BR112016005966B1 - Complexo contendo um oligodesoxinucleotídeo e beta-1,3-glucano uso do mesmo, composição farmacêutica, bem como agente para induzir a produção de interferon do tipo i e/ou do tipo ii, e agente imunoestimulante - Google Patents

Complexo contendo um oligodesoxinucleotídeo e beta-1,3-glucano uso do mesmo, composição farmacêutica, bem como agente para induzir a produção de interferon do tipo i e/ou do tipo ii, e agente imunoestimulante Download PDF

Info

Publication number
BR112016005966B1
BR112016005966B1 BR112016005966-2A BR112016005966A BR112016005966B1 BR 112016005966 B1 BR112016005966 B1 BR 112016005966B1 BR 112016005966 A BR112016005966 A BR 112016005966A BR 112016005966 B1 BR112016005966 B1 BR 112016005966B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
complex
spg
oligodeoxynucleotide
type
antigen
Prior art date
Application number
BR112016005966-2A
Other languages
English (en)
Other versions
BR112016005966A2 (pt
Inventor
Ken Ishii
Kouji KOBIYAMA
Taiki AOSHI
Fumihiko Takeshita
Yuji Kasuya
Takako Niwa
Makoto Koizumi
Original Assignee
National Institutes Of Biomedical Innovation, Health And Nutrition
Daiichi Sankyo Company, Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Institutes Of Biomedical Innovation, Health And Nutrition, Daiichi Sankyo Company, Limited filed Critical National Institutes Of Biomedical Innovation, Health And Nutrition
Publication of BR112016005966A2 publication Critical patent/BR112016005966A2/pt
Publication of BR112016005966B1 publication Critical patent/BR112016005966B1/pt

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7125—Nucleic acids or oligonucleotides having modified internucleoside linkage, i.e. other than 3'-5' phosphodiesters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A61K47/6931—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer
    • A61K47/6939—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer the polymer being a polysaccharide, e.g. starch, chitosan, chitin, cellulose or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
    • C08B37/0024—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid beta-D-Glucans; (beta-1,3)-D-Glucans, e.g. paramylon, coriolan, sclerotan, pachyman, callose, scleroglucan, schizophyllan, laminaran, lentinan or curdlan; (beta-1,6)-D-Glucans, e.g. pustulan; (beta-1,4)-D-Glucans; (beta-1,3)(beta-1,4)-D-Glucans, e.g. lichenan; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55583—Polysaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/17—Immunomodulatory nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3519—Fusion with another nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/31—Combination therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

OLIGODESOXINUCLEOTÍDEOS, COMPLEXOS CONTENDO OS MESMOS, USO DOS REFERIDOS OLIGODESOXINUCLEOTÍDEOS E COMPLEXOS, COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS, E AGENTES PARA INDUZIR A PRODUÇÃO DE INTERFERON DO TIPO I E/OU DO TIPO II, IMUNOESTIMULANTES, E PROFILÁTICOS OU TERAPÊU-TICOS. A presente invenção refere-se a um oligodesoxinucleotídeo contendo oligodesoxinu-cleotídeo CpG humanizado do tipo K e polidesoxiadenilato, em que o polidesoxiadenilato está colocado na lateral 3' do oligodesoxinucleotídeo CpG humanizado do tipo K. Além disso, a presente invenção provê um complexo contendo o oligodesoxinucleotídeo e (Beta)-1,3-glucano acima mencionados.

