JP7128477B2 - 病原性グラム陰性菌に対するワクチン - Google Patents

Description

本発明は、病原性グラム陰性菌に対するワクチンに関する。

高度先進医療や高齢化に伴い、多剤耐性菌による致死的感染症が多く報告されてきている。特に、日和見感染や集中治療対象となる人工呼吸器関連肺炎の高頻度起炎菌である緑膿菌の高度多剤耐性化は急激に進んでおり、抗菌薬に頼らない、免疫力を強化するワクチンの開発が強く求められている。

緑膿菌を含む多くの病原性グラム陰性菌は、標的真核細胞と直接接触し、特殊なIII型分泌システム(TTSS)を用いて、直接、タンパク毒素を標的細胞の細胞質内に転移させる(図1)。この病原性に対抗するには、毒素に対する抗体ではなく、毒素分泌の阻害や、あるいは転移した毒素の酵素作用を抑制する必要がある。緑膿菌はTTSSを通じて4種の毒素(ExoS, T, U, Y)を標的細胞に注入することで細胞死や貪食能阻害をもたらして病原毒性を発揮する(図2) (非特許文献１)。毒素の標的細胞質への注入には、III型分泌装置先端の構造と標的細胞膜上に形成されるポアーが必要であり、これらは３つのタンパク(PcrV、PopB、PopD)で構成される（図3）。特にPcrVタンパクは、ペスト菌のV抗原LcrVと相同体であり、本発明者らは緑膿菌感染に対するワクチン効果を持つことを発見した（非特許文献２）。後に、このPcrVはIII型分泌システムの分泌装置の突起先端部分にてpentamer cap構造(図3)を構成し、PcrVに対する特異的抗体（非特許文献３～５）が毒素のポアー通過を阻害することが解ってきた。本発明者らはこれまでの動物モデルにおける抗体療法の結果や、ヒトでの細菌学的・血清学的な疫学調査に基づいて、ヒトに臨床応用可能な緑膿菌用ワクチン開発を行ってきた(非特許文献６～７)。

Sawa T. J Intensive Care 2:10, 2014 Sawa T, et al. Nat Med 5:392, 1999 Frank DW, Sawa T, et al. J Infect Dis 186:64, 2002 Faure K, Sawa T, et al. J Immune Based Ther Vaccines 1:2,2003 Shime N, Sawa T, et al. J Immunol 167:5880, 2001 Sawa T, et al. Nat Med 5:392, 1999 Moriyama K, Sawa T, et al. Microbiol Immunol 53:587,2009

日本人死因は、平成23年以来、脳血管疾患を抜いて肺炎がその第三位を占め、その背景の一つとして多剤耐性化した緑膿菌による細菌性肺炎が増加している。今後、集中治療対象となる人工呼吸患者や免疫不全状態にある患者や高齢者に対する日和見感染として病原性グラム陰性菌、特に緑膿菌性肺炎が更に増加することが予想され、安価で効果的な予防効果を発揮する病原性グラム陰性菌ワクチンの開発が求められている。

本発明は、病原性グラム陰性菌に対する効果的なワクチンを提供することを目的とする。

本発明は、以下のワクチンを提供するものである。
項１． 少なくとも１種のIII型分泌システムのV抗原又はその相同体タンパク質又はその一部もしくはそれをコードする遺伝子とアジュバントとして少なくとも１種のCpGオリゴデオキシヌクレオチド(CpG ODN)を含む病原性グラム陰性菌に対するワクチン。
項２． III型分泌システムのV抗原又はその相同体タンパク質が、PcrV、LcrV、LssV、AcrV、VcrV、EspA、SipD、SeeB又はIpaDである、項１に記載のワクチン。
項３． III型分泌システムのV抗原又はその相同体タンパク質がPcrVタンパク質である、項２に記載の病原性グラム陰性菌に対するワクチン。
項４． 病原性グラム陰性菌が、緑膿菌、ペスト菌、百日咳菌、エルシニア菌、サルモネラ菌、赤痢菌、エアロモナスヒドロフィラ菌、せっそう病原因菌、仮性結核菌、病原性大腸菌、腸炎ビブリオ菌、ビブリオ・ハーベイ菌又はクラミジア菌である、項１～３のいずれか１項に記載のワクチン。
項５． 病原性グラム陰性菌が緑膿菌である、項４に記載のワクチン。
項６． CpG ODNが、ホスホロチオエート骨格を有するものである、項１～５のいずれか１項に記載のワクチン。
項７． CpG ODNのクラスが、A class(D type)、B class(K type)、C class又はP classである、項１～６のいずれか１項に記載のワクチン。
項８． CpG ODNのクラスがB class(K type)である、項７に記載のワクチン。
項９． アジュバントがCpG(K3)、CpG(D35)、CpG ODN(1018 ISS)及びCpG 7909からなる群から選ばれる少なくとも１種である、項１～８のいずれか１項に記載の病原性グラム陰性菌に対するワクチン。
項１０． アジュバントがCpG(K3)である、項９に記載の病原性グラム陰性菌に対するワクチン。
項１１． 経鼻投与または吸入投与される、項１～１０のいずれか１項に記載の病原性グラム陰性菌に対するワクチン。

