TW202332452A - 含有具有免疫賦活活性之寡核苷酸之複合體及其用途 - Google Patents

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TW202332452A
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complex
antigen
oligodeoxynucleotide
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TW112109803A
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石井健
小檜山康司
青枝大貴
武下文彥
粕谷裕司
丹羽貴子
小泉誠
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國立研究開發法人醫藥基盤 健康 營養研究所
日商第一三共股份有限公司
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Abstract

本發明提供含有人化K型CpG寡去氧核苷酸及聚去氧腺苷酸之寡去氧核苷酸，且聚去氧腺苷酸配置於該人化K型CpG寡去氧核苷酸的3’側。又，本發明提供含有前述寡去氧核苷酸及β-1,3-葡聚醣之複合體。

Description

含有具有免疫賦活活性之寡核苷酸之複合體及其用途
本發明係關於含有具有免疫賦活活性之寡核苷酸之複合體及其用途。詳細本發明係關於含有具有免疫賦活活性之CpG寡去氧核苷酸(ODN)及β-葡聚醣之複合體及其醫藥用途。
CpG寡核苷酸(CpG ODN)為含有免疫賦活性之CpG模體的短的(約20鹼基對)單股之合成DNA斷片，為Toll樣受體9(TLR9)之強力的激動劑，且使樹狀細胞(DCs)及B細胞活性化，產生I型干擾素(IFNs)及炎症性細胞介素(非專利文獻1、2)，用作為包含細胞傷害性T淋巴球(CTL)反應之Th1型的體液性及細胞性免疫反應之佐劑(非專利文獻3、4)。而CpG ODN被認為能作為對感染症、癌、氣喘及花粉症之免疫療法劑(非專利文獻2、5)。
有骨架序列及免疫賦活特性各自不同的至少4個型的CpG ODN(非專利文獻6)。D型(亦稱A型)CpG ODN，典型包含磷酸二酯(PO)骨架及硫代磷酸酯(PS)聚G尾以及1個迴文構造之CpG模體，使形質細胞樣DCs(pDCs)活性化而產生大量IFN-α，但不能誘導pDC成熟化 或B細胞活性化(非專利文獻7、8)。其他3個型的ODN由PS骨架所構成。K型(亦稱B型)CpG ODN，典型含有非迴文構造之複數的CpG模體，使B細胞強力活性化而產生IL-6，且使pDCs活性化而成熟化，但幾乎不產生IFN-α(非專利文獻8、9)。近年開發的C型及P型的CpG ODN，各自含有1個及2個迴文構造CpG序列，雙方皆如K型般使B細胞活性化、如D型般可使pDCs活性化，但與P型CpG ODN比較，C型CpG ODN誘導IFN-α產生較弱(非專利文獻10-12)。專利文獻1記載多數優異的K型CpG ODN。
D型及P型CpG ODN，各自形成稱為G-tetrads之形成平行4股構造的胡思町鹼基對、及順迴文構造部位與反迴文構造部位間的沃森-克里克鹼基對之所謂高次構造，此等在pDCs所致之強力IFN-α產生上為必要(非專利文獻12-14)。如此之高次構造在侷限於初期胞內體或透過TLR9之訊息傳遞上似乎為必要，但此等受到產物之多型性及沈澱影響，結果妨礙其臨床應用(非專利文獻15)。因此，僅K型及C型CpG ODN可普遍利用於作為人用之免疫療法劑及疫苗佐劑(非專利文獻16及17)。K型CpG ODN在人臨床試驗中，雖提高以感染症及癌為標的之疫苗之免疫原性(非專利文獻6、16)，但為了最佳佐劑效果，需要抗原與K型CpG ODN間之化學的及物理的連結。此等結果顯示4個型(K、D、P、及C)之CpG ODN有優點及缺點，期待不聚集，而使B細胞及pDCs之兩者 活性化之「All in one」CpG ODN的開發。
來自裂褶菌(Schizophyllum commune)之可溶性β-1,3-葡聚醣之西佐糖(SPG)，為作為子宮頸癌患者之放射線療法賦活藥而在日本30年來受到認可之醫藥(非專利文獻18)。同樣地來自香菇之可溶性β-1,3-葡聚醣之香菇多醣(LNT)為1985年被承認之醫藥，對無法手術及再發胃癌患者用於與氟嘧啶系藥劑併用(非專利文獻19、20)。β-1,3-葡聚醣，顯示形成聚去氧腺苷酸(dA)與三重螺旋構造之複合體(非專利文獻21)。
專利文獻2~4，揭示作為含西佐糖之β-1,3-葡聚醣與核酸(基因)之水溶性複合體的基因載體之用途。此等文獻，記載藉由形成該複合體，基因之反意義作用及對核酸分解酵素(核酸酶)之耐性作用提高。
專利文獻5，揭示藉由使用具有β-1,3-鍵結之多糖類作為載體(轉染劑)，提高包含CpG序列、且將磷酸二酯鍵取代為硫代磷酸酯鍵或二硫代磷酸酯鍵的免疫刺激性寡核苷酸的作用。
專利文獻6，記載特徵為以由免疫刺激性寡核苷酸與具有長鏈的β-1,6-葡萄糖苷鍵側鏈的β-1,3-葡聚醣所構成之免疫刺激性複合體。
本發明者們，得知以前連結有與SPG複合體化的5’末端具有磷酸二酯鍵之聚(dA)之小鼠及人化CpG ODN顯示有增強細胞介素產生，用作為流行性感冒疫苗佐劑或Th2細胞相關疾病之預防或治療劑(非專利文獻 22、23、專利文獻7)。K型及D型的各自之CpG的5’末端加成聚(dA)，與SPG形成複合體，則各自維持K型及D型的特性且其活性被增強。然而，在更有效果且費用效率高，達成適用前臨床及臨床開發上CpG-SPG複合體的高收率有困難。近年，顯示於CpG ODN連接具有硫代磷酸酯鍵之聚(dA)，則複合體形成幾乎上升至100%(非專利文獻24)。然而，並未進行解析最佳人化CpG序列，用以得到最佳4個型的CpG ODN的「All in one」活性之因子之綿密試驗。
專利文獻8，揭示抗原/CpG寡核苷酸/β-1,3-葡聚醣系之三元複合體的製造方法。
[先前技術文献]
[專利文獻]
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[專利文獻5] WO 2004/100965 A1
[專利文獻6] 特開2007-70307號公報
[專利文獻7] 特開2008-100919號公報
[專利文獻8] 特開2010-174107號公報
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本發明所欲解決課題在於提供比從前之CpG-SPG複合體具有更強力活性之免疫賦活劑。
本發明者們，進行努力檢討，同定含有3’末端具有聚(dA)尾之K型CpG ODN之K3(序列編號2)及SPG的新穎複合體、即K3-SPG。此形成可完全溶化之高次奈米粒子。同樣地本發明者們亦成功地製作含前述K型CpG ODN及香菇多醣(LNT)之新穎複合體K3-LNT。K3-SPG，K3-LNT雖不具有D型CpG ODN序列，但兼具K型CpG ODN特有之免疫賦活活性(例如使B細胞(較佳為人類B細胞)活性化，產生IL-6之活性)與D型CpG ODN特有之免疫賦活活性(例如使形質細胞樣樹狀細胞活性化而產生IFN-α之活性)。進而，K3-LNT、及K3-SPG具有強力疫苗佐劑活性，與抗原同時進行免疫接種，誘導該抗原特異的體液性免疫及細胞性免疫之兩者，實際顯示對RSV病毒或流行性感冒病毒非常強之感染防禦效果。基於此等知識，再檢討而完成本發明。
即，本發明如以下所示。
〔1〕一種寡去氧核苷酸，其係含人化K型CpG寡去氧核 苷酸及聚去氧腺苷酸之寡去氧核苷酸，其特徵係聚去氧腺苷酸配置於人化K型CpG寡去氧核苷酸之3’側。
〔2〕如〔1〕記載之寡去氧核苷酸，其中，人化K型CpG寡去氧核苷酸為10核苷酸以上之長度，且包含式：
[化1]5'N1N2N3T-CpG-WN4N5N6 3'
(式中，中央的CpG模體未被甲基化，W為A或T，N1、N2、N3、N4、N5及N6可為任何的核苷酸)；所表示之核苷酸序列。
〔3〕如〔1〕或〔2〕記載之寡去氧核苷酸，其中，人化K型CpG寡去氧核苷酸係由序列編號1所表示之核苷酸序列所構成。
〔4〕如〔1〕~〔3〕中任一記載之寡去氧核苷酸，其中，寡去氧核苷酸的磷酸二酯鍵的一部份或全部被硫代磷酸酯鍵所取代。
〔5〕如〔4〕之寡去氧核苷酸，其中，寡去氧核苷酸的磷酸二酯鍵之全部被硫代磷酸酯鍵所取代。
〔6〕如〔1〕~〔5〕中任一記載之寡去氧核苷酸，其中，聚去氧腺苷酸的長度為20~60核苷酸長。
〔7〕一種複合體，其特徵係含有〔1〕~〔6〕中任一記載之寡去氧核苷酸及β-1,3-葡聚醣。
〔8〕如〔7〕記載之複合體，其中，β-1,3-葡聚醣為香菇 多醣、西佐糖、硬葡聚糖、卡特蘭多醣、巴基馬、灰樹花蛋白多糖、或昆布糖。
〔9〕如〔8〕記載之複合體，其中，β-1,3-葡聚醣為香菇多醣、西佐糖、或硬葡聚糖。
〔10〕一種複合體，其特徵係由下述(i)記載之寡去氧核苷酸、及(ii)記載之β-1,3-葡聚醣所構成，
(i)序列編號1所表示之核苷酸序列所構成之寡去氧核苷酸的3’側鍵結有20~60核苷酸長之聚去氧腺苷酸，且磷酸二酯鍵之全部被硫代磷酸酯鍵所取代之寡去氧核苷酸
(ii)香菇多醣或西佐糖
〔11〕如〔7〕~〔10〕中任一記載之複合體，其為三重螺旋構造狀者。
〔12〕如〔7〕~〔11〕中任一記載之複合體，其具有使B細胞活性化而產生IL-6之活性、及使樹狀細胞活性化而產生IFN-α之活性。
〔13〕一種醫藥組成物，其特徵係包含〔1〕~〔6〕中任一記載之寡去氧核苷酸、或者請求項7~12中任一記載之複合體。
〔14〕如〔13〕記載之醫藥組成物，其係用於病毒感染症、癌、過敏疾病、細胞內寄生性原蟲或細菌感染症之預防或治療。
〔15〕如〔14〕記載之醫藥組成物，其係用於病毒感染症之預防或治療。
〔16〕如〔15〕記載之醫藥組成物，其中，病毒感染症為 RS病毒、或流行性感冒病毒感染症。
〔17〕一種I型及/或II型干擾素產生誘導劑，其特徵係包含〔7〕~〔11〕中任一記載之複合體。
〔18〕一種免疫賦活劑，其特徵係包含〔1〕~〔6〕中任一記載之寡去氧核苷酸、或者〔7〕~〔12〕中任一記載之複合體。
〔19〕如〔18〕之免疫賦活劑，其係疫苗佐劑。
〔20〕一種病毒感染症、癌、過敏疾病、細胞內寄生性原蟲或細菌感染症之預防或治療劑，其特徵係包含[1]~[6]中任一記載之寡去氧核苷酸、或者〔7〕~〔12〕中任一記載之複合體。
〔21〕如〔20〕記載之預防或治療劑，其中，病毒感染症為RS病毒、或流行性感冒病毒感染症。
〔22〕一種〔1〕~〔6〕中任一記載之寡去氧核苷酸、或者〔7〕~〔12〕中任一記載之複合體之用途，其係用於醫藥組成物之製造。
〔23〕如〔22〕記載之用途，其中，醫藥組成物係用於病毒感染症、癌、過敏疾病、細胞內寄生性原蟲或細菌感染症之預防或治療之醫藥組成物。
〔24〕如〔23〕記載之用途，其中，病毒感染症為RS病毒、或流行性感冒病毒感染症。
〔25〕一種溫血動物之疾病的治療或者預防之方法，其係包含將〔1〕~〔6〕中任一記載之寡去氧核苷酸、或者〔7〕~〔12〕中任一記載之複合體的藥理有效量投與溫 血動物。