Description

CAMPO TÉCNICO
[001] A presente invenção refere-se a um complexo contendo oligonucleotídeo que tem uma atividade imunoestimulante e uso do mesmo. Mais particularmente, a presente invenção se refere a um complexo compreendendo oligodesoxinucleotídeo CpG (ODN) que tem uma atividade imunoestimulante e β-glucano e uso farmacêutico dos mesmos.
TÉCNICA ANTECEDENTE
[002] Oligodesoxinucleotídeo CpG (ODN CpG) é um fragmento de DNA sintético de filamento único curto (em torno de 20 pares de base) contendo o motivo CpG imunoestimulante, um agonista potente para receptor 9 do tipo Toll (TLR9), que ativa células dendríticas (DCs) e células B para produzir interferons do tipo I (IFNs) e citoquinas inflamatórias (documentos não patente 1, 2) e age como um adjuvante em relação a ambas as respostas imunes humoral do tipo Th1 e celular incluindo as respostas citotóxicas do linfócito T (CTL) (documentos não patente 3, 4). Deste modo, requereu-se o CpG ODN como um possível agente imunoterapêutico contra doenças infecciosas, câncer, asma e polinose (documentos não patente 2, 5).
[003] Existem pelo menos quatro tipos de ODN CpG, cada um deles tem uma estrutura principal diferente, sequência e propriedades imunoestimulantes (documento não patente 6). D (também chamado A) ODN do tipo CpG, compreende tipicamente um motivo CpG palindrômico com uma estrutura principal de fosfodiéster (PO) e cauda poli G de fosforotioato (PS), que ativa os DCs plasmacitoides (pDCs) para produzir uma grande quantidade de IFN-α, porém falha em induzir a maturação de pDC e a ativação de célula B (documentos não patente 7, 8). Os outros três tipos de ODN consistem de uma estrutura principal de PS. ODN CpG do tipo K (também chamado B) contém motivos CpG não palindrômicos e ativa fortemente as células B para produzir IL-6 e pDCs até maturação, porém mal produz IFN-α (documentos não patente 8, 9). Recentemente, ODN CpG do tipo C e P foram desenvolvidos; esses contêm uma e duas sequência(s) de CpG palindrômicas, respectivamente, ambas as quais podem ativar as células B como do tipo K e pDCs como do tipo D, embora ODN CpG do tipo C induza produção de IFN-α mais fraca com comparação com ODN CpG do tipo P (documento não patente 10-12). Muitos ODNs CpG do tipo K superiores são descritos no documento de patente 1.
[004] O ODN CpG do tipo D e P se mostraram formar estruturas de hierarquia, pareamento de base de Hoogsteen para formar estruturas quádruplas chamadas tétrades G e pareamento de base de Watson-Crick entre as porções palindrômicas cis - e trans -, respectivamente, que são necessários para produção de IFN-α robusto por pDCs (documentos não patente 12-14). Embora tais estruturas hierárquicas pareçam necessárias para localização dos endossomos precoces e sinalização através de TLR9, eles sofrem de polimorfismos do produto, agregação e precipitação, com isso atrasando suas aplicações clínicas (documento não patente 15). Deste modo, apenas ODN CpG do tipo K e C estão geralmente disponíveis como agentes imunoterapêuticos e adjuvantes de vacina para o uso humano (documento não patente 16 e 17). Enquanto ODN CpG do tipo K melhora a imunogenicidade de vacinas que têm como objetivo doenças infecciosas e cânceres em testes clínicos humanos (documentos não patente 6, 16), a conjugação química ou física entre o antígeno e o ODN CpG do tipo K é necessária para os efeitos adjuvantes mais adequados. Estes resultados indicam que estes quatro tipos de ODN CpG (K, D, P e C) têm vantagens e desvantagens, no entanto o desenvolvimento de um ODN CpG "completo" que ative ambas as células B e pDCs sem agregação ainda está para ser realizado.
[005] Esquizofilano (SPG), um β-1,3-glucano solúvel derivado de Schizophyllum commune, é um fármaco aprovado em Japão como um potenciador da radioterapia em pacientes com carcinoma cervical, durante as três últimas décadas (documento não patente 18). Similarmente, lentinano (LNT), um β-1,3-glucano solúvel derivado do cogumelo shiitake, é um medicamento aprovado em 1985 e usado em combinação com um medicamento de fluoropirimidina para pacientes com câncer gástrico recorrente e inoperável (documentos não patente 19, 20). β-1,3-Glucano mostrou formar complexo com polidesoxiadenilato (dA) como uma estrutura de tripla hélice (documento não patente 21).
[006] Documentos de Patente 2 a 4 revelam o uso de um complexo solúvel em água de β-1,3-glucano incluindo esquizofilano e ácido nucleico (gene), como um portador do gene. Esses documentos descrevem que a formação do complexo melhora uma ação antissentido do gene e uma ação de resistência da mesma contra a nuclease.
[007] Documento de Patente 5 revela que o uso de polissacarídeos que têm uma ligação β-1,3 como um portador (agente de transfecção) melhora a ação de um oligonucleotídeo imunoestimulante que tem uma sequência CpG, em que uma ligação de fosfodiéster é substituída por uma ligação de fosforotioato ou uma ligação fosforoditioato.
[008] Documento de Patente 6 revela um complexo imunoestimulante que consiste em um oligonucleotídeo imunoestimulante e β-1,3-glucano que tem uma cadeia lateral de ligação longa de β-1,6-glucosideo.
[009] Os presentes inventores demonstraram anteriormente que ODN CpG de seres humanos e camundongo se ligou com polidA tendo uma ligação fosfodiéster na extremidade 5’ complexada com produção de citoquina melhorada SPG e agiu como um adjuvante da vacina da influenza e um agente profilático ou terapêutico para doenças relacionadas à célula Th2 (documentos não patente 22, 23, Documento de Patente 7). Quando poli(dA) foi adicionado à extremidade 5’ de CpG de cada um do tipo K e tipo D para formar um complexo com SPG, ambos mostraram atividade melhorada enquanto mantinham a propriedade do tipo K e tipo D. No entanto, foi difícil alcançar altos rendimentos do complexo CpG-SPG em direção a seu teste pré-clínico mais eficiente e econômico assim como o desenvolvimento clínico. Recentemente, quando o poli(dA) tendo ligação de fosforotioato ligado a ODN CpG, a eficiência da formação de complexo foi aumentada em cerca de 100% (documento não patente 24). No entanto, uma completa investigação ainda não foi conduzida para identificar a sequência de CpG melhor humanizada e a otimização de fatores para ganhar as atividades "completas" de quatro tipos de ODN CpG.
[0010] Documento de Patente 8 revela um método de produção de um complexo ternário do tipo antígeno/oligonucleotídeo CpG/β-1,3- glucano.
Lista de Documento Documentos de Patente
[0011] Documento de Patente 1: US 8.030.285 B2
[0012] Documento de Patente 2: WO 01/034207 A1
[0013] Documento de Patente 3: WO 02/072152 A1
[0014] Documento de Patente 4: JP-A-2004-107272
[0015] Documento de Patente 5: WO 2004/100965 A1
[0016] Documento de Patente 6: JP-A-2007-70307
[0017] Documento de Patente 7: JP-A-2008-100919
[0018] Documento de Patente 8: JP-A-2010-174107
[0019] Documentos de Não Patente
[0020] Documento de Não Patente 1: Hemmi, H., e outros, A Toll like receptor recognizes bacterial DNA. Nature 408, 740-745 (2000).
[0021] Documento de Não Patente 2: Krieg, A.M. Therapeutic potential of Toll-like receptor 9 activation. Nature reviews. Drug discovery 5, 471-484 (2006).
[0022] Documento de Não Patente 3: Brazolot Millan, C.L., Weeratna, R., Krieg, A.M., Siegrist, C.A. & Davis, H.L. CpG DNA can induce strong Th1 humoral and cell-mediated immune responses against hepatitis B surface antigen in young mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95, 15553-15558 (1998).
[0023] Documento de Não Patente 4: Chu, R.S., Targoni, O.S., Krieg, A.M., Lehmann, P.V. & Harding, C.V. CpG oligodeoxynucleotides act as adjuvants that switch on T helper 1 (Th1) immunity. The Journal of experimental medicine 186, 1623-1631 (1997).
[0024] Documento de Não Patente 5: Klinman, D.M. Immunotherapeutic uses of CpG oligodeoxynucleotides. Nature reviews. Immunology 4, 249-258 (2004).
[0025] Documento de Não Patente 6: Vollmer, J. & Krieg, A.M. Immunotherapeutic applications of CpG oligodeoxynucleotide TLR9 agonists. Advanced drug delivery reviews 61, 195-204 (2009).
[0026] Documento de Não Patente 7: Krug, A., et al. Identification of CpG oligonucleotide sequences with high induction of IFN- alpha/beta in plasmacytoid dendritic cells. European journal of immunology 31, 2154-2163 (2001).
[0027] Documento de Não Patente 8: Verthelyi, D., Ishii, K.J., Gursel, M., Takeshita, F. & Klinman, D.M. Human peripheral blood cells differentially recognize and respond to two distinct CPG motifs. Journal of immunology 166, 2372-2377 (2001).
[0028] Documento de Não Patente 9: Hartmann, G. & Krieg, A.M. Mechanism and function of a newly identified CpG DNA motif in human primary B cells. Journal of immunology 164, 944-953 (2000).
[0029] Documento de Não Patente 10: Hartmann, G., et al. Rational design of new CpG oligonucleotides that combine B cell activation with high IFN-alpha induction in plasmacytoid dendritic cells. European journal of immunology 33, 1633-1641 (2003).
[0030] Documento de Não Patente 11: Marshall, J.D., et al. Identification of a novel CpG DNA class and motif that optimally stimulate B cell and plasmacytoid dendritic cell functions. Journal of leukocyte biology 73, 781-792 (2003).
[0031] Documento de Não Patente 12: Samulowitz, U., et al. A novel class of immune-stimulatory CpG oligodeoxynucleotides unifies high potency in type I interferon induction with preferred structural properties. Oligonucleotides 20, 93-101 (2010).
[0032] Documento de Não Patente 13: Kerkmann, M., et al. Spontaneous formation of nucleic acid-based nanoparticles is responsible for high interferon-alpha induction by CpG-A in plasmacytoid dendritic cells. The Journal of biological chemistry 280, 8086-8093 (2005).
[0033] Documento de Não Patente 14: Klein, D.C., Latz, E., Espevik, T. & Stokke, B.T. Higher order structure of short immunostimulatory oligonucleotides studied by atomicforce microscopy. Ultramicroscopy 110, 689-693 (2010).
[0034] Documento de Não Patente 15: Puig, M., et al. Use of thermolytic protective groups to prevent G-tetrad formation in CpG ODN D type: structural studies and immunomodulatory activity in primates. Nucleic acids research 34, 6488-6495 (2006).
[0035] Documento de Não Patente 16: Bode, C., Zhao, G., Steinhagen, F., Kinjo, T. & Klinman, D.M. CpG DNA as a vaccine adjuvant. Expert review of vaccines 10, 499-511 (2011).
[0036] Documento de Não Patente 17: McHutchison, J.G., e outros, Phase 1B, randomized, double-blind, dose-escalation trial of CPG 10101 in patients with chronic hepatitis C vírus. Hepatology 46, 1341-1349 (2007).
[0037] Documento de Não Patente 18: Okamura, K., e outros, Clinical evaluation of schizophyllan combined with irradiation in patients with cervical cancer. A randomized controlled study. Cancer 58, 865-872 (1986).
[0038] Documento de Não Patente 19: Oba, K.; Kobayashi, M.; Matsui, T.; Kodera, Y.; Sakamoto, J. Individual patient based metaanalysis of lentinan for unresectable/recurrent gastric cancer. Anticancer Res., 2009, 29, 2739-2746.
[0039] Documento de Não Patente 20: Nakano, H.; Namatame, K.; Nemoto, H.; Motohashi, H.; Nishiyama, K.; Kumada, K. A multi- institutional prospective study of lentinan in advanced gastric cancer patients with unresectable and recurrent diseases: Effect on prolongation of survival and improvement of quality of life. Hepato- Gastroenterol., 1999, 46, 2662-2668.
[0040] Documento de Não Patente 21: Sakurai, K., Mizu, M. & Shinkai, S. Polysaccharide-polynucleotide complexes. 2. Complementary polynucleotide mimic behavior of the natural polysaccharide schizophyllan in the macromolecular complex with single-stranded RNA and DNA. Biomacromolecules 2, 641-650 (2001).
[0041] Documento de Não Patente 22: Shimada, N., e outros, A polysaccharide carrier to effectively deliver native phosphodiester CpG DNA to antigen-presenting cells. Bioconjugate chemistry 18, 1280 1286 (2007).
[0042] Documento de Não Patente 23: Koyama, S., e outros, Plasmacytoid dendritic cells delineate immunogenicity of influenza vaccine subtypes. Science translational medicine 2, 25ra24 (2010).
[0043] Documento de Não Patente 24: Minari, J., e outros, Enhanced cytokine secretion from primary macrophages due to Dectin- 1 mediated uptake of CpG DNA/beta-1,3-glucan complex. Bioconjugate chemistry 22, 9-15 (2011).
SUMÁRIO DA INVENÇÃO PROBLEMAS A SEREM RESOLVIDOS PELA INVENÇÃO
[0044] O problema a ser resolvido pela presente invenção é prover um agente imunoestimulante que tem uma atividade mais forte do que os complexos CpG-SPG convencionais.
MEIOS PARA RESOLVER OS PROBLEMAS
[0045] Os presentes inventores conduziram pesquisas intensivas e identificaram um complexo que compreende ODN CpG do tipo K (K3) (SEQ ID NO: 2) tendo uma cauda poli(dA) na extremidade 3’ e SPG, a saber K3-SPG. Ela forma uma nanopartícula que pode ser completamente solubilizada. De forma similar, os inventores tiveram sucesso na produção de um complexo K3-LNT que compreende o ODN CpG do tipo K acima mencionado e lentinano (LNT). Embora K3- SPG e K3-LNT não tenham uma sequência de ODN CpG do tipo D, ela tem simultaneamente uma atividade imunoestimulante exclusiva para o ODN CpG do tipo K (por exemplo, atividade para ativar as células B (preferivelmente, células B humanas) para produzir IL-6) e uma atividade imunoestimulante exclusiva para o ODN CpG do tipo D (por exemplo, atividade para ativar células dendríticas do tipo célula de plasma para produzir IFN-α). Além disso, K3-LNT e K3-SPG têm uma atividade adjuvante de vacina potente e quando inoculada junto com um antígeno para imunização, elas induzem tanto a imunidade humoral específica de antígeno quanto a imunidade celular e ainda mostraram um efeito protetor contra a infecção muito potente contra os vírus RSV e vírus influenza. Eles estudaram adicionalmente com base nessas constatações e completaram a presente invenção.
[0046] Consequentemente, a presente invenção provê o seguinte.
[0047] [1] Um oligodesoxinucleotídeo compreendendo oligodesoxinucleotídeo CpG humanizado do tipo K e polidesoxiadenilato, em que o polidesoxiadenilato é colocado na lateral 3’ do oligodesoxinucleotídeo CpG humanizado do tipo K.
[0048] [2] O oligodesoxinucleotídeo de [1], em que o oligodesoxinucleotídeo CpG humanizado do tipo K tem um comprimento de não menos do que 10 nucleotídeos e compreende uma sequência de nucleotídeos representada pela fórmula:
Figure img0001
[0049] em que o motivo CpG no centro não é metilado, W é A ou T e N1, N2, N3, N4, N5 e N6 podem ser quaisquer nucleotídeos .
[0050] [3] O oligodesoxinucleotídeo de [1] ou [2], em que o oligodesoxinucleotídeo CpG humanizado do tipo K consiste na sequência de nucleotídeos mostrada pela SEQ ID NO: 1.
[0051] [4] O oligodesoxinucleotídeo de qualquer um de [1] - [3], em que as ligações fosfodiéster no oligodesoxinucleotídeo são parcialmente ou completamente substituídas por ligações fosforotioato.
[0052] [5] O oligodesoxinucleotídeo de [4], em que as ligações fosfodiéster no oligodesoxinucleotídeo são completamente substituídas por ligações fosforotioato.
[0053] [6] O oligodesoxinucleotídeo de qualquer um de [1] - [5], em que o polidesoxiadenilato tem um comprimento de 20 - 60 nucleotídeos.
[0054] [7] Um complexo compreendendo o oligodesoxinucleotídeo de qualquer um de [1] - [6] e β-1,3-glucano.
[0055] [8] O complexo de [7], em que o β-1,3-glucano é lentinano, esquizofilano, escleroglucano, curdlano, paquimano, grifolano ou laminarano.
[0056] [9] O complexo de [8], em que o β-1,3-glucano é lentinano, esquizofilano ou escleroglucano.
[0057] [10] Um complexo consistindo em um oligodesoxinucleotídeo descrito no que segue (i) e β-1,3-glucano descrito em (ii):
[0058] (i) um oligodesoxinucleotídeo em que o polidesoxiadenilato com comprimento de 20 - 60 nucleotídeos está ligado na extremidade 3’ de um oligodesoxinucleotídeo consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada pela SEQ ID NO: 1 e todas das ligações fosfodiéster são substituídas por ligações fosforotioato.
[0059] (ii) lentinano ou esquizofilano.
[0060] [11] O complexo de qualquer um de [7] - [10], tendo uma estrutura de tripla hélice.
[0061] [12] O complexo de qualquer um de [7] - [11], tendo uma atividade para ativar as células B para produzir IL-6 e uma atividade para ativar células dendríticas para produzir IFN-α.
[0062] [13] Uma composição farmacêutica compreendendo o oligodesoxinucleotídeo de qualquer um de [1] - [6] ou o complexo de qualquer um de [7] - [12].
[0063] [14] A composição farmacêutica de [13], a qual é para profilaxia ou tratamento de infecção por vírus, câncer, uma doença alérgica ou infecção protozoária parasítica intracelular ou bacteriana.
[0064] [15] A composição farmacêutica de [14], a qual é para a profilaxia ou tratamento de infecção por vírus.
[0065] [16] A composição farmacêutica de [15], em que a infecção por vírus é infecção por vírus RS ou vírus influenza.
[0066] [17] Um agente para induzir a produção de interferon do tipo I e/ou tipo II, compreendendo o complexo de qualquer um de [7] - [12].
[0067] [18] Um agente imunoestimulante compreendendo o oligodesoxinucleotídeo de qualquer um de [1] - [6] ou o complexo de qualquer um de [7] - [12].
[0068] [19] O agente imunoestimulante de [18], o qual é um adjuvante para vacina.
[0069] [20] Um agente profilático ou terapêutico para infecção por vírus, câncer, uma doença alérgica ou infecção protozoária parasítica intracelular ou bacteriana, compreendendo o oligodesoxinucleotídeo de qualquer um de [1] - [6] ou o complexo de qualquer um de [7] - [12].
[0070] [21] O agente profilático ou terapêutico de [20], em que a infecção por vírus é infecção por vírus RS ou infecção por vírus influenza.
[0071] [22] Uso do oligodesoxinucleotídeo de qualquer um de [1] - [6] ou o complexo de qualquer um de [7] - [12], para a produção de uma composição farmacêutica.
[0072] [23] O uso de [22], em que a composição farmacêutica é uma composição farmacêutica para a profilaxia ou tratamento de infecção por vírus, câncer, uma doença alérgica ou infecção protozoária parasítica intracelular ou bacteriana.
[0073] [24] O uso de [23], em que a infecção por vírus infecção por vírus RS ou infecção por vírus influenza.
[0074] [25] Um método para o tratamento ou a profilaxia de uma doença em um animal de sangue quente, compreendendo a administração de uma quantidade farmacologicamente eficaz do oligodesoxinucleotídeo de qualquer um de [1] - [6] ou o complexo de qualquer um de [7] - [12] ao animal de sangue quente.
[0075] [26] O método de [25], em que a doença é infecção por vírus, câncer, uma doença alérgica ou infecção protozoária parasítica intracelular ou bacteriana.
[0076] [27] O método de [26], em que a infecção por vírus é infecção por vírus RS ou infecção por vírus influenza.
[0077] [28] O método de qualquer um de [25] - [27], em que o animal de sangue quente é um ser humano.
[0078] [29] Um método de induzir uma reação mune protetora em um animal de sangue quente, compreendendo a administração de uma quantidade farmacologicamente eficaz do oligodesoxinucleotídeo de qualquer um de [1] - [6], ou o complexo de qualquer um de [7] - [12] ao animal de sangue quente.
[0079] [30] O oligodesoxinucleotídeo de qualquer um de [1] - [6] ou o complexo de qualquer um de [7] - [12], para uso para o tratamento ou profilaxia de infecção por vírus, câncer, uma doença alérgica ou infecção protozoária parasítica intracelular ou bacteriana.
[0080] [31] O oligodesoxinucleotídeo ou complexo de [30], em que a infecção por vírus é infecção por vírus RS ou infecção por vírus influenza.
[0081] [32] Uma composição farmacêutica compreendendo
[0082] o oligodesoxinucleotídeo de qualquer um de [1] - [6] ou o complexo de qualquer um de [7] - [12], e (b) um antígeno.
[0083] [33] A composição de [32], a qual é para induzir uma reação imune ao antígeno.
[0084] [34] A composição de [33], em que o antígeno é derivado de um patógeno.
[0085] [35] A composição de [34], a qual é para a profilaxia ou tratamento de infecção com o patógeno.
[0086] [36] A composição de [35], em que o patógeno é um vírus.
[0087] [37] A composição de [36], em que o vírus é um vírus RS ou vírus influenza.
EFEITO DA INVENÇÃO
[0088] A presente invenção provê um oligodesoxinucleotídeo tendo uma atividade imunoestimulante superior e um complexo contendo a mesma. Particularmente, o complexo da presente invenção tem ao mesmo tempo uma atividade imunoestimulante exclusiva ao ODN CpG do tipo K e uma atividade imunoestimulante exclusiva ao ODN CpG do tipo D. Além disso, uma vez que o complexo da presente invenção tem uma forte atividade adjuvante de vacina, quando a imunização com o complexo da presente invenção junto com um antígeno é realizada, ambas as imunidade humoral específica ao antígeno e imunidade celular são estimuladas para prover um efeito protetor contra a infecção altemente forte. Deste modo, o complexo da presente invenção é útil como um agente imunoestimulante ou adjuvante de vacina.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0089] Fig. 1 mostra um método de complexação de ODN CpG e LNT ou SPG.
[0090] Fig. 2 mostra produção de pan-IFN-α por PBMCs.
[0091] Fig. 3 mostra o perfil da citoquina produzida a partir de PBMCs humanos na estimulação com K3, K3-dA40 ou K3-SPG.
[0092] Fig. 4 mostra uma imagem microscópica eletrônica de varredura de K3-SPG.
[0093] Fig. 5 mostra os tamanhos de partícula de K3-SPG, SPG e D35 como analisado pelo espalhamento dinâmico da luz.
[0094] Fig. 6 mostra a produção de pan-IFN-α, IFN-α2 e IFN-Y por PBMCs induzidos por estimulação com K3, K3-SPG ou D35.
[0095] Fig. 7 mostra a produção de pan-IFN-α e IL-6 por PBMCs humanos, a qual é induzida por estimulação com K3, K3-dA40, K3- SPG, CpG21798 (ODN CpG do tipo P), CpG21889(P), CpG2395(C) ou M362(C) (0,74, 2,2, 6,6 ou 20 μg/ml).
[0096] Fig. 8 mostra a colocalização de K3-SPG com endossomo contendo ODN CpG do tipo K. A escala gráfica mostra 10 μm. Os resultados são representativos de pelo menos dois experimentos independentes.
[0097] Fig. 9 mostra a colocalização de K3-SPG com endossomo contend ODN CpG do tipo D. A escala gráfica mostra 10 μm.
[0098] Fig. 10 mostra títulos de anticorpo de soro específicos do antígeno de camundongos imunizados com OVA sozinho, OVA+K3 ou OVA+K3-SPG. *p < 0,05 (Teste U de Mann-Whitney).
[0099] Fig. 11 mostra a produção de IFNY por esplenócitos de camundongos imunizados com OVA sozinho, OVA+K3 ou OVA+K3- SPG, que foi induzida pela reestimulação com o antígeno.
[00100] Fig. 12 mostra a proporção de células T CD8 específicas de OVA induzidas por imunização com OVA sozinho, OVA+K3 ou OVA+K3-SPG. *p < 0,05 (Teste U de Mann-Whitney).
