている陰イオン交換カラムを用いた方法で取り除いた。複合化率50%以下の混合溶液から、これらの方法を用いて複合化率90%以上にすることができた。この精製された複合体は、水溶液として室温で10日放置しても複合化率が変わることはなかった。
S3を用いた、S−d(A)40−D35の複合体において、実施例2では、複合体の調製には、シゾフィランを0.25N NaOH溶液で、濃度15mg/mLに溶解して、シゾフィランを1本鎖に解離させたのち、ポリ(デオキシリボヌクレオチド/シゾフィラン複合体)溶液とリン酸緩衝液(330mM NaH2PO4、pH4.5)とを混合した。シゾフィランとポリ(デオキシリボヌクレオチド/シゾフィラン複合体)の濃度を5倍、10倍、30倍と濃くしていくと、複合体の分子量が増加するとともに、X線小角散乱で測定した散乱強度の散乱角度依存性(I∝qaと表す。ここでqは散乱ベクトルの絶対値)が、qが10−1から1nm−1の範囲で、ポリヌクレオチド/シゾフィラン複合体の濃度が低い場合には、a=−1であったが、濃度が増加するにつれて符号は常に負であるものの、aの絶対値|a|が増加していった。また、同様の測定を、S4を用いたS−d(A)40−D35の複合体においても実施した。S4の場合は濃度を基準の1/100から調製した。
Claims (11)
- シゾフィランと、
前記シゾフィランと水素結合を介して結合し、CpG配列を有するポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体とを含み、
前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体の分子鎖1本と前記シゾフィランの分子鎖2本とからなる三重螺旋構造を有する複合体を形成していることを特徴とするポリヌクレオチド/シゾフィラン複合体。 - 分子量が1×105以上3×106以下であることを特徴とする請求項1記載のポリヌクレオチド/シゾフィラン複合体。
- 多角度光散乱測定又はX線小角散乱による慣性半径の測定値が20nm以上200nm以下であることを特徴とする請求項1又は2記載のポリヌクレオチド/シゾフィラン複合体。
- 前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体が、ホスホジエステル結合の一部又は全部がホスホロチオエート結合もしくはホスホロジチオエート結合で置換されたポリヌクレオチド誘導体であることを特徴とする請求項1から4のいずれか1項記載のポリヌクレオチド/シゾフィラン複合体。
- 前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体が、デオキシリボヌクレオチド又はその誘導体であることを特徴とする請求項1から5のいずれか1項記載のポリヌクレオチド/シゾフィラン複合体。
- デオキシリボヌクレオチド又はその誘導体のうち、前記シゾフィランと水素結合を介して結合する部分の重合度が10以上であることを特徴とする請求項6記載のポリヌクレオチド/シゾフィラン複合体。
- 前記シゾフィランと水素結合を介して結合する部分がデオキシリボヌクレオチドであり、その重合度が60以上であることを特徴とする請求項7記載のポリヌクレオチド/シゾフィラン複合体。
- 前記シゾフィランと水素結合を介して結合する部分が、デオキシリボヌクレオチドにおいてホスホジエステル結合がホスホロチオエート結合に置換されたデオキシリボヌクレオチドの誘導体であり、その重合度が20以上であることを特徴とする請求項7記載のポリヌクレオチド/シゾフィラン複合体。
- 前記シゾフィランと水素結合を介して結合する部分が、デオキシリボヌクレオチドにおいてホスホジエステル結合がホスホロジチオエート結合に置換されたデオキシリボヌクレオチドの誘導体であることを特徴とする請求項7記載のポリヌクレオチド/シゾフィラン複合体。
- 請求項1から10のいずれか1項記載のポリヌクレオチド/シゾフィラン複合体を含む医薬組成物。
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---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (7)
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MIZU,M. ET AL: "A polysaccharide carrier for immunostimulatory CpG DNA to enhance cytokine secretion", JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 126, no. 27, JPN6016007714, 2004, pages p.8372-8373, ISSN 0002-7863 * |
MIZU,M. ET AL: "Protection of polynucleotides against nuclease-mediated hydrolysis by complexation with schizophylla", BIOMATERIALS, vol. 25, no. 15, JPN6016007723, 2004, pages p.3109-3116, ISSN 0142-9612, XP004489064, DOI: doi:10.1016/j.biomaterials.2003.09.079 * |
MOCHIZUKI,S. ET AL: "Dectin-1 targeting delivery of TNF-α antisense ODNs complexed with β-1,3-glucan protects mice from", JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE, vol. 151, no. 2, JPN6016007721, 2011, pages p.155-161, ISSN 0168-3659, XP055197019, DOI: doi:10.1016/j.jconrel.2011.01.026 * |
POLYMER PREPRINTS JAPAN, vol. 58, no. 1, JPN6018040423, 2009, pages 20 - 9 * |
POLYMER PREPRINTS JAPAN, vol. 58, no. 2, JPN6018040425, 2009, pages 5257 - 5258 * |
SHIMADA,N. ET AL: "Synthesis and in Vitro Characterization of Antigen-Conjugated Polysaccharide as a CpG DNA Carrier", BIOCONJUGATE CHEMISTRY, vol. 17, no. 5, JPN6016007715, 2006, pages p.1136-1140, ISSN 1043-1802, XP055218957, DOI: doi:10.1021/bc060070g * |
望月慎一ら: "多糖β-1,3グルカンの受容体を利用したオリゴ核酸の選択的デリバリー", DRUG DELIVERY SYSTEM, vol. 25, no. 6, JPN6016007718, 2010, pages p.565-572, ISSN 0913-5006 * |
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