〔26〕如〔25〕記載之方法，其中，疾病為病毒感染症、癌、過敏疾病、細胞內寄生性原蟲或細菌感染症。
〔27〕如〔26〕記載之方法，其中，病毒感染症為RS病毒、或流行性感冒病毒感染症。
〔28〕如〔25〕~〔27〕中任一記載之方法，其中，溫血動物為人。
〔29〕一種誘導溫血動物之防禦免疫反應的方法，其特徵係包含將〔1〕~〔6〕中任一記載之寡去氧核苷酸、或者〔7〕~〔12〕中任一記載之複合體的藥理有效量投與溫血動物。
〔30〕如〔1〕~〔6〕中任一記載之寡去氧核苷酸、或者〔7〕~〔12〕中任一記載之複合體，其係用於病毒感染症、癌、過敏疾病、細胞內寄生性原蟲或細菌感染症之治療或預防。
〔31〕如〔30〕記載之寡去氧核苷酸或複合體，其中，病毒感染症為RS病毒、或流行性感冒病毒感染症。
〔32〕一種醫藥組成物，其特徵係包含
(a)〔1〕~〔6〕中任一記載之寡去氧核苷酸、或者〔7〕~〔12〕中任一記載之複合體、及
(b)抗原。
〔33〕如〔32〕記載之組成物，其係用於誘導對該抗原之免疫反應。
〔34〕如〔33〕記載之組成物，其中，抗原為來自病原體 之抗原。
〔35〕如〔34〕記載之組成物，其為病原體的感染症之預防或治療用。
〔36〕如〔35〕記載之組成物，其中，病原體為病毒。
〔37〕如〔36〕記載之組成物，其中，病毒為RS病毒或流行性感冒病毒。
根據本發明，提供具有優異的免疫賦活活性之寡去氧核苷酸或含其之複合體。尤其本發明之複合體兼具K型CpG ODN特有之免疫賦活活性與D型CpG ODN特有之免疫賦活活性。進而，本發明之複合體具有強力疫苗佐劑活性，將本發明之複合體與抗原同時免疫接種，則刺激該抗原特異的體液性免疫及細胞性免疫之兩者，顯示非常強的感染防禦效果。因此，本發明之複合體可用作為免疫賦活劑或疫苗佐劑。
[圖1]CpG ODN與LNT或SPG之複合體化之方法。
[圖2]PBMCs之pan-IFN-α產生。
[圖3]以K3、K3-dA40或K3-SPG刺激時由人類PBMCs產生的細胞介素輪廓。
[圖4]K3-SPG之掃描電子顯微鏡像。
[圖5]以動態光散射解析的K3-SPG、SPG及D35之粒子尺寸。
[圖6]因K3、K3-SPG或D35刺激誘導的PBMCs之pan-IFN-α、IFN-α2、及IFN-γ產生。
[圖7]因K3、K3-dA40、K3-SPG、CpG21798(P型CpG ODN)、CpG21889(P)、CpG2395(C)或M362(C)刺激(0.74、2.2、6.6或20μg/ml)誘導的人類PBMCs之pan-IFN-α及IL-6產生。
[圖8]一起侷限於含K3-SPG之K型CpG ODN之胞內體。線狀比例尺為10μm。該結果為至少2次之獨立試驗中之代表者。
[圖9]一起侷限於含K3-SPG之D型CpG ODN胞內體。線狀比例尺為10μm
Figure 112109803-A0202-12-0015-58
示
Figure 112109803-A0202-12-0015-59
。
[圖10]以OVA單獨、OVA+K3、或OVA+K3-SPG免疫的小鼠之抗原特異的血清抗體價。*p<0.05(Mann-Whitney U test)。
[圖11]以OVA單獨、OVA+K3、或OVA+K3-SPG免疫的小鼠之脾細胞之、以抗原再刺激誘導之IFNγ產生。
[圖12]以OVA單獨、OVA+K3、或OVA+K3-SPG之免疫誘導之OVA特異的CD8T細胞的比例。*p<0.05(Mann-Whitney U test)。
[圖13]以OVA單獨、OVA+K3、OVA+K3-dA40或OVA+K3-SPG之免疫誘導之生物體內OVA特異的CTL活性。*p<0.05(Mann-Whitney U test)。
[圖14]K3-SPG之胜肽疫苗佐劑效果。
[圖15]K3-SPG之用量依存的佐劑效果。
[圖16]以OVA單獨、OVA+K3、或OVA+K3-SPG免疫的小鼠之抗原特異的血清抗體價。免疫接種時的OVA用量表示於各圖表上。*p<0.05(Mann-Whitney U test)。
[圖17]以OVA單獨、OVA+K3、或OVA+K3-SPG免疫的小鼠之脾細胞的以抗原再刺激誘導之IFNγ產生。免疫接種時的OVA用量表示於各圖表上。
[圖18]與空(vector)、Dectin-1、或Dectin-2轉染子之SPG之鍵。
[圖19]與空(vector)、Dectin-1、或Dectin-2轉染子之K3或K3-SPG之鍵。
[圖20]C57BL/6J小鼠或Dectin-1缺損小鼠脾細胞的Zymosan Depleted刺激誘導TNF-α產生。
[圖21]C57BL/6J小鼠或Dectin-1缺損小鼠脾細胞的SPG刺激誘導TNF-α產生。
[圖22]C57BL/6J小鼠或Dectin-1缺損小鼠脾細胞的對CpG ODN刺激誘導IFN-α產生之Zymosan Depleted效果。*p<0.05(t-test)。
[圖23]C57BL/6J小鼠脾細胞的對CpG ODN刺激誘導IFN-α產生之SPG之效果。
[圖24]K3-SPG所誘導之細胞介素產生依存TLR9。a)FL-DCs之IFN-α產生、b)脾細胞的IL-6及IL-12 p40產生、c)FL-DCs之IFN-α產生、d)脾細胞的IL-6及IL-12 p40產生。
[圖25]以OVA+K3-SPG免疫的Tlr9+/+或Tlr9-/-小鼠之抗原特異的血清抗體價。*p<0.05(Mann-Whitney U test)。
[圖26]以OVA+K3-SPG免疫的Tlr9+/+或Tlr9-/-小鼠之脾細胞的以抗原之再刺激所誘導的IFN-γ產生。*p<0.05(Mann-Whitney U test)。
[圖27]使Tlr9+/+或Tlr9-/-小鼠以OVA+K3-SPG免疫所誘導的OVA特異的CD8T細胞的比例。*p<0.05(Mann-Whitney U test)。
[圖28]K3-SPG之佐劑效果不依存Dectin-1。a)血清中的抗原特異的抗體力價。b)抗原再刺激所致之脾細胞的IFN-γ產生。c)生物體內所誘導之抗原特異的CD8T細胞的比例。
[圖29]以OVA+K3-SPG免疫的Dectin-1+/-或Dectin-1-/-小鼠之抗原特異的血清抗體價。
[圖30]以OVA+K3-SPG免疫的Dectin-1+/-或Dectin-1-/-小鼠之脾細胞的以抗原之再刺激所誘導的IFN-γ產生。
[圖31]使Dectin-1+/-或Dectin-1-/-小鼠以OVA+K3-SPG免疫所誘導的OVA特異的CD8T細胞的比例。*p<0.05(Mann-Whitney U test)。
[圖32]Alexa 488-K3-SPG投與1小時後之分佈於iLNs表面上之K3-SPG。
[圖33]DQ-OVA投與1小時後之iLNs中之OVA、MARCO+細胞、及Siglec-1+細胞的分佈。
[圖34]將圖33中OVA之與MARCO+細胞或Siglec-1+細胞之共同分佈以Volocity解析結果。*p<0.05(t-test)。
[圖35]Alexa 488-K3或Alexa 488-K3-SPG投與1小時後的iLNs中之K3、K3-SPG、及MARCO+細胞的分佈。
[圖36]將圖35中K3或K3-SPG之與MARCO+細胞之共分佈以Volocity解析之結果。*p<0.05(t-test)。
[圖37]為氯膦酸二鈉脂質體所致之枯竭化試驗指南(上面板)、血清中抗原特異的抗體力價(左下)、及抗原刺激細胞介素產生。*p<0.05(t-test)。
[圖38]投與K3或K3-SPG之C57BL/6J或Tlr9-/-小鼠之各種DCs中CD40表現。
[圖39]表示以SV、WIV或SV+K3-SPG免疫的小鼠中之血清中抗原特異的抗體力價。
[圖40]為以SV、WIV或SV+K3-SPG使免疫後，以流行性感冒病毒A/P/R8(H1N1)負荷時之體重的經時變化(左)及生存率曲線(右)。
[圖41]表示以SV+K3或SV+K3-SPG使免疫的食蟹獼猴血清中的抗原特異的血清抗體力價之經時變化。*p<0.05(t-test)。
[圖42]表示以SV+K3或SV+K3-SPG使免疫的食蟹獼猴血清中的抗原特異的血清抗體力價(第110週)。
[圖43]K3與K3-SPG間之疫苗佐劑效果的比較。
[圖44]表示K3、K3-LNT或K3-SPG所致之pan-IFN-a產生與IL-6產生。
[圖45]表示接種添加K3、K3-LNT或K3-SPG之RSV F次單位疫苗的小鼠中之血清中RSV F抗原特異的IgG抗體價。
[圖46]表示接種添加K3或K3-LNT或K3-SPG之RSV F次單位疫苗之小鼠中之因RSV F抗原刺激而被特異性誘導之細胞介素產生。
[圖47]表示接種添加K3或K3-LNT或K3-SPG之RSV F次單位疫苗之棉鼠中之RSV感染防禦效果。
[實施發明之最佳形態]
1.寡去氧核苷酸
本發明為提供含K型CpG寡去氧核苷酸及聚去氧腺苷酸(dA)之寡去氧核苷酸(以下、稱本發明之寡去氧核苷酸)。者。
本發明之寡去氧核苷酸中包含磷酸二酯鍵經修飾(例如一部份或全部的磷酸二酯鍵被硫代磷酸酯鍵取代)者。
本發明之寡去氧核苷酸包含藥學上可容許之鹽。
又，本說明書中寡去氧核苷酸與ODN同義。又，「人化K型CpG寡去氧核苷酸(CpG ODN)」與「人化K 型CpG寡去氧核苷酸(CpG ODN)殘基」不論末尾用語「殘基」之有無而為同義，可交換使用。進而，聚去氧腺苷酸與聚去氧腺苷酸(殘基)同義。用語「殘基」雖指較大分子量之化合物之部份構造，但本說明書中「人化K型CpG寡去氧核苷酸(CpG ODN)」係指獨立分子、或較大分子量之化合物之部份構造，此點為該業者可由文章容易地理解。關於「聚去氧腺苷酸」等本發明之寡去氧核苷酸所包含之其他部份構造之用語亦相同。
CpG寡去氧核苷酸(CpG ODN)為含有免疫賦活性之非甲基化CpG模體之單股DNA，且為TLR9之激動劑。CpG ODN中有骨架序列及免疫賦活特性各自不同的K型(亦稱B型)、D型(亦稱A型)、C型及P型的4個型(Advanced drug delivery reviews 61,195-204(2009))。本發明之寡去氧核苷酸包含此等中之K型CpG ODN。
K型CpG ODN，典型含有非迴文構造之複數非甲基化CpG模體，且使B細胞活性化而產生IL-6，但為具有幾乎不誘導形質細胞樣樹狀細胞(pDCs)之IFN-α產生之構造的及機能的特性之CpG ODN。非甲基化CpG模體係指含有至少1個胞嘧啶(C)-鳥嘌呤(G)序列之短核苷酸序列，且該胞嘧啶-鳥嘌呤序列中之胞嘧啶的5位未被甲基化者。又，在以下說明中，CpG在未特別限制下，係指非甲基化CpG。因此，本發明之寡去氧核苷酸藉由含有K型CpG ODN，而具有K型CpG ODN特有之免疫賦活活性(例如使B細胞(較佳為人類B細胞)活性化而產生IL-6之 活性)。該技術領域中，已知多種人化K型CpG ODN(Journal of immunology 166,2372-2377(2001)；Journal of immunology 164,944-953(2000)；US 8,030,285 B2)。