本発明者はこれまでの研究成果を元に、実際に臨床応用可能なワクチン・アジュバント精製を行い、動物による有効性テストを実施し、臨床応用可能な抗緑膿菌ワクチンの発明に至った。TTSSは病原性グラム陰性菌において高い相同性を持って広く存在しており、緑膿菌での有効性確立は、他の病原性グラム陰性細菌に対する応用の可能性を持つ。また今回、同時に使用するCpG ODNアジュバントはTLR-9を刺激することで効果を発揮し、現在臨床使用されている細胞毒性を持つ水酸化アルミニウム等とは異なり、また経鼻投与することで有意な免疫効果が発揮されることから、より安全でかつ簡便なワクチン効果が期待できる。

本発明のワクチン又はワクチン組成物は、 CpG ODNアジュバントとして好ましくはCpG-oligodeoxynucleotides（CpG-ODN, K3タイプ）を用いる。CpG ODNアジュバントは、経鼻投与で強い免疫効果が発揮され、より安全でかつ簡便な利用が期待できる。

グラム陰性菌III型分泌システム 緑膿菌III型分泌毒素 緑膿菌III型分泌装置と転移に関わる３つのタンパク(PcrV, PopB, PopD) タグレス遺伝子組み換えPcrVタンパク生成のためのベクター SDS-PAGEと6xHis-tag染色 経鼻緑膿菌ワクチンの効果を調べるプロトコール PcrVワクチン経鼻投与による抗体価の上昇 PcrVワクチン（経鼻投与）マウスの緑膿菌感染生存率 感染24時間後の肺内細菌数

本発明において、III型分泌システムのV抗原又はその相同体タンパク質としては、PcrV(緑膿菌など)、LcrV（ペスト菌、仮性結核菌、腸炎エルシニア菌など）、LssV(フォトラブダス菌など)、AcrV(エアロモナスヒドロフィラ菌、せっそう病原因菌)、VcrV（腸炎ビブリオ菌、ビブリオ・ハーベイ菌）、EspA（O157などの病原性大腸菌など）、SipD,SeeB（サルモネラ菌など）、IpaD（赤痢菌など）が挙げられる。なお、括弧内は、ワクチンの対象となる病原性グラム陰性菌である。III型分泌システムとしては、Yop、Pop/Exo、Lop、Aop、Vop、Esp/Tir、Sop.Sip、Ipaなどが挙げられる。病原性グラム陰性菌としては、緑膿菌、ペスト菌、百日咳菌、エルシニア菌、サルモネラ菌、赤痢菌、エアロモナスヒドロフィラ菌、せっそう病原因菌、仮性結核菌、病原性大腸菌（O1、O26、O111、O121、O128、O157）、腸炎ビブリオ菌、ビブリオ・ハーベイ菌、クラミジア菌などが挙げられる。好ましいIII型分泌システムのV抗原又はその相同体タンパク質は、緑膿菌由来のPcrVであり、この場合緑膿菌に対するワクチンが得られる。本発明のワクチンがDNAワクチンの場合には、III型分泌システムのV抗原又はその相同体タンパク質を発現可能にコードするDNA、例えばプラスミドを含む。III型分泌システムのV抗原又はその相同体タンパク質は精製用にタグを結合してもよい。タグとしては、Hisタグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク質（MBP）、HAタグ、mycタグ、FLAGタグなどが挙げられる。

III型分泌システムのV抗原又はその相同体タンパク質の一部としては、III型分泌システムのV抗原又はその相同体タンパク質に対する抗体を生成可能な抗原決定基を有する部分ポリペプチドが挙げられ、例えば緑膿菌由来のPcrVの場合には、139-294のポリペプチドがIII型分泌システムのV抗原又はその相同体タンパク質の一部に包含される。緑膿菌以外のIII型分泌システムのV抗原又はその相同体タンパク質についても同様に抗原決定基を有する部分ポリペプチドが使用可能である。

