CN114901824A - 连结有聚脱氧腺苷酸的短链含CpG的寡脱氧核苷酸、含有该寡脱氧核苷酸的复合体、及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供寡脱氧核苷酸，其包含CpG寡脱氧核苷酸及能够与β‑1,3‑葡聚糖形成复合体的长度的聚脱氧腺苷酸，所述CpG寡脱氧核苷酸包含式(I)：5’X‑CpG‑L‑CpG‑TZ3’(I)(式中，X为T或C，L为由1～7个碱基形成的核苷酸序列，Z为T或C)表示的核苷酸序列且由8～16个碱基形成，聚脱氧腺苷酸与CpG寡脱氧核苷酸的3’侧连结。另外，本发明提供含有该寡脱氧核苷酸及β‑1,3‑葡聚糖的复合体。

Description

连结有聚脱氧腺苷酸的短链含CpG的寡脱氧核苷酸、含有该寡 脱氧核苷酸的复合体、及其用途

技术领域

本发明涉及连结有聚脱氧腺苷酸的短链含CpG的寡脱氧核苷酸、含有该寡脱氧核苷酸的复合体、及其用途。详细而言，本发明涉及具有经增强的免疫赋活活性的连结有聚脱氧腺苷酸的短链含CpG的寡脱氧核苷酸、该寡脱氧核苷酸与β-1,3-葡聚糖的复合体、及其医药用途等。

背景技术

CpG寡核苷酸(CpG ODN)为含有免疫赋活性的非甲基化CG序列(CpG基序)的、短的单链DNA片段，是Toll样受体9(TLR9)的强力激动剂。将树突状细胞(DCs)、B细胞活化而诱导I型干扰素及炎症性细胞因子的产生，作为包含细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应的Th1型的体液及细胞性免疫反应的佐剂发挥作用。CpG ODN具有强的免疫赋活活性，能够通过合成而简便地制成，因此，不仅期待作为佐剂，而且也期待作为抗癌剂、抗过敏剂。

目前为止，报道了骨架序列及免疫赋活特性不同的4种(A类、B类、C类、P类)的CpGODN(非专利文献6)。其中，A类(也称为D型)能够强力诱导I型干扰素产生，但由于形成高阶结构，在加入了盐的溶液中形成凝集块，难以进行临床开发。另一方面，B类(也称为K型)含有非回文结构的多个CpG基序，能够在不形成凝集块的情况下将B细胞强力地活化而产生IL-6，但几乎不诱导I型干扰素产生(非专利文献2、3)。非专利文献4中报道了几种B类CpGODN。

裂褶多糖(SPG)为来自裂褶菌的已知的可溶性β-1,3-葡聚糖，由β-(1→3)-D-葡聚糖的主链、和每3个葡萄糖1个β-(1→6)-D-葡萄糖基侧链形成(非专利文献5)。裂褶多糖等β-1,3-葡聚糖在天然情况下形成三重螺旋结构，但溶解于碱性溶剂中时三重螺旋解离而成为单链。在该单链的β-1,3-葡聚糖中混合聚脱氧腺苷酸(dA)并进行中和时，β-1,3-葡聚糖与聚(dA)形成三重螺旋结构的复合体(非专利文献6)。

近年来报道了在作为代表性的B类CpG ODN的K3的3’末端附加聚(dA)尾并与裂褶多糖、香菇多糖等β-1,3-葡聚糖形成复合体时，该复合体尽管不具有A类CpG ODN序列，但兼具B类CpG ODN所特有的免疫赋活活性(例如，将B细胞(优选为人B细胞)活化而产生IL-6的活性)、和A类CpG ODN所特有的免疫赋活活性(例如，将浆细胞样树突状细胞活化而产生IFN-α的活性)(专利文献1)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO2015/041318

非专利文献

非专利文献1：Vollmer,J.等人,Advanced drug delivery reviews 61,195-204(2009)

非专利文献2：Verthelyi,D.等人,Journal of immunology 166,2372-2377(2001)

非专利文献3：Hartmann,G.等人,Journal of immunology 164,944-953(2000)

非专利文献4：Verthelyi,D.等人,Journal of immunology 168,1659-1663(2014)

非专利文献5：Tabata,K.等人,Carbohydr.Res.,89,121-135(1981)

非专利文献6：Sakurai,K.,等人,Biomacromolecules 2,641-650(2001)

发明内容

发明所要解决的课题

通过专利文献1中公开的K3/β-1,3-葡聚糖复合体，提供了能够在不凝集的情况下诱导I型干扰素产生的新的CpG ODN，但该复合体为还兼具IL-6产生诱导活性的“全合一(all-in-one)”型，因此期望开发I型干扰素产生诱导能力增强、与IL-6相比更偏向I型干扰素产生诱导型的CpG ODN。

本发明目的在于提供I型干扰素产生能力增强的新的CpG ODN、包含其的复合体。

用于解决课题的手段

本申请的发明人为进一步强化该K3/SPG复合体的I型干扰素产生诱导活性而进行了研究，结果发现，作为CpG ODN，使用比K3短的具有特定共有序列的短链CpG ODN时，尽管短链CpG ODN单独的免疫赋活活性低于K3(非专利文献2及4)，但若在3’末端附加聚(dA)尾并与β-1,3-葡聚糖进行复合体化，则令人惊讶地，与K3的情况相比，IFN-α产生诱导活性反而增强。本申请的发明人基于上述见解，进一步进行研究，从而完成了本发明。

即，本发明涉及以下的方案。

[1]寡脱氧核苷酸，其包含CpG寡脱氧核苷酸及能够与β-1,3-葡聚糖形成复合体的长度的聚脱氧腺苷酸，

所述CpG寡脱氧核苷酸包含式(I)表示的核苷酸序列且由8～16个碱基形成，

式(I)：

5’X-CpG-L-CpG-TZ3’ (I)

(式中，X为T或C，

L为由1～7个碱基形成的核苷酸序列，

Z为T或C)，

聚脱氧腺苷酸与CpG寡脱氧核苷酸的3’侧连结。

[2]如[1]所述的寡脱氧核苷酸，其中，X为T。

[3]如[1]或[2]所述的寡脱氧核苷酸，其中，Z为T。

[4]如[1]～[3]中任一项所述的寡脱氧核苷酸，其中，L为式(II)表示的核苷酸序列，

5’Y₁Y₂Y₃Y₄Y₅Y₆Y₇3’ (II)

(式中，Y₁为选自由A、G、T及C组成的组中的任一碱基，

Y₂、Y₃、Y₄、Y₅、Y₆及Y₇各自独立地不存在或者为选自由A、G、T及C组成的组中的任一碱基)。

[5]如[4]所述的寡脱氧核苷酸，其中，式(II)中，Y₃、Y₄、Y₅、Y₆及Y₇不存在。

[6]如[5]所述的寡脱氧核苷酸，其中，Y₁为选自由A、G及T组成的组中的任一碱基。

[7]如[5]或[6]所述的寡脱氧核苷酸，其中，Y₂为选自由A、G及T组成的组中的任一碱基。

[8]如[4]所述的寡脱氧核苷酸，其中，Y₁为A或T，Y₂为G或T，Y₃为C或T，Y₄为G或T，Y₅为A或T，Y₆为G或T，Y₇不存在或者为A或T。

[9]如[1]～[8]中任一项所述的寡脱氧核苷酸，其中，L为选自由A、G、C、T、AA、AG、AT、GA、GT、TA、TT、TTTTTTT、TTTTTTA、TTCGTTT、TTCGTTA及AGCGAG组成的组中的任一核苷酸序列。

[10]如[1]～[9]中任一项所述的寡脱氧核苷酸，其中，CpG寡脱氧核苷酸在式(I)表示的核苷酸序列的3’侧不具有附加序列或者具有1～3个碱基的附加序列。

[11]如[10]所述的寡脱氧核苷酸，其中，1～3个碱基的附加序列为选自由C、CT及CTC组成的组中的任一核苷酸序列。

[12]如[1]～[11]中任一项所述的寡脱氧核苷酸，其中，CpG寡脱氧核苷酸在式(I)表示的核苷酸序列的5’侧不具有附加序列或者具有1个碱基的附加序列。

[13]如[12]所述的寡脱氧核苷酸，其中，1个碱基的附加序列为A。

[14]如[1]～[13]中任一项所述的寡脱氧核苷酸，其中，CpG寡脱氧核苷酸由8～15个碱基形成。

[15]如[1]～[14]中任一项所述的寡脱氧核苷酸，其中，CpG寡脱氧核苷酸由8～12个碱基形成。

[16]如[1]～[15]中任一项所述的寡脱氧核苷酸，其中，式(I)表示的核苷酸序列由序列号12、55、56、57、58、59、21、60、61、62、63或64表示的核苷酸序列形成。

[17]如[1]～[15]中任一项所述的寡脱氧核苷酸，其中，式(I)表示的核苷酸序列由序列号68、94、95、96、97、98或99表示的核苷酸序列形成。

[18]如[1]～[15]中任一项所述的寡脱氧核苷酸，其中，CpG寡脱氧核苷酸由序列号4、6、7、8、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、25、26或27表示的核苷酸序列形成。

[19]如[1]～[15]中任一项所述的寡脱氧核苷酸，其中，CpG寡脱氧核苷酸由序列号66、67、68、71、72、73、74、75、76、或77表示的核苷酸序列形成。

[20]如[1]～[19]中任一项所述的寡脱氧核苷酸，其中，寡脱氧核苷酸的磷酸二酯键的一部分或全部被硫代磷酸酯键替换。

[21]如[20]所述的寡脱氧核苷酸，其中，寡脱氧核苷酸的磷酸二酯键的全部被硫代磷酸酯键替换。

[22]如[1]～[21]中任一项所述的寡脱氧核苷酸，其中，聚脱氧腺苷酸的长度为20～60个碱基。

[23]如[1]～[22]中任一项所述的寡脱氧核苷酸，其包含序列号31、33、34、35、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、52、53、或54表示的核苷酸序列。

[24]如[1]～[22]中任一项所述的寡脱氧核苷酸，其包含序列号78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92或93表示的核苷酸序列。

[25]复合体，其含有[1]～[24]中任一项所述的寡脱氧核苷酸及β-1,3-葡聚糖。

[26]如[25]所述的复合体，其中，β-1,3-葡聚糖为裂褶多糖。

[27]如[25]所述的复合体，其中，β-1,3-葡聚糖为凝胶多糖。

[28]医药组合物，其含有(i)[1]～[24]中任一项所述的寡脱氧核苷酸及(ii)β-1,3-葡聚糖。

[29]如[28]所述的医药组合物，其中，(i)的寡脱氧核苷酸与(ii)的β-1,3-葡聚糖形成复合体。

[30]如[28]或[29]所述的医药组合物，其中，β-1,3-葡聚糖为裂褶多糖。

[31]如[28]或[29]所述的医药组合物，其中，β-1,3-葡聚糖为凝胶多糖。

[32]如[28]～[31]中任一项所述的医药组合物，其用于免疫赋活。

[33]如[28]～[31]中任一项所述的医药组合物，其用于I型干扰素产生诱导。

[34][25]～[27]中任一项所述的复合体在用于制造免疫赋活用或I型干扰素产生诱导用医药组合物中的用途。

[35][25]～[27]中任一项所述的复合体在用于制造I型干扰素产生诱导用医药组合物中的用途。

[36]将哺乳动物的免疫反应增强的方法，其包括将药理有效量的[25]～[27]中任一项所述的复合体施予至该哺乳动物的步骤。

[37]在哺乳动物中诱导I型干扰素产生的方法，其包括将药理有效量的[25]～[27]中任一项所述的复合体施予至哺乳动物的步骤。

[38]如[25]～[27]中任一项所述的复合体，其用于增强免疫反应。

[39]如[25]～[27]中任一项所述的复合体，其用于I型干扰素产生的诱导。

[1b]寡脱氧核苷酸，其包含CpG寡脱氧核苷酸及能够与β-1,3-葡聚糖形成复合体的长度的聚脱氧腺苷酸，

所述CpG寡脱氧核苷酸包含式(Ib)表示的核苷酸序列且由8～16个碱基形成，

式(Ib)：

5’X-CpG-Y₁Y₂-CpG-TZ3’ (Ib)