本發明之寡去氧核苷酸所包含之K型CpG ODN，較佳為經人化。「人化」係指具有對人類TLR9之激動劑活性。因此，含人化K型CpG ODN之本發明之寡去氧核苷酸對人類具有K型CpG ODN特有之免疫賦活活性(例如使人類B細胞活性化而產生IL-6之活性)。
本發明中宜使用的K型CpG ODN為10核苷酸以上之長度，且包含以式：
[化3]5'N1N2N3T-CpG-WN4N5N6 3'
(式中，中央的CpG模體未被甲基化，W為A或T，N1、N2、N3、N4、N5及N6可為任何的核苷酸)所表示之核苷酸序列。
一樣態中，本發明之K型CpG ODN為10核苷酸以上之長度，且包含上述式之核苷酸序列。但，上述式中，中央的4鹽基之CpG模體(TCpGW)包含於10核苷酸中即可，不一定需要位在上述式中N3及N4間。又，上述式中，N1、N2、N3、N4、N5及N6可為任何的核苷酸，N1及N2、N2及N3、N3及N4、N4及N5、以及N5及N6之至少任一個(較佳為一個)之組合可為2鹽基之CpG模體。前述4鹽基之CpG模體不位於N3及N4間之場合，上述 式中，中央的4鹽基(第4~7之鹽基)中連續之任2鹽基為CpG模體，而其他2個鹽基可為任何的核苷酸。
本發明中更宜使用的K型CpG ODN，含有含1個或複數的CpG模體之非迴文構造。再宜使用的K型CpG ODN為由含1個或複數的CpG模體之非迴文構造所構成。
人化K型CpG ODN一般以由TCGA或TCGT所構成之4鹽基之CpG模體為其特徴。又，許多例子中，一個人化K型CpG ODN中包含該4鹽基之CpG模體2或3個。因此，較佳樣態中，本發明之寡去氧核苷酸所包含之K型CpG ODN包含至少1個、更較佳為2以上、再較佳為2或3個、由TCGA或TCGT所構成之4鹽基之CpG模體。該K型CpG ODN具有2或3個4鹽基之CpG模體的場合，此等4鹽基之CpG模體可為相同或相異。但，具有對人類TLR9之激動劑活性下，不特別限定。
本發明之寡去氧核苷酸所包含之K型CpG ODN更較佳為包含序列編號1所表示之核苷酸序列。
K型CpG ODN的長度，在本發明之寡去氧核苷酸具有免疫賦活活性(例如使B細胞(較佳為人類B細胞)活性化而產生IL-6之活性)下，不特別限定，但較佳為100核苷酸長以下(例如10-75核苷酸長)。K型CpG ODN的長度，更較佳為50核苷酸長以下(例如10-40核苷酸長)。K型CpG ODN的長度，再較佳為30核苷酸長以下(例如10-25核苷酸長)。K型CpG ODN的長度，最佳為 12-25核苷酸長。
聚去氧腺苷酸(dA)之長度，為與β-1,3-葡聚醣(較佳為香菇多醣、或西佐糖)鏈一起形成三重螺旋構造之足夠長度，則不特別限定，但由形成安定的三重螺旋構造觀點，通常為20核苷酸長以上、較佳為40核苷酸長以上、更較佳為60核苷酸長以上。因聚dA愈長則愈可與β-1,3-葡聚醣形成安定的三重螺旋構造，故理論上無上限，但過長，則成為寡去氧核苷酸的合成時的長度上產生不均之原因，故通常為100核苷酸長以下、較佳為80以下。另一方面，除前述安定的三重螺旋構造之形成，由使每單位量之β-1,3-葡聚醣所鍵結的本發明之寡去氧核苷酸量增大、且避免寡去氧核苷酸的合成時的長度之不均、複合化效率觀點，聚dA之長度，較佳為20~60核苷酸長(具體上為20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59或60核苷酸長)、更較佳為30~50核苷酸長(30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50核苷酸長)、最佳為30~45核苷酸長(30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45核苷酸長)。尤其，30核苷酸長以上之場合，顯示良好的複合化效率。本發明之寡去氧核苷酸藉由含有聚dA，具有與2支西佐糖鏈一起形成三重螺旋構造之活性。又，亦將聚去氧腺苷酸表示為「聚(dA)」或「poly(dA)」。
於1分子的本發明之寡去氧核苷酸，可含有複數個K型CpG ODN及/或聚dA，但較佳為各含1個K型CpG ODN及聚dA，最佳為由各1個K型CpG ODN及聚dA所構成。
本發明之寡去氧核苷酸之特徵為聚dA配置於K型CpG ODN的3’側。藉由該配置，本發明之複合體(詳細如下述)除K型CpG ODN特有之免疫賦活活性外，亦具有D型CpG ODN特有之具有免疫賦活活性。
K型CpG ODN與聚dA，可藉由直接共價鍵連結，或透過間隔區序列連結。間隔區序列係指在2個相近的構成要素間插入的含有1個以上之核苷酸之核苷酸序列。間隔區序列之長度在本發明之複合體具有免疫賦活活性(較佳為使B細胞活性化而產生IL-6之活性、及使樹狀細胞活性化而產生IFN-α之活性)下，不特別限定，但通常為1~10核苷酸長、較佳為1~5核苷酸長、更較佳為1~3核苷酸長。最佳為K型CpG ODN與聚dA以直接共價鍵連結。
本發明之寡去氧核苷酸，除K型CpG ODN、聚dA及任意的間隔區序列外，於其5’末端及/或3’末端可具有付加的核苷酸序列。該付加的核苷酸序列之長度，在本發明之複合體具有免疫賦活活性(較佳為使B細胞活性化而產生IL-6之活性、及使樹狀細胞活性化而產生IFN-α之活性)下不特別限定，但通常為1~10核苷酸長、較佳為1~5核苷酸長、更較佳為1~3核苷酸長。
較佳樣態中，本發明之寡去氧核苷酸不含如此之5’末端及/或3’末端付加的核苷酸序列。即，本發明之寡去氧核苷酸，較佳為由K型CpG ODN、聚dA及任意的間隔區序列所構成、再較佳為由K型CpG ODN及聚dA所構成。
最佳樣態中，本發明之寡去氧核苷酸為由K型CpG ODN(具體上為例如序列編號1所表示之核苷酸序列所構成之寡去氧核苷酸)及聚dA所構成，且分別K型CpG ODN位於該寡去氧核苷酸的5’末端，聚dA位於3’末端。具體上為於序列編號1所表示之核苷酸序列所構成之寡去氧核苷酸的3’末端鍵結由20~60核苷酸長(更較佳為30~50核苷酸長(30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50核苷酸長)、最佳為30~45核苷酸長(30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45核苷酸長))之聚dA的寡去氧核苷酸，例如序列編號2、或9~12所表示之核苷酸序列所構成之寡去氧核苷酸。
本發明之寡去氧核苷酸的全長，通常為30~200核苷酸長、較佳為35~100核苷酸長、更較佳為40~80核苷酸長(具體上為40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79或80核苷酸長)、更較佳為50~70核苷酸長(具體上為50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64, 65,66,67,68,69,70核苷酸長)、最佳為50~65核苷酸長(具體上為50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65核苷酸長)。
本發明之寡去氧核苷酸可以對生物體內之分解(例如核酸外切酶或核酸內切酶所致之分解)具有抵抗性而適當被修飾。較佳為該改變包含硫代磷酸酯修飾或二硫代磷酸酯修飾。即，本發明之寡去氧核苷酸中之磷酸二酯鍵的一部份或全部被硫代磷酸酯鍵或二硫代磷酸酯鍵取代。
較佳為本發明之寡去氧核苷酸包含磷酸二酯鍵之修飾，更較佳為磷酸二酯鍵之修飾為硫代磷酸酯鍵(即，WO 95/26204所記載般，非交聯氧原子中的1個被硫原子取代)。即，本發明之寡去氧核苷酸中之磷酸二酯鍵的一部份或全部被硫代磷酸酯鍵取代。
本發明之寡去氧核苷酸，較佳為K型CpG ODN中，包含硫代磷酸酯鍵、或二硫代磷酸酯鍵之修飾，更較佳為該K型CpG ODN的磷酸二酯鍵之全部取代為硫代磷酸酯鍵。又，本發明之寡去氧核苷酸，較佳為聚dA中，包含硫代磷酸酯鍵、或二硫代磷酸酯鍵，更較佳為該聚dA之磷酸二酯鍵之全部取代為硫代磷酸酯鍵。再較佳為含有本發明之人化K型CpG寡去氧核苷酸及聚去氧腺苷酸之寡去氧核苷酸的磷酸二酯鍵之全部取代為硫代磷酸酯鍵。最佳為本發明之寡去氧核苷酸為於人化K型CpG寡去氧核苷酸(例如序列編號1)之3’末端鍵結有20~ 60核苷酸長(更較佳為30~50核苷酸長(30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50核苷酸長)、最佳為30~45核苷酸長(30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45核苷酸長))之聚dA之寡去氧核苷酸，且該寡去氧核苷酸所包含之全部之磷酸二酯鍵取代為硫代磷酸酯鍵。因藉由硫代磷酸酯鍵，本發明之寡去氧核苷酸中，不僅對分解之抵抗性，且免疫賦活活性(例如使B細胞活性化而產生IL-6之活性)之增強、及CpG-β-1,3-葡聚醣複合體的高收率受到期待。又，本說明書中之硫代磷酸酯鍵與硫代磷酸酯骨架、磷酸二酯鍵與磷酸骨架同義。
本發明之寡去氧核苷酸中包含上述寡去氧核苷酸的所有藥學上可容許之鹽類、酯、或彼等酯之鹽類。
本發明之寡去氧核苷酸的藥學上可容許之鹽類方面，較佳為鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽般鹼金屬鹽、鈣鹽、鎂鹽般鹼土類金屬鹽、鋁鹽、鐵鹽、鋅鹽、銅鹽、鎳鹽、鈷鹽等之金屬鹽；銨鹽般無機鹽、t-辛基胺鹽、二苄基胺鹽、嗎啉鹽、葡萄糖胺鹽、苯基甘胺酸烷基酯鹽、乙二胺鹽、N-甲基還原葡糖胺鹽、胍鹽、二乙基胺鹽、三乙基胺鹽、二環己基胺鹽、N,N’-二苄基乙二胺鹽、氯普魯卡因鹽、普魯卡因鹽、二乙醇胺鹽、N-苄基-苯乙基胺鹽、哌嗪鹽、四甲基銨鹽、參(羥基甲基)胺基甲烷鹽般有機鹽等之胺鹽；氟化氫酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、碘化氫酸鹽般鹵素原子化氫酸鹽、硝酸鹽、過氯酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽 等之無機酸鹽；甲烷磺酸鹽、三氟甲烷磺酸鹽、乙烷磺酸鹽般低級烷烴磺酸鹽、苯磺酸鹽、p-甲苯磺酸鹽般芳基磺酸鹽、乙酸鹽、蘋果酸鹽、富馬酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、草酸鹽、馬來酸鹽等之有機酸鹽；及甘胺酸鹽、離胺酸鹽、精胺酸鹽、鳥胺酸鹽、麩胺醯胺酸鹽、天門冬胺酸鹽般胺基酸鹽。
本發明之寡去氧核苷酸可為1股、2股、3股之任一形態，但較佳為1股。
本發明之寡去氧核苷酸較佳為經單離。「單離」係指經除去目的成分以外之因子的操作，而脫離天然存在之狀態。「經單離的寡去氧核苷酸」之純度(評估對象物之總重量所佔的目的寡去氧核苷酸重量之百分率)通常為70%以上、較佳為80%以上、更較佳為90%以上、再較佳為99%以上。
因本發明之寡去氧核苷酸具有優異的免疫賦活活性(例如使B細胞(較佳為人類B細胞)活性化而產生IL-6之活性)，可用作為免疫賦活劑等。進而，因本發明之寡去氧核苷酸具有與2支β-1,3-葡聚醣(較佳為香菇多醣、西佐糖、或硬葡聚糖)一起形成三重螺旋構造之性質，而可用於下述本發明之複合體的調製。
2.複合體
本發明為提供含有上述本發明之寡去氧核苷酸及β-1,3-葡聚醣之複合體(以下稱本發明之複合體。)者。