[00101] Fig. 13 mostra atividade CTL específica de OVA in vivo induzida por imunização com OVA sozinho, OVA+K3, OVA+K3-dA40 ou OVA+K3-SPG. *p < 0,05 (Teste U de Mann-Whitney).
[00102] Fig. 14 mostra um efeito adjuvante da vacina de peptídeo de K3-SPG.
[00103] Fig. 15 mostra um efeito adjuvante dependente de dose de K3-SPG.
[00104] Fig. 16 mostra títulos de anticorpo de soro específico de antígeno de camundongos imunizados com OVA sozinho, OVA+K3 ou OVA+K3-SPG. A dose de OVA no momento da imunização é mostrada em cada gráfico. *p < 0,05 (Teste U de Mann-Whitney).
[00105] Fig. 17 mostra a produção de IFNY por esplenócitos de camundongos imunizados com OVA sozinho, OVA+K3 ou OVA+K3- SPG, o qual foi induzido por reestimulação com o antígeno. A dose de OVA no momento da imunização é mostrada em cada gráfico.
[00106] Fig. 18 mostra a ligação de SPG ao (vetor) vazio, Dectin-1 ou transfectante de Dectin-2.
[00107] Fig. 19 mostra a ligação de K3 ou K3-SPG ao (vetor) vazio, Dectin-1 ou transfectante de Dectin-2.
[00108] Fig. 20 mostra a produção de TNF-α por esplenócitos de camundongo C57BL/6J ou camundongo deficiente em Dectin-1, o qual foi induzido por estimulação do Zimosano reduzido.
[00109] Fig. 21 mostra a produção de TNF-α por esplenócitos de camundongo C57BL/6J ou camundongo deficiente em Dectin-1, o qual foi induzido por estimulação de SPG.
[00110] Fig. 22 mostra o efeito de Zimosano Reduzido na produção de IFN-α por esplenócitos de camundongo C57BL/6J ou Camundongo deficiente em Dectin-1, o qual foi induzido pela estimulação de ODN CpG. *p < 0,05 (teste T).
[00111] Fig. 23 mostra o efeito de SPG na produção de IFN-α por esplenócitos de camundongo C57BL/6J, o qual foi induzido pela estimulação de ODN CpG.
[00112] Fig. 24 mostra que a produção de citoquina induzida por K3-SPG depende de TLR9. a) produção de IFN-α por FL-DCs, b) produção de IL-6 e IL-12 p40 por esplenócitos, c) produção de IFN-α por FL-DCs, d) produção de IL-6 e IL-12 p40 por esplenócitos.
[00113] Fig. 25 mostra títulos de anticorpo de soro específico de antígeno de camundongos Tlr9+/+ ou Tlr9-/- imunizados com OVA+K3-SPG. *p < 0,05 (Teste U de Mann-Whitney).
[00114] Fig. 26 mostra a produção de IFN-Y por esplenócitos de camundongo Tlr9+/+ ou Tlr9-/- imunizado com OVA+K3-SPG, os quais são induzidos pela reestimulação com o antígeno. *p < 0,05 (Teste U de Mann-Whitney).
[00115] Fig. 27 mostra a proporção de células T CD8 específicas de OVA induzidas por imunização de camundongo Tlr9+/+ ou Tlr9-/- com OVA+K3-SPG. *p < 0,05 (Teste U de Mann-Whitney).
[00116] Fig. 28 mostra que o efeito adjuvante de K3-SPG não depende de Dectin-1. a) Título de anticorpo específico de antígeno no soro. b) produção de IFN-Y por esplenócito devido à reestimulação do antígeno. c) Proporção de células T CD8 específicas de antígeno induzidas in vivo.
[00117] Fig. 29 mostra títulos de anticorpo de soro específico de antígeno de Dectin-1+/- ou Dectin-1-/- de camundongos imunizados com OVA+K3-SPG.
[00118] Fig. 30 mostra a produção de IFNy por esplenócitos de Dectin-1+/- ou Dectin-1-/- camundongos imunizados com OVA+K3- SPG, o qual foi induzido por reestimulação com o antígeno.
[00119] Fig. 31 mostra a proporção de células T CD8 específicas de OVA induzidas por imunização de Dectin-1+/- ou Dectin-1-/- camundongo com OVA+K3-SPG. *p < 0,05 (Teste U de Mann- Whitney).
[00120] Fig. 32 mostra a localização de K3-SPG na superfície de iLNs 1 hora após a administração de Alexa 488-K3-SPG.
[00121] Fig. 33 mostra a localização de OVA, células MARCO+ e células Siglec-1+ em iLNs 1 hora após a administração de DQ-OVA.
[00122] Fig. 34 mostra os resultados de análise, com o Volocity, de colocalização de OVA com as células MARCO+ ou células Siglec-1+ na Fig. 33. *p < 0,05 (teste t).
[00123] Fig. 35 mostra a localização de K3, K3-SPG e células MARCO+ em iLNs 1 hora após a administração de Alexa 488-K3 ou Alexa 488-K3-SPG.
[00124] Fig. 36 mostra os resultados de análise, com o Volocity, de colocalização de K3 ou K3-SPG com as células MARCO+ na Fig. 35. *p < 0,05 (teste t).
[00125] Fig. 37 mostra o protocolo do experimento de depleção como lipossoma de clodronato (painel superior), título de anticorpo específico de antígeno no soro (lado esquerdo inferior) e produção de citoquina por estimulação de antígeno. *p <0,05 (teste t).
[00126] Fig. 38 mostra a expressão de CD40 em vários DCs de camundongos C57BL/6J ou Tlr9-/- administrados com K3 ou K3-SPG.
[00127] Fig. 39 mostra título de anticorpo específico de antígeno no soro em camundongos imunizados com SV, WIV ou SV+K3-SPG.
[00128] Fig. 40 mostra as mudanças com o decorrer do tempo do peso corporal (lado esquerdo) e curva de sobrevivência (lado direito) quando imunizados com SV, WIV ou SV+K3-SPG, seguido pelo desafio com o vírus influenza A/P/R8(H1N1).
[00129] Fig. 41 mostra as mudanças com o decorrer do tempo do título de anticorpo específico de antígeno no soro de Macaca fascicularis imunizado com SV+ K3 ou SV+K3-SPG. *p < 0,05 (teste t).
[00130] Fig. 42 mostra o título de anticorpo de soro específico de antígeno no soro de Macaca fascicularis imunizado com SV+ K3 ou SV+K3-SPG (na semana 110).
[00131] Fig. 43 mostra a comparação do efeito de adjuvante de vacina entre K3 e K3-SPG.
[00132] Fig. 44 mostra a produção de pan-IFN-a e produção de IL-6 por K3, K3-LNT ou K3-SPG.
[00133] Fig. 45 mostra títulos de anticorpo de IgG específicos de antígeno RSV F no soro de camundongos inoculados com vacina de subunidade RSV F adicionada a K3-, K3-LNT- ou K3-SPG.
[00134] Fig. 46 mostra a produção de citoquina especificamente induzida por estimulação de antígeno de RSV F em camundongos inoculados com vacina de subunidade RSV F adicionada a K3-, K3- LNT- ou K3-SPG.
[00135] Fig. 47 mostra o efeito protetor da infecção por RSV em ratos do algodão inoculados com vacina de subunidade RSV F adicionada a K3-, K3-LNT- ou K3-SPG.
DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES 1. Oligodesoxinucleotídeo
[00136] A presente invenção provê um oligodesoxinucleotídeo compreendendo o oligodesoxinucleotídeo CpG do tipo K e polidesoxiadenilato (dA) (logo após referido como o oligodesoxinucleotídeo da presente invenção).
[00137] O oligodesoxinucleotídeo da presente invenção inclui um em que as ligações fosfodiéster são modificadas (por exemplo, uma parte de ou todas as ligações fosfodiéster é/são substituídas por uma ligação fosforotioato).
[00138] O oligodesoxinucleotídeo da presente invenção inclui sais farmaceuticamente aceitáveis.
[00139] No presente relatório descritivo, oligodesoxinucleotídeo e ODN tem o mesmo significado. Além disso, o "oligodesoxinucleotídeo CpG humanizado do tipo K (ODN CpG)" e "resíduo de oligodesoxinucleotídeo CpG humanizado do tipo K (ODN CpG)" tem o mesmo significado apesar da presença ou ausência do termo "resíduo" na parte inicial da frase e são usados de forma intercambiável. Além disso, polidesoxiadenilato e (resíduo) de ácido polidesoxiadenosínico tem o mesmo significado. O termo "resíduo" significa uma estrutura parcial de um composto que tem um peso molecular maior. Os versados na técnica podem entender facilmente a partir do contexto se o "oligodesoxinucleotídeo CpG humanizado do tipo K (ODN CpG)" significa uma molécula independente ou uma estrutura parcial de um composto tendo um peso molecular maior no presente relatório descritivo. O mesmo se aplica aos termos que se referem a outras estruturas parciais contidas no oligodesoxinucleotídeo da presente invenção, tal como "polidesoxiadenilato" e similares.
[00140] Oligodesoxinucleotídeo CpG (ODN ODN) é um DNA de filament único contendo um motivo CpG não metilado imunoestimulante e é um agonista de TLR9. ODN CpG inclui 4 tipos de do tipo K (também chamado tipo B), tipo D (também chamado tipo A), tipo C e tipo P, os quais são diferentes na estrutura principal, sequência e propriedade imunoestimulante (Advanced drug delivery reviews 61, 195-204 (2009)). Destes, o oligodesoxinucleotídeo da presente invenção compreende ODN CpG do tipo K.
[00141] ODN CpG do tipo K é um ODN CpG tendo propriedades estruturais e funcionais que contêm tipicamente motivos CpG não palindrômicos, plurais não metilados, ativam as células B para produzir IL-6, porém dificilmente induzem a produção de IFN-α por células dendríticas do tipo célula de plasma (pDCs). O motivo CpG não metilado é uma sequência de nucleotídeos curta contendo pelo menos uma sequência citosina(C)-guanina (G), em que a posição 5 da citosina na sequência citosina-guanina não é metilada. Na explicação que segue, CpG significa CpG não metilado, a menos que particularmente indicado. Deste modo, o oligodesoxinucleotídeo da presente invenção tem uma atividade imunoestimulante exclusiva do ODN CpG do tipo K (por exemplo, atividade para ativar as células B (preferivelmente, células B humanas) para produzir IL-6) ao conter ODN CpG do tipo K. Muitos ODNs CpG do tipo K são conhecidos no campo técnico pertinente (Journal of immunology 166, 2372-2377 (2001); Journal of immunology 164, 944-953 (2000); US 8, 030, 285 B2).
[00142] O ODN CpG do tipo K compreendido no oligodesoxinucleotídeo da presente invenção é preferivelmente humanizado. Ser "humanizado" significa que ele tem uma atividade agonista no TLR9 humano. Deste modo, o oligodesoxinucleotídeo da presente invenção compreendendo ODN CpG humanizado do tipo K tem uma atividade imunoestimulante para ser humano, a qual é exclusiva ao ODN CpG do tipo K (por exemplo, atividade para ativar células B humanas para produzir IL-6).
[00143] ODN CpG do tipo K preferivelmente usado na presente invenção tem um comprimento de não menos do que 10 nucleotídeos e contém uma sequência de nucleotídeos representada pela fórmula:
Figure img0002
[00144] em que o motivo CpG no centro é não metilado, W é A ou T e N1, N2, N3, N4, N5 e N6 podem ser qualquer nucleotídeo.
[00145] Em uma modalidade, o ODN CpG do tipo K na presente invenção tem um comprimento de não menos do que 10 nucleotídeos e contém uma sequência de nucleotídeos representada pela fórmula mencionada acima. Na fórmula mencionada acima, o motivo CpG de 4 bases (TCpGW) no centro apenas necessita estar contido nos 10 nucleotídeos e não necessita ser localizado entre N3 e N4 na fórmula mencionada acima. Além disso, N1, N2, N3, N4, N5 e N6 na fórmula mencionada acima podem ser qualquer nucleotídeo e a combinação de pelo menos (preferivelmente um) de N1 e N2, N2 e N3, N3 e N4, N4 e N5, e N5 e N6 podem formar um motivo CpG de 2 bases. Quando o motivo CpG com 4 bases supramencionado não está localizado entre N3 e N4, quaisquer 2 bases contínuas nas 4 bases no centro (4a - 7a bases) da fórmula mencionada acima é o motivo CpG e outras 2 bases podem ser qualquer nucleotídeo.
[00146] ODN CpG do tipo K mais preferivelmente usado na presente invenção contém a estrutura não palindrômica contendo um ou vários motivos CpG. ODN CpG do tipo K ainda mais preferivelmente usado na presente invenção consiste na estrutura não palindrômica contendo um ou vários motivos CpG.
[00147] ODN CpG humanizado do tipo K é geralmente caracterizado pelo motivo CpG consistindo em 4 bases de TCGA ou TCGT. Em muitos casos, 2 ou 3 de tal motivo CpG de 4 bases estão contidos em um ODN CpG humanizado do tipo K. deste modo, em uma modalidade preferencial, ODN CpG do tipo K contido no oligodesoxinucleotídeo da presente invenção contém pelo menos um, mais preferivelmente dois ou mais, ainda mais preferivelmente 2 ou 3, de motivos CpG de 4 bases consistindo em TCGA ou TCGT. Quando o ODN CpG do tipo K tem 2 ou 3 de motivos CpG de 4 bases, estes motivos CpG de 4 bases podem ser os mesmos ou diferentes e não estão particularmente limitados já que eles têm uma atividade agonista no TLR9 humano.
[00148] ODN CpG do tipo K contido no oligodesoxinucleotídeo da presente invenção mais preferivelmente compreende a sequência de nucleotídeos mostrada pela SEQ ID NO: 1.
[00149] Apesar do comprimento do ODN CpG do tipo K não estar particularmente limitado já que o oligodesoxinucleotídeo da presente invenção tenha uma atividade imunoestimulante (por exemplo, atividade que ativa células B (preferivelmente, células B humanas) para produzir IL-6), ele é preferivelmente de não mais do que 100 nucleotídeos de comprimento (por exemplo,10-75 nucleotídeos de comprimento). O comprimento do ODN CpG do tipo K é mais preferivelmente de não mais do que 50 nucleotídeos de comprimento (por exemplo,10-40 nucleotídeos de comprimento). O comprimento do ODN CpG do tipo K é mais preferivelmente não mais do que 30 nucleotídeos de comprimento (por exemplo,10-25 nucleotídeos de comprimento). O comprimento do ODN CpG do tipo K é ainda mais preferivelmente 12-25 nucleotídeos de comprimento.
[00150] Apesar do comprimento do polidesoxiadenilato (dA) não estar particularmente limitado já que ele é suficiente para formar uma estrutura de tripla hélice com cadeia de β-1,3-glucano (preferivelmente, lentinano ou esquizofilano), a partir dos aspectos de formação de uma estrutura de tripla hélice estável, ela tem geralmente não menos do que 20 nucleotídeos de comprimento, preferivelmente não menos do que 40 nucleotídeos de comprimento, ainda mais preferivelmente não menos do que 60 nucleotídeos de comprimento. De forma teórica, polidA não tem o limite superior do comprimento já que um polidA mais longo forma uma estrutura de tripla hélice mais estável com β-1,3-glucano. No entanto, quando ela é muito longa, o comprimento do oligodesoxinucleotídeo varia na síntese. Deste modo, ele é geralmente de não mais do que 100, preferivelmente não mais do que 80, nucleotídeos de comprimento. Por outro lado, a partir dos aspectos de formação da estrutura de tripla hélice estável supramencionada, assim como o aumento na quantidade do oligodesoxinucleotídeo da presente invenção que se liga por quantidade unitária de β-1,3-glucano, rejeição da variabilidade de comprimento na síntese do oligodesoxinucleotídeo e a eficiência da complexação, o comprimento do polidA é de preferivelmente 20 - 60 nucleotídeos de comprimento (especificamente, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 ou 60 nucleotídeos de comprimento), mais preferivelmente 30 - 50 nucleotídeos de comprimento (30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 nucleotídeos de comprimento), ainda mais preferivelmente 30 - 45 nucleotídeos de comprimento (30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 nucleotídeos de comprimento). Particularmente, quando ele não é de menos do que 30 nucleotídeos de comprimento, boa eficiência na complexação é alcançada. O oligodesoxinucleotídeo da presente invenção contendo polidA tem uma atividade para formar uma estrutura de tripla hélice com duas cadeias de esquizofilano. Observar que o polidesoxiadenilato é algumas vezes indicado como "poli(dA)" ou "poli(dA)".
[00151] Apesar de uma molécula do oligodesoxinucleotídeo da presente invenção poder conter vários ODNs CpG do tipo K e/ou polidAs, ela preferivelmente contém um de cada do ODN CpG do tipo K e polidA, ainda mais preferivelmente consiste em um de cada do ODN CpG do tipo K e polidA.
[00152] O oligodesoxinucleotídeo da presente invenção é caracterizado pelo fato de que o polidA está colocado na posição lateral 3’ do ODN CpG do tipo K. Com essa disposição, o complexo da presente invenção (detalhes a serem descritos abaixo) vem a ter uma atividade imunoestimulante exclusiva ao ODN CpG do tipo K assim como uma atividade imunoestimulante exclusiva ao ODN CpG do tipo D.
[00153] ODN CpG do tipo K e polidA podem estar diretamente ligados por uma ligação covalente ou ligado via uma sequência espaçadora. A sequência espaçadora significa uma sequência de nucleotídeos tendo um ou mais nucleotides a ser inserida entre dois elementos constituintes adjacentes. Apesar do comprimento da sequência espaçadora não estar particularmente limitado, já que o complexo da presente invenção tem uma atividade imunoestimulante (preferivelmente atividade para ativar células B para produzir IL-6 e atividade para ativar células dendríticas para produzir IFN-α), ela tem geralmente 1 - 10 nucleotídeos de comprimento, preferivelmente 1 - 5 nucleotídeos de comprimento, mais preferivelmente 1 - 3 nucleotídeos de comprimento. Ainda mais preferivelmente, ODN CpG do tipo K e polidA estão diretamente ligados por uma ligação covalente.
[00154] O oligodesoxinucleotídeo da presente invenção tem opcionalmente uma sequência de nucleotídeos adicional na extremidade 5’ e/ou 3’ da mesma, além do ODN CpG do tipo K, polidA e uma sequência espaçadora opcional. Apesar do comprimento da sequência de nucleotídeos adicional não estar particularmente limitado, já que o complexo da presente invenção tem uma atividade imunoestimulante (preferivelmente atividade para ativar células B para produzir IL-6 e atividade para ativar células dendríticas para produzir IFN-α), ela tem geralmente 1 - 10 nucleotídeos de comprimento, preferivelmente 1 - 5 nucleotídeos de comprimento, mais preferivelmente 1 - 3 nucleotídeos de comprimento.
[00155] Em uma modalidade preferencial, o oligodesoxinucleotídeo da presente invenção não contém tal sequência de nucleotídeos adicional na extremidade 5’ e/ou extremidade 3’. Isto é, o oligodesoxinucleotídeo da presente invenção preferivelmente consiste em ODN CpG do tipo K, polidA e uma sequência espaçadora opcional, mais preferivelmente consiste em ODN CpG do tipo K e polidA.
[00156] Em uma modalidade mais preferencial, o oligodesoxinucleotídeo da presente invenção consiste em ODN CpG do tipo K (especificamente, por exemplo, oligodesoxinucleotídeo consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada pela SEQ ID NO: 1) e polidA, em que ODN CpG do tipo K está presente na extremidade 5’ do oligodesoxinucleotídeo e polidA está presente na extremidade 3’ do mesmo. De forma específica, ele é um oligodesoxinucleotídeo em que polidA de 20 - 60 nucleotídeos de comprimento (mais preferivelmente, 30 - 50 nucleotídeos de comprimento (30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 nucleotídeos de comprimento), ainda mais preferivelmente, 30 - 45 nucleotídeos de comprimento (30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 nucleotídeos de comprimento)) está ligado na extremidade 3’ de um oligodesoxinucleotídeo consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada pela SEQ ID NO: 1, por exemplo, um oligodesoxinucleotídeo consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada pela SEQ ID NO: 2, ou 9 - 12.
[00157] O comprimento total do oligodesoxinucleotídeo da presente invenção tem geralmente 30 - 200 nucleotídeos de comprimento, preferivelmente 35 - 100 nucleotídeos de comprimento, mais preferivelmente 40 - 80 nucleotídeos de comprimento (especificamente, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 ou 80 nucleotídeos de comprimento), ainda mais preferivelmente 50 - 70 nucleotídeos de comprimento (especificamente, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 nucleotídeos de comprimento), ainda mais preferivelmente 50 - 65 nucleotídeos de comprimento (especificamente, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65 nucleotídeos de comprimento).
[00158] O oligodesoxinucleotídeo da presente invenção pode ser modificado de forma apropriada para ser resistente à degradação in vivo (por exemplo, degradação por exo- ou endonuclease). Preferivelmente, a modificação inclui modificação fosforotioato e modificação fosforoditioato. Isto é, uma parte de todas as ligações fosfodiéster no oligodesoxinucleotídeo da presente invenção é/são substituídas pela ligação fosforotioato ou ligação fosforoditioato.
[00159] Preferivelmente, o oligodesoxinucleotídeo da presente invenção inclui modificação de uma ligação fosfodiéster, mais preferivelmente, a modificação da ligação fosfodiéster é uma ligação fosforotioato (isto é, como descrito na publicação internacional WO 95/26204, um dos átomos de oxigênio não reticulados é substituído por um átomo de enxofre). Isto é, uma parte de todas ou todas as ligações fosfodiéster no oligodesoxinucleotídeo da presente invenção é/são substituídas pela ligação fosforotioato.
[00160] O oligodesoxinucleotídeo da presente invenção contém preferivelmente a modificação pela ligação fosforotioato ou pela ligação fosforoditioato no ODN CpG do tipo K, mais preferivelmente, todas as ligações fosfodiéster no ODN CpG do tipo K são substituídas por ligações fosforotioato. Também, o oligodesoxinucleotídeo da presente invenção contém preferivelmente uma ligação fosforotioato ou uma ligação fosforoditioato no polidA, mais preferivelmente, todas as ligações fosfodiéster no polidA são substituídas por ligações fosforotioato. Ainda mais preferivelmente, todas as ligações fosfodiéster no oligodesoxinucleotídeo da presente invenção compreendendo o oligodesoxinucleotídeo CpG humanizado do tipo K e polidesoxiadenilato são substituídas por ligações fosforotioato. Ainda mais preferivelmente, o oligodesoxinucleotídeo da presente invenção é um oligodesoxinucleotídeo em que polidA de 20 - 60 nucleotídeos de comprimento (mais preferivelmente, 30 - 50 nucleotídeos de comprimento (30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 nucleotídeos de comprimento), ainda mais preferivelmente, 30 - 45 nucleotídeos de comprimento (30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 nucleotídeos de comprimento)) está ligado à extremidade 3’ do oligodesoxinucleotídeo CpG humanizado do tipo K (por exemplo, SEQ ID NO: 1) e todas as ligações fosfodiéster contidas no oligodesoxinucleotídeo são substituídas por ligações fosforotioato. Devido à ligação fosforotioato, espera-se que o oligodesoxinucleotídeo da presente invenção mostre não apenas a resistência à degradação porém também o aperfeiçoamento de uma atividade imunoestimulante (por exemplo, atividade para ativar células B para produzir IL-6) e um alto rendimento do complexo de CpG-β-1,3-glucano.No presente relatório descritivo, a ligação fosforotioato tem o mesmo significado que a estrutura principal de fosforotioato e a ligação fosfodiéster tem o mesmo significado que a estrutura principal de fosfato.
[00161] O oligodesoxinucleotídeo da presente invenção inclui quaisquer sais farmaceuticamente aceitáveis, éster e sais de tal éster, do oligodesoxinucleotídeo acima mencionado.