(式中，X为T或C，

Y₁为选自由A、G、T及C组成的组中的任一碱基，

Y₂不存在或者为选自由A、G、T及C组成的组中的任一碱基，

Z为T或C)，

聚脱氧腺苷酸与CpG寡脱氧核苷酸的3’侧连结。

[2b]如[1b]所述的寡脱氧核苷酸，其中，X为T。

[3b]如[1b]或[2b]所述的寡脱氧核苷酸，其中，Y₁为选自由A、G及T组成的组中的任一碱基。

[4b]如[1b]～[3b]中任一项所述的寡脱氧核苷酸，其中，Y₂为选自由A、G及T组成的组中的任一碱基。

[5b]如[1b]～[4b]中任一项所述的寡脱氧核苷酸，其中，Z为T。

[6b]如[1b]～[5b]中任一项所述的寡脱氧核苷酸，其中，CpG寡脱氧核苷酸在式(Ib)表示的核苷酸序列的3’侧不具有附加序列或者具有1～3个碱基的附加序列。

[7b]如[6b]所述的寡脱氧核苷酸，其中，1～3个碱基的附加序列为选自由C、CT及CTC组成的组中的任一核苷酸序列。

[8b]如[1b]～[7b]中任一项所述的寡脱氧核苷酸，其中，CpG寡脱氧核苷酸在式(Ib)表示的核苷酸序列的5’侧不具有附加序列。

[9b]如[1b]～[8b]中任一项所述的寡脱氧核苷酸，其中，CpG寡脱氧核苷酸由8～12个碱基形成。

[10b]如[1b]～[9b]中任一项所述的寡脱氧核苷酸，其中，式(Ib)表示的核苷酸序列由序列号12、55、56、57、58、59、21、60、61、62、63或64表示的核苷酸序列形成。

[11b]如[1b]～[10b]中任一项所述的寡脱氧核苷酸，其中，CpG寡脱氧核苷酸由序列号4、6、7、8、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、25、26或27表示的核苷酸序列形成。

[12b]如[1b]～[11b]中任一项所述的寡脱氧核苷酸，其中，寡脱氧核苷酸的磷酸二酯键的一部分或全部被硫代磷酸酯键替换。

[13b]如[12b]所述的寡脱氧核苷酸，其中，寡脱氧核苷酸的磷酸二酯键的全部被硫代磷酸酯键替换。

[14b]如[1b]～[13b]中任一项所述的寡脱氧核苷酸，其中，聚脱氧腺苷酸的长度为20～60个碱基。

[15b]如[1b]～[14b]中任一项所述的寡脱氧核苷酸，其包含序列号31、33、34、35、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、52、53、或54表示的核苷酸序列。

[16b]复合体，其含有[1b]～[15b]中任一项所述的寡脱氧核苷酸及β-1,3-葡聚糖。

[17b]如[16b]所述的复合体，其中，β-1,3-葡聚糖为裂褶多糖。

[18b]医药组合物，其含有(i)[1b]～[15b]中任一项所述的寡脱氧核苷酸及(ii)β-1,3-葡聚糖。

[19b]如[18b]所述的医药组合物，其中，(i)的寡脱氧核苷酸与(ii)的β-1,3-葡聚糖形成复合体。

[20b]如[18b]或[19b]所述的医药组合物，其中，β-1,3-葡聚糖为裂褶多糖。

[21b]如[18b]～[20b]中任一项所述的医药组合物，其用于免疫赋活。

[22b]如[18b]～[20b]中任一项所述的医药组合物，其用于I型干扰素产生诱导。

[23b][16b]或[17b]所述的复合体在用于制造免疫赋活用或I型干扰素产生诱导用医药组合物中的用途。

[24b][16b]或[17b]所述的复合体在用于制造I型干扰素产生诱导用医药组合物中的用途。

[25b]将哺乳动物的免疫反应增强的方法，其包括将药理有效量的[16b]或[17b]所述的复合体施予至哺乳动物的步骤。

[26b]在哺乳动物中诱导I型干扰素产生的方法，其包括将药理有效量的[16b]或[17b]所述的复合体施予至该哺乳动物的步骤。

[27b]如[16b]或[17b]所述的复合体，其用于增强免疫反应。

[28b]如[16b]或[17b]所述的复合体，其用于I型干扰素产生的诱导。

发明的效果

根据本发明，可提供具有强力的I型干扰素产生诱导活性的寡脱氧核苷酸、包含其的复合体。本发明的复合体由于具有强力的I型干扰素产生诱导活性，因此作为使自然免疫、获得性免疫(尤其是细胞性免疫)活化的免疫赋活剂、疫苗佐剂有用。

附图说明

[图1]表示CpG ODN-dA40与裂褶多糖的复合体的人PBMC IFN-α产生诱导活性。横轴的数值表示化合物名。

[图2]表示CpG ODN-dA40与裂褶多糖的复合体的人PBMC IFN-α产生诱导活性。横轴的数值表示化合物名。

[图3]表示CpG ODN-dA40与裂褶多糖的复合体的人PBMC IFN-α产生诱导活性。横轴的数值表示化合物名。

[图4]表示CpG ODN-dA40与裂褶多糖的复合体的小鼠脾脏细胞IFN-α产生诱导活性。横轴的数值表示化合物名。

[图5]表示CpG ODN-dA40与裂褶多糖的复合体在体内的IFN-α产生诱导活性。横轴的数值表示化合物名。

[图6]表示CpG ODN-dA40与裂褶多糖的复合体在体内的IFN-α产生诱导活性。横轴的数值表示化合物名。

[图7]表示CpG ODN-dA40与裂褶多糖的复合体在体内的IFN-α产生诱导活性。横轴的数值表示化合物名。

[图8]表示CpG ODN-dA40与凝胶多糖的复合体的人PBMC IFN-α产生诱导活性。横轴的数值表示化合物名。

[图9]表示CpG ODN-dA40与裂褶多糖的复合体的人PBMC IFN-α产生诱导活性。横轴的数值表示化合物名。

[图10]表示CpG ODN-dA40与裂褶多糖的复合体的人PBMC IFN-α产生诱导活性。横轴的数值表示化合物名。

具体实施方式

1.寡脱氧核苷酸

本发明提供寡脱氧核苷酸，其包含CpG寡脱氧核苷酸及能够与β-1,3-葡聚糖形成复合体的长度的聚脱氧腺苷酸，

所述CpG寡脱氧核苷酸包含式(I)表示的核苷酸序列且由8～16个碱基形成，

5’X-CpG-L-CpG-TZ3’ (I)

(式中，X为T或C，

L为由1～7个碱基形成的核苷酸序列，

Z为T或C)，

聚脱氧腺苷酸与CpG寡脱氧核苷酸的3’侧连结。

本说明书中，“寡脱氧核苷酸”与“ODN”含义相同。另外，“CpG寡脱氧核苷酸(CpGODN)”和“CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)残基”无论有无末尾的术语“残基”，含义均相同，可交换地使用。术语“残基”是指较高分子量的化合物的部分结构，但本领域技术人员由上下文可容易地理解，本说明书中，“CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)”是指独立的分子，或者较高分子量的化合物的部分结构。对于“聚脱氧腺苷酸”等与本发明的寡脱氧核苷酸所包含的其他部分结构有关的术语也同样。

CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)为含有免疫赋活性的非甲基化CpG基序的单链DNA，是TLR9的激动剂。CpG ODN包括骨架序列及免疫赋活特性各自不同的、A类(也称为D型)、B类(也称为K型)、C类及P类4种类型(Advanced drug delivery reviews 61,195-204(2009))。

B类CpG ODN典型而言为具有下述结构特征及功能特性的CpG ODN：含有非回文结构的、多个非甲基化CpG基序，使B细胞活化而产生IL-6，但基本不诱导浆细胞样树突状细胞(pDCs)的IFN-α产生。非甲基化CpG基序是指含有至少1个胞嘧啶(C)-鸟嘌呤(G)序列的短核苷酸序列，该胞嘧啶-鸟嘌呤序列中的胞嘧啶的5位未被甲基化。本说明书中，只要没有特别说明，CpG是指非甲基化CpG。

近年来报道了：若在作为代表性B类CpG ODN的K3(atcgactctcgagcgttctc：序列号65)的3’末端附加聚(dA)尾，与裂褶多糖、香菇多糖等β-1,3-葡聚糖形成复合体，则该复合体尽管不具有A类CpG ODN序列，但是兼具B类CpG ODN所特有的免疫赋活活性(例如，将B细胞(优选为人B细胞)活化而产生IL-6的活性)、和A类CpG ODN所特有的免疫赋活活性(例如，将浆细胞样树突状细胞活化而产生IFN-α的活性)(WO2015/041318)。本申请的发明人为进一步强化该复合体的免疫赋活活性而进行了研究，结果发现，作为CpG ODN，使用比K3短的、具有特定共有序列的短链CpG ODN时，尽管短链CpG ODN单独的免疫赋活活性低于K3(D.VerthelyIet al J.Immunol.,vol.168,no.4,pp.1659-1663,2014；D.Verthelyi等人,J.Immunol.,vol.166,no.4,pp.2372-2377,2001)，但是若在3’末端附加聚(dA)尾并与β-1,3-葡聚糖进行复合体化，则令人惊讶地，与K3的情况相比，IFN-α产生诱导活性反而增强，从而完成了本发明。

本发明中使用的CpG ODN包含式(I)表示的核苷酸序列：

5’X-CpG-L-CpG-TZ3’ (I)

(式中，X为T或C，

L为由1～7个碱基形成的核苷酸序列，

Z为T或C)。

L的核苷酸序列的长度为1、2、3、4、5、6或7个碱基，优选为1或2个碱基。

一个方式中，L为式(ii)表示的核苷酸序列，

5’Y₁Y₂Y₃Y₄Y₅Y₆Y₇3’ (II)

(式中，Y₁为选自由A、G、T及C组成的组中的任一碱基，

Y₂、Y₃、Y₄、Y₅、Y₆及Y₇独立地不存在或者为选自由A、G、T及C组成的组中的任一碱基)。

该方式中，本发明的寡脱氧核苷酸包含CpG寡脱氧核苷酸及能够与β-1,3-葡聚糖形成复合体的长度的聚脱氧腺苷酸，

所述CpG寡脱氧核苷酸包含式(Ia)表示的核苷酸序列且由8～16个碱基形成，

5’X-CpG-Y₁Y₂Y₃Y₄Y₅Y₆Y₇-CpG-TZ3’ (Ia)

(式中，X为T或C，

Y₁为选自由A、G、T及C组成的组中的任一碱基，

Y₂、Y₃、Y₄、Y₅、Y₆及Y₇各自独立地不存在或者为选自由A、G、T及C组成的组中的任一碱基，

Z为T或C)，

聚脱氧腺苷酸与CpG寡脱氧核苷酸的3’侧连结。

一个方式中，式(II)及式(Ia)中的Y₃、Y₄、Y₅、Y₆及Y₇不存在。即，该方式中，本发明中使用的CpG ODN包含式(Ib)表示的核苷酸序列，

5’X-CpG-Y₁Y₂-CpG-TZ3’ (Ib)

(式中，X为T或C，

Y₁为选自由A、G、T及C组成的组中的任一碱基，

Y₂不存在或者为选自由A、G、T及C组成的组中的任一碱基，

Z为T或C)。

式(Ib)中，Y₁优选为选自由A、G及T组成的组中的任一碱基。

式(Ib)中，Y₂优选为选自由A、G及T组成的组中的任一碱基。

式(Ib)中，Y₁Y₂优选为AG、AA、AT、TA、TT、GA、A、T、C或G，更优选为AG、AA、AT、TA、TT、GA、A、T或G。

在另一方面，式(Ib)中的Y₁Y₂优选为AG、AA、AT、TA、TT、GA、GT、A、T、C或G，更优选为AG、AA、AT、TA、TT、GA、GT、A、T或G。

式(II)及式(Ia)的另一方式中，Y₁为A或T，Y₂为G或T，Y₃为C或T，Y₄为G或T，Y₅为A或T，Y₆为G或T，Y₇不存在或者为A或T。优选Y₁Y₂Y₃Y₄Y₅Y₆Y₇为选自由TTTTTTT、TTTTTTA、TTCGTTT、TTCGTTA及AGCGAG组成的组中的任一核苷酸序列。