因上述本發明之寡去氧核苷酸含有K型CpG ODN，故其單獨，發揮K型CpG ODN特有之免疫賦活活性(例如使B細胞(較佳為人類B細胞)活性化而產生IL-6之活性)而在D型CpG ODN特有之免疫賦活活性(例如使形質細胞樣樹狀細胞活性化而產生IFN-α之活性)上匱乏。然而，驚人的是藉由與β-1,3-葡聚醣(較佳為香菇多醣、或西佐糖)形成複合體，不需D型CpG ODN的序列，而可獲得D型CpG ODN特有之免疫賦活活性(例如使形質細胞樣樹狀細胞活性化而產生IFN-α之活性)。即，本發明之複合體兼具K型CpG ODN特有之免疫賦活活性(例如使B細胞(較佳為人類B細胞)活性化而產生IL-6之活性)與D型CpG ODN特有之免疫賦活活性(例如使形質細胞樣樹狀細胞(較佳為人類形質細胞樣樹狀細胞)活性化而產生IFN-α之活性)。
本發明所使用的β-1,3-葡聚醣，可舉例如香菇多醣、西佐糖、硬葡聚糖、卡特蘭多醣、巴基馬、灰樹花蛋白多糖、昆布糖等。β-1,3-葡聚醣，較佳為香菇多醣、西佐糖或硬葡聚糖般，為含大量1,6-吡喃葡萄糖苷分枝之(側鏈率33~40%)β-1,3-葡聚醣，更較佳為香菇多醣、或西佐糖，最佳為香菇多醣。
香菇多醣(LNT)為來自香菇之習知β-1,3-1,6-葡聚醣，分子式為(C6H10O5)n，分子量為約30~70萬。雖幾乎不溶於水、甲醇、乙醇(95)、或丙酮，但溶於極性有機溶劑之DMSO或氫氧化鈉水溶液。
香菇多醣具有活性化巨噬細胞、殺手T細胞、自然殺手細胞及抗體依賴性巨噬細胞的細胞毒作用(ADMC)活性之增強作用(Hamuro,J.,et al.：Immunology,39,551-559,1980、Hamuro,J.,et al.：Int.J.Immunopharmacol.,2,171,1980、Herlyn,D.,et al.：Gann,76,37-42,1985)。動物實驗中，對同系腫瘤及本身腫瘤藉由與化學療法劑之併用投與，確認到腫瘤增殖抑制作用以及延命效果。又，即使香菇多醣單獨投與亦可確認到腫瘤增殖抑制作用以及延命效果。臨床試驗中對於無法手術或再發胃癌患者，藉由與Tegafur經口投與之併用，確認到生存期間延長(醫藥品Interview Form「香菇多醣靜注用1mg「味之素」」)而在日本被承認。香菇多醣單獨投與所致之效果目前未被確認。
西佐糖(SPG)為來自裂褶菌之習知可溶性β-葡聚醣。SPG由β-(1→3)-D-葡聚醣之主鏈與每各3個葡萄糖1個之β-(1→6)-D-葡萄糖基側鏈所構成(Tabata,K.,Ito,W.,Kojima,T.,Kawabata,S.and Misaki A.,「Carbohydr.Res.」，1981,89,1,p.121-135)。SPG在作為對婦癌之免疫增強法之肌肉內注射製劑臨床藥有20年以上之用途實績(清水，陳，荷見，增淵，「Biotherapy」,1990,4,p.1390長谷川，「Oncology and Chemotherapy」,1992,8,p.225)，確認生物體內之安全性(Theresa,M.McIntire and David,A.Brant,「J.Am.Chem.Soc.」,1998,120,p.6909)。
本說明書中「複合體」係指複數的分子透過靜電結合、凡得瓦力結合、氫鍵、疏水性相互作用等之非共價鍵或共價鍵會合而得到的產物。
本發明之複合體較佳為三重螺旋構造狀。較佳樣態中，形成該三重螺旋構造之3支鏈中，2支為β-1,3-葡聚醣鏈，1支為上述本發明之寡去氧核苷酸中之聚去氧腺苷酸的鏈。又，該複合體一部份可含有未形成三重螺旋構造之部份。
本發明之複合體中寡去氧核苷酸與β-1,3-葡聚醣之組成比，因應寡去氧核苷酸中聚去氧腺苷酸的鏈長、及β-1,3-葡聚醣之長度等而可變化。例如β-1,3-葡聚醣鏈與聚去氧腺苷酸的鏈之長度相同之場合，2支之β-1,3-葡聚醣鏈與1支之本發明之寡去氧核苷酸會合，可形成三重螺旋構造。一般相對於β-1,3-葡聚醣鏈，聚去氧腺苷酸的鏈長為短，故相對於2支之β-1,3-葡聚醣鏈，複數的本發明之寡去氧核苷酸透過聚去氧腺苷酸會合，可形成三重螺旋構造(圖1作為參考)。
本發明之複合體為含有人化K型CpG ODN及β-1,3-葡聚醣(例如香菇多醣、西佐糖、硬葡聚糖、卡特蘭多醣、巴基馬、灰樹花蛋白多糖、昆布糖)之複合體，較佳為由人化K型CpG ODN及β-1,3-葡聚醣(例如香菇多醣、西佐糖、硬葡聚糖)所構成之複合體。更較佳為序列編號1所表示之核苷酸序列所構成之寡去氧核苷酸的3’側鍵結有20~60核苷酸長(具體上為20,21,22,23,24,25, 26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59或60核苷酸長)之聚去氧腺苷酸，且磷酸二酯鍵之全部被硫代磷酸酯鍵取代的寡去氧核苷酸、及β-1,3-葡聚醣(例如香菇多醣、西佐糖)所構成之複合體(例如K3-dA20~60-LNT、K3-dA20~60-SPG)，再較佳為由序列編號1所表示之核苷酸序列所構成之寡去氧核苷酸的3’側鍵結有30~50核苷酸長(具體上為30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50核苷酸長)之聚去氧腺苷酸，且磷酸二酯鍵之全部被硫代磷酸酯鍵取代的寡去氧核苷酸、及β-1,3-葡聚醣(例如香菇多醣、西佐糖)所構成之複合體(例如K3-dA30~50-LNT、K3-dA30~50-SPG)，最佳為序列編號1所表示之核苷酸序列所構成之寡去氧核苷酸的3’側鍵結有30~45核苷酸長(具體上為30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45核苷酸長)之聚去氧腺苷酸，且磷酸二酯鍵之全部被硫代磷酸酯鍵取代的寡去氧核苷酸、及β-1,3-葡聚醣(例如香菇多醣、西佐糖)所構成之複合體(K3-dA30~45-LNT、K3-dA30~45-SPG)。
關於本發明之複合體的調製方法，可與非專利文獻21~24或特開2008-100919號公報記載之條件同樣地進行。即，將原本天然以三重螺旋構造存在之β-1,3-葡聚醣溶於非質子性有機極性溶劑(二甲基亞碸(DMSO)，乙腈，丙酮等)或鹼水溶液(氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨、氫 氧化鈣等)後，解為單股。將如此得到的單股的β-1,3-葡聚醣之溶液與本發明之寡去氧核苷酸的溶液(水溶液、中性附近之pH緩衝水溶液、或酸性之緩衝水溶液、較佳為水溶液或中性附近之pH緩衝水溶液)混合，因應必要再度使pH調整至中性附近後維持適當時間，例如在5℃維持一夜。結果，藉由2支之β-1,3-葡聚醣鏈與該寡去氧核苷酸中之聚dA鏈形成三重螺旋構造，形成本發明之複合體。藉由對生成的複合體，進行以尺寸排除層析法之精製、超過濾、透析等，可除去未形成複合體之寡去氧核苷酸。又，藉由對生成的複合體，進行陰離子交換層析法之精製，可將未形成複合體的β-1,3-葡聚醣除去。藉由上述方法，可使複合體適宜精製。
本發明之複合體的形成，可藉由測定例如CD(圓偏光二色性)頻譜之立體構形變化、尺寸排除層析法之UV吸收位移、膠體電泳、微晶片電泳、毛細管電泳確認，但不限於此。
本發明之寡去氧核苷酸與β-1,3-葡聚醣之混合比，可考量聚dA鏈之長度等適宜設定，但通常莫耳比(SPG/ODN)為0.02~2.0、較佳為0.1~0.5。另外樣態中，莫耳比(β-1,3-葡聚醣(LNT等)/ODN)為例如0.005~1.0、較佳為0.020~0.25。
關於本發明之複合體的調製方法，以CpG-ODN與LNT複合體為例說明。使LNT溶於0.05~2N、較佳為0.1~1.5N之鹼水溶液(例如0.25N氫氧化鈉水溶 液)，在1℃~40℃放置10小時~4日(例如在室溫放置一晚)，調製單股的LNT水溶液(例如50mg/ml的LNT水溶液)。將前述LNT水溶液與另外調製的CpG水溶液(例如100μM的CpG水溶液)以莫耳比(LNT/ODN)0.005~1.0混合，接著，於前述LNT水溶液添加酸性之緩衝水溶液(例如NaH2PO4)後進行中和，在1~40℃維持6小時~4日(例如在4℃、一晚)以使複合化完畢。又，為了前述複合化，LNT水溶液可最後加入並混合。複合體的形成，可藉由使用例如尺寸排除層析法，將向CpG ODN的高分子量側之位移以監測240~280nm(例如260nm)中之吸收而確認。
一樣態中，本發明之複合體呈現竿狀之粒子的形態。粒子徑與用作為材料的β-1,3-葡聚醣(例如西佐糖)天然呈現三重螺旋構造而形成之粒子徑相同，通常平均粒子徑為10-100nm、較佳為20-50nm。該粒子徑，可藉由使複合體溶於水，使用Malvern Instruments Zeta Sizer在80℃之條件以動態光散射測量。
本發明之複合體較佳為經單離。「經單離的複合體」之純度(評估對象物之總重量所佔的目的複合體重量之百分率)，通常為70%以上、較佳為80%以上、更較佳為90%以上、再較佳為99%以上。
本發明之複合體具有優異的免疫賦活活性，尤其因具有K型CpG ODN特有之免疫賦活活性(例如使B細胞(較佳為人類B細胞)活性化而產生IL-6之活性)與D 型CpG ODN特有之免疫賦活活性(例如使形質細胞樣樹狀細胞(較佳為人類形質細胞樣樹狀細胞)活性化而產生IFN-α之活性)之兩者，可用作為免疫賦活劑等。例如含K型CpG ODN(例如序列編號2、11、12)與LNT之複合體(K3-LNT)及含K型CpG ODN(例如序列編號2)與SPG之複合體(K3-SPG)具有炎症反應誘導能力(pan-IFN-a、IL-6等)、病毒接種個體中之血清中抗原特異的IgG抗體價(Total IgG，IgG2c等)之增強作用、病毒接種個體中之抗原特異的細胞介素產生能力(IFN-γ，IL2等)、對病毒之感染防禦效果。K3-LNT亦具有病毒接種個體中Th2型細胞介素(IL-13等)之產生增強能力。因此，可用作為候補新穎疫苗佐劑。
3.醫藥組成物
本發明為提供含上述本發明之寡去氧核苷酸或上述本發明之複合體之醫藥組成物者。本發明之醫藥組成物可藉由使上述本發明之寡去氧核苷酸或上述本發明之複合體以常用手段製劑化而得到。本發明之醫藥組成物含有本發明之寡去氧核苷酸或複合體與藥理學上可容許之載體。又，本醫藥組成物可再含有抗原。如此之醫藥組成物可以適用經口或非經口投與之劑型提供。
非經口投與用之組成物，可使用例如注射劑、塞劑等，注射劑可包含靜脈注射劑、皮下注射劑、皮內注射劑、肌肉注射劑、點滴注射劑等之劑型。如此之注 射劑可以習知方法調製。注射劑之調製方法，可藉由例如使上述本發明之寡去氧核苷酸或複合體溶解或懸濁於通常注射劑使用之無菌水性溶劑而調製。注射用之水性溶劑，可使用例如蒸餾水；生理食鹽水；磷酸緩衝液、碳酸緩衝液、Tris buffer、乙酸緩衝液等之緩衝液等。如此之水性溶劑之pH可舉例如5~10，較佳為6~8。經調製的注射液以充填於適當的安瓶為佳。
又，使本發明之寡去氧核苷酸或複合體的懸濁液進行真空乾燥、凍結乾燥等之處理，亦可調製本發明之寡去氧核苷酸或複合體的粉末製劑。使本發明之寡去氧核苷酸或複合體以粉末狀態保存，使用時藉由使該粉末以注射用之水性溶劑分散而可供使用。