本発明のワクチンには、III型分泌システムのV抗原又はその相同体タンパク質とともに、アジュバントとしてCpGオリゴデオキシヌクレオチド(CpG ODN)が配合される。CpG ODNはTLR9アゴニスト作用を有し、TLR9を介して免疫系を活性化する。CpG ODNは、通常メチル化されていないものを指すが、メチル化されていてもよい。CpG ODNは、糖鎖で修飾されていてもよい。また、CpG ODNは1種のみでもよく、2種以上を併用してもよい。CpG ODNは、１種または複数の回文構造を含み得、次いで、これはCpGジヌクレオチドを包含し得る。

CpG ODNは種々のクラス(class)、例えばA class(D type)、B class(K type)、C class、P classを包含し、B class(K type)が好ましい。

K type (B class)のCpG ODNはホスホロチオエート骨格をもつlinearな構造であり、典型的には高次構造を形成しない。D type(A class)のCpG ODNは中心にホスホジエステル結合を持ち、両端のポリ-G モチーフがG-tetradという高次構造を形成する。ホスホロチオエート骨格はヌクレアーゼ耐性のため最も安定しており、B cellを強力に活性化しpDCを分化させる一方、pDCからのIFNα分泌作用は弱まる。しかし、K type CpG ODNを微粒子やビーズ、カチオン性脂質と合わせて人工的に高次構造をとらせると、高次構造を有するD typeと同様の免疫活性化作用（pDCからのIFNα分泌など）を持つようになる。

臨床応用されるCpG ODNは一般的に、少なくとも一部はホスホロチオエート骨格を有するように合成することが好ましい。これによりヌクレアーゼ耐性のため半減期が増加し（30-60分、天然のホスホジエステルでは5-10分）、より強い免疫刺激作用を示すためである。

炭疽菌やマラリアの臨床試験に使用されているCpG 7909は、このK typeに属する。HBVワクチンのHEPLISAVに含まれるCpG ODN(1018 ISS)は、少なくとも部分的にはK typeを含んでいると推測される。

CpG ODNは、数多くのものが公知になっており、それらを使用することができる。CpG ODNの製品としては、CpG(K3)、CpG(D35)(いずれも株式会社ジーンデザイン製)が挙げられる。

KタイプのCpG ODN(K3)の具体例としては、5'-ATC GAC TCT CGA GCG TTC TC-3'(配列番号1)が挙げられる。

本発明のワクチンの投与対象は、ヒト、サル、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス等の哺乳動物が挙げられ、好ましくはヒトである。

本発明のワクチンは１回の投与で免疫が得られるが、複数回ワクチンを投与することにより、さらに免疫能を高めることができる。例えば、０日目に初回刺激用量を与え、２～２４週の範囲、好ましくは４～８週の投与間隔で１回または複数回の追加免疫を与えることができる。

本発明のワクチンは皮下、皮内、筋肉内に投与してもよいが、点鼻、舌下、吸入などの経路で投与することができる。

以下、本発明を実施例及び比較例により詳細に説明する。

実施例１
GMP適合PcrV・CpG(K3)ワクチン
1) 遺伝子組み換えタグレスPcrVワクチン抗原の開発：
緑膿菌株PAO1よりpcrV遺伝子クローニングを行い、遺伝子組換えPcrVタンパクの生成をこれまでの実験で行なってきた。遺伝子組み換えPcrV精製のためにカラム精製のためHexahistidine-tag（6xHis）付きのタンパクを用いて実験を行ってきたが、臨床応用を目指すために、精製タグを持たない遺伝子組み換えPcrV生成用のベクター作成(Tagzyme pQE2::pcrV)を行った(図４)。このタンパクの精製用のN末端6xHisタグアミノ酸配列は、"MKHHHHHHHAKM"となって、IMACカラムで精製後にDAPase酵素処理にて、タグ部分を分解できる。本発明者らは、このタグレス遺伝子組み換えタンパク精製システムを用いて、タグレス遺伝子組み換えPcrVの生成に成功した（図５)。以前の実験（Frank DW, Sawa T, et al. J Infect Dis 186:64, Moriyama K, Sawa T, et al. Microbiol Immunol 53:587,2009）では、C末端側の#139-#250のドメイン領域を含むタンパクがワクチン効果を発揮することが判明しており、遺伝子組み換えPcrVについては、全長のアミノ酸配列を含むPcrV#1-#294ならびに、アミノ末端側配列を除去したブロッキング抗体エピトープ部分を含むPcrV#139-#294の二通りを作成した。 今回は、全長のアミノ酸配列を含む遺伝子組み換えPcrV#1-#294で動物実験を行っているが、遺伝子組み換えPcrV#139-#294についても同様の効果が期待できるため、今後は精製効率や抗体価の上昇などの効果を判定して、臨床試験に用いる配列を最終決定する予定である。
この生成物をもとに、外部委託にてGMP適合ワクチン用のPcrV精製を行った。アジュバントとして使用するPcrV・CpG(K3)は、医薬基盤・健康・栄養研究所アジュバント開発プロジェクト（石井健センター長）から供出された。