式(I)中，L优选为选自由A、G、C、T、AA、AG、AT、GA、GT、TA、TT、TTTTTTT、TTTTTTA、TTCGTTT、TTCGTTA及AGCGAG组成的组中的任一核苷酸序列。

式(I)、(Ia)及(Ib)中，X优选为T。

式(I)、(Ia)及(Ib)中，Z优选为T。

式(Ib)的一个方式中，X为T，

Y₁为选自由A、G及T组成的组中的任一碱基，

Y₂为选自由A、G及T组成的组中的任一碱基，

Z为T。

式(Ib)的一个方式中，X为T，

Y₁Y₂为AG、AA、AT、TA、TT、GA、GT、A、T、C或G(优选为AG、AA、AT、TA、TT、GA、GT、A、T或G)，

Z为T。

式(Ib)的一个方式中，X为T，

Y₁Y₂为AG、AA、AT、TA、TT、GA、A、T、C或G(优选为AG、AA、AT、TA、TT、GA、A、T或G)，

Z为T。

式(Ib)表示的核苷酸序列优选由序列号12、55、56、57、58、59、21、60、61、62、63或64表示的核苷酸序列形成。

[表1]

在另一方面，式(Ib)表示的核苷酸序列优选由序列号68或94表示的核苷酸序列形成。

[表2]

式(Ia)的一个方式中，

X为T，

Y₁为A或T，

Y₂为G或T，

Y₃为C或T，

Y₄为G或T，

Y₅为A或T，

Y₆为G或T，

Y₇不存在、或者为A或T，

Z为T。

式(Ia)的一个方式中，

X为T，

Y₁Y₂Y₃Y₄Y₅Y₆Y₇为选自由TTTTTTT、TTTTTTA、TTCGTTT、TTCGTTA及AGCGAG组成的组中的任一核苷酸序列，

Z为T。

一个方式中，式(Ia)表示的核苷酸序列优选由序列号95、96、97、98或99表示的核苷酸序列形成。

[表3]

式(I)表示的核苷酸序列优选由序列号12、55、56、57、58、59、21、60、61、62、63、64、68、94、95、96、97、98或99表示的核苷酸序列形成。

本发明中使用的CpG ODN可以在式(I)、(Ia)或(Ib)表示的核苷酸序列的3’侧具有附加序列，也可以不具有附加序列。具有附加序列的情况下，其长度优选为1～3个碱基(即，1、2或3个碱基)。优选的是，本发明中使用的CpG ODN在式(I)、(Ia)或(Ib)表示的核苷酸序列的3’侧不具有附加序列或者具有1～3个碱基(即，1、2或3个碱基)的附加序列。附加序列的长度为1个碱基时(附加序列：N₁)，N₁为选自由A、T、C及G组成的组中的任一核苷酸，优选为C或T，更优选为C。附加序列的长度为2个碱基时(附加序列：N₁N₂)，N₁及N₂独立地为选自由A、T、C及G组成的组中的任一核苷酸。N₁优选为C。N₂优选为T。附加序列：N₁N₂优选为CT。附加序列的长度为3个碱基时(附加序列：N₁N₂N₃)，N₁、N₂及N₃独立地为选自由A、T、C及G组成的组中的任一核苷酸。N₁优选为C。N₂优选为T。N₃优选为C。附加序列：N₁N₂N₃优选为CTC。更优选的方式中，本发明中使用的CpG ODN在式(I)、(Ia)或(Ib)表示的核苷酸序列的3’侧不具有附加序列或者具有选自由C、T、CT及CTC组成的组中的任一附加序列。在进一步优选的方式中，本发明中使用的CpG ODN在式(I)、(Ia)或(Ib)表示的核苷酸序列的3’侧不具有附加序列或者具有选自由C、CT及CTC组成的组中的任一附加序列。

本发明中使用的CpG ODN可以在式(I)、(Ia)或(Ib)表示的核苷酸序列的5’侧具有附加序列，也可以不具有附加序列。具有附加序列时，其长度优选为1～4个碱基(即，1、2、3或4个碱基)，更优选为1个碱基。附加序列的长度为1个碱基时，该附加序列为选自由A、T、C及G组成的组中的任一核苷酸，优选为A。优选的是，本发明中使用的CpG ODN在式(I)、(Ia)或(Ib)表示的核苷酸序列的5’侧不具有附加序列或者具有1个碱基的附加序列(例如，A)，更优选在式(I)、(Ia)或(Ib)表示的核苷酸序列的5’侧不具有附加序列。

优选的方式中，本发明中使用的CpG ODN在式(I)、(Ia)或(Ib)表示的核苷酸序列的3’侧不具有附加序列或者具有1～3个碱基(即，1、2或3个碱基)的附加序列，在式(I)、(Ia)或(Ib)表示的核苷酸序列5’侧不具有附加序列。更优选的方式中，本发明中使用的CpGODN在式(I)、(Ia)或(Ib)表示的核苷酸序列的3’侧不具有附加序列或者具有选自由C、CT及CTC组成的组中的任一附加序列，在式(I)、(Ia)或(Ib)表示的核苷酸序列的5’侧不具有附加序列。

在另一方面，本发明中使用的CpG ODN在式(I)、(Ia)或(Ib)表示的核苷酸序列的3’侧不具有附加序列或者具有1～3个碱基(即，1、2或3碱基)的附加序列，在式(I)、(Ia)或(Ib)表示的核苷酸序列5’侧不具有附加序列或者具有1个碱基的附加序列。更优选的是，本发明中使用的CpG ODN在式(I)、(Ia)或(Ib)表示的核苷酸序列的3’侧不具有附加序列或者具有选自由C、CT及CTC组成的组中的任一附加序列，在式(I)、(Ia)或(Ib)表示的核苷酸序列的5’侧不具有附加序列、或者具有A的1个碱基附加序列。

本发明中使用的CpG ODN由8～16个碱基(例如，8、9、10、11、12、13、14、15或16个碱基)形成，优选由8～15个碱基(例如，8、9、10、11、12、13、14或15个碱基)形成，更优选由8～12个碱基(例如，8、9、10、11或12个碱基)形成。

本发明中使用的CpG ODN优选由序列号4、6、7、8、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、25、26或27表示的核苷酸序列形成。

[表4]

另一方面，本发明中使用的CpG ODN优选由序列号66、67、68、71、72、73、74、75、76或77表示的核苷酸序列形成。

[表5]

聚脱氧腺苷酸(dA)的长度没有特别限定，只要是足以与β-1,3-葡聚糖(例如，裂褶多糖)链一起形成复合体的长度即可。该复合体可以为由1条聚脱氧腺苷酸(dA)链和2条β-1,3-葡聚糖(例如，裂褶多糖)链形成的三重螺旋结构。从形成稳定的三重螺旋结构的观点考虑，聚脱氧腺苷酸(dA)的长度通常为20个核苷酸长度以上，优选为40个核苷酸长度以上。聚(dA)越长，则越与β-1,3-葡聚糖形成稳定的三重螺旋结构，因此理论上没有上限，但若过长，则成为寡脱氧核苷酸的合成时的长度产生偏差的原因，因此，通常为80个核苷酸长度以下，优选为60个核苷酸长度以下。另一方面，除了形成上述稳定的三重螺旋结构外，从使得与每单位量的β-1,3-葡聚糖结合的本发明的寡脱氧核苷酸量增大、并且避免寡脱氧核苷酸的合成时的长度的偏差、复合化效率的观点考虑，聚(dA)的长度优选为20～60个核苷酸长度(具体而言，为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个核苷酸长度)，更优选为30～50个核苷酸长度(30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个核苷酸长度)，最优选为30～45个核苷酸长度(30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45个核苷酸长度)。另一方面，聚(dA)的长度优选为20～50个核苷酸长度(20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个核苷酸长度)，更优选为20～40个核苷酸长度(具体而言、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40个核苷酸长度)，进一步优选为25～40个核苷酸长度(25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40个核苷酸长度)。尤其为30个核苷酸长度以上时，显示出良好的复合化效率。本发明的寡脱氧核苷酸通过包含聚(dA)，从而具有与2条β-1,3-葡聚糖(例如，裂褶多糖)链一起形成三重螺旋结构的活性。需要说明的是，有时也将聚脱氧腺苷酸表述为“聚(dA)”或“poly(dA)”。

1分子的本发明的寡脱氧核苷酸中，可以包含多个CpG ODN及/或聚(dA)，但优选各含有1个CpG ODN及聚(dA)，最优选由1个CpG ODN及1个聚(dA)组成。

本发明的寡脱氧核苷酸的特征在于，聚(dA)与CpG ODN的3’侧连结。CpG ODN与聚(dA)可以通过共价键直接连结，也可以介由间隔序列而连结。间隔序列是指包含插入2个邻近的构成要素之间的1个以上核苷酸的核苷酸序列。间隔序列的长度没有特别限定，通常为1～10个核苷酸长度，优选为1～5个核苷酸长度，更优选为1～3个核苷酸长度。最优选的是，CpG ODN与聚(dA)不介由间隔序列(即，通过共价键直接)地连结，构成单链的寡脱氧核苷酸。

该CpG ODN与聚(dA)之间的共价键为可被适当地修饰以成为对体内降解(例如，由核酸外切酶或核酸内切酶引起的降解)具有耐受性的磷酸二酯键。该修饰为硫代磷酸酯修饰或二硫代磷酸酯修饰。CpG ODN与聚(dA)之间的共价键优选为经硫代磷酸酯修饰的磷酸二酯键(即，硫代磷酸酯键)。

本发明的寡脱氧核苷酸除了具有CpG ODN、聚(dA)及任选的间隔序列外，还可以在其5’末端及/或3’末端具有附加的核苷酸序列。该附加的核苷酸序列的长度没有特别限定，只要本发明的复合体具有免疫赋活活性(优选将B细胞活化而产生IL-6的活性、及将树突状细胞活化而产生IFN-α的活性)即可，通常为1～10个核苷酸长度，优选为1～5个核苷酸长度，更优选为1～3个核苷酸长度。

一个优选的方式中，本发明的寡脱氧核苷酸不包含5’末端附加的核苷酸序列。该方式中，CpG ODN位于本发明的寡脱氧核苷酸的5’末端最末。该方式中，本发明的寡脱氧核苷酸由CpG ODN、聚(dA)、任选的间隔序列及任选的3’末端附加的核苷酸序列形成，优选由CpG ODN、聚(dA)及任选的3’末端附加的核苷酸序列形成，更优选由CpG ODN及聚(dA)形成。

一个优选的方式中，本发明的寡脱氧核苷酸不包含这样的5’末端及3’末端附加的核苷酸序列。该方式中，CpG ODN位于本发明的寡脱氧核苷酸的5’末端最末，聚(dA)位于本发明的寡脱氧核苷酸的3’末端最末。该方式中，本发明的寡脱氧核苷酸优选由CpG ODN、聚(dA)及任选的间隔序列形成，进一步优选由CpG ODN及聚(dA)形成。

最优选的方式中，本发明的寡脱氧核苷酸由上述的CpG ODN及聚(dA)形成，分别地，CpG ODN位于该寡脱氧核苷酸的5’末端，聚(dA)位于3’末端。

本发明的寡脱氧核苷酸的全长通常为28～200个核苷酸长度，优选为30～100个核苷酸长度，更优选为35～80个核苷酸长度(具体而言，35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个核苷酸长度)，更优选为40～65个核苷酸长度(具体而言，40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65个核苷酸长度)，最优选为43～57个核苷酸长度(具体而言，43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57个核苷酸长度)。

作为本发明的寡脱氧核苷酸的具体例，可举出由序列号31、33、34、35、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、52、53、或54表示的核苷酸序列形成的寡脱氧核苷酸。

另一方面，作为本发明的寡脱氧核苷酸的具体例，可举出由序列号78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92或93表示的核苷酸序列形成的寡脱氧核苷酸。