醫藥組成物中之本發明之寡去氧核苷酸或複合體的含量，通常為醫藥組成物全體的約0.1~100重量%、較佳為約1~99重量%、更較佳為約10~90重量%左右。
本發明之醫藥組成物，作為有效成分可單獨含有本發明之寡去氧核苷酸或複合體，或可含有本發明之寡去氧核苷酸或複合體與其他有效成分之組合。
4.醫藥用途
本發明之寡去氧核苷酸及複合體，因具有優異的免疫賦活活性，本發明之寡去氧核苷酸、複合體及醫藥組成物可用作為免疫賦活劑。藉由將本發明之寡去氧核苷酸、複 合體或醫藥組成物投與哺乳動物(人類等之靈長類、小鼠等之齧齒類等)，可引發該哺乳動物中之免疫反應。尤其，本發明之複合體具有D型CpG ODN的活性特性，刺激末梢血單核球，使I型干擾素(Pan-IFN-α、IFN-α2等)及II型干擾素(IFN-γ)之兩者大量產生，故可用作為I型干擾素產生誘導劑、II型干擾素產生誘導劑、I型及II型干擾素產生誘導劑。因誘導I型及II型干擾素之兩者產生，本發明之複合體及含其之醫藥組成物可用於I型及II型干擾素中任一者或兩者有效的疾病之預防或治療。I型干擾素有效的疾病，可舉例如病毒感染症(例如C型肝炎病毒(HCV)、皰疹病毒、人類乳突病毒、RS病毒、流行性感冒病毒等)、癌等。II型干擾素有效的疾病，可舉例如過敏疾病、細胞內寄生性之原蟲(利什曼原蟲等)或細菌(李斯特菌、結核菌等)等之感染症等。對於包含RS病毒或流行性感冒病毒之急性病毒感染症，與I型干擾素及II型干擾素一起，提高與病毒排除有關之免疫反應，故本發明之複合體及含其之醫藥組成物可期待對急性病毒感染症之有效性。
又，本發明之寡去氧核苷酸及複合體、尤其本發明之複合體具有強力疫苗佐劑活性，使本發明之寡去氧核苷酸及複合體與抗原一起投與哺乳動物，則可強力地誘導對該抗原之免疫反應。因此，本發明為亦提供含有(a)本發明之寡去氧核苷酸、或本發明之複合體、及(b)抗原之誘導對該抗原之免疫反應用之組成物者。尤其，本發明 之複合體強力誘導對抗原之體液性免疫反應(抗原特異的抗體產生)與細胞性免疫反應(抗原特異的CTL誘導)之兩者。因此，本發明之寡去氧核苷酸、複合體、及醫藥組成物，尤其本發明之複合體及含其之醫藥組成物可用作為疫苗佐劑。
本說明書中佐劑係指促進免疫反應的補助劑，與抗原一起投與生物體時，使該對抗原之免疫反應非特異性地增強之物質。
作為抗原，對投與對象之哺乳動物(人類等之靈長類、小鼠等之齧齒類等)具有抗原性，且抗體或細胞傷害性T淋巴球(CTL，CD8+ T細胞)作為抗原辨識，則不特別限定，可使用成為抗原之所有物質(蛋白質、胜肽、核酸、脂質、糖質、以及前述物質之修飾體(例如導入一個或複數的胺基酸的缺失、取代、及/或付加等(以下、變異等)的修飾體等)。作為抗原，亦可使用原蟲、真菌、細菌、病毒等之來自病原體之抗原、癌、或與特定疾病相關的抗原。
本說明書中「抗原A來自病原體X」係指抗原A於該病原體X中被包含作為構成因子。例如抗原A為聚胜肽之場合，係指該聚胜肽之胺基酸序列存在於病原體X之基因組所編碼之蛋白質的胺基酸序列中。
作為來自病原體之抗原，可舉例如病原體本身或其一部份、不活化或減毒化的病原體本身或其一部份、或者導入彼等之變異等的修飾體等。
作為抗原使用來自病原體之抗原，則引起對該抗原之免疫反應，而產生使包含該抗原之病原體免疫學上地排除至生物體外之作用。因此，包含(a)本發明之寡去氧核苷酸、或本發明之複合體、及(b)來自病原體之抗原的誘導對該抗原之免疫反應用之組成物可用於該病原體之預防或治療。
本發明之複合體強力誘導對抗原之體液性免疫反應(抗原特異的抗體產生)以及細胞性免疫反應(抗原特異的CTL誘導)之兩者。因此，來自已知被細胞傷害性T淋巴球辨識的細胞內感染性之病原體(病毒、原蟲、真菌、細菌等)的抗原或與癌化細胞相關的抗原(例如腫瘤抗原)等可用作為抗原。
作為細胞內感染性病毒，不特別限定，可舉例如RS病毒、流行性感冒病毒、副流行性感冒病毒、C型肝炎病毒(HCV)、A型肝炎病毒(HAV)、B型肝炎病毒(HBV)、伊波拉病毒、巨細胞病毒、腺病毒、脊髓灰質炎病毒、日本腦炎病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、德國麻疹病毒、狂犬病病毒、黃熱病毒、水痘帶狀疱疹病毒、漢他病毒、登革熱病毒、諾羅病毒、輪狀病毒、小DNA病毒、冠狀病毒、犬瘟熱病毒、成人T細胞白血病病毒(HTLV-1)、人類免疫不全病毒(HIV)、皰疹病毒、人類乳突病毒等。細胞內感染性細菌，可舉例如黴漿菌等。細胞內感染性原蟲，可舉例如瘧疾原蟲、住血吸蟲等。細胞內感染性病原體，較佳為病毒(具體上為RS病毒、或流行性 感冒病毒等)。
作為與經癌化的細胞有關的抗原，可舉例如經癌化的細胞中特異表現的蛋白質、糖鏈、胜肽、以及前述物質的變異體(缺失、取代、及/或付加)或其修飾體等。
本發明之複合體因強力誘導I型及II型干擾素之兩者，在一樣態中，作為病毒選擇引起I型干擾素及II型干擾素之兩者有效的急性病毒感染症之病毒(例如RS病毒、流行性感冒病毒)。
例如藉由使包含(a)本發明之寡去氧核苷酸、或本發明之複合體、及(b)來自病原體或癌的抗原之誘導對該抗原之免疫反應用之組成物投與該病原體感染症或癌之患者、可能罹患該病原體感染症或癌之人類，使接受該投與的對象中之細胞傷害性T淋巴球(CTL)抗原特異性地活性化，誘導該抗原特異的抗體產生，即，藉由誘導溫血動物(較佳為人類)之防禦免疫反應，可預防．治療該感染症或癌。即，該組成物可用作為上述感染症、癌等之疾病之預防或治療用的疫苗。
又，本發明之複合體，因可強力誘導對抗原之體液性免疫反應(抗原特異的抗體產生)與細胞性免疫反應(抗原特異的CTL誘導)之兩者，故作為抗原可使用病原體或癌細胞的表面抗原與內部抗原任一，以混合使用表面抗原與內部抗原為佳。
含有(a)本發明之寡去氧核苷酸、或本發明之複合體、及(b)抗原之誘導對該抗原之免疫反應用之組成 物，可依據上述本發明之醫藥組成物調製。
包含本說明書中所舉專利及專利申請說明書之全部刊物所記載內容引用在本說明書，本說明書為與其全部揭示相同程度者。
【實施方式】
[實施例]
以下以實施例將本發明更詳細說明，但本發明不限於此等之實施例。
[方法]
動物及試藥
Tlr9缺損小鼠及Dectin-1缺損小鼠之製作，如從前記載(Koyama,S.,et al.,Science translational medicine 2,25ra24(2010)；Saijo,S.,et al.,Nature immunology 8,39-46(2007))。C57BL/6J小鼠購自Clea-Japan。
全部之動物實驗依據醫藥基礎研究所及大阪大學動物設施之機關實施基準實施。以下之CpG ODNs被(股)Genedesign合成(底線表示硫代磷酸酯鍵)。
Figure 112109803-A0202-12-0042-1
尤其除上述K3-dA40(序列編號2)，記載K3-dA35(序列編號12)、K3-dA30(序列編號11)、K3-dA25(序列編號10)及K3-dA20(序列編號9)之合成(表2)。
Figure 112109803-A0202-12-0042-2
(上述序列中之s表示核苷間之磷酸二酯鍵被硫代磷酸酯鍵取代)。
本寡去氧核苷酸，使用常法之固相磷醯胺酸 法(Nucleic Acids in Chemistry and Biology,3.Chemical synthesis(1990)ed.G.Michael Blackburn and Michael J.Gait.Oxford University Press)合成。
表3表示表2記載之CpG ODN的分子量、及用以下之條件以逆相HPLC分析場合之滯留時間(管柱：Waters，X-Bridge C18 2.5μm，4.6×75mm、A溶液：100mM六氟異丙醇、8mM三乙基胺、B溶液：甲醇、B%：5%→30%(20min，linear gradient)；60℃；1ml/min；260nm)。
Figure 112109803-A0202-12-0043-3
卵白蛋白(OVA)購自生化學工業(股)。DQ-OVA、Alexa488-OVA、CFSE、及Lipofectamine 2000購自Invitrogen。Hoechst33258、酵母聚糖及卡特蘭多醣購自SIGMA。Zymosan-Depleted購自Invivogen。氯膦酸二鈉脂質體購自FormuMax。流行性感冒裂解產物疫苗、甲醛不活化全病毒(WIV)、及精製流行性感冒病毒(H1N1)如之前記載般調製(Koyama,S.,et al.,Science translational medicine 2,25ra24(2010))。
CpG ODN與SPG之複合體化(圖1)
將7.22mg之K3-dA40溶於水(3.7mL)。使SPG(三井製糖)15mg溶於0.25N NaOH(1mL)。將1mL的330mM NaH2PO4加入至DNA溶液，接著使SPG溶液加入於DNA/NaH2PO4溶液，藉由以4℃維持一晚而完成複合體化。莫耳比(MSPG/MDNA)固定為0.27。複合體的形成以微晶片電泳裝置(SHIMADZU：MultiNA)確認。
CpG ODN與LNT之複合體化(圖1)
使香菇多醣(LNT：味之素股份公司、批號：2D8X1)以成為50mg/ml之方式，溶於0.25N NaOH，在室溫放置一晚。各種CpG ODN(表2，3)以成為100μM之方式，溶於注射用水。將LNT水溶液與各種CpG水溶液(K3-dA20(序列編號9)、K3-dA25(序列編號10)、K3-dA30(序列編號11)、K3-dA35(序列編號12)、K3-dA40(序列編號2))以表4所示比率混合，接著，加入與添加的LNT同體積之330mM NaH2PO4，在4℃維持一晚而完成複合體化。複合體的形成，藉由使用尺寸排除層析法，以監測向CpG ODN的高分子量側之位移、260nm中之吸收而確認(System：Agilent 1100series、Column：Asahipak GF7M-HQ(Shodex)2支連結、Flow rate：0.8mL/min、Buffer：10mM EDTA PBS，pH7.4、Temperature：40℃)。
Figure 112109803-A0202-12-0045-4
人類PBMCs之調製及刺激(圖2、3、6、7)
PBMCs得自3健康之成人男性自願者(30~40歲)。使用人類PBMCs之全部試驗被醫藥基礎研究所之設施內科學研究與倫理審查委員會認可。使用Ficoll調製PBMCs後，以1×107個/ml的濃度播種。將PBMCs維持於complete RPMI(添加有10% FCS、PENICILLIN、及streptomycin之RPMI 1640)中。使PBMCs以K3(0.24、0.74、2.2、6.6、20μg/mL)、K3-dA40、K3-SPG(K3-dA40之複合體)、dA40-K3、SPG-K3(dA40-K3之複合體)、D35、CpG21798、CpG21889、CpG2395、或M362刺激24小時。使上清進行pan-IFN-α(Mabtech)、IL-6(R&D)、及Milliplex(Millipore)用之ELISA。
電子顯微鏡解析(圖4)