2) マウス緑膿菌肺炎モデルを用いたGMP適合PcrV・CpG(K3)ワクチンの有効性の確認: これまでの研究で、本発明者の研究室にて生成した前臨床試験動物実験用の遺伝子組み換えPcrVタンパクとCpG(K3)アジュバントの混合ワクチンのマウスへの経鼻投与により、Al hydrogelアジュバント(以下Alum)との比較において、マウス緑膿菌肺炎モデルにおいて、遺伝子組み換えPcrV#1-#294 ワクチンと経鼻投与による予防効果を調べた(図６)。

マウスを3群に以下の3群に分けて比較した。
(i) PcrV+CpG(K3)群: PcrV 10μg/2.9μl＋CpG 10μg/10μl(n=15)
(ii) PcrV＋Alum群: PcrV 10μg/2.9μl＋Alum 15μl(n=14)
(iii) PcrV群; PcrV 10μg/2.5μl(n=15)

それぞれ生食で希釈し、1匹あたり計30μlずつ経鼻投与、投与間隔は 、週令4週のマウスに0、7、14、21日目でワクチンを計4回経鼻投与し、50日目に尾静脈より少量採血してELISA法にて抗PcrV抗体価測定して、抗PcrV抗体価の上昇を３群で比較した。続いて、60日目に肺内に致死量の緑膿菌PA103株を投与する感染実験を行い、 感染後の生存率や体温変化、肺内細菌数を測定して3群で比較検討した。その結果、CpG(K3) をアジュバントとして用いて、経鼻投与した群では、アジュバントを含まない群、並びにAlum群との比較において、有意な抗PcrV抗体価の上昇(OD460: CpG群0.82±0.69 vs Alum群0.24±0.27, アジュバントを含まないコントロール群0.08±0.03, *p<0.05 between CpG群 and Alum群)(図７)と、その後の感染実験での有意な生存率改善の効果が確認できた(生存率：CpG群73% vs Alum群29%、アジュバントを含まない群20%, *p<0.05)(図８)。また感染24時間後の肺内の細菌数は、CpG(K3)群において有意な低下が認められた(median、colony forming unit/肺: CpG群1.1x10^5 vs Alum群3.0x1-^5, アジュバントを含まないコントロール群6.1x10^5, *p<0.05 between CpG群 and Alum群)(図９)。

3) 上記実験結果からPcrV+CpG(K3)経鼻ワクチンは、PcrV+Alum経鼻ワクチン及びアジュバントを含まないPcrV経鼻ワクチンとの比較において、有意な抗PcrV抗体価の上昇をもたらし、致死量の緑膿菌感染に対する高い免疫力を発揮することが確認できた。

遺伝子組み換えタンパク質のアミノ酸配列
1)全長の緑膿菌ネイティブPcrVタンパク：native PcrV #1-#294 aa sequence

294 aa, 32.3kDa
今回作成した遺伝子組み換えヘキサヒスチジンタグ付きPcrV#1-#294タンパクワクチン抗原：
（アミノ末端のヘキサヒスチジンタグは、DAPase処理にて除去される）
TAGZyme-6xHis-PcrV#1-#294

波線: 6xHis tag
二重下線: DAPase-STOP
305 aa, 33.7kDa
After digestion with DAPase:32.4 kDa, 295 AAs

2) 以前の実験からPcrVタンパクの中で、抗毒性を発揮することが変わっているカルボキシル末端側（139-294アミノ酸）の緑膿菌ネイティブPcrV配列：native PcrV-C-term #139-#294:

MW 17.1kDa, 156 AAs
今回作成した遺伝子組み換えヘキサヒスチジンタグ付きC末端側PcrV139-294タンパクワクチン抗原：
（波線のアミノ末端のヘキサヒスチジンタグは、DAPase処理にて除去される）
TAGZyme-6xHis-PcrV-C-term #139-#294:

波線: 6xHis tag
二重下線: DAPase-STOP
MW 18.5kDa, 167 AAs
After digestion with DAPase: 17.3 kDa, 157 AAs

Claims (2)

1. 少なくとも１種のPcrVタンパク質又はその一部もしくはそれをコードする遺伝子とアジュバントとして少なくとも１種のCpG(K3)を含む緑膿菌に対するワクチン。
2. 経鼻投与または吸入投与するための、請求項１に記載のワクチン。

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