[00162] Os exemplos preferidos dos sais farmaceuticamente aceitáveis do oligodesoxinucleotídeo da presente invenção incluem sais metálicos tais como sais de metal alcalino (por exemplo, sal de sódio, sal de potássio e sal de lítio), sais de metal alcalino terroso (por exemplo, sal de cálcio e sal de magnésio), sal de alumínio, sal de ferro, sal de zinco, sal de cobre, sal de níquel, sal de cobalto e similares; sais de amina tais como sais inorgânicos (por exemplo, sal de amônio) e sais orgânicos (por exemplo, sal de t-octilamina, sal de dibenzilamina, sal de morfolina, sal de glucosamina, alquiléster sal de fenilglicina, sal de etilenodiamina, sal de N-metilglucamina, sal de guanidina, sal de dietilamina, sal de trietilamina, sal de dicicloexilamina, sal de N,N’-dibenziletilenodiamina, sal de cloroprocaína, sal de procaína, sal de dietanolamina, sal de N-benzil- fenetilamina, sal de piperazina, sal de tetrametilamônio, sal de tris(hidroximetil)aminometano) e similares; sais de ácido inorgânico tais como sais sais hidrácidos halogenados (por exemplo, fluoridrato, cloridrato, bromidrato, iodidrato), sal de nitrato, perclorato, sulfato, fosfato e similares; sais de ácido orgânico tais como alcanossulfonatos inferiores (por exemplo, metanossulfonato, trifluorometanossulfonato, etanossulfonato), arilsulfonatos (por exemplo, benzenossulfonato, p- toluenossulfonato), acetato, malato, fumarato, succinato, citrato, tartarato, oxalato, maleato e similares; e sais de aminoácido tais como sal de glicina, sal de lisina, sal de arginina, sal de ornitina, glutamato e aspartato.
[00163] Apesar do oligodesoxinucleotídeo da presente invenção poder tomar qualquer forma de uma fita única, uma fita dupla e uma fita tripla, ele é uma fita única.
[00164] O oligodesoxinucleotídeo da presente invenção é preferivelmente isolado. Ser "isolado" significa que uma operação para remover fatores diferentes dos componentes do objeto foi realizada e o oligodesoxinucleotídeo não está no estado de presença natural. A pureza do "oligodesoxinucleotídeo isolado" (porcentagem de peso do presente oligodesoxinucleotídeo no peso total do produto objeto de avaliação) é de geralmente não menos do que 70%, preferivelmente não menos do que 80%, mais preferivelmente não menos do que 90%, ainda mais preferivelmente não menos do que 99%.
[00165] Já que o oligodesoxinucleotídeo da presente invenção tem uma atividade imunoestimulante superior (por exemplo, atividade para ativar células B (preferivelmente, células B humanas) para produzir IL- 6), ele é útil como um agente imunoestimulante e similares. Além disso, já que o oligodesoxinucleotídeo da presente invenção tem a propriedade de formar uma estrutura de tripla hélice com dois β-1,3- glucanos (preferivelmente, lentinano, esquizofilano ou escleroglucano), ele é útil para a preparação do complexo da presente invenção mencionado abaixo.
2. Complexo
[00166] A presente invenção provê um complexo contendo o oligodesoxinucleotídeo da presente invenção acima mencionado e β- 1,3-glucano (a seguir a ser referido como o complexo da presente invenção).
[00167] Já que o oligodesoxinucleotídeo da presente invenção supracitado contém ODN CpG do tipo K, ele mostra, sozinho, uma atividade imunoestimulante exclusiva ao ODN CpG do tipo K (por exemplo, atividade para ativar células B (preferivelmente, células B humanas) para produzir IL-6), e é deficiente em uma atividade imunoestimulante exclusiva ao ODN CpG do tipo D (por exemplo, atividade para ativar células dendríticas do tipo célula de plasma para produzir IFN-α). De forma surpreendente, no entanto, ela adquire uma atividade imunoestimulante exclusiva ao ODN CpG do tipo D (por exemplo, atividade para ativar células dendríticas do tipo célula de plasma para produzir IFN-α) ao formar um complexo com β-1,3- glucano (preferivelmente, lentinano ou esquizofilano), sem requerer a sequência de ODN CpG do tipo D. Isto é, o complexo da presente invenção tem tanto uma atividade imunoestimulante exclusiva ao ODN CpG do tipo K (por exemplo, atividade para ativar células B (preferivelmente, células B humanas) para produzir IL-6), quanto uma atividade imunoestimulante exclusiva ao ODN CpG do tipo D (por exemplo, atividade para ativar células dendríticas do tipo célula de plasma (preferivelmente, células dendríticas do tipo célula de plasma humano) para produzir IFN-α.
[00168] Exemplos de β-1,3-glucano usados na presente invenção incluem lentinano, esquizofilano, escleroglucano, curdlano, paquimano, grifolano, laminarano e similares. O β-1,3-glucano é preferivelmente um contendo muitas ramificações de 1,6- glicopiranosídeo (taxa de cadeia lateral 33 - 40%) tal como lentinano, esquizofilano e escleroglucano, mais preferivelmente lentinano ou esquizofilano, ainda mais preferivelmente lentinano.
[00169] Lentinano (LNT) é um β-1,3-1,6-glucano conhecido derivado do cogumelo shiitake e que tem uma fórmula molecular de (C6Hioθ5)n, e um peso molecular de cerca de 300.000 - 700.000. Embora ele seja dificilmente solúvel em água, metanol, etanol(95) e acetona, ele é solúvel em solventes orgânicos polares (DMSO) e em uma solução de hidróxido de sódio aquoso.
[00170] Lentinano tem uma ação que aumenta macrófago ativado, células T exterminadoras, células exterminadoras naturais e atividade citotóxica mediada por macrófago dependente de anticorpo (ADMC) (Hamuro, J., e outros, : Immunology, 39, 551-559, 1980, Hamuro, J., e outros, .: Int. J. Immunopharmacol., 2, 171, 1980, Herlyn, D., e outros,: Gann, 76, 37-42, 1985). Em experimentos animais, a administração combinada com um agente quimioterápico mostrou uma ação supressiva no crescimento do tumor e um efeito prolongador da vida no tumor singênico e tumor autólogo. Também, uma administração de lentinano sozinho mostrou uma ação supressiva do crescimento do tumor e um efeito prolongador da vida. Em testes clínicos, um uso combinado com administração oral de tegafur prolongou o período de sobrevivência de câncer gástrico inoperável ou recorrente (forma farmacêutica do produto "injeção intravenosa de 1mg de lentinano" Ajinomoto Co., Inc.) e foi aprovado no Japão. O efeito da administração de lentinano sozinho ainda não foi confirmado.
[00171] Esquizofilano (SPG) é um β-glucano solúvel conhecido derivado de Schizophyllum commune. SPG consiste na cadeia principal de β-(1 ^3)-D-glucano e uma cadeia lateral de β-(1^6)-D- glucosila por 3 glicoses (Tabata, K., Ito, W., Kojima, T., Kawabata, S. e Misaki A., "Carbohydr. Res.", 1981, 89, 1, p.121-135). SPG foi, em realidade, usado por 20 anos ou mais como um fármaco clínico como uma injeção intramuscular para terapia imunoadjuvante de câncer ginecológico (Shimizu, Chin, Hasumi, Masubuchi, "Biotherapy", 1990, 4, p.1390 Hasegawa, "Oncology and Chemotherapy", 1992, 8, p.225) e segurança in vivo foi confirmada (Theresa, M. McIntire and David, A. Brant, "J. Am. Chem. Soc.", 1998, 120, p.6909).
[00172] No presente relatório descritivo, "complexo" significa um produto obtido em associação de várias moléculas através de uma ligação não covalente ou ligação covalente tal como ligação eletrostática, ligação de van der Waals, ligação de hidrogênio, interação de hidrofobia e similares.
[00173] O complexo da presente invenção preferivelmente exibe uma estrutura de tripla hélice. Em uma modalidade preferencial, das três cadeias que formam a estrutura de tripla hélice, duas são cadeias de β-1,3-glucano e uma é uma cadeia de polidesoxiadenilato no oligodesoxinucleotídeo acima mencionado da presente invenção. O complexo pode conter uma parte que não forma a estrutura de tripla hélice.
[00174] A taxa da composição de oligodesoxinucleotídeo e β-1,3- glucano no complexo da presente invenção pode variar dependendo do comprimento da cadeia de polidesoxiadenilato no oligodesoxinucleotídeo, do comprimento do β-1,3-glucano e similares. Por exemplo, quando o comprimento da cadeia de β-1,3-glucano e da cadeia de polidesoxiadenilato é equivalente, duas cadeias de β-1,3- glucano e um oligodesoxinucleotídeo da presente invenção podem estar associados para formar uma estrutura de tripla hélice. Em geral, já que o comprimento da cadeia de polidesoxiadenilato é menor do que aquele da cadeia de β-1,3-glucano, vários oligodesoxinucleotídeos da presente invenção podem estar associados com duas cadeias de β- 1,3-glucano através de polidesoxiadenilato para formar uma estrutura de tripla hélice (veja a Fig. 1).
[00175] O complexo da presente invenção é um complexo que contém ODN CpG humanizado do tipo K e β-1,3-glucano (por exemplo, lentinano, esquizofilano, escleroglucano, curdlano, paquimano, grifolano, laminarano), preferivelmente um complexo que consiste em ODN CpG humanizado do tipo K e β-1,3-glucano (por exemplo, lentinano, esquizofilano, escleroglucano). Mais preferivelmente, ele é um complexo que consiste em um oligodesoxinucleotídeo em que um polidesoxiadenilato de 20 - 60 nucleotídeos de comprimento (especificamente, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 ou 60 nucleotídeos de comprimento) está ligado à porção lateral 3’ de um oligodesoxinucleotídeo consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada pela SEQ ID NO: 1 e todas as ligações fosfodiéster são substituídas por ligações fosforotioato e β-1,3-glucano (por exemplo, lentinano, esquizofilano) (por exemplo, K3-dA20-60-LNT, K3-dA20-60- SPG), ainda mais preferivelmente, ele é um complexo consistindo em um oligodesoxinucleotídeo em que um polidesoxiadenilato de 30 - 50 nucleotídeos de comprimento (especificamente 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 nucleotídeos de comprimento) está ligado à porção lateral 3’ de um oligodesoxinucleotídeo consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada pela SEQ ID NO: 1 e todas as ligações fosfodiéster são substituídas por ligações fosforotioato e β-1,3-glucano (por exemplo, lentinano, esquizofilano) (por exemplo, K3-dA30-50-LNT, K3-dA30-50- SPG), ainda mais preferivelmente, ele é um complexo consistindo em um oligodesoxinucleotídeo em que um polidesoxiadenilato de 30 - 45 nucleotídeos de comprimento (especificamente 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 nucleotídeos de comprimento) está ligado à porção lateral 3’ de um oligodesoxinucleotídeo consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada pela SEQ ID NO: 1 e todas as ligações fosfodiéster são substituídas por ligações fosforotioato e β-1,3-glucano (por exemplo, lentinano, esquizofilano) (K3-dA30-45-LNT, K3-dA30-45-SPG).
[00176] O método de preparação do complexo da presente invenção pode ser realizado usando as condições similares àquelas descritas em documentos não patente 21 - 24 e JP-A-2008-100919. Isto é, β-1,3-glucano o qual está presente de forma inerentemente natural como uma estrutura de tripla hélice é dissolvido em um solvente polar orgânico aprótico (dimetil sulfóxido (DMSO), acetonitrila, acetona etc.) ou uma solução alcalina aquosa (hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, amônia, hidróxido de cálcio, etc.) para ser liberado em uma fita única. Uma solução da assim obtida fita única de β-1,3-glucano e uma solução (solução aquosa, solução aquosa tamponada com pH quase neutro ou solução aquosa acídica tamponada, preferivelmente, solução aquosa ou solução aquosa tamponada com pH quase neutro) do oligodesoxinucleotídeo da presente invenção são misturadas, o pH é ajustado até um pH quase neutro como necessário e a mistura é mantida por um tempo adequado, por exemplo, de um dia para o outro a 5°C. Como um resultado, duas cadeias de β-1,3-glucano e uma cadeia de polidA no oligodesoxinucleotídeo formam uma estrutura de tripla hélice, com isso o complexo da presente invenção pode ser formado. O complexo resultante pode ser submetido à purificação através de cromatografia por exclusão de tamanho, ultrafiltração, diálise e similares para remover oligodesoxinucleotídeo que não forma o complexo. Além disso, o complexo resultante pode ser submetido à purificação por cromatografia por troca aniônica para remover β-1,3-glucano que não forma o complexo. O complexo pode ser apropriadamente purificado pelos métodos acima mencionados.
[00177] A formação do complexo da presente invenção pode ser confirmada por, por exemplo, medição da mudança de conformação através do espectro de CD (dicroísmo circular), mudança da absorção de UV pela cromatografia por exclusão de tamanho, eletroforese em gel, eletroforese em microchip, eletroforese capilar, apesar do método não se limitar a estes.
[00178] Embora a taxa de misturação do oligodesoxinucleotídeo da presente invenção e β-1,3-glucano possam ser apropriadamente determinados em consideração do comprimento da cadeia de polidA e similares, a razão molar (SPG/ODN) é geralmente 0,02 - 2,0, preferivelmente 0,1 - 0,5. Em uma modalidade adicional, a razão molar (β-1,3-glucano (LNT etc.)/ODN) é, por exemplo, 0,005 - 1,0, preferivelmente 0,020 - 0,25.
[00179] O método de preparação do complexo da presente invenção é explicado ao se tomar o complexo de ODN-CpG e LNT como um exemplo. LNT é dissolvido em 0,05 - 2N, preferivelmente 0.1 - 1.5N, solução aquosa alcalina (por exemplo, 0.25N solução aquosa de hidróxido de sódio) e a mistura permanece a 1°C - 40°C por 10 horas - 4 dias (por exemplo, mantida de um dia para o outro em temperatura ambiente) para preparar uma solução aquosa de LNT de fita única (por exemplo, 50 mg/ml de solução aquosa de LNT). A solução aquosa de LTN supramencionada e a solução de CpG aquosa (por exemplo, solução de CpG aquosa 100 μM) preparada separadamente são misturadas a uma razão molar (LNT/ODN) de 0,005 - 1,0, depois a solução aquosa de LTN supramencionada é neutralizada com solução acídica aquosa tamponada (por exemplo, NaH2PO4) e mantida a 1 - 40°C por 6 horas - 4 dias (por exemplo, de um dia para o outro a 4°C) para completar a complexação. A solução aquosa de LNT pode ser adicionada por último e misturada para a complexação supramencionada. A formação do complexo pode ser confirmada através de, por exemplo, mudança do alto peso molecular de ODN CpG através de cromatografia por exclusão de tamanho, enquanto se monitora a absorção a 240 - 280 nm (por exemplo, 260 nm).
[00180] Em uma modalidade, o complexo da presente invenção exibe a forma de partículas em forma de bastonetes. O tamanho da partícula é equivalente àquele de uma partícula naturalmente formada por β-1,3-glucano (por exemplo, esquizofilano), usada como o material, ao exibir uma estrutura de tripla hélice. Um tamanho da partícula médio é geralmente de 10-100 nm, preferivelmente 20-50 nm. O tamanho da partícula pode ser medido pela dissolução de um complexo em água e ao submeter a solução a um método de Espalhamento Dinâmico da Luz a 80°C usando o Zeta Sizer da Malvern Instruments.
[00181] O complexo da presente invenção é preferivelmente isolado. A pureza do "complexo isolado" (porcentagem de peso do presente complexo para o peso total dos produtos objetos de avaliação) é de geralmente não menos do que 70%, preferivelmente não menos do que 80%, mais preferivelmente não menos do que 90%, ainda mais preferivelmente não menos do que 99%.
[00182] Uma vez que o complexo da presente invenção tem uma atividade imunoestimulante superior e tem tanto uma atividade imunoestimulante exclusiva ao ODN CpG do tipo K (por exemplo, atividade para ativar células B (preferivelmente, células B humanas) para produzir IL-6) quanto uma atividade imunoestimulante exclusiva ao ODN CpG do tipo D (por exemplo, atividade para ativar células dendríticas do tipo célula de plasma (preferivelmente, células dendríticas do tipo célula de plasma humano) para produzir IFN-α, ele é útil como um agente imunoestimulante e similares. Por exemplo, um complexo contendo ODN CpG do tipo K (por exemplo, SEQ ID NO: 2, 11, 12) e LNT (K3-LNT) e um complexo contendo ODN CpG do tipo K (por exemplo, SEQ ID NO: 2) e SPG (K3-SPG) tem uma capacidade de induzir a resposta à inflamação (pan-IFN-a, IL-6 etc.), uma ação para melhorar um título de anticorpo IgG específico ao antígeno (IgG Total, IgG2c etc.) no soro de um indivíduo inoculado com um vírus, uma capacidade do antígeno especificamente produzir citoquina (IFN- Y,IL2 etc.) em um indivíduo inoculado com um vírus e um efeito protetor da infecção pelos vírus. K3-LNT também tem uma capacidade de melhorar a produção de citoquina Th2 (IL-13 etc.) em um indivíduo inoculado com um vírus. Deste modo, eles são úteis como candidatos a adjuvante de vacina.
3. Composição farmacêutica
[00183] A presente invenção provê uma composição farmacêutica que compreende o oligodesoxinucleotídeo acima mencionado da presente invenção ou o complexo acima mencionado da presente invenção. A composição farmacêutica da presente invenção pode ser obtida pela formulação do oligodesoxinucleotídeo acima mencionado da presente invenção ou o complexo acima mencionado da presente invenção according em um meio convencional. A composição farmacêutica da presente invenção contém o oligodesoxinucleotídeo ou complexo da presente invenção e um veículo farmacologicamente aceitável. Além disso, a composição farmacêutica pode ainda conter um antígeno. Tal composição farmacêutica é provida em uma forma farmacêutica adequada para administração parenteral.
[00184] Como uma composição para administração parenteral, por exemplo, injeção, supositório e similares são usados e a injeção pode abranger formas farmacêuticas tais como injeção intravenosa, injeção subcutânea, injeção intradérmica, injeção muscular, injeção intravenosa por gotejamento e similares. Tal injeção pode ser preparara de acordo com um método conhecido. O método de preparação da injeção inclui dissolver ou suspender o oligodesoxinucleotídeo ou complexo acima mencionados da presente invenção em um solvente aquoso asséptico geralmente usado para injeção. Como exemplos do solvente aquoso para injeção, por exemplo, água destilada; solução fisiológica; tampões tais como tampão de fosfato, tampão de carbonato, tampão tris, tampão de acetato e similares podem ser usados. O pH de tal solvente aquoso é, por exemplo, 5 - 10, preferivelmente 6 - 8. A injeção preparada é preferivelmente inserida em uma ampola adequada.
[00185] Também é possível preparar uma preparação em pó do oligodesoxinucleotídeo ou complexo da presente invenção ao submeter uma suspensão do oligodesoxinucleotídeo ou complexo da presente invenção a um tratamento tal como secagem a vácuo, liofilização e similares. O oligodesoxinucleotídeo ou complexo da presente invenção podem ser usados ao se preservar o mesmo como um pó e dispersá-lo em um solvente aquoso para injeção quando em uso.
[00186] O teor do oligodesoxinucleotídeo ou complexo da presente invenção em uma composição farmacêutica é de geralmente cerca de 0,1 - 100% em peso, preferivelmente cerca de 1 - 99 % em peso, mais preferivelmente cerca de 10 - 90 % em peso da composição farmacêutica total.
[00187] A composição farmacêutica da presente invenção pode conter, como um ingrediente ativo, o oligodesoxinucleotídeo ou complexo da presente invenção sozinho ou uma combinação do oligodesoxinucleotídeo ou complexo da presente invenção e outro ingrediente ativo.
4. Uso farmacêutico
[00188] Já que o oligodesoxinucleotídeo e complexo da presente invenção têm uma atividade imunoestimulante superior, o oligodesoxinucleotídeo, complexo e composição farmacêutica da presente invenção podem ser usados como agentes imunoestimulantes. A administração do oligodesoxinucleotídeo, complexo ou composição farmacêutica da presente invenção a um mamífero (primatas tais como ser humano e similares, roedores tais como camundongo e similares, etc.) pode induzir uma reação imune no mamífero. Particularmente, já que o complexo da presente invenção tem uma propriedade de ativação do ODN CpG do tipo D e estimula células mononucleares sanguíneas periféricas para produzir grandes quantidades de interferon do tipo I (Pan-IFN-α, IFN-α2 etc.) e interferon do tipo II (IFN-Y), ele é útil como um agente na indução da produção de interferon do tipo I e agente na indução da produção de interferon do tipo II ou agente na indução da produção de interferon do tipo I e tipo II. Já que o complexo da presente invenção e a composição farmacêutica que contém o mesmo induzem a produção de ambos os interferons do tipo I e tipo II, eles são úteis para a profilaxia ou tratamento de uma doença para os quais ambos os interferons do tipo I e tipo II são eficazes. Exemplos da doença para a qual o interferon do tipo I é eficaz inclui infecção por vírus (por exemplo, vírus da hepatite C (HCV), vírus do herpes, vírus papiloma, vírus RS, vírus influenza, etc.), cancer e similares. Exemplos da doença para a qual o interferon do tipo II é eficaz inclui doença alérgica, infecções com protozoário parasítico (Leishmania etc.), bactéria (Listeria, Mycobacterium tuberculosis etc.) e similares. Para a infecção aguda por vírus com vírus RS, vírus influenza e similares, já que tanto o interferon do tipo I e interferon do tipo I melhoram as respostas imunes com relação à eliminação do vírus, espera-se que o complexo e a composição farmacêutica contendo os mesmos da presente invenção sejam eficazes para infecção aguda por vírus.
[00189] Além disso, o oligodesoxinucleotídeo e o complexo da presente invenção, particularmente, o complexo da presente invenção, têm uma forte atividade adjuvante de e a administração do oligodesoxinucleotídeo e complexo da presente invenção junto com um antígeno a um mamífero pode induzir a uma forte reação imune ao antígeno. Deste modo, a presente invenção também provê uma composição para induzir uma resposta imune a um antígeno, a qual contém (a) o oligodesoxinucleotídeo da presente invenção, ou o complexo da presente invenção, e (b) o antígeno. Particularmente, o complexo da presente invenção induz fortemente tanto a reação imune humoral a um antígeno (produção de anticorpo específica ao antígeno) e uma reação imune celular (indução de CTL específica ao antígeno). Consequentemente, o oligodesoxinucleotídeo, complexo e composição farmacêutica da presente invenção, particularmente o complexo da presente invenção e a composição farmacêutica que contêm os mesmos são úteis como adjuvantes de vacina.
[00190] No presente relatório descritivo, o adjuvante se refere a um auxiliar farmacêutico que promove respostas imunes, o qual é uma substância que melhora de forma não específica as respostas imunes a um antígeno quando administrado com o antígeno ao corpo vivo.