本发明的寡脱氧核苷酸可以适当地修饰以对体内降解(例如，由核酸外切酶或核酸内切酶引起的降解)具有耐受性。优选地，该改变包含硫代磷酸酯修饰或二硫代磷酸酯修饰。即，本发明的寡脱氧核苷酸中的磷酸二酯键的一部分或全部可被硫代磷酸酯键或二硫代磷酸酯键替换。

优选地，本发明的寡脱氧核苷酸包含磷酸二酯键的修饰，更优选地，磷酸二酯键的修饰为硫代磷酸酯键(即，如WO95/26204所记载那样，非交联氧原子中的1个被硫原子替换)。即，本发明的寡脱氧核苷酸中的磷酸二酯键的一部分或全部可被硫代磷酸酯键替换。

本发明的寡脱氧核苷酸优选在CpG ODN中包含基于硫代磷酸酯键或二硫代磷酸酯键的修饰，更优选地，该CpG ODN的磷酸二酯键的全部被硫代磷酸酯键或二硫代磷酸酯键替换，进一步优选地，该CpG ODN的全部磷酸二酯键被硫代磷酸酯键替换。另外，本发明的寡脱氧核苷酸优选在聚(dA)中包含硫代磷酸酯键或二硫代磷酸酯键，更优选地，该聚(dA)的全部磷酸二酯键被硫代磷酸酯键或二硫代磷酸酯键替换，进一步优选地，该聚(dA)的全部磷酸二酯键被硫代磷酸酯键替换。

优选的方式中，本发明的寡脱氧核苷酸中包含的全部磷酸二酯键被硫代磷酸酯键或二硫代磷酸酯键替换，更优选地，本发明的寡脱氧核苷酸中包含的全部磷酸二酯键被硫代磷酸酯键替换。

通过硫代磷酸酯键，在本发明的寡脱氧核苷酸中，不仅可期待对降解的耐受性，而且可期待免疫赋活活性的增强、及β-1,3-葡聚糖复合体的高收率。分别地，本说明书中的硫代磷酸酯键与硫代磷酸酯骨架含义相同，磷酸二酯键与磷酸骨架含义相同。

一个方式中，本发明的寡脱氧核苷酸包含CpG寡脱氧核苷酸及20～60个核苷酸长度(优选为30～50个核苷酸长度，更优选为30～45个核苷酸长度)的聚脱氧腺苷酸，

所述CpG寡脱氧核苷酸包含式(Ib)表示的核苷酸序列且由8～16个碱基(优选为8～12个碱基)形成，

5’X-CpG-Y₁Y₂-CpG-TZ3’ (Ib)

(式中，X为T，

Y₁为选自由A、G及T组成的组中的任一碱基，

Y₂不存在或者为选自由A、G及T组成的组中的任一碱基，

Z为T)，

在式(Ib)表示的核苷酸序列的3’侧不具有附加序列或者具有1～3个碱基(即，1、2或3个碱基)的附加序列，

在式(Ib)表示的核苷酸序列的5’侧不具有附加序列；

聚脱氧腺苷酸不介由间隔序列地与CpG寡脱氧核苷酸的3’侧连结，

CpG寡脱氧核苷酸位于5’末端最末，

聚脱氧腺苷酸位于3’末端最末、或者在聚脱氧腺苷酸的3’末端侧连结附加序列，

磷酸二酯键的一部分或全部被硫代磷酸酯键替换，

全长为28～200个核苷酸长度(优选为30～100个核苷酸长度，更优选为35～80个核苷酸长度，进一步优选为40～65个核苷酸长度，更进一步优选为43～57个核苷酸长度)。

一个方式中，本发明的寡脱氧核苷酸包含CpG寡脱氧核苷酸及20～60个核苷酸长度(优选为30～50个核苷酸长度，更优选为30～45个核苷酸长度)的聚脱氧腺苷酸，

所述CpG寡脱氧核苷酸包含式(Ib)表示的核苷酸序列且由8～16个碱基(优选为8～12个碱基)形成，

5’X-CpG-Y₁Y₂-CpG-TZ3’ (Ib)

(式中，X为T，

Y₁Y₂为AG、AA、AT、TA、TT、GA、A、T、C或G(优选为AG、AA、AT、TA、TT、GA、A、T或G)，

Z为T)，

在式(Ib)表示的核苷酸序列的3’侧不具有附加序列或者具有选自由C、CT及CTC组成的组中的任一附加序列，

在式(Ib)表示的核苷酸序列的5’侧不具有附加序列；

聚脱氧腺苷酸不介由间隔序列地与CpG寡脱氧核苷酸的3’侧连结，

CpG寡脱氧核苷酸位于5’末端最末，

聚脱氧腺苷酸位于3’末端最末、或者在聚脱氧腺苷酸的3’末端侧连结附加序列，

磷酸二酯键的一部分或全部被硫代磷酸酯键替换，

全长为28～200个核苷酸长度(优选为30～100个核苷酸长度，更优选为35～80个核苷酸长度，进一步优选为40～65个核苷酸长度，更进一步优选为43～57个核苷酸长度)。

式(Ib)表示的核苷酸序列可以为序列号12、55、56、57、58、59、21、60、61、62、63或64表示的核苷酸序列。

在另一方面，一个方式中，本发明的寡脱氧核苷酸包含CpG寡脱氧核苷酸及20～60个核苷酸长度(优选为20～50个核苷酸长度，更优选为20～40个核苷酸长度，进一步优选为25～40个核苷酸长度)的聚脱氧腺苷酸，

所述CpG寡脱氧核苷酸包含式(I)表示的核苷酸序列且由8～16个碱基(优选为8～15碱基，更优选为8～12个碱基)形成，

5’X-CpG-L-CpG-TZ3’ (I)

(式中，X为T，

L为由1～7个碱基形成的核苷酸序列，

Z为T)，

在式(I)表示的核苷酸序列的3’侧不具有附加序列或者具有1～3个碱基(即，1、2或3个碱基)的附加序列，

在式(I)表示的核苷酸序列的5’侧不具有附加序列或者具有1个碱基的附加序列；

聚脱氧腺苷酸不介由间隔序列地与CpG寡脱氧核苷酸的3’侧连结，

CpG寡脱氧核苷酸位于5’末端最末，

聚脱氧腺苷酸位于3’末端最末、或者在聚脱氧腺苷酸的3’末端侧连结附加序列，

磷酸二酯键的一部分或全部被硫代磷酸酯键替换。该寡脱氧核苷酸的全长通常可以为28～200个核苷酸长度(优选为30～100个核苷酸长度，更优选为35～80个核苷酸长度，进一步优选为40～65个核苷酸长度，更进一步优选为43～57个核苷酸长度)。L可以为选自由A、G、C、T、AA、AG、AT、GA、GT、TA、TT、TTTTTTT、TTTTTTA、TTCGTTT、TTCGTTA及AGCGAG组成的组中的任一核苷酸序列。

在另一方面，一个方式中，本发明的寡脱氧核苷酸包含CpG寡脱氧核苷酸及20～60个核苷酸长度(优选为20～50个核苷酸长度，更优选为20～40个核苷酸长度，进一步优选为25～40个核苷酸长度)的聚脱氧腺苷酸，

所述CpG寡脱氧核苷酸包含式(Ib)表示的核苷酸序列且由8～16个碱基(优选为8～15个碱基，更优选为8～12个碱基)形成，

5’X-CpG-Y₁Y₂-CpG-TZ3’ (Ib)

(式中，X为T，

Y₁为选自由A、G及T组成的组中的任一碱基，

Y₂不存在或者为选自由A、G及T组成的组中的任一碱基，

Z为T)，

在式(Ib)表示的核苷酸序列的3’侧不具有附加序列或者具有1～3个碱基(即，1、2或3个碱基)的附加序列，

在式(Ib)表示的核苷酸序列的5’侧不具有附加序列或者具有1个碱基的附加序列；

聚脱氧腺苷酸不介由间隔序列地与CpG寡脱氧核苷酸的3’侧连结，

CpG寡脱氧核苷酸位于5’末端最末，

聚脱氧腺苷酸位于3’末端最末、或者在聚脱氧腺苷酸的3’末端侧连结附加序列，

磷酸二酯键的一部分或全部被硫代磷酸酯键替换。该寡脱氧核苷酸的全长可以为28～200个核苷酸长度(优选为30～100个核苷酸长度，更优选为35～80个核苷酸长度，进一步优选为40～65个核苷酸长度，更进一步优选为43～57个核苷酸长度)。

在另一方面，一个方式中，本发明的寡脱氧核苷酸包含CpG寡脱氧核苷酸及20～60个核苷酸长度(优选为20～50个核苷酸长度，更优选为20～40个核苷酸长度，进一步优选为25～40个核苷酸长度)的聚脱氧腺苷酸，

所述CpG寡脱氧核苷酸包含式(Ib)表示的核苷酸序列且由8～16个碱基(优选为8～15个碱基，更优选为8～12个碱基)形成，

5’X-CpG-Y₁Y₂-CpG-TZ3’ (Ib)

(式中，X为T，

Y₁Y₂为AG、AA、AT、TA、TT、GA、GT、A、T、C或G(优选为AG、AA、AT、TA、TT、GA、GT、A、T或G)，

Z为T)，

在式(Ib)表示的核苷酸序列的3’侧不具有附加序列或者具有选自由C、T、CT及CTC组成的组中的任一附加序列，

在式(Ib)表示的核苷酸序列的5’侧不具有附加序列或者具有A的1个碱基附加序列；

聚脱氧腺苷酸不介由间隔序列地与CpG寡脱氧核苷酸的3’侧连结，

CpG寡脱氧核苷酸位于5’末端最末，

聚脱氧腺苷酸位于3’末端最末、或者在聚脱氧腺苷酸的3’末端侧连结附加序列，

磷酸二酯键的一部分或全部被硫代磷酸酯键替换。该寡脱氧核苷酸的全长可以为28～200个核苷酸长度(优选为30～100个核苷酸长度，更优选为35～80个核苷酸长度，进一步优选为40～65个核苷酸长度，更进一步优选为43～57个核苷酸长度)。

式(Ib)表示的核苷酸序列可以为序列号12、55、56、57、58、59、21、60、61、62、63、64、68或94表示的核苷酸序列。

在另一方面，一个方式中，本发明的寡脱氧核苷酸包含CpG寡脱氧核苷酸及20～60个核苷酸长度(优选为20～50个核苷酸长度，更优选为20～40个核苷酸长度，进一步优选为25～40个核苷酸长度)的聚脱氧腺苷酸，

所述CpG寡脱氧核苷酸包含式(Ia)表示的核苷酸序列且由13、14或15个碱基形成，

5’X-CpG-Y₁Y₂Y₃Y₄Y₅Y₆Y₇-CpG-TZ3’ (Ia)

(式中，X为T，

Y₁Y₂Y₃Y₄Y₅Y₆Y₇为选自由TTTTTTT、TTTTTTA、TTCGTTT、TTCGTTA及AGCGAG组成的组中的任一核苷酸序列，

Z为T)，

在式(Ia)表示的核苷酸序列的3’侧不具有附加序列或者具有选自由C、T、CT及CTC组成的组中的任一附加序列(优选为C或T)，

在式(Ia)表示的核苷酸序列的5’侧不具有附加序列或者具有A的1个碱基附加序列；

聚脱氧腺苷酸不介由间隔序列地与CpG寡脱氧核苷酸的3’侧连结，

CpG寡脱氧核苷酸位于5’末端最末，

聚脱氧腺苷酸位于3’末端最末、或者在聚脱氧腺苷酸的3’末端侧连结附加序列，

磷酸二酯键的一部分或全部被硫代磷酸酯键替换。该寡脱氧核苷酸的全长通常可以为28～200个核苷酸长度(优选为30～100个核苷酸长度，更优选为35～80个核苷酸长度，进一步优选为40～65个核苷酸长度，更进一步优选为43～57个核苷酸长度)。

式(Ia)表示的核苷酸序列可以为序列号95、96、97、98或99表示的核苷酸序列。

作为本发明的寡脱氧核苷酸，可举出后述的化合物4、6、7、8、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、25、26、27、28、29、30、31、36、37、38、41、42、43、44、45、46或47。