進行染色前將試料滴下至Formvar-carbon coated grid上。因陰性染色，使2%乙酸鈾(pH 4.0)之液滴載持於夾具上使風乾。將夾具在電子顯微鏡(Hitachi H-7650)上放大40,000倍觀察。
動態光散射(圖5)
將水溶液中之平均奈米粒子尺寸在80℃、Malvern Instruments Zeta Sizer上使用動態光散射進行測定。
脾細胞及樹狀細胞培養(圖8、9)
由6週齡C57BL/6J小鼠、Tlr9缺損小鼠、及Dectin-1缺損小鼠，採取小鼠脾臓。將脾細胞懸濁後，以ACK溶解緩衝液將紅血球(RBCs)溶解，並使細胞維持於complete RPMI中。使細胞以1×107cells/mL的濃度播種。使來自小鼠骨髄細胞與人類Flt3L(Peprotech)(100ng/mL)一起培養7日，製作來自骨髄之DCs。使細胞以1×107cells/mL的濃度播種。藉由與小鼠M-CSF(Peprotech)(20ng/mL)一起培養7日製作BMDMs。此等之細胞維持於complete RPMI中。
細胞內分佈(圖8、9)
將BMDMs以5×107cells/mL播種，以Alexa 488-K3(1μM)及Alexa 647-K3-SPG(1μM)、或Alexa 488-D35(1μM)及Alexa 647-K3-SPG(1μM)刺激3小時。使細胞以 Hoechst33258進行30分鐘染色而使核可視化，接著將細胞固定，使用螢光顯微鏡進行解析。
免疫接種
於6週齡的C57BL/6J小鼠、Tlr9缺損小鼠、及Dectin-1缺損小鼠之尾的基部，在第0日及第10日投與OVA(0.1、1、10、或100μg)；OVA(0.37、1.1、3.3、或10μg)及K3(538pmol)；OVA(0.37、1.1、3.3、或10μg)及K3-dA40(538pmol)；或OVA(0.37、1.1、3.3、或10μg)及K3-SPG(538pmol)。其他試驗中於6週齡的C57BL/6J小鼠之尾的基部，在第0日及第10日投與裂解疫苗(0.1μg)單獨；裂解疫苗及K3(538pmol)；或裂解疫苗及K3-SPG(538pmol)。於第17日採血，將抗原特異的血清抗體力價以ELISA測定(圖10、15a、16、25、28a、29、43a)。於第17日採取小鼠脾臓，並使脾細胞以上述方法調製。將細胞以OVA257-264(OVA257)：SIINFEKL(10μg/mL)；OVA323-339(OVA323)：ISQAVHAAHAEINEAGR(10μg/mL)；全OVA蛋白質(OVA)(10μg/mL)；NP260-283(NP260)：ARSALILRGSVAHKSCLPACVYGP(10 μg/mL)；或裂解疫苗(10μg/mL)再刺激24或48小時。使上清進行小鼠IFN-γ用的ELISA(圖11、15b、17、26、28b、30、43b)。為了Tetramer Assay，將脾細胞以H-2Kb OVATetramer(MBL)、抗CD8α(KT15)、抗TCRβ(H57-597)、抗CD62L(MEL-14)、及抗CD44(IM7)抗體、以及7-AAD染色。將OVATetramer+ CD44+ CD8α+ TCRβ+細胞數以FACS測定(圖12、15c、27、28c、31)。
體外CTLAssay(圖13)
於6週齡的C57BL/6J小鼠之尾的基部，於第0日投與OVA(100μg)；OVA及K3(3.3μg)；OVA及K3-dA40(3.3μg)；或OVA及K3-SPG(3.3μg)。於免疫接種後第7日，使naiveC57BL/6J脾細胞以不同濃度之CFSE(5或0.5μM)，10分鐘、37℃進行標記。使經染色的高濃度細胞在OVA257(10μg/mL)90分鐘、37℃進行脈衝。以培養基進行2次洗淨後，混合經標記的細胞，藉由靜脈內投與移入經免疫的小鼠。移入後24小時後，採取脾細胞，將以CFSE標記的細胞的比例以FACS測定。
胜肽免疫接種
將C57BL/6J小鼠以OVA257(10μg)；OVA257及K3(10μg)；OVA257及K3-dA40(10μg)；或OVA257及K3-SPG(10μg)進行免疫。自免疫7日後，調製脾細胞，以H-2Kb OVATetramer、抗CD8α、抗TCRβ、抗CD62L、及抗CD44抗體進行染色。將OVATetramer+ CD44+ CD8α+ TCRβ+細胞數以FACS解析(圖14左)。調製的脾細胞在體外以OVA257(10μg/mL)及Golgi Plug再刺激4小時。使細胞以抗IFN-γ、抗CD8α、及抗CD3e抗體染色，IFN-γ+ CD8α+ CD3e+細胞數以FACS進行測定(圖14右)。
轉染及Dectin-1結合Assay(圖18、19)
將HEK293使用Lipofectamine 2000，以空、Dectin-1、或Dectin-2表現質體進行轉染。轉染後48小時，使細胞以FITC-SPG(0.5μM)、Alexa 488-labeled K3-dA40(0.5μM)、或Alexa 488-labeled K3-SPG(0.5μM)，在37℃處理60分鐘。處理後收集細胞，使SPG或CpG ODN陽性細胞以FACS解析。
免疫細胞的刺激(圖20、21、22、23、24)
使來自C57BL/6J小鼠、Tlr9缺損小鼠、或Dectin-1缺損小鼠之脾細胞及FL-DCs以K3-SPG(0.014、0.03、0.04、0.08、0.12、0.25、0.37、0.74、1.1、2.2、3.3、6.7、10、或20μg/mL)、酵母聚糖(3.7、11.1、33.3、或100μg/mL)、卡特蘭多醣、Zymosan-Depleted、或SPG進行24小時刺激。其他試驗中，使來自C57BL/6J小鼠或Dectin-1缺損小鼠之脾細胞在D35(1μM)之存在下或不存在下，以Zymosan-Depleted(100、33.3、或11.1μg/mL)或SPG(100、33.3、或11.1μg/mL)刺激24小時。將上清進行IFN-α(PBL)、IL-6(R&D)、IL-12 p40(R&D)、IL-12 p70(R&D)、及Bioplex(BIO-RAD)用的ELISA。
免疫組織化學(圖32)
於C57BL/6J小鼠之基部投與DQ-OVA(10μg)；Alexa 488-K3-SPG(10μg)；Alexa 647-K3-SPG(10μg)；或DQ-OVA及Alexa647-K3-SPG(10μg)。採取iLNs後，使用冷凍切片機調製凍結切片。將凍結切片以4%三聚甲醛固定10分鐘，與抗Siglec-1(MOMA-1)、抗MARCO(ED31)、抗CD3e(145-2C11)、或抗CD11c(N418)抗體進行培養。影像化結果以ImageJ進行解析。
二光子顯微鏡(圖33、35)
於C57BL/6J小鼠、Tlr9缺損小鼠、或Dectin-1缺損小鼠之尾的基部，投與DQ-OVA(10μg)、Alexa 488-K3(10μg)、或Alexa 488-K3-SPG(10μg)。iLN採取30分鐘前，於小鼠之尾的基部投與PE-抗MARCO抗體、或PE-抗Siglec-1抗體。抗原及佐劑之投與後1小時，採取iLNs，交付二光子顯微鏡(Olympus)之影像解析。使Pearson相關使用Volocity共分佈解析計算。
抗原及佐劑投與後之生物體內分佈(圖34、36)
於C57BL/6J小鼠之尾的基部，投與Alexa 647-K3(538pmol)、Alexa 647-K3-SPG(538pmol)、Alexa 488-OVA(10μg)、Alexa 488-OVA及K3(10μg)、Alexa 488-OVA及K3-SPG(10μg)，DQ-OVA(10μg)、DQ-OVA及Alexa 647-K3(538pmol)、或DQ-OVA及Alexa 647-K3-SPG(538pmol)。投與24小時後，採取iLNs。為了調製單一細胞懸濁液，使iLNs與膠原酶D(1mg/mL)及DNase I(0.1mg/mL)在37℃培養30分鐘。將調製的細胞與抗B220(RA3-6B2)、抗CD8α(56-6.7)、及抗CD11c抗體培養，分離不同DC集團。將OVA及CpG ODNs之細胞內攝入以FACS解析。
氯膦酸二鈉(Clodronate)脂質體注入(圖37)
在免疫接種之5日或2日前中任一，於6週齡的C57BL/6J小鼠之尾的基部，投與氯膦酸二鈉脂質體。於第0日用OVA及K3-SPG使小鼠於尾根部進行免疫。於第8日採取血液及脾臓，將血清抗體力價及T細胞反應以ELISA進行測定。
生物體內中之DC活性化之檢討(圖38)
於C57BL/6J小鼠或Tlr9缺損小鼠之尾的基部，投與K3(10μg)或K3-SPG(10μg)。自投與24小時後，將iLNs以上述方法調製。使細胞與抗CD11c、抗mPDCA-1(JF05-1C2.4.1)、抗CD8α、及抗CD40(3/23)抗體培養並以FACS解析。
對流行性感冒病毒之感染防禦反應之檢討
於6週齡的C57BL/6J小鼠，於第0日及第14日投與裂解疫苗(0.1μg)；裂解疫苗及K3-SPG(10μg)；或WIV(0.2μg)。自免疫接種2週後，使血清抗體力價以ELISA測定(圖39)，於小鼠將2.3×103pfu(10 LD50)之流行性感冒病毒A/PR/8/34接種至鼻腔內。在接種後20日之間監測小鼠之體重及死亡率(圖40)。
食蟹獼猴之疫苗模型(圖41、42)
於食蟹獼猴之皮下，第0日及第14日投與流行性感冒裂解疫苗(5μg)及K3(5nmol)；或裂解疫苗及K3-SPG(5nmol)。在第-2、2、4、6、8及110週採取血液試料，將血清抗體力價以ELISA進行測定。
統計學的解析
群間統計學的顯著性(P<0.05)使用Student’s t-test或Mann-Whitney U test決定。
[結果]
1)K3-SPG之竿狀奈米尺寸粒子得到K型及D型CpG ODN的2個特性。
圖1所示般，CpG ODN與SPG之間更佳複合體化效率，透過變性-復元步驟，需要在5’末端或3’末端中之聚dA40的PS骨架之追加的序列(Shimada,N.,et al.,Bioconjugate chemistry 18,1280-1286(2007)；Minari,J.,et al.,Bioconjugate chemistry 22,9-15(2011))。在人化CpG ODN之複合體形成最佳化過程，本發明者們調查CpG ODN的5’末端及3’末端對免疫賦活性之影響。雖複合體化效率相同，與SPG複合體化的5’-K3-dA40-3’使人類末梢血單核球(PBMCs)活性化且產生多量之IFN-α，但在5’-dA40-K3-3’卻並非如此(圖2、圖3)。K3、K3-dA40及 dA40-K3雖可使人類PBMCs活性化產生IL-6般其他細胞介素，但無法產生IFN-α(圖2、圖3)。此等之結果表示作為新穎TLR9激動劑，相較於3’-CpG以5’-CpG較佳。