[00191] O antígeno não está particularmente limitado a ter somente antigenicidade para um mamífero (primatas tais como ser humano e similares, roedores tais como camundongo e similares, etc.), a ser o objeto de administração e poder ser reconhecido como um antígeno por um anticorpo ou linfócito T citotóxico (CTL, células T CD8+). Qualquer substância que se torna um antígeno (proteína, peptídeo, ácido nucleico, lipídio, carboidratos e uma modificação da substância acima mencionada (por exemplo, modificação introduzida com deleção, substituição e/ou adição de um ou mais aminoácidos (a seguir, mutação, etc.) e similares) pode ser usada. Como o antígeno, o antígeno derivado do patógeno tal como protozoário, fungo, bactéria, vírus e similares e um antígeno que se refere ao câncer ou a uma doença em particular também pode ser usado.
[00192] No presente relatório descritivo, "antígeno A derivado de um patógeno X" significa que o antígeno A está contido como um fator constituinte no patógeno X. Por exemplo, quando o antígeno A é um polipeptídeo, significa que a sequência de aminoácido do polipeptídeo está presente na sequência de aminoácido da proteína codificada pelo genoma do patógeno X.
[00193] Exemplos do antígeno derivado de um patógeno incluem o próprio patógeno ou uma parte do mesmo, um próprio patógeno inativado ou atenuado ou uma parte do mesmo ou a modificação introduzida com uma mutação nestes e similares, e similares.
[00194] Quando um antígeno derivado de um patógeno é usado como o antígeno, se induz uma reação imune ao antígeno e se produz um mecanismo para eliminar do corpo, de forma imunológica, o patógeno contendo o antígeno. Deste modo, uma composição compreendendo (a) o oligodesoxinucleotídeo da presente invenção ou o complexo da presente invenção, e (b) um antígeno derivado de um patógeno, por induzir uma reação imune ao antígeno, é útil para a profilaxia ou tratamento do patógeno.
[00195] O complexo da presente invenção induz fortemente tanto a reação imune humoral (produção de anticorpo específica ao antígeno), quanto uma reação imune celular (indução de CTL específica ao antígeno) too antígeno. Deste modo, um antígeno derivado de um patógeno infeccioso intracelular (vírus, protozoário, fungo, bactéria, etc.) conhecido por ser reconhecido por linfócitos T citotóxicos, um antígeno relacionado a células de câncer (por exemplo, antígeno tumoral) e similares são preferivelmente usados como o antígeno.
[00196] Embora não se limite particularmente ao vírus infeccioso intracelular, exemplos do mesmo incluem vírus RS, vírus influenza, vírus parainfluenza, vírus da hepatite C (HCV), vírus da hepatite A (HAV), vírus da hepatite B (HBV), Ebolavírus, citomegalovírus, adenovírus, vírus da polio, vírus da encefalite Japonesa, vírus do sarampo, vírus da caxumba, vírus da rubéola, vírus da raiva, vírus da febre amarela, vírus varicela-zóster, hantavírus, vírus da dengue, norovírus, rotavírus, parvovírus, coronavírus, vírus da cinomose, vírus da leucemia da célula T adulto (HTLV-1), vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus da herpes, vírus do papiloma e similares. Exemplos das bactérias infecciosas intracelulares incluem micoplasma e similares. Exemplos dos protozoários infecciosos intracelulares incluem plasmódio, esquistossomo e similares. O patógeno infeccioso intracelular é preferivelmente vírus (especificamente, vírus RS ou vírus influenza etc.).
[00197] Exemplos do antígeno relacionado às células de câncer incluem proteína, cadeia de açúcar, peptídeo que são especificamente expressos por células de câncer, variante das substâncias acima mencionadas (deletadas, substituídas e/ou adicionadas) ou modificação dos mesmos e similares.
[00198] Já que o complexo da presente invenção induz fortemente que ambos os interferons do tipo I e do tipo II, em uma modalidade, um vírus (por exemplo, vírus RS, vírus influenza) que causa infecção aguda por vírus, para a qual tanto o interferon do tipo I quanto o interferon do tipo II são eficazes, é selecionado como o vírus.
[00199] Por exemplo, uma composição contendo (a) o oligodesoxinucleotídeo da presente invenção ou o complexo da presente invenção, e (b) um antígeno derivado de um patógeno ou câncer, para induzir uma reação imune ao antígeno, é administrada a um paciente com uma infecção por patógeno ou câncer ou um ser humano potencialmente afetado com a infecção por patógeno ou câncer, para ativar especificamente os linfócitos T citotóxicos (CTLs) no indivíduo que recebeu a administração, induz a produção de anticorpo específica ao antígeno, isto é, induz uma reação protetora imune no animal de sangue quente (preferivelmente, o ser humano), com isso a infecção e o câncer podem ser prevenidos ou tratados. Consequentemente, a composição é útil como uma vacina para a profilaxia ou tratamento das doenças acima mencionadas tais como infecção, câncer e similares.
[00200] Além disso, já que o complexo da presente invenção pode induzir fortemente tanto uma reação imune humoral (produção de anticorpo específica ao antígeno) quanto uma reação imune celular (indução de CTL específica ao antígeno) a um antígeno, qualquer um antígeno superficial e antígeno interno do patógeno e célula de câncer podem ser usados como o antígeno, e também se deseja o uso de uma mistura de um antígeno superficial e um antígeno interno.
[00201] Uma composição compreendendo (a) o oligodesoxinucleotídeo da presente invenção, ou o complexo da presente invenção, e (b) um antígeno, para induzir uma reação imune ao antígeno, pode ser preparada de acordo com a composição farmacêutica acima mencionada da presente invenção.
[00202] Os conteúdos revelados em qualquer publicação citada no presente relatório descritivo, incluindo patentes e pedidos de patente, são incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência, na medida em que foram revelados no presente documento.
EXEMPLOS
[00203] A presente invenção é explicada em maiores detalhes a seguir com referência aos Exemplos, os quais não devem ser interpretados como limitativos.
Método Animais e Reagentes
[00204] Geração de camundongos deficientes em Tlr9 e deficientes em Dectin-1 foi descrita em (Koyama, S., e outros, Science translational medicine 2, 25ra24 (2010); Saijo, S., e outros, Nature immunology 8, 39-46 (2007)). Os camundongos C57BL/6J foram comprados da NIHON CLEA. Todos os experimentos animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes institucionais para o Instituto Nacional de Inovação Biomédica e para o departamento animal da Osaka University. Os ODNs CpG que seguem foram sintetizados pela GeneDesign, Inc. (o sublinhado indica ligações fosforotioato).
Figure img0003
[00205] Particularmente, a síntese de K3-dA35 (SEQ ID NO: 12), K3-dA30 (SEQ ID NO: 11), K3-dA25 (SEQ ID NO: 10) e K3-dA20 (SEQ ID NO: 9), além da K3-dA40 acima mencionada (SEQ ID NO: 2), é descrita (Tabela 2). Tabela 2
[00206] K3-dA40: AsTsCsGsAsCsTsCsTsCsGsAsGsCsGsTsTsCsTsCsAsAsAsAsAsAsA sAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsA sAsAsAsAsAsA (Listagem de Sequência, SEQ ID NO: 2)
[00207] K3-dA35: AsTsCsGsAsCsTsCsTsCsGsAsGsCsGsTsTsCsTsCsAsAsAsAsAsAsA sAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsA sA (Listagem de Sequência, SEQ ID NO: 12)
[00208] K3-dA30: AsTsCsGsAsCsTsCsTsCsGsAsGsCsGsTsTsCsTsCsAsAsAsAsAsAsA sAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsA (Listagem de Sequência, SEQ ID NO: 11)
[00209] K3-dA25: AsTsCsGsAsCsTsCsTsCsGsAsGsCsGsTsTsCsTsCsAsAsAsAsAsAsA sAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsA (Listagem de Sequência, SEQ ID NO: 10)
[00210] K3-dA20: AsTsCsGsAsCsTsCsTsCsGsAsGsCsGsTsTsCsTsCsAsAsAsAsAsAsA sAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsA (Listagem de Sequência, SEQ ID NO: 9)
[00211] (Nas sequências mencionadas acima, s mostra que a ligação fosfodiéster entre os nucleosídeos é substituída pela ligação fosforotioato.)
[00212] Os oligodesoxinucleotídeos foram sintetizados por um método convencional, método da fosforamidita em fase sólida (Nucleic Acids in Chemistry and Biology, 3. Chemical synthesis (1990) ed. G. Michael Blackburn and Michael J. Gait. Oxford University Press).
[00213] Tabela 3 mostra o peso molecular weight dos ODNs CpG descritos na Tabela 2 e o tempo de retenção analisado por HPLC de fase reversa sob as condições que seguem (coluna: Waters, X-Bridge C18 2.5 μm, 4.6 x 75 mm, solução A: 100 mM hexafluoroisopropanol, 8 mM trietilamina, solução B: metanol, B%:5%^30% (20 min, gradiente linear); 60°C; 1 ml/min; 260 nm).
Figure img0004
Figure img0005
[00214] Ovalbumina (OVA) foi comprada da Seikagaku Kogyo. DQ- OVA, Alexa488-OVA, CFSE e Lipofectamina 2000 foram compradas da Invitrogen. Hoechst33258, Zimosano e Curdlano foram comprados da SIGMA. Zimosano reduzido foi comprador da Invivogen. Lipossoma de Clodronato foi comprador da FormuMax. Produto de vacina fracionada do vírus Influenza, vírus complete inativado pela formalina (WIV) e vírus influenza purificados (H1N1) foram preparados como anteriormente descrito (Koyama, S., e outros, Science translational medicine 2, 25ra24 (2010)).
Complexação de ODN CpG e SPG (Fig. 1)
[00215] 7,22 mg de K3-dA40 foram dissolvidos em água (3,7mL). SPG (15 mg, Mitsui Sugar Co., Ltd.) foi dissolvido em NaOH a 0,25 N (1 mL). Um volume de 1 mL de NaH2PO4 a 330 mM foi adicionado à solução de DNA, então a solução de SPG foi adicionada à solução de DNA/NaH2PO4 e mantida a 4°C de um dia para o outro de modo a completar a complexação. A razão molar (MSPG/MDNA) foi fixada em 0,27. A formação do complexo foi confirmada por um aparelho de eletroforese microchip (SHIMADZU: MultiNA).
Complexação de ODN CpG e LNT (Fig. 1)
[00216] Lentinano (LNT: Ajinomoto Co., Inc., N° do lote: 2D8X1) foi dissolvido em NaOH 0,25N até 50 mg/ml e a mistura foi deixada descansar em temperatura ambiente de um dia para o outro. Vários ODNs CpG (Tabelas 2, 3) foram dissolvidos em água para injeção até 100 mM. A solução aquosa de LNT e várias soluções aquosas de CpG (K3-dA20 (SEQ ID NO: 9), K3-dA25 (SEQ ID NO: 10), K3-dA30 (SEQ ID NO: 11), K3-dA35 (SEQ ID NO: 12), K3-dA40 (SEQ ID NO: 2)) foram misturadas nas proporções mostradas na Tabela 4, depois o mesmo volume de 330 mM NaH2PO4 como LNT foi adicionao e a mistura foi mantida a 4°C de um dia para o outro até completar a complexação. A formação do complexo foi confirmada pela mudança do ODN CpG para uma coluna de peso molecular maior por cromatografia por exclusão de tamanho, enquanto se monitora a absorção a 260 nm. (Sistema: Agilent 1100 series, Coluna: Asahipak GF7 M-HQ (Shodex), duas colunas conectadas, Taxa de Vazão: 0.8 mL/min, Tampão: 10 mM EDTA PBS, pH 7.4, Temperatura: 40°C).
Figure img0006
Preparação e estimulação de PBMCs humanas (Figs. 2, 3, 6 e 7)
[00217] PBMCs foram obtidas de três homens adultos voluntários (30-40 anos). Todos os experimentos usando PBMCs humanas foram aprovados pelo Conselho Institucional do Instituto Nacional de Inovação Biomédica (Institutional Review Board of the National Institute of Biomedical Innovation). Após a preparação de PBMCs usando Ficoll, elas foram colocadas em uma concentração de 1 x 107 células/mL. PBMCs foram mantidas em RPMI completo (RPMI 1640 suplementado com 10% FCS, penicilina e estreptomicina). PBMCs foram estimuladas com K3 (0.24, 0.74, 2.2, 6.6, 20 μg/mL), K3-dA40, K3-SPG (complexo de K3-dA40), dA40-K3, SPG-K3 (complexo de dA40-K3), D35, CpG21798, CpG21889, CpG2395 ou M362 por 24 h. Os sobrenadantes foram submetidos a ELISA para pan-IFN-α (Mabtech), IL-6 (R&D) e Milliplex (Millipore).
Análise por microscópio eletrônico (Fig. 4)
[00218] Antes da coloração, as amostras foram colocadas em uma rede revestida com carbono com película de formvar. Para a coloração negativa, uma gota de acetato de uranila a 2% (pH 4,0) foi colocada em suportes e deixada secar. Os suportes foram examinados a uma taxa de magnitude de x40.000 em um microscópio eletrônico (Hitachi H-7650).
Espalhamento Dinâmico da Luz (Fig. 5)
[00219] Nanopartículas de tamanho médio em uma solução aquosa a 80°C foram medidas usando Espalhamento Dinâmico da Luz em um Zeta Sizer da Malvern Instruments.
Culturas de esplenócito e célula dendrítica (Figs. 8 e 9)
[00220] Baços de camundongo foram coletados de camundongos C57BL/6J de 6 semanas, deficientes em Tlr9 e deficientes em Dectin- 1. Após a suspensão de esplenócitos, os glóbulos vermelhos (RBCs) foram lisados com tampão de lise ACK e as células foram mantidas em RPMI completo. As células foram colocadas em placas com 1 x 107 células/mL. Células dendríticas (DCs) derivadas da medula óssea foram geradas pela cultura por 7 dias com Flt3L humano (Peprotech) (100 ng/mL). As células foram colocadas em placas em uma concentração de 1 x 107 células/mL. BMDMs foram gerados pela cultura por 7 dias com M-CSF de camundongo (Peprotech) (20 ng/mL). Estas células foram mantidas em RPMI completo.
Distribuição intracelular (Figs. 8 e 9)
[00221] BMDMs foram colocados em placas em uma concentração de 5 x107 células/mL e estimuladas com Alexa 488-K3 (1 μM) mais Alexa 647-K3-SPG (1 μM) ou Alexa 488-D35 (1 μM) mais Alexa 647- K3-SPG (1 μM) por 3 h. As células foram coradas com Hoechst33258 por 30 min para visualizar o núcleo, depois as células foram fixadas e analisadas usando microscópio de fluorescência.
Imunização
[00222] Camundongos C57BL/6J de 6 semanas, deficientes em Tlr9 e deficientes em Dectin-1 foram administrados com OVA (0,1, 1, 10 ou 100 μg); OVA (0,37, 1,1, 3,3 ou 10 μg) e K3(538 pmol); OVA (0,37, 1,1, 3,3 ou 10 μg) e K3-dA40 (538 pmol); ou OVA (0,37, 1,1, 3,3, ou 10 μg) e K3-SPG (538 pmol) na base da cauda nos dias 0 e 10. Para os outros experimentos, camundongos C57BL/6J de seis semanas foram administrados com vacina fracionada (0,1 μg) sozinha; vacina fracionada mais K3 (538 pmol); ou vacina fracionada mais K3- SPG (538 pmol) nos dias 0 e 10 na base da cauda. Sangue foi retirado no dia 17 e os títulos de anticorpo do soro específico de antígeno foram medidos por ELISA (Figs. 10, 15a, 16, 25, 28a, 29 e 43a). Os baços do camundongo foram coletados no dia 17 e esplenócitos preparados pelo método mencionado acima. As células foram reestimuladas com OVA257-264 (OVA257):SIINFEKL (10 μg/mL); OVA323-339 (OVA323):ISQAVHAAHAEINEAGR (10 μg/mL); proteína de OVA total (OVA) (10 μg/mL); NP260-283 (NP260):ARSALILRGSVAHKSCLPACVYGP (10 μg/mL); ou vacina fracionada (10 μg/mL) por 24 ou 48 h. Os sobrenadantes foram submetidos a ELISA para IFN-Y de camundongo (Figs. 11, 15b, 17, 26, 28b, 30 e 43b). Para o ensaio do tetrâmero, os esplenócitos foram corados com tetrâmero H-2Kb OVA (MBL), anticorpos anti-CD8α (KT15), anti-TCRβ (H57-597), anti-CD62L (MEL-14), e anti-CD44 (IM7) e 7-AAD. Os números da célula OVA tetrâmero+ CD44+ CD8α+ TCRβ+ foram determinados por FACS (Figs. 12, 15c, 27, 28c e 31).
Ensaio CTL in vitro (Fig. 13)
[00223] Camundongos C57BL/6J de seis semanas foram administrados com OVA (100 μg); OVA mais K3 (3,3 μg); OVA mais K3-dA40 (3,3 μg); ou OVA com K3-SPG (3,3 μg) na base da cauda no dia 0. Aos 7 dias pós-imunização, esplenócitos virgens de C57BL/6J foram marcados com concentração diferente de CFSE (5 ou 0,5 μM) por 10 min a 37°C. As células coradas em altas concentrações foram centrifugadas com OVA257 (10 μg/mL) por 90 min a 37°C. Após lavagem por duas vezes com meio, as células marcadas foram misturadas e transferidas para camundongos imunizados por administração intravenosa. Vinte e quatro horas após a transferência, os esplenócitos foram coletados e a porcentagem de células marcadas com CFSE foi medida por FACS.
Imunização com peptídeo
[00224] Camundongos C57BL/6J foram imunizados com OVA257 (10 μg); OVA257 mais K3 (10 μg); OVA257 mais K3-dA40 (10 μg); ou OVA257 mais K3-SPG (10 μg).
[00225] Sete dias após a imunização, os esplenócitos foram preparados e corados com o H-2Kb OVA tetrâmero, anticorpos anti- CD8α, anti-TCRβ, anti-CD62L e anti-CD44. Os números de célula de OVA tetramero+ CD44+ CD8α+ TCRβ+ foram analisados por FACS (Fig. 14 a esquerda). Os esplenócitos preparados foram reestimulados in vitro com OVA257 (10 μg/mL) mais Golgi Plug por 4 h. As células foram coradas com anticorpos anti-IFN-Y, anti-CD8α e anti-CD3e e os números de células de IFN-Y+ CD8α+ CD3e+ foram determinados por FACS (Fig. 14 à direita).
Transfecção e ensaio de ligação com Dectin-1 (Figs. 18 e 19)
[00226] As células HEK293 foram transfectadas com plasmídeos de expressão Dectin-1 ou Dectin-2 vazios usando Lipofectamina 2000. Em 48 h pós-transfecção, as células foram tratadas com FITC-SPG (0.5 μM), K3-dA40 marcado com Alexa 488 (0.5 μM) ou K3-SPG marcado com Alexa 488 (0.5 μM) por 60 min a 37°C. Após o tratamento, as células foram coletadas e as células positivas em SPG ou ODN CpG foram analisadas por FACS.
Estimulação de células imunes (Figs. 20, 21,22, 23 e 24)
[00227] Esplenócitos e FL-DCs de camundongos C57BL/6J deficientes em Tlr9 ou deficientes em Dectin-1 foram estimulados com K3-SPG (0,014, 0,03, 0,04, 0,08, 0,12, 0,25, 0,37, 0,74, 1,1, 2,2, 3,3, 6,7, 10 ou 20 μg/mL), Zimosano (3,7, 11,1, 33,3, ou 100 μg/mL), Curdlano, Zimosano Reduzido ou SPG por 24 h. Em outros experimentos, os esplenócitos de camundongos C57BL/6J ou camundongos deficientes em Dectin-1 foram estimulados com Zimosano Reduzido (100, 33,3 ou 11,1 μg/mL) ou SPG (100, 33,3 ou 11,1 μg/mL), com ou sem D35 (1 μM) por 24 h. Os sobrenadantes foram submetidos a ELISA para IFN-α (PBL), IL-6 (R&D), IL-12 p40 (R&D), IL-12 p70 (R&D) e Bioplex (BIO-RAD).
Imuno-histoquímica (Fig. 32)
[00228] Camungongos C57BL/6J foram administrados com DQ- OVA (10 μg); Alexa 488-K3-SPG (10 μg); Alexa 647-K3-SPG (10 μg); ou DQ-OVA mais Alexa647-K3-SPG (10 μg) na base da cauda. Após a coleta de iLNs, as partes congeladas foram preparadas usando um criostato. As partes congeladas foram fixadas com paraformaldeído 4% por 10 min e incubadas com anticorpos anti-Siglec-1 (MOMA-1), anti-MARCO (ED31), anti-CD3e (145-2C11), ou anti-CD11c (N418). Os resultados de imagem foram analisados por ImageJ.
Microscopia por dois fótons (Figs. 33 e 35)
[00229] Camundongos C57BL/6J deficientes em Tlr9 ou deficientes em Dectin-1- foram administrados com DQ-OVA (10 μg), Alexa 488-K3 (10 μg), ou Alexa 488-K3-SPG (10 μg) na base da cauda. 30 min antes da coleta de iLN , os camundongos foram administrados com anticorpos anti-PE-MARCO, ou anti-PE-Siglec-1 na base da cauda. Em 1 h pós-administração do antígeno ou adjuvante, iLNs foram coletados e preparados para análise de imagens usando um microscópio de dois fótons (Olympus). A correlação de Pearson foi calculada usando análise de colocalização Volocity. Distribuição in vivo de antígeno e adjuvante (Figs. 34 e 36)
[00230] Camundongos C57BL/6J foram administrados com
[00231] Alexa 647-K3 (538 pmol);
[00232] Alexa 647-K3-SPG (538 pmol);
[00233] Alexa 488-OVA (10 μg);
[00234] Alexa 488-OVA mais K3 (10 μg);
[00235] Alexa 488-OVA mais K3-SPG (10 μg);
[00236] DQ-OVA (10 μg);
[00237] DQ-OVA mais Alexa 647-K3 (538 pmol); ou
[00238] DQ-OVA mais Alexa 647-K3-SPG(538 pmol) na base da cauda. Vinte e quatro horas depois da administração, iLNs foram coletados. Para preparar suspensões de única célula, iLNs foram incubados com colagenase D (1 mg/mL) e DNase I (0,1 mg/mL) por 30 min a 37°C. As células preparadas foram incubadas com anticorpos anti-B220 (RA3-6B2), anti-CD8α (56-6,7) e anti-CD11c para separar as populações diferentes de DC. A absorção celular de OVA e ODNs CpG foi analisada por FACS.
Injeção de Lipossoma de Clodronato (Fig. 37)
[00239] Camundongos C57BL/6J de seis semanas foram administrados com lipossoma de clodronato na base da cauda tanto cinco ou dois dias antes da imunização. Os camundongos foram imunizados na base da cauda com OVA mais K3-SPG no dia 0. Sangue e Baço foram coletados no dia 8, e títulos de anticorpo do soro e respostas da célula T foram medidos por ELISA.
Investigação de ativação de DC in vivo (Fig. 38)
[00240] Camundongos C57BL/6J ou deficientes em Tlr9 foram administrados com K3 (10 μg) ou K3-SPG (10 μg) até a base da cauda. 24 h após a administração, iLNs foram preparados pelos métodos mencionados acima. As células foram incubadas com anticorpos anti-CD11c, -mPDCA-1 (JF05-1C2.4.1), -CD8α e -CD40 (3/23), depois analisadas por FACS.
Investigação da resposta de defesa contra infecção do vírus Influenza
[00241] Camundongos C57BL/6J de seis semanas foram administrados com vacina fracionada (0,1 μg);
[00242] vacina fracionada mais K3-SPG (10 μg); ou
[00243] WIV (0,2 μg) nos dias 0 e 14. Duas semanas após a imunização, os títulos de anticorpo de soro foram medidos por ELISA (Fig. 39) e camundongos foram testados em via intranasal com 2,3 x 103 pfu (10 LD50) de vírus influenza A/PR/8/34. As mudanças no peso corporal e mortalidade de camundongos testados foi monitorada por 20 dias (Fig. 40).
Modelo de Vacina de macaco cinomolgo (Figs. 41 e 42)
[00244] Macacos cinomolgos foram administrados por via subcutânea com vacina fracionada de influenza (5 μg) mais K3(5 nmol), ou vacina fracionada e K3-SPG (5 nmol) nos dias 0 e 14. As amostras de sangue foram coletadas em -2, 2, 4, 6, 8 e 110 semanas e os títulos de anticorpo do soro foram medidos por ELISA.
Análise estatística
[00245] A significância estatística (P < 0,05) entre grupos foi determinada usando o teste t de Student ou teste U de Mann-Whitney.
Resultados
[00246] 1) uma nanopartículas no formato de bastonete de K3-SPG ganha características duplas de ODN CpG do tipo K e D.
[00247] Melhor eficiência na complexação entre ODN CpG e SPG necessita de sequências adicionais da estrutura principal de PS para poly-dA40 nas extremidades 5’ ou 3’ através de procedimentos de desnaturação-renaturação como mostrados na Figura 1 (Shimada, N., e outros, Bioconjugate chemistry 18, 1280-1286 (2007); Minari, J., e outros, Bioconjugate chemistry 22, 9-15 (2011)). Durante a otimização da formação do complexo através de ODN CpG humanizado, os atuais inventores examinaram os impactos imunoestimulantes das extremidades 5’ e 3’ do ODN CpG. O 5’-K3-dA40-3’, porém não o 5’- dA40-K3-3’, complexado com células mononucleares sanguíneas periféricas humanas (PBMCs) ativadas com SPG para produzir grande quantidade de IFN-α, ainda que as eficiências de complexação fossem comparáveis (Figs. 2 e 3). K3, K3-dA40 e dA40-K3, os quais são capazes de ativar PBMCs humanas para produzir outras citoquinas, tais como IL-6, falharam em produzir IFN-α (Figs. 2 e 3). Estes resultados indicam que o CpG da extremidade 5’ é mais cobiçado do que o CpG da extremidade 3’ -CpG como um novo agonista do TLR9.
[00248] A qualificação e a quantificação do K3-SPG foram conduzidas por microscopia eletrônica de varredura (SEM) e Espalhamento Dinâmico da Luz (DLS). K3-SPG tinha uma estrutura do tipo bastonete, consistente com aquela vista em um relatório anterior (Bae, A.H., e outros, Carbohydrate research 339, 251-258 (2004)) (Fig. 4). Parecia ser uma nanopartículas monomérica solúvel com um diâmetro médio de 30 nm, quando comparado com o próprio SPG e menor do que o ODN CpG do tipo D (D35) (Fig. 5) (Klein, D.C. e outros, Ultramicroscopy 110, 689-693 (2010); Costa, L.T., e outros, Biochemical and biophysical research communications 313, 1065-1072 (2004)).