本发明的寡脱氧核苷酸中，可包含上述寡脱氧核苷酸的所有的药学上可容许的盐类、酯、或这样的酯的盐类。

作为本发明的寡脱氧核苷酸的药学上可容许的盐类，可合适地举出：钠盐、钾盐、锂盐这样的碱金属盐、钙盐、镁盐这样的碱土金属盐、铝盐、铁盐、锌盐、铜盐、镍盐、钴盐等金属盐、铵盐这样的无机盐、叔辛基胺盐、二苄基胺盐、吗啉盐、葡糖胺盐、苯基甘氨酸烷基酯盐、乙二胺盐、N-甲基葡糖胺盐、胍盐、二乙胺盐、三乙胺盐、二环己基胺盐、N,N’-二苄基乙二胺盐、氯普鲁卡因盐、普鲁卡因盐、二乙醇胺盐、N-苄基-苯乙基胺盐、哌嗪盐、四甲基铵盐、三(羟基甲基)氨基甲烷盐这样的有机盐等胺盐；氢氟酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐这样的氢卤酸盐、硝酸盐、高氯酸盐、硫酸盐、磷酸盐等无机酸盐；甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐、乙磺酸盐这样的低级烷烃磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐这样的芳基磺酸盐、乙酸盐、苹果酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、草酸盐、马来酸盐等有机酸盐；及甘氨酸盐、赖氨酸盐、精氨酸盐、鸟氨酸盐、谷氨酸盐、天冬氨酸盐这样的氨基酸盐。

本发明的寡脱氧核苷酸可以为单链、双链、3条链中的任意形态，优选为单链。

本发明的寡脱氧核苷酸优选被分离。所谓“分离”，是指进行了将目标成分以外的因子除去的操作，脱离天然存在的状态。“经分离的寡脱氧核苷酸”的纯度(目标寡脱氧核苷酸重量在评价对象物的总重量中所占的百分率)通常70％以上，优选为80％以上，更优选为90％以上，进一步优选为99％以上。

本发明的寡脱氧核苷酸与2条β-1,3-葡聚糖(例如，裂褶多糖)一起形成三重螺旋结构的复合体，呈现出优异的免疫赋活活性，因此对于下述的本发明的复合体、本发明的医药组合物的制备是有用的。

2.复合体

本发明提供含有上述本发明的寡脱氧核苷酸及β-1,3-葡聚糖的复合体(以下，称为本发明的复合体。)。

上述的本发明的寡脱氧核苷酸中包含的CpG ODN其单独缺乏A类CpG ODN所特有的免疫赋活活性(例如，将浆细胞样树突状细胞活化而产生IFN-α的活性)。然而，通过与β-1,3-葡聚糖(例如，裂褶多糖)形成复合体，从而在无需A类CpG ODN的序列的情况下获得强力的A类CpG ODN所特有的免疫赋活活性(例如，将浆细胞样树突状细胞活化而产生IFN-α的活性)。

作为本发明中使用的β-1,3-葡聚糖，可举出裂褶多糖、香菇多糖、硬葡聚糖、凝胶多糖、茯苓多糖、灰树花多糖、昆布糖等。β-1,3-葡聚糖优选为如裂褶多糖、香菇多糖或硬葡聚糖这样含有大量1,6-吡喃葡萄糖苷支链(侧链率33～40％)的β-1,3-葡聚糖，更优选为裂褶多糖。也优选如凝胶多糖这样不含1,6-吡喃葡萄糖苷支链的直链结构的β-1,3-葡聚糖。

裂褶多糖(SPG)为已知的可溶性β-葡聚糖，可以从裂褶菌中分离得到。SPG由β-(1→3)-D-葡聚糖的主链、和每3个葡萄糖1个β-(1→6)-D-葡萄糖基侧链形成(Tabata,K.,Ito,W.,Kojima,T.,Kawabata,S.and MisakIA.,Carbohydr.Res.,1981,89,1,p.121-135)。香菇多糖(LNT)为已知的β-1,3-1,6-葡聚糖，可以从香菇的子实体中分离得到。香菇多糖的分子式为(C₆H₁₀O₅)n，代表性分子量为约30～70万。

本说明书中，所谓“复合体”，是指：多个分子介由静电结合、范德华键、氢键、疏水性相互作用等非共价键或共价键而缔合所得到的产物。

本发明的复合体优选呈三重螺旋结构状。优选的方式中，形成该三重螺旋结构的3条链中，2条为β-1,3-葡聚糖链，1条为上述本发明的寡脱氧核苷酸中的聚脱氧腺苷酸的链。该复合体可以部分地包含不形成三重螺旋结构的部分。

本发明的复合体中的、寡脱氧核苷酸与β-1,3-葡聚糖的组成比可根据寡脱氧核苷酸中的聚脱氧腺苷酸的链长、及β-1,3-葡聚糖的长度等而变化。例如，β-1,3-葡聚糖链与聚脱氧腺苷酸的链的长度同等的情况下，2条β-1,3-葡聚糖链与1条本发明的寡脱氧核苷酸能够缔合而形成三重螺旋结构。通常，相对于β-1,3-葡聚糖链，聚脱氧腺苷酸的链长较短，因此，相对于2条β-1,3-葡聚糖链，多个本发明的寡脱氧核苷酸可介由聚脱氧腺苷酸缔合，形成三重螺旋结构。

本发明的复合体含有上述的本发明的寡脱氧核苷酸及β-1,3-葡聚糖(例如，裂褶多糖、凝胶多糖)，优选由本发明的寡脱氧核苷酸及β-1,3-葡聚糖(例如，裂褶多糖、凝胶多糖)形成。

一个方式中，本发明的复合体含有寡脱氧核苷酸及β-1,3-葡聚糖(例如，裂褶多糖、凝胶多糖)，该寡脱氧核苷酸包含CpG寡脱氧核苷酸及20～60个核苷酸长度(优选为30～50个核苷酸长度，更优选为30～45个核苷酸长度)的聚脱氧腺苷酸，

所述CpG寡脱氧核苷酸包含式(Ib)表示的核苷酸序列且由8～16个碱基(优选为8～12个碱基)形成，

5’X-CpG-Y₁Y₂-CpG-TZ3’ (Ib)

(式中，X为T，

Y₁为选自由A、G及T组成的组中的任一碱基，

Y₂不存在或者为选自由A、G及T组成的组中的任一碱基，

Z为T)，

在式(Ib)表示的核苷酸序列的3’侧不具有附加序列或者具有1～3个碱基(即，1、2或3个碱基)的附加序列，

在式(Ib)表示的核苷酸序列的5’侧不具有附加序列；

聚脱氧腺苷酸不介由间隔序列地与CpG寡脱氧核苷酸的3’侧连结，

CpG寡脱氧核苷酸位于5’末端最末，

聚脱氧腺苷酸位于3’末端最末、或者在聚脱氧腺苷酸的3’末端侧连结附加序列，

磷酸二酯键的一部分或全部被硫代磷酸酯键替换，

全长为28～200个核苷酸长度(优选为30～100个核苷酸长度，更优选为35～80个核苷酸长度，进一步优选为40～65个核苷酸长度，更进一步优选为43～57个核苷酸长度)。

一个方式中，本发明的复合体含有寡脱氧核苷酸及β-1,3-葡聚糖(例如，裂褶多糖、凝胶多糖)，该寡脱氧核苷酸包含CpG寡脱氧核苷酸及20～60个核苷酸长度(优选为30～50个核苷酸长度，更优选为30～45个核苷酸长度)的聚脱氧腺苷酸，

所述CpG寡脱氧核苷酸包含式(Ib)表示的核苷酸序列且由8～16个碱基(优选为8～12个碱基)形成，

5’X-CpG-Y₁Y₂-CpG-TZ3’ (Ib)

(式中，X为T，

Y₁Y₂为AG、AA、AT、TA、TT、GA、A、T、C或G(优选为AG、AA、AT、TA、TT、GA、A、T或G)，

Z为T)，

在式(Ib)表示的核苷酸序列的3’侧不具有附加序列或者具有选自由C、CT及CTC组成的组中的任一附加序列，

在式(Ib)表示的核苷酸序列的5’侧不具有附加序列；

聚脱氧腺苷酸不介由间隔序列地与CpG寡脱氧核苷酸的3’侧连结，

CpG寡脱氧核苷酸位于5’末端最末，

聚脱氧腺苷酸位于3’末端最末、或者在聚脱氧腺苷酸的3’末端侧连结附加序列，

磷酸二酯键的一部分或全部被硫代磷酸酯键替换，

全长为28～200个核苷酸长度(优选为30～100个核苷酸长度，更优选为35～80个核苷酸长度，进一步优选为40～65个核苷酸长度，更进一步优选为43～57个核苷酸长度)。

式(Ib)表示的核苷酸序列可以为序列号12、55、56、57、58、59、21、60、61、62、63或64表示的核苷酸序列。

在另一方面，一个方式中，本发明的复合体含有寡脱氧核苷酸及β-1,3-葡聚糖(例如，裂褶多糖、凝胶多糖)，该寡脱氧核苷酸包含CpG寡脱氧核苷酸及20～60个核苷酸长度(优选为20～50个核苷酸长度，更优选为20～40个核苷酸长度，进一步优选为25～40个核苷酸长度)的聚脱氧腺苷酸，

所述CpG寡脱氧核苷酸包含式(I)表示的核苷酸序列且由8～16个碱基(优选为8～15个碱基，更优选为8～12个碱基)形成，

5’X-CpG-L-CpG-TZ3’ (I)

(式中，X为T，

L为由1～7个碱基形成的核苷酸序列，

Z为T)，

在式(I)表示的核苷酸序列的3’侧不具有附加序列或者具有1～3个碱基(即，1、2或3个碱基)的附加序列，

在式(I)表示的核苷酸序列的5’侧不具有附加序列或者具有1个碱基的附加序列；

聚脱氧腺苷酸不介由间隔序列地与CpG寡脱氧核苷酸的3’侧连结，

CpG寡脱氧核苷酸位于5’末端最末，

聚脱氧腺苷酸位于3’末端最末、或者在聚脱氧腺苷酸的3’末端侧连结附加序列，

磷酸二酯键的一部分或全部被硫代磷酸酯键替换。该寡脱氧核苷酸的全长可以为28～200个核苷酸长度(优选为30～100个核苷酸长度，更优选为35～80个核苷酸长度，进一步优选为40～65个核苷酸长度，更进一步优选为43～57个核苷酸长度)。L可以为选自由A、G、C、T、AA、AG、AT、GA、GT、TA、TT、TTTTTTT、TTTTTTA、TTCGTTT、TTCGTTA及AGCGAG组成的组中的任一核苷酸序列。

在另一方面，一个方式中，本发明的复合体含有寡脱氧核苷酸及β-1,3-葡聚糖(例如，裂褶多糖、凝胶多糖)，该寡脱氧核苷酸包含CpG寡脱氧核苷酸及20～60个核苷酸长度(优选为20～50个核苷酸长度，更优选为20～40个核苷酸长度，进一步优选为25～40个核苷酸长度)的聚脱氧腺苷酸，

所述CpG寡脱氧核苷酸包含式(Ib)表示的核苷酸序列且由8～16个碱基(优选为8～15个碱基，更优选为8～12个碱基)形成，

5’X-CpG-Y₁Y₂-CpG-TZ3’ (Ib)

(式中，X为T，

Y₁为选自由A、G及T组成的组中的任一碱基，

Y₂不存在或者为选自由A、G及T组成的组中的任一碱基，

Z为T)，

在式(Ib)表示的核苷酸序列的3’侧不具有附加序列或者具有1～3个碱基(即，1、2或3个碱基)的附加序列，

在式(Ib)表示的核苷酸序列的5’侧不具有附加序列或者具有1个碱基的附加序列；

聚脱氧腺苷酸不介由间隔序列地与CpG寡脱氧核苷酸的3’侧连结，

CpG寡脱氧核苷酸位于5’末端最末，

聚脱氧腺苷酸位于3’末端最末、或者在聚脱氧腺苷酸的3’末端侧连结附加序列，

磷酸二酯键的一部分或全部被硫代磷酸酯键替换。该寡脱氧核苷酸的全长可以为28～200个核苷酸长度(优选为30～100个核苷酸长度，更优选为35～80个核苷酸长度，进一步优选为40～65个核苷酸长度，更进一步优选为43～57个核苷酸长度)。