將K3-SPG之定性及定量以掃描型電子顯微鏡(SEM)及動態光散射(DLS)實施。K3-SPG具有竿樣構造，且與以前報告(Bae,A.H.,et al.,Carbohydrate research 339,251-258(2004))中所見者一致(圖4)。其被認為係具有30nM的平均徑之可溶性之單聚物奈米粒子，與SPG本身相同，且比D型CpG ODN(D35)小(圖5)(Klein,D.C.et al.,Ultramicroscopy 110,689-693(2010)；Costa,L.T.,et al.,Biochemical and biophysical research communications 313,1065-1072(2004))。
考量K3-SPG形成奈米粒子，將K3-SPG之免疫賦活活性與C、D及P型CpG ODN比較。以K3-SPG刺激的PBMCs產生大量IFN-α及IFN-γ，但相較於以D35(圖6)、P型及C型CpG ODN(圖7)所誘導者，在相當低濃度之刺激中產生IFN-α。此等之IFNs已知為D型特異的細胞介素(Krug,A.,et al.,European journal of immunology 31,2154-2163(2001)；Verthelyi,D.et al.,Journal of immunology 166,2372-2377(2001)；Gursel,M.et al.,Journal of leukocyte biology 71,813-820(2002))，故此等之結果顯示K3-SPG不損及K型的特性，而得到D型CpG ODN的特性。為了理解K型及D型CpG ODN的雙重機能，本發明者們解析來自骨髄之巨噬細胞中之K3- SPG之細胞內分佈。K3-SPG如C型CpG ODN般(Guiducci,C.,et al.,The Journal of experimental medicine 203,1999-2008(2006))，不僅含有K型CpG ODN之胞內體，亦與含有D型CpG ODN之胞內體共分佈(圖8、圖9)，故顯示K3-SPG可能藉由K型及D型CpG ODN，傳遞胞內體媒介自然免疫訊息系。此等之結果，顯示K3-SPG形成奈米尺寸化的高次且完全可溶化之粒子，該「All in one」K3-SPG顯示比其他型的CpG ODN及以往已知CpG-SPG複合體更強力活性，顯示與彼等有不同特性。
2)K3-SPG為不抱合而誘導對蛋白質抗原之強力CTL反應之卓越疫苗佐劑。
本發明者們比較小鼠免疫化模型中之K3、K3-dA40、及K3-SPG之佐劑效果。將野生型小鼠以OVA單獨、或者各以與來自K3之佐劑一起與OVA進行免疫，K3-SPG比K3所誘導者，誘導顯著水準高的體液性免疫反應(圖10)、及更強力T細胞反應(圖11)。值得注目的是以Tetramer Assay明白了藉由K3-SPG誘導更多數的OVA特異的CD8T細胞(圖12)。亦確認無任何共價鍵而對共投與之蛋白質抗原之極強力生物體內CTL活性(圖13)。該K3-SPG所致之強力CTL誘導亦可以胜肽疫苗接種再現(圖14)且為用量依存性(圖15)。K3-SPG之抗原節約活性極強，相同的抗體及CD4T細胞反應藉由使用100倍量之 OVA抗原達成(圖16、17)。此等之結果，明確顯示K3-SPG比K3單獨為更卓越佐劑。
3)SPG為可溶性之Dectin-1配位基，但非Dectin-1激動劑。
Dectin-1顯示為酵母聚糖般β葡聚醣之受體(Herre,J.,et al.,Blood 104,4038-4045(2004))，故調查SPG及K3-SPG之細胞攝入、及其後的SPG及K3-SPG所致之活性化中之Dectin-1之角色。發現使用流式細胞儀，在表現Dectin-1之HEK293細胞中，無論ODN的存在與否，體外中之SPG或K3-SPG之攝入雖上昇，但在Dectin-2或Control Vector未上昇(圖18、19)。最近報告可溶型的β-葡聚醣不使Dectin-1訊號活性化(Goodridge,H.S.,et al.,Nature 472,471-475(2011))。進而，Dectin-1訊號透過細胞介素訊息抑制因子1(SOCS1)誘導，抑制TLR9媒介細胞介素產生(Eberle,M.E.& Dalpke,A.H.,Journal of immunology 188,5644-5654(2012))。因而調查SPG之激動劑活性。使脾臓細胞以Zymosan-Depleted刺激，則確認到用量依存的及Dectin-1依存的TNF-α及其他細胞介素之產生(圖20)，但在SPG刺激無法確認到(圖21)。因酵母聚糖及卡特蘭多醣所致之細胞介素產生為Dectin-1非依存性。Zymosan-Depleted雖阻礙CpG ODN所誘導的IFN-α，但該阻礙因Dectin-1缺損而被減輕(圖22)。對照上SPG不阻礙CpG ODN所誘導的IFN-α(圖23)。此等之 結果顯示SPG雖為Dectin-1之配位基，但非激動劑；因此SPG不妨礙TLR9媒介IFN-α產生。
4)K3-SPG之佐劑效果依存於TLR9，且部份依存Dectin-1。
K3-SPG因為CpG ODN與β-葡聚醣之複合體，故將TLR9(Hemmi,H.,et al.,Nature 408,740-745(2000))及Dectin-1(Saijo,S.,et al.,Nature immunology 8,39-46(2007))之角色使用受體基因剔除小鼠進行調查。使來自Tlr9缺損小鼠及Dectin-1缺損小鼠之脾細胞及來自Flt3配位基誘導骨髄之DCs(FL-DCs)以K3-SPG刺激，則細胞介素產生完全依存於TLR9，但在Dectin-1並非如此(圖24)。與體外之結果一致，K3-SPG及OVA所致之Tlr9缺損小鼠之免疫結果，體液性反應及T細胞反應減弱(圖25-27)。以OVA及10μG之K3-SPG將小鼠免疫，則Dectin-1缺損小鼠顯示與野生型小鼠相同之免疫反應(圖28)。將Dectin-1缺損小鼠以OVA及1μG之K3-SPG免疫，則關於抗體產生及來自T細胞之細胞介素產生，未確認到有顯著意義的變化(圖29、圖30)，Tetramer Assay中顯示減弱的CD8 T細胞反應(圖31)。此等之結果暗示K3-SPG之佐劑效果依存於TLR9訊號。SPG及K3-SPG雖不刺激Dectin-1訊號，但K3-SPG之效果在生物體內中，部份依存Dectin-1。
5)流入領域淋巴節中之MARCO+巨噬細胞雖優先捕捉抗原以及K3-SPG，但Siglec-1+巨噬細胞不捕捉。
因K3-SPG透過單純抗原混合物之免疫接種，產生生物體內中強力佐劑效果，故假設捕捉抗原及K3-SPG之兩者之細胞在佐劑效果之媒介中發揮重要角色。為了調查螢光標記OVA及K3-SPG之生物體內分佈，使用螢光顯微鏡及二光子顯微鏡。於尾的基部注入後1小時以內，抗原及佐劑到達流入領域淋巴節(iLNs)(圖32、33、35)。24小時後，部份的K3-SPG移動至CD3e+ T細胞領域，與DQ-OVA共分佈。含有K3-SPG及DQ-OVA之兩者的iLN的T細胞領域中之此等之細胞為CD11c+ DCs。
有趣的是螢光訊息之大部份停留在iLN的表面上(圖32)。由此，聚焦於已知分佈於LN表面上的2個型的巨噬細胞亦即Siglec-1(亦稱CD169或MOMA-1)+巨噬細胞(亦知為嚢下洞巨噬細胞)及MARCO+巨噬細胞(Martinez-Pomares,L.& Gordon,S.,Trends in immunology 33,66-70(2012))。使用一般螢光顯微鏡的組織學的解析，無法適當見到全iLN表面；進而，此等之巨噬細胞以流式細胞儀解析單離有困難(Aoshi,T.,et al.,European journal of immunology 39,417-425(2009)；Gray,E.E.& Cyster,J.G.,Journal of innate immunity 4,424-436(2012))。而使用二光子顯微鏡成像解析，使抗原及K3-SPG之分佈在生物體之外可明瞭。抗MARCO抗體及抗Siglec-1抗體的投與後，特異的巨噬細胞被可視化。投與後1小時，將iLN表 面以二光子顯微鏡監測，OVA及K3-SPG雖與MARCO+巨噬細胞共分佈，但不與Siglec-1+巨噬細胞共分佈(圖33、35)。以前報告中，暗示免疫複合體及不活化流行性感冒病毒被Siglec-1+巨噬細胞捕捉，誘導體液性免疫反應(Gonzalez,S.F.,et al.,Nature immunology 11,427-434(2010)；Suzuki,K.et al.,The Journal of experimental medicine 206,1485-1493(2009))。由Volocity之共分佈解析的確認結果，其分佈模式與MARCO+巨噬細胞完全一致，不與Siglec-1+巨噬細胞共分佈(圖34、36)。對照上K3與K3-SPG比較，在MARCO+領域與Siglec-1+領域間擴散性地分佈(圖35、36)。又，Tlr9缺損小鼠及Dectin-1缺損小鼠之兩者皆顯示與K3-SPG相同之分佈。為了調查K3-SPG之對佐劑效果的此等之巨噬細胞的貢獻，試驗於尾的基部注入氯膦酸二鈉脂質體後之巨噬細胞及DCs之不同回復動力學。注入後至第2日巨噬細胞完全枯竭。此等之細胞至少1週不回復，但DCs如以前報告(Aoshi,T.,et al.,Immunity 29,476-486(2008))，至第5日幾乎回復。使巨噬細胞及DCs之兩者枯竭，免疫反應有顯著意義地被抑制(圖37；Clo-d2)。僅使巨噬細胞枯竭，而不使DCs枯竭的場合，免疫反應與未處置小鼠相同(圖37；Clo-d5)。此暗示注入後LNs中，OVA及K3-SPG之兩者皆主要被MARCO+巨噬細胞捕捉，該巨噬細胞誘導適應免疫反應。換言之，K3-SPG之佐劑效果相當依存於DC集團。
6)K3-SPG在生物體內中，使具有抗原之DC集團標的化且強力地進行活性化。
本發明者們之見解，認為奈米微粒子K3-SPG之大部份於注入後被iLNs中之MARCO+巨噬細胞攝入，但佐劑效果被DCs所控制。而聚焦iLNs中之DC集團所致之抗原及佐劑之攝入。投與後24小時中，使DC集團之抗原及佐劑之攝入以流式細胞儀解析。3個DC subset(pDCs、CD8α+ DCs、CD8α- DCs)中之CpG陽性之頻度於K3-SPG注入後，比K3時更有顯著意義地增加。對照上OVA陽性DC之頻度在K3注入後與K3-SPG注入後為相同。聚焦於抗原及佐劑之兩者皆陽性之DCs，K3-SPG中確認到比K3更大幅增加。注入後24小時中，iLNs中之pDCs及CD8α陽性DCs之雙方皆被K3-SPG強力活性化，但非取決於K3，其全體依存於TLR9(圖38)。由此等之結果顯示pDCs及CD8α+ DCs非捕捉成熟化用的非微粒子K3，而優先捕捉奈米微粒子K3-SPG，發揮佐劑效果。
7)K3-SPG為小鼠及非人類靈長類模型中之流行性感冒疫苗之強力的佐劑。