[00249] Dado que o K3-SPG forma uma nanopartículas, as atividades imunoestimulantes de K3-SPG foram comparadas com ODN CpG do tipo C, D e P. As PBMCs estimuladas com K3-SPG produziram maior quantidade de IFN-α e IFN-Y e em muito mais baixas concentrações do que aquelas induzidas por D35 (Fig. 6), ODN CpG do tipo P e C (Fig. 7). Estes resultados sugerem que K3-SPG ganha uma característica de ODN CpG do tipo D, sem perder aquela do tipo K, devido a esses IFNs serem conhecidos por serem citoquinas específicas do tipo D (Krug, A., e outros, European journal of immunology 31, 2154-2163 (2001); Verthelyi, D. e outros, Journal of immunology 166, 2372-2377 (2001); Gursel, M. e outros, Journal of leukocyte biology 71, 813-820 (2002)). Para entender as funções duplas do ODN CpG do tipo K e D , os inventores analisaram a localização intracelular de K3-SPG em macrófagos derivados de medulla óssea. K3-SPG foi colocalizado não apenas com os endossomos contend ODN CpG do tipo K porém aqueles contendo também ODN CpG do tipo D (Figs. 8 e 9) como ODN CpG do tipo C (Guiducci, C., et al., The Journal of experimental medicine 203, 19992008 (2006)), sugerindo que K3-SPG pode transduzir vias de sinalização imunes inatas mediadas por endossomos por ODN CpG do tipo K e D. Estes resultados sugerem veementemente que K3-SPG forma uma partícula completamente solubilizada e que este K3-SPG "completo" mostrou uma atividade mais potente do que, e diferente característica a partir de quaisquer outros ODNs CpG e complexo CpG-SPG anteriormente conhecido.
[00250] 2) K3-SPG é um adjuvante de vacina importante que induz respostas CTL potentes ao antígeno da proteína sem conjugação.
[00251] Os presentes inventores compararam os efeitos adjuvantes de K3, K3-dA40 e K3-SPG em um modelo de imunização murino. Quando camundongos do tipo selvagem foram imunizados com OVA sozinha ou OVA com cada adjuvante do derivado de K3, K3-SPG induziu de forma significativa as respostas imunes humorais maiores (Fig. 10), e respostas da célula T mais fortes do que as induzidas por K3 (Fig. 11). Em nota, os ensaios tetrâmero revelaram um número significativamente maior de células T CD8 específicas de OVA (Fig. 12). Também se observou atividade CTL in vivo muito forte em oposição aos antígenos de proteína sem qualquer conjugação covalente (Fig. 13). Esta forte indução de CTL por K3-SPG foi reproduzida através da vacinação de peptídeo (Fig. 14), e era dependente de dose (Fig. 15). A capacidade de poupar o antígeno de K3-SPG era tão potente que respostas comparáveis da célula T CD4 e anticorpo foram alcançadas usando uma centésima parte da quantidade de antígeno de OVA (Figs. 16 e 17). Estes resultados indicam claramente que K3-SPG é um adjuvante importante melhor do que K3 sozinho.
[00252] 3) SPG é um ligante Dectin-1 solúvel, porém não é agonista de Dectin-1.
[00253] O papel de Dectin-1 na absorção celular de, e em seguida à ativação através de, SPG e K3-SPG foi examinado, à medida que Dectin-1 foi mostrado como sendo um receptor para β-glucanos tais como Zimosano (Herre, J., e outros, Blood 104, 4038-4045 (2004)). Ao usar a citometria de fluxo, verificou-se que as células HEK293 que expressam Dectin-1 mas não Dectin-2 ou um vetor de controle, aumentaram a absorção de SPG ou K3-SPG in vitro apesar da presença de ODN (Figs. 18 e 19). Reportou-se recentemente que a forma solúvel de β-glucano não ativa a sinalização de Dectin-1 (Goodridge, H.S., e outros, Nature 472, 471-475 (2011)). De forma adicional, a sinalização de Dectin-1 inibe a produção de citoquina mediada por TLR9 através da indução do supressor da proteína 1 de sinalização de citoquina (SOCS1) (Eberle, M.E. & Dalpke, A.H., Journal of immunology 188, 5644-5654 (2012)). Deste modo, a atividade agonistíca de SPG foi examinada. Quando as células do baço foram estimuladas com Zimosano Reduzido porém sem SPG, TNF-α dependente de dose e de Dectin-1 e outras produções de citoquina foram observados (Fig. 20) (Fig. 21). As produções de citoquina por Zimosano e Curdlano eram não dependentes de Dectin- 1. Zimosano Reduzido inibiu IFN-α induzido por ODN CpG, com esta inibição realçada pela deficiência em Dectin-1 (Fig. 22). Em contraste, SPG não inibiu a produção de IFN-α induzido por ODN CpG (Fig. 23). Estes resultados indicam que SPG é um ligante porém não um agonista de Dectin-1; deste modo SPG não interfere com a produção de IFN-α mediada por TLR9.
[00254] 4) Efeitos adjuvantes de K3-SPG dependem de TLR9 e dependem parcialmente de Dectin-1.
[00255] Já que K3-SPG é um complexo de ODN CpG e β-glucano, o papel de TLR9 (Hemmi, H., e outros, Nature 408, 740-745 (2000)) e Dectin-1 (Saijo, S., e outros, Nature immunology 8, 39-46 (2007)) foi examinado usando camundongos inativados por receptor. Quando os esplenócitos e DCs derivadas de medulla óssea induzidas pelo ligante Flt3 (FL-DCs) de camundongos deficientes em Tlr9 e deficientes em Dectin-1 foram estimulados com K3-SPG, a produção de citoquina estava completamente dependente de TLR9 mas não Dectin-1 (Fig. 24). Em uniformidade com os resultados in vitro, a imunização nos camundongos deficientes de TLR9 com K3-SPG mais OVA resultou em respostas de célula T e humorais dimunuídas (Figs. 25-27). Os camundongos deficientes em Dectin-1 mostraram respostas imunes comparáveis com camundongos do tipo selvage quando os camundongos foram imunizados com OVA mais 10 μg de K3-SPG (Fig. 28). Quando os camundongos deficientes em Dectin-1 foram imunizados com OVA mais 1 μg de K3-SPG, os camundongos exibiram uma resposta de célula T CD8 reduzida de acordo com os ensaios de tetrâmero (Fig. 31), sem mudanças significativas na produção de anticorpo e citoquina a partir das células T (Figs. 29 e 30). Estes resultados sugerem que o efeito adjuvante de K3-SPG depende da sinalização de TLR9. Embora SPG e K3-SPG não estimulem a sinalização de Dectin-1, o efeito de K3-SPG depende parcialmente de Dectin-1 in vivo.
[00256] 5) macrófagos MARCO+, sem os macrófagos Siglec-1+ na drenagem dos linfonodos capturam de forma dominante K3-SPG com antígeno.
[00257] Em consideração que o K3-SPG prove efeitos adjuvantes potentes in vivo através de imunização com uma simples mistura de antígeno, se pensou na hipótese de que as células as quais capturam tanto o antígeno quanto o K3-SPG devem ter um papel principal na medição de efeitos adjuvantes. Para examinar a distribuição in vivo de OVA e K3-SPG marcados com fluorescente, o microscópio de fluorescência e o microscópio de dois fótons foram usados. Depois de uma injeção na base da cauda, ambos o antígeno e o adjuvante alcançaram a superfície dos linfonodos inguinais de drenagem (iLNs) dentro de 1 h (Figs. 32, 33 e 35). Após 24 h, algum K3-SPG se mudou para a área de célula T CD3e+ T e foi colocalizado com DQ-OVA. Aquelas células que continham ambos o K3-SPG e DQ-OVA na área da célula T do iLN eram CD11c+ DCs.
[00258] De forma interessante, a maioria dos sinais de fluorescência permaneceram na superfície do iLN (Fig. 32), levando os inventores a focarem em dois tipos de macrófagos conhecidos por serem distrobuídos na superfície de LN, macrófagos Siglec-1 (também chamado de CD169 ou MOMA-1)+ (também conhecidos como macrófagos subcapsulares dos seios paranasais) e macrófagos MARCO+ (Martinez-Pomares, L. & Gordon, S., Trends in immunology 33, 66-70 (2012)). A análise histológica usando microscopia de fluorescência convencional não revela de forma adequada a total superfície de iLN; além disso, esses macrófagos eram difíceis de ser isolados para a análise de citometria de fuxo (Aoshi, T., e outros, European journal of immunology 39, 417-425 (2009); Gray, E.E. & Cyster, J.G., Journal of innate immunity 4, 424-436 (2012)). Por conseguinte, a análise das imagens da microscopia de dois fótons foi usada para esclarecer a distribuição de antígeno e K3-SPG ex vivo. Após a injeção de anticorpos anti-MARCO e anti-Siglec-1, macrófagos específicos foram visualizados. Quando a superfície de iLN foi monitorada por microscopia de dois fótons 1 h após a injeção, OVA e K3-SPG foram colocalizados com MARCO+ porém sem macrófagos Siglec-1+ (Figs. 33 e 35). Relatórios anteriores sugerem que o complex immune e o vírus influenza inativados são capturados por macrófagos Siglec-1+ para induzir as respostas imunes humorais (Gonzalez, S.F., e outros, Nature immunology 11, 427-434 (2010); Suzuki, K. e outros, The Journal of experimental medicine 206, 14851493 (2009)). O padrão de distribuição casou perfeitamente com aquele dos macrófagos MARCO+ nos iLNs e não se colocalizou com os macrófagos Siglec-1+ conforme confirmado pela análise de colocalização com Volocity (Figs. 34 e 36). Em contraste, K3 era distribuído de forma mais difundida entre áreas de MARCO+ e Siglec- 1+ em comparação com K3-SPG (Figs. 35 e 36). De forma adicional, ambos os camundongos deficientes em TLR9 e deficientes em Dectin- 1 mostraram localização comparável de K3-SPG. Para determinar a contribuição destes macrófagos com relação aos efeitos adjuvantes de K3-SPG, uma diferente cinética de recuperação de macrófagos e DCs após uma injeção de lipossoma de clodronato na base da cauda foi examinada. Após a injeção, os macrófagos foram completamente depletados até o dia 2. Essas células não se recuperaram por pelo menos uma semana, enquanto que as DCs foram na sua maioria recuperadas até o dia 5, conforme reportado anteriormente (Aoshi, T., e outros, Immunity 29, 476-486 (2008)). Quando ambos os macrófagos e DCs foram depletados, as respostas imunes foram suprimidas de forma significativa (Fig 37; Clo -d2). Apenas os macrófagos, sem as DCs, foram depletados e as respostas imunes se compararam com aquelas em camundongos não tratados (Fig 37; Clo-d5). Isto sugere que embora ambos OVA e K3-SPG fossem capturados especialmente por macrófagos MARCO+ nos LNs após a injeção, os macrófagos induziriam respostas imunes adaptivas. Em outras palavras, o efeito adjuvante de K3-SPG era amplamente dependente na população de DC.
[00259] 6) K3-SPG tem como objetivo e ativa fortemente a população de DC que carrega o antígeno in vivo.
[00260] As verificações dos inventores sugerem que embora uma grande parte de K3-SPG nanoparticulado foi tomada pelos macrófagos MARCO+ nos iLNs após injeção, os efeitos adjuvantes parecem ser controlados por DCs. O foco era a absorção de antígeno e adjuvante pela população de DC nos iLNs. 24 h após a injeção, a absorção de antígeno e adjuvantes pela população de DC foi analisada por citometria de fluxo. A frequência de positivos em CpG nos três subconjuntos de DC (pDCs, CD8α+ DCs, e CD8α-DCs) aumentou de forma significativa após a injeção de K3-SPG do que com K3. Em contraste, a frequência de DCs positivos em OVA podia ser comparada após as injeções de K3 e K3-SPG. Quando se foca em ambas DCs positivas em antígeno e adjuvante, houve um aumento substancial por K3-SPG em relação ao K3. Ambos pDCs e CD8α+ DCs nos iLNs foram fortemente ativadas pelo K3-SPG mas não 24 h após a injeção de K3 e isso depende totalmente de TLR9 (Fig 38). Estes resultados indicam que pDCs e CD8α+ DCs capturam de forma preferencial K3-SPG nanoparticulado em vez de K3 não particulado para maturação e para manifestar efeitos adjuvantes.
[00261] 7) K3-SPG é um adjuvante potente para vacina da influenza em modelos primatas não humanos e murinos.
[00262] O efeito adjuvante de K3-SPG foi examinado ao usar modelos de vacinação de influenza mais relevantes clinicamente em ambos camundongos e primatas não humanos. Quando os camundongos foram imunizados com vacina fracionada sem vírions enriquecida com antígeno de hemaglutinina (SV) mais o adjuvante indicado, K3-SPG demonstrou efeitos adjuvantes superiores ao K3 quando as respostas do anticorpo e as respostas da célula T foram comparadas (Fig 43). De forma mais importante, uma imunização com SV mais K3-SPG resultou em uma resposta de anticorpo 100 vezes maior, mesmo comparado com vacinação com uma vacina inativada total (vírion) (WIV) (0.2 μg/camundongo) (Fig 39), a qual contém RNA viral como um adjuvante incorporado (Koyama, S., e outros, Science translational medicine 2, 25ra24 (2010)). Os camundongos imunizados com SV (0.1 μg/camundongo) e K3-SPG exibiram menor perda de peso corporal do que os camundongos imunizados com WIV (Fig 40). Visivelmente, K3-SPG conferiu 100% de proteção contra vírus PR8 letal na dose da qual apenas 10% de camundongos vacinados com WIV sobreviveu (Fig 40). Estes resultados sustentam fortemente a noção de que K3-SPG funciona como um adjuvante potente para vacinas com proteína ou baseadas em proteína em um modelo murino, levando os inventores a estender essa verificação a um modelo de primata não humano usando macaco cinomolgo. Cada grupo de três macacos cinomolgos foi imunizado com SV mais K3 ou K3-SPG nos dias 0 e 14. Os títulos de anticorpo do soro foram então monitorados por 8 semanas. O SV mais K3-SPG induziu de forma significativa um título de anticorpo maior 2 semanas após a imunização e os níveis do título permaneceram altos por pelo menos outras 6 semanas (Fig 41). Em 2 anos (110 semanas) após a imunização, o grupo K3-SPG tinha títulos de anticorpo significativamente maiores do que no grupo K3 (Figs. 42 e 43). Em conjunto, estes resultados sugerem que K3-SPG é um adjuvante de vacina importante em um modelo primate não humano.
[00263] 8) Investigação da capacidade de indução da resposta de inflamação de complexos K3-LNT e K3-SPG usando PBMCs humanas
[00264] Ao usar PBMCs humanas (Lonza, Cat No. CC-2702, Lote No. 0000396517), uma capacidade de K3 (K3-dA30, K3-dA35, K3- dA40) sozinho, complexos de K3-LNT (K3-dA30-LNT, K3-dA35-LNT, K3-dA40-LNT) e complexos de K3-SPG (K3-dA40-LNT) para induzir a produção de pan-IFN-a (hIFNa) e IL-6 (hIL-6) foi avaliada.
[00265] Os resultados são mostrados na Fig. 44. Quando estimulados a uma baixa dose, a produção de pan-IFN-a e IL-6 era maior com K3-SPG o qual é um complexo de K3 e SPG, e K3-LNT o qual é um complexo de K3 e LNT, conforme comparado ao K3 sozinho. Além disso, se sugeriu que a capacidade de produção de citoquina inflamatória a qual é induzida por K3-LNTs tendo comprimento de dA diferente (dA30, dA35, dA40) fosse possivelmente quase equivalente. Além disso, quando a capacidade de produção de citoquina inflamatória de K3-SPG e K3-LNT foi comparada, se sugeriu que a capacidade de indução da produção de pan-IFN-a K3-LNT fosse possivelmente maior do que aquela de K3-SPG. Por outro lado, verificou-se que K3-SPG e K3-LNT são equivalentes na produção de IL-6.
[00266] 9) Título de anticorpo IgG específico do antígeno RSV F nos soros de camundongos inoculados com vacina de RSV F adicionada com complexo de K3-LNT e K3-SPG
[00267] Camundongos C57BL/6 de 7 semanas foram imunizados duas vezes na base da cauda com antígeno de RSV F (0.5 μg) e vários adjuvantes (10 μg) (K3 sozinho (K3-dA30, K3-dA35, K3-dA40), complexo K3-LNT (K3-dA30-LNT, K3-dA35-LNT, K3-dA40-LNT) e complexo K3-SPG (K3-dA40-SPG), fosfato de alúmen), por camundongo em intervalos de 2 semanas. Uma semana após a imunização final, sangue periférico foi recuperado e o soro foi preparado, os quais foram usados como amostras para avaliação. O título do anticorpo o qual se liga ao antígeno da vacina de RSV F no soro foi medido usando o método ELISA. Como mostrado na Fig. 45, a indução de IgG total específico de antígeno RSV F foi melhorada pela adição de adjuvante conforme comparado ao grupo de inoculação sozinho do antígeno RSV F (F), que sugere que o efeito adjuvante de K3 sozinho (F+K3-dA30, F+K3-dA35, F+K3-dA40), K3-LNT (F+K3- dA30-LNT, F+K3-dA35-LNT, F+K3-dA40-LNT) e complexo K3-SPG (F+K3-dA40-SPG) e fosfato de alúmen (F+Alum) podem ser equivalentes. No grupo de camundongo inoculado com o fosfato de alúmen (F+Alum), o qual é um adjuvante de Th2, verificou-se que a capacidade de indução da subclasse IgG1 era maior do que do antígeno RSV F junto com o grupo de inoculação. Por outro lado, os resultados mostraram que o grupo de imunização inoculado com K3 sozinho (F+K3-dA30, F+K3-dA35, F+K3-dA40), K3-LNT (F+K3-dA30- LNT, F+K3-dA35-LNT, F+K3-dA40-LNT), K3-SPG (F+K3-dA40-SPG) era maior em anticorpo de subclasse IgG2c do que o fosfato de alúmen (F+Alum), que sugere que o complexo de K3-LNT pode ser um adjuvante de Th1 como o K3-SPG.
[00268] 10) Capacidade de produção de citoquina específica do antígeno de RSV F em camundongo inoculado com vacina de subunidade de RSV F adicionada com complexo K3-LNT e K3-SPG
[00269] Camundongos C57BL/6 de 7 semanas foram imunizados duas vezes na base da cauda com antígeno de RSV F (0.5 μg) e vários adjuvantes (10 μg) (K3 sozinho (K3-dA30, K3-dA35, K3-dA40), K3-LNT (K3-dA30-LNT, K3-dA35-LNT, K3-dA40-LNT) e complexo de K3-SPG (K3-dA40-SPG), fosfato de alúmen), por camundongo, em intervalos de 2 semanas. Na primeira semana após a imunização final, o baço foi recuperado e os esplenócitos foram preparados. Os esplenócitos colocados em uma placa de cultura de 96 poços foram estimulados com cada peptídeo do epitopo de MHC classe I, peptídeo do epitopo de MHC classe II e proteína do antígeno da vacina do antígeno de RSV F e culturados por 24 h ou 48 h. A capacidade de produção de citoquina específica de antígeno de RSV F foi avaliada pelo método ELISA e se usou o sobrenadante da cultura como uma amostra. Nesta investigação, três tipos de citoquinas (IFN-g a qual é uma citoquina Th1, IL-2 produzido de células T ativadas e IL-13 que é uma citoquina Th2) foram avaliados.
[00270] Como um resultado, como mostrado na Fig. 46, se sugeriu que os efeitos melhoradores na indução específica de antígeno de RSV F da produção de IFN-g e produção de IL-2 podem ser equivalentes em K3-LNT (F+K3-dA30-LNT, F+K3-dA35-LNT, F+K3- dA40-LNT) e K3-SPG (F+K3-dA40-SPG). No grupo de inoculação do adjuvante do fosfato de alúmen (adjuvante Th2) (F+Alum), a produção de IFN-g estava abaixo do nível limite de detecção por qualquer estimulação. Por outro lado, o efeito de melhoramento na produção de IL-13 estava maior no grupo de inoculação do fosfato de alúmen (adjuvante Th2) e baixo no grupo de inoculação de K3-SPG (adjuvante Th1). De forma interessante, no grupo de inoculação de K3-LNT (F+K3-dA30-LNT, F+K3-dA 35-LNT, F+K3-dA 40-LNT), o efeito melhorador na produção de IL-13 estava alto quando comparado ao mesmo grupo de inoculação do adjuvante Th1 (K3-SPG) (F+K3-dA40- SPG). A partir disto, se sugeriu que o complexo K3-LNT tem uma capacidade de melhoramento de resposta de Th2 além de efeito de melhoramento de resposta de Th1 alto possuído por K3-SPG.
[00271] 11) Efeito protetor contra infecção por RSV em ratos de algodão inoculados com vacina de subunidade de RSV F adicionada com K3-LNT e K3-SPG
[00272] Ratos de algodão de 6 a 7 semanas foram imunizados duas vezes na base da cauda com antígeno de RSV F (1 μg) e vários adjuvantes (10 μg) (K3-LNT (K3-dA35-LNT, K3-dA40-LNT) e complexo K3-SPG (K3-dA40-SPG), fosfato de alúmen), por rato, em intervalos de 2 semanas. Duas semanas após a imunização final, os ratos de algodão foram testados com o sorotipo A do RSV (cepa longa) através de inoculação transnasal e a quantidade viral intrapulmonar foi medida 3 dias mais tarde. O grupo de administração do Synagis (palivizumab) foi administrado com Synagis (2.5 mg/kg) um dia após o teste de infecção e a capacidade protetora contra a infecção foi avaliada da mesma maneira como acima. As amostras de sangue foram coletadas da veia jugular dos ratos sob anestesia imediatamente antes da infecção e o título de anticorpo neutralizador foi investigado usando o soro obtido.
[00273] Os resultados da quantidade viral intrapulmonar são mostrados na parte esquerda da Fig. 47 e os resultados do título de anticorpo neutralizador são mostrados na parte esquerda da mesma. Os resultados da quantidade viral intrapulmonar revelam que uma quantidade viral de cerca de 105 pfu/pulmão é observada no grupo de administração de PBS, enquanto que foi suprimido para cerca de 100 vezes menor na quantidade viral (média) no grupo administrado com vacina de RSV F adicionada com fosfato de alúmen (F+Alum). Por outro lado, a atividade para induzir a proteção contra a infecção foi observada também no grupo de administração de vacina adicionada com K3-SPG (F+K3-dA40-SPG). O grupo de vacina adicionada com K3-LNT (F+K3-dA35-LNT, F+K3-dA40-LNT) mostrou o melhor efeito protetor contra a infecção, sugerindo assim a possibilidade de ser um candidato a novo adjuvante de vacina, o qual contribui para uma alta capacidade de defesa contra a infecção, conforme comparado com fosfato de alúmen e K3-SPG.
[00274] Encontrou-se como anticorpo neutralizador que induz a capacidade, atividade neutralizadora no sangue equivalente ao Synagis, no grupo de administração de vacina adicionada com fosfato de alúmen (F+Alum). Por outro lado, uma vez que o anticorpo neutralizador quase não foi induzido em 3 de 4 ratos no grupo de administração de vacina adicionada com K3-SPG (F+K3-dA40-SPG), o efeito protetor contra a infecção ao qual K3-SPG contribui foi considerado se derivar de um mecanismo que não depende do anticorpo neutralizador. Além disso, já que um elevado anticorpo neutralizador foi encontrado no grupo de administração de K3-LNT (F+K3-dA35-LNT, F+K3-dA40-LNT), conforme comparado ao K3-SPG, se sugeriu que o adjuvante K3-LNT pudesse ter uma propriedade diferente daquela do K3-SPG, por exemplo, uma capacidade de melhoramento de resposta do Th2.
APLICABILIDADE INDUSTRIAL
[00275] A presente invenção provê um oligodesoxinucleotídeo que tem uma atividade imunoestimulante superior e um complexo contendo os mesmos. Particularmente, o complexo da presente invenção tem ao mesmo tempo uma atividade imunoestimulante exclusiva ao ODN CpG do tipo K e uma atividade imunoestimulante exclusiva ao ODN CpG do tipo D. Além disso, K3-SPG e K3-LNT que tem uma forte atividade de adjuvante de vacina e imunização com K3- SPG ou K3-LNT junto com um antígeno estimulam ambas as imunidade humoral e imunidade específica ao antígeno. Deste modo, o complexo da presente invenção é útil como um agente imunoestimulante ou adjuvante de vacina no campo dos medicamentos.
[00276] Este pedido é baseado em um pedido de patente No. 2013-196206 depositado no Japão (data de depósito: 20 de setembro de 2013), cujo teor é incorporado por completo no presente documento.