在另一方面，一个方式中，本发明的复合体含有寡脱氧核苷酸及β-1,3-葡聚糖(例如，裂褶多糖、凝胶多糖)，该寡脱氧核苷酸包含CpG寡脱氧核苷酸及20～60个核苷酸长度(优选为20～50个核苷酸长度，更优选为20～40个核苷酸长度，进一步优选为25～40个核苷酸长度)的聚脱氧腺苷酸，

所述CpG寡脱氧核苷酸包含式(Ib)表示的核苷酸序列且由8～16个碱基(优选为8～15个碱基，更优选为8～12个碱基)形成，

5’X-CpG-Y₁Y₂-CpG-TZ3’ (Ib)

(式中，X为T，

Y₁Y₂为AG、AA、AT、TA、TT、GA、GT、A、T、C或G(优选为AG、AA、AT、TA、TT、GA、GT、A、T或G)，

Z为T)，

在式(Ib)表示的核苷酸序列的3’侧不具有附加序列或者具有选自由C、T、CT及CTC组成的组中的任一附加序列，

在式(Ib)表示的核苷酸序列的5’侧不具有附加序列或者具有A的1个碱基附加序列；

聚脱氧腺苷酸不介由间隔序列地与CpG寡脱氧核苷酸的3’侧连结，

CpG寡脱氧核苷酸位于5’末端最末，

聚脱氧腺苷酸位于3’末端最末、或者在聚脱氧腺苷酸的3’末端侧连结附加序列，

磷酸二酯键的一部分或全部被硫代磷酸酯键替换。该寡脱氧核苷酸的全长可以为28～200个核苷酸长度(优选为30～100个核苷酸长度，更优选为35～80个核苷酸长度，进一步优选为40～65个核苷酸长度，更进一步优选为43～57个核苷酸长度)。

式(Ib)表示的核苷酸序列可以为序列号12、55、56、57、58、59、21、60、61、62、63、64、68或94表示的核苷酸序列。

在另一方面，一个方式中，本发明的复合体含有寡脱氧核苷酸及β-1,3-葡聚糖(例如，裂褶多糖、凝胶多糖)，该寡脱氧核苷酸包含CpG寡脱氧核苷酸及20～60个核苷酸长度(优选为20～50个核苷酸长度，更优选为20～40个核苷酸长度，进一步优选为25～40个核苷酸长度)的聚脱氧腺苷酸，

所述CpG寡脱氧核苷酸包含式(Ia)表示的核苷酸序列且由13、14或15个碱基形成，

5’X-CpG-Y₁Y₂Y₃Y₄Y₅Y₆Y₇-CpG-TZ3’ (Ia)

(式中，X为T，

Y₁Y₂Y₃Y₄Y₅Y₆Y₇为选自由TTTTTTT、TTTTTTA、TTCGTTT、TTCGTTA及AGCGAG组成的组中的任一核苷酸序列，

Z为T)，

在式(Ia)表示的核苷酸序列的3’侧不具有附加序列或者具有选自由C、T、CT及CTC组成的组中的任一附加序列(优选为C或T)，

在式(Ia)表示的核苷酸序列的5’侧不具有附加序列或者具有A的1个碱基附加序列；

聚脱氧腺苷酸不介由间隔序列地与CpG寡脱氧核苷酸的3’侧连结，

CpG寡脱氧核苷酸位于5’末端最末，

聚脱氧腺苷酸位于3’末端最末、或者在聚脱氧腺苷酸的3’末端侧连结附加序列，

磷酸二酯键的一部分或全部被硫代磷酸酯键替换。该寡脱氧核苷酸的全长可以为28～200个核苷酸长度(优选为30～100个核苷酸长度，更优选为35～80个核苷酸长度，进一步优选为40～65个核苷酸长度，更进一步优选为43～57个核苷酸长度)。

式(Ia)表示的核苷酸序列可以为序列号95、96、97、98或99表示的核苷酸序列。

一个方式中，本发明的复合体含有寡脱氧核苷酸及β-1,3-葡聚糖(例如，裂褶多糖、凝胶多糖)，该寡脱氧核苷酸为选自由后述的化合物4、6、7、8、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、25、26、27、28、29、30、31、36、37、38、41、42、43、44、45、46及47组成的组中的任一者。

本发明的复合体可按照日本特开2008-100919号公报；WO2015/04131；Sakurai等人,Biomacromolecules 2,641-650(2001)；Shimada等人,Bioconjugate chemistry 18,1280-1286(2007)；Koyama等人,Science translational medicine 2,25ra24(2010)；Minari等人,Bioconjugate chemistry 22,9-15(2011)等中记载的方法进行制备。即，将天然以三重螺旋结构的形式存在的β-1,3-葡聚糖溶解于非质子性有机极性溶剂(二甲基亚砜(DMSO)，乙腈，丙酮等)或碱性水溶液(氢氧化钠、氢氧化钾、氨、氢氧化钙等)中，解开成单链。将以这样的方式得到的单链的β-1,3-葡聚糖的溶液与本发明的寡脱氧核苷酸的溶液(水溶液、中性附近的pH的缓冲水溶液、或酸性的缓冲水溶液，优选为水溶液或中性附近的pH的缓冲水溶液)混合，根据需要再次将pH调节为中性附近后，保持适当时间，例如，于5℃保持一夜。结果，2条β-1,3-葡聚糖链与1条本发明的寡脱氧核苷酸中的聚(dA)链形成三重螺旋结构，由此形成本发明的复合体。对生成的复合体进行利用体积排阻色谱的纯化、超滤、透析等，由此能够将未形成复合体的寡脱氧核苷酸除去。另外，对生成的复合体进行利用阴离子交换色谱的纯化，由此能够将未形成复合体的β-1,3-葡聚糖除去。利用上述的方法，可将复合体适当纯化。

本发明的复合体的形成例如可以通过测定基于CD(圆偏振光二色性)光谱的构象变化、基于体积排阻色谱的UV吸收位移、凝胶电泳、微芯片电泳、毛细管电泳来确认，但不限于此。

本发明的寡脱氧核苷酸与β-1,3-葡聚糖的混合比可考虑聚(dA)链的长度等而适当设定，通常，摩尔比(β-1,3-葡聚糖/ODN)为0.005～10.0。

本发明的复合体优选被分离。“经分离的复合体”的纯度(目标复合体重量在评价对象物的总重量中所占的百分率)通常为70％以上，优选为80％以上，更优选为90％以上，进一步优选为99％以上。

本发明的复合体具有优异的免疫赋活活性，诱导IFN-α产生的活性(例如，将浆细胞样树突状细胞(优选为人浆细胞样树突状细胞)活化而产生IFN-α的活性)高，因此作为免疫赋活剂等是有用的。

3.医药组合物

本发明提供包含上述本发明的寡脱氧核苷酸及β-1,3-葡聚糖(例如，裂褶多糖、凝胶多糖)的医药组合物。优选的方式中，本发明的寡脱氧核苷酸与β-1,3-葡聚糖(例如，裂褶多糖、凝胶多糖)形成复合体(即，本发明的复合体)。即，本发明的医药组合物优选包含上述的本发明的复合体。本发明的医药组合物可以通过将上述本发明的寡脱氧核苷酸及β-1,3-葡聚糖(例如，裂褶多糖、凝胶多糖)、或者上述本发明的复合体按照常规手段进行制剂化而得到。本发明的医药组合物除了包含本发明的寡脱氧核苷酸及β-1,3-葡聚糖(例如，裂褶多糖、凝胶多糖)、或者上述本发明的复合体外，还可以包含药理学上可容许的载体。本医药组合物可以还包含抗原(下文进行详述)。这样的医药组合物以适于经口或非经口施予的剂型的形式提供。

作为用于非经口施予的组合物，例如，可使用注射剂、栓剂等，注射剂可包含静脉注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂、肌肉注射剂、点滴注射剂等剂型。这样的注射剂可按照已知的方法制备。作为注射剂的制备方法，例如，可以通过将本发明的寡脱氧核苷酸与β-1,3-葡聚糖(例如，裂褶多糖、凝胶多糖)的组合、或者上述本发明的复合体溶解或悬浮于通常注射剂中使用的无菌的水性溶剂来制备。作为注射用的水性溶剂，例如，可以使用：蒸馏水；生理盐水；磷酸缓冲液、碳酸缓冲液、Tirs缓冲液、乙酸缓冲液等缓冲液等。这样的水性溶剂的pH可举出5～10，优选为6～8。制备的注射液优选填充于适当的安瓿中。

另外，通过对包含本发明的寡脱氧核苷酸与β-1,3-葡聚糖(例如，裂褶多糖、凝胶多糖)的组合、或者本发明的复合体的溶液或悬浮液进行真空干燥、冷冻干燥等处理，从而能够制备包含本发明的寡脱氧核苷酸及β-1,3-葡聚糖(例如，裂褶多糖、凝胶多糖)的组合、或者本发明的复合体的粉末制剂。将本发明的寡脱氧核苷酸及β-1,3-葡聚糖(例如，裂褶多糖、凝胶多糖)的组合、或者本发明的复合体以粉末状态保存，在使用时将该粉末溶解或分散于注射用的水性溶剂中，由此能够供于使用。

本发明的医药组合物包含寡脱氧核苷酸与β-1,3-葡聚糖(例如，裂褶多糖、凝胶多糖)的组合的情况下，寡脱氧核苷酸与β-1,3-葡聚糖(例如，裂褶多糖、凝胶多糖)的摩尔比(β-1,3-葡聚糖/ODN)没有特别限定，例如为0.005～10.0。

医药组合物中的本发明的寡脱氧核苷酸与β-1,3-葡聚糖(例如，裂褶多糖、凝胶多糖)的组合、或者本发明的复合体的含量例如为医药组合物整体的约0.1～100重量％，优选为约1～99重量％，进一步优选为约10～90重量％左右。

本发明的医药组合物可以单独含有本发明的寡脱氧核苷酸与β-1,3-葡聚糖(例如，裂褶多糖、凝胶多糖)的组合、或者本发明的复合体作为有效成分，也可以组合含有其他有效成分作为有效成分。

4.医药用途

本发明的复合体具有优异的免疫赋活活性，因此本发明的复合体及医药组合物可以作为免疫赋活剂使用。通过将本发明的复合体或医药组合物施予至哺乳动物(人等灵长类、小鼠等啮齿类等，能够引发该哺乳动物中的免疫反应。尤其是本发明的复合体刺激外周血单核细胞而强力地诱导I型干扰素(Pan-IFN-α、IFN-α2等)产生，因此作为I型干扰素产生诱导剂是有用的。由于诱导I型干扰素的产生，因此本发明的复合体及含有其的医药组合物对于I型干扰素有效的疾病的预防或治疗是有用的。作为I型干扰素有效的疾病，可举出病毒感染症(例如，丙型肝炎病毒(HCV)、疱疹病毒、乳头瘤病毒、RS病毒、流感病毒等)、癌等。

另外，本发明的复合体具有强力的疫苗佐剂活性，将本发明的复合体与抗原一起向哺乳动物施予时，能够强力地诱导针对该抗原的免疫反应。因此，本发明也提供包含(a)本发明的复合体及(b)抗原的、用于诱导针对该抗原的免疫反应的组合物。本发明的复合体强力地增强针对抗原的体液免疫反应(抗原特异性抗体产生)、细胞性免疫反应(抗原特异性CTL诱导)。因此，本发明的复合体及医药组合物、尤其是本发明的复合体及含有其的医药组合物作为疫苗佐剂是有用的。本说明书中，所谓佐剂，是促进免疫应答的辅助剂，是指与抗原一起施予至生物体时，非特异性地增强针对该抗原的免疫应答的物质。