將K3-SPG之佐劑效果在小鼠及非人類靈長類中，使用更臨床相關之流行性感冒疫苗接種模型進行調查。使小鼠以不含醚處理血球凝集素抗原濃縮病毒粒子之裂解疫苗(SV)及表示之佐劑進行免疫接種，比較抗體反應及T細胞反應，顯示K3-SPG比K3有更優異的佐劑效果(圖43)。 更重要的是，藉由SV及K3-SPG來進行之免疫接種，與使用含有病毒RNA作為內建佐劑(Koyama,S.,et al.,Science translational medicine 2,25ra24(2010))之全(病毒粒子)不活化疫苗(WIV)(0.2μg/小鼠)之疫苗接種相比，係產生100倍大的抗體反應(圖39)。以SV(0.1μg/小鼠)及K3-SPG免疫接種之小鼠，比以WIV免疫化的小鼠體重的減少為少(圖40)。驚人的是在WIV疫苗接種小鼠，僅10%生存的用量中，K3-SPG對於致死的PR8病毒負荷有100%之防禦(圖40)。此等之結果強力支持小鼠模型中，K3-SPG具有作為蛋白質或蛋白質基質之疫苗之強力的佐劑機能。此見解擴及於使用食蟹獼猴的非人類靈長類模型。於第0日及第14日，將各群3隻食蟹獼猴以K3或K3-SPG以及SV進行免疫接種。監測血清抗體力價8週。藉由SV及K3-SPG，免疫接種2週後誘導顯著水準高的抗體力價，該力價至少再維持6週於高值(圖41)。從免疫接種2年(110週)後，K3-SPG群顯示比K3群高的抗體力價(圖42及43)。總結由此等之結果，顯示K3-SPG即使在非人類靈長類模型中亦為卓越疫苗佐劑。
8)使用人類PBMCs的K3-LNT及K3-SPG複合體的炎症反應誘導能力之檢討
使用人類PBMCs(Lonza公司、Cat# CC-2702、Lot# 0000396517)，評估K3(K3-dA30,K3-dA35,K3-dA40)單獨、K3-LNT複合體(K3-dA30-LNT,K3-dA35-LNT,K3- dA40-LNT)及K3-SPG複合體(K3-dA40-LNT)之pan-IFN-a(hIFNa)與IL-6(hIL-6)之產生誘導能力。
結果如圖44。低用量之刺激中，確認pan-IFN-a與IL-6產生在K3與SPG之複合體之K3-SPG、及K3與LNT之複合體之K3-LNT中，比K3單獨高。又，顯示因dA tail長(dA30,dA35,dA40)不同K3-LNT所誘導之炎症性細胞介素產生能力為幾乎相同之可能性。進而，比較K3-SPG與K3-LNT之炎症性細胞介素產生能力，與K3-SPG相比，顯示K3-LNT所致之pan-IFN-a產生誘導能力為高之可能性。另一方面，確認到IL-6產生量中，K3-SPG與K3-LNT為相同。
9)接種添加K3-LNT及K3-SPG複合體之RSV F次單位疫苗之小鼠中之血清中RSV F抗原特異的IgG抗體價。
於7週齡的C57BL/6小鼠之尾根部，每一隻使用RSV F抗原0.5μg與各種佐劑(K3單獨(K3-dA30,K3-dA35,K3-dA40)、K3-LNT複合體(K3-dA30-LNT,K3-dA35-LNT,K3-dA40-LNT)及K3-SPG複合體(K3-dA40-SPG)、磷酸明礬)10μg，以2週間隔進行2次免疫。從最後免疫1週後，進行末梢血回收與血清之調製，作成評估試料。與血清中之RSV F疫苗抗原結合之抗體價，使用ELISA法進行測定。如圖45所示，RSV F抗原特異的Total IgG誘導，與RSV F抗原單獨接種群(F)相比，因佐劑添加被增強，顯示K3單獨(F+K3-dA30,F+K3-dA35, F+K3-dA40)、K3-LNT(F+K3-dA30-LNT,F+K3-dA35-LNT,F+K3-dA40-LNT)及K3-SPG複合體(F+K3-dA40-SPG)與磷酸明礬(F+Alum)之佐劑效果為相同之可能性。在接種Th2型佐劑之磷酸明礬(F+Alum)的小鼠群，確認IgG1 subclass誘導能力比RSV F抗原單獨接種群高。另一方面，IgG2c subclass抗體中，在接種K3單獨(F+K3-dA30,F+K3-dA35,F+K3-dA40)、K3-LNT(F+K3-dA30-LNT,F+K3-dA35-LNT,F+K3-dA40-LNT)、K3-SPG(F+K3-dA40-SPG)的免疫群，顯示比磷酸明礬(F+Alum)高之結果，且K3-LNT複合體為與K3-SPG相同之Th1型佐劑之可能性。
10)接種添加K3-LNT及K3-SPG複合體之RSV F次單位疫苗的小鼠中之RSV F抗原特異的細胞介素產生能力
於7週齡的C57BL/6小鼠之尾根部，每一隻使用RSV F抗原0.5μg與各種佐劑(K3單獨(K3-dA30,K3-dA35,K3-dA40)、K3-LNT(K3-dA30-LNT,K3-dA35-LNT,K3-dA40-LNT)及K3-SPG複合體(K3-dA40-SPG)、磷酸明礬)10μg以2週間隔進行2次免疫。從最後免疫1週後將脾臓回收，調製脾臓細胞。使播種於96 well培養盤的脾臓細胞分別以RSV F抗原之MHC class I拘束性抗原決定位胜肽、MHC class II拘束性抗原決定位胜肽、疫苗抗原蛋白質刺激，培養24小時或者48小時。RSV F抗原特異的細胞介素產生能力，以培養上清為試料，使用細胞介素ELISA法評估。在本探討，評估Th1型細胞介素之IFN- g、由活性化T細胞產生之IL-2、Th2型細胞介素之IL-13的3種細胞介素。
結果，如圖46所示，顯示RSV F抗原特異的IFN-g產生誘導與IL-2產生誘導之增強效果在K3-LNT(F+K3-dA30-LNT,F+K3-dA35-LNT,F+K3-dA40-LNT)與K3-SPG(F+K3-dA40-SPG)為相同之可能性。在Th2型佐劑之磷酸明礬佐劑接種群(F+Alum)，IFN-g產生在任何刺激中皆為偵測界線以下。另一方面，IL-13產生增強效果在Th2型佐劑之磷酸明礬接種群，確認為高，在Th1型佐劑之K3-SPG接種群為低。有趣的是K3-LNT接種群(F+K3-dA30-LNT,F+K3-dA 35-LNT,F+K3-dA 40-LNT)中，與相同Th1型佐劑之K3-SPG接種群(F+K3-dA40-SPG)相比，顯示高IL-13產生增強效果。由此顯示K3-LNT複合體除K3-SPG所具有之高Th1反應增強效果外，亦有Th2反應增強能力。
11)接種添加K3-LNT及K3-SPG之RSV F次單位疫苗的棉鼠中之RSV感染防禦效果
於6~7週齡的棉鼠之尾根部，每一隻使用RSV F抗原1μg與各種佐劑(K3-LNT(K3-dA35-LNT,K3-dA40-LNT)及K3-SPG複合體(K3-dA40-SPG)、磷酸明礬)10μg以2週間隔進行2次免疫。從最後免疫2週後，將RSV血清型A(Long株)使用對棉鼠經鼻接種攻撃感染，其3日後計算肺內病毒量。Synagis(palivizumab)投與群在攻撃感 染一日前肌肉內投與Synagis 2.5mg/kg，並與上述同樣地進行感染防禦能力評估。中和抗體價，於攻撃感染前在麻醉下從大鼠頸靜脈採血，使用得到血清進行檢討。圖47之左，為肺內病毒量之結果為右之中和抗體價之結果。由肺內病毒量之結果，在PBS-投與群，確認到約105pfu/lunG之病毒量而在投與添加磷酸明礬之RSV F疫苗的群(F+Alum)，抑制於平均值低約100倍之病毒量。另一方面，K3-SPG添加疫苗投與群(F+K3-dA40-SPG)中亦確認到感染防禦誘導能力。顯示最良好的感染防禦效果者為K3-LNT添加疫苗群(F+K3-dA35-LNT,F+K3-dA40-LNT)，與磷酸明礬或K3-SPG相比，顯示為賦予高感染防禦能力之新穎疫苗佐劑候補之可能性。
中和抗體誘導能力中，磷酸明礬添加疫苗投與群(F+Alum)中，確認到與Synagis相同之血中中和活性。另一方面，K3-SPG添加疫苗投與群(F+K3-dA40-SPG)中，因4隻中在3隻幾乎未誘導中和抗體，認為K3-SPG所致之感染防禦效果為中和抗體非依存的機制者。又，K3-LNT投與群(F+K3-dA35-LNT，F+K3-dA40-LNT)中，與K3-SPG相比，確認到高中和抗體，故顯示K3-LNT佐劑具有與K3-SPG不同特性、例如Th2反應增強能力之可能性。
[產業上之利用性]
根據本發明提供具有優異的免疫賦活活性之 寡去氧核苷酸或含其之複合體。尤其，本發明之複合體兼具K型CpG ODN特有之免疫賦活活性與D型CpG ODN特有之免疫賦活活性。進而，K3-SPG及K3-LNT具有強力疫苗佐劑活性，使K3-SPG或K3-LNT與抗原一起免疫接種，則刺激該抗原特異的體液性免疫及細胞性免疫之兩者。因此，本發明之複合體作為免疫賦活劑或疫苗佐劑而可用於醫藥領域。
本申請以日本申請的日本特願2013-196206(申請日：2013年9月20日)為基礎，其內容全包含於本說明書。
Figure 112109803-A0202-12-0067-5
Figure 112109803-A0202-12-0068-6
Figure 112109803-A0202-12-0069-7

Claims (18)

  1. 一種複合體，其包含
    (a)序列編號1所表示之核苷酸序列所構成之寡去氧核苷酸的3’側鍵結有30~40核苷酸長之聚去氧腺苷酸，且磷酸二酯鍵之全部被硫代磷酸酯鍵所取代之寡去氧核苷酸，及
    (b)香菇多醣；並且
    具有下述(i)及/或(ii)之性質：
    (i)(b)/(a)的莫耳比為0.020~0.25
    (ii)平均粒子徑為10~100nm。
  2. 如請求項1所記載之複合體，其為三重螺旋構造狀者。
  3. 如請求項1所記載之複合體，其具有使B細胞活性化而產生IL-6之活性、及使樹狀細胞活性化而產生IFN-α之活性。
  4. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1~3中任一項所記載之複合體。
  5. 如請求項4所記載之醫藥組成物，其係用於病毒感染症、癌、過敏疾病、細胞內寄生性原蟲或細菌感染症之預防或治療。
  6. 如請求項5所記載之醫藥組成物，其係用於病毒感染症之預防或治療。
  7. 如請求項6所記載之醫藥組成物，其中，病毒感染症為RS病毒、或流行性感冒病毒感染症。
  8. 一種I型及/或II型干擾素產生誘導劑，其包含如請求項1~3中任一項所記載之複合體。
  9. 一種免疫賦活劑，其包含如請求項1~3中任一項所記載之複合體。
  10. 如請求項9所記載之免疫賦活劑，其係疫苗佐劑。
  11. 一種醫藥組成物，其包含(a)如請求項1~3中任一項所記載之複合體，及
    (b)抗原。
  12. 如請求項11所記載之組成物，其係用於誘導對該抗原之免疫反應。
  13. 如請求項12所記載之組成物，其中，抗原為來自病原體之抗原。
  14. 如請求項13所記載之組成物，其為病原體的感染症之預防或治療用。
  15. 如請求項14所記載之組成物，其中，病原體為病毒。
  16. 如請求項15所記載之組成物，其中，病毒為RS病毒或流行性感冒病毒。
  17. 一種體液性免疫反應及細胞性免疫反應誘導劑之製造中的複合體的用途，前述複合體含有
    (a)寡去氧核苷酸，其包含由序列編號1所表示之核苷酸序列所構成之人化K型CpG寡去氧核苷酸、及聚去氧腺苷酸，且聚去氧腺苷酸配置於人化K型CpG寡去氧核苷酸 之3’側，及
    (b)香菇多醣。
  18. 如請求項17所記載之用途，其中，前述體液性免疫反應及細胞性免疫反應誘導劑可與表面抗原及/或內部抗原組合使用。
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