Claims (14)

1. Complexo, caracterizado pelo fato de que compreende um oligodesoxinucleotídeo e β-1,3-glucano, em que o oligonucleotídeo compreende: oligodesoxinucleotídeo CpG humanizado do tipo K e polidesoxiadenilato, em que o polidesoxiadenilato está colocado na lateral 3’ do oligodesoxinucleotídeo CpG humanizado do tipo K, em que o oligodesoxinucleotídeo CpG humanizado do tipo K consiste na sequência de nucleotídeos mostrada pela SEQ ID NO: 1, em que o polidesoxiadenilato tem um comprimento de 3040 nucleotídeos, e em que o β-1,3-glucano é lentinano.
2. Complexo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as ligações de fosfodiéster no oligodesoxinucleotídeo são parcialmente ou completamente substituídas por ligações de fosforotioato, preferencialmente as ligações de fosfodiéster no oligodesoxinucleotídeo são completamente substituídas pelas ligações de fosforotioato.
3. Complexo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que: (i) o polidesoxiadenilato está ligado na extremidade 3’ do oligodesoxinucleotídeo consistindo na sequência de nucleotídeos mostrada pela SEQ ID NO: 1, e todas as ligações fosfodiéster no oligodesoxinucleotídeo são substituídas por ligações fosforotioato; (ii) o complexo tem uma estrutura de tripla hélice; e/ou (iii) o complexo tem uma atividade para ativar células B para produzir IL-6, e uma atividade para ativar células dendríticas para produzir IFN-α.
4. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o complexo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
5. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que é para a profilaxia ou o tratamento de infecção por vírus, câncer, uma doença alérgica, ou infecção protozoária ou bacteriana parasítica intracelular, preferencialmente infecção por vírus, mais preferencialmente a infecção por vírus é infecção por vírus RS ou infecção por vírus influenza.
6. Agente para induzir a produção de interferon do tipo I e/ou do tipo II, caracterizado pelo fato de que compreende o complexo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
7. Agente imunoestimulante, caracterizado pelo fato de que compreende o complexo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
8. Agente imunoestimulante, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que é um adjuvante de vacina.
9. Uso do complexo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é para a produção de uma composição farmacêutica para o tratamento ou a profilaxia de uma doença em um animal de sangue quente e/ou para a indução de uma reação protetora imune em um animal de sangue quente.
10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que: (i) a composição farmacêutica é uma composição farmacêutica para a profilaxia ou o tratamento de infecção por vírus, câncer, uma doença alérgica, ou infecção protozoária ou bacteriana parasítica intracelular, preferencialmente a infecção por vírus é infecção por vírus RS ou infecção por vírus influenza; e/ou (ii) o animal de sangue quente é um ser humano.
11. Complexo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é para uso para o tratamento ou a profilaxia de infecção por vírus, câncer, uma doença alérgica, ou infecção protozoária ou bacteriana parasítica intracelular, preferencialmente a infecção por vírus é uma infecção por vírus RS ou infecção por vírus influenza.
12. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende (a) o complexo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, e (b) um antígeno.
13. Composição, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que é para induzir uma reação imune ao antígeno, em que preferencialmente o antígeno é derivado de um patógeno.
14. Composição, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que é para a profilaxia ou o tratamento de infecção com o patógeno, em que preferencialmente o patógeno é um vírus, preferencialmente um vírus RS ou vírus influenza.
BR112016005966-2A 2013-09-20 2014-09-19 Complexo contendo um oligodesoxinucleotídeo e beta-1,3-glucano uso do mesmo, composição farmacêutica, bem como agente para induzir a produção de interferon do tipo i e/ou do tipo ii, e agente imunoestimulante BR112016005966B1 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2013-196206 2013-09-20
JP2013196206 2013-09-20
PCT/JP2014/074835 WO2015041318A1 (ja) 2013-09-20 2014-09-19 免疫賦活活性を有するオリゴヌクレオチド含有複合体及びその用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BR112016005966A2 BR112016005966A2 (pt) 2017-09-26
BR112016005966B1 true BR112016005966B1 (pt) 2022-11-08