作为抗原，只要是对施予对象的哺乳动物(人等灵长类、小鼠等啮齿类等)具有抗原性，抗体或细胞毒性T淋巴细胞(CTL、CD8⁺T细胞)能够识别为抗原即可，没有特别限定，可以使用成为抗原的所有物质(蛋白质、肽、核酸、脂质、糖质、以及上述物质的修饰体(例如，导入了一个或多个氨基酸的缺失、替换、及/或附加等(以下，记为突变等)的修饰体等)。作为抗原，例如，可以使用来自原虫、真菌、细菌、病毒等病原体的抗原、与癌等特定疾病有关的抗原等，但不限于这些。

本说明书中，所谓“抗原A来自病原体X”，是指抗原A作为构成因子包含在该病原体X中。例如，抗原A为多肽的情况下，是指该多肽的氨基酸序列存在于由病原体X的基因组编码的蛋白质的氨基酸序列中。

作为来自病原体的抗原，可举出病原体本身或其一部分、经灭活或弱毒化的病原体本身或其一部分、或者导入了它们的突变等的修饰体等。

使用来自病原体的抗原作为抗原时，引发针对该抗原的免疫反应，构建将包含该抗原的病原体在免疫学上排除到生物体外的机制。因此，包含(a)本发明的复合体、及(b)来自病原体的抗原的、用于诱导针对该抗原的免疫反应的组合物对于该病原体感染症的预防或治疗有用。

本发明的复合体能够强力地诱导针对抗原的体液免疫反应(抗原特异性抗体产生)、细胞性免疫反应(抗原特异性CTL诱导)。尤其地，本发明的复合体强力地诱导I型干扰素。I型干扰素在病毒感染后的自然免疫应答、获得性免疫的活化中发挥重要的作用。I型干扰素诱导CD40、CD80、CD86这样的共刺激分子、MHC分子的表达，使树突状细胞(DC)成熟，促进病毒抗原的交叉呈递。另外，诱导趋化因子而使淋巴细胞、单核细胞向炎症部位游走。另外，在细胞毒性T细胞(CD8+T细胞)中，参与其活化、增殖、记忆CD8+T细胞的维持。因此，优选使用来自已知可被细胞毒性T细胞识别的细胞内感染性病原体(病毒、原虫、真菌、细菌等)的抗原、与癌化的细胞相关的抗原(例如，肿瘤抗原)等作为抗原。

作为细胞内感染性病毒，没有特别限定，可举出RS病毒、流感病毒、副流感病毒、C型肝炎病毒(HCV)、A型肝炎病毒(HAV)、B型肝炎病毒(HBV)、埃博拉病毒、巨细胞病毒、腺病毒、脊髓灰质炎病毒、日本脑炎病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、狂犬病病毒、黄热病毒、水痘带状疱疹病毒、汉坦病毒、登革热病毒、诺如病毒、轮状病毒、细小病毒、冠状病毒、温热病病毒、成人T细胞白血病病毒(HTLV－1)、人免疫缺陷病毒(HIV)、疱疹病毒、乳头瘤病毒等。作为细胞内感染性细菌，可举出支原体等。作为细胞内感染性原虫，可举出疟原虫、血吸虫等。细胞内感染性病原体优选为病毒(具体而言，RS病毒、或流感病毒等)。

作为与癌化的细胞相关的抗原，可举出在癌化的细胞中特异性地表达的蛋白质、糖链、肽、以及上述物质的突变体(缺失、替换、及/或附加)或其修饰体等。

例如，通过将包含(a)本发明的复合体、及(b)来自病原体、癌的抗原的、用于诱导针对该抗原的免疫反应的组合物施予至该病原体感染症、癌的患者、可能罹患该病原体感染症、癌的哺乳动物(例如，人)，从而促进接受了该施予的对象中的细胞毒性T细胞(CTL)活性，诱导或促进该抗原特异性的抗体产生，即，诱导或促进哺乳动物(例如，人)的防御免疫反应，由此能够预防或治疗该感染症、癌。即，该组合物作为上述感染症、癌等疾病的预防或治疗是有用的。

包含(a)本发明的复合体及(b)抗原的、用于诱导针对该抗原的免疫反应的组合物可以遵照上述本发明的医药组合物来制备。

本说明书中引用的所有参考文献(包括出版物，专利文献等)通过引用而并入本说明书中，其程度如同每个参考文献被具体地作为参考引入并且其全部内容被具体地记载。

以下，通过实施例来更具体地说明本发明，但本发明不限于此。

实施例

[实施例1]

以下的表6中记载的CpG ODNs由Ajinomoto bio pharma services、株式会社GeneDesign及神户天然物化学株式会社合成。这些寡脱氧核苷酸使用作为常规方法的固相亚磷酰胺法合成。(M.H.Caruthers.AbrieFreview oFDNA and RNA chemicalsynthesis.Biochem.Soc.Trans.,2011,39,575-580.)

[表6-1]

[表6-2]

上述序列中的s表示核苷间为硫代磷酸酯键。

在上述的表中，详细记载了化合物6、8、9、10及18。表7中示出前述的序列的CpGODN-dA40的分子量及使用反相HPLC进行分析的保留时间。(分析条件，柱：Waters，X-BridgeC18 2.5μm，4.6x100nm，A溶液：8mM三乙胺、100mM六氟异丙醇，B溶液：甲醇，B溶液梯度：5％→30％(20min)，温度：60℃，流速：1mL/min，波长：260nm)

[表7]

化合物名	计算值	测定值	保留时间(分钟)
				6	16947.8	16946.9	18.1
8	16322.7	16321.5	18.0
				9	15697.7	15696.7	17.9
10	15047.6	15047.0	17.9
				18	16297.7	16297.8	18.2

[试验例1]CpG ODN-dA(s)40与SPG(裂褶多糖)的复合体形成

以SPG溶液的浓度成为15mg/mL的方式添加0.25mol/L的氢氧化钠溶液，搅拌至固体完全溶解。向110μM核酸水溶液中，加入与SPG溶液等量的0.3M磷酸二氢钠水溶液，进行搅拌。向得到的核酸溶液中加入SPG溶液，彻夜搅拌。就溶液的混合比率而言，相对于核酸1摩尔，SPG为0.27摩尔。复合体的形成通过下述方式来确认：使用体积排阻色谱，针对CpG ODN信号向高分子量侧的迁移，监测波长260nm处的吸收(System:ACQUITYUPLC H-Classsystem(Waters)，将Pre-column：Asahipak GF-1G 7B(Shodex)、Column：Asahipak GF7M-HQ(Shodex)两根柱连结，流速：0.6mL/min，缓冲液:10mM EDTA PBS，温度40℃)。使用的复合体仅使用显示90％以上的复合体化率的复合体。在以下的试验例中的CpG ODN-dA(s)40的活性评价中，均使用该CpG ODN-dA(s)40与SPG的复合体。

[试验例2]K3与化合物6及化合物7的活性比较评价

向人PBMCs(Frozen NPB-MNC：AllCells，PB003Flot.3018992)中添加CpG ODN-dA(s)40/SPG复合体(1.0×10⁵个细胞/100μL/孔x96孔板，duplicate)，将该细胞培养24小时。利用ELISA(Human IFN alpha(pan specific)ELISA development kit 3425-1H-6(MabtecHAB))测定上清液中的IFN alpha浓度。

B类CpG是12个碱基以上的硫代磷酸酯骨架CpG ODN，已知碱基长度越长，则显示越高的免疫活性(Verthelyi,D.,Ishii,K.J.,Gursel,M.&Klinman,D.M.Human PeripheralBlood Cells Differentially Recognize and Respond to Two Distinct CpGMotifs.J.Immunol.2001,166,2372-2377.)。据报道通过使作为B类CpG的K3为SPG复合体，从而兼具B类CpG的免疫赋活活性(刺激B细胞而产生IL-6)和A类CpG的免疫赋活活性(作用于pDC而产生IFN alpha)(WO2015/041318)。本申请的发明人为研究将CpG ODN的碱基长度缩短时的效果，对CpG部分为12个碱基长度的化合物6/SPG复合体、化合物7/SPG复合体及K3-dA(s)40/SPG复合体评价了IFN alpha产生诱导能力。

如图1所示，化合物6/SPG复合体及化合物7/SPG复合体均显示出超过K3-dA(s)40/SPG复合体的IFN alpha产生诱导能力。K3为20个碱基长度，与此相对，化合物6及化合物7的CpG ODN部分为12个碱基长度。由该结果可知，CpG ODN部分的碱基长度越短的复合体的IFNalpha产生诱导能力越高。

[试验例3]使用了人PBMC的短链CpG ODN-dA(s)40/SPG复合体的活性评价

TLR9中，存在两处供ODN结合的部位，(1)5’-X₁CX₂-3’和(2)CpG基序与各部位结合(Umehara Ohto.Immunity 2018,48,1-10)。本发明中，认为通过具有这2种结合序列、并且使其为最小限度的碱基数，从而IFN alpha产生能力提高，进行这些序列的评价。

向人PBMC(CTL,Cat.CTL-UP1,Sample ID#HHU20190711)中添加CpG ODN-dA(s)40/SPG复合体(5.0×10⁵个细胞/100μL/孔x 96孔板，duplicate)，将该细胞培养24小时。利用Bio-Plex(BIO-RAD：Bio-Plex pro Reagent kitIII#171304090M，humans cytokineScreening Panel Standard#12007919，IFN alpha2 Set#171B6010M)，对上清液中的IFNalpha浓度进行测定。

将结果示于图2及3。可知，通过将较之在以K3为代表的CpG ODN中被认为是必要的碱基长度(12个碱基以上)(非专利文献2)而言短的CpG ODN与SPG复合化，从而显示出高的免疫赋活作用(IFN alpha产生诱导作用)。

需要说明的是，化合物1/SPG、化合物2/SPG、化合物3/SPG、化合物5/SPG、化合物9/SPG、化合物10/SPG、化合物11/SPG、化合物23/SPG及化合物24/SPG的复合体的IFN alpha产生诱导活性非常低、或者几乎没有。

[试验例4]使用了小鼠脾脏细胞的活性评价

向小鼠(C57BL/6J，雌性，8周)的脾脏细胞添加CpG ODN-dA(s)40/SPG复合体(1.0×10⁶个细胞/100μL/孔，96孔板，duplicate)，培养24小时。利用ELISA(IFN alpha MouseELISA Kit Thermo Fisher Scientific#BMS6027)测定上清液的IFN alpha。

将结果示于图4。与人PBMC同样地，本发明的复合体较之现有的K3-dA(s)40/SPG复合体而言更强力地诱导小鼠脾脏细胞的IFN alpha产生。

[试验例5]小鼠中的体内的活性评价

对小鼠(C57BL/6J，雌性，8周，n＝3)尾静脉施予(1.5nmol/200μL/只)CpG ODN-dA(s)40/SPG复合体。6小时后采血，利用ELISA(IFN alpha Mouse ELISA Kit Thermo FisherScientific#BMS6027)测定血浆中的IFN alpha浓度。

将结果示于图5。K3-dA(s)40/SPG复合体几乎未观察到IFN alpha产生诱导。另一方面，本发明的CpG ODN-dA(s)40/SPG复合体在小鼠生物体内也显示出高的IFN alpha产生诱导能力。目前为止，还没有将CpG尾静脉施予至小鼠而观察到血浆中的IFN alpha的增加的报告例，表明了本发明的复合体具有优异的免疫赋活化效果。

[实施例2]

以下的表8中记载的CpG ODNs由Ajinomoto bio pharma services、株式会社GeneDesign及神户天然物化学株式会社合成。这些寡脱氧核苷酸使用作为常规方法的固相亚磷酰胺法而合成。(M.H.Caruthers.A brieFreview oFDNA and RNA chemicalsynthesis.Biochem.Soc.Trans.,2011,39,575-580.)

[表8-1]

[表8-2]

上述序列中的s表示核苷间为硫代磷酸酯键。

化合物28、29、30及31具有与化合物21相同的CpG ODN(TsCsGsGsCsGsTsTsC)(序列号20)，但聚dA(s)的长度与化合物21不同。化合物21的聚dA(s)的长度为40，但化合物28、29、30及31的聚dA(s)的长度分别为35、30、25及20。化合物32、33、34及35具有与化合物21相同的CpG ODN碱基序列(序列号20)及相同长度的聚dA(s)(dA(s)40)，但CpG ODN内中包含的硫代磷酸酯键的数目及位置与化合物21不同。

在上述的表中，详细地记载了化合物28、29及30。示出化合物28、化合物29及化合物30的分子量、以及使用反相HPLC分析得到的保留时间。

(分析条件，柱：Waters，X-Bridge C18 2.5μm，4.6x75nm，A溶液：8mM三乙胺、100mM六氟异丙醇，B溶液：甲醇，B溶液梯度：5％→30％(20min)，温度：60℃，流速：1mL/min，波长：260nm)

[表9]

化合物名	计算值	测定值	保留时间(分钟)
				28	14359.2	14362.7	12.8
29	12712.8	12711.5	12.9
				30	11066.4	11065.3	12.7

[试验例6]小鼠中的体内的活性评价

对小鼠(C57BL/6J，雌性，8周)尾静脉施予(0.5nmol/200μL/只)CpG ODN-dA(s)n/SPG复合体。6小时后采血，利用ELISA(IFNalpha Mouse ELISA Kit，Thermo FisherScientific#BMS6027)测定血浆中的IFN alpha浓度。

将结果示于图6。本发明的CpG ODN-dA(s)n/SPG复合体在小鼠生物体内显示出高的IFN alpha产生诱导能力。根据化合物28、29及30的结果可知，即使聚dA(s)的长度小于40，也可维持复合体的IFN alpha产生诱导能力。

[试验例7]小鼠中的体内的活性评价

对小鼠(C57BL/6J，雌性，8周)尾静脉施予(0.5nmol/200μL/只)CpG ODN-dA(s)n/SPG复合体。6小时后采血，利用ELISA(IFN alpha Mouse ELISA Kit,Thermo FisherScientific#BMS6027)测定血浆中的IFN alpha浓度。

将结果示于图7。本发明的CpG ODN-dA(s)n/SPG复合体在小鼠生物体内显示出高的IFN alpha产生诱导能力。

[试验例8]CpG ODN-dA(s)n/Curdlan复合体的活性评价

除了代替SPG而使用凝胶多糖(Curdlan)以外，按照试验例1，形成化合物20与凝胶多糖的复合体。

向人PBMC(CTL，Cat.CTL-UP1，Sample HHU20190709)中添加化合物20/Curdlan复合体(5.0×10⁵个细胞/100μL/孔×96孔板，duplicate)，将该细胞培养24小时。利用ELISA(IFN alpha Human Matched Antibody Pair，Thermo Fisher Scientific，#BMS216MST)对上清液中的IFN alpha浓度进行测定。

将结果示于图8。图中“Naked”表示未与凝胶多糖形成复合体的化合物20。另外，“drCurdlan”是与化合物20/Curdlan复合体的制备同样地进行了改性及再生处理的凝胶多糖。drCurdlan的浓度与1000nM CpG ODN-dA(s)40/Curdlan复合体中的Curdlan浓度同等。化合物20/Curdlan复合体与化合物20/SPG复合体同样地诱导人PBMC的IFN alpha产生。由该结果可知，在使用凝胶多糖作为β-葡聚糖的情况下，也可维持本发明的复合体的免疫赋活活性。

[试验例9]使用了人PBMC的短链CpG ODN-dA(s)40/SPG复合体的活性评价

向人PBMC(CTL，Cat.CTL-UP1，Sample HHU20200611)中添加CpG ODN-dA(s)n/SPG复合体(5.0×10⁵个细胞/100μL/孔×96孔板，duplicate)，将该细胞培养24小时。利用ELISA(IFN alpha Human Matched Antibody Pair，Thermo Fisher Scientific，#BMS216MST)测定上清液中的IFN alpha浓度。

将结果示于图9。本发明的CpG ODN-dA(s)n通过与SPG复合化，从而显示出高的免疫赋活作用(IFN alpha产生诱导作用)。化合物36/SPG复合体及化合物42/SPG复合体具有显著的免疫赋活作用，因此，表明即使在式(I)的核苷酸序列的5’侧连结有至少1个碱基的附加序列，也可维持复合体的免疫赋活活性。另一方面，化合物39/SPG及化合物40/SPG的复合体的IFN alpha产生诱导活性非常低、或几乎没有。

[试验例10]使用了人PBMC的短链CpG ODN-dA(s)40/SPG复合体的活性评价

向人PBMC(CTL，Cat.CTL-UP1，Sample#HHU20190709)中添加CpG ODN-dA(s)40/SPG复合体(5.0×10⁵个细胞/100μL/孔×96孔板，duplicate)，将该细胞培养24小时。利用ELISA(IFN alpha Human Matched Antibody Pair，Thermo Fisher Scientific，#BMS216MST)测定上清液中的IFN alpha浓度。作为CpG ODN-dA(s)40，使用化合物43、44、45、46及47。这些化合物的特征在于，2个CpG间的核苷酸长度为6或7个碱基，CpG ODN部分的碱基长度为14或15。

将结果示于图10。评价的CpG ODN-dA(s)40通过与SPG复合化，从而显示出高的免疫赋活作用(IFN alpha产生诱导作用)。表明即使将CpG ODN内所含的2个CpG之间的核苷酸长度延长至6或7个碱基，也可维持本发明的复合体的免疫赋活活性。另外，表明即使将CpGODN部分的碱基长度延长至14或15，也可维持本发明的复合体的免疫赋活活性。

产业上的可利用性

通过本发明，可提供具有强力的I型干扰素产生诱导活性的寡脱氧核苷酸、包含其的复合体。本发明的复合体具有强力的I型干扰素产生诱导活性，因此，作为使自然免疫、获得性免疫(尤其是细胞性免疫)活化的免疫赋活剂、疫苗佐剂是有用的。

本申请以于日本提出申请的日本特愿2019-235078(申请日：2019年12月25日)为基础，其全部内容包括在本说明书中。

Claims (39)

1.寡脱氧核苷酸，其包含CpG寡脱氧核苷酸及能够与β-1,3-葡聚糖形成复合体的长度的聚脱氧腺苷酸：

所述CpG寡脱氧核苷酸包含式(I)表示的核苷酸序列且由8～16个碱基形成，

5’X-CpG-L-CpG-TZ3’ (I)

式(I)中，X为T或C，

L为由1～7个碱基形成的核苷酸序列，

Z为T或C，

聚脱氧腺苷酸与CpG寡脱氧核苷酸的3’侧连结。

2.如权利要求1所述的寡脱氧核苷酸，其中，X为T。

3.如权利要求1或2所述的寡脱氧核苷酸，其中，Z为T。

4.如权利要求1～3中任一项所述的寡脱氧核苷酸，其中，L为式(II)表示的核苷酸序列，

5’Y₁Y₂Y₃Y₄Y₅Y₆Y₇3’ (II)

式(II)中，Y₁为选自由A、G、T及C组成的组中的任一碱基，

Y₂、Y₃、Y₄、Y₅、Y₆及Y₇各自独立地不存在或者为选自由A、G、T及C组成的组中的任一碱基。

5.如权利要求4所述的寡脱氧核苷酸，其中，式(II)中，Y₃、Y₄、Y₅、Y₆及Y₇不存在。

6.如权利要求5所述的寡脱氧核苷酸，其中，Y₁为选自由A、G及T组成的组中的任一碱基。

7.如权利要求5或6所述的寡脱氧核苷酸，其中，Y₂为选自由A、G及T组成的组中的任一碱基。

8.如权利要求4所述的寡脱氧核苷酸，其中，Y₁为A或T，Y₂为G或T，Y₃为C或T，Y₄为G或T，Y₅为A或T，Y₆为G或T，Y₇不存在或者为A或T。

9.如权利要求1～8中任一项所述的寡脱氧核苷酸，其中，L为选自由A、G、C、T、AA、AG、AT、GA、GT、TA、TT、TTTTTTT、TTTTTTA、TTCGTTT、TTCGTTA及AGCGAG组成的组中的任一核苷酸序列。

10.如权利要求1～9中任一项所述的寡脱氧核苷酸，其中，CpG寡脱氧核苷酸在式(I)表示的核苷酸序列的3’侧不具有附加序列或者具有1～3个碱基的附加序列。

11.如权利要求10所述的寡脱氧核苷酸，其中，1～3个碱基的附加序列为选自由C、CT及CTC组成的组中的任一核苷酸序列。

12.如权利要求1～11中任一项所述的寡脱氧核苷酸，其中，CpG寡脱氧核苷酸在式(I)表示的核苷酸序列的5’侧不具有附加序列或者具有1个碱基的附加序列。

13.如权利要求12所述的寡脱氧核苷酸，其中，1个碱基的附加序列为A。

14.如权利要求1～13中任一项所述的寡脱氧核苷酸，其中，CpG寡脱氧核苷酸由8～15个碱基形成。

15.如权利要求1～14中任一项所述的寡脱氧核苷酸，其中，CpG寡脱氧核苷酸由8～12个碱基形成。

16.如权利要求1～15中任一项所述的寡脱氧核苷酸，其中，式(I)表示的核苷酸序列由序列号12、55、56、57、58、59、21、60、61、62、63或64表示的核苷酸序列形成。

17.如权利要求1～15中任一项所述的寡脱氧核苷酸，其中，式(I)表示的核苷酸序列由序列号68、94、95、96、97、98或99表示的核苷酸序列形成。

18.如权利要求1～15中任一项所述的寡脱氧核苷酸，其中，CpG寡脱氧核苷酸由序列号4、6、7、8、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、25、26或27表示的核苷酸序列形成。

19.如权利要求1～15中任一项所述的寡脱氧核苷酸，其中，CpG寡脱氧核苷酸由序列号66、67、68、71、72、73、74、75、76、或77表示的核苷酸序列形成。

20.如权利要求1～19中任一项所述的寡脱氧核苷酸，其中，寡脱氧核苷酸的磷酸二酯键的一部分或全部被硫代磷酸酯键替换。

21.如权利要求20所述的寡脱氧核苷酸，其中，寡脱氧核苷酸的磷酸二酯键的全部被硫代磷酸酯键替换。

22.如权利要求1～21中任一项所述的寡脱氧核苷酸，其中，聚脱氧腺苷酸的长度为20～60个碱基。

23.如权利要求1～22中任一项所述的寡脱氧核苷酸，其包含序列号31、33、34、35、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、52、53、或54表示的核苷酸序列。

24.如权利要求1～22中任一项所述的寡脱氧核苷酸，其包含序列号78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92或93表示的核苷酸序列。

25.复合体，其包含权利要求1～24中任一项所述的寡脱氧核苷酸及β-1,3-葡聚糖。

26.如权利要求25所述的复合体，其中，β-1,3-葡聚糖为裂褶多糖。

27.如权利要求25所述的复合体，其中，β-1,3-葡聚糖为凝胶多糖。

28.医药组合物，其含有：

(i)权利要求1～24中任一项所述的寡脱氧核苷酸；及

(ii)β-1,3-葡聚糖。

29.如权利要求28所述的医药组合物，其中，(i)的寡脱氧核苷酸与(ii)的β-1,3-葡聚糖形成复合体。

30.如权利要求28或29所述的医药组合物，其中，β-1,3-葡聚糖为裂褶多糖。

31.如权利要求28或29所述的医药组合物，其中，β-1,3-葡聚糖为凝胶多糖。

32.如权利要求28～31中任一项所述的医药组合物，其用于免疫赋活。

33.如权利要求28～31中任一项所述的医药组合物，其用于I型干扰素产生诱导。

34.权利要求25～27中任一项所述的复合体在用于制造免疫赋活用或I型干扰素产生诱导用医药组合物中的用途。

35.权利要求25～27中任一项所述的复合体在用于制造I型干扰素产生诱导用医药组合物中的用途。

36.将哺乳动物的免疫反应增强的方法，其包括将药理有效量的权利要求25～27中任一项所述的复合体施予至该哺乳动物的步骤。

37.在哺乳动物中诱导I型干扰素产生的方法，其包括将药理有效量的权利要求25～27中任一项所述的复合体施予至该哺乳动物的步骤。

38.如权利要求25～27中任一项所述的复合体，其用于增强免疫反应。

39.如权利要求25～27中任一项所述的复合体，其用于I型干扰素产生的诱导。

Images