Family

ID=52688965

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112016005966-2A BR112016005966B1 (pt) 2013-09-20 2014-09-19 Complexo contendo um oligodesoxinucleotídeo e beta-1,3-glucano uso do mesmo, composição farmacêutica, bem como agente para induzir a produção de interferon do tipo i e/ou do tipo ii, e agente imunoestimulante

Country Status (18)

Country Link
US (2) US10202606B2 (pt)
EP (3) EP4253546A3 (pt)
JP (4) JP6525455B2 (pt)
KR (2) KR102400963B1 (pt)
CN (3) CN105683372A (pt)
AU (2) AU2014322046B2 (pt)
BR (1) BR112016005966B1 (pt)
CA (1) CA2923806C (pt)
ES (2) ES2960793T3 (pt)
MX (2) MX2016003668A (pt)
MY (1) MY178288A (pt)
NZ (1) NZ718900A (pt)
PH (1) PH12016500464B1 (pt)
PL (1) PL3048170T3 (pt)
RU (2) RU2020117033A (pt)
SG (2) SG10201802199TA (pt)
TW (3) TWI696630B (pt)
WO (1) WO2015041318A1 (pt)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3103807B1 (en) * 2014-02-06 2021-08-25 Japan Science And Technology Agency Peptide/ beta-1,3-glucan complex and production method therefor, and pharmaceutical composition containing peptide/ beta-1,3-glucan complex
WO2016103531A1 (ja) * 2014-12-26 2016-06-30 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所 免疫賦活活性を有する核酸多糖複合体の抗腫瘍薬としての応用
TW201639583A (zh) * 2015-03-20 2016-11-16 國立研究開發法人醫藥基盤 健康 營養研究所 具有免疫賦活活性之含有ＣｐＧ－間隔基－寡核苷酸複合體及其用途
JP6534146B2 (ja) * 2015-06-10 2019-06-26 国立大学法人 東京大学 ワクチン用アジュバント、ワクチン、及び免疫誘導方法
US10801026B2 (en) 2015-10-15 2020-10-13 City Of Hope Compounds and compositions including phosphorothioated oligodeoxynucleotide, and methods of use thereof
JP7128477B2 (ja) * 2017-02-07 2022-08-31 京都府公立大学法人 病原性グラム陰性菌に対するワクチン
WO2018180005A1 (ja) * 2017-03-31 2018-10-04 国立研究開発法人日本医療研究開発機構 コンドロイチン硫酸生合成を阻害するアンチセンス核酸
US20210003546A1 (en) * 2018-03-09 2021-01-07 Mandom Corporation Method for detecting indicator of immune-related disease
KR102191491B1 (ko) * 2018-06-20 2020-12-15 (주)큐젠바이오텍 베타글루칸-펩타이드 복합체 및 항생제를 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물
CA3114149A1 (en) * 2018-09-28 2020-04-02 The University Of Kitakyushu Immunity-inducing agent comprising antigen peptide-adjuvant nucleotide conjugate and pharmaceutical composition comprising same
KR102111039B1 (ko) * 2018-10-30 2020-05-14 아주대학교산학협력단 항원특이적 면역반응 억제를 위한 커들란의 설하 투여용 조성물
CN114901824A (zh) 2019-12-25 2022-08-12 日商那帕洁制药股份有限公司 连结有聚脱氧腺苷酸的短链含CpG的寡脱氧核苷酸、含有该寡脱氧核苷酸的复合体、及其用途
CA3201815A1 (en) 2020-11-12 2022-05-19 Daiichi Sankyo Company, Limited Complex of .beta.-glucan and nucleic acid having controlled particle size
CA3228856A1 (en) * 2021-08-16 2023-02-23 Peter C. Demuth Compositions containing polynucleotide amphiphiles and methods of use thereof
WO2023068104A1 (ja) * 2021-10-20 2023-04-27 国立大学法人京都大学 がん特異的細胞表面分子に対する結合性分子および光感受性分子の複合体ならびにアジュバントを含む医薬
WO2024084785A1 (ja) * 2022-10-20 2024-04-25 一般財団法人阪大微生物病研究会 Ｒｓウイルスワクチンとしての利用に好適な組成物
CN116942808B (zh) * 2023-07-21 2024-02-02 北京成大天和生物科技有限公司 一种重组带状疱疹疫苗组合物及其制备方法和应用

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995026204A1 (en) 1994-03-25 1995-10-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US20030026782A1 (en) * 1995-02-07 2003-02-06 Arthur M. Krieg Immunomodulatory oligonucleotides
US6977245B2 (en) * 1999-04-12 2005-12-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
WO2000061151A2 (en) 1999-04-12 2000-10-19 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
WO2001034207A1 (fr) 1999-11-10 2001-05-17 Japan Science And Technology Corporation Supports de genes
US8017742B2 (en) 1999-11-10 2011-09-13 Japan Science And Technology Agency Gene carrier
JP4057425B2 (ja) 2001-03-13 2008-03-05 独立行政法人科学技術振興機構 多糖を利用する遺伝子キャリヤーとその製造方法
DE60221004T2 (de) * 2001-05-21 2008-03-13 Intercell Ag Immunostimulierende oligodeoxyribonuklein moleküle
JP2004107272A (ja) 2002-09-19 2004-04-08 Japan Science & Technology Corp 遺伝子治療剤
WO2004100965A1 (ja) 2003-05-15 2004-11-25 Japan Science And Technology Agency 免疫刺激剤
KR100558851B1 (ko) * 2004-01-08 2006-03-10 학교법인연세대학교 면역조절능력이 증가된 ＣｐＧ 올리고데옥시뉴클레오티드변형체
JP4712333B2 (ja) 2004-08-31 2011-06-29 独立行政法人科学技術振興機構 ハイブリッド多糖系キャリアーを用いる核酸類の導入方法。
JP2007070307A (ja) 2005-09-09 2007-03-22 Japan Science & Technology Agency 免疫刺激性複合体
JP4878915B2 (ja) 2006-05-25 2012-02-15 独立行政法人科学技術振興機構 核酸／多糖／カーボンナノチューブ複合体
JP2008100919A (ja) 2006-10-17 2008-05-01 Japan Science & Technology Agency Ｔｈ２細胞関連疾患の予防等に用いられる核酸／多糖複合体
US7625555B2 (en) * 2007-06-18 2009-12-01 Novagen Holding Corporation Recombinant human interferon-like proteins
US8552165B2 (en) 2008-12-09 2013-10-08 Heather Davis Immunostimulatory oligonucleotides
PL2376107T3 (pl) 2008-12-09 2014-09-30 Coley Pharm Group Inc Oligonukleotydy immunostymulujące
JP5035808B2 (ja) 2009-01-28 2012-09-26 公益財団法人北九州産業学術推進機構 三元複合体の製造方法
CN101745109A (zh) 2010-02-01 2010-06-23 云南沃森生物技术股份有限公司 一种含CpG ODN和poly I:C佐剂的喷鼻型流感病毒疫苗制备方法
JP5884578B2 (ja) 2012-03-16 2016-03-15 富士通株式会社 アクセラレータ管理装置、アクセラレータ管理方法および入出力装置
CN202938106U (zh) 2012-11-26 2013-05-15 甘俊辉 距离感应变光式led灯

Also Published As

Publication number Publication date
PL3048170T3 (pl) 2020-01-31
JP2019123751A (ja) 2019-07-25
ES2960793T3 (es) 2024-03-06
EP3572511B1 (en) 2023-07-12
MY178288A (en) 2020-10-07
KR102400963B1 (ko) 2022-05-24
JP2021167348A (ja) 2021-10-21
RU2016115052A3 (pt) 2018-09-03
SG11201601885WA (en) 2016-04-28
CA2923806A1 (en) 2015-03-26
US10202606B2 (en) 2019-02-12
EP3048170B1 (en) 2019-07-31
AU2014322046B2 (en) 2021-02-04
JP7278551B2 (ja) 2023-05-22
US20160208260A1 (en) 2016-07-21
KR20160055863A (ko) 2016-05-18
SG10201802199TA (en) 2018-04-27
JP6525455B2 (ja) 2019-06-05
NZ718900A (en) 2022-05-27
CA2923806C (en) 2018-09-04
EP4253546A2 (en) 2023-10-04
WO2015041318A1 (ja) 2015-03-26
JPWO2015041318A1 (ja) 2017-03-02
EP3048170A4 (en) 2017-05-03
AU2021202301A1 (en) 2021-05-13
TW201609786A (zh) 2016-03-16
CN114652739A (zh) 2022-06-24
ES2749627T3 (es) 2020-03-23
PH12016500464A1 (en) 2016-05-16
TWI696630B (zh) 2020-06-21
CN105683372A (zh) 2016-06-15
US20190112606A1 (en) 2019-04-18
RU2020117033A (ru) 2020-07-28
EP4253546A3 (en) 2023-12-13
KR20220068276A (ko) 2022-05-25
TW202332452A (zh) 2023-08-16
MX2020012133A (es) 2021-01-29
EP3572511A1 (en) 2019-11-27
TW202041514A (zh) 2020-11-16
US11015202B2 (en) 2021-05-25
TWI798557B (zh) 2023-04-11
PH12016500464B1 (en) 2016-05-16
EP3048170A1 (en) 2016-07-27
AU2021202301B2 (en) 2023-06-15
RU2016115052A (ru) 2017-10-25
RU2723943C2 (ru) 2020-06-18
JP6993649B2 (ja) 2022-02-03
CN114762695A (zh) 2022-07-19
MX2016003668A (es) 2016-06-24
JP2023086856A (ja) 2023-06-22
BR112016005966A2 (pt) 2017-09-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2021202301B2 (en) Complex containing oligonucleotide having immunopotentiating activity and use thereof
JP6698069B2 (ja) 免疫賦活活性を有するＣｐＧスペーサーオリゴヌクレオチド含有複合体及びその用途
AU2004238139B2 (en) Immunostimulating Agents
BR112021005601A2 (pt) indutor de imunidade que compreende conjugado de nucleotídeo de peptídeo adjuvante antigênico e composição farmacêutica que compreende o mesmo
BR122020017002B1 (pt) Usos de oligodesoxinucleotídeos na fabricação de agentes para tratamento ou profilaxia de câncer
US20230053708A1 (en) Short-chain cpg-containing oligodeoxynucleotide with linked polydeoxyadenylic acid, complex containing said oligodeoxynucleotide, and use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]
B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]
B06U Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette]
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 19/09/2014, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS